(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス抗原非ミョウバン製剤であって２℃〜８℃の温度で少なくとも１ヵ月間の保存に安定であり、
（ａ）ヒトパピローマウイルス様粒子を含むワクチン成分；
（ｂ）５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で存在する塩であって、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される塩；及び
（ｃ）０．２％ｗ／ｖまでの濃度で存在する非イオン界面活性剤であって、該非イオン界面活性剤が、ポリソルベート８０である非イオン界面活性剤；
を含み、ミョウバン含有アジュバントとは組み合わされない抗原製剤。
【請求項２】
ヒトパピローマウイルス様粒子がＬ１タンパク質又は、Ｌ１及びＬ２タンパク質を含む請求項１に記載の抗原製剤。
【請求項３】
ヒトパピローマウイルス様粒子が６ａ、６ｂ、１１、１６、１８及びその任意の組み合わせから構成されるヒトパピローマウイルス型からなる群から選択される請求項２に記載の抗原製剤。
【請求項４】
塩が塩化ナトリウムである請求項３に記載の抗原製剤。
【請求項５】
塩化ナトリウムが１５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で存在する請求項４に記載の抗原製剤。
【請求項６】
ポリソルベート８０が０．０１％ｗ／ｖまでの濃度で存在する請求項５に記載の抗原製剤。
【請求項７】
（ａ）６ａ、６ｂ、１１、１６及び１８からなる群から選択されるヒトパピローマウイルスのＬ１タンパク質を含むヒトパピローマウイルス様粒子の集団；
（ｂ）１５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム；及び
（ｃ）０．１％ｗ／ｖまでの濃度のポリソルベート８０；
を含むヒトパピローマウイルス抗原非ミョウバン製剤。
【請求項８】
ヒトパピローマウイルスのＬ１又は、Ｌ１及びＬ２タンパク質から誘導される精製ウイルス様粒子の集団を２℃〜８℃の温度で少なくとも１カ月間安定化する方法であって、５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと少なくとも０．２％ｗ／ｖまでの濃度のポリソルベート８０を含む非ミョウバン製剤に精製ウイルス様粒子を加えることを含む方法。
【請求項９】
ワクチン製剤が１５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度範囲の塩化ナトリウムを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリソルベート８０が少なくとも０．１％ｗ／ｖまでの濃度で存在する請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は抗原安定性が高く、抗原凝集及び沈降の少ないヒトパピローマウイルス抗原製剤に関する。本発明は本発明のヒトパピローマウイルス抗原製剤を使用したアジュバント入りＨＰＶワクチンの製造方法にも関する。本発明はこれらのヒトパピローマウイルス抗原製剤から製造したアジュバント入りヒトパピローマウイルスワクチンにも関する。
発明の背景
パピローマウイルス（ＰＶ）感染はヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ及びウシ等の種々の動物で生じる。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般に感染部位に良性上皮又は線維上皮腫瘍を誘発する。パピローマウイルスは種特異的感染物質である。
パピローマウイルスは感染する宿主により異なる群に分類される。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はＤＮＡハイブリダイゼーション試験により更に７０種を越える型に分類される。ある型のパピローマウイルス感染に対する中和免疫が別の型のパピローマウイルスに対する免疫を付与しないという点でＰＶ型は型特異的免疫原であると思われる。
ヒトではＨＰＶ型により異なる疾患が生じる。ＨＰＶ１、２、３、４、７、１０及び２６〜２９型は正常個体と免疫無防備状態の個体の双方に良性疣贅を誘発する。ＨＰＶ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６及び４６〜５０型は免疫無防備状態の個体に扁平病変を誘発する。ＨＰＶ６、１１、３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５型は生殖器又は呼吸器粘膜の非悪性コンジロームを誘発する。ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、４５及び５８型は生殖器粘膜の上皮異形成を誘発し、頚管、膣、陰門及び肛門管の大半のｉｎ  ｓｉｔｕ及び浸潤癌に関係がある。
パピローマウイルスはエンベロープをもたない小型の（５０〜６０ｎｍ）二十面体ＤＮＡウイルスであり、８個までの初期遺伝子と２個までの後期遺伝子をコードする。ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ８とＬ１及びＬ２と呼ばれ、「Ｅ」は初期を表し、「Ｌ」は後期を表す。Ｌ１とＬ２はウイルスキャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子はウイルス複製、転写調節及び細胞トランスフォーメーション等の機能に関係がある。
Ｌ１タンパク質は主キャプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量をもつ。Ｌ２タンパク質は副キャプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの推定分子量と７５〜１００ｋＤａの見かけの分子量（ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定）をもつ。免疫データによると、Ｌ２タンパク質の大半はウイルスキャプソメア内でＬ１タンパク質の内側にあると予想される。Ｌ１ＯＲＦは種々のパピローマウイルス間で保存度が高い。Ｌ２タンパク質は種々のパピローマウイルス間で保存度が低い。
Ｌ１及びＬ２遺伝子は免疫予防の良好なターゲットとして同定されている。初期遺伝子のうちにはワクチン開発の潜在的ターゲットであることが立証されているものもある。ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）系の試験の結果、（細菌又はワクシニアベクターを使用することにより生産した）組換えＬ１及び／又はＬ２タンパク質で免疫すると動物をウイルス感染から防御できることが判明した。バキュロウイルス発現系又はワクシニアベクターを使用してパピローマウイルスＬ１遺伝子を発現させ、得られたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の集合を使用し、ウイルス攻撃からの防御に相関する高力価ウイルス中和抗体応答が誘導されている。更に、Ｌ１及びＬ２遺伝子を使用して、動物のパピローマウイルス感染予防及び治療用ワクチンが製造されている。
ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含むウイルス様粒子は昆虫及び哺乳動物細胞系で発現されている。酵母細胞でＶＬＰを発現させると費用効果的であり、発酵槽での大規模増殖に利用し易いという利点がある。しかし、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は酵母細胞では低レベルでしか発現されない。これはＨＰＶ１１  Ｌ１  ｍＲＮＡが切断されるためであることが分かっている。他方、ＨＰＶ６  Ｌ１遺伝子は完全長ｍＲＮＡとして転写され、高レベルまで発現される。ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードするようにＨＰＶ６  Ｌ１  ＤＮＡを修飾することにより、完全長ｍＲＮＡの転写を容易にし、ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質発現を増すことが可能である。
Ｌ１及びＬ２遺伝子を使用して動物のパピローマウイルス感染予防及び治療用ワクチンが製造されている。ＨＰＶ１６型Ｌ１及びＬ２遺伝子をワクシニアウイルスベクターにクローニングし、ＣＶ−１哺乳動物細胞に組換えベクターを感染させてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が生産されている。
細菌由来組換えウシパピローマウイルスＬ１及びＬ２が生産されている。組換え細菌タンパク質に対する中和血清は天然ウイルスと低レベルでしか交差反応しなかったが、これは天然タンパク質と細菌由来タンパク質のコンホメーションの相異によると思われる。
ＨＰＶ１６  Ｌ１又はＨＰＶ１６  Ｌ２ＯＲＦを発現する組換えバキュロウイルスを使用して昆虫ＳＦ９に感染させ、Ｌ１及びＬ２タンパク質が生産されている。ウェスタンブロット分析によると、バキュロウイルス由来Ｌ１Ｌ及びＬ２タンパク質は抗ＨＰＶ１６抗体と反応することが分かった。バキュロウイルス由来Ｌ１はＶＬＰを形成する。
Ｊａｎｓｅｎら（１９９５，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３（１６）：１５０９−１５１４）はワタオウサギパピローマウイルスからＬ１及びＬ１＋Ｌ２  ＶＬＰの精製中に塩化ナトリウムとＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を含む流動バッファーを使用している。
現状では、精製組換えＨＰＶ  ＶＬＰ製剤は溶液中の凝集を防ぐために高いＮａＣｌ濃度で保存しなければならない。イオン強度が低いと、ＨＰＶ  ＶＬＰは溶液から沈降する点まで凝集する。以上及び他の関連知見により、ＨＰＶバルク溶液は高濃度のＮａＣｌ（１．２５〜２．５Ｍ）の存在下に凍結保存されている。ＨＰＶ１１  ＶＬＰの高凝集試料をＲＩＡ、ＥＩＡ又はＢＩＡコアアッセイにより測定すると不良なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性を示す。従って、生理的塩条件及び許容可能な長期保存条件下で安定な水性ＨＰＶ  ＶＬＰ製剤を製造することが必要とされている。本発明はこの必要に対処し、これを満たすものである。
発明の要約
本発明は界面活性剤の存在下に生理的塩濃度で抗原凝集を防止すると共に抗原安定性を増加するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原製剤に関する。
本発明は本発明のＨＰＶ抗原製剤を生物学的に有効な量のアジュバントと混合することにより形成されるアジュバント入りワクチンの製造にも関する。
本発明のＨＰＶ抗原製剤及びアジュバント入りワクチンは、非限定的な例としてＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６及び１８型からのＬ１又はＬ１及びＬ２タンパク質の組み合わせを含む組換えＨＰＶサブユニットワクチンとして製造されたウイルス様粒子を抗原成分として含む。この組換えワクチンの１価形態及び２価形態（非限定的な例として組換えＨＰＶ１１  Ｌ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１及びＨＰＶ６ａ  Ｌ１）と多価形態（非限定的な例として組換えＨＰＶ１１  Ｌ１、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１及びＨＰＶ１８  Ｌ１）を安定化することも本発明の範囲内である。
本発明は更に、生理的濃度の塩と、０℃を上回る温度で製剤のワクチン成分の安定化を増すために界面活性剤を含むＨＰＶ抗原製剤にも関する。本発明のＨＰＶ製剤は約２℃〜約８℃で少なくとも１カ月〜約２年間まで長期保存することができる。
本発明の１態様は非限定的な例として塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウム等の生理的に許容可能な塩を含むＨＰＶ抗原製剤に関する。製剤に塩を加える目的は所望イオン強度を達成するためである。イオン強度は、非限定的な例としてリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭＯＰＳ等の緩衝化合物により生成されるイオンと、非緩衝塩のイオンに起因し得る。
本発明の別の態様は非限定的な例として例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ６０（例えばＴｗｅｅｎ  ６０（登録商標））及びＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０（例えばＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標））等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（ポリソルベート類）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（例えばＢｒｉｊ  ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ  ３５（登録商標））、並びに非限定的な例として例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ  ８５及びＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）等の他の類の非イオン界面活性剤を含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の付加的態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の別の態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約５０ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の更に別の態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の別の態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に生理的に許容可能な塩が約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の特定態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に生理的に許容可能な塩が約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の好ましい態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に塩化ナトリウムが約５０ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在し、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの百分率範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の特に好ましい態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に塩化ナトリウムが約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在し、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの百分率範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明のＨＰＶ抗原製剤は、好ましくは非限定的な例として約ｐＨ５．０〜９．０のｐＨ範囲、特に約ｐＨ６．０〜約８．０のｐＨ範囲内の好ましくは非限定的な例としてリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はＭＯＰＳ等の生理的に許容可能なバッファー中で提供されることが当業者に理解されよう。
本発明は本発明のＨＰＶ抗原製剤を使用することを特徴とするＨＰＶワクチン製剤の製造方法にも関する。本明細書ではミョウバン又は非ミョウバン系ＨＰＶワクチンのこれらの改良製造方法について記載する。
本発明は生物学的に有効な量のアジュバントを生物学的に有効な量の本発明の抗原含有製剤と併用するアジュバント入りＨＰＶワクチンにも関する。
本明細書で使用する「ＰＶ」なる用語は「パピローマウイルス」の略語である。
本明細書で使用する「ＨＰＶ」なる用語は「ヒトパピローマウイルス」の略語である。
本明細書で使用する「ＶＬＰ」なる用語は「ウイルス様粒子」の略語である。
本明細書で使用する「生理的に許容可能」なる用語は、製剤がヒト等の免疫ターゲット宿主と生物学的に適合可能となるような濃度又はイオン強度のバッファー、賦形剤又は塩を意味する。
【図面の簡単な説明】
図１は４℃で２カ月間にわたってＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１．２５Ｍ  ＮａＣｌ）の流体力学的寸法に及ぼすタンパク質希釈の経時効果を示す。（□）４７０μｇ／ｍＬ；（■）１８μｇ／ｍＬ。
図２は室温で保存中のＨＰＶ１１及びＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰの流体力学的寸法に及ぼす塩濃度の効果を示す。試料をバッファーで希釈し、１時間保存後に分析した。ＨＰＶ１１の場合には、その後、同一バッファーで更に一晩透析した。ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰは種々のＮａＣｌ濃度の５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）で調製した。（○）透析せず；（□）透析あり。ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰは種々のＮａＣｌ濃度の５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）で調製した。（●）透析せず。
図３はタンパク質の透析膜吸着が室温で９６時間にわたってポリプロピレンチューブに入れた５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１８０ｍＭ  ＮａＣｌ中５０μｇ／ｍｌのＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰの流体力学的寸法（●）及びタンパク質濃度（■）［残留ＨＰＶ１１  Ｌ１の百分率として表す］に及ぼす効果を示す。
図４は室温で２４時間にわたって５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１．２５Ｍ  ＮａＣｌ中ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ吸着に及ぼすポリスチレン（○）、ポリプロピレン（●）及びガラス（◇）の効果を示す。
図５は５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，０．２５Ｍ  ＮａＣｌ中ＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）のポリプロピレン吸着に及ぼす比表面積の増加の効果を示す。（□）比表面積＝４ｃｍ-1；（●）比表面積＝６ｃｍ-1。
図６Ａ及び図６Ｂは動的光散乱（ＤＬＳ）試験の前に５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に室温で２０時間（Ａ）及び５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，４０ｍＭ  ＮａＣｌ中に５０℃で３０分後に室温で４８時間（Ｂ）保存したＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）の安定性に及ぼす種々の界面活性剤（０．０１％）の効果を示す。
図７Ａ及び７Ｂは種々のイオン強度即ち（●）０．４Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）；（○）０．１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4；（◇）０．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4；（ｘ）０．１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4；（｜）０．５Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4；（△）０．１Ｍ  ＮａＣｌ；及び（■）０．５Ｍ  ＮａＣｌの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０中で室温でポリプロピレン表面に接触させたＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（１６μｇ／ｍＬ）の表面吸着（Ａ）及び凝集（Ｂ）に及ぼすＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））の効果を示す。
図８は５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で室温でポリプロピレン表面に接触させたＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）の流体力学的直径及びＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ濃度に及ぼすＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））の経時効果を示す。初期タンパク質濃度の百分率としてタンパク質濃度を測定する。タンパク質濃度の低下は表面吸着に反比例する。（ｘ）０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、タンパク質濃度；（△）Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）添加せず、タンパク質濃度；（■）０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、流体力学的直径；及び（◆）Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）添加せず、流体力学的直径。
図９は（●）４０ｍＭ  ＮａＣｌと０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を添加、（◇）１００ｍＭ  ＮａＣｌと０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を添加及び（○）Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を添加せずに４０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０中ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）の流体力学的寸法に及ぼすＮａＣｌ濃度とＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））の組み合わせ効果を示す。
図１０Ａ及び図１０Ｂは４℃（Ａ）及び室温（Ｂ）で５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）の流体力学的寸法（Ｄｈ（ｎｍ））に及ぼすＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））濃度［（●）０．０００％ｗ／ｖ；（○）０．００１％ｗ／ｖ；（■）０．００５％ｗ／ｖ；（□）０．０１０％ｗ／ｖ］の経時効果を示す。
図１１は動的光散乱（ＤＬＳ）試験の前に５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に室温で５０日間保存したＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰ（２０μｇ／ｍＬ）の安定性に及ぼす種々の界面活性剤（０．０１％）の効果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は界面活性剤の存在下に生理的塩濃度で抗原凝集を防止すると共に抗原安定性を増加するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原製剤に関する。
本発明は本発明のＨＰＶ抗原製剤を生物学的に有効な量のアジュバントと混合することにより形成されるアジュバント入りＨＰＶワクチンにも関する。
本発明のＨＰＶ抗原製剤とアジュバント入りワクチンは、非限定的な例としてＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６及び１８型からのＬ１又はＬ１及びＬ２タンパク質の組み合わせを含む組換えＨＰＶサブユニットワクチンとして製造されたウイルス様粒子を抗原成分として含む。この組換えワクチンの１価形態及び２価形態（非限定的な例として組換えＨＰＶ１１  Ｌ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１及びＨＰＶ６ａ  Ｌ１）と多価形態（非限定的な例として組換えＨＰＶ１１  Ｌ１、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１及びＨＰＶ１８  Ｌ１）を安定化することも本発明の範囲内である。このために、本発明の実施例では組換えＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰを使用するが、本発明の抗原製剤で安定化のために製造可能なＨＰＶ型はこれに制限されない。実際に、本発明のワクチン製剤は非限定的な例として例えば他のＨＰＶ系ＶＬＰ等の他のワクチン製剤を安定化させるためにも使用できることが本開示から自明である。例えば、本発明のＨＰＶワクチン製剤は、非限定的な例としてＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６及び１８型からのＬ１又はＬ１及びＬ２タンパク質の組み合わせを含む組換えＨＰＶサブユニットワクチンとして製造されたウイルス様粒子を含む。従って、上述のように本発明の製剤が非限定的な例として２価（例えば組換えＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ６ａ  Ｌ１）や多価（例えばＨＰＶ１１  Ｌ１、ＨＰＶ６ａ  Ｌ１、ＨＰＶ１６  Ｌ１及びＨＰＶ１８  Ｌ１）ＨＰＶ製剤等の種々の２価及び多価製剤を安定化するために有用であることも自明である。
従って、本発明は有用なタンパク質濃度及び好適保存温度の全範囲で生理的に活性な塩及びバッファー条件でＨＰＶ  ＶＬＰを安定化する非イオン界面活性剤を含む抗原製剤に関する。本発明のＨＰＶ製剤は約２℃〜約８℃で少なくとも１カ月〜約２年間まで長期保存することができる。これらの製剤は例えばミョウバン含有アジュバント（例えばリン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム及びオキシ水酸化アルミニウム）と混合することができる。非ミョウバン系アジュバント、特にＨＰＶ  ＶＬＰ用として知られている高イオン強度製剤によりマイナスの影響を受ける非ミョウバン系アジュバントと本発明の抗原製剤を併用することも有用である。
低イオン強度では、ＨＰＶ１１  Ｌ１ＶＬＰは溶液から沈降する点まで凝集することが知られている。ＨＰＶ１１  Ｌ１ＶＬＰの高凝集試料は不良なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性を示すことが知られている（例えばＲＩＡ、ＥＩＡ又はＢＩＡコアアッセイ）。実施例３のデータに示すように、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ  Ｌ１（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ／１．２５Ｍ  ＮａＣｌ中４７０μｇ／ｍＬ）を融解し、溶液の一部を同一バッファーで１８μｇ／ｍＬまで希釈した。ＮａＣｌ濃度を１．２５Ｍ  ＮａＣｌに維持しても、タンパク質濃度の低い溶液は時間が経つと凝集した。従って、塩濃度を高くするだけではＨＰＶ  ＶＬＰ凝集を防止できない。実施例４は種々のＮａＣｌ濃度範囲で（短時間におけるバルク溶液の保存又は透析により）試験したデータを示しており、ＮａＣｌ濃度が低レベル（ＮａＣｌ約１５０ｍＭ以下）まで低下すると、タンパク質凝集（とそれに続く沈降）が生じる。この問題を解決するためには、ＨＰＶ１１  Ｌ１ＶＬＰを含む溶液を高濃度（約１．２５〜２．５Ｍ）のＮａＣｌの存在下で凍結保存すればよい。本明細書に開示する本発明の一部は、有用な温度範囲内で生理的塩濃度で凝集を防止するＨＰＶ  ＶＬＰを含む種々の製剤に関する。本発明の製剤は４℃で安定なＨＰＶ  ＶＬＰの長期保存を容易にし、ＨＰＶ単独又はアルミニウム塩アジュバントもしくは非アルミニウムアジュバントの存在下に有用な免疫原性試験を可能にする。
更に、実施例５に開示するように、ＨＰＶ  ＶＬＰを種々の表面と接触させても凝集が変化する。同実施例から明らかなように、ＨＰＶ  ＶＬＰとの接触表面積（例えば透析膜又は保存管）を増加すると、ＶＬＰの流体力学的寸法も増加する。この凝集の増加と同時にＨＰＶ  ＶＬＰ溶液のタンパク質濃度が低下するので、ＨＰＶ  ＶＬＰは膜表面に吸着し、表面吸着と凝集の相関を示唆している。従って、ワクチンを好適容器表面に接触させることも本発明の範囲内である。データによると、室温で２４時間インキュベートしたＨＰＶ１１  Ｌ１ＶＬＰ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ／１．２５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）はホウケイ酸ガラスに有意吸着を示すが、ポリスチレンでは有意吸着は認められない。
実施例６は本発明の製剤で使用するのに好適な賦形剤及び塩を示すデータを含む。
従って、本発明の本質は生理的塩濃度を含むＨＰＶ抗原製剤として、製剤の抗原成分が約０℃〜約４０℃の温度で長期安定性をもつと共に公知ＨＰＶ製剤に多く見られる凝集を防止するように非イオン界面活性剤を加えた製剤に関する。このために、本発明は宿主に生理的に許容可能なイオン強度で存在する非限定的な例として塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウム等の塩を含むＨＰＶワクチン製剤に関する。製剤に塩を加える目的は、必要なイオン強度を達成するためである。イオン強度は緩衝化合物により生成されるイオンと、非緩衝塩のイオンに起因し得る。
本発明の特に好ましい側面は、生理的に許容可能な濃度の塩を含むＨＰＶ抗原製剤として、製剤のワクチン成分の安定化を増すために最少量の非イオン界面活性剤を加えた製剤に関する。本発明の抗原製剤で使用する非イオン界面活性剤の非限定的な例としては、例えば非限定的な例としてＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０（登録商標））及びＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、例えば非限定的な例としてＢｒｉｊ  ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ  ３５（登録商標））等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、並びにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ  ８５及びＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）等の他の類が挙げられる。
本発明の付加的態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の別の態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約５０ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の更に別の態様は生理的に許容可能なバッファーの存在下に約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在する上記非イオン界面活性剤と、生理的に許容可能な塩として約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の別の態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に生理的に許容可能な塩が約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．２％ｗ／ｖまでの範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の特定態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に生理的に許容可能な塩が約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムであり、非イオン界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の好ましい態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に塩化ナトリウムが約５０ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度で存在し、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの百分率範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明の特に好ましい態様は、生理的に許容可能なバッファーの存在下に塩化ナトリウムが約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在し、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（非限定的な例としてＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））が約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖの百分率範囲で存在するＨＰＶ抗原製剤に関する。
本発明のＨＰＶ抗原製剤は生理的に許容可能なバッファー、好ましくは非限定的な例として約５．０〜約９．０のｐＨ範囲、好ましくは約６．０〜約８．０のｐＨ範囲内のリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はＭＯＰＳにより緩衝された製剤中で提供されることが当業者に理解されよう。
本発明に記載する製剤は非凍結状態でほぼ生理的塩濃度でＨＰＶ溶液を保存できる。従って、凍結融解段階が不要になり、適当な生理的イオン強度条件でＨＰＶをアルミニウムアジュバントに吸着させるか又は非アルミニウムアジュバントを加えることにより、アジュバントを含むＨＰＶ  ＶＬＰ溶液を直接調製することができる。
従って、本発明はミョウバン含有アジュバントと混合する前に温度及び塩濃度の苛酷な勾配を必要としないアジュバント入りＨＰＶワクチンの改良製造方法を開示する。例えば、本発明の抗原製剤はアルミニウムアジュバントと混合する前に４℃で調製及び保存できる。このミョウバン添加前の抗原製剤をリン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム及びオキシ水酸化アルミニウム等のアルミニウムアジュバントと混合する。必要に応じてチメロサール等の防腐剤を加えてもよい。本発明の方法は元の抗原製剤を約２℃〜約８℃の温度で少なくとも２年間まで長期保存することができる。
本開示から明らかなように、本発明のＨＰＶ抗原製剤の１つの利点は生理的に許容可能な濃度のミョウバン又は非ミョウバンアジュバントと直接混合できることである。同様に本開示から明らかなように、別の利点はこれらの製剤を適当なミョウバン又は非ミョウバン含有アジュバントに直接添加できるように凍結点を上回る約０℃〜約４０℃、特に約２℃〜約８℃の温度で安定性が高いことである。換言するならば、本発明の製剤は生理的塩濃度で非ミョウバンアジュバントを含むＨＰＶ溶液を直接調製することもできる。
好ましい製剤例を上記に例示したが、本明細書の教示から明らかなように種々の他の製剤も予想される。本明細書に教示するように、例示及び他の本発明の抗原製剤は宿主に生理的に許容可能なイオン強度の塩と、生理的に許容可能なバッファーと、ワクチン成分の安定性を増し、溶液から凝集又は沈降する傾向を減らし、より好都合な温度で長期保存できるように生物学的に許容可能な濃度の界面活性剤を含む。
本発明のＨＰＶワクチン製剤を使用する投与計画は患者の型、種、年齢、体重、性別及び医学的状態、治療する症状の重篤度、投与経路、患者の腎及び肝機能、並びに使用する特定化合物に応じて選択することができる。通常の技術をもつ医師であれば、症状の進行を予防、防止又は阻止するために必要なＨＰＶワクチンの有効量を容易に決定及び処方することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
組換えＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰの過剰発現
合成Ｌ１遺伝子の構築。ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰの過剰発現及び精製はいずれも１９９５年３月３０日に出願された米国出願第０８／４１３，５７１号及び０８／４１３，５７２号に記載されており、本実施例にも記載するが、単に例示に過ぎず、組換えＨＰＶ  ＶＬＰの製造に使用可能な方法を限定するものではない。本明細書は本発明の製剤を例示するために組換えＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ１６  Ｌ１の使用を開示する。公知組換えＤＮＡ技術を使用しても本明細書に記載する組換えＨＰＶ  ＶＬＰを製造できることが当業者に理解されよう。また、酵母以外の宿主を使用しても本発明の抗原製剤で使用するＨＰＶ  ＶＬＰを過剰発現できることも理解されよう。
Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから取り寄せた合成ＤＮＡオリゴマーを使用してＨＰＶ１１  Ｌ１の１．５ｋｂｐオープンリーディングフレームを構築した。これらのオリゴマーは５’末端リン酸を付けたものを入手した。以下に示す合計２４種のオリゴマーが必要であった。
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２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡを入れた別々のチューブで相補対を形成するオリゴマー（＃２４１−１と＃２４１−２４、＃２４１−２と＃２４１−２３、＃２４１−３と＃２４１−２２、＃２４１−４と＃２４１−２１、＃２４１−５と＃２４１−２０、＃２４１−６と＃２４１−１９、＃２４１−７と＃２４１−１８、＃２４１−８と＃２４１−１７、＃２４１−９と＃２４１−１６、＃２４１−１０と＃２４１−１５、＃２４１−１１と＃２４１−１４、＃２４１−１２と＃２４１−１３）をアニールした。チューブを４分間９８℃まで加熱した後、２５０ｍｌ容ビーカーに入れた９８℃の水２００ｍｌに加え、ゆっくりと冷却させた。水が室温まで冷却したら、アニールした対をフラグメントＡ（オリゴマー対＃２４１−１と２４及び−２と２３）、フラグメントＢ（＃２４１−３と２２、−４と２１、−５と２０及び−６と１９）、フラグメントＣ（＃２４１−７と１８、−８と１７、−９と１６及び−１０と１５）及びフラグメントＤ（＃２４１−１１と１４及び−１２と１３）としてチューブに加えた。これらのオリゴマー対ミックスを２分間６２℃まで加熱した後、前述のようにゆっくりと冷却した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）と製造業者に提供される試薬を使用して各チューブの内容物を２３℃で一晩連結した。
連結後、フラグメントＢは完全長産物の量を増加するためにＰＣＲ増幅が必要であった。このためには、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｔａｑポリメラーゼとオリゴマープライマー：
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を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサーモサイクラーで９４℃１分間、４８℃１分間、７２℃１分間、次いで７２℃１０分間のサイクルを１０サイクル実施する必要があった。連結産物とフラグメントＢ  ＰＣＲ産物を制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）で次のように消化した。フラグメントＡはＢｇｌＩＩとＳｐｈＩで消化し、フラグメントＢはＳｐｈＩとＫｐｎＩで消化し、フラグメントＣはＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化し、フラグメントＤはＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化した。消化したフラグメントを低融点アガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ゲル上で分離し、Ａｇａｒａｓｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）を製造業者に推奨されているように使用してバンドの切り出しとアガロースの消化により正しい寸法のフラグメントを単離した。フラグメントＡ、Ｂ及びＤをエタノール沈殿により回収した後、連結する各フラグメントに適合するように制限酵素で予め同様に消化しておいたベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）に夫々連結した。
アニールしたオリゴマー：
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にＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化したフラグメントＣをまず連結した。次にフラグメントＣをＸｈｏＩで再切断し、４５０ｂｐＫｐｎＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化したｐＳＰ７２ベクターに連結した。連結混合物を使用して大腸菌株ＤＨ５コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を形質転換した。インサートを含むクローンについて形質転換細胞をコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。Ｗｉｚａｒｄミニプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用して陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離した後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して配列決定した。４種のフラグメントの各々について正しいＤＮＡ配列を含むクローンを前述のように消化し、ｐＳＰ７２ベクターからフラグメントを遊離させた。ＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化したフラグメントＣをＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化したフラグメントＤ及びＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで切断したｐＳＰ７２に３方向連結した。次に連結産物を使用して大腸菌を形質転換した。得られた形質転換細胞を配列決定し、正しい配列のクローンを得た（ＣＤと命名）。ＣＤの７５０ｂｐＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩインサートをｐＳＰ７２ベクターから再切断し、望ましくない連結産物を減らすようにＢｇｌＩＩを加えた以外は前述と同様にＢｇｌＩＩとＳｐｈＩで消化したフラグメントＡ及びＳｐｈＩとＫｐｎＩで消化したフラグメントＢに３方向連結した。連結産物をアガロースゲル上で分離し、１．５ｋｂｐフラグメントを単離し、Ｄ３６１−１と命名した。
ＨＰＶ６／１１  Ｌ１、ＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ６  Ｌ１酵母発現ベクターの構築。プラスミドｐＢＭ２７２（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯに所在のワシントン大学、Ｍａｒｋ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ氏から入手）からのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅダイバージェントＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーターを含むｐＵＣ１８／２方向ＧＡＬプロモータープラスミドから１．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩフラグメントを単離することにより、ｐＧＡＬ１−１０酵母発現ベクターを構築した。ダイバージェントプロモーターは両端に酵母ＡＤＨ１転写ターミネーター（ＢｅｎｎｅｔｚｅｎとＨａｌｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３０１８−３０２５）のコピーを１個ずつもち、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第１のコピーの間にＢａｍＨＩクローニング部位が配置され、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの第２のコピーの間にＳｍａＩクローニング部位が配置されている。ｐＢＲ３２２、酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子（ＥｒｈａｒｔとＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：６２５−６３５）及び酵母２ｕプラスミド（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡに所在のワシントン大学、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈａｌｌ氏から寄贈）（ＢｒｏａｃｈとＶｏｌｋｅｒｔ，１９９１，Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から構成される酵母シャトルベクターをＳｐｈＩで消化し、１．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩダイバージェントＧＡＬプロモーターフラグメントに連結し、ｐＧＡＬ１−１０を得た。
ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードするＨＰＶ６／１１ハイブリッドＬ１  ＤＮＡ（実施例１からの試料Ｄ３６１−１）はＨＰＶ６／１１  Ｌ１開始メチオニンコドンのすぐ上流に酵母非翻訳リーダー配列（Ｋｎｉｓｋｅｒｎら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１３５−１４１）を含む。ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの間をＢａｍＨＩで切断してｐＧＡＬ１−１０プラスミドを直鎖化し、１．５ｋｂｐのＨＰＶ６／１１  Ｌ１遺伝子フラグメント（試料Ｄ３６１−１）に連結した。大腸菌ＤＨ５（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）形質転換細胞をスクリーニングし、ＨＰＶ６／１１  Ｌ１遺伝子を含むｐＧＡＬ１−１０プラスミドを単離し、Ｄ３６２−１と命名した。
尖形コンジローム病変（Ｄａｒｒｏｎ  Ｂｒｏｗｎ博士から寄贈）から野生型ＨＰＶ１１（ｗｔ−ＨＰＶ１１）ＤＮＡをクローニングした。完全ヒトゲノムＤＮＡを抽出し、制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｗｔ−ＨＰＶ１１  ＤＮＡを含むフラクションをＰＣＲ用鋳型として使用する大腸菌クローニングベクターに連結した。Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）と、１０サイクルの増幅サイクル（９４℃１分間、４８℃１分間、７２℃１分４５秒間）と、フランキングＢｇｌＩＩ部位（下線部）を含む以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
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を使用してｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１遺伝子をＰＣＲ増幅した。
センスプライマーはｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１開始メチオニンコドン（太字部分）のすぐ上流に酵母非翻訳リーダー配列（Ｋｎｉｓｋｅｒｎら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１３５−１４１）を導入する。１．５ｋｂｐ  ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１  ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１−１０プラスミドに連結し、プラスミドｐ３２９−１を得た。
ＨＰＶ６ａ陽性尖形コンジローム病変（Ｄａｒｒｏｎ  Ｂｒｏｗｎ博士から寄贈）から完全ゲノムＤＮＡを抽出した。鋳型として生検試料ＤＮＡを使用し、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）と、３５回の増幅サイクル（９４℃１分間、４８℃１分間、７２℃１分４５秒間）と、ｗｔ−ＨＰＶ１１  Ｌ１のＰＣＲについて上述したセンスプライマーと、配列：
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をもつアンチセンスプライマーを使用してＨＰＶ６ａ  Ｌ１遺伝子をＰＣＲ増幅した。１．５ｋｂｐ  ＨＰＶ６ａ  Ｌ１  ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１−１０プラスミドに連結し、プラスミドＤ１２８を得た。
１５５８株の調製
ａ．酵母株Ｕ９の調製。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株２１５０−２−３（ＭＡＴα，ｌｅｕ２−０４，ａｄｅ１，ｃｉｒ0）をＬｅｌａｎｄ  Ｈａｒｔｗｅｌｌ博士（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡに所在のワシントン大学）から入手した。２１５０−２−３株の細胞をＹＥＨＤ培地５ｍＬ中で３０℃で一晩増殖させた（Ｃａｒｔｙら，１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  ２：１１７−１２１）。細胞を３回滅菌蒸留水で洗浄し、滅菌蒸留水２ｍＬに再懸濁し、細胞懸濁液０．１ｍＬを６枚の５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）プレートの各々にプレーティングし、ｕｒａ３突然変異体を選択した（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。プレートを３０℃でインキュベートした。培地は蒸留水２５０ｍＬ当たりアミノ酸と硫酸アンモニウムを含まないＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース３．５ｇ、５−フルオロオロト酸０．５ｇ、ウラシル２５ｍｇ及びデキストロース１０．０ｇを加えた。
培地を０．２μｍ膜で濾過滅菌した後、５０℃に維持した４％Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）２５０ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬアデニン溶液１０ｍＬ及びＬ−ロイシン溶液（１８０ｍｇ／５０ｍＬ）５ｍＬと混合した。得られた培地を各ペトリ皿に２０ｍＬずつ分配した。
５日間インキュベーション後、多数のコロニーが出現していた。元のＦＯＡプレートからコロニーを新しいＦＯＡプレートに再画線することにより単コロニーを単離した後、３０℃でインキュベートした。ＹＥＨＤプレートとウラシル-プレートにレプリカプレーティングすることにより、第２組のＦＯＡプレートからの多数のコロニーにｕｒａ３突然変異が存在するか否かを試験した。所望結果はＹＥＨＤで良好に増殖し、ウラシル-培地で増殖しないことであった。これらの性質を示す１個の単離株（Ｕ９）が得られた。これを後期使用に備えて−７０℃で凍結グリセロールストック（＃３２５株）として保存した。
ｂ．酵母ＭＮＮ９遺伝子の破壊用ベクターの調製。ＭＮＮ９遺伝子の破壊用ベクターを調製するためには、まずＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子をクローニングすることが必要であった。標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によりこれを実施した。酵母ＭＮＮ９遺伝子の公表配列（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ヨーロッパ特許出願第８８１１７８３４．７号、公開第０−３１４−０９６−Ａ２号）に基づき、完全長ＭＮＮ９コーディング配列のＰＣＲに用いる５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマーを設計した。フランキングＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部）を含む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用した。
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ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンは太字で示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲＹ１８８からのゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と２５回の増幅サイクル（９４℃１分間、３７℃２分間、７２℃３分間）を使用してＰＣＲを実施した。得られた１．２ｋｂｐ  ＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化してアルカリホスファヌーゼで処理しておいたｐＵＣ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結した。得られたプラスミドをｐ１１８３と命名した。
ＭＮＮ９遺伝子を酵母ＵＲＡ３遺伝子で破壊するために、（ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子をコードする１．１Ｋｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む）プラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、機能的ＵＲＡ３遺伝子をもつ１．１ｋｂｐ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、ＰｍｌＩで消化しておいたプラスミドｐ１１８３（ＰｍｌＩはＭＮＮ９コーディング配列の内側を切断する）に連結した。得られたプラスミドｐ１１９９は機能的ＵＲＡ３遺伝子によるＭＮＮ９遺伝子の破壊を含む。
ｃ．ＭＮＮ９遺伝子の破壊を含むＵ９誘導株１３７２の構築。Ｕ９株（＃３２５）でＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、ｐ１１９９プラスミド３０μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、直鎖状ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３破壊カセットを構築した。３２５株の細胞をスフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３）によりＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐ１１９９ＤＮＡで形質転換し、ウラシルを含まず且つ１．０Ｍソルビトールを含む合成寒天培地で形質転換細胞を選択した。合成培地は蒸留水１リットル当たり寒天２０ｇ、酵母窒素ベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ、アデニン０．０４ｇ、Ｌ−チロシン０．０５ｇ、ソルビトール１８２ｇ、グルコース２０ｇ及びロイシン-溶液＃２  １０ｍｌを加えた。ロイシン-溶液＃２は蒸留水１リットル当たりＬ−アルギニン２ｇ、Ｌ−ヒスチジン１ｇ、Ｌ−ロイシン６ｇ、Ｌ−イソロアシン６ｇ、Ｌ−リジン４ｇ、Ｌ−メチオニン１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン６ｇ、Ｌ−トレオニン６ｇ、Ｌ−トリプトファン４ｇを含む。
プレートを３０℃で５日間インキュベートすると、多数のコロニーが出現した。コロニー１０個から染色体ＤＮＡ調製物を調製した後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次に、（プラスミドｐ１１９９から単離した）ＭＮＮ９遺伝子をもつ１．２ｋｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをプローブとして使用してＤＮＡ消化産物をサザンブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｔｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により評価した。サザンブロット上の予想ＤＮＡバンドシフトと、ｍｎｎ９突然変異体が一般に示すような極度の塊状を示す単離株（＃１３７２株）を同定した。
ｄ．酵母ＨＩＳ３遺伝子の破壊用ベクターの構築。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子をＵＲＡ３遺伝子により破壊する破壊用カセットを構築するために、プラスミドＹＥｐ６（Ｓｔｒｕｈｌら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５）をＢａｍＨＩで消化し、ＨＩＳ３遺伝子をもつ１．７ｋｂｐ  ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、ＢａｍＨＩで予め消化してＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたｐＵＣ１８に連結した。得られたプラスミド（ｐ１５０１又はｐＵＣ１８−ＨＩＳ３と命名）を（ＨＩＳ３コーディング配列を切断する）ＮｈｅＩで消化し、ベクターフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。ＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりプラスミドｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３からＵＲＡ３遺伝子を単離し、ＵＲＡ３遺伝子をもつ１．１ｋｂｐフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、上記ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３  ＮｈｅＩフラグメントに連結した。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３又はｐ１５０５と命名）は酵母ＨＩＳ３遺伝子を機能的ＵＲＡ３遺伝子により破壊する破壊用カセットを含む。
ｅ．ＨＩＳ３遺伝子による酵母ＰＲＢ１遺伝子の破壊用ベクターの構築。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＲＢ１遺伝子をもつプラスミドＦＰ８ΔＨをカーネギー・メロン大学のＥ．Ｊｏｎｅｓ博士から入手した（Ｍｏｅｈｌｅら，１９８７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５：２５５−２６３）。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＰＲＢ１遺伝子をもつ３．２ｋｂｐ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端にした。プラスミドｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ消化処理により平滑末端にした。得られたベクターフラグメントを上記ＰＲＢ１遺伝子フラグメントに連結し、プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を得た。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドＹＥｐ６をＢａｍＨＩで消化した。得られた機能的ＨＩＳ３遺伝子をもつ１．７ｋｂｐ  ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製した後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端にした。プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１をＥｃｏＲＶとＮｃｏＩで消化し、ＰＲＢ１コーディング配列を切断してプロテアーゼＢ活性部位とフランキング配列を除去した。ｐＵＣ１８にＰＲＢ１コーディング配列の残留５’及び３’部分をもつ５．７ｋｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端にし、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸し、上記平滑末端ＨＩＳフラグメントに連結した。得られたプラスミド（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、ストック＃１２４５と命名）は上記のように欠失させたＰＲＢ１遺伝子の部分の代わりに機能的ＨＩＳ３遺伝子を含む。
ｆ．ＭＮＮ９及びＰＲＢ１遺伝子の両者の破壊を含むＵ９関連酵母株の構築。ＭＮＮ９遺伝子破壊を含むＵ９関連株１３７２を構築した。１３７２株のクローン単離株をＦＯＡプレートに継代し、ｕｒａ３突然変異株を選択した。１３７２株の多数のｕｒａ３単離株を得、その後のＨＩＳ３遺伝子の破壊に１個の特定単離株（１２９３０−１９０−Ｓ１−１株）を選択した。ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３遺伝子破壊ベクター（ｐ１５０５）をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化して直鎖状ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３破壊カセットを生成し、酢酸リチウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９２，１９４：２９０）により１２９３０−１９０−Ｓ１−１株の形質転換に使用した。ウラシルを含まない合成寒天培地でｕｒａ+形質転換細胞を選択し、同一培地でクローン単離株のために再画線した後、ウラシル又はヒスチジンを含まない培地にレプリカプレーティングし、Ｕｒａ+且つＨｉｓ-の単離株をスクリーニングした。ＰＲＢ１遺伝子のその後の破壊のために１個の単離株（１２９３０−２３０−１株）を選択した。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、ストック＃１２４５）をＳａｃＩとＸｂａＩで消化して直鎖状ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊用カセットを生成し、酢酸リチウム法により１２９３０−２３０−１株の形質転換に使用した。ヒスチジンを含まない寒天培地でＨｉｓ+形質転換細胞を選択し、同一培地でクローン単離株のために再画線した。得られた多数のＨｉｓ+単離株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化した後、０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。次に、以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー：
0004598201.tif 000012
を使用して予めＰＣＲにより調製しておいたＰＲＢ１遺伝子の放射性標識６１７ｂｐプローブを使用してサザンブロット分析を実施した。
２．４４ｋｂｐ  ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３  ＤＮＡフラグントとプローブの予想通りのハイブリダイゼーションを示す１１個の単離株が得られた。これに対して、野生型ＰＲＢ１遺伝子ではプローブは１．５９ｋｂｐフラグントとハイブリダイズした。所望のｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊を含むこれらの単離株の１個を後期使用に備えて選択し、＃１５５８株と命名した。
実施例２
酵母におけるＨＰＶ１１  Ｌ１及びＨＰＶ６  Ｌ１の発現。プラスミドＤ３６２−１（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ６／１１Ｌ１）、ｐ３２９−１（ｐＧＡＬ１−１０＋ｗｔ−ＨＰＶ１１Ｌ１）、Ｄ１２８（ｐＧＡＬ１−１０＋ＨＰＶ６  Ｌ１）及びｐＧＡＬ１−１０を使用してスフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，１９２９−１９３３）によりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５５８（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２−０４，ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３，ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３，ａｄｅ１，ｃｉｒ0）を形質転換した。プラスミドＤ３６２−１で形質転換した＃１５５８酵母株を＃１７８２株と命名した。ＲＮＡ試験については、０．１Ｍソルビトールと２％グルコース又はガラクトースを含むＹＥＨ複合培地（Ｃａｒｔｙら，１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．２，１１７−１２１）で酵母クローン単離株を３０℃で２６時間増殖させた。細胞を回収後、文献に記載されている熱酸性フェノール法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９３）を使用して酵母ＲＮＡを抽出した。タンパク質分析については、０．１Ｍソルビトール、２％グルコース及び２％ガラクトースを含むＹＥＨ複合培地で同一単離株を３０℃で７０時間増殖させた。細胞を回収後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、イムノブロット分析によりＨＰＶ１１  Ｌ１又はＨＰＶ６  Ｌ１の発現について細胞溶解液を分析した。
ＨＰＶ６／１１  Ｌ１（＃１７８２株）の発酵。培地１リットル当たりアミノ酸と硫酸アンモニウムを含まないＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース８．５ｇ、アデニン０．２ｇ、ウラシル０．２ｇ、コハク酸１０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ及びＬ−チロシン０．２５ｇを含み、滅菌前にＮａＯＨでｐＨ５．０〜５．３に調整した無ロイシン液体培地に、１７８２株のプレート培養物の表面増殖細胞を無菌移転した。ロータリーシェーカーを２５０ｒｐｍに設定して２８℃で２５時間増殖させた後、−７０℃で保存前に無菌グリセロールを最終濃度１７％（ｗ／ｖ）まで加えることにより凍結培養バイアルを調製した（クリオバイアル当たり１ｍＬ）。１７８２株の発酵用接種材料を同一培地（２Ｌ容フラスコ当たり７５０ｍＬ）に蒔き、２本の凍結培養バイアルの内容物を融解して２Ｌ容フラスコに移し、ロータリーシェーカーを２５０ｒｐｍに設定して２８℃で２５時間インキュベートした。１７８２株の発酵には接種後に１８Ｌの作業容量をもつＣｈｅｍａｐ  ２３Ｌ発酵槽を使用した。培地１Ｌ当たりＤｉｆｃｏ酵母エキス２０ｇ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ＨｙＳｏｙペプトン１０ｇ、グルコース２０ｇ、ガラクトース２０ｇを含む産生用培地を使用し、滅菌前にｐＨ５．３に調整した。２Ｌ容接種材料フラスコの全内容物（５００ｍＬ）を発酵槽に移し、２８℃、９Ｌ空気／分、５００ｒｐｍ、３．５ｐｓｉ圧でインキュベートした。必要に応じて撹拌を強め、＞４０％飽和の溶存酸素濃度を維持した。発酵の進行をオフライングルコース測定（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２  Ａｎａｌｙｚｅｒ）とオンライン質量分析（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  １２００）によりモニターした。６６時間インキュベーション後、９．３２ｇ細胞乾量／Ｌの細胞密度に達した。このような発酵を２回実施し、内容物（ブロス合計１７．５Ｌ）を細胞回収までプールした。培養物を中空繊維濾過（Ａｍｉｃｏｎ  ＤＣ−１０濾過システムでＡｍｉｃｏｎ  Ｈ５ＭＰ０１−４３カートリッジを使用）により約２Ｌまで濃縮し、リン酸緩衝食塩水２Ｌで透析濾過し、（約１Ｌまで）更に濃縮した後、５００ｍＬ容遠心びんに分配した。８，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ  ＧＳ３ローター）で２０分間４℃で遠心分離することにより細胞ペレットを集めた。上清をデカント後、ペレット（合計細胞湿量３５８ｇ）を使用時まで−７０℃で保存した。
組換えＨＰＶ１１型Ｌ１キャプシドタンパク質の精製。全工程は特に指定しない限り４℃で実施した。細胞を−７０℃で凍結乾燥した。凍結細胞（湿量＝１８０ｇ）を２０〜２３℃で融解し、「粉砕用バッファー」（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．２，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ2）９００ｍＬに再懸濁した。プロテアーゼインヒビターＡＥＢＳＦ及びペプスタチンＡを夫々最終濃度１ｍＭ及び１．７ｍＭまで加えた。細胞スラリーをＭ１１０−Ｙ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に４回通して約１６，０００ｐｓｉ圧で粉砕した。粉砕した細胞スラリーに十分な量の１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（登録商標）洗剤（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加え、ＴＸ１００の濃度を０．５％にした。スラリーを２０時間撹拌した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で処理した溶解液を１２，０００ｘｇで４０分間遠心分離し、細胞破片を除去した。Ｌ１タンパク質を含む上澄み液を回収した。
３００Ｋタンジェンシャルフローメンブランカセット（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して上澄み液を２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，０．５Ｍ  ＮａＣｌ５容量で透析濾過した。膜に保持された材料はラジオイムノアッセイとウェスタンブロッティングによると、Ｌ１タンパク質を含むことが判明した。
２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，０．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳＰ  Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ（Ｍ）（登録商標）樹脂（ＩＢＦ，Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ，仏国）の高分解能アフィニティカラム（１１．０ｃｍＩＤｘ５．３ｃｍ）に濾渣を加えた。平衡化バッファーによる洗浄と、２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１．０Ｍ  ＮａＣｌによるステップ洗浄後、Ｌ１タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，２．５Ｍ  ＮａＣｌのステップ洗浄により溶離した。洗浄及び溶離中にフラクションを集めた。カラムフラクションの合計タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。次にフラクションをウェスタンブロッティング及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとコロイドクーマシー検出により分析した。更にラジオイムノアッセイによりフラクションを分析した。
妥当な純度とＬ１タンパク質の集積を示すＳＰ  Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘフラクションをプールした。最終産物をウェスタンブロッティング及びＳＤＳ−ＰＡＧＥとコロイドクーマシー検出により分析した。Ｌ１タンパク質は＞９０％均質であると推定された。Ｌ１タンパク質をウェスタンブロッティングにより同定した。最終産物を０．２２ｍｍメンブレンで滅菌濾過し、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ及び１．２５Ｍ  ＮａＣｌに−７０℃で保存した。
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により電子顕微鏡分析を実施した。試料のアリコートを２００メッシュ炭素被覆銅グリッドに載せた。ｐＨ７．０の２％リンタングステン酸１滴をグリッドに２０秒間滴下した。グリッドを風乾後、ＴＥＭ試験した。全顕微鏡試験はＪＥＯＬ１００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を１００ｋＶの加速電圧で使用して実施した。顕微鏡写真は最終倍率１００，０００倍とした。
全タンパクのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ。市販Ｃｏｏｍａｓｓｉ  Ｐｌｕｓ（登録商標）キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して全タンパクを定量した。試料はＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏで適当な濃度まで希釈した。標準及びマイクロアッセイプロトコールに必要な容量は夫々０．１ｍＬ及び１．０ｍＬであった。どちらのプロトコールもＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して標準曲線を作成した。アッセイは製造業者の指示に従って実施した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ＩＩｃｉコンピューターでＣｒｉｃｋｅｔＧｒａｐｈ（登録商標）ソフトウェアを使用して標準曲線をプロットした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットアッセイ。全ゲル、バッファー及び電気泳動装置はＮｏｖｅｘ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、製造業者の指示に従って使用した。要約すると、試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏで等タンパク濃度まで希釈し、２００ｍＭ  ＤＴＴを含む試料インキュベーション用バッファーと１：１に混合した。試料を１５分間１００℃でインキュベートし、プレキャスト１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルに加えた。試料を１２５Ｖで１時間４５分間電気泳動した。市販キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用してコロイドクーマシー染色によりゲルを展開した。
ウェスタンブロットについては、タンパク質を２５Ｖで４０分間ＰＶＤＦメンブレンに移した。メンブレンをＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ2Ｏで洗浄し、風乾した。一次抗体はＴｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク質（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ博士から寄贈）に対するポリクローナルウサギ抗血清とした。抗体溶液は抗血清をブロッティングバッファー（６．２５ｍＭ  リン酸Ｎａ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０２％  ＮａＮ3中５％無脂乳）で希釈することにより調製した。少なくとも１時間２０〜２３℃でインキュベートした。ＰＢＳ（６．２５ｍＭ  リン酸Ｎａ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を３回ずつ交換してブロットを１分間洗浄した。二次抗体溶液はヤギ抗ウサギｉｇＧアルカリホスファターゼ結合抗血清（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をブロッティングバッファーで希釈することにより調製した。同一条件下で少なくとも１時間インキュベートした。ブロットを前述と同様に洗浄し、１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して検出した。
実施例３
凝集のタンパク質濃度依存性
上述のようにＨＰＶ１１  ＶＬＰのロットを調製し、１．２５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳ中０．４７ｍｇ／ｍＬで保存した。このロットを融解し、この溶液の一部を同一バッファーで１８μｇ／ｍＬまで希釈した。タンパク質濃度の高いストック溶液は１０７〜１１５ｎｍ（動的光散乱により測定）の同一流体力学的直径（Ｄh）を４℃で２カ月間維持したが、タンパク質濃度の低い溶液は塩濃度を１．２５Ｍ  ＮａＣｌに維持しても時間が経つにつれて凝集した（図１）。図１から明らかなように、ＨＰＶタンパク質濃度が低いと、塩濃度が高くても４℃で保存中にＨＰＶの凝集を阻止できない。
実施例４
凝集の塩濃度依存性
ＨＰＶ１１及びＨＰＶ１６  ＶＬＰのロットを調製し、保存中の流体力学的寸法の塩依存性を試験した。組換えＨＰＶ１１及び１６ＶＬＰを（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，１．２５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０中）ストック溶液から５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファーで希釈し、最終タンパク質濃度を約２０ｇ／ｍＬの一定値に維持し、ＮａＣｌ濃度は図２に示すように変化させた。希釈液はポリプロピレンエッペンドルフチューブで調製し、室温で保存した。実施例３（図１）に記載したように塩濃度の高い溶液でもこのタンパク質濃度ではゆっくりと凝集が生じるので、希釈液の調製から１時間以内に測定した。Ｄh値は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＨＰＶ１１）及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ＨＰＶ１６）までほぼ変化しなかったが、塩濃度がそれ以下になると増加した（図２）。他方、ＨＰＶ１１の透析試料のほうが全塩濃度で大きい流体力学的寸法を示し、効果は０．５Ｍ  ＮａＣｌ未満の塩濃度で特に顕著であった。
ＨＰＶ１１の別のロットで行った別の実験（データは図形式で示さず）によると、（種々のＮａＣｌ濃度の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）で透析した）組換えＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰは０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の約１１３ｎｍから０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中の１３３ｎｍまでのＤｈの増加を示した。１．０、２．０及び３．０Ｍ  ＮａＣｌで透析した試料は照合比較で１１４、１１３及び１０８ｎｍのＤｈ値を示したが、ＮａＣｌ濃度０．０２５Ｍで透析した試料は目に見える沈殿を形成した。０．０２５Ｍ  ＮａＣｌ中の試料は溶液に残存している１６μｇ／ｍＬのタンパク質しか含有していなかったが、それ以外の試料のタンパク質濃度は１３０〜１７９μｇ／ｍＬ（Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイにより測定）であった。２．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）に保存して透析しなかった対照試料のＤｈ値は８２ｎｍであった。
本実施例のデータから明らかなように、塩濃度が低いか又はイオン強度が低いと、ＨＰＶ  ＶＬＰの粒子間凝集を招くが、低タンパク質濃度やＨＰＶ溶液の物理的操作（例えばタンパク質の透析）もＨＰＶ  ＶＬＰ凝集の要因である。
実施例５
ＨＰＶ１１  ＶＬＰの表面吸着
透析膜表面。透析膜の表面積を変えて０．１８Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー中５０μｇ／ｍＬタンパク質溶液をインキュベートし、ＨＰＶ１１凝集に及ぼす透析膜の直接効果を試験した。Ｄｈは室温で９６時間インキュベーション後に膜の表面積の増加と共に増加することが判明した（図３）。同時に、溶液中のタンパク質濃度は膜表面積の増加と共に低下することが判明した（図３）。これらの知見はＨＰＶ１１が膜表面に吸着することを示しており、表面吸着と凝集の相関を示唆している。これらのデータによると、低濃度のＨＰＶをポリプロピレン表面や透析膜表面に長時間暴露すると表面吸着と凝集が生じる。これらのプロセスはいずれも温度依存性である。４℃でインキュベートした試料はどちらのプロセスについても２５℃でインキュベートした試料より反応速度が遅かった。
種々の容器表面へのＨＰＶ吸着の比較。比表面積を一定にし、ＨＰＶ濃度を変えてホウケイ酸ガラス、ポリプロピレン及びポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ2の同一直径）でＨＰＶ吸着を比較した。ｐＨ７．０で１．２５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー中で試料をインキュベートし、室温で２４時間放置した。図４から明らかなように、ホウケイ酸ガラスでは１００μｇ／ｍＬ未満で相当の表面吸着が生じる。ポリプロピレンのほうが良好であり、３０μｇ／ｍＬ未満では吸着が相当問題となるが、同一条件で濃度が高ければ問題ない。ポリスチレンが最良であり、１０μｇ／ｍＬまで下げても有意タンパク質吸着を示さない。
ＨＰＶ１１（０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー中１８μｇ／ｍＬ）を２種の異なる比表面積でポリプロピレンチューブに入れ、ＨＰＶの表面吸着を更に試験した（図５）。室温で１日後、６．０ｃｍ-1の比表面積ではＨＰＶのほぼ全量が表面吸着したが、比表面積を４．０ｃｍ-1にすると吸着は約１５％であった（図５）。
実施例６
ＨＰＶ１１  ＶＬＰ表面吸着及び凝集を阻止する賦形剤
加速安定性実験における界面活性剤のスクリーニング。予備スクリーニング実験として、ＨＰＶ１１試料を０．０１％の数種の界面活性剤の存在下と不在下に室温で２０時間インキュベートした。ＨＰＶ濃度は１８μｇ／ｍＬとし、バッファーは５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０とした。動的光散乱により測定した処、数種の界面活性剤は界面活性剤で処理しなかったＨＰＶ試料に比較して同一条件下で凝集を部分的に防止した（図６Ａ）。
より苛酷な条件で界面活性剤スクリーニング実験を実施した。ＨＰＶ１１を各界面活性剤０．０１％の不在下又は存在下に５０℃で３０分間後、室温で２日間インキュベートした。ＨＰＶ濃度は１８μｇ／ｍＬとし、バッファーは５０ｍＭ  ＭＯＰＳ及び０．０４Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０とした。これらの条件下で、界面活性剤で処理しなかった対照ＨＰＶ試料は上記実験に比較して著しく高い程度まで凝集した。図６Ｂから明らかなように、試験した界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））とポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ  ５８（登録商標））がＨＰＶ１１  ＶＬＰ凝集を最良に防止した。
塩とＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０の組み合わせ防止効果。図７Ａ及び７Ｂから明らかなように、ＨＰＶ濃度が低いと、各々０．１Ｍ及び０．５Ｍの塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムでは塩濃度を高くしただけではＨＰＶ  ＶＬＰ表面吸着又は凝集を防止できない。他方、同様に図７Ａ及び７Ｂから明らかなように、０．４Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーに非イオン界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を加えると、室温で６日後でも吸着と凝集をほぼ完全に防止できる。
表面吸着と凝集に及ぼすＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標））の効果を別の実験で再確認した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）の存在下又は不在下に２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７を含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファーを入れたポリプロピレンチューブで濃度１８μｇ／ｍＬのＨＰＶ１１  Ｌ１  ＶＬＰをインキュベートした。図８は室温でインキュベーション時間の関数として吸着タンパク質の百分率とＤｈ値を示す。Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）の不在下では、吸着損失と凝集が非常に顕著であるが、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を加えるとどちらの問題も防止できる。
図９は、低濃度のＨＰＶ１１  ＶＬＰ（１００μｇ／ｍＬ）を凝集と吸着から防止するにはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０に加えて最適塩濃度が必要であることを示す。また、イオン強度の低い製剤でＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を増加すると、完全ではないが部分的に防止できることも明らかである。図９から明らかなように、５０ｍＭ  ＭＯＰＳと０．０４Ｍ  ＮａＣｌａを含むバッファーに０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）を加えてもＨＰＶ１１（１８μｇ／ｍＬ）の凝集を部分的にしか防止できないが、ＮａＣｌ濃度を０．１０Ｍまで上げると室温で４８時間ＶＬＰ凝集をほぼ完全に防止できた。
図１０は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０を含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー中のＨＰＶ１１  ＶＬＰ（１８μｇ／ｍＬ）の凝集に及ぼすＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０滴定の効果を示す。０〜０．０１％の濃度のＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）と共に試料を４℃と室温でインキュベートした。室温では部分的な凝集防止が観察されるが、４℃では０．０１％Ｔｗｅｅｎを含む試料に２０日間まで有意凝集は全く観察されなかった。
図１１は非イオン界面活性剤がＨＰＶ１６  ＶＬＰを凝集から防止する能力を示す。試験した界面活性剤はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（例えばＴｗｅｅｎ  ８０）、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０（例えばＴｗｅｅｎ  ２０）、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４及びポリオキシエチレンアルキルエーテル類（例えばＢｒｉｊ  ３５及びＢｒｉｊ  ５８）である。２０μｇ／ｍＬタンパク質のＨＰＶ１６試料を０．０１％の種々の界面活性剤と共に夫々室温（周囲温度）で５０日間インキュベートした。インキュベーションバッファーは５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７とした。ＤＬＳにより測定した処、全界面活性剤は保存中にＨＰＶ１６の凝集を防止したが、界面活性剤を加えなかった対照ＨＰＶ１６試料はそうではなかった（図１１）。この界面活性剤濃度（０．０１％）の防御の程度は界面活性剤毎に多少異なる。非イオン界面活性剤の防御能の塩依存性を試験するために、３０〜６０μｇ／ｍＬタンパク質のＨＰＶ１６試料を０．０１〜０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．１５〜０．５ＭのＮａＣｌ濃度で４℃で２４時間インキュベートした。ＮａＣｌ濃度が０．２Ｍ以上では非イオン界面活性剤との併用によりＨＰＶ１６  ＶＬＰ凝集を有意に防止できることが判明した。
非イオン界面活性剤の存在下のＨＰＶ凝集に対する塩濃度の安定化効果を全イオン強度により試験した。図２及び図９から明らかなように、非イオン界面活性剤の存在下又は不在下でＨＰＶ  ＶＬＰを安定化するためには最小ＮａＣｌ濃度が必要である。以下の実験では、種々の塩が一定イオン強度でＨＰＶ１６  ＶＬＰを安定化する能力を試験した。６０μｇ／ｍＬ  ＨＰＶ１６を２２℃で２４時間インキュベートした後、動的光散乱とＥＩＡ及びＢＩＡコア分析によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性（抗体結合）により流体力学的寸法（Ｄｈ）をアッセイするまで４℃で保存した。表１は、ＮａＣｌの代わりに種々の塩を使用した場合に同一イオン強度で塩濃度を低くしても同様のＨＰＶ安定性が観察されたことを示す。対照として、低イオン強度溶液はＨＰＶ凝集と抗原性の部分的損失を生じた。これらの結果は、塩安定化効果がこれらの条件下では塩の種類よりもイオン強度により支配されることを示唆している。より苛酷な条件（３７℃）で同様の塩安定化効果を試験した処、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原性アッセイと凝集分析により示すように、種々の塩の間に安定化能の多少の相違が観察された。例えば、ＣａＣｌ2とＭｇＣｌ2とリン酸バッファーは一定イオン強度でＨＰＶ  ＶＬＰの安定化効果が低かった。
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従って、０．０１％程度の低い濃度でもＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０が存在すると、ほぼ生理的イオン強度で数週間４℃でＨＰＶ１１とＨＰＶ１６を容器表面吸着と粒子間凝集から防止する。これらのデータは更に、（１）ＨＰＶの表面吸着と凝集が関連しており、（２）洗剤のみ又は塩のみでは吸着も凝集も完全に防止することができないことから静電及び疎水性メカニズムが関与しているらしいことも示している。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１６４
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡオリゴマー
配列
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配列番号：２
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配列
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配列番号：３
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配列
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配列
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配列番号：５
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配列番号：１０
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配列
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配列
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配列番号：２３
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配列
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配列番号：２４
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配列
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配列番号：２５
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配列の型：核酸
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配列
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配列番号：２６
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配列
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配列番号：２８
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配列
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配列番号：２９
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配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡオリゴマー
配列
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配列番号：３０
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配列の型：核酸
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配列
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配列番号：３１
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配列
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配列
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配列
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配列番号：３４
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配列
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配列番号：３５
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡオリゴマー
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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