(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラから次に示す式（Ｉ）
【化２】
0004454051.tif 000004
により表される糖脂質を製造する方法において、
前記紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラをアセトン、メタノールおよびクロロホルム−メタノール混液からなる群から選ばれる有機溶媒又は有機溶媒混液の１つにより抽出する工程と、
前記有機溶媒抽出物を減圧濃縮する工程と、
前記減圧濃縮した抽出物を酸性条件下に酢酸エチル−水による層分配に供し、水層を分離する工程と、
前記分離した水層をアルカリ性条件下に酢酸エチルとの層分配に供し、酢酸エチル層を分離する工程と、
前記分離した酢酸エチル層を減圧濃縮し、得られた緑色の粗粉末を回収する工程と、
前記粗粉末を精製する工程と、
前記精製工程で得られた溶液を減圧濃縮し、得られた白色粉末を回収する工程とを具備することを特徴とする方法。
【請求項２】
次の式（Ｉ）
【化６】
0004454051.tif 000005
により表される糖脂質を有効成分とする免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な糖脂質、その製造方法並びに高等動物ＤＮＡ合成酵素及びＨＩＶ(human immunodeficiency virus)由来逆転写酵素に対する阻害剤、免疫抑制剤及び制癌剤としてのその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等生物のＤＮＡ合成酵素群は、生体内の細胞分裂、分化などに根源的に関与することから、生物の恒常性維持に不可欠な要素である。ＤＮＡ合成酵素群のうちＤＮＡ合成酵素α、β、γ、δ及びεの５種類については、ここ１０年ほどで各々の酵素反応の特徴が主にイン・ビトロでの証明から明らかになっている。
【０００３】
例えば、ＤＮＡ合成酵素βは、ＤＮＡ鎖の組み換え(recombination) に深く関与する酵素であるといわれている。ここで「組み換え」とは、１つの細胞内にあるＤＮＡ同士の組み換えをいい、特定蛋白をコードするＤＮＡを、大腸菌などに組み込む遺伝子工学でいう「組み換え」とは異なる。
【０００４】
ＤＮＡ合成酵素βが関与するＤＮＡの組み換えは、主に次の２つの場面で必要であると考えられている。１つは、ＤＮＡ中に散在する傷の修復の際であり、他の１つは、細胞で新たな遺伝情報を発現する際である。前者はＤＮＡの組み換え修復と呼ばれ、後者は体細胞型ＤＮＡ組み換えと呼ばれる。
【０００５】
ＤＮＡ合成酵素βが関与する上記２種類の組み換えのうち体細胞型ＤＮＡ組み換えは、未だどのような組織で、あるいは生体反応のいかなる場面で起こりうるか完全には分かっていないが、少なくとも免疫担当細胞では必ず起こっているということが明らかになっている。
【０００６】
例えば、広瀬らの「マウス組織中のＤＮＡ合成酵素βの発現レベルにおける相違」(Experimental Cell Research, 181(1989), 169-180)には、ＤＮＡ合成酵素βは、動物組織のうち精巣、胸腺、脾臓、大脳において、酵素量としても、ｍＲＮＡの発現量でも突出して多く存在することが報告されている（図２、３、４、表１）。この広瀬らの文献には、胸腺、脾臓の組織におけるＤＮＡ合成酵素βが、体細胞型ＤＮＡ組み換えを司り得ると記載されている（第１７８頁、第３１〜３８行）。
【０００７】
広瀬らによりＤＮＡ合成酵素βが多く存在すると報告される上記４つの組織のうち胸腺及び脾臓は、免疫担当細胞が多く存在する組織である。胸腺はＴリンパ球、脾臓はＢリンパ球の存在組織とされている。Ｂリンパ球及びＴリンパ球は、侵入抗原に対し最も特異的な抗体（Ｔリンパ球では細胞表面の抗原レセプター）を産生すべく前駆細胞から分化する。このような、免疫反応において限られた遺伝子情報から多様な（異なる無数の）抗原に対し特異的に反応する抗体（又はＴリンパ球抗原レセプター）を生産する仕組みにＤＮＡ合成酵素βが関与していると考えられている。
【０００８】
より詳細に説明すると、Ｂリンパ球では、分化の途上で抗体蛋白をコードするＤＮＡのＶ遺伝子とＪ遺伝子との間で、上述したＤＮＡ合成酵素βが関与する体細胞型ＤＮＡ組み換えが起こる。この組み換えをＶ−Ｊ組み換えという。このような組み換えにより、限られた遺伝情報から組み合わせを変えることにより多様な抗体蛋白を生産し得る。これをＤＮＡ再構成という。
【０００９】
Ｔリンパ球の抗体レセプター蛋白も抗体と同様、該当ＤＮＡの組み換え、再構成により、多様な、言い換えれば個々の抗原の違いに対応できる特異的なレセプターを産生できる。
【００１０】
このように、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応のＤＮＡ再構成において抗原特異的に反応する抗体あるいはレセプター分子を作り出す根源に関与するといえる。
したがって、ＤＮＡ合成酵素βを阻害すると、ＤＮＡ再構成を中心とした免疫反応が抑制されると推測される。
【００１１】
上述したように、免疫反応において限られた遺伝子情報から多様な抗原に対し特異的に反応する抗体を生産する仕組みとしてＶ−Ｊ組み換えが存在する一方で、多様性の獲得には、このほかにもう一つ別の分子機構がある。すなわち、抗体遺伝子上に変異が起こることにより、組み換えと併せて更に多様性に幅ができるというものである。ここでいう「変異」は、例えば抗体蛋白の一部分が全て欠落してしまうような大規模なものではなく、塩基配列の一部が置換されたり新たな配列が挿入されてアミノ酸の構成が少しづつ違う抗体ができるというようなものである。したがって、変異といっても有害なものではなく、むしろある程度までは発生した方が免疫反応には都合が良いということになる。
【００１２】
この変異にもＤＮＡ合成酵素βが一定の役割を果たしていると考えられている。
例えば、トーマス(Thomas)らによる「末端トランスフェラーゼにより仲介されるＤＮＡの転移」(Proceedings National Academy of Science of the United States of America, vol. 83, pp.1867-1871, March 1986)には、ＴｄＴ(terminal deoxyribonucleotidyl transferase) とＤＮＡ合成酵素βを共存させた実験系で変異の頻度を測定した結果が報告されている。ＴｄＴは、上記５つのＤＮＡ合成酵素α〜εとは異なる特殊なＤＮＡ合成酵素であり、トーマスらによれば、変異の出現又はその頻度を上げるのに密接に絡んでいるとされる酵素である。トーマスらの文献の表２には、ＴｄＴの濃度に依存して変異頻度も上昇し、最大の４４％の変異頻度は、ＤＮＡ合成酵素β単独の場合よりも、ＴｄＴ単独の場合よりも高いことが報告されている。さらに、トーマスらの文献には、ＴｄＴとＤＮＡ合成酵素βとの両酵素が競合的に反応して変異を起こすと記載されている（１８６８頁、左欄）。
【００１３】
トーマスらの報告から、ＤＮＡ合成酵素βは、ＴｄＴが誘発する変異を、少なくとも補助的に増幅させる役割を果たしていると解釈することができる。すなわち、ＤＮＡ合成酵素βは、変異による抗体の多様性に一定の役割を果たしていることになる。このことからも、ＤＮＡ合成酵素βの阻害は免疫反応を抑制することにつながると考えられる。
【００１４】
現在、ＤＮＡ合成酵素βを選択的に阻害する化合物としては、ジデオキシＴＴＰが知られている（テルサ(Tersa) ら、Annual Review of Biochemistry 1991 60 513-552)。しかしながら、ジデオキシＴＴＰは、生体内では毒性が強く、際立つ生理活性は観察されていない。
【００１５】
一方、ＤＮＡ合成酵素群の酵素のうちＨＩＶ由来逆転写酵素は、周知のごとくＨＩＶ感染時の中心的役割を担う酵素である。ＨＩＶ由来逆転写酵素を阻害することによりＨＩＶに対して治療効果をもたらし得ることは、例えばアジドチミジンのような既に市販の臨床薬によっても実証されている（日本医薬情報センター編、株式会社薬事時報社発行、「１９９６年度版  医療薬  日本医薬品集」、第５９９頁）。しかしながら、容易に変異するＨＩＶに対してはアジドチミジンなど現存の薬剤のみでは対応が難しく、新たなＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害物質の開発が望まれている。
【００１６】
上記ジデオキシＴＴＰ、アジドチミジンを含む多くのＤＮＡ合成酵素阻害物質は、その構造がＤＮＡの類似体であり、ＤＮＡ合成反応において拮抗型阻害を示す。拮抗型の阻害剤は、その阻害率は良好である反面、他の様々なＤＮＡ代謝酵素にも取り込まれてしまい生体に対する副作用を示す一因となり得る欠点を有している。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、特にβ型のＤＮＡ合成酵素に対する高い阻害作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有する新規生理活性物質及びその製造方法を提供することを課題とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の藻類から抽出される糖脂質が、ＤＮＡ合成酵素βに対する高い阻害作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有すること、さらには、この糖脂質がＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用、及び特に特定の制癌剤と併用することにより癌細胞増殖抑制作用を有することを見い出し本発明を完成するに至った。
【００１９】
また、上述したように、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応の根源に関与する酵素である。したがって、ＤＮＡ合成酵素βの阻害活性を有する本発明の糖脂質は、免疫抑制剤として作用すると考えられる。
すなわち、本発明は次の（１）〜（６）を提供する。
（１）次の式（Ｉ）
【００２０】
【化７】
0004454051.tif 000002
により表される糖脂質。
【００２１】
（２）紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラから上記式（Ｉ）により表される糖脂質を製造する方法において、前記紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラをアセトン、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール又はクロロホルム−メタノール混液からなる群から選ばれる有機溶媒又は有機溶媒混液の１つにより抽出する工程と、前記有機溶媒抽出物を減圧濃縮する工程と、前記減圧濃縮した抽出物を酸性条件下に酢酸エチル−水による層分配に供し、水層を分離する工程と、前記分離した水層をアルカリ性条件下に酢酸エチルとの層分配に供し、酢酸エチル層を分離する工程と、前記分離した酢酸エチル層を減圧濃縮し、得られた緑色の粗粉末を回収する工程と、前記粗粉末を精製する工程と、前記精製工程で得られた溶液を減圧濃縮し、得られた白色粉末を回収する工程とを具備することを特徴とする方法。
【００２２】
（３）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とする医薬。
（４）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とするＤＮＡ合成酵素β阻害剤。
【００２３】
（５）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とするＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤。
（６）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とする免疫抑制剤。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質（以下ＫＭ０４３ともいう）について詳細に説明する。
本発明のＫＭ０４３の製造方法の一例を挙げる。
【００２５】
すなわち、海藻類から有機溶媒により抽出される物質を、酸性条件下に有機溶媒と水との液層分配に供する。得られた水層をアルカリ性条件下に有機溶媒との液層分配に供する。得られた有機層をさらに精製することにより本発明のＫＭ０４３を製造することができる。
【００２６】
海藻としては、例えば紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラ(Gigartina tenella) を用いることができる。
抽出溶媒としては、例えばアセトン、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール又はクロロホルム−メタノール混液（２：１（体積比））を用いることができる。抽出溶媒としては、アセトンがＫＭ０４３の収量の観点から好ましい。
【００２７】
抽出溶媒は、ＫＭ０４３の抽出効率の観点からできるだけ多く用いることが好ましい。抽出溶媒は、通常、海藻乾燥重量の５倍以上を用い、海藻乾燥重量の３０倍の抽出溶媒を用いるとより抽出効率が上がる。しかしながら、抽出溶媒の量は、抽出効率とコスト等の観点から適宜設定することができる。
【００２８】
本発明のＫＭ０４３の製造方法をより詳細に説明する。ギガルティナ・テネラ藻体の乾燥物を粉砕処理し、アセトンで抽出する。得られたアセトン層を減圧濃縮後、好ましくはpH２〜５、さらに好ましくはpH２の条件下に酢酸エチルと酢酸エチルに対して１〜３倍体積の水とにより液層分配を行う。液層分配に用いる水の量は、酢酸エチルに対して３倍体積が好ましい。得られた水層に対して１〜３倍体積、好ましくは３倍体積の酢酸エチルを添加、混合し、好ましくはpH９〜１１、さらに好ましくはpH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチル層を得る。これを減圧濃縮すると緑色の粗粉末が得られる。
【００２９】
この粗粉末は、例えば次のような工程にさらに供することにより精製することができ、白色粉末状の本発明の糖脂質の精製物が得られる。
すなわち、得られた粗粉末を、次の精製工程であるシリカゲルカラムクロマトグラフィーの展開溶媒として用いる有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付す。展開溶媒としては、例えば酢酸エチル、メタノールを用いることができる。酢酸エチル−メタノール−水（１００：３０〜１５：５、好ましくは１００：２０：５（いずれも体積比））の混合溶媒で溶出する分画を集める。これを減圧濃縮後、高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニトリル８０〜７０％水溶液、好ましくは７０％水溶液により溶出する分画を得る。これを減圧濃縮後、さらに高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニトリル７０〜６０％、好ましくは６５％水溶液により溶出する分画を得る。この分画を減圧濃縮することにより、白色粉末状の本発明の糖脂質の精製物が得られる。
【００３０】
ＫＭ０４３は、上記の方法以外に、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等による分配クロマトグラフィー、他の活性アルミナ樹脂、イオン交換樹脂のような適当な既知の吸着剤に吸着させて溶離させる方法、あるいは高速液体クロマトグラフィー法などを組み合わせることにより精製することもできる。
【００３１】
本発明のＫＭ０４３及びその薬学的に許容し得る塩は、医薬として用いることができる。具体的には、本発明のＫＭ０４３及びその薬学的に許容し得る塩（以下、医薬の説明において、単に「本発明のＫＭ０４３」ともいう）は、免疫抑制剤、ＨＩＶに対する抗ウイルス剤、抗癌剤又は既存の抗癌剤と共に治療効果を促進するための助剤として用いることができる。
【００３２】
ＫＭ０４３の薬学的に許容し得る塩の例としては、ナトリウム及びカリウムのような一価の陽イオンの塩を挙げることができる。
本発明のＫＭ０４３を医薬として用いる場合、ＫＭ０４３を単独で用いることもできるが、薬学的製剤として用いることが好ましい。薬学的製剤において、本発明のＫＭ０４３は、薬学的に許容され得る適切な担体または希釈剤等と組み合わせて製剤することができる。また、本発明のＫＭ０４３は、薬学的製剤において、薬学的に許容され得る他の活性化合物と共に用いることもできる。
【００３３】
本発明のＫＭ０４３を含有する薬学的製剤は、経口投与、非経口投与又は直腸内投与することができる。薬学的製剤は、これらの各の投与経路に対して適切な、それ自体は既知の通常用いられる方法により固体、半固体、液体又は気体の剤形にすることができる。具体的には、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤・乳剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルなどの剤形とすることができる。しかしながら、本発明のＫＭ０４３を含有する薬学的製剤の剤形はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明のＫＭ０４３を経口投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤・乳剤等に製剤することができる。
錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤には、本発明のＫＭ０４３を適切な担体と共に処方することにより製剤することができる。好適な担体として用い得るものには、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ又は馬鈴薯デンプンのような通常用いられる担体；結晶セルロース、セルロース誘導体、コーンスターチ又はゼラチンのようなバインダー；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン又はカルボキシメチルセルロースナトリウムのような錠剤崩壊剤；タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤等が含まれ、さらに、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、浸潤剤、保存剤及びフレーバー剤等を添加することができる。
【００３５】
シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤・乳剤には、所定量のＫＭ０４３と注射用滅菌水や規定生理食塩水のような薬学的に許容され得る溶媒を用い単位剤型に調製することができる。本明細書において、「単位剤型」との用語は、投与対象のための単位となる容量として適する物理的に個別の単位を指し、各単位は薬学的に許容され得る希釈剤、担体又は溶媒等と共に、必要な薬効を与えるのに十分な量に計算されたＫＭ０４３を所定量含有するものをいう。
【００３６】
また、本発明のＫＭ０４３は、液体又は微細粉末の形態で吸入用製剤として処方することができる。吸入用製剤には、気体又は液体の噴霧剤と共に、必要に応じて浸潤性付与剤のような従来用いられる助剤を添加することができる。吸入用製剤としては、本発明のＫＭ０４３をエアロゾル容器に充填することもできるし、ネブライザーのような非加圧容器に充填することもできる。エアロゾル容器に充填する場合、本発明のＫＭ０４３は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等の薬学的に許容し得る加圧ガス中に添加したものとすることができる。
【００３７】
非経口投与する場合、本発明のＫＭ０４３は、植物性油、合成樹脂酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールのような水性又は非水性の溶媒中に溶解、懸濁又は乳化し、さらに、必要に応じて可溶化剤、浸透圧調節剤、乳化剤、安定剤及び保存料のような従来の添加剤を添加することにより注射用製剤として処方することができる。
【００３８】
直腸内投与する場合、本発明のＫＭ０４３を乳化基剤又は水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより坐薬製剤として処方することができる。基剤の一例を挙げると、体温で融解するが室温では固化しているカカオバター、カーボンワックス及びポリエチレングリコールなどがある。
【００３９】
本発明のＫＭ０４３の投与量は、その用途すなわち、免疫抑制剤、ＨＩＶに対する抗ウイルス剤、抗癌剤及び既存の抗癌剤と共に治療効果を促進するための助剤、並びに投与経路、対象とする疾病の程度や段階等に応じて適宜設定することができる。一例を挙げると、ＫＭ０４３を経口剤として投与する場合には、好ましくは１〜８０ｍｇ／ｋｇ体重／日に設定することができる。ＫＭ０４３を注射剤として投与する場合には、１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重／日に設定することができる。これらの投与量は、医者等のような治療を行う者により、治療対象者の病状等に対応させて適宜調節することができる。
【００４０】
【実施例】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
（実施例１）
本発明の一般式（Ｉ）で表される糖脂質の抽出及び精製
海浜より採取したギガルティナ・テネラ藻体の乾燥物約２００グラムを粉砕処理し、２リットルのアセトンで１週間抽出した。
【００４１】
抽出物を減圧濃縮後、酢酸エチル−水（１：１（体積比））を用いてpH２条件下に液層分配を行い、水層を得た。残りの酢酸エチル層にこれと同体積の水を添加し、pH２条件下に液層分配を行い、水層を得た。再度残りの酢酸エチル層にこれと同体積の水を添加し、pH２条件下に液層分配を行い、水層を得た。得られた水層を集め、水層に対して同体積の酢酸エチルを添加し、pH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチル層を得た。残りの水層にこれと同体積の酢酸エチルを添加し、pH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチル層を得た。再度残りの水層にこれと同体積の酢酸エチルを添加し、pH９の条件下液層分配を行い、酢酸エチル層を得た。得られた酢酸エチル層を集め、これを減圧濃縮し、緑色の粗粉末を得た。この緑色の粉末を酢酸エチルに再溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(4cm×40cm、ワコーゲルC ２００  和光純薬社製）に付し、酢酸エチル−メタノール−水（１００：２０：５（体積比））の混合溶媒で溶出する分画を集めた。これを減圧濃縮することにより得られる黄色の粗粉末を、高速液体クロマトグラフィー(C18カラム  YMC D-ODS-5-ST 120A （株）ワイエムシイ社製) に付し、アセトニトリル７０％水溶液により溶出する分画を得た。これを減圧濃縮後、さらに高速液体クロマトグラフィー(C8 カラム  InertsilC8  ジーエルサイエンス（株）製）に付し、アセトニトリル６５％水溶液により溶出する分画を得た。この分画を減圧濃縮し、本発明の式（Ｉ）により表される糖脂質（ＫＭ０４３）を白色粉末として約２ミリグラム得た。
【００４２】
上記実施例１で得られたＫＭ０４３は、結晶化させることができず、融点を測定することができなかった。
＜測定例１＞
上記実施例１で得た白色粉末を高速原子衝撃質量分析(FAB-MS)に供した。得られたスペクトルを図１に示す。
【００４３】
図１のスペクトルより、FAB-MS m/z 839.2(M-H) - が得られ、ＫＭ０４３の分子量（測定値）として８４０を得た。（分子式：Ｃ45Ｈ76Ｏ12Ｓからの計算値：８４０）。
【００４４】
＜測定例２＞
実施例１で得たＫＭ０４３について、溶媒としてＣＤ3 ＯＤ（重メタノール）、内部標準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を用い、1 Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００４５】
得られたスペクトルを図２に示す。
図２において、（ａ）〜（ｆ）を付したシグナルは、それぞれ次のものと思われる。
【００４６】
（ａ）メチル基、                （ｂ）メチレン鎖、
（ｃ）＝ＣＨ−ＣＨ2 −ＣＨ2 −、（ｄ）−ＣＨ2 −ＣＯ−、
（ｅ）＝ＣＨ−ＣＨ2 −ＣＨ＝、  （ｆ）−ＣＨ2 −ＨＣ＝ＣＨ−ＣＨ2 −
上記シグナル（ａ）〜（ｆ）は、ＫＭ０４３の構造において不飽和高級脂肪酸鎖の存在を示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致した。シグナル（ｄ）は、ＫＭ０４３において脂肪酸と糖がグリセロール骨格を介して結合する「グリセロ糖脂質」であることを示唆し、式（Ｉ）の構造と合致する。
【００４７】
図２において、シグナル（ｇ）及び（ｇ' ）は、それぞれが糖のプロトンを示すものである。このことから、実施例１で得られたＫＭ０４３の糖部分が単糖であり、その１位と２位以下のプロトンの組み合わせを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致する。
【００４８】
＜測定例３＞
実施例１で得たＫＭ０４３を中性メタノールに溶解し、ＵＶスペクトルを測定した。
【００４９】
得られたスペクトルを図３に示す。
＜測定例４＞
実施例１で得たＫＭ０４３を以下に示す薄層クロマトグラフィーに付し、Ｒf 値を求めた。
【００５０】
吸着剤：シリカゲルプレート(Kieselgel60F254  メルク社製）
展開溶媒が酢酸エチル−メタノール−水（１００：２０：５）の場合のＲf 値は０．２０であった。
【００５１】
展開溶媒がイソプロパノール−メタノール（５：１）の場合のＲf 値は０．1 ０であった。
＜測定例５＞
実施例１で得たＫＭ０４３について、化学分解後、ガスクロマトグラフィーを行い、結合する脂肪酸を調べた。
【００５２】
得られたガスクロマトグラフを図４に示す。
図４のガスクロマトグラフから、Ｃ16:0とＣ20:5の脂肪酸に対応するピークの面積が同じであることが分かり、従って１：１の割合でそれぞれの脂肪酸がグリセロール骨格に存在することを示すものである。
【００５３】
＜測定例６＞
実施例１で得たＫＭ０４３の旋光度を測定し、［α］D＝＋５７．０２°（ｃ＝０．１１  ＭｅＯＨ）を得た。
【００５４】
＜定性試験１＞
上記実施例１で得たＫＭ０４３は、メタノール、ジメチルスルフォキシドに易溶であり、水、クロロホルムに難溶であった。
【００５５】
＜定性試験２＞
上記実施例１で得たＫＭ０４３は、硫酸オルシノール、ヨードに対して陽性であった。この結果は、ＫＭ０４３に炭素化合物が含有されることを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致する。
【００５６】
＜定性試験３＞
上記実施例１で得たＫＭ０４３は、ニンヒドリンに対して陰性であった。この結果は、ＫＭ０４３には蛋白、ペプチド、アミノ酸が含有されていないことを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致する。
【００５７】
＜測定例７＞
上記実施例１で得られたＫＭ０４３のＤＮＡ合成酵素群に対する活性を次の方法で調べた。
【００５８】
ＤＮＡ合成酵素群としてＤＮＡ合成酵素α、ＤＮＡ合成酵素β及びＨＩＶ由来のＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）を試験した。ＤＮＡ合成酵素αは、牛胸腺から常法により抽出精製した標品を、ＤＮＡ合成酵素βは、ラット由来の該当遺伝子を通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を、ＨＩＶ由来のＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）は、市販（Worthington Biochemical 社製）の標品を用いた。
【００５９】
これらのＤＮＡ合成酵素に対するＫＭ０４３の阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸ＩＶ、東京化学同人、第６３頁〜６６頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した［3 Ｈ］−ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成酵素反応を行い、放射比活性を生成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。
【００６０】
阻害率は、（ａ）コントロールでの合成ＤＮＡ量、（ｂ）実施例１に示した方法で生成したＫＭ０４３の存在下での合成ＤＮＡ量について、
（ａ−ｂ）／ａ×１００＝阻害率（％）
として評価した。
得られた結果を次の表１に示す。
【００６１】
【表１】
0004454051.tif 000003
【００６２】
表１の結果から、ＫＭ０４３は、ＤＮＡ合成酵素βに対して高い阻害作用を有することが分かる。
上記従来の技術の欄において説明したように、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応のＤＮＡ再構成において抗原特異的に反応する抗体あるいはレセプター分子を作り出す根源に関与するとともに、変異による抗体の多様性に一定の役割を果たしているともいわれている。これらのことから、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応に密接に関連し、ＤＮＡ合成酵素βを抑制することは、免疫反応の抑制につながると推測される。よって、ＤＮＡ合成酵素β抑制作用を有するＫＭ０４３は、免疫抑制剤としての作用を有することが期待される。
【００６３】
表１の結果から、ＫＭ０４３は、ＨＩＶ由来ＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）に対しても高い阻害作用を有することが分かる。
＜測定例８＞
上記実施例１で得られたＫＭ０４３のＤＮＡ合成酵素阻害の作用機構をLineweaver-Burk プロットにより調べた。
【００６４】
ＤＮＡ合成酵素βに関してＫＭ０４３は、活性化ＤＮＡ及びｄＴＴＰに対し共に非拮抗的阻害を示した。
＜測定例９＞
上記実施例１で得られたＫＭ０４３の癌細胞増殖抑制効果を次の方法を用いて評価した。
【００６５】
i)細胞培養方法
本実験に用いた細胞は、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ−Ｓ３細胞である。
培地としては、イーグル最少（ＭＥＭ）培地（日水製薬社製）に、０．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、０．０００３％（Ｗ／Ｖ）グルタミン、及び子牛血清１０％（V ／V ）を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ2 インキュベータにて３７℃で行った。
【００６６】
ii) ＫＭ０４３の添加および細胞生存率の測定
上記に示した培地に、予め各試験濃度になるようにＫＭ０４３を溶解した。ただし、ＫＭ０４３は水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培養中の培地内に存在するＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、本測定例で用いたＨｅｌａ−Ｓ３細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否定できる状態である。
【００６７】
本試験のための培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウエルに２．０×１０3 個の細胞を植込み、１つの試験濃度に対し３ウエルずつ与えた。またポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。
【００６８】
ＫＭ０４３添加後は、５％ＣＯ2 インキュベータ内、３７℃で４８時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。
生存率の判定は、文献（「Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays 」、Tim Mosmann, Journal of Immunological Methods, 65 (1983) 55 〜63）に記載されているＭＴＴアッセイ法を用いた。即ち、上記４８時間培養後テトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、更に４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞数に比例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）で定量した。
【００６９】
細胞生存率は次の式により算出した。
細胞生存率（％）
＝試験区のＯ. Ｄ. ［５７０ｎｍ］／対照区のＯ. Ｄ. ［５７０ｎｍ］
得られた結果を図５に示す。なお図５に示すデータは３ウエルの平均値である。
【００７０】
図５の結果から、ＫＭ０４３は、濃度依存的に癌細胞の増殖を抑えることが分かる。しかしながら、その細胞増殖抑制作用は、ブレオマイシンのような既知抗癌剤に比べると低い。
【００７１】
＜測定例１０＞
上記実施例１で得られたＫＭ０４３が他の抗癌剤と併用された場合に示す抗癌作用を次の方法を用いて測定した。
【００７２】
i)細胞培養
細胞培養条件は、上記測定例９と同じに行った。
ii) ＫＭ０４３及びブレオマイシン(Bleomycin) の添加
予め５０μＭのＫＭ０４３（上記測定例９と同じ方法で溶解した）と所定濃度のブレオマイシンを溶解した培地（１）：「ＫＭ０４３  ５０μＭ＋ブレオマイシンの試験区」、及び所定濃度のブレオマイシンのみを溶解した培地（２）：「ブレオマイシンのみの試験区」）を用意した。
【００７３】
各ブレオマイシン濃度に対しては、３ウエルずつを与えた。各ウエルには２．０×１０3 個の細胞を植込み、続いて薬剤を含む培地を加えた。
「ＫＭ０４３  ５０μＭ＋ブレオマイシンの試験区」、「ブレオマイシンのみの試験区」について、それぞれ５％ＣＯ2 インキュベータ内、３７℃で４８時間培養後、細胞生存率を測定した。（測定方法は、上記測定例９と同じ）。
【００７４】
得られた結果を図６に示す。図６において、破線により結ばれる黒い丸は、培地（１）：「ＫＭ０４３  ５０μＭ＋ブレオマイシンの試験区」の結果を、実線により結ばれる黒い四角は培地（２）：「ブレオマイシンのみの試験区」の結果を表す。
【００７５】
図６の結果から、実施例１で得たＫＭ０４３は、測定例９に示したようにその濃度が癌細胞の増殖にほとんど影響がないほどの低濃度（５０μＭ）であるにもかかわらず、低濃度のブレオマイシンと併用することによりブレオマイシンのみの場合より癌細胞の増殖を強く抑えることが分かる。
【００７６】
現在、抗癌剤治療においてその副作用が問題となっているが、実施例１で得たＫＭ０４３を併用することにより、抗癌剤の量をへらしつつ同等の治療効果を維持することができると考えられる。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な糖脂質、その製造方法及びその用途が提供される。
本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質は特にβ型のＤＮＡ合成酵素に対する高い阻害作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有する。
【００７８】
このようなＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応の根元に関与する酵素であるので、ＤＮＡ合成酵素βの阻害活性を有する式（Ｉ）で表される糖脂質は、免疫抑制剤として作用すると考えられる。さらに、その作用機序が非拮抗型であるので、式（Ｉ）で表される糖脂質は、生体に対する副作用が少ないことが予想される。
【００７９】
また、式（Ｉ）で表される糖脂質は、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害作用を有する。
さらに、式（Ｉ）で表される糖脂質は、特に他の抗癌剤との併用により強い癌細胞増殖抑制作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質の高速原子衝撃質量分析スペクトル。
【図２】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質の1 Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図３】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質のＵＶスペクトル。
【図４】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質のガスクロマトグラフ。
【図５】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質（単独）の癌細胞増殖抑制作用を表すグラフ。
【図６】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質（併用）の癌細胞増殖抑制作用を表すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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