(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化酵素と酸素供与体との非存在下、グルタチオンと被験物質とを混合した後、前記グルタチオンと被験物質との結合物の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法。
【請求項２】
結合物の有無を質量分析計を用いて測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルタチオンと被験物質との混合条件が、３７℃〜６０℃で、１時間〜２日間である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験物質の濃度が１ｍＭ〜５００ｍＭであり、グルタチオンの濃度が１０μＭ〜１００ｍＭであり、グルタチオンと被験物質とのモル濃度比が１：１００〜２０：１である請求項１、２又は３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物質の皮膚感作性の検定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学物質が皮膚に接触するとアレルギー反応が惹起されることがあることから、例えば医・農薬や化粧品等の化学物質を含む製品を開発するに当っては、その内容物質の皮膚感作性の検定が必要となる。
従来、被験物質の皮膚感作性を検定する方法としては、実験動物に被験物質を経皮投与して、その投与部位の皮膚反応を観察する方法（Maximization試験、Buehler試験等）、実験動物に被験物質を経皮投与して、リンパ球の増殖を調べる方法（Local Lymph Node Assay等）などが知られている。そして、かかる検定方法は、実験動物の飼育の他、被験物質の実験動物への投与や、皮膚観察、血液検査といった煩雑な作業を必要とし、また、そのための期間を要する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
医・農薬や化粧品等の開発に際しては、厳格な毒性試験が要求されていることから、最終的には上記のような動物実験による皮膚感作性の有無についての検定も必要とされている。しかしながら、開発初期段階における開発候補化合物の全てについて、このような動物実験を実施すると、多数の実験動物、多量の被験物質および多大な時間を要することから、被験物質の皮膚感作性を、少量の被験物質で、より簡便に、かつ迅速に検定する方法の開発が強く求められていた。
本発明の目的は、このような煩雑な動物実験を行うことなく、被験物質の皮膚感作性を簡便かつ迅速に検定する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、モノマーとしての分子量が約５万以下のシステイン含有ペプチドと被験物質とを混合し反応させた際の該ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することにより、当該被験物質の皮膚感作性を検定し得ることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
モノマーとしての分子量が５万以下のシステイン含有ペプチドと被験物質とを混合した後、前記ペプチドと被験物質との結合物の有無を測定することを特徴とする被験物質の皮膚感作性の検定方法
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の検定方法につき説明する。
本発明の検定方法において使用し得るペプチドは、システイン残基を1個以上含み、かつ、モノマーとしての分子量が約５万以下のペプチドであって、具体的には例えばグルタチオン等が挙げられる。かかるペプチドを、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩などの有機酸塩等を含む水性緩衝液、もしくは水、またはこれらと有機溶媒との混合溶媒に、例えば約０．０１μM〜約１M程度の濃度、通常約１０μM〜約１００ｍM程度の濃度となるよう溶解する。
被験物質は、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒またはこれらの混合溶媒に、例えば約０．０１μM〜約１M程度の濃度、通常約１ｍM〜約５００ｍM程度の濃度となるよう溶解する。
次いで、上記のペプチド溶液と被験物質溶液とを、ペプチドと被験物質のモル濃度比が例えば１：１００〜２０：１となるように混合し反応させる。該反応には、ペプチド溶液と被験物質溶液との混合液を、例えば約４℃から約６０℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約１０分間〜約２日間程度静置する。
【０００６】
かかる反応により生成した被験物質とペプチドとの結合物の有無は、ペプチド溶液と被験物質溶液との混合液を次のようにして分析することにより測定される。
混合液の分析方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、質量分析（MS）等をあげることができる。また、HPLC、GC、またはTLCのいずれかとMSとを組み合わせた分析方法（LC-MS，GC-MS，TLC-MS）等を用いることもできる。該方法によれば、試料に複数成分が含まれていてもそれらを個々に分離し、それぞれについて質量分析することができる。
上記のHPLC、GC、またはTLCに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、正相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販のカラムやTLCとしては、例えば、LCカラムとしてはSUMIPAX ODS A-212（住化分析センター製）、L-column ODS（化学品検査協会製）、コスモシール5C18-AR-II（ナカライテスク社製）等をあげることができ、TLCプレートではシリカゲル60F254（メルク社製）、Silica Gel 60 Plate（ナカライテスク社製）などを挙げることができる。
また、質量分析で利用することのできるイオン化法としては、例えば、マトリクス支援レーザーイオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法、大気圧イオン化（API）法、電子衝撃イオン化（EI）法、高速原子衝撃イオン化（FAB）法などを挙げることができる。このようなイオン化法に使用可能な市販のイオン源としては、MALDI法の場合、島津／KRATOS社製、PE バイオシステムズ社製、マイクロマス社製、Bruker社製等のイオン源が挙げられる。またESI法の場合、Finnigan Mat社製、マイクロマス社製、サイエックス社製、Hewlett-Packard社製、PE バイオシステムズ社製等のイオン源が挙げられる。質量分析計としては、磁場型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイクロトン共鳴型、飛行時間型の質量分析計をあげることができる。
上記のようにして得られた混合液の分析結果を、例えば、混合前のペプチド溶液および被験物質溶液各々の分析結果と比較し、混合前のペプチド溶液および被験物質溶液からは検出されず、かつ保温後の混合液からのみ検出される成分の有無を調べることにより、ペプチドと被験物質との結合物の有無を測定することができる。かかる分析に、MS、LC-MS、GC-MS、TLC-MS等の質量分析法を用いると、各成分について、質量スペクトルから得られる情報に基づいて質量、構造等を解析してその組成や構造を確認することにより、ペプチドと被験物質との結合物を特定することもできる。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０００８】
実施例１
１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（以下、DNCBと記す。皮膚感作性陽性。質量２０２）を2mg/ml（10mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.1mlと、以下に記載のグルタチオン溶液1〜３のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムを、上記のＤＮＣＢ溶液およびグルタチオン溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１〜３のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、ＤＮＣＢ溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピーク（以下、ピーク１と記す。）が検出された。
【０００９】
[グルタチオン溶液]
１；グルタチオンを3.0mg/ml（9.8mM）となるよう0.2M NaH2PO4-Na2HPO4  pH 6に溶解
２；グルタチオンを3.0mg/ml（9.8mM）となるよう0.2M NaH2PO4-Na2HPO4  pH 8に溶解
３；グルタチオンを3.0mg/ml（9.8mM）となるよう0.2M Na2CO3-NaHCO3  pH 10に溶解
【００１０】
[HPLC測定条件]
島津製作所製LC-10AD
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（６ｍｍ×１５０ｍｍ）
カラム温度：２５℃
流速：１ｍl/min.
検出波長：220nm
溶出液A：蒸留水にＴＦＡを0.1％添加した溶液
溶出液B：アセトニトリルにＴＦＡを0.08％添加した溶液
溶出条件：溶出液Aが95％、溶出液Bが5％の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、30分間かけて溶出液Bの割合を5％から80％にまで上げながら溶出液Aと溶出液Bの混合液を流した。
【００１１】
DNCBを20mg/ml(100mM)となるようアセトンに溶解した溶液0.4mlと、グルタチオンを6.5mMとなるよう0.2M酢酸アンモニウムに溶解した溶液2mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物をメタノールに溶解し、ＭＳに供した。その結果、上記のピーク１に相当する化合物の質量数は４７３と測定された。該質量数は、DNCBから塩素が脱離してグルタチオン（質量３０７）と結合してなる化合物の質量と一致する。
【００１２】
[ＭＳ測定条件]
PEバイオシステムズ製Voyager DE-STR型質量分析計
イオン化；MALDI法
【００１３】
実施例２
トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、TNBSと記す。皮膚感作性陽性。質量３１５）を3.5mg/ml（10mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液２の1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例１に記載の条件にてＨＰＬＣに供した。得られたクロマトグラム（図３）を、上記のグルタチオン溶液およびTNBS溶液をそれぞれ同様に分析して得られたクロマトグラム（図１および図２）と比較した。その結果、TNBS溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピーク（図３；ピーク▲１▼、▲２▼）が検出された。
上記のTNBSとグルタチオンとの混合液を、以下に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。上記のピーク▲１▼および▲２▼にそれぞれ相当するピークのＭＳスペクトル（図４、図５）から、これらのピークに相当する化合物の質量数は、▲１▼が５１８、▲２▼が５１８と測定された。該質量数は、TNBSから−SO3Na基が脱離してグルタチオンと結合してなる化合物の質量と一致する。
また、グルタチオン溶液２に替えて、グルタチオン溶液１を用いて同様に分析した。グルタチオン溶液２を用いた上記結果と同様の結果が得られた。
【００１４】
[ＬＣ−ＭＳ測定条件]
ＬＣ；日立製L-6200(UVはL-4000)
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１２（６ｍｍ×１５０ｍｍ）
カラム温度：２５℃
流速：１ｍl/min.
検出波長：254nm
溶出液A：蒸留水にＴＦＡを0.1％添加した溶液
溶出液B：アセトニトリルにＴＦＡを0.08％添加した溶液
溶出条件：溶出液Aが95％、溶出液Bが5％の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、30分間かけて溶出液Bの割合を5％から80％にまで上げながら溶出液Aと溶出液Bの混合液を流した。
【００１５】
ＭＳ；Finnigan  Mat製  TSQ700型質量分析計
イオン化：ＥＳＩ法
スプレー電圧：4.5kV
キャピラリー温度：２８５℃
シースガス：80psi
オグジュラリーガス：10Unit
【００１６】
実施例３
１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、DCCと記す。皮膚感作性陽性。質量２０６）を21mg/ml（100mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1〜３のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびDCC溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１〜３のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、DCC溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピークが検出された。このピークのＭＳスペクトルから、当該ピークに含まれる化合物の質量数は、５１３と測定された。該質量数は、DCC（質量206）とグルタチオン（質量307）との結合物の質量と一致する。
【００１７】
実施例４
１，２−エポキシオクタン（以下、１，２EOと記す。皮膚感作性陽性。質量１２８）を12mg/ml（100mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1〜３のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液および1,2EO溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１〜３のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、1,2EO溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピークが検出された。このピークのＭＳスペクトルから、当該ピークに含まれる化合物の質量数は、４３５と測定された。該質量数は、1,2EO（質量128）とグルタチオン（質量307）との結合物の質量と一致する。
【００１８】
実施例５
１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（以下、MNNGと記す。皮膚感作性陽性。質量１４７）を14mg/ml（100mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液１または２のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびMNNG溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１または２のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、MNNG溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピークが検出された。このピークのＭＳスペクトルから、当該ピークに含まれる化合物の質量数は、３９４と測定された。該質量数は、MNNGから−Ｎ（ＮＯ）ＣＨ3基が脱離してグルタチオンと結合してなる化合物の質量と一致する。
【００１９】
実施例６
ホルムアルデヒド（３７％水溶液）（以下、FAと記す。皮膚感作性陽性。質量３０）を3mg/ml（37mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1または２のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびFA溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１または２のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、FA溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピークが検出された。このピークのＭＳスペクトルから、当該ピークに含まれる化合物の質量数は、３３７と測定された。該質量数は、FAとグルタチオンとの結合物の質量と一致する。
【００２０】
実施例７
グルタルアルデヒド（25%水溶液）（以下、ＧＡと記す。皮膚感作性陽性。質量１００）を52mg/ml（130mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1または２のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびGA溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１または２のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、GA溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムには認められないピークが２本検出された。これらのピークのＭＳスペクトルから、これらのピークに含まれる化合物の質量数はそれぞれ、４０７および４８９と測定された。質量数４０７は、GAとグルタチオンとの結合物の質量と一致する。また、質量数４８９は、２原子の水素と１原子の酸素の脱離を伴って２分子のGAと１分子のグルタチオンとが結合してなる化合物の質量と一致する。
【００２１】
実施例８
サリチル酸メチル（以下、MSCと記す。皮膚感作性陰性。質量１５２）を15mg/ml（100mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1または２のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびMSC溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１または２のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、MSC溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムに認められないピークは検出されなかった。
【００２２】
実施例９
フェノール（以下、PHと記す。皮膚感作性陰性。質量９４）を9mg/ml（100mM）となるようメタノールに溶解した溶液0.1mlと、実施例１に記載のグルタチオン溶液1または２のいずれか1mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、その20μlを実施例２に記載の条件にてＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣにて得られたクロマトグラムを、上記のグルタチオン溶液およびPH溶液のそれぞれを同様に分析して得られたクロマトグラムと比較した。その結果、１または２のいずれのグルタチオン溶液を用いた場合にも、PH溶液およびグルタチオン溶液それぞれのクロマトグラムに認められないピークは検出されなかった。
【００２３】
実施例１０
エチルスルホニルベンゼン（以下、PVSと記す。皮膚感作性陽性。質量１６８）を16mg/ml（100mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.4mlと、グルタチオンを2mg/ml（6.5mM）となるよう0.2M酢酸アンモニウムに溶解した溶液2mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物をメタノールに溶解し、実施例１に記載の条件にてＭＳに供した。その結果、試料中には、質量数４７５の化合物と質量数６４３の化合物が含まれることが判明した。質量数４７５は、１分子のPVSと１分子のグルタチオンが結合してなる化合物の質量と一致する。また、質量数６４３は、2分子のPVSと１分子のグルタチオンが結合してなる化合物の質量と一致する。
【００２４】
実施例１１
無水マレイン酸（以下、MAと記す。皮膚感作性陽性。質量９８）を9.8mg/ml（100mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.4mlと、グルタチオンを2mg/ml（6.5mM）となるよう0.2M酢酸アンモニウムに溶解した溶液2mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物をメタノールに溶解し、実施例１に記載の条件にてＭＳに供した。その結果、試料中には、質量数４２３の化合物と質量数５２１の化合物が含まれることが判明した。質量数４２３は、１分子のMAと１分子のグルタチオンが結合してなる化合物のＮＨ4+塩の質量と一致する。また、質量数５２１は、2分子のMAと１分子のグルタチオンが結合してなる化合物のＮＨ4+塩の質量と一致する。
【００２５】
実施例１２
メチルメタンスルホネート（以下、ＭＭＳと記す。皮膚感作性陽性。質量１１０）を10mg/ml（100mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.4mlと、グルタチオンを2mg/ml（6.5mM）となるよう0.2M酢酸アンモニウムに溶解した溶液2mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物をメタノールに溶解し、実施例１に記載の条件にてMSに供した。その結果、試料中には、質量数４９７の化合物が含まれることが判明した。該質量数は、２分子のMMSからそれぞれメチル基が脱離し、１分子のグルタチオンに結合してなる化合物の質量と一致する。
【００２６】
実施例１３
フルオレセインイソチオシアネート（以下、FITCと記す。皮膚感作性陽性。質量数３８９）を40mg/ml（100mM）となるようアセトンに溶解した溶液0.4mlと、グルタチオンを2mg/ml（6.5mM）となるよう0.2M酢酸アンモニウムに溶解した溶液2mlとを混合し、３７℃で１時間保温した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物をメタノールに溶解し、実施例１に記載の条件にてMSに供した。その結果、試料中には、質量数６９６の化合物が含まれることが判明した（図７）。該質量数は、FITCとグルタチオンとの結合物の質量と一致する。
【００２７】
【発明の効果】
医・農薬や化粧品等の開発初期段階において、多数の候補化合物のいずれが皮膚感作性を発現するかを、少量の被験化合物で、動物実験を実施することなく、迅速に、かつ簡便に検定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】グルタチオン溶液２（ｐＨ８）の液体クロマトグラムである。GSHはグルタチオンのピークを示す。
【図２】トリニトロベンセンスルホン酸ナトリウム溶液の液体クロマトグラムである。
TNBSはトリニトロベンセンスルホン酸ナトリウムのピークを示す。
【図３】トリニトロベンセンスルホン酸ナトリウム溶液とグルタチオン溶液２（ｐＨ８）を混合し反応させた溶液の液体クロマトグラムである。GSHはグルタチオンのピークを示し、TNBSはトリニトロベンセンスルホン酸ナトリウムのピークを示す。TNBS・GSH反応物▲１▼、TNBS・GSH反応物▲２▼は、グルタチオン溶液２（ｐＨ８）およびトリニトロベンセンスルホン酸ナトリウム溶液それぞれの液体クロマトグラムでは検出されなかったピークを示す。
【図４】TNBS・GSH反応物▲１▼のESI-MSスペクトルである。
【図５】TNBS・GSH反応物▲２▼のESI-MSスペクトルである。
【図６】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）のMALDI-MSスペクトルである。
【図７】FITCとグルタチオンとの反応生成物のMALDI-MSスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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