(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）被験体を増幅剤と接触させる工程、
ｂ）前記被験体の少なくとも一つの所定の位置を増幅する工程、
ｃ）増幅産物の量を反応時間の関数として決定する工程、ここで、増幅反応の一時期に増幅産物の量が累進的に増加し、前記累進期後に増幅速度が減少する、
ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工程、ここでｎは自然数である、
ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、並びに
ｆ）前記極大、０値又は極小から前記被験体の初期濃度を計算する工程、
を含む、被験体の定量方法。
【請求項２】
前記導関数を数学的フィットにより計算する請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅産物を、蛍光を使って検出する請求項１記載の方法。
【請求項４】
増幅産物を、蛍光を使って検出する請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が核酸である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が核酸である請求項４記載の方法。
【請求項７】
増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得る請求項６記載の方法。
【請求項８】
増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得、かつ増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合体により検出する請求項２記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって被験体の配列と同一又は相補的な配列を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより増幅産物を検出し、前記ポリヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴ対、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ、および分子ビーコンオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
２つのポリヌクレオチドプローブを各々蛍光体で標識し、両プローブが増幅産物にハイブリッド形成したときに蛍光共鳴エネルギー移動をそれら２つの蛍光体間で生じさせる、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低濃度で存在するが適当な条件下に増幅または複製できる被験体の定量に関する。具体的には、本発明は、複数のポリヌクレオチドを含有する試料内の特定のポリヌクレオチド配列の定量に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸配列を検出し定量する様々な分析法のなかでもポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は最も強力で広く普及した技術になっており、その原理は米国特許第４，６８３，１９５号公報と米国特許第４，６８３，１０２号公報〔ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら〕に開示されている。しかし典型的なＰＣＲ反応はそれだけでは定性的データしか与えない。というのは、指数的または累進的増幅期の後、増幅された核酸の量は横ばい状態に達し、生成する反応産物の量はテンプレートＤＮＡの初期濃度に比例しないからである。
【０００３】
それゆえ、信頼でき再現性のある定量的データを得るために、ＰＣＲに基づく多種多様なプロトコルが開発されてきた。一般に、その基本原理は次の２種類に区別することができる：
ｉ）内部標準を利用する競争的ＰＣＲ、
ｉｉ）最初に検量線を作成することによる標的ＤＮＡの定量
〔これらはシーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）によって「感染症の分子診断法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」（Ｒｅｉｓｃｂｌ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ），ｐ．５５〜７９（１９９８））に概説されている〕。
【０００４】
定量的データの取得は、オンライン検出によってＰＣＲ反応の速度論を測定できる可能性により大きく改善される。これは、蛍光モニタリングによってアンプリコンを検出することにより、最近可能になった。このような技術の例は国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１２号パンフレットおよび国際公開第９７／４６７１４号パンフレット〔ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら〕に詳細に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
オンラインＰＣＲ検出が利用できるようになる前に、ウィズナー（Ｗｉｅｓｎｅｒ）ら〔Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，ｐ．５８６３−５８６４（１９９２）〕はＰＣＲ反応の多数のサイクルから得られるデータを始めて利用し、各サイクル後に、産物濃度を、放射活性の組込みとその後のシンチレーション計数によってアッセイした。各曲線について、初期テンプレート濃度（Ｎ0 ）と増幅効率（ｅｆｆ）が、次の式によって定義される、産物濃度（Ｎｎ）対サイクル数グラフ上のデータ点の線形回帰によって決定された：
ｌｏｇ  Ｎｎ＝（ｌｏｇ  ｅｆｆ）ｎ＋ｌｏｇ  Ｎ0 
【０００６】
ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら〔ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，ｐ．１０２６−２０３０（１９９３）〕は、各サイクルでの蛍光モニタリングを用いた初期テンプレート定量のより簡単な方法を初めて開示した。蛍光閾値レベルを用いて初期テンプレート濃度に関係するフラクショナルサイクル数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）が定義された。具体的に述べると、初期テンプレート濃度の対数は、蛍光対サイクル数曲線の蛍光閾値との交点と定義されるフラクショナルサイクル数（ＣＴ）に逆比例する。蛍光閾値法のさらに改善が進んだ態様では、閾値レベルは、手作業でまたは恣意的に選択されるのではなく、蛍光バックグラウンドノイズとして得られるシグナルの変動係数の３倍に設定される。
【０００７】
しかし、ここに言及した先行技術には重大な欠点がいくつかある。先ず第一に、先行技術の方法は、励起効率または発光効率の相違による試料間変動を補償するために、異なる蛍光バックグランドシグナルに対する補正を必要とする。第二に、テンプレート依存的増幅の定量は常に反応の対数線形期中に行なわれる必要があるので〔ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら「ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量：非放射性法（Ｑｕｎａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｙ  ＰＣＲ：Ｎｏｎｒａｄｉｏ−ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」（ケーラー編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ベルリン），ｐ．６（１９９５）〕、実際の定量実験に先立ってユーザーが反応の対数線形ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を決定する必要がある。また閾値レベルは行おうとする実験に固有の前提条件を考慮することなく手作業で選択されるので、閾値レベルの設定にも経験を積んだ実験者である当業者が必要とされる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、増幅可能または複製可能な被験体の濃度を、異なる蛍光バックグラウンドに対して補正を行なうことなく、ユーザー定義の対数期とユーザー定義の閾値レベルから独立して決定でき、また同時に、決定される濃度が反応の平坦期に生成されるシグナルの絶対レベルとは無関係であり、さらに、そのような絶対シグナルレベルからの独立性のため、異なるウィンドウ範囲を持つ複数のチャンネルで検出される複数の蛍光シグナルを比較しうるシステムにとっても有利である、被験体の定量方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、増幅または自己複製産物の量が連続的に測定されるような方法で増幅可能系または自己複製系を定量的に分析する方法に関する。本発明の一態様に従い、被験体を定量する方法が提供される。この方法は、被験体を増幅剤と接触させ、被験体の少なくとも一つの所定の位置（座）を増幅するという各工程を含む。次に増幅産物の量が反応時間の関数として決定され、該関数の一次、二次またはｎ次導関数が計算される（ここにｎは自然数である）。次に前記導関数の極大、０値または極小が決定され、被験体の初期濃度が前記極大、０値または極小から計算される。ここに開示する方法は、微生物の増殖速度を定量的に分析して、変更された環境条件の微生物の増殖に対する影響を測定するためにも使用できる。
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）  ａ）被験体を増幅剤と接触させる工程、
ｂ）前記被験体の少なくとも一つの所定の位置を増幅する工程、
ｃ）増副産物の量を反応時間の関数として決定する工程、
ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工程、ここでｎは自然数である、
ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、並びに
ｆ）前記極大、０値又は極小から前記被験体の初期濃度を計算する工程、
を含む、被験体の定量方法、
（２）  増幅反応の一時期に増幅産物の量が累進的に増加する前記（１）記載の方法、
（３）  前記累進期後に増幅速度が減少する前記（２）記載の方法、
（４）  前記導関数を数学的フィットにより計算する前記（３）記載の方法、
（５）  増幅産物を蛍光を使って検出する前記（１）〜（４）いずれか記載の方法、
（６）  前記被験体が核酸である前記（１）〜（５）いずれか記載の方法、
（７）  増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得る前記（１）〜（６）いずれか記載の方法、
（８）  増幅をポリメラーゼ連鎖反応により得、かつ増副産物を二本鎖ＤＮＡ結合体により検出する前記（４）記載の方法、
（９）  少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって被験体の配列と同一又は相補的な配列を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブにより増幅産物を検出する、前記（７）記載の方法、
（１０）  ２つのポリヌクレオチドプローブを各々蛍光体で標識し、両プローブが増幅産物にハイブリッド形成したときに蛍光共鳴エネルギー移動をそれら２つの蛍光体間で生じさせる、前記（９）記載の方法、
（１１）  ｂ）微生物又は細胞個体群を化合物の存在下に増殖させる工程、
ｃ）前記微生物又は細胞個体群の細胞数を反応時間の関数として決定する工程、
ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工程、ここでｎは自然数である、並びに
ｅ）前記化合物の影響の尺度として、前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、
を含む、微生物又は細胞個体群の増殖速度に対する化合物の影響の分析方法、並びに
（１２）  ｂ）被験体をシグナル生成結合体と、前記被験体と前記結合体との間に複合体が形成される条件下で接触させる工程、
ｃ）複合体の量を時間の関数として決定する工程、
ｄ）前記関数の一次、二次又はｎ次導関数を計算する工程、ここでｎは自然数である、
ｅ）前記導関数の極大、０値又は極小を決定する工程、並びに
ｆ）前記極大、０値又は極小から被験体の初期濃度を計算する工程、
を含む、被験体の定量方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、増幅可能系または自己複製系を、増幅または自己複製産物の量が連続的に測定されるような方法で、定量的に分析する方法を含む。ＰＣＲ反応における連続的測定とは、例えば、測定が各サイクルに１回行なわれることを意味してもよい。本発明の方法は、増幅反応または自己複製の一時期（通常、最初から始まり、または他方、初期誘導期後に始まる）に標的産物の量が累進的に増加する態様にとりわけ適している。さらに、本方法は前記指数期後に増幅速度が減少する態様に適している。
【００１２】
次に、適当な数学的アルゴリズムを使用することにより、得られたデータを使って、様々な時点で得られたシグナルが平滑化された速度論を明示する数学的関数を設定できる。そこから導関数を計算できる関数を得るために、例えば多項式フィットを行なうことにより、元々測定された生データの平滑化された速度論を反映するデータの組を得ることができる。多項式フィットをサビツキーゴーレイ（Ｓａｖｉｔｚｋｙ  Ｇｏｌａｙ）フィルターによって計算すると、本方法に有利であることが判明している〔プレス（Ｐｒｅｓｓ）ら「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｉｎＣ，  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」（ケンブリッジ大学出版，第２版）のｐ．６５０以降〕。このような関数から、一次、二次またはさらに高次の導関数を計算し、前記関数の極大、極小または０値を決定できる。得られたデータは、各増幅または自己複製に関する特徴的パラメーターであり、それを使って増幅体の元の量、またはその試料の増幅または自己複製中に存在する化合物または環境因子（温度、ｐＨ、電磁放射、若しくは栄養組成など）の影響を定量できる。
【００１３】
増幅可能系または自己複製系の大半は、特定の期間にわたって増幅または自己複製が指数的に達成されるように働き、その反応のまさに初期では通常そうである。しかし、微生物または細胞個体群の増殖曲線の場合は、例えば、最初に誘導期が存在して、その後の時点で指数期に入ることもある。しかしこのことは、そのような態様への本発明の適用可能性に影響を及ぼすものではない。
【００１４】
上に概論したように、本発明の一態様は、分析すべき試料中に少量で存在し、適当な増幅法を使って増幅または自己複製させうる特定核酸配列の定量に関する。核酸被験体の最も一般的な増幅方法は、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。基本的応用例は、シーベルト「感染症の分子診断法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」〔Ｒｅｉｓｃｂｌ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ニュージャージー州トトワ），ｐ．５５〜７９（１９９８）〕に要約されている。しかし、例えばＮＡＳＢＡ〔マレック（Ｍａｌｅｋ）ら，国際公開第９１１０２８１４号パンフレット〕など、異なる核酸増幅方法も本発明の範囲に含まれる。標的核酸は二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでもよく、またどのタイプのＲＮＡでもよい。後者の場合はＰＣＲの前に標準的プロトコルを用いたｃＤＮＡ合成を行いうる。
【００１５】
一態様として、被験体がポリ核酸である場合の被験体の定量方法を述べる。この方法は、被験体を増幅剤（および被験体の少なくとも一部を増幅するために必要な全ての化合物）と接触させ、被験体の少なくとも一部を増幅するという各工程を含む。通例、被験体の限られた領域だけが増幅され、核酸配列の場合は、２つのプライマーによってフランキングされた配列だけが増幅されるだろう。次に増幅産物の量が反応時間の関数として決定され、前記関数の一次、二次またはｎ次導関数が計算されるだろう（ここにｎは自然数である）。次に前記導関数の極大、０値または極小が決定され、前記極大、０値または極小から被験体の初期濃度が計算されるだろう。好ましい一態様では、増幅産物が蛍光を使って検出され、増幅産物がポリメラーゼ連鎖反応によって得られる。
【００１６】
本発明との関連では、時間の関数としての増幅産物の量の決定とは、増幅産物の絶対量を測定する必要があることを意味しない。むしろ、相対シグナルを決定するだけで十分である。というのは、相対的決定をするだけで導関数の計算が可能であり、本発明によれば次にその導関数を使って初期標的濃度の絶対量を決定しうるからである。
【００１７】
本発明の一態様では、被験体の増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって達成され、定量される被験体が核酸である。本発明の一態様によれば、増幅産物は通例、蛍光を使って検出される。被験体が核酸である場合、増幅産物は二本鎖ＤＮＡ結合体によって（例えば二本鎖ＤＮＡ結合性蛍光色素を使って）検出できる。他方、少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって、定量すべき被験体の配列と同一またはそれに相補的な配列を有する特別に設計されたポリヌクレオチドハイブリッド形成プローブを使って、増幅産物を検出できる。この別法の特定の態様では、２つのポリヌクレオチドプローブを、両プローブが増幅産物にハイブリッド形成した時に蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）がそれら２つの蛍光体間で起こりうるように、それぞれ蛍光体で標識する。
【００１８】
本発明の他の一つの態様として、被験体と検出成分との間の相互作用を示すシグナルを、シグナル強化カスケードを使って指数的に生成させてもよい。したがって本発明の一態様は、
ａ）前記被験体をシグナル生成結合体と、前記被験体と前記結合体との間に複合体が形成される条件下で接触させ、
ｂ）複合体の量を時間の関数として決定し、
ｃ）前記関数の一次、二次またはｎ次導関数を計算し（ここにｎは自然数である）、
ｄ）前記導関数の極大、０値または極小を決定し、
ｅ）前記極大、０値または極小から、被験体の初期濃度を計算する、
ことからなる、被験体の定量方法を行なうことである。
【００１９】
本発明のさらに他の一つの態様として、定量的データを得るために導関数を計算する原理は、微生物または細胞個体群の増殖速度の分析に応用できる（実施例３参照）。したがって、本発明はまた、ある化合物の、微生物または細胞個体群の増殖速度に対する影響を分析する方法であって、
ａ）前記微生物または細胞個体群をかかる化合物の存在下に増殖させ、
ｂ）前記微生物または細胞個体群の細胞数を増殖時間の関数として決定し、
ｃ）前記関数の一次、二次またはｎ次導関数を計算し（ここにｎは自然数である）、
ｄ）前記化合物の影響の尺度として、前記導関数の極大、０値または極小を決定する、
ことからなる方法に関する。
【００２０】
これらの態様についても、導関数を計算できる限り、細胞数または複合体形成の量を反映する相対シグナルを決定すれば十分である。
【００２１】
系の指数的または累進的増幅は、限られた濃度でしか提供されえないいくつかの化合物の利用可能性によって制限されうる。その結果、増幅または自己複製の速度は低下し始め、指数期から、もはや増幅または自己複製産物が生成しない平坦期への移行が起こる。このタイプの速度論に関する典型的な例はＰＣＲによるＤＮＡの増幅である。この場合、反応はＤＮＡポリメラーゼの量、増幅プライマーの濃度、またはヌクレオシド三リン酸の濃度によって制限されうる。他方、累進的増幅は産物阻害によって、例えばＰＣＲの場合であれば一本鎖ＰＣＲ産物が再アニーリングして、プライマーにハイブリッド形成できない二本鎖産物を形成することによって制限される場合もある。
【００２２】
本発明によれば、データ駆動型アルゴリズムを使って、さらなる分析のためのデータを選択する。適切に平滑化された速度論を得るには、数学的フィルターアルゴリズムを使用できる。核酸増幅の場合、好ましくは、サビツキーゴーレイフィルターを適用できる（「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｉｎＣ，  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」ケンブリッジ大学出版，第二版，ｐ．６５０以降）。
【００２３】
サビツキーゴーレイフィルターを適用すると、測定された各速度論点は、左側と右側にある近傍の点を含むウィンドウから計算される平滑化された点に置き換えられる。これらの点から、あらゆる測定値についてｎ次の多項式が計算される。ただし、左側または右側に点がないのでそのような計算が不可能な、反応のまさに最初とまさに最後で決定された値は除く。したがって、垂直ウィンドウパラメーター（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｗｉｎｄｏｗ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）はａ／ｎ／ｂと定義され、ここにａは左側から取った点の数、ｎは多項式の次数、ｂは右側からとった点の数である。
【００２４】
平滑化した速度論値から、一次、二次またはｎ次導関数の極大、極小または０値を計算する。このような極値の決定は、被験体の初期濃度を反映する各速度論に特有な一意的で信頼できるフラクショナルサイクル数の定義に適した設定点を与える。
【００２５】
最も信頼できるデータを得るには、一次導関数の計算された極大には垂直ウィンドウパラメーター３／３／４を持つサビツキーゴーレイフィルター、または二次導関数の計算された極大には垂直ウィンドウパラメーター６／２／４のサビツキーゴーレイフィルターを使用することが、とりわけ有利であることが判明している。
【００２６】
平滑化した速度論点のそれぞれについて、当技術分野で知られている方法によって導関数が計算される。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の所定のサイクル数ｘに関する平滑化された値ｙのそれぞれについての一次導関数はρ（ｘ）＝ｙ（ｘ）−ｙ（ｘ−１）として計算しうる。次に二次導関数はその一次導関数から同じ方法で計算できる。他方、所定のサイクルｘで、サビツキーゴーレイフィルターからの多項式フィットを、ｘとｙの一次および二次導関数について容易に評価できる。
【００２７】
次に、前記導関数から極値を決定するために、仮定した極値の周りに位置する３〜５点の数を考慮して、さらなる多項式フィットを適用できる。例えば図１５は、５点への二次フィットを用いた二次導関数極大のフラクショナルサイクル数決定を示す。二次導関数値はスライディングウィンドウ（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ）多項式フィット（一つのサビツキーゴーレイフィルター）によって決定した。
【００２８】
増幅反応の速度論を測定できる可能性は本発明の前提条件であるが、増幅産物の生成を分光学的検出原理によって、例えば蛍光を使って連続的に測定できる装置と方法を利用できるので、これは非常に容易になっている。好適な装置の例は、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，Ｎｏ．１，ｐ．１７６〜１８１（１９９７）に詳述されている。
【００２９】
増幅産物の生成の連続的モニタリングを可能にする、標的依存的蛍光シグナリングに基づく検出形式がいくつか開示されている〔ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，ｐ．１３０〜１３８，１９９７に概説されている〕。これらの検出形式には次に挙げるものがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
１．蛍光二本鎖ＤＮＡ認識化合物の使用
通常、二本鎖増幅産物の量は分析される試料中に元々存在していた核酸の量を超えるので、適当な波長で励起すると、二本鎖ＤＮＡに結合した場合にのみ強化された蛍光を示す二本鎖ＤＮＡ特異的色素を使用できる。好ましくは、例えばＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ＩのようにＰＣＲ反応の効率に影響を及ぼさない色素だけを使用しうる。
【００３１】
２．ハイブリッド形成時の増加した蛍光共鳴エネルギー移動
この検出形式には、増幅産物の一つの鎖の、近接してはいるが重複していない領域にハイブリッド形成できる、それぞれが蛍光部分で標識された２つのオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを使用する。好ましくは、一方のヌクレオチドはその５’末端で標識され、他方のオリゴヌクレオチドはその３’末端で標識される。標的ＤＮＡにハイブリッド形成させると、これら２つの蛍光標識は、２つの蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動が起こりうるように、密接に接触する。その結果、ハイブリッド形成は、供与部分の励起とそれに続く他方の受容部分の蛍光発光の測定によってモニターできる。
【００３２】
類似する一態様では、一つの適当に標識されたプライマーと共にやはり特異的ＦＲＥＴ対として役立ちうるただ一つの蛍光標識プローブを使用する〔ベルナルド（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３５，ｐ．１０１〜１０７（１９９８）〕。
【００３３】
３．タックマン（Ｔａｑ  Ｍａｎ）原理
増幅産物を検出するために、蛍光体で標識された一本鎖ハイブリッド形成プローブを使用する。かかる蛍光体の蛍光発光は、消光化合物として作用できる同じプローブ上の第二の標識によって消光される。ＰＣＲ反応のアニーリング工程でそのプローブはその標的配列にハイブリッド形成し、その後、プライマーの伸長中に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼがそのハイブリッド形成プローブを、前記蛍光体が前記消光化合物から分離されるように、より小さい断片に消化する。適当な励起後に、蓄積しつつある増幅産物の指標として、蛍光発光をモニターできる。
【００３４】
４．分子ビーコン
タックマンプローブと同様に、分子ビーコンオリゴヌクレオチドは、その分子の二次構造ゆえに互いに密接に近接する蛍光化合物と消光化合物で標識される。標的ＤＮＡに結合すると分子内水素結合が壊れ、プローブの一端に配置された蛍光化合物は、そのプローブの他端に配置された消光化合物から隔てられる〔リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら，米国特許第５，１１８，８０１号公報〕。
【００３５】
通常、開示されるハイブリッド形成プローブは、被験体の配列と全く同一または厳密に相補的な配列を有する。しかし、そのプローブが１または複数のミスマッチを含有している場合も、それが適当なハイブリッド形成条件で被験体にハイブリッド形成できる限りは、本発明の範囲に含まれる。いずれの場合も、配列の同一性または相補性が少なくとも１０個の連続残基の範囲にわたって１００％であれば、とりわけ有利であることがわかっている。また、プローブの長さが１００ヌクレオチドを超えなければ、好ましくは４０ヌクレオチド以下であれば、有利であることもわかっている。
【００３６】
外部標準を利用する原理に従った被験体の定量の場合は、検量線を作成する必要がある。定量しようとする被験体がＰＣＲによって増幅される核酸である場合は、既知量の被験体を増幅し、蛍光シグナルの強度をサイクル数の関数として決定する。数学的フィットによる速度論の平滑化後に、一次、二次またはｎ次導関数の１以上の極値を計算する。これは、元の標的濃度と決定された極値のフラクショナルサイクル数との間の相関を可能にする。その後に未知被験体濃度の決定を行なうことができる。
【００３７】
【実施例】
実施例１
ＰＣＲによるシクロフィリンＡ配列の増幅とそれに続くハイブプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅｓ）を用いた検出：先に開示されたアルゴリズムとの比較
シクロフィリンＡ配列を保持する線状化プラスミドから、連続希釈を行なって２μｌあたり１０7 、１０5 、１０3 および１０2 コピーの濃度にした。信頼できる統計データを得るために、これら希釈液は、複製を６つ調製した。合計２０μｌの容量で、各試料について、ＰＣＲ反応の準備をした：
【００３８】
【表１】
0004443717.tif 000002
【００３９】
表示したプライマーとプローブのヌクレオチド位置は、ヘンドラー（Ｈａｅｎｄｌｅｒ）ら〔Ｅｍｂｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６，ｐ．９４７〜９５０（１９８７）〕に記載のヌクレオチド位置に相当する。
【００４０】
製造者のプロトコルに従って、試料を１．５ｍｍ毛細管（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．社，カタログ番号１９０９  ３３９）に充填した。次に、その毛細管をＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製のライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）ＬＣ３２に挿入し、次のサーマルサイクリングプロトコルに従うＰＣＲ反応にかけた：
【００４１】
【表２】
0004443717.tif 000003
【００４２】
各サイクル後に、製造者のプロトコルに従って、各試料について２種類のチャンネルで蛍光を分析した。チャンネル１は５２０±２０ｎｍのバイパスに相当し、チャンネル２は６４５±２０ｎｍのバイパスに相当した。次に、ピペッティング誤差による容量差を正規化し、アラインメント誤差と検出誤差を排除するために、チャンネル１に対してチャンネル２から得られた値の比を計算した。
【００４３】
実施例１で得た生データを２種類の方法で処理した：
【００４４】
Ａ）先に開示された方法に従って、生蛍光データの適当なバックグランド除去後に、手作業で選択した閾値レベルを設定した。各試料について、閾値線と蛍光シグナル対時間の関数との間の交点を、以下のアルゴリズムで計算した：回帰計算に基づき、先に設定されたノイズバンドを上回る２つの測定点を使って、線形回帰により対数線形期を定めた。その対数線形領域内で、閾値線を手作業で設定し、その閾値線と試験した各コピー数に対応する回帰線との間の交点を計算した。その方法の妥当性に関する情報を得るために、計算された交点を使って、標的ＤＮＡの初期濃度のｌｏｇ１０計算値に対してサイクル数を示すプロットを作成した（図１および２参照）。このプロットから、この方法の正確度と精度に関する指標としての平均値、標準偏差および変動係数の計算を可能にする線形回帰を決定した。結果を表３に示す。ここに濃度と交点は実施例１に従って蛍光閾値法で計算したものであり、略号は次の通りである：平均値（Ｍｉｔｔｅｌｗｅｒｔ）、標準偏差（ＳＴＤＷＮ）および変動係数〔ＣＶ（％）〕。
【００４５】
【表３】
0004443717.tif 000004
【００４６】
Ｂ）本発明に従い、前もってバックグラウンド除去を行うことなく、垂直ウィンドウパラメーター６／２／４を有するサビツキーゴーレイフィルターを使った多項式フィットによって、同じ生データを平滑化した。得られた関数から、二次導関数の極大を計算し、初期テンプレート濃度の指標として使用した。ここでも、得られたデータから、標的ＤＮＡの初期濃度に対してフラクショナルサイクル数を示すプロットを作成した（図３および４参照）。平均値、標準偏差および変動係数を上述のように計算した。その結果を表４に示す。ここで濃度と交点は実施例１に従って二次導関数極大法で計算したものであり、略号は次の通りである：平均値（Ｍｉｔｔｅｌｗｅｒｔ）、標準偏差（ＳＴＤＷＮ）および変動係数〔ＣＶ（％）〕。
【００４７】
【表４】
0004443717.tif 000005
【００４８】
表３と表４の結果を比較することによってわかるように、先行技術に従って方法Ａ）によって得られる統計値も、本発明に従って方法Ｂ）によって得られる統計値も、ほぼ同じ程度の正確度と精度を与えた。しかし、本発明に従った方法は、生成した蛍光シグナルの実際の量からは独立しており、データ処理はユーザー主導型ではないので、先に開示された定量法に優る利点がある。
【００４９】
実施例２
ＰＣＲによるＴＮＦα配列の増幅と続くＳＹＢＲグリーンを用いた検出：一次導関数極大、二次導関数極大および二次導関数極小からの初期濃度の計算の比較
実験は、実施例１に従い、次の変更を加えて行なった。
【００５０】
ＴＮＦαゲノム配列〔シライ（Ｓｈｉｒａｉ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，ｐ．８０３，１９８５〕を保持するプラスミドを連続希釈にかけて、２μｌあたり１０7 、１０5 、１０3 、１０2 および１０1 コピーの試料濃度にした。各試料濃度につき、複製を６つ調製した。
【００５１】
各ＰＣＲ反応は２０μｌの総体積に下記の成分を含む：
【００５２】
【表５】
0004443717.tif 000006
【００５３】
適用したサーモサイクリングプロトコルは実施例１と同じである。各増幅サイクル後に、ＳＹＢＲグリーンの蛍光を製造者のプロトコルに従って、５２０±２０ｎｍのバイパスに相当するライトサイクラーチャンネル１で測定した。
【００５４】
本発明に従って、生データを、垂直ウィンドウパラメーター２／３／２、２／４／２、３／３／３、３／４／３、４／３／２、４／４／２、６／３／２、６／４／２、６／５／２および６／６／２を有するサビツキーゴーレイフィルターを用いた異なる多項式フィットによって平滑化した。得られた速度論から、一次導関数と二次導関数の極大、二次導関数の極小を、所定の被験体濃度の６つの複製すべてについて計算し、それらを初期テンプレート濃度の指標として使用した。
【００５５】
これらのデータにもとづき、サイクル数をテンプレートＤＮＡの様々なコピー数のｌｏｇ１０に対してプロットした。次に、回帰線を計算した。図５〜１４から推定できるように、これらの較正作業プロットの結果は、計算されたサイクル数と被験体濃度のｌｏｇ１０との間の直線関係を示しており、原理的に、異なるタイプの垂直ウィンドウパラメーターを用いた異なる極値の決定を、初期被験体濃度を決定するために使用できることを立証している。
【００５６】
一次および二次極大に関して、サビツキーゴーレイフィルターの選択に関する好ましい態様を決定するために、異なるプロット由来のデータを、主として次の３つの基準を考慮に入れて比較した：
ａ）１００コピーの被験体に相当する６つの複製について決定される変動係数ＣＶ（％）
ｂ）分解能の指標としての回帰直線の傾き
ｃ）ロバスト統計ウィルコクソン検定によって計算される被験体１０1 コピーと１０2 コピーの間の識別に関する分解能。ここではｐ値を決定し、それに関して０．０５未満の数字を有意とみなす。
【００５７】
この分析の結果を表６に要約する。
【００５８】
【表６】
0004443717.tif 000007
【００５９】
分解能に関して、このデータは、一次導関数極大の計算に先立って、また二次導関数極大の計算に先立って、異なるフィルターを使用することにより、基準ｂ）に関して同等の分解能があり、また基準ｃ）に関して試験した全てのフィルターについて十分な分解能があることを示している。
【００６０】
一次導関数の極大の決定については、比較的低いＣＶ（％）値が、試験した全てのフィルターパラメーターから得られた。二次導関数の極大の決定については、６／２／ｂの垂直ウィンドウパラメーター（ここにｂは３、４または５）が好ましいと認められる。
【００６１】
実施例３
対数増殖曲線は個体群増殖のモデル化に使用できる（図１６）。このような曲線は初期誘導期、指数増殖期および平坦期を持つ。細菌の成長はこの種の曲線に従う。増殖速度に対する刺激性または阻害性化合物の影響は、生物の相対数を経時的に追跡することによって決定できる。この曲線が左側にシフトすればその化合物は阻害物質であり、右側にシフトすればその化合物は増殖を刺激する。阻害または刺激の強さは曲線がどのくらいシフトするかに関係する。
【００６２】
例えば、分光光度計キュベット中の増殖培地（ＬＢブロス）に細菌（大腸菌）を接種し、撹拌し、３７℃に維持する。細菌の増殖は、キュベットを通した光散乱により５００ｎｍで５分毎にモニターされる。細菌数が増加するにつれて吸光度は増加し、細菌数の相対的尺度を与える。二次導関数極大を計算して対照試料（Ｔ）のフラクショナルサイクル数を得る。
【００６３】
並行反応として、物質Ａ、ＢおよびＣを培地の入った別々のキュベットに加え、先と同様に接種する。それらの増殖を上と同様に経時的にモニターする。図１７に示すような曲線が得られるだろう。図１７の例証的データに示すように、物質Ａは物質Ｂより強力な阻害物質であり、一方、物質Ｃは刺激物質である。阻害の強さは、フラクショナルサイクル数のシフトの大きさと方向によって定量できる：
ＣT −ＣB ＝物質Ｂの阻害の大きさ
ＣT −ＣA ＝物質Ａの阻害の大きさ
ＣT −ＣC ＝物質Ｃの阻害の大きさ
【００６４】
増殖を評価するために培地の濁度（５００ｎｍで測定される）を測定することに加えて、例えば培地のｐＨシフトや栄養素の消費など、数多くの他の増殖モニターを使用できることは明らかだろう。唯一の要件は、導関数を計算するのに足りる個体群サイズの相対尺度を得ることである。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の被験体の定量方法によれば、増幅可能または複製可能な被験体の濃度を、異なる蛍光バックグラウンドに対して補正を行なうことなく、ユーザー定義の対数期とユーザー定義の閾値レベルから独立して決定でき、また同時に、反応の平坦期に生成されるシグナルの絶対レベルとは無関係に濃度を決定することができる。そのような絶対シグナルレベルからの独立性ゆえ、異なるウィンドウ範囲を持つ複数のチャンネルで検出される複数の蛍光シグナルを比較しうるシステムにとっても有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＲＥＴハイブプローブを用いた蛍光シグナルの測定結果を示す図である。
【図２】実施例１に従った閾値法で計算した線形回帰曲線を示す図である。
【図３】ＦＲＥＴハイブプローブを用いた蛍光シグナルの測定結果を示す図である。
【図４】実施例１に従った二次導関数極大法で計算した線形回帰曲線を示す図である。
【図５】実施例２に従ったＳＹＢＲグリーン実験で、極大一次導関数、極小二次導関数および極大二次導関数を、テンプレートコピー数のｌｏｇ１０に対して決定することにより、６回反復して計算されたフラクショナルサイクル数を示すプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを２／３／２に設定した。
【図６】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを２／４／２に設定した。
【図７】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを３／３／３に設定した。
【図８】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを３／４／３に設定した。
【図９】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを４／３／２に設定した。
【図１０】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを４／４／２に設定した。
【図１１】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを６／３／２に設定した。
【図１２】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを６／４／２に設定した。
【図１３】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを６／５／２に設定した。
【図１４】図５と同様のプロットを示す図である。サビツキーゴーレイフィルター垂直ウィンドウパラメーターを６／６／２に設定した。
【図１５】二次導関数極大の二次推定によるフラクショナルサイクル数決定のグラフを示す図である。
【図１６】細胞個体群の増殖を示す対数増殖曲線のグラフを示す図である。
【図１７】物質Ａ（Ａ）、物質Ｂ（Ｂ）、物質Ｃ（Ｃ）および対照（Ｔ）の存在下に培養された細胞個体群の増殖を示す、培養細菌細胞の個体群について得られた増殖曲線のグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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