(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）の野生型遺伝子と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも１種の変異型遺伝子の遺伝子構造の差異に基づいて、遺伝子型を判定する方法であって、該変異型遺伝子の少なくとも１種が配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子である、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定する方法。
【請求項２】
ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも２種の変異型遺伝子を用いてＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損を判定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも２種の変異型遺伝子が、配列番号：１に記載の塩基配列を含有する全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子および配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＲ法および／またはハイブリダイゼーション法を含む方法により遺伝子構造の差異を解析することを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
下記工程：
（ａ）採取されたヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ならびにＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマーを調製する工程、
（ｃ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーをプライマー対としてＰＣＲ反応による増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅産物を制限酵素で消化して、制限酵素長多型を検出する工程、
を含む、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
５’−プライマーが配列番号：５に記載の塩基配列を有し、３’−プライマーが配列番号：６に記載の塩基配列を有するものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
制限酵素がＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、およびＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーである、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも２５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用い、野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子との遺伝子構造の差異を解析することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
下記工程：
（ａ）採取されたヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、および
（ｂ）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも２５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用い、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡまたはその断片とのハイブリダイゼーション反応を行う工程、
を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ断片が固相上に結合した形態であることを特徴とする、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定を行うに際し、請求項１〜１０いずれか記載の方法を含む方法により行うことを特徴とするＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定方法。
【請求項１２】
配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子。
【請求項１３】
配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも２５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片。
【請求項１４】
配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との２つの境界領域を含む、少なくとも６０ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載のＤＮＡ断片の結合した固相。
【請求項１６】
請求項１３又は１４記載のＤＮＡ断片、あるいは請求項１５記載の固相を含有してなる、ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型を判定するための診断キット。
【請求項１７】
配列番号：６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１８】
ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマー、ＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、ならびにＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーを含有してなる、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定するための診断キット。
【請求項１９】
５’−プライマーが配列番号：５に記載の塩基配列を有し、３’−プライマーが配列番号：６に記載の塩基配列を有するものである、請求項１８記載の診断キット。
【請求項２０】
下記工程：
（ａ）採取されたヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする、配列番号：５に記載の塩基配列を有する５’−プライマー、ならびにＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする、配列番号：６に記載の塩基配列を有する３’−プライマーを調製する工程、
（ｃ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーをプライマー対としてＰＣＲ反応による増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅産物をＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、およびＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーで消化して、制限酵素長多型を検出する工程、
を含む、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６（以下、ＣＹＰ２Ａ６と略記する）の基質となる物質の代謝能を判別するための、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子型の診断方法および診断キットなどに関する。
背景技術
ＣＹＰ２Ａ６には遺伝子多型が存在しており、基質となる物質の代謝能の個体差の原因となることが示されている（特開平９−１８７３００号公報、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｒｅｒ．１９９９，２８９（１）：４３７−４４２）。ＰＡＦ（血小板活性化因子）受容体アンタゴニストである（＋）−シス−３，５−ジメチル−２−（３−ピリジル）チアゾリジン−４−オン（ＳＭ−１２５０２）は、ＣＹＰ２Ａ６の代表的基質であり、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の全欠損型変異を有する者では、ＳＭ−１２５０２の生体内での代謝能が低いことが知られている（特開平９−１８７３００号公報、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｒｅｒ．１９９９，２８９（１）：４３７−４４２）。従って、ＳＭ−１２５０２等のＣＹＰ２Ａ６の基質となる薬物を投与する前に、患者の遺伝子型を診断し、あらかじめ代謝能を知っておくことは、副作用を防ぎ患者の個体差に応じた適切な治療を施すという観点から、非常に有用であると考えられる。
このような観点から、本発明者らは従来よりＣＹＰ２Ａ６遺伝子の全欠損型変異を診断する方法を検討してきた。特開平９−１８７３００号公報およびＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｒｅｒ．１９９９，２８９（１）：４３７−４４２において、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン１〜９の欠失が示唆された。その後、この欠失型遺伝子の構造を解明することにより、ホモ欠損者（ホモ欠損とは、対立遺伝子の両方が欠損していることを言う）を判定する診断法を開発した（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１５（４），ｐｐ５１７−５２４，１９９８に診断法の概要のみ記載）。しかしこの診断法による診断では、ヘテロ欠損者（ヘテロ欠損とは、対立遺伝子の一方が欠損していることを言う）の頻度が理論的に算出される頻度よりもはるかに高いという予期せぬ問題が生じた。
従って、本発明の目的は、患者におけるＳＭ−１２５０２等のヒトＣＹＰ２Ａ６の基質となる物質の代謝能を判別するための、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子の診断方法および診断キットなどを提供することにある。
発明の開示
ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の全欠損型変異をヘテロで有する場合にも酵素活性に影響のある可能性があるため、患者の個体差に応じた適切な治療という観点から、ホモ欠損者のみならずヘテロ欠損者も正確に診断する診断法が必要であると考えられる。そこで、本発明者らは、ヘテロ欠損者の頻度が理論的に算出される頻度よりもはるかに高い原因などを種々検討した結果、従来に報告のない新たな多型遺伝子の存在が考えられたため、前記旧診断法（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１５（４），ｐｐ５１７−５２４，１９９８）でヘテロと判定されたヒト肝臓試料からＣＹＰ２Ａ６ｃＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を解析した。その結果、５’−非翻訳領域およびコード領域には変異はなく、３’−非翻訳領域の約６０ｂｐがＣＹＰ２Ａ７遺伝子の対応領域に置換している新たな多型遺伝子（以下、置換型と称する）を見出した。ここでＣＹＰ２Ａ７遺伝子とは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と同じ１９番染色体上に位置し、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と相同性の高い、ＣＹＰ２Ａサブファミリーの他の遺伝子である（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５７：６５１−６６０，１９９５）。
本発明者らが新たに見出したＣＹＰ２Ａ６遺伝子の置換型変異をホモ又はヘテロで有する場合にも酵素活性に影響のある可能性がある。そこで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、これら野生型、全欠損型および置換型の３種類の遺伝子構造の差異に基づき、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を診断できる新たな診断法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、
（１）ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）の野生型遺伝子と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも１種の変異型遺伝子の遺伝子構造の差異に基づいて、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定する方法、
（２）該変異型遺伝子に生じた少なくとも１つの変異が、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ７（ＣＹＰ２Ａ７）遺伝子のエキソン９またはＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に存在する、前記（１）記載の方法、
（３）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する１種の変異型遺伝子を用いる遺伝子型の判定方法であって、該変異型遺伝子が配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子である前記（１）記載の方法、
（４）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも２種の変異型遺伝子を用いてＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損を判定する前記（１）記載の方法、
（５）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも２種の変異型遺伝子が、配列番号：１に記載の塩基配列を含有する全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子および配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子である、前記（４）記載の方法、
（６）ＰＣＲ法および／またはハイブリダイゼーション法を含む方法により遺伝子構造の差異を解析することを特徴とする、前記（１）〜（５）いずれか記載の方法、
（７）下記工程：
（ａ）ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ならびにＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマーを調製する工程、
（ｃ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーをプライマー対としてＰＣＲ反応による増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅産物を制限酵素で消化して、制限酵素長多型を検出する工程、
を含む、前記（１）〜（６）いずれか記載の方法。
（８）５’−プライマーが配列番号：５に記載の塩基配列を有し、３’−プライマーが配列番号：６に記載の塩基配列を有するものである、前記（７）記載の方法、
（９）制限酵素がＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、およびＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーである、前記（７）または（８）記載の方法、
（１０）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用い、野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子との遺伝子構造の差異を解析することを含む、前記（６）記載の方法、
（１１）下記工程：
（ａ）ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用い、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡまたはその断片とのハイブリダイゼーション反応を行う工程、
を含む、前記（１０）記載の方法、
（１２）ＤＮＡ断片が固相上に結合した形態であることを特徴とする、前記（１０）または（１１）記載の方法、
（１３）ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定を行うに際し、前記（１）〜（１２）いずれか記載の方法を含む方法により行うことを特徴とするＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定方法、
（１４）配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子、
（１５）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片、
（１６）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との２つの境界領域を含む、少なくとも６０ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片、
（１７）前記（１５）又は（１６）記載のＤＮＡ断片の結合した固相、
（１８）前記（１５）又は（１６）記載のＤＮＡ断片、あるいは前記（１７）記載の固相を含有してなる、ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型を判定するための診断キット、
（１９）配列番号：５又は６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、
（２０）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマー、ＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、ならびにＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーを含有してなる、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定するための診断キット、並びに
（２１）５’−プライマーが配列番号：５に記載の塩基配列を有し、３’−プライマーが配列番号：６に記載の塩基配列を有するものである、前記（２０）記載の診断キット、に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ヒトチトクロームＰ４５０２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）の野生型遺伝子と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種の変異型遺伝子の遺伝子構造の差異に基づいて、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定する方法を提供する。本発明の遺伝子型の判定方法においては、前記３種類の遺伝子の構造の差異を検出することができるため、例えば従来の課題であったホモ欠損およびヘテロ欠損を正確に診断することができるという優れた効果を発揮する。
本発明の遺伝子診断方法で診断されるＣＹＰ２Ａ６とは、薬物、化学発癌物質、環境汚染物質等の外因性基質またはステロイド、脂肪酸等の内因性基質といった、構造的に無関係な幅広いグループの化合物の代謝に関与するユビキタスな１原子酸素添加酵素のスーパーファミリーからなるヒトチトクロームＰ−４５０の１員であり、その遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３２２−１３２９，１９９０に記載されている。ＣＹＰ２Ａ６の基質としては、クマリンまたはＳＭ−１２５０２等が知られている。
本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６の野生型遺伝子（野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子）」とは、前記Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３２２−１３２９，１９９０に記載の塩基配列を有する遺伝子をいう。
本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも１種の変異型遺伝子」とは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子において認められる少なくとも一部の配列を含み、かつ野生型において認められる塩基配列とは異なる塩基配列を含む遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子の一部配列を含む変異型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子等が挙げられる。
また、本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する少なくとも２種の変異型遺伝子」とは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子において認められる少なくとも一部の配列を含み、かつ野生型において認められる塩基配列とは異なる塩基配列を含む遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子の一部配列を含む変異型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子等の２種以上のもの、好ましくは、配列番号：１に記載の塩基配列を含有する全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子および配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子が挙げられ、かかる２種の変異型遺伝子を、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損の判定に用いるのが好ましい。
該変異型遺伝子に生じた少なくとも１つの変異としては、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン９またはＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に存在するものが挙げられる。なお、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５７：６５１−６６０，１９９５またはＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２２０２９に記載されている。
前記変異型遺伝子の構造の具体例としては、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の上流にはＣＹＰ２Ａ７遺伝子が存在しているが、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の５’−非翻訳領域および翻訳領域に相当する部分が欠失し、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン９部分の後半（３’−非翻訳領域、以下３’−ＵＴＲと略す）がＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９部分の３’−ＵＴＲと直接連結している全欠損型遺伝子（全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子）構造、および野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９の３’−ＵＴＲの約６０ｂｐがＣＹＰ２Ａ７遺伝子の対応領域に置換している置換型遺伝子（置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子）構造が挙げられる。
より具体的には、全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子としては配列番号：１に記載の塩基配列を含むものが挙げられ、また置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子としては配列番号：４に記載の塩基配列を含むものが挙げられる。
これら全欠損型および置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の構造の模式図を、第４図に示す。
本発明において「遺伝子構造の差異」とは、エキソン−イントロン構造が異なっていること等、塩基配列が異なっていることをいう。
本発明のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法は、薬剤投与対象の患者におけるＣＹＰ２Ａ６の機能（ＣＹＰ２Ａ６の基質となる物質の代謝能）を事前に診断することなどを目的とするものである。また、本発明のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法の一態様によれば、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損を診断することも可能である。当該判定方法は、置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子および全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異部位の構造が本発明において初めて明らかにされたことに基づくものであり、本発明の判定方法によれば、例えば、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の変異に関連する１種の変異型遺伝子である配列番号：４に記載の塩基配列を含有する置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子を用いることにより、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型を判定することも可能である。
また、本発明の判定方法は、当業者であれば、通常の遺伝子診断に用いられる手法を組み合わせて適宜構築することができ（ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ  １０（９）．１９９５，１８−２３）、当該判定方法においては、かかる手法を含む方法により遺伝子構造の差異を解析して遺伝子型を判定する。
具体的には、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．）１９９５，ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ）、ハイブリダイゼーション法（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９０）７５，７３−７７）、ＲＦＬＰ法（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９８５）７６，１２８３−１２８５）、ＳＳＣＰ法（ＰＮＡＳ（１９８９）８６，２７６６−２７７０）、直接シーケンス法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，４８７−４９１、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３３０，３８４−３８６）、変異塩基対の化学的切断法（ＰＮＡＳ（１９８８）８５，４３９７−４４０１）、ＤＧＧＥ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５５，５０１−５２７）、変異塩基対の酵素的切断法（Ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｋ．Ｄａｖｉｅｓ）９５−１３９，ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ）、マススペクトル分析法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８（５），Ｅ１３（２０００））、及び／又はＨＰＬＣ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５６（３），２４７−２５３（１９９９）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０４（１），８９−９３（１９９９））などにより、当該遺伝子構造の差異を解析することができる。好ましくは、ＰＣＲ法及びハイブリダイゼーション法を含む方法が用いられる。
以下、本発明のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定法の代表例として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用した判定方法について記述する。
本発明においては、ＰＣＲにより遺伝子を増幅して診断する方法が用いられ、ＰＣＲとしては、ＬＡ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ）−ＰＣＲ等が挙げられる。
ＰＣＲ後のＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法、好ましくはＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損の判定方法としては、直接シークエンス法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法等が挙げられ、ＲＦＬＰ法が好ましい。
ＰＣＲ反応を利用した本発明のＣＹＰ２Ａ６の遺伝子の遺伝子型の判定方法の１つの態様は、下記工程：
（ａ）ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ならびにＣＹＰ２Ａ６  遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマーを調製する工程、
（ｃ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーをプライマー対としてポリメラーゼ連鎖反応による増幅反応を行なう工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅産物を制限酵素で消化して、制限酵素長多型を検出する工程、
を含む方法である。
工程（ａ）において、ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する。ヒト組織としては、ゲノムＤＮＡを単離することができれば特に限定されないが、血液、毛髪、爪、口腔粘膜および肝臓等が挙げられ、量および調製し易さの観点から血液が望ましい。
ゲノムＤＮＡの調製方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の常法により行なうことができ、市販のゲノム抽出キット等を利用することもできる。
前記ＣＹＰ２Ａ６の野生型遺伝子、全欠損型遺伝子および置換型遺伝子を増幅するために、工程（ｂ）において、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ならびにＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマーを調製する。
プライマーの設計に関して、前記３種類のいずれの遺伝子をも増幅し、かつ相同性の高い他のＣＹＰ２Ａサブファミリーの遺伝子（野生型ＣＹＰ２Ａ７およびＣＹＰ２Ａ１３等の遺伝子）の増幅を防ぐようにプライマーを設計することが重要である。このようなプライマーは、全欠損型遺伝子および置換型遺伝子の変異部位の構造が本発明において初めて明らかにされたことに基づき、当業者ならば適宜設計することができる。
ここで、「ハイブリダイズする」とは、例えば、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（１９８９）に記載の、プローブまたはプライマーのためのオリゴヌクレオチドに関する条件下で、前記ＣＹＰ２Ａ６の野生型遺伝子、全欠損型遺伝子または置換型遺伝子とのハイブリッドを形成することが可能であることを意味し、かかる性質により、後述の実施例などで具体的に説明されるようなＰＣＲ増幅条件下において、前記３種類のいずれの遺伝子をも増幅し、かつ相同性の高い他のＣＹＰ２Ａサブファミリーの遺伝子の増幅を防ぐ効果を十分に発現しうるものである。
プライマーの長さは、通常１０〜５０塩基であり、好ましくは２０〜３０塩基程度である。かかるプライマーの例は、５’−プライマーとして、配列番号：５の塩基配列を有するかまたは含むオリゴヌクレオチド、３’−プライマーとして、配列番号：６の塩基配列を有するかまたは含むオリゴヌクレオチドが挙げられ、配列番号：５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号：６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの組合せが好ましい。
プライマーの調製は、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により行なうことができる。
工程（ｃ）において、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）のプライマーをプライマー対としてポリメラーゼ連鎖反応による増幅反応を行なう。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ等に記載の方法等、常法により行なうことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ用の市販のＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、市販のＰＣＲキットに添付されているポリメラーゼも使用できる。本発明においては、選択したプライマーの位置から約１．３ｋｂ程度の増幅産物が予想されるので、例えば、ＬＡ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ製）等を用いることが好ましい。
ＰＣＲの条件は、前記鋳型、プライマー、増幅される断片長等に応じて適宜設定することが可能である。
工程（ｄ）において、工程（ｃ）で得られた増幅産物を制限酵素で消化して、ＲＦＬＰを検出する。
ここで、増幅産物の塩基配列を十分考慮して、制限酵素による消化がＲＦＬＰを生じるように制限酵素を選択することが好ましい。該制限酵素は、全欠損型遺伝子および置換型遺伝子の変異部位の構造が本発明において初めて明らかにされたことに基づき、当業者ならば適宜選択することができる。１例として、置換型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡと全欠損型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡをそれぞれ１箇所切断するが野生型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡを切断しない制限酵素ＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマーが使用できる。さらに、全欠損型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡを３箇所切断し、野生型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡと置換型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡをそれぞれ２箇所切断する制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーも使用できる。これらの制限酵素の切断位置を、第４図において矢印と矢頭で示す。さらに、増幅産物の塩基配列に応じてその他の制限酵素を使用することも可能である。
まず、前記２種類の制限酵素による消化は、別々の反応容器に増幅産物の一部を入れ、制限酵素の反応条件に従って増幅産物が完全に消化されるまで行なう。制限酵素は、市販の制限酵素を使用することができ、添付のプロトコルに従って消化を行なえばよい。
次に、得られた消化断片を電気泳動に供して、ＲＦＬＰを検出する。電気泳動は、ＤＮＡの分離に用いられるアガロースゲル等を用いて、通常の条件下で行なう。消化断片の長さを見積もるために、市販のＤＮＡのサイズマーカーを同時に泳動しておくことが好ましい。電気泳動後のＤＮＡ断片の検出は、例えば、臭化エチジウムを前記アガロースゲル等に添加しておき、泳動後ＵＶ照射下で、ＤＮＡの泳動パターンを目視により観察し、または写真撮影して、サイズマーカーに対する検出対象のＤＮＡ断片の相対位置により行う。例えば、第５図に示すように、野生型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡと置換型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡまたは全欠損型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡとを区別できるパターン（第５図ａ、ＡｃｃＩＩ−ＲＦＬＰ）、ならびに野生型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡおよび置換型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡと全欠損型ＣＹＰ２Ａ６ＤＮＡとを区別できるパターン（第５図ｂ、Ｅｃｏ８１Ｉ−ＲＦＬＰ）が得られる。
最後に、前記２種のＲＦＬＰに基づいて、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のホモ欠損およびヘテロ欠損を診断する。例えば、第６図（Ｂ）に示すように、ホモ欠損（図中、＊４Ｃ／＊４Ｃで示す）とヘテロ欠損（図中、＊１Ａ／＊４Ｃと＊１Ｂ／＊４Ｃで示す）が明確に判別される。また、すべての遺伝子型（図中、＊１Ａ／＊１Ａ、＊１Ａ／＊１Ｂ、＊１Ｂ／＊１Ｂ、＊１Ａ／＊４Ｃ、＊１Ｂ／＊４Ｃおよび＊４Ｃ／＊４Ｃで示す）も判別できる。
以上が、ＰＣＲ反応を利用したＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定法の代表例である。
本発明においては、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’−ＵＴＲの約６０ｂｐがＣＹＰ２Ａ７遺伝子の対応領域に置換した「置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子」を初めて見出した。置換領域を含む、置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の塩基配列の一部を、配列番号：４に示す。また、当該置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の塩基配列の一部（配列番号：４）と野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の対応する領域の塩基配列（配列番号：３）とを比較したものを、第３図に示す（下線部がＣＹＰ２Ａ７遺伝子への置換領域）。ここで配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との境界領域を含む塩基配列は、置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子に存在しているが野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子には存在していない配列である。従って、当該少なくとも１つの境界領域を含む塩基配列の有無を検出することにより、野生型  ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子との遺伝子構造の差異を解析することができる。かかる態様も、本発明の判定方法の一態様である。
具体的には、配列番号：４に記載の塩基配列における前記境界領域を少なくとも１つ含むＤＮＡ断片を診断用のＤＮＡとして用い、前述のＰＣＲ反応、ハイブリダイゼーション反応、マススペクトル分析、ＨＰＬＣ分析などを行うことにより、野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子との遺伝子構造の差異を解析することを含む方法が例示される。
ここで、境界領域を含むＤＮＡ断片の長さとしては、野生型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子と置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子との差異を検出できるものであれば特に限定されず、当業者の常識の範囲で適宜変更可能であるが、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、２５ｂｐ以上〜５ｋｂ以下の長さのものが挙げられる。また、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との２つの境界領域を含む、少なくとも６０ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片なども用いることができる。当該ＤＮＡ断片は、目的に応じて１本鎖の形態であっても２本鎖の形態であっても良い。
このようなＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法の１つの態様は、下記工程：
（ａ）ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用い、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行う工程、
を含む方法である。
工程（ａ）において、ヒト組織からゲノムＤＮＡを調製する。ヒト組織としては、ゲノムＤＮＡを単離することができれば特に限定されないが、血液、毛髪、爪、口腔粘膜および肝臓等が挙げられ、量および調製し易さの観点から血液が望ましい。
ゲノムＤＮＡの調製方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の常法により行なうことができ、市販のゲノム抽出キット等を利用することもできる。調製されたゲノムＤＮＡは、必要に応じて常法により蛍光等でラベルすることも可能である。また、得られたゲノムＤＮＡは必要に応じて断片化したり、ＰＣＲ反応で特定の部分を増幅するなどして、以下の工程（ｂ）に用いることができる。
工程（ｂ）において、配列番号：４に記載の置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む、少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片を用いる。ここで、ＤＮＡ断片の長さや形態は前述の通りであり、本発明において置換型遺伝子の構造が初めて明らかにされたことに基づき、当業者ならば適宜設計することができる。特に、当該工程（ｂ）においては２５ｂｐ以上〜５ｋｂ以下程度のＤＮＡ断片が好適に用いられる。これらＤＮＡ断片は、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により調製することができる。また、当該ＤＮＡ断片は必要に応じて蛍光等でラベルすることも可能である。
当該ＤＮＡ断片を用い、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡまたはその断片とのハイブリダイゼーション反応を行う。ここでハイブリダイゼーションの条件としては、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等に記載の通常の条件が挙げられる。その他、完全に相補的な配列と部分的な塩基配列の違いを含むものとを見分けられる条件であれば、如何なる条件であっても良い。
なお、前記ＤＮＡ断片は、固相上に結合させた形態でも用いることが可能である。ここで固相とは、ガラス、シリコン表面、ニトロセルロースフィルター、またはナイロンメンブレン等を指す。近年、これら固相上にＤＮＡ断片を結合させた、いわゆるＤＮＡチップを用いた診断・判定も行い得る状況にある。この場合、被験用のゲノムＤＮＡは断片化され、また蛍光等でラベルされていることが好ましい。当該ゲノムＤＮＡと固相上のＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、当該固相上の蛍光を検出することにより、前記の判定を行うことができる。ここで、ＤＮＡ断片を結合したＤＮＡチップは米国アフィメトリックス社に注文することにより入手可能であり、また、前記判定法の具体的な手法については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１，１−６０（１９９９）等を参考にすることができる。
以上のようなＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法は、ＣＹＰ遺伝子全体における遺伝子型の判定方法において利用されるものであり、従って、本発明はまた、前記いずれかの判定方法を含む方法により、ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定を行う、ＣＹＰ遺伝子の遺伝子型の判定方法を提供するものである。
さらに本発明は、前記したＣＹＰ２Ａ６遺伝子の遺伝子型の判定方法において使用される診断用ＤＮＡや診断用固相をも提供する。また、これらの診断用ＤＮＡや診断用固相を含有してなる診断キットをも提供するものである。
当該診断キットの具体例を、以下に示す。
１）配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との少なくとも１つの境界領域を含む少なくとも５ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片、配列番号：４に記載の塩基配列におけるＣＹＰ２Ａ６遺伝子とＣＹＰ２Ａ７遺伝子との２つの境界領域を含む少なくとも６０ｂｐ以上の長さのＤＮＡ断片、あるいはこれらＤＮＡ断片の結合した固相を含有してなる診断キット。
２）ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン８およびＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン８のいずれにもハイブリダイズする５’−プライマー、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９に特異的にハイブリダイズする３’−プライマー、制限酵素ＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマーならびに制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーを含有してなる診断キット。
ここで、前記２）の診断キットの好ましい例としては、以下の３）の診断キットが挙げられる。
３）配列番号：５に記載の塩基配列を有する５’−プライマー、配列番号：６に記載の塩基配列を有する３’−プライマー、ＡｃｃＩＩまたはそのイソシゾマー、ならびにＥｃｏ８１Ｉまたはそのイソシゾマーを含有してなる診断キット。
前記キットに含まれる５’−プライマーおよび３’−プライマーならびに制限酵素ＡｃｃＩＩ、Ｅｃｏ８１Ｉおよびそれらのイソシゾマーは、前記規定した通りである。また前記キットは、ＰＣＲを行なうためのＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用の緩衝液、制限酵素反応用緩衝液等をさらに含有してもよい。
本発明のキットは、本発明の診断方法を簡便かつ正確に実施するために用いられる。
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：全欠損型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の構造解析
ＳＭ−１２５０２の血中濃度測定を行いＥＭ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）と推定された検体、ＰＭ（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）と推定された検体（特開平９−１８７３００号公報）の末梢血より、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従い、ゲノムＤＮＡを抽出した。その後、得られたゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、ショ糖密度勾配（１０〜３８％）遠心分離により分画した。約１５ｋｂのフラグメントを含む画分をｄＧＴＰおよびｄＡＴＰで一部埋め、あらかじめＸｈｏＩで切断してｄＴＴＰおよびｄＣＴＰで一部埋めたラムダＦＩＸＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結した。次いで、連結産物を、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓを用いてインビトロパッケージングを行った。このようにして作製されたゲノムライブラリーから、１．６ｋｂのＣＹＰ２Ａ６ｃＤＮＡ断片をプローブとして、ＰＭおよびＥＭのＣＹＰ２Ａ６遺伝子ならびにその上流に位置するＣＹＰ２Ａ７遺伝子をクローニングし、シーケネースＶｅｒ．２（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製）を用いるジデオキシ法、またはアプライドバイオシステムスモデル３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサーを用いて製造業者の提供したプロトコールに従って塩基配列を決定した。プローブとして使用したヒトＣＹＰ２Ａ６の１．６ｋｂｃＤＮＡは、特開平９−１８７３００号公報に記載の方法により調製した。
その結果、ＰＭのＣＹＰ２Ａ７遺伝子ではエキソン９部分の後半（３’−ＵＴＲ）がＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’−ＵＴＲと連結（直結）していることが明らかとなった。この連結領域を含む前後の領域の塩基配列を第１図および配列番号：１（ＰＭ）に示し、ＥＭの対応する領域の塩基配列も第１図および配列番号：２（ＥＭ）に示す。第１図のＳｅｑｕｅｎｃｅＡとＢは、いずれもＣＹＰ２Ａ７遺伝子特異的な配列部分であるため、ＰＭにおいてはこのＳｅｑｕｅｎｃｅ  ＡとＢの間のどこかで連結の行われたことが示された。すなわち、ＰＭにおいてはＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’−ＵＴＲのみが存在しており、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の５’−ＵＴＲおよび翻訳領域については完全に欠損している構造を有することが明らかとなった。この全欠損型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊４Ｃ）の遺伝子構造と野生型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ）の遺伝子構造（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，ｐｐ１３２２−１３２９（１９９０））との比較（模式図）を、第２図に示す。
実施例２：置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の構造解析
前記実施例１で同定された全欠損型遺伝子と野生型遺伝子との遺伝子構造の違いを利用し、全欠損型遺伝子をホモで有する者（ホモ欠損者）を診断できる方法を開発した（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１５（４），ｐｐ５１７−５２４，１９９８に診断法の概略のみ記載）。しかし、この診断法ではヘテロ欠損者は診断できず、その原因として、従来報告のない新たな多型遺伝子の存在が示唆された。そこで、この新たな多型遺伝子をクローニングする目的で、以下の実験を行った。
ヘテロ欠損と判定されたヒトの肝臓から、常法のグアニジニウム−チオシアネート法により全ＲＮＡを調製した。６  μｇの全ＲＮＡを、３０  μｌの反応溶液中、ランダムヘキサマー（１２０  ｎｇ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をプライマーとして、ＭＭＬＶ逆転写酵素（０．２ユニット、Ｔｏｙｏｂｏ製）により逆転写した。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３２２−１３２９，１９９０により報告されている配列に対して設計したプライマーの組合せを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＣＹＰ２Ａ６  ｃＤＮＡを得た。得られたすべてのクローンを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）にサブクローニングし、アプライドバイオシステムスモデル３７７Ａ自動ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。対照として、遺伝子型が野生型ホモと判定されたヒトの肝臓由来の全ＲＮＡから調製したＣＹＰ２Ａ６ｃＤＮＡも同様にしてクローニングし、塩基配列を決定した。
前記配列決定されたヘテロ欠損ＣＹＰ２Ａ６ｃＤＮＡを、野生型ＣＹＰ２Ａ６ｃＤＮＡと比較したところ、５’−ＵＴＲおよびタンパクコード領域は野生型と同じ配列を有していたが、３’−ＵＴＲの約６０ｂｐがＣＹＰ２Ａ７の対応領域に置換している新規な配列を有することが明らかとなった。この置換部位を含む前後の領域の塩基配列を第３図および配列番号：４（置換型）に示し、野生型の対応する領域の塩基配列も第３図および配列番号：３（野生型）に示す。
実施例３：新規なＣＹＰ２Ａ６遺伝子診断法の開発
実施例１および２で同定されたＣＹＰ２Ａ６遺伝子の全欠損型および置換型の遺伝子構造を野生型のそれと比較することにより、これら３つのタイプの遺伝子をホモ又はヘテロで有する者を判別できる新たな診断法を開発した。
ａ）  ゲノムＤＮＡの調製
市販のゲノム抽出キット（Ｔａｋａｒａ製等）を用いて、最低０．１ｍｌ程度の末梢血から抽出したゲノムＤＮＡを利用することができる。
ｂ）  プライマー
以下のプライマー：
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をＤＮＡ合成装置を用いて合成し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、滅菌水で１０  μＭに希釈する。第４図において、各プライマーがハイブリダイズする位置を右向きの矢頭（５’−プライマー、配列番号：５）および左向きの矢頭（３’−プライマー、配列番号：６）で示す。
ｃ）  ＬＡ−ＰＣＲ法によるゲノムＤＮＡの増幅
ＬＡ−ＰＣＲ法を用いて、ゲノムＤＮＡを増幅する。前記ａ）で調製したゲノムＤＮＡ溶液（１．０μｌ）に滅菌水を２５．８μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ溶液を８．０μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウム溶液を５．０μｌ、１０×ＬＡ−ＰＣＲ緩衝液を５．０μｌ、１０μＭセンスプライマー（ＣＹＰ２Ａ６−Ｂ４）を２．５μｌ、１０μＭアンチセンスプライマー（ＣＹＰ２Ａ６−ＵＴＲＡＳ１）を２．５μｌ、ＬＡ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ製）を０．２μｌ加え、全量を５０μｌとする。さらに、ミネラルオイルを５０μｌ重層し、９４℃で３分間の変性反応の後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃２分間を１サイクルとして３０サイクル、さらに７２℃１０分間の伸長反応を行なう。
ｄ）  判定方法
前記ＬＡ−ＰＣＲの結果、約１．３ｋｂｐの増幅産物が得られる。これらのＬＡ−ＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＡｃｃＩＩで消化すると、置換型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂ）では約１．０４ｋｂｐと約０．２８ｋｂｐの断片に切断され、また全欠損型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊４Ｃ）では約１．０２ｋｂｐと約０．２８ｋｂｐの断片に切断されるが、野生型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ）では切断されないことに基づき、野生型ＣＹＰ２Ａ６の有無の判定を行なう（第４図、第５図ａ）。制限酵素による消化は、以下の条件で行なう。前記ｃ）のＬＡ−ＰＣＲ反応終了液（５．０μｌ）に滅菌水を３．７５μｌ、１０×制限酵素Ｍ溶液（Ｔａｋａｒａ）を１．０μｌ、ＡｃｃＩＩ（８Ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ製）を０．２５  μｌ加え、全量を１０  μｌとし、３７℃で１０時間インキュベートする。反応終了後、０．０２％臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、ＵＶ照射下でサイズマーカーＤＮＡとの比較により判定する。
一方、約１．３ｋｂｐのＬＡ−ＰＣＲ増幅産物を制限酵素Ｅｃｏ８１Ｉで消化すると、全欠損型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊４Ｃ）は、約０．７３、０．４３、０．１および０．０４ｋｂｐの断片に切断されるが、野生型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ）と置換型ＣＹＰ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂ）では、約０．７９、０．４３および０．１ｋｂｐの断片に切断される（第４図、第５図ｂ；ただし０．１ｋｂ及び０．０４ｋｂのバンドはゲル上では殆ど観察されない）。制限酵素による消化は、以下の条件で行なう。前記ｃ）のＬＡ−ＰＣＲ反応終了液（５．０μｌ）に滅菌水を３．５μｌ、１０×制限酵素Ｍ溶液（Ｔａｋａｒａ）を１．０μｌ、Ｅｃｏ８１Ｉ（８Ｕ／μｌ、Ｔａｋａｒａ）を０．５  μｌ加え、全量を１０  μｌとし、３７℃で１０時間インキュベートする。反応終了後、０．０２％臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、ＵＶ照射下でサイズマーカーＤＮＡとの比較により判定する。
この新規な診断方法を用いて、日本人健常者４４４名の判定を行った。得られたＲＦＬＰの例を第６図に示し、その結果を表１に要約する。第６図より、本発明の診断方法は、野生型（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ）、置換型（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂ）および全欠損型（ＣＹＰ２Ａ６＊４Ｃ）を含むすべての遺伝子型＊１Ａ／＊１Ａ、＊１Ａ／＊１Ｂ、＊１Ｂ／＊１Ｂ、＊１Ａ／＊４Ｃ、＊１Ｂ／＊４Ｃおよび＊４Ｃ／＊４Ｃを区別することができる。
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表１に示すように、ヘテロ欠損者（野生型／全欠損型と置換型／全欠損型の和）の頻度は、計算上推定される頻度とほぼ一致していたことから、この新規な診断法はホモ欠損者（全欠損型／全欠損型）のみならずヘテロ欠損者も正確に判別できる診断法であることが明らかとなった。
また、同じ診断方法を用いて、フランス人健常者２３９名の判定を行った。その結果を表２に示す。
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表２に示すように、フランス人では、ホモ欠損者〔すなわち、全欠損型遺伝子をホモで有する者（全欠損型／全欠損型）〕は、調べた範囲内では存在しなかった。一方、置換型に関しては、ヘテロ欠損者〔すなわち、置換型遺伝子をヘテロで有するもの（野生型／置換型と置換型／全欠損型）〕の頻度は、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの法則で理論上算出される頻度とほぼ一致していた。従って、欧米人においても各遺伝子型を正確に判別できる診断法であることが明らかとなった。
配列表フリーテキスト
配列番号：５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用に設計された５’−プライマーである。
配列番号：６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用に設計された３’−プライマーである。
産業上の利用可能性
本発明の診断方法により、野生型、全欠損型および置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子を判別することが可能であり、ヒトＣＹＰ２Ａ６の基質となる物質の代謝能の個体差を事前に診断することによって、患者に応じた治療が可能となるという優れた効果を奏する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１でクローニングされたＰＭおよびＥＭのＣＹＰ２Ａ７遺伝子のエキソン９の塩基配列の整列を示す。図中、太字の塩基は翻訳領域を示し、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡおよびＢはＣＹＰ２Ａ７遺伝子特異的な領域を示す。影付きのボックスで囲んだ部分は、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’−ＵＴＲの３’−ＵＴＲ特異的な１５ｂｐの欠失を示す。
第２図は、ＣＹＰ２Ａ６の野生型遺伝子と全欠損型遺伝子の構造を比較した模式図である。
第３図は、実施例２でクローニングされた野生型および置換型ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のエキソン９の３’末端側の塩基配列の整列を示す。図中、下線の部分は、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子に特徴的な領域を示す。
第４図は、本発明の診断方法で判別可能な３種のＣＹＰ２Ａ６遺伝子構造（野生型遺伝子構造、全欠損型遺伝子構造および置換型遺伝子構造）を表す模式図である。図中、右向きの矢頭は５’−プライマー（配列番号：５）がハイブリダイズする位置を示し、左向きの矢頭は３’−プライマー（配列番号：６）がハイブリダイズする位置を示す。両矢頭間を結ぶ線は、ＰＣＲで増幅される領域であり、上向きの矢頭はＥｃｏ８１Ｉ切断位置を、矢印はＡｃｃＩＩ切断位置をそれぞれ示す。
第５図は、ａ）ＡｃｃＩＩ−ＲＦＬＰ、およびｂ）Ｅｃｏ８１Ｉ−ＲＦＬＰの模式図である。
第６図は、本発明の診断方法による、日本人健常者のａ）ＡｃｃＩＩ−ＲＦＬＰ、およびｂ）Ｅｃｏ８１Ｉ−ＲＦＬＰの結果を示す電気泳動〔パネル（Ａ）〕ならびにそれらに対応する模式図〔パネル（Ｂ）〕の写真である。図中、Ｍ．Ｗ．はＤＮＡのサイズマーカーを示し、＊１Ａ／＊１Ａ、＊１Ａ／＊１Ｂ、＊１Ｂ／＊１Ｂ、＊１Ａ／＊４Ｃ、＊１Ｂ／＊４Ｃおよび＊４Ｃ／＊４Ｃは、野生型（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ）、置換型（ＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂ）および全欠損型（ＣＹＰ２Ａ６＊４Ｃ）の遺伝子型を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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