(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ性関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷のうちの何れかの関節炎に関連するメラノトランスフェリンの測定方法であって
ｉ）関節液中のメラノトランスフェリン濃度を測定し；そして
ｉｉ）関節液中のメラノトランスフェリン濃度が２ｎｇ／ｍｌ以上であることを、リウマチ性関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷のうちの何れかの関節炎の指標とし、さらに８ｎｇ／ｍｌ以上であることを、リウマチ性関節炎または外傷性関節損傷の指標とし、さらにまた、２５ｎｇ／ｍｌ以上であることをリウマチ性関節炎の指標とする、
ことを含む前記方法。
【請求項２】
メラノトランスフェリンに特異的な抗体を用いたサンドイッチ型イムノアッセイによって関節液中のメラノトランスフェリン濃度を測定することを含む、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
メラノトランスフェリンに特異的な抗体を含む、請求項１または２に記載の測定方法に使用するための試薬。
【請求項４】
メラノトランスフェリンに特異的な抗体が標識されている、請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
請求項３または４に記載の試薬を容器に含む、メラノトランスフェリン測定用キット。
【請求項６】
抗体固相用プレート、発色基質試薬または標識抗体をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
関節炎
関節の内側は軟骨と滑液により関節腔が形成され、軟骨下には骨、滑膜外には関節包、骨、筋肉、腱、靱帯などがある。関節は運動により常に機械的刺激を受けているので炎症を惹起しやすい。関節に生じた炎症を総称して「関節炎」という（南山堂  医学大辞典１８版，  第３８５頁、１９９８年，株式会社  南山堂）。
【０００２】
ｉ）骨関節炎
関節炎のうち「骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｏｒｏｓｉｓ：ＯＡ）」は、変形性関節症とも呼ばれ、関節に慢性の退行性変化および増殖性変化が同時に起こり、関節の形態が変化する疾患である。一次性変形性関節症と二次性変形性関節症に大別される。前者は主に中年以降にみられ、８０％は女性である。老化現象に加え、力学的ストレスが加わって発症する。後者が若年層にもみられ、関節の外傷、形態異常、疾患、代謝異常など明らかな原因に有するものに続発して生じるものである。病理学的には、関節軟骨は次第に摩耗、あるいは欠損し、骨が露出するようになる。一方、血管の増生を伴って軟骨の肥大増殖、骨棘形成をみる。その他滑膜の増生、関節包の肥厚、萎縮、遊離体の出現などがみられる。症状としては、関節のこわばり、次第に運動痛、関節可動域制限、関節の腫脹をみる。運動開始時に疼痛や軋轢音を伴うことがある。Ｘ線像では骨棘形成、関節裂隙の狭小化、あるいは消失、関節軟骨下骨の硬化、嚢胞形成などが認められる。治療としては、理学療法、運動療法、装具療法、薬物療法などが保存的に行われる。病変が進行し、著しい機能障害を示すものに対しては手術療法が行われている（南山堂  医学大辞典１８版，第１９２６頁，同上）
ｉｉ）リウマチ性関節炎
「リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）」は、慢性関節リウマチとも呼ばれ、原因不明の慢性関節炎を特徴とする疾患である。男女比は１：４で女性に多く、好発年齢は３０歳ないし５０歳である。我が国の罹病率は全人口の０．３％ないし０．５％と推定されている。発病原因は不明であるが、多因子性の遺伝的素因、特にＨＬＡ−Ｄ４との関連、およびウイルス感染が着目されている。関節炎はすべて滑膜関節に起こり、多発性、対称性の傾向を示す。初期には滑膜の炎症性腫脹のみであるが、進行すると軟骨、骨の破壊が起こり、関節は変形、脱臼し、また、骨性剛直により可動性を失う。特に手指、足趾は変形しやすく、中手指節間関節部での尺側変位、指のスワンネック変形、ボタン穴変形、趾では外反母趾などが特徴的である。朝起床時に関節が動きにくい、こわばった感じは「朝のこわばり」といって診断上も、治療効果をみる上でも重要な症状である。関節以外では、血管炎、心膜炎、皮下結節、肺繊維症などを伴うものがあり、血管炎を伴う型には結節性多発動脈炎様の予後不良例があって、悪性関節リウマチといわれる。
【０００３】
臨床検査においては、リウマチ因子が７０％ないし８０％の高率に検出されるほか、赤沈値亢進、ＣＲＰ陽性、軽度の貧血、血小板増加、血清補体高値などが認められる。滑膜組織所見は、非特異的慢性滑膜炎ある。
【０００４】
治療としては、抗炎症薬と寛解導入薬による内科的治療、整形外科的治療、リハビリテーション治療等を組み合わせて行われている（南山堂  医学大辞典１８版，第２０１９頁，同上）。
【０００５】
ｉｉｉ）外傷性関節損傷
関節炎のうち、生体外からの機械的又は物理的刺激に基づく関節損傷を「外傷性関節損傷（ＡＣＬ）」という。より詳細には、交通事故等により機械的若しくは物理的に関節が壊れ軟骨組織も破壊された状態であって、軟骨組織の構成タンパク質が一過的に関節液中に湿潤している状態をいう。
関節炎の診断
従来より、関節炎の診断は主に、関節での損傷および摩耗をレントゲン検査による造影法にて確認することによって行われている。しかしながら、レントゲン検査にて関節の軟骨組織破壊および損傷が写し出される時期は、関節炎症状がかなり進行・悪化した後期においてわかるのみであった。従って関節炎の早期における発見・治療という点からは問題であった。
【０００６】
また、リウマチ性関節炎は、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く使用されている。具体的には、前述した朝のこわばり、多発性対称性関節炎、皮下結節、手の関節Ｘ線所見等の７項目からなり、４項目以上該当すればリウマチ性関節炎と診断される。当該基準に基づく診断方法も、簡便性および関節炎の早期発見の観点からは必ずしも十分ではない。
【０００７】
一方、関節の軟骨組織に存在するタンパク質として、ラミニン、オステオネクチン等の数種の細胞外マトリックスタンパク質が見出されている。ラミニンは基底膜の主要構成成分である糖タンパク質であり、上皮細胞を結合組織に接着させる働きのほかに、神経細胞の突起伸長促進作用を有する。また、オステオネクチンは、骨の非コラーゲン性タンパク質の約１／４を占める酸性リン酸化糖タンパク質である。骨の有機基質から発見されたが、その後骨組織以外の軟組織でも広く発現することが明らかとなっている（生化学辞典  第３版  第１４６４頁および第２５１頁  ９８年１０月）。中村ら（ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ＆ＲＥＵＭＡＴＩＳＭ  Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４，１９９６，ｐ．５３９−５５１）は、ヒト関節液中のオステオネクチンの濃度がリウマチ性関節炎と関連していることを示唆している。しかしながら、中村らの文献には、オステオネクチンの場合リウマチ性関節炎では高値を示すが骨関節炎の診断には不向きであると記載されており、また、その他の関節炎との関係も不明である。
【０００８】
このように、本発明前は広く関節炎の示標となるマーカーは存在せず、骨関節炎、リウマチ性関節炎および外傷性関節損傷を識別ことも不可能であった。
メラノトランスフェリン
一方、「メラノトランスフェリン」（以下、「ＭＴＦ」と言う」）は、腫瘍関連抗原「ｐ９７」としてヒトのメラノーマ細胞より同定されたタンパク質である（ブラウンら，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，ｐ．４９８０−４９８３；ジポルドら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７，ｐ．６１１４−６１１８；ウッドバーグら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７，ｐ．２１８３−２１８７）。ＭＴＦ抗原は、正常および腫瘍の組織中における発現に関して広く研究されており、大部分のヒトメラノーマ細胞に存在することが知られている（ブラウンら，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７，ｐ．５３９−５４６；ブラウンら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８，ｐ．５３９−５４３；ガーリックスら，１９８２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９，ｐ．５１１−５１５）。よって、ヒト臨床実験における腫瘍の診断像出に対する標的として使用されている（ラーソンら，１９８３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７２，ｐ．２１０１−２１１４）。
【０００９】
さらに、ＭＴＦは肝細胞（サイオットら，Ｌｉｖｅｒ，Ｖｏｌ．９（１９８９），ｐ．１１０−１１９）、胎児の小腸上皮細胞（ダニエルソンら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３１（１９９５），ｐ．９３９−９５０）および脳（ローゼンバーガーら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１２（１９９６）ｐ．１１７−１２１）でも発現していることが報告されている。
【００１０】
また近年、ＭＴＦが鉄の脳細胞への取り込みに関与していることが示唆され、ＭＴＦの濃度がアルツハイマー病患者で正常人よりも数倍高いことが見出された。当該結果に基づきＭＴＦ濃度を測定することによりアルツハイマーを診断する診断薬が開発されつつある（日経バイオテク  １９９９．３．２９  第１１頁）。
【００１１】
カワモトら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，Ｓｅｐ．１５，２５６（３），ｐ．５０３−５０９）は、ウサギＭＴＦタンパク質のウサギ軟骨細胞表面上での発現を報告している。しかしながら、ヒト軟骨細胞上でのＭＴＦタンパク質の発現も、関節液中でのＭＴＦタンパク質の存在も開示していない。その他、本発明前は関節に関連する組織および体液でのＭＴＦの存在は報告されておらず、また関節炎とＭＴＦとの関係も知られていなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、関節炎に関連するメラノトランスフェリンの測定方法を提供することを目的とする。本発明の測定方法は、
ｉ）生体試料中のメラノトランスフェリン濃度を測定し；そして
ｉｉ）生体試料中のメラノトランスフェリン濃度が、対照の非関節炎生体試料と比較して有意に高い場合に関節炎であると判断する
ことを含む。
【００１３】
本発明の方法は、その一態様において、関節液中のメラノトランスフェリン濃度が約２ｎｇ／ｍｌ以上の場合、あるいは血清中のメラノトランスフェリン濃度が約５ｎｇ／ｍｌ以上の場合には関節炎であると判断する
ことを含む。
【００１４】
本発明の方法はまた、その一態様において、関節液中のメラノトランスフェリン濃度が約２ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、リウマチ性関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷のうちの何れかの関節炎であると判断し、さらに約８ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、リウマチ性関節炎または外傷性関節損傷であると判断し、さらにまた、約２５ｎｇ／ｍｌ以上の場合にはリウマチ性関節炎であると判断することを含む。
【００１５】
本発明の方法はさらに、その一態様において、メラノトランスフェリンに特異的な抗体を用いたサンドイッチ型イムノアッセイによって生体試料中のメラノトランスフェリン濃度を測定することを含む。
【００１６】
本発明は、さらに、メラノトランスフェリンに特異的な抗体を含む、上記メラノトランスフェリンの測定方法に使用する試薬を提供することを目的とする。
本発明は、さらにまた、上記試薬を適当な容器に含む、メラノトランスフェリン測定用キットを提供することを目的とする。
【００１７】
【課題が解決するための手段】
本発明者らは上記問題の解決を目的として鋭意研究に努めた結果、ＭＴＦの濃度が関節炎と関連することを見出し、本発明を想到した。具体的には、本発明により、ＭＴＦが広く関節炎の示標となりうること、さらに、骨関節炎、リウマチ性関節炎および外傷性関節損傷を識別も可能であることが初めて明らかとなった。
【００１８】
具体的には、本発明は関節炎に関連するＭＴＦの測定方法であって、ＭＴＦの生体試料中の濃度が、対照の非関節炎生体試料と比較して有意に高い場合に関節炎であると判断する、ことを含む前記測定法法に関する。
ＭＴＦ
本発明における「ＭＴＦ」は、前述したようにヒトメラノーマ細胞に最初に同定された腫瘍関連抗原である。単量体細胞表面シアロ糖タンパク質であり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定して約９７，０００ダルトンの見かけ分子量（ＭＷ）を有するタンパク質である。ＭＴＦタンパク質は鉄を結合させるトランスフェリン・ファミリーに属するタンパク質の１種で細胞の取り込みに働いている分子と考えられている。より詳細には、ＭＴＦタンパク質のアミノ酸配列はトランスフェリンと相同であり、トランスフェリンと同様に鉄を結合する（ブラウンら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２９６，ｐ．１７１−１７３）。体細胞ハイブリッド分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法により、ＭＴＦ遺伝子はトランスフェリンおよびトランスフェリンの遺伝子と同様に染色体領域３ｑ２１ないし３ｑ２９上に配置されることが示されている（プロウマンら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，ｐ．２７５２−２７５６）。
【００１９】
本明細書に参考文献として援用する特開平８−２８０３９０号および特開平９−１３５６９２号は、ヒトのＭＴＦの遺伝子配列および推定アミノ酸配列を開示している。本明細書の配列番号１には、ヒトＭＴＦのアミノ酸酸配列（７１８）をコード塩基配列とともに記載した。
測定方法
本発明の測定方法においては、生体試料内のＭＴＦを公知の任意の方法を用いて測定してよい。
【００２０】
好ましくはＭＴＦタンパク質は、免疫学的測定方法を用いて測定することができる。免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法である。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用可能である。
【００２１】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＳＢＮ  ０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載されている。
【００２２】
本発明において、抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法は特に限定されず公知のものを使用できる。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。以下、本発明のにおける抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法の態様を例示的に説明する。
【００２３】
ｉ）抗体の作製
本発明の測定方法に用いるポリクローナル抗体は、常法により作製することができる。
【００２４】
先ず、ＭＴＦ免疫原を調製する。例えば、先ず、ヒト軟骨培養細胞から膜分画を調製後、ＧＰＩアンカー特異的に作用するホスホリパーゼＣにて膜結合成分を可溶化する。次いで、可溶化成分をＭＴＦ結合性レクチン固定化ゲルに装填し、ＭＴＦをレクチンゲルに吸着させる。ｐＨの変化、塩濃度の変化または特果糖（例えば、固定化レクチンがコンカナバリンＡの場合には、α−メチルマンノピラノシド）を利用することにより、レクチンゲルに吸着した糖タンパク質分画を溶出する。次いで、所望により、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトマトグラフィー等に供してＭＴＦ抗原を精製することができる。あるいは、既知の抗ＭＴＦモノクローナル抗体（例えば、Ｌ２３５（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ８４４６−ＨＢ）等）を利用したアフィニティークロマトグラフィーを用いてＭＴＦ抗原を調製してもよい。免疫原は特に限定されず、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物由来のもの、例えばウサギ、を使用可能である。好ましくはヒト由来である。
【００２５】
あるいは、特開平８−２８０３９０号および特開平９−１３５６９２号等に開示されたＭＴＦ遺伝子の塩基配列に基づいて、ＭＴＦ遺伝子をクローニングし、公知の遺伝子工学技術を用いてＭＴＦタンパク質を発現させてもよい。
【００２６】
上述のように得られたＭＴＦ免疫原をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００２７】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【００２８】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、ＭＴＦと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
さらに、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【００２９】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
（ａ）免疫用抗原ＭＴＦの調製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ  テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載されている。
【００３０】
以下、本発明のＭＴＦに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００３１】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００３２】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，  １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ  ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ，  ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，  １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ  １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ，  ２７７，１３１−１３３，（１９７９））等を使用できる。
【００３３】
上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約１×１０6以上の細胞数を確保する。
【００３４】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学  ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【００３５】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００３６】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、ＭＴＦに対する抗体活性を測定する。
さらに、測定によりＭＴＦに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【００３７】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗ＭＴＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【００３８】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【００３９】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗ＭＴＦモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗ＭＴＦモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００４０】
以上のようにして得られた抗ＭＴＦモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
【００４１】
本発明おいては、本明細書の実施例において後述するように、新たな抗ＭＴＦモノクローナル抗体として４７−４Ｅおよび８−９Ｃを得た。実施例１の表１に示すように、４７−４Ｅおよび８−９ＣはＭＴＦに類似するトランスフェリンには全く交差反応性を有しない、ＭＴＦに非常に特異性の高いモノクローナル抗体である。また、抗ＭＴＦモノクローナル抗体は本発明前より公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されているＬ２３５（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８４４６−ＨＢ）等も使用可能である。
【００４２】
また、前述したカワモトらの論文（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８）は、ウサギＭＴＦに対する抗血清を開示している。このような抗血清も、例えばウサギを対象とする本発明の測定方法において使用可能である。
抗体による生体試料中のＭＴＦの測定
本発明で使用する抗体によるＭＴＦの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。
【００４３】
ＭＴＦの測定は、例えば各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）まず、固相化用抗原であるＭＴＦ抗原を担体に固相化する。
【００４４】
（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）これに各種濃度のＭＴＦを含む生体試料及び抗体を加え、抗ＭＴＦ抗体を前記固相化抗原及びＭＴＦに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、ＭＴＦ−抗体複合体を生成させる。
【００４５】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から生体試料中のＭＴＦの量を決定することができる。
（ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【００４６】
固相化用抗原を担体に固相化させるには、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【００４７】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原を固相化した担体において、ＭＴＦ部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００４８】
次いで（ｃ）工程において、ＭＴＦを含む生体試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びＭＴＦと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びＭＴＦ−抗体複合体が生成する。
【００４９】
ＭＴＦを含む生体試料としては、特に限定されず関節液の他に血清等も使用可能である。後述する実施例４（図３）に示すように、関節液中のＭＴＦ濃度は血清中のＭＴＦ濃度に相関関係を有する。よって、本発明の測定方法においては関節液を用いるのが好ましいが、血清、血液、リンパ球等の他の生体試料も使用可能である。生体試料の由来は特に限定されず、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物由来のもの、例えばウサギ、を使用可能である。好ましくはヒト由来である。
【００５０】
抗体としては、第一抗体として本発明のＭＴＦに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００５１】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素等の標識物質を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素を用いることができる。あるいは、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、32Ｐ、125Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などを用いてもよい。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。あるいは、第一抗体をビオチン化させておき、第二抗体の代わりに標識したストレプトアビジンを加えてもよい。
【００５２】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＭＴＦの量を算出することができる。
【００５３】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、１ＮのＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００５４】
ＭＴＦを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のＭＴＦを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のＭＴＦの濃度を算出できる。
【００５５】
あるいはＭＴＦの測定は、例えば以下に述べるような直接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
（ａ）まず、抗ＭＴＦモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
【００５６】
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のＭＴＦを含む生体試料に、ＭＴＦ免疫原と酵素を結合させた酵素結合ＭＴＦを加えた混合物を調製する。
【００５７】
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ＭＴＦ複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中のＭＴＦの量を決定する。
【００５８】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【００５９】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のＭＴＦ並びに酵素結合ＭＴＦが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００６０】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ＭＴＦの調製は、ＭＴＦを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ＭＴＦは、ＭＴＦを含む試料と混合する。
【００６１】
（ｄ）工程においてＭＴＦを含む試料及び酵素結合ＭＴＦを抗体固相化担体に接触させ、ＭＴＦと酵素結合ＭＴＦとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。ＭＴＦを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ＭＴＦを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００６２】
さらに、（ｅ）工程において酵素結合ＭＴＦの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からＭＴＦの量を算出することができる。
【００６３】
さらにまた、限定されるわけではないが、本発明の方法では好ましくはサンドイッチ法を用いることができる。サンドイッチ法は、「２抗体法」とも呼ばれる非競合型のイムノアッセイである。サンドイッチ法は、抗原上の重複していないエピトープに対する２種の異なる抗体により抗原を測定することを特徴とする（生化学事典  第３版  第５９９頁  １９９８年１０月）。
【００６４】
（ａ）まず、第一の抗ＭＴＦモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
【００６５】
（ｃ）ＭＴＦを含む生体試料を上記抗体固相化担体と反応させる。
（ｄ）標識した第二の抗ＭＴＦモノクローナル抗体を添加し、反応させる。
（ｅ）固相化第一抗ＭＴＦモノクローナル抗体−ＭＴＦ−標識第二抗ＭＴＦモノクローナル抗体複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中のＭＴＦの量を決定する。
【００６６】
（ｅ）工程においては、標識第２モノクローナル抗体の酵素に反応する発色基質溶液を前述のＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からＭＴＦの量を算出することができる。あるいは、第二抗体をビオチン化させておき、更に標識したストレプトアビジンを加えてビオチン−アビジン結合体を生じさせ、アビジンに結合した標識酵素を発色させてもよい。
【００６７】
サンドイッチ法においては、（ａ）工程において用いる担体に固相化させる第一のモノクローナル抗体と、（ｅ）工程において加える第二のモノクローナル抗体とは異なるエピトープを認識することを特徴とする。このため抗原検出の特異性と感度を高めることが可能である。限定されるわけではないが、好ましくは、本発明において得られた抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９Ｃを用いることができる。抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９Ｃを用いたサンドイッチ法の場合、約１ｎｇ／ｍｌないし約８０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３ｎｇ／ｍｌないし６０ｎｇ／ｍｌの濃度でＭＴＦの測定が可能である（実施例２、図１）。
【００６８】
ＭＴＦは細胞膜タンパク質として局在し、鉄結合能およびレクチン結合能等を有することが報告されている（ローゼンバーガーら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１２（１９９６），ｐ．１１７−１２１等）。よって、２種類の抗体を用いたサンドイッチ型イムノアッセイの他にも、レクチン−抗体のサンドイッチ型アッセイも可能である。さらに、例えば57Ｆｅ、58Ｆｅ等の放射性同位元素で標識した鉄−抗体を用いたサンドイッチ型アッセイも可能である。さらに、本発明はイムノアッセイに限定されず、生体試料中のＭＴＦ濃度を測定可能な方法であれば適用可能である。
関節炎
本発明の測定方法は、ＭＴＦの生体試料中の濃度が、対照の非関節炎生体試料と比較して有意に高い場合に関節炎であると判断する。本発明の測定方法によって、種々の関節炎を病む複数の生体試料中のＭＴＦ濃度を測定すると、いずれも関節炎とは無関係な陰性対照の生体試料中と比較してＭＴＦ濃度が有意に高い。例えば、後述する実施例３（図２）では、関節液中のＭＴＦ濃度が、陰性対照群（半月晩損傷疾患）に対し、骨関節炎で約５倍、リウマチ性関節炎で約１０倍、外傷性関節損傷で約７倍上昇した。
【００６９】
限定されるわけではないが、本発明の測定方法においては、関節液のＭＴＦ濃度が約２ｎｇ／ｍｌ以上の場合に関節炎であると判断する。また、実施例４（図３）に示すように血清のＭＴＦ濃度は関節液の場合と相関関係にあり、相関係数は０．６９４であり、血清ＭＴＦ＝関節液ＭＴＦ×０．６６４＋１．７１の関係式が成り立つ。よって、血清の場合には、約５ｎｇ／ｍｌ以上の場合に関節炎であると判断する。
【００７０】
本発明の測定方法により判断可能な関節炎は特に限定されず、リウマチ関節炎、骨関節炎、外傷性関節損傷、感染性関節炎、結合組織疾患に伴う関節炎等公知の任意の関節炎が対象となる。好ましくは、リウマチ性関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷が対象となる。
【００７１】
さらに、本発明の測定方法においてはリウマチ関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷の３種の関節炎の識別が可能である。具体的には、関節液中のＭＴＦ濃度が約２ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、リウマチ性関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷のうちの何れかの関節炎であると判断し、さらに約８ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、リウマチ性関節炎または外傷性関節損傷であると判断し、さらにまた、約２５ｎｇ／ｍｌ以上の場合にはリウマチ性関節炎であると判断する。そして約２ｎｇ／ｍｌ以下の場合に関節炎に罹患していないと判断する。
【００７２】
本発明の測定方法をさらに他の関節炎に関するデータ、例えば上述したようなレントゲンデータ、リウマチ診断基準、オステオネクチン分布データ等、と組み合わせることにより、関節炎の判断並びにリウマチ関節炎、骨関節炎および外傷性関節損傷の３種の関節炎の識別がより容易、確実にすることが可能である。
【００７３】
なお、本発明は、ＭＴＦと関節炎との関係を初めて見出し、関節炎の早期診断・発見を可能にしたものである。よって、本発明に基づき、生体試料中のＭＴＦのタンパク質濃度のみならず、遺伝子発現も関節炎と関連付けられると考えられる。即ち、生体試料中のＭＴＦのｍＲＮＡを、例えばＰＣＲ等の核酸増幅技術を用いることによって増幅し、対照の非関節炎由来の試料と比較することが可能である。
ＭＴＦ測定用試薬およびキット
本発明はさらに、上述したＭＴＦ測定方法に使用するための試薬を提供する。本発明の試薬は、ＭＴＦを測定し、関節炎を診断するために用いられる。さらに、本発明の試薬によりリウマチ関節炎、骨関節炎および外傷性関節炎の３種の関節炎の識別が可能である。
【００７４】
本発明の試薬はＭＴＦ濃度を測定するためのＭＴＦに特異的な抗体を含むことを特徴とする。ＭＴＦに特異的な抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくは、本発明の実施例１によって得られた抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９Ｃである。
【００７５】
本発明はまた、上記試薬を適当な容器に含むキットを提供する。ＭＴＦに特異的な抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。限定されるわけではないが、本発明のキットは、例えば、抗ＭＴＦモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌないし１，０００μｇ／ｍｌの濃度で含む溶液を１０μｌないし１０ｍｌの単位で容器に含むものである。
【００７６】
本発明のキットは、さらに、抗体固相用プレート、発色基質溶液、標準標識抗体、あるいはビオチン標識抗体およびストレプトアビジン若しくはアビジン標識酵素の組み合わせ、標準抗原液等のイムノアッセイに必要な試薬を含んでいてもよい。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７７】
【実施例】
実施例１  ＭＴＦに対するモノクローナル抗体の作製
ヒト軟骨培養細胞から膜分画を調製後、ＧＰＩリンカーに特異的に作用するホスホリパーゼＣを用いてＭＴＦを含む膜結合成分を可溶化した。
【００７８】
次いで可溶化膜結合成分を、ヒトＭＴＦに特異的なモノクローナル抗体Ｌ２３５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．８４４６−ＨＢ）を固定化したセルロファインゲルを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーに装填し、クロマトグラフィーにヒトＭＴＦを特異的に結合させた。０．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．４）を溶出分画として用い、ＭＴＦを溶出させた。
【００７９】
精製ＭＴＦの１０μｇを免疫用抗原としてフロイド完全アジュバントとともにＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。その後、追加免疫として皮下注射を繰り返し行った。マウス抗血清のＭＴＦに対する抗体価の上昇を、ＭＴＦ固相化マイクロタイタープレートを用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法にて確認した。次いで、抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞（ｘＡｇ８／６．５．３）との細胞融合を行い、同様なＭＴＦに対する間接競合ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定に基づき、ＭＴＦに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を２株取得した（４７−４Ｅおよび８−９Ｃ）。
【００８０】
取得した抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９ＣのＭＴＦの異なる供給源に対する特異性を、免疫用抗原の供給源である軟骨培養細胞由来のＭＴＦと、メラノーマ細胞由来のＭＴＦの各々に対する特異性を比較することによって調べた。陰性対照としてヒト血清由来のトランスフェリンを用いた。結果を表１示す。
【００８１】
【表１】
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表１に示されるように本願発明の抗ＭＴＦモノクローナル抗体は、測定対象化合物のＭＴＦの供給源に関係なく、ＭＴＦに特異的であることが明らかとなった。
実施例２  サンドイッチ型エンザイムイムノアッセイを用いたＭＴＦの測定
実施例１で得られた２種の抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９を用いたサンドイッチ型エンザイムイムノアッセイ（２抗体法）よりＭＴＦを測定した。
ａ）１次抗体（抗ＭＴＦモノクローナル抗体８−９Ｃ）の固相プレートの作製
ｂ）固相プレートのブロッキング
ｃ）ＭＴＦ抗原の添加および反応
ｄ）２次抗体（ビオチン化抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−３Ｅ）の添加および反応
ｅ）アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンの添加
ｆ）ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液の添加
ｇ）発色反応の停止
各操作の間には、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでの洗浄操作を行った。
【００８２】
具体的には、先ず実施例１で得た抗ＭＴＦモノクローナル抗体８−９Ｃを３０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌずつ分注し、４℃で１晩感作させて、マイクロプレートにコーティングした。さらに、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて固相プレートをブロッキングしてアッセイ用のプレートを作製した。
【００８３】
次に、実施例１で調製した０ないし１００μｇ／ｍｌのＭＴＦ抗原を１００μｌずつ各ウェルに入れ、室温で２時間反応させた。
反応後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでの洗浄し、２次抗体として２．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−３Ｅを加えた。反応は、室温で２時間行った。次いで、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを、０．５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した、同様に室温で２時間反応させた。反応終了後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでの洗浄し、発色基質溶液としてｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（バイオテックス  ラボラトリー社製、米国）を添加した。発色反応を室温で３０分間行った後、１Ｎ  ＮａＯＨを加えることにより停止した。
【００８４】
プレートリーダーにて４１５ｎｍにおかる吸光度を計測し、発色の度合いを測定した。メラノトランスフェリン標準液を用いて作成した較正曲線を図１に示す。図１に示すように、本発明の測定方法により、抗ＭＴＦモノクローナル抗体４７−４Ｅおよび８−９Ｃを用いたサンドイッチ法の場合、約１ｎｇ／ｍｌないし約８０ｎｇ／ｍｌの濃度でＭＴＦの測定が可能である。
実施例３  抗ＭＴＦ抗体を用いた関節液中のＭＴＦの測定
実施例２のサンドイッチ型エンザイムイムノアッセイの手順に従い、関節炎患者の関節液中のＭＴＦ濃度を測定した。
【００８５】
具体的には、関節炎患者として骨関節炎（ＯＡ）２６例、リューマチ性関節炎（ＲＡ）４６例および外傷性関節損傷（ＡＣＬ）１５例を対象とした。さらに、半月板損傷２例を陰性対照として測定した。結果を図２に示す。
【００８６】
図２より、骨関節炎、リューマチ性関節炎、外傷性関節損傷のすべての関節炎において、対照の半月板損傷と比較して、関節液中のＭＴＦ濃度が有意に高いことが示された。よって、関節液中のＭＴＦ濃度は関節炎を早期に発見・診断する上で有用であることが明らかとなった。
【００８７】
さらに、骨関節炎、リューマチ性関節炎、外傷性関節損傷の各関節炎ではＭＴＦ濃度の分布に有意に差があることが判明した。具体的には、骨関節炎（ＯＡ）では、ＭＴＦ濃度の分布が平均約３．１５ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ±２．７９）であり、最高値は約８ｎｇ／ｍｌであった。リューマチ性関節炎（ＲＡ）では、平均約１１．３０ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ±１１．８２）であり、最高値は約５２ｎｇ／ｍｌであった。そして、外傷性関節損傷（ＡＣＬ）では平均約９．８８ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ±５．２９）であり、最高値は約２５ｎｇ／ｍｌであった。これに対し、陰性対照の半月板損傷では平均約１．１４ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ±１．２１）であった。
実施例４  血清ＭＴＦ濃度と関節液ＭＴＦ濃度の相関関係
骨関節炎２６例、リューマチ性関節炎４６例および外傷性間接損傷１５例の患者につき関節液とともに血清を採取した。血清中のＭＴＦ濃度を測定し、関節液中のＭＴＦ濃度と比較した。
【００８８】
結果を図３に示す。図３に示すように血清中のＭＴＦ濃度と関節液中のＭＴＦ濃度との間に正の相関性があることが見出された。詳細には、血清中のＭＴＦ濃度と関節液中のＭＴＦ濃度の相関係数は約０．６９４であり、血清ＭＴＦ＝関節液ＭＴＦ×０．６６４＋１．７１の関係式が成り立つ。
【００８９】
【効果】
本発明により、ＭＴＦと関節炎との関係が明らかとなった。本発明のＭＴＦ測定方法によって生体試料中のＭＴＦ濃度を測定することにより、広く関節炎を簡便、迅速、安価に発見・診断することが可能となった。
【００９０】
本発明はさらに、ＭＴＦ濃度は３種の関節炎、骨関節炎、リューマチ性関節炎、外傷性関節損傷において、有意に差があることを見出し、三者の識別を初めて可能にした。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のサンドイッチ型エンザイムイムノアッセイによるメラノトランスフェリン標準液の較正曲線を示す。
【図２】図２は、本発明のサンドイッチ型エンザイムイムノアッセイによる各種関節炎患者由来の関節液中のＭＴＦ濃度を示す。
【図３】図３は、本発明のサンドイッチ型エンザイムイムノアッセイによる関節液中のＭＴＦ濃度と血清中のＭＴＦ濃度との相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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