(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療のために意図された組成物の製造における乳酸菌の使用であって、前記乳酸菌は、菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６，およびＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７から成る群から選択する少なくとも１種である、使用。
【請求項２】
前記組成物は歯の病原体を排除し、またはその付着を抑止するためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記乳酸菌は付着因子により歯の薄膜に付着する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物は虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防用の、有効量の前記乳酸菌を含む食用組成物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物は少なくとも１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇ前記乳酸菌を含有する、請求項１から４に記載の使用。
【請求項６】
前記乳酸菌は乳、発酵乳、カゼイノ−グリコマクロペプチド、ミセルカゼイン、弗素化ミセルカゼイン、レンニン処理乳またはバクテリオシンと組合せる、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６，およびＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７から成る群から選択した少なくとも１種の乳酸菌菌株を含む、口内保健用組成物。
【請求項８】
虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療に有効量の前記乳酸菌を含む、請求項７に記載の口内保健用組成物。
【請求項９】
少なくとも１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇ前記乳酸菌を含む、請求項８に記載の口内保健用組成物。
【請求項１０】
前記乳酸菌は乳、発酵乳、カゼイノ−グリコマクロペプチド、ミセルカゼイン、弗素化ミセルカゼイン、レンニン処理乳またはバクテリオシンと組合せる、請求項７から９のいずれか１項に記載の口内保健用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療のために意図された外因性乳酸菌を口内ミクロフローラに添加することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
口（口腔）は定住および非−定住ミクロフローラを含む。先ず第一は口腔表面に略々永久定住を確立できる微生物を含む。これらの細菌は主として舌、頬粘膜および歯に局在し、一方歯肉、くちびる、頬、口蓋および口床は非常にまばらなミクロフローラを支持するのみである。
【０００３】
舌および頬粘膜には、天然定住のミクロフローラはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓから選択された微生物を含む。歯には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ，ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉおよびＡｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓが主であるが、各種のグラム陽性および陰性球菌および桿菌を見出すことができる。
【０００４】
例えば、フランドセンらはＳ．ｓａｎｇｕｉｓは頬粘膜に多いが、その主な生育場所は歯の表面であり、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは歯肉上の熟成歯垢に生育し、Ｓ．ｏｒａｌｉｓおよびＳ．ｍｉｔｉｓは初期の歯垢に生育する（Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，１２９〜１３３，１９９１）ことを示した。口腔連鎖球菌群に属する菌株は歯に局在する（Ｓ．ｃｒｉｓｃｅｔｕｓ，Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ，Ｓ．ｆｅｒｕｓ，Ｓ．ｍａｅａｃａｌ，Ｓ．ｍｕｔａｎｓ，Ｓ．ｒａｔｔｕｓ，Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）。Ｓ．ｍｉｌｌｅｒｉ群に属する菌株は歯の膿瘍に多い（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ，Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ，Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ；ベントレーら．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｔｅｒ．１９９１，４１，４８７〜４９４；ウッドら，Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｅｔｅｒｉａ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｗ．Ｈ．ｌｄｓ．，１９９５）。
【０００５】
これらの微生物の多くは無害な共生微生物であるが、これらの多くはごく僅かな疾病の病因として認められている（ヒル、エム・ジェー、およびマーシュ、ピー・ディ、ｃｄｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，１９９０，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）。
【０００６】
歯垢は細胞外多糖類および唾液生成物のマトリックスの細菌細胞から成る歯の表面に形成するフィルムである。歯の萠出直後に、歯は唾液の非晶質層、約１．３μｍ厚さの、通常の歯磨きにより除去できない獲得エナメル薄膜（ＡＥＰ）により被覆される。ＡＥＰが形成されると直ぐに、歯に細菌が沈着し、プラークは複数層構造として８〜１２時間で明らかになる。第１層は主として特定の付着因子−受容体認識を経て歯に付着する細菌（もっとも早期にはコロニー形成体（ｃｏｌｏｎｉｓｅｒｓ））から成り、類似の特定結合を経て、または単純な並列を経て相互に付着する第２のコロニー形成体の基層を形成する。歯垢の粘着は本質的に３つの機作からなる。即ち、外部細菌層上の唾液薄膜の存在、異る細菌種間の特異的共凝集および細菌により合成され、歯垢マトリックスに捕集されて残るグルカン（スコペクら、Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，１９〜２４，１９９４；コレンブランデルら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２５３，３８５〜３９７，１９９５；ヒロイら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，９６，１９３〜１９８，１９９２；ギボンスら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５２，５５５〜５６１，１９８６）。
【０００７】
発酵プロセス中、口腔細菌により産生する有機酸は直接虫歯の原因となる。これらの酸はカルシウム、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、弗化物、ナトリウムのようなイオンの当然の遊離により歯の硬組織を攻撃する。口腔のｐＨが再び中性付近に上昇すると、唾液はカルシウムにより飽和されるようになり、従って歯からの遊離は抑止される。
【０００８】
口内に見出されるすべての食物残滓のうち、炭水化物は口内細菌発酵に直接利用されるので最高の虫歯促進効果を示す。
【０００９】
潜在的にすべての微生物発酵性糖は虫歯誘発性であるが、歯冠および歯根虫歯の主要な病因はストレプトコッカス変異菌で、これらは強酸産生菌であるためであり、高酸性である乳酸菌も包含する。ヒトでは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは一層強い虫歯誘発性菌株であり、全体の歯列をコロニー化しないが歯に生存する。大臼歯から前の歯のその数の減少は実際に実証された（リンキストら、Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，６９，１１６０〜１１６６，１９９０）。さらに、ヒトの密接歯垢では、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは接触面積に対し頂点のもっとも虫歯を生じやすい部位に優先的にコロニーを形成する（アーマディら、Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．，２７，１３５〜１３９，１９９３）。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの一層広い分布はＳ．ｍｕｔａｎｓのものと比較して大臼歯区域にも見出された（リンクイストら、Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．，２５，１４６〜１５２，１９９１）。
【００１０】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは主として特定付着因子−受容体を経て歯の薄膜に粘着することが示された。ギボンスらはＳ．ｍｕｔａｎｓは薄膜の唾液成分に結合する付着因子を含み、一方Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓは薄膜のグルカンに結合する付着因子を有するらしいことを示した（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５２，５５５〜５６１，１９８６）。
【００１１】
一時的ミクロフローラは時々口内に存在できるが、永久定住を確定しない外因性細菌を含む（たとえこれらの細菌の反復経口投与が行なわれるとしても）。すべての食用細菌、特に乳酸菌はこの一時的ミクロフローラの部分でありうる。これらの外因性乳酸菌は歯の薄膜に直接付着しうることは示されなかった。しかし外因性乳酸菌の反復投与は舌、頬粘膜、歯肉、くちびる、頬、口蓋、口床および歯のようなすべての口内表面で口内のコロニー化を生じうる。このコロニー形成は定住ミクロフローラの細菌に対する特異的結合により（共凝集現象）、または定住細菌が産生する多糖類のマトリックスに捕集されることにより、または唾液タン白（特にグリコタン白）に対する付着による付加から生じうる。
【００１２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＣＧ（ＡＴＣＣ  ５３１０３）は口、通常は頬粘膜上皮にコロニーを形成することが報告されている。この菌株も腸管の上皮に付着することができる（米国特許第５０３２３９９号、ゴルバッハら、Ｍｉｃｒ．Ｅｃｏｌ．Ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓ．，７，２９５〜２９８，１９９４）。対照的に、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓは歯に付着しない。
【００１３】
日本特許第４０２１６３３号明細書（Ｃｙｃｏｎｍｅｄｉｘ  ＫＫ）も口、通常は頬粘膜の上皮にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓによるコロニー形成を報告する。多くのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓも腸管上皮に粘着することが知られる。ＥＰ５７７９０４，ＥＰ１９９５３５，ペルジゴンら、Ｍｅｄｉｃｉｎａ，４６，７５１〜７５４，１９８６；ペルジゴンら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６３，１７〜２３，１９９８）。
【００１４】
外因性細菌は口内の定住ミクロフローラの生育を阻害する因子を産生することもある。例えば、ＥＰ７５９４６９号明細書（ネスレ社）は経口病原体Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ，Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓの発育を阻害するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓが産生するバクテリオシンの使用を記載する。
【００１５】
いくつかの戦略は、口内の定住ミクロフローラの発育を最少化するために使用されてきた。すなわち、虫歯誘発性でない、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＪＰ５９２２０１９１号明細書）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＪＰ０５００４９２７号明細書）および／またはＳｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓのような定住ミクロフローラの共生細菌の投与、および／またはＬ．ｃａｓｅｉ，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ，Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ，Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ，Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓのような外因性乳酸菌の反復投与である（タンザーら、Ｉｎｆｅｃ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４８，４４〜５０，１９８５）；ＷＯ９２／１４４７５；ＥＰ０５２４７３２号明細書）。
【００１６】
バクテリオシンの適用も虫歯の低減に提出された調査戦略の１つである。これらの分子は見込みのある抗虫歯作用剤として、および口腔のコロニー形成の調整に重要な要素として興味を引いた。いくつかのバクテリオシン適用の抗虫歯可能性はストレプトコッカス変異菌および歯垢と関連する細菌に対する有力かつ広い抗菌活性、およびヒトに安全と見做される細菌の自然発生に原因する（コルゲートの米国特許５３６８８４５号明細書およびスミスクライン  ビーチャムのＷＯ９４／１２１５０）。
【００１７】
乳関連品の適用も口の保健に関心がある。実際に、米国特許５４２７７６９号明細書（ネステック社）は歯をＳｔｒｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓによるコロニー形成を阻害する十分量のミセルカゼイン含有食用組成物と接触させることにより虫歯が防止される別法を記載する。ヨーロッパ特許７４８５９１号明細書（ネスレ社）も虫歯または歯垢の治療に弗化物を加えたミセルカゼインまたはそのミセルサブユニットの使用を報告する。米国特許４９９２４２０号明細書（ネステック社）は歯垢および虫歯の根絶に乳由来のカッパ−カゼイノ−グリコマクロペプチドによる頬の空洞治療を記載する。
【００１８】
口の定住ミクロフローラの部分でない乳酸菌が歯の薄膜に実際に直接付着できることを示すものはなかった。こうして、歯の表面にコロニーを形成することにより、このような乳酸菌は経口病原体を含む定住ミクロフローラの発育に対し阻害活性を示す。
【００１９】
（発明の要約）
本発明の目的は虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療に意図された組成物の製造に、口の定住ミクロフローラの部分でなく、酸性化が低く、歯の薄膜に直接付着しうる乳酸菌の使用を供することである。
【００２０】
乳酸菌は遺伝的に修正して付着因子による歯の薄膜に対するその付着を増加させ、および／または遺伝的に修正して約５．５〜７の口腔ｐＨに寄与する酸性化を少なくすることができる。
【００２１】
乳酸菌は、
・歯の薄膜に付着し、かつ低酸性化性であるように遺伝的に修正した酸性化乳酸菌、
・低酸性化であり、かつ歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正した非付着乳酸菌、
・歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正し、かつ低酸性化であるように遺伝的に修正した非付着、酸性化乳酸菌
から成る群から選択できる。
【００２２】
別の目的は定住ミクロフローラの部分でなく、低酸性であり、かつ歯の薄膜に直接付着できる乳酸菌を含む口の保健に対する組成物を供することである。
【００２３】
好ましい態様では、口内保健用組成物は菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７およびＬＭＧ  Ｐ−１８９９７から成る群から選択した少なくとも１種の乳酸菌菌株を含む。
【００２４】
口内保健用組成物は遺伝的に修正して付着因子による歯の薄膜に対するその付着を増加させ、および／または遺伝的に修正して一層低酸性化にして、約５．５〜７の口腔ｐＨに寄与する少なくとも１種の乳酸菌を含むことができる。
【００２５】
口内保健用組成物は、
・歯の薄膜に付着し、かつ低酸性化であるように遺伝的に修正した酸性化乳酸菌、
・低酸性化であり、かつ歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正した非付着乳酸菌、
・歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正し、かつ低酸性化であるように遺伝的に修正した非付着、酸性化乳酸菌
から成る群から選択した乳酸菌を含むことができる。
【００２６】
別の目的は、
・歯の薄膜に付着し、かつ低酸性であるように遺伝的に修正された酸性乳酸菌、
・低酸性であり、かつ歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正された非付着性乳酸菌、
・歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正され、かつ低酸性であるように遺伝的に修正された非付着性酸性乳酸菌から成る群から乳酸菌を含む、口の健康に対する組成物を供することである。
【００２７】
（発明の詳細な記載）
以下の記載で、口は口腔粘膜（歯肉、くちびる、頬、口蓋および口床）、舌および歯（人工構造物を含む）により構成されるヒトまたはペットのような動物の口腔を規定する。
【００２８】
口の定住ミクロフローラは口内に自然に定住するすべての微生物を含み、これらは口腔表面に恒久定住を確立できるためである。口の定住ミクロフローラは歯の硬質および軟質組織間（歯−歯肉の接合点）の界面区域に住む細菌も含む（歯肉隙および歯根膜ポケットは健康な口には存在しないとしても）。このミクロフローラはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ａｒａｃｈｎｉａ，Ｒｏｔｈｉａ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈｇａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｎｓ，Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ，Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ／Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ，Ｐｒｏｔｏｚｏａから選択した微生物を含む。
【００２９】
一時的ミクロフローラは時々口内に存在できるが、恒久定住を確立しない外因性細菌を含む。この一時的ミクロフローラはビヒドバクテリア（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ，Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ，Ｂ．ｂｒｅｖｅおよびＢ．ｌｏｎｇｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｃ  ｂｉｏｖａｒ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｓ．ｌａｃｔｉｓ，Ｓ．ｌａｃｔｉｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓおよびＳ．ｌａｃｔｉｓ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｎｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍおよびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを含むアシドフィル群（フジサワら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．，４２，４８７〜４９１，１９９２参照）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｉｓａｃｅｕｓ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉおよびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ）、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｐｈｉｚｏｐｕｓ，ＭｕｃｏｒおよびＰｅｎｅｃｉｌｌｉｕｍのかび、のようなすべての食用微生物を含むことができる。
【００３０】
本発明の第１目的について、虫歯の予防または治療に意図する組成物の製造に対し、口の定住ミクロフローラの部分でなく、低酸性であり、かつ歯の薄膜に直接付着しうる乳酸菌の使用に関する。
【００３１】
本発明の乳酸菌は低酸性であり、これらは歯の薄膜に直接付着することができるので、これらの乳酸菌により製造した組成物は歯の病原体を排除し、またはその付着を防止するためのものである。本発明の乳酸菌は「低酸性」であり、これはこれらが病原体菌株より酸性化が低いことを意味する。従って、これらは約５．５〜７の口腔のｐＨの一因となる。これらは乳起源由来のものが好ましい。
【００３２】
本発明の乳酸菌は特異的または非特異的の相互作用および／または付着因子により歯の薄膜に付着する。特異的付着因子はタン白または多糖類である。
【００３３】
少なくとも１種の乳酸菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ，およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓから成る群から、特に菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７およびＬＭＧ  Ｐ−１８９９７から成る群から選択する。
【００３４】
これらの菌株は歯の薄膜に付着するその能力に対し乳酸菌菌株のうちから選択し、その最適発育温度は口腔内温度で約３７℃である。さらにこれらはグルコースおよびシュクロースを発酵することができ、むし歯誘発性菌株の病原性要素であるグルカンを合成しない。
【００３５】
本発明の別の目的によれば、付着因子により歯の薄膜に付着するように遺伝的に修正した乳酸菌が考慮される。歯の薄膜に既に付着する乳酸菌では、この修正は歯の表面に菌株が一層よく付着するようにするためである。同様に、任意の非付着性乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉではない）は遺伝的に修正されるので歯の薄膜に付着する。
【００３６】
乳酸菌のこの修正は例えば、遺伝子Ｘ１７３９０、Ｘ１４４９０またはＸ５３６５７（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号）の挿入により達成できる。これらの遺伝子は唾液のグリコタン白に対する付着を仲介する抗原Ｉ／ＩＩの発現に対しＳ．ｍｕｔａｎｓに応答する。
【００３７】
本発明によれば、乳酸菌が低酸性であるように乳酸菌を遺伝的に修正することもできる。既に低酸性である乳酸菌に対してはこの修正はその乳酸産生を低減することによりその効果を高めるためである。
【００３８】
この修正は多くの方法で達成でき、好ましくは次の文書、ブーメルダシら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，２２９３〜２２９９，１９９７；プラッティら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６１，３９６７〜３９７１，１９９５；イトーら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１５６９〜１５７３，１９９４に記載されるプロトコルの１つにより達成できる。
【００３９】
本発明によれば、遺伝的に修正され、または修正されない少なくとも１種の乳酸菌は、ヒトまたはペットのような動物の虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療するための組成物の製造に対し「有効量」で使用される。この量は１０4〜１０9ｃｆｕ／ｇを含むことが好ましい。
【００４０】
少なくとも乳酸菌は、乳または発酵乳のような乳関連品、または例えば任意形のカゼイノ−グリコマクロペプチド、ミセルカゼイン、弗素化ミセルカゼイン、レンニン処理乳から選択した乳関連品またはバクテリオシンと組合せて使用することもできる。
【００４１】
（選択菌株の生化学的特徴）
発酵パターン：４９種の単糖類をａｐｉ５０  ＣＨ  ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ストリップ試験（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，６９２８０マルシ−レトール、フランス）により試験し、結果は表１に示す。
酸性化曲線：酸性化曲線は３７℃で次の条件、
Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６：ＦＵＭシュクロース１％およびＦＵＭグルコース１％、
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５：Ｂｅｌｉｋｅｒシュクロース１％およびＢｅｌｉｋｅｒグルコース１％
接種はすべて５％、ｐＨは２０分毎に記録する、で測定した。
シュクロース発酵からＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５はｐＨを４．５に下げ、一方Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６は４に下げる。
0004564169.tif 000002
0004564169.tif 000003
【００４２】
本発明の第２の主要目的は口内の定住ミクロフローラの部分でなく、低酸性であり、かつ歯の薄膜に直接密着できる乳酸菌を含む口の保健用組成物に関する。
これらの組成物は特に虫歯、歯垢および歯周疾患感染の予防または治療のためのものである。
【００４３】
この乳酸菌菌株はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓから成る群、好ましくは菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＬＭＧ  Ｐ−１８９９７，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７から成る群から選択される。
【００４４】
口の保健用のこのような組成物では、乳酸菌菌株は上記のように遺伝的に修正することができる。
この乳酸菌菌株は例えば食品、ペットフード、化粧または医薬組成物に含むことができる。
【００４５】
従って、これらの組成物は好ましくは例えばねり歯磨き、口のすすぎ液、ガム、噴霧液、飲料、キャンデー、幼児処方、アイスクリーム、冷凍デザート、スイートサラダドレッシング、乳調製品、チーズ、クォーク、ヨーグルト、酸性化乳、コーヒークリームまたはホイップクリームである。
【００４６】
これらの組成物では乳酸菌菌株は単独または例えば、相乗性調製品を得るために乳関連品と組合せて含むことができる。従って、口の保健用のこれらの組成物は、
・口の定住ミクロフローラの部分でなく、歯の薄膜に直接密着できる乳酸菌、
・任意形の乳グリコペプチド、レンニン処理乳またはバクテリオシン
を含む。
【００４７】
乳グリコペプチドは好ましくはカゼイノ−グリコマクロペプチド（ＣＧＭＰ）であり、弗素化またはミセルでないカゼイン（ヨーロッパ特許０６０４８０２号およびヨーロッパ特許０７４８５９１号明細書に記載のように得ることができる）またはレンニン処理乳も添加できる。カゼイノ−グリコマクロペプチドは約０．１％の最少量で添加するのが好ましい。カゼイノ−グリコマクロペプチドはこの乳酸菌が歯の薄膜に付着するのを阻害しないことも示された（図２および３）。
【００４８】
相乗組成物はグラム−陽性口腔細菌に対し活性の、少なくとも１種のバクテリオシンを添加して製造することもできる。この場合、口腔衛生組成物は組成物重量で精製バクテリオシンを０．００００１〜５０％、好ましくは０．００００１〜１５％を含むことができる。バクテリオシンはバリアシン（ヨーロッパ特許０７５９４６９号明細書）が好ましい。
【００４９】
組成物の分解を防ぐために、油溶性抗酸化剤を含むこともできる。適当な抗酸化剤は「トコフェロール」、ブチル−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびアスコルビン酸パルミチン酸エステルを含む。油溶性抗酸化剤は組成物重量で０．００５〜０．５％、好ましくは０．００５〜０．０１重量％の量で含む。
【００５０】
本発明の歯磨き組成物に使用する適当な研磨材は炭酸カルシウム、アルミノ珪酸カルシウム、アルミナ、アルミナ水和物、オルソリン酸亜鉛、プラスチック粒子およびシリカを含み、それらのうちシリカは好ましい研磨材である。
【００５１】
本発明組成物は口腔内に許容しうるｐＨを有し、そのｐＨ内で乳酸菌の活性は損なわれない。ｐＨは３．０〜９．５、好ましくは３．５〜６．５の範囲でよい。
【００５２】
これらの組成物は成分を適当な相対的量で混合し、必要の場合、ｐＨを所望値に調整することを含む常法により製造できる。
【００５３】
歯に付着しうる乳酸菌の選別方法は、
（１）歯に付着できる乳酸菌菌株の特異表面タン白を認識するモノクローナル抗体を調製し、そして
（２）歯に付着できる菌株のモノクローナル抗体を使用して任意の乳酸菌菌株を選別する、
工程を含むことができる。
【００５４】
本発明はここに記載する特定態様により範囲は限定されるものではない。実際、ここに記載するものの他に本発明の各種修正は前記記載および添付図面により当業者には明らかであろう。このような修正は特許請求項の範囲内に入るものである。各種刊行物はここに引用し、その開示は本発明の理解に必要な範囲にその全体を引用して挿入する。細菌細胞のＤＮＡ操作、クローニングおよび形質転換は、他の点で述べる場合を除いて、サムブルックらの教科書（サムブルックら、モレキュラークローニング、研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス、米国、１９８９）により行なう。これらの例では使用するプラスミド、菌株および各種媒体、およびモノクローナル抗体の製造方法の簡単な記載を先に記載する。
【００５５】
菌株Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１１８（ＮＣＣ  １５２９），Ｓ１２３（ＮＣＣ  １５６１），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ２９（ＮＣＣ  ２２１１），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  ｄｉｏａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ  ６９（ＮＣＣ  ２２２５）はブダペスト条約下で固定微生物カルチャーコレクション（それぞれＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７），２５  ｒｕｅ  ｄｏ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４，パリ、フランス１９９８年３月３日に寄託された。菌株Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＢＦ  １１１１６（ＣＮＢＬ  １１７７）はブダペスト条約下でベルギー微生物共同コレクションに寄託され、ＬＭＧ  Ｐ−１８９９７はＫ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，Ｂ−９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，１９９９年７月５日に寄託された。これらの寄託品の入手に関するすべての制限は、この出願に対し優先する利益を請求するこの出願または他の出願の最初の刊行により撤回される。
【００５６】
（図面）
図１ａ，１ｂおよび１ｃは各々Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６，Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１およびＳ．ｔｈｅｒｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１の付着飽和曲線を表わす。
図２は結合細胞数対ＣＧＭＰの増加量をプロットして３つの菌株について得た曲線を表わす。
図３は結合細胞数対Ａｓ−ＣＧＭＰの増加量をプロットして得た３菌株の曲線を表わす。
【００５７】
例１  菌株および培養条件
１００種以上の菌株（ネスレカルチャーコレクションに所属）を唾液−被覆ヒドロキシアパタイトビーズに付着する能力について選別し、特に次の２３菌株：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＳ４（ＮＣＣ  ２２８４），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ６（ＮＣＣ  １９７１），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ１３（ＮＣＣ  ２００８），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ２１（ＮＣＣ  ２０３８），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ３９（ＮＣＣ  ２１３０），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ４２（ＮＣＣ  ２１４５），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓｆｉ４７（ＮＣＣ  ２１７２），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１１８（ＮＣＣ  １５２９），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１１９（ＮＣＣ  １５３６），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１２２（ＮＣＣ  １５５４），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１２３（ＮＣＣ  １５６１），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｓ１２６（ＮＣＣ  １５８７），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ１５（ＮＣＣ  ９２），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ２５（ＮＣＣ  １９３２），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ１３６（ＮＣＣ  ２４１９），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ８（ＮＣＣ  １９７０），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ２８（ＮＣＣ  ２０５７），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ６９（ＮＣＣ  ２２２５），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ８０（ＮＣＣ  ２２７２），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ２９（ＮＣＣ  ２２１１），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ５０（ＮＣＣ  ２２２４），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ５４（ＮＣＣ  ２２２８），Ｓ．ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ２１６（ＮＣＣ  ２４８４）を選別した。
５種の口腔菌株Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６，Ｓ．ｏｒａｌｉｓ  ＯＭＺ６０７，Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  ＯＭＺ７４５，Ｖ．ｄｉｓｐａｒ  ＯＭＺ４９３およびＦ．ｕｎｃｌｅａｔｕｍ  ＯＭＺ５９６は口腔微生物と一般的免疫研究所、チューリッヒ大学から得られ、これらはＦＵＭ培地で嫌気的に（Ｇａｓ  Ｐａｃｋ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＢＢＬ）３７℃で培養した。
すべての菌株は−２０℃でグリセロールに貯蔵し、その特定最適温度で使用前１４時間予備培養した。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６はＦＵＭ培地で
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ラクトコッカスおよびストレプトコッカスはＭ−１７で（Ｄｉｆｃｏ）で生育し、しかしＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ  １５２９，Ｓ１１９，Ｓ１２２，ＮＣＣ１５６１およびＳ１２６はＢｅｌｌｉｋｅｒ（１リットルの水に２０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、２．５ｇゼラチン、５ｇデキストロース、５ｇラクトース、４ｇ  ＮａＣｌ、０．５ｇアスコルビン酸、１０ｇビーフエキスを溶解して調製）で生育した。
プレート計数に対しては、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６はＭｉｔｉｓ  Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ寒天（Ｄｉｆｃｏ）で、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５２９，Ｓ１１９，Ｓ１２２，ＮＣＣ１５６１，ＢＦ１１１６およびＳ１２６はＢｅｌｌｉｋｅｒ寒天（液体Ｂｅｌｌｉｋｅｒ  １５ｇにＢａｃｔｏ寒天を添加して調製、Ｄｉｆｃｏ）で、および残りの乳酸菌菌株はＭ１７寒天（Ｏｘｏｉｄ）で培養した。
【００５８】
例２  モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体はＳ−ＨＡディスクに一緒に生育し、かつ歯垢に類似するバイオフィルムを形成する５種の口腔菌株のうちからＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１を検出する用具として使用する。従って、モノクローナル抗体は交差反応しないことを証明するためにこれらの菌株に対し試験した。
このため、モノクローナル抗体はグラナトら「マウスモノクローナルＩｇＥ抗体抗−ウシ乳ラクトグロブリンは胃腸管におけるアレルギー研究を可能にする」ａｌｌｏｗｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６３，７０３〜７１０，１９８６に記載のように調製する。
【００５９】
例３  付着性乳酸菌の選別
唾液−被覆ヒドロキシアパタイトビーズ（Ｓ−ＨＡ）に対する付着
乳酸菌乳菌株のうちから唾液−被覆ヒドロキシアパタイトビーズ（Ｓ−ＨＡ）に付着しうるものを選択するために、ニイセルらが以前に記載した方法を僅かに修正して、すなわちビーズの洗浄は１５０μｌ容量により、水酸化ハイアミンは水酸化ベンゾソニウム（シグマ）で置換して、使用した。
簡単には、Ｂｅｌｌｉｋｅｒで培養したＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５２９，Ｓ１１９，Ｓ１２２，ＮＣＣ１５６１およびＳ１２６を除いて、すべての菌株はＦＵＭで対数相の終りまで生育した。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６，Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１，５０および５４，Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５２９，Ｓ１１９，Ｓ１２２，ＮＣＣ１５６１およびＳ１２６は３７℃で、残りのラクトコッカスは３０℃で、および残りのストレプトコッカスは４２℃で生育した。
５ｍｇのヒドロキシアパタイトビーズ（ＢＤＨケミカルズ社、プール、英国）は研究所のボランティアから得た７０μｌの清澄化唾液で被覆し、上記説明のように製造した（ニーサら、１９９４）。唾液被覆ビーズは一夜中、４℃に保持し、次いで洗浄し（最初に蒸留水で、その後ＨＥＰＥＳ緩衝液で）、最後に１００μｌの代謝標識した細菌サスペンジョン（細菌はそれらの培地で生育し、１０μＣｉ／ｍｌ14Ｃ酢酸を補充した）を接種した。３７℃で４５分間に付着が起こり、未結合細菌は洗い流し、付着細胞は直接ＬＫＢシンチレーション計数器（型１２１９  Ｒａｃｋｂｅｔａ）で計数した。
付着率％は各穴に添加した全放射能に対しビーズに結合した放射能として表わす。表２は数種の選別菌株およびＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６（対照菌株）で得た唾液被覆ヒドロキシアパタイトビーズに対する付着率％を報告する。
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４種の菌株Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５２９（ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４），Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１（ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５），Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１（ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６）（以下Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１）およびＬ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２２５（ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７）はＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６に近い値を示した。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１は口内の温度である３７℃で非常によく生育するので、尚さら見込みのある候補として選択し、一方Ｌ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２２５は最適生育温度が３０℃であった。特にＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１はシュクロースには生育できないが、広範囲の糖を発酵することができ、さらに他の口腔菌株はそれらのインベルターゼによりグルコースを供することができる。
付着飽和曲線
穴に接種した結合ＣＦＵ対ＣＦＵの曲線を測定して、ビーズ飽和が得られるかどうか確認した。５０％飽和は得た曲線の曲げ点から直接引き出した。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６，Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１の付着飽和曲線を測定した。これらは図１に示す。
３種の菌株について、５０％ビーズ飽和を得るために穴に接種されるＣＦＵ数および相当する結合ＣＦＵ数は曲線の曲げ点から直接推論し、表３に示す。
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【００６０】
例４  カゼイノグリコマクロペプチドの効果
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１の付着に及ぼすＣＧＭＰの影響は病原体（すなわちＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６）に対しこの２種の菌株の１つの卓越性を助成するためにその使用の可能性を証明する研究を行なった。カゼイノーグリコペプチド（ＣＧＭＰ）およびその脱シアリル誘導体（Ａｓ−ＣＧＭＰ）はネステック社から得た（その製造はニーサーら、１９９４参照）。
異る濃度でＣＧＭＰまたはＡｓ−ＣＧＭＰを含有する１００μｌの細菌サスペンジョン（予め計算した５０％ビーズ飽和に相当するＣＦＵ／ｍｌ）を穴に接種し、次に通例のように付着検定を行なうことによりＳ−ＨＡビーズに対する付着について用量応答効果を研究した。０．０５〜３ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を試験した。ＣＧＭＰまたはＡｓ−ＣＧＭＰの存在で細菌の前培養は行なわなかった。
図２では、結合細胞数対ＣＧＭＰの増加量をプロットして得た３菌株に対する曲線を提供する。接種細胞数は各菌株に対し先に計算した５０％ビーズ飽和に相当するものである。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６の場合に観察された強い抑制はニーサーら（１９９４）およびシュップバッハら（Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，７５，１７７９〜１７８８，１９９６）が得た以前の結果を確認する。
図２で明らかなように、０．２５ｍｇ／ｍｌはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６の５０％の付着抑制を生じ、一方２ｍｇ／ｍｌ以上はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１と同じ効果を有するために必要であった。ＣＧＭＰはＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１の付着を僅かに高める。
ＣＧＭＰの場合のように、脱シアリル誘導体はＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ  ＯＭＺ１７６の付着を抑制する。僅かに０．０５ｍｇ／ｍｌが付着％を５０％低減するのに必要である。Ａｓ−ＣＧＭＰはＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＮＣＣ２２１１の付着に影響がなく、僅かにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＣ１５６１の付着を助長する（図３）。
【００６１】
例５  ねり歯磨
ねり歯磨は凍結乾燥形の少なくとも１種の乳酸菌菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８６，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７を１０5ｃｆｕ／ｍｌで、
セチルピリジニウムクロリド                          １．６５％
ソルビトール（７０％溶液）                        ３３．０％
グリセリン                                        ２５．０％
カルボキシメチルセルロースナトリウム                ２．０％
弗化ナトリウム                                      ０．２５％
シリカ（ＲＰ９３）                                ２６．３％
増粘シリカ（Ｓｉｄｅｎｔ  ２２）                    ８．１％
サッカリンナトリウム                                ０．５％
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８）    ３．２％
を含有する混合物に添加して製造する。
この歯磨はむし歯、歯垢および歯周疾患の予防または治療するためのものである。
【００６２】
例６  アイスクリーム
１０．８％乳脂肪、１３．５％乳固体（無脂肪）、０．３％  Ｅｍｕｌｓｔａｂ（商標）ＳＥ３０および０．３％  Ｅｍｕｌｓｔａｂ（商標）フォーム（グリントステッド、ＤＫ）を含むクリームを調製し、次に１０５℃で２０秒殺菌し、７５℃および３００バールで均質化し、３８℃に冷却し、次いで少なくとも１種の乳酸菌菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５，ＣＮＣＨ  Ｉ−１９８６，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８７またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７を１０7〜１０8ｃｆｕ／ｍｌの割合で、指数生育相で採取したＭＲＳ培地の予備カルチャーを接種する。次にクリームは３８℃で１０時間約４．５のｐＨまで発酵する。発酵が終ると、シュクロースおよびグルコースシラップをそこに添加する。クリームの組成は表４に示す。
次に混合物は振動し、４℃に冷却し、４℃で貯蔵し、９５℃の容積膨脹度まで冷却する。
0004564169.tif 000007
【００６３】
例７  ヨーグルト
５ｌのＭＲＳ培養基を１２１℃で１５分滅菌し、次に約１０9ｃｆｕ／ｍｌを含有する少なくとも１種のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７の５容量％の活性カルチャーを接種する。４１℃で８時間の培養後４．５．１０8ｃｆｕ／ｍｌを含有するスタータを得る。
０．１％酵母エキスを添加した１０％乾物含量を有する５ｌの再構成脱脂乳を１２１℃で１５分滅菌し、ついで約１０9細胞／ｍｌを含有する市販増粘性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの２％活性カルチャーを接種した。４１℃で４時間培養後、４．５．１０8細胞／ｍｌを含有するスタータを得る。
２．５％の脱脂粉乳で強化し、次に９０℃で３０分殺菌した、３．７％の脂肪を含有する１バッチの全乳は次に少なくとも１種の菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７のスタータを２容量％および増粘性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのスタータを３容量％接種する。接種乳を撹拌し、ポットに注入し、４１℃で４時間培養する。
得たヨーグルトは良好なしっかりした、滑かなテクスチャーを有し、口内保健のためのものである。
【００６４】
例８  チューインガム
虫歯、歯垢または歯周疾患感染の予防または治療用チューインガムは約１０4〜１０9ｃｆｕ／ｍｌを含有するように少なくとも１種のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７の活性カルチャーを、次の一般的成分、
キシリトール                                ６７．５％
ガムベース                                  ２０％
炭酸カルシウム                                ５％
グリセリン                                    ３％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７                    ２％
セルロースガム                                １％
バラスト化合物                                ０．５％
フレーバ                                      １％
に添加して製造することができる。
【００６５】
例９  ペットフード組成物
口内保健用ペットフードはコーン、コーングルテン、チキンおよび魚粉、塩、ビタミンおよびミネラルから形成される飼料混合物を調製することにより得られる。飼料混合物はプレコンディショナーに送り、加湿する。プレコンディショナーを出る加湿飼料は次にエクストルーダクッカーに送り、ゼラチン化する。エクストルーダを出るゼラチン化マトリックスはダイに送り、押出す。押出し物は犬の給餌に適する断片に切断し、約１１０℃で約２０分乾燥し、ついで冷却して水分活性約０．６を有するペレットを得る。
ペレットに３種の被覆混合物を噴霧する。各被覆混合物は少なくとも１種のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８４，ＣＮＣＭ  Ｉ−１９８５またはＬＭＧ  Ｐ−１８９９７の活性カルチャーを含有するが、１つの被覆混合物は被覆基質として水素添加大豆脂肪を使用し、１つの被覆混合物は被覆基質として水を使用し、および１つの被覆混合物は被覆基質としてタン白消化物を使用する。ペレットは約１０4〜１０9ｃｆｕ／ｇ菌株を含有する。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ，１ｂおよび１ｃ】  ３種の菌株に対する各付着飽和曲線を示す。
【図２】  ３種の菌株に対し結合細胞数対ＣＧＭＰ増加量をプロットして得た曲線を示す。
【図３】  ３種の菌株に対し結合細胞数対Ａｓ−ＣＧＭＰ増加量をプロットして得た曲線を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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