(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）サンプルをシリカ・クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｂ）サンプルをイオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｃ）第２のイオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｄ）逆相ＨＰＬＣカラムに通して溶出し；そして
（ｅ）その溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに適用する、
を含む、サンプルから２３，０００〜２８，０００IU／mgの範囲の特定の生理活性を有する組換えｈＣＧを調製するための方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ）サンプルをシリカ・クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｂ）サンプルをＤＥＡＥセファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｃ）ＣＭ−セファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し；
（ｄ）シリカＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに通して溶出し；そして
（ｅ）その溶出液をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）サイズ排除クロマトグラフィーに適用する、
を含む、サンプルから請求項１に記載の組換えｈＣＧを調製するための方法。
【請求項３】
ＤＥＡＥセファロース・イオン交換クロマトグラフィーを通しての溶出がpH７．５のリン酸ナトリウム・バッファー中で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＭ−セファロース・イオン交換クロマトグラフィーを通しての溶出がpH６のリン酸ナトリウム・バッファー中で行われる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）の逆相ＨＰＬＣが、移動相として２−プロパノール／トリス−リン酸・バッファーを用いて行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーが、移動相として炭酸水素アンモニウム・バッファーを用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルがＣＨＯ細胞からの培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は絨毛性ゴナドトロピンの精製方法、特に未精製組換えヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）からの組換えｈＣＧの精製に関する。前記方法はイオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣの使用を含む。
【０００２】
絨毛性ゴナドトロピンは胎盤により産生されるホルモンであり、そしてもとは妊娠している女性の尿から得ていた。
【０００３】
前記ホルモンは非共有結合のα及びβサブユニットから成るヘテロダイマーである。その作用は主にゴナドトロピン黄体形成ホルモンのそれである。
【０００４】
絨毛性ゴナドトロピンは、ゴナドトロピンの欠損又は低濃度に起因する無排卵性不妊症の治療において、卵胞の発達を卵胞刺激ホルモン又は閉経期尿性腺刺激ホルモンにより刺激した後の排卵の誘発を女性に与える。５０００〜１００００単位の単回投与が筋中注射により与えられ、通常排卵を刺激する黄体形成ホルモンの月経中期のピークを模倣する。絨毛性ゴナドトロピンはメノトロピンと、そして時々クエン酸クロミフェンとも連結した状態で、インビトロ受精手順、並びに過剰排卵及び卵母細胞収集を含めた他の補助的な受胎技術のための添加物として与えられもする。男性において、それは思春期前の停留睾丸の治療に使用されている。投与計画は大きく変化するが、筋中注射により用量は通常５００〜４０００単位の範囲で週３回である。
【０００５】
それは低ゴナドトロピン性性機能低下症に関係した男性不妊のために与えられもする。同様に、その投与計画において相当なばらつきがあり、そして用量は５００〜４０００単位、週２〜３回まで変化する。卵胞刺激活性を有する作用物質、例えばメノトロピンが正常な精子形成を可能にするためによく加えられる。精子減少症のために、メノトロピン又は他の卵胞刺激製剤と一緒に３０００単位までの用量の絨毛性ゴナドトロピンが適用されうる。男性の性腺機能低下症に関係した思春期遅延の治療において、５００〜１５００単位の用量が週２回与えられる；その用量は血漿テストステロン濃度に対して滴定されるべきである。
【０００６】
未加工の尿サンプルからのｈＣＧの分離及び精製のためのさまざまな方法が使用されている（Birken et al., Endocrinology, 133 (3) : 1390-7, 1993 ; Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35 (5) : 1414-6, 1990 ; Donini et al., Acta Endocrinol., 73 (1) : 133-45, 1973）。最近、膜ろ過アフィニティー・クロマトグラフィーと称する、アフィニティー・クロマトグラフィーのさまざまな方法が開発され、そして尿からのｈＣＧ精製に適用されている（Xu et al., Protein expression and purification, 16 : 221-3, 1999）。前記方法はアフィニティー・クロマトグラフィーのカラムの固相としてＢｒＣＮ活性化セファロースの使用を避け、そしてアフィニティー・クロマトグラフィーによる尿サンプルからのｈＣＧの通常の精製方法の変化を示す。この方法に伴う精製ｈＣＧの免疫活性は８５５４IU／mgである。
【０００７】
組換えｈＣＧは、他のゴナドトロピン・ホルモン及びヒト起源の夾雑物を欠き、そしてヒトの尿中に存在するものより特異的であるという利点を有する。しかしながら、組換えｈＣＧの未精製標本はその組換え物産生に用いた細胞の他のタンパク質及び夾雑物の全てを含むので、組換え絨毛性ゴナドトロピンの絶対的な純度を達成するための方法には大きな価値がある。
【０００８】
本発明の概要
我々は、組換え処理の後に得られた培地の濃縮サンプル由来の、又は妊娠している女性の尿の未精製濃縮物由来のｈＣＧの未精製標本を、得られたｈＣＧが未精製ｈＣＧ標本中に含まれるタンパク質又は他の夾雑物を含まないように精製しうることをここで発見した。
【０００９】
前記精製方法はイオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣの使用に基づく。サイズ排除カラムのさらなる使用の可能性はあらゆる残余の微量な夾雑物の除去をもたらす。最適な結果は少なくとも２ステップのイオン交換クロマトグラフィーが実施される場合に得られる。
【００１０】
本発明の方法は組換え処理に由来した培地の未精製標本からの組換えｈＣＧの精製に使用される。そのｒ−ｈＣＧは、高純度及び高い特定の生理活性（２３，０００〜２８，０００IU／mgの範囲）を手に入れ、培地中に存在した場合、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）タンパク質を、そして組換え処理に使用した宿主細胞に含まれる核酸及び他の夾雑物を実質的に含まない。
【００１１】
本発明の方法は妊娠している女性の尿の未精製濃縮物から開始される尿ｈＣＧの精製、及び例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む他の哺乳動物からのＣＧの精製に良好に使用される。
【００１２】
イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣの使用を含むサンプルからのｈＣＧの精製方法の提供は本発明の目的である。前記方法はサンプルをイオン交換クロマトグラフィーに供し、そしてその溶出物を逆相ＨＰＬＣに供するステップを含む。前記溶出物をサイズ排除カラムに注ぐさらなるステップを場合により実施しうる。前記精製方法から最適な結果を得るために異なる条件下で２のイオン交換クロマトグラフィー・ステップを好ましくは実施する。本発明の方法の好ましい態様は以下の：
（ａ）サンプルをシリカ・クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出し；
（ｂ）ＤＥＡＥセファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出し；
（ｃ）ＣＭ−セファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出し；
（ｄ）シリカＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに通して、溶出し；そして
（ｅ）セファクリル・サイズ排除クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出する、
のステップを含む。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、ＤＥＡＥセファロース・イオン交換カラムを通した後の溶出は約pH７．５のリン酸ナトリウム・バッファーにより行われる。
【００１４】
ＣＭ−セファロース・イオン交換カラムを通した後の溶出は約pH６のリン酸ナトリウム・バッファーにより好ましくは行われる。
【００１５】
ステップ（ｄ）の逆相ＨＰＬＣは移動相として２−プロパノール／トリス−リン酸バッファーを用いて好ましくは行われる。
【００１６】
本発明のＣＧは、好ましくはヒトＣＧ、そして最も好ましくは組換え処理に利用したＣＨＯ細胞の培地由来の組換えｈＣＧである。
【００１７】
好適な賦形剤と一緒に治療として有効量の、前記組換え処理により調製された精製組換えｈＣＧを含む医薬組成物の提供は本発明のさらなる目的である。好適な賦形剤の一例は凍結乾燥製品の安定化を助けるショ糖である。組換えｈＣＧの医薬組成物は皮下投与に特に好適である。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明はｈＣＧの精製方法、特に組換え処理からの未精製培地からの組換えｈＣＧの精製方法を提供する。そのｒ−ｈＣＧは高い純度及び高い特定の生理活性（２３，０００〜２８，０００IU／mgの範囲）を手に入れ、培地中に存在する場合、ウシ胎児血清を、そして組換え処理に用いられた宿主細胞に含まれる核酸又は他の夾雑物を実質的に含まない。本発明は、出発材料サンプルとして生物材料、特にｈＣＧ及び本明細書中に言及される他の夾雑物を含む未精製材料への使用を意図する。以下に詳細に記載される実施例は、バイオリアクターからの細胞培養上清培地から得られたｒ−ｈＣＧを含む出発材料サンプルを使用する。あるいは、サンプルは、妊娠した女性からの未精製濃縮尿である。
【００１９】
前記サンプルは２日以上バイオリアクター内を潅流させた細胞培養上清培地の新たな採取により与えられる。好ましくは前記上清はろ過により不純物を除かれる。必要であれば、前記未精製溶液は濃縮され、そして細胞培養由来の夾雑物を除去するためにＣ４シリカ・クロマトグラフィーに供される。
【００２０】
限外ろ過後の半精製産物は次に好ましくは２度実施される、そして好ましくは異なる条件で実施されるイオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣに供される。最初のＤＥＡＥセファロース・イオン交換ステップは、基本的に大部分の非ｈＣＧタンパク質及びＤＮＡを除去するｈＣＧ「貫流」ステップとしての機能を果たすために実施される。好ましくはＣＭ−セファロース・カラムを通す第２のイオン交換ステップはｈＣＧ結合ステップとしての機能を果たし、そして残留ＤＮＡ及び宿主細胞又は培地のタンパク質夾雑物を除去する。好ましい態様において、このステップは、約pH６のリン酸ナトリウム・バッファーにより溶出し、約５℃で実施される。
【００２１】
シリカＣ１８カラムによる逆相クロマトグラフィーは、微量の核酸及び細胞培養由来の夾雑物の除去に効果的である。好ましくは前記カラムが移動相としての２−プロパノール／トリス−リン酸バッファーにより溶出される。好ましくは次にその保持物溶液を１０kDカットオフ限外ろ過に供し、濃縮し、そしてpH８の炭酸水素アンモニウムにより回収される。次に前記濃縮物をセファクリルＳ２００ＨＲによるサイズ排除クロマトグラフィー・カラムに注ぐ。このステップにおいて、分子サイズに基づく分離は、pH８の炭酸水素アンモニウムによる溶出でなおも存在しうる微量の細胞培養由来の夾雑物、可能性のある集合体、及び遊離のｈＣＧサブユニットの除去を達成する。次にその溶出物を好ましくはpH７のリン酸ナトリウム・バッファー中、１０kDカットオフの膜による限外ろ過により透析する。ろ過後、精製ｈＣＧバルクを好ましくは滅菌瓶中、低温で保存する。
【００２２】
実施例１
試薬：
アンモニア、分析用グレード
炭酸水素アンモニウム、分析用グレード（B.P.）
リン酸水素二ナトリウム、分析用グレード
無水変性エタノール
リン酸、分析用グレード（Ph. Eur.）
２−プロパノール、分析用グレード（Ph. Helv.）
塩化ナトリウム、分析用グレード（Ph. Eur.）
リン酸二水素ナトリウム、分析用グレード
水酸化ナトリウム・ペレット、分析用グレード（Ph. Eur.）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＰＬＣ用グレード
トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、分析用グレード
精製方法を要約したフロー図
細胞培養工程由来の採取材料を一連の５のクロマトグラフィーのステップにより精製及び濃縮する。
【００２３】
以下のフロー図（表１）はｒ−ｈＣＧ精製方法の好ましい態様を要約し、クロマトグラフィーのカラムの樹脂及び各中間ステップの操作の原理の要点をまとめる。
【００２４】
【表１】
0004588960.tif 000002
【００２５】
詳細なフロー図及び工程の説明を以下に示す。捕捉ステップ（ステップＩ）で提供される条件は未精製材料が組換え起源である時、普通に適用されるものである。
【００２６】
ステップＩ（捕捉ステップ）
このステップ（ステップＩ）において、予備的な濃縮を達成し、そしてバッファーを制御された組成物に変更する。このステップを室温で始め（シリカＣ４クロマトグラフィー）そして次に約＋５℃で続ける。好ましい温度範囲は５±３℃である。これをバイオリアクターの産生サイクルの間、個別にそれぞれの産物に対して続ける。
【００２７】
（ｉ）産物の浄化
バイオリアクターから新たに収集した培地をろ過により通常最初に不純物を取除く。
【００２８】
（ii）シリカＣ４クロマトグラフィー
浄化の後、産物を、前もってpH７の２５mMリン酸ナトリウムにより平衡化したＣ４シリカ・クロマトグラフィー・カラムに流す。好ましいpH範囲は６．６〜７．７である。前記カラムをＵＶモニターのシグナルがベースラインに戻るまで２５mMリン酸ナトリウムにより洗浄する。次に前記産物を２５mMリン酸ナトリウム中、３４．２％（ｗ／ｗ）２−プロパノールにより溶出する。
【００２９】
（iii）アンモニア処理
次に１Ｍの終濃度に達するまでその溶液にアンモニアを加える。この混合物を６時間インキュベートする。次にこの溶液を水により２倍希釈し、そして８５％リン酸を用いてpHを７．５に調整する。好ましいpH範囲は７．５±０．２である。
【００３０】
（iv）濃縮及び透析
バッチの間０．０５Ｍ水酸化ナトリウム中に保存した１０kDカットオフ膜をそのpHが約８に下がるまで精製水でリンスする。
【００３１】
前記産物を濃縮及び透析して（１０kD膜での限外ろ過による）１０kDより小さな分子量をもつ物質を除去し、微量の２−プロパノールを除き、そしてアンモニア溶液をpH７．５の４０mMリン酸ナトリウムに変える。好ましいpH範囲は７．５±０．２である。
【００３２】
３〜１５mg／mlの標的タンパク質濃度に達するように最終的な保持物を４０mMリン酸ナトリウムにより膜から回収する。
【００３３】
次にその溶液をろ過し、そして得られた濃縮物を約−１５℃で冷凍して保存する。
【００３４】
ステップII（ろ過及びＤＥＡＥセファロースＦＦクロマトグラフィーによるイオン交換）
このクロマトグラフィー・ステップは大部分の非ｒ−ｈＣＧタンパク質及び核酸を除去するｒ−ｈＣＧ「貫流」ステップである。前記ろ過を室温で実施するのに対して、産物をカラムに通すクロマトグラフィーの段階を低温室内で実施する。
【００３５】
（ｉ）前記ｒ−ｈＣＧ濃縮未精製産物の解凍及びプール
前記冷凍濃縮物を解凍し、そしてプールする。精製バルクｒ−ｈＣＧのバッチを、同様に機能する細胞バンクから産生された変更可能な数のｒ−ｈＣＧ未精製濃縮物のプールから調製する。ｒ−ｈＣＧ未精製濃縮プールの数に対する判断基準は精製工程における次のクロマトグラフィー・ステップの最大タンパク質結合容量に依存する（４mg総タンパク質／mg樹脂）。
【００３６】
（ii）ろ過による浄化
好ましくは前記ｒ−ｈＣＧ溶液をろ過器具に通し、そしてそのフィルターをpH７．５の４０mMリン酸ナトリウムにより洗浄する。
【００３７】
（iii）ＤＥＡＥセファロースＦＦによるイオン交換クロマトグラフィー
弱荷電アニオン交換樹脂、ジエチル・アミノ・エタン（ＤＥＡＥ）セファロース・ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を充填したカラムを４０mMリン酸ナトリウム（pH７．５）により平衡化する。
【００３８】
前記ｒ−ｈＣＧ溶液をそのカラムに流す。
【００３９】
そのカラムにpH７．５の４０mMリン酸ナトリウムを流す。このクロマトグラフィー工程を２８０nmでの分光測定により観察する。
【００４０】
溶出始めのピークまで初めの廃液を捨てる。次にｒ−ｈＣＧを含む非結合画分を回収する。
【００４１】
ステップIII（ＣＭセファロースＦＦクロマトグラフィー）
このクロマトグラフィー・ステップにおいて、大部分の宿主細胞の夾雑物が除去される。このクロマトグラフィー・ステップを約＋５℃で実施する。好ましい温度範囲は５±３℃である。
【００４２】
（ｉ）前記ＤＥＡＥセファロースＦＦ溶出物の希釈
注射用水をＤＥＡＥセファロースＦＦ溶出物に加え、そしてそのpHを８５％リン酸を用いて６に調整する。好ましいpH範囲は６±０．１である。
【００４３】
（ii）ＣＭセファロースＦＦによるイオン交換クロマトグラフィー
弱荷電カチオン交換樹脂、カルボキシメチル（ＣＭ）セファロース・ファースト・フローを充填したカラムを２０mMリン酸ナトリウム（pH６）により平衡化する。好ましいpH範囲は６±０．１である。
【００４４】
前記ｒ−ｈＣＧ溶液をそのカラムに流す。
【００４５】
カラムをpH６の２０mMリン酸ナトリウム・バッファーにより洗浄する。このクロマトグラフィー工程を２８０nmでの分光測定により観察する。
【００４６】
産物をpH６の１３０mMリン酸ナトリウム・バッファーを用いて溶出する。溶出始めのピークまで初めの廃液を捨てる。
【００４７】
ｒ−ｈＣＧを含む溶出ピークを回収する。ウイルスの夾雑物を除去するために産物を場合によりこの段階でろ過しうる。
【００４８】
ステップIV（シリカＣ１８によるＲＰ−ＨＰＬＣ）
このＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー・ステップは微量の細胞培養夾雑物、核酸残留物、及びエンドトキシンの除去に効果的である。それに１０kDカットオフ限外ろ過及び補足的なろ過が続く。
【００４９】
（ｉ）アリコートの調製
アリコートのpHを５に調整し、そして２−プロパノールを１５％（ｖ／ｖ）の終濃度まで加える。
【００５０】
（ii）シリカＣ１８によるＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー
シリカＣ１８樹脂を充填したカラムを０．５Ｍトリス−リン酸バッファー中、１５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールによりまず平衡化する。
【００５１】
最初のアリコートをカラムに流し、そしてそのクロマトグラフィーをＵＶ分光測定により観察する。
【００５２】
カラムを同じ平衡化バッファーにより洗浄する。
【００５３】
１５％〜２５％（ｖ／ｖ）の線形勾配の２−プロパノール／０．５Ｍトリス−リン酸バッファーによりｒ−ｈＣＧの溶出を続けて実施する。対応のピークが分光測定（Ａ280 ）により検出された時ｒ−ｈＣＧが分画される。その吸光度が、ピークが高くなる時点で最大のピーク高の６５％超、そしてピークが低くなる時点で最大ピーク高の２０％超である画分をプールする。
【００５４】
次にその４のｒ−ｈＣＧ含有プールをためて、そして等量の注射用水（ＷＦＩ）により希釈する。
【００５５】
その産物を濃縮及びＷＦＩに対して透析し（１０kD膜での限外ろ過による）１０kDを下回る分子量をもつ物質を除去し、そして２−プロパノールを除く。
【００５６】
次にその産物をpH８の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム・バッファーに対して限外ろ過により透析する。
【００５７】
得られた中間物質を約＋５℃又は必要であれば冷凍で保存する。好ましい保存温度はそれぞれ５±３℃及び−１５℃以下である。
【００５８】
ステップＶ（セファクリルＳ−２００ＨＲによるサイズ排除クロマトグラフィー）
このサイズ排除クロマトグラフィーは微量の細胞培養由来の夾雑物、予想しうる集合体、及び／又は遊離サブユニットの除去に効果的である。これに１０kDカットオフ限外ろ過が続く。セファクリルＳ−２００ＨＲ及び１０kDカットオフ限外ろ過ステップを約＋５℃で実施する。好ましい温度範囲は５±３℃である。
【００５９】
（ｉ）セファクリルＳ−２００ＨＲによるサイズ排除
セファクリルＳ−２００ＨＲ樹脂を充填したカラムを０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム（pH８）により平衡化する。好ましいpH範囲は８±０．２である。前記ｒ−ｈＣＧ溶液をそのカラムに流し、そしてpH８の０．５Ｍ炭酸水素アンモニウムを用いて溶出を始めた。好ましいpH範囲は８±０．２である。ｒ−ｈＣＧ画分の回収をピークの始まりから開始し、そしてピークが低下する場面で最大ピーク高の５０％水準となるまで続けた。
【００６０】
（ii）１０kDカットオフ限外ろ過
バッチの間０．０５Ｍ水酸化ナトリウム中に保存した１０kDカットオフ膜をpHが約８に下がるまでＷＦＩによりリンスした。
【００６１】
その産物を濃縮及びＷＦＩに対して透析する（限外ろ過による）。
【００６２】
次にその産物をpH７の０．０１Ｍリン酸ナトリウム・バッファーに対して（限外ろ過により）透析し、そして３．５mg／mlの標的の終濃度を達成するために最終タンパク質濃度を調整する。
【００６３】
好ましくは得られたｒ−ｈＣＧ最終バルク溶液を約−１５℃で冷凍して保存する。
【００６４】
クロマトグラフィー樹脂
以下のクロマトグラフィー樹脂を本精製方法に利用しうる：同等の樹脂を利用することもできる。
【００６５】
0004588960.tif 000003
現行の製造業者は以下のとおりである：
Amersham Pharmacia Biotech,
Bjoerkgatan 30 S-751 84, Uppsala Sweden
Millipore Corporation
17 Cherry Hill Drive Danvers, MA 01923 USA
Vydac, The Separations Group,
17434 Mojave St. Hesperia, CA 92345 USA
結果
・分子量及びサイズ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明の精製方法を受けて得られたｒ−ｈＣＧの相対分子量を既知の分子量の標準タンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。クーマシー・ブリリアント・ブルー染色後、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約分子量７０kD（６５〜７５kDの範囲）にｒ−ｈＣＧヘテロダイマーの幅広い単独のバンドを示した。そのバンドの正体をウェスタン・ブロッティングにより確かめた。
【００６６】
・生理活性
本発明の方法による精製後の異なるバッチのｒ−ｈＣＧの生理活性を表２に報告する。そのタンパク質濃度は２７６．５nmでの分光測定により決定したａ＝０．６１６。
【００６７】
前記ｒ−ｈＣＧ標本の平均の特定の活性は、著しく高く、約２５，０００IU／mgにのぼる。
【００６８】
【表２】
0004588960.tif 000004
【００６９】
・製剤
液体及び凍結乾燥製剤の両方を本発明の高度に精製した組換えｈＣＧを用いて作製した。
【００７０】
液体製剤
賦形剤としてマンニトール又はショ糖を用いた１００００IU／mlの２つの液体製剤をＤＩＮ  ２Ｒバイアル中に作製し、そして５０、４０、２５、及び４℃での安定性試験に供した。
【００７１】
その組成を表３及び４に表す。
【００７２】
【表３】
0004588960.tif 000005
【００７３】
【表４】
0004588960.tif 000006
【００７４】
バイオアッセイ、ＳＥ／ＨＰＬＣ、及びＲＰ−ＨＰＬＣにより行った安定性試験の結果は、マンニトール製剤がショ糖製剤に関してより安定であることを示した。タンパク質の酸化及び遊離サブユニットの形成を最小化するために好ましくは冷蔵保存条件が要求される。
【００７５】
凍結乾燥製剤
５０００IU力価の凍結乾燥製剤を賦形剤としてショ糖を用いて、５０、４０、２５、及び４℃での安定性試験のためにＤＩＮ  ２Ｒバイアル中に作製した。
【００７６】
その組成を表５に表す。
【００７７】
【表５】
0004588960.tif 000007
【００７８】
バイオアッセイ、ＳＥ／ＨＰＬＣ、及びＲＰ−ＨＰＬＣにより行った安定性試験の結果は、この凍結乾燥製剤が４０℃及び５０℃で少なくとも１９週間安定であることを示した。
【００７９】
２５℃及び４℃での安定性試験を６ヶ月まで実施し、活性物質の分解がないことを示した。