(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物遊離段階が実施される試料中の分析物の存在を測定するためのアッセイ方法であって、
ビオチンまたはビオチン模倣物に連結されたポリアミンによりコーティングされた支持体から基本的に成る表面であって、ここで該ビオチンまたはビオチン模倣物がビオチン結合性分子にさらに連結されている表面を提供する工程；
該表面を担体タンパク質に結合した分析物を含有する試料と接触させる工程；
該表面の存在下において、該担体タンパク質から該分析物を遊離させる工程；
該表面をビオチンまたはビオチン模倣物に連結された分析物結合性成分と接触させる工程であって、ここで遊離した分析物が分析物結合性成分に結合し、そして該分析物結合性成分に連結されたビオチンまたはビオチン模倣物がビオチン結合性分子に結合し、これにより該遊離した分析物が該表面に結合する工程；及び
該表面に結合した分析物の存在を検出することにより、分析物の存在を測定する工程、
を含んで成る、方法。
【請求項２】
前記ポリアミンがポリリジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビオチン結合性分子が１又は複数のアビジン及びストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物がビタミンＢ１２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物が葉酸である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はアッセイに用いられる表面または固相に関する。本発明はまた、前記表面を使ってアッセイを実施する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
イムノアッセイ技術や他の結合タンパク質アッセイ技術を使った体液試料中の様々な分析物の検出および定量は、病気の診断、治療および監視を必要とする分野において十分に確立されている。分析物（analyte ）は、タンパク質、ホルモン、化学物質およびそれらの代謝産物といった様々な因子のいずれであってもよい。常用される結合タンパク質アッセイ技術は、反応容器、例えばマイクロウェル上への、分析物のためのレセプターの固定化を含む。この固定化は、物理的吸着により、化学的結合により、またはビオチンとアビジンのような特異的結合ペアを使うことにより達成することができる（米国特許第5,367,624 号）。試料によっては、分析物と分析物特異的活性表面との相互作用を可能にし、かくして分析物の検出を可能にするような形で分析物を遊離させるために、前処理を必要とすることがある。分析物を遊離させるために苛酷な試料の前処理が必要であるアッセイは、従来、２つの別々の容器中かまたは２つの物理的に離れた表面上で実施される。以後、このような前処理段階を「分析物遊離段階」と称することにする。
【０００３】
例えば、血清または血漿試料中のビタミンＢ12または葉酸化合物（folate、以降葉酸と称する）を測定するためには、分析物特異的アッセイ成分が問題の分析物を結合することができ且つ適当な測定が実施できるほどの、結合タンパク質もしくは担体タンパク質または他の物質と複合体形成し得る分析物の部分を遊離させることが必要である。結合したまたは複合体形成した分析物の遊離は、通常、アッセイに先立って、分析物遊離段階を実施することにより、例えば強アルカリを試料に添加するかまたは還元剤の存在下で試料を煮沸することにより、達成される〔Branagan (1991) 〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、分析物遊離段階で使われる試薬が、マイクロウェル表面上の活性成分と反応して分析物結合の低下または除去を引き起こし得るということが問題として生じる。従って、通常は未コーティングのまたは活性化されてない容器を使って別の容器の中で試料前処理段階または分析物遊離段階が行われ、そして分析物遊離段階の後で試料の一部が活性反応容器へと移されるので、アッセイ手順に余分な段階を必要とする。あるいは、分析物の遊離後に試料の入った容器の中に導入される別の表面上でアッセイが実施される場合がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、分析物遊離段階に対して耐性である活性表面を提供することである。従って、本発明は、別々の容器または表面の必要性をなくし、そして他の方法ではアッセイ表面上の活性成分を変性または分解してしまうであろう分析物遊離段階を実施できるようにする。従って、本発明は、ビオチンまたはビオチン模倣物に連結されて複合体を形成する分子によりコーティングされた支持体を含んで成り、前記複合体が分析物遊離段階に対して耐性である、アッセイ用の表面に関する。好ましくは、ビオチンまたはビオチン模倣物に連結される分子がポリアミンである。最も好ましくは、該ポリアミンがポリリジンである。
【０００６】
本発明の別の態様では、ビオチンまたはビオチン模倣物が、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群より選ばれたビオチン結合性分子と更に結合される。アビジンまたはストレプトアビジンのどちらも使用でき、アッセイ条件によってどちらを使用すべきかを当業者は知っているだろう。この態様の一例は、アビジンに結合したビオチンに連結されたポリリジンによりコーティングされた固相である。
【０００７】
本願発明は、分析物遊離段階が実施される試料中の分析物の存在を測定するためのアッセイ方法であって、ビオチンまたはビオチン模倣物に連結されて複合体を形成する分子によりコーティングされた支持体を含んで成り、前記複合体が分析物遊離段階に対して耐性である表面を提供することを特徴とする方法にも関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、アッセイ用表面は、標準的カップリング化学により、ビオチンまたはビオチン模倣物に化学的に結合されている分子、例えばタンパク質または多糖によりコーティングされる。生じた複合体は更にビオチン結合性分子、例えばアビジンまたはストレプトアビジンに結合される。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンを固相上にオーバーコーティングすることができ、またはアッセイ試薬中に溶液状態で存在することができる。次いでアッセイの１または複数の分析物特異的成分がビオチン化されているアッセイを実施することができる。
【０００９】
本発明は更に、そのような表面を使ったアッセイ方法に関する。上述したように、従来の結合タンパク質アッセイ技術は、分析物のためのレセプターを固相支持体上へ固定化することを必要とする。典型的な技術は、次いで分析物を含む可能性のある試料と固相とを接触させ、分析物のための第二の結合性リガンドであって検出可能な基により直接的または間接的に標識されている第二のリガンドと前記固相とを接触させ、そして固相に結合した検出可能な基の量を測定することを含んで成るだろう。あるいは分析物の存在の指標として、固相に結合していない検出可能な基の量を測定することができる。検出可能な基は、例えば、酵素、放射性原子、蛍光分子または発光分子であることができる。当業者は、上記段階が同時にまたは連続して実施できることを理解するだろう。
【００１０】
アッセイ用表面は任意の支持体、例えばマイクロウェル、ゲル、膜、粒子、ビーズまたはディップスティックであることができる。当業者は、どんなタイプの支持体がアッセイを実施するのに最適であるかを知っているだろう。コーティング技術は当該技術分野で既知であり、その例としては例えば物理的吸着または化学的結合が挙げられる。ポリアミンという語はアミン側基を含むポリマー化合物、例えばポリリジンを意味する。ビオチン模倣物は、アビジンまたはストレプトアビジンに結合することができる任意の化合物である。ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの高親和性相互作用、並びにイムノアッセイおよび他の免疫学的技術におけるそれの使用は、当該技術分野で周知である〔Bayer, E.A. およびWilchek, M. (1988)〕。
本発明の有用性および利点を下記の実施例により更に説明する。
【００１１】
【実施例】
実施例１
ポリリジン−ビオチン／アビジンによるマイクロウェルのコーティング
本発明の一態様では、マイクロウェルをコーティングするのに用いるポリアミンはポリリジンである。ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩とビオチン−ＸＸ−ＮＨＳ（Calbiochem, Beeston, U.K. ）との反応により調製したポリリジン−ビオチン接合体を、0.1 Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0 または0.1 Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液 pH 10.0中2.5 mg／mLにおいて、ポリスチレン製マイクロウェルに添加した。ポリリジン−ビオチンが表面を飽和するのに十分な時間、マイクロウェルを室温でインキュベートした。この実験では、６分以上が十分であるとわかった。マイクロウェルを洗浄した後、同じリン酸塩または炭酸塩緩衝液中10 mg/mLの濃度でアビジンを添加した。マイクロウェル上の利用可能なビオチンを飽和するのに十分な時間、マイクロウェルをアビジン溶液と共にインキュベートした。この場合、50分以上が十分であると認められた。ポリアミン−ビオチンとアビジンの濃度は、生成する表面のビオチン結合能が0.05〜0.2 ng/mm2となるようなものを使用した。ビオチン結合能は当該技術分野で既知の方法（米国特許第5,362,624 号）により測定することができる。このようにして調製されたポリリジン−ビオチン／アビジンでコーティングされた表面または反応容器は、１または複数の特定アッセイ成分がビオチンで標識されるアッセイに用いることができる。
【００１２】
実施例２
ポリリジン−ビオチン（ＰＬＢ）／アビジンマイクロウェルとアビジンマイクロウェルを使った葉酸アッセイ
AMERLITEポリスチレンマイクロウェルを、実施例１に記載の通りにポリリジン−ビオチン（ＰＬＢ）とアビジンでコーティングした。ＰＬＢ−アビジンでコーティングしたウェルと同様のビオチン結合能を有する、アビジンだけでコーティングしたマイクロウェルを、対照として比較した。
【００１３】
試料の処理：異なる濃度の葉酸を含む血清試料10μL と、１％アスコルビン酸と0.03％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む試料処理用溶液10μL をウェルに添加し、そしてAMERLITEインキュベーター上で振盪しながら37℃で15分間インキュベートした。この後、0.8 M NaOH（変性剤溶液）10μL を加え、ウェルを37℃で更に５分間インキュベートした。全ての処理および変性剤溶液が水溶液であることに注目されたい。
【００１４】
葉酸アッセイ：前記インキュベーションの後、ホウ酸塩緩衝液（pH 7.2）中の0.04 mg/mLのビオチン化葉酸結合タンパク質（ビオチン−ＦＢＰ）100 μL と3 ng/mL の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識葉酸（葉酸−ＨＲＰ） 50 μL とを加え、マイクロウェルを37℃で60分間インキュベートした。与えられた試料中の葉酸は、ビオチン−ＦＢＰによる結合を目当てに葉酸−ＨＲＰと競争するだろう。ビオチン−ＦＢＰ／葉酸とビオチン−ＦＢＰ／葉酸−ＨＲＰ複合体は、ビオチン−アビジン結合を介してマイクロウェル上に固定化される。試料中に葉酸が存在しない場合は、ビオチン−ＦＢＰにより結合された全ての葉酸がＨＲＰで標識されるだろうから、最大ＨＲＰ活性がマイクロウェル上に固定化される。与えられた試料中の葉酸の濃度が増加するにつれて、ビオチン−ＦＢＰによる結合を目当てにした葉酸−ＨＲＰとの競争が増加し、そのため試料中の葉酸濃度が高くなればなるほどマイクロウェル上に固定化されるＨＲＰ活性が低くなる。
【００１５】
AMERLITE洗浄器上で洗浄した後、AMERLITEシグナル試薬を各ウエルに添加し、光出力をAMERLITE分析器により測定する。ＨＲＰ活性は増強発光反応により測定する〔Whitehead 他（1983）〕。発光生成基質（ルミノール誘導体と過酸塩）とエンハンサーとを含むAMERLITEシグナル試薬をウェルに添加して発光反応を開始させる。エンハンサー（置換フェノール）の目的は、生成する光のレベルを高め且つそれの放出を延長することである。アッセイの結果を表１に与える。
【００１６】
【表１】
0004455688.tif 000002
【００１７】
実施例３
ポリリジン−ビオチン（ＰＬＢ）／アビジンマイクロウェルとアビジンマイクロウェルを使ったビタミンＢ12アッセイ
AMERLITEポリスチレンマイクロウェルを、実施例１に記載の通りにポリリジン−ビオチン（ＰＬＢ）とアビジンでコーティングした。ＰＬＢ−アビジンでコーティングしたウェルと同様のビオチン結合能を有する、アビジンだけでコーティングしたマイクロウェルを、対照として比較した。
【００１８】
試料の処理：異なる濃度のビタミンＢ12を含む血清試料10μL と、0.015 ％KCN 、0.1 ％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およ0.5 M NaOHを含む試料処理／変性剤溶液20μL をウェルに添加し、そしてAMERLITEインキュベーター上で振盪しながら37℃で15分間インキュベートした。
【００１９】
ビタミンＢ12アッセイ：前記インキュベーションの後、リン酸塩緩衝液（pH 6.4）中の5 ng/mL のビオチン化内因子（ビオチン−ＩＦ）100 μL と2 ng/mL の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ビタミンＢ12（ビタミンＢ12−ＨＲＰ）50μL とを加え、マイクロウェルを37℃で60分間インキュベートした。与えられた試料中のビタミンＢ12は、ビオチン−ＩＦによる結合を目当てにビタミンＢ12−ＨＲＰと競争するだろう。ビオチン−ＩＦ／ビタミンＢ12とビオチン−ＩＦ／ビタミンＢ12−ＨＲＰ複合体は、ビオチン−アビジン結合を介して固相上に固定化される。試料中にビタミンＢ12が存在しない場合は、ビオチン−ＩＦにより結合された全てのビタミンＢ12がＨＲＰで標識されるだろうから、最大ＨＲＰ活性がマイクロウェル上に固定化される。与えられた試料中のビタミンＢ12の濃度が増加するにつれて、ビオチン−ＩＦによる結合を目当てにしたビタミンＢ12−ＨＲＰとの競争が増加し、そのため試料中のビタミンＢ12濃度が高くなればなるほどマイクロウェル上に固定化されるＨＲＰ活性が低くなる。
【００２０】
AMERLITE洗浄器上で洗浄した後、AMERLITEシグナル試薬を各ウェルに添加し、光出力をAMERLITE分析器により測定する。ＨＲＰ活性は実施例２と同様に増強発光反応により測定する。アッセイの結果を表２に与える。
【００２１】
【表２】
0004455688.tif 000003
【００２２】
葉酸およびビタミンＢ12アッセイの結果
表１と表２に与えた結果は、ＰＬＢ／アビジンでコーティングされたマイクロウェルの使用が、アビジン対照ウェルと比較して、葉酸とビタミンＢ12の不在下では有意に高いシグナルを与えそして分析物の濃度が増加するとより大幅なシグナルの減少を与えることを示す。検出される相違は、試料変性処理後の対照ウエル中のビオチン結合能の低下に起因する。
【００２３】
参考文献
１．米国特許第5,367,624 号
２．Branagan, P., Kit Inspection Laboratory Practice 40:11, pp.27-30 (1991)
３．Christenson, R.H., Dent, G.A. およびTuszynski, A., “Two Radioassays for Serum Vitamin B12 and Folate Determination Compared in a Reference Interval Study," Clin. Chem. 31:8, pp.1358-1360 (1985)
４．Bayer, E.A. およびWilchek, M. “The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Chem. vol.171, pp.1-32 (1988)
５．Whitehead, T.P. 他、“Enhanced Luminescence Procedure For Sensitive Determination of Peroxidase-labeled Conjugates In Immunoassay," Nature vol.305, pp.158-9 (1983)