(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物花粉アレルギー患者由来のＩｇＥと特異的に反応するポリペプチドをコードする、配列番号１に記載のオオアワガエリからのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １３のヌクレオチド配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１に記載のオオアワガエリからのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １３のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡ分子。
【請求項３】
発現制御配列に機能的に結合した請求項１に記載の、オオアワガエリからのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １３のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子からなる、組換えＤＮＡ発現ベクターまたはクローニングシステム。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸によってコードされるオオアワガエリからの単離された天然のＰｈｌ  ｐ  １３アレルゲン。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸によってコードされ、イネ科植物花粉アレルギー患者由来のＩｇＥと特異的に反応する組換えポリペプチド。
【請求項６】
イネ科植物花粉アレルギー患者由来のＩｇＥと特異的に反応するポリペプチドの製造方法であって、請求項３に記載の発現ベクターによって形質転換した原核細胞または真核細胞の培養、および該培養物からの対応するタンパク質またはポリペプチドの単離による、前記製造方法。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリペプチドを用いた、インビトロでの花粉アレルギーの分析方法。
【請求項８】
花粉アレルギーであるヒトまたは動物の治療処置のための、請求項４または５に記載のイネ科植物花粉アレルギー患者由来のＩｇＥと特異的に反応するポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項９】
花粉アレルギーであるヒトまたは動物の処置のための医薬の製造のための、請求項４または５に記載のイネ科植物花粉アレルギー患者由来のＩｇＥと特異的に反応するポリペプチドの使用。
【請求項１０】
花粉アレルギーであるヒトまたは動物のＤＮＡワクチン接種のための医薬の製造のための、配列番号１に記載のオオアワガエリからのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １３のヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の構築物の使用。
【請求項１１】
花粉アレルギーであるヒトまたは動物のＤＮＡワクチン接種のための医薬の製造のための、配列番号１に記載のオオアワガエリからのアレルゲンＰｈｌ  ｐ  １３のヌクレオチド配列と免疫刺激ＤＮＡフラグメントとを含む請求項３に記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、イネ科植物花粉アレルゲンおよびこれをコードする組換えＤＮＡ分子の同定および特徴づけに関する。オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉は、天然の原料として作用する。本発明はまた、フラグメント、部分的配列および突然変異体をも包含する。組換えＤＮＡ分子および誘導されたポリペプチド、フラグメントまたは変種を、花粉アレルギー疾患の療法に用いることができる。さらに、組換え方法により産生されたタンパク質およびフラグメントを、花粉アレルギーの診断に用いることができる。
【０００２】
１型アレルギーは、世界中で重要である。工業化された国の人口の２０％までが、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病訴に苦しんでいる。これらのアレルギーは、空気中に存在するアレルゲン（エアロアレルゲン(aeroallergen)）により生じ、これは、植物花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの種々のソースにより放出される。これらの１型アレルギー患者の４０％までがまた、イネ科植物花粉の場合において特異的なＩｇＥ反応性を示す(Friedhoff et al., 1986, J Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201)。
【０００３】
１型アレルギーを誘発する物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介しての摂取の後に、これらのアレルゲンは、感化されたヒト中の肥満細胞の表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子が、アレルゲンを介して互いに結合した場合には、この結果、エフェクター細胞によりメディエイター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインが放出され、従って対応する臨床的症状が発生する。
【０００４】
あるアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有するアレルギー患者の相対的頻度に依存して、メジャーアレルゲンとマイナーアレルゲンとの間に区別をする。チモシー（オオアワガエリ）の場合において、Ｐｈｌ  ｐ  １(Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796)、Ｐｈｌ  ｐ  ５(Matthiesen and Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen et al., 1992)、Ｐｈｌ  ｐ  ６(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54)およびＰｈｌ  ｐ  ２／３(Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), 299-304)が、これまで、メジャーアレルゲンとして特徴づけられ、Ｐｈｌ  ｐ  ４(Loewenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62)並びにホソムギ(Lolium perenne)からの群１０および１１(Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin, Immunol. 80, 229-235)が、マイナーアレルゲンとして特徴づけられた。
【０００５】
本発明に関して、アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ４は、特に重要である。その理由は、これが、約５５ｋＤａ(Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98 (1), 189-98)の、新規なアレルゲンと類似する分子量を有し、従って本発明において生成したアレルゲンに最も容易に適合するが、免疫学的および生化学的意味において顕著に異なるからである。前述の他のアレルゲンとは対照的に、Ｐｈｌ  ｐ  ４は、ゲノム配列または転写（ｃＤＮＡ）配列が未だ同定されていない唯一のものである。配列データは、特に、Ｐｈｌ  ｐ  １(Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5), 987-994)、Ｐｈｌ  ｐ  ５(Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151(9), 4773-4781)、Ｐｈｌ  ｐ  ６(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59)およびＰｈｌ  ｐ  ２(Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), 299-304)について入手できる。ｃＤＮＡ配列の補助により、診断および療法に用いることができる組換えアレルゲンを得ることができる(ScheinerおよびKreft, 1995, Allergy 50, 384-391)。
【０００６】
アレルギーの有効な治療処置のための古典的な方法は、特異的免疫療法または減感作である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4), 558-562)。これらの方法において、天然のアレルゲン抽出物を、患者に、増大する用量で皮下に注射する。しかし、この方法は、アレルギー反応またはさらにはアナフィラキシーショックの危険を伴う。これらの危険を最小にするために、アレルゴイド(allergoid)の形態の新規な製剤が用いられている。これらは、未処理抽出物と比較して、ＩｇＥ反応性が顕著に低下したが、Ｔ細胞反応性が同一である、化学的に修正されたアレルゲン抽出物である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382)。
【０００７】
さらに大きい程度の療法の最適化は、組換え方法により産生されるアレルゲンを用いて可能である。所望により個別の患者に整合させた組換え方法により産生された高純度のアレルゲンの規定されたカクテルは、天然のアレルゲン源からの抽出物に取って代わる。その理由は、後者が、種々のアレルゲンに加えて、比較的大きい数の免疫原性であるが非アレルギー性の随伴タンパク質を含むからである。発現生成物での安全な減感作を生じることができる実際的な見通しは、ＩｇＥエピトープが、療法に必須であるＴ細胞エピトープを損なわずに特異的に除去される、特異的に突然変異した組換えアレルゲンにより提供される(Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414)。
【０００８】
治療方法によりアレルギー患者中に分布したＴｈ細胞バランスに影響する他の可能性は、関連するアレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡでの処理である。免疫応答に対するアレルゲン特異性効果の最初の実験的確認は、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により、齧歯動物において得られた(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2(5), 540-544)。
【０００９】
本発明は、アレルギー性疾患、特に花粉症のインビトロおよびインビボ診断において有利に用いることができる。このために、クローニングした核酸を、発現ベクター中で連結し、この構築物を、適切な細胞のタイプにおいて発現させる。生化学的精製の後に、この組換えアレルゲンは、確立された方法によるＩｇＥ抗体の除去に有用である。一方、本発明はまた、特定の免疫療法のための組換えアレルゲン含有または核酸含有製剤における必須の成分として用いることができる。ここで、多くの可能性が出現する。第１に、修飾されていない一次構造を有するタンパク質は、製剤の構成成分であることができる。第２に、全体の分子のＩｇＥエピトープの特異的除去またはＴ細胞エピトープをコードする個別のフラグメントの生成により、低アレルゲン(hypoallergenic)（アレルゴイド）形態を、本発明において、療法に用いて、望まない副作用を回避することができる。最後に、核酸自体により、これが真核発現ベクターに連結された場合には、直接用いられた際に、治療的意味でアレルギー免疫状態を修正する製剤が得られる。
【００１０】
本発明は、核酸配列（図１）からなり、アレルゲンをコードする、組換えＤＮＡ分子に関する。イネ科、例えば特にオオアワガエリ、ホソムギ、カモガヤ(Dactylis glomerata)、ナガハグサ(Poa pratensis)、ギョウギシバ(Cynodon dactylon)、シラゲガヤ(Holcus lanatus)の花粉顆粒は、天然の原料として作用する。
【００１１】
天然のアレルゲンを精製し、単離した後、Ｎ末端タンパク質配列決定を行う。これから推定される核酸配列に基づいて、プライマーを産生する。このプライマーの補助により、対応するｃＤＮＡを、花粉のｃＤＮＡ集団から、ＰＣＲにより得、クローニングし、特徴づけした。フラグメントおよび部分的配列を、アレルゲンをコードするこのＤＮＡ分子から、本発明に従って産生した。
【００１２】
組換えＤＮＡ分子またはフラグメントおよび部分的配列を、細胞システム中の適切な発現ベクターにより発現させた後に、アレルゲンまたは低アレルゲン変種またはフラグメントを精製した。
【００１３】
チモシー花粉からの天然のアレルゲンの精製を、２段階プロセスにおいて行った。花粉の水性抽出の後、得られた抽出物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、２つのフラクション（カラムを通過したフラクションおよび溶出液）に分離した。カラムを通過したフラクションは、３種のアレルゲン、Ｐｈｌ  ｐ  １（３０〜３５ｋＤａ）、Ｐｈｌ  ｐ  ２／３（１１〜１４ｋＤａ）および未知のアレルゲン（５５〜６０ｋＤａ）を含んでいた。これらのタンパク質を、互いにスーパーデックス(Superdex)７５を用いたゲル濾過により分離した。
【００１４】
この現在まで未知のアレルゲンPhl p 13（作業名称ｐ５５）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離除去し、その後ＰＶＤＦ膜上にブロッティングし、精密に定められたフラクションを単離した。Ｎ末端アミノ酸配列を、このPhl p 13（ｐ５５)分子から、エドマン分解により決定した（図２）。
【００１５】
Phl p 13（ｐ５５)の対応するｃＤＮＡの産生およびクローニングのために、Ｎ末端配列（図３）に基づく特定のＤＮＡプライマー（２１量体）を、本発明に従って構成した。用いた第２のプライマーは、逆転写に用いるオリゴｄＴプライマー中に局在したアンカー配列であった。ＰＣＲ反応を、オオアワガエリ花粉からの代表的ｍＲＮＡ集団から産生したｃＤＮＡおよび本発明のプライマーおよびアンカープライマーを用いて厳密な条件下で行った。ＰＣＲ反応の分析的ゲル電気泳動において、１．６５ｋｂの大きさを有する増幅したＤＮＡを同定した。この増幅したＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクターに連結し、うまく形質転換した。２種の異なるクローンからの挿入体の配列決定により、同一の配列が得られた。
【００１６】
この一次増幅したＤＮＡにおいて、１４９２ｂｐの読み取り枠（ＯＲＦ）（図１参照）が同定された。
【００１７】
この核酸から対応する組換えタンパク質（図４）を産生するために、制限酵素による発現ベクターｐＰｒｏＥｘ  ＨｔｂへのｐＣＲ２．１ベクターの再クローニングを、先ず行った。発現および発現生成物の生化学的精製の後に、開発されたタンパク質のアレルゲン性性質の多くの分析を行った。すべての分析、例えばウエスタンブロットおよびドットブロットにおいて、組換えタンパク質は、イネ科植物花粉アレルギーの臨床的症状を診断した患者からのＩｇＥと特異的に反応した。用いた対照は、天然のPhl p 13（ｐ５５)であった。従って、組換えタンパク質は、明らかにアレルゲンである。従って、この発現生成物は、イネ科植物花粉アレルギー患者の高度に特異的な改善された診断に作用する。
【００１８】
改善された治療的使用のための低アレルゲン変種を産生することを意図して、定められたフラグメントおよび部分的配列の組み合わせを、発現ベクターにおいてクローニングした核酸から出発して、本発明に従って開発した。さらに、部位特異的点変異を、主にシステインをコードするトリプレットにおいて導入した。従って、本発明のこの部分は、減少したかまたは欠乏したＩｇＥ反応性による診断の目的のために開発された発明から区別される。従って、減少したののために明らかに低いかまたは欠乏した副作用を有する製剤は、減感作のために有用である。低アレルゲンタンパク質変種をコードする核酸またはPhl p 13（ｐ５５)をコードする修飾されていない核酸を、ヒト発現ベクターと連結する場合には、これらの製剤を、同様に、特定の免疫療法用の製剤として用いることができる。
【００１９】
従って、本発明は、以下の通りである。
ａ）アレルゲンとして作用し、好ましくはイネ科(Gramineae(Poaceae))および単子葉植物により表現されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えＤＮＡ分子；
ｂ）オオアワガエリ由来のヌクレオチド配列を有する、示したＤＮＡ分子；
ｃ）図１に示す、示したＤＮＡ分子のヌクレオチド配列；
ｄ）図１において定義した、最後に述べたヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡ分子；
ｅ）ｃ）またはｄ）に記載のヌクレオチド配列中に存在する部分的配列および部分的配列の組み合わせ；
【００２０】
ｆ）個別のコドンの特定的突然変異および除去または付加により修飾された、ヌクレオチド配列ａ）〜ｄ）を含むＤＮＡ分子；
ｇ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｃ）に記載のヌクレオチド配列；
ｈ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｄ）に記載のヌクレオチド配列；
ｉ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｅ）に記載のヌクレオチド配列；
【００２１】
ｊ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｆ）に記載のヌクレオチド配列；
ｋ）発現制御配列に機能的に結合したａ）〜ｄ）において定義した組換えＤＮＡ分子からなる、組換えＤＮＡ発現ベクターまたはクローニングシステム；
ｌ）ｃ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｍ）ｄ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｎ）ｅ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｏ）ｆ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｐ）ｇ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
【００２２】
ｑ）ｈ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｒ）ｉ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｓ）ｊ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；
ｔ）請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換した原核細胞または真核細胞の培養、および培養物からの対応するタンパク質またはポリペプチドの単離により、ポリペプチド、フラグメントまたはこれらの誘導体を産生する方法；
ｕ）ｌ）〜ｎ）に記載のポリペプチドを用いるインビボまたはインビトロでの花粉アレルギーの診断方法；
【００２３】
ｖ）花粉アレルギーであるヒトまたは動物を治療処置するための、ｌ）〜ｔ）に記載のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を含む医薬製剤；
ｗ）ｖ）において定義した医薬製剤を用いる、花粉アレルギーであるヒトまたは動物の治療方法；
ｘ）ｋ）において定義した構成物でのＤＮＡワクチン接種による、花粉アレルギーの治療方法；
ｙ）免疫刺激(immunostimulatory)ＤＮＡフラグメントを含むｋ）において定義したベクターでＤＮＡワクチン接種することによる、花粉アレルギーの治療方法。
【００２４】
従って、本発明は、アレルゲン成分を分解する患者特異的感作スペクトルの同定の一部としてインビトロ診断を改善する作用を有する。本発明は、同様に、イネ科植物花粉アレルギー患者の特異的免疫療法のための顕著に改善された製剤を製造する作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】Phl p 13（ｐ５５)の核酸配列
【図２】Ｎ末端アミノ酸配列  Phl p 13（ｐ５５)
【図３】Phl p 13（ｐ５５)特異的プライマー
【図４】推定されたアミノ酸配列
【図１】
0004588888.tif 000002
【図２】
0004588888.tif 000003
【図３】
0004588888.tif 000004
【図４】
0004588888.tif 000005