(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ:
【化１】
0004532619.tif 000004
（式中、Rは炭素数１６〜２０の直鎖または分岐鎖状アルキル基を示す。）
で表されるウリジン５’−アルキルホスフェート化合物を有効成分とするカルシウム拮抗剤。
【請求項２】
ウリジン５’−アルキルホスフェート化合物が遊離形、または水和物および塩から選択される生体内で遊離形を与え得る医薬的に許容される形で使用される、請求項１記載のカルシウム拮抗剤。
【請求項３】
血小板凝集抑制剤として使用される、請求項１または２記載のカルシウム拮抗剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウリジン５’−アルキルホスフェート化合物の新しい用途、特にカルシウム拮抗剤としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
感染症は、抗生物質などの薬剤によって克服されつつあるが、他方、循環器系疾患は、食生活の西洋化に伴う摂取脂肪量の急激な増加と日本古来からの高塩化ナトリウム食とが相まって、症例の拡大を見つつあり、高齢化が進む将来においてはゆゆしい問題になることが懸念されている。このような状況を反映して、種々の循環器用薬剤が開発されてきているが、中でもカルシウム拮抗作用を機序とする循環器用薬にはその優れた薬効から大きな期待が寄せられている。
【０００３】
カルシウム拮抗剤は、血管平滑筋細胞へのカルシウムイオンの流入を抑制することにより、冠動脈の太い部分および細い部分の両方を弛緩させ、これにより冠動脈血流量を増加させ、心筋への酸素供給を増大させる。従来のカルシウム拮抗剤は、主にニフェジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムの三つのタイプに分けられるが、これらのうち、ニフェジピンタイプ（ジヒドロピリジンタイプ）のカルシウム拮抗剤は、血管のみならず、心筋細胞におけるカルシウムイオンの流入も抑制する作用を有しており、ベラパミルやジルチアゼムに比較して、相対的に心臓抑制作用が弱いと理解されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
カルシウム拮抗剤は、現在、狭心症や心筋梗塞のような虚血性心疾患の治療薬として注目を浴びるに至っており、より強力かつ安全な効力を有するカルシウム拮抗剤の提供が、常時、要望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らも、このような要望に応えるべく、種々のヌクレオシド化合物について種々研究を重ねるうち、ウリジン５’−アルキルホスフェート化合物が顕著なカルシウム拮抗作用を有する事実を確認し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】
ウリジン類化合物については、本発明に先立って、ウリジン５’−モノホスフェート（ＵＭＰ）の血小板凝集作用の有無を検討した事実が存在するが、陰性の結果が得られた旨、報告されている（薬学雑誌、１１１（９）５０４−５０９（１９９１））。
【０００７】
また、ウリジン５’−アルキルホスフェート類は、酵母菌のα及びαハプロイド（１倍体）細胞間の有性凝集を阻害するが、細胞の成長には影響しないことが報告されている（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４７，１７−２２（１９９７））。この凝集阻害は、ウリジン５’−アルキルホスフェート類の酵母菌細胞壁への直接の作用によるものではないことが明らかになっている。
【０００８】
本発明の要旨は、式Ｉ：
【化２】
0004532619.tif 000002
（式中、Rは直鎖または分岐鎖状アルキル基を示す。）
で表されるウリジン５’−アルキルホスフェート化合物を有効成分とするカルシウム拮抗剤、特に血小板凝集抑制剤にある。
【０００９】
上記式Ｉにおいて、Rで示されるアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれであってもよい。その炭素数は、通常３０を超えることはなく、好ましくは４〜２４、更に好ましくは１６〜２０である。このようなアルキル基の具体例としては、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコシルなどの直鎖状アルキルまたはゲラニル、ファルネシルなどの分岐鎖状アルキルを挙げることが出来る。現時点で最も好ましいと考えられるものは、Ｒが炭素数１６のｎ−ヘキサデシル基を表す場合、すなわちウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＵＭＰＣ１６）である。
【００１０】
有効成分としてのウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（I)は、遊離形のみならず、医薬的に許容される限り、水和物、塩、エステルなど、生体内で遊離形を与えることの出来る任意の形で使用されてよい。従って、以下の記載において、化合物（I)は、遊離形のみならず、そのような医薬的に許容される任意形をも包括して意味するものとする。
【００１１】
本発明化合物（Ｉ）、すなわちウリジン５’-アルキルホスフェートは、一般にウリジン５’−モノホスフェート（式Ｉにおいて、Ｒ＝Ｈに相当する化合物）から自体常套の方法により合成することが出来る。たとえば、ウリジン５’−モノホスフェートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルアルコールをｔ−ブチルアルコールに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させることにより、製造することが出来る。反応温度は、溶媒の種類により異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは７０〜９０℃であり、反応時間は、反応温度により異なるが、通常２〜２０時間、好ましくは６〜８時間である。
【００１２】
化合物（I)は、後記するように、ウサギの血小板を使用する凝集試験において、阻害効果を有する事実が確認された。また、化合物（I）について、細胞内カルシウムイオン流入抑制作用を有する事実も確認された。従って、化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗剤として有用なものであり、更に血小板凝集抑制剤として有用なものである。
【００１３】
化合物（I)は、たとえば経口、非経口、口腔、経直腸または経皮投与により、すなわち薬剤を適用するのに都合のよい方法で投与することが出来る。経口投与のためには、液体または固体、たとえば、シロップ、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセルまたはロゼンジとして処方できる。
【００１４】
液体処方は、一般に、化合物（Ｉ）を、沈殿防止剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤などのような任意の添加剤と共に、適当な液体担体（たとえばエタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、油、水）中ヘ、懸濁または溶解させて調製する。
【００１５】
錠剤形である組成物は、固体処方の製造に慣用的な適宜の医薬担体を用いて製造することが出来る。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。
【００１６】
カプセル形である組成物は、慣用的カプセル化操作を用いて製造できる。たとえば、活性成分含有のペレットを標準担体の使用により調製し、次いで硬ゼラチンカプセルに充填することができる。別法として、いずれか適当な医薬担体、たとえば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁液を調製し、ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００１７】
化合物（Ｉ）は、また、ボーラス注射または点滴により非経口投与してもよい。典型的な非経口用組成物は、該化合物の滅菌水性担体または非経口的に許容される油中、たとえばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油中溶液または懸濁液からなる。別法として、該溶液を凍結乾燥し、ついで投与直前に適当な溶媒で復元してもよい。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセルまたはアンプルのような単位投与形であるのが好ましい。経口投与用の各投与単位は、１〜２５０ｍｇ（非経口投与では、好ましくは０.１〜６０ｍｇ）の化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）を含有するのが好ましい。
【００１９】
成人患者の場合、一日の投与量は、たとえば化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）が、１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２５０ｍｇ（たとえば５〜２００ｍｇ）の経口用量、あるいは０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０.１ｍｇ〜６０ｍｇ（たとえば１〜４０ｍｇ）の静脈内、皮下または筋肉内用量であり、それを一日に１〜４回投与する。また、化合物（Ｉ）を、好ましくは一日当たり４００ｍｇまでの用量で、連続的静脈内注入により投与してもよい。かくして、経口投与による一日の全用量は、１〜２０００ｍｇの範囲にあり、非経口投与による一日の全用量は０.１〜４００ｍｇの範囲にある。適当には、該化合物を連続的治療の期間中、たとえば１週間またはそれ以上の期間投与する。
【００２０】
【発明の実施の態様】
以下の記載は、本発明化合物（Ｉ）の製造例、製剤例および試験例を示すものである。
【００２１】
製造例
ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）およびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのｔ−ブチルアルコールに溶解した後、３ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、８０℃で２０時間加熱する。反応終了後、生成した沈殿を濾別し、ｔ−ブチルアルコールを減圧下に除去する。残渣をヘキサンおよびアセトンの混液（１：１）で数回洗浄し、乾燥した後、クロロホルムおよびメタノールの混液（９５：５）に溶解する。これを同溶液にて作成したシリカゲルカラムに負荷し、カラムを同液で充分洗浄してジシクロカルボジイミドを流出させる。以後、メタノールの濃度を順次、上昇させることによって、ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェートを溶出する。溶出液から溶媒を減圧下に除去することにより、白色の沈殿を得た。対ウリジン５’−モノホスフェートあたりの収率は、３２．４％であった。
【００２２】
製剤例１（静脈内注射）
化合物（Ｉ）              １−４０ｍｇ
バッファー                pＨ約７まで
溶媒                      １００ｍｌまで
【００２３】
製剤例２（ボーラス注射）
化合物（Ｉ）              １−４０ｍｇ
バッファー                pＨ約７まで
共溶媒                    ５ｍｌまで
【００２４】
上記製剤例１および２において、バッファーの具体例としてはクエン酸塩、リン酸塩および水酸化ナトリウム／塩酸を、溶媒の具体例としては水を、共溶媒の具体例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびアルコールを挙げることが出来る。
【００２５】
製剤例３（錠剤）
化合物（Ｉ）              １−４０ｍｇ
希釈剤／充填剤            ５０−２５０ｍｇ
結合剤                    ５−２５ｍｇ
崩壊剤                    ５−５０ｍｇ
滑沢剤                    １−５ｍｇ
【００２６】
上記製剤例３において、希釈剤／充填剤の具体例としては微結晶セルロース、ラクトースおよび澱粉を、結合剤の具体例としてはポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを、崩壊剤の具体例としてはナトリウム澱粉グリコレートおよびクロスポビドンを、滑沢剤の具体例としてはステアリン酸マグネシウムおよびステアリルフマル酸ナトリウムを挙げることが出来る。
【００２７】
製剤例４（経口用懸濁液）
化合物（Ｉ）              １−４０ｍｇ
沈殿防止剤                ０.１−１０ｍｇ
希釈剤                    ２０−６０ｍｇ
保存剤                    ０.０１−１.０ｍｇ
バッファー                pＨ約５−８まで
共溶媒                    ０−４０ｍｇ
フレーバー                ０.０１−１.０ｍｇ
着色剤                    ０.００１−０.１ｍｇ
【００２８】
上記製剤例４において、沈殿防止剤の具体例としてはキサンチンガムおよび微結晶セルロースを、希釈剤の具体例としてはソルビトール溶液、典型的には水を、保存剤の具体例としては安息香酸ナトリウムを、バッファーの具体例としてはクエン酸塩を、共溶媒の具体例としてはアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびシクロデキストリンを挙げることが出来る。
【００２９】
試験例
1．試験材料と試験方法
１−１．試験材料：−
試験化合物としてのウリジン５'−オクチルホスフェート（Ｉ：  Ｒ＝Ｃ8Ｈ17）（ＵＭＰＣ８）、ウリジン５'−ドデシルホスフェート（Ｉ：  Ｒ＝Ｃ12Ｈ25）（ＵＭＰＣ１２）、ウリジン５'−ヘキサデシルホスフェート（Ｉ：  Ｒ＝Ｃ16Ｈ33）（ＵＭＰＣ１６）、ウリジン５'−エイコシルホスフェート（Ｉ：  Ｒ＝Ｃ20Ｈ41（ＵＭＰＣ２０）およびウリジン５'−テトラコシルホスフェート（Ｉ：  Ｒ＝Ｃ24Ｈ49）（ＵＭＰＣ２４）は、それぞれ、製造例の方法に準じて合成した。
【００３０】
血小板凝集誘導剤としての１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＦ）は、Ｂachem Ｆeinchemikalien ＡＧ (Ｂubendorf, Ｓwitzerland)から購入したものを使用した。
【００３１】
カルシウム−イオン透過担体「Ａ２３１８７」、ウシ血漿由来トロンビン、アラキドン酸、パルミチン酸、アデノシン５'−ジホスフェート（ＡＤＰ）、イオノマイシンカルシウム塩およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、fraction Ｖ，必須脂肪酸を含まない）は、Ｓigma Ｃhemical Ｃo. (Ｓt. Ｌouis，ＭＯ，ＵＳＡ）の製品を用いた。フラ２ＡＭとフラ２は、同仁（熊本、日本）の製品を用いた。塩酸ベラパミル、１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）およびＦicoll−Ｐaqueは、それぞれ和光純薬（東京、日本）、Ｒesearch Ｂiochemicals Ｉnternational（Ｎatick, ＭＡ，ＵＳＡ）およびアマシャム・ファルマシア・バイオテク（東京、日本）から入手した。溶媒は全ての試薬が特級である。
【００３２】
バッファー組成は、次のとおりである：（１）基本タイロード（Ｔyrode）液：ＮaＣl ８.０１g/L，ＫＣl ０.１９５g/L，ＭｇＣl2 ６Ｈ2Ｏ ０.２１５g/L，ＮaＨＣＯ3 １.０２g/L，グルコース１.０１g/L，ｐＨ ７.２；（２）Ｃa2+ を含まずＥＤＴＡを含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ゼラチン（２.５g/L）とＮａ2 ＥＤＴＡ（０.３７３g/L）を含む,ｐＨ６.５; (３）Ｃａ2+を含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ＣaＣl2 ２Ｈ2Ｏ（０.１４３g/L）を含む,ｐＨ７.２; (４）ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを含む緩衝性生理食塩水：ＨＥＰＥＳ １.００g/L，ＮaＣl ８.０１g/L, ＫＣl ０.１９５g/L, デキストロース１.０１g/L, Ｎa2 ＥＤＴＡ ０.３７３g/L, ｐＨ７.４。
【００３３】
ウサギ血小板の調製：プラスチック容器やシリコン処理したガラス製容器が全ての血小板の調製と刺激実験に用いられた。洗浄されたウサギの血小板は、スガタニらの方法（J.Biol.Chem.，２６２巻、５７４０頁、１９８７年）を一部修正して調製した。それぞれ４５mL分のウサギ血液を、５mLの４１mM クエン酸−８５mM クエン酸三ナトリウム−２％グルコース溶液中で加え、１７０ｇで１０分間遠心分離した。血小板が豊富な血漿である上清多血小板血漿（platelet-rich  plasma：ＰＲＰ）は、１０mLのFicoll-Paqueで下層にし、７５０ｇで２０分間遠心分離した。血小板層は、０.１mMのＥＤＴＡを含んだ４０mLのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７.２）と穏やかに混合し、０.２mLのFicoll-Paqueに重層し、７５０ｇで、１０分間遠心分離した。再び、血小板層を０.１mMのＥＤＴＡを含んだ４０mLのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．２）で懸濁し、７５０ｇで１０分間遠心分離した。血球は、０.１mM  ＥＤＴＡを含んだタイロード/ゼラチン（ｐＨ６.５）で、１.０×１０9 cells/mLとなるように懸濁した。
【００３４】
1−２．試験方法：−
（血小板凝集試験）
血小板（１×１０8 cells，４００μL）は、１mM Ｃa2+ を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液中で刺激を受け、活性化される。凝集活性は、凝集測定器（Ｎikko Ｈematracer, ＰＡＴ−２Ａ）を使って、光透過の変化として測定される。０.０５％エタノール−０.００５％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解させたウリジン５'−アルキルホスフェートや生理食塩水に溶解させたベラパミルは、特に示さない場合は、ＰＡＦ等の刺激剤を添加する１分前に、反応系に添加される。血小板凝集阻害の割合は、［（コントロール反応−阻害反応）／コントロール反応］×１００で計算する。ＩＣ50は、添加量−反応量曲線の回帰分析によって得られる。
【００３５】
（サイトゾル中の遊離カルシウム濃度の測定）
０.１mMのＥＤＴＡを含んだＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７.４）中に懸濁したウサギ血小板（１×１０9 cells/mL）は、１×１０-6Ｍのフラ２−アセトキシメチルエステルと、３７℃４５分間インキュベートして細胞内に取り込ませ、細胞外色素を取り除くために１度洗浄した。０.１mM  ＥＤＴＡを含んだタイロード/ゼラチン緩衝液（ｐＨ６.５）で１×１０9 cells／mL濃度となるように再懸濁した。この血小板懸濁液（０.４８mL）を、丸底試験管に分取し、外液中のＣａ2+（[Ｃａ2+]0）濃度が１mMとなるようにＣaＣl2を添加した。
【００３６】
その後、これらのサンプルは、特注のキュベットホルダーに移し、記録計を備えた日本分光（東京、日本）蛍光分光光度計ＣＡＦ−１００中に設置し、３７℃に保温した。試験管内の磁石を回転させ、絶えず細胞を攪拌した。少なくとも５分間３７℃に保った後、細胞は、０.０１mMの前述した濃度のウリジン５'−アルキルホスフェートで１分間、次いで、０.０１mLの前述した濃度の凝集惹起物質を添加することにより、活性化した。フラ２蛍光は、３４０nm（Ｆ３４０）と３８０nm（Ｆ３８０）（それぞれ誤差±５nm）の励起波長で連続的に測定した。［Ｃａ2+]ｉの測定は、相当する発光シグナル（５００±１０nm）を、Ｒ３４０／３８０と表す比シグナル（Ｆ３４０／Ｆ３８０）と同様に計測した。
【００３７】
細胞内Ｃａ2+濃度［Ｃａ2+]ｉは、次の式から算出できる（G.Grynkiewicz  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  ２６０巻、３４４０頁、１９８５年）。
[Ｃａ2+]i＝Ｋｄ×Ｂ×［（Ｒ−Ｒmin）／（Ｒmax−Ｒ）］
ただし、Ｋｄ：Ｃａ2+に対するフラ２の解離定数で、in vivoでは２２４nMと仮定する式から算出できる（G.Grynkiewicz  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  ２６０巻、３４４０頁、１９８５年）；  Ｂ：Ｃａ2+を含んだ溶液中でのＦ３８０に対するＣａ2+を含まない溶液中でのＦ３８０の割合；  Ｒ：Ｆ３４０／Ｆ３８０で表される蛍光比；  Ｒmax：２０％ TritonX-100を０.０１mL添加し、細胞を溶解したときの細胞内フラ２による最大発光シグナル値；  Ｒmin：Ｒmaxの測定後、１５０mM Tris/450mM  ＥＧＴＡを０.０１mL添加し、Ｃａ2+を除去したときの発光シグナル値。
【００３８】
いずれの実験も、それぞれの阻害剤について３乃至４回測定した。また、血小板反応蛍光、色素の漏れおよび蛍光標識の影響を最小限に止めるために、実験を１時間以内に完了するように設定した。
データ表示：表や図に示した結果は、調整した血小板を分離して用い、少なくとも２回行った実験を表し、特別の場合を除き、複数回の平均値（±平均の範囲）を提供している。
【００３９】
２．試験結果
２−１．血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果：−
ＰＡＦとＵＭＰＣ１６の血小板凝集に対する投与量に依存的な効果を、図１に示す。すなわち、図１は、血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図であって、Ａは凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。
【００４０】
図１のＡにおけるａ〜ｆは、次の実験条件を示す。すなわち、１mMＣaＣl2を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の洗浄ウサギ血小板（１×１０8 cells, ０．３８mL）を、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（指示された濃度）（１０μＬ）と、１分間プレインキュベートし（ａ）、その後０.１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（１０μＬ）（最終濃度８×１０-11Ｍ）に、２分間（ＰＡＦ刺激により最大反応が得られる時間）、暴露した（ｂ）。血小板凝集の阻害率を上記の方法により計算し、結果を複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。ｃは媒介物、ｄは６×１０-6Ｍ、ｅは８×１０-6Ｍ、ｆは１×１０-5Ｍの場合を示す。
【００４１】
図１のＡに示すように、ＵＭＰＣ１６は、８×１０-11Ｍ  ＰＡＦによる血小板の形態、変化を抑制しなかったが、血小板凝集を阻害した。ＵＭＰＣ１６による凝集阻害は、ＵＭＰＣ１６とＰＡＦの濃度に依存した（図１のＢとＣ参照）。一方、１〜１０μＭ濃度のパルミチン酸（ＵＭＰＣ１６のアルキルの一部から成る）は、ＰＡＦによる血小板凝集を抑制しなかった。
【００４２】
２−２．血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰ、Ａ２３１８７およびＰＭＡに対するＵＭＰＣ１６の効果：−
ＵＭＰＣ１６による血小板凝集阻害は、ＰＡＦに対してのみ惹起されるのか検討するために、凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の効果を試験した。すなわち、2−1．（図１）の場合と同様に、血小板（１×１０8 cells, ０.３８mL）を１分間ＵＭＰＣ１６とプレインキュベートし、その後凝集惹起物質（１０μＬ）、すなわち０.１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０-11Ｍ）、生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０.０２U/mL）、４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したアラキドン酸（最終濃度２×１０-5Ｍ）、生理食塩水に溶解したＡＤＰ（最終濃度２.５×１０-5Ｍ）、４％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＡ２３１８７（最終濃度２×１０-7Ｍ）および４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したＰＭＡ（最終濃度２×１０-8Ｍ）に、それぞれ２分、４分、２分、２分、４分および３０分間（媒介物の存在下、凝集惹起物質で刺激することにより最大反応が得られる時間）、暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記方法で計算し、結果を複数個の平均値で、図２に示した（±平均値の範囲）。
【００４３】
図２から明らかなように、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰは、血小板凝集を惹起するＰＡＦと同様にＵＭＰＣ１６により明らかに抑制された。阻害の強さは、凝集惹起物質とＵＭＰＣ１６の濃度に依存した。凝集を惹起するＰＡＦ（８×１０-11Ｍ）、トロンビン（０.０２Ｕ／mL）、アラキドン酸（２×１０-5Ｍ）およびＡＤＰ（２.５×１０-5Ｍ）に対するＩＣ50値は、それぞれ２.４×１０-6Ｍ、５.４×１０-6Ｍ、２.１×１０-6Ｍおよび２.２×１０-6Ｍであった（データを示さず）。反対に、２×１０-8Ｍから２×１０-7Ｍの濃度のＡ２３１８７による血小板凝集と、２×１０-9Ｍから２×１０-7Ｍの濃度のＰＭＡによる血小板凝集は、１×１０-5ＭのＵＭＰＣ１６により阻害されなかった。これらの結果は、ＵＭＰＣ１６がＰＡＦの刺激のみならず、受容体を介した刺激を阻害するが、Ａ２３１８７により惹起される細胞外カルシウムの流入や、プロテインキナーゼＣ経路の活性化には影響を及ぼさなかったことを示している。
【００４４】
２−３．血小板凝集を誘発するＰＡＦとトロンビンに対するウリジン５'-アルキルホスフェート化合物（Ｉ）の阻害効果：−
各種ウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）、すなわちＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０およびＵＭＰＣ２４の血小板凝集阻害作用を調べた。すなわち、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解した所定濃度のＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０またはＵＭＰＣ２４（１０μＬ）を、１mM ＣaＣl2含有タイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の血小板（１×１０8 cells, ０.３８mL）に１分間暴露し、その後０.１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０-11Ｍ）（Ａ）または生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０.０２U/mL）（Ｂ）に、それぞれ２分または４分間暴露する。血小板凝集の阻害率を、上記した方法により計算し、結果を図３に複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。
【００４５】
図３のＡやＢから明らかなように、これらのウリジン５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）は、ＰＡＦやトロンビンによる血小板凝集に影響を及ぼす。極頭基のメチレン鎖の長さを引き延ばしたＣ１６やＣ２０を含むウリジン５'−アルキルホスフェート類は、血小板凝集を惹起するＰＡＦをＰＡＦ刺激に対する阻害が報告（K. D. Newman et al., J. Clin. Invest., ６１巻、３９５頁、１９７８年；T. C. Lee et al., Arch. Biochem. Biophys., ２２３巻、３３頁、１９８３年；F. H. Valone et al., Thromb. Res., ４０巻、３８５頁、１９８５年）されているカルシウムチャネル阻害剤であるベラパミルより強く阻害した。つまり、１×１０-5ＭのＵＭＰＣ１６と１×１０-5Ｍのベラパミルは、それぞれ対照試験に対し、８×１０-11Ｍ  ＰＡＦによる凝集を０％及び１９％抑制した。８×１０-11Ｍ  ＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の凝集阻害のＩＣ50値（２.４×１０-6Ｍ）は、ＵＭＰＣ２０のＩＣ50値（２.２×１０-6Ｍ）と同程度であった。さらに、ＵＭＰＣ１６とＵＭＰＣ２０は、ＰＡＦだけでなく、トロンビンの凝集も同様に抑制した。
【００４６】
２−４．凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の阻害作用の特徴：―
次に、ＵＭＰＣ１６により惹起された血小板凝集阻害が、ベラパミルで見られたのと同様に、補足のカルシウムにより元に戻るかどうかを調べた。すなわち、１mM又は１０mMのＣaＣl2を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７.２）中の血小板（１×１０8 cells, ０.３８mL）を、２.０％エタノール−２.０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（最終濃度１×１０-5Ｍ）（１０μＬ）と１分間プレインキュベーションした後、０.１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０-11Ｍ）に２分間暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記した方法により計算し、結果を図４に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。
【００４７】
図４から理解できるように、血小板の懸濁液中で、１mMから１０mMの範囲でカルシウム濃度を増加させたところ、ＰＡＦの凝集惹起に対するＵＭＰＣ１６による阻害は元に戻らなかった。逆に、補足ＣaＣl2濃度を１０mMにするとＰＡＦによる血小板凝集誘発の程度は、７２％に減少した。
【００４８】
さらに、ＵＭＰＣ１６は、ＰＡＦの添加後でも効果があるのか調べるために、血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の添加時間の影響を試験した。すなわち、ＵＭＰＣ１６または対照試験用の溶媒を、８×１０-8ＭのＰＡＦ添加前後の指定された時間に血小板に添加し、血小板凝集の阻害率を上記方法により計算し、結果を図5に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。８×１０-11ＭのＰＡＦを添加する前に１分間１×１０-5ＭのＵＭＰＣ１６とインキュベートしただけでなく、８×１０-11ＭのＰＡＦと同時に１×１０-5ＭのＵＭＰＣ１６を添加した場合も、ＰＡＦによる凝集が１００％阻害された。一方、ＵＭＰＣ１６をＰＡＦの添加後１０秒、３０秒及び１分経過した後の血小板に添加すると、血小板凝集は、それぞれ、対照試験に対し２９％、４２％及び７５％程度となった（図５）。これらの所見は、ＵＭＰＣ１６がベラパミル同様に脱凝集を引き起こし、ＰＡＦより後に添加した場合でさえ、ＰＡＦ刺激に対する阻害効果があったことを示している。
【００４９】
２−５．［Ｃa2+]ｉ反応を誘発するＰＡＦとイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の作用：−
［Ｃa2+]ｉ反応を誘発するＰＡＦやイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の作用を調べるため、ＵＭＰＣ１６や溶媒を３７℃の温水中で、直接血小板と１分間、プレインキュベーションした。最大反応は、溶媒の存在下で、ＰＡＦの刺激により測定した。添加を指示したのは、溶媒（ａ）、ＰＡＦ（ｂ，８×１０-11Ｍ）、ＵＭＰＣ１６（ｃ，１×１０−5Ｍ）、イオノマイシン（ｄ，４×１-8Ｍ）を添加した。結果は、少なくとも４回行った実験の代表例を、図６に示す。
【００５０】
血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦやイオノマイシンに対するベラパミルとＵＭＰＣ類の効果を比較した。すなわち、血小板（１０9 cells/mL）を、溶媒、ベラパミル（最終濃度１×１０-1Ｍ）またはＵＭＰＣ類（最終濃度１×１０-5Ｍ）と、上記２．４（図５）に記載したように、１分間、インキュベート、処理した後、ＰＡＦ（最終濃度４×１０-11Ｍ）やイオノマイシン（最終濃度４×１０-8Ｍ）に暴露した。最大[Ｃａ2+]ｉレベルは、上記したように、フラ−２蛍光で測定した。結果は、４-６回行った測定結果の平均値±ＳＤとして表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
この結果から、ＵＭＰＣ１６は、［Ｃa2+]ｉを誘発するＰＡＦの作用を減弱させるが、［Ｃa2+]ｉを誘発するイオノマイシンの作用を減弱させないことが理解できる（図６、表１）。１mMの細胞外カルシウムの存在下において、未刺激血小板の平均［Ｃa2+]ｉが５２.０±１８.４nM（ｎ＝１５）であり、ＵＭＰＣ１６はこの値を変化させなかった。８×１０-11ＭのＰＡＦを添加すると、血小板［Ｃa2+]ｉは４７４．７±７４．２ｎＭに上昇するが、ＵＭＰＣ１６は、このＰＡＦによる［Ｃa2+]ｉの上昇を減弱させた。ＵＭＰＣ１６による［Ｃa2+]ｉ反応の阻害の程度は、ベラパミルによるものより高かったが（表１）、血小板凝集阻害の様式は、よく似ていた。
【００５３】
３．試験結果の解析
上記試験結果は、ＵＭＰＣ１６が、ＰＡＦだけでなく、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸及びＡＤＰをも投与量依存的に直接阻害し、その阻害は血小板活性化を惹起するＰＡＦに限局したものでないことを示している（図１および２）。ＵＭＰＣ化合物のうち、ＵＭＰＣ１６は、血小板活性化に対する阻害効果がＵＭＰＣ８やＵＭＰＣ１２よりも強い（図３）。アラキドン酸は、ホスホリパーゼＣ経路の活性を誘発すると考えられているエンドペルオキシドやトロンボキサンＡ2を経てシクロオキシゲナーゼやトロンボキサンＡ2シンテターゼにより代謝される。ＰＡＦ、トロンビン、トロンボキサンＡ2およびＡＤＰによる刺激は、受容体を介して伝達され、４０−ｋＤａのタンパク質リン酸化を惹起する、プロテインキナーゼＣシステムと関連しているホスホリパーゼＣの活性化を誘発する。ＵＭＰＣ１６は、これら受容体を介した刺激による血小板凝集や、［Ｃa2+]ｉの変化を誘発するＰＡＦの作用を阻害した（図２と６および表１）。
【００５４】
血小板懸濁液中のカルシウム濃度の増加は、ＵＭＰＣ１６のＰＡＦに対する凝集誘発の阻害を回復させず（図４）、これは、ベラパミルの活性様式とは相違する。他の所見は、好中球におけるベラパミルの阻害効果が、単にカルシウムの流入を阻害するためだけでなく、ベラパミルにより活性化されたプロテインキナーゼＣ酵素に対する直接的な阻害活性もまたあるということを示している。一方、ＵＭＰＣ１６は、カルシウムイオン透過担体であり、血小板凝集を惹起するＡ２３１８７や［Ｃa2+]ｉを変化させるイオノマイシンの作用を阻害しなかった(図２と６)。さらに、ＵＭＰＣ１６は、血小板凝集を惹起するＰＭＡを阻害しなかった(図２）。ＰＭＡは、血小板において、40ｋＤａのタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼＣを直接活性化させ、細胞外Ｃa2+を必要としない。
【００５５】
図５で示したように、あらかじめＰＡＦで凝集された血小板に添加したとき、１×１０-5Ｍの濃度のＵＭＰＣ１６は、凝集を阻害できる。すなわち、脱凝集を引き起こす。ベラパミルは、４０‐ｋＤａや２０−ｋＤａのタンパク質のリン酸化を元に戻すことにより、ＰＡＦで凝集した血小板に脱凝集を引き起こすと報告されてきた（G. Bonadonna et al., Thromb. Heamos., ５６巻、３０８頁、１９８６年）。我々は、ウサギ血小板に結合するＰＡＦの動態についての研究で、ＰＡＦにより完全に凝集された血小板は、受容体に対するＰＡＦの量が減少すると同時に、脱凝集が見られる、つまり、血小板凝集を維持するために、受容体にＰＡＦの結合が必要であるということを示していることを解明している。
【００５６】
以上、ＵＭＰＣ１６の活性様式は、受容体に特異的に結合する凝集惹起物質を介するカルシウム流入を阻害したり、カルシウムチャンネル阻害剤であるベラパミルと同様に、凝集惹起物質の結合を阻害することによるものであると考えることが出来る。なお、細胞内カルシウムに依存する反応の阻害は、血小板反応に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性に影響を与える可能性が考えられる。結論として、ＵＭＰＣ１６は、血小板反応を介する受容体をベラパミルより効果的に阻害するということが出来る。
【００５７】
【発明の効果】
本願発明のヌクレオシド５'−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗作用を有し、特に細胞外液カルシウムの細胞内流入阻止に基づくカルシウム拮抗作用を有することから、心筋障害や不整脈発生の防止に有効であり、また優れた血小板凝集抑制作用を有することから、血栓症、塞栓症または動脈硬化症の予防薬または治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。Ａは凝集を誘発するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。
【図２】  血小板凝集を惹起する凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の阻害効果を示す図である。
【図３】  血小板凝集惹起剤に対するウリジン５'−アルキルホスフェート類の阻害効果を示す図である。Ａは惹起剤がＰＡＦの場合のもの、Ｂは惹起剤がトロンビンの場合のものである。
【図４】  血小板凝集を惹起するＰＡＦのＵＭＰＣ１６による阻害活性に対する細胞外カルシウムの効果を示す図である。
【図５】  血小板凝集を惹起するＰＡＦに対し、様々な時間にＵＭＰＣ１６を添加したときの効果を示す図である。
【図６】  血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦやイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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