(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合したマイコプラズマ・ホミナス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼを含んでなり、かつ、ポリエチレングリコールが１２，０００〜２８，０００の範囲の全重量平均分子量を有する化合物。
【請求項２】
連結基がスクシンイミド基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネートまたはそれらの組み合わせである、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
アルギニンデイミナーゼが７〜１５個のポリエチレングリコール分子に共有結合している、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
アルギニンデイミナーゼが９〜１２個のポリエチレングリコール分子に共有結合している、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
ポリエチレングリコールが１６，０００から２４，０００までの全重量平均分子量を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
請求項１記載の化合物を有効成分として含んでなる腫瘍を処置するための薬学的製剤。
【請求項９】
腫瘍が黒色腫である、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１０】
ポリエチレングリコールが２０，０００の全重量平均分子量を有する、請求項９記載の薬学的製剤。
【請求項１１】
連結基がスクシンイミド基である、請求項９記載の薬学的製剤。
【請求項１２】
スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項１１記載の薬学的製剤。
【請求項１３】
腫瘍が肝臓癌である、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１４】
連結基がスクシンイミド基である、請求項１３記載の薬学的製剤。
【請求項１５】
スクシンイミド基がスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはそれらの組み合わせである、請求項１４記載の薬学的製剤。
【請求項１６】
腫瘍が肉腫である、請求項８記載の薬学的製剤。
【請求項１７】
ポリエチレングリコールが２０，０００の全重量平均分子量を有する、請求項１３記載の薬学的製剤。
【請求項１８】
請求項１記載の化合物を有効成分として含んでなる原発腫瘍における転位を処置及び抑制するための薬学的製剤。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールに連結基を介して共有結合してマイコプラズマ・ホミナス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼを修飾することを含んでなり、かつポリエチレングリコールが１２，０００から２８，０００までの全重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される化合物。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールに連結基を介してマイコプラズマ・ホミナス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼを共有結合することにより該アルギニンデイミナーゼを修飾することを含んでなる該アルギニンデイミナーゼの循環半減期の増大方法であって、ここで、ポリエチレングリコールが１２，０００から２８，０００までの範囲の全重量平均分子量を有することを特徴とする方法。
【請求項２１】
ポリエチレングリコールに連結基を介してマイコプラズマ・ホミナス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｕｓ）のアルギニンデイミナーゼを共有結合することにより該アルギニンデイミナーゼを修飾すること含んでなる該アルギニンデイミナーゼの殺腫瘍活性の増大方法であって、該ポリエチレングリコールが１２，０００から２８，０００までの範囲の全重量平均分子量を有し、そして連結基がスクシンイミド基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基及びそれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は１９９７年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／０４６，２００号及び１９９８年２月１３日に出願された米国特許出願第０９／０２３，８０９号に対する優先権の利益を主張する。
発明の分野
本発明はポリエチレングリコールで修飾されたアルギニンデイミナーゼ、癌の処置方法並びに転移の処置及び／または抑制方法に関する。
発明の背景
悪性黒色腫（３期）及び肝臓癌は診断の１年以内に大部分の患者を死亡させる致死疾患である。米国では、年間約１６，０００人の人々がこれらの疾病で死亡する。黒色腫の発生率は米国において急速に増加しており、豪州のような他の国々におけるよりさらに高い。肝炎がその土地特有である世界の地域で、肝臓癌の発生はいっそう多い。例えば、肝臓癌は日本及び台湾における癌の主要な型の一つである。これらの疾病の有効な処置は緊急に必要とされる。
必須アミノ酸の選択的剥奪はある型の癌を処置するために用いられている。最もよく知られている例は、急性リンパ芽球性白血病の処置としてアスパラギンのレベルを下げるためのＬ−アスパラギナーゼの使用である。最も頻繁に用いられるＬ−アスパラギナーゼはエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離される。しかしながら、Ｙ．Ｋ．Ｐａｒｋ等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：３７３−３７６（１９８１）により記述されたように、この酵素の固有の抗原性及び短い循環半減期によりその臨床使用には信頼性が低下している。例えば、Ｐａｒｋ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、上記；Ｙ．Ｋａｍｉｓａｋｉ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２１６：４１０−４１４（１９８１）；及びＹ．Ｋａｍｉｓａｋｉ等、Ｇａｎｎ．、７３：４７−４７４（１９８２）により記述されたように、ポリエチレングリコールでのエシェリキア・コリＬ−アスパラギナーゼの共有結合的修飾はその抗原性を減少し、そしてその循環半減期を延ばす。癌の処置のために他の必須アミノ酸分解酵素を同定しようと多くの努力がなされているが、主として、必須アミノ酸の剥奪は自明のこととして多数の重い副作用をもたらすので、いずれも認可されていない。
アルギニンのような非必須アミノ酸を分解する酵素はある型の癌を制御する有効な手段となる可能性があると報告されている。例えば、シュードモナス・プジタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）から単離されたアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）はＪ．Ｂ．Ｊｏｎｅｓ、”Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ｏｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ、”博士論文、オクラホマ大学、１−１６５頁（１９８１）により記述された。シュードモナス・プジタから単離されたＡＤＩは、インビトロで腫瘍細胞を殺すことに有効であるが、中性ｐＨでほとんど酵素活性がなく、そして実験毒物の血液循環から迅速に取り除かれるので、インビボで効能を示すことができなかった。マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）から得られたアルギニンデイミナーゼは、例えば、Ｔａｋａｋｕ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５１：２４４−２４９（１９９２）及び米国特許第５，４７４，９２８号により記述されており、その開示は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。しかしながら、そのような異種起源のタンパク質の治療的使用と関係する問題はその抗原性である。ポリエチレングリコールでの塩化シアヌル酸連結基を介したマイコプラズマ・アルギニニからのアルギニンデイミナーゼの化学修飾は、Ｔａｋａｋｕ等、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８４：１１９５−１２００（１９９３）により記述された。しかしながら、修飾されたタンパク質は塩化シアヌル酸連結基からのシアン化物の遊離のために代謝された場合有毒であった。
非必須アミノ酸を分解し、そして先行類似技術と関係する問題がない組成物が必要とされる。本発明はこれら及び他の重要な目的に関する。
発明の要約
本発明はポリエチレングリコールで修飾されたアルギニンデイミナーゼに関する。好ましい態様として、アルギニンデイミナーゼは直接または生体適合性連結基を介して約１，０００〜約５０，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで修飾される。
本発明の別の態様は、例えば、肉腫、肝臓癌及び黒色腫を初めとする癌の処置方法に関する。また、本発明は腫瘍細胞の転移の処置及び／または抑制方法にも関する。
本発明のこれら及び他の態様は以下の本発明の詳細な説明において明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
図１はマイコプラズマ・アルギニニ（ＡＤＩＰＲＯＴと認定された一番上のアミノ酸配列）、マイコプラズマ・アルトリチデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）（ＡＲＴＡＤＩＰＲＯと認定された真ん中のアミノ酸配列）及びマイコプラズマ・ホミナス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｕｓ）（ＨＯＭＡＤＩＰＲＯと認定された一番下のアミノ酸配列）からクローン化されたアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列を示す。
図２Ａ及び２Ｂはマウスにおいて血清アルギニンレベル及び血清シトルリンレベルに対する天然のアルギニンデイミナーゼ及びポリエチレングリコール（例えば、分子量５，０００）で修飾されたアルギニンデイミナーゼの単一投与量の影響を示すグラフである。
図３は様々な連結基を介してＰＥＧ１０，０００をＡＤＩに共有結合的につないだ場合の血清アルギニンレベルに対する影響を示すグラフである。
図４は単一投与量のＰＥＧ−ＡＤＩを注射したマウスにおいてシトルリン生成に対して連結基及びポリエチレングリコールの分子量が有する影響を示すグラフである。
図５Ａ及び５ＢはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００が血清アルギニン及びシトルリンレベルに対して有した投与量反応を示すグラフである。図５Ｃ及び５ＤはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００が血清アルギニン及びシトルリンレベルに対して有した投与量反応を示すグラフである。
図６は天然のＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００及びＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を示すグラフである。
図７はＳＫ−ｍｅｌ ２ヒト黒色腫細胞を注射したマウスにおいて腫瘍の大きさに対してＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００での処置が有した影響を示すグラフである。
図８はＳＫ−ｍｅｌ ２８、ＳＫ−ｍｅｌ ２またはＭ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射したマウスにおいて腫瘍の大きさに対してＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００での処置が有した影響を示すグラフである。
図９はヒト肝臓癌ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞を注射したマウスの生存に対してＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００、ＡＤＩ−ＰＥＧ１２，０００またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００での処置が有した影響を示すグラフである。
発明の詳細な説明
正常細胞はアルギノコハク酸シンターゼ及びアルギノコハク酸リアーゼにより触媒される２段階の工程でシトルリンからアルギニンを合成できるので、それらは増殖のためにアルギニンを必要としない。それに反して、黒色腫、肝臓癌及びいくつかの肉腫はアルギノコハク酸シンターゼを発現せず；それ故、それらはアルギニン栄養要求性である。これらの型の癌を処置するための安全で且つ有効な治療を開発するためにこの代謝の違いを利用することができる。アルギニンデイミナーゼはシトルリンへのアルギニンの転化を触媒し、アルギニンを除くためにそれを用いることができる。従って、アルギニンデイミナーゼを黒色腫、肝臓癌及びいくつかの肉腫の処置として利用することができる。
天然のアルギニンデイミナーゼを微生物において見いだすことができ、それは患者において抗原性であり、血液循環から迅速に取り除かれる。アルギニンデイミナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有結合的に修飾することによりこれらの問題を克服することができる。（連結基でまたはそれなしに）ポリエチレングリコールで共有結合的に修飾されたアルギニンデイミナーゼを以下「ＡＤＩ−ＰＥＧ」と呼ぶことができる。天然のアルギニンデイミナーゼに比較した場合、ＡＤＩ−ＰＥＧはその酵素活性の大部分を保持し、はるかに抗原性が低く、非常に長い循環半減期を有し、そして腫瘍の処置においてはるかに有効である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は一般式Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ、式中、ｎは少なくとも４である、により表される分枝鎖または直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物をさす。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」はそのおおよその重量平均分子量を示すために数字の添字と組み合わせて用いられる。例えば、ＰＥＧ５，０００は約５，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；ＰＥＧ１２，０００は約１２，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；そしてＰＥＧ２０，０００は約２０，０００の全重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさす。
「黒色腫」は、口腔、食道、肛門管、膣、脳軟膜及び／または結膜もしくは眼を初めとする、皮膚及び他の器官のメラニン形成細胞系から生じる悪性または良性の腫瘍であってもよい。「黒色腫」という用語は、例えば、先肢端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫及び表在拡大型黒色腫を含む。
「肝臓癌」は例えば肝細胞癌を初めとする肝臓の悪性または良性の腫瘍であってもよい。
「患者」は動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをさす。
「生体適合性」は、生物学的機能に一般的に有害でなく、そしてアレルギーを起こす及び疾病状態を初めとするいかなる程度の容認できない毒性ももたらさない物質または化合物をさす。
本開示の全体にわたって、以下の略語を用いることができる：ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＡＤＩ、アルギニンデイミナーゼ；ＳＳ、スクシンイミジルスクシネート；ＳＳＡ、スクシンイミジルスクシンアミド；ＳＰＡ、スクシンイミジルプロピオネート；及びＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド。
本発明はポリエチレングリコールで修飾されたＡＤＩがある型の癌の処置及び癌の転移の抑制において優れた結果を与えるという予期しない発見に基づく。好ましい態様は連結基を利用するが、連結基でまたはそれなしにポリエチレングリコールにＡＤＩを共有結合的につなぐことができる。
本発明において、例えば、微生物、組み換えバイオテクノロジーまたはそれらのあらゆる組み合わせを初めとするあらゆる起源からアルギニンデイミナーゼ遺伝子を得るか、クローン化するかまたは製造することができる。好ましくは、マイコプラズマ属の微生物からアルギニンデイミナーゼをクローン化する。より好ましくは、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ホミナス、マイコプラズマ・アルトリチデスまたはそれらのあらゆる組み合わせからアルギニンデイミナーゼをクローン化する。特に、本発明において用いられるアルギニンデイミナーゼは、図１において示されるアミノ酸配列の１つまたはそれ以上を有することができる。
本発明の一つの態様として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は約１，０００〜約５０，０００；より好ましくは約３，０００から約４０，０００まで、より好ましくは約５，０００から約３０，０００まで；より好ましくは約８，０００から約３０，０００まで；より好ましくは約１１，０００から約３０，０００まで；さらにより好ましくは約１２，０００から約２８，０００まで；なおより好ましくは約１６，０００から約２４，０００まで；さらにより好ましくは約１８，０００から約２２，０００まで；さらにより好ましくは約１９，０００から約２１，０００まで、そして最も好ましくは約２０，０００の全重量平均分子量を有する。通例、３０，０００またはそれ以上の分子量を有するポリエチレングリコールは溶解するのが困難であり、配合生成物の収率を非常に下げる。ポリエチレングリコールは分枝鎖または直鎖、好ましくは直鎖であってもよい。通例、ポリエチレングリコールの分子量を増すことによりＡＤＩの免疫原性は減少する。例えば、黒色腫、肝臓癌及び肉腫を初めとする癌、好ましくは黒色腫を処置するために、本態様において記述された分子量を有するポリエチレングリコールをＡＤＩ及び場合により生体適合性の連結基と結合して用いることができる。
本発明の別の態様として、ポリエチレングリコールは約１，０００〜約５０，０００；好ましくは約３，０００〜約３０，０００、より好ましくは約３，０００から約２０，０００まで；より好ましくは約４，０００から約１２，０００まで；なおより好ましくは約４，０００から約１０，０００まで；さらにより好ましくは約４，０００から約８，０００まで；なおより好ましくは約４，０００から約６，０００までの全重量平均分子量を有し；約５，０００が最も好ましい。ポリエチレングリコールは分枝鎖または直鎖、好ましくは直鎖であってもよい。例えば、黒色腫、肝臓癌及び肉腫を初めとする癌、好ましくは肝臓癌を処置するために、本態様において記述された分子量を有するポリエチレングリコールをＡＤＩ及び場合により生体適合性の連結基と結合して用いることができる。
ＰＥＧにＡＤＩを共有結合的につなぐために用いられる連結基はあらゆる生体適合性の連結基であってもよい。上に説明したように、「生体適合性」は、化合物または基が無毒であり、そして損傷、疾病、疾患または死を引き起こさずにインビトロまたはインビボでそれを利用できることを示す。例えば、エーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合を介して、ＰＥＧを連結基につなぐことができる。適当な生体適合性の連結基は、例えば、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、（例えば、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を初めとする）マレイミド基、エポキシド基、（例えば、カルボニルジイミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ＣＤＩ）を初めとする）オキシカルボニルイミダゾール基、（例えば、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）もしくはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を初めとする）ニトロフェニル基、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミンを含む。好ましくは、生体適合性の連結基はエステル基及び／またはマレイミド基である。より好ましくは、連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳであり；ＳＳ、ＳＰＡまたはＮＨＳがより好ましく、ＳＳまたはＳＰＡが最も好ましい。
あるいはまた、アミノ基、スルフィドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介してＡＤＩを直接（すなわち、連結基なしに）ＰＥＧに連結してもよい。
例えば、Ｐａｒｋ等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１：３７３−３７６（１９８１）；並びにＺａｐｌｉｐｓｋｙ及びＬｅｅ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、２１章（１９９２）により記述されたように、当該技術分野において知られている方法を用いて、生体適合性の連結基を介してＰＥＧにＡＤＩを共有結合的につなぐことができ、それらの開示は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。
ＡＤＩへのＰＥＧの結合はＡＤＩの循環半減期を増加する。通例、ＡＤＩの第一級アミンにＰＥＧを結合させる。アルギニンデイミナーゼ上のポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者に知られているように、タンパク質の活性ドメイン内の部位の各々の役割により決定される。酵素活性の実質的な損失なしにアルギニンデイミナーゼの第一級アミンにＰＥＧを結合することができる。例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・アルトリチデス及びマイコプラズマ・ホミナスからクローン化されたＡＤＩは、この方法により修飾することができる約１７個のリシンを有する。すなわち、１７個のリシンは全て、ＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡ及び／またはＮＨＳのような生体適合性の連結基を介してＰＥＧにＡＤＩを結合することができる可能な場所である。また、本開示を考慮に入れて当業者に明らかなように、ＡＤＩ上の他の部位にＰＥＧを結合してもよい。
１から約３０までのＰＥＧ分子をＡＤＩに共有結合的につなぐことができる。好ましくは、約７〜約１５のＰＥＧ分子、より好ましくは約９から約１２までのＰＥＧ分子でＡＤＩを修飾する。すなわち、アルギニンデイミナーゼ中の第一級アミノ基の約３０％〜約７０％をＰＥＧで修飾し、アルギニンデイミナーゼ中の第一級アミノ基の好ましくは約４０％〜約６０％、より好ましくは約４５％〜約５５％、最も好ましくは約５０％をＰＥＧで修飾する。ＰＥＧをＡＤＩの末端に共有結合的につなぐ場合、好ましくは１ＰＥＧ分子のみを利用する。ＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数を増すことにより酵素の循環半減期は増加する。しかしながら、ＡＤＩ上のＰＥＧ単位の数を増すことにより酵素の比活性は減少する。従って、本開示を考慮に入れて当業者に明らかなように、それら２つの間のバランスを取ることが必要である。
本発明において、最も好ましい生体適合性連結基の共通の特徴は、それらがマレイミド基を介してアルギニンデイミナーゼの第一級アミンに結合することである。いったんアルギニンデイミナーゼと連結されると、ＳＳ−ＰＥＧはＰＥＧの隣にエステル結合を有し、それによりこの部位は体内でＡＤＩからＰＥＧを遊離することができる血清エステラーゼに感受性になる可能性がある。ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＰＥＧ２−ＮＨＳはエステル結合がなく、従って、それらは血清エステラーゼに感受性ではない。
本発明において、特定の連結基がＰＥＧ−ＡＤＩの循環半減期またはその比酵素活性に影響を与えないようである。しかしながら、本発明において生体適合性の連結基を用いることは重要である。タンパク質に結合するＰＥＧはＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＳＣ−ＰＥＧでのように単鎖であってもよく、またはＰＥＧ２−ＮＨＳでのようにＰＥＧの分枝鎖を用いてもよい。本発明における好ましい連結基の構造式を以下に記述する。
0004456184.tif 000002
本発明の化合物のいずれかの治療的に有効な量は、腫瘍成長を抑制するために有効な量である。通例、少量の投薬量で処置を開始し、その状況下で最適な結果が得られるまでわずかな増分でそれを増やすことができる。通例、本発明の化合物の治療投薬量は週に２回ないし２週毎に１回で約１から約２００ｍｇ／ｋｇまでであってもよい。例えば、投薬量は２ｍｌの静脈内注射として週に１回約１ｍｇ／ｋｇないし３日毎に１回約２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００での最適投薬は週に約２回であってもよく、一方、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００での最適投薬は週に約１回から２週毎に約１回までであってもよい。注射前に、ＰＥＧ−ＡＤＩをリン酸緩衝食塩水溶液または当業者に知られているあらゆる他の適切な溶液と混合してもよい。必要な場合、ＰＥＧ−ＡＤＩ配合物を固体（凍結乾燥品（ｌｙｏｐｈａｌａｔｅ））としてまたは液体配合物として投与することができる。
本発明の方法はインビトロまたはインビボ用途のどちらも含むことができる。細胞培養用途を初めとするインビトロ用途の場合、本明細書に記述される化合物を培養物中の細胞に添加し、次に、インキュベートすることができる。また、当該技術分野において周知の抗体製造技術を用いて、モノクローナル及び／またはポリクローナル抗体の製造を容易にするために本発明の化合物を用いてもよい。次に、当業者に明らかなように、モノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を多種多様な診断用途に用いることができる。
本発明の化合物の投与のインビボ手段は意図される用途により変わる。当業者が認識するように、例えば、経口的、鼻内、腹腔内、非経口的、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質、動脈内、皮下、眼内、滑液内、経表皮的及び経皮的に本発明のＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の投与を実施することができる。
実施例
本発明は以下の実施例においてさらに示され、それらは例示の目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１：組み換えＡＤＩの製造
マイコプラズマ・アルギニニ（ＡＴＣＣ ２３２４３）、マイコプラズマ・ホミナス（ＡＴＣＣ ２３１１４）及びマイコプラズマ・アルトリチデス（ＡＴＣＣ ２３１９２）の培養物をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。
Ｓ．Ｍｉｓａｗａ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３６：１４５−１５５（１９９４）により以前に記述されたようにマイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ホミナス及びマイコプラズマ・アルトリチデスからアルギニンデイミナーゼをクローン化し、エシェリキア・コリにおいて発現させ、その開示は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。上記の種の各々からのアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列を図１に記述する。ＡＤＩＰＲＯＴと認定された一番上のアミノ酸配列はマイコプラズマ・アルギニニからであり；ＡＲＴＡＤＩＰＲＯと認定された真ん中のアミノ酸配列はマイコプラズマ・アルトリチデスからであり；そしてＨＯＭＡＤＩＰＲＯと認定された一番下のアミノ酸配列はマイコプラズマ・ホミナスからである。アミノ酸配列の各々は９６％より多く保存されている。当業者に知られている方法による、比酵素活性、Ｋm、Ｖmax及びｐＨ最適条件に関するタンパク質の各々の特性化から、それらが生化学的に相互から区別できないことが示された。クエン酸バッファー（ｐＨ５−６．５）、リン酸バッファー（ｐＨ６．５−７．５）及びホウ酸バッファー（ｐＨ７．５−８．５）を用いてｐＨ最適条件を決定した。様々な濃度のアルギニンと酵素をインキュベートし、シトルリン生成を定量することによりＫm及びＶmaxを決定した。各種酵素のＫmは約０．０２〜０．０６μＭであり、Ｖmaxは約１５−２０μｍｏｌ／分／ｍｇであり、それらの値は相互の標準誤差内である。
例えば、Ｔ．Ｏｈｎｏ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８：３７８８−３７９５（１９９０）により記述されたような、マイコプラズマ・アルギニニの公開された配列から得られた以下のプライマー対：
0004456184.tif 000003
を用いてポリメラーゼ連鎖反応によりアルギニンデイミナーゼ遺伝子を増幅し、その開示は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応産物をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして発現プラスミドｐＱＥ１６中にクローン化した。ＤＮＡ配列分析により、このフラグメントがＯｈｎｏ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、上記により記述されたアルギニンデイミナーゼ遺伝子の同じ配列を有することが示された。例えば、Ｊ．Ｒ．Ｓａｙｅｒｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：５９２−５９６（１９９２）により教示されたように、エシェリキア・コリにおける遺伝子発現の前にオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、マイコプラズマにおいてトリプトファンをコードするＡＤＩ遺伝子中の５個のＴＧＡコドンをＴＧＧコドンに変えた。組み換えＡＤＩを全細胞タンパク質の１０％のレベルで封入体で発現した。
上記の３種のマイコプラズマの各々からのタンパク質は約９５％の相同性を有し、カラムクロマトグラフィーにより容易に精製される。１リットルの発酵培地から約１．２ｇの純粋なタンパク質を単離することができる。組み換えＡＤＩは３７℃で約２週間、そして４℃で保存した場合には少なくとも８カ月間安定である。当業者に知られている方法により測定した場合、それらのタンパク質はアルギニンに対する高い親和性（０．０４μＭ）及び約７．２〜約７．４の生理的ｐＨ最適条件を有した。
実施例２：組み換えＡＤＩの再生及び精製
Ｍｉｓａｗａ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３６：１４５−１５５（１９９４）により記述されたように、わずかに修飾してＡＤＩタンパク質を再生させ、その開示は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。１００ｇの細胞ペーストを８００ｍｌの１０ｍＭ Ｋ2ＰＯ4ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（バッファー１）中に再懸濁し、ミクロ流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に２回通すことにより細胞を壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を４％（ｖ／ｖ）の最終濃度を得るように添加した。ホモジェネートを４℃で３０分間撹拌し、次に、１３，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを集め、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する１リットルのバッファー１中に再懸濁した。１００ｋＤの保持定格を有する中空繊維カートリッジ（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）を用いて５容量の変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＤＴＴ）に対して溶液をダイアフィルトレートした（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。グアニジンＨＣｌを６Ｍの最終濃度を得るように添加し、溶液を４℃で１５分間撹拌した。溶液を巻き戻しバッファー１、１０ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、ｐＨ７．０中に１００倍希釈し、１５℃で４８時間撹拌し、１５，０００ ｘ ｇでの遠心分離により微粒子を除いた。
得られた上清を巻き戻しバッファに前以て平衡化したＱセファロースパーストフロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｐａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムで濃縮した。０．２Ｍ ＮａＣｌを含有する巻き戻しバッファーを用いてＡＤＩを溶出させた。その精製方法によりＡＤＩタンパク質が得られ、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により見積もった場合に＞９５％純粋であった。８ｇの純粋な再生されたＡＤＩタンパク質が１ｋｇの細胞ペーストから得られ、それは１リットルの発酵当たり２００ｍｇの精製されたＡＤＩに相当する。
Ｏｇｉｎｓｋｙ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、（１９５７）３：６３９−６４２により記述された方法のわずかな修飾によりＡＤＩ活性を測定した。０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4、ｐＨ７．０（ＢＵＮアッセイバッファー）中１０μｌのサンプルを９６ウェルマイクロタイタープレート中に入れ、ＢＵＮアッセイバッファー中４０μｌの０．５ｍＭアルギニンを添加し、プレートを覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。２０μｌの完全ＢＵＮ試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加し、プレートを１００℃で１０分間インキュベートした。次に、プレートを２２℃に冷却し、マイクロタイタープレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）により４９０ｎｍで分析した。１．０ＩＵは１分当たり１μｍｏｌｅのＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに転化する酵素の量である。ウシ血清アルブミンを基準としてＰｉｅｒｃｅクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてタンパク質濃度を決定した。
精製されたＡＤＩ調製物の酵素活性は１７−２５ＩＵ／ｍｇであった。
実施例３：ＡＤＩへのＰＥＧの結合
１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４中でＡＤＩにＰＥＧを共有結合的につないだ。簡潔に言えば、リン酸バッファ中のＡＤＩを１００モル過剰のＰＥＧと混合した。反応を室温で１時間撹拌し、次に、取り込まれなかったＰＥＧを除くために混合物を長く透析した（ｄｉａｌｉｓｉｚｅｄ）。
ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物において用いられる連結基の影響を評価する第一の実験を実施した。４種の異なる連結基を介してＰＥＧ１０，０００及びＡＤＩを共有結合的につないだ：ＳＳ、ＳＳＡ、ＳＰＡ及びＳＳＰＡを初めとするエステル基またはマレイミド基、その場合、ＰＥＧは５，０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３０，０００及び４０，０００の全重量平均分子量を有した；エポキシ基、ＰＥＧ−エポキシ、その場合、ＰＥＧは５，０００の全重量平均分子量を有した；並びに分枝状ＰＥＧ基、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、その場合、ＰＥＧは１０，０００、２０，０００及び４０，０００の全重量平均分子量を有した。
得られた組成物の５．０ＩＵをマウス（各群で５匹のマウス）に注射した。アルギニンの血清レベルを測定するために、マウスの後部眼窩集網叢（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）から瀉血した（１００μｌ）。採集後すぐに等容量の５０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を添加した。沈殿物を遠心分離（３０分間１３，０００ ｘ ｇ）により除き、上清を取り出し、−７０℃で凍結保存した。次に、製造業者により与えられるプロトコルを用いてＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからの自動アミノ酸分析器及び試薬を用いてサンプルを分析した。この方法によるシトルリンの感度の限界は約２−６μＭであり、測定の再現性は約８％以内であった。血清アルギニンの量をアミノ酸分析により決定した。図３における結果から認めることができるように、ＰＥＧ及びＡＤＩを共有結合的につないでいる連結基は、インビボで血清アルギニンを減らすＡＤＩの能力に対して容易に判断できる影響がなかった。すなわち、無毒の連結基がインビボ用途のために用いられなければならないことを除いて、連結基は実験の結果に対して重要ではない可能性がある。
インビボで血清シトルリンレベルに対する連結基及びＰＥＧの分子量の影響を評価する第二の実験を実施した。マウス（各群で５匹）に５．０ＩＵの量でＡＤＩ及びＰＥＧ−ＡＤＩの各種組成物を与えた。シトルリンの血清レベルを測定するために、マウスの後部眼窩集網叢から瀉血した（１００μｌ）。採集後すぐに等容量の５０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を添加した。沈殿物を遠心分離（３０分間１３，０００ ｘ ｇ）により除き、上清を取り出し、−７０℃で凍結保存した。次に、製造業者により与えられるプロトコルを用いてＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからの自動アミノ酸分析器及び試薬を用いてサンプルを分析した。この方法によるシトルリンの感度の限界は約２−６μＭであり、測定の再現性は約８％以内であった。シトルリンの量を測定し、曲線下の領域を概算し、μｍｏｌ日として表した。
図４において、白丸は天然のＡＤＩにより生成されたシトルリンの量を示し、黒丸はＡＤＩ−ＳＣ−ＰＥＧであり、白四角はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧであり、白三角はＡＤＩ−ＳＰＡ−ＰＥＧであり、そして黒三角は分枝鎖状ＰＥＧ−ＮＨＳ−ＰＥＧ2である。図４における結果はＰＥＧの分子量がＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果を決定することを示す。生体適合性の連結基がインビボ用途のために用いられなければならないことを除いて、ＰＥＧ−ＡＤＩ組成物の効果は必ずしもＡＤＩへのＰＥＧの結合の方法または手段に基づかない。
また、図４における結果はＰＥＧの最適分子量が２０，０００であることも示す。ＰＥＧ３０，０００はその薬効学の点においてＰＥＧ２０，０００より優れているようであるが、ＰＥＧ３０，０００はあまり可溶性でなく、それにより作業するのがより困難になる。酵素活性の回収に基づく収率はＰＥＧ５，０００及びＰＥＧ１２，０００では約９０％；ＰＥＧ２０，０００では約８５％、そしてＰＥＧ３０，０００では約４０％であった。従って、シトルリン生成により決定する場合、ＰＥＧ２０，０００が収率と循環半減期の間の最も望ましい妥協案である。
第三の実験では、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００及びＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００での血清アルギニン減少及びシトルリンの生成の投与量反応を測定した。マウス（各群で５匹）に０．０５ＩＵ、０．５ＩＵまたは５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００のいずれかの１回の注射を与えた。示した時間で上記のように血清を集め、血清アルギニン（図５Ａ及び５Ｃ）並びに血清シトルリン（図５Ｂ及び５Ｄ）を定量するためにアミノ酸分析を実施した。両方の配合物は投与量に依存する血清アルギニンの減少及び血清シトルリンの増加を誘導した。しかしながら、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００により誘導された結果はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により誘導された結果より顕著であり且つ長い期間のものであった。
実施例４：ＡＤＩによりもたらされる細胞毒性の選択性
多数のヒト腫瘍を用いてアルギニンデイミナーゼによりもたらされる細胞毒性の選択性を示した。具体的には、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００（５０ｎｇ／ｍｌ）に対する感受性に関してヒト腫瘍をインビトロで試験した。７日後に培養物の生存度を測定した。「抑制された」と定義される培養物では、９５％より多くの細胞がトリパンブルー色素を取り込まなければならない。また、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞及び繊維芽細胞を初めとする正常細胞の宿主も試験し、いずれもＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００により抑制されなかった。アルギニンデイミナーゼは正常及び大部分の腫瘍細胞に対していかなる容易に判断できる毒性ももたないが、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００はＡＴＣＣ、ＭＳＫＣＣ及びＥｕｒｏｐｅから市販されている全てのヒト黒色腫及び肝臓癌を非常に抑制した。
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対応する組の実験において、腫瘍からｍＲＮＡを単離した。ヒトアルギノコハク酸シンターゼｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析により、アルギニンデイミナーゼ処置に対する感受性とアルギノコハク酸シンターゼを発現できないことの間に完全な一致が示された。このデータから、ＡＤＩ毒性がアルギノコハク酸シンターゼを誘導できないことの結果生じることが示唆される。それ故、これらの細胞はシトルリンからアルギニンを合成できず、増殖のために必要なタンパク質を合成することができない。
実施例５：循環半減期
図３Ａ（→２Ａ？）及び３Ｂ（→２Ｂ？）において示されるように、天然のアルギニンデイミナーゼまたはポリエチレングリコールで修飾されたアルギニンデイミナーゼの各種配合物のいずれかの単一の５．０ＩＵ投与量をＢａｌｂ Ｃマウス（各群で５匹）に静脈内注射した。アルギニン及びシトルリンの血清レベルを測定するために、マウスの後部眼窩集網叢から瀉血した（１００μｌ）。採集後すぐに等容量の５０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を添加した。沈殿物を遠心分離（３０分間１３，０００ ｘ ｇ）により取り除き、上清を取り出し、−７０℃で凍結保存した。次に、製造業者により与えられるプロトコルを用いてＢｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからの自動アミノ酸分析器及び試薬を用いてサンプルを分析した。この方法によるアルギニンの感度の限界は約６ｐＭであり、測定の再現性は約８％以内であった。
図２Ａにおける黒丸により示されるような血清アルギニンレベルの投与量依存的減少及び図２Ｂにおける白三角により示されるような血清シトルリンの増加が、天然のＡＤＩ（黒丸）またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ（白三角）の単一投与量の投与から検出された。しかしながら、血清アルギニンの減少及び血清シトルリンの増加はつかの間であり、すぐに平均水準に戻った。アルギニン減少の半減期を以下の表に要約する。
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この実験から、正常細胞及び組織は細胞内でシトルリンをアルギニンに転化し戻すことができ、一方、黒色腫及び肝臓癌はアルギノコハク酸シンテターゼを欠くのでそれができないことが示される。
実施例６：ＰＥＧ修飾されたＡＤＩの抗原性
天然のＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００及びＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の抗原性を測定するために、例えば、Ｐａｒｋ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、上記及びＫａｍｉｓａｋｉ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、上記中に記述された方法に従った。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ Ｃマウス（各群で５匹）に約０．５ＩＵ（１００μｇのタンパク質）の天然のＡＤＩ、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００またはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を毎週１２週間静脈内注射した。実験の開始時並びに４、８及び１２週で動物の後部眼窩集網叢から瀉血した（０．０５ｍｌ）。血清を単離し、−７０℃で保存した。抗−ＡＤＩ ＩｇＧの力価をＥＬＩＳＡにより測定した。５０μｇのＡＤＩを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、室温で４時間インキュベートした。プレートをＰＢＳですすぎ、次に、非特異的タンパク質結合部位をブロックするためにウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）で覆い、４℃で一晩保存した。マウスからの翌日の血清を希釈し、それらのウェルに添加した。１時間後にプレートをＰＢＳですすぎ、ペルオキシダーゼに連結したウサギ抗−マウスＩｇＧをウェルに添加した。プレートを３０分間インキュベートし、次に、得られたＵＶ吸光度をマイクロタイタープレート読み取り装置を用いて測定した。バックグラウンドの吸光度（約０．５０ＯＤ）から２倍の増加をもたらす血清の最も高い希釈として力価を定義した。
結果を図６に示す。白丸は天然のＡＤＩを注射した動物から得られたデータを表し、それは非常に抗原性である。黒丸はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００を注射した動物から得られたデータを表し、一方、白三角はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を注射した動物から得られたデータを表す。図６から認めることができるように、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００及びＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００は天然のＡＤＩより著しく抗原性が低い。例えば、天然のＡＤＩのわずか４回の注射により約１０6の力価が生じ、一方、ＰＥＧ−ＡＤＩ配合物のいずれもの４回の注射はいかなる測定可能な抗体も生産することができなかった。しかしながら、８回の注射後、ＡＤＩ−ＰＥＧ５，０００は約１０2の力価を有し、一方、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０，０００は約１２回の注射後までこれだけの免疫応答を誘導しなかった。それらの結果はＡＤＩにＰＥＧを結合することによりタンパク質への免疫応答が弱められることを示す。
実施例７：ヒト黒色腫の腫瘍抑制
ヌードマウスにおけるヒト黒色腫（ＳＫ−Ｍｅｌ ２８（→２？））の成長に対するＰＥＧ−ＡＤＩの効果を測定した。ヌードマウス（各群で５匹）に１０6のＳＫ−ｍｅｌ２ヒト黒色腫細胞を注射し、腫瘍が約３−５ｍｍの直径に達するまで成長させた。マウスを未処置のままにするか（白丸）または５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００（黒三角）、ＡＰＩ−ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００（白三角）もしくはＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００（黒丸）で週に１回１２週間処置した。腫瘍の大きさを毎週測定し、腫瘍の平均直径を図７に示す。
図８はヌードマウスにおいてインビボで成長させた３種のヒト黒色腫（ＳＫ−ｍｅｌ２、ＳＫ−ｍｅｌ２８、Ｍ２４−ｍｅｔ）に対するＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の効果を示す。ヌードマウス（各群で５匹）に１０6のＳＫ−ｍｅｌ２、ＳＫ−ｍｅｌ２８またはＭ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射した。腫瘍を約３−５ｍｍの直径になるまで成長させた。その後、動物に５．０ＩＵのＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００を週に１回注射した。結果を図８に示し、それによりＰＥＧ−ＡＤＩが腫瘍成長を抑制したこと及び最終的に腫瘍が退縮及び消失し始めたことが示される。腫瘍はアルギノコハク酸シンテターゼ（ｓｙｎｔｈａｔａｓｅ）をもたなかったので、それらはタンパク質を合成できず（ＡＤＩがアルギニンを除き、それらの腫瘍はそれを作ることができなかったので）、その結果、細胞は「餓死した」。
Ｍ２４−ｍｅｔヒト黒色腫は非常に転移性であるので、Ｍ２４−ｍｅｔヒト黒色腫細胞を注射した動物を４週の処置後に屠殺し、動物の肺における転移の数を測定した。コントロール動物は平均して３２の転移があり、一方、ＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００で処置した動物はいかなる転移もなかった。それらの結果はＡＤＩ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００が原発黒色腫腫瘍の成長を抑制しただけでなく、転移の形成も抑制したことを示すと思われる。
試験した２００匹以上の動物において、コントロール群の転移の平均数は４９±１８であり、一方、単一の転移のみが１匹の処置動物において見られたことに注目することは興味深い。
実施例８：ヒト肝臓癌の腫瘍抑制
インビボでヒト肝臓癌の成長を抑制するＰＥＧ５，０００−ＡＤＩの能力を試験した。ヌードマウス（各群で５匹）に１０6のヒト肝臓癌ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞を注射した。腫瘍を２週間成長させ、次に、動物を５．０ＩＵのＳＳ−ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩ（黒丸）、ＳＳ−ＰＥＧ１２，０００−ＡＤＩ（黒三角）またはＳＳ−ＰＥＧ２０，０００−ＡＤＩ（白三角）で週に１回処置した。結果を図９に記述する。未処置の動物（白丸）は全て３週以内に死亡した。それに反して、ＡＤＩで処置した動物は図９から認めることができるようにはるかに長い平均余命を有した。６カ月後に全ての生存するマウスを安楽死させ、死体解剖によりそれらに腫瘍がないことが示された。
意外にも、インビボで肝臓癌成長を抑制することにおいてＰＥＧ５，０００−ＡＤＩが最も有効である。これが起こる正確な機構は分からない。本発明研究のいかなる理論にも拘束されないが、ＳＳ−ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩと配合されたタンパク質は肝臓において封鎖されるようになるようである。より大きい分子量のＰＥＧはそうではなく、それは肝臓内皮細胞の独特さ及びより大きい分子量のＰＥＧ−ＡＤＩコンジュゲートが排除されるような大きさのものである空間（窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ））のためである可能性がある。
実施例９：ヒトへの応用
ＰＥＧ５，０００−ＡＤＩ及びＰＥＧ２０，０００−ＡＤＩを正常ヒト血清とエクスビボでインキュベートし、アルギニン濃度に対する影響をアミノ酸分析により測定し、その場合、酵素は完全に活性であり、マウスを伴う実験における場合と同じ反応速度論で全ての検出可能なアルギニンを分解できると確認された。０．１ｍｌの容量で３７℃で１時間の期間で反応を実施した。さらに、ヒト血清中のアルギニン及びシトルリンのレベルはマウスにおいて見いだされたものと同一である。ＰＥＧ−タンパク質はマウスにおけるよりヒトにおいて長く循環する。例えば、ＰＥＧを結合させたアデノシンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｂｒｏｃｉｄａｓｅ）、ウリカーゼ、ヘモグロビン及びスーパーオキシドジムスターゼの循環半減期は全てマウスにおける同じ配合物より５〜１０倍長い循環半減期を有する。これが従来意味していることは、ヒト投与量がマウスにおいて用いられるもののたいてい１／５〜１／１０であることである。従って、ＰＥＧ−ＡＤＩはマウスにおけるよりヒトにおいてさらに長く循環するはずである。
本明細書に記述された特許、特許出願及び公開の各々は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書に記述されたものに加えて、本発明の様々な修飾が先の記述を考慮に入れて当業者に明らかである。そのような修飾も付加される請求の範囲内に入ると考えられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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