(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｘ
〔式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり；Ｘは、−Ｎ3基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；ｎは、８〜２０の整数である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない〕で示される化合物であって、（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zが、Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβである化合物。
【請求項２】
ｎが、８〜１６である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｎが、１２である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｌが、−Ｏ−（ＣＨ2)n−である、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3の化合物。
【請求項６】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′は、それぞれ請求項１に記載の定義を有するＧ1、Ｇ2、Ｇ3のヒドロキシル基が保護された基であり、ｘ、ｙ、及びｚは、請求項１に記載のとおりである）で示される化合物を臭素化して、−（Ｇ3′)zの末端の単糖のアノマー炭素に結合するヒドロキシル基が臭素化されている化合物である、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｂｒ
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、及びｚは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物を、式：Ｈ−Ｌ−Ｘ′（式中、Ｌは、請求項１に記載のとおりであり、Ｘ′は、−ＯＨである）で示される化合物と反応させて、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨである）である式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−Ｘ′
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ、及びＸ′は、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物をメシル化して、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−ＯＭｓ
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりであり、Ｍｓは、メシル基である）で示される化合物を得；
得られた化合物をアジド化して、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−Ｎ3である）である式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−Ｎ3
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
こうして得られた保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−Ｎ3である）から保護基を除去して、式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−Ｎ3である）を得ることを含む方法。
【請求項７】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物を含む、糖鎖生合成用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖生合成に使用しうる新規糖鎖プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞の表面は、通常様々の糖により修飾されたり、被覆されている。これらの糖は、膜タンパク質や脂質との共有結合により形成された糖タンパク質や糖脂質のオリゴ糖側鎖として、あるいはプロテオグリカン分子の中の多糖側鎖として存在する。オリゴ糖側鎖の糖の配列は非常に多様であり、多様に枝別れし、共有結合して、互いにつながりあっている。そしてこれらの糖鎖は、細胞の認識・接着、情報伝達、及び細胞機能の制御に重要な役割を果たしている。このためこれらの糖鎖の機能の研究のためには、上記のように多様な配列を有する糖鎖を得る必要がある。糖鎖を得る方法としては従来、化学的に合成する方法；分解酵素による方法；そして糖転移酵素を用いる方法などがあるが、化学的に合成する方法では、何段階もの工程が必要であり、収量が低く、合成工程の設計が複雑であるなどの欠点がある。分解酵素による方法では、使用できる酵素が限られているうえ、糖の供与体が限られているという欠点がある。また糖転移酵素を用いる方法では、使用できる転移酵素が少なく、出発原料として使用する糖−ヌクレオチドが高価であるなどの欠点がある。
【０００３】
一方、ラクトシドプライマーをＢ１６マウスメラノーマ細胞やラットＰＣ１２細胞に与えると、内因性のグリコスフィンゴ脂質の生合成が阻害されるとともに、細胞がそのプライマーに糖を付加する（グリコシル化する）ことは、Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 698-703 (1997) (Miura, Y., et al.) 及びJ. Biochem. 124, 148-156 (1998) (Nakajima, H., et al.) に記載されているが、その付加効率や糖鎖生合成におけるその用途についてはあまり検討されていない。
【０００４】
上記のような理由から、従来の方法では、目的とする糖鎖を効率よく合成することが困難であり、所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を、比較的簡単な工程により好収量で合成することができる方法が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来の方法に比較して、比較的簡単な工程により好収量で所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を合成することができる方法を求めて鋭意研究を行った結果、特定の官能基をその末端に有していてもよいアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を糖鎖プライマーとしてある種の細胞に与えると、細胞がこれを細胞内に取り込んで、オリゴ糖鎖の部分に更に糖を付加（グリコシル化）し、付加生成物を細胞内に蓄積せずに細胞外に分泌すること、また糖鎖プライマーを与える細胞の種類によって、付加される糖の種類が異なることが見出され、糖鎖プライマーの糖鎖の種類、そして糖鎖プライマーを与える細胞の種類を組み合わせることによって、所望の構造の糖鎖を細胞に生合成させることができることを見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｘ
〔式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり；Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；ｎは、８〜２０の整数である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない〕で示される化合物に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の式（Ｉ）の化合物において、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体である。単糖としては、いかなる単糖を使用することもできるが、なかでもペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。具体的には、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−及びＬ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−マンノース（Ｍａｎ）、Ｄ−タロース（Ｔａｌ）などのアルドヘキソース；Ｄ−及びＬ−アラビノース（Ａｒａ）、Ｄ−キシロース（Ｘｙｌ）、Ｄ−及びＬ−リキソース（Ｌｙｘ）、Ｄ−リボース（Ｒｉｂ）などのアルドペントース；Ｄ−フルクトース（Ｆｒｕ）、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトースなどのケトヘキソース；並びにＤ−リブロース、Ｄ−及びＬ−キシルロースなどのケトペントース、更にはＬ−フコース（Ｆｕｃ）、及びシアル酸（Ｓｉａ）を使用することができる。なかでもＤ−グルコース、Ｄ−及びＬ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロースを挙げることができる。またその誘導体としては、上記の単糖のＮ−アシルアミノ糖（特にＮ−アセチルアミノ糖）、Ｏ−アシル糖（特にＯ−アセチル糖）、デオキシ糖、ウロン酸などを使用することができる。
【０００８】
また、（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zのｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数である。ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、好ましくは０〜５、更に好ましくは０〜３、更に特に好ましくは０〜２である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。
【０００９】
（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zの好ましい例としては、（Ｇｌｃ)2；（Ｍａｎ)2；（Ｇｌｃ)1−（Ｍａｎ)1；（Ｇａｌ)1−（Ｇｌｃ)1；（Ｇａｌ)1；（Ｇｌｃ)1；（Ｍａｎ)1；及び（Ｘｙｌ)1などを挙げることができる。なかでも特に好ましいのは、（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zが、Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇｌｃ、つまりラクトース基である式（Ｉ）の化合物である。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物において、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり、−Ｌ−は、好ましくは−Ｏ−（ＣＨ2)n−である。ここで、ｎは、８〜２０の整数であり、ｎは、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。ｎが、８未満である場合、又は２０を越える場合には、式（Ｉ）の化合物を糖鎖プライマーとして細胞に与えても、糖鎖プライマーに対する細胞の糖付加能は低い。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物において、Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基である。Ｃ1-Ｃ4アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、tert−ブチルなどが挙げられるが、メチルであるのが好ましい。なかでもＸは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨであるのが好ましく、−Ｎ3又は−ＮＨ2であるのが特に好ましく、−Ｎ3であるのが更に特に好ましい。
【００１２】
上記の式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物を好ましい化合物として挙げることができる。
Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−２Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−３Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−２Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−３Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃβ１−２Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃβ１−３Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃβ１−６Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｍａｎα１−２Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｍａｎα１−３Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｍａｎα１−６Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇａｌβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇａｌα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧａｌＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｍａｎβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；
Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3；及び
Ｘｙｌβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3
【００１３】
上記の式（Ｉ）の化合物のうち、以下の式：
【００１４】
【化１】
0004532618.tif 000002
【００１５】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3が、特に好ましい式（Ｉ）の化合物である。
【００１６】
本発明はまた、上記の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′は、それぞれ上記に記載の定義を有するＧ1、Ｇ2、Ｇ3のヒドロキシル基が保護された基であり、ｘ、ｙ、及びｚは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を臭素化して、−（Ｇ3′)zの末端の単糖のアノマー炭素に結合するヒドロキシル基が臭素化されている化合物である、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｂｒ
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、及びｚは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物を、テトラヒドロフランなどの溶媒中、ＨｇＢｒ2−Ｈｇ（ＣＨ)2又は銀トリフラートなどの存在下で、式：Ｈ−Ｌ−Ｘ′（式中、Ｌは、上記に記載のとおりであり、Ｘ′は、−ＯＨ又は−Ｃ1-Ｃ4アルキルである）で示される化合物と反応させて、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ又は−Ｃ1-Ｃ4アルキルである）である式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−Ｘ′
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ、及びＸ′は、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物のうちＸ′が−ＯＨである化合物を、ピリジンなどの溶媒中、塩化メシルなどのメシル化剤と反応させることによってメシル化して、式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−ＯＭｓ
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりであり、Ｍｓは、メシル基である）で示される化合物を得；
得られた化合物を、ジメチルフランなどの溶媒中、アジ化ナトリウムなどのアジド化剤と反応させることによってアジド化して、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−Ｎ3である）である式：
（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)z−Ｌ−Ｎ3
（式中、Ｇ1′、Ｇ2′、Ｇ3′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
こうして得られた保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ、−Ｃ1-Ｃ4アルキル、又は−Ｎ3である）から、ナトリウムメチラート−メタノールなどの存在下で保護基を除去して、式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ、−Ｃ1-Ｃ4アルキル、又は−Ｎ3である）を得；
更に式（Ｉ）の化合物の基：Ｘを、−ＮＨ2又は−ＣＯＯＨに変換することを含む方法に関する。
【００１７】
本方法において出発化合物として使用する式：（Ｇ1′)x（Ｇ2′)y（Ｇ3′)zで示される化合物は、公知の方法で合成することのできる式：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zで示される化合物のヒドロキシル基を、例えばベンジル基などの保護基で保護することによって合成することができる。ベンジル基で保護する場合には、式：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)zで示される化合物を、ピリジンなどの溶媒中、塩化ベンジルなどのベンジル化剤と反応させる。
【００１８】
また本方法においては、Ｘが、−ＮＨ2である式（Ｉ）の化合物は、上記で得られたＸが−Ｎ3である式（Ｉ）の化合物から、当業者には公知の方法、例えばリンドラー触媒などを用いる接触還元により調製することができる。また、Ｘが、−ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物は、上記のように合成したＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物から、当業者には公知の方法、例えばＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物をシアン化ナトリウム、トリフェニルホスフィン、ＣＣｌ4と反応させて得られた対応するニトリル化合物を加水分解する方法；あるいはＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物をハロゲン化水素などのハロゲン化剤によりハロゲン化し、グリニャール反応によりカルボキシル基を導入する方法で合成することができる。
【００１９】
上記の方法で得られた本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、式（Ｉ）の化合物を取り込み、ゴルジ体において、式（Ｉ）の化合物の糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。細胞により付加される糖は、細胞により異なり、例えば、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に式（Ｉ）の化合物を与えると、ノイラミン酸のアシル誘導体であるシアル酸（ＳＡ）が付加され、ラットＰＣ１２細胞に投与すると、ガラクトースが付加される。したがって、所望の糖を付加する細胞に、所望の糖鎖を有する式（Ｉ）の化合物を糖鎖プライマーとして与えることによって、所望の糖鎖を有する糖付加生成物を得、更に必要に応じてこの工程を繰り返すことによって、多様な糖鎖を有する糖付加生成物を合成することができる。このようにして多様な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能である。また糖付加生成物は、細胞内に蓄積されずに細胞外に分泌されるので、培地から容易に回収することができる。したがって、本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして使用することによって、従来の方法に比較して、工程が比較的簡単で、効率的に高収量で、所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を合成することができる。
【００２０】
上記のようにして細胞から得られた、糖の付加されたグリコシル化生成物は、付加された糖鎖に応じて、各種の用途に使用することができる。例えば用いた細胞が付加する糖鎖に特異的親和性を有するウイルスやタンパク質の中和に用いることができる。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた場合に得られるシアル酸付加生成物は、インフルエンザウイルスを中和することができ、ラットＰＣ１２細胞を用いた場合に得られるガラクトース付加生成物は、病原性大腸菌のＯ−１５７毒素やボツリヌス毒素を中和することができる。これら以外にも、付加する糖鎖に応じて、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞ではコレラ毒素、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞では破傷風毒素、ヒトＭＯＬＴ−４細胞では腸炎ビブリオの中和に使用できる糖付加生成物を得ることができる可能性があり、またヒトＨＬ−６０細胞を用いた場合は、抗炎症効果を有する糖付加生成物を得ることができる可能性がある。糖の付加されたグリコシル化生成物の可能性のある用途としては、上記のほか、生体防御系刺激剤製造のための用途、各種医薬品（抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬など）又は細胞培養基材の製造のための用途、及び標的細胞ターゲッティング性を利用した生体内薬物運搬体の製造のための用途を挙げることができる。また上述のように多様な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能であるため、糖鎖の機能研究など広範囲の研究に使用することができる。
【００２１】
したがって本発明は、式（Ｉ）で示される化合物を含む、糖鎖生合成用プライマー、及び該糖鎖生合成用プライマーの、ウイルス又は細菌毒素の中和物質、生体防御系刺激剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬、細胞培養基材あるいは生体内薬物運搬体の製造のための用途にも関する。
【００２２】
本発明は、また細胞を用いて糖鎖を生合成する方法に関し、本方法は、上述したように、特定の官能基をその末端に有していてもよいアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物、特に式（Ｉ）で示される化合物を含む糖鎖生合成用プライマーの存在下で細胞を培養することによって、細胞に式（Ｉ）で示される化合物の糖鎖部分に糖を付加させてグリコシル化させ、培養培地から糖付加生成物を回収し、必要に応じて精製することを含む。そして本方法に使用することができる細胞としては、上述したＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、及びヒトＨＬ−６０細胞を挙げることができる。
【００２３】
本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして用いて得られる糖付加生成物のうち、そのアルキル鎖の末端に−ＣＨ3などのＣ1-Ｃ4アルキルを有する化合物は、エンドグリコセラミダーゼ又はセラミドグリカナーゼなどの酵素により切断してオリゴ糖鎖のみとすることができ、各種用途に用いることができる。また、そのアルキル鎖の末端に−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを有する糖付加生成物は、用途に応じて還元などの化学反応に付して、重合反応による糖鎖の高分子化や、その他の化合物との反応など広範囲の用途に使用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下に記載する実施例及び試験例により本発明を詳細に説明する。
実施例１
Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−ＯＨの調製
工程１
ラクトースを無水ピリジンに懸濁し、次に塩化ベンジルを滴下により加えた。混合物を室温で１時間、次いで６０℃で５時間撹拌した。反応混合物を冷却し、氷水を加え、溶媒を留去してシロップ状の生成物を得、これをアセトン／メタノール（１：３）から結晶化して、式（ａ）：
【００２５】
【化２】
0004532618.tif 000003
【００２６】
で示されるベンジル基を有するラクトースを白色結晶として得た。α：β＝２：１であった。収量は、約９０％であった。
【００２７】
工程２
前の工程で得られたベンジル基を有するラクトースを酢酸中、臭化水素により、室温で２〜３時間処理した。混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、水及びＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄し、乾燥し、溶媒を留去して、式（ｂ）：
【００２８】
【化３】
0004532618.tif 000004
【００２９】
で示される、グルコースのアノマー炭素に結合するヒドロキシル基が臭素化されている化合物を、無色のシロップ状物質として得た。H-1:δ 6.8, J1,2=4.2 Hz（α異性体のみ）。
【００３０】
工程３
前の工程で得た化合物を、テトラヒドロフラン中、ＨｇＢｒ2及びＨｇ（ＣＮ)2  １．２当量の存在下、ＨＯ（ＣＨ2)12ＯＨ  ３〜４当量と、反応をＴＬＣで観察しながら反応させ、反応終了後、通常の処理を行い、カラムクロマトグラフィーで精製して、式（ｃ）：
【００３１】
【化４】
0004532618.tif 000005
【００３２】
で示される化合物を得た。収量は、５０〜８０％であった。
【００３３】
工程４
前の工程で得た化合物を、ＭｅＯＮａ−ＭｅＯＨの存在下で脱ベンジル化して、式：
【００３４】
【化５】
0004532618.tif 000006
【００３５】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−ＯＨを得た。
【００３６】
実施例２
Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3の調製
工程１〜３
実施例１と同様の操作を行って、上記の式（ｃ）で示される化合物を得た。
工程４
前の工程で得た化合物を、ピリジンに溶解し、塩化メシル  ２当量を加え、室温で反応混合物を撹拌した。通常の処理後、カラムクロマトグラフィーで精製して、式（ｄ）：
【００３７】
【化６】
0004532618.tif 000007
【００３８】
で示される化合物を得た。
【００３９】
工程５
前の工程で得た化合物を、ジメチルフラン中、６０℃で、反応が終了するまで、ＮａＮ3  ２当量と反応させた。通常の処理後、クロマトグラフィーで精製して、式（ｅ）：
【００４０】
【化７】
0004532618.tif 000008
【００４１】
で示される化合物を得た。
【００４２】
工程６
前の工程で得た化合物を、ＭｅＯＮａ−ＭｅＯＨの存在下で脱ベンジル化して、式：
【００４３】
【化８】
0004532618.tif 000009
【００４４】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3を得た。
得られた化合物の物性値は、以下のとおりである。
融点：  182.2〜182.5℃
元素分析（Ｃ24Ｈ45Ｎ3Ｏ11）：
計算値：  Ｃ 52.26; Ｈ 8.22; Ｎ 7.62; Ｏ 31.90
実測値：  Ｃ 51.99; Ｈ 8.08; Ｎ 7.38
ＭＳ：  552 (Ｍ+Ｈ)+
赤外スペクトル：  3,234cm-1 (ＯＨ); 2,915cm-1 (ＣＨ対称); 2,846cm-1
(ＣＨ逆対称); 2,088cm-1 (Ｎ3); 1,720cm-1 (Ｃ＝Ｏ伸縮); 1,552cm-1
1Ｈ  ＮＭＲ：  Ｇｌｃ Ｈ−１：4.15ppm (7.6Hz) (β); Ｇａｌ Ｈ−１：
4.18ppm (7.6Hz) (β); (ＣＨ2)n：1.08-1.35ppm広域シグナル
【００４５】
試験例１
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（理研細胞銀行）を１０％ＦＢＳ（GIBCO BRL）含有ＤＭＥＭ（大日本製薬株式会社）（ペニシリンＧカリウム１００U/ml、ストレプトマイシン０．１g/l、ＮａＨＣＯ3３．７g/l添加）中で培養し、コンフレントになったら継代した。
本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマー溶液調製のために、式：
【００４６】
【化９】
0004532618.tif 000010
【００４７】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3  ０．００７０ｇをＤＭＳＯ１２７μlに溶解して、１００mMのプライマー溶液を得た。
実験用培地としては、フェノールレッドの入っていない液体培地であるＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＥＰＥＳ１５mM含有、GIBCO BRL）にインスリン５mg/ml（和光純薬）、トランスフェリン５mg/ml（和光純薬）及びＳｅＯ2  ５０μlを添加してＴＩ／ＤＦ培地を得た。調製しておいた１００mMＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3のＤＭＳＯ溶液を培地に加えて、最終濃度が５０μMとなるように調整した。コントロール用培地としては、プライマーを含有しないＴＩ／ＤＦ培地を用いた。
１００mmψのシャーレに実験用培地５mlを入れ、４．０×１０6個のＢ１６マウスメラノーマ細胞を蒔き、シャーレを５％ＣＯ2インキュベーターに入れ、３７℃で２４時間又は４８時間培養した。
所定時間の経過後、氷上で反応を停止させ、培養上清をパスツールピペットで回収し（培地画分）、細胞層を冷ＰＢＳ２mlで２回洗浄し、洗浄液は、培地画分に含めた。細胞が残っているシャーレに０．２５％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ２mlを入れ、インキュベーター(３７℃)に２分間入れて細胞をはがしたのち、細胞懸濁液を１５ml遠心分離管に入れた。シャーレを冷ＰＢＳ２mlで２回洗浄し、洗浄液を細胞懸濁液の入っている遠心分離管に入れ、１，０００rpmで５分間遠心分離した。上清を培地画分として回収した。ペレットに冷ＰＢＳ２．１mlを入れてよく懸濁し、エッペンドルフチューブに入れて、２，５００rpmで５分間遠心分離した。上清を培地画分として回収し、残りを細胞画分として得た。
【００４８】
培地画分からの糖脂質の抽出
ＳｅｐＰａｋＣ−１８カラム（Waters）にメタノール１０mlを通し、更にmilliＱ超純水１０mlを通して平衡化した。インターナルマーカーとして１００mMｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのmilliＱ超純水溶液２．５μlを培地画分試料に加え、試料をカラムに通した。メタノール２ml、次いでクロロホルム／メタノール（２／１）３mlで糖脂質を溶出し、溶出液を窒素ガス気流中で乾燥させた。
【００４９】
細胞画分からの糖脂質の抽出
インターナルマーカーとして１００μMｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのメタノール溶液３００μlを各細胞画分試料に加え、クロロホルム６６６μl、メタノール３４μlを入れ、vortexで振とう撹拌し、更にソニケーターに３０分間かけて糖脂質を抽出し、１５，０００rpmで２５分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブに回収し、窒素ガス気流中で乾燥した。細胞ペレットに、クロロホルム／メタノール／水（４／８／３）１mlを加え、vortexで振とう撹拌し、ソニケーターに３０分間かけて糖脂質を抽出し、１５，０００rpmで２５分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブを用いて回収し、窒素ガス気流中で乾燥した。
【００５０】
培地画分及び細胞画分中の糖脂質の分離、同定
乾燥しておいた培地画分をクロロホルム／メタノール（２／１）で溶解し、ＨＰＴＬＣプレートに載せた。一方、乾燥しておいた細胞画分は、クロロホルム／メタノール（２／１）に溶解し、やはりＨＰＴＬＣプレートに載せた。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２％ＣａＣｌ2水溶液（６０／３５／８）又はクロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ（水溶液）（６０／３５／８）を使用した。各プレートには、検量線作成のために、ＧＭ３（Ｎｅｕ−Ａｃα２−３ラクトシルセラミド）、プライマー、及びオクチルグルコシドを所定の濃度で載せた。
【００５１】
プライマーに付加されたシアル酸の発色のためには、レゾルシノール／塩酸試薬（１０mlの水にレゾルシノール２００mgを溶解し、塩酸８０mlと０．１M硫酸銅０．２５mlを加え、水を加えて１００mlとした溶液）を用い、１１０℃のオーブンに２０〜３０分間入れて発色させた。また糖脂質の定量のためには、デンシトメーター（Bio 1D イメージアナライザー、Vilber Lourmat）を用い、ＧＭ３の検量線よりシアル酸付加生成物量とＧＭ３量、プライマーの検量線よりプライマー量、そしてオクチルグルコシドの検量線よりオクチルグルコシド量を算出した。
【００５２】
また瀧らのＴＬＣブロッティング法（Taki, T., et al. Anal. Biochem. 225, 24-27, 1995）によりシアル酸付加生成物と思われるバンドをＰＶＤＦ膜に移し、質量スペクトルにより分析した。また培地画分をＨＰＴＬＣプレート上で展開し、ニンヒドリン試薬によりアミンの検出を行った。
【００５３】
分析結果
本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分には、シアル酸でグリコシル化されたプライマーは検出されず、シアル酸でグリコシル化されたプライマーは、細胞内には蓄積されずに、培地中に分泌されることが示された。
【００５４】
図１に示すように、質量分析によっても、予想生成物である、シアル酸でグリコシル化された化合物であるＳＡ−Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3の分子量８４２．８８とほぼ同じ分子量の位置（８４２．９２）にメインピークが現れたため、本発明化合物のプライマーであるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた。
【００５５】
また図２に示すように、培地画分のＨＴＰＬＣによる分析により、２４時間及び４８時間の培養後で、培地に添加された本発明化合物のプライマーのうち２４時間後では４．８％、４８時間後では９．０％がシアル酸でグリコシル化されたことが認められた。
【００５６】
また、図３に示すように、４８時間培養後の培地画分には、培地に添加された本発明化合物のプライマーのうち７８％が未変化体のまま残留しており、本発明化合物のプライマーが、安定であることが示された。この結果により、本発明化合物のプライマーの存在下で４８時間以上培養することによって、本発明化合物のプライマーが更にシアル酸でグリコシル化されて、グリコシル化率が更に上昇する可能性が示された。
【００５７】
またニンヒドリン試薬によりアミンの検出を試みたところ、陰性であり、本発明のプライマーでは、シアル酸によりグリコシル化された後でも、そのアルキル鎖末端の−Ｎ3は、還元されていないことが認められた。
【００５８】
更に図４に示すように、プライマーの存在下で培養することによって、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞自体のシアル酸付加能が上昇することが認められた。
【００５９】
【発明の効果】
上記の結果より、本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマーは、高いグリコシル化率を有し、また安定であるために更に多量のグリコシル体を生成する可能性を有し、更に細胞のグリコシル化能を高めることが認められた。またアルキル鎖の末端に−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを有する本発明の式（Ｉ）のプライマーは、グリコシル化後の生成物が、重合反応による糖鎖の高分子化や、その他の化合物との反応など広範囲の用途に使用することができるなどの利点を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シアル酸でグリコシル化されたＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ2)12−Ｎ3化合物であると予想される化合物の質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、２４時間及び４８時間の培養後のプライマーのグリコシル化率を示す。
【図３】図３は、４８時間培養後の培地画分中のプライマー及びグリコシル化されたプライマーの存在比を示す。
【図４】図４は、プライマーの存在下での細胞のシアル酸付加能を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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