(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルセミドおよびブメタニドからなる群より選択される１種以上のイオン輸送機構干渉剤を含み、角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも水晶体上皮細胞の剥離の発生率を高めて後嚢混濁を防止する、後嚢混濁を防止するための眼球処理溶液。
【請求項２】
フルセミドおよびブメタニドからなる群より選択される１種以上のイオン輸送機構干渉剤およびオスモライトを含み、角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも水晶体上皮細胞の剥離の発生率を高めて後嚢混濁を防止する、後嚢混濁を防止するための眼球処理溶液。
【請求項３】
オスモライトがアミノ酸を含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項４】
アミノ酸がタウリン、グリシンおよびアラニンからなる群より選択される、請求項３に記載の眼球処理溶液。
【請求項５】
オスモライトが糖を含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項６】
オスモライトがマンニトール、ミオイノシトール、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、尿素、スクロースおよびグルコースからなる群より選択される、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項７】
オスモライトが塩化物を含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項８】
オスモライトが塩化ナトリウムを含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項９】
オスモライトが塩化カリウム、塩化セシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウムおよび塩化フランシウムからなる群より選択される、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１０】
オスモライトが尿素を含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１１】
オスモライトがナトリウムを含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１２】
オスモライトが塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム、硝酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、イセチオン酸ナトリウムおよびグルコン酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１３】
オスモライトが塩を含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１４】
ｐＨが５〜１１である、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１５】
ｐＨが８〜１０である、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１６】
溶液のｐＨを調節することができる薬剤を更に含む、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１７】
ｐＨを調節することができる薬剤が水酸化物であり、８〜１０のｐＨを有する、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項１８】
水酸化物溶液が水酸化ナトリウムを含む、請求項１７に記載の眼球処理溶液。
【請求項１９】
イオン輸送機構干渉剤がフルセミドであり、８〜１０のｐＨを有する、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項２０】
フルセミドが１５μＭ〜１００μＭの範囲の濃度で処理溶液中に存在する、請求項１９に記載の眼球処理溶液。
【請求項２１】
イオン輸送機構干渉剤がブメタニドであり、８〜１０のｐＨを有する、請求項２に記載の眼球処理溶液。
【請求項２２】
フルセミドおよびブメタニドからなる群より選択される１種以上のイオン輸送機構干渉剤を含み、５〜１１のｐＨを有し、溶液適用後３０分以内に水晶体上皮細胞の剥離を誘発させる、後嚢混濁を防止するための眼球処理溶液。
【請求項２３】
角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも水晶体上皮細胞の剥離の発生率を高めて後嚢混濁を防止する、後嚢混濁を防止するための眼球処理溶液を製造するための、フルセミドおよびブメタニドからなる群より選択される１種以上のイオン輸送機構干渉剤の使用。
【請求項２４】
角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも水晶体上皮細胞の剥離の発生率を高めて後嚢混濁を防止する、後嚢混濁を防止するための眼球処理溶液を製造するための、フルセミドおよびブメタニドからなる群より選択される１種以上のイオン輸送機構干渉剤およびオスモライトの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の眼球細胞および組織を損なうことなく、冗長な術前処置を行うことなく、水晶体上皮細胞の剥離および／または死を選択的に誘発することにより後嚢混濁を防止するために使用されるイオン輸送機構干渉剤を単独でまたは他の試薬と組み合わせて含む新規処理溶液および方法に関する。
発明の背景
【０００２】
ヒトの目の水晶体の主な役割は、角膜および眼房水を通過した光線を網膜上に集中させることである。水晶体の構造および代謝は、その一体性および透明性の維持に直接貢献する。水晶体は、全体が、異なる成熟段階の上皮細胞からなり、成熟過程で組織が決して廃棄されない点で特異である。新しい水晶体細胞が形成されると、古い細胞は水晶体の内部に移される。水晶体は、間もなく、直接血液供給から分離され、栄養および排泄経路の両方について眼房水および硝子体液に依存する。水晶体の光学的特徴は、一定の細胞体積および細胞間空間体積を減少させるような線維の密充填を維持している水晶体細胞への依存が大きい。したがって、この繊細な構造を維持することが、水晶体の本質的特徴となる。水晶体は、このイオン、糖、アミノ酸および水のバランスを調節することにより一定の細胞体積を維持する独自の性能を発達させている。
【０００３】
ヒトの目の白内障は、水晶体の透明性の損失による光の透過の妨害である。視野のぼけおよび曇りを発生させる白内障は、明らかに低視力の最も一般的な原因である。曇った水晶体は、外科的処置、すなわち、嚢外白内障摘出（ＥＣＣＥ）により除去することができる。ＥＣＣＥは、手動または自動真空技術を用いて皮質浄化により臨床的核部を除去することを含む。後部の赤道嚢は、後室眼内水晶体を挿入することができる被膜または嚢として無傷のまま残される。後部嚢および小帯が無傷の場合、この水晶体は、通常、患者の人生を通して合併症無く所定の位置に残る。手術中、水晶体嚢の前部を注意深く開き、白内障を除去する。眼内水晶体を、嚢の残りの（後部）部分に挿入する。これにより、自然の水晶体調節が損なわれる。
【０００４】
標準的な白内障手術は、水晶体乳化として知られている手順である。この手順は、水晶体の内容物を攪拌して、水晶体物質を破壊し、これは、その後、洗浄液を同時に注入および抽出する水晶体乳化プローブにより水晶体嚢から放出される。この処置により剥離された死んだものと生きているものの両方の水晶体上皮細胞が、この放出作用により洗浄される。
【０００５】
前部水晶体嚢の保存と、注射可能な物質による水晶体内容物の置換とを含む新規治療が開発されつつある。
【０００６】
この手術後、視力が回復されるが、広く行われている白内障手術の最も頻繁な合併症の１つは、白内障手術後の水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）の増殖である。二次白内障としても知られている後嚢混濁（ＰＣＯ）は、嚢外手術の後に起こる最も頻繁な合併症であり、患者の約２０〜４０％において起こる。ここ数十年間で、多くの実験的および臨床的研究の結果により、ＰＣＯの病因の理解が向上した。
【０００７】
ＰＣＯの主な原因は、残留ＬＥＣの増殖および後部水晶体嚢への移動である。残留水晶体上皮細胞の大部分を除去しようとする外科医の苦労にかかわらず、これらの除去は困難である。したがって、多くのＬＥＣが、外科的処置の最後の水晶体嚢中に残される。ＬＥＣの増殖は、眼内水晶体がその中に配され経時的に曇る膜または被膜を発生させる。ＬＥＣの増殖は、例えば注射可能な水晶体を利用する新規白内障治療における大きな問題でもある。曇った膜は、「後白内障」すなわちＰＣＯと呼ばれる。ＰＣＯの症状は、白内障の症状と同じであり、視力が次第に衰え、処置しなければ失明に至ることもある。
【０００８】
ＰＣＯの形成を防止または最小化させる多くの努力が成された。これらの努力は、おおまかに３つの分野、すなわち、手術改良、水晶体設計改良および化学的予防に分類される。
【０００９】
ＰＣＯの防止を試みて多くの手術法が開発されている。これらは、種々の手術用具の使用、およびレーザー、超音波および凍結技術の適用を含んでいる。ＰＣＯが一旦生じると、曇った嚢の中心部に開口を設けるためにレーザービームを用いる簡単で迅速な手順としてＹＡＧレーザー嚢切開が適用される。しかしながら、ＹＡＧレーザー嚢切開には強度の危険を伴う。これは、主に、網膜剥離、緑内障、類嚢胞黄斑浮腫を含む。
【００１０】
眼内水晶体を作る物質のタイプ、および眼内水晶体端部の状態について、多大な関心が集まっている。両凸面および平坦凸ポリメチルアクリレート並びにシリコーン板肝性眼内水晶体および、鋭利な眼端部を有する水晶体が、ＰＣＯへの有利な効果を有すると報告されている。特に、Ａｌｃｏｎ’ｓ  Ａｃｒｙｓｏｆｌｅｎｓにより、この分野で著しい進展が成された。しかしながら、これらのレンズは、比較的高価で、それ自体の合併症および制約を生み出す。
【００１１】
化学薬剤を利用してＬＥＣの増殖を破壊または防止する他の試みが成された。２００１年９月２１日付出願の英国特許出願第０１２２８０７．１号において、アルドース還元酵素阻害剤によりソルビトール経路を調節してＬＥＣにおける細胞内ソルビトール濃度を減少させることにより、浸透圧ショックによりＬＥＣの死を誘発させることによりＰＣＯを防止できるという仮説が立てられた。しかしながら、ソルビトール経路を調節するためには、提案された治療は、手術前４８時間まで水晶体嚢を予備処置することを含み、したがって、現在の白内障手術に容易には取り込まれない。
【００１２】
他の化学的手法も試された。例えば、ＬＥＣに特異的な免疫毒素結合抗体の使用は、ＰＣＯの発生率を減少させ得るが完全には防止できない。Ｃｌａｒｋら著、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．１９９８年１２月；第２４（１２）巻：１６１４〜２０頁およびＭｅａｃｏｃｋら著、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．２０００年５月；２６（５）巻：７１６〜２１頁を参照されたい。エチレンジアミン四酢酸、トリプシンおよびＤＩＳＰＡＳＥ（登録商標）（中性プロテアーゼ）が、ＬＥＣの分離のために用いられたが、小帯および周囲組織を損傷し得る。Ｎｉｓｈｉ著、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．１９９９年１月；２５（１）巻：１０６〜１７頁およびＮｉｓｈｉら著、Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ．１９９１年８月；２２（８）巻：４４４〜５０頁を参照。ＰＣＯの防止について試験した他の薬剤には、水晶体上皮細胞の移動および増殖を阻害するＲＧＤペプチド；マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルのような有糸分裂阻害剤がある。Ｃｈｕｎｇ  ＨＳ、Ｌｉｍ  ＳＪ、Ｋｉｍ  ＨＢ著、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ  Ｓｕｒｇ．２０００年１０月；２６（１０）巻：１５３７〜４２頁；Ｓｈｉｎ  ＤＨ、Ｋｉｍ  Ｙ．Ｙ．、Ｒｅｎ  Ｊら著、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１９９８年；１０５巻：１２２２〜１２２６頁を参照。
【００１３】
不運なことに、上記化学的薬剤の大部分が、効果的投与量で用いた場合、角膜内皮細胞（ＣＥＤＣ）および網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）のような眼球細胞を含む周囲眼球組織への許容できないレベルの毒性を示す。
発明の簡単な概要
【００１４】
本発明によれば、先に論じたＰＣＯを防止する従来の手段の不利益が克服されている。本発明は、他の眼球細胞および組織を著しく損なうことなく、水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）の剥離および／または細胞死を迅速かつ選択的に誘発することによりＰＣＯを防止し、存在する標準的白内障手術におよび更なる可能性のある新規治療に容易に組み込まれ、白内障手術中またはその後に残留水晶体上皮細胞を容易に除去させることができる。ＰＣＯ防止は、処理溶液の単独または複数の適用により達成される。処理溶液は、白内障手術の前、中または後に水晶体嚢に適用または導入される。処理溶液は、イオン輸送機構干渉剤を単独または浸透圧ストレス剤および適当なｐＨを達成するための薬剤などの他の治療薬剤と組み合わせて含み、水晶体上皮細胞の剥離および／または死を選択的に誘発することにより後嚢混濁を防止する。イオン輸送機構干渉剤は細胞機構および広範囲の細胞の細胞イオン分布を干渉することができるが、薬剤の濃度は、処理溶液が水晶体上皮細胞の細胞機構を選択的に干渉するが他の眼球細胞は実質的に損なわないように選択される。処理溶液は、水晶体上皮細胞の細胞死および／または剥離を選択的に誘発するが、他の眼球細胞および組織は実質的に損なわれず、冗長な術前処置が要らない。
【００１５】
白内障手術の前、中または後に適用または導入することができる処理溶液の単独または複数は、（ｉ）正常の細胞機能の干渉によりそれらの基質または膜からのＬＥＣの選択的剥離を誘発して、結果的に細胞死を引き起こすまたは少なくともＬＥＣを容易に除去させる；（ｉｉ）正常細胞機能の干渉によりＬＥＣの選択的死を誘発する；および／または（ｉｉｉ）正常細胞機能の干渉によりＬＥＣの浸透圧ストレスへの感受性を誘発し、結果的に、細胞剥離および／または死を発生させることにより、ＬＥＣを選択的かつ迅速に除去することができる。本発明は、特異的かつ独自にＬＥＣを標的するように広範囲の細胞のイオン輸送機構を干渉する化学薬剤を提供する。
【００１６】
この眼球処理溶液および方法は、他の眼球細胞よりもＬＥＣの剥離および／または死の発生率を実質的に高めるようにイオン輸送機構干渉剤を利用することによりＰＣＯを防止する。本発明のイオン輸送機構干渉剤は、ＬＥＣの細胞膜を通過するイオンおよび水の流れを制御する細胞内、細胞外および／または細胞間機構を直接または間接的に干渉することができる。この干渉により、細胞を収縮および／または膨張させ、細胞剥離および／または死を引き起こすことができる。薬剤の濃度は、イオン輸送機構干渉剤を含む処理溶液が水晶体上皮細胞の著しい剥離および／または死を引き起こすが、他の眼球細胞のかなりの部分の死および／または剥離は引き起こさないように選択される。特に、イオン輸送機構干渉剤には、共輸送干渉剤、ナトリウムポンプ干渉剤、交換干渉剤、またはチャネル干渉剤がある。
【００１７】
イオン輸送機構干渉剤は、それ自体、ＬＥＣの細胞剥離および／または死を誘発する、または、浸透圧ストレスを引き起こす更なる薬剤にＬＥＣが充分に反応できなくするようにＬＥＣを感作して、ＬＥＣを選択的に剥離および／または殺し、ＰＣＯを防止することができる。この更なる薬剤は、ＬＥＣにおいて浸透圧ショックを誘発して細胞剥離および／または死を引き起こすオスモライトのような浸透圧ストレス剤である。
【００１８】
本発明の処理溶液は、特定の浸透圧ストレスの選択的濃度にしたがって選択される適当なｐＨを有する。溶液のｐＨは、溶液中の水素イオンの濃度を増加または減少させる任意の酸、塩基または他の薬剤により調節することができる。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の利点および新規特長、並びにここでの詳細は、以下の説明により、より充分に理解される。
発明の詳細な説明
【００２０】
本発明を１つ以上の好ましい実施形態を用いて説明するが、これらの実施形態に本発明が限定されるものではない。一方、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全ての変更、修飾および等価物を含む。
【００２１】
本発明は、イオン輸送機構干渉剤を単独または他の薬剤と組み合わせて用いて水晶体嚢からの剥離および／または水晶体上皮細胞の死を迅速かつ選択的に誘発することによりＰＣＯを防止するが、他の眼球細胞を実質的に損なうことなく、また冗長な術前処置を行わない。この選択的剥離および／または死は、目の他の細胞と異なるＬＥＣの特異的性質により可能になる。その結果、用いられる薬剤の投与量および濃度により、ＬＥＣが剥離され、殺され、および／または水晶体から除去され、他の眼球細胞および組織は損なわれないままである。
【００２２】
水は、効果的に、ヒト細胞の細胞膜を通過する熱力学的平衡を示す。実質的に全てのヒト細胞の細胞膜が水への透過性が高いので、細胞体積は、浸透活性溶解質（電解質およびオスモライト）の細胞内用物により、および、細胞外液の浸透度および／または張度により決められる。通常、細胞内および細胞外張度は同じであり、生理学的条件下において、大部分の哺乳動物細胞は、大きな範囲の張度に曝されない。体液の浸透度は、通常、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏであり、体液ホメオスタシスの極めて狭い範囲（±３％）内で調節される。しかしながら、病態生理学的条件下では、体液ホメオスタシスの妨害に遭遇し得る。約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの範囲の細胞質液浸透度が観察された。これらの極端な条件下において、体細胞は、体積制御機構の非存在下に、それぞれ２０〜３０％膨張および収縮する。
【００２３】
水晶体上皮細胞は、他の細胞と同様に、細胞外浸透度の変化に対して防御すると共に一定細胞体積を維持するために細胞体積制御プロセスを用いる。水晶体上皮細胞、線維上皮細胞および毛様体上皮細胞のための体積制御機構は、先に記載されている。例えば、Ｃ．Ｗ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら著、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１年９月；２８１（３）巻：Ｃ８６５〜７５頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら著、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７年３月：８２（２）巻：２４５〜５９頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら著、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４年９月：７９（５）巻：７４１〜５３頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら著、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７年３月：４９９巻（Ｐｔ．２）：３７９〜８９頁を参照されたい。浸透圧摂動後、細胞が等張媒体中で有していた体積に戻る傾向がある体積制御相が確保される。細胞体積の変化は、特定の代謝および膜輸送経路を活性化し、それにより、浸透活性溶質が蓄積または喪失される。制御体積減少（ＲＶＤ）は、低細胞外浸透圧または張度に反応して細胞体積を減少または維持するために用いられるプロセスである。制御体積増加（ＲＶＩ）は、高細胞外浸透圧または張度に反応して細胞体積を増加または維持するために用いられるプロセスである。細胞溶質含量（すなわち、細胞内張度）または細胞外張度が変化すると、迅速な膜内外水流が起こって平衡が回復される。形質膜は高度に影響を受け易いので、水流が細胞の膨張または収縮を引き起こす。
【００２４】
平衡を達成するように細胞が細胞内イオン濃度を変化させる１つの方法は、細胞の表面上に配されたイオン輸送機構の利用である。これらの機構は、イオンを細胞に入れまたは出し、細胞内イオン強度を変化させ、その結果、浸透圧を変化させる。例えば、種々の細胞型内でのＲＶＤ中に活性化されるイオン輸送機構は、導電性Ｋ＋およびＣｌ−チャネル（別々の導電性Ｋ＋およびＣｌ−輸送経路）、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送および機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。種々の細胞型内でのＲＶＩ中に活性化されたイオン輸送機構は、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送、および機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。
【００２５】
異なる細胞型の間においてイオン輸送機構の反応および性質が驚くほど多様である。ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ著、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９８９年４月；６９（２）巻：３１５〜８２頁を参照。例えば、細胞は、そこでＲＶＤおよびＲＶＩを行うことができる細胞がいずれも行わない特定の体積設定点を有する。異なる細胞は、そこで所定の輸送機構がオンオフする異なる体積設定点を有する。Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．ＣＡｍ著Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３年、２６５巻：Ｃ１１９１〜１２００頁；Ｐａｒｋｅｒ  ＪＣら著、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５年６月；１０５（６）巻：６７７〜９９頁を参照。水晶体細胞がそのＲＶＩおよびＲＶＤプロセスをオフする設定点または閾値は、他の眼球細胞と異なる。細胞の形態、細胞外マトリクスとのインテグリンの相互作用は、細胞の剥離および生存率の決定、または付着細胞におけるプログラム細胞死の誘発において重要な役割を果たす。これが、ＬＥＣと、眼および体の他の細胞との相違である。
【００２６】
水晶体上皮細胞のイオン輸送機構の干渉は、これらの細胞が、低浸透または高浸透細胞外環境または他の細胞ストレスに適切に反応することを妨げる。細胞がこれらのストレスに反応することができないので、細胞剥離および／または細胞死が直ちに引き起こされるか最終的に引き起こされる。
【００２７】
ストレスに反応することができない、または反応できなくなる水晶体上皮細胞は、幾つかの反応を奏する。１つの反応は細胞死である。別の考えられる反応は、その基礎となっている基質または膜からの細胞の剥離である。例えば、細胞は、基質へのその付着をもはや維持できなくなるように収縮することがあり、これが細胞骨格の再配列に関与し得る。細胞収縮により、付着細胞が、その局所的細胞接触部を転位させ、細胞骨格がこれらの接触部に転位することもある。剥離は、結果的に、細胞死を誘発するおよび／または細胞の除去を容易にする。細胞死は、周囲の細胞および細胞外マトリクス（ＥＣＭ）からの細胞剥離を導き、細胞剥離が即時的な細胞死を伴うことなく起こり得る。例えば、細胞外マトリクス接触部の破壊は、その派出細胞からの細胞剥離により誘発されるアポトーシスの一形態であるアノイキスを誘発することが示された。水晶体上皮細胞による別の考えられる反応は、細胞が浸透圧ストレスまたはショックの影響を受け易くなるように細胞を弱化または感作することである。例えば、一旦細胞が感作されると、浸透圧ショックまたはストレスに適当に反応できなくなり、ショックまたはストレスの感作細胞への導入が、剥離および／または細胞死を引き起こす。本発明の処理溶液および方法は、他の眼球細胞を実質的に損傷せずに、ＬＥＣからのこれらの反応の少なくとも１つを選択的かつ迅速に誘発することによりＰＣＯを防止する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の眼球処理溶液および方法は、イオン輸送機構干渉剤を用いて、角膜内皮細胞（ＣＥＤＣ）および網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）などの他の眼球細胞よりも、基質または膜からのＬＥＣの剥離および／または細胞死の発生率を実質的に高くすることによりＰＣＯを防止する。したがって、本発明の大きな利点は、本発明の薬剤での処理により、他の眼球細胞および組織を著しく損なうことなく、水晶体嚢から実質量のＬＥＣを除去させることによりＰＣＯを防止することである。
【００２９】
イオン輸送機構干渉剤は、水晶体上皮細胞の細胞膜を通過するまたはその中でのイオンおよび水の流れを調節する細胞内、細胞外および／または細胞間機構を直接または間接的に干渉することができる薬剤である。イオン輸送機構干渉剤は、正常細胞イオン分布機構を干渉し、結果として、細胞の機能を干渉する。本発明のイオン輸送機構干渉剤は、単独または他の薬剤と組み合わさって、ＬＥＣ細胞イオンの正常分布を妨げ、それにより、選択的にＬＥＣ剥離および／または死を直接または間接的に誘発してＰＣＯを防止する。薬剤の濃度は、処理溶液が、ＬＥＣのイオン輸送機構を干渉してＬＥＣの剥離および／または死を引き起こすが、他の眼球細胞のイオン輸送機構は実質的に干渉しないように選択される。ＬＥＣは、細胞剥離および／または死故に水晶体嚢から容易に除去することができるが、他の眼球細胞は実質的に損なわれないままである。
【００３０】
イオン輸送機構干渉剤は、ＬＥＣ中での１つ以上の以下の細胞機構を干渉することができる：（１）共輸送機構（例えば、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送、Ｎａ＋−Ｃｌ−共輸送、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送およびアミノ酸輸送）；（２）ナトリウムポンプ；（３）イオン交換（例えば、機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換；機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換；Ｃｌ−−Ｃｌ−交換、Ｃａ２＋−Ｎａ＋交換）；および（４）イオンチャネル（例えば、カリウムチャネル、塩化物チャネル、体積感受性有機オスモライトおよびアニオン交換（ＶＳＯＡＣ）および他のアニオンチャネル）。イオン輸送機構干渉剤は、これら細胞機構を直接または間接的に活性化または阻害することができる。
【００３１】
低張媒体中では、脊椎動物細胞は、最初に、浸透水平衡により膨張するが、続いて、ＫＣｌの正味損失および同時の細胞水の損失によりその体積を調節して正常細胞体積を回復する。細胞膨張は、輸送経路を活性化し、それにより、カリウム、塩化物および有機オスモライトの正味流出が生じる。種々の細胞型内でのＲＶＤ中に活性化されるイオン輸送機構は、導電性Ｋ＋およびＣｌ−チャネル（別々の導電性Ｋ＋およびＣｌ−輸送経路）、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送および機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。例えば、カリウムおよび塩化物は、主に、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送の活性化によりまたは別々のカリウムおよびアニオンチャネルにより細胞から失われる。
【００３２】
これに対して、高張媒体中では、脊椎動物細胞は、最初に、浸透水平衡により収縮するが、続いて、ＫＣｌの正味増加および同時の細胞水の取り込みによりその体積を調節して正常細胞体積を回復する。細胞収縮は、輸送経路を活性化し、それにより、塩化物、ナトリウムおよびカリウムの正味流入が生じる。種々の細胞型内でのＲＶＩ中に活性化されたイオン輸送機構は、Ｎａ＋−Ｃｌ−またはＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送、および機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３交換を含む。
【００３３】
イオン輸送機構干渉剤としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
ｎ−エチルマレイミド
バリノマイシン
グラミシジン
カテコールアミン
カルシウム
イオノフォアＡ２３１８７（例えば、イオノフォアＡ２３１８７＋カルシウムを含む）
カルモジュリン
ピモジド
ループ利尿剤（例えば、フルセミド、ブメタイド、エタクリン酸、ピレタニド、トラセミド）
アミロライド
ジ−イソチオシアノ−ジスルホニルスチルベン（ＤＩＤＳ）
スタウロスポリン（ＳＩＴＳ）
ニフルム酸
スチルベン誘導体（例えば、４，４’−ジニトロスチルベン−２，２’−ジスルホン酸）
キニーネ
サイトカラシンＢ
【００３４】
通常、４クラスのイオン輸送機構干渉剤がある：（１）共輸送干渉剤；（２）ナトリウムポンプ干渉剤；（３）交換干渉剤；および（４）チャネル干渉剤。以下に記載のように、イオン輸送機構干渉剤が、４つの上記クラスのうちの１つまたはそれ以上に含まれると分かる。
【００３５】
共輸送干渉剤は、細胞の共輸送機構を直接または間接的に干渉することができる薬剤である。より詳細には、共輸送干渉剤は、ＬＥＣの共輸送機構を活性化または阻害する。共輸送干渉剤の濃度は、処理溶液が、他の眼球細胞よりも、ＬＥＣの剥離および／または死の発生率を実質的に高めるように選択される。共輸送機構としては、例えば、Ｋ＋−Ｃｌ−またはＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送がある。共輸送干渉剤としては、例えば、以下のものがある：
ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（例えば、ｎ−エチルマレイミド＋ルビジウムを含む）
ヨードアセトアミド
フルセミド（フロセミドとしても知られている）
ブメタニド
水銀（Ｈｇ２＋）
および水晶体上皮細胞の共輸送機構を活性化または阻害することができる他の薬剤。
【００３６】
ナトリウムポンプ干渉剤は、細胞のナトリウムポンプ機構として知られているＮａ／Ｋ／ＡＴＰａｓｅを直接または間接的に干渉することができる薬剤である。より詳細には、ナトリウムポンプ干渉剤は、ＬＥＣのＮａ／Ｋ／ＡＴＰａｓｅポンプを活性化または阻害する。例えば、ＬＥＣは不浸透性のアニオン性高分子を含み、拡散性イオンと水の侵入から生じるコロイド浸透膨張（Ｇｉｂｂｉｓ−Ｄｏｎｎａｎ平衡）が、消散的漏侵入と同じ割合でイオンを押し出すイオン押し出しポンプの操作により定常的に生じる。ナトリウムポンプ干渉剤の濃度は、処理溶液が、他の眼球細胞よりも、ＬＥＣの剥離および／または死の発生率を実質的に高めるように選択される。ナトリウムポンプ干渉剤には、例えば、ウアバインおよび水晶体上皮細胞のナトリウムポンプを活性化または阻害することができる他の薬剤がある。
【００３７】
更に別のタイプのイオン交換機構干渉剤は、交換干渉剤である。交換干渉剤は、細胞のイオン交換を直接または間接的に干渉することができる薬剤である。より詳細には、交換干渉剤は、ＬＥＣのイオン交換機構を活性化または阻害し、これは、細胞内または細胞外イオン再分布を引き起こすのみならず、細胞内ｐＨも変化させる。イオン交換機構の例には、Ｋ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３交換およびＣｌ−−ＨＣＯ３交換に機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋交換がある。例えば、ＬＥＣのＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換の活性化によりカリウムおよび塩化物損失を誘発する刺激は、交換干渉剤である。交換干渉剤の例としては、以下のものがある。
スタウロスポリン（ＳＩＴＳ）
アミロライド
ジ−イソチオシアノ−ジスルホニルスチルベン（ＤＩＤＳ）
カルモジュリン（ＣａＭ）
銅（Ｃｕ２＋）
水素（Ｈ＋）
および水晶体上皮細胞の交換チャネルを活性化または阻害することができる他の薬剤。
【００３８】
チャネル干渉剤は、細胞のイオンチャネルを直接または間接的に干渉することができる薬剤である。より詳細には、チャネル干渉剤は、ＬＥＣのイオンチャネルを活性化または阻害する。イオンチャネルには、例えば、カリウム、塩化物およびＶＳＯＡＣ輸送経路がある。例えば、カリウムチャネルおよび塩化物チャネルの活性化により塩化カリウムおよび有機オスモライトの損失を誘発する刺激は、チャネル干渉剤である。チャネル干渉剤の濃度は、処理溶液が、他の眼球細胞よりも、ＬＥＣの剥離および／または死の発生率を実質的に高めるように選択される。チャネル干渉剤には、例えば以下のものがある。
ケトコナゾール（ＫＥＴＯ）
５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）
１，９−ジデオキシフォルスコリン（ＤＤＦ）
タモキシフェン
ベラパミット
キニーネ
バリウム（Ｂａ２＋）
ジフェニルアミン−２−カルボキシレート（ＤＰＣ）
アントラセン−９−カルボン酸
インドクリノン（ＭＫ−１９６）
ピモジド
および水晶体上皮細胞のイオンチャネルを活性化または阻害することができる他の薬剤。
【００３９】
本発明の薬剤を用いて、薬剤の濃度は、処理溶液の適用により、ＬＥＣ細胞生存率が好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、より好ましくは０％に近づくように選択される。ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣのような他の眼球細胞についての所望の細胞生存率は、好ましくは約７０％超、より好ましくは約９０％、より好ましくは１００％に近いものである。
【００４０】
これらの環境下において、上記試薬を、場合によっては他の薬剤と組み合わせて含む処理溶液は、選択的に、ＬＥＣの剥離および／または死を誘発し、他の眼球細胞よりも、ＬＥＣの剥離および／または死の発生率を実質的に高める。実施例に示すように、細胞の剥離および／または死は、ある領域を濯ぎ、洗浄しまたは、剥離および／または死んだＬＥＣが除去され得るように攪拌した後またはその前にこの細胞領域を観察することにより確認することができる。
【００４１】
先に記載した本発明の薬剤（以下、主薬剤と呼ぶ）は、単独でまたは以下に記載の更なる薬剤または他の薬剤および／または化学物質と組み合わせて、選択的に、ＬＥＣの剥離および／または死を直接または間接的に誘発する。例えば、本発明の眼球処理溶液および方法は、主薬剤に加えて浸透圧ストレス剤を含むことができ、この溶液は、角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも、水晶体上皮細胞の細胞剥離および／または死の発生率を実質的に高めて、後嚢混濁を防止する。
【００４２】
浸透圧ストレス剤は、ＬＥＣにおいて浸透圧ショックを誘発することができる薬剤である。ＬＥＣにおける浸透圧ショックは、正常の細胞内または細胞外イオン平衡を変化させる任意の細胞条件により引き起こすことができる。例えば、浸透活性溶質の細胞外濃度の変化および、細胞体積制御に含まれる特定のイオン輸送系の活性に影響を与える種々の刺激（例えば、ホルモン、成長因子および他の外部刺激、細胞膜電位、および細胞質セカンドメッセンジャー）は、浸透圧ショックを引き起こし得る。大きな細胞通過イオン流出は、細胞体積ホメオスタシスにショックを与える。低浸透圧ストレスは、低張溶液または低浸透圧の溶液に細胞を曝すことにより引き起こすことができる。逆に、高浸透圧ストレスは、高張溶液または高浸透圧の溶液に細胞を曝すことにより引き起こすことができる。浸透活性イオンおよび有機溶質の細胞内濃度の増加または減少は、細胞体積調節にショックを与え、ＲＶＤおよびＲＶＩ反応に含まれる膜輸送プロセスを活性化することもできる。
【００４３】
浸透圧ストレス剤の適用または導入は、主薬剤がＬＥＣを浸透圧ショックに感受性とする（例えば、イオン輸送機構の阻害により）場合に、および浸透圧ストレス剤自体が細胞剥離および／または死を誘発する場合に適している。例えば、イオン輸送機構干渉剤がナトリウム−カリウムポンプのような必須のイオン輸送機構を阻害する場合、ＬＥＣは、それ自体を、外部浸透圧ストレスまたはショックに対して防御することはできず、その結果、更なる浸透圧ストレス剤により引き起こされる細胞外浸透圧へのその感受性が高められる。浸透圧ストレスまたはショックにＬＥＣが反応できないことが、死シグナル伝達プロセスの活性化により細胞死を惹起する。
【００４４】
しかしながら、主薬剤は浸透圧ストレス剤でもあり、そのために、主薬剤が、選択的に、ＬＥＣのイオン輸送機構を干渉すると共に浸透圧ショックを引き起こすと解される。
【００４５】
より詳細には、浸透圧ストレス剤は、高浸透度または低浸透度を有する。低浸透溶液は、生理学的条件において通常見られるよりも低い溶質濃度を有し、高浸透溶液は、生理学的条件において通常見られるよりも高い溶質濃度を有する。換言すると、浸透圧ストレス剤は細胞外高浸透度または低浸透度を作り出す。
【００４６】
任意の生理学的に許容できる電解質およびオスモライト、浸透圧強度に貢献する任意の溶質は、浸透圧ストレスまたはショックの誘発に適している。オスモライトの例には、以下のものがある：
塩（ＮａＣｌなど）；
アミノ酸（タウリン、グリシンおよびアラニンなど）
糖（マンニトール、ミオイノシトール、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、ベタイン類、尿素、スクロースおよびグルコースなど）；
および任意の他の有機または無機のオスモライト。
【００４７】
オスモライトは、先に記載したように塩化ナトリウムであり得るが、塩化物はヨウ化物、臭化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、フッ化物、硫酸塩、イセチオン酸塩、グルコン酸塩および任意の他の許容できる代用物で置換することができ、同様に、ナトリウムはカリウム、セシウム、ルビジウム、リチウム、フランシウムおよび任意の他の許容できる代用物で置換することができることが分かる。
【００４８】
浸透圧ストレス剤および主薬剤は、ＰＣＯの治療において、別々に、同時にまたは順次適用することができる。
【００４９】
処理溶液は、好ましくは、用いられる薬剤および濃度に依存して、ｐＨが約５〜１１である。好ましい実施形態において、約±２００ｍＭのＮａＣｌを含む処理溶液はｐＨが好ましくは約８〜１０の範囲である。処理溶液のｐＨは、主薬剤または浸透圧ストレス剤の濃度を変化させることにより、またはｐＨを変化させる更なる化学的薬剤を導入することにより調節することができる。ｐＨは、任意の酸または塩基あるいは、水素イオン濃度を増加または低下させる任意の薬剤により調節することができる。
【００５０】
処理は、ある範囲の濃度の主薬剤、浸透圧ストレス剤および、ｐＨを調節する薬剤を用いると作用する。本発明によれば、適当な薬剤濃度は、広範囲の細胞の細胞機構を干渉することができる薬剤が、ＬＥＣのイオン交換機構を選択的に干渉して、ＬＥＣの剥離および／または死を引き起こすように選択される。処理溶液を適用すると、高い割合のＬＥＣが剥離および／または死滅される一方、低い割合の他の眼球細胞が損なわれる。濃度範囲の一端において、処理溶液の効率は低下し、ＬＥＣ細胞の死により長い時間がかかる。濃度範囲の他の端部において、薬剤は眼の中の他の細胞を損傷させる傾向がある。主薬剤、浸透圧ストレス剤および、ｐＨを調節する薬剤の適当な濃度は、ＬＥＣの選択的細胞死および／または剥離によりＰＣＯが防止され、他の眼球細胞および眼球組織への著しい損傷は引き起こさないように選択すべきである。好ましくは、単独または複数の薬剤の濃度は、適用時に、ＬＥＣについての細胞生存率が、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは０％に近づき、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣのような他の眼球細胞の細胞生存率が約７０％超、好ましくは約９０％、より好ましくは１００％に近づくように選択すべきである。
【００５１】
先に記載した薬剤および導入する濃度は、相互関係にある。例えば、高ｐＨ処理溶液は、浸透度が低水準であるＬＥＣを殺す。特定の薬剤の適当な濃度の例を、以下の実施例に示す。更に、濃度は、広く行われている白内障手術技術の特定の要望および患者の要求に適するように調節することができる。
【００５２】
本発明の処理溶液は、白内障手術の前、中または後に投与してＰＣＯを防止することができる。水晶体嚢の前部を開き、白内障を取り出す。次に、眼内水晶体を、嚢の後部に挿入することができる。あるいは、水晶体核部を注射可能な眼内水晶体で置換することができる。残留ＬＥＣを、真空または他の手術技術を用いて除去してもしなくてもよい。水晶体乳化、レーザーまたは他の技術を用いて、水晶体内容物を除去することができる。単独または複数の処理溶液を、このプロセスの前、中または後の任意の時間に局所的に適用または導入することができる。次に、眼球領域を洗浄して残留細胞を除去することができる。
【００５３】
先に記載したように、処理溶液は主薬剤、浸透圧ストレス剤、および溶液のｐＨの調節に用いられる任意の化学薬剤を含むことができる。あるいは、主薬剤、浸透圧ストレス剤、および／またはｐＨの調節のための任意の化学薬剤を含む別々の溶液を順次または同時に適用または導入してＰＣＯを防止することができる。先に記載したように、主薬剤は、浸透圧ストレス剤であっても良い。単独または複数の溶液を、注射器、ドロッパー、水晶体乳化に用いられるプローブ、または任意の他の適当なまたは従来の適用手段により適用することができる。
【００５４】
本発明の更なる利点は、処理溶液が、水晶体上皮細胞の比較的迅速な剥離および／または死を誘発して、それにより、本発明の処理溶液が白内障手術中に容易に導入されるということである。水晶体上皮細胞の剥離は、本発明の溶液または薬剤の適用後約３０分以内に起こり、数時間以内に細胞死が生じる。好ましくは、剥離は、適用後約１５分以内に起こるが、選択される薬剤および濃度に依存する。
【００５５】
本発明の処理溶液および方法が、他の眼球細胞よりも、ＬＥＣの細胞剥離および／または死の発生率を実質的に高めたか、すなわち、このような処理が選択的であるかを、処理後の細胞生存率を比較することによりまたは効果を決める他の許容できる方法により決めることができる。より詳細には、この処理溶液および方法は、先に記載したように他の眼球細胞の生理学的損傷は最小限にしか引き起こさないでＰＣＯを防止すべきである。好ましくは、単独または複数の薬剤の濃度は、適用時に、ＬＥＣについての細胞生存率が約１０％未満でありＲＰＥＣおよびＣＥＤＣのような他の眼球細胞についての細胞生存率が約７０％超であるように選択すべきである。単独または複数の処理溶液が、更なる薬剤、化学物質、蛋白、および／または物質を含んでもよく、２以上の主薬剤または浸透圧ストレス剤を含んでもよいことが理解される。更なる化学的成分または生物学的成分を添加して、単独または複数の処理溶液の特性、例えば、生理学的許容性、粘度および貯蔵性能を向上させることができる。
【００５６】
処理溶液をキットまたは他のパッケージに包装することができ、あるいは単一溶液もしくは、先に記載したように後で適用するための別々の溶液として貯蔵することができる。例えば、キットまたはパッケージには、浸透圧ストレス剤を含む溶液とは別に包装されたイオン輸送機構干渉剤を含有する溶液がある。更に、処理溶液は、水晶体乳化中に用いられる液体を含むキットまたはパッケージ中、または、注射可能な眼内水晶体の注入前に水晶体内容物を除去するために用いられるキット中に包装することができる。
実施例
【００５７】
（比較例１）
以下に記載のように、９６ウエル平底プレート中で成長させたＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣのコンフルエント単層を、種々の濃度のＮａＣｌ（オスモライト）溶液に曝す。ＮａＣｌ溶液（以下に記載のように調製）２００μｌを、各ウエルに、それぞれ１３７ｍＭ、１７０ｍＭ、３４０ｍＭ、６８０ｍＭ、１３６０ｍＭおよび２０００ｍＭ  ＮａＣｌの濃度で添加する。溶液はｐＨが８．０±０．４である。ＮａＣｌの濃度は、それぞれ約２８５〜４０００ｍＯｓｍ／Ｌの最終浸透度に相当する。高張ＮａＣｌの添加後約５〜１０分以内に、ＬＥＣの一部が収縮、丸まり、および単層からの接着性損失を用量依存的に奏し始めた。この効果は、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣでは顕著には見られない。
【００５８】
高浸透圧ＮａＣｌの増加に応じたＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣの細胞生存率を図１に示す（ＬＥＣを明灰色ダイアモンドで、ＲＰＥＣを暗灰色四角で、ＣＥＤＣを黒色ダイアモンドで示す）。各点は、２つの実験の平均を示す。約１３８０ｍＭ  ＮａＣｌの高張ストレスにおいて、ＬＥＣの約４０％が生き残り、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣの８０％超が生き残り、これらの細胞間の異なる浸透許容度を証明している。
【００５９】
ヒト水晶体上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞およびヒト網膜色素上皮細胞の一次および第一継代を培養する。ＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、細胞単離および酵素消化の標準的技術を用いて死後眼球から単離する。Ｕｅｂｅｒｓａｘ  ＥＤ，Ｇｒｉｎｄｓｔａｆｆ  ＲＤおよびＤｅｆｏｅ  ＤＭ著、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２０００年３月；７０（３）巻：３８１〜９０頁；Ｗａｇｎｅｒ  ＬＭ、Ｓａｌｅｈ  ＳＭ、Ｂｏｙｌｅ  ＤＪおよびＴａｋｅｍｏｔｏ  ＤＪ著、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．２００２年３月１４日；８巻；５９〜６６頁；Ｃａｍｍａｒａｔａ  ＰＲ、Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｇ、Ｃｈｅｎ  ＳＷ、Ｇｕｏ  ＺおよびＲｅｅｖｅｓ  ＲＥ著、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００２年２月；４３（２）巻：４２５〜３３頁；Ｒａｋｉｃ  ＪＭ、Ｇａｌａｎｄ  ＡおよびＶｒｅｎｓｅｎ  ＧＦ著、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２０００年１１月；７１（５）巻：４８９〜９４頁を参照されたい。ＬＥＣおよびＣＥＤＣを、イーグル基礎培地（ＭＥＭ）中で培養する。ＲＰＥＣを、２ｍＭグルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が加えられたハムＦ１０倍地中で培養する。初代培養ＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、９０〜１００％コンフルエンスに達するまで９６ウエル平底プレート中にて１０４細胞／ウエルの濃度で継代培養する。５％ＣＯ２の加湿雰囲気、３７℃のインキュベーター内で、これらの細胞をコフルエンスになるまで成長させる。アッセイ前の一晩、細胞をコンフルエントの状態に維持する。
【００６０】
ＮａＣｌの高浸透圧溶液を、まず、ｄＨ２Ｏ  ５００ｍｌにＮａＣｌ５８．４４ｇを添加することにより２Ｍ  ＮａＣｌ貯蔵溶液を作って調製する（ＮａＣｌは英国ドーセット在Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏから供給）。次に、２Ｍ貯蔵溶液を、蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で希釈することにより所望の濃度の浸透圧ＮａＣｌ溶液を調製する。例えば、１７０ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧溶液を作るには、２Ｍ  ＮａＣｌ貯蔵溶液を１対１０．１の比でｄＨ２Ｏにより希釈する；３４０ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧溶液を作るには、２Ｍ  ＮａＣｌ貯蔵溶液を１対４．５６の比でｄＨ２Ｏにより希釈する。最終的浸透度（ｍＯｓｍ／ｋｇ／Ｈ２Ｏ）を、凝固点降下浸透圧測定器を用いる凝固点降下法により決める。
【００６１】
処理後、処理細胞を充分洗浄し、新しい媒体と１２時間培養してから、細胞生存率を調べる。指示された高張ストレス水準でのこれらの細胞が生存する可能性を、曝露後１２〜２４時間でＭＴＴアッセイにより調べる。
【００６２】
ＭＴＴアッセイは、Ｍｏｓｍａｎｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．著、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８３年１２月１６日；６５（１−２）巻：５５〜６３頁）に記載のように行われるミトコンドリア機能を調べるためのアッセイである。テトラゾリウム塩３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から提供）をリン酸平衡塩（ＰＢＳ）溶液に５ｍｇ／ｍｌの割合で溶解し、０．２２μｍミリポアフィルターを通して滅菌する。ＭＴＴ貯蔵溶液を成長培地に１対１０の比で添加する。細胞をこの成長培地と共に、３〜４時間インキュベートする。ＭＴＴ添加時に生きている細胞において、ミトコンドリアの脱水素酵素が、テトラゾリウム環を暗青色ホルマザン反応生成物へと分解し、これが細胞内に蓄積する。更に処理することなく、ＭＴＴ反応培地を明視野顕微鏡観察により観察する。各ウエル中の細胞は、反応生成物で完全に満たされている（非付着細胞の場合）場合、または複数の増殖巣から生じる多くのホルマザン結晶を含む（付着または拡散細胞の場合）場合は、ＭＴＴ陽性と記録される。次に、ＭＴＴ反応培地を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、マイクロプレートリーダーで読み取り、細胞生存率を測定する。ウエル当たりの生きている細胞（ＭＴＴ陽性）の数を、特定濃度において決め、全細胞に対する百分率として表す（図１に表す）。
【００６３】
（実施例２）
実験前にＦＣＳを除去するために、ＬＥＣのコンフルエント単層をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗う。ＬＥＣを、実施例１と同じ９６ウエル培養プレート中で調製する。これらの細胞を、３０μＭフルセミド（共輸送干渉剤、イオン輸送機構干渉剤）の存在下および非存在下に、増加濃度（約１３５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約６８０ｍＭ、約１３６０ｍＭおよび約２０００ｍＭ）のＮａＣｌ（オスモライト）を含む処理溶液２００μｌ／ウエルに、約５〜１０分間曝す。処理溶液はｐＨ８．０±０．４である。処理後、処理された細胞を充分に洗い、新しい媒体を用いて培養する。処理ＬＥＣの生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でＭＴＴアッセイにより決めた。
【００６４】
この処理後、フルセミドの存在下では、比較例１で観察されたものと同じ細胞収縮および剥離の現象が生じたが、変化はより劇的である。図２は、フルセミドの非存在下では（ダイアモンドで示す）、１３８０ｍＭ  ＮａＣｌでの迅速高張ショック後にＬＥＣの約４０％が生き残っていることを示す。しかしながら、フルセミドを用いる共輸送機構の阻害後には（円で示す）、ＬＥＣの浸透圧許容性が劇的に低下し、３４０ｍＭ  ＮａＣｌでの迅速高張ショック後に殆ど細胞が生き残っていない。この結果は、ＬＥＣの生存能が、フルセミドの非存在下における２０００ｍＭ  ＮａＣｌでの高張ショックから、フルセミドの存在下における１７０ｍＭ  ＮａＣｌでの高張ショックへとシフトしていることを示す。
【００６５】
各点は、３つの実験の平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ）を表す。３０．３ｍＭフルセミドの貯蔵溶液を、まず、フルセミド２０ｍｇをＤＭＳＯ１００μｌに溶解して溶解を確認し、次に、所望の濃度の高浸透圧ＮａＣｌの１．９ｍｌに加えることにより調製する。３０μＭフルセミドを得るために、次に、フルセミド貯蔵溶液５μＬを、所望の濃度のＮａＣｌ溶液（比較例１に記載のように調製）５ｍｌに添加する。
【００６６】
（比較例３）
この実施例は、ＬＥＣ浸透圧生存率へのｐＨの効果を示す。比較例１に記載のようにＬＥＣのコンフルエント単層を調製する。細胞の対照群を、ｐＨ７．４±０．３において、生理学的１３５ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液に曝す。異なる群の細胞を、種々のｐＨ（８．０±０．４、８．４±０．５、８．９±０．８、および１０．６±０．５）において増加濃度の（〜１７０ｍＭおよび〜３４０ｍＭ）ＮａＣｌを含む溶液２００μｌ／ウエルに１０分間曝す。
【００６７】
０、１、３または５μｌの５Ｎ  ＮａＯＨ貯蔵溶液を、選択された高浸透圧ＮａＣｌ溶液（実施例に記載のように調製）１０ｍｌに直接添加することにより、溶液のｐＨを調節する。対応する最終的ｐＨを、専門ｐＨメーターを用いて決めた。ＮａＯＨを添加していないＮａＣｌ溶液１０ｍｌの最終的ｐＨは、約８．０±０．４のｐＨ読取値を示した。５Ｎ  ＮａＯＨ１μｌを添加したＮａＣｌ溶液１０ｍｌの最終的ｐＨは、約８．４±０．５のｐＨ読取値を示した。５Ｎ  ＮａＯＨ３μｌを添加したＮａＣｌ溶液１０ｍｌの最終的ｐＨは、約８．９±０．８のｐＨ読取値を示した。５Ｎ  ＮａＯＨ５μｌを添加したＮａＣｌ溶液１０ｍｌの最終的ｐＨは、約１０．６±０．５のｐＨ読取値を示した。
【００６８】
処理細胞の細胞生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でのＭＴＴアッセイにより決める。溶液適用後のＬＥＣの細胞生存率を図３に示す。示されるように、灰色棒は、ＬＥＣを生理学的１３５ｍＭ  ＮａＣｌに曝した対照群を表す。黒色および白色棒は、ｐＨを上げつつ、それぞれ１７０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３４０ｍＭ  ＮａＣｌに曝したＬＥＣを表す。示されるように、高張ストレスへのＬＥＣ感受性は、ｐＨの上昇およびＮａＣｌ濃度の上昇と共に増加する。約１０．６±０．５のｐＨにおいて、ＬＥＣの約７５％以上が５分以内に破壊され死んだ。約８．９±０．８のｐＨにおいて、ＬＥＣがその基質から効率的に剥離するが、著しく破壊することはない。
【００６９】
（比較例４）
この実施例は、ＲＰＥＣ浸透圧生存率への細胞外ｐＨの効果を示す。実施例１に記載のようにＲＰＥＣのコンフルエント単層を調製する。これらの細胞を、変化するｐＨ（８．４±０．５および１０．６±０．５）において増加濃度（１３７ｍＭ、１７０ｍＭ、３４０ｍＭ、６８０ｍＭ、１３６０ｍＭおよび２０００ｍＭ）のＮａＣｌを含む溶液２００μｌ／ウエルに１０分間曝す。ＮａＣｌの溶液を実施例１に記載のように調製する。溶液のｐＨを、実施例３に記載のように５Ｎ  ＮａＯＨを１μｌおよび５μｌ添加することにより調節する。
【００７０】
処理細胞の生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でのＭＴＴアッセイにより決めた。溶液適用後のＲＰＥＣの細胞生存率を図４に示す（ダイアモンドはｐＨ８．４±０．５を示し、丸はｐＨ１０．６±０．５を示す）。各点は３つの実験の平均±標準偏差を表す。示されるように、ｐＨレベルを上げた場合、高張ＮａＣｌに曝したＲＰＥＣの生存率水準が劇的に減少する。
【００７１】
（実施例５）
ＬＥＣおよびＲＰＥＣのコンフルエント単層を実施例１に記載のように調製する。これらの細胞を、（ｉ）２００ｍＭ以下の高浸透圧ＮａＣｌ；（ｉｉ）増加濃度（１０μＭ、３０μＭ、６０μＭ、９０μＭおよび１２０μＭ）の共輸送干渉剤フルセミドおよび（ｉｉｉ）３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液２００μｌ／ウエルに約１０分間曝す。
【００７２】
フルセミドを含む処理溶液を、実施例２に記載のように、フルセミドの貯蔵溶液を２００ｍＭ以下の高浸透圧ＮａＣｌ溶液（実施例１のように調製）で希釈することにより調製する。例えば、６０μＭのフルセミドを加えた高浸透圧ＮａＣｌ溶液を得るために、フルセミド貯蔵溶液１０μＬを、高浸透圧ＮａＣｌ溶液５ｍＬに添加する。溶液のｐＨを、３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨで調節する。
【００７３】
処理細胞の生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でのＭＴＴアッセイにより決める。ＬＥＣ（丸）およびＲＰＥＣ（ダイアモンド）の細胞生存率を図５に示す。各点は、ＨＬＥＣについて６つの実験のおよびＨＲＰＥＣについて４つの実験の平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。示されるように、１０μＭフルセミドにおいては、ＬＥＣの５０％超が収縮し、失われまたは死ぬ。３０μＭと１２０μＭとの間のフルセミドにおいて、ＬＥＣの９０％超が除去または殺される。一方、３０μＭと９０μＭとの間のフルセミドにおいて、ＲＰＥＣは殆ど除去または殺されない。したがって、例えば、このｐＨにおける高浸透圧ＮａＣｌ溶液約２００ｍＭ中では、約１５μＭ〜約１００μＭがＲＰＥＣに著しい損傷が生じない効果的濃度である。
【００７４】
（実施例６）
ＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣのコンフルエント単層を実施例１に記載のように調製する。これらの細胞を、（ｉ）２００ｍＭ以下の高浸透圧ＮａＣｌ；（ｉｉ）増加濃度（１４μＭ、２８μＭ、５６μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭ）の共輸送干渉剤ブメタニドおよび（ｉｉｉ）３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液２００μｌ／ウエルに約１０分間曝す。
【００７５】
ブメタニドを含有する処理溶液を以下のように調製する。１．４Ｍブメタニドの貯蔵溶液を調製する。次に、１．４Ｍブメタニド溶液１μｌを高浸透圧ＮａＣｌ溶液（実施例１のように調製）１ｍＬで希釈することにより１４ｍＭブメタニドの第２の貯蔵溶液を作る。１４ｍＭブメタニド貯蔵溶液をＮａＣｌ溶液で希釈して、それぞれ、約０μＭ（対照）、１４μＭ、２８μＭ、５６μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭのブメタニドの最終的所望濃度を得る。溶液のｐＨを、３μＬの５Ｎ  ＮａＯＨを用いて調節する。
【００７６】
処理細胞の生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でのＭＴＴアッセイにより決める。図６は、ＬＥＣ（丸）、ＲＰＥＣ（ダイアモンド）およびＣＥＤＣ（四角）の細胞生存率を示す。各点は、ＬＥＣについて６つの実験のおよびＲＰＥＣおよびＣＥＤＣについてそれぞれ３つの実験の平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。示されるように、２８μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭのブメタニドにおいて、位相差顕微鏡観察でＬＥＣの殆ど全てが収縮、剥離および／または死に、洗浄後に殆ど細胞が残っていない。殆ど１００％の細胞が、ＭＴＴ陰性反応を示す。一方、これら同じ濃度において、約２０％未満のＲＰＥＣおよび３０％未満のＣＥＤＣが殺されるまたは除去される。したがって、２８μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭのブメタニドが、これらの特定の処理溶液について適した処理濃度である。
【００７７】
（実施例７）
ＬＥＣのコンフルエント単層を実施例１に記載のように調製し、９６ウエル平底培養プレートの代わりにカバーガラス上で成長させる。次に、ＬＥＣを充分に洗って血清を除去する。
【００７８】
２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、９０μＭのフルセミドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含有する処理溶液１０ｍＬを、深い３５ｍｍペトリ皿内で調製する。
【００７９】
次に、カバーガラスを、処理溶液を含むペトリ皿に移し、処理溶液中に５〜１０分間維持する。次に、処理溶液を注ぎ出し、カバーガラスを剥離ＬＥＣと一緒に、吸引／灌水プローブを用いて僅かに圧力をかけて、新しいＨＢＳＳ溶液で濯いだ。位相差倒立顕微鏡を用いて迅速に検査し写真撮影した後、ＬＥＣを新しい媒体と一緒に７日間培養して、残留細胞が生き残るか調べる。
【００８０】
図７は、位相差倒立顕微鏡を用いて得たＬＥＣの画像、および処理中の浸透圧反応を示す。図７Ａは、０分における、全領域を覆うコンフルエントＬＥＣを示す。図７Ｂは、処理後５分における、堆積し基質から分離したＬＥＣを示す。図７Ｃは、処理後１０分および洗浄後における、細胞が洗浄除去された後の実質的に透明な基質を示す。
【００８１】
（実施例８）
インビボ内に近い環境における処理の効果を調べるために、水晶体器官培養ＰＣＯモデルを用いる（モデルは、当初、Ｌｉｕらにより開発された（Ｌｉｕ  ＣＳ、Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ  ＩＭ、Ｄｕｎｃａｎ  Ｇ，Ｍａｒｃａｎｔｏｎｉｏ  ＪＭ、Ｗｅｂｂ  ＳＦ、Ｄａｖｉｅｓ  ＰＤ著、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９６年４月；３７（５）巻：９０６〜１４頁））。ヒト水晶体を、ドナー（１９〜８９歳）の眼から単離し、テイラーメードのステンレス鋼スタンド上に貼り付ける。操作している顕微鏡下に、直径が約６ｍｍの水晶体嚢１００の前部を、連続的曲線状水晶体嚢開放器を用いて注意深く開く。次に、水晶体核部をＨＢＳＳで水素発現（ｈｙｄｒｏｅｘｐｒｅｓｓ）し、残りの水晶体線維を注意深く除去する。後嚢２００および赤道嚢３００を膜（袋）として無傷で残し、プラスチック培養皿（深さ３５ｍｍのペトリ皿）に貯蔵し、１０％〜１５％ＦＣＳを加えたイーグル基礎培地（ＭＥＭ）で覆う。次に、器官培養モデルにおけるヒトＬＥＣを、４〜５日放置して手術損傷から回復させる。
【００８２】
器官培養ＰＣＯモデル２群を達成した。対照として１０個の水晶体からなる第１の群を達成し、処理することなく器官培地中に保持する。これらの水晶体の全てが、４〜７日後に、前嚢１００および後嚢２００上にコンフルエント単層または多層増殖ＬＥＣを現した。
【００８３】
培養の４〜５日後、２０個の水晶体からなる第２の群も、増殖ＬＥＣの単層を有していた。この群を充分に洗浄して血清を除去してから、処理溶液を導入した。深い３５ｍｍペトリ皿内で、（ｉ）２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭのフルセミドまたは約２８μＭのブメタニドもしくは約１１２μＭのブメタニド、および（ｉｉｉ）３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液１０ｍＬを調製する。溶液を、他の実施例におけるように調整する。次に、器官培養物を、処理溶液を含むペトリ皿に移し、その処理溶液中に５〜１０分間維持する。次に、器官培養物を、ピンセットを用いて別のペトリ皿に移す。次に、嚢をＰＣＯ器官培地中の剥離ＬＥＣと一緒に、吸引／灌水プローブを用いて僅かな圧力をかけて新しいＨＢＳＳ溶液で濯いだ。直ちに検査した後、器官培養物を、新しい培地と一緒に７日間培養して、残留細胞が生き残るか試験する。
【００８４】
この処理の、ＰＣＯ器官培地モデル中のＬＥＣへの効果を、位相差倒立顕微鏡を用いて調べる。これらを、処理後０分、５分、１０分および１２時間に、Ｔ−Ｍａｘ４００フィルム（コダック製）で写真撮影する。図８に示すように、処理の５〜１０分以内に、ＬＥＣの全てが堆積し、単層および水晶体嚢から剥がれる。位相差顕微鏡写真８Ａは、切除から６〜７日後および処理前における前嚢１００および後嚢２００についての擬ＥＣＣＥ操作後の増殖ＬＥＣを低倍率（視野は１ｍｍ×０．７５ｍｍ）で示す。位相差顕微鏡写真８Ｂは、処理５分後に堆積および水晶体嚢からの剥離を開始したＬＥＣを高倍率（視野は３．４ｍｍ×１．５ｍｍ）で示す。位相差顕微鏡写真８Ｃは、処理後１０分で単層から剥離した処理細胞の大部分を高倍率で示す。位相差顕微鏡写真８Ｄは、洗浄後、処理１０分後には水晶体嚢がＬＥＣを欠くことを低倍率で示す。
【００８５】
（実施例９）
この実施例において、初代ＲＰＥＣへの処理の効果を調べる。他の眼球細胞への副作用を有するか否かを調べるために、初代培養ＲＰＥＣを、６ウエル平底培養プレートにおいて、２ｍＭグルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が加えられたハムＦ１０倍地中で９０〜１００％コンフルエンスに至るまで培養した。培養物を、５％ＣＯ２および３７℃の加湿雰囲気のインキュベーターに維持し、アッセイ前にコンフルエント状態に一晩保持した。
【００８６】
ＲＰＥＣ培地を充分に洗って血清を除去してから、処理溶液を導入した。先の実施例に記載のように深い３５ｍｍペトリ皿内で、（ｉ）２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭのフルセミドまたは約２８μＭのブメタニドもしくは約１１２μＭのブメタニド、および（ｉｉｉ）６μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液２０ｍＬを調製する。次に、処理溶液５ｍｌを、６ウエル培養プレートにおける３つのウエルの各ウエルにおいてコンフルエントＲＰＥＣに加える。約１０分後、溶液を完全に除去し、処理されたＲＰＥＣを、吸引／灌水プローブを用いて僅かな圧力をかけて新しいＨＢＳＳ溶液で充分に濯いだ。直ちに検査した後、ＲＰＥＣ初代培養物を、新しい培地と一緒に７日間培養して、残留細胞が生き残るか試験する。
【００８７】
この処理の初代ＲＰＥＣへの効果を、位相差倒立顕微鏡を用いて調べる。これらを、処理後０分、５分、１０分および１２時間に、Ｔ−Ｍａｘ４００フィルム（コダック製）で写真撮影する。ＲＰＥＣは、処理溶液への１０分間の曝露によりあまり影響を受けない。図９は、これらの細胞についての、処理の効果の例を示す。図９Ａは、０分におけるＲＰＥＣを示す。図９Ｂは、処理５分後のＲＰＥＣを示す。図９Ｃは、処理１０分後のＲＰＥＣを示す。図８Ｄは、処理に続いて細胞を洗浄した後のＲＰＥＣを示す。
【００８８】
（実施例１０）
この処理が他の眼球細胞への副作用を有するか否かを調べるために、ＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣのコンフルエント単層を実施例１に記載のように調製する。これらの細胞を、２００ｍＭ以上のＮａＣｌ、９０μＭのフルセミドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液２００μｌ／ウエルに約１０分間曝した。
【００８９】
処理細胞の生存率を、実施例１に記載のように処理後１２〜２４時間でのＭＴＴアッセイにより決める。処理に対するＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの細胞生存反応を図１０に示す。各点は、４つの実験の平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。示されるように、処理１０分後に、処理溶液は、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣよりも、細胞生存率により測定されるＬＥＣの細胞剥離および／または死の発生率を実質的に高めた。具体的には、処理後、ＣＥＤＣの７０％超およびＲＰＥＣの８０％が生き残った。これは、ＬＥＣについての１０％未満の生存率と比較される。
【００９０】
（実施例１１）
器官培養角膜ボタンへの処理の効果を調べて、処理が、インビボ内に近い環境において周囲眼球組織に損傷を起こすかどうか決める。感受性および処理への直接曝露の危険性から、角膜を選択する。角膜器官培養物をＨＢＳＳで洗い、テイラーメードのステンレス鋼スタンド上で内皮細胞側が上になるよう配する。次に、これらを、上皮の乾燥を防止するための加湿チャンバーを提供する培養皿の底部のみを覆うＭＥＭ成長培地を含む滅菌培養皿中に貯蔵する。次に、内皮角膜陥凹部を、１０％および１５％ＦＣＳを加えたＭＥＭ成長培地で満たし、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養する。
【００９１】
器官培養物を、対照および処理群に分割する。培養物を、まず、ＨＢＳＳで３回荒い、次に、その内皮細胞表面を、生理学的ＮａＣｌ（１３７ｍＭ、２９３±９ｍＯｓｍ／Ｌ）または処理溶液に１０分間曝す。
【００９２】
処理群については、深い３５ｍｍペトリ皿内で、（ｉ）２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭのフルセミドまたは約１１２μＭのブメタニド、および（ｉｉｉ）３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液１０ｍＬを調製する。器官培養物を、処理溶液を含むペトリ皿に移し、処理溶液中に１０分間以上保つ。次に、器官培養物を、ピンセットを用いて、新しいＨＢＳＳを含む別のペトリ皿に移す。次に、角膜器官培養物を、吸引／灌水プローブを用いて僅かな圧力をかけて新しいＨＢＳＳ溶液で充分に濯ぐ。処理後、角膜器官培養物を新しい培地中で６時間インキュベートする。
【００９３】
対照群については、先に記載した処理溶液の代わりに、新しいＨＢＳＳを角膜器官培地に１０分間適用した。
【００９４】
角膜内皮細胞への処理の毒性を調べるために、角膜器官培養ボタンを、位相差倒立顕微鏡および蛍光共焦点顕微鏡の両方で調べる。共焦点顕微鏡では、角膜内皮細胞のアクチン線維の形態を調べて、細胞の無傷の構造を証明する。これらの角膜器官培養物の内皮細胞を、処理の前および後に固定し、ＦＩＴＣ結合ファロイジンで染める。角膜内皮細胞の共焦点レーザースキャン画像は、未処理群（対照）と処理群との間に著しい相違を示さない。処理群の内皮細胞シートは、未処理群と同じ完全性を維持している。角膜内皮細胞は均一分布単層のままであり、細胞は、対照並びに処理器官培地において六角形外観を維持している。角膜内皮細胞に明らかな損傷はない。
【００９５】
上記技術を考慮して本発明の多くの修飾および変更が可能である。例えば、先に詳細に説明したものと異なるイオン輸送機構干渉剤を用いることができ、例えば、以下の適当な化合物が挙げられる：バリノマイシン、臭素、テオフィリンおよび他のアルキルキサンチン、イコサノイド、ホルボールエステル（例えば、ＴＰＡ）、カリウム保持性利尿剤（例えば、トリアムテレン、スピロノラクトン、およびカンレノ酸カリウム）、カリクリンＡ、オカダ酸（ＯＡ）、プロパノロールおよびその類似体、アンギオテンシンＩＩ、ケトコナゾール（ＣＤＣ）、アラキドン酸、ランタン、トリフルオペラジン、イドキシフェン、２−アミノイソ酪酸、１７β−エストラジオール、ブラジキニン、ホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、アデノシン３’，５’−環状モノホスフェート（ｃＡＭＰ）、グアノシン３’，５’−環状モノホスフェート（ｃＧＭＰ）、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ（Ｓ／Ｔ−Ｐｐａｓｅ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＲＣファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）、多不飽和脂肪酸、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスファターゼ（ＰＰ）、Ｇ−タンパク質、ルビジウム、銅（Ｃｕ２＋）、硝酸イオン（ＮＯ３−）、バリウム（Ｂａ２＋）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、カリウム（Ｋ＋）、細胞内マグネシウムおよび水素濃度を変化させる薬剤、および細胞外ナトリウム、塩化物またはカリウム濃度を減少させる薬剤。他のイオン輸送機構干渉剤も存在すると解すべきである。すなわち、添付の特許請求の範囲の範囲においては、本発明は先に記載した内容以外の実施が可能であることを理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、種々の濃度のＮａＣｌを含む溶液を導入した後の、様々な眼球細胞（ＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣ）の細胞生存率を示す図である。
【図２】図２は、共輸送干渉剤である、３０μＭのフルセミドの非存在下（ダイアモンド）および存在下（丸）において、増加した濃度のＮａＣｌを適用した後のＬＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図３】図３は、種々のｐＨレベルで増加した濃度のＮａＣｌを含む溶液を適用した後の合計ＬＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図４】図４は、種々のｐＨレベルで増加した濃度のＮａＣｌを含む溶液を適用した後のＰＲＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図５】図５は、２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、増加した濃度の共輸送干渉剤であるフルセミドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液を適用した後のＬＥＣおよびＲＰＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図６】図６は、２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、増加した濃度の共輸送干渉剤であるブメタニドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液を適用した後のＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの細胞生存率を示す図である。
【図７】図７は、洗浄の（Ａ）０分後、（Ｂ）５分後および（Ｃ）１０分後における、本発明の処理溶液を用いた、初代培養ＬＥＣへの処理の効果を示す３枚の写真である。
【図８】図８は、（Ａ）処理前、（Ｂ）処理の５分後、（Ｃ）処理の１０分後および（Ｄ）洗浄後における、本発明の処理溶液を用いた、ヒト器官培養ＰＣＯモデル中での初代ＬＥＣへの処理の効果を示す４枚の写真である。
【図９】図９は、処理の（Ａ）０分後、（Ｂ）５分後および（Ｃ）１０分後および（Ｄ）洗浄後における、２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、９０μＭのフルセミドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液を用いた、ＲＰＥＣへの処理の効果を示す４枚の写真である。
【図１０】図１０は、２００ｍＭ以下のＮａＣｌ、９０μＭのフルセミドおよび３μｌの５Ｎ  ＮａＯＨを含む処理溶液の適用後におけるＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの生存率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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