(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、または３４１位のＬｅｕをＨｉｓに置換する変異を有する機能改変型タンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載の野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、または３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異を有する機能改変型タンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載の野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、９位のＧｌｙおよび３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異を有する機能改変型タンパク質。
【請求項４】
配列番号１に記載の野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、２１７位のＧｌｙをＳｅｒに、または２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換する変異を有する機能改変型タンパク質。
【請求項５】
配列番号１に記載の野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、４９位のＣｙｓをＳｅｒに置換する変異を有する機能改変型タンパク質
【請求項６】
Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造を安定化する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのダイマー同士の会合を安定化する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載のサブユニットを１個以上含む多量体からなる酵素。
【請求項９】
４量体からなる請求項８に記載の酵素。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の酵素をタンパク質安定化剤により化学修飾した酵素。
【請求項１１】
該タンパク質安定化剤がポリエチレングリコール、デキストラン、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールまたはグルタルアルデヒドである請求項１０に記載の酵素。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項１５】
宿主が大腸菌株である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を培養する工程、および生産された組換えタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の製造方法により製造された組換えタンパク質から、請求項１０または１１のいずれかに記載の酵素を化学修飾することを特徴とする、該酵素の製造方法。
【請求項１８】
癌、肥満、心疾患、循環系疾患、神経系疾患、加齢 に対する、請求項８〜１１のいずれかに記載の酵素を含有する治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼのサブユニットのアミノ酸配列を改変した機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼに関する。さらに詳しくは、Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造および／またはダイマーの会合を安定化する機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを構成する組換えタンパク質、特に、補酵素であるピリドキサール５’りん酸（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ  ５’−ｐｈｏｓａｔｅ：ＰＬＰ）の脱離防止、アルカリ溶液中での安定性、熱安定性などの各種安定性の増大した機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼに関する。また、基質特異性が増大した機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼに関する。機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを構成する組換えタンパク質の多量体からなる酵素、安定化剤により化学修飾した酵素、それらをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を培養する工程、および生産された組換えタンパク質を培養培地から回収する工程を含む本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの製造方法、該機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを含有する癌、肥満、心疾患などに対する治療剤に関する。
背景技術
Ｌ−メチオニンγリアーゼ（ＥＣ  ４．４．１．１１）は、Ｌ−メチオニンまたはその誘導体のα，γ−脱離およびγ−置換を触媒し、さらにはＳ−置換Ｌ−システインまたはその誘導体のα，β−脱離およびβ−置換を触媒する、ピリドキサール５’りん酸（ＰＬＰ）を補酵素とする酵素である（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．ら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，１００−１０６（１９７７）．）。この酵素は主としてシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から精製されており、その物理化学的性質および酵素学的性質が調べられている（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，４２１−４２４（１９８４）．）。また、Ｌ−メチオニンγリアーゼの酵素反応のメカニズムについても種々報告されている（Ｅｓａｋｉ，Ｎ．ら；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，８４，３０９−３１２（１９７７）．、Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１５８７−１５９１（１９８８）．）。Ｌ−メチオニンγリアーゼは均一のサブユニット（モノマー）からなるテトラマーで構成されており、補酵素であるＰＬＰが１個のサブユニットに１分子結合している（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ら；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１５８７−１５９１（１９８８）．）。これらの文献は天然由来の酵素を対象にしている。一方、遺伝子組換え技術によって調製されるその組換え型酵素についても報告されている（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１１２０−１１２５（１９９５）．等、配列番号１）。しかしながら、安定性を改善した機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼについては記載も示唆もされていない。
Ｌ−メチオニンγリアーゼが抗癌活性を有していることが報告されている（ＷＯ９４／１１５３５；公開１９９４年５月２６日）。ここで用いられているＬ−メチオニンγリアーゼは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の培養物から抽出されたもので、天然由来のものである。さらに、Ｌ−メチオニンγリアーゼが、肥満（Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈ，Ｎ．ら；Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２３，２６９−２７４（１９９３）．）、パーキンソン病（Ｃｒｏｗｅｌｌ，Ｊｒ．ら；Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒ．Ｂｉｏｌ．，５９，１８６−１９３（１９９３）．）、心循環系疾患（Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｂ．Ｃ．ら；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７９，６７５−６８２（１９９１）．）および老化（Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈ，Ｎ．ら；Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２３，２６９−２７４（１９９３）．）の治療剤にもなりうることが報告されている（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｎ．；Ｈｅａｍａｎ Ｃｅｌｌ，１０，６９−８０（１９９７）．）。また、Ｌ−メチオニンγリアーゼのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡも公開されている（Ｉｎｏｕｅら；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１１２０−１１２５（１９９５）．）。Ｌ−メチオニンγリアーゼの動物たとえばラットでの血中半減期は８０分程度と短く、ポリエチレングリコール修飾を行っても半減期の増大は２倍程度である（Ｔａｎら；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｅｒｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．，１２，４５−５２（１９９８）．）。この場合には、酵素表面に露出しているリジン残基をポリエチレングリコールで化学修飾することにより、酵素の安定性の改良につながっていると考えられる。しかしながら、このようなアミノ酸残基の化学修飾はアミノ酸配列の変異の導入とは完全に異なる。故に、ポリエチレングリコールによるＬ−メチオニンγリアーゼの構造安定性の増加の成功は、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失によるＬ−メチオニンγリアーゼの構造安定性の増加の成功を示唆するものではない。また、ポリエチレングリコール等のタンパク質安定化剤による化学修飾にて機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの構造安定性をさらに増加させることを示唆するものではなかった。
医薬として利用される薬物の投与量は少ない方が望ましいことは当然である。従って、アミノ酸残基の置換などの変異を導入することで高活性、半減期の長い安定な機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを供給できれば、有用な抗癌剤などの医薬品を提供することが可能となる。また、機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼは、例えば、ポリエチレングリコールなどの化学修飾を行うことによりさらなる半減期の増大が期待できる。さらに、機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを他の抗癌剤と組み合わせることにより抗癌作用を増強し、副作用を低減させることが期待できる。
発明の開示
本発明は、天然型のＬ−メチオニンγリアーゼの結晶をＸ線で解析することにより、立体構造、特に４量体構造の保持および基質特異性に寄与している部位を同定し、構造安定化および活性増大に繋がるアミノ酸残基を推定し、変異を導入することにより本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１に記載の天然のＬ−メチオニンγリアーゼサブユニットのアミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、９位のＧｌｙをＣｙｓに、４９位のＣｙｓをＳｅｒに、６１位のＡｒｇをＬｙｓに、１１６位のＣｙｓをＳｅｒまたはＴｙｒに、１１９位のＡｌａをＳｅｒに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、２１７位のＧｌｙをＳｅｒに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、３４１位のＬｅｕをＨｉｓに、３８２位のＡｓｐをＰｒｏにおよび／または３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有する機能改変型タンパク質；
（２）配列番号１の１番から３９８番のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、（１）に記載の変異を有する機能改変型タンパク質；
（３）Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造を安定化する（１）または（２）記載のタンパク質；
（４）Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのダイマー同士の会合を安定化する（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質；
（５）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、３９５位のＬｙｓをＨｉｓに、９位のＧｌｙおよび３８２位のＡｓｐをＣｙｓにおよび／または９位のＧｌｙおよび３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異を有する（４）記載のタンパク質；
（６）Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのダイマー構造を安定化する（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質；
（７）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、１１６位のＣｙｓをＳｅｒまたはＴｙｒに、１１９位のＡｌａをＳｅｒに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓにおよび／または２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換する変異を有する（６）記載のタンパク質；
（８）Ｌ−メチオニンγリアーゼの補酵素であるピリドキサール５’りん酸の脱離を防止させるための変異を有する（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質；
（９）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、１９０位のＣｙｓをＳｅｒおよび／または３４１位のＬｅｕをＨｉｓに置換する変異を有する（８）記載のタンパク質；
（１０）該サブユニットのダイマー同士の会合およびダイマー構造を安定化させ、補酵素であるピリドキサール５’りん酸の脱離を防止させるため、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有する（１）〜（９）のいずれかに記載のタンパク質；
（１１）該サブユニットのダイマー同士の会合およびダイマー構造を安定化させ、補酵素であるピリドキサール５’りん酸の脱離を防止させるため、アミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、９位のＧｌｙをＣｙｓに、１１６位のＣｙｓをＳｅｒまたはＴｙｒに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、３４１位のＬｅｕをＨｉｓに、３８２位のＡｓｐをＣｙｓにおよび／または３９５位のＬｙｓをＨｉｓに置換する変異の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有する（１）〜（１０）のいずれかに記載のタンパク質；
（１２）天然型のＬ−メチオニンγリアーゼに比較して活性が上昇する変異である（１）〜（３）いずれかに記載のタンパク質；
（１３）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、および／または３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異を有する（１２）記載のタンパク質；
（１４）アルカリ溶液中で安定化する変異である（１）〜（３）いずれかに記載のタンパク質；
（１５）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、４９位のＣｙｓをＳｅｒに置換する（１４）記載のタンパク質；
（１６）高温で安定化する変異である（１）〜（３）いずれかに記載のタンパク質；
（１７）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、９位のＧｌｙおよび３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異を有する（１６）記載のタンパク質；
（１８）基質特異性を高める変異である（１）〜（３）いずれかに記載のタンパク質；
（１９）配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、２１７位のＧｌｙをＳｅｒにおよび２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換する変異を有する（１８）記載のタンパク質；
（２０）（１）〜（１９）のいずれか記載のサブユニットを１個以上含む多量体からなる酵素；
（２１）４量体からなる（２０）に記載の酵素；
（２２）（２０）または（２１）に記載の酵素をタンパク質安定化剤により化学修飾した酵素；
（２３）該タンパク質安定化剤がポリエチレングリコール、デキストラン、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールまたはグルタルアルデヒドである（２２）に記載の酵素；
（２４）（１）〜（１９）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ分子；
（２５）（２４）に記載のＤＮＡを含有するベクター；
（２６）（２５）に記載のベクターを宿主に導入して得られる形質転換体；
（２７）宿主が大腸菌株である（２６）に記載の形質転換体；
（２８）（２７）に記載の形質転換体を培養する工程、および生産された組換えタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、（１）〜（１９）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法；
（２９）（２８）に記載の製造方法により製造された組換えタンパク質を化学修飾することを特徴とする、（２２）または（２３）のいずれかに記載の酵素の製造方法；
（３０）癌、肥満、心疾患、循環系疾患、神経系疾患、加齢  に対する、（２０）〜（２３）のいずれかに記載の酵素を含有する治療剤に関する。
更に、本発明は、（３１）結晶Ｌ−メチオニンγリアーゼ、（３２）Ｘ線結晶解析により決定されるＬ−メチオニンγリアーゼの構造、（３３）結晶形態のＬ−メチオニンγリアーゼの構造および阻害剤の結合した結晶形態などの他の結晶形態のＬ−メチオニンγリアーゼの構造を解析するためのその構造の使用、（３４）天然型または機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失以外による、ポリエチレングリコールによる化学修飾などの構造安定化のためのＬ−メチオニンγリアーゼの構造の使用、および機能改変型の使用に関する。
本発明はひとつの態様として、配列番号１に記載される天然のＬ−メチオニンγリアーゼのサブユニットのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなる、該サブユニットの機能改変型であることを特徴とするタンパク質に関する。好ましくは、配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、６位のＬｙｓをＨｉｓに、９位のＧｌｙをＣｙｓに、４９位のＣｙｓをＳｅｒに、６１位のＡｒｇをＬｙｓに、１１６位のＣｙｓをＳｅｒに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、２１７位のＧｌｙをＳｅｒに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、３４１位のＬｅｕをＨｉｓに、３８２位のＡｓｐをＰｒｏにおよび／または３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換する変異の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有する機能改変型タンパク質である。さらに好ましくは、配列番号１の１番から３９８番のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなる機能改変型タンパク質である。相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）が開発したアルゴリズムからなる検索プログラムＢＬＡＳＴで処理することによりスコアで示される類似度を用いることができる。
「天然のＬ−メチオニンγリアーゼ」とは、配列番号１（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１１２０−１１２５（１９９５）．）で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるサブユニット（モノマー）４個で構成されており、１個のサブユニットにつき、１個の補酵素ピリドキサール５’りん酸を有していることを特徴とする酵素である。具体的には、２個のサブユニットがその内側に２個の補酵素ピリドキサール５’りん酸を有するようダイマー構造を形成することで補酵素の脱離を防止し、該ダイマー２個が会合してテトラマー構造を形成している酵素である。
「Ｌ−メチオニンγリアーゼのサブユニットの機能改変型タンパク質」とは、天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼと同様の生物学的活性を示し、かつ天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比べそのテトラマー構造が安定化された酵素および／または基質特異性が増大した酵素を構成するサブユニットであって、「天然のＬ−メチオニンγリアーゼ」のサブユニットのアミノ酸配列と比べて、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するものを意味する。
「テトラマー構造を安定化させる」とは、血中においてプロテアーゼなどによるタンパク質の分解などから酵素を防護するために、該酵素のサブユニットのダイマー同士の会合を安定化させ、該酵素のダイマー構造を安定化させ、および／または補酵素ピリドキサール５’りん酸の脱離を防止させることを包含する。
「ダイマー同士の会合を安定化させる」とは、ダイマー間にジスルフィド結合を形成させることによりプロテアーゼなどによる分解を防護するもので、配列番号１記載の９位のＧｌｙおよび３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換し、ダイマー間にジスルフィド結合を形成させる事によりテトラマー構造を安定化させる方法などが例示される。
「サブユニットのダイマー構造を安定化させる」とは、サブユニット間にジスルフィド結合などを形成させることで補酵素ピリドキサール５’りん酸の脱離を防止し、プロテアーゼなどからの分解を防護するもので、配列番号１記載の１２８位のＰｈｅをＣｙｓに置換し、サブユニット間のジスルフィド結合を形成させる事によりダイマー構造を安定化させる方法、配列番号１記載の２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換し、サブユニット間のジスルフィド結合を形成させる事によりダイマー構造を安定化させる方法、配列番号１記載の１１６位のＣｙｓをＡｓｐに置換および／または１１９位のＡｌａをＳｅｒに置換し水素結合を強化させる事によりダイマー構造を安定化させる方法などが例示される。
「補酵素ピリドキサール５’りん酸の脱離を防止」とは、補酵素ピリドキサール５’りん酸の結合部位近傍に存在するアミノ酸配列を変異することで、補酵素ピリドキサール５’りん酸とサブユニットとの相互作用を増大することなどにより脱離を防止することであり、配列番号１記載の６１位のＡｒｇをＬｙｓに置換、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに置換および／または３４１位のＬｅｕをＨｉｓに置換し、補酵素ピリドキサール５’りん酸との相互作用を高めることによりサブユニットからの脱離を防止させる方法などが例示される。該方法において、置換したアミノ酸残基が、親水性の残基の場合には、直接的、もしくは水分子を介した水素結合、または静電相互作用により、補酵素ピリドキサール５’りん酸の脱離が防止される。また、置換したアミノ酸残基が、疎水性の残基の場合には、ファンデル・ワールス相互作用により、補酵素ピリドキサール５’りん酸の脱離が防止される。
「天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼに比較して活性が上昇する」とは、同一の酵素活性測定条件において天然型よりも変異型が高い活性を示すものであり、配列番号１記載の６位のＬｙｓをＨｉｓに、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに、および／または３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換することにより酵素の構造安定化、基質特異性の増大、ＰＬＰの脱離が防止する方法などが例示される。
「アルカリ溶液中で安定化する」とは、酵素の至適ｐＨよりも高いｐＨにおいて酵素活性の低下を防止するものであり、配列番号１記載の４９位のＣｙｓをＳｅｒに置換することにより酵素の構造安定化、好ましくは、テトラマー構造の安定化することにより、酵素のａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎなどを防止する方法などが例示される。
「高温で安定化する」とは、酵素の至適温度よりも高い温度において酵素活性の低下を防止するものであり、配列番号１記載の９位のＧｌｙおよび３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換することにより酵素の構造安定化、好ましくは、サブユニットダイマー同士の会合を安定化させることにより、耐熱性が増大する方法などが例示される。
「基質特異性を高める変異」とは、基質であるＬ−メチオニンが認識する部位をより基質が特異的に会合しやすいアミノ酸残基に置換することにより基質特異性を高めることで酵素活性を増大させるものであり、配列番号１記載の２１７位のＧｌｙをＳｅｒに置換および／または２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換することによりＬ−メチオニンの特異性が向上する方法などが例示される。
数多くの可能なアミノ酸置換・挿入・欠失のうちのいくつかは、酵素活性に対して好ましくない影響を有することもあり得る。酵素−補酵素の結合部位周辺構造および立体構造をより強固なものとするためのアミノ酸置換、挿入、欠失は、Ｌ−メチオニンとの親和性を低下させ、また、分解速度を減少させうる。しかし、機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをＬ−メチオニン分解活性に関して試験し、顕著な活性の減少を示していないものを選択することが可能である。
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列に、上記のアミノ酸を置換、挿入、欠失された機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列を宿主それに適したベクターを用い、該ベクターに組込み、得られた組換えＤＮＡで宿主を形質転換した形質転換体よりＬ−メチオニンγリアーゼを製造する方法を包含し、その方法は以下の工程にて説明される。しかしながら、本発明によってＬ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列が明らかになった後は、これらの工程の一部は省略または簡略化できることは当業者の認めるところである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
Ｌ−メチオニンγリアーゼ粗酵素液の調製
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，１１２０−１１２５（１９９５）．に記載の方法に従って、Ｌ−メチオニンγリアーゼの構造遺伝子部分を組込んだ発現プラスミドを大腸菌に導入してＬ−メチオニンγリアーゼ発現菌株を作出し、該菌株を培養する。培養後、湿菌体を細胞破砕し、ポリエチレンイミン水溶液を添加して、終濃度０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜０．２％（ｗ／ｖ）に調製した後、５〜２５℃で１〜２０分処理して細胞残査を除去し、Ｌ−メチオニンγリアーゼの粗酵素液を得る。ポリエチレンイミン水溶液による処理の代わりに、湿菌体を細胞破砕した後、遠心分離して得られた上澄液を加熱処理（５５〜６５℃で１〜１０分）して細胞残査を除去してもよい。また、コポロックＳＡのようなろ過助剤を添加し、細胞残渣を除去してもよい。ついで、得られた粗酵素液を硫酸アンモニウムで塩析後、遠心分離し、得られた沈殿を緩衝液、好ましくはりん酸緩衝液に溶解して粗精製のＬ−メチオニンγリアーゼ溶液を得る。この時点でのりん酸緩衝液中のＬ−メチオニンγリアーゼの濃度は４〜３０ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２０ｇ／ｌの間であり、最も好ましくは、１５ｇ／ｌの濃度である。
粗精製のＬ−メチオニンγリアーゼ溶液に、終濃度が５〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは８〜１２％（ｗ／ｖ）となるようポリエチレングリコールを添加し、２〜１５℃、好ましくは４℃で、１０〜１２０分、好ましくは６０分間攪拌して夾雑物質を除去する。使用するポリエチレングリコールとしては平均分子量約７２００以上のもの、例えば、ＰＥＧ６０００などが好ましい。この時、Ｌ−メチオニンγリアーゼの溶解度を高め、損失を最小化するために、硫酸アンモニウムを終濃度で飽和濃度として８〜１２％、好ましくは１０％になるように添加するか、または、溶液のｐＨをＬ−メチオニンγリアーゼの等電点から離れた７．５〜９．５、好ましくは８．０〜９．０の範囲に調整する。
Ｌ−メチオニンγリアーゼ粗結晶の製造
（１）Ｌ−メチオニンγリアーゼ含有溶液、好ましくは上記工程１．で夾雑物質を除去した後の溶液を加温し、ポリエチレングリコールの添加を行う。加温はポリエチレングリコールを添加する前または添加した後の何れでもよいが、好ましくはポリエチレングリコールの添加前が良い。また、加温の前後に分けてポリエチレングリコールを添加しても良く、この場合、加温前のポリエチレングリコールの添加が上記の夾雑物質を除去するためのポリエチレングリコールの添加と兼ねていても良い。加温後の温度は２５〜４０℃、好ましくは３２℃である。ポリエチレングリコールの添加は通常行われる蛋白質の結晶化の方法に基づいて行えばよいが、好ましくは、平均分子量が７２００以上のポリエチレングリコールを使用し、終濃度が５〜２５％（ｗ／ｖ）になるように添加し、攪拌、溶解する。（２）上記溶液に無機塩を添加することにより、Ｌ−メチオニンγリアーゼの柱状結晶が得られる。無機塩としては、好ましくはアルカリ金属塩で、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどが挙げられるが、塩化ナトリウムが特に好ましい。無機塩は、好ましくは、終濃度２０〜５００ｍＭで、より好ましくは１００〜２００ｍＭで用いる。結晶は攪拌せずとも生成するが、好ましくは上記（１）および（２）の操作の間、攪拌しながら行う。また、結晶を製造する際の溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．２〜７．５に保つのが良い。このようにして析出したＬ−メチオニンγリアーゼ結晶は、例えば、遠心分離機を用いて採取することができる。
得られたＬ−メチオニンγリアーゼ粗結晶は、純度が高く、発熱物質の減少も認められた。さらに、結晶状態では冷所において長期間の保存が可能であった。また、得られたＬ−メチオニンγリアーゼ結晶を再溶解後、上記（１）および（２）の工程を繰り返し行うことにより、結晶化を行わず各種クロマトグラフィーを組み合わせて行った精製方法と同等または以上の高純度に精製された組換えＬ−メチオニンγリアーゼを得ることができる。さらに、当該結晶の製造方法を含む精製方法、例えば、本発明の結晶化を行った後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを行う精製方法を行えば、高純度で夾雑蛋白質が極めて少ないことのみならず、医薬品として承認を得ることができるのに十分な程、発熱物質を極低濃度にまで下げることができる。工業的にも、クロマトグラフィーより結晶化方法の方が経済的に有利であることは自明であり、従って本発明の結晶の製造方法を組み込んだＬ−メチオニンγリアーゼ精製方法は工業的に非常に有用な精製方法である。
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶の調製
Ｌ−メチオニンγリアーゼ含有溶液を用いて、Ｘ線解析実験用の結晶化を行うことができる。結晶化の方法としては蒸気拡散法、例えば、ＳｉｔｔｉｎｇＤｒｏｐ法およびＨａｎｇｉｎｇＤｒｏｐ法などや、透析法を用いることができる。いずれの方法においても、結晶化は蛋白質を含む溶液（内液）と蛋白質を含まない溶液（外液）との間で、結晶の析出および成長を促進させ得る平衡条件の実現によりなされるが、その際、内液と外液とが直接的には接触しない方法が蒸気拡散法であり、適当な分子量カットの透析膜を介して内液と外液とが直接に接触する方法が透析法である。Ｌ−メチオニンγリアーゼの結晶化においては、蒸気拡散法の一つであるＳｉｔｔｉｎｇＤｒｏｐ法を用いた。そして結晶化条件の検索においては、本専門分野で一般的に行われている方法を用いた。すなわち、結晶化条件の検索においては、用いる緩衝液の種類、沈殿剤の種類、添加剤、結晶化温度等の種類あるいは条件を様々な形で組み合わせて行う。緩衝液としてりん酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、沈殿剤としては、ＰＥＧ、ＭＰＤ、添加剤としては、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウムを用いて行った。
５０ｍＭりん酸をｐＨ７．１〜７．５、好ましくはｐＨ７．２に調節した溶液に、硫酸アンモニウムが０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１％（ｗ／ｖ）、ＭＰＤが４０％となるよう添加し結晶化用溶液１を調製した。次に、５０ｍＭりん酸をｐＨ７．１〜７．５、好ましくはｐＨ７．２に調節した溶液に、硫酸アンモニウムが０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１％（ｗ／ｖ）、ＰＥＧ６０００が２８〜３２％、好ましくは３０％となるよう添加し結晶化用溶液２を調製した。Ｌ−メチオニンγリアーゼ含有溶液を遠心分離器などを用いて濾過した溶液９．５〜１０．５μｌ、好ましくは１０μｌに結晶化用溶液１を４９０〜５１０μｌ、好ましくは５００μｌ、結晶化用溶液２を９．５〜１０．５μｌ、好ましくは１０μｌを添加し、緩やかに混ぜ合わせたものを内液とする。結晶化用プレートに該内液を添加し、速やかに３〜５℃、好ましくは４℃に調節されたチャンバー内に静置する。その結果、Ｘ線解析に適した結晶を得ることが出来る。
このような結晶化方法によって調製され得る組換え型Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶は再溶解した後も対応する天然のタンパク質と同様の酵素活性を有し、アミノ末端のアミノ酸配列も一致していた。
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶の構造解析
結晶の回折強度の測定は、大型放射光施設（Ｓｐｒｉｎｇ−８）兵庫県ビームラインＢＬ２４ＸＵハッチＡにて、イメージングプレートＸ線解析装置Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶ（リガク社製）、イメージングプレート、あるいは、ＣＣＤディテクター等のＸ線検出器を用いて行った。回転対陰極型Ｘ線発生装置またはシンクロトロン放射から得られるＸ線を結晶に照射し、結晶の回折パターンを得る。得られた回折強度は、ＤＥＮＺＯ（ＨＫＬ  Ｉｎｃ．）等の回折強度処理ソフトを用いて強度データセットとして立体構造の解析を行なう。立体構造の解析にはプログラムパッケージＸ−ＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ著，Ｘ−ＰＬＯＲ，Ｖｅｒｓｉｏｎ９８．０：Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，１９９８年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．提供）のような構造解析ソフトを用いる。最近のシンクロトロン放射とイメージングプレートを用いたデータ測定、ならびに、Ｘ−ＰＬＯＲを用いた精密化により、通常、Ｒ値が２５％以下、分解能が２〜３Åの立体構造を得ることが出来、阻害剤の同定には充分な質である。
アポ酵素と補酵素との複合体の視覚化は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｂｉｏｓｙｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ在）製）またはＱｕａｎｔａ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州バーリントン在）製）等のグラフィックスコンピューター用ソフトウエアを用いて行うことができ、アポ酵素と補酵素との相互作用様式に関してはこれらのプログラムに含まれるツールを用いてその幾何学を明らかにすることが出来る。Ｌ−メチオニンγリアーゼの結晶は、ｐＨ７．２のりん酸緩衝液、沈殿剤をＭＰＤ、ＰＥＧ６０００、硫酸アンモニウムを組合せ、タンパク質溶液よりＳｉｔｔｉｎｇＤｒｏｐ法により得た。結晶の回折強度の測定は、イメージングプレートＸ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ（リガク社製）を用いて行い、分解能１．８Åまでの反射を得た。結晶構造はプログラムパッケージＸ−ＰＬＯＲの分子置換ルーチンを用い、Ｒ値２３．４％を得た。なお、得られた結晶の空間群は、Ｐ４３２１２（Ｚ＝３２）で、非対称単位中に独立な４分子が存在しており、お互いの分子はローカルな２２２を形成している。補酵素であるＰＬＰは、この４量体を形成している２量体の境界付近に位置し、ローカルな２回対称で関係付けられる相手側の分子からも相互作用を受けている。得られた回折イメージはソフトウエアＤＥＮＺＯ（ＨＫＬ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．．）を用いて処理した。
Ｌ−メチオニンγリアーゼの機能改変型
本発明はまた、Ｌ−メチオニンγリアーゼの機能改変型を可能にし、そしてそれらの結晶構造の解明を可能にする。より詳細には、本発明によって、Ｌ−メチオニンγリアーゼの結晶構造に基づくダイマー会合部位、サブユニット会合部位およびピリドキサール５’りん酸結合部位の位置により、機能改変のための所望の部位の同定が可能となる。例えば、機能改変は、ダイマー会合部位、サブユニット会合部位およびピリドキサール５’りん酸結合部位のみのうちの特定の部位または組合わせを指向し得る。このような機能改変型は、野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比較したいくつかの異なる特性のいずれかにより特徴付けられる。例えば、このような機能改変型は、サブユニット解離に対する構造安定性の増加を有し得る。
（１）本発明により調製されるＬ−メチオニンγリアーゼ機能改変型タンパク質は、多くの方法により調製され得る。例えば、Ｌ−メチオニンγリアーゼの天然型アミノ酸配列は、本発明を用いて機能改変に望ましいと同定された部位において、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発または他の従来の技術、例えば、欠失などの手段により変異され得る。機能改変は、合成オリゴヌクレオチドを用いて、Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列中に導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の機能改変部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。機能改変するアミノ酸配列の変異は、Ｌ−メチオニンγリアーゼの完全長ＤＮＡ配列をコードする任意の配列中に変異を導入することで得られる。
（２）本発明により、上記方法または当該分野で周知慣用の技術を用いることにより産生される機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼＤＮＡ配列は、発現ベクターを用いて発現され得る。当該分野で周知であるように、発現ベクターは、典型的には宿主ゲノムから独立した宿主細胞中での自己複製を可能にするエレメント、および選択目的のための１つ以上の表現型マーカーを含む。所望の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列を囲むＤＮＡ配列の挿入の前または後に、発現ベクターはまた、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および必要に応じてリプレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子ならびに終止シグナルをコードする制御配列を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、産生された機能改変型タンパク質の分泌が所望される場合、「シグナル配列」をコードするヌクレオチドが機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列の前に挿入され得る。制御配列の制御下での発現のためには、所望のＤＮＡ配列は、制御配列に作動可能に連結されなければならない。すなわち、機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードし、かつ制御配列の制御下のこの配列の発現およびこのＬ−メチオニンγリアーゼ配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にする適切なリーディングフレームを維持するＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナルを有さなければならない。
（３）広範な周知の利用可能な発現ベクターは、いずれも本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼコード配列を発現するのに有用である。これらは、例えば、ＳＶ４０およびその誘導体、公知の細菌プラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を包含する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のプラスミドなど、より広い宿主域のプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えば、ＮＭ９８９などの多くのλファージの誘導体およびＭ１３や繊維状１本鎖ＤＮＡファージなどのＤＮＡファージ、酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはそれらの誘導体、ならびに該プラスミドとファージＤＮＡの組合わせから得られるベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するために改変されているプラスミドのような染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなるベクターを包含する。好ましくは、大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）用の発現ベクターである。
（４）さらに、機能改変型タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した場合、本発明による機能改変型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現するために、その発現を制御する、任意の広範な発現制御配列が発現ベクター中で使用される。このような発現制御配列として、例えば、動物細胞用のＳＶ４０の初期プロモーター配列および後期プロモーター配列、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系またはｔｒｃ系、ｆｄコートタンパク質のλファージ制御領域の主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター配列、Ｐｈｏ５などの酸性ホスファターゼのプロモーター配列、酵母α−交配因子のプロモーター配列、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが公知である他の配列およびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の好適な実施態様において、本発明者らは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサル腎臓細胞株ＣＯＳ−１のいずれかの宿主において有用な発現制御配列を用いる。
（５）発現ベクターで形質転換する宿主細胞として種々の広範なものが用いられ、それらは本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの産生に有用である。その様な宿主としては、原核生物、酵母などの単細胞真核生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。
原核生物としては、大腸菌属、バチルス属、ストレプトマイセス属などに属する細胞で、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどが例示できる。酵母としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属などなどに属する酵母菌株、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどが例示できる。動物細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞２９３細胞、アフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ細胞などが例示できる。植物細胞としては、タバコ、ポテト、小麦などに由来する細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）卵巣由来細胞Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが例示できる。好ましくは、大腸菌属、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株や動物細胞、例えば、ＣＯＳ−１細胞用いられる。  本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列を発現させ、該タンパク質を産生しようとする場合、全ての発現ベクターおよび発現系が、同じ様式で機能するとは限らないことが理解されるべきである。全ての宿主が同一の発現系を用いて等しく良好に機能するわけではない。しかし、当業者は、実験を行うことなく、そして本発明の範囲を逸脱することなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主から選択し得る。例えば、ベクターの選択の際に重要な考慮事項は、所定の宿主におけるベクターの複製能力である。また、ベクターのコピー数、コピー数の制御能力、および抗生物質マーカーなどの発現ベクター中にコードされる他のタンパク質の発現も考慮されねばならない。さらに、発現制御配列の選択の際、例えば、系の相対的強度、その制御能力、本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼをコードするＤＮＡ配列との適合性、特に潜在的二次構造に関する適合性など種々の要因が考慮されるべきである。
（６）宿主は、選択されたベクターとの適合性、宿主に対する機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの毒性、成熟産物を分泌する能力、タンパク質を適切に折り畳む能力およびテトラマーを形成する能力、発酵要求性、宿主からの機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの精製の容易さおよび安全性の考察により選択されるべきである。これらのパラメーター内で、当業者は有用な量の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを産生し得る、種々のベクター、発現制御系および宿主の組合わせを選択できる。これらの系で産生される機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼは、天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼを精製するために使用される工程およびストラテジーを包含する種々の工程およびストラテジーにより精製され得る。一旦、Ｌ−メチオニンγリアーゼの所望の位置、すなわち、活性部位または補助的結合部位に変異を導入したものが作製されると、変異体は、目的のいくつかの特性のいずれかについて試験され得る。その様な変異体としては、例えば、ダイマー解離、モノマー解離、ピリドキサール５’りん酸解離、ｐＨおよび熱に対する安定性の上昇した変異体ならびに基質特異性の増大した変異体が包含される。
本明細書中で記載される発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は例示の目的のみのためであって、いかなる方法においても本発明を限定するものとは考えられないことは言うまでもない。
実施例中における遺伝子工学的手法については、当該技術分野において周知慣用な方法で容易に行うことができ上記の工程中で、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第１＿３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）．のような実験操作書に従えば容易に実施することができる。使用される試薬、例えば、酵素、緩衝液、培地など全て市販の製品が使用でき、特に断わらない限り、製品にて指定された使用条件に従って使用することで完全に目的を達成することができる。
上記工程（１）において、タンパク質のアミノ酸配列の決定方法は知られており、例えば、市販のアミノ酸配列自動シーケンサーが使用できる。上記工程（１）および（２）において特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの合成には市販のＤＮＡ合成装置を用い、その操作手順に従って実施できる。上記工程（１）および（２）におけるＤＮＡ塩基配列の決定は公知のＭ１３ベクター系を用いたＳｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）．）により決定できる。
上記工程（１）および（２）において、クローニングに使用するベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３などのプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０などのファージベクターが挙げられる。クローニング用および発現用の宿主としては、大腸菌株を用いることができ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０３株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＭＶ１１８４株などが使用可能である。本発明の機能改変型タンパク質の発現用宿主として酵母を使用する場合、ベクターとしてｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などを用いることが可能で、培養上清から該タンパク質を容易に単離することができる。また、宿主としてシュードモナス属を使用する場合、ベクターとしてはＲＳＦ１０１０、ＲＫ２などを用いることが可能で、いわゆるセルフクローニングを行なうこともできる。これらのベクターおよび宿主は市販されており容易に入手することができる。
上記工程（３）および（４）において、目的の遺伝子を大腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを作成するためには、宿主内で機能する適切なプロモーター、例えば、Ｌａｃ、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、Ｔｒｐ、λＰＬなどとＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を有する発現ベクター、例えば、ｐＫＫ２２３−３やｐＰＬ−ｌａｍｂｄａなど、さらに翻訳開始コドンＡＴＧを備えたＡＴＧベクター、例えば、ｐＫＫ２３３−２やｐＴｒｃ９９Ａなどに目的の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すればよい。
上記工程（５）において、構築した発現プラスミドを適切な宿主、例えば、大腸菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株などに導入することにより、効率のよい発現が可能となる。
上記工程（６）において、発現された機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの精製・分離方法は自体公知の各種分離・精製方法を組合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー法などの各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの各種電気泳動などが用いられる。
本発明の機能改変型タンパク質は、「配列番号１に記載される天然のＬ−メチオニンγリアーゼのサブユニットのアミノ酸配列と比較して、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を有し、該サブユニットの機能改変型であることを特徴とするタンパク質」とは、その機能改変型タンパク質の機能または活性が実質的にシュードモナス・プチダＩＣＲ３４６０株が産生するＬ−メチオニンγリアーゼと同じであれば、化学的または生化学的な改変、または天然もしくは非天然のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことのできる機能改変タンパク質を意味している。このような機能改変型タンパク質は、例えば、ＰＣＲ法による部位特異的人工変異導入など、当業者に周知の手法により調製することができる。
本発明はさらに、本発明の機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼまたはその変異体を含有する抗癌剤をも提供する。本発明の抗癌剤は当業者に周知の賦形剤を含有でき、典型的には注射剤の形態をとり、凍結乾燥品とすることもできる。通常は非経口に、数日から数週間、毎日数十分から数時間かけて注入投与する。投与量は目的とする効果、患者の性別、年齢、体重、症状の重篤度等により変動するが、一般には約１−１０００Ｕ／キログラム体重／日、好ましくは約５０−５００Ｕ／キログラム体重／日である。
実施例
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
Ｌ−メチオニンγリアーゼ発現用菌株の培養
Ｌ−メチオニンγリアーゼ構造遺伝子部分を発現ベクターｐＫＫ２３３−２に挿入し、Ｌ−メチオニンγリアーゼ発現プラスミドｐＭＧＬＴｒｃ０３を大腸菌株ＪＭ１０９株に導入し、組換えＬ−メチオニンγリアーゼ発現用菌株とした。本菌をＬＢ培地で前々培養、０．５％グリセリンを含むＬＢ培地で前培養した後、３０−Ｌジャーファーメンターを３台用いて、４％グリセリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ培地にて２８℃で２４時間培養した。対数増殖期にＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを最終濃度が０．３ｍＭとなるように添加してＬ−メチオニンγリアーゼの発現を誘導した。
実施例２
粗酵素液の調製
実施例１で得られた組換え体培養液５７ｋｇを遠心分離機（アルファラバル社製使用）を用いて分離し、１９ｋｇの濃縮液を集め、予めＥＤＴＡ２４．５７ｇ、ピリドキサール５’りん酸（ＰＬＰ）１０．３４ｇ、ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）３．３ｇを溶解した１７．４ｋｇの１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加した。この菌体懸濁液を２８℃に加温した後、高圧ホモジナイザー（ＡＰＶゴーリン社製）にて菌体を破砕した。３６．６ｋｇの破砕終了液に、終濃度０．６％（ｗ／ｗ）になるようにろ過助剤コポロックＳＡ（大塚製薬製社製）を添加し、その後１時間攪拌した。３９ｋｇのコポロックＳＡ処理液を遠心分離し、３７ｋｇの粗酵素液を得た。この粗酵素液には、１６０ｇのＬ−メチオニンγリアーゼが存在し、比活性は約２９Ｕ／ｍｇであった。
実施例３
Ｌ−メチオニンγリアーゼ粗結晶の製造
実施例２で得られた粗酵素液を４０％硫酸アンモニウム飽和溶液とするために、硫酸アンモニウム８．８６ｋｇを徐々に添加し、アンモニア水でｐＨ７．２に調整しながら溶解させた後、４℃で塩析し１〜３日保存した。塩析後の溶液を遠心分離によって分離した沈殿物に、３．６Ｌの溶解用緩衝液（２０ｍＭりん酸緩衝液、ｐＨ７．２；０．５ｍＭＰＬＰ、０．０５％  ２−メルカプトエタノールを含む）に溶解後、１５０ｇの硫酸アンモニウムを溶解した０．２Ｌの溶解用緩衝液を添加した。この溶液をアンモニア水でｐＨ７．２に調整し、４℃まで冷却後、予め５４０ｇのＰＥＧ６０００を溶解した１．６Ｌの溶解用緩衝液を徐々に添加し、４℃で１時間攪拌した。遠心分離により沈殿物（不溶物）を除去した後、予め６５０ｇのＰＥＧ６０００を溶解した５．４Ｌの溶解用緩衝液を徐々に添加した。次に、この溶液を３２℃に加温し、攪拌しながら５４０ｍｌの４Ｍ  ＮａＣｌ溶液を２０分かけて添加した。さらに３２℃で１時間攪拌することにより溶液中にＬ−メチオニンγリアーゼの柱状結晶が確認された。その後、４℃で２０時間攪拌して柱状結晶を熟成させ、遠心分離によりＬ−メチオニンγリアーゼの柱状結晶（粗結晶）を得た。
実施例４
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶の製造
実施例３で得られた柱状粗結晶を６Ｌの溶解用緩衝液に溶解し、遠心分離により沈殿（不溶物）を除去した後、予め７６０ｇのＰＥＧ６０００を溶解した２．４Ｌの溶解用緩衝液を徐々に添加し、３２℃に加温した。その後、攪拌しながら４２０ｍｌの４Ｍ  ＮａＣｌ溶液を２０分かけて添加した。さらに３２℃で１時間攪拌した後、４℃で２０時間攪拌し、結晶を熟成させることでＬ−メチオニンγリアーゼの８面体結晶が析出した。遠心分離によってＬ−メチオニンγリアーゼ結晶を集め、６Ｌの溶解用緩衝液に溶解した。得られた６．３Ｌの結晶再溶解液には、１２５ｇのＬ−メチオニンγリアーゼが含まれており、比活性は約５５Ｕ／ｍｇであった。なお、活性測定はＥｓａｋｉらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）に従って測定した。
実施例５
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶のカラムクロマトグラフィー
実施例４で得られた結晶再溶解液を、予め２０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化した５ＬのＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロマトグラフィーに供した。その後、０．１ｍＭ  ＰＬＰおよび０．０１％  ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄した後、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、０．０１％  ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出させた。得られた活性画分１５Ｌを分画分子量１０ｋＤａの濾過膜（ミリポア社製）を用いて２．７Ｌにまで濃縮した。濃縮液には８７ｇのＬ−メチオニンγリアーゼが含まれていた。この濃縮液２．７Ｌのうち、０．９Ｌを予め０．０１ｍＭ  ＰＬＰを含む１０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した１８ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）カラムクロマトグラフィーに供した。この操作を３回実施した。得られた有効活性画分のＬ−メチオニンγリアーゼの比活性は約６１Ｕ／ｍｇであり、６９ｇのＬ−メチオニンγリアーゼが含まれていた。
表１に実施例３〜５の各操作後のＬ−メチオニンγリアーゼの比活性および回収率を示した。
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実施例６
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶の調製
実施例５によって得られた蛋白質溶液（サンプル溶液）を用いて、Ｘ線回折実験用の結晶化を行った。結晶化の方法としては蒸気拡散法（Ｓｉｔｔｏｎｇ  Ｄｒｏｐ法）を用いた（第１図）。結晶化に際しては、まず２種類の溶液を調製した。すなわち、結晶化用溶液１（５０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；１％  硫酸アンモニウム、４０％  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎａｔｎｅｄｉｏｌを含む）および結晶化用溶液２（５０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；１％  硫酸アンモニウム、３０％  ＰＥＧ６０００を含む）を調製し、結晶化用溶液１を５００μｌ、結晶化用溶液２を１００μｌを混合し、それを外液とした。次いで、サンプル溶液を遠心濾過膜を用いて遠心分離により濾過したもの１０μｌに、外液１０μｌを取りだし緩やかに混ぜ合わせ内液とした。このようにして調整した結晶化用プレートは速やかに４℃に調節されたチャンバー内に静置された。顕微鏡観察の結果、２日後に結晶の析出が確認された。その後、結晶をさらに１週間静置した結果、０．５Ｘ０．５Ｘ０．３ｍｍの大きさにまで成長した。
実施例７
Ｌ−メチオニンγリアーゼ結晶の構造解析
実施例６によって得られた結晶のＸ線結晶解析を行った。結晶の回折強度の測定は、大型放射光施設（Ｓｐｒｉｎｇ−８）にて、リガク社製のイメージングプレートＸ線回折装置（Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶ）を用い、表２に示す測定条件で測定を行った。得られた回折イメージはソフトウエアＤＥＮＺＯ（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて処理した。データの解析結果を表３および４に示す。
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結晶構造はプログラムパッケージＸ−ＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ著，Ｘ−ＰＬＯＲ，Ｖｅｒｓｉｏｎ９８．０：Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，１９９８年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の分子置換を用いて解いた。ちなみに、用いた分子モデル構造は、Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  β−Ｌｙａｓｅ（ＰＤＢ  ＩＤ＝１ＣＬ１）である、精密化の結果、２σ以上の１５３７７９個の反射に対して、Ｒ値０．２３４（Ｒｆｒｅｅ＝０．２９１９を得た。なお、構造計算には電子密度図より得られた７２１個の水分子を含めている。
実施例８
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼ遺伝子の構築
配列番号１で示されるアミノ酸配列において６位のＬｙｓをＨｉｓに置換、４９位のＣｙｓをＳｅｒに置換、１１９位のＡｌａをＳｅｒに置換、１２８位のＰｈｅをＣｙｓに置換、１９０位のＣｙｓをＳｅｒに置換、２１７位のＧｌｙをＳｅｒに置換、２４８位のＳｅｒをＣｙｓに置換、３４１位のＬｅｕをＨｉｓに置換、３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換、３９５位のＬｙｓをＨｉｓに置換、および９位のＧｌｙをＣｙｓに置換と３８５位のＡｓｐをＣｙｓに置換（以下本酵素をＫ６Ｈ，Ｃ４９Ｓ，Ａ１１９Ｓ，Ｆ１２８Ｃ，Ｃ１９０Ｓ，Ｇ２１７Ｓ，Ｓ２４８Ｃ，Ｌ３４１Ｈ，Ｄ３８５Ｃ，Ｋ３９５ＨおよびＧ９Ｃ＋Ｄ３８５Ｃ，野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼをＷＴと示す。）した機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを取得するためにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用いて機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼ遺伝子を構築した。部位特異的変異が挿入された合成オリゴヌクレオチドプライマーを作成し、プロトコールに従って変異を導入した。合成オリゴヌクレオチドプライマーは順方向と逆方向の２種をそれぞれ用意した。順方向の合成オリゴヌクレオチドプライマーを表５に示した。
プラスミドの該当部分に変異導入用プライマーをアニーリングさせ、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社製）により変異型プラスミドＤＮＡを合成する。この反応を１６回繰り返した後、鋳型ＤＮＡを制限酵素をＤｐｎＩで消化した後、大腸菌株ＪＭ１０９株を形質転換した。出現した形質転換体をＬＢ培地で培養後プラスミドを抽出し、そのＤＮＡ配列をジデオキシターミネーション法で確認した。以下の核酸配列は配列番号１５から２３に示す。
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実施例９
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの調製
実施例８で得られた形質転換株を０．５％グリセリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地で各１０本ずつ試験管で培養した後、４％グリセリンを含む１２０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地にて２８℃で、２４時間培養した。対数増殖期にｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄｔｈｉｏｇａｒａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度０．３ｍＭとなるように添加してＬ−メチオニンγリアーゼの発現を誘導した。培養後遠心分離により集菌し、１ｍＭ  ＥＤＴＥＡ−２Ｎａ、０．７５ｍＭ  ＰＬＰ、０．０１％  ＤＴＴを溶解した４０ｍｌの１００ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、高圧ホモジナイザーで菌体を破砕した。終濃度０．６％（ｗ／ｗ）になるようにろ過助剤コポロックＳＡ（大塚製薬製社製）を添加し、遠心分離により不純物を除去した後、５℃でｐＨを７．２に調節しながら最終濃度６０％飽和濃度となるように硫酸アンモウニウムを添加した。遠心分離で塩析物を取得し、０．５ｍＭ  ＰＬＰ、０．０５％  ２−メルカプトエタノールを含む２５ｍｌの２０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した。最終濃度が８％となるようにＰＥＧ６０００を添加し、遠心分離により不純物を除去した後、３７℃に加温して最終濃度２００ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加した。一晩５℃に保ち、析出した結晶を遠心分離によって集め、０．５ｍＭ  ＰＬＰ、０．０５％  ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した。結晶溶解液はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し、機能改変型酵素の特性分析の検討に十分な純度と収率を示した。
実施例１０
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（高活性体の取得）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの比活を天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼの活性を１００とした比活性で表６に示した。活性測定は、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニン基質下で生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で行った。
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取得した機能可変型酵素はいずれも野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比べて比活性の上昇が認められた。
実施例１１
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（ｐＨ安定性）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを０．１Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０）中、３７℃で３時間インキュベートし、残存活性を測定した。０．１Ｍ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中での残存活性を１００とした比活性を表７に示した。活性測定には、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニン基質下で生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で行った。
Ｃ４９Ｓの残存活性は野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比べてアルカリ性における耐性が増加していた。
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実施例１２
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（熱安定性）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを０．１Ｍ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、６５℃で３０分間インキュベートして残存活性を測定した。３７℃での残存活性を１００とした比活性を表８に示した。活性測定は、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニン基質下で生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で行った。
Ｇ９Ｃ＋Ｄ３８５Ｃは野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比べて熱安定性が大幅に向上していた。
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実施例１３
槻能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（ＰＬＰとの親和性）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼを一旦０．１Ｍ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で透析し、過剰のＰＬＰを除去した後、ＰＬＰ存在下での活性値とＰＬＰ非存在下での活性値を比較した。ＰＬＰ存在下での活性値を１００とした比活性を表９に示した。活性測定は、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンを基質下で生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で行った。
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ＰＬＰの脱落が防止された結果、いずれの改変酵素も野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼと比べて、酵素活性値が高くなった。
実施例１４
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（基質特異性）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの基質特異性を調べた。２５０ｍＭ  Ｌ−ホモセリン、及び２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンを基質とした場合に生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で活性を測定し、比較した。天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼにおけるＬ−ホモセリンに対するＬ−メチオニンの活性値を１００とした比活性を表１０に示した。
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いずれの機能改変酵素もＬ−メチオニンに対する活性が上昇していた。さらにＳ２４８Ｃと野生型Ｌ−メチオニンγリアーゼのＬ−メチオニンに対するＫｍ値をもとめたところ、天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼが１．３ｍＭであったのに対し、Ｓ２４８Ｃは１．０ｍＭであり、Ｌ−メチオニンに対する親和性が増加していた。
実施例１５
機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの特性（基質特異性）
実施例９で得られた精製機能改変型Ｌ−メチオニンγリアーゼの基質特異性を調べた。１２．５ｍＭ  Ｄ，Ｌ−ホモシステイン、及び２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンを基質とした場合に生成するα−ケト酪酸の生成速度を測定するＳｏｄａらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４３，４５９−４６５（１９８７）．）で活性を測定し、比較した。天然型Ｌ−メチオニンγリアーゼにおけるＤ，Ｌ−ホモシステインに対するＬ−メチオニンの活性値を１００とした比活性を表１１に示した。
いずれの機能改変酵素もＬ−メチオニンに対する活性が上昇していた。
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産業上の利用可能性
本発明の機能改変型組換えＬ−メチオニンγリアーゼは、組換え大腸菌を適切な培地で培養し、得られた菌体の可溶性画分（無細胞抽出液）から自然に４量体からなる活性型の酵素となる。本発明のタンパク質またはその変異体の多量体、好ましくは４量体からなる酵素は、癌、肥満、心疾患、循環系疾患、神経系疾患、加齢に対する治療剤として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、蒸気拡散法（Ｓｉｔｔｉｎｇ  Ｄｒｏｐ法）の模式図である。
第２図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造の模式図である。テトラマーは４個のサブユニットから成り、各サブユニットに１個の補酵素ピリドキサール５’リン酸が結合している。補酵素ピリドキサール５’リン酸は黒で示している。
第３図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造において、各サブユニットのアミノ酸配列のＮ末端側１０アミノ酸残基を黒で表した図である。
第４図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造において、各サブユニットのアミノ酸配列のＣ末端側１０アミノ酸残基を黒で表した図である。
第５図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼサブユニットのダイマー構造の模式図である。ダイマー構造は各サブユニットと補酵素ピリドキサール５’リン酸と結合し、相互作用している。補酵素ピリドキサール５’リン酸は黒で示している。
第６図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのモノマー構造の模式図である。サブユニットが補酵素ピリドキサール５’りん酸と結合している。
第７図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのテトラマー構造において、ダイマー同士の会合を表わしている。
第８図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのダイマー構造において、モノマー同士の会合を表わしている。
第９図は、Ｌ−メチオニンγリアーゼのダイマー構造において、補酵素ピリドキサール５’リン酸の結合部位を表わしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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