(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴペプチド酢酸塩を得るためにアセテート含有溶剤を使用する液体クロマトグラフィーによってオリゴペプチドを１工程で塩変換および精製する方法において、精製のために該オリゴペプチドをその塩酸塩の形で使用し、かつクロマトグラフィーを勾配溶離によって実施し、勾配溶離のための溶剤混合物として、以下の組成：
溶剤Ａ 溶剤Ｂ
ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水２０〜４８％
ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％
ｉｉｉ．アセトニトリル０〜５％ ｉｉｉ．アセトニトリル５０〜７０％
または
溶剤Ａ 溶剤Ｂ
ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水０〜１０％
ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％
ｉｉｉ．メタノール０〜５％ ｉｉｉ．メタノール８０〜９８％
を有する溶剤を使用するオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項２】
オリゴペプチドの保護された前駆体を濃塩酸で脱保護することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項３】
オリゴペプチドの純塩化物を、その塩酸溶液の凍結乾燥によって得ることを特徴とする、請求項２記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項４】
オリゴペプチドの塩化物を濃塩酸水溶液の形で使用することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項５】
純塩化物を、液体クロマトグラフィー溶剤または酢酸中に溶解させた後で使用することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項６】
該方法を温度−２５〜３０℃で実施することを特徴とする、請求項２記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項７】
液体クロマトグラフィーとして高圧液体クロマトグラフィーを使用することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項８】
勾配溶離のための溶剤混合物として、以下の組成：
溶剤Ａ                                溶剤Ｂ
ｉ．水９２％                          ｉ．水２８％
ｉｉ．酢酸５％                        ｉｉ．酢酸５％
ｉｉｉ．アセトニトリル３％          ｉｉｉ．アセトニトリル６７％
または
溶剤Ａ                                溶剤Ｂ
ｉ．水９０％                            ｉ．水５％
ｉｉ．酢酸５％                        ｉｉ．酢酸５％
ｉｉｉ．アセトニトリル５％          ｉｉｉ．アセトニトリル９０％
を有する溶剤を使用することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項９】
該方法を温度５℃〜５０℃で実施することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１０】
該方法を圧力５〜１００バールで実施することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１１】
固定相として、逆相カラム材料を使用することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１２】
オリゴペプチドとして、アミノ酸少なくとも５個および多くて２５個のペプチドを使用することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１３】
アミノ酸８〜１６個のペプチドを使用することを特徴とする、請求項１２記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１４】
アミノ酸１０個のペプチドを使用することを特徴とする、請求項１３記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【請求項１５】
液体クロマトグラフィーを、擬似移動床法または循環クロマトグラフィーによって実施することを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴペプチドは、屡々生物学的活性を示し、かつ従って治療剤として使用される。例としては、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられ、これらは就中、一定の型の癌の治療に使用される。
【０００３】
精製すべきオリゴペプチドは、当業者に公知の方法によって製造することができる。適当な方法は、特に固体担体材料上でのメリフィールドのペプチド合成または溶液中での慣用の合成を包含する。メリフィールドの固相合成および溶液中での合成の両者においては、分子中の一定の部位が、製造の最後に分解して除去される保護基を有することが不可欠である。固相合成においては、更に、オリゴペプチドを固体担体から分離する必要がある。ペプチド合成の更なる詳細は、関連文献（Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol.15/1および15/2；M.Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag 1984）を参照のこと。
【０００４】
製造すべきペプチドが医薬品であるならば、患者に薬剤の適用と一緒にいかなる異物または他の潜在的に有害な物質を与えてはならないため、屡々オリゴペプチドがその酢酸塩の形で存在することが所望される。
【０００５】
しかしながら屡々、合成に関連する事情のため、オリゴペプチドは必ずしも酢酸塩の形で存在することがない場合がある。というのも、酢酸以外の酸が保護基の最終的な開裂のために使用される必要があること、またはペプチドの遊離した形は製造できないかまたは困難を伴ってのみ製造でき、かつ酢酸による酢酸塩への簡単な変換が不可能であることのどちらかだからである。保護基の開裂または合成に必要な樹脂からのペプチドの開裂のためには、一般に比較的強酸、例えばトリフルオロ酢酸、塩酸または臭化水素酸を使用する必要がある。これらの開裂方法の更なる詳細は、再び標準テキスト（Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/1および15/2；M.Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag 1984）を参照のこと。
【０００６】
動物またはヒトに使用するために必要な関連するオリゴペプチドの酢酸塩を製造するためには、前記の場合においてオリゴペプチドを強制的に塩変換させることである。
【０００７】
有効物質として試験されるべきオリゴペプチドまたは既に治療剤として市販されているオリゴペプチドは、その純度に関して特定の必要条件を満たさねばならない。適当な慣用の精製方法がないため、合成中に形成する生成混合物は一般にクロマトグラフィー、特に高圧液体クロマトグラフィーによって精製される。この目的のために、オリゴペプチドを溶剤中、有利には溶離剤として選択された移動溶剤の溶剤混合物中に取り込み、これをカラムに適用する。
【０００８】
オリゴペプチドに関しては、幾つかの方法が塩変換および精製に関する文献に既に記載されている。ガブリエル（Gabriel）によれば（Int.J.Peptide Protein Res.1987, 30, 40-43）、オリゴペプチドＧＲＦ（１〜４４）−ＮＨ2は、そのトリフルオロ酢酸塩から酢酸塩にピリジン含有溶剤および酢酸含有溶剤を使用する高圧液体クロマトグラフィーによって変換することができる。かかる方法の後に、必然的にオリゴペプチド中に残留するピリジン残分に関しては、勿論該物質の毒性学的特性に関して問題が残る。また、危険なピリジンを比較的大量必要とする精製方法は、工業的な安全性の側面から不所望である。
【０００９】
ヘーゲル他（Hoeger et al）（Biochromatography 1987, 2, 134-142）は、ピリジン含有溶剤系の使用は避けてＧｎＲＨペプチドを塩変換および精製しようと試みた。フッ化物塩から出発して、２工程の逆相勾配クロマトグラフィーを、リン酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＰ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液中で改質剤（modifier）としてアセトニトリルを使用して実施した。精製ペプチド分画を凍結乾燥し、引き続き希酢酸での陰イオン交換クロマトグラフィーまたは酢酸アンモニウム／アセトニトリル勾配における逆相クロマトグラフィーによって酢酸塩に変換した。
【００１０】
欧州特許第０１４５２５８号明細書は、就中ＬＨＲＨアゴニストの群のノナペプチドおよびデカペプチドのＨＦ塩の精製を記載している。ここではまた、塩変換は精製工程と別々に、まず高圧条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーによって、引き続き酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルからなる溶離剤によってオクタデシル−シラン処理したケイ酸ゲル相上で最終的な精製をして実施する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、２つの作業工程を１工程にまとめ、かつピリジンの使用を避ける、オリゴペプチドの塩変換および精製のための更なる方法を提供することである。
【００１２】
前記課題およびより明確には特定しないが先行技術から明白である更なる課題は、請求項１の特徴部である。本発明の方法の有利な変更は請求項１に関する従属請求項である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
塩変換および精製すべきオリゴペプチドを、その塩酸塩の形でアセテート含有溶剤による液体クロマトグラフィーによって精製することによって、事実上塩化物不含の精製オリゴペプチドの酢酸塩が、極めて簡単であるが、それにもかかわらず有利な方法で得られる。従って、本発明による方法を使用することで、今まで２工程でまたは毒性学的に有害なピリジンを使用することによってのみ達成できた当該オリゴペプチドの効果的な精製と塩変換を、ピリジンを添加することなく単一の作業工程にまとめることが可能である。有利には、本発明によって得られる生成物分画を、合しかつ凍結乾燥によって乾燥させる。該酢酸塩は、塩化物から約８５％の収率で得られる。このようにして９９．５％までのパーセンテージで得られる純粋なオリゴヌクレオチドの酢酸塩は、適当な配合後に医学的治療および療法のための有効成分として使用することができる。
【００１４】
本発明の方法ためには、オリゴペプチドはその塩化物の形で使用する必要がある。これを解決するための最も簡単な方法は保護基の開裂のために塩酸を使用することである。しかしながら他方では、開裂剤の酸強度の結果として生じるペプチド加水分解および側鎖の基での他の二次反応は、不所望な競合反応を構成する。これらの理由および他の理由（例えばＴＦＡ中でのペプチドの可溶性）のため、あまり強くない無水の酸、例えばトリフルオロ酢酸または無水の強酸混合物、例えばＨＢｒ／酢酸を屡々かかる保護基の開裂のために使用する。
【００１５】
ここで、全く意想外であるが、にもかかわらず有利には、保護されたオリゴペプチドを水性濃塩酸を使用しても脱保護でき、それから形成するオリゴペプチドの塩が、あまり強くない無水トリフルオロ酢酸、あるいはそれと有機溶剤との混合物での、またはＨＢｒ／酢酸系でのより慣用の開裂と比較して、副生成物を非常に低い割合で含有することが判明した。このことは、明らかでも容易に推考できるものでもない。
【００１６】
有利には、前記のオリゴペプチドからの保護基の開裂は、温度範囲−２５℃〜３０℃、特に有利には−１０℃〜１０℃、より特に有利には０℃〜５℃で実施される。
【００１７】
オリゴペプチドの塩化物は、液体クロマトグラフィーによる精製のために濃塩酸水溶液の形で使用してもよい。しかしながら、有利には塩化物を、例えば保護基を開裂させた後に凍結乾燥によって単離し、次いでまずそれを液体クロマトグラフィー溶剤系または酢酸中に溶解させ、これをカラムに添加することにより単離する。
【００１８】
有利には、高圧液体クロマトグラフィーがオリゴペプチドを精製するための液体クロマトグラフィー法として使用される。以下の組成の溶剤が勾配溶離のための溶剤系として使用される：
0004414503.tif 000002
または
0004414503.tif 000003
【００１９】
勾配溶離のためには、有利には以下のものからなる溶剤混合物を使用する：
0004414503.tif 000004
または
0004414503.tif 000005
【００２０】
有利には、精製はカラム温度５℃〜５０℃、特に有利には１５℃〜３５℃、より特に有利には２０℃〜３０℃で実施する。
【００２１】
カラム圧力は、５〜１００バール、有利には２０〜８０バール、特に有利には３０〜６０バールにすべきである。原則的に、精製のための固定相として当業者に公知の材料を使用してもよい。逆相材料が特に適当である。逆相材料とは、担体材料、例えばシリカゲルまたは有機ポリマーをベースとするカラム充填体を意味すると解される。シリカゲルの場合においては、親水性表面をオルガノシランによって変性させてもよい。この目的のために、Ｃ−２、Ｃ−８またはＣ−１８変性が特に適当である。特に有利には、Ｃ−１８変性ＲＰ−１８相、より特に有利にはＭａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ社のＮｕｃｌｅｏｓｉｌ（Ｒ）３００−７−Ｃ18またはＭｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒ（Ｒ）ＲＰ１８（１０μｍ）を使用する。
【００２２】
本発明の明細書中でのオリゴペプチドとは、アミノ酸５〜２５個を有するペプチドを意味すると解される。アミノ酸８〜１２個を有する範囲のオリゴペプチドが有利である。アミノ酸１０個を有するオリゴペプチドの使用が極めて特に有利である。
【００２３】
オリゴペプチドの塩変換および精製のための前記の液体クロマトグラフィー法は、いわゆる擬似移動床技術（simulated moving bed method）ならびに循環クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００２４】
特に有利には、本発明による方法は、ＬＨＲＨアンタゴニストであるセトロレリックス（Cetrorelix）（１）およびアンタレリックス（Antarelix）（２）を製造するための合成において使用される。
【００２５】
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−Ｐａｌ（３）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＣＨ3ＣＯＯＨ
１
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−Ｐａｌ（３）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＣＨ3ＣＯＯＨ
２
セリンおよびチロシンの側鎖におけるｔ−ブチル保護基の導入は、合成において特に適当であると判明した。目的の生成物を得るためには、これらの保護基を酸性条件下（ＴＦＡまたはＨＣｌ）で再び分解除去せねばならない。塩酸によるｔ−ブチル基の開裂においては、ＴＦＡを使用する場合よりも副生成物の形成が極めて少ない。最適化した分離方法はクロマトグラフィー法に適当であり、かつ３０ｃｍ以上の内径およびクロマトグラフィー運転（chromatography run）につき２００ｇ以上の注入量を有する分取ＨＰＬＣカラムの使用を可能にする。
【００２６】
本発明による方法の結果として、前記のオリゴペプチドは、例えばより有利であり、従って経済的により有利な方法において数キログラム（multikilogram）の規模で製造することができる。
【００２７】
本明細書中に記載されている本発明のための出発物質は当業者に自体公知の方法によって製造することができる。関連するテキスト（Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol.15/1および15/2；M.Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag 1984）を参照のこと。
【００２８】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない：
【実施例】
例１：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＨＣｌ（１ａ）（セトロレリックス塩酸塩）の製造
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2５０ｇ（３１．６５ミリモル）を、激しく撹拌しながら氷冷濃塩酸２００ｍｌ中に添加する。反応混合物を０℃〜５℃で約１時間撹拌し、ｎ−ブタノール０．７５ｌおよび氷０．５ｋｇの撹拌混合物中に添加し、水１２０ｍｌの添加後に相を分離し、有機相のｐＨを水酸化ナトリウムで約２に調整し、かつブタノール溶液を真空で蒸発させる。残留物をｔ−ブチルメチルエーテル０．５ｌ中に懸濁し、吸引濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテル０．５ｌで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００２９】
１ａの収率：４９ｇ（１０３％、物質はＮａＣｌ約４重量％を含有する）、ＨＰＬＣ純度９４．４面積％（area%）（図６参照）。
【００３０】
例２：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＴＦＡ（１ｂ）（セトロレリックストリフルオロ酢酸塩）の製造
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2１ｇ（０．６３３ミリモル）をトリフルオロ酢酸１０ｍｌ中に溶解させ、溶液を１．５時間撹拌し、次いで氷冷ジイソプロピルエーテル１００ｍｌに添加する。生成物１ｂを吸引濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００３１】
１ｂの収率：１．０５ｇ（１００％）、ＨＰＬＣ純度８９．６面積％（図７参照）。
【００３２】
例３：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＨＣｌ（２ａ）（アンタレリックス塩酸塩）の製造
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−Ｂｏｃ）（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2７７．３ｇ（４６．２ミリモル）を、激しく撹拌しながら氷冷濃塩酸４００ｍｌに添加する。約１時間後に、反応混合物を水０．８５ｌおよび氷０．８５ｋｇの混合物中に注入し、この水溶液をその都度ｎ−ブタノール０．９ｌで２回抽出し、合したブタノール相のｐＨを炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で約２に調整し、相を分離し、有機相を真空で乾燥させる。残留物をｔ−ブチルメチルエーテル２ｌで浸漬し、吸引濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００３３】
収率７２ｇ（１０４％、物質はＮａＣｌ２重量％および残留ブタノールを含有している）、ＨＰＬＣ純度９４．０％（図８参照）。
【００３４】
例４：
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＴＦＡ（２ｂ）（アンタレリックストリフルオロ酢酸塩）の製造
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−Ｂｏｃ）（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2１ｇ（０．６ミリモル）をトリフルオロ酢酸１０ｍｌ中に溶解させ、溶液を約１．５時間撹拌し、次いで氷冷ジイソプロピルエーテル１００ｍｌに添加する。生成物１ｂを吸引濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００３５】
２ｂの収率：１．０１ｇ（１００％）、ＨＰＬＣ純度８９．４面積％（図９参照）。
【００３６】
例５：
慣用の溶液における合成の粗生成物（例１）からのセトロレリックスの分取精製
例１の方法からの粗生成物１８ｇを３０％酢酸５００ｍｌ中に溶解させ、濾過（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィルターによる）後に、カラム（長さ２５０ｍｍ、内径１００ｍｍ）に適用する。Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ社のＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７−Ｃ18または場合によりＭｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ １８（１０ｍｍ）を固定相として使用してもよい。まず、カラムを移動相Ａ（超純水９７０ｍｌ＋アセトニトリル３０ｍｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）９５％と移動相Ｂ（アセトニトリル７００ｍｌ＋超純水３００ｍｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）５％との溶剤混合物で２０分間コンディショニングする。次いで、クロマトグラフィーをＮｕｃｌｅｏｓｉｌ相上で以下の勾配プログラムによって実施する：
0004414503.tif 000006
【００３７】
溶離剤の流量は２００ｍｌ／分であり、カラム圧力３８〜６０バールはその都度勾配条件によって増加させる。
【００３８】
場合により、クロマトグラフィーをＰｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上で以下の勾配プログラムによって実施する：
0004414503.tif 000007
【００３９】
溶離剤の流量はその都度３００ｍｌ／分であり、その都度勾配条件によってカラム圧力３５〜５０バールをかける。
【００４０】
ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施し、手動で分画を実施する。立ち上がり端および立ち下がり端（rising and falling edges）（純度約９５％）が観察され、メインピーク（純度＞９９．５％）から分離し、これを再循環させる。アセトニトリルを分画から約１％の濃度まで水流ポンプによる真空下に約５０℃で回転蒸発器において除去する。次いで、濃縮した溶離液を凍結乾燥する。
【００４１】
使用される粗生成物のＨＰＬＣ分析：
図１に示す。
【００４２】
粗生成物の特性：
ペプチド純度：９４．４面積％
クロリド含有量：６．２％
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ相上でのセトロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣ：図２に示す。
【００４３】
Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのセトロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣ：
図３に示す。
【００４４】
精製した目的の生成物のＨＰＬＣクロマトグラム
図４に示す。
【００４５】
目的の生成物の特性
ペプチド純度：９９．７５％
クロリド含有量：２２０ｐｐｍ
アセテート含有量：６．５％
例６：
慣用の溶液における合成の粗生成物からのアンタレリックスの分取精製
粗生成物１５ｇを３０％酢酸５００ｍｌ中に溶解させ、濾過（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィルターによる）後に、カラム（長さ２５０ｍｍ、内径１００ｍｍ）に適用する。Ｍｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ １８（１０ｍｍ）を固定相として使用する。まず、カラムを、移動相Ａ（超純水９７０ｍｌ＋アセトニトリル３０ｍｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）９５％と移動相Ｂ（アセトニトリル７００ｍｌ＋超純水３００ｍｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）５％との溶剤混合物で２０分間コンディショニングする。
【００４６】
次いで、クロマトグラフィーを以下の勾配プログラムによって実施する：
0004414503.tif 000008
【００４７】
溶離剤の流量は３００ｍｌ／分であり、その都度勾配条件によってカラム圧力３５〜５０バールをかける。ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施し、手動で分画を実施する。立ち上がり端および立ち下がり端（純度約９５％）が観察され、メインピーク（純度＞９９．５％）から分離し、これを再循環させる。アセトニトリルを分画から約１％の濃度まで水流ポンプによる真空下に約５０℃で回転蒸発器において除去する。次いで、濃縮した溶離液を凍結乾燥する。
【００４８】
Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのアンタレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣ：
図５に示す。
【００４９】
目的の生成物の特性：
ペプチド純度：９９．３９％
クロリド含有量：＜２００ｐｐｍ
アセテート含有量：７．５％
例７：
メタノール／水／酢酸系におけるセトロレリックスの分取精製
粗生成物４ｇを３０％酢酸６０ｍｌ中に溶解させ、濾過（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィルターによる）後に、カラム（長さ２５０ｍｍ、内径４０ｍｍ）に適用する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＤｅｌｔａｐａｋ ３００Å、１５ｍｍを固定相として使用する。まず、カラムを、移動相Ａ（超純水９５０ｍｌ＋メタノール５０ｍｌ＋１００％酢酸６０ｍｌ）で２０分間コンディショニングする。次いで、クロマトグラフィーを、以下の勾配プログラムによって実施する（移動相Ｂ：メタノール９５０ｍｌ＋超純水５０ｍｌ＋１００％酢酸６０ｍｌ）：
0004414503.tif 000009
【００５０】
溶離剤の流量は６０ｍｌ／分であり、その都度勾配条件によってカラム圧力２０〜３０バールをかける。ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施し、手動で捕集を実施する。立ち上がり端および立ち下がり端（純度約９５％）が観察され、メインピーク（純度＞９９．５％）から分離し、これを再循環させる。メタノールを分画から約１％の濃度まで水流ポンプによる真空下に約５０℃で回転蒸発器において除去する。次いで、濃縮した溶離液を凍結乾燥する。
目的の生成物の特性
ペプチド純度：９９．６０％
クロリド含有量：２２０ｐｐｍ
アセテート含有量：７．１％
【図面の簡単な説明】
【図１】例５において使用される粗生成物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図２】例５におけるＮｕｃｌｅｏｓｉｌ相上でのセトロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図３】例５におけるＰｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのセトロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図４】例５における精製した目的の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】例６におけるＰｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのアンタレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図６】例１における生成物１ａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】例２における生成物１ｂのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】例３における生成物２ａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図９】例４における生成物２ｂのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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