(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
近交系ＦＬＳマウスに、正常なob遺伝子産物を発現しない変異を有するob遺伝子を戻し交配で導入することにより得られるコンジェニックマウス。
【請求項２】
肥満性II型糖尿病のモデルマウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウス由来のob遺伝子を導入した請求項１記載のマウス。
【請求項３】
導入されたob遺伝子をホモに有する請求項１または２に記載のマウス。
【請求項４】
以下の特徴を有する請求項３に記載のマウス：
１）５週齢から１５週齢にかけて雌雄ともにほぼ全例で尿糖強陽性が観察される；
２）雌雄とも若齢時から顕著な体重増加を示す；
３）若齢時から２０週齢にかけて著しい高血糖状態が持続する；
４）高インスリン血症を示す；
５）耐糖能の異常が認められる；
６）若齢時から２０週齢にかけて血中コレステロール、トリグリセライド、リン脂質濃度の上昇による高脂血症を呈する；
７）通常飼料飼育下で若齢時からトリグリセライドの沈着を主とした重篤な脂肪肝を発症する；及び
８）老齢個体に肝腫瘍が自然発生する。
【請求項５】
肥満性II型糖尿病の病態と重症肝疾患とを示す、請求項３または４に記載のマウス。
【請求項６】
導入されたob遺伝子をヘテロに有する請求項１または２に記載のマウス。
【請求項７】
以下の特徴を有する請求項６に記載のマウス：
１）通常飼料飼育下で若齢時からトリグリセライドの沈着を主とした脂肪肝を発症する；及び
２）老齢個体に肝腫瘍が自然発生する。
【請求項８】
肝疾患の病態を示す、請求項６または７に記載のマウス。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のマウスを交配させ、ob遺伝子をホモに有する動物を選択することからなる、肥満性II型糖尿病の病態と重症肝疾患とを示すヒト疾患モデルマウスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は疾患モデル動物に関し、さらに詳しくは近交系ＦＬＳマウスに、変異を有するob（obese）遺伝子、例えばII型糖尿病マウスのob遺伝子、を導入することにより製された新規のコンジェニック系統マウスであって、肥満性II型糖尿病及び／又は肝疾患のためのモデルマウスに関する。
背景技術
ヒトにおける糖尿病は、インスリンの分泌不全、絶対欠乏によりもたらされるインスリン依存性糖尿病（I型糖尿病）と、末梢組織におけるインスリンの作用が低下し、組織内へのグルコースの取り込みが円滑に行われないことにより高血糖を惹起するインスリン非依存性糖尿病（II型糖尿病）の２つに大別される。前者の場合には膵炎や自己免疫疾患等あるいは重篤なII型糖尿病の続発症として膵ラ氏島が機能低下あるいは破壊されインスリン欠乏をきたす。その治療法として、インスリン製剤の投与により血糖値のコントロールが行われる。後者はその病因が多様であると考えられており、主たる成因は未だ解明されていない。ヒトのII型糖尿病患者に多く認められる病態の特徴として、肥満、高インスリン血症、耐糖能異常、高脂血症、脂肪肝などが報告されている。特に肥満はII型糖尿病発症の重大な危険因子である。これらの病態は、直接患者の生命にかかわるような深刻なものではないが、二次的に惹起される様々な合併症を引き起こす原因となっており、結果として患者の体機能の障害や、寿命の短縮を引き起こす要因となっている。
糖尿病に限らず、多くのヒト疾患の成因究明や治療法の研究において、近年、疾患モデル動物が重要な役割をはたすようになっている。例えば、Ｉ型糖尿病のモデルとしてＮＯＤマウス（Makino,S.et al.:Exp.Anim.,29,1-13,1980）、ＢＢラット（Chappel,C.I.et al.:Metabolism,32,8-10,1983）があり、特にＮＯＤマウスはヒトにおけるＩ型糖尿病の遺伝要因を解明する上で、極めて重要な役割をはたしている。
一方、II型糖尿病はその成因、病態が多様であるため、その病因や治療法の研究を、単一の動物モデルを用いて行うことは不可能である。したがって、ヒト糖尿病の示す様々な病態の特徴を細分化し、それぞれの特徴に最も適した動物モデルを開発し、研究に利用することが求められている。現在ヒトII型糖尿病モデル動物としては、数多くの動物が提供されているが、既存のモデル動物では、多様なヒトII型糖尿病の病態の全てを網羅することができないため、さらに新しいタイプのII型糖尿病モデル動物を作出することが、ヒトII型糖尿病の成因究明及び治療研究等にとって必要とされている。また、肥満、糖尿病に伴う脂肪肝や肝癌を含む肝疾患の罹病率の増大に伴い、自然発症性の肝疾患に関する新しいモデル動物の開発も望まれている。
発明の開示
本発明は、上記の需要に応えるものであり、肥満性II型糖尿病及び／又は肝疾患のモデル動物として有用なマウスであって、近交系ＦＬＳマウスを背景遺伝子とし、正常なob遺伝子産物が発現していないヒト疾患モデルマウスを提供するものである。
本発明のヒト疾患モデルマウスの製造には、当該技術分野で用いられる任意の遺伝育種学的手法を用いることができ、例えば、上記近交系ＦＬＳマウスに既存の変異を有するob（obese）遺伝子を戻し交配により導入する方法が好ましい。また、本発明マウスは分子遺伝学的手法、例えば、ＦＬＳマウスの有するob遺伝子のノックアウト法によっても製造できる。ノックアウト法については、J oyner,A.L.ed.:Gene Targeting,IRL Press,Oxtord（1993）に詳述されている。
上記の遺伝育種学的手法により導入されるob遺伝子としては、本発明の目的に適う限り、任意のマウス由来の変異を有するob遺伝子を用いることができる。例えば、マウスの肥満形質を決定する単一遺伝子変異として、少なくとも６対の遺伝子座におけるものが知られているが、その１つであるob遺伝子による肥満は既に1950年に報告され、以後、主にＣ５７ＢＬ／６Ｊを遺伝背景とするＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obコンジェニックマウスが肥満及びII型糖尿病のモデル動物として利用されている。この変異を有するob遺伝子はY.Zhangら（Y.Zhang et al.,Nature 372 1994,425-432）により1994年にクローニングされ、そのｃＤＮＡの塩基配列も決定された。
従って、このようにして得られる動物の内、導入されたob遺伝子をホモに有するコンジェニック動物は、正常なob遺伝子産物（レプチン）を発現せず、本発明のヒトII型糖尿病モデルマウスとして有用である。
導入すべきob遺伝子の供給源としては、本発明の目的に適うことを条件として任意の既存の変異を有するob遺伝子を持つマウスを使用することができるが、そのような動物として、上記のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスが最も一般的であり、入手も容易である。
なお、本明細書中、近交系ＦＬＳマウスに導入される、又は導入されたob遺伝子は、変異を有するob遺伝子を意味する。
このようにして得られる動物の内、導入されたob遺伝子に関して、遺伝子型がヘテロである個体（ob／＋）は肝疾患の病態を表し、遺伝子型がホモである個体（ob／ob）は、導入されたob遺伝子の起源である肥満性II型糖尿病モデルマウス（例、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob）よりも重篤な肥満性II型糖尿病及び重症肝疾患を示す。
このように、本発明マウスは、ＦＬＳマウスを背景遺伝子とし、肥満性II型糖尿病マウス由来の導入されたob遺伝子を有している新規なマウスであって、該ob遺伝子に関してホモ（ob／ob）である個体とヘテロ（ob／＋）である個体を含む。これらの個体はいずれもＦＬＳに由来する脂肪肝や肝腫瘍等の肝疾患を発現するが、前者は、さらに肥満性II型糖尿病を併発する。いずれの型のマウスも疾患モデルマウスとして有用であると同時に、後者はそれら疾患モデルマウスの親動物としても有用である。
従って、本発明は、肥満性II型糖尿病の病態と重症肝疾患とを示すモデルマウスであって、近交系ＦＬＳマウスに、既存の変異を有するob遺伝子を有するマウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスのob遺伝子を戻し交配により導入することにより製され、導入されたob遺伝子をホモに有するマウス（ob/ob型マウスと称する）を提供するものである。
上記のob/ob型マウスは、例えば、以下の特徴を有する。
１）５週齢から１５週齢にかけて雌雄ともにほぼ全例で尿糖強陽性が観察される；
２）雌雄とも生後５週齢で既に正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスより約５〜１０ｇの体重増加が認められる；
３）若齢時から２０週齢にかけて４００ｍｇ／ｄｌ前後の著しい高血糖状態が持続する；
４）３００μＵ／ｍｌを越える高インスリン血症を示す；
５）耐糖能の異常が認められる；
６）若齢時から２０週齢にかけて高脂血症を呈し、血中コレステロール、トリグリセライド、リン脂質濃度はそれぞれ４００ｍｇ／ｄｌ以上に達する；
７）通常飼料飼育下でも若齢時からトリグリセライドの沈着を主とした脂肪肝を呈し、肝臓重量は正常マウスの５〜１０倍高値を示す；及び
８）老齢個体に肝腫瘍が自然発生する。
さらに、本発明は肝疾患の病態を表す疾患モデル動物であると同時に肥満性II型糖尿病モデルマウスの製造にも有用なマウスであって、近交系ＦＬＳマウスに、変異を有するob遺伝子を有するマウス、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスの変異を有するob遺伝子を戻し交配により導入することにより製され、該ob遺伝子をヘテロに有するマウス（ob/＋型マウスと称する）を提供するものである。
上記のob／＋型マウスは、例えば以下の特徴を有する。
１）通常飼料飼育下で若齢時からトリグリセライドの沈着を主とした脂肪肝を発症する；及び
２）老齢個体に肝腫瘍が自然発生する。
このように、ob／＋型マウスは肝疾患、特に肝腫瘍のモデルマウスとしても有用であると同時に、上記ob／ob型モデルマウスの製造における親動物としても有用である。即ち、該ob／ob型マウスは、ob／＋マウスを交配させ、ob遺伝子をホモに持つ個体を選択することにより製造することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＦＬＳ−ob／obマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスにおける尿糖出現率の推移を示すグラフである。
第２図は１０週齢における雌性ＦＬＳ−ob／obマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスにおける経口グルコース負荷試験の結果を示すグラフである。
第３図はＦＬＳ−ob／obマウス作出過程を示す模式図である。
第４図はＰＣＲ-select cDNA subtraction kit（CLONTECH社）を用いたサブトラクトcDNA作製の概略を示す図である。
第５図は、ノーザンブロットで分析したＦＬＳ-ob／obマウス肝組織におけるＯＰＮ（オステオポンチン）、ＰＡＰ（pancrea titis-associated protein）ｍＲＮＡの発現を示す写真の模写図である。６Ｍは６ケ月齢肝組織、１２Ｍは１２ケ月齢肝組織、１８Ｍは１８ケ月齢肝組織（肝腫瘍）を表す。β−アクチンはコントロールである。
第６図はＦＬＳ−ob／obマウスマウス肝腫瘍組織由来ＰＡＰｃＤＮＡの塩基配列である。上段はＦＬＳ−ob／obマウスＰＡＰ、下段はマウスＰＡＰの配列である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の疾患モデルマウスの製造方法、性質及び育成方法の一例を詳しく説明する。
本発明のマウスは、脂肪肝と肝腫瘍の自然発生を特徴とするＦＬＳ（Fatty Liver Shionogi）マウス（岸本嘉夫ら：第31回日本実験動物学会総会講演要旨集，pp119,1984）を背景遺伝子とし、遺伝子育種学的手法により、II型糖尿病マウス由来のob遺伝子を導入することにより、正常なob遺伝子産物［レプチン蛋白（肥満抑制ホルモン）］の発現を欠失させてなるマウスであり、ＦＬＳ遺伝子に由来する肝疾患の病態に加えて、導入されたob遺伝子をホモに有する個体（ob／ob型マウス）ではII型糖尿病の重篤な病態を示し、該疾患のモデル動物として極めて有用である。このob/ob型マウスは、特に、ヒトにおける肥満性II型糖尿病とそれに伴う脂肪肝や高脂血症などの合併症の病態、発症機序の解明や治療薬の開発に有用なモデル動物である。また、ヒトにおける脂肪肝を含む肝障害から肝癌という病態変化を研究するための、自然発症肝腫瘍のモデル動物としても有用である。
一方、導入されたob遺伝子をヘテロに有する個体（ob／＋型マウス）は、後述するように、II型糖尿病の病態は示さないが、脂肪肝、肝腫瘍などの病態を発現するので、上記のob／ob型マウスと同様、脂肪肝を含む肝障害から肝癌という病態変化を研究するための、自然発症肝腫瘍のモデル動物として有用である。さらに、このob/＋型マウスは、上記のII型糖尿病のモデルマウス（ob／ob）の親動物としても極めて重要である。
従って、本明細書中、本発明に関連して用いる「疾患モデルマウス」又は「本発明マウス」なる語句は、通常は、導入されたob遺伝子をホモに持つII型糖尿病のモデルマウス（ob／ob型マウス）を指すが、該ob遺伝子をヘテロに持つマウス（ob／＋型マウス）を包含する場合もある。いずれの意味で用いられているかは、文脈から明らかである。
本発明の疾患モデルマウスは、上記のＦＬＳマウスから遺伝育種学的手法により得られる。即ち、該ＦＬＳマウスに、例えば既存のII型糖尿病マウスのob遺伝子を戻し交配により導入することにより製されるコンジェニック系統であり、ＦＬＳ−obと命名された。得られた動物は、後述するように、ＦＬＳマウスと、ob遺伝子供給源であるマウスの両方の特徴を合わせた特徴を示す。
本発明の目的から、変異を有するob遺伝子を有するマウスとしては、既述のごとく、肥満、尿糖出現、高血糖、高インスリン血症、インスリン抵抗性を特徴とするＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウス（Ingalls,A.M.et al.:J.Hered,41,317-318,1950）が好ましいが、これに限定されない。
ＦＬＳマウスにＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスのob遺伝子を導入することにより得られるＦＬＳ−ob系統の本発明マウスは、これらＦＬＳマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスの両方の特徴を合わせた、以下に示す特性を有する。なお、以下の具体的な説明は、該組合わせによるコンジェニック動物に関連する。
（１）本発明マウスに導入したob遺伝子は常染色体上、第６染色体に位置する単純劣性遺伝子であり（Bray,G.A.et al.:Physiol.Rev.,59,719-809,1979）、以下の遺伝学的な特徴を示す。
ａ）単純劣性遺伝であるため、この遺伝子に交配されていると推察される肥満形質はob遺伝子をホモに有する個体にのみ発現する。
ｂ）常染色体上の遺伝子であることから、これらの形質は、雌雄ともに発現する。
ｃ）Zhangらによるポジショナルクローニングの結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスのob遺伝子はその配列にナンセンス変異を有しており、正常なob遺伝子産物を産生できない（Nature,372,425-431,1994）。すなわち、本発明マウスにおいても、ob遺伝子をホモに有する個体では、正常なob遺伝子産物は産生されない。
ｄ）ob遺伝子は脂肪組織で発現する（Zhangら，1994）。
ｅ）正常なob遺伝子によりコードされた産物、すなわち蛋白質はレプチンと名付けられ、肥満抑制ホルモンであることが明らかにされている（Halaas,J.L.et al.:Science,269,543-546,1995）。
ｆ）本発明のマウス系統は、ob遺伝子型がヘテロ（ob／＋）の親同士を交配することにより維持されているため、背景遺伝子は同一であるが、その個体の持つob遺伝子型は、ob／ob、ob／＋、＋／＋のいずれかに分離する。
上記の遺伝的な素因に関連し、ob遺伝子をホモに持つ、本発明のＦＬＳ−ob／obマウスの特徴を、対応するＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウス、及び既存の同様の目的のためのモデルマウスと比較して、以下に示す。
（２）本発明マウスは５週齢の時点で、雌雄ともほぼ全例に尿糖強陽性が観察される。この状態は１５週齢頃まで続く。その後、尿糖出現率は低下しはじめ、３５週齢で約５０％となり、６０週齢以後は尿糖の出現はほとんど観察されない。これらの観察はいずれも非絶食条件下で尿糖試験紙を用いて行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスにおける尿糖出現率は、ピーク時でも雄が約４０％、雌が約１５％と報告されている（西村正彦：糖尿病，15,426-430,1972）。本発明者らが、本発明マウスと同一飼育条件で観察した結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの尿糖出現率は、ピーク時に雄が約４５％、雌が約２０％であり、４０週齢以後の尿糖出現は、ほとんど観察されなかった。
したがって、本発明マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスと比較して、より長期に渡って糖尿発症が持続し、その発症率も高率であることが確認された（第１図参照）。
（３）本発明マウスは、導入したob遺伝子に起因すると推察される肥満を呈する。５週齢における体重は雄が平均２６．５g（n＝１７）、雌が２６．２g（n＝１９）を示す。３０週齢頃から体重増加は停止し、雌雄とも約５５〜６５gとなる。一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの５週齢における体重は雄が平均１７．４g（n＝１１）、雌が１６．７g（n＝１５）であり、本発明マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob/obに比べて若齢時の体重増加が顕著である（第１表参照）。
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また、加齢に伴い両マウス系統とも５０週齢を過ぎる頃から体重減少が始まる。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの体重は最大で９０gを越えることが報告（Bates,M.W.et al.:Am.J.Physiol.,180,301-303,1955）されているが、施設やコロニー間によりその値に幅があると思われる。本発明者らが、本発明のＦＬＳ−ob／obマウスと同一条件下で飼育した結果、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの体重は約５５〜６５gが最大で、本発明マウスとの間に差異は認められなかった。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウス以外の遺伝性肥満糖尿動物として、これまでにＣ５７ＢＬ／ＫsＪ−db／db（Hummel,K.P.et al.:Science,153,1127-1128,1966）、ＫＫ（近藤恭司ら：実験動物，6,107-112,1957）、ＫＫ−Ａy（Nishimura,M:Exp.Animal,18,147-157,1969）などのマウスが報告されている。また、Ｃ３Ｈマウス（Fenton,P.F.et al.:J.Nutr.,49,319-331,1953）は食餌誘発性肥満を起こすことが知られている。ラットではＺucker fatty（Zucker,L.M.et al.:J.Hered.,52,275-273,1961）、Ｗistar fatty（Ikeda,H.et al.:Diabetes,30,1045-1050,1981）、ＯＬＥＴＦ（Kawano,K.et al.:Diabetes,41,1422-1428,1989）などが報告されている。マウスに限った場合、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスとＣ５７ＢＬ／ＫsＪ−db／dbマウスは比較的早い時期から体重の増加が始まり、体重のピークはそれぞれ６ケ月齢、３ケ月齢であることがＨerbergら（Metabolism,26,59-99,1977）、Ｔhurlbyら（Br.J.Nutr.,39,397-402,1978）によって報告されており、両者は若年性肥満として位置付けられる。これに対して、ＫＫマウスやＫＫ−Ａyマウスは加齢に伴い徐々に肥満が進行するため、成人型肥満と呼ぶことができる（Nakamura,M.et al.:Proc.Japan Acad,38,348-352,1962）。
上記の通り、本発明マウスは５週齢の時点ですでに雌雄とも、その体重がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスより有意に高値を示すことから、非常に肥満進行の早い若年性肥満のモデルとして位置付けられる。
（４）本発明マウスは５週齢ですでに高血糖を呈し、この時の血中グルコース濃度は雌雄とも非絶食条件下で４００〜４５０mg／dlを示す。このような著しい高血糖状態はおよそ２０週齢まで観察される。血糖値はその後低下し、４０週齢で２００〜２５０mg／dlを示す。
一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの血糖値は５週齢で２５０〜３００mg／dlを示し、高血糖を呈するが、その程度は軽度である。その後、血糖値は加齢と共に上昇し、ピーク時（約10週齢）には約４００mg／dlに達するが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは本マウスより血糖値の低下する時期が早く、２０週齢で２００〜２５０mg／dlまで低下する。
このように、本発明マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスと比較して、より長期に渡って高血糖状態が持続する。
（５）本発明マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスと同様、II型糖尿病の特徴の一つである高インスリン血症を呈する。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの血中インスリン濃度は正常マウスの１０〜５０倍高値を示すことが報告されている（Genuth,S.M.:Endocrinology,88,1230-1238,1971）。本発明者らが維持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの血中インスリン濃度は350〜450μＵ／mlを示す。これは正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）の約１０倍にあたる。
本発明マウスの血中インスリン濃度も300〜450μＵ／mlを示し、そのレベルはＣ５７ＢＬ/６Ｊ-ob／obマウスと大きな違いはみられない。
既存のII型糖尿病モデルマウスの中で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは、それほど強度の高血糖は示さないが、顕著な高インスリン血症を起こすグループに分類され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ-db／dbマウス（Kaku,K.et al.:Ｄiabetologia,32,636-643,1989）も、このグループに属する。
本発明マウスも、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob/obマウスとほぼ同程度の高血糖、高インスリン血症を呈するため、このグループに分類することができる。
なお、Ｃ５７ＢＬ／ＫsＪ−db／dbマウスは強度の高血糖を呈し、血糖値は７００mg／dlにも達するが、インスリンはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスほど高くない（Herberg,L.et al.,1977）。ＫＫマウスの血糖値はＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスを下回る（３００mg／dl）が、インスリンは１，２００μＵ／mlを示す（Nakamura,M.et al.,1962）。
本発明マウスの雌マウスを用いたグルコース負荷試験の結果、１０週齢において著しい耐糖能の異常が認められた。一晩絶食後の初期血糖値は２１３±１３mg／dl（n＝５）を示し、グルコース経口負荷（２g／Ｋg体重）３０分後には５６４±２３mg／dlまで上昇した。さらに、負荷１８０分後の血糖値は３９３±１３mg／dlを示し、血糖値の回復遅延がみられた。これに対して、同週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／ob雌マウスの場合、初期血糖値は１２８±１８mg／dl（n＝５）を示し、グルコース負荷３０分後には５１３±１７mg／dlまで上昇したが、その後血糖値は比較的すみやかに下降し、１８０分後には１５４±１０mg／dlまで回復した（第２図参照）。
これらのことから、本発明マウスは、II型糖尿病の特徴である高血糖、高インスリン血症を示し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスより重篤な耐糖能異常を示すことが明らかである。
（６）本発明マウスは若齢期から重篤な脂肪肝を呈し、それは以下の特徴を示す。
ａ）肉眼的所見として著しい肝臓の肥大や黄色〜白色化が認められる。
ｂ）１５週齢における肝臓湿重量は雌雄とも５gを超え、加齢にともない増加し、１０gを超える個体も存在する。
１５週齢における上記値は正常マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの５〜６倍、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの約２倍に相当する。すなわち脂肪肝にともなう肝肥大の程度はＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob/obより本発明マウスの方が重症である。
ｃ）肝臓ホルマリン固定切片の光顕的観察から、本発明マウスの肝細胞中にはOil Red染色陽性の脂肪滴がびまん性に認められる。
ｄ）１５週齢の本発明マウスの肝臓１g当りのコレステロール量の平均値は雌雄共に１５．０mg、トリグリセライド量は雄が８９．１mg、雌が９８．２mg、リン脂質量は雄が２８．６mg、雌が３２．２mgを示す。
これらをＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスと比べると、トリグリセライド量は約１．５〜１．７倍、リン脂質は１．４〜１．５倍高値を示すが、コレステロール量に関しては差がない（表２参照）。
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以上の結果は本マウスがトリグリセライドの沈着を主とした脂肪肝を起こしていることを裏づけている。
ｅ）肝臓障害の指標であるグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）活性とグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ活性（ＧＰＴ）は１５週齢の本発明マウスにおいて雌雄ともそれぞれ９５０IU/l、９８０IU/l以上を示し、重篤な肝機能障害が伺われる。
既存の遺伝性肥満糖尿動物の中で、これほど重篤な肝障害を呈する例は報告されておらず、重症脂肪肝の発症は本発明マウスの大きな特徴と言える。
（７）本発明マウスは顕著な高トリグリセライド血症を呈し、これはＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスでは認められない。非絶食条件下で雌を対象に測定した結果から、５週齢における本発明マウスの血中トリグリセライド濃度は３１４±３２mg／dl（n＝５）であり、この値は正常マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの約８倍、脂肪肝を発症するＦＬＳマウスの約２倍である。
同週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスでは７１±１０mg／dl（n＝５）であり、本発明マウスは、その約４倍高値を示した。
本発明マウスの血中トリグリセライド値は１０週齢における６３４±５８mg／dl（n＝５）をピークとして減少し、２０週齢で４３２±５１mg／dl（n＝５）、４０週齢で１８７±４１mg／dl（n＝５）となった。
一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは５週齢から４０週齢にかけて、血中トリグリセライド値は約６０〜９０mg／dlの間を推移した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは肥満を呈するにも係わらず血中トリグリセライド濃度が低値を示すことがＭenahanら（Metabolism,32,172-178,1983）により報告されている。ob／obマウスは肝臓から血中へのトリグリセライドの分泌は正常マウスに比べて、高値を示すことがＳalmonら（Biochem.J.,136,551-563,1973）、Ｅlliotら（Biochem.Biophys.Acta.,343,307-323,1974）、Ｙenら（Biochem.Biophys.Acta.,441,213-220,1976）、Ｋaplanら（Am.J.Physiol.,240,E101-E107,1981）などによって報告されているが、脂肪組織等におけるＬipoprotein lipase活性が高く、血中トリグリセライド異化亢進が起こるため、みかけ上は血中のトリグリセライド値が低値を示すことをＧasquetら（Biochem.J.,127,445-447,1972）、松下（臨床科学，11,866-873,1975）が報告している。
遺伝性肥満糖尿ラットであるZucker Fattyラットは血中トリグリセライド代謝回転が亢進しているにも係わらず、肝臓からのトリグリセライドの放出がそれを上回るため、高脂血症を呈する。しかし、その値は正常ラットと比較して２倍程度高値を示すものの、１５０mg／dl程度である（Takemoto,S.et al.:Horm.Metab.Res.,7,242-246,1975）。
これに対して、本発明マウスの場合、血中コレステロールやリン脂質濃度も高値を示す。そのピークは１０週齢頃に認められ、非絶食条件下でそれぞれ約４５０mg／dl（n＝５）、約７３０mg／dl（n＝５）を示す。
一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスではそれぞれ約２５０mg／dl（n＝５）、約３３０mg／dl（n＝５）である。両マウスともこれらの状態が２０週齢頃まで続く。
以上から、本発明マウスはトリグリセライドだけでなくコレステロールやリン脂質も含めてＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスより重度の高脂血症を示すことが分かる。
糖尿病にはしばしば高脂血症を合併することが知られている。高脂血症は動脈硬化症などの心血管疾患の重大なリスクファクターであり、糖尿病に伴う死因として心血管系疾患が急増している今日ではその発生原因の理解や治療法の確立が重要である。しかしながら、現在の肥満性糖尿モデル動物では高インスリン血症、高血糖といった糖尿病態、肥満、高脂血症などの脂質代謝異常を共有するものは多くなく、その点で本発明マウスは重症な肥満、高脂血症を伴うII型糖尿モデル動物として利用価値が高いと考えられる。
（８）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは自由摂食条件下で５０週齢以後死亡率が高くなり、その前兆として運動失調、粗毛がみられ、剖検では脂肪肝、尿路結石、膀胱拡張などが認められることをＡustinら（Experimental Gerontology,19,121-132,1984）が報告している。
本発明マウスと本発明者らが維持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの生存率を比較すると、本発明マウスの場合、雌雄とも６５週齢頃から死亡するマウスが増えはじめ、雌雄とも７６〜７８週齢で生存率５０％になった。
一方、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの５０％生存率は雄が８３週齢、雌が９０週齢であり、本発明マウスの生存日数が短い傾向にある。本発明マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスの死亡時剖検所見を調べたところ、本発明マウスでは、肝臓の黄色化が雌雄合わせて４３例中４３例（１００％）、肝臓の結節形成が１８例（４２％）に認められた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスでは肝臓の黄色化は１００％の個体に出現したが、結節形成は２％に留まった（雌雄合わせて５０例を検索）。
また、本発明マウスは水腎症や腎臓膿瘍が２３％の個体にみられたが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスでは６％であった。
本発明マウスは老齢になると肝臓に腫瘍が自然発生する。ＦＬＳマウスも同様の特徴を持つ。ラットにおける自然発症肝腫瘍はまれであり、発癌試験などに利用されるＦ３４４系ラットの肝細胞癌の自然発生率はＧoodmanら（Toxicol.Appl.Pharmacol.,48,237-248,1979）、Ｈasemanら（J.Natl.Cancer Int.,75,975-984,985）、前川ら（変異原と毒性，14,22-41,1981）によれば約０．３〜０．５％であると報告されている。マウスではラットと比較して、自然発生肝腫瘍は比較的多いことがわかっている。特に好発系といわれるＣ３Ｈ系統の発生率は雄が７２〜９９％、雌が５８〜９６％と報告されている（前川昭彦ら，1981）。
本発明マウスは８ケ月齢頃から肝臓に結節形成や血腫が多発するようになる。これらは、光顕観察から肝細胞性腫瘍および血管腫瘍であることがわかっている。肝細胞腫瘍（hepatocellular carcinoma）は肉眼的に様々な大きさの腫瘍性結節（neoplastic nodule）として認められる。組織学的には周囲組織を圧迫し、索状性（trabecular type）ないし充実性（solid type）の増殖を示し、一部には繊管様構造も認められる。血管腫瘍は肉眼的に暗赤色、嚢胞状を呈し、多量の血液を含む。組織学的には血管腫（hemangioma）、あるいは血管内皮腫（hemangioendothelioma）として認められる。これらの腫瘍の発生頻度は老齢になるほど増加する。
ヒトの肝臓癌は一般的に慢性的な炎症（肝炎）から肝硬変を経て発生する。炎症による組織の壊死は肝の繊維化を引き起こし、代償性に亢進した肝細胞再生は変異のリスクを高める（佐藤信紘ら：分子医学の新しい流れ（日本臨床代謝学会編）,p116-120,中山書店，東京，1996）。ヒトの場合、肝炎、肝癌の原因は圧倒的にウィルス性のものが多いが（Saito,I.et al.:Proc.Natl,Acad.Sci.USA,87,6547-6549,1990）、一方で慢性化した脂肪肝も肝炎の原因になると考えられている（Schaffner,F.et al.:Prog.Liver Dis.,8,283-298,1986）。しかしながら、肝の脂肪化による炎症が発癌のリスクになり得るのかは未だ明らかでない。したがって、慢性的な重症脂肪肝と肝癌を併発する本発明マウスは脂肪性肝炎と発癌の関係を調べるモデルとして有望である。
本発明マウスはヒトのような肝硬変期が組織学的に見られないため、本マウスで発生する肝腫瘍がヒト肝癌の腫瘍生物学的特徴とどれほど一致するのか明確にする必要がある。これは、モデル動物のヒト疾患への外挿という点からも重要である。発明者らは、本マウスの肝腫瘍の特徴を分子生物学的に検討するため、腫瘍組織で発現している遺伝子をサブトラクション法（Hara,E.et al.:Nucleic Acids Res.,19,7097-7104,1991）で調べた。
サブトラクション法は種々の細胞型で特異的に発現している遺伝子を同定する方法のひとつである。すなわち、Ａ細胞で発現しており、Ｂ細胞で発現していない遺伝子を同定する場合、Ａ細胞のmＲＮＡから標識cＤＮＡプローブを作成し、Ｂ細胞のmＲＮＡあるいはcＤＮＡとハイブリダイゼーション反応を行う。その結果、双方の細胞で発現している遺伝子は2本鎖構造をとるが、Ａ細胞のみに発現している遺伝子は反応する相手がないため1本鎖のままである。そして、この1本鎖のcＤＮＡを回収して遺伝子の同定を行うという方法である（Michael Kriegler:動物細胞の遺伝子工学,p168-200,宝酒造,京都,1994）。本実験系では、18ヶ月齢のＦＬＳ-ob/obマウスの肝腫瘍組織と2ヶ月齢のＦＬＳ−ob/ob肝組織から、オリゴ（dT）-セルロースでmR NAを抽出し、市販のＰＣＲ-select cＤＮＡ subtraction kit（CLONTECH社）のプロトコールに従って、サブトラクトcＤＮＡを得た。サブトラクトcＤＮＡの作製法の概略を第４図に示す。これをTAクローニングベクター（Invitrogen社）にライゲーション後、大腸菌に形質転換してサブトラクトcＤＮＡライブラリーを作製した。プラスミドドットブロットにより腫瘍組織で発現が見られるcＤＮＡフラグメントをスクリーニングし、ＤＮＡシークエンサー（Model 307:Applied Biosystems社）で塩基配列を決定した。ホモロジー検索には遺伝子データベースであるEMBL/GenBank/ DDBJを使用した。
その結果、本発明マウスの肝腫瘍組織において、オステオポンチン（ＯＰＮ）mＲＮＡとpancrea titis-associated protein（ＰＡＰ）mＲＮＡの発現を認めた。加齢に伴う両mＲＮＡの発現をノーザンブロットで分析したところ、ＰＡＰ mＲＮＡは１８ヶ月齢の腫瘍組織にのみ発現が見られた。一方、ＯＰＮ mＲＮＡは６ヶ月齢ですでに発現しており、その発現は加齢により増加傾向にあった（第５図）。第５図において、６Ｍは６ケ月齢肝組織、１２Ｍは１２ケ月齢肝組織、１８Ｍは１８ケ月齢肝組織（肝腫瘍）を表す。β−アクチンはコントロールである。
ＯＰＮは最近ＣＤ４４のリガンドになり癌の浸潤、転移に関係していることが示唆されている（Weber,G.F.et al.:Science,271,509-512,1996）。一方、ＰＡＰは膵炎回復期に膵で発現するレクチンで、膵細胞の再生、増殖に関与していると考えられている（Keim,V.et al.:Digestion,29,242-249,1984）。ＰＡＰ遺伝子はこれまでラット（Iovanna,J.et a l.:J.Biol.Chem.,266,24664-24669,1991）、ヒト（Orelle,B.et al.:J.Clin.I nvest.,90,2284-2291,1992）、マウス（Itoh,H.et al.:Biochim.Biophys.Acta,11 72,184-186,1993）でクローニングされている。ＰＡＰは正常個体では小腸のみに発現が見られる（Itoh,H.et al.,1993）。1992年、Lasserreらはヒト原発性肝癌で発現している遺伝子を見出し、ＨＩＰと名付けた（Cancer Res.,53,5089-5095,1992）。ＨＩＰは原発性肝癌患者の25%で発現が認められた。同年、このＨＩＰはヒトＰＡＰと同一のものであることが明らかとなり、腫瘍細胞の増殖に関与していると考えられている（Lasserre,C.et al.,1992）。
本発明者らは、本発明マウスの肝腫瘍由来のＰＡＰ cＤＮＡのクローニングを行い、その配列を既報（Itoh,H.et al.,1993）と比較したところ、翻訳配列は一致したが、非翻訳領域は異なっていることを認めた（第６図）。第６図において、上段はＦＬＳ-ob/obマウスＰＡＰ、下段はマウスＰＡＰ（Itoh,H.et al.,1993）の配列である。本発明マウスの肝腫瘍由来のＰＡＰ cＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
動物腫瘍でのＰＡＰの発現はこれまで報告されておらず、ヒト肝癌でもみられるような腫瘍生物学的特徴が本発明マウスの肝腫瘍で確認されたことは、肝癌モデルとしての本マウスの有用性を強く示唆している。
以上に示した特性から、本発明マウスは既存の肥満II型糖尿病マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obと比べて、肥満の程度（最大体重）に明瞭な差はないものの、より早期から肥満が進展し、長期に渡る尿糖の出現と高血糖の持続において特徴的である。また、トリグリセライドの沈着を主とした重篤な脂肪肝を呈し、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ−ob/obマウスではみられない高脂血症を起こす。これらは本発明マウスがヒトのII型糖尿病患者で多く認められる臨床所見をよく有し、その点ではＣ５７ＢＬ/６Ｊ−ob/obマウスより優れた特性を持っていることを示す。
また、先に述べたように、II型糖尿病の成因が未解明であることから、本発明マウスの持つ病態も、その成因を探る上で有用であると考えられる。
さらに、本発明マウスでは、肝腫瘍が高頻度で自然発症することから、肝腫瘍発生の機構研究や、脂質代謝の異常と肝腫瘍発生の関係を検討するモデル動物としても有用であると思われる。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらは本発明を制限するものではない。
実施例１  動物の作出過程と飼育方法
（１）動物の由来
ＦＬＳ（Ｆatty Ｌiver Ｓhionogi）マウス：（岸本嘉夫ら：第31回日本実験動物学会総会講演要旨集，pp119,1984）
１９５５年に実験動物中央研究所から塩野義製薬油日ラボラトリーズへ導入された非近交系ddマウスから作出された近交系の一系統であり、組織学的観察や生化学的所見に基づいて脂肪肝を発症することが明らかにされており、肝臓の肥大、黄色化を多発する。１９９５年末日で１１９世代を超え、近交系として確立されている。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウス：（Ingalls,A.M.et al.:J.Hered,41,317-318,1950）:
肥満の形質を支配する遺伝子（ob遺伝子、Ingallsら、前掲）がＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに導入されて得られた系統。本発明者らが入手した時点における動物の世代数は２１世代であったが、１９９５年末に至るまでさらに１０世代（計３１世代）に渡り継代を行っている。
（２）動物の作出
本発明のコンジェニック系統のマウスは、既知の戻し交配（back−cross）方式により作出された。「戻し交配」とは、雑種第１代と最初の交雑に用いられたどちらか一方の親との交雑を意味する。この場合、親は、元の交雑（雑種第１代）に使用した親個体でなくとも良いが、同一系統に属し、同じ遺伝子型をもつ個体でなければはならない（藤原公策ら編：実験動物学事典、pp427-428、朝倉書店（東京）、1989））。本発明動物の具体的な作出法は以下の通りである。
１）ＦＬＳマウスを背景遺伝子とし、これにob遺伝子を導入するために、雌ＦＬＳマウスと雄Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ-obマウスを交配させ、交雑第１代（Ｎ1）を得た。この第１代ではob遺伝子座がob/＋の個体、＋/＋の個体が１：１に分離する。この中からさらにob遺伝子をもったob/＋個体とＦＬＳマウスの交配を行うが、肥満形質はob遺伝子をホモ（ob/ob）に有する個体にのみ発現するため、ob遺伝子をヘテロ（ob／＋）に有する個体と、野生型の遺伝子（＋/＋）を有する個体は、いずれも肥満を起こさず、外見上区別することができない。ヘテロ個体を確認するには、生まれた仔の中で再交配を行って確認する後代検定交配より行った。
ヘテロ同士の交配で生まれた仔（Ｎ１Ｆ１）は、ob遺伝子型がob/＋：ob/ob:＋/＋（２：１：１）に分離する。すなわち、肥満を呈する個体が存在すればその親は雌雄ともヘテロ個体と言える。肥満個体は約３週齢で体重から識別できる。
２）肥満個体を生んだ親のうち、雄親をさらに雌ＦＬＳマウスと交配させ、上述と同様な方法で戻し交配を重ねた。戻し交配は計１２代（Ｎ１２）に渡って行い、本発明マウス系統のob遺伝子以外の遺伝子置換率は９９．９７％と推定される。戻し交配の模式図を第３図に示した。
３）戻し交配１２代目の中から、ob／＋同士の交配により生まれた仔（Ｎ１２Ｆ１）をＦ１世代とし、以後兄妹交配を行い、世代数は１３世代に至る。
本件出願時ではいまだ近交世代数に達していないが、本発明のコンジェニック動物作製に用いた２系統がいずれも近交系であることから、本発明マウスの遺伝的特性はすでに固定していると思われる。近交系化は継続している。本発明マウス系統をＦＬＳ−obマウスと命名した。
（３）交配様式
ob遺伝子をホモ（ob／ob）に持つ個体が生殖能力を欠くため、雌雄ともob遺伝子をヘテロ（ob／＋）に持つ個体を用いて交配を行う。生殖能力の欠如が先天的なものか二次的なものかは不明である。ヘテロ個体同士の交配で得られる仔は上述のごとく、ob遺伝子型がob／ob、ob／＋、＋／＋の３種類に分離し、分離率はそれぞれ１：２：１となる。交配に用いるヘテロ個体の確認も上述のように後代検定交配により行う。１９９５年４月からはＰＣＲ−ＲＦＬＰによるob遺伝子判定法を用いて親動物として使用するヘテロ個体の選別を行っている。
（４）繁殖成績
本発明マウスの妊娠率は８９．０％（交配雌親２８１匹中、妊娠を確認できたもの２５０匹）であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスの８０．２％（交配雌親２９８匹中、妊娠を確認できたもの２３９匹）を若干上回っている。また平均産仔数は本発明マウスが５．７匹（２５０匹の雌親が１，４２５匹を出産）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスが４．６匹（２３９匹の雌親が１，０９５匹を出産）という成績であった。離乳率は本発明マウスが８７．２％（親づけ１，４０３匹中、１，２２４匹離乳）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスが８９．１％（親づけ１，００１匹中、８９２匹離乳）であり、離乳率は本発明マウスが幾分低値傾向にあった。また、これまでの繁殖成績から生まれた仔のうちob／obマウスの取得率は、本発明マウスは１７．３％で、雌親１産あたりのob／obマウスの取得数は平均０．９匹であった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−obマウスの場合、ob／obマウス取得率は１５．８％、雌親１産あたりのob／obマウスの取得数は平均０．６匹であった。
（５）動物の飼育方法
１）飼育環境
本発明マウスは、すべてＳＰＦ（specific pathogen free;特定病原菌非感染）化されているため、バリア環境下で飼育されている。飼育室内の環境条件は、室温２３±１℃、湿度６０±５％、１２時間毎の明暗切替えサイクル（照度３００lux）に設定されている。また、飼育室内の換気回数は１時間に１５回とし、ヘパフィルターを介した新鮮外気を導入している。バリア環境内は外界より陽圧に保ち、異物の侵入を防いでいる。飼育者は顔や手の消毒を十分に行い、滅菌処理した飼育服、靴、頭巾、マスク、手袋を着用して入室する。物品はオートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、紫外線殺菌、消毒薬液処置のいずれかを行った後、搬入する。さらに、飼育施設では毎月１回の微生物検索を行い、動物がＨＶＪ．、ＭＨＶ．、Bordetella bronchiseptica、Corynebacterium Kutscheri、Mycoplasma pulmonis、Tyzzer’s disease、Salmonella typhimurium、Salmonella sp.、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa、Pasteurella pneumotropicaに感染していないことを確認し、ＨＦＲＳ（腎症候出血熱）の検索も年２回程度行う。
２）飼料および飲水
本発明マウスには、飼育飼料として日本クレア製の繁殖用固形飼料ＣＡ−１をオートクレーブ滅菌処理（１２１℃、７分）した後、与える。飲水は水道水をポアサイズ３μmのフィルターと流水殺菌器（紫外線滅菌）に通した後に、自動給水装置で与える。
３）動物の性質
本発明マウスは性質温順で扱いやすく、雌雄とも数匹を同一ケージで飼育しても闘争することは少ない。
４）飼育上の注意点
本マウスは糖尿発症の期間中、多飲、多尿傾向にある。このため床敷き（ホワイトフレークなど）が汚れやすいので、適宜交換し、ケージ床部を清潔に保つ必要がある。また、給水瓶を用いる場合、飲料水の不足に注意すべきである。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ob／obマウスは低体温であることが知られている（Kaplan,M.L.et al.:Am.J.Physiol.,227,912-915,1974）。このことから、本マウスも同様と考え、飼育には金属製ケージよりプラスチック樹脂のケージが保温上好ましいと思われる。
５）分与について
本願発明の肥満、脂肪肝、高脂血症を伴うインスリン非依存性糖尿病マウスは本施設より分与可能である。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：７５６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
起源
生物名：FLS-ob/obマウス
組織の種類：肝腫瘍
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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