(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫機能を刺激および／または調整することによって、猫および／または犬の免疫系を調整するための組成物の製造のための、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）およびエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）からなる群から選択される少なくとも１つの菌株の使用。
【請求項２】
前記菌株が、前記組成物中に、１．０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｇ〜１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／ｇ含有されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
免疫機能を刺激および／または調整することによって、猫および／または犬の免疫系を調整するためのペットフード組成物であって、摂取しうる支持体または医薬マトリックスと関連している、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、およびラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）からなる群から選択される少なくとも１つの菌株を含有するペットフード組成物。
【請求項４】
選択された菌株を１．０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｇ〜１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／ｇの量で含有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
さらにプレバイオチックを含有する、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
組成物は、乾燥または含水の、冷却または貯蔵安定形の、栄養的に完全なペットフード粉末の形である、請求項３〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、およびラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）からなる群から選択される少なくとも１つの菌株を含有する、ペットフードの品質を改良するための補助食品。
【請求項８】
選択された菌株を１．０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｇ〜１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／ｇの量で含有する、請求項７に記載の補助食品。
【請求項９】
さらにプレバイオチックを含有する、請求項７または８に記載の補助食品。
【請求項１０】
付加的包装でペットフードと一緒に供される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の補助食品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規乳酸菌、特にそのプロバイオチックポテンシャルに対し単離し、選択した属ラクトバチルス、ビフィドバクテリウムおよびストレプトコッカス（エンテロコッカス）の微生物に関する。本発明はペットの健康を改良するためのペットフード組成物の製造におけるこれらの使用およびこれらを含有する組成物にも関する。このような微生物をペットに給与することによりペットの健康を維持または改良する方法も供される。
【０００２】
（発明の背景）
家畜の健康はその飼養に密接に関連する。正しい飼養をすることにより、ペットが元気に健康となる。栄養価を付与する他に、フード組成物は腸内菌相の平衡に影響を与え、胃腸障害を生じたりまたは予防することができる。従って、胃腸管および健康な動物の消化プロセスに関する知識は実際の飼養プラクティスの理解に必須である。肉食動物としての猫や犬は消化管が短かいことおよび食塊が速かに流動する点で特徴がある。
【０００３】
猫および犬の胃腸ミクロフロラの構成分としてバクテロイデス種、クロストリジウム種、エンテロバクテリアセ、ビフィドバクテリウム種、ラクトバチルス種、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種および酵母を回収することができる。
【０００４】
この内因性菌相の数および組成は、年令により異なるがやや安定であるが、食物によっては余り修正しない。胃の酸度、胆汁、腸のぜん動、および局所免疫は、ヒトや各種他の哺乳動物の小腸における菌相の調整に重要であると考えられる因子である。
しばしば犬や猫の胃腸疾患は細菌の過度の生育ならびに病原菌により生産される腸毒素の産生と関連する。
【０００５】
最近の数年間、乳酸菌のいくつかの貴重な菌株およびプロバイオチック剤としてのその使用の可能性に研究は集中した。プロバイオチックスは腸の自然のミクロフローラを保持することにより哺乳動物の健康を増進する生菌標品であると考えられる。プロバイオチックスは腸粘膜に付着し、腸管にコロニーを形成し、それにより有害な微生物がそこに付着することを防止すると考えられる。これらの作用に対する必要条件は、固有かつ生存形で腸粘膜に到達しなければならず、特に胃の優勢な低ｐＨの作用により殺されないことにある。特に、猫および犬の消化管の生理はヒトとは異る。例えば、胃の平均ｐＨは犬では約３．４および猫では４．２である。
【０００６】
米国特許５，９６８，５６９号明細書はペットフードシリアルにプロバイオチック微生物を含ませることが開示されるが、そのものも、残留利用技術も、ペットの健康に具体的に意図される菌株に関し情報を供しない。
従って、ペットに特に適応し、およびペットの健康に有利な高いプロバイオチック性で選択した新規菌株を供すること、およびこれらの菌株をペットフード組成物に添加することに対するニーズがある。
【０００７】
（発明の概要）
本発明の第１特徴によれば、生存能力およびペットの胃腸管にコロニーを形成する能力およびペットの健康に対し有利なプロバイオチック活性を働かせる能力について選択した、乳酸菌の新規プロバイオチック微生物が供される。
プロバイオチック菌株はラクトバチルス、ビフィズス菌またはエンテトロコッカスから選択できる。
【０００８】
ブロバイオチック菌株はラクトバチルス・ルーテリ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・アニマリス、ラクトバチルス・ルミニス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびビフィドバクテリウム種、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス種から成る群から選択できる。
【０００９】
好ましい態様では、プロバイオチック菌株はラクトバチルス・ルーテリ（ＮＣＣ２５８１；ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４８）、ラクトバチルス・ルーテリ（ＮＣＣ２５９２、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５０）、ラクトバチルス・ラムノサス（ＮＣＣ２５８３；ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、ラクトバチルス・ルーテリ（ＮＣＣ２６０３；ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１）、ラクトバチルス・ルーテリ（ＮＣＣ２６１３、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２）、ラクトバチルス・アシドフィラス（ＮＣＣ２６２８；ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（例えば、ＮＣＣ２６２７）、ビフィドバクテリウム種、ＮＣＣ２６５７またはエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＣＮＣＩＭＢ  １０４１５）から成る群から選択する。
【００１０】
新規菌株は約１．０Ｅ＋０４〜約１．０Ｅ＋１２ｃｆｕ／動物／日、好ましくは１．０Ｅ＋０５〜約１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／動物／日、もっとも好ましくは１．０Ｅ＋０７〜１．０Ｅ＋１０ｃｆｕ／動物／日の任意量で使用できる。
【００１１】
１特徴では本発明はペットの胃腸管の病原菌によるコロニー形成と関連する疾患の治療および／または予防するための組成物の製造に、上記菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物の使用に関する。特に断わらない限り、「菌株」とはその培養物の上澄および／またはその代謝産物を含む。
【００１２】
別の特徴では、本発明はペットの免疫応答を調整するために意図した組成物の製造のために、上記菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物の使用に関する。免疫応答を「調整」するとは、上記菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物がペットの健康に重要な或る免疫機能を刺激するか、または免疫疾患、例えば炎症、アレルギーなどに潜在的に包含する他の免疫機能を調整する能力を有することを意味する。これらの免疫機能の刺激または調整は上記菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物の各種組合せを使用することにより達成できる。
【００１３】
本発明はさらにペットの胃腸管、皮膚および／または被膜系または免疫系の健康を維持し、または改良する方法を供し、この方法は少なくとも１つの上記単離菌株を含有するペットフード組成物をペットに給与する工程を含む。
【００１４】
さらに、本発明は病原菌によるペットの胃腸管のコロニー形成と関連する疾患の治療および／または予防方法を供し、この方法は少なくとも１つの本発明による単離菌株を含有するペットフード組成物をペットに給与する工程を含む。
【００１５】
本発明はペットに免疫応答を調整する方法も供し、この方法は少なくとも１つの本発明による単離菌株を含有するペットフード組成物をペットに給与する工程を含む。
本発明はペットの加令効果を改善または低減する方法も供し、この方法は少なくとも１つの本発明による単離菌株を含有するペットフード組成物をペットに給与する工程を含む。
【００１６】
これらの選択した微生物はペットの胃腸管に、皮膚および／または被膜（ｃａｏｔ）に、その免疫系に、および加令効果に対しペットに特別の有利なインパクトを有する。
これらの菌株サルモネラ・チフィムリウム、エッシェリヒア・コリ、シゲラ・ダイセンテリエーまたはペットにコロニーを形成する他の病原腸細菌または蠕虫（トキソカラ種、原虫（クリプトスポリジウム種、ジアルジア種、ペンタトリコモナス・ホミニス、エンタモエバ・ヒストリチカ、トキソプラズマ・ゴンジイ、・・・・）のような寄生虫または酵母のような腸内病原体に特別の有利なインパクトを有する。
【００１７】
フードと組合せて、これらの微生物は特に呈味性、消化および腸の健康、免疫機能および衛生状態（これは糞容積の低減および少なくとも犬の糞の部分脱臭に寄与する）に有利なプロバイオチック効果を示す。すなわち、本発明の第２の特徴により、ペットフード組成物はペットに高いプロバイオチック活性を有し、これを摂取するペットの胃腸管を生存させ、およびコロニーを形成できる微生物を含む。
【００１８】
従って、本発明は上記のように単離した少なくとも１つのプロバイオチック菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物を、摂取しうる支持体または医薬マトリックスと関連して含有する、ペットの胃腸管の健康のために意図したペットフード組成物に関する。
また、本発明は上記のように単離した少なくとも１つの菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物を、摂取しうる支持体または医薬マトリックスと関連して含有する、ペットの免疫応答を調整するためのペットフード組成物に関する。
【００１９】
また、本発明は上記のように単離した少なくとも１つの菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物を、摂取しうる支持体または医薬マトリックスと関連して含有する、ペットの加令効果を改善または低減するためのペットフード組成物に関する。
最後に、本発明は上記のように単離した少なくとも１つの菌株および／またはその培養物の上澄および／またはその代謝産物を摂取しうる支持体または医薬マトリックスと関連して含有する、ペットの皮膚および／または被膜の健康のためのペットフード組成物に関する。
【００２０】
態様では、摂取しうる支持体は栄養的に均衡のとれたペットフード組成物を含む。この組成物は好ましくは単離菌株、その培養物の上澄および／またはその代謝産物を、組成物を完全食としてペットに給与する場合、予防効果を供するのに有効な十分量を含有する。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
以下の記載内で、略語ｃｆｕ（「コロニー形成単位」）は寒天プレート上の微生物計数により示される細菌細胞数を示す。
さらに、「ＮＣＣ」はネスレ・カルチャー・コレクションを示す（ネスレ・リサーチセンター、ローザンヌ、スイス）。
【００２２】
本発明の第１目的に関し、猫および犬のふんから単離した２０のラクトバチルスおよび１８のビフィズス菌を科学技術的および生理学的パラメータに関し選別し、選択した。
プロバイオチックの潜在的適用に対する最初の選別はイン・ビトロで（例１および２参照）、生育特性、異るｐＨの胃の酸性度に対しおよび猫や犬に見出されそうな十二指腸に存在する胆汁塩の異る濃度に対する許容性について行なった。
さらに、２つの異る極低温保護媒体に凍結乾燥した細胞が良好に生存することは、促進貯蔵試験により示されるように４℃および２０℃で明確に実証された。
【００２３】
これらの菌株は短い世代期間、その定常相中の高いカウント値（１．０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌ以上）、接種後８時間および２４時間の高い数値の安定性、凍結乾燥次いで貯蔵条件に対する安定性、十二指腸に見出される生理的胆汁濃度（２％胆汁）に対する耐性および４％までの胆汁の存在で生育する場合のその阻害率の低い点で特徴がある。さらにＤＮＡ分析の結果は試験の多様性を表わす菌を選択するために考慮された。
【００２４】
猫および犬の健康のために意図した菌株は２．０％までの胆汁塩の存在で少なくとも１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌまで生育できる。該菌株は約３．４〜約４．２のｐＨ範囲で約２時間後少なくとも１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌまで生育できる。
本発明による菌株はラクトバチルス・ルーテリ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・アニマリス、ラクトバチルス・ルミニス、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ビフィドバクテリウム種、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス種から成る群から選択できる。
【００２５】
次の菌株ラクトバチルス・ルーテリＮＣＣ２５８１、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３、ラクトバチルス・ルーテリＮＣＣ２５９２、ラクトバチルス・ルーテリＮＣＣ２６０３、ラクトバチルス・ルーテリＮＣＣ２６１３、およびラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８はブダペスト条約下で国立微生物カルチャーコレクション（フランス、パリ）に２０００年４月１９日に、それぞれ次の照合番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４８、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５０、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２およびＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３にて寄託した。これらの寄託菌の入手性に対するすべての制限はこの出願に対する優先権を請求する本出願または別の出願の最初の公開で撤回される。
【００２６】
選択菌株の生化学的特性
・ラクトバチルス・ルーテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４４８
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−かなり短く厚い小ロッド
−ヘテロ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸の産生、
−カタラーゼ（−）、グルコースからＣＯ２の産生、アルギニンの加水分解＝ＮＨ３産生
−５％および１０％ＮａＣｌで生育
−糖：Ｌ−アラビノース、ガラクトース、Ｄ−グルコース、ラクトース、サッカロース、Ｄ−ラフィノースを発酵
・ラクトバチルス・ラムノサスＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９  
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−かなり短く厚い小ロッド
−ヘテロ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）乳酸の産生
−カタラーゼ（−）
−Ｌｂ．ラムノサスに一般的なすべての糖を発酵
・ラクトバチルス・ルーテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５０
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−かなり短く厚い小ロッド
−ヘテロ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸の産生
−カタラーゼ（−）、グルコースからＣＯ２の産生、アルギニンの加水分解＝ＮＨ３の産生
−５％および１０％食塩で生育
−糖：Ｌ−アラビノース、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、ラクトース、サッカロース、Ｄ−ラフィノースを発酵
・ラクトバチルス・ルーテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−かなり短く厚い小ロッド
−ヘテロ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸の産生
−カタラーゼ（−）、グルコースからＣＯ２の産生、アルギニンの加水分解＝ＮＨ３産生
−５％および１０％  ＮａＣｌにより生育
−Ｌｂ．ルーテリに一般的なすべての糖を発酵
・ラクトバチルス・ルーテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−ヘテロ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸の産生
−カタラーゼ（−）、グルコースからＣＯ２の産生、アルギニンの加水分解＝ＮＨ３の産生
−糖：Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、ラクトース、サッカロース、Ｄ−ラフィノースを発酵
・ラクトバチルス・ルーテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３
−グラム陽性菌、運動性なし、胞子形成せず
−かなり短く厚い小ロッド
−ホモ発酵代謝を有する微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸の産生
−カタラーゼ（−）
−糖：Ｄ−グルコース、ラクトース、サッカロース、Ｄ−ラフィノースを発酵
【００２７】
猫から３つのラクトバチルス（ＮＣＣ２５８１、ＮＣＣ２５９２、ＮＣＣ２５８３）、犬から３つのラクトバチルス（ＮＣＣ２６０３、ＮＣＣ２６１３、ＮＣＣ２６２８）、猫から１つのビフィズス菌（ＮＣＣ２６２７）および犬から１つのビフィズス菌（ＮＣＣ２６５７）から単離した菌類を、さらにペットの潜在的プロバイオチック活性について試験した（例３および４参照）。
【００２８】
別の態様では、本発明はペットの健康を改良し、または維持しうるフード組成物を製造するために、上記菌株の使用に関する。
これらは生存形、または不活性形で、カルチャーの上澄またはその画分（例えば細胞壁、ペプチドグリカン、細胞質、精製タン白、機能性代謝産物、生物活性分子）として使用できる。
これらは約１．０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｇ〜約１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１．０Ｅ＋０５ｃｆｕ／ｇ〜約１．０Ｅ＋１０ｃｆｕ／ｇ、もっとも好ましくは１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｇ〜１．０Ｅ＋０９ｃｆｕ／ｇの量で使用するのが好ましい。
【００２９】
好ましい態様では、これらはペットフードの品質を改良するために補助食品として使用でき、約１．０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｇ〜約１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／ｇの量で含むことができる。補助食品として、これらはカプセル化することができ、または粉末形で、含水または乾燥の主食と一緒に、または別に包装して供することができる。例として、本発明により選択した微生物、その培養物の上澄の成分または部分または選択した代謝産物を含有する粉末は粉末形、またはゲルまたは脂質または他の適当なキャリアで小袋に包装できる。これらの別々に包装したユニットは使用者の指示により主食と一緒に、または主食またはオヤツと一緒に使用する複数−ユニット包装で供することができる。別の例では、プロバイオチック菌株は複数−区画包装ユニットで第２摂取成分、例えば含水または適度の水分含量のチャンキーミールまたは乾燥キブルのミール寸法バッチの柔軟な小袋形と一緒に供することができる。小袋の第１区画はプロバイオチック菌株を、第２の別の密封区画は第２摂取成分を含有する。
【００３０】
これらの選択した微生物はペットにその胃腸管、その皮膚および／または被膜、その免疫系、歯科または口腔の健康、その骨および加令効果で特に有利なインパクトを有する。
これらはまたフードの呈味性、消化、免疫機能および衛生状態（糞容積の減少および犬の糞の部分脱臭）をペットで改良することも分かった。
【００３１】
本発明は摂食支持体または医薬マトリックスと関連して上記特性を有する少なくとも１つのプロバイオチック菌株を含有する、ペットの健康を改良または維持するペットフード組成物にも関する。
【００３２】
上記特性を有する少なくとも１つの菌株および／またはその培養物、上澄またはその画分および／またはその代謝産物は通常の食事のサプリメントとして、または栄養的に完全なペットフードの成分としてペットに与えることができる。
【００３３】
本発明による栄養的に完全なペットフード組成物は粉末型、乾燥形またはウェットな冷却したまたは貯蔵安定性のペットフード製品でよい。これらのペットフードは微生物活性を望む場合、微生物の生存を確保するために注意することを条件として当業者に既知の方法により製造できる。菌株および／またはその発酵培地とは別に、これらのペットフードは任意の１つ以上の澱粉源、タン白源および脂質源を含むことができる。
【００３４】
適当な澱粉源は例えば、コーン、米、小麦、大麦、カラス麦、大豆のような穀物および豆類およびこれらの混合物である。
適当なタン白源は任意の適当な動物または植物タン白源、例えば肉およびミール、家禽ミール、魚粉、濃縮大豆タン白、乳タン白、グルテンなどから選択できる。老動物では、タン白源は高品質タン白を含有するのが好ましい。
適当な脂質源は肉、動物脂肪および植物脂肪である。
【００３５】
澱粉、タン白および脂質源の選択は動物の栄養要求、呈味性の考慮、および適用製品の型により主として決定される。老ペットの場合、ペットフードは若いペットのペットフードより比例的に少ない脂肪を含有することが好ましい。さらに澱粉源は１つ以上の米、大麦、小麦およびコーンを含むことができる。
さらに、他の各種成分、例えば糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン、ミネラル、フレーバ付与剤、脂肪などは必要に応じてペットフードに添加することもできる。
【００３６】
乾燥ペットフードの場合、ベーキングその他の適当な方法は使用できるが、適当な方法は押出し加熱である。押出し加熱する場合、乾燥ペットフードは通例キブルの形で供される。プレバイオチック炭水化物を使用する場合、このプレバイオチックは加工前乾燥ペットフードの他の成分と混合できる。適当な方法はヨーロッパ特許出願０８５０５６９号明細書に記載される。プロバイオチック微生物を使用し、最終製品に活性を望む場合、微生物は乾燥ペットフード上に被覆し、またはフード内に充填することが最善である。適当な方法はヨーロッパ特許出願０８６２８６３号明細書に記載される。微生物の生存が必要でない場合、押出し前のミックスに望むようにその培養物の上澄または代謝産物を添加できる。
【００３７】
ウェットフードの場合、米国特許４，７８１，９３９号および５，１３２，１３７号明細書に記載される方法は模造肉製品の製造に使用できる。チャンク型製品の他の製造方法、例えば蒸気オーブン加熱も使用できる。別法では、ローフ型製品は適当な肉材料を乳化して肉エマルジョンを製造し、適当なゲル化剤を添加し、缶または他の容器に充填前肉エマルジョンを加熱することにより製造できる。乾燥ペットフードの製造の場合におけるように、選択したプロバイオチック種の生存が必須でない場合、調理または加熱前、または製造方法の任意の適当な、または有利な工程で飼料ミックスに添加できる。
【００３８】
ペットフードのプレバイオチック量は好ましくは約２０重量％未満、一層好ましくは約１０重量％未満である。例えば、プレバイオチックはペットフードの約０．１〜約５重量％を含むことができる。プレバイオチックとしてチコリを使用するペットフードでは、チコリは飼料混合物の約０．５〜約１０重量％、一層好ましくは約１〜約５重量％から成るように含むことができる。
【００３９】
ペットフードは長鎖脂肪酸のような他の活性剤を含有できる。適当な長鎖脂肪酸はα−リノール酸、γ−リノール酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸を含む。魚油はエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の適当な源である。ルリヂサ油、黒スグリ種子油、および月見草油はγ−リノール酸の適当な源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、コーン油および大豆油は適当なリノール酸源である。
【００４０】
必要な場合、ペットフードは栄養的に完全であるようにミネラルおよびビタミンを補充する。
さらに、望む場合、菌株は例えば、糖マトリックス、脂肪マトリックスまたは多糖類マトリックスでカプセル化することができる。またヨーロッパ特許８６２８６３号明細書に記載のように被覆することもできる。
【００４１】
新規プロバイオチック菌株はペットフードが好ましくは約１．０Ｅ＋０４〜約１．０Ｅ＋１０のプロバイオチック微生物細胞／ｇ／ペットフード、一層好ましくは約１．０Ｅ＋０６〜約１．０Ｅ＋０８プロバイオチック微生物細胞／ｇ／ペットフードを含有するように使用することが好ましい。好ましくは約０．０２〜約６重量％、もっとも好ましくは約１〜約６重量％を含有する。
【００４２】
有利な効果を得るためにペットが消費するペットフード量はペットの大きさ、ペットの型、およびペットの年令による。しかし、少なくとも１つの乳酸菌菌株の約１．０Ｅ＋０３〜１．０Ｅ＋１４ｃｆｕの１日量を供するペットフード量および／または等量の発酵培地は通例適する。好ましくは犬の場合約１．０Ｅ＋０９〜１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／日または猫の場合１．０Ｅ＋０７〜１．０Ｅ＋１０ｃｆｕ／日が与えられる。
【００４３】
本発明組成物は高いプロバイオチック活性を有し、および／またはペットの健康な消化機能の改良および／または維持に、および胃腸管、皮膚および／または被膜、および／または免疫系、ペットの健康を改良し、維持するために特に有効であることが分かる。この組成物は猫および犬の加令効果に有利なインパクトも有する。
【００４４】
本発明はここに記載する特定態様により範囲を限定されるものではない。例は図の簡単な記載が先行する。
図１
マイトジエンまたはホルボルエステルにより刺激した犬の末梢血液単核細胞（ＰＭＢＣ）のリンパ球増殖。Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８を含み（黒色バー）または含まない（白色バー）４週給与した成犬からのＰＭＢＣを図に示す用量（μｇ／ｍｌ）の異るマイトジエンにより刺激した。マイトジエンはＰＨＡ（フィトヘマグルチン）、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）、ＰＷＭ（ポークウィードマイトジエン）であり、およびホルボルエステルはＰＭＡ／イオノ（ホルボルミリステートアセテートおよびイオノマイシン）である。＊＝Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ試験。
図２
異るプロバイオチック菌株により刺激した犬の白血球が生産したシトカイン。通常の成犬からの白血球はペットから単離後１８時間の異るラクトバチルス菌株により刺激した。対照培養は培地のみ（負の対照）またはヒトのラクトバチルス単離物ＳＴ１１（正の対照）を含有した。シトカインの同定はＲＴ−ＰＣＲにより行なった。その定量はエチジウムブロミド−歪のアガロースゲルを走査し、ＮＩＨイメジソフトウエアを使用して各バンドの相対的ピクセルを測定することにより行なった。結果は任意ユニットで２つの別個の試験の平均値として表わす。（Ａ）ＩＬ−１２、（Ｂ）ＩＬ−１０、（Ｃ）ＩＦＮγ、（Ｄ）ＴＧＦβ。
【００４５】
例
例１  菌株および培養条件
多数の菌株（ネスレ・カルチャー・コレクション＝ＮＣＣから）は猫および犬に使用するためその潜在的プロバイオチックを選別した。特に、生育可能性、次に貯蔵するための凍結乾燥に対する耐性、胃の酸度および猫や犬の胃腸管に見出される胆汁塩の各種濃度に対する耐性は猫および犬の糞から単離した２０のラクトバチルスおよび１８のビフィズス菌に対し評価し、表１に示す。
表１  試験のために選択した細菌のコードおよび特性
【表１】
0004456649.tif 000002
２０のラクトバチルスおよび１８のビフィズス菌のすべては、表１に示すように異る食物を続けた猫および犬から単離した。最初の同定は形態学的および生理学的特徴により測定した。ＡＰ１−５０ＣＨおよびＲａｐｉｄ−１Ｄ３２Ａシステム
【化１】
0004456649.tif 000003
をそれぞれラクトバチルスおよびビフィズス菌に対し使用した。純粋な菌株は凍結し、−８０℃でネスレ・カルチャー・コレクション（ＮＣＣ）に寄託した。
すべての細菌は検定に対しブロス−培地に培養した。各再活性化した菌株からの試料は１ｍｌ−極低温保護培地（４０％グリセロール＋６０％ＬＬ）に−８０℃で貯蔵した。カルチャーは１週１回１０ｍｌ−生育培地および３７℃で嫌気培養した１％接種物をベースに継代培養して維持した。
ラクトバチルスはＭＲＳで１８時間生育させた。ビフィズス菌はＭＲＳ＋０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｌ−システイン塩酸塩（ＭＲＳ−Ｃ）で３２時間、またはＢＨ１＋０．０５％Ｌ−システイン塩酸塩（ＢＨ１−Ｃ）で４８時間のいずれかで５％接種で出発して生育した。
すべてのカルチャーは異る転移間で＋４℃で貯蔵した。嫌気生活は一般に水素−炭素二酸化物嫌気系（ＧａｓＰａｋ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用して得られた。ビフィズス菌はその貯蔵期間中常にこれらのジャーに保存した。
【００４６】
例２  菌株の選択
このイン・ビトロ選別は生存細胞の工業的適用、抑制または有害な胃腸条件に対する生育能およびそのゲノムの多様性に対する生産特徴に基づいた。これらの非特性菌株の菌株多様性又はゲノム類似性はＲＡＰＤおよびリボタイプを使って考慮した。
材料および方法
・細菌の生育
多くの細胞を急速に生産しうる菌株を同定しなければならない。その細菌生育サイクルは短かい誘導期、短かい世代時間、最高の計数および永い定常期により特徴がある。従って、菌株はもっとも重要な特徴に相当する３つの可変因子、すなわちその誘導期の長さ、その世代時間（時間で）、およびその最高細胞計数値を考慮して比較した。
ラクトバチルスの場合
３７℃で予備培養した２００ｍｌ  ＭＲＳブロスは１％の新しい継代培養で接種した。１ｍｌの試料は接種後８時間で毎時間ごとに集めた。最終試料は２４時間後に採取した。１ｍｌの各試料は計数のためＴＳに１０倍連続稀釈した。カルチャーはＭＲＳ寒天（流しこみ−プレーティング技術）に、嫌気的に、３７℃で４８時間生育した。３０〜３５０のコロニー数を有するすべてのプレートはコロニー形成単位（ｃｆｕ）／カルチャーｍｌとして記録し、従って計数に対し考慮した。
（ＭＲＳ−Ｃ）中のビフィズス菌
予備試験で、すべての菌株はＭＲＳ−ＣおよびＴＲＹＧブロスの生育を２４時間計数した。結果はｃｆｕ／ｍｌで表わした。生育カーブはＭＲＳ−Ｃに生育する場合０、４、１２、２４、３２および４８時間後、ラクトバチルスに対し記載されるプロトコルにより細胞数を測定して確定した。継代培養培地および生育培地の脱ガス最高化の影響を測定するために、この検定を実施した。
・継代培養から、ＢＨ１−Ｃに４℃で４８時間貯蔵し、次いでＭＲＳ−Ｃに接種し、
・継代培養から、ＢＨ１−Ｃに４℃で４８時間貯蔵し、十分に脱ガスしたＭＲＳ−Ｃに接種し（培地を２回オートクレーブ処理し、直接嫌気性ジャーに貯蔵する最高化した酸素除去）、
・新しい継代培養からＭＲＳに、次いで試験前十分に脱気し、嫌気条件下で貯蔵したＭＲＳ−Ｃに接種する。
表２  細菌生育に対する試験培地
【表２】
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固体培地はＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ寒天（１５ｇ／ｌ）の添加により得た。培地は１２１℃で１５分オートクレーブ処理した。ビフィズス菌用液体培地は嫌気条件下で貯蔵し、または使用前脱気した。
【００４７】
胃のｐＨおよび胆汁に対する耐性
摂取する場合、微生物は動物の胃腸管で有利な活性を示しうる胃および十二指腸状態を残存せねばならない。胃のｐＨおよび胆汁塩は細菌菌相を調整する責任を有する主要成分である。従って、酸度および胆汁に対する菌株の耐性度を試験しなければならない。
猫および犬の消化管の生理はヒトとは異る。平均ｐＨは犬および猫でそれぞれｐＨ３．４および４．２である。再構成したペットの胆汁は試験用に推奨された（表４）。小腸における胆汁濃度は食物を摂取する場合０．５〜２％の範囲で変動する。
猫および犬に見出される極限ｐＨ値により、ｐＨ２．６における１０分後、ｐＨ３．４（犬から単離した菌株）またはｐＨ４．２（猫から単離した菌株）の２時間後の生存数は１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌ以下であってはならない。
・胃のｐＨに対する耐性
すべてのラクトバチルスはＭＲＳブロスに１％で接種し、３７℃で一晩嫌気的に生育させた。ビフィズス菌はＢＨ１−Ｃに５％接種し、３７℃で４８時間嫌気条件下で生育した。カルチャーは２ｍｌ反応管（エッペンドルフ）に分配し、３，５００×ｇ／１０分／２０℃で遠心分離した。細胞はリンゲル液で３回洗浄した。胃の酸性条件に対する耐性は塩酸（メルク）により調整したｐＨ値２．６、３．４および４．２を有する３つの模擬胃液でイン・ビトロで試験した。使い捨て濾過製品（ナルゲン）をすべての濾過−滅菌に使用した。各細菌サスペンジョンの生存は１．５ｍｌの０．５％ＮａＣｌ溶液を補足した一連の５ｍｌ模擬胃液（各種ｐＨ）に１ｍｌを添加して研究した。
試料は３７℃に培養し、生存微生物数を次により算定した。
・ｐＨ２．６胃液で０、１、５、１０分
・ｐＨ３．４（犬から単離した菌株に対し）または４．２（猫から単離した菌株に対し）のいずれかのｐＨを胃液が有する場合０、１、３０、６０、１２０、１８０分。
試料はリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に稀釈し、ＭＲＳ−Ｃ寒天上に注加して計数した。
表３  摸擬胃液
【表３】
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・胆汁塩に対する耐性
各種濃度の再構成ペット胆汁の存在で１８時間生育させたラクトバチルス生存数の進展を測定した。
２つの生存数はそのｌｏｇ１０の偏差が０．２５以上である場合有意に異ると考えられた。各菌株は２つの変数により特徴化された、
・対照と有意差が見出されなかった場合、試験した最高胆汁塩濃度
・生育培地の胆汁濃度が増加する場合、生存能力の減少割合。
胆汁濃度が１％段階で上昇する場合、その生存数がｌｏｇ１０より大きい損失に特徴がある菌株は胆汁に敏感であると考えられた。０および２％胆汁の存在で生育する細胞間に１ｌｏｇ１０以上、および胆汁の付加的％（２％以上）につき１ｌｏｇ１０以上の減少は許容しうると考えられた。さらに、２％までの胆汁塩の存在で生育する場合、１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌ以上を産生しうる菌株のみが、胃腸管に効果を産出するために選択されるべきである。
猫および犬から再構成したペット胆汁は表４に示すように調製し、使用前に濾過滅菌した。最初の試験では、ラクトバチルスはＭＲＳブロスに３７℃で２４時間嫌気的に生育し、追加の１８時間、新しいＭＲＳブロスプラス０，０．１，０．３，０．５，１，２，４％滅菌再構成ペット胆汁に移した。試料は計数のためＴＳに１０倍連続稀釈した。稀釈液１．０Ｅ−０３および１．０Ｅ−０５はＷＡＳＰ（「ウイットリオートマチックスパイラルプレーター」、ドン・ウイットリ・サイエンティフィック社、英国）を使用してＭＲＳ寒天上に注入して平板とした。乾燥する場合、プレートはさかさにし、３７℃で４８時間嫌気ジャー内で培養した。
フロックら（１９７２）は対照管生長と比較して試験で少なくとも２ｌｏｇ減少した場合抑制は有意であると規定した。これに基づいて、最初の検定で胆汁濃度に敏感であるすべてのラクトバチルスおよび４％胆汁に耐性の２つのラクトバチルスは０，１，１．５，２，２．５，３，４％胆汁の存在で同様に試験した。第２試験は反復能力を目的とし、生存菌数が濃度の増加につれて劇的に減少するかどうかを調べた。
他方、これらの菌株は１８時間中胆汁に耐性であることを指摘した。生育カーブは誘導期および生育割合が影響を受けるか否かを決定するために胆汁塩の存在で試験した。検定は早期の生育測定に対し記載されたプロトコルにより、１％再構成ペット胆汁を補足したＭＲＳブロスに生育するラクトバチルスにより行なわれた。
ビフィズス菌はＭＲＳ−Ｃブロスと０，１，２，３および４％再構成ペット胆汁を使用して継代培養し、３２時間／３７℃／嫌気的に生育させた。同じ計数方法は１．０Ｅ−０３，１．０Ｅ−０４および１．０Ｅ＋０５の稀釈液でラクトバチルスに対するように行なった。
表４  再構成ペット胆汁
【表４】
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【００４８】
・ラクトバチルス菌株の凍結乾燥およびその後の貯蔵に対する生存
生存の進展を評価した。１０Ｅ＋０５ｃｆｕ／ｍｌより劣る生存菌数は低すぎると考えられた。
各菌株の場合、新しいサブカルチャーを３％で２００ｍｌ  ＭＲＳブロスに接種した。カルチャーは３７℃で１６時間生育した。未通気條件（閉鎖容器）は本質的に嫌気性であるとみなした。生存菌数は上記混釈平板法を使用して計数した。
カルチャーは３，５００×ｇ／＋７℃／２０分で遠心分離して（ＲＣ３Ｃソルバル・インスツルメント・セントリフュージ）収穫し、１０ｍｌの２つの異る極低温保護媒体に再懸濁させた。各菌株は２つの異る極低温保護剤に再懸濁した。濃厚細菌サスペンジョンは計数し（混釈平板法）、びん（０．５ｍｌ／アンプル）に分配した。試料は液体窒素で−１９６℃で凍結し、１８時間真空乾燥した。凍結乾燥後、窒素は凍結乾燥機空気アドミッタンスバルブを通して導入し、すべてのアンプルは密封した。すべての小びんは＋４℃および＋２０℃で６ヶ月貯蔵した。生存細胞数／アンプル（各細菌およびサスペンジョン媒体）は毎月測定した。
【００４９】
結果
猫および犬に対し可能性を有するプロバイオチックの選択の枠内で、その生育可能性、凍結乾燥し、その後の貯蔵に対する耐性、猫および犬の胃腸管に見出される胃のｐＨおよび胆汁濃度に対する耐性に基づいて２０のラクトバチルスおよび１８のビフィズス菌のこのイン・ビトロ選別の結果は表５に示す。
２０のラクトバチルスは現在の研究でこれらが満たす基準に関し分類した。４つの菌株はその生育特性、胃のｐＨに対する耐性、胆汁耐性およびその凍結乾燥後の貯蔵中の生存に関し良好な結果を示した。４つの菌株はＬ．ルーテリＮＣＣ２５８１（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４８）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５９２（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５０）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２６０３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１）およびＬ．ルーテリＮＣＣ２６１３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２）であった。次の特徴をまとめた。
・世代時間はＭＲＳに生育する場合１時間未満であった。
・誘導期は短かかった（２時間未満）。
・細菌数は生育サイクルの定常期中高く（１．０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌ）、接取後８および２４時間安定であった。
・菌株は凍結乾燥および４℃および２０℃でその後６ヶ月の貯蔵を通して安定であった。
・猫および犬の胃腸管に見られそうな極限胆汁濃度に耐性であった（２％）。
・培地に４％までの胆汁の存在で有害な抑制はなかった。
・菌株はｐＨ２．６に少なくとも１０分耐性のあることを示し、１．０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌより高い量で残存した。
・菌株は少なくとも２時間胃の平均ｐＨに耐性であった。
従って猫から単離した２つのラクトバチルス（Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５８１およびＬ．ルーテリＮＣＣ２５９２）および犬から単離した２つ（Ｌ．ルーテリＮＣＣ２６０３およびＬ．ルーテリＮＣＣ２６１３）はプロバイオチック活性の可能性に対する研究に選択された。菌株ＮＣＣ２５８１、ＮＣＣ２５９２、ＮＣＣ２６０３およびＮＣＣ２６１３はＡＰＩ５０ＣＨ同定によりＬ．ルーテリと同定された。しかし、リボタイピングはＮＣＣ２５８１およびＮＣＣ２５９２が非常に近いパターンを有すること、およびＮＣＣ２６０３およびＮＣＣ２６１３は、こうしてありそうな密接な関係を示すことを現わした。菌株ＮＣＣ２５８１は非常に良好な生育特性を有し、ＮＣＣ２６０３はＮＣＣ２６１３以上に良好な胆汁耐性を有した。
猫の糞から単離した８つのビフィズス菌に関する結果はその生育特性、その胃のｐＨおよびその胆汁感受性の機能の選択が出来た。菌株ＮＣＣ２６２３は望む特性を１つも有せず、従ってそれ以上の研究に推せんされなかった。他方、菌株ＮＣＣ２６２７はすべての基準を満たした、すなわち  ・世代期間はＭＲＳ−Ｃに生育する場合１時間未満であった。
・誘導期はラクトバチルスと同様に短かかった。
・計数は高く、生育サイクルの定常期中安定であった。
・菌株は猫および犬の胃腸管に見られがちの極限胆汁濃度に耐性であった（２％）。
・培地の４％までの胆汁の存在で有意な抑制はなかった。
・菌株はｐＨ２．６に少なくとも１０分耐性を示し、１．０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌ以上の高量で残留した。
・菌株は少なくとも２時間胃の平均ｐＨに対し安定であった。
菌株ＮＣＣ２６２７はＮＣＣ２６２３およびＮＣＣ２６３５より一層強い耐性があったが、これらの３つの菌株はリボタイピングにより密接なパターンを有し、従ってありうる密接な関係を示す（２つの制限酵素による消化、ＥｃｏＲ１およびＥｃｏＲＶ）。
犬から単離した１０のビフィズス菌はリボタイピングにより特徴化される場合２つの異るパターンのみを示した。従って、胆汁耐性検定は４つの菌株（各グループから２つ）、すなわちＮＣＣ２６５７、ＮＣＣ２６６０、ＮＣＣ２６７１およびＮＣＣ２６７７によってのみ行なった。これらの４菌株はすべての胆汁の最高濃度に対し耐性であることがイン・ビトロ（２％胆汁）で見出すことができ、菌株ＮＣＣ２６６０およびＮＣＣ２６５７は４％胆汁の最高値処理する場合生存数は減少しなかった。結果として、犬の糞から単離したすべてのビフィズス菌は高濃度の胆汁にむしろ耐性である。
生育特性に関し、これらの１０の細菌はそれにより２つの群に分割できる、すなわち、
・胆汁に耐性で良好な生育特性を有する菌株、ＮＣＣ２６５７、ＮＣＣ２６５１、ＮＣＣ２６６３およびＮＣＣ２６６７。
・胆汁に耐性であり、工業的生産の最高化に必要な生育特性を有する菌株、ＮＣＣ２６６０、ＮＣＣ２６７１、ＮＣＣ２６７７、ＮＣＣ２６４７、ＮＣＣ２６５４およびＮＣＣ２６７４。
猫および犬の消化中見出された極限の胃ｐＨに対する耐性に関する完全な結果により、一層良い菌株の測定はそれ以上の研究で選択できるであろう。菌株ＮＣＣ２６５１のみはｐＨ耐性に対する選択基準を満たさなかった。
表５  要約
【表５】
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現在の結果に関し、猫から単離した１つのビフィズス菌株および犬から単離した３つのビフィズス菌株（それぞれＮＣＣ２６２７、ＮＣＣ２６５７、ＮＣＣ２６６３およびＮＣＣ２６６７）は選択できる。
表６  稀釈培地
【表６】
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９ｍｌ一部分を管に分配し、１２１℃で１５分オートクレーブ処理をした。
最後に、３８菌株のうち８菌株、すなわち猫から単離した３つのラクトバチルス（ＮＣＣ２５８１、ＮＣＣ２５９２、ＮＣＣ２５８３）、犬から単離した３つのラクトバチルス（ＮＣＣ２６０３、ＮＣＣ２６１３、ＮＣＣ２６２８）、猫からの１つのビフィズス菌（ＮＣＣ２６２７）および犬からの１つのビフィズス菌（ＮＣＣ２６５７）をさらに研究用に選択した。
これらの菌株は短かい世代時間、定常期中の高数（１．０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌ以上）および接種後８および２４時間の高度の安定性、凍結乾燥その後の貯蔵條件に対する安定性、十二指腸に見出される極限胆汁濃度に対する耐性（２％胆汁）、および４％までの胆汁の存在で生育する場合のその低抑制により特徴化される。さらに、ＤＮＡ分析からの結果は調査の多様性を表わす細菌の選択に考慮した。
【００５０】
例３  猫におけるコロニー形成の効力
Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５８１、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５９２、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ２５８３およびビフィドバクテリウム種ＮＣＣ２６２７は猫の胃腸管を通過して生き残るその能力を評価するために給与試験で試験した。
出来るだけ等数の１６匹の雄および雌猫はグランドメニューボエフ（ｂｏｅｕｆ）に３日間適応させた。給与プロトコルは「フリスキーズ・グランド・メニュー」による７日であり、「フリスキーズ・グランド・メニュー」による７日の試験は上記菌株、すなわちＬ．ルーテリＮＣＣ２５８１（食物Ａ）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５９２（フードＢ）、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ２５８３（フードＣ）およびビフィドバクテリウム種ＮＣＣ２６２７（フードＤ）の１つを含有する。フードの割当ては次の通りであった：
【表７】
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この菌株は十分量でかつ安定な凍結乾燥形で調製し、試験動物の胃腸管で菌株−生存に関しこれらの異る８つの細菌を適用した。すべての菌株は動物に対するフードマトリックスと調製菌株を混合し十分容積のキャリアを添加するために４ｇのトレハロースと混合した。細菌菌株は個々のプラスチック管で生産し（１．０Ｅ＋０９ｃｆｕ／ｍｌ）、毎日フードの部分に添加して全体の細菌が確実に喰べられるようにした。
新しい糞試料は細菌叢数を分析するために収得し、基準線と比較した（細菌添加せず）。
糞は７日および８日（基準線）
１４日および１５日  ２１日および２２日（基準線）
２８日および２９日に収集した。
無菌直腸プローブを使用して少なくとも０．１ｇの糞試料を得た。この試料は正確に秤量し、０．１ｇを１０％グリセロールを含有する１０ｍｌの生理溶液（リンゲル）と混合する。次にこの溶液は１ｍｌの極低温管に移し、液体窒素で凍結した。すべての試料は分析まで−８０℃で貯蔵する。
ラクトバチルス、バクテロイデス、エンテロバクテリエシエ、エンテロコッカス、ビフィズス菌およびクロストリジウム・パーフリンゲンスの内生菌数を計数した。細菌は選択または半−選択培地で検出した。１００倍連続稀釈は０．５％システインを含有するリンゲル溶液で−２から−８の範囲の稀釈により行なった。各種選択培地のペトリ皿に接種し、培養した（下表参照）。
【表８】
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＊  ワズワースアネロビック．バクテリオロジー・マニュアル、Ｖ．ステル、Ｄ．シトロンおよびＳ．ファインゴールド３版
＊＊  ホスホマイシン（７９．５ｍｇ／ｌ）＋スルファメトキサゾール（０．９３ｍｇ／ｌ）＋トリメソプライム（５ｍｇ／ｌ）
＊＊＊  ロウベリおよびリリー、１９９５からのＮＮ寒天
結果
細菌数はｌｏｇベース１０として表わし、表７に示す。
表７  猫の糞の細菌数（平均±Ｓｔｄｅｖ、ｎ＝８）
【表９】
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処理中、引用するプロバイオチック細菌の摂取によるラクトバチルスの糞中の数の増加を観察する。選択プロバイオチックの使用と関連する腸の生態系に損傷のないことを反映するエンテロバクテリエシエ数の劇的増加のないことを観察する。
【００５１】
例４  犬におけるコロニー形成の効力
Ｌ．ルーテリＮＣＣ２６０３、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２６１３、アシドフィラスＮＣＣ２６２８およびビフィドバクテリウム種ＮＣＣ２６５７は犬の胃腸管を通過して生き残るその能力を評価するために飼養試験で試験した。
４〜７才の１０匹の犬、５匹の雄および５匹の雌はこの特別の試験を行なった。飼養プロトコルは「フリスキーズ  バイタリティ」ｗ／ｏチコリによる５日の適応期間および「フリスキーズ  バイタリティ」ｗ／ｏチコリによる５日の試験期間、および「フリスキーズ  バイタリティ」ｗ／ｏチコリ＋細菌、すなわちＬ．ルーテリＮＣＣ２６０３（フードＥ）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２６１３（フードＦ）、Ｌ．アシドフイラスＮＣＣ２６２８（フードＧ）およびビフィドバクテリウム種ＮＣＣ２６５７（フードＨ）による３日の適応および５日の試験から成るものであった。このフードの割当ては次の通りであった。
【表１０】
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この菌株は十分量で、かつ安定な凍結乾燥形で調製して試験動物の胃腸管で生き残る菌株に関しこれらの８つの異なる細菌を適用した。すべての菌株は動物用のフードマトリックスと調製菌株を混合するため十分容積のキャリアを添加するように４ｇのトレハロースと混合した。細菌菌株は個々のプラスチック管に調製し（５．０Ｅ＋０９ｃｆｕ／ｍｌ）、毎日フードの部分に添加して全体の細菌が確実に食べられるようにした。
新しい糞試料は菌叢（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を分析するために収得し、基準線と比較した（細菌添加せず）。
糞は７日および８日（基準線）
１４日および１５日  ２１日および２２日（基準線）
２８日および２９日に収集した。
無菌直腸プローブを使用して少なくとも０．１ｇの糞試料を得た。この試料は正確に秤量し、０．１ｇを１０％グルセロールを含有する１０ｍｌの生理溶液（リンゲル）と混合する。次にこの溶液は１ｍｌの極低温管に移し、液体窒素で凍結した。次にすべての試料は分析まで−８０℃で貯蔵する。この細菌は例３記載と同一の培地で計数した。
結果  ｌｏｇベース１０として表わした細菌数を表８に示す。
表８  犬の糞の細菌数（平均±Ｓｔｄｅｖ、ｎ＝５）
【表１１】
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処理中、菌株Ｌ．アシドフイラスＮＣＣ２６２８の場合を除いて選択したプロバイオチック細菌の摂取により、糞のラクトバチルス数に主要な変化は認められない。試験条件下でＣ．パーフリンゲンスに対する抑制効果はＣ−パーフリンゲンスの基本量が非常に低いので有意ではなかった。選択したプロバイオチックの使用と関連する腸の生態系の動揺のないことを反映してエンテロバクテリエシエ数に劇的増加のないことを認める。
【００５２】
例５  ジアルジア・インテスチナリスの生存可能性に及ぼすラクトバチルスおよびその代謝産物の効果
猫および犬から単離したラクトバチルス菌株の培養濾液上澄の効果を研究した。
材料および方法
細菌菌株および培養：属ラクトバチルスに属する微生物はネスレ・カルチャー・コレクションからのものであった。細菌はＫＴＹＩ培地に生育させた。ラクトバチルス代謝産物を含有する上澄はｐＨ６に中和し、濾過滅菌した。
対照は１つの細菌カルチャー以上の同じｐＨにＭＴＹＩ培地を乳酸により酸性化することにより行なった。その後ｐＨは０．１Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ６に調製した。研究下の菌株の起源および上澄のｐＨおよび対照は表９に示す。
表９
【表１２】
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寄生虫：ジアルジア・インテスチナリスＷＢ（ＡＴＣＣ３０５９７）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、米国）で購入した。栄養型胞子虫は１ｌにつき次のものを含有するケイスター修正ＴＲ１−Ｓ−３３培地に生育した、すなわち、カゼイン消化物（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ、酵母エキス（ＢＢＬ）、１０ｇ、デキストロース（メルク）、１０ｇ、牛胆汁（Ｄｉｆｃｏ）、０．７５ｇ、Ｎａｃｌ（メルク）、２ｇ、Ｌ−システインＨＣｌ（シグマ）、２ｇ、アスコルビン酸ナトリウム（フルカ）、０．２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４（メルク）、０．６ｇ、クエン第２鉄アンモニウム（シグマ）、２２．８ｍｇ、成牛血清（シグマ）、１００ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ、１０００ＩＵ／ｍｌ）、１５ｍｌ。ｐＨは濾過滅菌前（０．２２μｍ孔寸法）ＮａＯＨ５Ｎにより６．９に調整した。
寄生虫は４０ｍｌのカルチャー培地を満たしたポリスチレン組織培養フラスコ（ＬＵＸ、マイルズラボラトリーズ、インク、ネーパービル１Ｌ６０５４０）で培養した。継代培養は寄生虫の付着しない上澄を廃棄し、５ｍｌの氷冷却カルチャー培地を添加し、氷浴で１０分培養して付着する栄養型胞子虫を引き離し、０．２ｍｌの形成サスペンジョンを新鮮培地に接種して行なった。培養は３７℃で暗所で行なった。
増殖検定：２００μｌの栄養型胞子虫サスペンジョン（１．４×１０５寄生虫／ｍｌ）は１００μｌの上澄または対照と混合し、１μＣｉの３Ｈチミジンを添加した。試料は３７℃で２４時間、９６−穴を有する組織培養プレート（ヌンクブランド製品）で培養した。次に、寄生虫は収穫し、チミジン添加を評価した。
結果
チミジン添加は表１０に示す。犬から単離した菌株ＮＣＣ２６２８はＷＢ菌株の強い増殖抑制を生じた（９１％）。研究した他の菌株は栄養型胞子虫の生育を抑制しなかった。
【表１３】
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表１０  ジアルジアインテスチナリス菌株の増殖に及ぼすカルチャー濾過上澄の効果
この試験においてＬ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８の生育中生成する機能性代謝産物はジアルジア・インテスチナリスの生育に対し非常に強い抑制効果を有することが実証できた。
【００５３】
例６〜８  本発明によるラクトバチルス菌株の腸病原菌に対する抑制効果
小腸病原菌に対し強い拮抗性を有する菌株と同定するために、共生培養試験を犬の小腸条件（ｐＨ、胆汁組成物および濃度、ムチン、パンクレアチン）を模擬するモデル系で行なった。模擬犬の小腸液は再構成犬胆汁（０．３４５ｇ／ｌ  タウロケノデオキシコレート、シグマ、ドイツ；０．７ｇ／ｌ  タウロデオキシコレート、シグマ、ドイツ；３．０４ｇ／ｌ  タウロコレート、シグマ、ドイツ；０．００６ｇ／ｌ  コレート、フルカ、スイス）、豚ムチン（１．９ｇ／ｌ、シグマ、ドイツ）、豚パンクレアチン（２．４２ｇ／ｌ、シグマ、ドイツ）および電解質溶液（５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．６ｇ／ｌ  ＫＣＬ、０．２５ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２、すべてメルク、ドイツ）を含有した。液のｐＨは０．１Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ６．５±０．５に調整した。
菌株および培養条件
小腸病原体
４つの可能性のある病原菌株、すなわちＳ．チフィムリウムＳＬ１３４４、Ｅ．コリＥＴＥＣ  ０８：Ｈ９およびＥ．コリ０１４９：Ｋ８８（病原性犬単離物）およびＳｈ．ダイセンテリエー（ヒト起源バウドイズ大、ホスピタルセンターＣＨＵＶローザンヌ、スイス）の臨床単離物を選択した。ルリアベルタニブロス（ディフコ、米国）で増殖したＳ．チフィムリウムＳＬ１３４４を除いて、すべてのエンテロバクテリエシエはブレーンハートインフユージョンブロス（ディフィコ、米国）で３７℃で振温下で（２４０ｒｐｍ）生育させた。
乳酸菌
Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭＩ−２４５３）、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭＩ−２４４９）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５８１（ＣＮＣＭＩ−２４４８）、Ｌ．ルーテリＮＣＣ２５９２（ＣＮＣＭＩ−２４５０）を含む犬および猫起源の広範囲のラクトバチルスはネスレ・カルチャー・コレクション（ＮＣＣ、ネステック、スイス）から選択し、生存、生理活性および上記小腸病原体に対する抑制効果に対し犬の小腸モデルで選別した。ラクトバチルスはマンロゴサシャープブロス（ディフコ、米国）で３７℃で嫌気的に（アンエアロカルト、オキソイド、英国）培養した。
生存細胞数の測定
試料は無菌リン酸塩緩衝液（ＮａＨ２  ＰＯ４、ｐＨ７、０．２Ｍ）で稀釈し、寒天プレート、すなっわちラクトバチルスに対しＭＲＳ寒天（ディフィコ、米国）、Ｓ．チフィムリウムおよびＳｈ．ダイセントリエーに対しサルモネラ−シゲラ寒天（オキソイド、英国）およびＥ．コリに対しソルビトールマックユンキー寒天（オキソイド、英国）に１０倍稀釈物を表面プレーティングした。寒天培養はラクトバチルスに対し嫌気的に３７℃で４８時間、およびエンテロバクテリエシエに対し３７℃で２４時間培養した。共生培養試験では、ＭＲＳ寒天上のエンテロバクテリエシエの生長はポリミキシン（オキソイド、英国）の添加により抑制された。
乳酸菌（ＬＡＢ）および病原体間の共生培養試験
可能性のあるプロバイオチックＬＡＢおよび病原菌菌株による共生培養試験は３７℃でカルチャーの代謝活性を有利にするため異る炭素源（糖、ペットフード）で強化した犬の模擬小腸液２０ｍｌ（ファルコン管）で行なった。ＬＡＢは１０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌで、病原体は１０Ｅ＋０２ｃｆｕ／ｍｌ、１０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｍｌ、および１０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌで接種した。試料は８時間まで指示する異る時間に採取し、生存細胞数は各培地に１０倍稀釈物を表面にプレーティングして測定した。
共生培養試験はデキストロース（５ｇ／ｌ）および異なる濃度の市販品として入手できる押出し乾燥ペットフード（５、２５または１００ｇ／ｌ、フリスキーズＡＬＰＯコンプリート、米国）により強化した犬の模擬小腸液を含む各種条件下で行なった。後者は均質化し（ストマッケルＬＡＢブレンダー）および電解質溶液に懸濁した。すべての試験は二重反復試験で行なった。
【００５４】
例６
４つのラクトバチルスおよび４つの可能性のある病原菌株Ｅ．コリ  ＥＴＥＣ０８：Ｈ９、Ｅ．コリ０１４９：Ｋ８８、Ｓ．チフィムリウムＳＬ１３４４およびＳｈ．ダイセントリエーは５ｇ／ｌのデキストロース（ディフコ）を強化した犬の模擬十二指腸液で行なった。ラクトバチルスは１０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌで、グラム陰性インジケータ菌株は１０Ｅ＋０２ｃｆｕ／ｍｌで接種した。結果は表１１に示す。
表１１  デキストロースを強化した犬の模擬小腸液にＬＡＢおよび病原可能性菌の共生培養
【表１４】
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＋  生育抑制
＋＋  生育の抑制および部分不活性化
＋＋＋  生育の抑制および完全な不活性化
４つのすべての試験したラクトバチルスは抗菌性を実証したが、Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）およびＬ．ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）のみはすべての試験病原体に対し高い活性を実証した。双方の菌株は生育を抑制できるのみでなく、また試験系に含有される病原体を完全に不活性化することができた（残存生存細胞なし）。
【００５５】
例７
市販品として入手できる押出し乾燥ペットフードで強化した（５，２５または１００ｇ／ｌ、フリスキーズ  ＡＬＰＯ  コンプリート、米国）犬の模擬十二指腸液で共生培養をラクトバチルス［（アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）、Ｌ．ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）］およびＳ．チフィムリウム間で行なった。ラクトバチルスは１０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌで、グラム陰性インジケータ菌株は１０Ｅ＋０２ｃｆｕ／ｍｌで接種した。結果は表１２に示す。
表１２  乾燥ペットフードを強化した犬の模擬小腸液でＬＡＢおよび病原菌の可能性のある菌間の共生培養
【表１５】
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＋  生育の抑制
＋＋  生育の抑制および部分不活性化
＋＋＋  生育の抑制および完全な不活性化
結果は特にＬ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）に生育を抑制し、および模擬小腸液とペットフードの混合物におけるような非常に実際的条件下で完全に小腸病原体を不活性化さえする高い可能性を実証した。Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８の抗菌活性は微生物に対し発酵性糖源として働く市販ペットフードの低量強化でさえ非常に高かった。Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８に対しなされたこの観察と対照的にＬ．ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）の有効性は抗菌活性の増加が試験系に添加されるペットフード量の増加につれて観察されるようにペットフードの強化量によるものであった。
【００５６】
例８
Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）およびＳ．チフィムリウムＳＬ１３４４の異る接種量による共生培養はデキストロース（５ｇ／ｌ、ディフコ）を強化した犬の模擬十二指腸液で行なった。Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）は１０Ｅ＋０８ｃｆｕ／ｍｌで、Ｓ．チフィムリウムＳＬ１３４４は１０Ｅ＋０２ｃｆｕ／ｍｌ、１０Ｅ＋０４ｃｆｕ／ｍｌおよび１０Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌで接種した。結果は表１３に示す。
表１３  Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）と異る接種量のＳ．チフィムリウムＳＬ１３４４の共生培養
【表１６】
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＋  生育の抑制
＋＋  生育の抑制および部分不活性化
＋＋＋  生育の抑制および完全な不活性化
Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）の抗菌活性は十分に高く、Ｓ．チフィムリウムＳＬ１３４４の初めの高い濃度でさえ完全に不活性化した。
【００５７】
例９  犬のイン・ビボ免疫刺激
ペット−単離のプロバイオチックの菌株に対する免疫刺激可能性はＬ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８菌株を使用して臨床試験で試験した。
方法
異るマイトジエンによる刺激による犬の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）
４〜７才の２０匹の犬でこの試験を行なった。飼養プロトコルは「フリスキーズ  バイタリティ」ｗ／ｏチコリによる１週の適応および「フリスキーズ  バイタリティ」ｗ／ｏチコリ＋アシドフィラスＮＣＣ２６２８細菌による４週の試験から成るものであった。
Ｌ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８は試験動物の胃腸管に生存する菌株について十分量および安定な凍結乾燥形で調製した。細菌は調製細菌と動物用フードマトリックスとの混合に十分容積のキャリアを添加するために４ｇのトレハロースと混合した。細菌は個々のプラスチック管に調製し（５．０Ｅ＋０９ｃｆｕ／日）、毎日フードの部分に添加して全体の菌が確実に喰べられるようにした。
血液は４週のプロバイオチック投与後犬から収集した。血液はＶａｃｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）カラム（ベクトン  ディッキンソン、マウンテン  ビュー、ＣＡ）を通して分画した。ＰＢＭＣは製造者の推せんにより回収された。
細胞はＴ細胞（コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ））、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、Ｂ細胞（ポクウィード  マイトジエン（ＰＷＭ））、およびすべての細胞（ホルボール−ミリステート−アセテート／イオノマイシン（ＰＭＡ／イオノ）の強い増殖を誘起する異るマイトジエンまたはホルボルエステルにより刺激した。１０５細胞／穴は９６−穴の平底カルチャープレート（ヌンク）の１０％牛胎児血清および抗生物質を補充した２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培養培地の最終容量にマイトジエンまたはホルボルエステル（それぞれの用量は図１に示す）と一緒に培養した。
細胞は３７℃で４８時間加湿５％ＣＯ２環境に維持した。細胞はさらに１８時間１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク、スイス）によりパルス−標識した。次に細胞はニトロセルロースフィルター（パッカード）上で収穫し、結合［３Ｈ］チミジンはシンチレーションカウンターにより測定した（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ、パッカード、スイス）。細胞増殖は三重反復試験から平均として計算した（計数／分（ｃ．ｐ．ｍ）（±ＳＤ）。
結果
図１：対照群と比較してＬ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８を給与した犬の群ですべてのマイトジエンに応答して細胞増殖が明確に増加した。この増加はホルボルエステルＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激したカルチャーで有意であった。このデータはプロバイオチック給与犬からのリンパ球はイン・ビトロで活性化すると一層反応性であることを示し、プロバイオチック給与犬の免疫系が刺激されたことを示唆する。
【００５８】
例１０  ペット−単離ラクトバチルス菌株による免疫機能のイン・ビトロモジュレーション
上記異るペット−単離ラクトバチルス菌株のイン・ビトロ選別はその免疫モジュレーションの可能性を測定するために行なった。このため前−炎症シトカイン（ＩＬ−１２、ＩＦＮγ）および／または抗−炎症シトカイン（ＩＬ１０、ＴＧＦ−β）を誘起するその能力を測定した。（アナンド・エイ・シー、アジア、シー・エム、１９９９、トロップ．ガストロエンテロール、２０（３）、９７〜１０６；スペルベルグ・ビー、エドワード・ジェイ・イー、Ｊｒ２００１、Ｃｌｉｘ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，３２（１）、７６〜１０２）。これは強い抗−病原性または抗−がん免疫機能および、アレルギーおよび炎症（炎症性腸疾患）のような犬の腸病原体に対する拮抗機能に対し可能性のある候補菌株を選択することを目的とする。付加的培養は培地単独（負の対照）、エンテロコッカス・フェシウム菌株ＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５、セルビオス−ファーマ、スイス）およびヒトのラクトバチルス単離物ＳＴ１１（ＮＣＣ２４６１、ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）（正の対照）により行なった。
方法
犬の白血球の異るプロバイオチック菌株により誘起されるシトカインプロフィル
通常の成犬からの血液は室温で５分ＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭのＫＨＣＯ３および０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、水中、ｐＨ＝７．４）により処理した。白血球は２回ＲＰＭＩ培地（抗生物質含まず）で洗浄し、組織培養プレートの２４−穴に２．１０６細胞／ｍｌで播種した。１０６ＣＦＵを含有する１ｍｌの細菌サスペンジョン（下記）を各穴に添加した。
対照処理では、培地のみを白血球に添加した。試料は３７℃および５％ＣＯ２で１８時間培養した。その後、白血球は集め、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離した。細胞ペレットは５００μｌのトリゾール試薬（ギブコＢＲＬ）により溶解した。ＲＮＡは細胞溶解物からヌクレオスピンＲＮＡキット（マチェレイ−ナゲル）を使用して抽出した。犬のシトカイン増幅用ＲＴ−ＰＣＲはＡＢ遺伝子キット（メルク）を使用して行なった。参照の手引き（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈがすべて作成）は下記する。エチジウムブロミド−着色アガロースゲルに現れたＰＣＲ−バンドの濃度計分析はＮＩＨイメジソフトウェアを使用して行なった。すべてのバンドは各試料により得た各β−アクチンＰＣＲ−製品バンドにより標準化し（内部対照）、結果は各シトカインＰＣＲ−製品バンドのピクセル密度を反映する任意単位として表わす（図２）。
−細胞の調製：ラクトバチルスの各種菌株をこれらが同じ濃度に達するまでＭＲＳ培地で約８時間生育させた。細菌は抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地に１０６ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に稀釈した。
−シトカイン−ＲＴ−ＰＣＲｓに対し使用した手引き
【表１７】
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結果
図２：データはラクトバチルスが誘起したシトカインプロフィルは菌株依存性であること示す。例えば、菌株ＮＣＣ２６２８は高量のＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを誘起し、アレルギーおよび炎症腸疾病のような炎症疾病の免疫調整にこの特別の菌株に対する可能性を強調する。対照的に、菌株ＮＣＣ２５８３は強量のＩＦＮγおよびＩＬ−１２を誘起し、これはこの菌株を抗−病原活性および抗−がん活性に対し良い候補者にする。
【００５９】
例１１
３つの乾燥ペットフードを研究に使用する。これらは「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」とする。ペットフード「Ａ」は栄養的に完全な乾燥ペットフードで、ブランド名ＡＬＰＯとして入手できる（ＡＬＰＯはスイス、ネスレ社の登録商標である）。
ペットフードＢはペットフードＡと同様に栄養的に完全な乾燥ペットフードであるが、小袋から供給される選択されたプロバイオチック微生物の粉末混合物が補充される。混合物は実質的に等量のＬ．アシドフィラスＮＣＣ２６２８およびビフィドバクテリウム種ＮＣＣ２６５７を含む。各食事毎にフード上に撒布する。供給用量は約１．０Ｅ８ｃｆｕ／日である。
ペットフードＣは栄養的に完全な乾燥ペットフードで、実質的にペットフードＡと同一であるが、これは１．２重量％のエンテロココッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）の乾燥したカルチャー上澄を含有する。
３０匹の犬を研究に使用する。犬はペットフードＡを使用して８週間予備給飼される。次に犬は各１０匹の犬の３群、Ａ、Ｂ、Ｃとし、８週間相当する名称のフードを給与される。
犬は水を自由に飲むことができ、１日に１回給与される。被膜のふけのひろまりを３０人の評価パネルが開始時と次に７週後に測定する。
犬はパネルが評価前手入れし、パネルメンバーは評価中特徴を比較しない。
この評価で犬は各個のパネリストに２０の異る組合せ（ｐａｉｒｉｎｇ）で提示する。パネリストは、提示した対のどちらの犬が（１）ふけが少ない、（２）被膜の艶の高さおよび（３）被膜の臭いの少なさを点数表で示すことを求められた。
すべての犬の全般的被膜状態は通常の健康な犬に予期できるものと同様に目で見て、および触って良好である。しかし、フードＣを給与した犬は対照フードＡを給与したものよりふけが著しく少なかった。フードＢを給与した犬は著しく艶のある被膜を有し、Ａのものより被膜の臭いが著しく少ないことを示す。これらの特徴はＢ群の犬と比較する場合統計的に有意的に異ならないことが分かった。
【００６０】
例１２
飼料混合物は約５８重量％のコーン、約６重量％のコーングルテン、約２３重量％の肉およびミール、塩、ビタミンおよびミネラルの残こりの形成量から製造する。
飼料混合物は予備コンディショナーに供給し、加湿する。この混合物に次のラクトバチルス菌株、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）およびエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）の混合物を含有する粉末を添加する。粉末は実質的に均一に混合物中に分散する。次に加湿飼料ミックスはエクストルーダ−クッカーに供給し、糊化させる。エクストルーダを出る糊化マトリックスはダイを経て押出される。押出し物は犬の給飼に適する片に切断し、約１１０℃で約２０分乾燥し、冷却してペレットを形成する。押出し物の片は添加菌株の細菌活性をチェックする。何も検知されない。
【００６１】
例１３
２４匹の犬をこの研究に使用する。これらは若い犬および老令犬を含み、後者は８〜１２才である。選択した老令犬は年令に相応した関節炎症の外部徴候を示し、時々運動に若干の困難を来たしているようである。或る動きは痛いらしい。これらの徴候は老令犬にしばしば認められ、関節炎状態に関するものと信じられる。
３つの乾燥ペットフードを研究に使用し、Ａ、ＢおよびＣとする。ペットフードＡは栄養的に完全な乾燥ペットフードである（ＡＬＰＯ  ビーフィ  ディナー）。これは対照フードである。
選択したすべての２４匹の犬はペットフードＡを使用して８週間予備飼養する。次に犬は３群、Ａ、ＢおよびＣ各８匹に分け、同じ割合の若い犬および老令犬を含む。次に各群は８週間次の各フードを給与する。
【表１８】
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ペットフードＢは栄養的に完全な乾燥ペットフードで、実質的にペットフードＡと同一であるが、その重量の２％を形成するコーティングを有し、該コーティングはエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）の微生物を含む。各犬に対する毎日のフード給与量は１．０Ｅ＋０９ｃｆｕ／日の用量であるように個々の体重により計算される。
フードＣは上記例１２で製造した押出しキブルを含む。各犬に対する毎日のフード給与量は微生物用量が１．０Ｅ＋１１ｃｆｕ／日であるように個々の体重により計算する。
犬は水を自由に飲むことができ、１日に１回給与される。活性計器を各犬の首輪に取り付け、毎日測定値を採取する。犬は犬舎スタッフにより活性を目でも評価する。
すべての犬の状態は通常の健康の犬に予期できるものと同様に目で見て、触って良好である。しかし、ペットフードＢおよびＣを受ける群の犬はフードＡによるその対応犬より一層著しく活性である。計器の読みはこれらの観察を支持する。
さらに、ＢおよびＣ群の老令犬は試験期間フードＢおよびＣを給与した後、局部関節炎症の外部徴候が少なくなるようである。さらに、犬は物理的運動による苦痛の程度が下がることを経験し、以前より一層自由に運動するようである。フードＢおよびＣは或る加令徴候について安心を与え、老令ペットの運動性を改良するようであると結論できる。
【００６２】
例１４  乾燥キャットフード
飼料混合物は５８重量％のコーン、約６重量％のコーングルテン、約２３重量％のチキンミール、塩、ビタミンおよびミネラルから形成する。
飼料混合物は予備コンディショナーに送り、加湿する。次に加湿飼料はエクストルーダ−クッカーに送り、糊化させる。エクストルーダを出る糊化マトリックスはダイを通して押出す。押出し物は猫の給与に適する断片に切断し、約１１０℃で約２０分乾燥し、冷却してペレットを形成する。この時点で、凍結乾燥粉末の１つ以上の次のラクトバチルス種の菌株、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）またはエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）をペレットに適用するために供する。猫に対する相当する飼料摂取量は約１．０Ｅ＋０７〜１．０Ｅ＋９ｃｆｕ／日であるように十分な粉末がこうして供される。いくらかの粉末はペレットの最初のマスに混合し、袋詰めする。粉末の第２量は計量し、脂質キャリアと混合し、次にペレットの第２マスに噴霧する。ペレットはコーティングが５０−６０℃で数分間十分に乾燥させた後袋詰めする。
【００６３】
例１５  ペットフードおよびサプリメントの缶詰
混合物は７３％の家禽屠体、豚の肺および牛の肝臓（細碎）、１６％の小麦粉、２％の着色料、ビタミンおよび無機塩から製造した。この混合物は１２℃で乳化し、プリン状に押出し、次に９０℃の温度で加熱する。３０℃に冷却し、チャンクに切断する。これらの４５％のチャンクは９８％水、１％の着色料および１％のグァーガムから製造したソース５５％と混合する。錫缶に充填し、１２５℃、４０分滅菌する。供飼前ペットフードと混合するプロバイオチックサプリメントとして、次のラクトバチルス種、ラクトバチルス・ラムノサスＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４４９）、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５３）またはエンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）の菌株を有する小袋形の付加的包装が供される。ペットに対する相当量は猫または犬により、および体重のような物理的因子により約１０６−１０１２ｃｆｕ／日である。これは給与指示と一緒に、缶に除去できるように貼付した補助として供給される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】マイトジエンまたはホルボールエステルで刺激した犬の末梢血液単核細胞のリンパ球増殖を示す。
【図２Ａ】異るバイオチック菌株で刺激した犬の白血球が生産したシトカインを任意ユニットＩＬ−１２（Ａ）、ＩＬ−１０（Ｂ）、ＩＦＮγ（Ｃ）およびＴＧＦβ（Ｄ）により示す。
【図２Ｂ】異るバイオチック菌株で刺激した犬の白血球が生産したシトカインを任意ユニットＩＬ−１２（Ａ）、ＩＬ−１０（Ｂ）、ＩＦＮγ（Ｃ）およびＴＧＦβ（Ｄ）により示す。
【図２Ｃ】異るバイオチック菌株で刺激した犬の白血球が生産したシトカインを任意ユニットＩＬ−１２（Ａ）、ＩＬ−１０（Ｂ）、ＩＦＮγ（Ｃ）およびＴＧＦβ（Ｄ）により示す。
【図２Ｄ】異るバイオチック菌株で刺激した犬の白血球が生産したシトカインを任意ユニットＩＬ−１２（Ａ）、ＩＬ−１０（Ｂ）、ＩＦＮγ（Ｃ）およびＴＧＦβ（Ｄ）により示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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