(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸を含む、永久羊膜細胞株。
【請求項２】
前記少なくとも一つの核酸は、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ２Ｂおよび／またはＥ４領域の遺伝子産物のおよび／またはＣｒｅリコンビナーゼの発現も引き起こす、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
Ｅ１Ａ領域の遺伝子産物の発現は、構成的プロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の細胞株。
【請求項４】
前記構成的プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、請求項３に記載の細胞株。
【請求項５】
Ｅ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現は、アデノウイルスプロモーターの制御下にある、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞株。
【請求項６】
前記アデノウイルスプロモーターは、アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターである、請求項５記載の細胞株。
【請求項７】
アデノウイルス遺伝子産物は、ヒトアデノウイルス型５に由来する、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞株。
【請求項８】
細胞株は、ヒト細胞株である、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞株。
【請求項９】
羊膜細胞に、Ｅ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域のアデノウイルス遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸を形質移入することを含む、永久羊膜細胞株を生成する方法。
【請求項１０】
一次羊膜細胞、特定的にはヒト一次羊膜細胞が使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸は、発現ベクターの形で使用される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｅ１Ａ領域の遺伝子産物の発現は、構成的プロモーターの制御下にあり、かつＥ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現は、アデノウイルスプロモーターの制御下にある、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記構成的プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノウイルスプロモーターは、アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
羊膜細胞および／または結果として生じる細胞株に形質移入することは、アデノウイルスＥ２Ａおよび／またはＥ２Ｂおよび／またはＥ４領域の遺伝子産物のおよび／またはＣｒｅリコンビナーゼの発現をさらに引き起こす、請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
アデノウイルス遺伝子産物は、ヒトアデノウイルス型５に由来する、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれかに記載の方法によって得られる、永久羊膜細胞株。
【請求項１８】
永久羊膜細胞株Ｎ５２．Ｅ６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２４１６）。
【請求項１９】
Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の形質移入により形質転換された永久羊膜細胞株を生成するための羊膜細胞の使用。
【請求項２０】
永久羊膜細胞株を生成するための、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域のアデノウイルス遺伝子産物の使用。
【請求項２１】
アデノウイルスベクターを生成するための、請求項１〜８のいずれかに記載の永久羊膜細胞株の使用。
【請求項２２】
アデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクター、第二世代アデノウイルスベクター、大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターおよび／または欠失されたアデノウイルスベクターである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
向性が改変されたアデノウイルスベクターを生成するための、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
羊膜細胞株は、請求項１〜６、１３または１４に規定されているようなものである、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれかに記載の永久羊膜細胞株が用いられる、アデノウイルスベクターを生成するための方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸を含む、永久羊膜細胞株（永久羊膜株化細胞）に関する。本発明は、さらに永久羊膜細胞株の生成、および遺伝子移入ベクターおよび／またはアデノウイルス変異体を生成するためのその使用に関する。さらなる局面は、羊膜細胞の、ならびにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域のアデノウイルス遺伝子産物の、永久羊膜細胞株を生成するための使用である。
【０００１】
アデノウイルス
アデノウイルスは、主としてウイルス性にコード化されたヘキソン、ペントン、および繊維タンパク質からなり、かつ約３６ｋｂ（キロベース）の大きさの直線状の二重鎖 ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ゲノムからなる正二十面体のキャプシドを特徴とする、ウイルスの比較的均質なグループである。ウイルスゲノムは、両末端に、複製のウイルス開始点からなる逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。さらに、ゲノムの左側末端には、感染周期中ウイルスゲノムのウイルスキャプシドへのパッケージングに必要な、パッケージング信号がある。アデノウイルスは、多くの種から単離されてきた。赤血球凝集、腫瘍形成能、およびＤＮＡ配列相同性等の、さまざまな血清型を区別するパラメータに基づいて、４０以上の異なるヒト血清型がある（Ｗｉｇａｎｄ（ウィガンド）他、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（アデノウイルスＤＮＡ）」、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（ドエルフラー）編、Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（マルティヌス  ニジョフ出版）、ボストン、４０８−４４１ページ、１９８６）。今まで、アデノウイルスベクターは、通常血清型２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）に由来している。Ａｄ２およびＡｄ５による感染は、ヒトに特有である。Ａｄ２およびＡｄ５が、ヒトにおいては発癌性ではなく、かつ十分な安全性の裏付けがあるのは、ワクチン接種は米国では軍人に対して無事にかつ合併症なく行われるからである（Ｐｉｅｒｃｅ（ピアス）他、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  アメリカ疫学ジャーナル）８７、２３７−２４６、１９６８）。アデノウイルス生物学が比較的よく理解されているのは、アデノウイルスが、ＤＮＡ複製、転写、ＲＮＡ（リボ核酸）スプライシング、および細胞形質転換等の、さまざまな基礎的な生物学原理を解明するための実験道具として、分子生物学においてきわめて重要な役割を果してきたからである。アデノウイルス粒子は、感染中、受容体が媒介されたエンドサイトーシス（形質膜陥入）を経て細胞に入り、そのエンドサイトーシスでは、現在の見解によれば、繊維タンパク質の小頭部ドメイン（領域）の、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）との相互作用は、ウイルス粒子の細胞面への接着を媒介する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ（ベルゲルソン）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）２７５、１３２０−１３２３、１９９７）。第２ステップでは、ウイルス粒子の内部移行があり、それに対して、ペントン塩基のインテグリンとの相互作用はきわめて重要な役割をはたす（Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｃｅｌｌ（細胞）７３、３０９−３１９、１９９３）。粒子が細胞に入った後、ウイルスゲノムは、ＤＮＡタンパク質複合体として細胞核に入る。アデノウイルス感染周期は、初期および後期に分けられ、それらはアデノウイルス複製開始によって区別される（Ｓｈｅｎｋ（シェンク）、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ウイルス学）」、Ｆｉｅｌｄｓ（フィールズ）編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｕｓｈｉｎｇ（リッピンコットーレーブン出版）、フィラデルフィア、２１１１−２１４８ページ、１９９６）。初期では、初期ウイルス機能Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３��よびＥ４が発現する。後期は、ウイルス構造タンパク質（ウイルス構造性タンパク質）の発現、および新しいウイルス粒子の生成のもとになる後期遺伝子の転写を特徴とする。
【０００２】
Ｅ１Ａは、細胞核が到達した後、ウイルス染色体によって発現されるべき第１ウイルス遺伝子である。Ｅ１Ａ遺伝子は、Ｅ１ＡのＲＮＡの代わりのスプライシングによって形成される１２Ｓおよび１３Ｓタンパク質をコードする（遺伝情報に指定する）。Ｅ１Ａタンパク質は、多くの細胞およびウイルス遺伝子の転写を、転写因子と相互作用することによって活性化する。Ｅ１Ａの主な機能は、ａ）他の初期ウイルス機能Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４の活性化、およびｂ）休止細胞を細胞周期のＳ期に入らせることである。Ｅ１Ａが単独で発現すると、プログラムされた細胞死（アポトーシス）がもたらされる。
【０００３】
Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ａによって活性化された初期ウイルス遺伝子の一つである。Ｅ１Ｂ遺伝子は、Ｅ１Ｂの５５ｋＤタンパク質およびＥ１Ｂの１９ｋＤタンパク質をコードし、それらは、Ｅ１ＢのＲＮＡの代わりのスプライシングを経て生じる。５５ｋＤタンパク質は、細胞周期の進行を、ｐ５３癌抑制遺伝子と相互作用することによって調節し、感染の後期において、細胞ｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）の輸送を妨げることに関与し、かつ細胞のＥ１Ａ誘発アポトーシスを妨げる。Ｅ１Ｂの１９ｋＤタンパク質は、同様に、細胞のＥ１Ａ誘発アポトーシスを妨げるのに重要である。
【０００４】
すべてのヒトアデノウイルスは、細胞培養において、げっ歯類の細胞を形質転換することができる。概して、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの同時発現は、発癌性の形質転換に必要である。
【０００５】
ウイルスキャプシドの構造成分をコードするタンパク質ＩＸ遺伝子は、Ｅ１Ｂ転写単位に包埋される。
【０００６】
Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂは、ウイルスゲノムの複製にとって絶対必要であるさまざまなタンパク質をコードする。これらは、末端タンパク質（ｐＴＰ）の前駆体タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、および一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）を含む。複製すると、ｐＴＰは、ウイルスゲノムのＩＴＲに結合する。そこでは、それは、細胞因子と共にＰｏｌによって開始されるＤＮＡ複製のためのタンパク質プライマーとして働く。Ｐｏｌ、ＳＳＢＰおよび細胞因子ＮＦＩＩ、ならびにたぶん他の因子は、ＤＮＡ鎖の延長に必要である。
【０００７】
Ｅ４は、さまざまなタンパク質をコードする。とりわけＥ４の３４ｋＤタンパク質は、Ｅ１Ｂの５５ｋＤタンパク質と共に、細胞ｍＲＮＡが細胞質内に蓄積することを妨害し、かつ同時にそれによって、ウイルスＲＮＡの細胞核から細胞質への輸送が容易になる。
【０００８】
ウイルスゲノムの複製の開始後、ウイルス構造タンパク質が発現され、それらはウイルスキャプシドの確立（株化）に必要であり、かつウイルスＤＮＡのウイルス性にコード化されたＤＮＡ結合タンパク質との複合体形成に必要である。明らかに、空のキャプシドの初期形成があり、そこにウイルスゲノムが引き続いて入る。ウイルスゲノム上のシスエレメントは、この工程、すなわちウイルスゲノムの左側末端に位置し、かつＡｄ５の場合には、塩基対２６０から塩基対４６０までの領域に渡って延びるいわゆるパッケージング信号に必要である（Ｈｅａｒｉｎｇ（ヒアリング）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｏｕｒｎｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ウイルス学ジャーナル）６２、２５５５−２５５８、１９８７；Ｇｒａｅｂｌｅ（グレーブル）およびＨｅａｒｉｎｇ（ヒアリング）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４、２０４７−２０５６、１９９０）。パッケージング信号は、Ｅ１Ａプロモーターの活動に絶対必要であるＥ１Ａエンハンサーと重なる。ウイルスゲノムのウイルスキャプシドへのパッケージングの正確なメカニズムは明らかではないが、たぶん細胞および／またはウイルスタンパク質の、パッケージ信号との相互作用がこれに必要であるだろう。
【０００９】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、発現ベクターとして、特に遺伝子治療の目的のために特に重要である。これにはいくつかの理由がある：アデノウイルス生物学は、徹底的に調査されてきた。ウイルス粒子は、安定しており、かつ比較的簡単にかつ高い力価で生成されうる。アデノウイルスゲノムの遺伝子操作は容易である。アデノウイルスベクターは、生体外でかつ生体内で複製および非複製細胞を効率的に形質導入することができる。
【００１０】
ａ）第一世代アデノウイルスベクター
第一世代アデノウイルスベクター（Ｇｉｌａｒｄｉ（ジラルディ）他、ＦＥＢＳ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）Ｌｅｔｔｅｒｓ（ヨーロッパ生化学会連盟文書）２６７、６０−６２、１９９０；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（ストラトフォードーペリコーデット）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ヒト遺伝子治療）１、２４１−２５６、１９９０）は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失（除去）を特徴とする。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂは、形質転換およびトランス活性化特性を有する。さらに、Ｅ１Ａは、ウイルス遺伝子を活性化するのに必要であり、かつＥ１Ｂは、ウイルス転写物が蓄積するのに必要である。さらに、いくつかのベクターでは、外来性ＤＮＡの取り込み容量（取り込み量）を増すために、Ｅ３が欠失される。Ｅ３は、細胞培養においてアデノウイルスを生成するのに必要でない。外来性ＤＮＡの取り込み容量は、約８ｋｂである。第一世代アデノウイルスベクターは、今までは、主としてベクターのＥ１ＡおよびＥ１Ｂの欠乏を補完する２９３個の細胞（以下参照）において生成されてきた。
【００１１】
ｂ）第二世代アデノウイルスベクター
第二世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの欠失に加えて、Ｅ２および／またはＥ４の欠失を特徴とする（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ（エンゲルハート）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ    米国国立科学アカデミー予稿集）９１、６１９６−６２００、１９９４；Ｙａｎｇ（ヤング）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  自然遺伝学）７、３６２−３６７、１９９４；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ（ゴルジグリア）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、４１７３−４１７８、１９９６；Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ（クロウグリアック）およびＧｒａｈａｍ（グラハム）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６、１５７５−１５８６、１９９５；Ｚｈｏｕ（周）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、７０３０−７０３８、１９９６）。さらに、いくつかのベクターでは、Ｅ３は、外来性ＤＮＡの取り込み容量を増すために欠失される。第二世代アデノウイルスベクターは、ウイルス遺伝子の転写およびウイルスタンパク質の発現をさらに減じるために、かつしたがって抗ウイルス免疫応答をさらに減じるために開発された。外来性ＤＮＡの取り込み容量は、第一世代アデノウイルスベクターと比較して無視できるほど増加する。第二世代アデノウイルスベクターは、細胞株において生成され、それらの細胞株は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに加えて、特定の欠乏（Ｅ２および／またはＥ４）を補完する。
【００１２】
ｃ）大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクター
大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターは、ウイルスコードＤＮＡ配列を含んでいないことを特徴とする（Ｋｏｃｈａｎｅｋ（コッカネック）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、５７３１−５７３６、１９９６；Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー）他、Ｖｉｏｌｏｇｙ（ウイルス学）２１７、１１−２２、１９９６；Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ（クマーーシング）およびＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎ（チェンバレン）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ヒト分子遺伝学）５、９１３−９２１、１９９６）。これらのベクターは、ＩＴＲおよびパッケージング信号を含めたウイルス末端を含むにすぎない。外来性ＤＮＡの取り込み容量が約３７ｋｂであるのは、アデノウイルスゲノムの主な部分がはるかに欠失されるからである。大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターを生成するためのさまざまなシステムを説明してきた（Ｋｏｃｈａｎｅｋ（コッカネック）他、上記参照；Ｐａｒｋｓ（パークス）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、１３５６５−１３５７０、１９９６；Ｈａｒｄｙ（ハーディ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、１８４２−１８４９、１９９７）。第一および第二世代アデノウイルスベクターと比較して、大ＤＮＡ容量のこれらのアデノウイルスベクターの利点は、外来性ＤＮＡのより大きな取り込み容量、ならびにより低い毒性および免疫原性である（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ（シードナー）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１８、１８０−１８３、１９９８；Ｍｏｒｒａｌ（モラル）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９、２７０９−２７１６、１９９８）。現在、大容量のアデノウイルスベクターは、輸送中に増殖性感染周期に必要なウイルス機能を提供する、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂが欠失されたヘルパーウイルスの助けで生成される。今まで、大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターは、２９３個の細胞において、または２９３個の細胞に由来する細胞株において生成されてきた。生成方法の一つ（Ｐａｒｋｓ（パークス）他、上記参照；Ｈａｒｄｙ（ハーディ）他、上記参照）では、アデノウイルスベクターは、改変された２９３個の細胞において生成され、それらの細胞は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに加えて、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼを発現する。このシステムでは、ヘルパーウイルスのパッケージング信号は、バクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識配列によってフランキングされる（隣接される）。Ｃｒｅを発現する２９３個の細胞がヘルパーウイルスおよび大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターに感染すると、ヘルパーウイルスのパッケージング信号が切除される。この理由のため、正常なパッケージング信号を含むベクターが主にパッケージングされる（詰め込まれる）が、ヘルパーウイルスはパッケージングされない。
【００１３】
ｄ）欠失されたアデノウイルスベクター
Ｃｒｅを発現する２９３個の細胞が感染すると、ウイルスコード配列の大部分またはウイルスコード配列の全てが、ｌｏｘＰ認識配列間の組換えによって欠失されるようにしてウイルスゲノムに位置するバクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識配列を有する第一世代ベクターとして、これらのベクターを説明してきた。これらのベクターのゲノムの大きさは、約９ｋｂである。外来性ＤＮＡの取り込み容量は、同様に、約９ｋｂである（Ｌｉｅｂｅｒ（リーバー）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、８９４４−８９６０、１９９６）。
【００１４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ＡＡＶは、パーボウイルス、属デペンドウイルスのファミリーに属し、かつ溶菌ウイルスかプロウイルスのいずれかとして生じる、２つの異なる生活型を有する。溶菌感染が起こるように、ウイルスは、ヘルパーウイルス（アデノウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス）に同時感染する必要がある。ヘルパーウイルスがないために、ＡＡＶは複製することができず、ゲノムに組み込まれ、かつ不活性なプロウイルスとしてそこに存在する。ＡＡＶを組み込まれたプロウイルスとして宿している細胞が、たとえばアデノウイルスに感染されると、プロウイルスは、溶菌感染周期に再び入ることができる（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  遺伝学＆発生における現在の意見）３、７４−８０、１９９３）。
【００１５】
ＡＡＶキャプシドは、正極性か負極性のいずれかの一本鎖直線状ＤＮＡゲノムを含む。いくつかのＡＡＶ血清型がある。最も多く調査されてきた血清型は、ＡＡＶ−２である。ＡＡＶ−２のゲノムは、４６８０個のヌクレオチドからなる。ゲノムは、両末端に、１４５の塩基対の長さの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。第１の１２５の塩基対は、２つの内部パリンドローム（回文構造）からなるＴ字形のヘアピン構造を形成する。
【００１６】
ＡＡＶゲノムは、非構造性複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造キャプシド（Ｃａｐ）タンパク質（構造性キャプシドタンパク質）をコードする。さまざまな複製たんぱく質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）は、異なるプロモーター（ｐ５およびｐ１９）を用いてかつ代わりのスプライシングによって生成される。さまざまなキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）は、ｐ４０プロモーターを用いて、代わりのスプライシングによって生成される。
【００１７】
ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶのＩＴＲおよびいくつかの隣接する非コードＡＡＶ配列のみを含む。この理由のため、外来性ＤＮＡの取り込み容量は、約４．５ｋｂである。組換え型ＡＡＶベクターを生成するためのさまざまなシステムを説明してきた（Ｓｋｕｌｉｍｏｗｓｋｉ（スカリモフスキー）およびＳａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（分子遺伝学における方法）」、７巻、Ａｄｏｐｈ（アドーフ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（アカデミックプレス社）、３−１２ページ）。組換え型ベクターの複製、発現、およびパッケージングに必要な成分が、これらのシステムにおいて与えられる。特定的には、発現カセットがあり、これらは、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、およびアデノウイルスヘルパー機能をコードする。ＡＡＶ生成に必要なアデノウイルスヘルパー機能は、具体的にはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４およびＶＡである。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能は、今まで生成のために使用されてきた２９３個の細胞において提供される。今まで説明してきた生成工程では、Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ機能は、現在、アデノウイルスに同時感染することによってかＥ２、Ｅ４およびＶＡを発現するプラスミドを同時形質移入することによって通常提供される（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、３８２２−３８２８、１９８９；Ａｌｌｅｎ（アレン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、６８１６−６８２２、１９９７；玉寄他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７、５０７−５１３、１９９６；Ｆｌｏｔｔｅ（フロット）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２、２９−３７、１９９５；Ｃｏｎｗａｙ（コンウェイ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、８７８０−８７８９、１９９７；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ（チオリーニ）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６、１５３１−１５４１、１９９５；Ｆｅｒｒａｒｉ（フェラーリ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、３２２７−３２３４、１９９６；Ｓａｌｖｅｔｔｉ（サルベッティ）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９、６９５−７０６、１９９８；Ｘｉａｏ（シャオ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２２２４−２２３２、１９９８；Ｇｒｉｍｍ（グリム）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９、２７４５−２７６０、１９９８；Ｚｈａｎｇ（チャン）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０、２５２７−２５３７、１９９９）。代わりに、アデノウイルス／ＡＡＶまたはヘルペス単純ウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターが、ＡＡＶベクターを生成するために用いられている方策が開発されてきた（Ｃｏｎｗａｙ（コンウェイ）他、上記参照；Ｊｏｎｓｔｏｎ（ジョンストン）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８、３５９−３７０、１９９７；Ｔｈｒａｓｈｅｒ（スラッシャー）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２、４８１−４８５、１９９５；Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７、２０７９−２０８７、１９９６；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（ジョンストン）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８、３５９−３７０、１９９７）。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する２９３個の細胞が、現在生成のために用いられているのは、これらの工程全てに共通である。
【００１８】
産生細胞株（産生株化細胞）
安全のため、ヒトでの用途向きのアデノウイルスベクターは、通常Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失を有する。輸送中Ｅ１機能を提供する細胞株を補完する際に生成が起こる。今まで、たいていのアデノウイルスベクターは、２９３個の細胞株において生成されてきた。ここ数年で、Ｅ１が欠失されたアデノウイルスベクターを生成するために使用することができるさらなる細胞株が生成されてきた。
【００１９】
ａ）２９３個のＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３細胞）
２９３個のＨＥＫ細胞は、長期間、Ｅ１が欠失されたアデノウイルスベクターを生成するために使用することができる細胞だけであった。２９３個のＨＥＫ細胞は、剪断されたアデノウイルスＤＮＡの、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）への形質移入によって、１９７７年に生成された。各々が平均２０のＨＥＫ培養液を使用する合計８の形質移入実験において、一つの不死化した細胞クローンのみを得ることが可能であった（Ｇｒａｈａｍ（グラハム）他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  一般ウイルス学ジャーナル）３６、５９−７４、１９７７）。この細胞クローンから確立された細胞株（２９３個のＨＥＫ細胞）は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子、および左側のＩＴＲおよびアデノウイルスパッケージング信号を含めて、アデノウイルスゲノムの完全な左側の１１％（Ａｄ５ゲノムの塩基対１ないし４３４４）を含む（Ｌｏｕｉｓ（ルイス）他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３３、４２３−４２９、１９９７）。アデノウイルスベクターの生成にとっての重要な問題は、Ｅ１が欠失されたアデノウイルスベクターと２９３個の細胞に組み込まれたアデノウイルスＤＮＡの部分との間の配列相同性である。ベクターのゲノムと２９３個の細胞に組み込まれたアデノウイルスＤＮＡとの間の相同的組換えは、複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）の発生の原因となる（Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ（ロックミューラー）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５、１４８５−１４９１、１９９４；Ｈｅｈｉｒ（イエール）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、８４５９−８４６７、１９９６）。この理由のため、２９３個のＨＥＫ細胞は、生成単位に容認できない量のＲＣＡがしばしば混入されているので、医薬品質のアデノウイルスベクターを生成するのに適さない。ＲＣＡは、複製適格アデノウイルスが、複製が不完全なアデノウイルスより明らかに高い毒性を有するので、臨床上の使用のために製造された製品においては容認できず、ヒト組織において抑制されていない複製が可能であり、かつそのうえ複製の不完全なアデノウイルスを補完することができる（Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ（ロックミューラー）他、上記参照；Ｉｍｌｅｒ（イムラー）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６、７１１−７２１、１９９５；Ｈｅｈｉｒ（イエール）他、上記参照）。
【００２０】
ｂ）ヒト胚性網膜細胞（ＨＥＲ細胞）および確立された細胞株
げっ歯類細胞を、アデノウイルスＥ１機能で容易に形質転換することができるが、一次ヒト細胞は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂでの形質転換が比較的進まないことがわかっている。上で述べたように、Ｇｒａｈａｍ（グラハム）および共同研究者は、剪断されたＡｄ５のＤＮＡで形質移入されたＨＥＫ細胞から単細胞クローンのみを単離することができた。Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）および共同研究者は、長時間、一次ＨＥＫ細胞をＡｄ１２のＥ１機能で形質転換しようとしたが、不成功に終わった（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  抗癌研究）６、４９９−５０８、１９８６）。これらの実験は、Ａｄ１２の１ｍｇ以上のＥｃｏＲＩのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）の断片が、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を含むようにして、３年の期間にわたって行われたが、不成功に終わった。多くの試みの後、実行された多くの実験にもかかわらず、４個のＡｄ１２−Ｅ１のＨＥＫ細胞株のみを単離することが可能であった（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（ホイッタカー）他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  分子および細胞生物学）４、１１０−１１６、１９８４）。同様に、Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）および共同研究者は、他の一次ヒト細胞を、ケラチン生成細胞、皮膚繊維芽細胞、肝細胞、および尿路上皮細胞を含むＥ１機能で形質転換しようとしたが、不成功に終わった（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６、４９９−５０８、１９８６）。今まで、アデノウイルスＥ１機能で複製できるように形質転換することが可能であった唯一のヒト細胞型は、ヒト胚性網膜細胞（ＨＥＲ細胞）からなる。ＨＥＲ細胞は、白色神経網膜に由来する細胞の混合物である。これらの細胞を得るためには、通常妊娠期間の１６週と２０週の間に、ヒトの胎児の眼窩から眼を除去する必要がある。眼は、横切開で開かれ、かつ白色神経網膜を、ピンセットで除去しかつ細胞培養液に入れることができる。
【００２１】
ａ）Ａｄ１２が誘発した腫瘍は、主として、原始的な神経上皮に由来する（向井他、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  神経病理学の進歩）３、８９−１２８、１９７６）およびｂ）Ａｄ１２は、眼内接種後、ネズミおよびヒヒにおける網膜腫瘍を誘発させる（向井他、上記参照；向井他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０、１０２３−１０２５、１９８０）という初期の観察に基づき、Ｂｙｒｄ（バード）および共同研究者は、ヒト胚性網膜芽細胞種（ＨＥＲ細胞）が、Ａｄ１２のＥ１遺伝子で形質転換されうることを見出した（Ｂｙｒｄ（バード）他、Ｎａｔｕｒｅ（ネーチャー）２９８、６９−７１、１９８２）。ＨＥＲ細胞の形質転換効率は、一次ネズミ細胞のそれ未満であったが、形質転換効率は、ＨＥＫ細胞のそれより１００倍高かった。Ａｄ１２のＥ１変異体を単離するために用いられうる補完細胞株を生成するために、調査を開始した。
【００２２】
この研究グループによるさらなる調査において（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）他、 Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ（癌細胞）４、３３９−３４８、１９８６）、ＨＥＲ細胞が、Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡで効率的に形質転換されうることが示された。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞株の形質転換および確立の効率は、Ａｄ５のＥ１遺伝子を使用するほうが、Ａｄ１２のＥ１遺伝子を使用するより約２０倍高かった。
【００２３】
これらのデータに基づき、Ｆａｌｌａｕｘ（ファラウ）および共同研究者（Ｆａｌｌａｕｘ（ファラウ）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７、２１５−２２２、１９９６；Ｆａｌｌａｕｘ（ファラウ）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９、１９０９−１９１７、１９９８）は、Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現したプラスミドでＨＥＲ細胞を形質転換することによって、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞株を確立した。細胞株９１１は、Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド７９−５７８９）を含み、かつ自然Ｅ１Ａプロモーターの制御下でＥ１Ａを発現するプラスミドで形質転換することにより生成された（Ｆａｌｌａｕｘ（ファラウ）他、上記参照；特許出願ＷＯ９７／００３２６）。さらにＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するＨＥＲ細胞株を、Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド４５９−３５１０を含むプラスミドを形質移入することによって確立することが可能であったが、Ｅ１Ａ遺伝子は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にあり、かつ自然Ｅ１Ｂポリアデニル化信号の代わりに、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原のポリ（Ａ）（ポリアデニル酸）配列が用いられる（Ｆａｌｌａｕｘ（ファラウ）他、上記参照；特許出願ＷＯ９７／００３２６）。これらのＨＥＲ細胞株は、ＰＥＲ細胞株と呼ばれてきた。２９３個の細胞または９１１個の細胞株と比較して、これらのより新しいＰＥＲ細胞株の利点は、第一世代アデノウイルスベクターのＤＮＡと、組み込まれたＡｄ５のＤＮＡとの間の配列相同性に欠けていることである。この理由のため、ＲＣＡの世代の可能性が目だって減少している。これらのＥ１ＡおよびＥ１Ｂが形質転換されたＨＥＲ細胞株（９１１個の細胞およびＰＥＲ細胞）は、第一世代アデノウイルスベクターのＥ１の欠乏を補い、したがってこれらのベクターを生成するために使用することができた。
【００２４】
同じようにして、ＨＥＲ細胞をプラスミドｐＴＧ６５５９で形質転換することによって確立された細胞株は、Ｉｍｌｅｒ（イムラー）および共同研究者による刊行物で述べられている（Ｉｍｌｅｒ（イムラー）他、上記参照；ＷＯ９４・２８１５２も参照されたい）。プラスミドｐＴＧ６５５９は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子のコード配列およびタンパク質ＩＸ遺伝子（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド５０５−４０３４）のコード配列を含み、Ｅ１Ａ遺伝子は、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にあり、かつＥ１Ｂ遺伝子とタンパク質ＩＸ遺伝子とのジョイント（共同）ポリアデニル化信号の代わりに、ウサギのβグロビン遺伝子のポリアデニル化信号を用いてきた。
【００２５】
一次ヒト細胞を、Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で形質転換することによって確立しようとする上記試みと対照的に、少数の場合には、予め確立された細胞株において、さまざまな血清型のＥ１ＡおよびＥ１Ｂを安定して発現しようとする試みがなされてきた（Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ（グロッドジッカ−）他、Ｃｅｌｌ  ２１、４５３−４６３、１９８０；Ｂａｂｉｓｓ（バビス）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６、４５４−４６５、１９８３；白木他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５、１０７４−１０８２、１９８３；Ｉｍｌｅｒ（イムラー）他、上記参照；ＷＯ９４／２８１５２も参照されたい）。これらの細胞株の欠点は、選択マーカーの同時発現が必要であること、およびＥ１ＡおよびＥ１Ｂの発現の安定性を欠くことが多いことである。これらの細胞株は、最初から不死化した細胞株であるので、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの発現は、細胞株の生存にとって必要ではなく、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂによる自然選択は、この場合にはかつ一次細胞の使用と対照的に必要ではない。
【００２６】
過去には、アデノウイルスベクターを作成するか、またはＡＡＶベクターを生成するための細胞株の生成は、特定の困難に関連していた。ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）を、ヒトの胎児の腎臓から得ることができる。胎児から腎臓を除去し、かつ腎細胞を細胞培養液に入れることによって、これを行う。剪断されたＡｄ５のＤＮＡをＨＥＫ細胞に形質移入しかつＡｄ５のＤＮＡの左側末端を組み込み、かつＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現すると、発表された一つの場合には、細胞が形質転換された。このようにして、単細胞株（２９３個の細胞）を確立することが可能であった（Ｇｒａｈａｍ（グラハム）他、上記参照；上記の「産生細胞株」の節ａ）を参照されたい）。２９３個の細胞は、アデノウイルスベクターを生成し、かつＡＡＶベクターを生成するために使用される。
【００２７】
ヒト胚性網膜細胞（ＨＥＲ細胞）を、ヒトの胎児の眼球から得ることができる。胎児から眼を除去し、かつ網膜からの細胞を培養液に入れることによって、これを行う。アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子をＨＥＲ細胞に形質移入することによって、ＨＥＲ細胞を形質転換することが可能であった（上記の「産生細胞株」の節ｂ）を参照されたい）。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを、アデノウイルスベクターを生成するために使用することができる。
【００２８】
いずれの場合にも、自然流産または治療上の死産か、社会的な根拠での妊娠中絶のいずれかから得られたヒトの胎児から器官を除去し、かつこの器官から細胞培養物を確立する必要がある。一次培養物の確立後、次に、これらの細胞を、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を形質移入することによって形質転換することができる。次に、このようにして確立され、かつＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞株を用いて、アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターを生成することができる。
【００２９】
胎児からの器官から一次細胞を得るのが複雑であることは明らかである。一次培養物は、新鮮な組織からのみ確立されうるので、適切な組織を得るために特別なロジスティックな努力が必要とされる。さらに、自然流産か治療上の死産か、または社会的な根拠での妊娠中絶のいずれかから得られる胎児の組織を使用すると、一次培養物の確立に特別な論理的考察および注意が必要となる。発明者の研究室は、妊娠中絶が頻繁に行われる産婦人科クリニックにあるが、１年以上の期間にわたって適切な組織を得ることは可能ではなかった。流産（死産、妊娠中絶）後、胎児の組織を除去するには、妊婦が適切な情報を受けた後、同意の宣言をすることが必要である。妊婦が、その計画、すなわち科学的な医学研究のために胎児から眼を除去することについての詳細な情報を受けた後に、器官除去処置についての彼女の同意を得るのが不可能なことが多かった。
【００３０】
遺伝子移入ベクターを生成する永久羊膜細胞株の使用は、以前には説明されていなかった。サルウイルス（ＳＶ４０）および／またはキルステン肉腫で形質転換されてきたヒト羊膜細胞が報告されたにすぎない（Ｓａｃｋ（サック）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（生体外）１７、１−１９ページ、１９８１；Ｗａｌｅｎ（ワレン）他、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  生体外細胞＆発生生物学）２２、５７−６５、１９８６）。ＳＶ４０だけに感染することで、寿命が延び（いわゆる不死化）、一方キルステン肉腫ウイルスだけに感染することでは、寿命は延びなかった。両方のウイルスに感染することによって、最終的には悪性腫瘍細胞となった（Ｗａｌｅｎ（ワレン）およびＡｒｎｓｔｅｉｎ（アーステイン）、上記参照）。この点については、ＳＶ４０が形質転換された羊膜細胞株は、これらの細胞自体が、腫瘍ウイルスであると知られているＳＶ４０を生成するので、遺伝子移入ベクターを生成するには不適当であるということに注目すべきである（Ｇｒａｆｆｎｅｙ（グラフネィ）他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  癌研究）３０、８７１−８７９、１９７０）。ヒト細胞のＳＶ４０での形質転換性は、さらにアデノウイルスのＥ１機能での形質転換性、および遺伝子移入ベクターの生成のためのその使用についての情報を与えない。たとえば、ケラチン生成細胞を、ＳＶ４０で形質転換することができる（Ｓａｃｋ（サック）、上記参照）が、ケラチン生成細胞を、ちょうど皮膚、繊維芽細胞および肝細胞のように、明らかにＡｄ１２で形質転換することができない（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ（ガリモア）他、１９８６、上記参照）。しかも、不死化した細胞におけるウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターの生成の点から見て、重要であるのはまさに特定の不死化機能をもつ不死化可能性ではない；それゆえまた、良好な感染可能性、および感染の良好な生産過程がある。これらの特性を予測することはできない；特定の細胞型を、遺伝子移入ベクターを生成するために使用することができるかどうかについての疑問は、細胞型毎に改めて決定されなければならない。
【００３１】
よって、本発明の目的は、羊膜細胞株の効率的で、簡単でかつ容易に再生できる生成のための新規の工程、およびとりわけアデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを生成するためのその使用を提供することであった。
【００３２】
全く驚いたことに、出生前の診断中に、診断の根拠のために羊水組織診（用水穿刺）によって常に得られる用水の細胞（羊膜細胞）にアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を形質移入すると、機能的に活性な態様でＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現しかつ遺伝子移入ベクターを生成するのに適する、多数の永久細胞株がもたらされた。
【００３３】
よって、本発明の一つの局面は、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸を含む、永久羊膜細胞株である。「永久細胞株（永久株化細胞）」は、本発明によれば、対応する細胞が、あるやり方で遺伝的に改変されてきて、それらは、細胞培養において永久的に成長し続けることができるということを意味する。比較すると、「一次細胞」は、生物体からの除去および継代によって得られ、かつ限られた寿命しかない細胞を意味する。永久羊膜細胞株は、本発明の目的のために、ここで提案した方法によって得られ、それは一次羊膜細胞にアデノウイルスＥ１機能を形質移入することを含む。アデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸は、それによってこれらの遺伝子産物が安定して発現されることになるいかなる適当な核酸であってもいい。それ／それらは、細胞のゲノムに、すなわち染色体性に組み込まれることができ、または染色体の外部に、たとえばエピゾームで複製しているプラスミドまたはミニ染色体として存在することができる。そのうえ、さまざまな遺伝子産物の発現は、一つのかつ同じ核酸分子または、たとえば異なる核酸分子によって引き起こされうる。「発現」は、先行技術状態では、特定の形質または特定の特質をもたらす特定のタンパク質である遺伝子産物、またはタンパク質に翻訳されないＲＮＡ型（たとえば、アンチセンスＲＮＡ、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ））の生成工程を意味する。所望の発現を達成するのに適している可能性は、この説明、特定的には提案された工程にも鑑み、熟練した研究者に明らかとなろう。新規の羊膜細胞株は、一般に遺伝子移入ベクターを生成するための使用のみならず、特定的には細胞株によって補完されるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失を特徴とする第一世代アデノウイルスベクターを生成するのに適している。
【００３４】
その少なくとも一つの核酸は、好ましくは、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ２Ｂおよび／またはＥ４領域の遺伝子産物のおよび／またはＣｒｅリコンビナーゼの発現も引き起こす。これによって、細胞株は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失に加えて、Ｅ２および／またはＥ４遺伝子の欠失を特徴とする第二世代アデノウイルスベクターを生成するのに特に適するようになる。バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼの発現は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂが欠失されたヘルパーウイルスの助けで、大容量のアデノウイルスベクターの生成において特に有利である（Ｐａｒｋｓ（パークス）他、上記参照；Ｈａｒｄｙ（ハーディ）他、上記参照）。Ｅ１Ａ領域の遺伝子産物の発現は、有利なことに、構成的プロモータ（構造性プロモーター）、好ましくはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にある。それは、Ｅ１Ｂ領域の遺伝子産物の発現にとって、それがアデノウイルスプロモーター、好ましくは、アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターの制御下にあるなら有利である。考えられるこれに代わるものは、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することである。すべてのアデノウイルス遺伝子産物は、好ましくは、同じ亜属、たとえばヒトアデノウイルス型５（Ａｄ５）のアデノウイルスに由来する（から誘導される）。永久羊膜細胞株は、これがヒトウイルス、たとえば、ヒトアデノウイルスまたはヒトＡＡＶ等に由来する遺伝子移入ベクターを生成するのに特に適するので、通常ヒト細胞株である。
【００３５】
考えられるこれに代わるものは、霊長類または他の哺乳動物、たとえば、ウシ等からの細胞株であり、それは、特定的な種において生じかつ固有なウイルスに由来する遺伝子移入ベクターを生成するのに特に適する。たとえば、羊膜細胞をウシアデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で形質転換することによって得られる永久羊膜細胞株は、ウシアデノウイルスに由来するベクターを生成するのに適する。
【００３６】
本発明の他の局面は、永久羊膜細胞株、特定的には上で規定した羊膜細胞株を生成する方法であって、羊膜細胞に、Ｅ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域のアデノウイルス遺伝子産物の発現を引き起こす少なくとも一つの核酸を形質移入することを含む。次に、結果として生じる細胞クローンを、さらに適当なところで単離し、かつもし必要なら、単細胞株を得るためにクローンニングすることができる。ここで、用語「形質移入」は、上記核酸を細胞に導入するのに適するいかなる工程も意味する。言及してもいい例は、電気穿孔法、任意の型のリポゾームシステム、およびこれらの工程の組み合わせである。用語「羊膜細胞」は、ここではより広い意味で、羊水に存在し、かつ羊水組織診によって得られうる全ての細胞を意味する。それらは、羊水と接触している羊膜からまたは胎児の組織のいずれかに由来する。羊膜細胞の３つの主な分類を説明し、かつ形態学的な判定基準：細胞（Ｆ細胞）のような繊維芽細胞、類上皮細胞（Ｅ細胞）、および羊水細胞（ＡＦ細胞）に基づいて区別する（Ｈｏｈｎ（ホーン）他、Ｐｅｄｉａｔ．Ｒｅｓ．（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  小児科学研究）８、７４６−７５４、１９７４）。ＡＦ細胞は、支配的な細胞型である。したがって、狭い意味では、「羊膜細胞」は、ここでは、ＡＦ型の羊膜細胞を意味する。好ましくは、一次羊膜細胞が使用される。「一次」細胞と呼ばれる細胞は、生物体からの除去および継代によって得られ、かつほんの限られた寿命をもつものであり、一方いわゆる「永久」細胞株は、制限なく成長し続けることができる。この点については、ヒト一次羊膜細胞を使用し、それによってヒト細胞株が生成されるのが特に好ましい（上記を参照されたい）。しかしながら、霊長類および他の哺乳類種、たとえばウシ等からの一次羊膜細胞を使用することも可能である。たとえばトリプシン処理によって、または絨毛膜性絨毛の組織診によって、羊膜から得られうる細胞を、対応する永久細胞株を生成するために同様に使用することが可能であることも、この説明に鑑み、熟練した研究者に明らかとなろう。
【００３７】
アデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を引き起こすその少なくとも一つの核酸は、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡでありうる。核酸は、好ましくは、ＤＮＡ発現ベクターの形で使用される。その例は、組み込みベクター、細菌性プラスミド、エピゾームで複製されたプラスミド、またはミニ染色体である。そのレシピエント細胞のゲノムへの組込みが、形質移入によって引き起こされる発現プラスミドが優先される。用語「少なくとも一つの核酸」は、発現を引き起こす要素（エレメント）が、一つおよび同じ核酸上か、異なる拡散上かのいずれかに存在することがあるということを表している。たとえば、別々の核酸が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂおよび／またはＥ４領域の遺伝子産物のおよび／またはＣｒｅリコンビナーゼの発現のために与えられてもいい。形質移入されるべき羊膜細胞は、これらの遺伝子産物の一つを既に発現し、そのため他の遺伝子産物の発現のみが引き起こされる必要があり、あるいはこれらの遺伝子産物の一つ以上の発現は、単に適切な調節要素を導入することによってオンに切り換えられる。核酸の生成、および適当な所では、核酸の突然変異生成のための、かつ遺伝子発現ならびにタンパク質分析のための適切な技術および工程を、熟練研究者が利用できる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（サムブロック・ジュニア）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローンニング）：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（研究室マニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（コールドスプリングハーバー研究室プレス）（１９８９）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ（グラバ−・ディーエム）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＤＮＡクローニング）：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（実際のアプローチ）、ＩＩ巻：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（発現システム）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＲＬ  プレス）（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ（アッシュベル）他、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学のショートプロトコル）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ジョン・ウイリー＆ソンス）（１９９９）；Ｒｅｅｓ，Ａ．Ｒ．（リーズ・エーアール）他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（タンパク質エンジアニアリング）；Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（実際のアプローチ）、ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９３））。Ｅ１Ａ領域の遺伝子産物が、構成的プロモータ（構造性プロモーター）、特定的にはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下で発現される方が好ましく、かつＥ１Ｂ領域の遺伝子産物が、アデノウイルスプロモーター、特定的にはアデノウイルスＥ１Ｂプロモーターの制御下で発現されるのが好ましい。アデノウイルスプロモーターの代わりに、たとえばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用するのも可能である。
【００３８】
好ましい実施例では、羊膜細胞および／または結果として生じる細胞株に形質移入することは、さらにアデノウイルスＥ２Ａおよび／またはＥ２Ｂおよび／またはＥ４領域の結果として生じる遺伝子産物および／またはＣｒｅリコンビナーゼの発現を引き起こす。先に論じたまたはその他先行技術で開示した可能性の全てを、この点について熟練研究者が利用できる。次の情報以外では、個々の遺伝子について参照する：Ｅ２Ａ：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ジェンバンク受入れ）＃Ｍ７３２６０；Ｋｒｕｉｙｅｒ（クルイヤー）他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  核酸研究）９、４４３９−４４５７、１９８１；Ｋｒｕｉｙｅｒ（クルイヤー）他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、４４９３−４５００、１９８２．Ｅ２Ｂ：ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．＃Ｍ７３２６０；Ｄｅｋｋｅｒ（デッカー）他、Ｇｅｎｅ（遺伝子）２７、１１５−１２０、１９８４；Ｓｈｕ（シュー）他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５、３４８−３５６、１９８８．Ｅ３：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．＃Ｍ７３６２０；Ｃｌａｄａｒａｓ（クラドラス）他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４０、２８−４３、１９８５．Ｅ４：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．＃Ｍ７３６２０およびＤ１２５８７；Ｖｉｒｔａｎｅｎ（ビルタネン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１、８２２−８３１、１９８４；Ｄｉｘ（デックス）他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２９７５−２９７６、１９９２。読み取りフレームは、いくつかの場合には、Ａｄ２についてのみ公知であり、かつたとえばＡｄ５の場合には、通常配列の比較によって割り当てられうる。Ｃｒｅリコンビナーゼ：Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．＃Ｘ０３４５３；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（シュテルンベルク）他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７、１９７−２１２、１９８６．
【００３９】
アデノウイルス遺伝子産物は、好ましくは、全て特定のアデノウイルス血清型から、特定的にはヒトアデノウイルス型５（Ａｄ５）に由来する。羊膜細胞を形質転換するために使用されるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の起源である特定のアデノウイルス血清型は、本発明にとって重要ではない。本発明において用いられうるアデノウイルス血清型の例は、先行技術において公知であり、かつ４０以上のヒト血清型、たとえばＡｄ２（亜属Ａ）、Ａｄ３およびＡｄ７（亜属Ｂ）、Ａｄ２およびＡｄ５（亜属Ｃ）、Ａｄ８（亜属Ｄ）、Ａｄ４（亜属Ｅ）、Ａｄ４０（亜属Ｆ）である（Ｗｉｇａｎｄ（ウィガンド）他、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（アデノウイルスＤＮＡ）」、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ（ドエルフラー）編、Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（マルティヌス  ニジョフ出版）、ボストン、４０８−４４１ページ、１９８６）。本発明の好ましい実施例では、亜属Ｃに由来するアデノウイルスベクターは、同じ亜属のアデノウイルスに由来するＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で羊膜細胞を形質転換することによって生成される。たとえば、血清型２または５のアデノウイルスベクターは、血清型２または５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で羊膜細胞を形質転換することによって生成される。Ａｄ１２に基づくアデノウイルスベクターは、Ａｄ１２等のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子で羊膜細胞を形質転換することによって生成される。ウシ、ヒツジ、ブタおよび他の哺乳動物に由来する周知のアデノウイルスを含む、非ヒトアデノウイルスベクターを生じるために、羊膜細胞株は、特定の種の羊膜細胞を形質転換することによって生成される。これは、アデノウイルス機能を、通常種の境界を越えて効率的に補完することができないので、通常必要である。
【００４０】
本発明の好ましい実施例では、羊水組織診による出生前の診断の範囲内で、診断上の根拠のために得られ、かつもはや診断上の目的のために用いられない羊膜細胞は、Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現した発現プラスミドを形質移入される。この作成物は、Ｅ１Ａ遺伝子が、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの制御下にあり、かつＥ１Ｂ遺伝子が、自然アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターの制御下であるように設計された。自然Ｅ１Ｂスプライス受容部位およびＥ１Ｂポリアデニル化配列の代わりに、ＳＶ４０ウイルスの対応する配列が用いられた。プラスミドＤＮＡを形質移入した数週間後、多数の細胞クローンが観察され、かつこれらは単離され、クローンニングされ、不死化細胞株として確立され、かつ分析された。分析された細胞クローンの全てはＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を発現した。Ｅ１が欠失され、β−ｇａｌを発現するアデノウイルスベクターに感染することおよび次の染色によって、これらの細胞の全てを感染させることができることが示された。Ｅ１が欠失された第一世代アデノウイルスベクターに対する感染実験によって、細胞株が、アデノウイルスベクターを生成するのに適することが明らかになった。これらの実験では、細胞株を、まずβ−ｇａｌを発現する第一世代アデノウイルスベクターに感染させた。４８−７２時間後、細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したとき、細胞を収集し、かつアデノウイルスベクターを、３回凍結および解凍することによって細胞から取り除いた。細胞可溶化物の一部を、２９３個の細胞を感染させるために使用し、かつβ−ｇａｌの発現を、遺伝子移入の約２４時間後に組織化学的に検出した。β−ｇａｌ陽性細胞の数から、個々の細胞株における生成によってベクターの収率を直接計算することが可能であった。羊膜細胞株は、このようにして、難なくかつ再現できるように得られ、かつ遺伝子移入ベクターを生成するのに非常に適する。単離された細胞株のいくつかによって、アデノウイルスベクターを、２９３個の細胞とちょうど同じくらいうまく又はそれよりうまく生成することができた。予期しなければならないが、細胞株は、組換えアデノウイルスベクターの生成における違いを示した（図４を参照されたい）。細胞株Ｎ５２．Ｅ６およびＮ５２．Ｆ４は、アデノウイルスベクターの急速な成長および特に良好な生成、遺伝子移入ベクターを生成するためのこれらの細胞株の使用に有利な特性によって区別された。
【００４１】
羊膜細胞を形質転換するのに使用されるＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する発現プラスミドの設計は、複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）の発生を、２９３個の細胞と対照的に、アデノウイルスベクターのまたはアデノウイルスヘルパーウイルスの、形質転換された羊膜細胞へ組み込まれたＤＮＡとの相同的組換えによって妨げる。これに代わるものとして、個々のＥ１機能を、さまざまな発現プラスミド上で、形質移入されるべき細胞へ導入することができる。２９３個の細胞株については、羊膜細胞の形質転換を実行し、かつ遺伝子移入ベクターの生成において発生されたバッチを、たとえば、ＰＣＲまたは感染試験法を用いてＲＣＡ含有量について検査することももちろん可能である。次に、ＲＣＡを含むバッチを、適当なところで廃棄することができる。
【００４２】
このように、本発明のさらなる局面は、ここで提案した工程によって得ることができる永久羊膜細胞株に関するものである。特定的な実施例では、本発明は、永久羊膜細胞株Ｎ５２．Ｅ６に関するものであり、それは、ブダペスト条約に従ってＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｔ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ドイツ・ザンムリング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・チェルクルウォーレン社）（ＤＳＭＺ）で１９９９年１０月２６日に析出され、かつ受入れ番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２４１６を受けた。
【００４３】
さらなる局面では、本発明は、アデノウイルスにより形質転換された永久羊膜細胞株を生成するための、羊膜細胞の使用に関するものである。用語「アデノウイルスにより形質転換される」は、ここでは一つ以上のトランスフォーミングアデノウイルス遺伝子による形質転換を意味する。「形質転換」は、この点については、成長制御にさらされる真核生物細胞の、制限なく成長するいわゆる永久細胞株への変換のことをいう。さらなる局面は、永久羊膜細胞株を生成するための、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域のアデノウイルス遺伝子産物の使用である。
【００４４】
本発明は、さらに、遺伝子移入ベクターを生成するための永久羊膜細胞株（ＳＶ４０により形質転換された羊膜細胞株を除く）の使用を含む。「遺伝子移入ベクター」は、ここでは、それを用いて一般的に一つ以上の治療遺伝子が所望の標的細胞、特定的にはこの特質を有するウイルスベクターに移入されるかまたは導入される全てのベクターを意味する。さらに、永久羊膜細胞株（ＳＶ４０により形質転換された羊膜細胞株を除く）を、アデノウイルス変異体を生成するために使用することができる。「アデノウイルス変異体」は、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ遺伝子における少なくとも一つの突然変異を有するアデノウイルスを意味する。しかしながら、好ましい実施例では、それらは、アデノウイルス遺伝子移入ベクターと対照的に、いかなる治療遺伝子も宿していない。その典型的な例は、Ｅ１Ｂの５５ｋＤタンパク質が発現されていないアデノウイルス変異体からなる(たとえば、アデノウイルス変異体ｄｌ１５２０（Ｂａｒｋｅｒ（バーカー）他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６、１０７−１２１、１９８７）。Ｅ１Ｂの５５ｋＤタンパク質が発現されていないアデノウイルス変異体が腫瘍症の治療にとっておおいに興味があるのは、そのウイルス変異体は、腫瘍細胞においては独占的に複製し、かつ一次正常細胞においては独占的ではなくまたは無視できる程度まで複製するからである（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（ビスチョフ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、３７３−３７６、１９９６；Ｋｉｒｎ（キルン）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  自然医学）４、１３４１−１３４２、１９９８）。
【００４５】
好ましい実施例は、アデノウイルスベクター、ＡＶＶ(アデノ随伴ウイルス)ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、キメラのアデノウイルスーＡＡＶベクター、キメラのアデノウイルス−レトロウイルスベクターおよび／またはキメラのアデノウイルスーレンチウイルスベクターを生成するための永久羊膜細胞株の使用である。ヘルペスベクターを生成するための使用もまた可能である。
【００４６】
ＡＡＶベクターは、通常ＡＡＶのＩＴＲ、およびいくつかの隣接する非コードＡＡＶ配列のみからなる。それらの外来性ＤＮＡの取り込み容量は、約４．５ｋｂである。上で述べたように、組換えＡＡＶベクターを生成するさまざまなシステムがある。組換えベクターの複製、発現、およびパッケージングに必要な成分が与えられるのは、これらのシステム全てに共通である。すなわち、これらは、ＡＡＶのレップ（ｒｅｐ）およびキャップ（ｃａｐ）タンパク質をコードする発現カセット、およびそのアデノウイルスヘルパー機能を含む。ＡＡＶ生成に必要なアデノウイルスヘルパー機能は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ遺伝子である。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株において提供され、かつしたがってＡＡＶベクターを生成するのに使用されうる。Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ機能を、アデノウイルスに同時感染することによって、またはＥ２、Ｅ４およびＶＡを発現するプラスミドを同時形質移入することによって、あるいはアデノウイルス／ＡＡＶまたは単純ヘルペスウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターによって提供することができる（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）他、上記参照；Ａｌｌｅｎ（アレン）他、上記参照；玉寄他、上記参照；Ｆｌｏｔｔｅ（フロッテ）他、上記参照；Ｃｏｎｗａｙ（コンウェイ）他、上記参照；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ（チオリーニ）他、上記参照；Ｆｅｒｒａｒｉ（フェラーリ）他、上記参照；Ｓａｌｖｅｔｔｉ（サルベッティ）他、上記参照；Ｘｉａｏ（シャオ）他、上記参照；Ｇｒｉｍｍ（グリム）他、上記参照；Ｚｈａｎｇ（チャン）他、上記参照）。
【００４７】
レトロウイルスベクター、すなわちレトロウイルスに由来するベクターは、同様に、遺伝子治療手順の範囲内での形質移入のための、たとえば中枢神経系における遺伝子治療のための媒体として非常に重要である（Ｓｕｈｒ（ズ−ル）他、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  神経学資料）５６、２８７−２９２、１９９９）。レトロウイルスベクターを、安定したベクター生成細胞株において、または一過性の形質移入によって生成することができる。レトロウイルスを生成するのに使用される個々の成分は、通常、構造タンパク質および複製と組込みタンパク質を発現する一つ以上のプラスミド、ならびにベクター自体からなるプラスミドを含む（Ｍｉｌｌｅｒ（ミラー）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（レトロウイルス）」、Ｃｏｆｆｉｎ（コフィン）、Ｈｕｇｈｅｓ（ヒューズ）、Ｖａｒｍｕｓ（バーマス）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（コールドスプリングハーバー研究室プレス）、１９９７、４３７−４７３ページ）。たとえば、複製のＳＶ４０開始点等、複製開始点を含むこれらのプラスミドが使用されるなら、羊膜細胞株が改変され、それゆえプラスミドの複製を促進するタンパク質が安定して発現される。たとえば、複製のＳＶ４０開始点を含むプラスミドの場合には、ＳＶ４０のＴ抗原を発現する羊膜細胞株が使用される。
【００４８】
レンチウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するベクターである（Ｎａｌｄｉｎｉ（ナルディニ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、２６３−２６７、１９９６；Ｄｕｌｌ（ダル）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、８４６３−８４７１、１９９８）。レンチウイルスベクターを、安定したベクター生成細胞株において、または一過性の形質移入によって生成することができる。
【００４９】
「キメラベクター」は、二つ以上の異なるウイルスベクターからの核酸の融合の産物であるベクターを意味する。永久羊膜細胞株を、キメラのベクターを生成するために、この説明に従って使用することができる。たとえばこのシステムでは、アデノウイルスベクター、好ましくは大容量のアデノウイルスベクターは、たとえばレトロウイルスからまたはＡＡＶに由来する組込みウイルスのための配列情報を有するＤＮＡの断片を宿している。標的細胞の転写後、治療遺伝子を宿している組込みウイルスは、アデノウイルス背景から遊離される（たとえば、隣接細胞を形質導入し、かつＤＮＡとして安定して組み込む感染性のレトロウイルス粒子を生成することによるレトロウイルスの挿入の場合）。２９３個の細胞において生成されたキメラベクターの例は、たとえばキメラのアデノウイルス−レトロウイルスベクターとして（Ｆｅｎｇ（フォン）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  自然生物工学）１５、８６６−８７０、１９９７）およびキメラのアデノウイルスーＡＡＶベクター（Ｒｅｃｃｈｉａ（レチャイア）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、２６１５−２６２０、１９９９）として過去に説明した。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株における生成は、２９３個の細胞と対照的に、複製適格ベクターを、相同的組換えによって生成することができないので、好ましいにちがいない。
【００５０】
アデノウイルスベクター、すなわちアデノウイルスに由来するベクターは、特定的には、遺伝子治療手順の範囲内で、形質移入の媒体として大いに重要である。アデノウイルスベクターは、永久羊膜細胞株の助けで生成される、第一世代アデノウイルスベクター、第二世代アデノウイルスベクター、大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクター、および／または欠失されたアデノウイルスベクターであってもいい。
【００５１】
ａ）第一世代アデノウイルスベクターの生成
第一世代アデノウイルスベクターは、通常Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失を特徴とする。第一世代アデノウイルスベクターの中には、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失に加えて、Ｅ３領域の欠失も含むものもある。Ｅ３機能は、細胞培養におけるアデノウイルスベクターの成長にとって必ずしも必要でない。
【００５２】
第一世代アデノウイルスベクターを、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株において生成することができる。細胞（３−５ＭＯＩ）毎に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞を、好ましくは３−５個の感染性の単位に感染させることによって、これを行う。約３６ないし７２時間後、細胞は、細胞変性効果を示す。細胞は、標準プロトコルによって収集される。アデノウイルスベクターを、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によってまたはクロマトグラフィー工程によって、それらから精製することができる。
【００５３】
ｂ）第二世代アデノウイルスベクターの生成
第二世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失を特徴とする。第二世代アデノウイルスベクターの中には、Ｅ３領域の欠失をも含むものもある。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失に加えて、第二世代アデノウイルスベクターは、少なくとも一つの他の不可欠なアデノウイルス遺伝子、たとえばＥ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子および／またはＥ４遺伝子の非活性化および好ましくは欠失を、またはＥ４機能の欠失と組み合わせたＥ２機能の欠失を特徴とする。
【００５４】
第二世代アデノウイルスベクターを生成するために、ベクター自体が、非活性化および／または欠失のために発現しない機能は、羊膜細胞株によって提供されなければならない。この目的のため、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを安定して発現する羊膜細胞株を、一つ以上の他のアデノウイルス機能のための遺伝子産物コーディングを発現する発現カセットの形質移入によって、安定して改変することが可能である。たとえば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失に加えて、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂおよび／またはＥ４遺伝子の欠失もまた有する第二世代アデノウイルスベクターを生成するために、適切な遺伝子が、選択マーカーと共に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株へ形質移入することによって導入される。細胞クローンは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能の発現に加えて、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂおよび／またはＥ４機能も発現するが、次に特定の第二世代ベクターを生成するために使用することができる。Ｅ２および／またはＥ４遺伝子は、通常非相同的なプロモーターの転写制御下にあり、そのいずれかは、構成的に活性であるかまたは調節されうる。
【００５５】
ｃ）大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターの生成
大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターは、ウイルスコード配列の大部分または全ての欠失を特徴とする。これらのベクターは、好ましくは、ウイルスＩＴＲおよびウイルスパッケージング信号のみからなる。アデノウイルス機能は、輸送中にヘルパーウイルスによって提供される。大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターを生成するさまざまなシステムを説明してきた。ヘルパーウイルスが、複製が不完全な、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂが欠失されたアデノウイルスに対応することは、今までかつヘルパーウイルスを用いて説明してきた全てのシステムに共通である。ヘルパーウイルスは、完全なパッケージング信号（三谷他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２、３８５４−３８５８、１９９５；Ｆｉｓｈｅｒ（フィッシャー）他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７、１１−２２、１９９６；Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ（クマーーシング）およびＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎ（チェンバレン）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５、９１３−９２１、１９９６）か、突然変異したパッケージング信号（Ｋｏｃｈａｎｅｋ（コッカネック）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、５７３１−５７３６、１９９６）かのいずれかを含む。後者の場合には、ヘルパーウイルスは、減衰されたパッケージング信号を含み、したがってさほど効率的でなくパッケージングされるので、ベクターは、好ましくはウイルスキャプシドにパッケージングされる。その代わりに、ヘルパーウイルスのパッケージング信号を、リコンビナーゼを使用することによって、産生株細胞株の感染後切除することができる（Ｐａｒｋｓ（パークス）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、１３５６５−１３５７０、１９９６；Ｈａｒｄｙ（ハーディ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、１８４２−１８４９、１９９７）。たとえば、ヘルパーウイルスのパッケージング信号を、バクテリオファージＰ１のＬｏｘＰ識別配列によってフランキングする（隣接させる）ことができる。バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼの発現の結果、ヘルパーウイルスのパッケージ信号が切除される。しかしながら、パッケージング信号がないために、ヘルパーウイルスのキャプシドへのパッケージングが起こる。バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、選択マーカーと共に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株へ形質移入することによって導入される。細胞クローンは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能の発現に加えて、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ機能も発現するが、次に大ＤＮＡ容量の特定のベクターを生成するために使用することができる。
【００５６】
ｄ）「欠失された」アデノウイルスベクターの生成
「欠失された」アデノウイルスベクターを、第一世代ベクターとして説明してきたが、それはＣｒｅを発現する２９３個の細胞が感染すると、ウイルスコード配列の大部分またはウイルスコード配列の全てが、ｌｏｘＰ認識配列間の組換えによって欠失されるようにしてウイルスゲノムに位置するバクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識配列を有する。これらのベクターのゲノムの大きさは、約９ｋｂである。外来性ＤＮＡの取り込み容量は、同様に約９ｋｂである（Ｌｉｅｂｅｒ（リーバー）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、８９４４−８９６０、１９９６）。欠失されたアデノウイルスベクターの生成において使用するために、バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、選択マーカーと共に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株へ形質移入することによって導入される。細胞クローンは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ機能の発現に加えて、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ機能も発現するが、次に特定の欠失されたＡｄベクターを生成するために使用することができる。
【００５７】
ｅ）向性が改変された遺伝子移入ベクターの生成
好ましい実施例では、永久羊膜細胞株は、向性が改変された遺伝子移入ベクターを生成するために使用される。ウイルスのおよびこのウイルスに由来するウイルスベクターの向性は、特定の細胞型がベクターと共にうまく伝達されえたかどうかを決める。遺伝子移入の細胞への取り込みは、この細胞への遺伝子移入が成功するのための第１段階である。このように、ウイルスベクターの向性は、特定の細胞または組織への効率的な生体外でのまたは生体内での遺伝子移入にとって不可欠な因子である。（アデノウイルスまたはＡＡＶベクターの場合にはキャプシドの、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター場合にはウイルス外皮の）ウイルスベクターの表面の、標的細胞の細胞膜との相互作用は、特定の細胞への取り込みに必要である。ウイルスベクターの標的細胞への取り込みの正確なメカニズムが、時々異なるベクター間で変動するが、全ての場合において、ウイルスベクターの表面構造（通常タンパク質リガンド）の、標的細胞上の構造（通常受容体または接着分子）との相互作用は、きわめて重要な役割を果たす。アデノウイルスベクターの取り込みは、たとえば、受容体が媒介されたエンドサイトーシスによって起こる。これには、細胞受容体とのアデノウイルスキャプシド結合の部分が必要となる。Ａｄ２またはＡｄ５に由来するアデノウイルスベクターの場合には、現在の知識状態によれば、通常、繊維タンパク質の小頭部ドメインの一部の、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）との結合、およびペントン塩基の一部の、αｖβ３またはαｖβ５インテグリンとの結合がある。小頭部ドメインのＣＡＲ上での結合は、現在の知識状態によれば、ベクターの標的細胞の細胞膜との接着に必要であるが、一方ペントン塩基のインテグリンとの結合は、ベクターの標的細胞への内部移行に必要である。
【００５８】
羊膜細胞株を、向性が改変されたベクターを生成するために使用することができる。これは、たとえば、第一および第二世代アデノウイルスベクターの生成、大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクター、欠失されたアデノウイルスベクター、キメラのアデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルスベクターにあてはまる。羊膜細胞株において向性が改変されたベクターを生成するためのさまざまな方策を用いることができる。特定の向性改変のために用いられる方策は、異なるベクター（たとえば、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター）毎に異なってもよい。特定のベクター（アデノウイルスおよびＡＡＶベクターの場合にはウイルスキャプシド、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの場合にはウイルス外皮）の表面が変更されて、ベクターの標的細胞との結合が変更されるのは、さまざまな方策にとって共通である。以下が、アデノウイルスベクターの改変の例である。
【００５９】
ａ）異なる血清型間での繊維タンパク質の交換：これの結果、アデノウイルスベクターが生じ、そのキャプシドは、異なる血清型の繊維タンパク質を搬送する。その例は、血清型２に由来するアデノウイルスベクターの自然繊維タンパク質の、血清型１７（Ｚａｂｎｅｒ（ザブナー）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、８６８９−８６９５、１９９９）または血清型９（Ｒｏｅｌｖｉｎｋ（ローエルビンク）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、７６１４−７６２１、１９９６）に由来する繊維タンパク質との交換である。他の例は、血清型５に由来するアデノウイルスベクターの自然繊維タンパク質の、血清型７ａ（Ｇａｌｌ（ガル）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、２１１６−２１２３、１９９６）または血清型３（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ（スチーブンソン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、４７８２−４７９０、１９９７；Ｋｒａｓｎｙｋｈ（クラスニック）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、６８３９−６８４６、１９９６；Ｄｏｕｇｌａｓ（ダグラス）他、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．（Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  神経筋障害）７、２８４−２９８、１９９７）に由来する繊維タンパク質との交換である。
【００６０】
ｂ）繊維タンパク質の除去：繊維タンパク質は、遺伝子操作の工程によって除去され、それゆえベクターの取り込みは、もっぱらペントン塩基のまたはヘキソンタンパク質の相互作用を経て起こる（Ｆａｌｇｏｕｔ（ファルガウト）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、６２２−６２５、１９８８；Ｌｅｇｒａｎｄ（ルグラン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、９０７−９１９、１９９９）。
【００６１】
ｃ）ペプチドのついた繊維タンパク質のＣ末端の改変：その例は、ポリリジンペプチドのついたＣ末端の改変（吉田他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｅｒ．９、２５０３−２５１５、１９９８：Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４、１５７０−１５７３、１９９６；Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、８２２１−８２２９、１９９７）、ポリヒスチジンペプチド（Ｄｏｕｇｌａｓ（ダグラス）他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、４７０−４７５、１９９９）、またはガストン放出ペプチド（Ｍｉｃｈａｅｌ（ミカエル）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２、６６０−６６８、１９９５）である。
【００６２】
ｄ）ペプチドの挿入による、繊維タンパク質の小頭部ドメインの部分の改変：その例は、ＦＬＡＧエピト−プの挿入である（Ｋｒａｓｎｙｋｈ（クラスニック）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１８４４−１８５２、１９９８）またはＲＧＤペプチドの挿入（Ｄｍｉｔｒｉｅｖ（ドミートリーブ）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、９７０６−９７１３、１９９８；Ｋａｓｏｎｅ（かそね）他、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  臨床癌研究）５、２５７１−２５７９、１９９９）。
【００６３】
ｅ）ペントン塩基の改変：その一例は、ＬＤＶモチーフによる、ペントン塩基内でのＲＧＤモチーフの、ベクターのα４β１インテグリンとの結合を媒介する目的との置換である（Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２、７５０−７５６、１９９５）。
【００６４】
ｆ）へキソンタンパク質の改変：その一例は、ポリオウイルス型３に由来するエピト−プの挿入である（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ（クロンプトン）他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５、１３３−１３９、１９９４）。
【００６５】
羊膜細胞株で生成されるベクターの向性を変更するために用いることができる代わりの方策は、ベクターの、細胞膜構造、たとえば、細胞受容体または接着分子等との結合を媒介するリガンドの使用に基づいている。これらのリガンドは、ペプチド、タンパク質または他の抗体であってもよい。リガンドを、さまざまな工程によって、ベクターの表面と結合することができる。リガンドの、（アデノウイルスまたはＡＡＶベクターの場合にはキャプシドの）ベクターの表面との結合を、抗体を使用することによってまたは化学架橋反応によって生成することができる。抗体を使用すると、その特異性が、ベクターのキャプシドに（たとえば、繊維タンパク質の小頭部ドメインに）向けられている抗体を使用することが可能である。その代わりに、その特異性が、ネオエピト−プ（たとえば、ＥＬＡＧエピト−プまたはｍｙｃエピト−プ）としてベクターのキャプシドに導入されてきたエピト−プに対して向けられる抗体を使用することが可能である。その例は、熟練した研究者に周知である。二重特異性抗体の使用例は、Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、６８３１−６８３８、１９９６（抗ＦＬＡＧ／抗―α―インテグリン）において；内皮細胞の伝達のために、Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｃａｎｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  癌免疫学免疫療法）４５、１４９−１５１、１９９７；Ｈａｒａｒｉ（ハラーリ）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６、８０１−８０７、１９９９（抗―ＦＬＡＧ／抗―Ｅ−選択）において；腫瘍細胞の伝達のために、Ｍｉｌｌｅｒ（ミラー）他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８、５７３８−５７４８、１９９８；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（ブラックウエル）他、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  耳鼻科学資料―頭部および頚部手術）１２５、８５６−８６３、１９９９（抗―Ａｄ／抗―ＥＧＦＲ）において；Ｔ細胞の伝達のために、Ｗｉｃｋｈａｍ（ウイッカム）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、７６６３−７６６９、１９９７（抗―ＦＬＡＧ／抗―ＣＤ３）において；樹状突起細胞の伝達のために、Ｔｉｌｌｍａｎ（ティルマン）他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  免疫学ジャーナル）１６２、６３７８−６３８３、１９９９（抗―ＣＤ４０／抗―Ａｄ）において説明されている。リガンドに結合される一つのウイルスキャプシド決定因子に対して特異性がある単鎖抗体の使用例は、Ｗａｔｋｉｎｓ（ワトキンズ）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｈｙ  遺伝子治療）４、１００４−１０１２、１９９７において；ＦＧＦ２受容体を発現する腫瘍細胞の伝達のために、Ｇｏｌｄｍａｎ（ゴールドマン）他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、１４４７−１４５１、１９９７；Ｒａｎｃｏｕｒｔ（ランコート）他、Ｃｈｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４、２４５５−２４６１、１９９８；Ｇｕ（グー）他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９、２６０８−２６１４、１９９９；Ｒｏｇｅｒｓ（ロジャーズ）他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４、１３８７−１３９２、１９９７（抗―Ａｄ／ＦＧＦ２）において；細胞表面上で葉酸受容体を発現する腫瘍細胞の伝達のために、Ｄｏｕｇｌａｓ（ダグラス）他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４、１５７４−１５７８、１９９６；Ｄｏｕｇｌａｓ（ダグラス）他、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄ．７、２８４−２９８、１９９７（抗―Ａｄ／Ｆｏｌａｔ）において説明されている。
【００６６】
たとえばリガンドをＡｄ５の繊維タンパク質の小頭部ドメインへ導入することによって、自然向性が無効にされかつその代わりに他の向性が用いられた遺伝子移入ベクターの場合には、この新しいリガンドを認識する受容体の好ましく安定した発現によって永久羊膜細胞株を改変する必要があるかもしれない（Ｄｏｕｇｌａｓ（ダグラス）他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、４７０−４７５、１９９９）。永久羊膜細胞株が、一つ以上の構造タンパク質の生成において欠陥がある遺伝子移入ベクターを生成することが同様に可能である。永久羊膜細胞株における遺伝子移入ベクターの特定の欠陥を補完することによって、これを行う。たとえば、繊維タンパク質のための遺伝子コーディングにおいて突然変異を有するアデノウイルスベクターを、繊維タンパク質における欠陥を補完する羊膜細胞株において生成することができる。これは、繊維発現カセットを、この羊膜細胞株における繊維タンパク質の安定した又は誘導性の発現に導入することによって達成される（Ｖｏｎ  Ｓｅｇｇｅｒｎ（フォン・ゼーゲルン）他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１４６１−１４６８、１９９８）。羊膜細胞株において発現された繊維タンパク質は、自然の、改変されていない繊維タンパク質、でなければ変更された、たとえば向性が改変された繊維タンパク質であってもいい（Ｖｏｎ  Ｓｅｇｇｅｒｎ（フォン・ゼーゲルン）他、上記参照）。永久羊膜細胞株において繊維タンパク質を完全に欠くアデノウイルスベクターを生成することも可能である（Ｌｅｇｒａｎｄ（ルグラン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、９０７−９１９、１９９９；Ｖｏｎ  Ｓｅｇｇｅｒｎ（フォン・ゼーゲルン）他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、１６０１−１６０８、１９９９）。
【００６７】
Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する羊膜細胞株の使用は、２９３個の細胞と対比して、いかなる複製適格ベクターの発生も相同的組換えによって起こりえないので、より好ましいにちがいない。遺伝子移入ベクターを生成する羊膜細胞株の使用の局面の好ましい実施例では、この細胞株は、本発明による細胞株である。
【００６８】
治療遺伝子
遺伝子の、特定的には治療遺伝子の産物は、形質転換された羊水細胞、すなわち羊水細胞株において生成されるベクターによってコード化されかつ発現されうるが、たとえば、筋タンパク質、凝固因子、膜タンパク質または細胞周期タンパク質であってもいい。形質転換された羊膜細胞において生成されるベクターによって発現されうるタンパク質の例は、ジストロフィン（Ｈｏｆｆｍａｎ（ホフマン）他、Ｃｅｌｌ  ５１、９１９、１９８７）、因子ＶＩＩＩ（Ｗｉｏｎ（ワイオン）他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７、７２６、１９８５）、嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（アンダーソン）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１、６７９、１９９１）、オルニチントランスカルバミル転移酵素（ＯＴＣ）（村上他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１８４３７、１９９８）、アルファ１−抗トリプシン（Ｆａｇｅｒｈｏｌ（ファーゲルホル）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１１巻、Ｈａｒｒｉｓ（ハリス）編、Ｐｌｅｎｕｍ（プレナム）、ニューヨーク、１ページ、１９８１）である。タンパク質のための遺伝子コーディングを、ゲノムまたはｃＤＮＡバンクからクローンニングすることができる。そのような遺伝子の例は、ジストロフィン遺伝子（Ｌｅｅ（リー）他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、３３４、１９９１）、因子ＶＩＩＩ遺伝子（Ｔｏｏｌｅ（ツール）他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、３４２、１９８４）、ＣＦＴＲ遺伝子（Ｒｏｍｍｅｎｓ（ローマン）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５、１０５９、１９８９；Ｒｉｏｒｄａｎ（リオールダン）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５、１０６６、１９８９）、ＯＴＣ遺伝子（Ｈｏｒｗｉｃｈ（ホーウィッチ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４、１０６６、１９８４）、およびアルファ１−抗トリプシン遺伝子（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ（ルマーチャンド）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９、６４８２、１９９２）。
【００６９】
形質転換された羊膜細胞において生成されうるベクターによって発現される他の遺伝子の例は、腫瘍症を治療するｐ５３遺伝子（Ｗｉｌｌｓ（ウイルス）他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５、１０７９、１９９４；Ｃｌａｙｍａｎ（クレイマン）他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５、１、１９９５）、血管増殖性障害を治療するＲｂ遺伝子（Ｃｈａｎｇ（チャン）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７、５１８、１９９５）、または腫瘍症の治療のための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）型１のチミジンキナーゼ遺伝子である。形質転換された羊膜細胞において生成されるベクターによって発現される遺伝子は、必ずしもタンパク質をコードする必要はない。こうして、たとえば、機能ＲＮＡが発現することが可能である。そのようなＲＮＡの例は、アンチセンスＲＮＡ（Ｍａｇｒａｔｈ（マグラス）、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  腫瘍学年報）５、付録１）、６７−７０  １９９４；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（ミリガン）他、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ニューヨーク科学アカデミー年報）７１６、２２８−２４１、１９９４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ（シュライヤー）、Ｐｈａｒｍａ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ．（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  ａｃｔａ  Ｈｅｌｖｅｓｔｉａｅ）６８、１４５−１５９、１９９４）、および触媒ＲＮＡ（Ｃｅｃｈ（セッシュ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  生化学会報）２１、２２９−２３４、１９９３；Ｃｅｃｈ（セッシュ）、Ｇｅｎｅ  １３５、３３−３６、１９９３；Ｌｏｎｇ（ロング）他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＦＡＳＥＢジャーナル）７、２５−３０、１９９３；Ｒｏｓｉ（ロージ）他、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  薬理学＆薬物療法学）５０、２４５−２５４、１９９１）である。
【００７０】
形質転換された羊膜細胞において生成されるベクターは、治療遺伝子に加えて、ベクターの発現によりよく追従することができるように、いかなるレポーター遺伝子も含む。レポーター遺伝子の例は、先行技術で公知であり、かつたとえば、β―ガラクトシダーゼ遺伝子を含む（Ｆｏｗｌｅｒ（ファウラー）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、１５０７、１９７７）。
【００７１】
形質転換された羊膜細胞において生成されうるベクターは、一つ以上の遺伝子から成ってもいい。そのようなベクターにおいて生成されうる最大数の遺伝子は、特定の遺伝子の取り込み容量、および遺伝子の大きさによって決まる。
【００７２】
形質転換された羊膜細胞において生成されるベクターの治療遺伝子の発現を制御するプロモーターの選択は重要でない。恒常的な、組織特異性のまたは調節可能な活性度を示すウイルスまたは非ウイルスプロモーターを、タンパク質または機能ＲＮＡを発現するために使用することができる。ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ（アンダースソーン）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、８２２２−８２２９、１９６４）を、たとえば、遺伝子の恒常的な発現のために使用することができる。筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターを使用すれば、骨格筋および心筋におけるタンパク質のまたは機能ＲＮＡの組織特異性を発現できる。遺伝子発現を、調節可能なシステムの使用によって、量的にかつ質的に制御することができる（Ｆｕｒｔｈ（ファース）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、９３０２−９３０６、１９９４）。
【００７３】
形質転換された羊膜細胞において生成されうるベクターに、レシピエント細胞内のベクターの挙動に影響を及ぼす遺伝因子を含むことが可能である。そのような因子の例は、ベクターＤＮＡの核ターゲティングを容易にする要素である（Ｈｏｄｇｓｏｎ（ホジソン）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー）１３、２２２−２２５、１９９５）。
【００７４】
このようにして生成されたベクタ−を、生体外でまたは生体内で使用することができる。生体外での遺伝子移入は、遺伝子移入の目的のために、培養中の細胞にまたは身体から取り出された一次細胞にベクターを加えることによって起こる。生体内での遺伝子移入の場合には、ベクター粒子を、形質導入されるべきである組織によってさまざまなやり方で与えることができる。例は、動脈又は静脈血管系への注射、関連組織（たとえば、肝臓、脳、筋肉）への直接注射、関連器官（たとえば、肺または消化管）への滴下注入、または表面上（たとえば、皮膚または膀胱）への直接投与である。
【００７５】
次の図面および例は、発明を、それに制限することなく詳細に説明することを意図している。
【００７６】
図面の説明
図１は、クローニングの概要を示す：図１Ａは、プラスミドＳＴＫ１４６のためのクローニングステップを図式で描いたものである。図１Ｂは、Ｅ１のＲＮＡ、コード（翻訳）領域、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ転写の開始点、およびクローニングにとって重要であるスプライス供与体およびスプライス受容部位ならびにポリアデニル化配列を含む、アデノウイルス型５のゲノムの左末端のほぼ１５％を描いている。スプライス受容部位およびポリアデニル化信号の代わりに、ＳＶ４０の対応する機能が使用されてきたということを除けば、Ａｄ５の塩基対３５１１でのスプライスドナー部位が、プラスミドＳＴＫ１４６のためのクローニングにおいて保持されてきたことは重要である。さらに、Ａｄ５のＥ１Ａプロモーターの代わりに、ＰＧＫプロモーターが使用されてきた。このように、ＳＴＫ１４６は、塩基対５０５−５３２２からのＡｄ５配列を含み、かつこのプラスミドで形質転換された細胞株は、第一または第二世代アデノウイルスベクターにまたはｌｏｘＰヘルパーウイルスに存在するＡｄ５配列を含まない。
【００７７】
図２は、アデノウイルスＥ１機能による形質転換によって羊膜細胞から得られる細胞島（図２Ａおよび図２Ｂ）、および単細胞からクローニングされる細胞株Ｎ５２．Ｅ６（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ２４１６；図２Ｃ）およびＮ５２．Ｆ４（図２Ｄ）を示している。今回、細胞株および単細胞クローンは、それらが通常より小さくかつそれらの成長が接触阻止されないという点で、羊膜細胞と形態学的に異なるということに注目すべきである。
【００７８】
図３は、サザンブロットによって、８個の異なるＥ１形質転換された羊膜細胞株におけるＳＴＫ１４６の組込み状態を示している。
【００７９】
図４は、細胞毎にｂｆｕ（バースト形成単位）に基づいてさまざまなクローンニングされた細胞株において第一世代アデノウイルスベクターを生成すること、およびプラーク形成に基づく適切な細胞株の形質移入効率を、表に列挙して示している。
【００８０】
図５は、８個のクローンニングされた羊膜細胞株におけるＡｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質の発現（ウエスタンブロット）を示している。
【００８１】
図６は、２個のクローンニングされた細胞株Ｎ５２．Ｅ６およびＮ５２．Ｆ４における組換えアデノウイルスベクターの合成の時間経過を示している。図６Ａは、第一世代アデノウイルスベクターの合成を示しており、かつ図６Ｂは、第ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターの合成を示している。
【００８２】
例
１．クローニング
図１は、クローニングの概要を描いている。
【００８３】
ａ）プラスミドＳＴＫ１３６
プラスミドＳＴＫ１３６は、ｐブルースクリプトＫｓＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン社））においてマウスのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（配列番号１；Ａｄｒａ（アドラ）他、Ｇｅｎｅ  ６０、６５−７４、１９８７）を含み、かつ以下のように生成した：
３．５μｇのプラスミドＰＧＫ−ｈＡＡＫ（Ｋａｙ（ケイ）他、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（肝臓学）２１、８１５−８１９、１９９５）を、ＥｃｏＲＶで消化し、かつ１．５％のアガロースゲルの大きさで分画した。求めたＰＧＫプロモーター断片を含む０．５ｋｂの帯（バンド）を、臭化エチジウム中での染色後、切り抜き、かつＤＮＡを電気溶出した。同時に、ｐブルースクリプトＫＳＩＩを、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、かつ遊離ＤＮＡの両末端を、脱リン酸化した。次のフェノール／クロロフォルムの抽出およびエタノール沈殿の後、等モル量のこれらのＤＮＡ断片を、結合しかつ超適格ＸＬ−２青色細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン社））に形質転換した。プラスミドクローンは、制限消化手段を特徴とし、かつそれから結果として生じるプラスミドを、ＳＴＫ１３６と呼ぶ（アイソレート＃６）。
【００８４】
ｂ）プラスミドＳＴＫ１３７
プラスミドＳＴＫ１３７は、３′スプライスを含むＡｄ５の完全なＥ１発現カセットおよびＳＶ４０からのポリアデニル化信号を含み、かつ以下のように生成した：
【００８５】
Ａｄ５配列塩基対５０５−８４１のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）増幅（ＰＣＲ  Ｉ）（配列番号２）
１０ｎｇ（ナノグラム）のプラスミドｐＸＣｌ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ（マイクロビクス社））を、４００ｎｇのオリゴヌクレオチド２７７５９（配列番号３）および２７６３４（配列番号４）の各々、０．２ｍＭ（ミリモル）のｄＮＴＰ、および１．２５ＵのＰｆｕ（プラーク形成単位）ポリメラーゼと共に、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７５で２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．１％のトリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と共に、以下の条件下で増幅した。
【００８６】
Ｉ      ９４度で１０分
ＩＩ    ９４度で１分
５０度で２分
７２度で３分
ＩＩＩ  ７２度で１０分
１５周期でステップＩＩを繰り返す。ＤＮＡを、製造業者が述べたようにＱＩＡ急速ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）精製キット（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン社））を使用して精製し、かつエタノール沈殿した。
【００８７】
ＰＣＲ断片をクローニングするために、２．５μｇのｐブルースクリプトＫＳＩＩを、ＥｃｏＲＶで消化し、かつ遊離ＤＮＡの両末端を、脱リン酸化し、ＰＣＲ断片と、等モル量で結合し、かつＸＬ−２青色細胞に形質転換した。それから結果として生じるプラスミドを、以下＃１と呼ぶ。
【００８８】
Ａｄ５配列塩基対３３２８−３５２２のＰＣＲ増幅（ＰＣＲ  ＩＩ）（配列番号５）：
１０ｎｇのプラスミドｐＸＣｌ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ（マイクロビクス社））を、４００ｎｇのオリゴヌクレオチド２７６３５（配列番号６）および２７６３６（配列番号７）の各々と共に、上で説明した条件下で増幅した。ＰＣＲの後、フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿し、ＥｃｏＲＩで消化し、再びフェノール／クロロフォルムで抽出し、沈殿し、かつ３０μｌのＴＥに溶解した。
【００８９】
３′スプライスおよびＳＶ４０からのポリアデニル化信号の、プラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ塩基対１９７８−２７４９の助けを借りたＰＣＲ増幅（ＰＣＲ  ＩＩＩ）（配列番号８）：
２０ｎｇのプラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ社）、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  Ａｃｃ．Ｎｏ．（ジェンバンク／エンブル社  受入れ番号）：Ｘ６５４３４）を、８００ｎｇのオリゴヌクレオチド２７６３７（配列番号９）および２７６３８（配列番号７）の各々、０．４ｍＭのｄＮＴＰＳ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼと共に、上述した条件下で増幅した。そのＰＣＲの後、ＤＮＡを、フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿し、ＥｃｏＲＩで消化し、再びフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿し、かつ３０μｌのＴＥに溶解した。次に、１０μｌのＰＣＲＩＩおよびＩＩＩからのＤＮＡの各々を、５０μｌの量で結合し、フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿し、かつ１００μｌの量のＢａｍＨＩで消化した。再生したフェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＤＮＡを、事前にＢａｍＨＩで消化しかつ脱リン酸化した等モル量のｐブルースクリプトＫＳＩＩのＤＮＡと結合した。それから結果として生じるプラスミドを、以下＃２９と呼ぶ。さらなるクローニングのために、３．５μｇのプラスミドＤＮＡ＃２９を、ＳａｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、脱リン酸化し、フェノール／クロロフォルムで抽出し、かつエタノール沈殿した。同時に、３．５μｇのｐＸＣｌを、ＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩＩで消化し、かつ２．９ｋｂの断片を、電気泳動で分画し、かつ電気溶出した。等モル量の２個のＤＮＡを、結合しかつＸＬ−２青色細胞に形質転換した。それから結果として生じるプラスミドを、以下＃５と呼ぶ。ＳＴＫ１３７の最後のクローニングのために、プラスミド＃１を、ＨｉｎｃＩＩおよびＢｓｐＥＩで消化しかつ電気詠動で分画し、かつ約３５０の塩基対の断片を電気溶出した。ベクターＤＮＡとして、プラスミド＃５を、ＫｓｐＩ（ＳａｃＩＩのイソ制限酵素）で消化し、その両末端を、Ｔ４ポリメラーゼで満たし、かつフェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿を行った。次に、そのＤＮＡを、ＢｓｐＥＩで消化し、その両末端を脱リン酸化し、かつフェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿を再度行った。２個のＤＮＡを、結合しかつＸＬ−２青色細胞に形質転換した。それから結果として生じるプラスミドを、ＳＴＫ１３７と呼んだ（アイソレート＃３４）。
【００９０】
ｃ）プラスミドＳＴＫ１４６（配列番号１８）
プラスミドＳＴＫ１４６は、マウスのＰＧＫプロモーター、Ａｄ５（塩基対５０５−３５２２）の完全なＥ１領域、および３′スプライス、ならびにＳＶ４０のポリアデニル化信号を含む。
【００９１】
クローニングのために、４μｇのＳＴＫ１３７を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、かつ電気詠動で分画し、かつ３．７ｋｂの断片を電気溶出した。さらに、３．３μｇのＳＴＫ１３６を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化し、フェノール／クロロフォルム抽出し、かつエタノール沈殿した。等モル量の２個のプラスミドを、結合し、かつＸＬ−２青色細胞に形質転換した。それから結果として生じるプラスミドを、ＳＴＫ１３９と呼んだ。ＳＴＫ１３９の最終的な配列分析によると、塩基対２６１３での突然変異が明らかとなった（この点についての番号付けは、Ａｄ５のＤＮＡ配列を参照する）が、それによって、チロシンがアスパラギンアミノ酸と交換された（２６１３ＴＡＣ→ＧＡＣ）。この理由のため、ＳＴＫ１３９における突然変異を含む断片の代わりに、ｐＸＣＬからのＢｓｔＥＩＩ（塩基対１９１５）からＢｇｌＩＩ（塩基対３３２８）までの断片を用いた。ＳＴＫ１３９の、ＢｓｔＥＩＩおよびＢｇｌＩＩによる消化、脱リン酸反応、フェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿、電気泳動による分画、および５．８ｋｂの断片の電気溶出によって、これを行った。ｐＸＣ１を、同様に、ＢｓｔＥＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化しかつ電気泳動で分画し、かつ１．４ｋｂの断片を電気溶出した。連結および形質転換の後、４プラスミドクローンからのＤＮＡを配列決定した；それらの２つは、塩基対２６１３に正しい配列を含んでいた。アイソレート番号２を、完全に配列決定し、かつ以下ＳＴＫ１４６と呼ぶ。
【００９２】
ｄ）ＳＴＫ１４６の配列分析
５００ｎｇのＳＴＫ１４６＃２を、標準条件下で、１０ｐｍｏｌ（ピコモル）の次の配列プライマーで配列決定した：
プライマー                ２８２３１    Ａｄ５  ｎｔ．９０１−９２０
（配列番号１１）
２８２３２  Ａｄ５  ｎｔ．
１３０１−１３２０  （配列番号１２）
２８２３３  Ａｄ５  ｎｔ．
１７０１−１７２０  （配列番号１３）
２８２３４  Ａｄ５  ｎｔ．
２１００−２１１９  （配列番号１４）
２８２３５  Ａｄ５  ｎｔ．
２５００−２５１９  （配列番号１５）
２８２３６  Ａｄ５  ｎｔ．
２８５３−２８７２  （配列番号１６）
２８２３７  Ａｄ５  ｎｔ．
３２４９−３２６８  （配列番号１７）
【００９３】
２．一次羊膜細胞および細胞株の培養
細胞培養試薬、培養液および血清の全てを、ＧＩＢＣＯ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．（ＧＩＢＣＯライフテクノロジー社）から購入した。いくつかの実験における制御として用いた細胞株２９３を、改変されたＥａｇｌｅ（イーグル）の培養液（ＭＥＭ）内で、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、３７度での１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｘ、Ｃａｔ＃１０３７８−０１６）、９５％の湿度および５％のＣＯ2で培養した。新しいＥ１が形質転換された細胞株を、出生前の診断の一部としての羊水穿刺によって羊水から得られた一次胎児細胞を用いて生成した。組織診後、細胞を、プラスチックの培養ビン内に日常的な方法で播き、かつＨａｍ（ハム）のＦ１０培養液（Ｈａｍ（ハム）のＦ１０とＬ−グルタミン、Ｃａｔ＃３１５５０−０２３との栄養混合物）、１０％のＦＣＳ、２％のＵｌｔｒｏｓｅｒ（登録商標）Ｇ、１ｘ抗菌／抗真菌溶液（１００ｘ、Ｃａｔ＃１５２５４−０１２）、２．５μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｉｏｎｅ（登録商標）（アンホテリシン）Ｂ、Ｃａｔ＃１５２９０−０１８）内で培養した。細胞のいくつかは、細胞培養ビンの底に付着し、かつ増殖した。染色体分析にとって十分な細胞は、約２週間後入手可能であった。核型の確立後、数値的にかつ構造的に正常な染色体をもつ羊膜細胞培養液を、細胞株を生成するために使用した。３、６または７週間前の羊水穿刺によって取られた３つの異なる源からの細胞を、さまざまな実験で使用した。使用した栄養培養液は、Ｈａｍ（ハム）のＦ１０培養液、１０％のＦＣＳ、２％のＵｌｔｒｏｓｅｒ（登録商標）Ｃｒ、１ｘ抗菌／抗真菌溶液、２．５μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｉｏｎｅ（登録商標）であった。培養条件は、３７度、９５％の湿度、および５％のＣＯ2であった。形質移入の７日後、羊膜細胞を、Ｈａｍ（ハム）のＦ１０培養液、１０％のＦＣＳ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン内でさらに培養した。単細胞クローンの生成後、これらを、新たな皿に移し、かつさらに、アルファーＭＥＭ内で、１０％のＦＣＳ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシンンで培養した。
【００９４】
３．羊膜細胞の形質移入および形質転換
形質移入のために、羊膜細胞を、細胞培養皿（直径６０ｍｍ、表面積２２．１ｃｍ2）上に、皿毎に２−５×１０5の密度で播き、かつ次の日形質移入した。その形質移入のために、２０μｇのプラスミドＳＴＫ１４６を、ＳｃａＩで消化し、フェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノール沈殿し、２０μｌのＴＥ内で溶解し、これによって０．５μｇ／μｌのＤＮＡ濃度を与えた。初期の実験では、羊膜細胞を、除去の３ないし７週間後、各々が製造業者（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン社））が述べたようなＥｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入キットをもつ５枚の皿内で、以下のように形質移入した：
【００９５】
ＳｃａＩで消化された４μｌのＳＴＫ１４６を、１４６μｌのＥＣ緩衝液と混合した。８μｌのエンハンサーの添加後、その溶液を、短くボルテックスで攪拌し、かつ５分間室温でインキュベート（保温）した。次に、２５μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅを添加し、かつ１０秒間ボルテックスで攪拌した後、さらに１０分間室温でインキュベートした。この間、培養液を、細胞から慎重に吸引し、かつその代わりに４ｍｌの新鮮な栄養培養液を用いた（上記第２章を参照されたい）。インキュベーションが完了した後、形質移入混合物を、１ｍｌの新鮮な栄養培養液と混合し、かつ慎重に滴下式で細胞に加えた。細胞を、さらに上述したように培養した。形質移入の７日後、各皿の細胞を、より大きい皿（直径１５０ｍｍ、表面積１４７．８ｃｍ2）に移した。培養液を慎重に吸引することによってこれを行い、かつ細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、トリプシン内で分離し、かつ第２章で述べたようにさらに新しい皿に移しかつ培養した。形質移入の１８ないし２２日後、クローン細胞島は、はっきりと見えるようになり、かつ羊水細胞から形態学的にはっきりと区別された（図２Ａ、図２Ｂ）。形質転換されていない羊膜細胞培養液内の主な比率は、より大きな細胞からなり、それらの細胞は、それらの成長の接触阻止を示している。形質転換された単細胞コロニーにおける細胞は、はるかに小さく、はるかに迅速に成長し、かつそれらの成長の接触阻止を示していない。それらは、一緒にぎっしり入っているより小さい細胞からなる細胞島として成長し、かつ光学顕微鏡のもとでは明白で、かつ難なく識別されうる。これらの細胞島を、選択しかつ上で述べた培養液を含む新しい皿（直径６０ｍｍ）に移した。さらに成長した後、細胞株を、１４７．８ｃｍ2の細胞培養皿に移し、かつさらに第２章のもとで述べたように培養した。１４７．８ｃｍ2の細胞培養皿への第一の移入後、細胞継代を計数した。まず第一に、除去の３および７週間後形質移入された細胞からの約４０個の細胞クローンをさらに培養した。その後、すなわち、長い培養後、細胞クロ−ンのいくつかの形態が急激に変化し、かつそれらは、それらの成長特性において不安定性を示した。更なる実験を、８個の形態学的に安定した細胞株の更なる培養および分析に制限した。これらを、以下のように呼ぶ。ＧＳ．Ａ５５（除去の３週間後形質移入された羊膜細胞から生成される）、ＧＳ．Ｎ２１、ＧＳ．Ｎ２４、ＧＳ．Ｎ２７、ＧＳ．Ｎ４９、ＧＳ．Ｎ５１、ＧＳ．Ｎ５２、ＧＳ．Ｎ５３（除去の７週間後形質移入された羊膜細胞から生成された）。
【００９６】
第１の継代中、細胞クローンの全ては、比較できる形態を示したが、これは次の継代によって変化した。このように、たとえばいくつかの細胞クローンは、非常に丸くなった形状をとり、かつ更なる継代の後、それらはもはや粘着性ではなくなった。他の細胞クローンは、広範な空胞化を示したが、これはそれらの成長に何ら影響を及ぼさなかったように見えた。単細胞クローニングの後、細胞株の全ては、均一な形態を示し、かつたとえばＮ５２．ＥＧおよびＮ５２．Ｆ４は、上皮性の様相を呈した。それらは、それらの成長速度および細胞密度が２９３個の細胞に匹敵した。
【００９７】
４．形質転換効率
Ｅ１機能による形質転換効率をより正確に決定するために、各々が２−５×１０5の細胞を含む７枚の新しい皿を、第３章で述べたように形質移入した。細胞を、形質移入のわずか２４時間後、大きさが１４７．８ｃｍ2の皿へ移し、かつ５日間Ｈａｍ（ハム）のＦ−１０培養液、１０％のウシ胎児血清、２％のＵｌｔｒｏｓｅｒ（登録商標）Ｇ、１ｘ抗菌／抗真菌溶液、２．５μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｉｏｎ内で、かつさらに２５日間Ｈａｍ（ハム）の培養液、１０％ウシ胎児血清、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン溶液内でさらに培養した。形質移入されなかった細胞の入った皿を、制御と同じ条件下で培養した。この間、単一形質転換事象から結果として生じる形態学的にはっきりと区別可能な（図２Ａ、図２Ｂを参照されたい）コロニーを計数した。単細胞クローンを、形質移入されなかった制御皿から離れた全ての細胞培養皿上で計数することができた。平均して、板毎に４個の細胞クローンがあり、それらは０．５−１×１０5の細胞において１の形質転換効率に対応していた。
【００９８】
５．単細胞クローニング
すでに述べたように、細胞株のいくつかは、異なる形態学的特徴を示したが、このことが最高１０個までの単細胞株が各細胞株から作られた理由である。個々の細胞株のための継代は、これらの場合に異なった：ＧＳ．Ａ５５：Ｐ１７、ＧＳ．Ｎ２１：Ｐ２４、ＧＳ．Ｎ２４：Ｐ２０、ＧＳ．Ｎ２７：Ｐ１９、ＧＳ．Ｎ４９：Ｐ２１、ＧＳ．Ｎ５１：Ｐ３９、ＧＳ．Ｎ５２：Ｐ２２、ＧＳ．Ｎ５３：Ｐ２０．この目的のために、細胞を、細胞培養皿から分離し、かつ５×１０6個／ｍｌの細胞の濃度で、栄養培養液内で１：１０００、１：５００００および１：５０００００に希釈した。全ての希釈液からの１００μｌの細胞を、９６穴板上に播き、かつ単細胞から結果として明白に生じた細胞クローンを、さらに培養した。図２Ｃは、細胞株ＧＳ．Ｎ５２．Ｅ６（ＤＳＭＺ番号）を示し、かつ図２Ｄは、細胞株ＧＳ．Ｎ５２．Ｆ４を示した；両方の細胞クローンは、本来の細胞株ＧＳ．Ｎ５２に由来する。
【００９９】
６．Ｅ１細胞株の特徴
ａ）サザンブロット分析
サザンブロット分析を、Ｅ１領域の細胞株への組込み状態を調査するために行った。これを、８個のＥ１羊水クローンの全てからゲノムのＤＮＡを単離することによって行い（第５章を参照されたい）、かつ５μｇの各Ｅ１羊水クローンを、ＥｃｏＲＶで消化し、電気泳動で分画し、かつナイロン膜に移入した。ＥｃｏＲＶは、Ｅ１発現カセット内でいったん切れる。放射標識されたＳＴＫ１４６のＤＮＡとのハイブリッド形成は、全てのクローン内のＳＴＫ１４６の１−２枚のコピー（複写）の組込みを確認した。図３は、Ｅ１細胞クローン内の組込みパターンを示している。主として、全てのクローンにとって明らかな２個の高分子量帯があり、このことから、ただ一枚のコピーが組込まれたことがわかる。細胞クローンＧＳ．Ｎ２４およびＧＳ．Ｎ５２の各々は、比較的強い強度をもつ付加的な帯を示し、このことから、ＳＴＫ１４６のタンデム型のコピーが組込まれたことがわかるだろう。細胞クローンのどれについても、ＳｃａＩおよびＥｃｏＲＶで消化されたＳＴＫ１４６より小さい帯がなく、このことは、全ての組込まれたものが完全に存在しかつ欠失されなかったことを示唆していた。
【０１００】
ｂ）組換えアデノウイルスの生成
単細胞クローニング後、細胞クローンを、それらの組換えアデノウイルスを生成する能力について検査した。約７０％の集密的な２４穴板において、各細胞株の３−５個の単細胞クローンを、約５ＭＯＩ（感染効率）のＡｄβｇａｌ（組換え第1世代アデノウイルスベクター）に感染させることによって、これを１度行った。感染の４８時間後、細胞を、３回凍結および解凍することによって溶解し、かつ生成したＡｄβｇａｌの量を、２９３個の細胞を感染させかつ続いてそれらの細胞を染色することによって（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ（マクレガー）他、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（遺伝子移入および発現プロトコル）」、Ｍｕｒｒａｙ（ムーレイ）編、Ｈｕｍａｎａ（ヒュマ−ナ）、Ｃｌｉｆｔｏｎ（クリフトン）、ＮＪ、７巻、２１７−２３５ページ、（１９９１））、β―ガラクトシダーゼ生成を検出するために分析した。この方法では、細胞の数、したがって使用したウイルスの量は、異なる細胞クローンにおいて、それらの大きさおよび成長速度のために異なることがあるので、組換えアデノウイルスをほぼ生成することができる。この第1の検査で最も大きな収率を与えた細胞クローンを、さらなる実験においてより正確に分析した。約３×１０7個の細胞を３枚の皿（直径１００ｍｍ、表面積６０ｃｍ2）上に播くことによって、これを行った。細胞を、次の日に計数し、かつ求めた細胞の数に基づき、厳密には５ＭＯＩのＡｄβｇａｌに感染させた。感染の48時間後、細胞を、収集し、かつ３回凍結および解凍することによって溶解し、かつ生成したＡｄβｇａｌの量を、２９３個の細胞を感染させかつ続いて染色することによって分析した。その結果を、図４に描く。
【０１０１】
ｃ）形質移入効率
クローニングされた細胞株のいくつかを、プラーク形成について検査した、リン酸カルシウム法によって、ほぼ７０％の周密的な細胞培養皿（直径６０ｍｍ）に、２μｇの感染性のプラスミドＧＳ６６を形質移入することによって、これを行った。プラスミドＧＳ６６は、ヌクレオチド４４０からヌクレオチド３５２３までのＥ１領域に欠失がある完全なアデノウイルスゲノムを含む。アデノウイルス末端反復配列（ＩＴＲ）を、このプラスミドにおいて、ＳｗａＩ制限切断部位によってフランキングし（隣接させ）、それゆえ感染性のウイルスおよびプラークを、ＳｗａＩが消化されたプラスミドの形質移入後生成することができる。形質移入の約２４時間後、細胞を、約１０ｍｌのＭＥＭ（最小必須培養液）、１％のアガロース、０．５ｘペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５％の酵母エキスで覆った。３７度、９５％の湿度、５％のＣＯ2で約1週間インキュベーションした後、プラークは肉眼で見えた。図４は、各場合の、２つの別々の形質移入について平均化される、計数したプラークの数を示している。
【０１０２】
ｄ）Ａｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ機能の発現
クローニングされた細胞株におけるＡｄ５−Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−２１ｋＤのタンパク質の発現を、単クローン抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって検出した。
【０１０３】
細胞を、ＰＢＳ／１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）内の細胞培養物（直径１０ｃｍ）から注意深く分離し、ペレットの形（小球形）にし、かつ１５０μｌの５０ｍＭのｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ＰＨ８）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ（ネプツニウム）４０、４ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコールビスアミノエチルエーテル四酢酸）、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、５％のグリセロール中で溶解した。細胞を、さらなるＤｏｕｎｃｅ粉砕によって１０分間１３０００ｒｐｍで下方へ遠心分離し、かつ上澄みでのタンパク質濃度を、タンパク質決定キットを用いて決定した（ＢＩＯＲＡＤ（バイオラド社）、微量検定法手順）。１０μｇのタンパク質を、１２％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル上で分画し、ニトロセルロース膜へ移し（Ｈｙｂｏｎｄ（ハイボンド）  ＥＣＬ（超クロム親和性細胞様）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社））、かつ抗―ＥｌＡまたは抗―ＥｌＢの  ２１ｋＤ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カルバイオケム社）、希釈１：３００）と共にインキュベートした。次の日、ブロットを、洗浄し、かつ西洋わさびペルオキシダーゼが結合される第２の抗マウス抗体（Ｅ１Ａ）または抗ラット抗体（Ｅ１Ｂ）とハイブリッド形成した。西洋わさびペルオキシダーゼ反応を、等しい容量の増強溶液1および２（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社））のインキュベーションによって開始し、かつそれによって生じた光化学反応を、Ｘ線フィルムへ短時間露光することによって可視化した。図５は、ウエスタンブロット分析の結果を示している。
【０１０４】
ｅ）大ＤＮＡ容量の組換え第一世代アデノウイルスベクターの合成の時間経過  クローニングされた細胞株Ｎ５２．Ｅ６およびＮ５２．Ｆ４は、上で述べた実験において組換え第1世代アデノウイルスベクターの最も高い収率を示した。時間経過についてのさらなる知識は、特にこれらの細胞が縣濁培養液に適合し、かつ感染の成功を細胞変性効果によって追従することができなかった場合には、アデノウイルスベクターの最適な生成にとって重要である。この分析のために、各々が３×１０6個の細胞が入った数枚の皿（直径６ｃｍ）を、５ＭＯＩのＡｄβｇａｌで感染し、かつ感染後規定された時間に収集した。組換えアデノウイルスの収率を、２９３個の細胞を感染させ、染色し、かつ青色細胞を計数することによって再び決定した（図６Ａ）。
【０１０５】
大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターを生成する新しい細胞株を使用することも将来意図している（上記を参照されたい）。これらのアデノウイルスベクターの生成は、輸送中の溶菌感染周期にわたり欠失された機能およびタンパク質を供給するヘルパーウイルスを必要としている。これらのヘルパーウイルスのパッケージング信号は、ｌｏｘＰ認識配列、および感染すると細胞株によって発現されるＣｒｅリコンビナーゼの助けで欠失される。よって、新しいＥ１が形質転換された細胞株は、Ｃｒｅを発現するプラスミドを形質移入され、かつリコンビナーゼは、安定して発現されることを将来意図している。
【０１０６】
予備実験において、新しいＥ１羊膜細胞も、大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターを生成することができるかどうか、かつ生成動力学および生成されたベクターの量が、既存のＣｒｅを発現する２９３個の細胞で達成されたものに対応するかどうか検査されてきた。この目的のために、各々に細胞株Ｎ５２．Ｅ６およびＮ５２．Ｆ４の３×１０6個の細胞が入った数枚の皿を、５ＭＯＩのｌｏｘＰヘルパーウイルスおよび大ＤＮＡ容量の１０ＭＯＩのＡｄＧＳ４６（β−ｇａｌを発現するアデノウイルスベクター）に感染させ、かつ感染後規定された時に収集した。大ＤＮＡ容量のβ−ｇａｌを発現するアデノウイルスベクターの収率を、２９３個の細胞を感染させ、染色し、かつ青色細胞を計数することによって再び決定した（図６）。羊膜細胞で合成された大ＤＮＡ容量のアデノウイルスベクターの量は、Ｃｒｅを発現する２９３個の細胞（データは図示せず）においても生成されたものに対応する。
【０１０７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  プラスミドＳＴＫ１４６のためのクローニングステップを図式で描いたものである。
【図１Ｂ】  Ｅ１のＲＮＡ、コード（翻訳）領域、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ転写の開始点、およびクローニングにとって重要であるスプライス供与体およびスプライス受容部位ならびにポリアデニル化配列を含む、アデノウイルス型５のゲノムの左末端のほぼ１５％を描いている。
【図２】  アデノウイルスＥ１機能による形質転換によって羊膜細胞から得られる細胞島（図２Ａおよび図２Ｂ）、および単細胞からクローニングされる細胞株Ｎ５２．Ｅ６（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ２４１６；図２Ｃ）およびＮ５２．Ｆ４（図２Ｄ）を示している。
【図３】  サザンブロットによって、８個の異なるＥ１形質転換された羊膜細胞株におけるＳＴＫ１４６の組込み状態を示している。
【図４】  細胞毎にｂｆｕ（バースト形成単位）に基づいてさまざまなクローンニングされた細胞株において第一世代アデノウイルスベクターを生成すること、およびプラーク形成に基づく適切な細胞株の形質移入効率を、表に列挙して示している。
【図５】  ８個のクローンニングされた羊膜細胞株におけるＡｄ５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質の発現（ウエスタンブロット）を示している。
【図６】  ２個のクローンニングされた細胞株Ｎ５２．Ｅ６およびＮ５２．Ｆ４における組換えアデノウイルスベクターの合成の時間経過を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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