(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞に、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする遺伝子を有する遺伝子発現カセットを導入してなる形質転換体であって、
前記宿主細胞は、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子、グルコース−６−リン酸  １−デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子、ホスホグルコムターゼをコードするｐｇｍ遺伝子及び定常期におけるタンパク質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子タンパク質をコードするｒｍｆ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子が破壊された宿主細胞である、前記形質転換体。
【請求項２】
前記宿主細胞は、大腸菌種、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・サチリス  Ｍ１６８由来株、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリキア・コリ  Ｋ１２由来株及びゲオバシラス・ステアロサーモフィラスからなる群から選択された宿主細胞である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の形質転換体と、炭素源とを接触させる工程を含む、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【請求項４】
前記炭素源は、Ｄ−グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか及び廃糖蜜並びにＤ−グルコースを得ることが可能なバイオマスからなる群から選択された少なくとも１種類の炭素源であることを特徴とする請求項３に記載の２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の形質転換体と、炭素源とを接触させて２−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物を得る工程と、
該組成物を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂とを有する混床式又は二床式カラムで処理する工程と、
を含む、２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
【請求項６】
前記有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂は、酢酸イオン型陰イオン交換樹脂であることを特徴とする請求項５に記載の２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
【請求項７】
２−デオキシ−シロ−イノソースを、トリアルコキシメタンと反応させて、２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを得る工程と、
該２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを、酸の存在下で加水分解する工程と、
をさらに含む、請求項５または６に記載の２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
【請求項８】
前記トリアルコキシメタンは、トリメトキシメタンである、請求項７に記載の２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭素６員環化合物は、従来石油化学の分野において、石油を原料として生産されてきた。一方、ブチロシン生産菌バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）において、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）を基質として、炭素６員環化合物である２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩともいう）を合成する反応を触媒する、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（ＤＯＩ合成酵素）が見い出された（図１、特許文献１）。【０００３】
ＤＯＩ合成酵素は、２−デオキシストレプタミンをアグリコンとして含有するアミノグリコシド抗生物質の生合成に関与する酵素であり、その生成物であるＤＯＩは、医薬原料や化学工業資源として有用な物質である。ＤＯＩを化学的に合成する方法は、多段階の反応と有害又は高価な金属とを使用するのに対し、ＤＯＩ合成酵素を用いれば、効率的に短工程でＤＯＩを生産することができる。これまでに、ＤＯＩ合成酵素を大腸菌に発現させることによって得られる組換えＤＯＩ合成酵素を用いて、グルコース−６−リン酸から短工程でＤＯＩを生産する方法が確立されている（特許文献１）。さらに、ＤＯＩは、グルコースにヘキソキナーゼとＤＯＩ合成酵素とを作用させる二段階の酵素反応か、グルコース−６−リン酸にＤＯＩ合成酵素を作用させる一段階の酵素反応で合成できることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。また、酵素反応液を濃縮して酢酸溶液としてヨウ化水素を作用させることにより、ＤＯＩを精製することなくカテコールに変換できることも報告されている（特許文献１）。【０００４】
しかしながら、ＤＯＩ合成酵素を組込んだ大腸菌を用いた、バイオマス由来のＤ−グルコースを原料とする、発酵によるＤＯＩの合成方法は、課題として提起されていなかった。【０００５】
また、現在までに、酵素反応によりＤＯＩを合成して、反応組成物のままのＤＯＩを変換することは、報告されているが、ＤＯＩそのものを精製・単離する方法は未だ報告されていない。更に、酵素反応液中より多種多量の培地成分、炭素源であるグルコースの他、ペプトンなどに由来するアミノ酸類や、各種の金属イオン類が含まれている微生物培養液中からＤＯＩを精製することに関する情報は、全く無い。すなわち、酵素反応液及び微生物培養液等の夾雑物存在下からＤＯＩを精製する報告はなく、況や工業的に応用可能な精製方法については全く確立されていないのが現状である。【０００６】
微生物培養液等の夾雑物存在下からＤＯＩを精製するには、実験室的にはＨＰＬＣによる分取あるいは活性炭カラムクロマトグラフィーによる方法が知られている。しかし、ＨＰＬＣによる分取が工業的生産には適さないことはいうまでもない。また、活性炭カラムによる方法では、培地中の有機化合物を一度活性炭に吸着させた後、アルコールなどの有機溶媒の濃度を変化させながら、吸着力の差を利用して順次溶出させることになる。したがって、大量のＤＯＩを生産する場合、培地中の大部分の有機化合物を吸着させるだけの量の活性炭が必要となり、この方法も大量精製には不向きである。そのようなことから、これまでは工業的方法でＤＯＩを精製する適切な方法は確立されていなかった。
【特許文献１】特開２０００−２３６８８１号公報（特許第３１２２７６２号）
【非特許文献１】Ｋ．Ｋａｋｉｎｕｍａ、Ｅ．Ｎａｎｇｏ、Ｆ．Ｋｕｄｏ、Ｙ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、及びＴ．Ｅｇｕｃｈｉ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０００年、４１巻、ｐ．１９３５−１９３８
【非特許文献２】Ｏｔａ，Ｙ．ら著、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、２０００年、５３巻、１ｐ．１５８−１１６７
【非特許文献３】Ｋｕｄｏ，Ｆ．ら著、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、１９９９年、５２巻、ｐ．５５９−５７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、ＤＯＩを工業的規模で製造可能な系を実現し得る遺伝子発現カセット、この遺伝子発現カセットを有する形質転換体並びに２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による遺伝子発現カセットは、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子からなることを特徴とする。【０００９】
本発明による遺伝子発現カセットにおいて、前記の２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子は、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素であることを特徴とする。これらにより、ＤＯＩを工業的に製造可能な形質転換体を取得可能となる。【００１０】
また、本発明による形質転換体は、宿主細胞に、上述の遺伝子発現カセットを導入してなることを特徴とする。【００１１】
本発明による形質転換体において、前記宿主細胞は、大腸菌種、及びＧＩＬＳＰ遺伝子組換え微生物リストに記載されている宿主細胞（平成１８年３月現在のもの）からなる群から選択された宿主細胞であることを特徴とする。これらにより、ＤＯＩを工業的に製造可能な方法を実施することが可能となる。【００１２】
本発明による形質転換体において、前記宿主細胞は、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子、グルコース−６−リン酸  １−デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子、ホスホグルコムターゼをコードするｐｇｍ遺伝子及び定常期におけるタンパク質合成の修飾を担うリボソーム修飾因子タンパク質をコードするｒｍｆ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子が破壊された宿主細胞であることを特徴とする。これにより、上述に加え、より効率的にＤＯＩを工業的に製造可能な方法を実施することが可能となる。【００１３】
一方、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを接触させる工程を有することを特徴とする。これにより、ＤＯＩを工業的に製造することが可能となる。【００１４】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法において、前記炭素源は、Ｄ−グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか及び廃糖蜜並びにＤ−グルコースを得ることが可能なバイオマスからなる群から選択された少なくとも１種類の炭素源であることを特徴とする。これにより、上述に加え、ＤＯＩを汎用的に製造することが可能となる。【００１５】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースは、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法により得たことを特徴とする。これにより、形質転換体を利用した製造方法の特質を生かした２−デオキシ−シロ−イノソースを得ることが可能となる。【００１６】
さらに、本発明による、２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを接触させて２−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物を得る工程と、該組成物を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂とを有する混床式又は二床式カラムで処理する工程と、を有することを特徴とする。これにより、純度の高いＤＯＩを工業的に取得可能となる。【００１７】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法において、前記有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂は、酢酸イオン型陰イオン交換樹脂であることを特徴とする。これにより、酢酸が濃縮操作により除去できるので、実用的に好ましく使用できる。【００１８】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースは、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法により得たことを特徴とする。これにより、純度が高く、形質転換体を利用した特質を生かした２−デオキシ−シロ−イノソースを得ることが可能となる。【００１９】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースを、トリアルコキシメタンと反応させて、２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを得る工程と、該２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを、酸の存在下で加水分解する工程と、を有することを特徴とする。これにより、上述に加え、夾雑物を効率的に分離可能となる。【００２０】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法において、前記トリアルコキシメタンは、トリメトキシメタンであることを特徴とする。これにより、後続の加水分解工程で生成するメタノールを濃縮操作により容易に除去できるので、実用的に好ましく使用できる。【００２１】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースは、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法により得たことを特徴とする。これにより、純度等の点で実用的にも優れた２−デオキシ−シロ−イノソースが得られる。
【発明の効果】
【００２２】
医薬品原料や化学工業原料として重要な炭素６員環化合物は、これまで、石油を原料とする石油化学によって製造されていた。しかしながら、本発明の技術を用いることにより、再生可能な植物資源（バイオマス）由来のＤ−グルコースを原料として炭素６員環化合物である２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）を細菌により合成することが可能となった。また、培養液を処理して、精製されたＤＯＩを回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｄ−グルコースからＤＯＩが生成する反応経路及びＤＯＩ合成酵素が触媒する反応を示す図である。
【図２Ａ】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図２Ｂ】ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図２Ｃ】ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図２Ｄ】ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図３Ａ】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４Δｐｇｉ株を２×ＹＴ培地、または米ぬか培地で各時間培養したときの菌体抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図である。
【図３Ｂ】ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を２×ＹＴ培地で各時間培養したときの菌体抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図である。
【図４Ａ】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４Δｐｇｉ株の培養（２×ＹＴ  ３Ｌ、３０℃、ｐＨ７．５、５％Ｄ−グルコース、培養２４時間）上清のオキシム化反応物のＨＰＬＣチャートである。
【図４Ｂ】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＹＩ７２４Δｒｍｆ株の培養（２×ＹＴ、１０ｍＬ、３０℃、ｐＨ７，３％Ｄ−グルコース、培養４８時間）上清のオキシム化反応物でＨＰＬＣチャート（左のチャートは培養０時間）である。
【図５】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４△ｐｇｉ株の培養（２×ＹＴ＋２％グルコース（◆）、または、２×ＹＴ＋５％Ｄ−グルコース（■）、３Ｌ、３０℃、ｐＨ７．５）に伴う（Ａ）培地の濁度、（Ｂ）Ｄ−グルコース濃度、及び（Ｃ）ＤＯＩ生産量のタイムコース（横軸は、グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
【図６】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４△ｐｇｉ△ｚｗｆ株の培養（２×ＹＴ＋３％マンニトール＋５％Ｄ−グルコース、３Ｌ、３０℃、ｐＨ７．５、）に伴う（Ａ）培地の濁度、（Ｂ）Ｄ−グルコース濃度、及び（Ｃ）ＤＯＩ生産量のタイムコース（横軸は、グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
【図７】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株の培養（２×ＹＴ＋５％Ｄ−グルコース＋０．５％マンニトール、３Ｌ、２５℃、ｐＨ７）に伴う（左）菌体濁度、（中）培地中のＤ−グルコース濃度、（右）ＤＯＩ生産量のタイムコース（横軸は、Ｄ−グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
【図８】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（◆）とｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）の培養（２×ＹＴ＋５％Ｄ−グルコース＋０．５％マンニトール、３Ｌ、２５℃、ｐＨ６−７）に伴う（左）菌体濁度、（中）培地中のＤ−グルコース濃度、（右）ＤＯＩ生産量のタイムコース（横軸は、Ｄ−グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
【図９】ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４野生型株（◆）とｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４Δｒｍｆ株（■）の培養（２×ＹＴ＋３％Ｄ−グルコース、１０ｍＬ、３０℃、ｐＨ７）に伴う（左）菌体濁度、（中）培地中のＤ−グルコース濃度、（右）ＤＯＩ生産量のタイムコース（横軸は、Ｄ−グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
【図１０】実施例８の方法で培養液をイオン交換樹脂に流して得られたフラクションのｐＨ、伝導度、ＤＯＩ濃度をプロットした図である。
【図１１】実施例８の方法で精製して得られたＤＯＩの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１２】実施例９の方法で培養液をイオン交換樹脂に流して得られたフラクションのｐＨ、伝導度、ＤＯＩ濃度をプロットした図である。
【図１３】実施例９の方法で精製して得られたＤＯＩの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１４】本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法の第二の態様の原理を示す概略図である。
【図１５】実施例１０の方法で精製して得られたＤＯＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１６】実施例１１の方法で精製して得られたＤＯＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１７】実施例１２の方法で精製して得られたＤＯＩの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ＤＯＩ合成酵素の特性を考えると、当該酵素を他の微生物に導入することにより、豊富に存在するバイオマス由来のＤ−グルコースを原料として、有用資源であるＤＯＩを効率的に、短工程で生産できる可能性がある。【００２５】
そこで本発明者らは、ＤＯＩの新規な合成方法として、大腸菌を宿主細胞としてＤＯＩを発酵法により簡便安価な方法で生産する方法を開発するために鋭意検討を行い、本発明をなすに至った。【００２６】
また、工業的方法でＤＯＩを精製する系を考えた場合、好ましい方法として、例えば培養液をカラムの上部から流すと、下部から精製されたＤＯＩが流出してくるような原理に基づく方法、及びＤＯＩまたはその誘導体を結晶化させて分離する方法、並びにこれらを組み合わせた方法が例示される。このような観点から、ＤＯＩ以外の物質を吸着し、且つＤＯＩは吸着されずに最初に流出してくるようなカラム基材を探索することにより、且つ結晶化・分離後に効率よくＤＯＩを取得可能なＤＯＩ誘導体を探索することにより、本発明をなすに至った。【００２７】
以下、本発明の好適な実施形態につき説明する。【００２８】
＜本発明による遺伝子発現カセット＞
本発明による遺伝子発現カセットは、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子からなることを特徴とする。つまり、本発明による遺伝子発現カセットは、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子と、この遺伝子の発現させ得る例えばベクター等の遺伝子とからなるものであれば、特に制限されない。【００２９】
（２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子）
本発明による遺伝子発現カセットにおいて、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子としては、２−デオキシ−シロ−イノソースを合成し得る公知のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。この例としては、Ｄ−グルコースからのＤＯＩを合成する、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のＤＯＩ合成酵素の４２ｋＤａサブユニットをコードするｂｔｒＣ遺伝子が例示される（特許文献１、非特許文献１及びＧｅｎｂａｎｋ  ＡＢ０６６２７６等参照。）。もちろん、ＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子であれば、バチルス・サーキュランス以外の生物に由来する遺伝子も利用できる。また、上記遺伝子の塩基配列は、本発明のＤＯＩの合成酵素活性を有する酵素を合成する遺伝子であれば、その遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよい。【００３０】
（本発明による遺伝子発現カセットの構築）
本発明による遺伝子発現カセットの構築には、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子を、下述する宿主細胞内で発現させ得る遺伝子を用いればよい。遺伝子発現カセットの遺伝子構成としては、プロモーター、転写活性化に関与する配列、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）、ターミネーター等が例示される。例えば、大腸菌を宿主細胞とするタンパク質の大量発現系においては、当該遺伝子の５’上流にプロモーター、転写活性化に関与する配列、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）等のＤＮＡ配列の連結、当該遺伝子の３’下流にターミネーター等のＤＮＡ配列を連結すればよい。これらのＤＮＡ配列は大腸菌内で機能する配列であればどのような配列でもよい。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターを用いてもよく、好ましくは発現の制御が可能なものである。また、大腸菌を宿主とする遺伝子発現においては、通常、ＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−ガラクトピラノシド；ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）をはじめとする比較的コストの高い誘導物質が一般的に用いられる。【００３１】
本発明では、ＩＰＴＧのような高価な誘導物質を用いずに目的遺伝子の高発現をもたらす発現系を用いることが望ましい。そのための宿主・ベクター系としては、例えば、ＰＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）、ＧＡＰプロモーターやＧＡＤプロモーターを用いた発現システムなどを利用することができる。【００３２】
ＰＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ系において、ベクター（ｐＬＥＸ、アンピシリン耐性マーカー）上に組込んだ遺伝子の発現は、λファージ由来の、構成的に強力な発現をもたらすプロモーターであるＰＬプロモーターによる制御を受ける。また、ＰＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍは、培地中のトリプトファン濃度によって発現制御を受け、トリプトファン濃度の高い培地で発現が誘導される仕組みになっている。【００３３】
一方、ｇａｐＡ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡをコードする遺伝子）プロモーターやｇａｄＡ（グルタメートデカルボキシラーゼＡをコードする遺伝子）プロモーターを単独または両方を用いた発現系において、ベクター（ｐＵＣ由来、アンピシリン耐性マーカー）上に組込んだ遺伝子の発現は、栄養増殖期または定常期に構成的に強力な発現をもたらす。このようなｇａｐＡプロモーターやｇａｄＡプロモーター等を用いた発現系では、特殊な試薬や操作を必要とせず、通常培養時おいて発現が誘導される仕組みになっている。【００３４】
一方、ＰＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ系では、大腸菌の培養に通常用いる完全培地にはプロモーター活性を誘導するのに十分な量のトリプトファンがあり、誘導発現のためにトリプトファンを別途加える必要はない。また、ｇａｐＡプロモーターやｇａｄＡプロモーターを用いた発現系も同様に誘導発現のために誘導物質を加える必要はない。すなわち、高価な誘導物質を用いずに、目的遺伝子の高発現が可能である。【００３５】
＜本発明による形質転換体＞
本発明による形質転換体は、宿主細胞に、上述の遺伝子発現カセットを導入してなることを特徴とする。以下、本発明における宿主細胞について、説明する。【００３６】
（宿主細胞）
本発明による形質転換体に使用し得る宿主細胞としては、特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている菌を使用することができる。このような例としては、例えば、大腸菌が挙げられる。また、大腸菌以外の宿主細胞として、ＧＩＬＳＰ（Ｇｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（優良工業規範））遺伝子組換え微生物リストに記載されている宿主細胞（平成１８年３月現在のもの、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・ブレビス  ＨＰＤ３１、バシラス・ブレビス  ＨＰＤ３１−Ｍ３、バシラス・リシェニフォルミス  ＤＮ２４６１、バシラス・リシェニフォルミス  ＤＮ２７１７、バシラス・サチリス  Ｋ２Ａ１、バシラス・サチリス  Ｍ１６８由来株、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリキア・コリ  Ｋ１２由来株、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス）を用いてもよい。【００３７】
（本発明における遺伝子破壊株）
本発明による形質転換体において、上述の宿主細胞は、２−デオキシ−シロ−イノソースの合成を考慮して、種々の染色体／プラスミド遺伝子を破壊した株を用いてもよい。本発明の好ましい態様では、宿主細胞が保有する、グルコース−６−リン酸の代謝に関わる酵素である、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸  １−デヒドロゲナーゼおよびホスホグルコムターゼをコードする遺伝子（それぞれ、ｐｇｉ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子およびｐｇｍ遺伝子）がそれぞれ単独で遺伝子破壊されているか、または２つが同時に遺伝子破壊されている（ｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子およびｐｇｉ遺伝子とｐｇｍ遺伝子）、もしくは３つが同時に遺伝子破壊されている。さらに、定常期におけるタンパク合成の制御に関わるＲＭＦタンパク質をコードする遺伝子（ｒｍｆ遺伝子）が単独で遺伝子破壊されているか、または上記のグルコース−６−リン酸の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子が破壊されている各種遺伝子破壊株に対してｒｍｆ遺伝子破壊されている。上記のこれによって、ＤＯＩ生産のための直接の基質となるグルコース−６−リン酸の菌による分解代謝が抑制され、また定常期におけるタンパク質合成によりＤＯＩ生産能が飛躍的に高まった。【００３８】
［グルコース−６−リン酸の分解に関与する遺伝子の破壊株］
ＤＯＩを可能な限り高収率で合成するためには、菌体によるＤ−グルコースの異化代謝をできる限り抑制する必要があると考えられる。大腸菌において、Ｄ−グルコースの異化代謝に関わる酵素をコードする遺伝子としては、解糖系においてグルコース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸への変換に関わるホスホグルコース・イソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）をコードする（ｐｇｉ）遺伝子と、ペントースリン酸経路において、グルコース−６−リン酸からホスホグルコノラクトンヘの変換に関与する酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｘｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードするｚｗｆ遺伝子やグルコース−６−リン酸からグルコース−１−リン酸への変換に関わる酵素ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）をコードするｐｇｍ遺伝子の３種が存在する。これらの遺伝子を破壊することによって、ＤＯＩ合成酵素の基質となるグルコース−６−リン酸の、菌体の増殖に伴う異化分解を抑制することが可能であると考えられる。【００３９】
［定常期におけるタンパク質合成に関与する遺伝子の破壊株］
定常期におけるＢｔｒＣタンパク質合成の抑制を解除するためには、これに関与するＲＭＦタンパク質の産生を抑制する必要があると考えられる。そこで、ＲＭＦタンパク質をコードするｒｍｆ遺伝子を破壊することによって、定常期以降もＢｔｒＣタンパク質の合成が継続し、さらにＤＯＩ合成が続くものと思われる。【００４０】
（本発明における遺伝子破壊株の作製）
本発明において、宿主細胞の特定の遺伝子を破壊した遺伝子破壊株を作製する方法としては、本技術分野公知の方法を用いればよい。例えば、突然変異を誘発させる方法（自然育種による方法、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射等）、ランダムな突然変異による方法（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳ）、トランスポゾン（Ｔｎ）等による方法）、部位特異的な遺伝子破壊法（シングル及びダブルクロスオーバー法によるもの）等が例示される。なかでも、破壊対象の遺伝子に、薬剤耐性を示す遺伝子を含む断片を挿入し得る部位特異的な遺伝子破壊法は、所望する遺伝子破壊株のスクリーニングの点で、好ましい。なお、下述するように、本発明による形質転換体に用いる遺伝子破壊を行った宿主細胞は、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ社のＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて作製したが、これに限定されるものではない。【００４１】
（本発明における形質転換体の作製方法）
本発明による形質転換体は、上述の遺伝子発現カセットを、上述の宿主細胞に導入して作製すればよい。この導入方法としては、コンピテンス法や受容体を介したエンドサイトーシスを用いた方法などを挙げられる。【００４２】
＜本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法＞
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを、形質転換体の成長等に適当な媒体中で接触させることを特徴とする。【００４３】
炭素源としては、Ｄ−グルコースやＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミンなどの含窒素単糖類、これらの単糖類からなる二糖以上の糖類又はオリゴ糖類または炭水化物（でんぷん、米ぬか、廃糖蜜など）の多糖類に由来する単糖類を用いることができる。【００４４】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法を行う媒体としては、宿主細胞を増殖／成長等させ得る公知の培地であれば、固形、液体等、媒体の形態は限定されない。このような例としては、寒天培地、ＲＭＧ培地、２×ＹＴ培地、ＬＢ培地、Ｍ９最少培地やＳＯＢ培地などが例示される。これらの媒体は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を有してもよい。この炭素源は、上述の他、マンニトールなどの表１に示すものなどであってもよい。この窒素源として、例えば、塩化アンモニウム、カザミノ酸、ペプトン、酵母エキスが挙げられる。この無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。前述のように、宿主・ベクター系としてＧＡＰ−ＧＡＤ発現システムやＰＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いると、高価な誘導物質を用いなくてもよい。【００４５】
一方、媒体は、宿主の成長等に応じて、適当な添加剤をさらに有してもよい。媒体は、上述の遺伝子発現カセットに導入した２−デオキシ−シロ−イノソースの合成に関与する遺伝子を発現させるため、例えば、ＩＰＴＧやトリプトファン等の、プロモーター活性を上昇させる化合物を有してもよい。特に、プロモーターによる遺伝子の発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。【００４６】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法において、上述の形質転換体と炭素源とを接触させる温度、時間、雰囲気等は、形質転換体の成長等に適した環境であれば、特に限定されない。例えば、この温度としては、２０℃乃至３７℃がより好ましい。また、この時間としては、特に制限はないが、１日乃至７日程度であってもよい。【００４７】
例えば、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法は、まず、上述の形質転換体に、炭素源として、大腸菌が資化し得るもの（例えば、Ｄ−グルコース等）とを培地中で接触させる。その後、得られた培養上清液からＤＯＩを回収する。このようにして、形質転換体を用いた、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法により、工業的にＤＯＩを得ることが可能となる。【００４８】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法は、上述のような構成からなるので、Ｄ−グルコースからヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）とＤＯＩ合成酵素を介すことでＤＯＩを高収率で合成できる。また、上述したプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ、ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ、ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣやｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを有するＧＩ７２４Δｒｍｆ形質転換株、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｒｍｆ形質転換株、ＧＩ７２４Δｐｇｉ形質転換株、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆ形質転換株やＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ形質転換株などを作製し、培養する方法により、図１に示すように、Ｄ−グルコースからグルコース−６−リン酸を経て、さらにＤＯＩ合成酵素が触媒する５段階の反応を経て、ＤＯＩが生産される。【００４９】
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法において、上述の通り、形質転換体と炭素源とを接触させると、２−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物（例えば、２−デオキシ−シロ−イノソースを含む培地、宿主細胞等）が得られる。例えば、２−デオキシ−シロ−イノソースを含む培地を２−デオキシ−シロ−イノソースの原料とする場合、培養上清から、ＤＯＩを採取すればよい。本発明において、ＤＯＩの培養液からの回収法としては、２−デオキシ−シロ−イノソースの物理的／化学的性質や、培地の組成等を考慮して、公知の抽出法により、２−デオキシ−シロ−イノソースを回収すればよい。例えば、次のような方法が使用できる。つまり、まず、培養終了後、培養液を遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。その後、この培養上清液をさらに濾過処理し、菌体等の固形物を除き、その濾液をイオン交換樹脂に添加し、蒸留水で溶出を行う。屈折率、ｐＨ、伝導率を測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除いてＤＯＩを回収することができる。得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。【００５０】
＜本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法の第一の態様＞
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の形質転換体と、炭素源とを接触させて２−デオキシ−シロ−イノソースを有する組成物を得る工程と、該組成物を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂とを有する混床式又は二床式カラムで処理する工程と、を有することを特徴とする。本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法において、形質転換体と炭素源とを接触させるステップは、上述の本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法に準じて行う。このステップにより、２−デオキシ−シロ−イノソースを含む組成物が得られる。この組成物は、上述の媒体からなるものであるが、以下、媒体として培地を用いた場合について、述べる。【００５１】
炭素源を有する培地中での形質転換体の培養が終了した培養液中には、残存している炭素源としてのグルコースの他、培地の各種成分が含まれる。これらの各種成分としては、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類などが挙げられる。ＤＯＩを得るには、これら各種成分を除去することが必要で、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法では、これを解決する方法を提供する。【００５２】
培地に含まれる除去すべき不純物としては、上述の通り、残存している炭素源としてのＤ−グルコース、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類がある。このうち培養条件の検討により、Ｄ−グルコースが完全に消費されるまで培養を続けることが可能であることが分かった。このようにして得た培地には、残存する不純物として、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類となった。アミノ酸類の中には、リジンやヒスチジン、トリプトファンのようにアミノ基が複数個ある塩基性アミノ酸もあれば、グルタミン酸やアスパラギン酸のようにカルボキシル基を複数個持っている酸性アミノ酸も存在する。また、金属イオンは当然カチオンであるが、同時にそのカウンターイオンとしての塩素イオンや硫酸イオンなども培地中には存在している。したがって、そのような不純物をすべて吸着させて、かつ、ＤＯＩを吸着させない基材を探索すればよいことになる。【００５３】
本発明者らは、そのような考えに基づいて基材の探索と溶出条件を検討した結果、汎用されるイオン交換樹脂、例えば、ナトリウムイオン型または水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂および塩素イオン型または水酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂を用いる方法ではＤＯＩを収率よく精製することはできなかった。すなわち、それぞれを連結した二床式カラム、または両者を混合した混床式カラムを用いても、その目的を達成することはできない結果となった。アミノ酸は、２種類のイオン交換樹脂のどちらかに結合する。また金属イオンは陽イオン交換樹脂に結合するのに対し、ＤＯＩはイオン性の官能基を持たないために、いずれのイオン交換樹脂にも結合しない特性を持っている。従って、アミノ酸類および金属塩類は、イオン交換樹脂に結合し、ＤＯＩのみが吸着せずに溶離してくると推察されるが、結果は異なっていた。ＤＯＩの回収率は５０％以下となり、かつイオン交換樹脂の使用条件により大きく変動した。大量処理する工業的方法に適合するためには、回収率がより高く加えて安定した成績が必要とされる。【００５４】
本発明者らは、基材と精製条件を更に拡大して鋭意検討した結果、陰イオン交換樹脂のカウンターイオンとして有機酸イオンを用いる方法、すなわち有機酸イオン型陰イオン交換樹脂と水素イオン型陽イオン交換樹脂とを用いた混床式または二床式カラムをを用いることにより、ＤＯＩを効率よく精製できることを見いだした。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸などが挙げられるが、なかでも、酢酸が好ましく使用できる。有機酸として酢酸を用いると、ＤＯＩがｐＨ８以上のアルカリ性領域で極めて分解し易く、ｐＨ３〜５の弱酸性条件下でのみ安定である点で好ましい。すなわち、ＤＯＩが酸性とアルカリ性の両領域で完全に安定であれば、汎用されている陰イオン交換樹脂と陽イオン交換樹脂とを別々のカラムに充填した二床式カラムに培養液を流すという方法でも上記の不純物を除くことができる。また、両領域でフルクトースと同等の安定性を有していれば、混合ベッド型カラムで精製が可能である。ＤＯＩが二床式カラムはもちろん、混合式カラムを使用しても分解が起こるほどアルカリ領域で不安定であることを見いだしたのは本発明者らが初めてである。【００５５】
この問題を解決するために、用いるイオン交換樹脂に結合するカウンターイオンの選択を検討した結果、本発明者らは、陰イオン交換樹脂のカウンターイオンとして有機酸イオンを用いる方法を見いだした。これにより、溶離液中には有機酸が残り、ＤＯＩの溶離画分にも混入するが、これは溶離液をｐＨ４前後に保つのに有効である。有機酸のなかでも、酢酸は濃縮により除去できる長所を有している。【００５６】
これにより、水素イオン型の陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型の陰イオン交換樹脂とを混合して作成したイオン交換カラムに、培養液を通過させることにより、ＤＯＩを精製できることが明らかになり、本発明が完成された。これは工業的大量生産にも十分叶う方法である。【００５７】
混床式または二床式イオン交換樹脂カラムを用いる精製方法においては、グルコースが完全に消費させた培養液中に残される原料由来の荷電性不純物、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン類を吸着除去できる。従って、吸着しない中性物質のＤＯＩを溶出することにより精製できた。但し、培養の条件によっては、このＤＯＩに微量の中性物質が混入する可能性があり、イオン交換樹脂カラムから溶出したＤＯＩを更に高度に精製する方法についても更に検討した。ＮＭＲなどの測定から、ＤＯＩはケトン型とハイドレート型とが混在した構造で存在すると推定でき、ＤＯＩの結晶化は困難に考えられた。現在までに、ＤＯＩは勿論その誘導体の結晶化も未だ報告されていないのが実情である。以下、ＤＯＩを更に高度に精製する方法について、説明する。【００５８】
＜本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法の第二の態様＞
本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、上述の２−デオキシ−シロ−イノソースを、トリアルコキシメタンと反応させて、２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを得る工程と、該２−デオキシ−シロ−イノソースジアルキルケタールを、酸の存在下で加水分解する工程と、を有することを特徴とする。この態様において用い得る２−デオキシ−シロ−イノソースとしては、２−デオキシ−シロ−イノソースを含む上述の組成物の他、第一の態様で得た２−デオキシ−シロ−イノソースなどが挙げられる。以下、この第二の態様について説明する。【００５９】
本発明者らは、溶出したＤＯＩを結晶性の物質に誘導変換して結晶化し、分離・精製した後、効率よくＤＯＩに復元する原理に基づき、この原理に叶う物質の探索と精製方法の検討を行った。この原理の概略を示したのが、図１４である。図１４は、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法の第二の態様の原理を示す概略図である。【００６０】
この要件を満たすためには、ＤＯＩを変換する反応条件及び復元する反応条件が、ＤＯＩが分解しない酸性条件下で実施できること、および、誘導変換された物質が容易に結晶化しかつＤＯＩに復元すること、更にこれらの実施が工業的規模で実施できることが必要要件となる。これらの要件に合致する方法を種々検討した。その結果、ＤＯＩを安定な酸性条件化で、トリアルコキシメタンと反応させて、２−デオキシ−シロ−イノソース  ジアルキルケタール（ＤＯＩ−ｄａｋ）に変換して結晶化・精製する方法を見出した。【００６１】
このトリアルコキシメタン（（ＲＯ）３ＣＨ）において、Ｒとしては、炭素数が１〜４のアルカン類であれば、特に制約がなく、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン等が挙げられる。本発明において、このアルコキシメタンとしては、後続の加水分解工程で生成するアルコールが容易に除去され得る点で、トリメチルメタンが最も好ましい。なお、トリメチルメタンを用いて行った場合、デオキシ−シロ−イノソース  ジメチルケタール（ＤＯＩ−ｄｍｋ）が得られることとなる。【００６２】
２−デオキシ−シロ−イノソース  アルキルケタールの結晶化は、２−デオキシ−シロ−イノソース  アルキルケタールを、適当な溶媒（例えば、メタノール、エタノール、水等）に溶解した後、液相の親水性を低下させる媒体（例えば、クロロホルム、ヘキサン、エーテル類等）を用いて行えばよい。このようにして、２−デオキシ−シロ−イノソース  アルキルケタールの結晶が得られる。【００６３】
このようにして得た２−デオキシ−シロ−イノソース  アルキルケタールは、酸の存在下で、加水分解して、２−デオキシ−シロ−イノソースとなる。この加水分解反応には、トシル酸、塩酸、硫酸など、適当な触媒の存在下で行ってもよい。加水分解後、２−デオキシ−シロ−イノソースが得られる。【００６４】
このことから、本発明による２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法は、工業的大量生産にも十分叶う方法である。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲が限定されるものではない。【００６６】
（実施例１）
＜＜ＤＯＩ合成酵素遺伝子＞＞
糖質環化酵素遺伝子としては、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来の、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）合成酵素の４２ｋＤａサブユニットをコードするｂｔｒＣ遺伝子（特許文献１、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ０６６２７６、非特許文献２等参照）を利用した。【００６７】
（実施例２）
＜＜組換えプラスミド及び組換え株の構築＞＞
＜ｂｔｒＣ遺伝子及びｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ＞
ｂｔｒＣ遺伝子全長を含むプラスミドｐＤＳ４（非特許文献３）を鋳型として配列番号１に示すプライマー１と配列番号２に示すプライマー２とを用い、ｂｔｒＣ遺伝子のＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、ＰＣＲの反応条件は、９４℃×３０秒、５２℃×３０秒、６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル行った。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩとＸｂａＩとで消化し、これをベクターｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを構築した（図２Ａ）。【００６８】
＜ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐ−ＧＡＤ−ｂｔｒＣ＞
ｇａｐＡプロモーター遺伝子は、大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１７に示すプライマーと配列番号１８に示すプライマーとを用い、ＰＣＲ増幅により、合成した。このｇａｐＡプロモーター遺伝子のＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼを用い、以下の反応条件で、行い、ｇａｐＡプロモーター断片を得た。【００６９】
９４℃×３０秒
５０℃×３０秒
６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル【００７０】
ｇａｄＡプロモーター遺伝子は、大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１９に示すプライマーと配列番号２０に示すプライマーとを用い、ＰＣＲ増幅により、合成した。このｇａｄＡプロモーター遺伝子のＰＣＲ増幅は、ＫＯＤポリメラーゼを用い、以下の反応条件で、行い、ｇａｄＡプロモーター断片を得た。【００７１】
９４℃×３０秒
５２℃×３０秒
６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル【００７２】
ａｓｐＡターミネーター遺伝子は、ａｓｐＡターミネーター遺伝子を含むプラスミドｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として配列番号２１に示すプライマーと配列番号２２に示すプライマーとを用い、ＰＣＲ増幅により、合成した。このａｓｐＡターミネーター遺伝子のＰＣＲ増幅は、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、以下の反応条件で、行い、ａｓｐＡターミネーター断片を得た。【００７３】
９４℃×３０秒
５５℃×３０秒
６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル【００７４】
ＰＣＲ増幅したｇａｄＡプロモーター断片と、上述のｂｔｒＣ断片とを、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、１６℃、３０分で反応させた。このようにして得たＬｉｇａｔｉｏｎ産物を鋳型として、配列番号２に示すプライマーと配列番号５に示すプライマーとを用い、ＫＯＤポリメラーゼを用いた、以下の条件のＰＣＲ増幅を行い、２つの断片を１つにした断片ｇａｄＡ−ｂｔｒＣ断片を得た。【００７５】
９４℃×３０秒
５２℃×３０秒
６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル【００７６】
この断片をＸｂａＩで消化したものを、ベクターｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＸｂａＩ部位に挿入した。【００７７】
次に、上記で増幅させたｇａｐＡプロモーター断片と、ｂｔｒＣ断片と、ａｓｐＡターミネーター断片とを、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘを用い、１６℃、３０分で反応させた。このようにして得たＬｉｇａｔｉｏｎ産物を鋳型として、配列番号３に示すプライマーと配列番号８に示すプライマーとを用い、ＫＯＤポリメラーゼを用いた、以下の条件のＰＣＲ増幅を行い、３つの断片を１つにした断片ｇａｐＡプロモーター−ｂｔｒＣ−ａｓｐＡターミネーター断片を得た。【００７８】
９４℃×３０秒
５０℃×３０秒
６８℃×１分を１サイクルとして、３０サイクル【００７９】
この断片をＢａｍＨＩで消化したものを、ｇａｄＡ−ｂｔｒＣを挿入したベクターｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを構築した（図５）。【００８０】
（実施例３）
＜＜宿主細胞の調製＞＞
遺伝子破壊は、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ社のＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、その添付説明書の方法に基づいて行った。ｐｇｉ遺伝子の単独破壊に用いるカセットの作製のために使用したＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号３と配列番号４とに示す。ｚｗｆ遺伝子の単独破壊に用いるカセットの増幅に用いたＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号５と配列番号６とに示す。ｐｇｍ遺伝子の単独破壊に用いるカセットの作製のためのＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０に示す。ｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子の二重破壊株を得るために、ｚｗｆ遺伝子の単独破壊株に対して、ｐｇｉ遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号１１と配列番号１２とに示す。ｐｇｉ遺伝子とｐｇｍ遺伝子の二重破壊株を得るために、ｐｇｉ遺伝子の単独破壊株に対して、ｐｇｍ遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０に示す。さらに、ｐｇｉ遺伝子とｚｗｆ遺伝子とｐｇｍ遺伝子の三重破壊株を得るために、ｐｇｉ遺伝子とｐｇｍ遺伝子の二重破壊株に対して、ｚｗｆ遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いたＰＣＲプライマーセットの配列を配列番号５と配列番号６とに示す。また、ｒｍｆ遺伝子の破壊カセットに用いたプライマーは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６に示す。【００８１】
Ｋｉｔに添付されている、大腸菌内での相同組換えを促進する酵素群をコードするベクター、ｐＳＣ１０１−ＢＡＤ−ｇｂａＡ−ｔｅｔｒａを宿主細胞である大腸菌株（ＧＩ７２４）に導入した。その株を３μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを添加したＬＢ培地で一夜前培養を行った。前培養菌体を、３μｇ／ｍＬを添加したＬＢ培地に１％濃度植菌し、３０℃でＯ．Ｄ．＝０．２まで培養した。その時点で、アラビノースを終濃度０．２％添加し、さらに３７℃１時間培養することにより、相同組換えの促進に関与する酵素群を誘導発現した。さらに遺伝子破壊用カセットをそれぞれ形質転換し、ターゲット遺伝子の遺伝子破壊を誘導した。形質転換体を、クロラムフェニコール、ネオマイシン（カナマイシン）若しくはストレプトマイシン若しくはその２つ又は３つを含有する、３７℃のＬＢ培地で選択することにより、目的の遺伝子破壊株（ｐｇｉ遺伝子破壊株（Δｐｇｉ株）、ｚｗｆ遺伝子破壊株（Δｚｗｆ株）、ｐｇｍ遺伝子破壊株（Δｐｇｍ株）、ｐｇｉ／ｚｗｆ二重遺伝子破壊株（ΔｐｇｉΔｚｗｆ株）、ｐｇｉ／ｐｇｍ二重遺伝子破壊株（ΔｐｇｉΔｐｇｍ株）及びｐｇｉ／ｚｗｆ／ｐｇｍ三重遺伝子破壊株（ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株））を得た。ｒｍｆ遺伝子破壊株（Δｒｍｆ株）については、上記の各種破壊株に対してのｒｍｆ破壊株を上記と同様の手法を用いて得た。このようにして得た野生型株および各遺伝子破壊株の各種単一炭素源での生育レベルを表１に示す。【００８２】
Δｐｇｉ株、Δｚｗｆ株およびΔｐｇｍ株は、Ｄ−グルコースを炭素源として利用できるが、Ｄ−グルコースによる生育速度は野生型株よりも顕著に遅くなっており、菌体によるＤ−グルコースの消費を抑えられていると考えられた。また、ΔｐｇｉΔｚｗｆ株、ΔｐｇｉΔｐｇｍ株およびΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株は、Ｄ−グルコースを単一炭素源として生育していくことが非常に困難なことから、グルコース−６−リン酸の分解はほぼ完全に抑制されていることが考えられた。このことから、これらの破壊株を用いることで、野生型株よりもＤＯＩ生産量、およびＤＯＩ変換効率が高まることが期待できる。また、各二重遺伝子破壊株および三重遺伝子破壊株は、マンニトールやグルコネートなどの非発酵性炭素源を補助的に加えることで、生育を改善させることが可能である（表１）。また、ｒｍｆ遺伝子破壊株での炭素源については、グルコース−６−リン酸代謝酵素遺伝子を破壊させた各種破壊株と同様の生育レベルを示した。【００８３】
【表１】
0004598826.tif 000002
【００８４】
（実施例４）
＜＜形質転換体＞＞
Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ社のＫｉｔの添付説明書に記載されているプロトコールに従って、上述の通り得たｐＬＥＸ−ｂｔｒＣにより宿主大腸菌株（ＧＩ７２４）を形質転換し、アンピシリンを含む培地で選択することにより、ＧＩ７２４／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ株を得た。また、同様に、ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを宿主大腸菌株（ＧＩ７２４）に形質転換し、アンピシリンを含む培地で選択することにより、ＧＩ７２４／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株を得た。さらに、ＧＩ７２４Δｒｍｆ、ＧＩ７２４Δｐｇｉ、ＧＩ７２４Δｚｗｆ、ＧＩ７２４Δｐｇｍ、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｒｍｆ、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆ、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｐｇｍ及びＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍの各遺伝子破壊株に対しても同様にｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを形質転換し、ＧＩ７２４Δｒｍｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４Δｐｇｉ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４Δｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４Δｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｒｍｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株、ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株やＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株をそれぞれ得た。【００８５】
（実施例５）
＜＜ＤＯＩ合成酵素の発現の確認＞＞
＜ＧＩ７２４Δｐｇｉ／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ株＞
ＧＩ７２４Δｐｇｉ／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ株を誘導培地（６％リン酸水素ナトリウム、３％リン酸二水素カリウム、０．５％塩化ナトリウム、１％塩化アンモニウム、０．２％カザミノ酸、０．５％Ｄ−グルコース、１ｍＭ塩化マグネシウム）にて、３０℃でＯ．Ｄ６００ｎｍ＝０．７まで培養した後、２×ＹＴ培地（大腸菌用完全培地、１．６％トリプトファン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）に移し、３７℃でさらに６時間培養した後、菌体を回収し、ＢｔｒＣタンパク質の発現を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。その結果を図３Ａに示す。２×ＹＴ培地で６時間培養することにより、ＢｔｒＣが大量発現することが確認された。なお、図３Ａの各レーンは、以下の通りである。【００８６】
レーンＭ：
分子量マーカー（商品名：プレジションＰｌｕｓプロテインスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、カタログ番号：１６１−０３７４）、以下同様）
レーン１：
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４株を最少栄養培地（Ｍ９最少培地：０．６％リン酸水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム）で６時間培養して得た菌体の抽出物（１×ＳＤＳ  Ｌｏｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）；２％ＳＤＳ；０．１％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ；１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ；１００ｍＭＤｉｔｈｉｏｙｈｒｅｉｔｏｌ溶液で抽出、以下同様）
レーン２：
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４株を、トリプトファンを添加した誘導培地で、６時間培養した菌体の抽出物
レーン３：
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４株を、トリプトファンを添加しない誘導培地で、６時間培養した菌体の抽出物
レーン４：
米ぬか培地（組成：２０％米ぬか酵素処理液）で２時間培養した菌体の抽出物
レーン５：
トリプトファンを添加した２×ＹＴ培地で米ぬか培地（組成：２０％米ぬか酵素処理液）で６時間培養した菌体の抽出物【００８７】
２×ＹＴ培地を用いた場合、トリプトファンを添加しなくてもＢｔｒＣが高発現した。また、米ぬか培地を用いて培養した菌体においても、ＢｔｒＣが高発現した。これらのことから、これらの発現系を用いることで、高価な誘導物質を使わずにＤＯＩ合成酵素遺伝子の高発現が可能であることが示された。【００８８】
＜ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株＞
ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ株を前培養培地（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセリン、１ｍＭ塩化マグネシウム）にて、３０℃で一晩培養した。この前培養液を本培養培地として２×ＹＴ培地（大腸菌用完全培地；１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）に１％植菌し、さらに３０℃でＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．７まで培養した後、菌体を回収し、ＢｔｒＣタンパク質の発現を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。その結果を図３Ｂに示す。なお、図３Ｂの各レーンは、以下の通りある。【００８９】
レーン１：分子量マーカー
レーン２：本培養０時間後に採取した菌体抽出物
レーン３：本培養１２時間後に採取した菌体抽出物
レーン４：本培養３６時間後に採取した菌体抽出物
レーン５：本培養７２時間後に採取した菌体抽出物【００９０】
図３Ｂより、２×ＹＴ培地で６時間培養することにより、ＢｔｒＣが大量発現することが確認された。この結果から、この発現系を用いることで、高価な誘導物質を添加せずにＤＯＩ合成酵素遺伝子の高発現が可能であることが示された。【００９１】
（実施例６）
＜＜ＤＯＩの合成＞＞
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４Δｐｇｉ株を用いたＤＯＩの合成＞
ＧＩ７２４Δｐｇｉ／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ株を３００ｍＬ三角フラスコに入れた３５ｍＬの前培養液（ＲＭＧ培地、０．６％リン酸水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセリン、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。次いで、３リットルの２×ＹＴ培地を入れた１０リットル培養槽に１％の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度３０℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、空気１０Ｌ／分、ｐＨ７．７の条件で、６００ｎｍのＯ．Ｄ．が０．７になった時点でＤ−グルコースを２％または５％濃度添加し、さらに４８時間培養を行った。所定の時間における培養液から遠心分離して菌体を除き、培養上清液１を回収した。【００９２】
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４△ｐｇｉ△ｚｗｆ株を用いたＤＯＩの合成＞
ＧＩ７２４△ｐｇｉ△ｚｗｆ／ｐＬＥＸ一ｂｔｒＣ株を３５ｍＬの１％マンニトールを含むＲＭＧ培地（０．６％リン酸水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセリン、１ｍＭ塩化マグネシウム）に植菌し、１晩前培養を行った。次いで、３リットルの３％マンニトールを含む２×ＹＴ培地（１０リットル培養槽内）に１％の濃度で菌体を植菌し、３０℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、空気１０Ｌ／分、ｐＨ７．７の条件で、培養し、６００ｎｍのＯ．Ｄ．が０．７となった時点でグルコースを３％濃度添加し、さらに培養を続けた。所定時間における培養液から遠心分離により菌体を除去し、培養上清液２を回収した。【００９３】
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を用いたＤＯＩの合成＞
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を３００ｍＬ三角フラスコに５０ｍＬの前培養液（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。この前培養液を、３Ｌの２×ＹＴ培地を入れた１０Ｌ培養槽（丸菱バイオエンジ社ＭＤＬ−６Ｃ型）に１％植菌した。これを培養温度２５℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、流入空気１０Ｌ／分、ｐＨ７．０の条件で培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７になった時点でＤ−グルコースを５％濃度になるように添加し、さらに７２時間培養を行った。所定の時間における培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清液３を回収した。【００９４】
＜ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を用いたＤＯＩの合成＞
ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を３００ｍＬ三角フラスコに５０ｍＬの前培養液（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。この前培養液を、３Ｌの２×ＹＴ培地を入れた１０Ｌ培養槽に１％植菌した。これを培養温度２５℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、流入空気１０Ｌ／分、ｐＨ６．０の条件で培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７になった時点でＤ−グルコースを５％濃度になるように添加し、さらに７２時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液４を回収した。【００９５】
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４Δｒｍｆ株を用いたＤＯＩの合成＞
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４Δｒｍｆ株を試験管に３ｍＬの前培養液（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。この前培養液を、１０ｍＬの２×ＹＴ培地を入れたＬ型試験管に１％植菌した。これを培養温度３０℃、振とう速度１６０ｒｐｍ、ｐＨ７．０の条件で培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７になった時点でＤ−グルコースを３％濃度になるように添加し、さらに７２時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液５を回収した。【００９６】
（実施例７）
＜＜ＤＯＩ生産量の測定＞＞
＜ＤＯＩのオキシム化＞
培養上清中に蓄積するＤＯＩの定量を以下に示す手順に従って行った。培養上清液１及び２については、各時間において、培養液を採取し、上清液と等量の水、上清液の２倍量のメタノール、及び終濃度１．５  ｍｇ／ｍＬのＯ−（４−ニ卜ロベンジル）ヒドロキシルアミン（ＮＢＨＡ）を加え混合し、６０℃で１時間インキュベートすることによりＤＯＩのオキシム化を誘導した。【００９７】
また、培養上清液３、４及び５については、９倍量の滅菌蒸留水を混ぜ、さらにこの溶液と等量のメタノールを加えた後、３０ｍｇ／ｍＬのｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（ＮＢＨＡ）を加え混合し、６０℃で１時間インキュベートすることによりＤＯＩのオキシム体を誘導した。【００９８】
＜ＤＯＩの検出＞
このようにして得たＤＯＩオキシム体について、Ｓｐｅｅｐ  Ｖａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社ＩＳＳ１１０）で溶媒を蒸発させた後、オキシム化ＤＯＩを適当量のメタノールに溶解し、その一部をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析法にて分析し、ＤＯＩの検出及び定量を行った。高速液体クロマトグラフィーではＳＨＩＭＡＤＺＵ社ＬＣ−１０ＡＴ、カラムはＰｈｒｎｏｍｅｎｅｘ社Ｌｕｎａ  ５ｕ  Ｃ１８（カラム長１５０ｍｍ、カラム内径４．６ｍｍ）を用い、溶離液として２０％メタノールを用いた。２６２ｎｍにおける紫外線吸収を測定した。ＤＯＩのＯ−（４−ニトロベンジル）オキシム誘導体の量を標準曲線法により定量した。なお、グルコースの定量は、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｓｓａｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｋｉｔ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を用いて、行った。【００９９】
図４Ａ及び４Ｂに示すように、ＨＰＬＣ分析においては、ＤＯＩのオキシム体に相当するピークが確認された。また、図５乃至７にＤＯＩ生産量、培地の濁度、及びＤ−グルコース濃度のタイムコースを示す。【０１００】
（参考例１）
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４Δｐｇｉ株を用いたＤＯＩの合成＞
ＧＩ７２４Δｐｇｉ／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ株を３００ｍＬ三角フラスコに入れた３５ｍＬの前培養液（ＲＭＧ培地：０．６％リン酸水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセリン、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。次いで、３リットルの２×ＹＴ培地を入れた１０リットル培養槽に１％の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度３０℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、空気１０Ｌ／分、ｐＨ７．７の条件で、６００ｎｍのＯ．Ｄ．が０．７となった時点でＤ−グルコースを２％または５％濃度添加し、さらに２４時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除き、培養上清液１１を回収した。【０１０１】
（参考例２）
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を用いたＤＯＩの合成＞
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を３００ｍＬ三角フラスコに５０ｍＬの前培養液（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、１５時間培養した。この前培養液を、３Ｌの２×ＹＴ培地を入れた１０Ｌ培養槽（丸菱バイオエンジ社ＭＤＬ−６Ｃ型）に１％植菌した。これを培養温度２５℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、流入空気１０Ｌ／分、ｐＨ７．０の条件で培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７になった時点でＤ−グルコースを５％濃度になるように添加し、さらに７２時間培養を行った。Ｄ−グルコース添加前及びＤ−グルコース添加後の培養液をそれぞれ回収し、この培養液を遠心分離して菌体を除去し、それぞれ培養上清液１２及び１３を回収した。【０１０２】
（参考例３）
＜ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４野生型株を用いたＤＯＩの合成＞
ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣを含むＧＩ７２４野生型株を、３ｍＬの前培養液（０．６％リン酸水素二ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ塩化マグネシウム）を有する試験管に接種し、１５時間培養した。この前培養液を、１０ｍＬの２×ＹＴ培地を入れたＬ型試験管に１％植菌した。これを培養温度３０℃、振とう速度１６０ｒｐｍ、ｐＨ７．０の条件で培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７になった時点でＤ−グルコースを３％濃度になるように添加し、さらに７２時間培養を行った。所定時間における培養液から遠心分離して菌体を除去し、培養上清液１４を回収した。【０１０３】
（参考例４）
＜ＤＯＩ生産量の測定＞
上述の通り得た培養上清液１１乃至１４中に蓄積するＤＯＩの定量を以下に示す手順に従って行った。【０１０４】
培養上清液１１については、この上清液と等量の水、上清液の２倍量のメタノール、及び終濃度１．５ｍｇ／ｍＬのＯ−（４−ニ卜ロベンジル）ヒドロキシルアミン（ＮＢＨＡ）を加え混合し、６０℃で１時間インキュベートすることによりＤＯＩのオキシム化を誘導した。【０１０５】
培養上清液１２、１３及び１４については、これら上清液に対して９倍量の滅菌蒸留水を混ぜ、さらにこの溶液と等量のメタノールを加えた後、３０ｍｇ／ｍＬのｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（ＮＢＨＡ）を加え混合し、６０℃で１時間インキュベートすることによりＤＯＩのオキシム体を誘導した。【０１０６】
上述の通り誘導体化した培養上清液１１乃至１４に由来する液を、Ｓｐｅｅｐ  Ｖａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社ＩＳＳ１１０）で溶媒を蒸発させた後、オキシム化ＤＯＩを適当量のメタノールに溶解し、その一部をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析法にて分析し、ＤＯＩの検出及び定量を行った。高速液体クロマトグラフィーではＳＨＩＭＡＤＺＵ社ＬＣ−９Ａ、カラムはＰｈｒｎｏｍｅｎｅｘ社Ｌｕｎａ  ５ｕ  Ｃ１８（カラム長１５０ｍｍ、カラム内径４．６ｍｍ）を用い、溶離液として２０％メタノールを用いた。２６２ｎｍにおける紫外線吸収を測定した。ＤＯＩのＯ−（４−ニトロベンジル）オキシム誘導体の量を標準曲線法により定量した。【０１０７】
（実施例８）
＜アンバーライトＩＲ１２０とアンバーライトＩＲＡ４１０の混床式カラムを用いる方法＞
水素イオン型のアンバーライトＩＲ１２０と酢酸イオン型のアンバーライトＩＲＡ４１０とを各２００ｍＬずつ混合した後、カラム（φ５ｃｍ×２５ｃｍ）に充填し、カラムをｐＨ２．９６に調整した、参考例１の培養液１００ｍＬ（１．４ｇのＤＯＩを含む）を添加した後、蒸留水を流速２ｍＬ／分で流すことにより溶離を行った。６ｍＬずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて１本おきにｐＨおよび伝導度を測定した。また、３本おきにＤＯＩの定量も行った。ＤＯＩの定量は、Ｏ−（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｉｍｅに誘導した後、ＨＰＬＣで面積を測定した後、検量線より計算した。このときの結果を図１０に示す。また、フラクションを４つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のＤＯＩの純度および量を測定した。結果を表２に示す。得られた精製ＤＯＩの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１１に示す。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、重水に溶解した試料をＢｒｕｋｅｒ社のＤＰＸ−２５０ＮＭＲ装置（１３Ｃ核は、６７．５ＭＨｚで共鳴）を用いて測定した。【０１０８】
（実施例９）
＜アンバーライトＩＲ２００とアンバーライトＩＲＡ４１０の混床式カラムを用いる方法＞
水素イオン型のアンバーライトＩＲ２００と酢酸イオン型のアンバーライトＩＲＡ４１０とを各２００ｍＬずつ混合した後、カラム（φ５ｃｍ×２５ｃｍ）に充填した。これにｐＨ２．９７に調整した、参考例１の培養液５０ｍＬ（５６２ｍｇのＤＯＩを含む）を添加した後、蒸留水を流速２ｍＬ／分で流すことにより溶出を行った。６ｍＬずつのフラクションを集め、得られたフラクションについて１本おきにｐＨおよび伝導度を測定した。また、３本おきにＤＯＩの定量も行った。このときの結果を図１２に示す。また、フラクションを４つのブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中のＤＯＩの純度および量を測定した。結果を表３に示す。得られた精製ＤＯＩの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１３に示す。ＤＯＩの定量方法および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定方法は実施例８と同様にして行った。【０１０９】
【表２】
0004598826.tif 000003
【０１１０】
【表３】
0004598826.tif 000004
【０１１１】
（実施例１０）
＜アンバーライト２００ＣＴとアンバーライトＩＲＡ  ９６ＳＢの二床式カラムを用いる方法＞
ＤＯＩ含有培養液（ＤＯＩ含有量：２２．１ｇ／８５０ｍＬ）を陽イオン交換樹脂カラム（アンバーライト２００ＣＴ、水素イオン型、４００ｍＬ）に負荷し、水で溶出させた。溶出液のＴＬＣ分析によりＤＯＩが含まれている画分を陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ、酢酸イオン型、６００ｍＬ）に通液し、続いて水で溶出させた。溶出液のＴＬＣ分析によりＤＯＩが含まれている画分を減圧濃縮すると、図１５の１Ｈ−ＮＭＲに示す純度のＤＯＩが２０．８ｇ得られた。その純度は混床式カラムによる精製法の場合とほぼ同程度であった。１Ｈ−ＮＭＲは、重水に溶解した試料をＢｒｕｋｅｒ社のＤＰＸ−２５０ＮＭＲ装置を用いて測定した。【０１１２】
（実施例１１）
＜ジメチルケタール誘導体に変換して結晶化・精製した後、２−デオキシ−シロ−イノソースを復元する方法＞
実施例１０の精製ＤＯＩ（１７．８ｇ）をメタノール（８３５ｍＬ）に溶解し、トリメトキシメタン（３１０ｍＬ）、トシル酸一水和物（２．１２ｇ）を加え３時間攪拌した後、重曹（３０．６ｇ）により反応液を中和し、濾過後に減圧濃縮を行った。残渣をメタノールに溶解し、その３倍量のシリカゲル（Ｃ−２００、６０ｇ）を加えて減圧濃縮することでＤＯＩをシリカゲル表面上に吸着させた。そのＤＯＩを吸着させたシリカゲルを酢酸エチル：メタノール＝５：１で作成したシリカゲルカラムに充填した。その後、酢酸エチル：メタノール＝５：１の混合溶媒を用いＤＯＩを溶出させた。ＤＯＩが含まれている溶出液を集めて減圧濃縮すると、ジメチルケタール誘導体（２０．７ｇ）を得た。続いて、メタノールを２５ｍＬ加えて溶かした溶液に、クロロホルム１００ｍＬとヘキサン７．５ｍＬとを加熱しながら加えて冷却して析出する白色結晶を分離すると、２−デオキシ−シロ−イノソース  ジメチルケタール結晶９．１ｇを得た。図１６に示す１Ｈ−ＮＭＲにおいて、不純物のシグナルは検出されていない。【０１１３】
ジメチルケタール体の結晶（９９５ｍｇ）をアセトン（２２ｍＬ）に溶かし、トシル酸一水和物（２８０ｍｇ）と蒸留水（６ｍＬ）を加え５時間攪拌した。ＴＬＣにより原料の消失を確認後、減圧濃縮した。水に溶解した残渣を陰イオン交換樹脂カラム（ＩＲＡ９６ＳＢ、酢酸イオン型、１０ｍＬ）に通液し、含有画分を濃縮することより高度に精製したＤＯＩ（７７０ｍｇ）を定量的に得た。図１７に示す１Ｈ−ＮＭＲにおいて、不純物のシグナルは検出されていない。【０１１４】
［寄託微生物の表示］
本発明において使用される寄託微生物の表示は、以下のとおりである。【０１１５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  
ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ／ｐＧＡＤ−ｂｔｒＣ
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０９
１．受領機関名：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
２．受領日：      平成１８年２月２４日
３．受領番号：    ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０９【０１１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
ＧＩ７２４ΔｒｍｆΔｐｇｉ／ｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０８
１．受領機関名：  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
２．受領日：      平成１８年２月２４日
３．受領番号：    ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８０８
【産業上の利用の可能性】
【０１１７】
本発明により、従来の石油由来の化学物質に代わり、再生可能な資源である、でんぷんなどのバイオマス由来の原料を用いて、発酵により、様々な炭素６員環化合物の製造のための出発原料となる高純度ＤＯＩを製造することが可能となった。
【０１１８】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【図１】
0004598826.tif 000005
【図２Ａ】
0004598826.tif 000006
【図２Ｂ】
0004598826.tif 000007
【図２Ｃ】
0004598826.tif 000008
【図２Ｄ】
0004598826.tif 000009
【図３Ａ】
0004598826.tif 000010
【図３Ｂ】
0004598826.tif 000011
【図４Ａ】
0004598826.tif 000012
【図４Ｂ】
0004598826.tif 000013
【図５】
0004598826.tif 000014
【図６】
0004598826.tif 000015
【図７】
0004598826.tif 000016
【図８】
0004598826.tif 000017
【図９】
0004598826.tif 000018
【図１０】
0004598826.tif 000019
【図１１】
0004598826.tif 000020
【図１２】
0004598826.tif 000021
【図１３】
0004598826.tif 000022
【図１４】
0004598826.tif 000023
【図１５】
0004598826.tif 000024
【図１６】
0004598826.tif 000025
【図１７】
0004598826.tif 000026
【配列表】
0004598826000001.app