(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能しうる形で連結された以下のＤＮＡ断片：
ａ）レシピエント細胞、好ましくは細菌、特に大腸菌内での複製を可能にする複製起点（１）；
ｂ）上記レシピエント細胞内で発現可能な選択マーカー領域（２）；および
ｃ）順に、
ｉ）真核細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域（３）と、
ｉｉ）第１の組換え部位（４）、第２の組換え部位（５）、第３の組換え部位（６）および第４の組換え部位（７）と、
ｉｉｉ）上記真核細胞内で機能する３’転写終結およびポリアデニル化領域（８）と、
を含むキメラＤＮＡ構築物；
を含んでなるベクターであって、
第１の組換え部位（４）および第４の組換え部位（７）が同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、そして、第２の組換え部位（５）および第３の組換え部位（６）が同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、また、
第１の組換え部位（４）および第２の組換え部位（５）は互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさないか、あるいは第３の組換え部位（６）および第４の組換え部位（７）は互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさない、上記ベクター。
【請求項２】
第１の組換え部位（４）および第２の組換え部位（５）が第２の選択マーカー遺伝子（１０）に隣接し、かつ、第３の組換え部位（６）および第４の組換え部位（７）が第３の選択マーカー遺伝子（９）に隣接する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
上記キメラＤＮＡ構築物が、第２の組換え部位（５）と第３の組換え部位（６）の間に位置した、上記真核細胞内で機能するイントロンプロセッシングシグナル（１１）によって挟まれた領域を含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
イントロンプロセッシングシグナルによって挟まれた上記領域が上記真核細胞内で機能するイントロン配列である、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
第２の組換え部位（５）と第３の組換え部位（６）の間に位置した、第４の選択マーカー遺伝子（１９）をさらに含んでなる、請求項３または４に記載のベクター。
【請求項６】
上記選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、および配列相補的ＰＣＲプライマーからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
上記プロモーター（３）が植物発現可能なプロモーターである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
上記キメラＤＮＡ構築物が左および右ボーダーＴ−ＤＮＡ配列によって挟まれている、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
上記左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー配列の間に位置した、植物細胞内で発現可能な選択マーカー遺伝子をさらに含んでなる、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
アグロバクテリウム属の細菌種で機能しうる複製起点をさらに含んでなる、請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１１】
第１の組換え部位（４）および第４の組換え部位（７）が配列番号４のヌクレオチド配列を含んでなるａｔｔＲ１であり、かつ、第２の組換え部位（５）および第３の組換え部位（６）が配列番号５のヌクレオチド配列を含んでなるａｔｔＲ２である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
第１の組換え部位（４）および第４の組換え部位（７）が配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでなるａｔｔＰ１であり、かつ、第２の組換え部位（５）および第３の組換え部位（６）が配列番号１１のヌクレオチド配列を含んでなるａｔｔＰ２である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
配列番号１３の配列を含んでなるベクター。
【請求項１４】
配列番号１３の1位のヌクレオチドから15002位のヌクレオチドからなる配列および、さらに配列番号１３の15661位のヌクレオチドから18691位のヌクレオチドからなる配列を含んでなるベクター。
【請求項１５】
配列番号２４の配列を含んでなるベクター。
【請求項１６】
配列番号２５の配列を含んでなるベクター。
【請求項１７】
配列番号２６の配列を含んでなるベクター。
【請求項１８】
機能しうる形で連結された以下のＤＮＡ断片：
ａ）レシピエント細胞、好ましくは細菌、特に大腸菌内での複製を可能にする複製起点（１）；
ｂ）上記レシピエント細胞内で発現可能な選択マーカー領域（２）；および
ｃ）順に、
ｉ）原核細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域（３）と、
ｉｉ）第１の組換え部位（４）、第２の組換え部位（５）、第３の組換え部位（６）および第４の組換え部位（７）と、
ｉｉｉ）上記真核細胞内で機能する３’転写終結およびポリアデニル化領域（８）と、
を含むキメラＤＮＡ構築物；
を含んでなるベクターであって、
第１の組換え部位（４）および第４の組換え部位（７）が同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、そして、第２の組換え部位（５）および第３の組換え部位（６）が同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、また、
第１の組換え部位（４）および第２の組換え部位（５）が互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさないか、あるいは第３の組換え部位（６）および第４の組換え部位（７）が互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさない、上記ベクター。
【請求項１９】
上記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージ単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクターを含んでなるキット。
【請求項２１】
上記組換え部位の少なくとも１つを含んでなるＤＮＡセグメントを組換えることができる少なくとも１つの組換えタンパク質をさらに含んでなる、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
真核細胞内でｄｓＲＮＡを発現可能なキメラＤＮＡ構築物を作製する方法であって、
ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、
ｉ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載のベクター；
ｉｉ）目的のＤＮＡセグメント（１２）が、
（１）上記ベクター上の第１の組換え部位（４）または第４の組換え部位（７）と組換え可能な第５の組換え部位（１３）、および
（２）上記ベクター上の第２の組換え部位（５）または第３の組換え部位（６）と組換え可能な第６の組換え部位（１４）、
によって挟まれているインサートＤＮＡ；
ｉｉｉ）第１の組換え部位（４）または第４の組換え部位（７）と第５の組換え部位（１３）、および第２の組換え部位（５）または第３の組換え部位（６）と第６の組換え部位（１４）を組換えることができる少なくとも１つの部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
ｂ）組換えを起こさせて、産物ＤＮＡ分子を含んでなる反応混合物を生成させ、ただし、上記産物ＤＮＡ分子は、順に、
ｉ）上記真核細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能な上記プロモーターまたはプロモーター領域（３）と、
ｉｉ）第１の組換え部位（４）と第５の組換え部位（１３）との組換え産物である組換え部位（１５）と、
ｉｉｉ）目的の上記ＤＮＡ断片（１２）と、
ｉｖ）第２の組換え部位（５）と第６の組換え部位（１４）との組換え産物である組換え部位（１６）と、
ｖ）第３の組換え部位（６）と第６の組換え部位（１４）との組換え産物である組換え部位（１７）と、
ｖｉ）逆方向の目的の上記ＤＮＡ断片（１２）と、
ｖｉｉ）第４の組換え部位（７）と第５の組換え部位（１３）との組換え産物である組換え部位（１８）と、
ｖｉｉｉ）上記真核細胞内で機能する上記３’転写終結およびポリアデニル化領域（８）と、
を含んでなり；
ｃ）上記産物ＤＮＡ分子を選択する；
各ステップを含んでなる上記方法。
【請求項２３】
上記の選択がｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記インサートＤＮＡが線状ＤＮＡ分子である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記インサートＤＮＡが環状ＤＮＡ分子である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記の少なくとも１つの組換えタンパク質が（ｉ）ＩｎｔおよびＩＨＦ、ならびに、（ｉｉ）Ｉｎｔ、ＸｉｓおよびＩＨＦから選択される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
異なる目的ＤＮＡ断片を含む複数のインサートＤＮＡが同時にベクターに導入される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
目的の標的核酸の表現型発現が減少または阻害される非ヒト真核生物を作出する方法であって、
ａ）請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って、上記非ヒト真核生物の細胞内でｄｓＲＮＡを発現可能な、上記標的核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１９ｂｐのヌクレオチド配列を含む目的の核酸（１２）を含んでなるキメラＤＮＡ構築物を作製し；
ｂ）上記キメラＤＮＡ構築物を上記非ヒト真核生物の細胞に導入し；そして
ｃ）上記真核生物を単離する；
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２９】
上記真核生物が植物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
特定の形質を決定することに関与している核酸分子を単離する方法であって、
ａ）請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って、非ヒト真核生物の細胞内でｄｓＲＮＡを発現可能なキメラＤＮＡ構築物のライブラリーを作製し；
ｂ）上記キメラＤＮＡ構築物のライブラリーの個々のメンバーを上記非ヒト真核生物の細胞に導入し；
ｃ）上記の特定形質を示す真核生物を単離し；そして
ｄ）上記核酸分子を単離する；
各ステップを含んでなる上記方法。
【請求項３１】
上記真核生物が植物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法によって得られるキメラＤＮＡ構築物を含んでなる、非ヒト真核生物。
【請求項３３】
植物である、請求項３２に記載の非ヒト真核生物。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法によって得られる非ヒト真核生物。
【請求項３５】
植物である、請求項３４に記載の非ヒト真核生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は目的の標的核酸配列をサイレンシングするのに有用なdsRNAを産生しうるキメラ核酸構築物を作製するための効率的な方法および手段に関する。開示した方法および手段の有効性は、さらに、機能が知られていないESTなどの単離された核酸の機能を調べるハイスループット分析法を可能にし、また、予め選択したグループの遺伝子の中から特定の遺伝子またはヌクレオチド配列を単離するために利用することができる。
【０００２】
総論
本明細書では、特許請求の範囲の後に、PatentIn Version 3.1を使用して作成したヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を提供する。配列表では各ヌクレオチド配列が識別番号〈210〉とその後に続く配列識別子(例えば、〈210〉1、〈210〉2、〈210〉3など)により識別される。配列の長さおよび型(DNA、タンパク質(PRT)など)、ならびに各ヌクレオチド配列の起源生物は、各々識別番号フィールド〈211〉、〈212〉および〈213〉に提供される情報で示される。本明細書中で言及するヌクレオチド配列は、「配列番号」とその後に続く配列識別子で定義される(例えば、配列番号１は〈400〉1で示された配列表中の配列をさす)。
【０００３】
本明細書中で用いるヌクレオチド残基の名称は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが推奨するものであり、ここでは、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミン、Yはピリミジン残基、Rはプリン残基、Mはアデニンまたはシトシン、Kはグアニンまたはチミン、Sはグアニンまたはシトシン、Wはアデニンまたはチミン、Hはグアニン以外のヌクレオチド、Bはアデニン以外のヌクレオチド、Vはチミン以外のヌクレオチド、Dはシトシン以外のヌクレオチド、そしてNは任意のヌクレオチド残基を表す。
【０００４】
本明細書中で用いる「に由来する」とは、特定の完全体(integer)が特定の起源から、必ずしも直接に得られる必要はないが、その起源から得られうることを示すものとする。
【０００５】
本明細書全体を通して、「含んでなる」または「含む」という用語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示されているステップまたは要素または整数、あるいは一群のステップまたは要素または整数を含むと解釈され、それ以外のステップまたは要素または整数、あるいは一群のステップまたは要素または整数を排除するものではないことが理解されよう。
【０００６】
当業者であれば、本明細書に記載した本発明は、明記したもの以外の変形および改変も可能であることが理解されよう。本発明はかかる全ての変形および改変も包含するものと解されるべきである。また、本発明は本明細書において言及または提示した全てのステップ、特徴、組成物および化合物を、個々にまたは集合的に、さらに上記ステップまたは特徴の任意のまたは全ての組合せ、あるいは任意の2以上を包含する。
【０００７】
本発明は本明細書に記載した特定の実施形態に範囲を限定されるものではなく、これらは単に例示に過ぎない。機能的に均等な産物、組成物および方法は、本明細書に記載するように、明らかに本発明の範囲内にある。
【０００８】
本明細書における先行技術への言及はいずれも、かかる先行技術がオーストラリアにおいて技術常識の一部を構成することを認めたり、何らかの形で示唆するものではなく、また、そのように解釈されるべきではない。
【０００９】
背景技術
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)をはじめとする生物の全ゲノムのヌクレオチド配列が次第に決定されてきており、これらのデータが入手可能になったことで、それらからまだ調査されていない大量の情報が得られる。これらのゲノムプロジェクトの最終目標は、ゲノムのあらゆる遺伝子の生物学的機能を同定することである。
【００１０】
ある機能を特定のヌクレオチド配列を有する核酸に帰することは、種々の方法により確認することができる。いくつかの遺伝子は好適なアッセイを用いて直接特徴づけられてきたが、他の生物で既知の機能を有する遺伝子(の一部)との相同性によって、仮の機能と結びつけられてきた遺伝子もある。また、例えばタグ付き挿入突然変異により得られる、機能欠損変異体もこれら未知遺伝子のいくつかの役割について、特に酵母ゲノムの大規模解析(Ross-MacDonaldら, 1999)において、多くの情報を提供してきた(AzpiroLeehanおよびFeldmann 1997; Martienssen 1998)。
【００１１】
また、機能欠損をもたらす構造突然変異体は、転写または転写後レベルにおいて目的の核酸の発現を妨げることによって模倣することができる。しかしながら、遺伝子機能を、特に多数の標的について、同定するためのアンチセンスまたは共抑制構築物を使用した遺伝子（特に植物遺伝子）のサイレンシングは、得られるサイレンシングされた個体（特にサイレンシングレベルがほぼ完全であるもの）の割合が比較的低いことにより妨げられる。
【００１２】
最近の研究で、標的配列に各々相補的および相同的なアンチセンスおよびセンスRNAヌクレオチド配列間の塩基対合により二本鎖RNAを形成しうるRNAをコードするキメラ構築物を用いると、サイレンシング効率が定量レベルでも定性レベルでも非常に向上する可能性があることが実証された。
【００１３】
Fireら, 1998には、線虫(Caenorhabditis elegans)における二本鎖RNAの実験的導入による特定の遺伝的妨害が記載されている。機能ゲノミクスに関するこれらの知見の重要性が議論されている(WagnerおよびSun, 1998)。
【００１４】
WO99/32619は、RNAを生細胞へ導入して、その細胞内での標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供している。この方法はex vivoでもin vivoでも実施することができる。そのRNAは二本鎖構造の領域を有している。阻害は、RNAの二本鎖領域のヌクレオチド配列および標的遺伝子の一部のヌクレオチド配列が同一であるという点で配列特異的である。
【００１５】
Waterhouseら, 1998は、センスおよびアンチセンスRNAの同時発現により植物におけるウイルス耐性および遺伝子サイレンシングを誘導しうることを記載している。センスおよびアンチセンスRNAは、自己相補性を有する１つの転写産物中に位置していてもよい。
【００１６】
Hamiltonら, 1998は、反復DNA（すなわち、その5'非翻訳領域の逆方向コピー）を有するトランスジーンがトマトにおけるACC-オキシダーゼ発現を高頻度で転写後抑制することを記載している。
【００１７】
WO98/53083には、遺伝子サイレンシングベクター内のポリヌクレオチド領域の全部または一部の逆方向反復配列を該ベクターに挿入することを含む、生物内の標的遺伝子の阻害を増強するための構築物および方法が記載されている。
【００１８】
WO99/53050は、標的核酸に対するセンスおよびアンチセンスRNA分子をコードするキメラ遺伝子（センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を有する領域間の塩基対合により二本鎖RNA領域を形成することができる）を導入することにより、またはRNA分子それら自体を導入することにより、真核細胞（特に植物細胞）において目的の核酸の表現型発現を低下させるための方法および手段を提供している。好ましくは、上記RNA分子はセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列の両方を同時に含む。
【００１９】
WO99/49029は、一般に、遺伝子発現の改変方法、ならびにトランスジェニック生物、特にトランスジェニック動物または植物の細胞、組織もしくは器官内での内因性遺伝子発現を改変するための合成遺伝子に関する。また、生物に導入したとき、その生物内での内因性遺伝子または標的遺伝子の発現を抑制、遅延、さもなくば低下させ得るdsRNAを形成することができる合成遺伝子および遺伝子構築物もまた提供される。
【００２０】
WO99/61631は、遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNA断片を使用して植物内での標的遺伝子の発現を改変する方法に関する。センスおよびアンチセンスRNA断片は対合して二本鎖RNA分子を形成することが可能であり、それにより遺伝子の発現が変更される。本発明はまた、これらの方法を用いて得られた植物、それらの子孫および種子にも関する。
【００２１】
WO00/01846は、細胞において特定の表現型を付与することに関与しているDNAを同定する方法を提供し、この方法は、a)好適な転写因子とプロモーターとの結合後にcDNAまたはDNAの二本鎖(ds)RNAへの転写を開始しうるプロモーターに対してある方向で、好適なベクター内に細胞DNAのcDNAまたはゲノムライブラリーを構築し；b)そのライブラリーを、転写因子を含む1個以上の細胞に導入し；そしてc)そのライブラリーを含む特定表現型の細胞を同定して単離し、さらに、その表現型を付与することに関与しているライブラリーからのDNAまたはcDNA断片を同定する；ことを含んでなる。この技術を用いると、a)細胞内のDNA配列の相同体を同定し、b)その細胞から関連DNA相同体またはその断片を単離し、c)その相同体または断片を、好適な転写因子とプロモーターとの結合後に該DNA相同体または断片からのdsRNAの転写を開始しうる好適なプロモーターに対してある方向で、好適なベクターにクローニングし、そしてd)このベクターを、転写因子を含むステップa)の細胞に導入する、ことにより既知DNA配列に機能を割り当てることも可能である。
【００２２】
また、WO00/44914には、二本鎖RNAを用いて、特にゼブラフィッシュにおいて、遺伝子発現をin vivoおよびin vitro減衰させるための組成物および方法が記載されている。
【００２３】
WO00/49035には、細胞内での内因性遺伝子の発現をサイレンシングする方法であって、細胞内で内因性遺伝子の核酸分子と、該内因性遺伝子の核酸分子に相補的な核酸分子を含むアンチセンス分子とを過剰発現させることを含んでなる方法が記載されている。ここで、細胞内での内因性遺伝子の核酸分子およびアンチセンス分子の過剰発現は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングする。
【００２４】
Smithら, 2000ならびにWO99/53050には、dsRNAを含むイントロンがサイレンシング効率をさらに高めることが記載されている。
【００２５】
しかしながら、先行技術では、目的のヌクレオチド配列を、真核細胞（特に植物細胞）内で、好ましくは多数のヌクレオチド配列のプロセッシングがしやすい様式で、dsRNAを生成することができるキメラ構築物へ効率よく変換することに関する問題が全く解決されていない。
【００２６】
これらならびに他の問題は、種々の実施形態および特許請求の範囲で後述するように、解決することができた。
【００２７】
発明の概要
本発明の目的は、機能しうる形で連結された以下のDNA断片a)微生物、好ましくは細菌、特に大腸菌内での複製を可能にする複製起点(1)；b)上記微生物、好ましくは細菌内で発現可能な選択マーカー領域(2)；およびc)順に、(i)真核細胞のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域(3)、好ましくは植物発現可能プロモーターと、(ii)第1の組換え部位(4)、第2の組換え部位(5)、第3の組換え部位(6)および第4の組換え部位(7)と、(iii)上記真核細胞内で機能する3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)と、を含むキメラDNA構築物；を含んでなるベクターを提供することであり、ここで、第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)は同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、そして、第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)は同じ組換え部位と反応可能であって、好ましくは同一であり、また、第1の組換え部位(4)および第2の組換え部位(5)は互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさないか、あるいは第3の組換え部位(6)および第4の組換え部位(7)は互いに、または同じ組換え部位とは組換えを起こさない。場合により、上記ベクターは、第1の組換え部位(4)と第2の組換え部位(5)の間に第2の選択マーカー遺伝子(9)、および／または第3の組換え部位(6)と第4の組換え部位(7)の間に第3の選択マーカー遺伝子(10)、および／または第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間に位置した、真核細胞内で機能するイントロンプロセッシングシグナル(11)によって挟まれた領域、好ましくはイントロン、および／または第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間に位置した第4の選択マーカー遺伝子(19)、および／またはキメラDNA構築物に隣接する左および右ボーダーT-DNA配列、および／または好ましくは左および右T-DNAボーダー配列の間に位置した、植物細胞内で発現可能な選択マーカー遺伝子、および／またはアグロバクテリウム属の細菌種において機能しうる複製起点などの、付加的エレメントをさらに含んでもよい。選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、および配列相補的PCRプライマーからなる群より選択することができる。好ましくは、第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)が配列番号4のヌクレオチド配列を含むattR1であり、かつ、第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)が配列番号5のヌクレオチド配列を含むattR2であるか、または第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)が配列番号10のヌクレオチド配列を含むattP1であり、かつ、第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)が配列番号11のヌクレオチド配列を含むattP2である。
【００２８】
本発明のもう1つの目的は、本発明の受容ベクターを含んでなり、好ましくはさらに、これらの組換え部位の少なくとも1つを含むDNAセグメントを組換え可能な少なくとも1つの組換えタンパク質を含んでなるキットを提供することである。
【００２９】
本発明のさらにもう1つの目的は、真核細胞内でdsRNAを発現可能なキメラDNA構築物を作製する方法を提供することであり、この方法は、
a)in vitroで、
i)本明細書で上述した受容ベクター；
ii)目的のDNAセグメント(12)が、
(1)上記ベクター上の第1の組換え部位(4)または第4の組換え部位(7)と組換え可能な第5の組換え部位(13)、および
(2)上記ベクター上の第2の組換え部位(5)または第3の組換え部位(6)と組換え可能な第6の組換え部位(14)、
によって挟まれている、好ましくは線状または環状の、インサートDNA；
iii)第1の組換え部位(4)または第4の組換え部位(7)と第5の組換え部位(13)、および第2の組換え部位(5)または第3の組換え部位(6)と第6の組換え部位(14)を組換えることができる少なくとも1つの部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
b)少なくとも１つの組換えタンパク質（好ましくは、(i)IntとIHF、および(ii)Int、XisおよびIHFから選択される）の存在下で組換えを起こさせて、産物DNA分子を含む反応混合物を生成させ、ただし、該産物DNA分子は、順に、
i)上記真核細胞のRNAポリメラーゼによって認識可能な上記プロモーターまたはプロモーター領域(3)と、
ii)第1の組換え部位(4)と第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(15)と、
iii)目的の上記DNA断片(12)と、
iv)第2の組換え部位(4)と第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(16)と、
v)第3の組換え部位(5)と第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(17)と、
vi)逆方向の目的の上記DNA断片(12)と、
vii)第4の組換え部位(7)と第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(18)と、
viii)上記真核細胞内で機能する上記3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)と、
を含んでなり；
c)上記産物DNA分子を、好ましくはin vivoで、選択する；
各ステップを含んでなる。
【００３０】
この方法は、異なる目的DNA断片を含む複数のインサートDNAを同時にプロセッシングすることを可能にする。
【００３１】
本発明はまた、目的の標的核酸の発現が減少または阻害される非ヒト真核生物（好ましくは植物）を作出する方法を提供し、この方法は、
a)本発明の方法に従って、非ヒト真核生物の細胞内でdsRNAを発現可能なキメラDNA構築物を作製し；
b)該キメラDNA構築物を非ヒト真核生物の細胞に導入し；そして
c)トランスジェニック真核生物を単離する；
ことを含んでなる。
【００３２】
また、本発明のもう1つの目的は、特定の形質を決定することに関与している核酸分子を単離する方法を提供し、この方法は、
a)本発明のいずれか1つの方法に従って、非ヒト真核生物の細胞内でdsRNAを発現可能なキメラDNA構築物のライブラリーを作製し；
b)キメラDNA構築物のライブラリーの個々のメンバーを非ヒト真核生物の細胞に導入し；
c)特定の形質を示す真核生物を単離し；そして
d)上記核酸分子を単離する；
各ステップを含んでなる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の方法によって得られるキメラDNA構築物を含む非ヒト真核生物、好ましくは植物を提供する。
【００３４】
図面の説明
図１：  本発明の好ましい実施形態において使用するベクターおよび方法の模式図。
図１A：  目的の核酸(12)を、互いにまたは同一の他の組換え部位とは反応できない2つの異なる組換え部位(13、14)を含むプライマーを使用して、PCRにより増幅する。その結果として、目的の核酸(12)が2つの異なる組換え部位(13、14)によって挟まれた「インサートDNA」が得られる。
【００３５】
図１B：  少なくとも1つの組換えタンパク質を使用して、インサートDNAと受容ベクターとに組換え部位間で組換えを起こさせて、それにより第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)がPCR増幅した目的のDNA(12)に隣接する組換え部位の一方(13)と反応し、かつ受容ベクター上の第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)が目的のDNA(12)に隣接する他方の組換え部位(14)と組換えを起こす。所望の産物DNAを単離するには、第1の組換え部位(4)と第2の組換え部位(5)間および第3の組換え部位(6)と第4の組換え部位(7)間にそれぞれ位置する選択マーカー遺伝子(9)および(10)の欠失について選択することが可能である。場合により、さらなる選択マーカー遺伝子を第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間に含めて、この選択マーカー遺伝子の存在について、また、その結果として機能的イントロンプロセッシングシグナル配列(11)によって挟まれた任意のイントロン配列について選択ができるようにしてもよい。受容ベクターならびに産物ベクターは、複製起点(Ori; (1))およびプラスミドの存在についての選択を可能にする選択マーカー遺伝子(2)をさらに含んでなる。
【００３６】
結果的に、真核生物プロモーター領域(3)；組換え部位(4)と(13)間の組換えにより生成された組換え部位(15)；目的DNA(12)の第1コピー；組換え部位(5)と(14)間の組換えにより生成された組換え部位(16)；場合により、イントロンプロセッシングシグナル(11)によって挟まれたイントロン配列；組換え部位(6)と(14)間の組換えにより生成された組換え部位(17)；目的DNA(12)の第1コピーと逆方向の目的DNAの第2コピー；組換え部位(7)と(13)間の組換えにより生成された組換え部位(18)；真核生物転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナル(8)を含んでなる、所望の形状を有するキメラDNA構築物がもたらされる。
【００３７】
図２A：  目的の核酸(12)を、2つの異なる組換え部位（中間体ベクター(図２B)上の組換え部位との組換えによって、受容ベクター上の第1の組換え部位(4)と第4の組換え部位(5)に、また、第2の組換え部位(6)と第3の組換え部位(7)にそれぞれ適合する組換え部位をもたらす）を含むプライマーを使用して、PCRにより増幅する。
【００３８】
図２B：  図２Aで得られたインサートDNAと中間体ベクターとに少なくとも1つの組換えタンパク質の存在下で組換えを起こさせると、目的のDNA(12)が2つの異なる組換え部位(13、14)によって挟まれており、かつ複製起点(1)および選択マーカー遺伝子(2)をさらに含んでなる中間体DNAが得られる。
【００３９】
図２C：  その後、(基本的には図１Bで記載したように)少なくとも1つの第2の組換えタンパク質を使用して、中間体DNAと受容ベクターとに組換えを起こさせる。
【００４０】
図３：  受容ベクター「pHELLSGATE」の模式図。
【００４１】
図４：  受容ベクター「pHELLSGATE 8」、「pHELLSGATE 11」および「pHELLSGATE 12」の模式図。
【００４２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、組換えクローニング法が、目的の核酸断片を、真核細胞内で発現され得るセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含むdsRNA転写物を生成しうるキメラDNA構築物に変換するための効率的なワンステップ法である、という本発明者らによる予期せざる知見に基づくものである。dsRNA分子は遺伝子サイレンシングの効率的なエフェクターである。これらの方法により、長い逆方向反復配列を有するキメラDNAを作製する際に以前に遭遇した効率の問題が改善される。
【００４３】
こうして、第1の実施形態において、本発明は、真核細胞内でRNA転写物を発現することができるキメラDNA構築物またはキメラ遺伝子を作製する方法を提供し、このRNAは、目的の核酸に相当するヌクレオチドのストレッチと、該転写物の他の場所に位置するその相補配列(すなわち、逆方向のヌクレオチドのストレッチ)との間で内部塩基対合する(そのため、ヘアピンRNAを形成する)ものであり、上記方法は以下のステップを含んでなる：
１．機能しうる形で連結された以下のDNA断片：
a)宿主細胞内での複製を可能にする複製起点(1)；
b)宿主細胞内で発現され得る選択マーカー領域(2)；および
c)順に、
i)真核細胞のRNAポリメラーゼによって認識され得るプロモーターまたはプロモーター領域(3)；
ii)第1の組換え部位(4)、第2の組換え部位(5)、第3の組換え部位(6)および第4の組換え部位(7)、ただし、
(1)第1の組換え部位(4)と第4の組換え部位(7)は同一の他の組換え部位と反応可能であって、好ましくは互いに同一であり、
(2)第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)もまた同一の他の組換え部位と反応可能であって、好ましくは互いに同一であり、
(3)第1の組換え部位(4)と第2の組換え部位(5)は互いに、または同一の他の組換え部位とは組換えを起こさず、そして
(4)第3の組換え部位(6)と第4の組換え部位(7)は互いに、または同一の他の組換え部位とは組換えを起こさない；および
iii)上記真核細胞内で機能する3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)；を含むキメラDNA構築物；
を含んでなる「受容ベクター」を提供すること。
【００４４】
２．目的のDNAセグメント(12)が、
a)第1の組換え部位(4)または第4の組換え部位(7)と組換え可能であるが、第2の組換え部位(5)または第3の組換え部位(6)とは組換え可能でない、第5の組換え部位(13)；
b)第2の組換え部位(5)または第3の組換え部位(6)と組換え可能であるが、第1の組換え部位(4)または第4の組換え部位(7)とは組換え可能でない、第6の組換え部位(14)；
によって挟まれている「インサートDNA」を提供すること。
【００４５】
３．インサートDNAと受容ベクターを、少なくとも1つの特異的組換えタンパク質の存在下にin vitroで組み合わせて組換えを起こさせ、とりわけ「産物DNA」分子を含む反応混合物を生成させること、ただし、該産物DNA分子は、順に、
i)真核細胞のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域(3)と、
ii)第1の組換え部位(4)と第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(15)と、
iii)目的のDNA断片(12)の第1コピーと、
iv)第2の組換え部位(4)と第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(16)と、
v)第3の組換え部位(5)と第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(17)と、
vi)第1コピーに対して逆方向の目的のDNA断片(12)の第2コピーと、
vii)第4の組換え部位(7)と第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(18)と、
viii)真核細胞内で機能する上記3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)と、
を含んでなる。
【００４６】
４．産物DNA分子を選択すること。
【００４７】
この方法は、組換え部位および選択マーカーの非限定的例を挙げて、図１に概略的に示されている。
【００４８】
本明細書中で用いる「宿主細胞」とは、受容ベクターまたは産物DNAのレシピエントでありうる原核または真核生物をいう。組換えDNA法でルーチンに用いられている大腸菌(Escherichia coli)株を宿主細胞とすることが便利である。
【００４９】
本明細書中で用いる「組換えタンパク質」とは、部位特異的リコンビナーゼならびに関連タンパク質および／または補因子を集合的にさす。部位特異的リコンビナーゼはある種のウイルスや細菌に存在し、エンドヌクレアーゼとリガーゼの両特性をもつことを特徴とする酵素である。これらのリコンビナーゼは（ある場合には関連タンパク質とともに）DNA中の特定の塩基配列を認識し、これらのセグメントに隣接するDNAセグメントを交換する。種々の組換えタンパク質は当技術分野で公知である(参考として、本明細書にその全体、少なくとも22〜26頁を組み入れるWO96/40724を参照のこと)。
【００５０】
かかるリコンビナーゼの例としては、バクテリオファージP1由来のCreおよびバクテリオファージλ由来のインテグラーゼが挙げられる。
【００５１】
CreはloxP部位と呼ばれる34bpのDNA配列間の交換を触媒するバクテリオファージP1由来のタンパク質(AbremskiおよびHoess, 1984)である(Hoessら, 1986参照)。Creは商業的に入手可能である(Novagen, カタログ番号69247-1)。
【００５２】
インテグラーゼ(Int)は大腸菌染色体へのλゲノムの組込みを媒介するバクテリオファージλ由来のタンパク質である。バクテリオファージλのInt組換えタンパク質は、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質att部位間の不可逆的な組換えを促進する。組換え反応の可逆性は組込み型または切出し型組換えのための2つの独立した経路から生じる。4つのタンパク質(Int、Xis、IHFおよびFIS)を必要とする協働的および競合的相互作用により、組換えの方向が決まる。組込み型組換えにはIntおよびIHFタンパク質ならびにattP(240bp)およびattB(25bp)組換え部位が必要である。組換えの結果として、新たな2つの部位、すなわちattLおよびattRが形成される。IntおよびIHFタンパク質を含む製剤が商業的に入手可能である(BPクロナーゼ(商標); Life Technologies)。切出し型組換えにはInt、IHFおよびXisならびにattLおよびattRが必要であり、attPおよびattBが形成される。Int、IHFおよびXisタンパク質を含む製剤が商業的に入手可能である(LRクロナーゼ(商標); Life Technologies)。
【００５３】
本明細書中で用いる「組換え部位」とは、リコンビナーゼとおそらくは関連タンパク質が認識して結合する特定のDNA配列をさす。Creリコンビナーゼにより認識される組換え部位はloxPであり、これは8塩基対のコア配列に隣接する2つの13塩基対の逆方向反復配列(リコンビナーゼ結合部位として働く)を含む34塩基対の配列である。組換え部位attB、attP、attLおよびattRはλインテグラーゼにより認識される。attBは2つの9塩基対のコア型Int結合部位および7塩基対の重複領域を含む約25塩基対の配列である。attPはコア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパク質IHF、FISおよびXisの部位を含む約240塩基対の配列である(Landy, 1993)。それぞれのatt部位は、15bpのコア配列と共に、この共通コアの境界内、境界外および境界に沿って存在する機能的に重要な個々の配列エレメントを含む(Landy, 1989)。種々のatt部位間の効率的な組換えには、中央の共通領域の配列が組換えパートナー間で実質的に同一である必要がある。しかしながら、正確な配列はWO96/40724に開示されるように改変可能であり、
0004454934.tif 000002
0004454934.tif 000003
から選択される改変組換え部位は、(それらの指数で示されるように)組換え可能な好適なペアまたは組換え部位の選択において、より融通性をもたせることができる。
【００５４】
当業者には、用いる組換え部位と用いる組換えタンパク質との間には一致が必要であることが明らかであろう。
【００５５】
1つの実施形態において、受容ベクターには以下の組換え部位の組合せが受容ベクター中に存在する：
−  第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)が同一であり、かつ配列番号10のヌクレオチド配列を含むattP1を含んでなり、また、第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)もまた同一であり、かつ配列番号11のヌクレオチド配列を含むattP2を含んでなる；または
−  第1の組換え部位(4)および第4の組換え部位(7)が同一であり、かつ配列番号4のヌクレオチド配列を含むattR1を含んでなり、また、第2の組換え部位(5)および第3の組換え部位(6)もまた同一であり、かつ配列番号5のヌクレオチド配列を含むattR2を含んでなる。
【００５６】
そして、インサートDNAには以下の組換え部位の組合せが用いられる：
−  第5の組換え部位(13)が配列番号1のヌクレオチド配列を含むattB1を含んでなり、また、第6の組換え部位(14)が配列番号2のヌクレオチド配列を含むattB2を含んでなる（この組合せは上記第1の受容ベクターとの組換えに好適である）；または
−  第5の組換え部位(13)が配列番号7のヌクレオチド配列を含むattL1を含んでなり、また、第6の組換え部位(14)が配列番号8のヌクレオチド配列を含むattL2を含んでなる（この組合せは上記第2の受容ベクターとの組換えに好適である）。
【００５７】
予期せざることに、標的遺伝子のサイレンシングにおいては、両方向の遺伝子インサートがattB組換え部位によって挟まれている産物DNA分子（attR組換え部位を有する上記第2の受容ベクター（例えば、pHELLSGATE 8）と、attL組換え部位によって挟まれたインサートDNAと、の間の組換えによって得られる)は、両方向の遺伝子インサートがattL組換え部位によって挟まれている産物DNA分子（attP組換え部位を有する上記第1の受容ベクター（例えば、pHELLSGATEまたはpHELLSGATE 4）と、attB組換え部位によって挟まれたインサートDNAと、の間の組換えによって得られる)よりも(定量的にも定性的にも)効率がよいことが分かった。本発明を特定の作用様式に限定するものではないが、attL部位が比較的長いことと、そこに存在しうる二次構造とが、転写を阻害するよう作用して、必要なdsRNAをある程度までしか生成しないと考えられる。しかし、より低い程度の標的遺伝子サイレンシングが有用であるかまたは必要である場合には、attP部位を有する上記第1の受容ベクターのような受容ベクターを使用することもできる。
【００５８】
本発明に従って作製されたキメラDNA構築物により得られるdsRNAは、真核生物、特に植物内で、直接にまたは真核生物の細胞内でのキメラDNA構築物の転写により、目的の核酸をサイレンシングする（すなわち、その表現型発現を低下させる）ために使用することができる。この場合には、以下の考慮事項が当てはまる。
【００５９】
目的の核酸(12)の長さは、約10ヌクレオチド(nt)から（表現型発現を低下させようとする）標的核酸の長さ(ヌクレオチドの長さ)に等しい長さまで様々であってよい。好ましくは、センスヌクレオチド配列の全長は、少なくとも10nt、または少なくとも19nt、または少なくとも21nt、または少なくとも25nt、または少なくとも約50nt、または少なくとも約100nt、または少なくとも約150nt、または少なくとも約200nt、または少なくとも約500ntである。センスヌクレオチド配列の全長の上限は標的核酸の全長にほかならないと考えられる。しかしながら、実用的な理由（例えば、キメラ遺伝子の安定性など）のため、センスヌクレオチド配列の長さは5000ntを超えるべきではなく、特に2500ntを超えるべきではなく、さらに約1000ntに限定されると予想される。
【００６０】
目的の核酸(12)の全長が長くなればなるほど、目的の核酸と標的遺伝子の対応する配列との配列同一性の要件の厳密性が低下することは理解されるであろう。好ましくは、目的の核酸は対応する標的配列に対して少なくとも約75%、特に少なくとも約80%、少なくとも約85%、約90%、特別には約95%、さらに特別には約100%の配列同一性をもつべきであり、特に、標的核酸の対応する部分と同一であるべきである。しかしながら、目的の核酸は常に標的核酸の対応する部分に対して100%の配列同一性を有する連続した約10ヌクレオチド、特に約25nt、さらに約50nt、特別には約100nt、さらに特別には150ntの配列を含むことが好ましい。好ましくは、配列同一性を算出して対応するセンス配列を設計するには、ギャプ数を最小限にすべきであり、特に比較的短いセンス配列の場合はそうである。
【００６１】
本発明において、2つの関連ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」(百分率で表す)とは、最適な状態に整列させた2つの配列において同一の残基を有する位置の数を、比較した位置の数で割った値(×100)をいう。ギャップ（すなわち、ある残基が一方の配列には存在するがもう一方の配列には存在しないアラインメントにおける位置）は同一でない残基の位置と見なされる。2配列のアラインメントはNeedlemanおよびWunschアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch 1970)によって行われる。上記のコンピューター支援配列アラインメントは、Wisconsin Package Version 10.1(Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA)の一部であるGAPなどの標準ソフトウェアプログラムを用いて、ギャップクリエーションペナルティ50およびギャップエクステンションペナルティ3のデフォルトスコアリングマトリックスを使用して行うことが便利である。配列が少なくとも約75%、特に少なくとも約80%、少なくとも約85%、約90%、約95%、さらに約100%の配列同一性を有する場合、特別には同一である場合には、かかる配列は「実質的に類似」として示される。明らかなように、RNA配列がDNA配列と実質的に類似する、つまりある程度の配列同一性を有する場合、DNA配列中のチミン(T)はRNA配列中のウラシル(U)に等しいと見なされる。
【００６２】
「インサートDNA」は、プライマーとして、好適な組換え部位を含むオリゴヌクレオチド配列ならびに目的の核酸の増幅に適するオリゴヌクレオチド配列を使用して、目的の核酸のDNA増幅法（PCRなど）により提供することが有利である。しかしながら、当技術分野では、目的の核酸にフランキング組換え部位を提供する（組換え部位を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸断片を目的の核酸にリガーゼによって共有結合させることを含むが、これに限らない）ために別の方法を利用することも可能である。
【００６３】
好適なフランキング組換え部位を核酸に提供することもまた複数のステップで進行しうる。例えば、第１のステップにおいて、目的の核酸に提供されるフランキング部位は、中間体ベクターの組換え部位との組換えにより、新しい組換え部位が目的の核酸に隣接して生成され、それが受容ベクターとの組換えに適合するようなものでありうる。このスキームの概略は、組換え部位および選択マーカーの非限定的例を挙げて、図２に示される。インサートDNAが環状でも線状でもよいことは言うまでもない。
【００６４】
本明細書中で用いる「複製起点」とは、微生物、好ましくは細菌、特に大腸菌株内での受容ベクターの複製を可能にし、かつ、微生物の増殖時に娘細胞が受容ベクターのコピーを確実に受け取れるようにするDNA断片をいう。
【００６５】
本明細書中で用いる「選択マーカー(遺伝子)」とは、好適な条件下でのDNAセグメントの有無の選択またはスクリーニングを可能にする、そのようなDNAセグメントをさす。選択マーカーとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：
(1)毒性の化合物に対する耐性を付与する産物をコードするDNAセグメント(例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子)；
(2)レシピエント細胞に欠けている産物をコードするDNAセグメント(例えば、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー)；
(3)遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNAセグメント；
(4)容易に確認できる産物をコードするDNAセグメント(例えば、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-グルクロニダーゼ(GUS))；
(5)細胞の生存および／または機能に有害である産物と結合するDNAセグメント；
(6)番号1〜5に記載したDNAセグメントのいずれかの活性を阻害しうるDNAセグメント(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)；
(7)基質を改変する産物と結合するDNAセグメント(例えば、制限エンドヌクレアーゼ)；
(8)所望の分子を単離するのに使用できるDNAセグメント(例えば、特異的タンパク質結合部位)；
(9)ほかの場合には非機能的でありうる特異的ヌクレオチド配列をコードするDNAセグメント(例えば、分子の小集団のPCR増幅のため)；
(10)存在しない場合、特定の化合物に対する感受性を直接または間接的に付与するDNAセグメント；
(11)存在しない場合、特定の化合物に対する耐性を直接または間接的に付与するDNAセグメント。
【００６６】
好ましい第1の選択マーカー(2)は抗生物質耐性遺伝子である。多数の抗生物質耐性遺伝子（特に細菌で使用可能なもの）は当技術分野で入手可能であり、限定するものではないが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼIおよびII、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ラクタマーゼ、アミノグリコシドアデノシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００６７】
好ましい第2の選択マーカー(9)および第3の選択マーカー(10)は、組換え後に(すなわち、産物DNAにおいて)不在つまり欠失されたとき陽性の選択を可能にする選択マーカーであり、例えば、限定するものではないが、ccdB遺伝子（その産物が大腸菌DNAジャイレースを妨害し、それにより大多数の大腸菌株の増殖を阻害する）などがある。好ましくは、第2および第3のマーカーは同一である。
【００６８】
本発明の1つの実施形態では、受容ベクターは第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間に第4の選択マーカー(19)、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子などの、その存在について陽性の選択を可能にするマーカーを含んでなる。好ましくは、第4の選択マーカーは第1の選択マーカーとは異なるべきであり、かつ、第2および第3の選択マーカーとも異なるべきである。第4の選択マーカーの存在によって、産物DNAにおける第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)間のDNA領域の保持についての選択またはスクリーニングが可能になるため、逆方向反復配列でクローニングされ、さらに真核生物発現シグナルに機能しうる形で連結された目的の核酸を有する所望の産物DNAが得られる効率が高まる。しかしながら、試験したほとんどの受容ベクターでは、選択マーカーの存在は必要でなく、期待された所望の産物DNA分子と所望でない産物DNA分子の比率(一般には、得られた産物DNA分子の約90%を超える)にもほとんど影響を及ぼさないことが分かった。
【００６９】
当業者が、期待された所望の産物DNA分子（例えば、限定するものではないが、制限酵素消化物）を認識するために、または組換え産物のヌクレオチド配列を決定するのにさえも、利用可能な多くの技術を熟知していることは言うまでもない。
【００７０】
本発明のもう1つの実施形態では、受容ベクターは、好ましくは第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間に位置した、真核細胞内で機能するイントロンプロセッシングシグナル(11)対またはイントロン配列をさらに含んでなる。しかしながら、イントロンプロセッシングシグナル対またはイントロンはキメラ構築物の他の場所、プロモーターまたはプロモーター領域(3)とターミネーター領域(8)の間にも位置しうる。背景技術で示したように、これは、dsRNAをコードするキメラDNA構築物が真核細胞内で標的遺伝子の表現型発現を低下させうる効率を向上させるだろう。植物細胞内で機能する特に好ましいイントロンはpdkイントロン(Flaveria trinerviaピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(pyruvate orthophosphate dikinase)イントロン2；参考として組み入れるWO99/53050を参照)である。第4の選択マーカー(19)はイントロンプロセッシングシグナル間またはイントロン内に位置してもよい(これらが第2と第3の組換え部位の間に位置する場合)が、またイントロンプロセッシングシグナルまたはイントロン近傍に位置してもよい。
【００７１】
当業者ならば、本明細書において記載する、第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)の間にある領域を含む受容ベクターとの組換えによって作製される産物DNA分子がその介在領域の方向によって識別可能な2種類のクラスに分かれることが分かるであろう。また受容ベクターが1つのイントロンを含む実施形態では、方向が異なることから正確な方向を確認するさらなるステップを必要としうる。このさらなるステップを回避するため、受容ベクターはその方向とは無関係にスプライシングされうるイントロン(pHELLSGATE 11に存在するものなど)を含んでもよい。または、受容ベクターは両方向にスプライシング可能なイントロン(pHELLSGATE 12に存在するものなど)を含んでもよい。
【００７２】
本明細書において用いる「プロモーター」という用語は、転写開始中にDNA依存性RNAポリメラーゼにより(直接または間接的に)認識され、さらに結合されるDNAをいう。プロモーターとしては、転写開始部位、ならびに転写開始因子およびRNAポリメラーゼの結合部位が挙げられ、これは遺伝子発現調節タンパク質が結合しうる場所である種々の他の部位(例えば、エンハンサー)を含んでもよい。
【００７３】
本明細書において使用する「調節領域」という用語は、タンパク質またはポリペプチドをコードするDNAなど、所与のDNA配列の転写の駆動および転写のタイミングおよびレベルの制御(すなわち、調節)に関与するDNAを意味する。例えば、5'調節領域(または「プロモーター領域」)はコード配列の上流(すなわち、5'側)に位置するDNA配列であり、これはプロモーターおよび5'非翻訳リーダー配列を含んでなる。3'調節領域はコード配列の下流(すなわち、3'側)に位置するDNA配列であり、これは1つ以上のポリアデニル化シグナルを含む好適な転写終結(および／または調節)シグナルを含んでなる。
【００７４】
本明細書において用いる「植物発現可能プロモーター」という用語は、植物細胞内で転写を制御(開始)しうるDNA配列を意味する。これには植物起源のあらゆるプロモーターだけでなく、植物細胞内で転写を指令しうる非植物起源のプロモーター、すなわち、CaMV35S、サブタレニアン・クローバー(subterranean clover)ウイルスプロモーターNo4もしくはNo7、またはT-DNA遺伝子プロモーターなどのウイルスまたは細菌起源のあるプロモーター、さらに、限定するものではないが、種子特異的プロモーター(例えば、WO89/03887)、器官原基特異的プロモーター(Anら, 1996)、茎特異的プロモーター(Kellerら, 1998)、葉特異的プロモーター(Hudspethら, 1989)、葉肉特異的プロモーター(光誘導性Rubiscoプロモーターなど)、根特異的プロモーター(Kellerら, 1989)、塊茎特異的プロモーター(Keilら, 1989)、維管束組織特異的プロモーター(Pelemanら, 1989)、雄しべ選択的プロモーター(WO89/10396、WO92/13956)、裂開部特異的プロモーター(WO97/13865)などを含む組織特異的または器官特異的プロモーターも含まれる。
【００７５】
受容ベクターは真核細胞内での発現のための選択マーカーをさらに含んでもよい。真核細胞内での発現のための選択マーカー遺伝子は当技術分野では周知であり、限定するものではないが、キメラマーカー遺伝子が挙げられる。キメラマーカー遺伝子はその5'末端で目的の宿主細胞内で機能するプロモーター、特に植物発現可能プロモーター、好ましくはCaMV 35Sプロモーターなどの構成性プロモーター、またはRubiscoの小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーターなどの光誘導性プロモーターに機能しうる形で連結され；かつ、その3'末端で好適な植物転写3'末端形成およびポリアデニル化シグナルに機能しうる形で連結されたマーカーDNAを含んでなる。マーカーDNAの選択は決定的なことではないので、どのような好適なマーカーも使用できると考えられる。例えば、マーカーDNAは形質転換植物細胞に識別可能な色を与えるタンパク質(A1遺伝子(Meyerら, 1987)など)、形質転換植物細胞に除草剤耐性を与えることができるタンパク質(ホスフィノトリシン耐性をコードするbar遺伝子など(EP 0,242,246))、または形質転換細胞に抗生物質耐性を与えることができるタンパク質(ゲンタマイシン耐性をコードするaac(6')遺伝子など(WO94/01560))をコードすることができる。
【００７６】
また、受容ベクターはキメラDNA構築物に隣接する左および右T-DNAボーダー配列をさらに含んでもよく、さらに、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の細菌種で機能する複製起点および／またはEP 0 116 718に記載されるヘルパーTi-プラスミドと相同であるDNA領域を含んでもよい。
【００７７】
目的の核酸が本発明の手段および方法を用いてキメラDNA構築物（真核生物5'および3'調節領域に機能しうる形で連結された逆方向反復配列の目的の核酸を2コピー含んでなる）に変換され得る効率および簡便性は、これらを自動化およびハイスループット解析に特に適合可能にする。
【００７８】
上記の受容ベクターは、真核細胞内で発現可能なプロモーターを任意のRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターと交換することによって、本明細書の他の箇所で記載したような選択した標的遺伝子と本質的に類似する相補的センスおよびアンチセンス部分を含む二本鎖RNAまたはRNAiをin vitroで大量に産生するのに使用できるベクターを提供するように容易に適合され得ることが当業者には明らかであろう。この目的において極めて好適なプロモーターは、大腸菌ファージT7、T3、□I、□II、W31、H、Y、A1、122、cro、C21、C22、およびC2；シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ファージgh-1；サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)ファージSP6；セラチア菌(Serratia marcescens)ファージIV；シトロバクター(Citrobacter)ファージViIII；およびクレブシェラ(Klebsiella)ファージNo.11由来のRNAポリメラーゼなどのバクテリオファージ単一サブユニットRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターなどのバクテリオファージ単一サブユニットRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである[Hausmann, Current Topics in Microbiology and Immunology, 75: 77-109(1976); Korstenら, J. Gen Virol. 43: 57-73(1975); Dunnら, Nature New Biology, 230: 94-96(1971); Towleら, J. Biol. Chem. 250: 1723-1733(1975); ButlerおよびChamberlin, J. Biol. Chem., 257: 5772-5778(1982)]。かかるプロモーターの例はT3 RNAポリメラーゼ特異的プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼ特異的プロモーターの各々である。CIGにおいて第1のプロモーターとして使用するT3プロモーターは、McGrawら, Nucl. Acid Res. 13: 6753-6766(1985)に記載されたT3遺伝子のプロモーターのいずれであってもよい。あるいは、T3プロモーターはT3 RNAポリメラーゼにより認識されるようにヌクレオチド位置-10、-11、および-12番で改変されたT7プロモーターであってよい[(Klementら, J. Mol. Biol. 215, 21-29(1990)]。好ましいT3プロモーターは米国特許第5,037,745号に記載されたT3プロモーターの「コンセンサス」配列を有するプロモーターである。本発明に従い、T7 RNAポリメラーゼと組み合わせて使用しうるT7プロモーターは、DunnおよびStudier, J. Mol. Biol. 166: 477-535(1983)に記載された1つのT7遺伝子のプロモーターを含んでなる。好ましいT7プロモーターは、DunnおよびStudier(上記)に記載されたT7プロモーターの「コンセンサス」配列を有するプロモーターである。従って、本発明は、
a)宿主細胞内での複製を可能な複製起点(1)；
b)上記宿主細胞内で発現可能な選択マーカー領域(2)；および
c)順に、
i)バクテリオファージ単一サブユニットRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域(3)；
ii)第1の組換え部位(4)、第2の組換え部位(5)、第3の組換え部位(6)および第4の組換え部位(7)、ただし、
(1)第1の組換え部位(4)と第4の組換え部位(7)は同一の他の組換え部位と反応可能であって、好ましくは互いに同一であり、
(2)第2の組換え部位(5)と第3の組換え部位(6)もまた同一の他の組換え部位と反応可能であって、好ましくは互いに同一であり、
(3)第1の組換え部位(4)と第2の組換え部位(5)は互いに、または同一の他の組換え部位とは組換えを起こさず、そして
(4)第3の組換え部位(6)と第4の組換え部位(7)は互いに、または同一の他の組換え部位とは組換えを起こさない；および
iii)真核細胞内で機能する3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)；
を含むキメラDNA構築物；
を含んでなる受容ベクターもまた提供する。
【００７９】
受容ベクターは本出願の他の箇所で記載したように目的のDNA断片を逆方向反復配列構造に変換するのに使用してもよく、受容ベクターDNAを当業者には周知の条件下で適切なバクテリオファージ単一サブユニットRNAポリメラーゼに接触させることによりdsRNAを大量に産生することができる。次いで、このようにして産生されたdsRNAを遺伝子サイレンシングしやすい植物細胞、真菌細胞または動物細胞などの細胞への送達に使用することができる。dsRNAはリポソームまたはその他のトランスフェクション剤(例えば、Clonfectionトランスフェクション試薬またはClonTech製のCalPhos哺乳類トランスフェクションキット)を介して動物細胞に導入してもよく、適切な標的遺伝子をサイレンシングすることによるヒトを含む動物の治療法にこれを使用できる。
【００８０】
受容ベクターは、特定の原核生物宿主内でのdsRNA発現に好適ないずれの原核生物プロモーターを備えてもよい。原核生物宿主は、例えば、それを標的遺伝子のサイレンシングが想定される線虫などの動物に与えることにより、dsRNAの供給源として使用できる。
【００８１】
また、真核細胞内で発現可能なプロモーターは哺乳類細胞内で発現可能なプロモーターであってよく、本発明のベクターはレトロウイルス送達系または他の動物トランスフェクション系を用いて一過性に送達されうる。
【００８２】
本発明のもう1つの実施形態では、目的の標的核酸の表現型発現が低下または阻害される真核生物（特に植物）を作出する方法を提供し、この方法は、本発明の方法に従って、目的の標的核酸に対して少なくとも70%の配列同一性を有する少なくとも19bpまたは25bpのヌクレオチド配列を含む目的の核酸(12)を含んでなり、かつ上記真核生物（特に植物）の細胞内でdsRNAを発現することができるキメラDNA構築物を作製し、該キメラDNA構築物を上記真核生物の細胞に導入し、該キメラDNA構築物についてトランスジェニックの真核生物を単離するステップを含んでなる。
【００８３】
本明細書中で用いる「目的の標的核酸の表現型発現」とは、宿主細胞内での核酸分子発現に関連する定量的形質を意味するものであり、従って、これには転写または複製されたRNA分子の量、転写後修飾されたRNA分子の量、翻訳されたペプチドまたはタンパク質の量、かかるペプチドまたはタンパク質の活性が挙げられうる。
【００８４】
目的の核酸の表現型発現に関連する「表現型形質」とは、記載の形質、ならびにRNA分子、ペプチドもしくはタンパク質、または翻訳後修飾されたペプチドもしくはタンパク質の存在により細胞またはその細胞を含有する生物に伝えられる直接または間接的な影響を含む、定量的または定性的形質をいう。たとえ定量的または定性的に追跡可能であるとしても、宿主細胞における核酸の単なる存在をその核酸の表現型発現または表現型形質とは考えない。細胞または生物に伝えられる直接または間接的な影響の例には、例えば、害虫または病気に対する耐性；より高いまたは改変された含油量などの農業経済上または産業上有用な形質がある。
【００８５】
本明細書において用いる「表現型発現の低下」とは、本発明のRNAまたはキメラ遺伝子の存在下での真核細胞に対する目的の標的核酸の表現型発現と、本発明のRNAまたはキメラ遺伝子の不在下での目的の標的核酸の表現型発現との比較についていう。このように、本発明のキメラRNAの存在下での表現型発現はその不在下での表現型発現よりも低く、好ましくはキメラRNAの不在下での表現型発現のせいぜい約25%、特に約10%のみ、さらに約5%のみであるべきである。特に全ての実用的な目的のためには、かかるRNAをコードするキメラRNAまたはキメラ遺伝子の存在により表現型発現は完全に阻害されるべきである。
【００８６】
表現型が定性的形質である場合の核酸の表現型発現の低下は、本発明のキメラRNAまたは遺伝子の存在下での表現型形質が、かかるRNAまたは遺伝子が不在である状況と比較した場合、明確に区別される状態に切り替わることを意味する。従って、核酸の表現型発現の低下は、特に、その核酸(の一部)の転写の低下、その核酸(の一部)の翻訳の低下、または転写されたRNAまたは翻訳されたポリペプチドの存在が真核細胞または生物に及ぼす影響の低下として測定することができ、最終的には改変された表現型形質がもたらされるだろう。目的の標的核酸の表現型発現の低下は、ある表現型形質の増大を伴うか、またはそれに相関しうることが明らかである。
【００８７】
本明細書において用いる「目的の標的核酸」とは、それが内在性の核酸、トランスジェニック核酸、ウイルス核酸などであろうと、真核細胞（特に植物細胞）に存在しうる特定のRNA分子またはDNA配列をいう。
【００８８】
トランスジェニック真核生物、特に植物を作出する方法については当技術分野では周知である。アグロバクテリウムが担う本発明のキメラ遺伝子を含んでなる無害化されたTi-プラスミドであるベクターを用いて遺伝子導入を行うことができる。この形質転換は、例えば、EP 0 116 718に記載される手順を用いて行うことができる。特定細菌種のアグロバクテリウムが媒介する形質転換法はシロイヌナズナ形質転換に特に好適な、いわゆるin planta法である(例えば、CloughおよびBent 1998)。あるいは、任意のタイプのベクターを使用し、直接遺伝子導入(例えば、EP 0 233 247に記載)、花粉媒介形質転換(例えば、EP 0 270 356、WO85/01856およびUS 4,684,611に記載)、植物RNAウイルス媒介形質転換(例えば、EP 0 067 553およびUS 4,407,956に記載)、リポソーム媒介形質転換(例えば、US 4,536,475に記載)などの方法を適用して植物細胞を形質転換することができる。Frommら(1990)およびGordon-Kammら(1990)によりトウモロコシに関して記載されたマイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)法などのその他の方法もまた好適である。WO92/09696で記載されるように、コンパクトな胚形成カルスを形成しうる、傷つけ、かつ／または酵素分解したコンパクトな胚形成組織、または傷つけた、かつ／または分解した未成熟胚を用いて主要穀物などの単子葉植物の細胞を形質転換することもできる。この後、得られた形質転換植物細胞を用いて常法により形質転換植物を再生させることができる。
【００８９】
得られた形質転換植物を通常の育種スキームに用いて、同じ特徴を有するより多くの形質転換植物を生産したり、または、同じまたは関連する植物種の他の変種またはハイブリッド植物内で本発明の目的の核酸の表現型発現を低下させるためにキメラ遺伝子を導入したりすることができる。形質転換植物から得られた種子は安定したゲノムインサートとして本発明のキメラ遺伝子を含有している。
【００９０】
もう1つの実施形態では、本発明は、目的の特定の表現型形質を決定することに関与している核酸分子の単離方法を提供する。この方法には以下のステップが含まれる：
a)本発明に記載の方法および手段を用いて、非ヒト真核生物の細胞内でdsRNAを発現することができるキメラDNA構築物のライブラリーを作製すること；
b)このキメラDNA構築物ライブラリーの個々のメンバーを、上記非ヒト真核生物の細胞に、好ましくはそれらのゲノム、特にそれらの核ゲノムへの安定した組込みにより導入すること；
c)特定形質を示す真核生物を単離すること；および
d)目的の形質を有する真核生物に存在する対応する核酸分子を、好ましくは上記ライブラリーから単離すること。
【００９１】
本発明の方法および手段を用いて、核酸断片または配列の一部または全部を、真核細胞に導入したときにdsRNA転写物を生成しうるキメラ構築物に変換し、そのキメラDNA構築物を真核生物に導入して、好ましくは多くのトランスジェニック生物を単離し、そして表現型形質の変化を観察することにより、機能が不明な単離された核酸断片または配列の機能を決定することができることは言うまでもない。
【００９２】
さらに、本発明は、本明細書に記載した受容ベクター、ならびに、かかるベクターを含んでなるキットも提供する。
【００９３】
本発明のベクター、方法およびキットは、遺伝子サイレンシングを受けやすい酵母、真菌類、植物、線虫、昆虫および節足動物などの動物、哺乳類およびヒトなどの脊椎動物を含めたあらゆる真核生物において使用することができる。
【００９４】
また、本発明により、順に機能しうる形で連結された以下のDNA断片：
i)真核細胞のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーターまたはプロモーター領域(3)；
ii)受容ベクター上の第1の組換え部位(4)と目的のDNAに隣接する第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(15)；
iii)目的の核酸断片(12)の第1のDNAコピー；
iv)受容ベクター上の第2の組換え部位(4)と目的のDNAに隣接する第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(16)；
v)受容ベクター上の第3の組換え部位(5)と目的のDNAに隣接する第6の組換え部位(14)との組換え産物である組換え部位(17)；
vi)第1のコピーと逆方向の目的の核酸断片(12)の第2のDNAコピー；
vii)受容ベクター上の第4の組換え部位(7)と目的のDNAに隣接する第5の組換え部位(13)との組換え産物である組換え部位(18)；および
viii)真核細胞内で機能する3'転写終結およびポリアデニル化領域(8)；
を含むキメラDNA構築物を含んでなる非ヒト生物も提供される。
【００９５】
本明細書において用いる「含んでなる」または「含む」は、記載するように、示された特徴、整数、ステップもしくは成分の存在を示すものと解釈されるが、1以上の特徴、整数、ステップもしくは成分、またはその群の存在または追加を排除するものではない。従って、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含んでなる核酸またはタンパク質は実際に列挙されたものより多いヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでもよい、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に組み込まれてもよい。機能的または構造的に定義されたDNA領域を含んでなるキメラ遺伝子はさらなるDNA領域などを含んでもよい。
【００９６】
「遺伝子」という用語は、好適な調節領域、例えば、植物発現可能プロモーターに機能しうる形で連結され、細胞内でRNA分子(例えば、mRNA)に転写されるDNA領域(「転写DNA領域」)を含んでなるDNA断片を意味する。従って、遺伝子はプロモーター、5'リーダー配列、コード領域、およびポリアデニル化部位を含む3'領域などの機能しうる形で連結されたいくつかのDNA断片を含んでもよい。特定植物種に内在する植物遺伝子(内在性植物遺伝子)はその植物種において天然に存在する、または通常の育種によりその植物種に導入されうる遺伝子である。キメラ遺伝子は植物種において天然には存在しない遺伝子、あるいはまた、プロモーターが転写されたDNA領域の一部または全てと、または遺伝子の少なくとも1つの他の調節領域と、天然で関連していない遺伝子である。
【００９７】
「遺伝子の発現」という用語は、適切な調節領域、特にプロモーターに機能しうる形で連結されたDNA領域が生物学的に活性である、すなわち、別の核酸と相互作用可能であるまたはポリペプチドまたはタンパク質に翻訳可能であるRNAに転写されるプロセスをいう。遺伝子発現の最終産物が、例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、または複製中間体などの生物学的に活性なRNAである場合には遺伝子はRNAをコードするものである。遺伝子発現の最終産物がタンパク質またはポリペプチドである場合には遺伝子はタンパク質をコードするものである。
【００９８】
好適な宿主細胞、特に植物細胞に導入する場合に核酸が転写(または複製)されてRNAが生じ、さらに／または翻訳されてその宿主細胞内にポリペプチドまたはタンパク質が生じうる場合には、核酸は「発現可能」である。
【００９９】
以下の非限定的な実施例では、目的の核酸断片を、真核細胞内でdsRNA転写物を発現することができるキメラDNA構築物に変換するための受容ベクターの構築ならびにその適用を説明する。実施例では特に断りのない限り、全ての組換えDNA技術は、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびにAusubelら(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第1巻および第2巻に記載の標準プロトコールに従って行われる。植物の分子的研究のための標準材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)およびBlackwell Scientific Publications, UKにより共同出版されたR. D. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax(1993)に記載されている。標準的な分子生物学技法に関するその他の文献としては、SambrookおよびRussell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Brown(1998) Molecular Biology LabFax, 第2版, Academic Press(UK)の第I巻および第II巻が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準材料および方法は、DieffenbachおよびDveksler(1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、ならびにMcPhersonら(2000) PCR-Basics: From Background to Bench, 第1版, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。
【０１００】
説明および実施例では、以下の配列を参照する：
配列番号1：組換え部位attB1のコア配列
配列番号2：組換え部位attB2のコア配列
配列番号3：組換え部位attB3のコア配列
配列番号4：組換え部位attR1のコア配列
配列番号5：組換え部位attR2のコア配列
配列番号6：組換え部位attR3のコア配列
配列番号7：組換え部位attL1のコア配列
配列番号8：組換え部位attL2のコア配列
配列番号9：組換え部位attL3のコア配列
配列番号10：組換え部位attP1のコア配列
配列番号11：組換え部位attP2,P3のコア配列
配列番号12：シロイヌナズナのカルコンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号13：受容ベクター「pHELLSGATE」のヌクレオチド配列
配列番号14：400bpおよび200bp CHS断片の増幅に使用したオリゴヌクレオチドattB1「フォワード」プライマー
配列番号15：400bp CHS断片増幅用のオリゴヌクレオチドattB2「リバース」プライマー
配列番号16：200bp CHS断片増幅用のオリゴヌクレオチドattB2「リバース」プライマー
配列番号17：100bp CHS断片の増幅に使用したオリゴヌクレオチドattB1「フォワード」プライマー
配列番号18：100bp CHS断片増幅用のオリゴヌクレオチドattB2「リバース」プライマー
配列番号19：50bp CHS断片の増幅に使用したオリゴヌクレオチドattB1「フォワード」プライマー
配列番号20：50bp CHS断片増幅用のオリゴヌクレオチドattB2「リバース」プライマー
配列番号21：25bp CHS断片増幅用のオリゴヌクレオチドattB1「フォワード」プライマー
配列番号22：25bp断片用のオリゴヌクレオチドattB2「リバース」プライマー
配列番号23：受容ベクター「pHELLSGATE 4」のヌクレオチド配列
配列番号24：受容ベクター「pHELLSGATE 8」のヌクレオチド配列
配列番号25：受容ベクター「pHELLSGATE 11」のヌクレオチド配列
配列番号26：受容ベクター「pHELLSGATE 12」のヌクレオチド配列
【０１０１】
実施例
実施例１
受容ベクターpHELLSGATEの構築
シロイヌナズナゲノムプロジェクトの完了、マイクロアレイ技術の出現および植物代謝、認識、および応答経路研究の高まりに伴い、目標とする遺伝子をサイレンシングする迅速な方法が重要な助けとなろう。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列、ならびに機能的イントロン配列を同時に含むキメラ遺伝子で形質転換した植物におけるサイレンシングの発生率および程度の高さから、かかるベクターがハイスループットサイレンシングベクターの基礎を形成しうることが示唆される。しかしながら、多数の確定遺伝子または不確定遺伝子のライブラリーのためにかかる通常のクローニングベクターを使用する際の主要な障害の1つは、各々の遺伝子に関するヘアピンアーム配列を正確な方向にクローニングすることであろう。
【０１０２】
センスおよびアンチセンスアームのPCR産物を、適切に切断されたベクターとともに単一ステップ4断片連結(single step four-fragment ligation)としてクローニングする試みは、効率のよいまたは再現性のある結果をもたらすことができなかった。そのため、Gateway(商標名)(Life Technologies)を利用するために構築物(pHELLSGATE)を作製した。この技術では、組換え部位(attB1およびattB2)に隣接しているPCR断片が作製されるが、かかる断片は、市販の組換えタンパク質調製を用いて、2組の好適な組換え部位(attP1およびattP2部位)を含むプラスミドへと指向的にin vitroで組換えられる。
【０１０３】
pHELLSGATEベクターは、適切なattB1およびattB2部位を有するプライマーからの単一PCR産物が該ベクターへと組換えられ、それと同時にヘアピンの2つのアームを形成するように設計された。DH5αなどの標準大腸菌株において致命的な(DB3.1では致命的でない)ccdB遺伝子を、アーム配列で置換される予定の位置に配置し、両方のアームを含有する組換え体だけが確実に回収されるようにした。イントロン内にクロラムフェニコール耐性遺伝子を配置することで、組換えプラスミド内のイントロンの保持を確実にするための選択が可能となる。
【０１０４】
pHELLSGATEは以下のDNA断片を含有する：
・スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子(配列番号13の7922位のヌクレオチドから9985位のヌクレオチド配列まで)；
・右T-DNAボーダー配列(配列番号13の10706位のヌクレオチドから11324位のヌクレオチド配列まで)；
・CaMV35Sプロモーター(配列番号13の11674位のヌクレオチドから13019位のヌクレオチド配列まで)；
・attP1組換え部位(配列番号13の17659位のヌクレオチドから17890位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補体)；
・ccdB選択マーカー(配列番号13の16855位のヌクレオチドから17610位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補体)；
・attP2組換え部位(配列番号13の16319位のヌクレオチドから16551位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補体)；
・クロラムフェニコール耐性遺伝子(配列番号13の15002位のヌクレオチドから15661位のヌクレオチドまで)を含み、イントロンスプライス部位(TACAG*TT)(配列番号13の16254位のヌクレオチドから16260位のヌクレオチドまで)およびイントロンスプライス部位(TG*GTAAG)(配列番号13の14660位のヌクレオチドから14667位のヌクレオチドまで)によって挟まれたpdkイントロン2(配列番号13の14660位のヌクレオチドから16258位のヌクレオチドまで)；
・attP2組換え部位(配列番号13の14387位のヌクレオチドから14619位のヌクレオチドまで)；
・ccdB選択マーカー(配列番号13の13675位のヌクレオチドから13980位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列の相補体)；
・attP1組換え部位(配列番号13の13048位のヌクレオチドから13279位のヌクレオチドまで)；
・オクトピンシンターゼ遺伝子ターミネーター領域(配列番号13の17922位のヌクレオチドから18687位のヌクレオチドまで)；
・以下のものを含む植物において選択可能なキメラマーカー：
・ノパリンシンターゼプロモーター(配列番号13の264位のヌクレオチドから496位のヌクレオチドまで)；
・nptIIコード領域(配列番号13の497位のヌクレオチドから1442位のヌクレオチドまで)；および
・ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター(配列番号13の1443位のヌクレオチドから2148位のヌクレオチドまで)；
・左T-DNAボーダー配列(配列番号13の2149位のヌクレオチドから2706位のヌクレオチドまで)；
・複製起点；
・カナマイシン耐性遺伝子。
【０１０５】
pHELLSGATEの完全なヌクレオチド配列を配列表(配列番号13)に示し、模式図を図3に示す。
【０１０６】
実施例２
目的の核酸断片を、dsRNAを産生するキメラサイレンシング遺伝子に変換するためのpHELLSGATEの使用
受容ベクターpHELLSGATEを試験するため、dsRNAを産生可能なキメラ遺伝子の構築のためにインサートの核酸断片としてシロイヌナズナ・カルコンシンターゼイソメラーゼコード配列(配列番号12)の約400bp、200bp、100bp、50bpおよび25bp断片(各々、配列番号12の83位のヌクレオチドから482位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列；配列番号12の83位のヌクレオチドから222位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列；配列番号12の83位のヌクレオチドから182位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列；配列番号12の83位のヌクレオチドから132位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列；および配列番号12の83位のヌクレオチドから107位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を有する)を使用した。
【０１０７】
シロイヌナズナにおいてはその突然変異対立遺伝子が明確に区別される表現型を与えることが報告されていることから、この遺伝子を選択した。CHS tt4(85) EMS突然変異体(Koornneef, 1990)は不活性CHSを産生し、その結果、茎および種皮のいずれかにアントシアニン色素が生成されなくなる。野生型植物では両方の組織に赤紫色の色素が産生される。
【０１０８】
第1のステップでは、各々の断片を、attB1およびattB2組換え部位をさらに含む特定のプライマーを使用してPCR増幅した。attB1およびattB2特異的プライマーはLife Technologiesから購入した。att部位によって挟まれた25および50bp断片はプライマーの二量体化により作製した。
【０１０９】
以下のプライマーの組合せを使用した：
400bp断片の場合
フォワードプライマー：
0004454934.tif 000004
および
リバースプライマー：
0004454934.tif 000005
【０１１０】
200bp断片の場合
フォワードプライマー：
0004454934.tif 000006
および
リバースプライマー：
0004454934.tif 000007
【０１１１】
100bp断片の場合
フォワードプライマー：
0004454934.tif 000008
および
リバースプライマー：
0004454934.tif 000009
【０１１２】
50bp断片の場合
フォワードプライマー：
0004454934.tif 000010
および
リバースプライマー：
0004454934.tif 000011
【０１１３】
25bp断片の場合
フォワードプライマー：
0004454934.tif 000012
および
リバースプライマー：
0004454934.tif 000013
【０１１４】
市販のBPクロナーゼ(Life Technologies)によるGATEWAY(商標名)技術を用いるPCR増幅および組換えは、製造業者の使用説明書(http://www.lifetech.com/content.cfm?pageid=2497で入手可能なマニュアル)に従って行った。
【０１１５】
in vitro組換え反応で(エレクトロポレーションにより、またはRbCl2処理したコンピテント大腸菌細胞に熱ショックを与えることにより)形質転換した大腸菌DH5α菌を分散させたクロラムフェニコール含有プレート上で得られた細菌コロニーをスクリーニングした。いずれの場合においても所望の組換えプラスミドを含有するコロニーが得られた。約400bp断片の場合には24コロニーがスクリーニングされ、23コロニーにCaMV35Sプロモーターに機能しうる形で連結された、逆方向反復配列の400bpを含有する所望の構築物が含まれていた。約200bp断片の場合には36コロニーがスクリーニングされ、35コロニーにCaMV35Sプロモーターに機能しうる形で連結された、逆方向反復配列の200bpを含有する所望の構築物が含まれていた。約50bp断片の場合には6コロニーがスクリーニングされ、4コロニーにCaMV35Sプロモーターに機能しうる形で連結された、逆方向反復配列の50bpを含有する所望の構築物が含まれていた。25bp断片の場合には6コロニーがスクリーニングされ、1コロニーにCaMV35Sプロモーターに機能しうる形で連結された、逆方向反復配列の400bpを含有する所望の構築物が含まれていた。いくつかの場合には、配列解析で構造を確認した。
【０１１６】
これらの結果から、このベクターによりhpRNA(ヘアピンRNA構築物)の迅速で、効率的かつ簡便な産生が容易になることが分かる。pHELLSGATEは取扱いやすくするために高コピー数の複数起点を有するT-DNAベクターである。キメラ構築物で植物を形質転換するため、組換えpHELLSGATE構築物を直接アグロバクテリウムに形質転換することができる。この系はハイスループット適用例で使用することが可能である。
【０１１７】
実施例３
実施例２のキメラ遺伝子を含む植物の評価
逆方向反復配列のカルコンシンターゼの400、200、100、50および25ヌクレオチドを含有するdsRNA産生キメラ構築物を含むベクター(実施例2)をエレクトロポレーションまたはtri-parental mating法のいずれかによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株AGL1、GV3101またはLBA4404に導入した。
【０１１８】
CloughおよびBent(1998)のディッピング(dipping)法を用いたこれらのアグロバクテリアでの形質転換によりトランスジェニックシロイヌナズナ細胞系が得られる。
【０１１９】
茎および葉の色を肉眼で観察することによりカルコンシンターゼ活性をモニターする(通常、強い光線の下で生育させた植物において、肉眼または顕微鏡による種皮色の目視観察による)。
【０１２０】
上記CHSサイレンシング構築物で形質転換したほとんどのトランスジェニック系は明白なサイレンシングを示す。こうした系の大部分の種子色はtt4(85)突然変異体の種子と肉眼では事実上見分けがつかない。光学顕微鏡下での種子の検査から、色素形成の程度が各種子の種皮細胞において、さらに同系の種子間で、ほぼ均一であることが分かる。
【０１２１】
実施例４
受容ベクターpHELLSGATE 4、pHELLSGATE 8、pHELLSGATE 11およびpHELLSGATE 12の構築
pHELLSGATE(実施例1)から、Hind IIIおよびEcoRIを用いてpdkイントロンおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を切り出し、それをpdkイントロンのみを含有するHind III/EcoRI DNA断片と置換することによりpHELLSGATE 4を作製した。pHELLSGATE 4の完全ヌクレオチド配列を配列表(配列番号23)に示す。
【０１２２】
鋳型としてpHellsgate DNAならびにプライマーとして下記の配列：
5'GGGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTG3'および
5'GGCTCGAGACCACTTTGTACAAGAAAGC3'
を有するオリゴヌクレオチドを用いて、PCR増幅によりpHELLSGATE 8を作製した。これらのプライマーはpHellsgate内のaatP部位をaatR部位に改変する。得られた断片を配列決定し、pdkイントロン断片を含有するDNA断片の上流でベクターのXhoI部位に挿入した。同様に、XbaI/XbaI断片を、プライマーとして下記のオリゴヌクレオチド：
5'GGGTCTAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTG3'および
5'GGGTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGC3'
ならびに鋳型DNAとしてpHEllSGATEを用いて増幅し、このカセットのaatP部位をaatR部位に改変した。この断片を配列決定し、pdkイントロンの下流で上記中間体のXbaI部位に挿入した。pHELLSGATE 8の完全なヌクレオチド配列を配列表(配列番号24)に示し、模式図を図4に示す。
【０１２３】
pHELLSGATE 11は、イントロンのスプライシングがその方向とは無関係 (いわゆる、「2ウェイイントロン(two-way intron)」)となるように、相補鎖内に分岐点を含めるべくpdkイントロンを操作したことを除き、pHELLSGATE 8と同様である。pHELLSGATE 11の完全なヌクレオチド配列を配列表(配列番号25)に示し、その模式図を図4に示す。
【０１２４】
pHELLSGATE 12もまた、pdkイントロンを逆方向反復配列として複製したことを除き、pHELLSGATE 8と同様である。pHELLSGATE 12の完全なヌクレオチド配列を配列表(配列番号26)に示し、その模式図を図4に示す。
【０１２５】
実施例５
3種類の異なるモデル標的遺伝子に向けて標的化されたdsRNAキメラサイレンシング遺伝子を生成するための異なるpHELLSGATEベクターの使用
異なるpHELLSGATEベクターの遺伝子サイレンシングにおける効率を、3種類の標的遺伝子、すなわち、開花遺伝子座C(Flowering locus C: FLC)、エチレン不感受性2(Ethylene insensitive 2: EIN2)およびフィトエンデサチュラーゼ(Phytoene desaturase: PDC)の断片を挿入することにより試験した。FLCの場合、390bp断片(Genbank登録番号AF116527として入手可能なヌクレオチド配列の303位のヌクレオチドから692位のヌクレオチドまで)を使用した。EIN2の場合、580bp断片(Genbank登録番号AF141203として入手可能なヌクレオチド配列の541位のヌクレオチドから1120位のヌクレオチドまで)を使用した。PDSの場合、432bp断片(Genbank登録番号L16237として入手可能なヌクレオチド配列の1027位のヌクレオチドから1458位のヌクレオチドまで)を使用した。5'attB1延長部(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)またはattB2延長部(GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)のいずれかを有する遺伝子特異的プライマーを使用してF1 Taq DNAポリメラーゼ(Fisher Biotec, Subiaco, WA, Australia)により製造業者のプロトコールに従って目的の遺伝子を増幅した。3倍容量のTEおよび2倍容量の30%(w/v)PEG3000、30mM MgCl2を加え、13000gで15分間遠心分離することによりPCR産物を沈降させた。PCR産物とpDONR201(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)またはpHELLSGATE 4のいずれかとの組換え反応を2μLのBPクロナーゼバッファー(Invitrogen)、1〜2μLのPCR産物、150ngのプラスミドベクターおよび2μLのBPクロナーゼ(Invitrogen)を含有する全量10μL中で行った。この反応混合物を室温(25℃)で1時間から一晩インキュベートした。インキュベーション後、1μLのプロテイナーゼK(2μg/μL; Invitrogen)を加え、37℃で10分間インキュベートした。1〜2μLの混合物を使用してDH5αを形質転換し、適切な抗生物質によりコロニーを選択した。クローンをDNAミニプレップの消化またはPCRのいずれかによりチェックした。pDONR201クローンからpHellsgate 8、11または12への組換え反応を2μLのLPクロナーゼバッファー(Invitrogen)、2μLのpDONR201クローン(約150ng)、300ngのpHellsgate 8、11または12および2μLのLP クロナーゼ(Invitrogen)を含有する全量10μL中で行った。この反応混合物を室温で一晩インキュベートし、プロテイナーゼ処理し、さらにこれを使用してBPクロナーゼ反応の場合のように大腸菌DH5αを形質転換した。シロイヌナズナの形質転換をフローラルディップ(floral dip)法(CloughおよびBent, 1998)により行った。100mg/lチメンチン(timentin)および50mg/l カナマイシンを補足した寒天固形MS培地で植物を選択した。FLCおよびPDS構築物では、生態型C24を使用し；EIN2構築物では、Landsberg erectaを使用した。EIN2表現型のスコアリングのため、形質転換T1植物を50μM 1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)を含有するMS培地に、同型接合性EIN2サイレンシング系および野生型Landberg erecta植物とともに移した。T1 FLS hpRNA植物については、MSプレートに移し、開花までの日数または開花時のロゼット葉をC24野生型植物およびflc突然変異体系との比較によりスコアリングすることで評価した。T1 PDS hpRNA植物については、葉の脱色性を調べてみることで評価した。異なるpHELLSGATEベクターで形質転換した植物の解析結果を表1に示す。
【０１２６】
pHellsgate 4-FLCおよびpHellsgate 8-FLCで形質転換した全ての植物が野生型C24よりかなり早く開花した。どちらの場合においてもflc-20系(FLC遺伝子の第1のイントロンに安定したDs挿入を担う)と同数のロゼット葉で開花する植物が観察された。pHELLSGATE 4-FLCおよびpHellsgate 8-FLC構築物で形質転換した植物集団間では開花時のロゼット葉にはっきりとした違いはなかった。
【０１２７】
pHELLSGATE 4-EIN2およびpHELLSGATE 8-EIN2植物の効果には違いが観察された。pHG4-EIN2に関する36形質転換体にはこの試験に使用した条件下で観察可能なACC耐性表現型を有する植物はなかったが、pHG8-EIN2トランスジーンを有する11植物のうち8植物にある程度のACC-耐性が見られた。pHG8-EIN2植物のACC耐性の程度がいろいろであったことから、形質転換体間でサイレンシングの程度に違いがあることが分かる。
【０１２８】
pHG4-PDSおよびpHG8-PDSを有する植物の大多数のものが、カロテノイドの不在による光保護の欠損と一致する表現型を示した。最も弱い表現型は子葉の脱色であった(本来の葉は生活環のいずれの時期においても脱色はない)。脱色子葉表現型はPDS hpRNA構築物で形質転換した植物にのみに見られ、本発明者らはこの表現型を有する植物はまたPDS hpRNA構築物を含有することを確認した(データは示されていない)。このことから、この表現型がカナマイシン選択による脱色ではなくPDSサイレンシングによるものであることが強く示唆された。pHELLSGATE 4-PDS構築物で形質転換した植物では、この弱い脱色子葉表現型しか得られなかった。これに対し、5本のpHELLSGATE 8-PDS植物は弱い表現型を有し、3本は本来の葉の広範囲にわたるまたは完全な脱色を伴うより強い表現型を示した。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の好ましい実施形態において使用するベクターおよび方法を示す模式図である。
【図２】  目的の核酸(12)を、2つの異なる組換え部位を含むプライマーを使用して、PCRにより増幅し(A)；Aで得られたインサートDNAと中間体ベクターとの組換えにより中間体DNAを得(B)；その後中間体DNAと受容ベクターとの組換え(C)を示す模式図である。
【図３】  受容ベクター「pHELLSGATE」を示す模式図である。
【図４】  受容ベクター「pHELLSGATE 8」、「pHELLSGATE 11」および「pHELLSGATE 12」を示す模式図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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