(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を産生するヒト肝癌組織由来の細胞ｈｕＧＫ-１４を培養し、得られた培養上清からＢ型肝炎ウイルス表面抗原を得る方法において、生産用培養液にデキサメタゾン０.５〜１μＭおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５〜３０ｍＭを含有させることを特徴とするＢ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法。
【請求項２】
デキサメタゾン０.５〜１μＭおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５〜２５ｍＭを含有させる請求項１に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、Ｂ型肝炎ワクチン製造原料であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原を産生するヒト肝癌組織由来の細胞を無血清培地で培養して、培養上清中に該抗原を産生分泌させるに際し、培養液にデキサメタゾンおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを添加することにより該抗原の生産を相乗的に高める技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢウイルス）は感染率の高いウイルスで、東アジアや中部アフリカを中心に世界的に無症候状のキャリアを含め２億人、我が国だけでも約２００万人の罹患者の存在が推定されている。ＨＢウイルスは急性肝炎・劇症肝炎の原因となるだけでなく、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌にまで関与し、無症候性キャリアでも長期的な肝癌発生率は健常人の２００倍以上といわれている。したがって、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原あるいは抗原）を用いて作製したＢ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチンあるいはワクチン）は、ＨＢウイルスの感染の予防に有効であるとともに、癌の予防にも有効であるともいえる。
【０００３】
ＨＢウイルスは、ヒト以外ではチンパンジーの肝臓でしか増殖しないため、ワクチン製造原料となるＨＢウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原あるいは抗原）粒子を得るため、当初はキャリアの血液から調製された直径が２２ｎｍのＨＢｓ抗原粒子が用いられた。しかし、キャリアの血液の供給量には限りがあり、また、感染性のＨＢウイルスの不活化はヒトあるいはチンパンジーでしか確認できず、さらに、未知因子の混入を完全に否定することが困難である。
【０００４】
遺伝子組換え技術は新しいワクチン開発の道を開き、遺伝子操作技術により、血液由来のワクチンと同等の物理化学的性状と免疫原性をもつＨＢｓ抗原粒子が製造できるようになった（McAleer, W. J. et al.: Nature, 307: 178-180, 1984）。しかしながら、遺伝子組換えＨＢワクチンは不活化ワクチンであり、複数回にわたって多量の抗原を投与あるいはアジュバントを使って投与しなければならず、発展途上国で広く使用されるには高価である。また、酵母を宿主として得られたＨＢｓ抗原は、血漿由来のＨＢｓ抗原の抗体との反応性を１００とすると２０〜５０％といわれている（William J. McAleer, et al.: Nature,307: 178, 1984）。
【０００５】
一方、ＨＢｓ抗原を産生するヒト肝癌組織由来の樹立細胞株ｈｕＧＫ-１４（日本国特許第1,823,385号）を、ウシ血清アルブミンおよびデキサメタゾンを添加した無血清培養液で培養し、その培養上清からＨＢワクチン原料となるＨＢｓ抗原粒子を分離・精製している（日本国特許第2,042,239号）。この抗原粒子の力価は、対照抗原（血漿由来）と同等である（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）。このワクチンは、安全性と有効性が確認されている。しかしながら、培養細胞から該抗原を培養液中に大量に産生分泌させることにより、該抗原の生産量をあげ、ワクチンの製造コストをさらに低下させることが望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、ＨＢｓ抗原を産生するヒト肝癌組織由来の樹立細胞株を培養して、その培養上清から該抗原を得るに際し、該抗原の生産をさらに高め、かつ、得られる該抗原の物理化学的特性および免疫学的特性が、天然型のＨＢｓ抗原（血漿由来）と同等である該抗原を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＨＢｓ抗原を産生するヒト肝癌組織由来の樹立細胞株ｈｕＧＫ-１４を培養し、その培養上清から該抗原を得るに際し、生産培養培地にデキサメタゾン（dexamethasone）および  Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）を生産用培養液（単に培地ともいう）に含ませることより、培養上清中に従来にない高い濃度のＨＢｓ抗原粒子が分泌産生されることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は
（１）  Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を産生するヒト肝癌組織由来の細胞を培養し、得られた培養上清からＢ型肝炎ウイルス表面抗原を得る方法において、生産用培養液にデキサメタゾン０.５〜１μＭおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５〜３０ｍＭを含有させることを特徴とするＢ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法、
（２）  デキサメタゾン０.５〜１μＭおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１５〜２５ｍＭを含有させる（１）のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法、
（３）  ヒト肝癌組織由来の細胞がｈｕＧＫ-１４である（１）または（２）のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、用いられるＨＢｓ抗原粒子を産生するヒト肝癌組織由来の樹立細胞株ｈｕＧＫ-１４は以下のようにして得られている。
許らは、ヒト肝癌患者（日本人の男性, ５３歳）の肝癌組織から細胞を分離し、１５％ウシ胎仔血清添加ＤＭ-１６０培地で培養し、ｈｕＨ-１細胞株を樹立した（Huh, N. and Utakoji, T. : Jpn. J. Cancer Res. 72: 178-179, 1981）。小池らは、ＨＢｓ抗原を著量産生する肝癌由来の細胞を得るために、このｈｕＨ-１細胞株を用いて、限界希釈法（Puck, T.T. et al.: J. Exp. Med., 103: 273-284, 1956）によるクローニングを行い、クローンｈｕＳＰを得た（Mizusawa, H. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 208-212, 1985）。さらに、小池らは、このクローンｈｕＳＰを用いて、軟寒天培養法によるクローニングを行い、ＨＢｓ抗原をｈｕＳＰよりもさらに高い濃度で培養液中に分泌産生する細胞株ｈｕＧＫ-１４を得た（Koike, K. et al.: Jpn. J. Cancer Res. 78: 1341-1346, 1987; 日本国特許第1,823,385号）。
【００１０】
この細胞株ｈｕＧＫ-１４の特徴は、無血清の生産用培地でも良好な分裂増殖を示し、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原粒子を培養液中に著量分泌産生し、さらにステロイドホルモンの一つであるデキサメタゾンを生産用培地に１μＭ添加すると、ＨＢｓ抗原の産生量を増加させることができる（日本国特許第2,042,239号）。
このようなホルモンによるＨＢｓ抗原産生誘導現象によるＨＢｓ抗原の生産性の向上に基づき、新たに分化誘導剤とホルモンの組み合わせによるさらなる生産性の向上を目的として検討を行った結果、デキサメタゾン単独による誘導効果を遙かに越えるデキサメタゾンと分化誘導剤との組み合わせを見い出した。
【００１１】
以下、本発明の理解のために試験例により本発明を説明する。
ＨＢｓ抗原の産生に最適の誘導物質濃度を探索する目的で、誘導物質としてデキサメタゾン（以下、「Ｄｅｘ」という）、あるいは各種誘導物質を選び、それぞれについて、ＨＢｓ抗原生産用培地に添加し、８週間にわたり、ＨＢｓ抗原の産生量を調べた。
Ｄｅｘを添加した場合、表１に示すように、Ｄｅｘの濃度が０.５〜１.０μＭの範囲では、ＨＢｓ抗原の産生量は、安定していたが、〜２μＭでは逆に産生量が低下することが示された。したがって、ＨＢｓ抗原を培養液中に高い濃度で分泌産生させるためには、生産用培地へ添加するＤｅｘの濃度は、０.５〜１μＭの範囲に設定するのが好ましく、さらに好ましい濃度はほぼ１μＭ近辺と考えられる。培地中のＤｅｘの濃度が生細胞数に及ぼす影響（細胞毒性）は、表１に示すように、設定した０.５〜２μＭの範囲ではほとんど認められず、増殖傾向にあった。
表中、分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
一方、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（以下、「ＤＭＡ」という）のＨＢｓ抗原産生誘導効果は、表２に示すように、１５〜２５ｍＭの範囲では、ＨＢｓ抗原の産生量は濃度依存的に増加することが示唆されたが、〜３０ｍＭでは逆に産生量が低下することが示された。したがって、ＨＢｓ抗原を培養液中に高い濃度で分泌産生させるためには、生産用培地へ添加するＤＭＡの濃度は１５〜２５ｍＭ近辺の範囲に設定するのが好ましく、さらに好ましい濃度は２０〜２５ｍＭ近辺の範囲であり、最も好ましい濃度は２５ｍＭ近辺、と考えられる。ＤＭＡの濃度が生細胞数に及ぼす影響は、表２に示すように、設定した５〜３０ｍＭの範囲ではほとんど認められず、増殖傾向にあった。
表中、分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
以上の結果から、ＤｅｘおよびＤＭＡを生産用培地にそれぞれ単独で添加した場合、ＨＢｓ抗原産生を増強し、かつ、添加した濃度範囲では、細胞毒性は極めて低く、単位細胞当たりのＨＢｓ抗原産生レベルの向上が示された。
そこで、本発明者らは、ＤｅｘとＤＭＡを生産用培地に添加した場合、ＨＢｓ抗原産生誘導が相乗的あるいは相加的に増強されるかどうか、そして、増強された場合での、ＤｅｘとＤＭＡの最適組合わせ濃度を調べた。
その結果、表３に示すように、生産用培地に添加するＤｅｘとＤＭＡの濃度が、Ｄｅｘが０.５〜１μＭの範囲で、かつ、ＤＭＡの濃度が１２.５〜２５ｍＭの範囲である組合わせの場合に、ＨＢｓ抗原の産生が、Ｄｅｘ単独の場合に対して２.３〜３.４倍、ＤＭＡ単独の場合に対して４〜６倍増強されることが明らかとなった。
表中、分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
【００１６】
【表３】
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【００１７】
ＤｅｘとＤＭＡの好ましい組み合わせは、Ｄｅｘが０.５〜１.０μＭ近辺で、かつ、ＤＭＡが１２.５〜２５ｍＭ近辺、さらに好ましい組み合わせは、Ｄｅｘ０.５〜１.０μＭで、かつ、ＤＭＡ 25ｍＭ近辺、最も好ましい組み合わせは、Ｄｅｘ０.５μＭ近辺と、ＤＭＡ 25ｍＭ近辺との組み合わせと考えられる。細胞毒性に関しては、細胞播種時の細胞数が維持されており、細胞毒性は低いと推察される。
ＤｅｘとＤＭＡとの組み合わせにより、ＨＢｓ抗原産生が著明に増強されることが明らかとなった。そこで、さらに、ＤＭＡと同様な分化誘導物質である、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）（以下、「ＤＥＡ」という）、Ｎ，Ｎ−ジメチルフオルムアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（以下、「ＤＭＦ」という）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（以下。「ＤＥＡＡ」という）、ヘキサメチレンビスアセトアミド（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ）（以下、「ＨＭＢＡ」という）、およびジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（以下、「ＤＭＳＯ」という）、について、Ｄｅｘとの組み合わせによるＨＢｓ抗原の産生増強効果を調べた。
その結果、表４に示すように、Ｄｅｘと各種分化誘導物質との組み合わせは、いずれも、ＨＢｓ抗原産生増強効果を示さなかった。すなわち、ＤｅｘとＤＭＡとは、極めてユニークな組み合わせであることが本発明により初めて明らかにされた。表中の数値はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示す。
【００１８】
【表４】
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【００１９】
さらに、本発明者らは、ＤｅｘとＤＭＡとの組み合わせが、ＨＢｓ抗原の産生を著明に増強したことに鑑み、Ｄｅｘ以外の他のホルモンとＤＭＡとの組み合わせがＨＢｓ抗原の産生を増強するかどうかを探索する目的で、他のホルモンとして、コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、プレドニソン、プレドニゾロン、トリアムシノロンを選び、これらのホルモンとＤｅｘとの組み合わせ効果を調べた。
その結果、表５に示すように、ＤＭＡ２５ｍＭとコルチゾール１〜１００μＭとの組み合わせは、Ｄｅｘ単独の場合に対して、ＨＢｓ抗原の産生を約３倍程度増強したが、ＤｅｘとＤＭＡの増強効果を超えることはなかった。表中の数値はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示す。
【００２０】
【表５】
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【００２１】
さらにまた、ＤｅｘとＤＭＡの組み合わせによる誘導効果は、一旦、ＤｅｘとＤＭＡによる誘導がかかれば持続するものなのか、あるいはＤｅｘとＤＭＡが常時培養液中に存在しないと誘導がかからないのかを明らかにするために、ＤｅｘとＤＭＡを間歇的に生産用培地中含ませたときのＨＢｓ抗原産生誘導を調べた。その結果、表６に示す（[  ]内は誘導物質無添加期間の抗原量を示す）ように、ＤｅｘあるいはＤＭＡ＋Ｄｅｘを常時添加した系においては誘導効果は培養期間中持続していた。しかし、ＤＭＡ＋Ｄｅｘを間歇的に培地中に存在させると、明らかに誘導剤が含まれる場合のみ誘導効果が確認され、誘導剤が含まれない場合の産生量は低値であった。間歇添加の系でのＨＢｓ抗原産生量はＤＭＡ＋Ｄｅｘを常時存在させた場合とほぼ同等であった。表中の数値はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示す。
【００２２】
【表６】
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【００２３】
以上の結果から、ＤｅｘとＤＭＡをＨＢｓ抗原生産用培地に添加することにより、ｈｕＧＫ-１４細胞は、ＨＢｓ抗原を高濃度で培養液中に分泌産生することが明らかとなった。
【００２４】
ところで、ｈｕＧＫ-１４細胞の生産用培養（Ｄｅｘ添加）上清から分離・精製したＨＢｓ抗原の力価（抗体価）および物理化学的特性が明らかにされている（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）。そこで、本発明で得られたＨＢｓ抗原が、ＨＢワクチンの原料として、あるいはＢ型肝炎の診断薬の抗原として上記ＨＢｓ抗原の抗原性および物理化学的特性を有しているかを調べる必要がある。
【００２５】
ＤＭＡとＤｅｘを含ませた生産用培地で産生誘導された抗原を精製し、精製抗原粒子の物理化学的特性と抗ＨＢｓ抗体保有血清に対する反応性について検討した。
【００２６】
その結果、（１）ＨＢｓ抗原は粒子を形成しており、その平均粒子径は２４〜２５ｎｍで天然型に存在するＨＢｓ抗原粒子径（約１８〜２５ｎｍ）とほぼ同じであり、（２）密度は１．２１ｇ／ｃｍ3、（３）紫外吸収スペクトルは波長２８２ｎｍにおいて吸収極大が、波長２７５ｎｍ付近および２９０ｎｍ付近に肩が認められ（図１）、（４）ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）電気泳動において、メジャーなポリペプチド（２２Ｋ）のピークとこれに糖鎖の結合したポリペプチド（２６Ｋ）を主成分とし、これらポリペプチドのダイマーである２本のポリペプチド（４４Ｋ、４７Ｋ）のピークが認められ（図３）、および（５）上記文献（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）の抗原と本発明で得られた抗原の、血清との反応性は同等であり、相関係数も高く（0.992）傾きも１に近い（図５）、ことから、本発明で得られた抗原と文献記載（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）の抗原との物理化学的特性および免疫学的特性は同等であることが明らかとなった。
ｈｕＧＫ-１４を培養して、ワクチン原料、あるいは診断薬の原料として適切なＨＢｓ抗原を得る方法は、当業者であれば、文献（日本国特許第2,042,239号）記載の方法、あるいはそれを適宜修正して実施可能である。したがってそのような修正も本発明に包含される。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例および試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
１）細胞培養
ＨＢｓ抗原産生細胞は、小池らにより樹立されたクローンｈｕＧＫ-１４（Koike, K. et al.: Jpn. J. Cancer. Res., 78: 1341-1346, 1987; 日本特許第1,823,385号）を使用した。
凍結保存したアンプル中のｈｕＧＫ−１４細胞（以下、「細胞」ともいう）を解凍した後、培養し、５継代以内の細胞を使用した。細胞の播種密度は約３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2とした。
細胞培養は、細胞を増殖させる増殖期と、ＨＢｓ抗原を生産させる抗原生産期に分けて行った。増殖期に用いる培地は、ＤＭ−１６０培地にウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を播種時は５％、その後の増殖（培地交換）にはＦＣＳを１％添加したものを用いた。ＨＢｓ抗原生産用培地は、ウイリアムズＥ培地にウシ血清アルブミンを０．１％、および各種誘導物質（分化誘導剤、ホルモン）を所定量添加したものを用いた。
細胞培養は６穴、あるいは２４穴培養プレートを用い、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキュベーター中で行った。増殖期間中は、２−３日間に一度の割合で培地交換を行った。一週間で細胞はほぼ飽和密度に達した。抗原生産期間中は、一週間に一度の割合で培地交換を行い、８−１１週間培養した。ＨＢｓ抗原産生誘導効果、細胞生存数、および長期間生産の可能性を評価した。なお、２４穴プレートは細胞数計測のために、６穴プレートはＨＢｓ抗原産生誘導評価のために使用した。ＨＢｓ抗原生産用培地に交換した時点および培地交換の都度生細胞数を計測した。計測はトリパンブルー色素排除法によった。
【００２９】
２）誘導物質
以下の誘導物質を用いた。
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）
Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡ）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡ）
ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
デキサメタゾン
コルチゾール
コルチゾン
コルチコステロン
プレドニソン
プレドニゾロン
トリアムシノロン
【００３０】
３）ＨＢｓ抗原量測定
ＨＢｓ抗原量は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定した。
純度９９％以上の精製ＨＢｓ抗原をＬｏｗｒｙ法で定量し、濃度既知の標準抗原とした。ＥＩＡは、９６穴プレートを用い、ＨＢｓ抗原上のたがいに異なるエピトープを認識する２種類の抗ＨＢｓモノクローナル抗体による１-ステップサンドイッチ法を採用した。
モノクローナル抗体をウエルに固相化し、ブロッキング操作を行った。ウエルを洗浄液で５回洗浄した後、あらかじめペルオキシダーゼ標識抗ＨＢｓモノクーロナル抗体と培養上清液との反応液を各ウエルに５０μｌ添加し室温で９０分間の反応させた。洗浄液でプレートを５回洗浄後、発色用基質溶液（ＴＭＢ発色液）を各ウエルに１００μｌ添加した。室温で３０分間発色反応をさせた後、２Ｎ−硫酸を各ウエルに１００μｌ加え、反応を停止させた。発色強度を９６穴マイクロプレートリーダーを用いて測定した（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍ）。標準抗原液の発色強度より検量線を作成し、培養上清液中の抗原濃度を算出した。
【００３１】
［試験例１］
各種濃度のＤｅｘを含む生産用培地について、８週間にわたり、ＤｅｘによるＨＢｓ抗原産生誘導効果、および生細胞数を調べた。結果を表１に示す。
表中、分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
Ｄｅｘが０.５〜１.０μＭではＨＢｓ抗原の産生誘導が安定しており、そして１.０μＭ近辺にＨＢｓ抗原の産生誘導の至適濃度が存在することが示唆される。
一方、生細胞数は、Ｄｅｘ０.５〜２.０μＭでは、細胞毒性は認められなかった。
各種濃度のＤＭＡを含む生産用培地について、８週間にわたり、ＤＭＡによるＨＢｓ抗原産生誘導効果、および生細胞数を調べた。結果を表２に示す。表中、分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
ＤＭＡ１５〜２５ｍＭでは濃度依存的にＨＢｓ抗原の産生誘導が高められ、そして２５ｍＭ近辺にＨＢｓ抗原の産生誘導の至適濃度が存在することが示唆される。
一方、生細胞数は、ＤＭＡ１５〜２５ｍＭでは増殖傾向にあり、細胞毒性は極めて低いとみなされ、結果、単位細胞当たりのＨＢｓ抗原の産生の向上が明らかとなった。
【００３２】
［試験例２］
実施例１において、ＤｅｘおよびＤＭＡは、いずれもＨＢｓ抗原産生誘導効果を有していることが確認された。そこで、両物質を生産用培地に添加すると、ＨＢｓ抗原産生誘導が相乗的、あるいは相加的に増強されるかを調べた。
ＤｅｘおよびＤＭＡの濃度を変え、ＨＢｓ抗原産生誘導に対する最適な組み合わせ濃度を検討した。８週間にわたり、ＤｅｘとＤＭＡの存在下でのＨＢｓ抗原産生誘導併用効果を調べた。結果を表５に示す。分子はＨＢｓ抗原量（ng/ml）を示し、分母は生細胞数（×１０5cells/cm2）を示す。
【００３３】
Ｄｅｘ０.５〜１.０μＭと、ＤＭＡ 12.5〜25ｍＭとの組み合わせは、Ｄｅｘ１.０μＭの場合に比較して、ＨＢｓ抗原の産生量が約２.３〜６倍増強していることが認められる。好ましい組み合わせは、Ｄｅｘ０.５〜１.０μＭと、ＤＭＡ 25ｍＭ近辺との組み合わせであり、さらに好ましい組み合わせは、Ｄｅｘ０.５μＭ近辺と、ＤＭＡ 25ｍＭ近辺との組み合わせと考えられる。
【００３４】
［試験例３］
ＤＭＡと同様な分化誘導作用を示すその他の物質すなわち、ＤＥＡ、ＤＭＦ、ＤＥＡＡ、ＨＭＢＡ、およびＤＭＳＯについて、Ｄｅｘとの、ＨＢｓ抗原誘導産生に対する組み合わせ効果を調べた。結果を表４に示す。
【００３５】
Ｄｅｘと、ＤＭＡ以外の分化誘導剤の組み合わせによるＨＢｓ抗原産生誘導は、いずれの組み合わせも、ＤｅｘとＤＭＡの組み合わせによるそれを超えるものはなかった。
【００３６】
［試験例４］
Ｄｅｘと同様なホルモン作用を示すその他の物質すなわち、コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、プレドニソン、プレドニゾロン、およびトリアムシノロンについて、ＤＭＡとの、ＨＢｓ抗原誘導産生に対する組み合わせ効果を調べた。結果を表５に示す。
【００３７】
コルチゾール１〜１００μＭとＤＭＡ２５ｍＭとの組み合わせは、Ｄｅｘ単独の場合に比較して約３〜３.６倍と最大のＨＢｓ抗原誘導効果を示したが、Ｄｅｘ０.５μＭとＤＭＡ 25ｍＭとの組み合わせのそれを超えることはなかった。
【００３８】
［試験例５］
ＨＢｓ抗原産生誘導に、誘導物質が常時培養液中に存在する必要があるかどうかを調べるために以下の試験を行った。
ＤＭＡ２５ｍＭ＋Ｄｅｘ０．５μＭを含む培地で２週間培養（１〜２週）、ついでこれらの誘導物質含まない培地で３週間培養（３〜５週）、そして、再度、ＤＭＡ２５ｍＭ＋Ｄｅｘ０．５μＭを含む培地で６週間培養（６〜１１週）培養を行った。結果を表９に示す。対照として、Ｄｅｘ1.0μＭ、あるいはＤＭＡ25ｍＭ＋Ｄｅｘ０．５μＭを培地中に、培養期間中含ませた系を用いた。結果を表６に示す。
【００３９】
ＤＭＡ＋Ｄｅｘを培地中に含む培地で培養し（１〜２週）、その後、ＤＭＡ＋Ｄｅｘを培地中に含まない培地で培養すると、その期間（３〜５週）は、対照（DMA＋Dex を含む）に比較して、ＨＢｓ抗原の産生誘導が低下していることが認められる。そして、再度ＤＭＡ＋Ｄｅｘを培地中に含む培地で培養（６〜９週）すると、ＨＢｓ産生誘導が対照（DMA＋Dex を含む）と同等かそれ以上に回復することが認められる。
【００４０】
［試験例６］
ＤＭＡ＋Ｄｅｘで産生誘導されたＨＢｓ抗原の抗原性および物理化学的特性が、すでに小田らにより明らかにされているＨＢｓ抗原（Ｄｅｘで産生誘導）のそれら（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）と同一か、ＨＢｓ抗原を精製して調べた。
１）  粒子径の測定
電子顕微鏡を用いて撮影した精製抗原粒子の粒子径をノギスで１００粒子測定し、その平均値を粒子径とした。その結果、平均粒子径は２４〜２５ｎｍであり、この値は小田らのＨＢｓ抗原のそれとほぼ同一であった。
２）  密度の測定
精製抗原粒子の密度を臭化カリウムによる平衡密度勾配超遠心分離法で求めたところ、１．２１ｇ／ｃｍ3であった。この値は小田らのＨＢｓ抗原のそれと同一であった。
３）  紫外吸収スペクトル
波長２８２ｎｍにおいて吸収極大が、波長２７５ｎｍ付近および２９０ｎｍ付近に肩が認められた（図１）。この紫外吸収スペクトルのプロフィルは小田らのＨＢｓ抗原（図２）のそれと同一であった。
４）  ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）
精製抗原液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、染色し、デンシトメーターにて解析した。精製抗原をＳＤＳと２-メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー中で１００℃で５分間加熱した。ポリアクリルアミドゲル（１０〜２０％グラジエントゲル）のウエルに加熱試料溶液を負荷した。３０〜５０ｍＡ／ゲルの定電流で約２時間泳動した。泳動終了後ゲルをクマシー染色液に浸し、約１時間染色した。
ゲルをデンシトメーターで解析した。メジャーなポリペプチド（２２Ｋ）のピークとこれに糖鎖の結合したポリペプチド（２６Ｋ）を主成分とし、これらポリペプチドのダイマーである２本のポリペプチド（４４Ｋ、４７Ｋ）のピークが認められた（図３）。これらのポリペプチドの移動度、およびピークの高さは、小田らのＨＢｓ抗原（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）（図４）のそれらと同一であった。
５）  免疫化学的特性
ＨＢｓ抗原はＨＢワクチン原料、あるいはＢ型肝炎の診断薬原料として使用されることから、抗原性が重要である。本発明方法で得られたＨＢｓ抗原、あるいは小田らのＨＢｓ抗原を固相化し、抗体保有血清検体と反応させ、抗原・抗体の反応性について比較した。結果を図５に示す。
図５から、本発明方法で得られたＨＢｓ抗原、あるいは小田らのＨＢｓ抗原（小田宗宏, 角尾 肇, 小池克郎 : 肝胆膵,13(3): 585-590, 1986）と血清検体中の抗体との反応性を近似式で示すと、近似式：y=1.1054x−0.013が導かれ、傾きがほぼ１であり、相関係数が0.992と高い値である。すなわち、本発明方法で得られたＨＢｓ抗原と小田らのＨＢｓ抗原の免疫学的特性は同等であることが明らかとなった。
これらの試験結果から、本発明方法で得られたＨＢｓ抗原の物理化学的特性、および免疫学的特性は、小田らのＨＢｓ抗原のそれと全く同一であり、ＨＢワクチン、あるいはＢ型肝炎の診断薬の抗原として有効であることが明らかになった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、従来の天然型ＨＢｓ抗原（血漿由来）に近いｈｕＧＫ−１４細胞由来のＨＢｓ抗原と同等の物理化学的特性および免疫学的特性を有するＨＢｓ抗原を、大量（従来の４〜６倍）に生産することが可能となり、ワクチン製造費の大幅なコストダウンが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒト肝癌由来のｈｕＧＫ-１４細胞を、デキサメタゾン1.0μＭおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）25ｍＭを含む生産用培地で培養して得られたＨＢｓ抗原の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図２】  ヒト肝癌由来のｈｕＧＫ-１４細胞を、デキサメタゾン1.0μＭを含む生産用培地で培養して得られたＨＢｓ抗原の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】  ヒト肝癌由来のｈｕＧＫ-１４細胞を、デキサメタゾン1.0μＭおよびＤＭＡ25ｍＭを含む生産用培地で培養して得られたＨＢｓ抗原のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元下）のデンシトメーター解析結果を示す図である。
【図４】  ヒト肝癌由来のｈｕＧＫ-１４細胞を、デキサメタゾン1.0μＭを含む生産用培地で培養して得られたＨＢｓ抗原のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元下）のデンシトメーター解析プロフィルを示す図である。
【図５】  ヒト肝癌由来のｈｕＧＫ-１４細胞を、デキサメタゾン1.0μＭおよびＤＭＡ25ｍＭを含む生産用培地、あるいはデキサメタゾン1.0μＭを含む生産用培地で培養して得られたＨＢｓ抗原と、抗体保有血清検体との反応性をＥＩＡ法で測定し（ＯＤ450）、回帰分析した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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