(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体に対する試薬の注射後に前記個体の遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を判定することによる前記個体の精神分裂病の診断のための注射可能な試薬を調製するための、６．５を越える等電点（ｐＩ）を有する血小板由来蛋白質又はそれらの画分を含む蛋白質調製物の使用。
【請求項２】
蛋白質又はそれらの画分が６．５ないし９．５の範囲内のｐＩを有する請求項１記載の使用。
【請求項３】
血小板由来蛋白質又はそれらの画分が被検者以外の数人の個体から得られる異種血小板より調製される請求項１又は請求項２記載の使用。
【請求項４】
血小板由来蛋白質又はそれらの画分が被検者から得られる自己血小板より調製される請求項１又は請求項２記載の使用。
【請求項５】
（i） ヒトの血小板から調製された１種類の蛋白質又はその画分であって、６．５を越えるｐＩを有する蛋白質又はその画分
（ii） ＤＴＨ反応を評価する方法の指針のための表及び／又は図、並びに
（iii） 使用説明書、
を含む、個体のＤＴＨ反応の検出により前記個体の精神分裂病の診断に使用するためのキット。
【請求項６】
蛋白質又はその画分が６．５ないし９．５の範囲内のｐＩを有する請求項５記載のキット。
【請求項７】
蛋白質又はその画分が被検者以外の数人の個体から得られる異種血小板から調製される、請求項５又は請求項６記載のキット。
【請求項８】
蛋白質又はその画分が被検者から得られる自己血小板から調製される、請求項５又は請求項６記載のキット。
【請求項９】
ａ） 数人の個体から血液試料を得る工程、前記の試料から貯留物を調製する工程及び、それらから血小板を収集する工程、
ｂ） 蛋白質又はそれらの画分を含む前記血小板調製物から蛋白質画分を調製する工程であって、前記蛋白質又はそれらの画分のｐＩが６．５を越える、工程
を含む、個体に対する試薬の注射後の、前記個体のＤＴＨ反応を検出することによる、前記個体の精神分裂病の診断に使用するための試薬の調製法。
【請求項１０】
ＤＴＨを判定することにより個体における精神分裂病を診断するための注射可能な試薬を調製する際における、請求項９記載の方法により調製される試薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は診断テスト法、そしてより具体的には精神病の診断テスト法に関する。
【０００２】
（引用文献のリスト）
次のものは本発明の背景を理解する目的上関連すると考えられる引用文献のリストである。
【０００３】
【表１】
0004455753.tif 000002
【０００４】
【表２】
0004455753.tif 000003
【０００５】
以上の引用文献は括弧内に示される、前記のリストからのそれらの番号を示すことにより以下の本文中に認められるであろう。
【０００６】
（発明の背景）
精神分裂病は、パラノイア、聴覚の幻覚、妄想、緊張性昏迷、異常行動及び情緒停滞を含む様々な症候を包含する症状である。全人口の約１％が精神分裂病に罹患する。その発症が若年期に起こり、従って患者を、かれらの生涯の大部分の期間、医学的及び精神医学的監督下に置くことを要するので、社会に対するその経済的及び社会的負担は莫大である。従って、精神分裂病は先進国において最も費用のかかる疾患の一つである。
【０００７】
精神分裂病の生化学的基礎は未だ解明されていないので、今日の診断は未だ精神医学的評価のみに基づいている。更に、その症状は神経弛緩薬により軽減させることはできるが、精神分裂病に対する治療法はいまだ発見されていない。
【０００８】
多数の報告が、幾つかの精神障害の原因及び経過を免疫系と関連付けてきた。脳の抗原と交叉反応する血清抗体が、精神分裂病患者の血液中に発見され(1〜6)、従って精神分裂病も自己免疫疾患であることを示している(7〜9)。更に、ニューロン組織のモデルとして血小板が使用され(10,11)、精神分裂病及び痴呆患者において、血小板に対する自己抗体の上昇した濃度が検出されたが、躁鬱障害、抑鬱症、人格障害又は分裂感情性障害の患者には認められなかった(12〜14)。多発脳梗塞性痴呆及びアルツハイマー型痴呆の診断のための判定は、高濃度の血小板関連抗体の検出に基づいて説明された(15)。
【０００９】
自身の血液から収集された血小板を注射されると、遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を示した精神分裂病患者において、自己血小板に対する細胞反応も示された(16)。
【００１０】
従って、患者の精神分裂病の診断のためのテスト法を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
（発明の要約）
本発明に従う新規の所見は、血小板蛋白質の特異的な、新規の画分を注射されると、精神分裂病患者が典型的な遅延型過敏症反応の特徴を表す反応を示すことである。この新規の画分は本明細書において「プール２蛋白質」と称される。本発明の一態様を形成するプール２蛋白質は、約６．５を越える、そして好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内の等電点（ｐＩ）を有することを特徴とする。プール２蛋白質を注射されると、精神分裂病患者はあたかも遅延型過敏症（ＤＴＨ）のような反応を示す。
【００１２】
プール２蛋白質に対する患者の反応は前記及び下記でＤＴＨ反応と称されるが、プール２蛋白質に対する患者の反応の時間プロファイルが、典型的なＤＴＨ反応の時間プロファイルと異なるような場合があり得ることに注意しなければならない。
【００１３】
従って、本発明は、個体へのそれらの注射時に、精神分裂病患者にＤＴＨ反応を誘導することができる、約６．５を越える、そして好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内の等電点（ｐＩ）を有する血小板由来蛋白質又はそれらの画分を含んでなる蛋白質調製物（以後「プール２蛋白質」）を提供する。
【００１４】
本発明は更に、（ａ） 有効成分として、約６．５を越える、そして好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内の等電点（ｐＩ）を有する血小板由来蛋白質又はそれらの画分を含んでなる調製物（「プール２蛋白質」）を得ること、（ｂ） 前記の蛋白質調製物を患者に注射すること、及び（ｃ） 注射部位の遅延型過敏症反応の発生につき患者を検査し、非精神分裂病の患者において観察される結果を上廻る反応である陽性の結果は、その患者が精神分裂病である高い可能性を有する指標とすること、を含んでなる、患者の精神分裂病を判定するための診断法を提供する。
【００１５】
本発明に従うと、驚くべきことには、プール２蛋白質は被検者の自己血小板から、又は代替的には、被検者以外の数人の個体から得られた異種の血小板の貯留物からのどちらからでも調製することができることが判明した。更に、驚くべきことには、多くの場合、個体が異種血小板の貯留物から得られたプール２蛋白質を注射される時には、彼自身の自己血小板から調製されたプール２蛋白質を注射された同一被検者における、より低いＤＴＨ反応に比して、精神分裂病患者のＤＴＨ反応は相当高いことが判明した。この所見は、その際即座に使用されるか、又は代替的には、多数の個体の精神分裂病を診断するために、様々な期間中、適当な条件下で（例えば冷蔵下で）貯蔵されて使用されることができる、プール２蛋白質調製物を調製する利点を提供する。これは本発明の診断法を実施する直前に被検者から血小板を含んでなる血液試料を繰り返し採取する必要を回避する。
【００１６】
従って、本発明は更に、好ましい態様により、
（ａ）  数人の個体から血液試料を採取し、前記の試料から貯留物を調製し、そしてそれらから血小板を収集すること、
（ｂ）  前記の血小板調製物から、約６．５を越える、好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内のｐＩをもつ蛋白質又はそれらの画分を含んでなる蛋白質画分を調製すること、
を含んでなる、精神分裂病の診断における使用のための試薬の調製法を提供する。
【００１７】
異種の個体から調製されたプール２蛋白質は精神分裂病に罹患した数人の個体からでも又は、代替的にはまた、精神分裂病患者並びに健康な個体から得られた血液試料の混合物からでも調製することができる。
【００１８】
本発明はまた更に、
（ａ）  被検者以外の、数人の精神分裂病及び／又は非精神分裂病の個体から血液試料を採取し、それらから血小板を収集すること、
（ｂ）  前記の血小板分離物から、約６．５を越える、好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内のｐＩをもつ蛋白質又はそれらの画分を含んでなる蛋白質画分を調製すること、
（ｃ）  前記の蛋白質調製物を患者に注射すること、並びに
（ｄ）  注射部位の遅延型過敏症反応の発生につき患者を検査し、非精神分裂病の患者において観察される結果を上廻る反応である陽性の結果は、患者が精神分裂病である高い可能性を有する指標とすること、
を含んでなる、患者の精神分裂病を判定するための診断法を提供する。
【００１９】
好ましい態様によると、段階（ｂ）で収集された蛋白質画分が、数人の被検者のために後日に、前記の段階（ｃ）及び（ｄ）に記載のような繰り返しの使用のために適切な条件下で貯蔵される、対象の精神分裂病の診断法が前記のように提供される。
【００２０】
前記のように、本発明の診断法に従い、被検者以外の数人の個体からのプール２蛋白質の貯留物の調製には利点があるが、被検者の自己血小板から調製されたプール２調製物を使用することもまた可能である。
【００２１】
このように、本発明は、
（ａ）  個体から血液試料を採取して、それらから血小板を収集すること、
（ｂ）  前記の血小板試料から、約６．５を越える、好ましくは約６．５ないし約９．５の範囲内のｐＩをもつ蛋白質又はそれらの画分を収集すること、
（ｃ）  前記の収集された蛋白質又はそれらの画分を被検者に注射すること、並びに
（ｄ）  注射部位の遅延型過敏症反応の発生につき患者を検査し、非精神分裂病の患者において観察される結果を上廻る反応である陽性の結果は、患者は精神分裂病である高い可能性を有する指標とする、
を含んでなる、患者の精神分裂病を判定するための診断法を提供する。
【００２２】
具体的には、プール２蛋白質は、収集された血小板蛋白質を、約６．５を越える、好ましくは６．５ないし９．５の範囲内のｐＩをもつ蛋白質が従来の当該技術分野で既知の方法で収集される等電点電気泳動にかけることにより、収集されるであろう。
【００２３】
しかし、本発明に従うと、プール２蛋白質調製物はまた、例えば洗剤を使用して、血小板試料から蛋白質を抽出することによるような、等電点電気泳動を含まない方法により調製することもできることが判明し、ここで、このような抽出は所望のｐＩ値をもち、精神分裂病患者のＤＴＨ反応を誘発することができるプール２蛋白質をもたらす。
【００２４】
所望の場合は、前記の方法のいずれか一つにより得られたプール２蛋白質調製物は、例えば薄層クロマトグラフィーにより、高圧液体クロマトグラフィーにより又はそれら自体既知の多数のその他の精製分別法により、更なる分別段階にかけることができる。このように得られた画分はそれぞれ、その際、活性、すなわち、精神分裂病患者にＤＴＨ反応を誘発するその能力を試験することができる。精神分裂病患者にＤＴＨ反応を誘発するのに活性な、このような精製された画分並びに、プール２蛋白質中の個々の蛋白質、ポリペプチド又はペプチドもまた、本発明の一態様である。
【００２５】
本発明に従って調製され、本発明の診断法に使用されるプール２蛋白質調製物は、プール２蛋白質から精製された蛋白質、このような蛋白質の配列、それらの画分を含んでなるポリペプチド又はペプチド、並びに、合成により又は遺伝子工学により得られた、プール２蛋白質の蛋白質の配列と同一の配列をもつ蛋白質、ポリペプチド又はペプチドを含む。
【００２６】
本発明に従うと、発明の診断法に使用されるプール２蛋白質は注射された対象にＤＴＨ活性を誘発することができるものであり、ここで、ＤＴＨ活性は当該技術分野で既知の試験により試験される。端的に言えば、プール２蛋白質を被検者の前腕又は大腿に皮内注射し、２４、４８及び７２時間後に注射部位の反応を、硬化部の周囲の反応直径を測定することにより判定する。前記のように、反応の時間プロファイルがＤＴＨ反応の典型的な時間プロファイルと異なる場合が存在する可能性がある。
【００２７】
本発明は更に、前記のプール２蛋白質、それらから得られた活性蛋白質画分、又は前記のプール２蛋白質に由来する個々の活性蛋白質又はペプチドを含んでなる、精神分裂病の診断に使用のためのキットを提供する。好ましくは、これらの蛋白質は注射可能な形態又は、注射可能な調製物を調製するのに適した形態、例えば凍結乾燥物で提供される。具体的には、キットには使用のための説明又は結果の判定の方法の指針のための表又は図が付けられているであろう。
【００２８】
今度は、本発明を付記の図に付記されている次の実施例において具体的に説明される。
【００２９】
【実施例】
患者の血液から収集された血小板の注射又はプール２蛋白質の注射に対する患者の反応に関する研究を、イスラエルのＳｈａ’ａｒ  ＭｅｎａｓｈｅのＴｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｐａｒｄｅｓ  ＨａｎａのＧｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて実施した。
【００３０】
（実施例１）  自己蛋白質の注射
１．  血小板の調製法
１０ｍｌの静脈血を患者から採取し、２０℃、１５０ｇで２０分間遠心分離した。血小板を含む上澄み液を収集し２０℃、２０００ｇで１０分間、３回遠心分離し、血小板を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。最後の洗浄後、血小板を滅菌ＰＢＳに再懸濁させて２×１０8血小板／ｍｌの最終濃度にした。
２．  自己皮膚テスト及び遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の測定法
特定の患者から前記のように得られた血小板懸濁物０．１ｍｌを同一患者の前腕中に皮内注射した。試料注射部位から約１０ｃｍ離れた０．１ｍｌのＰＢＳの第２の注射を対照とした。
【００３１】
注射部位のＤＴＨ反応を当該技術分野で既知の方法に従い測定した（Ｓｋｏｒｎｉｋ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１１：９３〜９６，１９８１）。
結果
テストを次の群の患者に実施した。
ａ）  ６５才未満の１８人の健常者、
ｂ）  ６５才より上の１０人の健常者、
ｃ）  ４１人の精神分裂病患者、
ｄ）  ２１人の痴呆患者。
【００３２】
このテストの結果は次の表１に示される。
【００３３】
表１  精神分裂病の検出のためのヒトの血小板に対する自己（自己−自己）皮膚反応
複数の機関における研究のまとめ
【００３４】
【表３】
0004455753.tif 000004
【００３５】
認められるように、４１人の精神分裂病患者中３８人がＤＴＨ反応を示し、一方、テストされた６５才未満の１８人の健常者中１人のみが陽性に反応した。６５才より上の１０人の健常者並びに２１人の痴呆患者において陽性反応は認められなかった。従って、このテストの感度は９２％であり、その特異性は９８％である。
【００３６】
表から認められるように、テストされた精神分裂病患者のほとんど全員が、彼らの自己血小板から調製されたプール２蛋白質に対してＤＴＨ反応を示し、健常者の１人のみが陽性のＤＴＨ反応を有した。従って本発明の診断法は、テストされた患者における精神分裂病の診断に対して非常に高い感度及び特異性を有した。
【００３７】
（実施例２）  プール１及びプール２蛋白質の調製
方法
約２０ｇｒの総蛋白を含む血小板懸濁液を実施例１のように得、血小板を、穏やかに震盪しながら室温で５分間、洗剤ＮＰ−４０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を０．５％含む溶液４０ｍｌで可溶化させた。次いで、溶液を２０℃で１５分間４０００ｇで遠心分離した。上澄み液を収集し、ペレットを、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の１０ｍｌで更に２回抽出した。３種類の上澄み液を合わせ、ＢｉｏＲａｄのＢｉｏ−Ｌｙｔｅ  ＡｍｐｈｏｌｙｔｅTM３／１０（４０％）を添加して１％の最終濃度にした。可溶化蛋白質を等電集束にかけた。陽極溶液として０．１Ｍのリン酸、そして陰極溶液として０．１ＭのＮａＯＨを使用して、試料６０ｍｌをＢｉｏＲａｄのＲｏｔｏｆｏｒTMシステムにかけた。電流が３０分間一定になるまで、１０ワットの一定電力を使用して１０℃で約４時間、等電集束を実施した。蛋白質をそれらのｐＩに従って２種類の別の群に分け、２〜６．５の範囲内のｐＩを有する蛋白質はプール１蛋白質と称され、一方、６．５〜９．５の範囲内のｐＩを有する蛋白質はプール２蛋白質と称される。プール１及びプール２蛋白質は別々に採取され、ＰＢＳで１：５０に希釈された。
【００３８】
（実施例３）  プール１及びプール２蛋白質の注射方法
次の４種類の調製物、
ｉ．  プール２蛋白質（Ｐ２としてマーク）
ii．  プール１蛋白質（Ｐ１としてマーク）
iii．  自己血小板（Ａとしてマーク）
iv．  ＰＢＳ、
を精神分裂病患者の前腕に皮内注射した。
【００３９】
前記の調製物各０．１ｍｌが注射され、調製物は相互から約１０ｃｍ離れた４カ所の異なる注射部位に注射された。各注射部位の皮膚反応を注射の２４時間、４８時間及び７２時間後に判定した。
【００４０】
結果
結果は図１に見られ、（ｉ）が腕の一番高い注射部位であり（ｉｖ）が一番低い注射部位である。
【００４１】
図から見られるように、前記に説明されたように測定されたＤＴＨ反応は、プール２蛋白質の注射部位で１人の精神分裂病患者で認められ、Ｐ１注射部位ではＤＴＨ反応は認められなかった。更に、Ｐ２の注射部位のＤＴＨ反応は自己血小板の注射部位で認められるＤＴＨ反応に比して実質的に高かった。従って、本発明の診断法においては、大部分の場合に、数人の異種対象から得られた血液試料の貯留物から得られたＰ２蛋白質調製物を使用することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  次の調製物、
ｉ．  プール２蛋白質（Ｐ２としてマーク）
ii．  プール１蛋白質（Ｐ１としてマーク）
iii．  自己血小板（Ａとしてマーク）
iv．  ＰＢＳ（Ｃ＝対照とマーク）
を注射された精神分裂病患者の前腕上の反応を示している。
【図１】
0004455753.tif 000005