(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からの腸外組織及び／又は体液の試料を、該試料中の細胞によりＣＲＣＡ−１転写体が発現されているか否かを決定するために試験する工程を含む、個体に転移した結腸直腸癌細胞があるか否かを決定するインビトロ法であって、ここで、該ＣＲＣＡ−１転写体の発現は該試料中の転移した結腸直腸癌細胞の存在の指標である、前記方法。
【請求項２】
該細胞による該ＣＲＣＡ−１転写体の発現がポリメラーゼ連鎖反応により決定され、ここで、該試料は該ＣＲＣＡ−１転写体又はそれらから発生されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該試料が体液である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該試料が血液である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞が結腸直腸腫瘍細胞であるか否かを決定するインビトロ法であって、該腫瘍細胞がＣＲＣＡ−１転写体を発現しているか否かを決定する工程を含み、ここで、ＣＲＣＡ−１転写体の発現は腫瘍細胞が結腸直腸腫瘍細胞であることを示す、前記方法。
【請求項６】
該腫瘍細胞による該ＣＲＣＡ−１転写体の発現がポリメラーゼ連鎖反応により決定され、ここで、該細胞は該ＣＲＣＡ−１転写体又はそれらから発生されたｃＤＮＡを選択的に増幅するプライマーと接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
個体からの腸外組織及び／又は体液の試料を、該試料中にＣＲＣＡ−１転写体が存在するか否かを決定するために試験する工程を含む、個体に転移した結腸直腸癌があるか否かを決定するインビトロ法であって、ここで、該試料中のＣＲＣＡ−１転写体の存在は該個体が転移した結腸直腸癌を有することを示す、前記方法。
【請求項８】
該試料が体液である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該試料が血液である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該ＣＲＣＡ−１転写体が、特異的にＣＲＣＡ−１転写体配列を増幅するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応アッセイにより検出される、請求項７に記載の方法
【請求項１１】
個体からの腸外組織及び／又は体液の試料中のＣＲＣＡ−１転写体の存在を検出することにより個体に結腸直腸癌があるか否かを決定するためのインビトロＰＣＲアッセイキットであって、ここで、該試料中の該ＣＲＣＡ−１転写体の存在は個体に転移した結腸直腸癌があることを示し、以下の：
該ＣＲＣＡ−１転写体又はそれらから発生されたｃＤＮＡを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを含んでいる第一の容器；
サイズマーカーを含んでいる第二の容器、該サイズマーカーは、該ＣＲＣＡ−１転写体が該試料中に存在するならば、増幅されたＤＮＡの予想されるサイズと同じである；及び
該キットを使用するための説明書
を含む、前記キット。
【請求項１２】
配列番号：１の核酸配列又はその機能性断片を有する単離された核酸分子であって、前記機能性断片が、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、かつ、少なくとも配列番号：１の１１０、１１１、１１２及び１１３のヌクレオチドを含む、前記核酸分子。
【請求項１３】
配列番号：１の核酸配列を有する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
少なくとも３０−２００ヌクレオチドである配列番号：１の機能性断片からなる請求項１２の核酸分子。
【請求項１７】
４０−１００ヌクレオチドである配列番号：１の機能性断片からなる請求項１２の核酸分子。
【請求項１８】
１５−５０ヌクレオチドである配列番号：１の機能性断片からなる請求項１２の核酸分子。
【請求項１９】
少なくとも１５ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子であって、前記機能性断片が、配列番号：１のヌクレオチド１１０〜１１３を含む、前記オリゴヌクレオチド分子。
【請求項２０】
３０−２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２１】
４０−１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２２】
１５−２５ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２３】
１５−５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２４】
１８−２８ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２５】
１５−３５ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２６】
少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列である配列番号：１の機能性断片に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２７】
少なくとも１８ヌクレオチドである配列番号：１の機能性断片からなる、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項２８】
１８−２８ヌクレオチドである配列番号：１の機能性断片からなる、請求項１２に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は結腸直腸癌細胞を検出するためのインビトロ診断法、そのような方法を実施するためのキットおよび試薬に関している。本発明は結腸直腸腫瘍のインビボイメージングおよび処置のための化合物および方法に関している。本発明は標的化された遺伝子治療、アンチセンスおよび薬剤組成物を作製および使用するための方法および組成物に関している。本発明は予防的および治療的抗結腸直腸癌ワクチンおよび組成物およびそれらを作製および使用する方法に関している。
【０００２】
背景技術
結腸直腸癌は世界的に３番目によく発生する新生物である。新しく診断された大腸癌の死亡率は５０％に達しており、過去４０年間にわたりほとんど改良されていない。この死亡率のほとんどは局所的、局部的および遠方への転移を反映している。
【０００３】
結腸直腸癌、特に転移した結腸直腸癌を持つ個体をスクリーニング、診断およびモニターするための試薬、キットおよび方法が必要とされている。起源のわからない癌が結腸直腸癌であることを同定および確認するための、結腸直腸癌を同定および確認するための、およびそのような癌細胞の移動のレベルを決定するために結腸組織を分析するための試薬、キットおよび方法が必要とされている。転移した結腸直腸癌細胞を特異的に標的化できる組成物に対する要求も残っている。転移した結腸直腸癌細胞に特異的に結合できるイメージング剤が必要とされている。転移した結腸直腸癌細胞をイメージングする方法を改良することも必要とされている。転移した結腸直腸癌細胞に特異的に結合できる治療薬が必要とされている。結腸直腸癌を患っていることが疑われる患者、特に結腸直腸癌の転移が疑われている患者を治療する改良された方法が必要とされている。転移した結腸直腸癌を治療および転移を予防するためのワクチン組成物が必要とされている。結腸直腸細胞へ遺伝子治療剤、アンチセンス化合物およびその他の薬剤を特異的に送達できる治療薬が必要とされている。
【０００４】
発明の概要
本発明はＣＲＣＡ−１転写体を含む単離された核酸分子に関している。本発明は配列番号：１に示された核酸配列またはその機能的断片を含む単離された核酸分子に関している。
【０００５】
本発明はさらに配列番号：１のヌクレオチド配列またはその機能的断片に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド分子に関している。
【０００６】
本発明はさらにＣＲＣＡ−１転写体を含む核酸分子から成る医薬組成物に関している。本発明は配列番号：１に示された核酸配列またはその機能的断片を含む核酸分子から成る、または医薬として受容可能な担体と組み合わされた医薬組成物に関している。
【０００７】
本発明はさらに配列番号：１またはその機能的断片を含むヌクレオチド配列を持つ核酸分子を含んでいる組換え発現ベクターに関している。本発明はさらに配列番号：１またはその機能的断片を含むヌクレオチド配列を持つ核酸分子を含む組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞に関している。
【０００８】
本発明はさらに実質的に純粋なＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその機能的断片をコード化している核酸配列を含む単離された核酸分子に関している。本発明は配列番号：２−８１に示されたアミノ酸配列を持つ実質的に純粋なタンパク質をコード化している核酸配列を含む単離された核酸分子に関している。
【０００９】
本発明はさらに実質的に純粋なＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその機能的断片；およびそれを含む医薬組成物にも関している。本発明はさらに配列番号：２−８１に示されたアミノ酸配列を持つ実質的に純粋なタンパク質；およびそれを含む医薬組成物にも関している。
【００１０】
本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物上のエピトープに結合する単離された抗体に関している。本発明はさらに配列番号：２−８１に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質上のエピトープに結合する単離された抗体にも関している。本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物上の少なくとも一つのエピトープを含んでいる単離されたタンパク質に関している。
【００１１】
本発明はさらに個体が転移した結腸直腸癌細胞を有するかどうかを決定するインビトロ法に関している。本発明は、結腸直腸腫瘍細胞を含む結腸直腸細胞に特異的である結腸直腸癌特異的転写体またはその翻訳生成物、ＣＲＣＡ−１が結腸直腸管の外側の細胞により発現されているかどうかを決定するために、個体の非結腸直腸組織または体液試料を試験するインビトロ法に関している。腸管外のＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはＣＲＣＡ−１転写体の存在はＣＲＣＡ−１発現の指標であり、個体が転移した結腸直腸癌を有する証拠である。
【００１２】
本発明はさらに腫瘍細胞が結腸直腸起源であるかどうかを決定するインビトロ法にも関している。本発明は個体の癌が結腸直腸癌からのものであるかどうかを診断するインビトロ法にも関している。本発明は結腸直腸腫瘍細胞を含む結腸直腸細胞に特異的であるＣＲＣＡ−１が腫瘍細胞により発現されているかどうかを決定するために、個体からの腫瘍試料を試験するインビトロ法に関している。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはＣＲＣＡ−１転写体の存在はＣＲＣＡ−１発現の指標であり、個体が結腸直腸癌を有する証拠である。
【００１３】
本発明はさらに本発明の方法を実施するためのインビトロキットおよび本発明のそのようなインビトロキット中の成分として有用な試薬および組成物に関している。
【００１４】
本発明はさらに活性部分と協同するＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合残基を含む組成物および化合物；およびそれらを含む医薬組成物に関している。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合残基は活性部分にコンジュゲートされていてもよいがコンジュゲートされていなくてもよく、それにはＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドをその表面に含み、および活性成分が中に包み込まれているようなリポソームから成る組成物が含まれる。活性部分は放射性であってもまたは放射安定性であってもよい。放射安定性残基はアンチセンス分子であろう。
【００１５】
本発明はさらに転移した結腸直腸腫瘍をイメージングする方法および転移した結腸直腸癌を持つことが疑われる個体を処置する方法に関しており、該方法は本発明に従った医薬組成物を該患者に投与する工程から成っており、ここで該組成物またはコンジュゲートされた化合物は結腸直腸癌を患ったヒトにおける治療的または診断的使用に有効な量で存在している。
【００１６】
本発明はさらに結腸の疾患、状態または障害が疑われる個体を処置する、またはそのような疾患、障害または状態が発生する危険性を持つ個体においてそのようなことを防止する方法に関しており、その方法には医薬として受容可能な担体または希釈剤を含んでいる医薬組成物およびその表面にＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを、およびその中に活性成分を含んでいるリポソームから成る非コンジュゲート組成物をそのような個体の結腸に投与する工程が含まれている。
【００１７】
本発明はさらに転移した結腸直腸癌細胞を含む個体の結腸細胞に活性な薬剤を送達する方法に関しており、医薬として受容可能な担体または希釈剤を含んでいる医薬組成物およびその表面にＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを、およびその中に活性成分を含んでいるリポソームから成る非コンジュゲート組成物をそのような個体に投与する工程が含まれている。
【００１８】
本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその少なくとも一つのエピトープを含んでいるタンパク質、および医薬として受容可能な担体または希釈剤から成るワクチンに関している。本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物の少なくとも一つのエピトープを含んでいるハプテン化されたタンパク質に関している。いくつかの態様において、ハプテン化されたタンパク質はＣＲＣＡ−１翻訳生成物を含んでいる。本発明はさらにそのようなハプテン化されたタンパク質および医薬として受容可能な担体または希釈剤から成るワクチンに関している。
【００１９】
本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその少なくとも一つのエピトープを含んでいるタンパク質をコード化している核酸分子、およびそのようなものを含むベクターおよびワクチンに関している。いくつかの態様において、核酸分子はプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスまたは細菌細胞である。いくつかの態様において、ベクターは組換えワクシニアウイルスである。
【００２０】
本発明はさらにＣＲＣＡ−１翻訳生成物の少なくとも一つのエピトープを含んでいるタンパク質を含む殺されたまたは不活性化された細胞または粒子；およびそれらを含んでいるワクチンに関している。いくつかの態様において、殺されたまたは不活性化された細胞または粒子はＣＲＣＡ−１翻訳生成物を含んでいる。いくつかの態様において、殺されたまたは不活性化された細胞または粒子はＣＲＣＡ−１翻訳生成物から成っている。いくつかの態様において、殺されたまたは不活性化された細胞または粒子ベクターは殺されたまたは不活性化された結腸直腸腫瘍細胞である。いくつかの態様において、殺されたまたは不活性化された細胞または粒子はハプテン化されている。
【００２１】
本発明はさらに転移した結腸直腸癌を患っている個体を処置する方法および転移した結腸直腸癌が疑われる個体を処置する方法に関している。本発明の方法はそのような個体にそのようなワクチンの有効量を投与することを提供する。本発明はさらに免疫治療剤としてのそのようなワクチンの使用に関している。
【００２２】
好適な態様の詳細な説明
本出願は１９９７年８月７日に出願された米国特許出願番号０８／９０８，６４３号（本明細書において援用される）に関連している。
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、用語”ＳＴ”および”天然ＳＴ”は相互交換的に使用され、大腸菌ならびに他の生物体により産生されるペプチドである熱安定性毒素（ＳＴ）を示すことを意味している。ＳＴは天然に存在するペプチドであり、１）生物体により天然に産生され、２）ＳＴレセプターに結合し、３）ＳＴ誘発下痢症を媒介するシグナルカスケードを活性化する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語”ＳＴレセプター”、”グアニリルシクラーゼＣレセプター”および”ＧＣＣレセプター”とはＳＴに結合する、局所的なおよび転移した結腸直腸癌細胞を含む結腸直腸細胞上に観察されるレセプターを示すことを意味している。正常な個体において、ＳＴレセプターは独占的に腸の細胞、特に十二指腸、小腸（空腸および回腸）、大腸、結腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸）および直腸の細胞で観察される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語”結腸直腸癌関連転写体（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）”および”ＣＲＣＡ−１転写体”とはヒトＳＴレセプター遺伝子の転写により産生されるＳＴレセプターのｍＲＮＡの代替形を示すことを意味している。ＣＲＣＡ−１転写体はＳＴレセプターコード化ｍＲＮＡの配列とは別の配列を有する。ＣＲＣＡ−１転写体は好適には配列番号：１に示されたヌクレオチド配列を有する。ＣＲＣＡ−１転写体は局所的なおよび転移した結腸直腸癌細胞を含む結腸直腸細胞上に観察される。正常な個体において、ＣＲＣＡ−１転写体は独占的に腸の細胞、特に十二指腸、小腸（空腸および回腸）、大腸、結腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ状結腸）および直腸の細胞で観察されている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語”ＣＲＣＡ−１転写体生成物の機能性断片”で使用される用語”機能性断片（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）”とは完全長配列の核酸分子に関連して機能的であるＣＲＣＡ−１転写体の断片を意味している。例えば、機能性断片はオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは核酸分子またはコード化配列として有用であろう。ＣＲＣＡ−１転写体の機能性断片は他の既知の核酸分子と比較して独特であり、特にＣＲＣＡ−１転写体の機能性断片はＳＴレセプターｍＲＮＡの核酸配列と比較して独特である。ヒトＳＴレセプタータンパク質コード化ヌクレオチド配列は図１（配列番号：８２）およびＦ．Ｊ．Ｓａｕｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７９１２−１７９１８（本明細書において援用される）に示されている。ＣＲＣＡ−１転写体を発生させる欠失配列は図１に示されている。従って、ＣＲＣＡ−１の機能性断片はＳＴレセプターｍＲＮＡには観察されない特異的配列を含んでいる。そのような独特の配列は欠失の両側の配列を含んでおり、ＳＴレセプターｍＲＮＡ配列に関して独特の配列を形成している。従って、機能性断片は配列番号：１のヌクレオチド１１０−１１３を含んでいるであろう。独特の配列はヌクレオチド１１０の５’側の５−１０若しくはそれ以上の配列またはヌクレオチド１１３側の３’側の５−１０若しくはそれ以上の配列をさらに含んでいることが好適である。機能性断片の配列を持つＣＲＣＡ−１転写体のオリゴヌクレオチドおよび他の断片は配列番号：１のヌクレオチド１１０−１１３を含んでおり、欠失により形成された独特の４ヌクレオチド配列の５’および３’側の配列をさらに含んでいてもよい。例えば、８−２８ヌクレオチドを有するＰＣＲプライマーはＣＲＣＡ−１のための独特の配列、即ち、８ヌクレオチドを有する機能性断片はヌクレオチド１０６−１１３または１１０−１１７、または中間体配列から発生された８ヌクレオチド配列（即ち、１１７−１１４、１０８−１１５または１０９−１１６）を含んでいるであろうし、２８ヌクレオチドを有する機能性断片はヌクレオチド配列８６−１１３または１１０−１３７または中間体配列から発生された２８ヌクレオチド配列を含んでいるであろう。同様に、ＣＲＣＡ−１転写体の他の機能性断片は配列番号：１の一部として配列番号：１の１１０−１１３を含んでいるであろう。ＣＲＣＡ−１特異的プライマーに関して、そのようなプライマーの組は一つのＣＲＣＡ−１転写体の独特の断片および一つの独特のＣＲＣＡ−１配列に特異的ではないプライマーを含んでいる（もしそのようなプライマー対がＣＲＣＡ−１特異的配列を増幅するために使用できるとすれば）。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語”結腸直腸癌関連翻訳生成物（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）”および”ＣＲＣＡ−１翻訳生成物”とは配列番号：２−８１に示された翻訳生成物を示していることを意味している。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語”ＣＲＣＡ−１転写体生成物の機能性断片”で使用されるような用語”機能性断片”とは完全長配列を持つタンパク質性化合物と同様の様式で機能するＣＲＣＡ−１転写体生成物の断片を意味している。例えば、ＣＲＣＡ−１の免疫学的機能性断片は抗ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体により認識されるエピトープを含んでいる。ＣＲＣＡ−１のリガンド結合性機能性断片は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物に認識されおよび結合されるリガンドへ結合できる構造を形成する配列を含んでいる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語”抗ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体により認識されるエピトープ”とは非ＣＲＣＡ−１翻訳生成物のエピトープを認識しない（即ち、非ＣＲＣＡ−１タンパク質とは交差反応しない）抗ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体により認識されるようなエピトープを示している。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語”抗体”とは完全で無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体およびそれらのＦａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片を示していることを意味している。完全で無傷の抗体にはマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化された抗体のようなモノクローナル抗体が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語”ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンド”とはＣＲＣＡ−１翻訳生成物へ特異的に結合する化合物を示していることを意味している。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物へ結合する抗体はタンパク質、ペプチドまたは非ペプチドであろう。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語”活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）”とは治療剤またはイメージング剤である化合物を示していることを意味している。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語”放射安定性（ｒａｄｉｏｓｔａｂｌｅ）”とは放射性改変を行わない、即ち、放射活性でない化合物を示していることを意味している。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語”治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）”とは化学治療剤、毒素、放射線治療剤、標的化剤または放射線増感剤を示していることを意味している。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語”化学治療剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）”とは、細胞と接触および／または細胞内へ取り込まれた場合、細胞の死、細胞分割の阻害または分化の誘導を含む細胞に対する影響を生み出すような化合物を示していることを意味している。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語”毒素（ｔｏｘｉｎ）”とは、細胞と接触および／または細胞内へ取り込まれた場合、細胞の死を起こすような化合物を示していることを意味している。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語”放射線治療剤（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）”とは、細胞と接触および／または細胞内へ取り込まれた場合、細胞の死を起こすような放射性核種を示していることを意味している。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語”標的化剤（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）”とは、他の化合物と結合および／または反応できる化合物を示していることを意味している。標的化剤は化学治療剤、毒素、酵素、放射線治療剤、抗体またはイメージング剤を標的化剤が関係する細胞へ送達するため、および／または同時に投与された活性成分を変換またはさらには変形または能力を高めるために使用される。標的化剤には細胞に局在化する第一の試薬を構成する残基を含んでおり、それは第二の試薬と接触した場合、どちらかが所望の活性を持つ第三の試薬へ変換されるか、または第二の試薬を所望の活性を持つ試薬へ変換する。局在化試薬は所望の活性を持つ薬剤の転移した細胞への曝露を容易にする結果を生じさせる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語”放射性増感剤（ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）”とは、イオン化放射線の損傷効果に対する細胞の感受性を増加させる薬剤を示していることを意味している。放射性増感剤はより低い線量の放射線照射によっても治療的に有効な線量を提供することを可能にする。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語”イメージング剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）”とは、検出することができる化合物を示していることを意味している。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語”ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分”とは、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを形成するコンジュゲートされた化合物の一部を示していることを意味している。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語”活性部分（ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｉｅｔｙ）”とは、活性薬剤を形成するコンジュゲート化合物の一部を示していることを意味している。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語”コンジュゲート化合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）”および”コンジュゲート組成物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”は相互交換的に使用され、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および活性部分を含み、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物に結合できる化合物を示していることを意味している。本発明に従ったコンジュゲート化合物はＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを形成する部分および活性薬剤を形成する部分を含んでいる。従って、本発明に従ったコンジュゲート化合物はＣＲＣＡ−１翻訳生成物へ特異的に結合でき、治療剤またはイメージング剤である部分を含んでいる。コンジュゲート化合物は架橋剤および／または残基間のスペーサーとして働く分子を含んでいるであろう。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語”架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）””架橋試薬””コンジュゲート化試薬””カップリング試薬””縮合試薬（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）”および”二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤”は相互交換的に使用され、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドおよび活性薬剤を結合してコンジュゲート化合物を形成させるために使用された分子基を示していることを意味している。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語”結腸直腸癌”とは、小腸より下の腸管（即ち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸を含む大腸（結腸）および直腸）の細胞癌により特徴付けられる医学状態として結腸直腸癌を定義している広く受け入れられている医学定義を含んでいることを意味している。加えて、本明細書で使用される場合、用語”結腸直腸癌”とは、さらに十二指腸および小腸（空腸および回腸）の細胞癌により特徴付けられる医学状態も含んでいることを意味している。本明細書で使用される結腸直腸癌の定義は通常の医学定義よりも広範囲であるが、十二指腸および小腸の細胞もＣＲＣＡ−１翻訳生成物を含んでおり、従って本発明の化合物を用いる本発明の方法で検査することができるのでそれとして提供されている。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語”転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）”とは、一つの器官または体の一部を起源とする癌細胞が体の別の部分に移動し、複製を続ける過程を示していることを意味している。転移した細胞はその後腫瘍を形成し、それはさらに転移する。それ故、転移とは本来発生した体の部分から体の別の部分への癌の広がりを意味している。本発明は転移した結腸直腸癌細胞へ活性薬剤を送達する方法に関している。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語”転移結腸直腸癌細胞”とは、転移した結腸直腸癌細胞；十二指腸、小腸（空腸および回腸）、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸を含む大腸（結腸）および直腸以外の体の一部に局在化した結腸直腸癌細胞を示していることを意味している。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語”非結腸直腸試料”および”腸外試料”とは相互交換的に使用され、結腸直腸組織以外の起源を持つ組織または体液試料を示していることを意味している。いくつかの好適な態様において、非結腸直腸試料はリンパ節のような組織試料である。いくつかの好適な態様において、非結腸直腸試料は起源が確認されていない腺癌である腸外組織の試料である。いくつかの好適な態様において、非結腸直腸試料は血液試料である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語”起源が確認されていない腺癌を患っている個体”とは、起源が明確に同定されていない腫瘍を有する個体を示していることを意味している。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語”個体が転移結腸直腸癌に感受性があると疑われている”とは、転移結腸直腸癌が発生する特別の危険性を有する個体を示していることを意味している。転移結腸直腸癌が発生する特別の危険性を有する個体の例は家族病歴が家族メンバーの間での結腸直腸癌の発生率が平均より上であることが示される個体および／または結腸直腸癌がすでに発生し、有効に処置されたが再発および反復の危険性に面している個体である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語”アンチセンス組成物”および”アンチセンス分子”は相互交換的に使用され、ＤＮＡまたはＲＮＡへハイブリダイズし、および転写または翻訳が起こることを阻害および／または防止することにより転写または翻訳を調節する化合物を示していることを意味している。アンチセンス分子には核酸分子および誘導体およびそれらの類似体が含まれる。アンチセンス分子は核酸分子または誘導体または類似体であるかどうかに関わらず、相補的ヌクレオチド配列が行うのと同一の様式でアンチセンス分子はＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする。アンチセンス分子はその発現が結腸直腸癌に関係している遺伝子の転写または翻訳を阻害または防止する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語”ＣＲＣＡ−１免疫原”とは、一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその断片または同一のまたはそのハプテン化生成物を含むタンパク質、少なくとも一つのＣＲＣＡ−１エピトープを示す細胞および粒子、および少なくとも一つのＣＲＣＡ−１エピトープを示すハプテン化細胞およびハプテン化粒子を示していることを意味している。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語”組換え発現ベクター”とは、適当な宿主に導入された場合、該タンパク質をコードしているコード化配列の発現を指示するのに必要な遺伝子要素を含んでいるプラスミド、ファージ、ウイルス粒子または他のベクターを示していることを意味している。コード化配列は必要な調節配列に作動可能なように結合されている。発現ベクターはよく知られており、容易に入手可能である。発現ベクターの例としては、宿主細胞を形質転換し、コード化配列の発現を容易にするのに有用なプラスミド、ファージ、ウイルス粒子および他の核酸分子または賦形剤を含んでいる核酸分子が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語”異常な転写”とは、他の組織からの細胞における組織特異的遺伝子の低レベルのまたはバックグラウンド発現を示していることを意味している。異常な転写の現象はそれ故他の組織における組織特異的転写のためのｍＲＮＡのコピーを提供する。遺伝子発現を検出するために使用された検出技術が異常な転写を検出するのに十分な感度であるならば、異常な転写による陰性試料中の転写の発現レベルは、対照および／または定量的アッセイおよび／または異常転写による偽陽性の発生を除去するための他の手段を用いて差し引かなければならない。もしくは、試料中のＣＲＣＡ遺伝子発現証拠の検出は、異常な転写により存在するＣＲＣＡ転写体を検出することなく達成される。これは、バックグラウンドとして存在する異常な転写により存在するＣＲＣＡ転写体を検出するには十分な感度をもたない技術を使用することにより達成される。
【００５５】
ＳＴレセプターおよびＣＲＣＡ−１
腸粘膜に由来する癌腫はその細胞表面にＳＴレセプターを発現し続ける。転移腫瘍によるＳＴレセプターの発現は、このタンパク質およびそのｍＲＮＡを腸外組織および血液における転移結腸直腸癌細胞の存在の特異的バイオマーカーとすることを可能とする。実際、この特性は結腸直腸癌を有する患者の進度決定、および血液中の再発性疾患の証拠として手術後の患者を追跡する診断試験としてのＲＴ−ＰＣＲ分析によるＳＴレセプターｍＲＮＡの検出を可能にしている。さらに、ＳＴレセプターはインビボにおいて活性薬剤を転移結腸直腸腫瘍細胞へ送達するため、活性薬剤にコンジュゲートされたリガンドの標的とされるであろう。
【００５６】
Ｗａｌｄｍａｎにより１９９６年５月２１日に公開された米国特許第５，５１８，８８８号、１９９４年１０月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２、１９９５年６月６日に出願された米国特許出願第０８／４６７，９２０号および１９９６年１月５日に出願された米国特許出願第０８／５８３，４４７号（各々本明細書において援用される）は転移した結腸直腸腫瘍はＳＴレセプターを標的とすることにより活性化合物の送達を標的化することができることを開示している。結腸直腸癌のマーカーとしての腸管外部細胞上のＳＴレセプターの存在は転移結腸直腸腫瘍についての個体のスクリーニング、同定および処置を可能にしている。ＳＴレセプターはまた、結腸直腸細胞への遺伝子治療剤およびアンチセンス化合物の標的化送達にも使用されるであろう。
【００５７】
Ｗａｌｄｍａｎにより１９９７年２月１１日に公開された米国特許第５，６０１，９９０号、１９９４年１０月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２、および１９９７年５月２日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０７４６７（各々本明細書において援用される）は腸管外部からの組織および血液試料中のＳＴレセプター発現の証拠は転移結腸直腸癌を示していることを開示している。
【００５８】
ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０７４６７（本明細書において援用される）はＳＴレセプターと反応する抗体により標的化できるエピトープを持つ免疫原は、予防的および治療的抗転移結腸直腸癌組成物として有用なワクチン組成物に使用できることを開示している。
【００５９】
最近、ヒト結腸癌腫細胞から単離されたＳＴレセプターの別の形のｍＲＮＡが同定された。このｍＲＮＡはＳＴレセプターのコード化領域中の最初のエキソンにかなりの核酸欠失を有する。この欠失はもはやＳＴレセプターのアミノ酸配列をコード化しないようなコード化領域のフレームシフトを生じている。しかしながら、この別のスプライス変異ｍＲＮＡはＳＴレセプターと相等しい発現の選択的パターンを示すようである。この新しく同定されたｍＲＮＡは正常腸粘膜細胞、ヒト結腸直腸腫瘍でのみ検出されており、腸外組織では検出されていない。さらに、この新しく同定されたｍＲＮＡの発現はＳＴレセプターｍＲＮＡと別に、ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出できる。従って、本発明は結腸直腸癌を持つ患者の診断、進度決定および手術後のサーベイランスのための特異的分子診断マーカーとしてこの結腸直腸癌関連転写体（ＣＲＣＡ−１）の使用を提供する。
【００６０】
新しく同定されたＣＲＣＡ−１は結腸直腸癌を持つ患者の診断、進度決定および手術後のサーベイランスのための高度に特異的なマーカーであるようである。ＲＴ−ＰＣＲを含む分子技術（これに制限されるわけではない）を用いるＣＲＣＡ−１発現の検出は患者の診断および進度決定、手術後の再発の発生の追跡、および潜在的な結腸直腸癌の発生に関して正常のヒトのスクリーニングのために用いることができる。
【００６１】
ＣＲＣＡ−１転写生成物のヌクレオチド配列は配列番号：１に示されている。結腸直腸起源の細胞はＣＲＣＡ−１転写生成物の存在または不在を検出することに基づいて他起源の細胞から区別される。
【００６２】
ＣＲＣＡ−１転写生成物の翻訳により一つまたはそれ以上の翻訳生成物が生成されることも発見されている。転写生成物は翻訳を始めることができる多数の開始コドンを含んでおり、多数の翻訳生成物を発生させる。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物のアミノ酸配列は配列番号：２−８１に示されている。結腸直腸起源の細胞は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在または不在を検出することに基づいて他起源の細胞から区別される。
【００６３】
ＳＴレセプターは腸管を裏打ちしている細胞の先端刷子縁膜にのみ局在化していることで独特である。実際、それらは胎盤性哺乳類の他のどんな細胞型にも観察されない。加えて、ＳＴレセプターはほとんど独占的に先端膜に局在化しており、腸細胞側面の側底膜にほんのわずか観察される。ＳＴレセプター同様に、ＣＲＣＡ−１の発現も同様に局在化している。
【００６４】
腸を裏打ちしている粘膜細胞は堅い結合によりお互いに連結されており、それは血流内への腸内容物のおよび血流成分の腸内腔への通過に対する障壁を形成している。従って、ＳＴレセプターおよびＣＲＣＡ−１単離物を発現している細胞が先端に位置していることは、それらの細胞が循環系から隔離されていることになり、それらは体の残りの部分と分離されて存在していると考えられる。従って、体の残りの部分は腸管の”外側”と考えられる。腸管の”外側”に投与された組成物は通常ＳＴレセプターを発現する細胞だけから離れておよび分離されて維持されている。逆に、腸管の外側からとられた組織試料は通常はＳＴレセプターおよびＣＲＣＡ−１を発現する細胞を含んでいない。
【００６５】
結腸直腸癌を患っている個体において、癌細胞はしばしばＳＴレセプターを産生および示す細胞に由来しており、これらの癌細胞はその細胞表面にＳＴレセプターを産生および示し続ける。ＣＲＣＡ−１は結腸直腸癌細胞により発現されることが観察されている。
【００６６】
そのような癌細胞が転移した場合、転移した癌細胞はＳＴレセプターを産生および示し続ける。転移腫瘍細胞によるＣＲＣＡ−１の発現は、インビトロでのスクリーニング、診断、モニタリングおよび進度決定のための検出可能な標的ならびにイメージングおよび処置のための活性薬剤を含むコンジュゲート組成物のインビボ送達のための標的を提供する。
【００６７】
本発明は単離されたＣＲＣＡ−１翻訳生成物に関している。本発明は単離されたＣＲＣＡ−１転写体に関している。本発明はそのような生成物に特異的な単離された抗体、およびそのような抗体を生成するハイブリドーマに関している。単離された翻訳生成物またはそれらの機能性断片は本発明に従った抗体を発生させるのに有用である。本発明のいくつかの態様において、該翻訳生成物をコード化している核酸分子が提供される。核酸分子は抗体を発生させるのに使用されるタンパク質を生成するために有用である。
【００６８】
インビトロ診断
本発明のいくつかの態様に従うと、ＣＲＣＡ−１の発現が結腸直腸癌の転移の指標である、腸管の外側の細胞によるＣＲＣＡ−１発現の証拠を検出するために患者および患者試料をスクリーニング、診断および分析するための組成物、キットおよびインビトロ法が提供される。さらに、本発明は、ＣＲＣＡ−１を発現する細胞の存在が腫瘍が結腸直腸癌起源であることを示すおよび／または確認される腸管の外側の腫瘍細胞によるＣＲＣＡ−１発現の証拠を検出するための患者および患者試料のインビトロスクリーニング、診断および分析に有用な方法、組成物およびキットに関している。本発明の別の態様において、結腸直腸細胞の可視化に有用である組成物、キットおよび方法が提供される。結腸組織からの組織試料を分析するそのような組成物、キットおよび方法は結腸直腸腫瘍細胞の粘膜固有層への転移または侵襲の程度を評価できる。
【００６９】
インビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、局在化した疾患および／または転移した疾患を持つと診断されている、および／または遺伝的にこの疾患に関連がある個体のモニタリングに使用できる。インビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、癌が転移したかどうかを決定するため、局在化した結腸直腸癌を処置中のおよび／または処置された個体のモニタリングに使用できる。インビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、転移した癌が除去されたかどうかを決定するために転移した結腸直腸癌を処置中のおよび／または処置された個体のモニタリングに使用できる。インビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、感受性のある、即ち、遺伝子スクリーニングおよび／または家族歴などにより遺伝的にかかりやすいと同定された個体のモニタリングに使用できる。遺伝学の理解の進歩、技術の発達ならびに疫学は、個体が結腸直腸癌を発生する可能性および危険度評価の決定を可能にしている。家族健康歴および／または遺伝子スリーニングを使用して、特定の個体が結腸直腸癌を含んだ癌のある種の型を発生する可能性を見積もることが可能である。特定の型の癌を発生しやすいと同定された個体は、転移した結腸直腸癌の証拠を検出するためにモニターまたはスクリーニングできる。そのような証拠の発見により、疾患と戦うための早期の処置をとることができる。従って、転移結腸直腸癌を発生する危険を持つ個体が同定され、そのような個体から試料が単離される。本発明は、結腸直腸癌を患った親戚を含む家族病歴を有すると同定された個体をモニタリングするために特に有用である。同様に、本発明は結腸直腸癌を有すると診断されたおよび特に、処置されて腫瘍が除去されたおよび／またはもしくは緩解を経験している個体（転移した結腸直腸癌が処置された個体を含んで）をモニターするために特に有用である。
【００７０】
インビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、腫瘍の分析に使用できる。ＣＲＣＡ−１の発現は細胞型のマーカーであり、未確認起源腺腫の起源の同定を可能にするとともに、確認されるべき結腸直腸癌の初期診断を可能にする。起源が結腸直腸であると信じられた腫瘍は本発明の組成物、方法およびキットを使用して確認できる。本発明は腫瘍が結腸直腸起源であることを確認することにより結腸直腸癌の診断を確定するために使用できる。同様に、起源が未知の腫瘍は本発明の組成物、方法およびキットを使用して起源が結腸直腸であることを分析および同定できる。本発明は起源が未知の腺腫を患っている個体から除去された腫瘍試料中の結腸直腸腫瘍を同定するために使用できる。
【００７１】
本発明のインビトロスクリーニングおよび診断組成物、方法およびキットは、結腸直腸腫瘍細胞の粘膜固有層内への転移または侵襲の程度を評価するために、結腸組織からの組織試料を分析するために使用できる。粘膜固有層は腸管および体の残りの部分間の障壁を意味している；Ｂａｉｌｅｙ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１６版、Ｃｏｐｅｒｈａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ  ページ４０４（本明細書において援用される）を参照されたい。粘膜固有層細胞中のＣＲＣＡ−１転写体または翻訳生成物の存在を同定することにより、非結腸直腸組織内への結腸直腸腫瘍細胞の侵襲／湿潤の程度が評価および確認できる。
【００７２】
本発明に従うと、ＣＲＣＡ−１転写体または翻訳生成物へ結合する化合物が提供される。体の正常組織は腸管の細胞を除いてＣＲＣＡ−１転写体または翻訳生成物を持っていない。転移した結腸直腸細胞は非結腸直腸試料中のＣＲＣＡ−１転写体または翻訳生成物を検出することにより同定される。ＣＲＣＡ−１の発現は細胞型のマーカーであり、腸外試料中の結腸直腸転移の同定を可能にする。ＣＲＣＡ−１転写体または翻訳生成物は粘膜固有層内への結腸直腸腫瘍細胞の侵襲の程度を評価するため、内腔の他の細胞からの結腸直腸由来細胞を可視化するために使用されるであろう。
【００７３】
本発明のいくつかの態様において、非結腸直腸組織および体液試料または腫瘍試料がＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在または不在を同定するためにスクリーニングされる。ＥＬＩＳＡアッセイおよびウェスタンブロットのような技術が一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が試料中に存在するかどうかを決定するために使用される。
【００７４】
本発明のいくつかの態様において、非結腸直腸組織および体液試料または腫瘍試料が、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在または不在を検出することにより腸管の外側の細胞中に一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が発現されているかどうかを同定するためにスクリーニングされる。ＣＲＣＡ−１転写体またはそれから発生されたｃＤＮＡの存在は、ＰＣＲ増幅、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノーザンブロット（ｍＲＮＡ）、サザンブロット（ｃＤＮＡ）またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのような技術を使用して決定できる。
【００７５】
本発明のいくつかの態様において、非結腸直腸組織試料または腫瘍試料の細胞は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在または不在を同定するために試験される。免疫組織化学的ブロットのような技術が試料中に一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が存在するかどうかを決定するために組織切片に対して実施される。
【００７６】
本発明のいくつかの態様において、ＣＲＣＡ−１転写体の存在または不在を検出することにより腸管の外側の細胞中に一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が発現されているかどうかを決定するために非結腸直腸組織および体液試料または腫瘍試料が試験される。組織切片の細胞中のＣＲＣＡ−１転写体またはそれらより発生されるｃＤＮＡの存在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような技術を用いて決定できる。
【００７７】
非結腸直腸組織および体液試料中、または非結腸直腸組織試料からの細胞上の一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在は結腸直腸腫瘍転移を示している。腫瘍試料中または腫瘍細胞上の一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在は、腫瘍が結腸直腸起源であることを示している。非結腸直腸組織および体液試料中、または非結腸直腸組織試料からの細胞中のＣＲＣＡ−１転写体の存在は結腸直腸腫瘍転移を示している。腫瘍試料および腫瘍細胞中のＣＲＣＡ−１転写体の存在は、腫瘍が結腸直腸起源であることを示している。
【００７８】
本発明のいくつかの態様は、粘膜固有層中の腫瘍細胞の転移的移動を評価し、基底膜内への結腸直腸腫瘍細胞の侵襲レベルを示すための方法およびキットに関している。本発明のいくつかの態様において、粘膜固有層の切片を含む組織試料は結腸直腸腫瘍を除去するための手術を受けているまたは手術から回復している個体から単離された。組織は新生生物的結腸直腸細胞による粘膜固有層の基底膜内への侵襲の程度を決定するために分析される。一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在または不在の同定は、転移を示している基底膜内への腫瘍細胞の移動の評価を確定する。転移的移動の指標である一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が組織試料中の細胞中に存在するかどうかを決定するために免疫組織化学的アッセイのような技術が実施される。もしくは、本発明のいくつかの態様において、粘膜固有層を含む組織試料はＣＲＣＡ−１転写体の存在または不在を検出することにより、一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が組織試料中の細胞で発現されているかどうか（転移的移動を示している）を同定するために分析される。ＣＲＣＡ−１転写体またはそれらより発生されるｃＤＮＡの存在は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような技術を用いて決定できる。
【００７９】
腫瘍からの試料は本発明の方法を使用して一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の発現を同定することにより結腸直腸起源であると同定されるであろう。起源が確認されていない腺腫を患っている個体から除去された腫瘍試料は、それらが一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはＣＲＣＡ−１転写体を有するかどうかを決定するために試験できる。もし試料が腸管から除去されたならば、腫瘍細胞が一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を発現しているかどうかを決定するために凍結細胞の切片が試験できる。もし細胞が腸組織以外から除去されたならば、腫瘍細胞が一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を発現しているかどうかを決定するために凍結細胞の切片が試験でき、または非癌細胞は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を持っていないであろうし、それ故バックグランドには存在しないので、試料を均一化させて試験できる。
【００８０】
試料は切除された組織または針バイオプシーを含むバイオプシー材料から得られる。外科病理学のための組織切片調製試料は凍結され、標準技術を用いて調製される。組織切片に対する免疫組織化学およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結合アッセイは固定された細胞で実施された。腸以外の試料は超音波処理、機械的破壊または界面活性剤溶解のような化学的溶解により均一化された。血液、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、膣液、精液および便試料のような体内の腫瘍試料もまたそのような腫瘍が結腸直腸起源であるかどうかを決定するためにスクリーニングすることも企図された。
【００８１】
非結腸直腸組織試料は結腸直腸管、即ち、小腸より下の腸管（即ち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸を含む大腸（結腸）および直腸）およびさらに十二指腸および小腸（空腸および回腸）の組織を除いた任意の組織から得られる。結腸直腸管を除いたすべての組織の細胞は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を発現しない。それ故、非結腸直腸試料中に一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはＣＲＣＡ−１転写体が検出されたら、転移した結腸直腸癌細胞の存在が示唆される。いくつかの好適な態様において、組織試料はリンパ節である。
【００８２】
組織試料はバイオプシー針の使用を含む標準外科技術により得られるであろう。当業者は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が試験される種々の試験試料を容易に理解し、組織試料を得るための方法を認識するであろう。
【００８３】
組織試料は超音波処理、機械的破壊または界面活性剤溶解のような化学的溶解またはこれらの組み合わせのようなよく知られた技術により一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在をスクリーニングするために均一化または別の方法で調製される。
【００８４】
体液試料の例には血液、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、膣液および精液が含まれる。いくつかの好適な態様において、血液が体液試料として使用される。細胞は例えば遠心分離により液体試料から分離される。当業者は一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が試験される種々の試験試料を容易に理解するであろう。試験試料は注射器での液体の引き出しまたはスワブによるような方法により得られるであろう。当業者は試験試料を得るための他の方法を容易に認識するであろう。
【００８５】
血液試料を用いるアッセイにおいて、血液血漿が血液細胞から分離されるであろう。血液血漿は、一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が転移結腸直腸腫瘍細胞から引き離されたまたは脱け落ちた場合に血液内へ放出される端が切断されたタンパク質を含む一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物がスクリーニングされる。いくつかの態様において、血液細胞分画が転移した結腸直腸腫瘍細胞の存在でスクリーニングされる。いくつかの態様において、血液細胞分画に存在するリンパ球が、細胞を溶解し、および血液細胞により吸い込まれた転移結腸直腸腫瘍細胞の存在の結果として存在する一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはＣＲＣＡ−１転写体の存在を検出することによりスクリーニングされた。
【００８６】
内腔組織の分析に関連する本発明の態様においては、手術患者から腫瘍部位からまたは近辺から採られた内腔試料を使用して結腸直腸腫瘍細胞の転移的移動のレベルを評価するのに本発明は有用である。本発明のいくつかの態様は、細胞を特徴付けるためおよび評価するために外科的病理学により日常的に調製される固定された切片である組織試料を分析する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は粘膜固有層からのものであり、結腸直腸腫瘍細胞の転移の程度を決定および評価するために分析される。粘膜固有層は結腸直腸管および体の残りの部分間の障壁を意味している。粘膜固有層の細胞中のＣＲＣＡ−１転写体または一つまたはそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物の存在を同定することにより、非結腸直腸組織内への結腸直腸腫瘍細胞の侵襲／湿潤の程度が評価できる。いくつかの態様において、細胞はバイオプシーにより除去されるかまたは起源が未知の腺腫であり、それらは結腸直腸腫瘍細胞であるかどうかを決定および評価するために分析される。いくつかの態様において、細胞は結腸直腸起源であると疑われる腫瘍からであり、本発明の方法、組成物およびキットが腫瘍細胞の起源の同定を確認するために使用される。
【００８７】
粘膜固有層の試料は切除または結腸鏡検査法によるような結腸直腸腫瘍除去手術の間に取り出される。基底膜細胞を含んでいる試料は凍結される。もし免疫組織化学またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが実施されるべきであれば、凍結切片が染色され、アッセイが行われる。当業者は容易に粘膜固有層部分を含む試料を単離し、標準技術を使用して固定および染色できる。ＣＲＣＡ−１検出技術で提供される可視化を加えることにより、切片はより幅広く分析でき、粘膜固有層内への新生物的結腸直腸細胞の侵襲レベルが決定できる。原発性または非転移性結腸直腸腫瘍がもし粘膜の下にある基底膜を貫いて粘膜下組織へ達していたら、局在化結腸直腸腫瘍の進行の程度を分析および評価するために本発明が使用されるであろう。
【００８８】
本発明の態様にはＣＲＣＡ−１転写体を検出するためのヌクレオチド配列に基づいた分子分析による、ＣＲＣＡ−１を発現する細胞を試料が含んでいるかどうかを決定するための種々の方法が含まれている。そのようなことを実施するために利用可能ないくつかの異なった方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノーザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術が含まれる。
【００８９】
本発明はＣＲＣＡ−１転写体を同定するための方法で使用されるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーおよびそのような成分を含む診断キットに関している。
【００９０】
ＣＲＣＡ−１転写体を検出するためのｍＲＮＡ配列に基づいた方法にはポリメラーゼ連鎖反応技術、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノーザンおよびサザンブロット技術、ｉｎ  ｓｉｔｅハイブリダイゼーション技術およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術が含まれるがそれらに制限されるわけではない。
【００９１】
本明細書に記載されている方法は本発明がどのように実行されるかの例示を意味しており、本発明の範囲を制限することを意味しているわけではない。非結腸直腸試料中のＣＲＣＡ−１転写体の存在を検出するための他の配列に基づいた方法論も本発明に従って利用されることが考えられている。
【００９２】
非結腸直腸試料に由来する遺伝子材料中のＣＲＣＡ−１転写体を検出する好適な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用している。ＰＣＲ技術は当業者には日常的に実施されており、診断におけるその使用はよく知られており、受け入れられている。ＰＣＲ技術を実施するための方法は”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（本明細書において援用される）に記載されている。ＰＣＲ技術の応用は”Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（本明細書において援用される）に記載されている。米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，９６５，１８８号および米国特許第５，０７５，２１６号（各々本明細書において援用される）はＰＣＲを実施する方法を記載している。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＧＥＮＥ  ＡＭＰ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット、製品番号第Ｎ８０８−００１７号を使用して日常的に実施される。
【００９３】
ＰＣＲ技術はＲＮＡまたはＤＮＡ分子中に存在する配列へハイブリダイズする５’および３’プライマーを提供し、さらに遊離のヌクレオチドおよびプライマー間のヌクレオチド配列へ遊離のヌクレオチドを相補的塩基で満たしてＤＮＡの相補鎖を産生する酵素を提供することによりＤＮＡ配列の多数のコピーを急速に発生させることを可能にする。酵素はプライマーに隣接する相補的配列を満たすであろう。もし５’プライマーおよび３’プライマーが核酸の同一の小さな断片上のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると、特異的二重鎖サイズの生成物の指数的増幅が起こる。もし、単一のプライマーのみが核酸断片にハイブリダイズすると直線的増幅で種々の長さの一本鎖生成物が生成される。
【００９４】
ＰＣＲプライマーは配列情報を使用して当業者が日常的に設計できる。ＣＲＣＡ−１転写体のヌクレオチド配列は配列番号：１に示されている。この方法を実施するには、ＲＮＡが試料中の細胞から抽出されて試験されるか、またはよく知られた方法および容易に入手可能な出発物質を用いたｃＤＮＡの作製に使用される。当業者は容易にＰＣＲプライマーを調製できる。抽出されたｍＲＮＡまたはそれらから発生させたｃＤＮＡに対してＰＣＲを実施する場合、もしＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡが存在するならば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの多数のコピーが作製されるであろう。もしそれが存在しないならば、ＰＣＲは個別的な検出可能生成物を発生しないであろう。プライマーは一般に８−５０ヌクレオチド、好適には約１５−３５ヌクレオチド、より好適には１８−２８ヌクレオチドであり、それらはＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡに同一または相補的であり、従ってそれらにハイブリダイズする。好適な実施態様において、プライマーは配列番号：１の各々１５−３５ヌクレオチド、より好適には１８−２８ヌクレオチド断片である。プライマーは増幅されるべき配列にハイブリダイズしなければならない。典型的なプライマーは１８−２９ヌクレオチド長であり、一般的に５０％から６０％のＧ＋Ｃ組成を有する。全プライマーは好適にはそれがハイブリダイズしなければならない配列と相補的である。好適には、プライマー１００塩基対から２０００塩基対のＰＣＲ生成物を発生する。しかしながら、５０から１０ｋｂおよびそれ以上の生成物を発生させることが可能である。もしｍＲＮＡが鋳型として使用されるならば、プライマーはｍＲＮＡ配列にハイブリダイズしなければならない。もしｃＤＮＡが鋳型として使用されるならば、プライマーはｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしなければならない。少なくとも一つのプライマーは、ＳＴレセプタータンパク質をコード化しているｍＲＮＡに観察されない特有のヌクレオチド配列へハイブリダイズする。
【００９５】
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは標準ＰＣＲプロトコールに従ってプライマー、遊離ヌクレオチドおよび酵素と混合される。混合物は一連の温度変化を行う。もしＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡが存在するならば、即ち、もし両方のプライマーが同一の分子上の配列へハイブリダイズするならば、プライマーおよび間に挟まった相補的配列は指数的に増幅されるであろう。増幅されたＤＮＡは種々のよく知られた手段により容易に検出できる。もしＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡが存在しないならば、ＰＣＲ生成物は指数的に増幅されないであろう。従って、ＰＣＲ技術は試料中のＣＲＣＡ−１転写体を検出する非常に簡単で、直接的で信頼できる方法を提供する。
【００９６】
ＰＣＲ生成物はいくつかのよく知られた手段により検出される。増幅されたＤＮＡの存在を検出するための好適な方法は、ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動で分離し、増幅されたＤＮＡがもし存在するならば可視化するためにエチジウムブロミドでゲルを染色する方法である。好適には対照として増幅されたＤＮＡに期待されるサイズのサイズ標準がゲルで流される。
【００９７】
異常に少量のＲＮＡが回収されおよび少量のｃＤＮＡのみがそれらから発生されるようないくつかの例において、第一の反応生成物に対してＰＣＲ反応を実施することが望まれるまたは必要とされる。即ち、第一の反応によって生成された増幅ＤＮＡの量を検出するのが困難であれば、第一の増幅ＤＮＡのＤＮＡ配列の多数のコピーを作製するために第二のＰＣＲが実施できる。第二のＰＣＲ反応においてはプライマーの入れ子になった組が使用される。入れ子になったプライマーの組は最初の反応で使用された５’プライマーの下流および３’プライマーの上流の配列にハイブリダイズする。
【００９８】
本発明はＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ法の実施のためのプライマーとして有用であるオリゴヌクレオチドを含んでいる。
【００９９】
本発明に従うと、非結腸直腸試料中のＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡの存在を検出するための方法の実施に有用である診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットはＰＣＲ法の実施のためのプライマーとして有用であるオリゴヌクレオチドを含んでいる。本発明に従った診断キットは増幅されたＤＮＡの存在を検出するために使用されるゲル上で標品として流されるサイズマーカーを含んでいる容器を含んでいることが好適である。サイズマーカーはＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡの存在下でプライマーにより発生されたＤＮＡと同一のサイズである。いくつかのキットの追加の構成要素にはアッセイを実施するための説明書が含まれる。さらに、キットは随意に陽性および陰性の結果の様子を示す叙述または写真を含んでいてもよい。
【０１００】
ＰＣＲアッセイは均一化組織試料および体液試料中の細胞におけるＣＲＣＡ−１転写体を検出するために有用である。体液試料の血漿部分に対するＰＣＲがＣＲＣＡ−１転写体を検出するために使用できることが期待される。
【０１０１】
試料がＣＲＣＡ−１を発現している細胞を含んでいるかどうかを決定する別の方法は、試料から抽出されたｍＲＮＡの分岐鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析によるものである。分岐鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは米国特許第５，５９７，９０９号、米国特許第５，４３７，９７７号および米国特許第５，４３０，１３８号（各々本明細書において援用される）に記載されているように実施される。試薬はこれらの特許の教えおよびＣＲＣＡ−１転写体の配列に従って設計される。
【０１０２】
試料がＣＲＣＡ−１を発現している細胞を含んでいるかどうかを決定する別の方法は、非結腸直腸試料から抽出されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析によるものである。ノーザンブロット分析を実施するための技術は当業者にはよく知られており、Ｓａｍｎｒｏｏｋ，Ｊ．ａｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。ｍＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡの電気泳動的分離、ブロッティング、プローブ調製およびハイブリダイゼーションはすべてよく知られた技術であり、容易に利用可能な出発物質を用いて日常的に実施できる。
【０１０３】
ｍＲＮＡはポリｄＴカラムを用いて抽出され、電気泳動により分離され、例えば、ニトロセルロースペーパーに移された。単離された特異的断片または断片類から作製された標識化プローブがペーパー上に固定された相補的断片の存在の可視化に使用できる。ノーザンブロットにおいてｍＲＮＡの同定に有用なプローブはＣＲＣＡ−１転写体と相補的であるヌクレオチド配列を有する。当業者は、そのようなプローブを設計するためまたはプローブとして使用すべきＣＲＣＡ−１転写体またはそれらから発生させたｃＤＮＡを単離およびクローン化するために配列番号：１の配列情報を使用することができる。そのようなプローブは少なくとも１５ヌクレオチド、好適には３０−２００、より好適には４０−１００ヌクレオチド断片であり、全ＣＲＣＡ−１転写体であってもよい。
【０１０４】
本発明に従うと、ノーザンブロット分析により、非結腸直腸試料中のＣＲＣＡ−１転写体の存在を検出するための方法の実施に有用である診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットはｍＲＮＡへハイブリダイズするためのプローブとして有用であるオリゴヌクレオチドを含んでいる。プローブは放射性標識されているであろう。本発明に従った診断キットはゲル上で標品として流されるサイズマーカーを含んでいる容器を含んでいることが好適である。本発明に従った診断キットはプローブへハイブリダイズするであろう陽性対照を含んでいる容器を含んでいることが好適である。いくつかのキットの追加の構成要素にはアッセイを実施するための説明書が含まれる。さらに、キットは随意に陽性および陰性の結果の様子を示す叙述または写真を含んでいてもよい。
【０１０５】
ノーザンブロット分析は均一化組織試料および体液試料中の細胞におけるＣＲＣＡ−１転写体を検出するために有用である。体液試料の血漿部分に対するＰＣＲがＣＲＣＡ−１転写体を検出するために使用できることが期待される。
【０１０６】
ＣＲＣＡ−１転写体の存在を検出する別の方法はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術によるものである。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は当業者にはよく知られている。簡単には、検出可能プローブはＣＲＣＡ−１転写体のヌクレオチド配列へハイブリダイズするであろう特異的ヌクレオチド配列を含んでいる。試料からのＲＮＡまたはＲＮＡから作製されたｃＤＮＡは固定される（通常はろ紙などに）。プローブが加えられ、固定された遺伝子材料に完全に相補的であるプローブのみのハイブリダイゼーションを可能にする条件下に維持する。条件は固定された材料にプローブの一部がハイブリダイズしているプローブは洗い流されるのに十分なほど厳重に調節されている。洗浄されたフィルター上でのプローブの検出は相補的配列を示している。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドアッセイでの使用に有用なプローブは少なくとも１８ヌクレオチドの相補的ＤＮＡを持ち、ＣＲＣＡ−１転写体の完全相補的配列と同じ長さであろう。いくつかの好適な態様において、本発明のプローブは３０−２００ヌクレオチド、好適には４０−１００ヌクレオチドである。プローブは好適にはＳＴレセプターをコード化している配列に関して特有である配列を含んでいる。
【０１０８】
当業者は配列番号：１に示した配列情報を使用してＣＲＣＡ−１転写体と完全に相補的であるが、ＳＴレセプターをコード化している配列とは異なるプローブを設計することができる。ハイブリダイゼーション条件は、非完全相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンド信号を最少にするように日常的に最適化できる。いくつかの好適な態様において、プローブは完全長クローンである。プローブは少なくとも１５ヌクレオチド、好適には３０−２００、より好適には４０−１００ヌクレオチド断片であり、全ＣＲＣＡ−１転写体であってもよい。
【０１０９】
本発明はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの実施のために有用である標識されたオリゴヌクレオチドを含んでいる。即ち、それらはＣＲＣＡ−１転写体と完全に相補的であるが、ＳＴレセプター転写体とはそうではない。例えば、ｍＲＮＡ配列は異なったエキソンによりコード化されている部分を含んでいる。本発明の標識化プローブは放射性標識されたヌクレオチドで標識されているか、またはさもなくば容易に利用可能な非放射活性検出系により検出可能である。
【０１１０】
本発明に従うと、本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法の実施に有用である診断キットを組み立てることができる。そのような診断キットはＣＲＣＡ−１転写体の一部をコード化しているが、ＳＴレセプターをコード化しているコード化配列とは異なった標識オリゴヌクレオチドを含んでいる。本発明に従ったオリゴヌクレオチド診断キットの標識プローブは放射性ヌクレオチドで標識されていることが好適である。本発明に従ったオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づいた診断キットは好適には陽性および陰性対照を示すＤＮＡ試料を含んでいる。陽性対照ＤＮＡは、プローブがアッセイ条件下で核酸分子にハイブリダイズするようにキットのプローブと完全に相補的であるヌクレオチド配列を持つ核酸分子を含むものである。陰性対照ＤＮＡ試料は、少なくとも一つの核酸分子を含んでおり、その核酸分子はキットのプローブの配列と部分的に相補的である。アッセイ条件下、プローブは陰性対照ＤＮＡ試料とはハイブリダイズしないであろう。いくつかのキットの追加の構成要素にはアッセイを実施するための説明書が含まれる。さらに、キットは随意に陽性および陰性の結果の様子を示す叙述または写真を含んでいてもよい。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション技術は、ホモジナイズした組織試料中のＣＲＣＡ−１転写体及び体液試料中の細胞の検出に有用である。流体試料の血漿部分に対するＰＣＲをＣＲＣＡ−１転写体の検出に利用可能であることが意図されている。
【０１１２】
本発明は、組織試料を評価して転移のレベルを決定するためのイン・ビトロキットに関し、かつそれを実施するのに有用な試薬及び組成物に関する。
【０１１３】
本発明の幾つかの態様においては、固有層の一部を含む組織試料を、切除又は結腸鏡検査を含む結腸腫瘍を除去するための手術を受けている、又はそれから回復した個人から単離することができる。この試料を分析してＣＲＣＡ−１転写体の存在又は非存在を見極める。免疫組織化学検定のような技術を行って１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物が組織試料の細胞に存在するかどうか（これは転移性の移動を示す）を決定することができる。本発明の幾つかの態様においては、ＣＲＣＡ−１転写体又は１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在又は非存在を検出することにより組織試料を分析してＣＲＣＡ−１が組織試料の細胞で発現しているかどうか（これは転移性の移動を示す）を見極める。ＣＲＣＡ−１転写体又はそれらから生じるｃＤＮＡの存在はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は免疫組織化学のような技術を用いて決定することができる。
【０１１４】
本発明は、腫瘍試料を評価してそれらの起源が結腸であるのかどうかを決定するためのイン・ビトロキット、並びにそれを実施するのに有用な試薬及び組成物に関する。本発明の幾つかの態様においては、腫瘍試料を、結腸の腫瘍を除去する手術を受けている、又はそれから回復している個人、他の臓器の腫瘍、あるいは生検材料から単離することができる。この腫瘍試料を分析してＣＲＣＡ−１転写体の存在又は非存在を見極める。免疫組織化学検定のような技術を行って１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物がその腫瘍試料の細胞中に存在するかどうか（これは結腸起源であることを示す）を決定することができる。あるいは、本発明の幾つかの態様においては、ＣＲＣＡ−１転写体又は１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在又は非存在を検出することにより管腔組織を分析してＣＲＣＡ−１がその腫瘍試料の細胞中で発現しているかどうか（これは結腸起源であることを示す）を見極める。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕＳＴ結合検定のような技術を用いてＳＴ受容体タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はそれらから生じるｃＤＮＡの存在を決定することができる。
【０１１５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術は当業者に公知である。簡単に述べると、細胞を固定し、特定のヌクレオチド配列を含む検出可能なプローブを固定した細胞に添加する。それらの細胞が相補的ヌクレオチド配列を含む場合、検出可能であるプローブがそれらにハイブリダイズする。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドにおいて有用なプローブは少なくとも１８ヌクレオチドの相補的ＤＮＡを含み、ＣＲＣＡ−１転写体に対する完全な相補的配列のような大きなものであってもよい。幾つかの好ましい態様においては、本発明のプローブは３０−２００ヌクレオチド、好ましくは４０−１００ヌクレオチドである。これらのプローブはＳＴ受容体をコードするものに独特の配列を含む。
【０１１７】
当業者は、配列番号１及びヒトＳＴ受容体ｍＲＮＡの既知配列に示される配列情報を用いて、ＣＲＣＡ−１を発現する細胞を同定するｉｎ  ｓｉｔｅハイブリダイゼーション技術において有用なプローブを設計することができる。プローブは、好ましくは、ＣＲＣＡ−１転写体に相当するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、ＳＴ受容体をコードする配列に対する完全に相補的ではないハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションによる背景信号を最小に止めるように定型的に最適化することができる。プローブは、好ましくは、完全長ＣＲＣＡ−１転写体にハイブリダイズする。プローブは少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０−２００、より好ましくは４０−１００ヌクレオチドの断片であり、ＣＲＣＡ転写体であっても、より好ましくはＣＲＣＡ−１転写体の１８−２８ヌクレオチドの断片であってもよい。
【０１１８】
これらのプローブは完全に相補的であり、部分的に相補的な配列にはうまくハイブリダイズしない。本発明によるｉｎ  ｓｉｔｅハイブリダイゼーションのためには、これらのプローブが蛍光によって検出可能であることが好ましい。一般的な手順は、プローブをビオチン修飾ヌクレオチドで標識した後、蛍光タグ付けされたアビジンで検出することである。これにより、必ずしもプローブそれ自体を蛍光で標識することなく、後に蛍光マーカーで検出することができる。
【０１１９】
本発明は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実施する上でプローブとして有用である標識オリゴヌクレオチドを含む。すなわち、それらはｍＲＮＡ配列と完全に相補的ではあるが、ゲノム配列又はＳＴ受容体ｍＲＮＡではない。例えば、そのｍＲＮＡ配列は異なるエキソンによってコードされる部分を含む。本発明の標識プローブは放射標識ヌクレオチドで標識されており、又は容易に利用可能な非放射性検出システムによって別の方法で検出可能である。
【０１２０】
本発明は、ＣＲＣＡ−１を発現する細胞を同定するｉｎ  ｓｉｔｅハイブリダイゼーションに有用なプローブに関する。
【０１２１】
細胞を固定し、これらのプローブをその遺伝材料に添加する。プローブはその試料中に存在する相補的核酸配列にハイブリダイズする。蛍光顕微鏡を用いて、これらのプローブをそれらの蛍光マーカーによって可視化することができる。
【０１２２】
本発明によると、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を実施するのに有用である診断キットを組み立てることができ、それはｍＲＮＡ配列と完全に相補的ではあるがゲノム配列ではない。例えば、そのｍＲＮＡ配列は異なるエキソン配列を含む。本発明によるｉｎ  ｓｉｔｕ診断キットの標識プローブは蛍光マーカーで標識されていることが好ましい。
【０１２３】
当業者は、固定された細胞を分析して、結腸癌細胞の転移性の移動のレベルを特徴付けることができる。結腸派生細胞を標識することで分析の改善が見込まれる。
【０１２４】
免疫組織化学技術を、１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物を含む細胞を同定し、それを本質的に染色するのに用いることができる。このような“染色”は転移性の移動を考慮したものである。上述のもののような抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を固定した細胞と接触させると、細胞中に存在するＣＲＣＡ−１翻訳産生物がそれらの抗体と反応する。これらの抗体は検出可能に標識され、又は標識第２抗体もしくはプロテインＡを用いて細胞を染色して検出する。
【０１２５】
腫瘍切片を評価するためのここに記載される技術は、リンパ節に加えて他の組織の試料の組織切片を分析して結腸腫瘍細胞の存在を見極めるのに用いることもできる。これらの試料を調製し、“染色”してＣＲＣＡ−１の発現を検出することができる。
【０１２６】
免疫検定法を結腸癌転移を患う個人の同定に用いることができ、これは、非結腸組織又は体液の試料中の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を、そのようなＣＲＣＡ−１翻訳産生物への露出に応答して産生される抗体を用いて検出することにより行う。さらに、免疫検定法を結腸癌を患う個人の同定に用いることができ、これは、腫瘍試料中の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を、そのようなＣＲＣＡ−１翻訳産生物への露出に応答して産生される抗体を用いて検出することにより行う。
【０１２７】
これらの抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、好ましくは、ヒト細胞において産生される１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物に対して生じたものである。免疫検定は公知であり、それらの設計は当業者が定型的に行うことができる。当業者は、幾つかのＣＲＣＡ−１翻訳産生物のうちの１つに特異的に結合し、かつ本発明の方法及びキットにおいて有用であるモノクローナル抗体を、標準技術及び容易に入手可能な出発物質を用いて生成することができる。モノクローナル抗体を生成するための技術は Harlow, E.及び D. Lane, (1988) ANTIBODIES:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor NY に概述されており、これは参照することによりここに組み込まれ、ハイブリドーマ及び標的タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の産生についての詳細な指示を提供する。１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物に特異的に結合するＦＡｂ及びＦ（Ａｂ）2を抗体の代わりに含めることは本発明の範囲内にある。
【０１２８】
簡単に述べると、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物をマウスに注射する。そのマウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離して不死化マウス細胞と融合させる。これらのハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマを培養し、抗体を分泌する細胞選択する。これらの抗体を分析し、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物に特異的に結合することが見出された場合には、それらを産生するハイブリドーマを培養し、抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物特異的抗体の継続的な供給源を生成する。
【０１２９】
本発明は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物への露出に応答して産生される抗体に関する。これらの抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、好ましくは、ヒト細胞において産生されるＣＲＣＡ−１翻訳産生物に対して生じたものである。
【０１３０】
試験試料中のタンパク質の存在を検出する手段は定型的なものであり、当業者はタンパク質又は抗体の存在又は非存在を公知の方法を用いて検出することができる。タンパク質の存在を検出する公知の方法の１つは免疫検定である。当業者は、免疫検定を実施して試料中のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を検出する多くの方法を容易に理解することができる。
【０１３１】
幾つかの態様によると、免疫検定は、試料中のタンパク質をプラスチック表面のような固相支持体に結合させることを含む。次に、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物のいずれかに選択的に結合する検出可能な抗体を添加する。検出可能な抗体が検出されることは、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を示す。検出可能な抗体は標識抗体であっても非標識抗体であってもよい。非標識抗体は、第１抗体に特異的に結合する第２の標識抗体、又は標識されたプロテインＡ、抗体と複合体を形成するタンパク質、を用いて検出することができる第２の非標識抗体を用いて検出することができる。様々な免疫検定法が Immunoassays for the 80's, A. Vollerら編, University Park, 1981 に記載されており、これは参照することによりここに組み込まれる。
【０１３２】
固相支持体を試験試料と接触させる簡単な免疫検定を行うことができる。試験試料中に存在するあらゆるタンパク質がその固相支持体に結合し、特異的で検出可能な抗体調製品によって検出することができる。このような技術は、ドット・ブロット、ウェスタンブロット及び他のそのような類似の検定の本質である。
【０１３３】
他の免疫検定はより複雑なものであり得るが、実際に優れた結果をもたらす。典型的かつ好ましい免疫測定的検定（immunometric assays）には、固相支持体に結合している第１抗タンパク質抗体を試験試料と接触させる、タンパク質を検出するための“フォワード”検定が含まれる。適切なインキュベーション期間の後、固相支持体を洗浄して非結合タンパク質を除去する。次に、第１抗体が認識しない特定のタンパク質の一部に特異的である第２の異なる抗体を添加する。この第２抗体は好ましくは検出可能である。この検出可能な抗体を、第１抗体を介して固相支持体に結合する特定のタンパク質と複合体を形成させる第２のインキュベーション期間の後、固相支持体の２回目の洗浄を行って非結合検出可能抗体を除去する。あるいは、第２抗体は検出可能でなくてもよい。この場合、第２抗体に結合する第３の検出可能な抗体を系に添加する。この型の“フォワード・サンドイッチ”検定は結合が生じるかどうかを決定する単純なイエス／ノー検定であってもよく、又は検出可能な抗体の量を対照において得られるものと比較することによって定量的に行うこともできる。このような“２部位”又は“サンドイッチ”検定は Wide, Radioimmune Assay Method, Kirkham編, E.& S.Livengstone, Edinburgh, 1970, pp.199-206 に記載されており、これは参照することによりここに組み込まれる。
【０１３４】
他の型の免疫測定的検定は、いわゆる“同時”及び“リバース”検定である。同時検定は、固相支持体に結合する第１抗体、第２の検出可能な抗体及び試験試料を同時に添加する１つのインキュベーション工程を含む。インキュベーションが完了した後、固相支持体を洗浄して非結合タンパク質を除去する。つぎに、固相支持体と会合している検出可能な抗体の存在を通常の“フォワード・サンドイッチ”検定と同様に検出する。この同時検定は、同様の方法で、試験試料中の抗体の検出に適合させることもできる。
【０１３５】
“リバース”検定は、検出可能な抗体の溶液を試験試料に段階的に添加し、これにインキュベーション期間が続き、さらなるインキュベーション期間の後に固相支持体に結合した抗体を添加することを含む。固相支持体を通常の様式で洗浄し、非結合タンパク質／抗体複合体及び未反応の検出可能な抗体を除去する。その後、固相支持体と会合した検出可能な抗体の決定を、“同時”及び“フォワード”検定と同様に決定する。このリバース検定は、同様の方法で、試験試料中の抗体の検出に適合させることもできる。
【０１３６】
免疫測定的検定の第１成分をニトロセルロース又はタンパク質を固定可能な他の固相支持体に加えることができる。試験試料中のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を決定するための第１成分は抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体である。“固相支持体”又は“支持体”が意図するところはタンパク質を結合可能なあらゆる物質である。公知の固相支持体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁鉄鉱が含まれる。支持体の性質は、本発明の目的上は、ある程度可溶性であっても不溶性であってもよい。支持体の形状は、ビーズのような球状であっても、試験管の内面又はロッドの外面のような円筒状であってもよい。あるいは、その表面はシート、試験片のように平坦であってもよい。当業者にはタンパク質を結合させるための多くの他の適切な“固相支持体”が公知であり、又は定型的な実験によってそれを確認することができる。好ましい固相支持体は９６ウェルマイクロタイタープレートである。
【０１３７】
１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を検出するには、検出可能な抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を用いる。抗体を検出するための幾つかの方法が公知である。
【０１３８】
抗体を検出可能に標識することができる方法の１つは、抗体を酵素に連結させ、続いてそれらの抗体を酵素免疫検定（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、例えば、捕獲ＥＬＩＳＡ（capture ELISA）において用いることによるものである。酵素は、続いてその基質に対して露出されたとき、その基質と反応し、例えば分光光度的、蛍光的又は視覚的手段によって検出することができる化学的部分を生成する。抗体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素にはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、同様に用いることができる他の酵素を容易に認識するであろう。
【０１３９】
酵素を検出可能に標識することができる他の方法は、放射性同位体により、続いてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において用いることである（例えば、Work. T.S.ら, Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holloand Publishing, N.Y., 1978 を参照、これは参照することによりここに組み込まれる）。放射性同位体はガンマカウンター又はシンチレーションカウンターの使用のような手段により、又はオートラジオグラフィーによって検出することができる。本発明の目的上特に有用である同位体は3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、及び14Ｃである。好ましくは、同位体は125Ｉである。当業者は、同様に用いることができる他の放射性同位体を容易に認識するであろう。
【０１４０】
抗体を蛍光性化合物で標識することも可能である。蛍光標識抗体を適正な波長を有する光に晒すと、その存在をその蛍光によって検出することができる。最も普通に用いられる蛍光標識化合物のうちにあるものは、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（o-phthaldehyde）及びフルオレサミンである。当業者は、同様に用いることができる他の蛍光性化合物を容易に認識するであろう。
【０１４１】
抗体は、蛍光放射性金属、例えば、125Ｅｕ又はランタニド系列の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート群を用いてタンパク質特異的抗体に結合させることができる。当業者は、同様に用いることができる他の蛍光放射性金属はもちろん、他の金属キレート群も容易に認識するであろう。
【０１４２】
抗体は、化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することもできる。化学発光標識抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。当業者は、同様に用いることができる他の化学発光化合物を容易に認識するであろう。
【０１４３】
同様に、生物発光化合物を抗体の標識に用いることができる。生物発光は生物学的な系において見出される型の化学発光であり、そこでは触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的に重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。当業者は、同様に用いることができる他の生物発光化合物を容易に認識するであろう。
【０１４４】
タンパク質特異的抗体、断片又は誘導体の検出は、例えば検出可能な標識が放射性ガンマ放射体である場合には、シンチレーションカウンターによって達成することができる。あるいは、例えば標識が蛍光物質である場合には、蛍光計によって検出を達成することができる。酵素標識の場合には、その酵素の基質を用いる比色法によって検出を達成することができる。また、同様に調製した標準との比較において、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって検出を達成することもできる。当業者は、同様に用いることができる他の適切な検出方法を容易に認識するであろう。
【０１４５】
所定のロットの抗体の結合活性は公知の方法に従って決定することができる。当業者は、定型的な実験を用いることにより、各々の決定についての操作上の、及び最適な検定条件を決定することができるであろう。
【０１４６】
試験検定と平行して実施される検定に既知量の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物を加える陽性対照及びＣＲＣＡ−１翻訳産生物を添加しない陰性対照を実施することができる。当業者は、適切な対照を実施するのに必要な知識を有するであろう。加えて、このキットは検定を実施するための取扱説明書を含んでいてもよい。加えて、このキットは、陽性及び陰性の結果の外見を表す図又は写真を含んでいてもよい。
【０１４７】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物は陽性対照用の試薬として定型的に生成することができる。当業者は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物を生成させて単離することができる異なる方法を認めるであろう。
【０１４８】
抗体組成物はタンパク質の検出に必要な抗体（１種類もしくは複数種類）を指す。例えば、試験試料中のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の検出に用いられる抗体組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物に結合する第１抗体はもちろん、それぞれ第１又は第２抗体に結合する第２又は第３の検出可能な抗体を含む。
【０１４９】
試験試料をＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在について試験するのに、以下に記載されるもののような標準的な免疫測定的検定を行うことができる。ＣＲＣＡ−１翻訳産生物の特定の部分を認識する第１抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を９６ウェルマイクロタイタープレートの特定容積のバッファに加える。このプレートを結合が生じるのに十分な期間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して非結合抗体を除去する。次に、このプレートをＰＢＳ／ＢＳＡでブロックして試料タンパク質がマイクロタイタープレートに非特異的に結合するのを防止する。続いて試験試料をウェルに添加し、そのプレートを結合が生じるのに十分な期間インキュベートする。ウェルをＰＢＳで洗浄して非結合タンパク質を除去する。第１抗体が認識しないＣＲＣＡ−１翻訳産生物の一部を認識する標識抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体をウェルに添加する。プレートを結合が生じるのに十分な期間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄して非結合標識抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を除去する。続いて、結合した標識抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体の量を標準的な技術によって決定する。
【０１５０】
試験試料中のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の検出に有用であるキットは、抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を収容する容器及び対照を収容する容器（１つもしくは複数）を含む。対照は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物を含まない１つの対照試料及び／又はＣＲＣＡ−１翻訳産生物を含む別の対照試料を含む。このキットにおいて用いられる抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体は、検出可能に標識されているもののように検出可能である。検出可能な抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体が標識されていない場合、例えば別の容器内の幾つかのキットで提供することもできる、第２抗体又はプロテインＡによって検出することができる。幾つかのキットにおけるさらなる構成要素には、固相支持体、バッファ、及び検定を実施するための取扱説明書が含まれる。加えて、このキットは、陽性及び陰性の結果の外見を表す図又は写真を含んでいてもよい。
【０１５１】
この免疫検定はホモジナイズした組織試料及び流体試料中の血漿部分又は細胞を含む体液における１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の検出に有用である。
【０１５２】
ウェスタンブロットを結腸癌転移を患う個人を同定する方法において用いることができ、これは、非結腸組織又は体液の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を検出することにより行う。ウェスタンブロットは、癌を患う個人に由来する腫瘍試料中に１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の存在を検出し、その腫瘍が結腸起源であることを同定し、及び／又は確認するのに用いることもできる。ウェスタンブロットは、試料中に存在するＣＲＣＡ−１翻訳産生物に結合させ、したがって試料中の受容体の存在を示すのに検出可能な抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を用いる。
【０１５３】
Sambrook, J.ら, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY （これは参照することによりここに組み込まれる）に記載されているウェスタンブロット技術は免疫検定に類似しており、その本質的な相違は、試料を抗体に晒す前に試料中のタンパク質をゲル電気泳動によって分離し、次に分離したタンパク質を抗体で精査することである。幾つかの好ましい態様においては、マトリックスがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルマトリックスであり、抗体で精査する前にマトリックス中の分離されたタンパク質を濾紙のような担体に移す。上述の抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体はウェスタンブロット法において有用である。
【０１５４】
一般には、試料をホモジナイズし、トリトン−Ｘのような洗浄剤を用いて細胞を溶解する。次に、その物質を Sambrook, J.ら, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY における標準技術によって分離する。
【０１５５】
ウェスタンブロットによる試験試料中の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物の検出に有用であるキットは、抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を収容する容器及び対照を収容する容器（１つもしくは複数）を含む。対照は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物を含まない１つの対照試料及び／又は１種類上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物を含む別の対照試料を含む。このキットにおいて用いられる抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体は、検出可能に標識されているもののように検出可能である。検出可能な抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体が標識されていない場合、例えば別の容器内の幾つかのキットで提供することもできる、第２抗体又はプロテインＡによって検出することができる。幾つかのキットにおけるさらなる構成要素には、検定を実施するための取扱説明書が含まれる。加えて、このキットは、陽性及び陰性の結果の外見を表す図又は写真を含んでいてもよい。
【０１５６】
ウェスタンブロットはホモジナイズされた組織試料及び流体試料中の血漿部分又は細胞を含む体液試料中の１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物を検出するのに有用である。
【０１５７】
イン・ビボ画像形成及び治療
本発明の幾つかの態様によると、個人における結腸腫瘍を検出し、画像形成し、又は治療するための組成物及びイン・ビボ法が提供される。
【０１５８】
本発明の複合化組成物は腸内壁を覆う細胞を標的とするの有用であり、これにはそのような細胞に由来する癌細胞、特にはそのような細胞に由来する転移癌細胞が含まれる。
【０１５９】
本発明の複合化組成物を腸管外部に投与した場合、例えば、循環系内に投与した場合、それらは腸管内部を覆う細胞とは隔離されたままとなり、転移結腸細胞のような腸管に由来する腸管外部の細胞のみに結合する。複合化組成物は非結腸由来細胞には結合しない。したがって、腸管外部に投与された複合化組成物の活性部分は転移結腸細胞のような腸管に由来する細胞に送達されるが、他のいかなる細胞へも送達されることはない。
【０１６０】
本発明の治療用及び診断用医薬組成物は転移性疾患を特異的に標的とする複合化合物を含む。これらの複合化合物は１種類以上のＣＲＣＡ−１翻訳産生物に結合する部分を含み、これらは、他の組織の細胞はそのような翻訳産生物を有することがないため、腸管の細胞を除く身体の正常組織の細胞には結合しない。さらに、本発明によると、このＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分はＳＴ受容体には結合しない。
【０１６１】
正常な結腸細胞及び局在化する結腸癌細胞とは異なり、転移結腸癌細胞は腸管外部に投与された物質、例えば、循環系に投与された物質に接近可能である。正常組織内の唯一のＣＲＣＡ−１翻訳産生物は腸粘膜細胞の頂端膜に存在し、したがって、腸の粘膜障壁によって腸管外部に投与された標的指向癌化学療法剤及び画像形成剤から有効に隔離される。したがって、転移結腸細胞を本発明の複合化合物の標的とすることが、そのような化合物を腸管外部に導入することによって、例えば、複合化合物を含む医薬組成物を循環系に投与することによって可能である。
【０１６２】
当業者は、結腸癌及び転移結腸細胞を患っていることが疑われる個人を見分けることが可能である。結腸癌と診断された個人においては、転移を疑い、転移細胞の根絶を積極的に試みることが標準的な治療である。本発明は、転移を画像形成し、それによってより決定的に診断するための医薬組成物及び方法を提供する。さらに、本発明は転移結腸癌細胞を特異的に標的とし、かつそれらを除去するための、治療薬を含む医薬組成物及び方法を提供する。さらに、本発明は、結腸癌細胞を特異的に除去するための、治療薬を含む医薬組成物及び方法を提供する。
【０１６３】
本発明の複合化組成物を含む医薬組成物は、局在化結腸腫瘍、すなわち、一次もしくは非転移性結腸腫瘍を患う個人の診断又は治療に、これらの腫瘍が粘膜の下層をなす基底膜からそれらが接近している多量の血液供給源が存在する粘膜下組織に侵入している場合に用いることができる。粘膜下組織への侵入は粘膜障壁を回避しており、循環系に導入された複合化組成物のこれらの腫瘍と相互作用する能力をもたらす。
【０１６４】
本発明は複合化組成物中のＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分の使用を頼みとする。このＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分は本質的にはＣＲＣＡ−１翻訳産生物に対するリガンドとして作用する複合化組成物の一部であり、したがって、それに特異的に結合する。また、複合化組成物は、このＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分と会合する活性部分をも含む；この活性部分は細胞を画像形成し、標的化し、中和し、又は殺すのに有用な活性剤である。
【０１６５】
本発明によると、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分は複合化組成物のＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンド部分である。幾つかの態様においては、このＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは抗体である。
【０１６６】
幾つかの好ましい態様においては、複合化合物は抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を含むＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分を含有する。
【０１６７】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分として用いられるＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは可能な限り小さいものであることが好ましい。したがって、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは非ペプチド小分子又は小ペプチドであることが好ましく、好ましくは２５個未満のアミノ酸、より好ましくは２０個未満のアミノ酸である。幾つかの態様においては、複合化組成物のＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分を構成するＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは１５個未満のアミノ酸である。１０個未満のアミノ酸を含むＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合ペプチド及び５個未満のアミノ酸のＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合ペプチドを本発明によるＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分として用いることができる。ＣＲＣＡ−１翻訳産生物に特異的に結合する抗体のような分子を含むがこれに限定されるものではない、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分として役立つより大きな分子を含めることは、本発明の範囲内にある。
【０１６８】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分として有用なＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは、様々な公知の組み合わせライブラリースクリーニング技術、例えば、本明細書の実施例１に説明されるものを用いて同定することができる。
【０１６９】
ペプチド及び非ペプチド組成物の両者を試験してそれらがＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドであるのかどうかを決定するのに、又は複合化組成物を試験してそれらがＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合活性を有するかどうかを決定するのに検定を用いることができる。ＣＲＣＡ−１翻訳産生物に特異的に結合するような組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物に結合することが知られる抗体を用いる競合結合検定によって同定することができる。この競合結合検定は薬理学における標準的な技術であり、容易に入手可能な出発物質を用いて当業者が容易に実施することができる。
【０１７０】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物は合成により、もしくは組換えにより産生させることができ、又は天然資源から単離することができる。
【０１７１】
例として固相合成を用いると、保護もしくは誘導体化アミノ酸をその保護されていないカルボキシル又はアミノ基を介して不活性固体支持体に結合させる。次に、アミノ又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合して既に固体支持体に結合している残基と反応させる。次に、この新たに加えられたアミノ酸残基からアミノ又はカルボキシル基の保護基を除去した後、次の（適切に保護された）アミノ酸を添加し、以下同様にする。全ての所望のアミノ酸を適切な配列で連結した後、残留するあらゆる末端及び側鎖保護基（及び固体支持体）を連続的に、又は同時に除去して最終ペプチドを得る。本発明のペプチドは、好ましくは、ベンジル化又はメチルベンジル化アミノ酸を欠いている。このような保護基部分は合成の過程では用いることができるが、それらのペプチドを用いる前に除去される。他所で記載されるように、分子内連結を形成して立体配座を制限するためにさらなる反応が必要となることがある。
【０１７２】
ペプチドであるＣＲＣＡ−１翻訳産生物及び複合可塑性物又はそれらの一部は組換えＤＮＡ技術によっても調製することができる。所望のペプチドをコードする適切なＤＮＡ配列を供給することで、当該技術分野において現在公知の組換え技術を用いてペプチドを産生することができる。コーディング配列は天然資源から得ることができ、又は広く入手可能な出発物質を用いて定型的な方法により合成し、もしくは他の方法で構築することができる。コーディングＤＮＡを合成によって調製する場合、そのＤＮＡを発現させようとする目的の宿主の既知コドン優先度を利用することができる。
【０１７３】
天然に生じるＣＲＣＡ−１翻訳産生物を産生するのに、当業者は、公知技術を用いて、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物をコードするＤＮＡ分子を得、そのＤＮＡ分子を、例えば本明細書に記載されるもののような公知の発現系において用いるための、市販の発現ベクターに挿入することができる。
【０１７４】
例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Invitrogen、San Diego、CA）は大腸菌における組換え産生に用いることができる。市販のプラスミドｐＹＥ３２（Invetrogen、San Diego、CA）は酵母のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株における産生に用いることができる。市販のＭａｘＢａｃTM（Invitrogen、San Diego、CA）完全バキュロウイルス発現系は昆虫細胞における産生に用いることができる。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  Ｉ（Invitrogen、San Diego、CA）はチャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物細胞における産生に用いることができる。
【０１７５】
当業者はこれらの、又は他の市販の発現ベクター及び発現系を用いることができ、又は公知の方法及び容易に入手可能な出発物質を用いてベクターを生成することができる。必須の制御配列、例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル、並びに好ましくは、エンハンサーを含む発現系は容易に入手可能であり、様々な宿主について当該技術分野において公知である。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Habor Press (1989)を参照。したがって、所望のタンパク質を原核生物及び真核生物系の両者において調製することができ、そのタンパク質の処理形態のスペクトラムが生じる。
【０１７６】
枯草菌及びシュードモナスのような他の系も有用であるが、最も一般に用いられる原核生物系は大腸菌のままである。原核生物系に対して適切な制御配列には構成的及び誘発性プロモーターの両者が含まれ、これにはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター、ラムダファージＰ１プロモーターが含まれる。一般には、外来性タンパク質をこれらの宿主において融合もしくは成熟タンパク質のいずれかとして産生させることができる。所望の配列が成熟タンパク質として産生される場合、産生された配列はメチオニンが先頭にあってもよく、これは必ずしも効率的に除去されるものではない。したがって、本明細書で請求されるペプチド及びタンパク質は、細菌内で産生される場合、Ｎ末端Ｍｅｔが先頭にあってもよい。さらに、ペプチドのコーディング配列の先頭に作動可能なシグナルペプチドがあり、それがタンパク質の分泌をもたらす構築体を作製することができる。原核生物宿主においてこの方法で産生された場合、シグナル配列は分泌の際に除去される。
【０１７７】
広く多様な真核生物宿主も現在組換え外来性タンパク質の産生に利用可能である。細菌と同様に、真核生物宿主を所望のタンパク質を直接産生する発現系で形質転換することができるが、より一般的には、タンパク質の分泌を達成するためにシグナル配列が付与される。真核生物系は、高等生物のタンパク質をコードするゲノム配列に生じることがあるイントロンを処理することができるというさらなる利点を有する。また、真核生物系は、例えば、特定のアミノ酸のグリコシル化、カルボキシ末端アミド化、酸化又は誘導体化、立体配座制御等を生じる様々な処理機構も提供する。
【０１７８】
一般に用いられる真核生物系には酵母、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、及び高等植物の細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの宿主型の各々における使用に適合し、かつ作動可能であることに加えて、終始配列及びエンハンサーである適切なプロモーター、例えば、バキュロウイルス多角体プロモーターを利用することができる。上述のように、プロモーターは構成的であっても誘発性であってもよい。例えば、哺乳動物系においては、重金属イオンを添加することによりマウス・メタロチオネン（metallothionene）プロモーターを誘発することができる。
【０１７９】
所望の宿主に適切な発現系の構築についての詳細は当業者に公知である。タンパク質の組換え産生のためには、それをコードするＤＮＡを選り抜きの発現ベクターに適切にライゲートした後、それを用いて適合する宿主を形質転換し、次にそれを外来性遺伝子の発現が生じる条件下で培養及び維持する。このようにして産生された本発明のタンパク質はこの培養物から、適切かつ当業者に公知の通り、細胞を溶解することにより、又は培養培地から回収する。
【０１８０】
当業者は、公知の技術を用いて、産生されたタンパク質を単離することができる。
【０１８１】
本発明によると、活性部分は治療薬又は画像形成剤であり得る。当業者は、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドで転移結腸細胞を特異的に標的とすることが可能であり、そのようなリガンドを多くの異なる活性剤と結合させることができる利点を容易に認識することができる。
【０１８２】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分に結合させたときに転移結腸細胞に特異的に送達される活性部分として有用な化学療法剤は、典型的には、化学合成によって生成される小さな化学的実体である。化学療法剤には細胞毒性及び細胞成長抑止剤が含まれる。化学療法剤には、細胞に対する他の効果、例えば形質転換状態から分化状態への逆転、を有するもの、又は細胞の複製を阻害するものが含まれうる。化学療法剤の例には通常の細胞毒性又は細胞成長抑止剤、例えば：メトトレキセート（アメトプテリン）、ドキソルビシン（アドリマイシン）、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、及び他のナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド）、ｃｉｓ−白金（cis-platinum）、ビンデシン（及び他のビンカアルカロイド）、マイトマイシン及びブレオマイシンが含まれる。他の化学療法剤には：ピューロチオニン（大麦粉オリゴペプチド）、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体及びトレニモンが含まれる。
【０１８３】
毒素は活性部分として有用である。毒素をＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分に結合させた場合、その複合化組成物はＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分として転移結腸細胞に特定基に送達され、毒素部分がその細胞を殺す。毒素は、一般には、細菌、植物等を含む様々な生物の複合毒性産生物である。毒素の例には：リシン、リシンＡ鎖（リシン毒素）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens）ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰＲ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アブリン、アブリンＡ鎖（アブリン毒素）、コブラ毒因子（ＣＶＦ）、ゲロニン（gelonin）（ＧＥＬ）、サポリン（saporin）（ＳＡＰ）、モデクシン（modeccin）、ビスクミン（viscumin）及びボルケンシン（volkesin）が含まれるが、これらに限定されるものではない。上に論じられるように、タンパク質毒素をＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合ペプチドと共に用いる場合には、複合化組成物を組み換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。簡単に述べると、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンド及び毒素の両者をキメラ遺伝子上にコードする組換えＤＮＡ分子を構築することができる。このキメラ遺伝子が発現すると、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分及び活性部分を含む融合タンパク質が産生される。タンパク質毒素は、非ペプチジル結合を介してＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合ペプチドと複合化合物を形成するのにも有用である。
【０１８４】
加えて、活性剤を癌の治療に利用するための他のアプローチが存在する。例えば、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分及び活性酵素である活性部分を含む複合化組成物を生成することができる。このＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分はその複合化組成物を腫瘍細胞に特異的に局在化させる。酵素によって活性薬物に変換することが可能な不活性プロドラッグを患者に投与する。このプロドラッグは腫瘍に局在化する酵素によってのみ活性薬物に変換される。酵素／プロドラッグ対の例には、アルカリホスファターゼ／エトポシドホスフェートが含まれる。このような場合、アルカリホスファターゼをＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合リガンドに結合させる。その複合化合物を投与し、転移細胞の部位に局在化させる。エトポシドホスフェート（プロドラッグ）と接触すると直ちにエトポシドホスフェートは化学療法剤であるエトポシドに変換され、これが癌細胞によって取り込まれる。
【０１８５】
放射線増感剤は放射線に対する細胞の感受性を高める物質である。放射線増感剤の例にはニトロイミダゾール、メトロニダゾール、及びミソニダゾールが含まれる（DeVita, V.T.Jr. in Harrison's Principles of Internal Medicine, p.68, McGraw-Hill Book Co., N.Y. 1983 を参照、これは参照することによりここに組み込まれる）。放射線増感剤を活性部分として含む複合化合物を投与し、転移細胞の部位に局在化させる。その個人を放射線に晒すと、放射線増感剤が“励起”し、細胞の死を引き起こす。
【０１８６】
放射性核種を放射線治療又は画像形成法に有用な医薬組成物において用いることができる。
【０１８７】
放射線治療において毒素として有用な放射性核種の例には：47Ｓｃ、67Ｃｕ、90Ｙ、109Ｐｄ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、199Ａｕ、211Ａｔ、212Ｐｂ及び212Ｂが含まれる。当業者によって用いられている他の放射性核種には：32Ｐ及び33Ｐ、71Ｇｅ、77Ａｓ、103Ｐｂ、105Ｒｈ、111Ａｇ、119Ｓｂ、121Ｓｎ、131Ｃｓ、143Ｐｒ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、191Ｏｓ、193ＭＰｔ、197Ｈｇ、全てのベータ陰性及び／又はオージュ（auger）放射体が含まれる。幾つかの好ましい放射性核種には：90Ｙ、131Ｉ211Ａｔ及び212Ｐｂ／212Ｂｉが含まれる。
【０１８８】
本発明によると、活性部分は画像形成剤であってもよい。画像形成剤は有用な診断法であることに加えて、転移細胞の位置を同定するのに用いられる方法である。画像形成は当業者に公知の多くの手順によって実施することができ、このような手順において有用な適切な画像形成剤を公知手段によってＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドに結合させることができる。画像形成は、例えば、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）又はコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）によって実施することができる。最も一般に用いられる放射性核種画像形成剤には放射性ヨウ素及びインジウムが含まれる。ＣＴスキャンによる画像形成では鉄キレートのような重金属を用いることができる。ＭＲＩ走査ではガドリニウム又はマンガンのキレートを用いることができる。加えて、酸素、窒素、鉄、炭素、又はガリウムのポジトロン放射体を用いてポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が可能である。画像形成法において有用な放射性核種の例には：43Ｋ、52Ｆｅ、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、77Ｂｒ、81Ｒｂ／81MＫｒ、87MＳｒ、99MＴｃ、111Ｉｎ、113MＩｎ、123Ｉ、125Ｉ、127Ｃｓ、129Ｃｓ、131Ｉ、132Ｉ、197Ｈｇ、203Ｐｂ及び206Ｂｉが含まれる。
【０１８９】
複合化組成物は非免疫原性であるか、又は非常に低いレベルで免疫原性であることが好ましい。したがって、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分は小さく、免疫原性に乏しい、もしくは非免疫原性のペプチド又は非ペプチドであることが好ましい。あるいは、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分はヒト化もしくは霊長類化抗体又はヒト抗体であってもよい。
【０１９０】
ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドは、当業者により過度の実験なしに容易に実施される様々な公知の技術によって活性剤に結合される。ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドを活性剤に結合させるのに用いられる技術はＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンド及び活性剤の分子の性質に依存する。ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドと活性剤とを結合させて単一の分子を形成した後、その結合した分子がそれらの部分の活性を保持することを保証するために検定を行うことができる。上述の競合結合検定を、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物結合部分が複合化合物としてその結合活性を保持することを確認するのに用いることができる。同様に、それぞれの型の活性剤の各々に対して様々な検定を用いて、活性部分の活性を試験することができる。放射性核種は、結合とは無関係に、それらの活性、すなわち、それらの放射能を保持する。毒素、薬物及びターゲッティング剤である活性剤に関しては、これらの化合物の非結合形態の活性を実証する標準的な検定を、その活性が保持されていることを確認するのに用いることができる。
【０１９１】
結合はＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドと活性剤との間で直接達成することができ、又はＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドと活性剤との間に連結中間分子群を付与することができる。架橋剤は、各々の部分に結合部位を付与することにより結合を容易にするのに特に有用である。架橋剤は、それらの部分を互いに分離していずれかが他方の活性を妨害するのを防止するスペーサーの役目を果たすさらなる分子群を含んでいてもよい。
【０１９２】
当業者は、公知の技術を用いて、ＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドを化学療法剤に結合させることができる。例えば、Magerstadt, M. Antibody Conjugates and Malignant Disease. (1991) CRC Press, Boca Raton, USA, pp.110-152 （これは参照することによりここに組み込まれる）では、抗体のアミノ酸への様々な細胞成長抑止剤の結合を教示している。このような反応は、適切なリンカーを用いる、抗ＣＲＣＡ−１翻訳産生物抗体を含むＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドへの化学療法剤の結合に適用することができる。癌の治療において現在用いられている化学療法剤の大部分は、タンパク質との直接の化学的架橋に馴染みやすい官能基を有する。例えば、遊離アミノ基はメトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、ｃｉｓ−プラチン、ビンデシン、マイトマイシン及びブレオマイシンで利用可能であり、これに対して遊離カルボン酸基はメトトレキセート、メルファラン、及びクロラムブシルで利用可能である。これらの官能基、すなわち、遊離アミノ及びカルボン酸は、これらの薬物を抗体の単一の遊離アミノ基に直接架橋させることが可能な様々なホモ二官能性及びヘテロ二感応性化学的架橋剤の標的である。例えば、遊離アミノ基を有するＣＲＣＡ−１翻訳産生物リガンドを遊離アミノ基を有する活性剤、例えば、メトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、ｃｉｓ−プラチン、ビンデシン、マイトマイシン及びブレオマイシン、又はアルカリホスファターゼ、又はタンパク質もしくはペプチドベースの毒素に架橋させるための手順の１つは、ホモ二官能性スクシンイミジルエステルを、好ましくはスベリン酸ジスクシンイミジル（Pierce Co、Rockford、IL）のような炭素鎖スペーサーと共に用いる。開裂可能な複合化合物が必要である場合には、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート；Pierce Co.）を利用して同じプロトコルを用いる。
【０１９３】
ペプチドまたはタンパク質であるＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを、毒素のようなペプチドを基本とする活性剤と複合させるために、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドおよびトキシンを、標準ペプチド合成法または組換えＤＮＡ技術のいずれかによって単一の融合タンパク質として作成することができ、両技術とも、当業者によって日常的に行われている。別法では、２つのペプチド、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドペプチドおよびペプチドを基本とするトキシンを、別々のペプチドとしても複合使用架橋物としても生成および／または単離することができる。化学療法剤を含む複合組成物と同様に、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合ペプチドと毒素の複合は、この分子のレセプター結合機能を保持しながらＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合ペプチドの一つの遊離アミノ基を修飾できる能力を利用することができる。
【０１９４】
当業者は、周知の技術を用いて、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを放射性核種と複合することができる。例えば、Ｍａｇｅｒｓｔａｄｔ，Ｍ．，１９９１、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬＡ，；ならびに、Ｂａｒｃｈｅｌ，Ｓ．Ｗ．および  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ｈ．，１９８３、Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＮＹ，ＮＹ（そのそれぞれをここに参照として採用する）は、抗体アミノ酸と様々な治療用および診断用放射性核種の複合について教授している。
【０１９５】
本発明は、複合した本発明の化合物および医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。当業者は、本発明の医薬組成物を調合することができる。適当な医薬キャリヤーは、この分野の標準参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌ；に記載されており、ここに参照として採用する。本発明の方法を実行するにあたって、本発明の複合化合物は、単独でまたは他の診断薬、治療薬または付加剤と組み合わせて、用いることができる。そのような付加剤には、着色剤、安定剤、浸透剤および抗細菌剤のような補助剤が含まれる。好ましくは、医薬組成物は、無菌で発熱物質を含まない。
【０１９６】
本発明の複合組成物は、例えば、医薬として許容しうる非経口のベヒクルを含む、溶液、縣濁液または乳濁液として調合することができる。そのようなベヒクルの例は、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％のヒト血清アルブミンである。リポソームもまた、用いることができる。ベヒクルは、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学安定性（例えば、バッファーおよび保存剤）を維持する添加剤を含むことができる。調合物は、共通に用いられている技術で無菌化される。例えば、注射による投与に適当な非経口組成物は、０．９％塩化ナトリウム溶液中に０．５％重量の活性成分を溶解することによって、調製される。
【０１９７】
本発明による医薬組成物は、一回の投与量として、または複数回の投与量として、投与することができる。また、本発明の医薬組成物を、個々の治療薬剤として、またはその他の治療薬剤と組み合わせて、投与することもできる。本発明の治療を、慣用の治療と組み合わせることもでき、順番にまたは同時に投与することもできる。
【０１９８】
本発明の医薬組成物は、複合組成物が標的細胞に到達することを可能にする任意の手段で、投与することができる。いくつかの実施態様では、投与形路は、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍のある器官の血液供給または腫瘍それ自身内への直接の局所投与、からなる群から選択されるそれらを含む。静脈内投与は、投与の好ましい様式である。それは、注入ポンプの助けを借りて成し遂げることができる。
【０１９９】
投与される投薬量は、活性部分の性質；複合組成物の性質；薬力学的性質；その投与様式および経路；レシピエントの年齢、健康および体重；症状の種類および範囲；同時治療の種類；および治療頻度、の様な要素に依存して変化する。
【０２００】
複合化合物は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を持つ細胞を特異的標的とするので、化学療法剤または毒素を含む複合化合物は、化学療法剤または毒素を複合していない活性薬剤として投与する場合に用いられる投薬量より少ない量で、好ましく最少で１／１００倍の活性薬剤を含む投与量で、投与される。いくつかの実施態様では、化学療法剤または毒素を含む複合化合物を、非複合活性薬剤として投与される化学療法剤または毒素の投与量より、活性部分として１／１０−１／１００倍の活性薬剤を含む投与量で、投与する。適当な投与量を決定するために、好ましくは、化合物量を、重量の代わりにモルで測定する。そのような方法では、異なるＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分の可変重量は、計算に影響を与えない。本発明の複合組成物内のＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分：活性部分の比率を１：１と仮定すると、投与される非複合化合物のモルと比較して、より少ないモルの複合化合物を、好ましくは、最少で１／１００倍モルを、投与することができる。
【０２０１】
典型的には、化学療法剤複合物は、投与量を複数回に分けて、静脈内投与することができる。
【０２０２】
典型的には、最大で１０ｇＩＶ／投与量メトトレキセートを、非複合形で投与する。メトトレキセートを、本発明の複合化合物内の活性部分として投与する場合、投与量は１／１０−１／１００倍に減少する。このように、それぞれの複合化合物が一つのＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分と複合した１モルのメトトレキセートを含むと仮定すると、投与される複合化合物総量内に、最大で約０．２−２．０ｇのメトトレキセートが存在し、そして投与される。いくつかの実施態様では、投与された複合化合物総量内に、最大で約２００ｍｇ−２ｇのメトトレキセートが存在し、そして投与される。
【０２０３】
画像診断薬剤として有用な医薬組成物内のラジオアイソトープである活性成分に連結したＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分を含む複合組成物を投薬するために、各々のＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分は一つの放射性活性部分と連結されると推定する。投与されるラジオアイソトープの量は、用いられるラジオアイソトープに依存する。当業者らは、活性部分として用いられる与えられた放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される複合化合物の量を容易に調合することができる。典型的には、０．１−１００ミリキューリー／画像診断薬剤投与量、好ましくは、１−１０ミリキューリー、たいてい２−５ミリキューリーが投与される。このように、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射性部分を含む複合組成物を含む画像診断薬剤として有用な本発明の医薬組成物は、０．１−１００ミリキューリー、いくつかの実施態様では好ましくは１−１０ミリキューリー、いくつかの実施態様では好ましくは２−５ミリキューリー、いくつかの実施態様ではより好ましくは１−５ミリキューリー、を含む。投与量の例としては、131Ｉ＝０．１−１００ミリキューリー／投与量、いくつかの実施態様では好ましくは１−１０ミリキューリー、いくつかの実施態様では２−５ミリキューリー、およびいくつかの実施態様では約４ミリキューリー； 111Ｉｎ＝約０．１−１００ミリキューリー／投与量、いくつかの実施態様では好ましくは１−１０ミリキューリー、いくつかの実施態様では１−５ミリキューリー、およびいくつかの実施態様では、約２ミリキューリー； 99mＴｃ＝約０．１−１００ミリキューリー／投与量、いくつかの実施態様では好ましくは５−７５ミリキューリー、いくつかの実施態様では、１０−５０ミリキューリー、およびいくつかの実施態様では約２７ミリキューリー；を含む。Ｗｅｓｓｅｌｓ  Ｂ．Ｗ．およびＲ．Ｄ．Ｒｏｇｕｓ、１９８４、Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．，１１，６３８；および、Ｋｗｏｋ，Ｃ．Ｓ．ら、１９８５、Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．，１２，４０５（その両方をここに参照として採用する）は、放射性複合化合物を含む本発明の医薬組成物の調製に用いることのできる診断用および治療用複合体としての詳細な服用量の計算について開示している。
【０２０４】
本発明の一つの態様は、転移性結腸直腸癌に罹患していると予想される個人を治療する方法に関する。医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射的に安定な治療薬剤である活性部分、を含む複合化合物を含む医薬組成物を個人に投与することによって、そのような個人を治療することができる。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤、ならびに抗体であるＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射能として安定な活性薬剤である活性部分を含む複合化合物を含む。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤、ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射能として放射的に安定な治療薬である活性部分を含む複合化合物を含む。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分およびメトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシナラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シス−プラチナ、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、プロチオニン、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体、トレニモン、リシン、リシンＡ鎖、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓホスホリパーゼＣ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ、アメリカやまごぼうの抗ウイルスタンパク質、アブリン、アブリンＡ鎖、コブラ毒液因子、ゲロニン、サポリン、モデッシン、ビスクミン、ボルケンシン、アルカリホスファターゼ、ニトロイミダゾール、メトロニダゾールおよびミソニダゾールからなる群より選択される放射能として安定な活性薬剤である活性部分、を含む複合化合物を含む。治療される個体は、転移性結腸直腸癌を持つと診断することができるか、または限局性結腸直腸癌を持つと診断することができ、結果として未だ検出されていないようなある転位の治療を前活性的に受けることができる。医薬組成物は、治療上有効な量の複合組成物を含む。治療上有効な量とは、個体の致死的副作用の原因とはならず、転移性結腸直腸癌細胞の細胞毒性または細胞増殖抑制性効果を起こすに有効な量である。
【０２０５】
本発明の一つの態様は、転移性結腸直腸癌にかかったと予想される個体を治療する方法に関する。医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射性をもつ活性部分を含む複合化合物医薬組成物を個体に投与することによって、そのような個体を治療することができる。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＴレセプター結合部位が抗体であるＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射性を持つ活性部分を含む複合化合物、を含む。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物、および47Ｓｃ、67Ｃｕ、90Ｙ、109Ｐｄ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、199Ａｕ、211Ａｔ、212Ｐｂ、212Ｂ、32Ｐおよび33Ｐ、71Ｇｅ、77Ａｓ、103Ｐｂ、105Ｒｈ、111Ａｇ、119Ｓｂ、121Ｓｎ、131Ｃｓ、143Ｐｒ、161Ｔｂ、177Ｌｕ、191Ｏｓ、193MＰｔ、197Ｈｇ（すべてβ−（−）および／またはオージェエミッター）；からなる群より選択される放射性薬剤である活性部分を含む複合化合物、を含む。治療される個人は、転位性結腸直腸癌を持つと診断されるか、または限局性結腸直腸癌を持つと診断され、結果として未だ検出されていないようなある転位の治療を前活性的に受けることができる。医薬組成物は、治療上有効な量の複合組成物を含む。治療上有効な量は、個体の致死的副作用の原因とはならず、転移性結腸直腸癌細胞の細胞毒性または細胞増殖抑制効果を生じるに有効な量である。
【０２０６】
本発明の一つの態様は、画像診断によって転移性結腸直腸癌にかかっていると考えられる個体内の転移性結腸直腸癌細胞を検出する方法に関する。そのような個体は、転移性結腸直腸癌に罹患していると診断することができ、そして転移性結腸直腸癌細胞は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射性を持つ活性部分を含む複合化合物を含む医薬組成物を、個体に、好ましくは静脈内投与により投与し、そしてＣＲＣＡ−１翻訳生成物を持つ細胞の存在を示す放射能の局所的蓄積または凝集の存在を検出することにより、検出することができる。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＴレセプター結合部位が抗体であるＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分および放射性を持つ活性部分を含む複合化合物、を含む。本発明のいくつかの実施態様では、医薬組成物は、医薬として許容しうるキャリヤーまたは希釈剤ならびにＳＴレセプター結合部位および；鉄キレートの様な放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子エミッター、43Ｋ、52Ｆｅ、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、77Ｂｒ、81Ｒｂ／81M Ｋｒ、87MＳｃ、99MＴｃ、111Ｉｎ、113MＩｎ、123Ｉ、125Ｉ、127Ｃｓ、129Ｃｓ、131Ｉ、132Ｉ、197Ｈｇ、203Ｐｂおよび206Ｂｉ；からなる群より選択される放射性薬剤である活性部分を含む複合化合物を含む。治療される個体を、転移性結腸直腸癌を持つと診断することができるか、または限局性結腸直腸癌を持つと診断され、そして結果として未だ検出されていないある転位を前活性的に治療することができる。医薬組成物は、診断上有効な量の複合組成物を含む。診断上有効な量とは、個体に致死的副作用を生じさせることなくＳＴレセプターを持つ細胞が位置する体内の部位を検出することのできる量である。
【０２０７】
本発明のもう一つの態様は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合リガンドおよび活性剤を含む非複合の組成物に関する。例えば、リポソームは、脂質からなる小ベシクルである。薬剤は、これらのベシクルの中央に導入することができる。これらのベシクルの外側の殻は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合リガンドを含む。Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、第１、２および３巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬＡ（ここに参照として採用される）は、外殻内にＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドと結びついた標的化薬剤を含む、リポソーム−カプセル化活性薬剤の調製について開示している。内側の活性薬剤と共にリポソームのマトリックス内にＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを含む非複合組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドが抗体であり、活性薬剤が、メトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシナラビノシド、エトピシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シス−プラチナ、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、プロチオニン、マクロモマイシン、１，４−ベンゾキノン誘導体、トレニモン、リシン、リシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、ジフテリア毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓホスホリパーゼＣ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ、アメリカやまごぼうの抗ウイルスタンパク質、アブリン、アブリンＡ鎖、コブラ毒液因子、ゲロニン、サポリン、モデシン、ビスクミン、ボルケンシン、アルカリホスファターゼ、ニトロイミダゾール、メトロニダゾールおよびミソニダゾールからなる群より選択される、そのような組成物を含む。
【０２０８】
一般的な結腸細胞を標的とする薬剤配達
本発明のもう一つの態様は、腸管の正常細胞および癌細胞ならびに転移性結腸直腸癌細胞のようなＣＲＣＡ−１翻訳生成物を含む細胞に、治療用核酸分子を配達するために用られる、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを含む非複合および複合の組成物に関する。いくつかの実施態様では、遺伝物質を、転移性結腸直腸癌細胞に配達して、免疫システムによって標的化されることのできる抗原を生成させるか、または細胞を殺すかあるいはその増殖を阻害するタンパク質を生成させる。いくつかの実施態様では、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを用いて核酸分子をコードする核酸を配達し、その核酸分子は欠損した内因性遺伝子を元通りに戻すか、または治療タンパク質をコードしている。いくつかの実施態様では、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドをこのように用いて、この器官に特異的な疾病を治療するために腸管の内側を覆う細胞に特異的に活性薬剤を配達する。本発明のこの態様では、組成物は、欠損遺伝子を元に戻すことのできる核酸分子を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子治療プロトコールに組成物を用い、遺伝子欠損を補うために必要なおよび／または所望される遺伝物質を個体に配達する。
【０２０９】
いくつかの実施態様では、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを配達ベヒクルと結合するか、またはベヒクル内に取り入れて、それによって配達ベヒクルを特異的に標的化された配達ベヒクルに変える。例えば、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合ペプチドを、ウイルス粒子の外側部分内に組み込み、そのようなウイルスを、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物−保持細胞特異的ウイルスにする。同様に、ウイルスをＣＲＣＡ−１翻訳生成物−保持細胞−特異的ウイルスにしたウイルス粒子の外側に晒されるか、さもなくば接近しやすくした活性なＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合ペプチドを含む、融合タンパク質として作り出すように、ウイルスの被覆タンパク質を工作することができる。いくつかの実施態様では、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドをリポソーム内に組込むか、さもなくば取り込むことができ、その中で、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドは、リポソームの外側に晒されているか、さもなくば接近しやすくなっており、そのようなリポソームをＣＲＣＡ−１翻訳生成物−保持細胞に特異的に標的化する。
【０２１０】
本発明のこの態様による複合または非複合−組成物内の活性薬剤は、核酸分子である。核酸は、ＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡであることができる。いくつかの実施態様では、核酸分子は、アンチセンス分子であるか、または細胞内に存在することが望ましくないタンパク質の生成を阻害するアンチセンス配列をコードしている。いくつかの実施態様では、核酸分子は、細胞内に存在することが望ましくないタンパク質の生成を阻害する、リボザイムをコードしている。いくつかの実施態様では、核酸分子は、細胞内で生成されることが望ましいタンパク質またはペプチドをコードしている。いくつかの実施態様では、核酸分子は、標的化された細胞には欠損している遺伝子の機能性コピーをコードしている。好ましくは、核酸分子は、細胞内のコード配列の発現に必要な調節エレメントに機能するように連結される。
【０２１１】
リポソームは、脂質からなる小ベシクルである。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物−保持細胞内で発現されることが望ましいタンパク質をコードする遺伝構築物を、これらのベシクルの中央に導入する。これらのベシクルの外殻は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを含む。リポソーム、第１、２および３巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬＡ（ここに参照として採用する）は、外殻内に抗体を含むリポソーム−カプセル化活性薬剤の調製について、開示している。本発明では、例えば、抗−ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体のようなＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを外殻に結びつける。リポソームマトリックス内に内側の活性薬剤と共にＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを含む非複合組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドが好ましくは抗体であるようなそのような組成物を含む。
【０２１２】
一つの実施態様では、例えば、嚢胞性線維症は、塩素輸送タンパク質をコードする特定の遺伝子に変異があり、結果として多くの系統、最も著しくは気道および腸管の機能に異常をきたす遺伝子疾患であり、この嚢胞性線維症は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを用いて細胞に修正遺伝子を配達する遺伝子治療技術によって治療される。現在広く行われている治療は、気道内細胞とのみ結合するウイルスを用いて、気道に並ぶ細胞に直接これらの遺伝子を標的化することによって、気道系統内の変異遺伝子を正常な遺伝子で置き換えることを指示している。同様に、正常遺伝子を、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドでそれらの表面を標的化したリポソーム内にパッケージングし、腸管に配達する。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドは、嚢胞性線維症の病変を直す正常遺伝子を含むリポソームを、十二指腸から直腸の腸管に並ぶ特別な細胞に、特異的に標的化し支配する。それらの細胞による遺伝物質の取り込みは、結果として腸管内の嚢胞性線維症を治療するはずである。
【０２１３】
もう一つの実施態様では、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の正常コピーの腸管への配達を、遺伝子治療を目標としたＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを用いて成し遂げる。Ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の変異は、腸管内の結腸直腸癌の増殖に顕著な役割を演ずると考えられる。この疾病と闘う一つの方法は、腸管のこの遺伝子の変異型を発現する細胞に、この遺伝子の正常なコピーを配達することである。正常なｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子を含む遺伝子構築物を、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを含むリポソーム内に取込む。組成物を、腸管に配達する。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合リガンドは、腸管細胞内のｐ５３サプレッサー遺伝子の変異によって作られる病変を修正するために、正常な遺伝子を含むリポソームを特異的に標的化し支配する。
【０２１４】
遺伝子構築物の調製は、当業者らの熟練と共にある。本発明は、本発明のＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを用いることによって、そのような構築物を特異的に標的化することを可能にする。本発明の組成物は、配達ベヒクルと結合した抗−ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体のようなＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドおよび 細胞内での発現に必要な調節配列と連結させた、腸管細胞に好まし生成物であるタンパク質のコード配列を含む遺伝子構築物を含む。腸管細胞によって取り込まれるために、組成物を経口または浣腸で投与し、そうすることによって組成物は腸管に入り、一つ以上の翻訳生成物を含む細胞と接触する。配達ベヒクルは、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドの力でＣＲＣＡ−１翻訳生成物と結びつき、ベヒクルを細胞内に取り込むか、さもなくば活性薬剤／遺伝子構築物を細胞に取り込ませる。いったん取り込まれたならば、構築物は、個体に治療効果をもたらすことができる。当業者は、経口または浣腸投与用のそのような組成物を容易に調合することができ、疾病または障害を治療するために投与されるそのような組成物の有効量を決定することができる。
【０２１５】
アンチセンス
本発明は、アンチセンス化合物を結腸細胞に特異的に配達し、それによって、所望しない遺伝子発現を起こさない細胞に負の影響を与えることなく、そのような非所望の発現を起こすそのような結腸細胞内で遺伝子の発現を停止する手段を提供ことによって、結腸細胞に生じる疾病の予防および治療に有用である、組成物、キットおよび方法を提供する。
【０２１６】
本発明の複合組成物は、転移性癌細胞ならびに限局性癌および正常な結腸細胞を含む、そのような細胞から誘導されたそれらの癌細胞を含む腸管壁内側を覆う標的細胞に有効である。複合組成物は、非結腸直腸誘導細胞とは結合しないであろう。従って、個体に投与される複合組成物の活性部分は、局所的に正常な結腸直腸細胞および癌性結腸直腸細胞ならびに転移性結腸直腸細胞の様な、腸管から誘導された細胞に配達される。一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物を欠く非結腸直腸細胞は、複合組成物を取り込まない。従って、本発明は、アンチセンス組成物を結腸細胞にのみ配達する組成物および方法を提供する。
【０２１７】
本発明は、結腸直腸細胞のみを化合物の活性部分に晒し、結腸直腸癌細胞のみが複合化合物によって影響を受ける、結腸直腸癌に特異的な研究方法を提供する。ＳＴレセプター結合部分は、正常な結腸直腸細胞、限局性結腸直腸癌細胞および転移性結腸直腸癌細胞を含む、結腸直腸細胞に特異的に結合する。これらの細胞に結合すると、複合化合物は内面化され、分子のアンチセンス部分を含む複合化合物の配達が果たされる。複合化合物の活性部分をなすアンチセンス分子が相補的である結腸直腸癌関連遺伝子を発現しないため、正常結腸直腸細胞内に複合化合物が存在しても、そのような細胞には影響を与えない。しかしながら、結腸直腸癌細胞内では、複合化合物の活性部分をなすアンチセンス部分と相補的な癌遺伝子が、発現している。結腸直腸癌細胞内に複合化合物が存在すると、癌遺伝子の転写または翻訳が阻害または防御され、それによってトランスフォームされた表現型が減少または排除される。
【０２１８】
本発明を用いると、限局性または転移性結腸直腸癌と戦い、トランスフォームされた表現型の非常事態を防ぐことができる。このように、本発明は、治療的ならびに予防的に用いることができる。
【０２１９】
本発明の治療用予防用医薬組成物は、結腸細胞を特異的に標的化した複合化合物を含む。腸管細胞を除くその他組織の細胞はＳＴレセプターを持たないので、これらの複合化合物には、腸管細胞を除く体内の正常組織細胞には結合しない、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分が含まれる。このように、正常な結腸直腸細胞、限局性結腸直腸癌細胞および転移性結腸直腸癌細胞のみが複合化合物を取り込む。
【０２２０】
当業者は、結腸直腸癌および転移性結腸直腸癌に罹患していると予想される個体を容易に同定することができる。結腸直腸癌と診断されたそのような個体では、この方法は、転位が疑われる標準療法であり、転位細胞を積極的に根絶できる試みでもある。本発明は、転移性結腸直腸癌細胞を特異的に標的化し排除する、医薬組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、結腸直腸癌細胞を特異的に排除するための療法および方法を含む、医薬組成物を提供する。本発明は、癌化に含まれる遺伝子の転写または翻訳を阻害するアンチセンス分子をそのような細胞に予防的に供給することにより、そのような細胞による癌化を防ぐ、結腸直腸細胞に特異的な医薬組成物および方法を提供する。
【０２２１】
本発明の複合組成物を含む医薬組成物を用いると、限局性および／または転移性結腸直腸腫瘍、即ち、一次性または非転移性結腸直腸腫瘍ならびに転移性結腸直腸腫瘍、に罹患した個体を診断または治療することができる。
【０２２２】
本発明は、複合組成物中でＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分を用いることをよる。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分は、実質上、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物へのリガンドとして働き、従ってこれらレセプターと特異的に結合する、複合組成物の一部分である。また、複合組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分と結びついた活性部分を含み；この活性部分は、癌と関連して発現する遺伝子発現の転写または翻訳の阻害または防御に有効なアンチセンス組成物である。
【０２２３】
本発明では、活性部分はアンチセンス組成物である。特に、複合化合物の活性部分を作るアンチセンス分子は、結腸細胞内のＤＮＡまたはＲＡＮとハイブリダイズし、それから起こるＤＮＡまたはＲＮＡの転写または翻訳を阻害および／または防御する。アンチセンス組成物は、核酸分子、その誘導体または類似体であることができる。アンチセンス組成物の化学的性質は、核酸分子、または修飾核酸分子、または発現を阻害されるかさもなくば防御されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子をまねた官能基を持つ非核酸分子、の性質であることができる。アンチセンス組成物は、その発現が結腸直腸癌とつながる遺伝子、即ち結腸直腸癌関連遺伝子、の転写または翻訳を阻害または妨害する。そのような遺伝子の例としては、限定するつもりはないが、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１およびｈＰＭＳ２のような遺伝性結腸非ポリポーシス(hereditary nonpolyposis coli)（ＨＮＰＣＣ）遺伝子、Ｒａｓ、腺腫様結腸ポリポーシス(adenomatous polyposis coli)（ＡＰＣ）、ＥＲＢＢ−１／ＨＥＲ−１、ＥＲＢＢ−２／ＨＥＲ−２、ｐ５３腫瘍サプレッサー、ＭＹＢ、ＦＯＳ、ＡＢＬ、タンパク質チロシンホスファターゼＧ１、サイクリックＡＭＰ−依存タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、ＣＲＩＰＴＯ、トランスフォーミング成長因子αおよびＩｐ、が含まれる。
【０２２４】
結腸直腸癌−関連遺伝子は、結腸直腸癌の遺伝的基礎を提供する。結腸直腸癌は、非抑制増殖と関連する腫瘍性表現型を導く上皮細胞内の遺伝子変異の蓄積を含む過程である。結腸直腸発癌現象は、アデノーマから浸潤癌への進行を含む多段階の過程からなる。もちろん、遺伝子異常の累進的総計が、それらの出現の種類より重要であるらしい。多くの遺伝子異常は、結果として対立遺伝子の損失または染色体フラグメントの欠損を生じる。結腸直腸癌表現型と関連する特異的な遺伝子異常は、以下に議論されるであろう。これらのすべては、遺伝的手法を用いた治療への可能性がある。Ｔｏｒｉｂａｒａ，ＮＷおよびＳｌｅｉｓｅｎｇｅｒ，ＭＨ、１９９５、「結腸直腸癌のスクリーニング」("Screening for colorectal cancer") Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３２，８６１−８６７：（ここに参照として採用され、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。
【０２２５】
ＨＮＰＣＣは、遺伝性結腸非ポリポーシス（ＨＮＰＣＣ）結腸直腸癌の原因であると予想される４つの遺伝子をさす。これらの４つの遺伝子は、Ｔｏｒｉｂａｒａ，ＮＷおよびＳｌｅｉｓｅｎｇｅｒ，ＭＨ、１９９５、「結腸直腸癌のスクリーニング」("Screening for colorectal cancer") 、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３２，８６１−８６７、に同定され議論されている。ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、およびｈＰＭＳ２と呼ばれる遺伝子は、ＤＮＡの塩基の誤対合を修復する遺伝子を校正する。この機能が無くなると、複製間違いがＤＮＡに起こるようになる。
【０２２６】
ポイントミューテーション挿入ならびにＫ−ｒａｓおよびＨ−ｒａｓの欠損が、結腸直腸腫様内で同定された。Ｔｏｒｉｂａｒａ，ＮＷおよびＳｌｅｉｓｅｎｇｅｒ，ＭＨ、１９９５、「結腸直腸癌のスクリーニング」("Screening for colorectal cancer") 、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３２，８６１−８６７；Ｋｎｉａｚｅｖ，ＰＧら、「オンコジーン  ＨＥＲ−２／ＥＲＢＢ−２、ＨＥＲ−１／ＥＲＢＢ−１、ＨＲＡＳ−１、Ｃ−ＭＹＣおよび抗−オンコジーンｐ５３、ＲＢ１の変化、ならびに結腸癌内の染色体１７の座の欠損、の複合特徴」("Complex characteristics of the alterations of oncogenes HER-2/ERBB-2、HER-1/ERBB-1、HRAS-1、C-MYC anti-oncogenes p53,RB1、as well as deletions of loci of chromosome17 in colon carcinoma.")、Ｍｏｌｅｋｕｌｉａｒｎａｉａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｉａ，２６（５），１１３４−４７、１９９２年９月−１０月；および、Ｒａｍｓａｙ，ＲＧら、「Ｍｙｂ発現は、正常粘膜よりヒト結腸癌および前悪性腺腫様ポリーブ内でより高い」("Myb expression is higher in malignant human colonic carcinoma and premalignant adenomatous polyps than in normal mucosa.")、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”３（１０），７２３−３０、１９９２年１０月：（ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。
【０２２７】
家族性腺腫様結腸ポリポーシス(adenomatous polyposis coli)（ＡＰＣ）を持つ患者は、染色体５ｑ、１８ｑ、１７ｐの欠損を含む一連の欠損を持つと考えられる。１７ｐ欠損は、ｐ５３サプレッサー遺伝子の欠損を示す。
【０２２８】
ＥＲＢＢ−１／ＨＥＲ−１およびＥＲＢＢ−２／ＨＥＲ−２遺伝子は、結腸直腸癌の場合、約４−８％で増幅されることが証明されている。
【０２２９】
ｐ５３遺伝子内のポイントミューテーションは、結腸直腸癌の場合、約３％で変異していると、報告されている。
【０２３０】
ＭＹＴプロト−オンコジーン発現は、結腸直腸腫様内でより高いことが証明された。Ｒａｍｓａｙ，ＲＧ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＭＡ．Ｈａｙａｍａ，ＪＡ．Ｒｅｉｄ，Ｇ．Ｇｏｎｄａ，ＴＪ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，ＲＨ．「Ｍｙｂ発現は、正常粘膜内より、悪性のヒト結腸癌および前悪性の腺腫様ポリーブ内でより高い。」("Myb expression is higher in malignant human colonic carcinoma and premalignant adenomatous polyps than in normal mucosa.")、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．３（１９），７２３−３０、１９９２年１０月；Ｍｅｌａｎｉ，Ｃら、「ｃ−ｍｙｂを発現する結腸腺癌細胞系でのｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる増殖の阻害」("Inhibition of proliferation by c-myb antisense oligodeoxynucleotides in colon adenocarcinoma cell lines that express c-myb.") 、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１１），２８９７−９０１、１９９１年１月１日；および、Ｒａｍｓａｙ  ＲＧら、「Ｍｙｂ発現は、正常粘膜内より悪性のヒト結腸癌および前悪性の腺腫様ポリーブ内でより高い」("Myb expression is higher in malignant human colonic carcinoma and premalignant adenomatous polyps than in normal mucosa.")、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３（１９），７２３−３０、１９９２年１０月：（ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。もちろん、ＭＹＢを最も高いレベルで発現する腫瘍および細胞は、大部分が形成異常であり、最も高いレベルで増殖する。ｃＭＹＢは、増殖シグナル化経路で役割を演ずるプロトオンコジーンである。この遺伝子の再配列、挿入および欠損が、見つかっている。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ＲＪら、「オンコジーンはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアによって誘導されたラット結腸腫瘍内で変化する」("Oncogene alterations in rat colon tumors induced by N-methyl-N-nitrosourea.") 、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０３（１），１６−２４、１９９２年１月：（ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。アンチセンスＭＹＢオリゴヌクレオチドは、インビトロでこのオンコジーンを最も高いレベルで発現する結腸腺癌細胞の増殖を遅らせる。
【０２３１】
ラットモデル内での化学的発癌現象は、転写の抑制および増殖を仲介するオンコジーンであるｆｏｓ内でのポイントミューテーションであることが証明された。Ａｌｅｘｓａｎｄｅｒ，ＲＪら、「オンコジーンは、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアによって誘導されたラット結腸腫瘍内で変化する」("Oncogene alterations in rat colon tumors induced by N-methyl-N-nitrosourea.") 、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０３（１），１６−２４、１９９２年１月：（ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。
【０２３２】
ラットモデル内での化学的発癌現象は、オンコジーンａｂｌ内のポイントミューテーションであることが証明された。Ａｌｅｘｓａｎｄｅｒ，ＲＪら、「オンコジーンは、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアによって誘導されたラット結腸腫瘍内で変化する」("Oncogene alterations in rat colon tumors induced by N-methyl-N-nitrosourea.") 、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０３（１），１６−２４、１９９２年１月：（ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される）を参照のこと。
【０２３３】
ＭＹＣは、転写および増殖を抑制する役割を演ずるオンコジーンである．ＭＹＣの発現の増加が、結腸直腸癌細胞内で認められた。Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＪＦら、「ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃｏｌｏ３２０結腸癌細胞のコロニー形成能力を阻害する」("c-myc antisense oligonucleotides inhibit the colony-forming capacity of Colo320 colonic carcinoma cells")、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ８９（５）、１５２３−７、１９９２年５月；および、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｒｚ−Ａｌｆａｇｅｍｅ，Ｃら、「染色体５の伝達によるヒト結腸癌細胞内の脱抑制されたｃ−ＭＹＣ発現の抑制」("Suppression of deregulated c-MYC expression in human colon carcinoma cells by chromosome 5 transfer")、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８９（４），１４８２−６、１９９２年２月１５日：、ここにその両方を参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。エキソンIIの翻訳開始領域に相補的なｍｙｃに対する１５−塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、結腸直腸癌細胞と共にインキュベートした。このアンチセンス分子は、ｄｏｓ−依存様式の結腸直腸癌細胞の増殖を阻害した。興味深いことに、このオリゴヌクレオチドの取り込みは低い（０．７％）。また、正常な染色体５の結腸直腸癌細胞への運搬は、結果としてｍｙｃの発現を抑制し、そして増殖しなくなる。これらのデータから、ｍｙｃの抑制に重要な腫瘍サプレッサー遺伝子はこの染色体上に含まれると、考えられる。
【０２３４】
新規のタンパク質チロシンホスファターゼＧ１が同定された。結腸直腸腫瘍細胞内のこのタンパク質をコードするｍＲＮＡの試験から、それはこれらの細胞内でポイントミューテーションおよび欠質を受けることが明らかにされ、これら細胞の増殖特徴に役割を演じることができる。Ｔａｋｅｎａｗａ，Ｍら、「タンパク質チロシンホスファターゼＧ１遺伝子の染色体上の位置決定およびヒト結腸癌細胞内の正常でない転写物の特徴」("Chromosomal localization of the protein tyrosine phosphatase G1 gene and characterization of the aberrant transcripts in human colon caner cells.")、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３９（３）２２２−８、１９９４年２月２１日、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２３５】
ガストリンは、ＰＫＡによって仲介されるサイクリックＡＭＰ依存性メカニズムを通して結腸癌細胞の増殖を抑制する。ＰＫＡの特別クラスの抑制サブユニットに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、結腸癌細胞内のサイ  クリックＡＭＰの成長促進効果を阻害した。Ｂｏｌｄ，ＲＪら、「ヒト結腸癌の実験的遺伝子治療」("Experimental gene therapy of human colon cancer") 、Ｓｕｒｇｅｒｙ，１１６（２），１８９−１９５；考察１９５−６、１９９４年８月；および、Ｙｏｋｏｚａｋｉ，Ｈら、「サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼのＲＩ−αサブユニットを涸渇させるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはヒトの癌細胞の増殖阻害を誘導する」(An antisense oligodeoxynucleotide that depletes RI alpha subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase induces growth inhibition in human cancer cells ")、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３（４），８６８−７２、１９９３年２月１５日、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２３６】
ＣＲＩＰＴＯは、大部分の結腸直腸癌腫瘍内で発現する上皮増殖因子−関連遺伝子である。ＣＲＩＰＴＯ  ｍＲＮＡの５’末端に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、明らかにＣＲＩＰＴＯの発現を減少させ、インビトロおよびインビボでの結腸直腸腫瘍細胞の増殖を阻害する。Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆら、「アンチセンスＲＮＡおよびオリゴデオキシヌクレオチドによるヒト結腸癌細胞のＣＲＩＰＴＯ発現および腫瘍形成性の阻害」("Inhibition of CRIPTO expression and tumorigenicity in human colon cancer cells by antisense RNA and oligodeoxynucleotides") 、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９（１），２９１−８、１９９４年１月、ここにその両方を参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２３７】
多くの癌細胞は、形質転換増殖因子αを分泌する。ＴＧＦα  ｍＲＮＡに対するＡ２３ヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結腸直腸癌細胞のＤＮＡ合成および増殖の両方を阻害した。Ｓｉｚｅｌａｎｄ，ＡＭ、Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＡＷ、「アンチセンス形質転換増殖因子αオリゴヌクレオチドは、結腸癌細胞系のオートクライン刺激増殖を阻害する」("Antisense transforming gtowth factor alpha oligonucliotides inhibit autocrine stimulated proliferation of a colon carcinoma cell line") 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、３（１１），１２３５−４３、１９９２年１１月、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２３８】
ヒト結腸直腸腫瘍は、染色体１ｐの欠失を伴うことが確認された。この染色体の一部分１ｐ３６−３４は、ＭＹＣの発現を抑制する腫瘍サプレッサー遺伝子を含む。Ｔａｎａｋａ，Ｋら、「正常な染色体１ｐ３６領域の導入によるヒト結腸癌細胞内の腫瘍形成性の抑制」("Supression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 1p36 region")、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８（８），２２５３−８、１９９３年８月、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２３９】
一般的に、オリゴヌクレオチド、その誘導体および類似体、複合プロトコール、および転写および翻訳を阻害するアンチセンスストラテジー、を含むアンチセンス組成物は、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．およびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬＡ、１９９３；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，ＧおよびＭ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０；および、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１；ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される；に記載されている。
【０２４０】
本発明のアンチセンス分子は、結腸直腸癌遺伝子のフラグメントに相補的な配列を含む。Ｕｌｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，２５０３、１９８６（ここに参照として採用される）を参照のこと。この定義により計画されたのが、結腸直腸癌細胞のコード配列内にあるｏｌｉｇｏｓのフラグメントである。
【０２４１】
本発明の複合化合物内の活性部分を作り上げることのできるアンチセンス組成物は、ホモピリミジンで形成されたオリゴヌクレオチドを含み、ＤＮＡ二重らせん内の局所的に続くホモプリンを認識し、そして主要グローブ内でそれらを結合して、三重らせんを形成する。Ｈｅｌｅｎ，ＣおよびＴｏｕｌｍｅ，ＪＪ、「アンチセンス、センスおよび抗遺伝子核酸による遺伝子発現の特異的調節」("Sspecific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucloeic acids") 、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０４９，９９−１２５、１９９０、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される、を参照のこと。三重らせんの形成は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される特定の遺伝子の能力を妨げる。ｍｙｃ−特異的オリゴヌクレオチドを用いると、三重らせんの形成が認められた。Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，４５６−４５９、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される、を参照のこと。
【０２４２】
イントロンとエクソンの間の境界にある配列と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、転写のためのｍＲＮＡ内の特定の遺伝子の新たに発生した核ＲＮＡ転写物の成熟を防ぐことができる。特定遺伝子と相補的なアンチセンスＲＮＡは、ｔａｔ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズでき、その翻訳を防ぐ。アンチセンスＲＮＡは、インビトロで合成された"ready-to-use"ＲＮＡとして、または転写時にアンチセンスＲＮＡが得られるであろう細胞内に安定にトランスフェクトされたアンチセンスとして、細胞に提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、結果として、ＲＮＡアーゼＨによるハイブリダイズ分子の分解および／または翻訳複合物の形成阻害を生じる。両方共、本来の遺伝子の生成物を生成できなくなる。
【０２４３】
ＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンス配列も、細胞に配達することができる。いくつかの化学修飾を行って、特異的配列を認識するそれらの能力を妨害することなく、安定性を延長しこれらの分子の機能を改良した。これらには、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、α−アノマーを含む、ＤＮアーゼによる分解に対するそれらの耐性の増加、ソラレンの様な様々な介在薬にそれらが共有結合することによるそれらアフィニティーの増加、および、ポリリシンを含む様々な基への複合による細胞による取り込みの増加、を含む。これらの分子は、ｍＲＮＡ内にコードされた特定の配列を認識し、それらのハイブリダイゼーションは、これらのｍＲＮＡの翻訳を妨害し、分解を増加させる。
【０２４４】
本発明の複合組成物は、腫瘍癌化の原因となる遺伝子の発現を終結するための特異的効果的手段を提供する。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物は、リガンド誘導エンドサイトーシスを受け、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分が結腸細胞上のＳＴレセプターと結合する場合、細胞の細胞質に複合化合物を配達することができる。これらのレセプターのユニークな局在性およびエンドサイトーシスを受けるそれらの能力から、それらは、これらの腫瘍に対する標的化治療を行うための卓越した候補になる。
【０２４５】
ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分を、結腸直腸腫瘍細胞内の応答の誘導に活性な、核酸のようなアンチセンス組成物に直接複合する。例えば、ＭＹＣに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを抗−ＣＲＣＡ−１翻訳生成物抗体に直接複合する。このことは、ＣＤ４レセプターと結合するペプチドを用いて行われる。Ｃｏｈｅｎ，ＪＳ編、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９８９、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される、を参照のこと。正確な骨格およびその合成は特定されておらず、良く確立された技術から選択することができる。合成は、化学的複合またはＦＭＯＣ化学を用いた固相合成によるキメラ分子の直接合成のいずれかを含むであろう。Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，Ｊら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２８，５１９９−５２０２、１９８７、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される、を参照のこと。代わりに、ペプチド−核酸複合体を、固相合成によるペプチド−ペプチド核酸キメラとして固相合成により直接合成することもできる。Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＰＥら、「配列特異的転写はＤＮＡテンプレートストランドに結合したペプチド核酸によって抑えられる」("Sequence-specific transctiption arrest by peptide nucleic acid bound to the DNA template strand") 、Ｇｅｎｅ，１４９，１３９−１４５、１９９４、ここに参照として採用し、そこに列挙されらすべての参考文献もまたここに参照として採用される。
【０２４６】
いくつかの実施態様では、ポリリシンを、核酸への非共有結合様式で本発明の複合組成物と複合させ、そして細胞の細胞質へのこれらの分子の配達を強化するために用いることができる。さらに、ペプチドおよびタンパク質を、共有結合様式でポリリシンと複合し、この複合体を非共有結合様式で核酸と複合させて、細胞内への核酸の取り込みの特異性および能力をより強化することもできる。このように、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンドを、確立された技術によって化学的にポリリシンと複合する。ポリリシン−ＣＲＣＡ−１翻訳生成物リガンド複合体を、選択された核酸と複合することができる。このように、ポリリシン−オロソムコイド複合体を、遺伝子を含む特異的プラスミドに用い、オロソムコイドレセプターを発現するヘパトーマ細胞に発現させる。この方法を用いると、全遺伝子またはオリゴヌクレオチドを配達することができる。従って、非所望の遺伝子発現を終結させる（例えば、ＭＹＣ、ｒａｓ）、または失われたあるいは欠失した遺伝子（例えば、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、およびｈＰＭＳ２）の機能を元に戻す可能性がある。
【０２４７】
好ましい実施態様では、Ｍｙｃは、その発現が複合組成物内のアンチセンス分子によって阻害される遺伝子として供給される。大部分ではないにしろ、多くの結腸直腸腫瘍細胞は、増殖の仲介に含まれる遺伝子であるＭＹＣを過剰発現する。結腸直腸腫瘍細胞の増殖の減少は、このタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズするＭＹＣに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、結果としてこのｍＲＮＡを分解し、ＭＹＣの生成を劇的に減少させることによって成し遂げることができる。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分を用いて、エキソンIIの翻訳開始領域に相補的なｍｙｃに対する１５−塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを配達する。この構築物は、結腸直腸癌細胞とインキュベートした場合、ＭＹＣの発現の阻害に活性であった。ＭＹＣに対する１５−塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＪＦ．Ｎｅｒｍａｎ，Ｐ，Ｓｃｈｕｃｈ，Ｃ．Ｂａｇｂｙ，ＧＣ，Ｊｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８９（５），１５２３−７、１９９２年５月、に報告された方法に従って、合成される。いくつかの実施態様では、複合組成物を、前に報告した方法に従って、ポリリシンに複合する。Ｗｕ，ＧＹ．およびＷｕ，ＣＨ．１９８８、「インビトロでのＨｅｐ  Ｇ２  ヘパトーマ細胞へのｅｄ遺伝子配達の証明」("Evidence for ed gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro") Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，８８７−８９２、ここに参照として採用する。
【０２４８】
複合組成物を、固相合成によって直接キメラ分子として合成することもできる。インビトロでは、この複合体はピコモルからナノモルの濃度で結腸直腸癌細胞内でのＭＹＣ合成を抑制する。
【０２４９】
好ましくは、アンチセンス分子は、長さ５−５０のヌクレオチド、より好ましくは５−２５ヌクレオチド、およびいくつかの実施態様では１０−１５ヌクレオチドである、ヌクレオチド配列とハイブリダイズする、即ち、相補的である。
【０２５０】
さらに、ミスマッチした配列が実質的に結腸直腸癌遺伝子配列に相補的であるような、本発明の方法を成し遂げる、上に同定された配列を持つミスマッチもまた、開示の範囲内にあると考えられる。結腸直腸癌遺伝子配列との実質上の相補性を許すミスマッチは、一度本開示を与えられた当業者らには既知であろう。また、ｏｌｉｇｏｓは、修飾されていなくても、または修飾されていても良い。
【０２５１】
治療用組成物および方法を用いると、限局性および／または転移性の結腸直腸癌と闘うことができる。個体に治療上有効な量の複合化合物を投与する。治療上有効な量は、個体の致死的副作用の原因とならずに転移性結腸直腸癌細胞への細胞毒性または細胞増殖抑制性効果の原因となるに有効な量である。治療上有効な量の複合組成物を投与された個体は、個体が治療上有効な量を受け取らなかった場合のリスクと比較して、結腸癌を排除する機会が増える。
【０２５２】
限局性結腸直腸癌を治療するために、治療上有効な量の複合化合物を、それが結腸内の局在性腫瘍と接触するであろうように、投与する。このように、複合化合物は、経口または非経口で投与される。複合化合物を経口で投与する場合、それらは、胃酸による分解を防ぐため、好ましくは腸でコートさもなくば製剤される。腸調合物は、合衆国特許第４，６０１，８９６号、合衆国特許第４，７２９，８９３号、合衆国特許第４，８４９，２２７号、合衆国特許第５，２７１，９６１号、合衆国特許第５，３５０，７４１号、および合衆国特許第５，３９９，３４７号、に記載されており、そのそれぞれをここに参照として採用する。経口および直腸調合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに教授されており、ここに参照として採用する。代わりの実施態様には、結腸への複合生成物の連続的配達を提供する、持続性放出製剤およびインプラントデバイスが含まれる。
【０２５３】
本発明の医薬組成物は、一回投与または複数回投与のいずれかで、投与されることができる。本発明の医薬組成物は、単独の治療薬剤として、またはその他の治療薬剤との組み合わせのいずれかで、投与されうる。本発明の治療を、慣用の治療と組み合わせることができ、順番にまたは同時に投与することができる。
【０２５４】
本発明は、結腸細胞へアンチセンス化合物を配達し、哺乳動物の結腸直腸癌遺伝子の発現を阻害する方法に関係する。方法は、結腸直腸癌遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡ領域に相補的な配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドに複合させたＣＲＣＡ−１翻訳生成物結合部分を含む、有効量の複合組成物の哺乳動物への投与を含む。
【０２５５】
複合化合物は、投与の予定経路および標準的医薬慣習に関して選択された、医薬として許容しうるキャリヤーとの混合物で、哺乳動物に投与することができる。投与量は、患者の体重および医療状態に関して設定されるであろう。本発明の複合組成物を、未分化細胞および／または異常な表現型を持つ細胞を含まない哺乳動物に充分な時間投与されるであろう。治療方法では、治療は増殖から癌化細胞を阻害するに充分な時間におよび、複合組成物を、その他の化学治療薬と複合させて投与し、患者の癌を操縦し、これと闘うことができる。
【０２５６】
本発明の複合化合物は、単独で、またはその他の化合物と組み合わせて、本発明の方法に用いられうる。また、投与される量は、患者の年齢、体重および臨床状態のようなそのような要因に依存するであろう。Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａｌｆｏｎｓｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ、を参照のこと。
【０２５７】
予防組成物および方法を用いると、結腸直腸癌の元を防ぐことができる。特に、複合化合物を結腸直腸癌にかかりやすいと考えられる個体に投与することができる。遺伝子型決定技術を用いると、個体感受性の具体的種類を同定することができる。即ち、どの癌遺伝子が個体の結腸直腸癌と関連するであろうかを決定できるであろう。例えば、ＡＰＣ遺伝子内の欠損およびＡＰＣ遺伝子診断用キットは、合衆国特許第５，３５２，７７５号に開示されており、ここに参照として採用される。同様に、ＭＣＣ遺伝子の欠損およびその遺伝子の診断用キットは、合衆国特許第５，３３０，８９２号に開示されており、ここに参照として採用される。予防的方法では、治療は、トランスフォーメーションの阻害に充分な時間、連続的にまたは時々散発的に、およぶ。
【０２５８】
結腸直腸癌を防ぐために、予防用として有効な量の複合化合物を、それが正常な結腸細胞と接触しそれに取り込まれるように、投与する。このように、複合化合物は、経口または非経口で投与される。複合化合物を経口投与する場合、好ましくは、それらを、上記の方法に従って、胃酸による分解を防ぐために、腸被覆するかさもなくば製剤される。
【０２５９】
予防に有効な量は、細胞内での結腸癌の癌化の開始を防ぐに有効な量である。予防に有効な量の複合組成物を投与された個体は、予防に有効な量を受けていない個体のリスクと比較して、結腸癌の発病リスクが減少する。
【０２６０】
治療用および予防用ワクチン
本発明は、転移性結腸直腸癌から個体を防御するための、そして転移性結腸直腸癌にかかった個体を治療するための、予防用および治療用ワクチンに関する。
【０２６１】
本発明では、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物が、予防治療免疫応答を誘導することのできる標的として供給される。具体的には、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物に対して免疫応答を誘導するワクチンを提供する。本発明のワクチンは、限定するつもりはないが、以下のワクチン技術を含む：
１）  ＤＮＡワクチン、即ち、ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からの少なくとも一つのエピトープをコードするＤＮＡを、エピトープを発現する個体細胞に投与し、免疫応答のための標的として供給される、ワクチン；
２）  組換えアデノウイルス、ワクシニア、サルモネラ、およびＢＣＧの様な感染ベクター仲介ワクチンであって、その中でベクターは、感染ベクターを個体に投与した場合エピトープを発現し免疫応答の標的として供給されるような、ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からのエピトープを少なくとも一つコードする遺伝情報を運ぶ、前記の感染ベクター仲介ワクチン；
３）  ａ）ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からの少なくとも一つのエピトープを表示する死滅細胞または不活性化ウイルス粒子のいずれかを含み、そしてｂ）個体に投与した場合に免疫応答の標的として供される；死滅または不活性化ワクチン；
３）  ａ）ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からの少なくとも一つのエピトープを表示する死滅細胞または不活性化ウイルス粒子のいずれかを含み、ｂ）より免疫原性であるようにハプテン化され、そしてｃ）個体に投与した場合に免疫応答の標的として供される；ハプテン化された死滅または不活性化ワクチン；
４）  ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からのエピトープを少なくとも１つ含むタンパク質分子を含むワクチンであるサブユニットワクチン；および
５）  ａ）ＳＴレセプタータンパク質上に存在しないＣＲＣＡ−１翻訳生成物からの少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質分子を含み、そしてｂ）より免疫原性であるようにハプテン化した、ワクチンであるハプテン化サブニットワクチン。
【０２６２】
本発明は、それぞれ、治療および予防免疫応答を誘導することのできる免疫原性エピトープを含むかコードするタンパク質または核酸分子を個体に投与することに関係する。そのようなエピトープは、一般的に長さが少なくとも６−８のアミノ酸である。それ故、本発明のワクチンは、ＳＴレセプタータンパク質上に存在しない一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物からの、少なくとも長さ６−８のアミノ酸であるタンパク質、または少なくとも長さ６−８のアミノ酸をコードする核酸を含む。本発明のワクチンは、少なくとも長さが１０−約１０００のアミノ酸であるタンパク質、または少なくとも長さが１０−約１０００のアミノ酸をコードする核酸を含む。本発明のワクチンは、少なくとも長さが約２５−約５００のアミノ酸であるタンパク質、または少なくとも長さが約２５−約５００のアミノ酸をコードする核酸、を含むことができる。本発明のワクチンは、少なくとも長さが約５０−約４００のアミノ酸であるタンパク質、または少なくとも長さが約５０−約４００のアミノ酸をコードする核酸、を含むことができる。本発明のワクチンは、少なくとも長さが約１００−約３００のアミノ酸であるタンパク質、または少なくとも長さが約１００−約３００のアミノ酸をコードする核酸、を含むことができる。
【０２６３】
本発明は、転移性結腸直腸癌を持つことが分かっている個体を治療するための組成物および方法に関する。転移性結腸直腸癌は、臨床および研究病理プロトコールで受け入れられる技術、ならびに／または合衆国特許０８／１４１，８９２、１９９３年１０月２６日出願、合衆国特許０８／３０５，０５６、１９９４年９月１３日出願、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２、１９９４年１０月２６日出願、に記載のそれらを用いて、当業者らによって、診断されうる。本発明は、転移性結腸直腸癌に罹っていると診断された個体の治療に有効な免疫治療用ワクチンを提供する。本発明の免疫治療用ワクチンは、これらに限定するつもりはないが、合衆国特許第０８／１４１，８９２、１９９３年１０月２６日、合衆国特許０８／３０５，０５６、１９９４年９月１３日出願、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２２３２、１９９４年１０月２６日出願、に記載の治療法を含む、その他の治療法と組み合わせて投与することができる。
【０２６４】
本発明は、転移性結腸直腸癌に罹りやすいと考えられる個体の転移性結腸直腸癌を防ぐ組成物および方法に関する。そのような個体群には、家族の医療歴が家族構成員の結腸直腸癌の平均出現率以上を示す個体群、および／または、既に結腸直腸癌を発病し効果的に治療されたがそれ故回帰(relapse)および再発(recurrence)の危険に直面している個体群、が含まれる。そのような個体群には、限局性のみ、または切除された、さもなくば治療された限局性および転移性結腸直腸癌を含む結腸直腸癌を持つと診断された個体群が含まれる。また、そのような個体には、遺伝評価によって確認されたような危険性の高い個体群も含まれる。例えば、ＡＰＣに変異を持つ個体群は、合衆国特許第５，３５２，７７５号、１９９２年１０月４日発行、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎら、に記載の方法に従って同定することができ、ここに参照として採用される。さらに、そのような個体群には、炎症性腸疾患にかかった個体群、特に潰瘍性大腸炎を持つ個体群；結腸ポリーブを持つ個体群；家族性腺腫様ポリーブである、多数の腸管ポリーブを発症する素因を患者に与える遺伝的変異を持つ個体群；ポイツ−ジェガーズ症候群を持つ個体群、遺伝的結腸非ポリポーシスである、結腸癌を発病する素因を人々に与える遺伝的変異を持つ個体群；中枢神経系の別の癌と複合したターコット症候群−結腸癌を持つ個体群；および直腸交際で結ばれた個体群；が含まれる。本発明のワクチンは、個体が予防的に結腸直腸癌転移を防ぎ戦い易くすることができる。
【０２６５】
本発明は、そのようなワクチンの活性成分であるか、または活性成分を作るために必要とされる組成物、活性成分を含むそのような組成物を作成する方法、およびワクチンを作成し使用する方法、に関する。
【０２６６】
ＣＲＣＡ−１転写物のヌクレオチド配列を、配列番号：１に示し、様々な翻訳生成物のアミノ酸配列を配列番号２−８１に示す。本発明は、特定のＣＲＣＡ−１翻訳生成物をコードするＣＲＣＡ−１転写物の単離フラグメントに関する。
【０２６７】
本発明は、ＣＲＣＡ−１転写物またはそのフラグメントを含む発現ベクターを含む、組換えベクターに関する。本発明は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはその機能的フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、組み換えベクターに関する。
【０２６８】
本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞、およびそのような組換え細胞を用いてＣＲＣＡ−１翻訳生成物を作製する方法、に関する。
【０２６９】
本発明は、単離されたＣＲＣＡ−１転写物、および単離されたＣＲＣＡ−１翻訳生成物、およびそのような生成物に特異的な単離された抗体およびそのような抗体を生成するハイブリドーマ、に関する。
【０２７０】
本発明は、単離されたＣＲＣＡ−１翻訳生成物およびその機能性フラグメントに関する。従って、本発明のいくつかの態様は、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物の少なくとも一つのエピトープを含む単離されたタンパク質に関する。
【０２７１】
本発明のいくつかの態様は、それをより免疫原性にするハプテン化された上記の単離されたタンパク質に関する。即ち、本発明のいくつかの態様は、少なくとも一つのＣＲＣＡ−１翻訳生成物エピトープを含むハプテン化タンパク質に関する。
【０２７２】
従って、本発明のいくつかの態様は、少なくとも一つのＣＲＣＡ−１翻訳生成物エピトープを含むタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【０２７３】
むき出しのＤＮＡワクチンは、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５に記載されており、ここに参照として採用する。その他は、リポソーム仲介ＤＮＡトランスファーの使用、ミクロ発射体(microprojectiles)を用いるＤＮＡ配達( 合衆国特許第４，９４５，０５０号、１９９０年７月３１日発行、Ｓａｎｆｏｒｄら、ここに参照として採用する）、およびエレクトロポレーションを用いたＤＮＡ配達、について教授している。各々の場合、ＤＮＡは、細菌内で生成され、単離され、そして治療される動物に投与される、プラスミドＤＮＡであることができる。プラスミドＤＮＡ分子は、興味あるタンパク質をコードする配列を発現する、動物細胞に取り込まれる。このように生成されたタンパク質は、動物に治療効果または予防効果を提供する。
【０２７４】
個体に治療的および／または予防的免疫効果を作り出すために個体細胞に核酸分子を配達するために、ウイルスベクターを含むベクターを用いることおよびその他の手段も、同様に良く知られている。ワクチンベクターを用いる組換えワクチンは、例えば、合衆国特許第５，０１７，４８７号、１９９１年５月２１日発行、Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇら、ここに参照として採用する、に開示されている。
【０２７５】
いくつかの場合、患者からの腫瘍細胞は、殺すかまたは不活性化され、ワクチン生成物として投与される。Ｂｅｒｄら、１９８６年５月、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，２５７２−２５７７、およびＢｅｒｄら、１９９１年５月、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，２７３１−２７３４（ここに参照として取り入れる）は、腫瘍細胞を基本としたワクチン生成物の調製および使用について記載している。本発明のいくつかの態様に従って、Ｂｅｒｄらに記載の方法および技術を、黒色腫細胞の代わりに結腸直腸癌細胞を用いることによって、適用する。
【０２７６】
例えば研究用試薬またはサブユニットワクチンの成分として有用な単離された翻訳生成物およびそのフラグメントを製造し使用することは、良く知られている。当業者らは、ＣＲＣＡ−１転写物またはＣＲＣＡ−１翻訳生成物またはそのフラグメントをコードするその特異的部分を単離することができる。一端単離したら、核酸分子は、標準技術および容易に入手できる出発物質を用いて発現ベクター内に挿入することができる。
【０２７７】
ＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントをコードする核酸分子をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、または、ＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントを含むタンパク質。本発明の組み換え発現ベクターは、本発明の単離されたタンパク質を調製する組換え発現系を調製する宿主の形質転換に有効である。
【０２７８】
本発明は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメント、または、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントを含むタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。タンパク質を生成する周知の組換え発現系に用いられる宿主細胞は、良く知られており、容易に入手できる。宿主細胞の例としては、大腸菌のような細菌細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様な酵母、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの様な昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の様なヒトでない哺乳動物の組織培養細胞、およびＨｅＬａ細胞のようなヒト組織培養細胞が含まれる。
【０２７９】
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む組み換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。組換えタンパク質の生成に有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック動物を作成するための必要な発現ベクターおよび技術として良く知られている。一般的には、トランスジェニック細胞は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメント、または一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントを含むタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞特異的プロモーターに機能しうる様に連結した組み換え発現ベクターであって、それによってコード配列が哺乳動物内でのみ発現され、そのようにして発現された組み換えタンパク質を動物のミルクから回収する、前記組み換え発現ベクターを含む。
【０２８０】
いくつかの実施態様では、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、そのようなＤＮＡ分子を、本明細書中に記載されたそれらのような周知の発現系で用いられる市販の発現ベクター内に挿入することができる。
【０２８１】
ＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはその機能性フラグメントまたはＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはその機能性フラグメントを含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合する宿主にトランスフォームし、次にその宿主を培養し、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下に維持する。このようにして生成された本発明のタンパク質は、適当かつ当業者に周知の方法に従って、細胞を溶解することによって、または培養液からのいずれかで、培養基から回収される。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメント、またはタンパク質と特異的に結合する抗体を用いて同タンパク質を含むタンパク質を精製する方法が、良く知られている。特定の抗体と特異的に結合する抗体を用いると、周知の技術を用いてタンパク質を天然源から、および容易に入手できる出発物質から、精製することができる。また、そのような抗体を用いると、組換えＤＮＡ方法論によってタンパク質を生成させた場合に存在する物質から、タンパク質を精製することができる。本発明は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは同一タンパク質を含むタンパク質上に存在するエピトープと結合する抗体に関する。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物上に存在するエピトープと結合する抗体は、天然源または組換え発現系の両方からの、アフィニティークロマトグラフィーのような周知の技術を用いたタンパク質の単離および精製に有用である。一般的に、イムノアフィニティー技術は、Ｗａｌｄｍａｎら、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９５，３９１−３９６（ここに参照として採用される）に記載されている。抗体は、サンプル内のそのようなタンパク質の存在の検出に、そして細胞がタンパク質を発現しているかについての決定に、有用である。抗体の生成ならびに完全な完全抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ(ａｂ)2 フラグメントのタンパク質構造ならびにそのような分子をコードする遺伝子配列の編制(organization)は周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ＥおよびＤ，Ｌａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８８、に記載されており、ここに参照として採用される。
【０２８２】
本発明のいくつかの実施態様では、トランスジェニック非ヒト動物を作成した。本発明のトランスジェニック動物は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは哺乳動物特異的プロモーターの調節制御下で同一物を含むタンパク質をコードする、ヌクレオチドを含む。当業者は、合衆国特許第４，８７３，１９１号、１９８９年１０月１０日発行，Ｗａｇｎｅｒ、および合衆国特許第４，７３６，８６６号、１９８８年４月１２日発行、Ｌｅｄｅｒ（ここにその両方を参考として採用する）に教授された方法のような標準技術を用いて、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは同一物を含むタンパク質を生成するトランスジェニック動物を作り出すことができる。好ましい動物は、ヤギならびに齧歯類、特にラットおよびマウスである。
【０２８３】
また、組換え技術によるこれらのタンパク質の生成に加えて、自動ペプチドシンセサイザーを用いて、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは同一物を含むタンパク質あるいはそのフラグメントを製造することもできる。そのような技術は、当業者らに周知であり、置換を持つ誘導体がＤＮＡのコードするタンパク質生成物内に提供されない限り、有用である。
【０２８４】
いくつかの実施態様では、サブユニットワクチンまたは死滅されるか不活性化されたワクチンの細胞または粒子を作り上げるタンパク質をハプテン化し、免疫原性を増加させることもできる。いくつかの場合には、ハプテン化は、一つ以上のＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは同一物を含むタンパク質により大きい分子構造を複合することである。いくつかの場合、患者からの腫瘍細胞は、有効なワクチン生成物を作るための手段として死滅させハプテン化される。ＣＲＣＡ−１翻訳生成物あるいはそのフラグメントまたは同一物を含むタンパク質を作り表示する遺伝子情報と共に提供される、細菌または真核生物細胞のようなその他の細胞を刺殺し、活性なワクチン成分として用いる場合、そのような細胞をハプテン化すると免疫原性が増加する。ハプテン化は、良く知られており、簡単に行うことができる。
【０２８５】
細胞をハプテン化する一般的な方法および腫瘍細胞をハプテン化する特別な方法は、Ｂｅｒｄら、１９８６年５月、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｋ，４６，２５７２−２５７７、およびＢｅｒｄら、１９９１年５月、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１，２７３１−２７３４、に記載されており、ここに参照として採用される。さらなるハプテン化プロトコールは、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７（５：１）、１５９１−１５２６、１９７６、に開示されている。
【０２８６】
本発明に記載のハプテン化ＣＲＣＡ−１免疫原を製造するために使用されるのに適合し得るハプテン化の組成物及び方法は、参照により本明細書に組み込まれる以下の米国特許に記載されているものを包含する：１９９１年８月６日、Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚへ発行された米国特許第５，０３７，６４５号；１９９２年５月１２日、Ｓｈｉｏｓａｋａらへ発行された米国特許第５，１１２，６０６号；１９８５年７月２日、Ｓｔｅｖｅｎｓへ発行された米国特許第４，５２６，７１６号；１９８２年５月１１日、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎらへ発行された米国特許第４，３２９，２８１号；及び１９７７年５月１０日、Ｇｒｏｓｓへ発行された米国特許第４，０２２，８７８号。本発明のＣＲＣＡ−１免疫原を修飾するのに適合し得るペプチドの免疫原性を増強するペプチドワクチン及び方法はまた、Ｆｒａｎｃｉｓら、１９８９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：６５９〜６７６に記載されていて、これは参照により本明細書に組み込まれている。Ｓａｄら、１９９２  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７６：５９９〜６０３は、参照により本明細書に組み込まれているが、性腺刺激ホルモン放出ホルモンをジフテリアトキソイドへ結合することによって免疫治療ワクチンを製造する方法を教示する。ＣＲＣＡ−１免疫原も、本発明の免疫治療ワクチンを生産するために同じようにして結合され得る。ＭａｃＬｅａｎら、１９９３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６：２１５〜２２２は、参照により本明細書に組込まれているが、本発明の免疫治療ワクチンを生産するのに適合され得る、免疫治療ワクチンを生産するための結合方法を記載する。ハプテンは、ＣＲＣＡ−１免疫原に結合され得るアオガイヘモシアニンである。
【０２８７】
本発明のいくつかの側面に記載のワクチンは、ＣＲＣＡ−１免疫原と複合した製剤的に許容される担体を含む。医薬製剤はよく知られていて、そのようなタンパク質を含んでなる医薬組成物は、当業者により常法で製剤化され得る。好適な医薬担体は、この分野の標準的な参考文献であり、参照により本明細書に組込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載されている。本発明は、製剤的に許容される担体及びＣＲＣＡ−１免疫原を含む注射用医薬組成物に関する。ＣＲＣＡ−１免疫原は、好ましくは無菌であり、無菌の医薬担体と複合している。
【０２８８】
例えば、ある実施形態では、１種又はそれ以上のＣＲＣＡ−１翻訳産物又はそのフラグメント又はそのフラグメント又はそれを含むタンパク質が、製剤的に許容される担体と複合した溶液、懸濁液、乳濁液又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。そのような担体の例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び脂肪油のような非水性担体も使用され得る。担体又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性を維持する添加剤（例、緩衝液及び保存剤）を含有し得る。製剤は通常使用される技術によって滅菌される。
【０２８９】
注射用組成物は、例えば滅菌水のような希釈剤、電解質／デキストロース、植物起源の脂肪油、脂肪エステル又はプロピレングリコール及びポリエチレングリコールのようなポリオールの中にＣＲＣＡ−１免疫原を含み得る。注射用組成物は無菌であり、発熱性物質があってはならない。
【０２９０】
本発明のワクチンは、この免疫原物質が生体の免疫系に認識され、免疫応答を誘発するように表れることを可能にする任意の手段によって投与され得る。医薬組成物は腸管外的に、即ち、静脈内、皮下、筋肉内へ投与され得る。
【０２９１】
投与量は、特定薬剤の薬物動態特性、投与の形式及び経路；レシピエントの年齢、健康状態及び体重；症状の種類及び程度、同時療法の種類、治療頻度、及び所望される効果のような既知の要因に応じて変化する。防御的又は治療的に有効な免疫応答を誘導するためにある量の免疫原がデリバリーされる。当業者は、常法により投与量の範囲及び最適投与量を容易に決定し得る。
【０２９２】
以下の実施例は例示的なものであり、本発明を制限することを意図しない。
実施例
実施例１
上記のように、ＣＲＣＡ−１翻訳産物の結合成分は、抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は非ペプチドであり得るＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドである。ペプチド及び非ペプチド性のＣＣＫ  Ａ受容体に特異的なリガンドは、既知の技術を使用して同定され得る。
【０２９３】
この１０年間で、受容体とリガンド、例えばＣＲＣＡ−１翻訳産物と抗−ＣＲＣＡ−１翻訳産物抗体の特異的な高親和性の相互作用が、リガンドの３次元コンホメーションスペース及びリガンド結合に関わる分子の領域の相補的な３次元配置に基礎を有することが認識されてきた。さらに、様々な配列（アレイ）の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸及び有機分子が、その直線的な構造では天然のリガンドに関連しないが、コンホメーションスペースにおいては天然リガンドの３次元構造に似ている配置に組織化され得ることによって高い親和性及び特異性で受容体によって認識されることも認知されてきた。さらに、文献には、受容体の天然リガンドには関連しないが、高い親和性及び特異性をもって受容体と相互作用する個々の分子を将来的に同定するために、天然アミノ酸、非天然アミノ酸及び有機分子のこれらアレイの大きなライブラリーを産生することを当業者に可能にする技術が記載されてきた。従って、ＣＲＣＡ−１翻訳産物に特異的かつ緊密に結合し得るが、抗ＣＲＣＡ−１翻訳産物抗体とは構造上の関連性を有さない天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸又は有機分子のアレイを同定することは、当業者には比較的容易な作業なのである。
【０２９４】
ペプチドであるＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために、当業者は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物に結合するペプチドを同定するためにランダムペプチドライブラリーをスクリーニングする既知の任意の方法を使用し得る。ほとんどの方法の基本では、ターゲットに結合するペプチドが単離され配列決定される。ある方法では、特定のランダムペプチドのコード配列を包含する核酸分子へ各ランダムペプチドが連結される。それぞれコード配列の付いたランダムペプチドをＣＲＣＡ−１翻訳産物と接触させ、ＣＲＣＡ−１翻訳産物に結合しないペプチドを除去する。次いで、ＣＲＣＡ−１翻訳産物に結合するペプチドのコード配列を包含する核酸分子は、このペプチドのアミノ酸配列を決定すること並びに大量のペプチドを産生することのために使用され得る。空間位置が特定の合成、つまり特定のペプチドに対応する固体支持体上でペプチドライブラリーを産生することも可能である。そのような方法では、写真平板に似た工程をしばしば使用して、固体支持体上で多様なペプチドライブラリーを創出し、支持体上の空間位置が配列決定を可能にする。
【０２９５】
固体支持体上での有機化合物ライブラリーの産生も、例えばオリゴヌクレオチド及び糖のような非ペプチド化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを産生するために使用され得る。固体支持体上でのペプチドライブラリー産生の場合のように、支持体上の空間位置は特定の合成、故に特定の化合物に対応する。そのような方法では、写真平板に似た工程をしばしば使用して、固体支持体上で多様な化合物ライブラリーを創出し、支持体上の空間位置によりその化合物を産生した合成法の決定を可能にする。合成法が同定されれば、化合物の構造も知ることができる。
【０２９６】
Ｇａｌｌｏｐら、１９９４  Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２３３は、参照により本明細書に組込まれているが、ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすること及びそのようなライブラリーからターゲットタンパク質に結合するペプチドを同定することに関する様々な方法論のいくつかを解説する。これらの教示に倣えば、ペプチドであり、ＣＲＣＡ−１翻訳産物に特異的な結合成分として有用であるＣＲＣＡ−１翻訳産物に特異的なリガンドが、当業者により同定され得る。
【０２９７】
ファージ粒子上に表出されるペプチド及びタンパク質がＧａｌｌｏｐら、同上に記載されている。細菌感染に利用されるバクテリオファージの表面タンパク質をコードする遺伝子へ核酸のランダムアレイが挿入され得て、核酸のランダムアレイによりコードされるペプチドをその表面に発現するファージを産生する。ペプチドを表出するこれらファージは、特定のタンパク質、受容体、抗体等にこれらのペプチドが結合し得るかを決定するために利用され得る。ペプチドの同一性は、ペプチドを発現するファージ由来の組換えＤＮＡを配列決定することにより決定され得る。このアプローチには１つのライブラリーに膨大な量のペプチドアレイ（１０９個までの個別ペプチド）を産出する可能性がある。この技術を利用して、天然に存在する受容体リガンドとは配列相同性がない、血小板のフィブリノーゲン受容体に結合する新規ペプチドが同定された（Ｓｍｉｔｈら、１９９３  Ｇｅｎｅ  １２８：３７、参照により本明細書に組込まれている）。同様に、この技術は、ＭＨＣクラスＩＩ受容体（Ｈａｍｍｅｒら、１９９３  Ｃｅｌｌ  ７４：１９７、参照により本明細書に組込まれている）及びシャペロニン受容体（Ｂｌｏｎｄ−Ｅｌｇｕｉｎｄｉら、１９９３  Ｃｅｌｌ  ７５：７１７、これは参照により本明細書に組込まれている）に結合するペプチドを同定するために応用された。
【０２９８】
プラスミド上に表出されるペプチドがＧａｌｌｏｐら、同上に記載されている。このアプローチでは、ペプチドのライブラリーをコードするランダムオリゴヌクレオチドが特定のプラスミド上で発現され得て、その発現はｌａｃオペロンのような特定プロモーターの制御下にある。ペプチドは、ｌａｃオペロンの制御下で、ＬａｃＩタンパク質に結合した融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質がプラスミド上のｌａｃオペレーターと特異的に結合するので、ランダムペプチドはそれをコードする特定のＤＮＡ要素に結合する。この方法では、ペプチドの配列は、融合タンパク質に結合したＤＮＡのＰＣＲによって演繹され得る。これらタンパク質は、特定受容体に結合し得るかを決定するために、液相においてスクリーニングされ得る。この方法を利用して、特定の酵素に対する新規な基質が同定された（Ｓｃｈａｔｚ  １９９３）。
【０２９９】
Ｇａｌｌｏｐら、同上、にも記載されている、プラスミド上のペプチドライブラリーをコードするランダムオリゴヌクレオチドが無細胞系で発現される、上記技術のバリエーションも利用し得る。このアプローチでは、オリゴヌクレオチドのランダムアレイを含有する分子ＤＮＡライブラリーが構築され、これは細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で発現される。リガンドの同一性は、関心対象のｍＲＮＡを含有する新生の鎖ペプチド／ポリゾームの複合体を、受容体を含むアフィニティー樹脂上で精製し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した後に配列決定することによって決定される。この技術を利用すれば、大量のライブラリー（１０１１組換え体まで）の産生が可能になる。ダイノルフィン特異的に向けられた抗体を認識するペプチドは、この技術を利用して同定された（Ｃｕｌｌら、１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５，これは参照により本明細書に組込まれている）。
【０３００】
受容体スクリーニングのためのペプチドライブラリーは化学合成によって産生され得る。例えば、Ｇａｌｌｏｐら、同上に記載されるような多重ペプチド合成のアプローチを利用して多数の多様なペプチドが同時に産生された。１つの応用では、標準的な固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成によってポリアミドマイクロタイタープレート上でランダムペプチドが産生され（マルチピン合成）、次いでこれは標準的な競合結合アッセイにおいて受容体結合と競合するその能力でスクリーニングされる（Ｗａｎｇら、１９９３  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４４７、これは参照により本明細書に組込まれている）。実際、このアプローチを利用して、サブスタンスＰ受容体に結合する新規ペプチドが同定された（Ｗａｎｇら、同上）。同様に、固体支持体樹脂のバッグが様々なアミノ酸と連続的にインキュベートされ、様々なペプチドのアレイを産生する「ティーバッグ」法を利用する多重ペプチド合成によって、ペプチドライブラリーが構築され得る（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。このアプローチを利用して、インテグリン受容体（Ｒｕｇｇｅｒｉら、１９８６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５７０８、これは参照により本明細書に組込まれている）及び神経ペプチドＹ受容体（Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒら、１９９０  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６：５２２、これは参照により本明細書に組込まれている）に結合するペプチドが同定された。
【０３０１】
一般に、コンビナトリアル・ライブラリーの産生及び有用性は、（１）構成単位の多様なアレイを産生する方法、（２）所望の機能を産生するアレイのメンバーを同定する方法及び（３）そのメンバーの構造を解読する方法に依存する。これらの制約に対するいくつかのアプローチが規定された。
【０３０２】
以下は、本発明に記載のＣＲＣＡ−１翻訳産物特異的なリガンドを同定する方法に使用され得るライブラリー産生の方法に関する記載である。
【０３０３】
上記アプローチの改良法を利用して、アミノ酸のような化学的構成単位セットのメンバーをあらゆる可能な組み合わせで結合することによって、分子が膨大に多様化したライブラリーを産生することができる（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。１つのアプローチでは、活性化モノマーの混合物がサイクルごとに固体支持体上で伸びてゆくアミノ酸の鎖に結合される。これは多価合成系である。
【０３０４】
また、分割合成は、単一の構成単位だけを含有する、個々の反応で伸びてゆく鎖をインキュベートすることを含む。すべての反応由来の樹脂は、付着した後で混合され、次の結合工程のために別々の反応へ配分される。これらアプローチはｎｘ個のスクリーニング用の様々なペプチドの確率論的な収集物を産生する（ｎは構成単位の数であり、ｘは反応サイクルの数である）。
【０３０５】
別のやり方では、１種又はそれ以上の位置が既知のアミノ酸を含有するが、残りの部分はランダムである、分子のアレイが産生され得る（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。これらは、所望の活性を有するメンバーについてスクリーニングされる限定されたライブラリーを産生する。これらメンバーは、同定され、その構造が決定され、他の位置に規定のアミノ酸を含有する構造が再生され、スクリーニングされる。この反復的なアプローチにより、受容体のコンホメーション結合ポケットを認識するのに最適であるペプチドが最終的に産生される。
【０３０６】
さらに、アレイはペプチドを形成するアミノ酸に限定されず、有機分子の直線的又は非直線的なアレイへ拡張され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、１９９４  Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ  ３７：１３８５、これは参照により本明細書に組込まれている）。実際、ランダムに配列した無機の構成単位のライブラリーを産生するこのアプローチを利用して、７−膜貫通受容体に結合するリガンドが同定された（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６２８、これは参照により本明細書に組込まれている）。
【０３０７】
現在では、合成後に化学的側鎖基及び結合を変化させて受容体との相互作用について試験する「デザイナー」アレイをもたらすように修飾され得るライブラリーが構築されている（Ｏｓｔｅｒｅｓｈら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８、これは参照により本明細書に組込まれている）。「ライブラリー由来のライブラリー」を産生するこの技術は、グラム陽性菌に対する選択的な抗菌活性のある化合物を産生するペプチドライブラリーの過メチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）へ応用された。
【０３０８】
アミノ酸の特定の構造アレイではない薬理モチーフのアレイを発現するライブラリーも構築されている（Ｓｅｐｅｔｏｖら、１９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：５４２６、これは参照により本明細書に組込まれている）。この技術は受容体に対する特異的なアフィニティーを有する構造モチーフを同定しようとするものであり、構造活性相関を規定するライブラリーを利用して、さらなる洗練化へ改良され得る。モチーフライブラリーを捜し、「ライブラリーのライブラリー」を産生するこのアプローチを利用すれば、ライブラリー検査の初期フェーズにおいてスクリーニングするのに必要な成分メンバーの数が減らせる。
【０３０９】
以下は、本発明に記載のＣＲＣＡ−１翻訳産物特異的なリガンドを、ランダムに産生された分子ライブラリーから同定する方法に関する記載である。
【０３１０】
受容体と相互作用するライブラリーの成分は、固体支持体に固定化された受容体に対するその結合によって同定され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、同上）。
【０３１１】
それらはまた、同起源の受容体に結合することについてネーティブなリガンドと液相において競合する能力によって同定され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、同上）。
【０３１２】
成分は、固体支持体に固定化されるとき、可溶性の受容体に結合することによって同定され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、同上）。
【０３１３】
受容体に結合するライブラリーのメンバーが同定されると、構造を同定して、研究対象とする大量を産生するために又は構造活性相関の研究用に更なる類似体を開発するために、このメンバーの構造を解明（演繹）しなければならない。以下は、本発明に記載の潜在的なＣＲＣＡ−１翻訳産物特異的なリガンドとして同定される分子の構造を演繹する解読法に関する記載である。
【０３１４】
ペプチドライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面上で発現され得る（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。受容体と相互作用するペプチドが同定されれば、その構造は、ファージからＤＮＡを単離してその配列をＰＣＲによって決定することによって演繹され得る。
【０３１５】
Ｌａｃオペロンの制御下にあって、プラスミド上で発現されるライブラリーが解読され得るのは、そのペプチドをコードするプラスミド上のｌａｃオペロンと特異的に相互作用するｌａｃＩタンパク質とこれらのペプチドが融合しているからである（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。この構造は，ｌａｃＩタンパク質に結合したプラスミドを単離してヌクレオチド及びペプチド配列をＰＣＲによって演繹することによって演繹され得る。
【０３１６】
プラスミド上で発現されるライブラリーはまた、転写／翻訳系を利用する無細胞系において発現され得る（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。このパラダイムでは、受容体と相互作用するタンパク質はその結合したリボゾーム及びｍＲＮＡとともに単離される。ペプチドの配列は結合したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって演繹される。
【０３１７】
ライブラリー構築は、ライブラリーの任意メンバーの構造が基質アレイ内のその位置を決定することにより演繹されるように、写真平板法と一体化され得る（Ｇａｌｌｏｐら、同上）。この技術が位置アドレス呼出し（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）と言われるのは、メンバーの正確な位置によって構造情報が演繹され得るからである。
【０３１８】
ライブラリーのメンバーはまた、他の分子の同定可能なアレイでライブラリーにタグを付けることによって同定され得る（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２、これは参照により本明細書に組込まれている、及びＧａｌｌｏｐら、同上）。この技術は、配列をコードするファージのプラスミドｔｏペプチドを結合する上記方法の改良である。ある方法は、ペプチドの連続的な合成史（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｉｓｔｏｒｙ）をコードするヌクレオチドのアレイを利用する。ここでは、伸長するペプチドにヌクレオチドが連続的に結合し、ＰＣＲによって解読されて結合したペプチドの構造が明らかになる。別のやり方では、小さな有機分子のアレイがペプチドの連続的な合成史をコードする配列決定可能なタグとして利用され得る。ここでは、ヌクレオチドは伸長するペプチドへ連続的に結合し、ＰＣＲによって解読され結合したペプチドの構造が明らかになる。別のやり方では、小さな有機分子のアレイがライブラリーメンバーの連続的な合成史をコードする配列決定しうるタグとして利用され得る。
【０３１９】
最終的には、ライブラリーメンバーの構造はアミノ酸配列分析によって直接決定され得る。
【０３２０】
以下の特許は、いずれも参照により本明細書に組込まれているが、ランダムペプチド又は非ペプチドライブラリーを合成し、そのようなライブラリーをスクリーニングしてターゲットタンパク質に結合する化合物を同定する方法を記載する。本発明に使用されるように、ＣＲＣＡ−１翻訳産物は、以下の特許に開示されるようにして産生されスクリーニングされるペプチド及び非ペプチドリガンドを同定するために使用されるターゲットであり得る。
【０３２１】
１９９３年１２月１４日にＳｃｈａｔｚらへ発行された米国特許第５，２７０，１７０号及び１９９４年８月１６日にＳｃｈａｔｚらへ発行された米国特許第５，３３８，６６５号は、いずれも参照により本明細書に組込まれているが、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得るペプチドライブラリー及びスクリーニング方法に言及する。
【０３２２】
１９９５年３月７日にＤｉｌｌｏｎらへ発行された米国特許第５，３９５，７５０号は、参照により本明細書に組込まれているが、前決定された抗原に結合するタンパク質を産生する方法に言及する。そのような方法は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを産生するために使用され得る。
【０３２３】
１９９３年６月２９日にＬａｄｎｅｒらへ発行された米国特許第５，２２３，４０９号は、参照により本明細書に組込まれているが、新規の結合タンパク質へ向けられた展開に言及する。このようなタンパク質は、そこで開示されるように、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために産生され、スクリーニングされ得る。
【０３２４】
１９９４年１１月２２日にＶｅｎｔｏｎらへ発行された米国特許第５，３６６，８６２号は、参照により本明細書に組込まれているが、有用なペプチドを産生してスクリーニングする方法に言及する。そこに記載される方法はＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３２５】
１９９４年８月２３日にＫａｕｖａｒへ発行された米国特許第５，３４０，４７４号、並びに米国特許第５，１３３，８６６号、米国特許第４，９６３，２６３号及び米国特許第５，２１７，８６９号は、いずれも参照により本明細書に組込まれているが、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３２６】
１９９５年４月１１日にＰｉｒｒｕｎｇらへ発行された米国特許第５，４０５，７８３号は、参照により本明細書に組込まれているが、ポリマーアレイの大規模な写真平板固相合成に言及する。その教示は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３２７】
１９９２年９月１日にＰｉｒｒｕｎｇらへ発行された米国特許第５，１４３，８５４号は、参照により本明細書に組込まれているが、ポリペプチドの大規模な写真平板固相合成及びその受容体結合スクリーニングに言及する。
【０３２８】
１９９５年１月２４日にＷｉｎｋｌｅｒらへ発行された米国特許第５，３８４，２６１号は、参照により本明細書に組込まれているが、機械的に指令されたフローパターンを使用するごく大規模な固定化ポリマーの合成に言及する。このような方法は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために有用である。
【０３２９】
１９９３年６月２２日にＣｏｏｌｉｄｇｅらへ発行された米国特許第５，２２１，７３６号は、参照により本明細書に組込まれているが、イムノアフィニティー技術を使用する連続的なペプチド及びオリゴヌクレオチド合成に言及する。このような技術は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３３０】
１９９５年５月２日にＭｃＧａｌｌらへ発行された米国特許第５，４１２，０８７号は、参照により本明細書に組込まれているが、オリゴヌクレオチド及び他の生物学的ポリマーを空間的に呼出し得るように表面上に固定化することに言及する。このような方法は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３３１】
１９９４年６月２８日にＣｏｄｙらへ発行された米国特許第５，３２４，４８３号は、参照により本明細書に組込まれているが、多重同時合成の装置に言及する。そこで開示された装置及び方法は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するためにスクリーニングされ得る多くの化合物を産生するために使用され得る。
【０３３２】
１９９３年１０月１２日にＢａｒｒｅｔｔらへ発行された米国特許第５，２５２，７４３号は、参照により本明細書に組込まれているが、抗リガンドを空間的に呼出し得るように表面上に固定化することに言及する。そこに記載された方法及び組成物は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３３３】
１９９５年６月１３日にＦｏｄｅｒらへ発行された米国特許第５，４２４，１８６号は、参照により本明細書に組込まれているが、ごく大規模な固定化ポリマー合成に言及する。そこに記載されたオリゴヌクレオチドの合成方法は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３３４】
１９９５年５月３０日にＣａｍｐｂｅｌｌへ発行された米国特許第５，４２０，３２８号は、参照により本明細書に組込まれているが、ホスホネートエステルの合成方法に言及する。そのように産生されるホスホネートエステルは、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドである化合物を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０３３５】
１９９４年２月２２日にＥｌｌｍａｎへ発行された米国特許第５，２８８，５１４号は、参照により本明細書に組込まれているが、固体支持体上でのベンゾジアゼピン化合物の固相及びコンビナトリアル合成に言及する。そのような方法及び化合物は、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドを同定するために使用され得る。
【０３３６】
上記のように、ＣＲＣＡ−１翻訳産物リガンドはまた抗体及びそのフラグメントであり得る。実際、これら受容体特有の決定基に対して産生される抗体は、そのタンパク質、しかもそのタンパク質だけを認識し、従って、この特定マーカーに対する新規の診断薬及び治療薬を指向するために使用され得る特定のターゲティング分子として役立ち得る。さらに、これらの抗体は、直腸結腸癌細胞の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断するために、生物学的なサンプルにおいてＣＲＣＡ−１翻訳産物又はそのフラグメントの存在を同定するために使用され得る。
【０３３７】
実施例２
グアニリルシクラーゼ受容体ファミリーのあるメンバーは、選択的スプライシングを起こすことが観察されている。ナトリウム利尿ペプチドＡＮＰ及びＢＮＰの受容体であるラットＧＣＡは、細胞外の傍膜領域に９ｂｐの配列が挿入された、選択的にスプライスされた形態であるＧＣＡ１として発現される（Ｔａｌｌｅｒｉｃｏ−Ｍｅｌｎｙｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０９：９３０〜９３５，１９９５）。この配列変化が結合及び触媒機能に対する影響は依然不明である。Ｃ−タイプのナトリウム利尿ペプチド受容体であるラットＧＣＢは、細胞内の傍膜領域で７５ｂｐが欠失した、選択的にスプライスされた形態であるＧＣＢ２として発現される（Ｏｈｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１８３：７４３〜７４９，１９９２）。この変異体は主として中枢神経系で発現され（Ｆｒａｎｃｏｅｕｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ１７２〜Ｓ１７４，１９９５）、完全長のＧＣＢと同じ結合親和性を有するが、リガンド−受容体相互作用はグアニリルシクラーゼ活性化やｃＧＭＰ産生に共役しない。末端が切れたナトリウム利尿性ペプチドのグアニリルシクラーゼ受容体である、ウシのＡＮＰクリアランス受容体は、選択的にスプライスしてＳｅｒ４７２−Ｇｌｙ４７３がＣｙｓ４７２に置換された変異体、つまり、追加的なシステイン残基をもった変異体を形成する（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６８：５１６２〜５１６７，１９９３）。クリアランス受容体の野生型及び変異体は同一の機能特性を有する。ラットＧＣＣ触媒ドメインには１５９ヌクレオチドの欠失が報告された（Ｌｏｎｄｏｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２７３：Ｇ９３〜Ｇ１０５，１９９７）。しかしながら、この転写物は選択的スプライシングによるのとは別の遺伝子から発生するらしい。この配列変化の触媒機能に対する意義は不明である。
【０３３８】
本研究は、ヒトでは、完全長の野生型転写物及び細胞外リガンド結合ドメインをコードする領域の１４２ｂｐが欠失している選択的にスプライスされた転写物としてＧＣＣが発現されることを示す。スプライシングはエクソン１の選択的な５’アクセプター部位で起こる。これによりリーディングフレームがシフトし、２３アミノ酸でシグナルペプチドが形成される野生型転写物の２６アミノ酸だけをコードする転写物が産生される（Ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６６：１７９１２〜１７９１８，１９９１、これは参照により本明細書に組込まれている）。選択的にスプライスされたＧＣＣ変異体の発現は野生型ＧＣＣのそれに匹敵し、腸由来の組織に限定される（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１０７：１６５３〜１６６１，１９９４；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１４８２７〜１４８３２，１９９６；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ．Ｒｅｃｔｕｍ．３９：１７１〜１８１，１９９６）。
【０３３９】
方法
細胞培養及び臨床標本
Ｔ８４ヒト結腸細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ロックビル、ＭＤ）を１５０ｃｍ２組織培養フラスコに入れたＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ／ＢＲＬ−ライフ・テクノロジーズ、ゲイサーズバーグ、ＭＤ）にて集密状態になるまで増殖させた。トマス・ジェファーソン大学病院及びヒト組織共同ネットワーク（フィラデルフィア、ＰＡ）の内部審査委員会が承認したプロトコールの下で組織を入手した。組織サンプルは、受領後すぐに液体窒素で瞬間凍結し、乳鉢及び乳棒を使用して粉砕した。
【０３４０】
核酸抽出
単一の試薬（ＴｒｉＺｏｌ試薬；ギブコ／ＢＲＬ）を使用するグアニジウムチオシアネート酸／フェノール／クロロホルム法の改良版によって全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＵＶ分光法によって定量した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ・ｍＲＮＡキット（キアジェン、チャツワース、ＣＡ）を利用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。ＲＮＡ調製物は、ジエチルピロカーボネート処理した水（ＲＮアーゼフリー）にて−８０℃で保存した。
【０３４１】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
ＤｅｌｔａＣｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍのサーモサイクラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ，サンディエゴ、ＣＡ）にて０．２ｍＬの熱サイクリング管（ＴＫＲ・バイオテクプロダクツ、ハンチンドンバレー、ＰＡ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各１ｍＭ、ＲＮアーゼ阻害剤１ユニット／μＬ及び１μＭアンチセンスプライマーを全量２０μＬに含有する反応液において、トリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素ＸＬ０．２５ユニット／μＬ（プロメガ、マジソン、ＷＩ）を使用して、ＲＮＡ（約３．５μｇ）の逆転写を実施した。熱サイクリングは、１サイクルにつき「５８℃３０分、９９℃５分及び４℃５分」で進行した。得られたｃＤＮＡを同一の反応管においてＰＣＲにかけ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．５μＭのセンスプライマーを含む１００μＬにＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）２．５ユニットを有する液と混合した。インキュベーション及び熱サイクリングの条件は、「９５℃２分を１サイクル、９４℃３０秒、５８℃３０秒及び７２℃９０秒を３５サイクル、７２℃７分を１サイクル」であった。反応生成物は４％ＮｕＳｉｅｖｅ（Ｒ）３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ、ロックランド、ＭＥ）にて電気泳動によって分離し、増幅生成物は臭化エチジウムによって視覚化した。ヒトβ−アクチンに特異的なプライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、パロアルト、ＣＡ）を陽性対照として使用した。増幅生成物の同一性を配列決定分析によって確認した。
【０３４２】
ＧＣＣｖａｒのクローニング
ＧＣＣ特異的なセンス（８１−９６）及びアンチセンス（１８３４−１８５３）プライマーを使用して、Ｔ８４全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ヌクレオチドの番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ配列のＳ５７５５１（Ｓｉｎｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．１７９：１４５５〜１４６３，１９９１、これは参照により本明細書に組込まれている）を参照にする。増幅生成物は、電気泳動により１％アガロース（シグマ、セントルイス、ＭＯ）ゲルで分離した。ＧＣＣの細胞外及び膜貫通領域（〜１７７２ｂｐ）を含有するフラグメントである、唯一のＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースから抽出し、ｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ）へ連結し、ＤＨ５αコンピテント細胞（ギブコ／ＢＲＬ）へ形質転換された。細菌からプラスミドＤＮＡを単離し、配列を決定し、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ（商標）プログラムを使用して配列を分析した。
【０３４３】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト結腸組織由来の全ＲＮＡについて、欠損領域に隣接する特定のセンス（１２６−１４７）及びアンチセンス（４１６−４３５）プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。１ピコモルのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（アマシャムライフサイエンス、クリーブランド、ＯＨ）をＰＣＲ反応混合物へ加え、放射標識ヌクレオチドの増幅生成物への取り込みを可能にした。得られたバンド、ＧＣＣｖａｒ（１６８ｂｐ）及びＧＣＣ（３０９ｂｐ）をゲルから切り出し、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ（商標）ＢＤシンチレーション液（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含有する７ｍＬシンチレーションバイアルの中へ入れた。３２Ｐレベルを定量化する１９００  ＴＲ液体シンチレーション分析機（パッカード・インスツルメンツ、メリデン、ＣＴ）にてサンプルを計数した。ＧＣＣｖａｒ／ＧＣＣ比をこれら転写物の相対的な発現の尺度として使用した。増幅生成物における放射活性は各生成物におけるｄＣＴＰ残基の数へ標準化された（８８／ＧＣＣｖａｒ；１６０／ＧＣＣ）。この技術を利用して、５種の異なるヒト結腸組織サンプルを同一２検体で分析した。
【０３４４】
タンパク質の発現及び検出
ポリメラーゼ連鎖反応を使用する重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）により、ＧＣＣｖａｒｃＤＮＡ転写物にｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）のタグを付けた。ＧＣＣｖａｒｃＤＮＡクローンを増幅し、ｃ−ｍｙｃエピトープを予測される終止コドンの近傍に挿入した。タグの付いたＧＣＣｖａｒｃＤＮＡをｐＲｃ／ＣＭＶ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、ＣＡ）へ連結し、リポフェクタミン試薬（ギブコ／ＢＲＬ）を使用してＣＯＳ−７細胞へトランスフェクトした。ｐＲｃ／ＣＭＶ２ベクターを陰性対照として使用し、発現ベクターｐＭＴ２でｃ−ｍｙｃエピトープのタグが付いたＧＣＣクローンを陽性対照として使用した。細胞は、トランスフェクト後２４時間、Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ還元血清培地（ギブコ／ＢＲＬ）２ｍＬにて増殖させた。細胞の上から培地を採取し、１ｘＰＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（Ｒ）−１００、１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム、３．５ｍＭドデシル硫酸ナトリウム、ロイペプチン０．５μｇ／ｍＬ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ペプスタチン１μｇ／ｍＬ及び０．２ｍＭ  ＰＭＳＦの溶液を使用して細胞を溶解し、タンパク質を可溶化した。タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ヘラクレス、ＣＡ）を使用して定量した。全細胞溶解液のタンパク質の約１４０μｇ、及び採取した培地の１．４ｍＬを、４％ビーズ化アガロース上に固定化されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（シグマ）の存在下で、ｃ−ｍｙｃ抗体（ｃ−ｍｙｃ（Ａｂ−１）；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ，ラジョラ、ＣＡ）１μｇを用いて免疫沈降させた。成形済みの４−２０％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（フィッシャーサイエンティフィック）上で免疫沈降物を分離し、一晩１５ボルトで、電気泳動的転写によってＰＶＤＦ膜へトランスファーさせた。１０ｍＭ  トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＴＷＥＥＮ（Ｒ）−２０及び５％脱脂粉乳を含有する溶液を用いてブロットを遮断した。この膜をｃ−ｍｙｃ抗体４０μｇとともにインキュベートし、洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（サンタクルツバイオテクノロジー、サンタクルツ、ＣＡ）の１０，０００倍希釈液とともにインキュベートし、再洗浄した。ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロッティングシステム（アマシャム・ライフサイエンス）を使用するオートラジオグラフィー（約１７時間露出）によってタンパク質を検出した。
【０３４５】
その他
平均値及び平均値の標準誤差は、マイクロソフトのＥｘｃｅｌ（商標）を利用して計算した。試験結果は少なくとも３回の実験を代表する。実験は少なくとも同一２検体で実施した。試薬はすべて市販品から入手し、最高の分析グレードであった。
【０３４６】
結果
ＲＴ−ＰＣＲを利用し、ＧＣＣｖａｒをコードするｃＤＮＡを単離した。ＧＣＣｖａｒクローンの配列は、翻訳開始コドンから７２ｂｐ後に１４２ｂｐの欠失が起きている他はＧＣＣのそれと同一である。スプライシングが起こるのは５’ドナー部位のコンセンサス配列の内部である。ＧＣＣのｃＤＮＡ転写物は、５’スプライス部位のコンセンサス配列（Ｃ／Ａ）−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｕ−（Ａ／Ｇ）−Ａ−Ｇ−Ｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）の正確な対である、Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）配列を含有する。選択的スプライシングは２つのグアニンヌクレオチドの間で起こり、ＧＣＣｖａｒの第一エクソンの未成熟な末端を表す。野生型のＧＣＣ転写物では、第一エクソンは開始Ａ−Ｔ−Ｇの２１４ｂｐ後で終結する。ＧＣＣｖａｒの第一エクソンでは末端が切れているので、翻訳リーディングフレームにシフトが生じる。野生型の開始コドンがコンピテントであると仮定すると、ＧＣＣｖａｒ転写物はＧＣＣタンパク質の最初の２５アミノ酸に同一の２６アミノ酸ペプチドをコードすることになる。しかしながら、２６位の残基はバリンからアラニンへ変化し、２７位のコドンは終止シグナルを生じるだろう。野生型のＧＣＣ転写物では、第一エクソンの末端は、７２位のアミノ酸としてアラニンを生じ、第二エクソン由来の２つのヌクレオチドとともに、７３位にはグリシンを生じる。
【０３４７】
ヒト結腸、回腸及び結腸癌組織及びヒト癌細胞系のＴ８４、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ６２０、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３及びＮＣＩからの全ＲＮＡにおいてＧＣＣｖａｒ（１６８ｂｐ）とＧＣＣ（３０９ｂｐ）の両方を検出するために、センス（１２６−１４７）及びアンチセンス（４１６−４３５）プライマーが使用された。これらのプライマーを利用すると、ヒト膵臓、子宮、肺、腎臓又はＨＳ７６６Ｔ細胞系からの全ＲＮＡには、ＧＣＣもＧＣＣｖａｒも検出されなかった。同様に、結腸、回腸及び結腸癌組織及びＴ８４、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ６２０、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３及びＮＣＩからの全ＲＮＡにおいてＧＣＣｖａｒ（３７８ｂｐ）を特異的に検出するために、欠失領域（１８０〜１９２＋３３５〜３４３）に及ぶセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（６７７〜６９９）が使用された。膵臓、子宮、肺、腎臓又はＨＳ７６６Ｔ細胞系では検出しなかった。以前の試験では、センス（８２８−８５０）及びアンチセンス（１０６８−１０９０）プライマーを使用して、ヒトではＧＣＣが腸組織だけで特異的に発現され、腸外の組織では発現されていないことを示した。これらプライマーは、ＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒがヌクレオチド配列において同一である欠損部分から下流の領域を増幅し、これら異なる転写物から判別不能な増幅生成物を生じる。今回の試験では、このプライマーセットを使用して２５６ｂｐ産物が検出され、結腸、回腸、結腸癌組織及びＴ８４、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ６２０、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３及びＮＣＩ細胞においてＧＣＣ及び／又はＧＣＣｖａｒの発現を確認したが、膵臓、子宮、肺、腎臓又はＨＳ７６６Ｔ細胞系では発現が確認されなかった。増幅生成物の同一性は配列決定分析によって証明した。β−アクチン特異的なプライマーは各サンプルについて増幅生成物を産出し、この分析に利用されたＲＮＡの完全性を示した。
【０３４８】
全ＲＮＡからＴ８４細胞及びヒト結腸のｍＲＮＡを単離した。これらのサンプルを、全ＲＮＡにおいてＧＣＣｖａｒの発現を検討するのに使用したのと同じプライマーを利用してスクリーニングした。欠失領域に隣接する特定のプライマーは、結腸及びＴ８４のｍＲＮＡにおいてＧＣＣ（３０９ｂｐ）並びにＧＣＣｖａｒ（１６８ｂｐ）を検出した。同様に、３７８ｂｐの増幅生成物を産生する欠失領域を網羅するセンスプライマーを利用することにより、結腸及びＴ８４のｍＲＮＡにおいてＧＣＣｖａｒが特異的に検出された。ＧＣＣ及び／又はＧＣＣｖａｒも、両転写物における同一領域を増幅して単一の２５６ｂｐ産物を産生するプライマーを使用することによって検出された。また、β−アクチン特異的なプライマーは各サンプルについて増幅生成物を産出し、この分析に利用されたＲＮＡの完全性を示した。
【０３４９】
欠失領域に隣接する特定のプライマーを使用して、ヒト結腸から単離されるＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒの全ＲＮＡ発現レベルを比較した。α３２Ｐ−ｄＣＴＰを利用してＰＣＲ反応混合液において半定量的なＲＴ−ＰＣＲを実施した。増幅生成物における放射活性は各生成物におけるｄＣＴＰ残基の数へ標準化した（８８／ＧＣＣｖａｒ；１６０／ＧＣＣ）。ヒト腸におけるＧＣＣｖａｒの全ＲＮＡはＧＣＣのそれよりも４．４±０．７（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）倍豊富であった（表１）。
【０３５０】
存在が疑われる２６アミノ酸のＧＣＣｖａｒペプチドの発現を検出するために、２７位の終止コドンの近傍にｃ−ｍｙｃエピトープを挿入した。ＧＣＣｖａｒをコードするｃＤＮＡ組換え体の発現は、培地又は細胞溶解液サンプルのいずれでも検出可能なタンパク質産物を産生しなかった。このペプチドは、エピトープタグ及び生のシグナルペプチドを包含して４ｋＤａのサイズであると予測された。このシグナルペプチドが開裂すれば、ペプチドは１．４ｋＤａとなっただろう。陰性対照である発現ベクターだけの場合と比較して、明瞭なタンパク質のバンドは検出されなかった。陽性対照であるＧＣＣをコードするｃＤＮＡの組換え体の発現は、細胞溶解液サンプルにおいて、明瞭な高分子量のタンパク質産物（約１２０ｋＤａ）を産生した。これは報告されている成熟ＧＣＣタンパク質のサイズに相当する。
【０３５１】
考察
本研究は、ヒトの腸細胞においてＧＣＣが選択的プロセシングをして変異転写物ＧＣＣｖａｒを産生することを示す。ＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒは、ＧＣＣｖａｒ転写物の第一エクソンの３’末端で１４２ｂｐの欠失が起きている他は同一である。この第一エクソンで末端が切れているためにフレームシフトが生じ、２７位のコドンで翻訳終止シグナルになる。しかしながら、ＧＣＣのネーティブな翻訳開始部位は、ＧＣＣｖａｒでは活性でない可能性がある。ｃ−ｍｙｃエピトープのタグが付いたＧＣＣｖａｒを使用する組換え発現試験では、このタグをネーティブな開始部位に正しいフレームで挿入したとき、検出可能なタンパク質産物は産生されなかった。このことは、ネーティブな開始部位がもはや活性ではないか、又はペプチド生成物が創出されるとすぐにタンパク質分解によって壊されてしまうかのいずれかを示している。
【０３５２】
ＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒは、ヒト結腸、回腸、結腸癌組織及びＴ８４、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ６２０、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３及びＮＣＩ細胞からの全ＲＮＡに検出されたが、ヒト肺、腎臓、膵臓、子宮、及びＨＳ７６６Ｔ細胞系からの全ＲＮＡでは検出されず、腸外の組織又は細胞ではなく、腸組織及び細胞においてこれら転写物が特異的に発現されることを示した。ＧＣＣｖａｒがヒトの腸細胞由来の全ＲＮＡ及びｍＲＮＡで検出されたことは、この転写物が核内に閉じ込められたＲＮＡ編集の不全産物ではなく、成熟した細胞質メッセージへプロセシングされることを示している。
【０３５３】
本研究は、ＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒから同一の増幅生成物を産生するプライマーを利用して、増幅生成物が腸由来の組織及び細胞だけに検出され、腸外の組織由来のものからは検出されなかったという、ヒト組織におけるＧＣＣ発現の特異性を検証したこれまでの試験結果を支持する。まとめると、これらのデータは、ヒトではＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒか腸由来の組織だけで特異的に発現されているという示唆を裏付ける。
【０３５４】
選択的スプライシングは、前駆体ｍＲＮＡの内部に様々な組み合わせのスプライス部位が存在していることを反映する。異なる転写物が変異タンパク質をコードし、そのいくつかは特徴的な生理機能を有する。スプライシングは２工程プロセスで起こる。先ず、プレｍＲＮＡが５’スプライス部位で開裂し、直線状の第一エクソンＲＮＡ種及びイントロン−第二エクソンＲＮＡ種をラリアット配置で生成する。５’スプライス部位のグアノシン及び３’スプライス部位近傍アデノシンの２’−ヒドロキシルが２’−５’ホスホジエステル結合、つまりＲＮＡの分岐点を形成し、ラリアットの形成を誘導する。次いで、プレｍＲＮＡが３’スプライス部位で開裂し、エクソンはともに連結してｍＲＮＡ転写物及び切出されたラリアット配置のイントロンを形成する。５’ドナー部位と３’アクセプター部位の両方についてコンセンサスＲＮＡ配列が存在する。しかしながら、分岐点の位置は、３’スプライス部位の決定にとってより重要である可能性がある。なぜなら、スキャニングプロセスが分岐点の最初のＡ−Ｇ下流部位を同定すると考えられているからである。ＲＮＡの２次構造、立体束縛、スプライス連結のアフィニティー及びスプライス部位の競合、といったことがすべて選択的スプライシングを調節する。
【０３５５】
グアニリルサイクラーゼファミリーにおける他の変異体に比較してＧＣＣｖａｒが独特であるように見えるのは、未成熟の翻訳停止をコードすることが初めて報告されているからである。グアニリルシクラーゼスプライス変異体では、ヌクレオチドの付加又は欠失にかかわらず、正確な翻訳リーディングフレームをそれぞれが保持している。９ｂｐ挿入により形成されるＧＣＡ１は、ラットの副腎及び腎乳頭でＧＣＡと同時発現されるが、リガンド親和性、シグナル伝達又は受容体内部化を変化させる可能性がある。ＧＣＢ２は７５ｂｐの欠失を有し、グアニリルシクラーゼの活性化とは共役しないナトリウム利尿ペプチド受容体を産生する。余分のシステイン残基を含有するＡＮＰクリアランス受容体の変異体は、ネーティブな受容体とは機能的に区別され得ない。変異クリアランス受容体における余分なシステインは、野生型受容体によって形成されるダイマーより大きいジスルフィド結合オリゴマーを形成する可能性がある。
【０３５６】
結論として、本試験は、ヒトではＧＣＣが完全長の野生型転写物、及び細胞外のリガンド結合ドメインをコードする領域から欠失した１４２ｂｐを欠く選択的にスプライスされる転写物として発現されることを示している。選択的スプライシングは、エクソン１の選択的５’スプライスアクセプター部位の使用から生じる。選択的スプライシングによりリーディングフレームがシフトし、２７位のコドンで未成熟の翻訳終止シグナルが形成される。選択的にスプライスされるＧＣＣ変異体の発現の特異性は、野生型ＧＣＣのそれに匹敵し、腸由来の組織に限定されている。興味深いことに、腸細胞は野生型ＧＣＣ転写物よりも多くのＧＣＣｖａｒ転写物を含有しているが、その意義は依然不明である。しかしながら、ＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒの相対量を操作することは、腸細胞が機能的なＧＣＣ発現を調節する１つの機構である可能性がある。
【０３５７】
【表１】
表１．ヒト腸におけるＧＣＣ及びＧＣＣｖａｒ発現の比較ａ
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ａ．欠失領域に隣接する特定のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ヒト結腸由来の全ＲＮＡを逆転写し、α３２Ｐ−ｄＣＴＰを含有するＰＣＲ混合液を使用して増幅した。アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分離した。増幅生成物、ＧＣＣｖａｒ（１６８ｂｐ）及びＧＣＣ（３０９ｂｐ）を切出し、シンチレーション分光法によって、取り込まれた３２Ｐを定量した。５種の異なる結腸サンプルを利用し、各サンプルは少なくとも同一２検体で分析した。
ｂ．ＧＣＣｖａｒ（増幅生成物におけるＣＰＭ／ｄＣＴＰ）とＧＣＣ（増幅生成物におけるＣＰＭ／ｄＣＴＰ）の比。増幅生成物における放射活性はその生成物におけるｄＣＴＰ残基の数へ標準化した（８８／ＧＣＣｖａｒ；１６０／ＧＣＣ）。
ｃ．ｎ＝５
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はヒトＳＴレセプターｍＲＮＡ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ寄託番号Ｓ５７５５１）（本明細書において援用される）のヌクレオチド配列を示している。斜線を付けた領域はＣＲＣＡ−１転写体で欠失されている配列であり、二つの枠で囲まれた”ＧＧ”配列の一つまたは各々の枠の一つのＧが含まれている。開始コドン、ＡＴＧ（配列のヌクレオチド１１８−１１９−１２０）はＳＴレセプタータンパク質発現の開始コドンである。ＣＲＣＡ−１転写体はヌクレオチド１９２−３３３、１９３−３３４または１９４−３３５におよぶ１４２ヌクレオチドが失われている。従って、ＳＴレセプターｍＲＮＡには観察されないＣＲＣＡ−１タンパク質の独特の配列には、図１に示されたようなまたは配列リストに示された配列からの対応する番号を用いてヌクレオチド１９１−１９２−１９３−３３６、１９１−１９２−３３５−３３６または１９１−３３４−３３５−３３６が挙げられる。これらの４ヌクレオチド配列はすべて同一であり（Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ）、配列番号：１のヌクレオチド１１０−１１１−１１２−１１３に対応している。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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