(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物に対するリガンドとベース担体とが化学結合してなり、−１０〜１０ｍＶの荷電（ゼータ電位、ｐＨ６〜８の水溶液中）を有してなる免疫測定用粒状担体であって、前記ベース担体が化学式（１）で表されるカルボキシメチル基（Ｐ１）及び／又は化学式（２）で表されるポリオキシアルキレン基（Ｐ２）が化学結合してなるベース担体であることを特徴とする免疫測定用粒状担体。
【化１】
0004421601.tif 000009
但し、Ｒは、アミノ基、イミダゾリル基又はグアニジル基を有する炭素数１〜４のアルキル基、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｏは酸素原子である。
【化２】
0004421601.tif 000010
但し、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、Ｒ’は水素原子、カルボキシエチル、炭素数１〜４のアルキル、炭素数２〜４のアルケニル、炭素数６〜７のアリール又は炭素数１〜４のアシル基、Ｏは酸素原子、ｘ、ｙ及びｚは０〜１２の整数を表し、（ｘ＋ｙ＋ｚ）は４〜２４である。
【請求項２】
２０〜１０００ｎｍの体積平均粒子径を有する請求項１に記載の粒状担体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫測定用粒状担体と、測定対象物を含む検体とを反応させる工程及びこの反応の前後で生じた濁度変化を計測する工程を含む凝集免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定用粒状担体及びこの製造方法に関する。詳しくはラテックス凝集免疫測定用として好適である粒状担体及びこの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラテックス凝集免疫測定用の担体は、免疫反応性を向上させた担体（非特異的反応の防止を含む）が知られている。例えば、（１）ベース担体と抗体とを物理吸着させる時に多価アルコールを存在させて得られる担体（特許文献１）、（２）ベース担体と抗体とを物理吸着させた後アニオン性多糖で処理して得られる担体（特許文献２）等が知られている。
また、免疫凝集法用抗体（担体を必要としない）としては、（３）等電点電気泳動法等により陰性荷電を帯びさせた抗体（特許文献３）が提案されている。
【特許文献１】特開平９−３０４３８６号公報
【特許文献２】特許第３０４０２２４号公報
【特許文献３】特許第３３３３５６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、（１）及び（２）の担体では、多価アルコールやアニオン性多糖が担体に物理吸着されているだけなので、経時的にこれらの物質が脱離するという問題がある。
また、（３）の抗体では、測定感度が著しく低く、また仮にこの抗体を粒状担体に結合し免疫測定用粒状担体としても荷電量が不十分であり、測定感度が低いという問題がある。
本発明の目的は、このような現状に鑑み、免疫反応性を長期間安定に維持できる免疫測定用粒状担体及びこの製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の免疫測定用粒状担体の特徴は、測定対象物に対するリガンドとベース担体とが化学結合してなり、−１０〜１０ｍＶの荷電（ゼータ電位、ｐＨ６〜８の水溶液中）を有してなる免疫測定用粒状担体であって、前記ベース担体が化学式（１）で表されるカルボキシメチル基（Ｐ１）及び／又は化学式（２）で表されるポリオキシアルキレン基（Ｐ２）が化学結合してなるベース担体である点を要旨とする。
【化１】
0004421601.tif 000002
但し、Ｒは、アミノ基、イミダゾリル基又はグアニジル基を有する炭素数１〜４のアルキル基、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｏは酸素原子である。
【化２】
0004421601.tif 000003
但し、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、Ｒ’は水素原子、カルボキシエチル、炭素数１〜４のアルキル、炭素数２〜４のアルケニル、炭素数６〜７のアリール又は炭素数１〜４のアシル基、Ｏは酸素原子、ｘ、ｙ及びｚは０〜１２の整数を表し、（ｘ＋ｙ＋ｚ）は４〜２４である。
また、本発明の免疫測定用粒状担体の製造方法の特徴は、ベース担体と測定対象物に対するリガンドとを化学結合させてリガンド結合担体を得る工程（１）、及びリガンド結合担体と荷電調節物質とを化学結合させて免疫測定用粒状担体を得る工程（２）を含む点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の免疫測定用粒状担体は、免疫反応性を長期間安定に維持できる。したがって、本発明の粒状担体を用いると、長期間にわたって高感度に測定対象物を定量することができる。そして、本発明の免疫測定用粒状担体の製造方法は、本発明の免疫測定用粒状担体の製造に最適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
測定対象物に対するリガンドとは、測定対象物に特異的に結合する物質を意味する。すなわちたとえば、測定対象物が抗原の場合、リガンドは抗原に対する抗体である。また、測定対象物が抗体の場合、リガンドは抗体が認識する抗原である。また、測定対象物が糖鎖の場合、リガンドはレクチンである。また、測定対象物がビオチンの場合、リガンドはアビジンである。また、測定対象物が遺伝子の場合、リガンドは相補的な遺伝子である。また、測定対象物及びリガンドは、抗原及び抗体の場合と同様に、その一方をリガンドとして使用できる。
【０００７】
リガンドとしては、例えば「免疫化学的同定法（第３版）」（1993，東京化学同人）に記載の抗原に対する抗体や、MSRS catalog［Manufacturers' Specification & Reference Synopsis catalog Primary Antibodies（ISBN No.0-9643268-3-3, 1995, Aerie Corporation）］に記載の抗体や、特開２００１−２６４３３２号公報に記載の特異的結合物質が挙げられる。これらのうち、測定感度等の観点から、抗体が好ましく、さらに好ましくは癌マーカー（ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９及びＣＡ１２５等）に対する抗体、高分子ホルモン（甲状腺刺激ホルモン、インシュリン及びプロラクチン等）に対する抗体、血清蛋白（β２−ミクログロブリン、フェリチン及びＣＲＰ等）に対する抗体、及びウイルス及びウイルス関連抗原（ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原等）に対する抗体である。
なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はこれらの混合のいずれであってもよい。モノクローナル抗体の場合、測定感度等の観点から測定対象物に対する認識部位の異なる複数の抗体を組み合わせて使用することが好ましい。さらに、抗体は、抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等であってもよい。
【０００８】
ベース担体としては、従来免疫測定法に用いられる担体（例えば、「検査と技術」vol.28, No.11, 2000年10月,1378-1381頁、「検査と技術」vol.16, No.7, 1988年増刊号,606-613頁に記載）のうち、リガンドと化学結合できる官能基（アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、ヒロドキシル基等）を有しているもの等が使用でき、シリカ粒子、及び変性ラテックス（ポリスチレンラテックスにカルボキシル基を導入したカルボキシ変性ラテックス、アミノ基を導入したアミノ変性ラテックス、メルカプト基を導入したメルカプト変性ラテックス等）等が含まれる。これらのうち、測定感度等の観点から変性ラテックスが好ましく、さらに好ましくはカルボキシ変性ラテックスである。
【０００９】
ベース担体の粒子径は測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択できるが、ベース担体の体積平均粒子径（ｎｍ）は、２０〜１０００が好ましく、さらに好ましくは３０〜５００、特に好ましくは５０〜３００である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
ベース担体の粒子径は、測定感度の観点等から、バラツキが小さい方が好ましく、粒子径の変動係数が１０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは３％以下である。なお、変動係数は、（粒子径分布の標準偏差／体積平均粒子径）×１００により算出される。粒子径分布の標準偏差及び体積平均粒子径は、レーザー回折散乱式粒径分布測定装置（たとえば、堀場製作所製、Partica LA-950）により測定される。
ベース担体の粒子の形状については、特に限定なく、球状、回転楕円体状、平板状、不定形状等いずれの形状でもよいが、測定感度等の観点から、球状が好ましい。
【００１０】
ベース担体とリガンドとの化学結合は、ベース担体とリガンドとが直接化学結合しても、結合材を介して間接的に化学結合してもよい。化学結合については、従来公知の方法が使用でき、例えば、Immunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Acdemic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Acdemic Press (1996)、又はAnal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法等が適用できる。
化学結合は、例えば、（１）ベース担体の官能基がカルボキシル基の場合、可溶性カルボジイミド｛1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride等｝等とベース担体とを反応させて、ベース担体のカルボキシル基を活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（リガンドのアミノ基が活性化されたカルボキシル基と直接化学結合する方法）；（２）ベース担体の官能基がカルボキシル基の場合、方法（１）と同様にカルボキシル基を活性化した後、アミノ基とカルボキシル基を有する物質（結合材、例えばε−アミノカプロン酸）を反応させ、さらにε−アミノカプロン酸のカルボキシル基を方法（１）と同様に活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（結合材を介して、カルボキシル基とアミノ基とを間接的に化学結合する方法）；（３）ベース担体の官能基がアミノ基の場合、グルタルアルデヒドとベース担体とを反応させて、ベース担体のアミノ基を活性化した後、これとリガンドとを反応させる方法（リガンドのアミノ基とアミノ基がグルタルアルデヒドによるシッフ塩基で架橋され化学結合する方法）；（４）ベース担体の官能基がメルカプト基の場合、メルカプト基とリガンドのアミノ基とを二架橋性試薬［N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide等］で架橋反応させる方法；（５）ベース担体の官能基がヒドロキシル基の場合、アミノ基を有するシランカップリング剤等とベース担体とを反応させて、これとリガンドとを反応させる方法；等により形成される。
これらの化学結合のうち、化学結合の形成のし易さ等の観点から（１）ベース担体のカルボキシル基とリガンドのアミノ基とを直接化学結合する方法及び（２）結合材を介して、カルボキシル基とアミノ基とを間接的に化学結合する方法が好ましく、さらに好ましくは（１）ベース担体のカルボキシル基とリガンドのアミノ基とを直接化学結合する方法である。
【００１１】
化学結合するリガンド量は、リガンドの力価、測定対象物、又は測定感度等により適宜設定できるが、測定感度等の観点からベース担体１ｍｇ当たり、２〜２００μｇ程度が好ましく、さらに好ましくは５〜１５０μｇ、特に好ましくは１０〜１００μｇである。
【００１２】
本発明の免疫測定用粒状担体の荷電（ｍＶ；ゼータ電位、ｐＨ６〜８の緩衝液中）は、−１０〜１０、好ましくは−１０〜５、さらに好ましくは−６〜２、次にさらに好ましくは−６〜１、特に好ましくは−６〜０、最も好ましくは−４〜０である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
免疫測定用粒状担体の荷電が−１０ｍＶ未満または１０ｍＶを超えると測定感度が悪くなる。
【００１３】
荷電（ゼータ電位）は、従来公知の電気泳動法により測定される（例えば、ＪＩＳ  Ｒ１６３８：１９９９に準拠した方法）。電気泳動法を応用したゼータ電位測定機器は広く市販されており、たとえば、レーザーゼータ電位計ＥＬＳ−８０００（大塚電子株式会社製）等が挙げられる。
【００１４】
本発明の免疫測定用粒状担体は、測定感度等の観点から荷電を制御するための特定の官能基を有することが好ましい。
特定の官能基としては、カルボキシル基とアミノ基とを有する有機基、並びにアルキル基、ヒドロキシル基及びポリオキシアルキレン基等が挙げられる。これらのうち、測定感度等の観点からカルボキシル基とアミノ基とを有する有機基、ヒドロキシル基及びポリオキシアルキレン基が好ましく、さらに好ましくはカルボキシル基とアミノ基とを有する有機基及びポリオキシアルキレン基である。
【００１５】
アルキル基には、炭素数１〜３のアルキル基等が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
カルボキシル基とアミノ基とを有する有機基には、化学式（１）で表されるカルボキシメチル基（Ｐ１）等が含まれる。
【化１】
0004421601.tif 000004
但し、Ｒは、アミノ基、イミダゾリル基又はグアニジル基を有する炭素数１〜４のアルキル基、Ｃは炭素原子、Ｈは水素原子、Ｏは酸素原子である。
【００１６】
（Ｐ１）としては、アミノブチルカルボキシメチル基、アミノプロピルカルボキシメチル基、アミノエチルカルボキシメチル基、アミノメチルカルボキシメチル基、イミダゾリルメチルカルボキシメチル基、イミダゾリルエチルカルボキシメチル基、イミダゾリルメチルカルボキシメチル基、グアジニノプロピルカルボキシメチル基、グアジニノエチルカルボキシメチル基及びグアジニノメチルカルボキシメチル基等が挙げられる。これらのうち、測定感度等の観点からアミノプロピルカルボキシメチル基、イミダゾリルメチルカルボキシメチル基及びグアジニノプロピルカルボキシメチル基が好ましい。
【００１７】
ポリオキシアルキレン基には、化学式（２）で表されるポリオキシアルキレン基（Ｐ２）等が含まれる。
【化２】
0004421601.tif 000005
但し、ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基（測定感度等の観点からオキシプロピレンが好ましい）、Ｒ’は水素原子、カルボキシエチル、炭素数１〜４のアルキル、炭素数２〜４のアルケニル、炭素数６〜７のアリール又は炭素数１〜４のアシル（水素原子又はカルボキシエチルが好ましい）、Ｏは酸素原子、ｘ、ｙ及びｚは０〜１２の整数（ｘ及びｚは２〜１２が好ましく、ｙは０〜４が好ましい）を表し、（ｘ＋ｙ＋ｚ）は４〜２４（測定感度等の観点から好ましくは６〜２４）である。
【００１８】
（Ｐ２）としては、ヒドロキシエチルポリオキシエチレン（６〜２４）基、ヒドロキシエチルポリオキシエチレン（２〜１０）ポリオキシプロピレン（２〜４）ポリオキシエチレン（２〜１０）基、メトキシエチルポリオキシエチレン（６〜２４）基、ｔ−ブトキシポリオキシエチレン（６〜２４）基等が挙げられる。なお、括弧内の数値はオキシエチレン基又はオキシアルキレン基の個数である。
【００１９】
本発明の免疫測定用粒状担体は、リガンドとベース担体とを化学反応させて得ることができるが、測定感度等の観点からさらに荷電調節物質を化学反応で結合させることが好ましい。すなわち、本発明の免疫測定用粒状担体の製造方法としては、ベース担体と測定対象物に対するリガンドとを化学結合させてリガンド結合担体を得る工程（１）、及びリガンド結合担体と荷電調節物質とを化学結合させて免疫測定用粒状担体を得る工程（２）を含むことが好ましい。
【００２０】
荷電調節物質としては、アミノ酸、ペプチド（又はタンパク質）、アミノアルコール及びアミノ基を有するポリオキシアルキレングリコール等が含まれる（リガンドは含まない）。
アミノ酸としては、ベース担体との化学結合に供されるアミノ基と、アミノ酸由来のカルボキシル基と当量のアミノ基とを有するアミノ酸（すなわち、アミノ基の数がカルボキシル基の数よりも１個多いアミノ酸）等が用いられ、リジン、ヒスチジン、アルギニン、δ−ヒドロキシリシン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−６−アミノヘキサン酸、アルビジイン、オルニチン及び４−オキサリシン等が挙げられる。アミノ酸の炭素数としては、２〜２０が好ましい。
ペプチド（又は及びタンパク質）としては、等電点が中性領域にあるペプチド（又はタンパク質）等が用いられ、ポリカルシトニン、α−グリアジン、コリシンＥ２、コリンアセチラーゼ及びピンギナイン等が挙げられる。ペプチド（又はタンパク質）の分子量としては、５００〜１００、０００が好ましい。
アミノアルコールとしては、炭素数２〜４のアミノアルコール等が用いられ、２−アミノエタノール、２−（２−アミノエトキシ）エタノール、３−アミノ−１−プロパノール及び３−アミノ−１，２−プロパンジオール等が挙げられる。
アミノ基を有するポリオキシアルキレングリコールとしては、アミノエチルポリオキシエチレン（重合度６〜２４）オキシエチルアルコール、３−アミノプロピルポリオキシエチレン（重合度６〜２４）オキシエチルアルコール、アミノエチルポリオキシエチレン（重合度６〜２４）−ｔ−ブチルエーテル、アミノエチルポリオキシエチレン（重合度６〜２４）オキシエタンカルボン酸等が挙げられる。
これらのうち、化学結合の形成のし易さ等の観点からアミノ酸、アミノアルコール及びアミノ基を末端に有するポリオキシアルキレングリコールが好ましく、さらに好ましくはアミノ酸及びアミノ基を有するポリオキシアルキレングリコールである。
【００２１】
工程（１）は、従来公知の方法、例えばImmunochemistry 6, 43-52 (1969)、Immunochemistry 6, 53-66 (1969)、Immobilised Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992)、Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)、Anal. Lett. 18(B9), 1143-1155 (1985)、又はProc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5374-5378 (1987)に記載された方法
等に準じて行うことができる。
【００２２】
工程（２）は、工程（１）と同様に従来公知の方法が適用できる。
ベース担体と電荷調整物質とが化学結合することにより、本発明の免疫測定用粒状担体の免疫反応による凝集活性をさらに長期間維持することができる。
【００２３】
本発明の粒状担体の粒子径は測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択することができ、この体積平均粒子径（ｎｍ）は、２０〜１０００が好ましく、さらに好ましくは３０〜５００、特に好ましくは５０〜３００である。これらの範囲であると、測定感度がさらに良好となる。
粒状担体の粒子径は、測定感度の観点等から、バラツキが小さい方が好ましく、粒子径の変動係数が２０％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは８％以下である。
【００２４】
本発明の免疫測定用粒状担体は、従来公知の凝集免疫測定用の粒状担体と同様に免疫測定に使用できる。
凝集免疫測定方法には、本発明の免疫測定用粒状担体と、測定対象物を含む検体とを反応させる工程、及びこの反応の前後で生じた濁度変化を計測する工程等が含まれる。
免疫測定の方法は、粒子の凝集を検出する方法であれば、特に限定はなく従来公知の方法（例えば、特許２６８２６９７号公報、特開２００２−２５０７２８号公報又は特開２００２−３６５２９６号公報に記載された測定法）が適用できる。
本発明の免疫測定用粒状担体は、適当な緩衝剤（リン酸緩衝液等のｐＨ緩衝剤等）、凝集促進剤等と組み合わせて免疫測定用キットとすることもできる。
【００２５】
以上のように、本発明の免疫測定用粒状担体は、免疫反応性を長期間安定に維持でき、かつ高感度な免疫測定を可能とする。また本発明の製造方法は、長期間安定な免疫測定用粒状担体を提供できる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径２００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）１００μＬ、ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬ、ＷＳＣ溶液（可溶性カルボジイミド、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochlorideの１Ｍ水溶液）５００μＬを、遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で１時間、チューブローラー（アズワン株式会社製、型番ＶＭＲ−５）を用い１００ｒｐｍで撹拌させた（カルボキシ変性ラテックスと可溶性カルボジイミドとを反応させた）。次いで、この遠心管を１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に純水１５００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散し、再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿にＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散した。この分散液に、抗ＡＦＰポリクローナル抗体［ダコ・サイトメーション（株）製、品番；Ａ０００８］を蛋白量として０．３ｍｇ加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、撹拌しながら反応させた。反応後、８０００ｒｐｍ（約６５００Ｇ）、１０分遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス（沈殿）を得た。
引き続き、この沈殿にAmino-dPEGn t-butyl ester (n=4）［Quanta BIODESIGN社製］１０ｍｇを含むＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）１ｍＬを加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、撹拌しながら反応させた。反応後、８０００ｒｐｍ（約６５００Ｇ）、１０分遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．０５重量％となるように希釈して、本発明の粒状担体（１）を含むラテックス試薬（１）を得た。
【００２７】
＜実施例２〜１２＞
Amino-dPEGn t-butyl ester (n=4）の代わりに、Amino-dPEGn t-butyl ester (n=8）［実施例２］、Amino-dPEGn t-butyl ester (n=12）［実施例３］、Amino-dPEGn t-butyl ester (n=24）［実施例４］、Amino-dPEGn acid (n=4）［実施例５］、Amino-dPEGn acid (n=8）［実施例６］、Amino-dPEGn acid (n=12）［実施例７］、Amino-dPEGn acid (n=24）［実施例８］｛以上、いずれもQuanta BIODESIGN社製｝、リジン［実施例９］、ヒスチジン［実施例１０］、アルギニン［実施例１１］又は３−アミノ−１−プロパノール［実施例１２］を用いたこと以外、実施例１と同様にして、本発明の粒状担体（２）〜（１２）を含むラテックス試薬（２）〜（１２）を得た。
【００２８】
＜比較例１＞
実施例１で得た抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス（沈殿）に、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．０５重量％となるように希釈して、比較用のラテックス試薬（Ｈ１）を得た。
【００２９】
＜比較例２＞
ポリスチレンラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径２００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）１００μＬ、抗ＡＦＰポリクローナル抗体［ダコ・サイトメーション（株）製、品番；Ａ０００８］を蛋白量として０．３ｍｇ含むＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを、遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた（抗体が物理吸着でラテックスに結合）。次いで、この遠心管を１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス（沈殿）を得た。引き続き、この沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散した。再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．０５重量％となるように希釈して、比較用のラテックス試薬（Ｈ２）を得た。
【００３０】
＜比較例３＞
ポリスチレンラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径２００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）１００μＬ、抗ＡＦＰポリクローナル抗体［ダコ・サイトメーション（株）製、品番；Ａ０００８］を蛋白量として０．３ｍｇ含むＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）８９５μＬ及びグリセリン５μＬを、遠心管に加え、室温（２０〜３０℃）で２時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた（抗体が物理吸着でラテックスに結合）。次いで、この遠心管を１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散した。再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．０５重量％となるように希釈して、比較用のラテックス試薬（Ｈ３）を得た。
【００３１】
＜比較例４＞
実施例１で得た抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス（沈殿）に、カルボキシメチルセルロースを１重量％含む脱イオン水を２０００μＬ加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散し、４℃で、４時間、チューブローラーを用い１００ｒｐｍで撹拌させた。再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）２０００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散した。再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）９００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を調製した。
この抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ラテックス分散液を、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で、ラテックスの含有量が０．０５重量％となるように希釈して、比較用のラテックス試薬（Ｈ４）を得た。
【００３２】
＜実施例１３＞
実施例４で得たラテックス試薬（４）２ｍＬを遠心管に加え、１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心した後、上清をアスピレーターで吸引除去し、沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）２０００μＬを加え、ボルテックスミキサーを用いて再分散した。再度１５０００ｒｐｍ（約２００００Ｇ）、１５分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去し、この沈殿に１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）２０００μＬを加え、超音波破砕機（トミー社製、品番ＵＤ−２０１）で２分間処理し再分散することにより、ラテックス試薬（１３）を得た。
【００３３】
＜実施例１４＞
１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に代えて１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）を用いたこと以外、実施例１３と同様にしてラテックス試薬（１４）を得た。
【００３４】
＜実施例１５＞
ラテックス試薬（４）に代えてラテックス試薬（１２）を用いたこと以外、実施例１３と同様にしてラテックス試薬（１５）を得た。
【００３５】
＜実施例１６＞
ラテックス試薬（４）に代えてラテックス試薬（１２）を用い、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に代えて１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）を用いたこと以外、実施例１３と同様にしてラテックス試薬（１６）を得た。
【００３６】
＜実施例１７＞
ラテックス試薬（４）に代えてラテックス試薬（８）を用いたこと以外、実施例１３と同様にしてラテックス試薬（１７）を得た。
【００３７】
＜実施例１８＞
ラテックス試薬（４）に代えてラテックス試薬（８）を用い、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に代えて１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．５）を用いたこと以外、実施例１３と同様にしてラテックス試薬（１８）を得た。
【００３８】
＜アミノ基を有するポリオキシアルキレングリコールの合成＞
＜合成例１＞
温度計、攪拌機を備えたＳＵＳ製オートクレーブに、３−アミノ−１−プロパノール｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝７５重量部、水酸化カリウム｛和光純薬工業（株）製、試薬特級｝１．３重量部及び（１）エチレンオキシド４８４重量部を仕込み、常法により、１５０℃で３時間（滴下時間、熟成時間を含む。以下同じ）反応させた後、さらに（２）プロピレンオキシド５８重量部を仕込み常法により、１５０℃で１時間反応させた。さらに（３）エチレンオキシド４８４重量部を仕込み、常法により、１５０℃で１時間反応させた後、活性白土を用いて常法により水酸化カリウムを吸着除去して、アミノ基含有ポリオキシアルキレングリコール（Ｐ２０１）を得た。
【００３９】
＜合成例２＞
（１）エチレンオキシド４８４重量部を３９６重量部に、（２）プロピレンオキシド４４０重量部を２３２重量部に、及び（３）エチレンオキシド４８４重量部を４４０重量部に変更したこと以外合成例１と同様にして、アミノ基含有ポリオキシアルキレングリコール（Ｐ２０２）を得た。
【００４０】
＜実施例１９〜２０＞
Amino-dPEGn t-butyl ester (n=4）の代わりに、アミノ基含有ポリオキシアルキレングリコール（Ｐ２０１）＜実施例１９＞、アミノ基含有ポリオキシアルキレングリコール（Ｐ２０２）＜実施例２０＞を用いたこと以外、実施例１と同様にして、本発明の粒状担体（１９）〜（２０）を含むラテックス試薬（１９）〜（２０）を得た。
【００４１】
＜実施例２１〜２４＞
カルボキシ変性ラテックス分散液（ＪＳＲ社製、体積平均粒子径２００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）の代わりに、カルボキシ変性ラテックス分散液（商品名estapor、Merck Chimie SAS社製、体積平均粒子径３０ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）＜実施例２１＞、カルボキシ変性ラテックス分散液（商品名estapor、Merck Chimie SAS社製、体積平均粒子径５０ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）＜実施例２２＞、カルボキシ変性ラテックス分散液（商品名estapor、Merck Chimie SAS社製、体積平均粒子径３００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）＜実施例２３＞、カルボキシ変性ラテックス分散液（商品名estapor、Merck Chimie SAS社製、体積平均粒子径１０００ｎｍ、ラテックス含有量１０重量％）＜実施例２４＞を用いた以外実施例１と同様にして、本発明の粒状担体（２１）〜（２４）を含むラテックス試薬（２１）〜（２４）を得た。
【００４２】
＜比較例５＞
実施例４で得たラテックス試薬（４）に代えて、比較例１で得たラテックス試薬（Ｈ１）を用いたこと以外、実施例１３と同様にして、比較用のラテックス試薬（Ｈ５）を得た。
【００４３】
＜比較例６＞
実施例４で得たラテックス試薬（４）に代えて、比較例１で得たラテックス試薬（Ｈ１）を用いたこと、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）に代えて、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）を用いたこと以外、実施例１３と同様にして、比較用のラテックス試薬（Ｈ６）を得た。
【００４４】
＜ゼータ電位の測定＞
実施例１〜２４で得たラテックス試薬（１）〜（２４）及び比較例１〜６で得たラテックス試薬（Ｈ１）〜（Ｈ６）について、以下のようにしてゼータ電位を測定した。
ゼータ電位測定装置「ゼータサイザーナノＺＳ」（シスメックス株式会社製）のゼータ電位測定用キャピラリーセルに、検体（ラテックス試薬）７５０μＬを分注し、測定温度３７℃でゼータ電位を測定した。この測定を３回繰り返し、これらの算術平均値を表１に示した。
【００４５】
【表１】
0004421601.tif 000006
【００４６】
＜評価＞
実施例１〜２４で得たラテックス試薬（１）〜（２４）及び比較例１〜６で得たラテックス試薬（Ｈ１）〜（Ｈ６）と、標準ＡＦＰ溶液（三洋化成工業株式会社製、「スフィアライト  ＡＦＰコントロールセット」、ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬ）を用いて、ラテックス試薬の感度を求めた。
＜濁度測定＞
（１）分光光度計測定セル（島津製作所製、ミクロブラックセルＬ、光路長１０ｍｍ）に、１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）１００μＬ、検体１０μＬを加えて均一撹拌した後、５分間保持した。
なお、検体として、標準ＡＦＰ溶液（三洋化成工業株式会社製、「スフィアライト  ＡＦＰコントロールセット」、ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
また、以下の工程を含む全ての操作は、３７℃に管理された恒温室で実施した。
（２）引き続き、評価サンプル（ラテックス試薬）を１００μＬ加えて均一撹拌し、直ちに濁度（α１）を計測した後、５分間反応させ、直ちに濁度（α２）を計測した。
なお、濁度の計測は、島津製作所製のＵＶｍｉｎ−１２４０（測定波長：５７０ｎｍ）を使用した。
（３）［｛濁度（α２）｝−｛濁度（α１）｝］×１００００を濁度変化量（β１）とし、表２に示した。
（４）検体として、標準ＡＦＰ溶液（三洋化成工業株式会社製、「スフィアライト  ＡＦＰコントロールセット」、ＡＦＰ濃度４００ｎｇ／ｍＬ）を使用した以外、上記（１）〜（３）と同様にして、濁度変化量（β２）を求め、表２に示した。
また、濁度変化量（β２）を濁度変化量（β１）で除した比（β２／β１：感度）を表２に示した。
【００４７】
【表２】
0004421601.tif 000007
本発明の免疫測定用粒状担体を用いると、免疫反応に伴う著しい濁度変化が認められた。また、荷電（ゼータ電位）の絶対値が小さい粒状担体（ラテックス試薬）ほど、測定感度が高い傾向があった。
比較例１〜６の担体では免疫反応に伴う濁度変化がきわめて小さく、荷電の絶対値が大きいため、粒子間の反発力により凝集が形成されなかったと考えられる。
【００４８】
＜長期保存安定性評価＞
実施例４、８、９及び１２で得たラテックス試薬（４）、（８）、（９）及び（１２）、比較例３及び４で得たラテックス試薬（Ｈ３）及び（Ｈ４）について、以下のようにして、長期保存安定性を評価した。
【００４９】
＜保存条件＞
サンプル（ラテックス試薬）を、密閉ガラス瓶中、１０℃で保存した。保存期間３日目及び９０日目に、感度の測定を行った。
【００５０】
＜濁度測定＞
１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に代えて、ＰＥＧ６０００Ｓ（三洋化成工業株式会社製、ポリオキシエチレングリコール；数平均分子量６０００）２重量％［測定感度を高めるための凝集促進剤として使用した］を含む１重量％牛血清アルブミン含有ＨＥＰＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を用いた以外は、上記の＜濁度測定＞と同様にして、保存期間３日目及び９０日目の濁度を求めた後、濁度変化量（β２）を濁度変化量（β１）で除した比（β２／β１：感度）を算出し表３に示した。
また、感度の比［感度（９０日目）／感度（３日目）］を長期保存安定性として（値が１に近いほど安定性が良いことを示す）表３に示した。
【００５１】
【表３】
0004421601.tif 000008
本発明の粒状担体（実施例４、８、９及び１２）は、９０日目でも高い感度を維持しており、長期保存安定性が０．９〜１．１の範囲内にあり、極めて安定であることが判った。