(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳もしくは脊髄の外傷または発作に起因する、認識作用を増強するまたは神経保護作用を提供するための薬剤の製造における化合物の使用であって、前記化合物が、次式：
【化１】
0004443763.tif 000082
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物である、上記使用。
［式中、
nは0〜3の整数であり、
Xは-S-、-O-、-NR-および-CH2-からなる群より選択され、
R1およびR2は、それぞれが独立に-H、-OR、-SR、-NRR、-NO2、-CN、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(NR)NRR、トリハロメチル、ハロゲン、(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、置換(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、置換(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アルカリール、置換(C6-C26)アルカリール、6-26員アルク-ヘテロアリール、および置換6-26員アルク-ヘテロアリールからなる群より選択され、
またはR1およびR2は一緒になって-CH2-(CH2)m-CH2-であり、ここでmは0〜6の整数であり、
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、ヘテロアリール、またはアルク-ヘテロアリールの各置換基は、それぞれが独立に-OR、-SR、-NRR、-CN、-NO2、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(NR)NRR、ハロゲン、およびトリハロメチルからなる群より選択され、
各Rは、-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アルカリール、および6-26員アルク-ヘテロアリールからなる群より独立に選択される]
【請求項２】
二環式2,5−ジケトピペラジン環の3位および6位の炭素の両者がS立体配置である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Xが-CH2-である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
nが1である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
R1およびR2が一緒になって-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、または-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記化合物が、次式：
【化２】
0004443763.tif 000083
0004443763.tif 000084
および
0004443763.tif 000085
からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記化合物が、次の構造：
【化３】
0004443763.tif 000086
を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
R1が-Hである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
nは0〜3の整数であり、
Xは-S-、-O-、-NH-または-CH2-であり、
R2が-CH2-R5、-CH2-CH2-R5、または-CH2-CH2-CH2-R5であり、
R5がフェニル、イミダゾール-2-イル以外のイミダゾリル、インドール-3-イル以外のインドリル、-SR6、-OR6、または-NHR6であり、
R6は-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、-C(NH)NH2、または-C(S)NH2である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
次式：
【化４】
0004443763.tif 000087
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
薬学的に有効な量の請求項１０に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩および
その医薬担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は一部 Department of Defense Grant No.DAMD 17-93-V-3018および CDC Grant No.R49 CCR 306634-07 の下で行なわれた。米国政府は本発明について一定の権利を所有する。
【０００２】
１．関連出願との相互関係
本出願は出願番号第09/022,184号（1998年2月11日出願）の一部継続出願であり、また仮出願番号第60/095,788号（1998年8月7日出願）の一部継続出願である。したがってこれら両出願の内容の全てが参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
２．発明の分野
本発明は実質的に神経学的活性を有する新規なクラスの化合物、その医薬組成物、ならびに神経保護剤として、および／またはヒトを含む動物の認識力の増強のためにこの化合物を使用する方法、に関する。さらに特定すると、本発明は環状ジペプチドおよび4-置換-2-アゼチジノン化合物、ならびにこれらの化合物のホモおよびヘテロ二量体、そして卒中、脳外傷および脊髄外傷を含む中枢神経系の傷害の治療ならびにCNS傷害またはアルツハイマー病などの神経変性疾患に起因する認識障害の改善のためのこの化合物の使用方法に関する。
【０００４】
３．発明の背景
脊髄および頭部傷害などの傷害に起因する中枢神経系（CNS）外傷が次第に一般的になってきている。これらの傷害の多くは自動車事故、深刻な墜落、ダイビング事故、破砕工業での傷害および銃傷若しくは刺傷などの一般的な出来事が原因となる。
【０００５】
外傷性の脳または脊髄傷害は直接的かつ間接的に、または二次的に、組織の損傷を引き起こす。直接の組織の損傷は典型的には組織に対する直接的な機械的傷害が原因である。二次的組織損傷は内在性で自己破壊性の神経化学物質の活性化が原因となると信じられている。卒中または低酸素症などのその他のタイプの急性CNS傷害も、神経外傷に関係する二次的傷害因子の多くが共通である二次的組織損傷を示す。
【０００６】
L-ピログルタミル-L-ヒスチジル-L-プロリンアミドとして同定された甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）は身体の各種の細胞、主としてCNSの神経細胞中に見出される小ペプチドである。TRHの構造を以下に示す：
【化１７】
0004443763.tif 000002
この分子の右側部分は当業者に「プロリンアミド」部分として知られ、分子の中央部は「ヒスチジル」または「イミダゾール環」部分として知られ、そして分子の左側部分は「ピログルタミル」部分として知られている。
【０００７】
内在性TRHは神経伝達物質、神経モジュレーターまたはその両方として作用し得る。TRHの大部分は正中隆起の視床下部神経末端から放出され、甲状腺刺激ホルモンの分泌を刺激する（TRHはこの機能に対して名づけられた）。TRHはCNSのその他の部位、ならびに消化管、膵臓、胎盤および網膜などの身体の組織中にも見出される。
【０００８】
身体のこれらの様々な部位でのTRHの機能は大部分未知である。しかし、TRHの呼称となっている下垂体刺激作用の他に、多数の生理学的作用が観察されている。例えば、TRHには自律神経系作用および興奮性作用（Yarborouhら、1979,Prog.Neurobiol.12:291-312）ならびにオピオイド（Holadayら、1978,Life Sci.22:1537-1543 ）、ニューロテンシン（Prangeら、1979:Central Nervous System Effects of Hypothalamic Hormones and Other Peptides中、pp.75-96,Raven,New York）、ロイコトリエン（Luxら、1983,Nature 302:822-824）および血小板活性化因子（Luxら、1983,Circ.Shock 10:262）の一定の生理学的作用を覆すかまたは弱める能力がある。TRHの投与はネコの外傷性脊髄傷害後の神経学的欠損を軽減する（Fadenら、1981,N.Engl.J.Med.305:1063-1067）。その上、TRHによる治療で、脳幹圧迫を受けたネコの電気的活性および神経学的回復が改善し（Fukudaら、1979,Folia Pharmacol.Jpn.75:321-331）、またマウスの頭部衝撃外傷後の脳震盪後行動抑制が短期化する（Manaka and Sano,1978,Neurosci.Lett.8:255-258）ことも分かっている。TRHの利点の１つは、これが侵害受容に影響することなく生理学的なオピエートアンタゴニストとして作用する点である。
【０００９】
しかし、CNS外傷を治療する薬剤としては、TRHにはいくつかの欠点がある。主な短所はTRHが非常に急速に代謝されることである。その結果、効果的な治療のためには、高用量および／または連続注入が必要である。血漿中の半減期の短さ（4〜5分）はおそらく、この分子のプロリンアミドおよびピログルタミル部分の両方でのペプチドの急速な in vivo分解または代謝によるものと思われる。ペプチダーゼによるTRHのピログルタミル部分の切断によって代謝産物であるシクロ-ヒスチジル-プロリン-ジケトピペラジンの生成が引き起こされる。TRHの脱アミドの結果、遊離酸であるTRH-OHが生成される。
【００１０】
TRHの欠点のため、２つのクラスの化合物、環状ジペプチドおよびアゼチジノンが研究された。環状ジペプチド（二環式2,5-ジオキソピペラジン；二環式2,5-ジケトピペラジン；シクロ(ジペプチド)；またはジペプチド無水物としても知られている）は一般的に、観察されたTRH代謝産物に基づいている。アゼチジノンはピログルタミル部分が2-アゼチジノンと置換したTRHに基づいている。
【００１１】
ピログルタミルアミノペプチダーゼによるTRHからのアミノ末端のピログルタミン酸の切断後、His-Pro-NH2の環状化によって、代謝物であるシクロ(His-Pro)が生成する（Prasad & Peterkofsky,1976,J.Biol.Chem.251:3229-3234；Prasadら、1977,Nature 268:142-144）。シクロ(His-Pro)およびその他の特定の環状ジペプチドの生物学的活性が試験されている。しかし、試験したものの中で、シクロ(His-Pro)、シクロ(Leu-Gly)、シクロ(Tyr-Arg)およびシクロ(Asp-Pro)の４種のみが哺乳動物中で何らかの生物学的活性を示す（各種の環状ジペプチドの活性の総説については、Prasadら、1995,Peptides 16(1):151-164、およびこの中に引用された参考文献を参照されたい）。これらの中で、神経保護剤として、またはアルツハイマー病などの神経学的疾患を治療するために、有用であると同定されたものはない。
【００１２】
GB 2 127 807には、神経遮断薬の反復投与後のカタレプシー効果に対する耐性の進行を阻害するため、そして記憶混乱、遅発性ジスキネジーおよびパーキンソン病の治療のために有用な、ある種の 2,5-ジケトピペラジンが開示されている。DD 153208には合成麦角アルカロイドとして潜在的に有用なある種の 2,5-ジケトピペラジンが開示されている。DD 246767には、環状ジペプチド、シクロ(Lys-Pro)、そして神経繊維の成長ならびに神経細胞の分化および維持の刺激剤として有用なそれらの医薬組成物が開示されている。JP 63135386には植物生長促進剤として有用なある種のヒドロキシプロリン環状ジペプチドが記載されている。しかし、これらの化合物のいずれも、神経保護剤として、またはアルツハイマー病などの神経学的疾患を治療するために有用なものとしては同定されていない。
【００１３】
TRHの１個以上の構成アミノ酸の改変の結果、各種のTRH類似体が開発され、それらのいくつかは酵素分解に対して高度に抵抗性で、CNS活性に関してTRHよりもはるかに強力である（Metcalf,1982,Brain Research 486:389-408）。CNS傷害におけるこれらの化合物の利点は、これらがより低い薬剤濃度および１回の非経口投与の利用を可能にする点である（Faden,"Role of TRH and Opiate Receptor Antagonists in Limiting Central Nervous System Injury"：Physiological Basis for Functional Recovery in Neurological Disease,S.Waxman,Ed.,Vol.47,Raven,New York,1987中、pp.531-546）。
【００１４】
しかし、組織の損傷に対して保護するためには、これらの化合物のある種のクラスのみが有効である。例えば、ピログルタミル部分に置換を有する化合物 CG3509（Faden and Jacobs,1985,Neurology 35:1331-1334）および CG3703（Fadenら、1988,Brain Research 448:287-293）は外傷性脊髄傷害後の結果を改善する （McIntoshら、1988,Am.J.Physiol.254:R785-R792）。対照的に、トリペプチドの両末端に改変を有する化合物 MK-771（Faden and Jacobs,1985、上記）、およびプロリンアミド部分のみに改変を有する化合物 RX-77368（Fadenら、1988、上記）は非常に高用量でも効果がないことが証明された。さらに、これらの類似体の多くは内分泌性、興奮性および自律神経系の作用などの中枢性活性作用を持つことがわかっている（Faden,1989,Brain Res.486:228-235；Fadenら、1993,J.Neurotrauma 10(2):101-108）。
【００１５】
Faden,1989,Brain Research 486:228-235には、TRHのピログルタミル部分が2-アゼチジノン部分で置換された、YM-14673と称するペプチダーゼ抵抗性TRH類似体が記載されている。YM-14673の構造を以下に示す：
【化１８】
0004443763.tif 000003
類似体 YM-14673は中枢性促進活性について、TRHよりも長時間（8〜36倍）作用し、実質的に効力が強い（10〜100倍）（Fadenら、1989、上記）。YM-14673による治療も外傷後のラットの継続的な神経学的回復を改善した（Fadenら、1989、上記）。
【００１６】
Fadenに対する米国特許第5,686,420号には、ヒスチジル部分のイミダゾール環が１以上のトリフルオロメチル基、ニトロ基若しくはハロゲン基で置換したイミダゾールと置換されたもの、ならびに／またはピログルタミル部分が2-アゼチジノン部分などの別の環構造と置換されたものである、ぺプチダーゼ抵抗性のTRH類似体が記載されている。代表的な化合物は イミダゾール環が2位および4位の炭素にてヨード基とジ置換されている、YM-14673の類似体である。このYM-14673のジヨード化類似体の構造を以下に示す：
【化１９】
0004443763.tif 000004
ピログルタミル部分が2-アゼチジノン部分で置換された別のTRH類似体が欧州特許 EP 0 123 444に記載されている。しかし、有効ではあるが、これらの2-アゼチジノンTRH類似体は望ましくない自律神経系および内分泌性の副作用を示す。
【００１７】
このように、当技術分野では、神経学的疾患を治療するのに有効な化合物、特にCNS傷害を受けた患者の二次的な脳および脊髄傷害を軽減するのに有効であって、侵害受容に影響を与えず、in vivoでプロテアーゼによって急速に代謝されず、かつTRHよりも内分泌性および／または自律神経系の作用が少ない、TRH類似体への需要が依然としてある。また、特に急性および慢性脳傷害後の認識機能を改善する化合物への需要も存在する。したがって、これらが本発明の目的である。
【００１８】
４．発明の概要
これらおよびその他の目的は、一態様において、プロテアーゼ耐性でありかつ強い中枢神経系(CNS)活性を示す新規クラスの化合物を提供する本発明によって達成される。一部にはこのCNS活性のため、本化合物は、認識作用、特に急性または慢性の脳損傷の後の記憶作用を増強するために、および／またはCNS損傷、アルツハイマー病のような神経変性疾患、または中枢神経系の外傷もしくは虚血が原因の神経障害を治療するために有用である。
【００１９】
本発明の第１のクラスの化合物は、構造式(Ia):
【化２０】
0004443763.tif 000005
を有する環式ジペプチド[二環式2,5-ジオキソピペラジン、二環式2,5-ジケトピペラジン、シクロ（ジペプチド）またはジペプチド無水物としても知られている]を含み、
上記式中、
nは0〜3の整数であり、
Xは-S-、-O-、-NR-および-CH2-からなる群より選択され、
R1およびR2は、それぞれが独立に-H、-OR、-SR、-NRR、NO2、-CN、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(NR)NRR、トリハロメチル、ハロゲン、(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、置換(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、置換(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アリールアルキル、置換(C6-C26)アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキル、および置換6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群より選択され、
またはR1およびR2は一緒になって-CH2-(CH2)m-CH2-であり、ここでmは0〜6の整数であり、
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルの各置換基は、それぞれが独立に-R、-OR、-SR、-NRR、-CN、-NO2、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(NR)NRR、-NR-C(NR)-R、-NR-C(NR)-OR、-NR-C(NR)-SR、-NR-C(NR)-NRR、ハロゲン、およびトリハロメチルからなる群より選択され、
各Rは、-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、(C6-C26)アリールアルキル、5-20員ヘテロアリール、および6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群より独立に選択される。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、環式ジペプチドは、上記構造(Ia)においてR1およびR2の少なくとも一方がフリーラジカル捕捉剤または酸化窒素シンターゼ(NOS)酵素の阻害剤として作用する部分からなる化合物である。
【００２１】
本発明の第２のクラスの化合物は、TRH分子の1つ、2つまたは3つ全部の部分でTRHと異なるTRH類似体を含む。しかし、最も顕著に異なる部分はピログルタミルおよびヒスチジル部分である。本発明のTRH類似体においては、2-アゼチジノン部分がピログルタミル部分と置換し、ヒスチジル部分のイミダゾール環が他の置換基により置換される。さらに、本発明のTRH類似体のプロリンアミド部分は、O、NまたはSのようなヘテロ原子および／または4〜7個の環原子を含むことができる。かくして、本発明の一実施形態においては、TRH類似体は構造式(Ib):
【化２１】
0004443763.tif 000006
を有する2-アゼチジノン化合物であり、
上記式中、
nは構造(Ia)で先に定義したとおりであり、
Xは構造(Ia)で先に定義したとおりであり、
R3およびR4は、それぞれが独立に-H、-CN、-C(O)OR’、-C(O)NR’R’、-C(NR’)NR’R’、トリハロメチル、(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、置換(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、置換(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アリールアルキル、置換(C6-C26)アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキル、および置換6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群より選択され、
またはR3およびR4は一緒になって-CH2-(CH2)p-CH2-であり、ここでpは0〜6の整数であり、
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキルの各置換基は、それぞれが独立に-R’、-OR’、-SR’、-NR’R’、-CN、-NO2、-C(O)OR’、-C(O)NR’R’、-C(S)NR’R’、-C(NR’)NR’R’、-NR’-C(NR’)-R’、-NR’-C(NR’)-OR’、-NR’-C(NR’)-SR’、-NR’-C(NR’)-NR’R’、ハロゲン、およびトリハロメチルからなる群より選択され、
各R’は、-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、(C6-C26)アリールアルキル、5-20員ヘテロアリール、および6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群より独立に選択される。
【００２２】
本発明の一実施形態において、TRH類似体は上記構造(Ib)に従う化合物であるが、ただし、
(i) nが1で、Xが-CH2-で、R3およびR4の一方が-Hであるとき、R3およびR4の他方は
【化２２】
0004443763.tif 000007
ではなく、ここでR10は-CF3、-NO2もしくはハロゲンで、R11が-Hであるか、またはR10は-Hで、R11が-CF3であるか、またはR10およびR11がそれぞれ独立にハロゲンである、および／または
(ii) nが1、2または3で、Xが-CH2-で、R3およびR4の一方が-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、または(C2-C6)アルキニルであるとき、R3およびR4の他方は-(CH2)a-R’’ではなく、ここでaは0、1、2または3であり、R’’はイミダゾリル、イミダゾール-5-イル、1個以上の-CF3、トリハロメチル、-NO2もしくはハロゲンで独立に置換されたイミダゾリル、1個以上の-CF3、トリハロメチル、-NO2もしくはハロゲンで独立に置換されたイミダゾール-5-イル、2,4-ジハロ-[1H]-イミダゾール-5-イル、および2,4-ジヨード-[1H]-イミダゾール-5-イルからなる群より選択される。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、TRH類似体は上記構造(Ib)においてR3およびR4の少なくとも一方がフリーラジカル捕捉剤または酸化窒素シンターゼ(NOS)酵素の阻害剤として作用する部分からなる化合物である。
【００２４】
本発明の第３のクラスの化合物は、構造式(Ic):
(Ic)    A-(CH2)r-S-S-(CH2)r-B
を有するジスルフィド架橋された二量体を含み、
上記式中、
-S-S-はジスルフィド橋を表し、
AおよびBはそれぞれ独立に
【化２３】
0004443763.tif 000008
からなる群より選択され、ここで
各nは、同一でも異なっていてもよく、構造(Ia)で先に定義したとおりであり、
各Xは、同一でも異なっていてもよく、構造(Ia)で先に定義したとおりであり、
各R2は、同一でも異なっていてもよく、構造(Ia)で先に定義したとおりであり、
各R4は、同一でも異なっていてもよく、構造(Ib)で先に定義したとおりである。二量体は、AとBがそれぞれジケトピペラジンまたはTRH類似体であるホモ二量体、またはAとBの一方がジケトピペラジンで、他方がTRH類似体であるヘテロ二量体であり得る。
【００２５】
別の態様において、本発明は、１種以上の本発明による化合物および製薬上許容される賦形剤、担体または希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。このような製剤は本発明の方法で投与することができる。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、神経障害、特に脳および／または脊髄の外傷もしくは発作によって引き起こされる神経障害の治療方法を提供する。この方法は、ヒトを含めた動物被験者に、神経病を治療するのに有効な量の少なくとも１種の本発明化合物またはその医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法により治療され得る神経病には、制限するものではないが、脳および脊髄の外傷、発作およびアルツハイマー病のような神経変性疾患が含まれる。
【００２７】
最後の態様において、本発明は、ヒトを含めた動物の認識作用を増強する方法を提供する。この方法は、動物被験者に、該被験者の認識作用を増強するのに有効な量の少なくとも１種の本発明化合物またはその医薬組成物を投与することを含む。この方法は、とりわけ急性または慢性の脳損傷の後の、学習および作業記憶作用の両方を強化するのに特に有用である。
【００２８】
4.1  定義
本明細書中で用いる下記の語句は下記の意味を有する：
「アルキル」は、飽和した分岐状、直鎖状又は環状炭化水素ラジカルをいう。典型的なアルキル基は、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、シクロブチル、ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどを含む。好ましい実施形態では、アルキル基は、（C1-C6）アルキルであり、（C1-C3）が特に好ましい。
【００２９】
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の分岐状、直鎖状又は環状炭化水素ラジカルをいう。このラジカルは、二重結合についてシス又はトランス立体配座のいずれかでありうる。典型的なアルケニル基は、これらに限定されないが、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、メタリル、シクロブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、シクロペンテニル、ヘキセニル、シクロヘキセニル、ビニリデン、プロピリデン、イソプロペニル、イソプロピリデン、ブテニリデン、t−ブテニルなどを含む。好ましい実施形態では、アルケニル基は、（C2-C6）アルケニルであり、（C2-C3）が特に好ましい。
【００３０】
「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和の分岐状、直鎖状又は環状炭化水素ラジカルをいう。典型的なアルキニル基は、これらに限定されないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを含む。好ましい実施形態では、アルキニル基は、（C2-C6）アルキニルであり、（C2-C3）が特に好ましい。
【００３１】
「置換アルキル、アルケニル又はアルキニル」は、1以上の水素原子がそれぞれ独立して別の置換基によって置換されているアルキル、アルケニル又はアルキニルラジカルをいう。典型的な置換基は、これらに限定されないが、−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−C(NR)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR-C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、−ハロゲン及び−トリハロメチルを含み、ここで各Rは独立して、本明細書中で定義される−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００３２】
「アリール」は、共役π電子系を有する不飽和の環状炭化水素ラジカルをいう。典型的なアリール基は、これらに限定されないが、ペンタ−2,4−ジエン、フェニル、ナフチル、アセナフチル（acenaphthyl）、アントラシル（anthracyl）、アズレニル（azulenyl）、クリセニル（chrysenyl）、インダセニル（indacenyl）、ペリレニル（perylenyl）、フェナントレニル（phenanthrenyl）、ピセニル（picenyl）、ピレニル（pyrenyl）、ピラントレニル（pyranthrenyl）、ルビセニル（rubicenyl）などを含む。好ましい実施形態では、アリール基は、（C5-C20）アリールであり、（C5-C10）が特に好ましい。
【００３３】
「置換アリール」は、1以上の水素原子がそれぞれ独立して別の置換基によって置換されているアリールラジカルをいう。典型的な置換基は、これらに限定されないが、−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−C(NR)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR−C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、−ハロゲン及び−トリハロメチルを含み、ここで各Rは、本明細書中で定義される−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００３４】
「ヘテロアリール」は、1以上の炭素原子が、N、P、O、S、As、Se、Si、Teなどの、別の原子で置換されているアリール部分をいう。典型的なヘテロアリール基は、これらに限定されないが、アクリジン、カルバゾール、β−カルボリン、クロメン、シンノリン（cinnoline）、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリジン（indolizine）、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン（naphthyridine）、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン（perimidine）、フェナントリジン、フェナントロリン（phenanthroline）、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、アクリダルシン（acridarsine）、アルサントリジン（arsanthridine）、アルシンドール（arsindole）、イソアルシノリン（isoarsinoline）、イソホスホインドール、イソホスフィノリン（isophosphinoline）、ホスホインドール、ホスフィノリン（phosphinoline）、セレノフェン（selenophene）、テルロフェン（tellurophene）及びキサンテンから誘導されたラジカルを含む。好ましい実施形態では、ヘテロアリール基は、5-20員ヘテロアリールであり、5-10員ヘテロアリールが特に好ましい。
【００３５】
「置換ヘテロアリール」は、1以上の水素原子が、それぞれ独立して別の置換基によって置換されているヘテロアリールラジカルをいう。典型的な置換基は、これらに限定されないが、−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−C(NR)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR−C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、−ハロゲン及びトリハロメチルを含み、ここで各Rは独立して、本明細書中で定義される−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００３６】
「アリールアルキル」は、末端炭素に結合している水素原子の１つがアリール部分で置換されている直鎖状アルキル、アルケニル又はアルキニル基をいう。典型的なアリールアルキル基は、これらに限定されないが、ベンジル、ナフチルメチル、ナフトベンジル、ベンジリデン、ベンジリジン、ベンゼノベンジル、ナフタレノベンジルなどを含む。好ましい実施形態では、アリールアルキル基は、（C6-C26）アリールアルキルであり、すなわち、アリールアルキル基のアルキル、アルケニル又はアルキニル部分が（C1-C6）であり、アリール部分が（C5-C20）である。好ましい実施形態では、アリールアルキル基は、（C6-C13）であり、すなわち、アリールアルキル基のアルキル、アルケニル又はアルキニル部分が（C1-C3）であり、アリール部分が（C5-C10）である。
【００３７】
「置換アリールアルキル」は、アリール部分の1以上の水素原子が、それぞれ独立して別の置換基で置換されているアリールアルキルラジカルをいう。典型的な置換基は、これらに限定されないが、−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−C(NR)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR−C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、−ハロゲン及び−トリハロメチルを含み、ここで各Rは独立して、本明細書中で定義される−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００３８】
「ヘテロアリールアルキル」は、末端炭素原子に結合した水素原子の１つが、ヘテロアリール部分で置換されている直鎖状アルキル、アルケニル又はアルキニル基をいう。好ましい実施形態では、ヘテロアリールアルキル基は、6-26員ヘテロアリールアルキルであり、すなわち、ヘテロアリールアルキルのアルキル、アルケニル又はアルキニル部分が（C1-C5）であり、ヘテロアリール部分が（イミダゾール以外の）5-20員ヘテロアリールである。特に好ましい実施形態では、ヘテロアリールアルキルが6-13員ヘテロアリールアルキルであり、すなわち、アルキル、アルケニル又はアルキニル部分が（C1-C3）であり、ヘテロアリール部分が5-10員ヘテロアリールである。
【００３９】
「置換ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリール部分の1以上の水素原子が、それぞれ独立して別の置換基で置換されているヘテロアリールアルキルラジカルをいう。典型的な置換基は、これらに限定されないが、−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−C(NR)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR−C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、−ハロゲン及び−トリハロメチルを含み、ここで各Rは独立して、本明細書中で定義される−H、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００４０】
５．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
６．発明の詳細な説明
「背景」の項で述べたように、CNS外傷を治療するための化合物としてのTRHの主な欠点は、その短い血漿半減期（4-5分）であり、そしてそれはin vivoでのペプチドの迅速な分解によると考えられる。TRHのピログルタミル部分のペプチダーゼによる開裂は、環式ジペプチド代謝産物シクロ（His-Pro）の形成を引き起こす。しかしながら、シクロ（His-Pro）及び他の環式ジペプチドは、天然に存在することがしられているが、哺乳類での生物学的活性が試験されたこれらの化合物は殆どない。試験されたもののうち、ほんの限られた数のものが何らかの生物学的活性を示す。特に、神経保護効果を示すか又は急性若しくは慢性の脳損傷後の作業及び学習記憶を増強するか、又は脳若しくは脊髄外傷、脳卒中又はアルツハイマー病などの神経変性疾患などの神経障害を治療するための環式ジペプチドで知られているものはない（既知の環式ジペプチド及びそれらの活性の概説としては、Prasad, 1995, Peptides 16(1):151-164を参照されたい；また、DD 246767、DD 153208及びGB 2127807も参照されたい）。
【００４１】
顕著なCNS活性を示すペプチダーゼ耐性TRH類似体は合成されている。しかしながら、今までのところ殆どの修飾は、TRH分子のピログルタミル及びプロリンアミド部分に限定されている。そのうち、最も神経保護性の類似体は化合物YM−14673であり、それは、TRHのピログルタミル部分が2−アゼチジノン部分で置換されている（Faden, 1989, 前掲）。該分子のヒスチジル部分になされた修飾は殆どなく、最も顕著なものは、イミダゾール環の種々の位置をトリフルオロメチル、ニトロ及び／又はハロゲン基で置換したものである（米国特許第5,686,420号を参照されたい）。これらの種々のTRH類似体のうち最も活性のあるものは、YM−14673のジヨード類似体である。TRH類似体YM−14673及びそのジヨード類似体（2−ARA−53aと呼ばれる）の構造を下記に示す：
【化２４】
0004443763.tif 000009
非常に驚いたことに、ある環式ジペプチド化合物（二環式2,5−ジオキソピペラジン；二環式2,5−ジケトピペラジン；シクロ（ジペプチド）；又はジペプチド無水物としても知られている）は、強い中枢神経系（CNS）活性を示すことが発見された。さらに、YM−14673及び2−ARA−53aなどの2−アゼチジノンTRH類似体のイミダゾール部分は、CNS活性には必要でないことが見出された。結果として、該分子のヒスチジル部分に顕著な修飾を含む2−アゼチジノンTRH類似体が強い中枢神経系活性を示すことが判明した。さらに、スルファニル基を含む環式ジペプチド化合物は、強いCNS活性を示すジスルフィド架橋二量体を形成できることが見出された。同様に、スルファニル基を含む2−アゼチジノン類似体は、強いCNS活性を示すジスルフィド架橋二量体を形成できる。さらに、一方の単量体が本発明の環式ジペプチド化合物であり、他方の単量体が本発明の2−アゼチジノンTRH類似体であるヘテロ二量体は、強いCNS活性を有する。
【００４２】
本明細書に記載された化合物の種々のクラスによって思いがけなく示された強いCNS活性故に、これらの全ての化合物は、認識作用、特に急性若しくは慢性の脳又は脊髄損傷後の作業及び学習記憶作用を増強するために使用できる。それらはまた、神経障害、特に脳外傷及び脊髄外傷を含む、CNSに対する外傷によって引き起こされた神経障害、並びに発作及びアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療にも使用できる。
【００４３】
本発明の化合物は、TRH及びその既知の類似体に比して多数の利点を提供する。例えば、本発明の化合物は、直接比較試験においてYM−14673より良好な神経保護効果を示し；全身的な作用に関しては殆ど示さず；そしてYM−14673より少ない興奮及び／又は自律神経作用を示す。さらに、本発明の化合物は、生体内に存在するプロテアーゼによる切断に感受性ではないので、それらはTRHよりも顕著に長いin vivo半減期を有する。結果として、本発明のTRH類似体は、TRHよりも低い用量で投与でき、そして、効果的であるためには連続的な輸液を必要とするTRHと違って、それらは単回の静脈内ボーラス注射で効果的に投与でき、それによって臨床現場での必然的な治療効果を与える。
【００４４】
6.1  化合物
本発明による神経保護剤として有用な（すなわち、CNS損傷若しくは神経病を治療する及び／又は記憶作用を増強するための）化合物は、一般に3つのクラスの化合物を含む。すなわち、二環式2,5−ジケトピペラジン類；2−アゼチジノンTRH類似体；及びそれらの種々のジスルフィド架橋ホモ及びヘテロ二量体である。二環式2,5−ジケトピペラジン類は、一般に、式（Ia）
【化２５】
0004443763.tif 000010
[式中、
nは、0〜3の整数であり；
Xは、−S−、−O−、−NR−及び−CH2−から選択され；
R1及びR2は、それぞれ独立して、−R、−OR、−SR、−NRR、−NO2、−CN、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(NR)NRR、ハロゲン、トリハロメチル、（C1-C6）アルキル、置換（C1-C6）アルキル、（C2-C6）アルケニル、置換（C2-C6）アルケニル、（C2-C6）アルキニル、置換（C2-C6）、（C5-C20）アリール、置換（C5-C20）アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、（C6-C26）アリールアルキル、置換(C6-C26）アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキル及び置換6-26員アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキル及び置換6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群より選択されるか、
又はR1及びR2は、一緒になって−CH2−(CH2)m−CH2−（ここで、mは0〜6の整数である）であり；
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルの置換基は、独立して−R、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2、−C(O)OR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、−NR−C(NR)−R、−NR−C(NR)−OR、−NR−C(NR)−SR、−NR−C(NR)−NRR、ハロゲン及びトリハロメチルからなる群から選択され；そして
各Rは、独立して−H、（C1-C6）アルキル、（C2-C6）アルケニル、(C2-C6）アルキニル、(C5-C20)アリール、（C6-C26）アリールアルキル、5-20員ヘテロアリール及び6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される]
を有する化合物である。
【００４５】
構造式（Ia）中、環の内側の数字は、親2,5−ジケトピペラジン環のIUPACナンバリングシステムに従う。n>1のとき、7及び8位の炭素原子の間に挿入される追加の炭素は、nの数値に応じて、7A、7B等と番号付けされる。
【００４６】
構造式（Ia）に見られるように、親二環式2,5−ジケトピペラジン環は、２つのキラル中心を3位の炭素（R1及びR2が互いに異なる置換基であるとき）及び6位の炭素に有する。本発明の化合物では、これら２つの炭素のキラリティーは、同一又は異なってもよく、R又はSのいずれかである。このように、本発明によって具体的に意図される化合物は、構造式（IIa）、（IIIa）、（IVa）及び(Va）によって記載される（ここで、R1、R2、X及びnは、上記構造式（Ia）で定義したとおりである）：
【化２６】
0004443763.tif 000011
0004443763.tif 000012
好ましくは、3位及び6位の炭素の両者でのキラリティーはSである。構造式（IIa）及び（IIIa）が好ましい。
【００４７】
当業者であれば、置換基R1及びR2もまたキラル中心を含むことができることを理解するであろう。さらに、R1及びR2置換基、並びに親二環式2,5−ジケトピペラジン環は、さらに互変異性、立体配座異性、又は幾何異性の現象を示しうる。本明細書中の式図は、たった１つの可能な互変異性、立体配座異性、鏡像体異性又は幾何異性形態を示すにすぎないので、本発明は、本明細書中に記載された生物学的又は薬理学的活性を示す、任意の互変異性、立体配座異性、鏡像体異性又は幾何異性形態を包含すると理解すべきである。
【００４８】
本発明の2−アゼチジノンTRH類似体は、一般に分子のピログルタミル部分が2−アゼチジノン部分で置換されており、分子のヒスチジル部分が修飾されているTRH化合物のクラスである。重要な点として、本発明のTRH類似体は、分子のヒスチジル部分にイミダゾール又は置換イミダゾール環を含まない。さらには、プロリンアミドは、O、N又はSなどのヘテロ原子を含むことができ、及び／又は4〜7個の環原子を含むことがきでる。このように、本発明の2−アゼチジノンTRH類似体は、下記構造式（Ib）：
【化２７】
0004443763.tif 000013
[式中、
nは、前記構造式（Ia）で定義したとおりであり；
Xは、前記構造式（Ia）で定義したとおりであり；
R3及びR4は、それぞれ独立して−H、−CN、−C(O)OR'、−C(O)NR'R'、−C(NR')NR'R'、トリハロメチル、（C1-C6）アルキル、置換（C1-C6）アルキル、（C2-C6）アルケニル、置換（C2-C6）アルケニル、（C2-C6）アルキニル、置換（C2-C6）アルキニル、（C5-C20）アリール、置換（C5-C20）アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員へテロアリール、（C6-C26）アリールアルキル、置換（C6-C26）アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキル及び置換6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択されるか、
又はR3及びR4は、一緒になって−CH2−(CH2)p−CH2−（ここで、pは、0〜6の整数である）であり；
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルの置換基は、独立して−R'、−OR'、−SR'、−NR'R'、−CN、−NO2、−C(O)OR'、−C(O)NR'R'、−C(S)NR'R'、−C(NR')NR'R'、−NR'−C(NR')-R'、−NR'−C(NR')−OR'、−NR'−C(NR')−SR'、−NR'−C(NR')−NR'R'、ハロゲン及びトリハロメチルからなる群から選択され；そして
各R'は、独立して−H、（C1−C6）アルキル、(C2-C6)アルケニル、（C2-C6）アルキニル、（C5-C20）アリール、（C6-C26）アリールアルキル、5-20員ヘテロアリール及び6-26員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される、
ただし、
(i) nが１；Xが−CH2−；そしてR3又はR4の一方が−Hであるとき、R3又はR4の他方は
【化２８】
0004443763.tif 000014
（ここで、R10は-CF3、−NO2又はハロゲンであり、R11は−Hであるか、又はR10が−Hであり、R11が−CF3であるか、又はR10及びR11はそれぞれ独立してハロゲンである）ではなく；及び／又は
(ii) nが1、2又は3であり；Xが−CH2−であり；そしてR3又はR4の一方が−H、（C1-C6）アルキル、（C2-C6）アルケニル又は（C2-C6）アルキニルであるとき、R3又はR4の他方は、−(CH2)a−R"（ここで、aは0、1、2又は3であり、R"はイミダゾリル、イミダゾール−5−イル、1個以上の−CF3、トリハロメチル、−NO2又はハロゲン基で独立して置換されたイミダゾリル、1個以上の−CF3、トリハロメチル、−NO2又はハロゲン基で独立して置換されたイミダゾール−5−イル、2,4−ジハロ−[1H]−イミダゾール−5−イル及び2,4−ジヨード−[1H]−イミダゾール−5−イルからなる群から選択される）ではない。
【００４９】
構造式（Ib）に見られるように、親分子は、３つのキラル中心を、アゼチジノン部分の4位の炭素、R3及びR4で置換された（R3及びR4が異なるとき）「骨格」α−炭素、及びプロリンアミド様部分の2位の炭素に有する。本発明のTRH類似体において、これら3つの炭素のキラリティーは、同一でも異なっていてもよく、R又はSのいずれであってもよい。このように、本発明によって具体的に意図されている化合物は、構造式（IIb）、（IIIb）、（IVb）、（Vb）、（VIb）、（VIIb）、（VIIIb）及び（IXb）に従う（ここで、R3、R4、X及びnは、前記構造式（Ib）で定義したとおりである）：
【化２９】
0004443763.tif 000015
0004443763.tif 000016
0004443763.tif 000017
本明細書に記載したTRH類似体の種々の実施形態のすべてにおいて、構造(IIb)および(IVb)に従うものが好ましい。
【００５０】
当業者ならば、置換基R3およびR4もキラル中心を含むことが理解できよう。さらに、R3およびR4置換基ならびに親分子はさらに、互変異性、配座異性、幾何異性の現象を示し得る。本明細書の範囲内にある構造式の図は、可能な互変異性、配座異性、鏡像異性または幾何異性型のうちのただ1つを示しており、本発明は本明細書に記載の生物学的または薬理学的活性を示す互変異性型、配座異性型、鏡像異性型または幾何異性型のいずれをも包含すると理解されるべきである。
【００５１】
当業者ならば、構造式(Ia)〜(Va)および(Ib)〜(IXb)（ここで、R1およびR2置換基のいずれか一方または双方、および／またはR3およびR4置換基のいずれか一方もしくは双方はそれぞれスルファニル基(-SH)を含む）の化合物が、ジスルフィド架橋二量体を形成し得ることが分かるであろう。かかる二量体は、1つの単量体が構造式(Ia)〜(Va)から選択されるジケトピペラジン化合物であり、もう1つの単量体が構造式(Ib)〜(IXb)から選択される2-アゼチジノンTRH類似体である、ヘテロ二量体であってもよい。あるいは、この二量体は、双方の単量体が構造式(Ia)〜(Va)から独立に選択されるジケトピペラジン化合物、または構造式(Ib)〜(IXb)から独立に選択されるTRH類似体のホモ二量体であり得る。かかるジスルフィド架橋二量体をin vivoで投与した場合、それらは単量体形態へと還元され得る。逆に、スルファニル含有単量体をin vivoで投与した場合、それらはジスルフィド架橋二量体形態へと酸化され得る。単量体形態および二量体形態双方がかなりの活性を有するため、これらの化合物の単量体形態および二量体形態の双方が本発明の範囲に包含される。
【００５２】
本発明の二量体は構造式(Ic)によって表すことができる。
【００５３】
(Ic)  A-(CH2)r-S-S-(CH2)r-B
式中、
-S-S-はジスルフィド架橋；
ｒは各々独立に1〜6の整数であり；かつ、
AとBは各々独立に：
【化３０】
0004443763.tif 000018
(式中、ｎは各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ia)に関して定義した通りであり；
Xは各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ia)に関して定義した通りであり；
R3は各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ia)に関して定義した通りであり；かつ、
R4は各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ib)に関して定義した通りである)
からなる群より選択される。
【００５４】
式(Ic)の二量体を構成する各単量体単位は、同一または異なる立体化学を有してよく、また(Ia)〜(Va)および(Ib)〜(IXb)のうちのいずれか1つの構造の特異的立体化学を有していてもよい。例えば、1つの単量体は構造式(IIa)に示された立体化学、もう一方は(IIb)に示された立体化学を有していてもよい。
【００５５】
構造(Ic)に従う一連の好ましい二量体には：
【化３１】
0004443763.tif 000019
(式中、
R2は各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ia)に関して定義した通りであり；かつ、
R4は各々、同一であっても異なっていてもよく、前記で構造式(Ib)に関して定義した通りである)
からなる群より選択される化合物が挙げられる。
【００５６】
構造式(Ic)に従う特に好ましい二量体としては、化合物14c、15cおよび16ｃがある。
【００５７】
【化３２】
0004443763.tif 000020
構造式(Ic)のジスルフィド架橋二量体は、それ自体TRH受容体に対しそれほど親和性は示さない。このように、それらの作用機構にはこれらの受容体との直接相互作用は関与していないようである。いずれの特定の理論に拘束されるつもりもないが、化学的に反応性のジスルフィド架橋を包含する構造式(Ic)の化合物は、in vivoでスルファニルを含有する単量体型に変換されると考えられる。グルタチオンの作用機構と類似して（Matsugo, 1995, Current Medicinal Chemistry 2:763-790）、構造式(Ic)の化合物の神経保護特性は、それらのフリーラジカルスカベンジャー特性に関与するものであろうと考えられる。
【００５８】
フリーラジカルに媒介される細胞の巨大分子（脂質、タンパク質、核酸等）の酸化は、卒中および頭部外傷を含む多くの病状に関与している（Kontos, 1989, Chem-Biol. Int. 72:229-255）。フリーラジカルにより媒介される酸化を誘発し得る反応性の酸素中間体には、スーパーオキシドラジカル陰イオン、過酸化水素および、攻撃性の強いヒドロキシルラジカルが含まれる。これらのラジカルは、主として連鎖反応の開始を通して作用し、神経膜に見られる不飽和脂質に対して広範囲にわたる損傷を与え、神経細胞壊死および結果として神経機能障害を引き起こし得る。
【００５９】
フリーラジカル酸化窒素も疾病経路に関与する。脳の活動の正常な状態下では、神経酵素である酸化窒素シンターゼ(NOS)により生成される酸化窒素は神経伝達物質としての役割を担うと考えられている。しかしながら、NOSの誘導可能な型は宿主防御機構においても働くために、慢性炎症の場合にフリーラジカル酸化窒素の過剰な産生が機能性組織の破壊を引き起こすこともあり得る(Moncadaら, 1991, Pharmacol. Rev. 43:12231-12234)。結果として、NOSの構成型（脳および血管内皮）および誘導型（マクロファージ）双方の阻害剤の発見に相当な注意が払われてきた。これらの構造の大多数はL-アルギニンの類似体である(Mooreら, 1994, J. Med. Chem. 37:3886-3888)。
【００６０】
部分的には、構造式(Ic)の二量体の推測される作用および疾病経路における特定のフリーラジカルと酵素の推測される役割により、本発明の重要な態様は、R1、R2、R3またはR4のうちの少なくとも1つがフリーラジカルスカベンジャーとしての特性を持つ部分、すなわちR1、R２、R３またはR4のうちの少なくとも1つが、反応性酸素中間体および酸化窒素双方が関与するカスケードを含むラジカル障害誘発カスケードを妨害する部分である、構造式（Ia)〜(Ib)および(Ic)の化合物である。
【００６１】
ラジカルスカベンジャー特性を有する、特に重要なクラスの本発明の化合物には、R1、R2、R3またはR4のうちの少なくとも1つが酸素−ラジカルトラップまたはNOSの阻害剤として作用する部分である、構造式(Ia)〜(Va)および(Ib)〜(IXb)の化合物が含まれる。酸素ラジカルトラップ（抗酸化剤）またはNOS阻害剤として作用する分子は、当技術分野において良く知られている。例えば、グルタチオン、チオレドキシンおよびビタミンEとCが酸素ラジカルスカベンジャー抗酸化剤として作用する（Matsugoら., 1995, 前記）。NOS阻害剤として作用する化合物には、例えばMooreら, 1994（前記）に記載されたL-アルギニン類似体が含まれる。その他の公知または後に発見されたラジカルスカベンジャー化合物またはNOS阻害剤も、R1、R2、R3またはR4置換基として有用である。本発明の範囲内で、TRH類似体および／または2,5-ジケト-ピペラジンを製造するためにR1、R2、R3またはR4置換基として使用できる活性に影響を与えるのにあずかる、公知または後に発見された抗酸化剤およびNOS阻害剤のそれらの部分を同定することは十分に当業者の能力の範囲内である。かかる部分は、構造式(Ia)〜(Va)および（Ib)〜(IXb)に示された主鎖構造に直接共有結合していてもよく、あるいは(C1-C6)アルキル鎖のような「リンカー」によって共有結合していてもよい。
【００６２】
本発明の化合物は、以下に記載されるさらなる好ましい実施形態を参照することにより、さらに明らかとなる。
【００６３】
一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式(Ia)〜(Va)の化合物である。
【００６４】
式中：
ｎは0〜3の整数であり；
Xは-S-、-O-、-NR-、および-CH2-からなる群より選択され；
R1およびR2は各々-H、-OR、-SR、-NRR、-NO2、-CN、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(NR)NRR、トリハロメチル、ハロゲン、(C1-C6)アルキル、置換(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、置換(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、置換(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アルカリル、置換(C6-C26)アルカリル、6-26員アルク-ヘテロアリールおよび置換6-26員アルク-ヘテロアリールからなる群より選択され、
またはR1およびR2はともに-CH2-(CH2)k-CH2-（ここで、ｋは0〜6の整数である）であり；
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリル、ヘテロアリールまたはアルク−ヘテロアリール置換基は独立に、-OR、-SR、-NRR、-CN、-NO2、-C(O)OR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(NR)NRR、ハロゲンおよびトリハロメチルからなる群より選択され；かつ、
Rは各々独立に-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、(C6-C26)アルカリル、6-26員アルク-ヘテロアリールからなる群より選択され、
ただし、(i)ｎが1または2であり、かつXが-CH2-であり、R1およびR2がともに-CH2-CH2-CH2-CH2以外である；かつ／または(ii)ｎが1または2であり、かつXが-CH2-であり、R1およびR2がともに-CH2-(CH2)Z-CH2-（ここでｚは1〜3の整数である）以外である；かつ／または(iii)ｎが1であり、Xが-CH2-であり、かつR1またはR2の一方がH、他方のR1またはR2が(C1-C6)アルキル、-NH2（好ましくは-(CH2)4-NH2）で一置換された(C１-C６)アルキル、-C(O)OH（好ましくは-CH2-C(O)OH）で一置換された(C1-C6)アルキル、-NH-C(NH)NH2 (好ましくは、-(CH2)3-NH-C(NH)NH2 ) で一置換された(C1-C6)アルキル、(C5-C20)アリール（好ましくはフェニル）、5-20員アルク−ヘテロアリール（好ましくは、アルキル部分が-CH2-であり、かつヘテロアリール部分がイミダゾール-2-イルもしくはインドール-3-イルである）、(C6-C26)アルカリル（好ましくはベンジル）、または-OHもしくは(C1-C6)アルコキシ（好ましくはp-ヒドロキシベンジル）で一置換された6-26員アルカリル以外である；かつ／または(iv)これらの化合物はシクロ（Pro-Ala）、シクロ（Pro-Val）、シクロ（Pro-Leu）、シクロ（Pro-ホモLeu）、シクロ（Pro-Ile）、シクロ（Pro-His）、シクロ（Pro-Phe）、シクロ(Pro-D-Phe)、シクロ（D-Pro-Phe）、シクロ（Pro-Tyr）、シクロ（Pro-Trp）、シクロ（Pro-Lys）、シクロ（Pro-Arg）もしくはシクロ(Pro-Asp)ではない（ここで特に断りのない限りアミノ酸はL-立体配置である）。
【００６５】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式（Ia)〜(Va)の化合物であり、より好ましくは構造式(IIIa)である(式中、Xは-CH2-であり、かつ／またはｎは1であり、かつR１およびR２は、前記で構造式(Ia)に関して定義した通り)。
【００６６】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式（Ia)〜(Va)の化合物であり、より好ましくは構造式(IIIa)である(式中R1はHおよびXであり、ｎおよびR２は前記で構造式(Ia)に関して定義した通り)。
【００６７】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式（Ia)〜(Va)の化合物である。
【００６８】
式中：
Xは-S-、-O-、-NH-または-CH2-であり；
ｎは1、2または3であり；
R1は-Hであり；
R2は-CH2-R5、-CH2-CH2-R5、または-CH2-CH2-CH2- R5であり；
R5はフェニル、イミダゾリル（好ましくはイミダゾール-2-イル以外である）、インドリル（好ましくはインドール-3-イル以外である）、-SR6、-OR6または-NHR6であり；かつ
R6は-H、(C1-C6)アルキル（好ましくはt-ブチル）、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、-C(NH)NH2または-C(S)NH2である。
【００６９】
本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は、構造式(IIa)および(IIIa)の化合物である(式中Xは-CH2-かつR5は-SR6である)。
【００７０】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式（Ia)〜(Va)の化合物である。
【００７１】
式中：
ｎは1〜3の整数であり；
Xは-S-、-O-、-NH-または-CH2-であり；
R1は-Hであり；
R2は-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニル、または-（CH2）g-CH2-R7であり；
ｇは0〜5の整数であり；
R7は-OR8、-SR8、-NR8R8、-CH(OR8)-CH３、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)NR8R8、-S-C-(NH)NH2、-NH-C-(NH)NH2、-NH-C-(S)NH2、フェニル、ヒドロキシフェニル、イミダゾリル、インドリルであり；かつ
R8は-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C2-C6)アルキニルである。本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は、式(IIa)または(IIIa)の構造式の化合物である(式中Xは-CH2-であり、かつ／またはｎは1である)。
【００７２】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、これらの化合物は構造式(Ia）〜(Va)の化合物である。ここで、
Xは-S-、-O-、-NH-または-CH2-であり；
ｎは1〜3の整数であり；かつ
R1およびR2はともに-CH2-(CH2)b-CH2-である（式中bは0〜6の整数である）。本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は、式(IIa)または(IIIa)の構造式の化合物である(式中Xは-CH2-であり、かつ／またはｎは1である）。
【００７３】
もう1つの一連の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、以下の(1a)〜(10a)の化合物から選択される：
【化３３】
0004443763.tif 000021
0004443763.tif 000022
もう1つの一連の好ましい実施形態では、本発明の化合物は構造式（Ia)〜(Va)の化合物である。ここで、
Xは-CH2-であり；
ｎは1であり；
R1は-Hであり；かつ
R2は-(CH2)q-R18である（式中ｑは0〜4の整数、かつR18はフリーラジカル捕捉剤またはNOS阻害剤として作用する部分である）。本発明のこの態様に従う好ましい化合物は、R18部分がジ-t-ブチル-ヒドロキシフェニル、3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル、トコフェロール、2,3-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾフラン-3-イル、ニトロン、2,4-ジオキソ-イソキノリルおよび2,4-ジオキソ-イソキノール-3-イルからなる群より選択される、フリーラジカル捕捉剤である化合物、および／またはR18部分が、-NR19-C(NR19)-R19、-NH-C(NH)-R19、-NR19-C(NR19)-SR19、-NR19-C(NH)-SR19、-NR19-C(NR19)-NR19R19、および-NH-C(NR19)-NH2からなる群より選択される、NOS阻害剤である化合物である（式中、R19は各々独立に-Hおよび(C2-C3)アルキルからなる群より選択される）。本発明のこの態様に従う好ましい化合物としては以下の化合物が挙げられる。
【００７４】
【化３４】
0004443763.tif 000023
0004443763.tif 000024
もう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明の化合物は式(Ib)〜(IXb)（ここで、nは1であり、Xは-CH2-である）の化合物から選択される。
【００７５】
もう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明の化合物は構造式(Ib)〜(IXb) に従うものである（ここで、ヘテロアリールはイミダゾリルではなく、置換ヘテロアリールは置換イミダゾリルではない）。
【００７６】
もう１つの一連の好ましい実施形態では、TRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb)に従う化合物である。ここで、R3およびR4はともに-CH2-(CH2)p-CH2-（ここでpは0〜6の整数である）である。
【００７７】
もう１つの一連の好ましい実施形態では、TRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb)に従う化合物である。ここで、R3またはR4の一方は-Hであり、他方は-(CH2)c-OR'、-(CH2)c-SR'および-(CH2)c-R12からなる群より選択される。ここでcは1〜3の整数（好ましくは1）であり、R'は構造(Ib)に関して前記で定義した通りであり、かつ、R12は(C5-C20)アリール、置換(C5-C20)アリール、5-20員ヘテロアリール、置換5-20員ヘテロアリール、(C６-C2６)アリールアルキル、置換(C６-C2６)アリールアルキル、6-26員ヘテロアリールアルキルおよび置換6-26員ヘテロアリールアルキルである。ただし、nが1のときXは-CH2-であり、R３またはR4の一方が-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニルまたは(C2-C6)アルキニルであって、R３またはR4の他方は-(CH2)h-R13ではない（ここでhは0、1、2または3であり、R13はイミダゾリル、イミダゾール-5-イル、独立に１以上の-CF3、トリハロメチル、-NO2またはハロゲン基で置換されたイミダゾリル、独立に１以上の-CF3、トリハロメチル、-NO2またはハロゲン基で置換されたイミダゾール-5-イル、2,4-ジハロ-[1H]-イミダゾール-5-イルおよび2,4-ジヨード-[1H]-イミダゾール-5-イルからなる群より選択される）。本発明のこの態様に従う化合物の中で好ましいのは、R'が-Hまたは(C1-C4)アルキル（好ましくはメチルもしくはt-ブチル）であって、R12がピラゾリル（好ましくはピラゾール-1-イル）またはインドリル（好ましくはインドール-3-イル）である化合物である。
【００７８】
もう１つの一連の好ましい実施形態では、TRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb)に従う化合物である（ここでR3およびR4は各々独立に、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニルおよび(C2-C6)アルキニルからなる群より選択される）。本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は、R3およびR4が各々メチルであるものである。
【００７９】
もう１つの一連の好ましい実施形態では、TRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb) に従う化合物である。ここで、
Ｘは-CH2-であり；
nは1であり；
R3は-Hであり；かつ、
R4は-(CH2)d-R14である（ここでdは0〜4の整数であり、R14はフリーラジカル捕捉剤またはNOS阻害剤として作用する部分である）。本発明のこの態様に従う好ましい化合物は、R14部分がジ-t-ブチル-ヒドロキシフェニル、3,5-ジ-t-ブチル-4-ヒドロキシフェニル、トコフェロール2,3-ジヒドロ-5-ヒドロキシ-2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾフラン-3-イル、ニトロン、2,4-ジオキソ-イソキノリルおよび2,4-ジオキソ-イソキノール-3-イルからなる群より選択される化合物、
および／またはR14部分が-NR15-C(NR15)-R15、-NH-C(NH)-R15、-NR15-C(NR15)-SR15、-NR15-C(NH)-SR15、-NR15-C(NR15)-NR15R15および-NH-C(NR15)-NH2（ここでR15は各々独立に-Hおよび(C1-C3）アルキルからなる群より選択される)からなる群より選択されるNOS阻害剤である化合物である。本発明のこの態様に従う好ましい化合物としては以下の化合物が挙げられる。
【００８０】
【化３５】
0004443763.tif 000025
もう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明のTRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb）に従う化合物である。ここで、
Xは-CH2-であり；
ｎは1であり；
R3は-Hであり；かつ
R4は-(CH2)e-OR16、-(CH2)eSR16および-(CH2)e-R17からなる群より選択される（ここでeは1〜3の整数（好ましくは1）であり、R16は-Hまたは(C1-C4)アルキル（特には-Hまたはt-ブチル）であり、R17は(C5-C10）ヘテロアリール、ピラゾリル（特にはピラゾール-1-イル）またはインドリル（特にはインドール-3-イル）である。ただし、ヘテロアリールはイミダゾリルまたはイミダゾール-5-イルではない)。
【００８１】
本発明のこの態様に従う好ましい化合物としては、以下のものが挙げられる。
【００８２】
【化３６】
0004443763.tif 000026
なおもう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明のTRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb)に従う化合物である。ここで、
Xは-CH2-であり；
nは1であり；かつ
R3およびR4は各々独立に(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニルおよび(C2-C6)アルキニルからなる群より選択される。本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は、以下の通りである。
【００８３】
【化３７】
0004443763.tif 000027
さらにもう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明のTRH類似体は構造式(Ib)〜(IXb)に従う化合物である。ここで、
Xは-CH2-であり；
nは1であり；かつ
R3およびR4はともに-CH2-(CH2)w-CH2である（ここでwは0〜6の整数である）。本発明のこの態様に従う特に好ましい化合物は以下の通りである。
【００８４】
【化３８】
0004443763.tif 000028
なお、更なるもう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明のTRH類似体は構造式(Ic)（ここで各Xは-CH2-であり、各nは1である）に従うヘテロまたはホモ二量体である。
【００８５】
本発明の１つの好ましい実施形態は、以下のようなヘテロ二量体である。
【００８６】
【化３９】
0004443763.tif 000029
もう１つの一連の好ましい実施形態では、本発明のTRH類似体は構造式(Ic)に従うヘテロ二量体またはホモ二量体ある。ここで、
Xは-CH2-であり；
nは1であり；
R２およびR4は各々独立に-H、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニルおよび(C2-C6)アルキニルからなる群より選択され；かつ
ｒは各々独立に1〜6の整数である。本発明のこの態様に従う特に好ましいホモ二量体は以下の通りである。
【００８７】
【化４０】
0004443763.tif 000030
最後の好ましい実施形態は、以下の構造式を有する化合物である。
【００８８】
【化４１】
0004443763.tif 000031
本発明の化合物は遊離酸の形態でも、遊離塩基の形態でも、あるいは製薬上有効なその塩であってもよい。かかる塩は化合物を適当な酸で処理することにより容易に製造できる。かかる酸としては、限定されるものではないが例示すれば、ハロゲン化水素酸（塩化水素、臭化水素など）、硫酸、硝酸、リン酸、などのような無機酸；および酢酸、プロピオン酸、2-ヒドロキシ酢酸、2-ヒドロキシプロピオン酸、2-オキソプロピオン酸、プロパン二酸、ブタン二酸などのような有機酸が挙げられる。逆に、塩はアルカリで処理することにより遊離塩基形態へ変換できる。
【００８９】
前記の化合物および製薬上許容されるそれらの塩の他、本発明では適当であれば溶媒和形態ならびに非溶媒和形態の化合物（例えば、水和形態）を使用してもよい。
【００９０】
本発明の化合物は化学化合物の製造に適用できることが知られているいずれの方法によって製造してもよい。好適な方法は当技術分野で十分に公知である。好ましい方法は代表的な実施例により示されている。必要な出発物質は市販のものを入手してもよいし、あるいは有機化学の標準的な方法により得てもよい。
【００９１】
例としては、本発明の環状ジペプチドは、以下のスキーム(I)で示されているように、適当なα-アミノ酸と適当なα-イミノ酸とを縮合させることにより便宜に製造できる。
【００９２】
【化４２】
0004443763.tif 000032
スキーム(I)において、R1、R2、Xおよびnは前記で構造式(I)に関して定義した通りである。スキーム(I)によれば、適当なα-アミノ酸11を、十分公知な方法に従い、溶媒としてのジオキサン／水中のジ-t-二炭酸塩(Boc2O)および重炭酸ナトリウムを用いて、対応するN-t-ブチルカルバメート12として保護する（例えば、Williamsら, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, 1997, CRC Press, Boca Raton, FL; AthertonおよびSheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford, England, ならびにそれらに記載されている参照文献を参照）。N保護ジペプチド14は、ジクロロメタン(DCM)またはジメチルホルムアミド(DMF)溶媒中、縮合剤として1,3-ジシクロヘキシルアルボジイミド(DCC)および1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール(HOBT)を用い、N-t-ブチルカルバメート12とα-イミノアミド13とを縮合させることにより製造される。DCM中50%のトリフルオロ酢酸(TFA)を用いてN-t-ブチルカルバメート14を脱保護した後、遊離アミノ中間体15をDCM溶媒中の大過剰のトリエチルアミン(N(Et)3)で処理すると、所望の二環式2,5-ジケトピペラジン（環状ジペプチド）16が形成する。
【００９３】
鏡像異性的に純粋な本発明の化合物は便宜には、鏡像異性的に純粋なα-アミノ酸11およびα-イミノアミド13を出発物質として用いることにより製造できる。出発物質の操作により、構造(II)、(III)、(IV)および(V)の全範囲の鏡像異性体、ならびにこれら構造式のラセミ混合物が容易に製造できる。
【００９４】
nが1であるα-イミノアミド13は市販のものを入手できる。n>1であるα-イミノアミド13は市販のものを入手できるか、または標準的な技術を用いて容易に製造できる（例えば、Nattら, 1981, J. Med. Chem. 24:682-688 を参照）。
【００９５】
例えば、TRH類似体は、下記のスキーム(II)に示されているように、適切に保護されたα-アミノ酸20を適当なα-アミノアミド22および2-オキソアゼチジン-4-カルボン酸25と縮合することによって都合よく調製することができる。
【００９６】
0004443763.tif 000033
スキーム(II)において、R3、R4、Xおよびnは、上記の構造式(Ib)で定義したとおりである。スキーム(II)によれば、適当なα-アミノ酸20は、周知の方法(例えば、Williamsら, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, 1997, CRC Press, Boca Paton, FL; Atherton & Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford, England, ならびにかかる文献に引用された参考文献を参照されたい）にしたがって溶媒としてのジオキサン／水中でジ-tert-ブチル-ジカーボネート(Boc2O)および重炭酸ナトリウムを用いて対応するN-tert-ブチルカルバメートとして保護されている。N-保護ジペプチド23は、N-tert-ブチルカルバメート21とα-アミノアミド22とを、ジクロロメタン(DCM)またはジメチルホルムアミド(DMF)溶媒中で縮合剤として1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を用いて縮合することによって調製される。DCM中で50%トリフルオロ酢酸(TFA)を用いてN-tert-ブチルカルバメート23を脱保護し、その後すぐにDCC/ペンタフルオロフェノールを用いて生じたジペプチドアミド24を2-オキソアゼチジン-4-カルボン酸25とカップリングすることにより所望の4-置換2-アゼチジノンTRH類似体26が得られる。これは、カラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００９７】
一方、本発明の2-アゼチジノンTRH類似体は、スキーム(III)にしたがって合成することができる。
【００９８】
0004443763.tif 000034
スキーム(III)において、R3、R4、Xおよびnは、上記の構造式(Ib)で定義したとおりである。スキーム(III)によれば、t-ブチルジメチルシリル（TBDMS)N-保護2-オキソアゼチジン-4-カルボン酸28を、室温にて、DMF溶媒中で縮合剤としてDCC/ペンタフルオロフェノールを用いてアミノ酸ベンジル(Bn)エステル27とカップリングすることによりN-保護ジペプチドエステル29が得られる。中間体ジペプチド29の接触水素化によりN-保護ジペプチド30が得られ、次いでこれを0℃にてDMF溶媒中で縮合剤としてDCC/HOBtを用いてα-アミノアミド22と縮合することにより2-アゼチジノンTRH類似体26が得られる。
【００９９】
アゼチジン-2-オン25および28は、スキーム(IV)にしたがって合成することができる。
【０１００】
0004443763.tif 000035
スキーム(IV)によれば、アスパラギン酸ジベンジルは、ディーン・スターク(Dean-Stark)装置中でアスパラギン酸31、ベンジルアルコール(BnOH)およびp-トルエンスルホン酸(TsOH)のベンゼン溶液を還流することによって調製される。このジエステルをトリエチルアミンおよびトリメチルシリルクロリド(TMSCl)と反応させた後、t-ブチルマグネシウムクロリド(t-BuMgCl)と反応させることにより、N-(ベンジルオキシ-カルボニル)アゼチジン-2-オン32が良好な収量で得られる。32の接触水素化により4-オキソアゼチジン-2-カルボン酸25が得られる。
【０１０１】
N-保護アゼチジン-2-オンエステル33は、N-(ベンジルオキシカルボニル)アゼチジン-2-オン32を、DMF溶媒中イミダゾールの存在下にてT-ブチルジメチルシリルクロリド(TBDMSCl)でシリル化することにより調製することができる。エステル33の接触水素化によりN-保護アゼチジン-2-オン28が得られる。
【０１０２】
N-ベンジル-4-オキソ-2-アゼチジン-3-カルボン酸35(当業者は、これを用いて本明細書に記載した方法をわずかに変更することにより本発明のTRH類似体を合成することもできる。)の調製は、事前にイミンを生成させた後、シアノ-水素化ホウ素ナトリウムで還元し、次いでエーテル溶媒中でt-BuMgClを用いて環化してアゼチジン-2-オン誘導体34を得ることでアスパラギン酸31をN-ベンジル化することにより行うこともできる。誘導体34の接触水素化によってN-ベンジル-4-オキソアゼチジン-2-カルボン酸35が得られる。
【０１０３】
本発明のエナンチオマーとして純粋な化合物は、出発物質としてエナンチオマーとして純粋なα-アミノ酸20、α-アミノアミド22およびアスパラギン酸31を用いて都合よく調製することができる。この出発物質の操作により、構造(IIb)〜(IXb)で示される全範囲の立体異性体ならびにこれらの構造式のラセミ混合物を容易に調製することができる。
【０１０４】
nが１であるα-アミノアミド22は市販されている。n＞1のα-アミノアミド22は市販されているか、標準的な手法(例えば、Nattら, 1981, J. Med. Chem. 24:682-688を参照されたい)を用いて容易に調製することができる。エナンチオマーとして純粋なα-アミノ酸20およびアスパラギン酸31は市販されている。
【０１０５】
スキームV
式(Ic)のジスルフィド架橋ダイマーは、スキーム(V)の適当なスルファニル含有モノマーの穏やかな酸化によって調製することができる。
【０１０６】
0004443763.tif 000036
スキームVにおいて、A、Bおよびrは、構造(Ic)で定義したとおりである。穏やかな酸化剤としては、例えば、ヨウ素が挙げられる。特定の立体化学を有するダイマーに関し、エナンチオマーとして純粋な出発物質は上記のように調製し得る。実施例ににはヘテロダイマー14cを合成するための別の方法を記載する。
【０１０７】
多くの場合、α-アミノ酸11または20は、本発明の化合物を合成するのに使用した条件下で反応性のある官能基を有する置換基R1および／またはR2を含み得ることが認識されるであろう。かかる場合、官能基は合成条件に対して安定な保護基で保護され得る。もちろん、適当な保護基は、保護を必要とする特定の官能基の特性に依存するだろう。種々の合成条件下で広範な種類の官能基を保護するのに適した基は、例えば、Green & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第2版, 1991, John Wiley & Sons, NY.に記載されている。適当な保護基を選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０８】
個々の化合物の、記憶機能を高めることおよび／または神経障害を治療することに関連した神経保護剤としての活性および効力は、標準的な手法を用いて測定し得る。一般に、本発明の活性化合物は、CNS損傷または神経変性障害の標準化モデル（例えばアルツハイマーのマウスモデル）において神経保護作用を示す化合物である。神経保護作用は、認識作業、運動性作業、磁気共鳴画像法(MRI)または組織学的方法を用いて実証することができる。認識力増強作用は、空間学習および／または作業記憶の古典的検査、例えば、Morris Water Maze, Barnes Maze等を用いて実証することができる。
【０１０９】
一般に、活性化合物は、非処置動物対照および／またはプラシーボもしくは媒体(vehicle)処置動物対照と比べて、組織学的検査において低い神経細胞損傷を示すか、または行動結果の改善（すなわち運動性作業または認識作業における神経スコア(neuroscores)の改善）を示す化合物である。あるいは、活性化合物は、公知の神経保護剤または認識力増強剤で処置した陽性動物対照と比べて、組織学的検査において同様の神経細胞損傷を示すか、または同様の行動結果（すなわち、運動性作業または認識作業において同様の神経スコア）を示す化合物である。活性を実証するのに適したモデルおよび検査を、下記の実施例に示す。
【０１１０】
6.1  製剤化および投与経路
本明細書に記載した化合物、またはその薬学的に許容される付加塩もしくは水和物は、広範な種類の投与経路または投与様式を用いてヒトなどの被験者に送達し得る。適当な投与経路としては、吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、腸管投与、および筋内注射、皮下注射、および静脈内注射のような非経口投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
上記で説明したように、本発明の化合物の有意な利点は、有効にするために連続注入が必要なTRHと比べて、単回ボーラス注射によって有効に投与し得ることにある。したがって、本発明の化合物は広範な種類の経路または様式で投与し得るが、単回ボーラス静脈注射による投与が好ましい。また本発明の化合物は、自律神経性作用または内分泌性作用もほとんどないので、これらの化合物は潜在的に安全なものであり、認識作用の治療などにおいて慢性的に使用可能である。
【０１１２】
本明細書に記載された化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または水和物は、単独で、本発明のその他の化合物と組合わせて、および／またはその他の治療剤と混合したカクテルとして投与し得る。もちろん、本発明の化合物と同時投与し得る治療剤の選択は、一部は、治療される症状に依存するであろう。
【０１１３】
例えば、本発明の化合物は、痛覚およびその他の症状ならびに一般に神経障害と関連した副作用を治療するのに用いられる薬剤を含有するカクテルとして投与し得る。
【０１１４】
本発明の化合物は、一般に神経障害を治療するのに用いられるその他の薬剤を含むカクテルとして投与することもできる。
【０１１５】
活性化合物は、そのままで投与してもよく、または1種もしくは複数の活性化合物ならびに1種以上の製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。投与される化合物は、エナンチオマーとして純粋であってもよく、またはエナンチオマーの混合物であってもよい。本発明にしたがって使用するための医薬組成物は、活性化合物の製薬上使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤(auxiliaries)を含む1種以上の生理学的に許容される担体を用いて通常の方法で製剤化することができる。適正な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０１１６】
注射のためには、本発明の薬剤は、水溶液として、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理的食塩水バッファーのような生理学的適合性のあるバッファーとして製剤化され得る。経粘膜投与のためには、透過する関門に適した浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般的には当技術分野で公知である。
【０１１７】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物と当技術分野で周知の製薬上許容される担体を組み合わせることにより製剤化され得る。そのような担体は、本発明の化合物を、治療される患者の経口摂取のための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを容易にする。経口使用するための医薬製剤は、固形賦形剤を混合し、任意に得られた混合物を粉砕し、所望により錠剤または糖剤のコアを得るために適当な補助剤を加えた後に粒状体からなる混合物を加工することにより得られ得る。適当な賦形剤は、特に、充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖質；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン(PVP)である。所望により、崩壊剤、例えば架橋ピリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）を加えてもよい。
【０１１８】
糖剤コアには適当なコーティングを施す。この目的のために、濃縮した糖溶液が用いられ得る。この溶液には任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物が含まれていてもよい。識別または活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために錠剤または糖剤コーティングに染料または色素を加えてもよい。
【０１１９】
経口使用し得る医薬製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプセル剤ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールなどからなる軟質の密封カプセル剤が含まれる。プッシュフィットカプセル剤は、活性成分と、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、ならびに任意に安定剤との混合物を含み得る。軟質カプセル剤においては、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用の製剤は全てかかる投与に適した剤形であるべきである。
【０１２０】
舌下投与のために、組成物は、通常の手法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１２１】
吸入投与のために、本発明で使用するための化合物は、通常、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適当なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレー噴霧の形態で送達される。加圧エアゾールの場合、計測した量を送達するためのバルブを設けることにより投薬単位を決定することができる。吸入器または注入器に使用するために、本発明の化合物と適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含む、例えばゼラチンからなるカプセル剤およびカートリッジが製剤化され得る。
【０１２２】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用の製剤は、保存剤を加えて、単位剤形、例えばアンプルまたは多回投与容器中に入れた状態で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得る。そして懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。
【０１２３】
非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁剤は、適当な油性注射懸濁剤として調製し得る。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁剤は、懸濁剤の粘性を増大させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含み得る。任意に、懸濁剤は、適当な安定剤またはかなり濃縮された溶液の製剤を準備するために化合物の溶解性を増大させる作用剤も含み得る。
【０１２４】
一方、活性成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水と混合するために粉末形態であってもよい。
【０１２５】
本発明の化合物は、例えば、カカオバターまたはその他のグリセリドなどの通常の座剤基剤を含む座剤または保持浣腸剤のような直腸内投与用組成物にも製剤化され得る。
【０１２６】
上記の製剤に加えて、本発明の化合物は、デポ製剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みまたは経皮送達（例えば皮下または筋内）、筋内注射または経皮パッチによって投与し得る。したがって、例えば、本発明の化合物は、適当なポリマー材料もしくは疎水性材料とともに（例えば許容しうる油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂とともに、または溶解性の低い誘導体、例えば溶解性の低い塩として製剤化され得る。
【０１２７】
医薬組成物は、適当な固相もしくはゲル相の担体または賦形剤も含み得る。かかる担体または賦形剤としては、例えば、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
【０１２８】
6.3 有効投与量
本発明の使用に適した医薬組成物には、活性成分が治療有効量、すなわちその所期の目的を達成するのに有効な量含まれる組成物が包含される。もちろん、特定の用途に対して有効な実際の量は、特に、治療される症状、患者の年齢および体重ならびに医師の判断などの種々の要素に依存する。例えば、神経保護剤として投与する場合、そのような組成物はかかる結果を得るのに有効な量の活性成分を含む。記憶力を高めるための方法において投与する場合、そのような組成物はかかる結果を得るために有効な量の活性成分を含む。有効量の決定は、特に本明細書の詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１２９】
本明細書に記載した任意の化合物について、ヒトでの使用に対する治療有効量は動物モデルから容易に決定することができる。例えば、ヒトに対する用量は、動物において治療される特定の適応症に有効であることが分かっている循環濃度を達成するように処方することができる。本明細書に記載した化合物で治療できる神経障害についての有用な動物モデルは当技術分野で周知であり、例えば、McIntoshら, 1989, Neuroscience 28(1):233-244; Faden, 1989, Brain Research 486:228-235; Grahamら, 1990, Neurosci. Lett. 110:124-130; YakovlevおよびFaden, 1994, Mol. Chem. Neuropathy 23:179-190; Andrewsら, 1988, J. Pharmacol. Exp. Ther. 247(3):1248-1254; Fadenら, 1989, Science 244:798-800; Fadenら, 1990, J. Pharmacal. Exp. Ther. 255(2):451-458; Grahamら, 1993, Brain Research 632:346-350; Soc. Neurosci. Abstr.に記載されている。
【０１３０】
治療有効用量は、同様の薬理学的活性を示すことが知られている化合物、例えばTRH、または好ましくはYM-14673についての動物またはヒトのデータから決定することもできる。適用される用量は、投与される化合物の、これらの他の薬剤と比べた場合の相対的な生物学的利用能、効力およびin vivo半減期に基づいて調整することができる。
【０１３１】
上記の方法および当技術分野で周知のその他の方法に基づいてヒトにおいて最大効力を得るための用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３２】
もちろん、局所投与の場合、投与された化合物の全身循環濃度はそれほど重要ではない。そのような場合、化合物は、局所領域で所期の結果を得るのに有効な濃度になるように投与される。
【０１３３】
記憶力を高め、および／またはCNS損傷（卒中など）、アルツハイマー病のような神経変性障害ならびに中枢神経系損傷により引き起こされる神経障害を治療することにおける使用のために、投与される化合物の単回静脈内ボーラス投与量は約0.1mg/kg〜10mg/kgであるのが有効であると考えられる。
【０１３４】
本明細書に記載した化合物の経口投与のための患者投与量は、典型的には、約0.4mg/日〜40 mg/日であり、より典型的には約1mg/日〜20mg/日であり、最も典型的には約2mg/日〜6mg/日である。
【０１３５】
その他の投与様式のために、投薬量および間隔を、それぞれ、特定の治療される臨床上の適応症に有効な血漿レベルの投与化合物がもたらされるように調整することができる。
【０１３６】
典型的には、本発明の化合物は、脊髄および／または脳損傷後に投与される。当業者は、多くの場合、損傷から化合物投与までの間隔が投薬量レベルに影響し得ることを認識するだろう。損傷後短時間のうちに化合物を投与することにより一定の利益が得られ得るので、投与様式にかかわらず損傷後できるだけ早く化合物を投与することが好ましい。しかしながら、化合物を、損傷後数時間のうちに投与した場合、あるいは数日間または数週間のうちに投与した場合にも、治療上の利益が得られると考えられる。さらに、神経変性障害、例えばアルツハイマー病を治療する方法において使用する場合、症状の発現の数年後の投与であっても治療上の利益がもたらされ得る。
【０１３７】
認識力を高める方法、特に記憶機能を増強する方法において使用する場合、本発明の化合物は、上記のように、急性または慢性的脳損傷後に投与され得る。あるいは、化合物は、脳損傷を受けていない動物およびヒトの記憶力を高めるために用いてもよい。そのような場合、化合物は、日用投与計画(daily regimen)の一部として、または所望の記憶パフォーマンスの改善が得られてから数日間もしくは数時間のうちに投与され得る。
【０１３８】
本明細書に記載した教示と組合せて、種々の活性化合物の中から選択し、効力、相対的生物学的利用能、患者の体重、有害な副作用の重篤度、好ましい投与様式、ならびに損傷から治療までの間隔などの要素を比較検討することにより、実質的な毒性を生じさせないが、特定の患者が示す臨床症状を治療するのに全く効果的である有効な治療的処置計画をたてることができる。
【０１３９】
6.4 毒性
特定の化合物に関する毒性と治療効果との間の比は、その治療指数であり、LD50（集団の50%に致死である化合物の量）とED50(集団の50%に対して有効な化合物の量)との比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。動物の研究から得た治療指数データは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を考慮する際に使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは、ED50を含み毒性をほとんどまたは伴わない血漿濃度の範囲内にあることが望ましい。用量は、この範囲内で、用いられる投薬剤形および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な処方、投与経路および用量は、患者の症状を考慮して個々の医師が選択できる（例えばFinglら、1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics等を参照されたい）。
【０１４０】
本発明をこれまでに記述してきたが、以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであり、本発明を限定するものではない。
【０１４１】
7. 実施例:化合物の合成
本実施例は、本発明に従った、特定の典型的な化合物の好ましい合成方法を示すものである。
【０１４２】
出発物質はAldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)または他の商業的供給者から入手した。溶媒を以下のように精製した：ジエチルエーテルおよびシクロヘキサンは五酸化リンから蒸留した；THFは新たに窒素下でナトリウムベンゾフェノンから蒸留した。
【０１４３】
赤外線(IR)スペクトルはATI Mattson Genesis spectrometer上で記録した。1Hおよび13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian Unity Inova instrumentを用いて300MHzおよび75.46MHzでそれぞれ得た。内部標準であるテトラメチルシラン(TMS)から低磁場側の1H化学シフト(δ) (ppm)が報告される。13C化学シフトはCDCl3(セントラルピーク、δ=77.0 ppm)、ベンゼン-d5(セントラルピーク、δ=128.0 ppm)またはDMSO-d5(セントラルピーク、δ=39.7 ppm)に対するものとした。
【０１４４】
融点はPyrexキャピラリー中でThomas Hoover Unimelt apparatusで測定され、補正されていない。マススペクトルは、70eVのイオン化ポテンシャルでのEIモード中で測定された。薄層クロマトグラフィー(TLC)は、Merck silica gel 60F254 ガラスプレート上で行った；カラムクロマトグラフィーを、Merck silica gel(60-200メッシュ)を使用して行った。以下の略語を使用した：DMSOはジメチルスルホキシドである；エーテルはジエチルエーテルである；THFはテトラヒドロフランである；MeOHはメタノールである；EtOAcは酢酸エチルである；DCMはジクロロメタンである；L-ProNH2はL-プロリンアミドである；DCCはジシクロヘキシルカルボジイミドである；HOBtは1-ヒドロキシベンゾトリアゾールである；Boc2Oはジ-tert-ブチルジカーボネートである；Et3Nはトリエチルアミンである。
【０１４５】
7.1 シクロ[(1-アミノ-1-シクロプロパン-カルボン酸)-Pro](化合物1a)の合成
ジオキサン(10ml)/水(6ml)中の1-アミノ-1-シクロプロパン-カルボン酸（「ACC」）(0.2g, 1.98mmol)溶液にNaHCO3(0.25g, 2.97mmol)およびBoc2O(0.65g, 2.97mmol)を添加した。その結果得られた混合物を25℃で15時間攪拌した。溶媒をエバポレートし、粗残留物をEtOAc(30ml)に溶解させ、10%HCl(30ml)、塩水(30ml)で洗浄し、乾燥させて(Na2SO4)濃縮し、1-(t-ブトキシカルボニルアミノ)-1-シクロプロパン-カルボン酸(N-t-Boc-ACC)を白色固体として得た(0.30g, 75%)。
【０１４６】
0004443763.tif 000037
DMF中のN-t-Boc-ACC(0.42g, 2.08mmol)溶液(7ml)へ、DCC(0.47g, 2.28mmol)およびHOBt(0.36g, 2.28mmol)を添加した。得られた混合物を25℃で2時間攪拌した。L-ProNH2(0.36g, 3.13mmol)を添加し、混合物を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残存物を濾過して除き、清澄な溶液を減圧下で濃縮した。残存物をEtOAc(60ml)に溶解させ、水(2×50ml)、飽和NaHCO3(50ml)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させて(Na2SO4)濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(DCM/MeOH 9/1)により、N-t-Boc-ACC-L-ProNH2を白色泡沫として得た(0.07g, 11%)。
【０１４７】
0004443763.tif 000038
DCM中のN-t-Boc-ACC-L-ProNH2(0.06g, 0.20mmol)の溶液(6ml)へ、0℃でトリフルオロ酢酸(2ml)を添加した。その結果得られた溶液を0℃で1時間攪拌し、続いて減圧下で濃縮した。粗残存物をDCM(10ml)中に溶解させ、続いてEt3N(0.5ml)を添加した。この溶液を25℃で15時間攪拌し、続いて飽和NH4Cl(2×20ml)、塩水(20ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(EtOAc/MeOH)により、表題の化合物（化合物1a）を白色固体として得た(20mg, 55%)。
【０１４８】
0004443763.tif 000039
7.2 シクロ[(1-アミノ-1-シクロヘキサン-カルボン酸)-Pro](化合物2a)の合成
DCM中の1-(t-Boc-アミノ)-1-シクロヘキサン-カルボン酸(0.60g, 2.46mmol)溶液(10ml)に、DCC(0.51g, 2.46mmol)、HOBt(0.38g, 2.46mmol)およびL-ProNH2(0.28g, 2.46mmol)を添加した。反応混合物を25℃で18時間攪拌した。固体を濾過し、清澄な溶出液を飽和NaHCO3(50ml)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させて(Na2SO4)濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(DCM/MeOH 9/1)により、[1-(N-t-Boc-アミノ)-1-シクロヘキサン-カルボン酸]-L-ProNH2を白色泡沫として得た(0.50g, 60%)。
【０１４９】
0004443763.tif 000040
DCM中の[1-(N-t-Boc-アミノ)-1-シクロヘキサン-カルボン酸]-L-ProNH2 (0.85g, 2.500mmol)の溶液(10ml)へ、0℃でトリフルオロ酢酸(1ml)を添加した。1時間後、溶液を減圧下で濃縮した。粗残存物をDCM(20ml)に溶解させ、Et3N(1.0ml)を添加した。この溶液を25℃で15時間攪拌し、続いて飽和NH4Cl(2×40ml)、塩水(40ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(EtOAc/メタノール)により、表題の化合物（化合物2）を白色固体として得た(0.35g, 63%)。
【０１５０】
0004443763.tif 000041
7.3 シクロ(Trp-Pro)(化合物3a)の合成
DCM中のN-t-Boc-L-Trp(1.0g, 3.29mmol)溶液(20ml)に、DCC(0.79g, 3.81mmol)、HOBt(0.55g, 3.52mmol)およびL-ProNH2(0.41g, 3.61mmol)を添加した。得られた混合物を25℃で18時間攪拌した。白色残存物を濾過して除去し、清澄な溶出液を減圧下で濃縮した。残存物をEtOAc(50ml)で希釈し、水(2×50ml)、NaHCO3(50ml)、塩水(50ml)で洗浄した。有機溶液を乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。粗残存物をシリカゲル上でのFlashクロマトグラフィーによりDCM/MeOH (9/1)を溶出液として用いて精製し、N-(t-Boc)-L-Trp-L-ProNH2を白色泡沫として得た(0.2g, 22%)。
【０１５１】
0004443763.tif 000042
DCM中のN-(t-Boc)-L-Trp-L-ProNH2(0.60g, 1.50mmol)の溶液(10ml)へ、0℃でトリフルオロ酢酸(5ml)を添加した。1時間後、溶液を減圧下で濃縮した。粗残存物をDCM(10ml)に溶解させ、Et3N(0.5ml)を添加した。この溶液を25℃で15時間攪拌し、続いて飽和NH4Cl(2×20ml)、塩水(20ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(EtOAc/MeOH)により、表題の化合物（化合物3）を白色固体として得た(20mg, 55%)。
【０１５２】
0004443763.tif 000043
7.4 シクロ(t-ブチル-Cys-Pro)(化合物4a)の合成
DCM中のN-FMOC-L-t-ブチル-システイン(0.50g, 1.25mmol)溶液(20ml)に、DCC(0.26g, 1.25mmol)、HOBt(0.196g, 1.25mmol)およびL-ProNH2(0.143g, 1.25mmol)を添加した。得られた混合物を25℃で18時間攪拌した。白色残存物を濾過して除去し、清澄な溶液を飽和NaHCO3(2×50ml)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。粗残存物をシリカゲル上でのFlashクロマトグラフィーによりDCM/MeOH (9/1)を溶出液として用いて精製し、N-FMOC-L-t-ブチル-システイン-L-ProNH2を白色泡沫として得た(0.55g, 89%)。
【０１５３】
0004443763.tif 000044
N-FMOC-L-t-ブチル-システイン-L-ProNH2(0.40g, 0.807mmol)をピペリジン(5ml)に溶解させた。この溶液を25℃で10時間攪拌し、真空下で濃縮した。シリカゲル上でのFlashクロマトグラフィー(EtOAc/MeOH 9/1)により、表題の化合物（化合物4a）を白色泡沫として得た(0.20g, 97%)。
【０１５４】
0004443763.tif 000045
7.5 ジベンジルL-アスパルテートの合成
L-アスパラギン酸(12.5g, 0.095mol)、ベンジルアルコール(30ml)、p-トルエンスルホン酸一水和物素(19g, 0.1mol)およびベンゼン(150ml)の混合物をDean-Stark装置を用いて8時間還流させた。冷却後、エーテル(150ml)を攪拌しながら添加し、白色沈殿物を濾過して除去し、エーテルで洗浄した。回収された白色塩をH2O(200ml)と混合し、NaHCO3飽和溶液(200ml)で処理し、この混合物をCHCl3で抽出した(3×200ml)。回収された有機相を硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、表題の化合物を無色の油として得た(24.8g, 83.2%)。
【０１５５】
0004443763.tif 000046
7.6 ジベンジルN-ベンジル-L-アスパルテートの合成
MeOH中のジベンジル-L-アスパルテート(0.95g, 3.03mmol)溶液(10ml)に、ベンズアルデヒド(0.39g, 3.33mmol, 1.1当量)、酢酸(0.21ml, 3.64mmol, 1.2当量)および水素化シアンホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)(0.38g, 6.06mmol, 2.0当量)を添加した。得られた溶液を室温で1時間攪拌し、減圧下で濃縮した。粗残存物をEtOAc(50ml)で希釈し、NaHCO3飽和溶液(2×50ml)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて減圧下で濃縮した。油状残存物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン 1/9)により精製し、表題の化合物を無色油として得た(1.2g, 98%)。
【０１５６】
0004443763.tif 000047
7.7 ベンジル(S)-N-ベンジル-4-オキソアゼチジン-2-カルボキシレート(化合物34)の合成
エーテル中のジベンジルN-ベンジル-L-アスパルテート(0.3g, 0.74mmol)溶液(10ml)を-5℃まで冷却し、tBuMgCl(0.74ml,エーテル中2.0M、 2当量)のエーテル含有溶液を滴下した。得られた混合物を2時間0℃で、続いて室温でさらに1時間攪拌した。反応を5mlの2N HCl水溶液（NH4Cl飽和）で停止させた。エーテル含有層の分離後、水層をEtOAc(2×20ml)で抽出した。合わせた有機層を塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させ減圧下で濃縮した。油状残存物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン 2/6)により精製し、表題の化合物を無色油として得た(0.22g, 95%)。
【０１５７】
0004443763.tif 000048
7.8 ベンジル(S)-4-オキソアゼチジン-2-カルボキシレート(化合物32)の合成
0℃で冷却したエーテル中のジベンジルL-アスパルテート(3.23g, 10.3mmol)溶液(40ml)にEt3N(1.72ml, 12.4mmol, 1.2当量)、続いてTMSCl(1.44ml, 11.34mmol, 1.1当量)を滴下した。得られた混合物を1時間0℃で攪拌し、続いて-5℃まで冷却し、tBuMgCl(31.8ml, エーテル中2.0M、 2当量)のエーテル含有溶液を滴下した。得られた混合物を2時間0℃で攪拌し、反応を15mlの2N HCl水溶液（NH4Cl飽和）で停止させた。エーテル含有層の分離後、水層をEtOAc(2×40ml)で抽出した。合わせた有機層を塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させ減圧下で濃縮した。油状残存物に10mlのEtOAcを添加し、濾過により結晶を回収し表題の化合物を白色固体として得た(1.0g, 47%)。さらに、母液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン 6/4)により精製し、さらに0.51gの所望の産物を得た。
【０１５８】
0004443763.tif 000049
メタノール中の前述の中間体(0.50g, 2.43mmol)の溶液(10ml)に、触媒として有効な量の10% Pd/Cを添加した。この異種混合物を1気圧、25℃で30分間水素添加した。続いて、セリットパッドを通しての濾過の後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、表題の化合物を粘性油として得た(0.26g, 93%)。
【０１５９】
0004443763.tif 000050
7.9 (S)-1-ベンジル-4-オキソアゼチジン-2-カルボン酸(化合物35)の合成
メタノール中の化合物34(0.35g, 1.19mmol)の溶液(10ml)に、触媒として有効な量の10% Pd/Cを添加した。この異種混合物を1気圧、25℃で30分間水素添加した。続いて、セリットパッドを通しての濾過の後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、表題の化合物を粘性油として得た(0.24g, 95%)。
【０１６０】
0004443763.tif 000051
7.10 ベンジル(S)-N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソアゼチジン-2-カルボキシレート(化合物28)の合成
化合物32(0.5g, 2.44mmol)、DMF(5ml)、イミダゾール(0.25g, 3.65mmol, 1.5当量)およびtert-ブチルジメチルシリルクロライド(0.55g, 3.65mmol, 1.5当量)の混合物を室温で20時間攪拌した。反応混合物をエーテル(50ml)とともに攪拌し、NH4Cl飽和溶液(2×50ml)、および塩水(50ml)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (EtOAc/ヘキサン 3/7)により精製し、表題の化合物を無色油として得た(0.65g, 84%)。
【０１６１】
0004443763.tif 000052
7.11 (S)-N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソアゼチジン-2-カルボン酸(化合物33)の合成
メタノール中の化合物33(0.64g, 2.0mmol)の溶液(10ml)に、触媒として有効な量の10% Pd/Cを添加した。この異種混合物を1気圧、25℃で30分間水素添加した。続いて、セリットパッドを通しての濾過の後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、表題の化合物を得た(0.37g, 80%)。
【０１６２】
0004443763.tif 000053
7.12 化合物14cの合成
7.12.1 N,N’-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-シスチン
L-シスチン(2.0g, 8,32mmol)をジオキサン(30.0ml)および0.5M NaOH(30.0ml)の混合物に溶解した。この溶液にジ-tert-ブチルジカーボネート(3.6g, 16.6mmol, 2.0当量)を添加し、得られた溶液を室温で15時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、EtOAc(50ml)および1M HCl(30ml)で希釈した。水溶液をEtOAc(2×50ml)で抽出し、合わせた有機層を塩水(100ml)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮し表題の化合物を白色固体として得た(3.1g, 83%)。
【０１６３】
0004443763.tif 000054
7.12.2 N1,N’-[N,N’-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-シスチル]ジ-L-プロリンアミド
EtOAc(15ml)およびDMF(5ml)中のN,N’-[ビス(tert-ブトキシカルボニル)]-シスチン(1.0g, 2.27mmol)溶液に、DCC(1.03g, 5.0mmol, 1.1当量)およびHOBt(0.78g, 5.0mmol, 1.1当量)を添加した。得られた混合物を25℃で2時間攪拌した。L-ProNH2(0.53g, 4.65mmol, 1.03当量)を添加し、混合物を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残存物を濾過して除き、清澄な溶液を減圧下で濃縮した。残存物をCHCl3 (60ml)に溶解させ、溶液を飽和NaHCO3(50ml)、塩水(50ml)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、そして減圧下で濃縮した。粗油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(DCM/MeOH 9/1)により精製し、表題の化合物を白色固体として得た(1.2g, 83%)。
【０１６４】
0004443763.tif 000055
7.12.3 化合物14c
前述の化合物(1.25g, 1.97mmol)をCH2Cl2(20ml)に溶解させ、溶液を0℃まで冷却した。トリフルオロ酢酸(15ml)を添加し、得られた溶液を0℃で2時間攪拌した。室温、減圧下での濃縮により、粗残存物をエーテル(40ml)でこねて、L-シスチルジ-L-プロリンアミドのトリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た。生成物を乾燥させ、その後の反応にそのまま用いた。DMF(6ml)中に溶解させ、溶液を0℃で冷却し、Et3N(0.30ml, 2.2mmol, 1.1当量)を滴下した。
【０１６５】
ジオキサン(10ml)およびDMF(3.4ml)の混合物に、0℃で(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボン酸(0.51g, 4.44mmol, 1.1当量)、DCC(0.97g, 4.44mmol, 1.1当量)およびペンタフルオロフェノール(0.87g, 4.44mmol, 1.1当量)を溶解させた。その結果得られた混合物を0℃で1.5時間攪拌し、続いて上記遊離アミン溶液を添加し、混合物をさらに0℃で2時間攪拌した。不溶性物質を濾過して除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残存物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3/MeOH/NH3aq 40/10/1)により精製し、表題の化合物を白色固体として得た(0.50g, 41%)。
【０１６６】
0004443763.tif 000056
7.13 YM-14637の合成
7.13.1 Nα-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ヒスチジル-L-プロリンアミド
DMF(10mL)中のNα-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ヒスチジン（0.5g, 1.96mmol)の溶液に、DCC（0.44g, 2.15mmol, 1.1当量）およびHOBt（0.34g, 2.15mmol, 1.1当量）を添加した。得られた混合液を25℃で2時間攪拌した。L-ProNH2（0.23g, 2.01mmol, 1.03当量)を添加し、混合液を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残留物を濾過除去し、透明な溶液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH/NH3 40/10/1)で精製し、表題の化合物（0.70g, 73%）を白色固体として得た。
【０１６７】
0004443763.tif 000057
7.13.2 Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-ヒスチジル-L-プロリンアミド（YM-14637)
Nα-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ヒスチジル-L-プロリンアミド(4.0g,8.80mmol)をCH2Cl2（30ml）に溶解し、溶液を0℃まで冷却した。トリフルオロ酢酸（25mL）を添加し、得られた溶液を0℃で1時間攪拌した。室温、減圧下で濃縮すると、粗残留物が得られ、それをエーテル（40ml）で摩砕するとL-ヒスチジル-L-プロリンアミドのトリフルオロ酢酸塩の白色固体が得られた。生成物を乾燥し、そのまま後に続く反応に使用した。該生成物をDMF(6mL)に溶解し、溶液を0℃まで冷却した。そして、Et3N(0.53mL, 3.82mmol, 1.05 当量)を滴下した。
【０１６８】
ジオキサン（20mL）およびDMF(7mL)の混合液に0℃で(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボン酸(1.02g, 8.80mmol, 1.0 当量)、DCC(2.01g, 9.74mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(1.38g, 9.74mmol, 1.1当量)を溶解した。得られた混合液を0℃で1.5時間攪拌し、上記の遊離アミンの溶液を添加し、混合液を0℃でさらに2時間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH/NH3 40/10/1)で精製し、表題の化合物（2.66g, 87%)の白色固体を得た。
【０１６９】
0004443763.tif 000058
7.14 Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-(3',5'-ジヨード-ヒスチジル)-L-プロリンアミドの合成
Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-4-カルボニル]-L-ヒスチジル-L-プロリンアミド(0.40g, 1.15mmol)およびNaI(0.17g, 1.15mmol, 1.0当量)をpH7.5のNa2HPO4-NaH2PO4バッファー(19ml, 0.1M)中、室温で攪拌した。水（１mL）に溶かしたクロラミン-T(N-クロロ-p-トルエンスルホンアミド-ナトリウム塩３水和物）（0.26g, 1.15mmol, 1.0当量)を添加した。20分後、Na2S2O5(0.18g, 1.15mmol, 1.0当量)を加えて、反応を停止させた。生成混合液のTLC分析は、ジヨード誘導体とともに3-モノヨードヒスチジン誘導体の形成を示した。混合液を凍結乾燥し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH/NH3 40/10/1)で精製し、2種のヨード誘導体を得た。
【０１７０】
Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-(3',5'-ジヨードヒスチジル)-L-プロリンアミド（0.10g, 15％）
0004443763.tif 000059
7.15 N-[2-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]イソブチリル]-L-プロリンアミド（化合物9b）の合成
7.15.1 2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-イソ酪酸
α-アミノイソ酪酸(1.0g, 9.70mmol)を、ジオキサン（15.0mL）および0.5M NaOH（15.0mL）の混合液に溶解した。この溶液に、ジ-tert-ブチル-ジカーボネート(2.5g, 11.64mmol, 1.2当量)を添加し、得られた混合液を室温で15時間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、EtOAc（50ｍL)および1M HCl（30mL）で希釈した。水溶液をEtOAc（2x30mL）で抽出し、合わせた有機層を食塩水（40mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、表題の化合物（1.3g,67％）の白色固体を得た。
【０１７１】
0004443763.tif 000060
7.15.2 N1-[2-[N-(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]イソブチリル-L-プロリンアミドの合成
EtOAc(15ml)およびDMF（5mL）中の(tert-ブトキシカルボニルアミノ)イソ酪酸(0.68g, 3.33mmol)の溶液に、DCC（0.76g, 3.66mmol, 1.1当量)およびHOBt(0.57g, 3.66mmol, 1.1当量)を添加した。得られた混合液を25℃で2時間攪拌した。L-ProNH2(0.40g, 3.50mmol, 1.05 当量)を添加し、混合液を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残留物を濾過除去し、透明の溶液を減圧下で濃縮した。残留物をEtOAc（60mL）に溶解し、溶液を水（2x50mL）、飽和NaHCO3（50mL）、および食塩水（50mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。シリカゲル（DCM/MeOH 9/1）のフラッシュクロマトグラフィーにかけると、表題の化合物（0.4g, 40%）の白色固体を得た。
【０１７２】
0004443763.tif 000061
7.15.3 N-[2-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]イソブチリル]-L-プロリンアミド（化合物9b）
前述の化合物を、前掲の6.10.2節に記載した方法によって、表題の化合物に変換した。
【０１７３】
0004443763.tif 000062
7.16 N1-[1-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]シクロプロパン-カルボニル]プロリンアミド（化合物 10b）の合成
7.16.1  ベンジル1-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-シクロプロパンカルボン酸
1-アミノシクロプロパンカルボン酸（0.3g, 2.96mmol)をジオキサン（7.0mL）およびNaOH 0.5M（7.0mL）の混合液に溶解した。この溶液にジ-tert-ブチルジカーボネート(1.0g, 4.44mmol, 1.5当量)を添加し、得られた混合液を室温で15時間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、EtOAc（50mL）および1M HCl（30mL）で希釈した。水溶液をEtOAc(2x30mL)で抽出し、合わせた有機層を食塩水（40mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、表題の化合物（0.5g, 84%）の白色固体を得た。
【０１７４】
0004443763.tif 000063
7.16.2  ベンジル1-(tert-ブトキシカルボニルアミノ）シクロプロパンカルボキシレート
DMF（10mL）中の1-(tert-ブトキシカルボニルアミノ）シクロプロパンカルボン酸(0.5g, 2.48mmol)の溶液にEt3N（0.83mL, 5.95mmol, 2.4 当量)および臭化ベンジル(0.71mL, 5.95mmol, 2.4 当量)を添加した。得られた溶液を室温で15時間攪拌し、エーテル（50mL）で希釈し、NH4Clの飽和溶液（50mL）および食塩水（50mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。粗混合液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/ヘキサン 1/9）で精製し、表題の化合物（0.5g，69%）の白色固体を得た。
【０１７５】
0004443763.tif 000064
7.16.3  ベンジル1-アミノシクロプロパンカルボキシレート
ベンジル1-（t-ブトキシカルボニルアミノ）シクロプロパン-カルボキシレート(0.49g, 1.68mmol）をCH2Cl2（5mL）に溶解し、溶液を0℃まで冷却した。トリフルオロ酢酸（5mL）を添加し、得られた溶液を0℃で1時間攪拌した。減圧下、室温で濃縮すると、粗残留物が生成し、これをCHCl3（30mL）で希釈した。該溶液をNaHCO3の飽和溶液（30mL）および食塩水（30mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮し、無色油状の表題の化合物（0.31g, 96%)が得られた。これを次のステップでそのまま用いた。
【０１７６】
0004443763.tif 000065
7.16.4  ベンジル[(S)1-[N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-シクロプロパンカルボキシレート
EtOAc(10mL)中の(S)-N-（tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-カルボン酸22（0.26g, 1.15mmol)の溶液に、DCC(0.26g, 1.26mmol, 1.1 当量)およびHOBt（0.20g, 1.1mmol, 1.1 当量)を添加した。得られた混合液を25℃で2時間攪拌した。ベンジル1-アミノシクロプロパン-カルボキシレート(0.53g, 4.65mmol, 1.03 当量)を添加し、混合液を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残留物を濾過除去し、透明な溶液を減圧下で濃縮した。残留物をCHCl3（40mL）に溶解し、溶液を飽和NaHCO3（40mL）および食塩水（40mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。粗製の油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/ヘキサン 1/1）で精製し、白色形態の表題の化合物（0.46g, 98%)を得た。Rf 0.4 （EtOAc/ヘキサン 4/2）；
0004443763.tif 000066
7.16.5 [(S)-1-[N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-シクロプロパンカルボン酸
メタノール（10mL）中の前述の中間体（0.45g, 1.12mmol)の溶液に、触媒反応量の10% Pd/Cを添加した。この不均質混合液を１atm、25℃で30分間、水素化した。そして、セライトパッドで濾過した後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、表題の化合物（0.26g, 75%)の白色固体を得た。
【０１７７】
0004443763.tif 000067
7.16.6 N1-[1-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]シクロプロパン-カルボニル]-L-プロリンアミド（化合物 10b）
前述の中間体（0.15g, 0.48mmol)、DCC(0.12g, 0.47mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.13g, 0.63mmol, 1.5 当量)をDMF(4mL)に0℃で溶解した。得られた混合液を0℃で1.5時間攪拌し、L-プロリンアミド(66mg, 0.46mmol, 1.1 当量)を添加し、混合液を室温でさらに2時間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH 9/1）で精製し、表題の化合物（0.06g, 42%)の白色固体を得た。
【０１７８】
0004443763.tif 000068
7.17 N1-[1-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]シクロヘキサンカルボニル]-L-プロリンアミド（化合物 11b）の合成
7.17.1  ベンジル1-アミノシクロヘキサンカルボキシレート
1-アミノシクロヘキサンカルボン酸(3.00g, 21.0 mmol)、ベンジルアルコール(6.7mL)、p-トルエンスルホン酸１水和物(4.4g、 23.0mmol, 1.1 当量)およびベンゼン(70mL)をDean-Stark装置で10時間還流した。冷却後、エーテル（150mL）を攪拌しながら添加し、白色沈殿を濾過除去し、エーテルで洗浄した。回収した白色塩を水（80mL）と混合し、NaHCO3の飽和溶液（80mL）で処理し、該溶液をCHCl3（3x80ｍL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、表題の化合物（1.10g, 23%)を無色の油状物質として得た。：Rf 0.4 （EtOAc/ヘキサン 4/2）；
0004443763.tif 000069
7.17.2  ベンジル[(S)-1-[N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]シクロヘキサンカルボキシレート
EtOAc（15mL）中のN-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボン酸(0.40g, 1.74mmol)溶液にDCC(0.43g, 2.09mmol、1.2当量)およびHOBt(0.30g, 1.91mmol, 1.1 当量)を添加した。得られた混合液を25℃で2時間攪拌し、ベンジル1-アミノシクロヘキサンカルボキシレート（0.43g, 1.83mmol, 1.05 当量)を添加し、混合液を25℃でさらに18時間攪拌した。白色の残留物を濾過除去し、透明な溶液を減圧下で濃縮した。該残留物をCHCl3（40mL）に溶解し、溶液を飽和NaHCO3（40mL）および食塩水（40mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。粗油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/ヘキサン 1/1）で精製し、白色形態の表題の化合物（0.53g, 68%)を得た。：Rf 0.7 （EtOAc/ヘキサン 4/2）；
0004443763.tif 000070
7.17.3 [(S)-1-[N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-シクロヘキサンカルボン酸
メタノール（10mL）中の前述の中間体（0.50g，1.12mmol)の溶液に、触媒反応量の10% Pd/Cを添加した。この不均質混合液を１atm、25℃で30分間、水素化した。そして、セライトパッドで濾過した後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、表題の化合物（0.38g, 96%)の白色固体を得た。
【０１７９】
0004443763.tif 000071
7.17.4 N1-[1-[N-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-シクロヘキサンカルボニル]-L-プロリンアミド（化合物 11b）
前述の中間体（0.15g, 0.42mmol)、DCC(0.10g, 0.47mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.12g, 0.63mmol, 1.5 当量)をDMF(4mL)に0℃で溶解した。得られた混合液を0℃で1.5時間攪拌し、L-プロリンアミド(53mg, 0.46mmol, 1.1 当量)を添加し、混合液を室温でさらに2時間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH 9/1）で精製し、表題の化合物（0.11g, 80%)の白色固体を得た。
【０１８０】
0004443763.tif 000072
7.18 N1-[Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-トリプトフィル]-L-プロリンアミド（化合物12b）
7.18.1 Nα-[(S)-N-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-トリプトファンベンジルエステル
EtOAc（10mL）中のN-(tert-ブチルジメチルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボン酸（0.30g, 1.31mmol)の溶液に、DCC(0.30g, 1.44mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.27g, 1.44mmol, 1.1 当量)を添加した。得られた混合液を0℃で1時間攪拌した。L-トリプトファンベンジルエステル(0.46g, 1.57mmol, 1.2 当量)を添加し、混合液を25℃でさらに2時間攪拌した。白色の残留物を濾過除去し、透明な溶液を減圧下で濃縮した。残留物をCHCl3（40mL）に溶解し、溶液を飽和NaHCO3（40mL）および食塩水（40mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。粗製の油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/ヘキサン 2/8）で精製し、白色形態の表題の化合物（0.49g, 74%)を得た。
【０１８１】
0004443763.tif 000073
7.18.2 N1-[Nα-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]-L-トリプトフィル-L-プロリンアミド
メタノール（10mL）中の前述の中間体（0.30g, 0.59mmol)の溶液に、触媒反応量の10% Pd/Cを添加した。この不均質混合液を１atm、25℃で30分間、水素化した。そして、セライトパッドで濾過した後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、遊離の酸（0.24g, 98%)の白色固体を得た。この化合物を次のステップでそのまま使用した。
【０１８２】
上記の酸中間体をDMF(4mL)に0℃で溶解し、DCC(0.13g, 0.65mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.12g, 0.65mmol, 1.1 当量)を添加した。得られた混合液を0℃で1.5時間攪拌し、L-プロリンアミド(74mg, 0.65mmol, 1.1 当量)を添加し、混合液を室温でさらに2時間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH 9/1）で精製し、表題の化合物（0.17g, 72%)の白色固体を得た。
【０１８３】
0004443763.tif 000074
7.19 N1-[2-[(S)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-3-（1-ピラゾリルプロパノイル-L-プロリンアミド（化合物 13b）の合成
7.19.1  ベンジル2-[[(S)-N-(tert-ブチルジメチリルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボニル]アミノ]-3-（1-ピラゾリル)プロパノエート
EtOAc(10mL)中の(S)-N-(tert-ブチルジメチリルシリル)-4-オキソ-アゼチジン-2-カルボン酸(0.15g, 0.65mmol)の溶液にDCC(0.15g, 0.72mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.18g, 0.98mmol, 1.5 当量)を添加した。得られた混合液を0℃で1時間攪拌した。ベンジル2-アミノ-3-（1-ピラゾリル）プロパノエート1(0.18g, 0.72mmol, 1.1 当量)を添加し、混合液を25℃で2時間攪拌した。白色残留物を濾過除去し、透明な溶液を減圧下で濃縮した。残留物をCHCl3（40mL）に溶解し、溶液を飽和NaHCO3（40mL）および食塩水（40mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧下で濃縮した。粗製の油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/ヘキサン 1/1）で精製し、無色の油状の表題の化合物（0.13g, 45%)を得た。：Rf 0.4（EtOAc/ヘキサン 6/4）；
0004443763.tif 000075
7.19.2 2-[(S)-2-アゼチジン-4-カルボニルアミノ]-3-（1-ピラゾリル)プロパノエート-L-プロリンアミド
メタノール（10mL）中の前述の中間体（0.13g, 0.29mmol)の溶液に、触媒反応量の10% Pd/Cを添加した。この不均質混合液を１atm、25℃で30分間、水素化した。そして、セライトパッドで濾過した後、得られた溶液を減圧下で濃縮し、遊離のカルボン酸（0.26g, 75%)を白色固体として得た。この化合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１８４】
上記の酸中間体をDMF(4mL)に0℃で溶解し、DCC(0.07g, 0.31mmol, 1.1 当量)およびペンタフルオロフェノール(0.08g, 0.43mmol, 1.5 当量)を添加した。得られた混合液を0℃で1.5時間攪拌し、L-プロリンアミド(36mg, 0.31mmol, 1.1 当量)を添加し、混合液を室温でさらに2時間攪拌した。不溶物を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH 9/1）で精製し、表題の化合物（0.06g, 60%)の白色固体を得た。
【０１８５】
0004443763.tif 000076
7.20  他の化合物
上記の合成法(7.1〜7.19)の日常的な改変または当業界で公知の他の方法により、本発明の他の化合物を合成することができる。適当な出発物質は、市販されており、または日常的な方法を用いて合成することができる。
【０１８６】
8.0  実施例：マウスにおけるin vivo研究
本実施例は、運動および認識結果スコアを用いて、本発明の特定の化合物の顕著な神経保護および認識増強作用を実証する。
【０１８７】
8.1  実験プロトコル
8.1.1  動物
Taconic Farms(Germantown, NY)から得たオスのC57B1/6マウス(20〜25 g)を、全ての手順に先がけて少なくとも１週間、手術室および行動室に直接接する領域で飼育した。全てのマウスを、一定の温度(22±2℃)および午前6時に光を当てる12時間の明／暗サイクルで維持し、明サイクル中に全ての行動試験を実施した。食餌および水は、自由に利用可能であった。
【０１８８】
8.1.2  制御された大脳皮質衝撃装置
損傷装置は、直径3.5 mmのチップを有するマイクロプロセッサに制御された空気インパクターで構成された。ミルテーブル(mill table)(Sherline, USA)上に該インパクターを垂直に取り付ける。それによりマウス頭部の上の垂直面における厳密な調整が可能となる。該頭部自体は、該装置に取り付けた定位装置(stereotaxic apparatus)（David Kopf Instruments, CA）に固定される。直線電圧差動変換器(linear voltage differential transducer)(LVDT, Serotec, USA)のコアロッドを、3.0〜9.0 m/sの速度を測定できるようにするために該インパクターの下端部に取り付ける。正圧および負圧(戻り)の双方の空気圧を微調整することにより、該インパクターの速度を調節する。オシロスコープ(Tektronix, USA)は、LVDT上で下向きの力により作成された時間／置換曲線を記録し、これによりインパクター速度の正確な測定が可能となる。
【０１８９】
8.1.3  手術
手術用麻酔を、1.0〜1.5 l酸素/分の流速を用いて、それぞれ4％および2％のイソフルランで誘導し、維持した。呼吸速度ならびに眼瞼および足の屈筋反射をモニターすることにより、麻酔の深さを評価した。次に、動物を加熱パッドの上に置き、中心体温をモニターして、38±0.2℃に維持した。頭部を定位フレームに固定し、手術部位をクリップではさみ、Norvasanでこすって洗い、その後、滅菌生理食塩水ですすぐ作業を連続３回実施した。頭蓋の正中線を10 mm切開し、皮膚および筋膜を反転させ、組織穿孔鋏(Roboz, USA)を用いて左頭頂骨の中心面の頭骨を4 mm切開した。37.5℃に温めた滅菌生理食塩水に継続的に浴した下層脳硬膜を傷つけるのを避けるために、頭頂骨の切除には細心の注意を払った。空気損傷装置のインパウンダー(impounder)チップを、パッドを用いて洗浄し、無水アルコールに浸し、露出した硬膜の表面に位置させ、44 mmのストローク距離を自動的に下ろした。中程度(速度6.0 m/s、組織変形の深さ1 mm)のレベルでの損傷の後、6-0絹糸を用いた断続縫合により切開部を閉じ、麻酔を停止し、マウスを温めたカゴに入れ、損傷後45分間正常体温に維持した。術後の少なくとも4時間は全ての動物を注意深くモニターし、その後は毎日モニターした。急性の神経学的試験中の麻酔による動物間の変動を最小化するために、各動物について、手術時間については20分、および縫合時間については5分が許容された。
【０１９０】
8.1.4  化合物の投与
意識のあるマウスをマウス拘束室に入れ、制御された大脳皮質衝撃損傷(CCI)の後の30分の時点で、生理食塩水(損傷対照；n=6)、1 mg/kgの化合物2a(n=8)、化合物10b(n=6)、化合物11b(n=6)、または化合物14c(n=6)のいずれかを、側尾静脈を介して注入した。nの値は特定の治療群のマウスの数を示す。研究者らには、手術の時点と神経および行動評価の時点で、薬剤治療の条件について伏せられていた。
【０１９１】
8.1.5  急性および慢性の神経学的評価
慢性の神経学的回復を、梁歩行タスクを用いて全ての動物について評価した。この方法は、損傷動物と、擬似操作された動物との間の運動調整の微細な差異を識別するのに特に優れている。該装置は、厚さ60 mmの発泡ラバーパッドの上300 mmの位置に吊り下げた、幅6 mmおよび長さ120 mmの細い木製の梁で構成された。梁の一端にマウスを置き、梁の両方向において計測した50歩に渡って右後肢のフットフォールトの数を記録した。手術の前に、このタスクにおける受容能力の基礎レベルを、50歩当り10個未満のフットフォールトという許容レベルであると規定した。
【０１９２】
8.1.6  空間学習評価
モリスの水迷路(Morris, 1984, J. Neurosci. Meth. 22:47-60)を用いて、隠され、水中に入れたプラットフォームを迷路外視覚情報により捜し出すためにマウスを訓練することによって、空間学習を評価する。該装置は、白く塗装され、水の表面の15 mm下に入れた直径76 mmのプレキシガラス製プラットフォームを備える、大きな、白い円形のプール(直径900 mm、高さ500 mm、水温24±1℃)からなり、該プラットフォームは、希釈した、白色の、非毒性の塗料を添加して不透明にしてある。訓練中、側壁から14 cmのところで、四分の1区画の中に該プラットフォームを隠す。４つの無作為に選択した90度離れた位置のうちの１つで、マウスを壁に向けて静かに水の中に入れる。90秒の基準時間以内に隠されたプラットフォームを捜し出すための待ち時間を、条件を伏せた観察者により記録させた。１回目のトライアルにおいては、90秒以内にプラットフォームを見つけ出せなかったマウスを援助して該プラットフォームに導く。動物は、最初のトライアルでは15秒間、および後続の全てのトライアルでは10秒間プラットフォームにとどまることを許される。トライアル間の間隔を30分とし、その間にマウスをタオルで乾かし、温熱ランプの下に置く。4つのブロックにおいて施す一連の16回の訓練トライアルを、典型的には手術後7、8、9および10日目に実施する。
【０１９３】
8.1.7  データの分析
分散分析(ANOVA)を用いて、群を超えて比較した連続変数を検討し、その後、Bonferroni補正(急性反射)を行う。試験期間（梁歩行、モリスの水迷路）に渡って反復測定した連続変数を、反復測定ANOVAを用いて分析し、続いて各時点でのTukeyの一対比較法(Tukey's pairwise comparison)を用いて分析した。<0.05のp値は、統計学的に有意であるとみなされる。
【０１９４】
8.2  結果
8.2.1  慢性の神経学的回復（梁歩行）
図３は、梁歩行試験の結果を示す。図３を参照すると、対側の後方フットフォールトは、擬似操作された対照と比較した場合、全ての損傷群で著しく増加し、損傷後２日で最大に達した。化合物2aで処理したマウスは、3日後にはいくらかの機能回復を示し始め、損傷後2〜3週間にはこのタスクをかなり上手にこなせるようになった。これは、試験期間中に重大な欠陥を示した生理食塩水で処理した損傷動物とは対照的である。擬似操作された群は、試験期間全体に渡って基準数のフットフォールトを維持した。反復測定ANOVAにより、有意な群効果[F(3,27) = 67.654, p < 0.0001]、日効果[F(6,18) = 97.657, p < 0.0001]、および群×日相互作用[F(18,162) = 11.941, p < 0.0001]が得られた。Tukeyの一対比較法を用いた事後分析により、1、2、3、7、14および21日目に、擬似操作した動物と、生理食塩水で処理した損傷動物との間に有意差を検出した(p<0.001)。しかし、損傷後14日目には、化合物2aで処理したマウスは、生理食塩水で処理した損傷動物と比較した場合、このタスクにおける行動に有意な改善を示した(p<0.05)。同様に、化合物2aで処理した動物においては、生理食塩水で処理した動物と比較した場合、損傷後21日目に、結果の継続的な改善が認められた(p<0.01)。
【０１９５】
図４は、用量応答梁歩行試験の結果を示す。図４を参照すると、化合物2aは逆U字型の用量応答曲線を示し、1 mg/kgの治療で最大の効果を示した。
【０１９６】
図８は、CCI損傷後に生理食塩水、化合物10bおよび化合物11bで処理したマウスの梁歩行試験の結果を示す。群の大きさが小さいにもかかわらず、梁歩行タスクにおける行動の欠陥は、生理食塩水ビヒクルのみを与えられた動物と比較して、化合物10bまたは11bで処理した動物において減少した。
【０１９７】
8.2.2  水迷路における空間学習
図５には、場所学習水迷路実験の結果を示す。図５に示すように、水迷路課題における場所学習に及ぼすCCIの作用を、各群につき４試行を行い、目的地までの日毎の平均潜伏時間(±SEM)を比較することで評価した。手術後７〜10日目に訓練した場合には、擬似手術を行った動物と生理食塩水で処理した損傷動物の間で学習能力に明確な差があることが明らかとなり、擬似動物は、対応の損傷動物よりも一貫して素早く隠れた目標のプラットフォームに到達した。反復測定ANOVAを４日間にわたって平均をとったところ、有意なGroup効果[F(3,28)=15.636、p=0.0001]、Day効果[F(3,84)=62.723、p＜0.0001]およびGroup×Day相互作用[F(9,84)=5.076、p＜0.0001]が認められた。Tukeyの対比較(pairwise comparison)を用いる事後分析(post-hoc analysis)では、損傷後８日目(p＜0.001)、９日目(p＜0.01)および10日目(p＜0.001)に、擬似動物と生理食塩水処理損傷対照との間で有意差が認められた。８日目には、化合物2aを投与した損傷動物でも擬似手術対照との間に有意な差が認められた(p＜0.001)。しかしながら、訓練３日目(損傷後９日目)には、化合物2aで処理した動物は対応の生理食塩水処理動物よりも優れており、擬似手術対照との間に有意差はもはや認められなかった(p＞0.05)。訓練の最終日には、生理食塩水処理損傷マウスに比べて、薬剤処理群では目標のプラットフォームを見つけるまでの潜伏時間が有意に向上した(p＜0.01)。
【０１９８】
図6Aおよび6Bには、２つの用量応答実験の結果を示す。図6Aに示すデータは、サンプル数n＝6の未損傷対照とサンプル数n＝8の各処理群を用いて収集した。図6Bに示すデータは、サンプル数n＝12の未損傷対照とサンプル数n＝8の各処理群を用いて収集した。手術後10日目には、全処理群において、生理食塩水処理対照(CCI＋生理食塩水)と比較して場所学習の向上が見られた。手術後10日目までに、10mg/kgの化合物2aで処理した群で最も顕著に学習の向上が見られた。
【０１９９】
8.2.3  水迷路における作業記憶
作業記憶に及ぼすCCIの作用を判定するため、両試行に対し目標のプラットフォームを見つけるまでの日毎の平均潜伏時間(±SEM)を各群について計算した。反復測定ANOVAを試行対の最初のものについて４日間にわたって平均をとったところ(図７中、黒塗りのバー)、有意なGroup効果[F(2,20)=4.842、p=0.0193]が認められ、この期間では３つの群の間で学習能力に差があることが判明した。有意なDay効果[F(3,60)=13.742、p＜0.0001]も同様に観察され、試行対の最初のものについて目的地までの潜伏時間が有意に減少したことが判明した。このことから、他のマウスよりも遥かに、時間に対する空間情報の保持に優れたマウスがいることが示唆される。このことは、Group×Day相互作用[F(6,60)=4.653、p=0.0006]からも裏付けられる。Tukeyの対比較検定を用いる事後分析では、手術後23および24日目に、未損傷対照(擬似)動物と損傷マウスの間に有意差が認められた(p＜0.05)。しかしながら、化合物2aで処理した損傷マウスの行動は、外傷後24日目には未処理の損傷動物と比較して有意に向上しており(p＜0.05、Tukeyの対比較)、薬剤処理マウスでは有意に優れた関連記憶機能(reference memory function)が認められた。
【０２００】
反復測定ANOVAを試行対のもう一方について４日間にわたって平均をとったところ(図７中、白抜きのバー)、有意なGroup効果[F(2,20)=8.760、p=0.0019]が認められ、この期間では３つの群の間で作業記憶に差があることが判明した。Tukeyの対比較検定を用いる事後分析では、手術後22および24日目に、未損傷対照(擬似)動物と損傷マウスの間に有意差が認められた(p＜0.05)。しかしながら、この課題における化合物2aで処理した損傷マウスの行動は、外傷後24日目には未処理の損傷動物と比較して有意に向上しており(p＜0.05、Tukeyの対比較)、薬剤処理マウスでは有意に優れた作業記憶が認められた。
【０２０１】
９．実施例：ラットにおけるin vivo活性
本実施例では、本発明の特定の化合物を例として、ラットの神経外傷を治療する能力を実証する。このような方法は、通常、本明細書に記載の他の化合物のin vivo活性を実証するのにも適用することができる。プロトコールは、一般的には、Faden, 1989, Brain Research 486:228-235およびMcIntoshら, 1989, Neuroscience 28(1):233-244に記載されているプロトコールである。
【０２０２】
9.1  実験プロトコール
9.1.1  動物
オスのSprague-Dawleyラット(375〜425g)をHarlan(Frederick, MD)から入手し、処置を行う前に少なくとも１週間飼育した。動物を一定温度(22±2℃)かつ12時間の昼／夜サイクル(午前６時にライトを点灯)で維持し、神経学的スコアリングは全て昼サイクル時に行った。飼料と水は無制限に摂取できるようにした。
【０２０３】
9.1.2  Fluid-Percussionによって誘導される外傷性脳損傷(TBI)
ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し(70mg/kg腹腔内)、大腿静脈および動脈カテーテルを挿管して埋め込んだ。側頭筋内のサーミスタを介して脳の温度を間接的に評価した。フィードバック制御された加温ブランケットによって体温を維持した。血圧を連続的に監視し、動脈の血中ガスを定期的に分析した。動物を定位フレームへ置いた後、頭皮と側頭筋を裏返し、小規模開頭術(5mm)を左側の頭頂皮質(pariental cortex)のラムダ縫合とブレグマ縫合の中間に施術し、Leur-Locを挿入して所定の場所に固定(cement)した。fluid-percussion頭部損傷装置(Medical College of Virginia製)は、等張生理食塩水を満たしたプレキシグラス円柱状レザバーからなる。装置の一方の端部にはトランスデューサが装備されており、オスのLeur-Locを介して手術時に固定したメスのLeur-Locにつながった5mmのチューブに接続されている。振り子を装置の反対側の端部にあるピストンに打ちつけることによって、約22ミリ秒間圧力パルスを発生させ、その下にある脳を変形させる。損傷の程度は圧力パルスと関連し、本発明者らの実験では、気圧(atm)単位で2.6atmの圧力パルスによって、神経学的かつ組織学的な欠陥に関して中程度の損傷を生じさせる。擬似(対照)動物は、麻酔し、fluid-percussionによる脳損傷を発生させずに手術を行う。
【０２０４】
9.1.3  神経学的スコアリング
TBI後１、７および14日目に、処理を行ったことを知らせずに標準運動スコアリングを行った。３種類の別々のテストを用いて運動機能を評価した。テストはそれぞれ０＝重度の損傷〜５＝正常な機能の順序尺度によってスコアリングした。テストには、垂直位置および２つの水平位置において斜面上で位置を５秒間維持する能力、前肢の屈曲(尾を持って吊り下げた場合)および横方向への強制的な押出しが含まれる。７つの個々のスコアの各々(鉛直角、左右の水平角、左右の前肢屈曲、左右の横方向への押出し)を加えて、０〜35までの複合的な神経学的スコアを作成した。このスコアリング法は、評価者によらず高い信頼性を示し、薬理学的処置に対して非常に感度の高いものである(Fadenら, 1989, Science 244:798-800参照)。
【０２０５】
9.1.4  反射および覚醒評価(automatic and analeptic assessment)
未損傷ラットの別の群を、薬剤投与の直前から投与後60分までの反射応答および覚醒応答について試験した。覚醒試験では、ラットをまず40mg/kg(腹腔内)のペンタバルビトンナトリウムで麻酔し、室温(22±2℃)で実験室用ベンチトップ(bechtop)の加温していないパッド上に載せた。サーミスタプローブを直腸へ入れ、深部体温を測定した。10分後、後述するように、尾静脈からラットへビヒクルまたは薬剤を投与した。次いで、全ての動物について体温を５分間隔で記録しながら、立直り反射が回復するまでの時間を判定した。
【０２０６】
新規なTRH類似体に対する反射応答を評価するため、別のラット群を４％イソフルラン(1.5L/分)で麻酔した。右側のartoid動脈と右側の頚静脈へカテーテルを挿入し、首の後ろから外へ引出した。ラットをケージ当たり1匹ずつ隔離し、麻酔から回復させた。外へ引出したカテーテルをラットの上方で吊り下げ、噛み切られないようにした。平均細動脈血圧(MAP)を、試験の期間中動脈カテーテルに直接接続されたトランスデューサによって連続的に記録した。カテーテルを設置した１時間後、後述するように、頚静脈のカテーテルを介してラットへビヒクルまたは薬剤を投与した。
【０２０７】
9.1.5  1a、2aおよび4aの投与
fluid-percussionによる損傷の30分後に、通常の生理食塩水(損傷対照、n＝５またはn＝11)、化合物1a(n＝５)、化合物2a(n＝12)または化合物4a(n＝８)のうちの１つを単回ボーラス用量(１mg/kg)にて大腿静脈カテーテルを介してラットへ注入した。nの値は処理群の動物の数を表す。手術時および神経学的スコアリングの際には、研究者に薬剤処理について知らせなかった。
【０２０８】
9.1.6  14cの投与
fluid-percussionによる損傷の30分後に、通常の生理食塩水(損傷対照、n＝14)、化合物YM-14673(n＝17)または化合物14c(n＝13)のうちの１つを単回ボーラス用量(１mg/kg)にて大腿静脈カテーテルを介してラットへ注入した。nの値は処理群の動物の数を表す。手術時および神経学的スコアリングの際には、研究者に薬剤処理について知らせなかった。自律および解析試験の場合には、通常の生理食塩水(n＝６)、化合物YM-14673(n＝６)または化合物14c(n＝６)をそれぞれ上述の時間でラットへ投与した。
【０２０９】
9.1.7  データ解析
群の間で比較した連続変数を分散分析(ANOVA)を用いて検討し、Bonferroni補正を行った(立直り反射)。期間中反復測定にかけた連続変数(心臓血管測定および深部体温測定)を、各時点で反復測定ANOVA、次いでTukeyの対比較を用いて分析した。個々のノンパラメトリックMann-Whitney U検定を用いるノンパラメトリックKruskal-Wallis ANOVAを用いて、順序測定(複合的な神経学的スコア)を評価した。Chi-Square検定を用いて残存する差を比較した。p値＜0.05を統計学上有意とした。
【０２１０】
9.2  結果
9.2.1  化合物1a、2aおよび4aの神経学的スコアリング
未処理ラット(即ち、通常の生理食塩水を投与したラット)では、fluid-percussionによる損傷によって損傷後に運動機能の有意な欠陥が引き起こされるが、２〜３週間期間を延長すれば徐々に機能は回復する。これらの試験では、損傷後１日目に検定した場合には、全ての動物で神経学的スコアが低く、処理間で明確な差は認められなかった(図１および２)。しかしながら、損傷後７および14日目には、化合物1a処理群(Kruskal-Wallis ANOVA、それぞれp＝0.2292およびp＝0.2846)、化合物2a処理群(Kruskal-Wallis ANOVA、それぞれp＝0.0042およびp＝0.0140)および化合物4a処理群(Kruskal-Wallis ANOVA、それぞれp＝0.2292およびp＝0.2846)の間で結果に有意差が認められた。７日目に、個々のMann-Whitney U検定を用いる解析をさらに行ったところ、化合物1a(p＝0.0758)、化合物2a(p＝0.0026)または化合物4a(p＝0.2723)をそれぞれ投与したラットにおいて、生理食塩水処理損傷対照に比べて非常に有意な機能の向上が明らかとなった。同様に、14日後にも、神経学的結果の向上が全ての動物で引き続き認められたが、化合物1a(p＝0.2101)、化合物2a(p＝0.0423)および化合物4a(p＝0.3798)で処理したラットにおいて、生理食塩水処理ラットに比べて有意な向上が認められた。
【０２１１】
9.2.2  化合物14cの神経学的スコアリング
未処理ラット(即ち、通常の生理食塩水を投与したラット)では、fluid-percussionによる損傷によって損傷後に運動機能の有意な欠陥が引き起こされるが、２〜３週間期間を延長すれば徐々に機能は回復する。これらの試験では、損傷後１日目に検定した場合には、全ての動物で神経学的スコアが低く、処理間で明確な差は認められなかった(図９)。しかしながら、損傷後７および14日目には、処理群の間で結果に有意差が認められた(Kruskal-Wallis ANOVA、それぞれp＜0.0042およびp＜0.014)。７日目に、個々のMann-Whitneyを用いる解析をさらに行ったところ、YM-14673を投与したラットにおいて非常に有意な機能の向上が明らかとなった(p＜0.0065)。14日後にも、神経学的結果の向上が全ての動物で引き続き認められたが、YM-14673(p＜0.0239)または化合物14c(p＝0.0021)で処理したラットにおいて有意な向上が認められた。
【０２１２】
9.2.3  1a、2aおよび4a実験における死亡率
中程度のレベルのfluid-percussionによる損傷は、典型的には、未処理動物で約25％の死亡率を伴うものである。化合物1a、2aおよび4aの試験では、通常の生理食塩水を投与された14匹のうち３匹(21.4％)(図１)および８匹のうち３匹(37.5％)(図２)のラットが試験の完了前に死亡した。これに比べ、化合物1a、2aおよび4aで処理した動物では、それぞれ７匹のうち２匹(28.6％)、16匹のうち４匹(25％)および８匹のうち０匹(０％) の死亡率を記録した。化合物14cの試験では、群の間で死亡率の差は見られなかった。
【０２１３】
9.2.4  反射および覚醒試験
深部体温は、麻酔の直後では全ての処理群で同様であった。しかしながら、60分後までに、通常の生理食塩水と化合物14cで処理したラットでは体温がほぼ３℃低下した(図10)。対照的に、陽性対照YM-14673で処理した動物は、深部体温を37〜38℃の間に維持していた。反復測定ANOVAでは、有意なGroup効果[F(3,20)=23.163、p＜0.0001]、Time効果[F(12,240)=279.967、p＜0.0001]およびGroup×Time相互作用[F(36,240)=35.989、p＜0.0001]が認められた。Tukeyの対比較を用いる事後分析では、立直り反射の喪失後20〜60分の時点で、YM-14673処理ラットと他の群の全てのラットとの間で有意差が認められた(p＜0.001)。
【０２１４】
立直り反射の回復については、生理食塩水または化合物14c処理群間で有意な差はなかったが、反射回復までの潜伏時間は、YM-14673を投与したラットでは有意に短縮された(図11)(p＜0.0001 Bonferroni 事後検定)。従って、YM-14673の覚醒作用が証明され、ビヒクルまたは化合物14cで処理した動物にはこの作用は見られなかった。MAPについては、ビヒクルまたは化合物14cで処理したラット間では有意な差はなかった(図12)。しかしながら、YM-14673を投与した動物は、他の全ての群と比べて有意に高いMAPを試験の期間中維持していた。反復測定ANOVAでは、有意なGroup効果[F(3,21)=3.728、p＜0.0271]およびGroup×Time相互作用[F(36,252)=1.551、p＜0.0289]が認められた。Tukeyの対比較を用いる事後分析では、注入後60および120分の時点でYM-14673処理ラットと他の群の全てのラットとの間で有意差が認められ(p＜0.05)、注入後30、40、70、90、100および110分の時点でYM-14673と化合物14cの間で有意差が認められた(p＜0.05)。
【０２１５】
10．実施例：製剤
以下の実施例には、本発明の化合物を哺乳動物被験体、特にヒト患者へ投与するための製剤例を示すが、限定を意図したものではない。本明細書に記載の化合物、またはこれらの薬学的な塩もしくは水和物は、いずれも以下の実施例に記載するように製剤化することができる。
【０２１６】
10.1  錠剤製剤
各々60mgの活性成分を含む錠剤を以下のように調製した。
【０２１７】
0004443763.tif 000077
活性成分、デンプンおよびセルロースは、No.45メッシュU.S.シーブに通し、十分に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られた粉末と混合し、次いでNo.14メッシュU.S.シーブに通す。顆粒を50℃〜60℃で乾燥させ、No.18メッシュU.S.シーブに通す。カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを予めNo.60メッシュU.S.シーブへ通し、次いで顆粒へ添加して混合した後、錠剤機で圧縮して各々150mg重量の錠剤を得る。
【０２１８】
上記成分から、湿式造粒法および圧縮により錠剤を調製することもできる。
【０２１９】
10.2  ゼラチンカプセル
硬質ゼラチンカプセルを以下の成分を用いて調製する。
【０２２０】
0004443763.tif 000078
上記成分を混合し、460mgの量で硬質ゼラチンカプセルに充填する。
【０２２１】
10.3  噴霧液剤
以下の成分を含む噴霧液剤を調製する。
【０２２２】
0004443763.tif 000079
活性化合物をエタノールと混合し、混合物を噴射剤22の一部へ添加して-30℃まで冷却し、充填機へ移す。次いで必要量をステンレス鋼容器へ注入し、残りの噴射剤で希釈する。次いでバルブユニットを容器に取付ける。
【０２２３】
10.4  坐剤
各々225mgの活性成分を含む坐剤を以下のように調製する。
【０２２４】
0004443763.tif 000080
活性成分をNo.60メッシュU.S.シーブに通し、必要最小限の熱によって予め溶融しておいた飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。次いで混合物を公称２g容量の坐剤型へ流し込み、冷却する。
【０２２５】
10.5  懸濁剤
５ml用量当たり各々50mgの薬剤を含む懸濁剤を以下のように調製する。
【０２２６】
0004443763.tif 000081
活性成分をNo.45メッシュU.S.シーブに通し、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびシロップと混合して滑らかなペーストを形成する。安息香酸溶液、着香剤および着色剤の一部を、攪拌しながら水の一部を加えて希釈する。次いで十分な水を添加して必要な容量とする。
【０２２７】
今まで記載してきた明細書は、当業者が本発明を実施し得るのに十分なものであると思料する。本発明を実施するための上記形態の各種改変は、製薬業界または関連の分野の当業者には明らかであり、これらの改変は本願の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものと思料する。
【０２２８】
引用した参考文献は全て、引用によりその全内容が本明細書に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、中程度の液体衝撃損傷後30分の、生理食塩水（白抜き）又は1 mg/kgの化合物2a（斜線）で処理したラットの神経学的機能の回復を示すグラフである。棒グラフ（白抜き又は斜線）は、その処置群の全動物の中央値を示す。点（●）は、個々の動物の値を示す。*は、食塩水処理対照に関してp<0.05を示し；**は、食塩水処理対照に関してP<0.01を示す。
【図２】  図2は、中程度の液体衝撃損傷後30分の、生理食塩水（白抜き）、1 mg/kgの化合物1a（斜線）又は1 mg/kgの化合物4a（黒塗り）で処理したラットの神経学的機能の回復を示すグラフである。棒グラフ（白抜き、斜線又は黒塗り）は、その処理群の全動物の中央値を示す。点（●）は、個々の動物の値を示す。
【図３】  図3は、制御された皮質損傷（CCI）後30分の、非損傷対照マウス（◇）及び生理食塩水（○）又は1.0 mg/kgの化合物2a（□）で処理したマウスの梁歩行能力（beam walking performance）を示すグラフである。結果は、処理群当たりの右後足のフットフォールト（footfaults）の１日の平均±SEM数（最高50）として表す。#は、損傷対照（CCI＋食塩水）に関してP<0.05を示し；##は、損傷対照（CCI＋食塩水）に関してP<0.01を示し；***は、非損傷対照（擬似（sham）＋食塩水）に関してp<0.001を示す。
【図４】  図4は、制御された皮質損傷（CCI）後60分の、非損傷対照マウス（＋）及び化合物2aの0.1 mg/kg（□）、1.0 mg/kg（△）又は10.0 mg/kg（◇）で処理したマウスの梁歩行能力を示すグラフである。結果は、処理群当たりの右後足のフットフォールトの１日の平均±SEM数（最高50）として表す。
【図５】  図5は、制御された皮質損傷（CCI）後30分の、非損傷対照マウス（黒塗り）及び生理食塩水（白抜き）又は1.0 mg/kgの化合物2a（斜線）で処理したマウスの、モリス水迷路（Morris watermaze）の場所学習バージョンで隠されたプラットフォームを探す潜伏時間を示すグラフである。結果は、4回のトライアルに対する各グループの１日の平均±SEMとして表す。*は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.05を示し；**は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.01を示し；***は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.001を示し；そして#は、損傷対照（CCI＋食塩水）に関してp<0.01を示す。
【図６】  図6A及び6Bは、制御された皮質損傷（CCI）後60分の、非損傷対照マウス（黒塗り）及び生理食塩水（白抜き）又は化合物2aの0.1 mg/kg（左下がり斜線）、1.0 mg/kg（右下がり斜線）又は10.0 mg/kg（点々）で処理したマウスの、モリス水迷路（Morris watermaze）の場所学習バージョンで隠されたプラットフォームを探す潜伏時間を示すグラフである。図6Aでは、対照群は6匹の動物を含み、各処理群は8匹の動物を含んでいた。図6Bでは、対照群は12匹の動物を含み、各処理群は8匹の動物を含んでいた。
【図７】  図7は、制御された皮質損傷（CCI）後30分の、非損傷対照マウス（擬似＋食塩水）及び生理食塩水（CCI＋食塩水）又は1.0 mg/kgの化合物2a（CCI＋化合物2a）で処理したマウスの、モリス水迷路（Morris watermaze）の場所学習バージョンで隠されたプラットフォームを探す潜伏時間を示すグラフである。黒塗りの棒グラフ（■）は、2回の連続したトライアルの1回目を示し；白抜きの棒グラフ（□）は、2回の連続したトライアルの2回目を示す。結果は、4回のトライアル対に対して各グループの１日の平均±SEMとして表す。*は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.05を示し；#は、損傷食塩水処理対照（CCI＋食塩水）に関してp<0.05を示す。
【図８】  図8は、制御された皮質衝撃（controlled cortical impact: CCI）損傷後の、食塩水（○）、1 mg/kgの化合物10b（△）又は1 mg/kgの化合物11b（□）によって処理されたマウスにおける梁歩行タスクでのフットフォールトの平均数を示すグラフである。
【図９】  図9は、中程度の液体衝撃損傷後30分の、生理食塩水（白抜き）、1 mg/kgのジヨード−YM−14673（点々）又は1 mg/kgの化合物14c（斜線）で処理されたラットの神経学的機能の回復を示すグラフである。棒グラフは、その処理群の全ての動物の中間値を示し；*は、食塩水処理対照に関してp<0.05を示し；そして**は、食塩水処理対照に関してp<0.01を示す。
【図１０】  図10は、軽く麻酔したラットの中心体温に及ぼす食塩水ビヒクル及びTRH類似体の影響を示すグラフである。白抜きの点（○）は、生理食塩水を示し；黒塗りの点（●）は、1 mg/kgのYM−14673を示し；（□）は、ジヨード−YM−14673を示し、そして白抜きの三角（△）は、1 mg/kgの化合物14cを示す。
【図１１】  図11は、軽い麻酔後のラットの立直り反射を回復する潜伏時間に及ぼす食塩水ビヒクル及びTRH類似体の影響を示すグラフである。ラットは、正常食塩水（白抜き）；1 mg/kg及び10 mg/kgの用量のYM−14673；ジヨード−YM−14673；又は化合物14c（左下がり斜線）のいずれかで静脈内処理した。
【図１２】  図12は、完全に意識がある、拘束されていないラットに、生理食塩水（○）、1 mg/kgのYM−14673（●）、1 mg/kgのジヨード−YM−14673（□）、又は1 mg/kgの化合物14c（△）の静脈内投与後の種々の時間での平均動脈血圧（MAP）を示すグラフである。
【図１３】  図13は、微細な運動調整を測定する梁歩行タスクでの擬似操作されたマウスおよび制御された皮質衝撃（CCI）損傷を受けたマウスの能力を示すグラフである。結果は、処理群当たりの右手足のフットフォールトの１日の平均+/-SEM数（最大50）として表す。#は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.05を示し；##は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.01を示し；***は、非損傷対照（擬似＋食塩水）に関してp<0.001を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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