(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出されるパクリタキセルを含むタキサン類の天然資源からパクリタキセルを抽出および精製する方法であって、以下のステップ：
ａ）  有機溶媒によって、タキサン類の前記天然資源からパクリタキセルを含む原材料を抽出するステップ；
ｂ）  前記ステップ（ａ）で得られたパクリタキセルを含む原材料に塩基性溶媒又は酸性溶媒を加えて、パクリタキセルを含むバイオマスを沈殿させた後に、この沈殿物を分離して乾燥し、このパクリタキセルを含むバイオマスを得るステップ；
ｃ）  前記ステップ（ｂ）で得られたパクリタキセルを含むバイオマスをアセトンに溶解した後、この溶液に１以上の非極性溶媒を加えることで溶液中の樹脂及び色素を除去してパクリタキセル濃縮油相を得るステップ；
ｄ）  前記ステップ（ｃ）で得られたパクリタキセル濃縮油相に、ステップ（ｂ）における沈殿処理が塩基性溶媒で行われる場合には酸性溶媒を加え、又はステップ（ｂ）における沈殿処理が酸性溶媒で行われる場合には塩基性溶媒を加え、パクリタキセルを含むバイオマスを沈殿させた後に、この沈殿物を分離して乾燥し、このパクリタキセルを含むバイオマスを得るステップ；
ｅ）  前記ステップ（ｄ）で得られたパクリタキセルを含むバイオマスを揮発性溶媒に溶解し、１回以上クロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィーによって得られた精製溶液を１回以上結晶化することで、パクリタキセル結晶の混合物を得るステップ；
をステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の順に行う方法。
【請求項２】
パクリタキセルを含むタキサン類の天然資源がタイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、カナダイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒマラヤイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、ウンナンイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、メディアイチイ「デンシフォルミス」（Ｔａｘｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、メディアイチイ「ヒックシー」（Ｔａｘｕｓ  ｈｉｃｋｓｉｉ）、メディアイチイ「ワーディー」（Ｔａｘｕｓ  ｗａｒｄｉｉ）、イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、イチイ「カピタータ」（Ｔａｘｕｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）又はメディアイチイ「ブラウニー」（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｏｗｎｉｉ）よりなる群から選択される針葉樹よりなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、針葉樹のすべての部分を処理することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、針葉樹の樹皮を処理することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において、針葉樹の枝と針葉を同時に処理することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において、有機溶媒がアルコール、ハロゲン化炭化水素、アルコールおよびハロゲン化炭化水素の混合物よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において、有機溶媒がメタノールおよびジクロロメタンの混合物、あるいはメタノールおよびトリクロロメタンの混合物であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アルコールおよびハロゲン化炭化水素が９：１から１：９の範囲の体積比で存在することを特徴とする、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルコールとハロゲン化炭化水素の体積比が１：１であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）で用いる塩基性溶媒が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、水酸化ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンよりなる群から選択される塩基性塩の溶液よりなる塩基性溶媒であることを特徴とする、請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
塩基性塩が水酸化ナトリウムであり；
水酸化ナトリウムが溶液１リットル当たり１０ｍＭ〜８０ｍＭからなる濃度で使用され；
溶液のｐＨが８．５〜１１である；
ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶液のｐＨが９〜１０であることを特徴とする、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）で用いる酸性溶媒が、鉱酸又は有機酸の溶液よりなる酸性溶媒であることを特徴とする、請求項１乃至請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
酸が塩酸、酢酸およびクエン酸よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
溶液の酸濃度が、溶液１リットル当たり１０ｍＭ〜５０ｍＭであることを特徴とする、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酸濃度が、溶液１リットル当たり２０ｍＭ〜３０ｍＭであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
溶液のｐＨが２〜４であることを特徴とする、請求項１３乃至請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）において、バイオマスの沈殿が塩基性溶媒又は酸性溶媒によって生成され、ステップ（ａ）で抽出された原材料に対する前記塩基性溶媒又は酸性溶媒の体積比が１〜１０であることを特徴とする、請求項１乃至請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）において、バイオマスを分離して乾燥する前に、沈殿に用いる溶液１リットル当たり２５〜２００ｇの濃度で塩化ナトリウムを加えることによって塩析させることを特徴とする、請求項１乃至請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において、沈殿に用いる溶液１リットル当たり５０〜１００ｇの濃度で塩化ナトリウムを加えることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、沈殿したバイオマスを濾過又は遠心分離によって分離し、次に通気又は凍結乾燥によって乾燥させることを特徴とする、請求項１乃至請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）で用いる１以上の非極性溶媒がヘキサン又はヘプタンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）で得られた乾燥バイオマスを、ステップ（ａ）で抽出した原材料の２体積に等しい体積のアセトンに溶解することを特徴とする、請求項１乃至請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）で得られた乾燥バイオマスを、アセトン、次に水を加えて溶解することを特徴とする、請求項１乃至請求項２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）で得られたバイオマスに加えるアセトンと水の体積比を、１００：２〜１０とすることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｄ）において：
ステップ（ｃ）で得られたパクリタキセル濃縮相を乾燥するまで蒸発させ、この乾燥したパクリタキセル濃縮相をメタノールに溶解してメタノール溶液を得て、；
ステップ（ｂ）で述べた最初の沈殿が酸性溶媒で行われた場合には、前記メタノール溶液に塩基性溶媒を加えてバイオマスを沈殿させ、
ステップ（ｂ）で述べた最初の沈殿が塩基性溶媒で行われた場合には、前記メタノール溶液に酸性溶媒を加えてバイオマスを沈殿させ；
この沈殿物を分離して乾燥することで、パクリタキセルを含むバイオマスを得ることを特徴とする、請求項１乃至請求項２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｄ）で得られたバイオマスを分離して乾燥する前に、沈殿に用いる溶液１リットル当たり３０〜２００ｇの濃度で塩化ナトリウムを加えることによってさらに塩析させることを特徴とする、請求項１乃至請求項２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
沈殿に用いる溶液１リットル当たり５０〜１００ｇの濃度で塩化ナトリウムを加えることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｅ）が以下のサブステップ：
ｅ１）  ステップ（ｄ）で分離した沈殿物を揮発性溶媒に溶解することと、そのように得られた溶液とシリカゲルとの混合物を調製することと、シリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムで前記混合物を処理することと、パクリタキセル濃縮画分を回収することを含む、第１のクロマトグラフィー精製；
ｅ２）  前のステップで回収されたパクリタキセル濃縮画分を残留物が得られるまで、蒸発させて乾燥することと、前記残留物を揮発性溶媒に溶解させることによって混合物を調製することより成り、他のパクリタキセル濃縮画分を得るために、前記混合物が前のサブステップと同じ条件下でクロマトグラフィーによって再精製される、第２のクロマトグラフィー精製；
ｅ３）  前のサブステップで得られた他のパクリタキセル濃縮画分を残留物が得られるまで、蒸発させて乾燥することと、前記残留物をアセトンで溶解した混合物を調製することと、混合物に含まれるパクリタキセルを非極性溶媒によって結晶化することを含む、第１の結晶化；
ｅ４）  アセトンに前のサブステップで得られたパクリタキセル結晶を溶解することと、前のサブステップと同じ条件下でパクリタキセルを再結晶化することを含む、第２の結晶化；
ｅ５）  溶液を得るために、前のサブステップで再結晶化することによって得られた結晶を揮発性溶媒に溶解することと、前記溶液とシリカゲルの混合物を調製することと、溶出溶媒とともにさらにパクリタキセル濃縮画分を得るために、シリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムで前記混合物を処理することを含む、第３のクロマトグラフィー精製；
ｅ６）  前のサブステップで得られたさらなるパクリタキセル濃縮画分を残留物が得られるまで、蒸発させて乾燥することと、別の混合物を得るために、残留物をアルコール、アセトン、又はアルコール−アセトン混合物に溶解させることと、別の混合物に含まれるパクリタキセルを水によって結晶化させることを含む、第３の結晶化；
をステップ（ｅ１）、（ｅ２）、（ｅ３）、（ｅ４）、（ｅ５）、（ｅ６）の順に行うことを特徴とする、請求項１乃至請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｅ１）において：
ステップ（ｄ）で得られたパクリタキセルを含むバイオマスを揮発性溶媒に溶解し；
得られた溶液をシリカゲルと混合し、通気下で乾燥させてパクリタキセルを含むゲルを得て；
このゲルを、シリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムに装填し；
３０〜４０％のアセトンおよび６０〜７０％のヘキサンからなる混合溶出液で精製してパクリタキセルを含む画分を得る；
ことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
混合溶出液が４０％のアセトンと６０％のヘキサンからなることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｅ２）において：
ステップ（ｅ１）でクロマトグラフィーによって得られたパクリタキセルを含む濃縮画分をまとめ、乾燥するまで蒸発させて揮発性溶媒に溶解し；
得られた溶液をシリカゲルと混合し、通気下で乾燥させてパクリタキセルを含むゲルを得て；
このゲルを、シリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムに装填し；
パクリタキセルを含むバイオマスを次に、３０〜４０％のアセトンおよび６０〜７０％のヘキサンからなる混合有機溶媒で再精製してパクリタキセルを含む画分を得る；
ことを特徴とする、請求項２９乃至請求項３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
混合有機溶媒が４０％のアセトンと６０％のヘキサンからなることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｅ３）において：
ステップ（ｅ２）でクロマトグラフィーによって得られたパクリタキセルを含む画分をまとめ、乾燥するまで蒸発させてアセトンに溶解してアセトン溶液を得、アセトンの量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によるパクリタキセルに対応するピークに対して前記溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．となるように調製し；
前記アセトン溶液に、３〜４体積のヘキサンを加えて結晶化させる；
ことを特徴とする、請求項２９乃至請求項３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｅ４）において：
ステップ（ｅ３）で得られた結晶は、濾過により分離されてアセトンに溶解してアセトン溶液を得、アセトンの量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によるパクリタキセルに対応するピークに対し、前記溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．となるように調製し；
前記アセトン溶液に、３〜４体積のヘキサンを加えて結晶化させる；
ことを特徴とする、請求項２９乃至請求項３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｅ５）において：
ステップ（ｅ４）で得られた結晶を濾過して塩化メチレンに溶解し；
そのように得られた溶液を次にシリカゲルと混合し、通気下で乾燥させ；
パクリタキセルで覆われたシリカゲルを、シリカゲルを含むクロマトグラフィーカラムに装填し；
有機溶媒ベースの混合溶出液を用いて、３度目の精製を行う；
ことを特徴とする、請求項２９乃至請求項３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
有機溶媒ベースの混合溶出液が９５〜９８％の塩化メチレンと２〜５％のイソプロパノールからなることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｅ６）において：
ステップ（ｅ５）でクロマトグラフィーによって得られたパクリタキセルを含む濃縮画分は、純度に従ってまとめられ、乾燥するまで蒸発させてメタノールに溶解してメタノール溶液を得、メタノールの量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によるパクリタキセルに対応するピークに対して、前記溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．となるように調製し；
前記メタノール溶液に、２〜１０体積の水を加えて３度目の再結晶を行う；
ことを特徴とする、請求項２９乃至請求項３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
メタノール溶液に、４〜７体積の水を加えることによって、パクリタキセルの３度目の再結晶を行うことを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｅ１）、（ｅ２）および（ｅ５）で使用された揮発性溶媒が、アセトン、Ｃ１−Ｃ３低級アルコール、酢酸エチル、塩化メチレンおよびこれらの溶媒の混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２９乃至請求項３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｅ６）において、水中でのパクリタキセルの結晶化の後、パクリタキセル結晶の混合物が濾過によって得られ、次に乾燥されることを特徴とする、請求項２９乃至請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
請求項１記載のステップ（ａ）〜（ｅ）で使用される水が、脱イオン化および／又は蒸留によって得られた精製水であることを特徴とする、請求項１乃至請求項４１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然資源からパクリタキセルを抽出および精製するための容易で迅速なプロセス（以下、「方法」という。）に関する。当業界で既知の従来方法と比較して、本方法は、限定数のステップよりなり、精製時の損失量が減少しているため、特に経済的である。
【０００２】
【従来の技術】
タキソール（登録商標）又はＰａｃｉｔａｘｅｌｉｎｅ（登録商標）とも呼ばれるパクリタキセルに関する最初の研究は、１９６０年代に米国で開始された。当時、国立がん研究所は、癌性腫瘍に対する活性、すなわち抗腫瘍活性を持つ植物抽出物を選択するプログラムを開始した。
【０００３】
１９６０〜１９８１年に、３５，０００種の植物から１１０，０００を超える複合体の抽出、分離および試験が行われた（Ｂｌｕｍｅ  Ｅ．  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  １９９１；  ８３：  １０５４−１０５６）。
【０００４】
イチイは選択および試験が行われた植物の一部であり、米国西海岸（オレゴン）産のイチイ樹皮（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  Ｎｕｔｔ）による最初の抽出物がＷａｎｉらによって得られた（Ｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９７１；  ９３：２３２５−２３２７）。これらの樹皮の原抽出物は、白血病性細胞に対する細胞障害活性と、各種腫瘍に対する阻害作用を示した。
【０００５】
２年後、抽出物の活性化合物が分離された。この活性化合物はパクリタキセルという一般名を与えられ、Ｘ線結晶学および１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって分子構造が決定された（Ｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９７１；  ９３：２３２５−２３２７）。
【０００６】
それ以来、生体外および生体内での癌性腫瘍に対するパクリタキセルの効果に関する研究が実施されており、得られた陽性の結果によって、この活性化合物は卵巣癌および乳癌治療の有望な薬剤のひとつとして分類されている（Ｒｏｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９９１；  ５２：  ３５−８４）。ところで各種癌治療へのパクリタキセルの仕様は、食品医薬品局によって１９９２年から認可されている。
【０００７】
パクリタキセル生成に使用した最初のイチイ品種は、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）であったが、地球上の別の地域で見られる他の品種についても試験が行われている。これらは、ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、カナダイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒマラヤイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ）、ウンナンイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、メディアイチイ「デンシフォルミス」（Ｔａｘｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、メディアイチイ「ヒックシー」（Ｔａｘｕｓ  ｈｉｃｋｓｉｉ）、メディアイチイ「ワーディー」（Ｔａｘｕｓ  ｗａｒｄｉｉ）、イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、イチイ「カピタータ」（Ｔａｘｕｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）又はメディアイチイ「ブラウニー」（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｏｗｎｉｉ）よりなる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８１；  ４６：  １４６９；  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９８１；  ４４：  ３２１；  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９８２；  ４５：  ４６６；  Ｓｅｎｉｌｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９８４；  ４７：  １３１−１３７；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９８６；  ４９：  ６６５−６６９；  Ｆｅｔｔ−Ｎｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２；  １０：  １５７２−１５７５）。
【０００８】
これらの種はすべてパクリタキセルを含むが、約０．０００４〜０．０００８％という、非常に限られた量である（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９９１；  ５２：  １−３４）。このようにパクリタキセルが低濃度であることにより、時間がかかり、一般に繰り返しクロマトグラフィーを行う必要があるため、抽出と精製にたいへん費用がかかる。
【０００９】
イチイのすべての品種のパクリタキセルの濃度が低いことによって、環境に大きな影響が及ぼされている。Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ樹皮から１ｋｇのパクリタキセルを抽出するには、約３０００本の成木を伐採して、１０，０００ｋｇの樹皮を得る必要がある。得られた量（１ｋｇ）のパクリタキセルによって、約５００人の患者を治療できるが、癌に苦しむ多数の患者は数十万人に上る。再度植樹しても、イチイの成長は遅いため、人間が早急に必要とするパクリタキセルの需要を満たすことはできない（Ｖｉｄｅｎｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９９０；  ５３：  １６０９−１６１０；  Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９９２；  ５５：  ９１２−９１７；  Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９９２；  ５５：  ４３２−４４０）。
【００１０】
パクリタキセルの抽出および精製の多数の方法が提案されている。たとえばＷａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９７１；  ９３：２３２５−２３２７）は、樹皮をアルコールで処理した後に、クロマトグラフィーによる数ステップの精製を行う、米国西海岸のイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）樹皮からのパクリタキセル抽出方法を提案した。
【００１１】
Ｍｉｌｌｅｒら（１９８１）は、Ｔａｘｕｓ  ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ  Ｚｕｃｃから以下の方法によってパクリタキセルを抽出した：
１）  植物からの抽出および抽出物の濃縮；
２）  水とヘキサンの分離による油脂除去；
３）  クロロホルムによる抽出と濃縮；
４）  第１のシリカカラムでのクロマトグラフィーによる第１の精製；
５）  第２のシリカカラムでのクロマトグラフィーによる第２の精製；
６）  第１の向流分配；
７）  第２の向流分配；
８）  分取高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ のことで、以下、「ＨＰＬＣ」という。）
【００１２】
Ｓｅｎｉｌｈら（１９８４）は、パクリタキセル（又はタキソール（登録商標）  Ａ：０．０１６５％）、セファロマンニン（又はタキソール（登録商標）  Ｂ：０．００６４％）および他の化合物を、以下の方法によってＴａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａの樹皮から分離した：
１）  アルコールによる抽出と濃縮；
２）  水とジクロロメタンの分離；
３）  濾過クロマトグラフィー；
４）  シリカカラムでのクロマトグラフィー；
５）  アルミナクロマトグラフィー；
６）  中圧シリカカラムでのクロマトグラフィー；
７）  ＨＰＬＣクロマトグラフィー
【００１３】
別の類似体では、２，３回の他のカラムクロマトグラフィーの後に、分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーが必要である。
【００１４】
ポリサイエンス社が用いる他の方法は、以下のステップを含む：
１）  乾燥粉砕樹皮をメタノール又はエタノールで処理し、アルコールを除去するために得られた抽出物を濃縮する、
２）  濃縮物を次にジクロロメタンで処理し、得られた溶媒抽出物を濃縮して粉末を得る、
３）  粉末をアセトンとリグロイン（１：１）で溶解し、濾過して不溶性物質を除去する、
４）  パクリタキセルを含む有機相を濃縮し、３０％のリグロインに溶解させ、登録商標Ｆｌｏｒｉｓｉｌのカラムに加える、
５）  カラムからのパクリタキセル画分を２回結晶化して精製する、
６）  そのように得られた結晶パクリタキセルをシリカカラムのクロマトグラフィーにかける。パクリタキセルは、このステップで他のタキサン類（関連類似体、セファロマンニンなど）から分離される、
７）  前のステップで得られた精製パクリタキセルは２回結晶化する、
８）  純粋なパクリタキセルの追加量を得るために、未分離混合物と母液はシリカカラムを通じて再利用する。
【００１５】
もちろん、以下の参考文献で説明するように、天然資源からのパクリタキセルを精製する他の方法もある：
Ｋｉｎｇｓｔｏｎらは、Ｔａｘｕｓ  Ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａから得られた新たなタキサンを開示し（Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９８２；  ４５：  ４６６−４７０）；
Ｗｉｔｈｅｒｕｐらは、Ｔａｘｕｓ  Ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａからパクリタキセルと関連化合物を分離する方法を開示した（Ｊ．  Ｌｉｑ．  Ｃｈｒｏｍ．  １９８９；  １２：  ２１１７−２１３２）。
【００１６】
１９９４年にＮａｉｒに発行された米国特許第５，２７９，９４９号は、パクリタキセル精製に観賞用イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｘ  ｍｅｄｉａ  Ｈｉｃｋｓｉｉ）の組織を使用することを開示している。本特許において：
１）  新しい針葉を７０％アルコールで抽出する、
２）  抽出物を炭で脱色し、濾過する、
３）  大半の有機溶媒を除去するために、濾過抽出物を濃縮する、
４）  水性濃縮物を遠心分離し、パクリタキセルを含む固体を分離する、
５）  次に固体を第１の順相シリカクロマトグラフィーにかける、
６）  得られた粗パクリタキセル画分を第２の低圧シリカクロマトグラフィーにかける、
７）  逆相カラムで最終精製を行う。
【００１７】
Ｐａｎｄeｙらに発行された米国特許第５，６５４，４４８号は、Ｔａｘｕｓ  Ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの樹皮からのパクリタキセルの抽出および精製方法を開示している。本方法において：
１）  樹皮をメタノールで３回抽出し、抽出はそれぞれ５日間にわたって行い、そのように得られた抽出物を次に濃縮する；
２）  メタノール濃縮物を分離して、塩化メチレンと水を得て、塩化メチレン抽出物を乾燥するまで蒸発させると、固体残留物は、約１．８〜２．２重量％のパクリタキセルを含んでいた；
３）  固体残留物をアセトンに溶解し、１体積のヘキサンと混合して、極性不純物を除去し、混合物を体積が１／３になるまで蒸発させる；
４）  アセトン／ヘキサン残留物をヘキサンに滴下して加えて（１０〜１５Ｌのヘキサンに対して１．５〜３．０Ｌの残留物）、沈殿を得て、これを濾過し、４０℃の温度にて高真空下（１ｍｍ〜２ｍｍ）で乾燥させ、約０．５〜０．６ｋｇの固体残留物を得る；
５）  前のステップで得られた固体残留物を０．５Ｌのアセトン−塩化メチレン１：９ｖ／ｖ混合物に溶解し、シリカカラムでクロマトグラフィーにかけた；セファロマンニンがパクリタキセルとともに溶出する；パクリタキセルとセファロマンニンを含む画分を一緒にプールし、ロータリーエバポレーターで乾燥させると、固体残留物は、３６〜４０ｇのパクリタキセル（４５〜５５％）を含むパクリタキセルとセファロマンニンの粗混合物である；
６）  前のステップで得た粗混合物（１０ｇ）を化学修飾して、臭素化によってセファロマンニンからパクリタキセルを分離する；臭素化反応後に得られる固体残留物の重量は１３．２ｇである；
７）  臭素化残留物をアセトン／塩化メチレン（１：９ｖ／ｖ）に溶解し、シリカカラムでクロマトグラフによって分離し、パクリタキセルを含む画分を一緒にプールし、乾燥するまで蒸発させる；
８）  前のステップで得られた固体残留物をアセトンに溶解し、等体積のｎ−ヘキサン又は他のヘキサンで結晶化する；結晶を冷アセトン／ヘキサンの１／１  ｖ／ｖ溶液で洗浄、濾過し、４０℃の真空下で乾燥し、そのようにして得られた固体結晶は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって測定されるように、重量が４．８４ｇであり、９７重量％より大きな濃度のパクリタキセルを含む。
【００１８】
Ｒａｏに発行された米国特許第５，４７５，１２０号と第５，６７０，６７３号は、パクリタキセルの分離方法を開示している。本方法において：
１）  樹皮、針葉、木材、根又はそれらの組合せをアルコールで処理し、大半のアルコールを除去するために、得られた抽出物を圧力下（＜３５−４０℃）で濃縮する。
２）  濃縮物をクロロホルム（又はジクロロメタン、ジクロロエタン又はトリクロロエタン）によって分配し、クロロホルム抽出物を減圧下で濃縮して濃縮シロップを作成し、シロップをガラス皿に注ぎ、樹皮又は木材を使用する場合には粉末を作成するために、針葉を使用する場合には針状結晶を作成するために、真空乾燥機（＜４０℃）で乾燥させる（１００ｋｇの樹皮又は木材からは、抽出物の収量は１．５−２．５ｋｇであり、１００ｋｇの針葉からは２．２−４．８ｋｇであった）。
３）  クロロホルム固体抽出物（２−２．５ｋｇ）をアセトニトリル（５Ｌ）に溶解させ、水（５Ｌ）を加えた；次に混合物をシリカゲル（２−３Ｌのスラリー）で平衡にし；混合物を撹拌しながら、さらに水（１５Ｌ）を徐々に加える；透明溶液を吸い取り、ここでサンプルのしみ込んだシリカゲルの濃縮スラリーをステンレス鋼カラムの上部に移す；パクリタキセルと各種の重要なパクリタキセル類似体を含む画分は、フード内に置き、溶媒をゆっくり蒸発させる；１〜２日後に結晶が生成し、方法は８−１０日間続ける；
４）  セファロマンニンの含有率が５％未満である、そのように得られた粗結晶は、アセトン／リグロイン混合物により、炭を使用して２回結晶化し、４１ｇの純粋なパクリタキセルが得られる。すなわち収量は０．０４％である。上の収量は１００ｋｇの樹皮より得られる；あるいは、クロロホルム溶液をシリカ又は登録商標Ｆｌｏｒｉｓｉｌの短いカラムに通して、粗結晶を脱色する。セファロマンニン汚染物質を除去する別の方法は、オゾンの使用よりなる。カラムを１−２％メタノールのクロロホルムとの混合液で洗浄すると、パクリタキセルのバルクが得られ、これは濃縮と再結晶で回収できる。収量は以前とほぼ同様で４０ｇである。ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析によって、そのように得られたパクリタキセルは０．３％未満のセファロマンニンを含むことがわかった。
【００１９】
Ｌｉｕに発行された米国特許第５，９６９，１６５号は、工業用分取低圧クロマトグラフィーによる、Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓからのパクリタキセルおよび他の関連化合物の分離および精製の方法を開示している。
【００２０】
本方法において、Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓの針葉および小枝（２００ｋｇ）を１０００Ｌのメタノールによって６０℃で５時間抽出した後、濾過する。原材料を７００Ｌのメタノールによって５５−６０℃にてさらに４時間抽出した後、濾過する。濾液を合わせ、１０ｋｇの活性炭（５重量％）と混合する。活性炭を濾過で除去する。濾液を次に約１００Ｌに濃縮する。次に、３００Ｌの水およびジクロロメタン（１：１）を加えた。有機相を回収し、水溶液を２００Ｌのジクロロメタンでさらに２回抽出する。ジクロロメタン溶液を合わせ、蒸発させてスラリーを生成させ、次に２０Ｌのアセトンで希釈する。
【００２１】
アセトン溶液を２０ｋｇの登録商標Ｃｅｌｉｔｅ  ５４５にコーティングして乾燥させ、次に３個の工業用低圧クロマトグラフィーカラム（１５０×１５ｃｍ）の上部に装填する。各カラムに１５ｋｇの酸化アルミニウム吸着剤を詰める。カラムはヘキサンとアセトンの混合物よりなる溶媒系で、約１０〜１５ｐｓｉの圧力にて、約１５０ｍｌ／分の流速で溶出させる。
【００２２】
タキサン類を含む画分を回収して合わせた後、濃縮して他の溶媒をすべて除去する。得られた物質はメタノールに溶解させ、室温で一晩維持し、針状結晶を得る。結晶を濾過し、アセトンで再結晶させて、１３−アセチル−９−ジヒドロバッカチンＩＩＩと識別される白色針状結晶を得る。
【００２３】
濾液を乾燥するまで濃縮する。残留物を３Ｌのアセトンに溶解させる。アセトン溶液に１．５ｋｇのポリスチレン−ジビニルベンゼンを混合する。溶媒を蒸発によって除去し、得られた粉末を、ポリスチレン−ジビニルベンゼンを充填した工業用低圧クロマトグラフィーカラムの上部に装填し、４５％アセトン水溶液を用いて、流速１５０ｍｌ／分、３０ｐｓi以下の動作圧で溶出する。
【００２４】
パクリタキセルとセファロマンニンを含む画分を合わせて蒸発させ、大半のアセトンを除去した後、脱イオン水で希釈し、２．５Ｌのジクロロメタンで３回抽出した。有機相は濃縮して乾燥させ、残留物を１Ｌのメタノールに溶解させる。
【００２５】
約３０％（ｖ／ｖ）の水をメタノール溶液に加え、混合物を６０℃まで数分間加熱した後、室温で一晩保持する。メタノール溶液からの粗結晶固体を濾過し、真空乾燥機内で７０−７５℃にて乾燥する。固体は約７０％のパクリタキセルと２５％のセファロマンニンよりなり、２００ｋｇのＴＡＸＵＳ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓの針葉および小枝で３１グラムの収量である。
【００２６】
粗パクリタキセルを２００ｍｌのアセトニトリルに溶解し、２５０ｍｌの脱イオン水で希釈し、クロマトグラフィーカラムに装填する。クロマトグラフィーカラムにはポリマー樹脂（登録商標Ｄｉａｉｏｎ、マクロ多孔性ポリメタクリレート樹脂）を充填する。カラムは３５、４０、４５および５０％アセトニトリル水溶液の段階勾配によって溶出させる。
【００２７】
パクリタキセル又はセファロマンニンを含む得られた画分は、それぞれ合わせて、結晶化するまで５℃で保持する。次に、パクリタキセルとセファロマンニン結晶を別個に濾過し、どちらもメタノールと水の混合液を用いて６５℃で再結晶させる。
【００２８】
パクリタキセルは白色針状結晶として得られ、純度は９９％を超え、収量は１８．５ｇ（０．００９％）である。セファロマンニンは、純度は９８％を超え、収量は６．５ｇ（０．００３％）である。
【００２９】
従って、出願者が知っている従来技術において開示された既知のパクリタキセル精製方法は、高純度パクリタキセルを得るためには、クロマトグラフィーによる分離と結晶化による精製の多くのステップを実施する必要があることを示している。このことは、イチイの他の各品種では、特にパクリタキセルが少ないため、生産コストが非常に高くなる。加えて、精製可能なバイオマスの量は、クロマトグラフィーカラムのサイズが小さいため、そして精製後に得られるパクリタキセルの収量が低いため、非常に限られている。
【００３０】
（発明の目的と概要）
本発明の第１の目的は：
異なる品種のイチイの樹皮、針葉および／又は枝の抽出後の、バイオマス獲得を容易にすること；
そのように得られ、クロマトグラフィーによって精製する必要のあるバイオマスの量を増加させること；
精製ステップを減少させること
得られたパクリタキセルの量を増加すること；および最後に
生産コストをさらに経済的なレベルまで下げること
が可能な方法を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、純度の高いパクリタキセル結晶の混合物を提供することである。
【００３２】
本発明により、上述した第１の目的は、抽出されるパクリタキセルを含むタキサンの天然資源からのパクリタキセルの抽出および精製方法によって達成され、該方法は以下のステップを（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の順に行う：
ａ）  有機溶媒によって、タキサンの前記天然資源からパクリタキセルを含む原材料を抽出するステップ；
ｂ）  パクリタキセルを含むバイオマスを得るために、前記原材料に塩基性溶媒又は酸性溶媒を加えて、前記バイオマスを沈殿させた後に分離して乾燥するステップ；
ｃ）  前記バイオマスをアセトンに溶解した後、非極性溶媒を加えることで溶液中の樹脂および天然色素を除去してパクリタキセル濃縮油相を得るステップ；
ｄ）  前のステップで得られたパクリタキセル濃縮油相に、ステップ（ｂ）における沈殿処理が塩基性溶媒で行われる場合には酸性溶媒を加え、又はステップ（ｂ）における沈殿処理が酸性溶媒で行われる場合には塩基性溶媒を加え、前記バイオマスを沈殿させた後に、この沈殿物を分離して乾燥し、このパクリタキセルを含むバイオマスを得るステップ；
ｅ）  前のステップで得られたバイオマスを揮発性溶媒に溶解し、１回以上クロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィーによって得られた精製溶液を１回以上結晶化することで、パクリタキセル結晶の混合物を得るステップ。
【００３３】
本発明により、上述した第２の目的は、パクリタキセル結晶の混合物によって達成され、この混合物は上の方法によって得られ、濾過および結晶の乾燥後、以下よりなる：
純度が９９％を超える、約５３％の結晶
純度が９８％を超える、約２２％の結晶
純度が９２％を超える、約２３％の結晶。
【００３４】
本発明、その利点および実施するために低減可能な方法は、以下の非制限的な説明を読めば理解されるであろう。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の範囲内および以下の説明において、“脱カラー化する（ｐｅｒｃｏｌｏｒｉｚｅ）”という表現は、“溶液と混和可能又は混和不可能な非極性溶媒を加えることによって、溶液から樹脂および色素を除去すること”を意味する。
【００３６】
上述のように、本発明による方法は、抽出されるパクリタキセルを含むタキサン類の天然資源からパクリタキセルを抽出および精製するために使用するものである。
【００３７】
（ステップ１−抽出）
方法の第１のステップは、タキサン類の天然資源からパクリタキセルおよびその類似体を含む原材料を、有機溶媒混合物を用いて抽出することよりなる。
【００３８】
本発明による方法を実施するための開始物質として使用されるタキサン類の天然資源は、Ｔａｘｕｓ種である。さらに詳細には、パクリタキセルを含む針葉樹種のいずれか１つよりなる。パクリタキセルを含むそのような針葉樹種は、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ  ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ、Ｔａｘｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔａｘｕｓ  ｈｉｃｋｓｉｉ、Ｔａｘｕｓ  ｗａｒｄｉｉ、Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ、Ｔａｘｕｓ  ｃａｐｉｔａｔａ又はＴａｘｕｓ  ｂｒｏｗｎｉｉよりなる。
【００３９】
本発明による方法は、パクリタキセルを含むタキサン類の天然資源のどの部分にでも使用可能であるという利点がある。抽出は選択された針葉樹の樹皮により実施することが好ましい。あるいは、抽出は選択した針葉樹の枝および針葉を同時に用いて実施することもできる。
【００４０】
好ましくは、沈殿物を除去するためにそのように得られた抽出物を濾過し、（好ましくは６５−７０℃の温度の）温水が供給される二重壁タンク内にデカントする。非常に濃い液体が得られるまで、溶媒をこのタンクから蒸留する。そして抽出物は回収され、メタノールに溶解される。
【００４１】
抽出ステップにおいて、使用する有機溶媒は、アルコール、ハロゲン化炭化水素およびハロゲン化アルコールならびに炭化水素の混合物よりなる群から選択されることが好ましい。そのような溶媒の例として、メタノール、ジクロロメタン、トリクロロメタン、およびメタノールとジクロロメタン又はトリクロロメタンの混合物が挙げられる。
【００４２】
ハロゲン化炭化水素とアルコールの混合物を使用する場合、アルコールとハロゲン化炭化水素は９：１〜１：９の体積比で存在することが好ましい。混合物の体積比は約１：１に等しいことがさらに好ましい。
【００４３】
（ステップ２−第１の沈殿）
本方法の第２ステップは、バイオマスの沈殿を得るために、原材料を塩基性溶媒又は酸性溶媒のどちらかで処理することよりなる。
【００４４】
塩基性溶媒中で沈殿させる場合、この溶媒は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳとも呼ばれる）などの塩基性塩の溶液よりなることが好ましい。
【００４５】
好ましい実施態様によると、塩基性溶媒は水酸化ナトリウムの溶液よりなり、水酸化ナトリウムは溶液１リットル当たり１０〜８０ミリモルの範囲の濃度で用いられ、さらに好ましくは溶液１リットル当たり２０〜５０ミリモルの範囲で用いられる。
【００４６】
塩基性溶媒のｐＨは、通常８．５〜１１であり、好ましくは９〜１０である。
【００４７】
酸性溶媒中で沈殿させる場合、酸性溶媒は通常、鉱酸又は有機酸溶液よりなる。酸は、塩酸、酢酸およびクエン酸よりなる群から選択できる。
【００４８】
溶液中の酸の濃度は、好ましくは溶液１リットル当たり１０〜５０ミリモル、さらに好ましくは溶液１リットル当たり２０〜３０ミリモルである。
【００４９】
酸性溶媒のｐＨは、２〜４であることが好ましい。
【００５０】
すべての場合において、バイオマスを沈殿させるために原材料に加える塩基性又は酸性溶液の体積は、方法の第１ステップで抽出された原材料の体積の１〜２０倍に等しい。
【００５１】
塩基性溶液を用いる場合、原材料に加える塩基性溶液の体積は、原材料の体積の１〜１５倍に等しいことが好ましい。酸性溶液を用いる場合、原材料に加える酸性溶液の体積は、方法の第１ステップで得られた原材料の体積の１〜１０倍に等しいことが望ましい。
【００５２】
これらの条件下で、生成される沈殿物は非常に微細で軽いため、その濾過はきわめて困難である。実際、沈殿物は低速の遠心分離（５，０００ｒｐｍ）では完全に回収できない。溶液から沈殿物を効率よく分離するには、１５，０００又は２０，０００ｒｐｍの速度までも必要である。
【００５３】
この問題を解決し、そのように得られたバイオマスから沈殿物を分離しやすくするために、分離および乾燥の前に、沈殿に用いる酸性又は塩基性溶液１リットル当たり２５〜２００グラムを含む濃度の塩化ナトリウムを加えることによって、バイオマスを塩析させてもよい。塩化ナトリウムは、沈殿に用いる酸性又は塩基性溶液１リットル当たり、好ましくは５０〜１００グラムを含む濃度、さらに好ましくは５０〜７５グラムを含む濃度で加える。
【００５４】
塩化ナトリウムを用いて溶液を塩析させると、凝集沈殿が得られる。ここで得られた沈殿物はさらに重く、さらに凝集されているため、濾過又は低速で遠心分離しやすい。
【００５５】
塩化ナトリウムは、溶液を激しく撹拌しながら迅速に加えることが好ましい。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施態様によると、本ステップで沈殿させたバイオマスは、濾過又は遠心分離によって溶液から分離し、次に、好ましくは通風又は凍結乾燥によって、周囲空気又は真空下で乾燥させる。
【００５７】
（ステップ３−脱カラー化）
本発明による方法の第３ステップは、前のステップで分離されたバイオマスを脱カラー化することよりなる。
【００５８】
より具体的には、前のステップの沈殿で得られたバイオマスに、沈殿前のステップ１で抽出した原材料の体積の１〜２倍のアセトンを加えて、アセトン溶液を得る。
【００５９】
さらに好ましくはバイオマスに、最初にアセトンを加え、次に水を加えることによって、アセトン溶液を得る。水は加えたアセトン１００体積当たり、２〜１０体積、さらに好ましくは５〜７体積の割合で加えることが好ましい。
【００６０】
溶解後、得られた溶液に１以上の非極性溶媒を加えて、パクリタキセル濃縮油相を形成する。
【００６１】
この脱カラー化ステップで用いる非極性溶媒は、ヘキサン又はヘプタンなどの、アセトンと混和可能な炭化水素よりなる群から選択されることが好ましい。ヘキサンを用いる場合、使用するヘキサンの体積は通常、アセトン溶液の体積の３〜４倍である。
【００６２】
得られた混合物は次にデカント用フラスコに移し、フラスコの底に沈殿しているパクリタキセルおよび他のタキサン類を含む油相を回収する。油相は次に蒸発させて、メタノールで置換する。
【００６３】
この第３ステップによって、開始物質として使用する針葉樹の樹脂および天然色素の大半を除去することができる。
【００６４】
（ステップ４−第２の沈殿）
本発明による方法の第４ステップは、沈殿によって別のバイオマスを得るために、前のステップで回収したパクリタキセル濃縮油相に塩基性溶媒又は酸性溶媒を加えて沈殿させ、次のこの別のバイオマスを分離して乾燥する。
【００６５】
さらに詳細には、この第４ステップにおいて、前のステップで得られたパクリタキセル濃縮油相を、まずは乾燥するまで蒸発させ、メタノールを用いて溶解する。
【００６６】
そのように得られたメタノール溶液は次に、ステップ２と呼ばれる上述の第１の沈殿ステップが酸性溶媒中で行われた場合は塩基性溶媒中で、第１の沈殿ステップが酸性溶媒中で行われた場合は塩基性溶媒中で沈殿させる。この沈殿の目的は、沈殿物の形でパクリタキセルを含むバイオマスを得ることである。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様によると、沈殿によってそのように得られたバイオマスは、分離又は乾燥の前に、沈殿に用いる酸性又は塩基性溶液１リットル当たり３０〜２００グラムを含む濃度の塩化ナトリウムを加えることによって、さらに塩析する。塩化ナトリウムは、沈殿に用いる酸性又は塩基性溶液１リットル当たり５０〜１００グラムを含む濃度で加えることが好ましい。
【００６８】
バイオマスに含まれる沈殿物は次に濾過し、周囲空気又は真空下で乾燥するか、凍結乾燥させる。
【００６９】
本ステップで生成される沈殿物は非常に微細で軽いため、濾過がきわめて困難である。実際、沈殿物は低速の遠心分離（５，０００ｒｐｍ）では一部しか回収できない。１５，０００又は２０，０００ｒｐｍの速度によってのみ、溶液から沈殿物を完全に分離できる。従って、沈殿物をさらに重く、さらに凝集性を高め、濾過又は低速で遠心分離しやすくする凝集沈殿を得るために、溶液に再び塩化ナトリウムを加えることが適当である。この処理に用いる塩化ナトリウム濃度は、好ましくは溶液１リットル当たり２５〜１００ｇ、さらに好ましくは溶液１リットル当たり５０〜７５ｇである。塩化ナトリウムは、溶液を激しく撹拌しながら迅速に加えることが好ましい。
【００７０】
（ステップ５−クロマトグラフィーによる精製）
本発明による方法の第５の最終ステップは、前のステップで得られた、他の分離バイオマスの１以上の揮発性溶媒による溶液をクロマトグラフィーによって精製することと、クロマトグラフィーによって得られた精製溶液を１回以上結晶化することよりなる。
【００７１】
そのために、ステップ４の乾燥後に得られた沈殿物を揮発性溶媒に溶解させ、次に１ステップ以上のクロマトグラフィーによる精製とクロマトグラフィーによって得られた精製溶液の１ステップ以上による結晶化を行う。しかし好ましくは、ステップ４の乾燥後に得られた沈殿物は、複数回のクロマトグラフィー精製および複数回の結晶化が行われ、好ましくは、連続する精製および結晶化の回数は３に等しい。これらの３回の連続する精製および結晶化は、以下のサブステップＡ−Ｆとしてここで説明する。
【００７２】
（Ａ−第１のクロマトグラフィー精製）
第１のクロマトグラフィー精製ステップにおいて、方法のステップ４で得られたバイオマスは揮発性溶媒に溶解させる。得られた溶液はシリカゲルと混合し、通気によって乾燥させた後、バイオマスに覆われたシリカゲルを、同じ種類のゲルを含むクロマトグラフィーカラムに装填する。このカラム中で、３０〜４０％のアセトンと６０〜７０％のヘキサンからなる混合溶出液によってバイオマスを精製する。混合溶出液は約４０％のアセトンと約６０％のヘキサンからなることが好ましい。
【００７３】
溶解に用いる揮発性溶液はアセトンであることが好ましい。アセトン溶液は次に濾過して、不溶性粒子を除去し、シリカゲルと混合する。そのように得られた混合物は次に、通気又は真空下で乾燥させる。
【００７４】
パクリタキセルおよびその類似体を含浸させたゲルを、好ましくは高さが１４２ｃｍ、内径が７．６ｃｍであり、２．２−２．３ｋｇのシリカゲルを含むカラムに装填する。カラムのゲルは、アセトンおよびヘキサン（４０−６０％、ｖ／ｖ）よりなる溶出混合物によって洗浄し、平衡にする。同じ溶媒混合物を用い、約１００ｍｌ／分の流速で、０〜３０ｐｓｉの範囲の圧力下で、画分を溶出させる。
【００７５】
（Ｂ−第２のクロマトグラフィー精製）
第２のクロマトグラフィー精製ステップにおいて、前のステップで回収されたパクリタキセル濃縮画分を好ましくは合わせ、次に残留物が得られるまで、蒸発させて乾燥する。
【００７６】
次に、揮発性溶媒に溶解させて、残留物溶液を調製する。そのように得られた溶液は次に、前のステップと同じ条件でクロマトグラフィーによって再精製して、あらたなパクリタキセル濃縮画分を得る。
【００７７】
好ましい実施態様によると、残留物はアセトンに溶解させ、次いでシリカゲルと混合し、乾燥させる。
【００７８】
パクリタキセルおよびその類似体を含浸させたゲルを、２．２−２．３ｋｇのシリカゲルを含むカラム（長さ１４２ｃｍ×内径７．６ｃｍ）に装填する。カラムのゲルは、アセトンおよびヘキサン（４０−６０％、ｖ／ｖ）よりなる混合溶出液によって洗浄し、平衡にする。同じ混合溶媒を用い、約１００ｍｌ／分の流速で、０〜３０ｐｓｉの範囲の圧力下で、画分を溶出させる。
【００７９】
パクリタキセル（一般に４０〜６０％のパクリタキセル）を含む画分を再度合わせる。
【００８０】
（Ｃ−第１の結晶化）
本ステップにおいて、前の精製ステップでクロマトグラフィーによって得られたパクリタキセルを含む画分を、乾燥するまで蒸発させてアセトンに溶解する。アセトンの量は、ＨＰＬＣ分析によるパクリタキセルに対応するピークに対して溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．（optic density）となるように調整する。次に３〜４体積のヘキサンをアセトン溶液に加えて、パクリタキセルを結晶化させる。
【００８１】
結晶は迅速に生成する。混合物は周囲温度又は２〜８℃で一晩放置し、結晶化を完了させる。
【００８２】
（Ｄ−第２の結晶化）
本ステップにおいて、前のステップで再結晶によって得られた結晶を、濾過により分離し、ＨＰＬＣ分析によるパクリタキセルに対応するピークに対して、溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．となるように調整した量のアセトンを用いて、アセトンに溶解する。
【００８３】
次にアセトン溶液に、溶液の１体積につきヘキサン３〜４体積を加えることによって、本溶液に含まれるパクリタキセルが再結晶化される。
【００８４】
本ステップで得られる結晶は、ＨＰＬＣ分析によると、パクリタキセル純度は８０％より高い。
【００８５】
（Ｅ−第３のクロマトグラフィー精製）
本ステップでは、前のステップで得られた結晶を濾過し、次に塩化メチレンに溶解する。
【００８６】
そのようにして得られた溶液は次に、シリカゲルと混合し、通気により乾燥させる。
【００８７】
パクリタキセルでコーティングされたシリカゲルは、同じ種類のゲルを含むクロマトグラフィーカラムに装填する。次に有機溶媒ベースの混合溶出液を用いて、３度目のパクリタキセル再精製を行う。混合溶出液は９５〜９８％の塩化メチレンと２〜５％のイソプロパノールよりなることが好ましい。
【００８８】
本ステップでは、結晶を塩化メチレンで溶解し、シリカゲルと混合して乾燥させることが好ましい。パクリタキセルおよびその類似体を含浸させたゲルを、１．５−１．６ｋｇのシリカゲルを含むカラム（長さ７６ｃｍ×内径７．６ｃｍ）に装填する。カラムのゲルは、塩化メチレンおよびイソプロパノール（９８−２％、体積当たり）よりなる混合溶出液によって洗浄し、平衡にする。同じ混合溶媒を用い、約５０ｍｌ／分の流速で、０〜３０ｐｓｉの範囲の圧力下で画分を溶出させる。
【００８９】
（Ｆ−第３の結晶化）
本ステップでは、前のステップでクロマトグラフィーによって回収したパクリタキセルを含む濃縮画分を純度に従って、好ましくは＋９８〜＋９９％および９０〜９８％の純度に従って合わせた。次に乾燥するまで蒸発させて、メタノールに溶解した。
【００９０】
添加したメタノール量は、ＨＰＬＣ分析によるパクリタキセルに対応するピークに対して、溶液の吸収の値が１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．となるように調整する。
【００９１】
次に、溶液１体積当たり２〜１０体積の水をメタノール溶液に加えて、パクリタキセルの３度目の再結晶を行った。好ましくはメタノール溶液の１体積当たり４〜７体積の水を使用するのが良い。
【００９２】
上で開示した精製および再結晶化の最終ステップにおいて、使用する水は脱イオン化および／又は蒸留によって得られた精製水であることが好ましい。
【００９３】
好ましい実施態様において、２〜４℃の温度に冷却した７〜１０体積の純水を、氷冷した１体積のメタノール溶液に加えた。次に、結晶がただちに現れる。結晶化は２〜４℃の温度で一晩継続させる。
【００９４】
メタノール溶液への水の添加は、周囲温度で実施できる。すると結晶の生成は遅くなるが、２〜４℃では一晩で完了する。微細な分離された粉末を得るために、結晶を濾過し、通気又は真空下で乾燥させる。結晶は次に、純水で懸濁させ、約−６０℃の温度で６６〜７２時間凍結乾燥させる。
【００９５】
タキサン類の得られた画分は、オートサンプラー（Ｗａｔｅｒｓ  ７１７  ｐｌｕｓ）、光ダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６）、多溶媒送出システム（登録商標Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ）およびＣ１８  登録商標Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  カラム、６０Å、４μｍ（３．９×１５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分析できる。
【００９６】
画分の分析は、５μｌの体積を注入して行う。溶媒勾配：アセトニトリル−水−メタノール（開始時２０：５０：３０；終了時３５：３５：３０）を用いた場合、移動相の流速は１ｍｌ／分である。
【００９７】
化合物のピークは２２８ｎｍで検出され、サンプルの分析時間は約３６分である。
【００９８】
残留物を溶解するためのクロマトグラフィー精製ステップで用いる揮発性溶媒は、アセトン、Ｃ１−Ｃ３低級アルコール、酢酸エチル、塩化メチレンおよびこれらの溶媒の混合物よりなる群から選択するのが好ましい。
【００９９】
ステップＦの終わりに、水中でのパクリタキセル結晶化、濾過および乾燥の後、パクリタキセル結晶の混合物が得られる。パクリタキセル結晶のこの混合物は以下よりなる：
純度が９９％を超える、５３％の結晶
純度が９８％を超える、２２％の結晶
純度が９２％を超える、２３％の結晶
【０１００】
以下の例は、例示の目的のみで与えられており、本発明の範囲を制限すると見なすべきではない。
【０１０１】
（実施例１）
（抽出）
Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓの乾燥針葉および小枝５０ｋｇを脱イオン水で洗浄し、通気して乾燥させた。原材料を粉砕し、木綿袋に移した。この袋を１５０Ｌの混合溶媒（塩化メチレン−メタノール；１：１  ｖ／ｖ）を含むステンレス鋼タンクに入れた。抽出は周囲温度で１６時間行った。抽出物をフィルターを通してポンプで第２の二重壁タンクに移した。タンクの二重壁に７０℃の温水を循環させて、非常に濃厚な液体を得るまで溶媒を蒸留した。
【０１０２】
（第１の沈殿）
抽出濃縮物を回収し、２Ｌのメタノールで希釈した。バイオマスは２０ｍＭのＮａＯＨ溶液を抽出物に加えて、沈殿により分離した。抽出物をＮａＯＨ溶液に加えると、非常に微細な沈殿物が生成した。抽出物の塩基性溶液に対する体積比は約１：１５であった。
【０１０３】
この微細な沈殿物は濾過が非常に困難であった。非常に高速（１５０００−２００００ｒｐｍ）での遠心分離によってのみバイオマスを回収できた。従って、沈殿物をさらに凝集させるために、ＮａＣｌを５０ｇ／Ｌの比で溶液に加えた。そして沈殿物を濾過したり、僅か４２００ｒｐｍで、２０℃で３０分間遠心分離したりした（Ｊ６ＭＣ  登録商標Ｂｅｃｋｍａｎ  遠心分離機  ４．２  ＪＳローター）。連続フロー遠心分離機を用いて大量の沈殿物を処理できることが理解されるであろう。
【０１０４】
そのように得られた沈殿物を空気乾燥又は真空乾燥するか凍結乾燥（凍結乾燥機−ＦＴＳシステムズ）した。沈殿物の重量は約５００−５５０ｇであった。この沈殿物を２Ｌのアセトンに溶解させ、含まれている不溶性粒子を除去するために、濾過するか、０−２℃にて３０分間、４２００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１０５】
（脱カラー化）
次に、１Ｌのアセトン溶液を６Ｌのフラスコに入れ、溶液に１Ｌのヘキサンを加え、次いで手動で激しく振った。これを繰り返すことにより４Ｌのヘキサンを混合した。混合物を約１０分間放置し、フラスコの底で油相を回収した。
【０１０６】
実際に、大型のＢｅｃｈｅｒ又は十分なタンクを用いることによって、アセトン溶液は１回のバッチで処理できる。そこからヘキサン相を吸い出し、残りの液体は、油相を完全に回収するために分離フラスコに移した。
【０１０７】
このステップの間、濃い色のヘキサン相は廃棄した。
【０１０８】
（第２の沈殿）
油相は次に、乾燥するまで蒸発させた。残留物を２Ｌのメタノールに溶解させた。バイオマスは、メタノール溶液を２０ｍＭのＨＣｌ溶液に加えて沈殿させ、２回目の分離を行った。抽出物を加えると、非常に微細な沈殿物が生成した。抽出物の酸性溶液に対する体積比は約１：５であった。再び、この微細な沈殿物は濾過が非常に困難であった。高速（１５０００−２００００ｒｐｍ）での遠心分離によってのみ、バイオマスを回収可能であった。それゆえ、ＮａＣｌを再度溶液に加え（５０ｇ／Ｌの溶液）、沈殿物をさらに凝集させた。次に沈殿物を濾過、又は、僅か４２００ｒｐｍの速度にて、２０℃で３０分間遠心分離した（Ｊ６ＭＣ  登録商標Ｂｅｃｋｍａｎ  遠心分離機、４．２ＪＳローター）。再度、連続フロー遠心分離機を用いて、大量の沈殿物を処理することができる。
【０１０９】
（低圧にてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーによる第１の精製）
回収した沈殿物は、空気又は真空下で乾燥させるか、凍結乾燥させた。沈殿物の重量は約２４０−２６０ｇであった。沈殿物を０．５Ｌのアセトンに溶解させ、含まれている不溶性粒子を除去するために４２００ｒｐｍにて、０−２℃で３０分間遠心分離した。アセトン溶液を次に２００−２５０ｇのシリカゲル（２３０−４００メッシュ、製薬品質、登録商標Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ、カナダ、ケベック）と混合した。抽出物に含浸させたゲルは通風により、あるいは真空下で乾燥させた。乾燥ゲルを２．２ｋｇのシリカゲル（２３０−４００メッシュ）を含むカラム（１４２×７．６ｃｍ内径）の上部に装填した。アセトンおよびヘキサン（４０：６０％、ｖ／ｖ）の混合物でゲルを洗浄し、平衡させた。溶出は、登録商標Ｄｙｎａｍａｘ  溶媒送出システムを用いて、同じ溶媒によって実施した。溶出の流速は、１０−３０ｐｓｉの圧力下で約１００ｍｌ／分であった。混合溶媒の体積は約３０Ｌであり、各画分は、１Ｌの溶媒精製を用いてバッチで回収した。ＨＰＬＣ分析によると、１７番目から２５番目まで、パクリタキセルを含む画分が９個あることが示されている。
【０１１０】
ＨＰＬＣによって決定したこれらの画分のパクリタキセル含有量はそれぞれ、１１；２４；３２；４０；３８；３３；２９；１４および９％であった。
【０１１１】
パクリタキセルを含む画分が、ある精製ステップから別の精製ステップの精製で、画分に関して分離されたものとなりうるということは、注意すべきことである。
【０１１２】
（低圧にてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーによる第２の精製）
パクリタキセルを含む画分はともに合わせて、乾燥するまで蒸発させた。残留物を１００ｍｌのアセトンに再溶解させ、１００ｇのシリカゲルに接触させた。パクリタキセルでコートされたゲルを、通気又は真空下で乾燥させた。乾燥ゲルを２．２ｋｇのシリカゲル（２３０−４００メッシュ）を含むカラム（１４２×７．６ｃｍ内径）に装填した。アセトンおよびヘキサン（４０：６０％、ｖ／ｖ）の混合物でゲルを洗浄し、平衡させた。溶出は、溶媒送出システムを用いて、同じ溶媒によって実施した。溶出の流速は、１０−３０ｐｓｉの圧力下で約１００ｍｌ／分であった。混合溶媒の体積は約３０Ｌであり、各画分は、１Ｌの溶媒精製を用いてバッチで回収した。ＨＰＬＣ分析によると、２２番目から２６番目までの５つの画分がパクリタキセルを含んでいた。ＨＰＬＣによって決定した、これらの画分のパクリタキセル含有量はそれぞれ、４０；５８；６６；５０および４９％であった。ここでも、パクリタキセルを含む画分が、ある精製ステップから別の精製ステップの精製で、画分に関して分離されたものとなりうるということは、注意すべきことである。
【０１１３】
（第１の結晶化）
パクリタキセルを含む画分を合わせて、乾燥するまで蒸発させた。残留物を８００ｍｌのアセトンに再溶解させた。ＨＰＬＣ分析におけるパクリタキセルのピークに対して１．０〜１．５ Ｏ．Ｄ．の吸収の値を得るようにアセトンの体積を調整する必要があった。３体積のヘキサン（２．４Ｌ）をアセトン溶液に加えた。１時間後に結晶が生成した。混合物を約２−８℃の温度で一晩保持して、結晶化を完了させた。
【０１１４】
（第２の結晶化）
得られた結晶を濾過し、４００ｍｌのアセトンに再溶解させた。３体積のヘキサン（１．２Ｌ）をアセトン溶液に加えた。１時間後に結晶が生成した。混合物を約２−８℃の温度で一晩保持して、結晶化を完了させた。結晶を空気又は真空下で乾燥させた。
【０１１５】
得られた結晶の乾燥重量は約１０ｇ±０．２ｇであった。ＨＰＬＣ分析によると、パクリタキセル含有量は約８０％以上であることが示された。
【０１１６】
（低圧にてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーによる第３の精製）
結晶を７５ｍｌの塩化メチレンに再度溶解させ、７５ｇのシリカゲルに接触させた。パクリタキセルでコーティングされたゲルを通気又は真空下で乾燥させた。乾燥ゲルを１．５ｋｇのシリカゲル（２３０−４００メッシュ）を含むカラム（７６×７．６ｃｍ内径）に装填した。塩化メチレンおよびイソプロパノール（９８：２％、ｖ／ｖ）の混合液でゲルを洗浄し、平衡させた。溶出は、登録商標Ｄｙｎａｍａｘ溶媒送出システムを用いて、同じ溶媒によって実施した。溶出の流速は、１０−３０ｐｓｉの圧力下で約５０ｍｌ／分であった。混合溶媒の体積は約３０Ｌであり、各画分毎に、１Ｌずつの溶媒で回収した。ＨＰＬＣ分析によると１１番目から２２番目まで、パクリタキセルを含む画分が１２個あることが示されている。これらの画分においてＨＰＬＣによって決定されたパクリタキセル含有量は次のとおりである：８０；９７；９９．５０；９９．７０；９９．７０；９９．３０；９８．６０；９７．３０；９４；９２；８９および８５％。ここでも、パクリタキセルを含む画分が、ある精製ステップから別の精製ステップの精製で、画分に関して分離されたものとなりうるということは、注意すべきことである。
【０１１７】
（第３の結晶化）
パクリタキセルを含む画分をそれぞれの純度に合わせ、乾燥するまで蒸発させた。１２番目から１６番目の画分は１００ｍｌのメタノール（ＨＰＬＣ級）に溶解させ、１７番目から１８番目の画分は４５ｍｌのメタノール（ＨＰＬＣ級）に溶解させ、１９番目から２２番目の画分は７５ｍｌのメタノール（ＨＰＬＣ級）に溶解させた。
１）事前に２−８℃に冷却した７００ｍｌの水（ＨＰＬＣ級）を、氷冷したメタノール溶液（１２番目から１６番目の画分）に加えた。白色結晶がただちに出現した。
２）事前に２−８℃に冷却した３００ｍｌの水（ＨＰＬＣ級）を、氷冷したメタノール溶液（１７番目および１８番目の画分）に加えた。白色結晶がただちに出現した。
３）事前に２−８℃に冷却した５００ｍｌの水（ＨＰＬＣ級）を、氷冷したメタノール溶液（１９番目から２２番目の画分）に加えた。白色結晶がただちに出現した。
【０１１８】
結晶は別個に濾過し、空気又は真空下で乾燥させた。乾燥重量およびＨＰＬＣで分析した結晶の純度は以下のとおりである：
１２番目から１６番目の画分：３．４０ｇ−純度：９９．３０％
１７番目から１８番目の画分：１．４０ｇ−純度：９８．８５％
１９番目から２２番目の画分：１．６０ｇ−純度：９２．７０％
【０１１９】
純度が９８％未満の結晶を取り、上述した第３の生成ステップと同じ条件下で、クロマトグラフィーによって一緒に再精製した。この再精製によって、純度が９９％を超える全量の約７５％の結晶が得られた。
【０１２０】
（実施例２）
実施例２で開示する方法は、第１および第２のステップを以下のように実施したことを除き、実施例１で開示した方法と同様である。
【０１２１】
（第１の沈殿）
抽出濃縮物を回収し、２Ｌのメタノールで希釈した。２０ｍＭのＨＣｌ溶液にバイオマスを加えて沈殿させて分離した。抽出物を加えると、非常に微細な沈殿物が生成した。抽出物の酸性溶液に対する体積比は約１：１０であった。この微細な沈殿物は濾過が非常に困難であった。高速（１５０００−２００００ｒｐｍ）での遠心分離によってのみ、バイオマスを回収可能であった。それゆえ、沈殿物をさらに凝集させるために、５０ｇ／Ｌの比でＮａＣｌを溶液に加えた。次に沈殿物を濾過、又は４２００ｒｐｍの速度にて、２０℃で３０分間遠心分離した（Ｊ６ＭＣ  登録商標Ｂｅｃｋｍａｎ  遠心分離機、４．２ＪＳローター）。
【０１２２】
回収した沈殿物を空気乾燥又は真空乾燥するか凍結乾燥した。沈殿物の重量は約５００−５２０ｇであった。この沈殿物を２Ｌのアセトンに溶解させ、そこに含まれている不溶性粒子を除去するために、濾過するか、０−２℃にて３０分間、４２００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１２３】
（第２の沈殿）
油相は次に、乾燥するまで蒸発させた。残留物を２Ｌのメタノールに溶解させた。バイオマスは、メタノール溶液を２０ｍＭのＮａＯＨ溶液に加えて沈殿させ、２回目の分離を行った。抽出物を加えると、非常に微細な沈殿物が生成した。抽出物の酸性溶液に対する体積比は約１：５であった。この微細な沈殿物は濾過が非常に困難であった。高速（１５０００−２００００ｒｐｍ）での遠心分離によってのみ、バイオマスを回収可能であったであろう。それゆえ、沈殿物をさらに凝集させるためにＮａＣｌを溶液５０ｇ／Ｌの比で溶液に加えた。次に沈殿物を濾過、又は４２００ｒｐｍの速度にて、２０℃で３０分間遠心分離した（Ｊ６ＭＣ  登録商標Ｂｅｃｋｍａｎ  遠心分離機、４．２ＪＳローター）。
【０１２４】
本実施例２で得られたパクリタキセルの収量と純度は、実施例１で得られたものと同じであった。
【０１２５】
上の実施例は、本発明による方法が、当業界で既知の他の方法と比べて、パクリタキセルの生産コストを実質的に低下させることを示している。このコスト低下は、許容可能な治療純度を有するパクリタキセル収量の増加によって、そして回収不能な生成物（溶媒、ゲル．．．）および生産時間に関する著しい節約によってもたらされる。これらの利点に加え、本発明は、処理バイオマスに含まれる少量のパクリタキセルに制限されることなく、工業レベルで使用可能である、非常に単純で、迅速および容易な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は本発明による方法の一部を説明するフローチャート。
【図２】  図２は本発明による方法のうち、図１に示す方法以降を説明するフローチャート。
【図３】  図３は本発明による方法のうち、図２に示す方法以降を説明するフローチャート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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