(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性環境における安定な有機シラン処理コロイド状シリカ懸濁物のバルク調製方法であって、該方法は以下：
２〜３の範囲のｐＨを有し、そして１時間、８０℃に加熱された有機シラン水溶液を提供する工程；
該有機シラン溶液にコロイド状シリカ懸濁物を添加して、５％と１０％との間の有機シランの最終濃度を有する有機シラン−コロイド状シリカ混合物を形成する工程；
該有機シラン−コロイド状シリカ混合物のｐＨを６．０より高いｐＨに調整する工程；
生理学的な塩または酸の存在下で沈殿形成のないことにより立証される安定なコロイド状懸濁物を生成するのに有効な時間、（ｉ）該懸濁物を少なくとも８０℃で少なくとも１時間加熱するか、または（ｉｉ）該懸濁物を紫外線照射に暴露するかの少なくとも１つをおこなう工程、を包含し、
ここで、該得られた安定なコロイド状シリカ懸濁物が水溶性かつ細胞に対して無毒性である、方法。
【請求項２】
前記安定な有機シラン処理シリカ懸濁物が、オートクレーブまたはγ放射線処理の２〜４サイクルの前後において一定のｐＨ、等張性および密度を維持することにより特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機シランが式：（Ｘ）3−Ｓｉ−（ＣＨ2）3−Ｙを有する、請求項１に記載の方法であって、ここで、Ｙが、以下
【化１】
0004576046.tif 000013
−Ｏ2ＣＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、−ＣＯ2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＯ2ＣＨ3、−ＮＨＣＯＣＨ2ＮＨＣ（ＣＨ3）Ｏ、
【化２】
0004576046.tif 000014
からなる群から選択され、ここで、Ｘが、Ｈ3ＣＯ、ＣｌおよびＨ5Ｃ2Ｏからなる群から選択される、方法。
【請求項４】
前記有機シランがγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有機シラン−コロイド状シリカ混合物の前記ｐＨが６．０〜７．０の範囲のｐＨに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨが６．２〜６．５の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コロイド状シリカ懸濁物が直径３〜１２ｎｍの大きさの範囲のシリカ粒子を含むことにより特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記シリカ粒子が直径７〜１２ｎｍの大きさの範囲により特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、例えば、細胞分離用の密度勾配培地（ｍｅｄｉｕｍ）として有用であるシラン処理コロイド状シリカ調製のためのプロセスに関する。
【０００２】
（参考文献）
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  ＰＡ（１９８８）。
【０００３】
（発明の背景）
シラン処理コロイド状シリカ調製は、種々の産業上の用途に使用され、これには、例えば、磨耗抵抗コーティングの生成、ゼログラフィートナー材料、および生物学的物質の密度勾配分離が挙げられる。
【０００４】
コロイド状シリカは、シラン処理のために最適である（必ずしもそうでない場合）条件下（例えば、酸性ｐＨ）で生来、不安定であるので、シラン処理コロイド状シリカの調製は困難であり得る。このような酸性条件下では、シリカはしばしば、「ゲル化」するか、またはその懸濁特性を失って半固体のゼリー様物質を形成する。より中性またはアルカリｐＨ条件では、恐らくシランの自己縮合のため、シラン処理は効率的に進行しない。いくつかの適用（例えば、抗磨耗コーティング）のためには、シリカ粒子を懸濁状態に保つことは重要ではないが、他の適用のためには（例えば、密度勾配材料）、懸濁物のコロイド状特性を保つことが重要である。
【０００５】
種々の方法が、シラン処理のこの認識された問題を回避するために考案された。一つの方法に従って、シラン処理は、水の非存在下で有機溶媒の存在下で実施されるが；しかしながら、このような有機溶媒は、調製物から除去するのが困難であり、これらはその適用に対して毒性であるかさもなければ有害であり得るので、多くの適用（例えば、密度勾配材料）には望ましくない。
【０００６】
シリカ粒子をシラン処理するための別の公知方法は、触媒を使用する。これはまた、望ましくない、潜在的に毒性の物質を調製物に添加する問題を有する。さらに、調製物への有機溶媒および／または触媒の添加は、潜在的により高いレベルの毒性廃棄物を生み出し、これは、その国のますます限られた区域で処理されなければならない。それゆえ、水溶性で環境に安全な試薬および中間体を利用する利用可能な代替の生成法を持つことが有益である。
【０００７】
米国特許第４，９２７，７５０号は、細胞に対して比較的無毒性である有機シラン処理（ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｉｚｅｄ）コロイド状シリカを調製する方法を記載しているが；しかしながら、この調製法には、混合物を比較的高温（７５℃）に維持しながら、コロイド状シリカへシランを「滴下」するかまたは数時間に亘って徐々に添加する工程を含む。この方法は、多くの時間を要し、それ自体で容易にはバルク製造法に向かない。この方法は、アルカリ条件下で実施され得るが、シリカへのシランの添加は徐々にでなければならないことが強調される。さらに、前述の方法からのわずかな逸脱が、この懸濁物のゲル化を引き起こし得、上記のように、特定の適用のためには使用できないものとしている。
【０００８】
本発明は、先行技術の方法を使用してなされる調製に固有の多くの問題（例えば、調製の不安定性、有機溶媒および他の毒性中間体の存在、および毒性の副生成物および廃棄物の生成）を解決する。すなわち、先行技術の方法に従って水溶性調製物は、有機シラン（ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｅ）とコロイド状シリカとの労を惜しまないゆっくりした混合によってのみ調製され得；さもなければ、この懸濁物は沈殿する。あるいは、この調製は有機溶媒を使用してなされる得るが；しかしながら、このような試薬の使用は、例えば生体物質の調製における、特定の使用のためのコロイド状シリカ組成物には望ましくない。このような試薬の使用は、危険な廃棄物生成を最小化する見地からも特に望ましくない。
【０００９】
本発明はそれゆえ、水性条件下でシリカのシラン処理を可能とする有機シラン処理コロイド状シリカ粒子を調製するための方法を提供することにより、従来技術の方法に固有の問題を克服し、これは、バルク製造プロセス用に容易にスケールアップされ得る。得られたシラン処理コロイド状シリカ調製物は極めて安定であり、そして培地の殺菌のために所望されるように、複数サイクルのオートクレーブ処理および／またはγ照射後でさえ、可溶性相に残る。この処方物は、ゲル化または沈殿することなく生理学的塩溶液に懸濁され得るので、動物細胞の調製での使用に特に良く適している。さらに、それは、レシピエント患者に有害反応を誘起しなく移植用のヒト細胞を処理するために使用され得るという知見により立証され得るように、このような細胞には比較的無毒性である。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、水性条件下で安定な有機シラン処理コロイド状シリカ懸濁物の調製のための新規で環境に安全な方法に関する。この方法は特に、有機シラン処理コロイド状シリカ粒子のバルク調製に適している。
【００１１】
この有機シラン処理コロイド状シリカ懸濁物を作成するための主要な試薬が、従来技術の方法で必要であるゆっくりとした注入または滴下に頼ることなく、かなり速い様式で共に混合され得ることが本発明の発見である。これは、この有機シラン試薬のｐＨが約２〜３の範囲内となるよう調整され、そしてこの試薬が約１時間、約８０℃にさらに加熱される場合に可能である。次いで、このように処理された有機シランにコロイド状シリカ懸濁物が添加されて、約５％と約１０％との間の有機シランの最終濃度を有する有機シラン−コロイド状シリカ混合物を形成する。この有機シラン−コロイド状シリカ混合物のｐＨは、約６．０より高いｐＨ、好ましい実施態様では６〜７の範囲のｐＨ、さらに詳細にはｐＨ６．２〜６．５に調節される。この懸濁物は次いで、安定なコロイド状懸濁物を生成するのに有効な時間の間「硬化」される。好ましい実施態様に従って、硬化は、例えば、少なくとも約８０℃まで加熱することによるか、または紫外線照射により達成される。このような安定な懸濁物は、生理学的な塩または酸の存在下で沈殿形成のないことにより立証される。
【００１２】
好ましい実施態様では、この有機シランは一般式：（Ｘ）3−Ｓｉ−（ＣＨ2）3−Ｙを有し、ここで
Ｙは、以下からなる群から選択される：
【００１３】
【化３】
0004576046.tif 000002
−Ｏ2ＣＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、−ＣＯ2ＣＨ3、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨ（ＣＨ2）2ＣＯ2ＣＨ3、ＮＨＣＯＣＨ2ＮＨＣ（ＣＨ3）Ｏ、
【００１４】
【化４】
0004576046.tif 000003
この実施態様に従って、ＸはＨ3ＣＯ、ＣｌおよびＨ5Ｃ2Ｏからなる群から選択される。
【００１５】
さらに別の好ましい実施態様では、この有機シランはγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランである。
【００１６】
さらに好ましい実施態様では、この反応のｐＨ範囲は、約６．０〜約７．０；好ましくは６．２〜６．５の範囲である。
【００１７】
コロイド状シリカ懸濁物を作成するシリカ粒子は、コロイド状懸濁物の維持と両立する任意の大きさの範囲であり得；好ましい大きさの範囲は、約３〜約１２ｎｍの直径、なおさらに好ましくは約７〜１２ｎｍの直径を含む。
【００１８】
本発明の重要な特徴に従って、シリカ懸濁物の安定性は、繰り返しオートクレーブ処理に対する耐性およびγ放射線処理に対する耐性、ならびに生理学的濃度の塩（例えば、０．９％塩化ナトリウム（生理食塩水））の存在下での安定性によりにより立証される。上述の製造プロセスはまた、試薬および成分が水溶性であるので、環境に対して比較的無毒性である。得られた組成物はまた、シラン処理コロイド状シリカに懸濁された細胞に対して比較的無毒性である。
【００１９】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が添付の図面と関連して読まれるとさらに全体が明らかとなる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
「コロイド状シリカ」とは、水に溶解したＳｉＯ2からモノケイ酸の重合により通常形成されるコロイド状シリカ粒子の水性懸濁物のことを言う。
【００２１】
「有機シラン処理コロイド状シリカ（ＯＣＳ）粒子」とは、有機シランコーティングに共有結合的に連結されるコロイド状シリカ組成物のことを言う。米国特許第４，９２７，７４９号は、有機シラン処理コロイド状シリカ調製の説明のために、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「安定なシラン処理コロイド状シリカ懸濁物」とは、上記に従って有機シラン処理され、数日間の間、あるいは１回以上のオートクレーブ処理またはγ照射への露出後、ｐＨ、浸透圧重量モル濃度および密度に関して組成的安定性を有することでさらに特徴づけられるコロイド状シリカ粒子のことを言う。安定なコロイド状シリカ懸濁物は、このような処理後、沈殿または「ゲル化」のないことにより立証される。このような安定な懸濁物はまた、生理学的塩濃度（例えば、０．９重量／容積％の塩化ナトリウム）の存在下または添加後、安定に残り、約５〜６のｐＨを生成する酸の添加に対して安定である。対照的に、生理学的塩または十分な酸が不安定な溶液に添加される場合、ゲル化または沈殿が起こり、先の透明な懸濁液が白色または不透明になることにより立証される。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「ゾル」とは、液状コロイド、懸濁液、または固体粒子が液体相に安定に分散している混合物のことを言う。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「ゲル」とは、固体中の液体のコロイド状懸濁物のことを言い、ゼリー様物質はゾルというよりもむしろ固体形態を形成する。
【００２５】
細胞に対して「無毒性」という用語は、生存細胞数を約２０％より多く減少させることなく、物質が少なくとも３０分間、生物学的細胞の懸濁物と密接に接触され得るということを意味する。好ましくは、このような生存細胞はまた、機能性であり、適切な機能性アッセイにより評価される。細胞毒性および機能性を測定する方法の例は、本明細書中の実施例３〜５に提供される。
【００２６】
（ＩＩ．安定なシラン処理コロイド状シリカ懸濁物の調製法）
上記に要約したように、シラン処理コロイド状シリカ粒子を形成するための従来技術の方法は、以下の２つの大きな反応条件のセットのひとつ：（１）水性環境中で、反応が酸性のｐＨ（約ｐＨ  ５．５）で実施され、ここで、ゾルのゲル化を防ぐため、シランが水性コロイド状シリカ「ゾル」に滴下様式または非常にゆっくりとした注入として添加されるか、または（２）反応が有機溶媒中で実施されるか、のいずれかを利用する。この反応は、両一般法において、化学合成中に「硬化」または安定化される。
【００２７】
上記に記載したように、有機溶媒の使用は一般に、毒性または毒性廃棄物の心配のため、多くの適用で望ましくないと考えられる。特に、生物学的画分の密度ベースの分離用物質の調製の関係では、有機溶媒の含有は一般に、細胞毒性の原因となる。水性条件下でのコロイド状シリカのシラン化のための公知方法は一般に、この物質の工業的生産のため必要とされる大容量の型には面倒でありそして非常に時間を要し；さらに、これらの方法を使用してさえ、生成物のゲル化が起こり得る。
【００２８】
本発明の主題である方法は、試薬の冗長でゆっくりとした（滴下）添加の必要性を除去し、安定で、生物学的材料（例えば、下記のセクションＩＶで示されるような細胞）に対して無毒性であるシラン処理生成物を生成する。従来技術は有機シラン処理組成物が水性条件で不安定であるということを示唆するので、本発明の方法は、安定な水性組成物を形成するための環境に安全な方法を提供することにより、有意な改善を提供する。
【００２９】
任意の特定の理論に委ねることなしに、本発明のプロセスは、シリカ粒子の表面上のシラノール基とシラン基の反応性部分との間の初期のシロキサン結合形成となり、このシリカ粒子への有機シランの結合は、硬化プロセス（これは、約１〜数時間の間、比較的高い反応温度（約８０℃より高い）に反応をさらすことを含む）を経てさらに強化されると考えられている。この反応は、例として有機シランのγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを使用して、図１に示される。
【００３０】
実施例１は、シラン化剤としてγ−グリシドオキシプロピル−トリメトキシシラン（ＧＰＭＳ）を使用して実施され得る本発明の方法の詳細を提供する。本発明の方法は、溶液中でシロキサン結合を形成するのに十分な反応性を有する任意のまたは全ての有機シランに容易に適用され得ると理解される。表１は、本発明の組成物を形成するのに使用され得る例示的な有機シランのリストを提供する。本発明の方法は、有機シラン試薬としてＧＰＭＳを使用して例示されるが、反応時間および条件の最適化は、選択される特定の試薬に依存し；そのような最適条件を決定するのは専門家の技術の範囲内にあると理解される。
【００３１】
実施例１は、生物学的分離培地の調製に適した有機シラン処理コロイド状シリカ粒子のためのＧＰＭＳの使用を例示する。ここで、ＧＰＭＳは、最初に水に添加されて約１０％の最終濃度を有する溶液を形成する。本発明の重要な特徴に従って、この溶液は、酸の添加のより酸性（ｐＨ約２．５）にされ、次いで、６０分間、８０℃まで加熱される。この溶液は次いで、室温まで冷却される。コロイド状シリカは、シランの総濃度が５〜１０％、好ましくは約６〜８容積／容積％の範囲となるまで、連続的に撹拌しながらシラン水溶液に添加される。シランシリカ混合物のｐＨは、６．２〜６．５に調整され、この溶液は、約１５〜３０分間、室温で撹拌される。
【００３２】
先の調製工程に使用されるシランは、任意の多数のシラン化合物であり得る。シラン選択の重要な特徴は、この化合物が水性条件下で可溶性であることである。従って、ＧＰＭＳに加えて、適切な有機シランには米国特許第４，９２７，７４９号（ＤＯＲＮ）（本明細書中で参考として援用される）に列記されたものが挙げられるが、これらに限定されない。表１は、本発明に使用され得る種々のシランの例を提供するが；しかしながら、本発明は表１の列挙により限定されない。
【００３３】
（表１）
試薬修飾コロイド状シリカを調製するため使用され得る有機シラン
【００３４】
【表１】
0004576046.tif 000004
0004576046.tif 000005
0004576046.tif 000006
0004576046.tif 000007
0004576046.tif 000008
好ましくは、本発明の方法は、式ＲＳｉ（ＯＲ1）3を有するトリアルコキシシランを使用し、ここで、Ｒ1基は、典型的には１〜約２０の炭素原子の脂肪族またはアリール有機ラジカル（例えば、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｔ−ブチル、３−ブテニル、フェニルなど）である。本明細書中でＧＰＭＳにより例示されるこれらの化合物は、例えばジアルコキシシランおよびモノアルコキシシラン（これらもまた使用され得る）に比べて、高い反応性を有するため、好ましい。例示的なトリアルコキシシランは、米国特許第４，６４４，０７７（Ｇｕｐｔａ）に列記され、本明細書中で参考として援用される。
【００３５】
このコロイド状シリカ出発物質は好ましくは、約１〜約５０００ｎｍの大きさの範囲のシリカ粒子の水性懸濁物を含有するコロイド状シリカ粒状組成物であり；細胞分離材料を調製する目的には、３〜２２ｎｍ、特に７〜１０ｎｍの大きさの範囲の粒子が望まれる。例示的な出発物質は、本明細書中の実施例１に記載される、ＤｕＰｏｎｔにより作られる「ＬＵＤＯＸ  ＨＳ−４０」である。
【００３６】
上記のように、本発明の根本の機構に委ねることなしに、粒子と添加されたシラン試薬との間の結合形成は、さらなるシロキサン結合、分子間結合などの形成によるか、またはそれに続く「硬化」プロセスのいずれかにより、強化されると考えられる。典型的には、このような硬化は熱処理；例えば、本明細書中の実施例１に記述されるように、懸濁物を６０分間、８０℃まで、続いて３時間、９５℃まで加熱することによりもたらされる。しかしながら、代替としてまたはさらに、硬化は、例えば、米国特許第４，８２２，８２８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように紫外光処理によりもたらされ得る。例えば、硬化プロセスの完全性を保証するため、加熱措置に続いて紫外光に曝露される。他の適切なそして等価な硬化プロセスは、当業者には明らかである。
【００３７】
（ＩＩＩ．シラン処理粒子の安定性）
本発明の重要な局面に従って、特許請求の範囲の製造方法に従って調製されたシラン処理粒子は特に、標準的なオートクレーブ条件（１２１℃、２．１Ｂａｒ、３０分間）により課せられるような高温、および約２．５メガラドと４．０メガラドとの間の線量を供給するγ放射線のようなイオン化放射線に対して安定である。安定性は典型的には、下記に記載されるような処置前後の調製物のｐＨ、浸透圧重量モル濃度および密度のような物理的パラメータを比較することにより測定される。安定性はまた、塩または酸を懸濁物に添加して、それぞれ生理学的塩濃度（０．９％重量／容積の塩化ナトリウム）または約５〜６のｐＨを生成することにより評価される。このような添加がなされる場合、安定な懸濁物は沈殿または「ゲル化」せず、一方、不安定な懸濁物は、沈殿またはゲル化のため白色または不透明になる。
【００３８】
図２Ａおよび２Ｂは、有機シラン処理コロイド状シリカの測定した密度に対する繰り返しオートクレーブ処理（２〜４サイクル、各１２０℃、３０分間）の影響を示す。示されるように、生理学的塩の非存在下または存在下では、懸濁物の密度は一定であった。
【００３９】
同様に、懸濁物の浸透圧重量モル濃度およびｐＨは、２〜４サイクルのオートクレーブ処理（図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ）後、塩の非存在下または存在下で一定であった。これらの実験では、懸濁物の初期および最終条件は次の通りであった：密度１．０６０５ｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４、浸透圧重量モル濃度２８０ｍＯｓｍ（＋塩）。このような物理化学的パラメータは、特定の型の有用な細胞（例えば、造血系前駆細胞、リンパ球、樹状細胞、間葉細胞など）を単離するため使用される。
【００４０】
本発明の支持のもと実施されるさらなる実験において、本発明の方法に従って調製されるシラン処理コロイド状シリカはまた、特に２．５〜４．０メガラドの範囲の放射線に対して安定であることが見出された。これは、例えば、生物学的細胞の単離のための溶液の最終殺菌に従来使用される線量の範囲に相当する。
【００４１】
（ＩＶ．シラン処理コロイド状シリカの生物学的適合性）
密度勾配遠心分離による細胞の分離は、バイオテクノロジーにおいてポピュラーな技術である。この方法は、細胞がそれらの浮遊密度に従って規定の密度の培地中に分配するという現象を利用する。種々の密度勾配材料が、このような分離のために使用され、これにはコロイド状シリカベース培地が含まれる。
【００４２】
密度勾配分離に通常使用されるコロイド状シリカベース密度培地の例は、「ＰＥＲＣＯＬＬ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの登録商標、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）である。ＰＥＲＣＯＬＬは、ポリビニルピロリドンコーティングを有するコロイド状シリカ粒子の安定な懸濁物である。ＰＥＲＣＯＬＬは生理学的ｐＨではかなり安定であるが、生理的条件下で（例えば、生理学的塩溶液中で希釈された場合）加熱またはイオン化放射線を使用する殺菌に対して不安定である。これらの性質は、最終的に殺菌された材料が必要であるヒトまたはその他への分離細胞の再導入を含む臨床適用の関係に特に、この生成物の有用性を限定する。
【００４３】
米国特許第４，９２７，７４９号は、上記で議論した問題のいくつかを克服する密度勾配分離用の有機シラン処理コロイド状シリカ（ＯＣＳ）粒子（ＯＣＳＰ）調製物を提供する。この培地は、ＰＥＲＣＯＬＬに対して、特にこの培地が殺菌された後、細胞、特に「稀な」血球（例えば、造血系前駆細胞、幹細胞、抗原特異的リンパ球、間葉細胞など）に対して非常に低毒性である利点を有する。しかしながら、上で述べたように、米国特許第４，９２７，７４９号に記載された調製方法には調製物へのシランのゆっくりとした添加を含み、これはバルク生成法のためには実用的ではなくかつ高価である。
【００４４】
シラン処理コロイド状シリカ粒子調製物が上記に記載した方法を使用して作成され得、そしてこの調製物が下記に記載されるような生物学的調製物、特に単離血球画分に対して同様に無毒性であるということが本発明の発見である。反対に、上記議論のように、従来技術の生成物は、調製するのがしばしば困難であり、殺菌に対して不安定であり、そして／または細胞に対して毒性である。
【００４５】
図５は、本発明の方法に従って調製されるコロイド状シリカを処理後、血液試料の界面に存在する種々の型の細胞の回収％を示す。簡単には、ＰＢＭＣは、遠心分離管中で、密度１．０６０５、ｐＨ７．４、２８０ｍＯｓｍを有する有機シラン処理コロイド状シリカの頂部に載せられ、実施例２に記載したように遠心分離された。細胞は、充填材料と密度勾配材料との間の界面から回収され、実施例４に詳述されるような染色およびＦＡＣＳ分析手順を使用して細胞型について分析された。図５に示したように、使用した条件下で期待されるように、ＣＤ３４+細胞およびＣＤ１４+細胞が、単離した細胞の優勢形態であった。
【００４６】
さらなる実験は、有機シラン処理コロイド状シリカと共に２４時間インキュベートされた場合でさえ、造血系前駆細胞が生存していることを示した。図６は、ＣＤ３４+細胞を、緩衝液（ＰＢＳ）、コロイド状シリカ（ｃｓ）または胎児ウシ血清（ＦＣＳ）と共に３０分間および２４時間インキュベートし、次いで生存率について試験した結果を示す。示したように、コロイド状シリカと共にインキュベートした細胞は、緩衝液または胎児ウシ血清と共にインキュベートした細胞と同様に生存した。
【００４７】
実施例３に詳述したさらなる研究では、種々の細胞型の機能残存率を、ＰＢＳまたはコロイド状シリカに対して３０分間；ＰＢＳまたはコロイド状シリカに対して３０分間、続いて細胞増殖培地（Ｉｓｃｏｖｅ緩衝液＋血清）に対して２４時間；あるいは血清の存在下にＰＢＳまたはコロイド状シリカに対して２４時間、曝露した後、測定した。図７に示したように、機能残存率（生物学的、増殖性および分化の能力）を、実施例５に記載したようにコロニー形成アッセイにより評価した。データは、最も過酷なインキュベーション条件下でさえ、コロニー形成の特性がＣＤ３４+細胞に関して変化しなかったことを示す。
【００４８】
哺乳動物種において本発明の支持のもと実施されたインビボ毒性試験はまた、静脈内または皮内に投与した場合、この生成物が明らかに無毒性であることを示した。このように、この生成物は、哺乳動物種（例えば、幹細胞移植における）への導入のための細胞の分離および調製における使用に適切であり得るさらなる利点を有する。
【００４９】
本発明はまた、水溶性の比較的無毒性の調製材料を使用して実施されるので、コロイド状シリカ物質を調製する環境に安全な方法を提供する。
【００５０】
以下の実施例は本発明を例示するが、決して本発明を限定することを意図しない。
【００５１】
（材料）
（Ａ．末梢血前駆細胞の調製）
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）および乳癌患者からアフェレーシスにより採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＢｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。ＰＭＢＣを、ＮＨＬ患者においてシクロホスファミド（ｃｙｃｔｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（４ｇ／ｍ2、静脈内）、続いてＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、静脈内、毎日）で処置することにより動員した。ＰＢＭＣを、乳癌患者においてＶＰ−１６（２ｇ／ｍ2、静脈内）、続いてＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、静脈内、毎日）で処置することにより動員した。ＰＢＭＣを、ＨＬ患者においてＧ−ＣＳＦ単独で処置することにより動員した。
【００５２】
（Ｂ．抗体）
造血系前駆細胞（ＣＤ３４、抗ＨＰＣＡ−２）および白血球（ＣＤ４５、抗ＨＬｅ−１）に特異的な表面抗原に対して向けられるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。種々のｍＡｂを、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３）に従って、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）を用いて直接標識した。ＰＥ標識アイソタイプコントロールＩｇＧ１ポリクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から得た。
【００５３】
以下の実施例は本発明を例示するが、決して本発明を限定することを意図しない。
【００５４】
（実施例１）
（シラン処理コロイド状シリカの調製）
γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＭＳ；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＰＡ）を水に添加し、１０％の最終濃度を有する溶液を形成した。ｐＨを、連続的に撹拌しながら１Ｎ  ＨＣｌを用いて２．５まで低下させた。この溶液を６０分間、８０℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。コロイド状シリカ（Ｌｕｄｏｘ  ＨＳ−４０、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を、シランの総濃度が７容積／容積％となるまで、連続的に撹拌しながらシラン水溶液に徐々に添加した。シランシリカ混合物のｐＨを６．２〜６．５に調整し、そしてこの溶液を室温で１５分間撹拌した。この溶液を、次いで８０℃で６０分間、続いて９５度で３時間加熱した。この溶液を室温まで冷却し、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ９〜１０まで上昇させた。このシラン処理コロイド状シリカ調整物を活性炭カラムを通して通過させて反応副生物を除去した。
【００５５】
（実施例２）
（密度勾配遠心分離）
ＰＢＭＣをピペットを使用して密度勾配溶液上に積み重ね（ｌａｙｅｒ）た。この積み重ねは、試料と溶液との混合を避けるためゆっくりと実施した。チューブあたり最大２×１０9細胞を積み重ねた。遠心分離を、室温において８５０ｇで３０分間実施した。この細胞と密度勾配溶液の混合を防ぐため、遠心分離は制動力無しに停止させた。この細胞を、界面に位置した低密度画分と、ペレットを形成する高密度画分とに分けた。両方の細胞画分をピペットを使用して集め、別の５０ｍｌのポリプロピレン遠心分離管に注いだ。これら細胞を、１回洗浄し、さらなる操作まで室温でＣａ++およびＭｇ++フリーのＤｕｌｂｅｃｃｏのＤ−ＰＢＳ中に保存した。両細胞画分中の造血系前駆細胞（ＣＤ３４+細胞）の数および機能を、図５および７にそれぞれ示したように、ＦＡＣＳ分析およびクローン原性アッセイにより決定した。
【００５６】
（実施例３）
（インビトロ毒性）
これらの実験の目的は、密度勾配溶液中でのヒト抹消血の混合およびそれに続くインキュベーションの影響を評価することである。この研究の目的は、密度勾配溶液がヒト造血系幹細胞の生存率および機能になんらかの影響があるかどうかを決定することであった。６つの異なる混合およびインキュベートの代表的な例を、下記に概略したようにこれらの実験で使用した。
【００５７】
詳細には、３×１０7細胞を、１５ｍｌのポリプロピレン遠心分離管中の５ｍｌの試験緩衝液または密度勾配溶液に懸濁した。これらのサンプルを次いで、下記の表２に示したように、室温で所定の時間インキュベートした。細胞を３０分間、３０分間続いて細胞培養培地（Ｉｓｃｏｖｅ緩衝液＋１０％胎児ウシ血清）中で２４時間、または２４時間インキュベートした。細胞を集め、造血系コロニー（ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を形成する能力についてスクリーニングした。ＰＢＭＣ試料の容積を測定し、そして２本の５０ｍｌの遠心分離管のそれぞれの中にその容積の半分を入れることにより、さらなる評価を行った。細胞試料を次いで、１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ++、Ｍｇ++フリー）を使用して総容積５０ｍｌに再懸濁した。１つの管を５５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをＣＤ３４濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）溶液を使用して元の容積（ｍｌ）まで再懸濁した。各アリコート中の細胞を次いで計測した。
【００５８】
【表２】
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（実施例４）
（ＦＡＣＳ分析によるＣＤ３４+細胞の染色手順および定量化）
ＣＤ３４+細胞の定量化をＦＡＣＳ分析により実施した。細胞を核色素を用いて標識し、ｍＡｂをＣＤ３４およびＣＤ４５に向けた。ＣＤ３４細胞の割合を有核細胞のゲートで決定した。このアプローチを、ＦＡＣＳにおけるＣＤ３４細胞分析の精度での非核粒状物質の妨害を避けるため、選択した。
【００５９】
２×１０7細胞／ｍｌの細胞懸濁液をＣａ++およびＭｇ++フリーＤ−ＰＢＳ中で作成した。この細胞懸濁液の５０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに、１×１０6細胞／ウェルの濃度で播種した。２０％熱不活性化ウサギ血清／Ｄ−ＰＢＳ溶液の５０μｌを次いで各ウェルに添加し、続いて１０μｇ／ｍｌ  ＬＤＳ溶液の１０μｌおよび７５μｌ／Ｄ−ＰＢＳ溶液を各ウェルに添加した。各ウェルの内容物を混合した。このマイクロタイタープレートをホイルで覆い、室温で３０分間インキュベートした。各コントロールウェルに２０μｌ  ＩｇＧ１−フィコエリスリン（ＩｇＧ１−ＰＥ）および２０μｌ  ＣＤ３４−ＰＥを添加し、続いて混合した。このプレートをホイルで再度覆い、４℃で１５分間インキュベートした。次いでプレートを、４℃、８５０ｇで２分間遠心分離した。プレートを次いで素早くフリックして（ｆｌｉｃｋ）上清を除去し、続いて各細胞ペレットを２００μｌの冷（４℃）１×ＤＰＢＳ（Ｃａ++およびＭｇ++フリー）中に再懸濁した。プレートを、４℃、８５０ｇで５分間遠心分離し、次いで素早くフリックして上清を除去した。各細胞ペレットを５０μｌの２０％熱不活性化ウサギ血清溶液に再懸濁した。２０μｌ  ＣＤ４５−ＦＩＴＣを各コントールおよび試験ウェルに添加し、続いて混合した。プレートをホイルで覆い、４℃で３０分間インキュベートした。冷（４℃）１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ++およびＭｇ++フリー）の１００μｌアリコートを全てのコントロールおよび試験ウェルに添加した。各プレートを４℃、８５０ｇで５分間遠心分離し、続いて素早くフリックして上清を除去した。細胞ペレットを１００μｌの冷（４℃）１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ++およびＭｇ++フリー）に再懸濁し、続いて４℃、８５０ｇで５分間遠心分離した。プレートを次いで素早くフリックして上清を除去し、そして各細胞ペレットを２００μｌの１％パラホルムアルデヒド（４℃）に再懸濁した。プレートをホイルで覆い、ＦＡＣＳ分析まで４℃で放置した。
【００６０】
ＦＡＣＳ分析を、ＬＹＳＹＳ  ＩＩプログラムを備えたＦＡＣＳＳｔａｒ  Ｐｌｕｓシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して１０4フローイベントで実施した。ゲート（Ｒｅｇｉｏｎ１）を、ＦＬ３中で染色するＬＤＳ  ７５１により決定した有核細胞の回りに配置し、赤血球、血小板および残骸（ｄｅｂｒｉｓ）をゲートアウトした。ＦＬ１およびＦＬ２を、Ｒｅｇｉｏｎ１を使用する点のプロットとして表示した。ゲート（Ｒｅｇｉｏｎ２）を、抗ＣＤ−４５および抗ＣＤ−３４ｍＡｂの両方で染色する細胞群の回りに配置した。抗ＣＤ−３４（ＦＬ２）および抗ＣＤ−４５（ＦＬ１）ｍＡｂで染色する細胞の割合をＲｅｇｉｏｎ２で決定した。これは、有核細胞総数におけるＣＤ３４陽性コイル％を示す。非処理試料、およびＰＢＭＣ試料を密度勾配溶液で処理後、界面およびペレットから得た細胞画分中のＣＤ３４陽性細胞の総数を決定した。
【００６１】
（実施例５）
（コロニー形成（ＣＦＵ）アッセイ）
細胞を、種々のコロニー刺激因子およびエリスロポイエチン（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）Ｈ４４３３培地、Ｔｅｒｒｙ  Ｆｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）を含有する半固体メチルセルロース１ｍＬ中、１０5細胞で混合した。３７℃で１４日間培養後、赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）および混合（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）コロニーを、倒立顕微鏡（×４０）下でカウントした。
【００６２】
（実施例６）
（統計分析）
細胞の回収率％を以下の式により決定した：
【００６３】
【数１】
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ＣＤ３４細胞の回収率％を以下の式により決定した：
【００６４】
【数２】
0004576046.tif 000011
クローン原性細胞の回収率％を以下の式により決定した：
【００６５】
【数３】
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本発明は特定の方法および実施態様に関して記載されるが、種々の改変および変化が本発明から逸脱することなくなされ得ると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、コロイド状シリカ粒子の表面上のシラノール基のシラン処理のための反応順序を示す（実施例１）；
【図２】  図２Ａおよび２Ｂは、塩の非存在下（２Ａ）および存在下（２Ｂ）で本発明の方法に従って調製されたコロイド状シリカの測定した密度に対する繰り返しオートクレーブ処理の影響を示す；
【図３】  図３Ａおよび３Ｂは、塩の非存在下（３Ａ）および存在下（３Ｂ）で本発明の方法に従って調製されたコロイド状シリカの測定した浸透圧重量モル濃度に対する繰り返しオートクレーブ処理の影響を示す；
【図４】  図４Ａおよび４Ｂは、塩の非存在下（４Ａ）および存在下（４Ｂ）で本発明の方法に従って調製されたコロイド状シリカの測定したｐＨに対する繰り返しオートクレーブ処理の影響を示す；
【図５】  図５は、本発明の方法に従って調製されたコロイド状シリカの処理後、試料の界面に存在する種々の種類の細胞の回収％を示す；
【図６】  図６は、本発明の方法に従って調製されたコロイド状シリカの存在下または非存在下でインキュベートした細胞の生存％を示す（実施例３）；そして
【図７】  図７は、異なる条件下で調製された細胞（コロニー形成単位；ＣＦＵ）の回収％を示す（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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