(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物粘膜組織からヘパリンを製造する方法であって、前記方法が、
ａ）粘膜組織にタンパク質分解酵素を加える段階、
ｂ）当該酵素と粘膜組織を周囲温度で２から８時間混合する段階、
ｃ）混合物の温度を５０から７５℃まで上昇させ、当該温度範囲内で１から６時間までの間前記混合物をインキュベートする段階、および
更に、ヘパリンを回収する段階を含む方法。
【請求項２】
段階（ｃ）における５０から７５℃での前記インキュベーション時間が１から４時間である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションの温度を６０から７０℃まで上昇させる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
温度を上昇させた前記インキュベーションの後、混合物を周囲温度まで冷めさせる請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記温度上昇が、８０から１００℃の間の温度の１から３倍の容積の水性溶媒を粘膜組織およびタンパク質分解酵素を含む前記混合物に加えることにより得られる請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記水性溶媒が沸騰水である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記回収段階において、前記混合物中に存在するヘパリンを結合させるために十分な量の陰イオン交換樹脂を、混合物の温度を上げた後に前記混合物に加える、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘパリンの結合した前記陰イオン交換樹脂をふるい分けして当該陰イオン交換樹脂からヘパリンを回収することをさらに含む請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヘパリンの調製に関する。特に、本発明は、ヘパリンの動物組織源中に存在するタンパク質の簡便化された除去方法に関する。
ヘパリンは、αおよびβ（１−４）結合により結合したウロン酸とα−Ｄ−グルコサミンの異なるように硫酸化した残基の交互配列で構成される非常に複雑なグリコサミノグリカンである。一次構造が複雑であるために、ヘパリンは分子量、物理化学的性質、および生物活性に関して非常に不均一な多分散ヘテロ多糖である。
ヘパリンは、静脈血栓症の治療および予防のための抗凝血薬および抗血栓剤として、既に長期にわたって使用されてきた。ヘパリンは種々の動物組織中に存在しており、これらから単離して得ることができる。現在、これらの目的で使用されるヘパリンの大部分は、ブタ腸粘膜から単離されている。この単離過程には、粘膜の加水分解と、その後のヘパリンの抽出が含まれる。
米国特許第５，６０７，８４０号は本明細書に引用するが、ここでは粘膜組織の加水分解方法が記載されている。この方法は、哺乳動物粘膜とタンパク質分解酵素を含む水性混合物を温度約５５℃で加水分解して、ポリアニオンを陰イオン交換樹脂に吸着させ、続いて樹脂からこのアニオンを回収し、タンパク質加水分解産物を消化された水溶液から回収することを含む。粘膜原材料を安定化させ細菌の増殖を防止するために、脱酸素剤または殺菌剤の形態の塩が溶液に添加される。
粘膜含有水性媒体中のヘパリン含有率は非常に低く、そのため大量の粘膜組織を処理しなければならない。従って、経済的な理由により、加水分解工程は、５０ｍ3を超える反応容器で行われる。反応時間中は、温度は２４時間を超えて一定に保たれ、混合物は高性能装置を用いて激しく撹拌される。
通常ヘパリン抽出プラントは、粘膜が収集される屠殺場から近距離にはなく、長距離の輸送が必要となる。特に離れた地域では、このために製造プラントに送られる原材料は低品質となり、費用も増大する。
本発明は、粘膜組織からヘパリンを単離するための新規で簡便な方法を提供する。哺乳動物粘膜組織を含む水性混合物中のタンパク質は、タンパク質分解酵素を加えて５０〜７５℃の温度で約６時間までの時間で消化することもできることを発見した。周囲温度での簡単な「予備加水分解」段階を任意に含むことができる。これによってタンパク質分解の効率が顕著に増大することが明らかとなった。温度を上昇させた後、加水分解を、好ましくはポリアニオン吸着物質の存在下５０℃より低温で続けることができる。消化は、中程度の容量の容器で行うことができる。
このように、本発明による方法は、粘膜の温度を約５０〜７５℃まで上昇させ、タンパク質分解酵素の存在下で粘膜を約６時間までの時間この温度範囲内でインキュベートする段階を含む。
本発明の方法は、比較的小規模で実施可能であるという利点がある。本発明の方法は、粘膜原材料が製造される場所での実施に非常に適しており、従って原材料の輸送が不用である。さらに、特殊な技術は必要としない。
本発明によると、本発明の方法は、
ａ）温度を上昇させる前、容器内の混合物を周囲温度で約８時間までの時間インキュベートする段階、
ｂ）温度を上昇させた後、溶液を周囲温度まで冷却しながらさらにインキュベートする段階、
というインキュベーション段階の一方または両方を含むこともできる。
５０〜７５℃でのインキュベーション時間は、好ましくは４時間未満である。好ましくはインキュベーション時間は１時間を超える。温度は、好ましくは約６０〜７０℃まで上昇させる。
温度は、粘膜水溶液を含む容器を直接加熱することで容易に上昇させることができる。例えば、通常のガス炎により急速に約６０〜７０℃の温度に達することができるが、例えば蒸気を加えることによってもできる。こうして得た温度は、中程度に加熱することで数時間維持することができる。別の方法としては、所望の温度に達してすぐに外部からの加熱を停止して、容器内の混合物温度を徐々に下げることができる。徐々に温度が下がるので、混合物は５０℃を超える温度を数時間維持する。従って、まず５０℃を超える温度でタンパク質の加水分解が起こる。外部からの加熱を停止した後、温度が低下し、より低い温度で加水分解が続く。低下した温度でのインキュベーション時間の長さに制限はないが、インキュベーション時間が２４時間未満であることが好ましく、終夜インキュベーションを行うことがより好ましい。周囲温度で長時間インキュベーションを続けることは必要条件ではないが、ヘパリン収率に影響することが示された。同様に周囲温度での「予備インキュベーション」段階が、ヘパリン収率を向上させることが示された。
反応容器は、例えば鉄製容器であってもよいが、特定の必要条件はない。
別の方法では、１〜３倍の容積の、８０〜１００℃の間の温度の溶液を加えて、温度を上昇させることができる。好ましくは水が使用されるが、希釈塩溶液を使用することもできる。好ましくは、水の温度は沸点である。体積が増加するために、熱容量が増大する。従って、温度は、所望の温度で十分長時間維持することができ、一方同時に冷却工程をゆっくりと行うことができる。水を加えることによるさらなる利点は、溶液の粘度が減少し、その結果ヘパリンの抽出に重要な吸着剤−ヘパリン複合体のふるい分けが行いやすくなることである。直接加熱が必要でなければ、他の材料の容器、例えばプラスチック缶を使用することができる。
本発明の手順を実施するための好都合な方法は、作業日に粘膜を収集して、容器に原材料を保管する間にタンパク質分解酵素を加えて加水分解を開始することである。その日の終りに、温度を５０〜７５℃まで上昇させ、任意にその温度で数時間維持して、次に徐々に周囲温度まで下げながら終夜インキュベートすることができる。
均一な溶液を得て吸着剤とヘパリン含有溶液との接触をよくするために、加水分解工程の間に混合物を攪拌することが好ましい
粘膜含有溶液は、動物組織を水に分散させることで得ることができる。組織は、例えば牛肉、イヌ、ブタ、およびヒツジから得ることができる。組織には、内皮または粘膜成分が含まれている。ヘパリンは、例えば、種々の動物の肺、腸、皮膚、および肝臓に存在する。好ましくは、豚由来の腸粘膜が使用される。
タンパク質分解活性を有するものであれば、工程には非常に多種多様の酵素を使用することができる。好適な酵素は、当技術分野において公知であり、例えば、微生物のプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシンが挙げられる。アルカリ加水分解への使用に適した酵素は、商標マキサターゼ（ｍａｘａｔａｓｅ）（登録商標）として市販されている。酵素の基質に対する割合は、通常約０．０２〜０．２％である。粘膜組織溶液に通常加えられる防腐剤は、本発明による方法においても加えることができる。好ましくは防腐剤としてメタ重亜硫酸ナトリウムが使用されるが、例えばプロピオン酸カルシウムまたはフェノールなどの他の防腐剤でも十分である。加えられる重亜硫酸塩量は、約０．５〜５ｋｇ／粘膜１００ｌである。防腐剤は、粘膜組織の収集の間に加えることが最も好ましい。
ｐＨは、アルカリ性試薬を用いてｐＨ７〜９に調整することができる。通常は水酸化ナトリウムが、約０．８〜１．２ｋｇ／粘膜１００ｌの量で加えられる。最も一般的に使用されるタンパク質分解酵素は、このｐＨにおいて最適の活性を示す。調整は、「予備加水分解」段階、およびより高温でのインキュベーション段階中に行うこともできる。
ヘパリンの単離方法を提供することも本発明の目的の１つである。本発明の加水分解方法は、ヘパリンの単離において重要である。加水分解溶液に存在するヘパリンを結合させるために、１つ以上のインキュベーション段階中に吸着剤を混合物に加えると、ヘパリンを加水分解産物から抽出することができる。好ましくは、吸着剤は、より高温でのインキュベーションの開始時に加えられる。
好ましい吸着剤は陰イオン交換樹脂であり、粘膜溶液中に存在するポリイオンを結合させるために十分である量が加えられる。このような陰イオン交換樹脂は、市販されている。通常は、粘膜１００ｌ当り２ｌの量が加えられる。ヘパリンに特異的な親和性吸着剤も、消化溶液からのヘパリンの抽出に使用することができる。
加水分解産物の全塩濃度は、ポリアニオンがイオン交換樹脂と結合する効率のために重要である樹脂によるほぼ定量的な取り込みが保証される範囲内で選択されるべきであり、通常は０．１〜０．５Ｍで変化する。粘膜に存在する塩の他に、通常は防腐剤およびアルカリ金属塩またはアンモニウム塩も加水分解工程中に加えられる。
加水分解工程の後で、吸着剤がふるい分けられる。次に吸着したヘパリンを高濃度溶液で溶離させて、さらにヘパリンを処理する。従って、ヘパリンの吸着した吸着剤をふるい分けし、吸着剤からヘパリンを溶離させるさらなる段階を含むヘパリンの単離方法を提供することも、本発明の目的の１つである。
ヘパリンの最適な回収を確実にするためには、溶離に使用する塩溶液が、ヘパリンを吸着剤からほぼ完全に放出させるために十分高いイオン強度をもつことが望ましい。ヘパリン−陰イオン交換樹脂複合体からヘパリンを回収する方法の１つは、２〜４Ｍの濃度のＮａＣｌで溶離させることである。
手順が容易に実施でき、最小限の装置のみが加水分解を行うために必要であるため、本発明による手順は、吸着されない材料すなわち粘膜のその生産される場所での処理を可能にすることが明らかであろう。従って、本発明による方法は、生産基盤の劣る低技術環境でさえも実施可能である。
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、決して本発明の範囲を制限するものと解釈するべきものではない。
実施例
実施例１
ブタ粘膜２５０ｋｇを０．５％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させたものに、マキサターゼ（登録商標）２００ｇを加えて、その混合物を周囲温度で撹拌した。４時間後、ガス炎ヒーターを用いて粘膜を６９℃で約７０分間加熱した。ＮａＯＨ（１５００ｇ）を加えるとｐＨが７．３となり、次いで陰イオン交換体３．５ｌを加えた。次に混合物を撹拌しながら、終夜放冷した。イオン交換体の分離を容易にするために、次の日イオン交換体をふるい分けする前に混合物を加熱した。イオン交換体を３．５％塩溶液で洗浄して、１４％塩溶液で溶離させた。溶離したヘパリンを、メタノールで沈殿させた。ヘパリンの収率は、溶離液中３６１００Ｕ／ｋｇ粘膜、沈殿物中３４３００Ｕ／ｋｇであった。活性および品質は、標準的方法で得た未精製ヘパリンと同程度であった。
実施例２
ブタ粘膜１００ｋｇを１％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させたものに、マキサターゼ（登録商標）８０ｇを加えて、その混合物を周囲温度で撹拌した。２時間後、沸騰水１２０ｌを約１０分間かけて加えることで粘膜を６５℃まで加熱した。３３％ＮａＯＨ溶液６３０ｍｌを加えてｐＨを変化させ（測定値７．３）、陰イオン交換体３．５ｌを加えた。開始温度は６５℃で、１時間後温度は６１℃となり、２時間後５６℃、３時間後５２℃となった。混合物を終夜放冷した。イオン交換体を２８℃の温度でふるい分けして、洗浄したイオン交換体を溶離させた。ヘパリンの収率は、溶離液中３０５００Ｕ／ｋｇ粘膜、沈殿物中２６４００Ｕ／ｋｇであった。活性および品質は、標準的方法で得た未精製ヘパリンと同程度であった。
実施例３
０．５％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させた粘膜４７．５ｋｇに、マキサターゼ（登録商標）８０ｇを撹拌しながら温度３０℃で加えた。４時間後、別の粘膜５５．５ｋｇを加えて、その混合物を周囲温度（２６℃）でさらに２時間撹拌した。次に、混合物に熱蒸気を送り込むことで、混合物を４０分間で６５℃まで加熱した。５５０ｇのＮａＯＨを加えてｐＨを７．２に変化させ、１時間撹拌後、イオン交換体１ｌを加えた。開始温度は６５℃で、１時間後温度は６２℃になり、２時間後５３℃になった。混合物を終夜放冷すると、温度は２７℃になった。ヘパリンの収率は、溶離液中４００００Ｕ／ｋｇ、沈殿物中３８７００Ｕ／ｋｇであった。
実施例４
断熱フラスコに入れたブタ粘膜３ｋｇを０．５％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させたものに、マキサターゼ（登録商標）２．３ｇを加えて、その混合物を周囲温度で撹拌した。３０℃で５．５時間後、沸騰水５．４ｌを加えて粘膜を６４℃に加熱した。３３％ＮａＯＨ溶液３５ｍｌを加えるとｐＨが７．６になり、さらに陰イオン交換体１１０ｍｌを加えた。次に、混合物を放冷した。約１６時間後、温度は４１℃となり、イオン交換体をふるい分けした。溶離液中のヘパリン収率は、３２２００Ｕ／ｋｇ粘膜であった。活性および質は、標準的方法で得た未精製ヘパリンと同程度であった。
実施例５
ブタ粘膜１１５ｋｇを１％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化したものに、マキサターゼ（登録商標）８８ｇを加えて、その混合物を周囲温度で撹拌した。２時間後、沸騰水１３３ｌを１０分間かけて加えて粘膜を６５℃まで加熱した。８８０ｇのＮａＯＨを加えてｐＨを変化させ（ｐＨ７．７５）、陰イオン交換体４ｌを加えた。引き続きマキサターゼ（登録商標）１０８ｇを加えた。開始温度は６５℃で、１時間後温度は６０℃となり、２時間後５７℃、３時間後５４℃となった。３時間後、イオン交換体をふるい分けした。洗浄したイオン交換体を溶離させて、ヘパリンを沈殿させた。ヘパリン溶離液には、２０５００Ｕ／ｋｇ粘膜が含まれ、沈殿物には１７５６５Ｕ／ｋｇ含まれていた。活性および品質は、標準的方法で得た未精製ヘパリンと同程度であった。
実施例６
ブタ粘膜１００ｋｇを１％メタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させたものに、マキサターゼ（登録商標）を加えて、その混合物を周囲温度で撹拌した。次に粘膜を、ガス炎ヒーターを使用して６０分間かけて６８℃まで加熱した。ＮａＯＨを加えるとｐＨが７．２になった。その後陰イオン交換体２．１ｌを加えた。次にその混合物を、温度が６０℃より低くなるまで放冷し、次にさらに加熱して６０℃より高温を維持するようにした。３時間後、イオン交換体をふるい分けした。イオン交換体を洗浄して、加工プラントに輸送するため５℃で貯蔵した。