(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された被検試料中のゲノミックＤＮＡ又はｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡについて、下記(1)〜(5)の少なくとも１つを調べることを含む、成人発症II型シトルリン血症の病因変異の検出方法。
(1)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAコード領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在しているか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(2)  配列表の配列番号６で示されるSLC25A13遺伝子の第１１イントロンの５’末端側領域の1ntのGがAに置換する変異が存在するか否か。
(3)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661ntの間のいずれかの部位に挿入される変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(4)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の674ntのＣがＡに置換する変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(5)  配列表の配列番号１３で示されるSLC25A13遺伝子の第１３イントロンの５’末端側領域の1ntのGがAに置換する変異が存在するか否か。
【請求項２】
上記(1)又は(3)に記載の変異の有無は、これらのいずれかの変異を含む核酸領域を増幅し、増幅された核酸断片のサイズから該変異の有無を調べることにより行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記(2)、(4)又は(5)に記載の変異の有無は、これらのいずれかの変異を含む核酸領域を増幅し、増幅された核酸断片を、該変異の有無により異なるサイズの消化核酸断片を生じる制限酵素で消化し、消化により生じた消化核酸断片のサイズから該変異の有無を調べることにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記(1)〜(5)に記載の変異が、ゲノミックＤＮＡ中に存在するか否かを調べる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記(1)〜(5)に記載の変異の有無は、上記SLC25A13遺伝子によりコードされる下記(i)〜(v)のタンパク質を調べることにより行われる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
(i)  上記(1)の変異により、配列番号１に示す配列中の第２８６番目のコドンの位置に停止コドンが導入されて生じた、途中で切断されたタンパク質。
(ii)  上記(2)の変異により、配列番号１に示す配列中の第３４０〜３９２コドンによりコードされる５３個のアミノ酸残基が欠失したタンパク質。
(iii)  上記(3)の変異により、配列番号１に示す配列中の第５５４コドンでフレームシフトが起き、これにより第５７０コドンが停止コドンとなって生じた、シトリンのＣ末端部分が切断されたタンパク質。
(iv)  上記(4)の変異により、配列番号１に示す配列中の第２２５コドンが停止コドンとなって生じた、途中で切断されたタンパク質。
(v)  上記(5)の変異により、配列番号１に示す配列中の第４１１〜４３７コドンによりコードされる２７アミノ酸残基が欠失したタンパク質。
【請求項６】
免疫測定法により行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記(1)〜(5)に記載の全ての変異の有無を調べる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列表の配列番号１、配列番号６又は配列番号１３に示される塩基配列において上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むSLC25A13遺伝子によりコードされる、上記(i)ないし(v)のいずれかのタンパク質。
【請求項９】
配列表の配列番号１、配列番号６又は配列番号１３に示される塩基配列において上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むSLC25A13遺伝子のゲノミックDNA配列、mRNA配列又はcDNA配列から成る核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、成人発症II型シトルリン血症の病因変異の検出方法及びそれに用いられるタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シトルリン血症(CTLN)は、血中及び尿中のシトルリン濃度及びアンモニア濃度が上昇し、嘔吐、意識障害、けいれん等を発症する疾患であり、尿素サイクル酵素の１つであるアルギニノコハク酸合成酵素(ASS)の異常に基づく疾患である。本願発明者らは、これまでに１７０症例を超えるCTLNを解析し、酵素異常から３型に、病因の違いから２病型に分類してきた。そのうちI型とIII型は、染色体9q34に座位するASS遺伝子の異常に起因する新生児小児発症の古典型シトルリン血症(CTLN1)である。
【０００３】
一方、成人発症の大部分に見られる成人発症II型シトルリン血症(CTLN2)は、ASSの肝臓特異的欠損を特徴とするが、ASS遺伝子には異常がなく、肝細胞中のASS mRNAにも異常がないという特異な病因に起因する疾患である。CTLN2は、意識障害及び昏睡を引き起こし、多くは発症２〜３年で死に至る。日本におけるCTLN2の発症頻度は約１０万人に１人であり、CTLN1よりも高い。CTLN2が肝臓特異的疾患であることは、現在までに９症例で行われた肝臓移植が良好な治療効果をあげていることからも支持される。本願発明者らは、これまでに１１８家系のCTLN2を経験し、そのうち２３家系が血族結婚由来であることから、CTLN2が常染色体劣性の遺伝性疾患であることを報告してきた。しかしながら、その責任遺伝子は全く不明であった。
【０００４】
現在、CTLN2の診断は、血中のアミノ酸分析や膵臓分泌トリプシンインヒビター(PSTI)濃度の増加等の生化学的マーカーを検査し、さらに肝組織におけるASS活性や蛋白の低下を測定することにより行われている。しかしながら、生化学的検査や酵素学的解析は煩雑で時間がかかるため、多数の検体を短時間で検査しなければならない臨床検査には必ずしも適してはおらず、また、それだけで確定診断を行うことが困難である。もし、CTLN2の責任遺伝子を明らかにすることができ、かつ、CTLN2を引き起こす、責任遺伝子中の変異を明らかにすることができれば、遺伝子検査により簡便、かつ、確実にCTLN2を診断することができ、有利である。しかも、CTLN2の診断のみならず、該遺伝子のキャリアの診断も可能になる。また、もし、この責任遺伝子がタンパク質をコードする構造遺伝子であり、CTLN2が該タンパク質の異常により引き起こされるものであるならば、該タンパク質を対象とした免疫測定等により簡便、かつ、確実にCTLN2を診断することが可能になる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、CTLN2の責任遺伝子及びCTLN2を引き起こす、該責任遺伝子中の変異を明らかにし、それによってCTLN2を遺伝子検査等により簡便、かつ、確実に診断することができる方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、CTLN2が常染色体劣性の遺伝病であると考え、血族結婚由来のCTLN2患者及び健常人のゲノミックＤＮＡを用いて、ホモザイゴシティ・マッピング法により、CTLN2の遺伝子座位を７番染色体上に見出し、これを基にゲノミックＤＮＡのポジショナルクローニングを行うことにより、CTLN2の責任遺伝子と考えられる、染色体7q21.3に位置する新規な遺伝子を同定した。さらに、CTLN2患者及び健常人の該遺伝子の塩基配列を決定することにより、CTLN2患者にはホモ接合あるいは複合ヘテロ接合で含まれるが、健常人にはホモ接合で含まれることがない５種類の突然変異を見出し、該遺伝子がCTLN2の責任遺伝子であるという結論に達した。そして、これらの５種類の突然変異を遺伝子検査により検出する方法を開発した。さらに、該責任遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、該タンパク質を抗原とする抗体を作製した。
【０００７】
すなわち、本発明は、生体から分離された被検試料中のゲノミックＤＮＡ又はｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡについて、下記(1)〜(5)の少なくとも１つを調べることを含む、成人発症II型シトルリン血症の病因変異の検出方法を提供する。
(1)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAコード領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在しているか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(2)  配列表の配列番号６で示されるSLC25A13遺伝子の第１１イントロンの５’末端側領域の1ntのGがAに置換する変異が存在するか否か。
(3)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661ntの間のいずれかの部位に挿入される変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(4)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の674ntのＣがＡに置換する変異がｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。
(5)  配列表の配列番号１３で示されるSLC25A13遺伝子の第１３イントロンの５’末端側領域の1ntのGがAに置換する変異が存在するか否か。
【０００８】
さらに、本発明は、配列表の配列番号１、配列番号６又は配列番号１３に示される塩基配列において上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むSLC25A13遺伝子によりコードされるタンパク質及び配列表の配列番号１、配列番号６又は配列番号１３に示される塩基配列において上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むSLC25A13遺伝子のゲノミックDNA配列、mRNA配列又はcDNA配列から成る核酸を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本願発明者等は、下記実施例に詳述するように、CTLN2が常染色体劣性の遺伝病であるということに基づいて、血族結婚由来のCTLN2患者及び健常人のゲノミックＤＮＡを用いてホモザイゴシティ・マッピング法によりCTLN2遺伝子座位を７番染色体上に見出し、これを基にゲノミックＤＮＡのポジショナルクローニングを行うことにより、CTLN2の責任遺伝子と考えられる、染色体7q21.3に位置する新規な遺伝子を同定し、そのｃＤＮＡ配列を決定した。さらに、該ｃＤＮＡに対応するゲノミックＤＮＡ（イントロン領域を含む）の塩基配列を決定した。そして、CTLN2患者にはホモ接合又は複合ヘテロ接合で含まれるが、健常人にはホモ接合で含まれることがない５種類の突然変異を見出した。これにより、該遺伝子がCTLN2の責任遺伝子であり、該５種類の突然変異がCTLN2の病因であることが明らかになった。該責任遺伝子を「SLC25A13」と命名し、該遺伝子がコードするタンパク質を「シトリン」と命名した。
【００１０】
健常人のSLC25A13由来のｃＤＮＡの塩基配列を、これがコードするタンパク質（シトリン）の推定アミノ酸配列と共に配列表の配列番号１に示す。以下、本明細書において、塩基の位置は、他に断りがない限り、配列番号１に示されるコード領域（配列番号１に示される配列の第１３８番目のＡから始まる）の第何番目の塩基であるかにより表す。例えば、コード領域第１番目の塩基であるＡの位置は「1nt」、１０００番目のＣの位置は、「1000nt」のように表す。該ｃＤＮＡが由来するゲノミックＤＮＡ中の遺伝子であるSLC25A13の塩基配列を解析し、それと配列番号１に示すｃＤＮＡ配列とを比較することにより、ｃＤＮＡ配列中のエクソン−エクソン境界を決定した。その結果、SLC25A13は１８個のエクソン領域を有することが明らかになった。ｃＤＮＡ中の各エクソン領域の位置を下記表１に示す。
【００１１】
【表１】
0004480199.tif 000002
【００１２】
イントロンは、SLC25A13中において、表１に示す各エクソンの間に位置する。イントロンの番号は、そのイントロンの直上流にあるエクソンの番号と同じである。すなわち、例えば、第１１イントロンは、表１に示す第１１エクソンと第１２エクソンの間に位置し、第１３イントロンは、第１３エクソンと第１４エクソンの間に位置する。本発明に関連する各イントロンの配列（又は部分配列）を配列番号２〜１３に示す。すなわち、配列番号２には、第７イントロンの３’末端側の塩基配列（配列番号２に示される塩基配列の３’末端のＧの直後に第８エクソンの５’末端のＡが来る。以下同様）を示す。配列番号３には、第８イントロンの塩基配列を示す。配列番号４には、第９イントロンの５’末端側の塩基配列（第９エクソンの３’末端のＧの直後に配列番号４に示される塩基配列の５’末端のＧが来る。以下同様）を示す。配列番号５には、第１０イントロンの３’末端側、配列番号６には、第１１イントロンの５’末端側、配列番号７には第１５イントロンの３’末端側、配列番号８には第１６イントロン、配列番号９には第１７イントロンの５’末端側、配列番号１０には第６イントロンの３’末端側、配列番号１１には第７イントロンの５’末端側、配列番号１２には第１２イントロンの３’末端側、配列番号１３には第１３イントロンの５’末端側の塩基配列をそれぞれ示す。
【００１３】
本願発明者らがCTLN2の病因であることを見出した、SLC25A13中の突然変異は次の５種類である。
(1)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異（以下、この変異を「[I]851del4」と言うことがある）。
(2)  SLC25A13の第１１イントロンの５’末端のGがAに置換する変異（以下、この変異を「[II]IVS11+1G>A」と言うことがある）。
(3)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661ntの間のいずれかの部位に挿入される変異（以下、この変異を「[III]1638ins23」と言うことがある）。
(4)  配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の674ntのＣがＡに置換する変異（以下、この変異を「[IV]S225X」と言うことがある）。
(5)  SLC25A13の第１３イントロンの５’末端のGがAに置換する変異（以下、この変異を「[V]IVS13+1G>A」と言うことがある）。
【００１４】
下記実施例において記載するように、シトリンは、他のミトコンドリアキャリアファミリーと高いホモロジーを示し、ミトコンドリアの脂質二重膜を６回貫通する構造を有し、ミトコンドリアの膜に存在しているものと考えられる。さらに、シトリンは特徴的なEF-handモチーフを４個有していることから、カルシウム依存性のミトコンドリアキャリア蛋白であると推測される。シトリンの存在状態を図６に模式的に示す。上記(1)〜(5)の突然変異のおよその位置も図６に併せて示されている。
【００１５】
上記(1)の変異により、配列番号１に示す配列の第２８６番目のコドンの位置に停止コドンが導入されるので、該変異遺伝子によりコードされるタンパク質は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上記(2)の変異はイントロン領域内に起きるものであるが、この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシングが異常となり、ｍＲＮＡの第１１エクソンが欠失し、図６に示す膜貫通領域TM1とTM2の間の親水性ループ内で、配列番号１に示す第３４０〜３９２コドンによりコードされる５３個のアミノ酸残基が欠失する。上記(3)の変異が存在すると、第５５４コドンでフレームシフトが起き、第５７０コドンが停止コドンとなってこの間に１６個の正常とは異なるアミノ酸配列が存在することとなる。従って、この突然変異によれば、シトリンのＣ末端部分が切断された不完全なタンパク質となる。上記(4)の変異が存在すると、第２２５コドンが停止コドンとなり、該変異遺伝子によりコードされるタンパク質は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上記(5)の変異はイントロン領域内に起きるものであるが、この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシングが異常となり、図６に示すTM2とTM3の間で２７アミノ酸残基（第４１１〜４３７コドン）が欠失する。このように、上記突然変異(1)〜(5)のいずれが存在する場合でも、変異SLC25A13によりコードされるシトリンは、正常なシトリンとは構造が大きく異なったものとなる。
【００１６】
本発明のCTLN2の診断方法では、上記(1)〜(5)の変異の少なくともいずれかを調べる。好ましくは、被検試料中のSLC25A13が上記(1)〜(5)の変異を全く有していないか、また、有しているとすれば(1)〜(5)のどの変異を有しているのかを調べる。これらの変異は、ゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのいずれを調べることによってもその存在の有無を調べることが可能である。上記変異(2)及び(5)は、イントロン領域内の変異であるが、上記のように、該変異によりｍＲＮＡ及びそれに由来するｃＤＮＡの配列が正常のものとは大きく異なるので、(2)及び(5)の変異もｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを調べることによりその存在の有無を調べることができる。なお、CTLN2は肝臓特異的な疾患であるから、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを対象として検査を行うのであれば被検試料としては肝細胞が必要となる。これに対し、ゲノミックＤＮＡを対象として検査を行うのであれば、容易に採取できる末梢血細胞等から抽出されるゲノミックＤＮＡを用いることができるので、肝細胞を採取する必要がなく、簡便で、患者の負担も小さいので好ましい。
【００１７】
本発明により、SLC25A13のｃＤＮＡの配列及びゲノミックＤＮＡ中の、上記突然変異部位近傍のイントロン配列並びに上記各突然変異の位置及び構造が明らかにされたので、上記各突然変異の有無は、種々の常法により容易に調べることができる。例えば、上記(1)又は(3)の変異の有無を調べる場合には、変異を含むゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡの領域をＰＣＲのような核酸増幅法により増幅し、増幅断片を電気泳動にかけてバンドのサイズを測定することにより行うことができる。変異が存在すると、欠失又は挿入に起因して増幅核酸断片のサイズが正常遺伝子の場合と比較して増減するので、増幅断片のサイズを調べることによりこれらの変異の有無を調べることができる。また、ｃＤＮＡについて調べる場合には、この方法により上記(2)及び(5)の変異の有無も調べることができる。また、ゲノミックＤＮＡについて調べる場合、上記(2)、(4)又は(5)の変異は、塩基の置換なので増幅断片の大きさは正常型も変異型も同じであるが、いわゆる制限断片長多型(RFLP)の手法を用いることにより容易に調べることができる。例えば、上記(4)の変異の有無を調べる場合には、塩基の置換によりAluI部位(AGCT)が導入されるので、(4)の変異を含む断片を核酸増幅法により増幅し、制限酵素AluIで消化し、消化断片を電気泳動にかけてそのサイズを測定することにより該変異の有無を調べることができる。正常型の場合には、増幅断片は切断されず、変異型の場合には増幅断片は、変異が存在する部位でAluIにより切断されるので、正常型の増幅断片よりも小さな断片が２つ現れる。また、変異によって適当な制限酵素部位が導入されない場合には、増幅断片中にこのような制限酵素部位が導入されるように、増幅プライマーの配列を意図的に変えることができる。例えば、上記(2)の変異を検出する場合に、リバース側のプライマーの３’末端を、鋳型ＤＮＡと相補的なＡではなく、Ｇとすることにより、変異部位に正常型ではGGTC、変異型ではGATCの配列が導入される。GATCは、制限酵素Sau3AIにより切断されるので、RFLPにより上記(4)と同様にして変異の有無を調べることができる。また、上記(5)の変異の有無は、リバース側プライマーの３’末端を、鋳型ＤＮＡと相補的なＡではなくＣとすることにより、変異部位に正常型ではCTGCGG、変異型ではCTGCAGの配列が導入されるので、制限酵素PstIを用いたRFLPにより変異(5)の有無を容易に調べることができる。さらに、正常型又は変異型のいずれか一方とはハイブリダイズしない、又はハイブリダイズしても増幅が起きないプライマーを用いて、核酸増幅法を行い、増幅が起きるか否かを指標として変異の有無を調べることも可能である。例えば、ゲノミックＤＮＡについて調べる場合、上記の(1)又は(3)の変異のように、欠失又は挿入が起きる変異の場合には、変異の箇所とハイブリダイズするプライマーを用いることができる。また、変異の部分にハイブリダイズするプローブを用いたサザンブロットやノーザンブロットにより変異の有無を調べることも可能である。また、増幅断片の塩基配列を直接決定することによって変異の有無を調べることも可能である。
【００１８】
なお、核酸増幅のために用いられるプライマーは、配列番号１に示すｃＤＮＡ配列又は配列番号２〜１３のいずれかに示されるイントロン配列と相補的なものであり（イントロンとエクソンにまたがる領域と相補的なものでもよい）、増幅すべき領域の両端にそれぞれハイブリダイズするものである。もっとも、完全な相補性は必ずしも必要ではなく、配列特異的なハイブリダイズが可能であれば非相補的な塩基を含んでいてもよい。プライマーのサイズは、通常１５塩基〜５０塩基程度、好ましくは２０塩基〜４０塩基程度であるがこれらに限定されるものではない。
【００１９】
また、上記のように、変異型のSLC25A13によりコードされるシトリンは、その構造が正常型シトリンと大きく異なるので、シトリンを調べることにより、上記変異の有無を調べることもできる。シトリンが変異型であるか正常型であるかは、例えば免疫測定により簡便かつ正確に調べることができる。変異型のシトリンとのみ特異的に反応し、正常型のシトリンとは反応しないモノクローナル抗体を用いることにより、変異型のシトリンを特異的に検出することができる。このようなモノクローナル抗体は、変異型のシトリンを免疫原として用いて常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常型のシトリンとは反応しないが変異型のシトリンとは反応するモノクローナル抗体を選択することにより得ることができる。免疫原として又はモノクローナル抗体のスクリーニングに用いる変異型又は正常型シトリンは、本発明により、そのｃＤＮＡの全塩基配列が明らかになっているので、常法に基づき、遺伝子工学的手法により、大量に作製することが可能である。この具体的な一例が下記実施例３に記載されている。なお、免疫原又はスクリーニング用のシトリンは、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するｃＤＮＡ若しくは上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むその変異体によりコードされるシトリンのみならず、該シトリンの１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失し若しくは置換し、若しくは該タンパク質に１若しくは複数のアミノ酸残基が付加され若しくは挿入された修飾シトリンであって、上記シトリンに対する抗体と免疫反応する修飾シトリンであってもよい。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
１．  方法
(1)  患者
血液試料、外科的又は剖検肝臓標本、及び臨床データは、互いに関連していない血族結婚家族の１８人の成人発症患者（１９〜４８歳）から採集した（図２のa）。なお、シトルリン血症の診断は確立された方法により行った。１２７人の１８〜５５歳の無関係な健常者を対照として用いた。
【００２２】
(2)  ホモ接合マッピング(Lander E.S. et al., Science 236, 1567-1570(1987))によるゲノムスクリーニング
Research Genetics, Inc.から市販されているCHLC Human Screening Set/Weber version 6からの３９１種のマイクロサテライトマーカーパネルを用いてスクリーニングを行った。高解像度ジェノタイピングのために、0.2μＭの蛍光標識[R110]-又は[R6G]-dUTPを含む混合物中でＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物のサイズは、サイズ標準としてGeneScan-500[TAMRA]を用い、ABI310 Genetic Analyzer上でGeneScan 672を用いて解像した。PON1-192, PON2-148及びPDK4プロモーター領域は、確立された方法(Humbert, R., et al., Nature Genetics 3, 73-76(1993); Hegele, R.A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3373-3377(1997); Rowles, J. et al., J. Biol. Chem. 271, 22376-22382(1996))に従い、ＰＣＲと制限酵素消化の組合せにより解析した。関係の統計学的有意差を評価するために、２×２分割表χ2テストを用い、患者におけるホモ接合の百分率を無関係な対照と比較した。Ｐ値はイェーツの修正により調整した。
【００２３】
(3)  SLC25A13遺伝子の同定
SLC25A13の３’部分が先ず、ESTクローンyg89b07(GenBank Acc. #R55737)(以下、単にAcc #のみを記載したものは全てBenBankのAccession No.を意味する)を図３に示すYACクローンにマッピングすることにより同定された。続いて常法によりｃＤＮＡライブラリースクリーニング、RT-PCR及び5'-RACE実験を行うことにより、この遺伝子の全長を単離した。遺伝子構造は、BACクローンであるH GS025M02(Acc. #AC002540)及びH GS244B22 (Acc. #AC002450)からｃＤＮＡ配列をゲノム配列と比べること及びゲノミックＤＮＡの逆ＰＣＲにより決定した。これまでにこの遺伝子の１８のエクソンが同定されている。
【００２４】
(4)  ノーザンブロット分析
プライマー5'-F (5'-acgccagccagccagtcagt-3', -53nt〜-34nt（SLC25A13 mRNAのヌクレオチドは、開始コドンのＡを+1として示す）)とプライマー10B(5'-tctgggcctcagccaagtta-3', 928nt〜909nt)を用いてＰＣＲにより増幅された981 bpの断片（ｃＤＮＡの５’側）をプローブとして、ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech #7760-1)とハイブリダイズさせることによりSLC25A13 mRNAを調べた。さらに、プライマー3'-F (5'-taggaagatcagccctggga-3')とプライマーEnd-B (5'-gcgcctctgaccattatgca-3')を用いたＰＣＲにより増幅された９３４ｂｐの断片（SLC25A13の3'-非翻訳領域、2026nt〜2959nt）をプローブとして用いて同じブロットにハイブリダイズさせた。aralar mRNA(del Arco, A. et al., J. Biol. Chem. 273, 23327-23334(1998))を検出するために、プライマー5'F (5'-gagcacagcatggcggtca-3')とプライマー5'B (5'-ctggagccagataggcctg-3')を用いて９７５ｂｐの断片（ｃＤＮＡの５’側、15nt〜989nt）を増幅し、クローニング及び配列決定の後、これをプローブとして用いた。
【００２５】
(5)  突然変異検出
各ｍＲＮＡのコード領域を増幅するためのＲＴ−ＰＣＲに際して、オリゴ(dT)12-18及びM-MuLV逆転写酵素を用いて肝臓ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成した。増幅されたｃＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、抽出し、TA-vector (Invitrogen社)を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。SLC25A13 mRNAのためには、オリゴヌクレオチドプライマー5'-F、10B及びMF (5'-gaacggattgctcctctgga-3', 871nt〜890nt)及び3'-B (5'-gacagcactatcccagggct-3', 2055nt〜2036nt)を用いた。TFPI-2 (Acc. #L27624), PON1 (Acc. #M63012), PON2 (Acc. #AF001601), PDK4 (Rowles, J. et al., J. biol. Chem. 271, 22376-22382(1996))及びDNCI1 mRNAの全コード領域は、それぞれ適当なプライマーセットを用いて増幅した。用いたプライマーセットは、それぞれ、5'-ggacgccttgcccagcgggc-3'と5'-ccaatgatttgtttcctcatgctg-3'、5'-cccccgaccatggcgaagct-3'と5'-tggcatgggtgcaaatcggt-3'、5'-cggagcgaggcagcgcgccc-3'と5'-agggccgttccttactggaa-3'、5'-atgaaggcggcccgcttcgt-3'と5'-agacccactttgatcccgtaaa-3'、及び5'-gagagaggaagtgatcgctc-3'と5'-acgctgagctctaggacaca-3'であった。
【００２６】
SLC25A13の突然変異検出のためには、各エクソンに隣接するイントロンの配列に基づき、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。IVS-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3'), IVS-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3'), IVS-7F (5'-tcactcattccagtgccttg-3'), IVS-9B (5'-caatgccgcaaaggcaactg-3'), IVS-10F (5'-ttgggctgtagcaatgtgcc-3'), IVS-11B (5'-ctagatgcctccagcctact-3'), IVS-12F (5'-ctcctgaaacatcagtgatgc-3'), IVS-13B (5'-cctagtagactctgcccttg-3'), IVS-15F (5'-ggagcagacatcttgcacac-3')及びIVS-17B (5'-ggagttgatacattctcatca-3')。それぞれの増幅されたゲノミックＤＮＡ断片の塩基配列を直接決定し、又はTA-vectorにクローニング後、塩基配列を決定した。
【００２７】
２．  結果
上記のように、血族結婚家族の患者からのＤＮＡについて、ホモ接合マッピングアプローチ(Lander, E.S., et al.,上掲)を用いてCTLN2座をゲノム全体に渡って検索した。先ず、常染色体に沿って分散された合計３３２個の遺伝マーカーを１５人のCTLN2患者と１５人の対照に対して分析した（図１）。染色体7q21-q22上の２つのマーカー(D7S821とD7S1799)が、それぞれ、１５人の患者のうち１２人（８０％）及び９人（６０％）においてホモ接合であり、これらのχ2値（Ｐ値）は、それぞれ13.4(0.0004)及び12.2(0.0007)であった。
【００２８】
常染色体を縦断する３３２個のマーカーのホモ接合マッピングの結果を図１に示す。それぞれの多型ＤＮＡマーカーについてのホモ接合の頻度のχ2解析は、血族結婚家族（図２参照）からの１８人のCTLN2患者のうち、AP-9、AP-69及びAP-80を除いた１５人と、１５人の無関係な対照との間で行った。対照と比較して高い患者のホモ接合百分率は、各染色体を示す線の右側にχ2値をプロットした。用いたマーカーの相対位置は、センチモルガン(cM)単位で各遺伝的距離を示した。染色体7q21-q22上の２つのマーカー(D7S821及びD7S1799)は、１５人の患者のうち、それぞれ１２人（８０％）及び９人（６０％）がホモ接合であり、それらのχ2値（Ｐ値）は、それぞれ13.4 (0.0004)及び12.2 (0.0007)であった。患者と対照との間の観察された差異により、CTLN2遺伝子は、D7S2212 (χ2=2.78, P=0.039)の先端部領域及びD7S22847(χ2=1.29, P=0.45)の忌憚部領域内に存在するかもしれないことが示唆された。１８人のCTLN2患者と１１８人の対照とを調べると、他の常染色体上では、D19S586もまた非常に有意であった(χ2=11.8, P=0.0017)。しかしながら、D19S586に１cM以内の距離で隣接する３つのさらなるマーカー、すなわち、D19S413(χ2=0.50, P=0.57)、D19S204(χ2=1.65, P=0.26)及びD19S583(χ2=4.04, P=0.062)では、有意な結果は検出されなかった。
【００２９】
この観察の有意性を確認し、染色体７ｑ上のCTLN2遺伝子座をより正確に特定するために、１６個のマイクロサテライトマーカー及び３個の遺伝子(PON1, PON2及びPDK4)(Humbert et al., 上掲；Hegele,R.A. et al.,上掲；Rowles J. et al.,上掲)中の多型を用いて、１８人の患者及び１２０人の対照全部を解析した。３つのマーカー(D7S527, D7S1812及びD7S821)のホモ接合の割合がχ2及びＰ値の両者とも、有意に高かった（図２）。さらに、D7S1812は、１８人の全てのCTLN2患者においてホモ接合であった。これらの１８人のCTLN2患者のうち、１３人（７２％）において２９０ｂｐのD7S1812対立遺伝子のホモ接合が観察され、これは１１６人の対照のうちの２４人（２１％）と比較して有意に高かった(χ2=20.7, P<0.0001)。２８１ｂｐのD7S1812対立遺伝子のホモ接合は、１８人の患者のうち５人（２８％）、１１６人の対照のうち１１人（9.5%）で観察され、これの有意性はより低かった(χ2=4.96、P=0.042)。全てのCTLN2患者のハプロタイプを比較すること及び対照と比較した対立遺伝子頻度に基づき、CTLN2遺伝子座の最も可能性の高い部位は、D7S527とD7S821の間でD7S1812に近い、7q21.3であると推定した（各マーカーの位置については図３参照）。さらに、ハプロタイプの解析により、５種類の異なる疾患遺伝子担持染色体が存在する可能性が示された（図２のb）。
【００３０】
図２は血族結婚両親(a)からの１８人のCTLN2患者及び対応するハプロタイプ(b)のリストを示す。図２のaにおいて、「いとこ」は、両親の血縁の程度を示す。「Cit」及び「Arg」は、それぞれ血清中のシトルリン及びアルギニン濃度を示し、Thr/Serは血清中のスレオニン／セリンの比率を示す。sPSTI及びhPSTIは、それぞれ血清中及び肝臓中のPSTI濃度を示す。肝臓ASS(hASS)は、対照に対する％で示されている。括弧内の各数字は「平均±標準偏差」を示す(Kobayashi, K., et al., Hepatology 25, 1160-1165(1997))。「n.t.」は測定しなかったことを意味する。図２のbにおいて、D7S2212ないしD7S1799からの各マーカーが、図の左側に、染色体7q21-q22領域を含むジェノミックインターバルの動原体側末端（上）からテロメア側末端（下）に向かう物理マッピングの順に示されている。括弧内の数字は、対照のホモ接合(ホモ接合／測定した人数)を示す。各患者がホモ接合であったマーカーのストレッチを淡灰色のシェーディングで示す。また、図２のｂにおいて、PON1の行のＲとＱ、PON2の行のＡとＧは、それぞれにPON1の１９２番目、PON2の１４８番目のアミノ酸であり、PDK4の行のCC, CTやTTは、それぞれにPDK4遺伝子の５’上流の-154番目（Ｃ又はＴ）と-209番目（Ｃ又はＴ）の塩基に相当するものである。患者では、３つのマーカーが、χ2及びＰ値の両者ともにおいて、ホモ接合の割合が有意に高かった。すなわち、χ2及びＰ値がそれぞれ42.1及び8.7 x 10-11であるD7S527、25.8及び3.9x10-7であるD7S1812、並びに25.7及び3.9x10-7であるD7S821である。共通のハプロタイプに基づき５つの異なるグループ(I/I, II/II, III/III, I/IV及びI/V)に分けることが可能であり、このことは、図６に示すように５つの異なる疾患遺伝子担持染色体の存在を示している。
【００３１】
染色体７ｑの完全な遺伝子地図を構築しようとする努力において、7q21.3領域から少なくとも１７個の遺伝子が同定された（図３）。PDK4、TFPI-2及びPON遺伝子がCTLN2の位置的（及び機能的）候補であったが、これらのコード領域の塩基配列を決定したところ、突然変異は見つからなかった。D7S1812を包含する直近領域における遺伝子同定実験により、中間鎖ダイニン遺伝子(DNCI1) 及びこれまでに特徴づけられていない遺伝子の存在が示された。ＤＮＡ配列決定及び解析、ESTマッピング、並びにｃＤＮＡライブラリースクリーニング及び特徴付けを組み合わせることにより、後者の遺伝子（SLC25A13と命名）が１８個のエクソンを有し、約200 kbのＤＮＡから成ることを決定した。この遺伝子はまた、D7S1812マーカーを包含し（図３）、突然変異スクリーニングにより究極的にこれがCTLN2遺伝子であることが同定された。
【００３２】
図３に7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物理的地図を示す。7q21.3をカバーするYACコンティグ及びこの染色体バンド内の公知の遺伝子が示されている。既知の場合には、５’から３’への遺伝子の転写方向が矢印で示されている。この研究に用いた遺伝マーカーを、YACコンティグ内での位置により決定された順に、黒丸を付して示す。３つのさらなる遺伝マーカー(D7S1513, D7S2430及びD7S1849)も白丸を付して示す。CTLN2の責任遺伝子をSLC25A13として示す。分析した全ての患者においてホモ接合であったD7S1812は、SLC25A13のエクソン１５及び１６の間に位置する。YACクローンは、公知の染色体７−特異的YACライブラリーからのものである。
【００３３】
塩基配列解析により、SLC25A13 cDNAの全長は３１３５ｂｐであり、予想されるオープンリーディングフレーム(ORF)は２０２５ｂｐであることがわかった。推定的ATG翻訳開始部位の近傍のＤＮＡ(ggcgaatcatgcg)は、Kozakコンセンサス配列(Kozak, M., Mamm. Genome 7, 563-574(1996))にとって必須的な-3プリンと+4グアニン残基を有する。
【００３４】
SLC25A13によりコードされる、「シトリン」と命名した推定タンパク質は、６７５個のアミノ酸残基から成り、約74 kDaの分子量を有する（図４）。Ｃ末端領域は、ミトコンドリア溶質キャリアファミリー(Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233(1993))と相同性（２０〜３０％のアミノ酸が一致）を有する。Ｎ末端領域は、カルシウム結合タンパク質において保存されている４つの推定的EF-hand領域(Kawasaki, H. et al., Protein Profile 1, 343-517(1994))を有する。シトリンの全体的な構造は、カルシウムに結合するミトコンドリアキャリアスーパーファミリー(del Arco, A. et al.,上掲)のメンバーであるアララー、及びC. elegansタンパク質(Q21153)とそれぞれ77.8%及び53.7%の相同性を有する。シトリンをアララー及びQ21153タンパク質と整列させることにより、Ｎ末端及びＣ末端の各末端近傍の領域を除き、配列が高度に保存されていることが明らかになった（図４）。これらの配列特徴は、アララーと同様、シトリンもまたミトコンドリアの膜中に位置し、カルシウム依存性ミトコンドリア溶質キャリア(del Arco, A. et al.,上掲)として機能しているかもしれないことを示唆している。
【００３５】
図４にシトリンと関連タンパク質の整列比較を示す。シトリン(SLC25A13タンパク質)と、アララー(SLC25A12タンパク質)と、C. elegans Q21153タンパク質の推定アミノ酸配列を比較を示す。アミノ酸の同一及び保存を、それぞれ黒又は斑点で強調してある。シトリンは、４つの推定的EF-hand領域を有し（第２８〜３９、６６〜７７、１００〜１１１、１７１〜１８２残基）、これらはカルシウム−結合タンパク質において保存されている(Kawasaki, H. et al., Protein Profile 1, 343-517(1994))。典型的なミトコンドリアキャリアシグネチャーであるGX3GX8PX(D/E)X(I/L/V)(K/R)X(R/K)XQX20-30GX4(Y/W)(R/K)GX9PがシトリンのＣ末端側半分の領域中に観察され（第３３５〜４０３、４３５〜４９５及び５２７〜５９１残基）、米印で記す。他のミトコンドリア溶質キャリアファミリーの他のメンバーと同様に、シトリンは、約１００残基の長さの繰り返し配列を含む。それぞれの繰り返し領域は、２つの膜貫通領域(TM)を含む。第１の領域は、より疎水性で、保存されたグリシン及びプロリン残基を有し、第２の領域は、より親水性で、非常に保存された親水性残基を規定された位置(Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233(1993))に有する。機能領域は、EF-hand及びTMらせんをそれぞれ示す、黒塗り及び白抜きの箱で示す。Ｃ末端側の３領域構造のそれぞれの３つの繰り返し領域内のTMらせんのそれぞれの対は、それらを結ぶ線で示す。
【００３６】
ヒト組織からのpoly(A)+RNAのノーザンブロット解析により、SLC25A13 cDNAの異なる領域からのプローブが、調べたほとんどの組織において約3.4 kbの主なハイブリダイゼーションバンドを検出することが示された（図５のa）。肝臓内での発現レベルが最も高いという観察は、この遺伝子が肝臓特異的CTLN2に関係していることと一貫している。比較的普遍的なSLC25A13の発現とは対照的に、3.3 kbと2.8 kbに２つの主なバンドを有し、6.6 kbに弱いバンドを有するアララーのｍＲＮＡは、心臓、脳及び骨格筋においてよく発現されるが、肝臓においては発現されない（図５のｂ）。
【００３７】
図５にSLC25A13の発現プロフィールを示す。図５に示すヒト組織からのpoly(A)+RNA(２μｇ)を含むノーザンブロットを、SLC25A13-特異的プローブ（コード領域の５’側）(a)、アララー−特異的プローブ（コード領域の５’側）(b)、及びβ−アクチン−特異的プローブ(c)と連続的にハイブリダイズさせた。Ｈは心臓、Ｂは脳、Ｐｌは胎盤、Ｌｕは肺、Ｌｉは肝臓、Ｓｋは骨格筋、Ｋは腎臓、Ｐａは膵臓を意味する。β−アクチンｍＲＮＡは、内部対照として検出した。SLC25A13 mRNA(3.4 kb)とは対照的に、アララー(SLC25A12)の発現は肝臓では観察されず、心臓、脳及び骨格筋において、3.3 kbと2.8 kbのサイズの２つの主なバンドが観察された。これらより弱いが、明らかに特異的なハイブリダイズを示す、約6.6 kbのサイズのバンドも観察された。
【００３８】
図６に示されるように、１８人の全ての血族結婚CTLN2患者のSLC25A13中に、５つの異なる突然変異（最初に図２のｂに示すハプロタイプによって定義された[I]〜[V]と命名）が同定され、これらがCTLN2の病因であることが確認された。このように、個々の突然変異は、上記CTLN2患者からのゲノミックＤＮＡ中に検出された。発見された突然変異は、[I]フレームシフト及び停止コドンの導入をもたらす４ｂｐの欠失、[II]TM1及びTM2領域の間のループを欠失させる置換、[III]停止突然変異をもたらす２３ｂｐの挿入、[IV]ナンセンス変異をもたらす置換、[V]エクソン１３の欠失を引き起こす置換を包含する（図６）。
【００３９】
図６にCTLN2患者におけるヒトシトリン及び突然変異の推定トポロジカルモデルを示す。これはアミノ酸配列（図４）に基づいて推定される、ヒトシトリンの模式図であり、SLC25A13の突然変異[I-V]により引き起こされる変異のおよその位置が示されている。
【００４０】
7q21.3における個々の観察されたハプロタイプ（図２のｂ）を説明する独立した突然変異の同定により、CTLN2が単一の遺伝子により引き起こされることが強く示唆される。血族結婚の両親から生まれた１８人の患者のうち、１５人までがそれぞれの突然変異についてホモ接合であった。驚くべきことに、３人の患者は、血族結婚の両親から生まれたにも関わらず、複合ヘテロ接合であった。このことは、日本人の間でこの疾患の発生率が高いこと及び／又は表現率が低いことを示唆している。非血族結婚の患者１０人全員にも、上記したのと同じ突然変異が観察された。さらに、１２７人の無関係な対照の中では、ただ一人のみがS225X配列変異を有しており、このヒトはおそらくこの疾患のキャリアである（この観察は、日本人の中でCTLN2のキャリアの頻度が1/150ないし1/200であるとの予想と一致する）。
【００４１】
実施例２  ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いた突然変異の検出
健常人又はCTLN2患者の末梢血リンパ球より、常法によりゲノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、以下の各変異検出用のプライマーセットを用い、常法に基づきＰＣＲにより核酸断片を増幅した。
【００４２】
(1)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：IVS-8F2 (5'-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3')(配列番号３の５’末端から166番目〜188番目の塩基配列)
リバース側：Ex-9B (5'-tcttccagaggagcaatccg-3')(配列番号１のコード領域の874nt〜893ntとハイブリダイズ)
【００４３】
(2)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：Ex-11F2 (5'-gaaagtgctacgctatgaagg-3')（配列番号１のコード領域の1137nt〜1157nt）
リバース側：IVS-11Bm2 (5'-aggtattgagcatgtggcactg-3')(配列番号６の５’末端から３番目〜２４番目の塩基配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの３’末端は非相補的）)
【００４４】
(3)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：IVS-15F2 (5'-tgttgtgtctctcctgcagg-3')(配列番号７の５’末端から160番目〜配列番号１のｃＤＮＡのコード領域の1592ntの塩基配列)
リバース側：Ex-16B (5'-gcagtctatcactccgctgt-3')（配列番号１のｃＤＮＡのコード領域の1676nt〜1695ntとハイブリダイズ）
【００４５】
(4)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：ISV-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3')(配列番号１０の５’末端から７２番目〜９１番目の塩基配列)
リバース側：ISV-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3')（配列番号１１の５’末端から５７番目〜７６番目の塩基配列とハイブリダイズ）
【００４６】
(5)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：Ex-13F(5'-gtgaacgattttgtgagggata-3')(配列番号１のコード領域の1231nt〜1250ntの塩基配列)
リバース側：IVS-13Bm (5'-gaagagagcttcaaaaggtacttc-3')（配列番号１３の５’末端から２番目〜２６番目の塩基配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの３’末端は非相補的）
【００４７】
(1)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、８２ｂｐの増幅断片が検出され、(1)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、７８ｂｐの増幅断片が検出された。
【００４８】
(2)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、Sau3AIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、６５ｂｐの増幅断片が検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、４２ｂｐと２３ｂｐの２つの増幅断片が検出された。
【００４９】
(3)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、１２３ｂｐの増幅断片が検出され、(3)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、１４６ｂｐの増幅断片が検出された。
【００５０】
(4)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、AluIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、５７ｂｐと３６９ｂｐの２つの増幅断片が検出され、(4)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、５７ｂｐ、２１４ｂｐと１５５ｂｐの３つの増幅断片が検出された。
【００５１】
(5)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、PstIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、１０６ｂｐの増幅断片が検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、８０ｂｐと２６ｂｐの２つの増幅断片が検出された。
【００５２】
実施例３
リコンビナントシトリン蛋白の作成
シトリンのリコンビナント蛋白として、N-half（883 bp）、C-half（1188 bp）、Full-length（2044 bp）、C末端膜外部（201 bp）の４種類を作成した。ヒト肝細胞より抽出したmRNAを用いて、First Strand cDNA Synthesis Kit（Pharmacia Biotech社）により、cDNAを合成した。そのcDNAを鋳型にして、以下のprimerを用いて  RT-PCRを行なった。プライマーの組み合わせは、N-half：ORF-1FN (5'-taggatccgatggcggccgccaaggtg-3')とORF-1B (5'-tcggatccaatgtctgctaaggtcgtc-3')、C-half：ORF-2F (5'-tgcatatgaccttagcagacattgaa-3')とORF-2B (5'-tcggatcctatgggcctccaccaa-3') 、Full-length：ORF-1FNとORF-2B、C末端膜外部：Ex17F (5'-caagcttcatatgggatcagagccagttcc-3')とORF-2Bであり、下線部分はCitrin cDNAの塩基配列を示す。PCRの条件  は、すべて１cycle（94℃、５分）、30 cycle（94℃、１分；  58℃、１分； 72℃、  ４分）、１cycle（72℃、20分）で行なった。PCR-productは１％agarose S gel（ニッポンジーン社）を用いて電気泳動を行ない、目的のバンドを切りだし、QIAEX II（QIAGEN社）によりDNAをゲルから抽出した。目的DNAはTA vector（Invitrogen社）に組み込み、クローニングした。Positive cloneの選別後、それぞれのプラスミドを適切な制限酵素で切断した。得られたインサートDNAをそれぞれ対応する制限酵素で切断したpET-15b vector（Novagen社）に組み込んで、クローン化した。N-halfおよびFull-lengthにはBamHI、C-halfならびにC末端膜外部にはNdeIとBamHIが用いられた。目的DNAをpET-15bに挿入したplasmidをBL21(DE3)細胞にtransformし、培養菌液のOD600nmが0.5-0.6付近になった時点で、終濃度0.4 mM のIPTGを添加後、さらに４時間培養することにより蛋白発現を行なった。得られた菌体を5,000g、20分、4℃の遠心で集めた。その沈殿を20 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM DTT、1% Triton X-100溶液に懸濁し、凍結融解を３回行ない、5,000g、20分、4℃で遠心した。その沈殿を8M Urea存在下0.1 M Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、His-Tag SystemのNi-columnにアプライ後、8 M Urea存在下0.1 M Imidazole、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液を用いて目的蛋白を溶出し、精製を行なった。目的蛋白を含む画分は終濃度10%のトリクロロ酢酸により濃縮し、その最終沈殿は100%エタノールで２回洗浄した後、-20℃で保存した。
【００５３】
実施例４
抗シトリン抗体の作成
上記の方法で精製したリコンビナント蛋白400μｇを250μｌの8M Urea存在下20mM Tris-HCl（pH8.0）で溶解し、同量のTiterMax Gold（CytRx社）を加えて超音波処理により混合し、その混液をウサギに注射した。１回目の免疫から３週間後、同様の方法で２回目の免疫を行ない、ELISA法により抗体の力価を測定した。最初の免疫から４週間後に３回目の免疫を実施し、その１週間後に全採血を行ない、抗血清を得た。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、初めてCTLN2を遺伝子検査又は免疫測定により、簡便、かつ確実に診断できるようになった。
【００５５】
【配列表】
0004480199.tif 000003
【００５６】
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0004480199.tif 000005
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】第７染色体上のCTLN2の遺伝マッピングを示す図である。
【図２】血族結婚両親からの１８人のCTLN2患者(a)及び対応するハプロタイプ(b)のリストを示す図である。
【図３】染色体7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物理的地図を示す図である。
【図４】シトリンと関連タンパク質の整列比較を示す図である。
【図５】  SLC25A13 mRNAの発現プロフィールを示す図である。
【図６】  CTLN2患者におけるヒトシトリン及び突然変異の推定トポロジカルモデルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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