(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食餌性のパルミトレイン酸をラウリン酸との組合せで含んでいる食用油脂の混合物またはその食用油脂を含有する食物を少なくとも含んでいるペットフード処方をペットに与える工程を含む、ペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善または維持する方法であって、
前記ペットフード処方が、当該ペットフード処方の乾燥重量に基づいて少なくとも０．３３重量％の食餌性パルミトレイン酸を少なくとも１．３重量％の食餌性ラウリン酸と組合せて含有している、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、動物の表皮中に存在する抗菌性脂肪酸のレベルを調節してペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善または維持することを目的とした食物組成物を調製する際の食餌性脂質原料の使用に関する。本発明はまたペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善するための方法、並びにそれについてのペットフード処方に関する。
【０００２】
本発明の背景
皮膚は体の外部境界であり、生体と環境の間のバリアとして重要な役割を果たしている。皮膚の最も重要な機能の一つは水および水溶性化合物を当該身体から流出または身体への進入をさせないことである。皮膚のバリア機能が損なわれると、例えば皮膚感染、炎症、かゆみなどをより起こしやすくなる。
【０００３】
当該皮膚の当該バリア機能の多くは、表皮のより外層である、角質層が備えている。その角質層は主にケラチノサイトの層からなり、ケラチノサイトは表面に向かって進みながら生命を失って脱落していく。角質層はケラチノサイト間の接着状態の維持を補助する脂質を含有し、表皮の防水性を確保している。
【０００４】
普通の状態であれば当該皮膚のバリア機能は適切であるが、生理的、環境的または病理的な状態の変化により充分でなくなる状況が幾つかある。当該皮膚は通常皮膚脂質：トリグリセリド、コレステロールとコレステロールエステル、セラミドの合成を増やすことでそれらの状況に対応している（Ｇｒｕｂａｕｅｒほか、１９８７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８７；２８（６）：７４６〜７５２）。この工程で約４８時間後には皮膚は適切な保護のレベルまで達することができる。
【０００５】
栄養は皮膚バリア機能に影響を与えているようである。例えば、国際特許出願ＷＯ  ９８５６２６３ではペットの皮膚の質および皮の状態の改善用にリノール酸および亜鉛の組合せを開示している。
【０００６】
栄養が皮膚に影響するだろうという他の態様は、例えば脂肪酸のα−リノレン酸のような脂肪酸が皮膚での炎症反応の発生を防ぐことによる（Ｖａｕｇｈｎ  ＤＭほか，１９９４，Ｖｅｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５：１６３〜１７３）。
【０００７】
皮膚脂質、より詳しくは遊離脂肪酸がグラム陽性病原菌に対して抗菌性であり得ることが知られている（Ｂｉｂｅｌ  Ｄ．Ｊ．他，１９８９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９２，６３２〜６３８）。特に、パルミトレイン酸およびラウリン酸は生体外（インビトロ）研究にて、普通の皮膚病原体に対するその抗菌活性が知られている。実際に、ラウリン酸、パルミトレイン酸またはリノール酸は生体外で、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどの数種の皮膚病原体に対して阻害性を示した（Ｋａｂａｒａ他，１９７２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏ．，２，２３〜２８および，１９７８，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，２９，７３３〜７４１）。
【０００８】
しかしながら、病原体成長に対して防護を増加するために栄養的に誘導したそのような脂肪酸の濃度増加、即ち当該表皮または当該皮膚において栄養により抗菌性脂肪酸のレベルを増加させることの効果についてのデータはない。
【０００９】
本発明の概要
従って、一つの態様では本発明は皮膚の病原体および微生物相が生成する臭気の増大を防止または制御して、ペットでの皮膚の健康および／または皮の質を改善または維持するのを目的とした食物組成物を調製するための食餌性脂質原料の使用に関する。
【００１０】
幾つかの食餌性脂質は、特に例えば動物の表皮において生物が利用可能な抗菌性脂肪酸の増大を誘導して皮膚脂質の組成および表皮脂肪酸の含有量を調節する能力を有し、それによりペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善するということを驚くことに見出した。
【００１１】
好ましいことに、本発明による食餌性脂質原料は動物の表皮に存在する抗菌性脂肪酸のラウリン酸およびパルミトレイン酸のレベルを改善することができる。これらの脂肪酸は、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓまたはＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓのような皮膚の病原体に対し活性がある。
【００１２】
食餌性脂肪酸は植物源由来であってもよい。それらは少なくとも食餌性パルミトレイン酸を、より好ましくはラウリン酸、リノレイン酸、アルファ−またはガンマ−リノレン酸のような他の食餌性脂肪酸との組み合わせで含む食用油脂の混合の形状または食用油脂を含有する食物であることが好ましい。
【００１３】
好ましい実施形態では、当該食餌性脂肪酸は動物の表皮に抗菌性脂肪酸を少なくとも５％のレベル、より好ましくは表皮パルミトレイン酸が少なくとも５％に達するのに充分な量で用いられる。
【００１４】
従って、食餌性脂肪酸の脂肪原料は食餌性パルミトレイン酸を全脂肪酸の乾燥重量に基づき少なくとも２．５重量％、好ましくは全食餌性脂肪酸の約３から１０％の量を含有することができる。
【００１５】
食餌性脂肪酸の原料も少なくとも食餌性パルミトレイン酸およびラウリン酸の混合物からなることができる。かくして全脂肪酸の乾燥重量に基づき少なくとも重量で約１０％の食餌性ラウリン酸との組合せで食餌性パルミトレイン酸は少なくとも０．２％の量で使用することができる。表皮のパルミトレイン酸に対するこの混合物の相乗作用は実施例２で示されている。この混合物は表皮のラウリン酸を増加させて表皮脂肪酸の約３．０％までにすることもできる。
【００１６】
更なる態様では、本発明は皮膚脂質の組成および表皮の抗菌性脂肪酸含量を調節する能力を有する食餌性脂質の原料を少なくとも含むペットフード処方をペットに与える工程を含む、ペットにおける皮膚の健康および／または皮の質を改善するための方法を提供する。
【００１７】
当該特許は更に、表皮における抗菌性脂肪酸の含量を調節する能力を有する食餌性脂質の原料を少なくとも含むペットフードをペットに与える工程を含む、ペットの体表面の臭いおよび／または皮の臭気を低減するための方法を提供する。
【００１８】
食餌性脂質の原料は好ましくは上記した通りである。
【００１９】
本方法は、体表面および皮臭気の発生の原因となる皮膚病原体および微生物相の発育を防止することでペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善または維持することができる。
【００２０】
他の態様では、当該発明は皮膚脂質の組成および表皮抗菌性脂肪酸含量を調節する能力のために選択した食餌性脂質の原料を含むペットフードの処方を提供する。
【００２１】
当該ペットフード処方は好ましくは完全で、栄養的にバランスがとれたペットフードである。或いは、それは補助食品または主食または軽食に付け加える添加物であってもよい。
【００２２】
当該ペットフード処方はこうして体表面および皮の臭気を発生する原因となる皮膚病原体および微生物相の成長を阻止することができる脂質薬剤を含む。
【００２３】
実施形態では、当該ペットフード処方はまた皮膚の健康を改善または維持するのに充分な量のリノール酸、α−およびγ−リノレン酸を含有してもよい。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、皮膚病原体の発育および微生物相生成の臭気を防止または調節することによりペットの皮膚の健康および／または皮の質を改善または維持することを意図した食物組成物を調製するための食餌性脂質原料の使用を提供する。
【００２５】
意外にもある種の食餌性脂質が動物の表皮に生物が利用できる抗菌性脂肪酸の増加を誘導する能力を有し、一方皮膚の適切なバリア機能も維持させる能力があることを見出した。一般的に、これらはＣ：１０からＣ：１８を有する活性脂肪酸である。これら表皮中の抗菌性脂肪酸は好ましくはパルミトレイン酸およびラウリン酸である。同時に、皮膚バリア機能および浸透性（リノール酸）の役割を伴う脂肪酸の表皮でのレベルのみならず抗炎症活性を伴う脂肪酸（α−リノレン酸およびγ−リノレン酸）も増加する。
本発明による食餌性脂質の原料は、特に動物の表皮および表皮分泌物中の抗菌性脂肪酸であるラウリル酸およびパルミトレイン酸のレベルを改善または調節することができる。これらの脂肪酸は、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓまたはＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓのような皮膚病原体に対して活性である。
【００２６】
食餌性脂質はいずれの適した原料から、好ましくは植物性原料から由来する。食餌性脂質の原料は、少なくともパルミトレイン酸のような食餌性脂肪酸を、より好ましくはラウリン酸、リノール酸、アルファ−またはガンマ−リノレン酸などの他の食餌性脂肪酸との組合せで含む食用油脂の混合物またはそれらの食用油脂を含有する食物であることができる。
【００２７】
好ましい実施形態では、食餌性脂肪酸は動物の表皮にある抗菌性脂肪酸を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも表皮パルミトレイン酸が５％のレベルに達成するのに充分な量で用いる。
【００２８】
従って、食餌性脂肪酸の原料は全食餌性脂肪酸の乾燥重量に基づいて少なくとも２．５重量％の量、好ましくは全食餌性脂肪酸の約３％から１０％の食餌性パルミトレイン酸を少なくとも含有することができる。
【００２９】
食餌性脂肪酸の原料は少なくともパルミトレイン酸およびラウリン酸の混合物からなっていてもよい。最終製品のパーセントで表すと、食餌性パルミトレイン酸は少なくとも０．０２％の量を、少なくとも約１．０％の食餌性ラウリン酸と組み合わせて使用することができる。当該混合物は少なくとも１．０％のリノール酸を含有することもできる。表皮パルミトレイン酸に対する本混合物の相乗効果は実施例２に示した。本混合物は表皮のラウリン酸を、表皮脂肪酸の約３．０％まで増加させることもできる。
【００３０】
当該脂肪酸組成は、最適（ｎ−６）／（ｎ−３）比が約７から１５を供するように更に調整される。
【００３１】
食餌性パルミトレイン酸は獣脂（羊肉、牛肉）、家禽（例えば鶏、アヒル）を原料にできるが、適している植物源からでもよい。微生物培養、例えば酵母または酵母脂質を原料とすることもできる。
【００３２】
食餌性ラウリン酸は例えばココナッツ油、ババスーヤシ油、コフネヤシ油、ムルムル油脂、パーム核油またはツーカム油を原料として得られる。
【００３３】
本発明による食餌性脂質またはこれらの脂質を含有する食物の経口投与は表皮中の抗菌性脂肪酸であるラウリン酸およびパルミトレイン酸のレベルを増加させるであろう。これは皮膚病原体、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓによる感染に対して抵抗する皮膚の適応性を向上させるであろう。
【００３４】
更なる態様では、本発明は皮膚脂質の組成および表皮脂肪酸含量を調節することができる食餌性脂質の原料を少なくとも含むペットフード処方をペットに与える工程を含む、ペットの皮膚の健康および／または皮の質を維持または改善するための方法を提供する。
【００３５】
当該方法は体表面および皮の臭気を生成する原因となる皮膚病原体および微生物相の生育の阻害または防止を含むことができる。
【００３６】
食餌性脂質の原料は上記の利益を提供するように選択される。
【００３７】
有益な効果を得るために当該ペットが食べるペットフード処方の量は、当該ペットの大きさ、ペットの種類および当該ペットの年齢に依存するであろう。しかしながら、当該ペットフード中に存在する濃度は乾燥重量に基づきパルミトレイン酸約０．４％または約０．１０ｇ／１００ｋｃａｌがより好ましく用いられる。また、当該ペットフードでの濃度は乾燥重量に基づいて約０．０５％のパルミトレイン酸と１．０％の食餌性ラウリン酸との組合せがより好ましく使用される。
【００３８】
更に、本発明は皮膚脂質の組成および表皮の抗菌性脂肪酸含量を調節するそれらの能力で選択した食餌性脂質の原料を含むペットフード処方を提供する。
【００３９】
好ましくは、食餌性脂質のは原料は体表面および皮の臭気を発生する原因である皮膚病原体および微生物相の生育を防止または少なくとも阻害することができるものである。
【００４０】
当該ペットフード処方は好ましくは完全で、栄養的にバランスがとれたペットフードである。それはペット用の補助食品または医薬品組成物の形態でもあり得る。
【００４１】
本発明による栄養的に完全なペットフード処方はいかなる形態、例えば粉末、乾燥穀物粒またはペレットか他の乾燥形態、押出した形態、肉塊またはローフまたはプディングのような半湿性または湿潤形態でよい。これは冷蔵または保存安定性製品として供されるであろう。
【００４２】
本ペットフードは従来の方法により生産することができる。この食品には澱粉原料、蛋白質原料および脂質原料のいずれの一つ以上を含むことができ、脂質原料は部分的または全体的に上記の脂肪混合物から構成される。
【００４３】
適している澱粉原料は、例えばトウモロコシ、米、小麦、大麦、燕麦、大豆およびそれらの混合物のような穀粒および豆果である。
【００４４】
適している蛋白質原料はいずれか適した動物また植物蛋白質原料から選択することができる；例えば肉および肉粉、家禽粉、魚粉、大豆蛋白質濃縮物、乳蛋白質、グルテンなどである。年を取った動物に対しては、蛋白質原料が高品質の蛋白質を含有することが好ましい。
【００４５】
適している脂質原料には肉、動物性脂肪および植物性脂肪、並びに油性の穀粒および豆が含まれる。
【００４６】
澱粉、蛋白質および脂質原料の選択は動物の栄養要求性、嗜好性理由および生産される製品のタイプにより殆ど決定されるであろう。年を取ったペットには、当該ペットフードは好ましくはより若いペットに対するペットフードより脂肪は比例して少ない方がよい。更に、澱粉原料は米、大麦、小麦およびトウモロコシの一つ以上を含むことができる。
【００４７】
当該ペットフードは場合によりプレバイオティック、プロバイオティック微生物または例えば長鎖脂肪酸のような他の活性薬剤も含有してもよい。ペットフード中のプレバイオティックの量は好ましくは１０重量％未満である。例えば、プレバイオティックはペットフードの約０．１重量％から約５重量％を含むことができる。当該プレバイオティックの原料としてチコリを使用するペットフードでは、当該チコリは当該飼料混合物の約０．５重量％から約１０重量％をなすように含ませることができる；より好ましくは約１重量％から約５重量％である。
【００４８】
プロバイオティック微生物を用いる場合、当該ペットフードは好ましくは当該ペットフードのグラム当たり約１０4から約１０10個のプロバイオティック微生物の細胞を含有する；より好ましくはグラム当たり約１０6から約１０8個のプロバイオティック微生物の細胞である。当該ペットフードはプロバイオティック微生物の混合物を約０．５重量％から約２０重量％を含有することができる：好ましくは約１重量％から約６重量％；例えば約３重量％から約６重量％である。
【００４９】
適した長鎖脂肪酸にはリノール酸、アルファ−リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸が含まれる。魚油がエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の適した原料である。ルリジサ油、クロフサスグリ実油（blackcurrent seed oil）およびマツヨイグサ油（evening primrose oil）がガンマ−リノレン酸の適した原料である。紅花油、ヒマワリ油、とうもろこし油および大豆油はリノール酸の適した原料である。
【００５０】
必要であれば、当該ペットフードにミネラルおよびビタミンを補うことでそれは栄養的に完全となる。更に、種々の他の成分、例えば砂糖、塩、香味料、調味料、風味剤などを望みによってペットフードへ組み込むこともできる。
【００５１】
ドライペットフードについての適したプロセスは押出し調理であるが、焼いたり他の適したプロセスを用いてもよい。押出し調理の場合、当該ドライペットフードは通常穀粒の形で提供される。プレバイオティックを用いる場合、当該プレバイオティックは加工処理する前にドライペットフードの他の成分と混合しておくのがよい。適したプロセスは欧州特許出願第０８５０５６９に記載されている；参照することによりその開示は援用してある。プロバイオティック微生物を用いる場合は、当該微生物は好ましくは当該ドライペットフードに被覆するか中に入れる。適したプロセスは欧州特許出願第０８６２８６３に記載されている；参照することによりその開示は援用してある。
【００５２】
ウエットフードに関し、米国特許第４，７８１，９３９および５，１３２，１３７に記載されたプロセスは模擬肉製品を製造するのに用いてもよい。これらの特許の開示は参照することにより援用してある。肉塊タイプ製品の製造には他の操作手順もまた使用してもよい；例えば蒸気オーブン中での調理である。その代わりとして、ローフタイプ製品は肉乳化物を製造するのに適した肉材料を乳化し、適切なゲル化剤を加え、当該肉乳化物を加熱してから缶または他の容器に入れて製造することができる。
【００５３】
当該ペットが消費して良い効果を得るためのペットフードの量は当該ペットの大きさ、ペットの種類およびペットの年齢に依存するだろう。しかしながら、ペットフードにおける濃度は、乾燥重量に基づき０．４重量％のパルミトレイン酸または１００カロリー当たり０．１ｇのパルミトレイン酸がより好ましく使用されている。また、乾燥重量に基づき約０．０５重量％のパルミトレイン酸を１．０％の食餌性ラウリン酸と組合せる当該ペットフード中の濃度がより好ましく使用される。
【００５４】
食餌性脂肪酸の効果を表皮脂肪酸および皮膚バリア機能を生体試験で評価した。表皮における抗菌性脂肪酸のレベルは食餌により操作できる。
【００５５】
最後の態様では、本発明によるペットフード処方は皮膚の健康を改善または維持するのに充分な量のリノール酸、α−およびγ−リノレン酸も含有する。食餌性リノール酸の適した原料はヒマワリ油または大豆油であってもよい。
【００５６】
以下の例は例示的のみに示したもので本出願の主題を制限していると解釈すべきものではない。全てのパーセントは他に述べなければ重量で示している。
【００５７】
【実施例】
例１：生体外での脂肪酸の抗菌性、最小阻止濃度（ＭＩＣ）測定
【００５８】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓおよびＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ株の脂肪酸への感受性の定量的測定用として比色法を開発した。本方法はＨｏｇａｎ，Ｊ．Ｓ．，他，１９８７，Ｊ．Ｄａｉｒｙ，Ｓｃｉ．，７０，９２７〜９３４およびＴｉｂａｌｌｉ，Ｒ．Ｎ．他，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３（４），９１５〜９１７に記述された検定法に基づいている。
【００５９】
本研究で使用した微生物はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＦＳＭ  ５１，５２，８４（食品単離物），ＡＴＣＣ  ６５３８，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ  ９０７９，１３３５１およびＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １４５２２であった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株はＬａｂ−Ｌｅｍｃｏブロス（ＬＬブロス，Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ１５）中にて３０℃で１８〜２０時間生育させ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａは液体Ｄｉｘｏｎ培地（３０ｇの麦芽抽出物，２０ｇのＯｘｂｉｌｅ，１５ｇの寒天，５ｇの菌ペプトン，２．５ｇのモノオレイン酸グリセロール，１０ｍｌのＴｗｅｅｎ（商標）４０，ｐＨ＝５．４±０．２）の中にて３０℃で５日間培養した。生理的食塩水（Ｏｘｏｉｄ，ＢＲ５３）で洗浄した後、細胞ペレットは０．１５％寒天（ｗ／ｖ）を補ったＬＬブロス中に再懸濁させた。
【００６０】
パルミトレイン酸、ラウリン酸およびオレイン酸（ＮＵ−ＣＨＥＣＫ−ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ，ＤＫのそれぞれＵ−４０−Ａ，Ｎ−１２−Ａ，Ｕ−４６−Ａ）の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、生育の指示薬として酸化還元色素であるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ，Ｆｒ）を用いたミクロ力価プレート検定法で検討した。各プレートには以下のような試験微生物を各々供給した：一つの段、０．１５％の寒天で補った１１０μｌの滅菌ＬＬブロス（陰性対照）、一つの段、０．１５％の寒天と１０μｌの試験微生物を補った１００μｌの滅菌ＬＬブロス（陽性対照）、他の段、試験用脂肪酸の連続的な２倍希釈物（０．１５％の寒天で補ったＬＬブロス中に希釈）１００μｌに１０μｌの微生物を加えた（１０３〜１０４細胞／ｍｌの最終濃度）。プレートを循環空気中３０℃でインキュベートし、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株およびＭａｌａｓｓｅｚｉａにつきそれぞれ２４時間目および４〜５日目に試験をした。インキュベーション期間後、２５μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）溶液（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０，Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５６３で１／４に希釈）を各穴（ウェル）に添加した。３０℃にて２時間（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および１日（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の二回目のインキュベーション、青色（生育なし）から桃色（生育）への色彩変化を観察して目で終点を決定した。ＭＩＣは生育なし（何らの色変化）を示す脂肪酸の最も低い濃度と定義づけた。
【００６１】
0004532822.tif 000002
表  １：ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）を用いた発色法により４種類のＳ．ａｕｒｅｕｓ株、２種類のＳ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ株および１種類のＭ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ株についてのＭＩＣ範囲。
【００６２】
例２：食餌性脂肪酸の表皮脂肪酸および皮膚バリア機能への効果についての生体試験
【００６３】
材料および方法
動物モデル
生体（インビボ）動物モデルは、全脂質の一定レベルで種々の油混合物にて栄養価を向上させた飼料で飼育したヌードマウスとした。ヌードマウスは毛がなく、生物物理的パラメータを測定する際に皮膚を容易に取り扱うことができるので選択した。更に主な皮膚脂質の組成は、セラミド組成に幾らかの相違が存在するものの、ヒトの皮膚脂質組成と類似している（Ｖｉｃａｎｏｖａ他，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９９，２９１：４０５〜４１２）。
【００６４】
プロトコルおよび飼料
離乳期のヌードマウス（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，Ｌ'Ａｒｂｒｅｓｌｅ，フランス）を免疫不全マウス用の標準放射線処理飼料（ＵＡＲ  Ｒ０３，ＵＡＲ，Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ，フランス）で４連続日飼育した。マウスは動物施設の特別域に収容して可能性ある病原体への曝露を最小限に保った。室は２６±１℃の温度および相対湿度４５±５％に維持した。マウスはそれから体重に応じて各１１匹のマウスからなる６実験群に割り当てた。マウスは３５日間当該実験飼料および水道水に随意に接近できるようにした。これらの飼料はヌードマウス用の市販の飼料（ＫＬｉｂａ  ２０４９，Ｋｌｉｂａ，Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ，スイス）に基づき，脂肪１１重量％を供するように調整した。これらの飼料の全脂肪含量はネスレ（Ｎｅｓｔｌｅ）が供給した脂肪混合物の形態で供され、基本的飼料に添加した。
【００６５】
対照食餌の原料は獣脂であった。他の原料はリノール酸と同様に関与可能性のある他の脂肪酸：α−リノレン酸、γ−リノレン酸および生体外で抗菌活性が知られている脂肪酸（ラウリン酸およびパルミトレイン酸）の種々な量を含有するように処方した。これらの食餌はまず放射線照射した。当該原料および当該食餌の脂肪酸一覧表を、放射線照射後に定量して表２に示す。
【００６６】
表２
0004532822.tif 000003
表  ２：食餌組成（ｇ／個々の脂肪酸を除いた１００ｇ：ｇ／脂肪酸１００ｇ）。値は、（ａ）：ＮＲＣ／ＱＳの分析および（ｂ）：ＮＲＣ／Ｎの分析を除けば製造業者が供したものである。Ｔａ．：獣脂、Ｓｕ．：ヒマワリ油、Ｍａ．：マカダミア油、Ｃｏ．：ココナッツ油。
【００６７】
これらの飼料を４週間与え、最後に皮膚の生物物理的パラメータを測定した：ｐＨ、水和作用、経皮水分損失（ＴＥＷＬ）。試験後の皮膚バリア機能再生の動的試験も試験した。５週の試験期間の最後にマウスを屠殺し、表皮脂肪酸をガスクロマトグラフィーで測定した。
【００６８】
経皮水分損失
基礎的経皮水分損失を、通常の６ｍｍのプローブを用いたＴＥＷＡメーターＴＭ  ２１０（Ｃｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａより）を使って３０日後に測定した。
【００６９】
試料採取
マウスは試験開始後３５および３６日目に屠殺した。皮膚を手足および頭を除いては全体を試料採取した。皮膚は約３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＨＢＳＳ中にトリプシンＥＤＴＡ，０．０５％トリプシン  ０．５３ｍＭＥＤＴＡ４Ｎａ，カタログ番号２５３００−０５４，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）を含有するガラス製ペトリ皿に真皮面を下にして張り付けた。皮膚試料は４℃で一夜放置し、真皮は手で削り落とした。当該表皮を−４０℃で冷凍し、凍結乾燥し、分析まで−２０℃で保存した。
【００７０】
分析方法
表皮脂質は凍結乾燥試料約１００ｍｇから２：１のクロロホルム／メタノール溶媒で抽出、０．９％のＫＣｌ溶液で洗浄し、脂肪酸をＨＣｌ／メタノールによる直接エステル交換後に内部標準としてＣ２３：０を用いて定量した。
【００７１】
統計
明記するときを除き、群間差異の検出は分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行い、群間の差異はＴｕｋｅｙ試験を用いて試験を行った。２つの群のみを比較するとき、古典的ｔ検定を用いた。有意のレベルは０．０５であった。
【００７２】
結果
有意な処理効果が表皮脂肪酸において見出されたと共に有意な差異が群間に見られた（表３）。
0004532822.tif 000004
表  ３：種々の油混合物（脂肪酸の％、平均±ＳＤ、ｎ＝１０）で栄養的に向上させた食餌で飼育したヌードマウスにおける重要な表皮脂肪酸。種々の文字の書き込みを共有する値はｐ＝０．０５で統計的に有意差ありである。＜ＬＤ：検出限界より小（＜０．１％に相当し、平均＜０．５％）。Ｔａ．：獣脂、Ｓｕ．：ヒマワリ油、Ｍａ．：マカダミア油、Ｆｌａｘ：亜麻種子油、Ｃｏ．：ココナッツ油。
【００７３】
表皮の抗菌性脂肪酸組成
表皮のパルミトレイン酸濃度は食餌レベルに依存し、脂肪酸の６％まで上昇することができることが意外なことに見出された（表３）。獣脂、ココナッツおよびマカダミア油（獣脂群、獣脂／ヒマワリ／ココナッツ油群および獣脂／ヒマワリ／マカダミア群）で飼育したマウス群は最も高いパルミトレイン酸濃度を有していた。食餌および表皮のパルミトレイン酸間の関係を図１に示した。ラウリン酸が存在しないとき、表皮のパルミトレイン酸は食餌含量の関数として上昇し、食餌性脂肪酸の約４％でプラトーに達し、その場合食餌の０．４５％に相当する。しかしながら獣脂／ヒマワリ／ココナッツ食餌では、パルミトレイン酸濃度が５．５％となり、そのパルミトレイン酸含量のみから期待できるより相当高くなるので、食餌性ラウリン酸との相互作用が明らかである（図における外れている値）。これはラウリン酸がパルミトレイン酸と相乗効果を持ち、表皮におけるパルミトレイン酸の含有量を高めるということを示している。この明らかなラウリン酸のパルミトレイン酸に対する相乗効果は、ラウリン酸がパルミトレイン酸の前駆体であるからか、或いはラウリン酸がパルミトレイン酸のβ酸化経路による分解生成物の一つであるのでラウリン酸の分解を防いでいるのかのどちらかによるものであろう。
【００７４】
獣脂（２０％）ココナッツ油（６０％）ヒマワリ油（２０％）混合物を与えると、表皮のラウリン酸につき顕著な変化が見られ、およその検出限界から表皮脂肪酸の３．２％まで増加した。
【００７５】
その結果、表皮におけるパルミトレイン酸およびラウリン酸のレベルは食餌手段により増加させることができた。両脂肪酸は生体外実験で、例えばｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓおよびｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓに対する強力な殺菌剤であることが示されている。そこで、表皮または皮脂の抗菌性脂肪酸組成の改質により日和見性病原体の発育に対して保護増強の可能性がある。最も活性な脂肪酸はＣ１０：０（カプリン酸）、Ｃ１２：０（ラウリン酸）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸）、Ｃ１６：１（パルミトレイン酸）、Ｃ１８：２ｎ−６（リノール酸）およびＣ１８：３ｎ−３（α−リノレン酸）であることは広く受け入れられている（Ｐｕｈｖｅｌ他，１９７０；Ｋａｂａｒａ他，１９７２；Ｋｏ他，１９７８；Ｇａｌｂｒａｉｔｈ他，１９７１）。幾つかの脂肪酸は一般的に顕著な抗菌性活性を呈さず、却って細菌の成長を助けることもある。オレイン酸がこれに当たる。
【００７６】
食餌性脂肪酸の表皮リノール酸への効果
食餌中のリノール酸のレベルが表皮中のリノール酸レベルを決定し、二つの極端な群間では３倍近くの差があることが見出された（表３）。これはマウス必要量からその６倍量までの摂取量の範囲にわたることが見られた。国際的に知られているヒトでのリノール酸の必要量は全食事カロリーの１〜２％で、ラットおよびマウスでは重量／重量基準で０．６８％である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｒｅｃｏｍｅｎｄｅｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ａｌｌｏｗａｎｃｅｓ，１０ｔｈ版。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｔｏｎｇ，１９８９；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｓｉｌ．  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ，４ｔｈ改訂版，Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９５）。ペットフード中のリノール酸の最小ＡＡＦＣＯレベルは、重量／重量基準でネコでは０．５％であり、イヌでは１．０％である。
【００７７】
他の脂肪酸への食餌の効果
α−およびγ−リノレン酸の濃度は食餌手段でも増加させることができ、その場合少なくとも１０のファクターで増加させることができる（表３）。その研究では前炎症性チャレンジは含まれていないが、γ−リノレン酸のレベル上昇はアトピー性湿疹の徴候（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，ＤＦ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２０００；７１（１補遺）：３６７Ｓ〜３７２Ｓ）、遅延型感作性チャレンジ後のプログラスタンジンＥ２産生（Ｗｕ  Ｄ．他，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９９；７０（４）：５３６〜５４３）および放射線誘発炎症（Ｈｏｐｅｗｅｌｌ  ＪＷ．他，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９３；６８（１）：１〜７）を低減する助けはできたが、６００ｍｇ／日のγ−リノレン酸補給２４週間のヒトにおける試験では手の皮膚炎を顕著に改善することはなかった（Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ＤＫ他，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９６；１９３（２）：１１５〜１２０）。他の表皮γ−リノレン酸増加の可能性ある応用は、局所塗布で５α−レダクターゼの阻害ができ（Ｌｉａｎｇ  Ｔ．他，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７；１０９（２）：１５２〜１５７）、幾つかのアンドロゲン依存性皮膚障害の発現を低減させた。しかし、経口投与での効果は確認の必要があるだろう。
【００７８】
生物物理的パラメータ
処置間における統計的に有意な差は基礎的ＴＥＷＬについても見出せなかった。これは皮膚バリア機能が全てのこれら脂肪混合物によっても適当なレベルに維持されたことを意味している。これはパルミトレイン酸およびラウリン酸の適当なレベルを、リノール酸、α−とγ−リノレン酸のような他の脂肪酸と共に含有する脂肪混合物が、特にペット用の食べ物などの食物に付加物として処方できることを裏づけている。
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表  ４：様々な油混合物の食餌で飼育したヌードマウスにおける生物物理的パラメータの基礎値。ｎ＝１１での平均±ＳＤ。Ｔａ．：獣脂、Ｓｕ．：ヒマワリ油、Ｍａ．：マカダミア油、Ｃｏ．：ココナッツ油、Ｆｌ：亜麻種子油
【００７９】
例３：ドライドッグフード
飼料混合物は約５８重量％のトウモロコシ、約５．５重量％のトウモロコシグルテン、約２２重量％の鶏肉、１０％の、６０％獣脂、２５％ヒマワリ油、１５％ココナッツ油からなる食餌性脂肪酸、および残りが食塩、ビタミンと無機物から構成されている。
【００８０】
当該飼料混合物を前処理装置に供給し、加湿する。そして加湿した飼料は押出調理器に供給し、ゼラチン状にする。押出機から出た当該ゼラチン化母体を金型に通して押出す。当該押出物をイヌに与えるのに適した小片に切断し、約１１０℃で約２０分間乾燥し、冷却してペレット状とする。
【００８１】
当業者にとっては、脂肪混合物または使用した油脂の一部または全体は、例えば被覆のような後の段階で加えることができるのは明らかである。
【００８２】
かくして本ペットフードはペットに、最終製品の重量で約０．５％のパルミトレイン酸および約０．０１％の食餌性ラウリン酸を、約１．８％のリノール酸と共に供することになる。本ドライドッグフードは試験基準で飼育したイヌの皮膚の健康および皮の質を維持するのに役立つことが判った。
【００８３】
例４
食餌性脂肪酸の混合物が４０％牛脂、２０％ヒマワリ油、３０％ココナッツ油および１０％亜麻種子油からなることを除いて、例３の如くペットフードを調製した。これで本ペットフードはペットに約１．３％食餌性ラウリン酸および約０．３３％パルミトレイン酸の量を供する。リノール酸の量は約１．５％である。これは更にネコに合った嗜好増進剤を含んでいる。
【００８４】
本処方を１２週間飼育試験で与えられたネコは、食餌性脂肪酸混合物なしの食餌を当てられた対照群と比較したとき、目だったツヤおよび全体の皮膚および皮の改善が見られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１：種々な油混合物入りの食餌で飼育したヌードマウスにおける食餌性と表皮のパルミトレイン酸（両方共脂肪酸の％で表した）の関係。各点は平均値（ｎ＝１０）である。平均±ＳＤ，ｎ＝１０。
【図１】
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