(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の網状赤血球を検出及び計数する方法であって、
ａ．試料サンプルを提供するステップ；
ｂ．以下の式を有する色素を前記試料サンプルに添加するステップ；
【化１】
0004454046.tif 000012
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は独立して水素およびハロゲンからなる群から選択された基を表し、但し、Ｒ1およびＲ2は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成でき、Ｒ3およびＲ4は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成できる；
Ｒ5は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールを表し、ただし、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも１つがハロゲンを表す；
Ｒ10は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ11、Ｒ12は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールからなる群から選択された基を表す；
Ｒ13は水素又は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表す；
Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｃ、又はＳｅを表す；
ｎは１を表す；及び
Ｘ-は対イオンを表す。）
ｃ．前記試料サンプルの蛍光を測定して、前記試料サンプル中の網状赤血球を検出及び計数するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
試料サンプル中の網状赤血球を検出及び計数する方法がフローサイトメトリーである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記色素が、
【化２】
0004454046.tif 000013
0004454046.tif 000014
からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記色素が、コンジュゲートの形ではない、請求項１の方法。
【請求項５】
試験サンプル中の細胞を検出する方法であって、
ａ．試料サンプルを提供するステップ；
ｂ．以下の式を有する色素を含むコンジュゲートを前記試料サンプルに添加するステップ；
【化３】
0004454046.tif 000015
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は独立して水素およびハロゲンからなる群から選択された基を表し、但し、Ｒ1およびＲ2は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成でき、Ｒ3およびＲ4は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成できる；
Ｒ5は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールを表し、ただし、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも１つがハロゲンを表す；
Ｒ10は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ11、Ｒ12は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールからなる群から選択された基を表す；
Ｒ13は水素又は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表す；
Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｃ、又はＳｅを表す；
ｎは１を表す；及び
Ｘ-は対イオンを表す。）
ｃ．前記試料サンプルの蛍光を測定して、前記試料サンプル中の細胞を計数するステップ
を含む前記方法。
【請求項６】
細胞はフローサイトメトリーによって検出される、請求項５の方法。
【請求項７】
前記色素が、
【化４】
0004454046.tif 000016
0004454046.tif 000017
からなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
固相イムノアッセイを実行する方法であって、
ａ．被分析物を含有していることが疑われる試料を捕獲試薬と接触させて、被分析物を捕獲試薬へ結合させるステップ；
ｂ．ステップａの生成物をコンジュゲートを用いて処理するステップであって、前記コンジュゲートが以下の式を有する色素で標識された結合要素を含む前記ステップ；
【化５】
0004454046.tif 000018
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は独立して水素およびハロゲンからなる群から選択された基を表し、但し、Ｒ1およびＲ2は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成でき、Ｒ3およびＲ4は、それらが付けられた環に結合するフェニル環を形成できる；
Ｒ5は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールを表し、ただし、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも１つがハロゲンを表す；
Ｒ10は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基又は１個の環を有するアリール基を表す；
Ｒ11、Ｒ12は独立して水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、１個の環を有するアリールからなる群から選択された基を表す；
Ｒ13は水素又は１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表す；
Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｃ、又はＳｅを表す；
ｎは１を表す；及び
Ｘ-は対イオンを表す。）
ｃ．ステップｂで形成された結合体を非結合コンジュゲートから分離するステップ；
ｄ．色素を励起させるステップ；および
ｅ．試料サンプル中の被分析物の存在又は含量を示す、色素により発生された信号を観察するステップ
を含む前記方法。
【請求項９】
前記被分析物は増幅反応の産物である、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記色素が、
【化６】
0004454046.tif 000019
0004454046.tif 000020
からなる群から選択される、請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、リボ核酸ポリマー（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸ポリマー（ＤＮＡ）を染色するのに適する、特に網状赤血球を染色するのに適する色素に関する。本発明はさらに、蛍光組成物に関する。
２．従来技術の考察
多くの場合、ＲＮＡ又はＲＮＡを含有する物質を検出する必要がある。例えば、網状赤血球はＲＮＡを含有していることが知られている物質である。血液試料中に含まれる網状赤血球の検出及びこれらの網状赤血球の計数は、臨床医にとって重要である。血液試料中の網状赤血球数は、造血活性の指標であり、急性出血及び溶血性貧血の指標であり、さらに鉄、ビタミンＢ12及び葉酸療法に対する反応の尺度である。当分野において知られているように、網状赤血球は成熟赤血球の前駆体であり、従って網状赤血球という用語は成熟赤血球への進展及び発達を包含している。
血液試料中の網状赤血球の検出及び計数は、ニュー・メチレン・ブルー（ＮＭＢ）、ブリリアント・クレシル・ブルー（ＢＣＢ）、アクリジン・オレンジ、及びピロニンＹのような適切な染色液を使用して手動及び自動の両方の方法によって実施されてきた。
色素ニュー・メチレン・ブルーを用いる生体染色は、網状赤血球測定の標準方法とされている。使用時に、この色素はＲＮＡを沈降させる。この方法は手動により行なわれ、極めて多数の細胞（例えば、５００〜１，０００細胞）を顕微鏡を用いて計数する必要がある。その結果、本方法は時間がかかり、冗長で、誤りやすい。
ニュー・メチレン・ブルーは、非蛍光性であり、真に沈降したＲＮＡを沈降した染料から識別するのはしばしば困難である。ニュー・メチレン・ブルーは、細胞内ＲＮＡ分子と結合することによって染色し、そのサイズ及び色のために顕微鏡検査下で見える着色複合体を形成する。しかし、特定の条件下では、色素分子自体が他の色素分子との複合体を形成しうる。これらの色素／色素複合体は色素／ＲＮＡ複合体と区別できなく、計数が不正確になる、及び／又は特定の細胞タイプに対して偽陽性になると言う結果が生じる可能性がある。この問題は、色素溶液を濾過して形成された非特異的色素／色素複合体が除去されないとき、より多く生じよう。
アクリジン・オレンジは、手動及び自動の両方の方法によって網状赤血球を染色するために使用されてきた。蛍光性であるアクリジン・オレンジも又ＲＮＡを沈降させる。その結果、この色素の使用は、エネルギー・トランスファー・プロセスにおいて相互に干渉する色素分子によって惹起された現象である消光の可能性があるために、ＲＮＡ含量の定量的推定を妨げる。消光条件下では、エネルギー・トランスファー・プロセスは正味蛍光放射を生じさせない。
蛍光に比例するＲＮＡ含量に基づく細胞の世代プロフィールは信頼できない。世代プロフィールは、赤血球のアッセイにおいて得ようとされている重要な情報である。網状赤血球を染色するための色素の機能は、主として全身循環に含まれる未熟赤血球のパーセンテージを測定することである。この情報は、赤血球形成の生体恒常性（ホメオスタシス）、赤血球関連代謝疾患の検出、及び貧血性疾患の存在又は不在を測定するために必要とされる。
アクリジン・オレンジは、フローサイトメーター内のプラスチック製チューブに対して大きな親和性を有しているため、バックグラウンドが増大し、その結果としてフローサイトメーターのチューブから色素を除去するための長々しい方法を必要となる。さらに、アクリジン・オレンジによって染色された細胞は、自家蛍光赤血球ピークから区別することが困難である。最後に、網状赤血球数は通常はニュー・メチレン・ブルーを用いて染色された数値より少なくなる。ニュー・メチレン・ブルーは、細胞内ＲＮＡと結合することによって染色し、細胞内で不溶性沈降物を形成する。相互作用に基づいて別々のブルーパターンが形成され、それによって手動での容易な顕微鏡的評価が可能になる。アクリジン・オレンジを用いた検出は、フローサイトメーター上で実施される。拡散パターンの性質のために、非特異的バックグラウンドに対して特異的染色をアクリジン・オレンジから識別することは困難である。その結果、バックグラウンドが高いときには、通常は正味陽性が減少し、より離散的なニュー・メチレン・ブルー染色法と比較して人為的な低い数値が生じるであろう。
ピロニンＹの使用には、事前にホルマリンを用いた赤血球の固定を必要とし、手間がかかり、時間がかかり、さらに一般的に不良な結果を生じさせる。さらに、ピロニンＹは量子効率が極めて低いので、極めて低い蛍光信号をもたらす。
従って、血液試料中の網状赤血球を正確に測定するための方法を提供するには、網状赤血球を染色するためにより適合した色素を提供する必要がある。
網状赤血球を染色するための色素は、好ましくは下記の特性を有している：
１．その色素はＲＮＡの不在下では蛍光を発してはならない。
２．その色素は、ＲＮＡの存在下において良好な蛍光量子収量を有していなければならない。
３．その色素は一定レベルの水溶性を示さなければならず、さらにＲＮＡを含有する細胞膜内に浸透できなければならない。
４．その色素は、好ましくは約６３３ｎｍで励起ピークを有していなければならない。
米国特許第４，９５７，８７０号は、下記の構造を有する色素を用いてヒト血液試料中に含まれる網状赤血球、ＲＮＡ、及びＤＮＡの検出を含んでいる：
0004454046.tif 000002
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ又はＣ（ＣＨ3）2を表す；
Ｒ1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表す；
Ｒ2は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を表す；
Ｒ3は、縮合ベンゼン、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、メトキシを表す、又は不在である；
Ｒ4は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、エトキシを表す、又は不在である；及び
ｎは０又は１〜６の整数を表す。
発明の概要
ある態様では、本発明はヘリウム−ネオンレーザーによって励起可能（６３３ｎｍで励起可能）な色素を合成するための方法を提供する。これらの色素は、好ましくは＜複素環式化合物、例えば７−ハロレピジンから誘導される。これらの色素は、ヒト血液試料中に含まれる網状赤血球を検出及び計数するのに適している。別の態様では、本発明は信号増幅のための方法を提供する。本方法は、一定構造の色素がＤＮＡ又はＲＮＡ内に挿入したときに色素の強度が増大するという現象に基づいている。
本発明に適する色素は、（ａ）第１複素環部分、（ｂ）第２複素環部分、及び（ｃ）第１及び第２複素環部分を結び付ける連結基を有していると述べることができる。第１及び第２複素環部分はどちらも、好ましくは共に縮合している少なくとも２個の環を含有していなければならない。この色素は、第１部分が第２部分にエチレンによって結合しているコンジュゲートにより特徴づけられる。
本発明における使用に適する色素の一般構造を下記に示す：
0004454046.tif 000003
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又はＲ1及びＲ2は一緒になって、又はＲ2及びＲ3は一緒になって、又はＲ3及びＲ4は一緒になって、１個以上の環を表す；
Ｒ5はアルキル基又はアリール基を表す；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又は少なくともＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも１つがハロゲンを表すことを条件に、Ｒ6及びＲ7は一緒になって、又はＲ7及びＲ8は一緒になって、又はＲ8及びＲ9は一緒になって、１個以上の環を表す；
Ｒ10は、アルキル基又はアリール基を表す；
Ｒ11、Ｒ12は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又はＲ11及びＲ12は一緒になって、１個以上の環を表す；
Ｒ13は水素又はアルキル基を表す；
Ｙは、ＹがＮではないことを条件に、Ｓ、Ｏ、Ｃ、又はＳｅを表す；
ｎは０〜３の数字を表す；及び
Ｘ-は対イオンを表す。
連結基に結び付いている第１部分の環は、５員環又は６員環であってよい。連結基に結び付いている第２部分の環は、５員環又は６員環であってよい。
Ｒ5及びＲ10は同一であっても相違していてもよい。好ましくは、Ｒ5及びＲ10は、１〜２０個の炭素原子及び０〜６個のヘテロ原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子及び０〜３個のヘテロ原子を有するアルキル基を表す。Ｒ5及びＲ10は、直鎖、分枝鎖又は環状基であってよい。Ｒ5又はＲ10がアルキル基の場合は、Ｒ5又はＲ10の炭素原子は水素原子以外の置換基を含有していてよい。Ｒ5及びＲ10はさらに、（ａ）好ましくは５個以下の環を有している、より好ましくは３個以下の環を有している、最も好ましくは１個以下の環を有しているアリール基であってよい、又は（ｂ）好ましくは２〜２０個の炭素原子を有している、より好ましくは２〜１０個の炭素原子を有しているアルケニル基であってよい。Ｒ5又はＲ10がアリール基又はアルケニル基である場合、Ｒ5又はＲ10のアリール基又はアルケニル基は水素原子以外の置換基を含有することができる。Ｒ5及びＲ10はヘテロアリール基であってよいが、ここで、ヘテロ原子は窒素、硫黄、酸素及びセレンからなる群から選択することができる。
Ｒ5及びＲ10に対する置換基の個性は重要ではないが、それらは色素の吸収特性に悪影響を及ぼさないように選択されなければならない。
ｎの値に関しては、色素の望ましい吸収特性を提供するように連結基内には十分な炭素原子がなければならない。
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9がハロゲンである場合は、ハロゲンは好ましくはＦ、Ｃｌ及びＩからなる群から選択される。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアルキルである場合は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、及び最も好ましくは１〜６個の炭素原子を含んでいる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアリールである場合は、好ましくは５個以下の環、より好ましくは３個以下の環、及び最も好ましくは１個以下の環を含んでいる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアルキル又はアリールである場合は、水素以外の置換基を含有していてよい。Ｒ1及びＲ2は一緒になって、又はＲ2及びＲ3は一緒になって、又はＲ3及びＲ4は一緒になって、又はＲ6及びＲ7は一緒になって、又はＲ7及びＲ8は一緒になって、又はＲ8及びＲ9は一緒になって、又はＲ11及びＲ12は一緒になって、１個以上の環を形成している場合は、これらの環は芳香族であっても非芳香族であってもよい。芳香族環は炭素環式又は複素環式芳香族環であってよく、ここでヘテロ原子は窒素、硫黄、酸素及びセレンからなる群から選択される。好ましくは、上記の組合せから形成された環構造は５個以下の環、好ましくは３個以下の環、及び最も好ましくは１個以下の環を有している。
本発明に適する色素は、ＤＮＡ又はＲＮＡが存在する場合に極めて低いバックグラウンド、狭い放射帯域、及び素晴らしい増強を示す。これらの色素は酸素、水分及び熱に対して安定性であるが、光線に暴露するとゆっくり脱色する。
本発明の色素は、ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するための信号発生剤として使用することができる。本発明の色素は、光源としてヘリウム−ネオン（Ｈｅ−Ｎｅ）レーザーを使用するフローサイトメーター上でヒト血液試料中の網状赤血球を検出するために使用できるように十分に高感受性である。ヘリウム−ネオンレーザーは、アルゴンレーザーよりはるかに安価である。
上記で述べたように、本発明の色素は先行技術において使用される色素に比較してはるかに高い増強、低いバックグラウンド、及び小さな放射帯域幅を示す。低いバックグラウンド及びより小さい放射帯域幅が、これらの色素を全血の高解像度分析のため及び複合アッセイにおいて使用することを可能にする。
詳細な説明
本発明に適する色素は、第１複素環部分、第２複素環部分、さらに第１及び第２複素環部分を結合する連結基を有すると言うことができる。第１及び第２複素環部分はどちらも、好ましくは一緒に縮合している少なくとも２個の環を含有していなければならない。この色素は、第１部分が第２部分にエチレンにより結合しているコンジュゲートにより特徴づけられる。
本発明において使用するのに適する色素の一般構造を下記に示す：
0004454046.tif 000004
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又はＲ1及びＲ2は一緒になって、又はＲ2及びＲ3は一緒になって、又はＲ3及びＲ4は一緒になって、１個以上の環を表す；
Ｒ5はアルキル基又はアリール基を表す；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又は少なくともＲ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも１つがハロゲンを表すことを条件に、Ｒ6及びＲ7は一緒になって、又はＲ7及びＲ8は一緒になって、又はＲ8及びＲ9は一緒になって、１個以上の環を表す；
Ｒ10は、アルキル基又はアリール基を表す；
Ｒ11、Ｒ12は独立して水素、ハロゲン、シアノ、アルキル、アリール、アルカリール、アラルキルからなる群から選択された基を表す、又はＲ11及びＲ12は一緒になって１個以上の環を表す；
Ｒ13は水素又はアルキル基を表す；
Ｙは、ＹがＮではないことを条件に、Ｓ、Ｏ、Ｃ、又はＳｅを表す；
ｎは０〜３の数字を表す；及び
Ｘ-は対イオンを表す。
連結基に結び付いている第１部分の環は、５員環又は６員環であってよい。連結基に結び付いている第２部分の環は、５員環又は６員環であってよい。
Ｒ5及びＲ10は同一であっても相違していてもよい。好ましくは、Ｒ5及びＲ10は、１〜２０個の炭素原子及び０〜６個のヘテロ原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子及び０〜３個のヘテロ原子を有するアルキル基を表す。Ｒ5及びＲ10は、直鎖、分枝鎖又は環状基であってよい。Ｒ5及びはＲ10は水素原子以外の置換基を含有していてよい。Ｒ5及びＲ10はさらに、（ａ）好ましくは５個以下の環を有している、より好ましくは３個以下の環を有している、最も好ましくは１個以下の環を有しているアリール基であってよい、又は（ｂ）好ましくは２〜２０個の炭素原子を有している、より好ましくは２〜１０個の炭素原子を有しているアルケニル基であってよい。Ｒ5又はＲ10のアリール基又はアルケニル基は水素原子以外の置換基を含有することができる。
Ｒ5及びＲ10に対する置換基の個性は重要ではないが、それらは色素の吸収特性に悪影響を及ぼさないように選択されなければならない。
Ｒ5及びＲ10はヘテロアリール基であってよいが、ここでヘテロ原子は窒素、硫黄、酸素及びセレンからなる群から選択することができる。
ｎの値に関して、色素の望ましい吸収特性を提供するように連結基内には十分な炭素原子がなければならない。
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9がハロゲンである場合は、ハロゲンは好ましくはＦ、Ｃｌ及びＩからなる群から選択される。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアルキルである場合は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、及び最も好ましくは１〜６個の炭素原子を含んでいる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアリールである場合は、好ましくは５個以下の環、より好ましくは３個以下の環、及び最も好ましくは１個以下の環を含んでいる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12又はＲ13がアルキル又はアリールである場合は、水素以外の置換基を含有していてよい。Ｒ1及びＲ2は一緒になって、又はＲ2及びＲ3は一緒になって、又はＲ3及びＲ4は一緒になって、又はＲ6及びＲ7は一緒になって、又はＲ7及びＲ8は一緒になって、又はＲ8及びＲ9は一緒になって、又はＲ11及びＲ12は一緒になって、１個以上の環を形成している場合は、これらの環は芳香族であっても非芳香族であってもよい。芳香族環は炭素環式又は複素環式芳香族環であってよく、ここでヘテロ原子は窒素、硫黄、酸素及びセレンからなる群から選択される。好ましくは、上記の組合せから形成された環構造は５個以下の環、好ましくは３個以下の環、及び最も好ましくは１個以下の環を有している。
Ｘ-は対イオン、好ましくは酢酸塩を表す。
これらの色素は、好ましくは水溶性であり、例えばフローサイトメーターにおけるような使用条件下で安定である。これらの色素は部分Ｒ5、部分Ｒ10又はその他の部分を介して例えばタンパク質又はポリマーのような分子へ結合することができる。
核酸に結合していないときは、本発明の色素は約６００ｎｍ〜約６３０ｎｍの範囲内での強力な吸収ピークを示す。しかし、非結合状態では、この色素は、検出可能な励起又は放射ピークのどちらも示さない。色素が網状赤血球中ＲＮＡを染色すると、色素の光学特性は劇的に変化する。特に、吸収曲線はより長い波長へ変化し、色素は強力な蛍光を示す。本発明において有用な典型的な色素については、励起極大は約６３３ｎｍ、放射極大は約６７０ｎｍであり、約４０ｎｍのＳｔｏｋｅｓシフトを生じる。結合した色素の励起ピークが約６３３ｎｍのオーダーであることから、自動フローサイトメーターに使用するための光源は、６３３ｎｍで強力な放射を有するヘリウム−ネオンレーザーであってよい。この色素が核酸に結合していないとき蛍光がなく、バックグラウンド値が低いので、操作者は単に非染色を対照とすることによって、フローサイトメーターのための蛍光閾値（又は「ゲート」）を選択することができる。他の波長で励起される可能性があるが、ここに記載された色素を用いて染色された網状赤血球は、好都合にも約６３０ｎｍ〜約６７０ｎｍの波長で励起させられる。本発明で使用するのに適した色素の代表的な例は、下記の構造式を有している。下記の構造では、「Ｐｈ」はフェニル基を表し、「Ａｒ」はアリール基を表し、単一実線は−ＣＨ3を表し、折れ線は−ＣＨ2ＣＨ3を表す。
0004454046.tif 000005
0004454046.tif 000006
下記の表は、本発明で使用するのに適した数種の色素についてのナノメートル吸収極大を示している。
0004454046.tif 000007
本発明において使用するのに適した色素は、下記によって調製できる：
（１）少なくとも２個の縮合した環を含有する複素環式化合物を無水酢酸及びＮ，Ｎ‘−ジフェニルホルムアミジン又はその高同族体と反応させて鎖延長中間を形成させる；
（２）上記の鎖延長中間を第三級アルキルアミン触媒の存在下において還流条件下でメチル化ハロレピジンと反応させて色素を形成させる。
結果として生じた色素は、次いで典型的にはジエチルエーテルを使用する沈降によって回収できる。或いは、本発明に適した色素は下記によって調製できる；
（１）少なくとも２個の縮合した環及び活性化メチル基を含有する複素環式化合物を無水酢酸及びＮ，Ｎ‘−ジフェニルホルムアミジン又はその高同族体と反応させて鎖延長中間物を形成させる；
（２）上記の鎖延長中間物を第三級アルキルアミン触媒の存在下において還流条件下でハロレピジンと反応させて色素を形成させる。
結果として生じた色素は、次いで典型的にはジエチルエーテルを使用する沈降によって回収できる。
少なくとも２個の縮合した環を含有する化合物の代表的な例には、ヨウ化２−メチル−Ｎ−アルキルベンゾチアゾリウム、ヨウ化２−メチル−Ｎ−アルキルベンゾキサゾリウム、ヨウ化２−メチル−Ｎ−アルキルナフトキサゾリウム、及びヨウ化２−メチル−Ｎ−アルキルナフトチアゾリウムが含まれる。Ｎ−メチル化ハロレピジンの代表的例には、７−クロロレピジン、７−フルオロレピジン、及び７−ブロモレピジンが含まれる。
本発明に使用するために適した色素は、下記の合成反応図式に従って調製できる。下記の合成反応図式においては、「Ｐｈ」はフェニル基を表し、「Ａｃ」はアシル基を表し、「Ｘ」はハロ基を表す。
0004454046.tif 000008
上記の合成反応図式においては、Ｒ及びＸの置換基の代表的組合せには下記が含まれる：
0004454046.tif 000009
本発明によれば、本発明の色素は、血液試料中の網状赤血球を染色するときに、水性溶液の形態、及び特に等張生理食塩水の形態で使用することができる。生理食塩水は少量のメタノールを含有してもよい。全血又は血液分画であってよい血液試料は、色素を含有する溶液と血液試料とを混合することによって、色素により染色される。ここに記載された色素を染色媒体として使用することによって、全血試料中の網状赤血球を検出かつ計数することが可能なことが見いだされた。
色素は網状赤血球に浸透しなければならないので、優れた細胞浸透特性を有していなければならない。本発明に適した色素はＲＮＡを沈降させないので、その結果、染色された網状赤血球は細胞内ＲＮＡの相対的に均質な分布を維持しており、それによって網状赤血球と成熟赤血球との境界を画する閾値を指定することが可能である。この特徴は、ＲＮＡ含量が網状赤血球の世代の関数であるという網状赤血球数以外の追加の情報を医師に提供する。従って、ここに記載した色素を使用することによって、臨床医は網状赤血球の世代プロフィール並びに単純な網状赤血球計数を実施する能力を手に入れる。ここに記載された色素を血液試料中の網状赤血球を染色するために使用すると、染色された網状赤血球からの蛍光信号をＲＮＡ又はＤＮＡを含有していない成熟赤血球の蛍光信号から容易に区別できるという長所をさらに提供する。この理由から、費用のかかるデータ操作を行わずにフローサイトメーターにおいて結果を直接的に読み取ることができる。
本発明の色素を用いて染色された網状赤血球及びＲＮＡ又はＤＮＡは、好ましくは自動フローサイトメーターにおいて計数されるが、それらは手動方法又は自動顕微鏡によって算定することもできる。
本発明に使用されるフローサイトメーターはいずれでもよい。従って、染色された網状赤血球は、例えば、自動フローサイトメーター又は半自動フローサイトメーター又は手動フローサイトメーターにおいて検出及び計数されうる。自動フローサイトメーターを使用するときには、非染色対照試料を使用することによって蛍光ゲートが設定され、さらにその蛍光ゲートが染色された試料で使用される。
ここに記載された色素は、網状赤血球を染色するために直接使用できる。それらはコンジュゲートを形成するために抗体その他に結合させる必要がない。染色は挿入機構によって行なわれ、色素の網状赤血球のＲＮＡ又はＤＮＡへの挿入が励起又は放射波長における青移動又は赤移動を惹起する。
或いは、ここに記載された色素は、コンジュゲートの形で使用することができる。ここに記載された色素を含有するコンジュゲートを使用する適用の一つは、試料中に含まれる細胞を検出するために蛍光コンジュゲート又は多重蛍光コンジュゲートを使用するフローサイトメトリーへの適用である。フローサイトメーターの例は、ベクトン、ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）によって製造された蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＣＳｃａｎ）である。一般に、イメージングシステムは励起源及び検出装置を含有している。励起源はコンジュゲートに伴われている蛍光信号発生基を励起し、検出装置は励起された信号発生基から放射された信号を検出する。
典型的なイメージングシステム分析では、試料は蛍光コンジュゲートと一緒にインキュベートされ、これが試料中に存在する可能性のあるある種の細胞と特異的に結合する。インキュベーションは、試料中に含まれる特定の細胞集団にコンジュゲートが結合するような時間及び温度で行なわれる。コンジュゲートと結合させられた細胞は、一般には染色されているとし、染色手順は様々な波長の信号を放射する複数のコンジュゲートを用いて、複数回、連続的又は同時に行うことができる。染色手順が完了した後、試料はフローサイトメーターを用いて分析することができる。
別の実施態様では、ここに記載された色素を含有するコンジュゲートを、例えばサンドイッチ型イムノアッセイのよりな通常の固相イムノアッセイにおいて使用するように、適合させることができる。サンドイッチ型イムノアッセイは、典型的には被分析物を含有していることが疑われる試料を、実質的に固体の不活性プラスチック、ラテックス、ガラスビーズもしくはガラス微粒子又は分析物と結合対を形成するその他の特異的結合要素を用いて被覆されている担体材料と、接触させることを含んでいる。結合要素被覆担体材料は、一般には「捕獲試薬」と呼ばれている。被分析物が担体材料に結合した後は、残りの試料は担体材料から取り除かれる。被分析物が結合している担体材料は、一般的には信号発生基を用いて標識された第２結合構成要素であるコンジュゲートを用いて処理される。このコンジュゲートは担体材料に結合している被分析物と結合する。第１結合要素を含有する担体材料、被分析物及びそれらに結合しているコンジュゲートの組合せは、典型的には１以上の洗浄ステップを用いてあらゆる非結合コンジュゲートから分離させられる。適切な励起を介して信号発生基によって発生する信号は、その後、視覚的に、又は好ましくは機器によって観察でき、試料中の被分析物の存在又は含量を示す。もちろん、こうしたアッセイを実行するために使用されるステップの順序及び回数によりここに記載された本発明を限定することが意図されていないことは、理解されるであろう。
こうしたイムノアッセイによって検出される被分析物は、増幅反応の生成物であり得る。従って、これらの被分析物は、核酸配列を含有しているか、または、全てが参照によりここに組み込まれる、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８及びＥＰ−Ａ−４３９  １８２に記載されているＬＣＲ及び米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号に記載されているＰＣＲのような、ハイブリダイゼーション反応の生成物であり得る。例えば被分析物がＬＣＲ又はＰＣＲ反応生成物又は配列を含有している場合には、その配列は指示試薬と結合対を形成する結合要素及び捕獲試薬と結合対を形成する結合要素を含有することができる、又は含有するように修飾することができる。
フローサイトメーターにおけるここに記載された色素を用いて染色された網状赤血球の使用は、特に蛍光バックグラウンドが低いという点において有益であり、さらに蛍光ゲートは非染色対照を使用することによって容易に選択できる。さらに、細胞内網状赤血球ＲＮＡの沈降が生じないので、細胞を固定する必要がない。さらに、蛍光信号と個々の網状赤血球との関係は網状赤血球の世代のような情報を提供する。
本発明のさらにもう１つの長所は、ここに記載された色素を用いて染色された網状赤血球は、光強度が低い自動フローサイトメーターにおいて使用することができる点にあり、例えば、アルゴンレーザーと対照的な、ヘリウム−ネオンレーザーを使用することができる。
下記の実施例では本発明の様々な特徴を例示するが、これは請求の範囲に述べられている本発明の範囲を、どのようにも限定することを意図していない。
実施例Ｉ
７−クロロレピジンの調製
３−クロロアニリン（１．５９ｇ）、塩化第二鉄六水和物（５．４ｇ）、塩化亜鉛（０．２ｇ）、エタノール（９５％水溶液２０ｍｌ）を含有する、６０℃に予備加熱された混合物に、１，３，３−トリメトキシブタン（１．４８ｇ）を添加した。生じた混合物を２時間還流させ、一晩放置した。その後、真空下で揮発性物質を除去し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を用いて残留物を塩基性とした。生じた混合物を水とジエチルエーテルとの間で分配させた（３回）。一緒にしたエーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。エーテル溶液の回転蒸発により暗色液体を得た。この液体をシリカゲルカラムに添加し、ヘキサン／酢酸エチル（３：１）を用いて溶離させ、黄褐色結晶として所望の生成物を得た。
ヨウ化７−クロロ−１−メチルレピジニウムの調製
上記のように調製した７−クロロレピジンの部分（８０ｍｇ）を、ＣＨ3ＣＮ（１ｍｌ）中でＣＨ3ｌ（０．５ｍｌ）と還流下に２時間加熱することによって、メチル化した。ジエチルエーテルを用いてこの混合物を処理し、その後に遠心分離によって黄色粉末を得た。
ヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムの活性化
無水酢酸（１０ｍｌ）中ヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム（３５０ｍｇ）及びＮ，Ｎ‘−ジフェニルホルムアミジン（４２０ｍｇ）の混合物を１２０℃で３０分間加熱した。ジエチルエーテルを添加し、懸濁液を遠心分離した。上清をデカンテーションし、沈降物をより多くのジエチルエーテルを用いて洗浄し、乾燥させた。
色素７の調製
上記で入手した活性化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム誘導体（４．５ｍｇ）に、クロロホルム（２５０μＬ）中上記で入手した７−クロロ−１−メチルレピジニウム塩を添加し混合物を形成させた。この混合物に次いでトリエチルアミン（５０μＬ）を添加した。生じた混合物を還流させながら３０分間攪拌し、その間に暗青色溶液を得た。この溶液にジエチルエーテルを添加し、生じた懸濁液を遠心分離した。上清を廃棄し、沈降物をジエチルエーテル中に再懸濁させ、遠心分離した（２回）。暗色粉末はメタノール溶液中において６３８ｎｍで吸収極大を示した。
実施例ＩＩ
色素８の調製
実施例Ｉにおけるヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムをヨウ化２，３−ジメチルベンゾチアゾリウムに置換する以外は、色素７の調製について記載された方法に従った。この色素も又メタノール中において６３８ｎｍで吸収極大を示した。
実施例ＩＩＩ
色素９の調製
実施例Ｉにおけるヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムをヨウ化２，３−ジメチルナフトキサゾリウムに置換する以外は、色素７の調製について記載された方法に従った。この色素はメタノール中において６２４ｎｍで吸収極大を示した。
実施例ＩＶ
色素２の調製
実施例Ｉにおける３−クロロアニリンを３−フルオロアニリン（１．８４ｇ）に置換する以外は、色素７の調製について記載された方法に従った。この色素はメタノール中において６２８ｎｍで吸収極大を示した。
実施例Ｖ
色素５の調製
実施例Ｉにおける３−クロロアニリンを３−ブロモアニリン（２．１５ｇ）に置換する以外は、色素７の調製について記載された方法に従った。この色素はメタノール中において６３８ｎｍで吸収極大を示した。
実施例ＶＩ
色素６の調製
実施例Ｉにおけるヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウムをヨウ化１，１，２，３−テトラメチル−１Ｈ−ベンズインドリウムに置換する以外は、色素７の調製について記載された方法に従った。この色素はメタノール中において６２３ｎｍで吸収極大を示した。
実施例ＶＩＩ
中性ｐＨおよび試験溶液の最終濃度０．５μｇ／ｍｌである緩衝液（“ＣＤ４０００  Ｒｅｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ”）中に色素を溶解させて蛍光を測定した。“ＣＤ４０００  Ｒｅｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ”は下記の成分を表示された量で含有していた：
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試験は、ヘリウム−ネオンレーザー光源を備えたフローサイトメーターにおいて実施した。ヘリウム−ネオンレーザーは波長６３０ｎｍで光線を生じさせた。光学系は従来型光学系であった。結果を表ＩＩＩに示す。
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表ＩＩＩに記載のデータから、本発明の色素２は米国特許第４，９５７，８７０の色素より大きなＤＮＡ及びＲＮＡとの信号増強を生じさせることを読み取ることができる。
当業者には、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに本発明の様々な修飾及び変更が可能であることは明白であり、さらに、本発明を本書に記載の例示的実施態様に不当に限定するべきではないと理解されるはずである。