(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性肺障害の治療用医薬の製造のためのＡＣＥ２ポリペプチドの使用。
【請求項２】
急性肺障害が、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＡＣＥ２ポリペプチドがヒトＡＣＥ２ポリペプチドである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＡＣＥ２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＡＣＥ２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＣＥ２ポリペプチドの活性を有する、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
薬理学的に許容しうるビヒクルとともに、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＡＣＥ２ポリペプチドを含む、急性肺障害の治療用医薬組成物。
【請求項７】
薬理学的に許容しうるビヒクルとともに、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＣＥ２ポリペプチドの活性を有するＡＣＥ２ポリペプチドを含む、急性肺障害の治療用医薬組成物。
【請求項８】
静注用である請求項６または７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧症、冠状動脈性心疾患、心不全、腎不全、肺浮腫、および中毒性ショックや人工換気などの肺障害を含む、心臓、肺および腎臓の疾患を診断および治療するのに用いる組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
心血管系疾患は２１世紀における健康管理の負担の大きい第一のものであり、２０２０年までに世界中の死亡の最も一般的原因となるであろうことが予測されている。心疾患の主たるリスク因子は高血圧である。高血圧症は、遺伝的因子および環境因子の両者によって制御される多因性の定量的形質である。食事や身体活動などの高血圧に貢献しうる環境因子については多くのことがわかっているが、心血管系疾患への素因となる遺伝的因子についてはあまりわかっていない。動物モデルでの高血圧と関係のある幾つかの推定の遺伝子の定量的形質部位（quantitative trait loci; QTL）の同定にも拘わらず、これらの部位のいずれも遺伝子に翻訳されていない。それゆえ、高血圧症および他の心血管系疾患の基礎となる分子的および遺伝的メカニズムの多くは不明のままである。
【０００３】
血圧のホメオスタシスの一つの重要なレギュレーターはレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）である。プロテアーゼのレニンは、アンジオテンシノーゲンを不活性な十量体ペプチドであるアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）に開裂する。ついで、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用は活性な八量体アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）へのＡｎｇＩの開裂を触媒し、このアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）が血管平滑筋の血管収縮および腎細管でのナトリウムの再吸収を促進することにより高血圧症に貢献しうるのである。ＡＣＥ突然変異体マウスは、突発性の高血圧症、部分的な雄の不妊、および腎臓の奇形を示す。ヒトではＡＣＥ多型は腎機能および心血管機能の決定要因と関係付けられており、ＡＣＥおよびＡｎｇＩＩレセプターの薬理学的な抑制は血圧および腎臓疾患の低下に有効である。さらに、ＡＣＥおよびＡｎｇＩＩレセプターの抑制は心不全にも有利な効果を有する。
【０００４】
最近、ＡＣＥ２と称するＡＣＥのホモログが同定されたが、このものは腎臓および心臓の血管内皮細胞で優先的に発現される。興味深いことには、２つのＡＣＥホモログがハエにも存在する。ＡＣＥとは異なり、ＡＣＥ２はカルボキシペプチダーゼとして機能し、ＡｎｇＩから単一残基を開裂してＡｎｇ１−９を生成し、ＡｎｇＩＩから単一残基を開裂してＡｎｇ１−７を生成する。これらのインビトロでの生化学データは、ＡＣＥ２がＲＡＳをモデュレートすること、それゆえ血圧制御に何らかの役割を果たしているかもしれないことを示唆している。インビボでの心血管系およびＲＡＳにおけるＡＣＥ２の役割はわかっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Actonらは米国特許第６,１９４,５５６号において、ＡＣＥ２関連疾患状態の診断および治療におけるＡＣＥ２の使用を記載している。この特許は、ＡＣＥ２発現レベルが高血圧症で増大していること、およびＡＣＥ２活性のアンタゴニストまたはインヒビターが高くなった血圧または関連する障害の治療に有用であることを述べている。カナダ特許出願第２,３７２,３８７号はＡＣＥ２インヒビターの特定の例を提供しているが、これは高血圧症などの心疾患の治療に有用であることを意図したものである。この文献もＡＣＥ２活性を増大させるのではなく抑制する必要があることを強調している。これら文献はＡＣＥ２活性の抑制の必要性を教示するものであるが、インビトロでの実験データに基づくものにすぎない。それら文献は、ＡＣＥ２を特徴付けるためのノックアウト哺乳動物のデータなどのインビボでのデータを提供していない。これまで高血圧症の治療のための医薬として承認されたＡＣＥ２インヒビターはない。さらに、心血管系およびＲＡＳでのＡＣＥ２のインビボでの役割は殆どわかっていないままである。心臓および腎臓の疾患の治療のための適切な診断試験および医薬をデザインすることができるように、ＡＣＥ２の機能を特徴付ける必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はレニン−アンジオテンシン系の制御のための新たなパラダイムを提供するものであり、インビトロデータ（Actonの特許）に基づく予測とは対照的に、また従来技術では予期しないことに、心臓機能および血圧制御に必要なＲＡＳの重要な負のレギュレーターとしてのＡＣＥ２の全く新規かつ予期しない使用を示す。ＡＣＥ２の活性化は、心臓、肺および腎臓疾患の治療および予防にとって重大である。本発明は、ＡＣＥ２アクチベーターの動物への投与が高血圧症および心臓および腎臓疾患、および肺障害を予防および治療することを初めて示すものである。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明はＲＡＳ系の制御のための新たなパラダイムを提供するものであり、ＡＣＥ２が心臓機能および心血管機能、腎臓機能および肺障害に必要なＲＡＳの重要な負のレギュレーターであることを示すものである。ＡＣＥ２の活性化は、心臓および腎臓の疾患および高血圧症および肺の疾患の治療および予防にとって重大である。本発明は、ＡＣＥ２アクチベーターの動物への投与が心不全および高血圧症、腎臓疾患および肺障害を予防および治療することを初めて教示するものである。
【０００８】
この結果は、心臓疾患を治療するにはＡＣＥ２活性を抑制しなければならないと教示する上記米国特許第６,１９４,５５６号やカナダ特許出願第２,３７２,３８７号などの従来技術の文献からすると全く予期しないものである。それゆえ、ＡＣＥ２の発現および／または活性を活性化することによって心臓疾患が実際に治療されることは驚くべきことである。
【０００９】
本発明は、ＡＣＥ２機能および／またはＡＣＥ２ ｍＲＮＡおよびＡＣＥ２タンパク質発現のアクチベーターを含む（これに限られるものではない）アクチベーター、および該アクチベーターを含む医薬組成物を包含する。本発明はまた、治療を必要とする動物に有効量のアクチベーターを投与することによる、心臓疾患、肺疾患および腎臓疾患の医学的な治療方法をも包含する。肺疾患としては、これらに限られるものではないが、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核および肺癌が挙げられる。
【００１０】
本発明はまた、心臓および腎臓の疾患および高血圧症および肺疾患を治療するのに用いることのできるＡＣＥ２アクチベーターを検出するためのスクリーニングアッセイをも包含する。これらアッセイはインビトロであってもインビボであってもよい。好ましい態様において、本発明は、候補化合物がＡＣＥ２の発現または活性を増大させることができるか否かを評価するための内皮、腎臓、肺または心臓の細胞アッセイを包含する。細胞をＡＣＥ２の発現または活性を活性化する能力について決定しようとする少なくとも１つの化合物の存在下で培養し、ＡＣＥ２発現の増大について細胞を測定する。本発明の他の側面は、ＡＣＥ２の喪失の効果を克服しうる化合物を同定するためのＡＣＥ２ノックアウトマウスに関する。これらのアッセイにおいてポリペプチドおよび小さな有機分子を試験する。本発明は、本発明のスクリーニング法によって同定され、医薬組成物にて動物に投与するのに適した全ての化合物を包含する。
【００１１】
本発明の他の側面は、心臓および／または腎臓の疾患および／または高血圧症および／または肺疾患の発症またはリスクの診断である。このことは、心臓、血清、または腎臓、または他の組織中のＡＣＥ２レベルを測定することによって診断することができる。野生型レベルよりも低いレベルのＡＣＥ２は「ＡＣＥ２低減状態」を示し、これは本発明が心臓および／または腎臓の疾患および／または高血圧症、および／または肺疾患、または疾患のリスクと直接関係することを示すものである。ＡＣＥ２の野生型レベルおよび低減レベルは当業者には明らかであろう。ＡＣＥ２低減状態はまた、以下に記載する多型ＡＣＥ２ａ〜ＡＣＥ２ｍによっても示される。本発明は低減したＡＣＥ２の発現または活性と関連する疾患を治療および診断するのに有用である。診断はまた、場合により、ＡＣＥ２低減状態と関係するＡＣＥ２遺伝子の上流および下流および遺伝子内の多型の分析によっても達成される。本明細書に記載する手段によって多型を識別するヌクレオチドの検出に必要な試薬はすべて、動物から単離したゲノムＤＮＡの分析のための単一のキットにて提供することができる。該キットは、疾患のリスクまたは発症の診断のため、遺伝子型決定および表現型決定を可能とすべくＡＣＥ２の多型を識別する標識プローブを含んでいるであろう。多型特異的なプローブは、唯一つの多型特異的プローブがハイブリダイズして検出することができ、それによって特異的なＡＣＥ２多型を同定できるように、適当に標識し、生成ＤＮＡ切片にアニーリング条件下で加えることができる。
【００１２】
治療法
上記で記載したように、本発明はＡＣＥ２遺伝子発現が高血圧症、心臓および腎臓疾患ではダウンレギュレーションされていることを示した。従って、本発明は、治療または予防を必要とする動物にＡＣＥ２の発現を増大させうる薬剤の有効量を投与することを含む、高血圧症、心臓疾患、肺または腎臓疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１３】
本明細書で使用する「ＡＣＥ２の発現を増大させうる薬剤」なる語は、該薬剤の不在下で同じ種類の細胞でのＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質のレベルまたは活性と比べてＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質のレベルまたは活性を増大させることのできるあらゆる薬剤を意味する。該薬剤はいかなる種類の物質であってもよく、核酸分子（ＡＣＥ２またはその断片を含む）、タンパク質（Ａｃｅ２またはその断片を含む）、ペプチド、炭水化物、小分子、または有機化合物を含むがこれらに限られるものではない。ＡＣＥ２遺伝子が増大したか否かは、ウエスタンブロッティング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫化学、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングおよびインシトゥハイブリダイゼーションを含む公知の方法を用い、当業者により容易に決定することができる。
【００１４】
本明細書で使用する「動物」の語は、動物界のあらゆる成員を含む。動物は好ましくはヒトである。
【００１５】
本明細書で使用する「有効量」なる語は、ＡＣＥ２のレベルを高めるのに必要な投与量および期間で有効な量を意味する。
【００１６】
本明細書において使用する「治療または治療する」の語は、臨床的な結果を含む有利なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有利なまたは所望の臨床結果としては、これらに限られるものではないが、検出しうるか検出しえないかに拘わらず、１またはそれ以上の徴候の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡散の予防、疾患の進行の遅滞、疾患状態の改善または一時的緩和、および緩解（部分的または全体的）が挙げられる。「治療」はまた、治療を施さなかった場合に予想される生存と比べて長引いた生存をも意味する。
【００１７】
ＡＣＥ２核酸分子の投与
一つの態様において、ＡＣＥ２遺伝子の発現がＡＣＥ２遺伝子またはその一部を含む核酸を投与することによって増大する。
【００１８】
他の態様において、ＡＣＥ２遺伝子の発現は、本明細書に開示したスクリーニングアッセイを用いて同定した薬剤を含む、ＡＣＥ２遺伝子発現を増大させる薬剤を投与することによって増大させることができる。
【００１９】
疾患、障害または異常な身体状態を患う動物はＡＣＥ２のアップレギュレーションによって治療することができるので、ＡＣＥ２発現を増大させる遺伝子療法は心臓または腎臓または肺の疾患の発生／進行を緩和するのに有用である。
【００２０】
本発明は、低減したＡＣＥ２発現またはＡＣＥ２ポリペプチドの活性の低減したレベルを特徴とする疾患、障害または異常な身体状態の治療のためのＡＣＥ２遺伝子療法を提供する方法および組成物を包含する。
【００２１】
本発明は、動物の細胞でのＡＣＥ２の発現が該細胞にＡＣＥ２ポリペプチドの生物学的活性または表現型をもたらすように、ＡＣＥ２をコードする核酸分子または機能的に同等の核酸分子を該細胞に提供する方法および組成物を包含する。該細胞にＡＣＥ２ポリペプチドの生物学的活性または表現型がもたらされるように、充分な量の核酸分子を投与し、充分なレベルで発現させる。たとえば、該方法は、好ましくは、ＡＣＥ２をコードするＤＮＡを含むベクターを主体に投与することを含む、心血管または腎臓または肺の疾患を有する動物の細胞にＡＣＥ２をコードする核酸分子を送達する方法を包含する。該方法はまた、ＡＣＥ２をコードするＤＮＡを投与することによって心血管または腎臓または肺の疾患を有する動物に生物学的に活性なＡＣＥ２ポリペプチドをもたらす方法にも関する。該方法は、インビボまたはエクスビボ（たとえば、肺、心臓、内皮または腎臓の幹細胞、先祖細胞（progenitor cells）または他の細胞が移植細胞であってよい）で行うことができる。ＡＣＥ２を単離細胞または動物に投与（遺伝子療法における場合を含む）する方法および組成物は、たとえば、米国特許第５,６７２,３４４号、同第５,６４５,８２９号、同第５,７４１,４８６号、同第５,６５６,４６５号、同第５,５４７,９３２号、同第５,５２９,７７４号、同第５,４３６,１４６号、同第５,３９９,３４６号、同第５,６７０,４８８号、同第５,２４０,８４６号、同第６,３２２,５３６号、同第６,３０６,８３０号および同第６,０７１,８９０号および米国特許出願第２００１００２９０４０号（参照のためのその全体を本明細書中に引用する）に説明されている。
【００２２】
本発明はまた、ＡＣＥ２をコードするＤＮＡを含む遺伝子療法に適したウイルスを産生することによる、組換えウイルスのストックを製造する方法にも関する。この方法は、好ましくは、ウイルス複製（該ウイルスは核酸分子を含む）を許容する細胞をトランスフェクションし、ついで産生したウイルスを回収することを含む。
【００２３】
該方法および組成物はインビボまたはインビトロで用いることができる。本発明はまた組成物（好ましくは遺伝子療法のための医薬組成物）をも包含する。該組成物はＡＣＥ２を含むベクターを含む。担体は、医薬担体またはベクターを含む宿主形質転換体であってよい。当該技術分野で知られたベクターとしては、これらに限られるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター、たとえばワクシニアウイルスベクター、ＨＩＶおよびレンチウイルスベースのベクター、またはプラスミドが挙げられる。本発明はまた、ベクターを製造するのに必要なパッケージングおよびヘルパー細胞株をも包含する。ベクターを製造する方法および該ベクターを用いた遺伝子療法の方法もまた本発明に包含される。
【００２４】
本発明はまた、該ベクターおよび組換えＡＣＥ２核酸分子配列を含む形質転換細胞をも包含する。
【００２５】
ＡＣＥ２突然変異体の使用−ポリペプチド配列の修飾
ＡＣＥ２突然変異体を本発明の方法に用いることができる。化学的に同等かまたは類似のアミノ酸配列という結果となる変化は本発明の範囲に包含される。ＡＣＥ２レセプターに対して配列同一性を有するポリペプチドは、本発明の方法に使用するのに適していることを確認すべく試験される。本発明のポリペプチドの突然変異体は、たとえば突然変異により天然でも存在するし、またはたとえば部位特異的突然変異誘発などのポリペプチド工学法（アミノ酸置換の技術分野でよく知られている）を用いて製造することもできる。たとえば、グリシンなどの疎水性アミノ酸残基を他の疎水性残基、たとえばアラニンで置換することができる。アラニン残基は、ロイシン、バリンまたはイソロイシンなどのさらに疎水性の残基で置換することができる。アスパラギン酸などの負に荷電したアミノ酸はグルタミン酸で置換することができる。リジンなどの正に荷電したアミノ酸はアルギニンなどの他の正に荷電したアミノ酸で置換することができる。
【００２６】
それゆえ、本発明は、アミノ酸配列に保存的な変化または置換を有するポリペプチドを包含する。保存的な置換は、置換されたアミノ酸と同様の化学的性質の１またはそれ以上のアミノ酸を挿入する。本発明は、化合物の活性を損なわない保存的な置換がされている配列を包含する。
【００２７】
１またはそれ以上のｄアミノ酸を含むポリペプチドが本発明に包含される。１またはそれ以上のアミノ酸がＮ末端でアセチル化されているポリペプチドも本発明に包含される。当業者であれば、本発明の対応ポリペプチド化合物と同じかまたは類似の所望の化合物活性を有するが、溶解度、安定性、および／または加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関して該ポリペプチドよりも有利な活性を有するポリペプチドミメチックを構築するのに種々の技術を利用できることを認識するであろう。たとえば、MorganおよびGainor, Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243-252 (1989)を参照。ポリペプチドミメチックの例は米国特許第５,６４３,８７３号に記載されている。ミメチックの製造および使用法を記載した他の特許としては、たとえば、米国特許第５,７８６,３２２号、同第５,７６７,０７５号、同第５,７６３,５７１号、同第５,７５３,２２６号、同第５,６８３,９８３号、同第５,６７７,２８０号、同第５,６７２,５８４号、同第５,６６８,１１０号、同第５,６５４,２７６号、同第５,６４３,８７３号が挙げられる。本発明のポリペプチドのミメチックはまた、当該技術分野で知られた他の方法に従っても製造することができる。たとえば、水素基をヒドロキシやアミノ基などの他の基に変化させることによって側鎖基を化学的に変える薬剤を用いて本発明のポリペプチドを処理することにより行うことができる。ミメチックは、すべてがアミノ酸からなる配列、またはアミノ酸と修飾アミノ酸または他の有機分子とを含むハイブリッドである配列を含んでいるのが好ましい。
【００２８】
本発明はまた、たとえばヌクレオチド配列が第二の配列と組み合わされているハイブリッドおよびポリペプチドをも包含する。
【００２９】
本発明はまた、ＡＣＥ２のポリペプチド断片が活性を保持している場合に化合物に活性を付与するのに用いることのできる該断片の使用方法をも包含する。本発明はまた、ポリペプチドまたはその活性を特徴付けるリサーチツールとして用いることのできる本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドの断片をも包含する。そのようなポリペプチドは少なくとも５つのアミノ酸からなるのが好ましい。好ましい態様において、そのようなポリペプチドは、６〜１０、１１〜１５、１６〜２５、２６〜５０、５１〜７５、７６〜１００または１０１〜２５０または２５０〜５００アミノ酸からなっていてよい。断片は、化合物の配列において１またはそれ以上のアミノ酸、たとえばＣ末端アミノ酸が除去された配列を含んでいてよい。
【００３０】
ＡＣＥ２ポリペプチド活性の促進
ＡＣＥ２の活性は、選択的な部位特異的突然変異誘発を行うことにより増大または低減する。Pharmacia BiotechからのＵ.Ｓ.Ｅ.（Unique site elimination）突然変異誘発キットまたは市販の他の突然変異誘発キットを用い、またはＰＣＲを用い、該核酸分子または配列同一性を有する核酸分子を含むＤＮＡプラスミドまたは発現ベクターをこれら研究に用いるのが好ましい。突然変異が生成されＤＮＡ配列分析によって確認されたら、突然変異体ポリペプチドを発現系を用いて発現させ、その活性をモニターする。
【００３１】
本発明はまた、ヒトまたはマウスＡＣＥ２（またはその部分配列）に対して少なくとも約２０＞％、＞２５％、＞２８％、＞３０％、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％または＞９０％、さらに好ましくは少なくとも約＞９５％、＞９９％または＞９９.５％の配列同一性を有するポリペプチドの使用法をも包含する。修飾したポリペプチド分子は以下で検討する。好ましくは約１、２、３、４、５、６〜１０、１０〜２５、２６〜５０または５１〜１００または１０１〜２５０のヌクレオチドまたはアミノ酸が修飾される。
【００３２】
同一性は当該技術分野で知られた方法に従って計算する。配列同一性は、BLAST version 2.1プログラムアドバンストサーチ（上記のパラメーター）により評価するのが最も好ましい。BLASTは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTでオンラインで利用できる一連のプログラムである。アドバンストBLASTサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=1）はデフォルトでパラメーターを選択するようにセッティングされている。（すなわち、Matrix BLOSUM62; Gap existence cost 11; Per residue gap cost 1; Lambda ratio 0.85 default）。
【００３３】
BLASTサーチに関する参照文献は以下のとおりである：Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993)"Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7: 649-656。
【００３４】
好ましくは約１、２、３、４、５、６〜１０、１０〜２５、２６〜５０または５１〜１００または１０１〜２５０のヌクレオチドまたはアミノ酸が修飾される。本発明は、活性の付与に関与しないポリペプチドの部分でのアミノ酸変化か、またはポリペプチドの活性を増大または低減させるべく活性の付与に関与するポリペプチドの部分でのアミノ酸変化を引き起こす突然変異を有するポリペプチドを包含する。
【００３５】
ＡＣＥ２アクチベーターのスクリーニング
ＡＣＥ２の発現または活性を増大させるか否かを決定すべく小さな有機分子をスクリーニングする。ＡＣＥ２のポリペプチド断片並びにＡＣＥ２との配列同一性を有するポリペプチドもまた、インビトロアッセイおよび細胞株でのインビボでＡＣＥ２活性を増大させるか否かを決定すべく試験する。アクチベーターは、ＡＣＥ２の特異的ドメインに向けられてＡＣＥ２活性化を増大させるのが好ましい。特異性を達成するため、アクチベーターはＡＣＥ２の独特の配列を標的とすべきである。
【００３６】
本発明はまた、ＡＣＥ２発現を増大させる物質の単離をも包含する。とりわけ、ＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質に結合することのできるリガンドまたは物質を単離することができる。生物学的試料および市販のライブラリーを、ＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質に結合するタンパク質などの物質について試験することができる。たとえば、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸配列を用いてペプチドライブラリーをプロービングすることができ、一方、ＡＣＥ２をコードする核酸配列を用いて核酸ライブラリーをプロービングすることができる。さらに、ＡＣＥ２に対して調製した抗体を用いてＡＣＥ２への親和性を有する他のペプチドを単離することができる。たとえば、標識抗体を用いてファージディスプレイライブラリーまたは生物学的試料をプロービングすることができる。
【００３７】
ある物質とＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質との複合体の生成を可能にする条件は、該物質およびＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質の性質および量などの因子を考慮したうえで選択することができる。物質−タンパク質または物質−遺伝子複合体、遊離の物質または複合体を生成していない物質の単離は、通常の単離法、たとえば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、分画、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはそれらの組み合わせにより行うことができる。成分のアッセイを容易にするため、ＡＣＥ２または該物質に対する抗体、または標識タンパク質、または標識物質を用いることができる。抗体、タンパク質、または物質は、以下に記載する検出可能な物質を用い、適切に標識することができる。
【００３８】
潜在的な結合パートナーが単離されたら、ＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質に結合する物質がＡＣＥ２発現を促進させるための本発明の方法において有用であるか否か、従って疾患の治療に有用であるか否かを決定するため、スクリーニング法をデザインすることができる。
【００３９】
それゆえ、本発明は、ＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質に結合することのできる物質を同定するための方法をも提供する。とりわけ、該方法は、ＡＣＥ２に結合することができ、ＡＣＥ２の発現を増大または促進することのできる物質を同定するのに用いることができる。従って、本発明は、ＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質に結合する物質の同定方法であって、下記工程：
（ａ）好ましくは固定化したＡＣＥ２遺伝子またはタンパク質を被験物質と複合体の生成を可能とする条件下で反応させ、ついで
（ｂ）複合体、遊離の物質、および複合体を生成していない遺伝子またはタンパク質についてアッセイする
を含む方法を提供する。
【００４０】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するいかなるアッセイ系または試験方法をも用いることができ、これには同時免疫沈降（co-immunoprecipitation）、架橋および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製（co-purification）が含まれる。さらに、Ｘ線結晶解析法を物質および分子との相互作用を評価する手段として用いることができる。たとえば、本発明の複合体中の精製した組換え分子は、適当な形状に結晶化させたときにＸ線結晶解析による分子内相互作用の検出に供することができる。分光法もまた相互作用の検出に用いることができ、とりわけＱ−ＴＯＦ装置を用いることができる。生物学的試料および市販のライブラリーをＡＣＥ２結合性ペプチドについて試験することができる。さらに、ＡＣＥ２に対して調製した抗体を用いてＡＣＥ２結合親和性を有する他のペプチドを単離することができる。たとえば、標識抗体を用いてファージディスプレイライブラリーまたは生物学的試料をプロービングすることができる。この観点から生物学的発現系を用いてペプチドを開発することができる。これら系の使用は、ランダムペプチド配列の大きなライブラリーの作製および特定のタンパク質に結合するペプチド配列についてのこれらライブラリーのスクリーニングを可能にする。ライブラリーの作製は、ランダムなペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適当な発現ベクター中にクローニングすることにより行うことができる（Christianら、1992, J. Mol. Biol. 227: 711; Devlinら、1990 Science 249: 404; Cwirlaら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378を参照）。ライブラリーはまた重複するペプチドの同時合成によっても構築することができる（米国特許第４,７０８,８７１号を参照）。アクチベーターを高血圧症、心臓または腎臓疾患の動物モデルで試験する。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、ＡＣＥ２発現または活性を活性化する能力について決定しようとする少なくとも１の化合物の存在下で細胞（好ましくは腎臓または心臓細胞）を培養し、その後、ＡＣＥ２発現および／または活性のレベルの増大について該細胞をモニターすることにより、ある候補化合物がＡＣＥ２発現または活性を増大させることができるか否かを評価するアッセイを包含する。増大したＡＣＥ２発現および／または活性は、該候補化合物が心臓または腎臓疾患または高血圧症の治療に有用であることを示している。
【００４２】
同様のスクリーニングアッセイを心臓疾患または腎臓疾患の罹患傾向のある当該技術分野で知られた哺乳動物で行うことができる。候補化合物を該哺乳動物に投与し、ＡＣＥ２発現および／または活性を測定する。増大したＡＣＥ２発現および／または活性は、該候補化合物が心臓および／または腎臓疾患の治療に有用であることを示している。
【００４３】
ある候補化合物がＡＣＥ２の活性を増大させる（そして心血管疾患および／または腎臓疾患および／または肺、および／または高血圧症を治療するのに有用である）か否かを決定する方法はまた、下記工程：
（ａ）（i）ＡＣＥ２、ＡＣＥ２の断片または両者のいずれかの誘導体を（ii）ＡＣＥ２基質と、候補化合物の存在下で接触させ、ついで
（ｂ）該基質でのＡＣＥ２活性が増大され、それによって該化合物がＡＣＥ２の活性を増大させることを示すか否かを決定する
をも含んでいてよい。増大したＡＣＥ２活性は、該化合物が本明細書に列記した心臓疾患または腎臓疾患または高血圧症の治療に有用であることを示している。ＡＣＥ２活性の増大の決定は、該化合物がＡＣＥ２のタンパク質分解活性を増大させる（基質の加水分解を増大させる）か否かを決定することを含むのが好ましい。本発明の一つの態様において、本発明のアッセイは、候補化合物がナトリウム−ハロゲン塩またはカリウム−ハロゲン塩ではないことおよびアッセイがイオン濃度の増大がＡＣＥ２タンパク質加水分解に及ぼす影響を測定することに向けられないこと、を条件とする。ＡＣＥ２基質としては、ＡｎｇＩ、ＡｎｇＩＩ、ｄｅｓ−Ａｎｇ、ＡｎｇＩＩ、アペリン−１３、ダイノルフィン１３、ベータ−カソモルフィンおよびニューロテンシンが挙げられる。
【００４４】
ＡＣＥ２の製造法はＣＡ２,３７２,３８７号に記載されている。ＡＣＥ２活性化のインビトロアッセイの一例は、Vickersら、Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. J. Biol. Chem. 2002, 277(17): 14838に示されている。他のアッセイ（並びに上記アッセイの改変したもの）は、本明細書の記載および米国特許第５,８５１,７８８号、同第５,７３６,３３７号および同第５,７６７,０７５号（その全体を参照のため本明細書中に引用する）などに記載された技術から明らかであろう。
【００４５】
ノックアウト哺乳動物
マウスＡＣＥ２のクローニングおよびＡＣＥ２ノックアウトマウスの生成の実際の例は下記実施例に記載してある。「ノックアウト」なる語は、哺乳動物の単一の細胞、選択した細胞、またはすべての細胞のＡＣＥ２遺伝子によってコードされたポリペプチドの少なくとも一部の発現の部分的または完全な低減をいう。該哺乳動物は、内生遺伝子の一方の対立遺伝子が破壊され他方の対立遺伝子がなお存在している「へテロ接合性ノックアウト」であってよい。Ｘ染色体上のＡＣＥ２において、雌はへテロ接合性であってよい。雄では唯一つの対立遺伝子があるのみであり、雄はホモ接合性である。あるいは、該哺乳動物は、内生遺伝子の両対立遺伝子が破壊された「ホモ接合性ノックアウト」であってよい。
【００４６】
「ノックアウト構築物」とは、哺乳動物の１またはそれ以上の細胞において内生遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現を低減または抑制すべくデザインしたヌクレオチド配列をいう。ノックアウト構築物として用いるヌクレオチド配列は、典型的に、（１）抑制されるべき内生遺伝子のある部分（１またはそれ以上のエクソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）からのＤＮＡ、および（２）細胞中のノックアウト構築物の存在を検出するのに用いるマーカー配列からなる。ノックアウト構築物を、ノックアウトしようとする内生遺伝子を含む細胞に挿入する。ついで、ノックアウト構築物は内生ＡＣＥ２遺伝子の一方または両方の対立遺伝子内に組み込まれ、そのようなＡＣＥ２ノックアウト構築物の組み込みは完全長の内生ＡＣＥ２遺伝子の転写を妨害または中断させることができる。細胞の染色体ＤＮＡ中へのＡＣＥ２ノックアウト構築物の組み込みは、典型的には相同的組換えによって達成される（すなわち、ノックアウト構築物を細胞中に挿入したときに、内生のＡＣＥ２ ＤＮＡ配列に相同なまたは相補的なＡＣＥ２ノックアウト構築物の領域が互いにハイブリダイズすることができる；ついで、これら領域はノックアウト構築物が内生ＤＮＡの対応位置に組み込まれるように組換えられる）。
【００４７】
典型的には、ノックアウト構築物は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と称する未分化の細胞に挿入する。ＥＳ細胞は、通常、以下で検討するように、それを導入することのできる発生胚と同じ種の胚または胚盤胞からのものである。
【００４８】
「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「発現の抑制」および「遺伝子抑制」は、細胞での完全長ＡＣＥ２分子の発現を低減または妨害するための、内生ＡＣＥ２遺伝子のコード領域（通常、１またはそれ以上のエクソンを含む）および／または該遺伝子のプロモーター領域の相同領域へのＡＣＥ２ヌクレオチド配列ノックアウト構築物の挿入をいう。挿入は、通常、相同的組換えによって行われる。例として、抗生物質耐性遺伝子を含むヌクレオチド配列を、破壊すべきＡＣＥ２をコードする単離ヌクレオチド配列の一部に挿入することによってヌクレオチド配列ノックアウト構築物を調製することができる。ついで、このノックアウト構築物が胚性幹細胞（「ＥＳ細胞」）に挿入されたら、該構築物は少なくとも１のＡＣＥ２対立遺伝子のゲノムＤＮＡ中に組み込まれることができる。かくして、ＡＣＥ２の内生コード領域の少なくとも一部が今や抗生物質耐性遺伝子によって破壊されているので、該細胞の多くの子孫は少なくとも幾つかの細胞においてもはやＡＣＥ２を発現しないか、または低減したレベルで、および／または末端切断された形態でＡＣＥ２を発現するであろう。
【００４９】
「マーカー配列」とは、（１）ＡＣＥ２の発現を破壊するためのより大きなヌクレオチド配列構築物（すなわち、「ノックアウト構築物」）の一部として用いられ、（２）染色体ＤＮＡ中にＡＣＥ２ノックアウト構築物が組み込まれた細胞を同定する手段として用いられる、ヌクレオチド配列をいう。マーカー配列はこれら目的を達成できる限りいかなる配列であってもよいが、典型的には抗生物質耐性遺伝子や天然では細胞中に認められないアッセイしうる酵素などの細胞に検出可能な特性を付与するタンパク質をコードする配列であろう。マーカー配列はまた、典型的に、その配列を制御する同種または異種のプロモーターをも含んでいるであろう。
【００５０】
本発明の範囲には、一方または両方のＡＣＥ２対立遺伝子、並びに他の遺伝子の一方または両方の対立遺伝子がノックアウトされた哺乳動物が包含される。そのような哺乳動物は、ＡＣＥ２ノックアウト哺乳動物を生成するための本明細書に記載した手順を繰り返すが他の遺伝子を用いることにより、またはＡＣＥ２の一方または両方の対立遺伝子をノックアウトした哺乳動物と、第二の遺伝子の一方または両方の対立遺伝子をノックアウトした哺乳動物との２つの哺乳動物を互いに飼育し、二重のノックアウト遺伝子型（二重のへテロ接合性または二重のホモ接合性ノックアウト遺伝子型、またはそれらの突然変異体）を有する子孫をスクリーニングすることによって得ることができる。
【００５１】
他のノックアウト動物および細胞も同様の方法を用いて作製することができる。
【００５２】
医薬組成物
ＡＣＥ２発現および活性のアクチベーターは、医薬組成物において担体などの他の成分と組み合わせるのが好ましい。これら組成物は、動物、好ましくはヒトに、心臓疾患、腎臓疾患または高血圧症を予防または治療するために可溶性の形態で投与することができる。心臓疾患としては、慢性心不全、左心室肥大、急性心不全、心筋梗塞、および心筋症が挙げられる。腎臓疾患としては腎不全が挙げられる。ＡＣＥ２アクチベーターは、血圧および動脈の高血圧を制御するのに有用である。正常血圧は、８５ｍｍＨｇ未満の拡張血圧を有する。高い正常血圧は、８５〜８９ｍｍＨｇの拡張血圧を有する。穏やかな高血圧症は９０〜１０４ｍｍＨｇの拡張血圧に対応する。中程度の高血圧症は１０５〜１１４ｍｍＨｇの拡張血圧に対応する。重篤な高血圧症は１１５ｍｍＨｇよりも高い拡張血圧を有する。異常な血圧はまた、収縮血圧からも決定される（拡張血圧が９０ｍｍＨｇ未満である場合に）。正常血圧は、１４０ｍｍＨｇ未満の収縮血圧を有する。境界領域の収縮性高血圧症は、１４０〜１５９ｍｍＨｇの収縮血圧を示す。散発的な（isolated）収縮性高血圧症は１６０ｍｍＨｇよりも高い収縮血圧を有する（Cecil: Essentials of Medicine、第３版、Andreoliら、W.B. Saunders Company (1993)）。高血圧症は、年齢１８歳以上の成人において、少なくとも２回の来診で２回またはそれ以上の血圧の測定の平均値が９０ｍｍＨｇよりも高い拡張血圧または１４０ｍｍＨｇの収縮血圧であるときに診断される。子供や妊婦はより低い血圧を有するので、１２０／８０（すなわち、１２０ｍｍＨｇの収縮血圧／８０ｍｍＨｇの拡張血圧）を超える血圧は高血圧症であることを示す。
【００５３】
医薬組成物はヒトまたは動物に、局所投与、経口投与、エアゾル投与、気管内点滴注入、腹腔内注射、および静注を含む（これらに限られるものではない）種々の方法により投与することができる。投与すべき投与量は、患者の必要性、所望とする効果および選択した投与経路による。ポリペプチドはリポソームなどの（これに限られるものではない）インビボ送達ビヒクルを用いて細胞に導入することができる。
【００５４】
医薬組成物は、有効量の核酸分子またはポリペプチドが薬理学的に許容しうるビヒクルと混合物中で組み合わされるように、患者に投与することのできる薬理学的に許容しうる組成物の調製のための公知の方法により調製することができる。適当なビヒクルは、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，イーストン、ペンシルベニア、米国）に記載されている。
【００５５】
この観点から、医薬組成物は核酸分子やポリペプチドなどの活性化合物または物質を１またはそれ以上の薬理学的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤とともに含んでいてよく、適当なｐＨおよび生理学的流体と等張な緩衝溶液中に含まれていてよい。活性分子をビヒクルと組み合わせる方法または活性分子を希釈剤と組み合わせる方法は当業者によく知られている。医薬組成物は活性化合物を組織内の特定の部位に輸送するための標的剤を含んでいてよい。
【００５６】
ＡＣＥ２の異種過剰発現
発現ベクターは高レベルのＡＣＥ２発現をもたらすのに有用である。本発明の核酸分子で形質転換した細胞培養液は、とりわけＡＣＥ２低減状態の研究のためのリサーチツールとして有用である。本発明は、ＡＣＥ２を通常生産している心臓細胞および腎臓細胞好ましくは内皮細胞に選択的なベクターを包含する。本発明はまた、これらベクターを含むトランスフェクションした細胞をも包含する。心臓細胞および腎臓細胞のためのベクターの例は、たとえば、Rosengartら、米国特許第６,３２２,５３６号；Marchら、米国特許第６,２２４,５８４号；Hammondら、米国特許第６,１７４,８７１号；Wolfgang-M. Franzら、Analysis of tissue-specific gene delivery by recombinant adenoviruses containing cardiac-specific promoters. Cardiovascular Research 35(1997) 560-566；Rothmann T.ら、Heart muscle-specific gene expression using replication defective recombinant adnovirus. Gene Ther. 1996 Oct. 3(10): 919-26；Phillips MI.ら、Vigilant vector: heart-specific promoter in an adeno-associated virus vector for cardioprotection. Hypertension 2002, Feb. 39(2Pt2): 651-5；Herold BCら、Herpes simplex virus as a model vector system for gene therapy in renal disease. Kidney Int. 2002 Jan. 61 Suppl. 1: 3-8；Figlin RAら、Technology evaluation: interleukin-2 gene therapy for the treatment of renal cell carcinoma. Curr. Opin. Mol. Ther. 1999 Apr. 1(2): 271-8；Varda-Bloom N.ら、Tissue-specific gene therapy directed to tumor angiogenesis. Gene Ther. 2001 Jun. 8(11): 819-27；Scott-Taylor TH.ら、Adenovirus facilitated infection of human cells with ecotropic retrovirus. Gene Ther. 1998 May, 5(5): 621-9；Langer JC.ら、Adeno-associated virus gene transfer into renal cells: potential for in vivo gene delivery. Exp. Nephrol. 1998 May-Jun, 6(3): 189-94；Lien YH.ら、Gene therapy for renal diseases. Kideny Int. Suppl. 1997 Oct. 61: S85-8；およびOhno K.ら、Cell-specific targeting of Sindbis virus vectors displaying IgG-binding domains of protein A. Nat. Biotechnol. 1997 Aug. 15(8): 763-7に記載されている。
【００５７】
細胞培養、好ましくは心臓および腎臓細胞培養および内皮細胞培養を、当該技術分野で知られた多くの方法に従って過剰発現および研究に用いる。たとえば、細胞株（不死化した細胞培養かまたは初代細胞培養のいずれか）をＡＣＥ２核酸分子（または配列同一性を有する分子）を含むベクターでトランスフェクションして核酸分子の発現および核酸分子およびポリペプチドの活性のレベルを測定する。これら細胞はまた、該ポリペプチドに結合し活性化する化合物を同定するのにも有用である。
【００５８】
ＡＣＥ２活性および／または発現を測定する診断キット
ＡＣＥ２発現または活性の測定はまた、（i）心臓または腎臓の疾患、肺疾患および／または高血圧症の診断、（ii）そのような疾患の発症前の疾患を発症するリスクにある患者の同定、（iii）冠状動脈疾患、慢性心不全などの心臓疾患、または腎臓疾患および／または高血圧症および／または肺障害を有する患者での治療応答の測定、および（iv）そのようなリスクにある患者での介入的疾患予防戦略の成功の測定、にも用いる。本発明は、下記工程：（ａ）動物から回収した検体から心臓または腎臓または肺の試料を調製し、（ｂ）該試料中のＡＣＥ２の存在について試験し、ついで（ｃ）試料中のＡＣＥ２の存在またはレベルを動物での心臓または腎臓または肺疾患などの疾患の存在（またはリスク）と相関させることを含む、動物でのＡＣＥ２のレベルを評価する方法を包含する。正常未満のＡＣＥ２レベルまたは低いＡＣＥ２活性は疾患の存在またはリスクを示す。
【００５９】
ＡＣＥ２単一ヌクレオチド多型に基づく診断キット
本発明はまた、低減したヒトＡＣＥ２発現がＡＣＥ２遺伝子発現を制御する多型の結果であることをも示す。ラットでのＱＴＬマッピングは、低減したＡＣＥ２のレベルと高血圧症および心血管疾患および腎臓疾患との間に１００％の相関関係があることを示している。以下に記載する多型のいずれもＡＣＥ２コード領域には見出されていない。すべてＡＣＥ２コード領域の上流または下流に存在する。これら多型あるいは心血管疾患、腎臓疾患、肺疾患および高血圧症におけるこれら多型の役割はこれまで知られていなかった。特定のＳＮＰハプロタイプは疾患のリスクの増大と関係している。このハプロタイプは、疾患のリスクの評価のため、および適当な医療処置の決定のために重要な診断ツールである。
【００６０】
これら多型は以下のとおりである：
【表１】
0004598518.tif 000002
【表２】
0004598518.tif 000003
【００６１】
上記および図１１に記載したＡＣＥ２遺伝子発現を制御する多型のヌクレオチド番号は、当業者が容易に決定することができる。
【００６２】
図表は、該図表中の３つの各集団（アフリカ系アメリカ人、カフカス人、アジア人）で参照塩基が見出されるパーセントを示す。たとえば、ＳＮＰ ｒｓ２３３５７４では予測されたＳＮＰはＣ／Ｔであり、参照ピークはＣである。この場合、アフリカ系アメリカ人の対立遺伝子頻度は８０％Ｃ；アジア人の対立遺伝子頻度は１００％Ｃ（換言すると、単一形態のマーカー）；およびカフカス人の対立遺伝子頻度は６０％Ｃである。
【００６３】
本発明は、動物の遺伝子型の決定、すなわち、あるヒトがこれら多型の一つまたは他方についてホモ接合性であるかあるいはこれら多型についてへテロ接合性であるか否か、敷衍すればあるヒトの表現型の決定に用いることのできるポリヌクレオチドプローブを提供する。表現型は、そのヒトの細胞でのＡＣＥ２発現の量を示す。さらに、本発明は、そのような遺伝子型および表現型の決定にそのようなポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られた方法（たとえば、米国特許第５,７９２,８５１号および同第５,８５１,７８８号を参照）に従って核酸分子を検出するためのプローブとして用いることができる。
【００６４】
たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、その末端をジゴキシゲニン−１１−デオキシウリジン三リン酸を用いて標識することによりプローブに変換することができる。そのようなプローブは、アルカリホスファターゼをコンジュゲートしたポリクローナルヒツジ抗ジゴキシゲニンＦ（ａｂ）フラグメントおよびニトロブルーテトラゾリウムを発色性基質としての５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸とともに用いて免疫学的に検出することができる。
【００６５】
それゆえ、本発明の一つの側面によれば、ＡＣＥの上流または下流配列の一部に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが提供される。プローブは、特定の多型を識別するため、一つのＡＣＥ２多型にはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが他の多型にはハイブリダイズしないようにデザインすることができる。
【００６６】
本発明の多型特異的なポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、たとえば、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含んでいてよい。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは自動合成により合成することができ、約１０〜３０塩基を含んでいるのが好ましいが、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションアッセイの技術分野で理解されるように、標的との潜在的なミスマッチが生じるプローブ内での位置、プローブ上の標識がハイブリダイゼーションを妨害する程度、およびプローブと標的とのハイブリダイゼーションを行う物理的条件（たとえば、温度、ｐＨ、イオン強度）に依存して、わずか８のヌクレオチドも約５０もの多くのヌクレオチドも有用でありうる。常法に従えば、本発明によるポリヌクレオチドプローブのデザインは、ハイブリダイゼーション条件（温度、イオン強度、暴露時間）に適合させるが多型特異性は確保すべくプローブの長さを調節することを含むのが好ましい。
【００６７】
本発明の他の側面によれば、下記：
（ａ）ＡＣＥ２の５’または３’領域の少なくとも一部を含む核酸を増幅させる手段、ここで該一部はＡＣＥ２ａ〜ＡＣＥ２ｍの一つに対応するヌクレオチドを含む、および
（ｂ）一つのＡＣＥ２多型を他の多型から識別する本発明のポリヌクレオチドプローブ
を含む遺伝子型決定のための試験キットが提供される。
【００６８】
「増幅させる手段」は、当業者であれば容易に理解できるように、使用した増幅法に依存する。それゆえ、これら手段は、もしも増幅がＰＣＲ法によって行われるのであれば、適当なプライマー、適当なＤＮＡポリメラーゼ、および４種の２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）を含んでいてよい。他の例を挙げると、増幅を３ＳＲ法などの転写に基づく方法によって行うのであれば、これら手段は、２つのプライマー（そのうち少なくとも一方は二本鎖となったときにプロモーターを提供する）、該プロモーターから転写することのできるＲＮＡポリメラーゼ、プライマーにより開始されＤＮＡ指向（DNA-directed）およびＲＮＡ指向（RNA-directed）のＤＮＡ重合において、およびおそらくＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからＤＮＡ鎖を遊離させるＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ分解において機能する逆転写酵素、４種のリボヌクレオシド三リン酸（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）、および４種の２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含んでいるであろう。他の例として、増幅をＬＣＲにより行うのであれば、これら手段は、２つのオリゴヌクレオチド、および標的（該標的にはこれら両オリゴヌクレオチドがライゲート可能な方向にて互いに隣接してハイブリダイズすることができる）が存在する場合にこれら２つのオリゴヌクレオチドを連結する適当なＤＮＡリガーゼを含んでいるであろう。
【００６９】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは標識するのが好ましいであろう。標的は、そのようなプローブの技術分野で利用できる種々の標識のいずれであってもよく、３２Ｐ；３５Ｓ；ビオチン（これにアビジンと結合したまたは複合体を形成したシグナル生成残基を複合させることができる）；蛍光残基；アルカリホスファターゼ（発色性反応を触媒することができる）などの酵素；上記に記載したジゴキシゲニンなどが含まれるが、これらに限られるものではない。
【００７０】
ＲＦＬＰ分析、電気泳動ＳＳＣＰ分析またはシークエンシング分析もまたＡＣＥ２多型の検出に用いることができる。
【００７１】
本発明の他の側面によれば、動物に由来するＡＣＥ２核酸中のＡＣＥ２多型特異的な標的配列の遺伝子型を決定する（typing）方法であって、下記工程：
（ａ）心臓または腎臓からのＤＮＡに適用した標的核酸増幅法により、ＡＣＥ２の上流または下流領域の部分配列（subsequence）（または部分配列の相補鎖）である配列を有するアッセイ可能な量の増幅した核酸を得、ここで該部分配列はＡＣＥ２多型が存在するかもしれないヌクレオチドを含んでおり、ついで
（ｂ）工程（ａ）で得た増幅核酸を分析して（たとえば、本発明によるポリヌクレオチドプローブを用いた核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにて）多型の位置にある１またはそれ以上の塩基を決定する
を含む方法もまた提供される。
【００７２】
本発明の遺伝子型決定法の一つの応用において、これら方法は、ある個体に適用して該個体が心臓または腎臓疾患を発症するリスクにあるか否かを決定する。
【００７３】
冠状動脈疾患を有しおよび／またはその後のバイパス手術を受けた患者は心臓の低酸素症を有する。それはまた、心性気絶（cardiac stunning）または心性冬眠（cardiac hibernation）としても知られる。これら患者では心臓の構造上の変化は殆どみられないが心臓の機能は低下している。構造上の変化なしに心臓の機能が変化することは非常にまれなことである。心性気絶または低酸素症のマウスモデルでは、動物はＡＣＥ２マウスの表現型と正確に似通った表現型を有する。さらに、本発明者らは低酸素症のマーカーがＡＣＥ２欠失マウスで誘発されることを示した。総合すると、本発明者らのデータは、これらマウスが慢性低酸素症のために心臓機能が低下しており、それゆえ冠状動脈疾患のモデルであることを示している。それゆえ、ヒトにおいてこの状態を診断するため、多型および／または低減したＡＣＥ２発現または活性を用いることができる。他の例は、拡張型心筋症を有する患者の心臓の機能が該疾患の発症がＡＣＥ２多型と関係することを示すか否かを試験することである。ＡＣＥ２発現および活性の増大を該状態を治療するために用いることができる。
【００７４】
ＲＡＳの負のレギュレーターとしてのＡＣＥ２の特徴付け
ＡＣＥ２は高血圧の３つのラットモデルにおいて高血圧症と関係するＱＴＬにマッピングされ、ＡＣＥ２レベルはこれら高血圧症ラット株のすべてにおいて低減される。マウスでは相同的組換えを用いたＡＣＥ２の遺伝子不活化は、組織中のＡｎｇＩＩペプチドレベルの増大、心臓での低酸素症遺伝子のアップレギュレーション、および重篤な心臓の機能不全という結果となる。
【００７５】
ａｃｅ２欠失背景でのＡＣＥ発現の除去（ablation）は、ａｃｅ２単一ノックアウトマウスの心不全表現型を完全に排除した。これらデータはＲＡＳの制御のための新たなパラダイムを提供するものであり、ＡＣＥ２を心臓機能を制御するＲＡＳの負のレギュレーターとして同定するものである。
【００７６】
ＡＣＥ２および血圧の制御
大抵の心血管疾患は、遺伝的因子および環境因子の両者によって制御される多因性の定量的形質である。心血管疾患の一つの主たる因子はＲＡＳである。遍在的に発現されるＡＣＥとは対照的に、最近同定されたＡＣＥ２は組織特異的な発現を示す。ＡＣＥ２は、そのＡｎｇＩ基質に対してＡＣＥと競合することにより、および／またはＡｎｇＩＩを開裂してＡｎｇ１−７を生成することにより、内生のＡｎｇＩＩレベルを制御している。本発明の前には心血管系におけるＡＣＥ２のインビボの役割については何も知られていなかった。ＡＣＥ２はＡｎｇＩＩの内生レベルを制御している。ＡＣＥ２はまたＲＡＳの負のレギュレーターとしても機能している。
【００７７】
自発的なまたは食餌により誘発した高血圧症および心血管疾患を発症している３つの異なるラット株において、ＡＣＥ２はＸ染色体上の定められたＱＴＬ内にマッピングされる。これら高血圧症に対して罹患性のラット株のすべてにおいて、ＡＣＥ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルはダウンレギュレーションされていた。SabraラットでのＱＴＬ分析において同定されたＳＳ−Ｘ遺伝子座はまた、塩負荷（salt loading）に対して耐性を付与する遺伝子座としても同定された。塩感受性株におけるＡＣＥ２の低減および耐性株におけるその発現の変化がないことは、ＡＣＥ２が食餌誘発による血圧の変化に対して耐性を付与することを示している。
【００７８】
その地図上の位置および低減した発現は、ＡＣＥ２がＸ染色体上の高血圧性ＱＴＬに寄与する遺伝子であることを示している。さらに、ａｃｅ２ヌルマウスにおけるＡｎｇＩおよびＡｎｇＩＩの増大した発現は、ＡＣＥ２がインビボでのＲＡＳ系のレギュレーターであることを確認している。しかしながら、本発明者らのマウスでのＡＣＥ２の喪失は、ＡＣＥ機能を阻止した場合でも血圧の直接的な変化という結果とはならなかった。血圧の変化は、老齢の雄マウスに極度の心臓機能不全が存在する場合にみ生じた。高血圧症に寄与する遺伝的因子は、それ自体では血圧を変化させることはない。むしろ、これらＱＴＬは、それが他の遺伝的多型と協調して血圧の変化を促進するような血圧の単一の決定因子を定めるものである。本発明者らはヒトの集団においてＡＣＥ２多型と高血圧との関係を同定した。重要なことには、本発明者らのデータはＡＣＥ２が高くなった血圧の負のレギュレーターとして機能することを示している。
【００７９】
ＡＣＥ２および心臓機能の制御
予期しないことに、マウスでのＡＣＥ２の喪失は、老齢マウスにおいて全身血圧の重篤な低下に導く重度の収縮機能不全という結果となる。重要なことに、この心臓機能不全はＡＣＥの破壊によって完全に元に戻り、ＡＣＥの触媒産物がＡＣＥ２の不在下での収縮障害を駆動することが示唆される。これら収縮性欠陥は肥大または血圧の検出しうる変化の不在下でも生じうるので、本発明者らのデータはまた、ＲＡＳ制御された心臓疾患表現型が血圧および心臓肥大に対するその影響とは遺伝的に切り離しうるという遺伝的な証拠をも提供するものである。
【００８０】
ＡＣＥ阻害剤およびＡｎｇＩＩレセプターブロッカーはヒトの心不全において心臓保護の役割を有することが示されており、それゆえＡｎｇＩＩは心臓疾患に関与している。本発明者らのａｃｅ／ａｃｅ２二重突然変異マウスでの心臓機能不全の完全な排除は、ＲＡＳが心臓機能を直接制御していること、およびＡＣＥ２はＲＡＳおよび心不全と拮抗する重要な負のレギュレーターであることを示している。本発明者らの遺伝的救済実験は、心不全を駆動するのは実際にＡＣＥの産物であること、すなわちａｃｅ２ヌルマウスの心臓で認められるＡｎｇＩＩの増大が心臓機能不全の原因であることを強く示している。ＡｎｇＩＩレセプターの薬理学的な抑制がａｃｅ２突然変異体マウスの心臓表現型を救済するのか否かは決定する必要がある。興味深いことに、ハエにおける本発明者らの結果は、ＡＣＥホモログであるＡＣＥＲと関連したＰ因子突然変異が心臓形態形成の重篤かつ致死的な欠陥という結果となる（データは示していない）ことを示しており、これは心臓でのＡＣＥ／ＡＣＥ２機能が進化の過程で保存されてきたことを示している。
【００８１】
ａｃｅ２突然変異体心臓での欠陥は、重篤な収縮性機能不全および低酸素症により制御された遺伝子のアップレギュレーション（老齢マウスではわずかなリモデリングのみ）、肥大がないこと、筋細胞喪失の徴候のないことを特徴とする。これらのａｃｅ２突然変異体マウスでの機能障害の（failing）心臓の表現型および分子パラメーターは、肥大および拡張性心筋炎とは異なるものである。むしろ、興味をそそられることには、ａｃｅ２突然変異体心臓は、ヒトの冠状動脈疾患の症例およびバイパス手術の症例で認められる心性気絶および冬眠に似ている。これらヒトの疾患および心性気絶／冬眠の動物モデルでは、慢性の低酸素状態が筋細胞代謝の補償的な変化、低酸素症誘発性遺伝子のアップレギュレーション、および心臓機能の低減に導く。ＡＣＥ２は血管の内皮で発現され心筋細胞では発現されないので、ＡＣＥ２の作用は脈管系に限定されていそうである。たとえば、ＡｎｇＩＩの局所的な増大は血管収縮に導き、低潅流（hypoperfusion）および低酸素症という結果となる。ＡｎｇＩＩはまた、酸化的ストレスの誘発により内皮の機能不全を引き起こすことが示されている。ＡＣＥ２の喪失が低酸素症誘発性遺伝子のアップレギュレーションという結果となりうるメカニズムは決定される必要がある。重要なことに、本発明者らのデータはＡＣＥ２の多型がヒトにおいて冠状心疾患の病理を引き起こすことを示している。
【００８２】
実施例
ＡＣＥ２は３つの高血圧症ラット株においてＸ染色体上のＱＴＬにマッピングされる
高血圧症および大抵の心血管疾患は性質が多因子性であり、疾患の病因は複数の罹病性遺伝子座の影響を受ける。種々の組換えラットモデルにおいて、高血圧症の複数のＱＴＬが同定されている。ＡＣＥ２がヒトのＸ染色体上にマッピングされること、および高血圧症の幾つかのラットモデルにおいてＱＴＬがＸ染色体上にマッピングされ、これには未だに候補遺伝子が割り当てられていないことから、ＡＣＥ２がこのＱＴＬの候補遺伝子でありうる。ラットＡＣＥ２の染色体マッピングを容易にするため、ラット腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより完全長のラットＡＣＥ２ ｃＤＮＡをクローニングした。ラットＡＣＥ２はヒトＡＣＥ２と高度に相同であり、ヒトおよびマウスのＡＣＥと３２％同一で４２％類似である（図１ａ）。ヒトＡＣＥ２と同様、ラット遺伝子は保存された亜鉛結合部位を含む単一のＡＣＥドメイン、シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを含む（図１ｂ）。ヒトと同様、マウスおよびラットでのＡＣＥ２は腎臓および心臓で優先的に発現され、肺および肝臓でも弱い発現が認められる（図１ｃ）。
【００８３】
放射線ハイブリッドマッピング（radiation hybrid mapping）は、ラットＡＣＥ２遺伝子がＸ染色体上にマッピングされることを示し、マーカーＤＸＲａｔ９、ＤＸＷｏｘ１４、ＤＸＷｏｘ１５およびＤＸＲａｔ４２への有意のＬＯＤスコアを有し、ａｃｅ２はＤＸＲａｔ９とＤＸＲａｔ４２との間に位置付けられた（図１ｄ）。比較マッピングは、ａｃｅ２マッピングの位置がマーカーＤＸＭｇｈ１２とＤＸＲａｔ８との間で認められSabra塩感受性ラットで同定された高血圧症についてのＱＴＬ間隔（interval）（ＳＳ−Ｘ）と重複することを示していた。さらに、染色体ａｃｅ２領域はＳＨＲＳＰラット（stroke-prone spontaneously hypertensive rats）で定められたＢＰ３ ＱＴＬにマッピングされ、以前に同定された高血圧症ＢＢ.Ｘ ＱＴＬはコンジェニック分析により自然発症高血圧症ラット（ＳＨＲ）のＸ染色体上で同定された（図１ｄ）。それゆえ、ＡＣＥ２は自然発症および食餌誘発高血圧症の３つの別個のモデルにおいてラットＸ染色体上のＱＴＬにマッピングされる。
【００８４】
高血圧症ラットにおけるＡＣＥ２発現のダウンレギュレーション
腎臓が血圧制御の主たる部位であるので、これら３つの高血圧症ラット株の腎臓でのＡＣＥ２発現レベルを決定した。ＡＣＥ２ ｍＲＮＡレベルをまず塩感受性Sabra高血圧症（ＳＢＨ／ｙ）ラットおよび対照の塩耐性Sabra正常血圧（ＳＢＮ／ｙ）ラットの腎臓で測定した。塩負荷（ＤＯＣＡ塩による）は正常血圧ＳＢＮ／ｙラットにおけるＡＣＥ２ ｍＲＮＡ発現に対して影響を及ぼさなかった。興味をそそられることには、ＳＢＨ／ｙラットでは、塩負荷および高血圧症の発症は正常血圧ＳＢＮ／ｙラットと比較してＡＣＥ２ ｍＲＮＡ発現の有意の低減と関係していた（図２ａ）。注目すべきは、通常の食餌を与えられたＳＢＨ／ｙラットでも同様の食餌を与えられたＳＢＮ／ｙ対照と比較してＡＣＥ２ ｍＲＮＡが低かったことである。この後者の知見は、通常の食餌を与えられたＳＢＨ／ｙラットとＳＢＮ／ｙラットとの間で観察された血圧の１０〜２０ｍｍＨｇの差異と一致する。
【００８５】
ＡＣＥ２タンパク質レベルを測定するため、ＡＣＥ２（マウスＡＣＥ２のアミノ酸２０６〜アミノ酸２２５）特異的なウサギ抗血清を生成した。この抗血清はラットＡＣＥ２およびヒトＡＣＥ２の両者と交差反応した（示していない）。低減したＡＣＥ２ ｍＲＮＡ発現と一致して、通常の食餌を与えられたＳＢＨ／ｙ動物ではＡＣＥ２タンパク質の発現は顕著に低下した（図２ｂ）。４週間ＤＯＣＡ塩の食餌を与えた後のＳＢＨ／ｙラットの血圧の上昇は、ＡＣＥ２タンパク質発現のさらなる低減と相関していた（図２ｂ）。塩耐性ＳＢＮ／ｙ対照ラットでは、塩負荷は血圧の上昇を駆動することもＡＣＥ２発現を変えることもなかった（図２ｂ）。ＡＣＥ２タンパク質レベルはまた、ＷＫＹ対照と比較して自然発症高血圧症ＳＨＲＳＰおよびＳＨＲ動物の腎臓で有意に低減した（図２ｂ）。さらに、ＡＣＥ２ ｍＲＮＡのレベルは高血圧症ＳＨＲＳＰおよびＳＨＲラットで顕著に低下した（示していない）。高血圧症ラット株でのＡＣＥ２のコード領域のクローニングおよびシークエンシングからは配列変化が明らかにされず、低減したＡＣＥ２発現はＡＣＥ２遺伝子発現を制御している多型の結果によりそうであることを示していた。地図上の位置および３つの異なるラット株でのＡＣＥ２の低減した発現は、ａｃｅ２がＸ染色体上のこの高血圧ＱＴＬの強力な候補遺伝子であることを示している。さらに、３つのすべての高血圧症ラット株における低減したＡＣＥ２発現は、この酵素が負のレギュレーターとして機能することを示唆していた。
【００８６】
マウスＡＣＥ２のクローニングおよびＡＣＥ２ノックアウトマウスの生成
ＱＴＬとしてのＡＣＥ２の候補性を確認するため、およびＡＣＥ２が実際に心血管生理および心血管疾患の病因において本質的な役割を果たしているか否かを試験するため、マウスＡＣＥ２遺伝子をクローニングした（図１ａ）。ラットおよびヒトＡＣＥ２と同様、マウスＡＣＥ２もまたＸ染色体上にマッピングされ（示していない）、単一のＡＣＥ−ドメインを含み（図１ｂ）、腎臓および心臓で優先的に発現された（図１ｃ）。興味深いことに、マウスではＡＣＥ２について２つのイソ型が全ての陽性の組織で観察された。ＣＯＳ細胞におけるマウスＡＣＥ２の過剰発現はＡＣＥ２がＡｎｇＩをＡｎｇ１−９に開裂することを示しており（示していない）、マウスＡＣＥ２がヒトＡＣＥ２と同じ生化学的特異性を有することを示していた。ＡＣＥ２のインビボでの役割を決定するため、マウスのａｃｅ２遺伝子を破壊してエクソン９をネオマイシン耐性遺伝子で置換し、亜鉛結合触媒ドメインを有効に欠失させた（方法および図３ａ）。ａｃｅ２遺伝子座で突然変異した２つのＥＳ細胞株を用いてキメラマウスを生成し、これをＣ５７ＢＬ／６に戻し交配して生殖細胞伝達（germ transmission）を得た。両マウス株は同一の表現型を示した。ａｃｅ２突然変異の伝達はサザーンブロット分析により確認した（図３ｂ）。ａｃｅ２のヌル突然変異は、ノーザンブロット分析（示していない）およびウエスタンブロット分析（図３ｃ）でのａｃｅ２ ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の不在によって確認された。腎臓および心臓でのＡＣＥ ｍＲＮＡ発現はａｃｅ２突然変異体マウスでも変わらなかった（図３ｄ）。
【００８７】
ＡＣＥ２遺伝子はＸ染色体上にマッピングされるので、雄の子孫はすべてＡＣＥ２に関してヌル突然変異体（ａｃｅ２−／ｙ）かまたは野生型（ａｃｅ２＋／ｙ）のいずれかであり、一方、雌の子孫はａｃｅ２の突然変異に関して野生型（ａｃｅ２＋／＋）、へテロ接合性（ａｃｅ２＋／−）、またはホモ接合性（ａｃｅ２−／−）のいずれかであった。以下に記載する全ての実験において、ａｃｅ２＋／−雌はａｃｅ２＋／＋雌と同様の挙動を示し、ａｃｅ２＋／ｙ雄はａｃｅ２のへテロ接合性の見かけの影響がないことを示していたことに注意すべきである。ＡＣＥ２ヌルマウスは予期されたメンデルの法則による頻度で生まれ、健康に見え、分析した全ての臓器で肉眼的な検出しうる変化を示さなかった。さらに、有意に低減した棯性を示すａｃｅ２−／−雌マウスと対照的に、雄および雌のａｃｅ２ヌルマウスはいずれも棯性である。
【００８８】
ａｃｅ２突然変異体マウスにおける血圧
ａｃｅ２突然変異体マウスは低下した血圧および腎臓の病理を示すことが以前に示されている。それゆえ、ＡＣＥ２発現の喪失が血圧のホメオスタシスおよび／または腎臓の発生または機能に影響を及ぼすか否かをまず試験した。興味をそそられることには、ＡＣＥ２の喪失は、対照の同腹子と比較して３ヶ月齢のａｃｅ２−／ｙ雄マウス（図４ａ）またはａｃｅ２−／−雌マウス（示していない）で血圧の変化という結果とはならなかった。ＡＣＥ２の喪失をＡＣＥが補償するということはあり得るので、本発明者らはａｃｅ２欠失マウスをカプトプリル（ＡＣＥ機能を阻害するがＡＣＥ２機能は阻害しない）で処理した。しかしながら、カプトプリルを用いたＡＣＥのインビボでの抑制は、ａｃｅ２−／ｙ雄マウスの血圧をカプトプリル処理した野生型の同腹子で観察されるのと同程度に低下させた（図４ａ）。それゆえ、ＡＣＥ抑制というシナリオにおいても、この定められたマウスの背景においてＡＣＥ２の喪失は血圧のホメオスタシスに対して何ら明らかな直接的な影響を及ぼさない。本発明者らのＲＡＳ ＱＴＬデータに基づき、本発明者らは本発明者らの突然変異体マウスを他のマウス背景に戻し交配してヒトにおける遺伝的背景と同様に血圧制御におけるＡＣＥ２の役割を示した。
【００８９】
ａｃｅ２突然変異体マウスにおける腎臓機能の障害
ＡＣＥ２は腎臓で高度に発現されるので、本発明者らは腎臓の形態および機能を調べた。３ヶ月齢および６ヶ月齢のａｃｅ２−／ｙ雄マウスおよびａｃｅ２−／−雌マウスはすべて正常な腎臓の形態を示し、腎臓のいかなる超微細構造の見かけの変化も示さなかった（図４ｂ）。腎管系および糸球体の正常な細胞性および腎構造もまた、連続切片形態計測を用いて確認された。
【００９０】
雄ａｃｅ２欠失マウスおよび年齢を一致させた同腹子対照マウスからの腎臓を、光学顕微鏡（ＰＡＳ染色）および電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用い、３ヶ月齢および１２ヶ月齢で調べた。各糸球体の硬化の重篤度を以下のとおり盲検により０から４＋までの段階で評価した：０は病変のないことを示す、１＋は糸球体の＜２５％の硬化、２＋、３＋、および４＋は、それぞれ糸球体の２５〜５０％の硬化、５０〜７５％の硬化、および＞７５％の硬化を示す。３ヶ月齢ではａｃｅ２欠失マウスからの腎臓に病理学的変化の徴候は認められなかった。しかしながら、１２ヶ月齢では、光学顕微鏡は糸球体硬化／障害の増大を明らかにした：１.４５±０.２ｖｓ０.２５±０.０６；ｎ＝６；ｐ＜０.０１。電子顕微鏡は、腎メサンギウム中の膠原原線維の沈着の増大および肥厚した基底膜を示した。上昇したＡｎｇＩＩレベルへの長期にわたる暴露は、ａｃｅ２欠失マウスからの腎臓で低酸素症および酸化的ストレスに導く。ウエスタンブロット分析は、ａｃｅ２欠失マウスからの腎臓において低酸素症誘発因子１α（hypoxia inducible factor-1 alpha；ＨＩＦ１−α）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の上昇した発現を明らかにした。脂質過酸化産物の測定は、６ヶ月齢のａｃｅ２欠失マウスでの酸化的ストレスの増大を示した：ヘキサナール（１００１±１６１ｖｓ１１５±１３ナノモル／ｇ；ｎ＝５；ｐ＜０.０１）およびマロンジアルデヒド（４８±６.４ｖｓ２４.３±２.８ナノモル／ｇ；ｎ＝５；ｐ＜０.０１）。
【００９１】
これら結果は、ＡＣＥ２の喪失が組織特異的な仕方でアンジオテンシンＩＩシグナル伝達の促進に導くこと、このシグナル伝達の促進が最終的にａｃｅ２欠失マウスの腎臓での有害な作用を媒介することを示している。低減したＡＣＥ２発現は、腎臓疾患において重要な病理学的役割を果たしている。
【００９２】
ＡＣＥ２の喪失は心臓機能の重篤な欠陥という結果となる
ＡＣＥまたはＡｎｇＩＩレセプターの薬理学的な抑制は、心臓機能の制御および心臓肥大におけるＲＡＳの役割を示唆した。しかしながら、ａｃｅヌルマウスもアンジオテンシノーゲンヌルマウスもともに明白な心臓疾患を発症しない。ＡＣＥ２は心臓の血管で高度に発現されるので、ａｃｅ２欠失マウスの心臓を分析した。ａｃｅ２突然変異体マウスの心臓は、左心室壁のわずかな肉薄および心室サイズの増大を示す（図５ａ）。ａｃｅ２欠失心臓での左心室前壁（anterior left ventricular wall；ＡＷ）の肉薄および左心室端拡張径（left ventricle end diastolic dimension；ＬＶＥＤＤ）の増大も心エコーにより認めることができる（表１）。これらの構造的な変化は、主として６ヶ月齢の雄マウスで観察される。しかしながら、心重量比は年齢を一致させた３ヶ月齢（示していない）および６ヶ月齢のａｃｅ２−／ｙマウスとａｃｅ２＋／ｙマウスとの間で同程度であった（図５ａ、図５ｂ）。心エコーはまた、左心室重量（ＬＶＭ）およびＬＶＭ／体重比が正常であることを示した（表１）。間質性心臓線維症の適応症も（図５ｃ、図５ｄ）ＡＮＦ、ＢＮＰ、ａ−ＭＨＣ、ｂ−ＭＨＣ、および骨格筋アクチン遺伝子発現の基本型変化も（示していない）認められなかったので、拡張性心筋炎の構造的および生化学的変化の特徴は観察されなかった。さらに、ＡＣＥ２ヌルマウスの個々の心筋細胞は肥大の徴候を示さず、ＴＵＮＥＬ染色によって検出されるように（示していない）本発明者らはＡＣＥ２ヌルマウスで変化した心筋細胞アポトーシスの証拠を観察しなかった。それゆえ、６ヶ月齢のＡＣＥ２ヌルマウスの心臓の軽い拡張にも拘わらず、心臓肥大または拡張性心筋炎の証拠はなかった。
【００９３】
興味深いことに、心エコーによる心臓機能の評価は、短縮比（fractional shortening；ＦＳ）の低減、および周辺繊維短縮の速度（velocity of circumferential fiber shortening）の低減によって決定されるように（表１および図６ａ、図６ｂ）、すべてのａｃｅ２−／ｙ雄マウスおよびａｃｅ２−／−雌マウスが重篤な収縮性心不全を示すことを明らかにした。機能の低減は年齢を一致させた３ヶ月齢のマウスと比較して６ヶ月齢の雄および雌マウスの方が重篤であることが認められ、表現型の進行を示唆していた（表１）。心筋収縮能の低下と一致して、６ヶ月齢ａｃｅ２−／ｙマウスは血圧の低下を示したが（図６ｃ）、これは年齢の一致するａｃｅ２−／−雌マウスおよび３ヶ月齢の雄マウスでは認められない特徴であり、血圧の低下が重篤な心臓の機能不全の結果によるものであって全身血圧に対するＡＣＥ２の喪失の直接の効果ではないことを示唆していた。これらの驚くべき結果は、ＡＣＥ２が心臓の収縮能の重要な負のレギュレーターであることを示している。
【００９４】
心臓機能における心エコー欠陥を確認するため、侵襲性の血行力学的測定をａｃｅ２ヌルマウスで行った。重要なことに、侵襲性の血行力学的測定はｄＰ／ｄＴ−ｍａｘおよびｄＰ／ｄＴ−ｍｉｎの両者がａｃｅ２突然変異体マウスで顕著に低下することを示し（表２）、収縮性の心臓機能の重篤な障害を示していた。ＡＣＥ２の喪失はまた大動脈圧および心室圧の有意の低下という結果となり、観察された心筋収縮能の低下と一致していた（表２）。注目すべきことに、これらデータは、ａｃｅ２突然変異体マウスの心筋収縮能の欠陥が明らかな心臓肥大がなくても起こり、血圧の変化とは遺伝的に関係がありえないことを確立するものである。
【００９５】
ａｃｅ２ヌルマウスにおける低酸素症誘発性遺伝子のアップレギュレーション
ａｃｅ２ヌルマウスでの肥大または心臓線維症の不在下での重篤な収縮性の機能不全および軽い拡張は、ヒトおよび動物モデルでの心性気絶／冬眠と似ている。心性気絶および冬眠は、冠状動脈疾患やその後のバイパス手術などの慢性の低酸素症への適応応答である。ＡＣＥ２は血管内皮細胞で高度に発現されるが収縮能は心筋細胞によって制御されるので、ＡＣＥ２の喪失は心臓の低酸素症という結果となりうることが考えられた。それゆえ、ＢＮＩＰ３２５やＰＡＩ−１などの低酸素症誘発性遺伝子の発現レベルをノーザンブロッティングにより分析した。すべてのａｃｅ２ヌルマウスの心臓において、ＢＮＩＰ３およびＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現は野生型の同腹子と比較して顕著にアップレギュレーションしていた（図７ａ）。それゆえ、ＡＣＥ２の喪失は低酸素症制御された遺伝子発現プロフィルの誘発という結果となる。
【００９６】
ａｃｅ２ヌルマウスでの増大したアンジオテンシンＩＩレベル
ＡＣＥ２はカルボキシペプチダーゼとして機能し、ＡｎｇＩから単一残基を解離してＡｎｇ１−９を、ＡｎｇＩＩから単一残基を解離してＡｎｇ１−７を生成するので、ＡＣＥ２は基質ＡｎｇＩおよび／またはＡｎｇＩＩの開裂および不活化に対してＡＣＥと競合することによりＲＡＳの負のレギュレーターとして機能するという仮説が立てられた。もし正しければ、ＡＣＥ２の喪失はインビボでＡｎｇＩＩレベルを増大させるに違いない。ラジオイムノアッセイを用い、ＡｎｇＩＩレベルが実際にａｃｅ２突然変異体マウスの腎臓および心臓において有意に増大することがわかった（図７ｂ）。さらに、ＡｎｇＩの増大もまた観察され（図７ｂ）、このことはＡｎｇＩがＡＣＥ２作用のインビボでの基質であることと一致していた。ＡＣＥのｍＲＮＡレベルは、対照と比べてａｃｅ２突然変異体マウスの心臓および腎臓で差異は認められず、増大したＡｎｇＩＩの組織レベルが増大したＡＣＥ発現によるものではないことを示していた（図３ｄ）。これらデータは、ＡＣＥ２がＲＡＳの負のレギュレーターとして機能し、ＡｎｇＩＩの内生レベルを制御していることを示している。
【００９７】
ａｃｅ２欠失マウスでのＡＣＥ発現の排除は心不全を救済する
もしもａｃｅ２突然変異体マウスの心臓の表現型がＡｎｇＩＩレベルの増大によるものであるなら、ＡＣＥの遺伝的排除とＡＣＥ２の破壊との組み合わせはＡｎｇＩＩレベルを低減させＡＣＥ２突然変異体マウスで観察された表現型を救済できる。この考えを検証するため、ａｃｅ／ａｃｅ２二重突然変異マウスを生成した。これら二重突然変異マウスは予期されたメンデルの法則比に従って生まれ、健康にみえた。ａｃｅ−ａｃｅ２二重ヌルマウスでの血圧（図８ａ）および腎臓の欠陥（示していない）はａｃｅ単一突然変異マウスのものと同様であった。ａｃｅ−ａｃｅ２二重突然変異マウスの棯性は問題とならなかった（not addressed）。それゆえ、ＡＣＥおよびＡＣＥ２の両者の喪失はａｃｅ単一突然変異マウスで認められるもの以上の明らかな疾患を引き起こすことはない。
【００９８】
ＡＣＥノックアウトマウスの心臓機能はこれまでに報告されていないので、これらマウスでの心臓パラメーターをまず分析した。ａｃｅ−／−マウスでは心臓は組織学的に正常であり（示していない）、心臓機能の欠陥は６ヶ月齢では検出することができなかった（図８ｂ、図８ｃ）。重要なことに、ａｃｅ２突然変異背景上のＡＣＥ発現の排除はａｃｅ２単一ノックアウトマウスの心不全表現型を完全になくした（図８ｂ、図８ｃ）。さらに、心エコーを用い、６ヶ月齢の年齢を一致させたａｃｅ−ａｃｅ２二重突然変異マウスのすべての心臓機能は、ａｃｅ単一突然変異同腹子および野生型同腹子のものに匹敵していた（表１）。心臓機能の回復は雄および雌の両方のａｃｅ−ａｃｅ２二重突然変異マウスで生じた。これら遺伝的データは、ＡＣＥ２の不在下で収縮性の心不全を誘起するにはＡＣＥ発現が必要であることを示している。重要なことに、ａｃｅノックアウトマウスとａｃｅ／ａｃｅ２ノックアウトマウスとで血圧に差異はなく（図８ａ）、より老齢の雄のａｃｅ２マウスでの血圧の低下は心臓機能の劇的な増大によるものであることがさらに示唆された。
【００９９】
ＡＣＥ２は肺障害を負に制御する
成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）は急性肺障害の重篤な症例であり、集中治療を受けられる場合であっても致死率は４０〜７０％である。外傷、重度の敗血症（全身感染）、散在性（diffuse）肺炎およびショックがＡＲＤＳの最も重篤な原因であり、これらのうちでも酸誘発肺障害（acid-induced lung injury）は最も一般的な原因の一つである。酸呼吸関連肺障害（acid aspiration-associated lung injury）を引き起こす潜在的なメカニズムとしては、肺胞−毛細管膜へのＨＣｌにより誘発された損傷、および多形核好中球（ＰＭＮ）の付着、活性化および隔離（sequestration）（肺浮腫およびガス交換の劣化という結果となる）が挙げられる。ＡＲＤＳの治療は、機械換気、および陥っている病気または障害の継続した治療からなる。肺がさらなる肺胞−毛細管膜の損傷に陥ることを防ぐ新規な薬剤を用いた支持的な治療は、患者が陥っている病気や障害を治療するためにＡＲＤＳ患者の肺の機能を保存し、ＡＲＤＳの致死率の低下に導くであろう。
【０１００】
ＡＣＥ２は肺で発現されるので、本発明者らはＡＣＥ２の喪失が急性肺障害において何らかの役割を果たしているか否かを評価した。図９は、ＨＣｌ処理したマウスおよび対照マウスでの肺エラスタンスの３時間の間での変化を示す。ＨＣｌ投与後、野生型マウスは４時間以上生存したのに対し、ＡＣＥ２ノックアウトマウスは２〜３時間以内に死亡した。生存の差異を反映して、ＡＣＥ２ノックアウトマウスは肺エラスタンスにおいて野生型マウスよりも有意に重篤な応答を示した。それゆえ、ＡＣＥ２は急性の酸誘発障害から肺を保護するうえで顕著な役割を果たしている。かくして、ＡＣＥ２の機能および／または発現を促進させることは、ＡＲＤＳおよび肺障害の治療の新規かつ予期されなかった標的である。
【０１０１】
方法
マウスおよびラットＡＣＥ２のクローニングおよび染色体ＱＴＬマッピング  マウスＡＣＥ２を特許（proprietary）ＥＳＴデータベースからクローニングした。マウスＡＣＥ２プローブを用い、本発明者らはついでラット腎臓ｃＤＮＡ（Invitrogen）をスクリーニングしてＤＮＡシークエンシングによって決定されるように完全長ラットｃＤＮＡを得た。染色体マッピングのため、ラットＡＣＥ２ ｃＤＮＡ特異的プローブを用いてラットＰＡＣライブラリー（ＲＰＣＩ−３１、Research Genetics）をスクリーニングし、２つの陽性クローン（６Ｍ６および１２５Ｋ９）を同定した。これらクローンの末端配列を決定し、ラット特異的なプライマー（ｍｃ２Ｌ：５’−ＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＧ−３’、ｍｃ２Ｒ：５’−ＧＡＧＧＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＡＡ−３’）をデザインして放射性ハイブリッドパネル（RH07.5、Research Genetics）をスクリーニングすることによりラットでのＡＣＥ２の染色体地図上の位置を決定した。ＳＨＲおよび対照ＷＫＹラットをHarlanから入手し、Ontario Cancer Instituteの動物施設にて研究所のガイドラインに従って維持した。ＳＨＲＳＰラットからの組織は、Detlev Ganten博士（ドイツ）の好意により提供された。塩耐性および塩感受性のSabraラットは、Ben-Gurion University Barzilai Medical Center（イスラエル）の動物施設で飼育し保持した。Doca-塩処理は上記に記載したとおりであった。
【０１０２】
発現分析  全ＲＮＡをラット腎臓からトリ試薬（tri-reagent）を用いて調製した。２０ｍｇのＲＮＡを０.８％ホルムアルデヒドゲル上で分離した。ナイロンメンブレン（Amersham）にブロットし、部分的ラットＡＣＥ２ ｃＤＮＡクローン（９−１）でプローブした。β−アクチンプローブおよびMultiple tissue Northern blotsはClontechから購入した。ウエスタン分析のため、腎臓を「完全」プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）および１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４を添加した溶解緩衝液（５０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ７.４、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％トリトン−Ｘ１００）中でホモジナイズした。１００ｍｇのタンパク質を８％トリス−グリシンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＡＣＥ２免疫血清は、マウス特異的ＡＣＥ２ペプチドＤＹＥＡＥＧＡＤＧＹＮＹＮＲＮＱＬＩＥＤで免疫したウサギから得た。この血清をsulpho-link kit（Pierce）を用いて免疫ペプチドでアフィニティー精製した。市販のβ−アクチン抗体を負荷対照として用いた（Santa Cruz）。
【０１０３】
ＡＣＥ２突然変異体マウスの生成  標的ベクター（５５９塩基対のショートアーム、および８.１キロベースのロングアーム）をｐＫＯ Scrambler ＮＴＫＶ−１９０７ベクター（Stratagene）を用いて構築した。ヌクレオチド＋１０６９〜＋１２９９を含むａｃｅ２ゲノムＤＮＡの一部をネオマイシン耐性カセットとアンチセンスの方向で置換した。ターゲティング構築物をＥ１４Ｋ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションにより導入し、陽性の相同組換えＥＳクローンのスクリーニングを５’および３’フランキングプローブにハイブリダイズしたＥｃｏＲＩ−消化ゲノムＤＮＡのサザーンブロッティングにより行った。２つの独立したａｃｅ−／ｙＥＳ細胞株をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞に注入してキメラマウスを生成し、これをＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。２つのＥＳ細胞株は、独立した生殖細胞伝達を与えた。この原稿で報告するデータは、これら２つの突然変異体マウス株の間で一致するものである。ＡＣＥ２発現の排除がＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、およびウエスタンブロット分析により確認された。すべての実験に同腹子のマウスのみを用いた。すべての組織の組織学、アポトーシスアッセイ、血液の血清学、および腎臓の形態計測は文献記載によった３１。完全なＡＣＥ突然変異体マウスはこれまでに記載されており８、Jackson Laboratoriesから入手した。マウスはOntario Cancer Instituteの動物施設にて研究所のガイドラインに従って維持した。
【０１０４】
心臓の形態計測、心エコー、血行力学および血圧の測定  心臓の形態計測のため、心臓を１０％緩衝ホルマリンで６０ｍｍＨｇにて潅流し、その後、パラフィン中に埋設した。心筋間質性線維症の決定は、Photoshop 6.0ソフトウエアと結合したImage Processing Tool Kit version 2.5を用いた色彩減算コンピューター支援造影分析（color-subtractive computer assisted image analysis）を用いた定量的な形態計測により行った。Picro-Sirius赤色染色切片を用い、全視野と比較した陽性のＰＳＲ染色を有する面積の比として間質性線維症を計算した。心エコー評価は、野生型および突然変異体の同腹子を用いて文献記載に従って行った３２。マウスをイソフルオラン／酸素で麻酔し、１５ＭＨｚ一次変換器を備えたAcusonR Sequoia C256を用いた経胸腔的心エコーにより調べた。ＦＳは、ＦＳ＝［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］＊１００として計算した。Ｖｃｆｃは心拍数について補正したＦＳ／拍出時間として計算した。血行力学的測定は文献記載に従って行った。簡単に説明すると、マウスを麻酔し、右頸動脈を単離し、増幅器（TCP-500、Millar Inc. 、ヒューストン）につないだ1.4 French Millarカテーテル（Millar Inc.）を用いてカニューレを挿入した。カテーテルを頸動脈に挿入した後、カテーテルを大動脈ついで左心室まで進め、大動脈圧および心室圧を記録した。測定および分析したパラメーターは、心拍数、大動脈圧、左心室（ＬＶ）収縮期圧、ＬＶ拡張期圧、およびＬＶ圧の最大および最小一次導関数（first derivatives）（それぞれ＋ｄＰ／ｄｔｍａｘおよびｄＰ／ｄｔｍａｘ）であった。Visitech Systems（アペックス、ノース・カロライナ）によって製造されたVisitech BP-2000 Blood Pressure Analysis Systemを用い、テール−カフ（tail-cuff）血圧測定法を採用した。カプトプリル処理にあたっては、血圧測定前に２週間にわたって４００ｍｇ／Ｌのカプトプリル（Sigma）を飲水に添加した。
【０１０５】
組織のアンジオテンシンペプチドレベル  心臓および腎臓を、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、１００μＭ）を含む上記ペプチダーゼインヒビターを含有する８０％エタノール／０.１Ｎ ＨＣｌ中、氷上でホモジナイズした。タンパク質ホモジネートを３０,０００ｇで２０分間遠心分離にかけ、上澄みをデカントし、１％（ｖ／ｖ）ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ、Pierce、ロックフォード、イリノイ）で酸性にした。上澄みをSavant真空遠心管（Savant、ファーミングデール、ニューヨーク）で５ｍｌに濃縮し、濃縮した抽出物を活性化Sep-Paksに適用し、０.１％ＨＦＢＡで洗浄し、５ｍｌの８０％メタノール／０.１％ＨＦＢＡで溶出した。心臓および腎臓組織からの抽出物中のアンジオテンシンペプチド含量のラジオイムノアッセイ分析を行った。ＡｎｇＩＩおよびＡｎｇＩ ＲＩＡについての検出限界は、それぞれ０.５フェムトモル／管およびＡｎｇＩ ５フェムトモル／管であった。
【０１０６】
急性肺障害モデル  ＡＣＥ２ノックアウトマウスおよびその同腹子（８〜１２週齢）をこの研究に用いた。吸引攻撃の１分前に２回の深い吸入（１回呼吸量の３倍）を送達して容積歴（volume history）を標準化し、測定をベースラインとして行った。麻酔し機械換気したマウスに２ｍＬ／ｋｇのＨＣｌ（ｐＨ＝１.５）、ついで空気ボーラス（a bolus of air）を気管内注射した。対照群ではマウスに食塩水注射をするかまたは注射をしなかった。すべての群で測定は３０分間隔で３時間行った。肺障害を生理的に評価するため、気管の最大圧、流量、および容積を測定することにより肺エラスタンス（ＥＬ；肺コンプライアンスの逆数）を評価した。ＥＬは気管最大圧を容積で除することにより計算した。ＥＬの変化は肺実質の変化および肺の硬化（stiffening）を反映している。
【０１０７】
本発明を詳細に且つ好ましい態様に特に言及しながら記載した；しかしながら、当業者であれば本発明の意図および範囲から逸脱することなく改変を行いうることが理解されるであろう。たとえば、本願がタンパク質について言及しているときはペプチドおよびポリペプチドもしばしば用いられることが明らかである。同様に、遺伝子を本願において記載している場合は核酸分子または遺伝子断片もしばしば用いられることが明らかである。
【０１０８】
すべての刊行物（ジーンバンクの収録項目を含む）、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願がその全体において参照のため引用されると明確かつ個別に示されているのと同程度に、その全体において参照のため引用される。
【０１０９】
参照文献
【表３】
0004598518.tif 000004
【０１１０】
【表４】
0004598518.tif 000005
【０１１１】
【表５】
0004598518.tif 000006
【０１１２】
【表６】
0004598518.tif 000007
【０１１３】
【表７】
0004598518.tif 000008
【０１１４】
表１：ａｃｅ２ヌルマウスの心臓機能
【表８】
0004598518.tif 000009
*ｐ＜０.０５；ａｃｅ２−／ｙ対ａｃｅ２＋／ｙまたはａｃｅ２−／−対ａｃｅ２＋／−
**ｐ＜０.０１；ａｃｅ２−／ｙ対ａｃｅ２＋／ｙまたはａｃｅ２−／−対ａｃｅ２＋／−
Ｂｐｍ＝１分間当たりの心拍数；ＡＷ＝前壁の肉薄；ＬＶＥＤＤ＝左心室端拡張径；ＬＶＥＳＤ＝左心室端収縮径；％ＦＳ＝パーセント短縮比；ＰＡＶ＝最大大動脈流出速度（peak aortic outflow velocity）；Ｖｃｆｃ＝周辺繊維短縮の速度；ＬＶＭ＝計算した左心室重量；ＢＷ＝体重
【０１１５】
表２：６ヶ月齢ａｃｅ２−／ｙマウスの侵襲性血行力学パラメーター
【表９】
0004598518.tif 000010
**ｐ＜０.０１；ａｃｅ２−／ｙ対ａｃｅ２＋／ｙ
ＳＢＰ＝収縮血圧；ＤＢＰ＝拡張血圧；ＭＢＰ＝平均動脈血圧；ＬＶＳＢＰ＝左心室収縮血圧；ＬＶＥＤＢＰ＝左心室端拡張血圧；ｄＰ／ｄＴｍａｘ＝左心室圧の変化／時間の最大一次導関数；ｄＰ／ｄＴｍｉｎ＝左心室圧の変化／時間の最小一次導関数
【０１１６】
表３：６ヶ月齢ａｃｅヌルマウスおよびａｃｅ／ａｃｅ２ヌルマウスの心臓機能
【表１０】
0004598518.tif 000011
ＡＷ＝前壁の肉薄；ＬＶＥＤＤ＝左心室端拡張径；ＬＶＥＳＤ＝左心室端収縮径；％ＦＳ＝パーセント短縮比；ＰＡＶ＝最大大動脈流出速度；Ｖｃｆｃ＝周辺繊維短縮の速度
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ラットＡＣＥ２の配列および染色体マッピングを示す。（ａ）ラット、マウスおよびヒトＡＣＥ２のマウスおよびヒト精巣−ＡＣＥ（Ｔ−ＡＣＥ）とのタンパク質アラインメント。黒い陰影はアミノ酸の同一性を示し、灰色の陰影はアミノ酸の類似性の程度を示す。（ｂ）ＡＣＥおよびＡＣＥ２のドメイン構造の模式図。ＡＣＥ２は共通亜鉛結合部位ＨＥＭＧＨを含むＡＣＥドメインを一つしか含まないことに注意。触媒中心は黒色で、シグナルペプチドは灰色で、膜貫通ドメインは斜線で示す。（ｃ）種々の成体組織および胚発生の種々の日数（Ｅ７＝胚の第７日目）でのマウスおよびラットＡＣＥ２遺伝子の発現パターン。ＡＣＥ２の２つのイソ型がマウスには存在するがラットまたはヒトには存在しない（示していない）ことに注意（これはＡＣＥについて認められるのと同様の特徴である１５）。（ｄ）Sabra塩感受性（Sabra salt-sensitive）動物（ＳＳ−Ｘ）、ＳＨＲＳＰ（ＢＰ３）、およびＳＨＲラット（ＢＢ.Ｘ）で同定したＱＴＬのマッピングと比較した、ラットＡＣＥ２の放射性ハイブリッドマッピングの結果。多型マーカー名を表意文字の左に示す。ＡＣＥ２と関連するマーカーのＬＯＤスコアおよびシータ値を示す。ｃＲ＝センチラド。
【０１１８】
【図２ａ】高血圧症のラットモデルにおけるＡＣＥ２の発現を示す。Sabra ＳＢＨ／ｙおよびＳＢＮ／ｙラットの腎臓からのＡＣＥ２ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。上段はアクチン対照レベルとともにノーザンブロットの表示を示す。下のパネルはアクチンレベルに標準化したａｃｅ２メッセージの相対レベルを示す。
【０１１９】
【図２ｂ】高血圧症のラットモデルにおけるＡＣＥ２の発現を示す。Sabra ＳＢＨ／ｙおよびその対照ＳＢＮ／ｙラット並びにＳＨＲおよびＳＨＲＳＰおよびその対照ＷＫＹラットの腎臓からのＡＣＥ２タンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す。上段は代表的なウエスタンブロットを示す。各Sabraラットでの収縮血圧（ＢＰ）をｍｍＨｇで示す。下のパネルはアクチンレベルに補正したＡＣＥ２の相対的なタンパク質レベルを示す。棒グラフは平均値±ＳＥＭを示す。*＝ｐ＜０.０５、**＝ｐ＜０.０１（ｎ＝４、全ての群について）。
【０１２０】
【図３ａ】相同的組換えによるマウスＡＣＥ２のターゲティングした破壊を示す。遺伝子ターゲティング戦略。マウスａｃｅ２野生型遺伝子座の一部（最上段）を示す。黒塗りはエクソンを示す。亜鉛結合触媒ドメインをコードするエクソン９を、アンチセンス方向に置いたネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子カセットで置換すべくターゲティングベクターをデザインした。チミジンキナーゼ（ＴＫ）を負の選択のために用いた。サザーン分析に用いた３'および５'フランキングプローブを斜線の四角で示す。
【０１２１】
【図３ｂ】相同的組換えによるマウスＡＣＥ２のターゲティングした破壊を示す。ａｃｅ＋／ｙおよびａｃｅ−／ｙＥＣ細胞のサザーンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、（ａ）に示した３'および５'フランキングプローブにハイブリダイズさせた。
【０１２２】
【図３ｃ】相同的組換えによるマウスＡＣＥ２のターゲティングした破壊を示す。ａｃｅ＋／ｙおよびａｃｅ−／ｙマウスの腎臓でのＡＣＥ２タンパク質発現のウエスタンブロット分析。抗ＡＣＥ２抗体を欠失のＮ末端側の領域に反応させる。
【０１２３】
【図３ｄ】相同的組換えによるマウスＡＣＥ２のターゲティングした破壊を示す。ａｃｅ２＋／ｙおよびａｃｅ２−／ｙマウスの心臓および腎臓におけるＡＣＥ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。線状増幅および対照としてのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルについての種々のＰＣＲサイクルを示す。
【０１２４】
【図４】正常血圧および腎臓の機能を示す。（ａ）ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルの不在下（左のパネル）または存在下での３ヶ月齢ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスでの血圧測定。尾の平手打ち（tail cuffing）を用いて血圧を測定し、平均値±ＳＤを示す。方法の欄に示すように、血圧を測定する２週間前にカプトプリルを投与した。これらの血圧を、侵襲性の血行力学的ランゲンドルフ測定法（示していない）を用いて確認した。カプトプリル処理したａｃｅ２＋／ｙおよびａｃｅ２−／ｙマウスの両者での差異は、それぞれの未処理群の差異よりも有意の差異があった（**ｐ＜０.０１）。（ｂ）正常な腎臓組織が６ヶ月齢のａｃｅ２＋／ｙおよびａｃｅ２−／ｙマウスで観察された。矢印は糸球体を示している。
【０１２５】
【図５ａ】心臓の形態を示す。６ヶ月齢のａｃｅ２＋／ｙおよびａｃｅ２−／ｙマウスから単離した心臓のＨ＆Ｅ染色切片。大きくなった左心室（ＬＶ）および右心室（ＲＶ）がａｃｅ２−／ｙマウスで観察された。しかしながら、全体としての心臓の大きさは両遺伝子型で同様であり、肉眼でも単離した心筋細胞でも心肥大の証拠はなかった。
【０１２６】
【図５ｂ】心臓の形態を示す。心肥大の指標としての６ヶ月齢ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスからの心重量／体重比の定量。体重、心重量、脛骨長、および心重量／脛骨長の比もまた、分析した全ての年齢での種々の遺伝子型群で変化が認められなかった（示していない）ことに注意すべきである。
【０１２７】
【図５ｃ】心臓の形態を示す。ａｃｅ２−／ｙマウスで間質性線維症は存在しなかった。拡張型心筋症の顕著な特徴の一つは、間質性線維症である。しかしながら、間質性線維症はａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスの心臓で同様であった。個々の心臓のＰＳＲ染色を示す。通常の脈管周辺の線維症は、野生型および突然変異動物の両者において赤く染色されることに注意。
【０１２８】
【図５ｄ】心臓の形態を示す。ａｃｅ２−／ｙマウスで間質性線維症は存在しなかった。拡張型心筋症の顕著な特徴の一つは、間質性線維症である。しかしながら、間質性線維症はａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスの心臓で同様であった。間隙における線維症変化の定量。
【０１２９】
【図６ａ】ＡＣＥ２の喪失は重篤な収縮性心不全という結果となることを示す。６ヶ月齢のａｃｅ２＋／ｙおよび２匹のａｃｅ２−／ｙマウスでの収縮期心臓の心エコー測定。ピークおよび谷は個々の心拍数の収縮期および拡張期を示す。矢印は、短縮比のパーセント（％ＦＳ）を決定する値である収縮期の収縮（ＬＶＥＳＤ）と拡張期の弛緩（ＬＶＥＤＤ）との距離を示す。ａｃｅ２−／ｙマウスでの拡張期および収縮期の大きさの増大は心臓の拡張を示すことに注意。実験データは表１に見出すことができる。
【０１３０】
【図６ｂ】ＡＣＥ２の喪失は重篤な収縮性心不全という結果となることを示す。心臓収縮の２つの顕著なパラメーターであるパーセント短縮比および周辺繊維短縮の速度が、６ヶ月齢ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスおよび６ヶ月齢ａｃｅ２＋／−（ｎ＝５）およびａｃｅ２−／−（ｎ＝５）雌マウスで認められた。値は心エコーにより決定した。平均値±ＳＤを示す。*遺伝子型群間でのｐ＜０.０５および**遺伝子型群間でのｐ＜０.０１。実験データは表１に見出すことができる。
【０１３１】
【図６ｃ】ＡＣＥ２の喪失は重篤な収縮性心不全という結果となることを示す。６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）マウスおよび６ヶ月齢雌ａｃｅ２＋／−（ｎ＝５）およびａｃｅ２−／−（ｎ＝５）雌マウスでの血圧測定。平均値±ＳＤを示す。血圧は、表２からわかるように、侵襲性の血行力学的測定を用いて確認した。*ｐ＜０.０５。
【０１３２】
【図７ａ】ＡＣＥ２不在下での低酸素マーカーのアップレギュレーションおよびアンジオテンシンＩＩレベルの増大。２つの低酸素誘発性遺伝子であるＢＮＩＰ３およびＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現レベルの６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝５）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝５）マウスでのノーザンブロット分析。個々のノーザンブロットデータを示す。**ｐ＜０.０１。
【０１３３】
【図７ｂ】ＡＣＥ２不在下での低酸素マーカーのアップレギュレーションおよびアンジオテンシンＩＩレベルの増大。２つの低酸素誘発性遺伝子であるＢＮＩＰ３およびＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現レベルの６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝５）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝５）マウスでのノーザンブロット分析。ｇａｐｄｈ対照に対して標準化したＢＮＩＰ３およびＰＡＩ−１のｍＲＮＡレベルの相対レベルを示す。**ｐ＜０.０１。
【０１３４】
【図７ｃ】ＡＣＥ２不在下での低酸素マーカーのアップレギュレーションおよびアンジオテンシンＩＩレベルの増大。６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）およびａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）同腹子マウスの心臓および腎臓におけるアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）およびアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）ペプチドレベル。ＡｎｇＩおよびＡｎｇＩＩの組織レベルはラジオイムノアッセイにより決定した。平均値ペプチドレベル±ＳＤを示す。**ｐ＜０.０１。
【０１３５】
【図８ａ】ＡＣＥ−ＡＣＥ２二重突然変異マウスは心不全を起こさないことを示す。６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）、ａｃｅ−／−（ｎ＝８）、およびａｃｅ−／−ａｃｅ２−／ｙ二重突然変異（ｎ＝６）マウスでの血圧測定。平均値±ＳＤを示す。血圧は、侵襲性の血行力学的測定を用いて確認した。**野生型マウスと比べて突然変異体のｐ＜０.０１。
【０１３６】
【図８ｂ】ＡＣＥ−ＡＣＥ２二重突然変異マウスは心不全を起こさないことを示す。６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ（ｎ＝８）、ａｃｅ２−／ｙ（ｎ＝８）、ａｃｅ−／−（ｎ＝８）およびａｃｅ−／−ａｃｅ２−／ｙ二重突然変異（ｎ＝６）同腹子におけるパーセント短縮比および周辺繊維短縮の速度。値は心エコーにより決定した。平均値±ＳＤを示す。**遺伝子型群間でのｐ＜０.０１。実験データは表３に見出すことができる。
【０１３７】
【図８ｃ】ＡＣＥ−ＡＣＥ２二重突然変異マウスは心不全を起こさないことを示す。６ヶ月齢雄ａｃｅ２＋／ｙ、ａｃｅ２−／ｙ、ａｃｅ−／−およびａｃｅ−／−ａｃｅ２−／ｙ二重突然変異同腹子マウスにおける収縮期心臓の心エコー測定。心エコーを図６ａの記載と同様にして分析し、標識した。ａｃｅ２ヌルバックグラウンドでのＡＣＥの除去がａｃｅ２−／ｙ単一突然変異マウスで観察された収縮期の心臓の障害を完全に救済することに注意。
【０１３８】
【図９】ベースラインからのエラスタンスの変化のパーセントを経時的に計算した。肺のエラスタンスは気管の最大圧を容積で除することにより計算した。
【０１３９】
【図１０】（ａ）ヒトＡＣＥ２ ＤＮＡ（配列番号１）。（ｂ）ヒトＡＣＥ２ポリペプチド（配列番号２）。
【０１４０】
【図１１】（ａ）マウスＡＣＥ２ ＤＮＡ（配列番号３）。（ｂ）マウスＡＣＥ２ポリペプチド（配列番号４）。
【０１４１】
【図１２】ＡＣＥ２ヌクレオチド多型および配列。
【図１】
0004598518.tif 000012
【図２ａ】
0004598518.tif 000013
【図２ｂ】
0004598518.tif 000014
【図３ａ】
0004598518.tif 000015
【図３ｂ】
0004598518.tif 000016
【図３ｃ】
0004598518.tif 000017
【図３ｄ】
0004598518.tif 000018
【図４】
0004598518.tif 000019
【図５ａ】
0004598518.tif 000020
【図５ｂ】
0004598518.tif 000021
【図５ｃ】
0004598518.tif 000022
【図５ｄ】
0004598518.tif 000023
【図６ａ】
0004598518.tif 000024
【図６ｂ】
0004598518.tif 000025
【図６ｃ】
0004598518.tif 000026
【図７ａ】
0004598518.tif 000027
【図７ｂ】
0004598518.tif 000028
【図７ｃ】
0004598518.tif 000029
【図８ａ】
0004598518.tif 000030
【図８ｂ】
0004598518.tif 000031
【図８ｃ】
0004598518.tif 000032
【図９】
0004598518.tif 000033
【図１０ａ】
0004598518.tif 000034
0004598518.tif 000035
【図１０ｂ】
0004598518.tif 000036
【図１１】
0004598518.tif 000037
【図１２】
0004598518.tif 000038
【配列表】
0004598518000001.app