(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
難消化性デキストリン含有試料中における還元難消化性デキストリンの定性方法であって、
（ａ）試料から３糖以上の食物繊維を分取する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維を加水分解する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた加水分解物中のグルコース量とソルビトール量との比率を求め、前記比率に基づいて試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであるかどうかを判定する工程とを含むことを特徴とする還元難消化性デキストリンの定性方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）で、前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維の９７重量％以上を単糖に加水分解する、請求項１に記載の定性方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）で、次の計算式により（ｙ）が所定の範囲の値であるときに、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定する、請求項１又は２に記載の定性方法。
（ｙ）＝［加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）／｛加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）＋加水分解物中のグルコース濃度（ｗ／ｖ）｝］×１００
【請求項４】
試料中の難消化性デキストリンが平均分子量１０００〜３０００のものである場合において、前記工程（ｃ）で、次の計算式により（ｙ）が５．５〜１６．７であるときに、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定する、請求項１〜３の何れか１項に記載の定性方法。
（ｙ）＝［加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）／｛加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）＋加水分解物中のグルコース濃度（ｗ／ｖ）｝］×１００
【請求項５】
前記工程（ａ）の前に、１種以上の消化酵素を用いて試料を消化する工程を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の定性方法。
【請求項６】
前記１種以上の消化酵素が熱安定性α‐アミラーゼ、プロテアーゼ、及びアミログルコシターゼである、請求項５に記載の定性方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難消化性デキストリン含有試料中における還元難消化性デキストリンの定性方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性食物繊維の一つである還元難消化性デキストリンの一例としては、焙焼デキストリンを酵素消化し、次いで水素添加して得られる還元難消化性デキストリンがある。この還元難消化性デキストリンは、特許文献１に示されるように、食品に添加した際に色を付与せず、経時的にも褐変することがないことから、例えば、水、透明な清涼飲料水、米飯など着色が問題となる食品に添加するのに有効とされている。特許文献１には、これを有効成分として含有する、保健機能を付与又は強化した飲食品が開示されており、この飲食品は、保健機能として整腸作用、血糖値調整作用、耐糖能維持改善作用、体脂肪調整作用、血清脂質調整作用があるため、特定保健用食品をはじめとする健康食品に利用され得る。
【０００３】
ここで、特定保健用食品は、食品機能を有する食品の成分全般を広く関与成分の対象として、ある一定の科学的根拠を有することが認められたものについて、厚生労働大臣の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示した食品であり、有効性及び安全性について、基本的に厚生労働省及び食品安全委員会の審査を得ることとされている。従って、還元難消化性デキストリンを関与成分とする食品について特定保健用食品として許可を得る場合、その食品に含有される関与成分が還元難消化性デキストリンであることを判定する試験（定性試験）が求められる。
【０００４】
一般に、食物繊維の定性試験法としては、分子量や極性等の違いによりＨＰＬＣの溶出時間から判別するもの、粘性から判別するもの、電気泳動のスポットの発色から判別するもの、構成糖の比から判別するもの等がある。しかし、還元難消化性デキストリンは分子量、極性などの性質が還元前の難消化性デキストリンとほとんど変わらず、構造上、末端グルコースがソルビトールに変化しただけのものである。両者を識別できる方法としては、上記の定性試験法の中では、構成糖の比からの判別する方法のみが適用できると考えられるが、そのまま適用するには問題点があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２８７４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、食品などの試料中に含まれている難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであるか否かを高い精度で判定することのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願は以下の発明を包含する。
（１）難消化性デキストリン含有試料中における還元難消化性デキストリンの定性方法であって、
（ａ）試料から３糖以上の食物繊維を分取する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維を加水分解する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた加水分解物中のグルコース量とソルビトール量との比率を求め、前記比率に基づいて試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであるかどうかを判定する工程とを含むことを特徴とする還元難消化性デキストリンの定性方法。
（２）前記工程（ｂ）で、前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維の９７重量％以上を単糖に加水分解する、（１）に記載の定性方法。
（３）前記工程（ｃ）で、次の計算式により（ｙ）が所定の範囲の値であるときに、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定する、（１）又は（２）に記載の定性方法。
（ｙ）＝［加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）／｛加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）＋加水分解物中のグルコース濃度（ｗ／ｖ）｝］×１００
（４）試料中の難消化性デキストリンが平均分子量１０００〜３０００のものである場合において、前記工程（ｃ）で、次の計算式により（ｙ）が５．５〜１６．７であるときに、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定する、（１）〜（３）の何れかに記載の定性方法。
（ｙ）＝［加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）／｛加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）＋加水分解物中のグルコース濃度（ｗ／ｖ）｝］×１００
（５）前記工程（ａ）の前に、１種以上の消化酵素を用いて試料を消化する工程を含む、（１）〜（４）の何れかに記載の定性方法。
（６）前記１種以上の消化酵素が熱安定性α‐アミラーゼ、プロテアーゼ、及びアミログルコシターゼである、（５）に記載の定性方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の定性方法により、試料中に含まれる難消化性デキストリンが、還元難消化性デキストリンであることを精度良く判定することができる。また、本発明の定性方法は、グルコース、ソルビトールや、これらを構成糖とする消化性の多糖を含んだ食品を試料とする場合においても適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において「難消化性デキストリン」とは、ヒトの消化酵素で加水分解されない難消化性、難吸収性のデキストリンの総称である。「難消化性デキストリン」という用語は、還元難消化性デキストリンと、還元難消化性デキストリンではない難消化性デキストリンとの両方を包含する用語である。
【００１０】
本発明において「還元難消化性デキストリン」とは、焙焼デキストリンを酵素消化し、次いで水素添加して還元末端のカルボニル基を還元して得られる難消化性デキストリンである。本発明は、３糖以上の還元難消化性デキストリンの定性に適用し得るが、例えば平均分子量が１０００〜３０００、より好ましくは１３００〜２５００の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであるか否かを判定する場合に適用することができる。このような還元難消化性デキストリンとして具体的には、松谷化学工業株式会社から販売されている粉末タイプのファイバーソル２Ｈ（商品名）等がある。
【００１１】
上記の「還元難消化性デキストリンではない難消化性デキストリン」とは、還元末端のカルボニル基が還元されていない難消化性デキストリンであり、例えば、焙焼デキストリンを酵素消化して得ることができる。このような難消化性デキストリンとして具体的には、松谷化学工業株式会社から販売されているパインファイバーＣ（商品名）や、パインファイバー（商品名）、ファイバーソル２（商品名）等がある。
【００１２】
本発明において「試料」とは、還元難消化性デキストリンが含まれている可能性のある試料であれば特に限定されないが、典型的には、水、清涼飲料水、ゼリーなどの食品が挙げられる。本発明の方法はグルコース又はソルビトール、或いはこれらを構成糖とする消化性の多糖を含む食品を試料とする場合においても好適に適用可能である。
【００１３】
本発明の方法は、
（ａ）試料から３糖以上の食物繊維を分取する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維を加水分解する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた加水分解物中のグルコース量とソルビトール量との比率を求め、前記比率に基づいて試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであるかどうかを判定する工程とを含む。
【００１４】
工程（ａ）では、具体的には、試料の中から遊離の単糖、二糖を分離するために、液体クロマトグラフィー等で試料から３糖以上の食物繊維画分を分取する。これにより、遊離の単糖、二糖を含めることなく３糖以上の食物繊維の糖組成に基づき還元難消化性デキストリンであるかどうかを判定することができる。液体クロマトグラフィーで分取する場合に使用するカラムはゲルろ過カラム、サイズ排除＋配位子交換カラム等が好ましい。液体クロマトグラフィーの条件例としては次のものが挙げられる。カラム：三菱化学社製ＭＣｌ（登録商標）ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ（φ８．０ｍｍ×３００ｍｍ）、カラム温度：８０℃、移動相：蒸留水、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、０〜２３分の溶出液を食物繊維画分として分取。
【００１５】
工程（ｂ）では、還元難消化性デキストリンの構成糖を測定する目的で、前記工程（ａ）で分取した３糖以上の食物繊維を単糖に加水分解する。分解率が低いと構成糖の比に影響を与えるので、３糖以上の食物繊維の９７重量％以上が単糖に分解されることが望ましい。また、加水分解は１〜２Ｎの塩酸、硫酸又はトリフルオロ酢酸を用いた酸加水分解が好ましい。酸加水分解は、９０〜１１０℃の温度で行う場合が好ましく、加熱時間は２〜６時間が好ましい。
【００１６】
工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で得られた加水分解物中のグルコース量とソルビトール量との比率を求める。具体的には、加水分解後の食物繊維画分中のグルコース濃度とソルビトール濃度を測定し、その比率を求める。各濃度は、液体クロマトグラフィーにより測定できる。液体クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、アミノ基結合カラム、サイズ排除＋配位子交換カラム等が適している。
【００１７】
加水分解後の食物繊維画分中のグルコース濃度とソルビトール濃度の比率に基づく還元難消化性デキストリンの定性は、次のように行うことができる。例えば、試料が特許文献１に記載の平均分子量１０００〜３０００の難消化性デキストリンを添加したものである場合には、次の計算式により（ｙ）が５．５〜１６．７であるときには、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定することができる。また、試料が平均分子量１３００〜２５００の難消化性デキストリンを添加したものである場合には、次の計算式により（ｙ）が６．６〜１２．８であるときには、試料中の難消化性デキストリンが還元難消化性デキストリンであると判定することができる。
（ｙ）＝［加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）／｛加水分解物中のソルビトール濃度（ｗ／ｖ）＋加水分解物中のグルコース濃度（ｗ／ｖ）｝］×１００
ここで、平均分子量と（ｙ）値との関係について説明する。（ｙ）値は還元難消化性デキストリンの「全構成糖に対するソルビトールの割合」（％）を意味し、式１．１が成り立つ。
【００１８】
（式１．１）
（ｙ）＝「全構成糖に対するソルビトールの割合」（％）
＝［ソルビトール重量／（ソルビトール重量＋グルコース重量）］×１００
＝［｛１８２×（ソルビトールｍｏｌ数）｝／｛１８２×（ソルビトールｍｏｌ数）＋１８０×（グルコースｍｏｌ数）｝］×１００
式１．１ではグルコースの分子量を１８０、ソルビトールの分子量を１８２とした。
【００１９】
還元難消化性デキストリンは末端のみがソルビトールであり、その他の構成糖はグルコースである。よって、式１．１におけるグルコースｍｏｌ数、ソルビトールｍｏｌ数は、ソルビトールｍｏｌ数：グルコースｍｏｌ数＝１：平均重合度−１という関係式で表すことができる。
【００２０】
平均重合度（Ｄｐｎ）は、下記の計算式で表される。
（式１．２）
平均重合度（Ｄｐｎ）＝｛平均分子量（Ｍｎ）−１８２｝／１６２＋１
式１．２では水が１分子脱水されたグルコースの分子量を１６２、ソルビトールの分子量を１８２とした。
【００２１】
本明細書では、還元性難消化性デキストリンが、平均分子量１０００〜３０００、１３００〜２５００の時の「全構成糖に対するソルビトールの割合」（ｙ）を以下のような手順で計算した。
【００２２】
（Ｉ）式１．２により、還元性難消化性デキストリンが、平均分子量１０００〜３０００、１３００〜２５００の時の平均重合度を計算する。
（ＩＩ）式１．１において、ソルビトールｍｏｌ数＝１、グルコースｍｏｌ数＝平均重合度−１を代入して、「全構成糖に対するソルビトールの割合（％）」（ｙ）の計算を行う。
計算結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
0004570572.tif 000002
【００２４】
よって、還元性難消化性デキストリンの分子量が１０００〜３０００の時、（ｙ）（「全構成糖に対するソルビトールの割合（％）」）は、５．５〜１６．７と計算される。
【００２５】
また、還元性難消化性デキストリンの分子量が１３００〜２５００の時、（ｙ）（「全構成糖に対するソルビトールの割合（％）」）は、６．６〜１２．８と計算される。
【００２６】
なお試料中の難消化性デキストリンの平均分子量は、例えば特許文献１の段落００１６に記載の方法により測定することができる。すなわち、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーを行い、数平均分子量を測定することができる。
【００２７】
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ，Ｇ３０００ＰＷＸＬ，Ｇ６０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
検出器：示差屈折率計
カラム温度：８０℃
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
移動相：蒸留水
サンプル量：１重量％、１００μｌ
【００２８】
分子量計算はマルチステーションＧＰＣ−８０２０（東ソー社製）を用いて、プルラン標準品（分子量既知）、およびマルトトリオース、グルコースより求めた検量線から、次式Ｍｎ＝ΣＨｉ／Σ（Ｈｉ／Ｍｉ）×ＱＦ（Ｍｎ：数平均分子量、Ｈｉ：ピーク高さ、Ｍｉ：プルランの分子量、ＱＦ：Ｑファクター（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ係数））により数平均分子量を求める。
【００２９】
本発明の方法は、工程（ａ）の前に、１種以上の消化酵素を用いて試料を消化する工程を更に含むことができる。この工程は、判別しようとする試料の、消化酵素で消化されない食物繊維からなる部分と、消化されて二糖、単糖に分解される部分とを分離することを目的とする。この工程では、消化酵素として、食物繊維の定量法として一般的である「プロスキー法」で用いられる酵素である熱安定性α‐アミラーゼ、プロテアーゼ及びアミログルコシターゼを組み合せて用いることが好ましい。
【００３０】
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲には限定されない。
【実施例１】
【００３１】
１．試料
「食物せんいのおいしい水」（商品名、ハウス食品株式会社製）
還元難消化性デキストリンであるファイバーソル２Ｈ（商品名、松谷化学工業株式会社製）が添加されている。
【００３２】
２．分析方法
「食物せんいのおいしい水」より食物繊維画分を分離後、塩酸分解した試料で測定された、全構成糖（グルコース＋ソルビトール）に対するソルビトール（還元末端）の割合をもとに、還元難消化性デキストリンであることを確認した。消化酵素の反応条件等は、低分子水溶性食物繊維を含む食品に適用される酵素−ＨＰＬＣ法（「栄養表示基準における栄養成分等の分析方法等について」、平成１１年４月２６日衛新第１３号、８食物繊維）を準用して行った。
【００３３】
（１）機器
ロータリーエバポレータ−、オイルバス、
HPLC分析装置（高圧定量ポンプ、カラムオーブン、屈折率検出器）、
食物繊維画分分離用カラム（三菱化学社製  ＭＣｌ（登録商標）ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  φ８．０ｍｍ×３００ｍｍ（サイズ排除＋配位子交換カラム））
糖測定用カラム（三菱化学社製  ＭＣｌ（登録商標）  ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  φ８．０ｍｍ×３００ｍｍ（サイズ排除＋配位子交換カラム））、
充填イオン交換樹脂（オルガノ社製：アンバーライトＩＲＡ−６７、アンバーライト２００Ｃ）
【００３４】
（２）試薬
塩酸、水酸化ナトリウム、ソルビトール、グルコース、熱安定性αアミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ。
【００３５】
（３）試験溶液等の調製
（ａ）検量線用標準液の作製
グルコース２．３５％、ソルビトール０．２３５％それぞれを含む溶液を作成し、３．３倍、２倍、１．２５倍に希釈した。原液、希釈液合わせて４種の濃度の標準液を調整した。
（ｂ）脱塩カラムの準備
イオン交換樹脂、アンバーライトＩＲＡ６７とアンバーライト２００Ｃを１：１で混合したもの５０ｍｌをカラム（φ２０ｍｍ×３００ｍｍガラス管）に充填した。
【００３６】
（４）試験試料
「食物せんいのおいしい水」１０ｇを秤量した。
【００３７】
（５）「食物せんいのおいしい水」酵素処理液の作製
試料をビーカーに入れ０．０８ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液５０ｍｌを加えた。酵素−ＨＰＬＣ法に従って、熱安定性α−アミラーゼによる消化、プロテアーゼによる消化、アミログルコシダーゼによる消化を行った。アミログルコシダーゼによる消化を終了した溶液を沸騰水浴中で１０分間加熱した後、蒸留水で１００ｍｌへ定容した。
【００３８】
次いで、このうちの５０ｍｌを脱塩カラムに５０ｍｌ／ｈｒの速度で通液した。さらに蒸留水を通液してカラム内を洗浄し、洗液と併せて２００ｍｌとした。この脱塩カラム処理により無機塩類、蛋白質、有機酸などの電荷をもった不純物が除かれた。
脱塩カラム処理した試験溶液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固し、０．５ｍｌの蒸留水に溶解させ、食物繊維分取前酵素処理液とした。
【００３９】
（６）食物繊維画分のＨＰＬＣによる分取
上記食物繊維分取前酵素処理液を下記の条件でＨＰＬＣに供し、食物繊維画分を分取した。
ＨＰＬＣへの一回の注入量は３０μｌとし、０〜２３分の溶出液を３糖以上の食物繊維画分として分取した。
これを５回繰り返し、各々の溶出液を合わせロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固し、５ｍｌの蒸留水に溶解させた。これを食物繊維分取後酵素処理液とした。
＜ＨＰＬＣ分取操作条件＞
カラム      ：三菱化学社製  ＭＣｌ（登録商標）ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ（φ８．０ｍｍ×３００ｍｍ）
カラム温度  ：８０℃
移動相      ：蒸留水
流速        ：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量      ：３０μｌ
検出器      ：示差屈折計
【００４０】
（７）食物繊維画分の塩酸分解
食物繊維分取後酵素処理液を試験管に入れ、塩酸を０．５ｍｌ加えた。１００℃のオイルバスで３時間加熱し、室温に冷却後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和した。イオン交換樹脂（５０ｍｌ）を詰めたカラムに５０ｍｌ／ｈｒで通液した後、蒸留水１００ｍｌを通液し脱塩した。カラム溶出液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固し、０．５ｍｌの蒸留水に溶解させた。これを塩酸分解食物繊維画分溶液とした。
【００４１】
（８）食物繊維画分の構成糖の測定
塩酸分解食物繊維画分溶液と検量線用標準を下記条件でＨＰＬＣにより測定した。グルコースとソルビトールそれぞれにおいて、横軸に濃度、縦軸に面積をとり検量線を作成し、塩酸分解食物繊維画分溶液のグルコース濃度とソルビトール濃度を求めた。
＜ＨＰＬＣ分析操作条件＞
カラム      ：三菱化学社製  ＭＣｌ（登録商標）ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ（φ８．０ｍｍ×３００ｍｍ）
カラム温度  ：８０℃
移動相      ：蒸留水
流速        ：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
注入量      ：１０μｌ
検出器      ：示差屈折計
【００４２】
（９）全構成糖に対するソルビトールの割合（重量％）
ＨＰＬＣ分析で測定された糖濃度をもとに、下記計算式により求めた。
全構成糖に対するソルビトールの割合（重量％）＝［ソルビトール濃度（ｍｇ／ｍｌ）／｛ソルビトール濃度（ｍｇ／ｍｌ）＋グルコース濃度（ｍｇ／ｍｌ）｝］×１００
【００４３】
（１０）同定
全構成糖に対するソルビトールの割合が６．６〜１２．８重量％の場合、還元難消化性デキストリンであると判断した。
【００４４】
３．結果
食物繊維分取前酵素処理液（上記（５）終了後の段階）のＨＰＬＣ分析チャートを図１ａに示す。食物繊維分取後酵素処理液（上記（６）終了後の段階）のＨＰＬＣ分析チャートを図１ｂに示す。
【００４５】
塩酸分解食物繊維画分溶液の糖分析チャートを図２に示す。
図２のチャート上において、グルコースピーク面積（相対値）は６５１９．０５であり、ソルビトールピーク面積（相対値）は４６４．４４９であった。
【００４６】
グルコース濃度とピーク面積値の関係を表２に、表２のデータに基く検量線を図３ａにそれぞれ示す。図３ａに示す検量線から、塩酸分解食物繊維画分溶液中のグルコース濃度は１２．０４ｍｇ／ｍｌと算出された。
【００４７】
【表２】
0004570572.tif 000003
【００４８】
ソルビトール濃度とピーク面積値の関係を表３に、表３のデータに基く検量線を図３ｂにそれぞれ示す。図３ｂに示す検量線から、塩酸分解食物繊維画分溶液中のソルビトール濃度は０．９０７５ｍｇ／ｍｌと算出された。
【００４９】
【表３】
0004570572.tif 000004
【００５０】
よって、上記（９）に示す式から、全構成糖に対するソルビトールの割合は７．０１重量％と算出された。
【００５１】
全構成糖に対するソルビトールの割合が６．６〜１２．８重量％の範囲内である。よって、試験検体中の食物繊維（難消化性デキストリン）画分は還元難消化性デキストリンと判断した。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１ａ】実施例１における食物繊維分取前酵素処理液のＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【図１ｂ】実施例１における食物繊維分取後酵素処理液のＨＰＬＣ分析チャートを示す。
【図２】実施例１における塩酸分解食物繊維画分溶液の糖分析チャートを示す。
【図３ａ】グルコース濃度とピーク面積値との関係から導かれる検量線を示す。
【図３ｂ】ソルビトール濃度とピーク面積値との関係から導かれる検量線を示す。
【図１ａ】
0004570572.tif 000005
【図１ｂ】
0004570572.tif 000006
【図２】
0004570572.tif 000007
【図３ａ】
0004570572.tif 000008
【図３ｂ】
0004570572.tif 000009