(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した検体中のタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分に、タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分のみと反応する条件下で抗体結合物質を直接結合させてタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分を検出し、または検体中の該タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分の総量を定量する方法。
【請求項２】
該抗体が結合している該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分がタンパク質である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
検体が気体または液体である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
１）抗体結合物質、２）検体中のタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分に抗体結合物質を直接結合させるための試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗体、および４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる２つまたはそれ以上を含む、検体中のタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分を検出し、またはタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分の総量を定量するためのキット。
【請求項６】
採取した検体中のタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分に、タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分のみと反応する条件下で抗体結合物質を直接結合させてタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分を検出し、または検体中の該タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分の総量を定量するための装置。
【請求項７】
該抗体が結合している該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する工程がさらに存在する、請求項６記載の装置。
【請求項８】
タンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる１種の成分がタンパク質である請求項６または７記載の装置。
【請求項９】
検体が気体または液体である、請求項６から８までのいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗原抗体反応を利用する、生物由来の微量成分、詳細にはタンパク質、糖質、脂質、核酸等およびそれらの複合体の中から選ばれる成分の検出および／または定量方法に関し、生物、医学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、医療などの分野の研究開発や応用研究に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質を検出、定量する方法としては従来から、紫外部吸収測定法（"Handbook of Biochemistry and Molecular Biology", Vol.2, Fasmann, G.D. ed., CRC press, Ohio (1976), p383）、ビュレット法（Gornoll, A.G. et al., (1949): J.Biol.Chem.177,751）またはLowry法（Lowry, O.H. et al., (1951): J.Biol.Chem.193, 265）等が知られているが、いずれの方法も、多量の試料が必要であったり、妨害物質の存在により測定不能となったりと何らかの欠点を有しており、特に微量タンパク質を検出、定量する方法としては適していない。
【０００３】
一方、ポリアクリルアミドゲル中などの微量タンパク質を検出する方法として、クーマシー・ブリリアント・ブルー等の色素を用いる微量定量法が提案されている（Brambhal, S. et al., (1969): Anal. Biochem. 31,146）。しかし、この方法では大量のタンパク質が必要となり、タンパク質の検出限界は１００ｎｇである。他に銀染色によるタンパク質の測定方法もあるがこれは再現性に乏しく、ｎｇレベル（正確には０．２ｎｇ）のタンパク質を検出するのが限界である（Oakley, B.r., et al., (1980): Anal. Biochem. 105, 261; Merril, C.R., et al., (1981): Science 211, 1437）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
細菌、カビ、ウイルス、原虫、アレルゲン等の空気・水環境汚染物質を検出するには、それらが極微量でしか存在しないため少なくとも１０ｐｇレベルでそれらを検出できる方法が求められる（大谷武司ら、(1992): アレルギー41 (3) 411-417）。よって、これらの汚染物質は特にアレルゲンの場合、その殆どがタンパク質で構成されるが、従来のタンパク質検出方法ではそれらを高精度で検出および定量することはできない。
また、糖質、脂質、核酸等の微量検出についても充分な低レベルでの検出手段を提供することは、生物・医学分野の基礎研究から食品科学などの分野の応用研究に役立つ。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明の検出および／または定量方法を見出した。即ち、本発明は、
第１の態様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量する方法；特に、該抗体が結合している該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する工程をさらに含む本発明方法；また、生物由来目的成分がタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる、好ましくは生物由来目的成分がタンパク質である本発明方法；特に、検体が気体または液体である本発明方法：
【０００６】
第２の態様として、１）抗体結合物質、２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合させるための試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗体、および４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来目的成分を検出し、または生物由来目的成分の総量を定量するためのキット：
【０００７】
第３の態様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量するための装置；特に、該抗体が結合している該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する工程がさらに存在する本発明装置；また、生物由来目的成分がタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体の中から選ばれる、好ましくは生物由来目的成分がタンパク質である本発明装置；特に、検体が気体または液体である本発明装置、に関する。
【０００８】
好ましい態様では、本発明は、採取した検体中の生物由来タンパク質に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生物由来タンパク質−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来タンパク質を検出し、または検体中の該生物由来タンパク質の総量を定量する方法またはそのための装置、要すれば該抗体が結合している該結合物に該抗体に特異的な標識二次抗体を結合させ、標識レベルを測定する工程をさらに含む本発明方法またはそのための装置、に関する。より好ましくは、抗体結合物質が２，４−ジニトロフェノールである方法または装置である。
【０００９】
従来における抗原抗体反応を利用する測定方法は、測定しようとする個々の標的物質に対して特異的な方法であった。これに対し、本発明の方法および装置は、標的物質が特異的な単一物質ではなく、検体に含まれる単一の成分、例えばタンパク質などを総合的に、即ち非特異的に検出および／または定量することを目的とする。この従来にない目的を達成する手段として、本発明は上記の各方法および装置を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１）検体中の生物由来目的成分を検出および／または定量する方法
本発明は第１の態様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量する方法に関する。
【００１１】
本発明における「検体」には、生体由来の細胞、組織、形質転換細胞等の抽出物、および食品、気体や液体など、あらゆる材料が含まれる。これらの材料は精製品であっても、材料の化学的合成品であっても、本発明における検出および／または定量の対象とすることができる。よって、検体には食品、細胞・組織から抽出された粗抽出物、あるいは遺伝子導入された細胞からの遺伝子導入産物を含む粗抽出物が含まれる。
【００１２】
本発明における微量成分たる「生物由来目的成分」としては、細菌、カビ、ウイルス、原虫、ダニあるいは哺乳動物細胞または組織を起源とするタンパク質、糖質、脂質、核酸およびそれらの複合体が挙げられる。タンパク質には単純タンパク質あるいはメチル化、リン酸化などされた修飾タンパク質が含まれる。糖質には多糖類や糖鎖などが含まれ、核酸にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などが含まれる。複合体には、糖または脂質などがタンパク質に結合している複合タンパク質、あるいは糖脂質などが含まれる。。
【００１３】
本発明における「抗体結合物質」とは抗体結合能を有しているあらゆる物質を意味し、それ自身は免疫原性を有していても有していなくてもよい。抗体結合物質は典型的には、抗体との結合能を有しているが免疫原性を有していないハプテンなどが例示される。より具体的には、タンパク質成分を修飾する場合には、免疫学分野で通常用いられるジニトロフェノール（ＤＮＰ、2,4-ジニトロフェノール）、トリニトロフェノール（ＴＮＰ、2,4,6-トリニトロフェノール）、オキサゾロン（4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン）、ベンジルペニシリン（ＢＰＯ-）K等が抗体結合物質として好適に使用される。
生物由来目的成分がタンパク質である場合、生化学分野で用いられるタンパク質の染色剤、例えばクーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）、また絹、羊毛等の動物素材の染色剤（染料・顔料）等も抗体結合物質として使用できる。
生物由来目的成分が糖質の場合、ジフェニールアミン−アニリン、ニンヒドリンなどの生化学分野で用いられている糖質の発色剤、および綿、麻などの多糖類繊維の染色剤が例示される。
生物由来目的成分が核酸の場合、エチジウムブロマイド、サイバーゴールドなどの生化学分野で用いられている核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の蛍光発色剤、および細胞組織染色で用いられている色素類が例示される。
【００１４】
「生物由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させる」における条件とは、生物由来目的成分がタンパク質であり、抗体結合物質がＤＮＰの場合を例に説明すると以下のとおりである。
タンパク質と抗体結合物質との反応水素イオン濃度、反応温度、反応時間、反応気圧等の結合条件は特に限定されないが、反応温度は大気圧下１０〜１００℃が良いが室温〜３７℃が使用しやすい。反応時間は１０分から２４時間が良いが１時間〜１６時間が実行しやすい。反応水素イオン濃度（ｐＨ）はアルカリ条件下が好ましい。
ＤＮＰをタンパク質に結合させるため２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いた場合、反応時間は３７℃、１時間とすることができ、あるいは２５℃にて２４時間の反応条件も使用できる。
なお、単純タンパク質は複合タンパク質や修飾タンパク質よりもその検出感度は高い。
【００１５】
上記のようにして生物由来目的成分と抗体結合物質との結合物を調製した後、それに抗体を結合させる。
本発明における「抗体」としては市販品を使用することができる。例えばジニトロフェノールについてはウサギ抗−ＤＮＰ（バイオジェネシス社）、トリニトロフェノールについてはラット抗−ＴＮＰ（エル・エス・エル社）がある。しかし、抗体は、例えばMakela, O. and Seppala (1986) In Weir, D.M. (ed), Handbook of Experimental Immunology, Col. 1. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 4th edition, p. 3.1.等に記載されている方法により抗体結合物質−キャリアー複合体を調製し、次いでそれを用いる通常の抗体作製手法に従って、容易に作製することができる。
【００１６】
上記のようにして作製された抗体が結合した結合物を検出および／または定量することにより、生物由来目的成分を検出および／または定量する。
かかる結合物の検出および／または定量は、その結合物に結合している上記抗体を検出および／または定量するための当業者に既知の種々の方法によって行うことができる。
例えば、抗体の検出および／または定量はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素―結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、ウェスターン・ブロッティング（ＷＢ）等によって行うことができる。
好ましくは、抗体に特異的な二次抗体を用いる方法である。このような二次抗体としては市販品を使用することができる。通常この二次抗体は標識することにより検出および／または定量に供する。標識物としてはＲＩ標識、蛍光標識、酵素標識等を用いることができる。
以下の実施例では、ＤＮＰ化タンパク質を電気泳動後、酵素標識二次抗体によるウェスターン・ブロッティングを用いて常法に従い検出方法を行っており、本方法では全工程を６時間程度で行うことができた。
【００１７】
検体が気体あるいは液体の場合、本発明方法では、気体、液体をフィルター等で濾過した後、フィルターに捕捉されている成分を検定する。例えば、空気中の微量成分である生物由来目的成分を検定するには、検体である空気をフィルターに通し、目的成分が捕捉されたフィルターを、抗体結合物質を含む反応液に浸し、上記所定の反応条件により抗体結合物質を目的成分に結合させて結合物を調製する。次いで、未反応の抗体結合物質を除去し、抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させ、検出／定量を行う。検出／定量は上記のようにＲＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＭＡ、ＷＢ等によって行うことができる。
【００１８】
本発明検出方法はｐｇ（ピコグラム）の生物由来目的成分を、殊にタンパク質を検出するのに有用な方法であり、測定範囲として１００ｎｇから１ｐｇ、特に１ｎｇから１０ｐｇの生物由来目的成分を検出するのに好適である。
また、本発明方法では、検体中に存在する生物由来目的成分のすべてを捕捉することが可能であるので、検体中に存在する生物由来目的成分の総量を定量するための方法として有用である。
【００１９】
２）検体中の生物由来の目的成分を検出および／または定量するためのキット
本発明は第２の態様として、１）抗体結合物質、２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合させるための試薬、３）その抗体結合物質に特異的な抗体、および４）該抗体に特異的な標識二次抗体の中から選ばれる２つまたはそれ以上を含む、検体中の生物由来目的成分を検出し、または生物由来目的成分の総量を定量するためのキットに関する。
好ましい組み合わせは、１）抗体結合物質、２）検体中の生物由来目的成分に抗体結合物質を結合させるための試薬、および３）その抗体結合物質に特異的な抗体を含むキット、あるいは１）抗体結合物質、および３）その抗体結合物質に特異的な抗体を含むキットである。
【００２０】
３）検体中の生物由来の目的成分を検出および／または定量するための装置
本発明は第３の態様として、採取した検体中の生物由来目的成分に他の成分とは反応しない条件下に抗体結合物質を結合させて生物由来目的成分−抗体結合物質の結合物とし、その抗体結合物質に特異的な抗体を該結合物に結合させることを特徴とする、検体中の該生物由来目的成分を検出し、または検体中の該生物由来目的成分の総量を定量するための装置に関する。本発明装置は、本発明検出方法に基づくものであり、それはエアコンなどの一部材を構成し、空気中のアレルギー、喘息等の原因物質を容易に検出できる手段を提供する。
【００２１】
【実施例】
実施例１
ＤＮＰ化タンパク質マーカーのウェスターン・ブロッティングによる検出
タンパク質分子量スタンダード・高分子用（GIBCO BRL  Cat#1600-018）を１００ｎｇ／ｍｌから２倍希釈を５段階行い、サンプル溶液を作製した。それぞれのサンプル溶液における最終タンパク質量は１バンド当たり２５０ｐｇ、１２５ｐｇ、６２．５ｐｇ、３１．３ｐｇおよび１５．７ｐｇとなる。
２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（東京化成社製）に１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加えたアルカリ溶液を作製し、ＤＮＢＳ溶液とした。
【００２２】
サンプル溶液１０μｌとＤＮＢＳ溶液１０μｌをマイクロチューブに入れ、ピペットチップの中で良く混和した。次いで３７℃で１時間静置した。
ＳＤＳサンプル緩衝液（62.5mM トリス-HCL pH6.8、2% SDS、25% グリセロール、0.01% ブロムフェノールブルーおよび2% 2-メルカプトエタノール）２０μｌを加え、５分間加熱変性する。それぞれのサンプルを泳動緩衝液（25mM トリス-HCL pH8.3、192mM グリシンおよび0.1% SDS）中、５−２０％のポリアクリルアミドグラジエントゲル（Bio Rad社製レディーゲル）で電気泳動した。泳動後のゲルを、転写緩衝液（25mM トリス-HCL pH8.3、192mM グリシンおよび15% メタノール）で５分間洗浄した。洗浄後のゲルをセミドライ型転写装置でＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）に転写させた。転写後のメンブレンを、洗浄緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ：20mM トリス-HCL pH7.6、137mM NaClおよび0.1% Tween-20）で３分間洗浄した。メンブレンをブロッキング溶液（20mM トリス-HCL pH7.6、137mM NaCl、0.1% Tween-20および5% スキムミルク）に室温で１時間浸した。
【００２３】
１次抗体（ウサギ抗−DNP（バイオジェネシス社製)：ブロッキング溶液にて２０００倍希釈）を室温１時間反応させ、洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄した。次いで、２次抗体（ヤギ抗−ウサギIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＣＮ−カペル社製)：ブロッキング溶液にて５０００倍希釈）を室温で３０分反応させ、洗浄緩衝液で３分間×４回洗浄した。化学発光基質（Lumi-Light PLUS: Roche Diagnostics社製）に５分間浸し、ＥＣＬカメラ（Amersham社製）にて、ポラロイドフィルム（＃６６７）に露光時間１分間にて露光した。
【００２４】
得られた結果を図１に示す。図１中、右から順にレインボーマーカー（非ＤＮＰ化)(バイオラッド社製）、２５０ｐｇタンパク質、１２５ｐｇタンパク質、６２．５ｐｇタンパク質、３１．３ｐｇタンパク質、１５．７ｐｇのバンドをそれぞれ示している。高分子量タンパク質マーカーの分子量は大きい方から２００ＫＤａ、９７．４ＫＤａ、６８ＫＤａ、４３ＫＤａ、２９ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．３ＫＤａである。レインボーマーカーのレーンで強く光っているバンドは４５．２Ｋｄの分子量を持つタンパク質マーカーである。
図１は、本発明方法が、タンパク質を数１０ｐｇまで検出可能なことを示している。
【００２５】
【発明の効果】
本発明方法は、微量成分の検出方法として生物・医学分野の基礎研究から食品科学、環境科学、医療などの分野の研究開発や応用研究において非常に有効である。また、本発明検出方法に基づく、検体中の微量成分、特にタンパク質を検出しまたは該タンパク質の総量を定量するためのシステムを備えた装置を作製すれば、それはエアコンなどの一部材を構成し、空気中のアレルギー、喘息等の原因物質になる汚染原を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＰ化タンパク質マーカーのウェスターン・ブロッティングによる検出結果を示す電気泳動の図面に代わる写真である。
【図１】
0004581266.tif 000002