(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0004412173.tif 000008
［式中、Ｒ1及びＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を意味し、Ｒ2は水素原子を意味し、Ｒ4及びＲaはそれぞれ独立に、水素原子又はＣ1-6アルコキシ基を意味する。］で表されるトロンボポエチンレセプター活性化剤。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ3がそれぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｒ4及びＲａがそれぞれ独立に、水素原子又はメトキシ基である請求項１記載のトロンボポエチンレセプター活性化剤。
【請求項３】
請求項１記載のトロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するトロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬。
【請求項４】
請求項１記載のトロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する血小板増多剤。
【請求項５】
請求項２記載のトロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する血小板増多剤。
【請求項６】
バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）を培養し、その培養液から式（２）
【化２】
0004412173.tif 000009
（式中、Ｒ5及びＲ7はそれぞれ独立に、水素原子、又はメチル基を意味し、Ｒ6は水素原子を意味し、Ｒ8及びＲbはそれぞれ独立に、水素原子又はメトキシ基を意味する。）で表される化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造法。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９４０として寄託されている微生物バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）Ｎｏ．１１４２株。
【請求項８】
式（３）
【化３】
0004412173.tif 000010
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンボポエチンレセプターに親和性及びアゴニスト作用を有することによりトロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬に関するものである。具体的には、例えば、造血幹細胞、巨核球前駆細胞、巨核球細胞の分化増殖を促進し、血小板増多作用を示しうる化合物あるいは血管内皮および内皮前駆細胞の分化増殖を促進し血管新生療法に用いたり、抗動脈硬化作用を示しうる化合物を構成成分とする医薬組成物ならびにそれらの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トロンボポエチンは332個のアミノ酸からなるサイトカインであり、レセプターを介して造血幹細胞、巨核球前駆細胞、巨核球細胞の分化、増殖を刺激することにより血小板産生を亢進することから血液疾患の病態に対する薬剤として期待されている。また最近では、血管内皮および内皮前駆細胞の分化増殖を促進することが報告され（Microvasc. Res., 1999 :58, 108-113、Circ. Res., 1999:84, 785-796、Blood 2001:98,71a）、血管新生療法や抗動脈硬化，心血管イベント抑制などが期待されている。現在までにトロンボポエチンレセプターを介して血小板産生を調節する生理活性物質としては、トロンボポエチンそのもののほか、特開平１０−７２４９２号公報（WO96/40750）、WO96/40189、WO98/25965等に記載のトロンボポエチンレセプターに親和性を有する低分子ペプチドが知られている。又、ペプチド誘導体ではない低分子化合物でトロンボポエチンレセプターを介して血小板産生を促進する化合物の探索も試みられており、トロンボポエチンレセプターに親和性のある低分子化合物の報告が数件なされている。
【０００３】
１）北陸製薬より出願されている１，４−ベンゾチアゼピン誘導体（特開平１１−１４７７号公報、特開平１１−１５２２７６号公報）
２）塩野義製薬より出願されている特許の国際公開公報（国際公開第01/07423号パンフレット、国際公開第01/53267号パンフレット、国際公開第02/059099号パンフレット、国際公開第02/059100号パンフレット）
３）スミスクライン  ビーチャム（Smithkline Beecham Corp）より出願されている特許の国際公開公報（国際公開第00/35446号パンフレット、国際公開第00/66112号パンフレット、国際公開第01/34585号パンフレット、国際公開第01/17349号パンフレット、国際公開第01/39773号パンフレット、国際公開第01/21180号パンフレット、国際公開第01/89457号パンフレット、国際公開第02/49413号パンフレット、国際公開第02/085343号パンフレット）
４）鳥居薬品より出願されている国内公報（特開2001-97948号公報）
５）Roche Diagnostics GMBH より出願されている国際公開公報（国際公開第99/11262号パンフレット）
６）山之内製薬より出願されている国際公開公報（国際公開第02/06275号パンフレット）
【０００４】
一方、キサントシリン類縁体は広く抗菌作用を有することが知られており、又それ以外にも、抗ウイルス作用、アロマターゼ阻害作用（特開平０７−６９８８３号公報）、抗腫瘍剤（特開平０２−３０４０５８号公報及び特開平０４−１８２４２７号公報）、駆虫剤（特開平０２−４０３２４号公報）、プロスタグランジン合成阻害作用、血小板凝集抑制作用等があることが報告されている。しかし、トロンボポエチンレセプター親和性及びアゴニスト活性については何ら報告されていなかった。
【０００５】
トロンボポエチンやトロンボポエチンレセプターに親和性を有する低分子ペプチドは、消化管で容易に分解されてしまう可能性が高く、通常、経口投与は困難であり、トロンボポエチンそのものには抗トロンボポエチン抗体の出現が報告されている。
又、ペプチド誘導体ではない低分子化合物は、経口投与が可能である可能性が高いものの、未だ実用可能な薬剤が上市されるに至ってはいない。
そのため、優れたトロンボポエチンレセプター親和性及びアゴニスト活性を有し、トロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬となり、且つ経口投与も可能な低分子化合物が望まれていた。具体的には、例えば、造血幹細胞、巨核球前駆細胞、巨核球細胞の分化増殖を促進し、血小板増多剤、あるいは他の血球系細胞増多剤となりうる低分子化合物、あるいは血管内皮および内皮前駆細胞の分化増殖を促進し血管新生療法に用いたり、動脈硬化を予防・治療する薬剤となりうる低分子化合物が望まれていた。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らはトロンボポエチンレセプター親和性及びアゴニスト活性を有する低分子化合物を見出すべく、鋭意検討したところ、意外にも従来公知であるキサントシリンおよびその類縁体及びそれらの誘導体がトロンボポエチンレセプターに親和性及びアゴニスト作用を有することを見出し、又、キサントシリン類縁体の新規な製造方法も見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は式（１）
【０００８】
【化１】
0004412173.tif 000002
［式中、Ｒ1及びＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又はＣ1-6アルキル基を意味し、Ｒ2は水素原子を意味し、Ｒ4及びＲa はそれぞれ独立に、水素原子又はＣ1-6アルコキシ基を意味する。］で表されるトロンボポエチンレセプター活性化剤に関するものであり、又、該トロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するトロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬に関するものであり、又、該トロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する血小板増多剤に関するものであり、又、バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）を培養し、その培養液から式（２）
【０００９】
【化２】
0004412173.tif 000003
（式中、Ｒ5及びＲ7はそれぞれ独立に、水素原子、又はメチル基を意味し、Ｒ6は水素原子を意味し、Ｒ8及びＲb はそれぞれ独立に、水素原子又はメトキシ基を意味する。）で表される化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造法に関するものであり、又、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９４０として寄託されている微生物バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）Ｎｏ．１１４２株に関するものであり、又、式（３）
【００１０】
【化３】
0004412173.tif 000004
で表される化合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本発明化合物(キサントシリンＸモノメチルエーテル）によるUT7/EPO-ｍｐｌ細胞の増殖に対する効果を、MTT法を用いて評価した図である。
【図２】図２は本発明化合物(キサントシリンＸモノメチルエーテル）によるUT7/EPO細胞の増殖に対する効果を、MTT法を用いて評価した図である。
【図３】図３は本発明化合物 (３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル)によるUT7/EPO-ｍｐｌ細胞の増殖に対する効果を、WST法を用いて評価した図である。
【図４】図４は本発明化合物 (３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル)によるUT7/EPO細胞の増殖に対する効果を、WST法を用いて評価した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
尚、本発明中、「n」はノルマルを、「i」はイソを、「s」はセカンダリーを、「t」はターシャリーを、「c」はシクロを、「o」はオルトを、「m」はメタを、「p」はパラを意味する。
【００１３】
まず、置換基Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3、Ｒ4及びＲaの各置換基における語句について説明する。
Ｃ１−６アルキル基としては、直鎖、分枝又は環状のもの（Ｃ３−６シクロアルキル基）を含んでいてもよく、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、c-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、c-ブチル、1-メチル-c-プロピル、2-メチル-c-プロピル、n-ペンチル、1-メチル-n-ブチル、2-メチル-n-ブチル、3-メチル-n-ブチル、1,1-ジメチル-n-プロピル、1,2-ジメチル-n-プロピル、2,2-ジメチル-n-プロピル、1-エチル-n-プロピル、c-ペンチル、1-メチル-c-ブチル、2-メチル-c-ブチル、3-メチル-c-ブチル、1,2-ジメチル-c-プロピル、2,3-ジメチル-c-プロピル、1-エチル-c-プロピル、2-エチル-c-プロピル、n-ヘキシル、1-メチル-n-ペンチル、2-メチル-n-ペンチル、3-メチル-n-ペンチル、4-メチル-n-ペンチル、1,1-ジメチル-n-ブチル、1,2-ジメチル-n-ブチル、1,3-ジメチル-n-ブチル、2,2-ジメチル-n-ブチル、2,3-ジメチル-n-ブチル、3,3-ジメチル-n-ブチル、1-エチル-n-ブチル、2-エチル-n-ブチル、1,1,2-トリメチル-n-プロピル、1,2,2-トリメチル-n-プロピル、1-エチル-1-メチル-n-プロピル、1-エチル-2-メチル-n-プロピル、c-ヘキシル、1-メチル-c-ペンチル、2-メチル-c-ペンチル、3-メチル-c-ペンチル、1-エチル-c-ブチル、2-エチル-c-ブチル、3-エチル-c-ブチル、1,2-ジメチル-c-ブチル、1,3-ジメチル-c-ブチル、2,2-ジメチル-c-ブチル、2,3-ジメチル-c-ブチル、2,4-ジメチル-c-ブチル、3,3-ジメチル-c-ブチル、1-n-プロピル-c-プロピル、2-n-プロピル-c-プロピル、1-i-プロピル-c-プロピル、2-i-プロピル-c-プロピル、1,2,2-トリメチル-c-プロピル、1,2,3-トリメチル-c-プロピル、2,2,3-トリメチル-c-プロピル、1-エチル-2-メチル-c-プロピル、2-エチル-1-メチル-c-プロピル、2-エチル-2-メチル-c-プロピル及び2-エチル-3-メチル-c-プロピル等が挙げられる。
【００１４】
Ｃ１−６アルコキシ基としては、直鎖、分枝又は環状のもの（Ｃ３−６シクロアルコキシ基）を含んでいてもよく、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、i-プロポキシ、c-プロポキシ、n-ブトキシ、i-ブトキシ、s-ブトキシ、t-ブトキシ、c-ブトキシ、1-メチル-c-プロポキシ、2-メチル-c-プロポキシ、n-ペンチルオキシ、1-メチル-n-ブトキシ、2-メチル-n-ブトキシ、3-メチル-n-ブトキシ、1,1-ジメチル-n-プロポキシ、1,2-ジメチル-n-プロポキシ、2,2-ジメチル-n-プロポキシ、1-エチル-n-プロポキシ、c-ペンチルオキシ、1-メチル-c-ブトキシ、2-メチル-c-ブトキシ、3-メチル-c-ブトキシ、1,2-ジメチル-c-プロポキシ、2,3-ジメチル-c-プロポキシ、1-エチル-c-プロポキシ、2-エチル-c-プロポキシ、n-ヘキシルオキシ、1-メチル-n-ペンチルオキシ、2-メチル-n-ペンチルオキシ、3-メチル-n-ペンチルオキシ、4-メチル-n-ペンチルオキシ、1,1-ジメチル-n-ブトキシ、1,2-ジメチル-n-ブトキシ、1,3-ジメチル-n-ブトキシ、2,2-ジメチル-n-ブトキシ、2,3-ジメチル-n-ブトキシ、3,3-ジメチル-n-ブトキシ、1-エチル-n-ブトキシ、2-エチル-n-ブトキシ、1,1,2-トリメチル-n-プロポキシ、1,2,2-トリメチル-n-プロポキシ、1-エチル-1-メチル-n-プロポキシ、1-エチル-2-メチル-n-プロポキシ、c-ヘキシルオキシ、1-メチル-c-ペンチルオキシ、2-メチル-c-ペンチルオキシ、3-メチル-c-ペンチルオキシ、1-エチル-c-ブトキシ、2-エチル-c-ブトキシ、3-エチル-c-ブトキシ、1,2-ジメチル-c-ブトキシ、1,3-ジメチル-c-ブトキシ、2,2-ジメチル-c-ブトキシ、2,3-ジメチル-c-ブトキシ、2,4-ジメチル-c-ブトキシ、3,3-ジメチル-c-ブトキシ、1-n-プロピル-c-プロポキシ、2-n-プロピル-c-プロポキシ、1-i-プロピル-c-プロポキシ、2-i-プロピル-c-プロポキシ、1,2,2-トリメチル-c-プロポキシ、1,2,3-トリメチル-c-プロポキシ、2,2,3-トリメチル-c-プロポキシ、1-エチル-2-メチル-c-プロポキシ、2-エチル-1-メチル-c-プロポキシ、2-エチル-2-メチル-c-プロポキシ及び2-エチル-3-メチル-c-プロポキシ等が挙げられる。
【００１５】
置換基Ｒ1及びＲ3の好ましい具体例としては、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基及びn-ヘキシル基等が挙げられる。
置換基Ｒ4及びＲaの好ましい具体例としては、それぞれ独立に、水素原子及びメトキシ基等が挙げられる。
【００１６】
本発明の、好ましい式（１）で表されるトロンボポエチンレセプター活性化剤、トロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬に用いる好ましい化合物及び血小板増多剤に用いる好ましい化合物としては、以下に示すものが挙げられる。
１）Ｒ1及びＲ3がそれぞれ独立に、水素原子又はメチル基であり、Ｒ4及びＲaがそれぞれ独立に、水素原子又はメトキシ基である式（１）で表される化合物。
２）Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲaが以下に示す組み合わせである化合物
Ｒ1＝ＣＨ３、Ｒ2＝Ｈ、     Ｒ3＝ＣＨ３、Ｒ4＝ＯＣＨ３、Ｒa＝Ｈ
Ｒ1＝Ｈ、   Ｒ2＝Ｈ、     Ｒ3＝Ｈ、   Ｒ4＝Ｈ、     Ｒa＝Ｈ
Ｒ1＝ＣＨ３、Ｒ2＝Ｈ、     Ｒ3＝ＣＨ３、Ｒ4＝Ｈ、     Ｒa＝Ｈ
Ｒ1＝Ｈ、   Ｒ2＝Ｈ、     Ｒ3＝ＣＨ３、Ｒ4＝Ｈ、     Ｒa＝Ｈ
Ｒ1＝ＣＨ３、Ｒ2＝Ｈ、     Ｒ3＝ＣＨ３、Ｒ4＝ＯＣＨ３、Ｒa＝ＯＣＨ３
３）Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲbが以下に示す組み合わせである化合物。
Ｒ5＝ＣＨ３、Ｒ6＝Ｈ、     Ｒ7＝ＣＨ３、Ｒ8＝ＯＣＨ３、Ｒb＝Ｈ
Ｒ5＝Ｈ、   Ｒ6＝Ｈ、     Ｒ7＝Ｈ、   Ｒ8＝Ｈ、     Ｒb＝Ｈ
Ｒ5＝ＣＨ３、Ｒ6＝Ｈ、     Ｒ7＝ＣＨ３、Ｒ8＝Ｈ、     Ｒb＝Ｈ
Ｒ5＝Ｈ、   Ｒ6＝Ｈ、     Ｒ7＝ＣＨ３、Ｒ8＝Ｈ、     Ｒb＝Ｈ
Ｒ5＝ＣＨ３、Ｒ6＝Ｈ、     Ｒ7＝ＣＨ３、Ｒ8＝ＯＣＨ３、Ｒb＝ＯＣＨ３
【００１７】
本発明の式（１）で示される化合物またはその製薬上許容される塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物およびそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。またアセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。
【００１８】
本発明の式（１）で示される化合物は、必要に応じて製薬上許容される塩に変換することも、または生成した塩から遊離させることもできる。本発明の製薬上許容される塩としては、例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウムなど）、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸との塩などが挙げられる。また無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸など）及び有機酸（酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）との塩も可能である。
【００１９】
本発明のトロンボポエチンレセプター活性化剤若しくは製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬は、通常錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤などの経口投与剤、直腸投与剤、経皮吸収剤あるいは注射剤として投与できる。本剤は１個の治療剤として、あるいはほかの治療剤との混合物として投与できる。それらは単体で投与してもよいが、一般的には医薬組成物の形態で投与する。それらの製剤は、薬理的、製剤学的に許容しうる添加物を加え、常法により製造することができる。すなわち、経口剤には通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、可塑剤、コーティング剤などの添加物を使用することができる。経口用液剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシルなどの形態であってもよく、あるいは使用前に水またはほかの適当な溶媒で調製するドライシロップとして供されてもよい。前記の液剤は、懸濁化剤、香料、希釈剤あるいは乳化剤のような通常の添加剤を含むことができる。直腸内投与する場合は座剤として投与することができる。坐剤はカカオ脂、ラウリン脂、マクロゴール、グリセロゼラチン、ウィテップゾール、ステアリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物など、適当な物質を基剤として、必要に応じて乳化剤、懸濁化剤、保存剤などを加えることができる。注射剤は、水性あるいは用時溶解型剤形を構成しうる注射用蒸留水、生理食塩水、５％ブドウ糖溶液、プロピレングリコールなどの溶解剤ないし溶解補助剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、安定化剤などの製剤成分が使用される。
【００２０】
本発明の薬剤をヒトに投与する場合は、その投与量を患者の年齢、状態により決定するが通常成人の場合、経口剤あるいは直腸内投与では０．１〜１０００ｍｇ/ヒト/日程度、注射剤で０．０５ｍｇ〜５００ｍｇ/ヒト/日程度である。これらの数値はあくまでも例示であり、投与量は患者の症状にあわせて投与されるものである。
【００２１】
本発明を使用する場面としては、トロンボポエチンレセプター親和性及びアゴニスト活性を有する化合物を使用することにより病態の改善が期待できる場面が挙げられる。具体的には、血小板数の異常を伴う血液疾患があげられる。より詳細には巨核球による造血過程の異常に起因するヒトを含む哺乳類の疾患、とりわけ血小板減少を伴う疾患の治療や予防に有用である。このような疾患としてはたとえば、癌化学療法及びまたは癌放射線療法に伴う血小板減少、骨髄移植、手術、及び重症感染症による血小板減少、あるいは消化管出血等をあげることができるが、これらに限定されることはない。血小板減少を伴う代表的な疾患である再生不良性貧血や突発性血小板性紫斑病、骨髄異形成症候群、トロンボポエチン欠損症なども本発明の医薬適用対象である。また、本発明は末梢血幹細胞放出促進剤、巨核球性白血病細胞の分化誘導剤、血小板ドナーの血小板増加剤などとして使用することもできる。またこの他、血管内皮および内皮前駆細胞の分化増殖により、血管新生療法に用いたり、動脈硬化症，心筋梗塞，不安定狭心症，末梢動脈閉塞症などを予防・治療する場面が想定されるが、これらに限定されることはない。
【００２２】
次に、式（２）で表される化合物の製造方法について説明する。
式（２）で表される化合物は、バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）を培養し、その培養液から採取することにより、製造することができる。
本発明に用いられるバシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）としては、バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）Ｎｏ．１１４２株が好ましい。
バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）Ｎｏ．１１４２株の菌学的性質は以下の通りである、
１．各種培地における生育状態
２５℃、７日間培養時の生育
オートミール寒天培地            ＋
麦芽エキス寒天培地              ＋
ポテトデキストロース寒天培地    ＋
３７℃での生育                  −
可溶性色素及び滲出液の産生      −
コロニーの形態：  直径３７〜４２ｃｍ、白色羊毛状、平滑、裏面白色
２．顕微鏡下における形態的特徴
菌糸          ：  幅１〜５μｍ、無色、平滑分岐、隔壁有
分生子柄      ：  直立、単生
分生子形成細胞：  直線状、先端での環紋無し
分生子        ：  鎖状連結、単細胞、球形〜亜球形、表面粗面、直径７〜１２μｍ
以上の諸性状に基づき既知菌種との比較を試みた結果、Ｎｏ．１１４２株をバシペトスポラ（Basipetospora）に属する一菌株と同定し、バシペトスポラ・エスピーＮｏ．１１４２株と命名した。本菌株は次の通り寄託した。
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (IPOD)
〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
2002年07月22日 (22.07.2002)、14産生奇 第990号（FERM P-18940）
受託番号：IPOD FERM BP-8410
【００２３】
バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）Ｎｏ．１１４２株は、他の糸状菌に見られるようにその性状が変化しやすい。例えば、Ｎｏ．１１４２株の、又は本菌株に由来する突然変異体（自然発生又は誘発性）、形質接合体又は遺伝子組み換え体であっても、キサントシリンＸモノメチルエーテル（Ｒ5 =H、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =H、Ｒb =Hである化合物）、キサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =H、Ｒb =Hである化合物）、３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =OCH3、Ｒb =Hである化合物）と３，３’−ジメトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =OCH3、Ｒb =OCH3である化合物）を生産するものは全て本発明に使用できる。
【００２４】
バシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）の培養方法について説明する。
本発明により式（２）で表される化合物を製造するには、まずバシペトスポラ・エスピー（Basipetospora sp.）を培地中で培養する。栄養源としては、従来糸状菌の培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、澱粉、デキストリン、大豆油等を使用しうる。また、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、オートミール、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を使用できる。その他必要に応じて食塩、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化マンガン、炭酸カルシウム、燐酸塩等の無機塩を単独又は組み合わせて加えることができるほか、本菌株の生育や、式（２）で表される化合物の生産を促進する有機物、例えば核酸類、ビタミン類や無機物を適当に添加することができる。なお、培養中の発泡が著しい時には、消泡剤等を適宜添加すればよい。
【００２５】
培養法としては、例えば振とう又は通気撹拌培養などの好気的条件下での培養法が最も適している。培養温度は２０〜２８℃、培地のｐＨは５．０〜８．０に調製することが好ましい。培養時間は通常８〜１６日間培養を行うと、式（２）で表される化合物が培地或いは菌体中に蓄積されるので、培養中の蓄積量が最大に達した時点で培養を終了するのが好ましい。なお、これらの培養条件は使用する生産菌の特性又は培養方法に応じてそれぞれ最適の条件を選択すればよい。
【００２６】
式（２）で表される化合物の分離・精製方法について説明する。
培養終了後、培養液から式（２）で表される化合物を採取するためには一般に微生物代謝産物をその培養物から単離するために用いられる分離、精製の方法が利用される。すなわち、減圧濃縮、凍結乾燥、例えばブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン等を用いた有機溶媒抽出、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、式（２）で表される化合物を単離そして採取することができる。かくして得られた式（２）で表される化合物のうち、幾つか化合物の理化学的性質につき以下に示した。
【００２７】
キサントシリンＸモノメチルエーテル（Ｒ5 =H、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =H、Ｒb =Hである化合物）
１．分子量：３０２
２．組成式：Ｃ１９Ｈ１４Ｎ２Ｏ２
３．性状、色：黄色針状結晶の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｄ），７．７２（２Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），７．０１（１Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｓ），６．８６（２Ｈ，ｄ），３．８５（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：４８．０，１１４．１，１１５．２，１１５．６，１１６．１，１２３．６，１２６．９，１２７．７，１３１．４，１３１．７，１５９．８，１６１．４，１７３．４，１７３．５
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３０２（Ｍ＋）
キサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =H、Ｒb =Hである化合物）
１．分子量：３１６
２．組成式：Ｃ２０Ｈ１６Ｎ２Ｏ２
３．性状、色：黄色針状結晶の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（４Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），６．９８（４Ｈ，ｄ），３．８７（６Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５，１１４．５，１１６．３，１２４．９，１２７．５，１３１．８，１６１．２，１７３．３
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３１６（Ｍ＋）
３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =OCH3、Ｒb =Hである化合物）
１．分子量：３４６
２．組成式：Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ３
３．性状、色：茶褐色の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｓ），７．４９（Ｈ，ｄ ），７．３６（Ｈ，ｄｄ ），７．０３（Ｈ，s），７．０２（Ｈ，s），６ ．９９ （２Ｈ，ｄ），６．９５（Ｈ，ｄ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９５（３Ｈ，ｓ），３．８８（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５， ５６．１， １１１．２，１１１．９，１１４．５，１１６．３，１１６．２， １２４．６，１２４．９，１２５．１，１２７．６，１２７．８，１３１．８，１４９．１，１５０．９，１６１．２，１７３．３，１７３．５
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３４６（Ｍ＋）
３，３’−ジメトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（Ｒ5 =CH3、Ｒ6 =H、Ｒ7 =CH3、Ｒ8 =OCH3、Ｒb =OCH3である化合物）
１．分子量：３７６
２．組成式：Ｃ２２Ｈ２０Ｎ２Ｏ４
３．性状、色：茶褐色の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｄ），７．０８（２Ｈ，ｓ），７．０５（Ｈ，ｓ）， ７．００ （Ｈ，ｓ ），６．９９ （２Ｈ，ｄ）， ３．９２（９Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５，５６．２，６１．１，１０７．４，１１４．６，１１６．０，１１７．５， １２４．７，１２７．５，１２７．８，１２８．３，１３２．０，１４０．１，１５３．３，１６１．４，１７３．５，１７３．９
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３７６（Ｍ＋）
【００２８】
次に、本発明に使用される、式（１）で表される化合物の製造方法について説明する。
式（１）で表される化合物は、微生物を利用する製造法、微生物を利用して得られた化合物を化学修飾する製造法及び化学的な合成による製造法により製造することができる。
微生物を利用する製造法により、式（１）で表される化合物のうち以下に示す化合物を製造することができる。
Ｒ1 =H、Ｒ2 =H、Ｒ3 =H、Ｒ4 =H、Ｒa =Hである化合物（キサントシリンＸ）は、Penicillium notatumやPenicillium Chrysogenum等の微生物を用いることにより製造することができる（GB 898498、 Antibiotics Ann (1957) Volume Date 1956-57 140-3p及びDE 1123087等）。
【００２９】
Ｒ1 =H、Ｒ2 =H、Ｒ3 =CH3、Ｒ4 =H、Ｒa =Hである化合物（キサントシリンＸモノメチルエーテル）は、Dichotomomyces albus等の微生物を用いることにより製造することができる（J.Antibiotics 21, 582-587 (1968)、J.Antibiotics 21 587-591(1968)）。
【００３０】
Ｒ1 =CH3、Ｒ2 =H、Ｒ3 =CH3、Ｒ4 =H、Ｒa =Hである化合物（キサントシリンＸジメチルエーテル）、Ｒ1 =C2H5、Ｒ2 =H、Ｒ3 =C2H5、Ｒ4 =H、Ｒa =Hである化合物（キサントシリンＸジエチルエーテル）及びＲ１ =CH3、Ｒ2 =H、Ｒ3 =CH3、Ｒ4 =OCH3、Ｒa =Hである化合物(３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル)は、Aspergillus sp.(Strain No.208またはNo.98)等の微生物を用いることにより製造することができる（J.Antibiotics 21(12)671-679(1968)）。
【００３１】
微生物を利用して得られた化合物を化学修飾する製造法により、式（１）で表される化合物のうち以下に示す化合物を製造することができる。
Ｒ1 =CH3、Ｒ2 =H、Ｒ4 =H、Ｒa =H、Ｒ3がアルキル基である化合物は、キサントシリンＸモノメチルエーテルを原料として、特開平２−３０４０５８号公報記載の方法に従って製造することができる。
【００３２】
【化４】
0004412173.tif 000005
【００３３】
即ち、K2CO3等の塩基の存在下、対応するハライド等をキサントシリンＸモノメチルエーテルに反応させることにより製造することができる。
Ｒ2 =H、Ｒ4 =H、Ｒa =H、Ｒ1及びＲ3がアルキル基である化合物は、キサントシリンＸを原料として、Chem Ber 105(9) 3061 (1972)記載の方法に従って製造することができる。
【００３４】
【化５】
0004412173.tif 000006
【００３５】
即ち、対応するジアゾアルキルをキサントシリンＸに反応させることにより製造することができる。
化学的な合成による製造法により、式（１）で表される化合物のうち、Ｒ1 =CH3、Ｒ2 =H、Ｒ3 =CH3、Ｒ4 =H、Ｒa =Hである化合物（キサントシリンＸジメチルエーテル）を製造することもできる（Angew Chem 74, 215 (1962)、Chem Ber 98(1) 193-201 (1965)及びDE 1167332）。
【００３６】
【化６】
0004412173.tif 000007
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を示し本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
製造例１
５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（組成；可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、ポリペプトン０．２％、コーンスチープリカー０．５％、）１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ殺菌した。これにバシペトスポラ属菌株Ｎｏ．１１４２の１白金耳を接種し、２５℃、１４０回転／分で４日間旋回培養を行った。ここで得られた培養液を、上記培地と同一組成の培地１リットルを分注した５リットル容三角フラスコ（１８本、オートクレーブ殺菌済）に移植し、２５℃、１４０回転／分で７日間旋回培養を行った。培養終了後、得られた培養液を濾過し、濾液と菌体を得た。
【００３８】
この培養菌体を８０％アセトン水５リットルで１晩抽出し、菌体を濾過により除いた後、菌体溶出液とした。この菌体溶出液を減圧濃縮により溶媒除去し、ヘキサン０．５リットル添加後得られた水層についてさらに酢酸エチル０．５リットルにて３回抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮して褐色の油状物質約７７１ｍｇを得た。これについてクロロホルム−メタノール（１００：０〜５）を展開溶媒とするシリカゲルクロマトグラフィー（２．５×２８ｃｍ）を行い、各画分を濃縮乾固し、キサントシリンＸモノメチルエーテルを含む黄色の活性画分Ａ（約３３ｍｇ）及びとキサントシリンＸジメチルエーテルを含む黄色の活性画分Ｂ（約３７ｍｇ）を得た。
【００３９】
引き続き活性画分Ｂについては、クロロホルム−ヘキサン溶媒による結晶化を行い、黄色針状結晶物質キサントシリンＸジメチルエーテルを得た（約３０ｍｇ）。また活性画分Ａについては、ヘキサン−アセトン（３：１〜３）を展開溶媒とするシリカゲルクロマトグラフィー（２．５×２８ｃｍ）を行い、各画分を濃縮乾固し、キサントシリンＸモノメチルエーテルを含む活性画分（約１１ｍｇ）を得た。さらに本画分について、クロロホルム−ヘキサン溶媒による結晶化を行い、黄色針状結晶物質キサントシリンＸモノメチルエーテルを得た（約１０ｍｇ）。
【００４０】
かくして得られた化合物は、以下の理化学的性質を示す。
１）得られたキサントシリンＸモノメチルエーテルの理化学的性質：
１．分子量：３０２
２．組成式：Ｃ１９Ｈ１４Ｎ２Ｏ２
３．性状、色：黄色針状結晶の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｄ），７．７２（２Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），７．０１（１Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｓ），６．８６（２H，d），３．８５（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：４８．０，１１４．１，１１５．２，１１５．６，１１６．１，１２３．６，１２６．９，１２７．７，１３１．４，１３１．７，１５９．８，１６１．４，１７３．４，１７３．５
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３０２（Ｍ＋）
２）得られたキサントシリンＸジメチルエーテルの理化学的性質：
１．分子量：３１６
２．組成式：Ｃ２０Ｈ１６Ｎ２Ｏ２
３．性状、色：黄色針状結晶の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（４Ｈ，ｄ），７．０２（２Ｈ，ｄ），６．９８（４Ｈ，ｄ），３．８７（６Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５，１１４．５，１１６．３，１２４．９，１２７．５，１３１．８，１６１．２，１７３．３
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３１６（Ｍ＋）
【００４１】
製造例２
５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（組成；可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、酵母エキス０．２％、リン酸マグネシウム１％，脱脂大豆１％）１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ殺菌した。これにバシペトスポラ属菌株Ｎｏ．１１４２の１白金耳を接種し、２５℃、１４０回転／分で４日間旋回培養を行った。ここで得られた培養液を、上記培地と同一組成の培地０．９リットルを分注した５リットル容三角フラスコ（５本、オートクレーブ殺菌済）に移植し、２５℃、１４０回転／分で１１日間旋回培養を行った。培養終了後、得られた培養液を濾過し、濾液と菌体を得た。
【００４２】
この培養菌体を８０％アセトン水１．５リットルで１晩抽出し、菌体を濾過により除いた後、菌体溶出液とした。この菌体溶出液を減圧濃縮により溶媒除去し、ヘキサン０．４リットル添加後得られた水層についてさらに酢酸エチル０．８リットルにて３回抽出し、酢酸エチル層を減圧濃縮して褐色の油状物質約６０８ｍｇを得た。これについてクロロホルム−メタノール（１００：０〜５）を展開溶媒とするシリカゲルクロマトグラフィー（２．５×２８ｃｍ）を行い、各画分を濃縮乾固し、３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルおよび３，３′−ジメトキシキサントシリンＸジメチルエーテルを含む褐色の画分（約３４ｍｇ）を得た。
【００４３】
引き続き、この画分をアセトニトリルに溶解させ、Ｃ１８逆相−分取HPLC（溶出液；７５%アセトニトリル水溶液、溶出速度；１５ｍｌ/分、吸光度検出器、カラム；Inertsil PREP-ODS 20x250mm、カラム温度；４０℃）で分離精製して、保持時間１３．３分〜１４．０分の画分を得た。保持時間１３．３分〜１４．０分の画分を濃縮乾固後、アセトニトリルに溶解させ、再びＣ１８逆相−分取HPLC（溶出液；６５％アセトニトリル水溶液、溶出速度；１５ｍｌ/分、吸光度検出器、カラム；Inertsil PREP-ODS 20x250mm、カラム温度；４０℃）で分離精製して、保持時間２５．４分および２７．４分の２画分を得た。保持時間２５．４分および２７．４分の画分をそれぞれ濃縮乾固し、茶褐色物質３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（約３．６ｍｇ）および茶褐色物質３，３′−ジメトキシキサントシリンＸジメチルエーテル（約５．５ｍｇ）を得た。
【００４４】
かくして得られた化合物は、以下の理化学的性質を示す。
１）得られた３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルの理化学的性質：
１．分子量：３４６
２．組成式：Ｃ２１Ｈ１８Ｎ２Ｏ３
３．性状、色：茶褐色の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴スペクトルの化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｓ），７．４９（Ｈ，ｄ ），７．３６（Ｈ，ｄｄ ），７．０３（Ｈ，s），７．０２（Ｈ，s），６ ．９９ （２Ｈ，ｄ），６．９５（Ｈ，ｄ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９５（３Ｈ，ｓ），３．８８（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５， ５６．１， １１１．２，１１１．９，１１４．５，１１６．３，１１６．２， １２４．６，１２４．９，１２５．１，１２７．６，１２７．８，１３１．８，１４９．１，１５０．９，１６１．２，１７３．３，１７３．５
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３４６（Ｍ＋）
２）得られた３，３’−ジメトキシキサントシリンＸジメチルエーテルの理化学的性質：
１．分子量：３７６
２．組成式：Ｃ２２Ｈ２０Ｎ２Ｏ４
３．性状、色：茶褐色の中性物質
４．１Ｈ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した水素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：７．７９（２Ｈ，ｄ），７．０８（２Ｈ，ｓ），７．０５（Ｈ，ｓ）， ７．００ （Ｈ，ｓ ），６．９９ （２Ｈ，ｄ）， ３．９２（９Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ）
５．１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した炭素核磁気共鳴の化学シフト（δ-値）を以下に示す。
δ（ppm）：５５．５，５６．２，６１．１，１０７．４，１１４．６，１１６．０，１１７．５， １２４．７，１２７．５，１２７．８，１２８．３，１３２．０，１４０．１，１５３．３，１６１．４，１７３．５，１７３．９
６．マススペクトル：（ＥＩ−ＭＳ）ｍ／ｚ＝３７６（Ｍ＋）
【００４５】
試験例１  トロンボポエチン（TPO）依存性細胞株の増殖促進活性（１）
（１）細胞及び培養
本発明化合物であるキサントシリンＸモノメチルエーテルのトロンボポエチン（TPO）レセプター応答性を、ヒト白血病細胞株UT7/EPO-ｍｐｌを用いて測定した。細胞株UT7/EPO-ｍｐｌは Takatokuらの方法（J．Biol. Chem., 272：7259-7263(1997)）により、cytomegalovirusプロモーター制御下にてヒトトロンボポエチンレセプター（c-ｍｐｌ）発現を誘導するベクターをヒト白血病細胞株UT7/EPO に導入した安定形質転換細胞株であり、トロンボポエチンに応答して増殖反応を示す。なお、その親株であるUT7/EPO細胞はトロンボポエチンに応答性を示さない。上記２種の細胞は１０％牛血清（TRACE  SCIENTIFIC）を含むIMDM培地（GIBCO）中で、CO２インキュベーター（５％CO2、３７℃）を用いて継代培養した。
（２）MTT法による細胞増殖の測定
上記継代培養細胞をPBSで２回洗浄後、細胞濃度が６×１０４個／mlとなるように１０％牛血清を含むIMDM培地に懸濁し、この懸濁液１００μｌを組織培養用９６穴プレート（CORNING）に移した。さらに、別途DMSO中に溶解したキサントシリンＸモノメチルエーテルを１０％牛血清を含むIMDM培地にて８３倍希釈した後、上記細胞懸濁液に２０μｌずつ添加した。引き続き、本細胞懸濁液をCO2インキュベーター（５％CO2、３７℃）中にて４日間培養した。細胞増殖はモスマンらの方法（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：５５−６３  （１９８３））に準じて測定した。すなわち、各穴に１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ MTT試薬（SIGMA）を添加し、３７℃にて４時間加温した。生成したホルマザン色素を各穴当たり１５０μｌのイソプロパノール／０．１mol/L−HCｌ溶液にて溶解した後、９６穴マイクロプレートリーダー（BIO−RAD、M450）を用いて５５０ｎｍの吸光度を測定した。UT7/EPO-ｍｐｌ細胞を用いた時の結果を図１に示した。また、トロンボポエチンレセプターが発現していないUT7/EPO細胞を用いた時の結果を図２に示した。
【００４６】
試験例２  トロンボポエチンレセプターシグナル伝達活性
本発明化合物であるキサントシリンＸモノメチルエーテルのトロンボポエチンレセプターシグナル伝達活性を、小松らの方法（Blood，８７：４５５２−４５６０（１９９６））に準じて測定した。ヒト白血病細胞株UT7/EPO-ｍｐｌをPBSで３回洗浄後、細胞濃度が９×１０５個／mlとなるように１０％牛血清（TRACE  SCIENTIFIC）を含むIMDM培地（GIBCO）に懸濁し、CO2インキュベーター（５％CO2、３７℃）中にて１８時間培養した。本細胞懸濁液２ｍｌ（７×１０６個／ml）に終濃度３０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチンあるいは別途DMSO中に溶解した終濃度１μｇ／ｍｌのキサントシリンＸモノメチルエーテルを添加し、３７℃にて１〜１５分加温した後、細胞を１．４ｍｌのTNEバッファー〔20mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1/400希釈 Protease inhibitor cocktail(SIGMA)〕にて溶解した。溶解液を遠心後、上清を各種シグナル伝達に関与する蛋白質に対する抗体〔anti-Jak2（UPSTATE BIOTECHNOLOGY）、anti-Tyk2（UPSTATE BIOTECHNOLOGY）、anti-STAT3（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY）、anti-STAT５A（UPSTATE BIOTECHNOLOGY）、anti-PLCγ１（UPSTATE BIOTECHNOLOGY）〕及びプロテインGセファロース（PHARMACIA）を用いて免疫沈降した。引き続き蛋白質をサンプルバッファーにて変性し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％）にて分離した。これを１００V、１時間の条件にてPVDF膜（ATTO、０．２μｍ）に転写し、アルカリフォスファターゼを標識した抗リン酸化チロシン抗体（RC２０、TRANSDUCTION  LABORATORIES）を用いてチロシンリン酸化された蛋白質を検出した。発色には１５０μｇ／ｍｌのNBT（BIO-RAD）及び３００μｇ／ｍｌのBCIP（BIO-RAD）を用いた。その結果を表１に示す。
【００４７】
表１
─────────────────────────────――――――
DMSO  キサントシリンXモノメチルエーテル      トロンボポエチン
─────────────────────────────――――――
Jak2      ―              ＋                              ＋
Tyk2      ―              ＋                              ＋
STAT３    ―              ＋                              ＋
STAT５A   ―              ＋                              ＋
PLCγ１   ―              ＋                              ＋
─────────────────────────────――――――
【００４８】
図１に示したように、トロンボポエチン応答性細胞株UT7/EPO-ｍｐｌの増殖はキサントシリンＸモノメチルエーテルの添加により濃度依存的に促進された。図２に示したように、本化合物は上記細胞の親株であるUT7/EPOの増殖には影響を及ぼさなかった。以上の結果より、本発明化合物であるキサントシリンＸモノメチルエーテルはトロンボポエチンレセプターに特異的に作用し、その活性化剤として働くことが明らかとなった。
表１に示したように、キサントシリンＸモノメチルエーテルの刺激によりJak2、Tyk2、STAT３、STAT５A及びPLCγ１のリン酸化が促進されることが明らかとなった。このリン酸化促進はトロンボポエチンによるものと同一であった。以上の結果より、本発明化合物はトロンボポエチンと同じシグナルを伝達することによりアゴニスト活性を発現することが明らかとなった。
【００４９】
試験例３  トロンボポエチン（TPO）依存性細胞株の増殖促進活性（２）
本発明化合物である３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルのトロンボポエチン（TPO）レセプター応答性を、ヒト白血病細胞株UT7/EPO-ｍｐｌを用いて測定した。
試験例１（１）の方法に従って継代培養した細胞をPBSで２回洗浄後、細胞濃度が６×１０４個／mlとなるように１０％牛血清を含むIMDM培地に懸濁し、この懸濁液１００μｌを組織培養用９６穴プレート（CORNING）に移した。さらに、別途DMSO中に溶解した３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルを１０％牛血清を含むIMDM培地にて８３倍希釈した後、上記細胞懸濁液に２０μｌずつ添加した。引き続き、本細胞懸濁液をCO2インキュベーター（５％CO2、３７℃）中にて４日間培養した。細胞増殖はWST-8試薬（岸田化学）を用い、添付の説明書に従って測定した。すなわち、各穴に１０μｌの5 mMのWST-8試薬溶液を添加し、３７℃にて４時間加温した。生成したホルマザン色素は９６穴マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス、Spectramax190）を用いて450 nmの吸光度を測定した。UT7/EPO-mpl細胞を用いた時の結果を図３に示した。また、トロンボポエチンレセプターが発現していないUT7/EPO細胞を用いた時の結果を図４に示した。
図３に示したように、トロンボポエチン応答性細胞株UT7/EPO-mplの増殖は３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルの添加により濃度依存的に促進された．図４に示したように、本化合物は上記細胞の親株であるUT7/EPOの増殖には影響を及ぼさなかった。以上の結果より、本発明化合物である３−メトキシキサントシリンＸジメチルエーテルはトロンボポエチンレセプターに特異的に作用し、その活性化剤として働くことが明らかとなった。
【００５０】
製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。
成分  式（１）で表される化合物              １０ｍｇ
乳糖                                  ７００ｍｇ
コーンスターチ                        ２７４ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                              １６ｍｇ
１０００ｍｇ
式（１）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（HPC-L）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒  孔径0.5〜1mm）した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し顆粒剤を得る。
【００５１】
製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
成分  式（１）で表される化合物                １０ｍｇ  
乳糖                                    ７９ｍｇ
コーンスターチ                          １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                  １ｍｇ  
１００ｍｇ
式（１）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをＶ型混合機にて混合する。10倍散１００ｍｇを5号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【００５２】
製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
成分  式（１）で表される化合物                １５ｍｇ  
乳糖                                    ９０ｍｇ
コーンスターチ                          ４２ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                                ３ｍｇ  
１５０ｍｇ
式（１）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（HPC-L）水溶液を添加し、練合、造粒した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し整粒し、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【００５３】
製剤例４
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分  式（１）で表される化合物                      １０ｍｇ  
乳糖                                          ９０ｍｇ
微結晶セルロース                              ３０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                        ５ｍｇ
CMC-Na                                        １５ｍｇ  
１５０ｍｇ
式（１）で表される化合物と乳糖と微結晶セルロース、CMC-Na(カルボキシメチルセルロース  ナトリウム塩)を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウムを添加し、製剤用混合末を得る。本混合末を直打し１５０ｍｇの錠剤を得る。
【００５４】
製剤例５
静脈用製剤は次のように製造する。
式（１）で表される化合物            １００ｍｇ
飽和脂肪酸グルセリド              １０００ｍｌ
上記成分の溶液は通常、1分間に１ｍｌの速度で患者に静脈内投与される。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明化合物は、トロンボポエチンレセプターに親和性及びアゴニスト作用を示すため、トロンボポエチンレセプター活性化作用が有効な疾患の予防・治療・改善薬、特に、血小板減少症等の血小板数の異常を伴う血液疾患の病態に対する薬剤や血管内皮および内皮前駆細胞の分化増殖を促進することで治療予防できる病態に対する薬剤として用いることができ、医薬品として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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