(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
撹拌することなく少なくとも15分間、室温及びｐＨ５．５〜５．８の条件下で、溶液中の生物学的マクロ分子を末端を閉じた炭素ナノチューブとインキュベートすることを含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び自己組織化の方法であって、前記の炭素ナノチューブは、その表面で一般式H-E-L、
式中：
− Hは正又は負の電荷を帯びた基；ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド及び抗原から選択される生物学的マクロ分子の配位子又は類似体；IDA、NTA、EDTA、ビピリジン又はテルピリジンから選択される配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、クロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウム錯体から選択される、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体から選択された親水性基を表す；
− Eは、不飽和かそうでないもの、或いは鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないポリオキシエチレン単位を有するC1-C10 炭素鎖から選択される、スペーサーアームを表し、当該Ｅは、以下から選択される：
【化１】
0004484361.tif 000014
ここで：
ｍは1〜10の整数を表し、
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHを表し、前記炭素鎖の両端でエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの付着のために有機官能基を構成する；
− Lは不飽和又はそうでないC12-C20の形態の、変えられる長さの１つ以上の鎖を有する脂質単位；式Ar1 又は式Ar2 の芳香族基を表す：
【化２】
0004484361.tif 000015
ここで：
Aは水素原子、次に挙げる基の1つ：アルキル、CF3、NO2 、NH2 、OH、O-アルキル、S-アルキル、COOH、ハロゲン、アルキルタイプの電子供与基又は、芳香環、又はC4-C6の形態の芳香族へテロ環を表す；そして
YはEとの結合を表す、
の化学試薬の物理的吸着により官能基化されている、方法。
【請求項２】
前記の抗原は可溶性の、膜又は貫膜タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記の溶液は、前記の生物学的マクロ分子を溶かすための溶媒からなり、その溶媒は水性若しくは水性-アルコール性であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーション時間が15分〜48時間であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ナノチューブ上に生物学的マクロ分子が結晶の形態で自己組織化している炭素ナノチューブからなることを特徴とするバイオナノ材料であって、前記の炭素ナノチューブは、その表面で一般式H-E-L、
式中：
− Hは正又は負の電荷を帯びた基；ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド及び抗原から選択される生物学的マクロ分子の配位子又は類似体；IDA、NTA、EDTA、ビピリジン又はテルピリジンから選択される配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、クロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウム錯体から選択される、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体から選択された親水性基を表す；
− Eは、不飽和かそうでないもの、或いは鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないポリオキシエチレン単位を有するC1-C10 炭素鎖から選択される、スペーサーアームを表し、当該Ｅは、以下から選択される：
【化３】
0004484361.tif 000016
ここで：
ｍは1〜10の整数を表し、
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHを表し、前記炭素鎖の両端でエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの付着のために有機官能基を構成する；
− Lは不飽和又はそうでないC12-C20の形態の、変えられる長さの１つ以上の鎖を有する脂質単位；式Ar1 又は式Ar2 の芳香族基を表す：
【化４】
0004484361.tif 000017
ここで：
Aは水素原子、次に挙げる基の1つ：アルキル、CF3、NO2 、NH2 、OH、O-アルキル、S-アルキル、COOH、ハロゲン、アルキルタイプの電子供与基又は、芳香環、又はC4-C6の形態の芳香族へテロ環を表す；及び
YはEとの結合を表す、
の化学試薬の物理的吸着により官能基化されている、バイオナノ材料。
【請求項６】
請求項1〜4のいずれかに記載の方法を用いて得られることを特徴とする、
請求項5に記載のバイオナノ材料。
【請求項７】
請求項5及び6のいずれかに記載のバイオナノ材料の、それと結合する生物学的マクロ分子の構造研究のための使用。
【請求項８】
請求項5及び6のいずれかに記載のバイオナノ材料の、生物学的試薬としての使用。
【請求項９】
請求項5及び6のいずれかに記載のバイオナノ材料の、バイオセンサー又はバイオ伝導体としての使用。
【請求項１０】
一般式H-E-L、式中：
− Hは正又は負の電荷を帯びた基；ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド及び抗原からなる群より選択される生物学的マクロ分子の配位子又は類似体；
IDA、NTA、EDTA、ビピリジン又はテルピリジンから選択される配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、クロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウム錯体から選択される、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体から選択された親水性基を表す；
− Eは必要に応じてアルキル基で置換され、不飽和を有する又は有しない、或いは鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないポリオキシエチレン単位を有する、C1-C10 炭素鎖から選択されるスペーサーアームを表し、当該Ｅは、以下から選択される：
【化５】
0004484361.tif 000018
ここで：
ｍは1〜10の整数を表し、
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHを表し、前記炭素鎖の両端でエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの付着のために有機官能基を構成する；
− Lは式Ar1又は式Ar2 の芳香族基を表す：
【化６】
0004484361.tif 000019
ここで：
Aは水素原子、次に挙げる基の1つ：アルキル、CF3、NO2 、NH2 、OH、O-アルキル、S-アルキル、COOH、ハロゲン、芳香環、又はC4-C6 の形態の芳香族へテロ環を表し；かつYはEとの結合を表す、
を有することを特徴とする、炭素ナノチューブ上で物理的に吸着されることのできる化学試薬であって、
当該化学試薬が、次に示す構造の1つを有する：
【化７】
0004484361.tif 000020
【請求項１１】
Hは次に示す有機金属錯体から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の化学試薬：
【化８】
0004484361.tif 000021
R1＝Eに結合するための有機基。
【請求項１２】
前記有機金属錯体がＥとの結合のためにアルキル基で官能基化されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記スペーサーアームＥがアルキル基で置換されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
Ａが、アルキルタイプの電子供与基又は、CF3 若しくはハライドタイプの電子吸引基で多置換された、芳香環、又はC4 -C6 の形態の芳香族へテロ環を表すことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液が、少なくとも１つの洗浄剤を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はマクロ分子を結合及び/又は結晶化させる方法、前記の方法において使用される化学試薬、得られる生成物、及び、特にバイオセンサー又は生体材料としての、材料及び構造生物学の分野における前記の生成物の応用に関するものである。
【０００２】
タンパク質の構造及び特にその活性部位を知ることは、タンパク質の作用メカニズムを理解する上で必須である。その様な研究：X線、NMR、電気結晶学(electrocrystalography)（2D結晶化）、を行うためにいくつかの方法が利用できる。
【０００３】
結晶化を適切に行うために、脂質フィルム又は単層上における空気/水界面での2次元結晶化の技術(E. E. Ugzirisら、Nature, 1983, 301, 125-129)により、生物学的マクロ分子（結晶）の自己組織化システムの形成、及び得られた結晶の電子顕微鏡分析によるこれらの分子構造の決定が可能である。
【０００４】
この方法は、空気/液体界面のレベルでの脂質単層を作り出す事にあり、脂質は脂質層に存在するタンパク質と相互作用するように選択される。そのタンパク質は脂質に結合し、それから組織化されたネットワークを形成する。
【０００５】
単層脂質へのタンパク質の結合は、脂質の極性頭部のレベルにおける化学相互作用を包含する。これらの相互作用は、特異的でない、つまり電荷を帯びた極性末端を有する脂質がイオン性相互作用により結晶化を起こす、又は特異的のいずれかである。後者の場合、脂質の極性頭部は、結合するタンパク質と高い親和性を示す配位子を有している。
【０００６】
特に、電荷を帯びた脂質フィルム、つまり研究されたタンパク質に対し、配位子により官能基化された脂質フィルム上で、可溶タンパク質は2次元的に結晶化することができることを示すことが可能になった(B. J. Japら、Ultramicroscopy, 1992, 46, 45-84)。
【０００７】
より最近、ニッケル錯体のような金属錯体により官能基化された脂質(E. W. Kubalekら、J. Struct. Biol., 1994, 113, 117-123)により、いわゆるヒスチジン標識融合タンパク質を結晶化させることが可能となった。これらのタンパク質は実際、そのN-又はC-末端に、いくつかのヒスチジンからなる配列を有している。その様なタンパク質の脂質-ニッケルへの結合は、ニッケル錯体及びポリヒスチジン配列間の強い相互作用によるものであることを示すことが可能になっている(C. Venien-Brianら、J. Mol. Biol., 1997, 274, 687-692)。その様な官能基化された脂質により、特に、適当な配位子が入手できなかった場合に、結晶体を得ることが可能になった。
【０００８】
しかしながら、脂質フィルム上のタンパク質の結晶化は比較的ランダムで、同時にコントロールするのは困難である多くの要因に依存しているという欠点があり、その要因とは：
−  脂質により保持される配位子は、タンパク質と相互作用するために十分接近できるものであるべきである。この接近しやすさは脂質と配位子間のスペーサーアームの長さに依存する：短すぎると、タンパク質の脂質層内への貫入が起こり；長すぎると、結合タンパク質上に非常に高程度の自由を与え、結晶中の欠陥発生率を増加させる；
−  脂質単層は結合タンパク質上に十分な横方向及び回転の可動性を与えるために、十分に流動的であるべきであり、この様にして、タンパク質が互いに関して組織化し、分子間接触を発達させることができ、その結果、結晶を生じる；
−  脂質単層上での結晶化に固有のもう１つ困難なことは単層の安定性に関する；実際、空気/液体界面の安定性はコントロールしにくい。さらに、たんぱく質の空間的組織化を可能にするために、脂質単層はタンパク質の結合前だけでなく、結合後も安定のままであるべきである；
−  結晶化ステップの次にくる顕微鏡研究には、得られる構造の平面性質のため、多数の面を作り出すことが必要である。
【０００９】
結果として発明者らは、溶液中で結合すること、及び、以前使用されていた2D結晶化法よりも実用的使用の必要条件により適しているマクロ分子の自己組織化を、必要に応じて誘発することを可能にする方法の提供を目的とした。
【００１０】
本発明の主題は、撹拌することなく少なくとも15分間、適切な温度及びpH条件下で、溶液中のマクロ分子を末端を閉じた炭素ナノチューブとインキュベートすることを本質的に含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び/又は自己組織化の方法である。
【００１１】
ナノチューブは1991年に発見された(S. Ijima, Nature 1991, 354, 54-56)；特にその機械的特性：高い機械的抵抗(M. M. J. Treacyら、Nature 1996, 381, pp. 678-680)、及び電子特性：伝導体又は半導体特性(J. W. G. Wildoerら、Nature 1998, 391, 59-62: T. W. Odomら、Nature 1998, 391, 62-64) のため、それ以来多くの関心を生み出してきた。
【００１２】
ナノチューブを調製するいくつかの方法は、高収率を得ることを可能にするT. W. Ebbesenらによる方法(Nature, 1992, 358, 220-222)も含め述べられてきた。ナノチューブを精製する方法も述べられてきた(H. Hiuraら、Adv. Mater., 1995, 7, 275-276; J-M Bonardら、Adv. Mater., 1997, 9, 827-831、及びG. S. Duesbergら、Chem. Commun., 1998, 435-436)；これらの様々な方法により、所望の量のナノチューブを得ることが可能である。炭素ナノチューブの化学官能基化法も述べられている(国際出願PCT WO97/32571)。
【００１３】
ナノチューブの化学官能基化の他の方法も述べられている；例えばTSANG S. C.ら、Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1995, 17, 1803-1804、及びDAVIS J. J.ら、Inorganica Chimica Acta, 1998, 272, 1, 2, 262-266が言及され得る。
【００１４】
しかしながら、それらの方法は、ナノチューブの幾何構造を激しく修飾する（末端のオープニング、外側のシートの部分的破壊）か、ナノチューブの固有物理的特性を破壊する化学反応を伴い、結果的にタンパク質のような生物学的マクロ分子をナノチューブ上で組織化することはできない。それゆえ、その様な破壊的方法により修飾されたナノチューブは、合成生成物又は生物学的マクロ分子の外表面上での吸着及び/又は自己組織化に適さない。
【００１５】
使用される技術及び条件により、いくつかのナノチューブの構造が調製され得る：ナノチューブは特に、グラファイトのいわゆる多数壁ナノチューブ構造(multi-wall nanotube structure(MWNT))又は単壁ナノチューブ構造(single-wall nanotube structure(SWNT))を有する。それらは完全に、又は部分的に酸化され得、又は全く酸化されない。
【００１６】
この様に化学的観点から、ナノチューブは炭素のみからなるポリマーであり、100万個以下の原子を含み得る。炭素化学の法則に従って、ナノチューブの原子は丈夫な共有結合により結合し、それぞれの原子がちょうど3個の隣接原子を有する。この様に、その長さに関わらず、ナノチューブはすべての化学結合を残さないように、その末端を閉じないといけない。一般的に、その直径は普通1〜30 nmで、その長さは数マイクロメートル以下であり得る。
【００１７】
物理学的観点から、ナノチューブは一方向に伸びる炭素結晶だと定義することができ、反復単位はらせん対称を有する(B. I. Yakobsonら、American Scientist, 1997, 85, 324-337)。
【００１８】
前記の方法の有益な実施態様によると、前記生物学的マクロ分子は特に可溶性の、膜又は貫膜タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸である。
【００１９】
前記の方法のもうひとつの有益な実施態様によると、前記の炭素ナノチューブは、一般式がH-E-Lである化学試薬の物理的吸着により官能基化され、この一般式において：
−  Hは親水性基を表し、正又は負の電荷を帯びた基；制限されないが、ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド、抗原のような生物学的マクロ分子の配位子又は類似体；IDA、NTA、EDTA、ビピリジン又はテルピリジンのような配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、クロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウム錯体の様な、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体、前記の配位子は必要に応じて、（Xのレベルで）Eに結合するためのアルキル基で官能基化される；正又は負の電荷を帯びた基は制限されないが、次のことを意味すると理解される：アンモニウム、カルボキシド、フォスフェート、スルフォネート；例えば次に挙げる基が言及され得る；-N(CH3)3+又は-CO2-、から選択される；
−  Eはスペーサーアームを表し、C1-C10炭素鎖から選択される。その炭素鎖は、必要に応じてアルキル基かそうでないもので置換され、不飽和、又は鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないポリオキシエチレン単位を有し、例えば次のようなものがある：
【００２０】
【化７】
0004484361.tif 000002
ここで：
ｍは1〜10の整数を表し、
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHを表し、前記炭素鎖の両端でエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの付着のために有機官能基を構成する；
−  Lは1つ以上の変えられる長さの鎖を有し、不飽和かそうでないものを有するC12-C20の形態の脂質単位；式Ar1又は式Ar2の芳香族基を表す：
【００２１】
【化８】
0004484361.tif 000003
ここで：
Aは水素原子、次に挙げる基の1つ：アルキル、CF3、NO2、NH2、OH、O-アルキル、S-アルキル、COOH、ハロゲン、アルキルタイプの電子供与基又は、CF3若しくはハライドタイプの電子吸引基で必要に応じて多置換された芳香環若しくはC4-C6の形態の芳香族へテロ環を表す；Lは例えば次に挙げる芳香族基の１つを表す：ベンジル、ナフチル、アントラセニル、フルオレニル、テトラベンゾフルオレニル、並びに
YはEとの結合を表している。
【００２２】
本発明の目的のため、アルキルは直鎖又は分枝の又は必要に応じて置換されたC1-C6アルキル基を意味すると理解される。
【００２３】
驚くべきことに、非処理（非官能基化）炭素ナノチューブ及び、上記で定義したような非破壊的方法により官能基化された炭素ナノチューブ両方とも、本発明に従った方法において使用することができる。
【００２４】
本発明に従った官能基化は、驚くべきことに、ナノチューブにとって破壊的でない；特にその末端のオープニングが起こらない。
【００２５】
その様な方法で、炭素ナノチューブの外側の表面で、合成生成物又は生物学的マクロ分子のいずれかを吸着及び/又は自己組織化することは可能である。
【００２６】
実際、本発明により、タンパク質の様なマクロ分子のらせん対称での配列形成（自己組織化）を誘発することが可能となる。
【００２７】
前記の方法のもう１つの実施態様によると、前記の溶液は、前記の生物学的マクロ分子を溶かすための溶媒からなり、その溶媒は水性若しくは水性-アルコール性であり、結晶化される生物学的マクロ分子により、必要に応じて少なくとも１つの洗浄剤を含む。
【００２８】
前記の方法のもう１つの有益な実施態様によると、インキュベーション条件は好ましくは次の通りである：室温、15分〜48時間、pH 5.5〜8.5におけるインキュベーション。
【００２９】
驚くべきことに、電子顕微鏡による構造研究及び、その物理学的、電気的、又は生物学的特性のため利用することができる新しいナノ材料の調製を可能にする生物学的マクロ分子の配列を、前記の方法により得ることができる。
【００３０】
その様な方法には、タンパク質の結晶化を再現性のあるものにするという利点がある；特に、タンパク質が所定の直径のナノチューブ存在下で結晶化しない場合、異なる直径のナノチューブを用いた方法を使うことは容易である；実際、所定のタンパク質の結晶化はナノチューブの直径に依存する。
【００３１】
しかしながら本発明において、ナノチューブの直径を変え、完全に若しくは部分的に酸化される若しくは全く酸化されない炭素の多数壁又は単壁ナノチューブを同様にうまく使用することは可能である。
【００３２】
また驚くべきことに、本発明に従った方法において、炭素ナノチューブ上でのマクロ分子の結合又は結晶化は、上記で定義したような適した実験条件下、全ての他の合成生成物の存在しない状態で自発的に起こるか、又は上記で定義したような化学試薬H-E-Lを加えることにより誘発されるかのどちらかである。
【００３３】
また驚くべきことに、再現性のある結晶化を可能にするために効果を示し得る様々な要因は、すでに上記で特定しているように、次のようなものである：サンプルの濃度、溶媒の選択、イオン抑制、溶液のpH、インキュベーション時間、及びナノチューブの直径。
【００３４】
不飽和かそうでないものを有するC12-C20の形態の、変えられる長さの1つ以上の鎖を有する脂質単位をLが表す試薬、及び、式Ar1又は式Ar2の芳香族基をLが表す試薬両方によって、ナノチューブ表面上でのマクロ分子の配列に適した官能基化したナノチューブを得ることが可能である；しかしながら、Lが式Ar1又は式Ar2の芳香族基を表す試薬が特に好ましい。
【００３５】
本発明の主題はまた、本質的に炭素ナノチューブからなり、そのナノチューブ上に生物学的マクロ分子が非共有結合により結合していることを特徴とするバイオナノ材料である。
【００３６】
本発明の主題はまた、本質的に炭素ナノチューブからなり、そのナノチューブ上に生物学的マクロ分子が結晶形態で自己組織化することを特徴とするバイオナノ材料である。
【００３７】
前記のバイオナノ材料の有益な実施態様によると、それらは上記で定義された方法を用いて得られる。
【００３８】
本発明の主題は、さらに、生物学的試薬として、及びより詳しくは免疫学的試薬として、及びバイオセンサー若しくはバイオ伝導体として、バイオナノ材料と結合する生物学的マクロ分子の構造研究への、前記のバイオナノ材料の応用である。
【００３９】
本発明の主題は、さらに、物理的に炭素ナノチューブ上に吸着されることのできる化学試薬であり、その試薬は一般式H-E-Lを有することを特徴とし、この一般式において：
−  Hは正又は負の電荷を帯びた基；生物学的マクロ分子の配位子又は類似体；アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体、及びその配位子はEとの結合のために、必要に応じてアルキル基で官能基化されている、から選択される親水性基を表す；
−  Eはスペーサーアームを表し、必要に応じてアルキル基で置換されたC1-C10炭素鎖から選択され、その炭素鎖は、不飽和かそうではなく又は鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないポリオキシエチレン単位を有し、次のようなものがある：
【００４０】
【化９】
0004484361.tif 000004
ここで：
ｍは1〜10の整数を表し、
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHを表し、前記炭素鎖の両端でエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの接着のために有機官能基を構成する；
−  Lは式Ar1又は式Ar2の芳香族基を表す：
【００４１】
【化１０】
0004484361.tif 000005
ここで：
Aは水素原子、次に挙げる基の1つ：アルキル、CF3、NO2、NH2、OH、O-アルキル、S-アルキル、COOH、ハロゲン、芳香環又はC4-C6の形態の芳香族へテロ環を表し、前記の環は、アルキルタイプの電子供与基又は、CF3若しくはハライドタイプの電子吸引基で必要に応じて多置換される；及び
YはEとの結合を表す。
【００４２】
前記の化学試薬の有益な実施様態によると、次に示す化合物の１つを有する：
【００４３】
【化１１】
0004484361.tif 000006
前記の化学試薬のもう１つの有益な実施様態によると、Hは次に示す有機金属錯体から選択される：
【００４４】
【化１２】
0004484361.tif 000007
R1＝Eに結合するための有機基。
【００４５】
【実施例】
しかしながら、これらの実施例は単に本発明の主題の説明として与えられるものであり、いかなる形でもこれを限定するものでないことを、明確に理解されるべきである。
実施例１：多数壁炭素ナノチューブ上における、ストレプトアビジン分子のらせん状結晶形態での自己組織化
使用する多数壁炭素ナノチューブ（MWNT）は、アークを用いたグラファイト電極の分解により製造される（T.W. Ebbesen et al., Nature 1992, Vol. 358, pp. 220-222）。炭素ナノチューブの溶液（2mg/ml）を超音波処理した後、20μgのMWNTを集めてエタンガス気流にて乾燥し、最終的に20μlの水／メタノール混合物（容量で40％のメタノール）に再懸濁する。超音波処理後、20μlのストレプトアビジン水溶液（10μg/ml）を添加し、該混合物を攪拌またはボルテックスすることなく室温で45分間放置する。次に5μlの炭素ナノチューブ懸濁液を炭素被膜でコートされた電子顕微鏡グリッドに沈着させる。ウラニルアセテート溶液を用いたサンプルのネガティブ染色の後、該グリッドを電子顕微鏡（Philips CM120）で観察する。直径ほぼ10nmのナノチューブがストレプトアビジンのらせん状結晶でコートされていることが確認できた。
【００４６】
実施例２：多数壁炭素ナノチューブ上における、“ヒスチジン標識”HupR分子のらせん状結晶形態での自己組織化
使用する多数壁炭素ナノチューブ（MWNT）は、アークを用いたグラファイト電極の分解により製造される（T.W. Ebbesen et al., Nature 1992, Vol. 358, pp. 220-222）。炭素ナノチューブの溶液（2mg/ml）を超音波処理した後、20μgのMWNTを集めてエタンガス気流にて乾燥し、最終的に20μlの水性バッファー（10mM Tris; pH=7.5; 350mM NaCl）に再懸濁する。超音波処理後、20μlのRhodobacter Capsulatus由来ヒスチジン標識HupRタンパク質の水溶液（10μg/ml）を添加し、該混合物を攪拌またはボルテックスすることなく室温で25分間放置する。次に5μlの炭素ナノチューブ懸濁液を炭素被膜でコートされた電子顕微鏡グリッドに沈着させる。ウラニルアセテート溶液を用いたサンプルのネガティブ染色の後、該グリッドを電子顕微鏡（Philips CM120）で観察する。多数のナノチューブがHupRタンパク質のらせん状結晶でコートされていることが示された。
【００４７】
実施例３：ビオチニル化した化学試薬の調製
【００４８】
【化１３】
0004484361.tif 000008
合成スキーム
実験プロトコル
（アントラセン−9−イルメトキシ）酢酸  １：
【００４９】
【化１４】
0004484361.tif 000009
方法
20mlのTHF  中の2.1g (10mmol, 1eq)の9−アントラセンメタノールを、20mlのTHF  中の1.2g（30mmol, 3eq）のオイル中60％の水素化ナトリウムの懸濁液に、0℃で加える。該混合物を還流下で1時間攪拌し、次に温度を0℃まで下げ、20mlのTHF中のブロモ酢酸1.4g（10mmol, 1eq）の溶液を添加する。この溶液を更に5分間0℃で、次に1時間室温で攪拌し、その後還流下で16時間加熱する。冷却後、40mlの飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、次に10mlの塩酸水溶液を添加することにより、該反応を停止する。次に該反応液を50mlエーテルにより２回抽出する。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、有機相を蒸発乾固させることにより、シリカ（へキサン/EtOAc/AcOH: 70/30/1）上でのクロマトグラフィー後に1.212gの黄色の固体を得る（収率： 45.5％）。
EF: C17H14O3
m.p.: 266.299 g/mol
TLC: Rf (EtOAc/Hex/AcOH; 80/20/1): 0.56;
1H NMR (300.13 MHz, アセトンd6): σ11.2 (bs, 1H, H1); 8.64及び8.10 (d及びd, 4H, J=8.8Hz, J=7.9Hz, H6, H9); 8.61 (s, 1H, H11); 7.5-7.7 (m, 4H, H7, H8); 5.68 (s, 2H, H3); 4.41 (s, 2H, H2);
13C NMR (75.47 MHz, アセトンd6): σ176.27 (1C, C1); 136.51, 136.16及び133.29 (5C, C4, C5, C10); 133.75, 131.10, 130.14及び129.73 (9C, C6, C7, C8, C9, C11); 71.88 (1C, C3); 69.81 (1C, C2):
MS (70eV/DCI/強度 %): m/e: 191 (100, [M-OCH2CO2H]+); 266 (12, [M+1]+); 284 (58, [M+18]+);
2,5−ジオキソピロリジン−１−イル（アントラセン−9−イルメトキシ）アセテート  ２：
【００５０】
【化１５】
0004484361.tif 000010
方法
20mlのTHF溶液中の510mg（2.47mmol, 1 eq）のDCCを、650mg（2.44mmol, 1 eq）の（アントラセン−9−イルメトキシ）酢酸１及び300mgのNHS（2.61mmol, 1.07 eq）の30ml THF溶液に、0℃で添加する。該混合物を一晩室温で攪拌する。次に該反応物を濾過し、その後エバポレートする。得られた残渣を50mlの無水エタノールに溶解させると、濾過後727mgの白色固体状2,5−ジオキソピロリジン−1−イル（アントラセン−9−イルメトキシ）アセテート２を得る（収率：82％）。
EF: C21H17NO5
m.p.: 363.374 g/mol
TLC: Rf (EtOAc/Hex; 50/50): 0.33;
1H NMR (300.13 MHz, CDCl3): σ8.51 (s, 1H, H11); 8.42及び8.02 (d及びd, 4H, J=9.0Hz, J=8.4Hz, H6, H9); 7.59及び7.48 (dd及びdd, 4H, H7, H8); 5.71 (s, 2H, H3); 4.53 (s, 2H, H2); 2.90 (s, 4H, H13);
13C NMR (75.47 MHz, CDCl3): σ168.49 (2C, C12); 166.16 (1C, C1), 131.13, 128.94及び126.36 (5C, C4, C5, C10); 128.82, 126.51, 124.88及び123.83 (9C, C6, C7, C8, C9, C11); 65.28 (1C, C3); 64.57 (1C, C2); 25.39 (2C, C13);
MS (70eV/DCI/強度 %): m/e: 381 (100, [M+18]+);
N−｛2−[2−（2−アミノエトキシ）エトキシ]エチル｝−2−（アントラセン−9−イルメトキシ）アセタミド  ３：
【００５１】
【化１６】
0004484361.tif 000011
方法
5mlのCH2Cl2溶液中の1.75mlのTEA及び91mg（0.25mmol, 1 eq）の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル（アントラセン−9−イルメトキシ）アセテート２を、370mg（2.50mmol, 10eq）の2,2'−（エチレンジオキシ）ジエチルアミンの20ml CH2Cl2溶液に加える。該混合物を7時間室温で攪拌する。次に該反応物をエバポレートする。得られた残渣を50mlの水、次に50mlの水酸化カリウム水溶液（0.1N）で洗浄する。有機相を乾燥し、エバポレートし、真空下で濃縮すると、シリカ上でのクロマトグラフィー（CH2Cl2/MeOH/TEA; 90/10/1）の後、55mgの黄色オイル状N−｛2−[2−（2−アミノエトキシ）エトキシ]エチル｝−2−（アントラセン−9−イルメトキシ）アセタミド３を得る（収率：55％）。
EF: C23H28N2O4
m.p.: 396.491 g/mol
TLC: Rf (CH2Cl2/MeOH/TEA; 90/10/1): 0.28;
1H NMR (300.13 MHz, CDCl3): σ8.44 (s, 1H, H11); 8.29及び7.98 (d及びd, 4H, J=9.0Hz, J=8.4Hz, H6, H9); 7.53及び7.45 (dd及びdd, 4H, H7, H8); 6.93 (t, 1H, J6-9=5.4Hz, 1H, H12); 5.51 (s, 2H, H3); 4.13 (s, 2H, H2); 3.3-3.5 (m, 8H, H14, H15, H16, H17); 3.25 (t, J=5.1Hz, 2H, H13); 2.7-2.8 (m, 2H, H19); 2.64 (t, 2H, J=5,1Hz, H18);
13C NMR (75.47 MHz, CDCl3): σ169.49 (1C, C1); 131.11, 130.73及び127.08 (5C, C4, C5, C10); 128.92, 128.69, 126.39, 124.87及び123.64 (9C, C6, C7, C8, C9, C11); 72.10, 69.89, 69.78, 69.47及び69.33 (5C, C3, C14, C15, C16, C17); 65.15 (1C, C2); 41.03 (1C, C13); 38.31 (1C, C18)
MS (70eV/DCI/強度 %): m/e: 397 (100, [M+1]+);
N−｛2−[2−（2−（アミノビオチン）エトキシ）エトキシ]エチル｝−2−（アントラセン−9−イルメトキシ）アセタミド  ４：
【００５２】
【化１７】
0004484361.tif 000012
方法
5mlのDMF溶液中の1mlのTEA及び40mg（0.12mmol, 1.2 eq）のビオチン−NHSを、40mg（0.1mmol, 1eq）のN−｛2−[2−（2−アミノエトキシ）エトキシ]エチル｝−2−（アントラセン−9−イルメトキシ）アセタミド３の5ml DMF溶液に加える。該混合物を16時間室温で攪拌する。次に該反応物を真空下で濃縮すると、シリカ上でのクロマトグラフィー（CH2Cl2/MeOH/TEA; 95/5/1）の後、55mgの黄色オイル状N−｛2−[2−（2−（アミノビオチン）エトキシ）エトキシ]エチル｝−2−（アントラセン−9−イルメトキシ）アセタミド４を得る（収率：89％）。
EF: C33H42N4O6S
m.p.: 622.793 g/mol
TLC: Rf (CH2Cl2/MeOH; 90/10): 0.5;
1H NMR (300.13 MHz, CDCl3): σ8.48 (s, 1H, H28); 8.31及び7.01 (d及びd, 4H, J=9.0Hz, J=8.4Hz, H23, H26); 7.55及び7.47 (dd及びdd, 4H, H24, H25); 6.89 (t, 1H, J16-17=5.0Hz, H17); 6.90 (s, 1H, H2); 6.53 (t, 1H, J10-11=5.0Hz, H10); 5.67 (s, 1H, H2'); 5.55 (s, 2H, H20); 4.31 (m, 1H, H3); 4.17 (s, 2H, H19); 4.15 (m, 1H, H3'); 3.2-3.5 (m, 12H, H11, H12, H13, H14, H15, H16); 2.97 (dt, 2H, H4); 2.75 (dt, 1H, J3'-4'a=4.8Hz, J4'a-4'b=12.7Hz, H4'a); 2.2 (d, 1H, J4'a-4'b=12.7Hz, H4'b); 2.08 (t, 2H, J7-8=7.4Hz, H8); 1.2-1.7 (m, 6H, H5, H6, H7);
13C NMR (75.47 MHz, CDCl3): σ173.00 (1C, C1); σ169.56 (1C, C18); σ163.76 (1C, C9);131.14, 130.73及び127.05 (5C, C21, C22, C27); 128.98, 128.75, 126.45, 124.93及び123.59 (9C, C23, C24, C25, C26, C28); 69.74, 69.55, 69.23及び65.25 (6C, C12, C13, C14, C15, C19, C20); 61.50及び59.88 (2C, C3, C3'); 55.32 (1C, C4); 40.18 (1C, C4'); 38.76, 38.33及び35.65 (3C, C8, C11, C16); 27.95及び27.81 (2C, C5, C7); 25.30 (1C, C6);
MS (70eV/DCI/強度 %): m/e: 623 (100, [M+1]+); 640 (8, [M+18]+);
実施例４： H−E−L構造をもつ化学試薬（以下CR174と呼ぶ）の、炭素ナノチューブ上における物理的吸着
プロトコル：CR174と呼ばれ、その化学式を以下に示す化学試薬のメタノール溶液（1mg/ml）1から20μlを、新たに超音波処理した炭素ナノチューブ溶液（メタノール中10mg/ml）20μlに加える。該混合物を次に超音波処理で攪拌し、その後エタンガス気流にて蒸発乾固する。トリスバッファー（20mM, pH 7.5; 50mM NaCl）40μlを乾燥した炭素ナノチューブに加え、懸濁液を超音波処理により再混合する。炭素ナノチューブに吸着しない過剰の試薬を除去するため、該混合物を随意に遠心分離し、500μlのバッファーで数回洗浄し得る。
【００５３】
炭素ナノチューブ上への試薬CR174の物理的吸着を、ポジティブ染色を用いて電子顕微鏡法により証明できた。炭素ナノチューブ上の試薬分子の存在の結果として、黒点が出現する。化学試薬CR174（又は5）が存在しない場合、これらの黒点は存在しない。
【００５４】
【化１８】
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前述の文章より明らかなように、本発明は、より明確に説明してきた、その実施例、実行、及び応用に全く限定されない；反対に、当業者に起こりうる全ての変形を、本発明の構成又は範囲を離れることなく包含する。
【００５５】
上記の配列に加え、以下に続く説明より明らかになるであろうように、本発明は更に他の配列を含み、該配列は、本発明の主題である方法の実施態様および添付の図面に関連する。
【図面の簡単な説明】
【図１】化学試薬の添加（物理的吸着）による炭素ナノチューブ上での生物学的マクロ分子の結晶化を示す；
【図２】物理的吸着により炭素ナノチューブを官能基化するために用いる化学試薬の構造を示す；
【図３】ストレプトアビジンのらせん状結晶で覆われた直径ほぼ10nmのナノチューブを示す；
【図４】HupRタンパク質のらせん状結晶で覆われたナノチューブを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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