(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌において機能性組換え組織因子を製造する方法であって、
該大腸菌の培養のために、酵母エキス、トリプトンエキス、ＮａＣｌおよび緩衝塩を含有する培地を用い、
細菌の定常増殖相において、高濃度のグルコースの存在下で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって、組換え遺伝子を抑制解除し、
前記グルコースは抑制解除開始相の過程で消費されて細胞は炭素欠乏状態になり、
細胞による発現の間、グルコースを連続的に供給し、また一方で酸素が提供される、上記方法。
【請求項２】
上記大腸菌の少なくとも１種のプロテアーゼは遺伝的に排除される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトｃＤＮＡの遺伝情報を含有するプラスミドベクターを使用する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
プラスミドベクターは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって抑制解除可能なプロモーター、および、一次翻訳生成物を最初の細胞コンパートメントに移送する特異的なシグナル配列を含有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
ついで細胞をホモジナイズして破壊し、ついで界面活性剤の存在下にインキュベートする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤含有抽出物をポリエチレングリコールで処理し、これによりポリエチレングリコールに関して０〜４０％の濃度とし、０〜２５℃の温度で０〜６時間インキュベートしたのち、ろ過によって澄明化する請求項５記載の方法。
【請求項７】
澄明化したろ液をさらに５,０００〜５０,０００ダルトンの分子量排除サイズを有する膜を通して透析ろ過によって処理する請求項６記載の方法。
【請求項８】
組織因子を透析ろ過の残留部からさらに精製する請求項７記載の方法。
【請求項９】
多重工程クロマトグラフィー精製法を用いる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
クロマトグラフィー工程の１つは、陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂上のイオン交換クロマトグラフィーである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
圧抵抗性担体材料にカップリングさせた強陰イオン交換基を使用する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
親和性クロマトグラフィー工程を包含する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
組織因子に対する抗体を親和性リガンドとして使用する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組織因子に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を圧抵抗性カラム材料に共有結合によってカップリングさせる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
組織因子は親和性リガンドから、塩、特定のｐＨ値を有する緩衝液、またはカオトロピック試薬を用いて分離する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィーによって精製された組織因子を透析ろ過法を用いて＞１ｇ／Ｌの濃度に濃縮する請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核性宿主生物体において機能性組換え組織因子を調製するための方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
組織表面と血液の接触は血液凝固の著しい加速を招来する。この加速は組織からの因子の特異的な作用による。この「組織因子」は抗血液凝固的な挙動をとることができるためにリン脂質と結合されていなければならないタンパク質である。このタンパク質は最初、１９８０年にウシの脳から精製され（Bachら、 J. Biol. Chem. 256 (16), 8324, 1981）、ヒト組織因子もまた精製された（Brozeら、 J. Biol. Chem. 260 (20), 10917, 1985）。このタンパク質のアミノ酸配列はそのタンパク質のクローン化を可能にするオリゴヌクレオチドプローブの設計に使用された。一次翻訳生成物は、２９５個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである。表面ドメインは受容体ドメインと一緒になって２１９個のＮ−末端アミノ酸を占める。長さ２３のアミノ酸の膜貫通ドメイン、および長さ２０のアミノ酸の細胞質の一部分がＣ−末端の方向に続いている（Edgingtonら、 Thromb. Haemostas. 66（1）, 67, 1991）。細胞質ドメイン中の孤立性のシステインは、チオエステル結合によって連結されるパルミテートまたはステアレート残基に対してアクセプターとして働くことができる。細胞外ドメイン中には２個の分子内ジスルフィド橋が配列され、これらのＣ−末端は血液凝固VIIａ因子を結合するために必要である。表面ドメインは３個のスレオニン残基でグリコシル化されている。
【０００３】
血液凝固の開始の現在容認されているモデルによれば、血管損傷は、たとえば血液の内皮細胞との接触を招く。血漿からの血液凝固VII因子または血液凝固VIIａ因子は内皮細胞上の組織因子受容体に結合する。カルシウムおよびリン脂質の存在下において、細胞表面上の複合体によって、血液凝固Ｘ因子はＸａ因子に変換される。続いて、血液凝固Ｘａ因子はプロトロンビンをトロンビンに変換し、同時に、後者はフィブリノーゲンをフィブリンに変換する。最後に、局所的な血餅が形成される。
【０００４】
上記タンパク質はクローン化されたヒトｃＤＮＡを用いて様々な系で発現されている。たとえば、Paborskyら、Biochemistry 28, 8072, 1989は大腸菌におけるその過剰発現が報告している。
【０００５】
大腸菌における真核性タンパク質の発現は多くの基本的な問題と関連する。これらの基本的な問題の１つは細菌がそれら自体のグリコシル化システムを欠くということである。機能的活性をグリコシル化に依存するタンパク質は大腸菌内では活性型として発現させることができない。他の問題は大腸菌内における細胞特異的プロテアーゼの高い活性であり（Mauriziら、Experientia 48, 176, 1992）、この活性が、挿入された異種遺伝子から形成される翻訳生成物の安定性を制限する。最後に、大腸菌内での組織因子の発現と関連した基本的な問題はこのタンパク質が膜タンパク質であることである。膜タンパク質が発現する速度は、多分、過剰発現した分子が沈着するようになった細胞コンパートメント、すなわち細菌細胞の膜への取り込み能力が制限されることから、可溶性タンパク質の発現の場合に比べ著しく低いことが知られている。この取り込み能力はミトコンドリアまたは葉緑体におけるそれらに類似する薄板状膜構造（細胞内膜嵌入）の形成によって増大できることが既に報告されているが、これらの構造は大腸菌特異的膜タンパク質が過剰発現した場合にのみ観察され、異種の真核性タンパク質の場合には認められない（「排除体」、von Meyenburg, K. ら、 EMBO Journal, ３巻、1791−1797, 1984）。
【０００６】
したがって、別の戦略は膜貫通ドメインを欠く突然変異組織因子分子を発現させることである。このいわゆる「可溶性」組織因子は、細菌細胞の細胞質に蓄積し、大腸菌内で比較的大量に発現させることができる。しかしながら、このシステムでは組織因子が大腸菌細胞内にいわゆる封入体の型の準結晶状態で存在するという問題が起こる。この場合は、封入体はきわめて大量のカオトロピック剤を用いて可溶化せねばならず、この方法でモノマー化されたタンパク質は、ついできわめて過大な努力と通常はきわめて低い収率により活性な再生コンフォーメーションに再フォールディングしなければならない。
【０００７】
しかしながら原理的に、可溶性組織因子はリン脂質と相互作用するためのドメインを欠くので、プロトロンビン時間試薬として使用するには適当でない。これらの困難を回避することは、タンパク質の生合成の間に、脂質膜中に未変性のタンパク質を組み込むことによってのみ可能である。この操作がとくに有利な点は、一方では、膜への組み込みの結果としてタンパク質の安定性が増大することであり、他方では、この組み込みにより生物学的に活性なコンフォーメーションも安定化することである。組織因子の過剰発現への他のアプローチは、多数の既知の、使用に成功している、遺伝子融合生成物（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ＭalＥ、グルタチオントランスフェラーゼおよびHis−tagとの）をコードする発現系を用いる方法である。しかしながらこれらのシステムは、生物学的に活性な組織因子の発現には不適当である。これらのシステムを用いた場合、発現産物は実際に検出され、発現のレベルも上昇させることができるが、同時に機能の完全な喪失を伴い、煩雑な再生方法を用いてさえも機能を回復させることはできない。
【０００８】
以上述べた大腸菌における過剰発現の様々な問題は、発現を真核性システムで行うことによって回避できる。すなわち、酵母、バキュロウイルスをベクターとして用いた昆虫細胞カルチャー、培養哺乳動物細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞、またはヒト細胞系における発現（Paborskyら、１９８９）が、たとえば、原理的には適している。しかしながら、これらのシステムは経費に関して決定的な欠点がある。
【０００９】
大量の完全に生物学的に活性な組換え組織因子を、大腸菌から高収率および高レベルの純度で調製する方法はこれまでに知られていない。
【００１０】
ネイティブな組織因子および組換え組織因子を精製する方法は、文献たとえば Paborskyら、１９８９に記載されている。一般に、細胞または組織から組織因子を抽出するためには界面活性剤、たとえば、デオキシコール酸またはTriton−X 100が使用される。精製方法には、様々なクロマトグラフィー工程が包含される。これらは、ゲルろ過から、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを経て、さらに親和性クロマトグラフィーを包含する工程まで達する。組織因子に対する因子および抗体が親和性材料として記載されている（Paborskyら、１９８９）。報告されている精製方法に共通の特徴は、それらの使用が１リットルまでの発酵槽容量に限定されていることである。比較的大量の純粋な組織因子をパイロットプラント規模（１０〜１００Ｌの発酵槽容量）で調製する確実な方法についてはこれまで報告がない。
【００１１】
組織因子は、たとえば、プロトロンビン時間試薬に使用される。この場合、血漿サンプルは、リン脂質およびカルシウムの存在下に、過剰の組織因子で凝固する。診断的に重要なものは血液凝固時間であり、それは適当な検量システムを用いて、たとえば標準の％活性値またはプロトロンビン比の値に変換することができる。この試験は外因性の血液凝固システムのスクリーニングに、たとえば手術前の外因性血液凝固システムの個々の因子の活性のチェックに、また、経口的抗凝固療法に関連する治療のモニタリングに使用される。
【００１２】
組織因子の他の診断的用途にはまた、この標準使用に加え、たとえば組織因子経路阻害剤の試験、ループス抗凝固剤のための中和試験および免疫学的試験のための増幅および検出システムとしても考えられる。
【００１３】
慢性的出血の処置に組織因子を治療的に使用する可能性は、検討下にある。この関連での出血傾向は先天性（血友病）であるか、または後天性（血液凝固因子に対する抗体、肝臓における血液凝固因子の妨害された合成、または感染性血管内凝固）であることができる。血友病の動物モデルにおいて組換え組織因子の注射は耐容性が良く感染性血管内凝固は起こらなかったことが示されている。この注入では、短期間、止血系の正常化にさえ可能であった（EP−A 0 278 776）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、したがって、比較的大量の純粋な組織因子を、パイロットプラント規模（１０〜１００Ｌの発酵槽容量）で調製するための確実な方法の提供をその目的の基盤とした。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに細菌細胞の周辺腔中に発現産物を向けるBordetella pertussisからのシグナル配列を含有するベクターを用いることにより、完全な組織因子分子の高い発現収率が大腸菌内で達成できることが、今、見出された。大腸菌内での組換えタンパク質の発酵および発現のための既知の標準メジウム、および標準方法は有効ではなかった。宿主細胞の代謝における実質的な変化は、一方では、トロンボプラスチンの発現が開始され、他方では、宿主細胞の生存能およびそのタンパク質の生物活性が維持されるように、誘導されなければならなかった。驚くべきことに、組換え大腸菌宿主の培養の間に組織因子が産生されるように代謝を成功裡に変化させるには、高い細胞密度が必須の前提要件である。本発明の意味の範囲内において高い細胞密度とは、少なくとも細胞５０ｇ／Ｌ、好ましくは細胞５０〜２５０ｇ／Ｌ、きわめて好ましくは細胞１５０〜２００ｇ／Ｌである。これは６５０nm、試料層の厚さ１cmにおける光学密度約５０〜１１０に相当する。これは培養の間に存在する高率の完全な培地成分によって達成され、これらの成分はその起源も重要である。たとえば動物組織のペプシンまたはトリプシン加水分解物（ペプトン、トリプトンまたはルリア肉汁）が生物体の培養に適当であり、かなりのバイオマス収率も生じさせるが、これらの培地はそれら自身に対してタンパク質産物の満足できる収率と関連させる発現を達成するための条件の創成には適当でない。付加的な複合的増殖促進物質成分（酵母エキス）を培養培地の主要構成成分として提供すること、および適当な微量元素の提供が個別に供給することによって保証されることも重要である。驚くべきことに、遺伝子産物の合成に必須の前提要件は、システムが抑制解除されたのち、炭素源（たとえば、グルコース）を発酵の開始時に提供しなければならないことであり、これにより、炭素源が消費されたのちに、大腸菌の代謝における劇的な変化に導く（炭素欠乏、ジオーキシー効果）。これと平行して細菌細胞の呼吸能が低下し、これは、細胞を空気の最大供給によって培養しなければならないとしても同様に劇的な酸素分圧（ｐＯ2）の低下から明らかである。これだけではまだ、組織因子タンパク質の経済的な生合成は生じない。さらに、細胞が炭素飢餓状態に維持される正確に決定された最小期間が要求される。ヒト組換え組織因子の合成は、この最小期間に続いて再び炭素源の供給を行った場合にのみ効果的に誘導されることができる。この期間が守られないと発現は全く認められないかまたはファクター１０未満の発現しか起こらない。これに関連してとくに驚くべき事実は、この決定された最小の休止期間、ともかく誘導過程（抑制タンパク質の抑制解除およびクローン化遺伝子の転写）を継続もしくは開始できる炭素欠乏状態に維持しなければならないことである。他方、炭素源（たとえば、グルコース）はその後に続く合成を維持するために絶えず添加されなければならない。さらに、生成物の安定性を、大腸菌のプロテアーゼ欠損株を用いることによって改良できることも発見された。細胞を破壊したのち、組織因子は界面活性剤を用いて完全に抽出できる。驚くべきことに、付随する宿主の主タンパク質は、ＰＥＧ／タンパク質共沈殿が通��きわめて高感度で剪断力に反応し再び崩壊することから、ＰＥＧ沈殿ついで接線流ろ過の手段により効果的に除去された。低分子量夾雑物は透析ろ過の手段により分離された。
【００１６】
【発明の実施の形態】
診断用または治療用組成物に組織因子を使用できるためには、純粋な濃縮された形態で生産されなければならない。生成物の安定性を限定するプロテアーゼは診断用組成物における干渉の特定の起源である。治療用組成物においては大腸菌に由来するすべての異種タンパク質が望ましくない副作用を発症させる潜在的な可能性を有する。一般にタンパク質の精製にはクロマトグラフィー法が用いられる。適当な方法の例は、ゲルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーである。大腸菌において異種ｃＤＮＡが過剰発現されている場合にその精製を達成するには、単一のクロマトグラフィー工程でしばしば十分である。本明細書に記載の方法による組織因子の精製には３つの好ましくない環境が考慮されなければならない。
【００１７】
１．第１に、組織因子はその発現形態いおいて膜貫通ドメインを有する膜タンパク質である。このタンパク質はクロマトグラフィーの目的で定常的に使用される緩衝系に溶解しない。また、必要なクロマトグラフィー工程を界面活性剤の存在下に実施できることも見出された。この関係での使用には様々なクラスの界面活性剤が適している。しかしながら、用いられる界面活性剤とマトリックスのリガンドとの間のイオン性の相互作用の可能性を排除するためには、非イオン界面活性剤の使用が好ましい。すべての非イオン界面活性剤を使用できるが、Triton−X 100またはオクチルグリコシドが好ましく、とくに Triton−X 100が好ましい。用いられる界面活性剤の濃度もきわめて重要である。界面活性剤の臨界ミセル濃度は界面活性剤分子からミセルが自然に形成される濃度以上の総濃度を指示している。Triton−X 100の場合には、この値はイオン強度に応じて０.０１％〜０.０６％である。可能な限り、界面活性剤ミセルの形成を防止するために、臨界ミセル濃度以下の濃度に調整ように試みることが必要であった。
【００１８】
２．膜タンパク質として、細胞あたりの組織因子の発現量は少ないことの方が考えられる。細胞内に不溶性の型で析出するような大量に生成されることは稀にしかない可溶性タンパク質とは対照的に、膜タンパク質はそれらが正規の細胞コンパートメントにチャンネリングされたとしても、それらが自由にできる空間は限られている。本明細書に記載の方法の場合、組織因子生成物は抽出を行ったのちに得られる抽出物中に含まれるタンパク質の＜１％にすぎない。したがって９９％以上の付随するタンパク質は除去されなければならない。
【００１９】
３．抽出および精製過程のそれぞれの中間段階において、無傷のタンパク質の保存も重要である。これは、緩衝液中にプロテアーゼ阻害剤を包含させることによってのみ達成することが可能であった。プロテアーゼ阻害剤を加えないならば、短い休止期間の間でさえも、大腸菌の新鮮な抽出物中においてタンパク質の大規模な分解が観察できる。各種のクラスのプロテアーゼについて市販の阻害剤を入手できる。最大の成果はセリンプロテアーゼ阻害剤の使用によって達成されることが見出された。セリンプロテアーゼの阻害剤はすべて使用できるが、ベンズアミジンおよびアンタゴサンの使用が好ましい。対照的に、他のプロテアーゼファミリーのメンバー（酸プロテアーゼまたはシステインプロテアーゼ）、またはアミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼの阻害剤の使用は、組織因子の安定化に何らの改善ももたらさなかった。
【００２０】
クロマトグラフィー工程の選択およびそれらを用いる順序は精製戦略の成功に重要である。驚くべきことに、開始時の困難な状態（生成物の低濃度、界面活性剤を包含させる必要性および干渉するプロテアーゼ）にもかかわらず、わずか２つのクロマトグラフィー工程で均一に精製できることが見出された。これらはイオン交換クロマトグラフィー工程と親和性クロマトグラフィー工程であった。
【００２１】
原理的に、イオン交換クロマトグラフィーの実施に際しては、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂の使用が考慮される。精製すべきタンパク質のｐＫ値および緩衝液で調整されるｐＨに応じて、異なるタンパク質は異なる強度で交換基に結合し、イオンを増量することによって溶出させることができる。本発明の関連では、強い陽イオン交換基たとえば、Mono−Ｓ、または強い陰イオン交換樹脂たとえば、ＤＥＡＥ、ＱＡＥもしくはMono−Ｑが好ましい。陰イオン交換樹脂としては、組織因子が生理学的なｐＨ値（約８）で結合するので、とくにＤＥＡＥが好ましい。イオン交換基は様々な担体材料に結合させることができる。たとえばセファロース、アガロースあるいはセルロースを使用することができる。架橋セルロースの使用は、この材料が圧力に対してきわめて良好な抵抗性を示すことから好ましい。
【００２２】
イオン交換クロマトグラフィーの好ましい実施方法を以下に記述するが、これはこの工程の他の可能な実施方法を排除することを意図するものではない。組織因子は上述のように大腸菌から抽出され、ＰＥＧ沈殿および透析ろ過の手段によって予め精製された。この抽出物をプロテアーゼ阻害剤により処理し、イオン交換カラムに負荷した。使用にとくに好ましいカラムは強い陰イオン交換基ＤＥＡＥを有する変性された架橋セルロースからなる。この工程のこの段階における Triton−X 100の有効濃度は臨界ミセル濃度よりもはるかに高い約１％である。したがって界面活性剤分子、大腸菌脂質および膜タンパク質からなるミセル混合物が形成することを期待することができる。それにもかかわらず、驚くべきことに、すべての組織因子はカラム材料に結合していることが見出された。組織因子は、塩、好ましくはナトリウム塩、とくに好ましくは食塩の量を増加させることにより溶出された。完全な溶出に要求される濃度は＜０.１Ｍである。一般に、達成されるイオン交換クロマトグラフィーの収率は＞８０％であり、純度は約３倍になる。
【００２３】
第２の精製工程としては親和性クロマトグラフィー法が選択された。イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液はまだ、総タンパク質に基づいて＜３％の組織因子を含有するにすぎないので、可能な限り特異的な超精製のための工程を選択することが賢明である。原理的に親和性リガンドとしての使用には、抗体、染料または生理的リガンドが適している。組織因子に対する抗体の使用が好ましく、とくにモノクローナル抗体の使用が好ましかった。一般に、親和性リガンドは担体材料に共有結合的にカップリングされる。この場合もアガロース、セファロースまたはセルロースがこの目的に適している。本明細書に記載された発明の場合、既に前もって活性化された セファロースの使用が好ましかった。抗体はエポキシ化学の手段によってカップリングされた。イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液を抗体／セファロースカラム上に負荷した。洗浄工程はプロテアーゼ阻害剤を含有し、また臨界ミセル濃度以下の濃度のTriton−X 100も含有する緩衝液を用いて行った。形成する抗原／抗体複合体は、溶出が起こるように解離させなければならない。たとえば、塩、カオトロッピク剤または酸をこの目的に使用できる。本発明の関連内では、グリシン緩衝液のとくにｐＨ２での使用が好ましかった。溶出した組織因子は中和された。
【００２４】
驚くべきことに、この方法で精製された組織因子はゲル電気泳動により純粋であることが見出された。も早、有意な濃度の不純物は検出できなかった。組織因子は、安定剤を添加しなくても凍結状態で何カ月も保存できる。濃縮したのち、組織因子は様々な目的に、たとえばプロトロンビン時間試薬の調製に、生物学的サンプル中の組織因子の検出のための標準として、またはインビボにおける血液凝固系を正常化する目的での治療用に活性な組成物として使用することができる。
【００２５】
【実施例】
以下の実施例は本発明をさらに明瞭にすることを意図するものである。
【００２６】
実施例１：
組換え組織因子の小規模（１０Ｌ発酵）調製
予備培養：５０μg／mlのアンピシリンを含有するルリカ肉汁培地（ＬＢ培地）６００mlに大腸菌の形質転換株を接種し、振盪インキュベーター中３７℃で１６時間培養する。さらに、ＬＢ培地（アンピシリン５０μg／ml）４００mlを添加した後、培養液を再び３.５〜４.５時間インキュベートする。この振盪フラスコ培養液８００mlを発酵槽の接種に用いる。
【００２７】
１０Ｌ発酵槽：以下の組成、すなわち、酵母エキス３２４ｇ；トリプトン８４ｇ；食塩４２ｇ；硫酸アンモニウム８.８ｇ；グルコース１２５ｇ；微量元素溶液（組成：３２mMホウ酸；０.６４mMモリブデン酸アンモニウム；０.６４mM硫酸銅（II）；２.４mMヨウ化カリウム；１２mM硫酸マンガン（II）；５.５６mM 硫酸亜鉛）８.４ml；無機培地（組成：２７.５mMリン酸水素二ナトリウム；１０.４mMリン酸二水素ナトリウム；１０.４mM硫酸マグネシウム；１６.８mM塩化カリウム；２５mMクエン酸；０.８mM硫酸鉄（III）６７０ml、を有する培地５Ｌを発酵のために最初に導入する。
【００２８】
培地をアンピシリン１００μg／mlおよびチアミン１μg／mlに調整する。発酵槽を、予備培養液８００mlで接種し、細菌を３７℃、最大通気で増殖させ、この間ｐＨは７.０に維持する。発酵を開始してから７.５時間後に５０％グルコース溶液２.０〜２.６Ｌを発酵の終了までポンプ注入する（１００ml／時）。発酵の開始後１９.５〜２０.５時間にＩＰＴＧ（最終濃度１〜５mM）を添加することによって組換え組織因子の発現を開始させ、混合物をさらに５.５〜６.５時間インキュベートする。ついで、バイオマスを遠心分離によって収穫する。収量：約１〜１.５kg。
【００２９】
破壊：全バイオマスを、２０mM Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリド４Ｌ中に再懸濁して、細胞ホモジナイザー（APV−Gaulin）中でホモジナイズし、ついで、Triton−X 100を濃度１％に添加したのち、細胞抽出液を０℃〜８℃で１時間攪拌する。ついで２％ポリエチレングリコール６００を加え、混合物をさらに１時間攪拌し、ついで細胞ライセートを接線流マイクロろ過（フィルター０.２μm）の手段によって澄明化し、細胞屑を洗い落とすため、この間保持側の容量を維持しながら１〜２破壊容量をさらに通過させる（緩衝液：２０mM tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび０.１％Triton−X 100）。ろ液を接線限外ろ過（１２,０００kd）の手段によって抽出開始容量にまで濃縮し、少なくとも５容量の緩衝液（２０mM tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）で透析ろ過する。収量は抽出液１リットルあたりトロンボプラスチン１６〜５０mgの間である。
【００３０】
実施例２：
組換え組織因子の大規模（１００Ｌ発酵）調製
予備培養：５０μg／ml のアンピシリンを含有するルリカ肉汁培地（ＬＢ培地）８Ｌを大腸菌の形質転換株で接種し、１０Ｌの発酵槽中において、３７℃で１６〜２０時間培養する。この振盪フラスコ培養液８Ｌを発酵槽の接種に用いる。
【００３１】
１００Ｌ発酵槽：以下の成分および量、すなわち酵母エキス３２４０ｇ；トリプトン８４０ｇ；食塩４２０ｇ；硫酸アンモニウム８８ｇ；グルコース１２５０ｇ；微量元素溶液（組成：上記参照）８４ml；無機培地（組成：上記参照）６.７Ｌを含有する培地５０Ｌを発酵のために最初に導入する。この培地をアンピシリン１００μg／ml およびチアミン１μg／ml に調整する。
【００３２】
発酵槽を予備培養液８Ｌで接種し、細菌を３７℃、最大通気で増殖させ、この間ｐＨは７.０に維持する。発酵を開始してから７.５時間後に５０％グルコース溶液２０〜２６Ｌを発酵の終了時までポンプ注入する（１Ｌ／時）。発酵の開始後１９.５〜２０.５時間にＩＰＴＧ（最終濃度１〜５mM）を添加して組換え組織因子の発現を開始させ、混合物をさらに５.５〜６.５時間インキュベートする。ついで、バイオマスを遠心分離によって収穫する。収量：約１０〜１５kg。
【００３３】
破壊：全バイオマスを、２０mM Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリド４０Ｌ中に再懸濁して、細胞ホモジナイザー（APV−Gaulin）中でホモジナイズし、ついで、Triton−X 100を濃度１％に添加したのち、細胞抽出液を０℃〜８℃で１時間攪拌する。ついで２％ポリエチレングリコール６００を加え、混合物をさらに１時間攪拌し、ついで細胞ライセートを接線流マイクロろ過（フィルター０.２μm）の手段によって澄明化し、細胞屑を洗い落とすため、この間保持側の容量を維持しながら１〜２破壊容量をさらに通過させる（緩衝液：２０mM tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび０.１％Triton−X 100）。ろ液を接線限外ろ過（１００,０００kd）の手段によって抽出開始容量にまで濃縮し、少なくとも５容量の緩衝液（２０mM Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５mM ＥＤＴＡ、１mMベンズアミジン、０.２mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）で透析ろ過する。収量は抽出液１リットルあたりトロンボプラスチン１６〜５０mgの間である。
【００３４】
実施例３：
イオン交換クロマトグラフィーによる組織因子の精製
界面活性剤を含有する大腸菌細胞の抽出液を蒸留水で１＋１に希釈する。伝導度が３mS／cm以上であれば、伝導度がこの値以下になるまで希釈抽出液を蒸留水でさらに希釈する。混合物をついで、Satrobran／minicandleフィルター（０.４５μm／０.２μm）を通してろ過する。
【００３５】
イオン交換樹脂 Cellufine−Ａ ５００（Amicon）は予め膨潤させたゲルとして供給される。Vantage S ２５０クロマトグラフィーカラム（Amicon）を、以後のゲル床の容量５Ｌに相当する量で充填する。操作の前に、ゲル材料を基礎緩衝液（１０mM Tris、１mMベンズアミジン、５KIU／mlのサン、０.１mM ＥＤＴＡ、０.１％ナトリウムアジド、０.１％Triton−X 100、ｐＨ８.０）の数ゲル容量で平衡化される。
【００３６】
カラム操作は、自動勾配形成およびポンプ速度５Ｌ／時を用いてＦＰＬＣユニット上で自動的に実施した。以下の液体を順次、ポンプによってカラムに通す：
１．１０Ｌの希釈大腸菌抽出液
２．１０Ｌの基礎緩衝液
３．１００mM ＮａＣｌを補充した１０Ｌの基礎緩衝液
４．２００mM ＮａＣｌを補充した１０Ｌの基礎緩衝液
５．１Ｍ ＮａＣｌを補充した１０Ｌの基礎緩衝液
６．１０Ｌの０.２Ｎ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ
７．１０Ｌの０.２Ｎ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ
８．１０Ｌの０.２Ｍ Tris、ｐＨ８
９．１０Ｌの基礎緩衝液
【００３７】
全カラム操作を通じて、ｐＨ、２８０nmにおける光学密度およびイオン強度を記録する。組織因子は、塩濃度を段階的に上昇させる勾配を用いて溶出させる。ＮａＣｌ ０.１Ｍ、０.２Ｍおよび１Ｍの濃度を含有する緩衝液に相当する３つの分画を自動的に収集する。カラムはアルカリ工程、酸工程ついで中和工程の手段によって再生される。
【００３８】
すべての精製工程からサンプルを採取し、それらの組織因子含量をＥＬＩＳＡによって調べる。以下の表は精製操作からの結果を示す。
【表１】
0004414499.tif 000002
事実上すべての組織因子が０.１Ｍ ＮａＣｌを含む溶出分画中に存在する。収率は＞８０％である。この分画を親和性クロマトグラフィー工程における次の精製に使用する（以下の実施例参照）。
【００３９】
実施例４：
親和性クロマトグラフィーによる組織因子の精製
製造業者の説明書に従い標準方法を用いて、組織因子に対するモノクローナル抗体をエポキシ活性化セファロース６Ｂ（Pharmacia）に固体担体材料１００ｇあたり抗体１ｇの濃度で共有結合によってカップリングさせた。この材料をクロマトグラフィーカラムに充填し、基礎緩衝液（４０mM ＨＥＰＥＳ、１mMベンズアミジン、５KIU／mlのアンタゴサン、０.０５％ Triton−Ｘ１００、ｐＨ ７.５）で平衡化する。
【００４０】
イオン交換クロマトグラフィーからの組織因子含有溶出分画を親和性クロマトグラフィーカラムに負荷する。カラム操作は、自動勾配形成およびポンプ速度１Ｌ／時を用いてＦＰＬＣユニット上で自動的に実施する。以下の液体を順次、ポンプによってカラムに通す：
１．１０Ｌのイオン交換クロマトグラフィーからの組織因子含有溶出分画
２．２Ｌの基礎緩衝液
３．１Ｌの溶出緩衝液（５０mMグリシン、０.１Ｍ ＥＤＴＡ、０.０５％ Triton−X 100、ｐＨ２.０）
４．１Ｌの基礎緩衝液
５．１Ｌの１Ｎ酢酸
６．２Ｌの基礎緩衝液
【００４１】
全カラム操作を通じて、ｐＨ，２８０nmにおける光学密度およびイオン強度を記録する。組織因子は、ｐＨを８.０から２.０に低下させることによって溶出させる。溶出液の収集はｐＨが６.５以下の閾値に低下すると同時に自動的に開始され、基礎緩衝液への切換えが起こり、ｐＨが再び６.８以上に上昇したのちに終了する。
【００４２】
溶出液をFiltron濃縮ユニット（Minisette）中排除サイズ１０kDaのフィルター層を用いて最小容量（約４０ml）に濃縮する。濃縮物をついで０.２μｍ流出フィルターを通してろ過し、−７０℃で凍結する。
【００４３】
すべての精製工程からサンプルを採取し、それらの組織因子含量をＥＬＩＳＡによって調べる。以下の表は精製操作からの結果を示す。
【表２】
0004414499.tif 000003
すべての組織因子が溶出液または濃縮物中に存在する。収率は＞８０％である。総タンパク質含量に基づき、この工程における濃縮は約５００倍である。
【００４４】
実施例５：
トロンビン時間試薬中への純粋な組織因子の使用
組織因子は大腸菌内で発現させる。細胞を破壊し、界面活性剤で抽出する。この抽出物から、イオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーの手段によって組織因子を均一に精製する。
再脂質化工程のために、以下と順次、混合する：
５０mMグリシンｐＨ３中１０％大豆リン脂質（Pospholipon 25 P，Nattermann）１２５μl
１０μlの２０％Triton−X 100
５０μlの純粋な組織因子（２mg／ml）
１５μlの蒸留水
全体を混合しながら、１５℃で２時間インキュベートする。混合物をついで、５０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１２mM塩化カルシウム、０.１％ナトリウムアジドおよび０.５％Polygelinからなる試薬緩衝液１００mlで希釈する。ついでそのままプロトロンビン時間試薬に使用する。
【００４５】
血漿の血液凝固時間は次のように測定する。５０μlの血漿をBehring Fibrin Timer A上、予め３７℃に加温したプロトロンビン時間試薬１００μlと混合する。血液凝固の時間は比濁法によって確認する。以下の表は、慣用のプロトロンビン時間試薬、すなわち、Behring Diagnosticsにより供給されているThromborel Sを用いて場合と比較して、上記方法で測定された血液凝固時間を示す。後者の試薬はヒト胎盤からのネイティブな組織因子に基づくものである。
【００４６】
【表３】
0004414499.tif 000004
上述のように調製されたプロトロンビン時間試薬を用いて測定された血液凝固時間はThromborel Sを用いて測定された血液凝固時間と類似する。この例に記載のように調製されたプロトロンビン時間試薬の因子欠損に対する感度は、対照試薬の感度よりも高い。
【００４７】
実施例６：
組織因子の検出のための標準としての純粋な組織因子の使用
組織因子は大腸菌内で発現させる。細胞を破壊し界面活性剤で抽出する。この抽出物からイオン交換クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーの手段により組織因子を均一に精製する。純粋な組織因子のタンパク質含量を測定する。
【００４８】
ＥＬＩＳＡを構築するために、試験プレートを、反応部位あたり１.５μg の抗−組織因子モノクローナル抗体で被覆する。酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼを抗−組織因子ポリクローナル抗体に共有結合でカップリングさせる。
【００４９】
純粋な組織因子（タンパク質２mg／ml）を、希釈緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、１３mM塩化カルシウム、６５mMグリシン、１％Triton−X 100、０.１％ナトリウムアジド、ｐＨ７.５）によって段階的に希釈する。
試験プレートの各反応部位に以下を添加する。
５０μlの標準としての希釈組織因子（または適当なサンプル）
５０μlのサンプル用緩衝液（１００mM Tris、１０mM ＥＤＴＡ、１％Triton−X 100、０.１％ナトリウムアジド、ｐＨ７.５）
プレートを接着フィルムで覆い水浴中３７℃で１５〜２０分間インキュベートする。プレートを１００μlの「Enzygnost洗浄溶液」（Behring Diagnostics）で３回洗浄する。
【００５０】
ついで１００μlのペルオキシダーゼ／ポリクローナル抗血清接合体を各場合に加える。プレートを再び接着フィルムで覆い、水浴中３７℃で１５〜２０分間インキュベートする。
【００５１】
この間に、それぞれの試験プレートについて１アリコートの「Enzygnost色素原」（Behring Diagnostics）を１アリコートの「Enzygnost用ＰＯＤ緩衝液／基質」（Behring Diagnostics）に溶解する。
【００５２】
プレートをそれぞれの場合に１００μlの「Enzygnost 用洗浄溶液」（Behring Diagnostics）で３回洗浄する。１００μlの「Enzygnost 色素原」を各ウエル中にピペットで加える。プレートを暗所中、室温で５分間インキュベートする。ついで１００μlの「Enzygnost 用停止溶液」（Behring Diagnostics）を各ウエルにピペットで加える。
【００５３】
４９２nmにおける光学的分析を最後のピペッティング工程後１時間以内に実施する。
以下の表はその結果を示す。
【表４】
0004414499.tif 000005
【００５４】
大腸菌から精製された組換え組織因子は上述のようにＥＬＩＳＡを構築するための標準として使用できる。検出は２オーダーのサイズの範囲にわたって高感度である。サンプル中の含量は標準希釈に対する値のプロット（二重対数型での含量に対する吸光度）から決定できる。