(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体における、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）のプロトタイプ（基準株）（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）のｃＤＮＡの塩基配列に相応する相補的両塩基配列において、４９８８〜５０２８番目及び５０８０〜５１０７番目のそれぞれから選ばれる相補的両塩基配列の、それぞれ少なくとも１種の１５〜３０塩基連続する塩基配列を選んで、これを基にした遺伝子増幅用プライマーを用いた遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物を用いて、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）を検出する、ウイルスの検出方法。
【請求項２】
遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、配列番号１、並びに、配列番号５及び／又は同６で表される塩基配列の組を構成する相補的両塩基配列である、請求項１に記載のウイルスの検出方法。
【請求項３】
ノーウォーク様ウイルス（ＧII）に対して得られる遺伝子増幅産物は、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）のプロトタイプ（基準株）（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）のｃＤＮＡの塩基配列の５０４２〜５０６７番目に相応する相補的両塩基配列の全部又は一部を含み、かつ、この相補的両塩基配列の部分を用いてノーウォーク様ウイルス（ＧII）に対する遺伝子検出を行うことにより、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）を検出する、請求項１又は２に記載のウイルスの検出方法。
【請求項４】
ノーウォーク様ウイルス（ＧII）の検出の指標となる遺伝子増幅産物は、遺伝子検出用プローブとして用いられる、請求項１〜3のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項５】
遺伝子検出用プローブは、配列番号１０、同１１、同１２、及び、同１３からなる群から選ばれる１種以上の相補的両塩基配列を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項４に記載のウイルスの検出方法。
【請求項６】
遺伝子検出用核酸プローブは、モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molrcular beacon Probe)、又は、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe) である、請求項４又は５に記載のウイルスの検出方法。
【請求項７】
ウイルスの検出方法は、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）の定量的な検出方法である、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項８】
以下に示す遺伝子増幅用プライマー及び／又は遺伝子検出用核酸プローブを含む、請求項４に記載のウイルスの検出方法を行うための、ウイルス検出用キット。
（１）遺伝子増幅用プライマー：ノーウォーク様ウイルス（ＧII）のプロトタイプ（基準株））（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）のｃＤＮＡの塩基配列に相応する相補的両塩基配列において、４９８８〜５０２８番目及び５０８０〜５１０７番目のそれぞれから選ばれる相補的両塩基配列の、それぞれ少なくとも１種の１５〜３０塩基連続する塩基配列の組、
（２）遺伝子検出用プローブ：上記の遺伝子増幅用プライマーを用いて、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）の遺伝子から得られる遺伝子増幅産物に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、検出用の標識が付加されている遺伝子検出用核酸プローブ。
【請求項９】
遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、配列番号１、並びに、配列番号５及び／又は同６で表される塩基配列の組を構成する相補的両塩基配列である、請求項８に記載のウイルスの検出用キット。
【請求項１０】
遺伝子検出用核酸プローブは、少なくとも、ノーウォーク様ウイルス（ＧII）のプロトタイプ（基準株）（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）のｃＤＮＡの塩基配列の５０４２〜５０６７番目に相応する相補的両塩基配列の全部又は一部に対して相補的な塩基配列を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項８又は９に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１１】
遺伝子検出用核酸プローブは、配列番号１０、同１１、同１２、及び、同１３からなる群から選ばれる１種以上の相補的両塩基配列を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項８〜１０のいずれかに記載のウイルス検出用キット。
【請求項１２】
遺伝子検出用核酸プローブは、モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molrcular beacon Probe)、又は、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe) である、請求項８〜１１のいずれかに記載のウイルス検出用キット。
【請求項１３】
遺伝子検出用核酸プローブは、モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molrcular beacon Probe)、又は、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe) である、請求項８〜１２のいずれかに記載のウイルス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウイルスの検出方法に関する発明である。
背景技術
食中毒というと、通常は、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌、病原性大腸菌などのバクテリア（細菌性食中毒）や、フグやキノコなどに含まれる自然毒（自然毒食中毒）が連想される。しかしながら、ウイルス、例えば、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）、ロタウイルス、アストロウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなどによる食中毒も非常に多く発生し、特に、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）は、典型的な食中毒性ウイルスであることが、最近の疫学的調査から明らかになってきた。
ＮＬＶｓは、米国で発生した集団胃腸炎患者から、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓとして、１９７２年にはじめて検出された。電子顕微鏡では、不明瞭な表面構造をもった、直径約３０ｎｍの、小型の球形ウイルスとして観察され、以降、このような形態をもったウイルス群は、総称して、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ  Ｒｏｕｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｖｉｒｕｓ：ＳＲＳＶ）と呼ばれるようになった。一方、１９７４年、英国で流行した、冬季嘔吐症の患者から、獣医学ではよく知られていた、ダビデの星と形容される特徴的な表面構造の、直径約３０ｎｍのカリシウイルスが、ヒト由来ではじめて検出された。以降、このような形態を有するウイルス群は、古典的ヒトカリシウイルスと呼ばれるようになった。
これらのウイルスは、組織培養細胞や実験動物における増殖が非常に困難で、糞便材料を用いたボランティアによる分離・培養が唯一の方法であった。このため、ウイルスの性状分析が非常に困難であったが、１９９０年、Ｘ．Ｊｉａｎｇらのグループにより、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓのゲノムがクローニングされ、以降、これらのウイルスの遺伝子解析が精力的に行われた。その結果、ＳＲＳＶも古典的ヒトカリシウイルスも、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡを有する、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｓｉｖｉｒｉｄａｅ）に属することが明らかになった。さらに、カリシウイルス科の分類が異なる４属からなるということが、第１１回国際ウイルス学会で報告された。
これに伴い、ＳＲＳＶと呼ばれていたウイルス群は、Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ＮＬＶｓ）属に、古典的ヒトカリシウイルスと呼ばれたウイルス群は、Ｓａｐｐｏｒｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ＳＬＶｓ）属に属することとなった。また、多くの臨床検体中から検出したウイルスゲノムの塩基配列の蓄積から、ＮＬＶｓは、さらに、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｏｕｔｈｅｒｐｔｏｎ  ｖｉｒｕｓなどのｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（ＧＩ）と、Ｈａｗａｉｉ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｒｕｓなどのｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（ＧＩＩ）の２つの遺伝子群に分類できることが明らかとなっている。
ＮＬＶｓの人への感染は、主に、食品（魚介類や水）を介して起こる。冬季に頻発するウイルス性食中毒のほとんどは、カキなどの貝類を摂食したことによるものと推定され、感染源としてカキからＮＬＶｓが検出されたという報告例も多数ある。また、ＮＬＶｓによって汚染されたサンドウィッチを摂食したために感染したという報告例もあり、感染者の糞便からも容易に感染すると考えられている（このウイルスは、感染力が強く、食品中数個から１００個程度のわすかなウイルスで感染することが知られている）。
食中毒が起こった場合、その原因と汚染源の特定は、非常に重要な要素であることはいうまでもない。すなわち、食中毒の原因を特定することにより、適切な治療方法を選択して、食中毒患者の一刻も早い回復を試みるべきであり、さらに、汚染源を一刻も早く特定して、食中毒の拡大を阻止するべきである。
特に、病原性微生物に起因する食中毒の原因と汚染源の特定のためには、原因となる病原性微生物を検出・特定して（食中毒の原因の特定）、食中毒患者の食事の履歴などを基に、食中毒の原因となった食品や食品製造設備をすること（食中毒の汚染源の特定）が必要である。
従来、上記のＮＬＶｓの検出は、電子顕微鏡観察により行われてきたが、この方法は、操作自体が煩雑であるばかりか、ウイルス量が少ないと、迅速・的確な検出が困難でる。特に、ＮＬＶｓは、わずかなウイルス量で感染可能であるので、汚染食品などから迅速・的確に検出する必要性が非常に大きいにもかかわらず、その実現が困難であった。また、この電子顕微鏡を用いた検出法は、電子顕微鏡という大掛かりな設備が必要であり、この方法でウイルスを検出可能な施設自体が限られていた。
ところが、近年の遺伝子解析技術の進展に伴い、より高感度で迅速な、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子解析も広く行われるようになってきた。この方法でウイルス検出を行うためには、特定の領域の遺伝子を増幅するための遺伝子増幅用プライマーや、所望する遺伝子増幅産物を、特定の遺伝子領域の存在を指標にして検出する検出用プライマーなどを設計して用いる必要がある。このようなプライマーの設計は、ＮＬＶｓなどのウイルスにおいては、特に困難な問題がある。すなわち、ウイルスにおいては、遺伝子変異が容易に起こり、このため、前回流行した食中毒の原因ウイルスと、今回流行しているウイルスが、同一の範疇のウイルスであっても、ウイルス検出に用いるべきプライマーが、前回と今回の食中毒に関して異なるものを用いなければ検出することができない可能性が大きいという問題を抱えている。無論、正確な汚染源の特定のためには、ウイルスの変異株毎に異なる検出用プライマーなどを用いる必要性も認められるが、これは、食中毒の原因ウイルスと感染源の特定が、おおむね行われた後に、確認の目的で行えば十分であり、それよりも、迅速な特定をすることが、食中毒患者への治療方針の確定と汚染の拡大防止のためには優先されるべきである。
この問題を解決するためには、検出対象のウイルスの遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域を見出し、かかる遺伝子領域に対応した検出用プライマーなどを設計して、これを用いたウイルスの検出手段を提供することが必要である。
本発明が解決すべき課題は、ＮＬＶｓの遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域を見出し、この知見を基に、ＮＬＶｓの迅速・的確な検出手段を提供することにある。
発明の開示
上記の課題の解決のために、鋭意検討を重ねた本発明者は、ついに、ＮＬＶｓのうち、ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩの遺伝子における高度保存領域（ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〜ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍）を見出し、さらに、この知見を基に、ＮＬＶｓのうち、ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩに属するウイルスの迅速・的確な検出手段を見出し、本発明を完成した。
まず、本発明を提供するにあたり、基本的な知見である、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）のｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ〔以下、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）ともいう〕の遺伝子における高度保存領域について説明する。
本発明者は、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）遺伝子の高度保存領域を見出すために、以下の試験を行った。
試験の内容
（１）糞便検体とＲＮＡ試料の調製
１９９８年から２０００年にかけて、埼玉県衛生研究所で、電子顕微鏡により、ＮＬＶｓ粒子が確認された、非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体を用いて、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の遺伝子解析を行った。
具体的には、各々の糞便検体を、滅菌蒸留水で１０％（Ｗ／Ｖ）程度に懸濁し、５分間遠心分離（３０００×ｇ）を行った。遠心上清１４０μＬより、ＲＮＡ抽出用キット（ＱＩＡ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ：ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従って、核酸を抽出し、５０μＬの滅菌蒸留水に懸濁して、ＲＮＡ試料とした。
（２）ＮＬＶｓ遺伝子の全長シークエンスの決定と遺伝子解析
上記のようにして得られたＲＮＡ試料より、ｏｒｉｇｏ  ｄＴをプライマーに用い、ｃＤＮＡを合成し、かかるｃＤＮＡから、ＬｏｎｇＲＴ−ＰＣＲを行うことによって得られた、遺伝子増幅産物の塩基配列を、ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８９  １７（１５）：６０８７−６１０２）による、ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにより決定した。ゲノム５’末端の配列の決定は、３種類のＲＡＣＥ法（ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ）により行った。
この遺伝子解析の結果、上記のＲＮＡ試料から、新たな８株（＃Ｕ１／ＡＢ０３９７７５，＃Ｕ３／ＡＢ０３９７７６，＃Ｕ４／ＡＢ０３９７７７，＃Ｕ１６６／ＡＢ０３９７７８，＃Ｕ１７／ＡＢ０３９７７９，＃Ｕ１８／ＡＢ０３９７８１，＃Ｕ２５／ＡＢ０３９７８０，＃Ｕ２０１／ＡＢ０３９７８２）の遺伝子の全塩基配列を決定し、さらに、３３株より、５３配列の部分塩基配列を決定した（＃１７，＃１９ａ，＃１９ｂ，＃１９ｃ，＃１９ｄ，＃１９ｆ，＃１９ｅ，＃８２，＃８３，＃８４ａ，＃８４ｂ，＃８９，＃１０５ａ，＃１０５ｂ，＃１０５ｃ，＃１０５ｄ，＃１０５ｅ，＃１６，＃１０１，＃１１１ａ，＃１１１ｂ，＃１８，＃２６，＃２７ａ，＃２７ｂ，＃３１，＃３２，＃３４，＃３５，＃３６，＃３７ａ，＃３７ｂ，＃３７ｃ，＃５３ａ，＃５３ｂ，＃６２，＃６３，＃６６，＃６８，＃８０ａ，＃８０ｂ，＃８０ｃ，＃８０ｄ，＃８０ｅ，＃８０ｆ，＃１０９，＃８５，＃８８，＃９，＃４９，＃９３，＃９８，＃９９）。さらに、これらの新たな変異株に加えて、プロトタイプ（基準株）（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）を含めた、既にＧｅｎｂａｎｋに登録されている、既知のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の変異株（Ｘ８６５５７／Ｌｏｒｓｄａｌｅ，Ｘ８１８７９−２／Ｍｅｌｋｓｈａｍ，Ｕ０７６１１−２／Ｈａｗａｉｉ，Ｕ０２０３０−２／Ｔｒｏｎｔｏ（ＴＶ２４），Ｌ２３８３０−２／ＯＴＨ−２５／８９／Ｊ，ＡＦ１９０８１７−２／Ａｒｇ３２０，Ｘ７６７１６−１／Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕ２２４９８−２／ＭＫ，Ｕ４６０３９  Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｕ７５６８２−１／Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ，ＡＢ０３２７５８  Ｃｈｉｔｔａ  ｖｉｒｕｓ，ＡＦ０８０５４９−１／１９９６／ＳＣ，ＡＦ０８０５５０−１／３４５−２／９６００２７３７／１９９６／，ＡＦ０８０５５１−１／００４／９５Ｍ−１４／１９９５／ＡＵ，ＡＦ０８０５５２−１／３５８／９６０１５１０７／１９９６／ＦＬ，ＡＦ０８０５５３−１／３６４／９６０１９５３７／１９９６／ＡＺ，ＡＦ０８０５５４−１／３６６／９６０１９５５４／１９９６／ＩＤ，ＡＦ０８０５５５−１／３７３／９６０１９７４３／１９９６／ＳＣ，ＡＦ０８０５５６−１／３７９／９６０１９９８４／１９９６／ＡＺ，ＡＦ０８０５５７−１／３８４／９６０２５０４６／１９９６／ＦＬ，ＡＦ０８０５５８−１／４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ，ＡＦ０８０５５９−１／４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ，ＡＦ１９５８４７−１／Ａｌｐｈａｔｒｏｎ／９８−２／１９９８／，ＡＦ１９５８４８−１／Ａｍｓｔｅｒｄａｍ／９８−１８／１９９８，ＡＪ００４８６４−１／Ｇｒｉｍｓｂｙ，ＨＣＡ２７７６０６／Ｇｉｒｌｉｎｇｔｏｎ／９３／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６０７／Ｈｉｌｌｉｎｇｄｏｎ／９０／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６０８／Ｌｅｅｄｓ／９０／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６１１／Ｂｈａｍ１３２／９５／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６１３／Ｐａｒｋｒｏｙａｌ／９５／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６１７／Ｒｂｈ／９３／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６１８／Ｗｏｒｔｌｅｙ／９０／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６１９／Ｓｙｍｇｒｅｅｎ／９５／ＵＫ，ＨＣＡ２７７６２０／Ｓｅａｃｒｏｆｔ／９０／��Ｋ，Ｕ７００５９−１／Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｓｔｒａｉｎ，ＡＢ００５２６０−１／ＳＡ１／８９／Ｊａｐａｎ，ＡＢ００５２６１−１／ＳＡ２／９１／Ｊａｐａｎ，ＡＢ０２０５４７−１／ＴＯＢ−９３−Ｊａｐａｎ，ＡＢ０２０５４９−１／ＴＯＣ１−９３−Ｊ，ＡＢ０２０５５１−１／ＴＯＣ２−９３−Ｊ，ＡＢ０２０５５２−１／ＩＺ１０−９４−Ｊ，ＡＢ０２０５６３−１／ＭＨ２２−８２−Ｊ，ＡＢ０２８２４４／ＮＬＶ３６，ＡＢ０２８２４５／ＮＬＶ２１，ＡＢ０２８２４６／ＮＬＶ１１４）を含めた塩基配列を用いて、ゲノムの多様性を調べ、最も保存性の高い遺伝子領域を検索した。
ここで、本発明において、遺伝子領域を表示する基準としては、上記のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）（ＡＦ１４５８９６／Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ）の遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ配列）を用いた。第１図は、ゲノムの多様性を調べた結果を示す図面である。第１図のｉ）のグラフにおいて、横軸は、５’末端から数えた、上記のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列の番号であり、縦軸は、保存性の度合いを示している（縦軸の数値が大きいほど、各株の塩基配列が共通して、遺伝子の保存性が高く、逆に、その数値が小さいほど、各株の塩基配列が変化に富んでおり、保存性が低いことを示している）。また、第１図のｉｉ）は、上記の塩基配列を有する遺伝子の、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）における機能を示している。
第１図に示す、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）遺伝子の解析の結果、最も、各株の遺伝子の相同性が高い領域は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍からＯＲＦ２領域のＮ末端近傍であり、最大値９０％以上の塩基配列の相同性を示した。
第２図〜第５図は、このＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〔第２Ａ図〜第２Ｃ図〕からＯＲＦ２領域のＮ末端近傍〔第４Ａ図〜第４Ｃ図、第５Ａ図〜第５Ｃ図：第３Ａ図〜第３Ｃ図は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２中間に位置する領域を示している〕のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。第２図〜第５図において、左端には、用いたＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株の名称が示してあり、その最上段がプロトタイプ（基準株）の塩基配列を示している〔本発明において基準となる塩基配列番号は、この最上段に示すプロトタイプ（基準株）の塩基配列番号である〕。各株の塩基配列の表示〔プロトタイプ（基準株）を除く〕において、「．」は、プロトタイプ（基準株）の塩基と同一の塩基であることを示し、空欄の場合には、そのプロトタイプ（基準株）の塩基に相当する塩基が存在しないことを示している。また、最下段の「＊」は、全ての株について同一の塩基であることを示し、最下欄の「．」は、株間で、何らかの塩基の相違があることを示している。
（３）結論
これらのＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の遺伝子の保存性の検討の結果により、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）において、その検出に向けて利用可能な程度の遺伝子の保存性を示す塩基配列部分は、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の４８５１〜５４５０番目に相応する部分であり、同４９１９〜５３８９番目に相応する部分は、特に高度の保存性が認められ、同４９８８〜５１０７番目に相応する部分は、極めて高度の保存性〔特に、同５０４２〜５０６７における保存性が最も高い（以下、この領域を最高保存性領域ともいう）〕が認められることが明らかとなった〔「相応する」とは、変異株を含んだＮＬＶｓ（ＧＩＩ）おいて、遺伝子解析の結果、上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列のことを意味する。具体的には、上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列の核酸に対して、ストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０ｍＭ以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な塩基配列のことを意味する。具体的には、第２図〜第５図において示される様々なＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列が例示される〕。
本発明は、かかるＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の遺伝子の保存性についての遺伝子解析の結果に基づき、高度の保存性を有する遺伝子領域（ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の４８５１〜５４５０番目に相応する部分：以下、このような遺伝子領域を、保存性領域ともいう）の核酸の塩基配列を活用して、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を、迅速・的確に検出する手段に関するものであり、具体的には、検体における、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の４８５１〜５４５０番目、好適には、４９１９〜５３８９番目（以下、高度保存性領域ともいう）、さらに好適には、４９８８〜５１０７番目に相応する相補的両塩基配列の核酸（以下、特別保存性領域ともいう）を指標として、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩＩ）を検出するウイルスの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
なお、本発明において、「相補的」とは、上記したように、ある塩基配列の核酸に対して、ストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０ｍＭ以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な程度の相補性を有する塩基配列のことを意味し、「相補的両塩基配列」とは、＋鎖に対する−鎖の関係を有する相補的塩基配列、および／または、−鎖に対する＋鎖の関係を有する相補的塩基配列の双方を含む塩基配列という意味である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。
具体的に、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の保存性領域についての知見を、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出の指標として用いるに際しては、保存性領域など（高度保存性領域、特別保存性領域、ないし、最高保存性領域を含む。以下、同様である）を、核酸増幅法を用いて増幅して、保存性領域などの遺伝子増幅産物を得ることが前提となる。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法を一例とする各種の核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。これらの核酸増幅法を用いるには、選択する核酸増幅法に基づいた遺伝子増幅用プライマーを設計・調製して用いる必要がある。このような遺伝子増幅用プライマーは、増幅を企図する遺伝子領域を、５’→３’の順方向（Ｆｏｒｗａｒｄ）と逆方向（Ｒｅｖｅｒｓｅ）に向けて遺伝子を増幅する＋−プライマーで挟み込むべく設計することが通常である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも、鋳型となる遺伝子において、相補的に結合するべき領域に正しく結合することが必要であり、特徴的な塩基配列に対してのみ相補的であるための最低限の塩基数は確保されていることが必要である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも１０塩基以上であり、好適には、１５〜３０塩基程度である。また、相補的に結合するべき領域の３’末端側から数えて５塩基分の領域に対しては、可能な限り厳密な相補性を有するように遺伝子増幅用プライマーを設計することが好適である。
また、遺伝子増幅用プライマーの基となるべき遺伝子領域は、少なくとも、遺伝子増幅産物に、保存性領域などに相応する相補的両塩基配列が含まれることが必要である。かかる観点から、遺伝子増幅用プライマーは、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の４９８８〜５０２８番目、同５０８０〜５１０７番目、同４９１９〜４９４１番目および同５３６７〜５３８９番目からなる群から選ばれる塩基配列を基準として選ばれた１０塩基以上、好適には、１５〜３０塩基連続する相補的両塩基配列であることが好ましい。
このように、本検出方法におけるＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出指標となる、保存性領域に相応する塩基配列の核酸は、かかる保存性領域から、少なくとも２種類の１０塩基以上連続する塩基配列、好適には、１５〜３０塩基連続する相補的両塩基配列を選んで、これを基にした遺伝子増幅用プライマーを用いた、前記の遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物として得られるものである。そして、得られるべき遺伝子増幅産物は、前記保存性領域のうち、高度保存性領域である、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のｃＤＮＡの塩基配列の４９４２〜５３６６番目に相応する部分を含むことが、好適である。また、この高度保存性領域から得られる遺伝子増幅産物に含まれる塩基配列を、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のｃＤＮＡの相補的両塩基配列の５０４２〜５０６７番目（最高保存性領域）とすることが最も好適である。
すなわち、この組み合わせの遺伝子増幅用プライマーを用いることにより、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）に由来する遺伝子増幅産物には、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の、少なくとも、５０４２〜５０６７番目に相応する塩基配列が含まれることとなる。そして、これらの高度保存性領域の遺伝子の塩基配列を検出可能な手段、最も典型的には、検出目的となる核酸のうち、高度保存性領域の一部またはすべてを含む相補的両塩基配列に対して相補的な検出用核酸プローブを用いて、検出目的とする遺伝子の増幅産物を、定量・検出して、その定量検出結果を指標として、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を、迅速・的確に検出することが可能となる。
また、最高保存性領域の塩基配列が含まれる遺伝子増幅産物を得るためには、遺伝子増幅用プライマーの基となる少なくとも２種類の１０塩基以上連続する相補的両塩基配列が、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の４９８８〜５０２８番目および同５０８０〜５１０７番目の組み合わせから選ばれることが好適である。
すなわち、この組み合わせの遺伝子増幅用プライマーを用いることにより、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）に由来する遺伝子増幅産物には、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５０４２〜５０６７番目に相応する塩基配列が含まれることとなる。そして、これらの最高保存性領域の遺伝子の塩基配列を検出可能な手段、最も典型的には、検出目的となる核酸のうち、最高保存性領域の一部またはすべてを含む相補的両塩基配列に対して相補的な検出用核酸プローブを用いて、検出目的とする遺伝子の増幅産物を、定量・検出して、その定量検出結果を指標として、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を、迅速・的確に検出することが可能となる。
上述した全ての遺伝子増幅用プライマーは、後述する本検出用キットの構成要素として用いることができる遺伝子増幅用プライマーとして用いることができる。
なお、本検出方法を適用すべき検体は、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出すべき全てのものが対象となる。例えば、食中毒患者において、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出すべき場合には、典型的には、食中毒患者の糞便、場合によっては、嘔吐物、血液等を検体として用いることが可能である。また、食品や食品生産設備においてＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出すべき場合には、対象となる食品そのものや、食品生産設備における付着物、食品生産者の衣服等を検体とすることが可能である。さらに、各種の汚水や排水、海水、河川水、湖水等の水系の水を検体として用いることも可能である。これらの検体からの遺伝子の入手方法は、用いる検体の種類に応じて適切な方法を選択することが可能であるが、概ね用いる検体を水等に浸漬または懸濁して、これらの水から得られる上清画分から、酸フェノール法（ＡＧＰＣ法：Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）などの常法により、ウイルスＲＮＡを抽出することにより行うことができる。かかるウイルスＲＮＡに対して、選択する遺伝子増幅法による処理、例えば、逆転写酵素を用いたウイルスＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの調製などを行い、この核酸試料を、上記の遺伝子増幅用プライマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、所望する遺伝子増幅産物を得ることができる（所望する遺伝子増幅産物の確認は、一般的には、電気泳動により、目的となる大きさの遺伝子増幅産物が認められるか否かにより行われる）。
遺伝子増幅産物の特定の塩基配列を、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の存在の指標として検出する手段としては、常法、典型的には、遺伝子増幅産物の上述したウイルス検出の指標となるべき相補的両塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む検出用核酸プローブ（例えば、蛍光標識や放射性同位体標識を施した核酸）を利用して、遺伝子増幅産物中の検出すべき塩基配列の存在を、ハイブリダイゼーションなどにより、ネガティブまたはポジティブに確認する方法などを用いることができる。一般的に、これらの検出手段は、得られた遺伝子増幅産物に対して、遺伝子増幅操作終了後に行うものであるが、このような方法であると、遺伝子増幅反応後に、チューブを開けて、分析サンプルを取り出さなければならないため、実験設備や試薬を、遺伝子増幅産物で汚染させてしまう機会を増やす上、余分な時間と労力が必要であり、さらに、汚染された遺伝子増幅産物は、その後の実験テンプレートとなって、偽陽性となる機会を与える可能性もあり、実際の検出現場においては、重大な問題となっている。そこで、汚染などの危険を回避し、さらに、検出操作に費やす時間を可能な限り短縮するために、遺伝子増幅操作の過程において、遺伝子増幅産物中の特定の塩基配列の存在をモニタリングすることが可能な手段を用いることが好適である。このような方法の代表的なものとして、例えば、▲１▼モレキュラー  ビーコン  プローブ（Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法、および、▲２▼タック−マン  プローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法を挙げることができる。
▲１▼モレキュラー  ビーコン  プローブ（Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中または増幅過程終了後に、蛍光でモニターするために使用できる、ヘアピン型のハイブリダイゼーションプローブ（モレキュラー  ビーコン  プローブ）を用いる、遺伝子の検出方法である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８  １６：４９−５３）。モレキュラー  ビーコン  プローブを構成する核酸の末端は、互いに相補的になっており、通常は、これらの末端同士が結合して、いわゆるステム構造を形成し、かかるステム構造におけるループ部分は、遺伝子増幅産物の目的とする領域（保存性領域など）に対して相補的となるように設計されている。さらに、蛍光体と非蛍光の消光剤が、核酸の両端にそれぞれ結合しており、溶液中で遊離しているときは、ヘアピン構造を形成するため、蛍光剤と消光剤はお互いに作用して蛍光は消えている。しかし、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物が存在する場合には、ループ部分が、その相補的な塩基配列に結合し、その結果、プローブ全体の構造が変化して、蛍光体と消光剤が離れて、消光剤の蛍光体に対する消光効果が解消するために、蛍光体が本来の蛍光を発するようになる。この消光効果の解消による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列（保存性領域など）の存在を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出することができる。
なお、モレキュラー  ビーコン  プローブにおける、上述した蛍光標識と消光剤の標識は、通常、核酸の５’末端に、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）や６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７，２’，７’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＥＴ）などのフルオレセイン系蛍光色素や、５−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＡＲＡ）などのローダミン系蛍光色素を標識し、さらに、同３’末端に、４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）などの消光剤を標識することにより行うことができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４：３０３−３０８など）。
▲２▼タック−マン  プローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中に、蛍光でモニターするために使用できる、ハイブリダイゼーションプローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いる、遺伝子の検出方法である〔実験医学Ｖｏｌ．１５  Ｎｏ．７（増刊）ｐ４６〜５１，１９９７など〕。タック−マン  プローブは、５’末端には、フルオレセイン系の蛍光色素（レポーター色素）が、３’末端には、ローダミン系の蛍光色素（クエンチャー色素）が、それぞれ標識された核酸である。レポーター色素とクエンチャー色素が、核酸を介して結合している状態では、ホエルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギーにより、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素により抑制されている。これに対して、プライマーおよびタック−マン  プローブが、遺伝子増幅産物のタック−マン  プローブの核酸に相補的な核酸をアニーリングして、伸長反応が進むと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性により、タック−マン  プローブの５’末端から加水分解が起こり、５’末端のレポーター色素が、３’末端のクエンチャー色素から離脱すると、抑制されていたレポーター色素の蛍光強度が増加する。レポーター色素による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列（保存性領域など）の存在を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出することができる。
なお、タック−マン  プローブにおける、上述した蛍光標識は、通常、核酸の５’末端に、６−ＦＡＭやＴＥＴなどのフルオレセイン系の蛍光色素を、同３’末端に、ＴＡＭＡＲＡなどのローダミン系の色素を、常法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３  ２１（１６）：３７６１−３７６６など）に従って行うことができる。
上述した全ての検出用核酸プローブは、後述する本検出用キットの構成要素として用いることができる検出用核酸プローブとして用いることができる。
本検出方法におけるＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出は、目的とする塩基配列を有する遺伝子増幅産物などの検出は、上述した手段により、目的とする核酸を定量して検出することも可能であり、定量を伴わなわずに、例えば、陽性若しくは陰性という定性情報として検出することも可能である。この遺伝子増幅産物などの検出情報（定量値や定性情報）を指標に、これと検体中のＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の存在・非存在、さらには存在量と関連付けることによって、所望するＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出を行うことができる。
本発明においては、本検出方法を用いるための、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出用キット（以下、本検出用キットともいう）も提供される。
本検出用キットには、通常、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の保存性領域などを、ＲＴ−ＰＣＲ法などにより増幅するために用いる、増幅用プライマー、および／または、遺伝子増幅産物における保存性領域などを検出するためのプローブが含まれるが、これらの双方が含まれることが好適である。
遺伝子増幅用プライマーは、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）遺伝子において、保存性領域などを、ＲＴ−ＰＣＲ法などの遺伝子増幅手段により、遺伝子増幅産物として、産生することが可能な核酸である。また、検出用核酸プローブは、保存性領域などに対応する配列に対して相補的な塩基配列の核酸を含む検出用核酸プローブである。検出用核酸プローブは、上記のごとく、相補的な塩基配列に、蛍光標識や放射性標識を施した基本的な態様の核酸プローブを用いることができるが、殊に、遺伝子増幅過程においてＮＬＶｓ（ＧＩＩ）を検出する場合には、相補的な塩基配列の核酸を、上述のモレキュラー  ビーコン  プローブ、または、タック−マン  プローブを検出用核酸プローブにおいて組み入れたものを用いることが好適である。
本検出用キットに含めることができる、遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子検出用核酸プローブについては、本検出方法の欄において述べた通りで、さらに、実施例においても具体例を示している。
実施例
以下、本発明の実施例を説明する。ただし、本実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔プライマーおよびプローブの調製〕
本実施例におけるＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の検出は、以下の遺伝子増幅用核酸プライマーおよび遺伝子検出用核酸プローブを用いて行った。下記の核酸は、ＡＢＩ３９４８全自動核酸合成精製システム（アプライドバイオシステム社）を用いて化学合成した。
遺伝子増幅用プライマー
〔Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｐｒｉｍｅｒ（ｍｉｘまたは単独）〕
＊特別保存性領域を増幅するために使用
Ｇ２ＦＡ：５’ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ  ３’（配列番号１：プロトタイプの５００３〜５０２８番に相応）
＊高度保存性領域を増幅するために使用
Ｇ２ＦＢ１：５’ＧＧＨＣＣＭＢＭＤＴＴＹＴＡＣＡＧＣＡＡ  ３’（配列番号２：プロトタイプの４９２２〜４９４１番に相応）
Ｇ２ＦＢ２：５’ＧＧＨＣＣＭＢＭＤＴＴＹＴＡＣＡＡＧＡＡ  ３’（配列番号３：プロトタイプの４９２２〜４９４１番に相応）
Ｇ２ＦＢ３：５’ＧＧＨＣＣＭＢＭＤＴＴＹＴＡＣＡＲＮＡＡ  ３’（配列番号４：プロトタイプの４９２２〜４９４１番に相応）
〔Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｒｉｍｅｒ（ｍｉｘまたは単独）〕
＊特別保存性領域を増幅するために使用
Ｇ２ＲＡ１：５’ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ  ３’（配列番号５：プロトタイプの５０８０〜５１００番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＲＡ２：５’ＴＣＡＹＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ  ３’（配列番号６：プロトタイプの５０８５〜５１０４番の相補鎖に相応）
＊高度保存性領域を増幅するために使用
Ｇ２ＲＢ１：５’ＣＣＡＣＣＷＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＲＴＡＣＡＴ  ３’（配列番号７：プロトタイプの５３６７〜５３８９番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＲＢ２：５’ＣＣＡＣＣＷＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＴＲＴＡＣＡＴ  ３’（配列番号８：プロトタイプの５３６７〜５３８９番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＲＢ３：５’ＣＣＲＣＣＮＧＣＡＴＲＨＣＣＲＴＴＲＴＡＣＡＴ  ３’（配列番号９：プロトタイプの５３６７〜５３８９番の相補鎖に相応）
遺伝子検出用核酸プローブ
〔タック−マンプローブ〕
Ｇ２ＴＭ１：５’ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴ  ３’（配列番号１０：プロトタイプの５０４８〜５０６７番に相応）
Ｇ２ＴＭ２：５’ＡＧＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡ  ３’（配列番号１１：プロトタイプの５０４８〜５０６７番の相補鎖に相応）
本例で用いたタック−マンプローブは、いずれも、５’末端にＴＥＴを標識し、３’末端にＴＡＭＡＲＡを標識した（標識方法は、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３  ２１（１６）：３７６１−３７６６」記載の方法に従った）。
〔モレキュラー  ビーコン  プローブ：小文字はステム部分〕
Ｇ２ＭＢ１：５’ｃｃｇｔｃｇＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴｃｇａｃｇｇ  ３’（配列番号１０：大文字部分：プロトタイプの５０４８〜５０６７番に相応）
Ｇ２ＭＢ２：５’ｃｇｔｇｃｔＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡｇｃａｃｇ３’（配列番号１２：大文字部分：プロトタイプの５０４９〜５０６４番に相応）
Ｇ２ＭＢ３：５’ｃｃｇｔｃｇＡＧＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡｃｇａｃｇｇ  ３’（配列番号１１：大文字部分：プロトタイプの５０４８〜５０６７番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＭＢ４：５’ｃｃｇｔｃｇＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡｃｇａｃｇｇ  ３’（配列番号１２：大文字部分：プロトタイプの５０５０〜５０６７番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＭＢ５：５’ｃｃｇｔｇｇＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣｃｃａｃｇｇ  ３’（配列番号１３：大文字部分：プロトタイプの５０４８〜５０６６番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＭＢ６：５’ｃｇｔｇｇａＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣｔｃｃａｃｇ  ３’（配列番号１３：大文字部分：プロトタイプの５０４８〜５０６６番の相補鎖に相応）
Ｇ２ＭＢ７：５’ｃｃｔｇｃＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡｇｃａｇｇ  ３’（配列番号１２：大文字部分：プロトタイプの５０４８〜５０６７番の相補鎖に相応）
本例で用いたモレキュラー  ビーコン  プローブは、いずれも、５’末端にＴＥＴを標識し、３’末端にＤＡＢＣＹＬを標識した（標識方法は、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４：３０３−３０８」記載の方法に従った）。
〔ウイルスの検出〕
（１）前述したＮＬＶｓ（ＧＩＩ）遺伝子の高度保存領域の検討試験において用いた、１９９８年から２０００年にかけて、埼玉県衛生研究所で、電子顕微鏡により、ＮＬＶｓ粒子が確認された、非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体から抽出したＲＮＡ試料について、本検出方法を行った。
まず、各ＲＮＡ試料について、逆転写反応を行った。具体的には、各ＲＮＡ試料（８μＬ）と、逆転写反応用液１２μＬ〔１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  溶液１μＬ，７５ｐｍｏｌのｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ，３０ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ），２００ｕｎｉｔｓのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ（−）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＵＳＡ），１００ｍＭＤＴＴ１μＬおよび５倍逆転写バッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で、全量が１２μＬとなるように、滅菌蒸留水で希釈したもの〕を混合し、４２℃で、１時間以上反応させた後、酵素失活反応を、７０℃で１５分間行うことにより、各ＲＮＡ試料に対するｃＤＮＡ（ＲＴ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を調製した。次いで、ＰＣＲ反応は、Ｇ２ＦＡ、Ｇ２ＲＡ１およびＧ２ＲＡ２（遺伝子増幅用プライマー名）を混合した核酸を、遺伝子増幅用プライマーセットとして、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ，ＵＳＡ）を用い、反応液（Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬ，ＲＴｐｒｏｄｕｃｔｓ５μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ５００ｎＭ  ｅａｃｈ，蛍光プローブ（タック−マンプローブＧ２ＴＭ１）５〜２０ｐｍｏｌ，全量５０μＬになるように滅菌蒸留水で調整）を調製し、ＡＢＩ７７００（ＡＢＩ，ＵＳＡ）で、ＰＣＲ反応時〔サイクルは、５０℃・２分間→９５℃・１０分間→（９５℃ｓｅｃ→５６℃・３分間）×５０サイクル〕の蛍光強度を経時的に測定した。
ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２０７〜５６９６番に相当する、ＳｚｕＧＩＩ株のｃＤＮＡを、常法により、ｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）にクローニングしたものを、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）特異的なポジティブコントロールとして検討した。その結果、上記の検出によって、プライマー／プローブセットＡ，Ｂ共に、１０１〜１０７コピーのＮＬＶｓ（ＧＩＩ）遺伝子を検出することが可能であり（検出限界：１０１コピー／１反応）、かつ、Ｃｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を参照することで、定量的に検出可能であることが明らかとなった。
また、先述の非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体のうち、２８例（６３．６％）で、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）が検出された。残りの１６例（３６．４％）は、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）ネガティブであったが、この１６例全てにおいて、別法により、ＮＬＶｓ（ＧＩ）が検出された。この２つのタイプのＮＬＶｓの検出結果を合わせると、ＮＬＶｓの検出率は１００％であった。
また、上記と同様の系において、遺伝子増幅用プライマーを以下の組み合わせ（Ｇ２ＦＢ１、Ｇ２ＦＢ２、Ｇ２ＦＢ３、Ｇ２ＲＡ１およびＧ２ＲＡ２の混合）あるいは（Ｇ２ＦＡ、Ｇ２ＲＢ１、Ｇ２ＲＢ２およびＧ２ＲＢ３の混合）で行った場合も、同様の結果が得られた。
また、遺伝子検出用プローブも、タック−マンプローブＧ２ＴＭ１のかわりに、同Ｇ２ＴＭ２、あるいは、モレキュラービーコンプローブＧ２ＭＢ１〜７を用いた場合も、同様の結果が得られた。
（２）上記の糞便検体に代えて、本検出方法を、実際に食品において用いることが可能であることを示すために、生カキを検体として、これに対して、本検出方法を用いた。
生カキ４０個体において、個体毎に摘出した中腸腺に滅菌蒸留水を添加した後に、３回の融解凍結操作を行って、組織を破砕し、これに対して２０分間の遠心分離（１００００×ｇ）を行った。これにより得られた遠心上清１４０μＬより、ＱＩＡ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を、プロトコールに従い用いて核酸を抽出し、これを５０μＬの滅菌蒸留水に懸濁して、これを生カキのＲＮＡ試料とし、上記（１）の手順に準じて、遺伝子検出用プローブとして、モレキュラービーコンプローブＧ２ＭＢ１を用いて、本検出方法を行った。
その結果、２個体の生カキから、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）が検出された。
（１）（２）の結果から、本検出方法により、ＮＬＶＳ（ＧＩＩ）を、迅速・的確に検出可能であることが明らかになった。また、上述したように、遺伝子検出用プライマーに、ＮＬＶＳ（ＧＩＩ）特異的な遺伝子検出用核酸プローブを用いて、遺伝子増幅工程をモニターすることにより、定量的な検出をすることが可能であり、極めて高感度で効率的なウイルス検出手段を提供し得ることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域が見出され、さらに、この知見を基に、ＮＬＶｓの迅速・的確な検出手段が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）ゲノムの多様性を調べた結果を示す図面である。
第２Ａ図〜第２Ｃ図は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。
第３Ａ図〜第３Ｃ図は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〜ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。
第４Ａ図〜第４Ｃ図は、ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面の一方である。
第５Ａ図〜第５Ｃ図は、ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面の他方である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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