(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路が設けられた基板と、該流路内に設けられ、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域と、前記流路内の前記抗体捕捉領域以外の領域に設けられた酵素反応生成物測定領域とを具備する酵素免疫センサを用い、前記被検物質と、該被検物質と抗原抗体反応する、酵素標識した抗体又はその抗原結合性断片とを含む試料液を前記抗体捕捉領域に流通させて未反応の前記抗体又はその抗原結合性断片を前記抗体捕捉領域に捕捉し、次いで、前記標識酵素の基質を含む基質液を前記抗体捕捉領域に流通させて前記標識酵素による酵素反応を行なわせた後、その酵素反応生成物の少なくとも一部を前記酵素反応生成物測定領域と接触させて該酵素反応生成物を測定することを含む、前記被検物質の酵素免疫測定方法であって、前記酵素反応生成物測定領域は金薄膜から成り、前記酵素反応は、チオール化合物を生成するものであり、酵素反応により生成した前記チオール化合物の、前記金薄膜への結合を表面プラズモン共鳴法により測定する酵素免疫測定方法。
【請求項２】
前記標識酵素がアシルチオコリンエステラーゼであり、前記基質がアシルチオコリンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識酵素がアセチルチオコリンエステラーゼであり、前記基質がアセチルチオコリンである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記流路は分岐しており、前記抗体捕捉領域は、分岐点よりも上流に位置し、前記酵素反応生成物測定領域は分岐点よりも下流の一方の流路内に位置しており、前記試料液は、分岐点通過後、前記反応生成物検出領域が形成されていない方の流路を流通し、前記基質液は、分岐点通過後、前記酵素反応生成物測定領域が形成されている方の流路を流通する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記流路は分岐のない１本の流路から成り、前記試料液は、前記抗体捕捉領域よりも上流の位置から前記流路に供給され、前記抗体捕捉領域を通過した後、前記酵素反応生成物測定領域に到達する前に流路から除去され、前記基質液は、前記抗体捕捉領域よりも上流の位置から前記流路に供給され、前記抗体捕捉領域を流通した後前記酵素反応生成物測定領域と接触する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記流路は分岐のない１本の流路から成り、前記試料液は、前記抗体捕捉領域と前記酵素反応生成物測定領域の間の位置から流路に供給されて前記抗体捕捉領域側に流通して前記抗体捕捉領域を通過し、前記基質液は、前記抗体捕捉領域を挟んで前記酵素反応生成物測定領域と反対側の位置から流路に供給されて前記抗体捕捉領域側に流通して前記抗体捕捉領域を通過して前記酵素反応生成物測定領域と接触する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫センサは、第１の流通方向規定領域と第２の流通方向規定領域を具備し、該第１の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域と前記酵素反応生成物測定領域の間に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成り、前記第２の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域を挟んで前記第１の流通方向規定領域と反対側の位置に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成り、前記試料液は前記抗体捕捉領域と前記第１の流通方向規定領域の間の位置から前記流路に供給され、前記基質液は前記第２の流通方向規定領域と前記抗体捕捉領域の間の位置から前記流路に供給され、前記試料液を供給した際の流通方向と、前記基質液を供給した際の流通方向とを、前記第１及び第２の流通方向規定領域に印加する電位を変えることにより切り替える請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１及び第２の流通方向規定領域に結合される、電位により親水性が変化する物質は、フェロセン又はその誘導体である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記流路は、前記酵素反応生成物が透過するが前記酵素標識抗体又はその抗原結合性断片は透過しない半透膜により上下２段に分離され、前記抗体捕捉領域は流路の上段に形成され、前記酵素反応生成物測定領域は下段に形成される請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
流路が設けられた基板と、該流路内に設けられ、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域と、前記流路内の前記抗体捕捉領域以外の領域に設けられた、金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域とを具備する、請求項１ないし３及び請求項５ないし９のいずれか１項に記載の方法を行なうための酵素免疫センサであって、前記流路は分岐のない１本の流路から成り、かつ、該免疫センサは、第１の流通方向規定領域と第２の流通方向規定領域とを具備し、該第１の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域と前記酵素反応生成物測定領域の間に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成り、前記第２の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域を挟んで前記第１の流通方向規定領域と反対側の位置に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成る酵素免疫センサ。
【請求項１１】
前記第１及び第２の流通方向規定領域に結合される、電位により親水性が変化する物質は、フェロセン又はその誘導体である請求項１０記載の酵素免疫センサ。
【請求項１２】
前記流路は、前記酵素反応生成物が透過するが前記酵素標識抗体又はその抗原結合性断片は透過しない半透膜により上下２段に分離され、前記抗体捕捉領域は流路の上段に形成され、前記酵素反応生成物測定領域は下段に形成される請求項１０記載の酵素免疫センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素免疫測定方法及びそれに用いられる酵素免疫センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体中のペプチド類を高感度かつ選択的に測定することが盛んに行われている。これまでは、これらペプチドに対する抗体の分子認識能力を利用した免疫測定法が行われてきた。しかしながら、生体試料中には脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、血液中で10 pg/mL程度）や、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、インシュリン、サブスタンスＰなど極めて低濃度でのみ存在する重要なペプチド類があり、これまで汎用的に用いられてきた酵素免疫測定法を用いてこれら極低濃度ペプチドを定量することは感度的に困難である。酵素免疫測定法の中でもサンドイッチ法によれば、より高感度な測定が可能であることが知られているが、同一抗原上で異なるエピトープを認識する２つのモノクローナル抗体を準備する必要があるため応用範囲は限られており、特に目的分子が小さい場合にはサンドイッチ法を適用することが困難であった。一方、ラジオ免疫測定法は極めて高感度な定量が可能であるものの、放射性同位元素を用いるため安全性に問題があり、ベッドサイド或いは在宅での測定は困難であった。このため、例えば心疾患患者などの一刻を争う臨床現場においては、心疾患のマーカー分子をベッドサイドなどで迅速・簡便に測定する新規なセンサが必要とされている。
【０００３】
現在、迅速・簡便な免疫測定法としては、一般的にイムノクロマトグラフィ法が良く用いられ、各社から市販されている（例えば、特許文献１など）。しかしながら、一般的にイムノクロマトグラフィ法の検出下限界は数ng/mL程度であり、測定対象は比較的高濃度に存在する分子に限られている。
【０００４】
一方、近年、ガラスやシリコンなどの上に分析システムを微小化、集積化する試みが盛んに行われており、操作の簡便化、自動化や分析時間の短縮などに有効であると考えられている。免疫測定法に関してもこれまでバルクで行われてきた手法を微小流路を用いて行うことにより、迅速で簡便な検出が可能になると考えられ、いくつかの報告例がある（例えば特許文献２及び特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１３３９５６号公報
【特許文献２】特開２００３−１１４２２９号公報
【特許文献３】特開２００１−４６２８号公報
【非特許文献１】W.C. Tang, D.P. Bame, T.K. Tang, Sensors and Actuators 83_2000.188193, I. Chakraborty
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、一般的なイムノクロマトグラフィ法では簡便かつ短時間に測定を行うことが可能であるものの、試料送液は毛細管現象を利用して行っているため、任意の流速に定めることが困難であり、定量性及び検出限界に乏しいという課題がある。比較的高感度な蛍光標識抗体とその蛍光検出においても、対象試料が展開される多孔質は一般的に透明性が低く、光の散乱が激しいこともイムノクロマトグラフィ法の定量性を乏しくしている。一方、これまで報告されている微小流路を用いた免疫測定法により微量生体分子の検出例が報告されているものの、微少量で十分な感度を得るために流路内でサンドイッチイムノアッセイを行い、さらに金コロイド等を標識した二次抗体を用いている。このために、測定対象分子はサンドイッチイムノアッセイが可能な比較的大きな分子に限られてしまうことや、チップ上に多数の微小流路を集積化し、反応と洗浄を複数回繰り返す必要があるため、複雑な送液手順を必要とするなどの問題点を残している。また、検出部分に試料溶液を直接導入した場合、非特異吸着の影響が非常に大きく、再現性に乏しいためＳ／Ｎ比向上が課題となっている。
【０００７】
本発明の目的は、これまで報告されてきたイムノクロマトグラフィ法や微小流路を有する免疫測定法における感度や非特異吸着の影響、測定時間並びに測定操作の煩雑さの問題点に鑑み、生体内に極微量で存在する分子においても、検出部分が非特異吸着の影響を受けずにＳ／Ｎ比良く、迅速、高感度かつ簡便に測定可能な、サンドイッチ法によらない酵素免疫測定方法及びそのための酵素免疫センサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、流路内に被検物質を不動化した抗体捕捉領域と、標識酵素の酵素反応生成物を検出可能な酵素反応生成物測定領域を設け、被検物質と、酵素標識した抗被検物質抗体とを含む試料液を、抗体捕捉領域に流通させて未反応の抗体を抗体捕捉領域に捕捉し、次いで、標識酵素の基質を含む基質液を抗体捕捉領域に流通させて標識酵素による、チオール化合物を生成する酵素反応を行なわせた後、その酵素反応生成物を金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域と接触させて該酵素反応生成物を表面プラズモン共鳴法により測定することにより、サンドイッチ法を用いることなく、生体内に極微量で存在する分子においても、検出部分が非特異吸着の影響を受けずにＳ／Ｎ比良く、迅速、高感度かつ簡便に測定することが可能であることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、流路が設けられた基板と、該流路内に設けられ、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域と、前記流路内の前記抗体捕捉領域以外の領域に設けられた酵素反応生成物測定領域とを具備する酵素免疫センサを用い、前記被検物質と、該被検物質と抗原抗体反応する、酵素標識した抗体又はその抗原結合性断片とを含む試料液を前記抗体捕捉領域に流通させて未反応の前記抗体又はその抗原結合性断片を前記抗体捕捉領域に捕捉し、次いで、前記標識酵素の基質を含む基質液を前記抗体捕捉領域に流通させて前記標識酵素による酵素反応を行なわせた後、その酵素反応生成物の少なくとも一部を前記酵素反応生成物測定領域と接触させて該酵素反応生成物を測定することを含む、前記被検物質の酵素免疫測定方法であって、前記酵素反応生成物測定領域は金薄膜から成り、前記酵素反応は、チオール化合物を生成するものであり、酵素反応により生成した前記チオール化合物の、前記金薄膜への結合を表面プラズモン共鳴法により測定する酵素免疫測定方法を提供する。また、本発明は、流路が設けられた基板と、該流路内に設けられ、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域と、前記流路内の前記抗体捕捉領域以外の領域に設けられた、金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域とを具備する、上記本発明の方法を行なうための酵素免疫センサであって、前記流路は分岐のない１本の流路から成り、かつ、該免疫センサは、第１の流通方向規定領域と第２の流通方向規定領域とを具備し、該第１の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域と前記酵素反応生成物測定領域の間に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成り、前記第２の流通方向規定領域は、前記抗体捕捉領域を挟んで前記第１の流通方向規定領域と反対側の位置に形成され、電位により親水性が変化する物質が結合された導体から成る酵素免疫センサを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酵素免疫測定方法によれば、サンドイッチ法を用いることなく、生体内に極微量で存在する分子においても、検出部分が非特異吸着の影響を受けずにＳ／Ｎ比良く、迅速、高感度かつ簡便に測定することが可能である。また、本発明の免疫測定方法は、酵素免疫測定方法であるので、危険で大掛かりな装置が必要で取扱いが不便な放射標識を用いない。したがって、本発明の方法は、ベッドサイドや患者の自宅等でも容易に行なうことができ、各種疾患の診断やそれに基づく治療に大いに貢献するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の通り、本発明の酵素免疫測定方法では、流路が設けられた基板と、該流路内に設けられ、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域と、前記流路内の前記抗体捕捉領域以外の領域に設けられた酵素反応生成物測定領域とを具備する酵素免疫センサを用いる。以下、先ず、この酵素免疫センサについて説明する。
【００１２】
本発明の酵素免疫測定方法に用いられる酵素免疫センサの基板は、液体が流通する流路を有する。流路は、基板の表面に設けられた溝状のものが好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、後述する試料液や基質液の供給や排出を行なう位置以外の部分を被覆したトンネル状のものとすることも可能である。基板は、単一の部材から構成されていてもよいが、流路になる部分を貫通孔とした上部シートと、単なる板状の下部基板とを貼り合せて基板としてもよい。この場合には下部基板が流路の底面を構成する。基板を構成する材料は、被検物質を非特異吸着しない材料であれば何ら限定されるものではなく、各種合成樹脂、合成ゴム、ガラス等を利用することができる。下記実施例では、流路を貫通孔としたシリコーンゴムシート（上部シート）と、ガラス板（下部基板）とを貼り合せて基板を構成しているが、もちろんこれに限定されるものではない。なお、基板は可撓性のある材料で形成してもよい。
【００１３】
流路は、分岐を１つ有する形状（例えばＴ字形）や、分岐を有さない形状（例えば直線状）が好ましい。流路の形状については、後で図面を参照して詳しく説明する。流路のサイズは特に限定されないが、あまりに大きいと試料液や基質液が多量に必要となって不利であり、また、あまりに小さいと液が流通しにくくなるので、流路の幅は、通常、５０μｍないし３ｍｍ程度、好ましくは５００μｍないし２ｍ程度、流路の深さは通常２０μｍないし５００μｍ程度、好ましくは１００μｍないし２００μｍ程度である。流路の長さは特に限定されないが、分岐のない１本の流路の場合、通常、１０ｍｍ〜１００ｍｍ程度、好ましくは１０ｍｍ〜４０ｍｍ程度である。
【００１４】
流路内には、被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質を不動化した抗体捕捉領域が設けられている。ここで、被検物質は、本発明の酵素免疫測定方法により測定すべき物質であり、抗原として抗原抗体反応し得るものであれば何ら限定されず、生体に投与された際に免疫応答を誘起する抗原のみならず、それ自体免疫応答は誘起しないが抗体とは抗原抗体反応するハプテンも包含される。被検物質としては、生体内、好ましくは血液や尿等の体液中に含まれる各種ペプチド類、タンパク質、多糖類、ポリヌクレオチド等の生体関連物質であるがこれらに限定されるものではなく、飲食品や環境水等、生体以外に含まれるものであってもよい。本発明の方法は、測定感度が高いので、被検物質が、試料中に微量にしか含まれない物質、例えば利尿ペプチド類、特に脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）等である場合に威力を発揮する。抗体捕捉領域には、このような被検物質に対する抗体と抗原抗体反応する抗体捕捉物質が不動化される。抗体捕捉領域には、好ましくは、被検物質自体が抗体捕捉物質として不動化されるが、被検物質に対する抗体と交差反応する、被検物質の誘導体等を抗体捕捉物質として不動化してもよい。正確な測定のために、抗体捕捉領域には、後述する試料液に含まれる抗体又はその抗原結合性断片の全量を抗原抗体反応により捕捉できる過剰量の抗体捕捉物質を不動化することが好ましい。好ましくは、試料液に含まれる抗体又はその抗原結合性断片のモル数の１０〜１００倍程度の抗体捕捉物質が不動化される。
【００１５】
抗体捕捉領域は、流路の底面のみに形成してもよいし、底面と側壁の両方又は側壁のみに形成してもよいが、試料液や基質液との接触を十分確保するために少なくとも底面の全面に形成することが好ましい。基板を上記のように上部シートと下部基板を貼り合わせて形成する場合には、下部基板の表面に部分的に形成するのが製造上便利である。抗体捕捉領域の長さは、このような過剰量の抗体捕捉物質が不動化できるサイズであれば特に限定されないが、通常、１ｍｍ〜２０ｍｍ程度、好ましくは５ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。
【００１６】
上記した抗体捕捉物質の抗体捕捉領域への不動化は、常法により行なうことができる。例えば、流路内の一領域にスパッタリングや蒸着等により金層を形成し、これにシステアミンを反応させることにより金層にアミノ基を結合させ、これにカルボジイミドのような結合試薬を用いてペプチド類等の被検物質のカルボキシル基を結合させることができる。あるいは、合成樹脂にアミノ基を共有結合させたものや、リジンで被覆した領域に同様にして抗体捕捉物質を結合させることも可能である。また、抗体捕捉物質を物理吸着させることも可能である。
【００１７】
流路内には、上記抗体捕捉領域以外の領域に、酵素反応生成物測定領域が設けられている。酵素反応生成物測定領域は、後述する、試料液に添加される抗体又はその抗原結合性断片の標識に用いられる標識酵素による酵素反応の反応生成物を検出する領域である。このため、その構成は用いる標識酵素の種類により異なる。
【００１８】
本発明の酵素免疫測定方法では、標識酵素として、チオール化合物を生成するアシルチオコリンエステラーゼ等が用いられ、酵素反応生成物測定領域として、金薄層が用いられる。チオール化合物は、そのＳＨ基が金に結合することが知られており、その結合反応を表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance: SPR)角の測定によりリアルタイムで測定することができる。SPRにより金層への酵素反応生成物の結合を測定する場合には、酵素反応生成物測定領域は、流路内に設けられた単なる金薄層であってよい。SPR測定による場合、金薄層からのエバネッセント波の染みだしが必要なため、金層の厚さは200nm以下が好ましい。金層の厚さの下限は特にないが、通常、５０ｎｍ程度が適している。なお、本明細書において、「測定」には定量、半定量及び検出のいずれもが包含される。酵素反応生成物測定領域を金薄層としてSPRにより測定する場合、その金薄層のサイズは特に限定されないが、測定を容易にするために、流路の幅よりも大きな径の領域とすることが好ましく、例えば、直径１ｍｍ〜５ｍｍ程度の円形等とすることができる。
【００２０】
本発明の酵素免疫測定方法は、上記した酵素免疫センサを用いて行なう。先ず、前記被検物質と、該被検物質と抗原抗体反応する、酵素標識した抗体又はその抗原結合性断片とを含む試料液を前記抗体捕捉領域に流通させる。被検物質は上記の通りである。被検物質を含む試料液には、該被検物質と抗原抗体反応する、酵素標識した抗体又はその抗原結合性断片が添加されている。酵素標識に用いられる標識酵素としては、上記の通り、チオール化合物を生成する酵素が用いられる。チオール化合物を生成する酵素の好ましい例としては、アシルチオコリンエステラーゼ、特にアセチルチオコリンエステラーゼを挙げることができる。これらの酵素自体は周知であり、市販もされているので容易に入手することができる。
【００２１】
試料液に添加する抗体又はその抗原結合性断片は、被検物質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片であればよく、必ずしも被検物質を免疫原として動物に免疫して得られた抗体又はその抗原結合性断片でなくてもよい。遺伝子工学的に生産された抗体でもよいし、被検物質と交差反応する抗体であってもよい。また、完全な抗体のみならず、Fab断片やF(ab')2断片のような、抗原と抗原抗体反応し得る断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）であってもよい。また、ScFvのような一本鎖抗体も抗原結合性断片に含めて解釈する。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、再現性や特異性の観点からモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の作製方法自体は周知である。抗体又はその抗原結合性断片を酵素標識する方法自体は、酵素免疫測定の分野において周知であり、下記実施例にもその１例が具体的に記載されている。
【００２２】
試料液には、酵素標識した、抗体又はその抗原結合性断片が添加される。添加する酵素標識抗体又はその抗原結合性断片の量は、試料中に含まれる被検物質に対して過剰量であることが好ましい。すなわち、試料液中に含まれる被検物質の量が、予想範囲の上限である場合であっても、その全量が抗原抗体反応できる量の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片を添加することが好ましい。過剰量の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片を添加しておけば、抗体又はその抗原結合性断片添加後における、未反応の抗体又はその抗原結合性断片の量が、試料液中に含まれる被検物質の量に必ず依存して変化するからである。
【００２３】
被検物質を含む試料液に、酵素標識抗体又はその抗原結合性断片を添加すると、被検物質と酵素標識抗体又はその抗原結合性断片とが抗原抗体反応して結合する。抗原抗体反応は、室温においても速やかに起きるが、十分に抗原抗体反応させるために、酵素標識抗体又はその抗原結合性断片添加後、酵素免疫センサに供する前に、室温にて６０〜６００秒程度の時間をおくことが好ましい。
【００２４】
上記の試料液を酵素免疫センサの流路に供給し、前記抗体捕捉領域上を流通させる。そうすると、未反応の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片が、抗体捕捉領域上の抗体捕捉物質と結合し、抗体捕捉領域上に捕捉される。なお、抗体捕捉領域上を流通させる際の流速は、試料液中の未反応の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片と抗体捕捉領域上の抗体捕捉物質との抗原抗体反応が十分に起きる流速に設定することが好ましい。例えば、下記実施例において作製した酵素免疫センサのように、流路が、幅２００μｍ、深さ５０μｍである場合には、流速は、特に限定されないが、通常、0.1μL/分〜10μL/分程度、好ましくは、0.2μL/分〜0.5μL/分程度である。また、通液する時間は、反応が十分に起きる時間であることが好ましく、特に限定されないが、通常１５秒〜５分間、好ましくは３０秒〜２分間程度である。なお、流路に流通させる液の流速は、例えば液をシリンジポンプのような微量定量ポンプを用いて流路に供給すること等により制御できる。抗体捕捉領域上を流通した後の試料液は、流路から排出するか、又は酵素反応生成物測定領域が設けられていない分岐流路に導くことにより、後から供給する基質液と混じらないようにすることが好ましい。
【００２５】
次に、標識酵素に用いた酵素の基質を含む基質液を酵素免疫センサの流路に供給し、抗体捕捉領域上を流通させる。基質液中の基質の量は、過剰量、すなわち、抗体捕捉領域に捕捉される予想量の範囲の上限の量の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片が捕捉される場合でも、その標識酵素の全量が反応する量であることが好ましい。基質液を流通させる際の流速は、抗体捕捉領域上に捕捉された酵素標識抗体又はその抗原結合性断片の標識酵素による酵素反応が十分に起きる流速であることが好ましく、例えば、下記実施例において作製した酵素免疫センサのように、流路が、幅２００μｍ、深さ５０μｍである場合には、流速は、特に限定されないが、通常、0.1μL/分〜10μL/分程度、好ましくは、0.2μL/分〜0.5μL/分程度である。また、通液する時間は、反応が十分に起きる時間であることが好ましく、特に限定されないが、通常１５秒〜２０分間、好ましくは３０秒〜５分間程度である。基質液が標識酵素と接触することにより酵素反応が起きることが必要であるので、酵素反応のために複数の基質が必要な場合には、基質液は該複数の基質を含む。
【００２６】
基質液が抗体捕捉領域上を流通する際に酵素反応が起き、酵素反応生成物が生成される。この酵素反応生成物は、基質液の中に混じった状態で基質液と共に流通する。酵素反応生成物を含む基質液は、さらに流路内を流通して、上記した酵素反応生成物測定領域と接触し、測定される。酵素反応生成物の測定は、上記したとおり、SPRにより測定される。
【００２７】
以下、図面を参照して本発明の酵素免疫測定方法に用いられる好ましい酵素免疫センサの構造を説明する。
【００２８】
図１は、本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましい１態様の模式分解斜視図である。なお、図（後述する他の図も同様）は、説明のためのものであるから、各種寸法の比率は実際の寸法比率とは大きく異なっている場合がある。図１に示す酵素免疫センサは、基板１０を含み、基板１０は、上部シート１０ａと下部基板１０ｂとを貼り合せたものである。なお、図１では、明瞭性のために、上部シート１０ａと下部基板１０ｂとを分解した状態を示している。上部シート１０ａは、例えばポリジメチルシロキサンのようなシリコーンゴム製であり、下部基板１０ｂは例えばガラス製である。基板１０には、実質的にＴ字形の流路１２が設けられている。流路１２は、上部シート１０ａを厚さ方向に貫通しており、従って、下部基板１０ｂの表面が流路１２の底面を構成する。流路１２の各端部は、液の供給や排出を容易にするために、直径が流路の幅よりも大きな円形状になっており、これらは上部シート１０ａにドリルで透孔を形成すること等により形成される。流路の「Ｔ」の字の横棒の一端が液供給口１４、「Ｔ」の字の横棒の他端が試料液排出口１６、「Ｔ」の字の縦棒の端部が基質液排出口１８である。試料液及び基質液は、液供給口１４から流路１２内に供給されるので、液供給口１４が流路１２における最上流になる。液供給口１４と、流路１２の分岐点（「Ｔ」字の横棒と縦棒の交点）との間に抗体捕捉領域２０が形成されている。上記のように、抗体捕捉領域２０は、例えば、下部基板１０ｂ上に蒸着やスパッタリング等により金薄膜を形成し、これにシステアミンを結合させてアミノ基を付加し、このアミノ基に被検物質を結合させることにより形成することができる。図示の例では、抗体捕捉領域２０は、流路１２の底面にのみ形成されている。流路１２の「Ｔ」字の縦棒の中央付近は、拡幅された領域２２が設けられており、該拡幅領域２２の底面には、酵素反応生成物測定領域２４が設けられている。図１に示す具体例では、酵素反応生成物測定領域２４は、SPR測定のための金薄膜から形成される。この金薄膜も下部基板１０ｂ上に蒸着やスパッタリング等により形成することができる。
【００２９】
図１に示す酵素免疫センサの具体例は、次のようにして使用することができる。先ず、上記した試料液（上記の通り、被検物質に対する、酵素標識した抗体又はその抗原結合性断片を添加したもの）を液供給口１４から供給する。試料液の供給は、例えばシリンジポンプのような微量定量ポンプに接続されたキャピラリーの先端を液供給口１４に差し込んで行なうことができる。一方、試料液排出口１６から吸引する。吸引も同様に、ポンプに接続されたキャピラリーの先端を試料液排出口１６に差し込んで行なうことができる。そうすると、供給された試料液は、抗体捕捉領域２０上を通過して試料液排出口１６に向かって流通し、試料液排出口１６から排出される。この際、試料液中に含まれる未反応の抗体又はその抗原結合性断片が抗体捕捉領域２０に不動化されている被検物質と抗原抗体反応して抗体捕捉領域２０に捕捉される。次に、酵素の基質液を液供給口１４から供給すると共に、基質液排出口１８から吸引する。そうすると、基質液は、抗体捕捉領域２０上を通過し、流路１２の分岐点で向きを変えて基質液排出口１８に向かう。この際に酵素反応生成物測定領域２４上を通過する。抗体捕捉領域２０上を通過する際、抗体捕捉領域２０に捕捉されている酵素標識抗体又はその抗原結合性断片の標識酵素により基質が酵素反応し、酵素反応生成物が生成する。なお、酵素反応生成物を金に結合させてSPRにより測定する場合には、上記の通り、酵素反応生成物はチオール化合物である。チオール化合物である酵素反応生成物は、金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域２４上を通過する際に、金と反応して結合する。この際の屈折率変化をSPR法で測定することにより、酵素反応生成物を測定することができる。なお、図１中、矢印２６はSPR測定用入射光、矢印２８はSPR測定用反射光を示す。
【００３０】
試料液に一定量の酵素標識抗体を添加すると、試料液中に含まれる被検物質の量が多いほど、未反応の標識抗体の量が少なくなり、その結果、酵素反応生成物測定領域２０に捕捉される酵素標識抗体の量が少なくなり、酵素反応する基質の量が少なくなり、ひいては酵素反応生成物の量が少なくなる。従って、上記方法により酵素反応生成物を測定することにより、試料中に含まれる被検物質を測定することができる。
【００３１】
なお、上記の例では、分岐点からの液の流通方向を、試料液排出口１６又は基質液排出口１８からの吸引により規定したが、例えば、分岐点に微小バルブを設けること等によっても、分岐点からの流通方向を規定することもできる。細い流路に設けられる微小バルブ自体は種々のものが周知であり、例えば、非特許文献１等に記載されている。なお、微小バルブを用いる場合には、各排出口からの吸引が不要になるので、各排出口にスポンジのような多孔性吸水材を配置して液を吸収するようにしてもよい。
【００３３】
本発明の酵素免疫センサの参考例を図２に示す。なお、図２に示す酵素免疫センサの構成は、図１に示した酵素免疫センサの構成と類似しており、図１に示す酵素免疫センサの部材に対応する部材には図１と同じ参照番号を付してある。図２に示す参考例が図１に示す具体例と異なる点は、金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域２４の形状が、基板の一端まで続く帯状をしており、さらに、同様な形状の金属薄膜から成る対向電極３２及び参照電極３０が、酵素反応生成物測定領域２４と、間隔をあけて平行に配置されている点である。また、図２に示す具体例では、流路１２のＴ字の縦棒部分に拡幅領域２２が設けられていない（ただし、拡幅領域を設けてもよい）。
【００３４】
図２に示す酵素免疫センサの使用方法も、酵素反応生成物測定領域２４に結合した酵素反応生成物の測定方法以外、図１に示す酵素免疫センサの使用方法と同様である。図２に示す酵素免疫センサでは、酵素反応生成物測定領域２４を作用電極とし、対向電極３２及び参照電極３０と共に電気化学セルを形成し、酵素反応生成物測定領域２４（作用電極）に電圧をかけて、酵素反応生成物測定領域２４に結合している酵素反応生成物を還元脱離させる。この際の還元電流を測定することにより、酵素反応生成物測定領域２４に結合した酵素反応生成物の量、ひいては試料液中の被検物質の量を測定することができる。還元電流の測定は、酵素反応生成物測定領域２４（作用電極）、対向電極３２及び参照電極３０をポテンショスタットに接続し、参照電極電位に対して作用電極電位を掃引し、その際に発生する電流を電流計にて測定することにより行なうことができる（下記参考例参照）。
【００３５】
あるいは、図２に示す参考例において、酵素反応生成物測定領域２４は、上記した過酸化水素測定用電極としてもよい（第２の参考例）。この場合には、上記の通り、標識酵素としては、各種オキシダーゼ等の、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素が用いられる。過酸化水素測定電極が、フェロセン誘導体等の酸化還元性物質を結合したものである場合には、上記の通り、基質液中にはヘミンやペルオキシダーゼ類が添加される。第２の参考例の場合でも、酵素反応により生成した過酸化水素は、第１の参考例と同様、酵素反応生成物測定領域２４（作用電極）、対向電極３２及び参照電極３０をポテンショスタットに接続し、参照電極電位に対して作用電極電位を掃引し、その際に発生する電流を電流計にて測定することにより行なうことができる（下記実施例参照）。
【００３６】
本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましい第２の具体例を図３に示す。図３に示す具体例においても、図１に示す酵素免疫センサの部材に対応する部材には図１と同じ参照番号を付してある。図３に示す具体例では、流路１２が分岐しておらず、１本の直線状の流路１２が形成されている。そして、試料液排出口１６が流路１２の中央付近に形成されている。抗体捕捉領域２０は、液供給口１４と試料液排出口１６の間に形成され、酵素反応生成物測定領域２４は試料液排出口１６と基質液排出口１８の間に形成されている。他の構成は図１に示す具体例と同様である。
【００３７】
図３に示す酵素免疫センサは、流路１２の形状と試料液排出口１６の位置が図１に示す具体例と異なっているだけであり、その使用方法は図１に示す具体例と同様である。すなわち、液供給口１４から試料液を供給し、試料液排出口１６から吸引して試料液排出口１６から排出する。この際、未反応の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片が抗体捕捉領域２０に結合する。次に、基質液を液供給口１４から供給し、基質液排出口１８から吸引して排出する。そうすると、抗体捕捉領域２０に結合されている標識酵素による酵素反応により生成した酵素反応生成物が酵素反応生成物測定領域２４に結合する。これをSPR法等により測定する。
【００３８】
本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましい第３の具体例を図４及び図５に示す。図５は図４の模式切断部端面図である（図４の流路を縦断して切断）。図４及び図５に示す具体例においても、図１に示す酵素免疫センサの部材に対応する部材には図１と同じ参照番号を付してある。
【００３９】
図４及び図５に示す酵素免疫センサも、図３に示す具体例と同様、流路１２は、分岐がなく、一本の直線状である。図４及び図５に示す具体例では、液供給口が試料液供給口１４ａと基質液供給口１４ｂに分離しており、これらの間に抗体捕捉領域２０が配置される。酵素反応生成物測定領域２４は、試料液供給口１４ａと基質液排出口１８の間に配置されている。さらに、試料液供給口１４ａと酵素反応生成物測定領域２４の間には第１の流通方向規定領域３４が形成され、一方、基質液供給口１４ｂと試料液排出口１６の間に第２の流通方向規定領域３６が形成され、第１及び第２の流通方向規定領域３４及び３６は、金属薄膜から成る電極上に、電位により親水性が変化する物質が結合されたものである。電位により親水性が変化する物質は、電極の全面に結合させる必要はなく、流路１２の底面に結合していればよい。電位により親水性が変化する物質としては、フェロセン及びその誘導体を挙げることができる。ここで、「誘導体」としては、フェロセン部分をそっくり含み、フェロセンと同様に、電位による親水性が変化するものが好ましく、例えば、アルキルチオール基（好ましくは炭素数１〜２０程度）が結合したアルキルチオール誘導体等を例示することができる。電位による親水性が変化する物質が結合した電極は、例えば、下記実施例に具体的に記載するように、フェロセンアルキルチオールの溶液に電極を浸漬し、電極表面をフェロセンアルキルチオールの自己組織化単分子膜で被覆することなどにより形成することができる。
【００４０】
使用時には、第１の流通方向規定領域３４をアースし（電位０Ｖ）、第２の流通方向規定領域３６に正電位（例えば+0.4V)をかける。そうすると、第２の流通方向規定領域３６上のフェロセン誘導体は親水性となり、第１の流通方向規定領域３４上フェロセン誘導体は疎水性のままである。この状態で、試料液供給口１４ａから試料液を供給する。そうすると、第１の流通方向規定領域３４は疎水性であるので試料液は第１の流通方向規定領域３４を乗り越えて進んでいくことはない。一方、第２の流通方向規定領域３６は親水性であるので、試料液は第２の流通方向規定領域３６を乗り越えて進み、試料液排出口１６に至る。この過程で、試料液は抗体捕捉領域２０上を通過するので、未反応の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片が抗体捕捉領域２０上に結合される。次に、第２の流通方向規定領域３６をアースし（電位０Ｖ）、第１の流通方向規定領域３４に正電位（例えば+0.4V)をかける。この状態で基質液供給口１４ｂから基質液を供給する。そうすると、電位の変化により、第２の流通方向規定領域３６は疎水性になっているので、基質液は第２の流通方向規定領域３６を乗り越えて進むことはない。一方、第１の流通方向規定領域３４は、電位の変化により親水性になっているので、基質液は、第１の流通方向規定領域３４を乗り越えて進み、基質液排出口１８に至る。この過程で、基質液は、抗体捕捉領域２０及び酵素反応生成物測定領域２４上を通過するので、上記した他の具体例の場合と同様、酵素反応生成物が酵素反応生成物測定領域２４上に結合する。これを他の具体例の場合と同様、SPR法等により測定する。この具体例では、以上のように、液の流通方向が、第１及び第２の流通方向規定領域３４及び３６に印加される電位より規定されるので、各排出口からの吸引が不要であるから、各排出口にスポンジのような多孔性吸水材を配置して液を吸収するようにしてもよい。
【００４１】
本発明の酵素免疫センサの好ましい第４の具体例を図６に示す。図６に示す具体例においても、図１に示す酵素免疫センサの部材に対応する部材には図１と同じ参照番号を付してある。
【００４２】
図６に示す酵素免疫センサも、図３に示す具体例と同様、流路は、分岐がなく、一本の直線状である。図６に示す具体例では、上部シートが、半透膜３８により上下２段に分離されている。従って、流路も半透膜３８により上下２段に分離されている。なお、上段のシートを１０ａ１、下段のシートを１０ａ２、上段の流路を１２ａ、下段の流路を１２ｂで示す。半透膜３８は、アセチルチオコリンのような酵素反応生成物は透過するが、前記酵素標識抗体又はその抗原結合性断片は透過しないものである。抗体捕捉領域２０は、上段のみに形成される。これは、半透膜３８上に抗体捕捉領域２０を設けることによっても達成されるし、あるいは、上段の流路１２ａの側壁に抗体捕捉領域２０を設けてもよい。図６に示す具体例ではまた、試料液排出口と基質液排出口が同一の排出口１８ａとなっている。また、下段流路１２ｂの一端が透析液供給口４０、他端が透析液排出口４２となっている。以上のような上部シートは、２枚のシートを、半透膜３８を挟んで貼り合せることにより容易に作製することができる。また、他の具体例と同様、下段シート１０ａ２の下側には、図示しない下部基板が張り合わされ、下部基板の表面に金膜が形成されて酵素反応生成物測定領域２４となっている。酵素反応生成物測定領域２４は、図３の具体例と同様、抗体捕捉領域２０よりも下流に形成される（ただし、酵素反応生成物測定領域２４は下段流路１２ｂ内、抗体捕捉領域２０は上段流路１２ａ内）。
【００４３】
図６に示す具体例の使用方法を説明する。先ず、透析液供給口４０から透析液を供給すると共に透析液排出口４２から吸引し、下部流路１２ｂ内に透析液を満たす。この状態で吸引を停止し、下部流路１２ｂ内に透析液が満たされた状態で維持する。なお、透析液としては、例えば0.1Mリン酸バッファー等を用いることができる。次に、液供給口１４から試料液を供給すると共に液排出口１８ａから吸引する。そうすると、試料液は、液排出口１８ａに向かって流れ、試料液中の未反応の酵素標識抗体又はその抗原結合性断片が抗体捕捉領域２０に結合する。この際、酵素標識抗体又はその抗原結合性断片は半透膜３８を透過しないので、下部流路１２ｂには移行しない。試料液が血液等の体液である場合、種々のタンパク質等が含まれるが、これらも半透膜３８を透過しないので、下部流路１２ｂには移行しない。次に、液供給口１４から基質液を供給すると共に液排出口１８ａから吸引する。そうすると、基質液は、液排出口１８ａに向かって流れ、その間に抗体捕捉領域２０上を通過し、その際に抗体捕捉領域２０に結合している標識酵素により酵素反応が起き、酵素反応生成物が生成する。生成した酵素反応生成物は、半透膜３８を透過するので、少なくともその一部が半透膜３８を介して下段流路１２ｂに移行し、酵素反応生成物測定領域２４に結合する。この際、透析液排出口４２から吸引してもよい。酵素反応生成物測定領域２４に結合した酵素反応生成物は、他の具体例と同様、SPR法等により測定することができる。
【００４４】
この具体例によれば、酵素反応生成物の測定を、試料液中の各種タンパク質等の高分子物質の非存在下において行なうことができ、より正確な測定が可能になる。
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
１．  アセチルチオコリンエステラーゼ標識ＢＮＰの調製
(1)   アセチルチオコリンエステラーゼを標識酵素とする脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）抗体（Ａｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥ）を以下のように作製した。１０ｍｇ／ｍＬのＳ−アセチルカプトサクシニルアンヒドリド溶液を１ｍｇ／ｍＬのアセチルチオコリンエステラーゼと反応させてアセチルチオコリンエステラーゼにチオール基を導入した。一方、０．１ｍｇ／ｍＬのスルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートと４００μｇ／ｍＬの抗ヒトＢＮＰ抗体（入手先：Phoenix Pharmaceuticals社）と反応させて、抗ヒトＢＮＰ抗体にマレイミド基を導入した。その後、チオール修飾したアセチルチオコリンエステラーゼとマレイミド基を導入した抗ヒトＢＮＰ抗体を反応させてＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを作製した。
【００４８】
２．  酵素免疫センサの作製
図１に示す第１の具体例になる酵素免疫センサを作製した。上部シート１０ａはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシート（16mm x 16 mm、厚さ50μm)から成り、下部基板１０ｂはガラス板であった。上部シート１０ａは、ステンレス基板にサンドブラスト加工法により形成した凸構造を有するネガパターンを鋳型としてＰＤＭＳ及び硬化剤を流し込み、硬化後、剥がし取ることにより作製した。流路は幅２００μｍ、深さ５０μｍであった。また、Ｔ字形の横棒の長さは１２ｍｍ、縦棒の長さは１２ｍｍであった。また、流路１２内の拡幅領域２２の直径は、３ｍｍであった。その後ドリルにより、液供給口１４、試料液排出口１６及び基質液排出口１８を開け、液の導入及び排出のためのキャピラリを接続した。ドリルで開けたそれぞれの孔の直径は０．６mmであった。
【００４９】
一方、下部基板１０ｂは、ガラス板（16mm x16mm、厚さ0.15ｍｍ、松浪硝子社製）から成り、抗体捕捉領域２０及び酵素反応生成物測定領域２４として、それぞれ金薄膜を形成した。金薄膜は、ガラス板上にマグネトロンスパッタ装置（日本シード社製）を用いてチタンを５ｎｍ堆積させた後、さらに金薄膜を厚さ５０ｎｍ堆積させることにより形成した。抗体捕捉領域２０長さは５mm、酵素反応生成物測定領域２４の直径は３mmであった。その後、抗体捕捉領域２０の金薄膜に０．１ｍＭシスタミン溶液を滴下、２時間放置し、金表面にアミノ基を導入した後、純水で洗浄し、さらに２．５ｍｇ／ｍＬのＢＮＰ及び０．１ｇ／Ｌの水溶性カルボジイミドを含む溶液中で１時間反応させることにより、金薄膜表面にＢＮＰを不動化した。得られた下部基板１０ｂを洗浄後、上記上部シート１０ａと貼り合わせ、本発明の第１の具体例になる酵素免疫センサを作製した。
【００５０】
３．  定量方法
ＢＮＰの定量は以下の手順で行った。各濃度のＢＮＰ含む水溶液に終濃度が１０ｎｇ／ｍＬになるようにＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを加えた。この試料液を、シリンジポンプを用いて液供給口１４から供給し、一方、試料液排出口１６から吸引し、液供給口１４から試料液排出口１６の方向に流速１μＬ／分で１分間流通させた。これにより、未反応抗体をＢＮＰが固定化された抗体捕捉領域２０上に固定化した。その後、１ｍＭのアセチルチオコリンを含む基質液を、液供給口１４から供給し、一方、基質液排出口１８から吸引し、液供給口１４から基質液排出口１８の方向に流速１μＬ／分において連続的に流通させつつ、拡幅領域２２内に配置された、金薄膜から成る酵素反応生成物測定領域２４表面の屈折率変化をＳＰＲ法により読み取った。ＳＰＲ角の測定は、市販されているＨａｎｄｙ−ＳＰＲ（商品名、ＮＴＴ−ＡＴ社製）を用いて行った。
【００５１】
４．  結果
結果を図７及び図８に示す。図７は各ＢＮＰ濃度に対するＳＰＲ角の上昇する様子を示している。試料液中に多くのＢＮＰが含まれる場合には、抗体捕捉領域２０上に固定化される未反応抗体の量が減少するため、アセチルコリンエステラーゼ活性が低く、酵素反応生成物であるチオコリンの生成量が少ない。このため、試料溶液中のＢＮＰ増加に伴いＳＰＲ角度変化が小さくなった。一方、試料液中にＢＮＰが少ない場合、未反応抗体が増加するため抗体捕捉領域２０上に固定化される未反応抗体の量が増加し、固定化されるアセチルコリンエステラーゼ活性が高いため、試料液中のＢＮＰ減少に伴いＳＰＲ角度変化が大きくなる。図８は各ＢＮＰ濃度に対する図７における５分後のＳＰＲ角の変化量を示している。試料液中のＢＮＰ濃度の増加に伴いＳＰＲ角の変化速度が小さくなる。すなわち本発明の方法によりＢＮＰが定量可能であることを示している。
【実施例２】
【００５２】
参考例１
１．  酵素免疫センサの作製
図２に示す参考例になる酵素免疫センサを作製した。上部シート１０ａは、実施例１と同様に作製した（ただし、実施例１の拡幅領域２２は形成しない）。下部基板１０ｂも実施例１と同様なガラス板であり、酵素反応生成物測定領域２４（作用電極）及び参照電極３０は、実施例１と同様に作製した金薄膜とした。対向電極３２は銀薄膜とした。なお、各電極の幅は１mmであった。
【００５３】
２．  定量
実施例１と同様にＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを作製した後、実施例１と同様に各濃度のＢＮＰ含む水溶液に終濃度が１０ｎｇ／ｍＬになるようにＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを加え、次いで、この試料液を、シリンジポンプを用いて液供給口１４から試料液排出口１６の方向に１μＬ／分の流速で１分間流路１２中に供給し、未反応抗体をＢＮＰが固定化された金薄膜（抗体捕捉領域）２０上に固定化した。その後、１ｍＭのアセチルチオコリンを含む基質液を液供給口１４から基質液排出口１８に向かって１μＬ／分の流速で供給し、酵素反応生成物測定領域（作用電極）２４表面に酵素反応生成物であるチオコリンを結合させた。その後、０．１Ｍの水酸化カリウム溶液を液供給口１４から基質液排出口１８に向かい送液し、検出流路１９内を０．１Ｍの水酸化カリウム溶液で満たし、送液を止めた。
【００５４】
その後、センサの作用電極２４、参照電極３０及び対向電極３２をポテンシオスタット（ＡＬＳ社製）に接続し、参照電極電位に対して−０．４Ｖから−１．４Ｖへ作用電極電位を掃引すると、−１．１Ｖ付近にピークを有する還元電流ピークが確認された。この還元電流は作用電極２４上に吸着していたチオコリンが還元脱離した際の電流である。本還元電流値はＢＮＰ濃度の上昇に伴い、減少した。これは試料中にＢＮＰが多い場合、未反応抗体が減少するため金薄膜２０上に固定化される未反応抗体の量が減少し、固定化されるアセチルコリンエステラーゼ活性が低いため、試料溶液中のＢＮＰ増加に伴い還元電流値が減少する。このように本発明では電気化学的手法においてもＢＮＰが定量可能であることを示している。
【実施例３】
【００５５】
参考例２
１．  グルコースオキシダーゼ標識抗ＢＮＰ抗体の調製
標識酵素としてアセチルチオコリンエステラーゼに代えてグルコースオキシダーゼを用いたことを除き、実施例１と同様にしてグルコースオキシダーゼ標識抗ヒトＢＮＰ抗体を調製した。
【００５６】
２．  酵素免疫センサの作製
酵素反応生成物測定領域２４（作用電極）を1 mMフェロセンウンデカンチオールのエタノール溶液に２時間浸漬し、電極表面をフェロセンウンデカンチオールの自己組織化単分子膜で修飾したことを除き実施例２と同様な酵素免疫センサを作製した。
【００５７】
３．  定量
実施例１と同様に各濃度のＢＮＰ含む水溶液に終濃度が１０ｎｇ／ｍＬになるようにグルコースオキシダーゼ標識抗ヒトＢＮＰ抗体を加え、次いで、この試料液を、シリンジポンプを用いて液供給口１４から試料液排出口１６の方向に１μＬ／分の流速で１分間流路１２中に供給し、未反応抗体をＢＮＰが固定化された金薄膜（抗体捕捉領域）２０上に固定化した。その後、基質溶液として１０ｍＭグルコース及び１μＭヘミンを含む溶液を実施例２と同様に送液した。これにより、流路１２内で過酸化水素を生成させ、ヘミンを介して作用電極２４上に修飾したフェロセンウンデカンチオールの一部を酸化させた。その後、実施例２と同様にフェロセンウンデカンチオールを修飾した作用電極電位を参照電極３０に対して電位を掃印することにより、還元電流ピークを観測することができた。これは、作用電極上に修飾されたフェロセンウンデカンチオールがヘミンを介して一部酸化された分子が、再び還元されたことによる。上記還元電流ピークより過酸化水素濃度を決定することが可能であり、さらに目的とする抗原であるＢＮＰ濃度を決定することが可能となる。
【実施例４】
【００５８】
１．  酵素免疫センサの作製
図３に示す第２の具体例の酵素免疫センサを作製した。上部シート１０ａの流路の形状を図３のように変更した以外は実施例１と同様にして作製した。ただし、酵素反応生成物測定領域２４を構成する金薄膜の直径は１０mmであった。
【００５９】
２．  定量
試料液及び基質液は実施例１と同様にして調製した。試料液排出口１６及び基質液排出口１８をシリンジに接続し、さらに該シリンジをシリンジポンプに取り付けた。その後、試料液排出口１６に接続したシリンジポンプのみを吸引することにより、ＢＮＰ及びＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを含む試料液を液供給口１４から試料液排出口１６に向かい吸引送液した。この間にＢＮＰが固定化されている金薄膜２０上に未反応抗体が固定化される。その後、基質液排出口１８に接続したシリンジポンプを吸引することにより、液供給口１４から基質液排出口１８に向かい、１ｍＭのアセチルチオコリン溶液を吸引送液した。なお、試料液及び基質液の送液条件は実施例１と同様であった。この時に金薄膜２０上に固定化されたＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥによりアセチルチオコリンの一部がチオコリンに分解され、金薄膜２４上に濃縮される。このチオコリンの濃縮を実施例１と同様にＳＰＲ法により検出した。
【実施例５】
【００６０】
１．  酵素免疫センサの作製
図４及び図５に示す第３の具体例の酵素免疫センサを作製した。上部シート１０ａは、流路の形状を図４及び図５に示すように変更した以外は実施例１と同様にして作製した。下部基板１０ｂには、実施例４と同様に抗体捕捉領域２０及び酵素反応生成物測定領域２４を形成した。さらに、第１の流通方向規定領域３４及び第２の流通方向規定領域３６の基層をそれぞれ金薄膜で形成した。これらの金薄膜を、1 mMフェロセンウンデカンチオールのエタノール溶液に2時間浸漬し、電極表面をフェロセンウンデカンチオールの自己組織化単分子膜で修飾して第１及び第２の流通方向規定領域３４及び３６を形成した。
【００６１】
２．  定量
試料液及び基質液は実施例１と同様にして調製した。先ず、第２の流通方向規定領域３６及び第１の流通方向規定領域３４の電極電位をおのおの０．４Ｖ，０Ｖに印加し、ＢＮＰ及びＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを含む試料液を試料液供給口１４ａから送液した。導入された試料液は親水性の高い第２の流通方向規定領域３６方向へ送液され、この間にＢＮＰが固定化されている抗体捕捉領域２０上に未反応抗体が固定化される。次に、第２の流通方向規定領域３６及び第１の流通方向規定領域３４の電極電位をおのおの０Ｖ，０．４Ｖに印加し、基質液供給口１４ｂから１ｍＭのアセチルチオコリン溶液を導入した。この際に、アセチルチオコリン溶液は親水性の高い第１の流通方向規定領域３４の方向に送液され、さらに酵素反応生成物測定領域（金薄膜）２４と接触する。なお、試料液及び基質液の送液条件は実施例１と同様であった。この時に金薄膜２４上に固定化されたＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥによりアセチルチオコリンの一部がチオコリンに分解され、金薄膜２４上に濃縮される。このチオコリンの濃縮を実施例１と同様にＳＰＲ法により検出、もしくは実施例２と同様に電気化学的に検出することにより、試料中のＢＮＰを定量可能であった。このように酸化還元種を固定化した金薄膜を各流路の境目に配置させることにより、送液方向を制御し、簡便にかつＳ／Ｎ比よく検出可能である。
【実施例６】
【００６２】
１．  酵素免疫センサの作製
図６に示す第４の具体例の酵素免疫センサを作製した。上部シートは、流路の形状を図６の通りにしたことを除き実施例１と同様にして作製した２枚のPDMSシートの間に半透膜３８を挟んで貼り合せた。半透膜３８は、平均孔径４nm、厚さ２０μmのセルロース膜であった。上部シートの上段１０ａ１の側壁に、実施例１と同様なスパッタリングにより金薄膜を形成し、これに実施例１と同様にＢＮＰを結合して抗体捕捉領域２０とした。下部基板は実施例１と同様であった。なお、下部基板には、酵素反応生成物測定領域２４となる金薄膜のみ形成した。
【００６３】
２．  定量
試料液及び基質液は実施例１と同様にして調製した。まず、透析液として０．１Ｍのリン酸バッファを透析液供給口４０から透析液排出口４２に向かい送液し、下段流路１２ｂ内に透析液を満たした。その後、シリンジポンプを用いて液供給口１４からＢＮＰ及びＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＡｃｈＥを含む試料液を排出口１８ａに向かい吸引送液した。その後、同様に基質液である１ｍＭアセチルチオコリンを送液した。なお、試料液及び基質液の送液条件は実施例１と同様であった。これにより生成されたチオコリンの一部は半透膜３８を通過し、酵素反応生成物測定領域（金薄膜）２４上に吸着濃縮される。濃縮されるチオコリンは実施例１と同様にＳＰＲ法により確認可能である。このように酵素生成物であるチオコリンのように分子量の小さい分子を選択的に検出流路へ送り込むことにより、試料中のタンパク質などの高分子の吸着の影響が無く測定可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましい１具体例を模式的に示す分解斜視図である。
【図２】酵素免疫センサの参考例を模式的に示す分解斜視図である。
【図３】本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましいさらに他の１具体例を模式的に示す分解斜視図である。
【図４】本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましいさらに他の１具体例を模式的に示す分解斜視図である。
【図５】図４の切断部端面図である。
【図６】本発明の方法に用いられる酵素免疫センサの好ましいさらに他の１具体例を模式的に示す分解斜視図である。
【図７】本発明の実施例１で測定した、種々の濃度の被検物質を含む各標準試料液についてのＳＰＲ角の時間変化を示す図である。
【図８】図７に示す結果から導かれた、試料液中のＢＮＰ濃度とＳＰＲ角の変化率との関係を示す検量線である。
【符号の説明】
【００６５】
１０  基板
１０ａ  上部シート
１０ａ１  上部シートの上段
１０ａ２  上部シートの下段
１２  流路
１２ａ  上段流路
１２ｂ  下段流路
１４  液供給口
１４ａ  試料液供給口
１４ｂ  基質液供給口
１６  試料液排出口
１８  基質液排出口
１８ａ  排出口
２０  抗体捕捉領域
２２  拡幅領域
２４  酵素反応生成物測定領域
２６  SPR測定用入射光
２８  SPR測定用反射光
３０  参照電極
３２  対向電極
３４  第１の流通方向規定領域
３６  第２の流通方向規定領域
３８  半透膜
４０  透析液供給口
４２  透析液排出口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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