(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
0004588215.tif 000041
を有する本質的に純粋なポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを発現するのに適する組換ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを有する、真核細胞における複製に適するベクター。
【請求項５】
前記ベクターは哺乳類細胞における複製に適する請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
イントロンを含まない請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
イントロンを含まない請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は複製可能なベクターを有する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１記載のポリペプチドの作製方法であって、前記ポリペプチドを発現する請求項８に記載の宿主細胞の培養と、前記ポリペプチドの単離とを有する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により入手可能な、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１又は１０のいずれかに記載のポリペプチドに反応する抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
化合物と、前記ポリペプチドとの接触と、
前記ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性が、前記化合物の不在下における前記ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性と比較して変化するかどうかの測定とを有する方法。
【請求項１３】
前記プロテインキナーゼ活性が減少する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテインキナーゼ活性が増加する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＲＥＢ、ＡＴＦ１、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）又はＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）に結合し、請求項１に記載されたポリペプチドによるＣＲＥＢ、ＡＴＦ１、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）又はＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）のリン酸化を促進又は阻害する化合物を同定する方法であって、
化合物が、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ１、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）若しくはＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）と、請求項１に記載のポリペプチドとの相互作用を促進するか又は阻害するかの測定、又は、この化合物が、請求項１に記載のポリペプチドによる、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ１、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）若しくはＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）のリン酸化を本質的に遮断するかどうかの測定を有する方法。
【請求項１６】
ＭＡＰＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２である相互作用ポリペプチドによる請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性化を遮断する化合物を同定する方法であって、
化合物が、（ａ）請求項１に記載のポリペプチドと、（ｂ）ＭＡＰＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８若しくはＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２である相互作用ポリペプチドとの間の相互作用を促進するか又は阻害するかの測定、又は、この化合物が、ＭＡＰＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８若しくはＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２である相互作用ポリペプチドによる、請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性化を本質的に遮断するかどうかの測定を有する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性化のためのＭＡＰＫ２の使用。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドに相互作用するポリペプチドを同定する方法であって、
１）ａ）請求項１に記載のポリペプチドと、ｂ）このような相互作用ポリペプチドを含有する可能性のある組成物との接触、２）請求項１に記載のポリペプチド及び相互作用ポリペプチドを含有する複合体の存在の検出、３）どの相互作用ポリペプチドが請求項１に記載の前記ポリペプチドに結合するかの同定を有する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を調節する、又は前記ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性化を調節する化合物のスクリーニングアッセイにおける請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドと、請求項１２〜１６及び１８のいずれか一つに記載の方法を実施するための手段とを有するパーツキット。
【請求項２１】
Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ），ＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ），ＣＲＥＢ，ＡＴＦ１、又はＣＲＥＢ若しくはＡＴＦ１融合タンパク質である前記ポリペプチドの基質を有する請求項２０に記載のパーツキット。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性化に有用な、ＭＡＰＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８s２であるタンパク質を有する請求項２０又は請求項２１に記載のパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポリペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの用途、特に二つのキナーゼドメインを有するプロテインキナーゼ（ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーのメンバーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
１０のマイトジェン活性（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーメンバーは哺乳類細胞で同定されてきている（Ｃｏｈｅｎ，１９９７参照）。これらのうちの二つ、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１及びＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、受容体がプロテインチロシンキナーゼであるポリペプチド成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）及び腫瘍促進性（ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）ホルボールエステルにより強く活性化されるが、（ほとんどの細胞環境（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｅｘｔｓ）においては）ストレス刺激（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｔｉｍｕｌｉ）及び炎症サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）によってはほとんど活性化されない。対称的に、他のＭＡＰＫファミリーメンバーは、ストレスシグナル（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌ）及び炎症サイトカインにより強く活性化されるが、（ほとんどの細胞環境においては）ポリペプチド成長因子及びホルボールエステルによりほんの少し活性化されるだけである。この理由から、それらはしばしばストレス活性（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫｓ）と言われる。
【０００３】
この分野の主要な試みは生理的基質とＭＡＰＫｓ及びＳＡＰＫｓのそれぞれの役割を同定することであるが、多くの基質がそれ自身複数の生理的役割を有するプロテインキナーゼであることから問題が生じる。従って、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１及びＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、ＭＡＰＫ活性（ＭＡＰＫ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテインキナーゼ−１ａ，１ｂ及び１ｃ（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃ，またＲＳＫ１／２／３として知られる）として知られる三つの密接に関係するプロテインキナーゼを活性化する（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ等．，１９８８及びＺｈａｏ等１９９５）。一方ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ等．，１９９４；Ｒｏｕｓｅ等．，１９９６）及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等．，１９９６）と名称付けされる二つの密接に関係する酵素を活性化する。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）はＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓのためのインビボでの基質であり、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３はＳＡＰＫ２／ｐ３８のためのインビボでの基質であるということがいくつかの証拠ライン（ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）からわかる。例えば、上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＭＡＰＫキナーゼ−１（ＭＫＫ１）の活性化を阻害することによりＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓの活性化を抑制するドラッグＰＤ９８０５９もまた、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームの活性化を阻害するが（Ａｌｅｓｓｉ等．，１９９５）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の活性化を阻害しない（Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６）。
【０００４】
反対に、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特異的阻害剤であるドラッグＳＢ２０３５８０は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の活性化を阻害する（Ｃｌｕｅｎｄａ等．，１９９５；Ｃｌｉｆｔｏｎ等．，１９９６）。
【０００５】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームは、一つのポリペプチド内に二つのプロテインキナーゼドメインをそれぞれ含んでいる点で異質であり、Ｃ末端キナーゼドメインの一つの役割は、Ｎ末端キナーゼドメインが外因性基質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）をリン酸化できるようにＮ末端キナーゼドメインを活性化することである（Ｂｊｏｒ    ｂａｅｋ等．，１９９５；Ｖｉｋ及びＲｙｄｅｒ，１９９７；Ｄａｌｂｙ等．，１９９８）。ＣＯＳ１細胞においてホルボールエステルに誘導される（Ｔｈｅ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化は六つの残基（Ｓｅｒ２２２，Ｔｈｒ３６０，Ｓｅｒ３６４，Ｓｅｒ３８１，Ｔｈｒ５７４及びＳｅｒ７３７）のリン酸化に付随し、六つの残基のうちの四つ（Ｓｅｒ２２２，Ｓｅｒ３６４，Ｓｅｒ３８１及びＴｈｒ５７４）が活性化に重要である。ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓはＣ末端ドメインのＴｈｒ５７４及び二つのキナーゼドメイン間に位置するＴｈｒ３６０及びＳｅｒ３６４をリン酸化する。Ｔｈｒ５７４のリン酸化はＣ末端ドメインを活性化し、それからＳｅｒ３８１をリン酸化する。Ｓｅｒ２２２もまたリン酸化されるなら、Ｓｅｒ３６４及びＳｅｒ３８１の結合リン酸化（Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）はＮ末端ドメインの活性化を引き起こす（Ｄａｌｂｙ等．，１９９８）。Ｓｅｒ２２２キナーゼの同定は不明確である。
【０００６】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（ＲＳＫ２）遺伝子における突然変異を不活性化することがコフィンローリー症候群（Ｃｏｆｆｉｎ  Ｌｏｗｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ），進行性骨格異常（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）及び厳しい精神遅滞に関係する病気の原因になることから、細胞機能におけるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の重要性が指摘されている（Ｔｒｉｖｉｅｒ等．，１９９６）。しかしながら、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームは多くのタンパク質をインビトロでリン酸化するが、生理的役割はまだ定義付けされていない。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、インビトロで転写因子ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答因子結合タンパク）をリン酸化する、すなわちインビボで活性化を引き起こすと知られる残基（Ｓｅｒ１３３）をリン酸化する（Ｘｉｎｇ等．，１９９６）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂはまた、ＣＲＥＢｔｉｄｅ（Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致する合成ペプチド）に作用する主要なキナーゼであると報告されており、ＣＲＥＢｔｉｄｅはＮＧＦ刺激性（ＮＧＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）ＰＣ  １２細胞から調整されるライゼートで検出できる（Ｇｉｎｔｙ等．，１９９４；Ｘｉｎｇ等．，１９９６）。さらに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードを活性化するとともにＰＤ  ９８０５９により阻害されるシグナルによって、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化が誘導される（Ｐｅｎｄｅ等．，１９９７）。これらのことから、ＣＲＥＢがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の生理的基質となるかもしれないが、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓの“下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）”に存在する別のプロテインキナーゼによりＣＲＥＢがリン酸化されるという可能性は除外されない。
【０００７】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３もまたインビトロにおいてＳｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化する（Ｔａｎ等．，１９９６）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、繊維芽細胞成長因子で刺激化される（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）又は亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）とのインキュベーションによりストレスされる（ｓｔｒｅｓｓｅｄ）ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞から調整されるライゼートで検出される主要なＣＲＥＢｔｉｄｅキナーゼとなる（Ｔａｎ等．，１９９６）。さらに、これら刺激（ｓｔｉｍｕｌｉ）はＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のＳｅｒ１３３のリン酸化を誘導するが、ＳＢ  ２０３５８０によりリン酸化は阻害される（Ｔａｎ等．，１９９６）。これらのことから、ＣＲＥＢはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３の生理的基質になると思われるが、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の“下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）”に存在する別のプロテインキナーゼによりＣＲＥＢがリン酸化されるという可能性はこのデータにより除外されない。
【０００８】
ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１及びＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２はインビボでＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームをリン酸化し（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３をリン酸化しない）、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βはインビボでＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３をリン酸化する（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１をリン酸化しない）。しかしながら、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓ及びＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８両方によりインビトロ及びインビボで活性化され、二つの密接に関係するプロテインキナーゼがより最近になって同定されてきている。これらのことからＭＡＰＫ統合（ＭＡＰＫ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）キナーゼ−１及び−２（ＭＮＫ１，ＭＮＫ２）と名称付けられる（Ｆｕｋｕｎａｇａ及びＨｕｎｔｅｒ，１９９７；Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ等．，１９９７）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３様、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は一つのキナーゼドメインを有する酵素である。ＭＮＫ１の一つの生理的基質は、タンパク合成開始因子（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）ｅｌＦ４Ｅである。インビトロにおいて、ＭＮＫはＳｅｒ２０９でｅｌＦ４Ｅをリン酸化する（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ等．，１９９７）。この残基は、成長因子又はホルボールエステルによりインビボでリン酸化が誘導される残基である。Ｓｅｒ２０９のリン酸化を誘導する成長因子はＰＤ  ９８０５９により阻害され、一方ストレスシグナルにより誘導されるＳｅｒ２０９のリン酸化はＳＢ  ２０３５８０により抑制される（Ｗａｎｇ等．，１９９８）。
【０００９】
我々は二つの新しいプロテインキナーゼの同定及びキャラクタリゼーション（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を記載する。前記キナーゼは一つのポリペプチド内に二つのプロテインキナーゼドメインを含むＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームに類似する。しかしＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と異なり（ＭＮＫｓと類似）、それらはインビトロ及びインビボでＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓ又はＳＡＰＫ２／ｐ３８のいずれかにより活性化される。この理由から、それらはマイトジェン及びストレス活性（Ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）プロテインキナーゼ−１及び−２（ＭＳＫ１，ＭＳＫ２）と名称付けされている。我々はまた、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３よりもむしろ、ＭＳＫ１及び／又はＭＳＫ２が成長因子及びストレスシグナルにより転写因子ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の活性化を仲介すると思われる証拠を述べる。
【００１０】
細菌感染（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の間ずっと、プロスタグランジン、ロイコトリエンス、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及びＴＮＦのような炎症伝達物質（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）が、グラム陰性菌の細胞壁の成分となるリポ多糖（ｌｉｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ；エンドトキシン）がＣＤ１４受容体に相互作用する際に引き起こされるシグナル導入経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）を経由して、マクロファージに産生される。これら炎症伝達物質は細菌感染と戦うのに必須な免疫応答を開始するのに重要な役割を果たす。しかしながら、それらの過剰産生はまた、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び敗血症性ショック（ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）の原因になる可能性がある。これらの理由から、炎症伝達物質の産生を抑制できるドラッグがこれらの症状を処置するのに有用となる。シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）はプロスタグランジン及びロイコトリエンス産生における律速段階を触媒し、マクロファージがＬＰＳにさらされる場合に合成される（Ｄｕｂｏｉｓ等（１９９８）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２，１０６３−１０７３）。
【００１１】
ＣＲＥＢは誘導（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）シクロオキゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）遺伝子の転写に関与するかもしれない。ＣＯＸ２は転写又は翻訳レベルで調節されるようである。ＣＯＸ２タンパクは不活性化又は迅速に破壊されるようである（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ等（１９７９）“組織におけるプロスタグランジン合成の抑制（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ）”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２，３５１０−３５１７参照）。ｍＲＮＡもまた不安定かもしれない：ＣＯＸ２ｍＲＮＡの長３’非翻訳領域は、迅速なｍＲＮＡ破壊に関する初期応答遺伝子（ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ）の特性をもつショー−カメン配列（ｔｈｅ  Ｓｈａｗ−Ｋａｍｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＡＵＵＵＡ）の多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ）を含んでいる（Ｋｏｓａｋａ等（１９９４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２１，８８９−８９７）。
【００１２】
ＣＯＸ２発現のＣＲＥＢ調節はＭｏｎｔｍｌｎｙ（１９９７）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６６，８０７−８２２に議論されている。
【００１３】
ＣＲＥＢはまた、ｃ−Ｆｏｓ（又はＦｏｓ）遺伝子の発現を誘導する。この遺伝子は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の調節に重要である。ｃ−Ｆｏｓの異常調節（Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が癌に関与するかもしれなし、Ｆｏｓ転写の阻害がほとんどの癌に適応できる抗癌療法（ａｎ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）として有用になるかもしれない。
【００１４】
ＩＬ−１のプロモーターは環状ＡＭＰ応答因子を含んでいる（Ｃｈａｎｄｒａ等（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５，４５３５−４５４３）。
【００１５】
ＡＴＦ１はＣＲＥＢと同様の役割を担いそうであり、ＣＲＥＢと互換性があるかもしれない。
【００１６】
一つのポリペプチド内に二つのプロテインキナーゼドメインを含む新しいマイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ（いわゆるＭＳＫ１）及び密接に関係する類似体（いわゆるＭＳＫ２）を我々は同定している。ＭＳＫ１（８０２残基）は、ＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１，またはｐ９０ＲＳＫと名称付けされる）の全アミノ酸配列と４０％の相同性を示し、“二つのキナーゼドメイン”を有する酵素である。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の対応するドメインと５４％及び４４％の相同性を有し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の四つの鍵となる活性リン酸化部位（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）がＭＳＫ１に保持されている。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１同様（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ等（１９９８））、ＭＳＫ１はＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２によりインビトロで活性化される。しかし、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と異なり、ＭＳＫ１はまたストレス活性プロテインキナーゼ２ａ（ＳＡＰＫ２ａ，またはｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２と名称付けされる）により活性化される。これらの点に一致して、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１が成長因子／ホルボールエステル刺激によってのみはっきりと活性化されるにもかかわらず、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＭＳＫ１はポリペプチド成長因子／ホルボールエステル刺激、又は、ＵＶ放射，酸化的及び化学的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｒｅｓｓ）への照射（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）のどちらかにより２９３細胞において活性化される。成長因子／ホルボールエステル刺激によるＭＳＫ１の活性化は、ＭＳＰＫカスケードの活性化を抑制するドラッグＰＤ  ９８０５９により阻害される。一方、ＵＶ放射，酸化的及び化学的ストレスによるＭＳＫ１の活性化は、ＳＢ  ２０３５８０，すなわちＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８βの特異的阻害剤により大きく阻害される。ヒーラ細胞（Ｈｅｒａ  ｃｅｌｌｓ）において、ＴＮＦがＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケードの両方を活性化するので、このアゴニストによるＭＳＫ１の活性化を抑制するのにＰＤ  ９８０５９及びＳＢ  ２０３５８０の両方が必要とされる。ホルボールエステル又はＵＶ放射のどちらかによるＭＳＫ１の活性化は、Ｎ末端又はＣ末端キナーゼドメインのどちらかにおいて単不活性化変異（ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を作製することにより廃止される。ＭＳＫ１は細胞の核に局在化され、Ｓｅｒ１３３で転写因子ＣＲＥＢをリン酸化する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
インビトロにおいては、ＣＲＥＢが、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化するＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりもＭＳＫ１のより優れた基質となる。Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致する合成ペプチドは、極度に低いＫｍ値（＜０．１μＭ）でリン酸化される。我々は、ＥＧＦ，ＵＶ及びＴＮＦにより誘導される（ｔｈｅ  ＥＧＦ，ＵＶ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の活性化に関するＳＢ  ２０３５８０及びＰＤ  ９８０５９の効果には、ＭＳＫ１活性化に関するこれら阻害剤の効果が反映されることを示す。他の観測に加えて、これらのことから、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２は、成長因子及びストレスにより誘導されるＣＲＥＢの活性化を仲介するように思われる。
【００１８】
我々は、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２が、炎症伝達物質ＣＯＸ−２及びＩＬ−１の遺伝子の転写、及び、炎症ＣＯＸ−２タンパクの誘導を調節するかもしれないという証拠を示す。我々は、マクロファージがＬＰＳで刺激される場合にＭＳＫ１及びＭＳＫ２両方が活性化されるということを示す。ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の活性化及び活性を抑制する化合物が、ＬＰＳに誘導されるＣＲＥＢ及びＡＴＦ１及び／又は転写因子Ｃ／ＥＢＰβのリン酸化，ＣＯＸ−２及びＩＬ−１遺伝子の転写，及びＣＯＸ−２タンパクの誘導を阻害するかもしれない。
【００１９】
ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１はＣＯＸ−２の転写に必須のようである；ＭＳＫ１の阻害剤は、ＣＯＸ２が関係する、又は、非ステロイド抗炎症（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＳＡＩＤｓ），特にＣＯＸ２選択的阻害剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）が有用とされる病気又は症状の治療に有用かもしれない。そのような病気又は症状には、炎症プロセス（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）が関与すると思われる、又は、無痛覚症（ａｎａｌｇｅｓｉａ）が有利となる病気又は症状が含まれる。
【００２０】
ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１はｃ−Ｆｏｓの転写に必須なので、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の阻害剤がｃ−Ｆｏｓの関係する病気又は症状の治療に有用となるかもしれない。そのような病気又は症状には、癌が含まれる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の側面は、アミノ酸配列
0004588215.tif 000002
0004588215.tif 000003
又は
0004588215.tif 000004
又は
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0004588215.tif 000006
又は
0004588215.tif 000007
又は
0004588215.tif 000008
又はそれの変異体、フラグメント、融合体、派生物、又は前記変異体、フラグメント、派生物の融合体を有する本質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）純粋な（ｐｕｒｅ）ポリペプチドを提供する。アミノ酸配列が上述されるようなポリペプチドが、マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）であると考えられる。
【００２２】
上述されたようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＭＳＫ１（マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ１；一番目の配列に示される）又はＭＳＫ２（マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ２；二番目の配列はヒトＭＳＫ２の一部の配列である，三番目の配列はヒトＭＳＫ２のスプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）の一部の配列である，四番目の配列はヒトＭＳＫ２の一部の配列であり、五番目の配列はマウスＭＳＫ２の一部の配列である）として本明細書に参照される。
【００２３】
ＭＳＫ１のアミノ酸配列はまた、図１に示される（ＭＳＫ１）。ヒトＭＳＫ２の一部のアミノ酸配列もまた、図２ｃに示される。マウスＭＳＫ２はヒトＭＳＫ２の変異体であり、マウスＭＳＫ２もまた図２ｃに示される。
【００２４】
“本質的に純粋（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）”とは、前記ポリペプチドに他のタンパク質が本質的にフリーであることを我々は意味している。従って、前記ポリペプチドとして重量にするとタンパク質含量（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ）の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％を含有するいずれかの組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含み、最も好ましくはタンパク質含量の９５％が前記ポリペプチドである。
【００２５】
従って、本発明はまた、前記ポリペプチドと混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）を含有する組成物を含んでいる。前記混入物は、重量にして前記組成物の７０％より少ない、好ましくは前記組成物の５０％より少ない、さらに好ましくは３０％より少ない、またさらに好ましくは１０％より少なく、最も好ましくは重量にして５％より少ない。
【００２６】
本発明はまた、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で他の成分が混ぜ合わせられた場合の本質的に純粋な前記ポリペプチドを含むが、前記他の成分は前記ポリペプチドが存在する細胞中の全ての成分ではない。
【００２７】
変異体（Ｖａｒｉａｎｔｓ）（自然に起こる（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｉｎｇ）か又はそれ以外）は、以下に示す組換ポリヌクレオチドを用い、その技術分野においてよく知られたタンパク質工学及び部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の方法を使用して作製されてもよい。
【００２８】
“前記ポリペプチドのフラグメント”に関して、活性を保持する、又は、例えば抗体作製（ｒａｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）又は結合測定法（ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）に用いる他の方法において有用となるあらゆるフラグメントを含んでいる。
【００２９】
“前記ポリペプチドの融合体”に関して、何らかの他のポリペプチドが融合された前記ポリペプチドを含んでいる。例えば、前記ポリペプチドの精製を容易にするために、前記ポリペプチドはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はプロテインＡのようなポリペプチドに融合されてもよい。ＧＳＴへのそのような融合体の一例は実施例１に与えられる。同様に、前記ポリペプチドは、Ｈｉｓ６のようなオリゴ−ヒスチジンタグ（ｏｌｉｇｏ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）、又は、よく知られたマイクタグエピトープ（Ｍｙｃ  ｔａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）のような抗体により認識されるエピトープに融合されてもよい。前記ポリペプチドの変異体、フラグメント又は派生物いずれかへの融合体もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
ポリペプチドの“変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）”とは、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）又は非保存的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）いずれかの挿入、欠損及び置換を含んでいる。特に、そのような変化によって前記ポリペプチドの活性が本質的に変わらないポリペプチドの変異体を含んでいる。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の変異体はまた、Ｒｓｋ１／２／３としても知られるヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の変異体はまた、ＷＯ  ９８／０３６６２に開示されるようなキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｐ７０  Ｓ６キナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない。このポリペプチドは、Ｎ末端ドメインにおいてＭＳＫ１又はＭＳＫ２とほぼ５５％の相同性があり、全体ではほぼ２０％の相同性がある。
【００３１】
上述した配列の全て（すなわち、本質的に全長のＭＳＫ１）と、又は、上述したヒト又はマウスＭＳＫ２配列の全てを本質的に含む全長ヒト又はマウスＭＳＫ２とを本質的に含む変異体が、特に有用になることが認識されるだろう。“本質的に全て（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｌｌ）”には、前記配列の少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％，９８％，１００％（すなわち全て）が意図される。“本質的に全長（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）”には、全長ポリペプチド配列の少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％，９８％又は１００％（すなわち全て）を含むことが意図される。
【００３２】
“同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）”には、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；及びＰｈｅ，Ｔｙｒのような組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）が意図される。
【００３３】
ポリペプチド変異体が、上述したアミノ酸配列と少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７５％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、もっとさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は９９％の相同性をもつアミノ酸配列を有するなら、特に好ましい。
【００３４】
二つのポリペプチド間のパーセント配列相同性（Ｔｈｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、例えばウィスコンシン大学遺伝子コンピューティンググループ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰプログラムのような適するコンピュータープログラムを用いて決定される。そして、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）が最適に配列される（ａｌｉｇｎｅｄ）ポリペプチドについてパーセント相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が算出される。
【００３５】
代わりとしてクラスタルＷプログラム（ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｐｒｏｇｒａｍ）を用い、配列（Ｔｈｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が実施されてもよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等．，１９９４）。用いられるパラメーターは以下の通りである：
Ｆａｓｔ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ；１，ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ；５，ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ；３，ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｏｐ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ；５．Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ｘ  ｐｅｒｃｅｎｔ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ；１０，ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ；０．０５．
Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ．
【００３６】
従って、これらパラメーターを用いると、ＭＳＫ１は、ＮＣＢＩデータベースにおいて最も近接した類似体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）；ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ，ｂ及びｃと全体で４２−４４％の相同性を有する。
【００３７】
本発明の詳しい実施例は、アミノ酸配列
0004588215.tif 000009
0004588215.tif 000010
からなる本質的に純粋なヒトＭＳＫ１ポリペプチド、又は、自然に起こる（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）それのアレリック（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体を提供する。そのアミノ酸配列はまた、ポリヌクレオチド配列の翻訳として図１に示される。
【００３８】
本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列
0004588215.tif 000011
又は
0004588215.tif 000012
0004588215.tif 000013
又は
0004588215.tif 000014
からなる本質的に純粋なＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそれのアレリック変異体を提供する。
【００３９】
本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列
0004588215.tif 000015
又は
0004588215.tif 000016
を含む本質的に純粋な全長ヒトＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそれのアレリック変異体を提供する。上述した配列のそれぞれが、全長ヒトＭＳＫ２の全部のアミノ酸配列ではないと認識されるだろう。
【００４０】
本発明のさらに詳しい実施例は、アミノ酸配列
0004588215.tif 000017
を含む本質的に純粋な全長マウスＭＳＫ２ポリペプチド、又は、自然に起こるそれのアレリック変異体を提供する。上述した配列が、全長マウスＭＳＫ２の全部のアミノ酸配列ではないと認識されるだろう。
【００４１】
必須ではないけれども、前記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の融合体が、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ；実施例１参照）、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ（Ｓｅｒ１３３周辺の配列が一致する合成ペプチド（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ；実施例１参照））のリン酸化、又は（好ましくは）例えば実施例１に記載のＧＳＴ−ＣＲＥＢ融合タンパクのリン酸化に関して、ＭＳＫ１の酵素活性の少なくとも３０％を有することが特に好ましい。あるいは、必須ではないけれども、前記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の融合体が、上述したＣｒｏｓｓｔｉｄｅ、ＣＲＥＢ、ＧＳＴ−ＣＲＥＢ融合タンパク又は適するＣＲＥＢｔｉｄｅに関して、ＭＳＫ２の酵素活性の少なくとも３０％を有することが特に好ましい。前記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の融合体が、ＣＲＥＢ又は上記した代わりになるべきもののリン酸化に関して、ＭＳＫ１の酵素活性のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％を有するなら、さらに好ましい。あるいは、前記ポリペプチドの変異体、フラグメント、派生物、融合体、又はその変異体、フラグメント、派生物の融合体が、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ又は上記されて適する代わりになるべきもののリン酸化に関して、ＭＳＫ２の酵素活性のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％を有するなら、さらに好ましい。しかしながら、例えば別のポリペプチドに相互作用することにより又は抗体をつくる際の（ｉｎ  ｒａｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）抗原として、酵素活性をもっていない変異体、融合体、派生物、フラグメントがやはり有用となることが認識されるだろう。
【００４２】
本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチドをコード化する、又は前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラグメント又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体をコード化する組換ポリヌクレオチドを提供する。以下に表現された配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ）（ＥＳＴｓ）がまた排除されるという点を除いては、前記ポリヌクレオチド変異体として好ましいもの及び排除するもの（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｓ）は、本発明の第一の側面と同様である：
【００４３】
ヒトＭＳＫ１に関するＥＳＴｓ：ＡＡ１５８５７２，ＡＡ１５８５７１，ＡＡ２５５８４６，ＡＡ６９９７２９，ＡＡ１３４３５９，ＡＡ３１４５６５，Ｎ３１６４１，ＡＡ３０５１６３，ＷＯ４９３０，ＡＡ１３４３５８，ＡＡ３２２２７０，Ｈ０９９８５，ＡＡ２５５９９６，Ｒ１１２３５，Ｎ５７０５９，Ｔ９７５３８，Ｔ９７５８４，Ｈ０９９８６，Ｒ１１１８３，ＨＳＣ０ＪＥ０８１，ＡＡ４７２１６５，ＡＡ８９７２２１，ＡＡ３８９１６８，ＡＡ０６１０１６，ＡＡ４４４３６６．
【００４４】
ヒトＭＳＫ２に関するＥＳＴｓ：ＡＡ５６８８９５，ＡＡ８５７４３１，Ｈ４１６４７，ＡＡ４４３６０１，ＡＡ６７８６７０，Ｈ５３７１４，ＡＡ６２７５５８，Ｈ４６２６８，Ｒ１７１０９，ＡＡ９５５１２９．
【００４５】
マウスＭＳＫ２に関するＥＳＴｓ：ＡＡ２６７４９０，ＡＡ４４４３６６，ＡＡ０６１０１６，ＡＡ３８９１６８，ＡＡ４７２１６５，ＡＡ６５７１０８．
【００４６】
実施例１に記載のように、全てのＥＳＴｓはジーンバンク取得番号（ｔｈｅ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）により同定される。
【００４７】
本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチドを発現するのに適する、又は前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラグメント又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体を発現するのに適する組換ポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチド変異体として好ましいもの及び排除するものは、本発明の第一の側面と同様である。
【００４８】
“発現するのに適する（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）”とは、そのポリヌクレオチドが、例えばＲＮＡのようにポリペプチドを形成するように翻訳されるポリヌクレオチドであること、又は、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）が、発現に関して適切な配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と正しいリーディングフレームを成して、プラスミドのような発現ベクターに組み込まれることが意図される。そのポリヌクレオチドは、何らかの望まれた宿主により認識される適する転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列につながれる。；そのような操作は発現ベクターに組み込まれているだろう。
【００４９】
上にリスト化したＥＳＴｓのうちのどれかが、上記に定義されたようなポリペプチドであるとは考えられない。；しかし、疑いをなくすために、上述に排除されたＥＳＴｓがさらに本発明のこの側面から排除される。
【００５０】
従って、本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたポリペプチドを発現するのに適する、又は、前記ポリペプチドの融合体の変異体又はフラグメント又は派生物、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体を発現するのに適する複製可能なベクターである。前記ポリヌクレオチド変異体として好ましいもの及び排除するものは、本発明の第一の側面と同様である。例えば、この複製可能なベクターは、例えば実施例１に記載されるように、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチドの融合体、特にＧＳＴ融合体を発現するのに適する。
【００５１】
本発明のさらなる側面は、本発明の第一の側面に定義されたポリペプチドの融合体、又は変異体又はフラグメント又は派生物の融合体、特にＧＳＴ融合体をコード化するポリヌクレオチドである。またさらなる側面は、哺乳類／真核細胞において複製に適するベクターであり、本発明の第一の側面に定義されたようなポリペプチド、又は変異体又はフラグメント又は派生物又はこのポリペプチドの融合体、又は変異体又はフラグメント又は派生物の融合体、特にＧＳＴ融合体をコード化するポリヌクレオチドを有する。以下に示すＥＳＴｓクローンは、哺乳類／真核細胞における複製に適し、本発明のこの側面から排除されるベクターとなる：ＡＡ３８９１６８；ＡＡ６７８６７０。本発明の他の側面から排除されるＥＳＴｓのどれかが上述に定義されるようなベクターであるとは考えられない；しかし、そのようなベクターとなるＥＳＴｓのどれかがまた排除されると認識されるだろう。
【００５２】
哺乳類／真核細胞において複製に適するベクターの特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）は、当業者によく知られており、以下に例が示される。原核及び真核細胞両方において、ベクターが複製に適することが認識されるだろう。
【００５３】
一つの好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列
0004588215.tif 000018
0004588215.tif 000019
又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。ＭＳＫ１をコード化するヌクレオチド配列は、関連するオープンリーディングフレームの翻訳とともに図１に示される。
【００５４】
別の好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列
0004588215.tif 000020
0004588215.tif 000021
又は
0004588215.tif 000022
0004588215.tif 000023
又は
0004588215.tif 000024
0004588215.tif 000025
又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。
【００５５】
上述のポリヌクレオチドは、一部のヒト（二つのスプライス変異体）又はマウスＭＳＫ２それぞれをコード化する。上述した配列を用いると、全長マウス又はヒトＭＳＫ２をコード化する配列は、当業者によりよく知られる方法を日常的に用いることで入手されることが認識されるだろう。従って、ＰＣＲ法、特に５’ｃＤＮＡ配列を合成するために改良された方法（例えば、当業者によく知られるような“ＲＡＣＥ”法）が用いられるだろう。
【００５６】
好ましい実施例において、このポリヌクレオチドは配列
0004588215.tif 000026
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0004588215.tif 000028
又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。ＭＳＫ１をコード化するヌクレオチド配列は、関連するオープンリーディングフレームの翻訳とともに図１に示される。
【００５７】
別の好ましい実施例において、このポリヌクレオチドはヌクレオチド配列
0004588215.tif 000029
0004588215.tif 000030
又は
0004588215.tif 000031
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又は
0004588215.tif 000033
0004588215.tif 000034
又はそれの変異体、フラグメント、融合体又は派生物を有する。
【００５８】
上述したポリヌクレオチドは、一部のヒト（二つのスプライス変異体）又はマウスＭＳＫ２それぞれをコード化する。
【００５９】
全長ヒトＭＳＫ２ポリペプチド配列は以下に示され、ジーンバンクエントリー取得番号ＡＪ０１０１１９に与えられる（Ｐｉｅｒｒａｔ等（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（４５），２９６６１−２９６７１）：
0004588215.tif 000035
0004588215.tif 000036
【００６０】
全長ヒトＭＳＫ２ポリヌクレオチド配列は以下に示され、ジーンバンクエントリー取得番号ＡＪ０１０１１９に与えられる（Ｐｉｅｒｒａｔ等（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（４５），２９６６１−２９６７１）：
0004588215.tif 000037
0004588215.tif 000038
【００６１】
翻訳に必要な配列を欠き、かつそれゆえに表現された配列タグの発現を欠く場合、表現された配列タグ（ＥＳＴ）クローンは上述に定義されるような組換ポリヌクレオチドではないことが認識されるだろう。ＥＳＴ配列は、ベクターＵｎｉ−ＺＡＰＸＲ，ｐＴ７Ｔ３Ｄ−Ｐａｃ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−，Ｌａｆｍｉｄ  ＢＡ又はｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ２ベクターでクローンされる（ｂｅ  ｃｌｏｎｅｄ）だろう。
【００６２】
本発明のポリペプチド又は変異体、フラグメント、融合体、派生物をコード化する、組換えポリヌクレオチドのフラグメントを含むポリヌクレオチドもまた有用でありうる。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは少なくともヌクレオチド１０個の長さのフラグメントを含んでおり、少なくとも１４個の長さであることがより好ましく、少なくとも１８個の長さであることが更に好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして有用である。このように本発明のポリペプチド又は変異体、フラグメント、融合体、派生物をコード化するポリヌクレオチド（又はそれらのフラグメント）に相補的なポリヌクレオチドもまた有用となる。このような相補的ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドとして、当業者によく知られている。
【００６３】
本発明のヌクレオチド又は組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡでありうる。これらのポリヌクレオチドはそのコード配列の中にイントロンを含んでもよいし、含まなくてもよい。；このポリヌクレオチドはｃＤＮＡであることが好ましい。
【００６４】
このようなポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、（ｉ）前記ポリヌクレオチドにコード化されたタンパク質に特異的に結合する抗体の生産に、順次利用されるタンパク質又はそのフラグメントの合成に使用可能なもの、又は（ｉｉ）その遺伝子あるいは（ｉ）で定義された変異型（ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ）に対応するアンチセンス配列を含む。例えば、同一のアミノ酸をコードする異なるコドンは、原形のコドンとして代用されることができる。変わりになるべきものとして、代用コドンは、タンパク質の活性あるいは免疫原性に影響しない、又はその活性や免疫原性を高め或いは逆に調節する、異なるアミノ酸をコードしうる。例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅの“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１９３−２１０（１９８５）に述べられたように、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）又はその他の技術が、置換、挿入、欠失、転移のような、一重又は多重の突然変異を発生するのに活用され、この技術が参考として本明細書に組み込まれている。このような修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ポリヌクレオチドは、既知の技術を本明細書に組み込まれた教示（ｔｈｅ  ｔｅａｃｈｉｎｇ）に応用することにより入手可能であるので、このように修飾されたポリヌクレオチドは特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある。
【００６５】
さらに、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列（若しくはそれらのフラグメント）が、高度にストリンジェントな条件下で、これらとハイブリダイズする他のポリヌクレオチド配列を得るのに使用できることは、当業者に認識されるだろう。このようなポリヌクレオチドはあらゆるゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を含む。よって、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の手法により同定されるポリヌクレオチドと、少なくとも６０％、好ましくは７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％の相同性を示すポリヌクレオチドを含んでいるが、これは、このような相同なポリヌクレオチドが、少なくとも以下に述べる手法のいくつかに於いて使用可能、若しくは有用であるポリペプチドをコード化する場合に於いてである。
【００６６】
パーセント相同性（Ｐｅｒ  ｃｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、例えばウィスコンシン大学遺伝子コンピューターグループ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰプログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）により測定できる。
【００６７】
ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＡＮ−ＲＮＡ，又はＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、０．１×から６×の濃度の標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）を含有する水溶液中で、５５℃から７０℃の温度において実施される。この技術分野に於いて、温度が高いほど、又は標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）の濃度が低いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになることがよく知られている。ここでいう“高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）”とは、２×標準食塩−クエン酸緩衝液と６５℃を意味する。１×標準食塩−クエン酸緩衝液は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。高度なストリンジェンシー（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の状態でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、特許請求の範囲に記載された発明の範囲に含まれる。
【００６８】
このポリヌクレオチドの“変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）”はまた、比較的短いストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）（例えば２０個から５０個のヌクレオチド）が、本発明のポリヌクレオチドと同等のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）と高い割合の相同性（少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０又は９５％）を示すポリペプチドを、たとえこれら二つのポリヌクレオチドの全体における相同性がこれよりもかなり低いとしても、含むものとする。これは、タンパク質の全体的な構造が異なる場合でも、その重要な活性又は結合部位が共有されうるからである。
【００６９】
ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを、例えば相補的な付着末端を経由して、ベクターに使用可能に結合させるために、様々な手法が開発されている。適当な手法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドをコード化するＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１により開示されたように、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この手法は、例えば適当な制限部位に於いて処理を行うなどして、ＤＮＡを適するベクターへと導入するのに使用される。あるいは、この技術分野において知られる他の有用な方法で、ＤＮＡを修飾するのにこの手法が使用される。
【００７１】
この手法では、酵素により増幅される（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）ＤＮＡは、２個の特異的なプライマーに隣接され、これらのプライマーはそれら自体がこの増幅されたＤＮＡに組み込まれる。前記の特異的なプライマーは、この技術分野で既知の手法を用いての発現ベクターの中へクローニングするのに使用されうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【００７２】
このＤＮＡ（レトロウィルスベクターの場合はＲＮＡ）は、それから、本発明の化合物を含有するポリペプチドを産生するのに適する宿主で発現される。ゆえに、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するこのＤＮＡは、発現ベクターを構成するために、既知の技術に従い用いられ、本明細書に含まれる教示（ｔｈｅ  ｔｅａｃｈｉｎｇ）を考慮して適切に修飾される。その後、このＤＮＡは、本発明のポリペプチドの発現及び産生に適する宿主細胞を形質転換するのに用いられる。このような技術は、Ｒｕｔｔｅｒ等に１９８４年４月３日に発行されたＵＳＰ．４，４４０，８５９、Ｗｅｉｓｓｍａｎに１９８５年７月２３日に発行されたＵＳＰ．４，５３０，９０１、Ｃｒｏｗｌに１９８６年４月１５日に発行されたＵＳＰ．４，５８２，８００、Ｍａｒｋ等に１９８７年６月３０日に発行されたＵＳＰ．４，６７７，０６３、Ｇｏｅｄｄｅｌに１９８７年７月７日に発行されたＵＳＰ．４，６７８，７５１、Ｉｔａｋｕｒａ等に１９８７年１１月３日に発行されたＵＳＰ．４，７０４，３６２、Ｍｕｒｒａｙに１９８７年１２月１日に発行されたＵＳＰ．４，７１０，４６３、Ｔｏｏｌｅ，Ｊｒ等に１９８８年７月１２日に発行されたＵＳＰ．４，７５７，００６、Ｇｏｅｄｄｅｌ等に１９８８年８月２３日に発行されたＵＳＰ．４，７６６，０７５、Ｓｔａｌｋｅｒに１９８９年３月７日に発行されたＵＳＰ．４，８１０，６４８において開示されたものを含み、これらは全て、参考として本明細書に組み込まれている。
【００７３】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するＤＮＡ（レトロウィルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主へ導入するために、他の多種多様なＤＮＡ配列と結合される。結合するＤＮＡ（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ＤＮＡ）は、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、又はエピソーム保持（ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）或いは組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が望ましいのかどうかに依存するだろう。
【００７４】
一般的に、ＤＮＡは、発現するために適切な配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）及び正確なリーディングフレームを成して、プラスミドなどの発現ベクターに導入される。必要ならば、ＤＮＡを、目的の宿主により認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に結合させるが、このような調節は通常、発現ベクターにおいて可能である。その後、このベクターは標準的な技術によって宿主に導入される。一般的に、すべての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。それゆえに、形質転換された宿主細胞を選別することが必要になる。選別する技術の一つは、あらゆる必要な調節因子（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を有し、形質転換された細胞中で、抗生物質耐性のような選択的特性をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに組み込むことを必要とする。変わりになるべきものとして、そのような選択特性を保持する遺伝子は他のベクターにも存在し、目的の宿主細胞を共形質転換する（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）のに用いられる。
【００７５】
本発明の組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞は、その後、目的のポリペプチドの発現がなされるように、本明細書で開示された教示（ｔｈｅ  ｔｅａｃｈｉｎｇｓ）を考慮して、十分な期間、当業者に知られた適切な環境の下で培養され、それから回収される（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）。
【００７６】
バクテリア（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（ｙｅｓｔ）（例えばサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ）を含む多くの発現システム（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が知られている。
【００７７】
そのベクターが、たとえ他の原核生物以外の細胞タイプの発現に使われるとしても、そのベクターはＣｏｌＥ１  ｏｒｉのような原核生物での増殖のための原核生物レプリコン（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含んでいる。このベクターはまた、それとともに形質転換された、大腸菌のようなバクテリア宿主細胞で、遺伝子の発現（転写と翻訳）を方向付けできる原核生物プロモーターのような適切なプロモーターも含むことができる。
【００７８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写の開始を許容するＤＮＡ配列によって形成される発現調節要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）である。模範的な細菌宿主に適合するプロモーター配列（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）は、本発明のＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を含むプラスミドベクター（ｖｅｃｔｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）に、典型的に備えられている。
【００７９】
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９と、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡで入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３である。
【００８０】
典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターはクローンされた遺伝子の発現を駆動させるためにＳＶ４０後期プロモーター（ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用し、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞（Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｏｄｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）で高いレベルの発現が確認される。
【００８１】
誘導哺乳類発現ベクター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）の例として、ｐＭＳＧがあり、このベクターもまたＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能である。このベクターは、クローンされた遺伝子の発現を駆動させるために、マウス乳がんウィルスの長末端リピート（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）のグルココルチコイド誘導プロモーター（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を使用する。
【００８２】
有用な酵母プラスミドはｐＲＳ４０３−４０６とｐＲＳ４１３−４１６で、通常Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択性遺伝標識（ｙｅａｓｔ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＣｐｓ）である。
【００８３】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で形質転換された宿主細胞に関する。この宿主細胞は、原核又は真核のどちらかでありうる。バクテリア細胞には原核宿主細胞が好ましく、典型的には、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手可能な大腸菌株ＤＨ５と、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＴＣ）ｏｆ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（Ｎｏ  ＡＴＣＣ  ３１３４３）から入手可能なＲＲ１のような大腸菌の一株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫や哺乳類の細胞を含むが、マウスやラット、サル、ヒトの繊維芽細胞系由来の細胞のような脊椎動物細胞がより好ましい。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから通常入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、ＹＰＨ５０１を含む。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＣＣＬ６１としてｔｈｅ  ＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ  １６５８としてｔｈｅ  ＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓ  ｍｏｕｓｅ胚細胞（ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌ）ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＲＬ  １６５０としてｔｈｅ  ＡＴＣＣから入手可能なサルの腎臓由来の（ｋｉｄｎｅｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ＣＯＳ−１細胞を含む。好ましい昆虫細胞としては、バキュロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現ベクターでトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）されるＳｆ９細胞がある。
【００８４】
本発明のＤＮＡ構造を有する、適当な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターのタイプに典型的に依存するよく知られた手法により遂行することができる。原核生物の形質転換に関しては、例えばＣｏｈｅｎ等（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，２１１０と、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。酵母細胞の形質転換はＳｈｅｒｍａｎ等（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７５，１０４−１０９の手法も有用である。脊椎動物細胞に関しては、例えばカルシウムホスフェート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ、ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎのような、これらの細胞のトランスフェクションにおいて有用な試薬が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８７７，ＵＳＡから入手可能である。
【００８５】
エレクトロポレーションもまた、細胞を形質転換及び／或いはトランスフェクションするのに有用であり、またこの技術は、酵母細胞、バクテリア細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞を形質転換する技術分野でよく知られている。
【００８６】
例えば、多くのバクテリア種は、参考として本明細書に組み込まれたＬｕｃｈａｎｓｋｙ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７−６４６に記載された手法によって、形質転換されてもよい。たくさんの形質転換体が、ｃｍ当たり６２５０Ｖ、２５：ＦＤ条件下で（ｕｓｉｎｇ  ６２５０Ｖ  ｐｅｒ  ｃｍ  ａｔ  ２５：ＦＤ）２．５×ＰＥＢ中に懸濁された（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）ＤＮＡ細胞混合物（ＤＮＡ−ｃｅｌｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ）のエレクトロポレーションに続いて一貫して回収される。
【００８７】
エレクトロポレーションによって酵母を形質転換させる手法は、ＢｅｃｋｅｒとＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）のＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２において開示されている。
【００８８】
適切に形質転換された細胞、つまり本発明のＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を有する細胞は、よく知られた技術で同定することができる。例えば、本発明の発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の導入の結果としてできた細胞は、本発明のポリペプチドを生産するようになる。細胞は収集、溶解され、それらのＤＮＡの内容（ｃｏｎｔｅｎｔ）は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３又はＢｅｒｅｎｔ等（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８に記載されたような手法を用いて、目的のＤＮＡが含まれているかどうか、試験される。代わりに、上清のタンパク質の存在が以下に記載した抗体を用いることによって検出される。
【００８９】
組換えＤＮＡの存在の直接的なアッセイ（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｓｓａｙｉｎｇ）に加えて、その組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指揮できる場合には、成功した形質転換は、よく知られた免疫学的手法によって確認される。例えば、発現ベクターとの形質転換に成功した細胞は、適当な抗原性を示すタンパク質を生産する。形質転換されたと思われる細胞のサンプルは、収集され、適する抗体を用いてそのタンパク質をアッセイされる。
【００９０】
それゆえに、形質転換された宿主細胞自体に加え、本発明は、栄養培地でのそれらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローニングされて均一な）培養もしくはモノクローナル培養から派生する培養も、深く考慮している。
【００９１】
本発明の更なる側面は、本発明のポリペプチド、又はそれの変異体、派生物、フラグメント又は融合体、又は変異体、フラグメント、派生物の融合体を作製する方法を提供する。この方法は、前記ポリヌクレオチドをコード化する組換えポリヌクレオチド又は複製可能なベクター（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）を有する宿主細胞の培養と、前記ポリペプチド又はそれの変異体、派生物、フラグメント又は融合体、又は変異体、フラグメント又は派生物の融合体を前記宿主細胞から単離することを有する。宿主細胞の培養方法と、組換えタンパク質の単離方法は、この技術分野に於いて良く知られている。
【００９２】
本発明はまた、本発明の上記の方法によって入手可能なポリペプチド、又はそれの変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は前記変異体又はフラグメント又は派生物の融合体も含んでいる。
【００９３】
本発明のまた更なる側面は、本発明のポリペプチドに対して反応する抗体を提供する。そのような抗体及びそのような抗体を調整する方法の例は、実施例１に記載されている。
【００９４】
本発明の前記ポリペプチドに対して反応する抗体は、この技術分野においてよく知られた手法で作製される。特に、この抗体はポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）又はモノクローナルである。
【００９５】
前記ポリペプチドに対して反応する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術によって調整される。またそれら既知の技術の例は、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）や、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＳＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示されている。
【００９６】
好ましい実施例において、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の特定なアミノ酸配列から得られる、あらゆる適したペプチド配列を適切に使用することによって、これらの抗体は作製される。ポリクローナルアンチペプチド抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が作られれば好ましい。ＭＳＫ１から得ることのできる適当なペプチドには、実施例１で論じるように、ＬＴＶＫＨＥＬＲＴＡＮＬＴＧＨＡＥＫＶ（ＭＳＫ１の２６から４４の残基に一致する）とＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥＲ（ＭＳＫ１の３８４から４０２の残基に一致する）が含まれる。ＭＳＫ２から得られる適当なペプチドはＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥＲ（ＭＳＫ２の７５３から７７２の残基に一致する）である。
【００９７】
ＭＫＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃのような他の二つのキナーゼドメインを有するプロテインキナーゼに対し、これらの抗体が本質的に反応しなければ、特に好ましい。従って、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２配列に基づくペプチドで、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ／ｃのような他のストレス活性プロテインキナーゼにおいて見つけられるペプチドとは顕著に異なるペプチドが用いられることが好ましいだろう。また、抗体が、ＭＳＫ１に対しては反応するがＭＳＫ２に対しては本質的には反応しない、若しくはその逆であることも好ましいだろう。
【００９８】
ペプチドが合成される前後で、一個若しくはそれ以上のアミノ酸残基が化学的に修飾される（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ペプチドは、そのペプチドの機能、すなわち生体内における特定の抗体の生産する機能が本質的に変化しなければ、使用される。このような修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、酸又は塩基、特に生理学的に受容される有機又は無機の酸及び塩基とによる塩の形成、カルボキシル基末端のエステル又はアミドの形成、Ｎ末端ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）のようなアミノ酸保護基の付着（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）を含む。このような修飾は、これらのペプチドを生体内の代謝から守る。このようなペプチドは、単コピー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ）として、又は例えば縦列反復（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）のような多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｙ）として存在する。このような縦列又は多重反復（ｔａｎｄｅｍ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｐｅａｔ）はそれら自体抗原として、キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）の使用を回避するのに十分である。またこのようなペプチドは、Ｎ末端とＣ末端を結合させてループ（ｌｏｏｐ）を形成したり、抗原性を高めるため及び／又はジスルフィド結合の形成を許容するために一個又はそれ以上のＣｙｓ残基を末端に付着したりするのに有利である。このようなペプチドがキャリアに、好ましくはポリペプチドに共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）するとき、その組み合わせ（Ｔｈｅ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は適しており、本発明のペプチドはループを形成する。
【００９９】
最近の免疫学的理論によれば、キャリア機能（ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）はあらゆる免疫系統（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で、免疫機構の刺激や刺激の増強によって現れる。もっとも優れたキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）は、Ｔ細胞エピトープ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を形成する（又は、抗原と共に、つくる）。そのペプチドは、血清アルブミン、ミオグロビン、細菌性毒素やキーホールツタノハガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）のような別のキャリアと、例えば架橋によって結合する。さらに最近では、Ｔ細胞を誘導する進化したキャリア（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ）は、Ｂ型肝炎コア抗原（ヌクレオキャプシド蛋白ともいわれる）や、トレオニン（Ｔｈｒ）−アラニン（Ａｌａ）−セリン（Ｓｅｒ）−グリシン（Ｇｌｙ）−バリン（Ｖａｌ）−アラニン（Ａｌａ）−グルタミン酸（Ｇｌｕ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−システイン（Ｃｙｓ）のようなＴ細胞エピトープ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）と推測されるもの、β−ガラクトシダーゼ、そしてインターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）の１６３〜１７１ペプチドを含む、免疫応答を助ける。後者の化合物は、キャリアとして、又はアジュバントとして、又はその両方として、様々にみなされてもよい。また一方、本発明と同じか又は異なるペプチドのいくつかのコピー（ｃｏｐｉｅｓ）は、互いに架橋されてもよい。この場合、それ自体分離したキャリア（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）はないが、キャリアの機能はそれらの架橋によって提供されてもよい。適する架橋剤には、シグマ又はピースのカタログｔｈｅ  Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔａｌｏｇｕｅのような中で挙げられている、例えばグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、そしてサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などが含まれ、後者の試薬（ａｇｅｎｔ）は、（存在すれば）Ｃ末端システイン残基のＳＨ基（ｔｈｅ−ＳＨ  ｇｒｏｕｐ）を利用する。
【０１００】
仮にペプチドが、適当な宿主（ｈｏｓｔ）中の適当なヌクレオチド配列の発現によって調整された場合、ペプチドは、キャリアとしてはたらくペプチド配列との融合生成物として発現するのが有利かもしれない。Ｋａｂｉｇｅｎの“エコシステム”（“Ｅｃｏｓｅｃ  ｓｙｓｔｅｍ”）は、そのような調整（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の例である。
【０１０１】
本発明のペプチドは、二重効果（ａ  ｄｕａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）をもたらすほかの抗原と結合している。
【０１０２】
ペプチドは、Ｌｕ等（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６，３４３３で発表、開示されている、ｔｈｅ  Ｆｍｏｃ−ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｍｏｄｅの固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ−ｆａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基の保護は、９−フルオレニルメチロキシカルボニル基（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）（Ｆｍｏｃ）で行われる。この強塩基不安定性の保護基の再開裂は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）中で２０％ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ）を用いてなされる。側鎖の機能性は、それらのブチルエーテル（ｂｕｔｙｌ  ｅｔｈｅｒｓ）（セリン、トレオニン、チロシンの場合）、ブチルエステル（ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）（グルタミン酸、アスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導体（ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（リジン、ヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（ｔｒｉｔｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（システインの場合）、そして４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（アルギニンの場合）として、保護されてもよい。グルタミン又はアスパラギンがＣ末端残基であるところは、４，４−ジメトキシベンズヒドリル基（４，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ）が、側鎖アミドの機能性の保護に利用される。固相支持（ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ−ｆａｓｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）は、ジメチルアクリルアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（バックボーンモノマーｂａｃｋｂｏｎｅ−ｍｏｎｏｍｅｒ）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（ｂｉｓａｃｒｙｌｏｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）（架橋物質ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒ）、そして、アクリロイルサルコシンメチルエステル（ａｃｒｙｌｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（機能試薬ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の三つのモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒｓ）から構成される、ポリジメチルアクリルアミドポリマー（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｐｏｌｉｍｅｒ）を基礎としている。ペプチドから樹脂への開裂可能に結合する試薬には、酸不安定性の４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸誘導体（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が用いられる。全てのアミノ酸誘導体は、逆向きのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｎ，Ｎ−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ／１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）が仲介するカップリング過程を用いて加えられるアスパラギンとグルタミンを除き、予め形成された（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）それらの対称無水物誘導体（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）として加えられる。全てのカップリングおよび脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応は、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）���トリニトロベンゼンスルホン酸（ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、又はイソチンテスト過程（ｉｓｏｔｉｎ  ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いてモニターされる。合成完了時、ペプチドは、５０％不純物除去剤混合物（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｍｉｘ）を含む９５％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）処理による側鎖保護基の除去に伴って、樹脂支持体（ｒｅｓｉｎ  ｓｕｐｐｏｒｔ）から解離される。一般的に用いられる不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）は、エタンジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、アニソール（ａｎｉｓｏｌｅ）と水（ｗａｔｅｒ）で、合成されているペプチドの成分であるアミノ酸に基いて厳密に選ばれる。トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）は減圧蒸発によって除去され、引き続いてジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）で磨砕し、粗ペプチドを得る。存在するあらゆる不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）は、水相の凍結乾燥による単純な抽出工程（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって取り除かれ、不純物除去剤（ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）のない粗ペプチドを与える。ペプチド合成の試薬は、一般にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ７  ２ＱＪ，ＵＫから得られる。精製は、サイズ除去クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）そして（主要なものに）逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒａｐｈｙ）のような技術の、一つによって又は組み合わせて行われてもよい。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｕｒａｐｈｙ）、酸加水分解後のアミノ酸分析（ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、高速原子衝突マススペクトル分析（ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ＦＡＢ）ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて行われてもよい。
【０１０３】
本発明のさらなる側面は、発明の第一の側面で定義されたポリペプチド活性を調節するドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ  ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）又はドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ  ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）開発のための誘導化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を同定する方法を提供する。その方法は、化合物と、ポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体との接触、及び前記化合物が存在しない状態において、前記ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性が、前記ポリペプチド、又はそれの前記変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体の活性と比較して変化するかどうかの測定とを有する。
【０１０４】
ドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ  ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という用語は、当業者によく知られたものであり、例えば薬の中の活性成分として、医療分野での使用がふさわしいかもしれない特徴を持つ化合物という意味を含んでもよい。従って、例えば、ドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ  ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、分子生物学や生化学の技術者よりも、むしろ有機化学者によって合成されるのが好ましい分子かもしれない。そして、５０００ダルトン分子量より小さく、水溶性であるような、小さな分子であることが好ましいかもしれない。ドラッグ様化合物（ｄｒｕｇ  ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、さらに、特定のタンパク質やタンパク質群との選択的相互作用や、生物学的利用性、そして／又は標的細胞膜を通過するという特徴を示すが、これらの特徴は絶対的なものでないことが認識されるであろう。
【０１０５】
誘導化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という用語は、同様に当業者に知られており、化合物そのものは薬として用いられるのにふさわしくないかもしれないが（例えば目的とする標的に対する効能が弱い、作用が非選択的である、不安定である、溶けにくい、合成するのが困難である、生物学的利用性が低いなどの理由で）、より望ましい特徴を持つ他の化合物をデザインする出発点を与え得る化合物という意味を含んでもよい。
【０１０６】
その化合物は、さらに以下で述べるように、例えばＭＡＰＫ２又はＳＡＰＫ２／ｐ３８によってその活性化を阻害するような、本発明のポリペプチドと相互作用したり、調節したりすることによって作用するかもしれない。
【０１０７】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においてポリペプチドの活性を調節しうる化合物を同定するのが望ましいことが理解されるであろう。従って、生体内において、前記ポリペプチドとその基質との相互作用が、ヒトＭＳＫ１又はＭＳＫ２とその基質や基質群との間の相互作用と実質上同じになるように、その方法の中で用いられる試薬と条件が選ばれるかもしれないということが理解されるであろう。前記ＭＳＫ１ポリペプチドの基質の例は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１である。
【０１０８】
一つの実施例において、その化合物は前記ポリペプチドの活性を低下させる。例えば、その化合物は実質上可逆的に、又は実質上非可逆的に前記ポリペプチドの活性部位に結合するかもしれない。さらなる例としては、その化合物は、前記ポリペプチドがその基質に結合するのを妨げるために、前記ポリペプチドの活性部位ではない部分に結合するかもしれない。また、さらなる例としては、その化合物は、アロステリック効果によって前記ポリペプチドの活性を低下させるために、前記ポリペプチドの一部分に結合するかもしれない。このアロステリック効果は、例えばＭＡＰＫ２やＳＡＰＫ２／ｐ３８のような上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）による前記ポリペプチドの活性化のように、前記ポリペプチド活性の自然法則に含まれるアロステリック効果かもしれない。
【０１０９】
化合物Ｒｏ３１８２２０は、実施例１および実施例５で述べられているように、ＭＳＫ１やＭＳＫ２の阻害剤の例である。この化合物は、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２に加えて他のプロテインキナーゼを阻害するが、例えばＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のような、これらの他のプロテインキナーゼのいくつかは、実施例１で述べられているように、ＭＳＫ１活性を除去する化合物濃度では十分に変化を受けない。
【０１１０】
さらなる実施例において、その化合物は前記ポリペプチドの活性を高める。例えば、その化合物は、前記ポリペプチドのその基質への結合を助けるために、前記ポリペプチドの活性部位ではない部分に結合するかもしれない。さらなる例では、その化合物は、アロステリック効果によって前記ポリペプチドの活性を高めるために前記ポリペプチドの一部分に結合するかもしれない。このアロステリック効果は、例えばＭＡＰＫ２やＳＡＰＫ２／ｐ３８のような“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”による前記ポリペプチドの活性化のように、前記ポリペプチドの活性の自然法則に含まれるアロステリック効果でもよい。
【０１１１】
都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているようにＭＳＫ１又はＭＳＫ２が、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ、又はＡＴＦ１又はＣｒｏｓｓｔｉｄｅをリン酸化するという事実を利用するが、適当ないかなる基質が用いられてもよい。従って、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ又はＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＡＴＦ１のリン酸化は当業者によく知られた技術を用いて測定されるかもしれない。
【０１１２】
都合のよいことに、その方法は、実施例１で示されているものと実質的に同様かもしれない定量（ａｓｓａｙ）を利用する。実施例１では、ＭＳＫ１によるＣＲＥＢ又はＡＴＦ１のリン酸化が測定される。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２は、組換えＭＳＫ１又はＭＳＫ２であることが好ましい。基質は、例えばＣＲＥＢやＡＴＦ１のように、組換え体であることが好ましい。
【０１１３】
もう一つのものとして、基質の活性における変化が測定されるかもしれない。例えば、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の転写因子としての活性が測定されるかもしれない。これは、当該学術分野でよく知られているように、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の、適当な結合部位を持つＤＮＡへの結合をを測定することによって行われてもよく、又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって調節されるプロモーターからのＲＮＡの発現を測定することによって行われてもよい。これは、細胞システム全体の中で、又は精製された、又は部分的に精製された成分を用いることで、行われてもよい。同様に、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１で調節されるプロモーターから転写されるＲＮＡによってコードされているタンパクの発現が、測定されるかもしれない。そのタンパクは、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１によって生理学的に調節されているかもしれないし、又は当業者によく知られている”リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）”かもしれない（すなわち、組換え体構造が用いられるかもしれない）。リポータータンパク（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、例えばβ−グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（例えばＴａｎ等（１９９６）参照）のように、活性が容易に測定されるかもしれない。
【０１１４】
ＣＲＥＢによって生理学的に調節されているプロテイン群は、ＣＯＸ２とＩＬ−１かもしれない。従って、ＣＲＥＢの阻害は、実施例５に示されるように、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の発現が予想される環境下において、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の発現を測定することによって測定されるかもしれない。従って、ＣＯＸ２は、例えばＭｉｔｃｈｅｌｌ等（１９９４）ＰＮＡＳ  ９０，１１６９３−１１６９７、およびＤｕｂｏｉｓ等（１９９８）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２，１０６３−１０７３に示されるように、エンドトキシンに暴露したＲＡＷ  ２６４ネズミ科マクロファージ又はＪ７７４．２マクロファージにおいて発現するかもしれない。Ｊ７７４．２とＲＡＷ２６４細胞は、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫから得られてもよい。ＣＯＸ２とＩＬ−１の発現は、何らかの簡便な方法、例えば、ＣＯＸ２又はＩＬ−１  ｍＲＮＡの存在を検出するＰＣＲや、ＣＯＸ２又はＩＬ−１タンパクを検出する抗体に基づいた定量、また、例えば（ＣＯＸの基質である）アラキドン酸に細胞を暴露してつくられるＰＧＥ２のようなプロスタグランジンの量を測定することによるＣＯＸ２の酵素活性を検出する定量などを用いて測定されるかもしれない。適した定量は、実施例５、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等（１９９４）、Ｓｌａｔｅｒ等（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７２（１），７７−８２又はＷＯ  ９４／１４９７７に記載されるだろう。プロスタグランジンは不安定であって速やかに代謝されるので、ＣＯＸ２の直接の生成物よりもむしろプロスタグランジン代謝物が測定されるだろう。
【０１１５】
いかなる測定が行われても、導く過程における何らかの他の効果を持つよりも、むしろ化合物がＣＲＥＢの活性化に影響を及ぼしているのを測定するために、当業者によく知られているように、様々なコントロール定量を行うことが必要であろう。しかしながら、例えばプロスタグランジン量が測定されるような定量は、細胞全体や生体内システムにおける化合物の有用性の評価や、例えば疾患における異なるモデルなど、異なる状況における概念の評価に有用かもしれない。例えばＣＯＸ２の発現や活性における化合物の効果が測定される定量は、平行して用いられてもよいし、また、例えばＭＳＫ１がＣＲＥＢをリン酸化するような能力における化合物の効果が、より直接的に測定されるような他の定量からの結果を用いて解釈されてもよいことが認識されるであろう。
【０１１６】
本発明のさらなる側面は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１の他の基質、）に結合し、かつ、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１によりその活性を促進又は阻害する化合物を同定する方法を提供する。その方法は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１の他の基質）、又はそれらの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント、変異体、派生物の適する融合体と、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド（好ましくはＭＳＫ１）との相互作用を、化合物が促進するか又は阻害するかの測定、又は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、好ましくはＭＳＫ１の他の基質）、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント、変異体、派生物の適する融合体の活性化を、本発明の第一の側面で定義されたようなポリペプチドにより、この化合物が実質的に遮断するかどうかの測定を有する。
【０１１７】
適当な定量は、上記と同様である。
【０１１８】
本発明のさらなる側面は、“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”、例えばＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２又はＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２により本発明の第一の側面で定義されたポリペプチドの活性化を調節する化合物を同定する方法を提供する。”上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”という言葉において、本発明のポリペプチドと相互作用した結果、本発明のポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を高める分子が意味される。それは一つのポリペプチドでもよい。好ましくは、それは天然ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の生理学的な活性化因子である。
【０１１９】
その方法は、化合物が、（ａ）本発明の第一の側面で定義されたポリペプチド、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント、変異体又は派生物の適する融合体と、（ｂ）“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”、例えばＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２、又はそれらの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体、又は変異体、派生物又はフラグメントの適する融合体との間の相互作用を促進するか又は崩壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）かの測定、又は、この化合物は、“上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）”又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体により、前記ポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は前記フラグメント、派生物又は融合体の融合体の活性化を実質的に遮断するかどうかの測定を有する。その化合物は、上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）又は本発明のポリペプチドのいずれか一方と、又はその両方と、相互作用するか又は結合してもよいことが認識されるであろう。
【０１２０】
ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を調節できる化合物の例は、例えば当業者に知られている、ＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）や、例えばＳＢ２０３５８０やＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）などの、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の阻害剤を含む。
【０１２１】
”ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）”という用語は、当業者によく知られたものであり、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ等（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５（１），４９−６４で述べられているように、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８と結合する及び／又はＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８を阻害する（また、あまり好ましくはないが、単球からのＩＬ−１の生成を阻害することで知られる）置換基を伴った、ピリジン環（ｐｙｒｉｄｙｌ  ｒｉｎｇ）とイミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ）からなる化合物を含む。ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はまた、例えば、ＷＯ９５／０２５９１の中で論議されている。このタイプの化合物は、サイトカイン抑制抗炎症薬（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ）（ＣＳＡＩＤｓ）のように、特定のプロテインキナーゼ阻害剤として知られる。これらの化合物のシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）研究における使用法は、Ｃｏｈｅｎ（１９９７）Ｔｒｅｎｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７，３５４−３６１の中で示されている。
【０１２２】
特定の化合物／タンパクとの結合に対する結合親和性や阻害ＩＣ５０を数値で表した測定値は、厳密な定量システムに基いていることが認識されるであろう。ピリジニルイミダゾール（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）は、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ等において述べられているように、もしＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８（ＣＳＢＰ）に対し１００μＭより少ない、好ましくは１０μＭより少ない、さらに、より好ましくは１又は０．１、又は０．０１μＭより少ない結合ＩＣ５０（ｂｉｎｄｉｎｇ  ＩＣ５０）又はキナーゼＩＣ５０（ｋｉｎａｓｅ  ＩＣ５０）を持つ場合、ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とみなされるかもしれない。ピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の例は、Ｔｏｎｇ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４（４），３１１−３１６で述べられているように、ＳＢ  ２０２１９０（ａ  ２，４，５−ｔｒｉａｒｙｌｉｍｉｄａｓｏｌｅ）、ＳＢ  ２０３５８０（もう一つの３，４，５−ｔｒｉａｒｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）そして、３’−ヨード化化合物（３’−ｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のような誘導体を含む。ｐ−メチルスルフィニルフェニル基（ｐ−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）が除去された誘導体は、また阻害剤としても作用するかもしれない。置換基は、イミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ）のＮ１原子につくられるかもしれず、イミダゾール環（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ）の２位の位置につくられた置換基は、効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）の重大な損失を伴わずにＮ１原子に移されるかもしれない。
【０１２３】
ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を調節できる化合物の例は、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２の阻害剤やＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２の活性化の阻害剤、例えばＭＡＰＫキナーゼ１（ＭＫＫ１）活性又は活性化の阻害剤、例えばＤＰ９８０５９又はＵＯ１２６を含む。
【０１２４】
ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２は、知らているＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化因子である。ここでは、ＭＳＫ１やＭＳＫ２として知られる本発明のポリペプチドの活性化因子としても示されている。”ＭＳＫ１の活性化”という言葉において、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１（又は上記で挙げられるような基質の他のもの）をリン酸化するＭＳＫ１の能力は、次のＭＳＫ１の処理、例えばＭｇＡＴＰとＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２により増大することが意味される。
【０１２５】
活性化されたＧＳＴ融合体としてのＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８とＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２の発現は、実施例１で述べられており、その中で上記タンパク質の配列を示している。
【０１２６】
従って、本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチド、例えばＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性化に関するＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２の用途である。
【０１２７】
本発明のさらなる側面は、本発明のプロテインキナーゼ（ポリペプチド）と相互作用するポリペプチドを同定する方法を提供する。その方法は、（１）（ａ）本発明の第一の側面で定義された前記プロテインキナーゼ、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又はそれの変異体、フラグメント又は派生物の融合体と、（ｂ）前記プロテインキナーゼと相互作用するポリペプチドを含有する化合物との接触（２）前記プロテインキナーゼとポリペプチドを含有する複合体の存在の検出、及び任意に（３）どのポリペプチドが前記プロテインキナーゼと結合するのかの同定を有する。
【０１２８】
一つの実施例において、その構造物（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は細胞成分からなるかもしれない。特に、細胞は次のようなタイプから選ばれるかもしれない：（１）刺激を受けたときもＭＳＫ１又はＭＳＫ２活性を持たない細胞、（２）刺激にさらされた後ＭＳＫ１又はＭＳＫ２活性を持つが、それほどさらされてはいない細胞、（３）刺激にさらした後の（２）のタイプの細胞。タイプ１〜３のみのサブセットにみられるポリペプチド群は、特に興味深いものがあり、さらに特徴づけられるかもしれない。そのようなペプチドは、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性化因子かもしれない。また一方では、それはＭＳＫ１又はＭＳＫ２の不活性化因子かもしれない。
【０１２９】
その方法は、たとえば当該学術分野でよく知られている酵母二ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、細胞の中で行われてもよいことが認識されるであろう。この例では、前記三つのタイプの細胞由来のｍＲＮＡから複製されたｃＤＮＡが用いられる。
【０１３０】
ＭＳＫ１又はＭＳＫ２遺伝子が変化される、及び／又は、組換ＭＳＫ１又はＭＳＫ２遺伝子が存在するトランスジェニック動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、例えば齧歯類、特にマウスが、例えばＭＳＫ１又はＭＳＫ２の基質の同定に有用かもしれないことが、さらに認識されるであろう。
【０１３１】
本発明のさらなる側面は、相互作用するポリペプチド、例えばＭＡＰＫ２又はＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２により、本発明の第一の側面で定義されたポリペプチドの活性化を遮断する化合物を同定する方法を提供する。その方法は、化合物が、（ａ）本発明の第一の側面で定義されたプロテインキナーゼ、又はそれの適するフラグメント、変異体、派生物又は融合体、又はフラグメント、変異体、派生物の適する融合体と、（ｂ）前記相互作用するポリペプチド、又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体、又は変異体、派生物、フラグメントの適する融合体との間の相互作用を促進するか又は崩壊する（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）かの測定、又は、この化合物が、本発明の第一の側面によるポリペプチド、又はそれの適する変異体、フラグメント、派生物又は融合体、又は前記フラグメント、派生物、融合体の融合体の活性化を、前記相互作用するポリペプチド又はそれの適する変異体、派生物、フラグメント又は融合体により、実質的に遮断するかどうかの測定を有する。
【０１３２】
都合のよいことには、この方法の中で用いられる本発明の第一の側面による前記ポリペプチド、又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体は、遺伝子組み換え技術によって産生されるものである。同様に、もし、前記プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を同定する方法において用いられた、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体が、遺伝子組み換え技術によって産生されるものであれば好ましい。同様に、もしその方法の中で用いられるＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２又は他の”上流活性化因子”（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）又はそれのフラグメント、派生物、変異体又は融合体が、遺伝子組み換え技術によって産生されるものであれば好ましい。
【０１３３】
定量に用いる前に本発明のポリペプチドを活性化することが必要となることが認識されるだろう。好ましい実施例では、本発明のポリペプチド（ＭＳＫ１又はＭＳＫ２）は、実施例１で述べられているように、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とＭｇＡＴＰでポリペプチドを処理することにより活性化される。もし、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２が、本発明の方法によってつくられた組み換えポリペプチドであれば、特に好ましい。
【０１３４】
“適する（ｓｕｉｔａｂｌｅ）”という言葉において我々が意味するものは、その方法の中の前記化合物は、場合によりＭＳＫ１又はＣＲＥＢ又はＡＴＦ１又は他の基質、又はＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８又はＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２のような上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）と実質的に同じ相互作用と活性を持つが、定量に用いるのにより簡便であるもの、ということが認識されるであろう。例えば、ＭＳＫ１又はＣＲＥＢの融合体は、前記融合体が容易に精製されるような部分を含んでいるかもしれないので、特に有用である。
【０１３５】
述べられている方法は、細胞の中で行われることが認識されるであろう。”レポーター遺伝子”（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）の構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、本明細書の教示を用い、当業者に知られている方法により調整されるだろう。例えば、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）の構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１依存性プロモーター配列でつくられるかもしれない。この構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２構築物とともに、母細胞株がＣＲＥＢ又はＡＴＦ１が知られた刺激に対する応答で活性化され、内因性のＭＳＫ１又はＭＳＫ２遺伝子が不活性化されている、細胞株に導入されるかもしれない。また一方で、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１が知られた刺激に対する応答で活性化される細胞株に導入されることができる。レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）の発現は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性に依存し、従って化合物の影響は測定されることができるであろう。さらなる例では、レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）は細胞にとっては致命的なものかもしれず、また一方では、ほかの致命的な条件のもとで細胞を生存させるかもしれない。従って、細胞の生存が、例えばＷＳＴ−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の還元などのミトコンドリア活動性に対する比色定量を用いて測定されることができる。ＷＳＴ−１は、サクシネートデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を介して受け取る電子の吸収において変化を受ける台湾染料である。さらなる例では、酵母二ハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）が使われる。
【０１３６】
前記本発明のポリペプチドと、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２又は上記で定義された相互作用ポリペプチド、又は適する派生物、フラグメント、融合体又は変異体との相互作用の促進又は崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が、生物化学の技術分野においてよく知られている方法、またタンパク−タンパク相互作用を評価するのに用いることができる何らかの方法を用いて、生体外で測定される。
【０１３７】
前記相互作用はまた、当該学術分野でよく知られている酵母二ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、細胞内でも測定されることができる。
【０１３８】
本発明は、例えばＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性、又はその上流活性化因子（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）との相互作用の、促進又は阻害のいずれかを調節するのに有用かもしれないドラッグのスクリーニング検定法（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を提供することが認識されるであろう。その方法で同定される化合物は、それ自体がドラッグとして有用かもしれないし、又はより効果的な化合物のデザインや合成のための誘導化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を示すかもしれない。
【０１３９】
高い処理能力を持つスクリーニング検定（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）が特に好ましいことが認識されるであろう。例は、述べられている細胞に基いた検定（ａｓｓａｙ）と、タンパク−タンパク結合検定（ａｓｓａｙ）を含んでもよい。さらなる例は、実施例２で述べられているＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）に基いたシステム（ＳＰＡ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）である。
【０１４０】
本発明のさらなる側面は、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物を提供する。ここでこの化合物はＲｏ３１８２２０、ＰＤ９８０５９、又は既知のＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではない。この化合物は、ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性を、促進する化合物、又は阻害する化合物だろう。またさらなる側面は、医療用の化合物を提供する。
【０１４１】
転写因子ＣＲＥＢは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、ＩＬ−１および酵素シクロオキシケナーゼ２又はプロスタグランジンシンターゼ−２（ＣＯＸ２／ＰＧＳ−２）の産生に必要とされる。我々はここに、ＣＲＥＢはＭＳＫ１／ＭＳＫ２によって活性化されることを示す。従って、ＭＳＫ１の阻害剤は、ＩＬ−１及び／又はＣＯＸ２の阻害剤の効果を持つだろうし、それゆえに、ＩＬ−１活性及び／又はＣＯＸ２の阻害剤と同様の臨床適応を持つだろう。
【０１４２】
ＩＬ−１は、炎症伝達物質（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。ＣＯＸ２は、プロ炎症シグナル物質（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であるプロスタグランジンのアラキドン酸からの合成に関わる、プロ炎症酵素（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ）として当業者にはよく知られている。ＣＯＸ２がプロ炎症シグナル経路の結果、炎症の初期で発現されるのに対し、シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ１）は、組織的に発現される関連酵素（ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ）である。アスピリンのようなＣＯＸ１阻害剤は、炎症を抑えるかもしれないが、しかし胃潰瘍を含む胃腸障害などの副作用を持つ。それゆえに、メロキシカムのような選択的ＣＯＸ２阻害剤の開発にさらなる努力が向けられている。しかし、多くのＣＯＸ２阻害剤はまた、ＣＯＸ１に対する活性も持つ。
【０１４３】
選択的ＣＯＸ２阻害剤は、副作用を回避しながら、ＣＯＸ１阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）に匹敵する、抗炎症、鎮痛、そして解熱作用を持つかもしれない（Ｂｏｔｔｉｎｇ（１９９６）Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  ＆  Ｐｅｒｓｐｅｃ  ９（２），１２３−１２８に示される）。
【０１４４】
それゆえに、（前述の本発明の化合物のような）ＭＳＫ１／ＭＳＫ２活性や活性化の阻害剤は、ＩＬ−１、ＣＯＸ２、又はプロスタグランジンが関係している後述の疾患又は状態の治療の方法において有用かもしれない。
【０１４５】
そのような疾患や状態は、炎症又は組織の傷害に関連するものを含む。ＣＯＸ２阻害剤が研究された炎症性疾患には、骨関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、そして他のリウマチ性や痛みの適応症を含む。炎症が関係し、またＭＳＫ１／ＭＳＫ２阻害剤が有用かもしれない他の疾患は、喘息（ａｓｔｈｍａ）、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、炎症性内臓疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む。プロスタグランジンは、子宮の収縮と痛み、および分娩に関係している（例えばＰｕｌｋｋｉｎｅｎ（１９９３）Ｄｒｕｇｓ  ４６（ｓｕｐｐｌ  １），１２９−１３３およびＳｌａｔｅｒ等（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７２（１），７７−８２参照）。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２阻害剤が有効かもしれないさらなる疾患は、ＷＯ  ９６／４１６４５に列挙されているだろう。
【０１４６】
本発明のさらなる側面は、炎症性疾患の治療に有用となり得る分子の同定において、本発明のスクリーニング方法のいずれかの用途である。
【０１４７】
本発明のさらなる側面は、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の活性の調節、例えば減少又は増加を必要とする患者の治療に有用となり得る分子の同定において、本発明のスクリーニング方法のいずれかの用途である。
【０１４８】
本発明のスクリーニング方法のいずれかによって同定可能な化合物は、炎症性疾患の治療に有用となり得ると考えられている。炎症性疾患は、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、そして炎症性内臓疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、また上記のような他の疾患又は状態を含む。
【０１４９】
従って、本発明のさらなる側面は、炎症性疾患の患者を治療する方法を提供する。その方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の有効量を患者に投与することを有する。ここでこの化合物は、既知のＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）阻害剤、例えばＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｌｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ではない。そのスクリーニング方法は、活性化又は阻害する化合物を同定するだろう。いずれかの活性を持つ化合物が適するだろうが、その化合物がＭＳＫ１又はＭＳＫ２により仲介されるリン酸化を阻害することが好ましい。
【０１５０】
またさらに発明は、患者の炎症性疾患を治療するための薬剤の製造における、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の用途を提供する。ここでこの化合物はＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１５１】
本発明の更なる側面は、患者を治療する方法を提供し、患者はＣＯＸ２又はＩＬ−１の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とするものである。この方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能である効果的な量の化合物を患者に投与することを有し、ここでこの化合物はＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。スクリーニング方法は、活性化するか阻害する化合物を同定するだろう。どちらかの活性がある化合物は適当であろうが、その化合物はＭＳＫ１又はＭＳＫ２により仲介されるリン酸化を阻害することが好ましいだろう。
【０１５２】
またさらに発明は、ＣＯＸ２又はＩＬ−１の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造における、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供する。ここでこの化合物は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１５３】
また本発明の更なる側面は、患者を治療する方法を提供し、患者はＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加（好ましくは減少）を必要とするもので、この方法は、（１）ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、既知であるＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））と、（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９とを患者に投与することを有する。
【０１５４】
また本発明の更なる側面は、（１）ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、既知であるＳＡＰＫ２／ｐ３８のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））と、（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９、との用途を、ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造において提供する。
【０１５５】
また、本発明の更なる側面は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知であるピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））の用途を、ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造において提供する。ここで、この患者は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９をすでに投与されているか今後投与されるものである。
【０１５６】
また、本発明の更なる側面は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えばＰＤ９８０５９の用途を、ＣＯＸ２の活性調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、例えば、減少又は増加を必要とする患者を治療するための薬剤の製造において提供し、ここでこの患者は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の阻害剤、例えば、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知であるピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））をすでに投与されているか今後投与されるものである。
【０１５７】
そのような、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物は、アポトーシスが伴われる病気を治療することに有用であるとさらに考えられる。例えば、そのような化合物はアポトーシスを抑制するかもしれず、これは細胞損傷過程の間又は細胞損傷過程に続く細胞生存を助けるだろう。そのような病気の例は、限定はされないが、虚血性疾患（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば発作（ｓｔｒｏｋｅ）と心筋梗塞、神経損傷（ｎｅｕｒａｌ  ｉｎｊｕｒｙ）と心筋梗塞を含む。
【０１５８】
ＣＯＸ−２は長期間の増強作用とシナプスの塑性に伴われるだろうし、発現はアポトーシス細胞死に優先し、アルツハイマー病のような神経退行性の病気に伴われるだろう。焦点となっている虚血（ｉｓｃｈａｅｍｉａ）は、皮質神経でのＣＯＸ２発現を含み、これは特に虚血性付随（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ）に続く死のようなものであろう。
【０１５９】
本発明の化合物のいくつか、例えば、ＣＲＥＢの増大した活性化をもたらす化合物はアポトーシスを助けるだろう。アポトーシスを助けている症状は、炎症の分解を含むためになりうる。ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１の減少した活性をもたらす本発明の化合物は、アポトーシスを阻害するだろう。
【０１６０】
したがって、本発明のさらなる側面は、虚血性疾患の患者を治療する方法を提供し、この方法は、本発明のスクリーニング方法により同定可能である、効果的な量の化合物を患者に投与することを有するもので、ここでこの化合物はＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１６１】
また更に発明は、患者の虚血性疾患を治療するための薬剤の製造における、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供し、ここでこの化合物は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１６２】
ＣＯＸ２は組織損傷（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａとａｌｌｏｄｙｎｉａ）に続いて起こる痛覚の変化に伴われ得るので、ＭＳＫ１の阻害剤は無痛覚症に有用だろう。ＣＯＸ２の発現は、偏頭痛に伴われ得るため、ＭＳＫ１の阻害剤は偏頭痛の治療に有用であろう。従って、本発明のさらなる側面は、偏頭痛を持つ又は無痛覚症をわずらう患者を治療する方法を提供し、この方法は、本発明のスクリーニング方法により同定可能であって、効果的な量の化合物を患者に投与することを有する。
【０１６３】
ＣＯＸ２は、がんに関わる。ＣＯＸ２を阻害することはがんを防止又は治療することに有用であろう。ＣＯＸ２は血管形成を促進し得る。ＣＯＸ２の阻害は、例えば結腸がんで、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）のセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）への変換を順々に刺激しうるアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のレベルを増加することにより、抗がん剤効果を持つだろうが、これはアポトーシスの仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として既に示唆されている。従って、上記本発明の化合物のようなＭＳＫ１阻害剤は、がんの治療又は防止に有用だろう。
【０１６４】
本発明の化合物はまた、アルツハイマー病の治療又は防止に有用だろう。ＮＳＡＩＤｓとコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）（抗炎症性でもある）はアルツハイマー病の発病の遅延又は進行を遅らせることに有用であると示唆されており、たとえ低用量で使用したとしても、鎮痛効果には十分であるが、抗炎症性治療のために用いられるよりも効果は少ない。ＣＯＸ２発現は、炎症性の仲介剤（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）に応じてアルツハイマー病の脳と膠細胞で高められることが示されている。形質転換したマウスモデルのニューロンでのＣＯＸ２の過剰発現は、インビトロでのβ−アミロイド（−ａｍｙｌｏｉｄ）神経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を導くだろうから、アルツハイマー病でのＣＯＸ２の役割を裏付けている。従って、ＭＳＫ１阻害剤は、アルツハイマー病及び他の神経退行性の病気の治療又は防止に有用だろう。
【０１６５】
Ｆｏｓは細胞のがん化及び悪性がんに伴うだろう。従って、本発明のさらなる側面は、がんを持つ患者を治療する方法を提供し、この方法は本発明のスクリーニング方法により同定可能である効果的な量の化合物を患者に投与することからなり、ここでこの化合物はＰＤ９８０５９ではない。この化合物はＲｏ３１８２２０でないことが好ましい。
【０１６６】
また本発明のさらなる側面は、がんを治療するための薬剤の製造における、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物の用途を提供し、ここでこの化合物はＰＤ９８０５９ではない。この化合物はＲｏ３１８２２０でないことが好ましい。
【０１６７】
前述の本発明の化合物又はこれらの調合物は、内服や非経口（例えば、皮下又は筋肉）注射を含む従来のいずれかの方法により投与され得る。治療は一回の服用、又は時間間隔を開けた複数回の服用からなるだろう。
【０１６８】
本発明の化合物が単独で投与されることが可能である間に、それを薬剤の調合として１つ又はそれ以上の受容可能なキャリアと共に示すことが好ましい。キャリアは、本発明の化合物と適合可能であるという意味で“受容可能”でなければならず、それらの受容体に有害であってはならない。典型的には、キャリアは無菌かつ発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）フリーの水又は塩類溶液だろう。
【０１６９】
従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング方法により同定可能な化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを有する薬剤の組成を提供するもので、ここで、この化合物はＰＤ９８０５９、Ｒｏ３１８２２０、又はＳＡＰＫ２／ｐ３８の既知のピリジニルイミダゾール阻害剤（ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えば、ＳＢ２０３５８０又はＦＨＰＩ（４−（４−フルオロフェニル）−２−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール）（ＦＨＰＩ（４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ））ではない。
【０１７０】
本発明のさらなる側面は、化合物のためのスクリーニングアッセイ（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）においての、本発明の第一の側面で定義されたようなポリペプチド（プロテインキナーゼ）の用途を提供するものである。その化合物は前記プロテインキナーゼの活性を阻害するか、前記プロテインキナーゼの相互作用を妨げる。
【０１７１】
本発明のさらなる側面は、前記スクリーニング方法を行う際に有用なパーツキット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）を提供する。従って、パーツキットは、本発明のポリペプチドと、このポリペプチドの基質とを有する。ポリペプチドの基質は、例えば、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）、ＣＲＥＢ又はＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ）、又は、例えばＧＳＴ−ＣＲＥＢ又はＡＴＦ１又はそれらの融合タンパク質であるＣＲＥＢ融合タンパク質である。代わりになるべきものとして、このキットは、本発明のポリペプチドと、上記のような本発明のポリペプチドを活性化するのに有用なタンパク質、例えばＭＡＰＫ２、を有してもよい。このキットは、（１）本発明のポリペプチドと（２）上記のような、前記ポリペプチドの基質と、（３）上記のような、前記ポリペプチドを活性化する際に有用なタンパク質とを有してもよい。
【０１７２】
【発明の実施の形態】
本発明は以下の図と実施例とを参照してより詳細に説明される。
【０１７３】
実施例１：マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）及びストレス活性化されたプロテインキナーゼ（ＭＳＫ１）、新規な２つのキナーゼドメイン酵素は、ＭＡＰＫとＳＡＰＫ２／ｐ３８によって直接活性化されるもので、おそらくＣＲＥＢの活性化を仲介するだろう。
【０１７４】
私達は、２つのプロテインキナーゼドメインを単一のペプチドに含む、新規なマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）及びストレス活性プロテインキナーゼ（ＭＳＫ１）及び密接に相関した同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（ＭＳＫ２）を同定した。ＭＳＫ１（８０２残基）は、ＭＡＰキナーゼ活性プロテインキナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ｐ９０  ＲＳＫともいう）他の“２つのキナーゼドメイン”酵素に対して全アミノ酸配列の４３％が相同性を示す。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での対応するドメインに対して５４％及び４４％が同一であり、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１での４つの主要な活性化リン酸化部位はＭＳＫ１に保持されている。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と同様に、ＭＳＫ１はＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２によりインビトロで活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と異なり、ＭＳＫ１はストレス活性プロテインキナーゼ２ａ（ＳＡＰＫ２ａ、ｐ３８ともいう）及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β２によっても活性化される。これらの結果と一致して、内因性のＭＳＫ１は、２９３細胞内で、ポリペプチド成長因子／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によって、又はＵＶ放射、酸化的及び化学的ストレスへの暴露によってのいずれかにより活性化されるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は意味深いことに成長因子／ホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）刺激のみで活性化される。成長因子／ホルボールエステル刺激（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によるＭＳＫ１の活性化は、ドラッグＰＤ  ９８０５９、これはＭＡＰＫカスケード（ＭＡＰＫ  ｃａｓｃａｄｅ）の活性を抑制する、により阻害されるが、一方ＵＶ放射、酸化的及び化学的ストレスによるＭＳＫ１の活性化はＳＢ  ２０３５８０、すなわちＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８及びＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特定の阻害剤によりほとんど阻害される。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞では、ＰＤ  ９８０５９とＳＢ  ２０３５８０との両方がそれぞれＴＮＦ、ＮＧＦ、及びＦＧＦによるＭＳＫ１の活性化抑制に必要とされる。なぜなら、このアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）はＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方を活性化するからである。ＭＳＫ１の活性化は、Ｎ末端又はＣ末端キナーゼドメインのどちらかにおける変異を単一（ｓｉｎｇｌｅ）不活性化させることにより終了する。ＭＳＫ１は非刺激又は刺激細胞の核に局在化するが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは、同じ条件下ではほとんど細胞質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）に局在化する。ＭＳＫ１は、ＰＫＡ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２より非常に低いＫｍ値で、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）ＣＲＥＢをＳｅｒ１３３においてリン酸化する。Ｓｅｒ１３３周辺の配列に対応するペプチドは、著しく低いＫｍ値（＜０．１μＭ）でリン酸化される。４つの細胞系内でのＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の作用薬（ａｇｏｎｉｓｔ）誘導活性化でのＳＢ  ２０３５８０、ＰＤ  ９８０５９及びＲｏ  ３１８２２０の効果は、これらの阻害剤のＭＳＫ１活性化での効果を反映し、この過程でのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３及びＭＡ���ＫＡＰ−Ｋ１の役割を排除している。これらの結果は他の観察結果と共に、ＭＳＫ１はＣＲＥＢの成長因子及びストレス誘導活性化を仲介するだろうということを示唆している。
【０１７５】
結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
【０１７６】
新規なＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１関連キナーゼとしてのＭＳＫ１の同定。私達は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＮ末端キナーゼドメインをコード化するＤＮＡ配列を使用し、ＮＣＢＩ  ＥＳＴデータベースに質問した（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）。この調査は、このサブファミリーの新規なメンバーの全長ｃＤＮＡクローンをコード化する１つのＥＳＴ（ＡＡ１１５８５７１）を同定した。以下ＭＳＫ１という。オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）は、分子量８９．９ｋＤａの８０２のアミノ酸のタンパク質をコード化した。５’から予測された開始ＡＴＧコドンのすぐに終止コドンがある。ＭＳＫ１ポリペプチドドメインは２つのプロテインキナーゼドメイン（図１）を持ち、その両方とも全プロテインキナーゼの１１のサブドメインの特徴を含んでいた（Ｈａｎｋｓ等、１９８８）。ＭＳＫ１はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の３つのアイソフォームと最大の類似性を示し、これはまた２つのキナーゼドメイン（図２Ａ）を持つ。ＭＳＫ１のＮ末端及びＣ末端キナーゼドメインは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の対応するキナーゼドメインと５４％及び４４％が同一であった。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＳＫ１間の全一致は４３％であった。私達は、多くの組織由来のＭＳＫ１のフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコード化する１４のヒトＥＳＴクローン（表１）を同定したが、これはＭＳＫ１が幅広く発現する酵素であることを示している。
【０１７７】
表１
ヒトＭＳＫ１  ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）
ＥＳＴの由来組織
ＡＡ３１４５６５、ＡＡ３０５１６３    結腸がん腫
ＡＡ１３４３５９、ＡＡ１３４３５８    結腸
ＡＡ６９９７２９、Ｒ１１２３５、Ｔ９７５８４、Ｔ９７５３８、Ｒ１１１８３  胎児の肝臓脾臓
Ｗ０４９３０  胎児の肺
ＡＡ１５８５７２、ＡＡ１５８５７１  膵臓
ＡＡ３２２２７０  小脳
Ｈ０９９８５、ＨＯ  ９９８６、Ｆ０５７０１、ＨＳＣ０ｊＥ０８１  幼児の脳
Ｎ３１６４１、Ｎ５７０９６  胎盤
ＡＡ２５５８４６、ＡＡ２５５９９６  胚中心Ｂ  細胞
ＡＡ８９７２２１  混合の
【０１７８】
マウスＭＳＫ１  ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）
ＡＡ４７２１６５  乳腺
ＡＡ３８９１６８、ＡＡ０６１０１６  胚
ＡＡ４４４３６６  心臓
【０１７９】
ヒトＭＳＫ２  ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）
Ｈ４１６４７  成人の脳
Ｒ１７１０９  脂肪細胞
Ｔ１９７６５  心臓血管の  システム
Ｒ７１９６９、ＡＡ６３１８９７、ＡＡ５０５８４２  乳房腫瘍
ＡＡ４４３６０１  卵巣腫瘍
ＡＡ６７８６７０  ゲスラーウィルムス（Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｗｉｌｍｓ）腫瘍
ＡＡ５７０６６８１  前立腺腫瘍
ＡＡ５９４５５９、ＡＡ５７６９７９、ＡＡ５６８８９５  結腸腫瘍
ＡＡ８５７４３１  咽頭  がん腫
【０１８０】
マウスＭＳＫ２  ＥＳＴｓのジーンバンク取得番号（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）
ＡＡ４７２１６５  乳腺
ＡＡ３８９１６８  胚
ＡＡ０６１０１６  胎児
ＡＡ６５７１０８  ｍｙｏｔｕｂｅｓ
ＡＡ２６７４９０  リンパ節
ＡＡ４４４３６６  心臓
【０１８１】
ヒト組織のノーザンブロット分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＭＳＫ１は調べられた全組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び膵臓）で４ｋｂ転写物として発現されることを示し、脳、筋肉及び胎盤において最高レベルで観察された（データは示さず）。ＭＳＫ１のＮ及びＣ末端キナーゼドメインの配列は、ＭＡＰＫファミリーメンバーにより活性化される他のプロテインキナーゼと共に、図２Ｂに示す。
【０１８２】
私達はまた、別のプロテインキナーゼ、これのアミノ酸配列の７５％はＭＳＫ１と同一でありＭＡＰＫＡＰＫ１とは４０％のみ同一である、をコード化するＥＳＴ  ｃＤＮＡクローン（表１）を見出し、これをＭＳＫ２と名づけた。マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＳＫ２のほぼ全長のコード配列及びヒトＭＳＫ２の部分配列をＭＳＫ１と並べて図２Ｃに示す。マウス（ｍｕｒｉｎｅ）及びヒトＭＳＫ２配列はアミノ酸配列が９０％一致する。私達は、多数の細胞及び組織由来であるＭＳＫ２のフラグメントをコード化する８つのヒトＥＳＴ  ｃＤＮＡクローンを同定した。このうち６つは腫瘍細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）であった。ヒト組織のノーザンブロット分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＭＳＫ２は３ｋｂ転写物として、ＭＳＫ１のそれと同様の分布で発現することを示した（結果は示さず）。
【０１８３】
ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２およびＳＡＰＫ２／ｐ３８によるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＭＳＫ１の活性化。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（イントロダクション参照）に存在する４つの重要な活性リン酸化部位（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）が、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２の中に保存される（図２）。プロリン残基（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）へと続くＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｓｅｒ  ３６０およびＴｈｒ  ５８１）の中の４つの部位のうち２つは、ＭＡＰＫによってリン酸化される（図２Ｃ）。これらの観察によって、ＭＳＫ１およびＭＳＫ２が１以上のＭＡＰＫによって活性化されているだろうということが示された。ＭＡＰＫによるＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋｌａとの活性化を比較するために、両方の酵素が、ヒト胚腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｃｅｌｌｓ）の中で、アミノ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（以下、ＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａと呼ぶ）として発現された。両方のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、グルタチオン−セファローゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で精製され、そして、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）にかけたとき、単一で主要なクーマシーブルー染色帯（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂａｎｄ）を示した（図３Ａ）。ＳＤＳ／ポリアクリルアミドケル電気泳動（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって概算されたＧＳＴ−ＭＳＫ１の見かけの分子量（１１６ｋＤａ）は、アミノ酸で６２分子分短い後者の酵素（図２Ａ）と一致したＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（図３Ａ）よりわずかに大きかった。
【０１８４】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）と名付けられたペプチドに対して高い活性を有することが知られている（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９６ａ）。一晩中血清枯渇された（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅｄ）２９３細胞から精製されたＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは、ＭｇＡＴＰおよび活性ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とのインキュベーションによって１００倍以上に強められた基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（２−４  Ｕ／ｍｇ）に対する低い活性を有した（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＧＳＴ−ＭＳＫ１もまたＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８およびＳＡＰＫ２ｂ／３８βによって同様に活性化された（図４Ａ）が、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは活性化されなかった（図３Ｃ）。ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１γおよびＳＡＰＫ３／ｐ３８βは、ＧＳＴ−ＭＳＫ１とＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａとの両方を活性化させなかった。ＳＡＰＫ４／ｐ３８δは、ＧＳＴ−ＭＳＫ１の弱い活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａを活性化させなかった。ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（データ省略）およびＳＡＰＫ２／ｐ３８（図３Ｄ）のＧＳＴ−ＭＳＫ１を活性化させる能力には、この酵素のリン酸化の程度と相関関係があった。
【０１８５】
内因性ＭＳＫ１（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＭＳＫ１）は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を介してＥＧＦおよびＴＰＡによって、さらに、ＳＡＰＫ２／ｐ３８経路を介してストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ  ｓｔｉｍｕｌｉ）によって活性化される。図３に表される実験によって、ＭＳＫ１が古典ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ＭＡＰＫ／ＥＲＫ  ｃａｓｃａｄｅ）を活性化させる刺激と同様にＳＡＰＫ／ｐ３８アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を活性化させる刺激に応答して活性化される可能性が生じた。この可能性を調べるために、三つの抗体が作製された（ｗｅｒｅ  ｒａｉｓｅｄ）、１つは残基２６から４４に対する（ａｇａｉｎｓｔ）（抗体“Ａ”）、２番目は残基３８４から４０２に対する（抗体“Ｂ”）、３番目は残基７１６から７３４に対する（抗体“Ｃ”）。３つすべての抗体は量的にＭＳＫ１を免疫沈降させ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）（図示せず）、発現されたＭＳＫ１（図４Ａ）または細胞ライゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）中の内因性ＭＳＫ１の免疫沈降は、適切なペプチド免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とのインキュベーションによって阻害された。
【０１８６】
この研究で使用されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの両方を免疫沈降させる（図４Ｂおよび図４Ｃ、Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）が、しかし、ＭＳＫ１を免疫沈降させなかった（図４Ａ）。さらに、どのＭＳＫ１抗体も、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまたはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂを免疫沈降させなかった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＭＳＫ１抗体“Ａ”を作製させる（ｒａｉｓｅ）のに使用されたペプチド配列は、ＭＳＫ２の中で保存されず、抗体“Ｂ”及び“Ｃ”を作製させる（ｒａｉｓｅ）のに使用された１９残基ペプチドは、ＭＳＫ２とともにそれぞれ９および１２の保存残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）しか有していない。３つすべてのＭＳＫ１抗体は、ＥＧＦ、ＴＰＡまたはストレスに曝された２９３細胞およびＴＮＦによって刺激されたヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）の両方の中で、同様のＭＳＫ１活性のレベルを免疫沈降させた。これらの結果より、ＭＳＫ２はＭＳＫ１とともに同時免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）されないことが示される。
【０１８７】
内因性ＭＳＫ１は、ＥＧＦ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢酸塩（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）（ＴＰＡ）によって前もって刺激され、または、細胞性ストレス（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ）（亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）、ＵＶまたは過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ））に曝された２９３細胞のライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）から抗体“Ａ”によって免疫沈降された。これらの実験によって、ＭＳＫ１はこれら全ての刺激によって強く活性化されることが示された（図５）。興味深いことに、ＥＧＦおよびＴＰＡによるＭＳＫ１の活性化は、ＰＤ９８０５９、すなわち、ＭＡＰキナーゼキナーゼ−１（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−１）の活性化の特定の阻害剤によって大きく阻害された（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）が、しかし、ＳＢ２０３５８０、すなわち、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８およびＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βの特定の阻害剤によって阻害されなかった（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）。対照的に、ストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ  ｓｔｉｍｕｌｉ）によるＭＳＫ１の活性化は、ＳＢ２０３５８０によって大きく阻害されたが、しかし、ＰＤ９８０５９によって阻害されなかった（図５Ａ）。抗体“Ｂ”または抗体“Ｃ”が抗体“Ａ”の代わりに使用されたときも、同じ結果が得られた（データ省略）。
【０１８８】
細胞のＥＧＦおよびＴＰＡ刺激によって、２９３細胞中でＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂが大きく活性化された。ＭＳＫ１の活性化のように、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化はＰＤ９８０５９によって抑制されるが、ＳＢ２０３５８０によって抑制されなかった（図５Ｂ）。ストレス性刺激は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの重要な活性化を誘発させなかった（図５Ｂ）が、しかし、ＳＢ２０３５８０によって阻害されるがＰＤ９８０５９によって阻害されないＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化を大きく誘発させた（図５Ｃ）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ＥＧＦまたはＴＰＡによってあまり活性化されなかった（図５Ｃ）。
【０１８９】
ＴＰＡおよびＵＶによるＭＳＫ１の活性化は、両方のキナーゼドメイン（ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）を要求する。ＭＳＫ１のキナーゼドメイン（ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）がインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での活性化のために要求されることを立証するために、我々は、野生型ＭＳＫ１（ＷＴ−ＭＳＫ１）、Ｎ末端キナーゼドメインが点突然変異によって不活性化される突然変異ＭＳＫ１（ＮＴ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ  ＭＳＫ１）、および、Ｃ末端キナーゼドメインが不活性化されるさらなる突然変異体（ＣＴ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ  ＭＳＫ１）をエンコードするＤＮＡ発現構築物（ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）で、２９３細胞をトランスフェクションした（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。全ての構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）は、これらの免疫沈降と細胞ライゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）からの検定（ａｓｓａｙ）とを可能にするために、Ｎ末端“フラグ”タグ（方法参照）を有した。ＴＰＡによる細胞の刺激またはＵＶの照射によって、それぞれ野生型ＭＳＫ１の２００倍、３０倍に活性化が誘発された。内因性ＭＳＫ１についての結果と同様に、ＴＰＡによるトランスフェクションされたＭＳＫ１（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ＭＳＫ１）の活性化は、ＰＤ９８０５９によって阻害されたが、ＳＢ２０３５８０によって阻害されなかった。一方、ＵＶ誘発活性化（ＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、ＳＢ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ９８０５９によって影響されなかった（図６Ａ）。トランスフェクションされた野生型酵素は、ＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ）および血清によって５０から１００倍に活性化された。活性化は、ＰＤ９８０５９によって阻害されたが、ＳＢ２０３５８０によって阻害されなかった（データ省略）。これらの観察によって、内因性プロテインキナーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）の免疫沈降によって得られた結果、すなわち、ＭＳＫ１が、古典ＭＡＰキナーゼカスケード（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ）によって、もしくは、ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路を介することによって、細胞内で活性化されることが確証される。
【０１９０】
対照的に、ＮＴ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ  ＭＳＫ１、ＣＴ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ  ＭＳＫ１の両方とも、ＴＰＡによる細胞刺激またはＵＶ照射の前後に検出可能な活性を有していなかった（図６Ａ）。両方の”キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１突然変異体は、野生型ＭＳＫ１タンパク質（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ＭＳＫ１  ｐｒｏｔｅｉｎ）と同じ濃度に発現された（図６Ｂ）。これらの観察によって、図６で測定されたＭＳＫ１の活性は、ＭＳＫ１自体によるもので、ＭＳＫ１とともに同時免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）された混入キナーゼ（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）によるものではないことが立証される。
【０１９１】
ＭＳＫ１は核に局在化しており、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは細胞質に局在化している。２９３細胞中で過剰発現された（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）野生型ＭＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）は、定量免疫電子顕微鏡法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって調査された（図７）。ＭＳＫ１は、主に刺激を受けていない細胞（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）の核に局在化されていた。核区画（ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中のＭＳＫ１の密度は、細胞質中に比べて１２から３０倍高かった（図７Ａおよび７Ｃ）。ＴＰＡでの刺激によるＭＳＫ１の活性化（図７Ａおよび７Ｄ）またはＵＶ照射によるＭＳＫ１の活性化（データ省略）によって、ＭＳＫ１の細胞下所在（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）で一切変化が誘発されなかった。ＭＳＫ１は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに存在しない残基７２６から７４８まで（図１）の間に、推定二分裂核局在シグナル（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を有している（Ｒｏｂｉｎｓ等、１９９１）。この観察と一致して、細胞中で過剰発現された場合、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａは主に細胞質中に局在化した（図７Ｂ）。さらに、このキナーゼの１００倍の活性化を誘発する（データ省略）細胞のＴＰＡ刺激をした後（図７Ｂおよび７Ｅ）、核へのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの重要な転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）は観測されなかった。
【０１９２】
ＭＳＫ１は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において非常に有用なＣＲＥＢキナーゼである。ＭＳＫ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの基質特異性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）は、ＴＰＡ刺激および細胞ライゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）からの精製へと続く２９３細胞内のＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現後に比較された（図３Ａ）。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１、図８Ａ）の飽和濃度でのＧＳＴ−ＭＳＫ１の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのそれと同じであることが分かった（図８の凡例参照）。ＣｒｏｓｓｔｉｄｅのＫｍは、ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまたはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに対して２から３μＭであった。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅは、リン酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からＮ末端側へ３番目および５番目の残基に位置する２つのアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）を含んでいるので、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１によって効果的にリン酸化される。この理由から、ペプチドＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ（ペプチド２、図８Ａ）は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂによって、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅとほぼ同一のＫｍおよびＶｍａｘの値でリン酸化される。このペプチドがＭＳＫ１によってさらに効果的にリン酸化されることが分かり、Ｋｍ値は０．２μＭであった。ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡにおけるポジションｎ−３のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をリシン（ｌｙｓｉｎｅ）に交換すること（ペプチド３、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと同様にＭＳＫ１に対するＫｍが約１００倍に増加した。しかしながら、ポジションｎ−５のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）をロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）に交換すること（ペプチド４、図８Ａ）によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂに対するＫｍが５倍に増加したにもかかわらず、ＭＳＫ１に対するＫｍがあまり増加しなかった。これらの実験から、ＭＳＫ１は、ポジションｎ−３にアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅｓ）を要求するが、ｎ−５に塩基性残基（ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を要求しないことが示される。
【０１９３】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｔａｎ等、１９９６）は、それぞれ成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ストレス性刺激（ｓｔｒｅｓｓｆｕｌ  ｓｔｉｍｕｔｉ）によって転写因子ＣＲＥＢ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ）の活性化を仲介することが報告されていた。優勢的なＭＳＫ１の核局在化を考慮すると、これら他のプロテインキナーゼと比較して、ＭＳＫ１がＣＲＥＢをリン酸化させる効率を比較することは、それ故、興味深いことであった。これらの実験によって、ＣＲＥＢがＫｍ値２μＭおよびＣｒｏｓｓｔｉｄｅまたはＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡと同様なＶｍａｘでリン酸化される驚くほどよいＭＳＫ１に対する基質であるという驚くべき知見が導き出された。対照的に、ＰＫＡによって、ＣＲＥＢが同じ条件下でＫｍ値１７μＭでリン酸化された（データ省略）が、一方、リン酸化がＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（図８Ａ）またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（データ省略）によって触媒作用されたとき、Ｋｍは高すぎて測定できなかった。その結果、ＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性がＣｒｏｓｓｔｉｄｅおよび／またはペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡに対して相性がよいとき、ＭＳＫ１による５μＭ  ＣＲＥＢのリン酸化速度は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａに比べて３０倍速く、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂに比べて１２倍速く、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２に比べて６０倍速かった（図８Ｂ）。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと比べて、熱ショックタンパク質２７（その生理的基質（ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）の一つ、Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）に対してはるかにより活性的であった（図８Ｂ）。
【０１９４】
ＭＳＫ１によりリン酸化されたＣＲＥＢ上の残基は、Ｃ１８カラムでの消化物（ｄｉｇｅｓｔ）のクロマトグラフィーへと続くトリプシン消化（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって立証された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）。１５％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で溶出されたある主要な３２Ｐ−標識ペプチド（３２Ｐ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が観察された（図８Ｃ）。このペプチドはホスホセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）を含み、さらに、固相シーケンス（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）にかけたとき、Ｅｄｍａｎ分解（Ｅｄｍａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の３番目のサイクル後に３２Ｐ放射能が解放された（データ省略）。その同定（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメトリー（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって立証されたが、その質量スペクトロメトリーは、ペプチドの分子量（７５８．３３）が、残基１３１から１３５を有しＳｅｒ  １３３でリン酸化されている予期されたトリプシンホスホペプチド（ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）の分子量（７５８．３６）と同一であるということを示した。同じ残基をリン酸化させることが知られているＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｘｉｎｇ等、１９９６）は、ＭＳＫ１と同じトリプシンペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を標識化した（データ省略）。
【０１９５】
ＣＲＥＢタンパク質によって得られた結果と一致して、ＣＲＥＢの残基１２６から１３６（ＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ、ペプチド５、図８Ａ）に対応する合成ペプチド（ＣＲＥＢｔｉｄｅと呼ばれる）は、低すぎて測定できないほどのＫｍ値（＜０．１μＭ）でリン酸化された。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、少なくとも２００倍高いＫｍ値でかなり乏しくこのペプチドをリン酸化させた。
【０１９６】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２が２９３細胞中でＵＶまたはＥＧＦによってＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。星形胞子類似体（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ）Ｒｏ  ３１８２２０は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂと同様に、ＩＣ５０値（ＩＣ５０  ｖａｌｕｅｓ）が１０から３０ｎＭまでの範囲で（Ａｌｅｓｓｉ  １９９７、図９Ａ）、全てのＰＫＣアイソフォームを阻害する（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。本研究において、Ｒｏ  ３１８２２０は、インビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）同程度の効力を持つ（ｅｑｕａｌｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ）ＭＳＫ１活性の阻害剤であることが分かった（図９Ａ）。Ｒｏ  ３１８２２０は、インビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）１０（ＭでもＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２をあまり阻害せず（図１１Ａ）、さらに、インビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＵＶに応答してもＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化に影響を及ぼさない（図９Ｂ）。さらに、ＲＯ  ３１８２２０を有する細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、ＨＳＰ２７のＵＶ誘発リン酸化（ＵＶ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２に対する生理的基質（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にあまり影響を及ぼさなかった（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５、図９Ｃ）。並行した実験において、ＵＶによるＨＳＰ２７のリン酸化は、ＳＢ２０３５８０によって遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）。ｆｏｒｓｋｏｌｉｎのように環状ＡＭＰ濃度を増加させるアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍｏｎｔｍｉｎｙ  １９８９）によって誘発されるＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介する環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）もまた、１０μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０によってあまり阻害されなかった（Ｄａｖｉｓ等、１９８９）。
【０１９７】
図９に示される結果によって、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化（およびＳｅｒ６３で近い関係のＡＴＦ１（ｃｌｏｓｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＡＴＦ１）のリン酸化）を仲介する間に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の役割を評価する機会が提供された。我々は、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１が、２９３細胞のＵＶの照射またはＥＧＦによる処理後にすばやくリン酸化されること、および、リン酸化が５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０によって大きく阻害されることを観測した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。対照的に、環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを介してＣＲＥＢリン酸化を誘発させる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎによるＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化が５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０によって影響されなかった（図１０Ｃ）。ＭＳＫ１の活性化のように、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のＵＶ誘発リン酸化が、ＳＢ  ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ  ９８０５９によって阻害されず（図１０Ｄ）、一方、ＥＧＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化（ＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＲＥＢ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＰＤ  ９８０５９によって阻害されるが、ＳＢ  ２０３５８０によって阻害されなかった（図１０Ｅ）。
【０１９８】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１がヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）の中でＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化を仲介しないという証拠。
内因性ＭＳＫ１が、ヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）の中で腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）（ＴＮＦ）によってすばやく（しかし、一時的に）活性化された。興味深いことに、ＭＳＫ１の活性化に対するＳＣ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９の影響は、刺激時間とともに変化した。５分後、活性化はＳＢ  ２０３５８０によって完全に阻害されたが、ＰＤ  ９８０５９によって影響されなかった。しかしながら、１５分後、ＭＳＫ１の活性化がＳＢ  ２０３５８０、ＰＤ  ９８０５９のうちいずれか一方によって部分的に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）が、両方のドラッグが一緒に加えられたならば、ほぼ完全に抑制された（図１１Ａ）。これらの観察は、ＳＡＰＫ２／ｐ３８およびＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の異なる活性化速度によって説明される。従って、ＴＮＦ刺激から５分後、（ＳＢ  ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ  ９８０５９によって阻害されない）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化によって判断されるように、ＳＡＰＫ２経路が活性化される。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化の欠如によって判断されるように、５分経過後も、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードは活性化されない（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。しかしながら、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の両方の活性化によって判断されるように、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８カスケード（ｃａｓｃａｄｅｓ）の両方が、ＴＮＦ刺激から１５分後、活性化される。１５分後におけるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂの活性化は、ＰＤ  ９８０５９によって抑制されるが、ＳＢ  ２０３５８０によって抑制されない（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【０１９９】
ＴＮＦによるヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）の刺激は、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化をすばやく誘発した。５分後、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１のリン酸化は、ＳＢ  ２０３５８０によって阻害されたが、ＰＢ  ９８０５９によって影響されなかった（図１２Ａ）。１５分後、ＣＲＥＢのＴＮＦ誘発リン酸化（ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ  ２０３５８０によって部分的に抑制され、ＰＤ  ９８０５９によってわずかに抑制され、両方の化合物の存在下では完全に阻害された（図１２Ｂ）。ＣＲＥＢの活性化へのＳＢ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９の影響は、それ故、ＴＮＦ誘発ＭＳＫ１活性化（ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＭＳＫ１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）へのそれらの影響に類似していた（図１１）。ＴＮＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化（ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＲＥＢ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０によって完全に遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）（図１２Ｃ）が、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化はこのドラッグによって影響されなかった（データ省略）。
【０２００】
ＰＣ１２細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関があるという証拠。ＰＣ１２細胞株のＮＧＦ刺激は、ＣＲＥＢのリン酸化（図１３Ａ）およびＭＳＫ１の活性化（図１３Ｂ）を誘発させた。ＣＲＥＢのリン酸化およびＭＳＫ１の活性化は、ＰＤ  ９８０５９、ＳＢ  ２０３５８０のうちいずれか一方を有する細胞のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によってあまり影響されないが、両方のドラッグの存在下では強く阻害された（図１３）。これらの結果によって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８経路の両方の阻害が、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化およびこれら細胞内でのＭＳＫ１活性化を阻害するのに必要であることが示され、このことは、さらにディスカスション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）で考察される。
【０２０１】
ＭＳＫ１のように、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１もまたＮＧＦによって５倍に活性化されたが、ＭＳＫ１と対比して、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化はＳＢ  ２０３５８０によって影響されず、ＰＤ９８０５９によって部分的に阻害され、両方のドラッグの組み合わせによってさらに阻害されなかった。従って、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性には、ＣＲＥＢのリン酸化と相関がなかった。以前に報告されたように（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）、ＮＧＦは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化のうちどの重要な活性化をもＰＣ２３細胞内で誘発しなかった。さらに、ＮＧＦ誘発ＣＲＥＢリン酸化は、５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０によって抑制され（データ省略）、再びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３に対する役割を排除した。
【０２０２】
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化には、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりはむしろＭＳＫ１の活性化と相関があるという証拠。この研究所での先行する研究によって、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）、ＦＧＦのうちいずれか一方によって誘発されるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中のＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化が、ＳＢ  ２０３５８０によって抑制される（Ｔａｎ等、１９９６）。本研究において、我々は、これらの細胞内でのＣＲＥＢおよびＭＳＫ１の亜ヒ酸ナトリウム誘発活性化（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、ＳＢ  ２０３５８０によって阻害されるが、ＰＤ  ９８０５９によっては阻害されないことを確証した。しかしながら、ＣＲＥＢのＦＧＦ誘発リン酸化（ＦＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ  ２０３５８０、ＰＤ  ９８０５９のうちいずれか一方によってわずかに阻害されたが、完全にＣＲＥＢのリン酸化を抑制するには両方のドラッグの存在が必要であった（図１４Ｄ）。同様に、それらの細胞内のＭＳＫ１のＦＧＦ誘発リン酸化は、ＳＢ  ２０３５８０、ＰＤ  ９８０５９のうちいずれか一方の存在によって部分的にのみ抑制されるが、両方の化合物の存在によって阻害される（図１４Ａ）。
【０２０３】
ＭＳＫ１と対比して、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）およびＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化は、ＳＢ  ２０３５８０によって完全に阻害されるが、ＰＤ  ９８０５９によって阻害されず（図１４Ｃ）、そして、（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化または活性に影響を及ぼさない）Ｒｏ  ３１８２２０は、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢのリン酸化を大きく抑制した。これらの知見によって、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化に対して速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。混乱を避けるために、Ｒｏ  ３１８２２０は、ＭＳＫ１活性の可逆的阻害剤であり、細胞内でＭＳＫ１活性に影響を及ぼさないことに注意すべきである。ひとたび細胞が溶解され（ｌｙｓｅｄ）、ＭＳＫ１がライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）から免疫沈降されると（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）、Ｒｏ  ３１８２２０阻害剤は除去され、従って、ＭＳＫ１はもはや阻害されない。
【０２０４】
ＭＳＫ１と対比して、ＦＧＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化は、ＰＤ  ９８０５９によって廃止されたが（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）、ＳＢ  ２０３５８０によって廃止されなかった（図１４Ｂ）。
しかしながら、（ＳＢ  ２０３５８０が存在していない状態での）ＰＤ  ９８０５９は、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化をあまり抑制しなかった。
【０２０５】
細菌内毒素（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）は、ＲＡＷ  ２６４マウスマクロファージ細胞系統（ＲＡＷ  ２６４  ｍｏｕｓｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）内でＭＳＫ１およびＣＲＥＢリン酸化に刺激を与える。図１５に示すように、ＲＡＷ  ２６４マクロファージのＬＰＳ刺激によって、ＭＳＫ１およびＣＲＥＢ／ＡＴＦ１リン酸化がもたらされる。５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９または１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０が、ＭＳＫ１およびＣＲＥＢ／ＡＴＦ１のリン酸化を阻害しているように見える。
【０２０６】
ディスカスション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
【０２０７】
我々は、新規で幅広く発現されたＭＳＫ１と呼ばれるプロテインキナーゼの配列（図１）と、近い関係のＭＳＫ２のほぼ完全な配列（図２、図１６および表１）をここに示す。ＭＳＫ１およびＭＳＫ２は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォームと非常に類似していており（全体のアミノ酸配列に対して４０％の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ））、単一ポリペプチドに２つのプロテインキナーゼドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）を有する点でそれらがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のアイソフォームと類似している（図２）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＮ末端キナーゼドメインが外因性基質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）をリン酸化するが、一方では、唯一知られたＣ末端ドメインの役割がＮ末端ドメインを活性化することである（イントロダクション（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）参照）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のＣ末端キナーゼドメインの重要性は、不活性突然変異（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）がＮ末端キナーゼドメインの活性化を８５から９０％抑制するという知見によって示される（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ等、１９９６）。対照的に、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメイン内の不活性な突然変異は（Ｎ末端キナーゼドメイン内の不活性な突然変異のように）、完全に活性化を廃止する（ａｂｏｌｉｓｈｅｓ）（図８）。もし、４つの重要なリン酸化部位の保存によって示唆されたように（図２）ＭＳＫ１の活性化のメカニズムがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のそれと類似しているならば、これによって、ＭＳＫ１のＣ末端キナーゼドメインがＮ末端ドメインの活性化に不可欠であることが示される。
【０２０８】
ＭＳＫ１が、インビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード、ＳＡＰＫ２／ｐ３８経路のうちいずれか一方によって活性化される。このことは、ＰＤ  ９８０５９が成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）およびホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ）によって内因性またはトランスフェクションされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＭＳＫ１の活性化を大きく抑制するが、一方では、ＳＢ  ２０３５８０がＵＶの照射または酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）によって誘発された活性化を抑制するという知見によって立証された（図５および図６）。これらの知見に一致して、ＭＳＫ１がインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、ＳＡＰＫ２／ｐ３８のうちいずれか一方によって活性化されることが可能である（図３）。ヒーラ細胞内のＴＮＦ（図１１０、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＦＧＦ（図１４）およびＰＣ１２細胞内のＮＧＦ（図１３）など、幾つかのシグナル（ｓｉｇｎａｌｓ）が、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２およびＳＡＰＫ２／ｐ３８の両方を活性化させ、そして、両方のシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ）は、これらの細胞内でＭＳＫ１の活性化に寄与する。ＭＳＫ１およびＭＮＫ１（Ｆｕｋｕｎａｇａ、Ｈｕｎｔｅｒ、１９９７およびＷａｓｋｉｅｗｉｃｚ等、１９９７）がインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）両方のＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ）によって活性化されることが可能である一方、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１がＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２によってのみ活性化されることが可能であるかという理由は不明瞭である。思うに、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１が、ＳＡＰＫ２／ｐ３８による認識のために必要とされる動機（ｍｏｔｉｆ）を欠いているか、これらの酵素による認識を阻止する動機を含んでいるかである。
【０２０９】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）またはＳＡＰＫ２／ｐ３８経路の活性化を引き起こすシグナルによってＭＳＫ１がインビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）活性化されるという知見は、ＭＮＫ１のように、それが様々な細胞外シグナル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｓ）の効果を統合する役割を演じていることを示している。従って、ＭＳＫ１の基質は、おそらく、マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｓ）の両方に応答してリン酸化されるタンパク質である。そのような２つのタンパク質は、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１であり（イントロダクション参照）、我々は、ＣＲＥＢがインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＭＳＫ１に対する驚くほど良い基質であることが分かった（図８）。ＭＳＫ１は、Ｓｅｒ  １３３でのみ、すなわち、インビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｓ）に応答してリン酸化される活性化部位（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）でＣＲＥＢをリン酸化させる。ＭＳＫ１によるＣＲＥＢのリン酸化に対するＫｍは、ＰＫＡ＜ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２によるリン酸化に比べてはるかに低い（図８）。ＭＳＫ１は、同等の残基で、０．１μＭ未満と概算された驚くほど低いＫｍでＣＲＥＢｔｉｄｅをリン酸化させる（図８Ａ）。我々の知識の中で、この値は、これまで同定されてきた（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）いかなるプロテインキナーゼのいかなるペプチド基質に対する最も低いＫｍ値である。これらの観察によって、ＭＳＫ１（および／またはＭＳＫ２）がマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）およびストレス性刺激によるＣＲＥＢの活性化を仲介し、そして、ＭＳＫ１の核局在化（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）（図７）はそのような役割と矛盾しないことが示唆される。
【０２１０】
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ニューロン細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）でストレス性シグナル（ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｓ）またはＦＧＦによってＣＲＥＢの活性化を仲介するであろう（Ｔａｎ等、１９９６）。しかしながら、本研究では、インビボでの（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化もインビトロでのその活性（図９および１４）も１０μＭまでのＲｏ  ３１８２２０によって影響されず、５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞および他の細胞株でＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を活性化させるすべてのシグナルに応答してＳｅｒ１３３でＣＲＥＢリン酸化を抑制する（図１０，１２および１４）。さらに、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は代わるべきものとしてのスプライスＣＲＥＢ２変異体（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＣＲＥＢ２  ｖａｒｉａｎｔ）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）をＳｅｒ１３３よりすばやくＳｅｒ９８でリン酸化させるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を強く活性化させるアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）による刺激後、Ｓｅｒ９８でのＣＲＥＢのリン酸化は観測されないことが分かった。これらの結果から、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／Ｋ３活性がＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞内のＣＲＥＢのストレス誘発活性化（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｎ）に対して速度制限（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）しないことが示される。ストレス性刺激によって活性化されることが知られており、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化させる唯一の他のプロテインキナーゼはＭＳＫ１である。ＭＳＫ１はインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２よりもはるかに効率的にＣＲＥＢをリン酸化させ（図８）、Ｒｏ３１８２２０によって強く（ｐｏｔｅｎｔｌｙ）阻害される（図９）。これらの理由から、現時点において、ＭＳＫ１（および／またはＭＳＫ２）が、Ｓｅｒ１３３でのストレス誘発ＣＲＥＢリン酸化（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＲＥＢ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を仲介するもっともよい候補である。
【０２１１】
ＭＳＫ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、両方とも、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）またはホルボールエステル（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ）による細胞刺激の後に、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓによって活性化され、それらは、両方とも、Ｓｅｒ１３３でＣＲＥＢをリン酸化させ、さらに、それらは、両方とも、Ｒｏ  ３１８２２０によって強く阻害される。このことによって、ＣＲＥＢの成長因子／ホルボールエステル誘発活性化（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）がＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームによって仲介されるかどうかという疑問が浮上している。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａよりもかなり効果的なＣＲＥＢキナーゼであり（Ｘｉｎｇ等、１９９６）、また、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、ＮＧＦ刺激ＰＣ１２細胞（ＮＧＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＰＣ  １２  ｃｅｌｌｓ）から調製されたライゼート（ｌｙｓａｔｅｓ）内で検出可能な主要なＣＲＥＢキナーゼである（Ｇｉｎｔｙ等、１９９４；Ｘｉｎｇ等、１９９６）ことが報告されている。しかしながら、我々の研究によると（ｉｎ  ｏｕｒｈａｎｄｓ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは同様なキナーゼでＣＲＥＢまたはＣＲＥＢｔｉｄｅをリン酸化させたが（図８）、両方ともＭＳＫ１ほどわずかに（ｒｅｍｏｔｅｌｙ）効果的ではなかった（図８）。
【０２１２】
さらに、生化学的に検出された主要なプロテインキナーゼがインビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）特定の基質に対する関連酵素でないことがその後示された例が多くある。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３）をリン酸化させ、および、不活性化させるＬ６ミオチューブ（Ｌ６  ｍｙｏｔｕｂｅｓ）から調製された抽出物中の主要なインスリン誘発プロテインキナーゼ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）であるが（Ｃｒｏｓｓ等、１９９４）、それでも、ＰＤ  ９８０５９を使用したその後の研究はこのプロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）でその掛かり合い（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を排除した（Ｃｒｏｓｓ等、１９９５）。ＭＳＫ１が生化学的分析によって事前に検出されなかった理由として、検査された細胞内でのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性と比較して、かなり低いＭＳＫ１の活性に原因があるのかもしれない。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２と比較して細胞内の低いＭＳＫ１の活性によって、ＭＳＫ１活性が事前の生化学的分析によって検出されなかった理由が説明されるだろう（Ｘｉｎｇ等、１９９６およびＴａｎ等、１９９６）。
【０２１３】
最近、Ｘｉｎｇ等（１９９８）は、ＳＢ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９の両方がＰＣ１２細胞内でＣＲＥＢのＮＧＦ誘発リン酸化（ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を妨げなければならないことを報告した。我々は、この観察を確証し（図１３Ａ）、ＮＧＦがこれらの細胞内でＭＳＫ１を活性化することを実証した（図１３Ｂ）。ＣＲＥＢのリン酸化のように、ＮＧＦによるＭＳＫ１の活性化は、これらの細胞内においてＳＢ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９の両方の存在下でのみかなり阻害される。これらの観察によって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケード（ｃａｓｃａｄｅ）、ＳＡＰＫ２／ｐ３８経路のうちいずれか一方の活性化がＭＳＫ１の最大の活性化およびＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化を引き起こすのに十分であることが示される。対照的に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォームのＮＧＲ誘発活性化（ＮＧＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、ＳＢ  ２０３５８０によって影響されず、ＰＤ  ９８０５９によって（ＳＢ  ２０３５８０が存在していない状態または存在している状態で）部分的に阻害されるだけである。従って、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム単体では、Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのＮＧＦ誘発リン酸化（ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を説明することができない。
【０２１４】
Ｓｅｒ１３３でのＣＲＥＢのリン酸化には、ＴＮＦ刺激ヒーラ細胞（ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）（図１１と１２との比較）およびＦＧＦ処理ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＦＧＦ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＳＫ−Ｎ−ＭＣ  ｃｅｌｌｓ）（図１４）におけるＭＳＫ１の活性化とよりよい相関がある。両方の状況において、ＭＡＰＫおよびＳＡＰＫ２／ｐ３８経路が活性化され、ＭＳＫ１の活性化と同様にＳｅｒ１３３でのＣＲＥＢリン酸化の抑制には、ＳＢ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９の両方の存在が必要であった。ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）において、ＰＤ  ９８０５９はそれぞれＦＧＦおよびＴＮＦによるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性化を完全に抑制し、それぞれのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）によって誘発されたＣＲＥＢリン酸化にわずかに影響をもたらした。
【０２１５】
概して、成長因子／ホルボールエステルによるＣＲＥＢの活性化における１以上のＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（または未だ同定されていないままのプロテインキナーゼ）に対する役割が完全に排除されることができないが、我々の結果によって、ＭＳＫ１（および／またはＭＳＫ２）がそれらの刺激によるＣＲＥＢの活性化を仲介することが示唆される。
【０２１６】
材料および方法
【０２１７】
材料。プロテインキナーゼの検定のためのペプチドが、ＤｕｎｄｅｅでＦ．Ｂ．Ｃａｕｄｗｅｌｌ氏によって合成され（ＭＲＣユニット）、抗体を作製する（ｒａｉｓｅ）のに使用されたペプチドは、Ｇ．Ｂｌｏｍｂｅｒｇ博士（Ｂｒｉｓｔｏｌ大学、イギリス）によって合成された。プロテインＧ−セファロース（Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびグルタチオンセファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ、イギリス）から購入され、アルキル化されたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、イギリス）から購入され、組織培養試薬（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）、ミクロシスチン−ＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ）およびＥＧＦは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｉｓｌｅｙ、イギリス）から購入され、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−酢酸塩（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）（ＴＰＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ、イギリス）から購入され、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）および過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）（Ｈ２Ｏ２，Ａｒｉｓｔａｒ  ｇｒａｄｅ）は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、イギリス）から購入され、ＳＢ  ２０３５８０およびＰＤ  ９８０５９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、イギリス）から購入され、ｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｅｅｋ、オランダ）から購入された。活性化されたＧＳＴ−ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１γ（Ｌａｗｌｅｒ等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８ａ、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８βおよびＧＳＴ−ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９７）、ＧＳＴ−ＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（Ｇｏｅｄｅｒｔ等、１９９７）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ等、１９９５）およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３（Ｃｌｉｆｔｏｎ等、１９９６）が、バクテリアで発現され、上述のようにインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）適切な上流キナーゼキナーゼ（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）を使用することで最大限に活性化された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂは、上述のようにＭＲＣユニットでＮ．Ｍｏｒｒｉｃｅ博士によってウサギ骨格筋から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等、１９９３）。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、バクテリアで発現され、上述のようにインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＧＳＴ−ＭＡＰＫを使用することで活性化された（ＢｅｎＬｅｖｙ等、１９９５）。ＰＫＡは、当業者に知られているウシの心臓（ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅａｒｔ）から調製された。
【０２１８】
抗体。ＭＳＫ１“Ａ”、ＭＳＫ１“Ｂ”およびＭＳＫ“Ｃ”は、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）においてそれぞれペプチドＬＴＶＫＨＥＬＲＴＡＮＬＴＧＨＡＥＫＶ（ＭＳＫ１の残基２６から４４に対応）、ＦＫＲＮＡＡＶＩＤＰＬＱＦＨＭＧＶＥＲ（ＭＳＫ１の残基３８４から４０２に対応）および、ＫＡＴＦＨＡＦＮＫＹＫＲＥＧＦＣＬＱＮ（ＭＳＫ１の残基７１６から７３４に対応）に対して作製された（ｒａｉｓｅｄ）。特にＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫沈降し（Ｃｌｉｆｔｏｎ等、１９９６）、またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａおよびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの両方を免疫沈降する（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９５）抗体は、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）においてペプチドＫＥＤＫＥＲＷＥＤＶＫＥＥＭＴＳ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の残基３４３から３５８）およびＲＮＱＳＰＶＬＥＰＶＧＲＳＴＬＡＱＲＲＧＩＫＫ（ヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの残基７１２から７３４）に対して作製された（ｒａｉｓｅｄ）。この研究で使用される全ての抗体は、適切なペプチドが共有結合されたＣＨ−セファロースカラム（ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ）でアフィニティー精製され（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、アメリカ）から商業的に入手可能である。フラッグエピトープ（Ｆｌａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ａｎａｃｈｅｍ（Ｌｕｔｏｎ、イギリス）から購入された。ＨＳＰ２７を認識するウサギポリクローナル抗体（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ（Ｙｏｒｋ、イギリス）から購入された。
【０２１９】
緩衝溶液。緩衝液Ａ−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍｍ  ＥＤＴＡ，１％（質量比）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００，１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ），５０ｍＭフッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ），５ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），０．２７Ｍスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ），１（Ｍミクロシスチン−ＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ），０．１％（体積比）β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）および“完全な”プロテイナーゼ阻害剤反応混液（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）（５０ｍｌあたり１錠Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗｅｓ，イギリス）。緩衝液Ｂ−５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．５，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）。
【０２２０】
ＭＳＫ１およびＭＳＫ２のクローニング。ＭＳＫ１の配列は、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から入手されたヒトＥＳＴ  ｃＤＮＡ（ＡＡ１５  ８５７１）を配列決定すること（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって得られた（Ｌｅｎｎｏｎ等、１９９６）。マウス（ｍｏｕｓｅ）およびヒトＭＳＫ２配列は、表１に示されるＥＳＴ  ｃＤＮＡクローンのうちの幾つかを配列決定することによって得られた。マウスＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ挿入断片（ＥＳＴ  ｉｎｓｅｒｔｓ）、ＡＡ４７２１６５，ＡＡ３８９１６８を配列決定することによって得られた。ヒトＭＳＫ２配列は、ＥＳＴ挿入断片（ＥＳＴ  ｉｎｓｅｒｔｓ）、Ｈ４６２６８，ＡＡ５６８８９５を配列決定することによって得られた。ＤＮＡ塩基配列決定（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、Ｔａｑダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ｔａｑ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）を使用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサー（３７３Ａ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）によって行われた。
【０２２１】
ＧＳＴ−ＭＳＫ１、Ｆｌａｇ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａをコード化するＤＮＡ発現構築物（ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）の調製。Ｎ末端でフラグ（ＦＬＡＧ）ＤＹＫＤＤＤＤＫエピトープタグ（ｔａｇ）とともにヒトＭＳＫ１を発現するＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は次のように調製された。ＰＣＲ反応が、鋳型として、ＭＳＫ１  ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド５’ＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧ−３’（下線が引かれていないＢｇｌＩＩ部位を組み込んでいる）および５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧ−３’を使用することで行われた。生じたＰＣＲ生成物は、ｐＴｏｐｏベクターに連結反応された（ｌｉｇａｔｅｄ）。その後、三重連結反応（ｔｒｉｐｌｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、ＥｃｏＲｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントとしてｐＴｏｐｏベクターからＮ末端ＭＳＫ１  ＰＣＲ生成物を除去し、ＭＳＫ１のＣ末端ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントとともにこれをｐＣＭＶ５ベクターのＥｃｏＲｌ−ＫｐｎＩ部位に連結反応する（ｌｉｇａｔｉｎｇ）ことによって、ｐＣＭＶ５哺乳動物発現（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、１９８９）ベクターで全長Ｆｌａｇ−ＭＳＫ１構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を生成するためにセットアップされた。ＧＳＴ−ＭＳＫ１発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ｐＥＢＧ２Ｔ（Ｓａｎｃｈｅｚ等、１９９４）発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位へのＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてｐＣＭＶ５ベクターからＦｌａｇ−ＭＳＫ１  ｃＤＮＡをサブクローニングすることにより調製された。Ｎ末端キナーゼドメイン、Ｃ末端キナーゼドメインのうちいずれか一方が不活性された（ｐＣＭＶ５ベクター内の）全長Ｆｌａｇ  ＭＳＫ１突然変異体は、キナーゼドメインのサブドメインＶＩＩ内の保存されたＡｓｐ１９５およびＡｓｐ５６５残基をアラニン（Ａｌａ）に変化させることによって調製された。このことは、ＰＣＲ基調メガプライマー戦略（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用することで達成された。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ｐＥＢＧ２Ｔ発現ベクターのＮｏｔＩ部位へのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして、（Ｄａｌｂｙ等、１９９８）に記載されているｐＧＥＸ４Ｔ．１ベクターからのＨＡ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのサブクローニングによって調製された。すべての発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の構造は、製造者のプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従ってクイアゲンプラスミドメガキット（Ｑｕｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  ｋｉｔ）を使用することによるバクテリアからの精製後に、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証された。
【０２２２】
ＧＳＴ−ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの発現。ヒト胚腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｃｅｌｌｓ）の直径１０ｃｍのディッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）２０個が培養され、それぞれのディッシュは、改良リン酸カルシウム法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９６ｂ）を使用することによって、ＧＳＴ−ＭＳＫ１、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａのうちいずれか一方をコード化するＤＮＡ  ２０μｇでトランスフェクションされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションしてから２４時間後、細胞は１６時間血清枯渇され（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅｄ）、刺激されていないままのもの、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ，１５分）で刺激されたものうちいずれか一方と細胞のそれぞれのディッシュが、氷冷された１ｍｌの緩衝液Ａに溶解された（ｌｙｓｅｄ）。２０のライゼートが、プールされ（ｐｏｏｌｅｄ）、４℃、１０分間、１３，０００ｘｇで遠心分離され、そして、上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）が、事前に緩衝液Ｂで平衡状態にされた１ｍｌのグルタチオン−セファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使って回転台（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で６０分間保温された（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）。懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）が、１分間、３０００ｘｇで遠心分離され、ビード（ｂｅａｄｓ）が０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有した１０ｍｌの緩衝液Ａで３回洗浄され、さらに、０．２７Ｍスクロースを含有した１０ｍｌの緩衝液Ｂで３回洗浄された。ＧＳＴ−ＭＳＫ１またはＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａが、２０ｍＭグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）および０．２７Ｍスクロースを含有した３本の１ｍｌ緩衝液Ｂを使って、環境温度で樹脂から溶出された。混合された溶出液（０．５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１用タンパク質および０．１ｍｇ／ｍｌ  ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ）は、アリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）に分割され、液体窒素中で急速冷凍され（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）、そして、−８０℃で保管された。
【０２２３】
細胞培養、刺激、細胞溶解（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）。ヒト胚腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｃｅｌｌｓ）およびヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ）が融合して（ｔｏ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍで１６時間保温された。ヒーラおよびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞が、直径１０ｃｍのディッシュ（ｄｉｓｈｅｓ）上で融合して培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍで２時間保温された。ＮＧＦの付加から数時間以内に分化し始める高濃度のＮＧＦ受容体を発現させるＰＣ１２細胞が、培養され、胎児子牛血清（ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）が省略されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍで２時間保温された（Ｒｏｕｓｅ等、１９９４）。これらの細胞内における高濃度のＮＧＦ受容体によって、ＰＤ  ９８０５９阻害剤が、ＭＡＰＫのＮＧＦ誘発活性化（ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を部分的にのみ抑制する。その後、細胞は、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９，１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０，５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０または対照としての同体積のＤＭＳＯで、図の凡例に示された時間だけ保温され、図の凡例のように刺激され、そして、細胞が１．０ｍｌの氷冷された緩衝液Ａに溶解された（ｌｙｓｅｄ）。ライゼートは、液体窒素の中ですぐに冷凍され、使用されるまで−８０℃で保管された。タンパク質の濃度は、標準として、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を使用して決定された（Ｂｒａｄｆｏｒｄ等、１９７６）。
【０２２４】
ＭＳＫ１，ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の免疫沈降および検定。それぞれの免疫沈降に使用された細胞ライゼートの量は、ＭＳＫ１（５００μｇタンパク質）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（５０μｇタンパク質）およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（５０μｇタンパク質）であった。ライゼートは、５μｌのプロテインＧ−セファロースと結合された５μｇのそれぞれの抗体を使って、振動台（ｓｈａｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で４℃、３０分間保温された。免疫沈降物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有した１ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄され、さらに、１ｍｌの緩衝液Ｂで１回洗浄された。標準ＭＳＫ１またはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ検定（５０μｌ）は、洗浄されたプロテインＧ−セファロース免疫沈降物（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ），５０ｍｍトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１％（体積比）２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ），２．５μＭ  ＰＫＩ（環状−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ｃｙｃｌｉｃ−ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）のペプチド阻害剤），Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（３０μＭ），１０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍｇ（Ａｃ）２）および０．１ｎＭ［（３２Ｐ）ＡＴＰ（１００−２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含んでいた。検定は、３０℃、１０分間行われ、検定チューブ（ａｓｓａｙ  ｔｕｂｅｓ）は、懸濁液中に免疫沈降物を保持するために連続的に振動され（ａｇｉｔａｔｅｄ）、その後検定を終了させ、（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）に記載されているように分析された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ（３０μＭ）が基質として使用されていることを除き、同様に検定された。活性の１ユニット（Ｏｎｅ  ｕｎｉｔ）は、１分間で１ｎｍｏｌのペプチド基質のリン酸化に触媒作用を及ぼす酵素の量であった。
【０２２５】
ＣＲＥＢの発現。Ｍ．Ｊ．Ｃｏｍｂ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ボストン，アメリカ）の好意により我々に提供されたＣＲＥＢ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）の３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）をコード化するＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で形質転換された大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ）ＢＬ２１が、０．３ｍＭのイソプロピル−（−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−（−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）とともに３７℃で５時間誘導された。ＧＳＴ−ＣＲＥＢが前述のようにＧＳＴ−ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）のためにグルタチオン−セファロース（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いて精製され、５０％のグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を含む緩衝液Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）に対して透析され（ｄｉａｌｙｓｅｄ），−２０℃で貯蔵された。この調剤（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は多数の小バンドとともに、６２ｋＤａと４３ｋＤａでの２つの主バンドを示した。この６２ｋＤａと４３ｋＤａのバンドのみがＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＳＫ１によってリン酸化された。ＣＲＥＢのタンパク質濃度は、ウシの血清アルブミン標準（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に関して６２ｋＤａと４３ｋＤａのバンドの強度を比較することによって見積もられた。
【０２２６】
リン酸化されたＣＲＥＢとＡＴＦ１の免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）。細胞抽出物（ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）が調整され（ｐｒｅｐａｒｅｄ）、これらの免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）が、記述されているように（Ｔａｎ等，１９９６）、ＵＢＩ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＵＳＡ）から購入されたＳｅｒ  １３３上のリン酸化されたＣＲＥＢおよびＳｅｒ  ６３上のリン酸化されたＡＴＦ１を認識するホスホスペシフィック（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いてなされた。リン酸化ＣＲＥＢとＡＴＦ１のタンパク質の検出は増強化学発光試薬（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてなされた。
【０２２７】
ＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂとによるＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７のリン酸化（図８参照）。ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として発現されたＭＳＫ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａがＴＰＡ刺激２９３細胞（ＴＰＡ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ２９３  ｃｅｌｌｓ）から精製され（図３）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂがラビット骨格筋（ｒａｂｂｉｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）から精製された（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等、１９９３）。ＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７とともに図８に示されているペプチドが、１０ｍＭのＭｇ（Ａｃ）２、１００（Ｍ［３２Ｐ］ＡＴＰ（１ｘ１０６ｃｐｍ／ｎｍｏｌｅ）、１０μＭ  ＰＫＩと１μＭ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲを含む緩衝液Ｂ中の２Ｕ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＳＫ１，ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａまたはＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂとともに３０℃でインキュベートされた。１０分間のインキュベーションの後，ペプチド内へのリン酸の組み込みがＰ８１ホスホセルロース紙（ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐａｐｅｒ）を用いて検定され（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９４）、ＣＲＥＢとＨＳＰ２７内へのリン酸の組み込みがトリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｔｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、０．２／１００ｖｏｌ．％（０．２ｖｏｌ  ｏｆ  １００％）を添加することによって測定され、その後，その試料が氷上に１時間インキュベートされた。この懸濁液は１３０００ｘｇで１０分間遠心分離され（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ）、その上澄みは捨てられ、ペレットは０．２ｍｌの氷の冷水で５回洗浄された。３２Ｐ標識されたもの（３２Ｐ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）がその後セレンコフ・カウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって検定された。ＭＳＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＲＫＫＡＰ−Ｋ１ｂによりリン酸化されたＣＲＥＢにおける部位をマッピングするために，このペレットは０．３ｍｌの５０ｍＭ，ｐＨ８．０のＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２μｇのアルキル化されたトリプシン（ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ）を含む０．１ｖｏｌ．％の還元されたＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００中で再懸濁され、３０℃で１６時間のインキュベーションの後，その消化物（ｄｉｇｅｓｔ）が１３０００ｘｇで５分間遠心分離された。９５％の３２Ｐ−標識（３２Ｐ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を含む上澄みは、図８についての凡例に記載されているように，Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（ｃｏｌｕｍｎ）を用いてクロマトグラフィーにかけられた。ミカエリス定数（Ｋｍ）とＶｍａｘ値は、１／Ｓに対する１／Ｖの二重逆数プロット（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｐｌｏｔｓ）から検定された。ここで、Ｖはリン酸化の初速度であり、Ｓは基質濃度である。
【０２２８】
ＭＳＫ１の２９３細胞へのトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）。２９３細胞が直径１０ｃｍの皿に培養され、リン酸カルシウム変法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ａｌｅｓｓｉ等、１９９６ｂ）を用いてフラグ・エピトープがタグされたＭＳＫ１構築物（Ｆｌａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ  ＭＳＫ１  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）をコード化するｐＣＭＶ５ベクターでトランスフェクションされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションの２４時間後（２４ｈ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、この細胞から１６時間の間に血清が奪われ、ＴＰＡにより刺激され、あるいはＵＶ放射に曝された。その後，細胞は１ｍｌの氷の冷たい緩衝液Ａに溶解され（ｌｙｓｅｄ），１３，０００ｘｇで５分間遠心分離された後，フラグ・タグされたＭＳＫ１プロテイン（Ｆｌａｇ  ｔａｇｇｅｄ  ＭＳＫ１  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、５μｌのプロテインＧ−セファロースに結合した２μｇのＦＬＡＧ抗体を用いて、２５μｇプロテインを含むライゼート（ｌｙｓａｔｅ）のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）から免疫沈降が行われた。
免疫沈降物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）はインキュベーションされ洗浄され，上記のようにＭＳＫ１活性について測定された（ａｓｓａｙｅｄ）。
【０２２９】
免疫電子顕微鏡法（Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）。細胞は、０．２Ｍのピペス（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ７．２において８％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）内に少なくとも１日固定され，ラバー・ポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ  ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）を用いてこすられ，１０％のブタの皮膚ゼラチンにペレットとして埋め込まれた。ブロックは、鉄のスタブ（ｓｔｕｂｓ）上に固定され液体窒素で凍らせる前に、２．１Ｍのスクロース／ＰＢＳ（ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳ）に少なくとも１５分間浸された。その後，低温超薄片（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）がライヒエット・ウルトラカット・Ｅ・低温ミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ  ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて−１００℃で調整され、カーボン／ホルムバール（ｃａｒｂｏｎ／ｆｏｒｍｖａｒ）被覆グリッドに固定された。グリッドは、まず０．５％のフィッシュ・スキンのゼラチン／ＰＢＳを用いてインキュベーションされ（５分）、その後、アンチＦＬＡＧマウス・モノクロール抗体（ａｎｔｉ  ＦＬＡＧ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（１５ｇ／ｍｌ）が続いた。その後，２ｇ／ｍｌのラビット・アンチマウス抗体（ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＡＬ，ＵＳＡ）が続き、最後に、タンパク質にＡ−８ｎｍの金複合体（ｇｏｌｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が前に開示されたように（Ｌｕｃｏｃｑ  １９９３）調整された。ＰＢＳ洗浄が、０．５％のフィッシュ・スキンのゼラチン／ＰＢＳで希釈された親和性試薬（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）の各々の後に続いた。最後に、蒸留水で洗浄した後、これらの薄片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）はメチル・セルロース／ウラニル・アセテート（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ／ｕｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）で対比された。
【０２３０】
ラベリング（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）は次のように定量化された。１５，０００倍の倍率で細胞質と核（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ）の両方を持つ標識細胞（ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｅｌｌ）の顕微鏡写真（ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）が撮られた（これらの核で重くなった薄片によって、個々の細胞におけるコンパートメントからのデータを比較することが可能となった）。サイトプラズムと核の面積は、１ｃｍの線間隔の正方形格子（ｓｑｕａｒｅ  ｌａｔｔｉｃｅ  ｇｒｉｄ  ｏｆ  １ｃｍ  ｌｉｎｅ  ｓｐａｃｉｎｇ）を用いてカウントし（ｐｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）、ゴールドラベリング（ｇｏｌｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｄ）をカウントすることによって見積もられた（Ｌｕｃｏｃｑ，１９９４）。エラー係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒ）はＣｏｃｈｒａｎ  １９５３によって計算された。
【０２３１】
引用文献
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「ＰＤ−０９８０５９は、インビトロおよびインビボでマイトジェン−活性プロテイン−キナーゼ  キナーゼの活性の特異的阻害剤である。」（ＰＤ−０９８０５９ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２７４８９−２７４９４；
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Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９７）「哺乳動物細胞におけるＭＡＰおよびＳＡＰキナーゼの生理的基質のための調査」（Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  ＭＡＰ  ａｎｄ  ＳＡＰ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，３５３−３６１；
Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ，Ａｌｅｓｓｉ  Ｄ．Ｒ，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ，Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃ  Ｍ  ａｎｄ  Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ａ（１９９５）「インスリンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害はプロテイン−キナーゼ−Ｂによって仲介される。」（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ−Ｂ．）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，７８５−７８９；
Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ａ．Ｅ．，Ａｌｅｓｓｉ  Ｄ．Ｒ．，Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅ，Ｊ．Ｒ．，ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｕｎｄａｌ，Ｈ．Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．「インスリンまたはラット骨格筋細胞系１６における成長因子１様インスリンによるグリコーゲン−シンターゼキナーゼ−３の阻害は、ワートマニンによって遮断されるが、ラパミシンによっては遮断されない。」（Ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｏｒ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  １６  ｉｓ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｂｙ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｙ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ  ３０３，２１−２６；
Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｄｏｚａ，Ｙ．Ｎ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｒ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｐａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．（１９９５）「ＳＢ  ２０３５８０は、細胞ストレスとインターロイキン−１によって刺激されるＭＡＰキナーゼ同族体の特異的阻害剤である。」（ＳＢ  ２０３５８０  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１．）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６４，２２９−２３３；
Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．，ＢｕｅｅＳｃｈｅｒｒｅｒ  Ｖ．ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞ストレスによるストレス活性プロテインキナーゼ−３（ＳＡＰＫ３）の活性化はＳＡＰＫＫ３（ＭＫＫ６）を介して仲介される。ＳＡＰＫ３とＳＡＰＫ２（ＲＫ／ｐ３８）の特異性の比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−３（ＳＡＰＫ３）ｂｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ＳＡＰＫＫ３（ＭＫＫ６）；  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＳＡＰＫ３  ａｎｄ  ＳＡＰＫ２（ＲＫ／ｐ３８））ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，２９５−３０５；
Ｄａｌｂｙ  Ｋ．Ｎ．，Ｍｏｒｒｉｃｅ  Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ  Ｆ．Ｂ．，Ａｖｒｕｃｈ  Ｊ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９８）
「窒素−活性プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）によって誘導し得るＭＡＰＫ−活性プロテインキナーゼ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）における調節リン酸化部位の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｒｎｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−１ａ／ｐ９０（ｒｓｋ）ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｂｙ  ＭＡＰＫ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１４９６−１５０５；
Ｄａｖｉｓ  Ｐ．Ｄ．，Ｈｉｌｌ  Ｃ．Ｈ．，Ｋｅｅｃｈ  Ｅ．，Ｌａｗｔｏｎ  Ｇ．，Ｎｉｘｏｎ  Ｊ．Ｓ．，Ｓｅｄｇｗｉｃｋ  Ａ．Ｄ．，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｊ．，Ｗｅｓｔｍａｃｏｔｔ  Ｄ．ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｓ．Ｅ．（１９８９）「プロテインキナーゼ−Ｃの強力な選択的阻害剤」（Ｐｏｔｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−Ｃ）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９，６１−６３；
Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｎ．Ｗ．，Ｒａｗｌｉｎｓｏｎ  Ｌ．，Ｇｕｅｓｄｏｎ  Ｆ．，Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．，Ｃｏｗｌｅｙ  Ｓ．，Ｈｓｕａｎ  Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｋｕｌａｔｖａｌａ  Ｊ．（１９９４）「インターロイキン−１は、ＨＳＰ２７をリン酸化する新規なプロテイン−キナーゼカスケードを活性化する。」（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＳＰ２７．）Ｃｅｌｌ  ７８，１０３９−１０４９；
Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｒ．ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．（１９９７）「プロテインキナーゼ基質を同定するための新規な発現スクリーニング方法によって分離された、ＭＮＫ１、新しいＭＡＰキナーゼ−活性プロテインキナーゼ」（ＭＮＫ１，ａ  ｎｅｗ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，１９２１−１９３３；
Ｇｉｎｔｙ  Ｄ．Ｄ．，Ｂｏｎｎｉ  Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｅ．（１９９４）「神経成長因子は、ＣＲＥＢのリン酸化を通してｃ−Ｆｏｓ転写を刺激するラス−依存プロテインキナーゼを活性化する。」（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａ  Ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｃ−Ｆｏｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ．）Ｃｅｌｌ  ７７，７１３−７２５；
Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ．，Ｃｕｅｎｄａ  Ａ．，Ｃｒａｘｔｏｎ  Ｍ．，Ｊａｋｅｓ  Ｒ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９７）「サイトカインおよび細胞ストレスによる新規なストレス活性プロテインキナーゼＳＡＰＫ４の活性化はＳＫＫ３（ＭＫＫ６）を介して仲介される。その基質特異性と他のＳＡＰキナーゼのそれとの比較」（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＳＡＰＫ４  ｂｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＫＫ３（ＭＫＫ６）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ＳＡＰ  ｋｉｎａｓｅｓ）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，３５６３−３５７１；
Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｇ．Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．Ｋ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｗ．Ｈ．，Ｋａｒｒ  Ｄ．，Ｍｅｎｚｅｌ  Ｐ．，Ｂｉｇｇｓ  Ｗ．，Ｖａｌｅ  Ｗ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｏｎｔｍｉｎｙ  Ｍ．Ｒ．（１９８９）「その配列によって予測される環状ＡＭＰ−調節核因子ＣＲＥＢ上のリン酸化部位のクラスター」（Ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＣＲＥＢ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｉｔｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７，７４９−７５２；
Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｎｔｍｉｎｙ  Ｍ．Ｒ．（１９８９）「環状ＡＭＰは、Ｓｅｒ  １３３でＣＲＥＢのリン酸化によるソマトスタチン遺伝子転写」を刺激する。（Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ａｔＳｅｒ  １３３．）Ｃｅｌｌ，５９，６７５−６８０；
Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｑｕｉｎｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９８８）「プロテインキナーゼファミリーの保存の特徴および触媒ドメインの推論される系統発生」（Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，４２−５２；
Ｌａｗｌｅｒ  Ｓ．，Ｃｕｅｎｄａ  Ａ．，Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９７）「ストレス活性プロテインキナーゼ−１（ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ）の新規な活性化因子であるＳＫＫ４」（ＳＫＫ４，ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−１（ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ））  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，１５３−１５８；
Ｌｅｎｎｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ａｕｆｆｒａｙ，Ｃ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｂ．（１９９６）「Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会；  ゲノムの組み込み分子分析」とそれらの発現（Ｔｈｅ  Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｙｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３３，１５１−１５２；
Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  Ｉ．Ａ．，Ｄａｌｂｙ  Ｋ．Ｎ．，Ｃａｕｄｗｅｌｌ  Ｆ．Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９６）「ｐ７０  Ｓ６キナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の特異性の比較がｐ７０  Ｓ６キナーゼのための相対比基質を同定する。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１のＮ末端キナーゼドメインはタンパク質のリン酸化にとって不可欠である。」（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐ７０  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＭＡＰＫＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−１  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐ７０  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ．  Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＭＡＰＫＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７５，２８９−２９３；
Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）「免疫電子顕微鏡法のための顆粒の遺伝標識；「微細構造免疫細胞化学」の第８章」（“Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  ｉｎ“Ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”）；
Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）「金のラベリングと免疫ラベルされた超薄片における抗原の定量」（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ  １８４，１−１３；
Ｉｏｒｄａｎｏｖ  Ｍ．，Ｂｅｎｄｅｒ  Ｋ．，Ａｄｅ  Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄ  Ｗ．，Ｓａｃｈｓｅｎｍａｉｅｒ  Ｃ．，Ｅｎｇｅｌ  Ｋ．，Ｇａｅｓｔｅｌ  Ｍ．，Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ  Ｈ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｅｒｒｌｉｃｈ  Ｐ．（１９９７）「ＣＲＥＢはｐ３８／ＨＯＧ−１依存プロテインキナーゼを介してＵＶＣにより活性化される。」（ＣＲＥＢ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＵＶＣ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐ３８／ＨＯＧ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，１００９−１０２２；
Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎ  Ｍ．Ｍ．，Ｋｕｍａｒ  Ｓ．，Ｍｃｄｏｎｎｅｌｌ  Ｐ．Ｃ．，Ｖａｎｈｏｒｎ  Ｓ．，Ｌｅｅ  Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｖｉ  Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｐ．Ｒ．（１９９６）「マイトジェン活性プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ−活性プロテインキナーゼ−３、ＣＳＢＰ  ｐ３８ＭＡＰキナーゼの新規な基質の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）Ｋｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ−３，ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｆ  ＣＳＢＰ  ｐ３８ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，８４８８−８４９２；
Ｐｅｎｄｅ  Ｍ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｐ．Ｂ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｊ．Ｔ．，Ｂｌｅｎｉｓ  Ｊ．ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ  Ｖ（１９９７）「祖先膠細胞における神経伝達物質−，成長因子−誘導ｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質のリン酸化；カルシウムイオン、プロテインキナーゼＣおよびマイトジェン活性プロテインキナーゼ／リボソームＳ６キナーゼ経路の役割」（Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ−ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ；  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ／ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１２９１−１３０１；
Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｊ．，Ｄｉｌｗｏｒｔｈ  Ｓ．Ｍ．，Ｌａｓｋｅｙ  Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  ｄｉｎｇｗａｌｌ  Ｃ．（１９９１）「ヌクレオプラスミン核標的配列における２つの相互依存塩基性ドメイン；２つに分かれた核標的配列のクラスの同定」（Ｔｗｏ  ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ    ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ｃｅｌｌ，６４，６１５−６２３；
Ｒｏｕｓｅ，Ｊ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，Ｔｒｉｇｏｎ，Ｓ．，Ｍｏｒａｎｇｅ，Ｍ．，Ａｌｏｎｓｏ−Ｌｌａｍａｚａｒｅｓ  Ａ．，Ｚａｍａｎｉｌｏ，Ｄ．，Ｈｕｎｔ，Ｔ．ａｎｄ  Ｎｅｂｒｅｄａ，Ａ．（１９９４）「ストレスおよびＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２と小さな熱ショックタンパクのリン酸化を刺激する熱ショックによってトリガーされる新規なキナーゼカスケード」（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｈｅａｔｓｈｏｃｋ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ＭＡＰＫＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−２  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｃｅｌｌ  ７８，１０２７−１０３７；
Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｉ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．ｔ．，Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｙｅｅ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ａｖｒｕｃｈ，Ｊ．，Ｋｙｒｉａｋｉｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．（１９９４）「転写因子を調節するストレス−活性経路におけるＳＡＰＫ／ＥＲＫの役割」（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＡＰＫ／ＥＲＫ  ｋｉｎａｓｅ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃ−Ｊｕｎ）Ｎａｔｕｒｅ，３７２，７９４−７９８；
Ｓｔｕｒｇｉｌｌ  Ｔ．Ｗ．，Ｒａｙ  Ｌ．Ｂ．，Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｅ．ａｎｄ  Ｍａｌｌｅｒ  Ｊ．Ｌ．（１９８８）「インスリン−刺激性ＭＡＰ−２キナーゼはリボソーム−プロテインＳ６キナーゼ−ＩＩをリン酸化し活性化する。」（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＭＡＰ−２  Ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ−ＩＩ．）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，７１５−７１８；
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｄ．Ｇ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．（１９９３）「ＲＳＫ２のウサギ当量としてのインスリン−刺激性プロテインキナーゼ−１の同定。マイトジェン活性プロテインキナーゼによる活性化の間にリン酸化される２トレオニンの同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−１  ａｓ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｏｆ  ＲＳＫ２；  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅ）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，５８１−５８８；
Ｔａｎ  Ｙ．，Ｒｏｕｓｅ  Ｊ．，Ｚｈａｎｇ  Ａ．Ｈ．，Ｃａｔｉａｔｉ  Ｓ．，ｃｏｈｅｎ  Ｐ．ａｎｄ  ｃｏｍｂ  Ｍ．Ｊ．（１９９６）「ＦＧＦとストレスはｐ３８ＭａｐキナーゼとＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２を含む経路を介してＣＲＥＢおよびＡＴＦ−１を調節する。」（ＦＧＦ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＣＲＥＢ  ａｎｄ  ＡＴＦ−１  ｖｉａ  ａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｐ３８  Ｍａｐ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＭＡＰＫＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−２．）
ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，４６２９−４６４２；
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）「配列の重量、位置比ギャップペナルティおよび最大重量の選択により進行性の複数の配列の感受性を改良するクラスタル−Ｗ」（Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０；
Ｔｒｉｖｅｒ  Ｅ．，Ｄｅｃｅｓａｒｅ  Ｄ．，Ｊａｑｕｏｔ  Ｓ．，Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ  Ｓ．，Ｚａｃｋａｉ  Ｅ．，Ｙｏｕｎｇ  Ｉ．，Ｍａｎｄｅｌ  Ｊ．Ｌ．，Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ  Ｐ．ａｎｄ  Ｈａｎａｕｅｒ  Ａ．（１９９６）「コフィンローリー症候群に関連するキナーゼＲＳＫ−２における変異」（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＲＳＫ−２  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，５６７−５７０；
Ｖｉｋ  Ｔ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｙｄｅｒ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）「ゼノプスｐｐ９０ｒｓｋの自律リン酸化の主要部位としてのセリン３８０の同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ３８０  ａｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｓｉｔｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｐｐ９０ｒｓｋ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．２３５，３９４−４０２；
Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｆｌｙｎｎ，Ａ．，Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｊ．，Ｗｅｂｂ，Ｂ．Ｌ．Ｊ．，Ｖｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｂａｉｎｅｓ，Ｉ．Ａ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）「ホルボールエステル、細胞ストレスおよびサイトカインに応答して、真核開始因子ｅＩＦ４Ｅは、はっきり識別できるＭＡＰキナーゼ経路によって仲介される。」（Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４Ｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ，ｃｅｌｌ  ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７１，９３７３−９３７７；Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚ  Ａ．Ｊ．，Ｆｌｙｎｎ  Ａ．，Ｐｒｏｕｄ  Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ  Ｊ．Ａ．（１９９７）「マイトジェン活性プロテインキナーゼはセリン／トレオニンキナーゼＭＮＫ１およびＭＮＫ２を活性化する。」（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｋｉｎａｓｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ＭＮＫ１  ａｎｄ  ＭＮＫ２．）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，１９０９１９２０；
Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｉｎｔｙ  Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｅ．（１９９６）「Ｒｓｋ２による遺伝子活性化に対するラス−ＭＡＰＫ経路の連結、成長因子調節ＣＲＥＢキナーゼ」（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，９５９−９６３；
Ｘｉｎｇ，Ｊ．，Ｋｏｒｎｈａｕｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｘｉａ，Ｚ，Ｔｈｉｅｌｅ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒ，Ｍ．Ｅ．（１９９８）「神経成長因子は細胞外シグナル−調節キナーゼおよびｐ３８マイトジェン活性プロテインキナーゼ経路を活性化し、ＣＲＥＢセリン１３３リン酸化を刺激する。」（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐ３８  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ＣＲＥＢ  ｓｅｒｉｎｅ  １３３  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８８，１９４６−１９５５；
Ｚｈａｏ  Ｙ．，Ｂｊｏｒｂａｅｋ  Ｃ．，Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚ  Ｓ．，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ  Ｄ．Ｅ．（１９９５）「ＲＳＫ３は、新規なＰＰ９０（ＲＳＫ）アイソフォームをユニークＮ末端配列−成長因子刺激キナーゼ機能および核転移とともにコード化する。」（ＲＳＫ３  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＰ９０（ＲＳＫ）ｉｓｏｆｏｒｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５，４３５３−４３６３  １．
【０２３２】
実施例２：代替アッセイ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙｓ）
【０２３３】
閃光近接分析（Ａ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が、３２Ｐ放射性物質のＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅへの組込みを定量するのに使用される。このシステムでは、サンプルは、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）とＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅに結合する抗体とを含むビード（ｂｅａｄｓ）と混合される。これは９６−ウエルフォーマット（９６−ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ）において行われると便利である。それからプレート（ｐｌａｔｅ）は、適切なシンチレーションカウンター（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）で、３２Ｐ  ＳＰＡアッセイの既知のパラメーターを用いて、測定される。シンチラント（ｔｈｅ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）に近接した３２Ｐのみ、つまり後に抗体に結合されるＣＲＥＢもしくはＣＲＥＢｔｉｄｅに結合している３２Ｐのみが測定される。
【０２３４】
実施例３：ＭＳＫ１活性を調節する化合物のアッセイ
【０２３５】
アッセイは、実施例１あるいは実施例２に記述されたように、ＣＲＥＢを用いて準備される。化合物はこのアッセイで調べられ、ＭＳＫ１の阻害または活性化を高めるものが、更なる研究のために選別される。観測されたいかなる効果もＣＲＥＢによる効果に由来するものではないことを確認するために、化合物は、例えばＣｒｏｓｓｔｉｄｅのように、ＣＲＥＢとは化学構造上異なるペプチド基質のような他の基質をリン酸化できるＭＳＫ１の効果の有無を試験される。ＣＲＥＢとペプチド基質のリン酸化に於いて、類似の効果を持つ化合物は選別される。化合物はまた、活性化されたＣＲＥＢと不活性ＣＲＥＢにおける効果の有無も試験される。
【０２３６】
実施例４：ＭＳＫ１と相互作用するポリペプチドの分析
【０２３７】
酵母二ハイブリッドアッセイシステム（ａ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）は、転写の活性化の発生を許容するのに十分安定した条件において、ＭＳＫ１と結合可能なポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを特定するために準備される。このようなポリヌクレオチドは、（別個の実験において）、ＭＳＫ１を活性させられる刺激の前または後に、ＭＳＫ１を発現できる細胞からの、またＭＳＫ１を発現しない細胞からのｍＲＮＡからコピーされたｃＤＮＡである。このような細胞のタイプのみの部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）に見られる相互作用は、特に興味深い。
【０２３８】
ポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドは、予想されたアミノ酸配列を得るために、実施例１で記述したようにサンガー法（ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）により挿入物を配列することによって、測定される。
【０２３９】
実施例５：ＲＡＭ  ２６４マクロファージのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）による、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）とインターロイキン−１の誘導調整における、ＭＡＰキナーゼカスケード（ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ）の役割
【０２４０】
ＲＡＷ２６４マクロファージのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）刺激は、マイトジェン及びストレス活性プロテインキナーゼ−１及び−２（ＭＳＫ１、ＭＳＫ２）と、それらの推定される基質、転写因子ＣＲＥＢとＡＴＦ１の活性化を引き起こした。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の活性化は、従来のＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８の活性化をそれぞれが抑制する２種の薬品の混合物と共に、細胞を前保温することによって抑制されたが、阻害は、いずれの阻害物の存在下に於いても部分的なものであった。ＣＲＥＢとＡＴＦ１のＬＰＳ刺激活性化（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）（ＣＯＸ−２）とインターロイキン−１β遺伝子（これらプロモーターはＣＲＥを含む）の転写、及びＣＯＸ−２タンパク質の誘導は、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２の効力の高い阻害剤であるＲｏ  ３１８２２０によるときと同様に、同じ薬品の組み合わせによって阻害された。我々の得た結果は、二つの異なるＭＡＰキナーゼカスケードは、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ１のＬＰＳに誘導される活性化（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と、ＣＯＸ−２とＩＬ−１遺伝子の転写とに対する、律速段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）であることを示している。これらはまた、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２がこの過程において重要な役割を担っており、ゆえに新規な抗炎症薬（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇ）の開発のための魅力的な標的であることを示唆している。
【０２４１】
材料と方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）
【０２４２】
材料。細胞培養に用いた試薬と抗体はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ  ＵＫ）から、ＰＤ  ９８０５９はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂａｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）から、Ｒｏ  ３１８２２０とＳＢ  ２０３５８０はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎと３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）はＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で、“完全な“プロテイナーゼプロテイナーゼ阻害剤混合物（“ｃｏｍｐｌｅｔｅ”ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）から、ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２  ａｎｔｉｂｏｄｙはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から、ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＲＥＢはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｇ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎ．Ｙ．）から、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰとＥＣＬ試薬はＡｍｓｔｅｒｄａｍ（Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）から、Ｒｎｅａｓｙ  ＭｉｎｉＫｉｔはＱＩＡＧＥＮ社から、ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍはＰｒｏｍｅｇａ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）から購入された。マウスのＲＡＷ  ２６４マクロファージはｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｗｉｌｔｓ，ＵＫ）から入手され、ＬＰＳとＵ０１２６はＤｒ．Ｊｏｈｎ  Ｌｅｅ（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，ＰＡ  ＵＳＡ）とＤｒ．Ｓｕｅ  Ｃａｒｔｌｉｄｇｅ（Ｚｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から提供された。
【０２４３】
細胞培養と刺激。ＲＡＷ２６４マクロファージは、１０％（ｖ／ｖ）熱処理不活性化された子牛の胎児性血清（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）と１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）と１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）で、９５％  ａｉｒ／５％  ＣＯ２の大気中（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）においてに、保持された。刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の前日にマクロファージは６ｃｍ培養皿（ｐｌａｔｅ）あたり細胞２×１０６個の密度で培養され、刺激の２時間前に培地は取り除かれ、ＤＭＥＭ２ｍｌに取り替えられた。細胞はそれから、数値記号に（ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｇｕｒｅ  ｌｅｇｅｎｄｓ）指示された時間の間、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ、若しくは２０μＭ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎと１０μＭ  ＩＢＭＸで刺激される。指示されているように、ＳＢ  ２０３５９０（１０μＭ）及び／又はＰＤ９８０５９（５０μＭ）、又はＵ０１２６（１０μＭ）又はＲｏ  ３１８２２０（５μＭ）が、刺激の一時間前に添加された。
【０２４４】
細胞溶解。刺激の後、培地は吸引され、細胞は、０．２ｍｌの氷温溶解バッファー（ｉｃｅ  ｃｏｌｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．２７Ｍ  スクロース、２μＭ  ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ−ＬＲ、１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、および５０ｍｌあたり１錠の”ｃｏｍｐｌｅｔｅ”プロテイナーゼ阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ））に可溶化された（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ）。その後サンプルは液体窒素の中で急速冷凍され、分析されるまでアリコートで（ｉｎ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）−８０℃で保存された。タンパク質濃度は［７］に従って測定される。
【０２４５】
免疫ブロッティング。ＣＲＥＢの免疫ブロッティングのために、核細胞抽出物（ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）記載されたように用意され［２］、免疫ブロッティングは、Ｓｅｒ  １３３でリン酸化されるＣＲＥＢとＳｅｒ  ６３でリン酸化されるＡＴＦ１を認識する、リン酸選択性（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いて実施された。ＣＯＸ−２の免疫ブロッティングのために、細胞溶解液（３０μｇタンパク質）は、ＳＤＳ中で変性され（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）へ転移され（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）、抗ＣＯＸ−２抗体（ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１．０ｍｇ／ｍｌ）と免疫ブロッティングされた。リン酸化されたＣＲＥＢとＡＴＦ１とＣＯＸ−２の検出は、強化された化学発光試薬（ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ＥＣＬ）を用いて実施された。
【０２４６】
免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）とプロテインキナーゼのアッセイ。すべての抗体は、実施例１に記載したように培養された。ＭＳＫ２は、細胞溶解液（１ｍｇたんぱく質）から、ＭＳＫ２の残基７５３−７７２に対応するペプチドＲＡＰＶＡＳＫＧＡＰＲＲＡＮＧＰＬＰＰＳに対して生産される抗体と、免疫沈降された。免疫沈降物は、実施例１に記載したように３０℃で、洗浄および分析された。ＭＳＫ１又はＭＳＫ２の活性の１単位は、リン酸基１ｎｍｏｌのペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧへの１分間の組み込みを触媒する量としてさだめられた。ＭＡＰキナーゼに活性化されたタンパク質（ＭＡＰｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ｐ９０ＲＳＫとしても知られる）は、細胞溶解液（５０μｇタンパク質）から、マウスのＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（ＲＳＫ２  イソ型）の残基６０５−６２７に対応するペプチドＲＮＱＳＰＶＬＥＰＶＧＲＳＴＬＡＱＲＲＧＩＫＫに対して生産される抗体と、免疫沈降された。この抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂと同様にＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（ＲＳＫ１）も免疫沈降する［８］。免疫沈降物は、記載されたように、３０℃で洗浄及び分析された［８］。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１活性の１単位は、リン酸基１ｎｍｏｌの［Ｇ２４５，Ｇ２４６］Ｓ６−（２１８−２４９）］（リボソームタンパク質Ｓ６のＣ末端に密接に関連したペプチド）への１分間の組み込みを触媒する量としてさだめられた。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は、ヒトタンパク質の残基３５６−３７１に対応するペプチドＭＴＳＡＬＡＴＭＲＶＤＹＥＱＩＫに対して生産される抗体を用いて、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１と同様の手法で、免疫沈降された。この抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２と同様に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３も免疫沈降した［９］。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２は記載されたようにアッセイされ［１０］、１単位は、リン酸基１ｎｍｏｌのペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡへの１分間の組み込みを触媒する酵素の量とした。
【０２４７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）。全体のＲＮＡは、ＬＰＳ刺激（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）又はコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）ＲＡＷ２６４細胞から、実験手引書（ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従ってＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて用意された。全体のＲＮＡは測定され、１００ｎｇが、オリゴヌクレオチドＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧとＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＧＣＴ（“ハウスキーピング遺伝子”ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ｈｙｐｏｘａｎｔｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＨＰＲＴをコードする）、ＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧとＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡ（ＩＬ−１遺伝子をコードする）とＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣとＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＴＣ（ＣＯＸ−２遺伝子をコードする）とともにＰｒｏｍｅｇａ  ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／ｍｌ）を用いて逆転写された。結果物である（ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ）一本鎖ＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅のための条件は、耐熱性Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及び１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を用い、９４度において変性を３０秒間、６０度においてアニーリングを１分間、６８度においてエクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を１分間、３０サイクルであった。ＰＣＲ生成物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、ＨＰＲＴの３５２ｂｐの単一のバンドを示し、ＣＯＸ−２の５１５ｂｐの単一のバンドを示した。
【０２４８】
結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
【０２４９】
ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳに誘導される活性化は、二つの異なるＭＡＰキナーゼカスケードによって仲介される。ＬＰＳは、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（ｐ９０  ＲＳＫとも呼ばれる）とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化においてそれぞれ示したように、マクロファージの従来のＭＡＰＫカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路の両方を活性化する［１１］。両方の酵素の活性化は一過性のものであり、３０−６０分後に最高値に達し、その後、２時間後に基底状態の近くまで低下する［１１］。本研究で、ＭＳＫ１とＭＳＫ２において、類似した結果が得られている。これらの酵素の活性は、刺激を受けていないマクロファージに於いてはごくわずかであるが、ＬＰＳによる刺激の後には非常に高められる。活性化は、３０−６０後に最高に達し、その後低下する（Ｆｉｇ１７Ａと１７Ｂ）。
【０２５０】
どちらのシグナル形質導入経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ（ｓ））が、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化を仲介するのかを特定するために、我々はＳＢ  ２０３５８０（Ｓｅｃｔｉｏｎ  １）と、ＰＤ  ９８０５９（Ｓｅｃｔｉｏｎ  １）のようにＭＫＫ１の活性化／活性を阻害するＵＯ１２６の効果を調べた。これらの実験は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１の活性（図１８Ｃ）を完全に抑制するＵＯ１２６の濃度は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化（図１８Ａと１８Ｂ）を部分的に阻害するのみであることを明らかにした。同様に、ＭＳＫ１とＭＳＫ２は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化（図１８Ｄ）を完全に遮断する濃度において、ＳＢ  ２０３５８０によって、部分的に阻害されるのみである（図１８Ａと１８Ｂ）。逆に、ＵＯ１２６とＳＢ  ２０３５８０の両方とも存在する条件下でマクロファージがインキュベイションされた場合、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化は、ほぼ完全に抑制される（図１８Ａと１８Ｂ）。これらの観測は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳにより誘導される活性化は（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、２つの異なるＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅｓ）に仲介されることを示した。
【０２５１】
ＬＰＳに誘導される（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＣＲＥＢとＡＴＦ１のリン酸化は、２つの異なるＭＡＰ  キナーゼカスケード（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅｓ）に仲介される。ＭＳＫ１／ＭＳＫ２のための２種の推定される生理学的な基質は、転写因子ＣＲＥＢとＡＴＦ１である。図１９Ａに示されたように、ＬＰＳは、ＣＲＥＢとＳｅｒ  １３３のリン酸化と、ＡＦＴ１とＳｅｒ６３のリン酸化を誘導する。ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化のように、ＣＲＥＢとＡＴＦ１のリン酸化は、１時間後に最高に達し、２時間後に基底レベルまで戻る。同様に、ＣＲＥＢとＡＴＦ１のＬＰＳに誘導されたリン酸化（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｉｏｎ）は、ＳＢ  ２０３５８０によって部分的に阻害され、ＰＤ  ９８０５９によって部分的に阻害され、両方ともの薬剤が存在するとき完全に阻害される（図１９Ｂ）。
【０２５２】
ＬＰＳに刺激された（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）ＣＯＸ−２とＩＬ−１の誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、２つの異なるＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅｓ）に仲介される。ＣＯＸ−２プロモーターはＣＲＥを含む［５］。それゆえに、我々は、この酵素のＬＰＳに刺激された誘導（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を仲介するシグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）が、ＣＲＥＢを活性化するために求められるものと同じであるかどうかを試験することとした。ＣＯＸ−２タンパク質は、刺激されていないマクロファージ中には確認されなかったが、ＬＰＳに暴露してから２時間後には強く誘導された。誘導は、４時間後に最大となり、最低８時間保持された（図２０Ａ）。ＣＯＸ−２の誘導は、ＳＢ  ２０３５８０によって部分的に阻害され、ＰＤ  ９８０５９によって部分的に阻害され、両方ともの薬剤が存在するとき完全に抑制される（図２０Ｂ）。
【０２５３】
これらの結果を独立した方法で確認するために、我々はＣＯＸ−２の遺伝子転写におけるＬＰＳの効果を調べた。ＬＰＳはＣＯＸ−２  ｍＲＮＡを強く誘導し、２時間刺激した後に最高レベルに達して最低８時間保持される（図２１Ａ）。ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの誘導は、ＳＢ  ２０３５８０によって部分的に抑制され、ＰＤ  ９８０５９によって部分的に抑制され、両方ともの阻害剤が存在するときほぼ完全に抑制される（図２１Ｂ）。
【０２５４】
我々はまた、そのプロモーターもＣＲＥを含む炎症サイトカインＩＬ−１（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＩＬ−１）を仲介するシグナル形質導入伝達経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）も調べた。ＩＬ−１遺伝子転写誘導の時間工程（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）は、ＣＯＸ−２遺伝子のものから見分けることはできない（図２１Ａ）。興味深いことに、ＩＬ−１ｍＲＮＡもまた、ＰＤ  ９８０５９に部分的に阻害され、ＳＢ  ２０３５８０によって部分的に阻害され、両方ともの薬剤が存在するとき完全に阻害される（図２１Ｂ）。
【０２５５】
逆に、“ハウスキーピング”遺伝子ＨＰＲＴをコード化するｍＲＮＡは、ＬＰＳ及び／又はＰＤ  ９８０５９及び／又はＳＢ  ２０３５８０によって影響されない。
【０２５６】
ＬＰＳに誘導される活性（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）におけるＲｏ  ３１８２２０の効果。
Ｒｏ  ３１８２２０は、ＭＳＫ１といくつかの他のプロテインキナーゼの強力な阻害剤であるが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のような他の多くのプロテインキナーゼは、ＭＳＫ１の活性を除去する薬剤濃度においては、影響されない（［１，３］、後に論じられた）。Ｒｏ  ３１８２２０（５μＭ）は、ＬＰＳに誘導される（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＭＳＫ１及びＭＳＫ２、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化には影響せず（図１８）、これらのシグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）において、この化合物によって阻害される“上流（ａｐｓｔｒｅａｍ）”のプロテインキナーゼは無いことを示している。しかしながら、Ｒｏ  ３１８２２０（５μＭ）は、Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢとＳｅｒ６３におけるＡＴＦ１の、ＬＰＳに誘導される（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）リン酸化を完全に阻害する（図１９）。同じ濃度のＲｏ  ３１８２２０はまた、ＣＯＸ−２タンパク質のＬＰＳに刺激される（ＬＰＳ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）誘導と（図４Ｂ）、ＣＯＸ−２とＩＬ−１遺伝子の転写（図２１Ｂ）を抑制する。逆に、ＨＰＲＴをコード化するｍＲＮＡはＲｏ  ３１８２２０によって影響されない。
【０２５７】
ＣＲＥＢの活性化は、ＣＯＸ−２またはＩＬ−１の合成を誘導するには不充分である。Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢと、Ｓｅｒ６３におけるＡＴＦ−１のリン酸化もまたインビボでＰＫＡに触媒され、それゆえ、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎのような環状ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ）の細胞内濃度を上昇させるアゴニストに誘導され得る。ｆｏｌｓｋｏｌｉｎによるマクロファージの刺激は、ＬＰＳによるもの（図２２）に類似した、ＣＲＥＢとＡＴＦ−１のリン酸化を引き起こす。しかしながらこれは、ＰＤ  ９８０５９とＳＢ  ２０３５８０とによって、又はＲｏ  ３１８２２０によって抑制されない（データは示されていない）。ＬＰＳとは異なり、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎは顕著な量のＣＯＸ−２タンパク質が現れることを誘導しない。この発見は、後に考察される。
【０２５８】
ディスカッション（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
【０２５９】
本明細書において我々は、ＭＳＫ１と密接に関連したＭＳＫ２がＲＡＷ２６４マクロファージに存在し、双方のキナーゼはＬＰＳに応答して、一時的に活性化されることを証明した（図１７）。活性化と不活性化の割合は、それぞれ従来のＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８経路の活性化の便利な“下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）”リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ）である、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１とＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化と不活性化の割合に類似している。ＭＳＫ１とＭＳＫ２のＬＰＳに誘導される活性化は、従来のＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を阻害する薬剤に部分的に阻害され、ＳＢ  ２０３５８０（ＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８の阻害剤）に部分的に阻害され、マクロファージが双方のタイプの薬剤の存在下でインキュベーションされたときほぼ完全に阻害される（図１８）。マクロファージにおけるＭＳＫ２の活性は、ＭＳＫ１のものよりもはるかに低く、２９３、ヒーラ及びＰＣ１２細胞においても同様である（結果は示されていない）。
【０２６０】
転写因子ＣＲＥＢとＡＴＦ１は、ＭＳＫ１（実施例１を参照のこと）とＭＳＫ２［１３］の生理学的な基質であり、本研究はこの仮説と一致している。したがって、ＣＲＥＢとＡＴＦ１は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２の活性化／不活性化と類似の速度で（ｗｉｔｈ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、一時的にリン酸化され、リン酸化はマクロファージを、従来のＭＡＰキナーゼカスケードとＳＡＰＫ２ａ／ｐ３８双方の阻害剤とともにインキュベーションすることにより阻害されたが、これらの経路のうち一つを阻害することにより部分的にのみ阻害された。さらに、ＣＲＥＢのリン酸化は、ＭＳＫ１とＭＳＫ２は阻害するが、わずかな他のプロテインキナーゼを阻害するのみである濃度において、Ｒｏ３１８２２０（図３Ｂ）によっても阻害された。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ３及びＰＫＡもまた、ＣＲＥＢとＡＴＦ１を、それぞれＳｅｒ１３３とＳｅｒ６３において、リン酸化する。しかしながら、先の報告［１，２］とは異なり、これらのプロテインキナーゼは、ＣＲＥＢとＡＴＦ１のＬＰＳに誘導される活性化に対する、律速段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）にはなり得ない。なぜなら、それらは、これらの実験に用いたＲｏ  ３１８２２０の濃度には、インビボでは影響されないからである（実施例１と［１］を参照のこと）。
【０２６１】
ＣＲＥを含むマクロファージの２つの遺伝子は、ＣＯＸ−２［５］とＩＬ−１β［６］をコード化するものである。我々は、ＬＰＳに誘導されるこれらの遺伝子の転写とＣＯＸ−２タンパク質の合成は、ＣＲＥＢの活性化を阻害するのとまったく同じ阻害剤の組み合わせ、つまりＳＢ  ２０３５８０とＰＤ  ９８０５９またはＲｏ  ３１８２２０によって阻害されることを発見した。これらの結果は、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２は、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの遺伝子の転写を、少なくとも部分的に、ＣＲＥＢをリン酸化することによって刺激することを示唆する。しかしながら、他の転写因子、Ｃ／ＥＢＰβは、ある細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）でのＣＯＸ−２［１４］とＩＬ−１β［１５］遺伝子の活性化において、決定的な役割を果たすことが報告されている。さらに、Ｃ／ＥＢＰβは、３Ｔ３−ＬＩ早期脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）においてＳＡＰＫ２／ｐ３８により活性化されるの［１７］と同様に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞において特定のトレオニン残基（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）のリン酸化を触媒するＭＡＰＫ／ＥＲＫにより活性化される［１６］ことが報告されている。それゆえに、ＰＤ９８０５９／ＵＯ１２６とＳＢ  ２０３５８０は、ＣＲＥＢの活性化と同様にＣ／ＥＰＢβの活性化も阻害することによって、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの転写を抑制する。ＣＲＥＢ同様にＣ／ＥＰＢβに対する要求は、環状ＡＭＰ活性剤（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）によって誘導される、ＣＲＥＢの活性化だけでは、ＣＯＸ−２遺伝子の顕著な転写を誘導するのに不充分なのかを説明しうる。これらの可能性に焦点を当てた実験はいまだ進行中であるが、ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫｓとＳＡＰＫ２ｓ／ｐ３８によるＣ／ＥＢＰβの直接的なリン酸化は、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの遺伝子転写におけるＲｏ  ３１８２２０の効果を説明できない。なぜなら、このようなＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（［３］と結果（ｒｅｓｕｌｔｓ）は示していない）とそれらの活性化を導くシグナル伝達経路（図１８）は、このドラッグに抵抗を示すからである。
【０２６２】
引用文献
0004588215.tif 000039
0004588215.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＭＳＫ１のヌクレオチドと推論されたアミノ酸配列である。下線が引かれた残基はキナーゼドメインに対応する。太字で示された残基（Ｓｅｒ２１２、Ｓｅｒ３６０、Ｓｅｒ３７７、Ｔｈｒ５８１）は、リン酸化部位を活性化すると推定される。残基７２６から７４５間（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂには存在しない）の推定上の二者間の（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル（Ｒｏｂｉｎｓ等、１９９１）は、アスタリスクで示される。終止コドンは黒三角で示される。
【図２】密接に関連したキナーゼと共にＭＳＫ１のアミノ酸配列を配列したものである。この配列は、クラスタルＷプログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９４）を用いて行った。同一の残基には、黒い影を付けている。（Ａ）ＭＳＫ１をヒトＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）とともに配列したもの。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ上の活性化する重要なリン酸化部位に対応する残基（Ｓｅｒ２２２、Ｓｅｒ３６４、Ｓｅｒ３８１、Ｔｈｒ５７４）は、アスタリスクでしるしを付してある。（Ｂ）ＭＳＫ１のＮ末端（ＭＳＫ１−Ｎ）とＣ末端（ＭＳＫ１−Ｃ）キナーゼドメインを、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２／３及びＭＮＫ１のキナーゼ領域と共に並べたものである。これらのキナーゼの非触媒領域では重要な相同性はない。（Ｃ）ヒトＭＳＫ１を、部分的なマウス（ｍＭＳＫ２）及びヒトＭＳＫ２配列と共に並べたものである。推定上の活性化するリン酸化部位をアスタリスクで示している。
【図３】ＧＳＴ−ＭＳＫ１の発現と精製及び、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２とＳＡＰＫ２とによるその活性化。（Ａ）非刺激（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）細胞及びＴＰＡ刺激細胞から精製されたＧＳＴ−ＭＳＫ１（２μｇタンパク質）とＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（２μｇタンパク質）とを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した。分子量マーカーであるβ−ガラクトシダーゼ（（−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）（１１６ｋＤａ）とグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（９７ｋＤａ）の位置が示されている。各タンパク質の活性はペプチド基質（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）。非刺激細胞由来（Ｂ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１又は（Ｃ）ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａを、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２（８Ｕ／ｍｌ、白丸）、ＳＡＰＫ２ｂ／ｐ３８β（１Ｕ／ｍｌ、黒四角）、ＳＡＰＫ３／ｐ３８γ（１Ｕ／ｍｌ、白三角）、又はＳＡＰＫ４／ｐ３８δ（１Ｕ／ｍｌ、黒三角）のいづれかと共に、１０ｍＭ  Ｍｇ（Ａｃ）２と１００μＭ非ラベル化ＡＴＰとバッファーＢ内で培養した。示されている時間において、アリコートが回収され、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むバッファーＢで１０倍に希釈され、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対しての活性を定量された。平行する実験で、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２、及びＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１γ以外の全てのＳＡＰＫ酵素の活性を、ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）。ＳＡＰＫ１／ＪＮＫ１γはＡＴＦ２を用いて定量した（ａｓｓａｙｅｄ）（データは示していない）。この結果を、６つの測定（ｄｅｔｅｒ  ｍｉｎａｔｉｏｎｓ）の±ＳＥＭとして表している（２つの独立した実験）。各点の誤差は、＜１５％である。（Ｄ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１を、（［３２Ｐ］ＡＴＰを使用したこと以外は、上記のＭＡＰＫ２／ＥＲＫ２及びＳＡＰＫ酵素と一緒にインキュベートした。２０分後、ＳＤＳを加えることにより反応は終了し、試料を７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で電気泳動し、ＧＳＴ−ＭＳＫ１に対応するクーマシーブルー染色バンドをオートラジオグラフィーにかけた。２つの別個の実験で同じような結果が得られた。
【図４】特にＭＳＫ１を免疫沈降する抗体の発生。（Ａ）ＴＰＡ刺激２９３細胞（１．０Ｕ／ｍｌで５０μｌ）から精製された活性ＧＳＴ−ＭＳＫ１を４℃で３０分間、示されたペプチド免疫原（１ｍＭ）の存在下又は非存在下で、示された抗体（５μｇ）に結合されたタンパク質Ｇ−セファロース（Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ（５μ１）と共に振とう台で培養し、その後１３，０００ｘｇで１分間遠心分離にかけた。ビード（ｂｅａｄｓ）は材料及び方法で記載したように洗浄し、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。（Ｂ）及び（Ｃ）ＴＰＡ刺激２９３細胞由来の活性ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ（Ｃ）を示されている抗体で免疫沈降した以外はＡと同様にし、洗浄した免疫沈降物のＣｒｏｓｓｔｉｄｅに対する活量を定量した。
【図５】ＴＰＡ、ＥＧＦ及び細胞ストレスによる内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＭＳＫ１の活性化。２９３細胞を１６時間血清飢餓とし、その後５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（白抜き棒）、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（斑点棒）の存在下で、又はいずれの化合物もない状態（黒棒）で、１時間培養した。細胞は非刺激（対照）（ｃｏｎｔｒｏｌ）のまま放置するか、ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ、１０分）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１０分）、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．５ｍＭ、３０分）のいづれかで刺激するか、ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、その後３７℃で３０分放置）又は、Ｈ２Ｏ２（２ｍＭ、３０分）にさらすかのいづれかとし、阻害剤の存在下又は非存在下は連続的とした。細胞を溶菌し、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰＫ２（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した。データは独立した実験の３回実行した各測定を±ＳＥＭ平均値として表してある。
【図６】２９３細胞内でのＴＰＡ及びＵＶによる活性化におけるＭＳＫ１の突然変異の効果。２９３細胞を、フラッグ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識された野生型ＭＳＫ１、Ｎ末端（ＮＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１及びＣ末端（ＣＴ）“キナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）”ＭＳＫ１を発現するＤＮＡ構築物に、瞬間的にトランスフェクトした（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。この細胞を、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０と共に、又は両化合物の非存在下で１時間培養した。それらをその後、１０分間ＴＰＡ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激するか、ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、その後３７℃で３０分放置）暴露し、これらは阻害剤の連続存在下又は非存在下で行った。細胞を溶菌し、ＭＳＫ１を溶菌液から免疫沈降し、Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅで定量した。データは、独立した３つの実験を各３回実行した測定を±ＳＥＭ平均値として表してある。（Ｂ）各溶菌液からの２μｇのタンパク質を１０％  ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で電気泳動し、モノクロナールフラグ抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｆｌａｇ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。免疫反応性ＭＳＫ１タンパク質は、非トランスフェクト細胞中に観察されなかった（データは示していない）。フラッグ（Ｆｌａｇ）エピトープ標識されたＭＳＫ１はグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（見かけ質量９７ｋＤａ）と共泳動する。
【図７】ＭＳＫ１は主に細胞の核に、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａはサイトゾルに局在化する。Ｎ末端にフラッグエピトープ標識された（Ｆｌａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇｇｅｄ）野生型ＭＳＫ１又はＮ末端にＨＡエピトープ標識されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａを発現する２９３細胞を、無血清培地で１６時間培養し、その後非刺激のままか、ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定の前にＴＰＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、１０分）で刺激し、分画し、適当な標識（ＭＳＫ１（Ａ＋Ｂ）にはフラグ、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｃ）にはＨＡ、のため免疫ゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）標識化した。細胞の核（Ｎｕｃ）及び細胞質（Ｃｙｔ）におけるＭＳＫ１又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの濃度の定量は、物質及び方法で記載したように行った。その結果は、ＴＰＡ刺激はＭＳＫ１及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの局在化に検出可能な効果はないことを示している。データは３つの独立した実験からのものである。ＭＳＫ１の対照としては、ｎ＝９、９、１４、ＴＰＡはｎ＋１０、１１、１５である。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａの対照として全部でｎ＝２２、ＴＰＡは全部でｎ＝９である（細胞質中に免疫反応性物質の示量魂のある細胞は除外している）。棒は、Ｃｏｃｈｒａｎ（１９５３）に従って計算した平均値の標準誤差を表す。（Ｃ）ＭＳＫ１（Ｃ、非刺激、及びＤ、ＴＰＡ）及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ（Ｅ、非刺激）の選択された試料を示し、構造及び、標識化分布を図示している。棒は５００ｎｍである。
【図８】ＭＳＫ１はＣＲＥＢをＳｅｒ１３３でリン酸化する。（Ａ）表示されているペプチドとＣＲＥＢに対する、ＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂの基質特異性の比較。リン酸化と分析は、材料及び方法で記載したように行った。報告された全ての反応速度定数に対する標準誤差は、＜±２０％（ＳＥＭ）の範囲内であり、そのデータは２つの別個の実験の平均値として報告している。Ｖｍａｘ値はＣｒｏｓｓｔｉｄｅ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ペプチド１）を基質として用いて得られた値の百分率として報告している。ＣＲＥＢの残基１２６−１３６に対応するペプチドＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫは、ＣＲＥＢｔｉｄｅと名づける。太字で表されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基は、ペプチドのリン酸化されたセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基に対応している。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに対するＭＳＫ１、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂのＶｍａｘ値はそれぞれ、２００Ｕ／ｍｇ、３５０Ｕ／ｍｇ、８００Ｕ／ｍｇである。（Ｂ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１（黒棒）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰＫ−１ａ（白棒）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ−１ｂ（斑点棒）及びＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（斜線棒）は表示されている基質で定量された。ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を用いた条件では、ＣＲＥＢの３４１アミノ酸スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）のＳｅｒ９８（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、１９８９）は、Ｓｅｒ１３３に比べて１０倍高いレベルにリン酸化された（データは示さず）。図示されたＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２によるＣＲＥＢのリン酸化は、訂正され、ＣＲＥＢへのリン酸基の全取込に対するＳｅｒ１３３リン酸化の寄与のみを示している。データは、３つの独立した実験の各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表されている。（Ｃ）ＭＳＫ１でリン酸化されたＣＲＥＢを、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で消化し、水で０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ｔｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＦＡ）で平衡化したＶｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４  Ｃ１８カラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）によりクロマトグラフィーにかけた。カラムを、流速０．８ｍｌ／分、線形アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）勾配（斜線）で展開し、０．４ｍｌのフラクションを回収した。カラムに照射された放射能の７５％が、主要３２Ｐ含有ペプチドから１３％アセトニトリルで（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）回収された（放射能の残りは多数の小さなピークとして溶出された）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂでリン酸化されたＣＲＥＢのペプチドマップは、ＭＳＫ１でリン酸化されたＣＲＥＢのものと同一であった（データは示さず）。
【図９】ＭＳＫ１の活性におけるＲｏ  ３１８２２０の効果。（Ａ）ＧＳＴ−ＭＳＫ１（黒丸）、ＰＫＣアイソフォーム混合物（白丸）、ＧＳＴ−ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ｂ及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（白三角）における、インビトロでのＲｏ  ３１８２２０の効果。結果は、阻害剤が取り除かれた対照インキュベーションと比較して表し、各測定を３回行った２つの実験の平均値として示している。各点の誤差は±１０％である。（Ｂ）２９３細胞を１時間、５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）と共に又は阻害剤なしで（−）前処理し、その後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２）にさらすかその処理をせず（−）、そしてその後さらに３０分、Ｒｏ  ３１８２２０の連続存在下で培養した。この細胞を溶菌し、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２を免疫沈降して定量した。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｃ）阻害剤での処理前に、２９３細胞を２時間、３２リン酸塩（０．１ｍＣｉ／ｍｌ）で培養した以外は上記と同じである。細胞はその後ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２）にさらすか未処理のまま（−）とし、更に２０分間阻害剤の連続存在下で培養した。細胞溶菌に続いて、ＨＳＰ２７を細胞抽出液から免疫沈降し（Ｃｕｅｎｄａ等、１９９５）、１５％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で流し、オートラジオグラフィーを行った。
【図１０】Ｒｏ  ３１８２２０は、ＣＲＥＢのＥＧＦ及びＵＶ誘導リン酸化を抑制する。２９３細胞を、５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）のそれぞれ存在下及び非存在下で前処理し、その後、（ＡＮＤ）ＵＶ放射（２００Ｊ／ｍ２、３０分、その後３７℃で３０分）、（Ｂ、Ｅ）ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、１５分）、（Ｃ）ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２０μＭ、１５分）のいづれかにさらした。細胞を溶菌し、タンパク質を１０％アクリルアミドゲル（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ）で分離し、リン酸化特異抗体（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットした。このリン酸化特異抗体は、Ｓｅｒ１３３とＳｅｒ６３でそれぞれリン酸化した時、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の両方を認識する。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。
【図１１】ＴＮＦによるＭＳＫ１の活性化。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（黒丸）、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（白三角）、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９＋１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（黒三角）、の存在下、又は両化合物の非存在下（白丸）で、無血清培地で培養した。その後、細胞を、表示した時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下において、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、溶菌して、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｂ）、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ａ／ｂ（Ｃ）を同じ溶菌液から免疫沈降し、定量した。データは、２つの別個の実験での各測定を３回行った平均値±ＳＥＭとして表す。
【図１２】ＴＮＦ誘導ＣＲＥＢリン酸化におけるＰＤ  ９８０５９、ＳＢ  ２０３５８０、Ｒｏ  ３１８２２０の効果。ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を２時間、無血清培地で、表示されているように５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）及び５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細胞を、図１１Ｃの説明文で述べたように、表示した時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下においてＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、溶菌して、ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために試料を免疫ブロットした。ブロット上のＣＲＥＢ及びＡＴＦ１の位置が表示されている。展開前のブロットの暴露時間（ｅｘｐ）を表示している。
【図１３】ＰＣ１２細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＮＧＦ誘導活性化におけるＰＤ  ９８０５９、ＳＢ  ２０３５８０、Ｒｏ  ３１８２２０の効果。ＰＣ１２細胞を無血清培地で２時間、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）又は１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細胞を１５分間、ＮＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。細胞溶菌後、アリコートをＣＲＥＢ（Ａ）のリン酸化に対して免疫ブロットしたか、溶菌液からの免疫沈降後、ＭＳＫ１（Ｂ）又はＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）を定量するのに用いた。
【図１４】ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞でのＣＲＥＢ及びＭＳＫ１の亜ヒ酸塩（ａｒｓｅｎｉｔｅ）及びＦＧＦ誘導活性化におけるＰＤ  ９８０５９、ＳＢ  ２０３５８０、Ｒｏ  ３１８２２０の効果。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を１時間、無血清培地で、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）、及び５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養した。その後細胞を、１５分間、亜ヒ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｒｓｅｎｉｔｅ）（０．５ｍＭ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）のいづれかについてこれらを溶菌液から免疫沈降した後定量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化のために免疫ブロットした（Ｄ）。
【図１５】ＲＡＷマクロファージ内のＣＲＥＢ及びＭＳＫ１のＬＰＳ誘導活性化におけるＰＤ  ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｒｏ  ３１８２２０の効果。ＲＡＷ  ２６４マクロファージを、無血清培地で２時間培養し、その後、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）、１０μＭ  ＳＢ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で１時間培養した。その後細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。細胞を溶菌した後、アリコートを、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｃ）についてこれらを溶菌液から免疫沈降した後定量するか、又はＣＲＥＢ及びＡＴＦ１のリン酸化に対して免疫ブロットした（Ｄ）。
【図１６】ヒトＭＳＫ２及びヒトＭＳＫ２のスプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【図１７】ＲＡＷ  ２６４マクロファージ中のＬＰＳによるＭＳＫ１及びＭＳＫ２の活性化。マクロファージを、表示した時間、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳと共に（開符号）、又は無しで（閉符号）刺激した。ＭＳＫ１活性（Ａ）又はＭＳＫ２活性（Ｂ）を、溶菌液から免疫沈降後、測定した。結果を、２つの別個の皿の２つの測定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に２つの実験から得られた。
【図１８】ＲＡＷ  ２６４マクロファージ内のプロテインキナーゼのＬＰＳ誘導活性化における阻害剤の効果。マクロファージを１時間、１０μＭ  ＵＯ  １２６（Ｕ）及び／又は１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後１時間、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳと共に又はなしで、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した。その後、ＭＳＫ１（Ａ）、ＭＳＫ２（Ｂ）、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１（Ｃ）、及びＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（Ｄ）を、溶菌液から免疫沈降した後、定量した。結果を、２つの別個の皿の２つの測定に対する平均値±ＳＥＭとして表す。同様な結果が更に２つの実験から得られた。
【図１９】  ＲＡＷ２６４マクロファージでのＬＰＳ誘導ＣＲＥＢ及びＡＴＦ１リン酸化。（Ａ）マクロファージをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で表示された時間、刺激した。細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリコートをＳＤＳで変性し、１０％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で電気泳動してニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）へ転移させた後、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ−）ＣＲＥＢ抗体で免疫ブロットした。分子量マーカーであるグリコーゲンホスホリラーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）（９７ｋＤａ）、子ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）（４３ｋＤａ）、及び炭酸脱水酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）（３０ｋＤａ）の位置が示されている。同様の結果が更に３つの実験で得られた。（Ｂ）マクロファージを１時間、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９及び／又は１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭＲｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後１時間１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳの存在下又は非存在下において、阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した以外はＡと同様。同様の結果が更に３つの実験で得られた。
【図２０】  ＲＡＷ２６４マクロファージでのＣＯＸ２タンパク質のＬＰＳ刺激誘導。（Ａ）マクロファージを表示された時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリコートをＣＯＸ−２抗体で免疫ブロットした（詳細と分子量マーカーについては図１９の説明文参照）。同様の結果が更に３つの実験で得られた。（Ｂ）マクロファージを１時間、５０μＭ  ＰＤ  ９８０５９（ＰＤ）及び／又は１０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（ＳＢ）、又は５μＭ  Ｒｏ  ３１８２２０（Ｒｏ）の存在下又は非存在下で培養し、その後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの非存在下又は存在下で、かつ阻害剤の連続存在下又は非存在下で４時間刺激した以外はＡと同様。同様の結果が更に３つの実験で得られた。
【図２１】  ＲＡＷ２６４マクロファージでの遺伝子転写（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）におけるＰＤ  ９８０５９及びＳＢ  ２０３５８０の効果。（Ａ）細胞を表示された時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。全ＲＮＡを各時間点で抽出し、ＩＬ−１、ＣＯＸ−２、及びＨＲＰＴをコード化するｍＲＮＡを、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（セクション２．６）を用いて決定した。（Ｂ）マクロファージを１時間、ＰＤ  ９８０５９（５０μＭ）及び／又はＳＢ  ２０３５８０（１０μＭ）、又はＲｏ  ３１８２２０（５μＭ）の存在下又は非存在下で培養し、その後、３時間、ＬＰＳの非存在下又は存在下で、かつ阻害剤の連続存在下又は非存在下で刺激した以外はＡと同様。ＲＴＰＣＲは、ＩＬ−１、ＣＯＸ−２、及びＨＰＲＴのフラグメントをコード化するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いて行われた。同様の結果が更に２つの実験で得られた。
【図２２】  ＲＡＷ２６４マクロファージでのＣＲＥＢリン酸化及びＣＯＸ−２誘導におけるｆｏｒｓｋｏｌｉｎの効果。（Ａ）マクロファージを、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間、又はｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｆ）（２０μＭ）とＩＢＭＸ（１０μＭ）で１５分間刺激した。細胞溶菌後、溶菌液（３０μｇタンパク質）のアリコートをリン特異（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＣＲＥＢ抗体で免疫ブロットした（詳細と分子量マーカーについては図１９の説明文参照）。（Ｂ）マクロファージを３時間、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、又はｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２０μＭ）とＩＢＭＸ（１０μＭ）で刺激し、特異的なＣＯＸ−２抗体で免疫ブロットを行った（物質及び方法セクション）。マーカータンパク質は図１９と同様である。同様な結果が更に２つの実験で得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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