(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末として生物学的活性物質の溶液または懸濁液を保存するための方法であって、
−１５〜７０℃の範囲の温度で減圧下で沸騰させることによりチャンバー内で生物学的活性物質の溶液または懸濁液を乾燥して、安定な気泡体を生成し、そして
チャンバー中に組み込まれている気泡体を破砕するための手段により、安定な気泡体を破砕して粉末を生成する
ことを含み、前記生物学的活性物質が、乾燥および破砕工程を通して外環境への曝露に対してバリア保護される前記方法。
【請求項２】
前記減圧が０〜２４Ｔｏｒｒである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記減圧が約４Ｔｏｒｒより低い請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記乾燥工程の前に、溶解している気体をパージするために前記生物学的活性物質の溶液または懸濁液に減圧が適用される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的活性物質の溶液または懸濁液が前記乾燥工程前に保護剤と混合される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記保護剤が、糖、ポリオールおよびポリマーから成る群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記保護剤が、単糖、二糖、オリゴ糖およびポリマーを含有する混合物をさらに含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記単糖がフルクトース、グルコース、ソルボース、ピスコース、リブロース、キシルロース、エリスロースなどから成る群から選択される単糖の非還元性誘導体である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記非還元性誘導体が少なくとも１つの還元基を有する単糖から調製され、少なくとも１つの還元基がメチル化、エチル化または塩素化により修飾される請求項８の方法。
【請求項１０】
前記乾燥工程前に、前記生物学的活性物質の溶液または懸濁液が界面活性剤と混合される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記破砕工程前に、気泡体がさらに乾燥される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記破砕工程前に、前記気泡体がガラス転移温度より高い温度で、さらに乾燥され、ガラス転移温度が熱刺激分極電流法により測定されるものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記破砕手段が、ブラシミル、回転羽根ミル、微粉砕ミル、回転磨砕ミル、ジェットミル、漸増切断作用ミル、ボールミル、ハンマーミル、回転チューブラミル、ホモジナイザーおよび音波処理機から成る群から選択されるミルを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記破砕手段が、チャンバー内側の変形可能容器を含み、前記乾燥工程が変形可能容器中で実行される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記破砕工程が、変形可能容器を機械的に変形することにより達成される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記変形可能容器が、容器を変形する前に密封される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記変形可能容器が前記生物学的活性物質の溶液または懸濁液の乾燥を可能にするために気体透過性である請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記変形可能容器が半硬質である請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記乾燥工程がチャンバー内側のトレイ上で行われる請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
乾燥および破砕の少なくとも１つの前記工程の間にチャンバーを回転する工程をさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
保存される生物学的活性物質の粉末化製剤を調製するための方法であって、
減圧下で沸騰させることにより生物学的活性物質を含有する少なくとも２つの溶液または懸濁液を乾燥して、少なくとも２つの安定な気泡体を生成し、
減圧チャンバー内で安定な気泡体を破砕して少なくとも２つの粉末を生成し、そして
生物学的活性物質を含有する粉末を混合して粉末化製剤を生成する
ことを含み、前記生物学的活性物質が、乾燥、破砕および混合工程を通して外環境への曝露に対してバリア保護される前記方法。
【請求項２２】
生物学的活性物質の溶液または懸濁液を乾燥および破砕するための一体型装置であって、チャンバー温度を調節するための加熱器および冷却器およびサーモスタット、ならびにチャンバー圧を調節するための真空ポンプおよび圧力解放弁を有するチャンバーを備える前記装置であって、安定な多孔質気泡体を破砕するための手段をさらに備えることを特徴とする、装置。
【請求項２３】
チャンバー温度を調節するための加熱器、冷却器およびサーモスタットが約−７０℃〜３００℃の範囲内のチャンバー温度を生じ得るものである請求項２２記載の装置。
【請求項２４】
破砕のための前記手段がチャンバー内のミルまたはチャンバー内の変形可能容器を含む請求項２２又は２３記載の装置。
【請求項２５】
前記変形可能容器が袋である請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
チャンバー内の前記変形可能容器を支持するのに適合したカセットをさらに備える請求項２４又は２５記載の装置。
【請求項２７】
前記カセットが熱伝達を促すための素子を備える請求項２６記載の装置。
【請求項２８】
チャンバー温度およびチャンバー圧をモニタリングするのに適合したプログラム可能コンピューターをさらに備え、前記コンピューターがチャンバー温度およびチャンバー圧を制御するのに適合している請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２９】
前記コンピューターがさらに前記破砕手段を制御するのに適合している請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
チャンバー中にトレイをさらに備える請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（技術分野）
本発明は、０℃を超える温度で貯蔵される脱水粉末の形態の感受性生物学的物質の保存に関する。特に本発明は、気泡体を生成し、その後、気泡体を乾燥し、微粉砕して乾燥粉末を生成することによる生物学的物質の保存、および、異なる実際用途のための混合乾燥物質（穀物）の製剤化の工程を統合するための技術的方法に関する。
【０００２】
（関連技術の説明）
生物学的活性物質、ウイルス、細胞および小型多細胞検体の溶液または懸濁液の保存および貯蔵は、食品および微生物学工業、農業、医学および研究の目的に関して重要である。これらの脱水生物学的活性物質の貯蔵は、重量低減および貯蔵空間の低減ならびに安定性増大といった多くの利点を有する。
【０００３】
脱水形態での感受性物質の保存を提供するための従来技術の示唆には、凍結乾燥および減圧または空気乾燥保存が含まれる。凍結乾燥および乾燥保存法はともに、正と負の特徴を有する。凍結乾燥法は工業的量に規模拡大可能であるが、一方慣用的減圧および空気乾燥法は、工業的量に規模拡大可能な生物学的物質の調製物を生じない。凍結乾燥法の凍結およびその他の工程は、多数の感受性生物学的物質にとって非常に有害である。凍結乾燥法は、非常に長く、非原価効率的であり、物質の滅菌性を保証するためのバリア技術を用いて実行できない。
【０００４】
凍結および乾燥による保存に関連した問題のいくつかは、凍結および乾燥のストレスに対して生物学的物質を安定化することが見出されている保護剤分子、特に炭水化物の付加により取り扱われてきた。しかしながら、保護剤の存在にもかかわらず、拡散依存性分解化学反応を阻害するために、凍結乾燥後の長期安定性は依然として低温貯蔵を要する。したがって、周囲温度で不安定な生物学的物質の長期貯蔵を提供するために、さらなる刷新が求められている。
【０００５】
周囲温度での乾燥物質の貯蔵は、低温貯蔵オプションと比較した場合、原価効率的である。さらに、ワクチンおよびホルモンのような生物学的物質の周囲温度貯蔵は、冷蔵がしばしば利用不可能な第三世界の国々に現代医学治療をもたらす際に非常に有益である。生物学的検体の貯蔵保存の多数の利点が高く評価されてきたので、研究者は、長期貯蔵中の分解過程から生物学的物質を防御する手段としてガラス化を利用しようと努力してきた。その結果、「ガラス」状態を達成するためのこの技術は、将来、優れた保存技術として出現すると予期されている。
【０００６】
ガラスは、最初に液体状態であった物質を実質的に過冷却することにより得られる非晶質固体状態である。ガラス化物質またはガラスにおける拡散は、非常に低速（例えば、数ミクロン／年）で起こる。その結果、１つより多い部分の相互作用を要する化学的または生物学的変化は、実際上完全に抑制される。ガラスは普通は均質で、透明で脆い固体であり、粉末に粉砕または微粉砕され得る。ガラス転移点（Ｔｇ）として知られている温度より上では、粘性は急速に下がり、ガラスは変形可能になり、その物質はさらに高温では流体に変わる。長期貯蔵のためのガラス化の最適利点は、Ｔｇが貯蔵温度より高い条件下でのみ確実になり得る。Ｔｇは存在する水の量に直接的に依存しており、したがって、水和のレベルを制御することにより改変され得る。含水量が低いほど、Ｔｇは高い。
【０００７】
残念ながら、周囲温度で不安定な生物学的物質に長期安定性を付与する手段としてのガラス化技法の利点は、十分には利用されていなかった。乾燥保存による周囲温度保存の慣用的方法は、極少量の物質の実験室加工処理のために設計されている。近年、V. Bronshtelnは、大規模商業的操作に適合性である気泡体生成による保存の代替的方法を開発した（米国特許第５，７６８，５２０号）。気泡体生成による保存は、空気乾燥およびガラス化保存工程のスケールアップに関連した技術的問題を克服する。このために、気泡体生成による保存は、生物学的物質の長期貯蔵のための規模拡大可能な方法として魅力がある。
【０００８】
本発明は、気泡体生成および加工処理操作により、保存に関連した操業問題を解決する。特別に設計された用具および装置が、保存物質の脱水保存性気泡体および均一粉末を再現可能的に製造するために用いられなければならない。装置は、乾燥保存、その後の乾燥物質の粉末形態への変換（例えば微粉砕による）、および、異なる生物学的物質の混合物を含有し得る製品をを製剤化するための乾燥粉末の使用により生物学的物質の規模拡大可能バリア保存を行う能力を統合すべきである。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、気泡体または粉末として生物学的溶液または懸濁液を保存するためのバリア法に関する。本方法は、先ず減圧下で試料を沸騰させて機械的に安定な気泡体を生成し、次に高温で気泡体を脱水して、貯蔵中の保存物質の安定性を保証するのに必要なガラス転移温度を得ることにより非損傷温度においてチャンバー中で生物学的溶液または懸濁液を乾燥し、そして機械的に安定な気泡体を破砕して（および／または微粉砕して）粉末を生成する工程を含む。
【００１０】
本方法は、生物学的溶液または懸濁液が、乾燥前に保護剤と混合され得ることをさらに提供する。乾燥状態での保存の他の方法と同様に、糖、ポリオールおよびそれらのポリマーは、乾燥保存の損傷作用から物質を保護するために用いられ得る。具体的には、保護剤は、単糖、二糖およびポリマーを含む混合物を含む。単糖は、フルクトース、グルコース、ソルボース、ピスコース、リブロース、キシルロース、エリスロースなどの非還元誘導体から成る群から選択され得る。このような誘導体は、還元基をメチル化、エチル化、塩素化するか他の方法で修飾することにより得られる。
【００１１】
気泡体を微粉砕する前に、それは任意に、所望貯蔵温度でのその安定性を増大するのに十分な条件下でさらに乾燥され得る。この二次乾燥操作中に得られる安定性増大は、乾燥チャンバーの内側で、または倉庫貯蔵中に乾燥チャンバーの外側で実行され得る。あるいは、気泡体は、所望の貯蔵温度よりそのガラス転移温度を上昇させるのに十分な条件下でさらに乾燥され得る。これらのさらなる乾燥工程は、気泡体が破砕されて粉末を生成した後に適用してもよい。
【００１２】
気泡体を破砕するための手段は、チャンバー中に組み込まれ得る。破砕手段は、ブラシミル、回転羽根ミル、微粉砕ミル、回転磨砕ミル、ジェットミル、漸増切断作用ミル、ボールミル、ハンマーミル、回転チューブラミル、ホモジナイザーおよび音波処理機から成る群から選択されるミルを含み得る。あるいは、破砕手段は、チャンバー内の変形可能容器を含み、この場合、変形可能容器を機械的に変形することにより、乾燥工程が成し遂げられる。乾燥が変形可能容器内で行われる場合、破砕は変形可能容器を機械的に変形することにより達成され得る。滅菌性を保持するためには、バリア技術に従って、変形可能容器は、容器を変形する前に密封され得る。
【００１３】
本発明の変形可能容器の変型は、生物学的溶液または懸濁液を乾燥させるが、滅菌性を保持し、液体または気泡体を保持するための気体透過性容器である。変形可能容器は、半硬質でもあり得る。
【００１４】
本方法の別の変型は、チャンバー内側のトレーを包含する。トレーは格子により細分され、これが溶液または懸濁液を保持し、あるいは柔軟性変形可能容器、例えば袋を支持し得る。
【００１５】
チャンバー温度を調節するための手段、チャンバー圧を調節するための手段および機械的に安定な気泡体を破砕するための手段を有するチャンバーを備える、生物学的試料を保存し、破砕するための装置も開示される。加工チャンバーは、少なくとも１リットルから、少なくとも１０リットル、少なくとも１００リットルまでの範囲の異なる容積の生物学的溶液または懸濁液を収容するサイズにされる。
【００１６】
チャンバー温度を調節するための手段は、約−７０℃〜３００℃の範囲内のチャンバー温度を生じ得るものである。圧力を調節するための手段は、約０．０１〜約５００Ｔｏｒｒの範囲内のチャンバー圧を生じ得るものである。破砕するための手段は、ミルまたはチャンバー内の変形可能容器（袋）を包含し得る。ミルは、ブラシミル、回転羽根ミル、微粉砕ミル、回転磨砕ミル、ジェットミル、漸増切断作用ミル、ボールミル、ハンマーミル、回転チューブラミル、ホモジナイザーおよび音波処理機から成る群から選択され得る。
【００１７】
好ましくは、装置は、チャンバー温度および圧力を検出するためのセンサー、ならびにチャンバー温度および圧力を監視し、制御するのに適合したプログラム可能コンピューターを備える。
【００１８】
乾燥粉末は、乾燥条件下で貯蔵され得る。最終生成物は、種々の異なる方法で、例えば１つ又はそれ以上の粉末を混合し、混合物をバイアルまたは密封され得るその他の容器中に入れるか、粉末をプレスすることにより錠剤を調製するか、または粉末吸入、経鼻またはその他の方法による乾燥物質送達のための用具を調製することにより、製剤化され得る。
【００１９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、生物学的活性物質に適用するための保存および加工法の組合せを開示する。本方法は、種々の方法操作を容易にするよう設計された一体型加工チャンバー中での生物学的物質の滅菌性を守るために、バリア技法を用いて行い得る。分かり易くするために、本方法および装置の特徴および限定を、別々に本明細書中で説明する。
【００２０】
生物学的物質−本発明の方法により保存され得る生物学的活性物質としては、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、補酵素、ビタミン、血清、ワクチン、ウイルス、リポソーム、細胞およびある種の小型多細胞検体が挙げられるが、これらに限定されない。高温での生物学的検体の脱水は、特に、例えば乾燥のために用いられる温度が適用可能タンパク質変性温度より高い場合には、非常に損傷性であり得る。高温に関連した損傷から試料を保護するために、脱水工程は多段階で、または温度と脱水の程度の同時増大により行い得る。一次脱水は、生物学的活性の損失を伴わない脱水を可能にするのに十分に低い温度で行われるべきである。
【００２１】
保護剤（充填剤）−種々のポリオールおよびポリマーが当業界で既知であり、それらが、乾燥および貯蔵に耐して生物学的活性物質の能力を増強するが、特定の生物学的活性を妨害しない限り、保護剤として役立ち得る。実際、保護剤分子は、脱水中に生物学的物質を安定化するほかに、保存中のその他の利点を提供する（機械的に安定な気泡体を生成するための一助として、以下参照）。特に、本発明による保護剤としては、簡単な糖、例えばスクロース、グルコース、マルトース、スクロース、キシルロース、リボース、マンノース、フルクトース、ラフィノースおよびトレハロース、単糖の非還元性誘導体およびその他の炭水化物誘導体、糖アルコール、例えばソルビトール、合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドおよびポリエチレンアミン、ならびに糖コポリマー、例えばフィコールおよびデキストラン、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。低分子量高溶解性タンパク質も保護剤として役立ち得る。
【００２２】
細胞またはウイルスが保存される本発明の変型においては、保護組成物は、低分子量糖、二糖、オリゴ糖、および、生物学的ポリマーを含むポリマーの混合物をさらに包含し得る。低分子量糖は、脱水中の細胞内構造を浸透、保護するために用いられる。低分子量透過性糖は、中性または高ｐＨで非還元性であるか、あるいはメチル化またはエチル化単糖である種々のケトースから選択され得る。非還元性ケトースには、六炭糖、フルクトース、ソルボースおよびピスコース；五炭糖、リブロースおよびキシルロース；四炭糖、エリスロース；ならびに三炭糖、１，３ジヒドロキシジメチルケトンが含まれる。メチル化単糖には、グルコ、マンノ、および、ガラクトピラノシドのαおよびβのメチル化体がある。メチル化五炭糖には、アラビノおよびキシロピラノシドのαおよびβ体がある。スクロースのような二糖は、それらが生物学的膜および高分子の表面上の水和水を置換するために、乾燥保存中の有効な保護剤であることは既知である。さらに、本発明者は、減圧下で乾燥される場合、スクロースおよび／またはその他の充填剤が、濃縮糖の薄い非晶質フィルムから成る安定気泡体に有効に転換され得る、ということを見出した。
【００２３】
本発明者は、単糖を二糖およびオリゴ糖と組合せると、脱水中のオリゴ糖の結晶化を有効に防止するということも見出した。また、ポリマーは、低分子量単糖の含入により低下し得る脱水混合物のガラス転移温度（Ｔｇ）を上昇させるために用いられ得る。濃縮糖溶液中で高溶解性である任意の生物学的ポリマーが用いられ得る。例えば、フィコールおよびデキストランのような多糖、ならびにヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドのような合成ポリマー、ならびに高溶解性天然および合成バイオポリマー（例えば、タンパク質）は、生物学的膜を安定化し、Ｔｇを上昇させるのに役立つ。
【００２４】
一次気泡体乾燥−加工操作のスケールアップを容易にするために、気泡体生成による保存は、減圧下での沸騰による機械的に安定な多孔質構造の形成を包含する。乾燥工程は、約−１５〜７０℃の範囲の温度で行われる。機械的に安定な多孔質構造すなわち気泡体は、濃縮充填剤の薄い非晶質フィルムから成る。気泡体生成による保存は、ガラス化前の大試料容積の効率的乾燥に、そして、商業的使用に適した易微粉砕乾燥物質を調製する場合の一助として、特によく適している。気泡体生成による保存のさらなる詳細は、米国特許第５，７５６，５２０号（Bronshtein）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に含まれている。
【００２５】
本発明の一変型では、稀釈生物学的試料は、減圧下での気泡体乾燥前に、水を一部除去して濃縮し粘性検体を生成し得る。この初期濃縮工程は、選択される濃縮方法によって、加工チャンバーに試料を導入する前または後に行い得る。あるいは、保護剤分子の付加後に十分粘性であり、したがって初期濃縮を要しない試料もある。試料の粘性を増大するのが望ましい状況では、初期濃縮に用いられるよう意図される方法としては、凍結乾燥、液体または部分凍結状態からの蒸発、逆浸透、その他の膜技法、あるいは当業界で既知の任意のその他の濃縮方法が挙げられる。
【００２６】
粘性試料は、１００℃より実質的に低い温度で乾燥中にそれらを沸騰させるために、減圧を施される。言い換えれば、生物学的活性物質の粘性溶液または懸濁液に減圧が適用されて、沸騰中に溶液または懸濁液を発泡させ、発泡工程中に、さらなる溶媒除去が、機械的に安定な連続気泡または独立気泡多孔質気泡体の最終生成を生じる。
【００２７】
低真空圧（０．１〜０．９気圧の範囲）が、濃縮粘性溶液を生成するための初期蒸発を促すために適用される一方、沸騰を生じるためには非常に高真空圧（０〜２４Ｔｏｒｒ）が用いられる。沸騰工程のための減圧は、好ましくは０〜１０Ｔｏｒｒ、最も好ましくは約４Ｔｏｒｒ未満である。ここでの沸騰は、水蒸気を含有するが空気またはその他の気体を含有しない泡の核形成および成長を意味する。実際、いくつかの溶液では、室温での低真空（約０．１〜０．９気圧）の適用により溶解気体をパージするのが有益であり得る。このような「脱気」は、乾燥容器から溶液が噴出するのを防止するのに役立ち得る。溶液が十分に濃縮され粘性になれば、高真空を適用して制御沸騰または発泡を引き起こし得る。初期蒸発中の５〜７０重量％の範囲での前記の保護剤の濃度は、その後の高真空下での凍結を防止するのに役立ち、粘性を付加して、それにより非制御化噴出を制限しながら、発泡を促す。
【００２８】
圧力または温度の急速増大は、気泡体を潰れさせる。この場合、多孔質構造の機械的安定性を増強するためには、乾燥気泡体への変換を意図された溶質の生物学的活性を妨害しない限り、界面活性剤が付加され得る。さらに、保護剤ポリマーの乾燥も、多孔質構造の機械的安定性に寄与する。本発明により調製される気泡体は、その後の加工操作（例えば安定性乾燥、ガラス化または微粉砕）前に、減圧乾燥気体、例えばＮ2雰囲気および／または化学的乾燥剤下で、加工チャンバー中に貯蔵され得る。
【００２９】
以下の実施例は、気泡体生成による保存方法にしたがった機械的に安定な多孔質気泡体の生成を説明する。
【００３０】
（１）１ｍｌ当たり５９．４単位の活性を含有するSigma Chemical Co.からの５０％グリセロールイソシトレートデヒドロゲナーゼ水溶液を、０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で５時間透析した。透析後の０．１ＭトリスＨＣｌ溶液中のイソシトレートデヒドロゲナーゼの活性は、２６±１．８単位／ｍｌであった。活性低減は、透析中の稀釈による酵素濃度の低減に関連した。
５０  ｌの５０重量％スクロース溶液および５０  ｌの０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中のイソシトレートデヒドロゲナーゼ懸濁液を含有する混合物（１００  ｌ）を１．５ｍｌプラスチック管中に入れて、室温での乾燥により保存した。先ず、試料を低真空（０．２気圧）下で４時間乾燥した。次に、高真空（＜０．０１気圧）下で４時間、沸騰させた。この工程中、機械的に安定な乾燥気泡体が試験管中に生成された。そして、室温において減圧下で、ドリエライト上で８日間、試料を貯蔵した。
８日後、試料を５００  ｌの水で再水和した。乾燥気泡体を含有する試料の再水和は、数秒で完了する容易な工程であった。３４０ｎｍで分光分析的に測定されるＮＡＤＰを還元する能力を検定することにより、活性に関して再構成試料を検定した。反応ミックスは、２ｍｌの０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、１０  ｌの０．５重量％ＮＡＤＰ＋、１０  ｌの１０ｍＭ  ＭｎＳＯ4、１０  ｌの５０ｍＭ  １−イソシトレートおよび１０  ｌのイソシトレートデヒドロゲナーゼ溶液を含んでいた。活性は、２．６±０．２単位／ｍｌであったが、これは、乾燥およびその後の室温での貯蔵中に活性の損失がなかったことを意味する。
【００３１】
（２）５０  ｌの５０重量％スクロースおよび５０  ｌの氷核細菌（シュードモナス  シリンガエＡＴＣＣ５３５４３）懸濁液を含有する混合物（１００  ｌ）を１．５ｍｌプラスチック管中に入れて、室温で乾燥することより保存した。先ず、試料を低真空（０．２気圧）下で４時間乾燥した。次に、高真空（＜０．０１気圧）下で４時間、沸騰させた。高真空下で沸騰後、機械的に安定な多孔質構造が試験管中に生成された。そして、室温において減圧下で、ドリエライト上で８日間、試料を貯蔵した。
８日後、試料を５００  ｌの水で再水和した。乾燥気泡体を含有する試料の再水和は、数秒で完了する容易な工程であった。次に、対照試料と比較して、氷核形成活性に関して検定した。本発明の方法により保存された試料と対照試料における１，０００細菌当たりの氷核形成活性に有意差は認められなかった。
【００３２】
（３）氷核細菌（ＩＮＢ）シュードモナス  シリンガエＡＴＣＣ５３５４３の濃縮懸濁液とスクロースの１：１混合物を含有する試料を用いた。最終懸濁液が５０重量％のスクロースを含有するように、スクロース結晶が溶解するまで試料を混合した。懸濁液を２ｇ／バイアルで２０ｍｌバイアル中に入れた。減圧チャンバーの内でバイアルを乾燥させた。バイアルを、チャンバー内のステンレススチール棚の表面に静置した。棚内に制御温度でエチレングリコール／水不凍液を循環させることにより、棚温度を制御した。減圧を適用する前に、棚温度を５℃に低下させた。次に、チャンバー内の静水圧を０．３Ｔｏｒｒに下げた。これらの条件下で、懸濁液は３０分間沸騰した。棚の温度を徐々に（３０分掛けて）２５℃まで上昇させた。これらの実験条件下でバイアルの内側に視覚的に安定した乾燥気泡体が３時間以内に生成された。その後、試料を室温で減圧下に１日以上保持した。１０ｍｌの０．０１Ｍリン酸塩緩衝液で試料を再水和後、保存ＩＮＢの氷核形成活性を測定した。−５℃において５分間で１０  ｌ緩衝液滴中に氷結晶を成核し得る氷核形成中心の濃度として、氷核形成活性を測定した。検定結果は、保存試料中の氷核形成活性が新鮮な対照で観察された活性と等価であったことを示す。
【００３３】
（４）濃縮ＩＮＢ懸濁液を、さらなる使用のために、−７６℃に凍結させた。凍結懸濁液（５ｇ）を４℃で解氷し、４ｇの９：１のスクロース：マルトリン混合物と混合した。最終懸濁液が３５重量％のスクロースおよび４重量％マルトリンを含有するように、糖が完全に溶解するまで試料を混合した。懸濁液を、２ｇ／バイアルで２０ｍｌバイアルに入れた。バイアルを乾燥チャンバー内で乾燥させた。バイアルを、チャンバー内のステンレススチール棚の表面に静置した。棚内に制御温度でエチレングリコール／水不凍液を循環させることにより、棚温度を制御した。減圧を適用する前に、棚温度を５℃に低下させた。チャンバー内側の静水圧を０．５Ｔｏｒｒに下げた。このような条件下で、懸濁液は３０分間沸騰した。棚の温度を徐々に（３０分掛けて）２５℃まで上昇させた。視覚的に、これらの実験条件下でのバイアル内の安定乾燥気泡体の生成が、２．５時間以内に完了した。いくつかのバイアルの除去後、温度を５０℃に上昇させ、残りの試料を減圧下に７日間保持した。
１０ｍｌの０．０１Ｍリン酸塩緩衝液で試料を再水和後、保存ＩＮＢの氷核形成活性を測定した。−５℃における５分間で１０  ｌ緩衝液滴中に氷結晶を成核する氷核形成中心の濃度として、氷核形成活性を測定した。
２５℃で乾燥後に減圧チャンバーから取りだしておいた試料の氷核形成活性は、凍結解氷ＩＮＢの初期活性より約５０％低かった（氷核形成活性の測定値の相対標準誤差は、２０％未満である）。ＩＮＢの凍結は氷核形成活性を有意に低減しないことが既知であるために、この実験で観察された活性の５０％低減はおそらくは、付加的凍結工程が乾燥による保存に対するＩＮＢの感受性を増大したためであると思われる。同時に、ＩＮＢの活性の付加的低減は、減圧下で５０℃におけるさらに７日間の乾燥後には観察されなかった。
【００３４】
（５）前記のように調製されたＩＮＢを含有する安定気泡体に、改変Virtisホモジナイザーを用いて微粉砕を施した場合、再水和気泡体と比較して、再水和粉末中の氷核形成活性の損失は認められなかった。
【００３５】
（６）６０重量％スクロース溶液（１ｍｌ）を、減圧チャンバー内の２０ｍｌガラスバイアル中で乾燥させた。バイアルを、チャンバー内のステンレススチール棚の表面に静置した。棚内に制御温度でエチレングリコール／水不凍液を循環させることにより、棚温度を制御した。この実験における棚の温度は、２０℃に保持した。チャンバー内の静水圧を０．３Ｔｏｒｒに下げた。このような条件下で、溶液は徐々に沸騰して、非晶質状態の濃縮スクロースを含有する薄いフィルムから成る気泡体を生成した。これらの実験条件下でバイアルの内側の視覚的安定乾燥気泡体を生成するには、２〜３時間を要した。
【００３６】
（７）ウロキナーゼの凍結乾燥試料を、２ｍｌの４０重量％スクロースで再水和した。次に、乾燥によるさらなる保存のために、溶液を２０ｍｌ滅菌ガラスバイアルに移した。乾燥前に、バイアルを灰色すりわり付きゴム栓で被覆した。バイアルを減圧チャンバー内で乾燥させた。バイアルを、チャンバー内のステンレススチール棚の表面に静置した。棚内に制御温度でエチレングリコール／水不凍液を循環させることにより、棚温度を制御した。減圧を適用する前に、棚温度を５℃に低下させた。チャンバー内の静水圧を０．５Ｔｏｒｒに下げた。このような条件下で、懸濁液は３０分間沸騰した。棚の温度を３０分掛けて徐々に２５℃まで上昇させた。視覚的に、これらの実験条件下で、バイアルの内側に安定乾燥気泡体が、３時間以内に生成された。室温でさらに１２時間乾燥後、さらに２４時間の間に温度を４５℃に上昇させた。チャンバーを乾燥Ｎ2気体で充填後、ゴム栓を押し下げて、バイアルをアルミニウム襞付きシールで密封した。
乾燥後、４０℃での３０日間貯蔵直後に、試料を検定した。ウロキナーゼ乾燥後、活性は初期活性の９３％であった。この低減は、初期バイアルからウロキナーゼが乾燥されたバイアルに移した時のウロキナーゼの損失に関連した。４０℃で３０日間の貯蔵後、活性は９０％であった。言い換えれば、ウロキナーゼ活性のさらなる有意の低減は、４０℃での１ヶ月間貯蔵中には観察されなかった。
【００３７】
（８）アンフォテリシンＢの凍結乾燥試料を、バイアル当たり５ｍｌの４０重量％スクロースで再水和した。次に、乾燥によるさらなる保存のために、溶液を５０ｍｌ滅菌ガラスバイアルに移した。乾燥前に、バイアルを灰色すりわり付きブチルゴム栓で被覆した。バイアルを減圧チャンバー内で乾燥させた。バイアルを、チャンバー内のステンレススチール棚の表面に静置した。棚内に制御温度でエチレングリコール／水不凍液を循環させることにより、棚温度を制御した。減圧を適用する前に、棚温度を５℃に低下させた。チャンバー内の静水圧を０．５Ｔｏｒｒに下げた。このような条件下で、懸濁液は３０分間沸騰した。棚の温度を徐々に（３０分掛けて）２５℃まで上昇させた。視覚的に、これらの実験条件下で、バイアルの内側に安定乾燥気泡体が、３時間以内に生成された。室温でさらに１２時間乾燥後、チャンバーを乾燥Ｎ2気体で充填し、バイアルの一部のゴム栓を押し下げた。バイアルをチャンバーから取り出して、その後、アルミニウム襞付きシールで密封した。乾燥後、２７．５℃および４０℃で３０日間貯蔵直後に、試料を検定した。その結果を、次の実験で得られた結果と一緒に、表１に示す。
アンフォテリシンＢの別の組の凍結乾燥試料を、バイアル当たり５ｍｌの４０重量％スクロースで再水和した。次に、前記と同様に乾燥によるさらなる保存のために、溶液を滅菌ガラスバイアルに移し、さらに２４時間、４５℃で乾燥した。その後、チャンバーを乾燥Ｎ2気体で充填し、ゴム栓を押し下げて、バイアルを密封した。乾燥後、２７．５℃および４０℃で３０日間貯蔵直後に、試料を検定した。その結果を、表１に示す。
【００３８】
【表１】
0004563588.tif 000002
【００３９】
乾燥直後のアンフォテリシン活性の低減は、初期バイアルからアンフォテリシンが乾燥されたバイアルに移した時のアンフォテリシンの損失に関連した。検定結果（表１）は、効力の損失は、低温（２５℃）で乾燥され、その後４０℃で貯蔵された試料で検出されただけであった。
【００４０】
（９）Stratageneからの大腸菌（エクスＬ１０−ＧＯＬＤ）の凍結（−７６℃）懸濁液を含有する１．５ｍｌ試験管を、氷浴中で解氷した。１００  ｌアリコートを５０ｍｌのＮＺＹＭ（カゼイン消化酵母抽出物培地）ブロスに移し、オービタル振盪器で３７℃で一夜インキュベートした。１４時間増殖後、１０ｍｌのこの増殖培養を１００ｍｌの滅菌ＮＺＹＭブロスに接種して、３７℃で培養増殖を継続した。培養増殖中、光学濃度（ＯＤ＠６２０ｎｍ）を毎時間測定して、対数細菌増殖の終結を決定した。遷移相に達したら（ＯＤ＝１〜１．０６）、細胞は収穫された。培地（５ｍｌ）をピペットで遠心管に移して、１０分間遠心分離した。次に上清を注ぎ出して、ペレットの重量を測定して、細胞のおよその濃度を決定した。
【００４１】
５ｍｌのＮＺＹＭブロスで、またはＭＲＳブロス中の２５％スクロースおよび２５％フルクトースから成る保存溶液で細胞を再懸濁させた。ＮＺＹＭブロスで再懸濁させた細胞は、対照として用いた。ＭＲＳブロス（１ｍｌ）中の２５％スクロースおよび２５％フルクトースに懸濁させた細胞を２０ｍｌガラスバイアル中に入れて、実施例２でＩＮＢを乾燥させたのと同様に減圧下で乾燥させた。その後、試料を室温で２４時間減圧下に保持した。乾燥試料を、選定時間間隔で検定した。室温において０．１％ペプトン水溶液で再水和後、保存細胞の生存を測定した。生育可能細胞の濃度を決定するために、ＬＢミラー寒天上に適切な稀釈で懸濁液をペトリ皿中に注ぎ入れ、その後、３７℃で３６〜４８時間インキュベートした。約２５±１０％の対照細胞が、乾燥および減圧下での１日貯蔵後に生存した。さらに、生存細胞の割合は、その後の室温で減圧下での２４日間の貯蔵中に低下しなかった。
【００４２】
安定性乾燥／ガラス化−一次乾燥中に生成された機械的に安定な気泡体に、任意に、温度を上げて、二次すなわち「安定性」乾燥を施した。Ｔｇは試料の含水量によるため、そしてＴｇは脱水増大に伴って増大するため、所望の貯蔵温度によって異なる安定性乾燥プロトコールが適用されて、その貯蔵温度への冷却時のガラス化に相当するＴｇを生じ得る。しかしながら、物質の脱水は実際には、一旦それらがガラス状態になったら不可能であるため、周囲貯蔵温度が望ましい本発明によるガラス化のために重要なのは、周囲温度より有意に高い温度で安定性乾燥を実行することである。
【００４３】
最終貯蔵温度は、好ましくは０〜７０℃の範囲内である。さらに好ましくは、一般的貯蔵温度は、０、４、２０、４０および５０℃以上である。冷蔵貯蔵が好ましいいくつかの場合には、安定性乾燥は室温で行い、その後貯蔵温度以下に冷却される。室温での安定性が望ましいその他の場合には、室温より高い温度での脱水と、その後の室温への冷却が用いられるべきである。
【００４４】
保存される任意の所定の検体に関しては、検体の性質および安定性特徴が、それが一次乾燥工程中に耐え得る最大温度を決定する。酵素保存の場合には、室温での一次乾燥後、安定性乾燥温度は、酵素活性の損失を伴わずに５０℃まで増大され得る、ということが示された。その後、脱水工程が高温での安定性乾燥中継続され得る。したがって、脱水温度の継続的または段階的増大により、不安定タンパク質はそれらの変性温度より十分に高い温度で熱安定性の状態におかれ得る。
【００４５】
選定貯蔵温度より高い温度での安定性乾燥の実行の他に、貯蔵温度より上にＴｇを実際に上昇させるのに十分な期間、この乾燥を行うということが重大である。１５％スクロース＋１５％ラフィノース溶液の乾燥１０μｌ滴を用いて得られた経験的結果に基づいて、７０℃より高い温度での１２時間より長い安定性乾燥は、２５℃より上にＴｇを上げるのに必要であることが示された。これらの実験における一次乾燥は、室温（２０℃）で１２時間であった。結果は、安定性乾燥時間延長（７０℃で１２時間以上、６０℃で３６時間以上）は、室温よりＴｇを上昇させるのに必要であり得ることを示唆する。熱不安定性でないいくつかの生物学的物質に関しては、高温での一次乾燥は、選定貯蔵温度を上回るようＴｇを上昇させるために必要とされる高温での安定性乾燥時間を低減する。
【００４６】
本発明の一実施態様では、気泡体は安定乾燥から微粉砕温度に冷却されて微粉砕され、次にその粉末は、減圧下でまたは大気圧下でさらに乾燥を施される。その後の乾燥温度は、約０℃〜１００℃の範囲である。このような乾燥は、ガラス転移温度が約０〜７０℃の範囲内の選定貯蔵温度より上に上げられるまで継続され得る。
【００４７】
Ｔｇが実際に貯蔵温度より高いことを保証するために、熱分析によりＴｇを推測するための少なくとも２つの方法が既知である。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は最も一般的に用いられる技法である。しかしながら、ＤＳＣは、ポリマーを含有する試料におけるＴｇの測定においては信頼できないことがあることを、本発明者は見出した。あるいは、熱刺激分極電流（ＴＳＰＣ）法が特にポリマーの分析に適合される。ＴＳＰＣ法は、すべての試料に関して信頼できるために好ましいが、しかしそれはわずかに大きい試料容積を要する。
【００４８】
均一粉末の生成−安定気泡体を粉末に破砕するために選択される手段にかかわらず、本発明の装置は、好ましくは、このような破砕手段を、一次および任意の安定性乾燥工程が成し遂げられる同一チャンバー、円筒または容器内に組み込んでいる。実際、本発明の利点の１つは、別々の装備により予め実行される機能の統合である。したがって、破砕手段は、好ましくは加工チャンバー中に収容され、保存工程の少なくとも１つが完了された時に操作される。
【００４９】
本発明の破砕手段は、慣用的ミル、ホモジナイザーおよび音波処理機、ならびに安定気泡体を粉末にするためのその他の手段を含む。これらのその他の手段には、乾燥チャンバーの内に配置された第二の容器の物理的変形が含まれる。第二チャンバーは、気泡体が容器への物理的衝突により粉末化される半硬質であるか、または破砕またはその他の物理的変形により気泡体が粉末化される袋のように柔軟性であり得る。あるいは、保存は、気泡体が格子から掻き取られて、破砕され得る仕切りトレイ中の格子セル内で起こり得る。種々の破砕手段を、下記にさらに詳細に説明する。
【００５０】
Ａ．慣用的微粉砕−慣用的微粉砕方法および構成要素は、本発明にしたがって用いられ得る。これらの例としては、ブラシミル；米国特許第５，３５２，４７１号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたような回転羽根ミル； 米国特許第４，６５１，９３４号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたような微粉砕ミル；米国特許第４，４０４，３４６号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたような回転磨砕ミル；例えば、米国特許第４，９１７，３０９号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載され、改良されたような、らせんまたはカウンターパイプミル（CF Winnacker, Kucher; Chemische Technologie, 4th Edition, Volume 1,p.91-93, 1984）の種類のジェットミル；例えば、米国特許第５，５２０，９３２号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたコミトロール（商標）１７００ミルのような漸増切断作用ミル；ボールミル；ハンマーミル（例えば、マイクロパルベライザー（商標））；例えば米国特許第５，１７４，５１２号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたマイクロナイジングミルのような衝撃耐性金属ボール、金属シリンダーまたは棒または石を含有する回転チューブラミル；ホモジナイザーおよび音波処理機；ならびに草刈り機のようなワイヤを備えるミル；ならびに当業界で周知の任意のその他の微粉砕手段が挙げられるが、これらに限定されない。種々の種類のミル、粉砕機および破砕メカニズムの差異および利点は、製薬技術の当業者には周知である。
【００５１】
Ｂ．変形可能容器−同一乾燥チャンバー中での乾燥および粉末への粉砕の概念を実行するためにとられる多数の代替的アプローチが存在する。慣用的微粉砕からの変型は、乾燥チャンバー内に配置される第二容器を用いる。この第二容器は、気泡体生成を介して保存される加工流体のホルダーとして役立つ。本容器はチャンバー内に配置され、保存溶液を充填される。この充填は、別々の充填管を介して成し遂げられ得る。気泡体生成による保存の完了後に、この容器は密封され、乾燥チャンバーから取り出されて、最終容器として、またはさらなる加工のための中間容器として役立つ。密封は、半硬質容器では簡単な蓋締用具により、または柔軟性容器では溶封により成し遂げられ得る。さらに、容器が半硬質である場合には、中に含まれる機械的に安定な気泡体は、硬質非柔軟性表面への容器壁の一連の衝撃またはその逆によるある種の粗い粉砕において破壊され得る。気体透過性リオグアード（商標）袋を用いる場合のように容器が柔軟性である場合には、中に含まれる気泡体は、相対的に弱い力で袋を潰すことにより粗く粉砕され得る。これは、簡単なローラー用具を用いて成し遂げられ得る。一旦粗く破壊されれば、その結果生じる粒子は完成形態であると考えられるか、または、最終使用要件によって、粉砕機に移してさらに加工され得る。この時点で、物質は粒状形態であるため、この移動は、動力取扱い系で一般に用いられる重力または真空装置により容易に行われる。最終微粉砕は、市販の微粉砕装置により行われ、物質最終規格書に示されているような特定の粒子サイズ分布に物質を粉砕するような方法で行われる。例えばクアドロ  コミル（商標）は、この目的に適している。
【００５２】
第二容器は気泡体生成による保存中に減圧環境にあるため、熱の、内側の保存溶液への伝達は遅く、制御するのが難しい。この制限は、誘導加熱の概念を用いることにより克服され得る。チャンバーの外周に巻き付けられる誘導コイルは、保存溶液中のイオン種中に分子運動を誘導することにより熱源を提供する。あるいは、乾燥チャンバー内外にスライドして、物質の容易な投入および搬出を提供するカセットと呼ばれる袋保持装置は、誘導コイルを支持する装置としても役立つ。本発明の装置の一実施態様は、図１に説明されている。コンデンサー１０は、加熱器１２を有する乾燥チャンバー１４に接続される。カセット１６は、乾燥チャンバーに収まり、変形可能容器２４を保持するのに適合している。本装置は、冷蔵システム１８、真空ポンプ２０および回転駆動モーター２２も備える。あるいは、カセットは、電気抵抗加熱および循環流体加熱のようなより伝統的な熱伝達系のハウジングとして役立ち得る。保存溶液のより均一な加工を提供するために、容器を保持するカセットも回転するよう作製され得る。
【００５３】
第二容器の概念は、前記ですでに述べたものを超える多数の利点を提供する。特に、無菌加工に関しては、充填管、チャンバーおよび容器は、一般的に許容可能な慣用手段（例えば、それそれの品目の構成物質によって、放射線、蒸気過酸化水素（ＶＨＰ）、蒸気等）により予備滅菌される。前記の密封用具と結びつけられるこのアプローチは、バリア型の加工を提供し、したがって気泡体生成による保存の途中で、オペレーターおよび物質を互いに効率的に隔離する。これは、生物学的および毒性物質を取り扱うのに非常に望ましい。隔離またはバリア技法の使用は、製薬産業においてこのような物質を加工するための標準設計アプローチと成りつつある。
【００５４】
概念の証拠を示す多数の実行可能性実験が行われている。実施例および変形可能容器を用いて得られた結果を以下に示す。
【００５５】
（１）第一の試験では、装置は、標準VirtisＳＬ６００ユニトップコンデンサーセクションに接続され、２つの実験室型ホットプレート（Corning）を介して加熱される内径４．５インチのガラス管から成った。ガラス管の反対端は閉じられた。脱イオン水中のスクロース５０％ｗ／ｗの溶液２００ｍｌを、清涼飲料用に一般に用いられる２Ｌ  ＰＥＴ飲料ボトルに導入した。これは、半硬質容器として適格である。ボトルを管中に配置し、スクロース溶液を気泡体生成により保存した。機械的に安定な気泡体が生成された後、気泡体を含有するボトルを、０．３Ｔｏｒｒで２５℃において一夜保持した。翌朝、空気を用いて減圧を解いた。全加工時間は２３時間であった。管分解直後に、ボトルを管から取り出して、約１分間、ドライ窒素でパージした。ボトルに、添付のプラスチックねじ蓋で蓋をした。気泡体はボトルを完全に充填しているように見えた。ボトルの外側に手でわずかな圧力を適用すると、気泡体が非常に脆くなっていることが示された。次に、ボトルを、軽度〜中等度の力で、実験室のカウンターに約８〜１０回打ち付けた。内側の気泡体はすべて、別々の粒子にばらばらに壊れ、砂の視覚的および流動的特徴を有した。少量の物質がボトルの内側に付着して残存した。粗粒状物質のガラス転移温度は１８℃であった。
【００５６】
（２）第二の試験では、第一の試験に用いたガラス管をジャケット付きガラス管に取り換えた。ジャケットに水を充填し、再循環加熱浴に接続した。用いたボトルは予め、スーパーマーケットで市販されている１ガロン容量のポリエチレンプラスチック貯蔵袋に取り換えた。これは、柔軟性容器として適格である。袋を開けたままにしておくために、袋をプラスチックホルダーにテープで貼った。袋に脱イオン水中の５０％ｗ／ｗスクロース１５０ｍｌを充填した。一次気泡体乾燥は、本質的に９０分後に完了し、熱源をホットプレートに切り換えた。その時点での条件は、３１℃で０．１５Ｔｏｒｒであった。次に、気泡体を一夜保持した。翌朝、減圧をドライ窒素で解除して、袋を取り出し、窒素で約１分間パージして、次にジップ−ロック（商標）１ガロンプラスチック貯蔵袋の内側に入れた。全加工時間は、７１時間であった。手で直接袋を静かに潰すことにより、前にボトル中で生成されたものと非常によく似た粒子に気泡体を分離させた。その結果生じた粒子のガラス転移温度は、１８．３３℃であった。
【００５７】
（３）第三の試験では、前記のスタイルの袋を、VWRにより供給されるようなペトリ皿（１００ｘ１５ｍｍサイズの皿）を包装するために用いられる袋から得られたより長く、より大きい袋と取り換えた。再び脱イオン水中の５０％ｗ／ｗスクロース溶液３００ｍｌを大型袋中に充填した。約３時間の一次発泡乾燥後、循環浴上での加熱を切って、２つのホットプレートにより熱を供給した。翌朝、ホットプレートを切り（Ｔ＝３０℃、Ｐ＝０．８Ｔｏｒｒ）、循環浴を５０℃に設定した。約７時間後、その系の温度および圧力は、それぞれ５５℃および０．２Ｔｏｒｒであった。全加工時間は２３．５時間であった。系の減圧をドライ窒素で解除し、袋を取り出して、１ガロンジップ−ロック（商標）袋に移し、静かに破砕した。前と同様に、気泡体はすべて、前に観察されたものとよく似た粒子に分離した。ガラス転移温度は３３．３℃であった。
【００５８】
（４）細菌株ラクトバチルス  アシドフィルスを、その種に特異的な標準プロトコールを用いて、２リットル容量発酵器中で増殖させた。発酵器細胞集団は８．１±０．７３ｘ１０8と計数された。遠心分離により細胞を収穫し、７．８３±０．７５ｘ１０8の集団を有する細胞濃縮物２００ｍｌを生じた。細胞濃縮物を、５０％緩衝液（ｗ／ｗ）中に溶解した４０％スクロース、１０％メチルアルファ−Ｄグルコピラノシドから成る８００ｍｌの保存溶液中で稀釈した。その結果生じた混合物を、３００ｍｌでポリエチレンペトリ皿袋中に充填した。残りは、別の使用のために保存した。空のポリエチレン袋を、アルミニウムフレームで取り囲まれた４．５ｘ１９インチの円筒形ガラスチャンバー内に位置する保持用具に取り付けた。このガラスチャンバーは、気泡体生成による保存のための大量乾燥チャンバーとして役立った。試験溶液を、シリコーン管により、ポリエチレン袋中に充填した。ガラスチャンバーは、全管長にわたって外部ガラス水ジャケットを備えていた。ジャケットは、再循環温度制御水浴と接続された。水ジャケットは、本方法のための熱源として役立った。ガラスチャンバーは、排出端で凍結乾燥機のコンデンサーと接続された。気泡体生成による保存の終結時に、系の減圧はドライ窒素を用いて解除された。袋を取り出し、検査した。乾燥した機械的に安定な脆性気泡体が、明らかに生成されていた。本物質を、軽く手で押すことにより静かに破砕して、砂との一致性を有する粒子にした。袋を切り開き、内容物を透明容器に移した。容器を３重にサンプリングした。次に容器をドライ窒素でパージして、密封した。試料を培養し、細胞集団を、同一方法により１０ｍｌバイアル中に発泡乾燥された１ｍｌの乾燥ラクトバチルスアシドフィルスの対照培養と比較した。被験細菌株の生存を明瞭に実証する結果を以下にまとめる。
【００５９】
【表２】
0004563588.tif 000003
【００６０】
気体透過性袋−無菌的方法での大量凍結乾燥のためにW.L. Goreにより開発された製品（現在、リオガード（商標）と呼ばれている）も、気泡体生成による保存の方法における挿入、変形可能容器としてのその効用に関して検査した。リオガード（商標）凍結乾燥袋は、水蒸気に対して透過性でないプラスチックである一側面とゴア−テックス（商標）膜から成るもう一つの側面で構成される溶封可能柔軟性袋であった。この膜は、公称孔サイズ０．２μ、疎水性で、液体の水に対して透過性でないが、水蒸気に対しては透過性である発泡ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）である。
【００６１】
リオガード（商標）袋は、液体状態の物質が膜を透過し、漏出するのを防止しながら、水蒸気を通し得るため、概して滅菌性を要する製薬製品を加工するための理想的方法を提供する。基本的方法は、動物健康製品、プロバイオテックス、食品等に適用され得る。手短に言えば、密閉容器加工が、滅菌性、取扱いの容易性、オペレーターからの病原体（例えば、細菌およびウイルス）の隔離、外来粒子汚染制御の領域で利点を有し得るあらゆる物質は、気泡体生成による保存へのリオガード（商標）袋の適用から利益を得る。さらに、袋の柔軟性は、袋と乾燥機棚との接触を増強する。棚は慣用的凍結乾燥機における熱伝達表面であるため、熱伝達は、リオガード（商標）袋を用いて気泡体生成による保存を行う場合に、最適であろう。これは、より迅速な乾燥過程をもたらす。
【００６２】
気泡体生成による保存のためにリオガード（商標）ゴア−テックス袋を用いることの可能性を調べるために、一連の実験を開始した。脱イオン水を用いた５０％ｗ／ｗ溶液は、試験媒質として役立った。２００ｍｌの容量を１０ｘ１４インチリオガード（商標）袋中に充填した。次に、市販の溶封用具を用いて、袋を溶封した。次に、袋を、ＵＰＴが気泡体生成による保存のために改変したビルティス  ゲネシス（商標）凍結乾燥機の３つの棚の１つに載せた。乾燥工程を行った。沸騰そして結局は気泡体生成が、乾燥が進行すると、袋の半透明下方不透性膜を通して観察された。４０℃で一夜乾燥後、凍結乾燥機から袋を取り出して、検査した。機械的に安定な気泡体が生成されているように見えた。この乾燥気泡体は脆性で、袋を開かなくても袋中で小粒子に容易に破砕された。これは、袋が気泡体物質の粗粉砕のための容器としても機能し得ることを示す。約３０分以内に袋を開け、乾燥粒子の再構成特性を観察するために、約１Ｌの水を加えた。ほとんどの粒子が、１０秒未満で容易に溶解した。圧力および温度勾配の変更、ならびに１０ｘ１４インチ袋中の２００〜４００ｍｌの範囲の充填を含めたその後の試験プロトコールは、約３００ｍｌが最適充填レベルであることを示唆した。典型的実行の完了時に、袋の外観は、気泡体の完全生成を示し、袋中の物質はすべて、容易に溶解する。
【００６３】
工業的酵素、食品および薬剤の大量凍結乾燥は、凍結乾燥機の温度制御棚に置かれるステンレススチールトレイを利用することにより一般に実行される。トレイは、典型的には当該粒状物質のための適切な環境で充填され、凍結乾燥機に移されて、そこで、それらは乾燥機に投入されて、凍結乾燥過程が実行される。トレイの寸法および容量は、凍結乾燥機の棚面積、その物質のための許容可能な充填高、および所望の物質取扱い特性により大きくは決定される。気泡体生成による保存に関しては、基本操作は同一である。物質は、前記の実施例にしたがって調製され、標準凍結乾燥トレイに注入されて、必要な条件を満たすようにされた機械中での気泡体生成により保存される。トレイは、生成物棚からトレイ内に収容される生成物への熱の移動を可能にする任意の物質で構成され得る。適切な物質の例は、ステンレススチール、被覆スチール、非鉄合金、例えばアルミニウムおよびチタン、ならびにプラスチック、例えばポリプロピレン、ポリエチレン等である。プラスチックは熱を低効率的に伝達するが、しかしその他の相殺的利点を有し得る、と認識される。
【００６４】
気泡体生成による保存のある面では、機械的に安定な乾燥気泡体の生成においてそれを適切に行うためには、本明細書中に記載した多数の刷新が典型的凍結乾燥トレイには必要である。好ましい実施態様では、トレイは、トレイの底面および側面により画定される内部空間中に位置する格子構造を備える。この格子構造は、全トレイが小単位に区切られるように、本質的にはトレイの領域を等面積または不等面積の一連のセルに細分する。格子の機能は、気泡体生成による保存における気泡体の膨張に利用可能な面積を低減し、それにより各格子の領域の内側に気泡を含有する。これは、気泡体構造が成長し得る高さを効率的に低減し、したがって成長中の気泡体が乾燥機棚あるいは気泡体真上のその他の乾燥機表面と接触しおよび／またはトレイからあふれ出る機会を最小限にする。格子構造は、トレイの内側に適合する任意の幾何学的形状をとり得る。運搬容器中のバイアルを分離するのに用いられるような正方形パターンは、一例であり得る。発泡工程が進行した場合に気泡体泡と隣接泡との相互連結を排除するために、格子壁高はトレイ側面の高さの少なくとも半分であるべきである。
【００６５】
別の実施態様では、トレイは、トレイ底面により画定される全面積全体に置かれるカバーを有する。このカバーは、気泡体生成による保存中の水蒸気を逃すような方法で置かれる。カバー縁とトレイ側面上部の間の隙間は、1/4インチまたはそれ以下であるべきである。より大きい寸法の隙間は確実に作用するが、しかし生産に利用可能な容積を最大にするために、棚と棚の間の間隙を最小限にすることは特に必要なことである。トレイカバーは、このような支持を実行するために利用可能な任意の手段により支持され、トレイ側面とカバー底縁との間に必要な隙間を提供する。前記の材料のいずれかまたは任意の同様の方法から作られる補助ポスト、一体型カバータブまたはスペーサーは、必要な隙間を達成し得る。これらのトレイ乾燥法は、動物健康製品、プロバイオティックス、食品、工業的酵素等に適用され得る。
【００６６】
トレイ中での大量乾燥−気泡体生成による保存のために修正された凍結乾燥機を用いたトレイ中での大量乾燥の実行可能性を調べるために、一連の実験を実行した。一次実験では、脱イオン水中の５０％ｗ／ｗスクロースから成る４００ｍｌの試験溶液を９．５ｘ１９．５ｘ１．２５インチの寸法のステンレススチールトレイ中に充填した。トレイを、３棚乾燥機の中間棚に載せた。次に物質を本発明にしたがって乾燥させた。この試験は、トレイは大量発泡容器として働くが、しかし気泡体を収容することと、沸騰工程中の隣接する表面上の液体のはねの両方に問題があることを示した。これらの問題はともに、気泡体生成による保存のためのトレイの使用を排除するに十分問題である、ということが最初に考えられた。しかしながら、細かな観察は、気泡体泡はトレイの全面積を横切って架橋するように見える、ということを示した。その結果、この利用可能面積の低減は、気泡体泡が非制御的に成長するのを防止する、と理論づけられた。
【００６７】
輸送カートン中の２０ｍｌバイアルを分離するために用いられてきた1.4375ｘ1.4375インチ格子中のプラスチック被覆厚紙物質から成る挿入物を、前記の試験に用いられたステンレススチールトレイの内側に適合するよう切断した。格子挿入物を用いて、一連の実験を実行した。これらの試験は、気泡体がより制御可能的に生成され、トレイ外側のはねは、格子が用いられる場合にはかなり低減することを示した。しかしながら、被験物質は、トレイに付着し、過程完了後の除去を困難にする顕著な傾向を示した。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のようなノンストック(non-stock)コーティングでステンレススチール表面をコーティングすると、問題解決策が提供される。
【００６８】
この考えを試験するために、プラスチックトレイの使用を調査することが決定された。９．５ｘ１９．５ｘ２．５インチトレイを、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）から作った。６セルｘ１２セル格子を有する着脱式ＨＤＰＥおよびＨＤＰＥカバーも作成した。この別の実験シリーズでは、トレイからの回収は明らかに改良された。その結果生じた気泡体は、再構成される場合、容易に且つ迅速に水和された。カバーの使用は、はねの制御をもたらした。さらに、セル−セル気泡体均一性も、トレイ内で改良された。格子を有するトレイ内での大量乾燥は、トレイ上の個々の格子セルからの物質の除去を必要とし得る。これを容易にする一手段は、手動で、半自動的に、または自動的にトレイを保持し、トレイ内部から内容物を掻き取るための用具を作成することである。これは、トレイとトレイ挿入物を別々に把持し、それらを引き離して、次に露呈されたトレイ内部全体に密着隙間羽根型掻き取り器を引くことにより成し遂げられる。挿入物は、格子セル寸法に密着隙間で寸法合わせした機械的指の適用によりきれいに掻き取られ得る。これらの指は、格子セルを力で押し進み、物質をセルから表面に押し出し、これはさらに収集容器中にきれいに掻き取られ得る。
【００６９】
加工チャンバー−初期濃度、一次発泡乾燥、安定性乾燥／ガラス化とその後の微粉砕を包含する本明細書中に開示した加工操作は、好ましくは、バリア技法を用いて、密閉装置で実行される。その最も簡単な実施態様では、本発明の装置は、チャンバー温度を調節するための加熱器および冷却器およびサーモスタット、チャンバー圧を調節するための真空ポンプおよび圧力解放弁、ならびに機械的安定多孔質気泡体を破砕するための手段を有するチャンバーの新規の組合せであり得る。本装置は、任意に、当業界で周知のように、直接またはベルト駆動メカニズムを有するモーターのような、加工中にチャンバーを回転するための手段を装備し得る。図２を参照すると、本装置は、好ましくは、チャンバー１０内の温度２６、圧力２４および微粉砕２８を監視するための検出手段を含む。温度を上げる１４または下げる１６および圧力を調節する１２ための手段ならびに微粉砕１８パラメーターを制御するための手段は、オペレーターが手動で動かすか、あるいは好ましくは、温度２６、圧力２４および微粉砕２８データ（例えば、ｒｐｍまたは周期／分等）を監視し、情報を統合し、温度、圧力および微粉砕を調節するための種々の手段に応答的作用をするのに適合したプログラム可能コンピューター３０により動かされ得る。
【００７０】
加工チャンバー１０は、好ましくは、それぞれ生物学的物質の導入および粉砕物質の分取のための別々の入口２０および出口２２を有する。本発明の装置は、チャンバー温度および圧力を調節するための手段、ならびに微粉砕を調節するための手段を含む。温度を調節するための手段は、加熱器および冷蔵器／冷凍器およびサーモスタットを含み、これらは一緒になって、種々の加工操作中のチャンバー温度を−７０℃〜１００℃の範囲にし得る。任意に、加熱器は、約１００℃〜３００℃の範囲の、滅菌のためのチャンバー内温度を提供し得る。チャンバー圧を調節するための手段は、約０〜５００Ｔｏｒｒの範囲でチャンバー減圧を生じ得る、任意にコンデンサーを備える真空ポンプ、および、圧力解放弁または放出弁を含む。さらに好ましくは、真空ポンプは、約０〜２４Ｔｏｒｒ（高真空）から約０．１〜０．９気圧（低真空）の範囲でチャンバー圧を生じ得る。ミルコントローラーは、ミルの操作を制御するための外部手段を提供する。微粉砕要素（例えばブラシまたは羽根）は、チャンバー内に置かれる。さらに、本装置の好ましい特徴は、温度センサー、圧力センサーおよびミル操作のための考え得る検出器（例えば、タコメーター）を含み得る。
【００７１】
本発明の装置は、マイクロプロセッサーを必ずしも組み込んだり、またはコンピューター作動制御手段を利用する必要はないが、しかしプログラム化した命令にしたがって、温度、圧力および微粉砕データを統合し、リアルタイム信号を発生し、温度および圧力の両方の段階的または同時勾配を実行するためのプログラム可能コンピューターの使用は、乾燥のための新規の二次元の温度および減圧プロトコールの自動実行を可能にする。
【００７２】
種々の加工チャンバー物質およびサイズが、本発明の開示内に包含される。実際、本装置は、小型の分析的サイズのチャンバーを、ならびに大型の工業規模チャンバーを用いて製造され得る。指示された温度および圧力範囲で安定で、そして感受性生物学的溶液および懸濁液と適合性である限り、チャンバーの製造には任意の物質が用いられ得る。加工チャンバーの構築のための物質の例としては、ステンレススチール、ガラスおよびプレキシガラスが挙げられる。さらに、チャンバーは、慣用的手段により滅菌され得る。一実施態様では、ユニットの加熱手段は、チャンバーおよび囲い込まれた微粉砕手段を滅菌するのに十分な温度で、試料処理の間に操作され得る。さらに、一体化された設計では、好ましくはバリア技法を用いるが、この場合、密閉系中に一旦導入されれば、試料操作は必要なく、したがって最適生成物品質および安定性が保持される。
【００７３】
本発明の別の実施態様は、種々の用途のための「シリアル」を生成するために乾燥粉末の混合物を乾燥し、微粉砕しおよび製剤化する統合機能を含む。例えば、種に特異的な標準プロトコールを用いて、細菌株ラクトバチルス  アシドフィルスを２リットル容量発酵器中で増殖させる。発酵器細胞集団を、遠心分離により収穫し、細胞濃縮物を、５０％緩衝液（ｗ／ｗ）中に溶解した４０％スクロース、１０％メチルα−Ｄグルコピラノシド８００ｍｌから成る保存溶液中で稀釈する。その結果生じた混合物を、変形可能容器中で、前記と同様に発泡乾燥させる。保存工程の終結時に、系の減圧はドライ窒素を用いて解除される。変形可能容器を密封し、乾燥チャンバーから取り出し、多孔質気泡体を軽く手で押すことにより静かに破砕して、砂との一致性を有する粒子にする。
【００７４】
前記のラクトバチルスと同一の保存溶液中の５％ビタミンＣの溶液を、変形可能容器中で発泡乾燥させる。変形可能容器を密封し、多孔質気泡体を破砕する。その後、滅菌性を維持するのに適合した慣用的粉末取扱い装置を用いて、共生ラクトバチルス粉末をビタミンＣと混合し、プロバイオテックおよびビタミン成分に関連した独特の性質を有する複合シリアルを生成し得る。このような製剤は、種々の異なる生物学的および薬理学的粉末化成分を混合することにより、例えば異なるワクチンまたは異なる抗原を混合することにより、調製し得る。
【００７５】
次に、単一構成成分または製剤を代表する粉末を用いて、医薬組成物を調製し得る。例えば、物質が錠剤に圧縮され、これが迅速溶解性固体投与製剤を提供し得る。
【００７６】
説明のために本発明を詳細に記載してきたが、このような詳細は単に説明のためであって、特許請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、当業者により変更がなされ得ると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施態様による変形可能袋中での気泡体乾燥のための一体型装置の模式図である。
【図２】  本発明の一体型乾燥−微粉砕装置の自動化実施態様を示す流れ図である。
【図１】
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【図２】
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