(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び配列番号２により特定されるゲノム及びプラスミド配列により特徴づけられるビフィドバクテリウムロンガム株。
【請求項２】
ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８。
【請求項３】
担体の調製のための、請求項１又は２に記載のビフィドバクテリウム、又はその培養上清若しくはその代謝物の使用。
【請求項４】
ビフィドバクテリウムが１０5ｃｆｕ／ｇ担体材料〜１０12ｃｆｕ／ｇ担体材料の量で担体に含まれている請求項３に記載の使用。
【請求項５】
担体が腸疾患又は腸不快感、好ましくはＩＢＤ（腸疾患）、クローン病又は下痢の予防及び／又は治療のためのものである請求項３又は請求項４に記載の使用。
【請求項６】
腸疾患又は腸不快感が病原性細菌及び／又はロタウイルスにより引き起こされる請求項５に記載の使用。
【請求項７】
担体が、乳汁、ヨーグルト、凝乳（カード）、チーズ、発酵乳、乳汁を主成分とした発酵製品、アイスクリーム、発酵穀類を主成分とした製品、乳汁を主成分とした粉末、乳児用調製粉乳、ペットフードから選択される食品組成物、又は錠剤、細菌懸濁液、乾燥経口栄養補助食品、湿潤経口栄養補助食品、乾燥経管栄養物若しくは湿潤経管栄養物から選択される薬剤組成物である請求項３から請求項６までのいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれビフィドバクテリウム属ロンガムの新規の微生物、特にそのゲノム及びプラスミド配列、並びに前記ビフィドバクテリウムのポリペプチドを生成する方法に関する。本発明はまた、それぞれこれらの核酸又はポリペプチドを検出する方法に関する。ＮＣＣ２７０５のヌクレオチド配列及び／又はポリペプチド配列を含むデータキャリアを提供する。さらに、本発明は、ビフィドバクテリウムロンガム株ＮＣＣ２７０５に関し、また、ロタウイルス及び病原性細菌により引き起こされる下痢の予防及び／又は治療のための前記ビフィドバクテリウム又はその活性成分を含む食品及び薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸を主要代謝成分として産生する生物は何十年も前から知られている。これらの細菌は通常、乳汁又は乳汁加工工場、生又は腐敗植物だけでなく、ヒト及び動物の腸内にも見いだされる。「乳酸菌」という用語でまとめられているこれらの微生物は、かなり不均質の群を代表し、乳酸球菌属、乳酸桿菌属、連鎖球菌属、ビフィドバクテリウム属、ペディオコッカス属等を含む。
【０００３】
乳酸菌は、腐敗菌の成長を抑制するその発酵作用中に発生する生成物の低ｐＨ及び作用の利点を用いる食品の保存用の発酵剤として人類により利用されてきた。さらに、乳酸菌は、チーズ、ヨーグルト及び乳汁製の他の発酵乳製品のような様々な食料品を調製するのにも用いられてきた。
【０００４】
かなり最近、乳酸菌は、一部の菌株が経口摂取でヒト及び動物に対して有用な特性を示すことが見いだされたという点で大きい関心を集めている。特に、乳酸桿菌属又はビフィドバクテリウム属の特定の菌株は、胃腸管の上部において、特に胃内で優勢な低ｐＨの影響により殺滅されずに生育可能かつ生きた形で胃腸管を通過し、腸粘膜にコロニー形成することができることが見いだされており、それらの腸内での一時的又は持続的維持は生物の健康に多くの良い効果をもたらすと推定されている。これらの菌株は、一般的に共生菌と称されている。
【０００５】
欧州特許第０７６８３７５号は、腸内菌叢に植え付けられた状態になることができ、腸細胞に接着する可能性のあるビフィドバクテリウム属のそのような特定の菌株を開示している。このビフィドバクテリウムは、免疫調節を助け、腸細胞への病原性細菌の接着を競合的に排除することができ、それにより個体の健康の維持を支えていると報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
乳酸菌の特定の菌株が備えている有用な特性を考慮して、ヒト及び／又は動物の福祉に有益であるさらなる乳酸菌株に対する願望が当技術分野に存在する。さらに、これらの菌株の生物学に関する、特に、宿主との相互作用、腸内の種々の環境条件を通るという現象並びに腸粘膜に接着する能力を有し、最終的に免疫系及び病原体に対する防御の増強に関与することに関するより詳細な情報が望まれており、これらの情報はこれらの機構のより十分な理解をもたらすものである。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、ヒト及び／又は動物にとって有益な特性を示す細菌株に関する実質的なデータを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の課題を考慮して、本発明の対象は、乳酸菌ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ２７０５ゲノムの配列である配列番号１を有するヌクレオチド配列及び／又はそれに含まれているプラスミドの配列番号１０９９のヌクレオチド配列にある。しかし、本発明は、配列番号１及び配列番号２に示されている配列に限定されないが、変異株、多形性、対立遺伝子変異体及びその突然変異体をエンコードするゲノム及びポリヌクレオチドを含む。
【０００９】
本発明は、２００１年１月２９日のブダペスト条約に従ってパスツール研究所により寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−Ｉ−２６１８を受けたビフィドバクテリウムロンガム株ＮＣＣ２７０５のゲノムの全ゲノム配列決定に基づいている。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１の配列と少なくとも９０％の同一性を示すヌクレオチド配列又は（ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１と相同又はハイブリッド形成するヌクレオチド配列又はその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列に関する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を示すヌクレオチド配列又は（ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号２と相同又はハイブリッド形成するヌクレオチド配列又はその一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列に関する。
【００１２】
ゲノム又はゲノム配列という用語は、ビフィドバクテリウムロンガムの染色体の配列を意味すると理解するものとする。プラスミドという用語は、本発明のビフィドバクテリウムに含まれるＤＮＡの染色体外断片を意味すると理解するものとする。ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド又は核酸は、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ又は長さが約１０〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む様々な長さの前記ＤＮＡｓの転写産物を意味すると理解される。
【００１３】
本発明による相同ヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列の塩基と少なくとも９０％、及びより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性の割合を有するヌクレオチド配列を意味すると理解される。前記相同は、例えば、ビフィドバクテリウムの種、好ましくはビフィドバクテリウムロンガム種に属する細菌のゲノム配列又はその代表的断片の配列と一致する配列並びにビフィドバクテリウムの種の変異体に属する細菌のゲノム配列又はその代表的断片の配列に一致する配列を含んでいてよい。本発明では、種及び属という用語は相互に交換可能である。
【００１４】
これらの相同配列は、したがって、同一種内又は種間の突然変異に関連する変異に対応していてよく、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの短縮、置換、欠失及び／又は付加に相当していてよい。前記相同配列は、科、種又は変異体に特異的であり、ビフィドバクテリウムに存在する可能性のある遺伝暗号の同義性又は遺伝暗号のバイアスに関連する変異に対応していてもよい。
【００１５】
タンパク質及び／又は核酸配列相同性は、当技術分野で知られている種々の配列比較アルゴリズム及びプログラムのいずれかを用いて評価することができる。そのようなアルゴリズム及びプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを含むが、これらに決して限定されない（例えば、ピアソン及びリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第８５巻、８号、２４４４〜２４４８ページ、アルトシュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻、３号、４０３〜４１０ページ、トンプソンら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２巻、２号、４６７３〜４６８０ページ、ヒギンスら（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２６６巻、３８３〜４０２ページ、アルトシュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻、３号、４０３〜４１０ページ、アルトシュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３巻、２６６〜２７２ページを参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に好ましい実施形態において、タンパク質及び核酸配列相同性を当技術分野でよく知られている基本局所配列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（「ＢＬＡＳＴ」）（前出）を用いて評価する。特に、４つの特異的ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施した。
（１）ＢＬＡＳＴＰ：アミノ酸検索配列をタンパク質配列データベースと比較する。
（２）ＢＬＡＳＴＮ：ヌクレオチド検索配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
（３）ＢＬＡＳＴＸ：すべての読み枠において翻訳されたヌクレオチド検索配列をタンパク質配列データベースと比較する。
（４）ＴＢＬＡＳＴＮ：タンパク質検索配列をすべての読み枠において動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。
【００１７】
これらの代表的断片のうち、ストリンジェントな条件下で本発明によるヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるものが好ましい。ストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成は、２つの相補的ＤＮＡ断片間にハイブリッド形成が維持されるような温度及びイオン強度条件を選択することを意味する。そのような高ストリンジェントな条件は、例えば、ＳＳＣ緩衝液、例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに相当する１×ＳＳＣの存在下で６５℃の好ましい温度でハイブリッド形成を行うことにより達成することができる。洗浄段階は、例えば次のとおりであってよい。すなわち、室温での２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄の後に、６８℃で１５分間にわたる１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとを用いる３回の洗浄。
【００１８】
配列番号１及び配列番号２のヌクレオチド配列はそれぞれ、ソフトウエアによるクローンの挿入断片の蛍光自動配列決定及びヌクレオチド断片（挿入断片）のこれらの配列の集合の後に、定方向配列決定の方法によりビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ２７０５のゲノム及びそれに含まれているプラスミドの配列決定を行うことにより得られた。このために、ゲノムの断片を作り、増幅及び増殖のため適切なベクターに連結させ、対応する断片の配列決定を行った。断片の重複及び最終配置、そのヌクレオチド配列を適切なソフトウエアを用いて評価した。
【００１９】
本発明は、配列番号１から得られる読み取り枠（ＯＲＦ）の知識を用いてポリペプチドを生成させるために用いることができる。したがって、他の態様によれば、本発明は、ビフィドバクテリウムロンガムゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）を選択し、よく知られている技術により所望のポリペプチドを発現させることにより、ポリペプチドを生成させる方法を提供する。
【００２０】
配列番号１により特定されるようなゲノム配列由来の核酸分子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた対応する配列の特異的増幅により得ることができる。本明細書に配列情報が記載されているので、当業者は適切なプライマーヌクレオチドを設計し、合成し、問題の断片をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅することができる。したがって、本発明は、核酸配列の増幅のためのプライマーとして使用することが可能である配列番号１から選択されるヌクレオチド配列も含む。例えば、ＴＡＳ（転写を用いる増幅システム［Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ］）法、３ＳＲ（自己持続複製［Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ］）法、ＮＡＳＢＡ（核酸配列を用いる増幅［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］）法、ＳＤＡ（鎖置換増幅［Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］）法又はＴＭＡ（転写媒介増幅［Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ］）法等の標的核酸を増幅する他の技術ももちろん用いることができる。
【００２１】
（ポリ）ヌクレオチドをプローブとして用いることができ、プローブとする核酸を増幅又は修飾する技術、例えば、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）法、ＲＣＲ（修復連鎖反応）法、ＣＰＲ（サイクリックプローブ反応）法又はＱβレプリカーゼ増幅法も十分に適用することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、本発明のヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド）を検出するためのハイブリッド形成（検出）プローブ及びプライマーを想定している。標的がＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡである場合、前記ｍＲＮＡは、直接検出するか、又は検出の前にｃＤＮＡに変換することができる。
【００２３】
あるいは、配列番号１により表される核酸の断片を得るために、ビフィドバクテリウムロンガムゲノムＤＮＡを選択した制限酵素による消化に供し、断片を例えば電気泳動又は他の適切な分離技術により分離してもよい。そのような技術は、当技術分野でよく知られており、とりわけサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９９２年に開示されている。そのような断片は、ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ２７０５のゲノムＤＮＡ（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８）を分離し、必要な段階を実施することにより容易に得られる。
【００２４】
別の形態として、サイズが大きすぎない場合には核酸を当業者によく知られている方法に従って化学合成により得ることもできる。
【００２５】
修飾ヌクレオチド配列は、当業者によく知られている技術に従って突然変異誘発によって得られ、正常な配列と比べて変化、例えば、特に、ポリペプチドの発現のレベルの変化又は複製サイクルの変調をもたらすポリペプチドの発現のための調節及び／又はプロモータ配列における突然変異を示すヌクレオチド配列を意味すると理解するものとする。修飾ヌクレオチド配列はまた、以下で定義される修飾ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列も意味すると理解されよう。
【００２６】
ビフィドバクテリウムロンガムゲノムの研究中に、以下の表１に示すＮＯ．１からＮＯ．１１４７により特定される読み取り枠を有する配列により特定される以下の注釈を行うことができた。
【００２７】
【表１−１】
0004570329.tif 000002
【表１−２】
0004570329.tif 000003
【表１−３】
0004570329.tif 000004
【表１−４】
0004570329.tif 000005
【表１−５】
0004570329.tif 000006
【表１−６】
0004570329.tif 000007
【表１−７】
0004570329.tif 000008
【表１−８】
0004570329.tif 000009
【表１−９】
0004570329.tif 000010
【表１−１０】
0004570329.tif 000011
【表１−１１】
0004570329.tif 000012
【表１−１２】
0004570329.tif 000013
【表１−１３】
0004570329.tif 000014
【表１−１４】
0004570329.tif 000015
【表１−１５】
0004570329.tif 000016
【表１−１６】
0004570329.tif 000017
【表１−１７】
0004570329.tif 000018
【表１−１８】
0004570329.tif 000019
【表１−１９】
0004570329.tif 000020
【表１−２０】
0004570329.tif 000021
【表１−２１】
0004570329.tif 000022
【表１−２２】
0004570329.tif 000023
【表１−２３】
0004570329.tif 000024
【表１−２４】
0004570329.tif 000025
【表１−２５】
0004570329.tif 000026
【表１−２６】
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【表１−２７】
0004570329.tif 000028
【表１−２８】
0004570329.tif 000029
【表１−２９】
0004570329.tif 000030
【表１−３０】
0004570329.tif 000031
【表１−３１】
0004570329.tif 000032
【表１−３２】
0004570329.tif 000033
【表１−３３】
0004570329.tif 000034
【表１−３４】
0004570329.tif 000035
【表１−３５】
0004570329.tif 000036
【表１−３６】
0004570329.tif 000037
【表１−３７】
0004570329.tif 000038
【表１−３８】
0004570329.tif 000039
【表１−３９】
0004570329.tif 000040
【表１−４０】
0004570329.tif 000041
【表１−４１】
0004570329.tif 000042
【００２８】
Ｎｏ．１〜１１４７ヌクレオチド配列に対応するＯＲＦは、上の表１において定義されており、配列番号１のゲノム配列におけるそれらの位置によって示されている。例えば、ＯＲＦ３配列は、配列番号１の配列の位置４６２２と６４７２のヌクレオチドの間のヌクレオチド配列により定義される（終端を含む）。
【００２９】
読み取り枠は、相同性解析並びに潜在的ＯＲＦ開始部位の解析により特定された。特定された各ＯＲＦは、前のＯＲＦの終止コドンに対してすぐ３’側のコドンから当該ＯＲＦヌクレオチド配列の枠における配列番号１の次の終止コドンの５’側までの隣接するヌクレオチド配列にわたるヌクレオチド配列からなることを理解されたい。
【００３０】
表１に、ＯＲＦのそれぞれによりエンコードされるポリペプチドの配列を公共公表データベースに示されている配列と比較した相同性調査の結果も示す。一実施形態において、公開データベースに存在するポリペプチドと約９９％を超える同一性を示す表１に示したポリペプチドは本発明の一部とみなされないことは理解される。同様にこの実施形態において、そのようなポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、本発明の一部とみなされない。
【００３１】
ＯＲＦヌクレオチド配列との相同性に関しては、１つのＯＲＦヌクレオチド配列の塩基と少なくとも８０％、好ましくは９０％及び９５％の同一性の割合を示す相同配列が好ましい。そのような相同配列は、例えば、上記のアルゴリズムにより、また以下の実施例において同定される。前記相同配列は、上で定義した相同配列に対応し、例えば、ビフィドバクテリウム科に属する細菌のＯＲＦ配列に対応する配列を含む可能性がある。
【００３２】
これらの相同配列は、同様に同じ種内又は種間の突然変異に関連する変異に対応し、特に少なくとも１つのヌクレオチドの短縮、置換、欠失及び／又は付加に対応する可能性がある。前記相同配列は、遺伝コードの同義性もしくは科、種又は変異株に特異的で、ビフィドバクテリウムに存在する可能性のある遺伝コードにおけるバイアスに関連する変異にも対応している可能性がある。
【００３３】
特に興味深い配列は、以下のポリペプチド又はその断片をエンコードするヌクレオチド配列である。
【００３４】
【化１】
0004570329.tif 000043
【化２】
0004570329.tif 000044
【化３】
0004570329.tif 000045
【化４】
0004570329.tif 000046
【化５】
0004570329.tif 000047
【化６】
0004570329.tif 000048
【化７】
0004570329.tif 000049
【化８】
0004570329.tif 000050
【化９】
0004570329.tif 000051
【００３５】
本出願に含まれている配列情報は、問題のポリヌクレオチド、すなわち既知又は未知の推定ポリペプチドをエンコードする読み取り枠を含む核酸を選択し、選択したポリヌクレオチドで微生物を形質転換するために用いることができることは理解されよう。形質転換ベヒクルとして、よく知られているプラスミド、ファージベクター（トランスフェクション）又はＦベクター（接合）を用いることができる。選択した微生物に導入された核酸は発現させることができ、その生物学的機能は、知られている場合、あるいはこれまでに未知のポリペプチドが発現している場合には解明された場合にそれとして利用することができる。選択する微生物は、ビフィドバクテリウム自体もしくは細菌、例えば、大腸菌、乳酸桿菌、連鎖球菌又は酵母のような他のよく知られている微生物、昆虫細胞又は動物及び植物細胞であってよい。
【００３６】
ポリペプチドはそれ自体又は融合ポリペプチドとして発現させることができることは理解されよう。当業者は、そのようなライゲーションを実施し、適切な細胞中で対応する融合ポリペプチドを発現する技術に精通している。
【００３７】
本発明を考慮して、本発明によるヌクレオチド配列のクローニング及び／又は発現のための新規の組換えベクターを案出してもよい。ベクターは、プロモータ、翻訳の開始及び終結のためのシグナル並びに転写の調節のための適切な領域のような、所与の宿主細胞内でヌクレオチド配列の発現及び／又は分泌を可能にするのに必要な要素を含む。例えば、タンパク質又はペプチドの発現は、当技術分野で知られているプロモータ／エンハンサにより制御することができる。具体例としてのプロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれているプロモータ、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、あるいは原核発現系については、β−ラクタマーゼプロモータ、ｔａｃプロモータ又はＴ７プロモータである。
【００３８】
ベクターは、宿主細胞中に安定に維持されることができなければならず、場合によっては翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを保有していてもよい。これらの種々の要素は、用いる宿主細胞に応じて選択する。この目的のために、本発明によるヌクレオチド配列を、選択した宿主内の自律的に複製するベクターもしくは例えば酵母人工染色体、プラスミド又はウイルスベクターのような選択した宿主内の組込みベクターに挿入することができる。ベクターは配列番号２によるプラスミド又は高コピー数を可能にする特定のオリにより補足されたその組換え体であってよいことが理解されよう。
【００３９】
当業者に知られているＤＮＡ断片をベクターに挿入する標準的方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナル及びタンパク質コーディング配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ及び合成法並びにｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）などがある。
【００４０】
ベクターは、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡをそれぞれ生成させるために配列番号１又は配列番号２に含まれる／により構成される核酸の転写及び／又は翻訳に用いることができる。そのようなベクターは、転写させ、所望の転写物を生成させることができる限り、エピソームのままとするか、又は染色体に組み込むことが可能である。
【００４１】
本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡとハイブリッド形成し、安定な二重らせんを形成することができるのに十分な相補性を有する配列を示す、配列番号１におけるポリヌクレオチド配列のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的な配列を含む。２本鎖アンチセンス核酸配列の場合には、二重らせんＤＮＡの１本鎖を試験するか、又は三重らせん形成を試験してもよい。
【００４２】
本発明は、本発明による及び上記の核酸又はベクターで形質転換した宿主細胞も含む。これらの細胞は、適切な細胞に上で定義したヌクレオチド配列又はベクターを導入し、次いで、形質転換／トランスフェクションしたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を可能にする条件下で前記細胞を培養することにより得ることができる。
【００４３】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞並びに植物細胞などの真核又は原核系から選択することができる。本発明の状況においては、細胞はより高等な生物学的システムを含むものと理解するものとされる。動物、植物全体又はその一部などである。さらに、宿主細胞系は、所望の特定の仕方で挿入された配列の発現を変調、あるいは遺伝子産物を修飾し、保有するものを選択することができる。
【００４４】
本発明のタンパク質の発現のための好ましい宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性細菌のような原核細胞からなる。本発明によるさらに好ましい宿主細胞は、ビフィドバクテリウム科に属する、より好ましくはビフィドバクテリウムロンガム種に属する細菌であるか、又はビフィドバクテリウムロンガム種に関連する微生物から選択する。
【００４５】
本発明による形質転換／トランスフェクトされた細胞は、モデルとすることが有利であり、本発明によるビフィドバクテリウムロンガム菌株によりもたらされた有益な効果のいずれかに寄与することができる化合物を研究、同定及び／又は選択する方法に用いることができる。
【００４６】
本発明はさらに、特に表１に列挙され、配列一覧表で確認されるビフィドバクテリウムロンガムＯＲＦによりエンコードされるポリペプチドを提供する。本明細書における記述では、ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質という用語は同義で用いられている。さらに本発明はまた、（ａ）ポリヌクレオチドによりエンコードされるポリペプチドを生産するのに適した条件下で本発明による宿主細胞を培養する段階と、（ｂ）培養からポリペプチドを回収する段階とを含む組換え手段によりそのようなポリペプチドを調製する方法に関する。
【００４７】
上記のポリペプチドは、最も活性である、あるいは所望の特性を示す化合物を選択するように、モデル系において試験する前にポリペプチドをいくつかの位置で修飾する、コンビナトリアルケミストリーを用いて得ることもできることは理解できよう。
【００４８】
これに関連して、化学合成は、非天然アミノ酸や非ペプチド結合を使用することができるという利点を有する。したがって、本発明によるポリペプチドの例えば寿命を延長するために、例えばＤ形のそのような非天然アミノ酸、あるいは好ましくは硫黄を含む形態のアミノ酸類似体を使用することが有利であろう。
【００４９】
最後に、本発明によるポリペプチド、その相同体又は修飾体の構造並びに対応する断片をポリペプチド型等の化学構造に組み込むことができる。したがって、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏ環境中に保存するために、Ｎ又はＣ末端においてプトテアーゼに対する分解抵抗性を有する最終産物を提供することが好ましい。
【００５０】
本発明による、また上記の方法により生産される各種ポリペプチドは、宿主動物の免疫系に対して抗原を提示する可能性があり、したがって、前記ポリペプチドに対する抗体が産生される可能性があることも理解されよう。これらの抗体は、混合物中の問題のポリペプチド又は試料中のビフィドバクテリウムの菌株の検出に用いることができる。さらに、それらは、例えば細胞表面エピトープに対する抗体を生産し、細菌細胞壁上のポリペプチドをブロックする効果を検討することにより研究ツールとして用いることができる。したがって、他の態様によれば、本発明は、本発明により提供される種々のポリペプチド上のエピトープに対する抗体を提供する。
【００５１】
他の態様によれば、本発明は、生物学的試料中のビフィドバクテリウムロンガムの検出及び／又は同定の方法も提供する。この方法は、ＰＣＲ又は適切なプローブを用いる単にハイブリッド形成のような当技術分野で知られているいくつかの技術を含むものである。あるいは、ビフィドバクテリウムロンガムの細胞壁エピトープに対して産生させた抗体を前記目的のために用いることができる。上記の方法は転換してもよく、ビフィドバクテリウムに対する抗体の存在は免疫複合体の生成を可能にする条件下で供試試料をビフィドバクテリウムのポリペプチドと接触させることにより確認することができることは理解されよう。
【００５２】
本発明によるポリペプチド、下記の本発明による抗体及び本発明によるヌクレオチド配列は、ビフィドバクテリウムの種に属する細菌の、それらを含む可能性のある生物学的試料（生物学的組織又は液体）中の検出及び／又は同定のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの方法に用いることができる。これらの方法は、用いる本発明によるポリペプチド、抗体及びヌクレオチド配列の特異性によって、ビフィドバクテリウムの種に属する細菌変異株並びに選択する本発明によるポリペプチド、抗体及びヌクレオチド配列により検出することができる関連微生物を検出及び／又は同定することができる。例えば、ビフィドバクテリウム科に対して特異的である本発明によるポリペプチド、抗体及び／又はヌクレオチド配列を選択することによりビフィドバクテリウム科の細菌を検出することができる本発明によるポリペプチド、抗体又はヌクレオチド配列を選択することが有利であろう。
【００５３】
本明細書において言及したすべての配列（配列番号１及び配列番号２）は、本明細書の一部とみなすべき添付の配列一覧に収載されている。
【００５４】
本発明は、固体支持体に共有結合により、又は非共有結合により固定化されている本発明によるヌクレオチド配列又はポリペプチドも含む。第１の例において、そのような支持体は、試験に供する生物学的試料から得られる標的核酸を特異的ハイブリッド形成により捕捉するのに役立つであろう。必要な場合、固体支持体を試料から分離し、捕捉プローブと標的核酸との間で形成されたハイブリッド形成複合体を、容易に検出できるエレメントで標識した検出プローブと呼ばれる第２のプローブにより検出する。
【００５５】
そのような支持体は、多数の分子プローブが固体支持体上に精密に組織化又は配置され、遺伝子の配列決定、遺伝子に含まれている突然変異及び遺伝子の発現の研究を可能にし、非常に小型で、分析回数の点で容量が高いため現在関心を集めている、いわゆるＤＮＡアレイ又はＤＮＡチップの形をとることができる。
【００５６】
これらのアレイ又はチップの機能は、分子プローブ、一般的に数平方センチメーター又はそれ以上の所望の大きさのキャリアに取り付けられている主としてオリゴヌクレオチドに基づいている。分析のために、キャリア（ＤＮＡアレイ／チップ）を、キャリアのあらかじめ定めた位置に配置されるプローブでコーティングする。その後、分析する標的核酸、例えば、事前に標識したＤＮＡ又はＲＮＡ又はｃＤＮＡの断片を含む試料をＤＮＡアレイ／チップと接触させ、ハイブリッド形成により二重らせんを形成させる。洗浄段階の後、チップの表面の分析により、標的に標識されたラベルにより放出されるシグナルによる有効なハイブリッド形成の位置の特定が可能となる。適切なコンピュータ処理によるこの分析からのハイブリッド形成フィンガープリント結果は、遺伝子の発現、試料中の特定の断片の存在、配列の決定、突然変異の存在のような情報を検索することを可能にする。
【００５７】
ＤＮＡチップ及び分析する試料上に付着又はｉｎ  ｓｉｔｕで合成された本発明のプローブ間のハイブリッド形成は、例えば、蛍光、放射能又は電子検出により測定することができる。
【００５８】
本発明によるヌクレオチド配列は、ビフィドバクテリウム遺伝子の発現の分析を行うためにＤＮＡアレイ／チップに用いることができる。この分析は、所与の遺伝子を特徴づけるそれらの特異性について選択されたプローブが存在するＤＮＡアレイ／チップに基づいている。分析する標的配列は、チップ上でハイブリッド形成させる前に標識する。洗浄した後、ハイブリッド形成を少なくとも２回行って、標識化合物を検出し、定量する。異なる試料について同じプローブ及び／又は同じ試料について異なるプローブを用いた場合に得られたシグナル強度の比較分析により、試料から得られるＲＮＡの転写の差異が決定される。
【００５９】
本発明によるＤＮＡアレイ／チップは、試料中の微生物の存在の迅速な確認ができる連続試験を可能にする他の微生物に特異的なヌクレチオドプローブを含んでいてもよい。
【００６０】
上述したＤＮＡチップの原理は、支持体を、ＤＮＡの代わりに本発明によるポリペプド又は抗体又はそのアレイでコーティングしたタンパク質チップを調製するのにも用いることができる。これらのタンパク質チップは、例えば、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によりタンパク質でコーティングした支持体上の標的分析物の親和捕捉により誘発された生体分子相互作用（ＢＩＡ）を分析することを可能にする。したがって、分析する試料における抗体又はポリペプドに特異的に結合することができる本発明によるポリペプド又は抗体を、試料中のタンパク質の検出及び／又は同定用のタンパク質チップに用いることができる。
【００６１】
本発明はまた、本発明による１つ又は複数のヌクレオチド及び／又はポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み取り可能媒体に関する。この媒体は、比較分析及び得られた結果の活用を促進するように、例えば、既知の配列との類似性及び／又は他の微生物のヌクレオチド及び／又はポリペプチド配列に関する情報のような本発明から抽出された追加情報も含んでいてよい。好ましい媒体は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ又は記録カセットのような例えば、磁気、光学、電気及びハイブリッド媒体である。
【００６２】
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、適切な場合、免疫反応又は特異的反応に適した培地を構成するための試薬、本発明によるポリペプチド（複数）と生物学的試料に存在する可能性のある抗体との間の免疫反応により生成する抗原抗体複合体の検出を可能にする試薬（これらの試薬も標識を有することが可能であるか、あるいは特に本発明によるポリペプチドが標識されていない場合に標識試薬により認識することができる）、本発明によるポリペプチドにより認識される抗体を含まない対照生物学的試料（陰性対照）、本発明によるポリペプチドにより認識されるあらかじめ定めた量の抗体を含有する対照生物学的試料（陽性対照）を含む、ビフィドバクテリウムロンガム種に属する細菌又は関連微生物の検出及び／又は同定のためのキット又はセットに関する。
【００６３】
本発明はまた、キットが本発明によるタンパク質チップを含む、ビフィドバクテリウムロンガム種に属する細菌又は関連微生物の検出及び／又は同定のため又は微生物の検出及び／又は同定のためのキット又はセットに関する。
【００６４】
ゲノム配列により本明細書に記載したＮＣＣ２７０５と称する新規の微生物は、２００１年１月２９日のブダペスト条約に従ってパスツール研究所に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−２６１８を受けた。この微生物は、ビフィドバクテリウム属、ビフィドバクテリウムロンガム種に属し、共生微生物であり、すなわち、本質的に生きていて、生存可能な形態で胃腸管を通過し、下痢を引き起こす病原性細菌による腸の集落形成を防ぐ能力を有し、さらに、ロタウイルスによる腸の感染の発生を防ぎ、あるいは低減する可能性がある。
【００６５】
当該微生物は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、ＣＯ2産生陰性であり、Ｌ（＋）乳酸を産生し、病原性大腸菌、例えば腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサルモネラ属、例えばネズミチフス菌のような下痢をもたらす細菌による集落形成を本質的に防ぎ、ロタウイルスによる腸の感染を防ぐ。
【００６６】
新規の微生物は、例えば、乳汁、ヨーグルト、凝乳、発酵乳、乳汁を主成分とした発酵製品、発酵穀類を主成分とした製品、乳汁を主成分とした粉末、乳児用調製粉乳のような様々な担体物質の調製に用いることができ、支持体に約１０5ｃｆｕ／ｇ〜約１０11ｃｆｕ／ｇの量で含めることができる。本発明の目的のために、略語ｃｆｕは、寒天プレート上の微生物数により示される細菌細胞の数と定義される「コロニー形成単位」を意味するものとする。
【００６７】
本発明はまた、少なくともビフィドバクテリウムＮＣＣ２７０５を含む、かつ／又は微生物が生育した上清又はそれぞれその活性画分／代謝物を含む食品又は薬剤組成物も提供する。
【００６８】
本発明の食品組成物を調製するために、本発明のビフィドバクテリウムの少なくとも１つを適切な支持体に約１０5ｃｆｕ／ｇ〜約１０12ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０6ｃｆｕ／ｇ〜約１０10ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは約１０7ｃｆｕ／ｇ〜約１０9ｃｆｕ／ｇの量で加える。
【００６９】
薬剤の場合、製品を錠剤、細菌懸濁液、乾燥細菌懸濁液、乾燥経口栄養補助食品、湿潤経口栄養補助食品、乾燥経管栄養物又は湿潤経管栄養物の形で調製することができ、これらに混入するビフィドバクテリウム／ビフィドバクテリアの量は最大約１０12ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０7ｃｆｕ／ｇ〜約１０11ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは約１０7ｃｆｕ／ｇ〜約１０10ｃｆｕ／ｇの範囲である。
【００７０】
個々の腸内の新規微生物の活性は、もちろん用量依存的である。すなわち、上記の食品材料又は薬剤組成物の摂取によって取り込まれる新規微生物又はその活性成分が多いほど、防御及び／治癒活性が高い。新規微生物はヒト及び動物に対して有害でなく、最終的に乳児の糞便から分離されるので、本質的に高い割合の個々の腸が新規微生物により集落形成されるように、その高い量を取り込ませることができる。
【００７１】
他の好ましい実施形態によれば、ビフィドバクテリウムの培養又はその活性画分の上清を担体の調製に用いることができる。上清は、そのまま用いるか、又は例えば凍結乾燥のような液体培地に微生物により分泌された代謝化合物を破壊しない条件下で乾燥し、担体に含めることができる。上清中の未知の化合物の数を最小限にするために、その組成が既知で、それを取り込む宿主に負の影響を及ぼさない明らかな培地中でビフィドバクテリアを生育させることが好ましい。さらに当業者は一般的知識に基づいて、例えばクロマトグラフィーにより望ましくない生成物の上清を随意に枯渇させるであろう。
【００７２】
本発明者らは、乳児の糞便を調査し、それから様々な細菌株を分離した。その後、これらの菌株の、大腸菌、赤痢菌属、クレブシエラ属、エルジニア属、緑膿菌、リステリア属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、クロストリジウムディフィシレ菌、ヘリコバクターピロリ菌及びカンジダアルビカンスのような下痢を引き起こすことが知られている細菌による集落形成及び／又は上皮細胞ヘの侵入を防ぐ能力について検討した。
【００７３】
ビフィドバクテリウム、乳酸球菌属及び連鎖球菌属を含むいくつかの細菌属の下痢抑制特性をスクリーニングした。感染者における下痢を引き起こす病原性微生物の代表としての大腸菌、クレブシエラ属、エルジニア属、緑膿菌、Ｈ．ピロリ菌及びネズミチフス菌のような病原性微生物を用いて、抑制特性の試験を実施した。
【００７４】
種々の細菌をそれらの最適増殖温度に相当する約３０〜４０℃の温度でＭＲＳ、Ｈｕｇｏ−Ｊａｇｏ又はＭ１７培地のような適切な培地中で生育させた。定常生産期に達した後、細菌を遠心分離により収集し、生理ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。各種試験の間には細菌細胞を凍結保存した（−２０℃）。
【００７５】
抗菌特性を評価するために以下の方法を選択した。
【００７６】
１つのプロトコールに従って、本発明の培養ビフィドバクテリウムが種々の病原性微生物の生存可能性を低下させる能力を検討した。この目的のために、病原性細菌の培養をビフィドバクテリウム培養の濃縮上清と接触させ、病原性細菌の増殖能を評価した。
【００７７】
第２のプロトコールに従って、腸の細胞培養モデルであるＴ84細胞への本発明のビフィドバクテリウムの接着能を、ビフィドバクテリウムをＴ84細胞とともに培養し、接着の率を評価することにより検討した。
【００７８】
他のプロトコールに従って、本発明のビフィドバクテリウムがサルモネラ菌による腸細胞の感染を防ぐ能力を腸のモデルとしての細胞系Ｃａｃｏ−２を用いて検討した。これに関して、本発明のビフィドバクテリウムの細胞培養の上清を病原微生物とともに腸細胞に加え、接着又は侵襲の率をそれぞれ評価した。
【００７９】
したがって、培養ビフィドバクテリウム及び上清が腸細胞への接着及び侵入を防止するのに極めて有効であることが判明したことを示すことができ、この微生物により分泌される１つ又は複数の代謝化合物が抗下痢活性を担っている可能性があることが示唆される。
【００８０】
他のプロトコールに従って、ＮＣＣ２７０５がロタウイルスによる上皮細胞の侵襲を防ぐことができるかどうかをさらに評価した。２種のプロトコールを適用した。１つのプロトコールに従って、種々の菌株をロタウイルス株との直接相互作用について検討し、一方、第２のプロトコールにおいては細胞のロタウイルス受容体と相互作用する菌株の有無について細菌をスクリーニングした。
【００８１】
第１のプロトコールは、各細菌懸濁液を異なるロタウイルス株と接触させ、適切な培地中でインキュベートすることを必要とした。その後、ウイルス−細菌混合物をヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９（腸上皮細胞系）の細胞単層に塗布し、インキュベーションを続けた。ウイルス複製を評価した。
【００８２】
第２のプロトコールは、各細菌懸濁液を最初にヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞単層とともにインキュベートし、その後ウイルスを加えることを必要とした。連続インキュベーションの後に、ウイルス複製を評価した。
【００８３】
ロタウイルス複製は、感染細胞におけるロタウイルスタンパク質の組織免疫染色により評価した。ロタウイルスと表示細菌とを接種した細胞培養中の感染細胞数がロタウイルスのみを接種した細胞と比較して９０％減少した場合、ロタウイルス阻害効果は所与の細菌に起因するものとした。
【００８４】
本発明を、限定することなく、実施例により記述することとする。
【００８５】
培地及び溶液は以下のとおりである。
ＭＲＳ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））
Ｈｕｇｏ−Ｊａｇｏ（トリプトン３０ｇ／ｌ［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］、酵母抽出物１０ｇ／ｌ［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］、ラクトース５ｇ／ｌ［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］、ＫＨ2ＰＯ4  ６ｇ／ｌ、牛肉抽出物２ｇ／ｌ［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］、寒天２ｇ／ｌ［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］）
Ｍ１７（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））
ユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）トマト寒天（缶詰トマトジュース４００ｍｌ、［ユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）］寒天ＢＢＬ  ４５．５ｇ、マルトース［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］１０ｇ、ヘミン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］５ｍｇ、寒天［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］５ｇ、蒸留水６００ｍｌ）
ＤＭＥＭ（ダルベッコ［Ｄｕｌｂｅｃｃｏ］の修正イーグル培地）
ＣＦＡ（ゴーシュら（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３年、第３１巻、２１６３〜６ページに準拠）
ミュラーヒングトン［Ｍｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ］寒天（オキソイド［Ｏｘｏｉｄ］）
ＬＢ（ルリア  ベルタミ、マニアチス［Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｍｉ，Ｍａｎｉａｔｉｓ］、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、コールドスプリングハーバー［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ］、１９９２年）
Ｃ14酢酸塩（５３．４Ｃｉ／ｍＭ、アマーシャムインターナショナル［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ］ＰＬＣ）
ＰＢＳ（ＮａＣｌ  ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．２ｇ／ｌ、  Ｎａ2ＨＰＯ4  １．１５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  ０．２ｇ／ｌ））
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメド［Ｓｅｒｏｍｅｄ］）
ＦＣＳウシ胎児血清（ギブコ［Ｇｉｂｃｏ］）
【００８６】
大腸菌ＤＡＥＣ  Ｃ１８４５はワシントン大学（シアトル［Ｓｅａｔｔｌｅ］所在）から入手し、大腸菌ＪＰＮ１５はメリーランド大学ワクチン開発センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ（米国）から入手した。ネズミチフス菌株ＳＬ１３４４はスタンフォード大学微生物学科（Ｄｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ［米国カリフォルニア州所在］）から入手した。この菌株は、マウスに対して病原体として作用し、ストレプトマイシンに対して耐性を有する。この菌株はＣａｃｏ−２結腸細胞に接着する（フィンレイ及びファルノウ（Ｆｉｎｌａｙ  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ）、１９９０年）。クレブシエラ属は、Ｆａｃｕｌｔｅ  ｄｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉｅ  Ｐａｒｉｓ  ＸＩ［フランス国Ｃｈａｔｅｎａｙ−Ｍａｌａｂｒｙ所在］の微生物研究所の保存臨床分離菌から入手した。エルジニア属はＩＮＳＥＲＭユニット４１１（ホピタルネッカー（Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｎｅｃｋｅｒ）［フランス国パリ所在］から入手した。緑膿菌は、Ｆａｃｕｌｔｅ  ｄｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉｅ  Ｐａｒｉｓ  ＸＩ［フランスＣｈａｔｅｎａｙ−Ｍａｌａｂｒｙ所在］の微生物研究所の保存臨床分離菌から入手した。
【００８７】
Ｈ．ピロリ菌は、ローザンヌ大学微生物研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｕｓａｎｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）［スイス国ローザンヌ所在］から入手した。
【００８８】
ヒトロタウイルスＷａ（Ｇ１血清型）及びサルロタウイルスＳＡ−１１（Ｇ３血清型）は、フィラデルフィア小児病院（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）［米国所在］のピー  エー  オフィット（Ｐ．Ａ．Ｏｆｆｉｔ）から入手した。ＤＳ−１ｘＲＲＶ再構築ウイルスは、ＮＩＨのエー  カピキアン（Ａ．Ｋａｐｉｋｉａｎ）［米国ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在］から入手した。血清型４ヒトロタウイルスＨｏｃｈｉは、ミュンヘン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ）［ドイツ所在］のピー  ベックマン（Ｐ．Ｂｅｃｋｍａｎｎ）から入手した。
【実施例１】
【００８９】
ビフィドバクテリアの分離
１５〜２７日齢の１６人の健常乳児のおむつから新鮮糞便を採取した。１ｇの新鮮糞便を実験室への輸送のために嫌気的条件下に置き、リンゲル液で連続希釈し、選択培地上で平板培養して、サンプリングから２時間以内に微生物学的分析を行った。３７℃で４８時間嫌気的にインキュベートしたユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）トマト寒天（缶詰トマトジュース４００ｍｌ、［ユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）］寒天ＢＢＬ  ４５．５ｇ、マルトース［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］１０ｇ、ヘミン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］５ｍｇ、寒天［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］５ｇ、蒸留水６００ｍｌ）を用いて、ビフィドバクテリアを分離した。コロニーを無作為に採集し、精製した。分離菌について生理学的及び遺伝学的な特徴決定を実施した。
【実施例２】
【００９０】
細胞系の培養
Ｃａｃｏ−２細胞：
阻害アッセイのために、Ｃａｃｏ−２細胞系を小腸の成熟腸細胞のモデルとして用いた。この細胞系は、例えば、分極、腸酵素の発現、特定の構造のポリペプチドの産生等の腸細胞の特性を示す。細胞は、異なる支持体上、すなわち、成長及び増殖用のプラスチック皿（２５ｃｍ2、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））上並びに接着試験用の脱脂及び滅菌済みの６ウエルガラスプレート（２２×２２ｍｍ、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））上で増殖させた。培養２日目の後は、培地（ＤＭＥＭ）を毎日交換した。使用前に培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌアムホテリン、５６℃で３０分間不活性化した２０％ＦＣＳ及び非必須アミノ酸（１０ｍＭ）を含む１％の溶液（ユーロバイオ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）［フランス国パリ所在］）を添加した。培養は、９０％空気及び１０％ＣＯ2からなる雰囲気中で３７℃で実施した。細胞を６日ごとに分割した。０．０１５％トリプシン及び３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含むＰＢＳで処理して、細胞をウエルの壁から脱離させた。トリプシンの効果を中和するために、ＦＣＳを含む同量の培地を得られた細胞懸濁液に加え、混合物を遠心分離し（１０００ｒｐｍで１０分）、ペレットを再び培地に溶解した。生存細胞（トリパンブルーで染色されない）を数えた。約３．５×１０5個の生存細胞を新しい培養瓶に移し、ウエル当たり約１．４×１０5個細胞を密集単層が得られるまで培養した。
【００９１】
Ｔ84細胞：
接着試験のために、Ｔ84細胞系を結腸細胞のモデルとして用いた。この細胞は、例えば、分極、腸酵素の発現、特定の構造のポリペプチドの産生等の腸細胞の特性を示す。Ｔ84細胞は、カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）［カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］から入手した。細胞を、２ｍＭグルタミン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸及び１０％不活性化（５６℃で３０分）ウシ胎児血清（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）［ドイツ国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在］）を添加したＤＭＥＭ（５０％）及びハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２（５０％）中、１０％ＣＯ2／９０％空気雰囲気中で３７℃で増殖させた。細胞は１０6細胞／ｃｍ2の濃度で播種した。細胞は、密集後後期、すなわち１０日後に接着アッセイに用いた。
【００９２】
ビフィドバクテリアを除くすべての菌株を、１５％グリセロールを含むそれらの培地中−８０℃で保持した。新しい培地への移しの回数が接着因子に影響を及ぼすので、サルモネラ菌株は２４時間以内に２回のみ移し、１回目の移しは菌株を凍結したときに行った。すべての培養を好気的に生育させた。
【００９３】
ビフィドバクテリア
菌株（ビフィドバクテリウムロンガムＣＮＣＭＩ−２６１８（ＮＣＣ２７０５））は、１５％グリセロールを含むＭＲＳ培地中に−２０℃で保存した。菌株を阻害アッセイに使用する前にＭＲＳ中で好気的条件下で増殖させ、２４時間間隔で２回新しい培地に移した。アッセイには、２×１０9ｃｆｕ／ｍｌの濃度を用いた。２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上清を収集し、その後、得られた上清における細菌の存在の有無を確認した。ビフィドバクテリウムの菌株をＭＲＳ中３７℃で１８時間嫌気的に培養した。次いで、培養を遠心分離し（４℃で２０分）、上清を収集し、凍結乾燥し、溶液に戻し、１０倍（１０×）濃縮した。上清のｐＨを最終的に４．５に調整した。
【００９４】
大腸菌Ｃ１８４５：
解凍後の最初の継代を、細菌による接着因子の発現をもたらすのに適しているＣＦＡ（ミュラーヒントン（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ））寒天上で行った。各実験の前に、細菌細胞を３７℃でインキュベートし、新しい培地への移しを２４時間後ごとに行った。
【００９５】
クレボシエラ：
細菌をルリアブロス中３７℃で１８時間にわたり一夜増殖させた。
【００９６】
エルジニア属：
細菌をルリアブロス中３７℃で１８時間にわたり一夜増殖させた。
【００９７】
緑膿菌：
細菌をルリアブロス中３７℃で１８時間にわたり一夜増殖させた。
【００９８】
Ｈ．ピロリ：
細菌を、０．２５％酵母抽出物（ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）所在］）、１０％ウマ血清及び０．４％カンピロバクター選択補体（スキローサプリメント、ＳＲ６９、オキソイドリミティッド（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ）［英国ベーシングストーク（Ｂａｓｈｉｎｇｓｔｏｋｅ）所在］）を含むブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）−寒天プレート上で増殖させた。
【実施例３】
【００９９】
６ウエルコーニング組織培養プレート（コーニングガラスワークス（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ）［ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）所在］）に入れたカバーガラス上に調製したＣａｃｏ−２及びＴ84単層をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。ビフィドバクテリア（１ｍｌ、使用済み培養上清、処理済み上清又は新鮮ＭＲＳブロス中４×１０8細菌／ｍｌ）を１ｍｌの細胞系培地に加えた。この懸濁液（２ｍｌ）を組織培養プレートの各ウエルに加え、プレートを１０％ＣＯ2／９０％空気中３７℃でインキュベートした。１時間インキュベートした後、単層を滅菌ＰＢＳで５回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色で染色し、顕微鏡により検査した。各接着アッセイを腸細胞の３連続継代にわたり２回実施した。カバーガラス上の各単層について、接着細菌の数を無作為に選択した２０顕微鏡視野において評価した。偏りをなくすために２人の技師が接着を評価した。
結果を表１に示す。この表から、ＮＣＣ２７０５が既知の細胞系ＧＧ（国際出願第９７／０００７８号）、Ｌａ１（欧州特許０５７７９０３号）又は他のビフィド株（ＢＬ２８／Ｃａ１）と比較して腸細胞に接着する能力があることが明らかになっている。
【実施例４】
【０１００】
病原性細菌の候補として大腸菌、クレブシエラ属、エウジニア属、緑膿菌及びＨ．ピロリ菌を用いた。
【０１０１】
１８時間にわたりＭＲＳ中で保持したＮＣＣ２７０５の培養に基づいて、指数的に増殖しつつある培養を調製した（３７℃で３時間）。この溶液の２ｍｌを取り、＋４℃、５５００ｇで５分間遠心分離した。上清の収集の後に、細胞ペレットを滅菌ＰＢＳで洗浄した。遠心分離した後、ペレットを収集し、２ｍｌの滅菌ＰＢＳを加えた。細菌を計数し、１〜５×１０6細菌／ｍｌとなるように懸濁液を構成した。
【０１０２】
本発明のビフィドバクテリアが及ぼした抗菌作用の評価を、レーラーら（Ｌｅｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１３７巻（１９９１年）、１６７〜１７３ページ（この文書は本明細書に援用する）に記載されているレーラー法（Ｌｅｈｒｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って行った。その結果を図２及び３に示す。
【０１０３】
上の結果から、本発明のビフィドバクテリウムは種々の病原性細菌の増殖を有効に阻害する可能性があることがわかるであろう。
【実施例５】
【０１０４】
サルモネラ属に対する阻害アッセイ
サルモネラ属は、上皮細胞に侵入し、その内部で増殖する細菌である。ネズミチフス菌に対する本発明のビフィドバクテリア阻害活性を検討するために、菌株ＳＬ１３４４及び以下の手順を用いた。
【０１０５】
病原性細胞をＬＢ培地中で培養した。新しい培地への第２継代の後、菌株をＬＢ培地中で１０μＣｉ／ｍｌのＣ14酢酸塩を用いて放射性同位体標識した。この培地中での菌株のインキュベーションは、３７℃で１８時間行った。
【０１０６】
上清から残りのＣ14酢酸塩を除去するために、その後細菌懸濁液を遠心分離（１０４１ｒｐｍ、１５分）に供した。ペレットを懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、細胞を１％滅菌マンノースに約１０8細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。マンノースは、非特異的接着を阻害することが知られている。次いで、細菌溶液を２×１０8細胞／ｍｌに調整した。
【０１０７】
病原体（１ｍｌ、２×１０8細胞）とビフィドバクテリウム培養の上清の分割量（１ｍｌ）とを３７℃で２時間プレインキュベートする。その後、上清を遠心分離し、得られる上清を除去し、ペレットを再び０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁する。次いで、この病原体溶液（０．５ｍｌ）を培養ヒト腸細胞と接触させる。培養を滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍｌの接着培地（ＤＭＥＭ）を加えた。細胞を１０％ＣＯ2雰囲気中で３７℃で１時間インキュベートする。
【０１０８】
インキュベートした後、インキュベーション培地中及び腸細胞上／内の細菌の数を計数する。腸細胞に接着及び侵入した細胞の量を測定するために、以下のアプローチを選択した。
【０１０９】
接着細菌数を測定するために、培地を傾斜し、細胞を培地で１回、滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。その後、１ｍｌの滅菌Ｈ2Ｏをコンパートメントごとに加えて、細胞を溶解して、細胞溶液を調製し、それを３７℃で１〜２時間インキュベートし、その後、連続希釈した。接着及び侵入細菌の数を計数するために、細胞溶液を遠心分離して、細胞破片を除去し、放射能を測定した。
【０１１０】
他のプロトコールに従って、１０分割したものをそれぞれＴＳＡ培地上にのせた。次いで、培地を３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
【０１１１】
侵入した細菌の量を測定するために、すべての非接着細胞を除去するようにＣａｃｏ−２細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含む培地を加え、インキュベーションを３７℃で１時間続けた。ゲンタマイシンは腸細胞に浸透しない抗生物質で、そのためすべての細胞外微生物は殺滅されるが、腸に既に侵入していた細菌は生き残る。次いで、細胞を３７℃でさらに１時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。滅菌蒸留水を加え、滅菌蒸留水中で３７℃で１〜２時間インキュベートして細胞を溶解した。細胞破片を除去した後、放射能を測定した。他のプロトコールに従って、連続希釈を行い、これらをＴＳＡ培地上にのせた。３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。
【０１１２】
培養細胞及び培養上清はサルモネラ属による腸細胞への接着及び侵入の防止に極めて有効であることがわかるであろう。
【実施例６】
【０１１３】
ネズミチフス菌株Ｃ５によるマウスの感染
無菌条件下で飼育した７〜８週齢の成体無菌雌マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ／ｏｕｊｃｏコンベンショナル、Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ［フランス所在］）を一定濃度のネズミチフス菌（０．２ｍｌ、１０8ｃｆｕ／マウス）により経口的に感染させた。一部のマウスは、一連のビフィドバクテリア株の移植によりモノゼニックとした。一部のマウスについて、腸を摘出し、ＰＢＳ中でその臓器を細切した後に、腸の各区域におけるビフィドバクテリアを計数した。他のマウスについて、無菌環境下に継続的に保持し、生存日数を対照群と比較する方法で、感染に対する防御を評価した。
【０１１４】
結果を図４に示す。図からわかるように、対照群ではほぼすべてのマウスが約１０日間の後に死亡した。これとは異なり、ＮＣＣ２７０５を投与したすべてのマウスが１０日後に生存しており、３０日間の後に２０％がサルモネラ属による有害な作用により死亡していたにすぎなかった。
【実施例７】
【０１１５】
第１プロトコール：
３０μｌの各細菌懸濁液（平均３×１０6細菌を含む）を、１０％トリプトースリン酸ブロス（フロー（Ｆｌｏｗ））及び５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（セロメド（Ｓｅｒｏｍｅｄ））を補足した７０μｌのＭ１９９培地と混合し、これに１００μｌの補足Ｍ１９９培地中ウイルスを加えた。そのようにして得られたウイルス−細菌混合物を４℃で１時間、３７℃で１時間インキュベートした。別個に、９６ウエルマイクロタイタープレートで集密的単層として増殖したヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞（１０％トリプトースリン酸（フロー（Ｆｌｏｗ））及び５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（セロメド（Ｓｅｒｏｍｅｄ））を補足し、ＰＢＳで１：４に希釈したＭ１９９培地中）をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。上に示したように処理したウイルス−細菌混合物を細胞に移し、マイクロタイタープレートをＣＯ2インキュベーター（ヘラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ））中で１８時間インキュベートした。ウイルス複製を下記のように測定した。
【０１１６】
第２プロトコール：
３０μｌの細菌懸濁液（前出）を、１０％トリプトースリン酸ブロス（フロー（Ｆｌｏｗ））及び５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（セロメド（Ｓｅｒｏｍｅｄ））を補足した７０μｌのＭ１９９培地と混合し、マイクロタイタープレート中で第１プロトコールにおいて記述したように増殖させ、前処理したＨＴ−２９細胞上に直接適用した。３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの補足Ｍ１９９培地中ウイルスをマイクロタイタープレート中の細胞に加えた。インキュベーションをＣＯ2インキュベーター（ヘラエウス（Ｈｅｒａｅｕｓ））中で１８時間続けた。ウイルス複製を下記のように測定した。
【０１１７】
ウイルス複製は、この後に記述するように感染細胞内のロタウイルスタンパク質の組織免疫染色により評価した。
【０１１８】
感染の１日後に、細胞培養基をマイクロタイタープレートから除去し、細胞を無水エタノールで１０分間固定した。エタノールを傾斜し、プレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ウサギ（ローザンヌのＩＳＲＥＣ大学から入手）において産生させ、ＰＢＳで１：２０００に希釈した５０μｌの抗ロタウイルス血清（主としてＶＰ６タンパク質に対する）を各ウエルに加え、ウエルの乾燥を防ぐためにカバーガラスをかけて３７℃で１時間インキュベートした。その後、抗血清を捨て、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ヤギにおいて産生させ、ペルオキシダーゼに結合させた５０μｌの抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗血清（ＧＡＲ−ＩｇＧ−ＰＯ、ノルディク（Ｎｏｒｄｉｃ））をＰＢＳで１：５００に希釈して、各ウエルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。血清を捨て、プレートを再びＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１００μｌの次の基質混合物を各ウエルに加えた。すなわち、１０ｍｌの０．０５Ｍトリス−塩化水素（ｐＨ７．８）、１ｍｌのＨ2Ｏ2（３０％超純級、Ｈ2Ｏで１：６００に希釈、メルク（Ｍｅｒｃｋ））及び２００μｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾール（０．１ｇ／１０ｍｌエタノール、２００μｌずつを−８０℃で保存、Ａ−５７５４、シグマ（Ｓｉｇｍａ））。プレートを室温で少なくとも３０分間インキュベートした。基質を捨て、ウエルに２００μｌのＨ2Ｏを満たして、反応を停止させた。感染細胞巣を倒立顕微鏡（Ｄｉａｖｅｒｔ、ライツ（Ｌｅｉｔｚ））を用いて計数した。
【０１１９】
非常に少数の菌株がロタウイルスと相互作用した。最初に選択した２６０個の細菌細胞のうちの４個の細菌細胞が少なくとも１つのプロトコールにおいてロタウイルスの複製を阻害したにすぎなかった。ビフィドバクテリウムアドレセンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８（ＮＣＣ２７０５）は、血清型１ロタウイルス、血清型３ロタウイルスＳＡ−１１及び血清型４ロタウイルスＨｏｃｈｉに対して極めて高い活性を示した。
【０１２０】
ＮＣＣ２７０５は、グラム陽性で、カタラーゼ陰性であり、発酵時にＣＯ2を産生せず、「乳酸菌の属（Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」、ビー  ジェー  ビー  ウッド及びダブリュ  エイチ  ホルザフェル（Ｂ．Ｊ．Ｂ．  Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ．  Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ）編、ブラキー  エーアンドピー（Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａ＆Ｐ）に開示されている方法に従ってＬ（＋）乳酸を産生する。
【０１２１】
これらの結果から、本発明のビフィドバクテリウムの極めて優れた特性が証明される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ヒト培養腸細胞に接着するビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ２７０５の能力を示すグラフである。比較として他のビフィドバクテリウム株ＢＬ２８  Ｃａ１を用いた。
【図２】ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ２７０５に対する病原性細菌の病原体感受性を示す図である。
【図３】ネズミチフス菌ＳＬ１３４４感染性Ｃａｃｏ−２細胞に対する細胞系ＮＣＣ２７０５及びＢ１  ２８の活性を示す図である。
【図４】ネズミチフス菌ＳＬ１３４４に感染させ、ビフィドバクテリウムＮＣＣ２７０５を投与したマウスの生存率を示す図である。
【図５】菌株ＮＣＣ２７０５のロタウイルス防御特性を評価するための細胞培養スクリーニングを示すスキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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