(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面においてO-抗原多糖を発現する微生物の抗原エピトープを露出させるための、一般的強化培地及び少なくとも１つの構造改変有機化学エネルギー脱共役剤を含む組成物の使用であって、該構造改変有機化学エネルギー脱共役剤が2,4-ジニトロフェノールである、使用。
【請求項２】
前記の一般的強化培地が、秀逸ブロス(Terrific Broth)、SOB培地、SOC培地、LB培地、NZCYM培地、最小培地、ラクトースブロス、緩衝化ペプトン水、脳心臓点滴培地、ヘモフィルス菌ブロス、トリプシン消化ダイズブロス及び栄養ブロスから成る群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
検査試料中の、細胞表面においてO-抗原多糖を発現する微生物を検出するための方法であって：
(a)  検査試料を請求項１に記載の組成物と接触させることによって、混合液を形成する工程；
(b)  微生物の抗原エピトープを露出させるため、かつ検出可能なレベルまで微生物を増殖させるために、前記混合液を十分な時間インキュベーションする工程；及び
(c)  前記混合液中の特異的な微生物の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項４】
前記混合液を界面活性剤と接触させることを更に含んで成る、請求項３に記載の方法であって、ここで該接触が検出の前に抗原エピトープを更に露出させる方法。
【請求項５】
検出の前に、前記混合液と界面活性剤との組み合わせを加熱することを更に含んで成る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウムから成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記の加熱を、約40〜約121℃で、抗原エピトープを更に露出させるために十分な時間行う、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、リステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌及びカンピロバクター菌から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
検査試料中のリステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌の存在を検出するための方法であって、ここでリステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌は細胞表面においてO-抗原多糖を発現し、ここで該方法は：
(a)  検査試料を請求項１の組成物と接触させることによって、混合液を形成する工程；
(b)  微生物の抗原エピトープを露出させるため、かつ検出可能なレベルまで微生物を増殖させるために、前記混合液を十分な時間インキュベーションする工程；及び
(c)  前記混合液中の特異的な微生物の存在を検出する工程であって、ここで陽性の検出結果が、前記検査試料中のリステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌の存在を示す工程、
を含んで成る方法。
【請求項１２】
前記混合液を界面活性剤と接触させることを更に含んで成る、請求項１１に記載の方法であって、ここで該接触が検出の前に抗原エピトープを更に露出させる方法。
【請求項１３】
検出の前に、前記混合液と界面活性剤との組み合わせを加熱することを更に含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウムから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記の加熱を、約40〜約121℃で、抗原エピトープを更に露出させるために十分な時間行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出を免疫検査法によって行う、請求項３又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫検査法が、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法及び免疫ブロット法から成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫検査法が、視覚的免疫沈殿検査法である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出が、相補的なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は抗体断片を用いるものである請求項１９に記載の方法であって、ここで該抗体又は抗体断片が、保存された細胞壁エピトープに特異的である方法。
【請求項２２】
検査試料中の標的微生物上の微生物特異的なエピトープを検出するための方法であって、ここで該標的微生物が細胞表面においてO-抗原多糖を発現し、該方法が：
(a)  検査試料中の標的微生物を許容される一般的強化培地中で増殖させる工程であって、ここで該培地は2,4-ジニトロフェノールである構造改変有機化学エネルギー脱共役剤を含有する、工程；及び
(b)  前記検査試料を検出試薬に結合した微生物特異的抗体と接触させる工程であって、ここで前記抗体との反応性により前記微生物の存在が示される工程、
を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記検査試料と前記抗体との接触を、装置又は検査系において行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検査系が、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法及び免疫ブロット法から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検査装置が、側方流動式検出装置である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、リステリア菌及びカンピロバクター菌から成る群から選択される微生物に特異的である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
試料中の標的微生物を検出するための側方流動式装置であって、微生物特異的抗体と、少なくとも１つの構造改変有機化学エネルギー脱共役剤を含有する一般的強化培地中で予め増殖させた検査試料とを含んで成り、前記抗体は、前記構造改変有機化学エネルギー脱共役剤によって露出された保存された特異的リガンドを認識するものであり、ここで該構造改変有機化学エネルギー脱共役剤は2,4-ジニトロフェノールである、前記装置。
【請求項２８】
前記抗体がサルモネラ菌に特異的である、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記抗体が腸管出血性大腸菌に特異的である、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
前記抗体がリステリア菌に特異的である、請求項２７に記載の装置。
【請求項３１】
前記抗体がカンピロバクター菌に特異的である、請求項２７に記載の装置。
【請求項３２】
前記の検査試料が、食品、水、環境試料、生物学的試料、人体試料及び獣医学的試料から成る群から選択される、請求項３、１１及び２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には、微生物を検出及び同定するための組成物、その製法、装置及び方法に関し、特には、抗体を用いた検出系によって検出するために十分なレベルまで微生物が増殖する能力を抑制すること無く、標的微生物の高度に保存された抗原部位を露出させることによって微生物を検出するための組成物、その製法、装置及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景
微生物病は、長い間世界中で主要な健康上の関心の的である。世界中でその急発生の頻度及び重症度が有意に増加している。新しい病原性細菌である大腸菌O157:H7が同定されている。更に、以前に検出された病原菌が変異して、薬剤耐性且つ高感染性の菌株、例えばSalmonella typhimirium DT104を形成している。この様な疾病の予防の主な特徴は、早期の診断である。疫学者は、有効な疾病予防策を見つけるために、環境及び食品中の微生物混入を検出する必要がある。
【０００３】
一例として、1992年に米国の太平洋岸北西地域で、牛挽き肉の混入による腸管出血性大腸菌(EHEC)の急発生が起きた。EHECは比較的に「新しく発見された」病原体である。EHECは1975年に最初に単離されたもので、1982年以降に米国における２例の食品に関連した出血性大腸炎の急発生が大腸菌O157:H7に関係した。大腸菌O157:H7の報告事例は増加している。大腸菌株は、典型的には無害な共生生物であるが、いくつかの菌株は病原性である。EHECは特に悪性であり、致死的な合併症、例えば、子供における重症な腹部痙攣及び急性腎不全、並びに心臓血管性及び中枢神経系の障害を誘発し得る。
【０００４】
もう１つの例として、サルモネラ菌(Salmonella)は、米国疾病管理センター(CDC)の食品による疾病の調査によれば、食品による細菌疾病の急発生の原因の第一位である(50%超)。1988年から1992年までに年間40000超の症例が、CDCに報告されている。サルモネラ菌は、広範囲の温血及び冷血動物に感染し、そして宿主外で長期間生存することが可能である。
【０００５】
別の例として、1990年代初期に最初にイギリスで、Salmonella typhimirium DT104が同定された。これは、高度に順応した薬剤耐性サルモネラ菌であり、悪性であることが知られている。従って、この血清型に臨床上の関心が集まっている。S. typhimirium DT104は、サルモネラ属間で高度に保存されているコア細胞壁抗原エピトープを有する。
【０００６】
グラム陽性細菌であるリステリア(Listeria)属は、自然界に広く分布していて、土、水、野菜及び多数の動物種から単離されている。農業環境におけるリステリア菌の検出頻度は明らかに増加している。リステリア症の急発生における地域別死亡率は、感染患者の30〜40％と推定されているが、最小感染量に関してはほとんど何も分かっていない。食品でのリステリア菌制御における特に問題な点は、リステリア菌が−0.4℃の低温から44℃の高温までの範囲で増殖することである。これらの因子の全てが、リステリア菌の食品病原性に益々有意に寄与する。
【０００７】
最近、Campylobactor jejuni及びcoliが、特に家禽を起源とする腸炎の第一位の原因と認められた。従って、人間の病原菌ではないいくつかの他のカンピロバクター(Campylobactor)菌種から前記の２種を識別する必要性が増している。このために、より特異性の高い細胞壁の膜抗原エピトープの識別選択が要求されている。
【０００８】
微生物が混入する潜在的な環境源及び食品源を、素早く且つ簡単に、しかし高度に特異的に監視する方法があれば、人間に感染する危険性を減らすことができるだろう。従って、特異性の高い分析方法、好ましくは、微生物、例えば細菌、酵母、カビ、真菌、寄生虫及びウイルスを検査することが可能な装置を用いるが、特別な又は技術的な装備を必要とせず、当分野で実行可能であり、そして特別の技能を要求しない前記方法が有用であろう。食品への細菌混入の場合、４つの主要な疾病関連生物は、サルモネラ菌、リステリア菌、EHEC及びカンピロバクター菌である。
【０００９】
現在、多数のサルモネラ菌、リステリア菌及びEHECの検出方法が利用できるが、標準的な培養分析方法によって検査結果を得るためには、熟練した技術者及び最低２〜５日数が必要である。新しいより速い方法は、酵素免疫検査法(EIA)、DNAハイブリダイゼーション、免疫拡散法、又は増殖／代謝測定法などの技術方法に基づいている。これらの急速方法は、培養方法に比べて必要時間が非常に短いが、依然として熟練技術訓練、機能的な実験室、及び特別な装置を必要とする。これらの検査方法では、一般的に合計２日以上の日数が必要であり、しかも人が携わる時間がかなりある。これまでのカンピロバクター菌の検出方法は、技術的に集約的な作業を要する面倒な培地と環境条件、その他に熟練分析者を要求する。
【００１０】
診断分野における別の技術は、側方流動式免疫検査法(lateral flow immunoassays)である。前記検査は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を検出するために開発されたもので、妊娠検査に用いられる。典型的には、モノクローナル及びポリクローナル抗体を、検出ゾーンと呼ばれる固体保持片の遠方端付近に個別のバンドとして固定する。別の一定量の抗体を検出試薬、例えば無機ゾル又は染色ポリスチレン粒子によって標識する。この標識した抗体を、保持片の近位端付近に可逆的に付着させる。抗原を潜在的に含んでいる試料液体によって前記近位端を水和させると、その抗原が標識抗体と反応し、生成した複合体が固定化抗体ゾーンを通過し、そして固定化抗体と反応し、その結果サンドイッチ体が生成する。発色試薬−抗原複合体の捕捉によって、検出ゾーンに視認されるシグナルが形成される。
【００１１】
病原微生物を識別するために、ホルモン又はその他の可溶性標的分子を識別する場合とは対照的に、２つの主要な課題を解決する必要がある。この課題は、抗原上類縁である多数の生物の存在下で、病原性微生物の全ての菌株を、低い偽陽性率で且つ非常に低い、好ましくはゼロの偽陰性率で検出する必要があることである。２つ目の課題は、微生物自体の物理的サイズ及び異質性である。典型的な臨床診断検査、例えば尿中のhCG検査は、特性が十分に評価された基体(尿)中で、単一で小さな特有の対象体(すなわちホルモン)を検出することに集中している。更に、分析物(hCG)の構造は明確であり、そのサイズ及び組成も均一である。
【００１２】
病原菌の検出、例えばサルモネラ菌の検査では、類似微生物、例えばシトロバクター属(Citrobacter)菌種及びエンテロバクター属(Enterobacter)菌種、の非病原性菌株から特定の病原性菌株を識別する必要がある。十分に明確な小サイズの大部分のホルモン又はマーカータンパク質とは対照的に、微生物は非常に大きく、その表面は異質性を示し、例えばSalmonella菌の鞭毛抗原の相変異に見られる通り、変化し得る多数の異なる抗原エピトープを含んでいる。
【００１３】
更に、多数の微生物の細胞壁膜は、一定の属内で高度に一致して反復される抗原エピトープ、例えばリポ多糖を含んでいる。これらの抗原エピトープは、相補的な特異的抗体と反応する非常に望ましい標的として機能し、これを用いることによって、偽陽性率が低く、そして正確性の高い方法が提供される。しかし、これらの高度に保存された抗原エピトープと反応する抗体を単離すること、そして結合させることは、困難である。なぜならこれらは、Ｏ抗原多糖鎖によって立体的に隠蔽されるからである。立体妨害と称するこの現象のために、一般的にはこれらに接触することができない。この立体妨害は、微生物の表面抗原エピトープによって生じる。この立体障害に寄与することが知られている表面構造の例は、表面タンパク質、群特異的リポ多糖、鞭毛、及び細胞被包化(cellular encapsulation)である。
【００１４】
内部抗原エピトープを露出させる過激な処理を行い得るが、これらの処理は細胞の生体活性を破壊し、多くの場合、細胞の個体性を完全に壊す。この様な処理の例は、熱処理（煮沸又はオートクレーブ処理）及び化学的抽出（亜硝酸消化）である。これらの抽出の重大な欠点は、微生物が死滅することである。従って、細胞増殖が、不活性化の前に、検出に十分なレベルまで到達しなかった場合、検査結果は得られないだろう。
【００１５】
従って、微生物の増殖が依然として可能でありながら、隠された高度に保存された抗原エピトープを露出することが同時に可能である方法が、当業界で必要とされている。更に、種々の基体の中で、異種微生物集団の存在下に特定の種の高度に保存された標的抗原エピトープの選択性の向上を付加することが当業界で望まれている。本発明は、この様な利点、そしてその他の関連の利点を提供する。
【００１６】
発明の要旨
本発明は、一般に、抗原エピトープを露出させる新規な微生物増殖組成物を提供する。１つの点として、本発明は、一般的強化培地(general enrichment media)及び少なくとも１つの構造改変有機化学薬品(structure modifying organic chemical)を含有する組成物を提供する。１つの態様として、この構造改変有機化学薬品は、2,4-ジニトロフェノール又はカルボニルシアニド-m-クロロフェニルヒドラゾンである。別の態様として、前記の一般的強化培地は、種々の容易に作成される、又は市販されている培地、例えば秀逸ブロス(Terrific Broth)、SOB培地、SOC培地、LB培地、NZCYM培地、最小培地、ラクトースブロス、緩衝化ペプトン水、脳心臓点滴培地、ヘモフィルス菌ブロス、トリプシン消化ダイズブロス、及び栄養ブロスである。
【００１７】
別の点として、本発明は、検査試料中の微生物の検出方法であって、検査試料を、一般的強化培地及び少なくとも１つの構造改変有機化学薬品を含有する組成物と接触させ、そして混合液を形成することによる前記方法を提供する。次にこの混合液を、微生物が検出可能なレベルに達するために十分な時間インキュベーションし、その後、特定の微生物の存在を検出する。この点に関する１つの態様として、当混合液を、検出の前に又は同時に界面活性剤と接触させる。別の態様として、当混合液を、検出の前に又は同時に界面活性剤と接触させ、且つ加熱する。１つの態様として、前記界面活性剤は陰イオン性である。別の態様として、前記界面活性剤は非イオン性である。１つの態様として、前記陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウムから選択される。１つの態様として、前記の非イオン性界面活性剤は、NP-40、テルギトール(tergitol)又はトライトンX-100である。１つの別の態様では、当混合液を、界面活性剤の存在下で40〜121℃の温度に加熱する。
前記検出方法の１つの態様として、検出する微生物は、リステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌である。
【００１８】
本発明の別の点として、検査試料中のリステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌の存在を検出するための方法であって、検査試料を、一般強化培地及び少なくとも１つの構造改変有機化学薬品と接触させ、次にこの混合液を、微生物が検出可能なレベルに達するために十分な時間インキュベーションすることによる前記方法が提供される。当混合液中の微生物が検出可能レベルに達した後に、リステリア菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌を特異的に検出する。この点に関する１つの態様として、当混合液を、検出の前に又は同時に界面活性剤と接触させる。別の態様として、当混合液を、検出の前に又は同時に界面活性剤と接触させ、且つ加熱する。１つの態様として、前記界面活性剤は陰イオン性である。別の態様として、前記界面活性剤は非イオン性である。１つの態様として、前記陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムでよい。１つの態様として、前記の非イオン性界面活性剤は、NP-40、テルギトール(tergitol)又はトライトンX-100である。１つの別の態様では、当混合液を、界面活性剤の存在下で40〜121℃の温度に加熱する。
【００１９】
別の態様として、本文に記載の検出方法で免疫検査法を用いる。１つの態様として、前記免疫検査法は、視覚的な免疫沈殿検査法(visual immunoprecipitate assay)、酵素免疫検査法(enzyme linked immunoassay)、化学発光法、及び免疫ブロット法から選択される。別の１つの態様として、前記免疫検査法は、視覚的免疫沈殿検査法である。更に１つの態様として、相補的なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体断片を利用した免疫検査法を用いる。ただし前記抗体又は抗体断片は、標的微生物の高度に保存された細胞壁エピトープに特異的なものである。
【００２０】
本発明の別の点として、微生物を含んでいる検査試料を、免疫親和性に基づいた検出装置と接触させることを含んでなる方法が提供される。この方法では、検査試料を、構造改変有機化学薬品の存在下で予め増殖させておく。
【００２１】
更に本発明は、微生物の細胞壁抗原エピトープが改変される様に微生物を増殖させる方法であって、検査試料を、一般的強化培地及び少なくとも１つの構造改変有機化学薬品を含有する組成物と接触させ、そしてその中の当該微生物を増殖させることによる前記方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の点として、検査試料中の標的微生物上の微生物特異的エピトープを検出する方法であって、検査試料中の微生物を、許容される一般的強化培地中で増殖させること、ただし前記培地は、構造改変有機化学薬品を含んでなり、そしてその検査試料を、検出試薬に連結した微生物特異的抗体と接触させることを含んでなる前記方法が提供される。この抗体との反応により、前記微生物の存在が検出される。別の態様として、この検査試料と抗体との接触は、装置又は検査系内で生じる。更に別の態様として、前記検査系は、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法及び免疫ブロット法から選択される。別の態様として、前記検査装置は、側方流動式検出装置(lateral flow detection device)である。１つの態様として、前記方法で用いる抗体は、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、リステリア菌及びカンピロバクター菌から選択される微生物に特異的なものである。
【００２３】
本発明は、別の点として、試料中の標的微生物を検出するための側方流動式装置であって、微生物特異的抗体と、一般的強化培地中で予め増殖させた検査試料とを含有する前記装置を提供する。ただし前記培地は、少なくとも１つの構造改変有機化学薬品を含有する。この点に関する１つの態様として、前記抗体は、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、リステリア菌又はカンピロバクター菌のいずれかに特異的なものである。
【００２４】
以下の詳細な説明及び実施例から本発明のこれらの点、及びその他の点が明らかになろう。ある種の方法又は組成物（例えば抗体、検査法など）を詳細に記載した以下に記載の参考文献を本文に組み込む。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明の説明の前に、以下の用語の定義を説明する。
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、人間に適応化させた抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ抗体、並びにそれらの断片、例えばF(ab')2及びFab断片、並びにその他の組換えにより生産された結合体を含んで意味する。更に当抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させ又は組換えにより融合させてよい。
【００２６】
「構造改変有機化学薬品」とは、特異的であり且つ保存されたリガンドを露出させる様に、微生物の細胞壁の組成を変化させ得る有機化学薬品を指す。要するに、前記有機化学薬品は、典型的には、細胞壁に立体的に妨害するエピトープの移転を阻害するものである。前記有機化学薬品には、限定でなく、2,4-ジニトロフェノール、カルボニルシアニド-m-クロロフェニルヒドラゾン、又は類似の電子伝達系脱共役剤(electron uncouplers)(すなわちプロトン駆動力を不能にするもの)があり、これらは、モノクローナル及びポリクローナル抗体によって認識される高親和性且つ特異的なエピトープを露出させる効果を有する。
【００２７】
用語「一般的強化培地」とは、微生物の増殖を促進するために有用であることが知られている任意の培地を指す。要するに、種々の一般的強化培地が市販されており、そして／又は容易に作ることができる。これらには、限定でなく、トリプトンをベースとする培地（例えば秀逸ブロス、SOB、SOC及びLB培地）、NZCYM培地、最小培地、ラクトースブロス、緩衝化ペプトン水、脳心臓点滴培地、ヘモフィルス菌ブロス、トリプシン消化ダイズブロス、及び栄養ブロスなどがある(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Habor Press, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995参照；Sigma Chemical Co., St.Louis, MO及びDifco Laboratories Inc., Detroit, Michiganから購入可能である)。
【００２８】
本発明では、高度に保存された、しかし立体的に接触不能である抗原エピトープを発現する標的微生物の検出であって、本発明の増殖培地組成物を用いた前記検出が提供される。この場合、一定の検出方式、例えば視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法、及び類似の方法に従って、非常に特異的な抗体を用いた検出が行われる。本発明は、内部細胞壁構造内に見出される高度に特異的で且つ保存された抗原エピトープを露出させる様に当該微生物の表面構造が改変されるが、実質的な細胞死を誘発することなく、当該微生物を最適レベルまで増殖させることができる修飾培地中の増殖環境を提供することによって、前記検出を可能にする。
【００２９】
本発明に従って、分析者は、注目する検査試料を、特異的抗原エピトープを露出させる本発明の増殖培地中で、しかも日常的な実験条件下でインキュベーションすることができる。本発明により、非常に正確な検査結果が得られるが、それでもなお分析者は、標準的な微生物実験条件を活用し得る。本発明の更に別の点は、独特な又は高価な装置及び設備を必要としないことである。
【００３０】
選択した検出系（例えば視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法又は同様の免疫親和性に基づく検出方法）による検出のために十分な数になるまで、注目する病原体を増殖させるために、継続した細胞生存力が重要であるので、本発明では、細胞壁組成の改変を誘導すると同時に、病原体の更なる増殖を可能にする方法を用いる。詳しく記すと、本発明は、標的微生物の非常に特異的な検出であって、当微生物を潜在的に含んでいる試料を、構造改変有機化学薬品を含有する増殖培地に接触させることによる前記検出に関する。ただし前記薬品は、高度に保存された抗原エピトープを出現させ、そしてそれに、検出試薬を結合した検出用の特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体を接触させ得るものである。当検出は、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法又は同様の免疫親和性に基づく検出方法などの方法によって行われる。本発明は、実質的な細胞死を引き起こすことなく、より高度に保存され且つ特異的である抗原エピトープに、検出試薬に連結した対応抗体が接触できる様に標的微生物の表面構造を改変することによって、前記検出を可能にする。
【００３１】
本発明の培地組成物は、最も特異的であり且つ保存されたエピトープを露出した改変細胞壁を形成する様に、標的微生物の代謝を生化学的に修飾する(例えばTsang et al., "Screening for Salmonella with a Murine Monoclonal Antibody M105 Detects both Felix O1 Bacteriophage Senstive and Resistant Salmonella Strains", Zbl.Bakt. 286:23-32, 1997; Tsang et al., "A Murine Monoclonal Antibody that Recognizes a Genus-Specific Epitope in the Salmonella Lipopolysaccharide Outer Core", Zbl.Bakt. 274:446-455, 1991; Tsang et al., "A Murine Monoclonal Antibody Specific for the Outer Core Origosaccharide of Salmonella Lipopolysaccharide", Infection and Immunity 55:211-216, 1987; Tsang et al., "Lack of the α-1,2-linked N-acetyl-D-glucosamine epitope in the outer core structures of lipopolysaccharides from the certain O serogroups and subspecies of Salmonella enterica", Res.Microbiol. 142:521-533, 1991参照)。この構造修飾は、微生物の増殖能を阻害することなく生じるので、標的病原微生物は、検出可能なレベルまで抑制されることなく増殖し続ける。構造修飾と複製能との組合せにより提供される利点は、試料中に一般的に存在する病原微生物が、大部分の迅速検出系の検出限界未満のレベルであることである。いかなる検出系を用いてもよいが、好ましい検出系は、限定でなく、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法、及び類似の検出系である。
【００３２】
本発明の１つの態様として、病原微生物を潜在的に含んでいる検査試料を、Ｏ抗原多糖の細胞表面出現の阻害剤を含有する増殖培地と接触させる。次に、培地を含有する前記試料に対して、検出方法、例えば視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法、及び類似の検出系を実行する。
【００３３】
好ましい態様として、本発明の組成物、その製法、検出装置、及び検出方法は、リステリア菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)、サルモネラ菌又はカンピロバクター菌に特異的なものである。特に好ましい態様として、本発明の増殖培地を、インキュベーションの後に、標的微生物に特異的な抗体を使用する検出系、例えば視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法及び類似の検出系に導入し、それによって非常に正確な結果を得る。
【００３４】
本発明では、いくつかの広く知られている一般的強化培地、例えばトリプシン消化ダイズブロス、栄養ブロス、緩衝化ペプトン水、ラクトースブロス、脳心臓点滴培地又は類似の培地と、特異的なエピトープに対して高親和性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体によって認識されるエピトープを露出させるための多数の抗原構造改変有機化学薬品、例えば、限定でなく、2,4-ジニトロフェノール、カルボニルシアニド-m-クロロフェニルヒドラゾン又は類似の電子伝達系脱共役剤とを組み合わせて用いる。前記有機化学薬品の作用機構は、内部特異的抗原を露出し得る欠陥細胞壁を生じる様に、標的微生物の代謝経路を改変することである。本発明では、細胞壁の構造を改変する代謝経路の改変を、迅速且つ特異的な検出を可能にする検出装置、例えば視覚的免疫沈殿検査法に用いる抗体−検出試薬と組み合わせる。
【００３５】
許容される条件下での本発明の培地中でのインキュベーションに続いて、好ましくは迅速な検出方法、例えば、限定でなく、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法及び類似の検出方法を用いて検出を行う。前記方法は、米国特許5,658,747及びWO 95/30903により詳しく記載されている。本発明の好ましい態様では、前記組成物と検査試料との混合液を、インキュベーションの後に、保存された抗原エピトープとの接触性を向上させるために界面活性剤溶液に接触させ得る。本発明の非常に好ましい態様では、エピトープの急速な露出を促進するために、前記界面活性剤を加熱し得る。更に別の態様では、前記混合液を、インキュベーションの後に、高温で界面活性剤に接触させる。その温度は、好ましくは約40〜121℃であり、一定時間、好ましくは２分〜１時間放置する。
【００３６】
１つの態様では、前記混合液中の界面活性剤は、検出の前に、約0.02〜2.0重量％とする。この界面活性剤は、好ましくは陰イオン性界面活性剤、更に好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、デオキシコール酸ナトリウム及び類似物から成る群から選択したものであるが、非イオン性界面活性剤、例えばNP-40、テルギトール及びトライトンX-100などでもよい。
【００３７】
本発明の別の点は、検査試料中の微生物の存在を検出するための視覚的免疫沈殿検査法の使用である。この視覚的免疫沈殿検査法では、試薬ゾーンに最初に配置する「抗体−検出試薬」などの抗体は、典型的にはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。更にポリクローナル抗体を用いる場合、本発明に用いる前に、この抗体を親和性精製することが好ましい。この様な抗体の生産は当業界に周知である(例えばAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988参照)。適当な親和性精製された抗体を市販業者から購入することもできる。例えば、サルモネラ菌特異的ポリクローナル抗血清を、Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Marylandから入手できる。好ましい視覚的免疫沈殿検査法は、米国特許5,658,747に記載された方法である。要するに、米国特許5,658,747では側方流動式診断装置が用いられており、これは、抗体−検出試薬を含んでいる試薬ゾーンと、その試薬ゾーンの下流に位置し、そして標的微生物と抗体−検出試薬との複合体に特異的に結合することができる固定された結合体を含んでいる検出ゾーンとを含んで成るものである。
【００３８】
当業者は、種々の温血動物、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ターキー、ウサギ、マウス又はラットを免疫化することによってポリクローナル抗体を容易に作成し得る。要するに、標的微生物、又は標的微生物に特異的に結合している抗原を用いて、前記動物を免疫化する。この注目するタンパク質又はペプチドの免疫原性を、アジュバント、例えば完全又は不完全フロイントアジュバントを用いて、あるいは別のタンパク質、例えばオブアルブミン又はテンガイヘモシアニン(KLH)との連結によって高め得る。
【００３９】
周知の方法によって、モノクローナル抗体を容易に作ることもできる(例えばMonoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.), 1980及びAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.)前出参照)。要するに、例えば対象動物を、ポリクローナル抗体生産の場合と同様に免疫化する。あるいは、モノクローナル抗体生産に適するインビトロ免疫化法も周知である。次に抗体生産細胞を、不死化ミエローマ細胞に融合させて、不死化ハイブリドーマ細胞株を作成する。融合処理した細胞を、適当な培地、習慣的にはHAT培地を含む培養プレートにまく。その他の適当な培地も当業界では周知である。約７日後、生成した融合細胞、すなわちハイブリドーマを、希望の抗原を認識する抗体の存在を決定することによって選択する。数回の株希釈と再検査をした後、注目のタンパク質に結合する抗体を生産するハイブリドーマを単離することができる。
【００４０】
モノクローナル抗体又は結合体を作成するために、その他の別の方法を用いてもよい(例えば、Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda" Science 246:1275-1281, 1989; Sastry et al., "Cloning of Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library" Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:5728-5732, 1989; Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas" Strategies in Molecular Biology 3:1-9, 1990; Larrick et al., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human monoclonal Antibody Variable Region Gene From Single Hybridoma Cells" BioTechnology 7:934-938, 1989参照)。
一旦適当な抗体が得られたならば、当業者に周知である多数の方法により、それを単離又は精製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane 前出参照)。
【００４１】
本発明に有用である抗体は、好ましくは、多数の抗原上の類縁生物の存在下で、標的微生物の全ての菌株を選択的に検出することができるものである。更に当抗体は、好ましくは、非特異的な結合性（これは偽陽性の結果を導く）が低く、そして標的微生物への非結合性（これは偽陰性の結果を導く）が非常に低いか又は無い検出を行うことができるものである。
【００４２】
本発明の１つの点として、0.1〜5 mMの2,4-ジニトロフェノールを含有する一般的強化培地であるトリプシン消化ダイズブロスに検査試料を加え、得られた混合液を37℃で６〜８時間インキュベーションすることがある。そのインキュベーション後に、その試料の一部を、0.05〜0.5%のSDS中で100℃で10分間処理する。次にその試料を、検出装置、例えば、視覚的免疫沈殿検査装置に適用し、そして視認できる線の形成を観察する。
【００４３】
好ましくは、当試料は、未精製の在野試料、例えば食品試料、環境試料、例えば水又は泥を含む、又はそれらから本質的に成る溶液である。あるいは、当試料は、生物学的液体、例えば体液であってもよい。別の態様では、当試料を、診断装置に適用する前に、実験用試料として部分的に又は実質的に精製してよい。当試料中に潜在的に存在する標的微生物に特異的な抗体−検出試薬を含有する組成物と、検査試料とを接触させた場合、抗体−検出試薬と標的微生物との結合が起こり、それによって特定の病原微生物の存在又は欠失が検出される。
【００４４】
本発明の別の点として、検査試料中の微生物を検出する方法であって、検査試料を、少なくとも１つの構造改変有機化学薬品を含有する一般的強化培地中で、検出可能なレベルまで微生物を増殖させるために十分な時間インキュベーションすることを含んで成る前記方法が提供される。次に、病原性微生物の存在を、免疫に基づいた検出方法、例えば、限定でなく、視覚的免疫沈殿検査法、酵素免疫検査法、化学発光法、免疫ブロット法及び類似の検出方法を用いて検出する。あるいは、検出の前又はそれと同時に界面活性剤処理することによって、試料中の抗原の露出を促進し得る。更に別の態様では、検出の前又はそれと同時に、界面活性剤の存在下で加熱することによって、本発明の組成物の存在下で予め増殖させた試料中の抗原の露出を促進し得る。
【００４５】
更に別の点として、本発明は、標的微生物を検出する方法であって、交差反応する抗原エピトープを有するが、標的ではないその他の属の菌の存在下で標的微生物を潜在的に含んでいる試料を、許容されるインキュベーション条件下で本発明の組成物と接触させることを含んで成る前記方法を提供する。インキュベーション後に、その試料に、抗体−検出試薬を標的微生物に結合させて、標的微生物と抗体−検出試薬との複合体を形成させる検査、例えば視覚的免疫沈殿検査法を施す。その複合体が、次に側方流動膜に沿って下流に移動し、その複合体と結合する固定化抗体を含んでいる検出ゾーンに達して、結合複合体が形成される。そしてその結合複合体が検出される。
【００４６】
限定ではなく説明のために、以下の実施例を記載する。
実施例
実施例１
非反応性の９種類のサルモネラ菌株を、視覚的免疫沈殿検査法で同定した。前記菌株は、表面抗原を過剰に発現していることが報告されている。本発明の培地中で前記菌株を増殖させることにより、表面Ｏ抗原エピトープの発現が無くなり、又は実質的に低下すると仮定された。その結果、視覚的免疫沈殿検査装置内に存在するリポ多糖のコア領域に対する非常に特異的なモノクローナル抗体による検出が可能となった。
【００４７】
前記生物を、本発明の培地中で増殖させた後、0.1% SDSによって100℃で10分間抽出処理した。その結果強い反応性が示された。本発明の培地組成物は、下記の成分を有する市販のトリプシン消化ダイズブロス調製液に、0.5mM(0.01%)の2,4-ジニトロフェノールを補充したものであった。
【００４８】
トリプシン消化ダイズブロス
カゼインの膵液消化物                          17.0ｇ
ダイズ粉のパパイン消化物                       3.0ｇ
塩化ナトリウム                                 5.0ｇ
リン酸二カリウム                               2.5ｇ
デキストロース                                 2.5ｇ
蒸留水                                        1000ml
【００４９】
実施例２
２種類のサルモネラ菌株、血清型Ａ及びＢは、競合する類縁微生物の存在下では、モノクローナル抗体を用いた視覚的免疫沈殿検査法及び酵素免疫検査法において弱い反応性を示すことが決定されている。前記菌株を、1000倍過剰の競合細菌の存在下で本発明の培地中でインキュベーションしたところ、高い反応性を示すことが分かった。本発明の培地組成物は、0.5mM(0.01%)の2,4-ジニトロフェノールを補充した市販の緩衝化ペプトン水であった。
【００５０】
緩衝化ペプトン水
ゼラチンの膵液消化物                          10.0ｇ
塩化ナトリウム                                 5.0ｇ
リン酸二カリウム                               3.5ｇ
リン酸一カリウム                               1.5ｇ
蒸留水                                        1000ml
【００５１】
実施例３
大腸菌O157:H7の菌株は、ポリクローナル抗体を用いた検査において弱い反応性を示すことが分かっている。この菌株を本発明の培地中で増殖させたところ、その感受性が100倍向上した。前記培地は、20mg/mlのノボビオシン(novobiocin)を含有する修飾トリプシン消化ダイズブロスに、0.5mM(0.01%)の2,4-ジニトロフェノールを補充したものであった。
【００５２】
修飾トリプシン消化ダイズブロス
Bactoトリプトン(Tryptone)                     17.0ｇ
Bactoソイトン(Soytone)                         3.0ｇ
塩化ナトリウム                                 5.0ｇ
リン酸二カリウム                               4.0ｇ
胆汁酸塩No.3                                   1.5ｇ
Bactoデキストロース                            2.5ｇ
【００５３】
実施例４
ポリクローナル抗体／モノクローナル抗体による酵素免疫検査において反応性を示さない病原性菌株Campylobacter jejuniを同定した。この菌株を本発明の培地中で増殖させ、そして0.1%デオキシコール酸ナトリウムで処理したところ、強い反応性を示すことが分かった。この培地は、0.5mM(0.01%)の2,4-ジニトロフェノールを補充したカンピロバクター単離用ブロスであった。
【００５４】
0.6%酵母抽出物を含有する栄養ブロスNo.2
Lab-Lemco粉末                                 10.0ｇ
ペプトン                                      10.0ｇ
塩化ナトリウム                                 5.0ｇ
酵母抽出物                                     6.0ｇ
蒸留水                                        1000ml
【００５５】
本明細書において、説明のために本発明の特定の態様を記載したが、本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが明白である。本発明は、請求の範囲による以外には限定されない。