(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有するトピラメート類似体。
0004435305.tif 000027
（式中、Ｒ1及びＲ2の一方はＨであり、もう一方はＲ−Ｙであり、Ｒは連結基であり、Ｙは免疫原性キャリヤ又はアミノ基を有する標識であり、ＸはＨ又はアルキル基である。）。
【請求項２】
該キャリヤがウシ血清アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニンからなる群より選ばれる、請求項１記載のトピラメート類似体。
【請求項３】
請求項１又は２記載のトピラメート類似体を免疫原として使用して誘導された抗トピラメート抗体。
【請求項４】
該抗体がポリクローナル抗体である、請求項３記載の抗トピラメート抗体。
【請求項５】
該抗体がモノクローナル抗体である請求項３記載の抗トピラメート抗体。
【請求項６】
該抗体が、トピラメートのスルファメート部分で誘導されたトピラメート類似体と反応する、請求項３記載の抗トピラメート抗体。
【請求項７】
下記の成分を含むトピラメートを分析する免疫分析キット。
ａ．請求項３記載の抗トピラメート抗体；及び
ｂ．請求項１又は２記載のトピラメート類似体。
【請求項８】
Ｒ2がＲ−Ｙである、請求項７記載の免疫分析キット。
【請求項９】
Ｒ−Ｙが（ＣＨ2）nＣＯ−ＮＨ−（標識）（ここで、ｎ＝１〜９）である、請求項７記載の免疫分析キット。
【請求項１０】
該標識が蛍光色素である、請求項７記載の免疫分析キット。
【請求項１１】
試料中のトピラメートを分析する方法であって、
ａ）該試料と、請求項１又は２記載のトピラメート類似体と請求項３記載の抗トピラメート抗体とを混合する工程；
ｂ）該試料中のトピラメート量を示すものとして該トピラメート類似体に結合した抗体量を求める工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
該トピラメート類似体が蛍光色素で標識される、請求項11記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、トピラメートのイムノアッセイ、免疫原とトレーサーとして有用なトピラメート類似体、及びイムノアッセイにおいて有用な抗トピラメート抗体に関するものである。
関連技術の説明
トピラメート（２，３：４，５−ビス−Ｏ−（１−メチルエチリデン）−β−Ｄ−フルクトピラノーススルファメート）は、けいれん性の病気の臨床治療において有用であることが示されてきた、最近開発された抗癲癇薬である。治療薬剤の血液レベルを追跡することは、治療を続け、患者の安全を保証するための通常のプラクティスである。組織又は体液中の薬剤の定量は、薬物動態学的研究及び患者のコンプライアンスを追跡することにおいても重要である。従って、患者の試料、特に血漿及び血清中のトピラメートの濃度を定量するための分析法が必要である。
現在、トピラメートの測定に利用できる２つの分析法がある。両方ともガスクロマトグラフィーを利用する。１つは、炎イオン化検出と連結されるガスクロマトグラフィーを使用し、２つ目は、質量分光法と連結されるガスクロマトグラフィーを使用する。これらの方法は、時間を消費し、特殊な装置、高度に熟練した分析者、及び広範囲にわたる試料の調製を必要とし、かつ高価である。また、これらの方法は、小児科の検査においては、トピラメートの濃度が異常に高くない限り利用できないほど多量の試料を必要とする。要するに、トピラメートのための現存の方法は、典型的な臨床化学研究所又は病院の研究所での通常の利用には適していない。
イムノアッセイは、２０年以上の間、臨床研究所又は病院で、治療薬剤の血清又は血漿レベルを追跡するために使用されてきた。イムノアッセイのいくつかの利点は、このような定量法は、正確であり、感度が高く、多くの市販のアッセイフォーマットにおいて、使用し易いということである。トピラメートを測定するためのイムノアッセイは、患者の試料中の薬剤レベルを定期的に測定するために使用できる分析法として有効であることは確かである。しかしながら、薬剤と反応する抗体を産生する免疫原を発現させるための巨大分子（タンパク質のような）に接合するのに適した薬剤類似体を作ることは、困難若しくは不可能である。しばしば、免疫原を生成するのに必要な誘導は、産生された抗体が、薬剤ではなく、その類似体を認識するように、その薬剤を完全に変えてしまうことがある。従って、タンパク質に接合するのに適し、類似体と薬剤の両方を認識する抗体を産生する類似体を調製することが、イムノアッセイを発展させるために要望されている。
発明の概要
本発明は、連結基を含有するように誘導されるトピラメート類似体を提供する。一実施態様においては、トピラメート類似体は、標識に接合され、トレーサーとして作用するトピラメート類似体を生成する。他の実施態様においては、トピラメート類似体は、キャリヤーに接合され、免疫原として作用するトピラメート類似体を生成する。一実施態様におけるトピラメート類似体は、次式で表される。
0004435305.tif 000002
式中、Ｒ1とＲ2のうち一方は、Ｈである。他方は、Ｒ−Ｙである。Ｒは、連結基で、Ｙは、キャリヤー又は標識である。Ｒ1がＨの場合は、ＸはＨである。Ｒ1がＨでない場合は、ＸはＨ又はアルキル基である。他の実施態様においては、トピラメート類似体は、次式で表される。
0004435305.tif 000003
式中、Ｒ3はＲ’−Ｙである。Ｒ’は、トピラメートのスルファメート基のＮが環の一員である複素環基を含有する連結基である。Ｙは、キャリヤー又は標識である。
また、本発明は、この発明の免疫原を使用して産生される抗トピラメート抗体を提供する。本発明のトピラメートのイムノアッセイ法は、試料中のトピラメートと抗トピラメート抗体のための本発明のトレーサーとの競合に基づいている。一実施態様においては、イムノアッセイは、蛍光分極イムノアッセイである。また、イムノアッセイキットも提供される。
発明の詳細な説明
本発明は、トピラメートの新規な類似体を提供する。一実施態様においては、トピラメート類似体は、免疫原又はトレーサーとして使用できるトピラメート類似体を生成するために、それぞれ、キャリヤー又は標識との接合を促進するための連結基を含有するように誘導される。キャリヤーを含有するトピラメート類似体は、その類似体と反応し、トピラメートと反応する抗体を産生する。標識を含有するトピラメート類似体は、競合的なイムノアッセイ構成において、トレーサーとして使用することができる。また、抗トピラメート抗体及び本発明の試薬を使用するトピラメートのためのイムノアッセイも提供される。
トピラメート類似体
本発明のトピラメート類似体は、キャリヤー又は標識のトピラメート類似体との結合を促進する化学的部位を含有するように誘導されたトピラメートである。本発明のトピラメート類似体は、トピラメートのスルファメート部位、９−炭素のメチル基、又は機能的に等価な１０−炭素のメチル基において誘導される（炭素の番号及びスルファメート部位の位置を示すトピラメートの構造は、下表１に示されている。）。便宜上後述するトピラメートの９−炭素についての議論で、等価な１０−炭素の位置と称することについても理解される。スルファメート部位を誘導することは、９−炭素メチル基を誘導することよりも有利である。なぜなら、抗体産生及び抗体認識に利用できるトピラメート類似体の部分は、トピラメート代謝生成物９−ヒドロキシ−トピラメート（表１参照）における部分とは異なるからである。このように、トピラメートのスルファメート部位による連結基とキャリヤーとの接合が、９−ヒドロキシ−トピラメートとの最少の交差反応活性で抗体を引き出すことのできる免疫原を生成する。
スルファメート部位又は９−炭素メチル基におけるトピラメートの誘導は、類似体によって産生された抗体が、類似体及びトピラメートの双方と反応するトピラメートと、免疫学的に十分類似するトピラメート類似体を提供する。従って、本発明のキャリヤーを含有するトピラメート類似体は、抗トピラメート抗体を産生することができる。さらに、トピラメート類似体は、以下にさらに詳しく述べるように、イムノアッセイにおけるトレーサーとして利用するために標識されうる。
本発明のトピラメート類似体の２つの一般式は、以下に示される。
0004435305.tif 000004
式中、Ｒ1とＲ2のうち一方は、Ｈである。他方は、連結基である。Ｒ1がＨの場合は、ＸはＨである。Ｒ1がＨでない場合は、ＸはＨ又はアルキル基である。
0004435305.tif 000005
式中、Ｒ3は、トピラメートのスルファメート基のＮが環の一員である複素環基を含有する連結基である。
周知のように、薬剤又は他のハプテンは、ハプテンがキャリヤー又は標識と結合することを促進する化学的部位を有する連結基を含有するように誘導されうる。ハプテンから免疫原及び／又はトレーサーを調製するための連結基は周知であり、例えば、米国特許第5,051,361号（Stengleinらに、1991年９月24日に発行された）及び、Wong,S.のChemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Florida（1991）に記載されている。接合のための連結基において好適な化学的部位は、カルボキシ、アミノ、イミノ、アミド、カルボニル、ノンオキソカルボニル、アジド、ホスホニウム、チオ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、スルホニルオキシ、ヒドロキシフェニル、イミダゾリル、マレイミド、及び同様のその他の飽和又は不飽和の基を含む。このような連結基は、このような連結基を担持するハプテン類似体を合成するための種々の化学的性質として周知である。いくつかの実施態様においては、以下にさらに詳しく述べるように、連結基は、トピラメート前駆体と反応することができ、連結基と結合したトピラメート（１又は１以上の水素が存在する）が生成される。
連結基は、３０個までの炭素原子と、酸素、イオウ、窒素、及びハロゲンより選択されたヘテロ原子を０〜１０個含有しうる。一般的に、連結基は、水素以外の１〜１５個の原子、さらに通常は、水素以外の１〜１０個の原子から成る。より長い連結アームは、トピラメート分子からより離れたところで、標識又はキャリヤーと結合する必要がある場合に、利用されうる。
Ｘが、アルキル基の場合は、そのアルキル基は、通常は１〜５個、さらに通常は、１〜３個、最も通常は、１〜２個の炭素を有する。Ｘがアルキル基であるトピラメート類似体を生成するためには、トピラメート前駆体を使うと都合がよい。特に、MaryanoffらのJ.Med.Chem.30:880-887（1987）に記載されているように、トピラメートの酸塩化物前駆体（ジイソプロピリデンフルクトピラノースクロロスルフェート）を調製し、アルキル−アミンと反応させて、Ｎ−アルキル−トピラメート類似体を生成しうる。酸塩化物は、簡単には、次のように調製することができる。塩化メチレン（100ml）に塩化スルフリル（93ml、1.15モル）を加えた溶液を塩化メチレン（400ml）とピリジン（150ml）にジアセトンフルクトース（150g、0.58モル）を加えた冷溶液（-35℃）に、滴下して加え、反応混合物を生成する。この反応混合物を攪拌し、室温まで暖める。その反応混合物を、さらに２時間攪拌する。溶媒を減圧下除去して、酸塩化物トピラメート前駆体を生成する。
そして、酸塩化物前駆体は、アルキル−アミンと反応して、Ｘがアルキル基であるトピラメート類似体を生成しうる。さらに具体的には、酸塩化物前駆体は、メチルアミン、６−アミノカプロン酸、Ｎ−メチル−グリシン、又はＮ−エチル−グリシンのようなアルキルアミンと反応して、Ｘがアルキル基であるトピラメート類似体を生成しうる。例えば、MaryanoffらのJ.Med.Chem.30:880-887（（1987）に記載されているように、トピラメートの酸塩化物前駆体は、メチルアミンと反応してＮ−メチル−トピラメートを生成しうる。上述のように調製した酸塩化物前駆体（35g、0.10モル）を無水アセトニトリル（150ml）に溶解し、メチルアミンを加える。得られた反応混合物を３日間密閉しておき、そして、溶媒を減圧下除去する。得られたシロップを液体クロマトグラフィー（シリカゲルのドライカラム、エチルアセテート／ヘキサン、４：１）にかけると、薄層クロマトグラフィー及び3ＨのＮＭＲによって均一である明黄色のシロップ（4.1g、12％）が生じる。同様の方法を、他のＮ−アルキルトピラメート類似体を生成するために、他のアルキルアミンに使用できる。
連結基は、トピラメートのスルファメート基のＮが環の一員である複素環基を含有しうる。複素環基は、閉環構造で、通常は、５又は６員環であり、環の１又は１以上の原子が炭素以外のものである。好適な典型的複素環基は、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、又はモルホリンである。
複素環基を生成するためには、通常、トピラメート前駆体が使用される。特に、トピラメートの酸塩化物前駆体は、複素環と反応して、複素環トピラメート類似体を生成しうる。
トピラメート類似体の連結基は、脱離基を含有しうる。脱離基は、トピラメート類似体が標識又はキャリヤーに接合するときに作用する化学的部位である。接合プロセスの一部として、脱離基の１又は１以上の原子が捨てられる。さらに、標識又はキャリヤーが接合すると、一般的に、脱離基が変化し、その変化に伴って生じる残基を、接合体の連結基が含有することになる。ここで、便宜上、用語「連結基」は、トピラメート類似体を生成するためにトピラメートに結合された連結基、及び標識若しくはキャリヤーとの接合に伴って生じる連結基の残基を意味する。
ここで例示されるいくつかの実施態様においては、トピラメートは、類似体を標識又はキャリヤーと結合させるために使用されるカルボキル基を含有する連結基を有して誘導される。典型的な接合プロセスにおいては、トピラメート類似体のカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応して活性なエステルを生成する。その活性なエステルが、アミノ基と反応して、トピラメート類似体接合体（複合体）を生成する。アミノ基は、フルオレセイン若しくはビオチン誘導体のような小さい分子の中又はウシの血清アルブミン若しくはアルカリ属ホスファターゼのようなタンパク質のような巨大分子の中に存在しうる。接合体が、キャリヤー又は標識を含有する場合は、トピラメート類似体は、それぞれ、免疫原又はトレーサーとして用いることができる。
ここで記載されているトピラメート類似体は、接合プロセスに関与するカルボキシル基を有するものが例示されているが、接合に関与しうる他の化学的部位は周知であり、かつ、適用できる。例えば、トピラメートのアミン誘導体又はチオール誘導体は、本技術の当業者に周知の方法を使って、キャリヤー又は標識に結合されうる。典型的なトピラメート類似体が、これら化合物の構造とともに、以下の表１にリストされている。化合物番号５の９−ヒドロキシ−トピラメートは、公知のトピラメート代謝生成物である。
0004435305.tif 000006
0004435305.tif 000007
本発明のトピラメート類似体は、標準的な化学合成法を用いて調製した。類似体２〜４を生成する典型的な方法は、実施例１〜３において詳細に記載されている。トピラメート及びいくつかのトピラメート類似体の調製は、MaryanoffらのJ.Med.Chem.30:880-887（1987）に記載されている出発原料を使用することができる。さらに、トピラメートは、Ortho/McNeil Pharmaceuticalsによって、商品名TOPAMAXで市販されている。
また、本発明のトピラメート類似体は、キャリヤー又は標識と結合して、それぞれ、免疫原又はトレーサーを生成するトピラメートを含む。本発明の免疫原においては、連結基を含有するトピラメート類似体は、キャリヤーと接合する。本発明のトレーサーにおいては、連結基を含有するトピラメート類似体は、標識と接合する。これらのトピラメート類似体は、以下に示す２つの一般式で表すことができる。
0004435305.tif 000008
式中、Ｒ1とＲ2のうち一方は、Ｈである。他方は、Ｒ−Ｙである。Ｒは、連結基で、Ｙは、キャリヤー又は標識である。Ｒ1がＨの場合は、ＸはＨである。Ｒ1がＨでない場合は、Ｘは、Ｈ又はアルキル基である。
他の実施態様においては、トピラメート類似体は、次式で表される。
0004435305.tif 000009
式中、Ｒ3はＲ’−Ｙである。Ｒ’は、トピラメートのスルファメート基のＮが環の一員である複素環基を含有する連結基である。Ｙは、キャリヤー又は標識である。
本発明の免疫原は、キャリヤーを含有するトピラメート類似体である。ここで、用語「キャリヤー」は、技術上、選択された宿主動物において免疫原性物質を意味するのと同様に使用されている。キャリヤーにハプテンを結合させて免疫原を調製することは、周知である。キャリヤー及び投与経路の選択は、宿主動物によって変わる。キャリヤーは、一般的に巨大分子、通常は、ポリマー、最も通常は、宿主動物以外の種から得られる巨大タンパク質である。ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）及びキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、及びヒツジに抗体を産生するためのキャリヤーとして、しばしば使用される。抗トピラメート抗体を産生するための免疫原性トピラメート類似体の典型的な調製は、実施例に記載されている。その典型的な免疫原の調製においては、Ｒ−Ｙは、（ＣＨ2）nＣＯ−ＮＨ−（キャリヤー）であり、ｎは、１〜９である。さらに具体的には、ｎが１又は５で、ＢＳＡが典型的なキャリヤーである実施例がある。
ここで、用語「トレーサー」は、技術上、競合的なイムノアッセイ法において使用される標識された分析用類似体を意味するのと同様に使用されている。本発明のトレーサーは、連結基によってトピラメートに結合する標識を含有するトピラメート類似体である。ここで、用語「標識」は、直接的に又は間接的に検知しうる物質を意味する。直接的に検知しうる標識は、例えば、放射性核種又は蛍光色素を含む。また１又は１以上の反応を経て間接的に検知しうる標識もある。このような標識は、着色生成物の生成によって検知される酵素を含む。このような酵素標識及びその着色の改良システムは周知である。他のこのような標識は、ビオチン／アビジンのように特異的な結合対を一員として使用することを含む。イムノアッセイ法において使用するのに適した標識は周知であり、例えば、酵素、放射線核種、蛍光色素、ビオチン等を含む。標識は、蛍光色素が、便利である。
好適な蛍光色素は、ローダミン（例えば、テトラメチルローダミンイソチオシアネート−ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、テキサスレッド（Molecular Probes,Eugene OR）を含み、好ましくは、フルオレセインである。アロフィコシアニン及びフィコエリトリンは、蛍光色素に適しているが、これらは、大きすぎるので、蛍光分極イムノアッセイのためには使用されない。好適なフルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−（アミノエチル）−チオウレイド−フルオレセイン（ＦＴＥＤ）、フルオレセイン−チオセミカルバジド（ＦＴＳＣ）、（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレセイン（ＦＡＭＣＯ−Ｅ）、エリトロシン（テトラ−ヨード−フルオロセイン）、及びフルオレセインアミン（ＦＡＭ）を含む。
蛍光色素は、蛍光色素核上の可能などの位置でも連結基と結合しうる。５−、６−、４’−、及び５’−位に結合された連結基からなるフルオレセイン標識が好ましい。５−及び／又は６−位に結合された標識が最も好ましい。（例えば、表２のトレーサー４〜１０を見よ。）
便宜上、フルオレセイン部位の５−位において連結基と結合しているフルオレセイン残基を有するトレーサーは、異性体Ｉと称される。フルオレセイン部位の６−位において連結基と結合しているフルオレセイン残基を有するトレーサーは、異性体IIと称される。特に言及しない場合は、異性体又は異性体の混合物とを区別しない。フルオレセイン及びローダミンで標識されたトレーサーは、蛍光の測定の間、ラクトンの形では、ほとんど又は全く存在せず、カルボキシル化された形で主に塩として存在する。フルオレセインは、均一な組成物又は異性体の混合物であってもよい。さらに、蛍光色素は、蛍光色素がイムノアッセイにおいて、イオン化状態で存在できるように、ラクトンの形で又は生物学的に許容される塩（例えば、Ｎａ、Ｋ、アンモニウム類の塩）として使用できる。
下表２は、実施例に記載されているように調製されたトピラメート類似体免疫原及びトレーサーを示す。これらは、表１に示されている典型的なトピラメート類似体から誘導された。免疫原及びトレーサーの調製においては、表１のトピラメート類似体が、標準的な方法で活性化され、カルボン酸基によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが生成された。この活性なエステルが、キャリヤー又は標識中の一級アミンと順次反応して、アミドが生成された。
換言すれば、カルボン酸は、技術的に公知の他の方法を使って、アミンと縮合しうる。カルボン酸のアミド生成の合成法は周知であり、例えば、米国特許第5,051,361号（Stengleinらに、1991年９月24日に発行された）に記載されている。また、免疫原性接合体の製造方法は、Methods in Immunology and Immunochemistry,（Curtis A.Williams and Merrill W.Chase eds.,Volume 1,1967）に記載されている。これらの文献は、引用文献として、その全体が本明細書に組み入れられている。さらに、トレーサー又は免疫原として有用な典型的なトピラメート類似体の典型的な製造方法が、実施例に詳細に記載されている。免疫原及びトレーサーとして有用な典型的なトピラメート類似体が、これら化合物の構造とともに、以下の表２にリストされている。
0004435305.tif 000010
0004435305.tif 000011
0004435305.tif 000012
0004435305.tif 000013
0004435305.tif 000014
抗トピラメート抗体
本発明の抗トピラメート抗体は、トピラメート及び抗体を誘導するために用いられるトピラメート類似体と反応する。抗トピラメート抗体は、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水等の水溶液中で処方される又はアジュバント又は類似の組成物中に供給される本発明の免疫原を用いて誘導される。本組成物がトピラメートに特異的であるかを求めるために誘導した抗体が試験される。
ポリクローナル抗トピラメート抗体組成物が所望の特異性を示さない（例えば、高レベルの代謝物含む試料用トピラメート代謝物と許容しえないレベルの交差反応性を有する）場合には、下記に詳述されるように、該抗体は低レベルの代謝物を含む試料を分析するために用いられ、代謝物との交差反応性が関係しない方法にも用いられる。
モノクローナル抗トピラメート抗体は、常法で調製される。マウスに、本発明の免疫原を含む組成物及び得られた脾臓細胞を注射する。脾臓細胞は、ハイブリドーマを調製するために融合パートナーと融合することができる。ハイブリドーマによって分泌された抗体は、抗体がトピラメートと反応するハイブリドーマを選択するためにスクリーニングされる。便利には、９−ヒドロキシトピラメートのようなトピラメート代謝物と最少の反応を示す抗体がスクリーニングされる。所望の特異性の抗体を生じるハイブリドーマを標準法によって培養する。ハイブリドーマ調製法及び培養法は、周知であり、本発明の一部を構成しない。
モノクローナル抗トピラメート抗体及びポリクローナル抗トピラメート抗体の具体的な調製は、実施例に記載される。ほとんどの患者試料においては、単一トピラメート代謝物が試料中に少量（通常４％未満）の濃度のトピラメートで存在することは留意される。しかしながら、数種の代謝物が存在することがあり、正常な患者においては薬剤量の２０％まで及び代謝が亢進した患者又は腎不全のような医療問題のある患者においては５０％まで集合体で存在することがある。
少量のトピラメート代謝物を含む試料中の正確な免疫分析値を得るのに抗トピラメート抗体と代謝物との交差反応性はほとんど重要でないが、抗トピラメート抗体はトピラメート代謝物と実質的に交差反応しないことが好ましい。“実質的に交差反応しない”とは、抗体が競合免疫分析形式に用いられる場合にトピラメートと同量の抗体阻害を得るため少なくとも約５倍以上の９−ヒドロキシトピラメートを必要とすることを意味する。
免疫分析（イムノアッセイ）
体液中に薬剤又は他の小分子のようなハプテンを検出する多くの定量的免疫分析形式は既知である。トピラメートの分析法は、次の要素を含む。該方法は、試料と抗トピラメート抗体とを混合する工程及び試料中のトピラメート量を表す抗トピラメート抗体−トピラメート複合体量を検出する工程が含まれる。トピラメートが検出される具体的な方法は、該方法が所望の感度及び信頼度を得る限り本発明の目的に重要ではない。免疫分析を行う種々の方法がTijssen,P.,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,（R.H.Burdon & P.H.van Kniffeberg eds.,Vol.15,1985）;The Immunoassay Handbook,（David Wild ed.,1994）に記載されている。
トピラメート免疫分析用試料は、体液、通常は血液、更に詳しくは血清又は血漿である。しかしながら、尿又は唾液のような他の体液の使用も企図される。
様々なプロトコールや標識を用いる多くの異なる種類の免疫分析が周知である。分析条件及び試薬は、従来技術に見られる種類のいずれでもよい。分析は、不均質又は均質であってもよく、便利には競合分析とする。トピラメートのスルファメート部分或いはトピラメートの９−炭素メチル基で誘導されたトピラメート類似体を認識する抗体の誘導によって示されるように、トピラメートは抗体認識できる少なくとも２種類の異なるエピトープがある。しかしながら、他の小分子とのようにある抗体がトピラメート又はトピラメート類似体に結合する場合、第２抗体によってトピラメートの認識が遮断され、２つの抗体が被検体に対する２つのエピトープに結合する従来のサンドイッチ型免疫分析の使用が除外される。
トピラメート免疫分析は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体としてもよい抗トピラメート抗体を使用する。便利には、分析は競合に基づき、試料中のトピラメートが本発明の所定量のトピラメートトレーサーと競合する。競合分析に必要なトレーサー量は、多くの周知の要因によって変動する。例えば、トレーサーが蛍光色素で標識される場合、分析に必要とされるトレーサー量は経験的に求められる。トレーサーの使用量は、バックグラウンドシグナルに関して用いられる検出器に適切なシグナルを与えなければならずかつトレーサー及び試料中に存在するトピラメートの範囲に対する抗トピラメート抗体の親和性が所望の感度を与えるようなトレーサー量を与えなければならない。
競合免疫分析においては、使用される抗体標品はトレーサーとして用いたトピラメート類似体と同じ位置で誘導されたトピラメート類似体を含む免疫原によって誘導される。即ち、抗体組成物及びトレーサーを誘導するために用いられる免疫原は共にトピラメートのスルファメート部分或いは９−炭素メチル基で誘導されたトピラメート類似体が含まれる。
抗体と試料中のトピラメート間の結合は、多くの方法で求められる。例えば、試料中に存在するトピラメートは抗トピラメート抗体結合部位の所定量の標識トピラメート類似体（トレーサー）と競合することができる。固相に付着したトレーサー量又は溶液中に残存するトレーサー量が求められる。実施態様においては、固相付着アビジンに結合することによりビオチンで標識したトレーサーが固相に付着する。試料中のトピラメートは、抗トピラメート抗体の固相付着トピラメートトレーサーと競合する。固相に付着した又は溶液中に残存する標識抗トピラメート抗体が検出される。抗トピラメート抗体は、直接標識されるか又は抗トピラメート抗体の種類に特異的な標識第２抗体を用いて検出される。
多くの他の形式も用いられる。例えば、抗トピラメート抗体は付着した固相とすることができる。所定量の特異的トレーサーは、抗体結合について試料中のトピラメートと競合することができる。固相付着トレーサー又は溶液中に残存するトレーサーの量が求められる。トレーサーは、放射性核種、蛍光色素等とのように直接に又は酵素とのように間接に検出される標識をもつことができる。また、トピラメートトレーサーはビオチンで標識され、酵素標識アビジン又はアビジン標識抗体で検出される。アビジン標識抗体は、直接標識されるか又は標識第２抗体で検出される。
他の実施態様においては、免疫分析は、患者の試料中のトピラメートを測定する蛍光偏光免疫分析である。便利には、蛍光偏光免疫分析は、臨床化学実験室や病院内での薬剤モニタリング用に設計されたTDx▲Ｒ▼及びTDxFlx▲Ｒ▼アナライザーのような自動装置で用いられる。
蛍光分極免疫分析は、分子量（典型的には５０００未満）の小さい蛍光的に標識されたトレーサーを用いる。トレーサーは、平面偏光の入射ビーム内に配置される。光が吸収され、蛍光として再発光される。小分子のブラウン運動が急速なために発光蛍光が偏光解消する。トレーサーのサイズが大きいと回転時間が非常に増加し、偏光したままの発光した蛍光を生じる。従って、フルオレセイン標識トレーサーへの抗体の結合は発光した光の偏光を引き起こす。試料中の被検体は、抗体結合に対してトレーサーと競合し、よって蛍光の偏光解消を増大させる。偏光解消の程度は、試料中の被検体の濃度による。従って、蛍光の偏光解消量が被検体の増加濃度と相関する競合免疫分析の標準曲線が調製される。
トピラメートを分析する試薬は、キット中に便利に包装される。トピラメートを分析する免疫分析キットは、抗トピラメート抗体及び本発明のトピラメート類似体トレーサーが含まれる。
個々の実施例であるが限定されない下記の実施例によって本発明を更に具体的に説明する。特にことわらない限り、温度は℃で示され、濃度は重量％として示される。実施するために構成的に縮小される手順は現在時制で記載され、実験室で行われた手順は過去時制で示される。上記明細書及び下記の実施例での引用は全て、本願明細書に含まれるものとする。
実施例１
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメートの調製
例示的な手順として、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート（トピラメートグリシン類似体、ＴＧＡ）は、以下に示すようにトピラメートから調製した（Maryanoffら、J.Med.Chem.、30、880〜887頁、1987年）。
トピラメート33.9ｇ（0.1mol）、ヘキサメチルジシラザン16.1g（0.1mol）、及びクロロトリメチルシラン約1mlをテトラヒドロフラン150mlに加えて溶液を得た。溶液を、５時間還流し、室温まで冷却した。攪拌しながら、80％ＮａＨの3.0g（0.1mol）を、約10分間にわたって少しずつ（portion-wise）加えて反応混合物を得た。反応混合物は、非常に濃厚になった。ジメチルホルムアミド20ml及びテトラヒドロフラン100mlを加えて、反応混合物中の沈殿物を溶解させると、反応混合物は、均質な溶液になった。その後、ｔ−ブチル−ブロモアセテート19.5g（0.1mol）を、30分間、反応混合物に滴下法で加えた。反応混合物を、終夜攪拌した。反応混合物を、酢酸エチル500mlで希釈し、水洗し（２×100ml）、塩水（水にＮａＣｌを飽和）で飽和し（100ml）、乾燥し（ＭｇＳＯ4を使用）、溶媒は、真空中で除去し、ｔ−ブチルグリシネート類似体粗生成物を粘着性の白色固体として得た。ｔ−ブチルグリシネート類似体を含むこの粗固体を、シリカゲルクロマトグラフィにかけ、18％酢酸エチル／ヘキサン（v/v）を溶出剤として溶出し、白色固体のｔ−ブチルグリシネート類似体17.2g（収率38％）を得た。
約9.0g（19.9mmol）のｔ−ブチルグリシネート類似体を室温で攪拌しながら、トリフルオロ酢酸90mlに少しずつ加えて、反応混合物を得た。10分後、反応混合物を、ろ過して少量の不溶物質を除去し、溶媒を真空中で除去して粗製のグリシン類似体を濃厚油状物として得た。この油状物は、1NのＮａＯＨ150mlで希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した（２×50ml）。水層を、3NのＨＣｌでｐＨ３に酸性化し、メチレンクロライドで抽出した（３×100ml）。混合した有機抽出物を真空中で濃縮して、白色気泡のグリシン類似体6.68ｇ（収率84％）を得た。
グリシン類似体（6.0ｇ、15.1mmol）を、13.6mlの1.0NＮａＯＨ中に溶解した。水を、真空中で除去し、得られた残留物を、トルエンを使って共沸的に乾燥して白色固体の粗製のナトリウムグリシネート４を得た。この白色固体をジエチルエーテル（２×50ml）で粉砕し、得られた固体を、真空ろ過して単離し、ナトリウムグリシネート水和物（Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート）5.3g（収率80％）を得た。Ｎ−カルボキシメチル−トピラメートの融点は、169.0℃から170.0℃である。元素分析で計算したＮ−カルボキシメチル−トピラメート（Ｃ14Ｈ22ＮＯ10ＳＮａ・Ｈ2Ｏ）は、Ｃ、38.44；Ｈ、5.53；Ｎ、3.20；Ｓ、5.26；Ｎａ、5.26である。元素分析で計算したＮ−カルボキシメチル−トピラメート類似体は、Ｃ、38.27；Ｈ、5.59；Ｎ、3.08；Ｓ、5.50；Ｎａ、5.50である。Ｈ2Ｏ（KF）％は4.12％である（KFは、含水量を、Karl Fischer法で測定し、かつ％w/wで表したものを示す）。
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート（ＴＧＡ）は、ナトリウム塩一水和物として得られ、これは、以下の実施例において、免疫原、トレーサー、及びビオチン結合を調製するために使用する。
実施例２
Ｎ−（５−カルボキシメチル）−トピラメート（ＴＣＡ）の調製
例示的な手順として、Ｎ−（５−カルボキシメチル）−トピラメート（トピラメートカプロン酸類似体、ＴＧＡ）を、以下に示すように2,3:4,5−ビス−Ｏ−（１−メチルエチリジン）クロロ硫酸塩から調製した（Maryanoffら、J.Med.Chem.、30、880〜887頁、1987年）。
2,3:4,5−ビス−Ｏ−（１−メチルエチリジン）クロロ硫酸塩（35.8g、0.10mol）のメタノール溶液（200ml）を、6−アミノカプロン酸（26.2g、0.20mol）、及びピリジン（7.91g、0.10mol）のメタノール溶液（300ml）にゆっくりと2.25時間にわたって滴下法で加え、混合物を得た。溶液を、２．５時間加熱還流し、減圧下で濃縮して赤橙色の油状物を得た。この油状物を、蒸留水（300ml）、酢酸エチル（200ml）に溶解し、4MのＮａＯＨ溶液でｐＨ１０〜１２に塩基化した。この油層は分離され、水層は、副産物であるジアセトンフルクトースが除去されるまで酢酸エチルで繰り返し抽出された（１２×200ml）。その後、水層を、濃ＨＣｌでｐＨ５．０に酸性化し、酢酸エチルで抽出した（４×150ml）。有機抽出物を混合し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、粗生成物の19.5％中に油状のカプロン酸誘導体を得た。
この油状物を２−プロパノール（230ml）に溶解し、４M NaOH溶液（13ml）で処理して反応混合物を得た。この反応混合物を濃縮し、得られる固体を、室温でISOPAR E（高沸点炭化水素、EXXON Corporationから入手可能）を用いて終夜スラリー化した。スラリーをろ過し、回収した固体を、ISOPAR Eで洗浄した。空気乾燥を、白色固体で融点が197.0〜202.0℃のカプロン酸ナトリウム類似体（Ｎ−（5−カルボキシペンチル）−トピラメート）23.64g（収率97.5％）を得た。元素分析で計算したＣ18Ｈ30ＮＯ10ＳＮａは、Ｃ、45.47；Ｈ、6.36；Ｎ、2.95；Ｓ、6.74；Ｎａ、4.83である。元素分析で計算したこの類似体は、Ｃ、44.87；Ｈ、6.31；Ｎ、2.89；Ｓ、6.44；Ｎａ、5.08である。
Ｎ−（5−カルボキシペンチル）−トピラメート（ＴＣＡ）は、以下の実施例において、免疫原及びトレーサーを調製するためのナトリウム塩として使用した。
実施例３
９−カルボキシメチル−トピラメート（９−ＣＭＴ）の調製
例示的な手順として、９−カルボキシメチル−トピラメート（９−ＣＭＴ）（レブリン酸ケタール類似体、ＴＧＡ）は、以下に示すように調製した。
トリエチルオルトギ酸塩（24.6g、0.166mol）は、レブリン酸エチル24.0g（0.166mol）、硫酸0.8ml、無水エタノール300mlを含む攪拌した溶液に加え、反応混合物を得た。反応混合物を30分、室温で攪拌した後、16.4g（0.055mol）の2,3−Ｏ−（1−メチルエチリジン）−Ｂ−Ｄ−フルクトピラノーススルファメート（Maryanoffら、J.Med.Chem.、30、880〜887頁、1987年）を加え、攪拌を16〜18時間続けた。固体炭酸ナトリウム（80.0g、0.75mol）を、反応混合物に続いて蒸留水（100ml）に加え、ｐＨ７．０を有する反応混合物を得た。反応混合物をろ過し、酢酸エチル（約500ml）で希釈した。この層を分離し、有機層を塩化ナトリウム飽和溶液洗浄し（３×200ml）、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮してケタール、少量のジオール、及びレブリン酸エチルの混合物である油状物を得た。油状物を、過剰のレブリン酸エチルが除去されるまでヘキセンで繰り返し粉砕し、その後、油状物をメタノール125mlに溶解して、メタノール溶液を得た。1NのＮａＯＨ（250〜300ml）をこのメタノール溶液に加え、得られる反応混合物を約２時間加熱還流した。室温まで冷却後、反応混合物を、酢酸エチルで抽出した（３×100ml）。水層を、3NのＨＣｌでｐＨ4.0に酸性化し、酢酸エチルで抽出した（３×100ml）。有機抽出物を混合し、終夜乾燥し（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、濃縮して、白色脆性気泡で融点42.0〜45.0℃のレブリン酸ケタール誘導体（９−カルボキシメチル−トピラメート）15.7g（収率71.8％）を得た。元素分析で計算したＣ14Ｈ23ＮＯ10Ｓは、Ｃ、42.31；Ｈ、5.83；Ｎ、3.52；Ｓ、8.07である。元素分析の実測値は、Ｃ、42.55；Ｈ、5.83；Ｎ、3.38；Ｓ、7.57である。
９−カルボキシメチル−トピラメート（９−ＣＭＴ）は、以下の実施例において、免疫原及びトレーサーを調製するための遊離酸として使用した。
実施例４
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原の調製
本実施例は、本発明の例示的な免疫原の調製において、実施例１の記述で調製されたＮ−カルボキシメチル−トピラメートが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合してＮ−カルボキシメチル−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原（ＴＧＡ：ＢＳＡ）を得るものについて記述する。
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート103mgとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）34.9mgのジメチルアセトアミド溶液１mlを、氷冷メタノール浴で冷却し、3.15Mのジシクロヘキシルカルボジイミド（ジメチルアセトアミド中）で処理して反応混合物を得た。反応混合物を、氷冷メタノール浴上で15分間攪拌し、ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を更に50μｌ加えた。攪拌を、反応混合物が、ゆっくりと室温になる間、続けた。その後、攪拌を、室温で終夜続けた。
終夜攪拌した後、反応混合物中に得られる活性エステルを、ウシ血清アルブミンに結合した。ウシ血清アルブミンを、結合に使用する前に、脱イオン水中、G-25 SEPHADEXカラムクロマトグラフィで脱塩する。あらかじめ脱塩したウシ血清アルブミン109mgの水溶液の全量15mlを、氷冷メタノール浴で冷却した。活性エステルを含む反応混合物を、５％Ｋ2ＣＯ3をｐＨが安定化するまで加えて（約１時間）ｐＨ８から９に維持して、攪拌しながらウシ血清アルブミン溶液に滴下法で加えた。
その後、得られる反応混合物を、終夜４℃に維持し、固体を遠心分離法で除去した。結合体を含む得られる上澄み液を、0.8μmポリカーボネート膜を通してろ過し、2.5×41cmのG-25 SEPHADEXカラムのクロマトグラフィにかけ、0.15M ＮａＣｌを含む0.01Mのリン酸カリウムでｐＨ7.4に平衡しかつ溶出した。全量97mg（タンパク質として）のこの結合物（複合体）を、最終生成物中に得た。結合物を凍結保存した。
本実施例及び後に続く実施例において、免疫原のタンパク質濃度を、市販ビュレット分析により、又はウシ血清アルブミンの1mg/ml溶液が、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で280nm、光路1cmで0.67の吸光度を示すと仮定することにより測定した。
実施例５
９−カルボキシメチル−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原の調製
本実施例は、本発明のもう一つの例示的な免疫原の調製において、実施例３の記述から調製した９−カルボキシメチル−トピラメートが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合して９−カルボキシメチル−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原（９−ＣＭＴ：ＢＳＡ）を得るものについて記述する。
９−カルボキシメチル−トピラメート206mgとＮ−ヒドロキシスクシンイミド70mgを、2mlのジメチルアセトアミドに溶解して反応混合物を得た。反応混合物を、氷冷メタノール浴で冷却し、ジメチルアセトアミド中、3.15Mのジシクロヘキシルカルボジイミド200μlを加えた。反応混合物を、氷冷メタノール浴上で15分間攪拌し、その後、更に3.15Mジシクロヘキシルカルボジイミド溶液100μｌを加えた。反応混合物を更に10分間、氷冷メタノール浴上で攪拌し、0.025molのピリジンを加えた。反応混合物を含む容器を、浴から取り除き、外界温度で数分間攪拌し、その後、-10℃で終夜保存した。翌日、反応混合物を、ウシ血清アルブミン溶液（G-25SEPHADEXカラムを使ってあらかじめ脱塩した）200mgを攪拌しながら氷浴中で加えた。反応混合物のｐＨを、ｐＨが安定化するまで５％Ｋ2ＣＯ3を加えてｐＨ８から９に維持した。その後、反応混合物を室温で終夜攪拌した。後日、固体を遠心分離法で除去し、上澄み液を、0.2μmフィルターでろ過して浄化溶液を得た。この溶液を、0.15M ＮａＣｌを含む10mMのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰｉ）でｐＨ7.4に平衡したG-25 SEPHADEXカラムで脱塩した。タンパク質の生成量は、189mgだった。９−ＣＭＴ：ＢＳＡ結合物を、凍結保存した。
実施例６
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原の調製
本実施例は、本発明のもう一つの例示的な免疫原の調製において、実施例２の記述から調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメートが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合してＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：ウシ血清アルブミン免疫原（ＴＣＡ：ＢＳＡ）を得るものについて記述する。
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメートのナトリウム塩250mgを、2mlのジメチルアセトアミドに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのナトリウム塩100mgを加えて反応混合物を得、この反応混合物を10分間室温で攪拌した。ジメチルアセトアミド中、3.15Mジシクロヘキシルカルボジイミド200μlを加え、反応混合物を30分間室温で攪拌した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド50mgを、3.15Mジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を100μl加えた後に反応混合物に加えた。反応混合物を、更に10分間攪拌し、0.025molのピリジンを加えた。その後、反応混合物を終夜室温で攪拌し、活性エステルを得た。
翌日、活性エステルを含む反応混合物を、攪拌しながら、ウシ血清アルブミン200mgの水溶液（使用する前に水のG-25SEPHADEXカラムクロマトグラフィで脱塩した）全量20mlを氷浴中で滴下法で加えた。反応混合物のｐＨを、５％Ｋ2ＣＯ3をｐＨが安定化するまで（約２時間）加えて、ｐＨ８から９に維持した。得られる懸濁液を終夜４℃で保存した。不溶性物質を0.2μmポリカーボネート膜でろ過して除去し、浄化溶液を得た。この浄化溶液を、0.15M ＮａＣｌを含む、10mMＫＰｉでｐＨ7.4に平衡したG-25 SEPHADEXカラムのクロマトグラフィにかけた。ＴＣＡ：ＢＳＡの最終生成量は、189mgだった。
実施例７
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＧＡ：ＦＴＥＤトレーサー）として有用な、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインの調製を記述する。
実施例１の記述から調製したＮ−カルボキシメチル−トピラメート22mgを、ジメチルアセトアミド200μlに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド20mgと1Mのジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）100μl（100μmol）を加えて反応混合物を得た。この反応混合物を、90分間室温で攪拌し、活性エステルを得た（ＴＧＡ：ＮＯＳ）。
ＭｅＯＨ2mlと1NＮａＯＨ0.1mlを試験管に加えた。（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセイン（ＦＴＥＤ）（Pourfarzenehら、Clinical Chemistry、26、730項、1980年の記載から調製）21.6mgを、メタノール溶液に溶解し、続いて活性ＴＧＡ：ＮＯＳエステルを含む反応混合物に加えた。沈殿物は、1NＮａＯＨの４×50μl分量を加えて再溶解して得た。得られる反応混合物のｐＨは、８．５だった。その後、反応混合物を、30分間室温で攪拌した。ｐＨを、1NＮａＯＨをｐＨが安定化するまで（約１時間）必要に応じて更に加えて、ｐＨ７．５から８．５に維持した。反応混合物の試料は、その後１時間、長くても４時間クロマトグラフィで除去した。
得られるＮ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインを、以下に記述するように、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水（4+4+1）中、シリカゲル（SGF−250）薄層クロマトグラフィの後、ＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（25+75+2）中、逆相（RPF−250）薄層クロマトグラフィで精製した。
本実施例中、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を、254nmで吸収する蛍光指示薬を含むシリカゲルプレートを使用して実施した。プレートは、250μm（SGF-250とする）又は1000μm（SGF-1000とする）の厚さだった。254nmで吸収する蛍光指示薬を含むC-18逆相シリカゲルプレートは、厚さ250μm（RPF-250とする）だった。薄層クロマトグラフィ溶媒系、シリカ及び逆相カラムクロマトグラフィ溶媒系は、すべて体積／体積組成で表現される。一定の化合物を、化合物の吸収（254nm又は366nm）又は種々のスプレー指示薬を用いてＴＬＣプレートに可視化した。多くの蛍光誘導体及び有色化合物は、処理なしでも見ることができた。
精製したトレーサー（Ｎ−アシルアミドフルオレッセイン）の近似の濃度を、0.05M炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した溶液に対し、最大吸収を示す波長（490〜500nm、スキャニングして測定）での67000のモル吸光係数から仮定し、かつ1cm光路長で読んで測定した。本実施例中、有機溶媒中のｐＨ測定を、含水ｐＨ紙で行った。
実施例８
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：フルオレッセイン−チオセミカルバジドの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＧＡ：ＦＴＳＣトレーサー）として有用な、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：フルオレッセイン−チオセミカルバジドの調製を記述する。
実施例１で記述したように調製したＮ−カルボキシメチル−トピラメート22.8mgを、ジメチルアセトアミド0.25mlに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド14.8mgを加えた後、1Mのジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）0.1mlを加えて反応混合物を得た。この反応混合物を、終夜室温で攪拌し、活性エステルを得た。
フルオレッセイン  チオセミカルバジド（10mg、Sigma Chemical Companyから入手）を、（ＭｅＯＨ0.1ml＋1N ＮａＯＨ0.05ml）に溶解し、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメートの活性エステルを含む反応混合物に加えた。反応混合物を、15分間攪拌し、その時に10％トリエチルアミン（ＭｅＯＨ中）0.05mlを加え、攪拌を室温で更に２時間続けてＮ−カルボキシメチル−トピラメート：フルオレッセイン−チオセミカルバジドを得た。このＮ−カルボキシメチル−トピラメート：フルオレッセイン−チオセミカルバジドを、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／Ｈ2Ｏ（4+4+1）溶液中のシリカゲルプレート（SGF−250）連続薄層クロマトグラフィ工程の後、ＭｅＯＨ／水／トリエチルアミン（20+80+1）溶液系中の逆相プレート（RPF−250）で精製した。
実施例９
（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、以下の実施例で記載したようなトピラメート類似体と結合した（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセイン（ＦＡＭＣＯ−Ｅ）の精製について記述する。
ＦＡＭＣＯ−Ｅを調製するために、フルオレッセインアミン異性体Ｉ3.25gを、ジメチルアセトアミド17.5mlに溶解し、2.5gの1,1’−カルボニルジイミダゾールを加え、反応混合物を得た。（フルオレッセインの異性体Ｉ及びIIは、フルオレッセイン環の５又は６位の置換基を有するものとして定義される。他言しない限り、全てのフルオレッセイン誘導体の記述は、異性体Ｉ誘導体である。しかしながら、異性体II又はＩとIIの混合物は、適したリガンド試薬を調製するために使用される。）反応混合物を、３時間、室温で攪拌した。エチレンジアミン5mlを、１リットルフラスコ中のメチレンクロライド500mlに加え、エチレンジアミン溶液を得、この溶液を氷冷メタノール浴で冷却した。1,1’−カルボニルジイミダゾール／フルオレッセインアミン反応混合物を、その後、勢いよく攪拌しながら冷却したエチレンジアミン溶液に滴下法で加えた。橙色沈殿物が生じた。反応混合物を、終夜室温で攪拌した。橙色沈殿物をブフナーロートで集め、メチレンクロライド、メチレンクロライド／アセトン／ＭｅＯＨ（100+10+1v/v）、そしてメチレンクロライドで連続的に大規模洗浄した。洗浄した沈殿生成物を乾燥し、アセトン中で乾燥し、ろ過し、石油エーテルで洗浄し、粗粉末を空気乾燥した。ＭｅＯＨ5ml及び１５M ＮＨ4ＯＨ0.15mlを、その乾燥粗粉末0.5042gに加え、透明深赤色溶液を得た。この溶液を攪拌しながら滴下法で、体積200倍のＭｅＯＨ／水／酢酸（10+90+1v/v）に加えた。いくらか沈殿を生じた。不溶性の物質を集め、ＭｅＯＨ／15M ＮＨ4ＯＨ（100+2v/v）に溶解し、再度、攪拌しながら滴下法で容積200のＭｅＯＨ／水／酢酸（10+90+1v/v）に加えた。この沈殿物を集め、廃棄した。たまったＭｅＯＨ／水／酢酸の溶液を浄化するためにろ過し、ＭｅＯＨ／水／酢酸（10+90+1v/v）で平衡化したカラムの低圧C18逆相クロマトグラフィにかけた。ＦＡＭＣＯ−Ｅは、カラムに結合し、ＭｅＯＨ／水／酢酸（15+85+1）で溶出した。溶出したＦＡＭＣＯ−Ｅを、7.5%メタノール洗浄工程（酢酸除去のため）を溶出前に行い、溶出をメタノール（100％）で行った他は、同一条件下、C18カラム上で再循環して濃縮した。溶出したＦＡＭＣＯ−Ｅを含む画分を貯蔵し、十分なトリエチルアミンを加えてｐＨを８から９にした。精製したＦＡＭＣＯ−Ｅを、メタノール溶液として-10℃で保存した。
実施例１０
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＧＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）として有用な、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製を記述する。
実施例１の記述により調製したＮ−カルボキシメチル−トピラメート10mgとＮ−ヒドロキシスクシンイミド5mgを、ジエメルアセトアミド0.2mlに溶解した。1Mのジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）0.05mlを加え、得られる反応混合物を2.5時間攪拌し、活性エステルを得た。活性エステルを含む反応混合物0.1mlを、実施例９の記載から調製した（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセイン（ＦＡＭＣＯ−Ｅ）溶液0.5mlに加えた。15分後、トリエチルアミン5μlをｐＨ８から９に維持するために加えた。反応混合物を、６０分室温でインキュベートした。得られるＮ−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインを、その後、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水（4+4+1）溶液系中のシリカゲル（SGF-250）連続薄層クロマトグラフィ工程、及びＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（20+80+2）溶液系中の逆相薄層クロマトグラフィで精製した。
実施例１１
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：グリシル−フルオレッセインアミンの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＧＡ：Ｇｌｙ−ＦＡＭトレーサー）として有用な、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：グリシル−フルオレッセインアミンの調製を記述する。
アミノアセトアミド−フルオレッセイン（Molecular Probes,Inc.、Eugene、Oregon）5mgを、ジメチルアセトアミド0.1mlに溶解した。実施例１０の記述から調製したＮ−カルボキシメチル−トピラメートの活性エステル0.15mlを加え、得られる反応を、１時間室温で行った。ｐＨを、少量のトリエチルアミンを加えてｐＨ6.5から８に維持した。得られるＮ−カルボキシメチル−トピラメート：グリシル−フルオレッセインアミンを、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水（4+4+1）溶液系中のシリカゲル（SGF-250）連続薄層クロマトグラフィ工程、及びＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（20+80+2）溶液系中の逆相（RPF-250）薄層クロマトグラフィで精製した。
実施例１２
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＣＡ：ＦＴＥＤトレーサー）として有用な、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインの調製を記述する。
実施例２の記述から調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメートのナトリウム塩250mgを、ジメチルアセトアミド2mlに加えた。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドのナトリウム塩0.1gを加え、得られる反応混合物を10分間攪拌し、3.15Mジシクロヘキシルカルボジイミド（ジメチルアセトアミド中）0.2mlを加えた。反応混合物を30分間攪拌し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド0.05gと3.15Mジシクロヘキシルカルボジイミド（ジメチルアセトアミド中）0.1mlを連続的に加えた。さらに10分攪拌した後、ピリジン0.025mlを加え、反応混合物を終夜室温で攪拌して活性エステルを得た。過剰の（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセイン（ＮａＯＨアルカリ性のメタノール中）を、活性エステルを含む反応混合物0.5mlを加えた。反応は、30分間室温で行った。得られるＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−チオウレイド−フルオレッセインを、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水（4+4+1）溶液系中のシリカゲル（SGF-250）薄層クロマトグラフィ、及びＭｅＯＨ／水／15MＮＨ4ＯＨ（27.5+72.5+2）溶液系中の逆相薄層クロマトグラフィの連続工程で精製した。
実施例１３
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）として有用な、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製を記述する。
実施例２の記述から調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメートのナトリウム塩473mgを、ジメチルアセトアミド5mlに加えて反応混合物を得た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド399mgを加え、反応混合物を５分間室温で攪拌し、その後５分間氷浴中で攪拌しながら冷却した。1Mジシクロヘキシルジカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）1mlを加え、反応混合物を１５分間氷浴上で攪拌し、その後終夜室温で攪拌した。
実施例９の記述から調製した、ＦＡＭＣＯ−Ｅ0.108mmolを含むＭｅＯＨ20mlを、反応混合物に加えた。ｐＨを、少量のトリエチルアミンを加えてｐＨ８から９に維持した。反応を、２時間室温で行い、ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを得、その後、反応混合物を、９倍の0.5％ＮＨ4ＯＨ（0.075M）で希釈し、ＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（10+90+0.5）で平衡化した低圧C18 HPLC吸着剤カラム（20g）を適用した。このカラムをカラム容量の約10倍のＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（10+90+0.5）で洗浄して混入物を除去し、その後、ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを、ＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（15+85+0.5）で溶出した。ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを、同様の条件下、C18クロマトグラフィで濃縮したが、溶出は、メタノール／トリエチルアミン（10+0.04v/v）で行った。その後、ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーは、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／水（4+4+1）溶液系中のシリカゲル（SGF-1000）プレート薄層クロマトグラフィで精製し、この中でトレーサーは約0.6のＲfを示した。トレーサーバンドをメタノール／トリエチルアミン（10+0.04）でシリカプレートから溶出し、溶液のｐＨをトリエチルアミンでｐＨ８から９に調節し、トレーサーを-10℃で保存した。
実施例１４
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセイン異性体IIの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー異性体II）として有用な、Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセイン異性体IIの調製を記述する。
本実施例で使用したＦＡＭＣＯ−Ｅ異性体IIを、フルオレッセイン異性体II（６−アミノフルオセッセイン）を、フルオレッセイン異性体Ｉ（５−アミノフルオセッセイン）の代わりに合成で使用し、粗粉体を、メタノール水／15M ＮＨ4ＯＨ（10+90+2）溶液系を用いた逆相プレート薄層クロマトグラフィで精製したことを除き、ＦＡＭＣＯ−Ｅ異性体Ｉの調製について実施例９に記述した方法により合成しかつ精製した。ＦＡＭＣＯ−Ｅを、メタノール溶液として-10℃で保存した。
実施例２の記述から調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）−トピラメートのナトリウム塩25mgを、ジメチルアセトアミド0.25mlに加えて反応混合物を得た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド10mgを加えた。反応混合物を、攪拌し、氷浴中で冷却し、1Mジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）0.05mlに加えた。反応混合物を、３０分以上氷浴上で攪拌し、その後２時間室温で攪拌した。過剰のＦＡＭＣＯ−Ｅ（異性体II）溶液を加え、反応を、１時間室温で、ｐＨをトリエチルアミンを必要に応じて加えて７以上に維持して行った。反応混合物を１時間外界温度でインキュベートしてＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー異性体IIを得た。その後、トレーサーを、ＭｅＯＨ／水／15M ＮＨ4ＯＨ（25+75+2）溶液系中の逆相プレート（RPF-250）薄層クロマトグラフィで精製した。
実施例１５
９−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製
本実施例は、フルオレッセンス偏光免疫学的測定法におけるトレーサー（９−ＣＭＴ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）として有用な、９−カルボキシメチル−トピラメート：（２−アミノエチル）−ウレイド−フルオレッセインの調製を記述する。
実施例３の記述から調製した９−カルボキシメチル−トピラメート12.4mgを、ジメチルアセトアミド0.20mlに加えた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド12.9mgを加えた後、1Mジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）0.05mgを加え、反応混合物を室温で2.5時間インキュベートした。過剰のＦＡＭＣＯ−Ｅ（メタノール中）を加えた後、トリエチルアミン（9μl）を加えてｐＨを8.5に調節した。反応混合物を、６０分間室温で攪拌し、その後、1NＮａＯＨ0.05mgを加え、反応混合物を振り混ぜた。更に15分室温でインキュベートした後、1NＨＣｌ0.05mlを加えて最終ｐＨ8.5とし、９−ＣＭＴ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを得た。トレーサーを、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水（50+50+1）溶液系中のシリカゲル（SGF-250）薄層クロマトグラフィ（SGF-250）精製した。
実施例１６
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：５−（（（Ｎ−ビオチノイル）アミノ）ヘキサノール）アミノ）ペンチルアミンの調製
本実施例は、ビオチン−アビジン−基準免疫学的測定法におけるトレーサーとして有用な、Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：５−（（（Ｎ−ビオチノイル）アミノ）ヘキサノール）アミノ）ペンチルアミン結合（ＴＧＡ−Ｒ：ビオチン）の調製を記述する。
Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート（実施例１の記述で調製）9mg、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド3.3mg、５−（（（Ｎ−ビオチノイル）アミノ）ヘキサノール）アミノ）ペンチルアミン（Molecular Probes、Eugene、Oregon）8.4mgを、ジメチルアセトアミド0.3mlに加え、反応混合物を得た。反応混合物を、氷／メタノール浴中で冷却し、1Mジシクロヘキシルカルボジイミド（テトラヒドロフラン中）0.025mlを加えた。反応混合物を数分間氷／メタノール浴上で攪拌し、その後、メタノール0.05mlを加えた。反応混合物を終夜室温でインキュベートした。冷却中、結晶が生成した。反応混合物を-20℃で１時間置き、不溶性物質を遠心分離して除去した。Ｎ−カルボキシメチル−トピラメート：ビオチン誘導体を、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／水（20+80+1）溶液系を用いたシリカゲル（SGF-250）薄層クロマトグラフィで可溶性の画分から精製した。生成物を、ほんの少しのＴＬＣプレートに0.2％ＫＭｎＯ4の1NＨ2ＳＯ4溶液をスプレーして可視化した。適当なバンドを、残りのプレート（可視化のためにスプレーしていない）からこすり取り、シリカからメタノールを用いて溶出した。競合的なアビジン−ビオチンフルオレッセンス偏向分析を使用して、調製中のビオチン濃度（トピラメート結合として）を評価した。濃度を約1.2mMとして評価した。ＴＧＡ−Ｒ：ビオチン結合をメタノール貯蔵溶液として-10℃で貯蔵した。
実施例１７
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：５−（（（Ｎ−ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチルアミン複合体を用いるＥＬＩＳＡ免疫分析
本実施例は、Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：５−（（（Ｎ−ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチルアミン複合体（ＴＧＡ：Ｒ−ビオチン）を用いるトピラメートの具体的なＥＬＩＳＡ免疫分析を記載するものである。
モノクローナル抗トピラメート抗体を産生する７Ｂ１０と称するハイブリドーマ細胞系を、実施例４に記載されるように調製したＮ−カルボキシメチルトピラメート：ＢＳＡ（ＴＧＡ：ＢＳＡ）で免疫したＢａｌｂ／ｃ雌マウスの脾臓細胞から作製した。マウスに、完全フロイントアジュバントに乳化した５０μgのＴＧＡ：ＢＳＡを腹腔内に１回免疫した。その後、マウスに、不完全フロイントアジュバントに乳化した５０μgのＴＧＡ：ＢＳＡを３〜５週間毎に注射して合計５回免疫した。次に、マウスに５０μgのＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：ＢＳＡ（実施例６に記載されたように調製した）を腹腔内に１回追加免疫した。脾臓細胞を用いて融合パートナーとしてＮＳ１マウスミエローマ系を用いてハイブリドーマ細胞系を調製した。下記のＥＬＩＳＡ法を用いてハイブリドーマ培養液中のトピラメート抗体の存在をスクリーニングした。ストレプトアビジンに固定化したＴＧＡ：Ｒ−ビオチンに結合したがストレプトアビジン単独には結合しない抗体を確認のために選択した。スクリーニング結果によって７Ｂ１０細胞系についてクローン化を選択し、サブクローン７Ｂ１０．２及びこのクローン７Ｂ１０．２．１を樹立及び凍結保存した。
ＰＢＳ（０．１５M ＮａＣｌ及び０．０１％チメロサルを含有する０．０１Mリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．４）中０．１μg/mlのストレプトアビジン溶液（Molecular Probes,オレゴン州ユージーン）を調製し、０．１mlのストレプトアビジン溶液をピアスイムノウェアポリスチレンマルチウェルプレートの各ウェルにピペットで分注した。ストレプトアビジン溶液をプレート上で４℃で一晩インキュベートした。他の工程は全て周囲温度で行った。
ウェルを０．１％（v/v）トウィーン20（以後、ＰＢＳ／トゥイーン）を含有するＰＢＳで４回洗浄し、はじいて大部分の液を全て取り除いた。実施例１６に記載されたように調製したＴＧＡ：Ｒ−ビオチンの貯蔵液（メタノール中約１．２mM）をＰＢＳ／トゥイーンで１／５０００に希釈し、０．１mlの希釈ＴＧＡ：Ｒ−ビオチン溶液を全ウェルに加えた。室温で３時間後、ＴＧＡ：Ｒ−ビオチン溶液を吸引し、プレートをＰＢＳ／トゥイーンで４回洗浄した。ＰＢＳ／トゥイーン中のトピラメートの貯蔵溶液を調製して濃度が２０、２００及び２０００ng/mlのトピラメート標準液を得た。トピラメート標準液（０．０５ml）をウェルに加えて最終濃度０、１０、１００及び１０００ng/mlを得た。トピラメート代謝物、９−ヒドロキシトピラメート（Ortho/Mcneil Pharmaceuticals,カタログNo.RJW-38214-000）を一連のウェルに加えて最終濃度１００、１０００及び１０，０００ng/mlを得た。
ハイブリドーマ細胞系７Ｂ１０からの細胞培養液をＰＢＳ／トゥイーンで１／１２８に希釈し、０．０５mlを各ウェルに加えた（最終抗体希釈度1/256）。プレートを周囲温度で２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／トゥイーンで４回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（CALTAG Laboratories,カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）をＰＢＳ／トゥイーンで１／５００に希釈し、各ウェル（０．１ml）に加えた。室温で２時間後、プレートをＰＢＳ／トゥイーンで４回洗浄し、０．１２５M酢酸ナトリウム／０．０７５Mクエン酸バッファー、ｐＨ４．０中２．６mMＨ2Ｏ2を含む０．１mlの０．３１mg/mlテトラメチルベンジジンを加えることにより分析した。４分後、各ウェルに０．１mlの１M硫酸を加えることにより反応を停止した。ダイナテックMR5000プレートリーダーで４５０nmの黄色生産物を読み取った。分析の結果を下記の表３に示す。表中のＢ／Ｂ0は、試験試料の４５０nmにおける吸光度を競合する被検体の存在しないときに得られた吸光度（Ｂ0）で割った比率である。
0004435305.tif 000015
表３に示されるように、トピラメートは１００ng/ml未満で抗体結合を５０％より大きく阻害し、１０，０００ng/mlの代謝物９−ヒドロキシトピラメートにおいては５０％未満の阻害が見られた。分析から、トピラメート代謝物９−ヒドロキシトピラメートに対する７Ｂ１０モノクローナル抗体の交差反応性が１％未満であることが証明された。
実施例１８
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）チオウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとしてＮ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）チオウレイドフルオレセイン（ＴＧＡ：ＦＴＥＤトレーサー）を用いてトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析（ＦＰＩＡ）を記載するものである。本実施例及び次の実施例に用いられる具体的な自動蛍光偏光免疫分析系に続いて実施例に用いられる抗体の調製を下記に述べる。
自動蛍光偏光免疫分析
競合免疫分析形式を用いて自動TDX▲Ｒ▼偏光アナライザー（テキサス州アービングのアボットラボラトリーズ）を用いる蛍光偏光免疫分析を行った。自動分析を行う試薬としては、抗被検体抗体（抗トピラメート抗体）又は“Ａ”、フルオレセイン：トピラメート類似体複合体（トレーサー又は“Ｔ”）、及び前処理バッファー又は“Ｂ”を含めた。実施例に記載された自動分析の検定は、ヒト血清にスパイクした指定濃度のトピラメートを含む６種類の一連の検定物質を用いて得られた。
自動分析は、アボットラボラトリーズ、テキサス州アービングから入手しうる文献に詳細に記載されている。本明細書に記載される実施例は全て、機器の“モード１”ピペット分注順序を用いた。患者試料（ニート血清又は血漿）をTDx▲Ｒ▼用に設計された円形カルーセルのプラスチック試料カップに入れた。カルーセルをＡ、Ｔ及びＢを含む試薬キットと共に機器に入れた。分析の最初のサイクルにおいては、患者試料のTDx Systems▲Ｒ▼バッファーによる前希釈を試料カップの第２ウェルで行い、試料（バッファーで希釈した患者試料）の全容量の１／２を試薬キットからの０．０２５mlの前処理バッファーＢと共に試料キュベット（全量約１ml）に入れる。ブランクの蛍光を読み取る。第２ピペット分注サイクルにおいては、希釈した患者試料の第２容量をキュベットの全量約２mlに０．０２５mlのトレーサー（典型的には０．５〜１０ピコモル／試験管）及び０．０２５mlの抗体と共に加える。反応が完結した後、アナライザーがガラスキュベット中の蛍光偏光を読み取り、その数値をヒト血清中で処方した薬剤（検定物質）の６種の濃度を測定することにより作られた検定曲線と比較する。０．５〜５マイクロリットルの患者血清又は血漿の等価量は、自動分析における典型的な試料サイズである（２mlの全試料容量に加えた）。蛍光偏光は、ミリ偏光単位（mP）で示される。TDx▲Ｒ▼アナライザーは、検定曲線と比較することにより試料中の被検体濃度を自動的に計算する。
実施例においては、免疫分析キット中の抗体試薬（８０×貯蔵溶液）とガラスキュベット中の最終希釈液双方の抗トピラメート抗体希釈液を記載する。実施例においては、免疫分析キット中に存在する試薬の８０×貯蔵溶液としてトレーサー希釈剤と前処理バッファー（Ｂ）を記載する。
ポリクローナルヒツジ抗トピラメート抗体
初回注射用完全フロイントアジュバント及び次回注射用不完全フロイントアジュバント中のエマルジョンとして全ての免疫原を調製した。ヒツジに１mlの免疫原（タンパク質として）を皮下に或いは５０μgの免疫原をリンパ腺に直接免疫した。ヒツジに典型的には３週間毎に注射した。マイクロタイタープレート内のストレプトアビジン上に固定化したＴＧＡ：Ｒ−ビオチンに結合したヒツジ抗体がウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Chemicon International,カリフォルニア州テメキュラ）を用いて検出される以外は上記マウスモノクローナル標品について記載されたＥＬＩＳＡを用いて血清をスクリーニングした。
３匹のヒツジからの抗血清を実施例に用いた。ヒツジを下記のように免疫した。
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ヒツジNo.787由来の３種の抗体標品を実施例に使用した。これらの標品を787-1、787-2及び787-3としてコードする。ヒツジ787を免疫するために用いるＴＧＡ：ＢＳＡを実施例４に記載されるように調製した。ヒツジ662を免疫するために用いられる９−ＣＭＴ：ＢＳＡを実施例５に記載されるように調製した。ヒツジ650を免疫するために用いるＴＣＡ：ＢＳＡを実施例６に記載されるように調製した。
ＴＧＡ：ＦＴＥＤトレーサーを用いる蛍光偏光免疫分析においては、上記のように調製しかつTDx Systems▲Ｒ▼バッファー（０．１M ＫＰｉ、ｐＨ７．５、０．１％アジ化ナトリウム及び０．０１mg/mlウシγグロブリン、ｐＨ７．０〜７．５を含有する）で１／２４（最終濃度1/1920）に希釈したヒツジ抗体No.787-1を用いて検定曲線を作った。トレーサーとして実施例７に記載されたように調製しかつ０．０１M ＫＰｉ、０．１５M ＮａＣｌ、０．１％w/vアジ化ナトリウム、１mg/mlウシγグロブリン、ｐＨ７．４〜７．５に希釈したＴＧＡ：ＦＴＥＤトレーサーを用いた。前処理バッファーは、TDx Systems▲Ｒ▼バッファーとした。検定物質の試料容量は１μlとした。
表４は、６種のトピラメート検定物質を用いて得られた偏光値を示す表である。本表及び次表においては、偏光値をミリ偏光単位で示す。
0004435305.tif 000017
実施例１９
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：フルオレセインチオセミカルバジドを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例８に記載されたように調製したＮ−カルボキシメチルトピラメート：フルオレセインチオセミカルバジド（ＴＧＡ：ＦＴＳＣトレーサー）を用いる具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＧＡ：ＦＴＳＣトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／２４（最終抗体希釈度1/1920）に希釈したヒツジ抗体No.787-1とした。トレーサー希釈剤はTDx Systems▲Ｒ▼バッファーとした。検定物質の試料容量は1.3μlとした。分析の結果を下記表５に示す。
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実施例２０
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例８に記載されたように調製したＮ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイン（ＴＧＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＧＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／８０（最終抗体希釈度1/6400）に希釈した抗体No.787-2とした。分析の結果を下記表６に示す。
0004435305.tif 000019
実施例２１
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：グリシルフルオレセインアミドを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１１に記載されたように調製したＮ−カルボキシメチルトピラメート：グリシルフルオレセインアミド（ＴＧＡ：Ｇｌｙ−ＦＡＭトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＧＡ：Ｇｌｙ−ＦＡＭトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／８０（最終抗体希釈度1/6400）に希釈した抗体No.787-2とした。分析の結果を下記表７に示す。
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実施例２２
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）チオウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１２に記載されたように調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）チオウレイドフルオレセイン（ＴＣＡ：ＦＴＥＤトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＣＡ：ＦＴＥＤトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／１００（最終希釈度1/8000）に希釈した抗体No.787-2とした。トレーサーを０．０１M ＫＰi、ｐＨ７．５、０．１％w/vアジ化ナトリウム、１mg/mlウシγグロブリンで希釈した。分析の結果を下記表８に示す。
0004435305.tif 000021
実施例２３
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１３に記載されたように調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）チオウレイドフルオレセイン（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／９０（最終希釈度1/7200）に希釈した抗体No.787-2とした。トレーサー希釈剤は、TDx Systems▲Ｒ▼バッファーとした。検定物質の試料容量は０．７μlとした。分析の結果を下記表９に示す。
0004435305.tif 000022
実施例２４
Ｎ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイン、異性体ＩＩを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１４に記載されたように調製したＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイン、異性体ＩＩ（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー、異性体ＩＩ）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー、異性体ＩＩを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ０．１M ＫＰi、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４〜７．６で１／６８（最終希釈度1/5440）に希釈した抗体No.787-3とした。トレーサー希釈剤は、０．１M ＫＰi、０．００５％ジオクチルナトリウムスルホスクシネート（ＤＯＳＳ）、０．１％w/vアジ化ナトリウム、１mg/mlウシγグロブリンとした。前処理バッファーは、２０mMＫＰi、ｐＨ４．０、０．１％ＤＯＳＳとした。検定物質の試料容量は１．４μlとした。分析の結果を下記表１０に示す。
0004435305.tif 000023
実施例２５
９−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１３に記載されたように調製した９−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイン（９−ＣＭＴ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行い９−ＣＭＴ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／１０（最終希釈度1/800）に希釈したヒツジ抗体No.662とした。トレーサー希釈剤は、TDx Systems▲Ｒ▼バッファーとした。検定物質の試料容量は５μlとした。分析の結果を下記表１１に示す。
0004435305.tif 000024
実施例２６
Ｎ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫分析
本実施例は、トレーサーとして実施例１０に記載されたように調製したＮ−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイン（ＴＧＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いるトピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析を記載するものである。TDx▲Ｒ▼自動偏光アナライザーを用いて蛍光偏光免疫分析を行いＴＧＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサーを用いて次のことを除き実施例１８に記載されるように検定曲線を作った。本実施例においては、抗体は実施例１８に記載されるように調製しかつ１／１０に希釈した（最終希釈度1/800）抗体No.650とした。トレーサー希釈剤は、TDx Systems▲Ｒ▼バッファーとした。検定物質の試料容量は２μlとした。分析の結果を下記表１２に示す。
0004435305.tif 000025
実施例２７
トピラメートの蛍光偏光免疫分析とガスクロマトグラフィー分析の比較
本実施例は、トピラメートの具体的な蛍光偏光免疫分析の結果とトピラメート治療を受けている患者から得られた１１７個の血漿試料を用いるガスクロマトグラフィー分析との比較を記載するものである。
蛍光偏光免疫分析は、０．１M ＫＰｉ、ｐＨ７．４〜７．６、０．００５％ジオクチルナトリウムスルホスクシネート（ＤＯＳＳ）、０．１％w/vアジ化ナトリウム、１mg/mlウシγグロブリンで希釈したＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイントレーサー（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いた。抗体は、実施例１８に記載されるように調製しかつ０．１％w/vアジ化ナトリウムを含有する０．１M ＫＰi、ｐＨ７．４〜７．６で１／６８（最終希釈度1/5440）に希釈したヒツジ抗体No.787-3を使用した。前処理バッファーは、０．１％ジオクチルナトリウムスルホスクシネート（ＤＯＳＳ）を含有する２０mMＫＰi、ｐＨ４．０とした。試料容量は１．４μlとした。検定曲線は、実施例１８に記載される自動分析を用いてTDx▲Ｒ▼アナライザーで作った。６種の検定物質とヒト血清中０、２、４、８、１６及び３２μg/mlのトピラメートとした。試料を２回の実験で分析し、比較方法のために平均値を用いた。
窒素リン検出によるガスクロマトグラフィーを、Cooper,JM.Stubbs,RJ & Palmer,ME,Pharmaceutical Research 8（10 Suppl.）,s19（1991）に記載されるように行った。この方法は多くを要求しており、感度、精度及び特異的であることがわかった。
試料の２〜３２μg/mlトピラメートの範囲にわたる検定を用いて２つの方法の直接比較を行った。１１７個の患者試料に対する蛍光偏光免疫分析とガスクロマトグラフィーの結果の比較から下記の関係が示された。
（FPIA値）=-0.147+0.985（GC値）r=0.9935
本実施例で証明されるように、本発明の具体的な試薬を用いる蛍光偏光免疫分析は、トピラメートのガスクロマトグラフィー分析法に対して優れた相関を示した。
実施例２８
抗体交差反応性の定量
本実施例は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体組成物とトピラメート代謝生成物９−ヒドロキシトピラメートとの交差反応量の定量を記載するものである。
ヒツジにおいて行われた２つのポリクローナル抗体標品（ヒツジ抗体No.662及び787-3）を実施例１８に記載されるように調製した。ヒツジ抗体No.662及び９−カルボキシメチルトピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイントレーサー（９−ＣＭＴ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）を用いる標準曲線は、実施例２５に記載されるように作られる。その検定曲線を用いてヒト血清中の既知量の９−ヒドロキシトピラメートを分析した。
ヒツジ抗体No.787-3とＮ−（５−カルボキシペンチル）トピラメート：（２−アミノエチル）ウレイドフルオレセイントレーサー（ＴＣＡ：ＦＡＭＣＯ−Ｅトレーサー）の標準曲線を実施例２７に記載されるように作った。その検定曲線を用いてヒト血清中の既知量の９−ヒドロキシトピラメートを分析した。
トピラメートの測定濃度を用いて次のように抗体標品と９−ヒドロキシトピラメートとのの交差反応量を算出した。（％交差反応性）＝（トピラメートの測定濃度μg/ml×１００）／（添加した９−ヒドロキシトピラメート濃度μg/ml）。その分析結果を表１３に示す。
0004435305.tif 000026
本実施例からトピラメート類似体がトピラメートのスルファメート部分で誘導された免疫原を用いる場合に市販の分析において使用するのに十分に特異的であったことが証明される。トピラメート類似体が９−炭素メチル基で誘導された免疫原を用いて調製された抗血清は、９−ヒドロキシトピラメートの量が試料中のトピラメート量に比べて相対的に少ない免疫分析に有用な抗体を示した。