(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIを発現する組換え微生物であって、
プラスミドｐＬＯＩ１９０８、ｐＬＯＩ１９０９及びｐＬＯＩ１９１０からなる群より選択されるプラスミドを含み、
前記ホスホ-β-グルコシダーゼ及び前記（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIが前記微生物にとって異種であり、
かつ、前記ホスホ-β-グルコシダーゼ及び前記（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIが、Klebsiella oxytoca起源の核酸分子によりコードされる、
エタノール産生組換え微生物。
【請求項２】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼがZymomonas起源の核酸分子によりコードされる、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記アルコールデヒドロゲナーゼがZymomonas起源の核酸分子によりコードされる、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼがZymomonas mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列と同一又は少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記アルコールデヒドロゲナーゼがZymomonas mobilisアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と同一又は少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項６】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする核酸分子を含む組換え核酸分子であって、
プラスミドｐＬＯＩ１９０８、ｐＬＯＩ１９０９及びｐＬＯＩ１９１０からなる群より選択されるプラスミドを含み、
かつ、前記ホスホ-β-グルコシダーゼをコードする核酸分子、及び
前記（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする核酸分子が、Klebsiella oxytoca起源の核酸分子である、
組換え核酸分子。
【請求項７】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼがZymomonas起源のものである、請求項６に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
セロビオースを請求項１〜５のいずれかに記載の組換え微生物に接触させるステップを含む、エタノールを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
大部分の燃料エタノールは現在、コーンスターチ又はショ糖のヘキトース糖からS. cerevisiae又はZ. mobilisを用いて生成されている。しかしながら、このような糖類は比較的高価なバイオマス糖の源であり、食料としての競合する価値も有している。その代わりとして、主要かつ安価な更新可能なバイオマス源が、反故紙や、埋立地から出た土砂ゴミ中にリグノセルロースという形で存在する。リグノセルロースは主にセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンの混合物である。セルロースはグルコースのホモポリマであるが、ヘミセルロースは主要構成成分であるキシロースだけでなくかなりの量のアラビノース、マンノース、グルコース及びガラクトースから成るより複雑なヘテロポリマである。この豊富なバイオマス源（反故紙及び土砂ゴミ）中に存在する糖類残渣を微生物によって転化すれば、１００億ガロンを超えるエタノールが供給されるであろうと予測される。
ヘミセルロースの加水分解により形成される糖類混合物をエタノールに効果的に発酵させることのできる組換え微生物が公知である。例えば、米国特許で、Ingram氏らの第5,028,539号、Ingram氏らの第5,000,000号、Ingram氏らの第5,424,202号、Fowler氏らの第5,487,989号、Ingram氏らの第5,482,846号、Fowler氏らの第5,554,520号、Picataggio氏らの第5,514,583号、及び、同時係属出願である1994年12月27日出願の米国特許出願番号08/363,868号、1995年6月7日出願の米国特許出願番号08/475,925号、1994年3月28日出願の米国特許出願番号08/218,914号を参照されたいが、これらすべての教示するところ全体を参考文献としてここに編入することとする。同様に、これらの特許及び出願は、セルロースの完全及び部分的加水分解の両方の生成物、即ちグルコース及びジサッカリドというセロビオースを発酵させてエタノールにすることのできる組換え微生物を説くものである。
しかしながら、ヘミセルロースの加水分解産物及びセルロースの加水分解産物の両方、特にジサッカリドというセロビオースを、発酵を通じてエタノールを高収率で生成する過程で資化することのできるような単一の生物を開発できれば非常に有利であろう。
発明の概要
本発明は、Klebsiella oxytocaのcas ABオペロンをエタノール産生微生物、例えばEscherichia coli K011又はZymomonas mobilis CP4、に挿入すると優れたセロビオース輸送系ができ、従ってセルロース物質を発酵させてエタノールにする優れた能力を持った組換え微生物が生まれるという発見に基づくものである。このK. oxytocaのcas ABオペロンは、（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II及びホスホ-β-グルコシダーゼをコードするものである。
このように、ある一つの実施例では、ここに説明された本発明は、セロビオースを効果的に輸送することで、エタノールを生成する際にヘミセルロース及びセルロースの両方を資化できる新規な組換えエタノール産生微生物に関する。当該微生物は、（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II及びホスホ-β-グルコシダーゼをコードする、異種の単離された核酸分子K. oxytoca cas ABオペロンにより特徴付けることができる。このセロビオース資化酵素IIは、ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系から得られる。当該微生物は、好ましくはキシロース、グルコース又はこの両方を発酵させてエタノールにすることのできる微生物であるとよい。本発明はさらに、相同体を含め、K. oxytoca cas ABオペロンをコードする単離された及び／又は組換え核酸分子、その有効断片又は変異体、これらの単離された及び／又は組換え核酸分子のコードするたんぱく質、K. oxytoca cas ABオペロンを含有するプラスミド、及び、これらの新規な組換え生物をエタノール生成に用いる方法、に関するものである。
ある態様では、本発明はピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdcとも言及する）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adhとも言及する）、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノール-ピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIを発現する組換え微生物に関する。概略的には、当該組換え微生物は、上記の物質を充分に機能的な量、発現することで、一次発酵産物としてのエタノールを高収率で容易に生成可能にするものである。
Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノール-ピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、この組換え微生物にとって異種（即ち外来）であるが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼはこの組換え微生物にとって天然のものでも又は異種のものでもよい。
具体的な実施例としては、当該組換え微生物のピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼはZymomonas起源の核酸分子によりコードされる。より具体的な実施例では、この組換え微生物のピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼは、Zymomonas mobilis（以下、Z. mobilis）が発現するであろう対応する酵素と同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施例では、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及び／又はKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、Klebsiella oxytoca起源の核酸分子によりコードされる。別の実施例では、このホスホ-β-グルコシダーゼはKlebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼと同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有する。更なる実施例では、この（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、Klebsiella oxytoca（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIと同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有する。
本発明の二番目の態様は、Zymomonasピルビン酸デカルボキシラーゼ、Zymomonasアルコールデヒドロゲナーゼ、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子を含む組換え微生物に関し、前記分子はセロビオースをエタノールに転化させるのに充分な量、発現する。いくつかの実施例では、当該微生物はさらに、例えば自発的又は変異誘発因子との接触により変異させられたものである。更なる実施例では、この変異した微生物は予め、例えば、概ね公知であり、本明細書、及び、ここに参考文献として編入することとする同時係属出願である1994年12月27日出願の米国特許出願08/363,868号、及び1997年4月7日出願の弁護士整理番号UF97-02番に説かれた方法に基づき、強化選別にかけられたものである。
本発明のこの態様のある一つの好適な実施例では、当該ZymomonasはZymomonas mobilisである。別の好適な実施例では、当該KlebsiellaはKlebsiella oxytocaである。
ある具体的な実施例では、当該組換え微生物は、Zymomonas mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ及びKlebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子を含む。更なる具体的な実施例では、この異種の核酸分子は単一のプラスミドとして微生物に挿入される。特定の実施例では、微生物に単一のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、この微生物にとって内生又は異種のいずれでもよい共通の調節制御下にある。特定の実施例では、微生物に一個のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、微生物中でプラスミド上に位置する。別の実施例では、微生物に一個のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、その微生物の染色体に組み込まれる。
さらに別の特定の実施例では、Zymomonas mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼをコードするこの異種の核酸分子は、Klebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸-依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子とは別のプラスミドで、組換え微生物中に挿入される。ある特定の実施例では、この別々のプラスミドで挿入された異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、その微生物にとって内生の調節制御下にある。別の特定の実施例では、この別々のプラスミドで挿入された異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、この微生物にとって異種の調節制御下にある。さらなる実施例では、この別々のプラスミドで挿入された異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、微生物中のプラスミド上に位置し、選択に応じて、この別々のプラスミドで挿入された異種の核酸分子のうちの少なくとも一つはこの微生物の染色体に組み込まれる。
グルコース及びキシロースをエタノールに効率的に転化させることができ、と同時にセロビオースを生物の代謝に向けて輸送することのできる単一の生物が得られれば、優れた同時発酵が可能となり、従って、固体の分離及び加水分解後の洗浄といった、別々の発酵が必要な手法で要されるステップが不要になるであろう。これらのステップが不要になれば経費を大幅に削減できるであろう。加えて、両方の基質（ヘミセルロース及びセルロース）を用いてエタノールを作製できるため、単量体の糖濃度及びセルロース濃度は、それぞれ別々に発酵を行なった場合よりも低くて済み、それでも尚匹敵するエタノール最終濃度を達成することができる。このことでさらに経費が削減でき、また著しくエネルギ集中的かつ複雑であるハイ・ソリッズ・リアクタ（原語：high solids reactor）から、固体をスラリとしてポンプ輸送する電動式のフロー・リアクタへというシフトが可能となるであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の前述及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面で示されたように、本発明の好適な実施例をより具体的に説明した以下の記載から明白となろう。尚、前記図面において、同様の参照記号は異なる図を通じて同じ部品を言及するものである。図面は必ずしも実寸ではなく、本発明の原理の実例を挙げることに重きを置いている。
図１は、セロビオース（50gリットル-1）を含有するルリア・ブロス中での、親株（プラスミドpLOI1906を持つK011）及び変異株MM106の成長（振盪フラスコ）を比較した図である。培養株を、セロビオース（60gリットル-1）を加えたルリア・ブロスを50ml入れた振盪フラスコ（250ml）中で35℃でインキュベートした。
図２Ａは、明示したプラスミドを持つE. coli K011の組換え株を、p-ニトロフェニル-β-D-グルコシドをモデル基質として用いて試験管内で比較した図である。細胞はグルコース（50gリットル-1）を含有するルリア・ブロス内で成長させた。
図２Ｂは、糖を加えない状態で、グルコース（50gリットル-1）、及びセロビオース（50gリットル-1）を含有するルリア・ブロス内で成長させたK. oxytoca P2を、p-ニトロフェニル-β-D-グルコシドをモデル基質として用いて試験管内で比較した図である。
図３Ａは、プラスミドpLOI1906と、casオペロンのE. coli K011内での発現を促進したプラスミドpLOI1908、pLOI1909及びpLOI1910での自発的欠失とを比較した図である。太線はベクタpUC18を表し、細線はK. oxytocaを由来とするDNAを表す。
図３Ｂは、ベクタDNA及びK. oxytoca DNAの一部の欠失を含んだプラスミドpLOI1908、pLOI1909及びpLOI1910の領域を、もとのプラスミドpLOI1906と比較してヌクレオチド配列を整列させた図である。
図４Ａは、明示したプラスミドを有するE. coliの組換え株によるセロビオースの発酵によるエタノール生成を表すグラフである。
図４Ｂは、明示したプラスミドを有するE. coli K011の組換え株によるセロビオースの発酵による細胞成長を表すグラフである。
図５は、明示したプラスミドを持つK. oxytaca P2及びE. coli K011による、混合反故事務紙（100gリットル-1）の同時糖化発酵法である。
図６は、pLOI1837を持つ組換えZ. mobilisでのK. oxytoca casABオペロンの発現を判定する試験管内アッセイの結果を示す。活性は、o-ニトロフェニル-6-ホスフェート（ONPG-P）からのo-ニトロフェノール（ONP）の遊離として測定した。結果は、三つの反復試験の平均を示したものである。
図７は、pLOI1836を持つ組換えZ. mobilisでのE. coli ptsHIオペロンの発現を判定する試験管内アッセイの結果を示す。この組合せアッセイでは、pLOI1837を持つ組換えZ. mobilisから発現させたPTS酵素II複合体及びホスホ-セロビアーゼをカップラとして作用させた。pLOI1837組換え体［Zm（pLOI1837）］から採った細胞抽出液をZm（pLOI1836）から採ったものと混合した。活性はp-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）からのp-ニトロフェノール（PNP）の遊離として測定した。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図８は、組換えE. coli［DH5α（pLOI1906）］及びZ. mobilis［Zm（pLOI1832）］でのセロビオース加水分解の全体的活性を試験管内比較した結果を示す。活性は、p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）からのp-ニトロフェノール（PNP）の遊離として測定した。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図９は、K. oxytoca及び組換えE. coliでのセロビオース加水分解の全体的活性の試験管内比較の結果を示す。活性は、p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）からのp-ニトロフェノール（PNP）の遊離として測定した。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図１０は、E. coli（DH5α）を標準として用いてZ. mobilisでのE. coli ptsHIオペロンの発現を推定した図である。この組合せアッセイでは、pLOI1837を持つ組換えZ. mobilisから発現させたPTS酵素II複合体及びホスホ-セロビアーゼをカップラとして作用させた。活性はp-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（PNPG）からのp-ニトロフェノール（PNP）の遊離として測定した。点線はZm（pLOI1832）からの活性、及び、対応するDH5α細胞抽出液の量を表す。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図１１は、組換えE. coli DH5α（pLOI1906）を標準として用いてZ. mobilisでのK. oxytoca casBオペロンの発現を推定した図である。活性はo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド6-ホスフェート（ONPG-P）からのo-ニトロフェノール（ONP）の遊離として測定した。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図１２は、Z. mobilisにおけるcasABオペロンの発現に対するptsHIオペロンの発現の影響を判定するための試験管内アッセイの結果を示す。活性はo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド6-ホスフェート（ONPG-P）からのo-ニトロフェノール（ONP）の遊離として測定した。結果は三つの反復試験の平均を示したものである。
図１３は、いくつかの細菌でのセロビオース代謝のモデルを示す。
発明の詳細な説明
Escherichia coli Bは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdcとも言及される）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（adhBとも言及される）をコードするZymomonas mobilis遺伝子をその染色体に組み込んでE. coli K011を作製するなど、可溶性の糖類からエタノールを生成するよう、これまでに操作されている。この特定の株、E. coli K011を、例えばリグノセルロースをエタノールに転化させる際に利用するためにこれまでに操作されたその他の組換え微生物と共に、表1に含める。
この表に含まれたもう一つの組換え微生物、K. oxytoca M5A1 P2には特定の意味がある。表１に示したように、K. oxytoca M5A1 P2は、Zymomonas mobilisのpdc及びadhB遺伝子を染色体に組み込んだK. oxytoca由来のものである。K. oxytoca M5A1 P2は迅速かつ効率的にセロビオースを多量のエタノールに転化させることができることが分かっている。セロビオースはセルロースを部分的に加水分解して得られるジサッカリドであり、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの阻害物質として働く。β-グルコシダーゼによるセロビオースの単量体の糖への加水分解は、セロビオースがβ-グルコシダーゼを阻害することが原因で、真菌ブロスによるセルロースの消化にしばしば限界を与えることが知られている。K. oxytoca M5A1 P2は、セロビオースを能動的に輸送かつ代謝する能力を有していると考えられるため、β-グルコシダーゼの必要性がなくなり、またセロビオースによるセルラーゼの最終生成物阻害を低下させることができると考えられる。
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これらの及びその他の関連する組換え生物や、それらの作製に用いられる技術及び材料のより詳細な説明は、例えば米国特許でIngram氏らの第5,028,539号、Ingram氏らの第5,000,000号、Ingram氏らの第5,424,202号、Fowler氏らの第5,487,989号、Ingram氏らの第5,482,846号、Fowler氏らの第5,554,520号、Picataggio氏らの第5,514,583号、及び、同時係属出願である1994年12月27日出願の米国特許出願番号08/363,868号、1995年6月7日出願の米国特許出願番号08/475,925号、1994年3月28日出願の米国特許出願番号08/218,914号、1997年4月7日出願の米国特許出願番号08/834,900号、及び、1997年4月7日出願の米国特許出願番号08/833,435号、並びに例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York（1988）（以下「Ausubel et al.」とする）、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1992）（以下「Sambrook et al.」とする）、Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, William & Wilkins Co., Baltimore（1984）（以下「Bergey’s Manual」とする）に見ることができ、これらすべての教示するところ全体を参考文献としてここに編入することとする。
上述したE. coli K011組換え微生物は、ヘミセルロースの加水分解から生じた糖類混合物をエタノールに効率的に転化させることが示されているが、K. oxytoca M5A1 P2は、セルロース及びセロビオースを多量のエタノールに迅速かつ効率的に転化させることが示されている。
本発明は、Klebsiella oxytoca cas ABオペロンをエタノール産生微生物、例えばEscherichia coli K011又はZymomonas mobilis CP4、に挿入すると、優れたセロビオース輸送系となり、従ってセルロース物質を発酵させてエタノールにする優れた能力を持つ組換え微生物が提供されるという発見に基づくものである。
本発明のK. oxytoca cas ABオペロンは（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II及びホスホ-β-グルコシダーゼをコードするものである。適切な調節配列を、このコドン配列に有効に連結することができるが、この調節配列には、例えばエンハンサ、プロモータ（天然又は異種）、インデューサ、オペレータ、リボゾーム結合部位及び転写終了因子が含まれる。本発明で核酸分子を単離するのに用いるのに適したその他の種のKlebsiellaには、例えばKlebsiella pneumoniae、Klebsiella terrigena及びKlebsiella planticolaがある。
ここで説明するようなセロビオース資化酵素IIは一体膜たんぱくを含むが、この一体膜たんぱくは、膜通過チャンネルを形成すると共にKlebsiella oxytocaにとって天然のホスホ−トランスフェラーゼ系（PTSとも言及する）としてセロビオースのリン酸化を触媒する。この系にはさらに、酵素IIIと呼ばれるたんぱく質、及び／又は、酵素Iと呼ばれるたんぱく質、及び／又は、HPrと呼ばれるたんぱく質を含めることができる（その教示するところを参考としてここに編入することとするStryer, Biochemistry, Third Edition, W.H. Freeman and Co., New York（1988）p.959-961を参照されたい）。このホスホトランスフェラーゼ系はホスホエノールピルビン酸−依存系であるが、それはなぜなら、そのホスホリル供与体が、例えばATP又はその他のヌクレオシドトリホスフェートではなく、ホスホエノールピルビン酸だからである。Klebsiella oxytocaにおけるPTSの全体的作用は、それがリン酸化した形で存在する細菌内のセロビオースの輸送である。従って、セロビオース輸送に関連があるとされているその他のたんぱく質をコードしている核酸を、このホスト細胞内にさらにクローンしてもよい。例えば、この核酸分子は、PTSの活性の酵素I、酵素III又はHPrをコードするものでもよい。セロビオース代謝のためのPTS系をコードする遺伝子は、7つの別々の細菌から、セロビオースの色素産生類似体であるメチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシドでライブラリをスクリーニングすることでクローンされており、用いられた技術と共に、Lai, et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 355-363（1997）に詳細に説かれている。この文献の教示するところ全体を参考としてここに編入することとする。ホスホ-β-グルコシダーゼは、ここで説明するように、リン酸化したセロビオースを対応するグルコース単量体へ転化させることを担う酵素である。
このように、ここで説明された本発明は、セロビオースを効果的に輸送することができるエタノール産生微生物であって、従ってエタノール産生に際してヘミセルロース及びセルロースの両方を資化することのできる新規な組換えエタノール産生微生物に関するものである。セルロースは、ここで説明するようにグルコースのホモポリマであり、ヘミセルロースは主要構成成分であるキシロースだけでなくかなりの量のアラビノース、マンノース、グルコース及びガラクトースから成るより複雑なヘテロポリマであり、そしてセロビオースはセルロースの部分的な加水分解で得られるジサッカリドである。
当該微生物は、異種の単離された核酸分子K. oxytoca cas ABオペロンで特徴付けることができ、このオペロンは、上に詳述した（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II及びホスホ-β-グルコシダーゼをコードするものである。当該微生物は、好ましくは両キシロース、グルコース又は両方を発酵させてエタノールにすることのできる生物であるとよい。
本発明はさらに、上述したK. oxytoca cas ABオペロンをコードする単離された及び／又は組換え核酸分子に関するものである。この単離された核酸分子は、例えばデオキシリボ核酸（DNA）配列又はリボ核酸（RNA）配列など、ヌクレオチド配列でよい。さらに単離された核酸分子には、サイレント・ミューテーションから生じたヌクレオチド配列を含めることができる。このようなヌクレオチド配列は、例えば、一つ又はそれ以上のコドンが変性コドン、即ち同じアミノ酸をコードするコドン、に起きかえられたような天然の配列の変異から生ずるものでもよい。このような変異ヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法、例えばAusubel et al.及びSambrook et al.に説かれた方法を用いて構成することができる。
単離された核酸分子には、さらにK. oxytoca cas ABオペロンたんぱくの活性断片をコードするヌクレオチド配列を含めてもよい。
単離された核酸分子には、さらにK. oxytoca cas ABオペロンをコードするヌクレオチド配列に相同のヌクレオチド配列が含まれる。このようなヌクレオチド配列は、K. oxytoca cas ABオペロンのヌクレオチド配列に対して80％を超える相同性を呈するものであるが、好ましくは約90％を超える相同性のヌクレオチド配列であるとよい。特に好適な配列は、少なくとも約95％の相同性を有するもの、又は概ね同じ配列を有するものである。変異ヌクレオチド配列の作製は、Old, et al., Principles of Gene Manipulation, Fourth Edition, Blackwell Scientific Publications（1989）、Sambrook, et al.、及びAusubel et al.に説かれたように、当業において公知の方法により達成が可能である。
本発明はまた、上述した核酸分子がコードする活性たんぱく質にも関するものである。本発明のたんぱく質はさらに、上述したように、K. oxytoca cas ABオペロンたんぱく質をコードする核酸分子又はそのサイレント・ミューテーションを異形発現させて生ずる組換えたんぱく質であってもよい。本発明の活性たんぱく質はK. oxytoca cas ABオペロンの表すアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を有していてよい。ここで用いられる場合の「相同」という術語は、少なくとも約80％の配列同一性又は相同性を基準のたんぱく質に対して有する、そして好ましくはアミノ酸の配列で約90％の配列相同性を有するたんぱく質を言う。最も好ましくは、当該たんぱく質が開示された配列と少なくとも約95％の相同性又は概ね同じ配列を呈するとよい。相同のたんぱく質には、融合たんぱく質など、そのカルボキシル末端又はアミノ末端に一つ又はそれ以上のアミノ酸がさらに付着していてもよい。
本発明の相同たんぱく質はさらに非自然発生型のものでもよい。一般的には、相同たんぱく質は、その基準と成るアミノ酸配列、例えば本発明の場合K. oxytoca cas ABオペロンの表すアミノ酸配列のうちの一つ又はそれ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換から生じた修飾アミノ酸配列を有する変異たんぱく質であってもよい。（欠失及び挿入を含む）保存的及び非保存的置換の両方を、そのアミノ酸配列に行なってもよい。保存的置換とは、第一のアミノ酸残基が、同じような側鎖の性質を有する第二の残基に置換されたようなものである。このような保存的置換の一例は、バリンなどの一疎水性残基の、ロイシンなどの別の疎水性残基などとの置換である。非保存的置換は、第一の残基が異なる側鎖の性質を持つ第二の残基に置き換わるものである。この種類の置換の一例はバリンなどの疎水性の残基がグルタミン酸などの酸性の残基に置き換わる置換である。
概して、変異させてもよいヌクレオチド、ひいてはアミノ酸は、変異させようとする当該配列と、その他の生物を由来とする同じような機能を持つ相同の配列とを整列させることにより同定することができる。典型的には、保存率の高いアミノ酸、特に当該たんぱく質の結合又は触媒活性にとって関連があるとされているアミノ酸は残すことが好ましい。
このようなアミノ酸配列変異体は当業において公知の方法により作製が可能である。例えば、所望の変異体を公知のペプチド合成法を用いて試験管内で合成することができる。アミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更を、天然のたんぱく質をコードするDNA分子に導入し、その変異酵素を適切なベクタで発現させることにより作製されると好ましい。これらの方法には例えば位置指定突然変異誘発又はランダム突然変異誘発がある。
さらにその他の実施例では、本発明の核酸分子は、化学的又は生物学的手段により、上述したヌクレオチド配列のうちの一つ又はそれ以上をその鎖に挿入して生まれた組換えDNA分子などの核酸分子であってもよい。組換えDNAには、制限ヌクレアーゼ、核酸ハイブリダイゼーション、DNAクローニング、DNA合成又は前記のものの何らかの組合せを用いる手法により合成されたあらゆるDNAが含まれる。
本発明にはさらに、上述したような本発明の核酸分子、例えばヌクレオチド配列、のうちの一つ又はそれ以上を含む組換えDNA配列又は分子を含有するプラスミド又はベクタが含まれる。「プラスミド」及び「ベクタ」という術語は、外来又は外生のDNAを化学的又は生物学的手段によりそれに挿入することができ、その後適切なヒト以外のホスト生物に形質転換させたときにこの外来又は外生のDNAインサートの産物を発現させる（例えば本発明のK. oxytoca cas ABオペロンを発現させる）ことのできる、複製能力のあるあらゆるプラスミド又はベクタを包含するものとして意図されている。加えて、このプラスミド又はベクタは、ここで説明するようなK. oxytoca cas ABオペロンをコードする本発明の一つの遺伝子又は複数の遺伝子を含有するDNA分子又はその断片の挿入を受け入れるものである。DNAプラスミドベクタを構成する手法には、Sambrook et al.及びAusubel et al.に説かれたものや、当業者に公知のその他のものがある。
ある一つの実施例では、本発明の組換え微生物はピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIを発現するものである。
アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼは、アルコール発酵に必要な酵素である。アルコール発酵において、アルコール発酵のための純反応及びNAD+の再生のための中間反応は以下の通りである。
中間：
２ピルビン酸→２アセトアルデヒド+２ＣＯ2
２アセトアルデヒド+２ＮＡＤＨ→２エタノール+２ＮＡＤ+
純：
２ピルビン酸+２ＮＡＤＨ→２エタノール+２ＣＯ2+２ＮＡＤ+
ピルビン酸デカルボキシラーゼは、上の反応に見るように、ピルビン酸のアセトアルデヒド及び二酸化炭素への開列を担う酵素である。アルコールデヒドロゲナーゼは、上の反応に見るように、水素当量をNADHからアセトアルデヒドに移動させてNAD+の再生を行なうことでエタノールの生成することを担う酵素である。
本発明の目的のためには、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、例えばウマ、酵母、ヒト、昆虫又はZymomonasなどの細菌、例えばZymomonas mobilis、から単離された遺伝子から提供させてもよい。数多くのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、1991年3月の時点でGenBankのデータベースに２５２のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が定義されていることが証左するように当業者に公知である（94040カリフォルニア州マウンテンビュー、E.エルカミノ・ドライブ700、インテリジェネティックス社製）。同様に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、Zymomonas mobilisなどのZymomonas由来の遺伝子に提供させても、又は必要な酵素活性をコードするがとうもろこし、酵母又はその他の生物を由来とする遺伝子に提供させてもよい。少なくとも5つのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が、1991年3月の時点でGenBankのデータベースに登録されている。従って、当業者が標準的な技術を用いれば、ある一つの酵素ファミリーの一つ又はそれ以上のメンバーから得られる主要な情報を用いることで、多種の源からピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼに対して機能的な等価で遺伝的に関係のある酵素を単離することができる。これらの特定の酵素の場合、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの活性は両方とも、当業者に公知の方法を用いてアルデヒド検知プレート上に直接観察することができるため、配列情報がなくともその他の遺伝子を見つけることができる。
Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、組換え微生物にとって異種（即ち外来）のものであるが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼは、当該組換えエタノール酸性微生物にとって天然のものでも又は異種のものでもよい。従って、組換え微生物は、Klebsiella以外の生物でもよく、好ましくは、両キシロース、グルコース、又は両方を発酵させてエタノールにすることができる生物であるとよい。
例えば、本発明での改良に適した生物には、とりわけ、動物細胞などの真核細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母、及び細菌、特に細菌及び酵母が含まれる。好適なホスト細胞は、糖類（特にグルコース及び／又はキシロース）のエタノールへの転化に必要な酵素を天然で又は突然変異又は組換え操作によりコードする細菌及び酵母である。従って、ホスト細胞はグラム陰性又はグラム陽性の細菌又は酵母であってよい。グルコース及びキシロースの両方をエタノールに転化させるように操作された組換え細菌が特に好適である。例えば、E. coliや、E. chrysanthemiのようなErwinia属のその他の腸内細菌が、多種の糖類を代謝できるため、魅力的である。その他の適したホストは、例えばXanthomonasの属の種などの幅広いグラム陰性細菌やグラム陽性細菌、例えばBacillus属の仲間、例えばB. pumilus, B. Subtilis及びB. coagulans、Clostridium属の仲間、例えばCl. acetobutylicum, Cl. aerotolerans, Cl. thermocellum、Cl. thermohydrosulfuricum及びCl. thermosaccharolyticum、Cellulomanas属の仲間、例えばC. uda及びButyrivibrio fibrisolvensから選択することができる。容認可能な酵母は、例えば、Cr. albidus、Monilia、Pichia stipitis、及びPullularia pullulansのようなCryptococcusの種のものである。その他の好適な微生物はZymomonas mobilisである。
具体的な実施例としては、当該組換え微生物のピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼは、Zymomonus、好ましくはZ. mobilis起源の核酸分子がコードするものである（Bergey’s Manualを参照されたい）。簡単に説明すると、Z. mobilisは酸化的リン酸化のための機能系を欠いた偏性発酵細菌である。酵母のSaccharomyces cerevisiaeのように、Z. mobilisはエタノール及び二酸化炭素を主要な発酵生成物として生成する。Z. mobilisは長らく、パーム・ワインや、アルコールを含有するメキシコ飲料であるリュウゼツラン酒を作るときのリュウゼツラン樹液の発酵のための接種剤として用いられてきた。この微生物はまた燃料エタノールの生成にも用いられており、報告に拠れば酵母よりも高いエタノール生成率をあげるとのことである。更なる実施例では、本組換え微生物の発現するピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼは、Z. mobilisの発現するような対応する酵素と同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有するものである。
いくつかの実施例では、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及び／又はKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、Klebsiella oxytoca起源の核酸分子によりコードされるものである（Bergey’s Manualを参照されたい）。別の実施例では、このホスホ-β-グルコシダーゼは、Klebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼと同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有する。更なる実施例では、（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIは、Klebsiella oxytoca（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIと同じ又は概ね同じアミノ酸配列を有する。
本発明の二番目の態様は、Zymomonasピルビン酸デカルボキシラーゼ、Zymomonasアルコールデヒドロゲナーゼ、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子を含む組換え微生物に関し、前記分子は、セロビオースをエタノールに転化させるのに充分な量、発現する。いくつかの実施例では、当該微生物はさらに、例えば自発的又は突然変異誘発因子との接触により突然変異したものである。適した突然変異誘発因子には光線、例えば紫外線、及び化学的突然変異誘発因子、たとえばN-メチル-N’ニトロソ-グアニジン、ヒドロキシルアミン、エチルメタンスルホネート及び亜硝酸がある。更なる実施例では、突然変異した微生物には、予め、当業において公知の方法及びここで説明するように、例えばセロビオース培地などで強化選別が行なわれる。
本発明のこの態様の一つの好適な実施例としては、ZymomonasはZymomonas mobilisである。別の好適な実施例では、KlebsiellaはKlebsiella oxytocaである。
ある具体的な実施例では、本組換え微生物は、Zymomonas mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、並びにKlebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子を含む。更なる具体的な実施例では、この異種核酸分子は単一のプラスミドとして微生物に挿入される。特定の実施例では、微生物に単一のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、微生物にとって内生又は異種でもよい共通の調節制御下にある。特定の実施例では、微生物に単一のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、微生物中でプラスミドの上に位置する。その代わりの実施例では、微生物に単一のプラスミドとして挿入されるこの異種の核酸分子は、当業者に公知である方法や、例えばIngram氏らの米国特許第5,424,202号、Fowler氏らの米国特許第5,487,989号、及びFowler氏らの米国特許第5,554,520号に説かれたようにこの微生物の染色体に組み込まれる。
更に別の具体的な実施例では、Zymomonas mobilisピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼをコードするこの異種の核酸分子は、この組換え微生物に対し、Klebsiella oxytocaホスホ-β-グルコシダーゼ及び（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子とは別のプラスミドで挿入される。ある特定の実施例では、別々のプラスミドで挿入されるこの異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、その微生物にとって内生の調節制御下にある。別の特定の実施例では、別々のプラスミドで挿入されるこの異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、その微生物にとって異種の調節制御下にある。更なる実施例では、別々のプラスミドで挿入されるこの異種の核酸分子のうちの少なくとも一つは、その微生物中でプラスミド上に位置するか、あるいは、別々のプラスミドで挿入されるこの異種の核酸分子のうちの少なくとも一つはこの微生物の染色体に組み込まれる。
更に別の態様では、本発明は、上述したようにセロビオースを組換え微生物に接触させるステップを含む、エタノールを作製する方法に関するものである。ある一つの実施例では、セロビオースを、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIを発現する組換え微生物に接触させてもよい。別の実施例では、セロビオースを、Zymomonasピルビン酸デカルボキシラーゼ、Zymomonasアルコールデヒドロゲナーゼ、Klebsiellaホスホ-β-グルコシダーゼ及びKlebsiella（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素IIをコードする異種の核酸分子を含む組換え微生物に接触させてもよく、このとき前記分子はセロビオースをエタノールに転化させるのに充分な量、発現する。本発明で用いるのに適した方法の詳細な説明は、例えば、そのすべての教示するところ全体を参考文献としてここに編入することとする、米国特許で、Ingram氏らの第5,028,539号、Ingram氏らの第5,000,000号、Ingram氏らの第5,424,202号、Fowler氏らの第5,487,989号、Ingram氏らの第5,482,846号、Fowler氏らの第5,554,520号、Picataggio氏らの第5,514,583号、及び、同時係属出願である1994年12月27日出願の米国特許出願番号08/363,868号、1995年6月7日出願の米国特許出願番号08/475,925号、1994年3月28日出願の米国特許出願番号08/218,914号、1997年4月7日出願の米国特許出願番号08/833,435号及び1997年4月7日出願の米国特許出願番号08/834,900号に見ることができる。
実験法
細菌株及び培地
E. coli K011（Ohta, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900（1990））及びK. oxytoca P2（Wood, B.E. and L.O. Ingram, Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110（1992））をすべての発酵研究で用いた。これらの株は、それぞれE. coli B及びK. oxytoca M5A1由来であり、エタノール生成のためのZ. mobilis遺伝子（pdc、adhB）及びクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（cat）を含有する。K011及びP2の保存種は、NaCl（5gリットル-1）、酵母抽出液（5gリットル-1）、トリプトン（10gリットル-1）、グルコース（20gリットル-1）、寒天（15gリットル-1）、及びクロラムフェニコール（0.6gリットル-1）を含有する改良されたルリア寒天（Atlas, R.M. and L.C. Parks（ed.）Handbook of Microbiological Media., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL（1993））上に維持した。株K011及びP2は原栄養性であり組換え能が高い。液体培養株及び発酵実験においては、クロラムフェニコールは40mgリットル-1の最終濃度になるよう加えられた。
（ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II（PTSセロビオースアップテーク（原語：uptake）とも言及する）及びホスホ-β-グルコシダーゼ（セロビオース開裂とも言及する）をコードする遺伝子を含有する三つのプラスミドをこの研究に用いた（Katzen, R. and D.E. Fowler, Appl. Biochem. Biotechnol. 45/46:697-707（1994））。pLOI1903はBacillus subtilisを由来とする遺伝子を含み、LOI1905はBacteroides fibrisolvensを由来とする遺伝子を含み、pLOI1906はK. oxytoca cas ABオペロンを含むものである。この研究ではpLOI1906から得た一連の変異プラスミドを開発して分析した。pLOI1908、pLOI1909、及びpLOI1910である。
セロビオース（20gリットル-1）の資化を、MacConkey寒天、M9ミニマル寒天、4-メチルウンベリフェリル-グルコシド（20mgリットル-1）を含有する改良されたルリア寒天、及び、セロビオース（60mgリットル-1）を含有するルリア・ブロス（Atlas, R.M. and L.C. Parks（ed.）Handbook of Microbiological Media., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL（1993））を用いてスクリーンニングした。アンピシリン（50mgリットル-1）をプラスミドの選別のために加えた。
PTS活性の試験管内アッセイ
casABホスホトランスフェラーゼ系及びホスホ-開裂酵素の合計活性を、p-ニトロフェニル-（pNPG）を基質として用いて基本的には前に説かれた（Lai, X. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363（1997））ように判定した。一晩（15時間）後の培養株を遠心分離（5,000×ｇ、5分間、４℃）して回収し、2回洗浄し、50mMのNaKHPO4緩衝液（pH7.2）中に約50 OD550ml-1の密度になるまで再懸濁させた。細胞をフレンチ・プレッシャ・セル（原語：French pressure cell）に20,000lb in-2で二回通過させて破砕した。溶解産物を、5mMのMgCl2、2mMのpNPG及び2mMのホスホエノールピルビン酸を含有する50mMのNaKHPO4緩衝液（pH7.2）中で37℃でアッセイした。等量の1MのNa2CO3を加えて反応を停止させた。遠心分離（5,000×g、5分間）して細胞破壊片を取り除いた後、p-ニトロフェノールを410nmで測定した。ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード試薬（カリフォルニア州リッチモンド、バイオ-ラド・ラボラトリーズ社製）を用いてたんぱく質を推定した。活性は1分毎にμモルミリグラム-1細胞たんぱく質として表される。
遺伝子法及びDNA配列決定
E. coli DH5αをプラスミド維持のホストとして用いた。標準的な方法をプラスミドの単離、構築、形質転換及び分析に採用した（Sambrook et al.）。DNAは、ジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネータ法により、LI-COR（ネブラスカ州リンカーン）より購入した蛍光M13プライマ（前方、5’-CACGACGTTGTAAAACGA-3’配列同定番号第1番、逆、5’-CGATAACAATTTCACACAGG-3’、配列同定番号第2番）を用いて配列決定した。Casアミノ酸残基Phe56-Ser50に延びる前方の特注プライマ（AAAGAAGAACAGCGCATCGC配列同定番号第3番）を、K. oxytocaとpUC18との間にある5’接合部を、dNTP及び蛍光標識付ATP（LI-COR）を用い、配列決定及び確認するのに用いた。CasBアミノ酸残基Asn312-Leu318に延びる逆方向の特注プライマ（AACAAAAAAGCGCGCGGCAA配列同定番号第4番）をcasBの3‘端及び下流領域を配列決定するのに用いた。伸長反応は前に説かれた（Lai et al.（1997））ようにパーキン・エルマのGeneAmp PCRシステム9600（コネチカット州ノーウォーク）及びSequiTherm・ロング-リード・サイクル・シークエンシング・キット-LC（ウィスコンシン州マジソン、エピセンター・テクノロジーズ社製）を用いて行なった。産物を分離し、LI-CORのDNAシークエンサ・モデル4000Lで読んだ。配列は、ウィスコンシン・ジェネティックス・コンピュータ・グループ・ソフトウェア・パッケージ（Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395（1984））を用いて分析した。
セロビオースのバッチ発酵
発酵（350ml体積）及び分析を、セロビオース（90gリットル-1）を発酵可能な糖として用いた以外は基本的には以前に説かれた（Beall, D.S. et al., Biotechnol. Bioeng. 38:296-303（1991））通りに、改良されたルリア・ブロスで行なった。KOHを自動で加えて、発酵（35℃、100rpm）中にブロスのpHがpH6.0より下に落ちないようにした。pHの上昇は制御しなかった。エタノールはガスクロマトグラフィで監視した。細胞量は550nmでの光学密度で測定した。エムデン−マイヤーホフ解糖作用及びZ. mobilisエタノール経路を用いると、理論上の最大収率は、セロビオース1モル当りそれぞれ4モルのエタノール及びCO2（1gのセロビオース当り0.538gのエタノール及び0.462gのCO2）である。
混合廃棄事務用紙の同時糖化及び発酵
混合廃棄事務用紙（100gリットル-1）を、800mlの攪拌した（60rpm）容器（35℃、pH4.9−5.2）中で、概ね以前説かれた（Brooks et al., Biotechnology Progress 11:619-625（1995））ように発酵させてエタノールにした。スペザイムCPセルラーゼを1：100の希釈度で加え、約1000濾紙単位リットル-1（10FPUグラム-1のセルロース基質）に提供した。発酵液のサンプルを24時間間隔で採取した。最初の24時間後はpHの制御の必要はなかった。
細菌株、プラスミド、及び成長条件
この研究に用いたその他の細菌株及びプラスミドを表４に挙げる。Z. mobilis株CP4は、TRG培地で30℃で成長させた。Escherichia coliの株はLB培地で37℃で（Sambrook）成長させた。Klebsiella oxytoca P2は5%の糖を含有するLB培地で30℃で成長させた。組換えZ. mobilis及びE. coliを選別するために、それぞれ120又は40μg/mlのクロラムフェニコールを滅菌後にこの培地に加えた。セロビオース加水分解の生体内活性を組換えZ. mobilisで調べるために、セロビオースの類似体である4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシド（MUG）（10μg/ml）（Wood, T., Methods of Enzymology 160:87-112（1988））を固体のTRG培地（15gリットル-1）に加えた。
分子生物学的技術
標準的手法を用いて組換えプラスミドの構築、単離、分析、及び形質転換を行なった（Sambrook）。PCRはパーキン・エルマのGene Amp PCRシステム9600（コネチカット州ノーウォーク、パーキン・エルマ社製）で行なった。E. coliからZ. mobilisへというプラスミドの接合は説かれて（Arfman, J. Bacteriol. 174: 7370-7378（1992））いる。
セロビオース加水分解の活性に関する試験管内アッセイ
一晩（ほぼ20時間）かけた培養株を遠心分離（5,000×g、5分間、4℃）により回収した。NaKHPO4緩衝液（pH7.2）で二回洗浄した後、細胞を同じ緩衝液中に再懸濁させ、フレンチ・プレッシャ・セル（原語：French Pressure Cell）に20,000lb in-2で二回通過させて均質化した。ウシ血清アルブミンを標準としたブラッドフォード試薬（カリフォルニア州リッチモンド、バイオ-ラド・ラボラトリーズ社製）を用いてたんぱく質濃度を判定した。PTSホスホトランスフェラーゼ及びホスホ-セロピアーゼの合計の活性を前に説かれた（Lai, et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363（1997））ように測定した。ホスホ−セロビアーゼの活性は、o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド6-ホスフェート（ONPG-P）を基質として用いて測定した（Fox, PNAS, USA 59:988-995（1968））。反応は5mMのMgCl2及び2mMのONPG-Pを含有する同じ緩衝液中で行なわせた。この反応を、等量の1MのNa2CO3を加えて停止させた。活性は遊離したo-ニトロフェノールの量を測定して判定した。
結果
K011のセロビオース陽性変異体の単離
我々の研究室から出たこれまでの研究で、（ホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系）セロビオース資化酵素II（セロビオース取り込みのためのPTS遺伝子とも言及する）及びホスホ-β-グルコシダーゼ（セロビオース開裂のための遺伝子とも言及する）を7つの微生物からクローニングしたことを説いている（Lai, X. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363（1997））。DH5αではすべてが、モデル基質であるメチルウンベリフェリル-β-グルコピラノシド（MUG）の開裂を起こすのに充分な発現をしたが、セロビオース-MacConkey寒天では三つのDH5α組換え体だけが陽性であり、セロビオース-最小培地で成長した。pLOI1903、pLOI1905、及びpLOI1906である。K011にこれら三つのプラスミドを形質転換すると、組換え体すべてがMUG検知プレートで陽性となったが、セロビオース-MacConkey寒天又はセロビオース-最小培地ではいずれも陽性ではなかった。これらのK011組換え体からプラスミドを再単離し、DH5αに形質転換させて戻した。DH5αではすべてがセロビオース資化について陽性であったが、このことは機能的cas遺伝子の存在を示唆するものである。制限分析の結果、これらのプラスミドがK011を通過しても変化がないようであることが確認された。
各組換え体の強化培養をセロビオース（1.8×150mMの培養チューブ中に10mlのブロス）を含有するルリア・ブロスを用いて30℃で行なって、セロビオースを資化する自発的変異体を選別した。これらは、祖先株を継続的にインキュベートしながら三週間にわたって24時間ごとに100倍に希釈された。K011（pLOI1906）のいくつかの株が非常に密度が高くなり、セロビオースの資化を示していた。セロビオースMacConkey寒天上にストリーキングすることで、これらのうちの二つからクローンを単離した。各強化から得られたコロニの約半分が高くなって暗褐色になっており、セロビオース資化について高い陽性を示した。10個の陽性のクローン（株MM101−MM110）を、60gのセロビオースリットル−1を含有する（表２）。全部が、変異のなかったK011（pLOI1906）又はK011（pUC18）に比べて細胞密度で4倍まで成長し、4倍のエタノールを生成した。変異体のあるブロスのpHは低下（炭酸）して約pH5.6になっていたが、親のそれは中性に近いままであり、炭水化物の代謝がなかったことに合致していた。
固体の培地に変異株を繰り返しストリーキングした結果、１０個のクローンのうちの6個に不安定性が見つかったため、これらのクローンを廃棄した。4個の安定したクローン、MM101、MM106、MM108、及びMM109はセロビオースを含有するM9最小培地で良好に成長した。図１は、振盪フラスコ中でのセロビオース上の親株及び株MM106の成長を比較した図である。エタノール産生性のK011について特徴的であるように、セロビオースのあるときのMM106の成長は約2O.D.550nmの細胞密度でほぼ線形であった。
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セロビオース陽性変異体の最初の特徴付け
セロビオース資化に至る仕組みを調べるため、プラスミドを株MM101、MM106、MM108、及びMM109から単離した。K011及びDH5αに形質転換させた後も、すべての組換え体がセロビオース資化能力を保持しており、K011での変異ではなくプラスミドの変異が、獲得された表現型を担っていることが示された。制限分析の結果、四つのプラスミドすべてが、もとのpLOI1906よりも小さい約500塩基対であることが分かった。株MM106及びMM108は兄弟であるが、MM106だけを研究対象に残した。MM101、MM106、及びMM109からのプラスミドをそれぞれpLOI1908、pLOI1909、及びpLOI1910とした。
DH5αをホストとして用いて作製したプラスミドの保存株を用いて、更なる研究のために天然のK011を形質転換した。これらのプラスミドのK011での安定性は、抗生物質選別の不在下での連続移植で調べられた。35代目の後では、グルコース有りのルリア寒天で成長させたコロニのうち95%が、セロビオースMacConkey寒天で調べた場合にセロビオース資化についても陽性であった。これらのプラスミドを持つK011でのcasオペロンの試験管内での発現を、pNPGをモデル基質として用いて合計PTS輸送量及び開裂活性を測定することにより評価した（図２Ａ）。K011（pUC18）又は変異のないpLOI1906を持つK011という対照株では活性はなかった。変異プラスミドpLOI1908、pLOI1909、及びpLOI1910は、セロビオースを誘導物質とした状態で成長させたK. oxytoca P2で測定された量のほぼ半分、K011において発現していた（9nモルmin-1mgたんぱく質-1）。興味深いことに、グルコースを加えたルリア・ブロス、又は、糖のないルリア・ブロスで成長させた後のK. oxytoca P2では活性はほとんど検出されず、天然のcasオペロンには誘導のためにセロビオースが必要であることが示唆された（図２Ｂ）。
casABの発現を促進する変異の遺伝的分析
制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてマッピングしたところ、三つのプラスミドのすべてのK. oxytocaインサートの5‘端に欠失（このベクタのEcoRI部位の欠失）があることが明らかになったが、3’端には変化がないようであった（図３Ａ）。casABの3‘端、又は、K. oxytocaインサートとベクタとの間の接合部に欠失がないことが、配列分析で確認された。
わずかに二つの塩基対分しか違わない二つのパターンの欠失が５‘端に見られた（図３Ｂ）。pLOI1908及びpLOI1909は、もとのプラスミドのpLOI1906に比較して、K. oxytocaのDNAで442塩基対、そしてベクタDNAで37塩基対、短くなっていた。pLOI1910で起きた欠失の結果、K. oxytocaのDNAで441塩基対、そしてベクタDNAで38塩基対が消失していた。このように、両方の組換えで起きた現象は基本的に同一であり、結果として推定上のcasABプロモータ及びオペレータ領域である不完全なcasRと、Lai et al.（1997）の説くステム−ループ領域とが欠失していた。欠失後、lacシャイン−ダルガルノ配列はcasAシャイン−ダルガルノ領域から僅かに２、３塩基対分上流に来ていた。pLOI1908、pLOI1909、及びpLOI1910におけるcasABの発現はlacプロモータ（ベクタ）に依存する。
これらの結果から、天然のプロモータ（及び上流のlacプロモータ）からのcasABの発現は、DH5αでより、E. coli B由来であるK011での方がより厳密に制御されている。この制御の基礎は、K. oxytocaで発現するためにはアンチ−ターミネータたんぱく+セロビオースの結合を必要とすると予測されるパリンドローム配列及びオペレータ領域であるかも知れない。K011での高い発現に結び付いたこの二つの個々の欠失の結果、この調節領域がかなり正確に消失していた。さらにその結果、これらのプラスミドに残ったlac及びcasシャイン−ダルガルノ領域は大変近接しており、その結果翻訳が促進されるのかも知れない。最近の研究で、E. coliのK12株の中で驚くべきシグマ因子の違いがあることが判明している（Jishage, M. et al., J. Bacteriol. 179: 959-963）。シグマ因子又はその他の調節たんぱくの違いが、E. coli DH5α及びK011（E. coli B由来株）の間でK. oxytoca casの発現に違いがある原因かもしれない。
セロビオースのエタノールへの発酵
セロビオースからのエタノール生成を、生体触媒として、天然のpLOI1906、及び、casAB発現度の高い生体内欠失変異体（pLOI1908、pLOI1909、及びpLOI1910）を持つK011を用いて調べた（図４）。K011（pLOI1906）による成長及びエタノール生成は大変小さかった。変異したプラスミドを持つKO11は、もとのpLOI1906を持つK011に比べ、最大で６倍の細胞量、20倍を超えるエタノール濃度を生じ、pH6を維持するのに膨大な量の塩基を消費した（表３）。塩基は多くの場合、大量の溶解CO2（炭酸）及び少量の酸性の発酵生成物が生じるために、pH6を維持するのに糖発酵中のK011にとって必要である。変異体で発酵は急速に終結に達し、約1Mのエタノールを達成した。エタノール収率はセロビオースからの理論上の収率の最大値の90%を超えた（0.538gエタノール  グラム-1セロビオース）。
このエタノール生成率及び細胞量の推定値に基づき、K011由来体によるセロビオースの取り込み及び加水分解について試験管内率の最小値を推定することが可能である。O.D.550nmが4.0であるときに細胞たんぱくが約1mgミリリットル-1であると想定すると、セロビオース代謝の当初の率は0.03μモルmin-1ミリグラム-1たんぱくである。このことから、pNPGをモデル基質として用いたとき、生体内での活性は、（セロビオースで誘導した）K. oxytoca P2で測定された試験管内での活性の4倍であり、最良のE. coliコンストラクトであるK011（pLOI1910）の10倍であることが実証された。
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混合廃棄事務用紙の同時糖化及び発酵
これまでの研究から、セルロース基質のエタノールへの転化の際のK. oxytoca P2の効果が実証されている（Brooks et al., Biotechnology Progress 11: 619-625（1995））。K. oxytocaからのcasオペロンを発現するE coli K011由来株（pLOI1908, pLOI1910）は、エタノール生成を混合廃棄事務用紙から行なう上でP2とほとんど等価であった（図４、表３）。発酵の当初の率は、P2がより高い最終エタノール濃度を達成したにも関わらず同様であり、K. oxytoca casABオペロンの発現が機能的に最も高かったコンストラクトであるK011（pLOI1910）は、混合廃棄事務用紙をエタノールに転化させる上でK011（pLOI1909）よりも優れているように思われた。
プラスミドの構築
セロビオースを資化するようにZ. mobilisを操作するために、一連の組換えプラスミドを作製した。プラスミドはすべて、E. coli-Z. mobilisシャトルベクタであるpLOI193（Conway, Appl. Environ. Microbiol. 53:235-241（1987））と、改良されたpLOI193のより小型の由来株であるpLOI1844とを基にして構築された。pLOI1844はpLOI193からSfi I/Sac I断片を削除し、この部位にSac Iリンカを挿入することで構築されたものである。その後、PstI／Cla I断片を削除し、Bam HIリンカを挿入した。その結果出来たpLOI1844は全テトラサイクリン耐性遺伝子及びColEIレプリコンが削除されており、pLOI193のその他の遺伝子はすべて残っていた。
プラスミドはすべて、E. coli株DH5α又はJLT2をホストとして用いて構築された。セロビオース遺伝子を持つ組換え体は、セロビオースを資化するようにDH5αを補うことで回収され、またptsHIオペロンを持つ組換え体は、フルクトースを資化するようにJLT2を補うことで単離された。
pLOI1812はBacillus stearothermophilusを由来とするcelオペロン（Lai et al., J. Bacteriol. 175:6441-6450）及びptsHI（Lai, Microbology 141:1443-1449,（1995））オペロンを含有していた。これは、まずpLOI903からのcelオペロンのNotI／SacI断片（Lai et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363（1997））をpLOI193のNotI／Sac I部位に挿入し、その後pLOI800からのptsHIオペロンを持つNot I断片をNot I部位に挿入することで構築された。
pLOI1836はE. coli ptsHIオペロンを含有していたが、このオペロンの前にはZ. mobilisのadhBプロモータ、後ろにはadhBターミネータがあり、その転写の方向は当該ベクタ、pBluescript KSIIのペプチドのそれと反対である。このプラスミド中のE. coli ptsHIオペロンは、DH5αのゲノムDNAから、二つの特注プライマ（5‘−ATGTCGACCTATAAGTTGGGGA配列同定番号第5番及び5’−ATGGATCCATGAGAGCGATGAA配列同定番号第6番）でPCRを行なって単離されたが、このPCR断片は、これもまたターミネータとして機能するかも知れないcrr遺伝子及び下流の領域を含んでいた。Z. mobilis adhBプロモータは、pLOI287を消化して単離された（Conway, J. Bacteriol 169: 2591-2597（1987））が、このadhBターミネータはpLOI287からM13万能前方プライマ及び特注プライマ（5‘−CCATCGATATCGCCAATCTCGG配列同定番号第7番）でPCRを行なって単離した。adhBプロモータを単離してLacZプロモータの反対に方向付けるために、pLOI287をHincII及びEcoRIで消化し、そのプロモータ断片を精製してpBluescript KSIIのHincII／EcoRI部位に挿入した後、余分なBstEII／SmaI断片をこのプラスミドから削除してpLOI1861を形成した。ptsHIオペロンのPCR断片をまずクレノウで処理し、pUC１８のHincII部位に挿入し、このプラスミドのcrr遺伝子を、AccI及びクレノウによる消化及び自己連結でノックアウトしてpLOI1874を形成した。ptsHIオペロン断片を精製するために、pLOI1874をまずSacI及びクレノウで処理し、これらの酵素を変性させた後、この平滑末端になったDNAをHindIIIで消化した。次に、精製されたptsHIオペロンをpLOI1861のHincII／HindIII部位に挿入してpLOI1866を形成した。adhBターミネータはpLOI287から、一つの特注プライマ（5’−CCATCGATATCGCCAATCTCGG配列同定番号第7番）及びM13前方プライマでPCRすることで単離された。このPCR断片をまずクレノウで処理し、次にSalIで消化した。この消化されたPCR断片を次に、EcoRV及びSalIで消化したpBluescript IIKSで連結してpLOI1838を形成した。adhBプロモータ及びptsHIオペロンを含有するDNA断片を、pLOI1866から、まずApaI及びクレノウ、次にSacIで消化することで単離した。この断片をpLOI1838のSmaI／SacI部位に挿入してpLOI1840を形成した。pLOI1840を次にScaIで消化し、シャトルベクタであるpLOI1844をBamHIで消化してクレノウ処理した。この後この二つの消化産物を連結してpLOI1836を形成した。
pLOI1837はKlebsiella oxytoca casABオペロンを含んでおり、lacZプロモータ及びZ. mobilisのpgmプロモータを上流にあるオペロン、及び、下流領域にあるpgmターミネータで融着させた。このcasABオペロン及びpgmプロモータをまずpLOI1886に組み合わせた。このプラスミドを構築するためには、pLOI1906をKpnIで消化した後、クレノウ処理し、これらの酵素を変性させた後、HindIIIで消化した。casABを持つこの断片を次に精製し、pLOI685のHincII／HindIII部位に挿入し（Yomano, J. Bacteriol. 175: 3926-3933（1993））てpLOI1886を形成した。pgmターミネータは、二つの特注プライマ（5‘−ACGGCCGTTGGTCTACGAATTG配列同定番号第8番及び５’−AAAGCTTCGGCATTGGCTTCGT配列同定番号第9番）を用い、pLOI685をテンプレートとして利用したPCRで単離された。このPCR断片をATベクタに直接挿入してpLOI1839を形成した。次に、pgmプロモータを持つEagI／HindIII断片をpLOI1839から精製し、同じ対の酵素で消化したpLOI1886に連結してpLOI1843を形成した。次にpLOI1843をScaIで消化し、BamHIで消化したシャトルベクタpLOI1844に連結し、クレノウ処理してpLOI1837を形成した。
pLOI1888はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。このcasABオペロンはlacZプロモータから発現し、ptsHIオペロンはその天然のプロモータから発現する。E. coli ptsHIオペロンを含有するプラスミド、pDS20（Saffen, J. Biol. Chem. 262: 16241-16253（1987））をBamHI、クレノウ及びClaIで、それぞれ前のステップでの酵素を洗浄した後にこの順で消化かつ処理した。ptsHIオペロンを含有するDNA断片を精製し、予めPstI，クレノウ、及びClaIでこの順に消化かつ処理されたpLOI193に連結した。その結果出来たプラスミドpLOI1898を次にClaI及びクレノウで消化かつ処理し、pLOI1906の消化産物から精製された、casABオペロンを含有するBglII／DraI断片に連結してpLOI1888を形成した。
pLOI1885はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。このcasABはその前にpgmプロモータを有しており、ptsHIはその天然のプロモータを用いた。このプラスミドは、pLOI1898及びpLOI1886からのDNA断片を融着させることで構築された。pLOI1886をSacI、クレノウ、及びBglIIでこの順に消化かつ処理した。次にpgmプロモータ及びcasABオペロンを含有するDNA断片を精製し、SfiI、クレノウ、及びSacIでこの順に消化かつ処理されたpLOI18908に連結した。
pLOI1882はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。このcasABはその前にadhBプロモータを有しており、ptsHIはその天然のプロモータを用いた。このcasABオペロン及びadhBプロモータを融着させてpLOI1893を形成したが、これは、pLOI1906を由来とするcasABオペロンのSacI／HindIII断片（SacIはクレノウで平滑末端とする）をpLOI287のHincII／HindIII部位に挿入することでなされた。次に、adhBプロモータ及びcasABオペロンを持つSacI／BglII断片（BglIIはクレノウで平滑末端にした）を精製し、pLOI1898のSacI／SfiI部位（SfiIはクレノウで平滑末端にした）に連結してpLOI1882を形成した。
pLOI1877はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。このcasABオペロンはlacZ及びpgmプロモータから発現させることができた。このptsHIオペロンはその天然のプロモータから発現した。このプラスミドは、pLOI1898及びpLOI1886を由来とするDNA断片を融着することで構築された。pLOI1898をベクタとして働かせ、ptsHIオペロンを提供させた。これはSacIで消化し、クレノウで処理し、次にNotIで消化することにより作製された。lacZ及びpgmプロモータを前方に持つこのcasABオペロンを、DraI及びEagIによるpLOI1886消化産物から精製した。次にこの断片を、作製されたpLOI1898に連結した。DraI側末端を、クレノウ処理したpLOI1898のSacI部位に連結し、EagI側末端をNotIでpLOI1898に連結した。
pLOI1853はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。このcasABオペロンはlacZ及びpgmプロモータの両方から発現させることができた。このptsHIオペロンはadhBプロモータから発現した。二つのオペロン並びにこれらプロモータはまずpLOI1879内で融着させた。このプラスミドを構築するために、pLOI1886をベクタとして働かせた。これはXbaIで消化した後クレノウで処理することで作製された。ptsHIオペロン及びadhBプロモータを含有する断片をpLOI1866の消化から精製した。この断片の両端のうち一方はクレノウ処理されたApaI部位を有し、もう一方の末端は平滑SacII部位を有していた。その結果出来たpLOI1879を次にScaIで消化し、予めBamHI及びクレノウで処理したシャトルベクタpLOI1844に連結してpLOI1853を形成した。
pLOI1872はcasABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。両方のオペロンとも、lacZ及びpgmプロモータから発現させることができた。これらのDNAはlacZ−プロモータ→pgm−プロモータ→casABオペロン→ptsHIオペロンというように方向付けられていた。このptsHIオペロンを、pDS20から、二つの特注プライマ（5‘−ATGTCGACCTATAAGTTGGGA配列同定番号第10番及び5’−ATGGATCCATGATCTTCTTCTA配列同定番号第11番）を用いたPCRによって単離した。このPCR断片をクレノウ処理し、pUC18のHincII部位に連結してpLOI1847を形成した。次に、このptsHIオペロンを含有するXbaI／HindIII断片をpLOI1847から精製してpLOI1886のXbaI／HindII位置に連結してpLOI1860を形成した。その後pLOI1860をScaIで消化し、予めBamHI及びクレノウで処理されたシャトルベクタpLOI1844に連結してpLOI1872を形成した。
pLOI1832もまた、casABオペロン及びptsHIオペロンの両方を含んでいた。casABの前にはlacZ及びpgmプロモータがこの順に並んでおり、後方にはpgmターミネータが来ていた。このptsHIオペロンはadhBプロモータから発現し、その後ろにadhBターミネータが来ていた。このプラスミドを構築するために、まずpLOI1843及びpLOI1840を由来とする必須DNA断片をすべて組み合わせてpLOI1833を形成した。pgmプロモータ、casABオペロン、及びpgmターミネータを含有するHindIII／SacI DNA断片をpLOI1843の消化から精製した。クレノウで処理した後、この断片を、予めApaI及びクレノウで処理したpLOI1840に連結して、pLOI1833を形成した。次にpLOI1833をScaIで消化し、予めBamHI及びクレノウで処理したシャトルベクタpLOI1844に連結してpLOI1832を形成した。
Z. mobilisでのpts及びセロビアーゼ遺伝子の発現
プラスミド構築物のすべてをE. coli株S17−1からZ. mobilis CP4株に接合させた。次にこれらのプラスミドを組換えZ. mobilisから回収してE. coliに形質転換させて戻し、プラスミドが変異していないことを確認した。Z. mobilisから回収されたプラスミドのうちいずれも変異していなかった。E. coli JLT2に形質転換させると、この組換え株はセロビオースだけでなく、もとのプラスミドにより形質転換したものまで資化することができ、組換えE. coliから回収されたこれらのプラスミドの酵素消化パターンはもとのプラスミドのものと同じであった。Z. mobilisにおける外来のプラスミドの安定性が高いことは、E. coli及びBacillus subtilisなどのその他の普通の研究室用生物ほど変異し易くないというその性質を反映するものかも知れない。
セロビオース又はMUGを代謝するための組換えZ. mobilis株のために、これらの基質をまずリン酸化してから細胞内へ輸送し、その後開裂させた。このZ. mobilis組換え体について、10mg／LのMUGを含有するTRG培地の検知プレートでこの合計活性を調べた。pLOI1832を持つ組換えZ. mobilisから最も高い活性が観察され、MUG検知プレート上で一晩インキュベートした後に明るい蛍光が見られたが、pLOI1872を持つ組換え株ではMUGを加水分解する活性が大変弱いことが判明した。
試験管内アッセイの結果、K. oxytoca casAB及びE. coli ptsHIオペロンの両方がZ. mobilisで機能的に発現できたことが確認された。ONPG−Pを基質として用いてアッセイした場合は、ホスホ−セロビアーゼ（casBの産物）の高い活性が、pLOI1837（casAB）を持つ組換えZ. mobilisから観察されたが、天然の対照試料である、ベクタpLOI1844を持つ組換えZ. mobilisは何ら活性を有していなかった（図６）。
組換えZ. mobilisにおけるHPr及び酵素II（ptsHIの産物）の活性の試験管内測定を、PNPGを基質として用いた組合せアッセイにより間接的に行なった。酵素I及びHPrを測定する従来の方法はZ. mobilisには利用できなかったが、それは、この生物はその他の生物に比べてはるかに高いピルビン酸キナーゼ活性を有するからである。従って、この酵素の活性が高ければ、酵素I及びJPrの活性をカバーするであろう。この間接的アッセイはホスホ−セロビアーゼをカプラとして用いる。ホスホ−セロビアーゼはpLOI1837からの産物の一つであり、リン酸化していないPNPG上では活性が弱い（図７）。pLOI1837及びpLOI1836組換え体から採った細胞抽出液を混合した後は、このPNPG活性は約3倍に上昇した（図７）。この結果は、E. coli ptsHIはpLOI1836組換え体Z. mobilisで機能的に発現したことを示すものである。これらの機能的HPr及び酵素Iは、pLOI1837組換え体で発現した酵素II複合体（casAの産物）とあいまって、完全なPTSホスホトランスフェラーゼ系を形成した。この系は、PNPGをリン酸化することができるため、ホスホ−セロビアーゼの活性が高くなった。
pLOI1906を持つ組換えE. coli、及び、pLOI1832を持つ組換えZ. mobilisからのセロビオース加水分解の全体的活性をPNPGをアッセイの基質として比較すると、組換えE. coliからの活性は組換えZ. mobilisからのそれの約15倍であった（図８）。しかしながら、DH5α9pLOI1906）のこの全体的活性はK. oxytoca P2株からのそれの僅かに半分未満であった（図９）。
セロビオース加水分解の組換えZ. mobilisにおける率制限ステップを調べるために、酵素I及びHPr並びにホスホ−セロビアーゼの相対的活性を推定して、セロビオース最小培地でも成長できたE. coli DH5α及びDH5α（pLOI1906）からのそれと比較した。酵素I及びHPrの推定の結果を図１０に示した。この組合せアッセイでは、pLOI1837を持つ組換えZ. mobilisに、酵素II複合体およびホスホ−セロビアーゼが提供され、その量は過度かつ定期的に維持された。反応は30分間行なわせた。DH5α細胞抽出液の量が増えるにつれ、PNPGから遊離するPNPも増加した。pLOI1832を持つ組換えZ. mobilisから採った0.23gの細胞抽出液をDH5αの代わりに用いた場合は約0.009μモルのPNPが遊離したが、この量は0.59mgのDH5α細胞抽出液から遊離したそれに相当していた。従って、組換えZ. mobilisで発現した酵素I及びHPrは、DH5αでのそれの3分の1を超えた（0.23／0.59＝39%）。ホスホ−セロビアーゼの活性の推定値を図１１に示す。Z. mobilisからのこの活性は、DH5α（pLOI1906）からのそれの僅かに10分の1であったが、K. oxytocaからのそれに匹敵した。
セロビオース加水分解にとって充分に機能的な系には、活性PTS酵素I、HPr、酵素II複合体、およびホスホ−セロビアーゼがある。試験管内アッセイによる上記の結果は、組換えZ. mobilisにおけるセロビオース加水分解の低い全体的活性は、酵素II複合体（casAの産物）の活性が低いことが原因である可能性を示すものであるが、それはなぜなら、この酵素の一部（EIICドメイン）は正しく折り畳まれ、かつ活性に機能するためには膜内に組み込まれなくてはならないからである。組換えE. coliからのホスホ−セロビアーゼ活性はK. oxytocaからのそれよりもずっと高い（図１１）が、その全体的活性はK. oxytocaからのそれの僅かに半分未満であり、K. oxytoca酵素II複合体はE. coli膜では正しく折り畳まれず、その結果天然のK. oxytoca細胞でほどは活性でないかも知れないことを示唆している。同じ問題がZ. mobilisでも起きるかも知れない。全体的活性が低いもう一つの理由は、E. coli酵素I及びHPrがK. oxytocaセロビオース特異酵素II複合体で補完されていることかも知れず、その結果セロビオースのリン酸化が乏しくなり、また輸送も乏しくなっているのかも知れない。
微生物発現系での異種の遺伝子の発現は、その系の構成要素に依存する。最も重要な構成要素の一つはプロモータである。プラスミドpLOI1977とpLOI1872との間の大きな違いは、ptsHIオペロンのためのプロモータであった。pLOI1877では、ptsHIオペロンはその天然のE. coliプロモータから発現した。pLOI1972では、lacZ及びpgmプロモータがptsHIオペロンの発現に関わっていた。両プラスミドのcasABオペロンは、lacZ及びpgmプロモータから発現した。両プラスミドがptsI変異E. coli株であるJLT2のptsI機能を取り戻すことで、この変異体はセロビオース最小培地で成長することができた。しかしながら、pLOI1872を持つ組換えZ. mobilisのMUGを加水分解する活性は弱く、また一方pLOI1877を持つものには活性がなかった。これらの結果は、E. coli ptsHIの天然のプロモータはZ. mobilisでは機能しないかも知れないことを示唆するものである。
ターミネータは発現において重要なもう一つの構成要素である。他の研究者は、Z. mobilisのgap−pgkオペロンの3‘端にあるステム−ループは、Z. mobilis及びE. coliの両方において転写ターミネータであり、完全長のgap−pgkの伝令を安定させるために必要であると報告している。またこの3’のステム−ループは、E. coli及びその他の細菌において、3‘から5’の豊富なエキソヌクレアーゼによる崩壊を遮断するのに必要であると報告されている。この研究では、ステム−ループの存在は発現を著しく助けた。pLOI1853を持つ組換えZ. mobilisは、このオペロンのためのステム−ループを含まず、検知プレート上では何ら活性を呈さなかったが、一方、pLOI1832を持つそれは、これらオペロンの各々のためのステム−ループを含んでおり、MUGを加水分解する高い活性を検知プレート上で示した。これらのステム−ループは、Z. mobilisにおいてcasAB及びptsHIオペロンの伝令を安定させる転写ターミネータとして機能するのか知れない。しかしながら、これら二つのプラスミドを持つ組換えE. coli株も二つのオペロンの性質を等しく良好に呈していたため、これらのステム−ループはE. coliでは必要ではないかも知れない。E. coliでは転写がより高速で行なわれることが、エキソリボヌクレアーゼによる伝令の崩壊を補償するのかも知れない。
Z. mobilisではptsHIオペロンの発現はcasABオペロンの発現を促進するように思われた（図１２）。pLOI1832とpLOI1837との間の違いは、pLOI1832は発現可能なcasAB及びptsHIオペロンを両方とも含んでいた（図１０及び図１１）のに対し、pLOI1837は発現可能なcasABオペロンのみを含んでいた（図６）ことである。これら二つのプラスミドにあるその他の構成要素は同じであり、同じベクタを含み、ベクタ上の位置も同じであり、casABオペロンのためのプロモータ及びターミネータも同じであった。しかしながら、pLOI1832を持つZ. mobilis組換え体からのホスホ−セロビアーゼ（casBの産物）の活性は、pLOI1837を持つ組換え体でのそれの二倍を超えていた。
結果の要約
操作されたZ. mobilis株CP4（pLOI1832）では、casAB及びptsHIは色素産生セロビオース類似体を利用して実証されたように機能的に発現する。4-メチル-ウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシドは細胞内へ輸送され、リン酸化し、色素産生（蛍光）生成物（4-メチルウンベリフェロン）と、グルコース-ホスフェートとに開裂するが、このグルコース-ホスフェートは試験管内で検知プレート上に容易に観察され、またp-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシドは、リン酸化し、色素産生生成物（p-ニトロフェノール）とグルコース-ホスフェートとに開裂する。ptsHIオペロン又はcasABオペロンのいずれかを欠くコンストラクトはこれらの活性を呈さないが、試験管内で混合してその活性を再構成することができる。
しかしながら、この取り込みプロセスの全体的活性は、最良の組換えZ. mobilisであるCP4（pLOI1832）においても尚、その他の発酵可能な糖の不在下ではこの基質上での成長を助けるのに充分な率ではセロビオースを代謝しない。
InzI及びHPrの活性は、数多くの糖類をPTS酵素を通じて輸送及びリン酸化するためにこれらの一般的たんぱく質を効果的に用いる生物であるE. coli中に存在するそれのほぼ3分の1であると推定される。casBの産物であるホスホ-β-グルコシダーゼは、セロビオースを発酵させる能力の大変高い生物であるK. oxytocaに等しい量、発現する。表５は、本発明の組換えZymomonas mobilisのセロビオース加水分解の生体内活性を要約した図である。
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等価物
以上、本発明をその好適な実施例を参照しながら具体的に示し、かつ説明してきたが、当業者であれば、様々な形式上かつ詳細の変更を、添付の請求の範囲に定義された本発明の精神及び範囲を逸脱することなく行なうことができることは理解されよう。当業者であれば、ごく通常の実験を行なうのみで、ここに具体的に説明された本発明の特定の実施例に対する等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価物は、当該請求の範囲の包含するところとして意図されている。
【図１】
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【図５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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