(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分とする抗腫瘍剤であって、口腔がんを抑制する化学的予防剤であることを特徴とする、前記抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な抗腫瘍剤に関するものであり、さらに詳しくは、フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分とする新しい抗腫瘍剤に関するものである。
本発明は、特に、口腔がんを抑制する化学的予防薬剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、各種のがんの予防薬及び治療薬が開発されている中で、今日、がんの一次的予防が注目されており、特に、罹患患者が増加する傾向にある口腔がんおよび大腸がんの積極的な一次予防が重要課題となっている。
これまでの研究報告によると、以下のような事項が指摘される。
即ち、口腔がんは過形成、異形成を経て上皮内がん、進行がんへと進行し、その間に遺伝子異常が積み重なるという自然史が示唆されている。アジア、大平洋上の島々、ヨーロッパの一部ならびにブラジルの一部などの地域では、口腔がんは頻度の高い悪性新生物であると認識されている。喫煙や飲酒は、舌がんを含む口腔がん発生の主要なリスクファクタ一であるとされている。最近、世界各地で若年者の舌がんが急速に増加しているとの報告がある。一方、大腸がんは世界では第３位の悪性新生物であり、アメリカ合衆国ではがんによる死因の第２位であり、日本では第３位である。日本では食習慣の欧米化が急速に進み、特に脂肪摂取の増加と炭水化物摂取の減少により、大腸がんの発生率が増加している。大腸がんの原因は完全には解明されていないが、食事はその発生に重要なファクターであると考えられている。食事ファクターは人の健康やがんを含む一部の慢性疾患の発生に重要な役割を果たしている。一部の食品には変異原物質や発ガン物質が含まれているのと同様に、発がん抑制物質も含まれている。
【０００３】
現在、我が国では増加を続けているがん罹患患者に対する対策として、その予防が重要視され、特に化学的予防を含む積極的な一次予防が注目されている。野菜や果物の摂取はさまざまな種類のがんに対する予防効果があることが、多くの疫学的データで指摘されており、食品中に存在する化学的予防物質の探索とその抑制機序に関する基礎的研究が世界的に展開されている。口腔がんや大腸がんでも野菜や果物の摂取量と口腔がんおよび結腸直腸がんの発生率には逆相関がみられるが、このような結果は、野菜や果物中には肉類や脂肪中の発がん物質、プロモーターを除去したり、また、発がんを阻止する化合物が含有されていることを示唆している。事実、動物実験では野菜や果物に含まれる多くの化合物が、がんの発生を抑制する実験結果が多数報告されている。
【０００４】
本発明者らも、野菜や果物を含む食用植物から口腔がんや大腸がんに対する化学予防候補物質をいくつか見い出してきた（Cancer Res. 57: 246-252, 1997 、Carcinogenesis 18: 957-965, 1997、J. Toxicol. Pathol. 9: 139-149, 1996）。平山が１９７９年に日本人２７万人のコホート調査の結果で指摘した（Nutr.Cancer 1: 67-81, 1979 ）ように、果物や緑黄色野菜の多量摂取と種々のがんの発生率とは逆相関がある。果物や野菜中には多量かつ種々のフラボノイドが存在しており、カロテノイドなどの栄養素に加えてこのような非栄養素が、がん発生リスクの低下に寄与している可能性がある。
このように、無煙煙草の使用により世界各地で舌がんの若年患者が増加し、また、日本では食習慣の欧米化が急速に進み、特に脂肪摂取の増加と炭水化物摂取の減少により、大腸がんの発生率が増加しているが、このような増加中のがんに対して、毒性のない化合物を使ったがん予防の重要性が指摘されている。
構造が判明している植物中の化合物のうち、フラボノイドは最近、特に注目され化学予防物質の候補として研究が盛んである。その理由として、フラボノイドはほぼすべての食用植物、果物、根中に存在し、ヒトはかなりの量のフラボノイドを、少なくとも２３ｍｇは毎日摂取しており、かつフラボノイドは熱に対して安定性が高いからである。加えて、フラボノイド類は無毒であり、さまざまな生物活性、例えば抗アレルギー性、抗炎症性、フリーラジカルの除去、酵素活性の調節、抗変異原性、抗発がん性などを有している。したがって、フラボノイドはがんを含むフリーラジカル関連疾患に対する化学的予防もしくは治療薬の候補物質として期待されている。本発明者らの最近の研究でも、２種類のフラボノイド類、すなわちジオスミンとへスペリジンが、ラットの口腔、食道、結腸および膀胱における実験的発がんに対し、効果的な発がん予防効果を発揮した（Cancer Res. 57: 246-252, 1997 、Carcinogenesis 18: 957-965, 1997、Cancer Res. 54: 4653-4659, 1994 、Carcinogenesis 18: 761-769, 1997、Int. J. Cancer 73: 719-724, 1997）。
【０００５】
モリン（ｍｏｒｉｎ）もそのようなフラボノイドの一種であり、ケルセチンなどとともにフラボノールに属するポリフェノールである。これまで報告されているモリンの生理活性の中では、特に抗酸化作用やアラキドン酸カスケードにおけるｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅやｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅの酵素活性を阻害する作用や抗変異原が注目に値する。
しかし、モリンのがん予防作用についてはこれまで報告された例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、食用植物中に存在するがん化学予防物質を見出す目的で、フラボノイドの生理活性、がん予防作用等について種々研究を進める過程で、フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）に着目し、その生理活性について種々研究を積み重ねた結果、モリン（ｍｏｒｉｎ）が、がん抑制作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、フラボノイドの一種であるモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分とする新しい抗腫瘍剤を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、特に、口腔がんの抑制作用を有する新規化学的予防薬剤を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段からなる。
（１）フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分とする抗腫瘍剤であって、口腔がんを抑制する化学的予防剤であることを特徴とする、前記抗腫瘍剤。
【０００８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の抗腫瘍剤は、前記のように、フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分として使用することを特徴としている。モリンは、天然に存在するフラボノール類の一つで、以下の化学構造式を有している。
【０００９】
【化１】
0004570184.tif 000002
【００１０】
本発明では、上記モリン、モリンの化学的修飾体、および同効の適宜のモリン誘導体も同様に使用することができる。これらは市販品を入手し、使用することが可能である。モリン（以下、ｍｏｒｉｎと記載することがある）は、前記したように、フラボノイドの一種でありケルセチンなどとともにフラボノールに属するポリフエノールである。
ｍｏｒｉｎにはいくつかの生物活性があり、特に抗酸化作用やアラキドン酸カスケードにおけるｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＬＯＫ）やｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ）の活性を阻害する作用が知られている。さらに、ｍｏｒｉｎの抗変異原も報告されている。このようなｍｏｒｉｎの生物活性からと既知の化学予防物質の生物活性を考慮して、ｍｏｒｉｎの発がん抑制効果を調べるために、本発明者らは、４−ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｌ−ｏｘｉｄｅ（４−ＮＱＯ）誘発ラット舌発がんおよびａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ（ＡＯＭ）誘発ラット大腸発がんモデルを用いてｍｏｒｉｎの混餌投与による発がん抑制作用を検討した。即ち、後記する実験例に示したように、舌、大腸の腫瘍発生頻度に加えて、前がん性病変である舌の異形成や大腸のａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｒｙｐｔ  ｆｏｃｉ（ＡＣＦ）の発生頻度をバイオマーカーとして発がん修飾作用の評価をおこなった。修飾機序に関する検討では、舌上皮や大腸粘膜上皮の増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）陽性細胞率と組織中および血中ポリアミン量を測定して標的臓器における細胞増殖活性に及ほすｍｏｒｉｎの影響を、肝、舌、大腸粘膜におけるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）活性、ｑｕｉｎｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＱＲ）活性を測定して解毒酵素活性に及ほすｍｏｒｉｎの影響を検討した。なお、本明細書においては、口腔がんおよび大腸腫瘍について説明するが、大腸腫瘍については、参考例として示すものである。
【００１１】
以上の結果から、フラボノイドｍｏｒｉｎの混餌投与で４−ＮＱＯ誘発舌発がんを効果的に抑制することが明かとなった。また、ｍｏｒｉｎはＡＯＭ誘発大腸発がんにおける大腸がん前駆病変ＡＣＦの発生も抑制したが、大腸がん発生抑制効果は舌がん発生抑制と比べて著明でなかった。
したがって、ｍｏｒｉｎは、口腔がん、大腸腫瘍、特にヒト舌がんに対する化学的予防剤として利用可能であることが示唆された。後記する実験例において、ｍｏｒｉｎの混餌投与は１００ｐｐｍないし５００ｐｐｍの濃度で行ったが、体重増加抑制はみられず、主要臓器において毒性を示唆する著明な病理学的変化は見られなかった。これらの所見は、ｍｏｒｉｎの毒性は認められないか、あっても極めて低いことを示唆するものである。がん化学予防物質をヒトへ応用する場合、長期の経口投与が望まれるため、これらの所見は極めて重要である。
【００１２】
これまで報告された口腔がんや大腸がんに対する化学予防候補物質の大部分は、標的臓器での細胞増殖活性を抑制する作用がある。本発明者らは、舌上皮、大腸粘膜、血中のポリアミン量と舌上皮や大腸粘膜のＰＣＮＡ陽性細胞数を用いて、標的臓器の細胞増殖活性を評価した。後記する実験１におけるこれらの細胞増殖バイオマーカーの変動の結果から、ｍｏｒｉｎには舌における細胞増殖を抑制する作用を有することが示唆された。したがって、ｍｏｒｉｎの舌がんに対する化学予防の作用機序の一部として、特に後イニシエーション相投与の場合、標的組織における細胞増殖の抑制が関与していることが示唆された。４−ＮＱＯは４−ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  １−ｏｘｉｄｅ（４−ＨＡＱＯ）を経て、４−ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  １−ｏｘｉｄｅ（４−ＡＱＯ）に代謝されるが、４−ＨＡＱＯが発がん性を発揮するといわれている。つまり、４−ＮＱＯは前発がん物質で、４−ＨＡＱＯは直接的（究極）発がん物質である。４−ＨＡＱＯは、さらにｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅによる活性化を受け、ｓｅｒｙｌ−４−ＨＡＱＯとなりＤＮＡ（特にグアニンやアデニン）と結合し、ＤＮＡ付加体を形成する。また、４−ＮＱＯの代謝過程ではラジカルも生じる可能性があり、４−ＮＱＯの発がん性との関わりも論議されている。４−ＮＱＯから４−ＨＡＱＯへの還元反応はＮＡＤＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを水素供与体として、ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ（ＱＲ）によって触媒される。ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅは舌組織（特に舌後部）にも存在することから、４−ＮＱＯによる舌発がんには舌組織中のＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）ＨやＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅの関与が予想される。一般に、がん原性物質を含む外来毒性物質は第Ｉ相、第ＩＩ相の薬物代謝酵素によって代謝され、活性化ないし解毒される。前述したように、他のがん原性物質とは異なり、４−ＮＱＯが発がん性を発揮するには、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０酵素ではなく第ＩＩ相の薬物代謝酵素ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ（ＱＲ）による代謝活性化が必要である。一方、第ＩＩ相の薬物代謝酵素であるＧＳＴ活性の増加を惹起するいくつかの化合物に、発がん抑制作用がみられることが指摘されている。
【００１３】
代表的な化合物は、ニンニク中に含まれている含硫化合物である。本発明者らの実験では、舌後部におけるＱＲ活性は４−ＮＱＯのみの投与群で無処置対照群に比べ、有意に増加していたが、舌前部のＱＲ活性は、無処置対照群とほぼ同様の値であった。
これらの生化学的データは４−ＮＱＯの飲水投与による舌がんは舌後部に特異的に発生するという病理学的所見と一致する。後記する実験１において、ｍｏｒｉｎの混餌投与は舌後部におけるＱＲ活性を低下させたが、舌前部のＱＲ値には影響を及ばさなかった。さらに、ｍｏｒｉｎの混餌投与により肝と舌のＧＳＴ活性は著しく増加し、また、ＱＲ活性も増加した。本発明者らが、新規有機セレニウム化合物が４−ＮＱＯ誘発舌発がんを著明に抑制することを明らかにした以前の研究（Cancer Res. 57: 3644-3648, 1997 ）でも、同様の結果が得られた。肝や舌におけるこれらの酵素の活性修飾は、ｍｏｒｉｎの発がん化学予防に寄与している可能性があるが、その他の機序、例えばａｐｏｐｔｏｓｉｓの誘導やＣＯＸ−２活性の抑制の有無についても考慮する必要がある。
【００１４】
後記する実験２では、予想に反してＡＯＭ誘発大腸発がんに対するｍｏｒｉｎの化学予防効果は、実験１での４−ＮＱＯ誘発舌発がん抑制効果に比べて弱い傾向にあった。その原因は不明である。ＭｏｒｉｎはＬＯＸ−ＣＯＸ活性を抑制することや、ＣＯＸないしＬＯＸ活性阻害物質のいくつかは発がん抑制作用があることから、本発明者らはｍｏｒｉｎの大腸発がんに対する抑制効果を予想して実験を行ったが、この実験ではその抑制効果は舌がん発生抑制と比べて著明ではなかった。最近、ＡＯＭ投与ラットに発生した大腸腫瘍ではＣＯＸ−２活性が増加しているという報告や、選択的なＣＯＸ−２阻害物質がＡＯＭ誘発大腸発がんを抑制するという報告がなされた。恐らく、５００ｐｐｍ  ｍｏｒｉｎ含有飼料の投与では大腸粘膜のＣＯＸ−２活性に影響しなかったものと考えられる。加えて、最近報告されたｍｏｒｉｎのｐｒｏ−ｏｘｉｄａｎｔ作用も後記する実験で認められたｍｏｒｉｎの大腸発がんにおける比較的弱い抑制作用に関係している可能性がある。
【００１５】
ＡＯＭ投与後にｍｏｒｉｎを混餌投与すると大腸粘膜のＧＳＴ、ＱＲの両活性を増加させたが、ＡＯＭとの同時投与ではＧＳＴ活性のみを上昇させた。このような解毒酵素に対する修飾作用もｍｏｒｉｎの比較的弱い大腸発がん抑制作用に関係していることが考えられる。
多様な遺伝子変化を伴う多段階発がんにおいて、細胞増殖は重要な役割を果たしている。ポリアミンやｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅを含むポリアミン合成酵素などは、細胞増殖に関与している。ＰＣＮＡ陽性細胞数の減少はＳ期細胞の減少を反映しており、細胞増殖活性の低下を意味する。最近の細胞回転における分子生物学的解析により、正常な細胞周期ではｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅの発現、チェックポイント制御や修復過程がいかに統制されて行われているか、また、この細胞周期調節はある特定の遺伝子変化によって破壊され得ることが明かとなった。これらの変化は増殖正常組織や増殖性腫瘍組織で生じていると考えられる。したがって、ポリアミン量やＰＣＮＡ陽性細胞数を低下させることは、腫瘍や前がん性病変における細胞増殖活性を抑制することに繋がる。本発明者らの研究では、ポリアミン量（大腸粘膜、舌上皮、血中）やＰＣＮＡ陽性細胞数（大腸粘膜、舌上皮）は、ｍｏｒｉｎの混餌投与で有意に低下した。したがって、ｍｏｒｉｎの発がん抑制効果は標的臓器における細胞増殖の修飾によると考えられる。
【００１６】
以上、ｍｏｒｉｎの発がん抑制効果は、大腸よりも舌において、より効果的であることが明かとなった。このようなｍｏｒｉｎの発がんに対する化学予防効果は、発がん物質により誘発された標的臓器の高増殖活性の制御や第ＩＩ相の薬物代謝酵素の誘導と関連していると考えられた。
本発明の抗腫瘍剤は、例えば、有効成分のモリン、その化学的修飾体、および同効の適宜のモリン誘導体と、薬学的に許容される適宜の担体、から構成され、必要に応じて、任意の副次的成分を配合することができる。上記担体、副次的成分としては、例えば、任意の充填剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、表面活性剤、防湿剤、賦形剤、希釈剤などを使用することができるが、これらに限らず、薬学的に許容される成分であれば、任意の成分を使用することが可能であり、その種類、配合量は特に制限されない。また、製剤形態は、その使用目的に応じて適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、丸薬、カプセルなどの固剤や、液剤、懸濁剤、乳剤などが例示される。本発明の抗腫瘍剤は、化学的予防薬剤として使用する場合、好適には、長期の経口投与が望ましく、その投与量は、投与する者の症状等に応じて適宜選択される。したがって、投与量、投与回数などは特に制限されない。
【００１７】
実験例
次に、実験例に基づいて本発明を具体的に説明する。以下の実験例において、口腔がん、大腸腫瘍について検討したが、大腸腫瘍は、参考例として示したものである。
１）実験動物、食餌、発がん物質
本実験では、４週齢の雄性Ｆ３４４ラツト（静岡実験動物センター、静岡）を使用した。ラットはワイヤー製ケージ内に収容し（３または４匹／ケージ）、飲用水と基礎食ＣＥ−２（日本クレア、東京）は自由摂取とした。動物は、温度２３±２℃、湿度５０±１０％、１２時間の明暗サイクルの条件でコントロールされた動物室で飼育した。実験動物は搬入後、１４日間の検疫を行い、実験群と対照群とに無作為に分けた。実験期間中、基礎食として粉末基礎食ＣＥ−２（３４５．２Ｃａｌ）を使用したが、その成分は粗炭水化物４５．５％、粗タンパク質２４．８％、粗脂肪４６％、粗灰分７．２％、粗セルロース４．２％、ミネラル３．９％、ビタミン混合物１％、水分８．８％であった。
発がん剤としては４−ＮＱＯ（ＣＡＳ５６−５７−５、純度９８％、和光純薬、大阪）、ＡＯＭ（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス）を使用した。ｍｏｒｉｎ（２′、３′、４′５、７ーペンタヒドロキシフラボン）は東京化成工業（東京）より購入した。ｍｏｒｉｎ含有飼料は１００ｐｐｍと５００ｐｐｍの濃度で粉末基礎食ＣＥ−２に混合し、２週間隔で作製した。４−ＮＱＯ溶液（２０ｐｐｍ）は、週１回作製し、実験飼料とともに使用まで冷暗所（４℃）に保管した。尚、ＡＯＭの投与（１５ｍｇ／ｋｇ体重）は午前１０時と１１時の間に胸部皮下注射で行った。
【００１８】
２）実験方法
モリンのがん予防効果を４−ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  １−ｏｘｉｄｅ（４−ＮＱＯ）誘発ラット舌発がんモデル（実験１）ならびにａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ（ＡＯＭ）誘発ラット大腸発がんモデル（実験２）で検討した。モリンは発がん剤投与中（イニシエーション相）ないし発がん剤投与後（後イニシエーション相）に通常の餌（基礎食）に混ぜてラットに与えた（混餌投与）。
【００１９】
（１）実験１
（モリンの４−ＮＱＯ誘発舌発がん抑制効果）
Ｆ３４４雄性ラット１３６匹を実験群とコントロール群に分け、舌がんを誘発するため、７週齢時より４−ＮＱＯを２０ｐｐｍの濃度で飲水投与した。モリンはイニシエーション相、後イニシエーション相に１００ｐｐｍないし５００ｐｐｍの濃度で混餌投与した。モリンのイニシエーンョン相投与は４−ＮＱＯ投与の１週間前から１０週間混餌投与し、その後２２週間は基礎食を投与した。モリンの後イニシエーション相投与は４−ＮＱＯ投与中止の１週間後から２２週間混餌投与した。別に、モリンのみの投与群と未処置対照群を設け、実験は３２週で終了した（図１）。
【００２０】
（２）実験２
（モリンのＡＯＭ誘発大腸発がん抑制効果）
Ｆ３４４雄性ラット５５匹を用い、大腸腫瘍は１５ｍｇ／ｋｇ体重のＡＯＭを週１回、計３回、前胸部に皮下注射して誘発した。モリンは５００ｐｐｍの濃度でイニシエーション相投与では５週間、後イニシエーション相投与では２８週間、混餌投与した。その他、モリンのみの投与群と未処置対照群を設けた（図２）。
【００２１】
（３）病理組織学的検索
実験終了時に犠牲死させた動物は直ちに解剖し、全臓器について肉眼的観察を行い、肉眼所見を記録した後、全臓器を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
舌、大腸では腫瘍数とその大きさも記録した。主要臓器（肝、肺、腎）とともに舌、大腸は型のごとく、脱水・透徹後、パラフィン包埋し、組織学的検討のためへマトキシリン・エオジン染色を行った。
【００２２】
（４）大腸ＡＣＦの解析
１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間、室温にて固定後、大腸を０．５％メチレンブルー溶液で３０秒間染色した。染色後、４０倍（対物４倍）の光学顕微鏡下でＡＣＦを観察した。本実験では大腸を３等分（近位部、中間部、遠位部）し、各部におけるＡＣＦの数とＡＣ数による分布を算定した。
【００２３】
（５）ＰＣＮＡ免疫組織化学染色
舌、大腸粘膜におけるＰＣＮＡ陽性細胞を測定するため、抗ＰＣＮＡ抗体（ＤＡＫＯ社、京都）を用いた酵素抗体法［ａｂｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＡＢＣ）法］でＰＣＮＡ免疫組織化学染色を行った。染色は既報の方法（Cancer Letter. 75: 73-78, 1993）に従った。組織切片作製後、キシレンで脱パラフィン、エタノールで脱キシレン、水洗した後、０．３％過酸化水素水で３０分間インキュべートして内因性ペルオキシターゼ活性を阻止した。次いで、１０％正常ウマ血清と共に室温で３０分間インキュベートし、その後にＰＣＮＡ抗体を用いて染色した。舌におけるＰＣＮＡ陽性細胞の測定は各群から５匹の舌を無作為に選び、１切片で舌前部と後部の非病変部における２００個の重層扁平上皮細胞についてＰＣＮＡ陽性細胞を算定し、１００分率で表した（ＰＣＮＡ陽性率）。大腸におけるＰＣＮＡ陽性細胞数の測定も各群５匹の大腸を無作為に選択し、ＡＣＦおよび非病変部の陰窩で行った。ＡＣＦにおけるＰＣＮＡ陽性細胞数の測定は大腸当たり１０個のＡＣＦについてその構成細胞数とＰＣＮＡ陽性細胞数を測定し、後者を前者で除することにより１００分率で表した（ＰＣＮＡ陽性率）。陰窩での測定は、形が完全に認められる陰窩を各大腸で１５個選び、ＰＣＮＡ陽性細胞数と各陰窩における全細胞数を測定し、ＰＣＮＡ陽性細胞数を全細胞数で除することにより、１００分率で表した（ＰＣＮＡ陽性率）。
【００２４】
（６）ポリアミン量の測定
解剖時に実験１、２の各群から３ないし５匹のラットの舌上皮と大腸粘膜を薄切切片作製用の替え刃ナイフで削ぎ落とし、組織中ポリアミン量の測定に供した。また、血中ポリアミン量は犠牲死の直前にラットの心臓から採血した血液（５ｍｌ）を測定に供した。組織中ならびに血中ポリアミン量の測定は、小出ら（Acta Urol Jpn. 36: 1103-1108, 1990）の方法によって従った。
【００２５】
（７）ＧＳＴおよびＱＲ活性の測定
実験１、２の終了時に、いずれも各群５匹のラットでＧＳＴおよびＱＲ活性を測定した。実験１では、肝、舌上皮の、実験２では大腸粘膜のＧＳＴ活性とＱＲ活性を測定した。肝での測定は動物を犠牲死させ、肝を生理食塩水で還流し血液を除去した後、直ちに細切して活性を測定した。舌上皮や大腸粘膜での測定は、ポリアミン量の測定と同様、薄切切片作製用の替え刃ナイフで上皮、粘膜を削ぎ落とし、酵素活性の測定に供した。得られた測定用サンプルを公知の方法に従い処理し、１−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅを基質としてＧＳＴ活性を、ＮＡＤＨとｍｅｎａｄｉｏｎｅを基質としてＱＲ活性を測定した。すべての分光分析は３４０ｎｍで、各サンプルについて３回測定した。酵素活性の１単位は２５℃で１分当たりｌμｍｏｌの基質転化を触媒する酵素量とした。タンパク量は、基準値にウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄの方法により決定した。
【００２６】
３）統計学的処理
実験１、２における各測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、χ2 検定、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔで処理した。
【００２７】
４）結果
実験１：
（１）一般所見
実験期間中、動物は発がん剤４−ＮＱＯの経口投与およびｍｏｒｉｎの混餌投与に対して十分に耐え、全ての群においてラットに毒性を示す臨床兆候はみられなかった。
組織学的にも、肝、腎、心、肺などの主要臓器において、ｍｏｒｉｎの毒性を示すような病理学組織学的変化はなかった。
【００２８】
（２）舌腫瘍および前がん性病変の発生頻度
上記実験の結果、表１、２に示すようにモリンのイニシエーンョン相投与により、舌がんの発生頻度が有意に低下した（１００ｐｐｍモリン投与で４４％の抑制率、Ｐ＝０．０００４；５００  ｐｐｍ  モリン投与で１００％の抑制率、Ｐ＝０．００００３）。モリンの後イニシエーション相投与でも、舌がんの発生頻度が有意に低下した（１００  ｐｐｍ、５００ｐｐｍのモリン投与でいずれも４４％の抑制率、Ｐ＝０．０００３）。モリンによる毒性作用は実験期間中、みられなかった。
【００２９】
【表１】
0004570184.tif 000003
【００３０】
【表２】
0004570184.tif 000004
【００３１】
（３）舌上皮におけるＰＣＮＡ陽性細胞率
舌上皮におけるＰＣＮＡ陽性細胞率を調べた結果、舌前部におけるＰＣＮＡ陽性細胞率は各群間で差はなかった。舌後部のＰＣＮＡ陽性率は第１群で第７群に比べ、有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。また、第２、３、５群のＰＣＮＡ陽性細胞率は第１群に比べ、有意に低かった（Ｐ＜０．０５ないしＰ＜０．０２）。
【００３２】
（４）舌上皮中および血中ポリアミン量
舌上皮と血中ポリアミン量（ｄｉａｍｉｎｅ量、ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ量、ｓｐｅｒｍｉｎｅ量およびその総和）を調べた結果、４−ＮＱＯのみを与えたラット（第１群）の舌上皮の総ポリアミン量は、無処置ラット（第７群）に比べ有意に高かった（Ｐ＜０．０５）（Ｔａｂｌｅ  ５）。第４、５群の舌上皮と血中の総ポリアミン量は第１群に比べ、有意に低かった（Ｐ＜０．０５、Ｔａｂｌｅｓ５、６）。
【００３３】
（５）肝、舌におけるＧＳＴ、ＱＲ活性
肝、舌のＧＳＴ活性とＱＲ活性を測定した結果、第１群の肝と舌（前部および後部）におけるＧＳＴ活性は、未処置群よりわずかに低かった。第２、３群における肝の、第５群における舌後部の、第２−５群における舌前部のＧＳＴ活性は、第１群に比べ有意に高かった（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０２、Ｐ＜０．００５、Ｐ＜０．００１ないしＰ＜０．０１）。第１群における肝、舌後部のＱＲ活性は第７群に比べ、有意に小さかった（Ｐ＜０．００１）。第３−５群における肝のＱＲ活性は第１群に比べ、有意に高かった（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．００１）。第２−５群における舌後部のＱＲ活性は、第１群に比べ、有意に低下した（Ｒ＜０．００１）。
【００３４】
実験２：
（１）一般所見
実験１と同様、動物は発がん剤ＡＯＭの皮下投与およびｍｏｒｉｎの混餌投与に対して十分に耐え、期間中、全ての群においてラットに毒性を示す臨床兆候を認めなかった。組織学的にも、肝、腎、心、肺などの主要臓器において、ｍｏｒｉｎの毒性を示す病理学組織学的変化はなかった。
【００３５】
（２）腸管腫瘍の発生頻度と発生腫瘍個数
上記実験の結果、表３、４、５に示すように、実験終了時（３２週）の大腸腺がんの発生頻度は、モリンのイニシエーション相投与で軽度の抑制効果があり（４３％の抑制率）、後イニシエーション相投与ではＡＯＭ単独投与群に比べ有意に減少していた（６１％の抑制率、Ｐ＝０．０２３）。実験１と同様、実験期間中にモリンの毒性作用はなかった。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
【表４】
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【００３８】
【表５】
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【００３９】
（３）大腸ＡＣＦの頻度
大腸ＡＣＦの解析結果を調べた結果、ＡＯＭ投与したラット（第１−３群）では、ｍｏｒｉｎ投与の有無に関わらずＡＣＦの発生を認めたが、第４、５群のラット大腸にはＡＣＦを認めなかった。第２、３群の大腸当たりのＡＣＦの頻度、単位面積（ｃｍ2 ）当たりのＡＣＦ数、大腸当たりの総変異陰窩数は、第１群に比べ、有意に低かった（Ｐ＜０．０００５ないしＰ＜０．０１）。しかし、ｆｏｃｕｓ当たりの変異陰窩数については、これらの群間で統計学的有意差はなかった。
【００４０】
（４）陰窩およびＡＣＦにおけるＰＣＮＡ陽性細胞率
大腸陰窩とＡＣＦにおけるＰＣＮＡ陽性細胞率を調べた結果、ＡＣＦのＰＣＮＡ陽性細胞率は正常陰窩に比べ、高い傾向にあった。Ｍｏｒｉｎの混餌投与によりＡＣＦや正常陰窩のＰＣＮＡ陽性細胞率は低下した。第３群のＡＣＦにおけるＰＣＮＡ陽性細胞率は第１群に比べ、有意に低値であった（Ｐ＜０．０５）。
【００４１】
（５）大腸粘膜および血中ポリアミン量
大腸粘膜中および血中ポリアミン量（ｄｉａｍｉｎｅ量、ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ量、ｓｐｅｒｍｉｎｅ量およびその総和）を調べた結果、ＡＯＭのみの投与群（第１群）における大腸粘膜と血中総ポリアミン量は無処置対照群（第５群）に比べ、有意に高かった（Ｐ＜０．００１ないしＰ＜０．０２）。Ｍｏｒｉｎの混餌投与（第２、３群）で大腸粘膜の総ポリアミン量（Ｐ＜０．０２またはＰ＜０．００５、表１３）と血中総ポリアミン量（Ｐ＜０．０５、Ｔａｂｌｅ  １４）は有意に低下した。
【００４２】
（６）大腸におけるＧＳＴ、ＱＲ活性
大腸粘膜ＧＳＴ活性値を調べた結果、ＡＯＭのみの投与群（第１群）の大腸粘膜ＧＳＴ活性、ＱＲ活性は無処置対照群（第５群）に比べて低値であった（Ｐ＜０．００１）。ＡＯＭとｍｏｒｉｎを投与した第２、３群の大腸粘膜ＧＳＴ活性は有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。第３群の大腸粘膜ＱＲ活性も有意に増加していた（Ｐ＜０．０１）。
【００４３】
以上の結果から、フラボノイドであるモリンには舌や大腸におけるがん予防作用が存在することが明かとなった。また、毒性がないことから、ヒト舌がん、大腸がんの予防に応用できることが判明した。
【００４４】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。
実施例１
モリンと結合剤をモリン１０ｍｇ／ペレットとなるように配合して、常法によりペレット状の錠剤を作製し、本発明の抗腫瘍剤としての化学的予防薬を製造した。
【００４５】
実施例２
以下の配合により、液剤を製造した。
モリン                ２５ｍｇ
溶剤                  ５０ｍｌ
【００４６】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明は、フラボノイドの一種のモリン（ｍｏｒｉｎ）を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤に係るものであり、本発明により、１）毒性のない、新しい抗腫瘍剤を提供することができる、２）特に、舌がんなどの口腔がんの抑制作用を有する化学予防薬剤としての抗腫瘍剤を提供することができる、という格別の効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】舌がん抑制実験デザインの説明図である。
【図２】大腸がん抑制実験デザインの説明図である。
【図１】
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【図２】
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