(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを含むインビトロ形質転換された細胞であって、該ベクターは、そのアミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで、発現に際して、該融合タンパク質は、該細胞表面上で発現される、形質転換された細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の形質転換された細胞であって、ここで、前記免疫刺激性細胞表面ポリペプチドが、
（ａ）食細胞を活性化するが；
（ｂ）補体を固定しない、
形質転換された細胞。
【請求項３】
前記細胞が、ヒト細胞および齧歯類細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の形質転換された細胞。
【請求項４】
前記齧歯類細胞が、ハムスター細胞もしくはマウス細胞である、請求項３に記載の形質転換された細胞。
【請求項５】
アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えポリヌクレオチドであって、ここで、前記免疫刺激性細胞表面ポリペプチドが、
（ａ）食細胞を活性化するが；
（ｂ）補体を固定しない、
組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチド。
【請求項８】
アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、作動可能に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項９】
免疫刺激性細胞表面ポリペプチドに対する応答について食細胞を試験するための、スクリーニング方法であって、該方法は、以下：
（ａ）食細胞に、アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞を、インビトロで接触させる工程；および
（ｂ）コントロール食細胞に対して、該食細胞の食作用活性を比較する工程であって、ここで、該食作用活性の増加は、該食細胞が、該細胞表面上のアミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドに応答することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
免疫刺激性細胞表面ポリペプチドに対する食細胞応答を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）食細胞に、アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞を、インビトロで接触させる工程；
（ｂ）食細胞に、試験薬剤および該アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する該形質転換された細胞を、インビトロで接触させる工程；ならびに
（ｃ）該試験薬剤の非存在下での該食細胞の食作用活性を、該試験細胞の存在下での該食細胞の食作用活性と比較する工程であって、ここで、該食作用活性における変化は、該試験薬剤が、該細胞表面上のアミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドに対する食細胞応答を調節すること示す、工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの細胞表面方向に優先的に結合する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）試験薬剤に、Ｉ型免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞を、インビトロで接触させる工程；
（ｂ）該試験薬剤に、アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞を、インビトロで接触させる工程；ならびに
（ｃ）該試験薬剤と該Ｉ型免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞との接触の効果を、該試験薬剤と該アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを細胞表面に発現する形質転換された細胞との接触の効果と比較する工程であって、ここで、効果における変化は、該試験薬剤が、該免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの該細胞表面方向に優先的に結合することを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
宿主の腫瘍細胞において免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現させることにより、該宿主から該腫瘍細胞を除去するための組成物であって、該組成物は、以下：
アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドを含み、ここで、該免疫刺激性細胞表面ポリペプチドが、
（ｉ）食細胞を活性化するが；
（ｉｉ）補体を固定せず、
ここで、宿主中の該腫瘍細胞による該免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの発現は、該腫瘍細胞の宿主食細胞媒介性除去を誘導する、
組成物。
【請求項１３】
前記免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの発現が、構成的であるか、または、誘導性である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
形質転換された細胞において組換えポリペプチドから治療有効量の免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現させることにより、該宿主における自己免疫障害を処置するための組成物であって、該組成物は、以下：
アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を含み、
ここで、宿主中の該標的細胞による該免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの発現により、該免疫刺激性細胞表面ポリペプチドが食細胞との接触に供され、該接触に際して、該接触した食細胞は、自己反応性Ｔ細胞を調節して、該宿主におけるＴ細胞の自己反応性を減少させる、
組成物。
【請求項１５】
形質転換された細胞から生物学的に活性な分子を分泌させることにより、該生物学的に活性な分子を患者に送達するための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）アミノ末端でトランスフェリンレセプターヒンジ領域に連結されたＩｇＧ分子のＦｃ部分を含む、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドを含む、１つ以上の形質転換された細胞を含むコアであって、該ポリペプチドは、宿主において該細胞に対する免疫応答を刺激し得る、コア；および
（ｂ）該コアを取り囲む、ジャケットであって、選択透過性膜を含む、ジャケット、
を有する、カプセル
を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫グロブリン、より詳細には、宿主による細胞表面分子を発現する細胞の拒絶を生じる、細胞表面分子誘導性マクロファージ活性化に関する。
【０００２】
（発明の背景）
細胞療法は、生物学的に活性な分子を患者中で産生する細胞を移植することによって、患者にその生物学的に活性な分子を提供することを要求する。非カプセル化細胞療法アプローチにおいて、「裸」の細胞を移植する。いくつかのアプローチが、移植された「裸」の細胞の拒絶を妨げるために採用されてきた。処置としては、患者の免疫抑制、天然の抗体のレシピエント血清からのプレクリアランス、または移植組織に結合する天然の抗体を阻害するために、高用量の低分子量ハプテンの投与が挙げられる。あるいは、研究者は、レシピエントにおける天然の抗体によって、細胞または組織の拒絶を刺激する抗原またはエピトープの発現を減少または排除するように、細胞を改変することを提案してきた。しかし、有糸分裂活性な細胞は、この移植組織の腫瘍形成の危険性を生じる。
【０００３】
カプセル化細胞療法アプローチにおいて、選択透過性物理的障壁は、宿主組織から移植組織を免疫的に分離する。この障壁は、患者とカプセル化組織との間の所望の分子の通過を可能にするが、このカプセル化細胞または組織を、患者の免疫系による破壊から防御する。カプセル化療法における異種組織または細胞の使用はまた、「安全特性」として作用する。なぜなら、カプセル化細胞は、カプセルが、破裂または断裂する場合に、患者の免疫系によって拒絶されるからである。
【０００４】
患者の免疫系は、いくつかのコンポーネントを有し、これらのいくつかは、カプセル化細胞療法に有用であり、そしてこれらのいくつかは、所望されない。１つのコンポーネントにおいて、食細胞が、標的細胞（例えば、上記の異種細胞）を清掃する。特に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、マクロファージによる、多くの標的細胞（腫瘍細胞を含む）の破壊に重要な役割を果たす。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）による標的細胞のオプソニン作用は、これらの物質の宿主からの除去を増強する。特定の抗体の存在下で、ＡＤＣＣによる標的細胞の破壊におけるマクロファージの役割は、十分に確証されている。マクロファージ標的化の選択性は、抗体の特異性に基づくが、この標的細胞に対する溶解性攻撃は、Ｆｃレセプター媒介性ＡＤＣＣによって誘発される。
【０００５】
免疫系の別のコンポーネントは、補体系の活性化である。補体活性化の２つの経路（古典的および代替的経路）の両方は、補体活性化における中心的工程である、Ｃ３の切断に方向付けられる。単一の末端経路は、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成である。古典的経路は、抗原−抗体複合体によって正常に活性化され、ここで、特定の抗体が、補体固定性（補体に結合して、古典的経路の活性化を引き起こし得る）である。古典的経路の活性化は、免疫グロブリンのＦｃ領域への、Ｃ１ｑ（補体カスケードの第１の因子）の結合と共に開始され得る。次いで、タンパク質分解性事象のカスケードは、Ｃ５コンバーターゼの活性化を生じ、これは、Ｃ５をＣ５ｂおよびＣ５ａに切断する。次いで、このＣ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８を結合し、Ｃ５ｂ−８複合体を形成する。Ｃ９分子のＣ５ｂ−８への結合は、Ｃ５ｂ−９（ＭＡＣ）を形成し、これは、脂質二重層内に挿入され、そしてイオンおよび高分子の二方向性流動を可能にする膜貫通チャネルを形成する。この機構によって、補体は、細胞の溶解を生じる。
【０００６】
補体系は、宿主防御に重要であるが、不適切な部位での、または過剰な程度での活性化は、宿主組織破壊を生じ得る。補体は、多くの疾患における組織損傷の発症または増殖における因子である。従って、ヒトにおけるカプセル化細胞療法アプローチのために、（１）非カプセル化細胞は、宿主によって直ちに拒絶されるべきであり；（２）カプセル化細胞は、宿主に対して非免疫原生であるべきであり；そして（３）細胞排除プロセスは、宿主の免疫学的記憶を導くべきではない。従って、ヒトの免疫学的「背景」を有するが、カプセルの破裂または破損の事象において患者による拒絶の安全特性をもまた提供するカプセル化細胞または組織を使用して、生物学的に活性な分子をヒト患者へ送達し得ることが所望される。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、Ｉ型細胞表面分子（すなわち、サイトゾルに向けて突出したカルボキシ末端［Ｃ−末端］および細胞表面から離れて突出するアミノ末端[Ｎ−末端]を有する）をＩＩ型分子（すなわち、サイトゾルに向けて突出したＮ−末端および細胞表面から離れて突出するＣ−末端を有する）として自然に発現させるための新規なアプローチを提供する。その生物学的機能は、ＩＩ型方向において維持される。このアプローチを使用して、（１）そのような分子を発現する細胞が治療薬剤として使用され得、そして（２）スクリーニングプロセスは、以前は試験のために利用可能ではなかった新規分子の機能を評価し得る。本発明はまた、形質転換された細胞の運命を予め決定する新規なアプローチを提供する。従って、本発明は、遺伝子治療および腫瘍治療の新しい局面である。遺伝子治療は、新しい分野であるが、腫瘍細胞に対して細胞毒感受性を与えることは、活発な研究分野であった。本明細書中で記載されるストラテジーは、腫瘍細胞を標的とするために使用され得、従って、免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現する腫瘍細胞が、マクロファージクリアランスに対してより感受性である。
【０００８】
本発明は、新規な免疫刺激細胞表面ポリペプチド、免疫刺激細胞表面ポリペプチドをコードする新規な組換えポリヌクレオチド、およびこの組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を提供する。組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞が、コードされた免疫刺激細胞表面ポリペプチドを宿主内で発現する場合、その宿主は、その宿主による形質転換された細胞の拒絶を生じる免疫応答を経験する。この宿主免疫応答は、食細胞（例えば、マクロファージ）の活性化を含み得るが、補体結合を含まない。特定の実施形態において、この免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ1Ｆｃを細胞原形質膜の表面に対して「逆方向」で固着させるヒトトランスフェリンレセプター膜ドメインを含む、キメラポリペプチドであり、従って、オプソニン作用の間、ＩｇＧの立体配置を模倣する。本発明の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞は、多くの障害の処置に対して治療上有用である。
【０００９】
本発明はまた、新規治療剤を同定するための診断方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、免疫刺激細胞表面ポリペプチドに対する応答について食細胞を試験するための方法である。食細胞をインビトロで組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞に接触させる。この組換えポリヌクレオチドは、免疫刺激細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターであり、そしてこの免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、食細胞を活性化するが、補体を結合しない。食細胞の食作用活性をコントロール食細胞と比較すると、増加した食作用活性は、その食細胞が免疫刺激細胞表面ポリペプチドに対して応答することを示す。別の実施形態において、本発明は、免疫刺激細胞表面ポリペプチドに対する食細胞応答を調節する化合物を同定するための方法である。食細胞を、組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞とインビトロで接触させる。次いで、食細胞を試験化合物、および組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞とインビトロで接触させることにより、このプロセスを繰り返す。その試験化合物の非存在下における食細胞の食作用活性を、その試験化合物の存在下における食細胞の食作用活性と比較する。食作用活性の変化は、その試験化合物が、免疫刺激細胞表面ポリペプチドに対する食細胞応答を調節することを示す。
【００１０】
本発明はさらに、食作用活性を刺激するための方法を提供する。免疫刺激細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを含む組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞が、宿主に投与される。１つの実施形態において、刺激された食細胞は、マクロファージ、とくにマクロファージ性腫瘍細胞である。別の実施形態において、この形質転換された細胞は、治療化合物（例えば、抗腫瘍化合物）を含む。
【００１１】
本発明は、宿主における免疫応答を調節するための方法を提供する。免疫刺激細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞が宿主に投与される。食細胞（特にマクロファージ）の活性化がＴリンパ球およびＢリンパ球の両方を調節するように作用するという理由で、この投与はその形質転換された細胞に対する免疫応答を刺激する。マクロファージは形質転換された細胞を包み込み、そしてその形質転換された細胞からＴ細胞へ抗原決定基を提示し、免疫応答を刺激する。１つの実施形態において、この細胞は、その細胞表面上で、「第２抗原」を発現し、その結果その宿主は、形質転換された細胞由来の第２抗原に対する免疫応答を生成する。免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、マクロファージとの細胞相互作用を増強させる。この増強された細胞相互作用の結果として、この第２抗原はＴ細胞に対する標的として提示される。１つの実施形態において、この形質転換された細胞は、組換えポリヌクレオチド由来の第２抗原を発現する。
【００１２】
本発明は、望まれていない標的細胞（例えば、患者における腫瘍細胞）を、本発明の組換えポリヌクレオチドの標的送達、続いて、コードされるポリペプチドの構成的または誘導的のいずれかの発現により除去するための、方法を提供する。本発明の免疫刺激細胞表面ポリペプチドの固形腫瘍への送達は、望まれていない細胞の食細胞媒介性選択的除去を生じる。
【００１３】
本発明は、自己反応性Ｔ細胞を除去することにより、宿主における自己免疫障害を処置するための方法を提供する。免疫刺激細胞表面ポリペプチドをコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを含む組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を、自己免疫障害を有する宿主に投与する。この細胞は、その組換えポリペプチドに由来する治療的に有効な量の免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現する。そのマクロファージと接触している免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、そのマクロファージを活性化し、宿主自己反応性Ｔ細胞を調節し、それによりその宿主におけるＴ細胞自己反応性を減少させる。マクロファージは、特に、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を調節する。Ｔ細胞の反応性は、同時刺激因子の有効性に依存して異なる。従って、Ｔ細胞は寛容性になるように誘導され得る。
【００１４】
本発明は、免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現し得る形質転換された細胞が免疫単離（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）カプセルにカプセル化された組成物を提供する。破裂したカプセルから漏れた細胞は、患者の免疫系により破壊されるという理由で、本発明の形質転換された細胞は、ヒト患者において、移植のためにカプセル化される場合に特に有用である。宿主免疫応答は、インタクトなデバイスにおいて免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現する形質転換された細胞によっては誘発されない。しかし、デバイス故障の場合には、放出された細胞は、補体活性化または免疫記憶の生成を伴わずに、効率良く食細胞により除去される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（序論）本発明は、細胞によって発現される場合に、宿主免疫系によるその細胞の拒絶を生じる免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードする新規な組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、その組換えポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞およびその形質転換された細胞を使用するための方法を提供する。実施例１において記載される特定の実施形態において、ヒトトランスフェリンレセプター膜ドメインを含むキメラポリペプチドは、ヒトＩｇＧ1Ｆｃを、細胞形質膜の表面に「逆方向」で固定し（配列番号２および配列番号４）、従ってオプソニン作用間のＩｇＧのコンフィギュレーションを模倣する（図１Ａおよび１Ｃ）。ヒトＩｇＧ1キメラポリペプチドは、Ｆｃレセプター（本明細書中で、ＦｃγＲＩ）を結合し、食細胞（例えば、マクロファージ）を活性化するが、補体カスケード（「補体結合反応」）をも活性化するという望ましくない特徴を回避する。慢性的に活性化された補体系は、宿主細胞を殺傷し得、そして蓄積している証拠によって、この機構が、多くの変性疾患（炎症および神経変性疾患を含む）を引き起こし得ることが示唆される。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下に添付する説明において示す。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が本明細書中において記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、その文脈が明らかに異なるように示さない限り、複数の指示対象を含む。他に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で引用されるすべての特許および刊行物は、参考として援用される。
【００１７】
（免疫刺激性細胞表面ポリペプチド）「免疫刺激性細胞表面ポリペプチド」は、宿主においてその細胞に対する免疫応答を刺激し得る、細胞表面上で発現されるポリペプチドである。本明細書中で使用される「生物学的に活性な分子」は、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドである。免疫刺激性細胞表面ポリペプチドとしての使用に適切なポリペプチドとしては以下が挙げられる：
ａ．オプソニン（例えば、ＩｇＧおよびＣ３ｂ）；
ｂ．食細胞のマンノース−フコースレセプターと相互作用する炭水化物残基を有するタンパク質；
ｃ．スカベンジャーマクロファージ上のレセプターによって認識され得るタンパク質；
ｄ．インテグリンに対するリガンド；食細胞上に配置される；
ｅ．糖タンパク質（例えば、インテグリンおよびセレクチン）；ならびに
ｆ．フコシルトランスフェラーゼ（マクロファージによって認識されるＧａｌ−Ｇａｌエピトープを生成する）。
【００１８】
免疫刺激性細胞表面ポリペプチドは、全長または切り詰めされた形態（適切なように）のいずれかで使用され得る。特に、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを記載するために使用される用語「領域」および「ドメイン」は、全長免疫刺激性細胞表面ポリペプチド、または免疫刺激性細胞ポリペプチドの部分（例えば、下記のＩｇＧ領域およびドメイン）のいずれかを含む。
【００１９】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、本発明における使用のための好ましい免疫刺激性細胞表面ポリペプチドである。ＩｇＧタンパク質は、（１）Ｆａｂ領域（ＶＨ、ＶＬおよびＣＨ1ドメインを含む）；（２）ヒンジ領域、ならびに（３）Ｆｃ領域（ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含む）を含む。Ｆａｂ領域は、抗原結合部位を含む抗体タンパク質の領域である。「ヒンジ」領域は、アミノ酸プロリンの多くの残基を含む免疫グロブリンポリペプチド上の可撓性領域であり、そしてＦｃフラグメントが２つのＦａｂフラグメントのうちの１つを結合する場所である。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンポリペプチド上の定常領域であり；免疫グロブリン重鎖上に配置され；そして抗原を結合することに関与しない。Ｆｃ領域は、食細胞上のＦｃレセプターに結合し得る。ＣＨ2ドメインのアミノ末端付近（特に、アミノ酸２３４〜２３７）は、ＦｃレセプターへのＦｃ領域の結合に重要である。Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ）は、食細胞白血球（例えば、マクロファージ）上に配置される内在性膜タンパク質である。ヒンジ領域は、Ｆｃ−Ｆｃレセプター相互作用を調節し、ポリペプチドに対して可撓性を提供し、そしてスペーサーとしての機能するために重要である。
【００２０】
組換え免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを産生するために使用される免疫グロブリンポリヌクレオチドは、任意の脊椎動物（例えば、ヒトまたはマウス）由来であり得る（実施例１を参照のこと）。好ましくは、ポリヌクレオチドは、宿主と同じ起源である実質的な数の配列を有する免疫グロブリンをコードする。例えば、ヒトが本発明のポリペプチドで処置される場合、好ましくは免疫グロブリンはヒト起源である。免疫グロブリンポリヌクレオチドは、全長ポリペプチドまたはフラグメント（例えば、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドおよび「第２の細胞表面ポリペプチド」を含む、より大きな融合タンパク質のフラグメント）をコードし得る。免疫グロブリン融合タンパク質を使用するいくつかの利点は、（１）多価リガンドについての可能性のある増加したアビディティー、（２）より長い血清の半減期、（３）Ｆｃドメインによってエフェクター細胞を活性化する能力、および（４）精製の容易さ（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーによる）のうちの１つ以上を含む。実施例１は、２つの免疫グロブリン融合タンパク質の構築および使用を示す。
【００２１】
１つの実施形態において、ＩｇＧ1−Ｆｃは、「逆方向」で細胞表面上で発現される（図２を参照のこと）。Ｆｃは、天然にＩ型の細胞表面ＩｇＧポリペプチドにおけるＦｃの方向（Ｃ末端はサイトゾルに向かって突き出ており、Ｎ末端は細胞表面から離れて突き出ている）と比較して、逆方向である（すなわち、ＩＩ型タンパク質として、Ｎ末端はサイトゾルに向かって突き出ており、Ｃ末端は細胞表面から離れて突き出ている）。実施例１において提供される特定の実施形態（配列番号２および配列番号４）において、逆方向は、ＩＩ型膜タンパク質膜貫通ドメインとのＦｃ領域の融合から生じる。本発明における新規な設計である、逆方向で発現される細胞表面Ｆｃは、実施例１において記載されるように、Ｆｃレセプターを結合してマクロファージ活性化を媒介するというＩｇＧ1  Ｆｃの生物学的機能を保持するが、補体結合反応能力を同時に失う。
【００２２】
ＣＨ1（例えば、配列番号２）またはＣＨ1およびヒンジ領域（例えば、配列番号４）がＩｇＧ1から欠失される場合のみ、逆Ｆｃの高レベルの形質膜発現が達成される（図２を参照のこと）。全長ＩｇＧ1重鎖定常領域（ｈＴＲ−Ｆｃ）は、主に小胞体に存在する。ＣＨ1ドメインの除去は、小胞体から形質膜へのキメラの転位を可能にする。
【００２３】
（食細胞活性化）免疫刺激性細胞表面ポリペプチドおよびそれらのレセプターは、外来性物質（哺乳動物細胞または細菌を含む）のクリアランスおよび破壊に重要である。免疫刺激性細胞表面ポリペプチドおよびそれらのレセプターは、食作用およびＡＤＣＣを活性化する。このプロセスは、外来性物質のオプソニン作用で開始する。オプソニンは、細胞または微生物が、食細胞によって飲み込まれる（ｅｎｇｕｌｆｅｄ）ことをより受けやすくする因子（通常には、抗体または補体成分）であり；オプソニン作用は、細胞をオプソニンでコートするプロセスである。食細胞は、別のものを飲み込みそして貪食（ｄｅｖｏｕｒ）する細胞であり；飲み込みおよび貪食のプロセスは、食作用である。本発明のために重要な食細胞には、マクロファージおよび単球がある。単球は、血液中に侵入するが、血流を離れて組織に侵入し、マクロファージに分化し得る大きな白血球の型である。マクロファージは、破片および外来性細胞を消化する。単球は一般に、ＣＤ１４の細胞表面発現によって特徴付けられる。
【００２４】
本発明の特定の実施形態では、免疫グロブリンでコートされた細胞は、食細胞上のＦｃレセプターによりこの食細胞に結合する。食細胞は、細胞骨格タンパク質をアセンブルすること、タンパク質チロシンキナーゼの活性化によって細胞骨格−タンパク質アセンブリをシグナル伝達すること、および免疫グロブリンでコートされた細胞を食することにより、Ｆｃレセプターからのシグナルに反応する。ＩｇＧ−ＦｃγＲＩ相互作用は、食作用、エンドサイトーシス、ＡＤＣＣ、炎症メディエータの放出およびスーパーオキサイドアニオン産生のような、種々の生物学的機能を活性化する。マクロファージは、マクロファージからのアニオン性物質の流入を促進する有機アニオントランスポータータンパク質を所有する。従って、ＦｃγＲＩは、マクロファージによりＡＤＣＣを媒介し、そして食作用およびスーパーオキサイド産生の両方の引きがねとなる。その反応のために、ＩｇＧのＦｃデメインが細胞の表面上で発現され食細胞Ｆｃレセプターと相互作用する、本発明の細胞および方法は、ＩｇＧのＦｃドメインを発現して、ＡＤＣＣを誘導する細胞に、食細胞を結合させる。マクロファージ上の高アフィニティーレセプターＦｃγＲＩと相互作用するＩｇＧ1およびＩｇＧ3アイソタイプは、本発明の細胞および方法に好適である。
【００２５】
マクロファージはまた、Ｔ細胞に対する抗原を提示し得る。このようにしてマクロファージは、体液性免疫応答（抗体産生）および細胞性免疫応答を含む免疫応答のその他の成分中に含まれる。
【００２６】
（抗体固定の不在）  ヒトＩｇＧ1に関連する主要な機能は、カプセル化細胞治療にとって所望されない特徴である補体の活性化である。補体経路の活性化は、デバイス内の損傷細胞のような、種々の所望されない生物学的作用に至り得る。本発明の形質転換された細胞は、（１）免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現する細胞；（２）その結果この免疫刺激細胞表面ポリペプチドはマクロファージを活性化する；しかし（３）この免疫刺激細胞表面ポリペプチドは補体カスケードを活性化しない、という有用な特徴を有する。
【００２７】
この免疫刺激細胞表面ポリペプチドが逆の配向にあるＦｃである実施形態である、実施例１では、Ｃ３ａ酵素免疫アッセイは、補体固定が生じないことを示した（図５）。対称的に、インタクトのＩｇＧを含む免疫複合体は、補体を効果的に活性化した。これは、ＩｇＧ1重鎖ＣＨ1およびヒンジドメインが補体活性化に重要であるという観察と一致する。従って、高レベルのＦｃが細胞表面で発現されるけれども、ＣＨ1およびヒンジを欠失したＩｇＧ1重鎖のキメラ（例えば配列番号４）は、マクロファージの潜在的な刺激物であるにも拘らず、補体を活性化しない。
【００２８】
（第２の細胞表面ポリペプチドに融合される免疫刺激細胞表面ポリペプチド）  １つの実施態様では、この免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、第２の細胞表面ポリペプチドに融合されて、細胞表面で発現される単一ポリペプチドを形成する。この第２の細胞表面タンパク質は、上記免疫刺激細胞表面ポリペプチドを細胞の外部に係留する。このような使用に適切であり得る第２の細胞表面タンパク質の例は、トランスフェリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、４Ｆ２、ＢＰ−１、エドグリン、Ｌｙ−４９、Ｍ−ＡＳＧＰ−ＢＰ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−ＰＩ、およびＰＣ−１を含む。これらの細胞表面分子のうち、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＢＰ−１、エンドグリン、Ｌｙ−４９、ＮＫＲ−ＰＩおよびＰＣ−１が好適である。なぜなら、これらのポリペプチドは２量体化することが公知であり、そしてＦｃの増大した安定性のために、抗体のＦｃ領域の２量体化を容易にし得るからである。
【００２９】
第２の細胞表面ポリペプチドは、ＩＩ型細胞表面タンパク質であるヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴＲ）であり得る。特定の実施形態では、トランスフェリンレセプターの細胞外領域は、Ｆｃ（残基８９−９７）を係留するために、ネイティブなＩｇＧのヒンジ領域を置換する。このｈＴＲフラグメントは、ネイティブなＩｇＧ1ヒンジに長さがほぼ等しいが、アミノ酸同一性はそうではなく、ヒンジ領域のスペーサー機能と類似のスペーサー機能を効果的に提供し得る。また、ＩｇＧのヒンジ領域は、重要なシステイン残基を用いて重鎖と軽鎖との間の分子内ジスルフィド結合を提供する。このｈＴＲ領域（１−９７）は、少なくとも１つのシステイン（Ｃ８９）を含み、ｈＴＲ−ＦｃΔＨモノマーの多量体会合を可能にすることによって、このヒンジ領域機能を模倣する。
【００３０】
（形質転換された細胞および組換え遺伝子技法）  「形質転換」細胞は、細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、組換え遺伝子技法により導入された細胞または細胞の子孫である。用語「組換え」は、ヒトが介入する産物をいう。この形質転換された細胞は、免疫刺激細胞表面ポリペプチドを発現し得る任意のヒト細胞であり得る。ヒト組織の任意の適切な供給源を、形質転換された細胞を生成するための供給源として使用し得、これには、公に利用可能な不死化細胞株および分裂する初代細胞培養が含まれる。ヒト細胞株の例は、ヒト神経幹細胞または前駆体細胞；ＲＰＭＩ  ２６５０、ＨＴ−１０８０またはＳＷ−１３上皮細胞；ＨＬ−６０マクロファージ細胞；ＣＣＲＦ−ＣＥＭまたはＲＰＭＩ  ８２２６リンパ様細胞；およびＷＩ−３８、ＨＥＬ１、ＭＲＣ−５またはＩＭＲ−９０線維芽細胞を含む。有用なヒト細胞株は、容易にトランスフェクトされる能力、ならびにタンパク質およびペプチドを分泌する能力を有する。
【００３１】
この形質転換された細胞は、その他の哺乳動物供給源、例えば、げっ歯類からであり得る。実施例１では、異なる濃度の抗体でオプソニン化されたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が、スーパーオキサイド産生において、用量依存性増加を刺激した（図３Ａ）。同様に、形質転換されたＢＨＫ−Ｆｃ細胞は、スーパーオキシド産生を誘導する。従って、形質転換されたハムスター細胞の細胞表面上のＩｇＧ  Ｆｃの存在は、マクロファージを活性化する。
【００３２】
免疫刺激細胞表面ポリヌクレオチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、標準的なＤＮＡ発現ベクター中に構築され、そして細胞内の発現のために細胞中に導入され得る。クローニングベクター中への挿入のためのポリヌクレオチド（例えば、コード化ポリヌクレオチド）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて構築され、適切なポリヌクレオチドを増幅し得る。ポリヌクレオチド合成技法および精製技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．１９９３）に記載されている。このＰＣＲ手順は、周知の方法によって実施される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、およびＢａｎｇｈａｍ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１中）を参照のこと。さらに、ＰＣＲキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のような会社から購入され得る。ＰＣＲの産物はクローニングベクター中にサブクローン化される。細菌宿主細胞のためのＰＣＲの使用は、例えば、Ｈｏｆｍａｎｎら（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ、編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、２０５−２１０頁）により、およびＣｏｏｐｅｒら（前述，３０５−３１６頁）により記載されている。コード化ポリヌクレオチドは、実施例１中、ＰＣＲにより構築される。
【００３３】
「ベクター」は、コード化ポリヌクレオチドが、付着されたコード化ポリヌクレオチドの複製または発現を起こすように付着されるレプリコンである。ベクターは、適切な制御配列と組み合わせたとき、適切なポリペプチドに対応するコード化ポリヌクレオチドを保持する細胞の形質転換の遺伝子操作において用いられ得、形質転換された細胞に対し特性の性質を与え得る。組換えベクターは、制限酵素およびリガーゼを用いて、異なる供給源からのポリヌクレオチドを切断および連結することにより構築される。
【００３４】
ベクターは、クローニングベクターおよび発現ベクターを含む。クローニングベクターは、プラスミド、コスミドまたは細菌ファージのような、宿主原核生物細胞または真核生物細胞において自律的に複製し得るポリヌクレオチドである。クローニングベクターは、ポリヌクレオチド配列がベクターの本質的な生物学的機能の損失なく所定の様式で挿入され得る１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびこのクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切であるマーカー遺伝子を代表的に含む。適切なクローニングベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．１９９３）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ（Ｂｒｏｗｎ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）により記載されている。クローニングベクターは、例えば、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｅｌｌｅ、ＭＤ）から得られ得る。
【００３５】
クローン化された改変体は、クローニングベクターでコンピテント細菌細胞を形質転換する工程、および適切な抗生物質の存在下で細菌宿主細胞を増殖する工程により増幅される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。次いで、細菌宿主細胞を、適切なクローンについてスクリーニングする。
【００３６】
得られる組換えポリヌクレオチドまたは関係ある部分は、クローニングベクターから発現ベクター中にクローン化され得、この発現ベクターは、常在のポリヌクレオチドのより高いレベル、またはより効率的な発現を可能にする特徴を有する。これらの構築物は、挿入されたコード化ポリヌクレオチドの転写を開始するプロモーターを要求し得る。「プロモーター」は、転写を指向するに十分なポリヌクレオチドであり、プロモーター依存性遺伝子発現を誘導可能にするに十分であるようなプロモーターエレメントを含む。代表的には、生物学的に活性な細胞表面タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。「作動可能に連結される」は、複数の成分がそれらの通常の機能を実施するように構成される並置をいう。従って、コード化ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは、コード化ポリヌクレオチドの発現を行い得る。「作動可能に連結される」は、コード化ポリペプチドおよびプロモーターが、機能的に連結され、適切なファクター（例えば、転写アクチベータタンパク質）が調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にすることを意味する。ベクターのエレメントの配向または配置は、作動可能な連結要求が、このコード化ポリヌクレオチドの制御および発現を遂行する限り、厳密ではない。「哺乳動物」プロモーターは、哺乳動物細胞における転写を指向するポリヌクレオチドである（例えば、哺乳動物または哺乳動物に感染するウイルスのプロモーター）。転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３、１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ  ３１：３５５、１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４、１９８１）；ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７  １９８２）；およびサイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１、１９８０）。
【００３７】
哺乳動物の細胞において異種遺伝子を発現するための多くの遺伝子構築物および方法が当該分野で公知であり、そして本発明における使用のために適切である。例えば、細胞表面タンパク質の発現は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、またはアデノ随伴ウイルス由来のベクター）を採用する方法のような、従来の遺伝子治療法で達成され得る。
【００３８】
（構成的発現）  １つの実施形態では、免疫刺激細胞表面ポリペプチドは、形質転換された細胞中で構成的に発現される。構成的発現は、構成的プロモーターを有するベクターの使用により達成される。例えば、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、哺乳動物エンハンサー−プロモーター配列から高レベルの構成的転写を提供する。別の構成的プロモーターは、インターフェロン−誘導性Ｍｘ−１プロモーターである。発現のレベルは、用いられる免疫刺激細胞表面ポリペプチド、ベクターコピー数、またはベクターの細胞位置もしくはゲノム位置に依存し得るが、誘導性発現とは対称的に、ファクターの添加に依存し得ない。
【００３９】
構成的発現は、この組換えポリペプチドが、その細胞から発生する生物のゲノムの一部分になる（すなわち、安定に組み込まれるか、または安定な染色体外エレメントのとしてのいずれか）とき生じ得る。このようなポリペプチドは、トランスジェニック生物にとって部分的または完全に異種（すなわち外来）である遺伝子を含み得るか、またはこの生物の内因性遺伝子に相同である遺伝子を提示し得る。
【００４０】
構成的発現または誘導性発現の増加は、当該分野で周知の増幅方法を用いてベクターコピー数を増加または増幅させることによって達成され得る。そのような増幅方法としては、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、米国特許第４，４７０，４６１号を参照のこと）またはグルコースシンセターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号、および欧州特許出願公開番号ＥＰ  ３３６，８４１号を参照のこと）。ゲネチシン（Ｇ４１８）またはハイグロマイシン薬物選択遺伝子を含む発現ベクター（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３１５，１９８１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１；３２７、１９８２）もまた有用である。これらのベクターは、種々の異なるエンハンサー／プロモーターの領域を使用して、目的の生物学的遺伝子およびＧ４１８またはハイグロマイシンＢのような毒素での選択に対する耐性を付与する遺伝子の両方の発現を駆動させ得る。Ｇ４１８耐性遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする。これは、その培養培地に添加されたＧ４１８を酵素的に不活化させる。ＡＰＨ遺伝子を発現する細胞のみが通常、薬物選択を生き残り、第二の生物学的遺伝子の発現がまた生じる。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＢＨ）遺伝子は、ハイグロマイシン毒素を特異的に改変し、そしてそれを不活化する酵素をコードする。ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子と同じプラスミドと同時トランスフェクトされるか、またはそれに含まれる遺伝子は、ハイグロマイシンＢの存在下で優先的に発現される。
【００４１】
（誘導性発現）別の実施形態において、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードする発現ベクターは、誘導性である。高レベルの発現が、適切な宿主細胞において下流の配列の転写の増加を提供する調節領域の付加によって達成され得る。哺乳動物宿主について、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、好ましくは、ウイルス供給源（例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来し、ここで、その調節シグナルには、高レベルの発現を有する特定の遺伝子が随伴する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、アクチン、コラーゲン、ミオシンおよびメタロチオネインの遺伝子のような哺乳動物遺伝子から得られ得る。
【００４２】
従って、本発明は、治療において使用するための「自殺遺伝子」を提供する。この実施形態において、形質転換された細胞を使用して、薬理学的に有効な処置を提供する。処置がもはや所望されなくなったとき（処置が首尾よくなかったか、またはその処置が首尾よく完了したなどの任意の理由による）には、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの発現が誘導される。この発現は、形質転換された細胞を生じ、これは、その患者から有効に取り出される。
【００４３】
（中枢神経系における発現）脳は、免疫学的に特別な部位であり、循環細胞および免疫系のタンパク質から遮断されているが、多くの脳疾患において補体が存在することを示唆する証拠の数が増加している（Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３８（１−２）：４３−５０、１９９７による概説を参照のこと）。脳における補体の合成および活性化は、この部位における免疫防禦において重要であるが、ＣＮＳ状態（例えば、アルツハイマー病、虚血およびパーキンソン病）ならびに末梢障害（例えば、心筋虚血および異物移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（ＭｃＧｅｅｒおよびＭｃＧｅｅｒ、Ｄｕｒｇｓ  ５５（６）：７３９−４６、１９９８）においてもまた重要であり得る。アルツハイマー病（ＡＤ）の症例において、古典的経路の補体タンパク質Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９についての陽性染色が錐体神経および老人斑において観察された（Ｔｅｒａｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７６９（２）：３８５−３９０、１９９７；Ｓｈｅｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７６９（２）：３９１−３９５、１９９７）。いくつかの脳の細胞は、補体を合成し、そしてまた特定のレセプターを発現し、いくつかは、補体の溶解効果に対して正確に感受性である。補体の活性化は、神経細胞死をインビトロで生じ、そしてこの神経変性プロセスは、Ｓｈｅｎらによって記載されるような相同的制限によって調節される（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｐｒｏｔｏｃ  １（２）：１８６−９４、１９９７）。従って、本発明の細胞、組成物および方法は、中枢神経系免疫応答の調節において有用である。
【００４４】
１つの実施形態において、プロモーターは、特異性が増加した神経細胞における免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現することについて、細胞特異的、組織特異的または段階特異的であり得る。使用され得る発現ベクターの例は、市販されるｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＲＣ／ＲＳＶ、およびｐＣＤＮＡ１ＮＥＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、ここでは、目的のウイルスプロモータ領域が中枢神経系内のウイルスプロモーターによって経験される下方調節に供されないプロモーター配列に置き換えられる。例えば、ＧＦＡＰプロモーターは、星状細胞のトランスフェクションのために使用され得、そしてＭＢＰプロモーターは、稀突起神経膠細胞において使用され得る。他のプロモーターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ｈＤＢＨ（ヒトドパミンβヒドロキシラーゼ）のプロモーター（Ｍｅｒｃｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ：７０３−７１６、１９９１）、ｈＴＨ（ヒトチロシンヒドロキシラーゼ）（Ｋａｎｅｄａら、Ｎｅｕｒｏｎ  ６：５８３−５９４、１９９１）、ｈＰＮＭＴ（ヒトフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ）（Ｂａｅｔｇｅら、ＰＮＡＳ，８５：３６４８−３６５２、１９８８）、ｍＧＦＡＰ（マウス神経膠原線維酸性タンパク質）（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８８７７−１８８８３、１９９１））、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ｍＮＦ−Ｌ（マウス神経フィラメント軽サブユニット）（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１９７８６−１９７９１，１９９０）、ｈＰｏ（ヒトＰ0、末梢神経系における主要なミエリン糖タンパク質をコードする遺伝子についてのプロモーター）（Ｌｅｍｋｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  １：７３−８３、１９８８）、ｍＭＴ、ｒＮＳＥ（ラットニューロン特異的エノラーゼ）（Ｓａｋｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  ６０、１０３−１１３、１９８７）、など。
【００４５】
（診断方法）本発明の形質転換された細胞または免疫刺激性細胞表面ポリペプチドは、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドに対するマクロファージ応答（例えば、炎症における）の検出について診断的に有用である。生物学的サンプル（例えば、血液またはその誘導物、生検、滑膜液など）がアッセイされ得る。アッセイは、細胞溶解物、インタクトな細胞、凍結切片などにおいて実施され得る。多くの臨床的に有意な障害（例えば、関節炎、細菌感染、過敏症、創傷治癒など）には、炎症が伴う。代表的なスクリーニングアッセイにおいて、インビトロでの食細胞（例えば、マクロファージ）の、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現するインビトロ細胞による活性化は、患者のマクロファージが特定の標的細胞を消化し、そして殺傷する能力のインビトロ試験のように測定される。あるいは、精製されたか、または半精製された免疫刺激性細胞表面ポリペプチドは、不溶性基材に結合され得、そして細胞または組織の代わりに使用され得る。
【００４６】
免疫刺激性細胞表面ポリペプチドはまた、薬剤が食細胞と免疫刺激性細胞表面ポリペプチドとの間の相互作用に介入するにおいて有効であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイにおいて診断的に有用である。代表的なスクリーニングアッセイにおいて、インビトロでの食細胞（例えば、マクロファージ）の、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現するインビトロ細胞による活性化が測定される。薬剤（特に、ペプチド、アプタマー、炭水化物、有機低分子など）は、抗体および細胞の混合物に添加され、そして食細胞活性において測定された減少は、その化合物が免疫刺激性細胞表面ポリペプチドと反応することを示す。
【００４７】
用語「薬剤」とは、食細胞の生理学的機能を代替するかまたは模倣する能力を有する任意の分子（例えば、タンパク質または医薬）をいう。一般に、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度と並行して用いて（アッセイを）実施して種々の濃度に対する異なる応答を得る。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度または検出限界未満の濃度）として作用する。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法に包含されるものはまた，化学的化合物を同定するためのコンビナトリアルケミストリ方法である。例えば、ＰｌｕｎｋｅｔｔおよびＥｌｌｍａｎ（「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ａｐｒｉｌ、６９、１９９７）を参照のこと。コンビナトリアルケミストリのための研究の領域は、治療処置の開発である。薬物スクリーニングは、罹患した細胞における機能の代替、増強または調節を提供する薬剤を同定する。特に興味深いのは、ヒト細胞について低毒性を有する薬剤についてのスクリーニングアッセイである。
【００４９】
候補薬剤は、多くの化学的分類を包含するが、代表的には、それらは、有機分子、好ましくは有機低分子（５０を超え、かつ約２，５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する）である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、そして代表的には少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学官能基の少なくとも２つを含む。候補薬剤は、しばしば、上記の官能基の１つ以上で置換された、環状炭素もしくはヘテロ環状構造、および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は又、以下を含むがそれらに限定されない生体分子のなかで見出される：ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログ、またはそれらの組合せ。
【００５０】
候補薬剤は、広汎で種々の供給源から得られる。その供給源としては、合成化合物または天然の化合物のライブラリーが挙げられる。例えば、多数の手段が、広汎で種々の有機化合物および生体分子のランダムおよび指向された合成で利用可能である。これには、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然にまたは合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的な手段によって容易に改変される。そして、これを使用してコンビナトリアルライブラリーを生成し得る。公知の薬理学的な薬剤を、指向されたまたはランダムな化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化またはアミド化）に供して構造アナログを生成し得る。
【００５１】
少なくともアッセイが結合アッセイである場合、１つ以上の分子が標識に結合され得、ここで、その標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供し得る。種々の標識としては、放射性同位体、蛍光、化学発光体、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば，磁性粒子）などが挙げられる。特異的結合分子としては、対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン）が挙げられる。特異的結合メンバーについて、相補的なメンバーは、通常、公知の手順に従って、検出を提供する分子を用いて標識される。
【００５２】
種々の他の試薬がスクリーニングアッセイにおいて含まれ得る。これらは、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン、界面活性剤など）のような試薬を含み、これらは、最適なタンパク質間結合を容易にするため、および／または非特異的な相互作用またはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される。アッセイの効率を改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビターまたは抗菌剤）が使用され得る。化合物の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適切な温度（代表的には、４℃と４０℃との間）で行われる。インキュベーション期間は、最適な活性について選択されるが、これもまた、迅速な高処理スクリーニングを容易にするために最適にされ得る。代表的には、０．１時間と１時間との間が充分である。
【００５３】
（第二の抗原提示）本発明は、抗原提示のための方法を提供する。緩和なまたは最低限に抗原性である基材（「第二の抗原」）を、免疫系に導入する。１つの実施形態において、第二の抗原は、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えポリヌクレオチドを含む、形質転換された細胞の表面に存在する。別の実施形態において、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えポリヌクレオチドを含む、形質転換された細胞は、実際に、第二の抗原物質を作製する。例えば、第二の抗原は、細胞を形質転換するために使用された組換えポリヌクレオチドによってコードされ得る。換言すれば、形質転換された細胞は、強力な免疫応答が所望される第二の抗原を発現する組換え技術によって構築され得る。本発明の方法は、そうでなければ弱い抗原に対する有意な免疫応答を促進するために有用である。弱い抗原の中にはとりわけ、主要関連抗原または特定のウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ−１の特異的抗原）などがある。
【００５４】
（食細胞活性を刺激するための方法）本発明は、食細胞活性を刺激するための方法を提供する。免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えポリヌクレオチドを含む、形質転換された細胞を作製して、食細胞（例えば、マクロファージ）を接触させる。この接触は、その食細胞によって食細胞活性の増加を刺激する。食細胞は、形質転換された細胞を飲み込み得る。この食細胞はまた、または代替的に、他の細胞を飲み込み得るか、または実施例１に記載されるような、活性化されたマクロファージの測定可能な特性を示し得る。
【００５５】
この方法は、マクロファージ腫瘍に対して治療化合物を標的化するために有用である。治療化合物（例えば、抗腫瘍化合物）は、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えポリヌクレオチドを含む、形質転換された細胞へと導入される。この形質転換された細胞は、宿主（例えば、患者）へと導入される。形質転換された細胞は、その形質転換された細胞を貪食するマクロファージ腫瘍へと標的化される。従って、その治療化合物が送達される。
【００５６】
（免疫応答を調節すること）本発明はまた、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドを発現する、形質転換された細胞を用いて、免疫応答を調節する方法を提供する。用語「調節する」とは、食細胞活性が本発明の方法によってインビボで制御または調節されることを意味する。用語「調節する」とは、その状況に応じて、その応答を刺激するかまたは阻害するかのいずれかを意味し得る。本発明の方法は、免疫反応が変質しており、そしてそのような応答または免疫応答の抑制が所望される状態か、あるいは免疫応答が重要であり、そしてそのような反応の刺激が所望される状態のいずれかの処置を包含する。免疫刺激性細胞表面ポリペプチドは、ワクチンへの免疫応答を増強し、腫瘍拒絶に対する応答を刺激するか、または量的様式でその応答を変動させるマクロファージを補充させるかたまたは活性化するにおいて有用であり得る。同様に、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドは、所望な場合（例えば、器官および組織の移植のあとの移植片拒絶応答、または自己免疫疾患）、免疫または炎症の応答を阻害または抑制し得る。一般に実施される移植手術のいくつかは、腎臓、心臓、肝臓、皮膚、膵臓島および骨髄のような器官および組織を包含する。
【００５７】
（自己免疫障害）「自己免疫障害」には、組織破壊を導く自己抗原に対する免疫系の反応によって生じる疾患の群が包含される。免疫系の応答は、主に体液性（自己抗体産生）であり得、主に細胞性（遅延型過敏性Ｔ細胞およびおそらく細胞傷害性Ｔ細胞すなわち「自己反応性Ｔ細胞」）、または体液性および細胞性の両方の反応が、誘導され得る。自己反応性Ｔ細胞の高度に特異的な反応性は、外部の細胞表面構造、内部の細胞質成分または核成分に対して指向されているか、または異なる機関における細胞によって生産される分泌された産物に対して指向されている。自己抗原反応性ＴH細胞の発生に関していくつかの種類の問題が明らかに存在する。本発明の方法において、免疫刺激性細胞表面ポリペプチドの発現は、自己反応性Ｔ細胞の除去を生じ、これにより、自己免疫障害に関与する因子を減少させる。
【００５８】
いくつかの重要な自己免疫疾患としては、糖尿病；自己免疫甲状腺炎；多発性硬化症および関連する脱髄疾患；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；および重症無筋力症が挙げられる。他の自己免疫および関連する障害としては，例えば、結節（ｎｏｄｏｓａ）多発関節炎；多発性筋炎および皮膚筋炎；進行性全身硬化症（散発性強皮症）；糸球体腎炎；シェグレン症候群；橋本病およびグラヴィス病；副腎炎；上皮小体機能低下；悪性貧血；ブドウ膜炎天疱瘡および類天疱瘡；肝硬変および他の肝疾患；潰瘍性結腸炎；心筋炎；限局性腸炎；成人性呼吸困難（窮迫）症候群；薬物反応の局所性発現（皮膚炎など）；皮膚の炎症関連またはアレルギー反応パターン；アトピー性皮膚炎および乳児湿疹；接触性皮膚炎、乾癬扁平苔癬；アレルギー性腸症；アトピー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎および気管支喘息）；移植拒絶（心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓島細胞など）；感染因子に対する過敏反応または破変性反応；ストレプトコッカス後疾患（例えば、リウマチ熱の心臓における発症）などが挙げられる。
【００５９】
（カプセル化）
本発明は、免疫刺激細胞表面のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞が、免疫隔離性（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）のカプセル中にカプセル化された組成物を提供する。「免疫隔離性のカプセル」は、宿主への移植の際、カプセルが、そのコアにある細胞に対する宿主の免疫系の有害な影響を最小化することを意味する。カプセル化された細胞がその整合性が破られたカプセルより漏れ出るべきである稀な事象においては、細胞は、特異的な免疫学的な記憶を誘発することなく、宿主細胞より直ちに排除され得る。カプセル化された場合、形質転換された細胞は、マクロファージを活性化しないが、非カプセル化された細胞は、宿主によって効果的に排除される。
【００６０】
カプセル化細胞治療法は、価値ある治療方法である。カプセル化細胞治療法は、宿主内の移植前に半透性の生体適合性材料を用いて細胞を取り囲むことによって、宿主の免疫系からの細胞を隔離するという概念に基づく。カプセル化技術を用いて、細胞は、免疫拒絶反応なしに、または免疫抑制性薬物の使用なしに宿主へ移植され得る。有用な生体適合性ポリマーカプセルは、通常以下を含む：（ａ）液体培地中で撹拌されたかまたは固定化マトリックス内に固定されたかのいずれかの細胞を含むコア、および（ｂ）隔離された細胞を含まず、生体適合性であり、そしてコア内に存在する場合に、隔離された細胞を有害な免疫学的攻撃より防御するのに十分である、選択透過性のマトリックスまたは膜（「ジャケット（ｊａｃｋｅｔ）」）の周辺領域または周縁領域。カプセル化は、免疫系の要素がカプセルに侵入するのを妨げ、これにより、カプセル化細胞を免疫破壊から防御する。カプセル膜の半透性の性質はまた、目的の生物学的に活性な分子が、カプセルから周辺の宿主組織へ容易に拡散することを可能にする。この技術は、腫瘍形成に固有の危険性を防ぎ、そしてレシピエントの免疫抑制なしに形質転換された細胞を使用することを可能にする。さらに、必要または所望されるのであれば、この移植物は、回収され得る。
【００６１】
カプセルは、生体適合性材料より作製される。「生体適合性材料」は、宿主への移植後に、例えば、カプセルの拒絶を生じるのに十分な、または分解を通じてそれを手術不能にするのに十分な有害な宿主応答を誘発しない材料である。生体適合性材料は、宿主免疫系の成分のような大分子に対しては比較的に不浸透性であるが、インシュリン、増殖因子、栄養素のような小分子、同じに除去されるべき代謝老廃物に対しては透過性である。種々の生体適合性材料は、本発明の組成物による増殖因子の送達に適切である。種々の外表面形態ならびに他の機械的および構造的な特質を有する、多数の生体適合性材料が、公知である。好ましくは、本発明のカプセルは、以下に記載されるものに類似である：Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら（国際特許出願ＷＯ９２／１９１９５）；Ｂａｅｔｇｅ（国際特許出願公開ＷＯ９５／０５４５２）；または米国特許第５，６３９，２７５号；同第５，６５３，９７５号；同第４，８９２，５３８号；同第５，１５６，８４４号；同第５，２８３，１８７号；および同第５，５５０，０５０号。このようなカプセルは、宿主免疫系の有害な影響を最小化する一方、代謝産物、栄養素および治療的物質の通過を可能にする。生体適合性材料の成分は、周囲の半透性膜および内部の細胞支持足場を含み得、好ましくは、形質転換された細胞は、選択透過性膜によってカプセル化される足場上に播かれる。糸状の細胞支持足場は、以下からなる群より選択される任意の生体適合性材料より作製され得る：アクリル性、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレンポリアセトニトリル、ポリエチレンテラフタラート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテステル（ｐｏｌｙｂｕｔｅｓｔｅｒ）、絹、綿、キチン、炭素、または生体適合性の金属。結合された繊維構造もまた、細胞移植に用いられ得る（米国特許第５，５１２，６００号）。さらに、Ｃｉｍａら（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５−５８、１９９１）によって総説されたように、生分解性ポリマーは、肝細胞および脾臓細胞に対する足場に用いられ得る。生分解性ポリマーは、ポリ（乳酸）ＰＬＡ，ポリ（乳酸−コグリコール酸）ＰＬＧＡ、およびポリ（グリコール酸）ＰＧＡならびにそれらの等価物から構成されるものを含む。気泡足場は、移植された細胞が接着し得る表面を提供するために用いられてきた。編目網状管は、血管移植物として用いられてきた。さらに、コアは、細胞の位置を安定化させるヒドロゲルより形成される固定化マトリックスから構成され得る。ヒドロゲルは、実質的には水から構成されるゲルの形態における、架橋親水性ポリマーの３次元のネットワークである。
【００６２】
種々のポリマーおよびポリマー混合物は、周囲半透性膜を製造するために用いられ得、以下を含む：ポリアクリレート（アクリルのコポリマーを含む）、ポリビニリデン、ポリビニルクロリドコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースニトレート、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物。好ましくは、周囲半透性膜は、生体適合性半透性の中空繊維膜である。このような膜、およびこれらを作製する方法は、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒおよびＷａｈｌｂｅｒｇ（米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号）によって開示される。この周囲半透性膜は、Ｗｅｃｈｓ（米国特許第４，９７６，８５９号）ならびにＭｕｌｌｅｒおよびＷｅｃｈｓ（米国特許第４，９６８，７３３号）に記載されるようなポリエーテルスルホン中空繊維より形成される。代替の周囲半透性膜物質は、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）である。
【００６３】
カプセルは、生物学的な活性を維持するのに適切な、および産物または機能の送達のためのアクセスを提供するのに適切な任意の構造（例えば、円柱状、長方形、円盤型、パッチ状、卵形、星状、または球状を含む）であり得る。さらに、カプセルは、網状様構造または入れ子状構造に巻かれ得るか、または覆われ得る。移植された後にカプセルが回収される場合、移植の部位からカプセルの移動が導かれる傾向にある構造（例えば、レシピエントの血管内へ移動するのに十分小さな球状のカプセル）は、好ましくない。特定の形状（例えば、長方形、パッチ状、円盤型、円柱状、および扁平なシート）は、より高い構造的整合性を提供し、そして回収が所望される場合に好ましい。
【００６４】
マイクロカプセルが用いられる場合、好ましくは１０3と１０8の間の細胞がカプセル化され、最も好ましくは、１０5と１０7の間の細胞が、各々のデバイスにカプセル化される。用量は、より少量またはより多量のカプセル（好ましくは、患者当たり１と１０の間のカプセル）を移植することによって制御され得る。
【００６５】
足場は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子でコーティングされ得る。ＥＣＭ分子の適切な例は、例えば、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンを含む。この足場の表面はまた、血漿照射で処理して細胞の接着を増強する変化を付与するように改変され得る。
【００６６】
ポリマー接着性および／または圧着、結びおよび熱封着の使用を含む、カプセルを密閉する任意の適切な方法が、用いられ得る。さらに、任意の適切な「乾燥」封着法もまた、例えば、米国特許第５，６５３，６８７号に記載されたように用いられ得る。
【００６７】
多くの移植部位が、本発明のデバイスおよび方法のために意図される。これらの移植部位は、脳、脊髄、ならびに目の眼房水および硝子体液を含む中枢神経系を含む。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、決して本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００６９】
（実施例１）
（逆配向のＩｇＧ1  ｃＤＮＡのクローニングおよび発現）
本実施例において、逆配向のＦｃを伴うＩｇＧ1Ｆｃキメラを構築し、そして細胞表面状に首尾良く発現させた。Ｆｃレセプター結合特性を、分子中に保持されたが、補体活性能は欠損された。
【００７０】
（キメラｈＴＲ−ｈＩｇＧ1発現カセットおよびキメラｈＴＲ−ｍＩｇＧ1発現カセットの設計および構築の原理）
本実施例の原理は、細胞を遺伝的に改変して、ＩｇＧ  Ｆｃを細胞表面上に逆配向で発現させ、細胞の除去のために天然のＩｇＧオプソニン化を模倣することである。概念を、図１に示す。ＩｇＧオプソニン化の場合において、ＩｇＧは、分子のＦａｂ部位を通じて標的と結合し、Ｆｃレセプター結合のためにＦｃ部位を露出する（図１Ａ）。Ｆｃを同様の配置で発現するために、Ｆｃ分子は、天然に存在する膜結合ＩｇＧに関して逆配向で、形質膜と固着されなければならない（図１Ｂ）。このような逆配向Ｆｃは、Ｆｃ部位を介して膜と固着される天然に存在する膜結合ＩｇＧ（図１Ｂ）と比べて、Ｎ末端によって細胞表面から突出するカルボキシル末端と固着されなければならない（図１Ｃ）。ＩＩ型膜貫通ドメインは、このような配置を達成するのに必要である。ｈＴＲは、シグナルペプチドとしても機能する膜貫通領域を伴うＩＩ型膜貫通タンパク質である。ヒトトランスフェリンレセプターの膜貫通ドメインを、ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の定常領域の第２および第３のドメインのＮ末端にインフレームで融合した。この融合分子は、トランスフェリンレセプターのＩＩ型膜固着特性を利用して設計して、逆配向で分子のＦｃ部位を発現させ、その結果、Ｆｃ部位は細胞表面から突出した。これは、Ｃ末端Ｉ型膜貫通ドメインによって固着される従来の細胞表面ＩｇＧとは対照的である。
【００７１】
このような特性を利用して、ｈＴＲ膜貫通ドメインおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含むキメラタンパク質を、設計した。逆配向Ｆｃを発現した細胞表面は、もはや補体を活性化しないが、Ｆｃレセプター結合能を保持し、そしてマクロファージによるスーパーオキシド産生を活性化した。この活性は、ＦｃγＲＩ特異的モノクローナル抗体によって完全にブロックされた。
【００７２】
（プライマー）
ＩｇＧ1のＲＴ−ＰＣＲ産物のｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクターへのクローニングを容易にするために、合成制限酵素部位を、上記のオリゴヌクレオチドの５’端に操作した。詳細には、ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を、以下に下線を伏したように、オリゴヌクレオチド＃４００（配列番号５）および＃４０４中に個々に操作した。オリゴヌクレオチド＃４０１（配列番号６）および＃４０５は、以下に二重下線を伏したのように、５’端に合成ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。
【００７３】
ヒトＩｇＧ1のＲＴ−ＰＣＲに関して、オリゴヌクレオチド＃４００（配列番号５）および＃４０１（配列番号６）を、用いた。
【００７４】
【化１】
0004456275.tif 000002
キメラヒトトランスフェリンレセプター−ヒトＩｇＧ1（「ｈＴＲ−ｈＩｇＧ1」）融合発現カセットを作製するために、オリゴヌクレオチド＃４０２（配列番号７）および＃４０３（配列番号８）を、用いた。オリゴヌクレオチド＃４０２（配列番号７）は、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的であり、そして以下に一重下線を伏したように合成ＢａｍＨＩ制限部位を含む。
【００７５】
【化２】
0004456275.tif 000003
オリゴヌクレオチド＃４０３（配列番号８）は、ヒトトランスフェリンレセプター（ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ）およびヒトＩｇＧ1（ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＧ）に特異的である。
【００７６】
【化３】
0004456275.tif 000004
マウスＩｇＧ1のＲＴ−ＰＣＲに関して、オリゴヌクレオチド＃４０４（配列番号９）および＃４０５（配列番号１０）を、用いた。
【００７７】
【化４】
0004456275.tif 000005
キメラヒトトランスフェリンレセプター−マウスＩｇＧ1（「ｈＴＲ−ｍＩｇＧ1」）融合発現カセットを作製するために、オリゴヌクレオチド＃４０６（配列番号１１）、＃４０７（配列番号１２）、＃４０８（配列番号１３）、および＃４０９（配列番号１４）を、用いた。オリゴヌクレオチド＃４０７（配列番号１２）および＃４０８（配列番号１３）は、お互いに相補的である。
【００７８】
【化５】
0004456275.tif 000006
オリゴヌクレオチド＃４０８は、ｈＴＲ配列に同一の５’の１２ヌクレオチドを有し、そしてｍＩｇＧ1配列に同一の３’の１８ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチド＃４０７（配列番号１２）は、ｍＩｇＧ1配列に同一の５’の１２ヌクレオチドを有し、そしてｈＴＲ配列に同一の３’の１８ヌクレオチドを有する。
【００７９】
オリゴヌクレオチド＃４０６（配列番号１１）および＃４０９（配列番号１４）は、個々に、ｈＴＲおよびｍＩｇＧ1配列に特異的である。以下に下線を伏したように、オリゴヌクレオチド＃４０６（配列番号１１）は、合成ＥｃｏＲＩ部位を５’端に含み、一方オリゴヌクレオチド＃４０９（配列番号１４）は、内部にＢａｍＨＩ制限部位を含む。
【００８０】
【化６】
0004456275.tif 000007
（ＰＣＲ反応）
Ｆａｂ、ＣＨ1またはヒンジドメインを欠くヒトＩｇＧ1のＦｃ部位のＮ末端欠失を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製し、そしてヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴＲ）の膜貫通ドメインにインフレームで融合した。推定のシグナル配列および膜貫通ドメインを含むｈＴＲの残基１〜９７、およびヒトＩｇＧ1のＮ末端欠失フラグメントを、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）よりＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いるＰＣＲによって増幅した。ＣＨ1ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインをコードするＩｇＧ1領域を、ヒトおよびマウス脾臓総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって作製した。総ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９、１９８７）に記載された酸／フェノール法によって、ヒトおよびマウスの細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを、以前にＧａｎｄｅｌｍａｎら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：１０２４−１０２９、１９９０）に記載されたように実施した。ヒトトランスフェリンレセプター（「ｈＴＲ」）の供給源は、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）からのプラスミドＨＢＭＡＣ３８（ＡＴＣＣ１００８０８）であった。
【００８１】
簡単には、０．５μｇの総ＲＮＡを、ＫｒｕｇおよびＢｅｒｇｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５、１９８７）に従って逆転写して、２０ｍｌの反応混合物中にｃＤＮＡを作製した。１〜５μｌの各々の反応混合物を、各々１０ｐｍｏｌの以下を含む最終５０μｌのＰＣＲ混合物を作製するように加えた：ヒトＩｇＧ1  ＲＴ−ＰＣＲに関して、オリゴヌクレオチド＃４００（配列番号５）およびオリゴヌクレオチド＃４０１（配列番号６）、ならびにマウスＩｇＧ1  ＲＴ−ＰＣＲに関して、オリゴヌクレオチド＃４０４（配列番号９）およびオリゴヌクレオチド＃４０５（配列番号１０）。１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ  ＨＢＭＡＣ３８を、以下を含む５０μｌのＰＣＲ反応混合物に加えた：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、８００ｎＭ  ４つのｄＮＴＰの各々、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４００ｎＭ  オリゴヌクレオチド＃４０２および＃４０３の各々、ならびに２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＰＣＲ反応はまた、以下を用いて実施した：オリゴヌクレオチド対＃４０６（配列番号１１）および＃４０７（配列番号１２）；ならびにオリゴヌクレオチド対＃４０８（配列番号１３）および＃４０９（配列番号１４）；それぞれに、鋳型ＨＢＭＡＣ３８およびｐｃＤＮＡ３．１（−）−ｍＩｇＧ1プラスミドに対する。反応混合物は、３０サイクルのＰＣＲを実施された。各々のサイクルは、変性（９４℃で一分間）、アニーリング（５０℃で一分間）、および伸長（７２℃で一分間）からなる。ＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）によって製造業者のプロトコールに従って、ＰＣＲ反応混合物中の用いたデオキシヌクレオチドおよび塩から精製した。
【００８２】
精製されたヒトおよびマウスＩｇＧ1  ＲＴ−ＰＣＲフラグメントを、個々にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、引き続き、アルカリホスファターゼ処理によって脱リン酸化されたｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに個々に連結した。ｈＴＲおよびＩｇＧ重鎖フラグメントを連結し、キメラ分子のコード配列を作製した。これらのキメラは、個々に、ｈＴＲ−Ｆｃ（全長のＩｇＧ1重鎖定常領域を含む）、ｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ1（ＩｇＧ1重鎖定常領域を欠いたＣＨ1ドメイン；配列番号１）およびｈＴＲ−ＦｃΔＨ（ＩｇＧ1重鎖定常領域を欠いたＣＨ1およびヒンジ；配列番号３）と命名された。連結混合物は、ＤＨ５ａに形質転換され、そしてアンピシリン耐性コロニーを、陽性クローンとしてスクリーニングした。
【００８３】
クラッキング（ｃｒａｃｋｉｎｇ）ゲル手順（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ，１９９１）を用いて、陽性クローンをスクリーニングして選んだ。正しいクローンの同定をＢａｍＨＩ／ＤｒａＩＩＩでの２重消化によりさらに確認した。アンピシリン耐性コロニーから得たプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化して、それぞれヒトおよびマウスのＩｇＧ1ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの存在を確認した。この得られたｐｃＤＮＡ３．１（−）に基づくヒトおよびマウスのＩｇＧ1媒介クローニングベクターを、それぞれｐｃＤＮＡ３．１（−）−ｈＩｇＧ1およびｐｃＤＮＡ３．１（−）−ｍＩｇＧ1と名付けた。
【００８４】
（融合タンパク質の特徴付けおよび局在化）トランスフェクトした細胞は、かなり高レベルのインタクトなｈＴＲ−ＦｃΔＨ（配列番号４）を発現する。ＢＨＫ細胞はまた、ほぼ予期された分子量を有することが示されたｈＴＲ−ＦｃおよびｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ1（配列番号２）を発現した。ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞のトランスフェクションを、ポリ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で被覆した、６ウェルの組織培養プレート（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）またはＬａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）へのプレートにより行った。１ウェルあたり、１ｍｌの培地あたり、１．０ｍｇのＤＮＡを用いる、リン酸カルシウムに基づくＳｔａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、細胞をトランスフェクトした。細胞を６〜８時間トランスフェクトし、そしてＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とともに２日間増殖させた。ポリクローナルな安定細胞株、およびモノクローナルな安定細胞株を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて選択し、そして０．２５ｍｇ／ｍｌに維持した。
【００８５】
（ウエスタンブロット、免疫染色、およびＥＬＩＳＡによる逆Ｆｃの発現および局在化）ウエスタンブロット分析を用いて、相対的ｈＴＲ−Ｆｃ発現を決定した。トランスフェクトした細胞をホットＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で直接溶解した。この溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして１：５０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合体化抗体（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いてイムノブロットした。特異的なバンドを化学発光により可視化した（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【００８６】
ｈＴＲ−ＦｃΔＨ（配列番号４）が所望の方向へ形質膜を標的化したか否かを決定するため、逆ヒトＩｇＧ  Ｆｃの表面発現を免疫染色およびＥＬＩＳＡの両方によりモニターした。免疫蛍光染色については、本質的にＲｉｃｈａｒｄｓら（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３４：１１５７〜６８、１９９６）に記載のように、細胞を処理した。キメラｈＴＲ−Ｆｃ分子を、１：１０００に希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的Ｃγ３（カルボシアニン）結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて可視化した。核をＤＡＰＩ染色により可視化した。
【００８７】
ｈＴＲ−ＦｃΔＨ（配列番号４）を発現する安定なＢＨＫ細胞株は、高レベルの逆Ｆｃを生成したが、一方野生型細胞は、観察可能シグナルを示さなかった。ＣＨ1欠失変異体（ｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ1：配列番号２）で、類似の膜標的化がみられ、たが、Ｆａｂ欠失のみを有するインタクトなＩｇＧ  Ｆｃ（ｈＴＲ−Ｆｃ）は、ほぼ独占的に小胞体に標的化された。
【００８８】
逆Ｆｃの表面発現は、ＥＬＩＳＡにより半定量化された。ＥＬＩＳＡについては、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第１版、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ、１９９４、第２．１．１３頁）により記載されるとおり、細胞を９６ウェル組織培養プレート中で１００，０００／ウェルで播種した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃアルカリホスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を１：１０００希釈で添加した。基質ＰＮＰＰを添加し、そしてこのプレートを３０分後に、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）上でＯＤ405ｎｍで読取った。
【００８９】
陽性の表面免疫蛍光を示す細胞由来の細胞表面で発現されたヒトＩｇＧ1ＦｃをＥＬＩＳＡでモニターした。トランスフェクトした細胞は、バックグラウンドに近いシグナルを示す野生型ＢＨＫ細胞に対して非常に高いシグナルを示した（図２）。これらの結果は、免疫蛍光のデータと一致して、形質転換したｈＴＲ−ＦｃΔＨ（配列番号４）細胞が細胞表面で高レベルのヒトＦｃを発現することを確認する。
【００９０】
（細胞表面発現逆Ｆｃ融合タンパク質の特徴付け）設計を試験するために、ＢＨＫ細胞および抗ＢＨＫ抗体を用いて免疫複合体を作製した。マウスマクロファージによるスーパーオキシド産生へのオプソニン化ＢＨＫ細胞の効果を試験し、その結果を図３Ａに示す。マウスマクロファージの調製は、以下のとおりに行った：ヌードマウス（Ｎ：ＮＩＨ（ｓ）−ｎｕ／ｎｕＤＦ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ））中でチオグリコレートブロスによりマクロファージを惹起した。チオグリコレートブロス注入の７２時間後にマウス腹膜マクロファージを収集し、そしてＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳ中で５×１０6細胞／ｍｌに再懸濁した。１ウェルあたり５０ｍｌの細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、そしてこのプレートを少なくとも３時間３７℃でインキュベートした。非接着細胞をＨＢＳＳで３回洗浄して除去し、そして５０ｍｌ／ウェルのＨＢＳＳを添加した。
【００９１】
異なる濃度の抗体でオプソニン化されたＢＨＫ細胞は、スーパーオキシド産生における用量依存性の増加を生じたが、コントロール細胞のみでは効果はなかった。
【００９２】
種々のｈＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質（ｈＴＲ−Ｆｃ、ｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ1［配列番号２］およびｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ［配列番号４］）は、ＢＨＫ細胞中で一過性にまたは安定に発現された。安定なクローンは、ｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ1［配列番号１］およびｈＴＲ−ＦｃΔＣＨ［配列番号３］でトランスフェクトしたポリクローナル細胞に由来し、そしてマウスマクロファージによるスーパーオキシド産生へのこれらのクローンの効果を図３Ｂに示す。全てのサブクローンがスーパーオキシド産生を誘導した。ｈＴＲ−Ｆｃは、細胞表面Ｆｃを発現せず、従ってこの研究から排除した。ＢＨＫ−ＦｃΔＨクローン３をさらなる特徴付けのために選択した。
【００９３】
（ＢＨＫ−ＦｃΔＨ（３）の機能的分析）。逆Ｆｃの細胞表面発現がＦｃレセプター結合および補体結合反応に関して生物学的に活性であるか否かを評価するため、ヒト単球様細胞株におけるＦｃレセプター媒介スーパーオキシド産生を試験した。スーパーオキシドをシトクロムＣを低下する細胞の能力の関数として分光光度的に測定した。スーパーオキシド産生をＴａｏら（Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．５８；２０３〜８、１９９５）の９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイを用いて決定した。ＢＨＫ−ＷＴ（コントロール）、オプソニン化ＢＨＫ細胞、またはＢＨＫ−逆Ｆｃクローンのいずれかの２５，０００細胞／ウェルを、組換えヒトインターフェロン−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で前処理したヒト単球様Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、または洗浄したマウス腹膜マクロファージのいずれかを含有するアッセイプレートに添加した。Ｏ2放出をＴｅｒｍｏＭａｘ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて５５０ｎｍでのシトクロムＣのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）阻害可能低下として測定した。Ｏ2産生の速度を、刺激後０時〜６０ｍｍでモニターした。
【００９４】
ＢＨＫ−ＦｃΔＨ（３）細胞は、スーパーオキシド産生の増加を誘導したが、野生型細胞は効果を有さなかった。
【００９５】
ＦｃγＲＩレセプター特異的抗体の添加はこの誘導をほぼ完全にブロックした（図４）。これは、観察されたマクロファージ活性化がＦｃγＲＩにより特異的に媒介されたことを示す。さらにＢＨＫ−ＦｃΔＨによって誘導されたスーパーオキシド産生は、用量依存性である。［ヒトＦｃγＲＩに特異的なモノクローナル抗体である抗ＣＤ６４Ｆ（ａｂ’）２とのＵ９３７細胞のプレインキュベーションは、ほぼ完全に、ＢＨＫ−ＦｃΔＨ誘導スーパーオキシド産生を消滅させた（図４）］。
【００９６】
（逆Ｆｃを発現する細胞が補体を活性化する能力）逆Ｆｃを発現する細胞が補体を活性化する能力もまた試験した。Ｃ３ａ酵素イムノアッセイにおいて、ＢＨＫ−ＦｃΔＨ細胞は、補体を活性化できなかったが、インタクトなＩｇＧを含む免疫複合体（ＩＣ）は、補体を効率的に活性化した（図５）。Ｃ３ａ酵素イムノアッセイについては、補体活性化へのＢＨＫ−ＷＴおよびＢＨＫ−ＩｇＧΔＨの効果を、ＱＵＩＤＥＬ  Ｃ３ａ酵素イムノアッセイキット（ＱＵＩＤＥＬ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて評価した。ヒト血清オプソニン化ザイモサン（免疫複合体）を、陽性コントロールとして用いた。全ての標品取り扱いを、製造業者により提供されるガイドラインに従って実行した。ヒト血清（補体）をＢＨＫ−ＷＴ、ＢＨＫ−ＩｇＧΔＨ、または免疫複合体とともに１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、血清サンプルを収集し、そしてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ定量化に供した。全ての計算を製造業者により提供される標準曲線から行った。
【００９７】
他のＣ３ａ酵素イムノアッセイは、Ｂｕｒｇｅｒ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：５５３〜８、１９８８）；Ｍｏｌｌｎｅｓら（Ｏｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７３：４８４〜８、１９８８）；およびＨｕｇｈ（Ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｋａｍｕｒａら編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８、第４４３頁）らにより記載されるように実行され得る。
【００９８】
（補体依存性細胞傷害性）。ＢＨＫ野生型（ＢＨＫ−ＷＴ）細胞およびＢＨＫ−ＦｃΔＨ（配列番号４）細胞を、ＡＤＣＣアッセイにおいて標的細胞として用いた。全ての試験サンプルを三連の２つの群に設定し、そして標準的なアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の組織タイピング技術（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ）Ｍａｎｕａｌ、１９９４）を使用してアッセイした。３連の１群をヒツジ高感作血清およびＢＨＫ−ＷＴ細胞で分析し、一方３連の第２群を外因的にプレスクリーニングしたウサギ補体の添加を用いて同じ様式においてアッセイした。ＢＨＫ−ＦｃΔＨの場合、このアッセイを外因性のプレスクリーニングしたウサギ補体の非存在または存在下で実行した。２色免疫蛍光微小細胞傷害性分析の手順を用いてサンプルを調製した。１ｍｌのヒツジ血清および１ｍｌの１，０００ＢＨＫ細胞含有の１時間インキュベーション後に、さらなる５ｍｌのウサギ補体を伴って、または伴わずに第２の１時間インキュベーションを行った。同じマイクロタイターウェルにおいて、生存細胞（陰性反応）のパーセンテージを、フルオレセインジアセテートを用いて可視化し、一方、死んだ細胞（陽性反応）のパーセンテージを、ヨウ化プロピジウムを用いて可視化した。全ての血清標品を、１：２の階段希釈で最大１：１００，０００希釈に設定した。全てのデータをＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ（登録商標）逆相蛍光顕微鏡を用いて４８８ｎｍの波長励起でスコア化した。
【００９９】
ＢＨＫ−ＷＴまたはＢＨＫ−ＦｃΔＨ（配列番号４）を含有するＡＤＣＣアッセイにおいて、補体の存在下で細胞溶解は観察されなかった（表１）、が一方、抗ＢＨＫ感作血清（インタクトＩｇＧを含有する）は、ＢＨＫ標的細胞を効果的に溶解した。これらの結果は、高レベルのＦｃが細胞表面上で発現されたが、ＣＨ1欠失またはＣＨ1およびヒンジ欠失を有するＩｇＧ1重鎖のキメラは、マクロファージについて強力な刺激であるにもかかわらず、補体を活性化しなかった。
【０１００】
【表１】
0004456275.tif 000008
これらの結果は逆の方向で細胞表面で発現されるＦＣが、マクロファージを活性化し得、そして観察された活性化は特にＦｃレセプターを通じて媒介されることを示唆する。ＣＨ1欠失（配列番号２）またはＣＨ1ヒンジ欠失（配列番号４）を有するＩｇＧ1重鎖は、類似のレベルのマクロファージ活性化を生じた。Ｆｃをアンカーするために用いられるトランスフェリンレセプターの細胞外領域（残基８９〜９７）は、ネイティブヒンジを置換し得る。この研究において用いられたｈＴＲフラグメントは、ネイティブなＩｇＧ1ヒンジに対して、アミノ酸同一でなくとも、ほぼ等しい長さであり、そしてヒンジ領域の機能と類似の機能を効果的に提供し得る。ヒンジの別の重要な機能は、重要なシステイン残基を用いて、重鎖と軽鎖との間の分子間ジスルフィド結合を提供することである。ＴＲの二量体化に必要な少なくとも１つのシステイン（Ｃ８９）を含むｈＴＲ（１〜９７）は、ｈＴＲ−ＦｃΔＨモノマーのマルチマー会合を可能にすることによりヒンジを模倣し得る。
【０１０１】
まとめれば、新規なヒトＩｇＧ1Ｆｃキメラが構築され、そしてキメラポリペプチドが逆方向で細胞表面に首尾良く発現された。Ｆｃレセプター結合特性は分子中で保持された、ＩｇＧ1Ｆｃキメラ補体活性化能力は存在しなかった。
【０１０２】
（実施例２）
（カプセル化手順）
実施例１由来の形質転換細胞を宿主中の移植のためにカプセル化する。カプセル化細胞デバイスは代表的に以下を含む：
１）ＡＫＺＯ  Ｎｏｂｅｌ  Ｆａｓｅｒ  ＡＧにより製造された半透性ポリエステルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー膜；
２）ｈｕｂ膜セグメント；
３）光硬化メタクリレート（ＬＣＭ）樹脂リーディング末端；および
４）シリコーンテザー（ｔｅｔｈｅｒ：繋ぎ）
デバイスの形態は以下の通りである：内部表面は、選択透過性のスキンを有する。壁はオープンセル発泡構造を有する。外部表面は開口構造を有し、１．５μｍまでの孔が外部表面の３０±５％を占める。中空ファイバーは、７２０ｍｍの外部直径および１００ｍｍの壁厚を有するＰＥＳ（ＡＫＺＯ−Ｎｏｂｅｌ  Ｗｉｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造される。これらのファイバーは、米国特許第４，９７６，８５９号および４，９６８，７３３号に記載される。ＰＥＳ＃５メンブレン（約２８０キロダルトン（ｋＤＡ）のＭＷＧＯを有する）をときに用いる。ＰＥＳ＃８メンブレン（約９０ｋＤａのＭＷＧＯを有する）を他の時に用いる。半透性のＰＥＳ膜は代表的に以下の特徴を有する：
内径                                    ５００±３０μｍ
壁厚                                    １００±１５μｍ
破壊点（Ｆｏｒｃｅ  ａｔ  Ｂｒｅａｋ）  １００±１５ｃＮ
引っ張り破壊点（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｂｒｅａｋ）４４±１０％
水圧透過性                                ６３±８（ｍｌ／ｍｎ  ｍ2分Ｈｇ）
ｎＭＷＧＯ（デキストラン）              ２８０±２０ｋＤａ。
【０１０３】
このデバイスの構成要素は市販されている。ＬＣＭ接着剤は、Ａｂｌｅｓｔｉｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）；Ｌｕｘｔｒａｋ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ＬＣＭ２３およびＬＧＭ２４から購入可能である。テザー（繋ぎ）物質は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒｓ（Ｒｏｂｌｅｓ、ＧＡ）から購入可能である。このテザーの寸法は、０．７９ｍｍＯＤ×０．４３ｍｍＩＤ×長さ２０２ｍｍである。
【０１０４】
カプセル化手順は以下の通りである：ファイバー物質をまず、５ｃｍ長のセグメントに切断し、そして各セグメントの遠位端を光重合アクリル接着剤（ＬＣＭ−２５、ＩＣＩ）で密封した。エチレンオキシドでの滅菌およびガス抜き後、結合された注入ポートを通してＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび２５ゲージの注射針により、コラーゲン溶液（Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）可溶性ウシコラーゲン）中の約２×１０5のトランスフェクトされた細胞の懸濁液とともに、ファイバーセグメントをロードする。カプセルの近位端を同じアクリル接着剤で密封した。時に、コラーゲンマトリックスは、Ｚｙｐｌａｓｔ（登録商標）であった。ヒト使用のためのデバイスの容量は約１５〜１８μｌである。
【０１０５】
シリコンテザー（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ）（ＩＤ：６９０μｍ；ＯＤ：１．２５ｍｍ）を、ファイバーの近位端にわたって配置し、この装置の容易な操作および回復を可能にした。
【０１０６】
前述の記載は、例示の目的のためのみに示されるものであって、上記の特許請求の範囲によって以外に、開示される形態そのものに本発明を限定する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１つの実施形態における本発明の原理を示す。図１Ａは、ＩｇＧオプソニン作用の天然の配置を示す。図１Ｂは、Ｉ型膜貫通ドメイン（サイトゾルに面するカルボキシル末端および細胞の外側に面するアミノ末端を有する）により固着された天然に存在する細胞表面ＩｇＧを示す。図１Ｃは、ＩｇＧオプソニン作用を模倣する、ＩＩ型膜貫通ドメイン（サイトゾルに面するアミノ末端および細胞の外側に面するカルボキシル末端を有する）により固着される逆の細胞表面Ｆｃを示す。
【図２】  図２は、ＢＨＫ細胞（ＥＬＩＳＡにより決定される原形質膜結合ｈＩｇＧを有する）における逆ｈＴＲ−ＦｃΔＨ（配列番号４）の発現を示す。
【図３】  図３は、スーパーオキシド産生に対する、細胞表面ＩｇＧ  Ｆｃ（インタクトなＩｇＧまたは組換え逆Ｆｃのいずれか）の効果を示す。図３Ａは、マウスマクロファージによるスーパーオキシド産生に対する抗血清オプソニン化ＢＨＫ細胞の用量−応答効果を示す。図３Ｂは、マウスマクロファージによるスーパーオキシド産生に対するＢＨＫ−逆ＦＣクローンの効果を示す。結果は、丸括弧内に個々のクローン数を示すとともに、Ｖmax（ナノモル  Ｏ2／１０7細胞／分）として表される。
【図４】  図４は、Ｕ９３７細胞におけるＢＨＫ−ＦｃΔＨ−誘導（配列番号４）スーパーオキシド産生に対する抗ＦｃγＲＩｍＡｂＦ（ａｂ’）2の効果を示す。無地の棒は、抗−ＦｃγＲＩｍＡｂ処置を伴わないスーパーオキシドアッセイ条件を示し、そして斜線の棒は、抗−ＦｃγＲＩｍＡｂ前処置を伴うアッセイ条件を示す。
【図５】  図５は、補体活性化におけるＢＨＫ−ＦｃΔＨ誘導（配列番号４）の効果を示す。ＢＨＫ−ＷＴ、ＢＨＫ−ＦｃΔＨ誘導（配列番号４）および免疫複合体（ＩＣ）を用いるヒト血清の前処理の後、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ酵素免疫アッセイを実施した。
【配列表】
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0004456275.tif 000023
0004456275.tif 000024
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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