(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミズキ、シシアクチ、アデク、カンレンボク、エゾミソハギ、ハウチワノキ、マルハチ、テリハハマボウ、シロテツ、ヤマヒハツ、ゴンズイ、デコラゴムノキ、カナダツガ、カツモイノデ、クサソテツ、オウゴンメタセコイヤ、ムレスズメ、ナツツバキ、ブラシノキ、ズボイシア、ブラッシュボックス（Brush Box）、フジウツギ及びオミナエシから選ばれる植物の抽出物を有効成分とするロイシン脱水素酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの不快な体臭の発生を抑制する化粧料に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ヒトの不快な体臭の防除技術には、収斂作用を有する物質や各種のアルミニウムやジルコニウム塩を用いて発汗を抑制する方法、トリクロサン、塩化ベンザルコニウム等の抗菌物質を用いて不快臭発生原因菌の増殖を抑制する方法、発生した低級脂肪酸等の不快な体臭を亜鉛華等により金属塩に変換したり、フラボノイド等の消臭物質により消臭する方法及び香水やオーデコロン等によりマスキングする方法等がある。
【０００３】
しかし、制汗技術、消臭技術及びマスキング技術は、効果の持続性という点で充分でなく、また抗菌技術においては、不快臭の発生原因菌以外に皮膚常在菌をも殺菌することで皮膚の一次バリアー機能を破壊するおそれが示唆されている。
【０００４】
本発明は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭を持続的に抑制できる化粧料を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトの不快な体臭の原因物質の一つとされるイソ吉草酸に着目し、その生成経路について検討したところ、細菌由来のロイシン脱水素酵素を阻害することによりイソ吉草酸の生成が抑えられることを見出すと共に、特定の植物抽出物等が該酵素の阻害活性を有し、皮膚常在菌を殺すことなく不快な体臭の発生を抑制できる化粧料として使用できることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、ロイシン脱水素酵素阻害剤を含有する化粧料を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
イソ吉草酸は、ヒトの体臭、主に足臭及び腋臭の原因臭とされる低級脂肪酸である。本発明者らは、斯かるイソ吉草酸が汗に含まれるロイシンから皮膚に棲息する細菌（枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）又はプロピオン酸菌（Propionibacterium spp.)）由来のロイシン脱水素酵素及び分岐鎖αケト酸脱水素酵素等の酵素系による代謝を介して生成されること、更にロイシン脱水素酵素が上記皮膚上細菌の全てに存在することを明らかにした（参考例１〜２）。従って、ロイシン脱水素酵素酵素を阻害することによりイソ吉草酸の生成を確実に抑制できると考えられる。
【０００８】
一方、ロイシン脱水素酵素を阻害する物質は、これまでに報告された例はなく、本発明において初めて、ミズキ、ハコネウツギ、シシアクチ、アデク、カンレンボク、エゾミソハギ、ハウチワノキ、マルハチ、テリハハマボウ、シロテツ、ヤマヒハツ、ゴンズイ、デコラゴムノキ、カナダツガ、カツモイノデ、クサソテツ、オウゴンメタセコイヤ、ムレスズメ、ナツツバキ、ブラシノキ、ズボイシア、ブラッシュボックス（Brush Box）、フジウツギ及びオミナエシから選ばれる植物の抽出物又はオイゲノールに当該阻害活性があることが見出された（実施例１）。従って、当該植物成分等をロイシン脱水素酵素阻害剤の代表例として挙げることができる。
また、本発明におけるロイシン脱水素酵素阻害剤は、皮膚のバリアー機能の維持に関与する皮膚常在菌に対して抗菌性、望ましくは殺菌性を示さないものが好ましく、斯かる点においても上記植物抽出物及びオイゲノールが好ましい。ここで、殺菌性を示さないとは、Ｔｗｅｅｎ８０を０．５％及びＬ−ロイシンを０．２％含むＳＣＤ培地に、被験物質を添加したものに皮膚常在菌を接種し、３７℃、２４時間反応後に、胞子形成菌(Bacillus subtilis)はコントロールに対し菌数が１／１０以下に減少せず、通常細菌(Staphylococcus epidermidis及びCorynebacterium minutissimumon)はコントロールに対し１／１００以下に減少しないことをいう。
【０００９】
ここで、ミズキとは、ミズキ科（Cornaceae）のミズキ（Cornus controversa Hemsl.）を、ハコネウツギとは、スイカズラ科（Caprifoliaceae）のハコネウツギ（Weigela coraeensis Thunb.）を、シシアクチとは、ヤブコウジ科（Myrsinaceae）のシシアクチ（Ardisia quinquegona Blume）を、アデクとは、フトモモ科（Myrtoceae）のアデク（Syzygium buxifolium Hook.et Arh.)を、カンレンボクとは、オオギリ科(Nyssaceae)のカンレンボク(Nyssa sylvatica Marsh.)を、エゾミソハギとは、ミソハギ科(Lythraceae)のエゾミソハギ(Lytbrum salicaria L.)を、ハウチワノキとは、ムクロジ科(Sapindaceae)のハウチワノキ(Dodonaea viscosa L.)を、マルハチとは、ヘゴ科(Cyatheaceae)のマルハチ(Cyperes alternifolius)を、テリハハマボウとは、アオイ科(Malvaceae)のテリハハマボウ(Hibiscus glaber)を、シロテツとは、ミカン科(Rutaceae)のシロテツ(Boninia glabra Planch.)を、ヤマヒハツとは、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)のヤマヒハツ(Antidesma japonicum S.et Z.)を、ゴンズイとは、ミツバウツギ科(Staphyleaceae)のゴンズイ(Euscaphis japonica Kanitz)を、デコラゴムノキとは、クワ科(Moraceae)のデコラゴムノキ(Ficus elastica)を、カナダツガとは、マツ科(Pinaceae)のカナダツガ(Tsuga)を、カツモイノデとは、ウラボシ科(Polypodiaceae)のカツモイノデ(Ctenitis subglandulosa)を、クサソテツとは、オシダ科(Aspidiaceae)のクサソテツ(Matteuccia struthiopteris L.Todaro)を、オウゴンメタセコイヤとは、スギ科(Taxodiaceae)のオウゴンメタセコイヤ(Metaseouoia glvptostroboides Hu et Cheng)を、ムレスズメとは、マメ科(Leguminosae)のムレスズメ(Caragana sinica)を、ナツツバキとは、ツバキ科(Theaceae)のナツツバキ(Stewartia pseudo-camellia Maxim)を、ブラシノキとは、フトモモ科(Myrtaceae)のブラシノキ(Callistemon speciosus)を、ズボイシアとは、ナス科(Solanaceae)のズボイシア(Duboisia myoporides R.Br.)を、ブラッシュボックス（Brush Box）とは、フトモモ科(Myrtaceae)のブラッシュボックス(Lophostemon confertus)を、フジウツギとは、フジウツギ科(Loganiaceae)のフジウツギ(Buddleja japonica Hemsl.)を、オミナエシとは、オミナエシ科(Valerifoliaceae)のオミナエシ(Patrinia scabiosifolia Fisch)をそれぞれ意味する。
【００１０】
本発明の上記植物は、その植物の全草又は葉、根、果実、種子、花のうち１又は２以上をそのまま又は粉砕して用いられ、これを常温又は加温下において抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、その乾燥末又はペースト状に調製したものが本発明の植物抽出物として使用される。
【００１１】
抽出に用いる溶剤としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ピリジン類等が挙げられ、これらは混合物として用いることもでき、特にジクロロメタン−メタノールの混合溶剤が好ましい。
【００１２】
また、オイゲノールは、天然に多量にオイゲノールを含むけい葉油、めぼうき油、ベイ油等から常法により抽出して得ることができるが、本発明においては、クローブバッドオイル、クローブリーフオイル等のオイゲノール含有香料を用いてもよい。
【００１３】
かくして得られる植物抽出物及びオイゲノールは、ロイシン脱水素酵素阻害作用を有し、皮膚上でのイソ吉草酸の生成を抑制する（後記実施例１〜３）。また、皮膚の常在菌を殺すことがないため、これを有効成分として含有する組成物（ロイシン脱水素酵素阻害剤）は、皮膚の一次バリアー機能を破壊することなく、不快な体臭の発生を抑制することができるデオドランド剤として使用できる。
【００１４】
当該デオドランド剤は、化粧料、外用医薬品又は医薬部外品等の製剤、例えばクリーム、乳液、ローション、パウダー、スプレー、スティック等として用いることができ、またいくつかの使用方法を併用することも可能である。
【００１５】
化粧料、外用医薬品又は医薬部外品として用いる場合のロイシン脱水素酵素阻害剤の含有量は、一般的に０．１〜２０重量％とするのが好ましく、特に０．５〜１０重量％とするのが好ましい。また、植物抽出物としての含有量は、一般的に固形分換算で０．０００１〜１０重量％とするのが好ましく、特に０．００１〜５重量％とするのが好ましい。また、オイゲノールについては０．００１〜０．１重量％とするのが好ましい。
【００１６】
これらの化粧料、外用医薬品又は医薬部外品には、通常用いられる各種成分、例えば化粧料成分として一般的に使用される油分、界面活性剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料等の他、紫外線吸収剤、美白剤、しわ改善剤、保湿剤、皮脂分泌抑制剤、柔軟剤、角質保護剤、薬効剤、酸化防止剤、溶剤等の成分を任意に組み合わせ配合して製剤化することができる。
【００１７】
本発明の化粧料は、足、腋、頭部、陰部等不快臭の発生しやすい箇所に局所的に適用することにより、不快臭の発生を制御することができる。斯かる場合の化粧料の使用量は、有効成分の含有量により異なるが例えば液状製剤の場合皮膚面１cm2当たり１〜２０mg、固形状の製剤の場合、同じく１〜５０mgとするのが好ましい。
【００１８】
【実施例】
製造例１  ミズキ有機溶媒抽出物の製造：
ミズキの葉を乾燥し（乾燥重量２１ｇ）、ジクロロメタン−メタノール（１：１）混合溶媒（３００ｍＬ）を用い室温で３日間抽出した。抽出液は濾過後、減圧下溶媒を留去し、有機溶媒抽出物（約２．１４ｇ）を得た。
【００１９】
製造例２  ハコネウツギ有機溶媒抽出物の製造：
ハコネウツギの葉を乾燥し（乾燥重量２０ｇ）、ジクロロメタン−メタノール（１：１）混合溶媒（３００ｍＬ）を用い室温で３日間抽出した。抽出液は濾過後、減圧下溶媒を留去し、有機溶媒抽出物（約２．３９ｇ）を得た。
【００２０】
製造例３  シシアクチ有機溶媒抽出物の製造：
シシアクチの葉を乾燥し（乾燥重量３．９ｇ）、ジクロロメタン−メタノール（１：１）混合溶媒（１００ｍＬ）を用い室温で３日間抽出した。抽出液は濾過後、減圧下溶媒を留去し、有機溶媒抽出物（約０．５４ｇ）を得た。
【００２１】
製造例４  アデク有機溶媒抽出物の製造：
アデクの葉を乾燥し（乾燥重量１３ｇ）、ジクロロメタン−メタノール（１：１）混合溶媒（２００ｍＬ）を用い室温で３日間抽出した。抽出液は濾過後、減圧下溶媒を留去し、有機溶媒抽出物（約０．８２ｇ）を得た。
【００２２】
製造例５  ミズキ水抽出物の製造：
製造例１において有機溶剤で抽出済みの葉を乾燥し、蒸留水２００ｍＬを加え、５℃で２日間抽出した。次に抽出液は濾過後、凍結乾燥し、水抽出物（１．７４ｇ）を得た。
【００２３】
製造例６  ハコネウツギ水抽出物の製造：
製造例２において有機溶剤で抽出済みの葉を乾燥し、蒸留水２００ｍＬを加え、５℃で２日間抽出した。次に抽出液は濾過後、凍結乾燥し、水抽出物（２．８２ｇ）を得た。
【００２４】
製造例７  シシアクチ水抽出物の製造：
製造例３において有機溶剤で抽出済みの葉を乾燥し、蒸留水２００ｍＬを加え、５℃で２日間抽出した。次に抽出液は濾過後、凍結乾燥し、水抽出物（０．２２ｇ）を得た。
【００２５】
製造例８  アデク水抽出物の製造：
製造例４において有機溶剤で抽出済みの葉を乾燥し、蒸留水２００ｍＬを加え、５℃で２日間抽出した。次に抽出液は濾過後、凍結乾燥し、水抽出物（０．５５ｇ）を得た。
【００２６】
製造例９
製造例１〜８と同様にして、下記表１に示す植物の水抽出物を得た。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
参考例１  各種アミノ酸塗布時の臭い発生率
腋の下に図１に示す各種アミノ酸１％溶液を無臭男性６名の片腋に０．５mL塗布し、酸臭の発生を官能評価した。結果を図１に示す。
【００２９】
腋の下に塗布後１５分〜３０分で、ロイシンのみ１００％（６名）酸臭が確認され、バリンで３３％（２名）、フェニルアラニンで１７％（１名）確認された。また、足底でも同様の結果が得られ、特に足底ではイソ吉草酸特有の臭いが強いことが判った。
【００３０】
参考例２  体臭発生菌の確認
（１）官能評価
足底から採取した汗５mL（ろ過滅菌）にバッファー（ｐＨ７．２，２０mMトリス−ＨＣｌバッファー）で洗浄（３回）した図２に示す５種類の菌体（Staphylococcus aureus、Staphylococcus lugdunensis、Propionibacterium avidum、Propionibacterium granulosum、Bacillus subtilis）を最終菌体量が約１０8 cfu/mLになるように接種し、３７℃、２時間（嫌気性菌は嫌気で）インキュベートした後、反応液の臭い成分を抽出（エーテルで抽出後、Ｎ2で固化）し、臭いの官能評価をした。結果を図２に示す。
【００３１】
（２）菌体内ロイシン脱水素酵素（LeuDH）活性の測定
０．５％Tween ８０、０．２％Ｌ−ロイシンを添加したＳＣＤ寒天培地で生育させた（３０℃、２日）表２に示す５種類のイソ吉草酸臭発生菌の菌体をｐＨ７．０、５０mMリン酸バッファーで集菌、洗浄し、球菌は、５０unitsリゾスタフィン、桿菌は、０．２％リゾチームで酵素処理（３７℃、１時間）した後、超音波破砕し、遠心上清のロイシン脱水素酵素活性を以下の方法により測定した。
ｐＨ１０．５、２５０mMグリシンバッファー１．５mL、６０mM Ｌ−ロイシン１０mL、１００mM ＮＡＤ+９３μl、蒸留水３１７μlを入れ３０℃で予備加温した（ブランク（対照）も同じ）。遠心上清を１００μl入れ、ブランクには使用した酵素液（リゾチーム又はリゾスタフィン）を１００μl入れ、反応を開始した。３０℃で３４０nmにおける吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／min）を求め、サンプルのΔＯＤ／min−ブランクのΔＯＤ／minからロイシン脱水素酵素活性を求めた。また、遠心上清及び、使用した酵素液（リゾチーム又はリゾスタフィン）のタンパク量をＢＩＯ−ＲＡＴ法で測定し、タンパクあたりの活性を求めた。結果を表２に併せて示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
ヒトの皮膚から分離した５菌種のイソ吉草酸発生菌は、ロイシン脱水素酵素活性が高いことが示された。
【００３４】
実施例１  植物抽出物のロイシン脱水素酵素阻害活性
ｐＨ１０．５、２５０mMグリシンバッファー１．５mL、６０mM Ｌ−ロイシン１．０mL、１００mM ＮＡＤ+９３μl、蒸留水１０７μlに図３に示す検体（抽出物）を３００μl、コントロールは、抽出物と同濃度のＥｔＯＨ水溶液を３００μl入れ、３０℃で予備加温した（ブランクも同じ）。ｐＨ９．５，１００mMグリシンバッファーで約２．５units／mLに希釈したLeuDH（和光：ロイシン脱水素酵素、組み換え体、Bacillus由来）を１０μl入れ、ブランクにはｐＨ９．５、１００mMグリシンバッファーを１０μl入れ、反応を開始した。３０℃で３４０nmにおける吸光度を測定し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／min）を求めた。検体のΔＯＤ／min−ブランクのΔＯＤ／minをコントロールと比較し、検体の阻害率を求めた。検体（抽出物）の色が濃いものは、１mmセルを使用するか、検体濃度を１／２から１／１０に希釈して試験をした。結果を図３に示す。
【００３５】
ミズキ、ハコネウツギ、シシアクチ、アデク、カンレンボク、エゾミソハギ、ハウチワノキ、マルハチ、テリハハマボウ、シロテツ、ヤマヒハツ、ゴンズイ、デコラゴムノキ、カナダツガ、カツモイノデ、クサソテツ、オウゴンメタセコイヤ、ムレスズメ、ナツツバキ、ブラシノキ、ズボイシア、ブラッシュボックス（Brush Box）、フジウツギ、オミナエシ及びオイゲノールには優れたロイシン脱水素酵素活性阻害効果が認められた。
【００３６】
実施例２  イソ吉草酸生成抑制作用
足底から採取した汗５mL（ろ過滅菌）にミズキ抽出物（固形分として１００ppm）を添加し、バッファー（ｐＨ７．２、２０mMトリス−ＨＣｌバッファー）で洗浄（３回）した皮膚分離菌（Bacillus subtilis）を最終菌体量が約１０8cfu／mLとなるように接種し、３７℃、２時間インキュベートし、ミズキ抽出物無添加と、イソ吉草酸生成量と菌数を比較した。
【００３７】
イソ吉草酸の生成量は、スクリュウキャップ付試験管に反応（培養）液５mL、安息香酸４０ppm（内部標準）、三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノール溶液２mLを入れ、８０℃、１時間反応し、空冷後、ヘキサン１．５mL加え攪拌後、遠心分離しヘキサン層を回収し、回収したヘキサン層を濃縮し、ガスクロマトグラフィーより測定した（カラム条件；Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−１、流速１．８mL／min、スプリット比１：５０、昇温条件；８０℃：５min、８０℃→３００℃：２０℃／min、３００℃：１５min）。
また、菌数測定は、生理食塩水で希釈後、ＳＣＤＬＰ寒天培地に塗抹し、３０℃、２４時間培養し、コロニーをカウントすることにより行った。結果を図４及び図５に示す。
【００３８】
ミズキ抽出物を１００ppm添加することにより、イソ吉草酸生成量が、約４割抑制された。また、菌数は、ミズキ無添加と同レベルで、菌を殺さず、ロイシン脱水素酵素を阻害することでイソ吉草酸の生成を抑制したと考えられる。
【００３９】
実施例３  オイゲノールのイソ吉草酸生成抑制効果
皮膚分離菌株の枯草菌（Bacillus subtilis）を使用し、オイゲノール０．０２％及び０．０４％でイソ吉草酸の生成抑制効果を確認した。
ＳＣＤ培地に０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、０．２％ロイシンを加えた培地にサンプル１０％／５０％ＥｔＯＨを各濃度になるように添加し、培養は、培地５mLに培地で洗浄（３回）した皮膚分離菌株（Bacillus subtilis）を最終菌体量がだいたい１０8cfu／mLになるように接種し、３７℃、２４時間インキュベートし、イソ吉草酸生成量及び菌数を測定した。イソ吉草酸の生成量は及び菌数の測定は実施例２と同様に行った。結果を図６及び図７に示す。
【００４０】
菌数は、コントロールと同等であった。また、イソ吉草酸生成量は、オイゲノールでは減少していた。
これらのことから、オイゲノールは、濃度によっては、菌を殺さず、ロイシン脱水素酵素を阻害することでイソ吉草酸の生成を抑制すると考えられる。
【発明の効果】
本発明の化粧料は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭の発生を持続的に抑制できることから、優れた消臭効果と高い安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種アミノ酸塗布時の臭い発生率を示した図である。
【図２】図２は各種体臭発生菌についての足底汗の臭いを評価した図である。においスコアにおける「０」は無臭、「１」は微香、「２」は弱い臭い、「３」は認知できる強さの臭い、「４」はやや強い臭い、「５」は強い臭いを示す。
【図３】図３は植物抽出物等のロイシン脱水素酵素阻害の阻害率を示した図である。
【図４】図４はミズキ抽出物を用いた場合のイソ吉草酸の生成量を示した図である。
【図５】図５はミズキ抽出物を用いた場合の菌数の変化を示した図である。
【図６】図６はオイゲノールを用いた場合の菌数の変化を示した図である。
【図７】図７はオイゲノールを用いた場合のイソ吉草酸の生成量を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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