(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の免疫応答を高めるための組成物であって、
（ａ）組換えウィルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である組換えウィルス様粒子、
（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部分であり、当該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、且つ１０から３０のヌクレオチドを含んでなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、
前記ウイルス様粒子（ａ）にパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）、及び
（ｃ）抗原であって、前記抗原が
花粉抽出物、
粉塵抽出物、
粉塵ダニ抽出物、
真菌抽出物、
哺乳動物表皮抽出物、
羽毛抽出物、
昆虫抽出物、
食品抽出物、
体毛抽出物、
唾液抽出物、及び
血清抽出物
からなる群に由来するアレルゲンであって、前記組換えウィルス様粒子（ａ）と混合されている前記抗原
を含む組成物。
【請求項２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１２２）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＡバクテリオファージＱβコートタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）が、リン酸骨格の１つまたは複数のチオリン酸修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチド（ｂ）の前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がチオリン酸修飾体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原が、
（ａ）蜂毒液ホスホリパーゼＡ２、
（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂａ１、
（ｃ）カバノキ花粉ＢｅｔｖＩ、
（ｄ）米国産クロスズメバチ属の毒液５ＤｏｌｍＶ、
（ｅ）イエダニＤｅｒｐ１、
（ｆ）イエダニＤｅｒｆ２、
（ｇ）イエダニＤｅｒ２、
（ｈ）粉塵ダニＬｅｐｄ、
（ｉ）真菌アレルゲンＡｌｔａ１、
（ｊ）真菌アレルゲンＡｓｐｆ１、
（ｋ）真菌アレルゲンＡｓｐｆ１６、及び
（ｌ）ピーナッツアレルゲン
からなる群から選択される、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤と共に、免疫学的に有効量の請求項１から５の何れか一項に記載の組成物を含んでなるワクチン。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
アレルギーを治療するための薬剤の製造における、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物の使用、または請求項６または７に記載のワクチンの使用。
【請求項９】
（ａ）組換えウィルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である組換えウィルス様粒子、
（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフがパリンドローム配列の一部分であり、当該パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、且つ１０から３０のヌクレオチドを含んでなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、
前記ウイルス様粒子（ａ）にパッケージ化されている非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）、及び
（ｃ）抗原であって、前記抗原が
花粉抽出物、
粉塵抽出物、
粉塵ダニ抽出物、
真菌抽出物、
哺乳動物表皮抽出物、
羽毛抽出物、
昆虫抽出物、
食品抽出物、
体毛抽出物、
唾液抽出物、及び
血清抽出物
からなる群に由来するアレルゲンであって、前記組換えウィルス様粒子（ａ）と混合されいる前記抗原
を含む組成物であって、当該組成物を動物へ導入することを含んでなる前記動物の免疫応答を高めるための方法に使用するための組成物。
【請求項１０】
前記免疫応答が高められたＴｈ１細胞応答である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記動物がヒトである、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記動物の皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、あるいはリンパ節に直接に導入される、請求項９から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
被検体の免疫応答を高めるための免疫化組成物であって該被検体に投与される免疫化組成物の製造における、請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
前記免疫応答が高められたＴｈ１細胞応答である、請求項１３の使用。
【請求項１５】
前記被検体がヒトである、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記免疫化組成物が、前記被検体の皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、あるいはリンパ節に直接に導入される、請求項１３から１５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１７】
請求項６又は７に記載のワクチンであって、動物を免疫化又は治療するための免疫学的有効量を動物に投与される、ワクチン。
【請求項１８】
前記動物がヒトである、請求項１７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種学、免疫学及び医学の分野に関する。本発明は、免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、より好ましくは少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドとパッケージ化したウィルス様粒子（ＶＬＰ）と混合された抗原に対する免疫応答を高めるための組成物及び方法を提供する。本発明を使用して、アレルギー、腫瘍及び慢性のウィルス性疾患、ならびに他の慢性疾患を治療するのに特に有用な強力な抗体及びＴ細胞応答を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の本質は、２つの別個の基礎杭上に成り立っている：１つは、特異的または適応免疫であり、これは比較的遅い応答動態及び記憶能力によって特徴付けられる；もう１つは、迅速な応答動態を示すが記憶が欠けている、非特異的または先天性免疫である。リンパ球は、適応免疫系の重要な役割を果たすものである。それぞれのリンパ球は、独特の特異性の抗原−受容体を発現する。エフェクターによって抗原を認識することにより、リンパ球は増殖し、エフェクター機能が進行する。少数のリンパ球が所与の抗原または病原体に関する特異性を示し、エフェクター応答、したがって適応免疫系の遅い動態を測定することができる前に、膨大な増殖が通常必要とされる。広がるリンパ球の大部分は生き延び、抗原の除去の後にある程度のエフェクター機能を維持することができるので、適応免疫系は、２度目に抗原に遭遇すると素早く反応する。これが、その記憶能力の基盤である。
【０００３】
リンパ球に関する状況とは対照的に、病原体に関する特異性が、機能を獲得するために広がらなければならないいくつかの細胞に限られる場合、先天性免疫系の細胞及び分子は、通常多数存在し、病原体と関連がある限られた数の不変の特徴を認識する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．ａｎｄ  Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．、Ｃｅｌｌ  ９１：２９５〜２９８（１９９７））。このような型の例には、リポ多糖（ＬＰＳ）、非メチル化状態のＣＧが豊富なＤＮＡ（ＣｐＧ）または二本鎖ＲＮＡがあり、これらはそれぞれ細菌及びウィルス感染に特異的である。
【０００４】
免疫学における大部分の研究は、適応免疫系に焦点が当てられてきており、ごく最近、先天性免疫系が興味の焦点に入ってきている。歴史的には、適応免疫系と先天性免疫系を、ほとんど共通点がない２つの別個のものとして、処理及び分析した。なぜ抗原が、先天性免疫を刺激するアジュバントと共に施用すると、特定の免疫系に関してより一層免疫原性があったのか、数人の研究者が不思議に思ったのは、この差異であった（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９）；Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。しかしながら、この質問に出される答えは、免疫系を理解するため、及び防御免疫と自己免疫の間のバランスを把握するために重要である。
【０００５】
先天性免疫系、特に自己特異的なＴ細胞応答を故意に誘導する、Ｔ細胞に関するＡＰＣの活性化の合理的な操作によって、Ｔ細胞系腫瘍を治療するための手段が与えられる。したがって、最新の療法の焦点は、持続的なＴ細胞応答を誘導するための、抗原担体としての活性化樹状細胞（ＤＣ）の使用に基づくものである（Ｎｅｓｔｌｅ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８（１９９８））。同様に、先天性免疫系のｉｎ  ｖｉｖｏの活性化物質、ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体などを、腫瘍細胞と共に施して、その免疫原性を高める（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９））。
【０００６】
先天性免疫を刺激する因子によるＡＰＣの全身活性化は、自己特異的リンパ球及び自己免疫性を誘発する原因となる可能性がしばしばある。この考えは、ＬＰＳ及び甲状腺エキスを投与することによって、免疫寛容を圧倒し自己免疫甲状腺炎を誘発することができるという観察と、適合性がある（Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。さらに、トランスジェニックマウスのモデルにおいて、自己ペプチド単独の投与によって、別の経路によってＡＰＣを活性化させない限りは、自己免疫を引き起こすことはできないことが最近示された（Ｇａｒｚａ，Ｋ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２０２１（２０００））。先天性免疫と自己免疫疾患の間の関連は、ＬＰＳ、ウィルス感染またはＡＰＣの全身活性化は、末梢の免疫寛容の確立を遅らせるかあるいは妨げるという観察によって、さらに強調される（Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：２６１（１９９５）；Ｅｈｌ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：７６３（１９９８）；Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２０２４（１９９９））。このようにして、先天性免疫は自己特異的リンパ球の活性化を高めるだけでなく、それらのその後の排除も阻害する。これらの知見は、腫瘍生物学及び慢性のウィルス性疾患の制御に広がることができる。
【０００７】
副組織適合抗原、ＨＹ−抗原などを用いた免疫処置の後の、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導には、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）の存在が必要である（Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５３２：１５８（１９８８）；Ｇｕｅｒｄｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：５５３（１９９２））。クロスプライミングによって、すなわちクラスＩ経路に達する外来性の抗原で初回抗原刺激を与えることによって、誘導されるＣＴＬ応答も、Ｔｈ細胞の存在を必要とすることが示されてきている（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。これらの観察は、腫瘍療法に関する重要な結果を有しており、この場合Ｔヘルパー細胞は、腫瘍細胞による防御ＣＴＬ応答を誘導するために重要である可能性がある（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，Ｆ．他、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３（１９９８））。
【０００８】
活性化Ｔｈ細胞上の１つの重要なエフェクター分子は、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞（ＤＣ）上のＣＤ４０と相互作用する、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。Ｂ細胞上のＣＤ４０の誘発は、イソ型を変えるため、及びＢ細胞の記憶を生み出すために必須である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。さらに最近、マクロファージ及びＤＣ上のＣＤ４０を刺激することによって、それらの活性化及び成熟がもたらされることが示された（Ｃｅｌｌａ，Ｍ．他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０（１９９７）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５（１９９８））。具体的にはＤＣは、共賦活分子を上方制御し、活性化によってＩＬ−１２などのサイトカインを生成する。興味深いことに、このＣＤ４０Ｌ仲介型のＤＣの成熟は、ＣＴＬ応答に対するヘルパーの影響の原因であるようである。実際、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０の誘発によって、ＤＣがＣＴＬ−応答を開始することができることが最近示されてきている（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８））。このことは、Ｔｈ細胞がＣＴＬと同じＡＰＣ上のリガンドを認識しなければならないという初期の観察と一致し、同族の相互作用が必要とされることが示される（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。したがって、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０Ｌ仲介型の刺激は、ＤＣの活性化をもたらし、これは後にＣＴＬ−応答を初回抗原により刺激することができる。
【０００９】
これらのＴｈ依存性ＣＴＬ応答とは対照的に、ウィルスは、Ｔ細胞の助けなしで防御ＣＴＬ応答を誘導することができることが多い（概説に関しては、（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７９１（１９９８）を参照のこと）。具体的には、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２２７８（１９８７）；Ａｈｍｅｄ，Ｒ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２１０２（１９８８）；Ｂａｔｔｅｇａｙ，Ｍ．他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１１５（１９９６）；Ｂｏｒｒｏｗ，Ｐ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２１２９（１９９６）；Ｗｈｉｔｍｉｒｅ，Ｊ．Ｋ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８３７５（１９９６））、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）（Ｋｕｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５：４１（１９９６））、インフルエンザウィルス（Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２９５５（１９９５））、ワクシニアウィルス（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：６７９（１９８９））、及びエクトロメリアウィルス（Ｂｕｌｌｅｒ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７７（１９８７））は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠いているか、あるいはクラスＩＩまたはＣＤ４０の発現に欠陥があるマウスにおいて、ＣＴＬ応答を誘導することができた。ウィルスによるこのＴｈ細胞依存性ＣＴＬ誘発に関する機構は、現在理解されていない。さらに、大部分のウィルスはＴｈ細胞依存性ＣＴＬ応答を完全に刺激するわけではないが、ウィルス特異的ＣＴＬ活性は、Ｔｈ細胞欠陥マウスでは低下する。したがって、Ｔｈ細胞は抗ウィルスＣＴＬ応答を高める可能性があるが、この助けの機構は未だに完全には理解されていない。ＤＣは、クロスプライミングによりインフルエンザ由来の抗原をディスプレイすることが、最近示されてきている（Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１３５９（１９９８）；Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６（１９９８））。したがって、副組織適合抗原及び腫瘍抗原に関して示されるのと同様に（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８）；Ｔｈ細胞が、ＤＣ上でのＣＤ４０誘発によって、ＣＴＬの誘導を助長する可能性があることが考えられる。したがって、ＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０抗体を使用してＣＤ４０を刺激することによって、ウィルスまたは腫瘍細胞による刺激後に、ＣＴＬ誘導を高めることができる。
【００１０】
しかしながら、ＣＤ４０ＬはＤＣの重要な活性化物質であるが、免疫応答中にＤＣの成熟及び活性化を刺激することができる、他の分子が存在するようである。実際ＣＤ４０は、ＬＣＭＶまたはＶＳＶに特異的なＣＴＬの誘導に関して測定できるほど関連があるわけではない（Ｒｕｅｄｌ，Ｃ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１８７５（１９９９））。したがって、ＶＳＶ特異的ＣＴＬ応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在に部分的に依存し（Ｋｕｉｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：４１（１９９６））、このヘルパー効果はＣＤ４０Ｌによって仲介されるわけではない。免疫応答中のＤＣの成熟を誘発するエフェクター分子に関する候補には、Ｔｒａｎｃｅ及びＴＮＦがあるが（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１０２５（１９９９）；Ｓａｌｌｕｓｔｏ、Ｆ．及びＡ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１１０９（１９９４））、例えばＣｐＧなどの、同様の性質を有するより多くのタンパク質が存在する可能性がある。
【００１１】
精製タンパク質のみを投与することは、強力な免疫応答を誘導するのに通常は充分ではなく、単離抗原は一般に、アジュバントと呼ばれる補助物質と一緒に与えなければならないことは充分に認められている。これらのアジュバント中には、急速な分解に対して投与される抗原が保護されており、アジュバントによって、低レベルの抗原の長期の放出がもたらされる。
【００１２】
単離タンパク質とは異なり、ウィルスは、Ｔ細胞の助力によってかつ助力なしで、任意のアジュバントの不在下において迅速で有効な免疫応答を誘導する（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウィルスはいくつかのタンパク質からなることが多いが、それらはその単離要素よりも一層強力な免疫応答を誘導することができる。Ｂ細胞応答に関しては、ウィルスの免疫原性に関する１つの重要な要因は、表面エピトープの反復性及び配列であることが知られている。多くのウィルスは、Ｂ細胞上でエピトープ特異的免疫グロブリンを効率よく架橋させるエピトープの通常の配列を示す、準結晶表面を示す（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：５５３〜５５８（１９９６））。Ｂ細胞上での表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期の進行及びＩｇＭ抗体の生成を直接誘導する、強力な活性化シグナルである。さらに、このような誘発Ｂ細胞はＴヘルパー細胞を活性化させることができ、次にＢ細胞におけるＩｇＭからＩｇＧ抗体生成の変化、及び長命Ｂ細胞記憶の発生を誘導し、これらは任意のワクチン接種の目的である（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウィルスの構造は、自己免疫疾患における、かつ病原体に対する本来の応答の一部分として、抗−抗体の生成とも関連がある（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）を参照のこと）。したがって、整然とした反復配列で編成されたウィルス粒子上の抗原は、非常に免疫原性がある。なぜならこれらは、Ｂ細胞を直接活性化させることができるからである。しかしながら、反復表面と結合しない可溶性抗原は、アジュバントの不在下では免疫原性が低い。病原体、アレルゲン抽出物及び腫瘍も、すべてを容易に発現することはできずＶＬＰなどの反復構造と結合した、多数の抗原を通常含むので、複雑な結合手順を必要とせずに抗原調製物と簡単に混合することができる、アジュバント配合物を有することが望ましいと思われる。
【００１３】
強力なＢ細胞応答に加えて、ウィルス粒子は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、免疫系の他の重要な部門の発生を誘導することもできる。これらの細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＩＶまたはＢ型肝炎ウィルスなどの非細胞変性ウィルスを排除するため、及び腫瘍を根絶するために特に重要である。細胞傷害性Ｔ細胞は、元の抗原は認識しないが、ＭＨＣクラスＩ分子と結合するそれらの分解生成物は認識する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ＆  Ｂｏｄｍｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１〜６２４（１９８９））。マクロファージ及び樹状細胞は、外来性ウィルス粒子を取り込み加工することができ（ただし、その可溶性、単離要素はできない）、生じた分解生成物を細胞傷害性Ｔ細胞に掲示することができ、それらの活性化及び増殖をもたらす（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２５９５〜２６００（１９９６））。さらに、活性化ＤＣは、可溶性タンパク質を処理し提示することもできる。
【００１４】
抗原としてのウィルス粒子は、その単離要素に優る２つの利点を示す：（１）それらの非常に反復的な表面構造のために、ウィルス粒子は、Ｂ細胞を直接活性化させることができ、高い抗体力価及び長時間続くＢ細胞の記憶をもたらす；及び（２）可溶性タンパク質ではなく、ウィルス粒子は、ウィルスが非感染性であり、アジュバントが存在しない場合でも、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【００１５】
いくつかの新しいワクチン戦略は、ウィルスの固有の免疫原性を利用するものである。これらの手法のいくつかは、ウィルス粒子の粒子的性質に焦点を当てている；ラテックスビーズ及び抗原からなるワクチンを開示する、（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５３：４９２５（１９９４）参照）；酸化鉄ビーズ及び抗原からなるワクチンを開示する、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．他、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３））；抗原でコーティングされたコア粒子を開示する、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ，Ｎ．他への米国特許第５，３３４，３９４号；共有結合した１つまたは複数のタンパク質を表面上に有する合成ポリマー粒子を開示する、米国特許第５，８７１，７４７号；及び前記コア粒子の表面を少なくとも部分的に覆う非共有結合コーティングを有するコア粒子、及び前記コーティングされたコア粒子と接触する、少なくとも１つの生物学的に活性がある物質（たとえば、ＷＯ９４／１５５８５を参照のこと）を参照のこと。
【００１６】
他の開発では、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）を、粒子の構造的性質及び非感染性のために、ワクチン生成の分野で利用する（例えば、ＷＯ９８／５００７１参照）。ＶＬＰは、多くのタンパク質分子と対称な形式で構築された、１つまたは複数の型の超分子構造体である。ＶＬＰはウィルスゲノムが欠けており、したがって非感染性である。ＶＬＰはヘテロ発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。
【００１７】
さらに、非メチル化ＣＧモチーフ（ＣｐＧ）が豊富なＤＮＡは、細菌及び大部分の非脊椎動物中に存在すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＢ細胞、樹状細胞、及び他のＡＰＣ上で、強力な刺激活性を示す。細菌ＤＮＡは多くの脊椎動物種で免疫賦活であるが、個々のＣｐＧモチーフは異なる可能性がる。実際、マウスの免疫細胞を刺激するＣｐＧモチーフが、ヒトの免疫細胞を必ずしも刺激することができるわけではなく、逆も同様である。
【００１８】
ＣｐＧモチーフが豊富なＤＮＡオリゴヌクレオチドは、免疫賦活能力を示すことができるが、その有効性は制限されることが多い。なぜならそれらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて不安定であるからである。したがってそれらは、好ましくない薬物動態を示す。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドをより強力にするためには、したがって、リン酸骨格をチオリン酸で修飾することによって、オリゴマーを安定化させることが通常は必要である。
【００１９】
免疫応答を刺激するためのＣｐＧの使用に関する第２の制限は、ＣＰＧと接触したすべてのＡＰＣ及びＢ細胞が刺激されるために、それらが特異性を欠いていることである。したがって、ＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴヌクレオチドの有効性及び特異性は、それらを安定化させること、あるいは関連抗原も提示する細胞への細胞の活性化を制限するような方法で、それらをパッケージ化することによって向上させることができる。
【００２０】
さらに、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドは、マウスにおいて巨脾症及びリンパ節症を伴う髄外造血を引き起こすことによって、強い副作用を誘導する（Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）、１６２：２３６８〜７４）。
【００２１】
近年の証拠によって、パッケージ化ＣｐＧを含むＶＬＰは、ＶＬＰと結合した抗原に対する、非常に強力なＴ細胞応答を誘導することができることが実証されている（ＷＯ０３／０２４４８１）。さらに、パッケージ化ＣｐＧは、マウスにおいてそれらの安定性を高め、巨脾症及びリンパ腺症を伴う髄外の造血を引き起こすなどの、それらの前述の副作用をほぼ除去した。特に、パッケージ化ＣｐＧは、巨脾症を誘導しなかった。しかしながら、前述のように、大部分の病原体、腫瘍及びアレルゲン抽出物は多数の抗原を含み、ＶＬＰと結合する前に組み換えによってすべてのこれらの抗原を発現することは、しばしば困難である可能性がある。したがって、複雑な結合手順を必要とせずに抗原調製物と簡単に混合することができる、アジュバント配合物を有することが望ましいと思われる。
【００２２】
近年ワクチン戦略において著しい進展がなされてきているが、既存の戦略の改善に関する必要性が依然として存在する。特に、当業界では、抗原と担体物質の結合を必要とせずに、深刻な副作用を伴わずに、強いＴ細胞及びＢ細胞応答を誘導することができる、新しい改良型のワクチンの開発の分野における必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、ＶＬＰにパッケージ化し、それらをさらに免疫原性にすることができるという驚くべき知見に基づくものである。予想外に、ＶＬＰ中に存在する核酸及びオリゴヌクレオチドはそれぞれ、具体的には免疫賦活物質及びＣｐＧモチーフを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドでそれぞれ置換することができる。驚くことに、これらのパッケージ化された免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、先天性免疫の広範囲の活性化なしで、免疫賦活能力を保持していた。本発明のＶＬＰ及び免疫賦活物質を含む組成物、特にＣｐＧ−ＶＬＰは、それらのＣｐＧを含まない相当物よりも著しく免疫原性があり、パッケージ化ＶＬＰと共に施して、すなわちパッケージ化ＶＬＰと混合して、抗原に対するＢ細胞及びＴ細胞応答を劇的に増大させる。予想外に、抗原とＶＬＰの結合は、免疫応答を増大させるために必要ではなかった。さらに、パッケージ化のために、ＶＬＰと結合したＣｐＧが、巨脾症などの全身の副作用を誘導することはなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
第１の実施形態では、本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物であって、ウィルス様粒子及び免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、その物質、核酸またはオリゴヌクレオチドが、ウィルス様粒子に連結、融合、または他の方式で付着、あるいは封入している、すなわち結合している、好ましくはパッケージ化される組成物を提供する。本発明の組成物は、ウィルス様粒子と混合した抗原をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、リン酸骨格のチオリン酸修飾体によって安定化させる。他の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、ＶＬＰ中でのＲＮＡの消化、及び選択したＣｐＧを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの同時の添加によって、ＶＬＰ中にパッケージ化する。同等に好ましい実施形態では、ＣｐＧの存在下でＶＬＰを再構築する前に、ＶＬＰを分解することができる。
【００２６】
他の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸はＣｐＧモチーフを含まず、免疫賦活活性を決して示さない。このような核酸は、ＷＯ０１／２２９７２中に記載されている。その中に記載されたすべての配列は、参照によりここに組み込まれている。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸ジエステル骨格のチオリン酸修飾体によって安定化することはない。
【００２８】
好ましい実施形態では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ヒト細胞においてＩＦＮ−αを誘導する。他の好ましい実施形態では、ＩＦＮ−αを誘導するオリゴヌクレオチドは、グアノシンが多量な反復配列と隣接しており、パリンドローム配列を含む。
【００２９】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。ウィルス様粒子がリポタンパク質のエンベロープを含まないことも好ましい。組み換えウィルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルス、はしかウィルス、シンビスウィルス、ロタウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロウィルス、ノーウォークウィルス、またはヒトパピローマウィルス、ＲＮＡファージ、Ｑβ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ及びＴｙの組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。特定の実施形態では、ウィルス様粒子は、１つまたは複数の異なるＢ型肝炎ウィルスのコア（キャプシド）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。
【００３０】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含む。好ましいＲＮＡファージは、Ｑβ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージである。
【００３１】
他の実施形態では、１つまたは複数の抗原、または抗原の混合物は、組み換え抗原である。他の実施形態では、１つまたは複数の抗原、または抗原の混合物は、花粉、粉塵、真菌、昆虫、食品、哺乳動物表皮、体毛、唾液、血清、蜂、腫瘍、病原体及び羽毛だけには限られないが、これらを含めた天然の供給源から抽出する。
【００３２】
他の実施形態では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；及び（５）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００３３】
さらなる実施形態では、抗原または抗原混合物を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（５）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；及び（６）薬剤、ホルモンまたは毒性化合物に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子からなる群から選択することができる。
【００３４】
特定の実施形態では、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴｈ細胞エピトープを含むか、あるいはこれからなる。関連実施形態では、抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むか、あるいはこれからなる。関連実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスのコアタンパク質を含む。
【００３５】
本発明の他の態様では、ヒトまたは他の動物種の免疫応答を高めるための方法であって、ウィルス様粒子及び免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む組成物を、動物に導入することを含む方法を提供する。その物質、好ましくは核酸、及びさらに好ましくはオリゴヌクレオチドが、ウィルス様粒子に結び付いて（すなわち結合、結着、あるいは封入されて）おり、好ましくはウィルス様粒子とパッケージ化されており、ウィルス様粒子は１つまたは複数の抗原、または抗原の混合物と混合している。
【００３６】
本発明の他の実施形態では、組成物を、動物の皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内、あるいはリンパ節に直接に導入する。同様に好ましい実施形態では、免疫増強組成物を、それに対するワクチン接種が望まれる腫瘍または局所のウィルスの病原巣の近くに、局所的に施す。
【００３７】
本発明の好ましい態様では、免疫応答はＴ細胞応答であり、抗原に対するＴ細胞応答が高まる。特定の実施形態では、Ｔ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が高まる。本発明の他の実施形態では、免疫応答はＢ細胞応答であり、抗原に対するＢ細胞応答が高まる。本発明は、免疫学的に有効量の本発明の免疫増強組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチンにも関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つのアジュバント、Ａｌｕｍまたは不完全フロイントアジュバントなどをさらに含む。本発明は、動物を免疫処置及び／または治療する方法であって、免疫学的に有効量の開示するワクチンを動物に投与することを含む方法も提供する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、免疫賦活物質含有ＶＬＰ、好ましくは免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰを、改変型ＶＬＰと混合させて、抗原に対する動物またはヒトのワクチン接種用に使用する。改変型ＶＬＰを使用して、例えば腫瘍、ウィルス性疾患、または自己分子に対して、ワクチン接種することができる。ワクチン接種は、予防または治療目的、あるいはその両方であってよい。さらに、改変型ＶＬＰを使用して、アレルギー、または喘息などのアレルギー関連の疾患に対するワクチン接種をして、アレルゲンに対する免疫偏向及び／または抗体応答を誘導することができる。したがって、このようなワクチン接種及び治療はそれぞれ、例えば以前アレルギーであった動物及び患者の脱感作を、それぞれもたらすことができる。
【００３９】
大抵の場合、所望の免疫応答は、免疫賦活物質含有ＶＬＰ、好ましくは免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰと混合した、抗原を対象とするものである。抗原はペプチド、タンパク質またはドメイン、及びこれらの混合物であってよい。
【００４０】
注射の経路は皮下または筋肉内であることが好ましいが、ＣｐＧ含有ＶＬＰを皮内、鼻腔内、静脈内、あるいはリンパ節に直接施用することも可能であると思われる。同様に好ましい実施形態では、抗原と混合されたＣｐＧ含有ＶＬＰを、それに対するワクチン接種が望まれる腫瘍または局所のウィルスの病原巣の近くに、局所的に施す。
【００４１】
前述の一般的記載と以下の詳細な記載の両方は、単なる例示的かつ説明的なものであり、特許請求する本発明のさらなる説明を与えることを目的とすることを理解されたい。
【００４２】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等あるいは均等である任意の方法及び物質を、本発明を実施または試験する際に使用することができ、好ましい方法及び物質は、本明細書で以下に記載する。
【００４３】
１．定義
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫、及び蛛形網を含むことを意味する。
【００４４】
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体及びそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及びＶＬまたはＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類及び哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つまたは複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物を、アレルギー治療用のワクチンの設計において使用することができる。ＩｇＥイソ型の抗体は、アレルギー反応における重要な要素である。マスト細胞はそれらの表面上のＩｇＥ抗体と結合し、特異的抗原とマスト細胞表面上で結合したＩｇＥ分子が結合すると、ヒスタミン、及びアレルギー応答の他の仲介物質を放出する。したがって、ＩｇＥ抗体の生成を阻害することは、アレルギーに対して防御するための有望な目標である。このことは、所望のＴヘルパー細胞応答を得ることによって、可能であるはずである。Ｔヘルパー細胞応答は、１型（ＴＨ１）及び２型（ＴＨ２）のＴヘルパー細胞応答に分けることができる（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：２６３〜２６６（１９９７））。ＴＨ１細胞はインターフェロン−γ及び他のサイトカインを分泌し、これによってＢ細胞がＩｇＥ抗体を生成するのを誘導する。これに対して、ＴＨ２細胞によって生成される重要なサイトカインはＩＬ−４であり、これがＢ細胞にＩｇＥを生成させる。多くの実験系において、ＴＨ１応答とＴＨ２応答の進行は互いに排他的である。なぜなら、ＴＨ１細胞はＴＨ２細胞の誘導を抑制し、逆も然りだからである。したがって、強いＴＨ１応答を誘導する抗原はＴＨ２応答の進行を、したがってＩｇＥ抗体の生成を同時に抑制する。高濃度のＩｇＧ抗体が存在することによって、アレルゲンとＩｇＥと結合したマスト細胞の結合が妨げられ、これによってヒスタミンの放出が阻害される可能性がある。したがって、ＩｇＧ抗体が存在することによって、ＩｇＥ仲介のアレルギー反応を防御することができる。アレルギーを引き起こす典型的な物質には、花粉（例えば、牧草、ブタクサ、カバノキまたはビャクシン）；室内塵及びイエダニ；哺乳動物表皮のアレルゲン及び動物の鱗屑；カビ及び真菌；昆虫体及び昆虫毒液；羽毛；食品；及び薬剤（例えばペニシリン）があるが、これらだけには限られない。参照によってその全容がここに組み込まれている、Ｓｈｏｕｇｈ、Ｈ．他、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ｃｈａｐ．８２）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）を参照のこと。したがって、非メチル化ＣＧモチーフが豊富なパッケージ化ＤＮＡを含むウィルス様粒子と混合させた、アレルゲンを用いて個体を免疫処置することは、アレルギーの発症前だけでなく、発症後も有益であるはずである。
【００４６】
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、かつ／あるいは、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／またはＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（Ｂ及びＴエピトープ）を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことが好ましいことが、示されることを意味する。本明細書で使用する抗原は、幾つかの個々の抗原の混合物であってもよい。
【００４７】
本明細書で使用する「微生物抗原」という用語は、微生物の抗原であり、感染ウィルス、感染細菌、寄生虫及び感染真菌だけには限られないが、これらを含む。このような抗原には、無傷微生物、及び天然単離体及びその断片、さらに、天然微生物抗原と同一であるか類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する、合成または組み換え化合物がある。化合物は、それが免疫応答（体液性及び／または細胞性）を誘導する場合、天然微生物抗原と類似している。このような抗原は当分野では日常的に使用され、当業者によく知られている。
【００４８】
ヒト中で知見されてきている感染ウィルスの例には、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ヒト免疫不全ウィルス、ＨＩＶ−１など（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；及び他の単離体、ＨＩＶ−ＬＰなど）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、デングウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、コロナウィルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（たとえば、水泡性口炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、エボラウィルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、パラインフルエンザウィルス、おたふくかぜウィルス、はしかウィルス、呼吸器多様体ウィルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、インフルエンザウィルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ハンタウィルス、ブンガウィルス、フレボウィルス及びナイロウィルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウィルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、レオウィルス、オルビウィルス、及びロタウィルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウィルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パラボウィルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分はアデノウィルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）１及び２、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）；及びＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、アフリカブタ熱ウィルス）；及び未分類ウィルス（たとえば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウィルスの欠陥付随体であると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部に伝播、；クラス２＝非経口的に伝播（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウィルス、及びアストロウィルス）があるが、これらだけには限られない。
【００４９】
グラム陰性菌及びグラム陽性菌は、脊椎動物中で抗原として働く。このようなグラム陽性菌には、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種があるが、これらだけには限られない。グラム陰性菌には、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種があるが、これらだけには限られない。感染細菌の具体例には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ．（たとえば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ及びＣｈｌａｍｙｄｉａがあるが、これらだけには限らない。
【００５０】
感染真菌の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓがある。他の真菌生物（すなわち、原生生物）には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、たとえばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなど、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ及びＳｈｉｓｔｏｓｏｍａがある。
【００５１】
他の医学的に関連がある微生物は、文献中に広く記載されており、たとえばその全容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ、「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照のこと。
【００５２】
本発明の組成物及び方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することによって、癌を治療するためにも有用である。本明細書で使用する「腫瘍抗原」は、腫瘍または癌と関係があり免疫応答を誘発することができる、ペプチドなどの化合物である。特に、ＭＨＣ分子の概念で提示されるとき、化合物は免疫応答を誘発することができる。腫瘍抗原は、たとえばＣｏｈｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：１０５５（１９９４）中に記載されたのと同様に、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、あるいは知られている抗原の新規合成によって、癌細胞から作製することができる。腫瘍抗原は、腫瘍または癌ポリペプチド全体であるかあるいはその抗原部分である、抗原を含む。このような抗原は、組み換えによって、あるいは当分野で知られている任意の他の手段によって、単離または作製することができる。癌または腫瘍には、胆管癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛上皮腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、（たとえば、小細胞及び非小細胞）；メラノーマ、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、及び腎臓癌、及び他の癌腫及び肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００５３】
アレルゲンは、脊椎動物における抗原としても働く。本明細書で使用する、用語「アレルゲン」は、「アレルゲン抽出物」及び「アレルゲンエピトープ」も含む。アレルゲンの例には、花粉（例えば、牧草、ブタクサ、カバノキまたはビャクシン）；室内塵及びイエダニ；哺乳動物表皮のアレルゲン及び動物の鱗屑；カビ及び真菌；昆虫体及び昆虫毒液；羽毛；食品；及び薬剤（例えばペニシリン）があるが、これらだけには限られない。
【００５４】
抗原決定基：本明細書で使用するように、「抗原決定基」という用語は、ＢまたはＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。抗原決定基に応答するＢリンパ球は抗体を生成し、一方Ｔリンパ球は、細胞及び／または体液性免疫の仲介に重要なエフェクター機能の、増大及び確立によって抗原決定基に応答する。
【００５５】
抗原提示細胞：本明細書で使用するように、「抗原提示細胞」という用語は、免疫賦活能力を有する異種群の白血球、または骨髄由来細胞を指すことを意味する。例えば、これらの細胞は、Ｔ細胞によって認識することができるＭＨＣ分子と結合するペプチドを生成することができる。この用語は、用語「補助細胞」と同義であり、例えばランゲルハンス細胞、指状突起細胞、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含む。幾つかの条件下では、上皮細胞、内皮細胞、及び他の非骨髄由来細胞も、抗原提示細胞として働くことができる。
【００５６】
結合（ｂｏｕｎｄ）：本明細書で使用するように、「結合」という用語は、共有、例えば非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとウィルス様粒子の化学的結合による、または非共有、例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を指す。共有結合は、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。この用語は、物質の封入、または部分的封入も含む。「結合」という用語は、「連結（ｃｏｕｐｌｅｄ）」、「融合（ｆｕｓｅｄ）」、「封入」及び「結着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」などより広義であり、これらを含む。さらに、ウィルス様粒子と結合している免疫賦活物質に関しては、用語「結合」は、免疫賦活物質の封入、または部分的封入も含む。したがって、ウィルス様粒子と結合している免疫賦活物質に関しては、「結合」という用語は、「連結（ｃｏｕｐｌｅｄ）」、「融合（ｆｕｓｅｄ）」、「封入」、「パッケージ化」及び「結着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」などより広義であり、これらを含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、オリゴヌクレオチドが単なる「パッケージ化」によって適所に保たれるように、ＶＬＰによって封入することができる。
【００５７】
連結：本明細書で使用する、「連結」という用語は、共有結合による、あるいは強い非共有的相互作用による結着、典型的かつ好ましくは共有結合による結着を指す。生物学的に活性がある物質を連結させるために、当業者により通常使用されている任意の方法を、本発明において使用することができる。
【００５８】
融合：本明細書で使用する、「融合」という用語は、アミノ酸配列のコードヌクレオチド配列をインフレームで組み合わせることによる、１本のポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸配列の組合わせを指す。「融合」という用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖中への異なる起源の配列の挿入、さらに鎖の両端の一端への融合を明確に含む。
【００５９】
ＣｐＧ：本明細書で使用する、「ＣｐＧ」という用語は、少なくとも１つの非メチル化シトシン、グアニジンジヌクレオチド配列（例えば、シトシンの次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド」またはＤＮＡを含み、脊椎動物骨髄由来細胞によるサイトカイン発現を刺激する／活性化する、例えばそれに対する促進効果を有する、あるいはそれを誘導するか増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。例えばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球及びマクロファージなどの活性化において、有用であることができる。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、例えばホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖または一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
【００６０】
コートタンパク質：本明細書で使用するように、「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、用語「ＣＰ」を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱｂの「コートタンパク質」は、「ＱβＣＰ」及びＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、及び少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコートタンパク質は、主にＱβＣＰ、及び少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
【００６１】
エピトープ：本明細書で使用するように、「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒト中で、抗原または免疫活性を有するポリペプチドの連続または不連続部分を指す。エピトープは、ＭＨＣ分子の概念では、抗体によって、あるいはそのＴ細胞受容体を介してＴ細胞によって、認識される。本明細書で使用する「免疫エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Ｇｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）、動物中で抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞受容体によって免疫特異的に結合させることができる。
【００６２】
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約５個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約８〜１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。
【００６３】
免疫応答：本明細書で使用するように、「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／またはＴリンパ球及び／または抗原提示細胞の活性化または増殖をもたらす、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を指す。しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つまたは複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される物質を指す。「免疫原ポリペプチド」は、アジュバントの存在下または不在下で、単独あるいは担体と結び付いて、細胞及び／または体液性免疫応答を誘導するポリペプチドである。抗原提示細胞は、活性化できることが好ましい。
【００６４】
免疫処置：本明細書で使用するように、「免疫処置する」または「免疫処置」という用語、または関連用語は、標的抗原またはエピトープに対する、充分な免疫応答（抗体及び／または細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む）を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基底状態より大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞及び／または体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫処置することができると考えられる。
【００６５】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、かつ／あるいは高めることができる核酸を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてよい。前に記載したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」という用語は、４−ブロモ−シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
【００６６】
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」という用語は、免疫応答を誘導する、かつ／あるいは高めることができる物質を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活物質は、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）活性化物質及びサイトカイン分泌誘導物質だけには限られないが、これらを含む。ＴＬＲ活性化物質は、免疫賦活性核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、及び免疫賦活有機分子、たとえばタクソールなどだけには限られないが、これらを含む。
【００６７】
混合：本明細書で使用するように、「混合」という用語は、一緒に加えられ、互いに化学結合しておらず、分離させることができる、２つ以上の物質、成分、または要素の組合せを指す。
【００６８】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」という用語は、２個以上のヌクレオチド、一般に少なくとも約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」という用語は、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含む核酸配列も指す。「オリゴヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドも指し、これは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。修飾体は、骨格またはヌクレオチド類似体を含むことができる。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には、二本鎖または一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を、非制限的に含む。さらに「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡ及びＤＮＡを含む三本鎖領域を指す。さらにオリゴヌクレオチドは、合成、ゲノムまたは組み換え、たとえばλ−ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体、及び糸状ファージ、たとえばＭ１３などであってよい。
【００６９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、１つまたは複数の修飾体を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、及び安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。たとえば、適切なヌクレオチド修飾体／類似体には、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化塩基、チオリン酸、アルキルチオリン酸、５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、５−メチルデオキシシトシン、及び５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジンがある。さまざまな修飾がＤＮＡ及びＲＮＡになされてきており、したがって、「オリゴヌクレオチド」は、化学的に、酵素によって、あるいは代謝によって修飾された形のポリヌクレオチド、自然界に典型的に見られるもの、及びウィルス及び細胞に特有の化学形のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。
【００７０】
パッケージ化：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰと関係がある免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸の状態を指す。本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的連結による、または非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を含む。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。「パッケージ化」という用語は、「連結」及び「結着」などの用語を含み、特に好ましくは、「パッケージ化」という用語は、物質の封入、または部分的封入も含む。例えば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。したがって、好ましい意味では、「パッケージ化」という用語、ここでは特に、免疫賦活性核酸が免疫賦活物質である場合、「パッケージ化」という用語は、パッケージ化された状態の核酸が、ＤＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅによる加水分解に曝されないことを示す。好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸は、ＶＬＰキャプシド中に、最も好ましくは非共有形式でパッケージ化されている。
【００７１】
ＰＣＲ産物：本明細書で使用する、「ＰＣＲ産物」という用語は、ＰＣＲの出発物質として働く標的ＤＮＡ配列の、増幅されたコピーを指す。標的配列は、例えば二本鎖ＤＮＡを含むことができる。ＰＣＲ用のＤＮＡの源は、「ｃＤＮＡ」とも呼ばれる相補ＤＮＡであってよく、これは逆転写酵素を使用したｍＲＮＡの転換産物であってよい。ＰＣＲ用のＤＮＡの供給源は、細胞から抽出した完全なゲノムＤＮＡであってよい。ＰＣＲ用にＤＮＡを抽出することができる細胞の源には血液サンプル、ヒト、動物、または植物組織、真菌、及び細菌があるが、これらだけには限られない。ＰＣＲ用のＤＮＡの出発物質は、粗製であるか、部分的に精製されているか、あるいは充分に精製されていてよい。ＰＣＲ用のＤＮＡの源は、プラスミドベクター及びバクテリオファージベクターだけには限られないが、これらを含めたベクター中の、クローン挿入体由来のものであってよい。「ＰＣＲ産物」という用語は、用語「ポリメラーゼ連鎖反応産物」と交換可能である。
【００７２】
本発明の組成物は、場合によっては薬剤として許容可能な担体と組み合わせることができる。本明細書で使用する、用語「薬剤として許容可能な担体」は、ヒトまたは他の動物に投与するのに適した、１つまたは複数の適合性のある固体または液体充填剤、希釈剤または被包性物質を意味する。用語「担体」は、活性成分と組み合わせて適用を容易にする、有機または無機成分、天然または合成物を示す。
【００７３】
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドも指すことを目的とする。組み換え体または誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
【００７４】
免疫応答を「高める」物質は、その物質を加えることによって、その物質を加えずに測定した同じ免疫応答と比較して、より高まった、あるいは増大した、あるいは任意の方向に偏向した免疫応答が観察される物質を指す。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、たとえばこの物質あり及びなしで５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。この物質なしのＣＴＬ溶菌活性と比較して、ＣＴＬ溶菌活性が高まる物質の量が、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに充分量であると言える。好ましい実施形態では、免疫応答は、少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上高まる。分泌するサイトカインの量またはタイプも、変わる可能性がある。あるいは、誘導される抗体またはそれらのサブクラスの量が変わる可能性がある。
【００７５】
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは充分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により慣例として決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するのに有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露により抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であると思われる。この用語は、「充分量」とも同義である。
【００７６】
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患または状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／または疾患または状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００７７】
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、または「治療している」という用語は、予防及び／または療法を指す。感染病に関して使用するとき、たとえば、この用語は、病原体による感染に対する被験者の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被験者が病原体によって感染するか、あるいは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、及び感染と戦うため、たとえば感染を低下させるか除外するため、あるいは感染が悪化するのを防ぐための、被験者が感染した後の治療を指す。
【００７８】
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁または溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、抗体及び／またはサイトカインの生成、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、及び／または他の細胞応答だけには限られないが、これらを含めた免疫応答を誘発することができる。
【００７９】
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に対して少量または多量で存在することができる、アジュバントをさらに含む。本明細書で使用するように、「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、または宿主中でデポー作用を生み出すことができる物質を指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層免疫応答の増強が与えられる。さまざまなアジュバントを使用することができる。その例には、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、及び改変型ムラミルジペプチドがある。
【００８０】
ウィルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウィルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語は、ウィルスに似ているが、病原性であることは証明されていない構造を指す。典型的には、本発明のウィルス様粒子は、ウィルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウィルス様粒子はウィルスゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。通常、本発明のウィルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウィルスゲノムのすべてまたは一部、特にウィルスゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウィルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウィルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウィルスキャプシドなどの、ウィルスキャプシドである。本明細書で互換的に使用する、用語「ウィルスキャプシド」または「キャプシド」は、ウィルスタンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウィルスタンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウィルスキャプシド及びキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状または管状である。たとえば、ＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、用語「キャプシド様構造」は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが充分な程度の状態及び反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウィルスタンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
【００８１】
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰは、ＱβＣＰサブユニット（配列番号１）（たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を邪魔するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じる、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）を参照のこと）のみから集合することができるか、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニット（配列番号２）をさらに含むことができる。読み過ごしプロセスは効率が低く、ＶＬＰ中に非常に少量のＡ１タンパク質のみをもたらす。パッケージ化ＩＳＳと連結抗体の異なる組合せを用いて、多数の例が実施されてきている。連結効率及びパッケージ化の違いは、ＱβＣＰサブユニットのみから構築されたＱβコートタンパク質のＶＬＰ、またはキャプシド中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰを使用したときは、観察されていない。さらに、これらのＱβＶＬＰ調製物間の免疫応答の違いは、観察されていない。したがって、簡潔にするために、用語「ＱβＶＬＰ」を、ＱβＣＰサブユニットのみから構築されたＱβコートタンパク質のＶＬＰ、またはキャプシド中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むＱβコートタンパク質のＶＬＰに関する例の記載中において使用する。
【００８２】
本明細書で使用するように、用語「ウィルス粒子」は、ウィルスの形態を指す。いくつかのウィルス型では、ウィルスはタンパク質キャプシドに囲まれたゲノムを含み、他のウィルスは追加的な構造（たとえば、エンベロープ、尾部など）を有する。
【００８３】
非エンベロープウィルス粒子は、ウィルスゲノムを囲み保護するタンパク質キャプシドでできている。エンベロープで覆われたウィルスは、ウィルスの遺伝物質を囲むキャプシド構造も有するが、さらに、キャプシドを囲む脂質二重層エンベロープを有する。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
【００８５】
Ｏｎｅ、ａ、またはａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、または「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、または「１つまたは複数」を意味する。
【００８６】
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施形態は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ及びＲＮＡの精製、原核及び真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく知見することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、ｅｄｓ．、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他、ｅｄｓ．、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９９８））、及び抗体系の技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」３ｒｄ  ｅｄ．、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））も文献中に充分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
【００８７】
２．免疫応答を高めるための組成物及び方法
開示する本発明は、動物中の１つまたは複数の抗原に対する、免疫応答を高めるための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、ウィルス様粒子及び免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなり、オリゴヌクレオチドはウィルス様粒子と結合しており、生成する改変型ウィルス様粒子は、１つまたは複数の抗原、または抗原の混合物と混合している。さらに好都合には、本発明によって実践者は、感染病、及び慢性感染病の予防及び／または治療、癌の予防及び／または治療、ならびにたとえばアレルギー、または喘息などのアレルギー関連の疾患の予防及び／または治療を含めた、さまざまな治療及び／または予防目的の、このような組成物を構築することができる。
【００８８】
本出願に述べるウィルス様粒子は、ウィルス粒子に似ているが病原性ではない構造を指す。一般にウィルス様粒子は、ウィルスゲノムが欠けており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することができ、容易に精製することができる。
【００８９】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。当業者は、組み換えＤＮＡ技術、及び公に容易に入手可能であるウィルスコード配列を使用して、ＶＬＰを生成することができる。たとえば、ウィルスエンベロープまたはコアタンパク質のコード配列を、ウィルスプロモーター、及びコード配列と制御配列の機能的連結を可能にする配列の適切な修飾体の制御調節下において、市販のバキュロウィルスベクターを使用してバキュロウィルス発現ベクター中で発現させるために、工学処理することができる。ウィルスエンベロープまたはコアタンパク質のコード配列を、たとえば細菌発現ベクター中で発現させるために、工学処理することもできる。
【００９０】
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウィルス（Ｗａｒｎｅｓ他、Ｇｅｎｅ１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンビスウィルス、ロタウィルス（米国特許第５，０７１，６５１号及び５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウィルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１６０３〜１６１０、（１９９５））、ノーウォークウィルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））のキャプシドタンパク質、レトロウィルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウィルス（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウィルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、及び特にＱβ−ファージの表面タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００９１】
当業者には容易に理解されるように、本発明のＶＬＰは任意の特定の形に限られない。粒子は化学的に、あるいは生物学的プロセスによって合成することができ、天然または非天然のものであってよい。たとえば、この型の実施形態は、ウィルス様粒子またはそれに由来する組み換え体を含む。
【００９２】
より具体的な実施形態では、ＶＬＰは、ロタウィルスの組み換えポリペプチド、ノーウォークウィルスの組み換えポリペプチド、アルファウィルスの組み換えポリペプチド、口蹄疫ウィルスの組み換えポリペプチド、はしかウィルスの組み換えポリペプチド、シンドビスウィルスの組み換えポリペプチド、ポリオーマウィルスの組み換えポリペプチド、レトロウィルスの組み換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウィルス（例えば、ＨＢｃＡｇ）の組み換えポリペプチド、タバコモザイクウィルスの組み換えポリペプチド、フロックハウスウィルスの組み換えポリペプチド、ヒトパピローマウィルスの組み換えポリペプチド、バクテリオファージの組み換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組み換えポリペプチド、Ｔｙの組み換えポリペプチド、ｆｒ−ファージの組み換えポリペプチド、ＧＡ−ファージの組み換えポリペプチド、ＡＰ２０５−ファージの組み換えポリペプチド、及びＱβ−ファージの組み換えポリペプチドから選択される、組み換えポリペプチドまたはその断片を含むか、あるいは本質的にこれらからなっているか、あるいはこれらからなっていてよい。ウィルス様粒子は、このようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、及びこのようなポリペプチドの変異体をさらに含むか、あるいは本質的にこれらからなっているか、あるいはこれらからなっていてよい。ポリペプチドの変異体は、たとえば、アミノ酸レベルで野生型の相当物と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を共有することができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；ｌ）バクテリオファージＰＰ７；及びｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されることが好ましい。
【００９４】
本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの、ＲＮＡバクテリオファージｆｒの、またはＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９５】
本発明の他の好ましい実施形態では、組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９６】
キャプシドまたはＶＬＰを形成するＲＮＡファージのコートタンパク質、またはキャプシドまたはＶＬＰへの自己組織化と適合性があるバクテリオファージのコートタンパク質の断片は、したがって本発明の他の好ましい実施形態である。バクテリオファージＱβコートタンパク質は、たとえば大腸菌中で組み換えによって発現させることができる。さらに、このような発現によって、これらのタンパク質はキャプシドを自然に形成する。さらに、これらのキャプシドは、固有の繰り返し編成である構造を形成する。
【００９７】
本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコートタンパク質の具体的な好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１；ＰＩＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、及び配列番号２；受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＲ１７（配列番号３；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号４；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４はＳＰＣＰを指し、及び配列番号７；受託番号ＳＰＡ１タンパク質を指すＮＰ６９５０２６）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号８；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号１３）、バクテリオファージＡＰ２０５（配列番号９０）などのＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質がある。さらに、バクテリオファージＱβ（配列番号２）のＡ１タンパク質、またはそのＣ末端から１００、１５０または１８０個ものアミノ酸を失っているＣ末端切断形を、Ｑβコートタンパク質のキャプシド集合体中に取り込ませることができる。一般に、キャプシド集合体中のＱβＣＰに対するＡ１タンパク質の割合は、キャプシド形成を確実にするために制限される。
【００９８】
Ｑβコートタンパク質は、大腸菌中で発現すると、キャプシドに自己組織化することも知見されてきている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．他、ＧＥＮＥ  １３７：１３３〜１３７（１９９３））。キャプシドはコートタンパク質の１８０のコピーを含み、これらはジスルフィド結合によって共有ペンタマー及びヘキサマー中で連結しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコートタンパク質のキャプシドの著しい安定性をもたらす。しかしながら、組み換えＱβコートタンパク質から作製されたキャプシドまたはＶＬＰは、キャプシド中でジスルフィド結合によって他のサブユニットに連結していないか、あるいは不完全に連結したサブユニットを含むことができる。したがって、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて組み換えＱβキャプシドを担持することによって、モノマーＱβコートタンパク質に対応するバンド、及びＱβコートタンパク質のヘキサマーまたはペンタマーに対応するバンドが、目に見える状態になる。不完全にジスルフィド結合したサブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてジマー、トリマー、またはさらにテトラマーのバンドとして現れると思われる。Ｑβキャプシドタンパク質は、有機溶媒及び変性剤に対して、普通ではない耐性も示す。驚くことに我々は、３０％ものＤＭＳＯ及びアセトニトリル濃度、及び１Ｍものグアニジニウム濃度が、キャプシドの安定性に影響を与えないことを観察している。Ｑβコートタンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に哺乳動物及びヒトの免疫処置及びワクチン接種での使用に関し、重要な特徴である。
【００９９】
大腸菌中で発現することによって、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）中に記載されたのと同様に、Ｎ末端をエドマンの配列決定により我々が観察したように、Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンは通常除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコートタンパク質から構成されるＶＬＰ、またはＮ末端メチオニンが切断されているか存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内のものである。
【０１００】
本発明の、ＲＮＡ−ファージ、特にＱβの他の好ましいウィルス様粒子は、参照によって開示のその全容がここに組み込まれている、ＷＯ０２／０５６９０５中に開示されている。
【０１０１】
他のＲＮＡファージのコートタンパク質も、細菌宿主中で発現することによって自己組織化することが示されてきている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、Ｇｅｎｅ  ２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ２８７：４５２  ４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージキャプシドは、コートタンパク質に加えて、いわゆる読み過ごしタンパク質Ａ１、及び成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１はＵＧＡ停止コドンにおける抑制によって生成し、３２９ａａの長さを有する。本発明で使用するファージＱβの組み換えコートタンパク質のキャプシドは、Ａ２溶解タンパク質を欠いており、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウィルスのライフサイクル中に翻訳抑制物質として作用するレプリカーゼ遺伝子の、リボソーム結合部位のステムループとする。相互作用の配列及び構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：７１〜７６（１９８９）；Ｌｉｍ  Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。一般にステムループ及びＲＮＡは、中に含まれることが知られているウィルス集合体（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））。
【０１０２】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、変異体コートタンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。あるいは、変異体コートタンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１０３】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、または配列番号１及び配列番号２または配列番号２の変異体のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。
【０１０４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、変異体Ｑβコートタンパク質を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、これらの変異体コートタンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。あるいは、これらの変異体コートタンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１０５】
４個のリシン残基が、Ｑβコートタンパク質のキャプシドの表面上で露出している。露出したリシン残基がアルギニンによって置換されている、Ｑβ変異体も、本発明用に使用することができる。したがって、以下のＱβコートタンパク質変異体、及び変異体Ｑβ  ＶＬＰを、本発明を実施する際に使用することができる。：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号１４）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号１５）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号１６）、「Ｑβ−２５１」（配列番号１７）及び「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号１８）。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、変異体Ｑβコートタンパク質の組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、ウィルス様粒子は、ａ）配列番号１４のアミノ酸配列；ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列；ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列；ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列；及びｅ）配列番号１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。前に示したＱβコートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びキャプシドそれぞれの構築、発現及び精製は、ＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。詳細には、前述の出願の実施例１８をここで参照する。
【０１０６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、これから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１個と対応するＡ１タンパク質の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０７】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０８】
ＡＰ２０５のゲノムは、関連ファージ中に存在しない、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼ及び２個のオープンリーディングフレームからなり；溶解遺伝子及びオープンリーディングフレームは、成熟遺伝子の翻訳において役割を果たしている（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５のコートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号９１）から発現される可能性があり、このプラスミドはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む。あるいは、ＡＰ２０５のコートタンパク質を、ベクター中に存在するリボソーム結合部位の下流で、ｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。いずれの手法も、タンパク質の発現及びキャプシドの形成をもたらす。ベクターｐＱｂ１０及びｐＱｂｌ８５は、ｐＧＥＭベクター由来のベクターであり、これらのベクター中でのクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号９１）は、以下の配列中に推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含み、これはＸｂａＩ部位の下流、及びＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流である：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴ  ＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ（配列番号９１の塩基７７〜１３３）。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流、及び開始コドンのすぐ上流に、Ｓｈｉｎｅ  Ｄｅｌａｇａｒｎｏ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧ  ＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ（配列番号９２）、Ｓｈｉｎｅ  Ｄｅｌａｇａｒｎｏ配列は下線部）。
【０１０９】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１０】
したがって、本発明のこの好ましい実施形態は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。このようなタンパク質は組み換えによって発現されるか、あるいは天然の供給源から作製される。細菌中で生成されたＡＰ２０５コートタンパク質は、電子顕微鏡法（ＥＭ）及び免疫拡散法によって実証されるように、キャプシドを自然に形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質によって形成されたキャプシド（配列番号９０）と、ＡＰ２０５  ＲＮＡファージのコートタンパク質によって形成されたキャプシドの構造的性質は、ＥＭで見るとほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５  ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／または抗原決定基と連結して、反復方式で配向した抗原及び／または抗原決定基を示す、構築体を生成させることができる。このように示された抗原に対する高い力価が誘導され、結合した抗原及び／または抗原決定基は、抗体分子との相互作用のために利用可能であり、免疫原性があることが示される。
【０１１１】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコートタンパク質、またはその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１２】
ＡＰ２０５コートタンパク質を含む、組織化能のある変異形のプロリンがアミノ酸５においてトレオニンに置換されたＡＰ２０５  ＶＬＰ（配列番号９３）も、本発明を実施する際に使用することができ、本発明の他の好ましい実施形態をもたらす。これらのＶＬＰ、天然の供給源に由来するＡＰ２０５  ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウィルス粒子は、本発明に従って、抗原に結合して、抗原の整然とした繰り返し配列を生成させることができる。
【０１１３】
ＡＰ２０５  Ｐ５−Ｔ変異体のコートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号９４）から発現される可能性があり、これはｐＱｂ１８５に直接由来し、変異体ＡＰ２０５コートタンパク質の遺伝子を、Ｑβコートタンパク質の遺伝子の代わりに含む。ＡＰ２０５コートタンパク質の発現用のベクターを、ＡＰ２０５コートタンパク質の発現用の大腸菌にトランスフェクトする。
【０１１４】
コートタンパク質及び変異体コートタンパク質をそれぞれ発現させ、ＶＬＰへの自己組織化をもたらす方法は、実施例１６及び１７に記載されている。適切な大腸菌の菌株は、大腸菌Ｋ８０２、ＪＭ  １０９、ＲＲ１だけには限られないが、これらを含む。適切なベクター及び菌株、及びそれらの組合せは、コートタンパク質及び変異体コートタンパク質の発現をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験することによって確認することができ、キャプシド形成及び集合は、場合によっては最初にキャプシドをゲル濾過により精製し、免疫拡散アッセイ（オクタロニー試験）または電子顕微鏡法でその後キャプシドを試験することによって確認することができる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。
【０１１５】
ベクターｐＡＰ２８３−５８及びｐＡＰ２８１−３２から発現されるＡＰ２０５コートタンパク質は、大腸菌の細胞質中でのプロセッシングのために、開始メチオニンアミノ酸を欠いている可能性がある。切断、非切断形のＡＰ２０５  ＶＬＰ、またはこれらの混合物は、本発明の他の好ましい実施形態である。
【０１１６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質、またはその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコートタンパク質、またはその断片の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１７】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質または組み換え変異体のコートタンパク質の断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１８】
ＶＬＰ及びキャプシドにそれぞれ集合することができる組み換えＡＰ２０５コートタンパク質断片も、本発明を実施する際に有用である。これらの断片は、それぞれコートタンパク質及び変異体コートタンパク質の内部または末端での、欠失によって生成させることができる。ＶＬＰへの集合と適合性がある、コートタンパク質及び変異体コートタンパク質の配列の挿入、または抗原配列とコートタンパク質及び変異体コートタンパク質の配列の融合は、本発明の他の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質、及び粒子をそれぞれもたらす。コートタンパク質配列の挿入、欠失及び融合の結果、及びそれがＶＬＰへの集合と適合性があるかどうかは、電子顕微鏡法によって判定することができる。
【０１１９】
前に記載したＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片及びキメラコートタンパク質によって形成される粒子は、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂカラム、及びこれらの組合せを使用して、沈殿による分画ステップとゲル濾過による精製ステップの組合せによって、純粋な形で単離することができる。ウィルス様粒子を単離する他の方法は当分野で知られており、これを使用して、バクテリオファージＡＰ２０５のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することができる。たとえば、超遠心分離を使用して酵母のレトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離することは、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９１８，１６６号中に記載されている。
【０１２０】
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５４（１９９６））。このような情報を使用して、当業者は、表面に露出した残基を容易に確認することができ、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を挿入することができるように、バクテリオファージのコートタンパク質を改変することができると思われる。したがって当業者は、本発明用に使用することができる、改変形のバクテリオファージのコートタンパク質を、容易に作製し確認することができると思われる。したがって、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体（たとえば、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、及びバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質）を使用して、本発明の組成物を調製することもできる。
【０１２１】
前に論じた変異体タンパク質の配列は、その野生型の相当物とは異なるであろうが、これらの変異体タンパク質は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を一般に保持しているであろう。したがって本発明は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体をさらに含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物、及びこのような組成物及びワクチン組成物をそれぞれ調製するための方法をさらに含み、個々のタンパク質サブユニットを使用して、このような組成物、及びこれらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する。したがって、本発明の範囲内に含まれるのは、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成し、キャプシドまたはキャプシド様構造と会合しこれを形成する能力を保持している、変異体形の野生型タンパク質である。
【０１２２】
結果として、本発明は、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、整然とした配列を形成しそれぞれ固有の反復構造を有するタンパク質を含む、それぞれ組成物及びワクチン組成物をさらに含む。多くの場合、これらのタンパク質をプロセッシングして、シグナルペプチドを除去する（例えば、異種のシグナルペプチド）。
【０１２３】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の組成物を調製するために使用するタンパク質をコードする、核酸分子である。
【０１２４】
具体的な実施形態では本発明は、配列番号１〜１１の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１２５】
本発明で使用するのに適したタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造ならびにその他の定序配列を形成する、Ｃ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１〜１１のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＣ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２６】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する、Ｎ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている、配列番号１〜１１のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２７】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する、Ｎ及びＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１〜１１のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端及びＣ末端切断型変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２８】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１２９】
したがって本発明は、定序配列を形成するタンパク質から調製した組成物及びワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニット及びＶＬＰまたはキャプシドからこれらの組成物を調製するための方法、これらの個々のタンパク質サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸分子を調製するための方法、及び本発明のこれらの組成物を使用して、ワクチン接種及び／また個体の免疫応答を誘導するための方法を含む。
【０１３０】
免疫応答を誘導する能力を保持しているＶＬＰの断片は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個のアミノ酸長のポリペプチドであるが、ＶＬＰを含むサブユニットの配列の長さに明らかに依存するポリペプチドを含むか、あるいはこれらからなっていてよい。このような断片の例は、免疫応答促進組成物を調製するのに適した、本明細書で論じるタンパク質の断片を含む。
【０１３１】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
【０１３２】
リポタンパク質エンベロープまたはリポタンパク質含有エンベロープの欠如、及び特に、エンベロープの完全な欠如は、その構造及び組成がより明確なウィルス様粒子をもたらす。したがって、このようなより明確なウィルス様粒子は、副作用を最少にすることができる。さらに、リポタンパク質含有エンベロープの欠如、及び特に、エンベロープの完全な欠如によって、おそらく毒性である分子及び発熱物質のウィルス様粒子中への取り込みが、回避されるかあるいは最少になる。
【０１３３】
前述したように、本発明は、ウィルス様粒子またはそれに由来する組み換え体を含む。当業者は、このような粒子を生成させ抗原をそれと混合する知識を有している。他の例を与えることによって、本明細書において本発明は、ウィルス様粒子としてのＢ型肝炎ウィルス様粒子の生成を与える（実施例１）。
【０１３４】
一実施形態では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、またはＨＢｃＡｇの断片から構成されており、他の実施形態では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、またはＨＢｃＡｇタンパク質の断片から構成されている。これが改変されて、遊離システイン残基の数がなくなっているかあるいは減少している。Ｚｈｏｕ他（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたＨＢｃＡｇは、会合しマルチマー構造を形成する能力を保持していることを実証した。したがって、本発明の組成物中で使用するのに適したコア粒子には、改変型ＨＢｃＡｇｓまたはその断片を含む粒子があり、その中では、１つまたは複数の本来存在するシステイン残基が欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基（たとえば、セリン残基）で置換されている。
【０１３５】
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じるタンパク質である。いくつかのイソ型のＨＢｃＡｇが同定されてきており、それらのアミノ酸配列は当業者には容易に利用可能である。たとえば、配列番号７１に示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇタンパク質は、１８３個のアミノ酸長であり、アミノ酸２１２個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。このプロセッシングによって、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端から、２９個のアミノ酸の除去がもたらされる。同様に、１８５個のアミノ酸長であるＨＢｃＡｇタンパク質は、アミノ酸２１４個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。
【０１３６】
殆どの場合、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれを、プロセッシングされた形のＨＢｃＡｇ（すなわち、そこからＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が除去されたＨＢｃＡｇ）を使用して調製する。
【０１３７】
さらに、プロセッシングが後で起こらない条件下でＨＢｃＡｇが生成されるときは、ＨＢｃＡｇは一般に「プロセッシング済みの」形で発現されよう。たとえば、タンパク質の細胞質への発現を指示する大腸菌の発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成させるとき、これらのタンパク質は一般に、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現されるであろう。
【０１３８】
本発明用に使用することができるＢ型肝炎ウィルス様粒子の作製は、たとえば、ＷＯ００／３２２２７、ここでは特に実施例１７〜１９及び２１〜２４中、及びＷＯ０１／８５２０８、ここでは特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１及び４１中、及びＷＯ０２／０５６９０５中に開示されている。後者の出願に関しては、実施例２３、２４、３１及び５１に特に言及する。３つの文書はすべて、参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１３９】
本発明は、改変されて１つまたは複数の追加的システイン残基が欠失しているか、あるいは置換されているＨＢｃＡｇ変異体も含む。したがって、本発明のワクチン組成物は、ＨＢｃＡｇを含む組成物を含み、その中では、配列番号７１に示すアミノ酸配列中に存在しないシステイン残基が欠失している。
【０１４０】
遊離システイン残基が、いくつかの化学的副反応と関連がある可能性があることは、当分野ではよく知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、たとえば、組合せ療法において他の物質と共に注射または形成される、化学物質または代謝産物との反応、または直接的酸化、及びＵＶ光への暴露によるヌクレオチドとの反応がある。ＨＢｃＡｇには核酸と結合する著しい性質がある事実を特に考慮すると、毒性の付加物が生成されると思われる。したがって毒性の付加物は、多様な種の間に分配すると思われ、これらは低濃度で個別にそれぞれ存在する可能性があるが、一緒になると毒性レベルに達する。
【０１４１】
前述の事項を鑑みると、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたワクチン組成物中に、ＨＢｃＡｇを使用する１つの利点は、抗原または抗原決定基が結着すると毒性種が結合することができる部位は、数が減少するかあるいは完全になくなると思われることである。
【０１４２】
本発明を実施する際に使用するのに適した、いくつかの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が同定されてきている。たとえば、Ｙｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号１９中の位置９７に対応する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基またはフェニルアラニン残基に置換されている、変異体を記載している。いくつかのＨＢｃＡｇ変異体、及びいくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体の変異体のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの報告中に開示されている。ＡＡＦ１２１２４０（配列番号２０）、ＡＦ１２１２３９（配列番号２１）、Ｘ８５２９７（配列番号２２）、Ｘ０２４９６（配列番号２３）、Ｘ８５３０５（配列番号２４）、Ｘ８５３０３（配列番号２５）、ＡＦ１５１７３５（配列番号２６）、Ｘ８５２５９（配列番号２７）、Ｘ８５２８６（配列番号２８）、Ｘ８５２６０（配列番号２９）、Ｘ８５３１７（配列番号３０）、Ｘ８５２９８（配列番号３１）、ＡＦ０４３５９３（配列番号３２）、Ｍ２０７０６（配列番号３３）、Ｘ８５２９５（配列番号３４）、Ｘ８０９２５（配列番号３５）、Ｘ８５２８４（配列番号３６）、Ｘ８５２７５（配列番号３７）、Ｘ７２７０２（配列番号３８）、Ｘ８５２９１（配列番号３９）、Ｘ６５２５８（配列番号４０）、Ｘ８５３０２（配列番号４１）、Ｍ３２１３８（配列番号４２）、Ｘ８５２９３（配列番号４３）、Ｘ８５３１５（配列番号４４）、Ｕ９５５５１（配列番号４５）、Ｘ８５２５６（配列番号４６）、Ｘ８５３１６（配列番号４７）、Ｘ８５２９６（配列番号４８）ＡＢ０３３５５９（配列番号４９）、Ｘ５９７９５（配列番号５０）、Ｘ８５２９９（配列番号５１）、Ｘ８５３０７（配列番号５２）、Ｘ６５２５７（配列番号５３）、Ｘ８５３１１（配列番号５４）、Ｘ８５３０１（配列番号５５）、Ｘ８５３１４（配列番号５６）、Ｘ８５２８７（配列番号５７）、Ｘ８５２７２（配列番号５８）、Ｘ８５３１９（配列番号５９）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６０）、Ｘ８５２８５（配列番号６１）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６２）、ＡＦ１２１２４２（配列番号６３）、Ｍ９０５２０（配列番号６４）、Ｐ０３１５３（配列番号６５）、ＡＦ１１０９９９（配列番号６６）、及びＭ９５５８９（配列番号６７）。これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。これらのＨＢｃＡｇ変異体は、配列番号６８中の位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２及び１８３に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めた、いくつかの位置でアミノ酸配列が異なる。本発明の組成物中で使用するのに適しており、本出願の開示に従ってさらに改変することができる他のＨＢｃＡｇ変異体は、ＷＯ０１／９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８及びＷＯ００／２１４４７８中に記載されている。
【０１４３】
本発明で使用するのに適したＨｂｃＡｇは、それらが封入、または結合、あるいはそれ以外の場合は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに結着し、免疫応答を誘導することができる限りは、任意の生物に由来するものであってよい。
【０１４４】
前に示したように、一般的にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわち、リーダー配列が欠けているＨＢｃＡｇ）を、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれに使用することができるであろう。本発明はワクチン組成物、及び前に記載した変異体ＨＢｃＡｇを使用する、これらの組成物を使用するための方法を含む。
【０１４５】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合してジマーまたはマルチマー構造を形成することができる、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されているこれらのタンパク質を形成する、アミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、組成物及びワクチン組成物それぞれをさらに含む。
【０１４６】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記の野生型アミノ酸配列、またはそのサブ部分の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの知られているコンピュータプログラムを使用して、従来決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、たとえば参照アミノ酸配列と９５％同一であるかどうかを判定するとき、そのパラメータは、同一性のパーセンテージを完全長の参照アミノ酸配列に関して計算し、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定する。
【０１４７】
配列番号２０〜６３及び６４〜６７で述べるアミノ酸配列を有する、ＨＢｃＡｇ変異体と前駆体は、互いに比較的類似している。したがって、配列番号６８中の特定の位置に対応する位置に位置する、ＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸残基を言及することは、配列番号６８で示すアミノ酸配列中のその位置に存在する、アミノ酸残基を指す。これらのＨＢｃＡｇ変異体間の相同性は、哺乳動物に感染するＢ型肝炎ウィルスではほとんどの部分で充分高いので、当業者には、配列番号６８及び特定のＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸配列を概説し、「対応する」アミノ酸残基を同定する際に、困難がほとんどないと思われる。例えば、ウッドチャックに感染するウィルスに由来するＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号６４のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、配列番号６８で示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと充分な相同性を有するので、３個のアミノ酸残基の挿入物が、配列番号６４中、配列番号６８のアミノ酸残基１５５と１５６の間に存在することは、容易に明らかである。
【０１４８】
本発明は、鳥類に感染するＢ型肝炎ウィルスのＨＢｃＡｇ変異体を含むワクチン組成物、及びこれらのＨＢｃＡｇ変異体の断片を含むワクチン組成物も含む。これらのＨＢｃＡｇの変異体では、これらのポリペプチド中に本来存在する、１個、２個、３個、あるいはそれより多くのシステイン残基は、それらを本発明のワクチン組成物に封入する前に、他のアミノ酸残基で置換または欠失させることができると思われる。
【０１４９】
前に論じたように、遊離システイン残基を排除することによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合することができる部位の数が減少し、同じまたは近隣のＨＢｃＡｇ分子のリシンとシステイン残基の架橋が起こる可能性がある部位も排除される。したがって、本発明の他の実施形態では、Ｂ型肝炎ウィルスのキャプシドタンパク質の１つまたは複数のシステイン残基は、欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基で置換されている。
【０１５０】
他の実施形態では、本発明の組成物及びワクチン組成物はそれぞれ、Ｃ末端領域（たとえば、配列番号６８のアミノ酸残基１４５〜１８５または１５０〜１８５）が除去されている、ＨＢｃＡｇを含む。したがって、本発明を実施する際に使用するのに適した他の改変型ＨＢｃＡｇには、Ｃ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１５１】
本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇには、Ｎ末端切断型変異体もある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去された改変型ＨＢｃＡｇがある。
【０１５２】
本発明を実施する際に使用するのに適した他のＨＢｃＡｇには、Ｎ及びＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。ただし、Ｃ末端の切断は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの結合と適合性があるものとする。
【０１５３】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、ワクチン組成物をさらに含む。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドに導入して、抗原または抗原決定基とＨＢｃＡｇのＶＬＰの結合を仲介させる。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、配列番号６８のアミノ酸１〜１４４、または１〜１４９、または１〜１８５を含むか、あるいはこれらからなり、改変されて、位置７９及び８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号９５）を有するペプチドで置換されて、配列番号９６のアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ改変体になっているＨＢｃＡｇを使用して調製する。他の好ましい実施形態では、配列番号６８の位置４８及び１０７におけるシステイン残基が、セリンに変異する（配列番号９７）。本発明は、配列番号２０〜６７のいずれかで示すアミノ酸配列を有し、前に示したアミノ酸の変更もある、対応するポリペプチドを含む組成物をさらに含む。他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合しキャプシドまたはＶＬＰを形成することができ、前に示したアミノ酸の変更がある、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって、本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されており、前に示した変更によって改変されている、これらのタンパク質を形成するアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなる、ＨＢｃＡｇポリペプチドを含む組成物をさらに含む。
【０１５５】
本発明の組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含むことができる。したがって、これらの組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから構成されていてよい。たとえば、「野生型」ＨＢｃＡｇ、及び１つまたは複数のアミノ酸残基が変わっている（たとえば、欠失、挿入または置換）改変型ＨＢｃＡｇを含む、ワクチン組成物を調製することができると思われる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、非常に整然とした反復抗原配列を示す組成物である。
【０１５６】
本発明の一態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが結合したウィルス様粒子を、それに対する高い免疫応答が望まれる、抗原／免疫原と混合させる。幾つかの場合、１つの抗原を、このように改変したウィルス様粒子と混合させる。他の場合は、このように改変したＶＬＰを、幾つかの抗原またはさらに複雑な抗原混合物と混合させる。抗原は組み換えによって生成することができ、あるいは天然の供給源から抽出することができ、抗原には花粉、粉塵、真菌、昆虫、食品、哺乳動物表皮、羽毛、蜂、腫瘍、病原体及び羽毛があるが、これらだけには限られない。
【０１５７】
前に開示したように、本発明は、改変型ＶＬＰ、すなわち免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、及びさらに好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドあるいは代替的にポリ（Ｉ：Ｃ）が結合した、及び好ましくは免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、及びさらに好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドあるいは代替的にポリ（Ｉ：Ｃ）が結合して、パッケージ化ＶＬＰをもたらしているＶＬＰは、このように改変したＶＬＰと抗原を単に混合させることによって、抗原に対するＢ及びＴ細胞応答を高めることができるという、驚くべき知見に基づくものである。驚くことに、抗原とＶＬＰの共有結合または連結は必要とされない。さらに、ＶＬＰ及び抗原に対するＴ細胞応答は、Ｔｈ１型を特に対象とする。パッケージ化された核酸及びＣｐＧはそれぞれ、分解から保護される、すなわち、それらはより安定性がある。さらに、免疫系からの細胞の非特異的活性化は、著しく低下する。
【０１５８】
先天性免疫系は、微生物病原体によって共有される不変の分子型を認識する能力を有する。最近の研究によって、この認識が効果的な免疫応答を誘導する際の重要なステップであることが、明らかになってきている。微生物体が免疫応答を高める主な機構は、ＡＰＣ、特に樹状細胞を刺激して、前炎症性サイトカインを生成させ、高レベルのＴ細胞の共賦活分子を発現させることである。これらの活性化された樹状細胞は、後に主要なＴ細胞応答を開始させ、Ｔ細胞仲介のエフェクター機能の型を指示する。
【０１５９】
２クラスの核酸、すなわち１）免疫賦活配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特定の隣接塩基中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）、及び２）さまざまな型のウィルスによって合成される二本鎖ＲＮＡが、免疫応答を高める細菌要素中の重要な構成要素である。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）などの合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、樹状細胞に前炎症性サイトカインの生成を誘導させ、高レベルの共賦活分子を発現させることができる。
【０１６０】
Ｔｏｋｕｎａｇａ及びＹａｍａｍｏｔｏ他による一連の研究によって、細菌ＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ヒトＰＢＭＣ及びマウス脾臓細胞を誘発して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を生成させることが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１１〜１９中に概説されている）。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、本来はＩ型ＩＦＮの強力な誘導物質として合成されたが、ＩＬ−１２などの他のサイトカインも誘導する。
【０１６１】
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン−ポリシチジル酸の二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）を含む。リボ核酸及びその修飾体、及びそれらを生成するための方法は、Ｌｅｖｙ、Ｈ．Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１、７８：２４２〜２５１）、ＤｅＣｌｅｒｃｑ，Ｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１、７８：２２７〜２３６）、及びＴｏｒｒｅｎｃｅ，Ｐ．Ｆ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１；７８：３２６〜３３１）、及びその中の参照によって記載されてきている。他の好ましいリボ核酸は、イノシン酸及びシチジル酸のポリヌクレオチドを含み、二本鎖のそのようなポリ（ＩＣ）が二本鎖ＲＮＡを形成する。リボ核酸は、生物から単離することができる。リボ核酸は、他の合成リボ核酸、特に合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドも含み、これらはリン酸ジエステル骨格の修飾によって、特にチオリン酸の修飾によって、ヌクレアーゼ耐性になっている。他の好ましい実施形態では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格が、デオキシリボースによって置換されている。当業者は、合成オリゴヌクレオチドの合成の仕方の手順を知っている。
【０１６２】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＴＬＲを活性化させる分子が含まれる。１０個のヒトのＴＬＲが、今日までに知られている。これらは、さまざまなリガンドによって活性化される。ＴＬＲ２はペプチドグリカン、リポタンパク質、リポ多糖、リポテイコ酸及びザイモサン、及びマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ−２によって活性化され；ＴＬＲ３はポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡによって活性化され；ＴＬＲ４はリポ多糖、リポテイコ酸及びタクソール、及び熱ショックタンパク質ＨＳＰ−６０及びＧｐ９６などの熱ショックタンパク質によって活性化され；ＴＬＲ５は、細菌フラジェラ、特にフラジェリンタンパク質によって活性化され；ＴＬＲ６はペプチドグリカンによって活性化され、ＴＬＲ７はイミクイモイド及びイミダゾキノリン化合物、Ｒ−８４８、ロクソリビン及びブロピリミンなどによって活性化され、ＴＬＲ９は細菌ＤＮＡ、特にＣｐＧオリゴヌクレオチドによって活性化される。ＴＬＲ１、ＴＬＲ８及びＴＬＲ１０のリガンドは、これまで知られていない。しかしながら、近年の報告によって、同じ受容体が異なるリガンドと反応することができ、他の受容体が存在することが示されている。前述のリガンドの列挙は網羅的なものではなく、他のリガンドは当業者の知識の範囲内にある。
【０１６３】
一般に、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、以下の配列であって、
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
上式でＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が任意のヌクレオチドである配列を含む。さらにオリゴヌクレオチドは、約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチドを含むことができる。さらにオリゴヌクレオチドは、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含むことができる。
【０１６４】
好ましい実施形態では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格の１つまたは複数のチオリン酸エステル修飾体を含む。たとえば、リン酸骨格の１つまたは複数のリン酸の修飾体を有するか、あるいは修飾されたリン酸骨格のすべてを有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び１個、数個、あるいはすべてのヌクレオチドのリン酸骨格の修飾体が、チオリン酸修飾体であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６５】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組み換え体、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、及び一本または二本鎖であってもよい。本発明において使用するために、当分野でよく知られているいくつかの手順のいずれかを使用して、核酸を新たに合成することができる。たとえば、ｂ−シアノエチルフォスフォアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９（１９８１）；ヌクレオシドＨ−リン酸法（Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７（１９８６）；Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８（１９８６）、Ｇａｆｆｎｅｙ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２（１９８８））。これらの化学的方法は、市場で入手可能なさまざまな自動式オリゴヌクレオチド合成装置によって、実施することができる。あるいは、ＣｐＧをプラスミド中において大規模で生成させることができ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）、これは被験者に投与された後にオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、知られている技法、制限酵素、エクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して、既存の核酸配列（たとえば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から作製することができる。
【０１６６】
免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、当分野で知られている任意の方法によってＶＬＰに結合することができ、その組成物は動物の免疫応答を高めるものとする。たとえば、オリゴヌクレオチドは、共有的または非共有的に結合することができる。さらに、ＶＬＰは、完全あるいは部分的に、免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入することができる。免疫賦活性核酸、及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合部位（本来存在するものまたは本来存在しないもの）、ＤＮＡ結合部位、またはＲＮＡ結合部位などのＶＬＰ部位に結合することができることが好ましい。他の実施形態では、ＶＬＰ部位はアルギニンが豊富な反復配列またはリシンが豊富な反復配列を含む。
【０１６７】
本発明の組成物の１つの具体的な使用は、抗原に対する特定の免疫応答を高める目的で、樹状細胞を活性化させることである。樹状細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの技法を使用して、高めることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏの手順を、自己または異種細胞に使用することができるが、自己細胞に使用することが好ましい。好ましい実施形態では、樹状細胞を末梢血液または骨髄から単離するが、これは樹状細胞の任意の源から単離することができる。癌の免疫療法の目的での、樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの操作は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１（１９９７）；Ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｔｅｎ，Ｗ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、Ｊｕｎｅ、２５５（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２４：８４９（１９９６）；及びＧｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１８７（１９９７）を含めた、当分野のいくつかの参照文献に記載されてきている。
【０１６８】
樹状細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を使用して、本発明の組成物と接触させることもできる。これを実施するために、ＣｐＧを、抗原と混合したＶＬＰと組み合わせて、免疫療法を必要とする被験者に直接投与する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ／ＣｐＧを腫瘍の局所領域に投与することが好ましく、当分野で知られている任意の方法、たとえば腫瘍への直接的な注射によって、これを実施することができる。
【０１６９】
本発明の他の非常に好ましい実施形態では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１２２）を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる。後者によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液細胞を刺激することができることは、以前に見出された（Ｋｕｒａｍｏｔｏ  Ｅ．他、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８３、１１２８〜１１３１（１９９２）。
【０１７０】
本発明の他の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフが、パリンドローム配列の一部分である。前記パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であることが好ましい。他の好ましい実施形態では、パリンドローム配列は、その３’末端及びその５’末端で、１０個未満のグアノシン単位と隣接しており、前記パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であることが好ましい。他の好ましい実施形態では、パリンドローム配列は、そのＮ末端で少なくとも３個、最大９個のグアノシン単位と隣接しており、かつ前記パリンドローム配列が、そのＣ末端で少なくとも６個、最大９個のグアノシン単位と隣接している。これらの本発明の免疫賦活物質は、ＶＬＰに非常に効率よくパッケージ化されることが予想外に見出された。そのパッケージ化能力は、５’及び３’末端で１０個のグアノシン単位と隣接している、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）を有する、対応する免疫賦活物質と比較するとここでは高かった。
【０１７１】
本発明の好ましい実施形態では、パリンドローム配列は、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなるか、あるいは配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、前記パリンドローム配列は、その５’末端で少なくとも３個、最大９個のグアノシン単位と隣接しており、かつ前記パリンドローム配列が、その３’末端で少なくとも６個、最大９個のグアノシン単位と隣接している。
【０１７２】
本発明の他の非常に好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフが、パリンドローム配列の一部分であり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、（ａ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０６）、かつ典型的には本明細書ではＧ３−６と略す）、（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０７）、かつ典型的には本明細書ではＧ４−６と略す）、（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０８）、かつ典型的には本明細書ではＧ５−６と略す）、（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０９）、かつ典型的には本明細書ではＧ６−６と略す）、（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１０）、かつ典型的には本明細書ではＧ７−７と略す）、（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１１）、かつ典型的には本明細書ではＧ８−８と略す）、（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１２）、かつ典型的には本明細書ではＧ９−９と略す）、及び（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１３）、かつ典型的には本明細書ではＧ６と略す）から選択される核酸配列を有する。
【０１７３】
本発明の他の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフは、パリンドローム配列の一部分であり、前記パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、前記パリンドローム配列は、その５’末端で少なくとも４個、最大９個のグアノシン単位と隣接しており、かつ前記パリンドローム配列が、その３’末端で少なくとも６個、最大９個のグアノシン単位と隣接している。
【０１７４】
本発明の他の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフが、パリンドローム配列の一部分であり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０７）、かつ典型的には本明細書ではＧ４−６と略す）、（ｂ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０８）、かつ典型的には本明細書ではＧ５−６と略す）、（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０９）、かつ典型的には本明細書ではＧ６−６と略す）、（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１０）、かつ典型的には本明細書ではＧ７−７と略す）、（ｅ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１１）、かつ典型的には本明細書ではＧ８−８と略す）、（ｆ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１２）、かつ典型的には本明細書ではＧ９−９と略す）から選択される核酸配列を有する。
【０１７５】
本発明の他の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフは、パリンドローム配列の一部分であり、前記パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、前記パリンドローム配列は、その５’末端で少なくとも５個、最大８個のグアノシン単位と隣接しており、かつ前記パリンドローム配列が、その３’末端で少なくとも６個、最大８個のグアノシン単位と隣接している。
【０１７６】
実験データによって、好ましい本発明の免疫賦活物質の、パッケージ化の容易さが示される。すなわち、この物質は、グアノシンと隣接している、パリンドロームかつ非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号１０５）であり、パリンドローム配列は、その３’末端及び５’末端で１０個未満のグアノシン単位と隣接しており、パリンドローム配列がより少ないグアノシン単位と隣接している場合、ＶＬＰ中に増大する。しかしながら、パリンドローム配列と隣接する、グアノシン単位の数が減少することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血液細胞刺激の低下がもたらされる。したがって、パッケージ化能力は、示した本発明の免疫賦活物質の、低い生物学的活性によって代償を払う。したがって、好ましい実施形態は、パッケージ化能力と生物学的活性との折り合いである。
【０１７７】
本発明の他の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフが、パリンドローム配列の一部分であり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０８）、かつ典型的には本明細書ではＧ５−６と略す）、（ｂ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１０９）、かつ典型的には本明細書ではＧ６−６と略す）、（ｃ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１０）、かつ典型的には本明細書ではＧ７−７と略す）、（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（（配列番号１１１）、かつ典型的には本明細書ではＧ８−８と略す）から選択される核酸配列を有する。
【０１７８】
本発明の非常に好ましい実施形態では、免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフが、パリンドローム配列の一部分であり、かつ前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、配列番号１１１の核酸配列を有する、すなわち免疫賦活物質はＧ８−８である。
【０１７９】
前述のように、ＶＬＰ中へのパッケージ化のために使用する最適配列は、パッケージ化能力と生物学的活性との折り合いで得られる。このことを考慮すると、Ｇ８−８免疫賦活物質は、他の非常に好ましい本発明の実施形態である。なぜなら、それは、適切にうまくパッケージ化されると共に、生物学的に高い活性があるからである。
【０１８０】
本発明の組成物は、改変型ウィルス様粒子と混合した、抗原または抗原決定基をさらに含む。本発明は、所望の治療効果を考慮して選択した、抗原または抗原決定基に従って変わる組成物を提供する。本発明で使用するのに適した、抗原または抗原決定基は、ＷＯ００／３２２２７中、ＷＯ０１／８５２０８中、及びＷＯ０２／０５６９０５中に開示されており、これらの開示は、参照によってその全容がここに組み込まれている。
【０１８１】
抗原は、既知または未知の起源の任意の抗原であってよい。細菌、ウィルスまたは他の病原菌、腫瘍、または樹木、牧草、雑草、植物、真菌、カビ、粉塵ダニ、食品、または感作患者のアレルギー反応を誘導することが知られている動物から、抗体を単離することができる。あるいは抗原は、それをコードする適切な核酸の発現から得られる、組み換え抗原であってよい。好ましい実施形態では、抗原は組み換え抗原であってよい。当然ながら、抗原の選択は、所望の免疫応答及び宿主に依存する。
【０１８２】
本発明は、広くさまざまな抗原に適用することができる。好ましい実施形態では、抗原はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。
【０１８３】
本発明の抗原は、以下の：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｂ）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｄ）家畜またはペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｅ）ポリペプチドに天然に存在する炭水化物及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）で述べた任意のポリペプチドの断片（たとえば、ドメイン）からなる群から選択することができる。
【０１８４】
好ましい抗原には、病原体（たとえば、ウィルス、細菌、寄生虫、真菌）、腫瘍（特に腫瘍関連抗原、すなわち「腫瘍マーカー」）及びアレルゲン由来の抗原がある。他の好ましい抗原は、それぞれ自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）及び自己抗原（ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【０１８５】
実施例中に記載する特定の実施形態では、抗原は蜂毒液である。群の３％までが蜂毒液に対してアレルギー性であり、蜂毒液に対してマウスを感作して、それらをアレルギー性にすることができる。したがって蜂毒液は、ＣｐＧパッケージ化ＶＬＰなどのさまざまなアジュバントの存在下または不在下において、そのような混合物によって誘導される免疫応答の試験を可能にする、理想的なアレルゲン混合物である（特に実施例４及び実施例９を参照）。
【０１８６】
幾つかの実施例では、ペプチドｐ３３を含むＶＬＰを使用した。ペプチドｐ３３を含むＶＬＰは、利便性の理由でのみ使用し、野生型ＶＬＰを本発明において同様に使用することができることに留意しなければならない。ペプチドｐ３３は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来である。ｐ３３ペプチドは、最もよく研究されているＣＴＬエピトープの１つである（Ｐｉｒｃｈｅｒ他、「Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｖａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５５９（１９８９）；Ｔｉｓｓｏｔ他、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａ  ｐＭＨＣ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ、「ＪＩｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３６：１４７（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｏｕｒ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋−ｓｉｇｎａｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：３４１４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５７６４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＣＲ−ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｇｏｎｉｓｔ／ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｉｃｔｌｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２１９５（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＬＦＡ−１  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：５４９（１９９７）」。ｐ３３特異的Ｔ細胞は、トランスジェニックマウスにおいて致命的糖尿病を誘導し（Ｏｈａｓｈｉ他、「Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ“ｔｏｌｅｒａｎｃｅ"ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｃｅｌｌ  ６５：３０５（１９９１））、かつ、ｐ３３を発現する腫瘍細胞の増殖を妨げることができることが示されてきている（Ｋｕｎｄｉｇ他、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３４３（１９９５）；Ｓｐｅｉｓｅｒ他、「ＣＴＬ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６４５（１９９７））。したがって、この特異的なエピトープは、自己免疫、腫瘍免疫学、及びウィルス性疾患の研究に非常によく適合する。
【０１８７】
本発明の１つの特定の実施形態では、抗原または抗原決定基は、感染症を予防するのに有用なものである。このような治療は、広範囲の宿主、たとえばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種及び非哺乳動物種に影響を与える、広くざまざまな感染症を治療するために有用であろう。感染症は当業者によく知られており、たとえばＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘、パピローマウィルスなどのウィルスが病因の感染；または細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；または寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などがある。したがって、本発明の組成物用に選択される抗原または抗原決定基は、医学分野の当業者によく知られており、抗原または抗原決定基の例には以下のものがある：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０及びｇｐ１６０；インフルエンザ抗原ヘマグルチニン、Ｍ２タンパク質及びノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原、またはマラリアのコア及び周辺胞子のタンパク質、またはその断片。
【０１８８】
前に論じたように、抗原は、天然の供給源に由来するかあるいは合成的な、ウィルス、細菌及び真菌、及びこれらの断片などの、感染性微生物を含む。ヒト及びヒト以外の脊椎動物の感染性ウィルスは、レトロウィルス、ＲＮＡウィルス及びＤＮＡウィルスを含む。レトロウィルスの群は、単純レトロウィルス及び複合レトロウィルスを含む。単純レトロウィルスは、Ｂ型レトロウィルス、Ｃ型レトロウィルス及びＤ型レトロウィルスの亜群を含む。Ｂ型レトロウィルスの一例は、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロウィルスは、Ｃ型群Ａ（ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、鳥類白血病ウィルス（ＡＬＶ）、及び鳥類骨髄芽球病ウィルス（ＡＭＶ）を含む）、及びＣ型群Ｂ（ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネズミ肉腫ウィルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血病ウィルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウィルス（ＲＶ）及びサル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）を含む）の亜群を含む。Ｄ型レトロウィルスは、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウィルス（ＭＰＭＶ）及びサルの１型レトロウィルス（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロウィルスは、レンチウィルス、Ｔ細胞白血病ウィルス、及び泡沫状ウィルスの亜群を含む。レンチウィルスはＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＮ、ビスナウィルス、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＮ）、及びウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）も含む。Ｔ細胞白血病ウィルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウィルス（ＳＴＬＶ）、及びウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）を含む。泡沫状ウィルスは、ヒト泡沫状ウィルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウィルス（ＳＦＶ）、及びウシ泡沫状ウィルス（ＢＦＶ）を含む。
【０１８９】
脊椎動物における抗原であるＲＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：レオウィルス科のメンバー、オルトレオウィルス属（多数の血清型の哺乳動物及び鳥類レトロウィルス）、オルビウィルス属（ブルータングウィルス、ユージェニアウィルス、ケメロボウィルス、アフリカ馬疫ウィルス、及びコロラドダニ熱ウィルス）、ロタウィルス属（ヒトロタウィルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウィルス、ネズミロタウィルス、サルロタウィルス、ウシまたはヒツジロタウィルス、鳥類ロタウィルス）を含む；ピコルナウィルス科、腸内ウィルス属（ポリオウィルス、コクサッキーウィルスＡ及びＢ、ＥＣＨＯ（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｐｈａｎ）ウィルス、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型肝炎ウィルス、サル腸内ウィルス、ネズミ脳脊髄炎（ＭＥ）ウィルス、ポリオウィルスムリス、ウシ腸内ウィルス、ブタ腸内ウィルス、カルジオウィルス属（脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）、メンゴウィルス）、ライノウィルス属（少なくとも１１３の亜型を含むヒトライノウィルス；他のライノウィルス）、アプトウィルス属（口蹄病（ＦＭＤＶ）を含む；カルシウィルス科、ブタ小水泡性発疹ウィルス、サンミゲルアシカウィルス、ネコピコルナウィルス及びノーウォークウィルスを含む；トガウィルス科、アルファウィルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウィルス、セムリキ森林ウィルス、チクングンヤウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバーウィルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、中央ヨーロッパダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病（ｌｏｕｐｉｎｇ  Ｉｌｌ）ウィルス、ポワッサンウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含む；ブンヤウィルス科、ブンヤウィルス属（ブンヤムウェラ及び関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボウィルス属（シシリアサシチョウバエウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビヒツジ病ウィルス）、及びユークウィルス属（ユークニエミ及び関連ウィルス）を含む；オルトミクソウィルス科、インフルエンザウィルス属（インフルエンザウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタインフルエンザウィルス、及び鳥類及びウマインフルエンザウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、及びインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含む；パラミクソウィルス科、パラミクソウィルス属（パラインフルエンザウィルス１型、センダイウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎ウィルス、ジステンパーウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、及びマウスの肺炎ウィル���）森林ウィルス、シンビスウィルス、チクングンヤウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバーウィルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイルウィルス、クンジンウィルス、中央ヨーロッパダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病ウィルス、ポワッサンウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含む；ブンヤウィルス科、ブンヤウィルス属（ブンヤムウェラ及び関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボウィルス属（シシリアサシチョウバエウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビヒツジ病ウィルス）、及びユークウィルス属（ユークニエミ及び関連ウィルス）を含む；オルトミクソウィルス科、インフルエンザウィルス属（インフルエンザウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタインフルエンザウィルス、及び鳥類及びウマインフルエンザウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、及びインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含む；パラミクソウィルス科、パラミクソウィルス属（パラインフルエンザウィルス１型、センダイウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎ウィルス、ジステンパーウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、及びマウスの肺炎ウィルス）を含む；ラブドウィルス科、ベシクロウィルス属（ＶＳＶ）、キャンディピュラウィルス、フランダース−ハートパークウィルス）、リッサウィルス属（狂犬病ウィルス）、魚類ラブドウィルス及びフィロウィルス（マールブルグウィルス及びエボラウィルス）を含む；アレナウィルス科、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭ）、タカリベウィルス複合体、及びラッサウィルスを含む；コロナウィルス科、伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウィルス、ヒト腸内コロナウィルス、及びネコ伝染性腹膜炎（ネココロナウィルス）を含む。
【０１９０】
脊椎動物における抗原である例示的なＤＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：ポックスウィルス科、オルトポックスウィルス属（大痘そう、小痘そう、サル痘ポックスワクシニア、牛痘、野牛痘、ウサギ痘、エクトロメリア）、レポリポックスウィルス属（ミキソーマ、繊維腫）、アビポックスウィルス属（鶏痘、他の鳥類ポックスウィルス）、カプリポックスウィルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウィルス属（豚痘）、パラポックスウィルス属（接触伝染性推定皮膚炎ウィルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウィルス）を含む；イリドウィルス科（アフリカ豚コレラウィルス、カエルウィルス２及び３、魚類のリンホシスチスウィルス）；ヘルペスウィルス科、アルファ−ヘルペスウィルス（単純ヘルペス１及び２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウィルス、ウマヘルペスウィルス２及び３、仮性狂犬病ウィルス、伝染性ウシ角結膜炎ウィルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウィルス、ネコ鼻気管炎ウィルス、伝染性咽頭気管炎ウィルス）、ベータ−ヘルペスウィルス（ヒトサイトメガロウィルス、及びブタ、サル及びげっ歯類のサイトメガロウィルス）；ガンマ−ヘルペスウィルス（エスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）、マレック病ウィルス、リスザルヘルペスウィルス、クモザルヘルペスウィルス、ワタオウサギヘルペスウィルス、モルモットヘルペスウィルス、リュッケ腫瘍ウィルス）を含む；アデノウィルス科、マストアデノウィルス属（ヒト亜群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、及び非分類種；サルアデノウィルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、及びウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、及び多くの他の種のアデノウィルス、アビアデノウィルス属（鳥類アデノウィルス）；及び非培養性アデノウィルスを含む；パポウィルス科、パピローマウィルス属（ヒトパピローマウィルス、ウシパピローマウィルス、ショープラビットパピローマウィルス、及び他の種のさまざまな病原性パピローマウィルス）、ポリオーマウィルス属（ポリオーマウィルス、ＳＶ−４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ＲＫＶ（Ｒａｂｂｉｔ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、Ｋウィルス、ＢＫウィルス、ＪＣウィルス、及び他の霊長類のポリオーマウィルス、リンパ親和性パピローマウィルスなど）を含む；パルボウィルス科、アデノ関連ウィルス属、パルボウィルス属（ネコ汎白血球減少症ウィルス、ウシパルボウィルス、イヌパルボウィルス、アリューシャンミンク病ウィルスなど）を含む。最後に、ＤＮＡウィルスは、前述の科と一致しないウィルス、クル及びクロイツフェルト−ヤコブ病ウィルス、及び慢性的な伝染性神経障害物質（ＣＨＩＮＡウィルス）などを含むことができる。
【０１９１】
それぞれの前述の列挙は例示的なものであり、制限を目的とするものではない。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態では、抗原は１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、または細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープの組合せを含む。
【０１９３】
ヒトの抗原特異的な免疫応答を高めることに加えて、好ましい実施形態の方法は、他の哺乳動物または動物、たとえば、鳥類、メンドリ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジなどを治療するのに非常によく適している。鳥類は、多くの型の感染の主な標的である。
【０１９４】
ニワトリにおける一般的な感染の一例は、ニワトリ伝染性貧血ウィルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶは、マレック病ワクチン接種の中断の調査中に、１９７９年に日本で最初に単離された（Ｙｕａｓａ他、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２３：３６６〜３８５（１９７９））。そのとき以来ＣＩＡＶは、あらゆる主要な家禽類製造国で、商業用の家禽類において検出されてきている（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ他、ｐｐ．６９０〜６９９「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ」中、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。
【０１９５】
鳥類のワクチン接種は、他の脊椎動物と同様に、任意の年齢で行うことができる。通常ワクチン接種は、生きている微生物に関しては１２週齢までで、不活性微生物または他の型のワクチンに関しては１４〜１８週の間で行う。卵内ワクチン接種に関しては、ワクチン接種は、胚分化の最後の４分の１で行うことができる。ワクチンは、皮下に、スプレーによって、経口的に、眼内に、気管内に、鼻に、卵内に、あるいは本明細書に記載した他の方法によって、投与することができる。
【０１９６】
畜牛及び家畜も、感染を受けやすい。これらの動物に影響を与える疾患によって、重大な経済的損失が、特に畜牛において生じる可能性がある。本発明の方法を使用して、家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギなどの感染に対して保護することができる。
【０１９７】
ウシは、ウシウィルスによって感染される可能性がある。ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）は、小さな被包されたプラス鎖ＲＮＡウィルスであり、豚コレラウィルス（ＨＯＣＶ）及びヒツジボルダ−病ウィルス（ＢＤＶ）と共にペストウィルス属に分類される。ペストウィルスは以前はトガウィルス科に分類されていたが、いくつかの研究によって、フラビウィルス及びＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）属と共にフラビウィルス科へのそれらの再分類が示唆されてきている。
【０１９８】
ウマヘルペスウィルス（ＥＨＶ）は、無症状から致死的疾患まで、ウマ中でさまざまな感染を引き起こす、抗原性が異なる生物学的物質の群を含む。これらは、ウマの偏在的な病原体である、ウマヘルペスウィルス−１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、呼吸管疾患、及び中枢神経系障害の多発と関連がある。他のＥＨＶには、ＥＨＶ−２、またはウマサイトメガロウィルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウィルス、及び以前はＥＨＶ−１の亜型２として分類されたＥＨＶ−４がある。
【０１９９】
ヒツジ及びヤギは、ビスナ−マエディを含めた、さまざまな危険な微生物によって感染される可能性がある。
【０２００】
サル、類人猿及びマカークなどの霊長類は、サル免疫不全ウィルスによって感染される可能性がある。細胞−ウィルス及び無細胞の全サル免疫不全不活化ワクチンは、マカークを保護することが報告されてきている（Ｓｔｏｔｔ他、Ｌａｎｃｅｔ  ３６：１５３８〜１５４１（１９９０）；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６３５３〜６３５７（１９８９）；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２９３〜１２９７（１９８９）；及びＣａｒｌｓｏｎ他ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：１２３９〜１２４６（１９９０））。組み換えＨＩＶ  ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーを保護することが報告されてきている（Ｂｅｒｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：６２２〜６２５（１９９０））。
【０２０１】
飼育用及び野生型のネコは、さまざまな微生物の感染を受けやすい。たとえば、ネコ伝染性腹膜炎は、飼育用及び野生型のネコ科動物、ライオン、ヒョウ、チーター、及びジャガーなどにおいて発生する疾患である。ネコ科動物においてこの型及び他の型の病原性微生物による、感染を予防することが望ましいときは、本発明の方法を使用してネコ科動物をワクチン接種して、それらを感染に対して予防することができる。
【０２０２】
飼育用ネコ科動物は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳＶ）、内因性Ｃ型腫瘍ウィルス（ＲＤ−１１４）、及びネコ融合細胞形成ウィルス（ＦｅＳＦＶ）だけには限られないが、これらを含めた、いくつかのレトロウィルスによって感染状態になる可能性がある。ネコＴリンパ親和性レンチウィルス（ネコ免疫不全ウィルスとも呼ばれる）の知見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：７９０〜７９３（１９８７）中で最初に報告された。ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、飼育用及び野生型ネコ科動物において、予測外に生じる散在性疾患である。ＦＩＰは主に飼育用ネコ科動物の疾患であるが、それがライオン、クーガー、ヒョウ、チーター、及びジャガーにおいて診断されてきている。ＦＩＰに苦しめられているより小さな野生型のネコ科動物には、オオヤマネコ及びカラカル、サバクネコ及びマヌルネコがある。
【０２０３】
魚類、甲殻類、または他の水生生命体のウィルス性及び細菌性疾患は、水産養殖産業の重大な問題となる。孵化用タンクまたは閉じられた海洋養殖領域中の動物の密度が高いために、感染症が、たとえば魚類、甲殻類、または他の水生生命体の設備中の、多量の在庫を根絶する可能性がある。疾患の予防は、ひとたび疾患が進行した後の介入よりも、魚類へのこれらの脅威に対する望ましい救済策である。魚類をワクチン接種することが唯一の予防法であり、これによって免疫性による長期の保護を与えることができる。核酸系の魚類のワクチン接種は、たとえば米国特許第５，７８０，４４８号中に記載されている。
【０２０４】
魚類の免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球、補体、及び免疫グロブリンの存在などの、哺乳動物の免疫系と類似した多くの特徴を有する。魚類は、哺乳動物のＢ及びＴ細胞のそれと多くの点で類似していると思われる役割がある、リンパ球亜群を有する。ワクチンは経口的に、あるいは液浸または注射によって、投与することができる。
【０２０５】
水生種には、魚類、甲殻類、または他の水生動物があるが、これらだけには限られない。魚類はあらゆる脊椎動物魚類を含み、これらは硬骨魚または軟骨魚、たとえばサケ、コイ、ナマズ、イエローテイル、タイ及びハタ科の魚などであってよい。サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケ及びアルプスイワナを含む、魚類の科である。甲殻類の例には、クラム、ロブスター、小エビ、カニ及びカキがあるが、これらだけには限られない。他の養殖水生動物には、ウナギ、イカ及びタコがあるが、これらだけには限られない。
【０２０６】
ウィルス性の水産養殖病原体のポリペプチドには、ウィルス出血性敗血症ウィルス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質または核タンパク質；伝染性造血壊死ウィルス（ＩＨＮＶ）のＧまたはＮタンパク質；伝染性膵臓壊死ウィルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３またはＮ構造タンパク質；コイスプリングウィルス血症（ＳＶＣ）のＧタンパク質；及びアメリカナマズウィルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被またはキャプシドタンパク質または糖タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２０７】
細菌性病原体のポリペプチドには、フランケル症を引き起こすＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、及びＡ−タンパク質、細菌性腎臓病（ＢＫＤ）を引き起こすＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面結合抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、及びべん毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、及び構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ及びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰ及びべん毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉ及びＥ．ｔａｒｄａのべん毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、アロＡ、及びプルＡ；及びＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原；及びＣｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造及び調節タンパク質；及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造及び調節タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２０８】
寄生虫病原体のポリペプチドには、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原があるが、これだけには限られない。
【０２０９】
本発明の他の態様では、「自己」遺伝子産物（たとえば、腫瘍壊死因子）によって引き起こされるか悪化させられる疾患または状態を、予防するかつ／あるいは低下させるための方法で使用するのに適した、ワクチン組成物を提供する。したがって、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされるか悪化させられる疾患または状態を、予防するかつ／あるいは低下させる抗体の生成をもたらす、組成物を含む。このような疾患または状態の例には、移植片と宿主の疾患、ＩｇＥ仲介型アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸障害症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節症（ＩＰＬ）、血管性免疫増殖性リンパ節症（ＡＩＬ）、免疫芽細胞リンパ節症（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病及び骨粗しょう症がある。
【０２１０】
関連する特定の実施形態では、本発明の組成物は、アレルギー、癌または薬物中毒を治療及び／または予防するために使用することができる、免疫療法剤である。
【０２１１】
組成物を調製するため、及びアレルギーを治療する方法において使用するための、抗原または抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原または抗原決定基の代表例には、以下のもの：蜂毒液ホスホリパーゼＡ２、Ａｍｂａ１（ブタクサ花粉アレルゲン）、ＢｅｔｖＩ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ＤｏｌｍＶ（米国産クロスズメバチ属の毒液のアレルゲン）、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２及びＤｅｒ２（イエダニアレルゲン）、Ｌｅｐｄ２（粉塵ダニアレルゲン）；Ａｌｔａ１、Ａｓｐｆ１、及びＡｓｐｆ１６（真菌アレルゲン）；Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２、及びＡｒａｈ３（ピーナッツアレルゲン）、ならびにこれらそれぞれの断片があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。さらに本発明は、花粉抽出物または蜂毒液などの、生物または生物の一部分から単離されたアレルゲン混合物を、使用するのに非常に有用である。好ましい実施形態では、花粉抽出物は、樹木、牧草、雑草、及び園芸植物を含むか、あるいはこれらからなる。樹木花粉抽出物の例には、以下のもの：アカシア、ハンノキ（グレー）、アーモンド、リンゴ、アプリコット、ヒノキ科クロベ属、トリネコ、ポプラ、ベーラムノキ、ブナ、カバノキ（春）、カバノキ（白）、ボトルブラッシュ、トネリコバカエデ、イナゴマメの木、日本スギだけには限らないがこれを含めたスギ、サクラ、クリ類、ハコヤナギ、イトスギ、ニワトコ、ニレ（アメリカ産）、ユーカリノキ、モミ、ハックベリー、ヘーゼルナッツ、ヘムロック、ヒッコリー、アメリカアサダ、鉄樹、ビャクシン、イナゴマメ、カエデ、メラルーカ、メスキート、バイカウツギ、クワ、オーク（白）、オリーブ、オレンジ、オセージオレンジ、パロベルデ、モモ、セイヨウナシ、ペカン、コショウの木、マツ、プラム、ポプラ、セイヨウボタ、セイコア、ホソグミ、トウヒ、モミジバフウ、スズカケノキ、アメリカカラマツ、ニワウルシ、クルミノキ及びヤナギがあるが、これらだけには限られない。牧草花粉抽出物の例には、以下のもの：バヒア、オオムギ、ビーチ、ベント、バミューダグラス、ブルーグラス（ケンタッキー産）、スズメノチャヒキ、ゴゼンタチバナ、コショウソウ、カラスノチャヒキ、コーン、フェスク（牧草）、グラーマ、ジョンソン、ナガハグサ、ケーラー、オーツ麦、カモガヤ、シバムギ、コヌカグサ、レイグラス（多年生）、塩性草、モロコシ、スーダン、ハルガヤ、オオアワガエリ、シラケガヤ、コムギ及びシバムギがあるが、これらだけには限られない。雑草及び園芸植物の抽出物の例には、以下のもの：アルファルファ、アマランス、アスター、バルサムルート、バッシア、ビーチバー、ブルームウッド、ブローブッシュ、自然の雑草、トウゴマ、チャミーズ、クローバー、オナモミ、ハルシャギク、コスモス、ラッパズイセン、ダリア、ヒナギク、セイヨウタンポポ、ギシギシ、カミツレモドキ、ヤナギラン、グラジオラス、アキノキリンソウ、グリースウッド、アサ、スイカズラ、ホップス、ヨードブッシュ、エルサレムアカザ、ホウキギ、アカザ、ユリ、マリーゴールド、テマリカンボク、アリタソウ、ヨモギ、カラシナ、イラクサ、ピックルウィード、アオゲイトウ、プレインテイン（英国産）、ポピー、不毛雑草、クエイルブッシュ、ブタクサ（大）、ブタクサ（小）、ブタクサ（西洋産）、バラ、ロシアンチスチル、ヤマヨモギ、ハマアカザ、芽鱗、エニシダ、マツナ、ヒメスイバ、キンギョソウ、てんさい、ヒマワリ、セイヨウトクゼリ、冬期脂肪、駆虫草、ニガヨモギがあるが、これらだけには限られない。
【０２１２】
好ましい実施形態では、花粉抽出物は、ライムギを含むか、あるいはこれからなる。ブタクサ花粉の季節的出現（９月〜１０月）によって、多くの個体で喘息が誘導される（Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｊ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：１９１〜１９７（２００１））。喘息は、肺炎症、可逆的気流障害、及び気道の過敏症によって特徴付けられる。空気アレルゲンに対する免疫応答の複雑なカスケードによって、気道中の白血球の増大がもたらされる。具体的には、リンパ球、マクロファージ、好酸球、好中球、形質細胞、及びマスト細胞が、気管支粘膜に浸潤する（Ｒｅｄｍａｎ、Ｔ．他、Ｅｘｐ．Ｌｕｎｇ  Ｒｅｓ．２７：４３３〜４５１（２００１））。好酸球の増大は、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５、慢性的炎症プロセスをサポートする喘息病状の主要な因子の多量の生成と関係がある（Ｊｕｓｔｉｃｅ、Ｊ．他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｌ３０２〜Ｌ３０９（２００２）、参照によって開示のその全容がここに組み込まれている）。短いブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）中の、免疫優性のブタクサアレルゲンは、Ａｍｂａ１である（Ｓａｎｔｅｌｉｚ、Ｊ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：４５５〜４６２（２００２））。本発明の特定の実施形態では、組成物は、ウィルス様粒子と混合されたＡｍｂａ１を含む（実施例６参照）。
【０２１３】
さらに他の好ましい実施形態では、粉塵抽出物は、室内塵及び粉塵ダニを含むか、あるいはこれらからなる。室内塵の例には、室内塵、マットレスの塵、及び室内装飾品の塵があるが、これらだけには限られない。粉塵ダニの例には、Ｄ．ｆａｒｎｉａｅ、Ｄ．ｐｔｒｅｒｏｎｙｓｉｉｎｕｓ、ダニ混合物、及びＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒがあるが、これらだけには限られない。粉塵抽出物には、シーダー材及びレッドシーダー材の塵、綿繰り機の塵、オーク材の塵、穀物（倉庫）の塵、パドック材の塵及び木材の塵もあるが、これらだけには限られない。
【０２１４】
粉塵ダニは、先進国の湿気のある気候での家庭における、永続的な室内アレルゲンの重要な源である（Ａｒｌｉａｎ、Ｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １：５８１〜５８６（２００１））。アレルギー性の気管支喘息を有する、すべての患者の約６０〜８５％が、イエダニＤｅｒｍａｔｏｐｈｏｇｏｌｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓに対して敏感である（Ａｒｌｉａｎ、Ｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １：５８１〜５８６（２００１））。免疫優性のＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ粉塵ダニアレルゲンには、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、及びＤｅｒ２がある（Ｋｉｒｃｈｅｒ、Ｍ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：５１７〜５２３（２００２）、及びＣｌａｒｋｅ、Ａ．他、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１２６〜１３４（１９９９）、これらの全容は参照によってここに組み込まれている）。本発明の特定の実施形態では、組成物は、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒ２、またはこれらの断片、あるいはウィルス様粒子と混合されたこれらの抗原混合物を含む。特に農業地域における、粉塵に対するアレルギー反応の重要な原因は、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒである（Ｅｒｉｃｋｓｓｏｎ、Ｔ．他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３１：１１８１〜１８９０（２００１））。免疫優性のＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ粉塵ダニアレルゲンは、Ｌｅｐｄ２である（Ｅｒｉｃｋｓｓｏｎ、Ｔ．他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３１：１１８１〜１８９０（２００１））。本発明の特定の実施形態では、組成物は、ウィルス様粒子と混合されたＬｅｐｄ２を含む。（実施例８参照。）
【０２１５】
好ましい実施形態では、真菌抽出物は、アルテルナリア、アスペルギルス、ボチリス、カンジダ、セファロスポリウム、セファロセシウム、カエトミウム、クラドスポリウム、クリトコッカス、クルブラリア、エピコッカム、エピデルモフィトン、フザリウム、ゲラシノスポラ、ゲオトリカム、グリオクラジウム、ヘルミントスポリウム、ホルモデンドラム、ミクロスポリウム、ケカビ、キノコ菌、黒胞子、パエシロミセス、ペニシリウム、ホーマ、パルラリア、クモノスカビ、ロードトルラ、サビ菌、サッカロミセス、黒穂菌、スポンジロクラジウム、ステンフィリウム、トリコデルマ、トリコフィトン及びバーティシリウムを含むか、あるいはこれらから本質的になる。
【０２１６】
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａは、米国において、アレルギー疾患を引き起こす最も重要な真菌の１つであると考えられている。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａは、米国及びオーストラリアの砂漠領域における、主要な喘息関連のアレルゲンであり、米国のミッドウエストシティーにおいて、重大な呼吸停止及び死を引き起こすことが報告されてきている（Ｖａｉｌｅｓ、Ｌ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：６４１（２００１）、及びＳｈａｍｐａｉｎ、Ｍ．他、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２６：４９３〜４９８（１９８２）、これらの全容は参照によってここに組み込まれている）。免疫優性のＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ抗原は、Ａｌｔａ１である（Ｖａｉｌｅｓ、Ｌ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：６４１（２００１））。８０％を超えるＡｌｔｅｒｎａｒｉａ感作個体が、Ａｌｔａ１に対するＩｇＥ抗体を有している（Ｖａｉｌｅｓ、Ｌ．他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３１：１８９１〜１８９５（２００１））。本発明の特定の実施形態では、組成物は、ウィルス様粒子と混合されたＡｌｔａ１を含む。（実施例７参照。）
【０２１７】
他の日和見真菌は、アレルギー性喘息を含めた広範囲の肺疾患と関係がある、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。免疫優性のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原には、Ａｓｐｆ１及びＡｓｐｆ１６がある（Ｖａｉｌｅｓ、Ｌ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：６４１（２００１））。本発明の特定の実施形態では、組成物は、ウィルス様粒子と混合されたＡｓｐｆ１またはＡｓｐｆ１６、あるいはその抗原混合物を含む。（実施例７参照。）
【０２１８】
さらに他の好ましい実施形態では、昆虫抽出物は、その身体全体がアレルギー反応を誘導する有刺昆虫、その毒液タンパク質がアレルギー反応を誘導する有刺昆虫、及び吸入アレルギー反応を誘導する昆虫を含むか、あるいはこれらからなる。その身体全体がアレルギー反応を誘導する有刺昆虫の例には、アリ（黒）、アリ（赤）、アリ（オオアリ）、混合アリ（黒／赤）、アリ（フシアリ）があるが、これらだけには限られない。その毒液タンパク質がアレルギー反応を誘導する有刺昆虫の例には、ミツバチ、キイロスズメバチ、ジガバチ、イエロージャケット、米国産クロスズメバチ属及び混合スズメバチがあるが、これらだけには限られない。吸入アレルギー反応を誘導する昆虫の例には、アリマキ、ブユ、チョウ、トビケラ、セミ／イナゴ、コオロギ、ゴキブリ、ミジンコ、メクラアブ、ミバエ、ミツバチ（身体全体）、ウマバエ、イエバエ、ヨコバイ、カゲロウ、メキシコマメゾウムシ、ダニ（粉塵）、蚊、蛾、キノコバエ、ラセンウジバエ、ワラジバエ、クモ及びミジンコがあるが、これらだけには限られない。（実施例４参照。）
【０２１９】
さらに他の好ましい実施形態では、食品抽出物は、動物産物及び植物産物を含むか、あるいはこれらからなる。動物産物の例には、牛肉、ニワトリ、シカ、アヒル、卵（ニワトリ）、魚類、ヤギ、ガチョウ、ラム、乳（ウシ）、乳（ヤギ）、豚肉、ウサギ、甲殻類及び七面鳥があるが、これらだけには限られない。植物産物の例には、リンゴ、アンズ、クズウコン、キクイモ、アスパラガス、アボカド、バナナ、マメ、ビーツ、ベリー、キャベツ類、ニンジン、セロリ、チェリー、チョコレート、柑橘系果実、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、ナツメヤシ、ナス、穀物、ブドウ、青菜、ゴム、ホップス、レタス、麦芽、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ナッツ、オクラ、オリーブ、オニオン、パパイヤ、パースニップ、エンドウ、ピーナッツ、ナシ、ピーマン、パイナップル、プラム、ジャガイモ、プルーン、パンプキン、ラディッシュ、ルバーブ、スパイス／香辛料、ホウレンソウ、スカッシュ、タピオカ、紅茶、トマト、ウォーターメロン及び酵母菌があるが、これらだけには限られない。
【０２２０】
ピーナッツ及び木の実に対するアレルギーは、致死的及びほぼ致死的なアナフィラキシー反応の大部分を占める（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。アメリカ人の約１．１パーセント、すなわち３００万人の人々が、ピーナッツ、木の実、あるいはこの両方に対してアレルギーである（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。約６パーセントのアメリカ人には、ピーナッツに対する感度の血清学的証拠（すなわち、ピーナッツタンパク質に特異的なＩｇＥ抗体の存在）があるが、これらの人々の大部分は、ピーナッツを食べるときは、アレルギー反応はないであろう（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２）、及びＨｅｌｍ、Ｒ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１３６〜１４２（２００２））。ピーナッツアレルギーは通常、しばしば授乳中の子宮内でのピーナッツタンパク質への暴露の後の初期、あるいは少年期の初期に進行し、生涯にわたる障害であることが多い（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２）；Ｌｉ、Ｘ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：６３９〜６４６（２００１）；及びＨｅｌｍ、Ｒ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１３６〜１４２（２００２））。ピーナッツアレルギーがある幼児は、彼らが年をとると、さらに重度のアレルギー反応を有する傾向がある（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。妊婦及び授乳中の女性用の栄養源として、ピーナッツ製品を増大させることは、西欧諸国のピーナッツアレルギーの高い蔓延に、貢献していることが示唆されてきている（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。
【０２２１】
ピーナッツアレルギー症状は、食物摂取後の数分〜数時間以内に進行する可能性があり、生命を脅かす場合、症状は重度の気管支痙攣を含む。現在、ピーナッツアレルギーの治療は、患者及びその家族にピーナッツの偶発的摂取の回避の仕方、アレルギー反応の初期症状の認識の仕方、及びアナフィラキシー反応の初期段階の対処の仕方を教えることからなっている（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。偶発的暴露によって、ピーナッツアレルギーがある平均的な患者で、３〜５年毎にアレルギー反応がもたらされる（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。これらの偶発的暴露は、さまざまな製品の製造で使用する装置、不充分な食品ラベル、レストランでの調理中の食品の交差汚染、及び予期せぬ暴露（例えば、飛行機内でのピーナッツ粉塵の吸入）の、ピーナッツ汚染の結果として起こる可能性がある（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。ピーナッツに対する急性反応の現在の治療には、筋肉内エピネフリン、経口、筋肉内、あるいは静脈内ヒスタミンＨ１及びＨ２受容体アンタゴニスト、酸素、吸入用アルブテロール、及び全身性コルチコステロイドを用いたチャレンジ的治療がある（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。さらに、ピーナッツに対する急性反応の後の、３日間行程の経口プレドニソン及び抗ヒスタミンが、しばしば勧められる。ピーナッツアレルギーの重度、蔓延、及びしばしば生涯にわたる持続性を考慮すると、ピーナッツアレルギーの予防または治療療法に関する必要性が存在する（Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｈ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（１７）：１２９４〜１２９９（２００２））。
【０２２２】
ピーナッツアレルギーがある９５％を超える患者によって認識される、２つの主なアレルギー性のピーナッツタンパク質は、Ａｒａｈ１及びＡｒａｈ２である（Ｂａｎｎｏｎ、Ｇ．他、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：７０〜７２（２００１）及びＬｉ、Ｘ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：１５０〜１５８（２０００）、これらの全容は参照によってここに組み込まれている）。Ａｒａｈ３は、ピーナッツアレルギーがある患者の約４５％によって認識される（Ｌｉ、Ｘ．他、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：１５０〜１５８（２０００））。本発明の特定の実施形態では、組成物は、抗原Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２、またはＡｒａｈ３、あるいはウィルス様粒子と混合されたこれらの抗原混合物を含む。（実施例５参照。）
【０２２３】
他の好ましい実施形態では、哺乳動物表皮アレルゲンには、ラクダ、ネコ体毛、ネコ生皮、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、アレチネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、飼育ブタ、ウマ、モヘア、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）があるが、これらだけには限られない。さらに他の好ましい実施形態では、羽毛には、カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、パラキート、ハト、七面鳥のものがあるが、これらだけには限られない。他の好ましい実施形態において、他の吸入抗原には、アカシア、藻類、トウゴマ、綿くず、綿種子、デリス根、シダ胞子、穀物粉塵、麻繊維、ヘンナ、亜麻子、ガーゴム、ジュート、カラヤゴム、カポック、なめし革、ヒカゲノカズラ、ニオイショウブ根茎、ジョチュウギク、シルク（原料）、サイザル、タバコの葉、トラガカント及び木材粉塵があるが、これらだけには限られない。
【０２２４】
他の好ましい実施形態では、天然の供給源から精製したか、あるいは組み換えによって発現された、典型的に定義される哺乳動物のアレルゲンが含まれる。これらには、ネコ由来のＦｅｌｄ１、Ｆｅｌｄ３（シスタチン）、ネコ、ラクダ、チンチラ、ウシ、シカ、イヌ、アレチネズミ、ヤギ、モルモット、ハムスター、飼育ブタ、ウマ、モヘア、サル、マウス、ウサギ、ウール（ヒツジ）由来のアルブミンがあるが、これらだけには限られない。
【０２２５】
癌を治療する組成物及び方法に関する、抗原または抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われ（参照により組み込まれている、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ他、Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３〜１５（２００１）を参照のこと）、このような抗原または抗原決定基は本発明の範囲内に含まれる。このような型の抗原または抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経こう腫）；ＣＥＡ（延髄甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００；ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００エピトープ、アミノ酸１５４〜１６２（配列：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ、配列番号７２）、２０９〜２１７（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ、配列番号７３）、２８０〜２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ、配列番号７４）、４５７〜４６６（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ、配列番号７５）及び４７６〜４８５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ、配列番号７６）など；ヒトメラノーマタンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒトメラノーマタンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ、アミノ酸２６〜３５（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号９８）、２６〜３５ＡＬ（ＥＬＡＧＩＧＩＣＴＶ、配列番号９９）、２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号７７）及び３２〜４０（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ、配列番号７８）など；チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質（たとえば、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２）；チロシナーゼエピトープ、アミノ酸１〜９（ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ、配列番号７９）及び３６８〜３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、配列番号８０）など；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質エピトープ、アミノ酸３８−６４（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ、配列番号８１）など；ＭＡＧＥ−３タンパク質；ＭＡＧＥ−３タンパク質エピトープ、アミノ酸２７１〜２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、配列番号８２）など；他のヒト腫瘍抗原、たとえばＣＥＡエピトープ、アミノ酸５７１〜５７９（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ、配列番号８３）など；ｐ５３タンパク質；ｐ５３タンパク質エピトープ、アミノ酸６５〜７３（ＲＭＰＥＡＡＰＰＶ、配列番号８４）、１４９〜１５７（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ、配列番号８５）及び２６４〜２７２（ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ、配列番号８６）など；Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープ、アミノ酸３６９〜３７７（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ、配列番号８７）及び６５４〜６６２（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ、配列番号８８）など；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質エピトープ、アミノ酸８６〜９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ、配列番号８９）など；及びそれぞれの断片または変異体があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２２６】
自己抗原と関連がある他の疾患または状態を治療する組成物及び方法に関する、抗原または抗原決定基の選択も、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原または抗原決定基の代表的な例は、たとえばリンフォトキシン（たとえば、リンフォトキシンα（ＬＴα）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ）、及びリンフォトキシン受容体、核因子ｋａｐｐａＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ）、破骨細胞関連受容体（ＯＳＣＡＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン１７及びアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｒａｎｋ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、エンドグリン、エオタキシン、グレーリン、ＢＬＣ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ブラジキニン、レジスチン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、ＧＩＨ、ＣＲＨ、ＴＲＨ及びガストリン、及びそれぞれの断片であり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２２７】
本発明の特定の実施形態では、抗原または抗原決定基は（ａ）ＨＩＶの組み換えポリペプチド；（ｂ）インフルエンザウィルスの組み換えポリペプチド（たとえば、インフルエンザウィルスＭ２ポリペプチドまたはその断片）；（ｃ）Ｃ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｄ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｅ）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａの組み換えポリペプチド；（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組み換えポリペプチド；（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘの組み換えポリペプチド；（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅの組み換えポリペプチド；（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅの組み換えポリペプチド；（ｊ）乳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｋ）腎臓癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｌ）前立腺癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｍ）皮膚癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｎ）脳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｏ）白血病細胞の組み換えポリペプチド；（ｐ）組み換えプロファイル；（ｑ）ハチ刺されアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｒ）ナッツアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｓ）花粉の組み換えポリペプチド；（ｔ）室内埃の組み換えポリペプチド；（ｕ）ネコまたはネコの毛アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｖ）食物アレルギーの組み換えタンパク質；（ｗ）喘息の組み換えタンパク質；（ｘ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの組み換えタンパク質；（ｙ）（ａ）〜（ｘ）に述べた任意のタンパク質源から抽出した抗原；（ｚ）（ａ）〜（ｘ）に述べた任意のタンパク質の断片からなる群から選択される。
【０２２８】
本発明の他の実施形態では、本発明の免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとパッケージ化された、ウィルス様粒子と混合した抗原は、Ｔ細胞エピトープ、細胞傷害性またはＴｈ細胞エピトープである。本発明の他の実施形態では、本発明の免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとパッケージ化された、ウィルス様粒子と混合した抗原は、Ｂ細胞エピトープである。他の好ましい実施形態では、抗原は少なくとも２つの、好ましくは異なるエピトープの組合せであり、かつ少なくとも２つのエピトープは直接結合しているか、あるいは連結配列によって結合している。これらのエピトープは、細胞傷害性及びＴｈ細胞エピトープからなる群から選択されることが好ましい。
【０２２９】
本発明の抗原、及び特に示した１個または複数個のエピトープは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、合成、あるいは組み換えによって発現、ウィルス様粒子と結合、あるいはウィルス様粒子と融合することができる。抗原とウィルス様粒子の結合を記載する代表的な手順は、ＷＯ００／３２２２７中、ＷＯ０１／８５２０８中、及びＷＯ０２／０５６９０５中に開示されており、それらの開示は、参照によりここに組み込まれている。
【０２３０】
本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法であって、前記組成物がＶＬＰ、及びＶＬＰと結合した非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、前記方法がオリゴヌクレオチドと共にＶＬＰをインキュベートすること、ＲＮａｓｅを加えること、及び前記組成物を精製することを含む方法も提供する。同等に好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＶＬＰをＲＮａｓｅと共にインキュベートすること、オリゴヌクレオチドを加えること、及び組成物を精製することを含む。一実施形態では、ＶＬＰは細菌発現系で生成される。他の実施形態では、ＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ  Ａである。
【０２３１】
本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法であって、前記組成物が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと結合したＶＬＰを含み、前記方法がＶＬＰを分解すること、オリゴヌクレオチドを加えること、及びＶＬＰを再構築することを含む方法をさらに提供する。この方法は、少なくとも部分的に分解されたＶＬＰの核酸を除去すること、及び／または再構築後に組成物を精製することをさらに含むことができる。
【０２３２】
本発明は、疾患または状態を予防する、かつ／あるいは低下させるために使用することができる、ワクチン組成物も提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的に有効量の本発明の免疫増強組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含むか、あるいはこれらからなる。ワクチンは、アジュバントも場合によっては含むことができる。
【０２３３】
本発明は、動物の疾患または状態を予防する、かつ／あるいは低下させるための、ワクチン接種法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、広範囲の動物種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、感染症を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、ウィルスが病因の感染、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、ＥＢ（エプスタインバー）、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘など；または細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；または寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などを治療することができる。
【０２３４】
他の実施形態では、本発明は、広範囲の種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、リンパ腫、癌腫、肉腫、及びメラノーマだけには限られないが、これらを含めたあらゆる型の癌を治療することができる。
【０２３５】
当業者は理解されていると思われるが、本発明の組成物を動物に投与するとき、それらは、組成物の有効性を向上させるのに望ましい、塩、バッファー、アジュバントまたは他の物質を含む、組成物の形であってよい。薬剤組成物の調製において使用するのに適した物質の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、（１９９０））を含めた多数の源中に与えられる。
【０２３６】
さまざまなアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を高めることができ、アジュバントにはフロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル、表面活性化物質、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなど、及び潜在的に有用なヒト用アジュバント、ＢＣＧ（カルメット−ギランかん菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどがあるが、これらだけには限られない。このようなアジュバントも、当分野ではよく知られている。本発明の組成物と共に投与することができる他のアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、及びＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術品があるが、これらだけには限られない。アジュバントは、これらの物質の混合物を含むこともできる。
【０２３７】
南アメリカ産の樹木であるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来のアジュバント活性を有する、免疫学的活性があるサポニン分画は、当分野で知られている。例えば、ＱＡ２１としても知られるＱＳ２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹木由来のＨｐｌｃ精製分画であり、その分画のその生成法は、米国特許第５，０５７，５４０号中に（ＱＡ２１として）開示されている。Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンは、Ｓｃｏｔｔ他、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．、１９８５、７７、４０９によって、アジュバントとしても開示されてきている。モノホスホリル脂質Ａ及びその誘導体は、当分野で知られている。好ましい誘導体は、３ｄｅ−ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａであり、英国特許第２２２０２１１号から知られている。他の好ましいアジュバントは、その開示を参照によって本明細書に組み込んだ、ＷＯ００／００４６２中に記載されている。
【０２３８】
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。さらに、本発明の組成物は、「治療上有効量」（すなわち、望ましい生理学的効果を生み出す量）で投与される。
【０２３９】
本発明の組成物は、当分野で知られているさまざまな方法によって投与することができる。選択される個々の形式は、選択される個々の組成物、治療される状態の重度、及び治療効果のために必要とされる用量に、当然ながら依存するであろう。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に許容される任意の投与形式、すなわち臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生成する、任意の形式を使用して行うことができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、脳槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ）、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤または経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口または鼻部スプレーとしての投与がある。本明細書で使用する、用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む、投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。
【０２４０】
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水）または非水溶液及び懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
【０２４１】
付随的に、たとえば混合物として、あるいは別々に、組合せを投与することができるが、一斉にすなわち同時に、あるいは順次に投与することもできる。このことは、組合せ物質が治療用混合物と共に投与されること、及び組合せ物質が一斉にではなく別々に、たとえば別の静脈内経路によって同じ個体に投与される手順の表示を含む。「組合せ」投与は、所与の成分または物質の１つを最初に、次に第２のものを別々に投与することをさらに含む。
【０２４２】
用量レベルは、投与形式、被験者の性質、及び担体／アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、被験者当たり約０．００１μｇ〜約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、被験者当たり少なくとも約１μｇ〜約１００μｇである。被験者を免疫処置するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。抗原の典型的な量は、ＶＬＰを加えない投与用に典型的に使用される範囲とほぼ同等、同等、あるいは同一である範囲内である。
【０２４３】
本発明の組成物は、好都合なことに単位用量の形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。それらの方法は、本発明の組成物と１つまたは複数の追加成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に、これらの組成物は、本発明の組成物を均一かつ完全に、液状担体、微細固形担体、またはこの両方と結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
【０２４４】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤またはトローチ剤などの、分離した単位として存在することができ、それぞれが所定量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性の液体または非水性の液体に懸濁させた懸濁液、シロップ、エリキシル剤またはエマルジョンなどがある。
【０２４５】
他の送達系は、時間放出、遅延放出または徐放送達系を含んでよい。このような送達系によって、前に記載した本発明の組成物の繰り返しの投与を避けることができ、被験者及び医者に対する利便性が高まる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
【０２４６】
本発明の他の実施形態は、本発明の組成物を生成するための方法、及び前記組成物を使用する癌及びアレルギーの医学的な治療の方法を含む。
【０２４７】
したがって、本発明は特に、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）は、非メチル化Ｃ及びＧ（ＣｐＧ）が豊富なＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化することができるという知見に関する。このようなＣｐＧ−ＶＬＰを抗原と混合させた場合、これらの抗原の免疫原性は劇的に増大する。さらに、抗原に対するＴ細胞応答は、Ｔｈ１型を特に対象とする。驚くことに、抗原とＶＬＰの共有結合は必要とされず、ＶＬＰと同時投与用のアジュバントを、単に混合すれば充分であった。さらにＶＬＰは、それらをＣｐＧと、それぞれ充填及びパッケージ化しない限り、免疫応答を高めることはなかった。したがって、ＣｐＧパッケージ型ＶＬＰと混合した抗原は、アレルギー、腫瘍及び他の自己集合分子、及び慢性のウィルス性疾患に対する、予防的または治療的ワクチン接種用の、理想的なワクチンである可能性がある。
【０２４８】
他の態様では、本発明は、ウィルス様粒子、及び前記ウィルス様粒子中にパッケージ化された免疫賦活物質を含む、動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法を提供し、前記方法は、（ａ）前記ウィルス様粒子と前記免疫賦活物質をインキュベートすること、（ｂ）ＲＮａｓｅを加えること、及び（ｃ）前記組成物を精製することを含む。
【０２４９】
他の態様では、本発明は、ウィルス様粒子、及び前記ウィルス様粒子中にパッケージ化された免疫賦活物質を含む、動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法を提供し、前記方法は、（ａ）前記ウィルス様粒子とＲＮａｓｅをインキュベートすること、（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、及び（ｃ）前記組成物を精製することを含む。
【０２５０】
さらに他の態様では、本発明は、ウィルス様粒子、及び前記ウィルス様粒子中にパッケージ化された免疫賦活物質を含む、動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法を提供し、前記方法は、（ａ）前記ウィルス様粒子を分解すること、（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、及び（ｃ）前記ウィルス様粒子を再構築することを含む。他の実施形態では、本発明に従った動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法は、分解したウィルス様粒子の核酸を除去することをさらに含む。さらに他の実施形態では、本発明に従った動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法は、再構築（ｃ）の後に組成物を精製することをさらに含む。
【０２５１】
さらに他の態様では、本発明は、ウィルス様粒子、及び前記ウィルス様粒子中にパッケージ化された免疫賦活物質を含む、動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法を提供し、前記方法は、前記ウィルス様粒子と、前記ウィルス様粒子の核酸を加水分解することができる金属イオンを含む溶液をインキュベートすること、（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、及び（ｃ）前記組成物を精製することを含む。ウィルス様粒子の核酸を加水分解することができる金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン、（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン、（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン、（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）の少なくとも１つのイオンの任意の混合物からなる群から選択されることが好ましい。前に示した、本発明に従った動物の免疫応答を高めるための組成物の生成法の好ましい実施形態では、免疫賦活免疫賦活物質は、（ａ）リボ核酸、好ましくはポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体、（ｂ）デオキシリボ核酸、好ましくは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、（ｃ）キメラ核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物からなる、あるいは本質的にこれらからなる群から選択される、免疫賦活性核酸である。
【０２５２】
前に示した、本発明に従った動物の免疫応答を高めるための組成物の製造方法の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、細菌または哺乳動物発現系で生成され、他の好ましい実施形態では、ＲＮａｓｅはＲＮａｓｅＡである。
【０２５３】
以下の実施例は単なる例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態及び変形形態を本発明の方法で作製することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の変更形態及び変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、含むことが考えられる。
【０２５４】
本明細書で言及するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、その全容を参照により明確に組み込んである。
【実施例１】
【０２５５】
ＶＬＰの生成
ＬＣＭＶ由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇのＤＮＡ配列を、配列番号７０中に与える。ｐ３３−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ）を、以下のように生成させた：Ｂ型肝炎ウィルスの完全なウィルスゲノムを含む、Ｂ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。発現プラスミドの作製は既に述べた（ＷＯ／０２４４８１参照）。
【０２５６】
良い発現用に選択した大腸菌Ｋ８０２のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を増殖させ、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理の後、４μｌのベンゾナーゼ及び１０ｍＭのＭｇＣ１２を加え、懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、４℃において１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みは保持した。
【０２５７】
次に、２０％（ｗ／ｖ）（０．２ｇ／ｍｌの溶解物）硫酸アンモニウムを、上澄みに加えた。氷上での３０分間のインキュベーション、及び４℃において２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを捨て、ペレットを２〜３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍｌのＰＢＳ溶液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ）に担持し、画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに担持し、精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰキャプシドを含む画分を集めた。集めた画分は、ヒドロキシアパタイトカラムに担持した。流動物（精製したｐ３３−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰキャプシドを含む）を回収した。電子顕微鏡法は、標準的なプロトコルに従って行った。代表的な例は、Ｓｔｏｒｎｉ  Ｔ．他、（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，；１６８（６）：２８８０〜６の図１に示す。
【０２５８】
ペプチドｐ３３を含むＶＬＰはあくまでも便宜上の理由で使用されているにすぎず、野生型ＶＬＰを本発明において同様に使用することができることに留意すべきである。記載を通じて、用語ｐ３３−ＨＢｃＡｇＶＬＰ、ＨＢｃＡｇ−ｐ３３ＶＬＰ、ｐ３３−ＶＬＰ及びＨＢｃ３３は、互換的に使用する。特に、実施例１〜４、９、及び１０、１８で使用するＶＬＰは、ｐ３３−ＨＢｃＡｇＶＬＰである。
【実施例２】
【０２５９】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
実施例１で記載の通りに生成した組み換えＶＬＰに、純粋なアガロースゲルの電気泳動（１％アガロース）を行い、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはタンパク質を検出するために臭化エチジウムまたはクーマシーブルーで染色した（図１）。細菌生成ＶＬＰは高レベルの一本鎖ＲＮＡを含み、これはおそらく、ＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端の近くに現れ、Ｘ線結晶解析によって示されるように、形状的にはＶＬＰの内側に位置している、アルギニン反復配列と結合している。汚染したＲＮＡは容易に消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる。非常に活性があるＲＮａｓｅ  Ａ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有しており、ＶＬＰに入り望ましくないリボ核酸を排除するほど、おそらく充分小さい。
【０２６０】
組み換えＶＬＰに、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化前に、ＣｐＧが豊富なオリゴヌクレオチド（配列番号６９参照）を補った。図２に示すように、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの存在によって、未処理ｐ３３−ＶＬＰと比較した同様の移動によって示されるように、キャプシド構造が保たれた。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド含有ＶＬＰを、透析（３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜を使用して、２４時間かけてＰＢＳに４５００倍希釈）によって、非結合オリゴヌクレオチドから精製した（図３参照）。
【実施例３】
【０２６１】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅによりＲＮＡを除去し、その後オリゴヌクレオチドをＶＬＰにパッケージ化することによって、ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ＶＬＰ（細菌一本鎖ＲＮＡを含み、実施例１で記載の通りに生成した）を、ＲＮａｓｅ  Ａと共に最初にインキュベートしてＲＮＡを除去し、第２のステップでは、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（通常のリン酸ジエステル部分を含むだけでなく、リン酸骨格のチオリン酸修飾体も含む）を、サンプルに補った（図４）。この実験によって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解反応中に必ずしも同時に必要とされるわけではなく、後で加えることができることが明らかに示される。
【実施例４】
【０２６２】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＶＬＰは、同時投与される蜂毒液に対する強いＩｇＧ応答を誘導する。
実施例１に記載したのと同様に作製したＶＬＰを、この実験用に使用した。マウスは、５μｇの蜂毒液（ＡＬＫ  Ａｂｅｌｌｏ）単独で、あるいはこれを以下の１つ：５０μｇのＶＬＰ単独、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化した５０μｇのＶＬＰ、または２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合させた５０μｇのＶＬＰと混合させたもので、皮下を初回抗原刺激した。あるいはマウスは、ＶＬＰ単独、または水酸化アルミニウムと結合したＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＶＬＰと混合させた５μｇの蜂毒液で、初回抗原刺激した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激し、第２１日に出血させた。第２１日からの血清中の蜂毒液特異的ＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（正常なリン酸ジエステル部分を含む）内に担持されるＨＢｃＡｇに由来し、非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから透析させた、ＲＮａｓｅＡ処理ＶＬＰは、蜂毒液アレルゲン（ＢＶ）に対するＩｇＧ応答を高める際に有効であった。図５に示すように、遊離ＣｐＧ、またはＣｐＧと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＶＬＰの存在によって、蜂毒液に対するＩｇＧ応答が劇的に増大した。ＣｐＧを含まないＶＬＰが、免疫応答を高めることはなかった。アジュバントとしてのＡｌｕｍの存在は、ＩｇＧ応答をさらに増大させた。ＩｇＧサブクラスを測定した場合（図６）、ＣｐＧパッケージ型ＶＬＰによって、ＩｇＧ１優性からＩｇＧ２ａ優性に応答性が移ったことは明らかであり、Ｔｈ１応答が使用されたことが示された。興味深いことに、Ａｌｕｍの存在によって、Ｔｈ２関連のＩｇＧ１イソ型が増大した。したがって、ＣｐＧパッケージ型ＶＬＰをＡｌｕｍ中の蜂毒液に加えることによって、高いＩｇＧ力価がもたらされたが、その応答は依然としてＩｇＧ１によって支配されていた。重要なことに、ＶＬＰにパッケージ化されたＣｐＧは、Ａｌｕｍの存在下または不在下において蜂毒液に対するＩｇＧ応答を高める際に、遊離ＣｐＧとして同様に有効であったが、それらは全身の免疫活性化の徴候は示さなかった（図７）。具体的には、遊離ＣｐＧの存在下で、マウスにワクチン接種することによって、脾臓の全リンパ球数が４倍まで増大した巨脾症が誘導された一方で、ＶＬＰ中にパッケージ化されたＣｐＧが、全リンパ球数の増大をもたらすことはなかった。
【実施例５】
【０２６３】
ピーナッツアレルギーに対して使用したＶＬＰ。
以下の実施例５〜８では、使用したＶＬＰは、Ｇ１０−ＰＯ（配列番号１２２）と共にパッケージ化したＱｂコア粒子（配列番号１）である。５週齢のメスのＣ３Ｈ／ＨｅＦマウスを、５ｍｇの新鮮にすりつぶした、焙煎状態の完全なピーナッツ、及び１０μｇのコレラ毒素を第０日に用いる、胃管栄養法によってピーナッツに感作させる。マウスは、１週間後及び３週間後に追加抗原刺激する。最後の感作投与の１週間後、マウスに、１０ｍｇの粗製ピーナッツ抽出物と混合させたＶＬＰ、５μｇのＡｒａｈ１と混合させたＶＬＰ、５μｇのＡｒａｈ２と混合させたＶＬＰ、５μｇのＡｒａｈ３と混合させたＶＬＰ、またはＡｒａｈ１、Ａｒａｈ２及びＡｒａｈ３のそれぞれの５μｇと混合させたＶＬＰのいずれかを与える。非投薬マウス、ＶＬＰのみを与えたマウス、１０ｍｇの粗製ピーナッツ抽出物のみを与えたマウス、または５μｇの無関係な抗原と混合させたＶＬＰを与えたマウスを、対照として働かせる。
【０２６４】
ピーナッツ特異的ＩｇＥのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用することによって測定する。ピーナッツ感作マウスから集めた血清において、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２及びＡｒａｈ３に特異的なＩｇＥ抗体を調べる。プレートは、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２及びＡｒａｈ３（２μｇ／ｍｌ）でコーティングする。ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルも、ＥＬＩＳＡによって測定して、ＴＨ１またはＴＨ２応答が使用されるかどうかを判定する。
【０２６５】
アナフィラキシー症状を、以下の記録システム：０、症状なし、；１、鼻及び頭部周辺の引っかき傷及び擦り傷、；２、眼及び口周辺の膨張、下痢、立毛、低下した活性、及び／または高い呼吸率による低い活性；３、喘息、呼吸困難、及び口及び尾周辺のチアノーゼ；４、刺激後の無活性、または震え及び痙攣；５、死を使用することによる、第２のチャレンジ投与後に、３０〜４０分間評価する。
【０２６６】
第２の胃管栄養法によるチャレンジ後３０分で、血液を回収する。血漿ヒスタミンのレベルは、製造者により記載されたのと同様に、酵素イムノアッセイキット（ＩｍｍｕｎｏＴＥＣＨ  Ｉｎｃ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して測定する。
【０２６７】
第５週に再チャレンジした後、ピーナッツ感作マウス及び非投薬マウスから脾臓を除去する。それらの活性化状態の指標として、ピーナッツ抗原を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激後に増殖する、脾細胞の能力を測定する。具体的には、脾細胞を単離し、完全な培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０及び１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１％グルタミン）に懸濁させる。脾細胞（１×１０６／０．２ｍＬ中のウエル）は、粗製ピーナッツ抽出物、Ａｒａｈ１、Ａｒａｈ２またはＡｒａｈ３（１０または５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下において、マイクロウエルプレート中の三連の培養でインキュベートする。ＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）で刺激した細胞は、陽性対照として使用する。６日後、ウエル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを用いて１８時間、培養物を標識する。細胞を採取し、取り込まれた放射活性はβ−シンチレーションカウンターで計数する。脾細胞は、粗製ピーナッツ抽出物（５０μｇ／ｍｌ）またはＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下において、２４ウエルプレート中でも培養する（４×１０６／ウエル／ｍｌ）。上清は７２時間後に回収する。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＦＮ−γは、製造者の教示書に従いＥＬＩＳＡによって測定して、ＴＨ１またはＴＨ２応答が使用されるかどうかを判定する。
【実施例６】
【０２６８】
ブタクサアレルギーに対して使用したＶＬＰ。
６〜１０週齢のオスのＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、第０日及び第４日に８０μｇのＲＷを腹腔内注射することによって、ブタクサ（ＲＷ）に感作させる（エンドトキシン含量＞２．３ｎｇ／ｍｇ  ＲＷ；Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣ）。感作用溶液は、１ｍｇのＲＷが１ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）及び３３３ｍｌのＩｍｊｅｃｔ  ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に溶けた溶液からなる。最後の感作投与の１週間後、マウスに、１６０ｕｇのＲＷと混合させたＶＬＰ、または８０ｕｇのＡｍｂａ１と混合させたＶＬＰのいずれかを与える。非投薬マウス、ＶＬＰのみを与えたマウス、１６０ｕｇのＲＷのみを与えたマウス、または８０ｕｇの無関係な抗原と混合させたＶＬＰを与えたマウスを、対照として働かせる。
【０２６９】
第２５日に、尾部静脈から０．５ｍｌの末梢血液を回収し、ケタミン（９０μｇ／体重１ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）を用いて、マウスに麻酔をかけ、次いでＲＷの気管内投与（０．１ｍｌの０／９％ＮａＣｌ中に１０ｕｇのＲＷ）によってチャレンジする。ＲＷチャレンジの１２時間後、尾部静脈からの末梢血液０．５ｍｌを回収し、１つのＰＢＳの１ｍｌ等分試料で肺を洗浄する。サンプルは２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、気管支肺胞洗浄液を回収する。インターロイキンＩＬ−４及びＩＬ−５のレベルは、製造者の教示書に従い、二箇所免疫酵素アッセイキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して測定する。検出の下限は、ＩＬ−４とＩＬ−５の両方に関して１ｐｇ／ｍｌである。肺を洗浄した後、それらを除去する。肺に４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を３０分間注入し、ＰＢＳですすぎ、０．５Ｍスクロース（ＰＢＳ中）に一晩４℃で浸す。肺は膨張させ、パラフィン包埋する。組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、炎症性好酸球の浸潤の程度を、画像分析によって定量化する。
【０２７０】
白血球細胞を、不連続なＰｅｒｃｏｌｌ勾配の遠心分離、及びその後の残りの赤血球細胞の低張溶解によって、末梢血液から単離する。好酸球は、抗ＣＤ９０及び抗ＣＤ４５Ｒ抗体を使用する陰性選択法により白血球細胞から増大させて、製造者の示すプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に従ったＭＡＣＳ磁気ビーズ分離法を使用して、Ｂ細胞及びＴ細胞群を欠失させる。好酸球分画は、＜９８％に常に増大する。
【０２７１】
精製した末梢血液の好酸球は、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）及び５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に再懸濁させる。細胞は、１０−７Ｍのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）及び１０−７ＭのＡ−２３１８７（Ｓｉｇｍａ）を用いて、９６ウエルプレート中において、３７℃で３０分、１時間、及び１６時間、あるいはＡｍｂａ１（２０μｇ／ｍｌ）で６日間刺激を与える。刺激後、Ａｍｂａ１によって誘導されるＴＨ２優性のサイトカイン分泌概略を逆にする、ＶＬＰの能力を分析する。具体的には、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を生成する好酸球の能力を、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって分析する。
【０２７２】
ブタクサ特異的ＩｇＥのレベルを、ＥＬＩＳＡを使用することによって測定する。ブタクサ感作マウスから集めた血清において、Ａｍｂａ１に特異的なＩｇＥ抗体を調べる。プレートは、Ａｍｂａ１（２μｇ／ｍｌ）でコーティングする。ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルも、ＥＬＩＳＡによって測定して、ＴＨ１またはＴＨ２応答が使用されるかどうかを判定する。
【実施例７】
【０２７３】
真菌アレルギーに対して使用したＶＬＰ。
７日齢で非投薬のニュージーランド白ウサギを、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ抽出物から抽出し精製した、１０μｇのＡｌｔａ１、２８ｋｄの熱安定性二量体と混合させたＶＬＰ、または１０μｇのＡｓｐｆ１及びまたは１０μｇのＡｓｐｆ１６、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓから抽出し精製したタンパク質と混合させたＶＬＰで免疫処置する。非投薬ウサギ、ＶＬＰのみを与えたウサギ、及び２１０ｎｇのタンパク質／１ｍｌの凍結乾燥させたＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抽出物、通常の生理食塩水に還元したものを与えたウサギを、対照として働かせる。ウサギ抗Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ及び抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＩｇＥは、均一な受身皮膚アナフィラキシー反応（ＰＣＡ）によって測定する。非投薬で３カ月齢のニュージーランド白ウサギに、３カ月齢の免疫処置済みウサギ由来の０．２ｍｌの血清希釈液を、背部に沿って皮内注射する。非免疫処置ウサギ、及びウシ血清アルブミンで免疫処置したウサギ由来の血清は、対照として試験する。３日間の潜伏期の後、レシピエントであるウサギに、５ｍｌの２．５％エバンスブルー染色液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）に希釈した、ＡｌｔｅｒｎａｒｉａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ抽出物の２．１ｎｇのタンパク質を、静脈内注射する。皮膚試験の応答性を測るために、リン酸ヒスタミン（０．２７５ｍｇ／ｍｌの０．２ｍｌ）及び通常の生理食塩水を、抽出物−染色液混合物を与える１０分前に皮内注射する。個々の注射部位の青色化は、染色液投与後１時間で測定する。任意の希釈液の陽性応答は、直径５ｍｍ以上の青色のスポットである。
【０２７４】
３カ月齢の免疫処置済みウサギ、及び非免疫処置の対照ウサギに、メトヘキシタールナトリウム（Ｂｒｅｖｉｔｏｌ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、１０ｍｇ／ｍｌ通常の生理食塩水に溶かしたもの１〜３ｍｌを、静脈内に与えて麻酔をかける。ウサギには、３．５ｍｍの気管内チューブ（Ｐｏｒｔｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ  ＭＡ）を挿管する。３ｃｍ長の、Ｐ−２４０カテーテル（Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）と接続した、ラテックスバルーン（Ｙｏｕｎｇ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｃｏ．、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ）を、食道内に置く。９ｍｍ径の気管内チューブの４ｃｍ断片を、食道カテーテル及び小さな気管内チューブを覆う中咽頭の背部に置いて、ウサギの奥歯によるそれらへのダメージを防ぐ。口はテープで閉じ、動物は２時間起きた状態にする。少量の空気をバルーンに導入した後、バルーンの位置を、呼気終末圧が最も低下し心臓の人工産物が最少になる地点に調節する。食道のバルーンカテーテルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ２７０差圧変換器（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と結び付け、バルーン圧と気管内チューブ圧の間の差を、肺内外圧較差として記録する。基底状態の測定は、動物が完全に起きた後で行う。これらの測定は、呼吸頻度、吸気及び呼気流速、１回換気量、及び肺内外圧較差を含む。
【０２７５】
基底状態の測定を行った後、通常の生理食塩水、通常の生理食塩水に１：２０重量／体積で希釈した、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ抽出物、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抽出物のいずれかのエアゾールで、動物をチャレンジする。１ｍｌの通常の生理食塩水、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ抽出物、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ抽出物を、４Ｌ／分の空気流を（圧縮空気と共に）使用して、気管内チューブに直接５分間噴霧する。５分間のチャレンジの最後に、肺の機能測定を６時間中３０分毎に行う。
【０２７６】
Ａｌｔａ１、Ａｓｐｆ１またはＡｓｐｆ１６特異的ＩｇＥのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用することによって測定する。ＡｌｔｅｒｎａｒｉａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ感作マウスから集めた血清において、Ａｌｔａ１、Ａｓｐｆ１またはＡｓｐｆ１６に特異的なＩｇＥ抗体を調べる。プレートは、Ａｌｔａ１、Ａｓｐｆ１またはＡｓｐｆ１６（２μｇ／ｍｌ）でコーティングする。ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルも、ＥＬＩＳＡによって測定して、ＴＨ１またはＴＨ２応答が使用されるかどうかを判定する。
【実施例８】
【０２７７】
粉塵ダニアレルギーに対して使用したＶＬＰ。
６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、第０日に１０μｇのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ全抽出物を皮下注射することによって、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｏｇｏｌｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒに感作させる。
【０２７８】
第１４日に、Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓに感作させたマウスを、１０μｇのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓと混合させたＶＬＰ、または完全なＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ抽出物から抽出し精製した、５μｇのＤｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、及び／またはＤｅｒ２と混合させたＶＬＰで免疫処置する。非投薬マウス、ＶＬＰのみを与えたマウス、１０μｇのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓのみを与えたマウス、または５ｕｇの無関係な抗原と混合させたＶＬＰを与えたマウスを、対照として働かせる。
【０２７９】
第１４日に、Ｌ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒに感作させたマウスを、１０μｇのＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒと混合させたＶＬＰ、または完全なＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ抽出物から抽出し精製した、５μｇのＬｅｐｄ２と混合させたＶＬＰで免疫処置する。非投薬マウス、ＶＬＰのみを与えたマウス、１０μｇのＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒのみを与えたマウス、または５ｕｇの無関係な抗原と混合させたＶＬＰを与えたマウスを、対照として働かせる。
【０２８０】
第２８日に、尾部静脈から０．５ｍｌの末梢血液を回収し、ケタミン（９０μｇ／体重１ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）を用いて、マウスに麻酔をかけ、次いで１０μｇのＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒを用いて気管内をチャレンジする。Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒによるチャレンジの７２時間後、尾部静脈からの末梢血液０．５ｍｌを回収し、肺を除去する。肺に４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を３０分間注入し、ＰＢＳですすぎ、０．５Ｍスクロース（ＰＢＳ中）に一晩４℃で浸す。肺は膨張させ、パラフィン包埋する。組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、炎症性好酸球の浸潤の程度を、画像分析によって定量化する。
【０２８１】
白血球細胞を、不連続なＰｅｒｃｏｌｌ勾配の遠心分離、及びその後の残りの赤血球細胞の低張溶解によって、末梢血液から単離する。白血球細胞は、不連続なＰｅｒｃｏｌｌ勾配で末梢血液から単離する。好酸球は、抗ＣＤ９０及び抗ＣＤ４５Ｒ抗体を使用する陰性選択法により両方の群から増大させて、製造者の示すプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に従ったＭＡＣＳ磁気ビーズ分離法を使用して、Ｂ細胞及びＴ細胞群を欠失させる。好酸球分画は、＜９８％に常に増大する。
【０２８２】
精製した末梢血液の好酸球は、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）及び５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に再懸濁させる。細胞は、１０−７Ｍのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）及び１０−７ＭのＡ−２３１８７（Ｓｉｇｍａ）を用いて、９６ウエルプレート中において、３７℃で３０分、１時間、及び１６時間５μｇのＤｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、またはＤｅｒ２で、あるいはＬｅｐｄ２（２０μｇ／ｍｌ）で６日間刺激を与える。刺激後、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、またはＤｅｒ２で、あるいはＬｅｐｄ２によって誘導されるＴＨ２優性のサイトカイン分泌概略を逆にする、ＶＬＰの能力を分析する。具体的には、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を生成する好酸球の能力を、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって分析する。
【０２８３】
Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ特異的ＩｇＥのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用することによって測定する。Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓまたはＬ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ感作マウスから集めた血清において、誘導性Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、またはＤｅｒ２、及びＬｅｐｄ２に特異的なＩｇＥ抗体を調べる。プレートは、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒ２及びＬｅｐｄ２（２μｇ／ｍｌ）でコーティングする。ＩｇＧサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのレベルも、ＥＬＩＳＡによって測定して、ＴＨ１またはＴＨ２応答が使用されるかどうかを判定する。
【実施例９】
【０２８４】
蜂毒液のチャレンジに対してのマウスの脱感作
ＶＬＰとＣｐＧのパッケージ化、及び蜂毒液と混合させたＶＬＰ（ＣｐＧ）を用いたマウスの免疫処置
配列番号７０に示すのと同様の配列を有するＶＬＰを、大腸菌において生成させ、消化することができ、したがってＶＬＰとＲＮａｓｅＡをインキュベートすることによって除去することができる量のＲＮＡを含む。使用した非常に活性があるＲＮａｓｅＡ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有する。ＰＢＳバッファーｐＨ７．２中に０．８ｍｇ／ｍｌで濃縮させた、組み換えによって生成させたＨＢｃＶＬＰを、ＲＮａｓｅＡ（３００μｇ／ｍｌ）（Ｄｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下または存在下において、３７℃で３時間インキュベートした。ＲＮａｓｅＡによる消化後、チオリン酸骨格を有する（配列番号６９に示すのと同様の配列の）１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧオリゴヌクレオチドをＶＬＰに補い、３７℃で３時間インキュベートした。マウスの免疫処置用のＶＬＰ調製物を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２及び３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）で、２４時間充分に透析して（１０，０００倍希釈）、ＲＮａｓｅＡ及び過剰のＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを除去した。
【０２８５】
一群の１３匹のＣＢＡ／Ｊマウスを、第０、９、２３及び３８日に、ＰＢＳと混合させた０．２ｕｇの蜂毒液（Ｐｈａｒｍａｌｇｅｎ）及び１ｍｇのＡｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、繰り返し注射することによって感作した。これらのマウスには、注射日当たり皮下に６６ｕｌ（それぞれの側当たり３３ｕ１）の合計体積を与えた。４回の感作後、ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液、またはＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを用いて、第６５、７３、及び８０日に、マウスを脱感作した。第１群の７匹のマウスには、３回の注射、それぞれＰＢＳに溶かした５０ｕｇのＶＬＰ（ＣｐＧ）＋５ｕｇの蜂毒液を与えた。２００ｕｌの合計体積を、２回の投与でそれぞれの側当たり１００ｕｌ、皮下に与えた。第２群の６匹のマウスには、第１群と同じ免疫処置スケジュール（第６５、７３、及び８０日）に従い、同量のＶＬＰ（ＣｐＧ）を与えたが、蜂毒液は与えなかった。最後に、第８７日に、すべてのマウスを、合計体積３００ｕｌのＰＢＳに溶かした３０ｕｇの蜂毒液で、皮下をチャレンジした。
【０２８６】
記載及び図面を通じて、用語ＶＬＰ（ＣｐＧ）及びＶＬＰ−ＣｐＧは互換的に使用され、ＣｐＧとパッケージ化されたＶＬＰを意味する。
【実施例１０】
【０２８７】
蜂毒液でチャレンジしたワクチン接種マウスの、温度変化の評価及び血清分析
ＶＬＰ（ＣｐＧ）複合体を用いた脱感作の、防御効果を評価するために、マウスの体温を、蜂毒液チャレンジ後に１時間、１０分間隔で測定した（図８）。図８は、ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスにおける、アレルギー性の体温低下を示す。２組のマウスを試験した。グループ１（ｎ＝７）には、ワクチンとして蜂毒液と混合させたＶＬＰ（ＣｐＧ）を与えた。グループ２（ｎ＝６）には、ＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを与えた。高用量の蜂毒液（３０ｕｇ）でチャレンジした後、アレルギー反応を、マウスの体温の変化の点で評価した。蜂毒液及びＶＬＰ（ＣｐＧ）を与えたグループ１では、体温の有意な変化は、試験したマウスのいずれにおいても観察されなかった。対照的に、脱感作ワクチンとしてＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを与えたグループ２は、６匹の動物中４匹で顕著な体温の低下を示した。したがって、これらのマウスは、アレルギー反応からは保護されなかった。注釈：図中の記号は、（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または７（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液に関する）、標準偏差（ＳＤ）を含めた６匹の個々のマウスの平均を表す。
【０２８８】
血清分析用に、第０日（免疫前）、第５８日（感作後）及び第８６日（脱感作後）に、眼窩後方でマウスを出血させた。ＥＬＩＳＡ試験は以下のように行った。ＥＬＩＳＡプレートは、コーティングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ、ｐＨ９．６）１ｍｌ当たり５ｕｇの蜂毒液で、４℃において一晩コーティングした。これらのプレートを、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で、３７℃において２時間ブロッキングし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いでブロッキングバッファーに連続的に希釈したマウス血清と共に、室温で２時間インキュベートした。ＩｇＥ検出のために、免疫血清を、タンパク質Ｇカラムに予め吸収させた。プレートは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＥ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２ａ抗体１ｕｇ／ｍｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒａｃｈ）と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液を加えた（０．０６６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍのクエン酸（ｐＨ５．０）＋０．４ｍｇのＯＰＤ（１．２−フェニレンジアミン二塩酸塩）＋０．０１％のＨ２Ｏ２）。１０分後、着色反応を５％のＨ２ＳＯ４を用いて停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。対照として、同じマウスの免疫前血清も試験した。ＥＬＩＳＡ力価は、１：２５０（ＩｇＥ）、１：１２５００（ＩｇＧ１）または１：５００（ＩｇＧ２ａ）希釈血清の光学濃度（ＯＤ４５０ｎｍ）として表した（図９）。図９は、脱感作前後の、マウス中の特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ血清抗体の検出を示す。すべてのマウスの血液サンプルを、脱感作前後に採取し、それぞれ蜂毒液特異的ＩｇＥ抗体（パネルＡ）、ＩｇＧ１抗体（パネルＢ）及びＩｇＧ２ａ抗体（パネルＣ）に関して、ＥＬＩＳＡで試験した。図９Ａに示すように、高いＩｇＥ力価が、脱感作後にＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスに関して観察される。これらの結果は、１：２５０の血清希釈液における光学濃度（ＯＤ４５０ｎｍ）として表す。標準偏差（ＳＤ）を含めた、６匹の（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または７（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液）の個々のマウスの平均を、この図中に示す。図９Ｂによって、ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスに関してのみ、脱感作後の高い抗蜂毒液ＩｇＧ１血清力価が明らかである。ＩｇＧ２ａ血清力価を決定した図９Ｃに関しても、同じことが当てはまる。成功裏の脱感作に関して予想されたように、ＩｇＧ２ａ抗体力価の増大が最も顕著であった。これらの結果は、それぞれ１：１２５００（ＩｇＧ１）または１：５００（ＩｇＧ２ａ）血清希釈液に関する、ＳＤを含めた２匹の（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または３（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液）マウスの平均として示す。
【実施例１１】
【０２８９】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＶＬＰは、同時投与される牧草花粉抽出物に対するＩｇＧ応答を誘導する。
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用した。これらは未処理で使用し、あるいはリン酸骨格のチオリン酸修飾体を有する、ＣｐＧ−２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とのパッケージ化後に使用した。ＣｐＧ−２００６のパッケージ化は、０．２ｍｌの１００ｍＭ  ＺｎＳＯ４溶液の存在下において６０℃で一晩、８ｍｌのＱｂＶＬＰ溶液（２．２ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートすることによって行った。この処理によって、ＱｂＶＬＰ中に含まれるＲＮＡの加水分解がもたらされる。透析チューブ（カットオフＭＷＣＯ  ３０００００）を使用した、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に対する透析後、ＣｐＧ−２００６を１３０ｎｍｏｌ／１ｍｌ  ＶＬＰ溶液で加え、６５０ｒｐｍでの振とう下において、３７℃で３時間インキュベートした。非パッケージ化ＣｐＧ２００６の除去は、１ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下における３７℃で３時間の、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を用いたその後の処理、次に前に記載した２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に対する透析によって行った。ＣｐＧ−２００６のパッケージ化は、核酸を視覚化するために、臭化エチジウムで、次にタンパク質の視覚化用にクーマシーブルーで染色した、アガロースゲルの電気泳動によって確認した。さらに、パッケージ化ＶＬＰをＴＢＥ−尿素ゲル上で分析し、パッケージ化ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの量を評価した。約６．７ｎｍｏｌのＣｐＧ−２００６が、１００ｕｇのＱｂＶＬＰにパッケージ化された。
【０２９０】
メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、以下の１つ：５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、ＣｐＧ−２００６または３ｍｇの水酸化アルミニウム（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰと混合させた、１．９Ｂ．Ｕ．の牧草花粉抽出物（５−ｇｒａｓ−ｍｉｘ  Ｐａｎｇｒａｍｉｎ、Ａｂｅｌｌｏ、多年生ライムギ、果樹、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス、及びヒロハノウシノケグサの花粉から調製したもの）で、皮下を免疫処置した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激し、第２１日に出血させた。第２１日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。図１０に示すように、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＶＬＰの存在によって、花粉抽出物に対するＩｇＧ２ｂ応答が増大した。ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰの存在下では、花粉抽出物に対するＩｇＥ応答は誘導されなかったが、Ａｌｕｍの存在下では、強いＩｇＥ応答が観察された。Ａｌｕｍとは対照的に、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰは、ＩｇＧ１抗体を誘導しなかった。これは、Ｔｈ２指向型応答の不在を示す。
【実施例１２】
【０２９１】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＶＬＰは、アレルギー性マウスにおいて、同時投与される牧草花粉抽出物に対するＩｇＧ応答を誘導する
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用した。これらは、実施例１１に記載したのと同様に、ＣｐＧ−２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とのパッケージ化後に使用した。
【０２９２】
メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、３ｍｇの水酸化アルミニウム（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と混合させた、１．９Ｂ．Ｕ．の牧草花粉抽出物（実施例１１参照）で、皮下を感作した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激した。１グループのマウスは未処理状態とした。他のグループには、１．９Ｂ．Ｕ．の牧草花粉抽出物のみ、またはこれを以下の１つ：５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、ＣｐＧ−２００６または３ｍｇのＡｌｕｍ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰと混合させたものを注射することによって、第２１日、第２８日及び第３５日に脱感作処理を施した。他のグループのマウスは、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰを用いて、脱感作させた。第１４日、第２１日、第２８日、第３５日及び第４２日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。図１１に示すように、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した花粉及びＶＬＰの存在下では、花粉抽出物に対する強いＩｇＧ２ｂ応答が誘導されたが、この応答は未処理マウス、または花粉抽出物で治療したマウスでは不在であった。ＩｇＧ１応答は、花粉抽出物のみで治療したマウスよりも、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰで脱感作したマウスの方が高かった。未処理マウス、及び花粉の不在下で、ＣｐＧ−２００６と共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰで治療したマウスは、ＩｇＧ１抗体を誘導しなかった。
【実施例１３】
【０２９３】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＶＬＰは、アレルギー性マウスにおいて、同時投与される樹木花粉抽出物に対するＩｇＧ応答を誘導する
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用する。これらは、実施例１１に記載したのと同様に、ＣｐＧ−２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とのパッケージ化後に使用する。
【０２９４】
メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、樹木花粉抽出物で皮下を感作した。１グループのマウスには、Ａｌｎｕｓ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ及びＣｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａの花粉抽出物を含む、２Ｂ．Ｕ．の樹木花粉抽出物の混合物（３種の樹木の混合物、Ａｂｅｌｌｏ）を与える。第２のグループには、Ａｌｎｕｓ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ抽出物のみを与え、グループ３には、Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ花粉抽出物のみを与え、グループ４には、Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ花粉抽出物のみを与え、グループ５には、日本スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）花粉抽出物のみを与える。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激する。１グループのマウスは未処理状態にする。他のグループのマウスには、感作用に使用した２Ｂ．Ｕ．の同じ樹木花粉抽出物を注射することによって、第２１日、第２８日及び第３５日に脱感作処理を施す。この対応する抽出物は単独で、あるいは以下の１つ：５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、ＣｐＧ−２００６または３ｍｇのＡｌｕｍ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰと混合させて使用する。第１４日、第２１日、第２８日、第３５日及び第４２日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価する。
【実施例１４】
【０２９５】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＶＬＰは、アレルギー性マウスにおいて、同時投与されるネコアレルゲン抽出物に対するＩｇＧ応答を誘導する
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用する。これらは、実施例１１に記載したのと同様に、ＣｐＧ−２００６オリゴヌクレオチド（配列番号１１４）とのパッケージ化後に使用する。
【０２９６】
２グループのメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、０．５μｇ及び５μｇのＦｅｌｄ１タンパク質に対応する、ネコアレルゲン抽出物で皮下を感作した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激する。１グループのマウスは未処理状態にする。他のグループのマウスには、感作用に使用した同じネコアレルゲン抽出物を注射することによって、第２１日、第２８日及び第３５日に脱感作処理を施す。この対応する抽出物は単独で、あるいは以下の１つ：５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、ＣｐＧ−２００６または３ｍｇのＡｌｕｍ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰと混合させて使用する。第１４日、第２１日、第２８日、第３５日及び第４２日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価する。
【実施例１５】
【０２９７】
Ｇ１０−ＰＯを含むＶＬＰは、同時投与されるアレルゲン抽出物に対するＩｇＧ応答を誘導する。
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用した。これらは未処理で使用し、あるいはＧ１０−ＰＯ（配列番号１２２）とのパッケージ化後に使用した。Ｇ１０のパッケージ化は、以下の方法によって行った：
【０２９８】
分解：４５ｍｇのＱβＶＬＰ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定したもの）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に溶かしたものを、攪拌条件下において室温で１５分間、５ｍＭのＤＴＴを用いて還元した。攪拌条件下における室温で３０分間の第２のインキュベーションを、７００ｍＭの最終濃度まで塩化マグネシウムを加えた後に続けて、ＲＮＡを沈殿させた。この溶液を４℃において１００００ｇで１０分間遠心分離して、ペレット中の沈殿したＲＮＡを単離した。上清中の分解されたＱβコートタンパク質二量体を、クロマトグラフィーによる精製ステップ用にそのまま使用した。
【０２９９】
陽イオン交換クロマトグラフィーによる、分解されたＱβコートタンパク質の２ステップの精製法：分解されたコートタンパク質及び残存ＲＮＡを含む、分解反応の上清を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦに施した。５ｍｌ／分の流速で室温において行った展開中に、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムを平衡状態にし、サンプルは１：１０に希釈して、１０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度にした。溶離ステップ（５ｍｌ分画中）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウムに対する勾配で続けて、汚染物質から純粋なＱβコートタンパク質二量体を単離した。
【０３００】
場合によっては後のステップで、単離したＱβコートタンパク質二量体（陽イオン交換カラムから溶離させた分画）を、バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いて平衡状態にした、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）に施した。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定し、Ｑｂ二量体に対応する分画を集めた。
【０３０１】
再構築：１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製したＱβコートタンパク質二量体を、オリゴデオキシヌクレオチドＧ１０−ＰＯの存在下においてＱβＶＬＰの再構築用に使用した。再構築反応用の、オリゴデオキシヌクレオチド濃度は３５μＭであった。再構築用溶液中のコートタンパク質二量体の濃度は７０μＭであった。尿素をこの溶液に加えて、１Ｍ尿素の最終濃度を与えた。あるいは、２．５ｍＭのＤＴＴを尿素以外に加えた。塩化ナトリウムを、２５０ｍＭの全体濃度まで加えた。再構築反応中にパッケージ化するオリゴデオキシヌクレオチドは最後に加え、２５ｍｌという再構築反応の最終体積を与えた。この溶液を、まず、室温において５ｋＤａのＭＷＣＯを有するＰｅｌｌｉｋｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  ５膜を使用して、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含むバッファーで、１００分間にわたり分離濾過した。この後、７ｍＭの過酸化水素と一緒の１時間のインキュベーションを行わずに、あるいはこのインキュベーションを行った後で、第２の分離濾過を行う。第２の分離濾過では、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を、１００ｋＤａのＭＷＣＯを有するＰｅｌｌｉｋｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ１００膜、または３００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を使用することによって使用した。
【０３０２】
オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβＶＬＰの分析：
Ａ）再構築したキャプシドの流体力学的大きさ：オリゴデオキシヌクレオチドＧ１０−ＰＯの存在下で再構築したＱβキャプシドを、動的光散乱装置（ＤＬＳ）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβＶＬＰと同じ流体力学的大きさ（質量及び立体配座の両方に依存する）を示した。
Ｂ）再構築したキャプシド中のジスルフィド結合の形成：再構築したＱβＶＬＰを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、ペンタマー及びヘキサマーの存在によって、完全なＱβＶＬＰと同じジスルフィド結合型を示した。
Ｃ）アガロースゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβＶＬＰの核酸含量の分析：再構築したＱβＶＬＰを１％アガロースゲルに載せ、臭化エチジウム及びクーマシーブリリアントブルーで染色した。再構築したＱβＶＬＰを、実施例１８に記載したのと同様にプロテイナーゼＫで処理した。次いで反応混合物を、ＴＢＥ−尿素のサンプルバッファーと混合させ、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルに載せた。定性及び定量標準として、１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌの、再構築反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに載せた。このゲルを、ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−１１４９４）で染色した。ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄによる染色によって、再構築したＱβキャプシドは、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した核酸を含んでいたことが示された。アガロースゲルによって、オリゴヌクレオチド染色とタンパク質染色の同じ移動が示された。まとめると、タンパク質を有するＱβＶＬＰの核酸含量の移動、及びプロテイナーゼＫの消化による精製した粒子からのオリゴデオキシヌクレオチドの単離によって、オリゴデオキシヌクレオチドのパッケージ化が実証される。
【０３０３】
実施例１１及び１４に記載したのと同様に、メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、牧草花粉抽出物またはネコ毛髪抽出物で皮下を感作した。
【０３０４】
それぞれの感作マウスグループの１グループは、未処理状態にする。他のグループには、感作用に使用した同じアレルゲン抽出物を注射することによって、第２１日、第２８日及び第３５日に脱感作処理を施す。この対応する抽出物は単独で、あるいは以下の１つ：５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、Ｇ１０−ＰＯまたは３ｍｇのＡｌｕｍ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、それぞれ充填及びパッケージ化した、５０μｇのＱｂＶＬＰと混合させて使用する。第１４日、第２１日、第２８日、第３５日及び第４２日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価する。
【実施例１６】
【０３０５】
ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子のクローニング
ＡＰ２０５コートタンパク質（ＣＰ）のｃＤＮＡ（配列番号９０）を、逆転写ＰＣＲ技法を使用し、塩基配列決定用の市販のプラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯでのクローニングによって、ファージＡＰ２０５ＲＮＡから作製した２つのｃＤＮＡ断片から構築した。逆転写技法は、当業者によく知られている。プラスミドｐ２０５−２４６中に含まれていた第１の断片は、ＣＰ配列の上流に２６９のヌクレオチド、及びＣＰの第１の２４Ｎ末端アミノ酸をコードする７４のヌクレオチドを含んでいた。プラスミドｐ２０５−２６２中に含まれていた第２の断片は、ＣＰのアミノ酸１２〜１３１をコードする３６４のヌクレオチド、及びＣＰ配列の下流に他の１６２のヌクレオチドを含んでいた。ｐ２０５−２４６及びｐ２０５−２６２はいずれも、Ｊ．Ｋｌｏｖｉｎｓからの寛大な寄贈品であった。
【０３０６】
プラスミド２８３．−５８を、２ステップのＰＣＲによって設計して、プラスミドｐ２０５−２４６及びｐ２０５−２６２由来の２つのＣＰ断片を、１つの完全長ＣＰ配列に融合させた。
【０３０７】
プラスミドｐＱｂｌ８５へのクローニング用のＮｃｏＩ部位を含む上流プライマーｐ１．４４、またはプラスミドｐＱｂ１０へのクローニング用のＸｂａＩ部位を含むｐ１．４５、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む下流プライマーｐ１．４６を使用した（下線を引いた制限酵素の認識配列）：
ｐ１．４４  ５’−ＮＮＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＣＣＧ−３’（配列番号１００）
ｐ１．４５  ５’−ＮＮＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１０１）
ｐ１．４６  ５’−ＮＮＡＡＧＣ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  Ｇ−３’（配列番号１０２）
【０３０８】
２つの他のプライマー、ｐ２０５−２６２中に含まれる断片の５’端でアニーリングさせたｐ１．４７、及びプラスミドｐ２０５−２４６中に含まれる断片の３’端でアニーリングさせたｐ１．４８を使用して、第１のＰＣＲにおいて断片を増幅させた。プライマーｐ１．４７とｐ１．４８は、互いに相補的である。
ｐ１．４７：５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＧＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＴ−ＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号１０３）
ｐ１．４８：５’−ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＡＡＡＣＧＡ−ＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣ−３’（配列番号１０４）
【０３０９】
最初の２回のＰＣＲ反応では、２つの断片を作製した。第１の断片は、プライマーｐ１．４５及びｐ１．４８、ならびに鋳型ｐ２０５−２４６を用いて作製した。第２の断片は、プライマーｐ１．４７及びｐ１．４６、ならびに鋳型ｐ２０５−２６２を用いて作製した。両方の断片を、第２のＰＣＲ反応、スプライス−重複部伸長用の鋳型として、ｐ１．４５とｐ１．４６、またはｐ１．４４とｐ１．４６のプライマーの組合せで使用した。２つの第２ステップのＰＣＲ反応の生成物を、ＸｂａＩまたはＮｃｏＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化し、大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターの制御下において、同じ制限部位を、それぞれｐＱｂ１０またはｐＱｂ１８５、２つのｐＧＥＭ由来の発現ベクターにクローニングした。
【０３１０】
２つのプラスミド、ｐＱｂｌ０においてｗｔＡＰ２０５ＣＰ（配列番号９０）をコードする遺伝子を含むｐＡＰ２８３−５８（配列番号９１）、及びｐＱβ１８５においてＰｒｏ５→Ｔｈｒ（配列番号９３）に突然変異したｐＡＰ２８１−３２（配列番号９４）を得た。コートタンパク質の配列は、ＤＮＡの塩基配列決定によって確認した。ＰＡＰ２８３−５８は、ＣＰのＡＴＧコドンの上流、ＸｂａＩ部位の下流に４９のヌクレオチドを含み、コートタンパク質ｍＲＮＡの推定される元のリボソーム結合部位を含む。
【実施例１７】
【０３１１】
組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの発現及び精製
Ａ．組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの発現
大腸菌ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ２８３−５８を用いて形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に１種のコロニーを接種し、３７℃で１６〜２４時間、振とうせずにインキュベートした。
【０３１２】
調製した接種原を、２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００〜３００ｍｌのＬＢ培地中に１：１００に希釈し、３７℃で一晩、振とうせずにインキュベートした。生成した第２の接種原を、緩衝用に０．２％グルコース及びリン酸を含む２ＴＹ培地中に１：５０に希釈し、振とう装置で３７℃で一晩インキュベートした。遠心分離によって細胞を採取し、−８０℃に凍結させた。
【０３１３】
Ｂ．組み換えＡＰ２０５ＶＬＰの精製
溶液及びバッファー：
溶解バッファー
１ｍｌ中に５マイクログラムの、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０及び５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００ならびにＰＭＳＦ
ＳＡＳ
水に溶かした飽和硫酸アンモニウム
バッファーＮＥＴ．
２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８及び５ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに１５０ｍＭのＮａＣｌ。
ＰＥＧ
ＮＥＴ中に溶けた４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
【０３１４】
溶解：
凍結細胞は、２ｍｌ／ｇ細胞で溶解バッファーに再懸濁させた。この混合物を、２２ｋＨで５回１５秒間、１分の間隔で超音波処理して、氷上で溶液を冷却した。次いで溶解物を、Ｆ３４−６−３８ローター（エッペンドルフ）を使用して、２０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した。以下に記載する遠心分離ステップはいずれも、特に示さない限りは同じローターを使用して行った。上清は４℃で保存し、一方細胞残骸は溶解バッファーで２回洗浄した。遠心分離後、溶解物の上清及び洗浄分画を集めた。
【０３１５】
硫酸アンモニウム沈殿をさらに使用して、ＡＰ２０５ＶＬＰを精製することができる。第１ステップでは、ＡＰ２０５ＶＬＰが沈殿しない硫酸アンモニウムの濃度を選択する。生成したペレットは捨てる。次のステップでは、ＡＰ２０５ＶＬＰが多量に沈殿する硫酸アンモニウム濃度を選択し、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２０分間）によって、この沈殿ステップのペレットから、ＡＰ２０５ＶＬＰを単離する。得られたペレットは、ＮＥＴバッファーに溶かす。
【０３１６】
クロマトグラフィー：
集めた上清からのキャプシドタンパク質を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（２．８×７０ｃｍ）に載せ、４ｍｌ／時間／分画でＮＥＴバッファーを用いて溶出した。分画２８〜４０を回収し、６０％飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。沈殿前に、ＡＰ２０５に特異的な抗血清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、これらの分画を分析した。遠心分離によって単離したペレットをＮＥＴバッファーに再溶解させ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂカラム（２．３×６５ｃｍ）に載せ、３ｍｌ／時間／分画で溶出した。分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、分画４４〜５０を回収し、これらを集めて、６０％飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。遠心分離によって単離したペレットをＮＥＴバッファーに再溶解させ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂカラム（２．５×４７ｃｍ）上で精製し、３ｍｌ／時間／分画で溶出した。分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。分画２３〜２７を回収し、塩濃度を０．５Ｍに調節し、ＰＥＧ６０００を用いて沈殿させ、４０％から１３．３％の最終濃度まで水に溶かしたストックを加えた。遠心分離によって単離したペレットをＮＥＴバッファーに再溶解させ、前と同じＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂカラムに載せ、同様に溶出した。分画４３〜５３を回収し、６０％飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。遠心分離によって単離したペレットを水に再溶解させ、得られたタンパク質溶液は水でのみ透析した。細胞１グラム当たり、約１０ｍｇの精製タンパク質を得ることができた。電子顕微鏡でウィルス様粒子を調べることによって、それらの粒子がファージ粒子と同一であったことが示された。
【実施例１８】
【０３１７】
免疫賦活性核酸は、ＨＢｃＡｇＶＬＰ中にパッケージ化することができる。
ＨＢｃＡｇＶＬＰは、Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質ｐ３３−ＨＢｃＡｇ（ＨＢｃ３３）（実施例１参照）を発現させることによって、大腸菌中で生成されると、ＲＮＡを含み、このＲＮＡを消化しＶＬＰとＲＮａｓｅＡをインキュベートすることによって除去することができる。ペプチドｐ３３を含むＶＬＰは単に便宜上の理由で使用しているにずぎず、野生型ＶＬＰを本発明において同様に使用することができることに留意しなければならない。
【０３１８】
酵素によるＲＮＡ加水分解：１×ＰＢＳバッファー（ＫＣＩ  ０．２ｇ／Ｌ、ＫＨ２Ｐ０４  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰ０４  １．１５ｇ／Ｌ）ｐＨ７．４中に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度である、組み換えによって生成させたＨＢｃＡｇ−ｐ３３（ＨＢｃ３３）ＶＬＰを、サーモミキサー中において６５０ｒｐｍで、３７℃で３時間、３００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下において、インキュベートした。
【０３１９】
免疫賦活性核酸のパッケージ化：ＲＮＡｓｅ  ＡによりＲＮＡを消化した後、ＨＢｃＡｇ−ｐ３３  ＶＬＰに、１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧ、ＮＫＣｐＧ、Ｇ１０−ＰＯ（表Ｉ）を補った。同様に、いずれもＣｐＧモチーフの多数のコピーを含む、１５０量体一本鎖Ｃｙ１５０−１、及び２５３量体二本鎖ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３を、それぞれ１３０ｎｍｏｌ／ｍｌまたは１．２ｎｍｏｌ／ｍｌで加え、サーモミキサー中において３７℃で３時間インキュベートした。二本鎖ＣｙＣｐＧ−２５３  ＤＮＡは、ＣｙＣｐＧの二本鎖マルチマーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−のＥｃｏＲＶ部位にクローニングすることによって生成させた。大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅにおいて生成され、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔを使用して単離した、生成したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＸｂａＩによって消化し、生成した制限酵素産物を、アガロースの電気泳動によって分離した。２５３ｂｐの挿入物を、エレクトロ−エリューション及びエタノール沈殿によって単離した。両方の鎖の配列決定によって、配列を確認した。
【０３２０】
表１：実施例で使用した免疫賦活性核酸の用語及び配列
小文字はチオリン酸結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示し、一方大文字はリン酸ジエステル結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示す。
0004598519.tif 000002
0004598519.tif 000003
【０３２１】
ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理：パッケージ化されたＨＢｃＡｇ−ｐ３３  ＶＬＰに、後に３７℃で３時間ＤＮａｓｅＩによる消化（５Ｕ／ｍｌ）を行い（ＤＮａｓｅＩ，ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４（２００倍体積に対して２倍）で２４時間かけて充分に透析して、ＲＮＡｓｅ  Ａ及び過剰なＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを排除した。
【０３２２】
ベンゾナーゼ処理：いくつかの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理に部分的に耐性があったので、ベンゾナーゼ処理を使用して、調製物から遊離オリゴヌクレオチドを排除した。１００〜１２０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を加え、透析前に３７℃で３時間インキュベートした。
【０３２３】
透析：マウスの免疫処置実験で使用する、免疫賦活性核酸をパッケージ化したＶＬＰ調製物を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４（２００倍体積に対して２倍）で２４時間かけて充分に透析して、加えた酵素及び遊離核酸を排除した。
【０３２４】
パッケージ化の分析：パッケージ化された免疫賦活性核酸の放出：５０μｌのキャプシド溶液に、１μｌのプロテイナーゼＫ（６００Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、３μｌの１０％  ＳＤＳ溶液、及び６μｌの１０倍プロテイナーゼバッファー（０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４）を加え、その後３７℃で一晩インキュベートした。このような条件下で、ＶＬＰを加水分解させる。プロテイナーゼＫは、６５℃で２０分間加熱することによって不活性化させた。１μｌのＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ、１００μｇ／ｍｌ、２５０倍希釈）を、２５μｌのキャプシドに加えた。２〜３０μｇのキャプシドを、１体積の２×ローディングバッファー（１×ＴＢＥ、４２％ｗ／ｖ尿素、１２％ｗ／ｖ  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０１％  Ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）と混合し、９５℃で３分間加熱し、１０％（約２０ｎｔ長のオリゴヌクレオチドの場合）または１５％（４０量体より小さい核酸の場合）ＴＢＥ／尿素ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に担持した。あるいはサンプルを、６×ローディング染料（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．４％オレンジＧ）を含む１％アガロースゲルに担持した。ＴＢＥ／尿素ゲルはＣＹＢＲＧｏｌｄで染色し、アガロースゲルは臭化エチジウムで染色した。
【０３２５】
図１２は、Ｇ１０−ＰＯオリゴヌクレオチドのＨＢｃ３３へのパッケージ化を示す。ＶＬＰ中のＲＮＡ含量はＲＮａｓｅＡ処理後に大幅に減少したが（図１２Ａ）、大部分のキャプシドは、おそらく負に帯電したＲＮＡが除去されたために、緩慢な移動物質として移動した（図１２Ｂ）。過剰のオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした後、これらのキャプシドは、ＲＮａｓｅＡ処理したキャプシドよりも多量の核酸を含んでおり、したがって未処理キャプシドと同じ速度で移動した。ＤＮＡｓｅ  Ｉまたはベンゾナーゼを用いた他の処理によって、遊離オリゴヌクレオチドが分解したが、キャプシド中にパッケージ化されたオリゴヌクレオチドは分解せず、オリゴヌクレオチドのパッケージ化が明らかに示された。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、ＤＮＡｓｅＩ／ベンゾナーゼ処理及び透析の後に、（実施例１５及び１６に記載したように）プロテイナーゼＫによる消化によって確認された。オリゴヌクレオチドはキャプシドの移動を元通りにするという知見によって、オリゴヌクレオチドのパッケージ化が明らかに実証された。
【０３２６】
この実施例中で使用し示した他のオリゴヌクレオチドについて、同様の結果及び数値を得た。
【実施例１９】
【０３２７】
Ｑβの分解、再構築及びパッケージ化
Ｑβ  ＶＬＰの分解及び再構築
分解：１０ｍｇのＱβ  ＶＬＰ（同義的にＱβキャプシドとも呼ぶ）（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定したもの）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌに溶かしたものを、最終飽和度６０％の固体硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。沈殿は４℃で一晩行い、沈殿したＶＬＰを４℃で６０分間の遠心分離によって沈殿させた（ＳＳ−３４ローター）。ペレットを、１００ｍＭのＤＴＴ（最終濃度）を含む１ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＩ）に再懸濁させ、４℃で８時間インキュベートした。
【０３２８】
サイズ排除クロマトグラフィーによるＱβコートタンパク質の精製：溶液は、１０分間１４０００ｒｐｍで浄化し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ、固定角ローターＦ４５−３０−１１中、以下のステップすべてで使用した）、７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴを含むバッファー（２０００ｍｌ）で一晩透析した。透析バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、分解したコートタンパク質及びＲＮＡを含む上澄みを、「充填用画分」として保存した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、５ｍｇの合計タンパク質を、７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１０ｍＭのＤＴＴを用いて平衡状態にした、ＨｉＬｏａｄ（商標）ＳｕｐｅｒｄｅＸ（商標）７５調製用カラム（２６／６０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に施した。サイズ排除クロマトグラフィーは、平衡化バッファー（７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴ）を用いて１２℃において、０．５ｍｌ／分の流速で行った。溶出中に、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。ピーク物質を１．５ｍｌの画分で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色、及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色によって、等分試料を分析した。これによって、第２のピークで溶出させたコートタンパク質から、ＲＮＡを分離することができたことが示された。
【０３２９】
イオン交換クロマトグラフィーによるＱβコートタンパク質の精製：あるいは、浄化した上澄みを、７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０を含むバッファー（２０００ｍｌ）で一晩透析した。透析バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、分解したコートタンパク質及びＲＮＡを含む上澄みを、「充填用画分」として保存した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、合計１０ｍｇの合計タンパク質を、バッファーＡ（以下参照）を用いて１０ｍｌの最終体積に希釈し、１ｍｌ／分の流速で、７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０のバッファーＡを用いて平衡状態にした、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１５１−０１）に施した。ＲＮＡを含んでいた流動物を、１つの画分として回収した。カラムをバッファーＡ（３０ＣＶ）で充分に洗浄した後、結合したＱβコートタンパク質を、０％〜１００％のバッファーＢの直線勾配（勾配長は５ＣＶであった；バッファーＡ：前を参照、バッファーＢ：７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で溶出させた。充填、洗浄及び溶出中に、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。１ｍｌのピーク画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色、及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色によって分析した。Ｑβコートタンパク質を含むがＲＮＡを含まない画分を識別し、１００μｌの１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることによって、ｐＨを調節した。
【０３３０】
Ｑβコートタンパク質を含むがＲＮＡを含まないサンプルを集め、０．８７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ、１０ｍＭのＤＴＴ（２０００ｍｌ）で一晩透析し、バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みを、「分解したコートタンパク質」として保存した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０３３１】
再構築：０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の精製したＱβコートタンパク質を、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下においてＶＬＰの再構築用に使用した。再構築反応用に、Ｑβ−ＶＬＰキャプシドの計算した理論上の量（１８０で割ったモノマー濃度）より１０倍過剰な、オリゴデオキシヌクレオチドを使用した。Ｑβコートタンパク質を、再構築反応中に、パッケージ化するオリゴデオキシヌクレオチドと混合した後、この溶液（５ｍｌまでの体積）を、４℃において１０％β−メルカプトエタノールを含む５００ｍｌのＮＥＴバッファーで２時間最初に透析し、次いで８ｍｌ／ｈというＮＥＴバッファーの流速で、４℃で７２時間かけて連続形式で透析し、最後にさらに７２時間、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌから構成されるバッファーを用いて、同じ連続形式で透析した。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みは、再構築しパッケージ化されたＶＬＰを含んでいた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、必要な場合は、再構築しパッケージ化されたＶＬＰを、遠心分離濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＶ４ＢＣＣ２５、５Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いて濃縮して、最終タンパク質濃度３ｍｇ／ｍｌにした。
【０３３２】
再構築しパッケージ化されたＶＬＰの精製：１０ｍｇまでの合計タンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡状態にした、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂカラム（１６／７０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に担持した。サイズ排除クロマトグラフィーは、平衡化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて室温において、０．４ｍｌ／分の流速で行った。溶出中に、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。０．５ｍｌの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシーブルー染色によって同定した。大腸菌由来の完全な充分に精製されたＱβキャプシドに関する、カラムの検量によって、主要な第１のピーク物質のみかけの分子量が、Ｑβキャプシドと一致することが明らかになった。
【０３３３】
オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの分析：
Ａ）キャプシドの全体的構造：以下のオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｙＯｐＡ（配列番号１２７）、Ｃｙ（ＣｐＧ）２００ｐＡ（配列番号１２６）、Ｃｙ（ＣｐＧ）２０（配列番号１２５）、ＣｙＣｙＣｙ（配列番号１２８）、（ＣｐＧ）２００ｐＡ）（配列番号１２４）の１つの存在下、または大腸菌由来のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９５４１）の存在下で、再構築したＱβ  ＶＬＰを、電子顕微鏡法（酢酸ウラニルｐＨ４．５によるネガティブ染色）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。陰性対照として、核酸が除去された再構築反応混合物が働いた。再構築型キャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じ構造的特徴及び性質を示した（図１３）。
Ｂ）再構築したキャプシドの流体力学的大きさ：オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβキャプシドを、動的光散乱装置（ＤＬＳ）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じ流体力学的大きさ（質量及び立体配座の両方に依存する）を示した。
Ｃ）再構築したキャプシド中のジスルフィド結合の形成：再構築したＱβ  ＶＬＰを、純粋なポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じジスルフィド結合型を示した。
Ｄ）アガロースゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析：５μｇの再構築したＱβ  ＶＬＰを、２５μｌの合計反応体積で、０．３５単位のＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）、１５単位のＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１３６）と共に、あるいは他の酵素は一切加えずに、３７℃において３時間インキュベートした。大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰが対照として働き、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したキャプシドに関して記載したのと同じ条件下で、これらをインキュベートした。次いで反応混合物を、最初に臭化エチジウム（図１４Ａ）、次にクーマシーブルー（図１４Ｂ）で染色した０．８％アガロースゲルに担持した。臭化エチジウム染色によって、加えた酵素はいずれも、再構築したＱβキャプシド中の核酸含有物を消化することができなかったことが示され、核酸含有物（すなわち、オリゴデオキシヌクレオチド）が保護されることが示される。この結果は、加えたオリゴデオキシヌクレオチドが、再構築反応中に新しく形成されたキャプシドにパッケージ化されたことを示す。対照的に、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰ中の核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａを加えることによって分解し、このＶＬＰ中の核酸含有物はＲＮＡからなることが示される。さらに、アガロースゲルの臭化エチジウム染色及びクーマシーブルー染色によって、核酸含有Ｑβ  ＶＬＰ（それぞれ大腸菌から再構築及び精製したもの）が、ほぼ同じ大きさで移動していることが示され、再構築反応によって、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰに匹敵する大きさの、Ｑβ  ＶＬＰがもたらされたことが示される。
【０３３４】
したがってゲルによって、ＤＮＡｓｅ  Ｉ保護型オリゴデオキシヌクレオチドが、再構築したＱβ  ＶＬＰ中に存在したことが示される。さらに、パッケージ化されたオリゴデオキシヌクレオチドを、フェノール／クロロホルムによって抽出させた後、それらはＤＮＡｓｅ  Ｉによって消化可能であったが、ＲＮＡｓｅ  Ａによって消化することはできなかった。したがってオリゴデオキシヌクレオチドは、ＶＬＰの最初の分解、核酸由来の分解したコートタンパク質の精製、及びその後のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのＶＬＰの再構築の後に、Ｑβ  ＶＬＰ中に首尾良くパッケージ化することができた。
【０３３５】
Ｅ）変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析：４０μｇの再構築したＱβ  ＶＬＰ（０．８ｍｇ／ｍｌ）を、６０μｌの合計反応体積で、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＰＣＲ−ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１９６４３６４）、及び反応バッファーと共に、製造者の指示に従って、３７℃において３時間インキュベートした。大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰが対照として働き、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したキャプシドに関して記載したのと同じ条件下で、これらをプロテイナーゼＫと共にインキュベートした。次いで反応混合物を、ＴＢＥ−尿素のサンプルバッファーと混合し、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６８８５）に担持した。定性及び定量標準として、１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ及び１０ｐｍｏｌの、再構築反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに担持した。このゲルを１０％酢酸、２０％メタノールで固定し、中性ｐＨに平衡化し、ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−１１４９４）で染色した。ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄによる染色によって、再構築したＱβキャプシドは、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した核酸を含んでいたことが示された。（大腸菌から精製した）完全なＱβ  ＶＬＰは、同じ大きさの核酸を含んでいなかったことに留意されたい。まとめると、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析によって、オリゴデオキシヌクレオチドがＤＮａｓｅ  Ｉによる消化から保護されたことが示され、それらがパッケージ化され、加えたオリゴデオキシヌクレオチドが、適切な手段（たとえば、プロテイナーゼＫによるＱβ  ＶＬＰの消化）によって、再び単離された可能性があることを意味している。
【０３３６】
図１３は、異なるオリゴデオキシヌクレオチドの存在下において再構築した、Ｑβ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。ＶＬＰは示したオリゴデオキシヌクレオチドの存在下、またはｔＲＮＡの存在下で再構築したが、サイズ排除クロマトグラフィーによって均質な懸濁液に精製したわけではなかった。陽性対照として、大腸菌から精製した「完全な」Ｑβ  ＶＬＰの調製物が働いた。重要なことに、任意の示した核酸を再構築反応中に加えることによって、「陽性」対照と比較すると、大きさ及び立体配座が適切であるＶＬＰを形成することができた。これによって、再構築プロセスは一般に、使用するオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列及び長さとは無関係であることが示される。核酸を再構築反応中に加えることは、Ｑβ  ＶＬＰを形成するために必要であることに留意されたい。なぜなら、再構築反応から核酸が除去された場合、粒子が形成されなかったからである。
【０３３７】
図１４は、ヌクレアーゼ処理及びアガロースゲルの電気泳動による、再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析を示す：５μｇの再構築及び精製したＱβ  ＶＬＰ、及び５μｇの大腸菌から精製したＱβ  ＶＬＰをそれぞれ、示したように処理した。この処理の後、サンプルをローディング染料と混合し、０．８％アガロースゲルに担持した。作業の後、ゲルを最初に臭化エチジウム（Ａ）で染色し、染色が示された後、同じゲルをクーマシーブルー（Ｂ）で染色した。再構築及び精製したＱβ  ＶＬＰの核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化に対して耐性があったが、一方大腸菌から精製したＱβ  ＶＬＰの核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａと共にインキュベートすると消化されたことに留意されたい。これによって、再構築したＱβキャプシドの核酸含有物はデオキシヌクレオチドからなっていることが示され、このデオキシヌクレオチドは当然ながら、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化から保護されている。したがって、オリゴデオキシヌクレオチドは、再構築反応中にＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化された。
【実施例２０】
【０３３８】
ＡＰ２０５の分解−精製−再構築、及び免疫賦活性核酸のパッケージ化
Ａ．オリゴヌクレオチドを加えずに再構築することができる物質由来の、ＡＰ２０５  ＶＬＰの分解及び再構築
分解：４０ｍｇの凍結乾燥させ精製したＡＰ２０５  ＶＬＰ（配列番号９０または９３）を、４ｍｌの６Ｍ  ＧｕＨＣｌに再溶解させ、４℃で一晩インキュベートした。分解混合物を、８０００ｒｐｍで遠心分離にかけた（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０  Ｒ、固定角ローターＦ３４−６−３８中、以下のステップすべてで使用した）。ペレットを７Ｍ尿素に再溶解させ、一方上澄みは、ＮＥＴバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、及び５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で３日間かけて透析し、バッファーは３回交換した。あるいは透析を、４日間かけて連続形式で行った。透析した溶液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけ、ペレットを７Ｍ尿素に再溶解させ、一方上澄みは、硫酸アンモニウム（６０％飽和）によってペレット状にし、１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた。７Ｍ尿素に再溶解させた前のペレットすべてを一緒にし、硫酸アンモニウム（６０％飽和）を用いて沈殿させ、１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた。１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた物質を一緒にし、平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムに充填し、２ｍｌ／ｈで１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーで溶出した。１ピークの物質がカラムから溶出した。３ｍｌの画分を回収した。ＡＰ２０５コートタンパク質を含むピーク画分を集め、硫酸アンモニウム（６０％飽和）を用いて沈殿させた。８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって、ペレットを単離した。それを７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴに再溶解させ、短いＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１．５×２７ｃｍ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、２ｍｌ／ｈ、７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、溶出バッファーとして）に充填した。ショルダー値が小さい、主に１ピークの物質が、カラムから溶出した。ＡＰ２０５コートタンパク質を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって識別し、ショルダー値のものを除き集めた。これによって１０．３ｍｌのサンプルを生成させた。タンパク質濃度は、測定用に２５倍希釈したタンパク質の等分試料を測定することにより、分光測定法によって測定した。以下の式：（１．５５×ＯＤ２８０−０．７６×ＯＤ２６０）×体積を使用した。平均濃度は、ＶＬＰ（２．６ｍｇ／ｍｌ）１ｎｍｏｌ／ｍｌであった。２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の比は、０．１２／０．１０５であった。
【０３３９】
再構築：１．１ｍｌのβ−メルカプトエタノールをサンプルに加え、以下の再構築反応物を設定した：
１ｍｌのＡＰ２０５コートタンパク質、核酸含まず
１ｍｌのＡＰ２０５コートタンパク質、ｒＲＮＡ（約２００  ＯＤ２６０単位、１０ｎｍｏｌ）
９ｍｌのＡＰ２０５コートタンパク質、ＣｙＣｐＧ（２２５ｐｍｏｌ／ｕｌの溶液３７０ｕｌ、すなわち８３ｎｍｏｌ）
【０３４０】
これらの混合物を、１０％β−メルカプトエタノールを含む３０ｍｌのＮＥＴバッファーで１時間透析した。核酸を含まない混合物は別に透析した。その後透析を連続形式で続け、１リットルのＮＥＴバッファーを３日間にわたって交換した。反応混合物は、水でその後充分に透析し（バッファー５回交換）、凍結乾燥させた。これらを水に再溶解させ、ＥＭによって分析した。臭化エチジウム染色を使用したアガロースゲル電気泳動によって測定し、ＥＭ分析で立証したように、混合物はすべて、キャプシドを含んでおり、ＡＰ２０５  ＶＬＰの再構築は検出可能な核酸の存在と無関係であることが示される。ＥＭ手順は以下の通りであった：タンパク質の懸濁液を、カーボン−ホルムバール被覆型グリッドに吸収させ、２％リンタングステン酸（ｐＨ６，８）で染色した。グリッドは、ＪＥＭ  １００Ｃ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）電子顕微鏡を用いて８０ｋＶの加速電圧で調べた。写真による記録（ネガ）をＫｏｄａｋ電子画像フィルム上に行い、Ｋｏｄａｋ  Ｐｏｌｙｍａｘ紙上にネガをプリントすることによって、電子顕微鏡写真を得た。ＣｙＣｐＧの存在下で再構築したＶＬＰを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１×５０ｃｍ）で精製し、ＮＥＴバッファーで溶出させた（１ｍｌ／ｈ）。画分をオクタロニー分析によって分析し、ＶＬＰを含む画分を集めた。これによって８ｍｌのサンプルを生成させ、このサンプルを透析により水で脱塩し、乾燥させた。キャプシドの収量は１０ｍｇであった。臭化エチジウムで染色した０．６％アガロースゲル中の、再溶解物質を分析することによって、キャプシドが核酸を含んでいなかったことが示された。再構築ステップ後及びさらなる透析前に採取した、ＣｙＣｐＧを含む再構築反応混合物のサンプルを、０．６％アガロースゲル上で分析した。完全なＡＰ２０５  ＶＬＰと同じ高さで移動し、かつ臭化エチジウム及びクーマシーブルー染色用に染色されたバンドを得ることができ、オリゴデオキシヌクレオチドを含むＡＰ２０５  ＶＬＰが再構築したことが示された。再構築手順の後のさらなる透析ステップによって、ＶＬＰの外側へのオリゴデオキシヌクレオチドの拡散がもたらされた可能性がある。重要なことに、臭化エチジウム染色を使用したアガロースゲル電気泳動によって測定したように、ＡＰ２０５  ＶＬＰは、検出可能なオリゴデオキシヌクレオチドの不在下でも再構築することができた。したがってオリゴデオキシヌクレオチドは、ＶＬＰの最初の分解、核酸由来の分解したコートタンパク質の精製、及びその後のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのＶＬＰの再構築の後に、ＡＰ２０５  ＶＬＰと首尾良く結合することができた。
【０３４１】
Ｂ．添加オリゴヌクレオチドの不在下では再構築することができない分解した物質を使用する、ＡＰ２０５  ＶＬＰの再構築
分解：１００ｍｇの精製し、乾燥した組み換えＡＰ２０５  ＶＬＰを、前に記載したように分解用に使用した。すべてのステップは、本質的にＡ項の分解で記載したのと同様に行った。ただし、８Ｍ尿素を使用して、硫酸アンモニウム沈殿ステップのペレットを可溶化させ、再構築前のＣＬ−４Ｂカラムを使用するゲル濾過ステップは省略した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラムの集めた画分は、Ａ項に記載した式を使用する分光測定法により測定して、２１ｍｇのタンパク質を含んでいた。サンプルの２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の比は、０．１６〜０．１２５であった。このサンプルは、測定用に５０倍希釈した。
【０３４２】
再構築：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５によるゲル濾過精製ステップから生じたタンパク質調製物を、６０％飽和の硫酸アンモニウムによって沈殿させ、生成したペレットを、２ｍｌの７Ｍ尿素、１０ｍＭのＤＴＴに可溶化させた。１０％  ２−メルカプトエタノールをＮＥＴバッファーに溶かしたもの８ｍｌで、サンプルを希釈し、１０％  ２−メルカプトエタノールをＮＥＴバッファーに溶かしたもの４０ｍｌで１時間透析した。透析バッグ中で、０．４ｍｌのＣｙＣｐＧ溶液（１０９ｎｍｏｌ／ｍｌ）をタンパク質サンプルに加えることによって、再構築を開始させた。連続形式の透析を設定し、ＮＥＴバッファーを溶出バッファーとして使用した。透析は２日間続け、この透析ステップの終了後に、サンプルをＥＭ分析用に採取した（図４４Ｂ）。透析した再構築溶液を、その後ＮＥＴバッファーに溶かした５０％ｖ／ｖグリセロールで透析し、濃度を得た。１回のバッファーの交換を、透析の１日後に行った。透析は合計３日間続けた。
【０３４３】
透析及び濃縮した再構築溶液を、ＮＥＴバッファー中において、流速１ｍｌ／時間でのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４−Ｂカラム（１×６０ｃｍ）によるゲル濾過によって精製した。画分をオクタロニー分析において試験し、キャプシドを含む画分を乾燥させ、水に再懸濁させ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．６中で平衡化させた４−Ｂカラムにおいて、再びクロマトグラフィーにかけた。それぞれの以下の３つの式を使用した：
１．（１８３＊ＯＤ２３０ｎｍ−７５．８＊ＯＤ２６０ｎｍ）＊体積（ｍｌ）−２．（（ＯＤ２３５ｎｍ−ＯＤ２８０ｎｍ）／２．５１）×体積−３．（（ＯＤ２２８．５ｎｍ−ＯＤ２３４．５ｎｍ）＊０．３７）×体積
再構築したＶＬＰの６〜２６ｍｇのタンパク質量を測定した。
【０３４４】
再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰは、非還元条件下において、前に記載したのと同様のＥＭ、アガロースゲル電気泳動及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３４５】
分解した物質のＥＭ分析によって、ＡＰ２０５  ＶＬＰを塩酸グアニジンで処理することにより、ＶＬＰのキャプシド集合体が本質的に破壊されることが示される。この分解した物質とオリゴヌクレオチドの再構築よってキャプシドが生じ（図１５Ｂ）、これを精製し、ゲル濾過によってさらに富化させた（図１５Ｃ）。２つの大きさの粒子を得た；直径約２５ｎｍの粒子、及び小さな粒子は、図４４Ｃの電子顕微鏡写真において見ることができる。オリゴヌクレオチドの不在下では、再構築体は得られなかった。アガロースゲル電気泳動で、再構築した粒子を担持することによって、再構築した粒子が核酸を含んでいたことが示された。フェノール抽出による核酸含有物の抽出、及びその後臭化エチジウムで染色したアガロースゲルに担持することによって、これらの粒子が、再構築用に使用したオリゴヌクレオチドを含んでいたことが明らかになった（図４５Ａ）。パッケージ化されるオリゴヌクレオチドの同一性は、このオリゴヌクレオチドのサンプルを粒子から抽出した核酸物質の傍らにに担持することによって調節した。再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰを担持し、前に臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを、次にクーマシーブルーで染色し、オリゴヌクレオチド含有物と粒子のタンパク質含有物が同時に移動したことが明らかになり（図１６Ｂ）、オリゴヌクレオチドが粒子にパッケージ化されたことが示された。
【０３４６】
再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに担持し、還元剤の不在下で作業することにより、再構築した粒子が、未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰの場合と同様に、ジスルフィド結合を形成したことが示された。さらに、そのジスルフィド結合型は、未処理粒子と同一である。
【０３４７】
図１５Ａに示すのは、分解したＡＰ２０５  ＶＬＰタンパク質の電子顕微鏡写真であり、一方図１５Ｂは、精製前に再構築した粒子を示す。図１５Ｃは、精製した再構築ＡＰ２０５  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。図３Ａ〜Ｃの倍率は、２０００００倍である。
【０３４８】
図１６Ａ及びＢは、アガロースゲル電気泳動によって分析した、再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰを示す。両方の図のゲルに担持したサンプルは、左から右に：未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰ、ＣｙＣｐＧと再構築し精製された異なる量のＡＰ２０５  ＶＬＰを含む３個のサンプル、及び未処理Ｑβ  ＶＬＰであった。図１６Ａのゲルは臭化エチジウムで染色し、一方図１６Ｂでは、同じゲルをクーマシーブルーで染色した。
【実施例２１】
【０３４９】
免疫賦活性核酸は、Ｑβ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ｐ３３ペプチドとＱβ  ＶＬＰの結合：
ＲＮＡバクテリオファージＱｂの組み換えによって生成させたウィルス様粒子（ＱＢ  ＶＬＰ）を、未処理で、あるいはＮ末端ＣＧＧまたは及びＣ末端ＧＧＣ延長部（ＣＧＧ−ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ（配列番号１１５）及びＫＡＶＹＮＦＡＴＭ−ＧＧＣ（配列番号１３１））を含む、ｐ３３ペプチドと結合させた後に使用した。組み換えによって生成させたＱβ  ＶＬＰを、２５℃で０．５時間、１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて誘導体化させ、次に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で４℃において透析して、未反応ＳＭＰＨを除去した。５倍モル過剰のペプチドを加え、３０％アセトニトリルの存在下で、サーモミキサー中において２５℃で２時間反応させた。図１７は、多数の結合バンドが、Ｑβモノマーと結合した１個、２個または３個のペプチドからなることを実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（矢印、図１７）。簡潔性のために、ペプチドｐ３３とＱβＶＬＰの結合産物は、特に実施例項中ではＱｂｘ３３と名付けた。ペプチドｐ３３を含むＶＬＰは単に便宜上の理由で使用しているにすぎず、野生型ＶＬＰを本発明において同様に使用することができることに留意しなければならない。
【０３５０】
Ｑβ  ＶＬＰは、バクテリオファージＱβキャプシドタンパク質を発現することによって大腸菌中で生成されると、ＲＮＡを含み、このＲＮＡを消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる。
【０３５１】
低いイオン強度及び低いＱβ濃度が、ＲＮａｓｅ  ＡによるＱβ  ＶＬＰのＲＮＡ加水分解を可能にする：
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＱβ  ＶＬＰを、ＲＮａｓｅ  Ａ（３００μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を加えることによって直接消化し、あるいは４倍体積のＨ２Ｏで希釈して、最終０．２×ＨＢＳ濃度にし、次いでＲＮａｓｅ  Ａ（６０μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共にインキュベートした。インキュベーションは、サーモミキサー中において６５０ｒｐｍで、３７℃において３時間行った。アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によって、１×ＨＢＳでは、ＲＮＡ含量の非常にわずかな減少が観察され、一方０．２×ＨＢＳでは、大部分のＲＮＡが加水分解されたことが実証される。これと一致して、１×ＨＢＳ中に溶かしたＲＮＡｓｅ  Ａを加えた後、キャプシドの移動は変化がなかったが、一方０．２×ＨＢＳ中に溶かしたＲＮＡｓｅ  Ａを加えた後には、移動が遅くなった。
【０３５２】
低いイオン強度が、Ｑβ  ＶＬＰ中の核酸のパッケージ化を増加させる：
ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後、０．２×ＨＢＳ中に、Ｑβ  ＶＬＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｉｃｒｏｃｏｎまたはＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮装置を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、等分試料を１×ＨＢＳまたは０．２×ＨＢＳで透析した。Ｑβ  ＶＬＰに１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧを補い、サーモミキサー中で３７℃において３時間インキュベートした。その後Ｑβ  ＶＬＰに、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）による消化を３７℃において３時間行った。サンプルは、臭化エチジウムまたはクーマシーブルーで染色した後、１％アガロースゲル上で分析した。１×ＨＢＳ中では、非常に少量のオリゴヌクレオチドのみをパッケージ化することができたが、一方０．２×ＨＢＳ中では、強烈な臭化エチジウム染色バンドが検出可能であり、これがキャプシドのクーマシーブルー染色部分と同時局在していたことが示された。
【０３５３】
異なる免疫賦活性核酸を、Ｑβ及びＱｂｘ３３  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる：
ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後、０．２×ＨＢＳ中に、Ｑβ  ＶＬＰまたはＱｂｘ３３  ＶＬＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｉｃｒｏｃｏｎまたはＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮装置を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧｐｔ、ｇ１０ｇａｃｇａ及び２５３量体ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３（表Ｉ）を補い、サーモミキサー中で３７℃において３時間インキュベートした。その後Ｑβ  ＶＬＰまたはＱｂｘ３３  ＶＬＰに、ＤＮＡｓｅ  Ｉによる消化（５Ｕ／ｍｌ）またはベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）による消化を、３７℃において３時間行った。サンプルは、臭化エチジウムまたはクーマシーブルーで染色した後、１％アガロースゲル上で分析した。図１８は、異なる核酸Ｂ−ＣｐＧｐｔ、ｇ１０ｇａｃｇａ及び２５３量体ｄｓＤＮＡを、Ｑｂｘ３３中にパッケージ化することができたことを示す。パッケージ化された核酸はＤＮＡｓｅ  Ｉによる消化に耐性があり、透析中パッケージ化されたままであった（図１８）。Ｂ−ＣｐＧｐｔのパッケージ化は、プロテイナーゼＫによる消化による核酸の放出、次にアガロースの電気泳動及び臭化エチジウム染色によって確認した（図１８Ｃ）。
【０３５４】
図１８は、臭化エチジウム（Ａ）及びクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロースゲル上での、Ｂ−ＣｐＧｐｔのＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の５０μｇのサンプルである：１．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＢ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；５．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー。（Ｃ）は、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ／尿素上における、ＶＬＰから抽出されたパッケージ化されたオリゴの量の分析を示す：ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．ＢＣｐＧｐｔオリゴ含有２μｇＱｂｘ３３  ＶＬＰ、プロテイナーゼＫで消化した後の、ＲＮａｓｅ  Ａ処理したもの；２．２０ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔ対照；３．１０ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔ対照；４．５ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔ対照。
【０３５５】
図１８Ｄ及びＥは、臭化エチジウム（Ｄ）及びクーマシーブルー（Ｅ）で染色した１％アガロースゲル上での、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の１５μｇのサンプルである：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化したもの；５．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化し、ベンゾナーゼで処理し、かつ透析したもの。
【０３５６】
図１８Ｅ及びＦは、臭化エチジウム（Ｅ）及びクーマシーブルー（Ｆ）で染色した１％アガロースゲル上での、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３のＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の１５μｇのサンプルである：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３をパッケージ化し、かつＤＮａｓｅＩで処理したもの；５．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３をパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの。
【実施例２２】
【０３５７】
免疫賦活核酸のＶＬＰへのパッケージ化。
ＶＬＰの核酸含有物のＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４仲介性の分解。
ＱβＶＬＰを、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４または４ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において、実施例２１に記載したのと同様にＲＮａｓｅＡで処理した。あるいは、ＱβＶＬＰ及びＡＰ２０５ＶＬＰを、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４または４ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において、実施例１１に記載したのと同様にＺｎＳＯ４で処理した。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４または２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４中に溶かした、ＡＰ２０５ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を、５０℃においてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ中５５０ｒｐｍで、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４を用いて４８時間処理した。Ｑβ及びＡＰ２０５ＶＬＰサンプルを、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、最初に２１２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４を用いて４℃において２時間、バッファーを交換した後一晩、１０．０００ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｃａｔ．ｎｒ．１２８  １１８）中で、上清を透析した。サンプルは実施例１１に記載したのと同様の透析後に浄化し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０３５８】
ＩＳＳのＲＮａｓｅＡ及びＺｎＳＯ４処理ＶＬＰへのパッケージ化
ＲＮＡ加水分解及び透析の後、Ｑβ及びＡＰ２０５ＶＬＰ（１〜１．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＶＬＰ１ｍｌ当たり、１３０μｌのＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＮＫＣｐＧ、例えば表１；Ｇ３−６、Ｇ８−８、例えば表２；１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８中の１ｍＭのオリゴヌクレオチドストック）と混合させた。サンプルは、サーモシェーカー中において６５０ｒｐｍで、３７℃で３時間インキュベートした。次にサンプルを、２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下において、１２５Ｕのベンゾナーゼ／ＶＬＰ１ｍｌ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理し、透析前に３７℃で３時間インキュベートした。サンプルは、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で４℃において２時間、バッファーを交換した後同じバッファーで一晩、３００．０００  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｃａｔ．ｎｒ．１３１  ４４７）中で透析した。透析後、サンプルを１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０３５９】
アガロースゲル電気泳動、ならびにその後の臭化エチジウム及びクーマシーブルーによる染色によって、オリゴヌクレオチドがＶＬＰにパッケージ化されたことが示された。
【実施例２３】
【０３６０】
免疫賦活性のグアノシンと隣接するオリゴヌクレオチドの、ＶＬＰへのパッケージ化。
Ｑｂｘ３３ＶＬＰ（ペプチドｐ３３と結合したＱβＶＬＰ、実施例２１参照）を、実施例２１に記載したのと同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）においてＲＮａｓｅＡで処理して、Ｑｂｘ３３ＶＬＰのＲＮＡ含有物を加水分解した。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４での透析後、Ｑｂｘ３３ＶＬＰを、グアノシンと隣接するオリゴヌクレオチド（表２：Ｇ３−６、Ｇ７−７、Ｇ８−８、Ｇ９−９またはＧ６、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８中の１ｍＭのオリゴヌクレオチドストックからのもの）と混合させ、実施例２２に記載したのと同様にインキュベートした。その後、Ｑｂｘ３３ＶＬＰをベンゾナーゼで処理し、３００．０００ＭＷＣＯチューブ中で透析した。オリゴＧ７−７、Ｇ８−８及びＧ９−９を含むサンプルを、４回バッファーを交換して３日間充分に透析して、遊離オリゴを除去した。１％アガロースゲル上で、プロテイナーゼＫによる消化後、ＴＢＥ／尿素ゲル上で、パッケージ化を確認した。
【０３６１】
表２．実施例で使用した免疫賦活性核酸の配列
小文字は、チオリン酸結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示し、大文字は、リン酸ジエステル結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示す。
【０３６２】
0004598519.tif 000004
0004598519.tif 000005
【実施例２４】
【０３６３】
ＶＬＰへのリボ核酸のパッケージ化
ＶＬＰの核酸含有物のＺｎＳＯ４依存性の分解
ＱβＶＬＰを、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４または４ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において、実施例１１に記載したのと同様にＺｎＳＯ４で処理した。ＡＰ２０５ＶＬＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を、５０℃においてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ中５５０ｒｐｍで、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４を用いて４８時間処理した。Ｑβ及びＡＰ２０５ＶＬＰサンプルを、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、実施例２２と同様に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で透析した。
【０３６４】
ＺｎＳＯ４処理ＶＬＰへのポリ（Ｉ：Ｃ）のパッケージ化：
免疫賦活性リボ核酸ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｃａｔ．ｎｒ．２７−４７３２−０１、ポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．ｎｒ．１４０４０）または水に溶かして、４ｍｇ／ｍｌ（９μＭ）の濃度にした。ポリ（Ｉ：Ｃ）を６０℃で１０分間インキュベートし、次いで３７℃に冷却した。インキュベートしたポリ（Ｉ：Ｃ）を、１０倍モル過剰でＺｎＳＯ４処理Ｑβ及びＡＰ２０５ＶＬＰ（１〜１．５ｍｇ／ｍｌ）に加え、この混合物は、６５０ｒｐｍでサーモミキサー中において、３７℃で３時間インキュベートした。その後、過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を、３００ｒｐｍでサーモミキサー中において３７℃で３時間、２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で、ＶＬＰ混合物１ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼとインキュベートすることによって、酵素により加水分解した。ベンゾナーゼによる加水分解後、サンプルを１４０００ｒｐｍで遠心分離し、３００．０００ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｃａｔ．ｎｒ．１３１  ４４７）中において、２１２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で４℃において２時間、バッファーを交換した後同じバッファーで一晩、上清を透析した。透析後、サンプルを１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【０３６５】
１％アガロースゲル上で、プロテイナーゼＫによる消化後、ＴＢＥ／尿素ゲル上で、パッケージ化を確認する。
【実施例２５】
【０３６６】
免疫賦活性のグアノシンと隣接するオリゴヌクレオチドの、ＨＢｃＡｇＶＬＰへのパッケージ化。
ＨＢｃＡｇＶＬＰを、実施例２１に記載したのと同様に、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）においてＲＮａｓｅＡで処理して、ＶＬＰのＲＮＡ含有物を加水分解する。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４での透析後、ＶＬＰを、グアノシンと隣接するオリゴヌクレオチド（表２：Ｇ３−６、Ｇ７−７、Ｇ８−８、Ｇ９−９、Ｇ１０−ＰＯまたはＧ６、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８中の１ｍＭのストック）と混合させ、実施例２２に記載したのと同様にインキュベートした。その後、ＶＬＰをベンゾナーゼで処理し、３００．０００ＭＷＣＯチューブ中で透析した。１％アガロースゲル上で、プロテイナーゼＫによる消化後、ＴＢＥ／尿素ゲル上で、パッケージ化を分析する。
【実施例２６】
【０３６７】
ＨＢｃＡｇＶＬＰへのリボ核酸のパッケージ化。
ＨＢｃＡｇＶＬＰを、低イオン強度条件（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４または４ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において、実施例１１に記載したのと同様にＺｎＳＯ４で処理し、実施例２２と同様に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で透析した。ポリ（Ｉ：Ｃ）を、１０倍モル過剰でＨＢｃＡｇＶＬＰに加え（１〜１．５ｍｇ／ｍｌ）、実施例２４に記載したのと同様に、６５０ｒｐｍでサーモミキサー中において、３７℃で３時間インキュベートした。その後、過剰な遊離ポリ（Ｉ：Ｃ）を、３００ｒｐｍでサーモミキサー中において３７℃で３時間、２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で、ＶＬＰ混合物１ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼとインキュベートすることによって、酵素により加水分解した。サンプルは、ベンゾナーゼによる加水分解後、実施例１１に記載したのと同様に浄化し、実施例２４に記載したのと同様に透析した。透析後、サンプルを１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。
【実施例２７】
【０３６８】
Ｑβの分解、再構築、及びパッケージ化
ＱβＶＬＰの分解及び再構築
分解：４５ｍｇのＱβＶＬＰ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に溶かしたものを、攪拌条件下において室温で１５分間、１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元した。７００ｍＭの最終濃度まで塩化マグネシウムを加えた後、攪拌条件下における室温で１５分間の第２のインキュベーションを行いＲＮＡを沈殿させた。溶液を４℃において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ、固定角ローターＡ−４−６２中、以下のステップすべてで使用した）、ペレット中の沈殿したＲＮＡを単離した。上清中の分解されたＱβコートタンパク質二量体を、クロマトグラフィーによる精製ステップ用にそのまま使用した。
【０３６９】
陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによる、分解Ｑβコートタンパク質二量体の２ステップの精製法：分解されたコートタンパク質及び残存ＲＮＡを含む、分解反応の上清を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（１６／２０；６ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）に施した。５ｍｌ／分の流速で室温において行った展開中に、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７を用いてカラムを平衡状態にし、サンプルは１：１０に希釈して、９ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度にした（この伝導度までの希釈が必要であった、これは０．５×平衡化バッファーを使用して行った）。溶離ステップ（５ｍｌ分画中）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウムに対する勾配で続けて、汚染物質から純粋なＱβコートタンパク質二量体を単離した。カラムは０．５ＭのＮａＯＨで再生した。
【０３７０】
第２のステップでは、単離したＱβコートタンパク質二量体（陽イオン交換カラムから溶離させた分画）を、バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）を用いて平衡状態にした、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲカラム（２６／６０；３２０ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）に施した（２つに展開）。クロマトグラフィーは、室温において流速２．５ｍｌ／分で行った。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで吸光度を測定した。５ｍｌの分画を回収した。カラムは０．５ＭのＮａＯＨで再生した。
【０３７１】
再構築：２ｍｇ／ｍｌの濃度の精製したＱβコートタンパク質二量体を、オリゴデオキシヌクレオチドＧ８−８の存在下においてＱβＶＬＰの再構築用に使用した。再構築反応用の、オリゴデオキシヌクレオチド濃度は１０μＭであった。再構築反応用の、コートタンパク質二量体の濃度は４０μＭであった。尿素及びＤＴＴを溶液に加えて、それぞれ１Ｍの尿素及び５ｍＭのＤＴＴの最終濃度を与えた。再構築反応中に、パッケージ化したオリゴデオキシヌクレオチドを、最後にＨ２Ｏと共に加えて、３ｍｌという再構築反応の最終体積を与えた。この溶液を、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含む１５００ｍｌのバッファーで４℃において、７２時間最初に透析した。透析した再構築混合物を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できる程度の沈殿物を捨て、上清は、再構築しパッケージ化されたＶＬＰを含んでいた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。再構築しパッケージ化されたＶＬＰを、遠心分離濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＶ４ＢＣＣ２５，５Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いて濃縮して、最終タンパク質濃度３ｍｇ／ｍｌにした。
【０３７２】
再構築しパッケージされたＶＬＰの精製：１０ｍｇまでの合計タンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて平衡状態にした、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−４Ｂカラム（１６／７０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に載せた。サイズ排除クロマトグラフィーは、平衡化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて室温において、０．４ｍｌ／分の流速で行った。２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。０．５ｍｌの分画を回収し、これらの分画を含むＱｂＶＬＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシーブルー染色によって確認した。大腸菌由来の完全な充分に精製されたＱβキャプシドに関する、カラムの検量によって、主要な第１のピーク物質のみかけの分子量が、Ｑβキャプシドと一致することが明らかになった。
【０３７３】
オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβＶＬＰの分析：
Ａ）再構築したキャプシドの流体力学的大きさ：オリゴデオキシヌクレオチドＧ８−８の存在下で再構築したＱβキャプシドを、動的光散乱装置（ＤＬＳ）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβＶＬＰと同じ流体力学的大きさ（質量及び立体配座の両方に依存する）を示した。
Ｂ）再構築したキャプシド中のジスルフィド結合の形成：再構築したＱβＶＬＰを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、ペンタマー及びヘキサマーの存在によって、完全なＱβＶＬＰと同じジスルフィド結合型を示した。
Ｃ）変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβＶＬＰの核酸含量の分析：Ｇ８−８オリゴヌクレオチドを含む、再構築したＱβＶＬＰ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を、２ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で、ＱβＶＬＰ混合物１ｍｌ当たり１２５Ｕのベンゾナーゼと共に、３７℃で２時間インキュベートした。その後、ベンゾナーゼ処理したＱβＶＬＰを、実施例１１に記載したのと同様に、プロテイナーゼＫ（ＰＣＲ−ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号１９６４３６４）で処理した。次いで反応混合物をＴＢＥ−尿素サンプルバッファーと混合し、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５）に載せた。定性及び定量標準として、１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ及び１０ｐｍｏｌの、再集合反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに載せた。このゲルを、ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  カタログ番号Ｓ−１１４９４）で染色した。ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄによる染色によって、再構築したＱβキャプシドは、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した核酸を含んでいたことが示された。まとめると、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下における、再構築したＱβＶＬＰの核酸含有物のベンゾナーゼによる消化に対する耐性、及びプロテイナーゼＫの消化による精製した粒子からのオリゴデオキシヌクレオチドの単離によって、オリゴデオキシヌクレオチドのパッケージ化が実証される。
【実施例２８】
【０３７４】
Ｇ１０−ＰＯを含むＶＬＰは、Ａｌｕｍの存在下において、同時投与される牧草花粉抽出物に対するＴｈ１型応答を誘導する。
ＲＮＡバクテリオファージＱｂのコートタンパク質によって形成されたＶＬＰを、この実験用に使用した。これらは未処理で使用し、あるいは実施例１５に記載したのと同様に、Ｇ１０−ＰＯ（配列番号１２２）とのパッケージ化後に使用した。メスのＢａｌｂ／ｃマウスを、５０μｇのＱｂＶＬＰのみ、あるいはＧ１０−ＰＯと共に、それぞれ充填及びパッケージ化した５０μｇのＱｂＶＬＰの存在下において、Ａｌｕｍ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）と混合させた、１．９Ｂ．Ｕ．の牧草花粉抽出物（５−ｇｒａｓ−ｍｉｘ  Ｐａｎｇｒａｎｍｉｎ、Ａｂｅｌｌｏ、多年生ライムギ、果樹、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス、及びヒロハノウシノケグサの花粉から調製したもの）で、皮下を免疫処置した。対照群のマウスには、Ａｌｕｍのみと混合した花粉抽出物を与えた。５０日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激し、第５７日に出血させた。第５７日からの血清中のＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。対照群はＩｇＧ１イソ型の抗花粉抗体を示したが、ＩｇＧ２ａイソ型は示さなかった。Ｇ１０−ＰＯが充填されたＶＬＰの存在によって、花粉抽出物に対するＩｇＧ２ａ応答が誘導された。Ｇ１０−ＰＯと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰの存在下では、花粉抽出物に対するＩｇＥは誘導されなかったが、一方Ａｌｕｍのみの存在下では、ＩｇＥ応答が観察された。これによって、ＶＬＰに充填されたＧ１０−ＰＯは、Ｔｈ１応答を誘導し、Ａｌｕｍ誘導型のＩｇＥ生成を抑制することができることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０３７５】
【図１】対照インキュベーション後、またはＲＮａｓｅＡによる消化後の、純粋なアガロースゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す図である。臭化エチジウム（Ａ）またはクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡまたはタンパク質の存在を評価した。組み換えによって生成させたＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５ｕｇ／ｕｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）または存在下（レーン２）において、３７℃で２時間インキュベートした。その後これらのサンプルに、６倍濃縮したＤＮＡローディングバッファー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補い、１％の純粋なアガロースゲル中に１００ボルトで３０分間展開した。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ＶＬＰ中に封入されたＲＮＡ（Ａ）またはＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。３個の独立した実験において、同一の結果を得た。
【図２】バッファーのみまたはＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴマーの存在下での、対照インキュベーション後、またはＲＮａｓｅＡによる消化後の、純粋なアガロースゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す図である。臭化エチジウム（Ａ）またはクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはタンパク質の存在を評価した。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５ｕｇ／ｕｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）または存在下（レーン２及び３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（骨格のチオリン酸の修飾塩基を含む）を、ＲＮａｓｅＡによる消化の前にサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰ中に封入されたＲＮＡ／ＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）またはｐ３３−ＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン酸結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドをＶＬＰとＲＮａｓｅＡの同時インキュベーション用に使用したところ、ほぼ同等の結果を得た。
【図３】ＣｐＧ含有ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドの存在下でのＲＮａｓｅＡによる消化、及びその後の透析（ＶＬＰ非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを排除するため）前後の、純粋なアガロースゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す図である。臭化エチジウム（Ａ）またはクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＤＮＡまたはタンパク質の存在を評価した。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５ｕｇ／ｕｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）または存在下（レーン２〜５）において、３７℃で２時間インキュベートした。５０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（チオリン酸結合を含む：レーン２及び３、リン酸骨格の正常なリン酸修飾塩基を含む：レーン４及び５）を、ＲＮａｓｅＡによる消化の前にＶＬＰに加えた。処理したサンプルを、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ（４５００倍希釈）で２４時間かけて充分に透析して、過剰なＤＮＡを排除した（レーン３及び５）。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ＶＬＰ中に封入されたＲＮＡ／ＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）またはＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。
【図４】対照インキュベーション後、またはＲＮａｓｅＡによる消化後の、純粋なアガロースゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるＶＬＰを示す図である。ＣｐＧ含有ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ消化が終了した後でのみ加え、臭化エチジウム（Ａ）またはクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはタンパク質の存在を評価した。組み換えＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５ｕｇ／ｕｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）または存在下（レーン２及び３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のチオリン酸の修飾塩基を含む）を、ＲＮａｓｅＡによる消化の後でのみサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ＶＬＰ中に封入されたＲＮＡ／ＣｐＧ−ＤＮＡ（Ａ）またはＶＬＰ自体（Ｂ）の存在を示している。正常なリン酸結合を有するＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを、ＶＬＰを再構築させるために使用すると、同一の結果を得た。
【図５】ＣｐＧ多量ＤＮＡ（正常なリン酸ジエステル部分を含む）内に担持されるＨＢｃＡｇに由来し、非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから透析させた、ＲＮａｓｅＡ処理したＶＬＰは、蜂毒液アレルゲン（ＢＶ）に対するＩｇＧ応答を高める際に有効であることを示す図である。マウスは、５μｇの蜂毒液（ＡＬＫ  Ａｂｅｌｌｏ）単独で、あるいはこれを以下の１つ：５０μｇのＶＬＰ単独、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化した５０μｇのＶＬＰ、または２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合させた５０μｇのＶＬＰと混合させたもので、皮下を初回抗原刺激した。あるいはマウスは、ＶＬＰ単独、または水酸化アルミニウムと結合したＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＶＬＰと混合させた５μｇの蜂毒液で、初回抗原刺激した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激し、第２１日に出血させた。血清中の蜂毒液特異的ＩｇＧ応答は、ＥＬＩＳＡによって評価した。これらの結果は、示した血清希釈液に関する光学濃度として示す。それぞれ２匹のマウスの平均を示す。
【図６】ＣｐＧ多量ＤＮＡ（正常なリン酸結合を含む）内に担持され、非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから透析させた、ＲＮａｓｅＡ処理したＶＬＰ（ＨＢｃ）は、蜂毒液アレルゲンＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）に対するＩｇＧ１応答よりも、ＩｇＧ２ａ応答を誘導する際に有効であることを示す図である。マウスは、５μｇの蜂毒液（ＡＬＫ  Ａｂｅｌｌｏ）単独で、あるいはこれを以下の１つ：５０μｇのＶＬＰ単独、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化した５０μｇのＶＬＰ、または２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合させた５０μｇのＶＬＰと混合させたもので、皮下を初回抗原刺激した。あるいはマウスは、ＶＬＰ単独、または水酸化アルミニウムと結合したＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＶＬＰと混合させた５μｇの蜂毒液で、初回抗原刺激した。１４日後、マウスを同じワクチン調製物で追加抗原刺激し、第２１日に出血させた。第２１日からの血清中の、ＰＬＡ２特異的ＩｇＧサブクラスを、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ａｌｕｍの存在によって、ＣｐＧパッケージ型ＶＬＰまたは遊離ＣｐＧの存在下でさえも、ＩｇＧ１の誘導が助長されたことに留意されたい。これらの結果は、２０倍希釈した血清サンプルに関する光学濃度として示す。それぞれ２匹のマウスの平均を示す。
【図７】ＶＬＰ（ＨＢｃ）中にパッケージされたＣｐＧではなく、遊離ＣｐＧが、ワクチン接種後に脾臓の大きさを劇的に増大させることを示す図である。１００μｇのＶＬＰ単独、ＣｐＧｓ単独（２０ｎｍｏｌ）、２０ｎｍｏｌのＣｐＧと混合されているか、あるいはパッケージ型ＣｐＧを含む１００μｇのＶＬＰでマウスを免疫処置した。全リンパ球数／脾臓を、１２日後に測定した。
【図８】ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスにおける、アレルギー性マウスの体温低下を示す図である。２組のマウスを試験した。グループ１（ｎ＝７）には、ワクチンとして蜂毒液と混合させたＶＬＰ（ＣｐＧ）を与えた。グループ２（ｎ＝６）には、ＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを与えた。高用量の蜂毒液（３０ｕｇ）でチャレンジした後、アレルギー反応を、マウスの体温の変化の点で評価した。蜂毒液及びＶＬＰ（ＣｐＧ）を与えたグループ１では、体温の有意な変化は、試験したマウスのいずれにおいても観察されなかった。対照的に、脱感作ワクチンとしてＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを与えたグループ２は、６匹の動物中４匹で顕著な体温の低下を示した。したがって、これらのマウスは、アレルギー反応からは保護されなかった。注釈：図中の記号は、（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または７（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液に関する）、標準偏差（ＳＤ）を含めた６匹の個々のマウスの平均を表す。
【図９】脱感作前後の、マウス中の特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ血清抗体の検出を示す図である。すべてのマウスは、アジュバント（Ａｌｕｍ）での蜂毒液の４回の注射で感作した。次いで、マウスにＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を、あるいは対照としてＶＬＰ（ＣｐＧ）のみを接種して、防御免疫応答を誘導した。すべてのマウスの血液サンプルを、脱感作前後に採取し、それぞれ蜂毒液特異的ＩｇＥ抗体（パネルＡ）、ＩｇＧ１抗体（パネルＢ）及びＩｇＧ２ａ抗体（パネルＣ）に関して、ＥＬＩＳＡで試験した。図９Ａに示すように、高いＩｇＥ力価が、脱感作後にＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスに関して観察される。これらの結果は、１：２５０の血清希釈液における光学濃度（ＯＤ４５０ｎｍ）として表す。標準偏差（ＳＤ）を含めた、６匹の（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または７（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液）の個々のマウスの平均を、図中に示す。図９Ｂによって、ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液を接種したマウスに関してのみ、脱感作後の高い抗蜂毒液ＩｇＧ１血清力価が明らかである。ＩｇＧ２ａ血清力価を決定した図９Ｃに関しても、同じことが当てはまる。成功裏の脱感作に関して予想されたように、ＩｇＧ２ａ抗体力価の増大が最も顕著であった。これらの結果は、それぞれ１：１２５００（ＩｇＧ１）または１：５００（ＩｇＧ２ａ）血清希釈液に関する、ＳＤを含めた２匹の（ＶＬＰ（ＣｐＧ））または３（ＶＬＰ（ＣｐＧ）＋蜂毒液）マウスの平均として示す。
【図１０】ＱｂＶＬＰ、ＣｐＧ−２００６またはＡｌｕｍと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰのいずれかと混合させた、牧草花粉の抽出物で免疫処置した、Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗体応答を示す図である。１グループ当たり無血清の５匹のマウスを使用した。ＥＬＩＳＡアッセイは、花粉抽出物をプレートにコーティングして行った。ウエルは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇ２ｂを検出するために、第２１日からのそれぞれのマウス血清の１：６０の希釈液と共に、あるいはＩｇＥイソ型抗体を検出するために、１：１０の希釈液と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた対応するイソ型特異的抗マウス二次抗体を用いて、検出を行った。４５０ｎｍでの光学濃度を、着色反応後にプロットする。
【図１１】Ａｌｕｍと混合させた牧草花粉の抽出物で感作し、その後ＱｂＶＬＰ、あるいはＣｐＧ−２００６またはＡｌｕｍと共に、それぞれ充填及びパッケージ化したＱｂＶＬＰと混合させた牧草花粉の抽出物で脱感作した、Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗体応答を示す図である。１グループのマウスは脱感作後、未処理状態のままにした。ＥＬＩＳＡアッセイは、花粉抽出物をプレートにコーティングして行った。ウエルは、それぞれのマウス血清の一連の希釈液と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａイソ型特異的抗マウス二次抗体を用いて、検出を行った。ＥＬＩＳＡ力価は、飽和時の５０％の光学濃度を与える希釈の逆数として計算した。図１１ＡはＩｇＧ１の力価を示し、図１１ＢはＩｇＧ２ｂの力価を示す。
【図１２】臭化エチジウム（Ａ）及びクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロースゲル上での、ＨＢｃ３３ＶＬＰへのｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのパッケージ化の分析を示す図である。このゲル上には、１５μｇの以下のサンプル：１．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー；２．ＨＢｃ３３ＶＬＰ、未処理；３．ＨＢｃ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理したもの；４．ＨＢｃ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯでパッケージ化したもの；５．ＨＢｃ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯでパッケージ化し、ベンゾナーゼで処理し透析したものを載せる。
【図１３】異なるオリゴデオキシヌクレオチドの存在下において再構築された、ＱβＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す図である。示したオリゴデオキシヌクレオチドの存在下において、あるいはｔＲＮＡの存在下においてＶＬＰを再構築したが、これをサイズ排除クロマトグラフィーによって、均質な懸濁液に精製することはしなかった。陽性対照として、大腸菌から精製した「完全な」ＱβＶＬＰの調製物を使用した。
【図１４】ヌクレアーゼ処理及びアガロースゲル電気泳動による、再構築したＱβＶＬＰの核酸含量の分析を示す図である。５μｇの再構築及び精製したＱβＶＬＰ、及び大腸菌から精製した５μｇのＱβＶＬＰをそれぞれ、示したように処理した。この処理の後、サンプルをローディングダイと混合させ、０．８％アガロースゲル上に載せた。展開後、ゲルを最初に臭化エチジウム（Ａ）で染色し、文書化後、同じゲルをクーマシーブルー（Ｂ）で染色した。
【図１５】図１５Ａは、分解したＡＰ２０５ＶＬＰタンパク質の電子顕微鏡写真を示す図であり、一方図１５Ｂは、精製前に再構築した粒子を示す図である。図１５Ｃは、精製した再構築ＡＰ２０５ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す図である。図１５Ａ〜Ｃの倍率は、２０００００倍である。
【図１６】図１６Ａ及びＢは、アガロースゲル電気泳動によって分析した、再構築されたＡＰ２０５ＶＬＰを示す図である。２つの図のゲル上に載せたサンプルは、左から右に：未処理ＡＰ２０５ＶＬＰ、ＣｙＣｐＧと共に再構築され精製された、異なる量のＡＰ２０５ＶＬＰを含む３つのサンプル、及び未処理ＱβＶＬＰであった。図１６Ａのゲルは臭化エチジウムで染色し、一方図１６Ｂでは、同じゲルをクーマシーブルーで染色した。
【図１７】Ｑβモノマーと結合した、１つ、２つまたは３つのペプチドからなる多数の結合バンド（矢印、図１７）を実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。簡潔性のために、ペプチドｐ３３とＱβＶＬＰの結合産物を、特に実施例項中ではＱｂｘ３３と呼んだ。
【図１８】臭化エチジウム（Ａ）及びクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロースゲル上での、Ｑｂｘ３３ＶＬＰへのＢ−ＣｐＧｐｔのパッケージ化の分析を示す図である。（Ｃ）は、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ／尿素上での、ＶＬＰから抽出したパッケージ化オリゴの量の分析を示す。ゲル上に載せるのは、以下のサンプル：１．プロテイナーゼＫによる消化及びＲＮａｓｅＡ処理の後に、２μｇのＱｂｘ３３のＢＣｐＧｐｔオリゴ含有物；２．２０ｐｍｏｌのＢ−ＣｐＧｐｔ対照；３．１０ｐｍｏｌのＢ−ＣｐＧｐｔ対照；４．５ｐｍｏｌのＢ−ＣｐＧｐｔ対照である。図１８Ｄ及びＥは、臭化エチジウム（Ｄ）及びクーマシーブルー（Ｅ）で染色した１％アガロースゲル上での、Ｑｂｘ３３ＶＬＰへのｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのパッケージ化の分析を示す図である。ゲル上に載せるのは、１５μｇの以下のサンプル：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯでパッケージ化したもの；５．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯでパッケージ化し、ベンゾナーゼで処理し透析したものである。図１８Ｅ及びＦは、臭化エチジウム（Ｅ）及びクーマシーブルー（Ｆ）で染色した１％アガロースゲル上での、Ｑｂｘ３３ＶＬＰへのｄｓＣｙＣｐＧ−２５３のパッケージ化の分析を示す図である。ゲル上に載せるのは、１５μｇの以下のサンプル：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３とパッケージ化したもの；５．Ｑｂｘ３３ＶＬＰ、ＲＮａｓｅＡで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３とパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し透析したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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