(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列33、36、２、または３の少なくとも１つを含有する20アミノ酸以下のペプチド。
【請求項２】
以下から選択される配列を有する少なくとも16〜30アミノ酸の少なくとも１つのペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア中に含有する物質の組成物：
SAVALTYS(配列番号33)、PSAVALTYSP(配列番号36)、TVTASVDPTIDLLQAD(配列番号３)、ならびにASVDPTIDLLQA(配列番号２)。
【請求項３】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号３３および配列番号３６からなる群より選択される、単離されたペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが一方の末端に結合したプロリンを有する、請求項１および３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが一方の末端に結合したシステインを有する、請求項１および３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが免疫原に結合されている、請求項１および３〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、ウシ血清アルブミンまたは破傷風トキソイドに結合されている、請求項１および３〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、Streptococcus pneumoniae 14型ポリサッカライドにさらに結合されている、請求項１および３〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントがフロイントアジュバントである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記薬学的に受容可能なキャリアが生理食塩水である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記キャリアが細菌含有増殖培地に適用するために適切である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
被験体における免疫応答を誘導することにおいて使用するためか、または被験体における免疫応答を誘導するための医薬の調製において使用するための、請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
被験体における免疫応答を誘導することにおいて使用するためか、または被験体における免疫応答を誘導するための医薬の調製において使用するための、請求項２および９〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチドに結合する少なくとも１つの抗体およびキャリアを含む、組成物。
【請求項１７】
前記キャリアが細菌含有増殖培地に適用するために適切である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、該抗体／ペプチド結合体の同定を補助するタグを有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タグが蛍光剤である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記タグが測色タグである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
サンプルにおいて、CS4-CFA/Iタンパク質ファミリーに属するタンパク質に対する抗体を検出するためのアッセイであって、請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチドを該サンプルと接触させる工程、および該抗体と該ペプチドとの結合体の存在を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２２】
サンプルにおいて、CS4-CFA/Iタンパク質ファミリーに属するタンパク質を検出するためのアッセイであって、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の組成物を該サンプルと接触させる工程、および該組成物とタンパク質との結合体の存在を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２３】
請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項２に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【請求項２４】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【請求項２５】
請求項１および３〜８のいずれか１項に記載のペプチドに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、以下の式のコンセンサスペプチド内に由来するアミノ酸配列に関する：
VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA(配列番号１)。
コンセンサスペプチド内に由来する８マーペプチドが、コンセンサスペプチドに対して惹起された抗体に対して試験された。ファミリーのタンパク質を産生する天然生物由来の変性タンパク質に対して惹起された抗体に関する研究もまた有用であり、そして特定の価値のいくつかの配列を示した。式ASVDPTIDLLQA(配列番号２)の配列がそれによって同定された。式TVTASVDPTIDLLQAD(配列番号３)の拡大された配列もまた、変性タンパク質に対して惹起された抗体に対する結合部位であるとして、配列VTASVDPTIDLLQAD(配列番号４)、TASVDPTIDLLQAD(配列番号５)、およびTASVDPTIDLLQA(配列番号６)のような中間配列と同様に特に興味深い。
発明の背景
哺乳動物におけるE.coliの効果は、生物の特定の株に依存する。多くの有益なE.coliが腸内に存在する。下痢病との最初の関連付け以来、以下の５つの範疇の下痢原性(diarrheagenic)E.coliが同定され、そして現在認識されている：腸毒素原性(ETEC)、腸病原性(EPEC)、腸管出血性(EHEC)、腸凝集性(enteroaggregative)(EAggEC)、および腸侵襲性(enteroinvasive)(EIEC)。これらの範疇は、毒素および集落形成因子の加工、ならびに／または腸上皮細胞との特定の型の相互作用のような特徴的な菌力特性に従って分類される。ETECは、下痢原性E.coliの中で最も一般的であり、そして旅行者を最大の危険にさらす。ファミリーCS4-CFA/IのE.coliは、より一般的な腸毒素原性E.coliのいくつかである。CS4-CFA/Iファミリーのより一般的なメンバーと交差反応し、そしてそれに対して交差防御する抗体を起こさせる、このクラスのE.coliに対して特異的なワクチンの必要性が存在する。ETEC線毛タンパク質のこのファミリーの６つのメンバー、CFA/I、CS1、CS2、CS4、CS17、およびPCF 0166が存在する。ETECは発展途上国における高い幼児死亡率の原因であり、推定で１年あたりほぼ800,000の死亡がこれらの生物に起因する。これらの生物はまた、この疾患が風土病である地域への成人旅行者に病気を引き起こす。
ETECの集落形成因子抗原(CFA)は、集落形成および細菌の腸上皮への接着の最初の段階において重要である。下痢を有する成人および小児の疫学的研究において、CSF/Iは、ETECの原因である病的状態の高い割合において見出される。CFA/Iは、ピリ線毛(線毛)の形態で細菌の表面上に存在し、これは、反復するピリンサブユニットから構成される堅固な直径７nmのタンパク質繊維である。CFA/I抗原は、見かけのシアル酸感受性を有する、ヒト刷子縁へのマンノース耐性付着を促進する。
CS4-CFA/Iファミリーに属するE.coliにおけるタンパク質の研究は、このタンパク質のＮ末端領域が、この群のメンバー間で高度の配列同一性を維持しているという知見をもたらした。免疫学的証拠は、交差反応が、ファミリーCS4-CFA/Iのメンバー間に存在することを示す。
Casselらは、E.coliファミリーCS4-CFA/Iの全てのメンバーのタンパク質に対する抗体を惹起する免疫原として作用する36アミノ酸のコンセンサスペプチドを同定した。サブユニット中に示されるタンパク質の領域は、CFA/Iの既知の直鎖状Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープを包含する。コンセンサスペプチドは、６つの異なる集落形成因子を有する株に対する高レベルの相同性を有する。コンセンサスペプチドは以下の式のものである：
VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA(配列番号１)。
発明の説明：
E.coliファミリーCSA-CFA/Iの全てのメンバーを凝集させる抗体を惹起するために使用され得る特定のエピトープを同定することは、本発明の目的である。CS4-CFA/Iファミリータンパク質に対する抗体を惹起する目的のために免疫原として作用する、Casselsにより以前に同定されたコンセンサスペプチドのサブユニットを同定することは、本発明のさらなる目的である。
さらに、E.coliのCS4-CFA/Iファミリーの全てのメンバーおよびこのような生物に対する抗体を、臨床的および環境的なサンプルにおいて同定する際に使用するキットを提供することは、本発明の目的である。抗体は、配列番号１のコンセンサスペプチドに対して惹起された。
材料及び方法
ペプチド合成：
切断可能な合成のための数組のピンを、Chiron Mimotope U.S.から入手した。ペプチド合成を、製造業者の説明書に従って、Opfp-誘導体化アミノ酸を用いて行った。７つの重複を有する長さ８のペプチドを、最も高い縮退を有する配列中に全ての線形エピトープを配置させるために製造した。ペプチドは、リンカーであるアミノ酸Ser-Gly-Ser-Gly-およびＮ末端に共有結合したビオチンを有し、全長12アミノ酸であった(ビオチンを含んで17反応)。ペプチドを、40％アセトニトリルを含有する0.1Ｍリン酸緩衝液(pH 8.0)を用いてピンから切断した。２つのペプチドを作製し、そしてペプチドの純度の証拠としてのアミノ酸分析のために犠牲にした。ジニトロフェノール(DNP)ピンを、切断の効率が分光学的にモニターし得るように含めた。
全36アミノ酸コンセンサスペプチドを含む全部で29のペプチドを、以下のように合成した：
0004484968.tif 000002
CS4-CFA/Iファミリータンパク質を有するE.coliを凝集させることが見出された抗体を用いて、36マーコンセンサスペプチドに対する応答の結合部位を同定する試みがなされた。コンセンサスペプチドに対して惹起された１つのモノクローナル抗体が、CS4-CFA/Iファミリーの全てのE.coliに結合することを見出した。
ELISA法：
材料：
ブロッキングのために、PBS中に５％脱脂乾燥ミルクおよび0.2％アジ化ナトリウを含有する組成物を使用した。水中1mg/mlのストックストレプトアビジン(Calbiochem Corp.,LaJolla,CA)を、アリコートで、最高数ヶ月間、凍結維持した。使用の当日に、ストックストレプトアビジンを、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に希釈し、５μg/mlストレプトアビジンの濃度を得た。ヤギF(ab’)2抗マウス、抗ウサギ、および抗ヒト血清を、アルカリホスファターゼ(Bioscience,International,Camarillo,CA)で標識した。
ストレプトアビジンを５μg/ml、ウェルあたり50μlでプレートし、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを３回PBS/0.1％Tween 20で手洗いした(Nunc Immunowash 12 hand plate washer,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)。次いで、ペプチドをPBS中で10μg/mlに希釈し、そして50μl/ウェルでプレートした。１時間室温でインキュベートに続いて、洗浄した後、ペプチドを２時間室温で、適切な濃度(５％脱脂乾燥ミルク)で、ブロッカー中に希釈した血清とともにインキュベートした。ウェルを洗浄した後、ブロッカー中で1:1000希釈したホスファターゼ標識抗血清のIgG 50μlを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した。製造業者の説明書に従って調製したPNDP(p-ニトロフェニルホスフェート)基質の100μlを各ウェルに添加した。結果を、マイクロタイタープレートリーダー(UVmaxTM,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて５、15、および60分で読んだ。
コンセンサスペプチドでの免疫化：
コンセンサスペプチドを、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイドに結合させ、その後Streptococcus pneumoniae 14型ポリサッカライドに結合させた。ペプチドを以下に示すように結合させた後、システインをペプチドの終結末端に付加し、以下のペプチドを得た：
CVEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA(配列番号37)
次いで、アルブミンまたはトキソイドをヨードアセチル化した。ペプチドを、アセチル化アルブミンまたはトキソイドで混合した。(それによりスルフィド結合を、結合体化タンパク質を提供するシステイン残基間に形成する。)
免疫原性組成物は、完全フロイントアジュバントを含有し、そして１日目にウサギに皮下投与した。21日目に、追加免疫し、そして32日目に、動物から採血した。
実施例１：
ウサギから採血し、次いで０日目に、フロイント完全アジュバント中に280μgのペプチド/BSA結合体を含有する組成物で免疫した。21日目に、動物を、フロイント不完全アジュバント中の140μgのペプチド/BSA結合体で追加免疫した。血液を32日に採取した。種々の株の変性タンパク質の特異的抗原に対して惹起した抗体の相互作用を、ウェスタンブロットによって、０日目に得た動物由来の血清の相互作用を、32日目に得た動物由来の血清に対する応答と比較することによって研究した。すべての場合において、ウェスタンブロットは、０日目に得た血清との反応について陰性であった。変性タンパク質で32日に回収した免疫血清の相互作用に関するウェスタンブロットデータを、以下に示す。０は、反応無し、そして４は、強力な反応である：
0004484968.tif 000003
実施例２：
完全フロイント試薬中に、システインを介してBSAに結合した2800μg/mlの式：VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAのペプチドの結合体を含む免疫原性組成物を調製する。
実施例３：
完全フロイントアジュバント中に4000μg/mlの式：VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAのペプチドを含む免疫原性組成物を調製する。
実施例４：
ウサギに、完全フロイントアジュバント中に式：VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAの400μgのペプチドを含む組成物を与えた。応答を実施例２のように評価した：
0004484968.tif 000004
実施例５：
同じ研究を行い、PCF 0166の変性タンパク質に対して惹起された抗体を比較した。
0004484968.tif 000005
実施例６：
全体のCS2タンパク質に対して惹起された抗体の効果を、実施例５の様式で研究した。
0004484968.tif 000006
実施例７：
このペプチドに対して惹起された抗体が種々の株の細菌全体の凝集を引き起こすかどうかを決定するために研究を行った。ウサギを免疫化するために使用されたコンセンサスペプチド抗原の３つの調製物に対する抗体応答を比較した：１)ウシ胎仔アルブミンに結合したペプチド(aPepBS)、２)遊離ペプチド(aPepFr)および３)破傷風トキソイドおよびS.pneumonia T14に結合したペプチド(aPepTT)。破傷風トキソイドを、BSAへの結合に関して前述されたものを用いてペプチドに結合させた。３つの調製物を用いて、それぞれ２匹の動物を免疫化させた。次いで、血清を、細菌全体と接触させ、そして細菌の凝集についてスライドを観察した。
0004484968.tif 000007
試験データから、コンセンサスタンパク質が、変性タンパク質と反応する抗体を生じ、そしてCS4-CFA/IファミリーのE.coliの１つ以上の株の凝集を引き起こし得ることをこのデータが示していることが理解される。しかし、より大きな分子への結合が、細菌全体およびこれらの生物のタンパク質に対する抗体を惹起する目的について、このペプチドに改善された特性を提供することもまた理解される。
次いで、ウサギ由来の抗体を、配列番号１から得られた特異的な８量体ペプチドに対して上記に開示された様式で試験し、コンセンサスペプチドとの血清中の抗体の結合部位を決定した。
この試験方法では、最も反応性が高いペプチドは、式：EKNITVTA(配列番号８)、KNITVTAS(配列番号９)、NITVTASV(配列番号10)、ITVTASVD(配列番号11)、TASVDPTI(配列番号14)、ASVDPTID(配列番号15)、SVDPTIDL(配列番号16)、VDPTIDLL(配列番号17)、DPTIDLLQ(配列番号18)、PTIDLLQA(配列番号19)、SALPSAVA(配列番号29)、ALPSAVAL(配列番号30)、LPSAVALT(配列番号31)、PSAVALTY(配列番号32)、SAVALTYS(配列番号33)、AVALTYSP(配列番号34)、およびVALTYSPA(配列番号35)のペプチド２、３、４、５、８、９、10、11、12、13、14、23、24、25、26、27、28、および29を含むペプチドであるようであった。このデータから、これらのペプチドを含むエピトープがコンセンサスペプチドに対して惹起された抗体との反応における使用に好ましい。ペプチドASVDPTID(配列番号15)、SVDPTIDL(配列番号16)、VDPTIDLL(配列番号17)、DPTIDLLQ(配列番号18)、PTIDLLQA(配列番号19)、PSAVALTY(配列番号32)、SAVALTYS(配列番号33)、およびAVALTYSP(配列番号34)を含むエピトープは、コンセンサスペプチドに対して惹起された抗体とより確実に反応性があった。さらに、そのアミノ酸で終了しない任意のペプチドのいずれか一方または両方の末端へのプロリンの付加が、結合活性を増大することが予想されるようである。式SAVALTYS(配列番号33)のペプチドは、特にPSAVALTYSP(配列番号36)を提供するようにプロリンによって結合される場合に好ましいペプチドである。
８量体単位へのPEPESCANデータの適用
この方法を用いて、式ASVDPTIDLLQA(配列番号２)の配列を含む他の配列を同定した。式TVTASVDPTIDLLQAD(配列番号３)の拡大された配列はまた、変性タンパク質に対して惹起された抗体の結合部位であるので、VTASVDPTIDLLQAD(配列番号４)、TASVDPTIDLLQAD(配列番号５)、およびTASVDPTIDLLQA(配列番号６)のような中間体配列と同様に、特に興味深い。
変性サブユニットに対する抗体を入手するための手順
部分的から完全に精製されたコロニー形成因子(40％〜100％純粋)を、SDS-PAGEゲル(５〜15μg/レーンの10コームゲル(予め鋳造された、10コーム、１mm厚のNovex,San Diego,CaliforniaからのTris-triceneゲル))において泳動し、一次免疫について、各ウサギについて９レーン泳動した(一次免疫において使用した1/2量の45〜135μgのCFタンパク質を追加免疫として使用した)。
ゲルを、水中で１時間、0.5％のCoomassie Blue(BioRad,Richmond,California)で染色し、次いで、60〜90分間の複数の水の交換で脱染した。コロニー形成因子のバンドを、メスで切り出し、そして過剰のゲルを除去した。使用するまでバンドを−20℃で保存した。
免疫化：
冷凍庫からの取り出し後、ゲル切片を、先端に溝があるテフロンの乳棒を用いてガラスの組織ホモジナイザーへと移した。切片を0.3mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で粉砕した。ドリルを動かしてゲルを30〜45秒間ホモジナイズした。(この場合、携帯ドリルのチャックへの乳棒の配置を可能にした鋼鉄のシャフト付きの乳棒を使用した。)
ホモジネートを、使い捨てのプラスチック移入ピペットで16mm×150mmの試験管へと移した。乳棒およびホモジナイザー容器をPBSで反復してリンスし、そして1.2mlの容積が得られるまで内容物を16×150試験管へ移した。
上記で得られたサンプルをボルテックスミキサーに配置して、そして空中でボルテックスした。フロイントのアジュバント1.2mlを添加した。(完全フロイントを一次免疫のために使用したが、不完全フロイントを追加免疫に使用した。)組成物を、ほとんどバターの粘度の濃い乳濁液が得られるまでボルテックスした(12〜20分間)。
免疫前血清を、すべての動物について得た。次いで、これらの動物に、1mlの乳濁液を皮下的に、肩部および臀部上で４〜６ヶ所免疫した。３週間後動物を追加免疫して、次いで追加免疫注射の後10日で採血した。
８マーペプチドを動物の血清に曝露し、そしてサンプルを、結合が生じたかを決定するために上記で開示する手段により試験した。データを下記に示す。
抗体での試験は、抗体に結合するこれらのエピトープを示した。結果として、おそらく血清サンプル中での抗体に結合するらしいこれらのエピトープを同定し得た。
0004484968.tif 000008
上記のデータから、天然の生物に応答して生じるほとんどすべての抗体と相互作用すると推測され得る配列番号１のコンセンサスペプチドの単位を同定した。このようなペプチドは、配列番号12〜配列番号20のすべてのアミノ酸、すなわち：TVTASVDPTIDLLQAD(配列番号３)を含む。配列を、最初の３アミノ酸および最後のアミノ酸の任意またはすべての欠失でいくらか短縮し得るが、生物の標的クラスに対する活性を保持する目的のためのアミノ酸配列ASVDPTIDLLQA(配列番号２)を含むべきである。これらの配列を含むペプチドは、タンパク質のCS4-CFA/Iファミリーを産生する天然の産物のほとんどの抗体と反応するはずであり、そして個々の動物がETEC E.coliに対する抗体を有するかどうかを決定するために使用され得る。これらの配列、ならびに本明細書中で開示されるより大きなコンセンサスペプチドおよび他の８マーペプチドは、CS4-CFA/Iファミリータンパク質を産生する天然の生物に対する抗体を惹起するために使用され得る。
本発明のペプチドは、タンパク質のCS4-CFA/Iファミリーを産生する生物に対する抗体を産生するための免疫化に有用である。特に好ましい配列は、配列２、３、３３、および３６を含む配列である。なぜなら、これらのエピトープは、効果的な抗体に対して結合するからである。免疫化の目的のために、これらの好ましい配列からのこれらの配列を含むペプチドは、少なくとも16アミノ酸を含むことが好ましい。本発明のペプチドは、当該分野で公知の通常の手段(皮下、皮内(intradramally)、経口、および経鼻を含む)により投与のために薬学的に受容可能なキャリア中で投与され得る。当該分野で公知のアジュバントは、このようなキャリア中で使用され得る。免疫原性ペプチドは、本明細書中における教示に従って、追加免疫に使用される第二および第三の用量を伴う一次用量として投与され得る。
このペプチドに対して産生された抗体は、培養物におけるCS4-CFA/Iファミリーのメンバーを同定するのに有用である。この抗体を含むアッセイキットが調製され得、そしてさらに、抗体／抗原結合体の容易な同定のためのタグ化のための薬剤を含み得る。このようなタグは、放射性同位体、蛍光薬剤、および測色(colorometric)指示薬を含む。このような薬剤は、固体支持体に結合され得る。例えば、ELISA試験キット系を使用して、抗体／抗原結合体を同定し得る。
本明細書中の教示に従って産生された抗体を含む組成物は、増殖培地への添加に適切なキャリアを使用して調製され得る。生理食塩水および他の当該分野で公知の緩衝化溶液は、抗体のためのキャリアとして適切である。
本発明の配列に対して産生された抗体は、薬学的に受容可能なキャリア溶液中で調製され得、そして感染領域に投与され得、CS4-CFA/Iタンパク質を有する細菌を凝集させ得る。投与は、生物へ接触する組成物の手段を提供する。例えば、組成物は、胃および十二指腸中での破壊から抗体を保護するカプセル中で経口で投与され得る。この組成物は、ETEC E.coli凝集有効量の薬学的組成物を投与することによる、短期の予防、およびETEC E.coli感染の処置の両方のための使用に適している。
ワクチン組成物における使用のために配列番号１または２のコンセンサスペプチドの配列を有する、少なくとも８アミノ酸であるがせいぜい30のアミノ酸の、少なくとも１つのペプチドを含む配列であって、上記ペプチドが以下から選択される配列を有する配列が使用され得る：EKNITVTA(配列番号８)、KNITVTAS(配列番号９)、NITVTASV(配列番号10)、ITVTQSVD(配列番号11)、TASVDPTI(配列番号14)、ASVDPTID(配列番号15)、SVDPTIDL(配列番号16)、VDPTIDLL(配列番号17)、DPTIDLLQ(配列番号18)、PTIDLLQA(配列番号19)、SALPSAVA(配列番号29)、ALPSAVAL(配列番号30)、LPSAVALT(配列番号31)、PSAVALTY(配列番号32)、SAVALTYS(配列番号33)、AVALTYSP(配列番号34)、およびVALTYSPA(配列番号35)、PSAVALTYSP(配列番号36)、TVTASVDPTIDLLQAD(配列番号３)、ならびにASVDPTIDLLQA(配列番号２)。このようなペプチドは、少なくとも16アミノ酸を有することが好ましい。免疫原としての使用のための組成物はまた、当該分野で使用されるアジュバントを含み得る。