(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式の化合物：
【化１】
0004598757.tif 000068
ここで、ＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して１−５（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の２‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して１−４（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２は（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループを形成し、
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、又はシアノであり、
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり、そして
Ｒ５及びＲ６は、タイプ（−ＯＣＨＲ９ＣＨＲ１０Ｏ−）の連鎖として結合しているフェニル炭素と共に環を形成し、ここでＲ９及びＲ１０は独立して、Ｈ、ハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フォルミル、フォルミル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１−Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）チオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり、ここでｎ＝１−３、Ｒｃ及びＲｄは直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｅ及びＲｆはＨ又は直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｇは（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、あるいはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立しており、
もし、
ｉ      Ｒ９とＲ１０が両方ともＨ、あるいは
ｉｉ    Ｒ９かＲ１０がハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又はベンゾイルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルならば、
その場合は、シアノ置換体を除いて、Ｒ１又はＲ２の炭素原子の数が４よりも大きい、又は、シアノ置換体を除いて、Ｒ１の炭素原子の数が４よりも大きく且つＲ２の炭素原子の数が４よりも大きい、そして、シアノ置換体を除いて、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の炭素原子の数の合計が１０、１１又は１２である。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であり、そこで、
ＸとＸ’はＯであり、
Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して１−５（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の２‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して１−４（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロであり、
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、又はシアノであり、
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロであり、そして
Ｒ９及びＲ１０は独立して、Ｈ、ハロ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フォルミル、フォルミル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、シアノ、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、カルボキシ、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（−（ＣＨ２）ｎＲｃＲｅ）、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、オキシモ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシモ（−Ｃ＝ＮＯＲｄ）、アルコキシモ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）カルボキサミド、（Ｃ１−Ｃ３）カルボキサミド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、セミカルバジド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、アミノカルボニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールスルホニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）チオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホキシド（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）であり、ここでｎ＝１−３、Ｒｃ及びＲｄは直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｅ及びＲｆはＨ又は直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｇは（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、あるいはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立している。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であり、そこで、Ｒ１とＲ２は（Ｃ１−Ｃ４）直鎖又は分岐鎖のアルキルで、Ｒ３はＨ又はメチルである。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であり、そこで、
Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して１−５（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の３‐ピリジルで、置換体は独立して１−４（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキルであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチルであり、
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は、独立に次の中から選ばれた：Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキルであり、そして
Ｒ９及びＲ１０は独立して、Ｈ，ハロ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、フォルミル、シアノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、カルボキシ、アミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、オキシモ（−ＣＨ＝ＮＯＨ）、（Ｃ１−Ｃ３）カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、（Ｃ１−Ｃ２）セミカルバジド（−Ｃ＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ）、アミノカルボニルオキシ（−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲｇ）、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、メチルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、メチルスルホキシド（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、メチルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、又は（Ｃ１−Ｃ５）三置換シロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル（−（ＣＨ２）ｎＳｉＯＲｄＲｅＲｇ）。ここでｎ＝１−３、Ｒｄは直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｅ及びＲｆはＨ又は直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Ｒｇは（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、あるいはハロ又は（Ｃ１−Ｃ３）アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは互いに独立している。
【請求項５】
以下の化合物で構成されるグループから選ばれた請求項１に記載の化合物：
ａ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐ヒドロキシメチル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｂ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐（ｔｅｒｔ‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル）‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｃ）７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐カルボン酸
ｄ）７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐カルボン酸メチルエステル
ｅ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐セミカルバジドメチル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｆ）フェニル‐カルバミン酸７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐イルメチルエステル
ｇ）３，５‐ジメチル‐安息香酸‐Ｎ’‐［３‐（２‐アミノ‐エチル）‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル］‐Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヒドラジド
ｈ）７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル
ｉ）７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐カルボン酸メチルアミド
ｊ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐フォルミル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｋ）トルエン‐４‐スルホン酸７‐［Ｎ’‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３，５‐ジメチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジノカルボニル］‐８‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン２‐イルメチルエステル
ｌ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐（ヒドロキシイミノ‐メチル）‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｍ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐シアノメチル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｎ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（５‐メチル‐３‐メチルスルファニルメチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド
ｏ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐メタンスルフォニルメチル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド、及び
ｐ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐Ｎ’‐（３‐フルオロメチル‐５‐メチル‐２，３‐ジヒドロ‐ベンゾ［１，４］ダイオキシン６‐カルボニル）‐ヒドラジド。
【請求項６】
以下の一般式の化合物：
【化２】
0004598757.tif 000069
ここで、ＸとＸ’は独立してＯ又はＳであり、
Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して１−５（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の２‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して１−４（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換（Ｃ１−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換（Ｃ２−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換（Ｃ３−Ｃ７）分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２は（Ｃ１−Ｃ７）シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループを形成し、
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、又はシアノであり、
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり、そして
Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ４）アルケニルアルキル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロであり、
シアノ置換体を除いて、Ｒ１又はＲ２の炭素原子の数が４よりも大きい、又は、シアノ置換体を除いて、Ｒ１の炭素原子の数が４よりも大きく且つＲ２の炭素原子の数が４よりも大きい、そして、シアノ置換体を除いて、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の炭素原子の数の合計が１０、１１又は１２である。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であり、そこで、
ＸとＸ’はＯであり、
Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して１−５（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の２‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して１−４（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロであり、
Ｒ３はＨ、メチル、エチル、又はシアノであり、
Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、シアノ、又はニトロであり、そして
Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、（Ｃ１−Ｃ４）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ又はニトロである。
【請求項８】
以下の化合物で構成されるグループから選ばれた化合物：
ｑ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヘプチル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｒ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヘプチル）‐Ｎ’‐（３‐エチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｓ）３，５‐ジメトキシ‐４‐メチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヘプチル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｔ）３，５‐ジメトキシ‐４‐メチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヘプチル）‐Ｎ’‐（４‐エチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｕ）２‐メトキシ‐ニコチン酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐ヘプチル）‐Ｎ’‐（４‐エチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｖ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３，４，４‐トリメチル‐ペント‐２‐エニル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド
ｗ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐シアノ‐ビニル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド、
ｘ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ブチル‐２，２‐ジメチル‐ペンチル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド、及び
ｙ）３，５‐ジメチル‐安息香酸Ｎ‐（１‐ブチル‐２，２‐ジメチル‐ペント‐４‐エニル）‐Ｎ’‐（３‐メトキシ‐２‐メチル‐ベンゾイル）‐ヒドラジド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物と、製薬的に容認できる担体と、を含む製剤。
【請求項１０】
宿主細胞に於いて標的遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節剤であり、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含み、宿主細胞は、第１ポリヌクレオチドを含む第１遺伝子発現カセットと、第２遺伝子発現カセットとを含んでいるが、その第１ポリヌクレオチドは第１ポリペプチドをコードしており、その中に含まれているのは、
（ｉ）トランスアクティベーション・ドメイン
（ｉｉ）ＤＮＡ結合ドメイン、そして
（ｉｉｉ）グループＨ核受容体リガンド結合ドメインであり、
第２遺伝子発現カセットに含まれるのは、
（ｉ）上記ＤＮＡ結合ドメインに結合できる応答配列
（ｉｉ）トランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター
（ｉｉｉ）上述の標的遺伝子である、遺伝子発現調節剤。
【請求項１１】
対象の中で１つ又はそれ以上の外因性遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節剤であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含む、遺伝子発現調節剤。
【請求項１２】
遺伝子導入された対象細胞の中で、内因性又は非相同性の遺伝子発現を調節する遺伝子発現調節剤であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含み、前記化合物が前記対象細胞内でエクジソン受容体複合体と結合することによって作動し、前記細胞は、エクジソン受容体複合体のためのＤＮＡ結合配列を有しており、前記化合物によって形成されるエクジソン受容体複合体／前記化合物／ＤＮＡ結合配列からなる複合体が遺伝子の発現を誘導する、遺伝子発現調節剤。
【請求項１３】
前記エクジソン受容体複合体はキメラエクジソン受容体複合体であり、前記ＤＮＡ結合配列はプロモーターを含んでいる、請求項１２に記載の遺伝子発現調節剤。
【請求項１４】
請求項１２に記載の遺伝子発現調節剤で、そこで対象は哺乳類である。
【請求項１５】
宿主細胞の遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節剤であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含み、
前記宿主細胞には遺伝子発現調節システムが導入されており、そのシステムに含まれるのは、
ｉ）第１ハイブリッド・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞の中にあり、発現を可能にする第１遺伝子発現カセットであり、そのポリペプチドに含まれるのは、
（ａ）発現調節の対象となっている遺伝子に関連した応答配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン、そして
（ｂ）エクジソン受容体リガンド結合ドメインであり、
ｉｉ）第２ハイブリッド・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むその宿主細胞の中にあり、発現を可能にする第２遺伝子発現カセットであり、そのポリペプチドに含まれるのは、
（ａ）トランスアクティベーション・ドメイン、そして
（ｂ）キメラ・レチノイドＸ受容体結合ドメインであり、そして
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞の中で発現を可能にする第３遺伝子発現カセットであり、そのポリヌクレオチドに含まれるのは、
（ａ）第１ハイブリッド・ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答配列、
（ｂ）第２ハイブリッド・ポリペプチドのアクティベーション・ドメインが活性化するプロモーター
（ｃ）発現調節の対象である遺伝子である、遺伝子発現調節剤。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を含み、細胞に接触させることによってポリペプチドを生成する、ポリペプチド生成剤であって、
前記細胞には、ＤＮＡコンストラクトとエクジソン受容体複合体が導入され、
前記ＤＮＡコンストラクトは、ポリペプチドをコードする外因性遺伝子と、応答配列とを含み、前記外因性遺伝子は前記応答配列のコントロール下にあり、
前記エクジソン受容体複合体は、ＤＮＡ結合ドメインと、リガンド結合ドメインと、トランスアクティベーション・ドメインとを含む、ポリペプチド生成剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、2003年2月10日に提出された米国仮出願番号60/446,223への優先権を請求する。
[発明の分野]
[0001] 本発明は生物工学または遺伝子工学の分野に関係している。特に、本発明は遺伝子の発現分野に関係している。更に具体的には、本発明は天然及び突然変異の核受容体に対する非ステロイド・リガンド、核受容体ベースの誘導性遺伝子発現に於けるその使用、そしてこういうリガンド及び誘導性発現システムを使って宿主細胞内で遺伝子の発現を調節する方法に関係している。
【発明の背景】
【０００２】
[0002] 本出願には種々の出版物が引用されており、その明細は全て参照として編入されている。しかし、参照の引用があったとしても、そういう参照が「従来の技術」として即座に応用可能であると解釈されるべきではない。
【０００３】
[0003] 遺伝子工学の分野では、遺伝子発現の正確なコントロールは、発育や他の生理学的プロセスの研究、操作、及びコントロールにとって貴重な道具である。遺伝子発現は、蛋白質間の特異的な数多くの相互作用を含む複雑な生物学的プロセスである。遺伝子発現が活性化され、蛋白質合成の第1段階に必要なRNAの生成が行なわれるには、転写アクティベータが、遺伝子転写をコントロールするプロモーターの近くに運ばれなければならない。普通、転写アクティベーター自身、遺伝子のプロモーター部位のDNA結合サイトに結合する少なくとも１つのDNA結合ドメインを持つ蛋白質と提携している。従って、遺伝子の発現が起きるには、DNA結合ドメインとDNA結合ドメインから適切な距離にあるトランスアクティベーション・ドメインを含む蛋白質が、遺伝子のプロモーター部位の正確な位置に運ばれなければならない。
【０００４】
[0004] 従来の遺伝子導入方法は、設計された導入遺伝子の発現を行なうために、細胞タイプに特異的なプロモーターを利用する。導入遺伝子を含むDNAコンストラクトは、宿主のゲノムにまず取り込まれ、転写アクティベータによる刺激があると、所定の細胞タイプで導入遺伝子の発現が起きる。
【０００５】
[0005] 細胞内にある外来性の遺伝子の発現を規制する別の方法は、誘導性プロモーターを通して行われる。そういう誘導性プロモーターの使用例には、PR1-aプロモーター、原核生物のレプレッサー・オペレーター・システム、免疫抑制イミュノフィリン・システム、ステロイド・ホルモン受容体システムのようなより高度な真核生物の転写活性化システムなどが含まれ、以下で説明される。
【０００６】
[0006] タバコから得られるPR1-aプロモーターは、病原体の攻撃後、全身性の獲得抵抗反応時に誘導される。PR1-aプロモーターの使用は、内因性の物質、そして病原体、UV-B照射、汚染物などの外的要因に反応する場合が多いので、制限される場合がある。熱ショック、インターフェロン、そして重金属により誘導されるプロモーター・ベースの遺伝子調節システムについては報告がある (ワーン (Wurn) 等、1986、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; アーンハイター (Arnheiter) 等、1990、細胞 (Cell) 62: 51-61; フィルマス (Filmus) 等、1992、核酸研究 (Nucleic Acids Research) 20:27550-27560)。しかし、こういうシステムは、標的とする遺伝子以外の遺伝子発現に影響を及ぼすので限界がある。
【０００７】
[0007] 原核生物のレプレッサー・オペレーター・システムは、バクテリアのレプレッサー蛋白質とそれが結合するユニークなオペレーターDNA配列によって機能する。大腸菌 (Escherichia coli) から得られるテトラサイクリン (“Tet”) と乳糖 (“Lac”) のレプレッサー・オペレーター・システムは、遺伝子発現をコントロールするために植物と動物で使用されている。Tetシステムでは、テトラサイクリンがTetＲレプレッサー蛋白質に結合し、その結果構造上の変化が生じ、オペレーターからレプレッサー蛋白質を放出し、それが原因で転写が起きる。Lacシステムでは、乳糖あるいはイソプロピル-b-D-チオガラクトシドのような合成類似体の存在に反応して、lacオペロンが活性化される。残念ながら、リガンドすなわちテトラサイクリンと乳糖の化学的不安定性および毒性、天然に存在存在すること、あるいは誘導または抑制には比較的高いレベルの量が要求されることなどの理由によりこういうシステムの使用には限界がある。
【０００８】
[0008] FK506、ラパマイシン、シクロスポリンＡなどの免疫抑制分子は、イミュノフィリンFKBP12、シクロフィリンなどに結合できる。この情報を基に、2つの蛋白質のそれぞれにFK506を配置するか、１つにFK506を配置し別の１つにシクロスポリンを配置する事により、2つの蛋白質を組み合わせる戦略が考案された。FK506(FK1012) の合成ホモ２量体、あるいはFK506とシクロスポリンの融合から得られる化合物 (FKCsA) が、これらの分子の２量体化を誘導するのに使用できる (スペンサー (Spencer) 等、1993、サイエンス (Science)262:1019-24; ベルショー (Belshaw) 等、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4604-7)。FKBP12と融合するGal4 DNA結合ドメイン、シクロフィリンと融合するVP16アクティベータ・ドメイン、そしてFKCsAは、プロモーターを含むGal4結合サイトのコントロールの下に、ヘテロ２量体化とレポーター遺伝子の活性化を示すのに使用された。このシステムは、残念ながら、副作用をもたらす可能性のある免疫抑制剤を含んでおり、従って哺乳類の遺伝子スイッチ・アプリケーションの使用には限界がある。
【０００９】
[0009] ステロイド・ホルモン受容体システムのようなより高度な真核生物の転写活性化システムも利用されている。ステロイド・ホルモン受容体は核受容体のスーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物の細胞に見出される。残念ながら、遺伝子発現を規制するために受容体を活性化するステロイド系化合物の使用は、それが天然の生物学的経路の他の多くにも関係しているので、特に植物と哺乳類に於いては制限されている。そういう困難を乗り越えるため、昆虫のエクジソン受容体 (EcR) を使う代替システムが開発された。
【００１０】
[00010] 昆虫の成長、脱皮、発達は、エクジソン・ステロイド・ホルモン (脱皮ホルモン) と幼若ホルモンにより調節されている (ダディアラ(Dhadialla) 等1998、Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569)。昆虫のエクジソンの分子標的は、少なくともエクジソン受容体 (EcR) とウルトラスパイラクル蛋白質 (USP) で構成される。EcRは、シグネチャーDNA、リガンド結合ドメイン、そして活性化ドメインで特徴付けられる核ステロイド受容体のスーパーファミリーのメンバーである (コエル (Koelle) 等、1991、細胞 (Cell)、67:59-77)。EcR受容体は、ポナステロンＡやムリステロンＡ等の数多くのステロイド化合物に反応する。最近、エクジステロイド作用活性を持つ非ステロイド化合物が発表されており、ローム・アンド・ハース・カンパニー (Rohm and Haas Company) が全世界で市販している農薬、テブフェノジドやメトキシフェノジドもその中に含まれる (国際特許出願番号PCT/EP96/00686および米国特許5,530,028を参照の事)。両類似体は、他の有機体に対し一際優れて安全である。
【００１１】
[00011] 昆虫のエクジソン受容体 (EcR) は哺乳類のRXRに相当する昆虫の相同体であるウルトラスパイラクル (Ultraspiracle) (USP) とヘテロ２量体を形成し、エクジステロイド及びエクジソン受容体応答配列と結合し、エクジソン反応遺伝子の転写を活性化する。EcR/USP/リガンド複合体は、昆虫の発育及び繁殖期間中重要な役割を演じる。EcRはステロイド・ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーで、５つの調節ドメイン、すなわちA/B (トランスアクティベーション)、Ｃ（ＤＮＡ結合、ヘテロ２量体化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ２量体化）、Ｅ（リガンド結合、ヘテロ２量体化及びトランスアクティベーション）、そしてＦ（トランスアクティベーション）ドメインを有している。これらのドメインのいくつか、例えばA/B、Ｃ，そしてＥは、他の蛋白質との融合によってもその機能を維持している。
【００１２】
[00012] 厳格に調節された誘導性遺伝子発現システム、すなわち「遺伝子スイッチ」は、遺伝子療法、細胞内に於ける大量の蛋白質生産、細胞を用いた高処理スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、遺伝子導入植物や動物での発現形質の調節など種々のアプリケーションに有益である。
【００１３】
[00013] EcRベースの遺伝子スイッチの最初のバージョンは、ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster) のEcR (DmEcR) とハツカネズミ (Mus musculus) のRXR (MmRXR) を使い、これらの受容体が、ポナステロンＡステロイドの存在の下に、哺乳類の細胞株と遺伝子導入マウスのレポーター遺伝子をトランスアクティベートする事を示した (クリストファーソン(Christopherson) K. S.、マーク (Mark) M.R.、バジャ (Baja) J. V.、ゴドウィスキー (Godowski) P. J. 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 89: 6314-6318; ノー (No) D.、ヤオ (Yao) T. P.、エバンス (Evance) R. M.、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 3346-3351)。  後に、サー (Suhr) 等は、1998、Proc. Natl.Acad. Sci. 95：7999−8004に於いて、エクジソン作用薬であるテブフェノジドが、外因性のヘテロ２量体パートナーの不在下に、蚕 (Bombyx mori) のEcR (BmEcR) を通し、哺乳類の細胞に於いてレポーター遺伝子のトランスアクティベーション・レベルを高める事を示した。
【００１４】
[00014] 国際特許出願番号PCT/US97/05330 (WO 97/38117) 及び PCT/US99/08381 (WO99/58155) は、外因性遺伝子の発現の調節方法を開示したが、それによると、外因性遺伝子とエクジソン応答配列を含むDNAコンストラクトがエクジソン受容体を含む第2のDNAコンストラクトによって活性化され、第2のDNAコンストラクトはそのリガンドの存在下に、できればサイレント・パートナーとして活動できる受容体の存在下に、エクジソン応答配列と結合し、遺伝子発現を誘導する。選択されたエクジソン受容体は、ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)から単離された。普通、そういうシステムが最適活性化を提供するには、サイレント・パートナー、できればレチノイドＸ受容体 (RXR) の存在を必要とする。哺乳類の細胞では、昆虫のエクジソン受容体 (EcR) はレチノイドＸ受容体 (RXR)とヘテロ２量体を形成し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願番号PCT/US98/14215 (WO 99/02683) は、蚕蛾 (Bombyx mori) から単離されたエクジソン受容体が、外因性の２量体パートナーの必要性なしに、哺乳類システムで機能する事を明らかにした。
【００１５】
[00015] 米国特許番号6,265,173 Ｂ1は、ステロイド／サイロイド受容体スーパーファミリーの種々のメンバーが、ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)のウルトラスパイラクル受容体 (USP) あるいは遺伝子発現システムで使用されるUSPの２量体化ドメインを少なくとも含むその断片と結合できる事を明らかにした。米国特許番号5,880,333は、ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster) のEcRと植物で使用されるウルトラスパイラクル (USP) ヘテロ２量体システムについて、トランスアクティベーション・ドメインとDNAドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質の上に配置されている事を明らかにした。残念ながら、こういうUSPベースのシステムは、動物細胞の構成要素であり、従ってレポーター遺伝子発現の調節には有効ではない。
【００１６】
[00016] こういうケースでは、トランスアクティベーション・ドメインとDNAドメイン (国際特許出願番号PCT/US98/14215では天然のEcRとして、国際特許出願番号PCT/US97/05330では修正されたEcRとして) は単一の分子に取り込まれ、他のヘテロ２量体パートナー、つまりUSPかRXRが天然の状態で使われていた。
【００１７】
[00017] 上述のEcRベースの遺伝子制御システムの欠点は、リガンドの不在下にかなりのバックグランド活性がある事、そしてこういうシステムは植物と動物の両方には適用できない事などが含まれる (米国特許番号5,880,333を参照の事）。従って、業界では、植物と動物の両方で外因性の遺伝子の発現を正確に調節できる改善されたEcRベースのシステムが必要とされている。そういう改善されたシステムは、遺伝子療法、大量の蛋白質及び抗体の生産、細胞ベースの高処理スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、遺伝子導入動物の形質発現の調節などのアプリケーションに有益である。遺伝子療法のようなある種のアプリケーションでは、合成非ステロイド・リガンドに良く反応する誘導性遺伝子発現システムを持ち、それと同時に天然のステロイドには反応しない事が望ましい。従って、改善されたシステムとは、簡単で、簡潔で、比較的安価で、直ぐ入手可能であり、宿主にとって毒性の低いリガンドに依存するもので、それが生物学的システムの調節には有効であることが実証されるであろう。
【００１８】
[00018] トランスアクティベーションとDNA結合ドメインを各々２つの異なる蛋白質上に配置することによって、互いに分離されているエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムでは、リガンドの不在下でのバックグランド活性が大幅に減少し、リガンドの存在下にバックグランド活性を超える活性が大幅に上昇した事が最近報告されている (出願中PCT/US01/09050、参照のためその全体をこの出願に取り入れる)。この２つのハイブリッド・システムは、出願PCT/US97/05330及びPCT/US98/14215で開示された2つのシステムと比べて、大幅に改善された誘導性の遺伝子発現調節システムである。２つのハイブリッド・システムは、相互作用する２つの蛋白質の能力を利用して、転写活性化ドメインをDNA結合ドメインとの関係でより望ましい位置に移動させており、その結果、DNA結合ドメインが遺伝子のDNA結合サイトに結合すると、トランスアクティベーション・ドメインはより効果的にプロモーターを活性化する。簡単に言えば、２つのハイブリッド遺伝子発現システムには２つの遺伝子発現カセット、すなわち核受容体ポリペプチドと融合するDNA結合ドメインのコード、及び異なる核受容体ポリペプチドと融合するトランスアクティベーション・ドメインのコードが含まれている。リガンドの存在下で、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの相互作用により、DNA結合ドメインがトランスアクティベーション・ドメインに効率的に繋ぎ止められる。DNA結合ドメインとアクティベーション・ドメインは2つの異なる分子上にあるため、リガンド不在下のバックグランド活性は大幅に減少する。
【００１９】
[00019] 2ハイブリッド・システムは、ポナステロンＡ（PonA）やムリステロンＡ（MurA）のようなステロイド系リガンドと比べて、ジアシルヒドラジンなどの非ステロイド系リガンドの方により優れた感受性を提供する。更に、EcR遺伝子スイッチに基づくトランスアクティベーションは細胞株依存の場合が多いので、スイッチング・システムをアプリケーション毎に調節し、最大のトランスアクティベーション能力を得るのは容易な事である。更に、非改良RXRをスイッチング・パートナーとして使う時RXRの過発現が生じやすいが、2ハイブリッド・システムはそれが原因で起きる副作用のいくつかを回避できる。好ましいハイブリッド・システムでは、EcR又はRXRの天然DNA結合ドメイン及びトランスアクティベーション・ドメインが排除され、その結果、そういうハイブリッド分子が細胞内に存在する他のステロイド・ホルモン受容体と相互作用を起こすチャンスが少なくなり、副作用の減少が促進される。
【００２０】
[00020] エクジソン受容体ベース遺伝子調節システムの改善により、種々のアプリケーションへのその使用が増大し、ひいては現在よりも活性の高いリガンドへの需要が上昇する。米国特許6,258,603 B1 (及びそこで引用されている特許)はジベンゾイルヒドラジン・リガンドを開示しているが、異なる構造と物理化学的性質を持つ追加リガンドの必要性が存在する。我々は新規のジアシルヒドラジン・リガンドを発見した。この化合物は、導入遺伝子の発現調節能力について今まで記述された事も証明された事もなかった。
【発明の要約】
【００２１】
[00021] 本発明は、核受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムとその機能を誘発する非ステロイド系リガンドを使って宿主細胞内の遺伝子発現を調節する方法に関係している。
【００２２】
[00022] 出願者の発明は、本発明のリガンドによって促進される遺伝子発現調節システムを使って、宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法にも関係している。特に、出願者の発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法を提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）ｉ）遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインと結合するドメインを含む応答配列； ii）遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子からなる遺伝子発現カセットを宿主細胞に導入；ｃ）リガンドを宿主細胞へ導入。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。出願者の発明は、遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインと結合するドメインを含む応答配列、それを含む遺伝子発現カセット、それを含む宿主細胞内で、遺伝子の発現を調節する方法；遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインによって活性化されるプロモーター；そして発現が調節の対象となっている遺伝子も提供する。方法は次のステップで構成される：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）リガンドを宿主細胞へ導入。ここで、リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【発明の詳細説明】
【００２３】
[00023] 出願者は、天然及び突然変異の核受容体のために新規のリガンドを発見した。従って、出願者の発明は、宿主細胞内で関心のある遺伝子の発現を調節するのに役立つエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システム用リガンドを提供する。特に好ましい実施例では、背景遺伝子発現のレベルが縮小し、非ステロイド系リガンドのサブマイクロモル濃度に反応する誘導性遺伝子発現システムを出願者の発明は提供する。従って、出願者による新規のリガンド、誘導性遺伝子発現システム、そして宿主内の遺伝子発現を調節する方法に於けるその使用は、現在利用可能な誘導性発現システムの限界を乗り越えるものであり、腕のいい熟練工に遺伝子発現をコントロールする効果的な手段を提供する。
【００２４】
[00024] 本発明は、遺伝子療法、大量の蛋白質及び抗体の生産、細胞ベースの高処理量スクリーニング・アッセイ、機能ゲノミックス、プロテオミクス、メタボロミクス、遺伝子導入有機体の特徴の調節など遺伝子発現のコントロールが望まれるアプリケーションに有益である。出願者の発明の有利な点は、遺伝子発現を調節する手段、及びユーザーの要件に合った発現レベルに調節する手段を提供する事である。
【００２５】
[00025] 本発明は、以下の一般式の化合物に関係する。
【化７】
0004598757.tif 000002
【００２６】
[00026] ＸとＸ’は独立してＯ又はＳである。
【００２７】
[00027] Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して1-5 H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、(C2-C4) アルケニル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の2‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して1-４ H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、(C2-C4) アルケニル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロである。
【００２８】
[00028] Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換 (C1-C7) 分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換 (C2-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換 (C3-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２の原子価は (C1-C7) シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループ (Ra Rb C=) を形成する。ここでRa及びRb の非置換炭素数の合計は0−6である。
【００２９】
[00029] Ｒ3  はＨ、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、又はシアノである。
【００３０】
[00030] Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８  は、独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、(C2-C4)アルケニル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、又はニトロである。そして
【００３１】
[00031] Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、(C2-C4)アルケニル、(C3-C4)アルケニルアルキル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、(C1-C4)アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、又はタイプ(−OCHR9CHR10O−)の連鎖として結合しているフェニル炭素と共に環を形成する。ここでR9及びR10は独立して、Ｈ，ハロ、(C1-C3)アルキル、(C2-C3)アルケニル、(C1-C3)アルコキシ(C1-C3)アルキル、ベンゾイルオキシ(C1-C3)アルキル、ヒドロキシ(C1-C3)アルキル、ハロ(C1-C3)アルキル、フォルミル、フォルミル(C1-C3)アルキル、シアノ、シアノ(C1-C3)アルキル、カルボキシ、カルボキシ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルコキシカルボニル(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルカルボニル(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルカノイルオキシ(C1-C3)アルキル、アミノ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルアミノ(C1-C3)アルキル、(−(CH2)nRcRe)、オキシモ (-CH=NOH)、オキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルコキシモ (-C=NORd)、アルコキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)カルボキサミド(-C(O)NReRf)、(C1-C3)カルボキサミド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)セミカルバジド (-C=NNHC(O)NReRf)、セミカルバジド(C1-C3)アルキル、アミノカルボニルオキシ (-OC(O)NHRg)、アミノカルボニルオキシ(C1-C3)アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル(C1-C3)アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、アリールスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)チオ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホキシド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホニル(C1-C3)アルキル、又は(C1-C5)三置換シロキシ(C1-C3)アルキル (-(CH2)nSiORdReRg)。ここでｎ＝1−3、Rｃ及びRdは示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rｃ及びRdはＨ又は示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rgは(C1-C3)アルキル、あるいはハロ又は(C1-C3)アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Rｃ、Rｄ、Rｅ、Rｆ、及びRgは互いに独立している。
【００３２】
[00032] もし以下の如くならば、
ｉ  R9とR10が両方ともＨ、あるいは
ii  R9かR10がハロ、(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルコキシ(C1-C3)アルキル、又はベンゾイルオキシ(C1-C3)アルキル、
あるいは
iii  R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプの連鎖を形成しない。
【００３３】
[00033] その場合は、シアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1かR2のいずれか又は両方に関して４よりも大きい、そしてシアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1、R2、そしてR3は、10、11、又は12である。
【００３４】
[00034] 一般式の化合物は以下の場合望ましい。
【００３５】
[00035] ＸとＸ’はＯである。
【００３６】
[00036] Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して1-5 H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の2‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して1-４ H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロである。
【００３７】
[00037] Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換 (C1-C7) 分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換 (C2-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換 (C3-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２の原子価は (C1-C7) シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループ (Ra Rb C=) を形成する。ここでRa及びRb の非置換炭素数の合計は0−6である。
【００３８】
[00038] Ｒ3  はＨ、メチル、エチル、又はシアノである。
【００３９】
[00039] Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８  は、独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロである。そして
【００４０】
[00040] Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、(C1-C4)アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、又はタイプ(−OCHR9CHR10O−)の連鎖として結合しているフェニル炭素と共に環を形成する。ここでR9又はR10はＨ、そして代替R9又はR10は、Ｈ，ハロ(C1-C3)アルキル、フォルミル、フォルミル(C1-C3)アルキル、シアノ、シアノ(C1-C3)アルキル、カルボキシ、カルボキシ(C1-C3)アルキル、アミノ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルアミノ(C1-C3)アルキル、(−(CH2)nRcRe)、オキシモ (-CH=NOH)、オキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルコキシモ (-C=NORd)、アルコキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)カルボキサミド、(C1-C3)カルボキサミド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)セミカルバジド (-C=NNHC(O)NReRf)、セミカルバジド(C1-C3)アルキル、アミノカルボニルオキシ (-OC(O)NHRg)、アミノカルボニルオキシ(C1-C3)アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル(C1-C3)アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、アリールスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)チオ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホキシド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホニル(C1-C3)アルキル、又は(C1-C5)三置換シロキシ(C1-C3)アルキル (-(CH2)nSiORdReRg)。ここでｎ＝1−3、Rｃ及びRdは示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rｃ及びRdはＨ又は示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rgは(C1-C3)アルキル、あるいはハロ又は(C1-C3)アルキルで任意に置換されたアリールを表し、Rｃ、Rｄ、Rｅ、Rｆ、及びRgは互いに独立している。
【００４１】
[00041] もし以下の如くならば、
ｉ  R9とR10が両方ともＨ、あるいは
ii  R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプの連鎖を形成しない。
【００４２】
[00042] その場合は、シアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1かR2のいずれか又は両方に関して４よりも大きい、そしてシアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1、R2、そしてR3は、10、11、又は12である。
【００４３】
[00043] 一般式の化合物は以下の場合望ましい。
【００４４】
[00044] ＸとＸ’はＯである。
【００４５】
[00045] Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して1-5 H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロ；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の2‐ピリジル、３‐ピリジル、又は４‐ピリジルで、置換体は独立して1-４ H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロである。
【００４６】
[00046] Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換 (C1-C7) 分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換 (C2-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換 (C3-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２の原子価は (C1-C7) シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループ (Ra Rb C=) を形成する。ここでRa及びRb の非置換炭素数の合計は0−6である。
【００４７】
[00047] Ｒ3  はＨ、メチル、エチル、又はシアノである。
【００４８】
[00048] Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８  は、独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、シアノ、又はニトロである。そして
【００４９】
[00049] Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、(C1-C4)アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、又はタイプ(−OCHR9CHR10O−)の連鎖として結合しているフェニル炭素と共に環を形成する。ここでR9又はR10はＨ、そして代替R9又はR10は、Ｈ，ハロ(C1-C3)アルキル、フォルミル、フォルミル(C1-C3)アルキル、シアノ、シアノ(C1-C3)アルキル、カルボキシ、カルボキシ(C1-C3)アルキル、アミノ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルアミノ(C1-C3)アルキル(−(CH2)nRcRe)、オキシモ (-CH=NOH)、オキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルコキシモ (-C=NORd)、アルコキシモ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)カルボキサミド(-C(O)NReRf)、(C1-C3)カルボキサミド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)セミカルバジド (-C=NNHC(O)NReRf)、セミカルバジド(C1-C3)アルキル、アミノカルボニルオキシ (-OC(O)NHRg)、アミノカルボニルオキシ(C1-C3)アルキル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル(C1-C3)アルキル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、アリールスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)チオ(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホキシド(C1-C3)アルキル、(C1-C3)アルキルスルホニル(C1-C3)アルキル、又は(C1-C5)三置換シロキシ(C1-C3)アルキル (-(CH2)nSiORdReRg)。ここでｎ＝1−3、Rｃ及びRdは示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rｃ及びRdはＨ又は示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rgは(C1-C3)アルキル、あるいはハロ又は(C1-C3)アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Rｃ、Rｄ、Rｅ、Rｆ、及びRgは互いに独立している。
【００５０】
[00050] もし以下の如くならば、
ｉ  R9とR10が両方ともＨ、あるいは
ii  R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプの連鎖を形成しない。
【００５１】
[00051] その場合は、シアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1かR2のいずれか又は両方に関して４よりも大きい、そしてシアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1、R2、そしてR3は、10、11、又は12である。
【００５２】
[00052] R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプとして、結合しているフェニル炭素と環を形成し、R9とR10のいずれかがＨではない場合、
【００５３】
[00053] その場合は、R1とR2は(C1-C4)直鎖又は分岐鎖のアルキルで、R3はＨ又はメチルである。
【００５４】
[00054] 一般式の化合物は以下の場合望ましい。
【００５５】
[00055] ＸとＸ’はＯである。
【００５６】
[00056] Ｙは
（ａ）置換又は非置換フェニルで、置換体は独立して1-5 H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル；あるいは
（ｂ）置換又は非置換の３‐ピリジルで、置換体は独立して1-４ H、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキルである。
【００５７】
[00057] Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、シアノ、シアノ置換又は非置換 (C1-C7) 分岐鎖又は直鎖アルキル、シアノ置換又は非置換 (C2-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニル、シアノ置換又は非置換 (C3-C7) 分岐鎖又は直鎖アルケニルアルキル、あるいは一緒にＲ１及びＲ２の原子価は (C1-C7) シアノ置換又は非置換アルキリデン・グループ (Ra Rb C=) を形成する。ここでRa及びRb の非置換炭素数の合計は0−３である。
【００５８】
[00058] Ｒ3  はメチルである。
【００５９】
[00059] Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８  は、独立に次の中から選ばれた：Ｈ、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル。そして
【００６０】
[00060] Ｒ５及びＲ６は独立して、Ｈ、(C1-C4)アルキル、ハロ (F, Cl, Br, I)、(C1-C4)ハロアルキル、(C1-C4)アルコキシ、又はタイプ(−OCHR9CHR10O−)の連鎖として結合しているフェニル炭素と共に環を形成する。ここでR9又はR10はＨ、そして代替R9又はR10は、Ｈ，ハロ(C1-C2)アルキル、フォルミル、シアノ(C1-C2)アルキル、カルボキシ、アミノ(C1-C2)アルキル、オキシモ (-CH=NOH)、(C1-C3)カルボキサミド(-C(O)NReRf)、(C1-C2)セミカルバジド (-C=NNHC(O)NReRf)、アミノカルボニルオキシ (-OC(O)NHRg)、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル、ｐ−トルエンスルホニルオキシ(C1-C3)アルキル、メチルチオ(C1-C2)アルキル、メチルスルホキシド(C1-C2)アルキル、メチルスルホニル(C1-C2)アルキル、又は(C1-C5)三置換シロキシ(C1-C3)アルキル (-(CH2)nSiORdReRg)。ここでｎ＝1−3、Rdは示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rｃ及びRdはＨ又は示された長さの直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を表し、Rgは(C1-C3)アルキル、あるいはハロ又は(C1-C3)アルキルで選択的に置換されたアリールを表し、Rｃ、Rｄ、Rｅ、Rｆ、及びRgは互いに独立している。
【００６１】
[00061] もし以下の如くならば、
ｉ  R9とR10が両方ともＨ、あるいは
ii  R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプの連鎖を形成しない。
【００６２】
[00062] その場合は、シアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1かR2のいずれか又は両方に関して４よりも大きい、そしてシアノ置換体の炭素数を除いた炭素原子の数は、グループR1、R2、そしてR3は、10、11、又は12である。
【００６３】
[00063] R5とR6が (-OCHR9CHR10O-) タイプとして、結合しているフェニル炭素と環を形成し、R9とR10のいずれかがＨではない場合。
【００６４】
[00064] その場合は、R1とR2はメチルである。
【００６５】
[00065] 本発明の化合物のうち最も望ましいのは以下の通りである。
【化８】
0004598757.tif 000003
【化９】
0004598757.tif 000004
【化１０】
0004598757.tif 000005
【００６６】
[00066] 本発明の一般式の化合物はいくつかのステレオジェニック炭素原子を含んでいる場合があるので、たとえ立体中心が明示されたとしても、鏡像異性体、ジアステレオマー、立体異性体、あるいはその混合物として存在する。
【００６７】
定義
[00067] Ｒｘグループが明記されており、ｘが文字a - g を表しており、同じＲｘグループが (C1-C3) のようなアルキル・グループの鎖の長さで明記されている場合は、明記されている鎖の長さはＲｘがアルキルの場合だけを言及しているのであり、ＲｘがＨやアリールのようなアルキルではないグループの場合とは関係がない。
【００６８】
[00068] 「アルキル」と言う用語は、分岐鎖及び直鎖両方ののアルキル・グループを含む。典型的なアルキル・グループは、例えば、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、第二級ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ｎ‐ペンチル、イソペンチル、ｎ‐へキシル、ｎ‐へプチル、イソオクチル、ノニル、デシルなどである。
【００６９】
[00069] 「ハロ」と言う用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、あるいはヨードである。
【００７０】
[00070] 「ハロアルキル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルキル・グループを言い、例えば、クロロメチル、2‐ブロモエチル、3‐ヨードプロピル、トリフルオロメチル、パーフルオロプロピルなどである。
【００７１】
[00071] 「シクロアルキル」と言う用語は、アルキル、ヒドロキシ、ハロなどで任意にに置換された環式脂肪族構造を言い、例えば、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、２‐ヒドロキシシクロペンチル、シクロへキシル、４‐クロロシクロヘキシルなどである。
【００７２】
[00072] 「ヒドロキシアルキル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヒドロキシ・グループにより置換されたアルキル・グループを言い、例えば、ヒドロキシメチル、2,3‐ジヒドロキシブチルなどである。
【００７３】
[00073] 「アルキルスルホニル」と言う用語は、アルキル・グループで置換されたスルホニル部分を言い、例えば、メシル、ｎ‐プロピルスルホニルなどである。
【００７４】
[00074] 「アルケニル」と言う用語は、１つ又は２つのエチレン結合を持つ直鎖又は分岐鎖のエチレン的に不飽和の炭化水素グループを言い、例えば、ビニル、アリル、１‐ブテニル、２‐ブテニル、イソプロペニル、２‐ペンテニルなどである。
【００７５】
[00075] 「ハロアルケニル」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルケニル・グループを言う。
【００７６】
[00076] 「アルキニル」と言う用語は、１つ又は２つのアセチレン結合を持つ直鎖又は分岐鎖の不飽和炭化水素グループで、例えば、エチニル、プロパルギルなどである。
【００７７】
[00077] 「アルキルカルボニル」と言う用語は、アルキルケト機能を言い、例えば、アセチル、ｎ‐ブチリルなどである。
【００７８】
[00078] 「ヘテロサイクリル」又は「ヘテロサイクル」と言う用語は、1つ、２つ、あるいは３つのヘテロ原子を含む置換された又は置換されていない、飽和、部分的不飽和、あるいは不飽和の５乃至６員環を言い、１つ又は２つのヘテロ原子が酸素、窒素、硫黄を含むグループから独立に選択されているのが望ましい。ヘテロサイクリルには、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、モルフォリニル、ピペラジニル、ジオキソラニル、ジオキサニルなどがある。
【００７９】
[00079] 「アルコキシ」と言う用語は、末端の酸素原子に結合した分岐鎖及び直鎖のアルキル・グループを言う。典型的なアルコキシ・グループには、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、イソプロポキシ、第三級ブトキシなどがある。
【００８０】
[00080] 「ハロアルコキシ」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルコキシ・グループを言い、例えば、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、パーフルオロイソブトキシなどがある。
【００８１】
[00081] 「アルキルチオ」と言う用語は、末端の硫黄原子に結合する分岐鎖及び直鎖のアルキル・グループを言い、例えば、メチルチオなどがある。
【００８２】
[00082] 「ハロアルキルチオ」と言う用語は、1つ又はそれ以上のハロ・グループで置換されたアルキルチオ・グループを言い、例えば、トリフルオロメチルチオなどがある。
【００８３】
[00083] 「アルコキシアルキル」と言う用語は、アルコキシ・グループで置換されたアルキル・グループを言い、例えば、イソプロポキシメチルなどがある。
【００８４】
[00084] 「シリカゲル・クロマトグラフィー」と言う用語は、精製方法を意味し、ガラス、プラスチック、又は金属製のシリンダーにシリカゲル又は化学的に修飾されたシリカゲルを詰めた縦型カラムの上部に、関心のある化学物質を濃縮サンプルとして適用する事、及びそういうカラムから溶媒又は混合溶媒を持ちいて行う溶出を言う。
【００８５】
[00085] 「フラッシュ・クロマトグラフィー」と言う用語は、通常10乃至50 psi の範囲で空気、アルゴン、又は窒素圧の下に行なわれるシリカゲル・クロマトグラフィーを言う。
【００８６】
[00086] 「グラジエント・クロマトグラフィー」と言う用語は、混合溶媒の構成を連続的に変化させる事により化学物質をカラムから溶出させるシリカゲル・クロマトグラフィーを言う。
【００８７】
[00087] 「Rf」と言う用語は、薄層クロマトグラフィーに使用される用語で、関心のある化学物質が溶出溶媒の動きの距離と比較して薄層クロマトグラフィーのプレート上を移動する分距離を言う。
【００８８】
[00088] 「パール・水素添加装置 (Parr hydrogenator) 又はパール・シェーカー (Parr shaker)」と言う用語は、イリノイ州モリン(Moline, IL) にあるパール・インスツルメント・カンパニー (Parr InstrumentCompany) から入手可能な装置を言い、関心のある化学物質を含む溶液を反応ガスの加圧雰囲気の下に、懸濁した固体触媒と激しく混合する操作を簡便化するために設計されたものである。ガスは通常水素を使い、触媒は細かい木炭粒子の上に置かれたパラジウム、プラチナ、あるいはその酸化物である。
【００８９】
[00089] 「デス‐マーチン (Dess-Mrtin) 試薬」と言う用語は、アクロス・オーガニックス／フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー(Acros Organics/Fisher Scientific Company) L.L.C.から入手可能な (1,1,1‐トリアセトキシ)−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンジオドキソール‐３(１Ｈ)‐オンのジクロロメタン溶液を言う。
【００９０】
[00090] 「PS-NMM」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス (San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (Argonaut Technologies) から入手可能なSO2NH(CH2)3-モルフォリンの機能を向上させたポリスチレン樹脂である。
【００９１】
[00091] 「AP-NCO」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス (San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (Argonaut Technologies) から入手可能な機能を向上させたイソシアンテ樹脂を言う。
【００９２】
[00092] 「APトリサミン」と言う用語は、カリフォルニア州サンカーロス (San Carlos, CA) のアーゴノート・テクノロジーズ (Argonaut Technologies) から入手可能なポリスチレンCH2NHCH2CH2NH(CH2CH2NH2)2樹脂を言う。
【００９３】
[00093] 本発明の目的で使われる「分離された」と言う用語は、最初の環境 (天然に存在する環境) から除かれた生物学的物質 (核酸又は蛋白質)を意味する。例えば、植物や動物の中に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは分離されていないが、天然に存在する隣接した核酸から分離されたポリヌクレオチドは「分離された」と見なされる。「精製された」と言う用語は、他の化合物の存在が全くない完全に純粋な状態の存在を言うのではない。むしろ相対的な意味で使われる。
【００９４】
[00094] ポリヌクレオチドは最初の物質又は天然の物質を精製した後は、少なくとも1桁、望ましくは２乃至3桁、更に望ましくは４乃至5桁の割合で「精製された」状態にある。
【００９５】
[00095] 「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合のサブユニットで構成される重合化合物である。核酸にはポリリボ核酸 (RNA) とポリデオキシリボ核酸(DNA) が含まれる。両方とも一本鎖か二本鎖である。DNAには、これだけに限定されるものではないが、cDNA、 ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNA、半合成DNAなどがある。DNAは直線の場合も、環状の場合も、高次コイルの場合もある。
【００９６】
[00096] 「核酸分子」は、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、あるいシチジン；RNA分子)、又はデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、あるいデオキシシチジン；DNA分子)のリン酸エステル重合体、あるいはホスホロチオアートやチオエステルのようなそのリン酸エステル類似体を言い、一本鎖の場合と二本鎖のヘリックスの場合がある。二本鎖のDNA-DNA、DNA-RNA、そしてRNA-RNAヘリックスも可能である。核酸分子と言う用語、特にDNA又はRNAは、分子の一次構造と二次構造のみを言うのであり、特定の三次構造に限定されるものではない。従ってこの用語には、特に、直線又は環状のDNA分子(例えば制限断片)、プラスミド、そして染色体の中に含まれる二本鎖のDNAも含まれる。特定の二本鎖DNA分子の構造を語る場合は、本出願に於いては、転写されていないDNA鎖 (すなわちmRNAと相同の配列を持つ鎖) に沿って５’から３’の方向のみに配列を記述する通常の方法に従って、配列が記述される。「組み換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【００９７】
[00097] 「断片」と言う用語は、標準核酸と比べて縮小した長さのヌクレオチド配列であり、共通部分に関しては標準核酸と同一のヌクレオチド配列を含んでいる。本発明によるそういう核酸の断片は、より大きいポリヌクレオチドの一部として適切な場所に含まれているかもしれない。そういう断片は様々な長さのオリゴヌクレオチドを含んでおり、本発明による核酸の連続ヌクレオチドとしては少なくとも６、８、９、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、あるいは1500がある。
【００９８】
[00098] 本出願で使用される「分離された核酸断片」と言う用語は、一本鎖又は二本鎖のRNA 又はDNAの事を言い、選択的に合成、非天然、あるいは変更されたヌクレオチド塩基も含む。DNA重合体の形で分離された核酸断片は、ｃDNA、ゲノムDNA、あるいは合成DNAの1つ又はそれ以上の断片で構成される場合もある。
【００９９】
[00099] 「遺伝子」とはポリペプチドをコードしているヌクレオチドの構築の事であり、ｃDNA及びゲノムDNA核酸も含まれる。「遺伝子」とは特定の蛋白質又はポリペプチドを発現する核酸の断片の事でもあり、これにはコード配列の前部 (５’非コード配列) と後部 (３’ 非コード配列) の調節配列も含まれる。「天然の遺伝子」とは、自らの調節配列を有する天然に見出される遺伝子の事である。「キメラ遺伝子」とは、天然の遺伝子ではない遺伝子の事であり、天然には見出されない調節および／またはコード配列を含んでいる。従って、キメラ遺伝子は異なる源から来ている調節配列及びコード配列を含んでいる場合もあるし、同じ源から来ているが天然に見出されるのとは異なる方法で並べられた調節配列及びコード配列を含んでいる場合もある。キメラ遺伝子は異なる源から来ているコード配列、および／または異なる源から来ている調節配列を含む場合もある。「内因性遺伝子」とは、有機体のゲノムに生来存在する天然の遺伝子の事である。「外来性の」遺伝子又は「非相同」遺伝子とは宿主の有機体には通常見出されないが、遺伝子移入により宿主の有機体に導入された遺伝子の事である。外来性遺伝子には、非天然の有機体又はキメラ遺伝子に挿入された天然の遺伝子を含む場合もある。「導入遺伝子」とは、形質転換の方法によりゲノムに導入された遺伝子の事である。
【０１００】
[000100] 「非相同」DNAとは、細胞又は細胞の染色体サイトに天然には存在しないDNAを意味する。非相同DNAには、細胞にとって外来性の遺伝子を含めるのが望ましい。
【０１０１】
[000101] 「ゲノム」と言う用語は、染色体、並びにミトコンドリア、葉緑体、そしてウィルスのDNA又はRNAも含む。
【０１０２】
[000102] 核酸分子は、適切な温度条件と溶液のイオン強度の下に、核酸分子の一本鎖と別の核酸分子とをアニールするならば、ｃDNA、ゲノムDNA、RNAのような別の核酸分子と「ハイブリッドする事が可能」である (サムブルック(Sambrook) 等、1989、後出を参照の事)。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は良く知られており、例証も行なわれている。サムブルック (Sambrook)、J.、フリッチュ (Fritsch)、E.F.、マニアティス(Maniatis) 分子クローニング：実験室マニュアル (Molecular Clonind)、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー (Cold Spring Harbor) (1989)、特に第11章及び表11.1 (参照として本出願にその全体を取り入れる)。温度とイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「厳密さ」を決定する。
【０１０３】
[000103] 関連性の少ない有機体の相同配列のように中程度にしか類似性のない断片のスクリーニングから、密接に関連した有機体の機能酵素を複製する遺伝子のように極めて類似の断片のスクリーニングまで、厳密さの条件を調節する事が可能である。相同核酸の予備スクリーニングには、Tm 55°に対応する厳密さの低いハイブリダイゼーション条件が使用される。例えば5 x SSC、0.1％ SDS、0.25％ミルク、ホルムアミドなし、又は30％ホルムアミド、5 x SSC、0.5％ SDS。中程度の厳密さのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応する。例えば、40％ホルムアミドと５ｘ又は６ｘSCC。高度の厳密さのハイブリダイゼーション条件は、最高のTmに対応する。例えば、50％ホルムアミド、５ｘ又は６ｘSCC。
【０１０４】
[000104] ハイブリダイゼーションの厳密さ次第では塩基間にミスマッチが起きる可能性はあるけれども、２つの核酸に相補的な配列が含まれている事がハイブリダイゼーションには必要である。「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を述べる時に使用される。例えば、DNAに関して言えば、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明は、本出願で開示あるいは使用された完全な配列並びに実質的に類似の核酸配列に相補的な分離核酸断片も含んでいる。
【０１０５】
[000105] 本発明の特定の実施例に於いては、Tm 55°のハイブリダイゼーション・ステップを含むハイブリダイゼーション条件と上述の条件を利用する事により、ポリヌクレオチドが検出される。望ましい実施例ではTmは60℃、更に望ましい実施例ではTmは63℃、更に望ましい実施例ではTmは65℃である。
【０１０６】
[000106] ハイブリダイゼーション後の洗浄も厳密さの条件を決定する。望ましい条件のセットでは一連の洗浄が行なわれ、まず６X SSC、0.5％SDS、室温で15分を条件に開始され、次に２XSSC、0.5％SDS、45℃で30分繰り返し、更に0.2X SSC、0.5％SDS、50℃で30分を2度繰り返す。更に望ましい厳密な条件のセットでは、より高い温度が使用される。洗浄は上述と同じであるが、最後の0.2X SSC、0.5％SDS、50℃で30分を2度の際の温度が60℃に上げられる。別の望ましい厳密な条件のセットでは、最後の2回の洗浄を、0.１X SSC、0.１％SDS、65℃で行なう。ハイブリダイゼーションの厳密さ次第では塩基間にミスマッチが起きる可能性はあるけれども、２つの核酸に相補的な配列が含まれている事がハイブリダイゼーションには必要である。
【０１０７】
[000107] 核酸のハイブリダイゼーションにとって適切な厳密さは核酸の長さと相補性の程度次第であり、業界ではよく知られている変数である。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きければ大きいほど、そういう配列を持つ核酸のハイブリッドに関しては、Tmの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性 (高いTmに対応) は、次の順番で減少する：RNA:RNA、DNA: RNA、そしてDNA:DNA。ヌクレオチドの長さが100を超えるハイブリッドに関して、Tm計算のための公式が導かれた (サムブルック (Sambrook) 等、前出、9.50−0.51を参照の事)。より短い核酸つまりオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置は更に重要であり、オリゴヌクレオチドの長さが特異性を決定する (サムブルック (Sambrook)等、前出、11.7−11.8を参照の事)。
【０１０８】
[000108] 本発明の特定の実施例に於いては、500ｍＭ未満の塩、少なくとも37℃、洗浄ステップでは2XSSPE と63℃のハイブリダイゼーション・ステップを含むハイブリダイゼーション条件を利用する事により、ポリヌクレオチドが検出される。望ましい実施例では、ハイブリダイゼーションの条件は200ｍＭ未満の塩と少なくとも37℃のハイブリダイゼーション・ステップを含む。更に望ましい実施例では、ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションと洗浄ステップの両方に2XSSPEと63℃の条件が含まれる。
【０１０９】
[000109] ある実施例では、ハイブリッドが可能な核酸の長さは少なくとも10ヌクレオチド程度である。ハイブリッドが可能な核酸の最低の長さは少なくとも15ヌクレオチド程度であるのが望ましい。更に望ましいのは、少なくとも20ヌクレオチド程度である。最も望ましいのは少なくとも30ヌクレオチドである。更に、優れた熟練工は、温度と洗浄溶液の塩分濃度がプローブの長さなどの要因に従って必要に応じて調節可能である事を認識している。
【０１１０】
[000110] 「プローブ」と言うのは、相補的な一本鎖の標的核酸と塩基対を組んで二本鎖の分子を形成する事のできる一本鎖の核酸分子の事である。
【０１１１】
[000111] 「オリゴヌクレオチド」と言うのは、本出願で用いられている場合、ゲノムDNA分子、ｃDNA分子、プラスミドDNA、あるいはmRNA分子とハイブリッドを形成できる一般に少なくとも18のヌクレオチドからなる核酸の事である。オリゴヌクレオチドは、例えば32Ｐヌクレオチド、あるいはビオチンなどと共有結合したヌクレオチドで標識化が可能である。標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するプローブとして使用できる。オリゴヌクレオチド(一方又は両方を標識して)は、核酸の全体又は断片をクローン化するため、あるいは核酸の存在を検出するため、PCRプライマーとして利用する事も可能である。オリゴヌクレオチドは、DNA分子と三重ヘリックスを形成するのにも利用できる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成されるが、核酸シンセサイザで合成するのが望ましい。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合のように天然では生じないホスホエステル類似体結合で生成可能である。
【０１１２】
[000112] 「プライマー」は、標的核酸配列とハイブリッドを形成し、適切な条件下で、DNA合成の出発点となる二本鎖の核酸部位を形成するオリゴヌクレオチドである。こういうプライマーはポリメラーゼ連鎖反応で使用可能である。
【０１１３】
[000113] 「ポリメラーゼ連鎖反応」は略してPCRと呼ばれ、インビトロで特定の核酸配列を酵素的に増幅生成させる方法である。PCRは温度サイクルの一連の繰り返しであり、各サイクルは次の3段階を含んでいる：テンプレートの核酸を変性させ標的分子の鎖を分離；  一本鎖のPCRオリゴヌクレオチド・プライマーをテンプレートの核酸にアニール；アニールされたプライマーをDNAポリメラーゼで増幅生成。PCRは標的分子の存在を検出する手段を提供するし、定量又は半定量条件下では、核酸を含む粗成物中での特定の標的分子の相対量を決定する手段も提供する。
【０１１４】
[000114] 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は略してRT-PCRと呼ばれ、インビトロでRNA分子から標的のｃDNA分子を酵素的に生成し、さらに、その標的ｃDNA分子内で特定の核酸配列を酵素的に増幅生成させる方法である。RT-PCRは標的核酸分子の存在を検出する手段を提供するし、定量又は半定量条件下では、複数の核酸種の混在した生物材料中での特定な標的分子の相対量を決定する手段も提供する。
【０１１５】
[000115] DNA「コード配列」は、適切な調節配列のコントロール下に置かれた時、細胞のインビトロ又はインビボでポリペプチドに転写及び翻訳される2本鎖のDNA配列の事である。「適切な調節配列」と言うのは、コード配列の上流(５’非コード配列)、内部、又は下流(３’非コード配列)に位置し、転写、RNA処理又は安定性、関連コード配列の翻訳などに影響を及ぼすヌクレオチド配列の事である。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニレーション認識配列、RNA処理サイト、エフェクター結合サイト、ステムループ構造などが含まれる。コード配列の境界は、５’(アミノ)末端の開始コドン及び３’(カルボキシル)末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、これだけに限定されるものではないが、原核生物の配列、mRNAからのcDNA、ゲノムDNA配列、更に合成DNA配列なども含まれる。コード配列が真核生物の細胞での発現である場合、ポリアデニレーション・シグナル及び翻訳終了配列は、通常コード配列の３’に存在する。
【０１１６】
[000116] 「オープンリーディングフレーム」はORFと略され、DNA、ｃDNA、又はRNAのある長さをもった核酸配列の部分を意味し、ATGやAUGのような翻訳開始シグナル又は開始コドンと終始コドンを含んでおり、ポリペプチド配列に翻訳される可能性もある。
【０１１７】
[000117] 「ヘッド・トゥ・ヘッド」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドの５’末端から遠ざかる方向に進む場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド・トゥ・ヘッドの関係にあると言う。「ヘッド・トゥ・ヘッド」と言う用語は(５’)-トゥ-(５’)と略され、記号(→ ←)や(３’←５’５’→３’)によっても表される。
【０１１８】
[000118] 「テール・トゥ・テール」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドから互いに近づく方向に進む場合、２つのポリヌクレオチドはテール・トゥ・テールの関係にあると言う。「テール・トゥ・テール」と言う用語は(３’)-トゥ-(３’)と略され、記号(→ ←)や(５’→３’３’←５’)によっても表される。
【０１１９】
[000119] 「ヘッド・トゥ・テール」と言う用語は、本出願では、2つのポリヌクレオチドの互いの方向関係を記述する目的で使用される。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端がもう１つのポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端の隣にあり、１つのポリヌクレオチドの転写の方向がもう1方のポリヌクレオチドと同じ方向である場合、２つのポリヌクレオチドはヘッド・トゥ・テールの関係にあると言う。「ヘッド・トゥ・テール」と言う用語は(５’)-トゥ-(３’)と略され、記号(→ →)や(５’→３’５’→３)によっても表される。
【０１２０】
[000120] 「下流」と言う用語は、標準ヌクレオチド配列の３’に位置しているヌクレオチド配列を意味している。特に、下流ヌクレオチド配列は、通常、転写の開始点の後に続く配列に関係している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始サイトの下流に位置している。
【０１２１】
[000121] 「上流」と言う用語は、言及するヌクレオチド配列の５’に位置しているヌクレオチド配列を意味している。特に、上流ヌクレオチド配列は、通常、コード配列又は転写の開始点の５’側に位置している。例えば、ほとんどのプロモーターが転写の開始サイトの上流に位置している。
【０１２２】
[000122] 「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」と言う用語は、二本鎖のDNA内で特定のヌクレオチド配列を結合したり切断したりする酵素を意味する。
【０１２３】
[000123] 「相同組み換え」は外来性のDNA配列を別のDNA分子に挿入する事を意味する。例えば、染色体へのベクターの挿入である。相同組み換えのために、ベクターが特定の染色体サイトを標的にするのが望ましい。特定の相同組み換えを行なうには、ベクターは染色体の配列に対して十分長い相同体の部位を持っているべきで、そうして初めて、染色体へのベクターの相補的結合と取り込みが可能となる。相同体の部位が長ければ長いほど、そして配列の類似性が高ければ高いほど、相同組み換えの効率は高くなる。
【０１２４】
[000124] 業界で知られているいくつかの方法が、本発明に基づくポリヌクレオチドの増産に使用できる。適切な宿主システムと成長条件さえ確立されれば、組み換え発現ベクターを増幅増産させ大量に準備する事ができる。本出願に述べられているように、使用可能な発現ベクターには、これだけに限定されるものではないが、次のベクター又はその誘導体が含まれる：ワクシニアウィルスやアデノウィルスのようなヒトや動物のウィルス、バキュロウィルスのような昆虫のウィルス、酵母ベクター、バクテリオファージ・ベクター(例えばλファージ)、プラスミド及びコスミドDNAベクター、その他諸々。
【０１２５】
[000125] 「ベクター」は、核酸をクローン化する、および／または宿主細胞に移入する手段として使われる。ベクターは別のDNA断片が結合し、結合した断片の複製を可能にするレプリコンでもあり得る。「レプリコン」は、インビボでDNAの複製を自動的に行なう、つまり自らのコントロールで複製可能な遺伝子要素である(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウィルス等)。「ベクター」と言う用語には、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞に核酸を導入するウィルス的及び非ウィルス的手段の両方が含まれる。業界で知られている数多くのベクターが、核酸を操作し、応答配列及びプロモーターを遺伝子等に取り入れるのに利用できる。可能性のあるベクターとしては、例えば、プラスミドやウィルスで、その中にはλ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322やpUCプラスミド誘導体ようなプラスミド、あるいはブルースクリプト・ベクターなども含まれる。例えば、応答配列やプロモーターに対応するDNA断片の挿入は、相補的粘着端末を有する選ばれたベクターに適切なDNA断片を結合させる事によっても達成できる。あるいは、DNA分子の末端を酵素的に修正する事も可能であるし、あるいはDNA末端にヌクレオチド配列(リンカー)を結合させる事によりＤＮＡ分子内のどのサイトでも生成可能である。こういうベクターは、選択可能マーカー遺伝子を含むように加工し、ゲノムにマーカーを取り入れた細胞を選択できるようにする事も可能である。そういうマーカーは、そのマーカーによってコードされた蛋白質を取り入れ発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【０１２６】
[000126] ウィルス・ベクター、特にレトロウィルス・ベクターは、細胞及び生きた動物に遺伝子を移入する様々なアプリケーションに広く利用されている。使用可能なウィルス・ベクターには、これだけに限定されるものではないが、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ポックスウィルス、バキュロウィルス、ワクシニアウィルス、単純ヘルペスウィルス、エプスタイン‐バーウィルス、アデノウィルス、ジミニウィルス、カリモウィルスなどのベクターである。非ウィルス・ベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的にチャージされた脂質(シトフェクチン)、DNA蛋白質複合体、バイオポリマーなどが含まれる。ベクターには、核酸以外にも、1つ又はそれ以上の調節部位、および／または核酸移入の結果を選択、測定、モニターする(移入された組織、発現の持続期間など)場合に役立つ選択可能なマーカーも含まれる。
【０１２７】
[000127] 「プラスミド」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運んでいるエキストラな染色体構成分子を意味し、通常は環状の二本鎖DNA分子の形で存在している。そういう構成分子は、1本鎖又は2本鎖のDNAやRNA (直線、環状、高次コイル) の配列、ゲノム統合配列、ファージ、又はヌクレオチドなどをその源に関係なく全て自動的に複製しているのかもしれない。そこでは数多くのヌクレオチド配列が組み合わされ、組み換えられて、ユニークな構造となり、プロモーター断片及び選択された遺伝子生成物のDNA配列を適切な3’の未翻訳配列とともに細胞へ導入する事が可能となっている。
【０１２８】
[000128] 「クローニング・ベクター」とは「レプリコン」の事であり、連続的に複製を行なう核酸、好ましくはある単位の長さのDNAで、プラスミド、ファージ、コスミドのような複製源を含んでおり、それに別の核酸断片が結合する事により結合した断片の複製が行なわれる。クローニング・ベクターは、１つの細胞タイプで複製を行い、別の細胞タイプで発現させてもよい(シャトル・ベクター)。
【０１２９】
[000129] ベクターは、形質移入、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、DNAベクター・トランスポーターなど業界で知られている方法を使って望ましい宿主細胞に導入が可能である (例えば、ウー (Wu) 等、1992、J. Biol. Chem. 267:963-967; ウー (Wu) 及びウー (Wu)、1988、J. Biol. Chem.263：14621−14624；及びハートマット (Hartmut) 等、カナダ特許出願番号2,012,311、出願1990年3月15日を参照の事)。
【０１３０】
[000130] 本発明によるポリペプチドは、リポフェクションによってインビボ導入が可能である。過去10年間、インビトロで核酸を被包し形質移入するのにリポソームが益々多く利用されている。リポソーム媒介形質移入に伴う困難と危険を克服するために考案された合成カチオン性脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボ形質移入用として、リポソームを準備するとき使用可能である (フェルグナー(Felgener) 等、1987、PNAS 84:7413; マッキー (Mackey) 等、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031; 及びアルマー (Ulmer) 等、1993、サイエンス (Science)259:1745-1748)。カチオン性脂質の使用は、負にチャージされた核酸の被包を促進し、同時に、負にチャージされた細胞膜との融合も促進する (フェルグナー (Felgener)及びリンゴルド (Ringold)、1989、サイエンス (Science) 337：387-388)。特に有益な脂質化合物及び核酸移入の構成については、国際特許公告WO95/18863及びWO96/17823、そして米国特許番号5,459,127に記されている。外因性の遺伝子をインビボで特定の器官に導入するリポフェクションには使用上の利点がある。リポソームを特定の細胞に分子標的するのも利点の一つである。、明らかに、膵臓、肝臓、腎臓、脳など多種類の細胞種から成り立つ組織においては、特定の細胞タイプに形質移入することが特に望ましい。脂質は標的目的のために他の分子を化学的に結合させる (マッキー (Mackey) 等、1988、前出)事が可能である。例えば標的のためのペプチド、例えばホルモンや神経伝達物質、抗体などの蛋白質、あるいは非ペプチド分子を、リポソームと化学的に結合させることができる。
【０１３１】
[000131] 他の分子もインビボで核酸の形質移入を促進するのに有効である。カチオン性オリゴペプチド (例えばWO95/21931)、DNA結合蛋白質から導かれるペプチド(例えばWO96/25508)、カチオン性ポリマー (例えばWO95/21931) などである。
【０１３２】
[000132] ベクターをインビボで裸のDNAプラスミドとして導入するのも可能である(米国特許5,693,622、5,589,466、及び5,580,859を参照の事)。受容体媒介のDNA導入方法も利用できる (キュリエル (Curiel) 等、1992、Hum. Gene Ther. 3:147-154; 及びウー (Wu) 及びウー (Wu)、1987、J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)。
【０１３３】
[000133] 「形質移入」と言う用語は、細胞による外因性又は非相同性RNA又はDNAの摂取を意味する。外因性又は非相同性RNA又はDNAが細胞内に導入される事により、細胞は「形質移入」される。形質移入されたRNA又はDNAが表現型の変化を経験すると、細胞は外因性又は非相同性RNA又はDNAによって「形質転換」された事になる。形質転換されたRNA又はDNAは染色体のDNAに統合(共有結合)され細胞のゲノムを構成するようになる。
【０１３４】
[000134] 「形質転換」は、核酸断片が宿主有機体に移入され、遺伝的に安定した形質になった事を意味する。形質転換された核酸断片を含む宿主有機体は、「形質導入された」、「組み換えが行なわれた」、あるいは「形質転換された」有機体と呼ばれる。
【０１３５】
[000135] 「遺伝子部位」と言う用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子又はヌクレオチドの部位を意味する。
【０１３６】
[000136] 本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、その増幅又はマーカーや選択目的のマーカーの発現が求められている宿主細胞に対してひとつ以上の源に由来するものも含まれる場合がある。
【０１３７】
[000137] 「選択可能なマーカー」と言う用語は、抗生物質や化学物質への抵抗遺伝子のような同定因子を意味する。マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質への抵抗、除草剤への抵抗、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択可能である。その効果は、関心のある核酸の遺伝形質を追跡、および／または関心のある核酸を受け継いだ細胞や有機体を同定するのに使用される。業界で知られ使用されている選択可能マーカーの例は次の通りである：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに抵抗を与える遺伝子、表現型のマーカーとして使われる遺伝子、すなわちアンソシアニン調節遺伝子、イソペンタニル転移酵素遺伝子など。
【０１３８】
[000138] 「レポーター遺伝子」とは、同定因子をコードする核酸の事で、その因子はレポーター遺伝子の発現(その発現は関心のある核酸の遺伝形質の追跡に用いられる)に基づいて同定可能で、関心のある遺伝子を発現する細胞や有機体を同定、および／または遺伝子発現の誘導又は転写を測定するのに使用される。この分野で知られて用いられているレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ (Luc)、緑蛍光蛋白質 (GFP)、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ (CAT)、βガラクトシダーゼ (LacZ)、βグルクロニダーゼ (Gus)などである。選択可能マーカーもレポーター遺伝子と見なす事ができる。
【０１３９】
[000139] 「プロモーター」とは、コード配列又は機能RNAの発現をコントロールできるDNA配列を意味する。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に存在する。プロモーターはその全体を天然の遺伝子に由来する事もできるし、天然の異なるプロモーターから導かれる異なる要素で構成することも、更には合成DNAを含む事も可能である。プロモーターが色々な組織や細胞タイプに応じて、あるいは発育の段階に応じて、あるいは様々な環境や生理学的条件に応じて直接遺伝子の発現を促進できる事は、その分野の熟練技術者には良く知られている。ほとんどの細胞タイプでほとんどの場合に遺伝子の発現を促進するるプロモーターは一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞タイプで遺伝子の発現を起こしているプロモーターは一般に「細胞特異的プロモーター」又は「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発育段階又は細胞分化の段階で遺伝子の発現を起こしているプロモーターは一般に「発達特異的プロモーター」又は「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。薬品、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などプロモーターを誘導するものに晒された、あるいはそういうもので細胞を処理した後に遺伝子発現を誘導されるプロモーターは一般に「誘導性プロモーターー」又は「調節可能プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な同定は明確でないので、異なる長さのDNA断片が同じプロモーター活性を持っている場合もある。
【０１４０】
[000140] 「プロモーター配列」とは、細胞のRNAポリメラーゼに結合し下流(３’方向)のコード配列の転写を開始できるDNA調節部位の事である。本発明を明確にする目的で言えば、プロモーター配列は転写開始サイトにより３’末端に束ねられ、検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は配列を含むように上流(５’方向)に伸びている。プロモーター配列内には、転写開始サイト(例えばヌクレアーゼS1でマッピングする事により明確にされる)、及びRNAポリメラーゼの結合を可能にする蛋白質結合ドメイン(コンセンサス配列)がある。
【０１４１】
[000141] コード配列は、RNAポリメラーゼがそのコード配列をｍRNAに転写するとき細胞の転写及び翻訳コントロール配列の「コントロール下」にあり、その後(コード配列にイントロンが含まれているならば)trans-RNAのスプライシングが起き、コードされた蛋白質へ翻訳される。
【０１４２】
[000142] 「転写及び翻訳コントロール配列」とはプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのDNA調節配列で、宿主細胞でコード配列の発現を提供する。真核生物の細胞では、ポリアデニレーション・シグナルはコントロール配列である。
【０１４３】
[000143] 「応答配列」と言う用語は、最初のキメラ遺伝子のDNA結合ドメインとの相互作用を通してプロモーターに応答を与える1つ又はそれ以上のシス作用性DNA配列を意味する。これらのDNA配列はは配列面でパリンドローム(完全又は不完全)である場合もあるし、様々な数のヌクレオチドで分離された配列モチーフ又はハーフサイトで構成される場合もある。ハーフサイトは類似あるいは同一である場合もあるし、直接の繰り返し又は逆からの繰り返しとして配列されていたり、又は単一の場合も隣のハーフサイトと連続した多量体として存在する場合もある。応答配列は、それを取り込む細胞や有機体の性質次第ではあるが、異なる有機体から分離された最小プロモーターを含む場合もある。最初のハイブリッド蛋白質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下あるいは不在下に、応答配列のDNA配列と結合し、この応答配列の規制の下に、下流の遺伝子の転写を開始又は抑制する。天然のエクジソン受容体の応答配列のDNA配列の例としては次を参照の事：RRGG/TTCANTGAC/ACYY  (チャーバス (Cherbas) L. 等、(1991)、Genes Dev. 5, 120-131 を参照の事)；AGGTCAN(n)AGGTCA, ここでＮ(n)は1つ又はそれ以上のスペーサー・ヌクレオチドであり得る (ダビノ (D’Avino) PP., 等、(1995)、Mol. Cell. Endocrinol.113, 1-9 )；及びGGGTTGAATGAATTT (アントニウスキー (Antoniewski) C. 等、(1994)、Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474を参照の事)。
【０１４４】
[000144] 「実施可能なリンク」と言う用語は、1つの機能が他の機能により影響を受けるような形で、核酸配列が単一の核酸断片と関連している事を意味する。例えば、プロモーターがあるコード配列の発現に影響を及ぼす事ができる(すなわちそのコード配列はそのプロモーターの転写コントロール下にある)ならば、そのプロモーターはそのコード配列と実施可能なリンクで結ばれている。コード配列が、センス又はアンチセンス方向で調節配列に実施可能なリンクで結ばれている場合もある。
【０１４５】
[000145] 「発現」と言う用語は、本出願で使用される限り、核酸又はポリヌクレオチドに由来するセンス(mRNA)又はアンチセンスRNAの定常的な蓄積及び転写を意味する。発現はmRNAを蛋白質又はポリペプチドに翻訳する意味もある。
【０１４６】
[000146] 「カセット」、「発現カセット」、及び「遺伝子発現カセット」と言う用語は、特定の制限サイトで、あるいは相同組み換えによって、核酸又はポリヌクレオチドに挿入する事のできるDNA断片を意味する。DNA断片には関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれ、カセット及び制限サイトは、転写及び翻訳のための適切なリーディングフレームでカセットの挿入が行なわれるのを確証できるように設計される。「形質転換カセット」とは、関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、特定の宿主細胞の形質転換を簡便化するポリヌクレオチドに加えていくつかの要素を持っている特定のベクターを意味する。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、及び形質転換カセットは、宿主細胞に於いて関心あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を向上させる要素を含んでいる場合もある。こういう要素には、これだけに限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答配列、ターミネーター配列、ポリアデニレーション配列などが含まれる。
【０１４７】
[000147] 「遺伝子スイッチ」と言う用語は、本発明の目的に於いては、プロモーターと機能的に連結している応答配列、及び1つ又はそれ以上のリガンドの存在下に遺伝子発現を調節する応答配列とプロモーターの機能を組み込んだEcRベースのシステムを組み合わせたものである。
【０１４８】
[000148] 「調節」と言う用語は、核酸又は遺伝子の発現を誘導、減少、あるいは阻止する事を意味し、それは、それぞれ蛋白質又はポリペプチド産生の誘導、減少、あるいは阻止に繋がる。
【０１４９】
[000149] 本発明によるプラスミド又はベクターは、さらに宿主細胞に於いて遺伝子の発現を促進するのに適した少なくとも１つのプロモーターを有する場合もある。「発現ベクター」と言う用語は、宿主への形質転換の後、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミド、あるいは媒体を意味する。クローン遺伝子すなわち挿入された核酸配列は、普通、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの調節配列の制御をうける。望ましい宿主細胞に於いて核酸の発現を促進するのに役立つ開始コントロール部位又はプロモーターは数多く存在し、このことはその分野のの熟練技術者には良く知られていることである。遺伝子を駆動する事のできるプロモーターであるならば、本発明にとってほとんど全て適しており、その中には、これだけに限定されるものではないが、次のものが含まれる：ウィルス・プロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳類プロモーター、合成プロモーター、構成プロモーター、組織特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；CYC1, HIS3, GAL1, GAL4,GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI,  アルカリ性ホスファターゼ・プロモーター(サッカロミセス属 (Saccharomyces) の発現に有効)；AOX1プロモーター (ピチア属 (Pichia) の発現に有効)；βラクタマーゼ、lac, ara, tet, trp, lPL, iPR, T7, tac, 及び trcプロモーター(大腸菌 (Escherichia coli) の発現に有効)；光調節、種特異的、花粉特異的、子宮特異的、病原又は病気関連、カリフラワー・モザイクウィルス35Ｓ、CMV 35S 最小、キャッサバ・ベイン・モザイクウィルス (CsVMV)、クロロフィルa/b 結合蛋白、リブロース1,5‐リン酸二水素カルボキシラーゼ、発芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿状ウィルス、植物スーパー・プロモーター、ジャガイモ・ロイシン・アミノペプチダーゼ、硝酸リダクターゼ、マンノピン・シンターゼ、ノパリン・シンターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白、及びアンソシアニン・プロモーター；その技術分野で知られている動物及び哺乳類のプロモーターには、これだけに限定されるものではないが、次のものが含まれる。SV40 初期 (SV40e) プロモーター部位、ラウス肉腫ウィルス(ＲＳＶ)の３’末端の長い繰り返しに含まれるプロモーター、Ｅ１Ａのプロモーター又はアデノウィルス(Ａｄ)の主要後期プロモーター(ＭＬＰ)、サイトメガロウィルス(ＣＭＶ)前期プロモーター、単純ヘルペスウィルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ) プロモーター、バキュロウィルスIE1プロモーター、延長因子1アルファ(EF１) プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ) プロモーター、ユビキトン(Ubc) プロモーター、アルブミン・プロモーター、マウス・メタロチオネイン‐Ｌプロモーター及び転写コントロール部位の調節配列、ユビキタス・プロモーター(HPRT、ビメンチン、αアクチン、チューブリン等)、中間径フィラメント(デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等)、治療遺伝子のプロモーター（MDR、CFTR又は第VIII因子タイプ等）、病原又は病気関連のプロモーター、及び組織特異性を示し、膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子コントロール部位など、遺伝子導入動物で利用されるプロモーター；膵臓のベ���タ細胞で活性なインシュリン遺伝子コントロール部位、リンパ細胞で活性なイミュノグロブリン遺伝子コントロール部位、精巣、乳房、リンパ腺、そしてマスト細胞で活性なマウスの乳房腫瘍ウィルス・コントロール部位；アルブミン遺伝子、肝臓で活性なApo AI及びApo AIIコントロール部位、肝臓で活性なアルファ・フェトプロテイン遺伝子コントロール部位、肝臓で活性なアルファ1‐アンチトリプシン遺伝子コントロール部位、骨髄細胞で活性なベータ‐グロビン遺伝子コントロール部位、脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子コントロール部位、骨格細胞で活性なミオシン軽鎖‐2遺伝子コントロール部位、視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子コントロール部位、ピルベート・キナーゼ・プロモーター、ヴィリン・プロモーター、腸蛋白質に結合する脂肪酸のプロモーター、平滑筋細胞αアクチンのプロモーター等。更に、こういう発現配列はエンハンサーや調節配列などを追加する事により調節可能である。
【０１５０】
[000150 ] 本発明の実施例で使用されるエンハンサーには、これだけに限定されるものではないが、ＳＶ40エンハンサー、サイトメガロウィルス(ＣＭＶ)エンハンサー、延長因子１(EF１) エンハンサー、酵母エンハンサー、ウィルス遺伝子エンハンサーなどが含まれる。
【０１５１】
[000151] 終了コントロール部位すなわちターミネーター又はポリアデニレーション配列は、宿主に本来備わっている遺伝子に由来する事もある。終了サイトは不必要ではあるが、含めた方が最も望ましい。本発明の望ましい実施例では、終了コントロール部位は合成配列、合成ポリアデニレーション・シグナル、ＳＶ40後期ポリアデニレーション・シグナル、ＳＶ40ポリアデニレーション・シグナル、ウシの成長ホルモン(ＢＧＨ) ポリアデニレーション・シグナル、ウィルス・ターミネーター配列に由来し又それらで構成される事もある。
【０１５２】
[000152] 「３’非コード配列」又は「３’非翻訳部位(ＵＴＲ)」と言う用語は、コード配列の下流(３’)に位置しているＤＮＡを意味し、ポリアデニレーション [poly (A)] 認識配列及びmRNA処理や遺伝子発現に影響を及ぼす事のできる調節シグナルをコードしている他の配列を含める事も可能である。ポリアデニレーション・シグナルは、mRNA前駆体の３’末端にポリアデニル酸を加える時、それに影響を及ぼすのが特徴である。
【０１５３】
[000153] 「調節部位」とは、第2の核酸配列の発現を調節している核酸配列の事である。調節部位は、特定の核酸の発現を本来そうであるように調節する配列(相同部位)や、あるいは異種の細胞に働いて異種の蛋白質の発現や合成蛋白質の発現を調節する異なる源に由来する配列(非相同部位)がふくまれる。特に配列は、原核生物、真核生物、またはウィルス遺伝子の配列、あるいは特異的または非特異的、誘導的または非誘導的方法で、遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であっても良い。調節部位には、複製の源、RNAスプライシング・サイト、プロモーター、エンハンサー、転写終了配列、及びポリペプチドを標的細胞の分泌経路へ導く信号配列なども含まれる。
【０１５４】
[000154] 「非相同源」からの調節部位は、発現された核酸とは生来関連性のない調節部位である。非相同調節部位に含まれるのは、異なる種からの調節部位、異なる遺伝子からの調節部位、ハイブリッド調節配列、天然には生じないがその分野のの通常の技術を持った人によって設計される調節部位などである。
【０１５５】
[000155] 「ＲＮＡトランスクリプト」とは、ＤＮＡ配列をＲＮＡポリメラーゼが触媒作用により転写した生成物のことである。ＲＮＡトランスクリプトは第一次トランスクリプトと呼ばれるＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであり、あるいは第一次トランスクリプトの転写後処理によって得られたＲＮＡ配列であり、その場合は成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」とは、イントロンを持たず、細胞によって蛋白質に翻訳可能なＲＮＡの事である。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的でｍＲＮＡによって導かれる2本鎖のＤＮＡを言う。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡトランスクリプトであり、従って細胞によって蛋白質に翻訳可能なものである。「アンチセンスＲＮＡ」とは、第一次標的トランスクリプト又はｍＲＮＡの全体又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡトランスクリプトの事である。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子トランスクリプトすなわち５’非コード配列、３’非コード配列、あるいはコード配列の一部であっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，又は翻訳されていないが細胞プロセスに影響を与える他のＲＮＡの事である。
【０１５６】
[000156] 「ポリペプチド」とは、共有結合したアミノ酸残基を持つ重合化合物の事である。アミノ酸の一般構造は以下の通りである。
【化１１】
0004598757.tif 000006
【０１５７】
[000157] アミノ酸は分岐鎖Ｒを基に７つのグループに分類される。(１) 脂肪族分岐鎖、(２) ヒドロキシ(ＯＨ)グループを含む分岐鎖、（３）硫黄原子を含む分岐鎖、(４) 酸又はアミド基を含む分岐鎖、(５) 塩基グループを含む分岐鎖、(６) 芳香環を含む分岐鎖、そして(７) プロリンつまり分岐鎖がアミノ基と結合しているイミノ酸。本発明のポリペプチドは、少なくとも14のアミノ酸を含むのが好ましい。
【０１５８】
[000158] 「蛋白質」は生きた細胞で構造的又は機能的役割を演ずるポリペプチドである。
【０１５９】
[000159] 「分離されたポリペプチド」又は「分離された蛋白質」とは、天然の状態では通常関係している化合物(例えば、他の蛋白質やポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質など) がかなりな程度に除かれたポリペプチド又は蛋白質である。「分離された」と言う用語は、他の化合物との人工的又は合成的な混合物や生物活性に干渉しない不純物の存在を除外するものではない。不純物は、不完全な精製、安定剤の添加、又は薬学的に許容可能な調節時の混合の故に存在する場合がある。
【０１６０】
[000160] 「置換突然変異ポリペプチド」又は「置換突然変異」とは、少なくとも１つの野生型又は天然のアミノ酸をその野生型又は天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換したものを含む突然変異ポリペプチドの事である。置換突然変異ポリペプチドは１つだけの野生型又は天然のアミノ酸置換体を含む場合もあり、その場合は「点突然変異」又は「単一点突然変異」と呼ばれる。あるいは、野生型又は天然のアミノ酸が2つ又はそれ以上をその野生型又は天然のアミノ酸とは異なる2つ又はそれ以上のアミノ酸によって置換された場合も含まれる。本発明によれば、置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチドは、少なくとも１つの野生型又は天然のアミノ酸がその野生型又は天然型とは異なるアミノ酸で置換したものを含んでいる。
【０１６１】
[000161] 野生型又は天然のアミノ酸を2つ又はそれ以上の非野生型あるいは非天然型のアミノ酸で置換される場合は、置換で削除された数と同じ数の野生型又は天然のアミノ酸で置換する場合もある。すなわち２つの野生型又は天然のアミノ酸が２つの非野生型又は非天然のアミノ酸で置換される。あるいは置換で削除された数と同じ数ではない野生型又は天然のアミノ酸で置換される場合もある。すなわち２つの野生型アミノ酸が１つの非野生型アミノ酸で置換(置換＋削除突然変異)される、あるいは２つの野生型アミノ酸が３つの非野生型アミノ酸で置換される(置換＋挿入突然変異)場合である。
【０１６２】
[000162] 置換突然変異は略式の命名方法を使って表記する事ができ、アミノ酸の残基と標準ポリペプチド配列内で置換された数、そして新しく置換されたアミノ酸残基を示す事ができる。例えば、ポリペプチドの20番目のアミノ酸残基が置換される置換突然変異の場合、「ｘ20ｚ」と表記できる。ここで「ｘ」は置換されたアミノ酸、「20」はアミノ酸残基の位置又はポリペプチド内の数、そして「ｚ」は新しく置換されたアミノ酸である。従って、相互交換的に「Ｅ20Ａ」又は「Ｇlu20Ala」と表記される置換突然変異では、突然変異にはグルタミン酸 (通常「Ｅ」又は「Ｇlu」と表記) がアラニン残基 (通常「Ａ」又は「Ala」と表記) によって置換された事を示している。
【０１６３】
[000163] 置換突然変異は、その分野でで知られている突然変異誘発技術を使って実行可能である。それには、これだけに限定されるものではないが、インビトロ部位特異的変異 (ハッチンソン(Hutchinson), C, 等、1987、J. Biol. Chem. 253: 6551; ゾラー (Zoller) 及びスミス (Smith)、1984、オリファント (Oliphant) 等、1986、遺伝子 (Gene) 44: 177; ハッチンソン (Hutchinson) 等、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83: 710)、TAB（登録商標）リンカー(ファーマシア (Pharmacia))の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／断片削除及び置換、PCRベース／オレゴヌクレオチド特異的変異などである。部位特異的変異ではPCRベースの技術が望ましい (ヒグチ (Higuchi)、1989、「ＤＮＡ工作のためのPCR使用」、PCRテクノロジー：DNA増殖のための原理及び応用、Ｈ．アーリッヒ (Erlich) 版、ストックトン・プレス (Stockton Press)、第6章、61−70ページを参照の事)。
【０１６４】
[000164] 本発明によるポリペプチドの「断片」とは、アミノ酸配列が言及するポリペプチドのそれより短く、言及するポリペプチド全体の中に同一のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドを意味する。、もしも適切であれば、このような断片は、それが由来するより大きいポリペプチドの中に含まれる。本発明によるポリペプチドのそういう断片は、少なくとも２，３，４，５，６，８、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、又は300の長さのアミノ酸を持つ場合がある。
【０１６５】
[000165] ポリペプチド又は蛋白質の「変異型」とは、あるポリペプチド又は蛋白質に由来したもので、そういうポリペプチド又は蛋白質の生物学的性質を少なくとも１つは保持している類似体、断片、誘導体、あるいは突然変異体である。ポリペプチド又は蛋白質の様々な変異型が天然には存在している。そういう変異型は蛋白質の構造遺伝子コードのヌクレオチド配列が異なる事を特徴とする対立形質の変異である場合もあるし、ディファレンシャル・スプライシング又は翻訳後の修飾が関係している場合もある。優秀な熟練技術者なら、1つ又は複数のアミノ酸を置換、削除、追加、又は補充した変異型を作る事ができる。こういう変異型には、特に、次のようなものが含まれる：(ａ)1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が同類又は非同類のアミノ酸で置換されている変異型、(ｂ) ポリペプチド又は蛋白質に1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が追加された変異型、（ｃ）1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有している変異型、及び（ｄ）ポリペプチド又は蛋白質が血清アルブミンのような他のポリペプチドと結合した変異型。こういう変異型を入手する技術は、遺伝子的(抑制、削除、突然変異など)、化学的、及び酵素学的技術も含めて、その分野の通常の技術を持つ人には良く知られている。変異型のポリペプチドは少なくとも14ほどのアミノ酸を含んでいるのが望ましい。
【０１６６】
[000166] 「非相同蛋白質」とは、細胞内で天然に生産されない蛋白質を意味する。
【０１６７】
[000167] 「成熟蛋白質」とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち第一次翻訳生成物に存在するプリペプチド及びプロペプチドが除かれたポリペプチドを言う。「前駆体」蛋白質とは、ｍＲＮＡの翻訳の第一次生成物、すなわちプリペプチド及びプロペプチドがまだ存在しているものを言う。プリペプチド及びプロペプチドは、細胞内局在シグナルであることもあるがそれに限定されるものではない。
【０１６８】
[000168] 「シグナル・ペプチド」と言う用語は、成熟蛋白質の分泌前のアミノ末端ポリペプチドを意味する。シグナル・ペプチドは切断されるので、成熟蛋白質には存在しない。シグナル・ペプチドは、分泌された蛋白質を細胞膜を通し細胞外へ移動させる機能を有する。
【０１６９】
[000169] 「シグナル配列」は蛋白質のコード配列の初めに含まれており、細胞表面で発現する。この配列はシグナル・ペプチドをコードし(Ｎ末端から成熟ポリペプチドへ)、ポリペプチドの移動を宿主細胞に指示する。「トランスローケーション・シグナル配列」と言う用語は、本出願では、こういう種類のシグナル配列を意味するのに使用される。トランスローケーション・シグナル配列は、真核生物及び原核生物に天然に存在する様々な蛋白質に関連して見出され、両タイプの有機体で機能している場合が多い。
【０１７０】
[000170] 「相同性」と言う用語は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド間の同一性の程度に言及している。ある配列と別の配列の比較はその分野で知られている技術で決定可能である。例えば、相同性は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較する事により決定できる。配列情報を並べ手元のコンピュータープログラムを利用する。あるいは、相同部位間で安定したデュプレックスを形成できる条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行ない、次に1本鎖の特異的ヌクレアーゼで消化し、消化された断片のサイズを決める方法によっても相同性は決定できる。
【０１７１】
[000171] 「相同の」と言う用語は、本出願で使用される場合、文法的にも様々の綴り方によっても、スーパーファミリー(例えばイミュノグロブリンスーパーファミリー)からの蛋白質を含む「進化的に共通の源」を有している蛋白質と、異なる種から来ている相同蛋白質(例えばミオシンの軽鎖など)の関係について言及している (リエック (Reeck) 等、1987、細胞 (Cell) 50: 667)。そういう蛋白質(及びそれをコードする遺伝子)は、高度の配列上の類似性に示されるように、配列の相同性を有している。しかし、一般的な使用方法、そして本アプリケーションでは、「相同の」と言う用語は、「極めて」のような副詞で修飾された場合、配列の類似性に言及しているのであり、進化的に共通の源を意味しているのではない。
【０１７２】
[000172] 従って、「配列の類似性」は、あらゆる文法的意味からも、進化的に共通の源を持つあるいは持たないかもしれない核酸又は蛋白質のアミノ酸配列間の同一性及び相対性の度合いについて言及している。
【０１７３】
[000173] 特定の実施例において、２つのＤＮＡが、そのＤＮＡの配列の一定の長さに関して、ヌクレオチドの少なくとも50％程度(望ましくは少なくとも75％程度、最も望ましくは少なくとも90又は95％程度)マッチしている場合は、「実質的に相同」あるいは「実質的に類似している」と言える。実質的に相同な配列は、配列データ銀行で入手可能な標準のソフトを使って、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション実験をそのシステムが定義する厳格な条件の下に行なって比較すれば同定可能である。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、その分野の熟練技術者には良く知られている。例えば、サムブルック (Sambrook) 等、1989、前出を参照の事。
【０１７４】
[000174] 「実質的に類似」と言う用語は、本出願で使用される場合、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化が結果として1つ又はそれ以上のアミノ酸の置換になっても、そのＤＮＡ配列でコードされている蛋白質の機能的性質には影響が及ばないような核酸断片の事を意味する。「実質的に類似」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化が、アンチセンス又はコサプレッション技術による遺伝子発現の変化を仲介する核酸断片能力に影響を及ぼさない場合、そういう核酸断片の事も意味する。更に「実質的に類似」と言う用語は、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの塩基の削除又は挿入を行なっても、その結果のトランスクリプトの機能的性質には実質的な影響を及ぼさないような本発明の核酸断片の修飾にも言及している。従って、本発明は、特定の模範的な配列だけでなくそれ以上の内容を含んでいる事は了解済みである。提案されている各修飾過程およびコードされた生物活性の保持を測定する方法は、その分野のの技術者には良く知られている事である。
【０１７５】
[000175] 更に、その分野の熟練技術者は、本発明が扱う実質的に類似の配列が、本出願で例証されている配列に関して、厳しい条件 (0.1XSSC, 0.1% SDS, 65℃、及び2X SSC, 0.1% SDS、その後0.1X SSC, 0.1% SDSで洗浄) の下にハイブリダイゼーションを行なう能力によっても決定される事を認識している。本発明による実質的に類似の核酸断片とは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と比べて、ＤＮＡ配列が少なくとも70％同一である核酸断片の事である。本発明による望ましい実質的に類似の核酸断片とは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と比べて、ＤＮＡ配列が少なくとも80％同一である核酸断片の事である。更に望ましい核酸断片は、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも90％同一である事である。更に望ましいのは、本出願で報告されている核酸断片のＤＮＡ配列に少なくとも95％同一の核酸断片である。
【０１７６】
[000176] アミノ酸の約40％を超える値が同一で、60％を超える値が類似 (機能的に同一) である場合、その2つのアミノ酸配列は「実質的に相同」あるいは「実質的に類似」である。望ましいのは、類似又は相同の配列を、例えばGCG (ジェネティックス・コンピューター・グループ (Genetics Computer Group)、GCGパッケージのプログラム・マニュアル、ウィスコンシン州マジソン (Madiosn, Wisconsin)) パイルアップ・プログラムを使った配列により確認する事である。
【０１７７】
[000177] 「対応する」と言う用語は、類似又は相同の配列である事を意味している。類似性又は相同性の測定の比較対象となっている分子と正確な位置が同じであるか異なっているかには関係しない。核酸又はアミノ酸配列の整合にはスペースも含まれる場合がある。従って、「対応する」と言う用語は、配列の類似性を言うのであって、アミノ酸残基又はヌクレオチド塩基の数を言うのではない。
【０１７８】
[000178] アミノ酸又はヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、熟練した技術者による配列の直接的な比較によるか、あるいはBLAST (ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール (Basic Local Alignment Sequence Tool)、アルチュル (Altschul), S. F.等、(1993) J. Mol.Biol. 215:403-410; 更にwww.ncbi.nlm.gov/BLAST/も参照の事）のようなアルゴリズムを使ったコンピューター自動化配列比較を用いてポリペプチドあるいは遺伝子を同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列をいう。一般的に、あるポリペプタイド又は核酸配列が既知の蛋白質又は遺伝子に相同であると推定的に同定するには、10あるいはそれ以上の隣接アミノ酸又は30あるいはそれ以上のヌクレオチドが必要である。更に、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子同定 (例えば、サザン・ハイブリダイゼーション) 及び分離 (例えば、細菌のコロニーやバクテリオファージのプラクのインサイチュー・ハイブリダイゼーション)の配列依存方法に於いて、20−30の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブが使用される。更に、12−15塩基の短いリゴヌクレオチドも、PCRの増殖プライマーとして使用し、そのプライマーを含む特定の核酸断片を得る事ができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、核酸断片を同定および／または分離するのに十分な量の配列を含んでいる。
【０１７９】
[000179] 「パーセント・アイデンティティ」と言う用語は、業界で知られている通り、配列の比較により決定される2つ又はそれ以上のポリペプチド配列、あるいは2つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を意味する。業界では、「アイデンティティ」と言うのは、配列ストリング間のマッチングにより決定されるポリペプチド、あるいは場合によってはポリヌクレオチド配列間の配列関係の度合いと言う意味も含んでいる。「アイデンティティ」及び「類似性」は、これだけに限定されるものではないが、次のような既知の方法により直ぐに計算できる：コンピューター分子生物学  (レスク (Lesk), A.M., 版)、オックスフォード大学プレス (Oxford University Press)、ニューヨーク(1988)；バイオコンピューティング：インフォーマティックス及びゲノム・プロジェクト (スミス (Smith), D.W., 版)、アカデミック・プレス (Academic Press)、ニューヨーク(1993)；配列データのコンピューター分析。パートＩ（グリフィン (Griffin), A.M., 及びグリフィン (Griffin), H.G. 版）フマナ・プレス (HumanaPress)、ニュージャージー(1994)；分子生物学に於ける配列分析 （フォン・へインジ (von Heinje), G., 版）、アカデミック・プレス(1987)；及び配列分析プライマー (グリブスコフ (Gribskov), M., 及びデベロー (Devereux), J., 版)、ストックトン・プレス (Stockton Press)、ニューヨーク(1991)。アイデンティティを決定する望ましい方法は、試験される配列間で最高のマッチングを与えるように設計されている。アイデンティティ及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピューター・プログラムにより体系化されている。配列アラインメント及びパーセント・アイデンティティの計算は、LASERGENEバイオインフォーマティックス・コンピューティング・スイートのメガリン (Megalign) プログラム (DNASTARInc., ウィスコンシン州マジソン (Madiosn,WI)) を使っても実行できる。配列の複数アラインメントは、デフォルト・パラメーター (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10) 付きクラスタル (Clustal) アラインメント法 (ヒギンズ及シャープ (Higgins and Sharp) (1989) CABIOS,5:151-153) を使って実行可能である。クラスタル(Clustal) 方法を使ったペヤ毎のアラインメントのデフォルト・パラメーターは、次から選択可能である：KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 及びDIAGONALS SAVED=5
【０１８０】
[000180] 「配列分析ソフト」と言うのは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の分析に有益なあらゆるコンピューター・アルゴリズム又はソフトを意味する。「配列分析ソフト」は商業的にも入手可能だし、自分で独立にも開発できる。典型的な配列分析ソフトには、これだけに限定されるものではないが、GCGスイート・オブ・プログラム (ウィスコンシン・パッケージ版9.0、ジェネティック・コンピューター・グループ (Genetics ComputerGroup)、ウィスコンシン州マジソン (Madison,WI)), BLASTP, BLASTN, BLASTX (アルチュル (Altschul) 等, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) 及び DNASTAR (DNASTAR, Inc. 米国ウィスコンシン州マジソン、サウス・パーク・ストリート1228番、郵便番号WI 53715 (1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) などがある。本発明のアプリケーションに於いては、分析に配列分析ソフトが使用される場合は、特に説明がない限り、分析結果は参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づいている事は了解済みである。本出願に関する限り、「デフォルト値」とは、ソフトを最初に初期化した時ローディングされた値又はパラメーターのセットを意味する。
【０１８１】
[000181] 「合成遺伝子」は、この分野の技術者には良く知られている方法を使って、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの基礎単位から組み立てる事ができる。こういう基礎単位は、結合されアニールされて遺伝子断片となり、それから酵素的に組み立てられて全遺伝子が作られる。「化学的に合成」というのは、ＤＮＡの配列に関しては、ヌクレオチドの成分がインビトロで組み立てられる事を意味する。手動によるＤＮＡの化学合成は既に確立済みの方法を使って達成できるし、商業的に入手可能な機械を使って自動化学合成も可能である。従って、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化を基に、遺伝子を調節して、遺伝子発現を最適化させる事が可能である。コドン・ユーセージが宿主の好むコドンの方向にバイアスされているならば、その分野の技術者は遺伝子発現成功しそうだと思うであろう。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づいて行なえる。
【０１８２】
[000182] 本出願に於いては、次のような条件の時、2つ又はそれ以上の個別に実行可能な遺伝子調節システムは「直交している」と言われる；(ａ)選定された濃度で、各リガンドを使って、各所定のシステムを調節した結果、そのシステムの遺伝子の発現が大幅に変更した場合；そして(ｂ)変化が、調節の同時性又は連続性とは無関係に、細胞、組織、又は有機体で同時に実行可能な他の全てのシステムの発現の変化よりも統計的に大幅に異なっている場合。個別に実行可能な各遺伝子調節システムの調節により、細胞、組織、又は有機体で実行可能な他の全てのシステムよりも、少なくとも2倍遺伝子発現が変化するのが望ましい。更に望ましいのは、その変化が少なくとも5倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも10倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも100倍大きい事である。更に望ましいのは、その変化が少なくとも500倍大きい事である。理想的には、選定された濃度で、各リガンドを使って、各所定のシステムを調節した結果、そのシステムの遺伝子の発現が大幅に変更し、しかも細胞、組織、又は有機体で同時に実行可能な他の全てのシステムの重要な発現の変化が全くない事である。そういう場合に、複数の誘導性遺伝子調節システムは「完全に直交的である」と言われる。同時出願中の米国出願09/965,697(参照としてその全体を本出願に取り入れる)に述べられているように、本発明は、直交的リガンド及び直交的受容体ベースの遺伝子発現システムの調査にとって有益である。
【０１８３】
[000183] 「調節」と言う用語は、所定のリガンド受容体複合体が、外来性遺伝子のトランスアクティベーションを誘発または抑制することのできる能力を意味している。
【０１８４】
[000184] 「外因性の遺伝子」と言う用語は、ある対象にとって外来性の遺伝子を意味する。つまり形質転換プロセスを通して対象に導入された遺伝子の事である。すなわち内因性の変異遺伝子の未変異バージョン又は内因性の未変異遺伝子の変異バージョンである。形質転換の方法は本発明にとって余り重要ではない。この技術分野で知られている方法で、対象にとって適切なものであればどの方法でも良い。例えば、遺伝子導入植物は、形質変換された細胞を再分化させる事により得られる。形質転換方法に関する文献が数多く知られている。例えば、アグロバクテリウム (Agrobacterium tumefaciens) 又はそのＴ１プラスミドを使ったアグロインフェクション、エレクトロポレーション、植物細胞及びプロトプラストのマイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル形質転換などである。動物細胞の形質転換及びそういう形質転換された細胞を遺伝子導入動物内で再生させる方法についても、相補的な技術が知られている。外因性の遺伝子は天然でも合成でも良いし、ＤＮＡやＲＮＡの形で対象に導入され、逆転写酵素のような方法でＤＮＡ中間体を通して機能する治療遺伝子でも可能である。そういう遺伝子は標的細胞に導入できる。対象に直接導入しても良いし、形質転換された細胞を対象に移入する間接的な導入方法でも良い。「治療遺伝子」と言う用語は、有益な機能を宿主細胞に与え発現させる遺伝子を意味する。治療遺伝子は、天然では宿主細胞には見出されない。
【０１８５】
[000185] 「エクジソン受容体複合体」と言う用語は、ステロイド受容体ファミリーの2つのメンバー、つまりエクジソン受容体 (EcR) 及びウルトラスパラクル (USP) 蛋白質からなるヘテロ2量体蛋白質複合体を意味する (ヤオ (Yao), T. P.,等 (1993) ネーチャー (Nature) 366, 476-479; ヤオ (Yao), T. P., 等 (1992) 細胞 (Cell) 71, 63-72を参照の事)。機能的なエクジステロイド受容体複合体には、イミュノフィリンのような追加の蛋白質が含まれる場合もある。転写因子として知られている蛋白質のステロイド受容体ファミリーの追加メンバー(例えばDHR38, betaFTZ-1, あるいはその他の昆虫相同体)も、EcRおよび／またはUSPにとっては、リガンド依存又は非依存のパートナーとなる場合がある。エクジソン受容体複合体はエクジソン受容体蛋白質のヘテロ２量体、及びウルトラスパイラクル、レチノイン酸‐Ｘ‐受容体 (ＲＸＲ) 蛋白質の脊椎動物相同体でもあり得る。エクジソン受容体蛋白質又はUSPのホモ2量体複合体も、ある状況下では機能する場合もある。
【０１８６】
[000186] エクジステロイド受容体複合体は、活性なエクジステロイド又は複合体の蛋白質の1つ (EcRも含まれるが、複合体の他の蛋白質が除外されるわけではない) に結合した非ステロイド・リガンドによっても活性化される。
【０１８７】
[000187] エクジソン受容体複合体はステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含んでいる。そのメンバーは全て、アミノ末端トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)、そしてヒンジ部位で分けられているリガンド結合ドメイン(ＬＢＤ)の存在を特徴としている。そのファミリーのメンバーの中には、ＬＢＤのカルボキシ末端側に、別のトランスアクティベーション・ドメインを持っているのもある。ＤＢＤの特徴は２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在であり、その間にＰボックスとＤボックスの２つのアミノ酸モチーフがあり、それがエクジソン応答配列に特異性を与えている。こういうドメインは、天然型でも、修飾されたものでも、非相同受容体蛋白質の異なるドメインからなるキメラであっても良い。
【０１８８】
[000188] 外因性の遺伝子、応答配列、及びエクジソン受容体複合体で構成されるＤＮＡ配列は、始原細菌、大腸菌 (Escherichia coli) や枯草菌 (Bacillussubtilis) のような原核生物の細胞、他のエンテロバクテリア、あるいは植物や動物のような真核生物の細胞に導入できる。しかし、遺伝子により発現される蛋白質の多くは、バクテリアでは不正確に処理されるので、真核生物の細胞の方が望ましい。細胞は単細胞でも良いし、多細胞の有機体でも良い。外因性遺伝子、応答配列、及び受容体複合体のヌクレオチド配列は、ＲＮＡ分子としても導入できる。タバコモザイクウィルスのように機能性のウィルスＲＮＡである方が望ましい。真核生物の中では、脊椎動物の方が望ましい。エクジソン受容体用の本発明のリガンドに反応を与える分子が脊椎動物には天然に欠如しているからである。従って、本発明のリガンドには脊椎動物には感受性がない。つまり本発明のリガンドは、形質転換された細胞あるいは有機体全体に、無視できるほどの生理学的その他の影響しか及ぼさない。従って、細胞は、リガンドの存在によって実質的に全く影響を蒙らないで、成長しまた希望する生成物を発現できる。
【０１８９】
[000189] 「対象」と言う用語は、天然のままの植物、動物、あるいは植物又は動物の細胞を意味する。対象が真菌や酵母でもリガンドは同様に機能すると期待されている。対象が天然のままの動物である場合、脊椎動物であるのが望ましい。最も望ましいのは哺乳類である。
【０１９０】
[000190] 本発明のリガンドは、外因性遺伝子と結合した応答配列と更に結合したエクジソン受容体複合体と共に使用されると、外因性遺伝子の発現を外的に一時的に規制する手段を提供する。種々の成分が互いに結合する順序、すなわちリガンドと受容体複合体、そして受容体複合体と応答配列などの順序は余り重要ではない。通常、外因性遺伝子発現の調節は、エクジソン受容体複合体が特定のコントロール又は調節ＤＮＡ要素に結合する事により、その反応として生じる。エクジソン受容体蛋白質は、ステロイド受容体ファミリーの他の全メンバー同様、トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、そしてリガンド結合ドメインの少なくとも3つのドメインを有している。この受容体は、ステロイド受容体ファミリーのサブセット同様、ヘテロ２量体化の特性をもたらす余り良く知られていない部位を持っている。ＵＳＰ又はＲＸＲとのヘテロ２量体化の後、リガンドがエクジソン受容体蛋白質のリガンド結合ドメインと結合する事により、ヘテロ２量体蛋白質のＤＮＡ結合ドメインが、活性化された形で、応答配列に結合し、その結果、外因性遺伝子の発現又は抑制が行なわれる。この機構は、リガンドがEcR かUSPに結合し、その結果活性なホモ２量体複合体 (例えばEcR+EcR又はUSP+USP) が形成される可能性を排除するものではない。1つ又はそれ以上の受容体ドメインが異種で、キメラの遺伝子スイッチを作る方が望ましい。通常、3つのドメインのうち1つ又はそれ以上が異なる源から選ばれ、従って、トランスアクティベーション活動、リガンドの相補的結合、そして特定の応答配列の認識の面で、キメラ受容体は選ばれた宿主細胞又は有機体の中で最適化される。更に、応答配列自体が修飾されたり、酵母のGAL-4蛋白質 (サドウスキー (Sadowski) 等 (1988) ネーチャー (Nature), 355, 563-564)あるいは大腸菌 (E. coli) のLexA蛋白質のような他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインの応答配列で置き換えられたりして、キメラ・エクジソン受容体複合体の調節を行なう。キメラ・システムの別の有利な点は、期待する最終結果に応じて、外因性遺伝子の駆動に使われるプロモーターの選択が可能になる事である。そういう二重のコントロールは、発現のタイミングと発現が起きる細胞が共にコントロールできるので、遺伝子療法の分野、特に細胞毒の蛋白質が生産される場合は重要である。「プロモーター」と言う用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチド配列を意味する。その配列は、適切な条件下に転写が開始されるサイトである。適切なプロモーターと結合している外因性の遺伝子が対象の細胞に導入されると、外因性の遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在によりコントロールされる。プロモーターは定常的ににあるいは誘導的に規制され、あるいは組織特異的であったり(すなわち特定の細胞タイプだけで発現される)、あるいは有機体のある発育段階に特異的であったりできる。
【０１９１】
[000191] 本発明の別の面は、対象の1つ又はそれ以上の外因性遺伝子の発現を調節する方法であり、それには効果的な量、つまり本発明の化合物を含むリガンドの望ましい遺伝子発現又は抑制を行なう適切な量を対象に投与する事も含まれる。対象の細胞は以下を含む。
ａ）エクジソン受容体複合体に含まれるもの：
１）ＤＮＡ結合ドメイン
２）リガンドのための結合ドメイン
３）トランスアクティベーション・ドメイン
ｂ）ＤＮＡコンストラクトに含まれるもの
１）外因性遺伝子
２）応答配列
ここで外因性遺伝子は応答配列のコントロール下にあり、リガンドの存在下でＤＮＡ結合ドメインと応答配列と結合する事により、遺伝子の活性化又は抑制が起きる。
【０１９２】
[000192] 本発明が関係している別の面は、遺伝子を導入された対象で、内因性又は非相同性の遺伝子発現を調節する方法である。それには本発明の化合物を含むリガンドを対象の細胞内でエクジソン受容体に接触させる事も含まれる。細胞はエクジソン受容体のためにＤＮＡ結合配列を含んでおり、エクジソン受容体‐リガンド‐ＤＮＡ結合配列の複合体が遺伝子の発現を誘発する。
【０１９３】
[000193] 本発明の第4の面は、ポリペプチドを生産する方法で、それには以下のステップが含まれる。
ａ）本発明の化合物を含むリガンドと接触しても殆ど何も反応しない細胞を選択
ｂ）細胞への導入
１）ＤＮＡコンストラクトに含まれるもの
i) ポリペプチドをコードしている外因性遺伝子
ii) 応答配列
ここで、遺伝子は応答配列のコントロール下にある。
２）エクジソン受容体複合体に含まれるもの：
i）ＤＮＡ結合ドメイン
ii）リガンドのための結合ドメイン
iii）トランスアクティベーション・ドメイン
ｃ）細胞をリガンドに接触させる。
【０１９４】
[000194] 細胞によるポリペプチド生産を一時的にコントロールする利点同様、ポリペプチドの発現が短期間に限定されていると言う意味で、ポリペプチドの蓄積が細胞に害を与えるような場合には、本発明のこの面は更に利点となる。外因性遺伝子が治療遺伝子の場合、こういうコントロールは特に重要である。治療遺伝子は、ある必要な機能をコントロールするポリペプチドを生産するように要求されるかもしれない。例えば、糖尿病患者のインシュリン生産などである。害を与える又は致命傷を与える蛋白質を生産するのにも使用できる。例えば癌細胞にとって致命的な蛋白質などの場合である。こういうコントロールは、遺伝子導入植物に見られるように、生産された蛋白質の量が生長や生殖の代謝に害を及ぼすような場合にも重要である。
【０１９５】
[000195] 様々なポリペプチドをコードする数多くのゲノム及びｃＤＮＡ核酸配列が、その技術分野では知られている。本発明のリガンドが役に立つ外因性の遺伝物質には、関心のある生物活性蛋白質をコードする遺伝子も含まれる。例えば、細胞から放出される分泌性蛋白質、有毒物質を無毒物質に代謝する酵素、不活性な物質を活性な物質にする酵素、調節蛋白質、細胞表面受容体などである。有益な遺伝子には次のようなものをコードする遺伝子が含まれる：血液凝固因子、インシュリンのようなホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン放出因子、アルファ及びベータ精インヒビン、ヒト成長ホルモン；欠乏すると異常な状態が発生する酵素などの蛋白質をコードする遺伝子；インターフェロン、顆粒細胞マクロファージ・コロニー刺激因子、コロニー刺激因子‐１、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチンのようなサイトカイン又はリンフォカインをコードする遺伝子；アルファ1‐アンチトリプシンのような阻害物質をコードする遺伝子、ジフテリア及びコレラの毒のように薬として機能する物質をコードする遺伝子などである。更に、有益な遺伝子には、癌治療や先天性障害の治療なども含まれる。その分野の技術者には、既知の遺伝子のほとんど全てについて核酸配列情報の入手が可能であり、核酸分子を公的な保管所、配列を公表している機関から直接入手する事もできるし、そういう分子を作成する方法も利用可能である。
【０１９６】
[000196] 遺伝子治療について言えば、本出願で記述されているリガンドは、製薬的に容認できる担体、例えば液体、懸濁液、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル、注射可能物質などと一緒に摂取できる。製薬的な調剤はリガンドを重量比で0.01％から99％まで含む事ができる。特定の製薬的な調剤に使われるリガンドの量は、有効な摂取量、つまり望ましい遺伝子の発現または抑制に必要な量である。
【０１９７】
[000197] 製薬的な製剤を投与する経路としては、経口、直腸、局所(皮膚、頬、舌下も含む)、膣、非経口(皮下、筋肉内、静脈、皮内、クモ膜下、硬膜外も含む)、および経鼻胃管などがある。望ましい投与経路は、治療状態にもよるし、患者の状態などの種々の条件によっても異なっている事は、その分野の技術者には良く知られている。
【０１９８】
[000198] 本出願で記述されているリガンドは、他の製薬学的に活性な化合物と一緒に投与する事も可能である。本出願で記述されているリガンドと一緒に使用する製薬学的に活性な化合物は、ひどい副作用を避けるように、そして化合物間の望ましくない相互作用を避けるように選択されなければならない事は、業界の熟練工には良く知られている。リガンドと一緒に使用できる製薬学的に活性な化合物は、例えば、エイズのための化学療法薬、アミノ酸誘導体、鎮痛薬、麻酔薬、肛門直腸製品、制酸薬及び抗膨満薬、抗生物質、抗凝血薬、解毒剤、抗繊維素溶解薬、アンチヒスタミン、抗炎症薬、抗腫瘍薬、駆虫薬、抗原虫薬、防腐薬、抗痙攣薬、抗コリン作動薬、抗ウイルス薬、食欲抑制剤、関節炎の薬、生体反応調節物質、骨代謝調節薬、腸排泄薬、心臓血管薬、中枢神経刺激薬、脳代謝エンハンサー、耳垢溶解薬、コリンエステラーゼ阻害剤、風邪及び咳用の製剤、コロニー刺激因子、避妊薬、細胞保護薬、歯科用製剤、脱臭剤、皮膚薬、解毒薬、糖尿病の薬、診断用薬、下痢用の薬、ドーパミン受容体作用薬、電解質、酵素及び消化促進薬、麦角製剤、妊娠薬、繊維補助食品、抗真菌薬、乳汁露出阻害薬、胃酸分泌阻害薬、胃腸運動賦活薬、ゴナドトロピン阻害薬、髪成長刺激薬、造血薬、痔の薬、止血薬、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ホルモン、高血糖薬、高血脂薬、免疫抑制薬、下剤、抗ライ菌薬、白血球搬出補助薬、肺表面活性剤、片頭痛用製剤、粘液溶解薬、筋弛緩拮抗薬、筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、鼻内噴霧、吐き気用薬ヌクレオシド類似体、栄養補助食品、骨粗鬆症用製剤、子宮収縮薬、副交感神経遮断薬、副交感神経様作用薬、パーキンソン病の薬、ペニシリン補助薬、リン脂質、血小板阻害薬、ポルフィリア症の薬、プロスタグランジン類似体、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害薬、掻痒薬向精神性、キノロン、呼吸器刺激薬、唾液刺激薬、塩代用品、硬化剤、皮膚のけが用製剤、喫煙停止補助薬、スルホンアミド、交感神経遮断薬、血栓崩壊薬、トゥレット症候群用薬、腫瘍用製剤、肺結核用製剤、尿酸排泄薬、尿道用の薬、子宮収縮薬、子宮弛緩薬、膣用製剤、めまい用の薬、ビタミンＤ類似体、医療画像造影剤。ある場合には、リガンドを医薬品を使った治療の補助薬として使う事もできる。例えば、特定の薬を代謝する酵素があれば、それを生産する遺伝子を遮断するなど。
【０１９９】
[000199] 上述の応用の他に、農業面の応用に関しても、本発明のリガンドはバチルスチューリンゲンシス (Bacillus thuringiensis) (Bt) 毒のような殺虫性のある蛋白質の発現をコントロールするのにも使用できる。そういう発現は組織又は植物特異的であるかもしれない。更に、特に植物害虫のコントロールが必要な場合、1つ又はそれ以上の農薬を本出願で述べられているリガンドと組み合わせ、例えば農薬を個別で使う場合よりも全体量が少なくて済むなど、追加の利点と効果を提供する事ができる。農薬と混合する場合、含まれる各成分の割合は、収穫物、害虫、および／または雑草との関係で相対的な効率および望ましい適用率などを考慮する事によって決定される。農薬の混合は、単独で使用する場合よりも活性の幅が広がる等の利点が提供される事をその分野の技術者は良く知っている。本出願で記述されているリガンドと組み合わされて使用できる農薬には、抗真菌薬、除草剤、殺虫剤、そして殺菌剤が含まれる。
【０２００】
[000200] 本出願で記述されているリガンドは、大量水圧スプレー、少量スプレー、空気ブラスト、空中スプレーなど従来から一般的に使用されている方法によって、水溶性のスプレーとして、植物の葉に適用できる。希釈度および適用率は、用いる道具のタイプ、望ましい適用方法と頻度、そしてリガンドの適用率によって異なる。スプレー・タンクに追加の補助剤を加えるのが望ましい。そういう補助剤に含まれるのは、表面活性剤、分散剤、浸潤剤、展着剤、泡消剤、乳化剤、その他類似の物質で、マカッチョン (McCutcheon) の乳化剤及び洗浄剤、マカッチョン(McCutcheon) の乳化剤及び洗浄剤／機能的物質、そしてマカッチョン (McCutcheon) の機能的物質に記述されており、全てＭＣパブリッシング・カンパニー (MC Publishing Company) (ニュージャージー) のマカッチョン部門 (McCutcheonDivision) により年一度出版されている。リガンドは適用する前に肥料あるいは肥料性の物質と混合しても良い。リガンドと固形の肥料性物質は混合機で混合しても良いし、肥料と一緒にして顆粒状にしても良い。肥料の相対的な割合は、収穫物及び処理される雑草に適した量を使用する。本出願で記述されているリガンドは、一般に肥料の組成の5％から50％を含む。肥料は、こういう組成によって、望ましい植物の生長を促進できると同時に、遺伝子の発現もコントロールできる。
【０２０１】
宿主細胞及び本発明のヒト以外の有機体
[000201] 本上述の如く、本発明の遺伝子発現調節システムのリガンドは、宿主細胞の遺伝子発現を調節するのにも使用できる。遺伝子導入宿主細胞の発現は、関心のある種々の遺伝子の発現にとって有益である。本発明は、原核生物及び真核生物の宿主細胞に於いて、遺伝子発現調節のためにリガンドを提供する。遺伝子導入宿主細胞の発現は、関心のある種々のポリペプチドの発現にとって有益である。その中には、これだけに限定されるものではないが、ワクチンのように植物内で生産される抗原、アルファ・アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシランスのような酵素、あるいは昆虫、線虫、真菌、バクテリア、ウィルス、及び非生物的ストレスに対して抵抗性のある遺伝子、また抗原、ニュートラスティカル、医薬品、ビタミン、アミノ酸含有量、除草剤抵抗、寒さ、旱魃、及び熱抵抗を調節する遺伝子、産業生成物、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化物、男性避妊植物、花、燃料、他の出力、治療用ポリペプチド、経路中間物；既に宿主に存在する経路を調節して、今まで宿主を使っても不可能だった新しい生成物を合成；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミックス・アッセイ、バイオ治療蛋白質の生産、プロモーター・アッセイなどである。更に、遺伝子製品は、宿主の成長と収穫を高める、あるいは代替生長モードを可能にすると言う意味で有益である。
【０２０２】
[000202] 従って、本発明は、本発明に従って、分離された宿主細胞で、遺伝子の発現を調節するためのリガンドを提供する。宿主細胞はバクテリアの細胞、真菌の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、魚の細胞、植物細胞、鳥の細胞、動物細胞、あるいは哺乳類の細胞であっても良い。更に別の実施例では、本発明は宿主細胞の遺伝子発現を調節するリガンドに関係しているが、そこでは核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現に於いて、置換突然変異を含む発現を許す条件下で上述の宿主細胞を培地で培養し、培地から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを分離する方法が用いられる。
【０２０３】
[000203] 特定の実施例では、分離された宿主細胞とは、原核生物の宿主細胞あるいは真核生物の宿主細胞である。別の特定の実施例では、分離される宿主細胞とは、無脊椎動物の宿主細胞あるいは脊椎動物の宿主細胞である。宿主細胞は、バクテリアの細胞、真菌の細胞、酵母の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、魚の細胞、植物細胞、鳥の細胞、動物細胞、あるいは哺乳類の細胞からなるグループの中から選択されるのが望ましい。更に望ましいのは、宿主細胞は、酵母の細胞、線虫の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、ゼブラダニオの細胞、鶏の細胞、ハムスターの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ラビットの細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ウシ属の細胞、ヤギの細胞、雌牛の細胞、ブタの細胞、ウマの細胞、ヒツジの細胞、猿類の細胞、サルの細胞、チンパンジーの細胞、あるいはヒトの細胞である。望ましい宿主細胞の例としては、これだけに限定されるものではないが、アスペルギラス（Aspergillus）、トリコデルマ (Trichoderma)、サッカロマイセス （Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ (Candida)、ハンセヌラ (Hansenula)のような真菌又は酵母の種、シネコシスティス (Synechocystis)、シネココッカス (Synechococcus)、サルモネラ (Salmonella)、バチルス (Bacillus)、アシネトバクター (Acinetobacter)、ロードコッカス (Rhodococcus)、ストレプトマイセス (Streptomyces)、大腸菌 (Escherichia)、スードモナス (Pseudomonas)、メチロモナス (Methylomonas)、メチロバクター (Methylobacter)、アルカリゲネス (Alcaligenes)、シネコシスティス (Synechocystis)、アナバエナ (Anabaena)、チオバチルス (Thiobacillus)、メタノバクテリウム (Methanobacterium)、クレブシエラ (Klebsiella) 属の中の細菌種；リンゴ、シロイスナズナ (Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属 (Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦からなるグループの中から選ばれる植物種；動物；及び哺乳類の宿主細胞。
【０２０４】
[000204] ある特定の実施例では、宿主細胞は、サッカロマイセス （Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ (Candida)宿主細胞からなるグループから選ばれた酵母細胞である。
【０２０５】
[000205] 別の特定の実施例では、宿主細胞は、Caenorhabdus elegans 線虫細胞である。
【０２０６】
[000206] 別の特定の実施例では、宿主細胞は昆虫の細胞である。
【０２０７】
[000207] 別の特定の実施例では、宿主細胞は、リンゴ、シロイスナズナ (Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属 (Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦細胞からなるグループの中から選ばれる植物細胞である。
【０２０８】
[000208] 別の特定の実施例では、宿主細胞はゼブラダニオの細胞である。
【０２０９】
[000209] 別の特定の実施例では、宿主細胞は鶏の細胞である。
【０２１０】
[000210] 別の特定の実施例では、宿主細胞は、ハムスターの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ラビットの細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ウシ属の細胞、ヤギの細胞、雌牛の細胞、ブタの細胞、ウマの細胞、ヒツジの細胞、サルの細胞、チンパンジーの細胞、あるいはヒトの細胞からなるグループの中から選ばれた哺乳類の細胞である。
【０２１１】
[000211] 宿主細胞の形質転換はその技術分野では良く知られており、種々の方法で達成可能である。その中には、これだけに限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ウィルス感染、プラスミド／ベクター形質移入、非ウィルス・ベクター媒介形質移入、アグロバクテリウム (Agrobacterium) 媒介の形質転換、高速粒子衝撃などが含まれる。望ましい遺伝子生成物の発現には、適切な条件下に行なわれる形質転換された宿主細胞の培養、及び形質転換された遺伝子の発現誘導の過程も含まれる。原核生物及び真核生物の細胞に於ける培養条件と遺伝子発現プロトコールは、業界では良く知られている(実施例の一般方法のセクションを参照の事)。遺伝子生成物に特有のプロトコルに従って、細胞の収穫と遺伝子生成物の分離を行う事ができる。
【０２１２】
[000212] 更に、挿入されたポリヌクレオチドの発現を調節する、あるいは特定の望ましい方法でポリペプチド生成物を修飾及び処理する宿主細胞を選択する事もできる。蛋白質の翻訳と翻訳後の処理及び修飾 (例えば糖鎖形成やシグナル配列などの開裂) は、宿主細胞毎に特徴的で特有のメカニズムが存在する。発現された外来性蛋白質の望ましい修飾及び処理には、適切な細胞株又は宿主システムを選択できる。例えば、バクテリア・システムの発現は、グリコシル化されていないコア蛋白質生成物を生産するのに利用できる。しかし、バクテリアで発現されたポリペプチドは適切には折り畳まれていない。酵母での発現はグルコシル化された生成物を生産する。真核生物の細胞の発現は、「天然の」糖鎖形成及び非相同蛋白質の折り畳みの可能性を高める。更に、哺乳類の細胞での発現は、ポリペプチド活性の再構成又は構成のツールを提供できる。更に、ベクター／宿主発現システム毎に、蛋白質分解・開裂などの処理反応に及ぼす影響の程度は異なっている。本発明は、本発明に従って、分離された宿主細胞を含むヒト以外の有機体にも関係している。特定の実施例では、ヒト以外の有機体は原核生物の有機体あるいは真核生物の有機体である。別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体は無脊椎動物の有機体あるいは脊椎動物の有機体である。
【０２１３】
[000213] ヒト以外の有機体は、バクテリア、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚、植物、鳥、動物、及び哺乳類からなるグループから選択されるのが望ましい。更に望ましいのは、ヒト以外の有機体が酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラダニオ、鶏、ハムスター、マウス、ラット、ラビット、ネコ、イヌ、ウシ属、ヤギ、雌牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、猿類、サル、又はチンパンジーである。
【０２１４】
[000214] 特定の実施例では、ヒト以外の有機体は、サッカロマイセス （Saccharomyces）、ピチア (Pichia)、カンディダ (Candida)からなるグループから選ばれる酵母細胞である。
【０２１５】
[000215] 別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体はCaenorhabdus elegans 線虫細胞である。
【０２１６】
[000216] 別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体は、リンゴ、シロイスナズナ (Arabidopsis)、トウジンヒエ、バナナ、大麦、インゲン豆、蕪、ブラックグラム、ヒヨコマメ、チリ、胡瓜、茄子、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、オート麦、オクラ、キビ属 (Panicum)、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、胡椒、リュウキュウ豆、パイナップル、インゲン豆 (Phaseolus)、ジャガイモ、南瓜、米、モロコシ属、大豆、スクウォッシュ、サトウキビ、砂糖大根、向日葵、薩摩芋、茶、トマト、タバコ、西瓜、及び小麦からなるグループの中から選ばれる植物である。
【０２１７】
[000217] 別の特定の実施例では、ヒト以外の有機体はハツカネズミ族 (Mus musculus) である。
【０２１８】
本発明の遺伝子発現調節システム
[000218] 本発明は、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現システムに役立つリガンドのグループに関係している。本出願で述べられているように、新規なグループのリガンドは、原核生物と真核生物の両方の宿主細胞に於いて、改良された誘導性遺伝子発現システムを提供する。従って、本発明は、遺伝子の発現を調節するのに役立つリガンドに関係している。特に、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で発現が可能な少なくとも1つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節システム、そのシステムをトランスアクティベートする能力を持つリガンドに関係している。グループＨ核受容体リガンド結合は、エクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、NER-1、ステロイド・ホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質15、肝臓Ｘ受容体β、ステロイド・ホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、受容体相互作用蛋白質14、及びファルネソール受容体から来ているのが望ましい。更に望ましいのは、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体から来ているものである。
【０２１９】
[000219] 特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答配列、それを認識するＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、並びに置換変異体を含むグループＨ核受容体結合ドメイン、それを含む遺伝子発現カセットが含まれる。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第2の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答配列；ii)第1遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０２２０】
[000220] 別の特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、ａ）発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答配列、それを認識するＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、並びに置換変異体を含むグループＨ核受容体結合ドメイン、及びｂ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、及び2つのポリペプチド断片を含むキメラリガンド結合ドメイン (ここで第1のポリペプチド断片は、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、又はウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインから来ており、第2のポリペプチド断片は、別の脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、又はウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインから来ている) からなるグループから選ばれた第2の核受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現カセットが含まれる。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第2の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答配列；ii)第1遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０２２１】
[000221] 別の特定の実施例では、遺伝子発現調節システムには、発現の調節が行なわれる遺伝子と関係する応答配列、それを認識するＤＮＡ結合ドメイン及び核受容体リガンド結合ドメインを含む第1のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、それを含む第1の遺伝子発現カセット、そしてトランスアクティベーション・ドメイン及び核受容体リガンド結合ドメインを含む第2のポリペプチド、それをコードしているポリヌクレオチド、それを含む第2の遺伝子発現カセットが含まれる。ここで核受容体リガンド結合ドメインの１つは、置換変異体を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインである。望ましい実施例では、第1のポリペプチドはトランスアクティベーション・ドメインから実質的にフリーであり、第2のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインから実質的にフリーである。本発明目的では、「実質的にフリー」と言うのは、問題の蛋白質が、問題のドメインに関して、活性化又は活性化の抑制を提供するほどには十分な配列を含んでいない事を意味する。更に、遺伝子発現調節システムには、以下を含む第３の遺伝子発現カセットを含めても良い：ｉ）第1遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答配列；ii) 第２遺伝子発現カセットの第2のポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター;  及び iii) 発現が調節される遺伝子。
【０２２２】
[000222] １つの核受容体リガンド結合ドメインだけが置換変異体を含むグループＨリガンド結合ドメインである場合、もう１つの核受容体リガンド結合ドメインは、置換変異体を含むグループＨリガンド結合ドメインと２量体を形成する他の核受容体から来ても良い。例えば、置換変異体を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインが置換変異体を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである場合は、もう１つの核受容体リガンド結合ドメイン(「パートナー」)は、エクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体(ＲＸＲ)、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスパイラクル(ＵＳＰ)、あるいは脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、及びＵＳＰからなるグループから選ばれる少なくとも2つの異なる核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチド断片を含むキメラ核受容体から来ても良い(同時出願中の PCT/US01/ 09050、PCT/US02/05235及びPCT/US02/05706を参照の事。参照としてその全体を本出願に取り入れる)。「パートナー」の核受容体リガンド結合ドメインには、トランケーション変異体、遺伝子欠損変異体、置換変異体、その他の修飾を含めても良い。
【０２２３】
[000223] 脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒト (Homo sapiens)、マウス (Mus musculus)、ラット (Rattusnorvegicus)、鶏 (Gallus gallus)、ブタ (Susscrofa domestica)、蛙 (Xenopus laevis)、ゼブラダニオ (Daniorerio)、ホヤ (Polyandrocarpa misakiensis)、又はクラゲ (Trepedaliacysophora) から来るのが望ましい。
【０２２４】
[000224] 無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタ (Locusta migratoria) ウルトラスパイラクル・ポリペプチド (LmUSP)、マダニ (Amblyomma americanun) RXR 類似体１ (AmaRXR1)、マダニ ( Amblyomma americanun) RXR類似体２ (AmaRXR2)、シオマネキ (Celucapugilator) RXR 類似体 (CpRXR)、カブトムシ (Tenebriomolitor) RXR 類似体、ミツバチ (Apismellifera) RXR 類似体 (AmRXR)、アリマキ (Myzuzpersicae) RXR 類似体 (MpRXR)、あるいは非双翅類／非鱗翅類 RXR 類似体から来るのが望ましい。
【０２２５】
[000225] キメラRXRリガンド結合ドメインは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び非双翅類／非鱗翅類無脊椎動物種RXR 類似体ポリペプチド断片からなるグループから選ばれた少なくとも２つのポリペプチド断片を含むのが望ましい。本発明で使用されるキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2種類の種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいても良いし、種が同じ場合は、その種ＲＸＲポリペプチド断片の2つ又はそれ以上の異なるアイソフォームでも良い。
【０２２６】
[000226] 望ましい実施例では、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいる。
【０２２７】
[000227] 更に望ましい実施例では、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片、及び１つの非双翅類／非鱗翅類 無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチド断片を含んでいる。
【０２２８】
[000228] 特定の実施例では、発現が調節される遺伝子が宿主細胞に対して相同の遺伝子である。別の特定の実施例では、発現が調節される遺伝子が宿主細胞に対して非相同の遺伝子である。  
【０２２９】
[000229] 以下に説明されるように、本発明で使用されるリガンドは、遺伝子と結合している応答配列、それと結合している核受容体のリガンド結合ドメインと組み合わされる時、その遺伝子の発現を外的に一時的に調節する手段を提供する。結合メカニズム又は本発明の種々の要素が互いに結合し合う順序、例えば、リガンドとリガンドの結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインと応答配列、トランスアクティベーション・ドメインとプロモーターなどの結合順序は余り重要ではない。
【０２３０】
[000230] 特定の実施例では、グループＨ核受容体のリガンド結合ドメイン、及びその核受容体リガンド結合ドメイン・パートナーとリガンドの結合は、遺伝子の発現又は抑制を可能にする。このメカニズムは、リガンドがグループＨ核受容体 (GHNR) 又はそのパートナーと結合し、活性のホモ２量体複合体を形成(例えば、GHNR+GHNR、あるいはパートナー＋パートナー) する可能性を排除するものではない。1つ又はそれ以上の受容体ドメインが異種で、ハイブリッドの遺伝子スイッチを作る方が望ましい。通常、ＤＢＤ，ＬＢＤ，そしてトランスアクティベーション・ドメインの3つのドメインのうち1つ又はそれ以上が異なる源から選ばれ、従って、トランスアクティベーション活動、リガンドの相補的結合、そして特定の応答配列の認識の面で、ハイブリッド遺伝子及びその結果のハイブリッド蛋白質は、選ばれた宿主細胞又は有機体の中で最適化される。更に、応答配列自体が修飾されたり、酵母のGAL-4蛋白質 (サドウスキー (Sadowski) 等 (1988) ネーチャー (Nature), 355, 563-564) あるいは大腸菌 (Escherichia coli) のLexA蛋白質、あるいは特定の相互作用を行なうように設計、修飾、及び選択された蛋白質との標的相互作用に特異的な合成応答配列 (例えば、キム (Kim) 等 (1997), Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 94: 3616-3620を参照の事) のような他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインの応答配列で置き換えられたりして、ハイブリッド受容体の調節を行なう。２つのハイブリッド・システムの別の有利な点は、期待の最終結果に従って、遺伝子発現の駆動に使われるプロモーターの選択が可能になる事である。そういう二重のコントロールは、発現のタイミングと発現が起きる細胞が共にコントロールできるので、遺伝子療法の分野、特に細胞毒の蛋白質が生産される場合は重要である。適切なプロモーターと結合している遺伝子が対象の細胞に導入されると、外因性の遺伝子の発現は本発明のリガンドの存在によりコントロールされる。プロモーターは定常的にあるいは誘導的に規制される、あるいは組織特異的であったり(すなわち特定の細胞タイプだけで発現される)、あるいは有機体のある発育段階に特異的であったりできる。
【０２３１】
[000231] エクジソン受容体は核受容体スーパーファミリーのメンバーで、サブファミリー1グループＨ (本出願では「グループＨ核受容体」と呼ばれる) に分類される。各グループのメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインで40−60％のアミノ酸アイデンティティを共有する (ラウデット (Laudet) 等、核受容体サブファミリーのための統一命名システム、1999；細胞 (Cell) 97:161-163)。核受容体サブファミリー1グループＨには、エクジソン受容体の他にも次のようなものがある：ユビキタス受容体 (UR)、オーファン受容体１ (OR-1)、ステロイド・ホルモン核受容体１ (NER-1)、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質15 (RIP-15)、肝臓Ｘ受容体β (LXRβ)、ステロイド・ホルモン受容体様蛋白質(RLD-1)、肝臓Ｘ受容体 (LXR)、肝臓Ｘ受容体α (LXRα)、ファルネソイド受容体 (FXR)、受容体相互作用蛋白質14 (RIP-14)、及びファルネソール受容体 (HRR-1)。
【０２３２】
[000232] 特に、本出願で述べられているのは、置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインからなる遺伝子発現調節システムにとって有益な新規のリガンドである。この遺伝子発現システムは、トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、及びリガンド結合ドメインが１つのコードされたポリペプチド上に載っている「単一スイッチ」ベースの遺伝子発現システムであっても良い。あるいは、遺伝子発現調節システムは、トランスアクティベーション・ドメインとＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるコードされたポリペプチド上に載っている「二重スイッチ」ベース又は「2ハイブリッド」ベースの遺伝子発現調節システムであっても良い。
【０２３３】
[000233] 本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調節システムは、ヘテロ２量体でもホモ２量体でも良い。機能的EcR複合体とは、一般に、ステロイド受容体ファミリーの2つのメンバー、すなわち種々の昆虫から得られるエクジソン受容体蛋白質、及びウルトラスパイラクル(ＵＳＰ)蛋白質、又はＵＳＰの脊椎動物相同体であるレチノイドＸ受容体蛋白質で構成されるヘテロ２量体蛋白質複合体を意味する (ヤオ (Yao), 等 (1993) ネーチャー (Nature) 366, 476-479; ヤオ (Yao), 等 (1992) 細胞 (Cell) 71, 63-72を参照の事)。しかし以下に詳細に記述するように、複合体はホモ２量体であっても良い。機能的エクジソン受容体複合体は、イミュノフィリンなどの追加の蛋白質を含む事もできる。転写因子として知られる蛋白質のステロイド受容体ファミリーの追加メンバー(DHR38又はベータFTZ-１等)は、EcR、USP、および／またはRXRのリガンド依存又は非依存パートナーであっても良い。更に、コアクティベーター(あるいはアダプター又はメディエイター)として一般的に知られる蛋白質などの共同因子も要求される場合がある。こういう蛋白質はＤＮＡに配列特異的に結合する事も塩基の転写に関係する事もない。こういう蛋白質は、アクティベーターのＤＮＡ結合を刺激するなど種々のメカニズムを通し、クロマチン構造に影響を与えたり、アクティベーター開始複合相互作用を仲介したりする事により、転写の活性化に影響を及ぼしている。こういうコアクティベーターには、RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP、プロミスキュアス・コアクティベーターＣ応答配列Ｂ結合蛋白質、CBP/p300などがある (グラス (            Glass)等、Curr. Opin. Cell Biol.9: 222-232, 1997を参照の事)。更に、リガンド不在のとき転写活性を効果的に阻害するため、コレプレッサーとして一般に知られる(又レプレッサー、サイレンサー、又はサイレンシング・メディエイターとしても知られる)蛋白質共同因子が要求される場合もある。こういうコレプレッサーはリガンドのないエクジソン受容体と相互作用を起こし、応答配列の活性を和らげる。
最近の証拠によれば、リガンドとの結合は受容体の構造を変え、それがコレプレッサーの放出と上述のコアクティベーターの呼び出しに繋がり、その結果、活性を和らげる働きが廃止される。コレプレッサーにはN-CoR及びSMRTも含まれる (ホルウィッツ (Horwitz) 等Mol Endocrinol.10: 1167-1177, 1996) を参照の事)。こういう共同因子は細胞や有機体内の内因性の場合もあれば、遺伝子導入のように外部から加えて規制状態又は無規制状態で発現させる場合もある。エクジソン受容体蛋白質USP又はRXRのホモ２量体複合体も、ある環境の下では機能する場合がある。
【０２３４】
[000234] エクジソン受容体複合体は、普通、核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質を含んでおり、そのスーパーファミリーの全メンバーの特徴は、アミノ末端トランスアクティベーション・ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン(DBD)、そしてヒンジ部位でDBDから分離されているリガンド結合ドメイン(LBD)の存在である。本出願で使用する場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答配列と関わって機能するのに必要なＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列であり最も長くてもＤＮＡ結合蛋白質の全長の配列である。受容体スーパーファミリーのメンバーは4つ又は5つのドメイン(Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ)、そしてあるメンバーではＦの存在によっても特徴付けられている (米国特許4,981,784及びエバンス (Evans), サイエンス (Science) 240：889-895(1988)を参照の事)。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランスアクティベーション・ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ部位に対応する。そして「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーのあるメンバーは、「Ｆ」に対応するLBDのカルボキシ末端側に、別のトランスアクティベーション・ドメインを持っている。
【０２３５】
[000235] ＤＢＤの特徴は２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在であり、その間にＰボックスとＤボックスの２つのアミノ酸モチーフがあり、それがエクジソン応答配列に特異性を与えている。こういうドメインは、天然でも、修飾されたものでも、非相同受容体蛋白質の異なるドメインからなるキメラであっても良い。EcR受容体は、ステロイド受容体ファミリーのサブセット同様、ヘテロ２量体化の特性に責任のある余り良く知られていない部位を持っている。核受容体のドメインは天然ではモジュール方式であるので、LBD、DBD、そしてトランスアクティベーション・ドメインは相互交換可能であるかもしれない。
【０２３６】
[000236] 遺伝子スイッチ・システムは、エクジソン受容体複合体の構成分子を組み込むことが知られている。しかしこういう既知のシステムでは、EcRが使われる時、同じ分子上にある天然又は修飾ＤＮＡ結合ドメイン及びトランスアクティベーション・ドメインが組み込まれる。ＵＳＰ又はＲＸＲは静かなパートナーとして普通使われる。以前に証明された事であるが、ＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインが同じ分子上にある場合は、リガンドの不在下にバックグランド活性が活発になるが、ＤＮＡ結合ドメインとトランスアクティベーション・ドメインが異なる分子、つまりヘテロ２量体又はヘモ２量体複合体の2つのパートナーのそれぞれの分子上にある場合は、そういう活性は大幅に減少する。
【０２３７】
本発明の遺伝子発現の調節方法
[000237] 本発明は、本発明による遺伝子発現調節システムを使って、宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法にも関係している。特に、本発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法を提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）宿主細胞にリガンドを導入；ここで調節される遺伝子は次のものを含む遺伝子発現カセットの構成要素である：ｉ）遺伝子発現調節システムのDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む応答配列； ii）遺伝子発現調節システムのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２３８】
[000238] 本発明は、次のようなステップを含めて宿主細胞で遺伝子発現を調節する方法も提供する：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）宿主細胞に本発明による遺伝子発現カセットを導入；ここで遺伝子発現カセットは次の内容を含む：ｉ）遺伝子発現調節システムのDNA結合ドメインにより認識されるドメインを含む応答配列； ii）遺伝子発現調節システムのトランスアクティベーション・ドメインにより活性化されるプロモーター；そしてiii）発現が調節の対象となっている遺伝子；ｃ）リガンドを宿主細胞へ導入。リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２３９】
[000239] 本発明は、遺伝子発現調節システムの第1ハイブリッド・ポリペプチドからのDNA結合ドメインに結合するドメインを含む応答配列、それを含む遺伝子発現カセット、それを含む宿主細胞内で、遺伝子の発現を調節する方法；遺伝子発現調節システムの第2ハイブリッド・ポリペプチドのトランスアクティベーション・ドメインによって活性化されるプロモーター；そして発現が調節の対象となっている遺伝子も提供する。方法は次のステップで構成される：ａ）本発明による遺伝子発現調節システムを宿主細胞に導入；ｂ）リガンドを宿主細胞へ導入。ここで、リガンドを宿主細胞へ導入する事により、遺伝子の発現が調節される。
【０２４０】
[000240] 本発明で記述されている方法を使って、宿主細胞内で発現が求められている遺伝子は、内因性の場合も外因性の場合もある。望ましい遺伝子又は蛋白質の核酸又はアミノ酸配列情報は、公的にアクセス可能な多くのデータベースで入手できる。例えば、GENBANK, EMBL, Swiss-Prot, PIR、あるいは多くの生物学関連の雑誌などである。従って、この分野の技術者には、既知のほとんど全ての遺伝子に関して核酸配列情報の入手が可能である。そういう情報を使って、本出願で記述される方法で遺伝子発現カセットに対象の遺伝子を挿入するためのコンストラクトを構築できる。
【０２４１】
[000241] 本出願で説明されている方法を使って、宿主細胞内で発現が求められている遺伝子の例は、これだけに限定されるものではないが、次の内容を含む：ワクチンのように植物内で生産される抗原、アルファ・アミラーゼ、フィターゼ、グルカン、キシランスのような酵素、昆虫、線虫、真菌、バクテリア、ウィルス、及び非生物的ストレスに対して抵抗性のある遺伝子、ニュートラスティカル、医薬品、ビタミン、アミノ酸含量、除草剤抵抗、寒さ、旱魃、及び熱抵抗を調節する遺伝子、産業生成物、油、蛋白質、炭水化物、抗酸化物、男性避妊植物、花、燃料、他の出力；健康状態、病気、障害、機能不全、遺伝的疾患などの治療に使う事のできる遺伝子でコードされた治療学的に好ましいポリペプチドや生成物で、例えば、モノクローナル抗体、酵素、蛋白質分解酵素、サイトカイン、インターフェロン、インシュリン、エリスロポイエチン、凝血因子、その他血液因子や成分など。又この技術は遺伝子療法のためのウィルス・ベクター、ワクチン用のウィルス、医薬品発見の標的、機能的ゲノミックス、プロテオミックス分析などに応用できる。
【０２４２】
遺伝子発現／転写の測定
[000242] 本発明の方法の有効な測定方法の1つは、細胞の転写状態の測定であり、それにはＲＮＡ、望ましくはｍＲＮＡのアイデンティティ及び発生量も含まれる。こういう測定は、既に存在しているいくつかの遺伝子発現技術を使ってｃＤＮＡの発生量を測定する事により行なえる。
【０２４３】
[000243] 核酸アレイ技術はｍＲＮＡ配列の差の決定に有効な技術である。こういう技術には、例えば、オリゴヌクレオチド・チップやＤＮＡマイクロアレイなども含まれる。こういう技術は様々な遺伝子又はＤＮＡに対応する固体の支持体に固定されたＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドに依存しており、材料は、細胞、組織、又は全有機体から抽出された全ｍＲＮＡプールからｃＤＮＡを合成したサンプルでこれをプローブにハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチド・チップは、写真石版術を使って基質上に合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。1700までの遺伝子を分析可能なチップが作られている。ＤＮＡマイクロアレイはＤＮＡサンプルのアレイで、普通PCRの生成物で、顕微鏡スライド上にロボットを使って印刷される。各遺伝子は全長又は部分的長さの標的ＤＮＡ配列によって分析される。現在では10,000遺伝子までのマイクロアレイが商業的に生産されている。この２つの技術の主な違いは、オリゴヌクレオチド・チップは普通25-merのオリゴヌクレオチドを使って短いＤＮＡ分子の分析を行なうが、もっと大きいＤＮＡ標的を使うマイクロアレイでは、約1000の塩基対が扱われ、複雑なＤＮＡ混合物の分析の面でより高度の感度を提供できる。
【０２４４】
[000244] 本発明の方法の有効な別の測定方法は、この技術分野で良く知られているプロセスを使って、細胞に存在する構成蛋白質の発生量を測定する事により、細胞の翻訳状態を決定する方法である。
【０２４５】
[000245] 種々の生理学的機能に関連した遺伝子の同定を行いたい場合は、アッセイが行なわれ、次のような機能の変化が測定される：細胞の成長、アポプトシス、老化、分化、付着、特定の分子への結合、別の細胞への結合、細胞の組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送の簡便化、エネルギー変換、代謝、筋形成、神経形成、および／または造血など。
【０２４６】
[000246] 更に、本発明を使って遺伝子発現調節を測定するのに、選択可能マーカー又はレポーター遺伝子を使う事もできる。
【０２４７】
[000247] 遺伝子発現生成物を検出する他の方法は業界では良く知られており、例えば、サザン・ブロッティング法 (DNA検出)、ドット・オア・スロット・ブロッティング法 (DNA, RNA)、ノーザン・ブロッティング法 (RNA)、RT-PCR (RNA)、ウェスターン・ブロッティング法 (ポリペプチド検出)、ELISA (ポリペプチド)分析などがある。
【０２４８】
[000248] ある場合には、核酸配列の量を増殖させる必要がある。いくつかの適切な方法があるが、それを1つ又はそれ以上使えば実現可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、リガーゼ連鎖反応応 ( LCR)、核酸増幅同定検査 (SDA)、転写ベース増殖などがある。PCRは既に知られている技術に従って実行される。例えば、核酸のサンプルは熱に安定なDNAポリメラーゼの存在の下、ハイブリダイゼーションを行なう条件で処理される。1組のオリゴヌクレオチド・プライマーが使われ、１つのプライマーは検出されるべき特定の配列の1本鎖(テンプレート)にハイブリダイゼーションを行なう。プライマーはハイブリッドされる特定の配列のテンプレート鎖に十分相補的である。各プライマーの拡張生成物が合成され、それは核酸テンプレート鎖に相補的である。各プライマーから合成された拡張生成物は、同じプライマーを使って拡張生成物を更に合成するためのテンプレートとしても機能できる。拡張生成物の合成が十分な回数行なわれたら、上述の方法でサンプルを分析し、検出されるべき配列が存在するかどうか評価する。
【０２４９】
[000249] 本発明は、本発明の例として提供される以下の制限なしの実施例を参照する事により、更に良く理解できるかもしれない。
【実施例】
【０２５０】
一般的方法
[000250] 本出願で使用される標準の組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は業界では良く知られており、次のような記述がある：
サムブルック (Sambrook), J.、フリッチュ(Fritsch), E.F.、及びマニアティス(Maniatis), T.、分子クローニング：実験室マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)：コールド・スプリング・ハーバー (Cold Spring Harbor)、ニューヨーク (1989)、(マニアティス (Maniatis)) 及びT.J.シルヘイビー (Silhavy)、M.L.ベンナン (Benna)、及びL.W.エンクイスト (Enquist)、遺伝子融合の実験、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー (Cold Spring Harbor)、ニューヨーク (1984)、及びアウスベル(Ausubel), F.M., 等、分子生物学に於ける現在のプロトコール、グリーン・パブリッシング・アソシエーション (Greene Publishing Assoc.) 及びワイリー・インターサイエンス (Wiley-Interscience) (1987)。
【０２５１】
[000251] 細菌培養の維持と生長に適した材料及び方法は業界では良く知られている。以下の実施例で使用されるのに適した技術は、次に見出される：一般細菌学の方法マニュアル (フィリップ・ゲハート (Phillipp Gerhardt)、R. G. E. マレイ (Murray)、ラルフN.コスティロウ (Ralph N. Costilow)、ユージンW.ネスター (Eugene W.Nester)、ウィリスA.ウッド (Willis A. Wood)、ノエルR.クリーグ (Noel R. Krieg) 及びG.ブリッグス・フィリップス (Briggs Phillips) 版)、マイクロバイオロジー米国協会 (American Society for Microbiology)、ワシントンＤＣ(1994)、あるいはトーマスD.ブロック (Thomas D. Brock)、バイオテクノロジー：産業用マイクロバイオロジーのテキスト、第2版、シナウア・アソシエーツ・インク(Sinauer Associates, Inc.)、マサチューセッツ州サンダーランド (Sunderland, MA) (1989)。宿主細胞の生長及び維持に用いられる試薬、制限酵素、及び材料は全て、別の表記がない限り、アルドリック・ケミカルス (Aldrich Chemicals) (ウィスコンシン州ミルウォーキー (Milwaukee, WI))、DIFCOラボラトリーズ (Laboratories) (ミシガン州デトロイト (Detroit, MI))、GIBCO/BRL (メリーランド州ガイサースバーグ (Gaithersburg, MD))、あるいはシグマ・ケミカル・カンパニー (Sigma Chemical Company) (ミズリー州セントルイス (St. Louis, MO)) から入手した。
【０２５２】
[000252] 遺伝子配列の操作は、ジェネティックス・コンピューター・グループ・インク (GeneticsComputer Group, Inc.) (ウィスコンシン・パッケージ9.0版、ジェネティックス・コンピューター・グループ(Genetics ComputerGroup) (GCG)、ウィスコンシン州マジソン (Madison,WI)) から入手可能なプログラムを使って行なわれた。GCGプログラムの「Pileup」が使われる時は、ギャップ作成デフォルト値12及びギョップ拡張デフォルト値14が使用される。GCGの「Gap」又は「Bestfit」プログラムが使われる時は、デフォルト・ギャップ作成ペナルティ50及びデフォルト・ギャップ拡張ペナルティ３が使用される。いずれの場合も、GCGプログラムのパラメーターが指示されていない場合は、他のGCGプログラムを含めて、デフォルト値が使用される。
【０２５３】
[000253] 略語の意味は次の通りである：「ｈ」は時間、「min」は分、「sec」は秒、「ｄ」は日、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「μＭ」マイクロモル、「ｍＭ」はミリモル、「Ｍ」はモル、「mmol」はミリモル、「μg」はマイクログラム、「ｍｇ」はミリグラム、「Ａ」はアデニン又はアデノシン、「Ｔ」はチミン又はチミジン、「Ｇ」はグアニン又はグアノシン、「Ｃ」はシチジン又はシトシン、「xg」は重力を掛ける、「nt」はヌクレオチド、「aa」はアミノ酸、「bp」は塩基対、「kb」はキロベース、「ｋ」はキロ、「μ」はマイクロ、「℃」は摂氏の温度、「Ｃ」は化学式の中では摂氏、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフラン、「ＤＭＥ」はジメトキシエタン、「ＤＭＦ」はジメチルフォルムアミド、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴、「psi」は平方インチ当たりのポンド、及び「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを意味する。
【０２５４】
実施例１：化合物の調整
[000254] 本発明の化合物は、以下のような合成経路に従って製造できる。
1.1  RG-115853の調製
【化１２】
0004598757.tif 000007
【０２５５】
[000255] 20.0ｇ(0.232モル)のpivaldehydeを磁気撹拌棒及び温度計の付いた3ネック丸底2Ｌ底フラスコ内の600ｍＬのTHFに溶解した。フラスコには窒素ガスを流した。溶液はドライアイス／アセトン浴槽で‐65℃に冷却した。2.3Ｍのヘキシリチウム・ヘキサン溶液(0.23モル)100ｍＬをゴム栓とガラス製のネックの間に挿入した20ｍＬのガラス製シリンジを通して、温度を‐65℃以下に保ちながら、５ｍＬずつ添加した。‐60℃で1時間撹拌した後、反応物は1時間かけて‐5℃まで暖めた。反応物は再び‐65℃に冷却し、NH4Cl水溶液を徐々に加え冷やしてから、温度を‐50℃より上まで上げた。反応混合物は100ｍＬの水を加えて温度を上げた。揮発性生成物の損失を防ぐため、浴槽の温度を25-30℃に保ちながら、回転式蒸発装置でＴＨＦを除去した。生成物はエチルエーテルで抽出した。有機層は乾燥し、溶媒は、重量の損失をモニターしながら、回転式蒸発装置で注意して除去した。生成物2,2‐ジメチル‐ノナン‐３‐オールは、高度に濃縮したエーテル溶液として、次の酸化ステップで使用した。
【化１３】
0004598757.tif 000008
【０２５６】
[000256] 濃縮エーテル溶液である2,2‐ジメチル‐ノナン‐３‐オール(約0.23モル、前工程を参照)は、500ｍＬ丸底フラスコに入った約350ｍＬのCH2Cl2に溶解した。激しく撹拌し外部を冷却しながら、ピリジニウム・クロロクロメート(PCC、76.6ｇ、0.355モル)を徐々に加えた。反応混合物の色は黒に変わり、温度が上昇し始めた。反応物は撹拌しながら室温で一夜放置し、上澄み液は除去し、生成した黒色の沈殿物を得た。沈殿物は約40ｍＬのヘキサンで抽出し、CH2Cl2と合わせた。この混合物は100ｇのシリカゲル・カラムに直接注ぎ、まずCH2Cl2／ヘキサン、次に10％酢酸エチルのヘキサン溶液で溶出し、緑色の粗生成物35.8ｇを得た。この物質はもう一度クロマトグラフィーを使いへキサンで溶出し、回転式蒸発装置を使って25℃で注意して蒸発させ、26.1ｇの2,2‐ジメチル‐ノナン‐３‐オンを得た(収率67％)。1H NMR (500 MHz, CDCl3), d (ppm): 2.47 (t, 2H), 1.28 (br, 8H), 0.89 (t, 3H).
【化１４】
0004598757.tif 000009
【０２５７】
[000257] 磁気撹拌装置の付いた500ｍＬの3ネック・フラスコ(氷水の浴槽で冷却)に50ｍＬのCH2Cl2、次に80ｍＬの水に溶解した32ｇ(231mmol)のK2CO3溶液、そして24ｇ(479 mmol)のヒドラジン水和物を加えた。温度を10℃以下に保ちながら、30−60分かけて、100ｍＬのCH2Cl2に溶解した20ｇ(108.3 mmol)の２‐メチル，3‐メトキシベンゾイル塩化物を加えた。反応混合物は更に1時間撹拌し、沈殿物を得た。沈殿物は集め、CH2Cl2／CHCl3混合液で良く掻き混ぜた。液体層は残渣の固体層と分離し、溶媒は真空で除去し、5.85ｇのヒドラジド粗生成物を得た。一方、最初のCH2Cl2液は分離漏斗に移し、CHCl３で希釈し、水と良く掻き混ぜた。有機層は除去し、水でもう一度洗浄し、乾燥させ、溶媒を除去し、固体の残渣を得た。ヘキサンで良く洗浄し、濾過し、6.05ｇの追加のヒドラジド粗生成物を得た。ヒドラジド粗生成物は一緒にして、熱エーテル又は酢酸エチル/ヘキサン混合物で再結晶し、10.04ｇの3‐メトキシ‐２‐メチル安息香酸ヒドラジドを得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.2 (t, 1H), 6.95 (br s, 1H), 6.9 (m, 2H), 4.15 (br s, 2H),3.84 (s, 3H), 2.27 (s, 3H).
【化１５】
0004598757.tif 000010
【０２５８】
[000258] tert-ブチルカルバゼート(80.0ｇ、605mmol)を800ｍLの塩化メチレン中で撹拌し、0℃に冷却した。これに炭酸カリウム溶液(937ｇ、847 mmol)を加えた。2‐エチル‐3‐メトキシベンゾイル塩化物(132ｇ、666 mmol))を400ｍLの塩化メチレンに溶解し、反応混合物に15分かけて滴下した。混合物は0℃で15分、次に室温で18時間撹拌した。反応物は塩化メチレンと水で希釈し、液層は分離した。残りの有機層は１N HCｌ、水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥後蒸発させた。残渣はヘキサンで滴定し、白色の固体N’‐(２‐エチル‐３‐メトキシ‐ベンゾイル)‐ヒドラジン・カルボン酸 tert‐ブチル・エステルを得た(167ｇ、567 mmol)。収率94％。1H-NMR(300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.4 (br s, 1H), 7.22 (t, 1H),7.03 (br d, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.65 (br, 1H), 3.84 (s, 3H), 2.8 (q, 2H), 1.51(s, 9H), 1.2 (t, 3H).
【化１６】
0004598757.tif 000011
【０２５９】
[000259] 丸底フラスコにオーバーヘッドの撹拌装置(反応中に大量の固体が沈殿するので必要)と窒素取り入れ口を備えた。このフラスコで、N’-(2‐エチル‐3‐メトキシ‐ベンゾイル)‐ヒドラジン・カルボン酸 tert‐ブチルエステル(166g、564mmol)の塩化メチレン(2260ｍL)溶液を撹拌した。この混合物にトリフルオロ酢酸(217ｍL、2820 mmol)を加えた。反応混合物は室温で18時間撹拌した。エーテル(1000ｍL)とヘキサン(1000ｍL)を加え、混合物を1時間撹拌した。沈殿物は濾過し、50％のエーテル/ヘキサンで洗浄し、生成物のトリフルオロ酢酸塩として白色の固体(90.2g)を得た。液体部分と洗浄液を合わせ、蒸発させ、エーテルで滴定し、追加の白色固体を得た(15.5ｇ)。これも2‐エチル‐3‐メトキシ‐安息香酸ヒドラジドのトリフルオロ酢酸塩である。合計収率は60％(105.7ｇ)。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) d (ppm): 7.3 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 6.95 (d, 1H), 3.85 (s, 3H), 2.65q, 2H), 1.1 (t, 3H).  19F-NMR(282.4 MHz, DMSO-d6) d (ppm): -74.2(s). 遊離塩基2‐エチル‐3‐メトキシ‐安息香酸ヒドラジドの分析: 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) d (ppm): 9.4 (br s, 1H), 7.2 (t, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.85 (d, 1H),4.45 (br, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.6 (q, 2H), 1.1 (t, 3H).
【化１７】
0004598757.tif 000012
【０２６０】
[000260] 3.40g(20mmol)の2,2‐ジメチルノナン‐3‐オンを40ｍLの100％エチルアルコールに溶解した。次に3.60ｇ(20mmol)の2‐メチル，3‐メトキシベンゾイルヒドラジドと20滴の氷酢酸を加えた。反応混合物は10時間還流し(完全な反応に必要)、TLCでモニターした。中間生成物３‐メトキシ‐2‐メチル‐安息香酸(１‐tert‐ブチル‐へプチリデン)‐ヒドラジド溶液に3.5ｍLの氷酢酸と1.89g(30 mmol)の水素化シアノ硼素ナトリウムを加えた。反応物は室温で24時間撹拌し、次に1時間還流した。反応物を冷却した。反応物が塩基になるまで、50ｍLの水と10％のNaOH水溶液を加えた(ｐH＝約14)。アルコールの大半は回転式蒸発装置で除去し、生成物はCHCl3で抽出した。水溶性の抽出物を乾燥し、一定の重さになるまで濃縮し、粘着性の物質6gを得た。TLC(1:1酢酸エチル:ヘキサン)は、生成物のアルキル化ヒドラジド、Rf＝0.6(1:1酢酸エチル:ヘキサン)、及び最初のアルキル化されていないヒドラジド、Rf＝0.10(1:1酢酸エチル:ヘキサン)が、等量含まれている事を示していた。精製された生成物は、シリカを使ったカラム・クロマトグラフィーで得られた。３‐メトキシ‐2‐メチル‐安息香酸N’‐(１‐tert‐ブチル‐へプチル)‐ヒドラジドは、20−30％の酢酸エチル・ヘキサン液で溶出した。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.18 (t, 1H),7.05 (br s, 1H [NH]), 6.91 (d, 1H), 4.9 (br s, NH), 3.84 (s, 3H), 2.5 (m, 1H),2.28 (s, 3H), 1.2-1.8 (複数の無定型名ピーク、10H),0.97 (s, 9H), 0.9 (t, 3H).
【化１８】
0004598757.tif 000013
【０２６１】
[000261]164mg(0.49mmol)の３‐メトキシ‐2‐メチル‐安息香酸N’‐(１‐tert‐ブチル‐へプチル)‐ヒドラジドと82mgの3,5‐ジメチルベンゾイル塩化物を10ｍLのCH2Cl2に溶解した。７ｍLの25％K2CO3を加え、反応混合物を室温で一夜撹拌した。反応物はTLCでモニターした。層の分離を行ったが、その操作を助けるため、必要に応じてCH2Cl2および/または水を加えた。CH2Cl2層を乾燥し、溶媒は真空中で除去し、240mgの粗生成物を得た。この物質はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。5−20％の酢酸エチル・ヘキサン溶液を使ってステップグラジエントで溶出した。15％の酢酸エチル分画に溶出された目的生成物として、TLC Rf＝0.62(1:1酢酸エチル：ヘキサン)、3,5‐ジメチル‐安息香酸N‐(1‐tert‐ブチル‐ヘプチル)‐N’‐(3‐メトキシ‐2‐メチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジドを得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.2 (s, NH),7.05 (s, 2H), 7.03 (m, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.83 (d, 1H), 6.25 (d, 1H), 4.67 (d,1H), 3.81 (s, 3H), 2.28 (s, 6H), 1.79 (s, 3H), 1.55 (br m, 2H), 1.3 (br, 8H),1.34 + 1.07 (s+s, 9H), 0.089 (br s, 3H).
1.2  RG-115845の調製
【化１９】
0004598757.tif 000014
【０２６２】
[000262] 25ｍLの小瓶を使って、123.1mg(0.388mmol)の４‐エチル‐安息香酸N’‐(１‐tert‐ブチル‐ヘプチル)‐ヒドラジドを5ｍLのCH2Cl2に溶解した。3等量のPS-NMM (ポリスチレン‐SO2NH(CH2)3‐モルホリン、アルゴノート・テク(Argonaut Tech.))、次に３ｍLのCH2Cl2を加え、撹拌可能な懸濁液を得た。１等量の酸塩化物を加え、反応混合物を一夜撹拌した。翌日、２等量のAP-NCO樹脂(イソシアンテ・スカベンジャー、アルゴノート・テク(Argonaut Tech.))、及び２等量のAPトリサミン(ポリスチレン‐CH2NHCH2CH2NH(CH2CH2NH2)２、アルゴノート・テク(Argonaut Tech.))を３ｍLのCH2Cl2と共に加えた。混合物を4時間撹拌し、樹脂を濾過した。反応物はTLCで分析し、溶媒を除去し、樹脂は真空中乾燥した。1−100％エーテル・ヘキサン液のグラジエントを使ってシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを行うと、107.5mgの2‐メトキシ‐ニコチン酸N‐(１‐tert‐ブチル‐ヘプチル)‐N’‐(4‐エチル‐ベンゾイル) ‐ヒドラジドが単離された。
【０２６３】
[000263] RG-115843、RG-115844、及びRG-115854も、対応する出発ヒドラジド及び酸塩化物から同じような方法で調整した。
1.3  RG-116878の調製
【化２０】
0004598757.tif 000015
【０２６４】
[000264] 窒素を流しゴム栓で密閉した２Lの3ネック・フラスコを使い、15g(133mmol)の2,2‐ジメチル‐4‐ペンテナルを600ｍLのTHFに加えた。反応混合物はドライアイス/アセトン浴槽で‐60℃に冷却した。ブチルリチウム液(2.5Mヘキサン液、64.4ｍL、160.7mmol)を20ｍLのガラス・シリンジから一度に4−5ｍLずつ加えた。反応温度は添加中‐65℃に保ち、その後更に1時間撹拌した。反応混合物は1時間かけて‐5℃に温め、再び‐60℃に冷やし、塩化アンモニウム液(10.5g/200 mL水、200mmol)で徐々に冷やした。水槽の温度を30℃に設定したまま、THFを回転式蒸発装置で蒸発させ、生じた水溶液をCH2Cl2(3x200ｍL)、次にエーテル(1x200ｍL)で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し、回転式蒸発装置で濃縮すると、22.64ｇの4,4‐ジメチル‐ノン‐１‐エン‐５‐オール)が得られた。TLC Rf=0.67 (1:1酢酸エチル：ヘキサン、I2により視覚化)。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) d (ppm): 5.86 (m, 1H), 5.06 (m, 1H)), 5.03 (s, 1H), 3.26 (d, 1H),2.15 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.5 (m, 2H), 1.3 (m, 4H), 0.95, (t, 3H), 0.90 (s,3H), 0.89 (s, 3H).
【化２１】
0004598757.tif 000016
【０２６５】
[000265]17.50g(102.9mmol)の4,4‐ジメチル‐ノン‐１‐エン‐５‐オールと300ｍLのCH2Cl2を500ｍLのフラスコに加えた。反応物は氷水で冷やした。激しく撹拌しながら、33.29g(154ｍmol)のピリジニウム・クロロクロメートを少しずつ加えた(氷の浴槽)。反応物は室温で24時間撹拌したが、その期間中に色が黒に変わり、フラスコの底に沈殿物が堆積した。黒/こげ茶色のCH2Cl2をデカントして除去し、沈殿物をCH2Cl2で2度洗浄した。反応生成物はシリカ・カラムクロマトグラフィーで精製した。こげ茶色のCH2Cl2混合物を乾燥シリカのカラムを通すと、精製された生成物がCH2Cl2液として溶出された。その溶媒を蒸発させると、12.69gの生成物4,4‐ジメチル‐ノン‐１‐エン‐５‐オンが得られた。5％の酢酸エチル/ヘキサンで溶出すると、更に1.40ｇが得られた(収率81％)。精製された生成物のTLCは、Rf＝0.71(1:1酢酸エチル：ヘキサン、I2で視覚化)。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) d (ppm): 5.7 (m, 1H), 5.05(m, 2H), 2.45 (t, 2H), 2.27 (d, 2H), 1.5 (m, 2H), 1.3 (m, 2H), 1.12, (s, 3H),0.90 (t, 3H).
【化２２】
0004598757.tif 000017
【０２６６】
[000266] 50ｍLの丸底フラスコを10.62g(59ｍmol)の２‐メチル‐3‐メトキシベンゾイル・ヒドラジド、10.0g(59.5ｍｍol)の4,4‐ジメチルノナン‐１‐エン，５‐オン、及び150ｍL(ママ)のメタノールで満たした。20滴の氷酢酸を触媒として添加し、反応混合物を9時間還流し、室温で48時間撹拌した。中間生成物のヒドラジンが単離されたが、TLCにより30％の生成物が得られた(Rf=0.58、1:1ヘキサン：酢酸エチル)事を示していた。反応混合物に４ｍLの酢酸と4.72g(75ｍｍol)のNaCNBH3を加え、反応物は1時間還流した。反応混合物は600ｍLのビーカーに移し、100ｍLの水を加え、その後アルカリ性になるまで10％NaOHを添加した。アルコールの大半は蒸発した。残りの混合物を酢酸エチルで抽出すると、12.2ｇの残渣が得られた。シリカゲル・クロマトグラフィーを使って15−25％の酢酸エチル/ ヘキサンで溶出すると、粗生成物のヒドラジンが得られた。TLCでは2スポット、Rf=0.47及び0.55(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。酢酸エチル/ ヘキサン・グラジエントで再クロマトグラフィーを行い溶出すると、精製された生成物が得られた。10％の酢酸エチル/ヘキサン分画から精製された3‐メトキシ‐2‐メチル‐安息香酸N’‐(１‐ブチル‐2,2‐ジメチル‐ペント‐4‐エニル)‐ヒドラジンが得られた。Rf＝0.56(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.18 (t, 1H), 7.03 (s, 1H, NH), 6.90 (d, 1H), 5.87 (m, 1H),5.04 (m, 2H), 4.9 (br s, 1H NH), 3.84 (s, 3H), 2.55 (m, 1H), 2.28 (s, 3H), 2.16(m, 1H), 2.06 (m, 1H), 1.7 (m, 1H), 1.6 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.3 (m, 3H),0.96 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.92 (t, 3H).
【化２３】
0004598757.tif 000018
【０２６７】
[000267] 1.8g(5.42ｍｍol)の3‐メトキシ‐2‐メチル‐安息香酸N’‐(１‐ブチル‐2,2‐ジメチル‐ペント‐4‐エニル)‐ヒドラジド、及び1.34g(８ｍｍol)の3,5‐ジメチルベンゾイル塩化物を50ｍLのCH2Cl2に溶解した。20mLの20％K2CO3(15ｍｍol)を添加し、反応混合物を室温で一夜撹拌した。層を分離したが、この操作を助けるため、必要に応じてCH2Cl2および/または水を加えた。CH2Cl2の層を乾燥し、溶媒を真空中で除去すると、1.65gのガラス状固形物が得られた。この物質は、シリカゲル・カラム・クロマトグラフィーを使って、５−25％の酢酸エチル・ヘキサン液によるステップグラジエントで溶出して精製した。TLCRf=0.59(1:1酢酸エチル：ヘキサン)、収率＝1.0g。酢酸エチル/ヘキサンによるステップグラジエントでもう一度クロマトグラフィーを行なうと、目的の3,5‐ジメチル‐安息香酸N‐(１‐ブチル‐2,2‐ジメチル‐ペント‐４‐エニル)‐N’‐(3‐メトキシ‐2‐メチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジドが、精製された白色固体として得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.2 (br s, NH), 7.11 (m, 1H), 7.1 (s, 2H), 7.02 (s, 1H),6.87 (d, 1H), 6.3 (d, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.1 (m, 2H), 4.77 (m, 1H), 3.78 (s,3H), 2.35 (d, 1H), 2.28 (s, 6H), 2.15 (d, 1H), 1.77 (s 3H), 1.2-1.6 (br m, 6H),1.05 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 0.94 (t, 3H).
1.4  RG-115877の調製
【化２４】
0004598757.tif 000019
【０２６８】
[000268] パラジウム木炭触媒を使い、水素の雰囲気下に、メタノールの入ったパール・シェーカー中で、RG-115878(240mg)の水素添加を行なった。3,5‐ジメチル‐安息香酸N‐(１‐ブチル‐2,2‐ジメチル‐ペンチル)‐N’‐(3‐メトキシ‐2‐メチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジドが白色の固体として単離された。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.07 (m, 3H [NH]), 7.00 (m, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.29 (d, 1H),4.73 (d, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.29 (s, 6H), 1.78 (s, 3H), 1.58 (br, 4H), 1.38(br, 6H), 1.03 (m, 6H), 0.96 (m, 6H).
1.5  RG-115855の調製
【化２５】
0004598757.tif 000020
【０２６９】
[000269] 1.84g(100ｍｍol)の2,2,5,6,6‐ペンタメチルヘプテン‐3‐オン(ランカスター合成)を量り、200ｍLの丸底フラスコに添加した。1.80(10ｍｍol)の2‐メチル‐3‐メトキシベンゾイルヒドラジン、50ｍLのエタノール、20滴の氷酢酸を加えた。反応物は撹拌しながら24時間還流した。生成物のヒドラゾンは単離されなかったが、直接還元工程へ移された。
【０２７０】
[000270] 3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐3,4,4‐トリメチル‐ペント‐2‐エニル) ‐ヒドラジド反応混合物に３ｍLの氷酢酸と950mg(14.5ｍｍol)の95％水素化シアノ硼素ナトリウムを加え、反応物を室温で一夜撹拌した。エタノールの大半は蒸発した。50ｍLの水を加え、混合物は10％NaOHでｐH14になるまでアルカリ化した。残りのエタノールは蒸発した。生成物はクロロホルムで抽出した。残渣のTLCは、目的のヒドラジド(Rf＝0.55、1:1酢酸エチル：ヘキサン)、最初のヒドラジド(Rf＝0.08)、そしていくつかの重要性の少ない生成物の存在を示していた。精製されたヒドラジドは、グラジエント(酢酸エチル/ヘキサン)シリカゲル・クロマトグラフィーにより得られた。生成物は20％の酢酸エチル・ヘキサン液で溶出された。真空中で濃縮する事により、515mgの3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐3,4,4‐トリメチル‐ペント‐2‐エニル) ‐ヒドラジドが白色結晶として得られた(収率15％)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm):7.2 (t, 1H), 6.93 (s, 1H [NH]), 6.88 (d 1H), 5.24 (d, 1H), 5.2 (br s, 1H), 3.83(, 3H), 3.63 (d, 1H), 2.26 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.07 (s, 9H), 0.99 (s, 9H).
【化２６】
0004598757.tif 000021
【０２７１】
[000271]219mg(0.63ｍｍol)の3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐3,4,4‐トリメチル‐ペント‐2‐エニル) ‐ヒドラジド、230mg(1.36ｍｍol)の3,5‐ジメチルベンゾイル塩化物、７ｍLの25％K2CO3水溶液、そして７ｍLのCH2Cl2を20mLの小瓶に加えた。反応物は室温で24時間撹拌した。混合物はCH2Cl2を使って分離漏斗へ移され、45ｍLの17％K2CO3水溶液を加えた。CH2Cl2層を分離し、水溶液層を50ｍLのCH2Cl2で2回抽出した。有機層は一緒にし、乾燥し、真空中で濃縮乾固すると、0.53gの残渣が得られた。Rf＝0.67(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。残渣は、酢酸エチル/ヘキサン・グラジエントのシリカゲル・クロマトグラフィーを使い、10-11％の酢酸エチル・ヘキサン液で溶出すると、0.21gの精製された3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐3,4,4‐トリメチル‐ペント‐2‐エニル)‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジドが得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.2 (1H, [NH]), 7.12 (m, 1H), 7.1 (br s, 2H), 6.95 (s, 1H),6.85 (d, 1H), 6.6 (d, 1H), 5.55 (d, 1H), 5.45 (d, 1H), 3.8 (s, 3H), 2. 3(s,6H), 1. 95 (s 3H), 1.6 (s 3H), 1.07 (s, 9H), 1.02 (s 9H).
1.6  RG-115860の調製
【化２７】
0004598757.tif 000022
【０２７２】
[000272] tert‐ブチル‐シアノメチルケトン(‘1.75g、14ｍｍol、ランカスター合成)、及び2‐メチル‐3‐メトキシベンゾイルヒドラジド(2.52g、14ｍｍol)を20滴の氷酢酸で酸化した20ｍLのメタノールに加えた。反応混合物は室温で一夜撹拌した。溶媒は真空中で除去し、残差は再びCH2Cl2に溶解し、その結果得られた混合物はK2CO3水溶液で抽出した。有機層は乾燥し、溶媒は真空中で除去した。シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、10-35％の酢酸エチル/ヘキサン・グラジエントで溶出すると、0.69gの精製された3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐2‐シアノ‐ビニル)‐ヒドラジド、及び精製度合いは少々落ちるがほとんど等量の物質が得られた。TLC:Rｆ＝0.56(1:1酢酸エチル：ヘキサン)。1HNMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.18 (t, 1H), 7.07 (d, 1H), 6.91 (d,1H), 5.56 (br s, 2H [NH]), 5.27 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.145 (s,9H).
【化２８】
0004598757.tif 000023
【０２７３】
[000273]340mg(1.18ｍｍol)の3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐2‐シアノ‐ビニル)‐ヒドラジド、290mg(1.7ｍｍol)の3,5‐ジメチルベンゾイル塩化物、３ｍLの25% K2CO3水溶液、及び５ｍLのCH2Cl2を室温で2日間撹拌した。混合物は水とCH2Cl2で希釈した。有機層は分離し、水槽はCH2Cl2で抽出した。有機層は一緒にし、乾燥し、真空中で濃縮乾固すると、0.72gの半固体が得られた。Rf=0.69(1:1酢酸エチル：ヘキサン、主な不純物はRf=0.63)。残渣は、2−20％酢酸エチル/ヘキサン・グラジエントのシリカゲル・クロマトグラフィーを使い、4％の酢酸エチル・ヘキサン液で溶出すると、106mgの精製された3‐メトキシ‐２‐メチル‐安息香酸N’ ‐(１‐tert‐ブチル‐2‐シアノ‐ビニル)‐N’‐(3,5‐ジメチルベンゾイル)ヒドラジドが得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.57 (s, 2H),7.25 (t, 1H), 7.2 (s, 1H), 7.1 (d, 1H [C==CH]), 7.02 (s, 1H), 6.99 (d, 1H),3.87 (s, 3H), 2.4 (s, 6H), 2.16 (s, 3H), 1.24 (s, 9H).
1.7  RG-115790の調製
【化２９】
0004598757.tif 000024
【０２７４】
[000274] オーバーヘッドの撹拌装置と窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、ピペロニル酸(50.0g、301ｍｍol)及びテトラヒドロフラン(753ｍL)を加えた。それをドライアイス・アセトン槽で‐75℃に冷却した。反応物の温度を‐65℃以下に保ちながら、N-ブチルリチウム(1.6M、ヘキサン中)(414ｍL、662ｍｍol)を滴下した。滴下が完了したら、冷却槽を除き、反応物が‐20℃まで温まるのを待った。反応物を再び浴槽へ戻し。少なくとも‐60℃まで冷却してから、ヨードメタン(37.5ｍL、602ｍｍol)を滴下した。冷却装置を除き、反応物が10℃になるまで待ってから氷の浴槽に入れ、0℃で30分間撹拌した。反応物には１N HClを加え、テトラヒドロフランは蒸発により除去した。残渣は１N HClでスラリー状にしてから濾過した。濾液は水で洗い、50−60℃で真空乾燥すると、淡黄色の固体である4‐メチル‐ベンゾ[1,3]ジオキソール‐5‐カルボン酸(52.8g、293ｍｍol)が得られた。収率97％。1H-NMR(300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.44 (s, 3H),6.10 (s, 2H), 6.77 (d, 1H), 7.64 (d, 1H). TLC Rf  = 0.54 (1:1酢酸エチル/ヘキサン、ピペロニル酸＝0.41)
【０２７５】
[000275] 注：カルボン酸塩は流動性に乏しい沈殿物を形成するので、磁気ではなくオーバーヘッドの撹拌装置が必要。ブチルリチウムの第一等量の添加はかなり発熱反応である(カルボン酸の脱プロトン化)。ブチルリチウムの添加速度は、第二等量に関しては大幅に速めても良い。ブチルリチウム添加が完了する前に反応温度が‐60℃あるいはそれよりも高くなると、ブチルケトンの生成が加速される。ヨードメタンの添加は発熱反応である。最初の温度は約‐10℃から0℃で、その時点で、10−15℃の温度上昇が起きる。
【化３０】
0004598757.tif 000025
【０２７６】
[000276] 磁気撹拌装置、添加漏斗、そして窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、ベンゾ(1,4)ジオキサン‐6‐カルボン酸(18.00g、99.91ｍｍol)、及び1,2‐ジメトキシエタン(667ｍL)を加えた。この混合物はドライアイス・アセトン槽で‐75℃に冷却した。反応温度を‐60℃より下に維持しながら、これに1.3M sec‐ブチル・リチウム・シクロヘキサン溶液(230.6ｍL、299.mmol)を1時間かけて添加した。反応物は冷却槽から除き、‐20℃まで温度が上がるのを待った後、‐20℃で45分間撹拌した。反応物は‐50℃に冷却し、ヨードメタン(15.6ｍL、249.8mmol)を加えた。反応物は再び冷却槽から除き、‐20℃まで温度が上がるのを待ち、その温度で45分間撹拌した。冷却装置は全て外し、反応物は室温で16時間撹拌した。反応物には数ミリリットルの１N HCl(水溶液)を加え、溶媒は蒸発により除去した。残渣は１N HCl水溶液を加えてかなり酸性にした。その結果得られた沈殿物は濾過し、水で洗浄すると、薄茶色の固体である５‐ベンゾ(1,4)ジオキサン‐6‐カルボン酸  (6.60g、33.9ｍｍol)が得られた。収率34％  1H-NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.62 (d, 1H),6.8 (d, 1H), 4.30 (br s, 4H), 2.52 (s, 3H).
【化３１】
0004598757.tif 000026
【０２７７】
[000277] 磁気撹拌装置、25％NaOHガス・トラップ、そして窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、２‐メチルピペロニル酸(26.0g、144mmol)と塩化メチレン(482ｍL)を加えた。これに三塩化ホウ素を加えた。混合物を室温で3時間撹拌した。反応には500ｍLの水を注意して加え冷やした。注意：このステップで泡が立ち、大量のHClが生じる。反応物は30分撹拌した。層を分離した。有機層はTLCを使って生成物が含まれていない事を確認し、その後廃棄した。水溶液層は酢酸エチルで3回抽出した。抽出物は一緒にし、水で1度、飽和NaCl溶液で1度洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて、黄褐色の固体である3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸(20.0g、119mmol)を得た。収率82％。注：BCl3のヘプタン溶液を使っても同じような好結果が得られた。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.51 (s, 3H),6.76 (d, 1H), 7.45 (オーバーラップs+d、１H+1H)、9.06 (s, 1H).  TLC Rf = 0.20(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化３２】
0004598757.tif 000027
【０２７８】
[000278] 磁気撹拌装置と還流濃縮装置の付いた丸底フラスコに、3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸(23.3g、139mmol)、メタノール(139ｍL)、そして濃硫酸(0.77ｍL、13.9mmol)を加えた。この混合物を18時間加熱して還流させた。反応物は室温まで冷却し、メタノールを蒸発させた。残渣はエーテルに移し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で1度、飽和塩化ナトリウム溶液で1度洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて、茶色の固体であるメチル‐3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸塩(20.9g、114mmol)を得た。収率83％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3)d (ppm):  2.47 (s, 3H),3.79 (s, 3H), 6.78 (d, 1H), 7.46 (d, 1H); TLC: Rf = 0.54 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化３３】
0004598757.tif 000028
【０２７９】
[000279] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、メチル‐3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸塩(24.0g、132mmol)、(２R)-( - )-トシル酸グリシジル(30.1g、132mmol)、炭酸カリウム(21.8g、158mmol)、そしてDMF (264ｍL)を加えた。この混合物を60℃で5時間加熱した。混合物を室温まで冷やし、エーテルで希釈し、水で1度洗浄した。洗浄水をエーテルとエーテルを含む溶液を組み合わせて1度抽出した。有機溶液は飽和塩化ナトリウム溶液で3回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて茶色の油を得た。この油をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使って25％の酢酸エチル・ヘキサン液で溶出すると、黄色の油である3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸メチルエステル(24.6g、103mmol)が得られた。収率78％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.42 (s, 2H),3.80 (s, 3H), 3.83 (m, 1H), 4.12 (dd, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.42 (dd, 1H), 6.75(d, 1H), 7.42 (d, 1H); TLC Rf = 0.40 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【０２８０】
[000280] 注：（a）同一条件下で(2S)-(+)-トシル酸グリシジルを使えば、反対の立体化学を得る事ができる。(ｂ)この化合物のモッシャーのエステルを作る事により、19FNMRを使って、単一の位置及び立体異性体の存在が分かる。（ｃ）(R) - (+) -1-(1-ナフチル)エチルアミンから得られるアミドのX線結晶構造決定により、生成物３−ヒドロキシメチルベンゾジオキサンの位置及び立体化学を確認した。デラゴA. (Delago A.) ; レクラーク(Leclerc),G..; ロバト(Lobato), C.: モーレオン(Mauleon), D., Tetrahedron Lett. 1988, 29(30), 3671。
【化３４】
0004598757.tif 000029
【０２８１】
[000281] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸メチルエステル(0.10g、0.44mmol)、及び乾燥塩化メチレン(1.5ｍL)を加えた。混合物を氷の浴槽で冷やし、トリエチルアミン(0.12ｍL、0.87mmol)、次に(R)‐(‐)‐メトキシ‐α‐トリフルオロメチルフェニルアセチル塩化物(0.09mL、0.48mmol)を加えた。混合物は2時間撹拌したが、この時点では反応は不完全である事をTLCが示していた。更に(R)‐(‐)‐メトキシ‐α‐トリフルオロメチルフェニルアセチル塩化物(0.09mL、0.48mmol)を加え、反応物を室温で1時間撹拌した。混合物は塩化メチレンで希釈し、１N HClで1度、飽和重炭酸ナトリウムで1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い塩化メチレンで溶出すると、透明な油である5‐メチル‐3‐(3,3,3‐トリフルオロ‐2‐メトキシ‐2‐フェニル‐プロピオニルオキシメチル)‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸メチルエステルが得られたが、収率は決定されていない。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.38 (s, 3H),3.58 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 4.10 (m, 1H), 4.48 (dd, 1H), 4.65 (m, 2H), 4.86 (m,1H) 6.78 (d, 1H) 7.47 (m, 5H), 7.60 (d, 1H); 19F-NMR (300 MHz, CD3COCD3)d (ppm):  -72.89 (s); １Hも19FNMRも単一の立体及び位置異性体の存在を示している；TLC: Rf=0.62(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化３５】
0004598757.tif 000030
【０２８２】
[000282] 磁気撹拌装置の付いた丸底フラスコに、3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸メチルエステル(6.40g、26.9mmol)、水酸化バリウム一水和物(25.44g、134.3mmol)、及びメタノール(108ｍL)を加えた。混合物は室温で24時間撹拌した。メタノールは蒸発させた。その結果得られたスラリー状の物質は水に移し、エーテルで1度洗浄した。水溶液層は冷却した濃縮HClを注ぐ事により酸性化した。これを酢酸エチルで2度抽出した。酢酸エチル抽出物は合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させると、黄色の固体である3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸(4.82g、21.5mmol)が得られた。収率80％。1H-NMR(300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.45 (s, 3H),3.85 (m, 2H), 4.12 (m, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 6.76 (d, 1H), 7.51 (d,1H); TLC: Rf = 0.32 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化３６】
0004598757.tif 000031
【０２８３】
[000283]磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸(2.00g、8.92mmol)、THF(45ｍL)、(R)‐(＋)‐1‐(1‐ナフチル)エチルアミン(2.23ｍL、8.92mmol)、そして最後に1‐(3‐ジメチルアミノプロピル)‐3‐エチルカルボジイミドHCl(EDC)(1.53g、9.81mmol)を加えた。混合物は室温で36時間撹拌した。水を数滴添加し、混合物を5分間撹拌した。反応物はエーテルで希釈し、１NHClで1度、飽和重炭酸ナトリウム(水溶液)で1度、更に１N HClでもう一度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸(1‐ナフタレン‐1‐イル‐エチル) ‐アミドを得た。X線結晶学に必要な純度の結晶は、物質を真空下60℃で2度昇華させる事により得られた。ナフチルエチルアミンの立体中心は知られており、合成の条件下ではラセミ化しないので、X線分析の結果、化合物の位置化学及び絶対立体化学が以下に示されるように確立された。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3)d (ppm):  1.71 (d, 3H),2.22 (s, 3H), 3.80 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 6.09 (m,1H), 6.65 (d, 1H), 6.87 (d, 1H), 7.55 (m, 3H), 7.69 (m, 2H), 7.83 (d, 1H), 7.94(d, 1H), 8.35 (d, 1H); TLC Rf = 0.12 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)
【化３７】
0004598757.tif 000032
【表１】
0004598757.tif 000033
【表２】
0004598757.tif 000034
【表３】
0004598757.tif 000035
【化３８】
0004598757.tif 000036
【０２８４】
[000284] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸(1.40g、6.24mmol)、THF(32ｍL)、及びt‐ブチルジメチルシリル塩化物(5.65g、18.73mmol)を加えた。混合物は室温で30分撹拌した。イミダゾール(1.87g、27.47mmol)を加え、反応混合物を更に30分間撹拌した。混合物はヘキサンで希釈し、１N HClで1度、塩水で1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させて黄色の油である3‐(tert‐ブチルジメチルシリル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸tert‐ブチルジメチルシリルエステル(1.26g、2.78mmol)を得た。収率45％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  0.10 (d, 6H),0.33 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 0.99 (s, 9H), 2.45 (s, 3H), 3.95 (m, 2H), 4.13 (m,1H), 4.26 (m, 1H), 4.40 (dd, 1H), 6.75 (d, 1H), 7.51 (d, 1H); TLC: Rf＝0.87(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化３９】
0004598757.tif 000037
【０２８５】
[000285] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、出発物質(1.40g、3.09mmol)、メタノール(16ｍL)、炭酸カリウム(水溶液)(５ｍL)を加えた。混合物は室温で4時間撹拌した。メタノールは蒸発させ、残渣には酢酸エチルを加えた。混合物を１N HClで酸性化し、層を分離した。水溶液層はもう一度酢酸エチルで抽出した。一緒にした酢酸エチル層は塩水で1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させて黄色い固体である3‐(tert‐ブチルジメチルシリル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸tert‐ブチルジメチルシリルエステル  (0.93g、2.75mmol)を得た。収率89％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  0.10 (s, 6H),0.90 (s, 9H), 1.94 (s, 3H), 3.95 (m, 2H), 4.13 (m, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.40 (dd,1H), 6.75 (d, 1H), 7.51 (d, 1H); TLC Rf = 0.62 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化４０】
0004598757.tif 000038
【０２８６】
[000286] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸(23.0g、137mmol)、ベンジルアルコール(21.2ｍL、205mmol)、そしてTHF(274ｍL)を加えた。この混合物に撹拌しながら１‐(3‐ジメチルアミノプロピル) ‐3‐エチルカルボジイミドHCl(EDC)(30.2g、157mmol)を加えた。混合物を室温で36時間撹拌し、数ミリリットルの水を加え、10分間撹拌してTHFを蒸発させた。残渣は酢酸エチルと１N HClに分けた。層は分離し、水溶液層は酢酸エチルで2度抽出した。合わせた有機抽出物は、飽和重炭酸ナトリウム溶液で1度、１N HClで1度、そして塩水で1度洗浄した。次に有機溶液は硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。その結果得られた油を50％塩化メチレン・ヘキサン溶液で細かく砕き、黄褐色の固体である3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチル安息香酸塩を濾過して得た。収率43％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm):  2.49 (s, 3H),5.29 (s, 2H), 6.78 (d, 1H), 7.43 (m, 6H); TLC: Rf＝0.49 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化４１】
0004598757.tif 000039
【０２８７】
[000287] 500ｍLの丸底フラスコに、25.21ｇ(97.71mmol)のベンジル3,4‐ジヒドロキシ‐2‐メチルベンゾエート、22.28g(97.71mmol)の(２R)‐(‐)‐トシル酸グリシジル、16.56g(120mmol)のK2CO3、及び200ｍL DMFを加えた。反応混合物は65℃の油の浴槽で5時間撹拌した。反応物は冷却し、水(750ｍL)で希釈し、エーテルで抽出した(3ｘ300ｍL)。エーテル層は100ｍLの水で抽出した。合わせた有機層は乾燥し、蒸発させて、31.1gの油を得た。TLCは反応が完了した事を示していた。Rf=0.36 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。10−50％の酢酸エチル・ヘキサン溶液のグラジエントを使ったカラムクロマトグラフィーにより、23.0gの精製された3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ベンジルエステルを得た(収率80％)。1H NMR (300 MHz, CD3OD) d (ppm):  7.4 (m, 6H),6.75 (d, 1H), 5.28 (s, 2H), 4.4 (d, 1H), 4.2 (m, 1H), 4.1 (dd, 1H), 3.8 (m,2H), 2.46 (s, 3H).
【化４２】
0004598757.tif 000040
【０２８８】
[000288]23g(78.2mmol)の3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ベンジルエステルを300ｍLの乾燥THFに溶解した。撹拌しながら、18.08gのt‐ブチルジメチルシリル塩化物と10.2gのイミダゾールを加えた。混合物は室温で一夜撹拌したが、その期間中に、白色の沈殿物であるイミダゾールHClが生じた。TLC(1:1酢酸エチル/ヘキサン)をモニターする事により、反応の進行度合いを確認した。白色の沈殿物は濾過・除去し、残りのTHF溶液を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣は300ｍLのCH2Cl2にもう一度溶解し、300ｍLの水で抽出した。CH2Cl2抽出物を乾燥し、溶媒を真空除去すると、26.55のシリルエーテル生成物が得られた。TLC: Rf＝0.７(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。粗収率＝83％。生成物は150ｍLのヘキサンに再び溶解し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、ヘキサン、次に2％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出した。21.28gの精製された3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ベンジルエステルが得られた(収率67％)。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.45 (d, 1H),7.3 (m, 6H), 6.65 (d, 1H), 4.27 (d, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.05 (dd, 1H), 4.85 (dd,1H), 4.75 (dd, 1H), 2.37 (s, 3H), 0.81 (s, 9H), 0.01 (s, 3H).
【化４３】
0004598757.tif 000041
【０２８９】
[000289] 9.63gの3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ベンジルエステルを約125ｍLのCH2Cl2に溶解した。溶液はパール水素添加ボトルに移し、5％のパラジウム炭素を加えた。ボトルは水素で満たし、パール水素添加装置で3時間振盪した。水素添加は、圧力モニターが示すように2時間で終了した。100ｍLのCHCl3を加え、粒子サイズを増すためMgSO4を加えたのち、パラジウム炭素は濾過・除去した。CH2Cl2−CHCl3層は200ｍLの0.1N HClで洗浄し、副産物のベンジルアルコールを除去した。有機層は乾燥し、蒸発させ、真空オーブンで微量の溶媒を除去した後、3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸を得た。TLC: Rf＝0.55 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。注：(a) パラジウム触媒の水素添加は、ベンジルエステル開裂に関しては、トリエチルシラン/パラジウム二酢酸塩の方法よりもはるかに優れている。(ｂ) 弱酸性水溶液で生成物を洗浄するのは、ベンジルアルコールの除去に関しては優れた方法である。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.55 (d, 1H), 6.7 (d, 1H), 4.3 (d, 1H), 4.17 (m, 1H), 4.02(dd, 1H), 3.82 (dd, 1H), 3.75 (dd, 1H), (2.45 (s, 3H), 0.8 (s, 9H), 0.01 (s,3H).
【化４４】
0004598757.tif 000042
【０２９０】
[000290] 磁気撹拌装置及び窒素取り入れ口の付いた丸底フラスコに、3‐(tert‐ブチルジメチルシラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸(0.72g、2.13mmol)、及び酢酸エチル(11ｍL)を加えた。これにペンタフルオロフェノール(0.82g、2.23mmol)、次に１M ジシクロヘキシルカルボジイミド塩化メチレン溶液(2.34ｍL、2.34mmol)を加えた。この混合物を室温で4時間撹拌した。数ミリリットルの水を加え、10分間撹拌を続けた。反応物は濾過し、酢酸エチルで希釈し、１N HClで1度、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で1度、飽和塩化ナトリウムで1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、油を得た。この油は、フラッシュ・シリカゲル・クロマトグラフィーを使いヘキサンで溶出すると、透明無色の油である3‐(tert‐ブチルジメチルシラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル(0.90g、1.78mmol)が得られた。収率84％。1H-NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 0.10 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 2.50 (s, 3H), 3.90 (m, 2H), 4.14(m, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 6.83, (d, 1H), 7.86, (d, 1H); TLC: Rf＝0.88 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化４５】
0004598757.tif 000043
【０２９１】
[000291] 磁気撹拌装置の付いた丸底フラスコに、酢酸エチル(5ｍL)及び25wt%の炭酸カリウム水溶液(2.96g、5.35mmol)を加えた。これにt‐ブチルヒドラジンHCl(0.33g、2.68mmol)、次に酢酸エチル(4ｍL)に溶解した3‐(tert‐ブチルジメチルシラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル(0.90g、1.78mmol)を加えた。この混合物を室温で18時間撹拌した。層は分離し、有機層を水で1度、10％のNaOH(水溶液)で1度、１N HClで1度、飽和塩化ナトリウム水溶液で1度洗浄した。溶液は硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、白色の固体を得た。この物質をヘキサンで細かく砕いて白色の固体である3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸N’ ‐tert‐ブチル‐ヒドラジド(0.50g、1.22mmol)を得た。収率69％。1H-NMR(300 MHz, CD3COCD3) d (ppm): 0.12 (s, 6H), 0.92 (s, 9H), 1.53 (s, 9H), 2.32 (s, 3H), 3.97(m, 2H), 4.14 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 6.79 (d, 1H), 7.22 (d, 1H);TLC: Rf＝0.43 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化４６】
0004598757.tif 000044
【０２９２】
[000292] tert‐ブチル, エチルケトン(5g)、及び酢酸3滴を加えた30ｍLのメタノール中のtert‐ブチルカルバゼートを室温で混合した。1時間内に固体が生じた。更にメタノールを加えて、室温で3日間撹拌すると、N’‐(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピリデン)‐ヒドラジン・カルボン酸tert‐ブチルエステルが得られた。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) d (ppm): 7.5 (br, 1H), 2.23 (q, 2H)), 1.51 (s, 9H), 1.15 (s, 9H), 1.1(t, 3H).
【化４７】
0004598757.tif 000045
【０２９３】
[000293] 約10.3gのN’‐(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピリデン)‐ヒドラジン・カルボン酸 tert‐ブチルエステルをパール・シェーカーに入れ、水素雰囲気の下、4.14g(3.9mmol)の10％パラジウム炭素CH2Cl2溶液と4時間混合した。反応はTLC(I2指示薬)でモニターした。粗生成物を10％エーテルを使って2度クロマトグラフィーを行なうと、N’‐(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピル)‐ヒドラジン・カルボン酸tert‐ブチルエステルが得られた。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) d (ppm): 6.05 (br, 1H), 3.9 (br, 1H)), 2.45 (m, 1H), 1.6 (m, 1H), 1.5(s, 9H), 1.25 (m, 1H), 1.1 (t, 3H), 0.92 (s, 9H).
【化４８】
0004598757.tif 000046
【０２９４】
[000294] 酢酸エチルに溶解したN’‐(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピル)‐ヒドラジン・カルボン酸tert‐ブチルエステル(1.31g、5.68mmol)を氷の浴槽内で、15ｍLのトリフルオロ酢酸と混合し、室温で一夜撹拌した。反応混合物はもう一度冷却し、40ｍLの冷水を加えると、(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピル)‐ヒドラジンを含む新しい油の層が形成された。次に、混合物がアルカリ性を維持するまで10％のNaOH(約60ｍL)を加えた。この酢酸エチル/水混合物は、ペンタフルオロフェニル・エステルと結合させる時、「そのまま」使用した。
【化４９】
0004598757.tif 000047
【０２９５】
[000295] 上述の2層の調剤である(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピル)‐ヒドラジンに、10ｍLの酢酸エチルに溶解した約1グラムの3(S)‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル溶液を加えた。混合物は室温で2時間撹拌し、その後水溶液の層を除き、１MのK2CO3で置き換えた。混合物は一夜撹拌した。水溶液層は分離し、有機層を１MのK2CO3で1度、水で1度抽出した。有機層を乾燥した。粗生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーを使い、10％のエーテル・ヘキサン溶液のステップ・グラジエント、次にニートエーテルで溶出すると、3(S)‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸N’‐(1‐エチル‐2,2‐ジメチル‐プロピル) ‐ヒドラジドが得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.15 (br, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.73 (d, 1H), 4.85 (br, 1H),4.3 (d, 1H), 4.25 (m, 1H), 4.1 (dd, 1H), 3.87 (m, 2H), 2.41 (m, 1H), 2.29 (s,3H), 1.8 (br, 1H); 1.65 (m, 1H), 1.3 (m, 1H), 1.45 (t, 3H), 0.98 (s, 9H); TLC:Rf＝0.23 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
【化５０】
0004598757.tif 000048
【０２９６】
[000296] 磁気撹拌装置の付いた丸底フラスコに、酢酸エチル(７ｍL)、25wt%の炭酸カリウム水溶液(2.03g、3.67mmol)、及び3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボン酸N’ ‐tert‐ブチル‐ヒドラジド(0.50g、1.22mmol)を加えた。これに3,5‐ジメチルベンゾイル塩化物(0.31g、1.84mmol)を加えた。撹拌は18時間継続した。反応物は酢酸エチルで希釈し、層は分離した。有機層は水で1度、飽和塩化ナトリウム水溶液で1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣はフラッシュ・シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを用い、20％のエーテル/ヘキサン、次に50％のエーテル/ヘキサンで溶出すると、白色の固体である3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐[3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル]‐ヒドラジド(0.50g、0.92mmol)が得られた。収率76％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3)d (ppm): 0.10 (s, 6H), 0.90 (s, 9H), 1.59 (s, 9H), 1.89 (s, 3H), 2.25(s, 6H), 3.92 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 6.33 (d, 1H),6.56 (d, 1H), 7.02 (s, 1H), 7.13 (s, 2H), 9.49 (s, 1H); TLC: Rf＝0.30 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.8  RG-115789の調製
【化５１】
0004598757.tif 000049
【０２９７】
[000297] 磁気撹拌装置の付いた丸底フラスコに、3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐[3‐(tert‐ブチル‐ジメチル‐シラニルオキシメチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル]‐ヒドラジド(0.26g、0.48mmol)、THF(5.0ｍL)、及びテトラブチルアンモニウム・フッ化物のTHF(1.39ｍL,1.39ｍｍol) 1M溶液を加えた。混合物は室温で3時間撹拌した。この溶液は水で1度、飽和塩化ナトリウム水溶液で1度洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をヘキサンで細かく砕くと、白色の固体である3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジド(0.025g、0.48mmol)が得られた。収率100％。1H-NMR (300 MHz, CD3COCD3) d (ppm): 1.59 (s, 9H), 1.89 (d, 3H), 2.25 (s, 6H), 3.79 (m, 2H), 4.04(m, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.33 (m, 1H), 6.33 (dd, 1H), 6.56 (dd, 1H), 7.03 (s,1H), 7.12 (s, 2H), 9.51 (s, 1H); TLC: Rf=0.03 (エーテル/ヘキサン)。
1.9  RG-115812の調製
【化５２】
0004598757.tif 000050
【０２９８】
[000298] 50m Lの丸底フラスコを使って、1.00g(2.35mm)のN‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドを10ｍLのCH2Cl2に溶解し、商業的に入手可能なデス・マーチン(Dess-Martin)試薬を加えた。反応物は室温で24時間撹拌した。反応混合物はCH2Cl2で分離漏斗へ移し、NAHCO3希釈水溶液、次に酸化剤の活性を抑えるために希釈チオ硫酸ナトリウム(Na2S２O3)で抽出した。有機層はMgSO4で乾燥し、蒸発・乾燥させると、1.32gの生成物を得た。1HNMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 9.70 (s,1H), 7.50(s,1H), 7.05(s,2H), 6.95 (s, 1H), 6.6 (m, 1H) 6.1-6.2 (q, 1H), 4.6 (d, 2H), 4-4.3 (m, 3H),2.27 (s, 6H), 2.02 - 2.06 (d, 3H), 1.60 (s, 9H); TLC: Rf＝0.13 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.10  RG-115814の調製
【化５３】
0004598757.tif 000051
【０２９９】
[000299]100mg(0.24mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐フォルミル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドを含む100ｍLの丸底フラスコに、0.50gのトリエチルアミン、70mg(1mm)のヒドロキシルアミンHCl、そして２５ｍLのメタノールを加えた。反応混合物を1時間還流した。メタノールは回転式蒸発装置で除去し、残渣はクロロホルムと希塩酸で溶解して、分離漏斗へ移した。クロロホルム抽出物を乾燥し、蒸発乾固した。残渣はシリカ・カラムクロマトグラフィーを用い、40％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出した。溶媒を蒸発させると、85mgの3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐[3‐(ヒドロキシイミノ‐メチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル]‐ヒドラジドが得られた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.7 (s,1H), 7.4 (d,1H), 7.05 (s,2H), 6.95 (s,1H), 6.55(d,1H), 6.15 (m, 1H), 4.8 (m, 1H), 4.0-4.4 (m,4H), 2.248 (s,6H), 1.915 (s,3H),1.574 (s, 9H); TLC: Rf＝0.40 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.11  RG-115813の調製
【化５４】
0004598757.tif 000052
【０３００】
[000300] 100ｍLの丸底フラスコに、1.00mg(2.35mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジド、538ｍg(2.82mm)の塩化トシル、そして10ｍLのピリジンを加えた。反応混合物は50−60℃の水浴で加熱し3時間撹拌し、それから室温で24時間撹拌した。反応混合物はCH2Cl2に溶解し、まず希釈K2CO3で、次に希塩酸(ピリジンを除くため)で抽出した。CH2Cl2抽出物を乾燥し蒸発させると、約1.4gの物質が得られた。TLC(1:1酢酸エチル/ヘキサン)によれば、この主要化合物のRf値は0.35であった。生成物はシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。45％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、約1.1gの精製されたトルエン‐4‐スルホン酸７‐[N’‐tert‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐イルメチル・エステルを得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.8 ppms (d,1H), 7.55 (br s,1H), 7.36 (d, 1H), 7.05 (s, 2H),6.95 (s, 1H), 6.5 (m, 1H) 6.1 (q, 1H), 4.0 - 4.4 (m,5H) 2.45 (s, 3H), 2.25 (s,6H), 1.85 (d, 3H), 1.58 (s, 9H).
1.12  RG-115816の調製
【化５５】
0004598757.tif 000053
【０３０１】
[000301]300mg(0.52mm)のトルエン‐4‐スルホン酸７‐[N’‐tert‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐イルメチル・エステル、100mgのKCN、10mgのKI、12ｍLのCH3CN、そして４ｍLのDMFを5時間還流した。反応生成物は回転式蒸発装置で濃縮した。反応生成物は酢酸エチルと水で分離漏斗へ移し、エーテルで2度抽出した。エーテル抽出物を水で抽出し、乾燥し、濃縮すると、0.17gの白色の固体が得られた。TLC(1:1酢酸エチル/ヘキサン)は、生成物であるニトリルのRf値が0.27である事を示していた。3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐シアノメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドは、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを用い、45％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出する事により精製された。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.70 (s,1H), 7.05 (s,2H), 6.95 (s,1H) 6.60 (d,1H), 6.1-6.2(m,1H), 4.0-4.4 (m,3H), 2.78 (d,2H), 2.25 (s,6H), 1.93 (d,3H), 1.57 (s,9H).
1.13  RG-115815の調製
【化５６】
0004598757.tif 000054
【０３０２】
[000302]250mg(0.43mm)のトルエン‐4‐スルホン酸７‐[N’‐tert‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐イルメチル・エステル、テトラブチルアンモニウム・フッ化物(TBAF)の１M THF溶液２ｍL、そして１５ｍLのTHFを4時間還流した。反応混合物は濃縮し、CH2Cl2でもう一度溶解した。CH2Cl2抽出物を希釈した重炭酸ナトリウムで洗浄し、乾燥し、濃縮すると、0.37gの生成物が得られた。TLC(1:1酢酸エチル/ヘキサン)は、主要成分のRf値が0.48である事を示していた。シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを用い、26％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、精製された3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐フルオロメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドが得られた(約0.25g)。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.80 ppms (s, 1H), 7.02 (s, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.5 (d, 1H),6.1 (t, 1H), 4.70 (d, 1H), 4.5 (d, 1H), 4-4.3 (m, 3H), 2.24 (s, 6H), 1.93 (d,3H), 1.56 (s, 9H).
1.14  RG-115817の調製
【化５７】
0004598757.tif 000055
【０３０３】
[000303]400mg(0.69mm)のトルエン‐4‐スルホン酸７‐[N’‐tert‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐イルメチル・エステル、147mg(2.1mm)のCH3SNa、そして15ｍLのC3CCNを室温で24時間還流した。反応混合物は濃縮乾固し、もう一度CH2Cl2に溶解した。CH2Cl2抽出物は希釈NaHCO3水溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮すると、0.26gの生成物が得られた。TLCは混合物の主要成分のRF値が0.52である事を示していた(1:1酢酸エチル/ヘキサン)。シリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製すると、目的の生成物である3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(5‐メチル‐3‐メチルフルファニルメチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドが得られた。1H NMR: (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.40 (s, 1H), 7.05 (s, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.6(d, 1H), 6.1(q,1H), 4.0-4.3(m, 3H), 2.7-2.9 (m, 2H), 2.27 (s, 6H), 2.21(s, 3H), 1.97 (d, 3H) ,1.59 (s, 9H).
1.15  RG-115818の調製
【化５８】
0004598757.tif 000056
【０３０４】
[000304] 3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(5‐メチル‐3‐メチルフルファニルメチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドを6mLのCH3OHに溶解した。撹拌しながら、6ｍLの水に溶解した250mg(0.4mm)のオキソンを加え、更に30分間撹拌を続けた。メタノールは回転式蒸発装置で除去し、残渣はCHCl3及び水にもう一度溶解した。水溶液層はクロロフォルムで抽出し、乾燥し、濃縮すると、130mgの白色の固体が得られた。TLC (1:1酢酸エチル/ヘキサン)は、主要生成物である3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐メタンスルフォニル‐メチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドのRf値が0.12である事を示していた。シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを用い、80％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出する事により精製した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.55 (d, 1H),7.02 (s, 2H), 6.98 (s, 1H), 6.6 (d, 1H), 6.0-6.1 (m. 1H), 4.0-4.5 (m, 3H), 2.8(d, 2H), 2.25 (s, 6H), 1.92-1.94 (d, 3H), 1.57 (s, 9H).
1.16  RG-115807の調製
【化５９】
0004598757.tif 000057
【０３０５】
[000305]200mg(0.47mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐フォルミル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジド、0.5gのトリエチルアミン、210mg(1.9mm)のセミカルバジドHCl、10ｍLのメタノール、そして2滴の氷酢酸を100ｍLの丸底フラスコに加え、4時間還流した。反応混合物は回転式蒸発装置で濃縮し、CHCl3に再び溶解した。その結果得られたCHCl3溶液を希釈NaHCO3で2度抽出し、濃縮すると、0.16gの粗生成物が得られた。TLC(1:1酢酸エチル/ヘキサン)は、主要生成物が原点にある事を示していた。生成物である3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐フォルミル・セミカルバジド‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドは、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーを用い、10％のCH3OH酢酸エチル溶液で溶出する事により精製した。1H NMR: (300 MHz, CDCl3) d (ppm):  CD3OD-CDCl3:  7.2 (d, 1H),7.07 (s, 2H), 6.97 (s, 1H), 6.5-6.6 (2d, 1H), 6.2-6.3 (q, 1H), 4.8 (m, 1H)4.1-4.3 (m, 2H), 2,28 (s, 6H), 1.88 (m, 3H), 1.586 (s, 9H).
1.17  RG-115805の調製
【化６０】
0004598757.tif 000058
【０３０６】
[000306]0.85g(2mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐フォルミル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジド、10ｍLの温かいt‐ブチルアルコール、そして20ｍLのアルドリッチ・リン酸緩衝液(ｐH7.2、＃31925−2)を100ｍLの丸底フラスコに加え、それを55℃の水浴に入れた。反応混合物を撹拌しながら、380mg(2.4mm)の過マンガン酸カリウムを徐々に添加し、反応物は55℃で7時間、室温で24時間撹拌した。ｐHが12になるまで、10％のNaOH水溶液を加え、黒い沈殿物(MnO2)を濾過・除去した。水溶液は酢酸エチルで抽出する事により茶色の色を除き、分離漏斗へ移し、１NHClで酸性化し(その時生成物が沈殿する)、それからCHCl3で2度抽出した。CHCl3抽出物を乾燥し、蒸発乾固し、真空オーブンで乾燥させると、0.76gの生成物である７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸が得られた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm):  7.06 (s, 2H),6.97 (s, 1H), 6.6 (q, 1H), 6.3 and 6.0 (d+d, 1H), 4.91 (m, 1H), 4.5-4-3 (m, 2H)2.265 (s, 6H), 2.13 and 1.90 (s+s, 3H) 1.588 (s, 9H); TLC: Rf＝0‐0.17、条線 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.18  RG-115806の調製
【化６１】
0004598757.tif 000059
【０３０７】
[000307] 190mg(4.3ｍｍ)の７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸、15ｍLのCH3OH、そして１滴の濃硫酸を室温で24時間撹拌した。CH3OHは回転式蒸発装置で除去し、残渣はCHCl3に溶解し、希釈したNaHCO3溶液で抽出した。CH3OH抽出物を乾燥し、蒸発させると、0.10gの白色の固体が得られた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.52 (s, 1H), 7.07 (s, 2H), 6.97 (s, 1H), 6.5-6.6 (q, 1H),6.3 and 6.0 (d+d, 1H), 4.8 (m, 1H), 4.4-4.2 (m, 2H), 3.772 (3H), 2,26 (s, 6H),2.035 and 1.919 (s+s, 3H), 1.584 (s,9H). TLC: Rf＝0.35 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.19  RG-115810の調製
【化６２】
0004598757.tif 000060
【０３０８】
[000308] 小瓶の中の97mg(0.32mm)の７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸、60mg(0.35mm)のペンタフルオロフェノール、60mg(0.32mm)のDCC、そして3ｍLの酢酸エチルを室温で24時間撹拌した。反応混合物は丸底フラスコに移し、蒸発乾固した。残渣は再びCH2Cl2に溶解し、シリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。40％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出すると、ペンタフルオロフェノールのエステルである７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸ペンタフルオロフェノール・エステルが80mg得られた。1H NMR(300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.60 (d, 1H), 7.03 (s, 2H),6.95 (d, 1H), 6.6 (q, 1H), 6.3 and 6.0 (d+d, 1H), 4.6 (m, 1H), 4.4 (m, 1H),2.251及び2.230 (s+s, 6H), 2.052及び1.903 (s+s, 3H), 1.58及び1.574 (s+s, 9H) (多くのシグナル分割)；TLC: Rf＝0.52 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.20  RG-115811の調製
【化６３】
0004598757.tif 000061
【０３０９】
[000309] 小瓶の中の80mg(0.2mm)のペンタフルオロフェノールのエステルである７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸ペンタフルオロフェノール・エステル、及び２ｍLの２M CH3NH2THF溶液を室温で24時間撹拌した。反応混合物はシリカ・カラムクロマトグラフィーに移した。不純物は45％の酢酸エチル・ヘキサン溶液により、生成物である７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐カルボン酸メチルアミドは90％の酢酸エチル・ヘキサン溶液により溶出した。1H NMR  (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 8.1 (d, 1H), 7.05 (s, 2H), 6.97 (d, 1H), 6.40 (d, 1H), 6.00(d, 1H), 4.45-4.25 (m, 2H), 3.9-4.0 (m, 1H), 2.88及び2.86 (s+s, 3H), 2.24及び2.22 (s+s, 6H), 2.07及び1.87 (s+s, 3H), 1.59及び1.57 (s+s, 9H) (いくつかの分割シグナル)；TLC: Rf＝0.06 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.21  RG-115808の調製
【化６４】
0004598757.tif 000062
【０３１０】
[000310]120mg(0.28mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐ヒドロキシメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジド、70mg(0.55mm)のフェニルイソシアネート、そして２ｍLのCH3CNを小瓶に入れ、室温で24時間撹拌した。CH3CNは窒素の流れで吹き飛ばし、残渣はペンタンで細かく砕いた。上澄み液は除去し、残渣のペンタンを窒素で吹き飛ばすと、0.15gの生成物である７‐[N’‐tert‐ブチル‐N’‐(3,5‐ジメチル‐ベンゾイル)‐ヒドラジノカルボニル]‐8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐2‐イルメチル・エステルを得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.65 (d, 1H), 7.4-7.2 (m, 5H), 7.1 (d, 1H), 7.06 (s, 2H),6.98 (s, 1H), 6.86 (br s, 1H), 6.53 (d, 1H), 6.12 (d, 1H), 4.5-4.2 (m, 3H), 4.0(m, 2H), 2.23 (s, 6H), 1.94 (s, 3H), 1.58 (s, 9H); TLC: Rf＝0.4−0.5 条線 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.22  RG-115809の調製
【化６５】
0004598757.tif 000063
【０３１１】
[000311]150mg(0.34mm)の3,5‐ジメチル安息香酸N‐tert‐ブチル‐N’‐(3‐シアノメチル‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐ヒドラジドを8ｍLの氷酢酸に溶解し、約16mgのPtO2と一緒にパール水素添加ボトルに加えた。パール水素添加は4時間行ない、反応混合物は濾過した。内容物はCHCl3及び酢酸エチルと一緒に丸底フラスコに移し、反応混合物は濃縮乾固した。残渣はCHCl3と0.1N KOHでもう一度溶解し、分離漏斗に移した。水溶液の層はもう一度CHCl3で抽出した。CHCl3抽出物を乾燥し、濃縮すると、0.14gの生成物である3,5‐ジメチル安息香酸N’‐[3‐(2‐アミノ‐エチル)‐5‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐6‐カルボニル)‐N‐tert‐ブチル‐ヒドラジドが得られた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.8 (d, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.6-6.5 (m, 1H),6.2-6.1 (m, 1H), 4.4-3.8 (m, 3H), 2.9-2.75 (m, 2H), 2.244 (s, 6H), 1.92 (t,3H), 1.7 (m, 2H), 1.565 (s, 9H); TLC: Rf＝0.24 (1:1酢酸エチル/ヘキサン)。
1.23  RG-119098の調製
【化６６】
0004598757.tif 000064
【０３１２】
[000312]16.7g(64.7mmol)のベンジル‐2‐メチル‐3,4‐ジヒドロキシベンゾエートをエチル2,3ジブロモプロピオン酸塩(20.17g、77.6mmol)を炭酸カリウム(10.72g、77.6mmol)及びDMF(216ｍL)と混合し、40‐45℃で4時間加熱した。反応混合物はエーテルで希釈し、水で1度、塩水で3度洗浄した。有機層は硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。僅量のサンプルをフラッシュ・クロマトグラフィーを使い、10％のエーテル/塩化メチレンで溶出した。高真空下に於けるクーゲルロール蒸留装置、及び200度までの加熱によっても、目的の生成物は揮発しなかった。蒸留フラスコ内にオレンジ色の油として残った。しかし、そういう処置は、8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐２ (又は3), 7‐ジカルボン酸７‐ベンジルエステル‐２ (又は3)‐エチルエステルの精製にある程度貢献した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm): 7.565 and 7.525 (d+d, 1H), 7.4 (m, 5H), 6.865 and 6.725 (d+d1H), 5.3 (s, 2H), 4.9 (m, 1H), 4.4 (m, 2H), 4.3 (m, 2H), 2.54 and 2.46 (s+s,3H), 1.3 (m, 3H).
【化６７】
0004598757.tif 000065
【０３１３】
[000313] RG-119098、8‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐ベンゾ[1,4]ダイオキシン‐２ (又は3), 7‐ジカルボン酸７‐ベンジルエステル‐２ (又は3)‐エチルエステルが含むベンゾジオキサンの位置及び立体異性体の約1:1:1:1混合物は、ベースライン分解能との比較で互いに分離され、Chiralcel（登録商標） OD-H（登録商標）HPLCキラル・クロマトグラフィーカラム(シリアル番号：ODH0CE-CB035)を使って、マルチグラム・スケールで精製された。移動相は97.5：2.5ヘキサン：エタノールで、流量は１ml/min.、25℃であった。４つの異性体は互いに分離された。その作業を行なったのはキラル・テクノロジーズ(ChiralTechnologies)、ペンシルバニア州イクストン、スプリング・ドライブ730番(730 SpringDrive, Exton, PA)である。
【０３１４】
[000314] 別の実験では、約12gのベンジルエステルRG-119098がシリカゲルで精製された。ヘキサンによる溶出により、２つの位置異性体の約:1：1混合物10gが得られた。ベンジルCH3グループの吸収に基づいて、それぞれ「2.46異性体」及び「2.54異性体」と名付けられた。10％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出を継続すると、2.46異性体の濃度の高いサンプルが得られた。2.54異性体と比べて約2：1の割合であった。6−9％の酢酸エチル・ヘキサン溶液のグラジエントでもう一度この物質のクロマトグラフィーを行なうと、更に2.46異性体の濃度が高まる事が証明された。すなわち、8％の酢酸エチル・ヘキサン溶液で溶出した分画に於ける2.46と2.45の比率は6：1、9％の場合は8：1であった。
【化６８】
0004598757.tif 000066
【０３１５】
[000315] 類似の１H NMR (300MHz, CDCl3)シグナルに基づいているダイアグラムが示するように、異性体は、RG-119097の結晶構造との相関関係に基づいて、位置異性体が知られている関連の２‐ヒドロキシメチルベンゾジオキサンのそれに暫定的に割り当てられている。RG-119098を含む分離された異性体の１H NMRとRG-119097(ダイアグラムに示される異性体III)と相関関係にある対応するエチルエステルとの比較により、各異性体の明瞭な位置化学的割り当てが可能である。
【０３１６】
実施例２：化合物の生物学的試験
[000316] 本発明のリガンドは、遺伝子療法、関心のある蛋白質の宿主内での発現、遺伝子導入された有機体の生産、細胞ベースのアッセイなど種々の応用に有効である。、
【０３１７】
27−63アッセイ
遺伝子発現カセット
[000317] GAL4DBD (1-147) - CfEcR(DEF)/VP16AD - βRXREF - LmUSPEF：ハマキガ科のガの幼虫であるChoristoneura fumiferana EcR (CfEcR-DEF;SEQ ID NO: 1) の野生型D, E, 及びFドメインはGAL4 DNA結合ドメイン(Gal4DBD1=147; SEQ ID NO: 2) と融合させ、ホスホグリセレート・キナーゼ・プロモーター (PGK; SEQ ID NO: 3) のコントロール下に置かれた。ヒトRXRβ(HsRXRβ-EF；SEQ ID NO:４のヌクレオチド1−465)のEFドメインのへリックス１から8まで、及びバッタLocusta migratoriaウルトラスパイラクル蛋白質 (LmUSP-EF; SEQ ID NO: 5のヌクレオチド403−630)のEFドメインのヘリックス9から12までは、VP16(VP16AD; SEQ ID NO: 6)のトランスアクティベーション・ドメインと融合し、延長因子１αプロモーター (EF-1α; SEQ ID NO: 7)のコントロール下に置かれた。５つのコンセンサスGAL4応答配列結合サイト (5XGAL4RE; SEQ ID NO: 8を含むGAL4REの５つのコピーを含む)は合成TATA最小プロモーターと融合し、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子(SEQ ID NO:10)の上流に置かれた。
【０３１８】
[000318] CHO細胞は、単一のプラスミド上で偏在的に活性な細胞プロモーター(PGK及びEF-1α)がコントロールするGAL4DBD(1-147)CfEcR(DEF)及びVP16AD βRXREF-LmUSPEFの転写カセットで一時的に形質移入された。安定的に形質移入された細胞は、ゼオシン(Zeocin)耐性により選択された。個別に分離されたCHO細胞のクローンは、GAL4 REルシフェラーゼ・レポーター(ｐFR Luc)で一時的に形質移入された。27-63のクローンが、ハイグロマイシンを使って選択された。
【０３１９】
リガンドで処理
[000319] 細胞はトリプシン処理され、2.5ｘ10４ 細胞 ｍLの濃度に希釈された。100μLの細胞懸濁液が96ウェル・プレートの各ウェルに置かれ、５％CO2の下、37℃で24時間培養された。リガンド保存溶液はDMSOで調製され、全ての処理で300倍に希釈された。用量応答試験は、33μMから0.01μMの８つの濃度で構成された。
【０３２０】
レポーター遺伝子アッセイ
[000320] ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子発現は、プロメガ(Promega)のブライト-グロ・ルシフェラーゼ・アッセイ・システム(Bright-GloTM Luciferase Assay System)を使った細胞処理の48時間後に測定された。発光は、ダイネックス (Dynex) MLXのミクロタイター・プレート・ルミノメーターを使って、室温で検出された。EC50sは、３パラメーター算定モデルを使って、用量応答データから計算された。
【０３２１】
[000321] アッセイの結果は表１に示してある。各アッセイは２つのウェルで行い、その値の平均値を得た。相対最大FIは、最大の誘導のみられた濃度に於いて観察されるGS-TM-E (3,5-ジメチル-安息香酸N-tert-ブチル-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド)の最大誘導倍数と、最大の誘導のみられた濃度での試験リガンド(本発明の実施例)の最大誘導倍数の比較として決定された。
【表４】
0004598757.tif 000067
【０３２２】
[000322] 更に、この分野の通常の技術を持っている人なら予測できる事であるが、本出願で開示されているリガンドは、グループH及びグループB核受容体に基づく遺伝子発現システムを使って、上述の種々の細胞タイプで、遺伝子発現の調節も行なう。
【配列表】
0004598757000001.app