(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１２】
0004563648.tif 000046
を有する少なくとも２つの異なる化合物の混合物を含むことを特徴とする、内因系経路による凝固の診査における使用のための組成物であって、当該２つの化合物が、Ａ基に関して同一であっても、又は異なっていてもよく、かつＲ基に関して同一であっても、又は異なっていてもよく、Ａ基及びＲ基は、
・Ａが下記式：
【化１３】
0004563648.tif 000047
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；
・Ｒが
【化１４】
0004563648.tif 000048
〔ｍは２、３、４、又は５に等しく、かつｎは１〜１７０の整数である〕を表すものである、組成物。
【請求項２】
ｎが１〜５０の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｎが１〜３０の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｎが１〜２０の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
下記式：
【化１６】
0004563648.tif 000049
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕を有する、それぞれ酸化型エチレングリコールガラート（ＥＧＧｏｘ）の酸型及び塩基型を構成する化合物（IV）及び（Ｖ）の混合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ケト−エノール平衡により生成し、かつ式：
【化１７】
0004563648.tif 000050
〔式中：
・Ａは下記式：
【化１８】
0004563648.tif 000051
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され、
・Ｒは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨである〕を有する異なる型のエチレングリコールガラートを含むことを特徴とする、請求項１又は請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
・没食子酸をエチレングリコールでエステル化し、下記式：
【化１９】
0004563648.tif 000052
を有するエチレングリコールガラート（ＥＧＧ）により構成された反応生成物の１つを回収する工程、
・ＥＧＧをアルカリ性媒体と接触させること、及び７０〜９０℃の範囲の温度に２４時間加熱することにより、ケト−エノール平衡を移動させる工程を含む方法を実施することにより得られる請求項５又は請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
・ｐＨを調整することにより、得られたケト−エノール平衡を安定化する工程；
・アルカリ性ｐＨにおいて溶液中の下記式：
【化７２】
0004563648.tif 000053
を有する化合物を回収する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
水性溶液の形態であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
式：
【化２０】
0004563648.tif 000054
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕を有する塩基性ＥＧＧｏｘを主に含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
安定化された平衡状態で下記式：
【化７３】
0004563648.tif 000055
を有する化合物を含有すること、並びに生理学的に許容されるｐＨを有していることを特徴とする、請求項１〜６又は１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
下記式：
【化７４】
0004563648.tif 000056
を有する化合物の混合物を含有すること、並びにそのｐＨが７．６〜７．８の範囲であることを特徴とする、請求項１〜６、１０又は１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
ＭＯＰＳ緩衝剤及びＴＲＩＣＩＮＥ緩衝剤より選択される緩衝剤をさらに含む、血漿試料と接触した際に内因系凝固を活性化することができる、請求項１〜６又は１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
含有している化合物が、血漿試料と接触した際に内因系凝固を活性化するために十分な濃度で存在することを特徴とする、請求項１〜６又は１０〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも下記式：
【化７５】
0004563648.tif 000057
〔式中：
・Ａは、下式：
【化７６】
0004563648.tif 000058
〔Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；
・Ｒは
【化７７】
0004563648.tif 000059
〔ｍは２、３、４、又は５に等しく、かつｎは１〜１７０の整数である〕を表す〕を有する化合物を含む、内因系凝固の検査において使用するための試薬。
【請求項１６】
下記式：
【化７８】
0004563648.tif 000060
〔式中：
・Ｒは−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ〔ｎは１〜１７０の整数である〕を表す〕を有する、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
下記式：
【化７９】
0004563648.tif 000061
〔式中：
・Ｒは−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ〔ｎは１〜１７０の整数である〕を表し；
・Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕を有する、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１８】
Ｒが−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ〔ｎは１〜１０の整数である〕を表す、式（II）又は（III）を有する、請求項１６又は請求項１７に記載の試薬。
【請求項１９】
ｎが１に等しい、請求項１８に記載の試薬。
【請求項２０】
下記式：
【化８０】
0004563648.tif 000062
〔式中：
・Ａは
【化８１】
0004563648.tif 000063
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕であり；
・Ｒは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨである〕を有する、請求項１５〜１９のいずれかに記載の試薬。
【請求項２１】
カチオンが金属カチオンであることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれかに記載の試薬。
【請求項２２】
金属カチオンがＭｎ2+、Ｃｕ2+、及びＣｏ2+より選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の試薬。
【請求項２３】
カチオンが金属カチオンであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
金属カチオンがＭｎ2+、Ｃｕ2+、及びＣｏ2+より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
内因系凝固アクチベーターを構成するような条件下で、血小板膜リン脂質の代用物をさらに含む、内因系凝固のin vitro検査において使用するための、請求項１５〜２２のいずれかに記載の試薬。
【請求項２６】
内因系凝固アクチベーターを構成するような条件下で、請求項１〜１４、２３又は２４のいずれかに記載の組成物を含み、血小板膜リン脂質の代用物をさらに含む、内因系凝固のin vitro検査において使用するための試薬。
【請求項２７】
内因系凝固アクチベーターが、式：
【化２２】
0004563648.tif 000064
〔式中：
Ｍ+はカチオンを表し、ｑは１又は２に等しく、かつｐはｐ×ｑ＝２となるようなものであり；
・Ｒは、
【化２３】
0004563648.tif 000065
〔ｍは２、３、４、又は５であり、かつｎは１〜１７０の整数である〕を表す〕を有する活性型のＥＧＧを含むことを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の試薬。
【請求項２８】
ＥＧＧ濃度が１００〜１０００μＭの範囲であることを特徴とする、請求項１５〜２２又は２５〜２７のいずれかに記載の試薬。
【請求項２９】
置換型ポリアミノ酸である、感度を変調することができる成分と会合した、請求項１５〜２２又は２５〜２８のいずれかに記載の試薬。
【請求項３０】
置換型ポリアミノ酸である、感度を変調することができる成分と会合した、請求項１〜１４、２３又は２４のいずれかに記載の組成物を含む、内因系凝固のin vitro検査において使用するための試薬。
【請求項３１】
スクシニル化ポリリシンと会合した、請求項２９又は３０に記載の試薬。
【請求項３２】
２００００〜３０００００Ｄａの範囲の分子量を有するスクシニル化ポリリシンと会合した、請求項３１に記載の試薬。
【請求項３３】
グルタリル化ポリリシンと会合した、請求項２９又は３０に記載の試薬。
【請求項３４】
内因系凝固のin vitro検査のためのテストを調製するための、請求項１５〜２２又は２５〜３３のいずれかに記載の試薬の使用。
【請求項３５】
内因系凝固のin vitro検査のためのテストを調製するための、請求項１〜１４、２３又は２４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３６】
内因系経路による凝固の診査のための、請求項１５〜２２又は２５〜３３のいずれかに記載の試薬の使用。
【請求項３７】
内因系経路による凝固の診査のための、請求項１〜１４、２３又は２４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３８】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が決定される、請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項３９】
活性化された全血の凝固時間が決定される、請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項４０】
活性化された血漿の凝固時間が決定される、請求項３６又は３７に記載の使用。
【請求項４１】
内因系凝固経路に関与している凝固因子の検査のための、請求項１５〜２２又は２５〜３３のいずれかに記載の試薬の使用。
【請求項４２】
内因系凝固経路に関与している凝固因子の検査のための、請求項１〜１４、２３又は２４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４３】
下記式：
【化２９】
0004563648.tif 000066
〔式中：
・Ａは
【化３０】
0004563648.tif 000067
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；かつ
・Ｒは−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ〔ｎは１である〕を表す〕を有する化合物のケト−エノール平衡に関与しているＥＧＧ型の混合物を調製するための方法であって、
・エチレングリコールの存在下で没食子酸を反応させる工程；
・得られた没食子酸エステルをアルカリ性媒体と接触させ、式：
【化３１】
0004563648.tif 000068
を有する化合物を形成させる工程；
・式：
【化３２】
0004563648.tif 000069
を有する錯体の形成を可能にする条件下で、金属カチオンＭq+（式中、ｑは１又は２に等しい）を添加する工程；
・緩衝剤を添加することにより、生理学的に許容されるｐＨにおいて、化合物（II）と（III）との間で得られた平衡を安定化する工程；
・得られた溶液を回収する工程を含む方法。
【請求項４４】
式：
【化３３】
0004563648.tif 000070
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕を有する可溶型ＥＧＧが回収されることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
式：
【化３４】
0004563648.tif 000071
〔式中：
Ａは、下記式：
【化３５】
0004563648.tif 000072
〔Ｍ+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；かつ
・Ｒは−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ（式中、ｎは１〜１７０の整数である）を表す〕を有する化合物を調製するための方法であって、
・没食子酸をエステル化する工程；
・得られた没食子酸エステルを、緩衝溶液中で、アルカリ性ｐＨにおいて、７０〜９０℃の範囲の温度に、１６〜２４時間の範囲の時間、加熱する工程；
・溶液中に存在する異なる型の没食子酸エステルを回収する工程を含む方法。
【請求項４６】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定するための方法であって、
・内因系凝固経路の活性化を可能にする条件下で、血小板膜リン脂質の代用物の存在下で、血小板枯渇血漿試料を、請求項１５〜２２もしくは２５〜３３のいずれかに記載の試薬、又は請求項１〜１４、２３もしくは２４のいずれかに記載の組成物と接触させる工程；
・２０〜２５ｍＭの範囲の量のＣａ2+イオンを添加する工程；
・フィブリノーゲンをフィブリンへと変換するために必要な時間を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、内因系凝固のアクチベーター化合物、及びその診査のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
「内因系経路」により開始される凝固は、in vitroで、血液が負の電荷を有する表面に曝され接触することにより生じる。in vivoでは、それは、フィブリン塊の成長の二次的な補強を提供する。
【０００３】
「内因系経路」により開始される凝固（以後、「内因系凝固」という表現で呼ぶ）の診査は、凝固異状のin vitro検出のための、又は抗凝固活性を有する物質で処置された患者のモニタリングのためのテストにおいて使用される。
【０００４】
内因系凝固経路は、負の電荷と接触した際のＸＩＩ因子（ｆ．ＸＩＩ）の活性化によりin vitroで開始される。ＸＩ因子（ｆ．ＸＩ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、抗血友病因子Ｂとしても既知のＩＸ因子（ｆ．ＩＸ）のようなその他の酵素因子、及び補因子である抗血友病因子Ａ（ｆ．ＶＩＩＩｃ）の存在下、酵素型の活性化のカスケードが、血小板リン脂質（ＰＦ３）及びカルシウム（Ｃａ++）の同時存在下で誘発される。
【０００５】
その活性化の連鎖が完了すると、今度は、活性化ＩＸ因子（ｆ．ＩＸ）が、Ｘ因子（ｆ．Ｘ）及びプロトロンビンとしても既知のＩＩ因子（ｆ．ＩＩ）を含む第二の酵素系列のカスケード活性化を誘発し、その活性化は、血小板リン脂質（ＰＦ３）、カルシウム（Ｃ++）、及び補因子であるＶ因子（ｆ．Ｖ）の存在下で達成される。
【０００６】
第二活性化カスケードは、フィブリノーゲンを、血液又は血漿の塊の主成分であるフィブリンへと変換するトロンビン（ｆ．ＩＩａ）の形成で完了する。
【０００７】
内因系（in vitro）凝固経路の単純化されたスキームは、以下のように図示されうる。
【０００８】
【化３７】
0004563648.tif 000002
【０００９】
一般的に、凝固の診査は、出血症候群に参与している可能性のある患者における生物学的異状を探査するために、又は凝固レベルにおける疾患の結果をモニタリングするために、又は凝固を直接的もしくは間接的に修飾しうる医学的処置をモニタリングするために実施される。
【００１０】
このため、内因系凝固経路に関与している因子の定性的又は定量的な観察から、トロンビンによるフィブリノーゲンの変換により生じるフィブリン形成に影響を与える種々の異状を調査するため、種々のテストが提唱されている。
【００１１】
内因系凝固（内因性凝固としても既知）を診査するための種々のテストが商業的に入手可能であり、特に、内因系経路に関与している因子のレベルにおいて血漿試料中の異状又は欠陥を検出しうる活性化部分トロンボプラスチン時間テストＡＰＴＴを挙げることができ、その異状は、正常域を超えている凝固時間により露呈する。
【００１２】
ＡＰＴＴテストは、最も高頻度な体質性出血性疾患、即ちヴィレブランド病、並びに血友病Ａ及びＢを識別するために実施される。そのテストは、ヘパリン療法のモニタリングにも頻用されている。
【００１３】
概略的には、ＡＰＴＴテストの原理は、負の電荷を有するＸＩＩ因子アクチベーター（接触アクチベーター）を、カルシウムイオンと共に、テスト血漿試料及び血小板膜リン脂質の代用物へと添加することからなる。
【００１４】
測定される凝固時間は、接触アクチベーター、血小板代用物、カルシウムの添加から、凝塊の出現までの時間に相当する。それは、血漿中のプロトロンビンの１％をトロンビンへと変換するために必要な時間である。次いで、フィブリン形成が短時間で起こる。カルシウムは、系の誘発要因である。
【００１５】
ＡＰＴＴテストの実施に適したアクチベーターは、比較的多数存在する。それらは、例えば、シリカ、ガラス、もしくはカオリンのような固体アクチベーター、又はエラグ酸及びその誘導体、もしくはスルファチド（sulphatides）のような液体アクチベーターを含む。
【００１６】
固体アクチベーターに基づく試薬は、広範に使用されているが、ある種の短所を有しないものは存在しない。それらが含有しているカオリン又はシリカの粒子は、凝固テストの過程で沈着する傾向を有する。従って、連続的な撹拌が提供されなければならず、それが、試薬の不安定性、及び自動装置でのテスト実施における障害に関する問題をもたらす。さらに、カオリンのようなアクチベーターは、光学的な凝固測定を実施するためには使用され得ない。
【００１７】
液体アクチベーターは、固体アクチベーターの代替物である。しかしながら、エラグ酸のようなアクチベーターは、テスト結果のばらつきを誘導しやすいことが知られている。さらに、それらの感度は、上記の試薬のものと比較して劣っている。そのような試薬の性能を改良するため、多様な会合が提唱されている。一例として、国際特許出願ＷＯ−Ａ−９１／１６４５３は、好ましくはデキストラン硫酸と会合した、エラグ酸、フェノール、及び金属イオンに基づく試薬を推奨している。
【００１８】
その他の液状接触アクチベーターは、特に、接触アクチベーターが没食子酸プロピル及びタンニンより選択されるヒドロキシ置換芳香族化合物である欧州特許ＥＰ−Ａ−０  ５２５  ０３５、接触アクチベーターがエラグ酸である国際特許出願ＷＯ−Ａ−９８／４４３５２、並びに接触アクチベーターがテトラヒドロキシ−１，４−キノンである米国特許ＵＳ−Ａ−５  ５５０  ０２８に記載されている。
【００１９】
スルファチドは、内因性経路を介した凝固のアクチベーター化合物として提唱されている。しかしながら、それらの活性レベルは、必ずしも十分であるとは考えられず、そのような化合物には、他の利用可能なアクチベーターと比較して比較的高価であるというさらなる短所もある。
【００２０】
従って、経済的観点から有利でありながら、十分な安定性及び感度を有し、短い活性化時間を誘導し、かつテストを大量生産するための自動分析装置において使用されうる製品を提供するため、新規な凝固試薬、又は既存の試薬の改良が必要とされている。
【００２１】
本発明は、内因系凝固に参与することができ、そしてこの内因系凝固を診査し、異常の検出を可能にすることができる系及びテストの作製に参与することができる、そのような代替的な接触アクチベーターに関する。
【００２２】
本発明は、さらに、ＡＰＴＴ型の内因系凝固の診査のためのアッセイにおける、これらのアクチベーターの使用に関する。
【００２３】
特定の実施態様によると、内因系凝固のアクチベーターは、ある種の病理において認められる凝固時間の異常のため、ＡＰＴＴにおいて使用される試薬の応答の感度の変調を可能にする化合物と会合している。
【００２４】
内因系凝固を活性化することができる物質の調査に関連して、本発明者らは、ＡＰＴＴテストにおいて凝固アクチベーターとして現在使用されている化合物と比較して有利な可溶性を有する化合物を研究し、特に没食子酸から出発し、内因系凝固を活性化することができる誘導体を研究した。
【００２５】
本発明の分野とは無関係の分野において、特許出願ＤＥ２７５０  ５６０Ａ１は、エチレングリコール又は様々なポリエチレングリコールによる没食子酸のエステル化により得られたエステルを記載している。これらのエステルは、コンクリートを含有する複合材料に含まれるガラス繊維の保護材料として使用されている。
【００２６】
もう一つの分野、食品中の脂肪及び油脂の劣化に対して使用するための抗酸化化合物の分野において、ウィータール（Weetall）Ｈ．Ｈ（Applied Biochemisry and Biotechnology  第１１巻、１９８５）は、特定のアルコール及びジオールを使用して没食子酸からエステルを合成することを提唱している。その公開物は、エステル及びジオールエステルが実際にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来タンナーゼを使用して合成された場合、生成物の特別な性質は未だ決定されていないことを明記している。
【００２７】
当該試薬は、凝固誘発活性を有することができる、即ちＰＦ３及びカルシウムの存在下で血漿試料を３７℃でインキュベートした後、ＸＩＩ因子を活性化ＸＩＩａ因子へと活性化することができる内因系凝固経路の接触アクチベーターである。
【００２８】
好ましくは、これらの化合物は、可溶性であるか、又は必要であれば修飾の後に可溶性にさせられてもよい。
【００２９】
従って、本発明は、下記式：
【００３０】
【化３８】
0004563648.tif 000003
【００３１】
〔式中：
・Ａは
【００３２】
【化３９】
0004563648.tif 000004
【００３３】
〔Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；
・Ｒは
【００３４】
【化４０】
0004563648.tif 000005
【００３５】
〔ｍは２、３、４、又は５に等しく、かつｎは１〜１７０の整数である〕；又は
【００３６】
【化４１】
0004563648.tif 000006
【００３７】
〔ＡＡは、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつｒは１〜１０の整数である〕を表す〕を有する化合物を提供する。
【００３８】
前記定義の化合物のうち、特定の実施態様において、本発明は、溶解、特に水性溶液に溶解しうるという利点を有する化合物に関する。好ましくは、それらは完全に可溶性である。
【００３９】
前記のような意味を有するＲにより構成された側鎖は、ｎの値が好ましくは１以上１７０以下であるようなものである。特に、ｎは１〜５０の範囲、例えば１〜３０の範囲、有利には１〜２０の範囲である。
【００４０】
特に好ましくは、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい。
【００４１】
本発明に係る好ましい化合物の第１のファミリーは、以下のように定義される。
【００４２】
【化４２】
0004563648.tif 000007
【００４３】
〔式中：
Ｒは
【００４４】
【化４３】
0004563648.tif 000008
【００４５】
〔ｍは２、３、４、又は５に等しく、かつｎは１〜１７０の整数である〕；又は
【００４６】
【化４４】
0004563648.tif 000009
【００４７】
〔ＡＡは、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつｒは１〜１０の整数である〕を表す〕
【００４８】
本発明の第１の好ましい実施態様において、前記式（Ｉ）又は（II）の１つにおいて、Ｒは
【００４９】
【化４５】
0004563648.tif 000010
【００５０】
〔ｍ及びｎは前記の意味を有する〕を表す。
【００５１】
有利には、本発明に関して、式（II）を有する化合物は、Ｒが−〔−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＯＨ〔ｎは１〜１７０、好ましくは１〜１０の整数である〕を表すようなものである。
【００５２】
この本発明の化合物（II）の好ましい形態は、酸化型ポリエチレングリコールガラートに相当する。
【００５３】
酸化型とは、式（II）中に存在する芳香環の−ＯＨ基の１つの、アルカリ性媒体中での酸化により生じたキノン型である。
【００５４】
さらなる面において、本発明の化合物は、本発明に関して定義された１価又は２価のカチオンと会合した、式（III）のイオン化型に相当する下記式を有するファミリーによっても構成されうる。
【００５５】
【化４６】
0004563648.tif 000011
【００５６】
〔式中：
Ｒは
【００５７】
【化４７】
0004563648.tif 000012
【００５８】
〔ｍは２、３、４、又は５に等しく；かつｎは１〜１７０の整数である〕を表し；かつ
Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンである〕
【００５９】
４位のキノンに加え、この式（III）を有する本発明の化合物の第二の特定のファミリーは、媒体のｐＨがｐＫａよりも高い場合に形成される２個の−ＯＨ官能基（３位及び５位）をイオン化型（ナトリウムアルコラート）で含む。
【００６０】
特に、本発明は、アルカリ性媒体中でカチオンと会合している、塩基型のエチレングリコール又はポリエチレングリコールの酸化型ガラートに関する。
【００６１】
好ましくは、それは、Ｒが前記の意味を有し、かつｍ＝２、かつｎ＝１であるエチレングリコールガラートの塩基型である。
【００６２】
この酸化型エチレンガラートの塩基型は、水溶性である。
【００６３】
使用可能にするためには、得られた組成物のｐＨを、生理学的に許容される値にまで低下させなければならない。生理学的ｐＨにおけるナトリウム型キノン（式IIIに相当）への平衡の移動は、それに即時凝固特性を付与するカチオンを添加することにより、加速され、安定化されうる。
【００６４】
前記の式（Ｉ）を有する化合物のうち、本発明は、有利には、以下のように定義される化合物を提供する。
【００６５】
【化４８】
0004563648.tif 000013
【００６６】
〔式中：
・Ａは
【００６７】
【化４９】
0004563648.tif 000014
【００６８】
〔Ｍq+はカチオンであり、ｑは１又は２に等しく、かつｐはｐ×ｑ＝２となるようなものである〕であり、
・Ｒは−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨである〕
【００６９】
これらの化合物は、それぞれ、酸化型エチレングリコールガラートの酸型、及び酸化型エチレングリコールガラートの塩基型又は塩型である。
【００７０】
塩基性キノン塩型は、３５５nmの波長で検出可能な黄色により特徴付けられ、水性媒体への可溶性のため特に有利である。
【００７１】
前記定義のような本発明の化合物を作製するため、以下の頁において、カチオンＭq+は有利には金属カチオン、特にＭｎ2+又はＣｕ2+又はＣｏ2+である。
【００７２】
又は、それは、アルカリ性媒体中での加熱により、本発明の化合物の調製の過程で供給される対イオンのような非金属性カチオンにより構成されうる。そのような調製法は、以下の頁において定義されており、カチオンＭq+は有利にはＮａ+又はＫ+又はＮＨ4+である。
【００７３】
カチオンの濃度は、正常参照試料について観察される凝固時間の関数として定義されうる。金属カチオンの場合、有利には、この濃度は５〜１５マイクロモル（μM）の範囲、好ましくは約１０μMである。
【００７４】
さらなる特定の実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【００７５】
【化５０】
0004563648.tif 000015
【００７６】
〔式中：
・Ａは下記式：
【００７７】
【化５１】
0004563648.tif 000016
【００７８】
〔式中、Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；
・Ｒは−〔−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−〕n−ＮＨ2〔ｎは１〜１７０の整数である〕を表す〕を有する化合物のファミリーを提供する。
【００７９】
特に、Ｒの定義に関して、ｎは１〜５０の範囲、例えば１〜３０の範囲、有利には１〜２０である。
【００８０】
ポリエチレンジアミンガラートの好ましい型は、芳香環上の−ＯＨ基のうちの１つの酸化により生じたキノン型である。それは、下記式：
【００８１】
【化５２】
0004563648.tif 000017
【００８２】
〔式中、ｎは１〜１７０の整数、好ましくは１〜５０の範囲、例えば１〜３０の範囲、有利には１〜２０の範囲である〕に相当する。
【００８３】
前記式中、ｎは、特に好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい。
【００８４】
有利には、それは、エチレンジアミンガラート（ｎ＝１）である。
【００８５】
本発明の化合物は、１価又は２価のカチオン、特に金属カチオンと会合した型で存在してもよい。これらの化合物は、下記式を有する。
【００８６】
【化５３】
0004563648.tif 000018
【００８７】
〔式中、
・ｎは１〜１７０の整数であり、
・Ｍq+はカチオンであり、ｑは１又は２に等しく、かつｐはｐ×ｑ＝２となるようなものである〕
【００８８】
特に、ｎは１〜５０の範囲、例えば１〜３０の範囲、有利には１〜２０の範囲である。
【００８９】
特に好ましくは、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい。
【００９０】
第３の実施態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【００９１】
【化５４】
0004563648.tif 000019
【００９２】
〔式中：
・Ａは下記式：
【００９３】
【化５５】
0004563648.tif 000020
【００９４】
〔Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択され；
・Ｒはアミノ酸残基又はペプチドである〕を有することを特徴とする化合物を提供する。
【００９５】
好ましくは、本発明の最初の２つの実施態様の場合に示されたように、本発明の化合物は、芳香環上の−ＯＨ基のうちの１つの酸化により生じたキノン型：
【００９６】
【化５６】
0004563648.tif 000021
【００９７】
又は１価もしくは２価のカチオンと会合した型：
【００９８】
【化５７】
0004563648.tif 000022
【００９９】
〔Ｍ、ｑ、及びｐは前記と同義である〕で存在する。
【０１００】
前記化合物を作製するための好ましいアミノ酸は、
【０１０１】
【化５８】
0004563648.tif 000023
【０１０２】
であるセリンである。
【０１０３】
この場合、本発明の化合物は、有利には、下記式：
【０１０４】
【化５９】
0004563648.tif 000024
【０１０５】
〔Ｍ、ｑ、及びｐは前記と同義である〕を有する。
【０１０６】
本発明は、同一ファミリーもしくは同一グループの化合物であってもよいし、又は反対に前記定義のもののうち異なるファミリーもしくはグループに属する化合物であってもよい、前記のものより選択された複数の化合物の混合物、特に少なくとも２個の化合物の混合物を含むことを特徴とする組成物も提供する。
【０１０７】
特に、組成物は、式：
【０１０８】
【化６０】
0004563648.tif 000025
【０１０９】
を有する少なくとも２種の化合物（これらの化合物は、Ａ基に関して同一であっても又は異なっていてもよく、かつＲ基に関して同一であっても又は異なっていてもよく、Ａ及びＲは前記と同義である）を含むことを特徴とする。
【０１１０】
本発明は、好ましくは、下記式：
【０１１１】
【化６１】
0004563648.tif 000026
【０１１２】
〔Ｍ、ｑ、及びｐは前記と同義である〕を有する、それぞれ酸化型エチレングリコールガラート（ＥＧＧｏｘ）の酸型及び塩基型を構成する化合物（IV）及び（Ｖ）の混合物を含むことを特徴とする組成物に関する。
【０１１３】
従って、この組成物は、アルカリ性媒体中で加熱された場合、又は金属カチオンの存在下に置かれた場合に、エチレングリコールガラートから得られるケト−エノール平衡の生成物に相当する酸化型エチレングリコールガラートの酸型及び塩基型の混合物を含む。
【０１１４】
酸化型エチレングリコールガラートの酸型と塩基型との平衡は、反応条件を調整することにより、特にｐＨ、又は反応媒体中に存在するカチオンの濃度を変化することにより、移動させられうる。
【０１１５】
有利には、定義されたような組成物は、溶液、好ましくは水性溶液であることを特徴とする。
【０１１６】
特定の面において、上記の定義に関して、本発明は、式（Ｖ）を有する塩基型の酸化型エチレングリコールガラートが優勢である組成物に関する。
【０１１７】
この水溶性塩基型は、内因系凝固、特に内因系凝固の診査のためのin vitroテストの実施のための活性化組成物の構成に関して、全く有利な特性を有する。
【０１１８】
本発明の特定の実施態様において、前記定義のうちの１つを有する組成物は、生理学的に許容されるアルカリ性ｐＨを有する。このｐＨは、例えば緩衝分子：ＭＯＰＳ（（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）又はＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−グリシン）の存在下で、ＥＧＧを酸化した後に調整される。有利には、ＭＯＰＳ分子が選択される。
【０１１９】
本発明のさらなる実施態様において、組成物は、ケト−エノール平衡により生成した、式：
【０１２０】
【化６２】
0004563648.tif 000027
【０１２１】
〔Ｍ、ｑ、及びｐは前記と同義である〕を有する、ガラートの異なる型の混合物を含むことを特徴とする。
【０１２２】
没食子酸エステルのエノラートの型のうちのいずれかの存在は、反応条件に依存し、従って、ケト−エノール平衡は、生成したガラート型のうちの１つがより多く又はより少なく得られるよう移動させられうる。
【０１２３】
本発明に関して、式（Ｖ）を有する酸化型ガラートの塩基型の存在が好都合である傾向が存在する。
【０１２４】
本発明の好ましい化合物及び組成物は、
・没食子酸をエチレングリコールでエステル化し、下記式：
【０１２５】
【化６３】
0004563648.tif 000028
【０１２６】
を有するエチレングリコールガラート（ＥＧＧ）により構成された反応生成物の１つを回収する工程、
・ＥＧＧをアルカリ性媒体と接触させること、及び７０〜９０℃の範囲の温度に加熱することによりケト−エノール平衡を移動させる工程を含む方法の実施の結果としても定義されうる。
【０１２７】
ケト−エノール平衡形成反応は、有利には、８０℃で２４時間実施される。
【０１２８】
前記方法を使用した調製は、酸化型へと移動していてもよい３つのガラート型の混合物をもたらす。
【０１２９】
好ましくは、得られた組成物は、方法が、
・ｐＨを調整することにより、得られたケト−エノール平衡を安定化する工程；・アルカリ性ｐＨにおいて溶液中の式（IV）及び（Ｖ）を有する化合物を回収する工程をさらに含むことを特徴とする。
【０１３０】
酸化型ＥＧＧは、酸化型エチレングリコールガラートの塩基型へとケト−エノール平衡を移動させるため、水酸化ナトリウム、特に過剰の水酸化ナトリウムの存在下で形成される。熱処理は、７０〜９０℃の範囲の温度、好ましくは８０℃の温度で２４時間実施される。
【０１３１】
溶液のｐＨはアルカリ性ｐＨであり、水酸化ナトリウムの作用は、得られたケト−エノール平衡の安定化に寄与する緩衝剤を添加することにより停止させられうる。特に好ましくは、本発明の組成物のｐＨは、７．６〜７．８の範囲である。
【０１３２】
添加される緩衝剤は、例えばＭＯＰＳ緩衝剤又はＴＲＩＳ緩衝剤である。
【０１３３】
組成物は、１００〜１０００μMの範囲の濃度で本発明の化合物を含有している。
【０１３４】
本発明に関して定義された組成物及び化合物は、血漿試料と接触した際に内因系凝固を活性化することができる；換言すると、約３７℃の温度でＰＦ３及びカルシウムの存在下で血漿試料と接触させられインキュベートされた後に、ＸＩＩ因子をＸＩＩａ因子へと活性化することができる。
【０１３５】
本発明は、その試薬の中に前記定義のような化合物又は組成物を含む、血液試料中の内因系凝固のin vitro検査のため使用される試薬の系にも関する。
【０１３６】
本発明の好ましい試薬は、式：
【０１３７】
【化６４】
0004563648.tif 000029
【０１３８】
〔Ｍ、ｑ、及びｐは前記と同義であり；
Ｒは
【０１３９】
【化６５】
0004563648.tif 000030
【０１４０】
〔ｍは２、３、４、又は５であり、かつｎは１〜１７０の整数である〕；又は
−ＡＡ1−ＡＡ2−．．．．．．．．．．−ＡＡr
〔ＡＡは、天然又は非天然のアミノ酸であり、ｒは１〜１０の整数である〕を表す〕を有する、活性型の没食子酸の塩（没食子酸塩）を含む。
【０１４１】
特に、Ｒの定義に関して、ｎは１〜５０の範囲、例えば１〜３０の範囲、有利には１〜２０の範囲である。
【０１４２】
特に好ましくは、前記式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい。
【０１４３】
本発明の化合物の濃度の決定は、ＡＰＴＴ系においては、健康被験者からの血漿に関して予想された凝固時間が一般的には２８〜４０秒であるという事実を考慮に入れる。これに関して、本発明の化合物、及び凝固試験に利用される他の成分の濃度は、健康血漿からの試料に関する所望の凝固時間から定義されうる。特に、本発明の化合物の濃度は、１００〜１０００μMでありうる。
【０１４４】
試薬の主成分の濃度の最適化は、少なくとも３０人の健康被験者からの一連の血漿試料に関して、この区間内の凝固時間を与えることを目的とされる。
【０１４５】
さらに、ＡＰＴＴ試薬の活性要素に関する生化学的パラメータの最適化は、時間を延長させ、それによりＡＰＴＴテストに明らかとされるある種の障害のための検出感度を調整することを可能にしうる。従って、例えば、ループス性抗凝固因子症候群の場合には、健康参照被験者と比較して少なくとも２０％の時間の延長が考えられる。未分画ヘパリン抗凝固薬により処置された被験者からの血漿については、考えられる時間の延長は、参照時間の１．５〜３．０倍の範囲の比率である。Ａ型及びＢ型の血友病については、可能な限り高い感度が必要とされ、大きな時間の延長が考えられる。
【０１４６】
好ましくは、そのように構成された試薬は、活性化されたエチレングリコールガラートを含む。その活性は、得られたケト−エノール平衡及び生理学的に許容されるｐＨにおけるその安定化によって生じる。
【０１４７】
本発明の特定の実施態様において、記載された組成物又は試薬系の中のガラート、特にエチレングリコールガラートの濃度は、有利には１００〜１０００μMの範囲、好ましくは１００μMである。
【０１４８】
本発明は、内因系凝固の診査のための、特にＡＰＴＴテストの実施のための試薬の調製のための、本発明の化合物又は組成物の応答の感度に対する変調活性を有する成分と会合した、前記定義の任意の化合物又は組成物にも関する。
【０１４９】
感度の変調は、ループス性抗凝固因子の型の病理に罹患した患者、又は、例えば未分画ヘパリン抗凝固薬に基づく抗凝固物質により処置された対象からの血漿の試料において観察される凝固時間の延長の減衰からなりうる。
【０１５０】
又は、この感度の変調は、非病理学的血漿試料において測定される凝固時間の減少からなりうる。
【０１５１】
本発明の化合物又は組成物を用いて調製された試薬の感度の変調に適したそのような成分は、ポリアミノ酸、特に置換されたポリアミノ酸、特に部分的に置換されたものであり、その置換はスクシニル（−−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２  ＣＯＯＨ）基又はグルタリル（−−ＣＯ−（ＣＨ２）３  ＣＯ）基で置換されたアミノ基に関するものである。
【０１５２】
置換は、置換されたポリアミノ酸がもはや感度に対する変調効果を達成することができないような条件で、最初の成分の空間的配置及び／又は安定性に影響を与えるものであってはならない。
【０１５３】
これらの理由から、完全に置換されたポリアミノ酸は、演繹的に便利ではないであろう。
【０１５４】
本発明の好ましい実施態様によると、モジュレーター成分は、置換されたポリリジン（Ｄ−ポリリジン又はＬ−ポリリジン又はそれらの混合物のいずれか）、特にスクシニル化ポリリジンであり、例えば、それは置換されたＬ−ポリリジン、有利にはスクシニル化Ｌ−ポリリジンである。本発明者らは、特に、ＳＩＧＮＭＡカタログ（２００１〜２００２）にて入手可能なスクシニル化Ｌ−ポリリジンを使用した。グルタリル化ポリリジンも使用されうる。
【０１５５】
有利には、２００００〜３０００００Ｄａの範囲、好ましくは５００００〜３０００００Ｄａの範囲の分子量を有するスクシニル化Ｌ−ポリリジンが使用されうる。
【０１５６】
ＡＰＴＴテストを実施するために調製された試薬の中のモジュレーター成分の濃度、特にスクシニル化Ｌ−ポリリジン（ＳＩＧＭＡ）の濃度は、１０〜１００μg/mlの範囲、好ましくは５０〜１００μg/mlの範囲である。
【０１５７】
置換されたポリアミノ酸、特にスクシニル化ポリリジンは、ＡＰＴＴのような内因系凝固の診査のためのテストにおいて使用するための試薬の調製中の任意の時点で添加されうる。
【０１５８】
内因系凝固の接触アクチベーターに加え、本発明の試薬系は、血小板膜リン脂質の代用物を含む。この代用物は、哺乳動物の脳より抽出されたリン脂質の懸濁液、セファリンでありうる。
【０１５９】
本発明は、他の試薬とは別に、内因系経路に関与する因子の活性化を誘発するためのＣａ2+イオンも含む試薬系にも関する。
【０１６０】
ＡＰＴＴテストを実施するために使用される本発明の試薬、そして適宜、他の成分は、キットへと配置されうる。
【０１６１】
凝固、特に内因系凝固を診査するための本発明の化合物、組成物、又は試薬は、血液試料、特に血漿試料の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定するために使用されうる。これに関して、有利には、血小板枯渇血漿が使用される。
【０１６２】
この測定に関して、このテストを実施するための通常の条件が、特に試料の調製に関して編集された。
【０１６３】
血漿試料は、最初に、試料がもはや凝固し得ないよう、例えば試料中に含まれるＣａ2+イオンを複合体化するためクエン酸塩で処置されうる。次いで、試料は凝固アクチベーターとしての本発明の化合物又は組成物、及びリン脂質代用物と共にインキュベートされる。次いで、凝固を誘発するため、Ｃａ2+イオンが、複合体化されたものと等価な量、添加される。
【０１６４】
本発明の化合物又は組成物の活性は、ｐＨが生理学的に許容される値であることを必要とする。
【０１６５】
本発明の化合物、組成物、又は試薬は、全血の凝固時間又は血漿の凝固時間を決定するためにも使用されうる。
【０１６６】
従って、本発明は、内因系凝固経路に関与する凝固因子を検査するための試薬の系の調製のための、前記のような化合物又は組成物の使用を可能にする。関連する因子は、主にＸＩＩ因子、ＸＩ因子、ＩＸ因子、及びＶＩＩＩ因子である。
【０１６７】
これに関して、本発明は、例えばウィレヴランド病、血友病Ａ及びＢに関係した異状の検出、又は抗凝固因子の検出に関する。これらの異状は、通常は２０〜４０秒である正常値を超えたＡＰＴＴ時間をもたらす。
【０１６８】
従って、本発明は、
・内因系凝固経路の活性化を可能にする条件の下で、血小板膜リン脂質の代用物の存在下で、血小板枯渇血漿試料を、本発明に係る化合物又は組成物と接触させる工程；
・血漿試料中の複合体化されたイオンの量と等価な量のＣａ2+イオンを添加する工程；
・フィブリノーゲンをフィブリンへと変換するために必要な時間を測定する工程を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定するための方法にも関する。
【０１６９】
特に、前記方法の実施に関して、血漿試料は、血小板枯渇血漿により構成され、凝固アクチベーターは、３７℃で約２〜５分間、血漿と共にインキュベートされる。リン脂質膜代用物は、反応の開始から添加されてもよいし、又はアクチベーターと混合されてもよいし、又は反応の途中で個別に添加されてもよい。
【０１７０】
次いで、例えば塩化カルシウムの形態のカルシウムイオンが、２０〜２５mMの範囲の濃度で添加される。次いで、フィブリン形成のために必要な時間が測定される。
【０１７１】
正常凝固状況に相当する時間（即ち、２０〜４０秒）を超えている場合、測定された時間は、内因系凝固経路のパラメータの１つが、欠如も含め、異常な量で存在すること、又は抗凝固化合物がテスト血漿中に存在することを示す。
【０１７２】
テスト血漿が内因系凝固経路の因子を異常な量で含む場合には、本発明は、その因子が枯渇しており、他の全てのパラメータを過剰に導入されている系を使用して、当該因子の定量分析を実施することを可能にしうる。この系においては、研究される血漿の添加の後、アッセイされる因子のみが限定された量で存在する。
【０１７３】
本発明は、下記式：
【０１７４】
【化６６】
0004563648.tif 000031
【０１７５】
〔式中：
・Ａは、下記式
【０１７６】
【化６７】
0004563648.tif 000032
【０１７７】
〔Ｍq+は、ｑが１又は２に等しく、かつｐがｐ×ｑ＝２となるようなものであるカチオンを表す〕より選択された１個以上の化合物を表し；
・Ｒは
【０１７８】
【化６８】
0004563648.tif 000033
【０１７９】
〔ｍは２、３、４、又は５であり、かつｎは１〜１７０の整数である〕；又は
【０１８０】
【化６９】
0004563648.tif 000034
【０１８１】
〔ＡＡは、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつｒは１〜１０の整数である〕を表す〕を有する化合物を調製するための方法にも関し、該方法は、
・少なくとも１個のアルコール官能基を含有する化合物の存在下で没食子酸をエステル化するか、又は少なくとも１個のアミン官能基を含有する化合物の存在下で没食子酸をアミド化する工程；
・得られた没食子酸誘導体を、ＯＨ−イオンと接触させ、式：
【０１８２】
【化７０】
0004563648.tif 000035
【０１８３】
を形成させる工程；
・式
【０１８４】
【化７１】
0004563648.tif 000036
【０１８５】
を有する複合体の形成を可能にする条件の下で、金属カチオンＭq+（ｑは１又は２に等しい）を添加する工程；
・ＭＯＰＳ又はＴＲＩＣＩＮＥのような緩衝剤を添加することにより、生理学的に許容されるｐＨにおいて、化合物（II）と（III）との間で得られた平衡を安定化する工程；
・得られた溶液を回収する工程を含む。
【０１８６】
この方法は、好ましくは、エチレングリコールガラートが形成されるようエチレングリコールの存在下でエステル化が実施されるようなものであり、それにより、反応が完了したときに、特に酸化型エチレングリコールガラートの酸型及び塩基型を含むケト−エノール平衡の生成物の回収が可能となり、必要であれば残りの量のエチレングリコールガラートの回収も可能となる。
【０１８７】
方法の定義は、本発明の化合物又は組成物の好ましいファミリー又は基の定義を包含する。
【０１８８】
本発明の特定の実施態様において、式（Ｖ）を有する酸化型エチレングリコールガラートの塩基型を主に回収することが望ましいかもしれず、このため、この塩基型へと平衡を移動させることが有利であるかもしれない。
【０１８９】
内因系凝固活性化特定を有する本発明に係る式Ａを有する化合物を調製するためのさらなる方法が本発明者らにより開発された。この方法は、
・没食子酸をエステル化する工程；
・得られた没食子酸エステルを、緩衝溶液中で、アルカリ性ｐＨにおいて、７０〜９０℃の範囲、好ましくは８０℃の温度に、１６〜２４時間の範囲の時間、好ましくは２４時間、加熱する工程；
・溶液中に存在する種々の型の没食子酸エステルを回収する工程を含む。
【０１９０】
本発明のその他の特性及び利点は、本発明の主題の好ましい実施態様及び手段を構成するものである以下の実施例より明らかとなろう。
【０１９１】
実施例１
この実施例においては、多様なカチオンを使用して、本発明に従い作製されたＡＰＴＴ試薬を用いて凝固時間を測定した。種々の型の血漿（正常な血漿、及びＡＰＴＴテストにより明らかにされる疾患を象徴する血漿の両方）を試験した。・ＣＫ−Ｐｒｅｓｔ＝接触アクチベーターがカオリンである参照ＡＰＴＴ試薬；・プールＮ＝健康対象に由来する等量の血漿の混合物；
・ＣＣＮ＝凝固対照正常：対照血漿、正常レベル；
・ＣＣＰ＝凝固対照病理：対照血漿、疾患レベル；
・ヘパリン＝ナトリウム塩又はカルシウム塩の形態の未分画ヘパリンに基づく抗凝固処置を受けている患者からの血漿；
・ループス＝ループス性抗凝固因子症候群を示す患者からの血漿；
・ｄｅｆ．ｆ  ＶＩＩＩｃ＝ｆ  ＶＩＩＩｃ欠陥（血友病Ａ）を示す患者からの血漿。
【０１９２】
測定は、止血装置（ＳＴＡ−Diagnostica Stago）を使用して実施した。
【０１９３】
【表１】
0004563648.tif 000037
【０１９４】
実施例２
次の実施例においては、没食子酸のアミド又はエステルから得られたＡＰＴＴ試薬から、種々の血漿の凝固時間を決定した。
・正常血漿＝健康対象からの等量の血漿のプール；
・ＣＣＮ＝凝固対照正常：対照血漿、正常レベル；
・ＣＣＰ＝凝固対照病理：対照血漿、疾患レベル；
・ヘパリン＝ナトリウム塩又はカルシウム塩の形態の未分画ヘパリンに基づく抗凝固処置を受けている患者の血漿；
・ループス＝ループス性抗凝固因子症候群を示す患者からの血漿；
・ｄｅｆ．ｆ  ＶＩＩＩｃ＝ｆ  ＶＩＩＩｃ欠陥（血友病Ａ）を示す患者からの血漿。
【０１９５】
【表２】
0004563648.tif 000038
【０１９６】
参照試薬ＣＫ−Ｐｒｅｓｔを用いて得られたものに最も近い結果は、エチレングリコールガラートにより得られたものであったことが、この表より分かる。
【０１９７】
実施例３
８０℃で２４時間加熱した後、ｐＨ７．００に緩衝された５００μMのエチレングリコールガラート溶液は、ＡＰＴＴ凝固テストにおいて活性なものとなった。以下の表は、分子の活性化動態を示している。
【０１９８】
エチレングリコールガラート溶液の凝固誘発活性を、アクチベーターがカオリンであるＡＰＴＴ試薬である参照試薬：ＣＫ−ＰＲＥＳＴのものと比較した。凝固時間を測定するために使用した装置は、自動ＳＴＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ止血装置（３０７シリーズ）であった。
【０１９９】
凝固活性の出現と平行して、３５５nmにおいて測定可能な黄色が出現した。
【０２００】
テスト血漿は、品質対照血漿であった。
ＣＣＮ＝凝固対照正常；ＣＣＰ＝凝固対照病理（バッチ番号９８０９０１）。
作製されたＡＰＴＴ試薬＝８０℃で酸化された５００μMエチレングリコールガラート＋５００mMトリシン（ｐＨ７．００）＋セファリン（血小板リン脂質の代用物）。
【０２０１】
【表３】
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【０２０２】
実施例４
生物学的な系においてルーチンに使用されているものより選択された多様な緩衝分子が、妥当な加熱時間（＜４日）で、参照試薬ＣＫ−ＰＲＥＳＴのものと近い有意な凝固誘発活性を生じさせることができた。それらは、以下の分子であった。
・ＴＲＩＣＩＮＥ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン；
・ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；
・ＭＯＰＳ：（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸；
・ＴＲＩＳ：〔トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕。
【０２０３】
ＴＯＲＩＣＩＮＥ緩衝剤及びＭＯＰＳ緩衝剤が、好ましくは使用され、ＴＲＩＳと同様に、エチレングリコールガラートの活性化の過程で沈殿物が出現し、ＨＥＰＥＳ緩衝剤では、比較的長い時間、加熱を実施しなければならない。以下の表は、２つの対照血漿（正常及び病理）、健康ドナーからの１個の血漿プール、及びＡＰＴＴ型凝固系において検出可能な障害を象徴する４個の血漿について得られた性能を示している。
・プールＮ＝複数の正常血漿のプール；
・ＣＣＮ＝凝固対照正常：対照血漿、正常レベル；
・ＣＣＰ＝凝固対照病理：対照血漿、病理学的レベル；
・ＬＡ：ループス性抗凝固因子症候群を示す患者からの血漿；
・Ｈｅｐ＝カルシウム塩の形態の未分画ヘパリンに基づく抗凝固処置を受けている患者からの血漿。０．０９及び０．０３４国際単位／mlという２つのレベルのヘパリン血症を有する２つの血漿を試験した；
・ｄｅｆ．ｆ  ＶＩＩＩｃ＝４０％のＶＩＩＩｃ因子活性を有する血友病Ａからの血漿。
【０２０４】
得られた凝固時間を秒単位で示す。
【０２０５】
４つの緩衝剤で作製された各試薬により得られた応答感度を、患者の血漿について得られた凝固時間を正常プールで得られたもので割ることにより、又は病理学的凝固対照（ＣＣＰ）を正常対照（ＣＣＮ）で割ることにより得られる比率（Ｒ）を計算することにより、客観的なものにした。
【０２０６】
【表４】
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【０２０７】
実施例５
ＡＰＴＴ試薬の使用は、
・正常−異常応答を有する内因系血液凝固経路の一般的な診査；
・内因系凝固系路に関与している凝固因子：ｆＸＩＩ−ＸＩ−ＩＸ−ＶＩＩＩｃの分析的及び定量的な診査という２つの目的を有することができ、
・患者の血漿において、その因子が特異的に枯渇している系を使用して、内因系経路における任意の凝固因子をアッセイすることが可能である。他の全てのパラメータは過剰に導入され、アッセイされる因子のみが限定された量で存在する。その活性は、同一条件下で作製された較正曲線との比較の後に定量可能となる。欠陥のサイズに応じて、凝固時間は、大きく、又は小さく延長される（ＶＩＩＩｃ因子に関する例を参照のこと）。
【０２０８】
【表５】
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【０２０９】
実施例６
ＡＰＴＴ試薬の凝固活性は、２つの活性要素の共同作用を必要とする。
・内因系経路の接触相を活性化する分子。実際、これは、８０℃への加熱により活性化されたエチレングリコールガラートであった。
・血小板膜リン脂質の代用物である、ウサギ脳のクロロホルム抽出により得られたセファリン。
【０２１０】
このように構成されたＡＰＴＴ試薬の最適活性は、エチレングリコールガラート及びセファリンの濃度に依存する。
【０２１１】
下記表は、異なる障害を象徴する血漿、及びいくつかの対照について得られた結果を示す。
【０２１２】
【表６】
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【０２１３】
選択は、１００〜１０００μMの範囲の濃度でなされうる。好ましいのは、１００μMの濃度である。
【０２１４】
最適セファリン濃度の決定
【０２１５】
【表７】
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【０２１６】
実施例７：塩化マンガンの濃度の選択
この実施例においては、塩化マンガンの濃度を変動させ、本発明に従い作製されたＡＰＴＴ試薬を用いて凝固時間を測定した。
【０２１７】
テスト血漿は、品質対照血漿であった。正常レベル及び病理学的レベルという２つのレベルを使用した。
【０２１８】
市販のＣＫ  Ｐｒｅｓｔ試薬を平行してテストし、参照とした。
【０２１９】
【表８】
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【０２２０】
好ましくは、１０μMの濃度が利用される。
【０２２１】
実施例８
様々な病理学的状況において観察される凝固時間の異状のため、ＡＰＴＴ試薬の応答の感度を変調しうることが有利である場合もある。この変調は、異なる製造ロット間でも再現性のある、応答の感度に関する特別な特徴を有する試薬を得ることを目的とする。
【０２２２】
本発明者らは、エチレングリコールガラートを含有するＡＰＴＴ試薬に、スクシニル化Ｌ−ポリリジン（ＳＩＧＭＡ）の添加を行った場合、ループス性抗凝固因子症候群を示す患者、又は未分画ヘパリンに基づく抗凝固薬により処置された患者より得られた血漿について得られうる凝固時間を短縮させることが可能であることを観察した。又、スクシニル化Ｌ−ポリリジンの使用は、正常集団から得られた血漿において測定される凝固時間を減少させることが可能であることも観察された。
【０２２３】
これらの観察は、試薬の感度のレベルを定義するため、アミノ基のレベルでスクシニル基又はグルタリル基による多少の置換を受けたポリアミノ酸の使用によって得られうる。
【０２２４】
本発明の好ましい実施態様の１つは、部分的に置換されたＬ−ポリリジンの使用からなる。下記表は、実施例で使用された様々な対照血漿で得られた結果を要約している。
ＣＣＮ：凝固対照正常
ＣＣＰ：凝固対照病理
プールＮ：複数の正常血漿のプール
ＬＡ：ループス性抗凝固因子症候群を示す患者からの血漿
ヘパリン：未分画ヘパリンに基づく抗凝固処置を受けている患者からの血漿
Ｄｅｆ  ＶＩＩＩ  Ｃ＝４０％のＶＩＩＩ因子活性を有する血友病Ａからの血漿
【０２２５】
【表９】
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【０２２６】
本発明におけるスクシニル化Ｌ−ポリリジンの使用のため、スクシニル化Ｌ−ポリリジンの分子量は、好ましくは５００００〜３０００００Ｄａの範囲であり、この分子量範囲において、濃度は好ましくは５０μg/mlからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＫ−Ｐｒｅｓｔ参照と比較した、ｆＶＩＩＩｃ欠陥に対するＡＰＴＴ−エチレングリコールガラート試薬の感度を示す図である。
【図１】
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