(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に精製されたポリペブチドであって、
（i）配列番号１において提供される配列を含むポリペプチド；
（ii）配列番号２において提供される配列を含むポリペプチド；
（iii）配列番号３において提供される配列を含むポリペプチド；
（iv）配列番号４において提供される配列を含むポリペプチド；または
（v）（i）から（iv）のいずれか一つに９５％より多く同一な配列を含むポリペプチド、
から選択され、有機リン酸エステル分子を加水分解することができるホスホトリエステラーゼであり、且つ、配列番号１７で定義されるポリペプチドと比べて、以下の有機リン酸エステル：クマホス、パラチオン−メチル、ホスメット、フェンチオン、ジアジノンおよび/またはｄＭＵＰの少なくとも１つを加水分解するための高められた性能を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
有機リン酸エステル分子が、クマホス、コロクソン、パラオクソン、パラチオン、パラチオン−メチル、ホスメット、フェンチオン、ジアジノン、クロルピリホス、ｄＭＵＰ、ＤＦＰ、ジメトアート、マラチオン、およびマラオクソンからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドがアグロバクテリウム種から精製され得る、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つの他のポリペプチド配列に融合された、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つの他のポリペプチドが、マルトース結合タンパク質である、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（i）配列番号５において示されるヌクレオチド配列；
（ii）配列番号６において示されるヌクレオチド配列；
（iii）配列番号７において示されるヌクレオチド配列；
（iv）配列番号８において示されるヌクレオチド配列；
（v）請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列；または
（vi）（i）から（iv）のいずれか一つに少なくとも９５％同一な配列、
から選択された配列を含み、
有機リン酸エステル分子を加水分解することができるホスホトリエステラーゼであって、且つ、配列番号１７で定義されるポリペプチドと比べて、以下の有機リン酸エステル：クマホス、パラチオン−メチル、ホスメット、フェンチオン、ジアジノンおよび/またはｄＭＵＰの少なくとも１つを加水分解するための高められた性能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
ウィルスベクターである請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドベクターである請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製するための方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を、ポリペプチドの生成を許容する条件下で培養すること、および、該ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項１２】
有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド、および1つ以上の許容される担体を含む組成物。
【請求項１３】
有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、請求項１０に記載の宿主細胞、および１つ以上の許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、試料を請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドにさらすことを含む方法。
【請求項１５】
該ポリペプチドが、請求項１２または請求項１３に記載の組成物として提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料を二価陽イオンにさらすことをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
二価陽イオンが亜鉛である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料が、土壌、水、生物学的物質、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する遺伝子導入植物。
【請求項２０】
試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、請求項１９に記載の遺伝子導入植物に試料をさらすことを含む方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが、少なくとも遺伝子導入植物の根に生成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
豪州政府分析研究所に２００１年４月２０日にＮＭ０１／２１１１２として寄託された、アグロバクテリウム・ラジオバクター単離株。
【請求項２３】
有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、請求項２２に記載のアグロバクテリウム・ラジオバクター株、および１つ以上の許容される担体を含む組成物。
【請求項２４】
試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、請求項２２に記載のアグロバクテリウム・ラジオバクター株に試料をさらすことを含む方法。
【請求項２５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する単離されたアグロバクテリウム種。
【請求項２６】
アグロバクテリウム種がアグロバクテリウム・ラジオバクター株である、請求項２５に記載の単離された細菌。
【請求項２７】
試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する単離されたアグロバクテリウム種の使用。
【請求項２８】
有機リン酸エステル分子を加水分解するための高分子スポンジもしくは発泡体であって、高分子多孔質支持材上に固定化された請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む発泡体もしくはスポンジ。
【請求項２９】
多孔質支持材がポリウレタンを含む、請求項２８に記載の高分子スポンジもしくは発泡体。
【請求項３０】
スポンジもしくは発泡体が、さらに、多孔質支持材上もしくは中に、埋め込まれた、または一体化された、炭素を更に含む、請求項２８または２９に記載の高分子スポンジもしくは発泡体。
【請求項３１】
試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のスポンジもしくは発泡体に試料をさらすことを含む方法。
【請求項３２】
有機リン酸エステルの存在を検出するためのバイオセンサーであって、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド、および該ポリペプチドによる有機リン酸エステル分子の加水分解を検出するための手段を含むバイオセンサー。
【請求項３３】
有機リン酸エステルを加水分解するための高められた性能、または有機リン酸エステルに対する変更された基質特異性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
（i）請求項１から５のいずれか一項に記載された第一のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸を変異させること、
（ii）有機リン酸エステルを加水分解するための変異体の性能を測定すること、および
（iii）第一のポリペプチドと比べて、有機リン酸エステルを加水分解するための高められた性能、または有機リン酸エステルに対する変更された基質特異性を有する変異体を選択すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解することができる酵素に関する。特に、本発明は、有機リン殺虫剤を加水分解する土壌から単離されたアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）株から同定されたホスホトリエステラーゼ酵素およびその酵素をコードする遺伝子に関する。本発明は、変更された基質特異性を有する同定されたホスホトリエステラーゼ酵素の変異体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
有機リン殺虫剤の残留物は、望ましくない環境汚染物質であり、商品の範囲である。特定の感度の領域は、土壌、再生利用され、下流の灌漑施設によって用いられた、もしくは単に農場に流出された灌漑用放水路の水の汚染、および農園芸輸出物における許容レベル以上の残留物を含む。有機リン酸エステル類による汚染は、これらの化学薬品にさらされる農作業者にとって、化学戦争において用いられた有機リン酸エステル類にさらされた兵士と同様に、問題をもたらす。さらに、有機リン神経作用物質の備蓄により、これらの在庫品を無毒化することが必要となる。それゆえ、バイオリミジエーション方法が、これらの有機リン酸エステル残留物および／または備蓄物を除去するまたは減らすために、必要となる。
【０００３】
１つの提案される方法は、有機リン酸エステル残留物を固定化する、または分解することができる酵素の使用を含む。そのような酵素は、例えば、汚染水を通すことができるバイオリアクター、または、果物、野菜または動物製品の収穫後の駆除後の洗浄溶液において、残留濃度と保留時間を減らすために用いることができる。有機リン酸エステル残留物を分解するために適した酵素は、細菌由来の有機リン酸エステル加水分解酵素（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２）、脊椎動物由来の有機リン酸エステル加水分解酵素（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）および有機リン酸エステル耐性昆虫由来の有機リン酸エステル加水分解酵素（特許文献３および特許文献４）を含む。有機リン酸エステル加水分解酵素が早い速度で有機リン酸エステル残留物を分解することが望ましい。
【０００４】
最も徹底的に研究された有機リン酸エステル分解酵素は、両フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ.）ＡＴＣＣ２７５５１およびブリブンジモナス・ジミニュタ・エムジー（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＭＧ）（非特許文献８；および非特許文献９）において、異なるプラスミド上の同一遺伝子によってコードされた細菌性オルガノホスファートジヒドロラーゼ（ＯＰＤ）である。ＯＰＤは、広範囲のリン酸トリエステル類（両オクソンおよびチオン有機リン酸エステル類）を加水分解することが可能なホモ二量体タンパク質である（非特許文献１０、１１）。その反応機構は、直接的または間接的に、金属イオン、好ましくはＺｎ＋＋を含む。ＯＰＤは、リン酸モノエステル類もしくはジエステル類で検出できる活性を有さない（非特許文献１０、１１；非特許文献１２）。
【０００５】
ＯＰＤ相同体類（ホスホトリエステラーゼ相同タンパク質類、またはＰＨＰ類）が、大腸菌（ｅＰＨＰ）、マイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ｍｔＰＨＰ）、およびマイコプラズマ・ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ｍｐＰＨＰ）の染色体において同定されているが、大腸菌（ｅＰＨＰ）だけがホスホトリエステラーゼ活性について試験されている（非特許文献１３；非特許文献１４）。ｐ−ニトロフェニルアセタート、ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスファート、パラオクソンおよびｐ−ニトロフェニルホスファートなど、試験されたいかなる基質を用いても、ｅＰＨＰ未精製溶菌液中に活性は検出されなかった。
【０００６】
また、ＯＰＤ相同体は、脊椎動物においても同定されているが、これらの生物におけるそれらの機能について知られていない（非特許文献１５）。ＯＰＤ、ｅＰＨＰ、ｍｔＰＨＰ、および哺乳動物ＰＨＰ類は、アミノ酸レベルで２７〜３０％同一であるが、ｍｐＰＨＰはそれほど類似していない。Ｚｎ＋＋結合に関与するアミノ酸残基は、現在までに同定されたホスホトリエステラーゼファミリーの６つの構成員にわたって保存されている。（非特許文献１４）
【０００７】
３つの他の異なる有機リン酸エステル加水分解酵素類が、有機リン酸エステル類にさらしたことのある細菌から単離されている（非特許文献９；非特許文献１；非特許文献３）。配列データが利用できる２つは、互いに、そしてＯＰＤと、関係がない。一方、アルテロモナス種（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来のプロリダーゼは、通常、Ｘ−Ｐｒｏジペプチド類の加水分解において機能する。殺虫剤有機リン酸エステル類としての活性は、特異性定数Ｋｃａｔ／Ｋｍに換算して、報告されていないが、あまり大きくないと報告されている（非特許文献３）。他方、ノカルジア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）Ｂ−１株由来のアリールジアルキルホスファターゼ（ＡＤＰａｓｅ）は、ＯＰＤに関して報告されたターンオーバー数よりも４５００倍低いパラチオンエチルに対するターンオーバー数を有する（非特許文献９；非特許文献１）。
【０００８】
パラオクソナーゼ、またはＰＯＮ１は、哺乳動物において見出された異なる有機リン酸エステル加水分解酵素である。ＯＰＤのように、それは、金属酵素、この場合はＣａ＋＋が好ましい、であり、血漿中で低密度リポプロテインと会合しており、通常、酸化脂質複合体の物質代謝に関与する。それは、パラオクソンに対する高い活性を、特異性定数約１０６／Ｍ・秒で有している（非特許文献１６；非特許文献１７）。
【０００９】
また、広範囲の脊椎動物、無脊椎動物、および微生物において、他の酵素、いわゆるジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ）酵素に関する証拠もある（非特許文献５；非特許文献１８；非特許文献１９）。これらの酵素は、多くの生化学的特性において顕著に異なるが、全て、有機リン化学兵器に対する加水分解活性によって特徴づけられる。限られた配列データは、それらが前記他の有機リン酸エステル加水分解酵素全てに関係しないことを示す。
【００１０】
有機リン酸エステル耐性クロバエおよびイエバエは、クロルフェンビンホス（ｃｈｌｏｒｆｅｎｖｉｎｆｏｓ）（ＣＶＰ）様オクソン有機リン酸エステル類およびマラチオン様カルボキシルエステル有機リン酸エステル類に対する活性を有するエステラーゼ酵素の源である（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；特許文献３；特許文献４）。クロバエエステラーゼＥ３（およびそのイエバエ類似体（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、ＡＬ１）における残基１３７でのグリシンからアスパラギン酸への置換により、ＣＶＰに対する活性を獲得する結果となり、一方で、同じ酵素における残基２５１でのトリプトファンからロイシン／セリンへの変異により、マラチオンに対して活性となる。しかしながら、これらの酵素の有機リン酸エステル基質に対する特異性定数は、ＯＰＤのパラオクソンに対する特異定数よりも桁が小さい。
【非特許文献１】Mulbry, W.W. (1992). Gene 121:149-153
【非特許文献２】Mulbry, W.W. および Kearney, P.C. (1991). Crop Protection 10: 334-345
【非特許文献３】Cheng, T., DeFrank, J.J. および Rastogi, V.K. (1999). Chemico-Biological Interactions 119-120: 455-462
【非特許文献４】Wang, F., Xiao, M. および Shaofeng, M. (1993). Journal of Biochemistry and Toxicology 8: 161-166
【非特許文献５】Wang, Q., Sun, M., Zhang, H., および Huang, C. (1998). Journal of Biochemistry and Molecular Toxicology 12: 213-217
【非特許文献６】Gan, K.N., Smolen, A., Eckerson, H.W. および Bert, N.L. (1991). Drug Metabolism and Disposition 19: 100-106
【非特許文献７】Broomfield., C.A., Lockridge, O. および Millard, C.B. (1999). Chemico-Biological Interactions 119-120: 413-418
【特許文献１】US 5,484,728
【特許文献２】US 5,589,386
【特許文献３】WO 95／19440
【特許文献４】WO 97／19176
【非特許文献８】Harper, L.L., McDaniel, S., Miller, C.E. および Wild, J.R. (1988). Applied and Environmental Microbiology 54: 2586-2589
【非特許文献９】Mulbry, W.W.および Karns, J.S.(1989).Journal of Bacteriology 171: 6740-6746.
【非特許文献１０】Dumas, D.P., Wild, J.R. および Raushel, F.M. (1989a). Biotechnology and Applied Biochemistry 11: 235-243
【非特許文献１１】Dumas, D.P., S.R. Caldwell, J.R. Wild および F.M Raushel, (1989b). Journal of Biological Chemistry 264: 19659-19665.
【非特許文献１２】Dumas, D.P., Wild, J.R. および Raushel, F.M. (1990). Experientia 46: 729-731
【非特許文献１３】Scanlen, C.S. および Reid, R.C. (1995). Chemistry and Biology 2: 71-75.
【非特許文献１４】Buchbinder, J.L., Stephenson, R.C., Dresser, M.J., Pitera, J.W., Scanlan, T.S. および Fletterick, R.J. (1998). Biochemistry 37: 5096-5160.
【非特許文献１５】Davies, J.A., Buchman, V.L., Krylova, O. および Ninkina, N.N. (1997). FEBS Letters 410: 378-382.
【非特許文献１６】Doorn, J.A., Sorenson, R.C., Billecke, S.S., Hsu, C. および La Du, B.N. (1999). Chemico-Biological Interactions 120: 235-241.
【非特許文献１７】Hong, S.B. および Raushel, F.M. (1999). Chemico-Biological Interactions 120: 225-234.
【非特許文献１８】Hoskin, F.C.G., Walker, J.E. および Mello, C.M. (1999). Chemico-Biological Interactions 120: 399-404.
【非特許文献１９】Billecke, S.S., Primo-Parmo, S.L., Dunlop, C.S., Doorn, J.A., La Du, B.N. および Broomfield, C.A.(1999). Chemico-Biological Interactions 120: 251-256.
【非特許文献２０】Newcomb, R.D., Campbell, P.M., Ollis, D.L., Cheah, E., Russell, R.J. および Oakeshott, J.G. (1997). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 94: 7464-7468.
【非特許文献２１】Campbell, P.M., Newcomb, R.D., Russell, R.J. および Oakeshott, J.G. (1998). Insect Biochemistry and Molecular Biology 28: 139-150.
【非特許文献２２】Claudianos, C., Russell, R.J. および Oakeshott, J.G. (1999). Insect Biochemistry and Molecular Biology 29: 675-686.
【非特許文献２３】J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning, John WileyおよびSons(1984)
【非特許文献２４】J.Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory出版社(1989)
【非特許文献２５】T.A.Brown（編集者）, Essential Molecular Biology: A Practical Approach,第１および２巻、IRL出版社(1991)
【非特許文献２６】D.M.GloverおよびB.D. Hames（編集者）, DNA Cloning: A Practical Approach,第１〜４巻、IRL 出版社(1995および1996)
【非特許文献２７】F.M.Ausbel等（編集者）、Current Prorocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatesおよびWiley-Interscience(1988、現在までに改訂されたもの全てを含む)
【非特許文献２８】Pearson, W.R. および D.J. Lipman.(1988). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85: 2444-2448.
【特許文献５】WO 99/53037
【非特許文献２９】Gordon, R.K., Feaster, S.R., Russell, A.J., LeJeune, K.E., Maxwell, M.D., Lenz, D.E., Ross, M. および Doctor, B.P. (1999). Chemical-Biological Interactions 14:463-470.
【非特許文献３０】Petrikovics, I., Cheng, T.C., Papahadjopoulos, D., Hong, K., Yin, R., DeFrank, J.J., Jaing, J., Zong, Z.H., McGuinn, W.D., Sylvester, D., Pei, L., Madec, J., Tamulinas, C., Jaszberenyi, J.C., Barcza, T. および Way, J.L. (2000a). Toxicology Science 57:16-21.
【非特許文献３１】Petrikovics, I., McGuinn, W.D., Sylvester, D., Yuzapavik, P., Jaing, J., Way, J.L. Papahadjopoulos, D., Hong, K., Cheng, T.C., および DeFrank, J.J. (2000b). Drug Delivery 7: 83-89.
【非特許文献３２】LeJuene, K.E., Wild J.R. および Russell, A.J.(1998). Nature 395:27-28.
【特許文献６】WO 00/64539
【非特許文献３３】Rekha, M., Thakur, M.S., および Karanth, N.G. (2000). Critical Reviews in Biotechnology 20: 213-235.
【非特許文献３４】Cook, A.M., Daughton, C.G. および Alexander, M. (1978). Applied and Environmental Microbiology 36: 668-672.
【非特許文献３５】Rosenberg, A. および Alexander, M. (1979). Applied and Environmental Microbiology 37: 886-891.
【非特許文献３６】Rainey, F.A., M. Dorsch, H.W. Morgan および E. Stackebrandt (1992). Systematic and Applied Microbiology 15: 197-202.
【非特許文献３７】Lane, D.J.(1991). 6S/23S rRNA sequencing, p115-175. In E. Stackebrandt および M. Goodfellow (ed.) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, New York.
【非特許文献３８】Krieg, N.R. および Holt, J.G. (ed.) 1984. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
【非特許文献３９】Kovacv, N.(1956). Nature 178: 703
【非特許文献４０】Serdar, C.M., Murdock, D.C. および Rohde, M.F. (1989). Bio/Technology 7: 1151-1155
【非特許文献４１】Sambrook, Fritsch, J.E.F. および Maniatis, T. (1989). Molecular cloning − A laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA.
【非特許文献４２】Gardiner, A.T, MacKenzie, R.C., Barrett, S.J., Kaiser, K. および Cogdell, R.J. (1996). Photosynthesis Research 49: 223-235.
【非特許文献４３】Zimmerer, R.P., Hamilton, R.H. および Pootjes, C.(1966). Journal of Bacteriology 92: 746-750.
【非特許文献４４】Bowen, A.R.StG. および Pemberton, J.M. (1985). Mercury resistance transposon Tn813 mediates chromosome transfer in Rhodopseudomonas sphaeroides and intergeneric transfer in pBR322. in Helsinki, D.R., S.N. Cohen, D.B. Clewell, D.A. Jackson および A. hollaender (ed.), Plasmids in Bacteria. Plenum Press, New York, p105-115
【非特許文献４５】Yanisch-Perron, Vieira, C.J. and Messing, J. (1985). Gene 33:103-119
【非特許文献４６】Benning, M.M., Kuo, J.M., Raushel, F.M. および Holden, H.M. (1995). Biochemistry 34: 7973-7978
【非特許文献４７】diSioudi, B., Grimsley, J.K., Lai, K. および Wild, J.R. (1999). Biochemistry 38: 2866-2872
【非特許文献４８】Gill, S.C. および von Hippel, P.H. (1989). Analytical Biochemistry 182: 319-326.
【非特許文献４９】Roth, M. (1969). Methods of Biochemical Analysis 17: 189-285
【非特許文献５０】Ibrahim, F.B. および Cavagnol, J.C. (1966). Journal of Agricultural and Food Chemistry 14: 369-371
【非特許文献５１】Lai, K., Stolowich, N.J. および Wild, J.R. (1995). Archives of Biochemistry and Biophysics 318: 59-64
【非特許文献５２】Munnecke, D.M. および Hsieh, D.P. (1976). Applied and Environmental Microbiology 31:63-69.
【非特許文献５３】Yang, F., Wild, J.R. および Russell, A.J. (1995). Biotechnology Progress 11: 471-474
【非特許文献５４】Lai, K., Stolowich, N.J. および Wild, J.R. (1995). Archives of Biochemistry and Biophysics 318:59-64
【非特許文献５５】Harcourt, R.L., Horne, I., Sutherland, T.D., Hammock, B.D., Russell, R.J. および Oakeshott, J.G. (2002) Lett. Appl. Microbiol. 34:263-268
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
バイオリミジエーション方法に用いることできる更なる有機リン酸エステル分解酵素が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者達は、クマホス（チオン有機リン殺虫剤）加水分解に対する迅速で高感度の蛍光測定アッセイを開発し、それを用いて、唯一のリン源として有機リン酸エステル類を使うことができる汚染土壌から細菌を単離した。１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列決定により、アグロバクテリウム・ラジオバクター株として細菌（単離されたＰ２３０）を同定した。また、本発明者達は、このクマホス加水分解活性の原因酵素を単離し、そして特徴付け、そしてバイオリミジエーション方法においてこの酵素を使用する方法を提供する。
【００１３】
一面において、本発明は、実質的に精製されたポリペプチドであって、
（i）配列番号１において提供される配列を含むポリペプチド；
（ii）配列番号２において提供される配列を含むポリペプチド；
（iii）配列番号３において提供される配列を含むポリペプチド；
（iv）配列番号４において提供される配列を含むポリペプチド；または
（v）（i）から（iv）のいずれか一つに９０％より多く同一な配列を含むポリペプチド、
から選択され、有機リン酸エステル分子を加水分解することができるポリペプチドを提供する。
【００１４】
好ましい有機リン酸エステル分子は、限定されないが、クマホス、コロクソン（ｃｏｒｏｘｏｎ）、パラオクソン、パラチオン、パラチオン−メチル、ホスメット（ｐｈｏｓｍｅｔ）、フェンチオン、ジアジノン、クロルピリホス、ｄＭＵＰ、ＤＦＰ、ジメトアート、マラチオン、およびマラオクソンを含む。より好ましくは、該有機リン酸エステルは、ホスメットまたはフェンチオンである。
【００１５】
好ましい一実施態様において、該ポリペプチドは、アグロバクテリウム種から精製されることができる。
【００１６】
さらに好ましい一実施態様において、該ポリペプチドは、（i）から(iv)のいずれか一つに、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より更に好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００１７】
別の一面において、本発明は、実質的に精製されたポリペプチドであって、
（i）配列番号１において提供される配列を含むポリペプチド；
（ii）配列番号２において提供される配列を含むポリペプチド；または、
（iii）（I）または（ii）に９０％より多く同一なポリペプチド、
から選択されるポリペプチドを提供する。
【００１８】
別の一面において、少なくとも１つの他のポリペプチド配列に融合された本発明によるポリペプチドを含む融合ポリペプチドが提供される。
【００１９】
好ましくは、少なくとも１つの他のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの安定性を高めるポリペプチド、および融合ポリペプチドの精製に役立つポリペプチド、からなる群から選択される。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１つの他のポリペプチドは、マルトース結合タンパク質である。
【００２１】
別の一面において、本発明は、単離されたポリヌクレオチドであって、
（i）配列番号５において示されるヌクレオチド配列；
（ii）配列番号６において示されるヌクレオチド配列；
（iii）配列番号７において示されるヌクレオチド配列；
（iv）配列番号８において示されるヌクレオチド配列；
（v）本発明によるポリペプチドをコードする配列；または
（vi）（i）から（v）のいずれか一つに少なくとも９０％同一な配列、
から選択された配列を含み、有機リン酸エステル分子を加水分解することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
好ましくは、該ポリヌクレオチドは、（i）から（v）のいずれか一つに、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００２３】
更なる一面において、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２４】
好ましくは、該ベクターは、ポリヌクレオチドの複製および／または発現に適している。該ベクターは、例えば、複製開始点、好ましくはポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび任意でプロモーターのレギュレーターを設けたプラスミド、ウィルス、またはファージベクターであることができる。該ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー、例えば、細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または、哺乳類発現ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子、を含むことができる。該ベクターは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、例えば、ＲＮＡ生成のために用いることができ、あるいは、宿主細胞をトランスフェクトする、または形質転換するために用いることができる。
【００２５】
別の一面において、本発明によるベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２６】
更なる一面において、本発明は、本発明のポリペプチドを調製するための方法であって、本発明の宿主細胞を、ポリペプチドの生成を許容する条件下で培養すること、および、該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。そのような細胞は、コードされたポリペプチドを商業的に有用な量で生成するために用いることができる。
【００２７】
別の一面において、本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、本発明によるポリペプチド、および1つ以上の許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２８】
別の一面において、本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、本発明の宿主細胞、および１つ以上の許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２９】
本発明が、試料中の有機リン酸エステル類を加水分解するために用いられ得ることが評価されるであろう。例えば、農作物に有機リン殺虫剤を噴霧した後、有機リン酸エステル残留物を、人が消費する前に、種、果実、および野菜から加水分解することができる。同様に、有機リン酸エステルに汚染された土壌または水を、本発明のポリペプチドで処理することができる。
【００３０】
従って、更なる一面において、本発明は、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、試料を本発明によるポリペプチドにさらすことを含む方法を提供する。
【００３１】
好ましくは、該ポリペプチドは、本発明の組成物として提供される。
【００３２】
さらに、該方法が、試料を二価陽イオンにさらすことを更に含むことが好ましい。好ましくは、該二価陽イオンは、亜鉛である。
【００３３】
好ましくは、該試料は、土壌、水、生物学的物質、またはそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。好ましい生物学的試料は、肉などの動物に由来する物質と同様に、種、野菜または果物などの植物に由来する物質を含む。
【００３４】
好ましい有機リン酸エステル分子は、限定されないが、クマホス、コロクソン、パラオクソン、パラチオン、パラチオン−メチル、ホスメット、フェンチオン、ジアジノン、クロルピリホス、ｄＭＵＰ、ＤＦＰ、ジメトアート、マラチオン、およびマラオクソンを含む。より好ましくは、該有機リン酸エステルは、ホスメットまたはフェンチオンである。
【００３５】
該試料は、利用可能な任意の手段を介してポリペプチドにさらすことができる。これは、担体または賦形剤などを用いて、もしくは用いずに、ポリペプチドを直接的に試料に供給することを含む。また、該ポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞、典型的には、細菌もしくは真菌などの微生物の形態で提供されることができる。一般に、該ポリペプチドは、本発明の組成物として提供されるであろう。
【００３６】
試料中の有機リン酸エステル分子は、本発明のポリペプチドを生成する遺伝子導入植物に、試料をさらすことによって、加水分解させることもできる。
【００３７】
このように、更なる一面において、本発明によるポリペプチドを生成する遺伝子導入植物が提供される。
【００３８】
更なる一面において、本発明は、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、本発明による遺伝子導入植物に試料をさらすことを含む方法を提供する。
【００３９】
好ましくは、該試料は、土壌である。
【００４０】
更に、該ポリペプチドが、少なくとも遺伝子導入植物の根に生成されることが好ましい。
【００４１】
さらに別の一面において、本発明は、豪州政府分析研究所に２００１年４月２０日にＮＭ０１／２１１１２として寄託された、アグロバクテリウム・ラジオバクター単離株を提供する。
【００４２】
別の一面において、本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解するための組成物であって、本発明のアグロバクテリウム・ラジオバクター株、および１つ以上の許容される担体を含む組成物を提供する。
【００４３】
さらに別の一面において、本発明は、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、本発明によるアグロバクテリウム・ラジオバクター株に試料をさらすことを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明の開示は、有機リン酸エステル類を加水分解する他の細菌の種／株を単離するために、容易に用いられることができる。例えば、他の細菌種／株は、ここに開示されているように、蛍光測定スクリーニング方法を用いて単離することができる。あるいは、本発明のポリペプチドの天然の変異体を生成する細菌を同定するために、プローブおよび／またはプライマーを、本発明のポリヌクレオチドに基づいて、設計することができる。
【００４５】
従って、更なる一面において、本発明は、本発明によるポリペプチドを生成する単離された細菌を提供する。
【００４６】
好ましくは、該細菌は、アグロバクテリウム種である。より好ましくは、該細菌は、アグロバクテリウム・ラジオバクター株である。
【００４７】
更なる一面において、本発明は、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための、本発明によるポリペプチドを生成する単離された天然細菌の使用を提供する。
【００４８】
更なる一面において、本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解するための高分子スポンジもしくは発泡体であって、高分子多孔質支持材上に固定化された本発明によるポリペプチドを含む発泡体もしくはスポンジを提供する。
【００４９】
好ましくは、該多孔質支持材は、ポリウレタンを含む。
【００５０】
好ましい実施態様において、該スポンジもしくは発泡体は、さらに、多孔質支持材上もしくは中に、埋め込まれた、または一体化された、炭素を更に含む。
【００５１】
更なる一面において、本発明は、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解するための方法であって、本発明によるスポンジもしくは発泡体に試料をさらすことを含む方法を提供する。
【００５２】
別の一面において、本発明は、有機リン酸エステルの存在を検出するバイオセンサーであって、本発明のポリペプチド、および該ポリペプチドによる有機リン酸エステル分子の加水分解を検出するための手段を含むバイオセンサーを提供する。
【００５３】
更なる別の一面において、本発明は、有機リン酸エステル分子を加水分解する作用物質をスクリーニングするための方法であって、
（i）有機リン酸エステルを候補作用物質にさらすこと、および
（ii）工程（i）から生じた蛍光シグナルを測定すること、
を含み、該蛍光シグナルが有機リン酸エステルの加水分解を示す方法を提供する。
【００５４】
好ましくは、有機リン酸エステルは、クマホスまたはコロクソンである。
【００５５】
更に、作用物質が、ポリペプチドまたは微生物であることが好ましい。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、変異させることができ、得られた変異体は、基質特異性における変化など変更された活性で選別することができる。
【００５７】
このように、更なる一面において、本発明は、有機リン酸エステルを加水分解するための高められた性能、または有機リン酸エステルに対する変更された基質特異性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
（i）請求項１から５のいずれか一項に記載された第一のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸を変異させること、
（ii）有機リン酸エステルを加水分解するための変異体の性能を測定すること、および
（iii）第一のポリペプチドと比べて、有機リン酸エステルを加水分解するための高められた性能、または有機リン酸エステルに対する変更された基質特異性を有する変異体を選択すること、
を含む方法を提供する。
【００５８】
実施例で概略を述べたように、本発明は、配列番号２および配列番号３として規定されたポリペプチドを生成するために、うまく適用されている。
【００５９】
好ましくは、第一のポリペプチドは、配列番号１から４のいずれか一つから選択される。
【００６０】
更なる一面において、本発明は、上記方法によって生成されたポリペプチドを提供する。
【００６１】
本明細書を通して、用語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの語尾変化は、記述された要素、整数（integer）、もしくは方法、または要素、整数、もしくは方法の群を包含することを意味するが、他のいかなる要素、整数もしくは方法、または要素、整数もしくは方法の群をも除外することを意味しないと理解されるであろう。
【００６２】
本発明は、以後、以下の限定されない図面と実施例として記載されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
一般技術
他に示さなければ、本発明において使われる組換えＤＮＡ技術は、当業者に良く知られた標準的な方法である。そのような技術は、非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７などの出典における文献中に記載され、説明されている。
【００６４】
有機リン酸エステル類
有機リン酸エステル類は、合成有機リン酸エステル類およびホスホロアミダート類などの関連化合物である。それらは、一般式（ＲＲ’Ｘ）Ｐ＝Ｏまたは（ＲＲ’Ｘ）Ｐ＝Ｓ、式中、ＲおよびＲ’は、短鎖基である、を有する。殺虫剤有機リン酸エステルの場合、Ｘは、アセチルコリンエステラーゼの不可逆阻害のための要件である、適切な脱離基である。
【００６５】
本発明のポリペプチド類は、有機リン酸エステル類のリン酸エステル結合を加水分解する。これらの有機リン酸エステル類は、限定されないが、オクソンおよびチオン有機リン酸エステル類であることができる。有機リン酸エステルは、芳香族もしくは脂肪族脱離基（Ｘ）を有することができる。
【００６６】
殺虫剤としてのそれらの使用はよく知られているが、有機リン酸エステル類は、哺乳動物に対する神経ガスとしても用いられている。従って、本発明のポリペプチドが、殺虫剤ではない有機リン酸エステル類の加水分解にも有用であるだろうことが予想される。
【００６７】
ポリペプチド類
「実質的に精製されたポリペプチド」によって、我々は、一般的に、自然な状態では会合している脂質、核酸、他のポリペプチド、および他の汚染分子から分離されているポリペプチドを意味する。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、自然に会合している他の成分を、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは９０％含まない。
【００６８】
ポリペプチドの同一性パーセントは、初期設定および少なくとも５０アミノ酸長の照会配列を用いたＦＡＳＴＡ（非特許文献２８）解析（ＧＣＧプログラム）によって決定され、それによって、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって整列させる。より好ましくは、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって整列させる。より好ましくは、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって整列させる。よりさらに好ましくは。ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも３５０アミノ酸領域にわたって整列させる。
【００６９】
本発明のポリペプチド類のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変異を、核酸配列に導入する、または、所望するポリペプチドの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成によって、調製することができる。そのような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終蛋白生成物が、所望する特性を有するならば、最終構築物に到達するように、欠失、挿入および置換の組み合わせがなされう得る。本発明の変異体の例は、実施例８において提供される。
【００７０】
アミノ酸配列の変異体を設計する際、変異部位の場所および変異の性質は、修飾されるべき特性に依存するであろう。変異部位は、独立して、もしくは一連して、例えば、（１）最初に、保存アミノ酸選択で置換し、次いで得られた結果物に依存したよりラジカルな選択で置換すること、（２）標的残基を欠失すること、または（３）位置する部位に隣接して他の残基を挿入すること、によって、修飾することができる。
【００７１】
アミノ酸配列の欠失は、通常、約１から３０残基まで、より好ましくは約１から１０残基まで、および典型的には約１から５隣接残基までで変動する。
【００７２】
置換変異体は、ポリペプチド分子において少なくとも1アミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換変異生成に関して最も大きな関心がある部位は、活性部位として同定されている部位を含む。関心がある他の部位は、様々な種から得られた特定の残基が同一な部位である。これらの部位は、生物学的活性に重要である。これらの部位、特に少なくとも３つの他の一致して保存された部位の配列内に位置する部位、が、好ましくは、比較的保存的に、置換される。そのような保存的な置換が、表１において、「代表的な置換」の見出しで示されている。
【００７３】
配列番号１の配列は、フラボバクテリウムＯＰＤ酵素の配列に９０％同一であるため、配列番号１は、所望の活性を有するが、９０％未満同一であるフラボバクテリウムＯＰＤ酵素の変異体を設計するために用いることができる。より具体的には、有機リン酸エステル分子を加水分解するために重要であるこれらのアミノ酸は、本発明のポリペプチドを同一であるように変異させることができ、そして、この活性に影響をもたらさない他のアミノ酸も、確実に同一性のレベルが９０％を超えないように変異させることができる。そのようなＯＰＤ変異体の例は、アミノ酸変異Ｌ２７２Ｆおよび／またはＨ２５７Ｙを含む。また、そのような変異体も、本発明に含まれる。
【００７４】
【表１】
0004454937.tif 000002
【００７５】
さらに、所望されれば、天然でないアミノ酸または化学的アミノ酸の類似体は、置換または付加として本発明のポリペプチドに導入することができる。そのようなアミノ酸は、限定されないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸類、β−メチルアミノ酸類、Ｃα−メチルアミノ酸類、Ｎα−メチルアミノ酸類などのデザイナーアミノ酸、および一般のアミノ酸類似体を含む。
【００７６】
また、合成中または合成後に、例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解開裂、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合、などによって、異なって修飾された本発明のポリペプチド類も本発明の範囲に含まれる。これらの修飾は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を高めるために役立つかもしれない。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、天然タンパク質の生成および回収、組換えタンパク質の生成および回収、およびタンパク質の化学合成を含む様々な方法で、調製することができる。一実施態様において、本発明の単離されたポリペプチドは、ポリペプチドを生成するのに有効な条件下で、ポリペプチドを発現し得る細胞を培養し、そしてポリペプチドを回収することによって、生成される。有効な培養条件は、限定されないが、蛋白質の生成を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、および酸素条件を含む。有効な培地とは、細胞が培養され、本発明のポリペプチドを生成する任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には、同化炭素、窒素、およびホスファート源、および適切な塩類、ミネラル類、金属類、およびビタミン類などの他の栄養素を有する水性培地を含む。本発明の細胞は、通常の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリシャーレ中で、培養することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素濃度で、行なうことができる。そのような培養条件は、当業者の専門技術内である。
【００７８】
ポリヌクレオチド
「単離されたポリヌクレオチド」により、我々は、一般的に、自然な状態で会合しているもしくは結合しているポリヌクレオチドから分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、自然に会合している他の成分を、少なくとも６０％、より好ましくは７５％、最も好ましくは９０％含まない。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、ここに、用語「核酸分子」と、互換可能に用いられる。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５から８と比べて、１つ以上の変異を有することができる。これらの変異は、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換であることができる。変異体は、天然体（すなわち、天然源から単離された）または合成体（例えば、核酸における特定部位における変異誘発を行うことによって）のいずれかであることができる。このように、本発明のポリヌクレオチドは、天然体または組換え体のいずれかであることができるのは、明らかである。
【００８０】
ポリヌクレオチドの同一パーセントは、初期設定および少なくとも１５０ヌクレオチド長の照会配列を用いたＦＡＳＴＡ（非特許文献２８）解析（ＧＣＧプログラム）によって決定され、それによって、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも１５０ヌクレオチドの領域にわたって整列させる。より好ましくは、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも３００ヌクレオチドの領域にわたって整列させる。よりさらに好ましくは、ＦＡＳＴＡ解析は、２つの配列を、少なくとも１０５０ヌクレオチドの領域にわたって整列させる。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはどちらかの誘導体であることができる。そのようなオリゴヌクレオチドの最少サイズは、オリゴヌクレオチドと本発明の核酸分子上の相補的配列との間の安定したハイブリッド形成に必要とされるサイズである。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブまたは核酸分子を生成するためのプライマーとして、用いることができるオリゴヌクレオチドを含む。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号５から８に設定された配列に、選択的にハイブリダイズすることができる。ここに用いられるように、ストリンジェントな条件とは、（１）洗浄するために、低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４を用いる；（２）バイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、ｐＨ６．５で７５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドを用いる；または、（３）０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を用いる、条件である。
【００８３】
ベクター
本発明の一実施態様において、核酸分子を宿主細胞に運搬することができる任意のベクター中に挿入された、本発明の単離された核酸分子を少なくとも一つ含む組換えベクターを含む。そのようなベクターは、非相同性核酸配列、すなわち、天然には本発明の核酸分子に隣接して見出されず、好ましくは、核酸分子が得られた種以外の種から得られた核酸配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかであることができ、そして、典型的にはウィルスまたはプラスミドである。
【００８４】
組換えベクターの一種は、発現ベクターに適切に作用するように結合された本発明の核酸分子を含む。語句、適切に作用するように結合された、は、分子が宿主細胞に形質転換された時に発現できるように、発現ベクター中への核酸分子の挿入を指す。ここに用いられるように、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、詳記された核酸分子を発現させることができるＤＮＡもしくはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核生物または真核生物の何れかであることができ、典型的には、ウィルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、体内寄生虫、節足動物、他の動物、および植物細胞を含む本発明の組換え細胞において機能する（すなわち、遺伝子を発現する）任意のベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌、酵母菌、植物および哺乳動物細胞において遺伝子を発現することができる。
【００８５】
本発明の発現ベクターは、転写調節配列、翻訳調節配列、複製開始点、および組換え細胞と適合し、本発明の核酸分子の発現を調節する他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明の組換え分子は、転写調節配列を含む。転写調節配列は、転写の開始、伸長および終結を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびリプレッサー配列など、転写の開始を調節する配列である。適した転写調節配列は、本発明の少なくとも１つの宿主細胞において機能することができる任意の転写調節配列を含む。様々なそのような転写調節配列は、当業者に公知である。好ましい転写調節配列は、限定されないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｐｍ／ｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージλ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α−交配因子（α−ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）アルコールオキシダーゼ、アルファウィルスサブゲノムプロモーター（シンビス（Ｓｈｉｎｂｉｓ）ウィルスサブゲノムプロモーターなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウィルス、ヘリオシス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｚｅａ）昆虫ウィルス、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、アライグマポックスウィルス（ｒａｃｃｏｏｎ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、他のポックスウィルス、アデノウィルス、サイトメガロウィルス（介在初期プロモータなど）、シミアンウィルス４０、レトロウィルス、アクチン、レトロウィルスロングターミナルリピート（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、ラウス肉腫ウィルス、熱ショック、リン酸および硝酸転写調節配列など、原核細胞または真核細胞において遺伝子発現を調節することができる他の配列と同様に、細菌、酵母菌、植物および哺乳動物細胞において機能する配列を含む。更に適した転写調節配列は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含む。
【００８６】
本発明の組換え分子は、（ａ）本発明の発現ポリペプチドが、ポリペプチドを生成する細胞から分泌されることができるように、分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含む、および／または、（ｂ）融合タンパク質として本発明の核酸分子を発現させる融合配列を含む、こともできる。適したシグナルセグメントの例は、本発明のタンパク質を分泌させることができる、任意のシグナルセグメントを含む。好ましいシグナルセグメントは、限定されないが、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性およびウィルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメントを、天然のシグナル配列と同様に含む。更に、本発明の核酸分子は、ユビキチン融合セグメントなど、プロテオソームにコードされたタンパク質を導く融合セグメントに結合させることができる。組換え分子は、本発明の核酸分子の核酸配列の周囲および／または核酸配列内に、介在および／または非翻訳配列を含むこともできる。
【００８７】
宿主細胞
本発明の別の実施態様は、本発明の1つ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞を含む。細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子を細胞に挿入することができる任意の方法によって行なうことができる。形質転換方法は、限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、および原形質融合を含む。組換え細胞は、単細胞のままであることができ、または、組織、器官、または多細胞生物に成長することができる。本発明の形質転換核酸分子は、染色体外のままであることができ、または、形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１つ以上の部位に、それらの発現能が保持されるように組み込むことができる。
【００８８】
形質転換に適した宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換され得る任意の細胞を含む。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、または、既に少なくとも１つの核酸分子（例えば、１つ以上の本発明のタンパク質をコードした核酸分子）で形質転換されている細胞のいずれかであることができる。本発明の宿主細胞は、内生的に（すなわち、自然に）本発明のタンパク質を生成することができる、または、そのようなタンパク質を、本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換後、生成することができる、のいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を生成することができる任意の細胞であることができ、細菌、真菌（酵母菌を含む）、体内寄生虫、節足動物、動物、および植物細胞を含む。好ましい宿主細胞は、細菌、マイコバクテリム、酵母菌、植物および哺乳動物細胞を含む。より好ましい宿主細胞は、アグロバクテリウム、サルモネラ、エシェリキア、バシラス、リステリア、サッカロマイセス、スポドペテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、マイコバクテリア、トリコプルジア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（イヌヘルペスウィルス培養のための正常イヌ腎臓細胞株）、ＣＲＦＫ細胞（ネコヘルペスウィルス培養のための正常ネコ腎臓細胞株）、ＣＶ−１細胞（例えば、アライグマポックスウィルスを培養するために用いられるアフリカザル腎臓細胞株）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、およびＶｅｒｏ細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、大腸菌Ｋ−１２派生株を含む大腸菌；サルモネラ・チフィ（ｔｙｐｈｉ）；弱毒化株を含む、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；スポドペテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；トリコプルジア・エヌアイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）；ＢＨＫ細胞；ＭＤＣＫ細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ−１細胞；ＣＯＳ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；および非腫瘍形成性マウス筋原細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２４６）を含む。さらに適した哺乳動物細胞宿主は、他の腎臓細胞株、他の繊維芽細胞株（例えば、ヒト、げっ歯類、またはニワトリ胚性繊維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞および／またはＨｅＬａ細胞を含む。
【００８９】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を向上させるために用いられることができる。本発明のポリヌクレオチド分子の発現を増強するために有用な組換え技術は、限定されないが、操作的にポリヌクレオチド分子を高コピー数のプラスミドに連結すること、ポリヌクレオチドを１つ以上の宿主細胞の染色体に組み込むこと、プラスミドにベクター安定配列を加えること、転写調節シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサ）の置換もしくは修飾、翻訳調節シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シェイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−ｄａｌｇａｒｎｏ）配列）の置換もしくは修飾、宿主細胞のコドン使用に一致するように本発明のポリヌクレオチド分子の修飾、および転写物を不安定化する配列の欠失を含む。本発明の発現された組換えタンパク質の活性は、そのようなタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を断片化、修飾、または誘導することによって、向上させることができる。
【００９０】
遺伝子導入植物
特許文献５において一般的に記載されているように、試料中の有機リン酸エステルの濃度は、試料を、適切な酵素を発現する遺伝子導入植物にさらすことによって減らすことができる。典型的には、試料は、土壌である。従って、本発明のポリヌクレオチドは、試料中の有機リン酸エステル分子を加水分解できるように、遺伝子導入植物、特に植物の根において、発現させることができる。
【００９１】
用語「植物」は、全植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種、および植物細胞などを指す。本発明の実施における使用が検討される植物は、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む。代表的な双子葉植物は、綿、トウモロコシ、トマト、タバコ、ジャガイモ、豆、およびダイズなどを含む。
【００９２】
遺伝子導入植物は、本発明の文脈において規定されるように、所望された植物もしくは植物器官において本発明の少なくとも１つのタンパク質の生成をもたらす、または高めるように、組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝学的に修飾された植物（前記植物の一部および細胞と同様に）およびそれらの子孫を含む。
【００９３】
本発明のポリペプチドは遺伝子導入植物において、発育の全段階を通じて構成的に発現させることができる。植物または植物器官の使用に応じて、タンパク質を、段階特異的に発現させることもできる。さらに、使用に応じて、タンパク質を、組織特異的に発現させることができる。
【００９４】
植物種の選択は、植物またはその一部の意図された使用および植物種の形質転換のしやすさによって決定されている。
【００９５】
植物において興味のあるタンパク質をコードする遺伝子の発現をもたらすことが知られている、もしくは見出された調節配列を、本発明において用いることができる。用いられる調節配列の選択は、興味のある標的植物および／または標的器官に依存する。そのような調節配列は、植物または植物ウィルスから得られることができ、または、化学合成されることができる。そのような調節配列は、当業者に十分公知である。
【００９６】
終止配列およびポリＡ化シグナルなどの他の調節配列は、植物において調節配列として機能する任意の配列を含み、その選択は、当業者にとって明らかであろう。そのような配列の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン合成（ｎｏｓ）遺伝子の３’フランキング領域である。
【００９７】
いくつかの技術が、興味のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を、標的植物に導入するために利用可能である。そのような技術は、限定されないが、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション、または（被覆）粒子ボンバード（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を用いたプロトプラストの形質転換を含む。これらのいわゆる直接的ＤＮＡ形質転換方法に加えて、ウィルスおよび細菌ベクター（例えば、アグロバクテリウム属由来）などのベクターを必要とする形質転換方法が、広く利用できる。選択および／またはスクリーニング後、形質転換されたプロトプラスト、細胞または植物部分は、当該分野において公知の方法を用いて、全植物において再生させることができる。形質転換および／または再生技術の選択は，本発明にとって重大なことではない。
【００９８】
組成物
本発明の組成物は、ここに「許容される担体」とも称される賦形剤を含む。賦形剤は、処理されるべき動物、植物、植物もしくは動物物質、または環境（土壌および水試料を含む）が許容できる任意の物質であることができる。そのような賦形剤の例は、水、塩、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、および他の水性生理平衡塩溶液を含む。不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルも用いることができる。他の有用な処方は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの増粘剤を含む懸濁液を含む。賦形剤は、等張性および化学的安定性を高める物質など、微量の添加剤を含むこともできる。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびトリス緩衝液を含み、防腐剤の例は、チメロサールまたはｏ―クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールを含む。賦形剤は、組成物の半減期を増加させるために用いられることもでき、限定されないが、例えば、高分子制御遊離ビヒクル類、生物分解性インプラント類、リポソーム類、細菌類、ウィルス類、他の細胞類、油類、エステル類、およびグリコール類であることができる。
【００９９】
さらに、本発明のポリペプチドは、有機リン酸エステルの加水分解の速度および／または程度を高める、または、ポリペプチドの安定性を増強する組成物中に提供されることができる。例えば、ポリペプチドは、ポリウレタン基盤上に固定させる（非特許文献２９）、または適切なリポソーム中に包み込む（非特許文献３０、３１）ことができる。ポリペプチドは、消化活動において決まって用いられる発泡体などの発泡体を含む組成物中に組み込むこともできる（非特許文献３２）。当業者に認識されるように、本発明のポリペプチドは、特許文献６、この内容はここに全体において組み込まれる、において開示されているように、スポンジまたは発泡体中で容易に用いられることができる。
【０１００】
本発明の一実施態様は、動物、植物、動物もしくは植物物質、または環境（土壌および水試料を含む）中に、本発明の組成物をゆっくりと放出することができる制御された放出製剤である。ここに用いられるように、制御された放出製剤は、制御された放出ビヒクル中に、本発明の組成物を含む。適した制御された放出ビヒクルは、限定されないが、生体適合性ポリマー類、他の高分子基質類、カプセル類、マイクロカプセル類、微粒子類、塊薬製剤類、浸透性ポンプ類、拡散装置類、リポソーム類、リポスフェア類、および経皮送達システム類を含む。好ましい制御された放出製剤は、生物分解性（すなわち、生物腐食性）である。
【０１０１】
本発明の好ましい制御された放出製剤は、有機リン殺虫剤を噴霧された領域の土壌または水中に、本発明の組成物を放出することができる。製剤は、好ましくは、約１から約１２ヶ月までで変動する期間にわたって放出される。本発明の好ましい制御された放出製剤は、好ましくは少なくとも約１ヶ月間、より好ましくは少なくとも約３ヶ月間、さらにより好ましくは少なくとも約６ヶ月間、さらにより好ましくは少なくとも約９ヶ月間、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１２ヶ月間、処置を行なうことができる。
【０１０２】
有機リン酸エステルを加水分解するために有効な組成物を生成するために必要とされるであろう本発明のポリペプチド、ベクター、または宿主細胞の濃度は、汚染除去される試料の性質、試料中の有機リン酸エステルの濃度、および組成物の処方に依存するであろう。組成物内のポリペプチド、ベクター、もしくは宿主細胞の有効濃度は、当業者によって理解されるであろうように、実験に基づいて容易に決定されるであろう。
【０１０３】
バイオセンサー
バイオセンサーは、典型的に、酵素などの生物学的に活性な物質、および、生化学的反応を、処理、送信、および測定できる定量可能な電気シグナルに変える変換器からなる分析装置である。有機リン化合物の検出に用いられているバイオセンサーの総説は、非特許文献３３、その内容の全てが参照によって組み込まれる、によって提供される。本発明のポリペプチドは、そのようなバイオセンサーにおける使用のために適合させることができる。
【実施例】
【０１０４】
実施例１−クマホス加水分解活性を有する微生物のための土壌試料の濃縮
クマホス加水分解に関する蛍光アッセイ
ホスホトリエステラーゼ酵素は、有機リン酸エステル（ＯＰ）分子におけるリン酸エステル結合の開裂に触媒作用を及ぼし、リン酸ジエステルとアルコールを生じる。クマホス（３−クロロ−４−メチル−７−クマリニルジエチルホスホロチオアート）の場合、リン酸トリエステル加水分解により、ジエチルチオホスファートおよび蛍光性アルコール、クロルフェロン（３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン；図１）を生じる。それゆえ、クマホス加水分解は、クロルフェロンの生成により、波長３５５ｎｍでの励起と４６０ｎｍの放出強度によって測定すると、蛍光的に測定することができる。クロルフェロンの蛍光発光は、０．０１μＭから２．５μＭまでの範囲にわたって直線であった。
【０１０５】
すべての蛍光発光の測定は、９６穴白色マイクロタイタープレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐ表面を有するＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃプレート、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と最終反応容量１００μｌを用い、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ蛍光計（ＢＭＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，オーストラリア）中で行なった。クマホスとクロルフェロンの保存溶液（０．４ｍＭ）は、２０％メタノール中で調製した。全細胞の未精製アッセイは、１００μＭのクマホス、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で行なった。細胞溶解物のクマホス加水分解アッセイは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いずに行なった。
【０１０６】
細菌コロニーおよび染色されたポリアクリルアミドゲルの蛍光発光は、携帯型長波長（およそ３４０ｎｍ）ＵＶ光（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて試験した。
【０１０７】
集積培養
ホスホトリエステラーゼのリン酸ジエステル加水分解生成物は、リン源として広範囲の細菌によって用いられる（非特許文献３４；非特許文献３５）。それゆえ、クマホスが唯一添加されたリン源である集積培地５０ｍｌ（表２）に対して、ジアジノン（ジエチルチオンＯＰ）に以前さらされた国内の放飼場から得られた土壌１ｇが接種原として使われる集積培養が、確立された。
【０１０８】
【表２】
0004454937.tif 000003
【０１０９】
唯一のリン源としてクマホスを含む新鮮な集積培地５０ｍｌ中、２回、集積培養物１０％を継代培養した。次いで、集積培地および前記継代培養した培養物中のクマホスを、ジアジノン（１００ｍＭ）に置換した。２８℃で３日間培養後、集積培養物を、１００ｍＭパラチオン（他のジエチルチオンＯＰ）が唯一のリン源である培地中で、さらに、継代培養した。２日後、培養物は、黄色に変化する（おそらく、ｐ−ニトロフェノールの生成による）ことが認められた。次いで、この培養物を、リン不含培地で希釈し、低塩ＬＢプレート（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母菌抽出物５ｇ／ｌ、およびＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ）上に播種した。２８℃での培養３日後、およそ１００コロニーを無作為にピックアップし、純度を保証するために再度面線接種し、次いで、前記マイクロタイタープレートアッセイを用いてクマホス加水分解活性でアッセイした。室温で８時間後、蛍光発光を測定した。１単離株（Ｐ２３０と称する）が、有意な蛍光発光を示し、この単離株をさらに試験した。この単離株のコロニーも、クマホスを含む寒天プレート上で蛍光発光を示した。
【０１１０】
実施例２−単離されたＰ２３０の同定
単離されたＰ２３０は、グラム陰性、カタラーゼ陽性およびオキシダーゼ陽性、桿菌であった。単離されたＰ２３０を同定するために、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列解析を行なった。ＤＮＡは、非特許文献３６に従って、単離されたＰ２３０から抽出した。２８℃で一晩、低塩ＬＢ培地（２ｍｌ）中で培養したＰ２３０培養物の細胞は、マイクロチューブ中で、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／２分）によりペレット化した。細胞ペレットは、４００μｌのＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再度懸濁し、５μｌの新たに調製されたリゾチーム溶液（０．３μｇ／μｌ）を加えた。３７℃で２０分間保温後、プロテイナーゼＫ（１％溶液１５μｌ）およびＳＤＳ（２５％溶液１０μｌ）を加え、反応物を、６０℃で３０分間保温した。次いで、ＤＮＡ調製物を、等量の緩衝液で飽和されたフェノール、次いで等量のクロロホルムにより、順次、抽出した。
【０１１１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、抽出されたＤＮＡから、細菌に普遍的なプライマー２７ｆ（５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’）（配列番号：９）および１４９２ｒ（５’ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’）（配列番号：１０）、それらの名称は大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のナンバリングシステム（非特許文献３７）に基づいた、を用いたＰＣＲによって増幅させた。単離されたＰ２３０から、およそ１３２０ｂｐの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が得られ、配列類似をＦＡＳＴＡアルゴリズム（非特許文献２８）を用いて行なった。単離されたＰ２３０の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、配列において、他のアグロバクテリウム株の配列と非常に類似していた（表３）。
【０１１２】
【表３】
0004454937.tif 000004
【０１１３】
これらの結果は、単離されたＰ２３０がアグロバクテリウム株であることを示唆した。単離されたＰ２３０による炭素源の使用を、Ｂｉｏｌｏｇシステム（Ｏｘｏｉｄ）を用い、製造元によって推奨された方法に従って調べた。次いで、炭素使用の概要を、既知のアグロバクテリウム種の炭素使用の概要と比較した（表４；非特許文献３８）。単離体は、炭素源として、スクロース、オルニチン、およびグルコースを用いることができた。コヴァチ（Ｋｏｖａｃ）法（非特許文献３９）を用いて測定された陽性のオキシダーゼ反応と共に、これは、単離体が、Ａ．ツメファシエンス次亜種１、またはＡ．ラジオバクター次亜種１のいずれかに最も類似していることを示唆した。
【０１１４】
【表４】
0004454937.tif 000005
【０１１５】
Ａ．ツメファシエンス次亜種１およびＡ．ラジオバクター次亜種１は、前者における腫瘍誘導プラスミドの存在によって識別することができる。Ｐ２３０株の腫瘍誘導能は、水中の細菌の大量懸濁液を葉に移し、滅菌針を用いて、懸濁液介して葉の表面を突き刺すことによって、トマトの苗木において試験された。４週間後、腫瘍の証拠は認められなかった。Ａ．ツメファシエンスＣ５８が、陽性対照として用いられ、この期間で腫瘍を生じた。Ａ．ツメファシエンスＣ５８の硬化株は、陰性対照として用いられ、試験植物において単離されたＰ２３０と同様の効果を生じた。それゆえ、単離されたＰ２３０は、アグロバクテリウムラジオバクター次亜種１株として称された。
【０１１６】
実施例３−クマホス加水分解活性の構成性の発現
Ａ．ラジオバクターＰ２３０のホスホトリエステラーゼ活性が、ＯＰ類の存在に関わらず、構成的に発現しているかを判定するために、Ａ．ラジオバクターＰ２３０の培養物のパラチオン加水分解活性を、パラチオン存在下、および不在下において調べた（表５）。成育を、ＢｉｏＲａｄ型３５５０−ＵＶマイクロプレート分光光度計において５９５ｎｍでの培養光学密度を測定することによって、観測した。パラチオン加水分解活性は、非特許文献４０に従って、アッセイした。これは、パラチオンからｐ−ニトロフェノールの生成を、ＢｉｏＲａｄ型３５５０−ＵＶマイクロプレート分光光度計において４０５ｎｍで測定することを含んだ。反応混合液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、８８０μＭのパラチオンを含んだ（この反応液は５％メタノールも含んだ）。表５は、パラチオン加水分解活性が、単離されたＰ２３０において構成的に発現されていることを示し、そして、この活性の大部分が初対数期から中対数期までにおいて発現されていることを示す。
【０１１７】
実施例４−Ｐ２３０抽出物の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
単一の酵素がクマホス加水分解に関与していたことを示すために、Ａ．ラジオバクターＰ２３０細胞抽出物の未変性ゲルをクマホス加水分解活性で染色した。低塩ＬＢ培養液中におけるＡ．ラジオバクターＰ２３０の培養物（５０ｍｌ）を、８０００ｇで１５分間遠心することによりペレット化し、細胞ペレットを、２ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で、再度懸濁した。細胞を、超音波処理（４℃で１５秒間の破砕を５回）により破裂させ、大きな細胞破片または無傷の細胞を遠心分離（８０００ｇで１５分間）によって除去した。次いで、得られた上清のアリコート（５μｇのタンパク質を含む）を、１０％（２９：１アクリルアミド：ビス）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。負荷する前に、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールのいずれも試料中に加えず、さらに、試料は、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥのように煮沸させなかった。泳動後、ゲルは５分間、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で平衡状態に置き、次いで、さらに５分間、８μＭのクマホスを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中でインキュベートした。次いで、ゲルを、前記ＵＶ光下で調べた。Ｐ２３０単離体がクマホス加水分解活性を有する単一の酵素を含むことを示す主要な蛍光バンドが検出された。この酵素は、見かけの分子質量６６ｋＤａを有した。
【０１１８】
【表５】
0004454937.tif 000006
【０１１９】
実施例５−クマホス加水分解活性の原因遺伝子のクローニング
クローニング技術およびＤＮＡ調製
他に示さなければ、一般的なクローニング技術は、標準的なものであり、非特許文献４１に記載されているようなものであった。染色体ＤＮＡを、非特許文献４２の方法に従って、Ａ．ラジオバクターＰ２３０から抽出した。簡単には、Ａ．ラジオバクターＰ２３０の一晩培養物（１００ｍｌ）を、５０００ｇで２０分間の遠心分離によってペレット化し、１０ｍｌの氷冷ＳＴＥ緩衝液（前記参照）で２回洗浄し、最後に、１０ｍｌのＳＴＥ中に再度懸濁した。リゾチーム（２０ｍｇ）を加え、細胞を３７℃で２時間保温した。等量のＳＴＥを、ＳＤＳ（最終濃度２％（Ｗ／ｖ）まで）およびＲＮａｓｅ（最終濃度２０μｇ／ｍｌまで）と共に加え、細胞溶解産物を４２℃で１時間保温した。次いで、プロテイナーゼＫ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を加え、溶液が透明になるまで溶解産物を５５℃で保温した。等量の緩衝液で飽和されたフェノール／クロロホルム（１：１）を加え、試料を完全に混合し、次いで、４℃で１時間、５０００ｇで遠心分離した。ＤＮＡの剪断を防ぐために、折れたピペットを用いて、上側の水層を、きれいなチューブに移した。染色体ＤＮＡを沈殿させるために、３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２（０．１容量）および氷冷エタノール（２．５容量）を加え、溶液を穏やかに混合し、２０℃で１時間放置した。次いで、ＤＮＡを、「鉤付き」パストゥールピペットを用いて取り除いた。この沈殿物は、７０％のエタノールで洗浄し、５分間風乾させた。ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０；１ｍｌ）を加え、ＤＮＡを４℃で一晩放置し、溶解させた。
【０１２０】
大腸菌におけるライブラリーの構築
Ａ．ラジオバクターＰ２３０染色体ＤＮＡの部分Ｓａｕ３ＡＩ消化物は、３７．５μｇのＤＮＡを、４、２、１、０．５および０．２５ユニットのＳａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼで１０分間、３７℃で消化することにより、調製した。１０〜１２ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡ断片を、０．７％アガロースゲルから切り取り、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製／ゲル抽出キットを用い、製造元の指示に従い、抽出した。Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  Ｐｌａｓｍｉｄミニプレップキットを用いて調製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋プラスミドＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、ＢａｍＨＩで、１時間３７℃で消化し、仔牛腸内アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて脱リン酸化した。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ホスファターゼを除去した。サイズ分画されたＰ２３０ＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼ処理されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓによって提供されたＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液を用いて結紮した。結紮は、４℃で２０時間行なった。
【０１２１】
次いで、結紮されたＤＮＡは、改訂ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）形質転換法（非特許文献４１）を用いて、大腸菌ＤＨ１０βに形質転換した。形質転換混合物は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド；４０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に播種し、３７℃で一晩培養した。およそ３５０個の白色コロニーが出現した。
【０１２２】
Ａ．ツメファシエンスにおける発現のための三親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ）
Ａ．ツメファシエンスにおいてＯＰ加水分解活性をコードする遺伝子が、発現に基づいて同定できるほど十分には、大腸菌で発現されない可能性があったため、上記大腸菌ライブラリー由来のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを、近縁株、Ａ．ツメファシエンスＣ５８に転移させた。Ａ．ツメファシエンスＣ５８は、アグロバクテリウムの非ＯＰ加水分解株である（非特許文献４３）。簡単には、アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、およびＩＰＴＧを含むＬＢプレート上で前記同定された白色コロニーを、いかなる添加物も含まないＬＢプレート上に継いだ。Ａ．ツメファシエンスＣ５８、および接合共挿入性プラスミド、ｐＲ７５１：：Ｔｎ８１３（非特許文献４４）を含む大腸菌ＪＭ１０９（非特許文献４５）も、同じプレート上の同じ場所に継いだ。接合共挿入性プラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ派生物を含む大腸菌ＤＨ１０βに移され、共挿入体を形成することが意図された。共挿入体は、次いで、Ａ．ツメファシエンスＣ５８に移された。
【０１２３】
三親交配物を、２８℃で一晩培養した。次いで、交配混合物を、スクレーパーで回収し、マイクロタイタープレート中におけるクマホス加水分解活性でアッセイした。これは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μＭのクマホス、および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含むアッセイ緩衝液中で、交配混合物を再度懸濁することを含んだ。次いで、マイクロタイタープレートを、室温で、８時間保温し、蛍光量を前記のように書き留めた。１つの交配混合物（クローンｐ６５を含む）が有意な蛍光を示した。
【０１２４】
大腸菌ＤＨ１０βｐ６５の細胞不含抽出物のクマホス加水分解活性
大腸菌ＤＨ１０βｐ６５の細胞不含抽出物、およびｐＰｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのみを含む対照抽出物を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で中対数期まで培養した細胞から調製した。５０ｍｌの培養物を、８０００ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍｌ中に再度懸濁した。細胞は、超音波処理（４℃で１５秒間の破裂を５回）によって破砕し、大きな細胞片や無傷の細胞を遠心分離（８０００ｇで１５分間）によって除去した。上清のアリコート（１５μｇのタンパク質を含む）を、クマホス加水分解活性でアッセイした。蛍光の増加を経時的に測定し、活性量を決定した。クローンｐ６５を含む大腸菌ＤＨ１０βの細胞不含抽出物が、ベクターのみの対照と比べて、有意なクマホス加水分解活性を示すことが、表６からわかる。
【０１２５】
クローンｐ６５におけるＯＰ加水分解活性をコードする遺伝子の局在
クローンｐ６５ＤＮＡを、ＨｉｎｄIIIで完全に消化し、得られた４つの断片［５．５ｋｂ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを含む）、４ｋｂ、３．５ｋｂ、および１．４ｋｂ］を分離し、次いで、１％のアガロースゲルから切り出した。断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、前記のように調製したＨｉｎｄIII消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＤＮＡに結紮した。結紮混合物は、大腸菌ＤＨ１０βに形質転換し、各クローンを、クマホス加水分解活性でアッセイした。４ｋｂのＨｉｎｄIII断片を含むいくつかのクローンが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおける断片のｌａｃプロモーターに対する方向に依存して、クマホス加水分解活性を示した。
【０１２６】
【表６】
0004454937.tif 000007
【０１２７】
実施例６−ｏｐｄＡの配列
前記同定された４ｋｂのＨｉｄIII断片のヌクレオチド配列は、ベクターにおけるＴ３およびＴ７プロモータに相補的なプライマーと「プライマー歩行」を用いて決定された。ＤＮＡは、ＢｉｇＤｙｅターミネーターシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７自動化ＤＮＡシークエンサーで配列決定された。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、活性を有するクローンにおいて、ｌａｃＺプロモーターと同じ方向で、かつ、活性を有さないクローンにおいて、反対の方向で認められた。オープンリーディングフレームは、１１５２ヌクレオチドを含み（図２）、そして、翻訳されると、３８４アミノ酸（図３）かつ４１．４ｋＤａのタンパク質をコードするであろう。
【０１２８】
配列類似度は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（非特許文献２８）を用いて算出された。これにより、ＯＲＦが、以前に同定されたフラボバクテリウム種ＡＴＣＣ２７５５１（非特許文献９）由来のホスホトリエステラーゼ遺伝子であるｏｐｄと８８％のスクレオチド配列で同一であることが示された。さらに、推測されたＯＲＦのアミノ酸配列は、フラボバクテリウムＯＰＤ酵素（図４）のアミノ酸配列と、９０％同一であった。このため、我々は、このオープンリーディングフレームを「ｏｐｄＡ」と名づけた。
【０１２９】
いくつかの顕著な違いが、フラボバクテリウムｏｐｄ配列とＡ．ラジオバクターＰ２３０由来のｏｐｄＡ配列との間で認められた（図２および３）。ＯｐｄＡタンパク質の推定シグナル配列においてアミノ酸が１つ少なく、シグナル開裂部位も異なっているようである。さらに、ｏｐｄＡ遺伝子の３’末端近くのフレームシフト変異により、ＯｐｄＡに付加的な１６アミノ酸が生じている。ｏｐｄＡにおける余分な塩基が配列決定の誤りではないことを確かめるために、この領域を、複数回、配列決定した。
【０１３０】
天然のＯＰＤ酵素は、単量体サブユニット当たり２つの亜鉛イオンを含むホモ二量体である（非特許文献４６）。ＯＰＤタンパク質配列における部位２５４と２５７の２つのＨｉｓ残基が、各単量体に存在するバイメタル活性部位の近くに位置し、活性部位残基および基質結合ポケットにおける基質と相互作用すると考えられる。これらの各Ｈｉｓ残基をＡｒｇおよびＬｅｕで、各々置換すると、二量体あたり２つの金属原子のみを有する酵素となる（非特許文献４７）。ＯｐｄＡタンパク質は、ＯＰＤにおけるＨｉｓ２５４とＨｉｓ２５７に相当する位置に、ＡｒｇとＴｙｒを有する（図４）。それゆえ、ＯｐｄＡ天然酵素は、天然ＯＰＤと同様に、２量体あたり、４つではなく、２つの金属イオンのみを含むであろうと予想される。
【０１３１】
実施例７−精製されたＯｐｄＡタンパク質の活性
図３におけるオープンリーディングフレームがＯＰ加水分解活性を生じるタンパク質をコードしていることを確かめるために、タンパク質を発現させ、マルトース−結合タンパク質との融合タンパク質として精製した。
【０１３２】
融合タンパク質としてのＯｐｄＡとＯＰＤの発現
ＯｐｄＡおよびＯＰＤタンパク質は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのｐＭＡＬタンパク質融合および精製システムを用いて、大腸菌において発現させ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質を発現させた。
【０１３３】
ｏｐｄＡ遺伝子を、ｐＭＡＬ−ｃベクターにクローン化するために、上流および下流プライマー、５’ＧＡＴＣＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧ（配列番号：１１）および５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＴ（配列番号：１２）、を各々用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｏｐｄＡ遺伝子（シグナルペプチド領域を含まない）を増幅させた。ＰｓｔＩクローニング部位をスタートコドンで、ＨｉｎｄIIIクローニング部位をストップコドン（下線を引いた塩基）で、挿入した。ＰＣＲ断片は、次いで、組換えプラスミドｐｍａｌ−ｏｐｄＡを生じるように、ｐＭＡＬ−ｃのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIIIクローニング部位にクローン化した。
【０１３４】
ｏｐｄ遺伝子（非特許文献９）を、同様の方法で、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に、クローン化した。シグナルペプチド領域を含まないｏｐｄ遺伝子を、ＰＣＲを用いて増幅させた。上流および下流オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＧＡＴＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＴＣＧＧＣＡＣＡＧＧＣＧＡＴＣＧＧ（配列番号：１３）および５’ＧＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＣＧＧ（配列番号：１４）、を、各々、ｏｐｄスタートコドンにおいてＢａｍＨＩ制限部位を、そしてストップコドンにおいてＨｉｎｄIII制限部位（下線を付した塩基）を含むように、設計した。ＰＣＲ断片を、続けて、組換えプラスミド、ｐＦｍａｌを生じるように、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII制限部位にクローン化した。
【０１３５】
ＯｐｄＡおよびＯＰＤタンパク質の精製
両方のＭＢＰ融合タンパク質を、大腸菌ＤＨ１０β細胞において発現させた。中対数期の細胞（ＯＤ６００＝０．６）を、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで５時間、３７℃で誘導させると、ＭＢＰ融合タンパク質の最適の生成物が、得られた。回収した細胞を、超音波処理によって破砕し、可溶性画分を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡状態を保たせたアミロース樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上に負荷した。ＭＢＰ融合タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、１０ｍＭのマルトースで溶出させた。クマホス加水分解活性を含む画分を集め、Ｘａプロテアーゼ（１０μｇ／ｍｌ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で５時間、切断させた。次いで、切断された画分を、ＤＥＡＥセファロースイオン交換樹脂に通した。切断されたＯｐｄＡおよびＯＰＤタンパク質は、この樹脂に結合せず、空隙容量で溶出された。この試料からの画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定すると単一体であるようであった。精製された試料中のタンパク質の量は、非特許文献４８の方法に従って算出された。
【０１３６】
ＯＰＤおよびＯｐｄＡの反応速度解析
（ｉ）基質
反応速度パラメーターを、以下の基質：クマホス、パラチン（Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスホロチオアート：Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅｎ  Ｈａａｎ）、パラチオン−メチル（Ｏ，Ｏ−ジメチルｐ−ニトロフェニルホスホロチオアート；Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅｎ  Ｈａａｎ）、パラオクソン（Ｏ，Ｏ−ジエチルｐ−ニトロフェニルホスファート；Ｓｉｇｍａ）、コロクソン（３−クロロ−４−メチル−７−クマリニルジエチルホスファート；Ａｌｌｔｅｃｈ）、フェンチオン（Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−[３−メチル４−（メチルチオ）フェニル]ホスホロチオアート；Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａａｎ）、ジアジノン（標識化−Ｏ，Ｏ−ジエチル−Ｏ−（２−イソプロピル−４−メチル−６−ピリミジニル）−ホスホロチオアート；Ａｌｌｔｅｈｃ）、ｄＭＵＰ（Ｏ，Ｏ−ジメチル４−メチル−ウンベリフェリルホスファート；Ａｌａｎ  Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅからの贈与物）、クロルピリホス（Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−３，５，６−トリクロロ−２−ピリジルホスホロチオアート；Ａｌｌｔｅｃｈ）、およびホスメット（Ｓ−[（１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）メチルＯ，Ｏ−ジメチルホスホロジチオアート；Ａｌｌｔｅｃｈ]、のＯｐｄＡおよびＯＰＤによる加水分解に関して決定した。
【０１３７】
（ii）アッセイ
全ての反応物は、アセトン中に溶解されたホスメットを除き、メタノール中に溶解された有機リン酸エステルを含んだ。反応物中のアセトンもしくはメタノールの濃度は、適切である５％で一定であった。全ての反応は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、２５℃で行なわれた。
【０１３８】
精製したＯＰＤおよびＯｐｄＡのクマホスおよびクロクソンとの反応の初速度は、前記蛍光アッセイを用いて、測定された。
【０１３９】
両ＯＰＤおよびＯｐｄＡのｄＭＵＰとの反応の初速度は、加水分解生成物、４−メチルウンベリフェロン（非特許文献４９）の形成を定量化するための蛍光分析を用いて測定した。蛍光は、励起波長３５５ｎｍおよび放出強度４６０ｎｍを用いて、測定した。
【０１４０】
精製された両酵素と、パラチオン、パラチオン−メチルおよびパラオクソンとの反応初速度を、分光光度法で、加水分解生成物、ｐ−ニトロフェノール、の形成を、４０５ｎｍで、減衰係数１７０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、定量化することによって測定した（非特許文献１１）。
【０１４１】
ＯｐｄＡとフェンチオンとの反応初速度を、分光光度法で、２５２ｎｍでの吸光度における減少を観測することによって、定量化した（非特許文献５０）。ＯＰＤによるフェンチオンとホスメットの加水分解の欠如を、基質をＯＰＤと共に２４時間インキュベート後、薄層クロマトグラフィーによって、確かめた。
【０１４２】
ＯｐｄＡおよびＯＰＤとクロルピリホスとの反応速度を、分光光度法で、２７６ｎｍでの吸光度における増加を観測することにより測定した（非特許文献１１）。
【０１４３】
ホスメットの加水分解を、前記のように有機リン酸エステルにおけるＰ−Ｓ加水分解を観測するためにＤＮＴＢ（エルマン試薬；５’５ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸））を用いた反応経過中の遊離チオール類の形成を定量化することにより測定した（非特許文献５１）。これは、ＤＴＮＢ（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５およびメタノール、１：１（ｖ／ｖ）、中、１ｍｇ／ｍｌで８０μｌ）を、様々な時間で採取した反応アリコート２０μｌに加えることを含む。
【０１４４】
放射同位元素で標識されたＯＰ基質に予め用いられた放射分析分配アッセイにおいて、放射性同位元素で標識されたジアジノン（エチル−１−１４Ｃ；１４．８ＭＢｑ／ｍｍｏｌ）を用い、ジアジノンの加水分解を観測した（非特許文献２１）。反応中の様々な時間で、アリコート（５０μｌ）を除去し、１５０μｌの水で希釈した。次いで、これを、５００μｌのジクロロメタンで抽出した。上側の水層（１５０μｌ）を除去し、液体シンチレーションにより定量化した。
【０１４５】
結果
反応速度解析の結果を表７に示す。ＯｐｄＡおよびＯＰＤは、基質クマホス、コロクソン、パラオクソン、パラチオン、パラチオン−メチル、ジアジノン、クロルピリホス、およびｄＭＵＰを加水分解することができた。ＯｐｄＡは、パラチオン−メチルおよびｄＭＵＰに関して、より高いＫｃａｔを有し、そして、ＯＰＤは、ホスメットまたはフェンチオンのいずれも加水分解することができなかった。後者２つの基質の加水分解の欠如は、２４時間にわたり、薄層クロマトグラフィーによっても観察された（非特許文献５２）。これは、等量の酢酸エチルと共に０．４ｍＭの基質を含む１００μｌ反応物の抽出を含んだ。上側の有機層を、窒素気流で緩やかに乾燥させ、残りの残渣を１０μｌのアセトンに溶解し、次いで中性シリカゲルＦ２５４ＴＬＣプレート（Ａｌｌｔｅｃｈ、ＮＳＷ、オースラリア）に塗布した。次いで、プレートを、ヘキサン−クロロホルム−メタノール（７：２：１）中で展開させ、化合物を、短波長紫外光で可視化した。ＯｐｄＡに関しては、ホスメットおよびフェンチオンの両方の加水分解が観察され、ＯＰＤに関しては、いずれの加水分解も観察されなかった。
【０１４６】
要するに、ＯｐｄＡとＯＰＤの間での基質特異性におけるいくつかの違いが観察された。ＯｐｄＡは、フェンチオンとホスメットを加水分解したが、ＯＰＤはしなかった。さらに、ＯｐｄＡがＯＰＤよりもメチル−パラチオンおよびｄＭＵＰに関して高いＫｃａｔ値を有することに加えて、ジメチルＯＰ類に関するＫｃａｔ値において、ＯｐｄＡとＯＰＤの間に有意な差があった。また、我々は、ＯｐｄＡが、ＯＰＤのように（非特許文献１０；非特許文献５３）、有機リン神経作用物質も加水分解すると予想するであろう。
【０１４７】
前記のように、ＯＰＤタンパク質配列における位置２５４および２５７での２つのＨｉｓ残基が、各単量体に存在するバイメタル活性部位の近傍に位置し、活性部位残基および基質結合ポケットにおける基質と相互作用すると考えられる（非特許文献４６）。これらの各Ｈｉｓ残基を、ＡｒｇおよびＬｅｕに、各々置換することにより、単量体当たり唯一の金属イオン、デメトンなどのより大きな基質に対して増強された触媒作用活性、およびパラオクソンなどのより小さな基質に対して減少された触媒作用活性を有する酵素となる（非特許文献４７）。結合金属イオン数における変化により、構造屈曲性が高められ、活性部位へのより大きな基質の接近が増し、一方同時に、より小さな基質に対する活性が減少することが仮定されていた。ＯｐｄＡタンパク質は、ＯＰＤにおけるＨｉｓ２５４とＨｉｓ２５７に相当する部位に、ＡｒｇとＴｙｒを有する（図４）。それゆえ、ＯｐｄＡが、ＯＰＤよりも高いメチル−パラチオンに対するｋｃａｔを有していたが、より大きなエチル−パラチオン基質に対するそのｋｃａｔがＯＰＤと同程度であったことは驚くべきことである。同様の結果が、クマホス／ｄＭＵＰ基質対に対しても得られた。明らかに、残基２５３／２５４および２５６／２５７での違い以外のＯｐｄＡおよびＯＰＤアミノ酸配列間の違いが、触媒作用活性に影響を及ぼしている。
【０１４８】
【表７Ａ】
0004454937.tif 000008
【０１４９】
【表７Ｂ】
0004454937.tif 000009
【０１５０】
実施例８−改変された特異性を有するＯｐｄＡ変異体の同定
プラスミドｐｍａｌ−ｏｐｄＡを、大腸菌変異誘発株ＸＬ１−ｒｅｄに形質転換させた。該プラスミドは、この株において、１２０世代間で伝播され、２４世代毎にプラスミドを抽出した。次いで、これらのプラスミドを、大腸菌ＤＨ１０βに形質転換し、形質転換混合物を、アンピシリンを含有するＬＢ中５０ｍｌに希釈した。
【０１５１】
培養物がＯＤ５９５０．３に達した時、融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、誘導を５時間行なった。次いで、培養物を遠心分離によってペレット化し、マラチオンを最終濃度４４０μＭまで加えた２ｍｌの滅菌した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に懸濁した。このアッセイ混合物を１時間放置し、マラチオンの加水分解を、エルマン試薬（ＤＮＴＢ）を用いて検出した（非特許文献５４）。
【０１５２】
次いで、活性を有するプールを希釈し、アンピシリンを含むＬＢプレート上に播種した。次いで、各コロニーを選択し、前記のようにマラチオンおよびジメトアート加水分解活性に関して試験した。２つのコロニー（ｐｍａｌ−ｏｐｄＡ１およびｐｍａｌ−ｏｐｄＡ２と称する）を選択し、さらに調べた。
【０１５３】
２つの変異体の配列を調べ、野性型ＯｐｄＡの配列と比較した。ＯｐｄＡ１は、４つの変異（Ｐ４２Ｓ、Ｐ１３４Ｓ、Ａ１７０Ｓ、およびＳ２３７Ｇ）（配列番号：３）を含み、ＯｐｄＡ２は、１つの変異（Ａ１１９Ｄ）（配列番号：４）を含んだ。ナンバリングシステムは、シグナル配列を考慮して、ＯｐｄＡのアミノ酸残基のナンバリングに基づいた。ＯＰＤとナンバリングを相関させるために、各番号に１を加えた。
【０１５４】
ＯｐｄＡと２つの変異体、ＯｐｄＡ１およびＯｐｄＡ２を、プラスミドｐＣＹ７６で発現後、精製した。遺伝子を、プライマー、ｐＥＴｏｐｄＡ５（５’ＧＡＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＣＡ、ＥｃｏＲＩ部位に下線を付し、ＮｄｅＩ部位に二重下線を付した）（配列番号：１５）およびｐＥＴｏｐｄＡ３（５’ＧＡＴＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＴＴＧ、ＢａｍＨＩ部位に下線を付した）（配列番号：１６）を用いて、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに結紮した。断片の配列を、このベクター中で確かめた。次いで、ｐＢＳ−派生体をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩ−ＢｇｌII−消化ｐＣＹ７６で結紮した。陽性クローンを、５００ｍｌのＬＢ中で培養した。培養物を２４時間成育させた後、７０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によってペレット化した。このペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ｍｌ中に再度懸濁し、超音波処理によって破砕した（非特許文献５５）。次いで、細胞不含抽出物を、予め５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化させたＤＥＡＥセファロースカラムに負荷した。ＯｐｄＡおよび変異体は、このカラムに結合せず、溶離剤が回収され、予め５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化されたヘパリンセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に置いた。ＯｐｄＡおよび変異体は、このカラムに結合し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．１ＭのＮａＣｌで溶出された。このカラム工程後、ＯｐｄＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一体であることを判定した。タンパク質の反応速度は、脂肪族ＯＰ類、ジメトアート、マラチオン、マラオクソン、およびＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスファート）に対して調べた（表８）。両変異体は、ジメトアート、マラチオンおよびマラオクソンに対して活性であったが、野性型ＯｐｄＡは活性ではなかった。さらに、変異体は、野性型ＯｐｄＡに比べて、ＤＦＰに対して増強された活性を有していた。
【０１５５】
【表８】
0004454937.tif 000010
【０１５６】
広く記載された本発明の精神ないし範囲から逸れないで、特定の実施態様において示されたように、本発明に多くの変更および／または改変を施すことができることは、当業者によって、認識されるであろう。それゆえ、本実施態様は、全ての点で、例示するものであって、制限するものではないとみなされるべきである。
【０１５７】
前記全ての文献は、ここに、全体において組み込まれる。
【０１５８】
本明細書に含まれている文書、法令、物質、装置、もしくは物品などのいかなる議論も、単に、本発明のための前後関係を供することを目的としたものである。これらの事柄のいくつか、もしくは全てが、従来技術の基礎の部分を形成する、または、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していたとして本発明に関する分野において一般に広く行き渡った知識であったことを、認めたものとして解されるべきではない。
【０１５９】
〔参考文献〕
0004454937.tif 000011
0004454937.tif 000012
0004454937.tif 000013
0004454937.tif 000014
0004454937.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】クマホスおよびその加水分解生成物の構造
【図２】ｏｐｄＡのＤＮＡ配列（配列番号５）。シグナルペプチド領域をコードしている領域は、配列番号６としてここに称される残りの配列と共に、太字で記載されている。
【図３】ＯｐｄＡのアミノ酸配列（配列番号１）。シグナルペプチドは、太字で記載されている。
【図４】ＯＰＤおよびＯｐｄＡのアミノ酸配列を一列に並べたもの（配列番号１７）。分泌シグナルが太字で記載されている。
【図１】
0004454937.tif 000016
【図２】
0004454937.tif 000017
【図３】
0004454937.tif 000018
【図４】
0004454937.tif 000019
【配列表】
0004454937000001.xml