(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質基体と架橋被膜とから構成された、負電荷を持つ微孔質膜であって、該架橋被膜が多糖類とアニオン性ポリマーとを含む溶液から調製され、該アニオン性ポリマーは、負電荷の基を有する不飽和モノマー、親水性非イオン性不飽和モノマー、並びに少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシアルキル）−もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミドモノマーを含む混合物の重合により得られたものであり、該架橋被膜がアミド−エステルおよびアミド−アミド架橋を含んでいる、負電荷を持つ微孔質膜。
【請求項２】
親水性不飽和モノマーがアクリルモノマーである、請求項１記載の負電荷を持つ微孔質膜。
【請求項３】
Ｎ−（ヒドロキシアルキル）−もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミドが炭素数４以下のアルキル基を含有する、請求項１または２に記載の負電荷を持つ微孔質膜。
【請求項４】
負電荷の基がスルホン酸またはカルボン酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の負電荷を持つ微孔質膜。
【請求項５】
少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口とを備え、この入口と出口との間に流体流路を画成し、かつ該入口と該出口との間に該流体流路を横断して請求項１〜４のいずれか１項に記載の複数の膜が配置されている装置。
【請求項６】
下記工程を含む、多孔質基体と負電荷の基を有する架橋被膜とから構成される負電荷を持つ微孔質膜の製造方法：
(a)多孔質基体を用意し；
(b)この基体に多糖類とアニオン性ポリマーとを含む溶液を接触させ、ここで該アニオン性ポリマーは、負電荷の基を有する不飽和モノマー、親水性非イオン性不飽和モノマー、並びに少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシアルキル）−もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミドを含む混合物の重合により得られたものであり、
(c)工程(b)で得られた基体を硬化させて負電荷を持つ微孔質膜を取得し；そして(d)場合により、工程(c)で得られた膜を抽出処理して、その中の抽出性残渣を除去する。
【請求項７】
下記工程を含む、多孔質基体と負電荷の基を有する架橋被膜とから構成される負電荷を持つ微孔質膜の製造方法：
(a)多孔質基体を用意し；
(b)この基体に多糖類とアニオン性ポリマーとを含む溶液を接触させ、ここで該アニオン性ポリマーは、負電荷の基を有する不飽和モノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、並びに親水性不飽和モノマーを含む混合物の重合により得られたものであり；
(c)工程(b)で得られた基体を硬化させて負電荷を持つ微孔質膜を取得し；そして(d)場合により、工程(c)で得られた膜を抽出処理して、その中の抽出性残渣を除去する。
【請求項８】
負電荷の基がスルホン酸基またはカルボン酸基である請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記不飽和モノマーがアクリルモノマーである請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される微孔質膜。
【請求項１１】
流体から正電荷を持つ物質を分離する方法であって、該流体を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の負電荷を持つ微孔質膜と接触させて、正電荷を持つ物質を該膜に吸着させるようにすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の対応関係】
この出願は1999年２月25日出願の米国仮特許出願第60/121,668号の優先権を主張するものであり、該出願の開示全体をここに援用する。
【０００２】
【発明の技術分野】
本発明は、広義には負電荷を持つ膜(negatively charged membrane) に関し、具体的には多孔質基体と架橋被膜(crosslinked coating) とから構成される負電荷を持つ膜に関する。この膜は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、タンパク質といった正電荷を持つ種を含有する流体の処理に有用である。
【０００３】
【発明の背景】
負電荷を持つイオン交換膜は、タンパク質、アミノ酸、および核酸といった生物学的分子(biomolecule) の分離および／または精製用に提案されている。イオン交換膜にとって、上記用途において効果的に機能するには、膜がいくつかの重要なパラメータを満たすべきである。例えば、膜は、高い流体流速（流量）を示すべきである。膜は、生物学的分子に対して高い動的結合容量を有するべきであり、かつ表面電荷が異なる生物学的分子を選択的に結合させることができるべきである。従って、膜は、例えば疎水性相互作用により生ずる非特異的結合は低くなるべきである。膜は、高い処理流体速度に耐えるべきである。膜の製造は、実施が煩雑な化学反応や処理工程を含むべきではない。従来より公知のカチオン交換膜の一部は、上述したパラメータの１または２以上を満たすことができないという難点を抱えている。
【０００４】
従って、高い流体流量を示すカチオン交換膜への要望が存在する。また、生物学的分子に対して高い動的結合容量および選択性を示すカチオン交換膜に対する要望も存在する。さらに、非特異的結合が低いか、または疎水性相互作用により生ずる結合が低い膜に対する要望も存在する。さらに、高い流体速度に耐えることができる膜に対する要望も存在する。さらに、実施が煩雑ではない化学反応および／または処理工程で製造される膜に対する要望も存在する。
【０００５】
本発明の以上の利点、ならびにそれ以外の発明の特徴は、本明細書における発明の説明から明らかとなろう。
米国特許第5,021,160 号は、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸と、Ｎ− (イソブトキシメチル) アクリルアミドまたは２−ヒドロキシエチルメタクリレートのいずれかとから合成されたコポリマー、およびアニオン性電荷変性微孔質濾過膜の製造方法を開示している。
WO 98/17377 は、多孔質基体と、基体の細孔中に位置する架橋ポリ電解質またはヒドロゲルから構成された電荷を持つ膜を開示している。
欧州特許出願第0 474 617 A1は、支持体膜がその表面に付着したヒドロゲルの層を有する表面変性支持体膜を開示している。
【０００６】
【発明の要約】
以上の要望の多くが、多孔質基体と、負電荷の基を有する架橋被膜とから構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する本発明により満たされた。１好適態様において、この膜は、アニオン基を有する不飽和モノマー、少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシアルキル）−および／もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミド、ならびに親水性不飽和モノマーを含む重合した組成物から調製することができる。
【０００７】
本発明はさらに、多孔質基体、ならびに多糖類のようなヒドロキシル基の多い材料と、アニオン基を有する不飽和モノマー、少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシメチル）−および／もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、および開始剤を含む重合した組成物とから調製された架橋被膜、から構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、多孔質基体と固定された負電荷を与える架橋被膜とから構成される、約25 mg/mlリゾチーム以上のタンパク質結合容量を有する、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。本発明はさらに、多孔質基体と、アニオン基ならびにアミド−アミドおよびアミド−エステル架橋点を有するポリマーを含む架橋被膜とから構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【０００９】
本発明の膜は有利には、基体との共有結合またはグラフト化結合を有していない。
本発明はさらに、多孔質基体をアニオン基を含む重合した組成物で被覆し、得られた膜を硬化させることを含む、本発明の膜の１態様の製造方法を提供する。膜は、任意に、洗浄または浸出処理して、残留する抽出性残渣を除去することができる。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の膜を備えた装置、例えば、フィルター装置、クロマトグラフィー装置、巨大分子(macromolecule) 移送装置、および膜モジュール、を提供する。本発明はさらに、正電荷を持つ原子、分子および微粒子、好ましくは生物学的分子といった正電荷を持つ物質を流体から分離する方法も提供し、この方法は、本発明の負電荷を持つ微孔質膜に該流体を接触させ、正電荷を持つ物質を膜に吸着させるようにすることを含む。本発明はさらに、正電荷を持つ物質を含有する流体を本発明の膜と接触させ、正電荷を持つ物質を選択的に遊離させることを含む、該流体の処理方法も提供する。本発明はさらに、巨大分子を電気泳動ゲルのような装置または要素から移行させる方法であって、該ゲルを本発明の膜と接触させ、生物学的分子を膜に移行させることを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明を以下に特定の好ましい態様および処理手順について説明および開示するが、本発明をこれらの特定態様に制限する意図はない。そうではなく、本発明の技術思想および範囲内に包含される全ての別の態様および変更例を包含するものである。
【００１２】
【好適態様の詳細な説明】
本発明は、高い電荷密度、高い水流量、高い動的タンパク質結合容量、および低い非特異的タンパク質結合容量を有する、負電荷を持つ膜の態様を提供する。本発明の膜は、カチオン交換クロマトグラフィーならびに電荷を持つ種、特にタンパク質のような生物学的分子の分離および／もしくは精製に有用である。
【００１３】
本発明は、一部の態様において、多孔質基体と、アニオン基を持つ架橋被膜とから構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。この架橋被膜は、アニオン基を有する不飽和モノマー、少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシアルキル）−もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミド、ならびに親水性不飽和モノマーを含む重合組成物から調製することができる。この組成物は開始剤をさらに含有することができる。好適態様において、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）−もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミドは、アルキル部分の炭素数が４以下、より好ましくはアルキル部分がメチルであるものである。
【００１４】
一部の態様において、膜は、多孔質基体と、アニオン基を有する不飽和モノマー、少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシメチル）−および／もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、多糖類のようなヒドロキシル基の多い材料、ならびに場合により開始剤を含む重合組成物から調製された架橋被膜とから構成される。本発明はさらに、多孔質基体と、アニオン基ならびにアミド−アミドおよびアミド−エステル架橋点を有するポリマーを含む架橋被膜とから構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【００１５】
本発明の膜は、固定されたアニオン基を含有する。アニオン基は、任意の負電荷を持つ基−スルホン酸、カルボン酸、ホスホン酸の各基等、好ましくはスルホン酸またはカルボン酸基でよい。被膜形成用(coating) 組成物は、アニオン基を有する不飽和モノマーを含有する。任意の適当な不飽和モノマー−ビニル、ビニル芳香族、アクリル、または他のモノマーを使用できる。
【００１６】
不飽和モノマーは、好ましくはアクリルモノマーである。アクリルモノマーはアクリレートまたはアクリルアミドとすることができる。アクリルモノマーは好ましくはアクリルアミドである。「アクリルアミド」なる用語は、ここでは、
−Ｃ＝Ｃ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｎ−部分を有する非置換ならびに置換モノマーを意味する。窒素およびＣ＝Ｃ炭素原子は、水素または他の非極性置換基に結合することができる。このような置換基の例はアルキルである。従って、置換アクリルアミドはアルキルアクリルアミドとすることができる。「アルキル」なる用語は、ここでは炭素数１〜約10、好ましくは１〜約６、より好ましくは１〜約３のアルキル基を意味する。スルホン酸基を有するアクリルアミドモノマーの例は、アクリルアミド−Ｎ−アルキルスルホン酸、好ましくは２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸である。カルボン酸基を有するアクリルモノマーの好ましい例は、３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸(AMBA)、２−アクリルアミドグリコール酸、およびβ−カルボキシエチルアクリレートである。
【００１７】
ある種の態様では、被膜形成用組成物は親水性不飽和モノマー、例えば、非イオン性親水性不飽和モノマーを含有する。任意の適当な親水性不飽和モノマーを使用できるが、好ましくはアクリルモノマーである。このモノマーは、親水性に寄与する１または２以上の極性基を含んでいる。このような基の例としては、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、およびアミドが挙げられる。好ましい親水性基は、ヒドロキシルおよびヒドロキシアルキルである。従って、好ましい親水性アルキルモノマーは、ヒドロキシアクリルおよびヒドロキシアルキルアクリルモノマーである。このアクリルモノマーはアクリレートエステルまたはアクリレートアミドとすることができる。好ましいヒドロキシアルキルアクリレートモノマーの例は、ヒドロキシプロピルメタクリレートである。
【００１８】
被膜形成用組成物は、架橋剤を含有する。当業者に公知の任意の適当な架橋剤を使用することができる。好ましい架橋剤としては、Ｎ−(アルコキシメチル) アクリルアミドおよびＮ−(ヒドロキシメチル) アクリルアミドが挙げられる。Ｎ−(イソブトキシメチル) アクリルアミドがさらに好ましい。
【００１９】
被膜形成用組成物は、好ましくは開始剤を含有する。任意の適当な開始剤−ラジカル (遊離基) 開始剤、光重合開始剤、等を使用することができる。ラジカル開始剤が好ましい。適当なラジカル開始剤の例は過硫酸アンモニウムのような過硫酸化合物である。
【００２０】
ある特定の理論に拘束されるものではないが、ある種の態様における上記３種類のモノマーの使用は、電荷の空間的分離の増大に寄与すると考えられる。即ち、アニオン基間の距離が増大するものと考えられる。この距離の増大はアニオン基の会合には不利である。従って、アニオン基の連鎖間および／または連鎖内会合は、アニオン性モノマーと架橋性モノマーとだけを使用した系、特に、多糖類のような親水性もしくはヒドロキシル基を多く含む材料を使用しない２モノマー系に比べて、低減する。この会合の低減により、負電荷を持つ基が、処理流体中の正電荷を持つ基との相互作用に利用可能となる。その結果、例えば、動的タンパク質結合用量が増大する。
【００２１】
一部の態様に係る膜は、ヒドロキシル基を多く含む材料を含有する被膜形成用組成物から作製される。この材料は、１分子当たり複数のヒドロキシル基、例えば、２、３、４またはそれ以上のヒドロキシル基を有する小分子またはポリマーでよい。ヒドロキシル基を多く含む材料の例としては、多糖類およびポリビニルアルコールが挙げられ、好ましくは多糖類である。ある特定の理論に拘束されるものではないが、ヒドロキシル基を多く含む材料のヒドロキシル基は、流体との水素結合に関与すると考えられる。糖環の反復単位は立体効果を発揮する。これらのメカニズムの一方または両方の作用は、アニオン基間の電荷分離の増大を生ずる。電荷分離の増大は、アニオン会合を減少させ、アニオン部位と処理流体中の正電荷を持つ種との間の相互作用を促進させると考えられる。
【００２２】
任意の適当な多糖類を用いることができるが、好ましくは水溶性多糖類である。好ましい多糖類の例はデキストランである。デキストランの分子量は約40,000,000以下、例えば約10,000〜約2,000,000 、好ましくは約10,000〜約500,000 、より好ましくは約10,000〜約300,000 の範囲内である。好適な分子量の具体例としては、110,000 および148,000 が挙げられる。
【００２３】
ある種の態様の被膜形成用組成物は、アニオン基を有するアクリルモノマー、非イオン性親水性モノマー、架橋剤、および開始剤を混合し、重合させることにより調製することができる。一部の態様では、被膜形成用組成物は、アニオン基を有するアクリルモノマー、多糖類、架橋剤、および開始剤を混合し、重合させることにより調製される。
【００２４】
重合は溶媒中、好ましくは水または水／メタノール溶液中で実施することができる。重合はゲルの生成または過大な架橋の前に停止することが好ましい。重合溶液の粘度を監視して、重合度を制御することができる。重合は任意の適当な時間、例えば、約４時間またはそれ以上行う。ある種の態様によると、重合は約４〜約５時間行う。別の態様によると、重合は約16〜約24時間行う。溶液の粘度は典型的には約2000 cps (2 Pa.s) 以下、例えば、好ましくは約50 cps (0.05 Pa.s)〜約500 cps (0.5 Pa.s)、より好ましくは約100 cps (0.1 Pa.s)〜約500 cps (0.5 Pa.s)である。ある態様によると、粘度は約100 cps (0.1 Pa.s)〜約250 cps (0.25 Pa.s) である。
【００２５】
重合溶液はアニオン性アクリルモノマー(A) 、架橋剤(B) 、および非イオン性親水性モノマー(C) を適当な比率で含有することができる。各モノマー (A, B, またはC)の割合は、約 0.1〜30重量％、好ましくは約 0.1〜20重量％の範囲とすることができる。
【００２６】
架橋した被膜は、非イオン性親水性モノマーと架橋剤との反応の結果として生成するアミニド−エステル架橋 (点) を含んでいると考えられる。例えば、これらの結合は、ヒドロキシアルキルアクリレート中のヒドロキシル基とＮ−(イソブトキシメチル)-アクリルアミドとの反応の結果として生成する。また、アミド−アミド架橋 (点) も、２つのＮ−(イソブトキシメチル)-アクリルアミドモノマーの間の反応の結果として生成する。例えば、アミド−エステル架橋は次式を有することができる：
−Ｃ (＝Ｏ) Ｏ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ (＝Ｏ)
式中、Ｒは２価基、好ましくはアルコキシアルキル基であり、より好ましくは−CH2−CH2−CH2−O−CH2−である。アミド−アミド架橋は、次式を有することができる：
−Ｃ (＝Ｏ) ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ (＝Ｏ)
式中、Ｒは２価基、好ましくはアルコキシアルキル基であり、より好ましくは−CH2−O−CH2−である。
【００２７】
被膜形成用溶液は、上記のように調製したアニオン性ポリマーと、場合により多糖類、好ましくはデキストランとを含有する。アニオン性ポリマーと多糖類は、約100:１〜約１:100、好ましくは約10:1〜約1:10、より好ましくは約5:1 〜約1:5 の比率で被膜形成用溶液中に存在させることができる。
【００２８】
被膜形成用溶液は、アニオン性ポリマーおよび任意成分のデキストランを、被膜形成用溶液の約0.01〜約15重量％、好ましくは約0.1 〜約10重量％、より好ましくは約0.5 〜約５重量％の量で含有する。例えば、被膜形成用溶液は4.5 重量％のポリマーと1.5 重量％のデキストランとを含有することができる。
【００２９】
被膜形成用溶液のpHは適当に調整することができる。例えば、カルボキシル化ポリマーを含有する被膜形成用溶液のpHは約3.0 〜約4.0 、好ましくは約3.75に調整することができる。被膜形成用溶液のpHは、酸または塩基の添加により調整することができる。適当な塩基の例は2N NaOH 水溶液である。
【００３０】
被膜形成用溶液を多孔質基体、好ましくは親水性基体に被覆する。親水性多孔質基体は任意の適当な材料から作製できるが；好ましくは基体はポリマーを含む。適当なポリマーの例としては、ポリ芳香族、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、フッ素ポリマー、酢酸セルロースおよび硝酸セルロースのようなセルロース系ポリマー、ならびにPEEKが挙げられる。芳香族ポリスルホンが好ましい。芳香族ポリスルホンの例としては、ポリエーテルスルホン、ビスフェノールＡポリスルホン、およびポリフェニルスルホンが挙げられる。ポリエーテルスルホンが特に好ましい。多孔質基体は任意の適当な細孔寸法、例えば、約10μｍ以下、例えば、約0.01〜約10μｍ、好ましくは約 0.1〜約５μｍ、より好ましくは約 0.2〜約５μｍ、を有することができる。多孔質基体は非対称型でもよいが、好適態様においては対称型のものである。
【００３１】
多孔質基体は当業者に公知の方法により作製することができる。例えば、多孔質基体は、転相プロセスにより作製することができる。即ち、ポリマー、溶媒、細孔形成剤、湿潤剤、および場合により少量の非溶媒を含有する流延溶液を、成分の好ましくは高温での混合により調製する。得られた溶液を濾過して不純物を除去する。この流延溶液をシートまたは中空繊維の形態に流延するか、押出す。得られたシートまたは繊維を、転相膜として固化またはゲル化させる。固化した膜を次に浸出処理して、溶媒および他の可溶性成分を除去する。
【００３２】
被膜形成用溶液による多孔質基体の被覆は当業者に公知の各種方法、例えば、浸漬塗布、噴霧塗布、メニスカス塗布、等により行うことができる。例えば、浸漬塗布は次のようにして実施することができる。基体を該溶液中に、細孔壁面の完全または実質的に完全な被覆を確保するのに十分なある時間だけ浸漬する。浸漬時間は約１秒ないし1.0 分、好ましくは約0.1 分ないし約0.5 分、より好ましくは約1/6 分ないし約1/3 分である。浸漬後、基体上の過剰な被膜形成用溶液を、重力下で排液させるか、またはスクイージ (絞り器) もしくはエアナイフを使用して除去する。得られた被覆基体を硬化させて、被膜形成用組成物の硬化または架橋を行わせる。
【００３３】
例えば、膜の硬化は、150 ℃以下、例えば、約60℃〜約130 ℃の温度、好ましくは約80℃〜約130 ℃の温度で、適当な時間行うことができ、この時間は約５分〜約120 分の範囲内、好ましくは約５分〜約60分の範囲内でよい。ある種の態様によれば、膜を約120 ℃〜約125 ℃の温度で約20分〜約30分間硬化させる。
【００３４】
得られた膜を洗浄して、膜に残る抽出性成分を浸出し除去することができる。ある種の態様の膜、特にカルボキシル官能性を持つ膜は、塩基性溶液、好ましくは約８〜約12のpHの溶液中で洗浄または浸出処理する。浸出用液体は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムのような塩基を添加することにより調製することができる。塩基は固体または溶液として添加することができる。浸出用液体のpHの具体例は、約11.9、約11.4および約8.1 である。これらのpHは、例えば、2N NaOH 溶液、炭酸ナトリウム、または重炭酸ナトリウムを使用して得ることができる。
【００３５】
例として、カルボキシル化膜は、約37℃〜約93℃またはそれ以上、好ましくは約54℃〜約73℃またはそれ以上の温度で洗浄または浸出処理することができる。スルホン酸含有膜は約54℃〜約93℃またはそれ以上の温度で洗浄または浸出処理することができる。膜の態様によっては、高温の脱イオン水、例えば73℃以上に保持した脱イオン水中で浸出処理することもできる。洗浄または浸出は、適当な長さの時間、例えば、約20分〜約30分またはそれ以上行うことができる。ある種の態様の膜によると、洗浄または浸出を約１時間以上行うことができる。得られた膜を次いで空気中またはオーブン中で乾燥して、水分を除去する。
【００３６】
本発明は、多孔質基体と側鎖アニオン基を有する架橋被膜とから構成される、負電荷を持つ微孔質膜の製造方法を提供する。この方法の１態様は下記工程を含む：
(a) 多孔質基体を用意し；
(b) この基体に、ヒドロキシル基の多い材料と、アニオン基を有する不飽和モノマー、少なくとも１種もしくは２種以上のＮ−（ヒドロキシアルキル）−および／もしくはＮ−（アルコキシアルキル）−アクリルアミド、親水性不飽和モノマー、ならびに場合により開始剤を含む重合組成物とを接触させ；
(c) 工程(b) で得られた基体を硬化させて負電荷を持つ膜を取得し；そして
(d) 場合により、工程(c) で得られた膜を抽出処理して、その中の抽出性残渣を除去する。
【００３７】
本発明はさらに、多孔質基体と架橋被膜とから構成される負電荷を持つ膜を提供する。その製造方法の１態様は下記工程を含む：
(a) 多孔質基体を用意し；
(b) この基体に、多糖類と、アニオン基を有する不飽和モノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−および／もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、ならびに開始剤を含む重合組成物とを接触させ；
(c) 工程(b) で得られた基体を硬化させて負電荷を持つ膜を取得し；そして
(d) 場合により、工程(c) で得られた膜を抽出処理して、その中の抽出性残渣を除去する。
【００３８】
本発明はさらに、１態様において、多孔質支持体と架橋被膜とから構成され、架橋被膜が、アニオン基を有する不飽和モノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、非イオン性親水性アクリルモノマー、ならびに開始剤を含む重合組成物から調製される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、別の態様において、多孔質基体、ならびに多糖類と、アニオン基を有する不飽和モノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、および開始剤を含む重合組成物とから調製された架橋被膜から構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【００４０】
本発明は、さらに別の態様において、多孔質基体、ならびにアニオン基を有するアクリルモノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、非イオン性親水性アクリルモノマー、および開始剤を含む組成物から調製された架橋被膜から構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【００４１】
本発明は、さらに別の態様において、多孔質基体、ならびに多糖類と、アニオン基を有するアクリルモノマー、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−もしくはＮ−（アルコキシメチル）−アクリルアミド、および開始剤を含む重合組成物とから調製された架橋被膜から構成される、負電荷を持つ微孔質膜を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、本発明の１または２以上の負電荷を持つ膜を備えた装置、例えば、フィルター装置、クロマトグラフィー装置、巨大分子移行装置、流れ分配設備、および／または膜モジュール、を提供する。この装置は任意の適当な形態とすることができる。例えば、装置は実質的に平面または折り畳み（プリーツ）形態の負電荷を持つ膜を含むフィルター要素を備えることができる。１態様において、フィルター要素は中空の概ね円筒形態を有することができる。所望により、装置は上流および／または下流の支持体層または排液層と組合わせたフィルター要素を備えることができる。装置は、例えば多層フィルター要素を構成するために、複数の膜を備えることができ、または膜クロマトグラフィー用の膜モジュールのような膜モジュールを構成するために積み重ねることができる。フィルターカートリッジは、流体シールならびに少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口とを与えるようにハウジングおよび末端キャップを設けることにより作製することができる。装置は、交差流もしくは接線流方式ならびにデッドエンド方式で作動するように構成することができる。従って、処理すべき流体は、例えば、膜表面に接線方向に流すか、または膜表面に垂直に流すことができる。
【００４３】
チューブもしくは繊維の形態、または複数のチューブもしくは繊維の束の形態の膜の態様の場合、膜は、例えば、それらの末端を接着剤により注封した後に、モジュールとして形づくることができる。代表的なクロマトグラフィー装置、多孔質媒体モジュール、および流れ分配設備の説明については、米国仮特許特許出願第60／121,667 号および第60／121,701 号 (いずれも1999年２月25日出願) 、米国仮特許特許出願第60／168,738 号および第60／168,750 号 (いずれも1999年12月６日出願) 、ならびに2000年２月25日に出願された「正電荷を持つ膜」と題する国際出願 (Xiaosong Wu, Chung-Jen Hou, Jayesh Dharia, Peter Konstantin およびYujing Yang); 「クロマトグラフィー装置およびクロマトグラフィー装置に使用する流れ分配設備」と題する国際出願 (Mark Hurwitz, Thomas Sorensen, John Stempel,およびThomas Fendya); および「クロマトグラフィー装置、クロマトグラフィー装置に使用する多孔質媒体モジュールおよび多孔質媒体モジュールの製造方法」と題する国際出願 (Mark Hurwitz, Thomas Fendya,およびGary Bush)を参照されたい。
【００４４】
本発明の膜は、水透過率 (透水性) 、動的タンパク質結合容量および電荷密度が高いことを含む、１または２以上の有利な特性を有する。従って、例えば、膜は好ましくは、24インチHgでの水流量が、約５mL/min/cm2以上、好ましくは約10 mL/min/cm2 以上であり、例えば、約20 mL/min/cm2 から約160 mL/min/cm2、好ましくは約25 mL/min/cm2 から約100 mL/min/cm2である。膜は頑丈で、高い処理流体流量に耐えることができる。従って、膜は、10 psi (68.9 kPa) で10 cm/min まで、例えば、約１cm/minから10 cm/min までの流速を受けさせることができる。膜の開放(open)泡立ち点は約70 psi (482 kPa)以下、例えば約2.5 psi (9.39 kPa)から約70 psi (482 kPa)、好ましくは約5 psi (34.47 kPa) から約50 psi (344.7 kPa)の範囲である。
【００４５】
本発明の膜は、高い電荷密度を有する。膜の電荷密度は当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、電荷密度は、正電荷を持つ染料を結合する膜の能力により測定することができる。例として、膜のメチレンブルー染料結合容量は、10 ppm染料水溶液で試験した時に、少なくとも約10 mL であり、例えば、約10 mL から約1000 mL 、好ましくは約100 mLから約800 mLである。メチレンブルーは正電荷を持つ染料である。染料結合容量は、重量で10 ppmのメチレンブルー染料の水溶液 (pH 6.6) を、24インチHgの負圧下に、直径25 mm の膜ディスク中で濾過し、痕跡量の染料が濾液内に現れ始めるまでの濾液の量を監視することにより測定される。
【００４６】
本発明の膜は、高い特異的タンパク質結合容量を有する。膜のリゾチーム特異的結合容量は、約10 mg/mL以上であり、例えば、約10 mg/mLから約130 mg/mL 、好ましくは約25 mg/mLから約120 mg/mL の範囲である。特異的結合容量は、下記の代表的方法により測定することができる。10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) 中にリゾチームタンパク質を含有する流体を、１cm/minで膜を通過させることにより濾過し、濾液中のタンパク質の濃度を時間の関数として測定する。タンパク質の濃度は、分光光度法により、例えば、280 nmでタンパク質の吸光度を測定することで求めることができる。その後、ｘ軸が濾過実験の時間を示し、ｙ軸が濾液中のタンパク質濃度を示す、図１に示すような貫流曲線 (破過曲線) を作製することができる。本発明の膜は、高い特異的タンパク質結合容量と低い非特異的もしくは疎水性結合とを有する。膜で得られた貫流曲線の傾斜は垂直または実質的に垂直である。この特性はタンパク質の分解および分離の改善を与える。本発明の膜はまた、高い動的タンパク質結合容量を有する。
【００４７】
本発明の膜の１つの利点は、タンパク質が貫流(break-through) より前に漏出しないことである。本発明の別の利点は、膜が被膜と基体との間のグラフト点または共有結合点を持たないか、または実質的に持たないように膜の成分が慎重に選択されていることである。本発明の負電荷を持つ膜の製造は、比較的単純で実施の容易な化学反応および処理操作を含んでいる。
【００４８】
本発明の膜は、その特性により、タンパク質、アミノ酸、核酸、およびウイルスといった生物学的分子の検出、分離、および／または精製に使用するのに魅力的である。核酸の例は、修飾または未修飾、合成または天然のRNA およびDNA を包含する。
【００４９】
本発明の膜は、正電荷を持つ原子、分子および微粒子を含有する流体の濾過、電気泳動ゲルから固定用マトリックスへの核酸およびタンパク質の移動のような電気泳動ゲルからの巨大分子の移行、といった各種用途に有用である。本発明の膜は、生物学的流体に存在する成分の分離または精製に使用することもできる。例えば、膜は血清からのヒトアルブミンの精製、血液の治療用分画、ならびに遺伝子操作された細胞培養物または発酵ブロス中の成分の分離に使用することができる。膜はまた、例えば、ウイルスワクチンおよびアデノ随伴ウイルスといった遺伝子治療ベクターの精製に使用することができる。
【００５０】
従って、本発明は、生物学的分子を含有する流体を、負電荷を持つ膜と接触させることを含む、該流体の処理方法を提供する。膜に吸着された正電荷を持つ物質を適当な溶媒溶離剤で溶離させて回収することができる。本発明はさらに、複数の種類の生物学的分子の混合物を含有する流体を、選択された特定の生物学的分子の吸着に有利な条件下で膜と接触させることを含む、該流体から１種または２種以上の生物学的分子を選択的に吸着させる方法を提供する。本発明はさらに、吸着された複数の種類の生物学的分子を有する膜を、選択された特定の生物学的分子の放出に有利な条件下で溶離剤と接触させることを含む、本発明の膜から１種または２種以上の生物学的分子を選択的に放出する方法も提供する。本発明はさらに、本発明の膜を電気泳動ゲルと接触させ、巨大分子をゲルから膜に移行させることを含む、電気泳動ゲルから巨大分子を移行させる方法も提供する。
【００５１】
本発明の負電荷を持つ膜は、所定の流体pHに対して正の表面電荷を持つ生物学的分子を含有する流体を処理するのに特に適している。例えば、リゾチームは等電点が11.25 であり、pH 5.5の塩濃度の低い流体 (例、10 mM MES)から本発明の負電荷を持つ膜を使用して精製することができる。本発明の膜を使用して、表面電荷が異なる２以上のタンパク質を分離、例えば、シトクロムＣからリゾチームを分離、することもできる。
【００５２】
即ち、リゾチームとシトクロムＣとの混合物を次のようにして分離することができる。３mg/ml のリゾチームと１mg/ml のシトクロムＣを含有する流体80μl を、直径25 mm の本発明の負電荷を持つ膜５層のスタック (積み重ね) またはクロマトグラフィーカラム上に入れることができる。このスタックまたはカラムを、10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) から1M NaCl-10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) までの７mlの密度勾配下で溶離することができる。流量は４ml/minとすることができる。シトクロムＣがまず溶離し、その後でリゾチームが溶離する。
【００５３】
以下の実施例は本発明をさらに例示するものであるが、本発明の範囲を制限するものとは決して解すべきではない。
【００５４】
【実施例１】
本実施例は、本発明の負電荷を持つ膜の１態様を製造するためのポリマー組成物の調製方法を例示する。
【００５５】
２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、Ｎ− (イソブトキシメチル) アクリルアミド、およびヒドロキシプロピルメタクリレートを、メタノール−水媒質中で8.0:2.5:1.5 の重量比で混合し、固形分含有量が12重量％の重合溶液を得た。開始剤として過硫酸アンモニウムを溶液の0.3 重量％の量で使用した。重合は室温 (20〜25℃) で約10〜15時間行った。得られた溶液の粘度は166 cps (0.166 Pa.s)であった。
【００５６】
【実施例２】
本実施例は、本発明の負電荷を持つ膜の１態様の製造方法を例示する。本実施例はさらにこの態様の特性も例示する。
【００５７】
実施例１に記載の重合溶液を分子量148 K のデキストランの水溶液と、得られた溶液がポリマーとデキストランを3:1 の重量比で含有するように混合して、被膜形成用溶液を調製した。
【００５８】
細孔寸法が約0.8 μｍの親水性微孔質ポリエーテルスルホン基体を、上記被膜形成用溶液で被覆した。被覆した基体を 100〜110 ℃のオーブンで１時間硬化させた後、沸騰脱イオン水中で１時間洗浄した。得られた膜をオーブンで乾燥して、本発明の１態様の膜を得た。
【００５９】
上で得た膜を、リゾチームを含有する溶液の処理に対して試験した。この試験溶液は、10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) １ml当たり206.4 μg を含有していた。この処理流体の流量は４ml/minであった。直径25 mm の２枚の膜ディスクを積み重ねて用いた。得られた貫流曲線を図１に示す。膜のリゾチーム結合容量は97 mg/mlであった。最初の10分間の処理中に得られた相対的に平坦な曲線は、膜が漏出を生じていないことを確認した。この曲線のほぼ垂直な傾斜は、膜が高い分離能を与えることができることを示している。
【００６０】
【実施例３】
本実施例は、本発明の負電荷を持つ膜の１態様の製造方法を例示する。本実施例はさらにこの態様の特性も例示する。
【００６１】
実施例１に記載の重合溶液を分子量148 K のデキストランの水溶液と、得られた溶液がポリマーとデキストランを4:1 の重量比で含有するように混合して、被膜形成用溶液を調製した。
【００６２】
細孔寸法が約0.8 μｍの親水性微孔質硝酸セルロース基体を、上記被膜形成用溶液で被覆した。被覆した基体を 100〜110 ℃のオーブンで１時間硬化させた後、沸騰脱イオン水中で１時間洗浄した。得られた膜をオーブンで乾燥して、本発明の１態様の膜を得た。
【００６３】
上で得た膜をリゾチームを含有する溶液で試験した。この溶液は、10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) １ml当たり201.3 μg を含有していた。処理流体の流量は４ml/minであった。直径25 mm の２枚の膜ディスクを積み重ねて用いた。得られた貫流曲線を図２に示す。膜のリゾチーム結合容量は77 mg/mlであった。最初の10分間の処理中に得られた相対的に平坦な曲線は、膜が漏出を生じていないことを確認した。この曲線のほぼ垂直な傾斜は、膜が高い分離能を与えることができることを示している。
【００６４】
【実施例４】
本実施例は、本発明の負電荷を持つ膜の１態様の製造方法を例示する。本実施例はさらにこの態様の特性も例示する。
【００６５】
２−アクリルアミドグリコール酸、２−カルボキシエチルアクリレート、Ｎ− (イソブトキシメチル) アクリルアミド、Ｎ− (ヒドロキシメチル) アクリルアミド、およびヒドロキシプロピルアクリレートを、メタノール−水媒質中にて、5.0:5.0:3.0:1.5:1.5 の重量比で混合して、固形分含有量が16重量％の重合溶液を得た。開始剤として過硫酸アンモニウムを溶液の0.4 重量％の量で使用した。重合は室温で約16〜24時間行った。得られた溶液の粘度は116 cps (0.166 Pa.s)であった。この重合溶液を、分子量148 K のデキストランの水溶液と、得られた溶液が４重量％のポリマーと1.33重量％のデキストランとを含有するように混合して、被膜形成用溶液を調製した。
【００６６】
細孔寸法が約0.8 μｍの親水性微孔質ポリエーテルスルホン基体を、上記被膜形成用溶液で被覆した。被覆した基体を 100〜110 ℃のオーブンで１時間硬化させた後、沸騰脱イオン水中で１時間洗浄した。得られた膜をオーブンで乾燥して、本発明の別の態様の膜を得た。
【００６７】
上で得た膜をリゾチームを含有する溶液で試験した。この溶液は、10 mM MES 緩衝液 (pH 5.5) １ml当たり213.6 μg を含有していた。この処理流体の流量は４ml/minであった。直径25 mm の２枚の膜ディスクを積み重ねて用いた。得られた貫流曲線を図３に示す。膜のリゾチーム結合容量は45 mg/mlであった。最初の10分間の処理中に得られた相対的に平坦な曲線は、膜が漏出を生じていないことを確認した。この曲線のほぼ垂直な傾斜は、膜が高い分離能を与えることができることを示している。
【００６８】
本明細書に引用した、特許、特許出願および出版物を含む全ての参考文献は、それらの全体を参考のために援用する。
本発明を以上にいくつかの態様を強調しながら説明したが、これらの態様の変更が可能であり、本発明はここに具体的に記載した以外のやり方でも実施できるものであることは当業者には自明であろう。従って、本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の技術思想および範囲に包含される全ての変更例を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の１態様の膜で得られたリゾチームに対する貫流曲線を示す。ｘ軸は濾過時間を、ｙ軸は280 nmにおける濾液の吸光度を示し、これは該タンパク質の濃度の指標である。さらなる詳細については実施例２を参照。
【図２】  本発明の別の態様の膜で得られたリゾチームに対する貫流曲線を示す。ｘ軸とｙ軸は図１に説明した通りである。さらなる詳細については実施例３を参照。
【図３】  本発明の別の態様の膜で得られたリゾチームに対する貫流曲線を示す。ｘ軸とｙ軸は図１に説明した通りである。さらなる詳細については実施例４を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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