(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性：
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）において増殖的複製する能力を有するが、ヒト表皮ケラチノ細胞系HaCat、ヒト胚腎細胞系293、ヒト骨肉腫細胞系143Bおよびヒト頸部腺癌細胞系HeLaにおいて増殖的複製する能力は有さないこと、および
（ｉｉ）成熟BおよびT細胞を生成できないマウスモデルにおいて複製することができないこと、
を有し、英国ソールズベリー（Salisbury）のヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ECACC）にV00083008の番号で寄託されているMVAワクシニアウイルスおよびその誘導体。
【請求項２】
少なくとも一種の非相同核酸配列を含む、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記非相同核酸配列が、少なくとも一つの抗原、抗原エピトープ、および／または治療化合物をコード化する配列から選択される、請求項２に記載のウイルス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス、および薬学的に許容できるキャリア、希釈剤および／または添加剤を含んでなる薬剤組成物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスを含んでなるワクチン。
【請求項６】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を影響する薬物としての、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項７】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を誘発する薬物としての、請求項６に記載のウイルス。
【請求項８】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を影響する薬物としての、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を誘発する薬物としての、請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を影響する薬物としての、請求項５に記載のワクチン。
【請求項１１】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を誘発する薬物としての、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において治療有効量で投与される請求項１から３および６から７のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１３】
第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において治療有効量で投与される請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において治療有効量で投与される請求項５に記載のワクチン。
【請求項１５】
薬剤またはワクチンの調製のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスの使用。
【請求項１６】
相同および／または非相同核酸配列を標的細胞中に導入する方法であって、標的細胞に請求項２または３に記載のウイルスを感染させることを含んでなる方法。
【請求項１７】
ペプチド、蛋白および／またはウイルスを産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞に請求項１または３に記載のウイルスを感染させる工程と、
（ｂ）感染した宿主細胞を適当な条件下に培養する工程と、
（ｃ）前記宿主細胞により産生されたペプチドおよび／または蛋白および／またはウイルスを単離および／または増菌する工程と、
を含んでなる方法。
【請求項１８】
ヒトを含む動物生体における免疫反応を影響するための薬剤組成物の製造のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス、請求項４に記載の組成物または請求項５に記載のワクチンの使用であって、前記薬剤組成物が治療すべき動物またはヒトに投与されるためのものである、前記の使用。
【請求項１９】
ヒトを含む動物生体における免疫反応を誘発するための薬剤組成物の製造のための請求項１８記載の使用であって、前記薬剤組成物が治療すべき動物またはヒトに投与されるためのものである、前記の使用。
【請求項２０】
少なくとも102 TCID50（組織培養感染量）のウイルスが投与される、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
ウイルス、組成物またはワクチンが、第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において、治療有効量で投与されるためのものである、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
動物が免疫寛容されている、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
動物がポックスウイルスに対する予め存在する免疫を有する、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
動物が抗ウイルス治療を受けている、請求項１８から２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
抗ウイルス治療が抗レトロウイルス治療である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスのアジュバントとしての使用。
【請求項２７】
ワクチン中に含まれる抗原および／または抗原エピトープに対する特異的免疫反応を高めるための薬剤組成物の製造のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスの使用であって、前記薬剤組成物がワクチンで治療すべきヒトを含む動物生体に、アジュバントとして投与されるためのものである、前記の使用。
【請求項２８】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスからなるアジュバント。
【請求項２９】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスを含んでなる、細胞。
【請求項３０】
請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスを含んでなる、ヒト細胞。
【請求項３１】
請求項１に記載のワクシニアウイルスを得る方法であって、
CEF細胞から選択される、その中でウイルスが増殖的に複製することができる非ヒト細胞中に、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ECACC）にV00120707の番号で寄託されているMVA575を導入する工程と、
これらの細胞からのウイルス粒子を単離／増菌させる工程、および
得られたウイルスが、請求項１に定義された生物学的特性の少なくとも一つを有するかどうかを分析する工程と、
を含んでなり、
前記工程が、所望の複製特徴を有するウイルスが得られるまで、任意に繰り返される方法。
【請求項３２】
第１のバイアル／容器で第１の接種（初回接種）を行い第２のバイアル／容器で第２の接種（ブースト接種）を行うための、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルスと、請求項４に記載の組成物と、請求項５に記載のワクチンまたは請求項６または７に記載にウイルスとを含んでなる初回／ブースト免疫化用キット。
【請求項３３】
ワクチンを調製するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス、請求項４に記載の組成物、請求項５に記載のワクチンまたは請求項６または７に記載のウイルスの使用であって、ウイルス、組成物またはワクチンが第１の接種および第２の接種において治療有効量で投与されるためのものである、前記の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、変性ワクシニアアンカラウイルスから誘導されると共に、ヒト細胞系において増殖的に複製する能力が失われていることを特徴とする弱毒化されたウイルスに関する。本発明は、さらに、このウイルスから誘導された組換えウイルス、およびこのウイルスまたは組換え体の薬剤またはワクチンとしての使用を記載する。さらに、免疫無防備状態（易感染性）の患者、ワクチンウイルスへの予め存在する免疫を有する患者または抗ウイルス治療を受けている患者においても免疫反応を誘発する方法が提供される。
【０００２】
（背景技術）
変性ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属の一員であるワクシニアウイルスに関する。ＭＶＡは、ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ菌株のニワトリ胚線維芽細胞上を５１６回連続的に通過することにより産出された（検討のために、Ｍａｙｒ，Ａ．，ら著、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ第３巻、６〜１４頁［１９７５］を参照されたい）。これらの長期間の通過の結果、得られるＭＶＡウイルスは、そのゲノム配列の約３１キロ塩基を欠失し、従って、鳥類細胞に高度に限定された宿主細胞として記載された（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら著、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７２巻、１０３１〜１０３８頁［１９９１］）。種々の動物モデルにおいて、得られるＭＶＡがかなり無毒性であることが示された（Ｍａｙｒ，Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，Ｋ．著［１９７８］、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．第４１巻：２２５〜３４頁）。さらに、このＭＶＡ菌株は、ヒト天然痘病に対して免疫するためのワクチンとして、臨床試行において試験された（Ｍａｙｒら著、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ、Ａｂｔ．Ｏｒｇ．第Ｂ１６７巻３７５〜３９０頁［１９８７］、Ｓｔｉｃｋｌら著、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．第９９巻、２３８６〜２３９２頁［１９７４］）。これらの研究は、高度に危険な患者を含む１２０,０００人を超えるヒトを含み、ワクシニア系ウイルスと比べて、ＭＶＡは、優れた免疫原性を維持しつつ低下した毒性または感染性を有することがわかった。
【０００３】
その後の数十年において、組換え遺伝子発現用のウイルスベクターとして、または組換えワクチンとして使用するためにＭＶＡが加工された（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら著、［１９９４］、Ｖａｃｃｉｎｅ第１２巻：１０３２〜４０頁）。
【０００４】
この点において、Ｍａｙｒらが１９７０年代に、ＭＶＡが高度に弱毒化されておりヒトおよび哺乳動物において無毒性であることを示したが、一部の最近報告された観察（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら著、１９９８年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ第７９巻、１１５９〜１１６７頁；ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ著、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２３８頁、１９８〜２１１頁；Ａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒの米国特許第５，１８５，１４６号：Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら著、１９９９年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ第５５（５）巻、５６９頁）によれば、残留複製がこれらの細胞において起こり得るのでＭＶＡが哺乳動物およびヒト細胞系において充分弱毒化されていないことが示されたことは最も驚くべきである。使用されるウイルスは、種々の細胞系におけるその特性、特にその成長挙動が本質的に異なるので、ＭＶＡの種々の菌株を用いて、これらの公報において報告された結果が得られると想定される。
【０００５】
成長挙動は、ウイルス弱毒化の指示手段であると理解される。通常、ウイルス菌株は、その能力を失った場合または宿主細胞において増殖的に複製する低下した能力しか有さない場合、弱毒化されたと見なされる。前記観察、すなわち、ヒトおよび哺乳動物細胞においてＭＶＡが完全に複製不可能であることは、ヒトワクチンとしての、または組換えワクチン用のベクターとしてのＭＶＡの完全な安全性についての疑問を引き起こす。
【０００６】
特に、ワクチンおよび組換えワクチンについて、ワクチンベクターウイルスの効能と安全性との間のバランスが極めて重要である。
【０００７】
（発明の目的）
すなわち、本発明の目的は、ワクチンまたは薬剤のような安全性の高い生成物の開発について安全性が高められた新規ウイルス菌株を提供することにある。さらに、さらなる目的は、存在するワクチン接種方式を向上させる手段を提供することである。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
前記目的を達成するために、本発明の好ましい実施形態によれば、非ヒト細胞および細胞系、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびハムスター幼児腎細胞系ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ８５０１１４３３）において増殖的複製することができるが、ヒトケラチノ細胞系において増殖的複製することはできない新規ワクシニアウイルスが提供される。
【０００９】
既知のワクシニア菌株は、少なくとも一部のヒト細胞系、特にヒト表皮ケラチノ細胞系ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら著、１９９８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１０６（３）巻：７６１〜７１頁）において、増殖的に複製する。細胞系ＨａＣａｔでの複製は、生体内での複製、特に、ヒトにおける生体内複製を予想させるものである。実際、ＨａＣａｔにおいて残留増殖複製を示す試験した全ての既知のワクシニア菌株が、生体内においても複製することが実施例部分において示されている。すなわち、本発明は、好ましくは、ヒト細胞系ＨａＣａｔにおいて増殖的に複製しないワクシニアウイルスに関する。最も好ましくは、本発明は、ヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ヒト胚腎細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）および細胞株ＨａＣａｔのいずれのヒト細胞系においても、増殖的に複製できないワクシニアウイルス菌株に関する。
【００１０】
ウイルスの成長挙動または増幅／複製は、通常、最初の部分において細胞を感染するのに最初に用いられる量（入力）に対する感染細胞から生成されたウイルス（出力）の比（「増幅比」）により表される。出力と入力との比「１」は、感染細胞から生成されたウイルスの量が細胞を感染させるのに最初に用いられた量と同じである増殖状態を定める。この状態は、感染細胞をウイルス感染およびウイルス増殖に用い得るという事実を示唆している。
【００１１】
１未満の増幅比、すなわち入力水準を下回る増幅の低下は、増幅的複製の欠如を示す、すなわち、ウイルスの弱毒化を示す。従って、幾つかのヒト細胞系、特にヒト細胞系１４３Ｂ、ＨｅＬａ、２９３およびＨａＣａｔの全てにおいて増幅比が１未満の菌株を同定し最終的に単離することが発明者にとって特に興味深いことであった。
【００１２】
すなわち、「増幅的に複製することができない」という用語は、本発明のウイルスが、一部の特異的ＭＶＡ菌株についての本明細書の実施例１に概略する条件下に細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）およびＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら著、１９９８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１０６（３）巻：７６１〜７１頁）のようなヒト細胞系において１未満の増幅比を示すことを意味する。好ましくは、前記ヒト細胞系ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂの各々において、本発明によるウイルスの増幅比は０．８以下である。
【００１３】
実施例１および表１において、細胞系１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔのいずれにおいても、本発明によるウイルスが増幅的に複製しないことが詳細に示されている。実施例において用いられた本発明による特定の菌株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーにＶ０００８３００８の番号で寄託されている。この菌株は、明細書全体において、「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼ばれる。
【００１４】
既知のＭＶＡ菌株は、試験したヒト細胞系の少なくとも一種において残留複製を示す（図１、実施例１）。全ての既知のワクシニア菌株は、細胞系ＨａＣａｔにおいて少なくとも一部の複製を示すが、本発明によるＭＶＡ菌株、特にＭＶＡ−ＢＮは、ＨａＣａｔ細胞において増幅的に複製しない。より詳しくは、ヒト胚腎細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）においてＭＶＡ−ＢＮは０．０５〜０．２の増幅比を示す。ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）において、この比は、０．０〜０．６の範囲にある。ヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）およびヒト表皮ケラチノ細胞系ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら著、１９９８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１０６（３）巻：７６１〜７１頁）において、増幅比は、それぞれ０．０４〜０．８および０．０２〜０．８である。ＭＶＡ−ＢＮは、アフリカ緑サル腎細胞（ＣＶ１：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−７０）において０．０１〜０．０６である。すなわち、本発明によるプロトタイプ菌株であるＭＶＡ−ＢＮは、試験されたヒト細胞系のいずれにおいても増幅的に複製しない。
【００１５】
ＭＶＡ−ＢＮの増幅比は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ：一次培地）またはハムスター幼児腎細胞系ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３２）において明らかに約１である。先に概略したように、「１」を超える比は、細胞を感染させるのに用いたウイルスの量に比べて感染細胞から生成されたウイルスの量が増加するので、増幅的複製を示す。従って、ウイルスは、ＣＥＦ一次培地において５０００を超える比で、またはＢＨＫ細胞において５０を超える比で容易に増殖および増幅させることができる。
【００１６】
本発明の特別の実施形態において本発明は、ＥＣＡＣＣ  Ｖ００８３００８として寄託されているウイルスの誘導体に関する。ＥＣＡＣＣ  Ｖ００８３００８として寄託されているウイルスの「誘導体」は、寄託された菌株と本質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの一または二以上の部分において相違を示すウイルスを意味する。寄託されたウイルスと同じ「複製特性」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞および細胞系ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂにおいて、寄託された菌株と同様の増幅比で複製すると共に、ＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデル（以下参照）において決められるものと同様の生体内複製を示すウイルスである。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明によるワクシニアウイルス菌株、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、生体内で複製できないことを特徴とする。本発明の要旨において、「生体内で複製できない」というのは、ヒトおよび、以下に説明するマウスモデルにおいて複製しないウイルスを意味する。「生体内で複製できない」ことは、好ましくは、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができないマウスにおいて決めることができる。そのようなマウスの一例は、トランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９（スイス国チューリッヒ在チューリッヒ大学のウイルス学研究所のＭａｒｋ  Ｓｕｔｔｅｒから得た）である。このマウス菌株は、ＩＦＮ受容体のタイプＩ（ＩＦＮ−α／β）およびタイプＩＩ（ＩＦＮ−γ）において、およびＲＡＧにおいて遺伝子標的破壊を有する。これらの破壊の為に、マウスはＩＦＮ系を有さず、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができず、そのものとして、強度に免疫寛容され、複製しているウイルスに高度に感受性がある。ＡＧＲ１２９マウスの代わりに、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができず、そのものとして、強度に免疫寛容され、複製しているウイルスに高度に感受性がある任意の他のマウス菌株を用いることができる。特に、本発明によるウイルスは、腹腔内に投与された１０7ｐｆｕウイルスでのマウス感染後、少なくとも４５日、より好ましくは少なくとも６０日、最も好ましくは９０日の期間内にはＡＧＲ１２９マウスを殺さない。好ましくは、「生体内で複製することができない」ウイルスは、腹腔内に投与された１０7ｐｆｕウイルスでのマウス感染後、４５日、好ましくは６０日、最も好ましくは９０日のＡＧＲ１２９の器官または組織からウイルスを回収できないことを更なる特徴とする。ＡＧＲ１２９マウスを用いた感染アッセイに関する詳細な情報および、感染マウスの器官および組織からウイルスを回収し得るかどうか決めるのに用いられるアッセイは、実施例部分において見ることができる。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明によるワクシニアウイルス菌株、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、致死チャレンジマウスモデルにおいて決められる既知の菌株ＭＶＡ５７５と比較してより高い免疫原性により特徴付けられる。この実験の詳細が、以下に示す実施例２に概略されている。簡単に言えば、そのようなモデルにおいては、ウエスタンリザーブ菌株Ｌ９２９  ＴＫ＋またはＩＨＤ−Ｊのような複製コンピテントワクシニア菌株での感染後に、ワクチン接種していないマウスは死亡する。複製コンピテントワクシニアウィルスでの感染は、致死チャレンジモデルの説明の状況において「チャレンジ」と呼ばれる。チャレンジの４日後、マウスは通常殺され、卵巣中のウイルス量が、ＶＥＲＯ細胞を用いる標準的プラークアッセイにより決められる（より詳細については、実施例部分を参照）。ウイルス量が、非ワクチン接種マウスおよび、本発明のワクシニアウイルスを接種したマウスについて決められる。より詳しくは、本発明のウイルスは、この試験において、本発明のウイルス１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌを接種した後、卵巣ウイルス量が、非ワクチン接種マウスと比べて少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％減少する。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明のワクシニアウイルス、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、ワクチンの初回／ブースト投与での免疫化に有用である。配達ベクターとしてＭＶＡを用いる初回／ブースト方式は誘発する免疫反応が弱く、ＤＮＡ初回ＭＶＡブースト方式に劣っていることを示唆している多くの報告がある（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら著、１９９８年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第４巻；３９７〜４０２頁）。これらの全ての研究において、本発明によるワクシニアウイルスと異なるＭＶＡ菌株が用いられた。初回およびブースト投与についてＭＶＡを用いた場合の弱い免疫反応を説明するために、初回投与中にＭＶＡに対して生成された抗体が、二次免疫化で得られたＭＶＡを中和し、免疫反応の効果的ブーストを妨げるという仮定をたてた。これに対して、ＤＮＡ初回／ＭＶＡブースト方式が高い結合反応の発生において優れていると報告されているが、これは、この方式が、ＤＮＡが免疫反応を効果的に開始する能力を、ＭＶＡへの予め存在している免疫の不存在下にＭＶＡがこの反応をブーストする特性と組み合わせているからである。明らかに、ＭＶＡおよび／またはワクシニアへの予め存在している免疫が、免疫反応のブーストを妨げる場合、ワクチンまたは治療薬としてＭＶＡを用いることにより、特に天然痘に対してワクチン接種された個体において効果が制限される。しかしながら、さらなる実施形態によれば、本発明のワクシニアウイルス、特に、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体、並びに非相同配列を有する対応する組換えウイルスを、天然動物および、ポックスウイルスへの予め存在する免疫を有する動物において、最初に初回免疫反応、次にブースト免疫反応を効果的に行うために用いることができる。このように、本発明のワクシニアウイルスは、ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、少なくとも実質的に同じ水準の免疫をワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式で誘発する。
【００２０】
以下の二つのアッセイ（「アッセイ１」および「アッセイ２」）の一つ、好ましくは両方のアッセイにおいて測定されたＣＴＬ反応が、ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式において少なくとも実質的に同じである場合、ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式において少なくとも実質的に同じ水準の免疫を、ワクシニアウイルスが誘発すると見なされる。より好ましくは、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト投与後のＣＴＬ反応は、ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、前記アッセイの少なくとも一つにおいて、より高い。最も好ましくは、ＣＴＬ反応は、以下のアッセイの両方において、より高い。
【００２１】
［アッセイ１］
ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト投与のために、６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｔｈｏｍｓｏｎら著、１９８８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻、１７１７頁に記載のように、マウスポリトープを発現する本発明のワクシニアウイルス１０7ＴＣＩＤ50を静脈内投与して初回免疫し、３週間後に同じ方法で投与される同じ量の同じウイルスでブースト免疫する。この目的のために、前記ポリトープを発現する組換えワクシニアウイルスを組み立てることが必要である。そのような組換えウイルスを組み立てる方法は当業者に知られており、以下により詳細に記載されている。ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式において、初回ワクチン接種は、ワクシニアウイルスと同じ抗原を発現するＤＮＡ５０μｇをマウスに筋肉内注射することにより行われ、ワクシニアウイルスのブースト投与は、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト投与と正確に同じ方法で行われる。ポリトープを発現するＤＮＡプラスミドも、Ｔｈｏｍｓｏｎらによる前記参照公報に記載されている。両方式において、エピトープＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭおよび／またはＹＰＨＦＭＰＴＮＬに対するＣＴＬ反応の進行は、ブースト投与の２週間後に決められる。ＣＴＬ反応の決定は、好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら著、１９９８年、Ｎａｌ．Ｍｅｄ．第４巻、３９７〜４０２頁に記載され、本発明の一つの特定のウイルスについて以下の実施例部分に概説されているように、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて行われる。本発明のウイルスは、この実験において、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト投与により誘発される前記エピトープに対するＣＴＬ免疫反応が、ＩＦＮγ生成細胞／１０6脾臓細胞の数により調べられる（これも実施例部分を参照）ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式により誘発されるものと実質的に同じ、好ましくは少なくとも同じであることを特徴とする。
【００２２】
［アッセイ２］
このアッセイは、基本的にアッセイ１に相当する。しかしながら、アッセイ１で投与されたワクシニアウイルス１０7ＴＣＩＤ50の代わりに、このアッセイでは、本発明のワクシニアウイルス１０8ＴＣＩＤ50を、初回免疫化およびブースト免疫化のために皮下投与する。本発明のウイルスは、この実験において、ワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト投与により誘発される前記エピトープに対するＣＴＬ免疫反応が、ＩＦＮγ生成細胞／１０6脾臓細胞の数により調べられる（これも実施例部分を参照）ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト投与により誘発されるものと実質的に同じ、好ましくは少なくとも同じであることを特徴とする。
【００２３】
前記アッセイの一つにおいて測定されるＣＴＬ反応の強度は、保護水準に相当する。
【００２４】
すなわち、本発明によるウイルスは、ワクチン接種の目的に特に適している。
【００２５】
要約すれば、本発明のワクシニアウイルスは、以下の特性の少なくとも一つを有することを特徴する。
【００２６】
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）および細胞系ＢＨＫにおいて増殖的複製する能力を有するが、ヒト細胞系ＨａＣａｔにおいて増殖的複製する能力は有さないこと、
（ｉｉ）生体内で複製することができないこと、
（ｉｉｉ）致死チャレンジモデルにおいて、既知の菌株ＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７）と比べて高い免疫原性を誘発すること、および／または
（ｉｖ）ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、少なくとも実質的に同じ水準の免疫をワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式で誘導すること。
【００２７】
好ましくは、本発明のワクシニアウイルスは、前記特性の少なくとも二つ、より好ましくは前記特性の少なくとも三つを有する。最も好ましいのは、前記特性の全てを有するワクシニアウイルスである。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、第１のバイアル／容器で第１の接種（初回接種）を行い、第２のバイアル／容器で第２の接種（ブースト接種）を行うための、本発明によるウイルスを含んでなるワクチン接種用キットに関する。ウイルスは、非組換えワクシニアウイルス、すなわち、非相同ヌクレオチド配列を含まないワクシニアウイルスであってよい。そのようなワクシニアウイルスの例は、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体である。また、ウイルスは、ワクシニアウイルスに相同であるさらなるヌクレオチド配列を含む組換えワクシニアウイルスであってよい。別の説明部分に概説しているように、相同配列は、免疫系により反応を誘発するエピトープをコードし得る。すなわち、前記エピトープを含む蛋白または薬剤に対してワクチン接種するために組換えワクシニアウイルスを用いることができる。ウイルスは、以下により詳細に示すように調製することができる。各ワクチン接種に用いることができるウイルスの量は、前述のように定義される。
【００２９】
以下の特性の少なくとも一つを有するワクシニアウイルスをいかに得ることができるかを、当業者は知っている。
【００３０】
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびハムスター幼児腎細胞系ＢＨＫにおいて増殖的複製する能力を有するが、ヒト表皮ケラチノ細胞系ＨａＣａｔにおいて増殖的複製する能力は有さないこと、
生体内で複製することができないこと、
致死チャレンジモデルにおいて、既知の菌株ＭＶＡ５７５と比べて高い免疫原性を誘発すること、および／または
ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、少なくとも実質的に同じ水準の免疫をワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式で誘導すること。
【００３１】
そのようなウイルスを得るための方法は、以下の工程を含んでよい。
【００３２】
（ｉ）ＣＥＦ細胞およびその細胞系ＢＨＫから好ましく選択される、その中でウイルスが増殖的に複製することができる非ヒト細胞中に、既知のワクシニアウイルス菌株、好ましくはＭＶＡ５７４またはＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７）を導入する工程、
（ｉｉ）これらの細胞からのウイルス粒子を単離／増菌させる工程、および
（ｉｉｉ）得られたウイルスが、先に定義された所望の生物学的特性の少なくとも一つを有するかどうかを分析する工程。
【００３３】
ここで、前記工程は、所望の複製特徴を有するウイルスが得られるまで、任意に繰り返すことができる。本発明は、さらに、本発明によるこの方法により得られるウイルスに関する。所望の生物学的特性を如何に決めるかの方法が、他の説明部分に説明されている。
【００３４】
この方法の適用において、発明者らは、複数回のクローン精製において、ＭＶＡ単離経路５７５（ＭＶＡ５７５）から本発明の菌株を同定し単離した。この新規菌株は、前述の受け入れ番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ００８３００８の菌株に相当する。
【００３５】
本発明のワクシニアウイルスの成長挙動、特に、ＭＶＡ−ＢＮの成長挙動は、本発明の菌株が、ヒト細胞系における弱毒化および生体内増幅できないことに関して、今まで特徴付けられた他のいかなるＭＶＡ単離物よりはるかに優れていることを示している。従って、本発明の菌株は、以下に記載するようなワクチンまたは薬剤のような安全物の開発のための理想的な候補である。
【００３６】
一つの実施形態において、本発明のウイルス、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、天然痘のようなヒトポックスウイルス疾患に対するワクチンとして用いられる。さらなる実施形態において、本発明のウイルスは組換えしてよい、すなわち、非相同遺伝子、例えば、ウイルスに非相同な抗原またはエピトープを発現してよく、非相同抗原またはエピトープに対する免疫反応を誘発するワクチンとして有用である。
【００３７】
「免疫反応」という用語は、異物または微生物が生物に入ったときの免疫系の反応を意味する。定義として、免疫反応は特異的反応と非特異的反応とに分けられるが、両者は密に関連している。非特異的免疫反応は、広く種々の異物および感染剤に対する直接的防御である。特異的免疫反応は、生物にある物質を初めてチャンレンジするときに、遅延期後に高められる防御である。
【００３８】
特異的免疫反応は高度に効果的で、特異的感染から回復する個体が、この特異的感染に対して保護されるという事実の原因である。すなわち、同じまたは非常に類似の感染剤での二次感染の場合、既にこの剤に対して「予め存在している免疫」が存在するので、症状が非常に穏やかであるか全く無い。そのような免疫および免疫学的記憶は、それぞれ、長期間続き、ある場合には、終生続く。従って、免疫学的記憶の誘発を、ワクチン接種に用いることができる。
【００３９】
「免疫系」は、異物および微生物に対する生物の防御に含まれる複合器官を意味する。免疫系は、リンパ球および、白血球から誘導される他の細胞のような幾つかの細胞型を含む細胞器官と、小さなペプチドおよび補体因子を含む液性器官とを含む。
【００４０】
「ワクチン接種」は、感染剤、例えば、この感染剤の弱毒化または不活性化型で生物をチャンジンして、特異的免疫を誘発することを意味する。ワクチン接種という用語は、生物を、本発明の組換えワクシニアウイルスで、特に、ウイルスに非相同性の抗原またはエピトープを発現している組換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体でチャレンジすることも含む。そのようなエピトープの例は他の説明部分に挙げられ、例えば、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶのような他のウイルスから誘導された蛋白からのエピトープ、腫瘍および癌の進行に係わる蛋白から誘導されたエピトープを含む。組換えワクシニアウイルスを体に投与した後、エピトープは発現され、免疫系に提示され、これらのエピトープに対する特異的免疫反応を誘発することができる。すなわち、生物は、組換えワクシニアウイルスでコード化されるエピトープを含む剤／蛋白に対して免疫される。
【００４１】
「免疫」は、感染剤またはその特徴的部分で予め感染することを首尾よく排除するので、感染剤により引き起こされる疾患に対して生物を部分的または完全に保護することを意味する。免疫は、免疫系の特殊細胞の存在、誘発および活性化に基づく。
【００４２】
本発明の一つの実施形態において先に指摘したように、本発明の組換えウイルス、特に組換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、少なくとも一つの非相同核酸配列を含む。以下において、「非相同」という用語は、普通は天然のウイルスに密接に関連して見つかることはない核酸配列の組み合わせについて用いられ、そのようなウイルスも「組換えウイルス」と呼ばれる。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態によれば、非相同配列は、好ましくは、任意の非ワクシニア源から選択される抗原エピトープである。最も好ましくは、前記組換えウイルスは、熱帯熱マラリア原虫、マイコバクテリア、インフルエンザウイルスから、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの科から選択されるウイルスから、またはハンタウイルスまたはフィロウイルスのような出血熱を引き起こすウイルス、すなわち、エボラまたはマールブルグウイルスからの一種または二種以上の抗原エピトープを発現する。
【００４４】
さらなる実施形態によれば、しかしながら、抗原エピトープの前記選択に加えて、非相同配列は、別のポックスウイルスまたはワクシニア源から選択することができる。これらのウイルス配列を用いて、ウイルスの宿主範囲または免疫原性を変性させることができる。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明のウイルスは、治療化合物を発現する非相同遺伝子／核酸をコード化することができる。ウイルス中の非相同核酸によりコードされる「治療化合物」は、例えば、アンチセンス核酸のような治療的核酸、または所望の生物学的活性を有するペプチドまたは蛋白であり得る。
【００４６】
さらなる好ましい実施形態によれば、非相同核酸配列の発現は、好ましくは、限定的ではないが、ポックスウイルスプロモーター、より好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下にある。
【００４７】
さらなる実施形態によれば、非相同核酸配列は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域中に挿入される。本発明のもう一つの好ましい実施形態において、非相同核酸配列は、ＭＶＡゲノムの天然発生欠失部位に挿入される（ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に開示）。非相同配列をポックスウイルスゲノムに如何に挿入するかは、当業者に知られている。
【００４８】
もう一つのさらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ウイルスのゲノム、その組換え体またはその機能的部分も含む。そのようなウイルス配列を用いて、ＰＣＲ、ハイブリッド化技術またはＥＬＩＳＡアッセイを行うことにより、ウイルスまたはその組換え体を同定または単離することができる。さらに、そのようなウイルス配列を発現ベクターから発現させて、コードされた蛋白またはペプチドを生成することができ、それは次に、発現ベクター中に含まれるウイルス配列を欠損するウイルスの欠失突然変異体を補うことができる。
【００４９】
ウイルスゲノムの「機能的部分」は、蛋白、蛋白領域、蛋白のエピトープのような物理的構成要素をコード化する完全ゲノム配列の一部を意味する。ウイルスゲノムの機能的部分は、調節要素をコード化する完全ゲノム配列の一部、または、プロモーター、エンハンサー、シスまたはトランス作用要素のような個別化される活性を有する要素の一部も意味する。
【００５０】
本発明の組換えウイルスを、標的細胞に相同または非相同である非相同核酸配列を標的細胞中に導入するのに、用いることができる。標的細胞中への非相同核酸配列の導入を用いて、生体外非相同ペプチドまたはポリペプチドを生成、および／または前記配列によりコードされるウイルスを完成することができる。この方法は、宿主細胞に組換えＭＶＡを感染させること、感染された宿主細胞を適当な条件下に培養すること、および、前記宿主細胞により生成されたペプチド、蛋白および／またはウイルスを単離および／または増菌させることを含む。
【００５１】
さらに、細胞への相同または非相同配列の導入方法は、生体外および、好ましくは生体内治療に適用することができる。生体外治療のために、ウイルスを予め（ｅｘ  ｖｉｖｏ）感染させた単離細胞を、免疫反応を誘発するために動物生体に投与する。生体内治療のためには、ウイルスまたはその組換え体を、免疫反応を誘発するために動物生体に直接投与する。この場合、接種部位を包囲する細胞が、本発明のウイルスまたはその組換え体により、生体内で直接感染される。
【００５２】
本発明のウイルスはヒトおよびサル細胞において高度に成長制限されており、すなわち高度に弱毒化されているので、ヒトを含む広範囲の哺乳動物を治療することが理想的である。従って、本発明は、例えば、ヒトを含む動物生体中において免疫反応を誘発するための、薬剤組成物およびワクチンも提供する。本発明のウイルスは、任意の他の遺伝子治療プロトコールにおいて、いっそう安全である。
【００５３】
薬剤組成物は、通常、一種以上の薬学的に許容できるおよび／または認可されるキャリア、添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤および／または安定化剤を含んでよい。そのような助剤物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝性物質等であり得る。適当なキャリアは、一般的には、蛋白、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーまたは脂質凝集体等のような大きな、ゆっくり代謝する物質である。
【００５４】
ワクチンの調製のために、本発明のウイルスまたはその組換え体は、生理学的に許容できる形状に転化される。これは、天然痘に対するワクチン接種のために用いられるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて行うことができる（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら著［１９７４年］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．第９９巻、２３８６〜２３９２頁）。例えば、精製されたウイルスは、約１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で調製された５×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌの量で−８０℃で貯蔵される。ワクチンショットの調製のために、例えば、１０2〜１０8のウイルス粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプル内で２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下に燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で凍結乾燥する。また、ワクチンショットを、製剤中でのウイルスの段階的凍結乾燥により生成する。この製剤は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのようなさらなる添加剤、または酸化防止剤のような他の添加剤、または不活性ガス、安定化剤あるいは、生体内投与に適した組換え蛋白（例えば、ヒト血清アルブミン）を含み得る。次に、ガラスアンプルを封鎖し、４℃〜室温で数ヶ月貯蔵することができる。しかしながら、必要が無い間は、アンプルを、好ましくは−２０℃を下回る温度で貯蔵する。
【００５５】
ワクチン接種または治療のために、凍結乾燥物を水溶液、好ましくは生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液０．１〜０．５ｍｌ中に溶解し、全身的または局所的に、すなわち、非経口的に、筋肉内に、または当業者に知られている他の投与経路により投与する。投与方式、投与量および投与回数は、当業者により既知の方法で最適化することができる。
【００５６】
さらに、さらなる実施形態によれば、本発明のウイルスは、免疫無防備状態の動物、例えば、ＳＩＶが感染したサル（ＣＤ４＜４００／血液μｌ）、または免疫無防備状態のヒトにおいて免疫反応を誘発するのに特に有用である。「免疫無防備状態の」という用語は、不完全な免疫反応しか示さない、または感染剤に対する防御において効果が低下している個体の免疫系の状態を表すものである。より興味深いさらなる実施形態において、本発明のウイルスは、これらの動物またはヒトにおいてポックスウイルスへの予め存在する免疫が存在していても、免疫無防備状態の動物またはヒトにおいて免疫反応をブーストすることができる。特に興味深いのは、本発明のウイルスが、抗ウイルス、例えば、抗レトロウイルス治療を行っている動物またはヒトにおいても免疫反応をブーストできることである。「抗ウイルス治療」は、例えば（ｉ）ヌクレオチド類似体の適用、（ｉｉ）ウイルス酵素的活性またはウイルス収集用の抑制剤の適用または（ｉｉｉ）宿主の免疫反応に影響を与えるためのサイトカインの適用を含む、ウイルス感染を除去または抑制するための治療概念を含む。
【００５７】
さらなる実施形態によれば、ワクチンは特に、しかし排他的ではなく、獣医分野で、例えば、動物ポックス感染に対する免疫化のために適用することができる。小動物においては、免疫化用の接種は、好ましくは、非経口的または鼻腔から行われ、大きな動物またはヒトにおいては、皮下、筋肉内または経口接種が好ましい。
【００５８】
発明者らにより、既に、本発明のウイルスを僅か１０2ＴＣＩＤ50（組織培養感染投与量）の有効投与量含むワクチンショットが、マウスにおける野生型ワクチンウイルスチャレンジに対して完全な免疫を誘発するのに充分であることが発見された。このことは、本発明のウイルスのそのような高度の弱毒化が抑制的に影響されることが予想され、それにより、その免疫原性が低下することは特に驚くべきことである。そのような予想は、免疫反応の誘発のためには抗原エピトープが免疫系に充分な量で提示される必要があるという考えに基づく。高度に弱毒化され、すなわち複製しないウイルスは、非常に少量の抗原エピトープ、すなわちそれ自体が組み込んでいる量しか提示しない。ウイルス粒子により運ばれるこの量の抗原は、効果的な免疫反応の誘発に充分であると考えられない。しかしながら、本発明のウイルスは、マウス／ワクシニアチャレンジモデルにおいて、僅か１０2ＴＣＩＤ50の非常に低い有効投与量で、効果的かつ保護的な免疫反応を刺激する。本発明のウイルスは、他の今まで特徴付けられていたＭＶＡ菌株と比べて、予想不可能でさらに増加した免疫原性を示す。この高い免疫原性は、本発明のウイルスおよびそれから誘導されるワクチンを、免疫寛容動物またはヒトにおける適用に特に有用にする。
【００５９】
本発明のさらもう一つの実施形態によれば、ウイルスがアジュバントとして用いられる。本記載の文脈における「アジュバント」は、ワクチンにおける特異的免疫反応のエンハンサーを意味する。「ウイルスをアジュバントとして用いる」は、ウイルスを予め存在するワクチン中に含み、それにより、ワクチンを受ける患者の免疫系をさらに刺激することを意味する。大部分のワクチン中における抗原エピトープの免疫化効果は、所謂アジュバントの添加により高められることが多い。アジュバントは、ワクチンの抗原エピトープに対して強力な特異的免疫反応を引き起こすことにより免疫系を共刺激する。この刺激は、インターフェロンおよびインターロイキンのような非特異的免疫系の因子により制御することができる。
【００６０】
従って、本発明のさらなる実施形態において、ヒトを含む哺乳動物においてウイルスが用いられて、免疫系が活性化、支持または抑制され、好ましくは任意の抗原決定基に対する免疫反応が活性化される。ウイルスは、ストレスの場合のような感染に対する増加した感受性の刺激において免疫系を支持するために用いることもできる。
【００６１】
アジュバントとして用いられるウイルスは、非組換えウイルス、すなわち、そのゲノム中に非相同ＤＮＡを含まないウイルスであってよい。このタイプのウイルスの一例がＭＶＡ−ＢＮである。また、アジュバントとして用いられるウイルスは、ウイルスゲノム中に天然には存在しない非相同ＤＮＡ配列をそのゲノム中に含む組換えウイルスである。アジュバントとして用いるには、ウイルスの組換えウイルスＤＮＡは、好ましくは、免疫刺激ペプチドまたは、インターロイキンのような蛋白をコード化する遺伝子を含み発現する。
【００６２】
さらなる実施形態によれば、アジュバントとして用いられるまたはもう一つのワクチンに添加される場合、ウイルスが不活性化されることが好ましい。ウイルスの不活性化は、例えば、当該分野で知られているように熱または化学物質により行うことができる。好ましくは、ウイルスはβ−プロピオラクトンにより不活性化される。本発明のこの実施形態によれば、不活性化されたウイルスが、多くの感染または増殖性疾患に対するワクチンに添加されて、この疾患の患者の免疫反応が上昇する。
【００６３】
（発明の概要）
本発明は、特に、以下のものを単独または組み合わせて含む。
【００６４】
以下の特性の少なくとも一つを有するワクシニアウイルス：
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびハムスター幼児腎細胞系ＢＨＫにおいて増殖的複製する能力を有するが、ヒト表皮ケラチノ細胞系ＨａＣａｔにおいて増殖的複製する能力は有さないこと、
生体内で複製することができないこと、
致死チャレンジモデルにおいて、既知の菌株ＭＶＡ５７５と比べて高い免疫原性を誘発すること、および／または
ＤＮＡ初回／ワクシニアウイルスブースト方式と比べて、少なくとも実質的に同じ水準の免疫をワクシニアウイルス初回／ワクシニアウイルスブースト方式で誘導すること。
【００６５】
ウイルスが、ヒト胚腎細胞系２９３、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂおよびヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａのいずれかのヒト細胞系においても、増殖的に複製できない前記ウイルス。
【００６６】
ソールズベリー（英国）のヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）にＶ０００８３００８の番号で寄託されている前記ウイルス、およびその誘導体。
【００６７】
少なくとも一種の非相同核酸配列を含む、前記ウイルス。
【００６８】
前記非相同核酸配列が、少なくとも一つの抗原、抗原エピトープ、および／または治療化合物をコード化する配列から選択される前記ウイルス。
【００６９】
先に定義したウイルスから誘導される、ゲノムまたはその機能的部分。
【００７０】
前記ウイルスおよび／または、先に定義したゲノムおよび／またはその機能的部分、および薬学的に許容できるキャリア、希釈剤および／または添加剤を含んでなる薬剤組成物。
【００７１】
前記ウイルスおよび／または、先に定義したゲノムおよび／またはその機能的部分を含んでなるワクチン。
【００７２】
ヒトを含む生体動物において免疫反応を影響する、好ましくは誘発する薬物としての、前記ウイルス、先に定義したゲノムおよび／またはその機能的部分、先に定義した組成物または先に定義したワクチン。
【００７３】
第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において治療有効量で投与される前記ウイルス、先に定義した薬剤組成物、先に定義したワクチンまたは先に定義したウイルス。
【００７４】
薬剤またはワクチンの調製のための、前記ウイルスおよび／または先に定義したゲノムの使用。
【００７５】
相同および／または非相同核酸配列を標的細胞中に導入する方法であって、標的細胞に先に定義された非相同配列を含むウイルスを感染させること、または標的細胞に先に定義されたゲノムを形質移入させることを含んでなる方法。
【００７６】
ペプチド、蛋白および／またはウイルスを産生する方法であって、
宿主細胞に前記ウイルスを感染させる工程、
感染した宿主細胞を適当な条件下に培養する工程、および
前記宿主細胞により産生されたペプチドおよび／または蛋白および／またはウイルスを単離および／または増菌する工程
を含んでなる方法。
【００７７】
ヒトを含む動物生体における免疫反応に影響する、好ましくは誘発する方法であって、前記ウイルス、先に定義したゲノムおよび／またはその機能的部分、先に定義した組成物または先に定義したワクチンを、治療すべき動物またはヒトに投与することを含んでなる方法。
【００７８】
ウイルスの少なくとも１０2ＴＣＩＤ50（組織培養感染量）を投与することを含んでなる前記方法。
【００７９】
第１の接種（初回接種）および第２の接種（ブースティング接種）において、ウイルス、組成物またはワクチンを治療有効量で投与する前記方法。
【００８０】
動物が免疫寛容されている前記方法。
【００８１】
動物がポックスウイルスに対する予め存在する免疫を有する前記方法。
【００８２】
動物が抗ウイルス治療を受けている前記方法。
【００８３】
動物が抗ウイルス治療を受けており、抗ウイルス治療が抗レトロウイルス治療である方法。
【００８４】
前記ウイルス、先に定義されたゲノムおよび／またはその機能的部分のアジュバントとしての使用。
【００８５】
ワクチン中に含まれる抗原および／または抗原エピトープに対する特異的免疫反応を高める方法であって、ワクチンで治療すべきヒトを含む動物生体に、前記ウイルスまたは先に定義されたゲノムをアジュバントとして投与することを含んでなる方法。
【００８６】
アジュバントとしての、前記ウイルスまたは先に定義されたゲノム。
【００８７】
前記ウイルスまたは先に定義されたゲノムまたはその機能的部分を含んでなる、細胞、好ましくはヒト細胞。
【００８８】
前記ワクシニアウイルスを得る方法であって、
ＣＥＦ細胞およびその細胞系ＢＨＫから好ましく選択される、その中でウイルスが増殖的に複製することができる非ヒト細胞中に、一般的に入手できるワクシニアウイルス菌株、好ましくはＭＶＡ５７５を導入する工程、
これらの細胞からのウイルス粒子を単離／増菌させる工程、および
得られたウイルスが、先に定義された生物学的特性の少なくとも一つを有するかどうかを分析する工程
を含んでなり、
前記工程が、所望の複製特徴を有するウイルスが得られるまで、任意に繰り返される方法。
【００８９】
第１のバイアル／容器で第１の接種（初回接種）を行い、第２のバイアル／容器で第２の接種（ブースト接種）を行うための、前記ウイルス、前記ワクチンまたは先に定義された薬剤としてのウイルスを含んでなる初回／ブースト免疫化用キット。
【００９０】
ワクチンを調製するための、前記ウイルス、先に定義された組成物および／または先に定義されたワクチンの使用であって、ウイルス、組成物またはワクチンが第１の接種で投与され、同じウイルスまたはワクチンがブースト接種において投与される使用。
【００９１】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに説明する。当業者は、提供される実施例が、本発明により提供される技術の適用性をこれら実施例に決して限定しないことを良く理解している。
【００９２】
（図面の簡単な説明）
図１：
異なる細胞系におけるＭＶＡの異なる菌株の成長速度を示す図である。Ａ）において、結果は、試験したＭＶＡ菌株に従って群分けし、Ｂ）において、結果は、試験した細胞系に従って群分けしてある。培養４日後（Ｄ４）の細胞系から回収したウイルスの量を、プラークアッセイにより決め、１日後（Ｄ１）の初期接種量に対する４日後に回収したウイルスの比として表す。
【００９３】
図２：
ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ５７５でのワクチン接種の後のワクシニアの致死チャレンジに対して提供される保護を示す図である。保護は、標準的プラークアッセイによるチャレンジ４日後に決められる卵巣での量の減少により測定される。
【００９４】
図３：
異なる初回−ブースト方式を用いるインフルエンザチャレンジに対して提供される、ＣＴＬの誘発および保護を示す図。
【００９５】
３Ａ：マウスポリトープをコード化するＤＮＡまたはＭＶＡ−ＢＮワクチンを異なる組み合わせでワクチン接種した後の４つの異なるＨ−２d制限エピトープへのＣＴＬ反応の誘発。ＢＡＬＢ／ｃマウス（一群当たり５匹）に、ＤＮＡ（筋肉内）またはＭＶＡ−ＢＮ（皮下）をワクチン接種し、３週間後にブースター免疫化を行った。ワクチンによりコードされる４つの異なるエピトープに対するＣＴＬ反応（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、インフルエンザ；ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、Ｐ．Ｂｅｒｇｈｅｉ；ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ、サイトメガロウイルス：ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＬＣＶ）を、ブースター免疫化後２週間にＥＬＩＳＰＯＴを用いて決めた。
【００９６】
３Ｂ：マウスポリトープをコード化するＤＮＡまたはＭＶＡ−ＢＮワクチンを異なる組み合わせでワクチン接種した後の４つの異なるエピトープへのＣＴＬ反応の誘発。ＢＡＬＢ／ｃマウス（一群当たり５匹）に、ＤＮＡ（筋肉内）またはＭＶＡ−ＢＮ（皮下）をワクチン接種し、３週間後にブースター免疫化を行った。ワクチンによりコードされる４つの異なるエピトープに対するＣＴＬ反応（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、インフルエンザ；ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、Ｐ．Ｂｅｒｇｈｅｉ；ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ、サイトメガロウイルス：ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＬＣＶ）を、ブースター免疫化後２週間にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決めた。
【００９７】
３Ｃ：皮下投与される最適量（１×１０8ＴＣＩＤ50）の組換えＭＶＡ−ＢＮを用いる相同初回ブーストの後の、ペプチドおよびＭＶＡ特異的Ｔ細胞の頻度。マウス８匹の群に、図に示すような組み合わせの２ショットをワクチン接種した。最終ワクチン接種から２週間後、ペプチド特異的脾細胞の数を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて測定した。バーは、特異的スポットの平均数±平均からの標準偏差、を示す。
【００９８】
図４：
ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆまたはＭＶＡ−ＢＮをワクチン接種したサルのＳＩＶ負荷を示す図である。
【００９９】
図５：
ＳＩＶを感染した後のワクチン接種サルの生存率を示す図である。
【０１００】
図６：
サルのＭＶＡ−ＢＮへの血清抗体量を示す図である。各動物についての抗体量は異なる形状で示すが、平均量は中実矩形として表す。
【０１０１】
図７：
ｔａｔをコード化するＭＶＡ−ＢＮでのワクチン接種の後の免疫寛容サル（ＣＤ４＜血液４００ｍｌ）におけるＳＩＶ水準を示す図である。サルは、予め、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆのワクチン接種を３回（０、８、１６週）受けており、ＳＩＶの病原性単離体で感染されていた（２２週）。１００、１０２および１０６週（矢印で示す）において、サルにＭＶＡ−ＢＮ  ｔａｔをワクチン接種する。
【０１０２】
図８：
抗レトロウイルス治療およびＭＶＡ−ＢＮを用いる治療的ワクチン接種を受けているサルにおけるＳＩＶ水準を示す図である。３群のサル（ｎ＝６）をＳＩＶで感染し、毎日ＰＭＰＡで治療した（黒線で示す）。１０および１６週に、動物に、組換えＭＶＡの混合物または生理食塩水を接種した（矢印で示す）。
【０１０３】
図９：
感染および組換えＭＶＡのワクチン接種の後にＳＩＶに対して生じた液性反応を示す図である。３つの群（ｎ＝６）のサルに、ＳＩＶ（０週）の病原性単離体を感染させ、次に、抗レトロウイルス治療薬で治療した（ＰＭＰＡ；太線で示す）。サルに、１０および１６週に、組換えＭＶＡの混合物または生理食塩水を接種した。ＳＩＶへの抗体を、標準的ＥＬＩＳＡにおいて、感染されたＴ細胞溶解物を抗原として用いて決めた。
【０１０４】
図１０：
抗レトロウイルス治療を受けているＳＩＶ感染サルにおけるＭＶＡに対して発生した液性反応を示す図である。３つの群（ｎ＝６）のサルに、ＳＩＶ（０週）の病原性単離体を感染させ、次に、抗レトロウイルス治療薬で治療した（ＰＭＰＡ；太線で示す）。サルに、１０および１６週に、組換えＭＶＡの混合物または生理食塩水を接種した。ＭＶＡへの抗体を、ＭＶＡ用の標準的捕獲ＥＬＩＳＡを用いて決めた。
【０１０５】
図１１：
マウスに異なる天然痘ワクチンを接種した後のＭＶＡへの抗体の誘発を示す図である。ＭＶＡ−ＢＮをワクチン接種（０および４週）した後のＭＶＡに対して発生した抗体の水準を、尾乱切（０週）により得られる従来のワクシニア菌株ＥｌｓｔｒｅｅおよびＷｙｅｔｈ、ＭＶＡ５７２（０および４週）ならびにプレＥｌｓｔｒｅｅワクチンとして得られるＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ５７２と比較した。ＭＶＡ５７２は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーにＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７として寄託されている。捕獲ＥＬＩＳＡを用いて量を決め、グラフの線形部分を用いて線形回帰により計算し、光学密度０．３になる希釈として定義した。＊ＭＶＡ−ＢＮ：ＭＶＡ−ＢＮはＭＶＡ５７２：ＭＶＡ５７２とかなり異なる（ｐ＞０．０５）。
【０１０６】
実施例１
選択された細胞系におけるＭＶＡの新規菌株の成長速度および生体内複製
（ｉ）細胞系における成長速度
本発明により新たに単離された菌株（ＭＶＡ−ＢＮとも称される）を特徴付けるために、この新規菌株の成長速度を、既に特徴付けられている他のＭＶＡ菌株の成長速度と比較した。
【０１０７】
実験は、以下に列挙する一次細胞および細胞系における以下のウイルスの成長速度を比較することにより行った。
【０１０８】
ＭＶＡ−ＢＮ（ウイルス株＃２３、１８．０２．９９粗物、２．０×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌで滴定）
Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ（米国特許５，１８５，１４６）により特徴付けられ、ＭＶＡ−ＨＬＲとも呼ばれるＭＶＡ
Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ（Ｍａｙｒ，Ａ．ら著、［１９７５年］Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ第３巻；６〜１４頁）により特徴付けられ、ＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７）とも呼ばれるＭＶＡ
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３（ＷＯ  ０１／６８８２０）において特徴付けられているＭＶＡ−Ｖｅｒｏ（ウイルス株、４９継代、＃２０、２２．０３．９９粗物、４．２×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌで滴定）
使用した一次細胞および細胞系は：
ＣＥＦ：ニワトリ胚線維芽細胞（ＳＰＦ卵から新しく調製）
ＨｅＬａ：ヒト頸部腺癌（上皮）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２
１４３Ｂ：ヒト骨肉腫  ＴＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２
ＨａＣａＴ：ヒト表皮ケラチノ細胞系、Ｂｏｕｋａｍｐら、１９８８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１０６（３）巻：７６１〜７７１頁
ＢＨＫ：ハムスター幼児腎臓、ＥＣＡＣＣ  ８５０１１４３３
Ｖｅｒｏ：アフリカ緑サル腎線維芽細胞、ＥＣＡＣＣ  ８５０２０２９９
ＣＶ１：アフリカ緑サル腎線維芽細胞、ＥＣＡＣＣ  ８７０３２６０５
感染のために、異なる細胞を６ウエルプレートに５×１０5細胞／ウエルの濃度で接種し、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ製、カタログＮｏ．６１９６５−０２６）＋２％ＦＣＳ中、３７℃、５％ＣＯ2にて一晩インキュベートした。細胞培養培地を除去し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ2にてｍｏｉ約０．０５で１時間感染させた（感染について、細胞数は一晩で２倍になると推定される）。異なる細胞型の各感染のために用いられるウイルスの量は５×１０4ＴＣＩＤ50であり、これは入力と呼ばれる。次に、細胞をＤＭＥＭで３回洗い、最後にＤＭＥＭ１ｍｌで洗い、２％ＦＣＳを添加し、プレートを放置して３７℃、５％ＣＯ2にて９６時間（４日間）インキュベートした。これらの感染は、滴定分析の準備ができたプレートを−８０℃で凍結することにより停止した。
【０１０９】
滴定分析（ワクシニアウイルス特異的抗体での免疫染色）
ウイルスの量の滴定のために、試験細胞（ＣＥＦ）を、９６ウエルプレート上で、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ製、カタログＮｏ．６１８７０−０１０）、７％ＦＣＳ、１％抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ製、カタログＮｏ．１５２４０−０６２）中、１×１０4細胞／ウエルの濃度で接種し、３７℃、５％ＣＯ2にて一晩インキュベートした。感染実験剤を含む６ウエルプレートを、３回凍結／乾燥し、ＲＰＭＩ成長培地を用いて１０-1〜１０-12の希釈物を調製した。ウイルス希釈物を試験細胞上に分配し、３７℃、５％ＣＯ2にて５日間インキュベートして、ＣＰＥ（細胞変性効果）を発生させた。試験細胞を１０分間固定（アセトン／メタノール１：１）し、ＰＢＳで洗い、インキュベーション緩衝液中１：１０００の希釈でポリクローナルワクシニアウイルス特異的抗体（Ｂｅｒｌｉｎ在Ｑｕａｒｔｅｔｔ製、カタログＮｏ．９５０３−２０５７）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製、カタログＮｏ．２００１２−０１９）で２回洗った後、ＨＰＲ結合抗ウサギ抗体（マンハイム在Ｐｒｏｍｅｇａ製、カタログＮｏ．Ｗ４０１１）をインキュベーション緩衝液（３％ＦＣＳを含むＰＢＳ）中１：１０００の希釈で室温で１時間加えた。細胞を再びＰＢＳで２回洗い、染色溶液（ＰＢＳ１０ｍｌ＋１００％エタノール中のｏ−ジアニシジンの飽和溶液２００μｌ＋新たに調整したＨ2Ｏ2１５μｌ）と共に、褐色スポットが見えるまで（２時間）インキュベートした。染色溶液を除去し、染色反応を止めるためにＰＢＳを添加した。褐色スポットを示す各ウエルを、ＣＰＥに陽性であるとマークし、Ｋａｅｒｂｅｒの式を用いて滴定量を計算した（ＴＣＩＤ50に基づくアッセイ）（Ｋａｅｒｂｅｒ，Ｇ．１９３１年、Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．第１６２巻、４８０頁）。
【０１１０】
ウイルスを用いて、一方では、ＭＶＡに許容されると予想されるＣＥＦおよびＢＨＫ、他方では、ＭＶＡに許容されないと予想されるＣＶ−１、Ｖｅｒｏ、Ｈｅｌａ、１４３ＢおよびＨａＣａｔの二組を、低感染多重度で、すなわち、細胞当たり０．０５の感染単位で感染させた（５×１０4ＴＣＩＤ50）。この後、ウイルス接種物を除去し、細胞を３回洗って、残りの吸収されていないウイルスを除去した。感染物を合計４日間放置し、その間にウイルス抽出物を調製し、次に、ＣＥＦ細胞上で滴定した。表１および図１は、滴定アッセイの結果を示しており、そこで、値は、４日間の感染後に生成されたウイルスの合計量として与えられる。
【０１１１】
全てのＭＶＡに対して許容できる細胞系なので、全てのウイルスが予想通りにＣＥＦ細胞（にわとり胚線維芽細胞）中でうまく増幅したことが示された。さらに、全てのウイルスがＢＨＫ（ハムスター腎細胞系）においてうまく増幅したことが示された。ＢＨＫは許容できる細胞系なので、ＭＶＡ−Ｖｅｒｏが最良に働いた。
【０１１２】
Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞系）における複製に関しては、ＭＶＡ−Ｖｅｒｏが予想通りうまく増幅した、すなわち、入力の１０００倍増幅した。ＭＶＡ−ＨＬＲおよび、ＭＶＡ−５７５も、入力より、それぞれ３３倍および１０倍増幅した。ＭＶＡ−ＢＮのみが、他のものと比較して、これらの細胞において良好に増幅しなかった、すなわち、入力の２倍しか増加しなかった。
【０１１３】
ＣＶ１細胞（サル腎細胞系）における複製に関しても、ＭＶＡ−ＢＮがこの細胞系において高度に弱毒化されることが発見された。これは、入力よりも２００倍の低下を示した。ＭＶＡ−５７５も入力水準を越えて増幅せず、僅かに否定的に増幅を示した、すなわち、入力よりも１６倍低い低下を示した。最高のＭＶＡ−ＨＬＲは入力よりも３０倍の増幅を示し、続いてＭＶＡ−Ｖｅｒｏが入力よりも５倍の増加を示した。
【０１１４】
最も興味深いのは、ヒト細胞系における種々のウイルスの成長速度の比較である。１４３Ｂ細胞（ヒト骨癌細胞系）における増幅的複製に関しては、ＭＶＡ−Ｖｅｒｏが入力を超える増幅（３倍増）を示す唯一のものであることが示された。全ての他のウイルスは、入力を超えて増幅しなかったが、ＭＶＡ−ＨＬＲと、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−５７５との間には大きな相違があった。ＭＶＡ−ＨＬＲは「ボーダーライン」（入力より１倍低い）であり、ＭＶＡ−ＢＮが最も大きな弱毒化（入力を３００倍下回る低下）を示し、続いてＭＶＡ−５７５（入力を５９倍下回る低下）であった。要約すると、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト１４３Ｂ細胞における弱毒化に関して優れていた。
【０１１５】
さらに、ＨｅＬａ細胞（ヒト頸部癌細胞）における増幅に関しては、ＭＶＡ−ＨＬＲはこの細胞系において良好に増幅し、許容されるＢＨＫ細胞中での増幅（ＨｅＬａは入力を超えて１２５倍増加；ＢＨＫは入力を超えて８８倍増加）よりも大きいことが示された。ＭＶＡ−Ｖｅｒｏも、この細胞系において増幅した（入力を超えて２７倍増加）。しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮおよび、程度は少ないがＭＶＡ−５７５も、これらの細胞系において弱毒化した（ＭＶＡ−ＢＮは入力を下回る２９倍の低下、およびＭＶＡ−５７５は入力を下回る６倍の低下）。
【０１１６】
ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮ケラチノ細胞系）における複製に関して、ＭＶＡ−ＨＬＲがこの細胞系において良好に増幅（入力を超えて５５倍増加）することが示された。適用されたＭＶＡ−ＶｅｒｏおよびＭＶＡ−５７５の両方が、この細胞系において増幅（入力を超えて、それぞれ１．２倍および１．１倍の増加）を示した。しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮが唯一、弱毒化を示した（入力を下回る５倍の低下）。
【０１１７】
結論として、ＭＶＡ−ＢＮがこのウイルス群において最も弱毒化したウイルス菌株であると言うことができ、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト胚腎細胞（２９３：ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）（データは表１に含まれない）において０．０５〜０．２の増幅比を示すことによりヒト細胞系において極端に弱毒化されることを示し、これは、さらに、１４３Ｂ細胞における約０．０の増幅比、ＨｅＬａ細胞における約０．０４の増幅比、およびＨａＣａｔ細胞における約０．２２の増幅比を示している。さらに、ＭＶＡ−ＢＮは、ＣＶ１細胞において約０．０の増幅比を示している。Ｖｅｒｏ細胞においてのみ、増幅を観察すことができる（２．３３の比）が、ＢＨＫおよびＣＥＦのような許容できる細胞系におけるのと同じ程度ではない（表１と比較）。すなわち、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト細胞系１４３Ｂ、ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび２９３の全てにおいて１未満の増幅比を示す唯一の既知のＭＶＡ菌株である。
【０１１８】
ＭＶＡ−５７５は、ＭＶＡ−ＢＮと類似のプロフィールを示すが、ＭＶＡ−ＢＮのように弱毒化されることはない。
【０１１９】
ＭＶＡ−ＨＬＲは試験した全ての細胞系（１４３Ｂ細胞を除く）において良好に増幅し、すなわち、１４３Ｂ細胞を除いて試験した全ての細胞系において複製コンピテントであると見なすことができる。一つの場合において、許容できる細胞系（ＢＨＫ）におけるよりもヒト細胞系（ＨｅＬａ）において、より増幅する。
【０１２０】
ＭＶＡ−Ｖｅｒｏは、全ての細胞系において増幅を示すが、ＭＶＡ−ＨＬＲよりも示される程度が小さい（１４３Ｂの結果を無視）。それにもかかわらず、弱毒化に関して、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−５７５と同じ「クラス」にあると見なすことはできない。
【０１２１】
２．生体内複製
一部のＭＶＡ菌株が生体外で明らかに複製するとして、トランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９を用いて生体内で複製する、異なるＭＶＡ菌株の能力を試験した。このマウス菌株は、ＩＦＮ受容体Ｉ型（ＩＦＮ−α／β）およびＩＩ型（ＩＦＮ−γ）遺伝子においておよびＲＡＧにおいて遺伝子標的破壊を有する。これらの破壊の為に、マウスはＩＦＮ系を有さず、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができず、そのものとして強く免疫寛容され、複製しているウイルスに高度に感受性である。マウス６匹の群を、１０7ｐｆｕのＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−ＨＬＲまたはＭＶＡ−５７２で免疫化（腹膜内）（独国の１２０,０００人の人々において用いた）し、毎日、臨床症候についてモニターした。ＭＶＡ−ＨＬＲまたはＭＶＡ−５７２をワクチン接種した全てのマウスが、それぞれ２８日および６０日以内に死亡した。剖検において、大部分の器官において幾つかのウイルス感染の一般的症候があり、標準的プラークアッセイにおいて、卵巣からＭＶＡ（１０8ｐｆｕ）が回収された。これに対して、同じ投与量のＭＶＡ−ＢＮ（寄託された菌株ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８に相当）をワクチン接種したマウスは、９０日を超えて生存し、器官または組織からＭＶＡを回収することはできなかった。
【０１２２】
これらを併せると、生体外および生体内の研究からのデータは、親菌株および市販のＭＶＡ−ＨＬＲ菌株よりも、ＭＶＡ−ＢＮがより高度に弱毒化することを明示している。
【０１２３】
実施例２
免疫学的および生体内データ
これらの実験は、他のＭＶＡと比較して、ＭＶＡ−ＢＮの異なる投与および接種方式を比較するものである。
【０１２４】
２．１  ＭＶＡの異なる菌株が、免疫反応を刺激する能力において異なる
ワクチンの複製コンピテント菌株が、マウスにおける効果的免疫反応を誘発し、高い投与量においては致死的である。ＭＶＡは高度に弱毒化され、哺乳動物の細胞において複製する能力が低下しているが、ＭＶＡの異なる菌株間において弱毒化に相違がある。実際、ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ菌株よりも、親菌株ＭＶＡ５７５であっても、それよりもいっそう弱毒化するようである。この弱毒化の相違が、保護的免疫反応を誘発するようにＭＶＡの効果に影響を与えるかどうか決めるために、致死ワクシニアチャレンジモデルにおいて、異なる投与量のＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−５７５を比較した。保護水準を、チャレンジの４日後に決めた卵巣ワクシニア量の低下により測定し、これにより、ＭＶＡの異なる投与量および菌株を定量的に評価することができる。
【０１２５】
致死チャレンジモデル
特定の病原性のない６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）マウス（ｎ＝５）を、異なる投与量（１０2、１０4または１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ）のＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−５７５で免疫化（腹腔内）した。ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−５７５をＣＥＦ細胞上で増殖させ、スクロースを精製し、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で調製した。３週間後に、マウスは、ＭＶＡの同じ投与量および菌株のブーストを受け、２週間後に、ワクシニアの複製コンピテント菌株を用いて致死チャレンジ（腹腔内）を行った。複製コンピテントワクシニアウイルス（「ｒＶＶ」と略す）として、菌株ＷＲ−Ｌ９２９  ＴＫ＋または菌株ＩＨＤ−Ｊを用いた。対照マウスは、プラセボワクチンを受けた。保護は、標準的プラークアッセイにより、チャレンジの４日後に決められる卵巣中の量の低下により測定した。このために、マウスを、チャレンジの４日後に殺し、卵巣を取り除き、ＰＢＳ（１ｍｌ）中に均質化し、ＶＥＲＯ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら著、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０巻：１７１７頁）を用いる標準的プラークアッセイによりウイルス量を決めた。
【０１２６】
ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−５７５の１０4または１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌの２回免疫化を接種したマウスは、チャレンジの４日後の卵巣ｒＶＶ量における１００％低下（図２）により判断されるように、完全に保護されていた。チャレンジウイルスを取り除いた。しかしながら、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−５７５により与えられた保護の水準における相違が、より低い投与量において観察された。ＭＶＡ−５７５の１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌの２回免疫化を受けたマウスは、卵巣ｒＶＶ量の多さ（平均３．７×１０7ｐｆｕ±２．１１×１０7）により判断されるように保護できなかった。これに対して、同じ投与量のＭＶＡ−ＢＮをワクチン接種したマウスは、卵巣ｒＶＶ量において大きな低下（９６％）を誘発した（平均０．２１×１０7ｐｆｕ±０．２８７×１０7）。プラセボワクチンを受けた対照マウスは、平均ウイルス量が５．１１×１０7ｐｆｕ（±３．５９×１０7）であった（図２）
ＭＶＡの両方の菌株が、マウスにおいて、致死ｒＶＶチャレンジに対する保護的免疫反応を誘発した。ＭＶＡの両菌株は、高い投与量においては等しく効果的であったが、最適量より少ない量では、それらの効果の相違が明らかである。ＭＶＡ−ＢＮは、致死ｒＶＶチャレンジに対する保護的免疫反応の誘発において、その親菌株ＭＶＡ−５７５よりも効果的であり、これは、ＭＶＡ−５７５と比べてＭＶＡ−ＢＮの弱毒化が増加していることに関係し得る。
【０１２７】
２．２  初回−ブーストワクチン接種方式におけるＭＶＡ−ＢＮ
２．２．１  マウスに異なる天然痘ワクチンを接種した後のＭＶＡに対する抗体の誘発
ＭＶＡ−ＢＮの効果を、天然痘の根絶のために以前に用いられたワクシニア菌株および他のＭＶＡと比較した。これらは、ＣＥＦ細胞中で生成され尾乱切により得られたＥｌｓｔｒｅｅおよびＷｙｅｔｈワクシニア菌株を用いる一回免疫化、および独国において天然痘根絶プログラムにおいて以前に用いられていたＭＶＡ５７２を用いる免疫化を含んでいた。さらに、ＭＶＡ−ＢＮとＭＶＡ５７２とをプレワクチンとして比較し、続いて、乱切によるＥｌｓｔｒｅｅを用いた。各群について、８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、全てのＭＶＡワクチン接種（１×１０7ＴＣＩＤ50）は、０および３週目に皮下に行った。ブースト免疫化から２週間後、マウスにワクシニア（ＩＨＤ−Ｊ）をチャレンジし、卵巣中の量を、チャレンジの４日後に決めた。全てのワクチンおよび方式が、１００％の保護を誘発した。
【０１２８】
これらの異なるワクチンまたは方式を用いて誘発された免疫反応を、チャレンジ前に、動物において測定した。抗体を中和する水準、Ｔ細胞増殖、サイトカイン生成（ＩＦＮ−γとＩＬ−４）およびＴ細胞によるＩＦＮ−γ生成を測定するアッセイを用いた。ＥＬＩＳＰＯＴにより測定される、ＭＶＡ−ＢＮにより誘発されるＴ細胞反応の水準は、通常、他のＭＶＡおよび生物的等価性を示すワクシニアウイルスと等しい。異なるワクチン接種方式に続くＭＶＡへの抗体量の１週間の分析により、他のワクチン接種方式と比べて、ＭＶＡ−ＢＮでのワクチン接種が、抗体反応の速度および程度を著しく向上させることが示された（図１１）。実際、ＭＶＡの抗体量が、ＭＶＡ５７２を接種したマウスと比較して、ＭＶＡ−ＢＮを接種した場合、２、４および５週目（４週目のブースト後１週間）において著しく高かった（ｐ＞０．０５）。４週目のブーストワクチン接種の後に、抗体量は、ワクシニア菌株ＥｌｓｔｒｅｅまたはＷｙｅｔｈのいずれかを１回接種したマウスと比較して、ＭＶＡ−ＢＮ群において著しく高かった。これらの結果は、ＭＶＡ−ＢＮを２回接種すると、従来のワクシニア菌株（ＥｌｓｔｒｅｅおよびＷｙｅｔｈ）を１回接種する方法と比べて、優れた抗体反応が誘発されることを明らかに示しており、ＭＶＡ−ＢＮが他のＭＶＡ菌株よりも免疫原性が優れているというセクション１．５からの見識が確認される。
【０１２９】
２．２．２：ＭＶＡ初回およびブースト方式が、インフルエンザ  チャレンジモデルにおいて、ＤＮＡ初回ＭＶＡブースト方式と同じ水準の保護を生じさせる
高結合力ＣＴＬ反応を生じさせるＭＶＡ初回−ブースト方式の効果を評価し、優れていると報告されていたＤＮＡ初回／ＭＶＡブースト方式と比べた。ＤＮＡベクターまたはＭＶＡ−ＢＮのいずれかによりコードされるマウスポリトープ構造体を用いて異なる方式を評価し、ＣＴＬ誘発の水準をＥＬＩＳＰＯＴにより比較し、一方、反応の結合性を、インフルエンザでのチャレンジ後に与えられる保護の程度として測定した
構造
マウスポリトープをコード化するＤＮＡプラスミド（インフルエンザ、オボアルブミンを含む１０ＣＴＬエピトープ）は先に記載した（Ｔｈｏｍｓｏｎら著、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６０頁、１７１７頁）。このマウスポリトープを、ＭＶＡ−ＢＮの欠失部位ＩＩに挿入し、ＣＥＦ細胞上で増殖し、スクロース精製し、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で調製した。
【０１３０】
ワクチン接種プロトコール
最近の研究において、特定の病原性のない６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）マウスを用いた。５群のマウスをＥＬＩＳＰＯＴ分析に使用し、群当たり６匹のマウスを、インフルエンザチャレンジ実験に用いた。結果に詳細に記載する、マウスポリトープをコード化するＤＮＡまたはＭＶＡを用いて、異なる初回−ブースト方式で、マウスにワクチン接種した。ＤＮＡでの免疫化のために、マウスに麻酔をかけ、次に、麻酔下に、内毒素を含まないプラスミドＤＮＡ（ＰＢＳ５０μｌ中）５０μｇを４頭筋に１回注射した。マウス当たり１０7ｐｆｕのＭＶＡ−ＢＮを静脈内投与する、またはマウス当たり１０7ｐｆｕまたは１０8ｐｆｕのＭＶＡ−ＢＮを皮下投与することによりＭＶＡを用いる初回免疫化を行った。初回免疫化の３週間後に、ブースト免疫化を行った。ＤＮＡを用いる初回免疫化（前記参照）と同じ方法でプラスミドＤＮＡを用いるブースティングを行った。ＣＴＬ反応を達成するために、インフルエンザＣＴＬエピトープペプチド（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ）、Ｐ．Ｂｅｒｇｈｅｉエピトープペプチド（ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）、サイトメガロウイルスペプチドエピトープ（ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ）および／またはＬＣＶペプチドエピトープ（ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ）を用いて、標準的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら著、１９９８年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第４巻；３９７〜４０２頁）を、最後のブースト免疫化の２週間後に脾細胞に行った。チャレンジ実験のために、マウスに、致死量未満のレゾルタント（ｒｅｓｓｏｒｔａｎｔ）インフルエンザウイルスＭｅｍ７１（ＰＢＳ５０ｍｌ中４．５×１０5ｐｆｕ）を感染（ｉ．ｎ．）させた。感染の５日後、肺を除去し、標準的インフルエンザプラークアッセイを用いて、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞系においてウイルス量を２回決めた。
【０１３１】
結果：
ＤＮＡワクチン単独を用いると、ＣＴＬの、マウスポリトープによりコードされた４Ｈ−２dエピトープへの誘発は乏しく、Ｐ．Ｂｅｒｇｈｅｉ（ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）およびリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ）のためのエピトープの二つについて弱い反応しか検出できなかった。これに対して、ＤＮＡ初回ＭＶＡブースト方式（皮下投与された１０7ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮ）を用いると、かなりのＣＴＬがＳＬＹ（８倍増加）およびＲＰＱ（３倍増加）に誘発され、マウスサイトメガロウイルス（ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ）用の第３のエピトープへも反応が観察された（図３Ａ）。しかしながら、相同初回ブースト方式において、皮下投与された１０7ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮを用いると、ＤＮＡの後にＭＶＡ−ＢＮを用いる場合と同じ水準の反応が誘発された（図３Ａ）。驚くべきことに、ＭＶＡ−ＢＮ（１０7ＴＣＩＤ50）の１回免疫化を用いる場合、３つのエピトープの誘発されたＣＴＬの数において大きな相違は無く、これは、ＭＶＡ−ＢＮでの二次免疫化がＣＴＬ反応をあまりブーストしないことを示している。
【０１３２】
特に静脈内免疫化と比較すると、１０7ｐｆｕ  ＭＶＡの皮下投与は最も非効率的経路であること、およびＭＶＡの他の菌株を用いる接種用のウイルス濃度が以前に示されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら著、１９９８年）。最適免疫化方式を定義するために、ウイルスの量を変化させて、または投与方式を変えて、前記実験を繰り返した。一つの実験において、１０7ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮワクチン接種を静脈内に行った（図３Ｂ）。さらなる実験においては、１０8ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮを皮下に投与した（図３Ｃ）。これらの実験において、ＭＶＡ−ＢＮ初回−ブースト免疫化は、ＤＮＡ初回ＭＶＡブースト方式と比べて、平均ＣＴＬ数を高めて全部で３つのＣＴＬエピトープを得た。また、１０7ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮの皮下投与とは異なり、１０7ｐｆｕ  ＭＶＡ−ＢＮの静脈内投与および１０8ｐｆｕの皮下投与は、ＣＴＬ反応をかなりブーストし、これは明らかに、ＭＶＡ−ＢＮを用いて、ベクターへの予め存在する免疫の存在下におけるＣＴＬ反応をブーストし得ることを示している。
【０１３３】
２．２．３  ＳＩＶ感染アカゲサルにおけるＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆワクチンの効果
ＳＩＶの有毒一次単離物でのチャレンジの後のウイルス負荷および疾患の遅延を調べることにより、ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆワクチンの効果を決める。さらに、この研究は、ＭＶＡへの予め存在する免疫を有する免疫寛容サルにおいてＭＶＡ−ＢＮを用いて免疫反応を安全にブーストできるかどうか決める。
【０１３４】
ワクチン接種プロトコール
２群（ｎ＝６）のアカゲサル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｌｔａ）に、０、８および１６週に、ＭＶＡ−ＢＮ単独または組換えＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆをボーラスの筋肉内注射により接種した。２２週において、全てのサルに、静脈内経路により、一次非培養アカゲサルＰＢＭＣからの病原性細胞関連ＳＩＶ株（１×Ｃ）の５０ＭＩＤ50をチャレンジした。動物の臨床状態を頻繁にモニターし、定期的に血液サンプルを採取して、ウイルス血症、免疫パラメーター、および全範囲の血液病学的および血液臨床化学的パラメーターを測定した。ＡＩＤ状疾患を発症した動物を殺し、生き延びているサルを、ワクチン接種後９９週間モニターした。１００週目において、生き延びているサルを全て、ＭＶＡ−ＢＮで筋肉内免疫化し、１０２および１０６週目において、同じＭＶＡ−ＢＮ  ｔａｔでさらなる免疫化を行った。
【０１３５】
ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆのいずれのワクチン接種後にも、悪影響は観察されなかった。サルにＳＩＶを感染させた後、ウイルス血症が急激に生じ、感染から２週間でピークに達した（図４）。群内での大きな標準偏差の為に、ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆまたはＭＶＡ−ＢＮをワクチン接種した群の間においてＳＩＶの平均水準に大きな相違はなかった。しかしながら、対照（ＭＶＡ−ＢＮ）群と比べて、ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆを接種した群において、通常、１０倍低いＳＩＶ負荷があった。さらに、注射の３５週間（初期観察期間）後、対照群中の６匹の動物のうち４匹と比べて、ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆを接種した６匹のサルのうち１匹のみを安楽死させなくてはならなかった（図５）。病気の進行は、高いウイルス負荷と明らかに関連しており、そのものとして動物を、感染後さらに２９週間観察した。ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆは、対照群と比較して、病気の進行を遅らせるようであり、感染の４６週後にも、６匹のＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆ動物のうち５匹が生き残った（図５）。しかしながら、感染の５９週後、ｎｅｆ接種群のさらなる２匹の動物を安楽死させ、５匹の生存動物を残した（３匹はＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆ群からで、２匹がＭＶＡ−ＢＮ接種したものである）。これらの１２匹のサルにおけるＭＶＡ−ＢＮに対して生じた抗体量の試験は、ＭＶＡへの予め存在する免疫の存在下においてもＭＶＡ−ＢＮが免疫反応をブーストすることを明らかに示した（図６）。ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆでの初回免疫化後、全てのサルが、平均滴定量１０００でＭＶＡへの抗体反応を生じた。この抗体反応は、二次免疫化後にかなりブーストされ、これは明らかに、健常サルにおいて初回−ブースト免疫反応のためにＭＶＡを用い得ることを示している。これらの抗体量は次第に低下したが、免疫化の４９週間後までに、滴定量は一定になり、その結果、９９週目でのＭＶＡへの平均滴定量は２０００であった。
【０１３６】
５匹の生き残っているサルにＳＩＶを感染させ、４００／μｌ血液より少ないＣＤ４数で免疫無防備状態の。免疫寛容サル中でＭＶＡ−ＢＮを用いる衝撃を調査するために、初期ワクチン接種の１００、１０２および１０６週後に、５匹の動物をＭＶＡ−ＢＮ  ｔａｔで３回ワクチン接種した。ＭＶＡ−ＢＮ  ｔａｔでの最初の免疫化は、６週間後の３回目の免疫化でさらにブーストされたこれらの免疫寛容サルにおいて、ＭＶＡへの抗体反応を著しくブーストした（図６）。これらの結果は、さらに、免疫寛容サルにおいても、ＭＶＡへの著しい予め存在する免疫の存在下に、ＭＶＡ−ＢＮが免疫反応をブーストし得ることを示している。サル免疫反応は、ＭＶＡ−ＢＮ  ｔａｔで免疫化した後にブーストされたが、ＳＩＶの水準を安定しており、これは、ＭＶＡ−ＢＮでの免疫化が安全であり、免疫寛容サルにおいてＳＩＶ水準に影響を与えないことを示している（図７）。
【０１３７】
この研究は、ＭＶＡ−ＢＮが、免疫寛容ミドリサルにおける免疫反応を初回−ブーストすることができ、ＭＶＡ−ＢＮ免疫化が安全であり、ＳＩＶ感染動物におけるウイルス血症の水準に影響を与えないことを示した。ＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆワクチンを接種した動物におけるＡＩＤＳ状疾患の進行の遅延は、免疫反応がｎｅｆに対して首尾よく生じたことを示している。
【０１３８】
２．２．４  抗レトロウイルス治療を受けているＳＩＶ感染サルの治療的ワクチン接種
ＭＶＡ−ＢＮ系治療的ＨＩＶワクチンを、同様に、抗レトロウイルス治療を受けている個体において用いた。従って、この研究は、ＰＭＰＡで治療したＳＩＶ感染サルにおいて種々のＳＩＶ抗原（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔおよびｎｅｆ）をコード化する組換えＭＶＡの安全性（ＳＩＶ水準への影響）および効果を示した。ＰＭＰＡは、ヌクレオシドが類似しており、ＨＩＶおよびＳＩＶに効果的である（Ｒｏｓｅｎｗｉｒｔｈ，Ｂ．ら著、２０００年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ第７４巻、１７０４〜１１頁）。
【０１３９】
構造
全ての組換えＭＶＡ構造物をＣＥＦ細胞上で増殖し、スクロース精製し、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で調製した。
【０１４０】
ワクチン接種プロトコール
３群（ｎ＝６）のアカゲサル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｌｔｔａ）に、病原性一次ＳＩＶ単離物（１×Ｃ）の５０ＭＩＤ50を感染させ、次に、ＰＭＰＡ（６０ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）で毎日、１９週間治療した。１０週目に、動物に、組換えＭＶＡ−ＢＮ（筋肉内）または生理食塩水を接種し、６週間後に同じワクチン接種を行った。１群は、ＭＶＡ  ｇａｇ−ｐｏｌとＭＶＡ−ｅｎｖとの混合物を与え、２群は、ＭＶＡ−ｔａｔ、ＭＶＡ−ｒｅｖおよびＭＶＡ−ｎｅｆを与え、３群は、生理食塩水を与えた。動物の臨床状態を頻繁にモニターし、ウイルス血症、免疫パラメーター、および全範囲の血液学的および血液臨床化学的パラメーターを測定するために定期的に血液サンプルを得た。
【０１４１】
全ての動物は、感染の２週間後にピークを示す高ＳＩＶ負荷を達成した（図８）。ＰＭＰＡでの毎日の治療に続いて、ＳＩＶ水準が低下し、９週間目までに低水準に安定した。先の研究におけるように、１０および１６週目のＭＶＡでのワクチン接種は、ＳＩＶ水準に影響を与えず、これは、ＭＶＡ−ＢＮが、免疫寛容動物にとって安全なワクチンベクターであることを示している。一旦、動物をＰＭＰＡ治療を止める（２１週）と、ＳＩＶ水準が増加した。１群における３匹の動物は、対照の３群と比べて、ＳＩＶの水準が低下したが、ＰＭＰＡ治療の終了後、どの群の間にも平均ＳＩＶ負荷の大きな相違はなかった（図８）。ＥＬＩＳＡ〜ＳＩＶ感染Ｔ細胞溶解物を用いて、全ての群の動物が、感染の４週後までにＳＩＶへの抗体反応を示した（図９）。ＰＭＰＡ治療中に対照群（生理食塩水）におけるＳＩＶ抗体量が低下し、ＰＭＰＡ治療を停止すると迅速に増加し、これは、抗レトロウイルス治療中のＳＩＶ水準の低下およびその後の増加を反映している（図９）。ＭＶＡ−ｔａｔ、ＭＶＡ−ｒｅｖおよびＭＶＡ−ｎｅｆを受けた２群において、ＳＩＶ抗体量に同様のパターンが観察され、これはおそらく、ＥＬＩＳＡで用いたＳＩＶ感染Ｔ細胞溶解物におけるこれらの調節蛋白の発現中に反映している。これに対して、１群の抗ＳＩＶ抗体量は、１０週目にＭＶＡ  ｇａｇ−ｐｏｌおよびＭＶＡ−ｅｎｖでワクチン接種した後に増加し、これは、抗レトロウイルス治療を受けている（ＳＩＶ）感染動物におけるＳＩＶへの免疫反応を、組換えＭＶＡ−ＢＮがブーストし得ることを示している。重要なことは、１６週目に二次免疫化した後に抗ＳＩＶ抗体量がブーストされ、これも、ＭＶＡへの予め存在する免疫の存在下においてさえも免疫寛容動物における免疫反応を、ＭＶＡがブーストし得ることを示している（図８）。１群における抗ＭＶＡ抗体量もこのパターンを反映し、初回免疫化に続く抗体反応を生じ、これは、二次免疫化に続いておおきくブーストされた（図１０）。
参考文献：
【０１４２】
【外１】
0004421188.tif 000002
【０１４３】
表１：４日間の感染後の入力水準を越えるウイルス増幅
増幅率＝出力ＴＣＩＤ50／入力ＴＣＩＤ50
値は、ＴＣＩＤ50での値
【０１４４】
【表１】
0004421188.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は異なる細胞系におけるＭＶＡの異なる菌株の成長速度を示す。
【図２】  図２はＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ５７５でのワクチン接種の後のワクシニアの致死チャレンジに対して提供される保護を示す。
【図３】  図３は異なる初回−ブースト方式を用いるインフルエンザチャレンジに対して提供される、ＣＴＬの誘発および保護を示す。
【図４】  図４はＭＶＡ−ＢＮ  ｎｅｆまたはＭＶＡ−ＢＮをワクチン接種したサルのＳＩＶ負荷を示す。
【図５】  図５はＳＩＶを感染した後のワクチン接種サルの生存率を示す。
【図６】  図６はサルのＭＶＡ−ＢＮへの血清抗体量を示す。
【図７】  図７はｔａｔをコード化するＭＶＡ−ＢＮでのワクチン接種の後の免疫寛容サル（ＣＤ４＜血液４００ｍｌ）におけるＳＩＶ水準を示す。
【図８】  図８は抗レトロウイルス治療およびＭＶＡ−ＢＮを用いる治療的ワクチン接種を受けているサルにおけるＳＩＶ水準を示す。
【図９】  図９は感染および組換えＭＶＡのワクチン接種の後にＳＩＶに対して生じた液性反応を示す。
【図１０】  図１０は抗レトロウイルス治療を受けているＳＩＶ感染サルにおけるＭＶＡに対して発生した液性反応を示す。
【図１１】  図１１はマウスに異なる天然痘ワクチンを接種した後のＭＶＡへの抗体の誘発を示す。
【図１】
0004421188.tif 000004
【図２】
0004421188.tif 000005
【図３】
0004421188.tif 000006
【図４】
0004421188.tif 000007
【図５】
0004421188.tif 000008
【図６】
0004421188.tif 000009
【図７】
0004421188.tif 000010
【図８】
0004421188.tif 000011
【図９】
0004421188.tif 000012
【図１０】
0004421188.tif 000013
【図１１】
0004421188.tif 000014