(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とを備え、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激する融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインがデカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えることを特徴とする請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
操作可能な状態でプロモータに結合されている核酸配列であって、この核酸配列がコラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とをコードしており、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激することを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
前記発現ベクターが、レトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターを備えることを特徴とする宿主細胞。
【請求項７】
コラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とを備える融合ポリペプチドを生産する方法であって、前記核酸配列の発現を許容する条件下で請求項６に記載の宿主細胞を育てて、前記融合ポリペプチドを回収することを特徴とする融合ポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、原核細胞であることを特徴とする請求項７に記載の融合ポリペプチドの生産方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする請求項７に記載の融合ポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】
コラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とを備え、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激する融合ポリペプチドを備えた組成物。
【請求項１１】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインが、デカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
コラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とを備えた融合ポリペプチドをコードした核酸配列を備え、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激する発現ベクターを備えた組成物。
【請求項１４】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインが、デカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）血管内皮細胞を備える単離された組織と（ｂ）血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドとを備える組織移植片であって、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激する組織移植片。
【請求項１７】
前記組織が、血管組織であることを特徴とする請求項１６に記載の組織移植片。
【請求項１８】
前記組織が、血管であることを特徴とする請求項１６に記載の組織移植片。
【請求項１９】
前記組織が、皮膚であることを特徴とする請求項１６に記載の組織移植片。
【請求項２０】
前記組織が、器官であることを特徴とする請求項１６の組織移植片。
【請求項２１】
前記器官が、心臓であることを特徴とする請求項２０に記載の組織移植片。
【請求項２２】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項１６に記載の組織移植片。
【請求項２３】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインが、デカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えるものであることを特徴とする請求項２２に記載の組織移植片。
【請求項２４】
単離された組織と、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドの効果的量とを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で接触する工程を含む組織移植片を準備する方法であって、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激することを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記組織が、血管組織であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織が、血管であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織が、皮膚であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が、器官であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記器官が、心臓であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインが、デカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
移植片を活性化させる方法であって、以下の工程を含む方法：単離された組織と、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸配列（この核酸配列は前記移植片を活性化するように、前記単離された組織において発現されたものである）の効果的量とを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で接触させる工程を含み、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激することを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記核酸配列は、操作可能な状態でプロモータに結合されているものであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸配列が、発現ベクター内に組み込まれていることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記組織が、血管組織であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織が、血管であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記組織が、皮膚であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織が、器官であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記器官が、心臓であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記コラーゲン結合ドメインが、フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記フォンビルブラント因子のコラーゲン結合ドメインが、デカペプチドＷＲＥＰＳＦＭＡＬＳ（配列番号１）を備えることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
薬学的に許容可能なキャリアによって、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドを備える製薬組成物であって、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激することを特徴とする製薬組成物。
【請求項４３】
薬学的に許容可能なキャリアによって、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸を備える製薬組成物であって、前記血管形成調整剤が血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）であり、かつ前記血管形成調整剤が内皮細胞の増殖を刺激することを特徴とする製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は医薬品剤のターゲッティングに関するものであり、特に所望の組織へ医薬品剤を向かわせるために、コラーゲン結合部位を使用することを特徴とする。
【０００２】
【従来の技術】
【発明の背景】
虚血性の冠状動脈疾患は、米国での羅病率及び死亡率の主要な原因のひとつのである。現在の治療手段には、血管形成術、ステントまたは冠状動脈バイパスによるリスク因子の緩和、心筋酸素消費量の低減および冠状血管動脈系血流の局部的回復がある。これらの治療選択肢は多くの場合に十分には提供されておらず、外科的処置の候補者にさえなれない患者が大勢いる。いくつかの試みが、移植や、既存の血管を広げるための調整によって、虚血心筋に冠状血管動脈の血流量供給を向上するために行われた。
【０００３】
血管形成治療は、心筋内の側枝血管（collateral blood vessels）の形成に利用できる処理である。「血管形成」という単語は、新しい血管の成長を伴う組織血管系形成の過程である。血管形成は、新しい血管系の形成と編成を最終結果とする内皮性細胞および平滑筋細胞の増殖および移動を伴った細胞間マトリックスの分解に関連した複雑な過程である（Folkman, J., and Klagsbrun, M., Science 235:442-7, 1987）。血管形成は、普通以下の３種類の機構のひとつを経て生じる：(1)血管新生（血管内皮細胞が新しい血管の発生を開始している血管より先に移動して出て行く）、(2)血管形成（血管が前駆細胞から新たに発生する）、(3)血管拡大（既存の小さい血管の径が大きくなることにより、大きい血管となる）（Blood, C.H., and Zetter, B.R., Biochem. Biophys. Acta. 1032:89-118, 1990)。血管形成は、通常の新生児成長過程において、および黄体成長周期間の女性生殖器系において重要な過程である（see Moses, M.A., et al., Science 248: 1408-10, 1990)。通常の状態の下で、新しい血管形成や既存の血管の再構築に関連した過程は、自己制御式の過程であり、特定のタイプの細胞の拡がりは制御されており、かつ協調されている。血管形成は、創傷治癒に関連しており、また組織炎症、関節炎、喘息、腫瘍成長、糖尿病性網膜症およびその他の状態を含んでいる数多くの臨床疾患の発病学にも関連している。血管形成と関連する臨床症状は、血管形成不全（Folkman and Klagsbrun, 1987, 前出）と称する。
【０００４】
「成長因子」という単語は、当初は細胞の成長を促進する物質のことを言う単語だった。成長に見せるように作用する分子（分裂促進物質）だけでなく、成長を阻害する分子（時々、成長抑制因子と称する）を言う時にも使用される。成長因子は、また、細胞移動（例えば分裂促進のサイトカイン）を刺激したり、走化性因子として作用したり、腫瘍細胞の細胞移動または侵襲を抑制したり、細胞の分化機能を調整したり、アポトーシスに関連したり、細胞の生き残りを促進したりすることも知られている。このような因子は拡散因子として分泌されることもあれば、細胞膜内に埋め込まれた状態で存在しているものもある。それらは、したがって、オートクリン、パラクリン、ジャクスタクリン（juxtacrine）またはレトロクリン（retrocrine）といった方法で働くことができる。サイトカインは、成長因子の一種である。
【０００５】
「サイトカイン」という単語は、ピコモルからナノモルの濃度で液性の調節因子として働き、また通常のまたは病理学の条件下いずれにおいても個々の細胞及び組織の機能上の活性を調整する働きをする多様なグループの可溶性タンパク質およびペプチドのための一般名として使用されている。これらのタンパク質は、また細胞間の相互作用を直接媒介したり細胞外の生育環境において起こっている過程を調節する。サイトカインには、以下のものが含まれる；インターロイキン（最初は、白血球だけが作ると思われた）、リンフォカイン（最初は、リンパ球だけが作ると思われた）、モノカイン（最初は、単球だけが作ると思われた）、インターフェロン（最初は、抗ウイルス性反応に関連していると思われた）、コロニー刺激因子（最初は、半固形培地での細胞生長を維持すると思われた）、ケモカイン（化学走性に関連していると思われた）、その他のタンパク質である。生体内では、大部分のサイトカインの発現は厳密に調整されており、これらの因子は通常、誘導信号に応答して活性化した細胞だけによってつくられる。
【０００６】
一般に、サイトカインは、ホルモンよりも標的細胞種類の範囲が広い。おそらく、通常ホルモンと考えられる媒体からサイトカインを区別している大きな特長は、サイトカインはホルモンとは異なり、特定の腺組織に分化した特殊化した細胞によってつくられるのではないということ、つまりこれらの媒体の源となるある特定の器官があるわけではないということである。サイトカインが、分泌されたタンパク質であるということは、発現部位が必ずしも生物学的作用を行う部位であるとは予測できないことを意味する。いくつかのサイトカインは古典的な酵素と同一であるということが、それらの一次構造の決定によって判明した（たとえば、成人型Ｔ細胞白血病-由来因子（ADF）、nm23、血小板由来内皮細胞成長因子（PD-ECGF、またはneuroleukin））。酵素活性を持つという例外の発見が増えつつあるが、サイトカインはふつう酵素活性を持っていない。サイトカインの生物学的活性は、いろいろあるが、因子依存性の細胞系を用いて測定されることができる。また、サイトカインそのものは、たとえば、抗体を用いた他の検定で測定されることができる。メッセージ増幅タイピング（Message  amplification phenotyping）は、分子生物学の現代の技法を用いて、サイトカイン特定のメッセンジャーRNAの存在を検出する。
【０００７】
多くの実験は、通常もしくは病理学の条件下で、血液供給量の少ない状態では、組織が血管形成を促進する血管形成因子を生じることができることを示唆した。線維芽細胞成長因子（bFGF）および血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）など、サイトカインおよび他の分子の中にあるいくつかの血管形成因子が、虚血心筋の血管形成を促進することが生体内で証明された（Lopez and Simons, Drug Delivery 3: 143 1996）。これらの因子および化合物は、細胞特異性や、それらが新しい血管の成長を誘発する機構において異なっている。それらが血管内皮細胞の移動および増殖を誘発、もしくはコラゲナーゼの生産を刺激している可能性がある（例えば、see Klagsbrun, M., and D’Amore, P.A., Ann. Rev. Physiol. 53:217-39, 1991）。血管形成の活性を直接測定できる多くの生物学的測定法がある（Wilting, J., et al., Anat. Embrol. (Berl) 183:259-71, 1991）。
【０００８】
血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、46〜48 kDa（24kDaのサブユニット）のホモダイメリックな、大量にグリコシル化されたタンパク質である（レビューとしては、以下のものがある。Ferrara, N., et al.,J.Cell Bio. 47:211, 1991; Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 13:18-32, 1991)。しかしながら、グリコシル化は、生物学的活性のためには必要でない。サブユニットは、ジスルフィド結合により連結される。ヒトの血管内皮細胞増殖因子は、メッセンジャーRNAが、異なるスプライシングを受けた結果によって、アミノ酸の数で１２１、１６５、１８９および２０６のいくつかの分子変異体で存在する。VEGF-B、VEGF-CおよびVEGF-Dを含むVEGFの他のいくつかの変異体が確認されている。アミノ酸１８９個の変異体VEGF（VEGF-189）は、血管透過性因子（VPF）と同一のものである。VEGF-189およびVEGF-206が、大部分は細胞表面または基底膜のヘパリンを含んだプロテオグリカンに結合されている一方で、VEGF-121およびVEGF-165は可溶性の分泌された形態の因子である。ラットおよびウシのVEGFは、ヒトのものよりもアミノ酸がひとつ短い。また、ウシとヒトのアミノ酸配列は９５%の相同を示す。８個のシステイン残基の位置は、VEGFおよびPDGFにおいてすべて保存されている。分子量170〜235 kDaのVEGFに対する高親和性グリコプロテインリセプタ−は、血管内皮細胞に発現している。VEGFは、かなり血管透過性に影響しており、いくつかのバイオアッセイにおいて強力な血管形成タンパク質であり、血管内皮細胞に対して非常に特異性のある細胞分裂促進剤であることが示された。試験管内では、２種類の短い形態のVEGFは、太い血管（macrovascular）の内皮細胞の増殖を刺激するが、他の細胞型の増殖を高める効果は現さない。
【０００９】
bFGFの血管周囲への放出は、慢性心筋虚血症の副行循環および心筋機能を向上することが示された（Harada et al., J. Clin. Invest. 94:623-30, 1994)。bFGFおよびVEGFは、ヘパリンアルギン酸塩ミクロスフィアおよび埋め込み型浸透ポンプによって、心筋環流の血管周囲への送出しの間、側枝血流量を増加させることが示された(Lopez and Simmons, 1996, 前出)。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、静脈内注入のような手段による成長因子の全身への投与は多くの限界を有する。血管形成成長因子の全身の投与によって、膜性腎症および骨髄サプレッションのような腎性のおよび血液生成末端器官損傷を含む多くの副作用が、血液動態の効果(Lopez and Simmons, 1996, 前出)と同様に記載された。加えて、これらの薬剤の全身投与は、休眠中の腫瘍細胞を刺激する懸念を可能性のあるものにした。組換え型成長因子タンパク質の全身投与にかかる費用は、また大変高価なものと考えられる。
本願発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、局所的に治療目的の血管形成を誘発するための新しい化合物および方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段、発明の作用、および発明の効果】
本願発明は、局所的に治療目的の血管形成を誘発するための新しい化合物および方法を提供する。そしてこれらは、心筋に新しい側副の血管（collateral blood vessels）を発現させることと、血流量の局所的な回復を達成するための試みを目的とするものである。本願発明はまた、発作、組織炎症、潰瘍性状況、関節炎、喘息、腫瘍成長、糖尿病性網膜症および他の状況を含む多数の臨床の疾患に役立つ新しい化合物と方法を提供する。
【００１２】
一つの実施形態では、血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチド（この融合ポリペプチドは、コラーゲンに結合することができる）が、提供される。血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチド（この融合ポリペプチドは、コラーゲンに結合することができる）をコードしている核酸配列もまた提供される。
【００１３】
もう一つの実施形態では、血流循環を調整できる量の血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドを被検者に投与することによって、被検者の血流循環を局所的に変更するための方法が提供される。被検者の循環を局所的に変更するための方法は、血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の治療として効果的な量を被検者に投与することによっても、また、提供される。
【００１４】
更なる実施形態において、血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドと接触させた血管内皮細胞を含んでいる単離された組織を用いた組織移植が提供される。血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドの効果的な量を、単離された組織と接触することによって、組織移植を準備する方法もまた、提供される。血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の効果的な量を単離された組織と接触させることによって、その核酸配列が前記組織において発現されることにより、移植片を活性化する方法が更に提供される。
【００１５】
また別の実施形態において、薬学的に許容可能なキャリアの中に、血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドを含んでいる製薬組成物が提供される。薬学的に許容可能なキャリアの中に、血管形成調整剤と連結したコラーゲン結合部位を含む融合ポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる製薬組成物もまた、提供される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本願明細書中および特許請求の範囲において、特に複数形を除く旨の記載がない限り、単数形で示されている場合であっても（“ひとつの”、“そして”および“その”：英語原文中では、「”a,” ”and,” and “the”」）、複数形を含むものとする。したがって、例えば、「一つのターゲット細胞」（a target cell）には、複数のそのような細胞が含まれるし、「発現ベクター」（the expression vector）には、ひとつ又はそれ以上のトランスフォーメーションベクター及び当該技術分野に精通する者にとっての同等物が含まれる。
【００１７】
一方定義が与えられない限り、全ての技術的および科学的な単語は、本願発明が属している技術に精通する者によく理解されているのと同じ意味を有する。本願明細書において記載されているものと同等の或いは類似したいかなる方法、細胞および遺伝子は本願発明に使用可能であるけれども、以下には、好ましい方法、装置および材料について説明する。
【００１８】
本願明細書において言及されるすべての公開文書については、本願発明に関連するように使用できる公開文書中に記載されている細胞株、ベクターおよび方法論の全部を本願明細書に引用したものとする。このような公開文書は、本願発明の出願日よりも前の開示だけのために単に提供される。このことは、本願明細書において、発明者が従来の発明によって、かかる開示に先だつ権利がないという告白として解釈されるものではない。
【００１９】
本願発明は、コラーゲン結合ドメインと血管形成調整剤とを備える融合ポリペプチドを提供する。本願発明との関連において、「ポリペプチド」という単語は、モノマーであるアミノ酸残基が、互いにアミド結合で一緒に結合されたポリマーのことを意味する。アミノ酸がαアミノ酸である場合には、L型光学異性体またはD型光学異性体のいずれも使用できるが、L型光学異性体が好ましい。「ポリペプチド」または「タンパク質」という単語は、本願明細書において、いかなるアミノ酸配列も含み、かつグリコプロテインのような修飾された配列をも含む。「ポリペプチド」という単語は、特に自然に生じているタンパク質と共に、組換えまたは化学合成によって形成されたタンパク質をも含んでいる。「フラグメント」という単語は、ポリペプチドの一部分のことである。「フラグメント」という単語は、少なくとも一つの役立つエピトープを呈するポリペプチドの一部分のことを意味する。「ポリペプチドの機能的断片」という語句は、そのポリペプチドの活性を保持するポリペプチドのすべての断片を意味する。例えば、血管形成調整剤の機能的断片には、血管新生活性を保持するフラグメントを含む。例えば、生物学的に機能的な断片とは、大きさにおいて広い範囲を持つものであり、抗体分子に結合可能なエピトープ程度の小さなポリペプチドフラグメントから、細胞に対してその細胞型を変化させるように誘起またはプログラミングできる程度に大きなポリペプチドまでを意味している。「エピトープ」とは、抗原に対して接触することにより発現される免疫グロブリンに結合可能なポリペプチドの領域のことである。
【００２０】
フラグメントは、自然に生じているタンパク質として同じであるもの、または実質的に同じアミノ酸配列を有することができる。「実質的に同じであるもの」とは、アミノ酸配列が全く同一ではないが、その大部分が同じであって、元のアミノ酸配列が有する機能上の活性を保持しているアミノ酸配列のことを意味する。機能上の活性の例としては、あるフラグメントが、そのフラグメントの元である完全な長さのポリペプチドを認識する抗体に対して結合するであろうという例が挙げられる。一般的に二つのアミノ酸配列が少なくとも８５%同一であるか、またはその配列中に保存的バリエーションがある場合には、両アミノ酸配列は、「実質的に同じである」か、「実質的に同質である」（substantially homologous）と言える。例えばBLASTプログラム（Altschul et al.,1990）のようなコンピュータプログラムは、配列の同一性を比較するために用いられるし、ALOMというコンピュータプログラム(Klein et al.,1985)は、アミノ酸配列が、潜在的に外周部分（potential peripheral）に位置するものであるか、膜貫通部位（membrane-spanning）であるかを分析する際に使用できる。
【００２１】
「保存的バリエーション」とは、本願明細書において、あるアミノ酸残基が生物学的に同等な他のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。保存的バリエーションには、イソロイシン、バリン、ロイシンおよびメチオニンのような疎水性残基が互いに置換されること、極性残基が他の極性残基に互いに置換されること、アルギニンとリジンとが互いに置換されること、グルタミン酸とアスパラギン酸とが互いに置換されること、グルタミンとアスパラギンとが互いに置換されること等の例がある。「保存的バリエーション」には、また、アミノ酸置換後のポリペプチドに対して発現された抗体が、アミノ酸置換前の元のポリペプチドに対しても反応性を持つという意味も含んでいる。
【００２２】
本願発明の融合ポリペプチドは、コラーゲンに結合することができる。「融合タンパク質」とは、２またはそれ以上の異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列の部位を含むポリペプチド、または同じタンパク質に由来する２またはそれ以上の領域であって通常は隣接しない部分を含むポリペプチドである。「コラーゲン結合ドメイン」とは、コラーゲンに結合できる全てのポリペプチド又はそれらの部分である。いくつかのコラーゲン結合ドメインは、従来技術において公知である（Cruz, M.A., et al., Interaction of the von Willebrand factor (vWF) with collagen: Localization of the primary collagen-binding site by analysis of recombinant vWF A domain polypeptides, J. Biol. Chem., 270:10822-10827, 1995; Hoylaerts, M.F., et al., von Willebrand factor binds to native collagen VI primarily via its Al domain, Biochem. J., 324:185-191, 1997; Lankhof, H., et al., A3 domain is essential for interaction of von Willebrand factor with collagen type III, Thrombos Haemostas, 75;950-958, 1996）。一つの実施形態では、コラーゲン結合ドメインは、フォンビルブラント因子（von Willebrand factor）のコラーゲン結合ドメインであり、それは露出された血管のコラーゲンの認識に関与している（Takagi, J., et al., Biochemistry 32:8530-4, 1992; Tuan, T.L., et al., Conn. Tiss. Res. 34:1-9, 1996; Gordon, E.M., et al., Hum. Gene Ther. 8:1385-1394,上記の全ての文献は、参照によって、本願明細書において組み込まれたものとする。）。フォンビルブラント因子は、遺伝的な血友病の研究の止血因子として最初に同定され（Wagner, Ann. Rev. Cell. Biol. 6:217, 1990)、その後、血管病変に対する血小板の凝集を行わせることによって、生体防御反応（vital surveillance function）を誘導するものであることが示された（Ginsburg and Bowie, Blood 79:2507-2519, 1992）。デカペプチドWREPSFMALS（配列番号１）は、フォンビルブラント因子をコラーゲンに結合するためのキーであることが同定された（Takagi, J., et al., 前出, 1992; Tuan, T.L. et al., 前出, 1996）。本願発明において使用されるが、コラーゲン結合ドメインを同定する試験方法は、従来技術において公知である（Takagi, J., et al., 前出, 1992; Tuan, T.L. et al., 前出, 1996）。
【００２３】
コラーゲン結合ドメインを同定するための方法としては、例えば、ELISAである（Hall et al., Hum. Gene. Ther., 8:2183-2192, 1997）。キメラタンパク質が、コラーゲン結合能力を持っているか否かを判定するために、組換え型エンベロープ作成物（SU-ECB-CEE+）が、PCRにより準備され、大腸菌によって発現された。約１μgのタンパク質が、コラーゲンコートされたマイクロタイタープレートにアプライされ、結合のために２０分間放置された後、所定の条件で洗浄され、修飾されたELISA法によってコラーゲン結合タンパク質の検出がなされた。５種類の判定実験によって、免疫反応性のキメラタンパク質（SU-ECB-CEE+）が、PBS、１M NaCl、１Mおよび２Mの尿素による洗浄後にも、コラーゲンに結合されたままであったことが判明した。なお、そのキメラタンパク質をコラーゲンマトリックス（レーン5-8）から遊離させるには、３M以上の濃度の尿素が必要であった。コラーゲンコートされたマイクロタイタープレート及び、処置または未処置・傷ついたまたは傷ついていない大動脈の、またはIVCセグメント（IVC segments）の凍結切片は、１：１０００に希釈された一次抗体によって、室温で４時間、インキュベートされた。ラット免疫グロブリンGに対するビオチン化ヤギ抗体が、アプライされた後に、ストレプトアビジンとホースラディッシュ・ペルオキシダーゼとの結合物が続いてアプライされた。ジアミノベンジディン（diaminobenzidine, DAB）が発色物質（chromogen）として使用され、マイクロタイタープレートの発色促進のために塩化ニッケルが添加された。組織のスライドは、ヘマトキシリンによって、逆染色（counterstained）された。
【００２４】
「血管形成調整剤」とは、血管新生または血管内皮細胞の増殖を誘発できるいかなる物質をも含む。例えば、血管形成調整剤には、サイトカイン、成長因子、酵素、酵素のインヒビター（enzymatic inhibitor）、または抗体が含まれる。「サイトカイン」とは、ナノモルあるいはピコモルの濃度で液性の調節因子として働くポリペプチドのことであり、通常のまたは病理的な条件下において、個々の細胞および組織の機能上の活性を調整することができる。サイトカインは、直接に細胞間の相互作用を調整することができ、および／または細胞外の環境において起こっている事象を制御することができる。サイトカインには、インターロイキン、リンフォカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインに加えて、種々のタンパク質が含まれる。
【００２５】
血管形成調整剤のうちの一つのクラスは、ポリペプチド性血管形成因子であり、例えば、サイトカインや成長因子がある。更に具体的には、アンジオポエチン１（angiopoeitin-1）、上皮細胞成長因子（EGF）、肝細胞成長因子（HGF）、腫瘍壊死因子（TNFα）、血小板由来内皮細胞成長因子（PD-ECGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様増殖因子（IGF）、インターロイキン８、成長ホルモン、アンジオポエチン、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、酸性または塩基性線維芽細胞成長因子（FGFs）、トランスフォーミング成長因子（TGFα）、CYR61（Babic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6355, 1998; Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16:1326, 1996）および血小板由来成長因子(PDGF)を含むが、これらによって限定されるものではない。これらの各々の分子は、生体内において、血管形成を誘発することが示されている。血管形成活性を示す他の類似した分子としては、ヘパリン結合性増殖因子（HBGFs）がある。ポリペプチド性の血管形成因子に加えて、他の血管形成調整剤が知られている。例えば、プロスタグランジンE1およびE2（これらは、脂質由来の血管形成因子である）は、血管形成活性と共に、公知の炎症細胞誘引物質である（J. Natl. Cancer Inst. 69 475-482, 1982）。加えて、ニコチンアミドは、トリ角膜またはトリ細胞接着分子（CAM）アッセイにおける実験を行うと、血管形成活性を示す（Science 236, 843-845, 1987）。加えて、ネガティブな血管形成調整分子（negative angiogenic regulatory molecules）としては、アンジオスタチン（O’Reilly et al., Cell 79:315, 1994);エンド−スタチン（O’Reilly et al., Cell. 88:277, 1997)；およびトロンボスポンジン（Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6624, 1990）が含まれる。
【００２６】
本願発明は、血管形成調整剤またはそれらの機能性フラグメントと連結されたコラーゲン結合ドメインを含んでいる融合ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」とは、少なくとも１０塩基の長さを持つ核酸が連結されたものを示す。「単離された核酸配列」という語句は、それらが由来する組織において自然に発生する遺伝子としては連続している（５‘側から３’側に）けれども、必ずしもいつも連続しているというわけではないポリヌクレオチドのことを意味する。従ってこの語句は、例えば、ベクター；プラスミドやウイルス中における独自の繰り返し；原核生物または真核生物のゲノムDNA中に組み込まれている組換えDNAや、他の配列から独立している別の分子（例えばcDNA）として存在する組換えDNAを含む。本願発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれのヌクレオチドの修飾体をも含む。また、ヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAを含む。
【００２７】
血管形成調整剤またはそれらの機能的フラグメントに連結されるコラーゲン結合ドメインをコードする核酸配列は、操作可能な状態で発現を調節する配列に結合することができる。「操作可能な状態で結合される」とは、連結されているコンポーネントが、互いが発現するように意図された方法によって共同する、ということを意味する。あるコーディング配列が発現調節配列に操作可能な状態で結合されていると、そのコーディング配列は、その発現調節配列の調節の下で発現がなされるということになる。本明細書中において、「発現調節配列」とは、その配列が操作可能な状態で結合されている別の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを意味する。発現調節配列が別の核酸配列に操作可能な状態で結合されていると、その発現調節配列は、その別の核酸配列の転写を、また好ましくは翻訳をも、制御及び調節する。したがって、発現調節配列には、適当なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を許可するための遺伝子の正しい解読枠の維持およびストップコドンが含まれる。「調節配列」とは、最小の意味では、その存在が発現に影響を与えるコンポーネントを含み、また、その存在が有利である（例えばリーダー配列や、融合パートナー配列（fusion partner sequences））ような付加的なコンポーネントを含むことができる。発現調節配列には、プロモータが含まれる。
【００２８】
「プロモータ」とは、転写を行うために必要最小限な配列のことを意味する。本明細書中においては、プロモータ要素には、細胞タイプ特異的または組織特異的または外部からの信号や調節剤によってプロモータ依存的に遺伝子の発現を制御するに十分なプロモータ要素もまた含んでおり、そのような要素は遺伝子の５’または３’の領域に設置されるだろう。構成的な（constitutive）または誘導的な（inducible）プロモータは、いずれも本願発明に含まれる（例えば, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987）。例えば、バクテリアのシステムにおいてクローニングを行う場合には、誘導的なプロモータとして、バクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lac のハイブリッドプロモータ）などのプロモータが使用されるだろう。哺乳動物細胞のシステムにおいてクローニングを行う場合には、哺乳動物細胞由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）や、哺乳動物ウイルス由来のプロモータ（例えば、レトロウイルスの末端反復配列（LTR）；アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス7.5Kプロモータ）が使用されるだろう。組換えDNAや合成手法によって作成されたプロモータは、本願発明の核酸配列の転写を行うために提供されるだろう。
【００２９】
本願発明において、本願発明の融合ポリペプチドをコードしている核酸配列は、組換え発現ベクターに挿入されるだろう。「組換え発現ベクター」という単語は、プラスミド、ウイルス、および当該技術分野において、本願発明の融合ペプチドをコードする核酸配列を挿入または移入することによって、その中に導入することが可能な他のもの（vehicle）を含んでいる。発現ベクターは典型的には、複製開始点、プロモータおよび、その発現ベクターが導入された細胞の表現型の選択を許容する特別な遺伝子を含んでいる。本願発明ために適切なベクターとしては、バクテリアの発現のためにはT7に基づく発現ベクター（Rosenberg, et al., Gene 56:125, 1987）、哺乳動物細胞の発現のためにはpMSXND発現ベクター（Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988）、昆虫細胞の発現のためにはバキュロウイルス由来のベクター、その他にカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）；タバコモザイクウイルス（TMV）等が含まれるが、これらによって制限されるものではない。
【００３０】
利用されるベクターに従って、多くの適切な転写および翻訳要素、例えば構成的または誘導的なプロモータ、転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等が、発現ベクターにおいて、使用されるであろう（例えば、 Bitter, et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987）。これらの要素は、当業者にとって公知のものである。
【００３１】
酵母においても、構成的または誘導的プロモータを含んでいる多くのベクターが使用されるだろう（総説として、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Grant, et al., “Expression and Secretion Vectors for Yeast,” in Methods in Enzymologv, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; and “Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast,” Methods in Enzvmologv, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684, 1987; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982.等がある)。ADHまたはLEU2のような構成的なイーストプロモータや、GALのような誘導的なプロモータが使用されるだろう（“Cloning in Yeast,” Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986）。あるいは、外来性DNA配列のイーストクロモソームへの組み込みを促進するベクターが、使用されるだろう。
【００３２】
「形質転換」、あるいは「トランスフォーメーション」（transformation）という単語は、新しいDNA（すなわち、その細胞にとっては外部性DNA）を導入することによって、その細胞が永久的な遺伝子変化を起こすことを意味している。細胞が哺乳動物細胞である場合には、永久的な遺伝子変化は、その細胞のゲノム中にDNAが導入されることによって、通常には達成される。「形質転換細胞」（transformed cell）という単語は、その細胞（あるいは、その細胞の祖先の細胞）が、組換えDNA技術によって、コラーゲン結合ドメインに結合された血管形成調整剤（またはそのフラグメント）からなる融合タンパク質をコードしているDNA分子が導入された細胞であることを意味している。組換えDNAで宿主細胞を形質転換することは、当該技術に精通する者にとって、よく知られているように、一般的な技法によって行われるだろう。宿主が原核細胞（例えば大腸菌）であるときには、DNAの取り込み能力を有するコンピテント細胞は、指数増殖期の後に集められた細胞を当該技術においてよく知られる手順によって、塩化カルシウム法によって処理することで準備することができる。また塩化カルシウムの代わりに、塩化マグネシウムまたは塩化ルビジウムを使用することもできる。トランスフォーメーションは、また、宿主細胞のプロトプラストを作成した後に、またはエレクトロポレーションによって実行することができる。
【００３３】
本願発明の融合ポリペプチドは、原核生物において、そのタンパク質をコードしている核酸の発現によって得ることが可能である。そのような原核生物としては、本願発明の融合タンパク質をコードするバクテリオファージ、プラスミドDNA、コスミドDNA発現ベクターによって形質転換された微生物（例えばバクテリア）が挙げられるが、これによって限定されるものではない。融合タンパク質は、試験管内での試験において、大腸菌を大規模スケールで培養することによって、発現させることが可能である。その融合タンパク質のバクテリアからの精製は、ニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程で純化するための標識（tags）を配列中に持たせることによって単純化できる。その作成物にもまた、融合ポリペプチドの単離を単純化するために標識を含ませることができる。例えば、６個のヒスチジン残基のようなポリヒスチジン標識は、蛍光性タンパク質のアミノ末端に組み込まれることができる。ポリヒスチジン標識によって、ニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程でタンパク質の単離を効率よく行うことができる。本願発明の融合ポリペプチドは、また、タンパク質の回収を補助する目的で、切断部位を含むように設計されることができる。また別法としては、本願発明の融合ポリペプチドは、その位置で（in situ）アッセイを行うために、所望の宿主細胞中において、直接に発現させることもできる。
【００３４】
宿主が真核生物である場合には、リン酸カルシウム共沈法や、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのようなよく知られた機械的な手法、リポソーム内に封入されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターが、DNAのトランスフェクションに使用されるだろう。真核細胞には、また、本願発明の融合ポリペプチドをコードしているDNAと、選択可能な形質（例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子）をコードしている第２の外部DNA分子とを共にトランスフェクションすることができる。別の方法としては、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス４０（SV４０）またはウシパピローマウイルス）を使用して、一時的に真核細胞にウイルスベクターを感染させて形質を転換させ、タンパク質を発現させることが可能である（Eukarvotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982）。好ましくは、本願明細書において記載されているように、真核細胞が宿主細胞として利用される。
【００３５】
真核細胞系（更に好ましくは、哺乳類細胞の発現系）は、タンパク質が発現された後の適当な翻訳後修飾が生じるのを許容する。転写一次産物の適切なプロセシング（例えばグリコシル化、リン酸化）を行ったり、都合よく遺伝子産物を分泌するための細胞内機構を持っている真核細胞は、蛍光性指示薬によって発現を確認できるような宿主細胞として使用され得る。かかる宿主細胞株としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293およびWI38が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
組換え型タンパク質を長期間に渡って高い収率で生産するためには、安定的な発現系（stable expression）が好ましい。そのためには、ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりはむしろ、宿主細胞が、適切な発現調節要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）によって制御され、かつ本願発明の融合タンパク質をコードしているcDNAと、選択可能なマーカーとによって、形質転換されていることが好ましい。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、細胞に対して選択に対する耐性を授け、安定してプラスミドをそれらのクロモソームに組み込んで、順番にクローンをつくることが可能でありかつ細胞株として確立できるような細胞コロニー（foci）を形成することができるようなものが好ましい。例えば、宿主となる細胞に対して外来性DNAを導入し、その細胞を１〜２日間を栄養素の豊富な培地（enriched media）で培養した後に、選択用培地に変更して培養する。次に示すような多くの選択系が使用されるであろう。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, et al., Cell 11:223, 1977)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska& Szybalski, Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, et al., Cell, 22:817, 1980）の選択系においては、選択用の遺伝子は、それぞれtk-、hgprt-、およびaprt-である。但し、本願発明は、上記の例によって制限されるものではない。また、代謝系をブロックする選択系（antimetabolite resistance）として、dhfrはメトトレキセートへの耐性を与える遺伝子（Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567, 1980; O’Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:1527, 1981)；gptはミコフェノール酸への耐性を与える遺伝子（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981）；neoはアミノグリコシドG-418への耐性を与える遺伝子（Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981）；およびhygroはハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子（Santerre, et al., Gene 30:147, 1984）である。最近、更なる選択可能な遺伝子が発見されている。例えば、trpBは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを許容する；hisDは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを許容する（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047, 1988)；および、ODC（オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子）は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン（DFMO）に対する耐性を与える（McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987）。
【００３７】
本願発明のポリペプチドが原核細胞または真核細胞によって発現された後の単離または精製の技術については、従来より公知の手段、例えばクロマトグラフ分離、および（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗原を使用した）免疫学的な分離のようないかなる手段にもよって、行うことができるだろう。
【００３８】
本願発明は、被検者の局所的な循環を変更することに役立つ構成物および方法を提供する。被検者には、いかなる哺乳類（例えば、ハツカネズミ、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヒト）も含む。好ましい実施形態では、被検者はヒトである。本願発明の方法は、血管形成調整剤を使用して治療することができる疾患を有する被検者において、局所的な循環を変更するために使用されることができる。「治療」（”treatment,”）、「治療のため与える」（”treating,”）、「治療する」（”treat”）等の単語は、本願明細書中において、通常には、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。その効果とは、完全にまたは部分的に疾患またはそれらの症状を防ぐ観点からの予防的なもの、および／または、疾患の不完全なまたは完全な安定化または疾患および／またはその疾患に由来する副作用の治癒を意味している。本願明細書において、「治療」とは、被検者（特に、ヒト）の疾患に関するあらゆる治療であり、以下のものを含む：(a)ある疾患または症状が生じやすいけれども未だその疾患または症状には至っていない被験者について、そのような疾患または症状が生じるのを防止すること；(b)疾患の症状を抑制し、すなわち、その疾患の進行をくい止めること；または、(c)疾患の症状を解消する、すなわち疾患または症状の原因を取り除くこと。本願発明の方法を使用して治療することができる疾患は、以下の疾患を含むが、これに限定されるものではない：心筋梗塞や末梢の動脈疾患のような心臓血管系疾患、バルーン血管形成術後の血管の再狭窄、潰瘍性および炎症性疾患、遺伝子欠損および腫瘍（下記を参照）。加えて、本願発明の方法は、心筋レーザ処理血管再生術（transmyocardial laser revascularization）の効果増強、内皮幹細胞の単離および拡大の促進、または血管移植片への内皮細胞の増殖を促進するために使用されることができる。
【００３９】
本願発明の方法が、創傷の治癒を援助するであろうことは想像される。例えば、本願発明の方法は、ヒトまたは他の被検者の潰瘍部位において、組織回復または再生成を援助する際に使用されることができる。別の態様においては、本願発明は、組織工学の処理の間に、組織の成長を促進する目的のために有用である。「組織工学」という単語は、身体の組織および器官の作成、増強または置換のために、合成物または自然材料と協力して、生物に対する人工的補充物を創作、デザイン、および製作することを意味する。したがって、その方法は、病気となったり損傷を受けた組織を修復または置換するために、身体の内部における組織のデザインと成長とを増強する目的で使用されることができる。特別な、しかし本願発明を限定することにはならない実施形態としては、熱傷および潰瘍の処置としての治療のために使用される移植用の皮膚移植片の成長を促進する際に本願発明の方法を用いることができる。
【００４０】
「腫瘍」という単語は、不適当な細胞増殖の疾患のことを意味する。腫瘍組織が生きて活動している器官の機能に障害を生じさせることは、臨床的には最も顕著なものである。通常の組織と悪性の組織とは、一つの細胞のレベルにおいても組織のレベルにおいても、同じ増殖特性を共有することができるので、正常組織の成長に関する概念が、悪性腫瘍組織にも適用できる。腫瘍という疾患は、組織の成長の調節が乱されている疾患であるのと同程度に、細胞の成長の調節が乱されている疾患でもある。腫瘍の増殖特性としては、新しい細胞の生産が細胞死を上回るようになっており；腫瘍性の状態では、自己複製を経て増大する幹細胞の比率が増加し、通常であれば成熟するように進行する幹細胞の比率が減少するという傾向がある（McCulloch, E.A., et al., “The contribution of blast cell properties to outcome variation in acute myeloblastic leukemia (AML) , Blood 59:601-608, 1982）。
【００４１】
「局所的に循環を変更する」とは、被検者における特定の部位で、血流量のパターンが変化することを意味する。血流量のパターンの変化は、一つの血管の形状または形態が変化することによって、または血管のパターンが変化することによって引き起こされることがあり得る。局所的に循環を変更するためのひとつの手段は、側枝血管（collateral blood vessels）を形成することである。局所的に循環を変更するための別の手段は、血管内皮細胞の分裂を促進し、または血管新生を誘発することである。「血管内皮細胞」とは、内皮を構成している細胞のことであり、循環系の内部表面に沿って配置され単なるへん平形状の細胞が単層となっているものである。これらの細胞は細胞分裂を行うための能力を保持しているものの、その増殖は非常にゆっくりとしており、標準状態の下では、おそらく年に一度程度の細胞分裂しか行わない。血管内皮細胞の増殖は、Ｓ期にある細胞をトリチウムチミジンでラベルすることにより示されることができる。通常の血管において、ラベルされる血管内皮細胞の比率は、特に動脈が枝分かれしている部位で高いが、それは、ここでの血流の乱れ及び消耗が、血管内皮細胞のターンオーバーを刺激するためのようである（Goss, R.J., The Physiology of Growth, Academic Press, New York, pp.120-137, 1978）。このように通常の血管内皮細胞は静止性、すなわち分裂していないので、以下に示すように、血管形成を行っている血管内皮細胞からは、分離して識別することが可能である。
【００４２】
血管内皮細胞はまた、移動する能力を有するが、このプロセスは、血管形成において重要なものである。傷を修復する間や、腫瘍を形成する場合のように、必要が生じると、血管内皮細胞は生体内において新しいキャピラリ（細い管）を形成する。新しい血管の形成は、「血管形成」または「血管新生」と呼ばれており、この過程には、内皮細胞に対して分裂促進または化学的誘因を行う分子（血管形成因子、または血管新生因子）が関与している（Klagsburn、前出）。血管形成の際には、血管内皮細胞が、既に存在しているキャピラリから新しい血管を形成することができるように移動してくる、すなわち、ある血管の内皮細胞は、その血管が延長するようなやりかたで、移動することを許容される（Speidel, C.C., Am J. Anat. 52:1-79)。試験管内での実験は、血管内皮細胞の増殖および移動を確認している；培養されている血管内皮細胞は増殖することができ、および自発的に毛細管を形成することができる（Folkman, J., and Haudenschild, C., Nature 288:551-56, 1980）。
【００４３】
「血管形成血管内皮細胞」および「血管形成段階の血管内皮細胞」等の言い方は、本願明細書中において、血管形成（上記の定義の通り）を行っている血管内皮細胞（上記の定義の通り）について、上記の言い方を相互に取り換えながら、使用するものとする。したがって、血管形成段階の血管内皮細胞は、通常の条件下のように、粗く言えば年に一度程度の細胞分裂を行っている血管内皮細胞と比較すると、すさまじい速度で増殖している血管内皮細胞のことである。そのような血管内皮細胞の分裂スピードは、通常の血管内皮細胞の分裂スピードと比べると、２，５ないし１０倍程度だろうが、それは年齢、患者の状態、腫瘍のタイプ、血管疾患のタイプなどの要因に従って、大きく変わり得る。通常の血管内皮細胞と血管形成段階の血管内皮細胞との分裂スピードは大きく異なるので、判別することができるし、生物学上も重要な相違であるので、この細胞の二つのタイプは、区別することができる。「調和している血管内皮細胞」、「通常のまたは静止性の血管内皮細胞」等の言い方によって、（通常の条件下において）同じ組織の内部で通常の静止性の血管内皮細胞としてとどまっており、その集団のあるものは血管形成中であり、またあるものは静止性であるというものを示している。
【００４４】
「循環を調整できる量」とは、循環を局所的に調整できるような薬剤の量という意味である。「剤」とは、局所循環を変更できる機能を有する如何なる分子（例えばタンパク質、核酸または医薬品）をも意味している。
【００４５】
「血管形成調整剤」とは、血管形成または、血管内皮細胞の増殖を調整できるいかなる剤をも意味している。「調整する」とは、血管形成、または局所的な循環を必要に応じて誘起または増強できるということを意味している。あるいは、血管形成調整剤は、局所的な循環に影響を及ぼすために、血管形成を抑制することもあるかも知れない。例えば、血管形成調整剤は、サイトカイン、成長因子、酵素、酵素のインヒビター（enzymatic inhibitor）または抗体であり得る。
【００４６】
一つの実施形態では、コラーゲン結合ドメインに結合された血管形成調整剤を備える融合ポリペプチドを被検者に投与することにより、その被検者の局所的な循環を変更する方法が提供される。本願発明の制約組成物を「投与する」とは、当業者にとって知られているいかなる手段によっても達成されるだろう。
【００４７】
製薬組成物は、投与単位に分けて準備され、投与されることが好ましい。固体の投与単位としては、錠剤、カプセルおよび坐薬である。患者の治療のためには、化合物の活性、投与の方法、疾患の性質および程度、患者の年齢および体重に従って、一日当たりの投与量を異ならせることが必要である。しかしながら、特定の状況の下では、初期に設定された投与量よりも、より高いまたはより低い投与量を与えることも適切となり得るだろう。１日量の投与は、投与単位量あるいは細かく分割された細投与単位量を合わせてその投与単位量として、単独投与によって与えることができるし、再分割された投与量を適当な間隔を設けながら複数回に渡って投与することもできる。
【００４８】
本願発明の製薬組成物は、局所的に投与されることができる。「局所」への投与とは、治療が必要とされる生理学的な部位またはその近くに、本願発明の組成物を送り込むことである。本願発明の製薬組成物の投与方法としては、一般的には局所的に、つまり静脈内投与、経口投与、非経口投与（parenterally）、埋め込み型投与（implants）とされるが、原理的には直腸内投与の方法も可能である。製薬組成物の固体または液体としての適切な形態としては、例えば顆粒、粉末、タブレット、コーティング錠、（ミクロの）カプセル、坐薬、シロップ、エマルジョン、懸濁剤、クリーム、エアロゾル、アンプルに封入された液滴または注射可能な溶液、活性のある薬剤を徐々に放出するように調整された物質（preparations with protracted release of active compounds）があるし、更には上記の形態については、製法賦形剤および／または添加剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香料、甘味料または可溶化剤のようなものを慣習的に使用することもできる。製薬組成物は、様々なドラッグデリバリーシステムを用いながら使用することができる。現在のドラッグデリバリーシステムについては、ランガーの短い総説（Science, 249:1527-1533, 1990）がある。この総説の内容については、本願明細書に引用したものとする。
【００４９】
局所的に循環を変更するのに必要な発明の化合物（剤）の量は、「治療的に有効な用量」または「循環を調節するための量」により意味される。この使用のために効果的な量は、もちろん、疾患の状態、体重および患者の一般的な状態によって決まる。通常は、生体外で（in vitro）使用される供与量は製薬の組成が投与されるその場所における（in situ）投与量に対して役立つガイダンスを提供するだろう、そして動物モデルは特定の疾患の治療のための効果的投与量を判定するために使用されるだろう。種々の考慮は、例えば、ギルマンほか編集、グッドマン・ギルマン治療のための薬理学的基礎(Goodman And Gilman’s: The pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990)及び、レミントンの薬学（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990）に記載されている。それぞれの著書は、本願明細書において、引用したものとする。
【００５０】
本願発明は、また、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の薬理的有効量を投与することによって、被検者の循環を局所的に変更するための方法を提供する。かかる治療は、疾患を有している細胞に対して生体内で（in vivo）、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている治療用ポリヌクレオチドの導入によって、または、その治療用ポリヌクレオチドをエクソビボ（ex vivo）で細胞内に導入した後にその細胞を再び患者に戻すことによって、その治療の効果を達成するだろう。この治療用ポリヌクレオチドの送り込み（delivery）は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターやコロイド分散系を使用して達成されることができる。血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の治療のための送り込みは、特に目標に到達するようにターゲット化されたリポソームの使用によって達成される。
【００５１】
細胞に核酸配列を導入するために利用できる種々のウイルスベクターとしては、本願明細書において教示するように、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアを含み、好ましくはレトロウイルスのようなRNAウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスのベクターは、齧歯類(murine)または鳥類(avian)のレトロウイルスの誘導体である。単一の異種遺伝子を導入することが可能なレトロウイルスのベクターの実施例としては、以下のものが挙げられるが、これに限定されるものではない：モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus 、MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（Harvey murine sarcoma virus 、HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（murine mammary tumor virus、 MuMTV）およびラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus 、RSV）。被検者がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス（the gibbon ape leukemia virus、GaLV）のようなベクターを利用することが好ましい。他のレトロウイルスのベクターは、多くの遺伝子を組み込むことができる。遺伝子導入された細胞を同定すること及びそのような細胞が生き延びることが可能であるために、これらのベクターの全ては選択可能なマーカー用遺伝子を転送又は組み込むことができる。たとえばある特定の特異的な目的細胞上のリセプタのためのリガンドをコードする別の遺伝子と一緒に、ウイルスベクターに本願発明の融合ポリペプチドをコードしている核酸配列を挿入することによって、そのベクターは所定の細胞に対して特異的なものとなる。レトロウイルスのベクターは、例えば糖、グリコリピドまたはタンパク質を結合させることによって、所定のターゲットに対して特異的なものとすることができる。好ましいターゲッティングは、レトロウイルスベクターをターゲットに特異的なものとするために抗体を使用することにより達成される。当該技術分野に精通した人々であれば、過度の実験によることなしに、レトロウイルスゲノムに挿入されることが可能であり、かつ血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を標的特異的に輸送することを可能とするために、ウイルスエンベロープに取り付けられることが可能であるような特定のポリヌクレオチド配列を容易に確認できるだろう。
【００５２】
組換え型レトロウイルスに欠陥があることから、それらは感染性のベクター粒子を生じるために適切な援助を必要とする。この援助は、例えば、ＬＴＲ(long terminal repeat)中の調節遺伝子の制御のもとでレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することにより提供できる。これらのプラスミドは、カプシド形成のためのRNA転写物を認識するためのパッケージング機構を可能とするヌクレオチド配列を欠損している。そのようなパッケージングシグナルを欠損しているヘルパー細胞株としては、例えばQ2、PA317およびPA12があるが、これらの例に限定されるものではない。これらの細胞株では、ゲノムがパッケージングされないので、そのような細胞株は、空のビリオンを生じる。もしレトロウイルスベクターが、パッケージング信号は正常であるけれども、構造遺伝子が他の目的遺伝子によって置き換えられている細胞に導入されると、そのベクターはパッケージングされて、ベクターウイルス粒子が生産される。
【００５３】
上記の方法の代わりに、NIH 3T3細胞株や他の培養細胞に対しては、通常のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子であるgag、polおよびenvをコードしているプラスミドを直接にトランスフェクションすることができる。次に、これらの細胞には、目的の遺伝子を含んでいるベクタープラスミドをトランスフェクションする。結果として生じる細胞は、培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【００５４】
治療用ポリヌクレオチドを目的とするところに運搬する（delivery）ための他のシステムとしては、コロイド分散系がある。コロイド分散系の例として、巨大分子複合体、微細カプセル（nanocapsules）、ミクロスフィア、ビーズおよび脂質に基づく系（lipid-based systems）例えば、水中油型乳剤、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームなどがある。本願発明の好ましいコロイド系としては、リポソームがある。リポソームは、人工膜小胞であり、試験管内および生体内で輸送用小胞体（delivery vehicles）として有効なものである。ラージ・ユニラメラ・ベヒクル（large unilamellar vesicles(LUV)）は、0.2〜4.0 μmの寸法において、巨大分子を含んでいる水性緩衝液を十分なパーセンテージでカプセル化することができることが示されている。RNA、DNAおよび無傷のウイルス粒子は、LUV内部の水性環境中にカプセル化された状態とすることが可能であり、そのまま生物学的に機能できる形態で細胞に配送することができる（Fraley et al., Trends Biochem. Sci 6: 77, 1981)。リポソームは、哺乳類の細胞に加えて、植物、酵母およびバクテリア細胞に対して、ポリヌクレオチドを導入するために使用することもできる。リポソームが遺伝子導入のための有効な運搬物であるためには、以下の特性を備えているべきである：(1)目的とする遺伝子が生物学的に活性を失うことなく高い効率でカプセル化されること、(2)標的としていない細胞との比較において、標的細胞に対する優先的な及び十分な結合性能を持つこと、(3)リポソーム内の水性内容物を標的とする細胞の細胞質に効率よく導入すること、および(4)遺伝情報の発現を正確にかつ効率的に行えることである（Mannino et al., Biotechniques, 6: 682 1988）。
【００５５】
リポソームの組成は、通常リン脂質の組合せであり、特に高い相転移温度（high-phase-transition-temperature）を持つリン脂質が、通常にはステロイド（特にコレステロール）と組み合わせて用いられる。他のリン脂質や他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的な特性は、pH、イオン強度および二価カチオンの存在によって決まる。
【００５６】
リポソームの生産に有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシドおよびガングリオシド）を含む。特に、ジアシルホスファチジルグリセロール（ここで、脂質部分の一方は、14〜18個の炭素原子からなり、特に16〜18個の炭素原子からなり、飽和されているもの）が役に立つ。図示されているリン脂質は、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【００５７】
リポソームによるターゲッティングは、解剖学的（anatomical）および機械的要因に基づいて分類されることができる。解剖学的分類法は、選択作用（例えば、器官特異性)、細胞特異性、およびオルガネラ特異性（organelle-specific）のレベルに基づくものである。機械的なターゲッティングは、それが受動的なものか、または能動的なものかどうかに基づいて区別されることができる。受動的なターゲッティングは、シヌソイドに関するキャピラリ（sinusoidal capillaries）を含む器官の細網内皮系（reticulo-endothelial system,RES）の細胞に分布するリポソームの自然の傾向を利用する。一方、能動的なターゲッティングは、特定のリガンド（例えば単クローン抗体、糖、グリコリピドまたはタンパク質）をリポソームに連結することによって、またはリポソームが自然に局在している部位以外の器官および細胞タイプに対するターゲッティングを達成するためにリポソームの組成または寸法を変えることにより、リポソームを変化させる方法を含んでいる。
【００５８】
ターゲットデリバリーシステム（targeted delivery system）の表面は、種々の方法によって修飾されている。リポソームを修飾するターゲットデリバリーシステムの場合には、ターゲット用リガンドが脂質二重層中に安定して留まることができるように、脂質グループが、リポソームの脂質二重層中に組み込まれることができる。種々の結合グループは、ターゲッティングリガンドに脂質鎖を結合するために使用されることができる。
【００５９】
もう一つの実施例による方法は、単離された組織移植片（isolated tissue graft）により提供される。その移植片は、血管内皮細胞と血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドとを含んだ単離された組織を含んでいる。ここで、「単離された組織（isolated tissue）」とは、被検者における自然の位置から除去された組織のことを意味している。好ましい実施の形態において、単離された組織は、血管内皮細胞をその要素として有している。その組織は、器官、器官の一部(a portion of an organ)、または単離された細胞であり得る。例えば、その組織は、皮膚、皮膚から分離されるいくつかの細胞層、血管(vessel)または血管から分離される血管組織(vascular tissue)であり得る。一つの方法では、移植片は血管であり、例えばバイパス移植のために使用した血管である。血管には、冠状動脈（aortorenal）、腸骨動脈（aortoiliac）、腎臓動脈（aortorenal）、および大腿骨動脈（femoropopliteal）が含まれる。また、別の態様においては、組織は心臓であり得る。単離された組織は、その組織が単離された被験者または別の被験者に対して移植される前に、血管形成調整剤に連結されたコラーゲン結合ドメインを含む融合ポリペプチドの効果的な量と、生体外において接触させておくことができる。なお「接触する（contacting）」とは、その組織と、コラーゲン結合ドメインに連結された血管形成調整剤を含む融合ポリペプチドとが相互作用を許容される条件を含み、また液相ないし固相のいずれの場合をも含む。
【００６０】
本願発明は、更に、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドの効果的量を単離された組織と接触することによって、組織移植を準備する方法を提供する。その単離された組織は、自己由来（autologous）のまたは非自己由来（heterologous）の組織であり得る。「活性化された（activated）」移植片とは、試験管内で（in vitro）血管新生が誘導されるように刺激されており、または、その移植片がレシピエントに戻されると直ぐに血管新生が生じるようにされた単離された組織のことを言う。「異型移植（allograft）」とは、同じ種間において遺伝的に異なる者に移植される移植である。「異種移植片(xenograft)」とは、ある種のものからの移植片が、異なる種のものに移植される移植である。「ドナー」という語は、ある組織が採取される被検者または培養（culture）のことを言い、「レシピエント」という語は、その組織が配置される被検者または培養のことを意味する。レシピエントは、移植の前か後に免疫抑制因子を投与されることがあるだろう。
【００６１】
単離された組織は、その組織が同じものまたは別のものに移植される前に、試験管内で、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドの効果的量と接触させておくことができる。あるいは、単離された組織は、その組織を摘出した被験者とは別の被験者においてその組織が摘出されたのと同じ部位に移植することができるし、その組織が摘出された被験者においてその組織が摘出された部位とは異なる部位に移植することもできる。そして、移植が行われた後に、生体内で、その組織は、血管形成調整剤と連結されたコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドと接触させることができる。
【００６２】
あるいは、単離された組織は、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の効果的量に接触させることができる。単離された組織は、その組織が単離された被験者または他の被験者に移植される前に、生体外（in vitro）で血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の効果的量に接触させることができる。あるいは、単離された組織は、その組織が採取された被験者とは別の被験者においてその組織が採取された部位に移植することができるし、その組織が採取された被験者においてその組織が採取された部位とは異なる部位に移植することもできる。そして、その組織は、移植後に生体内（in vivo）において、血管形成調整剤に連結されるコラーゲン結合ドメインを備える融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の効果的量に接触させることができる。移植片と融合ポリペプチドとの接触は、インビボ（in vivo）またはインビトロ（in vitro）のいずれでも行うことができるし、本願発明の融合ポリペプチドをコードしている核酸配列の取込みおよび発現を許容する条件をも含む。
【００６３】
必ずしも必要ではないが、移植の前および／または移植の後に、移植されたレシピエントに免疫抑制因子を与えることは望ましいだろう。そのような因子として、サイクロスポリンA（CsA）が好んで使用されるが、免疫抑制作用を起こす他の因子、例えばラパマイシン、デソキシスペルグアリン（desoxyspergualine）、およびFK506、またはこれらの薬剤と機能的に同等の物もまた利用されるだろう。CsAは、免疫抑制薬用量で注射によって好ましくは投与される。CsAの投与期間は、約２日から約２０日までの間で変動するだろう。
【００６４】
免疫抑制因子が利用される場合には、適切な手段を使用して、非経口的（parenteral）、皮下内、肺内（intrapulmonary）、鼻腔内への投与を行うことができるし、もし局所的に免疫抑制薬治療を行う必要がある場合には、病変への投与（intralesional）を行うことが好ましい（移植の前に、一面に振りかけておくこと（perfusing）、もしそうでなければ、移植片と免疫抑制因子とを移植前に接触させることをも含む）。非経口的投与には、筋肉内、静脈内、動脈内、または腹膜内の投与を含む。加えて、特に免疫抑制因子の服用を減少させるには、免疫抑制因子はパルス注入液によって最適に投与される。投薬は、好ましくは注射（さらに好ましくは、静脈内または皮下内への注射）によって与えられるが、部分的にはその投与が簡単でまたは常習的であるかどうかによって決定される。
【００６５】
上記の開示は、一般的に本願発明を記載したものである。より完全な理解は、本願明細書中において図面だけのために提供されている以下の実施例（但し、各実施例によって、本願発明を制限するものではない）を参照することにより得られるだろう。
【００６６】
【実施例１】
コラーゲンをターゲットとしたVEGF-CBD融合タンパク質の分子工学
＜VEGF-CBD融合タンパク質の構成＞
VEGFは、実際に単一遺伝子の選択的スプライシングによって、生じる４つのアイソフォーム（VEGF-206、189,165および121）からなるファミリーである（Ferrara et al., Endocrine Rev. 18:4, 1997, Neufeld et al., Prog. Growth Factor Res. 5:89-97, 1994; Tischer et al., J. Biol. Chem. 266:11947, 1991）。VEGF165（最も豊富に発現されたアイソフォーム）は、一つの糖鎖結合部位を持つグリコプロテインであり、ヘパリン結合性を示すものであって、ほぼ45kDaのホモダイマとして分泌される。VEGF165は、プラスミンにより酵素的に切断され得るが、そのときプラスミンは、血管内皮細胞において分裂促進の活性に関してVEGF120と同等の活性を示すVEGF110ダイマーを生じるためにＣ末端部分のヘパリン結合ドメイン（111-165）を除去する（Houck et al., J. Biol. Chem. 267:26301-26307, 1992）。VEGF165-CBDおよびVEGF110-CBD融合タンパク質は、VEGF110アイソフォームと同様に、大腸菌を用いた高度発現のために適切な構築物としてクローンされたものである。露出された血管のコラーゲンの認識（Takagi et al., supra, 1992; Tuan et al., supra, 1996）に関わるウシのフォンビルブラント因子（vWF;CBD）における機能的ドメインから得られたコラーゲン結合配列を戦略的に修飾したものを利用した。元のフォンビルブラント因子の配列中のシステイン残基は、メチオニン残基によって、保守的に置き換えられたが、これはこの補助的なドメインがこの組換え型成長因子の折畳み（folding）および／または再形成（renaturation）にとって必要とされる精巧なジスルフィド結合の形成を阻害しないようにするためである。側部リンカー（flanking linkers）は、回転を許容する柔軟性を増加させるためおよびステアリン障害を最小にするためにグリシン残基を含んでデザインされた。またヒスチジン残基は、コラーゲン結合ドメインの外部コンフォメーション（external conformation）を促進するために含まれたものであった。したがって、VEGF-CBD融合タンパク質（VEGFタンパク質にデカペプチドWREPSFMALS（配列番号１）を結合したものである。）は、損傷、炎症、疾患または治療的な（reparative）外科手術によって表出されたコラーゲンをターゲットとして、VEGFをターゲティングするために設計された。
【００６７】
これらの遺伝子工学的に作成された血管内皮細胞増殖因子の開発は、次のように６個の別々のステップの結果として記載することができる：
1) 分子的作成物のデザイン;
2) 発現用プラスミドの分子クローニング;
3) 組換え型融合タンパク質の発現;
4) 融合タンパク質の精製;
5) 組換え型成長因子の再生成（renaturation）;
6) 特定の生物学的活性の測定。
【００６８】
＜組換え型VEGF-CBD融合タンパク質のデザインおよび分子クローニング＞
原核細胞での発現ベクターは、三つの部分からなる融合タンパク質を生じるた  めに設計された（図１を参照のこと：ターゲティングされた血管内皮細胞増殖因子の同属体（congeners）を示す）ものであり、三つの部分は、精製用標識としての6xHis（His-His-His-His-His-His）、コラーゲン結合部位としての補助的なフォンビルブラント因子から派生した部位、そしてヒトVEGF110（VEGF110-CBD）またはVEGF165（VEGF165-CBD）の成熟した活性化フラグメントをコードしているcDNA配列部位からなる。
【００６９】
これらの実験において利用されるPCRプライマは、次の通りだった：
VEGF-110：
１．Sense(VEGF-110TS1、21924)
CATATGGGTGCACCCATGGCAGAAGGAG（配列番号２）
２．Antisense(VEGF-110AS1、21926)
TCATCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTC（配列番号３)
VEGF-110+CBD
１．Sense(VEGF-110TS2、21927)
CATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCT（配列番号４)
CTGAGCGGTGCACCCATGGCAGAAGGAG（配列番号５）
２．Antisense(VEGF-110AS1、21926)
TCATCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTC（配列番号６)
VEGF-165+CBD
１．Sense(VEGF-110CTS2、21927)
CATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCT（配列番号４)
CTGAGCGGTGCACCCATGGCAGAAGGAG（配列番号５）
２．Antisense（VEGF-165 CBD AS1）
TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCA（配列番号７)
VEGF配列ソース：EMBL/GenBank/DDBJデータベース
アクセス番号(accession number) X62568
VEGF遺伝子、ヒト、配列位置１〜６４９
【００７０】
【実施例２】
VEGF融合タンパク質の発現、精製および再生成
分子的作成物は、RT-PCRによって、ヒト血管内皮細胞から生成させた。PCR産物は、まずＴＡクローニングベクターに組み込まれ、次に組み込まれた塩基配列は、ダイレクトDNAシークエンスによって確かめられた。正しいDNAの塩基配列の確認に基づいて、それぞれの挿入配列は制限酵素によって切り出され、pET発現ベクター（Novagen）にクローニングされた後、その発現ベクターはコンピテント細胞（大腸菌BL21 DE3株）に組み込まれた。ベクターからの融合タンパク質の発現は、IPTGの存在によって開始できた。発現された融合タンパク質は、大腸菌封入体から単離されて、６M 塩酸グアニジン（guanidinium HCl）によって可溶化されて、ニッケルキレートクロマトグラフィ（８Mの尿素）を使用している条件下で立体構造を破壊された状態（denaturing conditions）で均一化されて精製され、最適化された還元条件の下（redox conditions）で、酸化的再生成によって活性のある状態とされた。VEGF110タンパク質は、高レベルに生産されており（回収は、１００mlの細菌培地あたり約８〜１０mgである）、金属キレートクロマトグラフィーによって、ほぼ均一に近い状態に精製された。また均一性はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によっても確認されている。
【００７１】
発現された融合タンパク質は、最初には細菌内の封入体として不溶解性のタンパク質（insoluble refractile protein）として確認される。VEGF110モノマー（約15kDa）は、６Mグアニジン塩酸または、８Ｍ尿素のいずれかによって、可溶化されることができ、そのように可溶化されたモノマーは、慎重に管理された還元条件下のもとで、非還元条件下で約３３kDaのダイマーに移行させることができた。最適の条件下で、精製された組換え型タンパク質のほぼ９０%が、活性型へと再生成され、ダイマーとして回収することができた。
【００７２】
更に、そのタンパク質の再生成に関する物理化学的実験（タンパク質濃度を変化させて、再生成されるタンパク質の回収率（％回収）を確認した試験（図２を参照）と、変性剤を透析によって取り除く際の添加物（例えばシュークロース）による安定性効果（%回収）を確認した試験（図３を参照））を行った。これらの実験の結果は、最適なタンパク質のリフォールディングと回収率は、0.1mg/ml以下のタンパク質濃度で得られることを示していた。
【００７３】
【実施例３】
＜特定の生物学的活性の評価＞
組換え型VEGF融合タンパク質の生物学的活性度は、商業的に購入でき精製されたVEGFをコントロール物質として使用しつつ、試験管内（in vitro）の細胞増殖活性を評価することにより行われた。ヒトの臍帯血管内皮細胞が自発的に変化した細胞株は、ATCCから入手した（ECV3O4;ATCC  CRL-1998）ものであり、その細胞株は上記の評価試験のために単層培養されながら維持された。VEGF活性は、低い血清（１%）の下で４８時間プレインキュベートされた上記細胞によるトリチウムチミジン（3H-thymidine）の取り込み（t=16-20hr）により判定された。これらの条件の下で、我々は、商用のVEGFが、2.5ng/mlの低濃度で有意なトリチウムチミジン取り込み活性を示す（最適濃度としては、約5ng/ml）ことを観察した。図４および図５に示すように、各作成物（VEGF110、VEGF110-CBD、VEGF165-CBD）の特定の生物学的活性は、商用の標準品の生物学的活性とほとんど同等であることが判明した。このことから、再生成されたVEGF融合タンパク質は、安定性ダイマーにリフォールディングされただけでなくて、生物学的にも活性を有するものであることが示された。
【００７４】
【実施例４】
＜合成GPAFTS中への血管内皮細胞のトラッピング＞
VEGFおよびCYR61のような血管由来の因子は、血管内皮細胞の増殖活性と同様に移動活性を有していることが知られている。したがって、遺伝子工学的に作成されたコラーゲン結合ドメインを持つ組換え型成長因子を用いることによって、コラーゲンコートまたはゼラチンコートされた血管の移植片には、生体外（in vitro）または生体内（in vivo）において、移植を強化するのに役立ち、かつその移植片への血管内皮細胞の増殖を促進させることができるだろう。
【００７５】
加えて、コラーゲン結合性の血管由来因子は、おそらく循環系に存在する内皮細胞性前駆細胞を刺激するのに役立つだろう（Asahara, T. et al., Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis, Science 275:964-967, 1997）。さらに、我々は以前に、間充織前駆細胞（mesenchymal precursor cells）のための生存因子として、コラーゲン結合性TGFβ1が、エクソビボ（ex vivo）での遺伝子治療に用いる予備実験としての血清を欠乏させた試験管内（in vitro）の条件下において、選択的な生存によって、幹細胞を“捕獲する”ために使用でき得ることを示している（Gordon et al., Capture and expansion of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with a transforming growth factor b1-von Willibrand factor fusion protein for retrovirus-media ted delivery of coagulation factor IX, Human Gene Ther. 8:1835-1394, 1997）。同様にして、コラーゲン結合ドメインを持つVEGF融合タンパク質は、同様の方法で内皮細胞の幹細胞（そのような細胞は、VEGFレセプターを持っている）を選択または／および“捕獲”するために使用でき、これによってエクソビボ（ex vivo）での遺伝子治療プロトコールまたは、細胞に基づく移植プロトコルにおいて使用できるであろう。
【００７６】
加えて我々は、VEGF165+CBD（コラーゲン結合ドメイン；collagen binding domain）とVEGF110+CBDが、傷ついたラット頸動脈には結合するが、傷ついていない動脈に対しては結合しないことを確認している。これに対して、コラーゲン結合ドメインのないVEGF110は、傷ついている動脈および傷ついていない動脈のいずれに対しても結合しなかった。これらの実験は、生体内（in vivo）におけるラット頸動脈損傷モデルにおいて、実行された（Zhu et al., Circulation 96(2) :628-635, 1997)。
【００７７】
図６は、CBD―成長因子によって、心筋レーザ処理血管再生術（transmyocardial laser revascularization）の効果の増強を図示したものである。
図７は、CBD―成長因子による処理を行うことによって、合成血管移植片の内部に血管内皮細胞をトラッピングさせるときの図解である。
【００７８】
本願発明は、上記に示したような好適な本実施例に関して記載されているにもかかわらず、本願発明の要旨を逸脱することなく種々の変更を行なうことができると理解されるはずである。したがって、本願発明は、実施例ではなく、請求項によってのみ制限されるものである。
【００７９】
【配列表】
0004564657.tif 000002
0004564657.tif 000003
0004564657.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】コラーゲンをターゲットとしたVEGFタンパク質の概要図である。
【図２】コラーゲンをターゲットとしたVEGFタンパク質の回収率を示したグラフである。
【図３】異なる製法において、コラーゲンをターゲットとしたVEGFタンパク質の回収率の変化を図示している棒グラフである。
【図４】コラーゲンをターゲットとしたVEGFタンパク質によって誘導された細胞増殖を示す図である。パネルAは、異なる濃度のコラーゲンをターゲットとしたVEGFタンパク質によって誘導されるトリチウムチミジン（3H-thymidine）の取り込み量を図示している棒グラフである。パネルBは、V110、V110-CBDまたはV165-CBDのそれぞれの異なる濃度に接触させた細胞のトリチウムチミジンの取り込み量を比較しているグラフを示す。
【図５】V110-CBDおよびV110の異なる濃度と接触した細胞に誘導されるトリチウムチミジンの取り込み量を比較しているグラフである。
【図６】CBD-成長因子によって、心筋レーザ処理血管再生術（transmyocardial laser revascularization）の効果の増強を図示している概要図である。
【図７】CBD-成長因子によって、合成血管移植片にトラップした内皮細胞の概要図である。
【図８】移植用およびエクソビボ（ex  vivo）での遺伝子治療に利用する内皮細胞性幹細胞捕獲の概要図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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