(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の生物学的液体のサンプルにおけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための方法であって、
前記被検サンプルを、Ｈ. ピロリの鞭毛タンパク質の生合成の調節に関与するｆｌｂＡ遺伝子のヌクレオチド配列における塩基またはヌクレオチドフラグメントの置換、付加および／または欠失による突然変異によってもたらされる非鞭毛表現型を有し、前記配列は下記の二つの縮退オリゴヌクレオチド
OLFlba-1: ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG および
OLFlba-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC,
を用いて増幅されたＨ. ピロリ由来のヌクレオチドフラグメントに対応するプローブで高厳密度の条件下においてハイブリダイズすることができる、ヘリコバクター・ピロリの組換え型菌株と接触させる工程（前記突然変異は、前記ｆｌｂＡ遺伝子がもはや前記組換え型菌株で発現させない、または前記ｆｌｂＡ遺伝子がＨ. ピロリの鞭毛の合成を許容しないものである）と、
前記組換え型菌株と、前記被検サンプル中に存在する、Ｈ. ピロリに対する抗体との間の免疫反応を検出する工程と
からなる方法。
【請求項２】
請求項1に記載の患者由来の生物学的液体のサンプルにおけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための方法であって、
前記被検サンプルを、配列番号６のヌクレオチド配列における塩基またはヌクレオチドフラグメントの置換、付加および／または欠失による突然変異によってもたらされる、非鞭毛表現型を有しているヘリコバクター・ピロリの組換え型菌株と接触させる工程と、
前記組換え型菌株と、前記被検サンプル中に存在する、Ｈ. ピロリに対する抗体との間の免疫反応を検出する工程と
からなる方法。
【請求項３】
請求項1に記載の患者由来の生物学的液体のサンプルにおけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための方法であって、
前記被検サンプルを、配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における塩基またはヌクレオチドフラグメントの置換、付加および／または欠失による突然変異によってもたらされる、非鞭毛表現型を有しているヘリコバクター・ピロリの組換え型菌株と接触させる工程と、
前記組換え型菌株と、前記被検サンプル中に存在する、Ｈ. ピロリに対する抗体との間の免疫反応を検出する工程と
からなる方法。
【請求項４】
請求項1または2に記載の方法であって、患者由来の生物学的液体のサンプルが血清サンプルである方法。
【請求項５】
組換え型のヘリコバクター・ピロリ菌株であって、Ｈ. ピロリの鞭毛タンパク質の生合成の調節に関与するｆｌｂＡ遺伝子のヌクレオチド配列における塩基またはヌクレオチドフラグメントの置換、付加および／または欠失による突然変異によってもたらされる、非鞭毛表現型を有し、前記配列は下記の二つの縮退オリゴヌクレオチド
OLFlba-1: ATGCCTCGAGGTCGAAAAGCAAGATG および
OLFlba-2: GAAATCTTCATACTGGCAGCTCCAGTC,
を用いて増幅されたＨ. ピロリのヌクレオチドフラグメントに対応するプローブで高厳密度の条件下においてハイブリダイズし、前記突然変異は前記ｆｌｂＡ遺伝子がもはや前記組換え型菌株で発現しない又は前記ｆｌｂＡ遺伝子がＨ. ピロリの鞭毛の合成を許容しないものであることを特徴とする組換え型の菌株。
【請求項６】
請求項5に記載の組換え型の菌株であって、更に、Ｈ. ピロリのフックタンパク質が欠失していることを特徴とする菌株。
【請求項７】
請求項5または6に記載の組み換え菌株であって、Ｎ６ｆｌｂＡ−株であり、１９９５年６月３０日に、ＮＣＩＭＢ受付番号第４０７４７号でＮＣＩＭＢに寄託されたものであることを特徴とする菌株。
【請求項８】
請求項5〜7の何れか一項に記載の組換え型の菌株であって、弱められたウレアーゼを産生するか、或いはもはやウレアーゼを産生しないように更に突然変異されていることを特徴とする菌株。
【請求項９】
請求項8に記載の組換え型の菌株であって、更なる突然変異が、ｕｒｅＡ遺伝子、ｕｒｅＢ遺伝子、ｕｒｅＣ遺伝子、ｕｒｅＤ遺伝子、ｕｒｅＥ遺伝子、ｕｒｅＦ遺伝子、ｕｒｅＧ遺伝子、ｕｒｅＨ遺伝子、またはｕｒｅＩ遺伝子の中から選択される一以上の遺伝子のヌクレオチド配列の突然変異からなることを特徴とする菌株。
【請求項１０】
請求項5〜9の何れか一項に記載の菌株の抽出物であることを特徴とするバクテリア抽出物。
【請求項１１】
請求項10に記載のバクテリア抽出物であって、ｎ−オクチルグルコシドで抽出した後に得られることを特徴とするバクテリア抽出物。
【請求項１２】
請求項10に記載のバクテリア抽出物であって、ＰＢＳまたはグリシンで抽出した後に得られるバクテリア抽出物。
【請求項１３】
患者由来の生物学的液体のサンプルにおけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための方法であって、前記被検サンプルを、請求項10〜12の何れか一項のバクテリア抽出物と接触させる工程と、前記バクテリア抽出物と、前記被検サンプル中に存在するＨ. ピロリに対する抗体との間の免疫反応を検出する工程とからなる方法。
【請求項１４】
請求項13に記載の方法であって、患者由来の生物学的液体のサンプルが血清サンプルである方法。
【請求項１５】
Ｈ. ピロリに感染した患者の抗体を診断するためのキットであって、請求項1〜9何れか一項に記載の菌株または請求項10〜12の何れか一項に記載のバクテリア抽出物と、抗原／抗体タイプの反応を明示するために必要とされる試薬とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、現在までのところヒトの胃粘膜表面上に特異的に見られることがわかっている、グラム陰性細菌であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ. ピロリとも命名されている）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの細菌と共通して、Ｈ. ピロリもまた、酸性p Ｈの培養液に対しては感受性であるが、生理学的濃度の尿素存在下においては、酸性度を許容することが可能である（Marshallら、１９９０、Gastroenterol.  ９９: ６９７- ７０２）。尿素を加水分解して二酸化炭素とアンモニアにし、細菌の微小環境下に放出することで、Ｈ. ピロリのウレアーゼは、胃の酸性環境下においても該細菌を生存させることを可能にする。動物モデルを使った最近の研究により、ウレアーゼは消化器官の粘膜でのコロニー形成における重要な因子であることが示唆された（Eaton ら、１９９１、Infect. Immun.  ５９: ２４７０- ２４７５）。該ウレアーゼはまた、直接的もしくは間接的に消化器粘膜に損傷を引き起こすことが疑われている。
【０００３】
現在は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ. ピロリ）はアントラル・ガストリテス(antral gastrites)の病因であると認識されていて、潰瘍の発達に必要な共因子の一つであることがわかっている。更に、胃癌の発達に、Ｈ. ピロリの存在が関連している可能性があることがわかっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヘリコバクター・ピロリ種の細菌による試験管内感染を検出する感受性、特異的な新規の方法を開発するために、発明者らは当該細菌の移動性を制御するシステムに興味を有している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この目的を見据え、発明者らは、感染患者の血清による認識には影響を与えないが、特にカンピロバクター（Campylobacter ）ファミリの細菌（例としてはCampylobacter jejuni）に関しての「偽陽性」型の反応を避けることが可能な、Ｈ. ピロリ株の異なる修飾に興味を持っている。
【０００６】
更に発明者らは、必要ならば、免疫組成物または組成物を構築するにあたって、得られた修飾済み細菌をワクチン接種に用いることが可能であると述べている。
【０００７】
【発明の実施の形態】
第一段階において発明者らは、Ｈ. ピロリの鞭毛の生合成の制御、及びその結果として当該細菌の移動性の制御に関わるｆｌｂＡ遺伝子を同定し、単離した。鞭毛の生合成は、フラジェリンＡ及びＢの合成と鞘（sheath）の生合成とを具備している。ｆｌｂＡ遺伝子はフラジェリンＡ及びＢの生合成、並びにフラジェリンを含む鞘の生合成の両方を制御する。発明者らは、ｆｌｂＡ遺伝子が該細菌の固着蛋白質（「フック」とも呼ばれる）の生合成を制御する点においても重要であるということを確立している。
【０００８】
故に本発明は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) の鞭毛タンパク質の生合成を調節すると共に、高厳密度の条件下において、下記の配列を有する二つのオリゴヌクレオチドを用いて増幅されたＨ. ピロリ由来のヌクレオチドフラグメントに対応するプローブとハイブリダイズすることができるか、
ＯＬＦｌｂＡ−１：  ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧ
ＯＬＦｌｂＡ−２：  ＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣ
或いは、高厳密度の条件下において、これらのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列に関する。
【０００９】
上記の配列は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) の鞭毛タンパク質の生合成を調節するｆｌｂＡ遺伝子のヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列は、
Ｈ. ピロリ株の染色体ＤＮＡを含むゲノムライブラリーを、下記の配列を有する二つのオリゴヌクレオチドを用いて増幅されたＨ. ピロリ由来のヌクレオチドフラグメントに対応するプローブか、
ＯＬＦｌｂＡ−１：  ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧ
ＯＬＦｌｂＡ−２：  ＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣ
或いは、高厳密度の条件下において、これらのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを用いてスクリーニングする工程と、前記プローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列を回収する工程と、得られたＤＮＡ配列をプラスミドタイプの適切なベクター中にサブクローニングし、次いで、高厳密度の条件下において、オリゴヌクレオチドＯＬＦｌｂＡ−１およびＯＬＦｌｂＡ−２を用いて増幅されたＨ. ピロリ由来のヌクレオチドフラグメントに対応するプローブとハイブリダイズする修飾ベクターを選別する工程と、上記プローブとハイブリダイズするプラスミドベクター中に含まれているＤＮＡフラグメントの配列決定を行い、これらフラグメントに含まれるオープンリーディングフレームを決定する工程とによって得られる。
【００１０】
有益には、これらのＤＮＡ断片を使って、約２１６９ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームに対応した、ｆｌｂＡ遺伝子のコード配列が再構築される。
【００１１】
Ｈ. ピロリの染色体ＤＮＡを含むゲノムライブラリは、どんなＨ. ピロリの株からも得ることができる。コスミドライブラリもまた、Ｈ. ピロリの染色体ＤＮＡから調製することが可能である。
【００１２】
このライブラリを構築するのに使う株の例は、Ｎ６株であり、これは１９９２年６月２６日にＮＣＩＭＢ４０５１２としてＮＣＩＭＢに寄託された。
【００１３】
Ｈ. ピロリＤＮＡライブラリ中に存在する検索すべきのＤＮＡに対してハイブリダイズさせる為の、プローブの調製に使った二つのオリゴヌクレオチドプライマは、Lcr Ｄ/ ＦｌｂＦファミリの種々の蛋白質の保存領域から選択した。
【００１４】
二つのオリゴヌクレオチドプライマＯＬＦb Ａ- １及びＯＬＦb Ａ- ２は、プローブとして利用でき、以下の配列
ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＡＴＴ  ＧＡＴ
ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ
ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ
ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ
ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＴＴＴ
を有する１３０塩基対の断片を増幅させることが可能である。
【００１５】
上記した高厳密度の条件は以下のとおりである：ハイブリダイゼーションは４２℃で、０. １％ＳＤＳを含んだ2 X ＳＳＣ緩衝液中の５０％のホルムアミド（１  Ｘ  ＳＳＣは、０. １５Ｍ  Ｎa Ｃl に１５m Ｍのクエン酸ナトリウムを加えたものでp Ｈは７. ０）の存在下で行った。洗浄は６８℃で行い、例としては２ X  ＳＳＣプラス０. １％ＳＤＳを使って１時間の間に２回行った。
【００１６】
本発明に関しての特に興味深いヌクレオチド配列は、図３、４に記載のヌクレオチド配列、または高厳密度において上記した配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列に対応したｆｌｂＡ遺伝子の配列である。
【００１７】
本発明の別の態様によると、本出願の主題である該ヌクレオチド配列は、図３、４に記載のヌクレオチド配列であって、図３、４に示したアミノ酸配列を有するタンパク質、またはＨ. ピロリの鞭毛タンパク質の生合成に関して上記配列と同じ調節特性をもったアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることで特徴付けられる。
【００１８】
本発明はまた、ヌクレオチド配列であって、該配列は前述の定義に対応し、更に、ｆｌｂＡ遺伝子がもはやホスト細胞内で発現せず、またはホスト細胞内でのｆｌｂＡ遺伝子の発現がＨ. ピロリの鞭毛の生合成を可能としないように、また適切な場合には、Ｈ. ピロリのフックタンパク質の合成ができないように、欠失、置換または挿入によって修飾されているヌクレオチド配列に関する。
【００１９】
本発明のヌクレオチド配列に対する修飾は、不可逆であって、特に、この配列がこのようにして修飾されたヌクレオチド配列で形質転換した細菌内に存在する、ｆｌｂＡ遺伝子と組み換えを起こした時に、不可逆であるものでなくてはならない。この組み換えは例として、二重交差型である。好ましくはヌクレオチド配列の該修飾は、（この修飾配列によって、与えられたＨ. ピロリ株内のそれに対応した正常なｆｌｂＡ遺伝子の断片を置換した後に）隣り合う遺伝子群の機能に関して、実質的な修飾を起こさせるべきではない。
【００２０】
本発明の範囲に更に含まれるものとしては、上記した基準に合致したｆｌｂＡ遺伝子のフラグメントを構成するヌクレオチド配列がある。例としては、本発明の主題である断片は少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは、１００ヌクレオチドではないにしろ、少なくとも５０ヌクレオチドのフラグメントからなる。
【００２１】
このような断片が選択される理由は、例えばそのｆｌｂＡ遺伝子の特異的な特徴のため、もしくはLcr Ｄ/ ＦｌｂＦファミリの蛋白質をコードしたいくつかの遺伝子の保存領域に属するためである。
【００２２】
別の態様において本発明はまた、遺伝子中に存在する制限部位を境界として持つｆｌｂＡ遺伝子断片に向けられている。これらの部位のうちいくつかを例として、図２で定義する。
【００２３】
本発明に記載の別の断片は、ｆｌｂＡ遺伝子のどこかの領域に由来し、好ましくは制限部位を含むか、または制限部位を含むことができる、少なくとも１０００塩基対の断片である。
【００２４】
本発明における他のヌクレオチド配列は例として、上記した様なヌクレオチド配列を含み、該配列はマーカー、例えば抗生物質に対する耐性遺伝子、または１９９４年５月２０日に出願のＦＲ９４０６２０２に記載された様な重金属に対する耐性遺伝子を含むカセットの挿入によって修飾されていることを特徴とする組み換え核酸がある。
【００２５】
それゆえに、カナマイシンに対する抵抗性用のカセットを挿入することが可能である。この状況においては、種々の技術を利用することが可能であり、参考文献として特に、Labigne Ａ. ら（J.of Bacteriology,  １７０, １９８８, １７０４- １７０８）と、Labigne A.らの論文（Res.Microbiol.  １９９２, １４３, １５- ２６）を参照されたい。
【００２６】
本発明はまた、前述で定義したヌクレオチド配列由来の特異的なオリゴヌクレオチドであって、以下の配列
ＯＬＦｌｂ- １: ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧ
ＯＬＦｌｂ- ２: ＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣ
ＯＬＦｌｂ- ７: ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣ
ＯＬＦｌｂ- ８: ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＣ
のうちどれか一つを有することで特徴付けられる特異的なヌクレオチド配列に関するものである。
【００２７】
別の態様において本発明は、前述のように定義された様なヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、Ｈ. ピロリのＦｌｂＡ蛋白質のアミノ酸配列に関するものである。
【００２８】
Ｈ. ピロリのＦｌｂＡ蛋白質の特異的なアミノ酸配列は図３、４に記載されている。
【００２９】
それゆえに本発明の範囲内において、ｆｌｂＡ遺伝子及びこの遺伝子により発現される蛋白質は、特にワクチン接種において利用する免疫学的組成物もしくは組成物にとって興味深い。
【００３０】
本発明はまた、ヘリコバクター・ピロリ菌株であって、塩基またはヌクレオチド断片の置換、付加および／または欠失によって、Ｈ. ピロリの鞭毛タンパク質の生合成の調節に関与する、上記のｆｌｂＡ遺伝子のヌクレオチド配列に生じた突然変異によってもたらされる、非鞭毛フェノタイプを有することを特徴とする菌株に向けられたものである。
【００３１】
ｆｌｂＡ遺伝子の関するこの修飾は、非鞭毛フェノタイプの株を得ることを可能とし、すなわち該株はＦlaＡ蛋白質もＦlaＢ蛋白質も発現しなくなり、更に好ましくは鞘蛋白質も発現しなくなる。
【００３２】
この菌株に関する一つの態様において、得られた該株は更にＨ. ピロリのフック蛋白質を欠損している。
【００３３】
好ましくは、上記した基準に見合う菌株であって、Ｎ６株から得られたものであり、１９９２年６月２６日に、ＮＣＩＭＢ受付番号第４０５１２号でＮＣＩＭＢに寄託されたものであることを特徴とする。
【００３４】
例として本発明は、Ｈ. ピロリの組み換え非鞭毛株であって、Ｎ６ｆｌｂＡ- と命名され、１９９５年６月３０日に、ＮＣＩＭＢ受付番号第４０７４７号でＮＣＩＭＢに寄託されたＨ. ピロリの非鞭毛株に関する。
【００３５】
このようなＨ. ピロリの非鞭毛株は、血清学における利用と、その結果として試験管内でのＨ. ピロリの感染の検出にとって特に興味深い。有益には、これらの株は組み換え型である。
【００３６】
特にこれらの株は、Ｈ. ピロリによる感染を特異的且つ感度の良い方法で検出するのに有利である。言い換えれば、本発明は有益なことに、例えばサルモネラ(Salmonerlla) またはカンピロバクタ(Campylobacter) 等の菌株による「偽陽性」の結果を避けながら、Ｈ. ピロリによる感染を特異的に検出せしめる。
【００３７】
このように定義された、非鞭毛型のＨ. ピロリ株が仮に、たとえばワクチン接種組成物の調製に使われる用に、他の適用が考えられるならば、組み換え体の非鞭毛菌株であって、例えば弱められたウレアーゼを産生するか、或いはもはやウレアーゼを産生しないように更に突然変異されており、この突然変異は、例えばｕｒｅＡ遺伝子、ｕｒｅＢ遺伝子、ｕｒｅＣ遺伝子、ｕｒｅＤ遺伝子、ｕｒｅＥ遺伝子、ｕｒｅＦ遺伝子、ｕｒｅＧ遺伝子、ｕｒｅＨ遺伝子、およびｕｒｅＩ遺伝子の中から選択される一以上のヌクレオチドの突然変異からなることを特徴とする、第二の修飾もしくは変異を有する菌株を調製することは興味深い。ウレアーゼの構造遺伝子群である、ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ、ｕｒｅＤは、論文に発表されている（Labigne ら、１９９１、J.of Bacteriol. １７３: １９２０- １９３１）. その他の遺伝子群は特許出願ＥP ０６１０３２２に記載されている。
【００３８】
本発明の菌株はそのままで、もしくは抽出液として利用でき、更に本発明は特に、以前記載された株から得た細菌の全抽出物に関するものである。
【００３９】
そのようなバクテリア抽出物は、n-オクチルグルコシドで抽出することができる。この場合に使う調製技術は、Lelwala-Guruge J. （Scan. J. Infectt.Dis. １９９２、２４：４５７- ４６５）によって記述されたものである。
【００４０】
別のバクテリア抽出物も記述された技術により、PBS(Bazaillou M.ら、Clin.Diagn. Lab. Immuno., １９９４, １: ３１０- ３１７による方法）もしくはグリシン(Aguirre P.M., Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,  １９９２, １１: ６３４- ６３９による方法) を使った抽出により得ることができる。
【００４１】
本願の範囲において本発明は、患者由来の生物学的液体のサンプル( 特に血清サンプル）におけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための組成物であって、活性成分として本発明の菌株または、上記のバクテリア抽出物を含有したものに関する。
【００４２】
用いる生物学的サンプルはどのようなタイプのものであってもよく、また特に、どのようなタイプの生物学的液体サンプルでもよく、例としては血清、唾液、尿があげられる。
【００４３】
同様にして検出に用いる方法は、免疫学的な反応を含む、どのようなタイプのものでもよく特に抗原／抗体タイプのものがよい。例としてはウェスタンブロットやＥＬＩＳＡなどの技術を使った使用があげられる。
本発明はまた、患者由来の生物学的液体のサンプル（特に血清サンプル）におけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための方法であって、前記被検サンプルを、本発明の菌株、または上記のバクテリア抽出物と接触させる工程と、前記菌株と、前記被検サンプル中に存在し且つＨ. ピロリに向けられる抗体との間の免疫反応を検出する工程とを具備する方法に関する。
【００４４】
例としては、生物学的サンプルにおけるＨ. ピロリによる感染のインビトロでの検出は、
天然の、もしくは組み換え体の蛋白質、非鞭毛株、またはバクテリア抽出物、特にＮＯＧ（n-オクチルグルコシド）を使ったＮ６ｆｌｂＡ株の抽出物（例としては、抽出物の量は３μg/ml、抗原の量は２μg/ml）などの検出に使う抗原でプレートを覆う工程と、ネガティブ及びポジティブのコントロールの範囲で使い（ポジティブコントロールは異なる希釈度で用いられる）、１００分の１に希釈された患者の血清を平行して試験する（供せられる容量は、１００μl ）工程と、インキュベーションの工程が例として、３７℃、１時間で行われ、その後の洗浄を連続的に幾度か行い、次にインキュベーション（例としては３７℃で１時間）をモノクローナル接合体(conjugate) （ペルオキシダーゼでラベルしたヒトＩｇＧタイプ）と行い、該接合体が異なる希釈度で用いられ（例としては抗原の場合は１/ ３２, ０００で、菌抽出物の場合は１/ ６４, ０００）、供せられる容量が１００μl である工程と、モノクローナル接合体とのインキュベーション後にいくつかの異なる洗浄を行い（例えば例４）、酵素反応を「OPＤと基質」を使い、３０分間遮光して行わせることを満たすことで実行できる。次に酵素反応は、硫酸を加えて終了させて、光学濃度であるO Ｄを４９２nm/ ６２０nmで読む。
【００４５】
本発明は更に、Ｈ. ピロリに対する抗体を得るための免疫原組成物であって、活性成分として、本発明の菌株、または上記のバクテリア抽出物を含有することを特徴とする免疫原組成物に向けられている。
【００４６】
本発明の一つの特異的な態様において、Ｈ. ピロリに対する抗体を得るための免疫原組成物は、ＦｌｂＡ蛋白質由来のアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする。
【００４７】
本発明の範囲に更に含まれるものとしては、Ｈ. ピロリによる感染に対して防御する抗体を得るためのワクチン接種組成物であって、活性成分として本発明の菌株または、上記のバクテリア抽出物を含有することを特徴とする組成物がある。
【００４８】
Ｈ. ピロリによる感染に対して防御する抗体を得るための別のワクチン接種組成物は、活性成分としてウレアーゼタイプの抗原、特にｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ、またはｕｒｅＤ遺伝子によってコードされ、上記に定義したアミノ酸を有する蛋白質を有することを特徴とする。
【００４９】
本発明は上記したアミノ酸配列に向けられるモノクローナル抗体またはポリクローナル血清に関する。この抗体は、それ自体は知られた方法によって得られ、特に、動物を選択した抗原で免役し、次に抗体を合成し、合成された抗体を回収し、その中からＨ. ピロリを特異的に認識するものを選択するか、または前もって免役しておいた動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、次にこのハイブリドーマを培養して、選択したＨ. ピロリ抗原に対しての特異的認識をもとに選択したモノクローナル抗体を得ることにより得られる。
【００５０】
本発明の他のモノクローナル抗体、またはポリクローナル血清は、上記したように非鞭毛性Ｈ. ピロリに向けられている。
【００５１】
本発明は更に、生物学的サンプルにおけるＨ. ピロリによる感染をインビトロで検出するための組成物であって、活性成分として、本発明の非鞭毛性のフェノタイプのＨ. ピロリに対して得られるモノクローナル抗体、またはポリクロナール血清を含有する組成物に関する。
【００５２】
本発明はまた、薬物の活性成分として、本発明によるアミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列であって、動物またはヒトで免役学的反応を誘導することができるヌクレオチド配列に関する。薬物としてヌクレオチド配列を使用する技術は、Donneyら（１９９５； Nature Medic.  １( ６), pp ５８３- ５８７）に記載されている。
【００５３】
例Ｉ
ｆｌｂＡ遺伝子の同定及び非鞭毛株の調製
細菌の移動度の発現を制御する機能を担うことが知られている蛋白質の中で興味のあるものは、最近同定されたＬｃｒＤ／ＦｌｂＦファミリに属する蛋白質であり、その中にはイェルシニア属の細菌のＬｃｒＤ蛋白質（６）、サルモネラのＩｎｖＡ蛋白質（２）、シゲラのＭｘｉＡ（１）、カウロバクター  クレセンタスのＦｌｂＦ（７）、及びカンピロバクター  ジェジュニのＬｆｂＡ（４）がある。ＬｃｒＤ、ＩｎｖＡ、及びＭｘｉａ蛋白質は、該蛋白質を発現する細菌の病原性に関わる蛋白質の制御及び／または分泌に関わり、一方カウロバクター  クレセンタスのＦｌｂＦ蛋白質、及びカンピロバクター  ジェジュニのＦｌｂＡは鞭毛の生合成の制御に関わり、それゆえに移動度に関わる。現在までに知られたLcr Ｄ/ ＦｌｂＡファミリの相同体は、特にこの蛋白質のＮ末端部分が非常によく保存された領域を有しており、それゆえにこの２つの保存領域（イェルシニアのLcr Ｄ蛋白質の１５１から１５６番目のアミノ酸であるＭＰＧＫＱＭ、及びLcr Ｄの１８９から１９５番目のアミノ酸であるＭＤＧＡＭＫＦ）を使って２つの縮退したオリゴヌクレオチド（L ＯＬＦｌｂＡ- １及びＯＬＦｌｂＡ- ２、表１）を限定することが可能であったが、該ヌクレオチドは、ヘリコバクター・ピロリの染色体ＤＮＡ上で行う遺伝子増幅におけるヌクレオチドプライマとして合成されて使用される。このようにして、１３０塩基対（bp）の断片を増幅することが可能であり、そのヌクレオチド配列の決定により、該断片がＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦファミリの蛋白質に非常に相同である蛋白質の一部をコードしていることが証明された。この増大された断片は次に、放射性のラベルがなされＨ. ピロリのコスミドベクタのスクリーニングに使われた。
【００５４】
この断片は図３、４に示した配列の５７５から７０７の間のヌクレオチドに対応した配列である。
【００５５】
ゲノムライブラリのコスミドのうちの一つは、Ｈ. ピロリのＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦ相同体をコードしているものとして同定され、Ｓａｕ３Ａによる部分消化を行って、２から５（キロ塩基対）の大きさをもつ挿入断片を含む、ベクタｐＩＬＬ５７０中のコスミドのミニライブラリ（２００サブクローン）を構築した。ベクタｐＩＬＬ５７０はLabinge Ａ. らの論文（パスツール研究所／Elsevier Paris１９９２.Res. Microbiol,  １９９２, １４３, １５- ２６）に記載されている。このベクタの制限地図は、図１に示してある。上記の２００クローンを１３０塩基対のプローブにハイブリダイズすると、プラスミドｐＳＵＳ３９およびｐＳＵＳ２０７をもつクローンが陽性を示した。これら二つの組み換えプラスミドの線形制限地図は、図２に示してあり、これらのクローンの挿入部がそれぞれ重なり合った配列をゆすることを示した。これらの二つの挿入部のヌクレオチド配列を決定して、これら導入部にはｆｌｂＡ遺伝子がそのままは含まれないことを明かにした。カンピロバクタ  ジェジュニのＦｌｂＡ遺伝子に対する相同体であるために、Ｈ. ピロリのｆｌｂＡと命名される当該遺伝子は、２１９６塩基対のオープンリーディングフレームに対応し、８０. １キロダルトンの計算上の分子量をもつ蛋白質をコードしている。ｆｌｂＡのヌクレオチド配列及びＦｌｂＡのアミノ酸配列を図３、４に示してある。プロモータ及びターミネータに特徴のコンセンサス配列は、該オープンリーディングフレームの上流及び下流には検出さていない。
【００５６】
ＦｌｂＡ蛋白質は、共に移動度に関わるカンピロバクタ  ジェジュニのＦｌｂＡ蛋白質及びカウロバクタ  クレセンタスのＦｌｂＦ蛋白質と類似点を呈しているが（それぞれ５１. ７％、４０. ４％）、この類似の割合は、移動度に関わらないLcr Ｄ/ ＦｌｂＦ蛋白質ファミリとの比較ではより低く、イェルシニアのＬｃｒＤとは３２. ８％の相同性、シゲラのＭｘｉＡとは３０. ５％の相同性、そしてサルモネラのＩnvＡとは２９. ３％の相同性である。これらの蛋白質の、Ｈ. ピロリのＦｌｂＡに対するマルチプル整列（multiple alighnment ）を図５、６に示してある。ＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦファミリの相同体で最も保存された領域は蛋白質のＮ末端部分に位置している。
【００５７】
移動度に関わる蛋白質（ＦｌｂＡ及びＦｌｂＦ）の系統学的進化、及び病原性に関わる蛋白質の発現及び／または分泌の制御に関わる蛋白質の系統学的進化は、系統樹を使って示してある（図７）。二つの別個の分岐が見られる：Ｈ. ピロリのＦｌｂＡが、鞭毛の生合成に関わる制御蛋白質に対応する分岐に属することは、はっきりとしている。
【００５８】
ＦｌｂＡ蛋白質の合成を欠損している、Ｈ. ピロリのアイソジェニック変異体の構築と特徴づけ
プラスミドｐＳＵＳ３９の１６００塩基対の断片を、それぞれの５’末端にＢamＨＩ制限部を有するオリゴヌクレオチドＯＬＦｌｂＡ- １及びＯＬＦｌｂＡ- ７を使って増幅した（表  ）。この断片の中央部には、ユニークなＨind ＩＩＩ制限部位があり、この断片を、ｐＵＣ１９の誘導体であってそのマルチプルクローニング部位のＨind ＩＩＩ部位を取り除いた、ｐＳＵＳ３３へクローニングした。ｐＳＵＳ３３を得るために、プラスミドｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その結果得られる粘着末端をクレノー酵素及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端にし、その結果の断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで再連結して、pSUS３３を得るために大腸菌ＤＨ５αへ挿入した。上記の１６００塩基対の断片をpSUS３３へ挿入して得た組み換えプラスミドをpSUS４０と命名し、ＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、その末端を平滑にして、プラスミドｐＩＬＬ６００（Labinge A.ら１９８８、J.Bact. １７０, １７０４- １７０８）由来のＳｍａＩカナマイシンカセットをこのユニークな部位へクローニングして、プラスミドｐＳＵＳ４２を得た。プラスミドpSUS４２を次に、電気穿孔法によりＨ. ピロリのＮ６株へ導入した。電気穿孔法は、Ferrero R.L.ら（Journal of Bacteriology, July,１９９２, pp４２１２- ４２１７,Vol１７４, Ｎo １３）が記載の方法に添って行った。次にカナマイシン（２５μg/ml）を含んだ選択培地で選択した形質転換体に関して、遺伝型及び表現型の特徴づけを行った。図８は変異体作成にあたって従った手順を示している。遺伝子増幅及びサザンハイブリダイゼーションによるこれらの変異体の遺伝型分析により、カナマイシン抵抗性形質転換体のゲノムがｆｌｂＡ遺伝子の真ん中に、該抵抗性遺伝子を含んでいいることと、それゆえに二重交差による、野生型のｆｌｂＡ遺伝子の不活型ｆｌｂＡ- Ｋｍへの対立遺伝子置換が、pSUS３３ベクタのヌクレオチド配列の喪失を伴って起きたこととが示された。Ｈ. ピロリのｆｌｂＡ- 変異体の表現型分析により、該変異体は移動度を有しないこと、更に電子顕微鏡による分析により、鞭毛要素の完全な欠失及び鞭毛の鞘の欠失があることを示した。Ｈ. ピロリの鞭毛全体の蛋白質に向けられた抗体を使ったイミュノブロット実験（ウェスタンブロット）（図９）は、鞭毛のサブユニットであるＦlaＡ及びＦlaＢに対応したペプチドのバンドが欠失していることと、また同様に最近O'Ｔooleと共同研究者（５）によってフック蛋白質（もしくは固定蛋白質）または鞭毛と同定された蛋白質（５）で、見かけ分子量が９０キロダルトンのポリペプチドに対応したバンドも欠失していることを示した。
【００５９】
全体としてみると、これらの結果はＨ. ピロリのＦｌｂＡ蛋白質は鞭毛の構造全体の合成に必須であり、この蛋白質をコードした遺伝子の不活化は、該構造の構成要素の輸送の阻害ではなくて、鞭毛形成にくわわるいかなる構造の合成をも完全に停止する結果となることを示唆している。
【００６０】
【表１】
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例ＩＩ
調べたＨ. ピロリの血清学モデル
１）ＨｓｐＡｍａｌＥ: ４７. ５k Ｄa （ＨｓｐＡ＝１３ｋＤａ）の組み換え蛋白質
保存されていた血清の、母集団Ｉと呼ばれるものにおいて４１％の感受性、９６％の特異性が得られた。
【００６１】
２）Ｎ６ｆｌｂＡ−：ヘリコバクター・ピロリの非鞭毛株
３種類の抽出法を行った（n-オクチルグルコシド、ＰＢＳ、グリシン）。さしあたり、n-オクチルグルコシドによる抽出が最もよいことがわかった。
【００６２】
３）−Ｎ６: 野生型株に対応している。抽出はn-オクチルグルコシドで行った。
【００６３】
血清の第二の母集団も使った（母集団ＩＩ）。この母集団は、臨床的、内視鏡的、組織学的、細菌学的、及び解剖病理学的（anatomopathological)見地からよく記録された数百の血清からなっている。本調査において異なるモデル系の出来栄えを調べるために使ったのが、この母集団ＩＩであった。５つの異なる母集団を試験した。
【００６４】
試験した５つの血清は、
３００の通常の血清（ＦＮＴＳ）
ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ血清学で陽性であった１８の血清（ＣＢＭＳ）
母集団ＩＩ血清と名付けられた９２の、よく記録された血清
細菌学的、解剖病理学的（anatomopathological ）見地からよく記録され、また母集団Ｉと名付けられた、８７の血清
以下の交差反応を示す２３の血清
抗レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）陽性の１０の血清
抗クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）陽性の１０の血清
抗カンピロバクタ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）陽性の３つの血清
文献で効果が認められている２つの競合するキットをパラレルに使って試験した。
【００６５】
２つの市販のキット
Ｃｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ（ＲＯＣＨＥ）
Ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｔａｔ（ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）
結果
通常の血清（ＦＮＴＳ）( 図１０から１４、表２、３)
以下のモデルを通して得た３００の血清
Ｈｓｐ  Ａ  ｍａｌＥ
Ｎ６  ｆｌＢＡ
Ｎ６
疫学的な調査によると、フランスでは２０から２５％の血清陽性率（sero-prevalences）となっている。３００人の血液提供者の血清の分布を調べ、ＣＢＭS ライブラリを使って以前に定義された域値（ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ血清学）を確証する為に異なる域値に対する陽性の支配度を計算した。
【００６６】
この研究により、同じ血清陽性率を使って異なる試験を比較することができる。
【００６７】
最初の４３の血清は、以下のモデルを通して得た
Ｃｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ（Ｒｏｃｈｅ）
Ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｔａｔ（ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）
JLＦ血清学として知られる血清学（数種類の水溶性バクテリア抽出物に基づくＥＬＩＳＡ試験）
結果は任意の単位に基づいて、異なる域値に対して表してある；陽性の結果は１、陰性の結果は０と表す。
【００６８】
異なる試験によって、これら４３の血清を比較して、以下のことが判明する：
非鞭毛株であるＮ６ｆｌｂＡ- 及びＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ試験( Ｒｏｃｈｅ) では、２０％のオーダーに匹敵する血清陽性率となる。
【００６９】
ＨspＡでは、非常に低い血清陽性率（７％）となり、これは引き続く結果の観点からは、感受性の欠失を示唆している。
【００７０】
引き続く結果を考慮すると、JLＦ血清学は、血清陽性率がわずかに１４％であるので非常に感度がよいことがわかる。
【００７１】
Ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｔａｔ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ) 試験では、高い血清陽性率（２９％）となるが、これは特異性の欠如、または域値が低すぎることを示している。
【００７２】
【表２】
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【表３】
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ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ血清学で陽性の血清（ＣＢＭＳ）（表４）
Ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｔａｔ試験（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で陽性であった血清はわずか３つであった。この３つの血清は、他の試験では確認できなかった。
【００７３】
この結果は特異性の欠如によるものであると思われる。もし、現在の市場で最も良いＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ試験（Ｒｏｃｈｅ）を参照するならば、我々の異なるモデルをＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅに対して比較することが可能である。
【００７４】
非鞭毛Ｎ６ｆｌｂＡ- 株はＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅと完全に一致する。
【００７５】
Ｃｏｂａｓ  Ｃｏｒｅで陰性であった上記の３つの血清は、Ｎ６ｆｌｂＡ- でも陰性であった。
【００７６】
Ｃｏｂａｓ  Ｃｏｒｅで陽性であった１５の血清は、Ｎ６ｆｌｂＡ- でも陽性であった。
【００７７】
野生型Ｎ６株は非鞭毛株と同じ結果となった。
【００７８】
９つのＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ血清がＨspＡで陰性であるので、ＨspＡもまた感受性がない。
【００７９】
Ｃｏｂａｓ  Ｃｏｒｅで陰性である上記の３つの血清は、ＨspＡでも陰性である。
【００８０】
【表４】
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母集団ＩＩの血清
９２の血清を選択し、３つのグループへ分類した：
３４：消化不良患者、内視鏡または組織学での潰瘍との診断（十二指腸、胃）、培養及び／または解剖病理学によりヘリコバクター・ピロリが存在すること、迅速な尿素試験も実行、このグループはＨｐ＋／Ｕ＋と命名。
【００８１】
２７：消化不良患者、内視鏡または組織学での潰瘍との差動的診断（十二指腸、胃）、培養及び／または解剖病理学によりヘリコバクター・ピロリが存在すること、迅速な尿素試験も実行、このグループはＨｐ＋／Ｕ−と命名。
【００８２】
３１：消化不良のまたは消化不良でない患者、内視鏡及び組織学では正常な胃十二指腸、培養及び／または解剖病理学によりヘリコバクター・ピロリが存在しないこと、迅速な尿素試験も実行、このグループはＨｐ−と命名.
臨床、内視鏡、組織学、細菌学、及び解剖病理学な知見を、それぞれの患者に対して示した。
【００８３】
この良く記録された集団により、感受性及び特異性の基準の定義がなされる。
【００８４】
Ｈp Ａ: 母集団Ｉに見られるように、実質的な感受性の欠如がいぜんとして見られる。
【００８５】
感受性は５９％で特異性は１００％である。
【００８６】
Ｎ６ｆｌｂＡ:n- オクチルグルコシド抽出物に対して１００％の感受性が確認でき、特異性は９０％である。
【００８７】
この結果は、ＲｏｃｈｅのＣｏｂａｓ  Ｃｏｒｅ試験の結果で得られたもの（感受性が９８％で特異性が９４％）と匹敵する。
【００８８】
Ｎ６: 母集団ＩＩにおいて、野生型株は非鞭毛株に完全に匹敵する。
【００８９】
陰性の３１の血清は野生型に対しては陽性である。鞭毛による交差反応は、母集団ＩＩに関しては全く見られなかった。
【００９０】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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血清学の位置づけ
血清学を２つのレベルで位置づけた。
【００９１】
高感度血清学：心窩部痛をうったえる若年患者に存在する細菌を検出するためのもの。
【００９２】
この血清学で陰性となった場合は、患者は内視鏡の検査または生検を受けることはなく、他の痛みの原因となるものを調べる。
【００９３】
危険特異的血清学：これはヘリコバクター・ピロリによる感染での危険性、すなわち潰瘍、癌、または胃リンパ腫（ＭＡL Ｔリンパ腫）を示すこと含む。
【００９４】
疑いのある危険性に特異的な分子を使うか
または危険特異的な域値を使う（域値は危険のある患者では、危険のない患者よりも高い）。
【００９５】
この特異的な血清学を使って、一般の母集団をスクリーニングにかけ、それによってヘリコバクター・ピロリに関わり、また症状がないために検出できない様な癌及びリンパ腫を検出する（痛みを訴えている患者のみが胃腸科にかかる。）
感受性の問題に対する応答は良い。
【００９６】
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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胃炎の強度と抗体レベルとの間の相関関係
胃炎は３つの変数で定義される：
萎縮（Ｇの後の最初の数字で表現）；強度は１から４で表す。
【００９７】
中性好性多核細胞及び単球の侵入に対応する全体の炎症（Ｇの後の二番目の数字で表現）；強度は１から３で表す。
【００９８】
中性好性多核細胞の数に対応した活性（Ｇの後の三番目の数字で表現）；強度は０から３までで表す。ろ胞状のものはＦと表現する。
【００９９】
通常は、以下の相関関係が見られる：
活性はヘリコバクター・ピロリと非常に良く相関する。
【０１００】
炎症はヘリコバクター・ピロリと相関する。
【０１０１】
それぞれのグループで見られる力価の平均は、故に上記の３つの変数とその強度とを使って計算される。
【０１０２】
結果の評価：
t 試験を使って２つのデータの平均が顕著に異なるか、または５％の危険度でそうでないかを証明することが可能となる。
【０１０３】
t 試験が基づく仮定が、変数の等価性であり、Ｆ試験（Ｆｉｓｈｅｒ試験）で示されている。
【０１０４】
変数の中には等しくないものがあるので、よってそれぞれを全ての平均値と比較することはできない。
【０１０５】
可能であるならば平均を比較することで、異なるグループの間の差が顕著であるかそうでないかを示すことができる。
【０１０６】
顕著な差：ＨｓｐＡに対する「２」及び「３」、と「炎症」グループのＮＯＧとの間の平均。
【０１０７】
顕著でない差：活性に関しては、異なる強度レベル間での顕著な差は見られなかった：
ＨｓｐＡ: ０と２、０と３、１と２、１と３、及び２と３との間には顕著な差はない
ＮＰＧ: ０と１、０と２、１と２、１と３、及び２と３との間には顕著な差はない.
しかしながら、力価が胃炎の強度に依存して増大する傾向は見られる：
萎縮に関して：ＨｓｐＡ及び非鞭毛株のＮＯＧ抽出のは平均値は、レベルが１から２、及び２から３へ移ると、二倍になる。
【０１０８】
炎症に関して：レベルが２から３になると、平均が二倍になる。
【０１０９】
それぞれのグループにおける数は、統計的に顕著な差であると結論するには、相対的に少ない（それぞれ３０より少ない）。
【０１１０】
【表１９】
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【表２０】
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交差反応性を呈する血清
２つのタイプの血清を用いた。
２０の血清（１０の抗- レジオネラ+ 、１０の抗- クラミジア+ ）：これら３つの細菌はそれぞれが非常に似た熱ショック蛋白質を有しているため、ＨspＡに対して交差反応することができる
３つの抗- クラミジア陽性抗体：非鞭毛株であるＮ６ｆｌｂＡでは消出する、鞭毛株Ｎ６との交差反応性を示すため。抗−カンピロバクタ陽性血清を得ることは非常に難しい；これが、わずかに３つの血清しか得られない理由である。
【０１１１】
ＨｓｐＡは、１０の抗- レジオネラ陽性抗体とも、１０の抗- クラミジア陽性抗体とも、交差反応性を全く示さない。
【０１１２】
これらの血清のうちいくつかは、鞭毛株及び非鞭毛株の両方について、抗- ヘリコバクター・ピロリ抗体に関する陽性力価を有しているが、これらの血清の臨床的意義はわかっていない。
【０１１３】
【表２１】
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結論
ＨｓｐＡ  ｍａｌＥ
感受性が欠損しているために、この分子自体を利用することはできないが、他の分子と結合しているならば興味深いであろう。
【０１１４】
しかしながら、異なる細菌間で実質的に保存された熱ショック蛋白質による交差反応の危険性をはらんでいる。
【０１１５】
Ｎ６ｆｌｂＡ-
この非鞭毛変異体は非常に興味深いことがわかってきている；母集団ＩＩで判明した感受性及び特異性は、非常に好ましい効果を示している。
【０１１６】
Ｎ６
さしあたっては、鞭毛株が興味深い。しかしながら鞭毛に関連した交差反応性に関してはわずかしか調べられていないが、これはカンピロバクタ血清学に関して良く考証されている血清を得ることが難しいためである。
【０１１７】
ＪＬＦ試験
ヘリコバクター・ピロリの幾つかの株についての水溶性（ＰＢＳ）抽出に基づいた血清学的試験を開発した。
【０１１８】
非鞭毛株変異体のＮＯＧ抽出を使って母集団Ｉの血清を試験した。
【０１１９】
細菌学的及び解剖病理学的見地からのみ考証された８７の血清を、非鞭毛細菌抽出を使って試験した。
【０１２０】
培養が陽性であるか、または解剖病理学的試験及び迅速な尿素試験で陽性であれば、血清は陽性である。
【０１２１】
３つの試験（培養、解剖病理学、及び迅速な尿素試験）で陰性であれば血清は陰性である。
【０１２２】
感受性は９０. ３％（２８/ ３１）で、特異性は７１. ４％（４０/ ５６）であった。
【０１２３】
はじめの試験であやまって陽性とされた１６の血清のうち、９つはＪＬＦ血清学またはＪＬＦウェスタンブロット、もしくはその両方により陽性であった。
【０１２４】
はじめの試験であやまって陰性とされた３つの血清全ては、ＪＬＦ血清学またはＪＬＦウェスタンブロットで陰性であり、一つは両方で陰性であった。
【０１２５】
【表２２】
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【表２３】
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技法
プレートは以下のものでコートした：
２μg/mlのＨｓｐＡ抗原
３μg/mlの、ＮｆｌｂＡ及びＮ６のＮO Ｇ抽出
範囲
５つの範囲でのネガティブコントロール
ポジティブコントロールは４つの希釈度で使用
患者血清
１/ １００希釈
容量：１００μl
インキュベーション      ３７℃１時間
３回洗浄
モノクローナル接合体（ＩｇＧ  ｔｏｘｏ）
使用濃度  ＨｓｐＡに対しては１/ ３２０００
Ｎ６ｆｌｂＡ- に対しては１/ ６４０００
Ｎ６に対しては１/ ５６０００
容量  １００μl
接合体のインキュベーション：３７℃、１時間
４回の洗浄
ＯＰＤ+ 基質による酵素反応の進行
遮光で３０分間
硫酸による酵素反応終結
４９２nm/ ６２０nmでのＯＤ測定
ＯＤの、任意の単位（ＡＵ）への変換
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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参考文献
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２. Ｇａｌａｎ，Ｊ．Ｅ．，  Ｇｉｎｏｃｃｈｉｏ，Ｃ．，  Ｃｏｓｔｅａｓ，  Ｐ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎｖＡ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＩｎｖＡ  ｔｏ  ｍｅｎｂｅｒｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４: ４３３８- ４３４９( １９９２).
３. Ｌｅｙｉｎｇ，Ｈ．，  Ｓｕｅｂａｕｍ，  Ｓ．，  Ｇｅｉｓ，  Ｇ．，Ｈａａｓ，Ｒ．：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２５６３- ２８７４( １９９３).
４. Ｏ’Ｔｏｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．，  Ｋｏｓｔｒｚｙｎｓｋａ，  Ｍ．，  Ｔｒｕｓｔ，Ｔ．Ｊ．：Ｎｏｎ−ｍｏｂｉｌｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｉｌｏｒｉ  ａｎｄ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｏｏｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４: ６９１- ７０３( １９９４).
５．Ｐｌａｎｏ，Ｇ．Ｖ．，  Ｂａｒｖｅ，Ｓ．Ｓ．，  Ｓｔｒａｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．：  ＬｃｒＤ，  ａ  ｍｅｎｂｒａｎｅ  −ｂｏｕｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｌｏｗ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３: ７２９３- ７３０３( １９９１).
６. Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａａｎ，  Ｇ．，  Ｚｈａｏ，Ｊ−Ｌ．，  Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．：Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｆｌｂＦ  ｏｆ  Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ｉｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３: ７２８３- ７２９２( １９９１).
７．Ｓｕｅｒｂａｕｍ，  Ｓ．，  Ｊｏｓｅｎｈａｎｓ，Ｃ．，  Ｌａｂｉｇｎｅ，Ａ．：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ａｎｄ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ  ｆｌｂ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ｆｌａ−  Ａｎｄ  ｆｌＢ−  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．, １７５: ３２７８- ３２８８( １９９３).
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＩＬＬ５７０、およびカナマイシン抵抗性遺伝子カセットを含んだ小型トランスポゾンＴn ３の制限地図。
【図２】組み換えプラスミドｐＳＵＳ３９及びｐＳＵＳ２０７の線形制限地図。表示の番号は制限断片の長さに対応していて、塩基対で表示されている。Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂｇ：ＢｇｌＩＩ。星印は、クローニング中に制限部位が修飾されて、対応していた制限酵素で認識されなくなったことを示す。
【図３】Ｈ. ピロリのｆｌｂＡのヌクレオチド配列及び、一文字表示による推定のアミノ酸配列。
【図４】Ｈ. ピロリのｆｌｂＡのヌクレオチド配列及び、一文字表示による推定のアミノ酸配列。
【図５】Ｈ. ピロリのＦｌｂＡ蛋白質と、他の５つのLcr Ｄ/ ＦｌｂＦファミリとのマルチプル整列（multiple alignment）。Ｃj ＦｌｂＡ：カンピロバクタ  ジェジュニ( Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ) ＦｌｂＡ; Ｃc ＦｌｂＦ: カウロバクタ  クレセントゥス( Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅａｃｅｎｔｕｓ) ＦｌｂＦ; ＹｐＬｃｓＤ: イェルシニア  ペスティス( Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＬｃｒＤ; ＳｔｌｎｖＡ: サルモネラ  ティフィムリウム( Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ) ＩｎｖＡ; ＳｆＭｘｉＡ: シゲラ  フレクスネリ( Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＭｘｉＡ。星印はＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦファミリの相同体全てにおいて保存されているアミノ酸の位置を示し、点は相同体６つのうち少なくとも５つにおいて保存されているアミノ酸の位置を示す；縮退したオリゴヌクレオチドの合成に用いられた、保存アミノ酸配列には下線が引いてある。これらの相同体のＮ末端領域においての保存の度合いにたいして注意するべきであり、これはＣ末端の疎水性領域の多様性の度合いと対照的である。
【図６】Ｈ. ピロリのＦｌｂＡ蛋白質と、他の５つのＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦファミリとのマルチプル整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）。Ｃj ＦｌｂＡ：カンピロバクタ  ジェジュニ( Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ) ＦｌｂＡ; Ｃc ＦｌｂＦ: カウロバクタ  クレセントゥス( Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅａｃｅｎｔｕｓ) ＦｌｂＦ; YpLcs Ｄ: イェルシニア  ペスティス( Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ) ＬｃｒＤ; ＳｔｌｎｖＡ: サルモネラ  ティフィムリウム( Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ) ＩｎｖＡ; ＳｆＭｘｉＡ: シゲラ  フレクスネリ( Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ) ＭｘｉＡ。星印はＬｃｒＤ/ ＦｌｂＦファミリの相同体全てにおいて保存されているアミノ酸の位置を示し、点は相同体６つのうち少なくとも５つにおいて保存されているアミノ酸の位置を示す；縮退したオリゴヌクレオチドの合成に用いられた、保存アミノ酸配列には下線が引いてある。これらの相同体のＮ末端領域においての保存の度合いにたいして注意するべきであり、これはＣ末端の疎水性領域の多様性の度合いと対照的である。
【図７】  Lcr Ｄ/ ＦｌｂＦファミリに属する６つの蛋白質の系統樹を描いた図。移動度の発現制御に関わる蛋白質、すなわちＨ. ピロリのＦｌｂＡ( Ｈp ＦｌｂＡ) 及びカンピロバクタ  ジェジュニのＦｌｂＡ( Ｃj ＦｌｂＡ) 、並びにカウロバクタ  クレセントゥス( Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅａｃｅｎｔｕｓ) のＦｌｂＦ( Ｃc ＦｌｂＦ) は、病原性蛋白質( サルモネラのＩnvＡ、シゲラのＭxiＡ、及びイェルシニアのＬｃｒＤ) の分泌に関わる蛋白質とはかけ離れたブランチを形成する。表示の番号は、相対的な進化の距離を表す。
【図８】Ｈ. ピロリの同質遺伝子的変異体株Ｎ６、すなわちＦｌｂＡ蛋白質をコードした遺伝子が、カナマイシン抵抗性をコードした遺伝子の挿入によって不活化された変異体を構築する際に従った方法を描いた図。
【図９】Ｈ. ピロリから精製した鞭毛に対して特異的なＡK １７９抗血清( ３) を使って行った、Ｎ６ｆｌｂＡ- 変異体由来の蛋白質の免疫ブロット（ウェスタンブロット）；１：Ｎ６- ｆｌｂＡ変異体、２：ｆｌａＡ/ ｆｌａＢ二重変異体、３：  ｆｌａＢ( ８) 変異体、４：fla Ａ( ８) 変異体、５：野生型Ｎ６株。
【図１０】Ｈ. ピロリに対して行った血清学の結果比較。
【図１１】Ｈ. ピロリに対して行った血清学の結果比較。
【図１２】Ｈ. ピロリに対して行った血清学の結果比較。
【図１３】Ｈ. ピロリに対して行った血清学の結果比較。
【図１４】Ｈ. ピロリに対して行った血清学の結果比較。
【図１５】非鞭毛株Ｎ６ｆｌｂＡ- を使った抽出：グリシン、ＰＢＳ、またはＮＯＧを使って行った抽出。いかのデータに基づいて曲線を描いた。
0004414003.tif 000032
係数：P ２= ２. ０３２４, P １= ２. ２７５３, P ０= ０
平均：- １. ０３５６Ｅ- ０７, 標準偏差：０. ０１３０
【図１６】非鞭毛株Ｎ６ｆｌｂＡ- を使った抽出：グリシン、ＰＢＳ、またはＮＯＧを使って行った抽出。ミニメソッド( ＢｉｏＲａｄ) の蛋白質アッセイ。グリシン：１/ ２希釈、グルコシド：１/ １０希釈、上清１：１/ ４希釈、上清２：希釈せず。
以下のデータに基づいて曲線を描いた。
0004414003.tif 000033
係数：P ２= １４４. ６３, P １= ３１４. ３１,P０= ２. ４８１５
【図１７】非鞭毛株Ｎ６ｆｌｂＡ- を使った抽出：グリシン、ＰＢＳ、またはＮＯＧを使って行った抽出。
【図１】
0004414003.tif 000034
【図２】
0004414003.tif 000035
【図３】
0004414003.tif 000036
【図４】
0004414003.tif 000037
【図５】
0004414003.tif 000038
【図６】
0004414003.tif 000039
【図７】
0004414003.tif 000040
【図８】
0004414003.tif 000041
【図９】
0004414003.tif 000042
【図１０】
0004414003.tif 000043
【図１１】
0004414003.tif 000044
【図１２】
0004414003.tif 000045
【図１３】
0004414003.tif 000046
【図１４】
0004414003.tif 000047
【図１５】
0004414003.tif 000048
【図１６】
0004414003.tif 000049
【図１７】
0004414003.tif 000050
【配列表】
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