(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被処理水中に１０Ｅ−７Ｍ以下の濃度で含有されているステロイド骨格をもつ女性ホルモン類を酸化チタン光触媒を用いて分解するとともに、その女性ホルモン活性を失活させることを特徴とする、ステロイド骨格をもつ女性ホルモン類のホルモン活性失活方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境汚染物質としてのステロイド骨格をもつ物質、とくに女性ホルモン類を含有する排水中の女性ホルモン作用を除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境中に放出された化学物質の内、体内に入ったホルモンの産生、分泌を乱したり、ホルモン受容体に結合しホルモン様作用を示したり、あるいはホルモンの作用を阻害したりして、固体の生殖、発生、成長に影響を及ぼす化学物質を環境ホルモンあるいは内分泌攪乱物質と呼ぶが、その大部分が女性ホルモン（エストロゲン）様作用をもち、ヒトを含めた動物の生殖への影響が懸念されている。
【０００３】
この環境中の内分泌攪乱物質としては様々な物質が知られてきており、とくにステロイド骨格をもつ物質の影響が懸念されている。中でも、ヒト及び家畜の尿に由来し、下水あるいは生活廃水に含まれる女性ホルモンそのものとその代謝物や女性ホルモン製剤（以下、女性ホルモン類と言うこともある。）は、河川や湖の環境汚染をし内分泌攪乱物質としてかなりの部分に寄与しているものと考えられている。女性ホルモンは体内で生成、分泌されるが、近年更年期障害の治療用の薬剤としてあるいは避妊用のピルとして、また家畜では肉質改善のため餌として体内にとりこまれ、代謝され尿や糞便中に排泄されている。これらは女性ホルモンそのものであり、また避妊目的のためのピルではホルモン作用が持続するように高濃度に作られている。女性の体内を通過して、ピルの大半は女性ホルモンそのものとして環境中に放出される。すでに欧米では生態系を変える環境汚染物質として大きな問題となり、また日本でも近年ピルが解禁され今後の問題となろうとしており、環境の保全のためには何らかの対策が必要である。
【０００４】
通常の下水処理では、流入する女性ホルモンは主に生物処理槽における吸着作用により十分の一程度に減らすことができる。しかし、女性ホルモンはホルモンそのものであるために他の環境中の物質に比べて極めて低い濃度で作用し高い活性を持つため、通常の下水処理だけでは不充分である。
【０００５】
また従来、ステロイド骨格をもつ女性ホルモンのホルモン活性を除去する方法としては、酵素反応による抱合体形成や、活性基の置換などの方法と活性炭等を用いた吸着法により行われてきた。これらの方法は効率が悪く、材料となる酵素や、活性炭などが高価であり、大量の処理には向いていない。また、吸着による方法は吸着材の廃棄や再処理が必要でありその際のホルモンの再度の流出や汚染の可能性がある。したがって、ホルモンの吸着ではなく分解による方法が望ましいが、そのような方法はいままでなかった。
【０００６】
一方、近年、酸化チタンの光触媒反応が注目されつつあり、酸化チタン光触媒が各種有機物の分解に極めて有効であることが知られつつある。この酸化チタンは触媒として作用するものであるから、各種有機物の分解においては、酸化チタン自身は環境に対しまったく悪影響を及ぼさない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の課題は、排水中に含まれる女性ホルモン類の環境汚染への問題と、酸化チタン光触媒の優れた有機物分解活性とに着目し、ステロイド骨格をもつ物質、とくに女性ホルモン類の処理の分野に酸化チタン光触媒を活用することを初めて提案することにあり、それによって、今後問題となる、女性ホルモン類に代表されるステロイド骨格をもつ物質による環境汚染を防止することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明に係るステロイド骨格をもつ女性ホルモン類のホルモン活性失活方法は、被処理水中に１０Ｅ−７Ｍ以下の濃度で含有されているステロイド骨格をもつ女性ホルモン類を酸化チタン光触媒を用いて分解するとともに、その女性ホルモン活性を失活させることを特徴とする方法からなる。
【００１２】
本発明においては、下水処理等に応用すべくステロイド骨格をもつ女性ホルモン類の分解にもとづくホルモン活性の除去に酸化チタン光触媒反応を応用した基本的方法の開発の検討を行った。その結果、本発明に係るステロイド骨格をもつ女性ホルモン類のホルモン活性失活方法においては、短時間に水中の女性ホルモンを一万分の一程度まで減らすことができ、ホルモン活性も消失させることができることが明らかとなった。
【００１３】
この酸化チタン光触媒を用いる方法は、下水、生活廃水、産業廃水、用水や河川、湖水等の浄化に応用できる。とくにこの方法は、
（１）効率よく女性ホルモンとその類似物質を分解し活性を除去できる、
（２）分解効率は光量、酸化チタン光触媒量、反応時間で容易に調節できる、
（３）自然光も十分応用可能である、
（４）酸化チタン光触媒はくり返し使用可能である、
（５）分解反応の相手となる物質の選択性は少ないので複合的な化学物質の分解にも対応できる、
等の利点をもつ。
【００１４】
したがって、本発明に係るステロイド骨格をもつ女性ホルモン類のホルモン活性失活方法により、排水中に含まれる女性ホルモン類を効率よく大量処理することが可能になり、環境汚染の問題を解消することが可能になる。また、酸化チタン光触媒は、繰り返し使用可能であるから、本発明に係る方法は、大量の処理を安価にしかも二次的な汚染を生じることなく実施できる方法である。さらに、生態系を破壊しヒトにも大きな影響をあたえる可能性のある女性ホルモン類の対策に広く役立つ方法でもある。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に係るステロイド骨格をもつ女性ホルモン類のホルモン活性失活方法の望ましい実施の形態について説明する。
図１は、本発明の一実施態様に係る方法を実施するためのステロイド骨格をもつ物質の除去装置を示しており、１は除去装置全体を示している。除去装置１においては、供給されてくる被処理水としての排水２は、まず貯槽３に貯留される。貯槽３からの被処理水は、ポンプ４によって通水手段５へと送られる。通水手段５は、管状のもの、平板状のもののいずれでもよく、また、流路も、直進状に形成されたのもの、蛇行状に形成されたのもののいずれでもよい。この通水手段５の被処理水との接触面、つまり内面には、酸化チタン光触媒層６が成膜されている。
【００１６】
通水手段５上には、該通水手段５内の酸化チタン光触媒層６に向けて光、本実施態様では紫外線を照射する紫外線照射手段７が設けられている。本実施態様では、紫外線照射手段７からの紫外線は、通水手段５の外面から内面側の酸化チタン光触媒層６へと通水手段５の壁を透過して到達するようになっているので、通水手段５の壁は、透明または半透明の材質で構成されている。
【００１７】
通水手段５を通過した処理水は、循環ライン８を介して貯槽３に戻され、貯槽３から再び通水手段５へと送られて処理が繰り返されるようになっている。所定時間の処理が終了した処理水９は、放流されるか、あるいは、必要に応じて他成分除去のための二次処理工程に送られる。この循環ライン８と処理水排出ライン１０との切替えは、バルブ１１、１２の切替えによって行われる。
【００１８】
上記のような装置によって、被処理水中に含有されているステロイド骨格をもつ女性ホルモン類が、紫外線照射手段７からの紫外線照射による酸化チタン光触媒層６の活性により、分解される。紫外線照射手段７から照射される紫外線の波長を、酸化チタン光触媒の励起波長である３８０ｎｍ、とくに３６０ｎｍ近傍の波長に設定することにより、高い分解効率が得られる。
【００１９】
酸化チタン光触媒層６によるステロイド骨格をもつ女性ホルモン類の分解特性を、以下のように確認した。
【００２０】
まず、女性ホルモンとしての１７β−estradiol を水に溶かし、酸化チタンを加えて攪拌し、紫外線を照射し（波長：３６０ｎｍ、照射強度：６ｍＷ／ｃｍ2 ）、時間経過に伴う１７β−estradiol の濃度を、Radio-Immuno-Assay法（ＲＩＡ法）にて測定した。試験は、酸化チタンを加えずに紫外線照射のみを行った場合、試験液１ｍｌ当たり５０μｇの酸化チタンを加えるとともに紫外線照射を行った場合、２５０μｇの酸化チタンを加えるとともに紫外線照射を行った場合、２５０μｇの酸化チタンを加え紫外線照射を行わなかった場合、のそれぞれについて実施した。結果を図２に示す。
【００２１】
図２から分かるように、酸化チタンの添加と紫外線の照射の両方を行った場合のみ、１７β−estradiol の大きな濃度低下が得られた。
【００２２】
次に、上記のように女性ホルモンが酸化チタン光触媒によって分解されると、女性ホルモン活性（エストロゲン活性）がどのようになるかを測定した。実験は、表１に示す実験群Ｉ〜Ｖの条件で行った。結果を図３に示すが、酸化チタンの添加と紫外線の照射の両方を行った実験群ＩＩＩ〜ＩＶでは、エストロゲン活性がほとんど無くなっていることが分かる。つまり、女性ホルモンがほぼ完全に近く分解されていることが分かる。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
なお、上記の実験におけるエストロゲン活性は次のように測定した。
ホルモン応答配列の下流にレポーター遺伝子を配置したプラスミドを培養細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を検出するレポーターアッセイを用いる。酵母にエストロゲンレセプター発現プラスミド及びレポータープラスミドを導入し、レポーターとして発現したβ-Galactosidase反応からレポーター遺伝子の発現量を求める。
【００２５】
酵母前々培養として、BJ3505(ER transformed)ＭＭ寒天培地を用い、シングルコロニーアイソレーションにて、３０℃、７２時間静培養したＭＭ培地組成は:
Yeast Nitrogen Base  :   ６．７ｇ／ｌ
Dextrose             :     ２０ｇ／ｌ
L-Lysine-HCl         :   ３６ｍｇ／ｌ
L-Histidine-Hcl      :   ２４ｍｇ／ｌ
Bactoagar            :     ２０ｇ／ｌ
とした。
【００２６】
前培養として、ＭＭ液体培地１０ｍｌ（試験管）に１コロニー接種し、３０℃、１８〜２０時間振とう培養した。
【００２７】
菌濃度調整として、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ測定後、ＭＭ培地でＯ．Ｄ．１．０に調整した。
【００２８】
本培養として、ＭＭ培地１０ｍｌ（試験管）に、菌液を２５０μｌ、１０ｍＭＣｕＳＯ4 を５０μｌ、β-Estradiol溶液５０μｌを添加し、３０℃、１８〜２０時間振とう培養した。
【００２９】
次に菌濃度をＯ．Ｄ．６００ｎｍにて測定した。そして、生理食塩水２５０μｌ、菌液１５０μｌを混合し、１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心上清除去することにより、菌洗浄した。
【００３０】
溶菌として、Z-bufferを７００μｌ、０．１％ＳＤＳ溶液を２５μｌ、Chloroformを５０μｌ添加してボルテックスで強攪拌後、３０℃、Incubate  ５ｍｉｎ、室温放置（２０ｍｉｎ以上) の順に処理した。
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【００３１】
β-galactosidase反応させるため、o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside (４ｍｇ／ｍｌ,in Z-buffer）を添加し、２０ｍｉｎ反応後、１Ｍ  Ｎａ2 ＣＯ3 を添加した。しかる後、１４０００ｒｐｍ、４ｍｉｎの条件で遠心操作を行った。吸光度をＯ．Ｄ．４２０ｎｍにて測定した。ユニット計算は、次式によった。
(O.D.420 nm × 1000)／（反応時間(min) ×菌液量(ml)× O.D.600nm）
【００３２】
上述の如く、とくに図２、図３に示した結果から、酸化チタン光触媒とそれへの光照射により、際立った女性ホルモンの分解、除去効果が得られることが分かる。このような効果は、基本的に、ステロイド骨格をもつ物質に対して同様に得られる。
【００３３】
本発明が、基本的にステロイド骨格をもつ物質に対して有効であり、とりわけ各種女性ホルモンの分解、除去に有効であることを確認するために、前述の１７β−estradiol 以外の女性ホルモンについて試験を行った。試験は、天然型女性ホルモンと合成型女性ホルモンについて行った。
【００３４】
まず、代表的な天然型女性ホルモンであるエストロンとエストリオールに対する分解特性を試験した。エストロンとエストリオールを水に溶かし、エストロン（初発濃度：５×１０Ｅ−８Ｍ）とエストリオール（初発濃度：５×１０Ｅ−８Ｍ）の混合液のサンプルを調製した。このベースサンプルを用いて、図４、図５に示すような各種サンプルについて試験した。図４、図５において、"control" と表示されているのは、上記ベースサンプル自身の経時特性を測定したものであり、"TiO2"と表示されているのは、上記ベースサンプルに２５０μｇ／ｍｌの酸化チタンを加えて攪拌したサンプルの光照射なしの条件での経時特性を測定したものであり、"UV"と表示されているのは、上記ベースサンプルに酸化チタンを加えることなく紫外線を照射した条件での経時特性を測定したものであり（紫外線波長：３６０ｎｍ、照射強度：６ｍＷ／ｃｍ2 ）、"TiO2+UV" と表示されているのは、上記ベースサンプルに酸化チタンを加えるとともに紫外線を照射した条件での経時特性を測定したものである（酸化チタン添加量：２５０μｇ／ｍｌ、紫外線波長：３６０ｎｍ、照射強度：６ｍＷ／ｃｍ2 ）。測定は４０分間行った。
【００３５】
図４、図５から明らかなように、エストロンとエストリオールともに、酸化チタンの添加と紫外線の照射の両方を行うことにより、濃度が大幅に低下していき、女性ホルモンが良好に分解されていることが分かる。したがって、女性ホルモン活性も無くすことができる。酸化チタンの添加、紫外線の照射のいずれか一方のみでは、効果がないことも分かる。
【００３６】
次に、代表的な合成型女性ホルモンであり、薬剤として使われることがあるジエチルステルベステロール（以下、「ＤＥＳ」と略称することもある。）と、ピル中に使われることがあるエチニルエストラダイオール（以下、「ＥＥＳ」と略称することもある。）に対する分解特性を試験した。ＤＥＳとＥＥＳをそれぞれ水に溶かし、ＤＥＳのサンプル（初発濃度：１０Ｅ−７Ｍ）と、ＥＥＳのサンプル（初発濃度：１０Ｅ−９Ｍ）をそれぞれ調製した。これらベースサンプルに、２５０μｇ／ｍｌの酸化チタンを加えて攪拌したサンプルに対し、紫外線を照射した場合と、照射しない場合とについて、エストロゲン活性（女性ホルモン活性）の低下度合を測定した。照射する紫外線の強度は６ｍＷ／ｃｍ2 とし、ＤＥＳのサンプルに対しては１０分間照射し、ＥＥＳのサンプルに対しては４０分間照射した。
【００３７】
結果、図６に示すように、紫外線を照射しなかった場合にはエストロゲン活性の変化は実質的に無かったが、酸化チタンを添加し紫外線を照射した場合には、ＤＥＳ、ＥＥＳともに、分解によりエストロゲン活性を大幅に低下させることができた。なお、図６における"TiO2-UVA"と表示されているのは、酸化チタンは添加したが紫外線を照射しなかった場合を示しており、"TiO2+UVA"と表示されているのは、酸化チタンを添加し紫外線を照射した場合を示している。
【００３８】
上述した各試験では、照射する光として紫外線を用いたが、本発明においては、太陽光（自然光）を用いることも可能である。このことを確認するために以下の試験を行った。
【００３９】
女性ホルモンとしての１７β−estradiol を水に溶かし（初発濃度：１０Ｅ−７Ｍ）、それに酸化チタンを加えないサンプルと、酸化チタンを５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ添加したサンプルとを調製し、各サンプルに対し、自然光（太陽光）を照射した（波長：３６０ｎｍ、強度：１．８〜２．０ｍＷ／ｃｍ2 ）。試験は屋外で午前１０時３０分から午後０時３０分までの２時間行い、その時の天候は「晴れ時々曇り」であり、気温は３７〜３８℃（日陰：３３℃）であった。
【００４０】
結果、図７に示すように、酸化チタンを添加しなかった場合には（図７において、「−ＴｉＯ2 〕ｔｏ表示）、自然光を照射してもエストロゲン活性はほとんど変化しなかったが、酸化チタンを添加した場合には、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌの両サンプルともに、自然光４０分照射後にはエストロゲン活性がほぼ完全に無くなった。この結果、自然光（太陽光）であっても、女性ホルモンとしての１７β−estradiol を充分に分解できることが確認できた。
【００４１】
さらに、酸化チタンを添加して光照射により女性ホルモンを分解する場合、光照射量（光のフォトン数）とどのような関係があるかを確認する試験を行った。
試験は、女性ホルモンとしての１７β−estradiol を水に溶かし、酸化チタンを２５０μｇ／ｍｌ添加してサンプルを調製し、このサンプルに紫外線を照射した場合の、１７β−estradiol の濃度（ｐｇ／ｍｌ）のフォトン数に対する関係を測定した。
【００４２】
結果、図８に示すように、１７β−estradiol の濃度は、光照射量（光のフォトン数）にほぼ比例して低下するが、フォトン数の高い領域では、その効果がやや飽和する傾向にあることが分かった。したがって、女性ホルモンを分解するためには、あるレベル以上のフォトン数で充分であることが分かった。つまり、格別強度の高い紫外線照射手段等を使用する必要はなく、通常の紫外線照射手段等で充分であると考えられる。
【００４３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る方法によれば、被処理水中に含有されているステロイド骨格をもつ女性ホルモン類を酸化チタン光触媒を用いて極めて効果的に分解、除去できるので、今後問題となる、ステロイド骨格をもつ女性ホルモン類による環境汚染を防止することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施態様に係るステロイド骨格をもつ物質の除去装置の概略構成図である。
【図２】酸化チタン光触媒によるステロイド骨格をもつ物質の除去効果を確認するための実験における特性図である。
【図３】酸化チタン光触媒処理による女性ホルモン活性除去効果を確認するための実験における特性図である。
【図４】酸化チタン光触媒処理による女性ホルモン分解効果を確認するための別の実験における特性図である。
【図５】酸化チタン光触媒処理による女性ホルモン分解効果を確認するためのさらに別の実験における特性図である。
【図６】酸化チタン光触媒処理による女性ホルモン活性除去効果を確認するためのさらに別の実験における特性図である。
【図７】酸化チタン光触媒処理による太陽光照射下での女性ホルモン分解効果を確認するためのさらに別の実験における特性図である。
【図８】酸化チタン光触媒処理における、照射する光のフォトン数と女性ホルモン分解効果との関係を確認するためのさらに別の実験における特性図である。
【符号の説明】
１  ステロイド骨格をもつ物質の除去装置
２  ステロイド骨格をもつ物質を含有する排水
３  貯槽
４  ポンプ
５  通水手段
６  酸化チタン光触媒層
７  紫外線照射手段
８  循環ライン
９  処理水
１０  処理水排出ライン
１１、１２  切替えバルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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