(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択されたエピトープを発現する分子を検出する方法であって、
（ａ）選択されたエピトープを発現する分子を、選択された表面に固定化し；
（ｂ）上記表面をエピトープ検出器に接触させることにより、表面上の固定化された分子にエピトープ検出器が結合するようにするが、但し、エピトープ検出器は、
（ｉ）ＲＮＡプロモーターを含むオリゴヌクレオチドであって、下記（ii）に結合したオリゴヌクレオチド；
（ii）選択されたエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、選択されたエピトープに特異的に結合する単鎖Ｆｖ、選択されたエピトープに特異的に結合する強制されたＣＤＲ、選択されたエピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物、又は選択されたエピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造
を含み；
（ｃ）ＲＮＡ増幅により上記オリゴヌクレオチドから増幅されたＲＮＡを生成し；そして
（ｄ）増幅されたＲＮＡ産物の存在を検出するが、但し、
（ｉ）ＲＮＡ産物を染色する蛍光染料に上記の増幅されたＲＮＡ産物を溶液中で接触させ、そして染色されたＲＮＡから放射される蛍光シグナルの量を測定するが、但し、染色されたＲＮＡから放射される蛍光が、表面上に固定化された分子上の選択されたエピトープに結合したエピトープ検出器に正比例すること、
（ii）さらに、リバーストランスクリプターゼを用いてＲＮＡ産物を増幅し、そしてさらなる増幅産物を溶液中で検出するが、但し、さらなる増幅産物の検出が、表面上に固定化された分子上の選択されたエピトープに結合したエピトープ検出器の指標であること、そして
（iii）さらに、レプリカーゼを用いてＲＮＡ産物を増幅し、そしてさらなる増幅産物を溶液中で検出するが、但し、さらなる増幅産物の検出が、表面上に固定化された分子上の選択されたエピトープに結合したエピトープ検出器の指標であること
からなる群から選択される方法により増幅されたＲＮＡ産物の存在を検出すること
を含む方法。
【請求項２】
選択されたエピトープを発現する分子を検出する方法であって、
（ａ）選択されたエピトープを発現する分子を、選択された表面に固定化し；
（ｂ）上記表面をエピトープ検出器に接触させることにより、表面上の固定化された分子にエピトープ検出器が結合するようにするが、但し、エピトープ検出器は、
（ｉ）ＲＮＡプロモーターを含み、下記（ii）に結合したオリゴヌクレオチド；
（ii）選択されたエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、選択されたエピトープに特異的に結合する単鎖Ｆｖ、選択されたエピトープに特異的に結合する強制されたＣＤＲ、選択されたエピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物、又は選択されたエピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造
を含み；
（ｃ）ＲＮＡ増幅により上記オリゴヌクレオチドから増幅されたＲＮＡを生成し；
（ｄ）ＲＮＡ産物を染色する蛍光染料に上記の増幅されたＲＮＡ産物を溶液中で接触させ；そして
（ｅ）染色された増幅ＲＮＡ産物から放射される蛍光シグナルの量を測定するが、放射される蛍光シグナルの量が、サンプル中に存在するエピトープを発現する分子の数に正比例すること
を含む方法。
【請求項３】
２−成分系を用いてインビトロにて分子の相互作用を監視する方法であって、
（ａ）第１の分子を固相表面に固定化し；
（ｂ）第１の分子に相互作用する第２の分子を固相表面に添加するが、但し、第２の分子はユニバーサルエピトープを含み；
（ｃ）ＲＮＡプロモーターを含むオリゴヌクレオチドをコンジュゲートしたユニバーサルエピトープ検出器を上記固相表面に添加し；
（ｄ）ＲＮＡ増幅を実施し；
（ｅ）増幅されたＲＮＡ産物を、ＲＮＡ産物を染色する蛍光染料に溶液中で接触させ；そして
（ｆ）、染色されたＲＮＡから放射された蛍光シグナルの量を測定するが、染色されたＲＮＡから放射された蛍光が第１の分子の第２の分子に対する結合に正比例すること
を含む方法。
【請求項４】
第１の分子及び第２の分子が、蛋白質、糖、糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は構造上のコンフォメーションを伴うペプチドである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
インビトロにて分子の相互作用を監視する方法であって、
（ａ）請求項３又は４記載の方法に従い２−成分系を使用し；
（ｂ）第３の分子を２−成分系に添加し；そして
（ｃ）蛍光の変化を測定することにより上記の２−成分系の第１分子と第２分子の結合及び相互作用に対する第３の分子の作用を監視するが、但し、蛍光の正の変化が第１分子と第２分子の結合を促進する第３分子の指標であり、そして負の変化が第１分子と第２分子の結合を阻害する第３分子の指標であること
を含む方法。
【請求項６】
第３の分子がリガンド又は薬学上の薬剤を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
特異的エピトープに特異的に結合するＣＤＲ構造、特異的エピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物構造又は特異的エピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造を同定する方法であって、
（ａ）選択されたエピトープを発現する分子を、選択された表面に固定化し；
（ｂ）上記表面をＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造のライブラリーに接触させるが、但し、
（ｉ）ＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造のライブラリーは、各々、ＲＮＡプロモーターを含むオリゴヌクレオチドに結合しているか；又は
（ii）ＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造のライブラリーはユニバーサルエピトープを含み、且つ、ユニバーサルエピトープに結合するエピトープ検出器をさらに添加するが、エピトープ検出器はＲＮＡプロモーターを含むオリゴヌクレオチドを含み
（ｃ）ＲＮＡ増幅によりオリゴヌクレオチドから、増幅されたＲＮＡ産物を生成し；
（ｄ）ＲＮＡ産物を染色する蛍光染料に上記の増幅されたＲＮＡ産物を溶液中で接触させることにより増幅されたＲＮＡ産物の存在を検出し；そして
（ｅ）染色されたＲＮＡ産物から放射された蛍光シグナルの量を測定するが、但し、染料されたＲＮＡ産物をから放射される蛍光が、選択された表面上に固定化された分子上の特異的エピトープに特異的に結合するＣＤＲ構造、選択された表面上に固定化された分子上の特異的エピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物構造又は選択された表面上に固定化された分子上の特異的エピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造を同定する指標であること
を含む方法。
【請求項８】
選択された表面が、チップ、９６−ウエルプレート及び３８４−ウエルプレートからなる群から選択される、請求項１乃至７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ビオチン−ストレプトアビジンリンカーによるか；又は
（ｂ）オリゴヌクレオチドがモノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ、強制されたＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造上のエピトープに特異的に結合する分子にコンジュゲートされるかにより、
モノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ、強制されたＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に結合している、請求項１乃至８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが二重鎖ｃＤＮＡ分子である、請求項１乃至９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡプロモーターがＴ７のＲＮＡプロモーター、Ｔ３のＲＮＡプローター及びＳＰ６のＲＮＡプロモーターからなる群から選択される、請求項１乃至１０の何れか１項記載の方法。
【請求項１２】
蛍光染料が非対称性シアニン染料である、請求項１乃至１１の何れか１項記載の方法。
【請求項１３】
選択されたエピトープを発現する分子の蛍光を用いた検出又は定量のための、
（ａ）（ｉ）ＲＮＡプロモーターを含むオリゴヌクレオチドであって、下記（ii）に結合したオリゴヌクレオチド；
（ii）選択されたエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、選択されたエピトープに特異的に結合する単鎖Ｆｖ、選択されたエピトープに特異的に結合する強制されたＣＤＲ、選択されたエピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物、又は選択されたエピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造
を含むエピトープ検出器；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）増幅反応バッファー；
（ｄ）溶液中でＲＮＡに結合する蛍光非対称性シアニン染料
を含むキット。
【請求項１４】
（ａ）細胞溶解物の中に存在する蛋白質上の選択されたエピトープに特異的に結合するエピトープ検出器の混合物であって、上記エピトープ検出器の各々は、
（ｉ）ＲＮＡプロモーターを含み、下記（ii）に結合したｃＤＮＡ；
（ii）選択されたエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、選択されたエピトープに特異的に結合する単鎖Ｆｖ、選択されたエピトープに特異的に結合する強制されたＣＤＲ、選択されたエピトープに特異的に結合するＣＤＲ模倣物、又は選択されたエピトープに特異的に結合する工作されたＣＤＲ構造を含むが、
但し、同じ特異的エピトープに特異的に結合するエピトープ検出器が同じ長さのＲＮＡ増幅産物を生じるｃＤＮＡｓにコンジュゲートされており、そして異なる特異的エピトープに特異的に結合するエピトープ検出器が異なる長さのＲＮＡ増幅産物にコンジュゲートされているエピトープ検出器混合物；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）増幅反応バッファー；
（ｄ）溶液中でＲＮＡに結合する蛍光非対称性シアニン染料
を含むキット。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ビオチン−ストレプトアビジンリンカーによるか；又は
（ｂ）オリゴヌクレオチドがモノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ、強制されたＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造上のエピトープに特異的に結合する分子にコンジュゲートされるかにより、
モノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ、強制されたＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に結合している、請求項１３又は１４項記載のキット。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが二重鎖ｃＤＮＡ分子である、請求項１３乃至１５の何れか１項記載のキット。
【請求項１７】
ＲＮＡプロモーターがＴ７のＲＮＡプロモーターであり且つＲＮＡポリメラーゼがＴ７のＲＮＡポリメラーゼであるか、ＲＮＡプロモーターがＴ３のＲＮＡプロモーターであり且つＲＮＡポリメラーゼがＴ３のＲＮＡポリメラーゼであるか、又はＲＮＡプロモーターがＳＰ６のＲＮＡプロモーターであり且つＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼである、請求項１３乃至１６の何れか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
序論
この出願は、２０００年７月２５日に出願された米国特許出願連続番号０９／６２４，９４６号の一部継続出願である、２００１年２月１５日に出願した米国特許０９／７８３，８９６号の一部継続出願である。
発明の背景
蛋白質の検出及び定量のための慣用の方法論は、２−Ｄゲル電気泳動、質量分光測定及び抗体結合を含む。各方法論は相対的に大量の組織からの蛋白質レベルを定量するのに使用されてきたが、各々は感度の欠如をこうむる。
【０００２】
蛋白質、脂質、糖及び代謝レベル及びそれらの修飾を監視する能力の改良が、細胞生物学及び医薬に必要とされる。様々な技術が用いられることにより、これらの分子を検出する感度が改良されてきた。検出法の最近の例は、免疫−ＲＮＡ，ＲＣＡ及び免疫−ａＲＮＡを含む。
【０００３】
免疫−ＰＣＲ（米国特許第５，６６５，５３９号）は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を、蛋白質を検出する感度を増大させるための慣用の検出法と組み合わせる。しかしながら、免疫−ＰＣＲの主な限界は、ＰＣＲ反応の非直線性増幅能力に見いだされ、この技術を、定量性検出法として限定させる。即ち、この方法は、シグナルの量と存在する蛋白質の量の間の非直接の相関を提供する。
【０００４】
相対的な恒温性回転循環ＤＮＡ増幅技術（ＲＣＡ；Ｓｃｈｗｉｅｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，１０１１３，２０００）は、この技術が免疫−ＰＣＲに付随する定量に関する問題の幾つかを克服するものとして、免疫−ＰＣＲを超える改良を提供する。
【０００５】
米国特許第５，９２２，５５３号は、免疫−ａＲＮＡと呼ばれる技術を通して、選択された蛋白質のレベルを定量する方法を開示する。この方法においては、選択された蛋白質を標的とする一次抗体を固相支持体に固定化する。当該支持体を、次に、選択された蛋白質と接触させることにより、選択された蛋白質を、一次抗体に固定化する。固相支持体は、次に、上記選択された蛋白質を標的とする二次抗体に共有カップリングさせたＲＮＡプロモーター推進性ｃＤＮＡ配列に接触させる。選択された蛋白質の量は、増幅ＲＮＡ技術により、結合した二次抗体に共有カップリングした上記プロモーター推進性ｃＤＮＡ配列のレベルを定量することにより、測定される。好ましい態様においては、Ｔ７プロモーター推進性ｃＤＮＡ配列を二次抗体に共有カップリングさせる。
【０００６】
単鎖断片並びに環外ペプチドに基づく相補決定領域（ＣＤＲ）サブユニットがこの免疫−ａＲＮＡ技術において使用可能であることを、今見いだした。さらに、ＰＣＲ、並びに増幅されたＲＮＡ技術を用いて、結合した単鎖断片又はＣＤＲサブユニットに共有カップリングさせたプロモーター推進性ｃＤＮＡ配列を定量することができることを発見した。既に存在する大きな単鎖又は環状ペプチドライブラリーにカップリングさせた小さな抗体結合のユニット又は断片の使用及びロボットの補助の使用は、この方法を、医療の目的及び研究の目的の両方のために広く有用なものとさせる。さらに、単独の第３の検出器（detector）の種は、二重鎖ＤＮＡにカップリングさせ且つ単鎖Ｆｖ又はＣＤＲｓのいずれかに結合させることができ、検出を均一且つ単純にさせる。
発明の概要
本発明の目的は、サンプル中の、選択されたエピトープを発現する分子を検出する方法を提供することである。この方法においては、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカー種を選択された表面に固定化させる。当該エピトープアンカーは、単鎖Ｆｖ断片、ＣＤＲ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造、抗体、又は他のリガンドペプチド又は選択されたエピトープと相互作用する化学物質又は医薬を含んでよい。表面を、次に、選択されたエピトープを発現する分子を含む疑いのあるサンプルと接触させて、上記分子を固定化されたエピトープアンカーに結合させる。選択されたエピトープのための単鎖Ｆｖ又はオリゴヌクレオチド、好ましくはｃＤＮＡに結合させた、強制的（constrained）エピトープ特異的ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造を含むエピトープ検出器を次に使用して、あらゆる結合分子を検出する。上記オリゴヌクレオチドは、単鎖Ｆｖ，ＣＤＲ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に結合するビオチン−ストレプトアビジン又はビオチン−アビジンを通して、化学的にコンジュゲートするか又は結合させることができる。あるいは、本発明の方法をエピトープアンカーなしに実施することができる。この態様においては、エピトープ検出器を用いて、表面へ直接結合させた分子を規定する。
【０００７】
この方法の好ましい態様において、検出は、蛍光に由来する数値の標準蛍光測定装置を用いて読み出しを通して実施する。より特定すれば、この態様においては、エピトープアンカーのオリゴヌクレオチドの増幅後に、蛍光染料を直線様式にて核酸に取り込む。選択された波長における励起に際して、染料は、負荷されたサンプルの質量に正比例して蛍光シグナルの量を生じる。
【０００８】
異なる長さのｃＤＮＡにコンジュゲートされた、選択されたエピトープのためのモノクローナル抗体、選択されたエピトープのための単鎖Ｆｖ又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造の何れかを含む混合物を用いて、本発明の方法を細胞溶解物中の蛋白質をプロファイルするのに用いることもできる。
【０００９】
一つの態様において、エピトープ検出器における使用のためのＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造は、分子をエピトープと結合させるＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造を規定するための、ＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造のライブラリーのスクリーニングを通して同定される。これらのライブラリーを通してスクリーニングすることにより同定されたＣＤＲｓ又はＣＤＲ模倣物は、受容体を標的とする治療剤又は受容体と相互作用する蛋白質として使用することもできる。治療剤として使用された場合、ＣＤＲｓ又はＣＤＲ模倣物はヒト化抗体に再挿入されるか又はＦｃに結合させることが好ましい。
【００１０】
本発明の別の目的は、選択されたエピトープのための単鎖Ｆｖ又はオリゴヌクレオチド、好ましくは二重鎖ｃＤＮＡに結合させた、強制的エピトープ特異的ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造を含むエピトープ検出器を含む、選択されたエピトープを発現する分子の検出のためのキットを提供することである。さらに、上記キットは、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ、増幅バッファー及び増幅産物の染色のための蛍光染料を含む。本発明のキットは、さらに、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを含んでよい。一つの態様において、上記単鎖Ｆｖ又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造は、オリゴヌクレオチドへの結合を可能にさせるために修飾する。別の態様において、上記キットは、細胞溶解物の中の蛋白質のプロファイリングのためのエピトープ検出器の混合物を含む。
【００１１】
本発明の方法及びキットは、サンプルの高処理量操作及びスクリーニングのための、便利な９６−ウエル又は３８４−ウエルのプレートプラットフォームに処方する（formulated）ことができる。
【００１２】
本発明の方法及びキットは、特に分子の相互作用、例えば蛋白質−蛋白質相互作用及び糖−蛋白質相互作用を分析する際、並びに化学物質薬学物質及び限定ではないが蛋白質、脂質及び糖を含む他の分子種により誘導されるこれらの相互作用における変化を監視するのに有用である。
発明の詳細な説明
本発明は、選択された分子のレベルを定量するための改良された方法及びこれらの改良された方法を実施するための系及びキットに関する。一つの態様において、上記方法は、分子の選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを、選択された表面に結合させることを含む。エピトープアンカーは、単鎖のＦｖ断片、ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造、抗体、又は他のリガンドペプチド又は選択されたエピトープに特異的な化学物質を含んでよい。好ましい態様において、エピトープアンカーは上記表面上の指定されたスポットに結合させる。例えば、上記表面はチップを含んでよく、そしてエピトープアンカーをチップ上の規定されたスポットに結合させる。一つの態様において、エピトープアンカーは、ピペッター又は単一の部位においての適用を可能にさせる類似の装置の支援により表面又はプレート上に被覆される。結合したエピトープアンカーを伴う表面を、次に、選択されたエピトープを発現する分子を含む疑いのあるサンプルに接触させ、それにより、分子はエピトープアンカーに結合する。他の態様においては、上記分子を直接表面に、エピトープアンカーを使用せずに結合させる。
【００１３】
本発明の方法によりアッセイできるサンプルの例は、限定ではないが、個体（individual）の細胞及び生物学上の液体、例えば血清を含む。
表面上に結合したあらゆる分子を結合できるエピトープ検出器を次に使用することにより、結合した分子の量を検出及び定量する。上記エピトープ検出器は、モノクローナル抗体、選択されたエピトープのための単鎖Ｆｖ又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造を含むか又はオリゴヌクレオチド、好ましくは二重鎖ＤＮＡの結合を単一部位にて可能にさせるように修飾されたものを含んでよい。あるいは、結合活性を有する抗体の断片、ｓｃＦｖ又はＣＤＲペプチドを用いることにより、この技術において抗体を置き換えることができる。
【００１４】
選択されたエピトープに関するＦｖ断片は、組換えＤＮＡ技術の使用により細胞中又は微生物上にて生産することができる。例えば、Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８  ２４０：１０３８−１０４４）は、大腸菌内での機能性Ｆｖ断片のための発現系を記載する。
【００１５】
抗体の軽鎖又は重鎖の可変ドメインのみをコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを有する真核発現ベクターを有する真核宿主細胞内でＦｖ断片を製造する方法も記載された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８  ２０３：８２５−８２８）。完全な機能性Ｆｖ断片が細胞上清中に生産されるように、Ｆｖ断片の鎖が宿主細胞により分泌されて正確に折り畳まれる。さらに、アミノ末端エンドがオリゴヌクレオチドの共有カップリングに適した表面を伴う一つ又は複数の残基を発現するために、上記ＤＮＡコーディング配列をその５’末端に向かって変更させてよい。さらに、システイン残基が各可変ドメインのＣ−末端エンドに向かって生産されて、ダイマー中の可変ドメインがジスルフィド結合により互いに結合することを可能にするため、３’末端エンドを変更させてよい。これは、Ｆｖ断片の集合を促進するかもしれない。あるいは、第１可変ドメインをコードする第１ＤＮＡ配列と第２可変ドメインをコードする第２ＤＮＡ配列を有し、且つ接合ペプチド配列をコードする第３のＤＮＡ配列により上記第１配列と第２ＤＮＡ配列が結合しているベクターの使用により、Ｆｖ断片を安定化させてよい。この場合、接合ペプチド配列は、上記２つのポリペプチドが機能性単一鎖Ｆｖに折り畳まれるのを可能にさせるように、十分長くて柔軟である。好ましくは、宿主細胞は、形質転換前に全部の抗体又は軽鎖を分泌しない骨髄腫細胞系である。そのような細胞系はよく知られており、広く利用可能である（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８  ２０３：８２５−８２８）。
【００１６】
任意のハプテン又は化学化合物に対してのランダムファージ技術もＦｖｓを選択するのに使用可能であると信じられる。（Ｈａｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｔｄ．（欧州），Ｗａｔｆｏｒｄ，英国）
ＣＤＲ技術はよく知られており、米国特許第５，３３４，７０２号、米国特許第５，６６３，１４４号及び米国特許第５，９１９，７６４号に記載されている。抗体分子は、相補性決定基（ＣＤＲｓ）と呼ばれる６つの可変ループを通してそれらの抗原に結合する。重鎖からのＣＤＲ３はしばしばその特異性を媒介する。強制的環状ＣＤＲ模倣物のデザインのための一般的な方法論は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９  ８６：５５３７−５５４１）、Ｓａｒｇｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  ２５３：７９２−７９５）及びＭｕｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８  １７：１６３−１６９）により記載される。通常、ＣＤＲｓは、強制的に（constrained）環状にされて芳香性残基により修飾された６から１５マーのペプチドを含む。ＣＤＲ模倣物は、特異性、親和性及び生物活性に関してそれらの親抗体を模倣することができる小さな分子である（約１ｋＤａ）。ＣＤＲ模倣物の環状形態は約５から１３の強制的アミノ酸を含む。
【００１７】
本発明のためには、ＣＤＲを含むエピトープ検出器又はエピトープアンカーは、ＣＤＲ又はＣＤＲ模倣物から本質的になってよい。あるいは、エピトープ検出器又はエピトープアンカーは、ヒト化抗体フレームワークに再挿入されるか又はＦｃに結合される結合として定義されるＣＤＲ又はＣＤＲ模倣物を含んでよい。ヒト化抗体フレームワークに再挿入されるか又はＦｃに結合されるＣＤＲｓ又はＣＤＲ模倣物も、本明細書では、工作されたＣＤＲ構造と呼ぶ。しかしながら、この開示を読んだ当業者には理解されるとおり、用語「工作されたＣＤＲ構造」は、ＣＤＲ又はＣＤＲ模倣物が挿入されるあらゆる蛋白質を含む。そのような蛋白質の例は、限定ではないが、イムノグロブリン遺伝子ファミリー、ミニボディ又は小抗体様の分子、あるいはＣＤＲが抗原結合表面として機能することを可能にさせる他のあらゆるフレームワークを含む。
【００１８】
本発明における使用のための、ＣＤＲ、ＣＤＲｓ模倣物及び工作されたＣＤＲ構造のデザインにおける重要な工程は、活性に重要な残基の描写である。これは、一般に、最初にオリジナル抗体又は受容体又はリガンドの生物活性ドメインから一連の違う長さの類似体を合成し、そして完全活性及び部分活性のための最小の鎖の長さを立証することにより達成される。最小の鎖の長さが立証されたなら、各側鎖を規則正しく変更することにより、各位置の電荷、立体の大きさ、疎水性、芳香性、キラル性（chirality）の重要性を決定することができる。類似体の大きなセットの特性を評価したあとには、結合に関与する官能基とコンフォメーションの特性を同定することができる。別々のコンフォメーション上の強制的類似体を次に開発することができる。ペプチドを強制する（constraining）様々な手段が開発されている。
【００１９】
一つの手段は、コンフォメーション上強制されたアミノ酸を導入することを含む。Ｈｒｕｂｙ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９８２  ３１：１８９−１９９）は、ビルトインのコンフォメーション上の強制物による多数のアミノ酸とジペプチド誘導体の合成、並びに生物学上活性なペプチドへのそれらの取り込みを記載する。Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９５  ３５：１１−２０）も、α−炭素の水素の位置をメチル基に交換することによりアミノ酸のコンフォメーションを強制して、ジアルキルアミノ酸を生産する方法を記載する。米国特許第６，０２２，５２３号は、Ｃ−αとＣ−β原子において二重結合を導入することによるアミノ酸のコンフォメーション上の自由度を制限する方法を記載する。
【００２０】
ペプチドを強制するための別の手段は、共有架橋結合の導入を含む。共有架橋結合の導入によるペプチドバックボーンの強制は、普通でないアミノ酸を取り込むよりも、より劇的な効果を提供する。大環状化は、ペプチドのＮ−末端とＣ−末端の間、側鎖とＮ又はＣ末端の間、又は２つの側鎖の間に、アミド結合を形成させることにより、しばしば達成される。第一世代のジアルコキシベンジル結合剤である４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酢酸により誘導されたポリスチレン樹脂上のＦｍｏｃ／ｔ−ブチル固相手法により側鎖を保護されたペプチドのヘッドトウーテイル環状化が、Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１９８２  ２０：４５１−４５４）に記載された。さらに、類似のリンカー、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−ブチル酸（ＨＡＭＡ）が、最近、これらの高度に酸感受性のリンカーによる断片濃縮化及び固相合成において用いられた（Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ編纂、ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  １９９１，１３１−１３３）。Ｓｃｈｉｌｌｅｒにより記載されたエンケファリン類似体は、バックボーンの共有環状化に対する側鎖の例を適用するが、ＬｅｕのＣ末端バックボーンカルボキシレート基への、Ｄ−ｌｙｓ残基のｅ−アミノ基の共有結合が有能性及び重要性の高いμ受容体選択性を有する環状の１６−員環類似体を生成する（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８５；２５：１７１−１７７）。ＢＯＰ−試薬及びカルボジイミド／１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールの組み合わせも、環状ペプチドの形成に有用であることが報告された（Ｆｅｌｉｘ，Ａ．Ｍ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８８  ３１：２３１−２３８）。Ｄｅｇｒａｄｏらも、リンカーとしてｍ−アミノメチル安息香酸を用いて、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の生物学上活性な環状化ペプチド類似体を開発した（米国特許第６，０２２，５２３号）。
【００２１】
ジスルフィドは、特定の位置におけるシステインの導入による酸化により形成することもできる。例えば、Ｒｏｍａｎｉ，Ｓ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８７  ２９：１０７−１１７）は、アゾジカルボキシル酸のジ−第三級ブチルアスター（aster）の支援により非対称性ジスルフィドが構築できることを証明した。Ｐｌｏｕｘ，Ｏ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８７  ２９：１６２−１６９）も、３Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基のチオール置換による非対称性ジスルフィドの形成方法を記載する。
【００２２】
好ましい態様において、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、二重鎖であって、且つＴ７プロモーター推進性ｃＤＮＡ配列を含むことにより、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅することができる。この態様においては、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼのための鋳型としての使用のために、二重鎖ｃＤＮＡを合成する。Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼはそのプロモーター部位が二重鎖であることを必要とする。
【００２３】
一つの態様において、オリゴヌクレオチドが結合する、Ｆｖ又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造上の部位は、化学物質、例えばヘテロダイマーカップリング試薬又は他のリンカーからなるリンカーの結合を可能にさせる残基のシリーズを含む。これらの残基は、リンカー結合のための特有な結合部位を提供する。リンカーはこの部位に結合し、そしてオリゴヌクレオチドをＦｖ又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に結合させる。オリゴヌクレオチドは、未修飾でも修飾されていてもよい。例えば、ビーコン（beacon）又は蛍光により標識したオリゴヌクレオチドを上記混合物に取り込むことにより、増幅されたオリゴヌクレオチドの存在を増強することができ、エピトープ発現分子の迅速な半定量的評価を可能にさせる（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００  ６：１１０７−１１１１；Ｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  ２６（９）：２１５０−２１５５）。
【００２４】
別の態様においては、エピトープ検出器のオリゴヌクレオチドをビオチンにカップリングさせ、そしてモノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に特異的な強制的エピトープをストレプトアビジンにカップリングさせ、そしてモノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に特異的な強制的エピトープへの上記オリゴヌクレオチドの結合が、ビオチンとストレプトアビジンの複合体形成により起こる。
【００２５】
結合したエピトープ検出器は、慣用のＰＣＲ又はａＲＮＡ技術による増幅のような方法により定量してよい。用いられる検出方法が免疫ａＲＮＡならば、二重鎖ｃＤＮＡをエピトープ検出器として用いるのが好ましい。この態様においては、ａＲＮＡを、ポリメラーゼ、未標識リボヌクレオチド及び蛍光標識リボヌクレオチドを用いて、固相支持体上で転写させる。本発明のための「ポリメラーゼ」は、特定のプロモーターを認識するポリメラーゼを意味する。本発明に有用なポリメラーゼの例は、限定ではないが、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３のＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、ψ２９のポリメラーゼ、及びＴａｑポリメラーゼを含む。別の態様においては、増幅された産物をリバーストランスクリプターゼ又はレプリカーゼによるさらなる増幅のための鋳型として作用させて、感度を増加させることができる。
【００２６】
様々な手段がエピトープ検出器の増幅産物の検出に利用可能である。一つの態様においては、核酸配列は、放射線標識又は蛍光標識によるように検出可能に標識される。好ましい態様においては、核酸配列は標識されないが、蛍光染料により染色される。他の方法、例えば、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーションアッセイ、免疫組織化学アッセイ及び／又は特異的結合アッセイも、検出に用いることができる。
【００２７】
Ｆｖｓ及びＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造の、エピトープ検出器としての使用は、米国特許第５，９２２，５５３号の免疫ａＲＮＡ技術により同定できたのよりも大きなポリペプチドを同定すること、及び細胞又は細菌又はあらゆる他の真核生物の上清、液体、抽出物内のモチーフを同定することにおいて、本発明の方法を有用にさせる。従って、本発明の方法は、医療の目的及び研究の目的の両方において広い応用性を有する。さらに、本発明の方法は、現在利用可能な方法よりも感度がよくて、定量性の結果を提供する。
【００２８】
Ｆｖｓ及びＣＤＲｓ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造が本発明の方法において選択された分子のエピトープ検出器として機能する能力を、ｐ１８５受容体に関して証明した。この実験に関しては、７．１６．４の単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）構築物（７．１６．４  ＳｃＦｖと呼ぶ）をＰｅｔｅｒｓｏｎ  ＆  Ｇｒｅｅｎｅ（ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８  １７（１２）：１０３１−１０４０）により概説された手法に従い製造したが、重鎖のＦｖ領域と軽鎖領域を（ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）５リンカーにより連結した。ＳｃＦｖ７．１６．４はポリヒスチジンのタグを含んだため、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製した。精製後に、７．１６．４ＳｃＦｖの結合をＢ１０４−１−１細胞上のＦＡＣＳ分析により、モノクローナル抗体に対する直接の結合及び競合結合の両方において確認した。
【００２９】
抗−ヒトｐ１８５抗体のＣＤＲ３．Ｈ領域からデザインされた強制的環外ペプチドであるＡＨＮＰも使用した。ＡＨＮＰはｐ１８５に結合して、４Ｄ５の成長阻害効果を模倣する（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００  １８：１９４−１９８）。
【００３０】
ＳｃＦｖ７．１６．４及びＡＨＮＰの両者を、二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓ−ｏｌｉｇｏ）にカップリングさせることにより、エピトープ検出器を形成させた。ｄｓ−ｏｌｉｇｏをカップリングした７．１６．４ＳｃＦｖ及びＡＨＮＰは共に、それらの抗原である、Ｂ１０４−１−１細胞及びＴ６−１７細胞由来のヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕをそれぞれ検出することができた。さらに、エピトープ検出器を形成させるためのｄｓ−ｏｌｉｇｏとのコンジュゲーションは、プラズモン共鳴分析により測定したところ、ＣＤＲ検出分子とそれらの抗原との結合親和性を変化させなかった。７．１６．４ＳｃＦｖ及びｍＡｂ  ７．１６．４はｐ１８５受容体に対して同等の結合親和性を有するので、それらをこのアッセイにおいて同等のモル濃度にて使用した。しかしながら、ＡＨＮＰは、その親和性が４Ｄ５よりもｐ１８５Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対して低いため、高濃度で使用した。
【００３１】
ＡＨＮＰは、Ｍ１３ファージシステムを用いてストレプトアビジン融合蛋白質としても発現させた。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ由来のコアのストレプトアビジン配列のｃＤＮＡを、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカーの配列も含む５’ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲによりクローン化した。ＡＨＮＰ及び追加のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーをコードする相補なオリゴヌクレオチドを合成してアニールさせることにより、二重鎖ＤＮＡを形成させた。ライゲーションの後に、融合物は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーのＮ−末端のＡＨＮＰからなり、コアストレプトアビジン（ＳＡ）配列へと続く。テトラマーＡＨＮＰ模倣物と、テトラマーに普通は似ているＳＡの間の柔軟性を生じるように、リンカー領域を導入する。３又はそれより長いＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを含む長いリンカー及び２又は１のリンカーを含む短いリンカーの両方をこれらの融合蛋白質において使用した。しかしながら、３Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの長いリンカーは大きな柔軟性を提供するため、好ましい。
【００３２】
融合構築物は、ファージ発現ベクターファージ３．２２（Ｍａｘｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）内でＳａｌＩ−ＡｐａＩ部位にクローン化された。当該融合物を最初に、ＴＧ１細菌株のｐＩＩＩファージ蛋白質リーディングフレーム内で発現させた。ＡＨＮＰ−ＳＡ融合物も、ｐＩＩＩ成分を含まない別の細菌宿主株（ＨＰ２１５１）内で発現させることができる。ｐ１８５Ｈｅｒ２／ｎｅｕとイムノグロブリンＦｃ領域からあるキメラ蛋白質（Ｈｅｒ２−Ｆｃ）を使用することにより、発現されたＡＨＮＰ−ＳＡ形態の結合親和性を試験した。Ｈｅｒ２−Ｆｃを９６−ウエルの免疫アッセイプレート上にコートして、ファージ上清をプレート上に加えた。ビオチンをコンジュゲートしたパーオキシダーゼを次に使用して、ＡＨＮＰ−ＳＡ分子の、精製されたＨｅｒ２−Ｆｃに対する結合活性を検出した。
【００３３】
即ち、本明細書に示すとおり、ＡＨＮＰ−ＳＡ種はビオチン化オリゴヌクレオチドに結合させた場合にポリメラーゼに基づく増幅に影響を受けやすいので、ＡＨＮＰ−ＳＡ種は迅速で多様なプロテオミクスのアプローチを開発するための手段を提供する。
【００３４】
抗−ＥＧＦｒ分子のＣＤＲ模倣物、ＡＥＲＰは、異なる数の強制的アミノ酸も明らかになって（developed）、ＥＧＦｒに関してｎＭの親和性を有することも示された。
本発明における検出のための好ましい手段は、蛍光染料により染色することを含む。この態様においては、ポリメラーゼ、例えば、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３のＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、ψ２９のポリメラーゼ又はＴａｑポリメラーゼによるＲＮＡ増幅の後に、反応混合物の一部を蛍光染料、例えば、溶液仲でＲＮＡに直接結合してあとで蛍光シグナルを放出する非対称性シアニン染料である、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）（米国特許第５，４３６，１３４号）と混合する。この方法において有用な類似の特性を有する他の蛍光染料の例は、限定ではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ，ＴＯＴＯ−１又はＹＯＹＯ−１を含む。反応はマイクロプレート中で実施することが好ましく、蛍光は、蛍光計、例えばＳｐｅｃｔｒａ  Ｆｌｕｏｒａを用いて、ＲＮＡ溶液をＲｉｂｏＧｒｅｅｎ染料と混合後、５から１５分間読む。
【００３５】
本発明の方法において、選択されたエピトープに対するモノクローナル抗体、選択されたエピトープに関する単鎖Ｆｖｓ，又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造の何れかを、異なる長さのｃＤＮＡにコンジュゲートされて含むエピトープ検出器の何れかを、単一の反応において使用することにより、細胞溶解物を厳密に調べて、自動化配列決定により細胞溶解物中の蛋白質のプロファイルを提供することができる。この方法においては、蛍光染料を用いた増幅産物の増幅及び染色後に、反応混合物を電気泳動により分離して、ＲＮＡ産物のサイズを蛍光染料又はプローブにより可視化する。さらに、特異的プローブを反応混合物にハイブリダイズさせて、相当する抗原の存在及び豊富さを明らかにする。
【００３６】
本発明の蛍光検出方法の感度は、ｐ１８５受容体に関して証明された。これらの実験においては、キメラｐ１８５−Ｆｃポリペプチドを最初に直接９６ウエルプレートにコートした。１ｋｂのｃＤＮＡにコンジュゲートした４Ｄ５モノクローナル抗体を次にキメラｐ１８５−Ｆｃ受容体を検出するのに用いた。当該ｃＤＮＡはＴ７プロモーターを含んだので、Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼにより増幅した。増幅後に、ＲＮＡ産物を９６ウエルプレート中でＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬と混合して、４８５ｎｍにて５から１０分後に励起した。蛍光の読みは５３５ｎｍにおいて集めた。この方法を用いて、０．１７７ｐｇ／ｍｌほどの低い濃度を検出した。
【００３７】
ｄｓ−ｏｌｉｇｏのＣＤＲ又は単鎖Ｆｖへの直接のカップリングは、特に、目的が集団のスクリーニングプロテオミクアッセイにおける数百又は数千の抗原の検出である場合に、時間を浪費する手法であり得る。さらに、カップリング効率の変化は増幅の結果の解釈を複雑にし得る。従って、本発明の好ましい態様においては、Ｆｖ又はＣＤＲが一般的又はユニバーサルなエピトープ、例えばヘマグルチニンＨＡタグ又はポリヒスチジンタグを含む。一般的エピトープ又はユニバーサルエピトープの例は、蛋白質の精製のために最初にデザインされた７．１６．４ＳｃＦｖ中のポリ−Ｈｉｓ−タグである。ｄｓ−ＤＮＡにカップリングさせた単一のモノクローナル抗体又は単鎖Ｆｖを、次に、ユニバーサルエピトープ検出器の創製のために一般的エピトープに結合させるのに使用する。本発明の方法におけるユニバーサルエピトープ検出器の効率を、７．１６．３ＳｃＦｖ中のポリ−Ｈｉｓ−タグを用いて証明した。これらの実験においては、ｐ１８５受容体を、プレート上で全部コートし、遊離の７．１６．４ＳｃＦｖを添加し、続いて大規模な洗浄及びｄｓ−オリゴをコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体とのインキュベートにより捕捉した。Ｔ７ポリメラーゼの増幅後に、上記細胞の１０−６希釈物の溶解物からの特異的バンドを検出した。従って、この感度はユニバーサルエピトープ検出器無しの基礎プロトコルを用いて観察されたのよりもいっそう高かった。
【００３８】
本発明の方法は、翻訳後修飾の検出にも有用である。ＰＣＲ及びａＲＮＡ技術は、新規に、ＤＮＡレベルにて標的遺伝子の活性を検出するのに開発した。これらの方法は、ハイブリダイゼーションなしにときどき組み合わされたゲノミクスの研究の応用において広範囲に採用されてきた。感度に拘わらず、これらの方法は、蛋白質レベルにおいて翻訳後修飾を検出することができない。そのような事象を監視することは、しかしながら、極めて決定的なことであり、限定ではないがリン酸化及びグリコシル化を含む多くの修飾が蛋白質の機能状態に関係するからである。即ち、ＥＧＦ処理により誘導されたｐ１８５受容体のリン酸化を検出する本発明の方法の能力を証明するために実験を実施した。ＥＧＦ刺激に際してＥＧＦＲはｐ１８５とヘテロダイマーを形成してｐ１８５をトランス活性化することによりｐ１８５受容体上のチロシン残基のリン酸化をもたらす、シグナリングモデルを確立した（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４  １５：１５００−１５０４）。ＥＧＦＲ並びにｐ１８５  ｅｒｂＢ２を過剰発現するＡ４３１細胞系をこれらの実験に用いた。ＥＧＦ刺激後に、細胞溶解物中のｐ１８５受容体を、ｐ１８５ｅｒＢ２／ｎｅｕに対して生成させたモノクローナル抗体である１Ｅ１により捕捉した。抗−リン酸化Ｔｙｒ抗体のＩｇＧ２ｂタイプであるＰＹ９９を用いてリン酸化された受容体を検出した。二次抗体、抗−ＩｇＧ２ｂをｄｓ−ｏｌｉｇｏにカップリングさせて、抗原−抗体サンドイッチ複合体を厳密に調べるのに使用した。ＥＧＦにより刺激されたＡ４３１細胞は陽性のバンドを生じたが、ＥＧＦ処理なしでは細胞中に観察されなかった。Ｔ６−１７細胞は、しかしながら、陽性のバンドを示したことから、ｐ１８５上の構成的なホスホチロシンを示唆する。これらのデータは、この方法が、その修飾を分析することにより蛋白質の機能状態を検出可能なことを示す。ｄｓ−オリゴにカップリングさせたＦｖ又はＣＤＲを含むエピトープ検出器も、蛋白質の機能状態を検出するのに使用することができる。
【００３９】
即ち、本発明は、免疫−ＰＣＲ技術の非定量性についての問題を排除し、且つプロテオミクスの分野において莫大な可能性を提供する、感度の良い検出法を提供する。特定のプロモーター、例えばＴ７のＲＮＡプロモーター、Ｔ３のＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、ψ２９のポリメラーゼ、又はＴａｑポリメラーゼを認識するポリメラーゼ並びに上記プロモーターを増幅工程において使用することにより、この方法に従い実行されるアッセイは、生物学上及び医学上のアッセイに関連する直線増幅性及び正確な定量性をもつ。検出の感度に影響する因子の数も減った。抗原とそれらのＦｖ又は単価ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造の間の特異的結合が、この方法の唯一の決定的なパラメーターである。
【００４０】
ユニバーサルエピトープ検出器を提供する能力は、複数の追加の利点を本発明の方法に提供する。最初に、モノクローナル抗体を最初にｄｓ−ｏｌｉｇｏにカップリングさせることなしに、あらゆる細胞抗原が検出できる。ユニバーサルプローブなしでは、当該方法は、一時に一つ又はいくつかの特定の抗原を調べる際に有用でしかないはずである。他方、ユニバーサルプローブは、利用可能なＦｖｓ又はＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造による、あらゆる細胞又は液体に存する抗原の検出を可能にさせる。さらに、プロトコルのわずかな修飾により、異なるサイズのオリゴヌクレオチドを、エピトープ検出器のＦｖ又はＣＤＲ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に結合させた場合に、異なる蛋白質が一つの電気泳動レーン内で同時に検出できる。即ち、本明細書にて示されるとおり、本発明の方法は、検出の単一細胞レベルにおいて蛋白質抗原の同定並びにポリペプチド及び糖又は脂質のような他の構造の翻訳後修飾に適用可能な、用途の広い技術を提供する。
【００４１】
本発明の方法は、分子の相互作用の分析及び小さな分子の検出にも有用である。例えば、リガンドペプチドは、特定の受容体の発現を同定するためにエピトープ検出器として使用可能であり、逆もあり得る。利用可能なＦｖｓ又はＣＤＲｓ，ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造、又は結合蛋白質により、小さな分子、例えば毒素又は薬剤代謝物が、限定ではないが、水、食物、及び体液を含むあらゆる液体中で検出できる。
【００４２】
分子の相互作用を研究するために、２つの成分（分子Ａ／分子Ｂ）の相互作用系が開発される（developed）。２つの成分、分子Ａと分子Ｂは、蛋白質、糖又は限定ではないが糖、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又は構造上のコンフォメーション、例えばアルファヘリックス又はベータシートを有するエピトープを含む他の種の化学実在物を含んでよい。この２つの成分系を開発する（develop）ためには、エピトープ検出器、例えば、以後本明細書では分子Ａと呼ぶ、第１の分子に対する抗体を、分子Ａを含むサンプルに近接して配置して、分子Ａをエピトープ検出器に結合させる。各々の発現された蛋白質もＨＡタグ又は類似のタグを含むように構築された発現ライブラリーの産物を含む溶液を、次に、分子Ａと相互作用する分子を同定するのに添加することができる。本発明のためには、これらの分子を分子Ｂ又は第２分子と呼ぶ。あるいは、正常な細胞抽出物又は溶解物あるいは可能性のある分子Ｂを含むあらゆる液体を使用することができる。
【００４３】
ライブラリー生成物又は細胞抽出物又は溶解物の中の第２分子である分子Ｂがエピトープ検出器により結合された第１分子Ａに結合したなら、タグ又はマーカーに結合するユニバーサル検出器によるか又は分子Ｂに特異的なＣＤＲライブラリー又はＳｃＦｖライブラリーの使用の何れかにより、新規な分子が検出され得る。好ましい態様において、分子Ａと分子Ｂの間の相互作用を監視することは、ユニバーサル検出器にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドからの増幅された核酸配列を検出する蛍光に基づく定量可能なアッセイにより実施される。
【００４４】
２成分（分子Ａと分子Ｂ）の相互作用系の分子の一方がリガンド又は製薬学上の薬剤を結合する場合、２成分系を用いて、分子Ａの分子Ｂに対する結合に対するリガンド又は薬剤の効果を調査することができる。従って、本発明は、分子の相互作用に対する薬剤の影響を監視するためのインビトロ系も提供する。リガンド又は薬剤は、リガンド又は薬剤が分子Ａの分子Ｂに対する結合を如何にして変化させるかを決定するために、アッセイの如何なる段階においても添加できる。さらに、一つより多い薬剤を２成分系に添加することができる。例えば、第２薬剤、例えば第１薬剤のアンタゴニストを添加することができ、そしてＡのＢへの結合並びにＡとＢの複合体に関するレベルを決定することができる。さらに、公知のリガンド又は薬剤の代わりに、他のタグにより標識された（marked）分子Ｃの別のライブラリーの産物を含む第３溶液をＡとＢの複合体に添加することができ、そしてこの第３溶液の結語に対する効果を測定することができる。
【００４５】
即ち、本発明は、生物学上の読み出し（readout）、即ち複雑な相互作用の形成を、迅速なインビトロスクリーニングアッセイに提供する。さらに、この種の系を用いると、その出力が各進行する添加（each progressive addition）により明らかとなった事象の数に依存する構造上類似なコンピューターのように作用する、スクリーニング系を構築することができる。これらの進行性の事象は、この集合体を干渉する製薬学上の薬剤又はリガンドのような第３の分子の添加により妨害される。第３分子の添加の前と後のシグナルの定量は、出力の変化を規定する。陽性の変化は、製薬学上の薬剤又はリガンドが分子Ａの分子Ｂへの結合を促進することを意味し、陰性の変化は、製薬学上の薬剤又はリガンドが分子Ａの分子Ｂへの結合を阻害することを意味する。
【００４６】
活性なＣＤＲｓ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造は、本発明により、特定の疾患状態に付随する蛋白質のファミリー、即ちｅｒｂＢファミリー及びそのオリジンとの関連及び悪性腫瘍の初期の検出を同定及び研究するために、一連の（spectrum）ＣＤＲｓ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造を操縦するための出発鋳型分子としても使用できる。例えば、強制されたターン（constrained turns）に発展する単一のリングサイズのＣＤＲ模倣物の大きくて多様な集団（＞１０６）を含むライブラリーが開発されて、芳香性に修飾された末端を有する。この特定のライブラリーは、Ｍ１３ファージシステムを用いて生成されて、ランダム化を通して５員環のＡＨＮＰペプチドから多様化されたＣＤＲ−ストレプトアビジン結合モイエティの大きなレパートリーを含む。上記ランダム化の多様化のために、ランダム化されたＣＤＲ領域をコードするが固定化された強制的フレームワーク領域を伴わない合成オリゴヌクレオチドライブラリーを、高可変性ＣＤＲストレプトアビジン融合蛋白質の発現を導くファージ構築物に挿入する。
【００４７】
ＣＤＲ−ＳＡライブラリーは本発明において、例えば、腫瘍表面マーカーに関して形質転換細胞系と腫瘍細胞を選別するのに使用することができる。この態様においては、初期のスクリーニングは、細胞への結合に関して蛍光に基づく微蛍光測定法を用い、続いて細胞溶解物由来の捕捉された蛋白質に結合に関してＥＬＩＳＡタイプのアッセイを用いる。例えば、モノクローナル抗体をＰＩ３−キナーゼ又はｒａｓに結合させることができ、あらゆる結合ＣＤＲ−ＳＡ形態を検出することができる。腫瘍特異的に選択されたＣＤＲ−ＳＡ分子のあらゆる未知の標的の配列を次に決定することができる。一つの態様において、精製されたＣＤＲ−ＳＡは、ＣＯＳ細胞のような細胞において及び悪性腫瘍の様々な段階からの新たに単離された腫瘍組織から調製した発現ライブラリーの中で構築されたｃＤＮＡ発現ライブラリーを選別するために使用される。
【００４８】
ＣＤＲｓ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造のライブラリーは、受容体、受容体の活性化に際して関連する蛋白質及び受容体に関連する経路に関与する蛋白質を検出するために、一連のプローブを生成するのに使用することもできる。例えば、ＣＯＳ模倣物ライブラリーを用いて、ｅｒｂＢ受容体、ｅｒｂＢ受容体の活性化に際して関連する蛋白質及びｅｒｂＢ受容体に関連する経路、例えばＰＩ−３キナーゼ経路に関与する蛋白質に対して一連のプローブを生成することができる。受容体、当該受容体の活性化に際して関連する蛋白質及び当該受容体に関連する経路に関与する蛋白質に結合するとして定義されたライブラリーのＣＤＲｓ又はＣＤＲ模倣物も、受容体又は蛋白質を標的とするように治療に使用することができる。治療上の使用のための好ましい態様においては、ＣＤＲ又はＣＤＲ模倣物を、ヒト化抗体フレームワークに再挿入するか又はＦｃに結合させる。この態様においては、工作されたＣＤＲ構造を、単独で投与してよいし、あるいは放射性標識又は細胞毒をそれに結合させて含んでよい。
【００４９】
いくつかのランダムに変化させたＣＤＲｓによりｓｃＦｖライブラリーを製造する方法は、Ｗｉｎｔｅｒらにより、米国特許第６，２９１，６５０号、米国特許第６，２２５，４４７号、米国特許第６，１７２，１９７号及び米国特許第６，１４０，４７１号に記載される。しかしながら、ＣＤＲ−ＳＡライブラリーの生産はＷｉｎｔｅｒらにより記載されていない。
【００５０】
本発明においては、本発明の方法を実施するためのキットも提供される。一つの態様において、選択されたエピトープを発現する分子の検出のためのキットが提供される。好ましい態様において、上記分子の検出は、核酸配列を染色する蛍光染料により実施される。即ち、このキットは、選択されたエピトープ、当該エピトープに関する単鎖Ｆｖ又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造に関するモノクローナル抗体を含むエピトープ検出器、並びにＲＮＡポリメラーゼ、増幅反応バッファー、及び蛍光染料を含むのが好ましい。別の態様においては、混合物、例えば細胞溶解物の中の蛋白質をプロファイルするためのキットが提供される。この態様においては選択されたエピトープ、選択されたエピトープに関する単鎖Ｆｖ又は強制的エピトープ特異的ＣＤＲに関するモノクローナル抗体を含む、異なる長さのｃＤＮＡｓにコンジュゲートされたエピトープ検出器、並びにＲＮＡポリメラーゼ、増幅反応バッファー、及び蛍光染料を含むのが好ましい。
【００５１】
オリジナルの免疫−ＰＣＲはアッセイにおいて純粋な抗原を用いた。免疫−ＰＣＲの後の反復は混合された抗原を試験した（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９  ２３（３）：５２２−５２９）が、ＥＬＩＳＡよりも２桁から３桁高い感度しか示さなかった。莫大に多様な非特異的抗原を含むバックグラウンドを伴う実在のアッセイにおいては、アッセイの特異性により、いつも感度が制限される。Ｆｖｓ又はＣＤＲ断片により結合されたエピトープは、より大きなポリペプチドを同定することが予測され、そして細胞又は細菌又はあらゆる他の真核生物の上清、液体又は抽出物においてモチーフを同定するために使用することができる。さらに、ポリペプチド、有機分子又は糖構造の実際の同定は、Ｆｖｓによるいくつかのエピトープの結合をガイドとして用いることにより、データベースのコンピューター支援分析により決定することができる。例えば、Ｆｖ  ａ，ｄ，ｅ，及びｆによる結合は、側鎖ａ，ｄ，ｅ，及びｆを有するものとして、よってこれらの同じ側鎖を有する糖のファミリーに属するものとして、糖分子を同定するはずである。この様式において、本発明は、任意の一つの特定の時間における細胞中の全ての分子でなければ、多くの定義及び同定を可能にする。さらに、このアプローチは、活性な細胞及び細胞上清中で翻訳される別の転写形態を同定するのに使用することができる。この手法は、１）非放射性検出方法、もっとも好ましくは蛍光染料、２）ミクロ化された（microtized）液体取り扱い手法、３）低サンプル容量検出法、例えば「プロテインチップ」分析及び４）ロボット化を使用するように容易に受容可能である。例えば、複数の結合要素又はユニット及び一つのユニバーサルエピトープ検出器を含むチップを開発することができる。モノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ，又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造上の共通の表面を認識する結合要素、例えばユニバーサル抗体を使用することができる。あるいは、アビジンを、各抗体、単鎖Ｆｖ又はＣＤＲ、ＣＤＲ模倣物又は工作されたＣＤＲ構造内に用いて、ビオチンをオリゴヌクレオチドにカップリングさせることができる。これらのチップは、より迅速且つ高親和性の利点を提供し、それにより、シグナルを増加させる。
【００５２】
以下の非限定例を、本発明をさらに例示するために提供する。
実施例
実施例１：材料
使用した抗体はｍＡｂｓ  ７．１６．４とＡ１１であり、各々がｐ１８５ｎｅｕの細胞外ドメイン内の異なるエピトープに反応する。１Ｅ１は、ヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕの外部ドメインに対して生じさせたＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ｒｈｕＭＡｂ  ４Ｄ５（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから得た。抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体ＰＹ９９は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。細胞系Ｂ１０４−１−１はラットの発癌性ｐ１８５ｎｅｕを発現することによりＮＩＨ３Ｔ３細胞に由来する。Ｂ１０４−１−１内のｐ１８５ｎｅｕの発現レベルは、１２５Ｉ−標識された抗−ｎｅｕ  ｍＡｂ結合アッセイを用いて測定した。ＥＧＦＲ及びｐ１８５ｎｅｕの両者に対して陰性のＮＲ６は、ＮＩＨ３Ｔ３からのサブクローンであった。Ｔ６−１７は、ヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体を過剰発現することによりＮＩＨ３Ｔ３から誘導した。これらの細胞系は、全部、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むダルベッコイーグル培地（ＤＭＥＭ）内で３７℃において５％のＣＯ２雰囲気中で培養した。
実施例２：Ｈｉｓタグを付けた７．１６．４の発現と精製
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１５０ｍｌ）を大腸菌ＤＨ５αの１５ｍｌの一晩培養液中に植え付けて、０．５の光学密度（６００ｎｍ）が得られるまで、３０℃において維持した。イソプロピル−β−（−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度にて添加して、Ｈｉｓタグ付加７．１６．４ＳｃＦｖを誘導した。３時間後に、細胞を回収して、凍結と融解により溶解して、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオリド、２μＭ  ペプスタチンＡ，及び２μＭ  ロイペプチンを付加した１０ｍｌの尿素溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１Ｍ  ＮａＨ２ＳＯ４，１Ｍ   ＮａＣｌ，８Ｍ尿素）中に懸濁した。不溶の細胞残渣は、遠心分離（１２，０００  ｘ  ｇにて１５分間、続いて１２，０００  ｘ  ｇにて３０分間）により除去した。透明にされた上清を２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースと混合して、氷の上で１時間穏やかに撹拌した。混合物を空のカラムに負荷して、未結合の蛋白質を尿素溶解バッファー（ｐＨ６．３）により４℃において溶出した。Ｈｉｓ−タグを付加した蛋白質を尿素溶解バッファー（ｐＨ４．５）により溶出して、溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＦＡＣＳ分析により、実施例３に記載されたとおりに試験した。ピーク画分中の蛋白質をプールして、ＴＫＣバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に対して透析した。
実施例３：ＦＡＣＳ分析による７．１６．４ＳｃＦｖ結合の確認
細胞表面抗原を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出した。Ｂ１０４−１−１細胞（約５Ｘ１０５）を、精製された７．１６．４ＳｃＦｖを含む２００μｌのＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０２％アジ化ナトリウム）中でインキュベートした（４℃にて３０分間）。次に、細胞をＦＡＣＳバッファー中で洗浄して、抗−Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした（３０分間、４℃）。この第２のインキュベーションの後に、細胞を再びＦＡＣＳバッファー中で洗浄して、さらにマウスイムノグロブリンに対するＦＩＴＣ−標識されたＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後に、細胞沈殿物をＰＢＳバッファーに懸濁して、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による分析のために処理した。各サンプルに関して、１０，０００の生存細胞をサイズ（フォワードスキャター、ＦＳＣ）及び粒状性（granularity）（サイドスキャター、ＳＳＣ）のパラメーターに従いゲートを通して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。競合結合に関しては、Ｂ１０４−１−１細胞を最初に異なる濃度の７．１６．４ＳｃＦｖの存在下で、モノクローナル抗体７．１６．４とインキュベートした。細胞を次にＦＡＣＳバッファー中で洗浄して、フローサイトメーター上の分析前に、マウスイムノグロブリンに対するＦＩＴＣ−標識ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）とインキュベートした。
実施例４：ビオチン化ｄｓ−ＤＮＡとストレプトアビジンコンジュゲートの合成
以下の配列（ＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴ（配列番号：１））のオリゴヌクレオチドを５’末端にビオチンを付加して合成することにより、ストレプトアビジン又はアビジンに対する結合を可能にした。別のオリゴプライマー（ＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡ（配列番号：２））はＶＣＰ  ｃＤＮＡからの内部配列に由来した。これらの２つのプライマーを用いて、約０．６ｋｂのｃＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＣＰから増幅した。この断片は、５’末端にビオチンを含み、そしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性を通してｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を指示するように使用されるＴ７のプロモーター部位（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：３））を含む。２．５μｇの抗体の１０μｇのストレプトアビジンへの結合のために、半分の容量の０．８％グルタルアルデヒドを４μｌのアリコートに添加した。当該溶液を回転装置上で３時間室温にて混合した。エタノールアミン（１Ｍ；１／２０溶；ｐＨ７．５）を次に添加した。当該溶液をさらに２時間室温にて混合した。抗体−ストレプトアビジン複合体を４℃において保存した。
実施例５：ＲＮＡ増幅手法
９６ウエルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ，ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ）を、１００μｌのコーティングバッファーと共にプレートを４℃にてインキュベートすることにより（抗体濃度：５μｇ／ｍｌ）、異なる濃度のキメラｐ１８５細胞外ドメイン−Ｆｃポリペプチドによりコートした。次に、プレートを３回、０．２％  ＴＷＥＥＮ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ；２００μｌ／ウエル）で１時間室温にて洗浄して、再び３回ＰＢＳ−Ｔにより洗浄した（２００μｌ／ウエル）。このインキュベーション工程後に、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し（６回、２００μｌ／ウエル）、そしてヒト化抗−ｐ１８５Ｈｅｒ２抗体４Ｄ５−ストレプトアビジンコンジュゲートと２時間室温にてインキュベートした（１５０ｎｇ／ｍｌ，５０μｌ／ウエル）。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄室温（６回）、ビオチン化ｃＤＮＡ（８００ｎｇ／ｍｌ，０．０５ｍｌ／ウエル）と１．５時間インキュベートした。次に、プレートを６回洗浄して、ＲＮＡ増幅を実施した。以下の試薬を加えた：１Ｘ  ＲＮＡ増幅バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  スペルミジン；１０ｍＭ  ＤＴＴ；７５０μＭ  ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＧＴＰ及びＣＴＰ；０．５μｌ  ＲＮＡｓｉｎ；２００Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡ）。当該溶液を次に４時間３７℃においてインキュベートした。ＲＮＡ産物をウエルから取り出して、２５μｌを７５μｌのＴＥバッファーで希釈して、次に２０００倍希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬１００μｌと混合した。１０分後に、９６ウエルプレート中のサンプルを４８５ｎｍにて励起して、蛍光放射を５３５ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａ  Ｆｌｕｏｒａリーダー（Ｔｅｃａｎ，オーストリア）を用いて集めた。