(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１〜３のいずれか１種以上の遺伝子多型として表されるヒト下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子の検出を行うことにより、ヒト女性の閉経後骨粗鬆症の素因を検出する方法。
１．(a)ヒト下垂体グルタミン環状化酵素蛋白質のアミノ酸配列の５４番目のアミノ酸がアルギニンであり、かつ、当該酵素蛋白質をコードするヒト下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子の１６０番目の塩基がシトシンであること、あるいは、(b)当該５４番目のアミノ酸がトリプトファンであり、かつ、当該１６０番目の塩基がチミンであること、により表現される多型
２．ヒト下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子の塩基配列の−１０９５番目の塩基がチミンまたはシトシンであることで表現される多型
３．ヒト下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子の塩基配列の−１８４４番目の塩基がシトシンまたはチミンであることで表現される多型
【請求項２】
インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子の検出を行う、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの遺伝子の検出方法に関し、より具体的には、ヒトの骨粗鬆症の素因を検出するための指標となり得る、遺伝子多型の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、老齢者、特に、閉経後の女性に多く認められる疾患である。骨粗鬆症の臨床診断は、骨密度値の計測と、単純エックス線撮影による老人性骨折の有無等を指標として行われるが、これらの診断方法には、予防診断学的な意味は乏しい。なお、一部の健康診断等において、若年者に対する骨密度値の測定が予防診断学的な目的で行われているが、骨密度値は、環境要因を含めた全ての要因の総合結果を示すもので、骨粗鬆症の個々のリスクファクターの存在を直接的に示すものではない。
【０００３】
また、骨粗鬆症は、最も一般的に見られる多因子疾患のひとつであり、治療応答性を早期に予測することが非常に重要である。さらに、若年齢のうちに、運動や食事により骨密度を向上させることにより、たとえ、骨粗鬆症の素因を有する者であっても、中年期以降の発症を抑止または緩和することが可能であると考えられている。
【０００４】
しかしながら、骨粗鬆症に対して予防医学的なアプローチがなされることは、むしろ稀であり、現実的には、骨粗鬆症患者に、事後的に、既存の治療法を逐次行った結果を個別に評価して、はじめて治療応答性についての評価が得られるのが常である。
【０００５】
骨粗鬆症における治療応答性の事前の検出手段として、骨粗鬆症についての遺伝要因の関与の検討が挙げられる。このような遺伝要因の関与を検討した成果として、ビタミンＤ受容体遺伝子、Ｉ型コラーゲン遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子、および、インターロイキン６遺伝子における遺伝子多型と骨密度との相関が示されてきた。しかしながら、遺伝子多型が、骨粗鬆症の素因の実用的な診断マーカーとして提供された例は、未だ、認められない。
【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある。
【０００７】
【非特許文献１】
Orimo, H., Hayashi, Y., Fukunaga, M., Sone, T., Fujiwara, M., Shiraki, M., Kushida, K., Miyamoto, S., Soen, S., Nishimura, J., Oh-hashi, Y., Hosoi, T., Gorai, I., Tanaka, H., Igai, T., Kishimoto, H. Diagnostic criteria for primary osteoporosis: year 2000 revision. J Bone Miner Metab 19: 331-337, 2001.
【非特許文献２】
Morrison NA, Qi JC, Tokita A, Kelly PJ, Crofts L, Nguyen TV, Sambrook PN, Eisman JA. 1994 Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 367: 284-287
【非特許文献３】
Grant SFA, Reid DM, Blaake G, Herd R, Fogelman I, Ralston SH. 1996 Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Sp1 binding site in the collagen type I alpha 1 gene. Nature Genet. 14; 203-205
【非特許文献４】
Kobayashi S, Inoue S, Hosoi T, Ouchi Y, Shiraki M, Orimo H 1996 Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene. J Bone Miner Res 11; 306-311
【非特許文献５】
Murray RE, McGuigan F, Grant SFA, Reid DM, Ralston SH. 1997 Polymorphism of the interleukin-6 gene are associated with bone mineral density. Bone 21; 89-92
【非特許文献６】
Ota N, Nakajima T, Nakazawa I, Suzuki T, Hosoi T, Orimo H, Inoue S, Shiraki M, Emi M. 2001 A nucleotide variant in the promoter region of the interleukin-6 gene associated with decreased bone mineral density. J Hum Genet 46: 267-272
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、骨粗鬆症の素因を、予防診断学的に検出可能な指標として用い得る遺伝子多型を見出し、かかる遺伝子多型を指標として用いた骨粗鬆症を診断するための検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前述したように、骨粗鬆症は多数の要因の組み合わせによって発症する多因子性成人疾患であるが、なかでも正常エストロゲンレベルの維持は最も重要な要素である。エストロゲンレベルを調節する因子として、ゴナドトロピン遊離ホルモンなどを介した視床下部―下垂体―性腺調節機構が主として関与している。
【００１０】
本発明者は、骨粗鬆症の素因と、上記視床下部―下垂体―性腺調節機構の関係について検討を行った結果、驚くべきことに、活性型ゴナドトロピン遊離ホルモンのアミノ基末端のグルタミン残基を環状化する酵素である、下垂体グルタミン環状化酵素（Ｎ末端グルタミン閉環化酵素又はグルタミンペプチド閉環酵素ともいう。以下、当該酵素をＱＰＣＴと略記することもある）遺伝子は、骨粗鬆症の素因を規定する遺伝子の一つであり、その遺伝子多型を検出することにより、骨粗鬆症の素因を特定することが可能であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記１〜３のいずれか１種以上の遺伝子多型として表されるヒトＱＰＣＴ遺伝子の検出を行うことにより、ヒト女性の閉経後骨粗鬆症の素因を検出する方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
１．(a)ヒト下垂体グルタミン環状化酵素蛋白質のアミノ酸配列の５４番目のアミノ酸がアルギニンであり、かつ、当該酵素蛋白質をコードするヒト下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子の１６０番目の塩基がシトシンであること、あるいは、(b)当該５４番目のアミノ酸がトリプトファンであり、かつ、当該１６０番目の塩基がチミンであること、により表現される多型
２．ヒトＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列の−１０９５番目の塩基がチミンまたはシトシンであることで表現される多型
３．ヒトＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列の−１８４４番目の塩基がシトシンまたはチミンであることで表現される多型
【００１２】
なお、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕
バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ  Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』
【００１３】
また、本明細書中の表記で、例えば、「Ａ１００Ｖ」とは、「アミノ酸配列における１００番目のアミノ酸が、アラニンまたはバリンであることにより表現される遺伝子多型であって、当該アミノ酸がアラニンである頻度が、バリンである頻度よりも高いこと」を意味するものとする。また、例えば、「１００Ｇ＞Ａ」とは、「塩基配列における１００番目塩基が、グアニンまたはアデニンである遺伝子多型であって、当該塩基がグアニンである頻度が、アデニンである頻度よりも高いこと」を示すものとする。
【００１４】
また、後述する遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列（多型部分において頻度が高い方の塩基を有している配列）は、特に断らない限り、全て、ゲノムＤＮＡの塩基配列番号である。よって、後述する遺伝子多型は、全て、少なくともゲノムＤＮＡにおいて認められる多型である。ただし、かかるゲノムＤＮＡの多型に対応するｃＤＮＡにおける多型を指標として、骨粗鬆症の素因を特定するＱＰＣＴ遺伝子の検出方法も、本検出方法の技術的範囲に包含される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
上述したように、本発明は、ゴナドトロピン遊離ホルモンに関連する遺伝子である、下垂体グルタミン環状化酵素遺伝子（ＱＰＣＴ遺伝子）における多型を検出することで、骨粗鬆症の素因を検出する、遺伝子の検出方法である。
【００１６】
ＱＰＣＴ遺伝子は、第２染色体の長腕 (2p22.3)に位置する遺伝子であり、ＱＰＣＴ遺伝子と、これがコードするＱＰＣＴ蛋白質については、すでに解析がなされている（Molecular cloning, sequence analysis and expression of human pituitary glutaminyl cyclase.  J. Mol. Endocrinol. 13 (1), 77-86 (1994), Genbank Accession Number: mRNA; NM_012413 [gi:9257235], protein; NP_036545 [gi:6912618]）。
【００１７】
このＱＰＣＴ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部の塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、第１図と配列番号１に示した。なお、第１図に示したＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列と別添の配列表におけるＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列は同一の配列であるが、その塩基の番号の付け方が異なっている。本明細書における、ＱＰＣＴ遺伝子の多型塩基等を特定する番号は、第１図に従うこととする。なお、第１図（１）は、当該ＱＰＣＴ遺伝子の−１８７５〜−７３６の範囲を示しており、（２）は、−７３５以降の範囲を示している。また、第１図において、矢印で示している数字は、塩基配列番号であり、囲みのある塩基とアミノ酸は、多型塩基とこれがコードするアミノ酸であり、括弧内の塩基とアミノ酸は、頻度が少ない多型の塩基とこれがコードするアミノ酸である。
【００１８】
ＱＰＣＴ遺伝子における多型と、これらの多型に起因するＱＰＣＴ蛋白のアミノ酸配列の相違や、遺伝子からｍＲＮＡへの転写効率の変化等により惹起されると考えられる現象、すなわち、骨密度の減少、生化学的代謝マーカーの変動、性ホルモン調節レベルの変動等との関係を具体的に解析することにより、本検出方法において利用し得る、ＱＰＣＴ遺伝子の特定の遺伝子多型を見出すことができる。すなわち、骨粗鬆症患者と健常人との組合せにおいて、ＱＰＣＴ遺伝子の多型が高頻度で認められる部分、その多型が構造遺伝子部分の多型である場合には、当該多型による蛋白質の機能への影響等を解析することにより、骨粗鬆症の素因の指標となり得る、特定の遺伝子多型を見出すことができる。
【００１９】
ＱＰＣＴ遺伝子における特定の多型のうち、２種類以上の異なる多型を選択して、これらを組み合わせて、骨粗鬆症の素因の指標として用いて、ＱＰＣＴ遺伝子を検出することにより、さらに的確に骨粗鬆症の素因を検出することが可能である。
【００２０】
このＱＰＣＴ遺伝子における、２種類以上の異なる多型の組合せによる骨粗鬆症の素因の検出は、この異なる多型の組合せの方式をアルゴリズム化して、かかるアルゴリズムを実行することができるコンピュータソフトウエアを用いて行うことが好適である。
【００２１】
この、異なる多型の組合せの方式を行うことができるアルゴリズムは、適切なプログラム言語、例えば、機械語、アセンブラ言語等の低水準言語；Fortran、COBOL、BASIC、Ｃ等の手続型言語；RPG、Prolog、LISP、APL、Smalltalk、Ｃ＋＋、JAVA（登録商標）等の非手続型言語等に従い、ソフトウエア化され、コンピュータ端末等のハードウエアに組み込まれて実行することで、２種類以上の異なるＱＰＣＴ遺伝子の多型を骨粗鬆症の素因の検出の指標とする、本検出方法を、好適な態様として行うことができる。
【００２２】
前述したように、ＱＰＣＴ遺伝子において見出され、骨粗鬆症素因と関連が認められる、代表的な遺伝子多型として、下記の多型を挙げることができる。これらの遺伝子多型は、上記のコンピュータソフトウエアのアルゴリズムを構成する、２種類以上の特定の多型として選択することが可能であり、かつ、好適である。
【００２３】
１．ＱＰＣＴ遺伝子の、ＱＰＣＴ蛋白質のアミノ酸配列の５４番目のアルギニンをコードする塩基配列における多型［例えば、ＱＰＣＴ遺伝子の１６０番目の塩基における多型（例えば、当該塩基におけるシトシンとチミンの相違による多型により、ＱＰＣＴ蛋白質のアミノ酸配列５４番目が、アルギニンまたはトリプトファンであることにより表現される多型）］
【００２４】
２．ＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列の-1095番目（プロモーター領域）の塩基における多型(例えば、当該塩基がチミンまたはシトシンであることで表現される多型）
【００２５】
３．ＱＰＣＴ遺伝子の塩基配列の-1844番目（プロモーター領域）の塩基の多型（例えば、当該塩基がシトシンまたはチミンであることで表現される多型）
遺伝子多型の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ法(denaturing gradient gel electrophoresis) 法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimid modification)法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法、インベーダー・アッセイ法〔Third Wave Technologies 社（米国）〕、Sd-PCR法等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（1993）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法については、Myers,R.M.,Shefield,V.,and Cox,D.R.(1988) in Genomic Analysis:A Practical Approach.K.Davies,ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139 等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子多型を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。
【００２６】
第２図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第２図において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。
【００２７】
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、多型検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、多型検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、多型検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
【００２８】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
【００２９】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の多型検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
【００３０】
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。
【００３１】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
【００３２】
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、多型検出対象塩基において、存在頻度が高い塩基が認められる野生型遺伝子であることを検出することができる。
【００３３】
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の多型検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
【００３４】
また、鋳型ヌクレオチド１１に、頻度が高い多型塩基と頻度が低い多型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
【００３５】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分の検討を行うことにより、遺伝子多型の内容を検出することも可能である。さらに、ここでは、頻度の高い多型遺伝子を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
【００３６】
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。
【００３７】
ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ−clamp ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Shefield,V.C. et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236等を参照のこと〕。
【００３８】
よって、ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ−clamp を付加する工程が必要となる。
【００３９】
本検出方法における、ＱＰＣＴ遺伝子の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。
【００４０】
すなわち、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子変異（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することが可能である。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける変異を検出することも可能である。
【００４１】
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子多型部位において低頻度塩基が認められた場合、この遺伝子多型部位と、骨粗鬆症の素因と関連付けて、被験者が発症する蓋然性の高い骨粗鬆症の種類や部位を特定することができる。また、現に発症している骨粗鬆症の原因を特定することができる。現状では、ＱＰＣＴ遺伝子の多型による、骨密度の相違は、橈骨（とうこつ：radius）において認められており、この多型を指標として検出可能な骨粗鬆症は、股関節部や手関節部等への影響が大きいことが想定される。
【００４２】
本検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型部位における塩基の相違を検出可能な反応を行い、かかる検出反応により、所望する遺伝子多型部位における塩基の相違を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、遺伝子の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
【００４３】
本検出方法を行うことによって、例えば、特定の遺伝子多型部位に、低頻度の塩基、または、当該塩基の相違によるアミノ酸配列の相違が認められる場合には、被験者において、骨粗鬆症の素因が認められ、現時点で、被験者に異常がなくても、骨粗鬆症を発症するリスクが高いことを明らかにすることができる。このような場合、骨強化法（運動、食事・栄養指導、薬剤の投与等）を行うことによって、骨粗鬆症の発症を予防することが可能である。また、日常生活において、特定部分（例えば、股関節部や手関節部等）の保護に心がけることにより、骨密度の低下により、頻度が高くなる骨折を予防することも可能となる。
【００４４】
また、例えば、既に、骨粗鬆症を発症している被験者に対して、本検出方法を行うことにより、ＱＰＣＴ遺伝子の特定の遺伝子多型に起因する骨粗鬆症であるのか否かを、高い確度で推定することが可能である。このような場合、治療方法として適したものを選択することにより、より効果的な骨粗鬆症の治療を行うことができる。
【００４５】
さらに、特定遺伝子の多型が骨粗鬆症に関係しているメカニズムを明らかにすることにより、かかるメカニズムに対応した、骨粗鬆症の治療薬の開発の途を提供することも可能である。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［被験者の遺伝子の解析］
DNAの抽出
血液抽出DNAは、384名の成人日本人女性を被験者として、末梢血液から、常法により抽出された。被験者の平均年齢および平均肥満指数と標準偏差は 58.4 ± 8.6 歳(32歳-69歳) および 23.7 ± 3.61 kg/m2 (14.7-38.5 kg/m2) であった。橈骨骨密度 (g/cm2) はDTX-200 (Osteometer Meditech Inc., Hawthorne, CA, USA)を用いたDEXA法（dual energy X-ray absorptiometry）によった。骨密度値に影響する年齢・伸長・体重差を補正するため年齢および肥満係数BMI（Body Mass Index）を独立変数とした重回帰分析により標準化をおこなった補正骨密度値をInstat 3 software (GraphPad Software, San Diego, CA)により計算した 。 補正式を以下に示す。
【００４７】
[adjusted-BMD (g/cm2)] = [measured-BMD (g/cm2) ] − 0.006375 x [58.39 − [age (years)]] + 0.008961 x [23.65 − [BMI (kg/cm2)]].
橈骨DEXAによるBMDは、日本国における原発性骨粗鬆症の診断基準に基づき、行った。
【００４８】
なお、被験者の中には、下垂体疾患や甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、腎不全、副腎疾患、リウマチ性疾患などの骨代謝に影響を及ぼすことの知られた疾患や治療を受けているものはいなかった。エストロゲン補充療法を受けているものはいなかった。本試験は、検体収集を行った所属機関におけるinstitutional review board の承認を得て行なわれた。すべての被験者はボランティアであり、書面でのインフォームドコンセントの得られた研究参加者であった。
【００４９】
SNP 選別
QPCT遺伝子の3つの遺伝子多型は公的データーベースNCBI, dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) およびJSNP-database
(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html) から抽出された（第１表）。dbSNPに登録された42SNPsのうち、プロモーター領域から2つのSNP -1844T>C および -1095T>C (IMS-JST108247 およびIMS-JST108246).を、翻訳領域からアミノ酸置換を伴うひとつのSNP nt+160C/T; R54W (rs2255991 on dbSNP, IMS-JST059074 on JSNP-database) を選んだ。
【００５０】
遺伝子多型のタイピング法 
3つのSNPの遺伝子多型タイプは、インベーダー法により決定された。
a)塩基配列における-1095番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたプローブは、
インベーダープローブ（配列番号２）：
5'-CAACTCCATGGGAGTCCTGAAGCTGAAAAAGACGt  -3'
Cアレルプローブ（配列番号３）：
5'-cgcgccgaggGTCAAAGTTGTCCCATACT-3'
Tアレルプローブ（配列番号４）：
5'- acggacgcggagATCAAAGTTGTCCCATACTG-3'
であり、
【００５１】
b)塩基配列における-1844番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたプローブは、
インベーダープローブ（配列番号５）：
5'- TGGCTATGAGTTTTTAAAGAGAGGGCTTGCCTGGAAATACt-3'
Tアレルプローブ（配列番号６）：
5'- cgcgccgaggACTGTTCTGCCCTCC -3'
Cアレルプローブ（配列番号７）：
5'- acggacgcggagGCTGTTCTGCCCTC-3'
であり、
【００５２】
c) アミノ酸配列において、Ｒ５４Ｗとして表現される遺伝子多型をタイピングするために用いたプローブは、
インベーダープローブ（配列番号８）：
5'- ACATTTCAGAGATACTGGTGCCTTCTGCAATTTGCCt -3'
Cアレルプローブ（配列番号９）：
5'- acggacgcggagGAAGAGCCGATGAATTCA-3'
Tアレルプローブ（配列番号１０）：
5'- cgcgccgaggAAAGAGCCGATGAATTCA-3'
である。
【００５３】
転写因子のプロモーター領域内結合部位についての情報処理的なシーケンス解析は、公的データーベース TRANSFAC4.0 database
( HYPERLINK "http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html" http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html) に基づく MatInspector V2.2 により行った。
【００５４】
ハプロタイプの推定と連鎖不平衡解析
ハプロタイプの頻度推定の計算は、検討された768アレルについてArlequine software (Genetics and Biometry Laboratory, Geneva, Switzerland) を用いて行われた. 連鎖不平衡の解析はすべての可能は組み合わせについて通常行なわれる３つの方法 (D, D', and r2) について検討された。
【００５５】
統計解析
遺伝子型と補正BMD値 (g/cm2)との量的形質の相関は、ANOVA およびpost-hocテストとしての回帰分析により解析された。Instat 3 ソフトウェア(GraphPadソフトウェア) を使用した。各SNP (ex; rs2255991のためのC/C、C/TおよびT/T) の3つの遺伝子型カテゴリーは、SNPの頻度の低い対立遺伝子を所有する染色体の数に相当するインクリメント値、0、1および2に、それぞれ置きかえて解析した。有意水準は直線回帰分析の p-値 5%未満 (p<0.05) とし、遺伝子多型タイピング結果のHardy-Weinberg平衡についてはχ２乗検定により確認した(p>0.05)。
【００５６】
骨粗鬆症感受性遺伝子に対する最も有望な候補のひとつとしてQPCT遺伝子の遺伝子多型とBMDとの相関を検討した。検討に適したSNPとして、5'上流領域に存在する2つのプロモーター領域SNP (-1844C>Tおよび1095T>C)と、第二エクソン内のアミノ酸置換を伴う翻訳領域SNP(R54W) を選択した (第１表)。384検体についてインベーダーアッセイを行い、遺伝子多型の遺伝子型を決定することにより、今回検討した集団における対立遺伝子頻度および異型接合性を明らかにした (第１表)。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
これらの解析結果について分散分析（ANOVA）と直線回帰分析を行った（第２表）。
【００５９】
【表２】
0004414683.tif 000003
【００６０】
（１）解析されたすべてのSNPは補正橈骨の骨密度値と有意な相関を示し、第一エクソンの3'-端から1833塩基対上流に位置するSNP -1844C>T (参照コンティグ; NT_005367.1 GenBank) では、頻度の低いT-アレルをホモで保有する者は最も低い骨密度を示し(0.372 ± 0.059 g/cm2) 、ヘテロの被験者は中間の値を示し(0.400 ± 0.055 g/cm2)、頻度の高いC-アレルをホモで有するものでは最も高い骨密度を示した (0.406 ± 0.050 g/cm2)。マイナーアレルのT-アレルが、共優性な効果をもつと推定すると、その相関は有意であり (r=0.17, p = 6.4 x 10-4) (第３図(1))、劣性効果を推定するとその有意性はさらに強かった (p = 2.0 x 10-4, スチューデントのｔ-テスト)。また -1095T>CについてもマイナーなC-アレルをホモで持つものは最も低いBMDを示し (0.372 ± 0.059 g/cm2)、ヘテロでは中間値を (0.400 ± 0.055 g/cm2)、メジャーアレルのホモで最も高いBMDを示し (0.406 ± 0.050 g/cm2)、同様の有意な相関を示していた (r = 0.17, p = 7.0 x 10-4) (第３図(2))。
【００６１】
さらに R54W (+160C>T)でも、マイナーアレルのT-アレル (トリプトファンをコードするTGGコドンの第一塩基にあたる) (R/R)を持つもので最も低く(0.372 ± 0.058 g/cm2)、ヘテロ(R/W)で中間値を (0.399 ± 0.054 g/cm2)、メジャーアレル C (アルギニンをコードするCGGコドンの第一塩基にあたる) (R/R)をホモで持つ者で最も高いBMD(0.407 ± 0.051 g/cm2) を示し、同等の相関を示していた (r = 0.18, p = 3.4 x 10-4)（第３図（３））。連鎖不平衡の指標としてD'およびr2値の検討をすべての組み合わせについて行ったところ、3つのSNPは強い連鎖不平衡の関係にあることがあきらかとなり(D' > 0.97, r2 > 0.92)、これらの結果は3つのSNP(-1844C>T, -1095A>G および R54W)のいずれも、またはいずれかが骨密度の決定に作用していることを示唆していた。さらにQPCT遺伝子座領域全体にわたる連鎖不平衡を調べるため、10SNP（-2300C>T, IVS1＋3583C>G, IVS1-3796A>G, IVS1-1629G>C, ＋126C>T(Y42T), IVS2-42A>G, INV4＋974G>A, INV4＋1053T>C,  INV4-1132C>A, IVS6＋73A>4 ）を更に追加して検討した結果、遺伝子上流領域約2キロ塩基配列から第６イントロンに至るまでほぼ全長にいたる明瞭な連鎖不平衡が示された（第４図）。
【００６２】
（２）性ホルモンレベルの調節の変化は骨格形成と閉経後の骨量減少の両者に影響を及ぼしうる。QPCT遺伝子の遺伝子多型が、これらの内どちらに影響しているのか検討するため対象検体を50歳未満（n =75）と50歳以上 (n = 309)の2群にわけて補正骨密度値との相関の検討を行った。興味深いことに50歳以上の対象においては再現性のある有意な相関が再現されたのに対し(-1844C>T r=0.21, p=0.0002, -1095A>G: r=0.21, p=0.0002, R54W: r=0.22, p=0.0001)、50歳未満の対象集団においては全く相関が観察されなかった (-1844C>T: r=0.03 , p=0.77, -1095A>G: r=0.03, p=0.82, R54W: r=0.03, p=0.80)。さらに5年間の経過観察を行うことの出来た126例について骨量減少量と遺伝子多型との相関を検討すると、これらの遺伝子多型は年間骨量減少量とのあいだに相関傾向を示していた (r = 0.14, p =0.11)。以上の結果から、QPCTの遺伝子多型は主として閉経後の骨量減少に関与していることが示唆され、QPCTの遺伝子多型を検出することにより、骨粗鬆症の中でも頻度が高い、閉経後骨粗鬆症(postmenopausal osteoporosis)の素因を検出することができることが認められた。
【００６３】
なお、上述した３８４名の成人日本人女性の血液抽出ＤＮＡ検体に対して、インベーダー・アッセイ法に換えてＳｄーＰＣＲ法［アレル特異的な多型反応のＰＣＲ増幅法に改良を加えたもの。すなわち、２つのアレル特異的配列をもったプライマー（ＡＳ−プライマー）と、１つの逆方向プライマーをＳＮＰ毎に設計し、アレルの識別は、ＡＳ−プライマーの長さの相違に基づくＰＣＲ増幅断片のサイズの相違により行う方法である］で、上記の特定の多型(-1844C>T: , -1095A>G, R54W)における骨粗鬆症との相関解析を行った結果、上述したインベーダー・アッセイ法による結果と同様の結果が得られ、遺伝子多型の検出手段をＳｄーＰＣＲ法等の他の検出方法としても、本検出方法を行うことができることが明らかとなった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、骨密度に関連する遺伝子多型を用いた、骨粗鬆症の素因を検出可能な、遺伝子の検出方法が提供される。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＱＰＣＴ遺伝子（−１８７５〜−７３６）における多型塩基の位置等を示した図面である。
【図２】ＱＰＣＴ遺伝子（−７３５以降）における多型塩基の位置等を示した図面である。
【図３】インベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
【図４】ＱＰＣＴ遺伝子における特定の遺伝子多型と骨密度の減少の相関関係を示した図面である。
【図５】ＱＰＣＴ遺伝子座位における連鎖不平衡を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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