(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球またはＣＤ３４陽性細胞と赤血球および血小板を含む骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを粗分離した細胞集団を、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を捕捉し、赤血球および血小板は実質的に通過する、容器に不織布を充填したフィルターに導入し、次に該フィルターに５ｍＰa・ｓ以上３１．８ｍＰa・ｓ以下の粘度を有する液体を細胞集団の通液方向と逆方向に導入して、該フィルターに捕捉されている該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を該フィルターより剥離し、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を回収することを特徴とする細胞分離方法。
【請求項２】
５ｍＰa・ｓ以上３１．８ｍＰa・ｓ以下の粘度を有する液体が、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞の保存剤として使用し得るものである請求項１記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する利用分野】
本発明は、細胞集団から特定の細胞を分離するための分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、骨髄移植療法が広く施行されている。骨髄移植療法とは、移植骨髄による致死的造血障害の回復法であるため、患者にとって致死的な大量放射線及び／又は大量化学療法（以下、大量化学療法と略す）の施行が可能となり、白血病や固形癌の治癒につながる。また、近年、骨髄と同様に末梢血中にも、これらの治療に必要な造血幹細胞が含まれていることが明らかになった。通常、これらの細胞の末梢血中での含有率はかなり低値であり、採取して骨髄移植の代わりに用いることは困難であるが、抗癌剤及び／又はＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等のサイトカインを投与することにより、その含有率が増大することが明らかにされ、骨髄採取と比べると、全身麻酔が不要で安全なことから、盛んに臨床応用が行われている。更に近年、臍帯血中には末梢血よりもはるかに高濃度で造血幹細胞が含有されていることが明らかになり、臨床応用が始まった。ここで、移植法は細胞の提供者（ドナー）が誰であるかにより同種移植と自家移植に分けられる。前者は健康な他人（血縁者又は非血縁者）が提供者になり、後者は患者自身が提供者となるものである。自家移植においては全てが、また同種移植においては臍帯血を用いる場合はほとんどが移植まで凍結保存が行われる。凍結保存の前には、通常赤血球の除去が行われる。これは全血で保存した場合、保存スペースや解凍時の破壊赤血球による副作用が問題となるためである。従来、赤血球除去は遠心分離器により行われており、より分離効率を上げたい場合には比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重遠心法が採用されている。本法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。特開昭６１−８４５７７号公報、特開平２−１３４５６４号公報等で操作の煩雑さを解決すべく、多くの試みがなされているが、比重液を用いるという点では変わらず、抜本的解決には至っていない。ところで、遠心分離を用いない赤血球除去法の提案も散見されるようになった。特開平８−１０４６４３号公報では赤血球と造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を含む細胞集団を、実質的に赤血球は通過し、白血球は捕捉するフィルターに通液した後、前記通液方法とは逆方向の液流を惹起させ、捕捉された白血球を回収することを特徴とする赤血球の除去方法が提案されている。しかしながら、特定粘度の回収液を用いると回収率が向上するとの記載は一切ない。
ところで、特開昭５５−１３０９１７号公報にはフィルター、吸着剤充填カラム等に残留する体液を容器から回収する際の体液押し出し液として粘度２センチ・ポイズ（ＣＰ）以上の液体を用いる事を特徴とした体液の回収方法が開示されている。しかしながら、同公報によれば、生理食塩水等の低粘度を用いると、フィルター内に粘着している細胞をも回収してしまい好ましくない。そこで、粘着している細胞を回収しないために高粘度を用いるとしている。即ち、同公報ではほとんどフィルターを通過し、フィルター内にわずかに残存した体液を回収するための方法であり、本願とは全く異なる技術思想である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術の問題点に鑑み、本発明は簡便な操作且つ短時間で、必要細胞と不要細胞の混合物から必要細胞を高率に回収する方法。例えば白血球、血小板、赤血球の混合物から白血球を選択的に高率に回収する方法を提供する事を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち本発明は、白血球またはＣＤ３４陽性細胞と赤血球および血小板を含む骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを粗分離した細胞集団を、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を捕捉し、赤血球および血小板は実質的に通過する、容器に不織布を充填したフィルターに導入し、次に該フィルターに５ｍＰa・s以上３１．８ｍＰa・s以下の粘度を有する液体を細胞集団の通液方向と逆方向に導入して、該フィルターに捕捉されている該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を該フィルターより剥離し、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を回収することを特徴とする細胞分離方法である。また、５ｍＰa・s以上３１．８ｍＰa・s以下の粘度を有する液体が、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞の保存剤として使用し得るものである細胞分離方法である。
【０００５】
【作用】
本発明の細胞分離方法においては、５ｍＰａ・ｓ以上３１．８ｍＰａ・ｓ以下という特定の粘度を有する液体を回収液として使用することにより、捕捉手段に捕捉されている白血球またはＣＤ３４陽性細胞を高い回収率で、しかも簡単な操作で且つ短時間に剥離回収することができる。更に特定粘度を有する回収液に凍結保存液を用いることにより得られた細胞浮遊液は、そのまま凍結保存ができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる捕捉手段としては、捕捉材を容器に充填したものがあげられる。前記捕捉材としては水不溶性であればいかなる材質でも使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプリロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属があげられる。また、これらの捕捉材はこのままでも用いることができるが、必要に応じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった特定の細胞に親和性のあるリガンドを固定してもよい。また、捕捉材の形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、平板、スポンジ状多孔質体等があげられるが、体積あたりの表面積が大きいという点で不織布が好ましい。
本発明における少なくとも白血球またはＣＤ３４陽性細胞と赤血球および血小板を含む細胞集団の例としては、骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離器等により粗分離したものがあげられる
本発明においては捕捉手段に捕捉されている細胞を特定粘度を有する液体で回収するものであるが、この粘度としては５ｍＰａ・ｓ以上３１．８ｍＰａ・ｓ以下である。粘度が５ｍＰａ・ｓ未満では回収率は低く、３１．８ｍＰａ・ｓを超えると、作業性が劣る。成分としては細胞への悪影響が少ないものが好ましい。いくつか例示するとポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子溶液、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、キチン誘導体、コラーゲン、ファイブロネクチン、アルブミン、グロブリン等の天然高分子溶液、グルコース、サッカロース、マルトース、ソルビトール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等の有機物溶液及びこれらの混合物があげられる。また、これらを溶かす溶媒としては生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコリン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられる。
【０００７】
また、本発明による特定の粘度を有する液体はこのまま凍結保存または液状保存に用いられるものであることがより好ましい。即ち、幹細胞の凍結保存を例にあげると、通常、前述のＦｉｃｏｌｌ法等により赤血球が分離された細胞集団を洗浄後、凍結保存剤を添加して細胞浮遊液を調製し、これを液体窒素中あるいは冷凍庫内で凍結保存を行うが、本発明においては特定の粘度を有する液体に凍結保存剤を用いることにより、赤血球除去後に煩雑な操作を加えることなく、凍結保存用の細胞浮遊液とすることができる。
本発明による特定の粘度を有する液体を捕捉手段に通液する方法としては、ポンプの利用、シリンジによる注入、液体を貯留したバッグを押しつぶしで液流を惹起する方法、落差による方法があげられる。また、液体流入口と液体流出口が別々の容器からなる捕捉手段の場合は、原料血液の通液方向と同一の方向で回収液を通液するか、逆方向で通液するかに分かれるが、一般的に逆方向の方が回収率が高い傾向がある。更に、単純に通液するだけでなく、捕捉手段に振動を加えたり、ストップドフローにしても良い。また、液体流入口と液体流出口が同一の場合、例えばフラスコの場合は、フラスコに本発明による特定の粘度を有する液体をピペット等で導入してから、フラスコ本体を振る、あるいは機械的・超音波振動を加えることで細胞を回収する。
【０００８】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
１細胞分離器の作製
容器寸法４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布２５枚を、出口側に平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布１２枚を充填した。なお、本フィルターの充填密度は０．２ｇ／ｃｍ３ であった。
また、このフィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体の１％エタノール溶液を該フィルターの液体流入口から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
２細胞分離操作
１で作製した細胞分離器に末梢全血５０ｍｌを液体流入口から落差（流速約５ｍｌ／分）により通液した後、フィルター内に残存する赤血球、血小板を洗流する目的で生理食塩水３０ｍｌを通液した。その後、３．５％ポリビニルピロリドン（平均分子量３６万）水溶液３０ｍｌを液体流出口からポンプを用いて１００ｍｌ／分で通液し、液体流入口から細胞を回収した。なお、本回収液の粘度は２０．３ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ７５％、９９％、９８％であった。なお、回収率、除去率の算出方法は以下のとおりである。
回収率（％）＝１００×（分離後細胞数／分離前細胞数）
除去率（％）＝１００−１００×（分離後細胞数／分離前細胞数）
【０００９】
【実施例２】
▲１▼細胞分離器の作製
実施例１と同様の細胞分離器を用いた。
▲２▼細胞分離操作
３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに４０％牛血清アルブミン生理食塩水溶液を用いた以外は実施例１と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は１７．２ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ９８％、９５％、８０％であった。
【００１０】
【実施例３】
▲１▼細胞分離器の作製
実施例１と同様の細胞分離器を用いた。
▲２▼細胞分離操作
３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに市販の凍結保存剤（極東製薬製「ＣＰ−１」、ヒドロキシエチルデンプン約１８％、ジメチルスルホキシド約１５％）を用いる以外は実施例１と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は３１．８ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ７５％、９６％、８８％であった。なお、本回収液で回収された細胞はその後、前述の凍結保存剤に添付されていたプロトコールにより凍結保存が可能であった。
【００１１】
【実施例４】
▲１▼細胞分離器の作製
実施例１と同様の細胞分離器を用いた。
▲２▼細胞分離操作
３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに市販のヒドロキシエチルデンプン生理食塩水溶液（ルセル森下製「６−ＨＥＳ」）に牛血清アルブミンを２５％になるように添加した液体を用いる以外は実施例１と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は１７．４ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ７４％、９６％、９８％であった。なお、本回収液で回収された細胞はその後、実施例３の凍結保存剤に添付されていたプロトコールと同様な操作で凍結保存が可能であった。
【００１２】
【実施例５】
１細胞分離器の作製
容器寸法４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１２枚を、出口側に平均繊維径２．３μｍのマウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体固定ポリスチレン不織布２５枚を充填した。本フィルターの充填密度は０．２ｇ／ｃｍ３ であった。
なお、マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体のポリスチレンへの固定は特開平２−２６１８３３号公報で提案されている公知のハロアセトアミド法にて行った。
２細胞分離操作
１で作製した細胞分離器に臍帯全血５０ｍｌを液体流入口から落差（流速約５ｍｌ／分）で通液した後、フィルター内に残存する赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細胞を洗流する目的で生理食塩水３０ｍｌを通液した。その後、市販の凍結保存剤（極東製薬製「ＣＰ−１」）に同凍結保存剤の使用説明書に従い、２５％ヒト血清アルブミン溶液を添加したもの（１２％ヒドロキシエチルデンプン、１０％ジメチルスルホキシド、８％ヒト血清アルブミン）を液体流出口からポンプを用いて１００ｍｌ／分で通液し、液体流入口から細胞を回収した。なお、本回収液の粘度は１９．０ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作でのＣＤ３４陽性細胞回収率、ＣＤ３４陽性細胞純度、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ８０％、９３％、９８％、９８％であった。なお、本回収液で回収された細胞は前述の凍結保存剤に添付されていたプロトコールにより凍結保存が可能であった。
【００１３】
【比較例１】
▲１▼細胞分離器の作製
実施例１と同様の細胞分離器を用いた。
▲２▼細胞分離操作
３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに生理食塩水を用いる以外は実施例１と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は１．０ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ３１％、９９％、９５％であり、白血球回収率が低値であった。
【００１４】
【比較例２】
▲１▼細胞分離器の作製
実施例５と同様の細胞分離器を用いた。
▲２▼細胞分離操作
市販の凍結保存剤にヒト血清アルブミンを添加したものの代わりに生理食塩水を用いる以外は実施例５と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は１．０ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作でのＣＤ３４陽性細胞回収率、ＣＤ３４陽性細胞純度、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ１０％、７３％、９９％、９９％であった。表１に結果のまとめを示す。
表１
0004412621.tif 000002
【００１５】
【発明の効果】
以上示したように、本発明による細胞分離方法は簡便な操作且つ短時間で、必要細胞と不要細胞の混合物から必要細胞を高率に回収することができ、また得られた細胞浮遊液はその後の煩雑な細胞浮遊液調製操作を経ることなく凍結保存が可能なので、造血幹細胞移植分野や養子免疫療法分野の細胞処理工程における省力化に貢献するところ大である。