(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フマル酸還元酵素を構成するサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも一つ、及び乳酸脱水素酵素遺伝子が不活性化されている、エシェリキア・コリＷ３１１０の形質転換体を、好気条件下にて培養し、さらに嫌気条件で培養して水素生成能力を誘導した後、グルコース、キシロース、スクロース、フルクトース、アラビトール、及びキシリトールからなる群より選ばれる少なくとも１種の糖類の存在下嫌気条件で培養することを特徴とする水素製造方法。
【請求項２】
エシェリキア・コリＷ３１１０の形質転換体が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３７，国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２６）である請求項１に記載の水素製造方法。
【請求項３】
糖類が、グルコース、及びフルクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の水素製造方法。
【請求項４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３７，国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物であって、該微生物が有する嫌気代謝経路における乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が、不活性化されている微生物を用いて水素を製造する方法に関する。本発明の方法により生成する水素は、燃料電池用燃料源として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
水素は、化石燃料と異なり、燃焼しても炭酸ガスや硫黄酸化物等の環境問題が懸念される物質を発生しない究極のクリーンエネルギー源として注目されている。水素は、単位質量当たりの熱量が石油の３倍以上あり、燃料電池に供給すれば電気エネルギーおよび熱エネルギーに高い効率で変換できる。
【０００３】
水素生成のために従来化学的製法として、例えば天然ガスやナフサの熱分解水蒸気改質法等の技術が提案されている。これらの方法は高温高圧の反応条件を必要とし、そしてこの方法により製造される合成ガスにはＣＯ（一酸化炭素）が含まれるため燃料電池用燃料として使用する場合には、燃料電池電極触媒劣化の問題を回避するためＣＯを除去する必要がある。しかしながら、ＣＯ除去は、技術的に困難であり容易ではない。
【０００４】
一方、微生物による生物的水素生成は常温常圧の反応条件で行え、そして発生するガスにはＣＯが含まれないためその除去も不要である。
このような観点から、微生物による生物的水素製造方法は燃料電池用燃料供給のより好ましい方法として、注目されている。
【０００５】
生物的水素製造方法は大別して光合成微生物を使用する方法と非光合成微生物（主に嫌気性微生物）を使用する方法に分けられる。
前者の方法は水素生成に光エネルギーが用いられるが、低い光エネルギー利用効率のため、広大な集光面積を要し、水素生成装置の価格問題や維持管理の難しさ等、解決しなければならない課題が多く未だ実用的なレベルには至っていない。
【０００６】
後者の方法では、嫌気性微生物における水素生成に関する代謝経路が種々知られている。該代謝経路としては、例えば、グルコースのピルビン酸への分解経路において水素が発生する経路；ピルビン酸からアセチルＣｏＡを経て酢酸が生成する過程において水素が発生する経路；又はピルビン酸由来の蟻酸より直接水素が発生する経路等が挙げられる。グルコースからピルビン酸への分解経路による、もしくはピルビン酸からアセチルＣｏＡを経て酢酸が生成する過程における、ＮＡＤＨ等の再酸化と共役した水素生成は、絶対嫌気性微生物に多く見られる。また、ピルビン酸由来の蟻酸より直接水素を発生する経路は、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステム（以下、ＦＨＬシステムという）として、通性嫌気性微生物をはじめ多くの微生物が有しており、ＦＨＬシステムに関してはエシェリキア・コリにおいて数多くの研究がなされている。エシェリキア・コリに代表される通性嫌気性細菌でのグルコースからの水素生成は、グルコース１分子からピルビン酸が２分子生成し、ピルビン酸がアセチルＣｏＡと蟻酸に開裂することにより、アセチルＣｏＡと蟻酸がグルコースからはそれぞれ２分子生成し、その内の蟻酸が水素と二酸化炭素に分解される、という経路を取ると考えられている。従って、通性嫌気性細菌によるグルコース１モルからの水素理論収率は２モルとされている。
【０００７】
現在まで、グルコースを基質とし、ＦＨＬシステムを介して水素生産を行う方法がいくつか知られている。おり、エシェリキア・コリの乳酸経路を不活性化することによる水素製造方法が報告されている。
“早出広司ら、Ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ  II、２００１年、ｐ．１９５−２０４”は、乳酸生成経路を不活性化した微生物を用いてグルコースから水素を製造する方法を開示している。しかし、乳酸生成経路を不活性化しても水素収率は殆ど向上しておらず、グルコースからの水素収率は理論収率を１００％とした場合に２２％〜２４％程度である。また水素生成速度も向上していない。
【０００８】
また、国際公開第２００４／０７４４９５号公報は、水素生成能力を有する微生物を得るために、微生物を好気条件で培養し、その得られた菌体を嫌気条件で培養して、微生物に水素生成能力を付与する方法を開示している。しかし、同公報には、遺伝子の改変による水素生成速度および水素収率の向上には何ら言及していない。
【０００９】
“Ｋ．Ｙ．ＡＬＡＭら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９年、第１７１巻、ｐ．６２１３−６２１７”は、酸化還元レベルの異なる様々な基質による有機酸等の生成バランスについて報告している。同文献は、乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、ｌｄｈＡともいう）およびフマル酸還元酵素遺伝子（以下、ｆｒｄＡＢＣＤともいう）を不活性化することにより、それぞれ乳酸及びコハク酸の生成が抑えられた微生物を得たことを報告している。同文献には、生成物の酸化還元バランスについて記載されているが、水素生成、及び水素収率に関する記載は全くない。フマル酸還元酵素は４つの遺伝子ｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣ、及びｆｒｄＤによりコードされた４種のタンパクがそれぞれサブユニットとなり複合酵素として活性を持つとされているが、同文献には、如何なる方法によりフマル酸還元酵素（ＦＲＤ）が不活性化されているのか、又いずれのサブユニットが不活性化されているかが記載されていない。
【００１０】
同文献の表３（６２１５頁）には、各種糖類を使用した場合に生成する各有機酸等の組成が示されている。また、野生株を用いた場合に比較して、乳酸脱水素酵素遺伝子及びフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄが不活性化されている変異株は、水素生成に関連すると思われる蟻酸の生成量がほとんど変化していないデータが示されている。同文献は、糖類からの水素生成の収率や速度が向上する技術やそのような現象を示唆していない。
“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１，２３，ｐ５３７−５４１”は、嫌気性代謝経路を変異原物質を用いて不活性化することにより、水素収率が大幅に向上したことを開示している。しかし、同文献は不活性化された遺伝子を特定していない。また、コハク酸についての記載はない。
ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２０９２号公報は、高効率水素製造方法を開示しているが、同文献の方法では蟻酸存在下での菌体の培養条件が限定されており、また微生物の遺伝子組み換えにより水素収率を向上させることは教えていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
嫌気条件下において、有機性基質からの水素収率、例えば１モルのグルコースからの水素理論収率は２モルである。しかし、実際には、嫌気性微生物による水素生成の基本原理である還元力の排出は、水素生成以外の形でも行われているため、理論収率で水素を得ることは困難である。また、微生物を用いて水素を製造する方法は、水素生成速度が遅い。
本発明の第１の目的は、微生物を用いて、高収率かつ高速度で、有機性基質から水素を製造する方法を提供することである。そのようにして得られる水素は燃料電池用の燃料源として使用することができる。
本発明の第２の目的は、有機性基質から高収率かつ高速度で水素を生産することができる微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は上記の課題を解決することを目的として、鋭意検討を行った結果、ヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物であって、微生物の持つ嫌気代謝経路のうち乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が不活性化されている微生物を用いて、嫌気条件下で有機性基質による水素生成反応を行うことにより、有機性基質からの水素収率が格段に向上し、微生物重量あたりの水素発生速度が一段と向上できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の水素製造方法及び微生物を提供する。
項１．  ヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、かつ嫌気代謝経路における乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が不活性化されている微生物を、有機性基質の存在下嫌気条件で培養することを特徴とする水素製造方法。
項２．  微生物が、さらに蟻酸脱水素酵素遺伝子を有するものである項１に記載の水素製造方法。
項３．  微生物が、通性嫌気性細菌である項１に記載の水素製造方法。
項４．  通性嫌気性細菌が、エシェリキア・コリの形質転換体である項３に記載の水素製造方法。
項５．  微生物が、乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子を有し、かつその乳酸脱水素酵素遺伝子、およびフマル酸還元酵素を構成するサブユニットをコードする遺伝子の少なくとも一つが不活性化されているものである項１に記載の水素製造方法。
項６．  微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３７，国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２６）である項４に記載の水素製造方法。
項７．  微生物が、好気条件下にて培養された後、さらに嫌気条件で培養されたものである項１に記載の水素製造方法。
項８．  有機性基質が糖類である項１に記載の水素製造方法。
項９．  糖類が、グルコース、ガラクトース、キシロース、スクロース、及びフルクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である項８に記載の水素製造方法。
項１０．  ヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、かつ嫌気代謝経路における乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が不活性化されている水素製造用微生物。
項１１．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３７，国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２６）。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、糖類等の有機性基質から効率的な水素生成が可能となる。さらには、有機性基質からの微生物重量あたりの水素生成速度が向上し、水素生成反応器の容量を小さくすることが可能となる。また水素生成時の各種有機酸等の副生物の生成を抑えることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る水素製造方法は、ヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物であって、該微生物が有する嫌気代謝経路における乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が、不活性化されている微生物を用いることにより実現される。このような微生物を水素生成用の液体に懸濁し、それに嫌気条件下にて有機性基質を供給することにより、工業的に有利に水素生成を行うことができる。以下、本発明につき詳細に説明する。
【００１６】
本発明に係る微生物の構築に用いられる微生物は、ヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物である。ヒドロゲナーゼとしては、代表的には蟻酸水素リアーゼ（Formate Hydrogen Lyase）複合体に含まれるヒドロゲナーゼ（Ｒ．Ｂｏｅｈｍら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、４巻、ｐ．２３１−２４３）や、細胞内にモノマーで存在する可溶性ヒドロゲナーゼ（Ｊ．Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００４年，３２４巻，６７９−６８５頁）が挙げられる。このヒドロゲナーゼは、２つのプロトンと電子から１分子の水素への変換を触媒する。ヒドロゲナーゼとしては、蟻酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、フェレドキシン、シトクロム、メナキノンなどを基質とするヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００１７】
この微生物は、さらに蟻酸脱水素酵素遺伝子（Ｆ．Ｚｉｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６年、８３巻、ｐ．４６３０−４６５４）を有することが好ましい。蟻酸水素リアーゼ複合体には、蟻酸脱水素酵素遺伝子が含まれる。
微生物がヒドロゲナーゼ活性を有することは、菌体から粗酵素液を抽出し、水素を基質とする酵素反応により、ＮＡＤ＋、ベンジルビオロジェン、又はメチルビオロジェンなどを還元する反応を行い、吸光度の変化の有無を検出することにより確認できる。また、微生物が、蟻酸脱水素酵素遺伝子を有することは、菌体から粗酵素液を抽出し、粗酵素液に蟻酸ナトリウムを添加し、ベンジルビオロジェンなどを還元する反応を行い、吸光度の変化の有無を検出することにより確認できる。また、微生物がこれらの酵素を有することは、マウスやラットを用いて作製したヒドロゲナーゼ抗体を用いて、微生物から調製したタンパク質に対するウェスタンブロッティングを行うことによっても確認することができる。また、ヒドロゲナーゼ間又は蟻酸脱水素酵素間で保存されている塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、微生物から抽出したＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを行うことによっても確認することができる。
【００１８】
また、本発明において使用される微生物の構築に用いられる微生物は、嫌気性微生物であることが好ましい。嫌気性微生物としては、偏性嫌気性微生物または通性嫌気性微生物が挙げられるが、偏性嫌気性微生物よりも通性嫌気性微生物が好ましい。通性嫌気性微生物としては、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物―例えばエシェリキア・コリ［（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ１１７７５、ＡＴＣＣ４１５７、ＡＴＣＣ２７３２５等］、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属微生物―例えばクレブシェラ・ニューモニエ［（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１３８８３、ＡＴＣＣ８０４４等］またはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物―例えばエンテロバクター・アエロギネス［（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）  ＡＴＣＣ１３０４８、ＡＴＣＣ２９００７等］若しくはエンテロバクター・クロアセ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）等が挙げられ、また、偏性嫌気性微生物としては、例えばクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物―例えばクロストリジウム・ベイエリンキイ［（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）  ＡＴＣＣ２５７５２、ＡＴＣＣ１７７９５等］、クロストリジウム・ブチルクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）またはクロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）等が挙げられる。
【００１９】
これらの嫌気性微生物は、嫌気条件による分裂増殖は好気条件によるそれと比較して極めて遅いことより好気条件による培養が好ましい。この意味で嫌気性微生物の内、偏性嫌気性微生物より通性嫌気性微生物が、本発明に係る水素製造方法に好適に使用される。上記微生物の内ではエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはエンテロバクター・アエロギネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が、本発明に係る水素製造方法に好適に使用される。
【００２０】
本発明方法で使用する微生物は、嫌気代謝経路における乳酸生成経路及びコハク酸生成経路が不活性化されている。本発明において、「不活性化」には、実質的に全く活性を示さない場合、及び天然型微生物に比べて活性が低下している場合の双方が含まれる。
乳酸生成経路およびコハク酸生成経路を不活性化する方法としては、最終的に、該微生物が有する嫌気代謝経路において乳酸およびコハク酸の生成を抑制するように、該微生物の遺伝子を組み換える方法等が挙げられる。該方法としては、より詳細には、例えば、変異原を用いた突然変異による非遺伝子工学的手法や、制限酵素またはリガーゼなどを用い、任意に遺伝子配列の操作を行う遺伝子工学的手法等が挙げられる。このうち、目的とする遺伝子を確実に不活性化するためには、遺伝子工学的手法が好ましい。
【００２１】
本発明に係る微生物が有する嫌気代謝経路における乳酸生成経路を不活性化して、乳酸の生成を抑制するためには、乳酸生成経路に関与する遺伝子、たとえば乳酸脱水素酵素遺伝子を不活性化することが好ましい。また、コハク酸生成経路は、ホスホエノールピルビン酸からオキザロ酢酸、リンゴ酸、フマル酸を経てコハク酸に変化する経路である。本発明の微生物は、嫌気性代謝経路におけるコハク酸生成経路のいずれのステップが不活性化されていてもよいが、フマル酸からコハク酸を生成するステップが不活性化されていることが好ましい。このため、コハク酸生成経路に関与する遺伝子、例えばフマル酸還元酵素遺伝子を不活性化することが好ましい。
フマル酸還元酵素遺伝子については、フマル酸還元酵素サブユニットをコードする遺伝子の少なくとも一つが不活性化されていればよい。
【００２２】
遺伝子工学的手法により乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子を不活性化する方法としては、乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子をあらかじめクローニングしておき、該遺伝子の特定部位に非遺伝子工学的手法もしくは遺伝子工学的手法により突然変異を起こす、該遺伝子の特定部位に遺伝子工学的手法により特定の長さの欠損部位を設ける、または該遺伝子の特定部位に薬剤（カナマイシンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質等）耐性マーカーなどの外来性遺伝子を導入すること等により、不活性化のための変異遺伝子を含むＤＮＡを準備し、このＤＮＡを細胞へ戻す方法が好ましく用いられる。
【００２３】
薬剤耐性マーカーを乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子に導入し不活性化する場合、薬剤耐性マーカーを含む培地にて目的とする株をスクリーニングすることにより、薬剤耐性マーカーを導入した株を得ることができる。この方法では、薬剤耐性マーカーなどの外来遺伝子が周辺の遺伝子に影響を及ぼす場合がある。このような事態を避けることができる方法として、乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子に特定の長さの欠損部位を設けることが望ましい。特定の長さのＤＮＡを欠損させるだけでは不活性化された株を取得することができないため、不活性化されるべき遺伝子と致死遺伝子とを同時に細胞内に導入し、相同組み換えを行う方法により遺伝子に特定の長さの欠損部位を設けることができる。致死遺伝子としては、例えば、エシェリキア・コリ内ではバチルス・サブチリス由来のｓａｃＢ遺伝子が挙げられる。形質転換のためのベクター内に、特定長の欠損領域のある遺伝子と、ｓａｃＢ遺伝子を挿入する。このベクターを用いて組み換えを行う宿主に導入し、相同組み換えを行う。相同組み換えを効率よく行うためには、温度感受性のベクターを用いることがより好ましい。温度感受性ベクターとしては、温度感受性レプリコンｐＳＣ１０１ｔｓを持つ、ｐＭＡ２、ｐＬＯＩ２２２６、ｐＴＨ１８ｋｓ１またはｐＴＨ１８ｋｓ５などが挙げられる。一度相同組み換えを行った宿主内には、不活性化された遺伝子と元来より存在する不活性化されていない遺伝子が存在する。一度相同組み換えを行った宿主細胞を致死遺伝子が誘発される条件下で培養することにより、致死遺伝子領域と不活性されていない遺伝子領域との二度目の相同組み換えが起こり、乳酸脱水素酵素遺伝子またはフマル酸還元酵素遺伝子は完全に不活性化され、目的とする組み換え株を得ることが可能となる
【００２４】
組み換えを起こす遺伝子のベクター（プラスミド）への挿入は、公知の方法で行うことが出来るが、市販のライゲーションキット等を用いるのが簡便で好ましい。ライゲーションキットとしては、例えばＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  １、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（タカラバイオ社製）、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ（登録商標）；  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＲ  ＢＲＯＷＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ製）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）又はラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等が挙げられる。
【００２５】
上記のようにして得られるベクターを宿主に導入する方法は公知の方法を用いることができる。該方法としては、例えば、コンピテント細胞を塩化カルシウムで処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．、Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））や、細胞をプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅｔ．，１６８．１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  １９２９（１９７８））、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３１９７（１９９７））等が挙げられる。
【００２６】
また、微生物が有する乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が不活性化された遺伝子は、乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子などを、文献調査、もしくは公知の分子生物学的実験もしくはそれから派生する相同性検索等により特定した後、その配列を用いて遺伝子を選択して、上述の操作により遺伝子を組み換えることにより得られる。より詳しくは、例えばエシェリキア・コリ  Ｋ−１２  Ｗ３１１０株は既に全ゲノムＤＮＡ配列が解読されており、Ｗ３１１０株内に存在する乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ、フマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤの配列は、以下ＵＲＬに記載のデータベース
http://gib.genes.nig.ac.jp/
http://ecoli.aist-nara.ac.jp/GB5/search.jsp
より検索を行うことにより、見出すことができる。そして、ここで得られるＤＮＡ配列に基づき、ｌｄｈＡ遺伝子、ｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子を有した配列を増幅することが可能であるので、このようにして得られる遺伝子を前述した操作により組み換えることで不活性化することができる。ここで、乳酸脱水素酵素は遺伝子ｌｄｈＡによりコードされる単一酵素であり、フマル酸還元酵素は遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤによりコードされ、４つのサブユニットで構成される酵素である。
あるいは、ｌｄｈＡおよびｆｒｄＡＢＣＤとそれぞれ相同性の高い配列を、以下ＵＲＬに記載のデータベース
http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html
より検索し、この配列を用いて該当遺伝子を探索することができる。本発明に係る乳酸脱水素酵素遺伝子およびフマル酸還元酵素遺伝子の不活性化は前述のいずれかの方法によっても行うことができる。
このようにして、乳酸生成経路およびコハク酸生成経路が不活性化されている微生物を創製できる。
【００２７】
以下、上記の方法により得られる微生物に水素生成能力を獲得させるための培養方法、およびその微生物を用いた水素製造方法を示す。
本発明による水素製造方法としては、微生物の嫌気増殖とともに水素生成を行う方法と、微生物培養段階と嫌気条件下の水素生成段階とを分けて行う方法とが挙げられる。水素の生産性向上の観点から、微生物培養段階と水素生成段階とを分ける方法が好ましい。
【００２８】
以下に微生物培養段階と水素生成段階とを分ける方法について具体的に記す。まず微生物培養段階において、水素生成能力を有していない微生物を好気条件で培養する。次に水素生成段階において、培養段階で得られた水素生成能力を有していない微生物に嫌気条件下にて水素生成能力を誘導し、ついでこの微生物を用いて水素を生成させる。
【００２９】
まず、好気条件で微生物を培養する段階について示す。この段階においては、短時間で高微生物濃度まで培養することができる。培養するための手段としては公知な手段が用いられる。培養手段としては、好気条件で、例えば、振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養もしくはタンク培養等の液体培養、又は固体培養等が挙げられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃、好ましくは約３０〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約０．５〜５日が好ましい。
【００３０】
次に、水素生成段階において、水素生成能力を有していない微生物に水素生成能力を誘導する工程について示す。
水素生成能力を有していない微生物へ水素生成能力を誘導する方法は、嫌気条件下で行うことが好ましい。嫌気条件下での培養は、培地中成分の拡散を促進するために撹拌培養が好ましい。嫌気条件下での攪拌培養開始時の微生物濃度は、約０．０１〜８０質量％（湿潤状態微生物質量基準）であることが好ましい。この際、微生物が水素生成能力を獲得するために、嫌気条件下での攪拌培養中に、微生物が分裂増殖をすることが好ましいが、分裂増殖することは必ずしも必要ではなく、分裂増殖しない場合においても、微生物の水素生成能力が誘導されれば良い。
【００３１】
嫌気条件下とは、培養液中の酸化還元電位が好ましくは約−１００〜−５００ｍＶ程度、さらに好ましくは約−２００〜−５００ｍＶ程度であることをいう。培地の嫌気状態を調整する方法としては、培地中の溶存酸素を除去する方法であれば、いずれも好ましく用いることが出来、例えば培地の加熱処理や減圧処理あるいは培地中への窒素ガス等のバブリング等により溶存ガスを除去する方法が挙げられる。具体的には培養液中の溶存ガス、特に溶存酸素の除去を行う方法として、好ましくは約１３×１０２Ｐａ以下、より好ましくは約７×１０２Ｐａ以下、さらに好ましくは約４×１０２Ｐａ以下の減圧下で好ましくは約１〜６０分間、より好ましくは５〜６０分間程度、脱気処理する方法が挙げられ、該方法により、嫌気条件の培養液を得ることができる。また、必要に応じて還元剤を培養液に添加して嫌気条件の培養液を調整することができる。培養液に用いる還元剤としては、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンまたは硫化ソーダ等が挙げられる。これらの一種、あるいは数種類を組み合わせて、培養液に添加することも可能である。
【００３２】
嫌気条件下で微生物に水素生成能力を誘導するための培養は、炭素源、窒素源、及びミネラル源等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ラクトース、スクロース、セルロース、リボース、リビトール、アラビトール、ラムノース、フコース、廃糖蜜またはグリセロール等を挙げることができる。窒素源としては、無機態窒素源または有機態窒素源を挙げることができる。無機態窒素源としては、例えばアンモニア、アンモニウム塩または硝酸塩等を挙げることができる。有機態窒素源としては、例えば尿素、アミノ酸類またはタンパク質等を挙げることができる。これら無機態窒素源および有機態窒素源は、それぞれ単独もしくは混合して栄養培地に添加することができる。無機態、有機態ともに同様に利用することが可能である。またミネラル源として、おもにＫ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓなどを含む、例えばリン酸一水素カリウムまたは硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチンまたはチアミン等各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。また、培地は水素生成のために、微量金属成分を含むことが好ましい。必要な微量金属成分としては、培養する微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン又はニッケル等が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキス等の天然栄養源には相当程度含まれている。
【００３３】
嫌気条件下で水素生成能力を誘導するための培養には、上記記載の炭素源が必要であるが、微生物内へ取り込む速度の遅い炭素源を用いることが好ましい。これらの炭素源としては、ラクトース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、リビトール、アラビトール、ラムノースまたはフコースなどが挙げられる。
【００３４】
微生物濃度に関して、高濃度の微生物濃度で嫌気条件下にて微生物を培養することが、より効果的に水素生成能力を誘導することが出来るために好ましい。
【００３５】
嫌気条件下での攪拌培養の条件として、温度域は、約２０〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃が好ましい。ｐＨ域は、約４．０〜１０．０が好ましく、約５．０〜８．０がより好ましい。酸およびアルカリを用いてｐＨの調整を行うことができる。温度域、ｐＨ域ともに、上記の範囲内が微生物にとって最適な温度域、ｐＨ域である。通常、培養開始時の炭素源濃度は約０．１〜２０％（ｗ/ｖ）が好ましく、さらに好ましくは１〜５％（ｗ/ｖ）である。
【００３６】
次に、上記方法にて得られた水素生成能力を有する微生物を用いた水素生成工程について示す。
上述の水素生成能力を誘導するための培養終了後、培地中にある水素生成能力が誘導された微生物をそのまま用いることもできるし、一度微生物を分離した後に、嫌気条件下、還元状態にある水素生成溶液に分離した微生物を加えて使用することもできる。いずれの場合であっても、培地又は水素生成溶液に有機性基質を供給することにより、微生物に水素を生成させることができる。水素生成反応は一定のｐＨで行うことにより安定的に起こるため、反応液には緩衝作用を持つ成分を添加することが好ましい。水素生成に用いる緩衝剤としては、リン酸バッファ、酢酸バッファまたは炭酸バッファなどの酸バッファや、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳまたはＣＡＰＳなどのＧｏｏｄの緩衝試薬などが挙げられる。反応液のｐＨにより、緩衝剤の濃度および試薬の種類は適宜調整され得ることが可能である。ｐＨは約５〜８に保つことが好ましい。
【００３７】
水素を生成させる方法としては、連続的にあるいは間欠的に、微生物を添加した水素生成溶液に有機性基質を供給する方法が挙げられる。本発明の方法は乳酸およびコハク酸等余分な成分を生成しない特徴を有効利用する方法であるため、水素生成溶液に供給される有機性基質としては、解糖系の中間体のうちホスホエノールピルビン酸より上流に位置する有機性基質が好ましく、微生物が取り込むことが容易な点、及びコストの観点より、糖類がより好ましい。
【００３８】
ここで糖類等とは、一般にＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｎを基本単位とするものを示し、単糖・オリゴ糖・多糖を含む。具体的には、例えば、グルコース、マルトース、メリオビオース、ガラクトース、ラクトース、トレハロース、スクロース、セロビオース、フルクトース、マンノース、ソルボース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−グルコサミン、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、リボース、リビトール、アラビトール、デオキシリボース、グルシトール、マンニトール、ガラクシトール、キシリトール、グルクロン酸、ガラクチュロン酸、グルコン酸、デンプンまたはグリコーゲンなどが挙げられる。それらの中でも、微生物が効率的に利用できるという観点からグルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトースまたはスクロースが好ましく、グルコース、及びスクロースがより好ましい。
【００３９】
水素生成溶液へ添加する有機性基質の濃度は、約１％（ｗ／ｗ）〜飽和水溶液が好ましく、約５０％（ｗ／ｗ）〜飽和水溶液がより好ましい。また、有機性基質は、固体状態で添加することが好ましい。水素生成溶液中の糖類の濃度が低すぎると、有機性基質の供給に伴い、水素生成溶液の体積が増加してするために、微生物濃度も変化していくことから好ましくない。また、有機性基質の供給速度としては、水素生成溶液のｐＨが約４．０〜９．０の範囲で制御される範囲であれば、特に制限はない。
【００４０】
水素の生成反応の反応温度は、約２０〜５０℃の条件が好ましく、さらに好ましくは約３０〜４５℃の範囲が微生物のライフの面からも好ましい。
【００４１】
水素生成溶液としては、嫌気条件（還元状態）下の水素生成溶液を用いる必要がある。この溶液の嫌気条件として、水素生成溶液の酸化還元電位が約−１００〜−５００ｍＶであることが好ましく、約−２００〜−５００ｍＶであることがさらに好ましい。
【００４２】
水素生成溶液の微生物濃度は、約０．１〜８０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態微生物質量基準）であることが好ましく、また、水素生成溶液の粘性が高くなるという観点から、微生物濃度は約０．１〜７０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態微生物質量基準）がより好ましい。
【００４３】
水素生成溶液には、気体の発生が激しいため、消泡剤を加えることが好ましい。消泡剤については、公知なものが用いられ、具体的には例えばシリコーン系［例えば、ＳＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ）等］、又はポリエーテル系［例えばＰＥ−Ｈ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｈｉｇｈ）、ＰＥ−Ｍ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｍｅｄｉｕｍ）、ＰＥ−Ｌ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｌｏｗ）等］の消泡剤が好ましく用いられる。
【００４４】
微生物、有機性基質および消泡剤は、公知の方法に従って水素生成溶液に供給することができる。
【００４５】
以下、本発明の水素製造方法を用いた燃料電池システムについて示す。
本発明の水素製造方法においては、主に水素と二酸化炭素からなるガスが生成され、一酸化炭素は生成されない。一般的に固体高分子型燃料電池の燃料として、天然ガスの改質法等通常の方法で製造される水素を用いる場合には、該方法により得られる水素等を含むガスから一酸化炭素を除去するシステム（ＣＯ変成器、ＣＯ除去器等）を用いて、ＣＯは１０ｐｐｍ以下に維持する必要がある。本発明の微生物を用いた水素製造方法により製造される水素ガスは、ＣＯを含有しないため、燃料電池システムにＣＯを除去する改質器を設置する必要がなく、装置を簡易化できる。また燃料電池の寿命の面からも、本発明に係る水素製造方法により製造されるガスを用いることは好ましい。
【００４６】
また、従来の都市ガスを用いた水素生成装置の改質方法では、６００℃以上の改質温度が必要となり、メタノールを用いた改質方法でも数１００℃の改質温度が必要となるのに対して、本発明の水素製造方法に用いる反応容器はほぼ常温で用いることが可能である。さらに、通常、従来の改質器は、立ち上げに時間がかかり、また終了時に時間がかかるものであったのに対して、本発明の水素製造方法を用いた場合には、水素の生産までの取り扱いが容易で時間を短縮でき、本発明の水素製造方法を燃料電池システムに用いることは好ましい。
【００４７】
また、本発明の水素製造方法を用いた燃料電池システムは、ＣＯ発生しないため燃料電池の劣化に対しても問題が少ないこと、水素の供給方法としても高温の必要な改質器のシステムを必要としないこと、有機性基質の供給と同時に水素生産可能であることなどの点で、化石燃料の化学的改質方法による水素製造方法と比べて、本発明に係る水素製造方法は優れている。
【実施例】
【００４８】
以下実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
［実施例１］エシェリキア・コリ株（Ｗ３１１０株；ＡＴＣＣ  ２７３２５）のｌｄｈＡを不活性化した株（以下、ｌｄｈＡ不活性化株という）およびエシェリキア・コリ株のｆｒｄＢＣを不活性化した株（以下、ｆｒｄＢＣ不活性化株という）の作製
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
エシェリキア・コリ株を、表１記載のＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養行い、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４９】
【表１】
0004588693.tif 000002
【００５０】
（２）ｌｄｈＡ不活性化（破壊）株作製用ベクターの作製
上記（１）にて取得したゲノムＤＮＡから、プライマー
5’-CCTGTTTCGCTTCACCGGTCAG-3’（配列番号１）
5’-TCTTTGGTTCTGTCCAGTACCG-3’（配列番号２）
を用い、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｌｄｈＡ領域を増幅した。増幅したＤＮＡおよびプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで制限酵素処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）製）によりライゲーションを行い、ｌｄｈＡ-ｐＨＳＧ３９８を得た。さらに、得られたｌｄｈＡ-ｐＨＳＧ３９８を鋳型として、プライマー
5’-GGACTAGTCTGGCGTTCGATCCGTATCC-3’（配列番号３）
5’-GCTCTAGACCAAAACCTTTCAGAATGCGCA-3’（配列番号４）
を用いてインバースＰＣＲした後、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩで処理した。そして、得られたＤＮＡに、ｐＨＳＧ３９８を鋳型としてプライマー
5’-GCTCTAGAACGGAAGATCACTTCGCAGAAT-3’（配列番号５）
5’-GGACTAGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCT-3’（配列番号６）
を用いて増幅したクロラムフェニコールカセットを挿入し、ΔｌｄｈＡ−ｐＨＳＧ３９８を得た。
【００５１】
また、ｐＭＶ５(Ｖｅｒｔｅｓ、Ａ.Ａ.  ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＳ３１８３１、ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１、７３９−７４６（１９９４）)から、プライマー
5’-CTCTGCATGCAACCCATCACATATACCTGC-3’（配列番号７）
5’-CTCTGCATGCATCGATCCTCTAGAGTATCG-3’（配列番号８）
を用いてＰＣＲを行うことによりｓａｃＢ領域を増幅したもの、およびプラスミドｐＴＨ１８ｋｓ１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ａｎ  ｉｓｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，ｋａｎａｍｉｃｉｎ、ｌａｃＺ、ｒｅｐＡ、ｐａｒ、ｐｏｌＡ）.Ｇｅｎｅ ２４１,１８５−１９１(２０００)）を、ＳｐｈＩで制限酵素処理した後、ライゲーションを行い、ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。
【００５２】
そして、得られたｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１のＢａｍＨＩサイトとＰｓｔＩサイトの間に、ΔｌｄｈＡ−ｐＨＳＧ３９８のΔｌｄｈＡ領域を挿入し、ΔｌｄｈＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。ΔｌｄｈＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の構築図を図１に示す。
【００５３】
（３）ΔｌｄｈＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の導入およびｌｄｈＡ不活性化株の作製
上記の方法により得られたΔｌｄｈＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を、Ｗ３１１０株にエレクトロポレーション法により導入した。そして、下表２記載の培地（１０ｍｌ）にて４３℃で培養することで相同的組み換えを行い、その組み換えベクターが染色体上に挿入された組み換え株を得た。
【００５４】
【表２】
0004588693.tif 000003
【００５５】
さらに、上記の寒天培地で培養することにより得られた組み換え株を、表３で示す寒天培地（１０ｍｌ）にて３０℃で培養することにより、ｌｄｈＡ不活性化株を得た。
【００５６】
【表３】
0004588693.tif 000004
【００５７】
（４）ｌｄｈＡ不活性化株の分子生物学的確認
上記の方法により得られたｌｄｈＡ不活性化株は、シーケンサーＰｒｉｓｍ  ３１００  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）により、Ｗ３１１０株のｌｄｈＡ領域が削除された株であることを確認した。
【００５８】
（５）ｆｒｄＢＣ不活性化用ベクターの作製
上記（１）にて取得したゲノムＤＮＡから、プライマー
5’-GCGAGCTCGTGCAAACCTTTCAAGCCGA-3’（配列番号９）
5’-CGGGATCCGACACCAATCAGCGTGACAA-3’（配列番号１０）
を用い、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｆｒｄＡＢＣＤ領域を増幅した。増幅したＤＮＡ、およびプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで制限酵素処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）製）によりライゲーションを行い、ｆｒｄＡＢＣＤ-ｐＨＳＧ３９８を得た。
【００５９】
さらに、得られたｆｒｄＡＢＣＤ-ｐＨＳＧ３９８を鋳型として、プライマー
5’-CCGCTCGAGCTGAACCCAGAGTTCATCGG-3’（配列番号１１）
5’-CCGCTCGAGAACGTACGCTTTCGCCAGTT-3’（配列番号１２）
を用いてインバースＰＣＲ後、ＸｈｏＩで処理した。そして、得られたＤＮＡに、ｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を鋳型として、プライマー
5’-CCGCTCGAGGAAGATGCGTGATCTGATCCT-3’（配列番号１３）
5’-CCGCTCGAGGCCACGTTGTGTCTCAAAATC-3’（配列番号１４）
を用いて増幅したカナマイシンカセットを挿入し、ΔｆｒｄＢＣ−ｐＨＳＧ３９８を得た。
【００６０】
そして、得られたｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１のＢａｍＨＩサイトとＳａｃＩサイトの間に、ΔｆｒｄＢＣ−ｐＨＳＧ３９８のΔｆｒｄＢＣ領域を挿入し、ΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。ΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の構築図を図２に示す。
【００６１】
（６）ΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の導入およびｆｒｄＢＣ不活性化株の作製
上記（５）の方法により得られたΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を、（３）で得られたｌｄｈＡ不活性化株にエレクトロポレーション法により導入した。下表４記載の培地（１０ｍｌ）にて４３℃で培養することで相同的組み換えを行い、その組み換えベクターが染色体上に挿入された組み換え株を得た。
【００６２】
さらに、上記で得られた組み換え株を表３で示す寒天培地（１０ｍｌ）にて３０℃で培養することにより、エシェリキア・コリ株のｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣを不活性化した株（以下、ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株という）を得た。
【００６３】
【表４】
0004588693.tif 000005
【００６４】
（７）ｆｒｄＢＣ不活性化株の分子生物学的確認
上記の方法により得られたｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株は、シーケンサーＰｒｉｓｍ  ３１００  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）により、エシェリキア・コリ株のｌｄｈＡ領域およびｆｒｄＢＣ領域が削除された株であることを確認した。
【００６５】
上記の如くして、本実施例により形質転換されたＷ３１１０株は、Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣと命名されて、平成１７年１２月２０日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７３７として、受託された。また、上記株は、国際寄託当局である同センターに、平成１８年１１月１３日に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７２６として、受託された。
【００６６】
［実施例２］実施例１により得られたｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株を用いたグルコースからの水素製造方法
（１）好気および嫌気条件下での培養
実施例１により得られたｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株を、下表５で示される組成の培養液１０ｍｌに加え、好気条件下、３７℃で一晩振盪培養した。
一晩振盪培養したｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株を含む培養液１０ｍｌを、表５記載の培地１．０Ｌへ植菌し嫌気培養を行った。嫌気条件下での培養は、窒素９５％および水素５％の雰囲気の嫌気チャンバーシステム（Ｃｏｙ社製）内で行った。この嫌気条件下での培養は、培地をｐＨ＝６．０（５Ｎ  ＮａＯＨにて調整）に保ちながら、３７℃で１２時間行った。そして、これにより得られた培養液を遠心分離機（６５００回転、２０分）にかけた後、上澄み液を除去し、約４ｇ（湿重量）の菌体を得た。
【００６７】
【表５】
0004588693.tif 000006
【００６８】
（２）水素生成反応
得られた菌体を、下記表６に記載の組成からなる水素生成用溶液１００ｍｌに、菌体密度が４％（湿潤状態菌体質量基準）になるように懸濁した。
【００６９】
【表６】
0004588693.tif 000007
【００７０】
このようにして作成した菌体を懸濁した水素生成用溶液に、３Ｍグルコース水溶液を嫌気条件下（窒素９５％および水素５％）にて添加し、微生物の水素生成能力を測定した。このとき、菌体を懸濁した水素生成用溶液中のグルコース濃度が６０ｍＭとなるようにした。
菌体の水素生成能力の測定は、グルコースを滴下した直後に、生成するガスを水上置換法により集める方法により行い、水素生成初速度は、グルコースの添加から１０分間に発生するガス量より求めた。
得られた生成ガスをガスクロマトグラフィー（島津製作所社製）により分析したところ、生成ガス中には約６０容積％の水素と約４０容積％のガス（炭酸ガス）を含んでいた。このときの水素収率および水素生成速度を後掲の表７に示す。
【００７１】
［実施例３］実施例１により得られたｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株を用いたフルクトースからの水素製造方法
水素生成反応のための３Ｍグルコース水溶液を３Ｍフルクトース水溶液とする以外は、実施例２と同様の方法で、水素生成初速度および水素収率の測定を行った。このときの水素収率および水素生成速度を後掲の表８に示す。
【００７２】
［比較例１および２］ｌｄｈＡ遺伝子およびｆｒｄＢＣ遺伝子を不活性化していないエシェリキア・コリ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を用いた水素生成用菌体の培養方法および水素生成反応
ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株の代わりに、野生株のエシェリキア・コリ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を用いる以外は、実施例２および３と同様の方法で、好気条件下での培養、嫌気条件下での培養を行い、水素収率および水素生成初速度の測定を行った。基質としてグルコースを用いた場合を比較例１、基質としてフルクトースを用いた場合を比較例２とした。
【００７３】
［比較例３および４］ｌｄｈＡ遺伝子のみを不活性化したエシェリキア・コリ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ株を用いた水素生成用菌体の培養方法および水素生成反応
ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株の代わりに、ｌｄｈＡが不活性化されたエシェリキア・コリ  Ｗ３１１０  ΔｌｄｈＡ株を用いる以外は、実施例２および３と同様の方法で、好気条件下での培養、嫌気条件下での培養を行い、水素収率および水素生成初速度の測定を行った。基質としてグルコースを用いた場合を比較例３、基質としてフルクトースを用いた場合を比較例４とした。
【００７４】
表７に、実施例２、比較例１および３において、水素収率および水素生成速度を測定した結果を示す。
表８に、実施例３、比較例２および４において、水素収率および水素生成速度を測定した結果を示す。
表７および表８より、ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢＣ不活性化株を水素生成に用いた場合（実施例２および３）は、対照株（比較例１−４）と比較して、水素収率および水素生成速度が大幅に向上していることが明確である。
【００７５】
【表７】
0004588693.tif 000008
【００７６】
【表８】
0004588693.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明方法は、微生物燃料電池等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ΔｌｄｈＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の構築を示す図である。
【図２】ΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１の構築を示す図である。
【図１】
0004588693.tif 000010
【図２】
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【配列表】
0004588693000001.app