(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの酵素活性を測定する方法であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を用いて検体を処理し、処理された検体中の残存するＣＫ活性を測定し、測定されたＣＫ活性に基づいてクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の活性を求めることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）活性測定法。
【請求項２】
ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体を含むＣＫ活性測定用試薬を検体に添加することによって、検体を処理する請求項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
【請求項３】
ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体を一つの工程中で同時に作用させる請求項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
【請求項４】
ｍＣＫに対する阻害抗体とＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とを、別々の工程において作用させる請求項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
【請求項５】
ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体を用いて検体に第一の処理を施し、ｍＣＫに対する阻害抗体を用いて第一処理された検体に第二の処理を施し、第二処理された検体中の残存するＣＫ活性を測定する請求項４のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
【請求項６】
免疫阻害法によりクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定するための試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
【請求項７】
前記ｍＣＫに対する阻害抗体が、サルコメリックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）およびユビキタスｍＣＫ（ｕｍＣＫ）から選択される少なくとも１つである請求項６のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
【請求項８】
前記ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体を含有する第一の試薬と、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を含有する第二の試薬とを含む請求項６または７のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの活性測定方法および測定試薬に関する。さらに詳しくは、本発明はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）および／またはミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の活性測定方法および測定試薬に関する。
【０００２】
背景技術
ヒトのＣＫは遺伝子を異にする４つの蛋白質が存在する。それらは、細胞質に由来する２種類の蛋白質〔局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型）〕と、ミトコンドリアに由来する２つの蛋白質Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ＣＫ（ｓｍＣＫ）とｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ＣＫ（ｕｍＣＫ）である。ｓｍＣＫは心筋および骨格筋に、ｕｍＣＫは小腸、脳および胃に存在する。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型の２量体から構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される〔高木康、鵜澤龍一、五味邦英：臨床検査、３２巻、１３０９−１３１５（１９８８）〕。またｍＣＫは組織中では８量体で存在するが、血液中では経時的に２量体になる。以下、ｍＣＫとは、ｓｍＣＫおよび／またはｕｍＣＫを含む。
【０００３】
これらアイソザイムの電気泳動の移動度は陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｓｍＣＫとｕｍＣＫの移動度は同じである。ｍＣＫ（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしまう。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリンが結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免疫対向流法などによりザイモグラムから確認することができる。これらＣＫのアイソザイムの諸性質を表１にまとめた。
【０００４】
【表１】
0004455767.tif 000002
【０００５】
臨床検査において総ＣＫ、ＣＫ−ＭＢの定量が広く行われている。なかでもＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量はＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法等がある。
【０００６】
ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定できる反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動法は操作が煩雑で熟練を要する。また、結果を出すまでにデンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要があり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により迅速簡便に測定ができる利点があるが、特異性に欠ける欠点を有していた。
【０００７】
しかし現状では、急性心筋梗塞（以下、ＡＭＩと略称することがある）の早期診断が求められるため、免疫阻害法が広く使用されている。この方法は、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体を用いて、Ｍサブユニットを失活させ、残存するＢサブユニット活性を測定するものである。この方法を用いると、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、またこれが逸脱する（組織破壊等により、組織から血中に放出される）疾患が少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており〔豊田陽子他、生物物理化学、４２、１７５−１７９（１９９８）〕〔（星野忠他：生物物理化学、４２補冊２、２１（１９９８）〕、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり、結果の判定を混乱させる。最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている〔（ 星野忠他：臨床病理、４６、総会号、５７（１９９８）〕〔（ 金光房江他：臨床病理、４６、総会号、５６（１９９８）〕。しかも、この測定方法ではＣＫ−ＭＢ活性も約半分阻害されるため、その活性は測定値に２を乗じて算出される。このため、ｍＣＫ活性の影響は２倍になってしまう。すなわち、従前の免疫阻害法によりＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法は、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ−ＭＢ活性を測定するものであり、簡便で迅速に測定できるが、この方法ではｍＣＫ活性も同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定は期待できない。
【０００８】
発明の開示
本発明の目的は、ｍＣＫの酵素反応作用を選択的に免疫的に排除することにより、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便な、所望により自動化も可能なＣＫ−ＭＢ活性測定方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、該測定方法に用いる測定試薬を提供することにある。
【０００９】
ＣＫ−ＭＢ活性を感度よく、簡便に、迅速に、自動化により検出するための測定系を提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ＣＫ−ＭサブユニットおよびｍＣＫの酵素作用を選択的、免疫的に排除する処理をした後に、ＣＫ活性を測定することにより前記の目的を達成できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの酵素活性を測定する方法であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を用いて検体を処理し、処理された検体中の残存するＣＫ活性を測定し、測定されたＣＫ活性に基づいてクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の活性を求めることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）活性測定法。
２．ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体を含むＣＫ活性測定用試薬を検体に添加することによって、検体を処理する前項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
３．ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体を一つの工程中で同時に作用させる前項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
４．ｍＣＫに対する阻害抗体とＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とを、別々の工程において作用させる前項１のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
５．ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体を用いて検体に第一の処理を施し、ｍＣＫに対する阻害抗体を用いて第一処理された検体に第二の処理を施し、第二処理された検体中の残存するＣＫ活性を測定する前項４のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
６．免疫阻害法によりクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定するための試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
７．前記ｍＣＫに対する阻害抗体が、サルコメリックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）およびユビキタスｍＣＫ（ｕｍＣＫ）から選択される少なくとも１つである前項６のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
８．前記ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体を含有する第一の試薬と、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を含有する第二の試薬とを含む前項６または７のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
【００１１】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＣＫアイソザイム活性の測定法において、阻害抗体を組み合わせて用いることにより、目的とするＣＫアイソザイム活性を選択的に測定することが可能になることを見出し、この発見に基づいて完成された。
【００１２】
すなわち、第一の実施の形態に従えば、本発明のＣＫアイソザイム活性測定法は、免疫阻害法によりＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法であって、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体（抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体）およびヒトｍＣＫに対する阻害抗体（抗ヒトｍＣＫ阻害抗体）で検体を処理し、ＣＫ−ＭサブユニットおよびｍＣＫの酵素作用を選択的、免疫的に排除する処理をほどこした後、残存するＣＫ活性を測定することを特徴とする。
【００１３】
第二の実施の形態に従えば、本発明のＣＫアイソザイム活性測定法は、免疫阻害法によりＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法であって、別々にＣＫ−ＭサブユニットおよびｍＣＫの酵素作用を選択的、免疫的に排除し、ＣＫ−ＭＢ活性およびｍＣＫ活性をも測定することを特徴とする。すなわち、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ−ＭＭの全ての活性およびＣＫ−ＭＢの約半分の活性をそれぞれ阻害して測定を行い、その後抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を加えてさらに測定を行うことを特徴とする。
【００１４】
第三の実施の形態に従えば、本発明のＣＫアイソザイム活性測定法は、免疫阻害法によりＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法であって、ｍＣＫの酵素作用を選択的、免疫的に排除し、ｍＣＫ活性を測定することを特徴とする。すなわち、ＣＫ活性を測定し、その後抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を加えてさらに測定を行うことを特徴とする。
【００１５】
本発明の基本原理は、免疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法を利用する。一般に、この方法によるＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われる。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性阻害抗体を使用し、血清ＣＫのＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定は、例えば、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）を用いる酵素反応系を利用した紫外部測定法により行われる。この測定法は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成するＡＴＰをヘキソキナーゼ（ＨＫ）とＧ−６−ＰＤＨからなる共役反応によってＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度増加として測定する初速度測定法である（化２）。
【００１６】
【化１】
0004455767.tif 000003
【００１７】
【化２】
0004455767.tif 000004
【００１８】
抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いるＣＫ−ＭＢ活性の測定は、従来法ではｍＣＫ活性も同時に測定してしまうため、正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなかったが、本発明では、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫの活性をも阻害することにより、実用上十分に正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定を簡便迅速にできる。
【００１９】
また、本発明は、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ−ＭＭの全ての活性およびＣＫ−ＭＢの約半分の活性をそれぞれ阻害して、まず残存するＣＫアイソザイムの酵素活性を測定し、ついで抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を添加し、なおも残存するＣＫアイソザイム活性を測定することにより、ＣＫ−ＭＢ活性を簡便迅速に測定することができる。また、最初に測定したＣＫアイソザイムの酵素活性からＣＫ−ＭＢ活性の値を差し引くことによりｍＣＫの活性を得ることができる。
【００２０】
具体的には、活性測定を目的とするアイソザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体および抗ヒトｍＣＫ阻害抗体で検体を処理し、血清ＣＫのＭＭ、ＭＢ中のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）およびｍＣＫ活性を阻害し、残存するＢサブユニット活性を測定して、測定値を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性とする。なお、ＣＫ−ＢＢは血中にほとんど存在しないため無視できる。
【００２１】
一方、活性測定を目的とするＣＫアイソザイムがＣＫ−ＭＢとｍＣＫである場合は、まず抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体で検体を処理してＣＫ活性を測定する。ついで抗ヒトｍＣＫ阻害抗体で処理して、なお残存するＣＫ活性を再度測定し、測定値を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性とする。また、最初の測定で得られたＣＫ活性から、二回目の測定で得られたＣＫ活性を差し引くことにより、ｍＣＫ活性の値が得られる。このように本発明の測定方法により、同一検体中のｍＣＫ活性とＣＫ−ＭＢ活性の両方を同時に求めることができる。
【００２２】
ｍＣＫの活性のみが測定目的である場合は、ＣＫ活性を測定し、ついで抗ヒトｍＣＫ阻害抗体で処理して、なお残存するＣＫ活性を再度測定し、最初の測定で得られたＣＫ活性から、二回目の測定で得られたＣＫ活性を差し引くことにより、ｍＣＫ活性の値が得られる
【００２３】
不要なＣＫアイソザイムまたはＣＫ−Ｍサブユニットの活性を取り除くため活性阻害処理する際に用いる上述の阻害抗体は、それぞれ別々に用いて検体を処理してもよいが、同時に用いて検体を処理してもよい。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣＫ阻害抗体が異種動物で作製された抗体である場合は混合すると沈殿などを生成する場合がある。このようなときは一方の動物の免疫グロブリンを固定化したアフィニティーカラムで処理して使用する。より好ましくは、異好性抗体の存在のリスクを避けるためには、別々に検体に作用させることが推奨される。
【００２４】
また、これらの阻害抗体は、ＣＫ活性を測定するための酵素反応系に使用する酵素試薬および／または基質液とは別々に調製した試薬として検体の処理に用いてもよいし、あるいは酵素試薬および／または基質液に添加して調製した試薬として用いてもよい。
【００２５】
ＣＫ活性の測定は、通常のＣＫ活性測定法により、試薬として例えば国際試薬社製ＣＰＫ試薬Ｌ「コクサイ」を用いて行うことができる。
【００２６】
本発明の測定法に使用する抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体および抗ヒトｍＣＫ阻害抗体は、例えばヤギをヒトＣＫ−ＭサブユニットまたはヒトｍＣＫ画分で常法〔Ｊ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂ．Ｃ．，Ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３２，ｐｐ．１６９４２−１６９５３（１９８８）〕に従って免疫・採取・精製することにより得ることができる。
【００２７】
抗ヒトｍＣＫ阻害抗体は具体的には、例えば以下のようにして作製することができる。すなわち、抗原としては、目的とする特異性によっても異なるが、ヒトまたは哺乳類のｍＣＫが用いられる。特異性を高めるためには種特異的な抗原を用いることが好ましい。
【００２８】
ヒトｍＣＫに対して特異的に親和性を有し、且つヒトｍＣＫの酵素活性を特異的に阻害する抗体を得る場合には、該抗原は遺伝子工学的手法によっても調製できる。
感作抗原としては、精製ｍＣＫ蛋白質分子あるいは遺伝子工学的に調製した部分的なアミノ酸配列に基づいた発現蛋白質をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物質として５０〜５００μｇ／ｍｌ程度の濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原等、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン等の適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることが好ましい。
【００２９】
この抗原を免疫感作させる動物としては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、上述の溶液をアジュバントと混合して投与することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅ１１ａ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合わせが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。
【００３０】
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無等により、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができる。例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍｌ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。上述の抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。ポリクローナル抗体を利用する場合は、この採血した血液より血漿を得、自体公知の抗体の精製法を用いて、所望により純度を調整して、製造できる
。
【００３１】
抗体は単独または組み合わせることにより、試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害し、ＣＫ−ＭＢ活性を特異的に測定することができる。また、本発明において抗体として、抗血清そのもの、または精製したＩｇＧ抗体、さらに抗体をパパイン消化して得られるＦａｂフラグメントを使用することができる。
【００３２】
本発明の方法により測定される検体は特に制限はないが、通常当分野で行われているＣＫ−ＭＢを測定されている方法に適用し得る。
【００３３】
また、本発明においては、本発明の測定法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム活性測定用試薬を提供する。ここでいう試薬には、急性心筋梗塞マーカーに用いられているＣＫ−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
実施例
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
実施例１
ポリクローナル抗体の作製方法
（１）ウサギＮＺＷ／クリーン（ケアリー）ウサギ、雄、入荷時体重１．２５〜１．３５ｋｇ／匹を入手し、動物飼育チェンバーで標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
【００３６】
（２）免疫原の調製
ヒトｍＣＫはヒト心筋組織およびヒト胃組織を用い、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂ．  Ｃ．、  Ｖｏｌ．２５５、  ｐｐ．２８７０〜２８７７（１９８０）、およびＡ．Ｍ．Ｇｒａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．  Ｂ．  Ｃ．、  Ｖｏｌ．２５８、  ｐｐ．１５３４６〜１５３５４（１９８３）に記載されている方法により精製した。約３００ｇのヒト心筋より精製ｓｍＣＫが得られた。同様に約１５０ｇのヒト胃より精製ｕｍＣＫが得られた。これらを使用するまで凍結保存した。
【００３７】
（３）免疫方法
上記（２）で調製した抗原ｓｍＣＫとｕｍＣＫ各々をＲｉＢｉアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）で１００μｇ／ｍｌに調製し、激しく混和して均一な懸濁液とした後、３羽ウサギの両鼠径部にそれぞれ２００μｌずつ、また背中２箇所に５０μｌずつ投与した。さらに４週間毎に、同様に調製した上記抗原を４回同様の方法により繰り返し投与した。
【００３８】
（４）抗体価測定
抗体価の測定に当たっては、定期的に兎耳静脈より少量の全血を採取し、血清を分離した後、５５℃で６０分間処理することによりウサギ血清中のＣＫ活性を失活させ、使用直前まで凍結保存した。免疫開始よりｓｍＣＫとｕｍＣＫに対する抗体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
【００３９】
すなわち、各兎の血清をＰＢＳで１００倍希釈して調製した抗体溶液５０μｌを９６穴マイクロタイタープレートに採取し、５０μｌのｍＣＫ酵素液（ＰＢＳ緩衝液に０．２Ｕ／ｍｌ  ｓｍＣＫまたはｕｍＣＫを含む）を加え室温で１０分間放置後、１００μｌのＣＫ発色試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５′−二リン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５′−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ  Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５′−五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ  １−チオグリセロール、２０ｍＭ  Ｄ−グルコース、２ｍＭ  ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を加え、３７℃で１０分間反応させた。
ついで、上記の各穴に５０μｌの０．２Ｎ塩酸を加えて反応を停止させ、波長５７０ｎｍにおける吸光度を精製水を対照に測定した。さらに、得られた吸光度から、ｍＣＫの酵素活性の阻害が認められた場合、基質反応が抑制されるため吸光度の変化量は低く、酵素活性阻害特異抗体の存在を特定することができた。なお、抗体陰性コントロールとしてＰＢＳのみを添加したものを使用し、検体盲検としてｍＣＫ酵素液の代りにＰＢＳを使用した。
【００４０】
（５）反応特異性の検討
得られた抗ヒトｓｍＣＫ阻害抗体およびｕｍＣＫ阻害抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、上記と同様の方法によりそれぞれの酵素に対する酵素活性阻害を確認した。
【００４１】
実施例２
ＣＫ活性測定用試薬として以下の試薬を調製した。
酵素試薬：１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデノシン−５′−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン−５′−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭ  Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５′）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍＭ  １−チオグリセロール、２８ｍＭ  Ｄ−グルコース、２ｍＭ  ＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌ  ヘキソキナーゼ、２．１Ｕ／ｍｌ  グルコース６リン酸脱水素酵素、ｐＨ６．６
基質液：１５０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリム
分画試薬：酵素試薬に１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｓｍＣＫ阻害抗体（ウサギ）またはｕｍＣＫ阻害抗体（ウサギ）を添加して分画液とした。
【００４２】
精製ヒトＣＫ（０．１％ＢＳＡを含む生理食塩水）５段階希釈液の２０μｌに酵素試薬２５０μｌを加え、３７℃で恒温とした後、波長３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する（Ａ）。さらに基質液１００μｌを添加２〜３分後より吸光度変化量を測定する（Ｂ）。ＣＫ活性は以下の計算式（数１）で算出する。
【００４３】
【数１】
0004455767.tif 000005
【００４４】
次に酵素試薬に代えて分画試薬を用いて同様に操作し、吸光度変化量を測定してＣＫ活性を測定した。ＣＫ活性は前述の計算式（数１）で算出する。結果を表２〜表４に示した。この抗体はヒトｍＣＫを阻害し、ＣＫ−Ｍサブユニット、ＣＫ−Ｂサブユニットは阻害しない。
【００４５】
【表２】
ＣＫ−ＭＭ活性（Ｕ／Ｌ）に与える阻害抗体の影響
0004455767.tif 000006
【００４６】
【表３】
ＣＫ−ＢＢ活性（Ｕ／Ｌ）に与える阻害抗体の影響
0004455767.tif 000007
【００４７】
【表４】
ｓｍＣＫ活性（Ｕ／Ｌ）およびｕｍＣＫ活性（Ｕ／Ｌ）に与える阻害抗体の影響
0004455767.tif 000008
【００４８】
ｓｍＣＫ、ｕｍＣＫのどちらで抗体を作製しても阻害交差性が確認された。従って、以下の実施例は、抗ヒトｓｍＣＫ阻害抗体を使用して行った。以下の実施例で抗ヒトｍＣＫ阻害抗体と表示している抗体は、この阻害交差性を有する抗ヒトｓｍＣＫ阻害抗体である。
【００４９】
実施例３
ヒト健常検体およびヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（ウサギ）および２つの阻害抗体を混合したものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を使用し、４０分間泳動した。泳動後、実施例１で調製したＣＫ発色試薬を泳動したゲルに染み込ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥させてコピーした結果を図１に示す。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣＫを阻害できないためＣＫ−ＭＢとして測定されてしまう。また抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を併用して使用することによりＣＫ−ＭＢが初めて特異的に測定されることが示唆された。
【００５０】
実施例４
実施例２の酵素試薬に抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（ウサギ）を添加したもの（本発明）を調製した。ＣＫ活性が３００Ｕ／Ｌ以下の検体１９例、ＧＰＴ活性が８０Ｕ／Ｌ以上の肝疾患検体２６例についてＣＫ−ＭＢ活性を実施例２の操作方法に従って測定して比較検討を行った。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算式（数２）により算出する。
【００５１】
【数２】
0004455767.tif 000009
【００５２】
結果を表５および６に示す。表５の結果よりＣＫ−ＭＢ活性の平均値は対照法が１３Ｕ／Ｌに対して本発明は７Ｕ／Ｌと約半分になることが分かった。従来、ＣＫ−ＭＢ活性のカットオフ値は約２５Ｕ／Ｌといわれているが、本発明では非特異的反応をするｍＣＫ活性を阻害できるため、約１０Ｕ／Ｌに設定できる。
表６に示すように、肝疾患患者検体は対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかかわらず７検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しかしながら、本発明においてはすべての検体が１０Ｕ／Ｌ以下となった。
以上の結果より、本発明はＣＫ−ＭＢ活性のカットオフ値が下がることにより急性心筋梗塞に対する早期マーカーとして従来よりも感度および特異性が高くなることが期待される。
【００５３】
実施例５
抗ヒトｍＣＫ阻害抗体の添加は酵素試薬または、基質液に添加することもできる。さらに基質液および酵素試薬とは別の試薬として抗ヒトｍＣＫ阻害抗体液を調製し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を含む酵素試薬と基質液で従来のＣＫ−ＭＢ活性測定を行った後、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体液を添加してｍＣＫ活性を差し引いて測定することもできる。この場合の利点として、ＣＫ−ＭＢ活性以外にｍＣＫ活性を求めることがきる。以下にその実施例を示した。
【００５４】
急性心筋梗塞発症後、予後がよかった患者と予後が悪く死亡に至った患者から経時的に採血した検体を用いてＣＫ−ＭＢ活性とｍＣＫ活性の同時定量を行った。
検体２０μｌに、実施例２の酵素試薬に抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加した試薬２５０μｌを加え、３７℃で恒温とした後、波長３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する（Ａ）。次に基質液１００μｌを添加し、２〜３分後より吸光度変化量を測定する（Ｂ）。次に抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（５．７Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭイミダゾール緩衝液ｐＨ６．６）５０μｌを加え、２〜３分後より吸光度変化量を測定する（Ｃ）。ＣＫ−ＭＢ活性とｍＣＫ活性は以下の計算式（数３）より算出する。また、対照法を用いて求めたＣＫ−ＭＢ活性と比較し、結果を表７、８、図２、３に示した。
【００５５】
この結果より予後がよいケースでは急性心筋梗塞発作後ピークに達するまでは対照法と本発明の測定方法に差がみられないが、ＣＫ−ＭＢ活性値が低下する回復期においては本発明の測定方法の方がより低値になり、正常に復帰するのが早いことが分かる。
この原因は、早期においては細胞質由来のＣＫ−ＭＢが逸脱し、その後細胞壊死を伴ってミトコンドリア由来のｍＣＫが逸脱してくるためであると考えられ、予後の経過観察にも有用性が高まることが分かった。また、予後がよい場合はｍＣＫ活性値は低く推移するが、予後の悪い場合はｍＣＫ活性値が高く推移した。
ミトコンドリア酵素は細胞壊死が起こってから血中に逸脱するため、現在はｍＧＯＴ（ミトコンドリア・グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ）活性が測定されている。しかし、本発明を用いるとＣＫ−ＭＢ活性の精密測定を行うと同時に細胞壊死程度を類推して急性心筋梗塞の重篤度および予後の情報を得ることもできる。
【００５６】
【数３】
0004455767.tif 000010
【００５７】
【表５】
ＣＫ活性３００Ｕ／Ｌ以下の検体のＣＫ−ＭＢ活性測定結果（Ｕ／Ｌ）
0004455767.tif 000011
【００５８】
【表６】
ＧＰＴ活性８０Ｕ／Ｌ以上の検体のＣＫ−ＭＢ活性測定結果（Ｕ／Ｌ）
0004455767.tif 000012
【００５９】
【表７】
予後良好例
0004455767.tif 000013
【００６０】
【表８】
予後不良例
0004455767.tif 000014
【００６１】
産業上の利用の可能性
現在、ＣＫ−ＭＢ活性の測定はＣＫ−ＭＭ活性を特異的に阻害する抗体を試薬系に、添加することによりその特異性が改良されているが、ｍＣＫ活性も測定してしまい、必ずしも心筋由来の特異的なＣＫ−ＭＢ活性を測定しているわけではない。本発明では抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を用い、従来識別することのできなかったｍＣＫ活性を特異的に抑制することにより、正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が可能となる。本発明の測定法は、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体を使用し、急性心筋梗塞患者血清中のｍＣＫ活性を特異的に阻害することにより真のＣＫ−ＭＢ活性値が測定され、より確度の高い急性心筋梗塞の重篤度、病態の把握が可能となり、急性心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニターが可能となり臨床検査上大きな意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】  抗ヒトＣＫ−ＭおよびｍＣＫ阻害抗体処理したときの健常人検体およびｍＣＫ陽性検体の電気泳動図である。
【図２】  急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の予後良好な症例について、対照法（−●−；ＣＫ−ＭＢ活性＋２×ｍＣＫ活性）で測定したＣＫ活性と、本発明の測定法で測定したＣＫ活性（−○−；ＣＫ−ＭＢ活性、−△−；ｍＣＫ活性）とを、ＡＭＩ発作後の経時的な測定において比較した結果を示す図である。
【図３】  急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の予後不良な症例について、対照法（−●−；ＣＫ−ＭＢ活性＋２×ｍＣＫ活性）で測定したＣＫ活性と、本発明の測定法で測定したＣＫ活性（−○−；ＣＫ−ＭＢ活性、−△−；ｍＣＫ活性）とを、ＡＭＩ発作後の経時的な測定において比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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