(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフォームされた酵母株であって、アセチルＣｏＡプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ(ＡＰＡＴ)活性が、この活性をコードする遺伝子を変化させることにより除去されており、且つ下記より選択するコレステロールからのヒドロコーチゾンの生合成の経路の酵素の少なくとも１つを発現させる当該トランスフォームされた酵母株であり、変化される遺伝子が、遺伝子番号ＹＧＲ１７７ｃとして同定されたS.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子、又は、該ＡＴＦ２遺伝子に対して１又は数個のヌクレオチドが挿入、欠失又は置換されており、ＡＰＡＴ活性を有しＹＧＲ１７７ｃの配列を有する蛋白質をコードする遺伝子である酵母株：
−  コレステロールの側鎖開裂酵素(Ｐ450ＳＣＣ)、
−  ３β−ヒドロキシ−デルタ5−ステロイドデヒドロゲナーゼ／デルタ5−デルタ4−ステロイドイソメラーゼ(３β−ＨＳＤ)及び
−  １７α−ステロイドヒドロキシラーゼ(Ｐ450１７α)。
【請求項２】
変化される遺伝子が、遺伝子番号ＹＧＲ１７７ｃとして同定されたS.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子である、請求項１に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項３】
ＡＴＦ２遺伝子が、選択遺伝子又は酵母発現ブロックを挿入することにより変化された、請求項１又は２に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項４】
ＡＴＦ２遺伝子が、ＵＲＡ３選択遺伝子を挿入することにより変化された、請求項３に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項５】
３β−ＨＳＤを発現する、請求項４に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項６】
寄託番号Ｉ-１９７８のＴＧＹ１５８／ｐＴＧ１０８６２と呼ばれる、請求項５に記載のトランスフォームされたS.cerevisiaeの株。
【請求項７】
ＡＴＦ２遺伝子が、発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermを挿入することにより変化された、請求項３に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項８】
Ｐ450１７αを発現する、請求項７に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項９】
寄託番号Ｉ-２１１９のＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４３５と呼ばれる、請求項８に記載のトランスフォームされたS.cerevisiaeの株。
【請求項１０】
３β−ＨＳＤ及びＰ450１７αを発現する、請求項７に記載のトランスフォームされた酵母株。
【請求項１１】
寄託番号Ｉ-２１１８のＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４１７と呼ばれる、請求項１０に記載のトランスフォームされたS.cerevisiaeの株。
【請求項１２】
内因性ステロール、外因性ステロール又は外因性ステロイドから選択する基質のイン・ビボ酸化の方法であって、該方法では、請求項１〜１１の何れか１つに記載のトランスフォームされた酵母株を用い、該酵母株を、この株が内因性ステロールを生成する場合には単独で培養し、或いは外因性ステロール又はステロイドと共にインキュベートし、必要であれば得られた酸化された化合物を単離する、上記の方法。
【請求項１３】
基質が３β−ヒドロキシステロイドであり、請求項５に記載のトランスフォームされた酵母株を用い、必要であれば得られた３−オキソ−デルタ4−ステロイドを単離する、請求項１２に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【請求項１４】
３β−ヒドロキシステロイドをプレグネノロン又は１７α−ヒドロキシプレグネノロンから選択する、請求項１３に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【請求項１５】
基質がステロイドであり、請求項８に記載のトランスフォームされた酵母株を用い、必要であれば得られた１７α−ヒドロキシステロイドを単離する、請求項１２に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【請求項１６】
ステロイド基質がプレグネノロン又はプロゲステロンである、請求項１５に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【請求項１７】
基質が３β−ヒドロキシステロイドであり、請求項１０に記載のトランスフォームされた酵母株を用い、得られた１７α−ヒドロキシ３−オキソ−デルタ4−ステロイドを必要であれば単離する、請求項１２に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【請求項１８】
ステロイド基質がプレグネノロンである、請求項１７に記載のイン・ビボ酸化の方法。
【発明の詳細な説明】
哺乳動物のステロイドホルモンのすべてのクラスの生合成における３−オキソ−デルタ4−ステロイドの３β−ヒドロキシ−デルタ5前駆体からの形成は、酵素系３β−ヒドロキシ−デルタ5−ステロイドデヒドロゲナーゼ(ＥＣ１．１．１．１４５)及びデルタ5−デルタ4−ステロイドイソメラーゼ(ＥＣ５．３．３．１)により触媒される(３β−ＨＳＤと呼ばれる)。例えば、３β−ＨＳＤは、プレグネノロンのプロゲステロンへの変換、１７α−ヒドロキシプレグネノロンの１７α−ヒドロキシプロゲステロンへの変換、デヒドロエピアンドロステロンのデルタ4−アンドロステンジオンへの変換又は５−アンドロステン−３β−１７β−ジオールのテストステロンへの変換を触媒する(Simard等，1996)。
従って、３β−ＨＳＤは、哺乳動物の副腎皮質における、コレステロールから出発するヒドロコーチゾンの生合成の道筋におけるキー酵素の１つである(図１)。
ヒドロコーチゾンを生成するためのこの生合成ルートの哺乳動物酵素の少なくとも１つの異種発現を可能にする組換え微生物特に改変した酵母又はこの生合成の中間体の利用は、例えば、欧州特許出願ＥＰ３４０８７８、米国特許第５，１３７，８２２号、Dumas等，1994及びCauet等，1994に記載された。
機能的な３β−ＨＳＤが酵母で発現される場合には、それらのトランスフォームされた酵母細胞は、３β−ヒドロキシステロイドを対応する３−オキソステロイドに、例えばプレグネノロンをプロゲステロンに完全には変換しないで、トランスフォームされてない酵母の細胞の場合にも認められる化合物を蓄積する。この出発ステロイドの３β−アセテートエステルとして蓄積された化合物の同定及びこのエステル化の原因であるアシルトランスフェラーゼ活性の特性表示を本願において記載する(「アセチル補酵素Ａプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ」を、以後、ＡＰＡＴと呼ぶ)。その上、プレグネノロンを生成するトランスフォームされた酵母株によるプレグネノロンアセテートの蓄積は、欧州特許出願ＥＰ７２７４８９に記載された。これらの観察に基づいて、この酵母により生成された３β−ヒドロキシステロイドのエステル化は、二次反応及び副生物の原因である(これは、蓄積された３β−ヒドロキシステロイド例えばプレグネノロンの収量の減少、又は３β−ヒドロキシ−デルタ5−ステロイドの３−オキソ−デルタ4−ステロイドへの生物学的変換の収量の減少、特に、既に言及した生合成ルートによるヒドロコーチゾンのその後の生成の減少へと導くプロゲステロン又は１７α−ヒドロキシ−プロゲステロンの生成の減少へと導く)ので、望ましくないと考えることができる。
上記の得られた結果に基づいて、本発明は、望ましくないＡＰＡＴ活性をこの活性をコードしている遺伝子の変化によって喪失した酵母株の構築を記載する(後者の存在下における３β−ヒドロキシステロイドの安定化を生じる)。これらの株は、それ故、３β−ヒドロキシステロイドを更なる生成物に改良された収率で変換することのできる組換え株を構築するための出発株として用いることができる。
この発明は又、ＡＰＡＴ活性を、この活性をコードする遺伝子の変化により、及びコレステロールからヒドロコーチゾンを生合成するルートの３β−ＨＳＤ若しくはシトクロームＰ450１７αの何れかの発現又は３β−ＨＳＤとシトクロームＰ450１７αの同時発現により失った酵母株の構築をも記載する。例えば３β−ＨＳＤを発現する株は、ヒドロキシ−デルタ5−ステロイドの３−オキソ−デルタ4−ステロイドへの生物学的変換の収率を改善することができ、それ故、酵母におけるヒドロコーチゾンの又はその中間体の改良された生成方法において用いることができる。
それ故、本発明の主題は、アセチルＣｏＡプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ(ＡＰＡＴ)活性がこの活性をコードする遺伝子を変化させることにより除去された(３β−ヒドロキシステロイドの安定化を生じる)改変した酵母株である。
ＡＰＡＴ活性をコードする遺伝子の変化は、例えば、遺伝子の機能的エレメント例えばプロモーター中又はＡＰＡＴ活性を有する蛋白質をコードする配列中のＤＮＡ配列の挿入、欠失又は置換によって達成することができる。次いで、この方法により変化されたＤＮＡ配列の酵母の宿主株へのインテグレーションを、例えば、相同組換えの技術により達成することができ、それは、ＡＰＡＴ活性の消失及び３β−ヒドロキシステロイドの安定化が示されるこの発明の改変された株に対応する酵母の染色体変異体の生成へと導く(例えば、プレグネノロンの存在下での細胞培養及びプレグネノロン含量の時間の関数としての測定により、例えば、実験の節に後述する操作条件に従う)。
下記を特にこの発明で用いる宿主酵母株として挙げることができる：Saccharomyces株例えばS.cerevisiae、Candida株例えばC.maltosa、Kluyveromyces株例えばK.lactis又はPichia株例えばP.pastoris。
この発明の特定の主題は、上記のように改変された酵母株であり、該酵母株においては、変化された遺伝子は、S.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子であり又は後者の同族体である。
遺伝子ＡＴＦ２とは、酵母ゲノム中で遺伝子座ＡＴＦ２又は「Saccharomyces Genome Database」(SGD)(Cherry等http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)のＹＧＲ１７７ｃに同定されたS.cerevisiaeの遺伝子を意味する。ＹＧＲ１７７ｃと呼ばれるオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)は、Ｍｉｐｓデータベース中のアミノ酸配列に翻訳され、これは、受入番号Ｓ６４４９１にてアクセス可能であり(Hebling U., Hofmann B.及びDelius H.(May 1996))、その配列を図４に示す。この遺伝子は、実験節において後で示すように、ＡＰＡＴ活性を有する蛋白質をコードする。
ＡＴＦ２遺伝子の同族体である遺伝子とは、ＡＰＡＴ活性を有する蛋白質及び蛋白質ＹＧＲ１７７ｃの配列と約６０％以上の配列同一性を有する蛋白質をコードする遺伝子を意味する。
この発明の一層特定の主題は、上記のように改変された酵母株であって、変化された遺伝子が、S.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子である酵母株であり、以後、ａｔｆ２変異株と呼ぶ。
この発明の全く特定の主題は、上記のように改変された酵母株であって、該酵母株において、ＡＴＦ２遺伝子は、少なくとも１ヌクレオチドを有するＤＮＡ配列の挿入により変化されている酵母株である。
すべてのＡＰＡＴ活性を失うようにＡＴＦ２遺伝子に挿入されるＤＮＡ配列は、例えば、宿主株の栄養要求を与える栄養要求性の選択遺伝子例えば遺伝子ＵＲＡ３、遺伝子ＬＥＵ２、遺伝子ＴＲＰ１、遺伝子ＨＩＳ３又は遺伝子ＡＤＥ２、例えば優性選択遺伝子例えば抗生物質例えばＧ４１８、フレオマイシン若しくはヒグロマイシンＢに対する耐性遺伝子又は例えばレポーター遺伝子例えばβＧＡＬ遺伝子であってよい。
ＡＴＦ２遺伝子に挿入されるＤＮＡ配列は、プロモーター及び転写ターミネーターよりなる酵母発現ブロックであってもよい(例えば、ＰＧＫ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１又はＴＥＦ１等の酵母プロモーター、例えば、ＣＹＣ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１又はＰＧＫ等の酵母ターミネーター)。この発現ブロックは、上記のエレメントの組合せであってよい(例えば、ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫterm)。
この発明の一層全く特定の主題は、上記のように改変された酵母株であり、該酵母株においては、ＡＴＦ２遺伝子は、ＵＲＡ３選択遺伝子又は発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermの挿入により変化されている。
この発明の特定の主題は、上記のように改変された酵母株であり、該酵母株においては、ＡＴＦ２遺伝子は、ＵＲＡ３選択遺伝子の挿入により変化されている。
この発明のａｔｆ２変異株は、ＡＰＡＴ活性がなく且つ該変異株においては、ＵＲＡ３遺伝子が挿入されており(以後、ａｔｆ２−Δ::ＵＲＡ３と呼ぶ)、従って、ウラシル原栄養性により選択することができよう。
この発明の全く特定の主題は、ＴＧＹ１５６及びＴＧＹ１５８と呼ばれる改変されたS.cerevisiae株であり、その詳しい構築は、実験節にて後述する。
この発明の特定の主題は、やはり上記のように改変された酵母株であって、該酵母株においては、ＡＴＦ２遺伝子は、発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermの挿入により変化されている。この発明のａｔｆ２変異株は、ＡＰＡＴ活性がなく且つ該変異株においては、発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermが挿入されており(以後、ａｔｆ２−Δ::ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermと呼ぶ)、機能的ＵＲＡ３遺伝子の不在(発現ブロックにより置換)、それらの５−フルオロ−オロチン酸(５−ＦＯ)に対する耐性により選択することができよう。
この発明の全く特定の主題は、ＴＧＹ１８６と呼ばれるS.cerevisiaeの改変された株であり、その詳細な構築を、実験節にて後述する。
この発明の主題は又、トランスフォームされた酵母株でもあり、該酵母株においては、アセチルＣｏＡプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ(ＡＰＡＴ)活性がこの活性をコードする遺伝子を変化させることにより除去されており、下記より選ぶ少なくとも１つの哺乳動物のコレステロールから出発するヒドロコーチゾンの生合成経路の酵素が発現される：
−  コレステロール側鎖開裂酵素(Ｐ450ＳＣＣ)、
−  ３β−ヒドロキシ−デルタ5−ステロイドデヒドロゲナーゼ／デルタ5−デルタ4−ステロイドイソメラーゼ(３β−ＨＳＤ)及び
−  １７α−ステロイドヒドロキシラーゼ(Ｐ450１７α)。
この発明のトランスフォームされた酵母株は、例えば、この発明のａｔｆ２変異株の公知の方法によるトランスフォーメーションにより例えばＰ450ＳＣＣの並びにＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターによるトランスフォーメーション、３β−ＨＳＤの発現ベクター又はＰ450１７αの発現ベクターによるトランスフォーメーションにより得ることができる。ａｔｆ２変異株は又、必要であれば、例えば、３β−ＨＳＤの発現ベクター及びＰ450１７αの発現ベクターにより同時トランスフォームすることができ、又は３β−ＨＳＤ及びＰ450１７αの同時発現ベクターによりトランスフォームすることができ、そして例えばプレグネノロンの１７α−ヒドロキシプロゲステロンの生物変換のプロセスにおいて用いることができる。
ウシ又はヒト起源のＰ450ＳＣＣの並びにＡＤＸ及びＡＤＲの酵母株での発現のために構築されたベクターは、例えば、Dumas等，1994(欧州特許出願ＥＰ３４０８７８号又は米国特許第５，１３７，８２２号中)に記載された。
この発明の特定の主題は、上記のようにトランスフォームされた酵母株であり、その変化した遺伝子は、S.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子又は後者の同族体である。この発明の一層特定の主題は、上記のようにトランスフォームされた酵母株であり、その変化した遺伝子は、S.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子であり、トランスフォームされたａｔｆ２株に対応する。
この発明の全く特定の主題は、上記のようにトランスフォームされた酵母株(該酵母株において、ＡＴＦ２遺伝子は、少なくとも１つのヌクレオチドを有するＤＮＡ配列の挿入により変化されている)であり、特に、ＡＴＦ２遺伝子がＵＲＡ３選択遺伝子の挿入により変化されており、改変されたａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３株に対応するトランスフォームされた酵母株である。
すべてのＡＰＡＴ活性を喪失するための遺伝子の変化、ＡＴＦ２遺伝子又は後者の同族体並びに宿主株は、前に示されたものと同じ意味を有する。
この発明の全く特定の主題は、上記のようにトランスフォームされた３β−ＨＳＤを発現する酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３であって、特に、ＴＧＹ１５８／ｐＴＧ１０８６２と呼ばれるS.cerevisiaeのトランスフォームされた株であり、その詳細な構築を、実験節において後述する。
この発明の全く特定の主題は、やはり上記のようにトランスフォームされた酵母株であって、該酵母株においては、ＡＴＦ２遺伝子が、発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermの挿入により変化されており、トランスフォームされた株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermに対応している。
この発明の全く特定の主題は、やはり上記のようにトランスフォームされたＰ450１７αを発現する酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermであり、特に、ＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４３５と呼ばれるS.cerevisiaeのトランスフォームされた株である。
この発明の特定の主題は、上記のように改変された３β−ＨＳＤ及びＰ450１７αを同時発現する酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermであり、全く特に、ＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４１７と呼ばれるS.cerevisiaeのトランスフォームされた株である。
この発明の主題は又、上記のトランスフォームされた酵母株を用いる内因性ステロール、外因性ステロール又は外因性ステロイドから選択する基質のイン・ビボでの酸化方法でもあり、該酵母を単独で培養し(この株が内因性ステロールを生成する場合)、又はステロール若しくは外因性ステロイドと共にインキュベートして得られた酸化された化合物を所望であれば単離する。
内因性ステロールとは、酵母株内に蓄積するステロールであって、側鎖開裂酵素(Ｐ450ＳＣＣ)の基質であるステロールを意味する(酵母を、例えば、Ｐ450ＳＣＣの、ＡＤＸの及びＡＤＲの発現ベクターによるトランスフォーメーション後に、外因性ステロールの非存在下で培養した場合)。この発明の方法を適用するために用いられる内因性ステロールは、例えば、エルゴスタ−５−エン−３−オール、エルゴスタ−５，２４(２８)−ジエン−３−オール又はエルゴスタ−５，２２−ジエン−３−オールであってよい。欧州特許出願ＥＰ７２７４８９は、これらのステロール酵母株中の蓄積及び、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターによるトランスフォーメーション後のこの株の培養におけるそれらの側鎖の開裂を記載している。かかるＡＰＡＴがやはり存在している酵母株は、この発明によるａｔｆ２変異株を得るために予め改変することができ、その後、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターによりトランスフォームしてこの発明によるトランスフォームされたａｔｆ２変異株を得ることができる。
外因性ステロールとは、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターによりトランスフォームされた酵母株とのインキュベーションによるＰ450ＳＣＣ開裂酵素の基質であるステロール例えばコレステロール又はシトステロールを意味する。かかる株は、例えば、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲの発現ベクターによりトランスフォームされたａｔｆ２変異株であってよい。
基質として用いられる内因性又は外因性ステロールの側鎖の開裂により得られた３β−ヒドロキシステロイドは、完全に、遊離形態であり、即ち、Ｐ450ＳＣＣ、ＡＤＸ及びＡＤＲを発現するトランスフォームされたａｔｆ２株の培養において対応する３β−アセテートエステルを伴わない。
ステロイドとは、例えば３β−ＨＳＤの発現ベクターによりトランスフォームされた酵母株とのインキュベーションによる３β−ＨＳＤ酵素の基質であるステロイド例えばプレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン若しくはデヒドロエピアンドロステロンを意味し、又は例えばＰ450１７αの発現ベクターによりトランスフォームされた酵母株とのインキュベーションによるＰ450１７α酵素の基質であるステロイド例えばプロゲステロン若しくはプレグネノロンを意味する。かかる株は、例えば、この発明による３β−ＨＳＤの発現ベクターにより又はＰ450１７αの発現ベクターによりトランスフォームされたａｔｆ２変異株であってよい。
この発明の特定の主題は、上記のイン・ビボ酸化方法であって、該方法においては、基質は３β−ヒドロキシステロイドであり、３β−ＨＳＤを発現するトランスフォームされた酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３を用い、且つ得られた３−オキソ−デルタ4−ステロイドを必要であれば単離する当該方法であり、特に、３β−ヒドロキシステロイドをプレグネノロン又は１７α−ヒドロキシプレグネノロンから選択する方法である。
基質として用いる３β−ヒドロキシステロイドは、３β−ＨＳＤの発現ベクターによりトランスフォームされたこの発明のａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３株とインキュベートしたときに安定である。従って、この発明は、後記の実験節で示すように、すべての３β−ヒドロキシ基質を３−オキソ−デルタ4−ステロイドへ酸化することができるので、酵母における３−オキソ−デルタ4−ステロイドの生成ための改良された方法を提供する。
この発明の特定の主題は又、上記のイン・ビボ酸化方法であって、該方法においては、基質はステロイドであり、Ｐ450１７αを発現するトランスフォームされた酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermを用い且つ得られた１７α−ヒドロキシルステロイドを必要ならば単離する当該方法でもあり、特に、ステロイド基質がプレグネノロン又はプロゲステロンである方法である。
基質として用いるプレグネノロンは、Ｐ450１７αの発現ベクターによりトランスフォームされた株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermとインキュベートしたときに安定である。従って、この発明は又、すべての３β−ヒドロキシ基質を１７α−ヒドロキシル化することができるので、３β−ヒドロキシステロイドから出発する１７α−ヒドロキシステロイドの生成の改良された方法をも提供する。
この発明の特定の主題は又、上記のイン・ビボ酸化方法であって、その基質は３β−ヒドロキシステロイドであり、３β−ＨＳＤ及びＰ４５０−１７αを同時発現するトランスフォームされた酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermを用い、得られた１７α−ヒドロキシル３−オキソ−デルタ4−ステロイドを必要であれば単離する当該方法でもある。この発明の全く特定の主題は、ステロイド基質がプレグネノロンである上記の方法である。
この発明のトランスフォームされたａｔｆ２変異体酵母株及び方法は、酵母でのヒドロコーチゾン又はその中間体の改良された生成におけるそれらの有利な利用を示唆する。
この発明の株の構築及びこの発明の方法の適用の例を、後記の実験節において記載する。
一般的な材料と方法
１．株及び培地
この発明を実施するために用いるS.cerevisiaeの株は、Achstetter等,1992に記載されたｃ１３ＡＢＹＳ８６のＬｅｕ+同遺伝子型誘導体である株ＴＧＹ７３．４(ＭＡＴα、ＵＲＡ３−Δ５、ｐｒａ１−１、ｐｒｂ１−１、ｐｒｃ１−１、ｃｐｓ１−３、ｈｉｓ)及びThierry等,1990に記載された株Ｆｙ１６７９(ＭＡＴａ、ＵＲＡ３−５２、ｔｒｐ１−Δ６３、ｌｅｕ２−Δ１、ｈｉｓ３−Δ２００、ｆｅｎ１、ＧＡＬ)である。これらの株は、F.Sherman,1991により記載された条件に従って、２８℃で、２％のグルコースを含むＹＰＤ完全培地(Difco Laboratories)において生育させる。
S.cerevisiaeのトランスフォーメーションのために、これらの細胞を、酢酸リチウム法によってコンピテントにする(Ito等,1983)。これらの酵母を、日常的に、１００μｇ／ｍｌの濃度の必須栄養素を添加した２％グルコースを含む合成最少培地ＳＤ(F.Sherman,1991)において培養する。
大腸菌株ＢＪ５１８３(D.Hanahan,1983)を、イン・ビボ組換えのために用い、大腸菌株Ｃ６００、ｈｓｄＲ(Hubacek等,1970)をライゲーションの古典的反応のための受容株として用いた。
２．大腸菌におけるＤＮＡ及び組換えのイン・ビボでの操作
用いる分子生物学の一般的方法は、Sambrook等,1989に記載されている。イン・ビボでの組換えのための方法は、E.Degryse,1995及びE.Degryse,1996に記載された。
３．ＡＰＡＴ酵素活性の試験
ＡＰＡＴアセチルトランスフェラーゼ活性を、[3Ｈ]アセチルＣｏＡ(New England Nuclear)からのプレグネノロン中の[3Ｈ]アセテートの取込みを測定することにより測定した。反応培地(５００μｌ)は、[3Ｈ]アセチルＣｏＡ(２０μＭ、２５Ｃｉ／モル)及びプレグネノロン(Sigma)(３０μＭ)を含む。このプレグネノロンを、２μｌのチロキサポール(Sigma)／エタノール混合物(１：１)(ｐＨ７．０リン酸カリウム緩衝液(２０ｍＭ)中)に溶液にて加える。３０℃で１５分間のインキュベーションの後に、反応を、２ｍｌのジクロロメタンの添加により停止する。
これらのステロイドを、ジクロロメタンで抽出し、次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー(以後：ＲＰ−ＨＰＬＣという)により、イソクラティク溶出条件にて、アセトニトリルを用いて、Ultrasphere ODSカラム(Beckman)にて、４５℃で、形成されたプレグネノロン[3Ｈ]アセテートの量の測定を可能にするＦＬＯ−Ｏｎｅ５００ラジオデテクター(Packard)に接続したＨＰ１０９０クロマトグラフ(Hewlett-Packard)にて分離する。
ＡＰＡＴの１単位を、上記の条件において、３０℃で毎分１ｎモルのプレグネノロンアセテートを生成する酵素の量として定義する。
４．蛋白質濃度の測定
「蛋白質アッセイキット」(Bio-Rad)を用い、ウシ血清アルブミンを標準として用いて、蛋白質濃度を測定した。
この発明の幾つかの面を添付の図面により説明する。
図１は、哺乳動物におけるヒドロコーチゾンのコレステロールからの生合成の経路を示している。
図２Ａ及び２Ｂは、S.cerevisiaeにおけるプレグネノロンのプレグネノロンアセテートへの生物学的変換を示している。
分析は、２０５ｎｍで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより行う：
図２Ａは、プレグネノロンアセテートの生成の速度論及びインキュベーションの１２時間の時間間隔でのプレグネノロンの消失の速度論を示している。
図２Ｂは、プレグネノロン及びプレグネノロンアセテート標準のプロフィルに対するステロイドのｔ＝０及びｔ＝１０ｈにおけるプロフィルを示している。
図３は、ＭｏｎｏＰＨＲ５／２０でのクロマトグラフィーによるＡＰＡＴの精製を示している：
(Ａ)は、画分１０〜２０に存在するＡＰＡＴ活性のプロフィルを示している。
(Ｂ)は、合わせて濃縮した画分１４、１５及び１６(ライン２)の分子量マーカー(ライン１)の存在下での、クーマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。矢印は、６２ｋＤａの見かけ分子量のバンドを示している。
図４は、蛋白質ＹＧＲ１７７ｃの一文字コードでのアミノ酸配列を示している。精製してトリプシン消化したＡＰＡＴ蛋白質に基づいて配列決定されたペプチドに下線を引いてある。
図５は、二重融合ＰＣＲ技術によりＵＲＡ３遺伝子と結合させることによるＡＴＦ２遺伝子の破壊のストラテジーを示している。中空のバー及び中実のバーは、それぞれＡＴＦ２及びＵＲＡ３の配列を表している。
図６は、S.cerevisiaeにおけるプレグネノロンのアセチル化に対するＡＴＦ２遺伝子の破壊の効果を示している。プレグネノロンアセテートの存在は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、２０５ｎｍにて、親株ＴＧＹ７３．４(Ａ)又は変異株ＴＧＹ１５８(Ｂ)の１６時間培養に基づいて検出される。
図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、酵母におけるヒトの３β−ＨＳＤの発現ベクターｐＴＧ１０８３２及びｐＴＧ１０８６２の構築の概要を示している。図７Ａは、ヒトの３β−ＨＳＤをコードする配列を含むＭｓｃＩ−ＭｌｕＩフラグメントの生成を記載している。図７Ｂは、ＣＹＣ１p／３β−ＨＳＤ／ＰＧＫt発現ブロックを含むＮｏｔＩフラグメントの生成を記載している。図７Ｃは、ｐＴＧ１０８３２プラスミドの及びｐＴＧ１０８６２プラスミド生成を記載している。
図８は、プラスミドｐＴＧ１０８３２の制限地図を示している。
図９は、プラスミドｐＴＧ１０８６２の制限地図を示している。
図１０は、発現プラスミドｐＴＧ１０４３５の構築の概要を示している。
図１１は、プラスミドｐＴＧ１００５８の構築の概要を示している。
図１２は、プラスミドｐＴＧ１００５８の制限地図を示している。
図１３は、プラスミドｐＴＧ１０２９３の制限地図を示している。
図１４は、プラスミドｐＴＧ１０４３５の制限地図を示している。
図１５Ａ及び１５Ｂは、プラスミドｐＴＧ１０２７４の構築の概要を示している。
図１５Ａは、プラスミドｐＴＧ１０２１４の生成を記載している。図１５Ｂは、プラスミドｐＴＧ１０２７４の生成を記載している。
図１６は、プラスミドｐＴＧ１０２７４の制限地図を示している。
図１７は、プラスミドｐＴＧ１０４０１の制限地図を示している。
図１８は、発現ベクターｐＴＧ１０２６２の構築の概要を示している。
図１９は、プラスミドｐＴＧ１０２６２の制限地図を示している。
図２０は、プラスミドｐＴＧ１０４０３の制限地図を示している。
図２１は、プラスミドｐＴＧ１０４１７の制限地図を示している。
(制限酵素の略号は、Ｓ、ＳａｌＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；ＢＩＩ、ＢｇｌＩＩ；Ｍ、ＭｌｕＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｎ0、失われたＮｃｏＩ部位；ＸｂａＩ0、失われたＸｂａＩ部位；Ｅ、ＥｃｏＲＩ)。
実施例１：  酵母のＡＰＡＴ活性の同定
Ａ−酵母によるプレグネノロンのイン・ビボでのアセチル化
ＴＧＹ７３．４株を、タージトール(Sigma)／エタノール混合物(１：１)中の１０ｍｇ／ｍｌのプレグネノロン溶液１００μｌを加えた２４時間予備培養物からＡ６００＝０．１にて接種した１０ｍｌのＹＰＤ培地(Difco)において２８℃で培養した。形成されたステロイドを、１０時間にわたる時間間隔で採取したブロスの２５０μｌのアリコートにおいて同定した。２ｍｌのジクロロメタンでの抽出後、有機相を窒素下で蒸発させ、次いで、得られた残留物をアセトニトリルに再溶解させた。これらのステロイドを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、Ultrasphere ODSカラム(Beckman)にて、下記を溶離剤として連続的に用いて分析した：６０％アセトニトリル(水中)、１０分間、次に、６０〜８０％に変化するアセトニトリル(水中)、５分間、次に、８０％アセトニトリル(１ｍｌ／分の流量)、５分間、４５℃、２０５ｎｍにて検出。
得られたクロマトグラム(図２Ｂ)は、プレグネノロンが代謝されて、プレグネノロンアセテート標準と同じＴＲを有する一層無極性の生成物になることを示している。図２Ａは、プレグネノロンが酵母によってその代謝産物に急速に変換されることを示している。
アルカリ(メタノール中の６％ＫＯＨ)処理後に、認められた代謝産物は、プレグネノロンと同じＴＲを有する生成物を遊離する。この代謝産物のプレグネノロンアセテートとしての同定を、次いで、質量分析により確認した。
Ｂ−ＡＰＡＴ活性を有する酵素の精製
ＴＧＹ７３．４株を、１０リットルのファーメンター中で、１６０ｇ／ｌにグルコースを富化したKappeli培地(Fiechter等,1981)にてＡ６００＝３０に達するまで３０℃で培養した。これらの細胞を、遠心分離により分離して、１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(４℃でｐＨ８．０)(緩衝液Ａ)４リットルに再懸濁した。これらの細胞をManton Gaulinホモジェナイザーで、１０００ｐｓｉの圧力で破砕した。得られた細胞溶解物を４０℃で１５分間１２，０００×ｇで遠心分離し、次いで、上清に塩化亜鉛を終濃度４０ｍＭまで加えた。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを５．５に調節し、４℃で３０分間沈殿させた。４℃で１０分間の１０，０００×ｇでの遠心分離の後に、沈殿を単離して、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む３リットルの緩衝液Ａに再懸濁した。ＥＤＴＡを、Ｙ１０Ｓ１０カートリッジ(Amicon)にて３０リットルの緩衝液Ａに対する透析濾過(diafiltration)により除去した後に、保持物(retentate)を、予め緩衝液Ａで平衡化した１．５リットルのＤＥＡＥ−セファセル(Pharmacia)のカラムに３５ｍｌ／分の速度にて４℃で詰めた。このカラムを緩衝液Ａで洗い、その後０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗った後、ＡＰＡＴ活性は、０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで溶出された。ＤＥＡＥ−セファセルのＡＰＡＴ活性(「一般的な材料と方法」に示したようにして測定)を含む画分を合わせて、ＮａＣｌを終濃度２Ｍまで加え、その後、それらを、１５ｍｌ／分の速度にて４℃で、予め２Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化してある５００ｍｌのフェニルセファロース(Pharmacia)のカラムに詰めた。このカラムを、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗った後に、ＡＰＡＴ活性を、１．５リットルの緩衝液Ａ中のコール酸ナトリウムの０〜１％の線形勾配を用いて溶出させる。これらのＡＰＡＴ活性を含む画分を合わせ、次いで、ＹＭ１０メンブレン(Amicon)にて限外濾過により濃縮し、その後、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
精製を続けるのに十分な量で材料を調製するために、全プロセスを一回繰り返した。
前述の２調製物から精製した材料を解凍し、その後、予め緩衝液Ａにて平衡化してあるＱ−セファロースファーストフロー(Pharmacia)の１００ｍｌのカラムに４ｍｌ／分の速度にて４℃で詰めた。このカラムを同緩衝液で洗った後に、ＡＰＡＴ活性を５００ｍｌの同緩衝液中のＮａＣｌの０〜１Ｍの線形勾配にて溶出させた。ＡＰＡＴ活性を含むＱ−セファロースの画分を合わせ、次いで、予め０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化してあるセファロースビーズ(Pharmacia)上に固定化されたコール酸ナトリウムの７ｍｌのカラムに２．５ｍｌ／分の速度にて４℃で直接詰めた。このカラムを同緩衝液で洗った後に、ＡＰＡＴ活性を、１００ｍｌの同緩衝液中のコール酸ナトリウムの０〜１％の線形勾配で溶出させた。これらのＡＰＡＴ活性を含む画分を合わせ、ＹＭ１０メンブレン(Amicon)にて限外濾過により濃縮して蛋白質濃度を１．８ｍｇ／ｍｌとしてから−８０℃に貯蔵した。
このように、ＡＰＡＴ活性を、特異的活性に基づいて約５００倍に精製した(下記の表１に示すように収率は、約１６％)。
0004443636.tif 000002
上記の得られた半精製された物質の半分(約６ｍｇの蛋白質)を、次いで、解凍して、ＰＥＧ４０００(Prolabo)を終濃度２０％(ｗ／ｖ)まで加えてコール酸塩及びＮａＣｌを除去した。４℃で３０分間撹拌した後に、沈殿を、４℃で３０分間の１２，０００×ｇの遠心分離により集め、次いで、４ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁させた。こうして得られた溶液を、次いで、予め緩衝液ビス−トリス２５ｍＭ(ｐＨ６．３)で平衡化してあるＭｏｎｏＰＨＲ５／２０(Pharmacia)のカラム中に１ｍｌ／分の速度で詰めた。ＡＰＡＴ活性を、緩衝液ポリバッファー７４(ｐＨ４．０)(Pharmacia)を用いて溶出させた。１ｍｌの画分を、酸性ｐＨでの酵素の不活性化を制限するために、各々、５０μｌの２Ｍ緩衝液トリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)の存在下で集めた。最高のＡＰＡＴ活性を含む画分１４、１５及び１６(図３(Ａ))(上記のようにして測定)を合わせて、ＹＭ１０メンブレン上での限外濾過により濃縮し、次いで、使用時まで−８０℃に貯蔵した。こうして得られた活性画分を、１０％ポリアクリルアミドのゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。クーマシーブルー染色により、幾つかのバンドが現れたが、主要なバンドは、見かけ分子量６２ｋＤａを有し(図３(Ｂ))、これは、Superose 6(Pharmacia)のゲル上での濾過により測定された分子量と同じであり、ＡＰＡＴ活性に対応している。
Ｃ−ＡＰＡＴの特性
ａ)基質特異性
アセチルＣｏＡ及びプレグネノロンについて上述した方法に従って、種々のアシルドナー又は種々のステロイド基質を用いて、半精製されたＡＰＡＴは、３β−オール、デルタ4又はデルタ5−ステロイド上でアセテートをかなりの効率で移動させるが、他方、エストロゲン上では移動は僅かでありステロール上では検出し得ず且つアシルドナーとしてアセチルＣｏＡに対する顕著な優先性がある。
下記の表２は、得られた結果を示している(該表において、ａ)については、試験を、３０μＭの各試験されるステロイド及び１００μＭの[3Ｈ]アセチルＣｏＡを用いて行い、ｂ)については、試験を、１００μＭの各アシルドナー及び３０μＭの[3Ｈ]プレグネノロンを用いて行う)：
0004443636.tif 000003
ｂ)阻害
ＡＰＡＴ活性は、スルフヒドリル基の試薬例えばＮＥＭ及びＤＴＮＢにより強く阻害される。阻害は、塩化亜鉛(１ｍＭ)の存在下で完全である。
Ｄ−部分アミノ酸配列
部分アミノ酸配列を、トリプシン消化後、ゲルセクションにて、Rosenfeld等，(1992)により記載された方法に従って決定した。
上で得られた濃縮物の２／３から出発し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、６２ｋＤａのバンドを切り出し、次いで、トリプシン(Promega)と共にインキュベートした。生成したペプチドを、次いで、Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰカラム(１．５×１２５ｍｍ)上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、１００μｌ／分の速度で、アセトニトリルの０〜６０％の線形勾配を用い(８０分)、次いで、６０〜１００％の線形勾配を用いて(２０分)(０．１％ＴＦＡ水溶液中)分離し、その後、アミノ酸配列決定にかけた。
Ｎ−末端配列を、ＰＴＨ−アミノ酸のＨＰＬＣ分析機に接続したモデル４７７Ａ蛋白質シーケンサー(Applied Biosystems)上で決定した。
配列決定された試料の内で、それぞれ下記の１０及び１６アミノ酸よりなる２つのピークｘ及びｙが明白な配列を与える：
ピークｘについて：  ＩＳＥＱＦＫＫＤＤＦ
ピークｙについて：  ＬＩＥＬＩＳＰＶＩＩＰＬＧＮＰＫ
こうして得られた２ペプチドを、S.cerevisiaeのゲノムのデータベースをスクリーニングするために用いた。上記の２ペプチドの配列を正確に含む６２ｋＤａの蛋白質を同定した(Ｍｉｐｓ、受入番号Ｓ６４４９１、Hebling等,1996年5月)。この蛋白質(その配列は図４に示してあり、その機能は記載されたことはない)は、遺伝子座ＹＧＲ１７７ｃの遺伝子によりコードされよう。アシルトランスフェラーゼ活性を有するこの発明の蛋白質と、Fujii等(1994)により記載されたS.cerevisiae中のＡＴＦ１遺伝子産物(これにアルコールアセチルトランスフェラーゼが帰する)との間の約３７％のアミノ酸配列の同一性に基づいて、我々は、ＡＴＦ２という呼称を、S.cerevisiaeにおけるＡＰＡＴ活性の原因の蛋白質をコードする遺伝子について用いる。
実施例２：  ＵＲＡ３遺伝子により破壊されたＡＴＦ２遺伝子を有し且つＡＰＡＴ活性を喪失した酵母株(ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３)の構築
Ａ)ＡＴＦ２遺伝子のターゲティング
S.cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子を、続くウラシル原栄養体性による変異株の選択を可能にするS.cerevisiaeのＡＴＦ２遺伝子の選択した部分の置換によって導入する。
ＵＲＡ３選択マーカーを、Amberg等(1995)により記載された方法による二重融合ＰＣＲによってＡＴＦ２遺伝子と結合させた。その後のストラテジー(図５に示す)は、全部で４ＰＣＲ反応を含む。最初の２反応(ＰＣＲ１と呼ぶ)は、それぞれ、破壊されるＡＴＦ２標的遺伝子中のＵＲＡ３マーカーの挿入部位に隣接する５’及び３’領域の増幅を可能にし、第３の反応(ＰＣＲ２と呼ぶ)は、ＵＲＡ３マーカー遺伝子の増幅を可能にする。二重融合(ＰＣＲ３と呼ぶ)は、最終的に、ＡＴＦ２標的遺伝子の５’及び３’領域のＵＲＡ３マーカー遺伝子との結合を可能にする(５’ＡＴＦ２−ＵＲＡ３−３’ＡＴＦ２と呼ぶ)。
第一に、ＡＴＦ２標的遺伝子のＤＮＡ源として用いるＦｙ１６７９株の無傷の細胞試料を、２ｍＭｄＮＴＰ(Pharmacia)を含むＰＣＲ緩衝液中で、下記の条件下で増幅した：２５サイクル；９３℃、３０秒；５４℃、２分間；６８℃、３分間、その後、７２℃で５分間の伸長を行う；ポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ(Perkin Elmer)。
一方では、ＡＴＦ２遺伝子の５’領域を、直接及び間接プライマーとして下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより：
0004443636.tif 000004
{これらは、ＡＴＦ２遺伝子(ＳＧＤ：ＹＧＲ１７７ｃ)の配列の５’領域と相同な領域を含む}及び制限部位ＳａｌＩを加える(ＯＴＧ１０８４１について)ことにより増幅した。
他方において、ＡＴＦ２遺伝子の３’領域を、直接及び間接プライマーとして下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより：
0004443636.tif 000005
{これらは、ＡＴＦ２遺伝子(ＳＧＤ：ＹＧＲ１７７ｃ)の配列の３’領域と相同な領域を含む}及び制限部位ＭｌｕＩを加える(ＯＴＧ１０８４２について)ことにより増幅した。
第二に、S.cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子を、直接プライマーとして下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用い：
0004443636.tif 000006
{これは、ＡＴＦ２遺伝子の５’領域と相同な配列(OTG10844に相補的)と結合されたＵＲＡ３遺伝子の公開された配列(Rose等,1984；ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＳＣＯＤＣＤ受入番号：Ｋ０２２０７；ＳＧＤ：ＹＥＬ０２１ｗ)の５’領域と相同な配列を含む}且つ間接プライマーとして下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより増幅した：
0004443636.tif 000007
{これは、ＡＦＴ２遺伝子の３’領域に相同な配列(OTG10846に相補的)と結合されたＵＲＡ３遺伝子の３’領域と相同な配列を含む}。シャトルベクター大腸菌−酵母ｐＴＧ１００２１(Degryse等,1995)から制限酵素ＨｉｎｄIIIでの消化により単離されたＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡの２０ｎｇの試料を上述の条件下で増幅した。
それぞれ得られたＰＣＲ生成物を、「Geneclean Kit」(Bio 101社、米国、La Jolla在)を用いて精製し、次いで、２０サイクルのプログラムを用いる、前のＰＣＲ反応で用いた増幅条件にて、上述のオリゴヌクレオチドOTG10841及びOTG10842をプライマーとして用いる二重融合反応にかけた。
機能的なＵＲＡ３遺伝子に融合されたＡＴＦ２遺伝子に隣接する領域を含む最終的融合生成物の増幅後に、ＵＲＡ３遺伝子の存在を、増幅された物質中のこの部位の存在を示すＥｃｏＲＶ制限酵素での消化により確認した。
Ｂ)酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３の生成
上で得た融合生成物を直接Ｆｙ１６７９株又はＴＧＹ７３．４株のコンピテント細胞中にトランスフォームして、ＳＤ培地(F.Sherman,1991)上での成長により、この株の必須栄養素の存在下で且つウラシルの非存在下で、トランスフォーマントを選択した。
単離されたクローンから出発して、ＡＴＦ２遺伝子の５’領域とＵＲＡ３遺伝子の新たな組合せ(5’ATF2-URA3-3’ATF2)を、ＰＣＲ増幅により、無傷の細胞において上述のプライマーOTG10841及びOTG10845を用いて示した。次いで、ＡＰＡＴ活性のないことを、細胞ホモジェネートに基づいて記載された試験により、顕著なＡＰＡＴ活性を示す親株と比較して、イン・ビトロで示した。
こうして、これらの基準に合致する株を、ａｔｆ２変異株(ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３と呼ぶ)として特性表示した。親株Ｆｙ１６７９から出発してこうして得られた変異株をＴＧＹ１５６と呼び、親株ＴＧＹ７３．４から出発して得られた変異株をＴＧＹ１５８と呼んだ。
ＴＧＹ１５６株の試料を、１９９８年２月２日に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(ＣＮＣＭ)(パスツール研究所、フランス国、PARIS CEDEX 15, Rue du Docteru Roux 75724, 25在)に番号Ｉ−１９７７で提出した。
ＴＧＹ１５８株の試料を、１９９８年２月２日に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(ＣＮＣＭ)(パスツール研究所、フランス国、PARIS CEDEX 15, Rue du Docteru Roux 75724, 25在)に番号Ｉ−１９７６で提出した。
Ｃ)酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３の培養におけるプレグネノロンのイン・ビボでの安定化
上で得たＴＧＹ１５８株の細胞を、１００μｇ／ｍｌのプレグネノロンを含むＹＰＤ培地(Difco)中に、Ａ６００＝０．１にて接種した。２８℃で１６時間のインキュベーション後に、これらのステロイドをジクロロメタンで抽出して、上述のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。図６(Ｂ)は、変異体ＴＧＹ１５８がプレグネノロンをエステル化する能力を喪失したが、同じ培養条件で親株ＴＧＹ７３．４はプレグネノロンをプレグネノロンアセテートに変換することを示している(図６(Ａ))。
これらの結果に基づいて、ＡＴＦ２遺伝子の産物が酵母によるプレグネノロンのエステル化の原因であり、他方、ＡＴＦ２遺伝子の中断は通常の条件において細胞成長の明白な変化へと導かないということを結論することができる。
実施例３：  ＵＲＡ３遺伝子により破壊されたＡＴＦ２遺伝子を有する酵母株の構築及び３β−ＨＳＤの発現
S.cerevisiaeのＣＹＣ１プロモーター又はS.cerevisiaeのＴＥＦ１プロモーターの制御下のヒト３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡ配列及びＧ４１８耐性遺伝子を有する２μプラスミドを、図７Ａ〜７Ｃの概要に従って構築し、次いで、変異酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３中にトランスフォームした。
最初に、ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位に隣接しており且つ酵母プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１の下流に位置されるE.Rheaume等,1991により記載されたII型３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡを含むトランスファーベクターｐＴＧ１００９５を、下記のようにして生成した：
３β−ＨＳＤをコードする配列を、E.Rheaume等,1991により、制限断片ＳａｌＩ−ＮｏｔＩとしてベクターBluescriptII(Stratagene)の同じ部位にサブクローン化した。E.Rheaume等,1991により記載された得られたベクターは、３β−ＨＳＤをコードする配列の３’末端に位置するＮｏｔＩ部位を含む。このベクターを、次いで、ＮｏｔＩ制限酵素により消化し、粘着性末端を満たすためにｄＮＴＰの存在下でクレノウ断片により処理し、その後、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で再連結した：
0004443636.tif 000008
(ＭｌｕＩ部位を導入するために、予めリン酸化して、それ自身にハイブリダイズさせてある)。こうして得られたベクターｐＴＧ１００８２(図７Ａ)は、ＢｇｌII部位を含みＳａｌＩ部位とＭｌｕＩ部位とで縁取られた３β−ＨＳＤをコードする配列を含んでいるが、ＮｏｔＩ部位は失われた。このベクターは、依然として、ＢｇｌII部位の存在により同定される天然の５’非コード領域を含んでいる。
上流にＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターを導入することを我々が望んでいるイニシエーターＡＴＧの近くにＳａｌＩ部位をもたらすために、ベクターｐＴＧ１００８２を、５’非コード領域内とイニシエーターＡＴＧの直ぐ上流に制限部位のあるＭｓｃＩ制限酵素で及びＭｌｕＩ制限酵素により消化した。この３β−ＨＳＤをコードする配列を含む１．８ｋｂのＭｓｃＩ−ＭｌｕＩ断片(図７Ａ)を単離し、次いで、ｐＴＧ１００３３プラスミド(E.Degryse等,1995)中に連結した(該プラスミドは、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターを含んでおり、予めＳａｌＩ制限酵素で消化し次いでＭｌｕＩ制限酵素で消化してある)。こうして、ｐＴＧ１００９５ベクター(図７Ｂ)が得られる。
第二に、酵母の２μプラスミド、大腸菌のレプリコン、ＣＹＣ１prom−ＰＧＫterm発現カセット及び選択マーカーＬＥＵ２を含む組換えベクターｐＴＧ１０２６８(図７Ｂ)を構築した。このベクターは、記載されたベクターｐＴＧ１０１５９(E.Degryse等,1995)と同じである(但し、２μ領域に含まれるＸｂａＩ部位は除き、これは、自然のＸｂａＩ部位をクレノウ断片の存在下で満たしてから再び連結することにより得られるマーカーＸｂａ0で置換した)。
次いで、ｐＴＧ１０２６８発現プラスミドを、プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１ｐを含む発現ブロック(該発現ブロックは、上で調製したプラスミドｐＴＧ１００９５から出発し次いでＮｏｔＩ制限酵素により消化することにより得た)を、予め制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩにより消化したプラスミドｐＴＧ１０２６０に導入することによる相同組換えによって生成した。このプラスミドｐＴＧ１０２６８(図７Ｂ)は、II型ヒト３β−ＨＳＤをコードする配列をプロモーターＣＹＣ１の制御下に含む。
次いで、３β−ＨＳＤをコードする配列をプロモーターＴＥＦ１の制御下に含む発現プラスミドｐＴＧ１０８６２を下記のようにして構築した(図７Ｃ)：
先ず、プラスミドｐＴＧ１０８３２(図８)を、上で調製したプラスミドｐＴＧ１０２６８から得たＮｏｔＩ断片と予め制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩにより消化した組換えプラスミドｐＴＧ１０１６４(E.Degryse等,1995)との間の相同組換えにより構築した。
次いで、発現プラスミドｐＴＧ１０８６２を、プラスミドｐＴＧ１００８５(E.Degryse等,1995)から単離したＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片に含まれるプロモーターＴＥＦ１を、上で構築したプラスミドｐＴＧ１０８３２の制限酵素ＣｌａＩ及びＳａｌＩによる消化によって切り出したプロモーターＣＹＣ１の代わりに導入することにより得た。
こうして得たプラスミドｐＴＧ１０８６２(図９)(II型ヒト３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡ配列を含む)を、それぞれ、親株ＴＧＹ７３．４又はその変異体ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３(実施例２で得られたＴＧＹ１５８株に対応する)に並びに親株ＦＹ１６７９又はその変異体ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３(実施例２で得られたＴＧＹ１５６株に対応する)にトランスフォームした。これらのトランスフォーマントを上記のように、Ｇ４１８を２５０μｇ／ｍｌで含むＹＰＤ培地(Difco)において分離した。
こうして得られた候補のコロニーを、次いで、各株に必要な栄養素(ＴＧＹ７３．４株についてのヒスチジン及びウラシル；ＴＧＹ１５８についてのヒスチジン；ＦＹ１６７９株についてのトリプトファン、ヒスチジン、ロイシン及びウラシル；ＴＧＹ１５６株のためのトリプトファン、ヒスチジン及びロイシン；各１００μｇ／ｍｌの濃度)を含むＳＤ培地で予備培養し、次いで、プレグネノロン１００μｇ／ｍｌを含む培地に接種した。２８℃で２４時間の生育及び生物学的変換の後に、これらのステロイドを抽出し、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。得られた結果(各株からの３クローンについて測定)を下記の表３に示す：
0004443636.tif 000009
これらの結果は、基質のプレグネノロンが変異株ＴＧＹ１５６又はＴＧＹ１５８において殆ど定量的に回収されることを示しており、該株においては、プレグネノロンのプロゲステロンへの生物学的変換の開始が認められ、プロゲステロンを生成するにしても非常に僅かしか生成しないが実施例２に示したようにプレグネノロンアセテートを蓄積する親株ＴＧＹ７３．４又はＦＹ１６７９におけるプレグネノロンの消失は完全である。
改変された株ＴＧＹ１５８／ｐＴＧ１０８６２の試料を、１９９８年２月２日に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(ＣＮＣＭ)(パスツール研究所、フランス国、PARIS CEDEX 15, Rue du Docteru Roux 75724, 25在)に番号Ｉ−１９７８で提出した。
実施例４：  ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermにより破壊されたＡＴＦ２遺伝子を有する酵母株(ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１／ＰＧＫ)の構築
実施例２に記載したＴＧＹ１５６株(ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３)に由来する株であるＴＧＹ１８６株(該株においては、ＡＴＦ２遺伝子座のＵＲＡ３遺伝子が発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermにより置換されている)を下記のように構築した：
第一に、発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermを、実施例２に記載した条件に従う(但し、ＵＲＡ３選択マーカーの代わりに、E.Degryseにより記載されたS.cerevisiaeの発現ブロックＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermを用いる)二重融合ＰＣＲにより、ＡＴＦ２遺伝子と結合させた。
破壊された標的遺伝子のＡＴＦ２中のＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermブロックの挿入部位に隣接するＡＴＦ２遺伝子の５’及び３’コード領域の増幅をそれぞれ可能にする最初の２ＰＣＲ反応(ＰＣＲ１)を、それぞれ、５’領域については直接及び間接プライマーとして、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて行い：
0004443636.tif 000010
３’領域については、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて行った：
0004443636.tif 000011
プライマーＯＴＧ１１０４９及びＯＴＧ１１０５０を、それぞれ、制限部位ＳａｌＩ及びＭｌｕＩを導入するために指定した。
ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermブロックの増幅を可能にする第３のＰＣＲ反応(ＰＣＲ２)を、それぞれ、直接及び間接プライマーとして下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて行った：
0004443636.tif 000012
(これらは、制限部位ＣｌａＩ及びＨｉｎｄIIIを導入する)。
最後に、結合を、上で得たＰＣＲ生成物の、配列ＯＴＧ１１０４９(SEQ ID NO:８)及びＯＴＧ１１０５０(SEQ ID NO:１１)を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる二重融合により行った(これらは、制限部位ＳａｌＩ及びＭｌｕＩをＡＴＦ２接合部位に導入する)。
精製後に、最終融合生成物を、下記のように構築して予め制限酵素ＢｓｔＩ及びＳｔｕＩで消化したプラスミドｐＴＧ１０８８５に含まれるＡＴＦ２遺伝子と再結合した。こうして、ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermシグナルをＡＴＦ２遺伝子の隣接領域により縁取られたＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII部位に含むプラスミドｐＴＧ１０８８８を得た。
プラスミドｐＴＧ１０８８５の調製は、ＦＹ１６７９株から出発して実施例２に記載した条件に従うＡＴＦ２遺伝子の増幅を含む(但し、直接及び間接プライマーとして、それぞれ、配列ＯＴＧ１１０４９(SEQ ID NO:８)及びＯＴＧ１１０５０(SEQ ID NO:１１)を有するオリゴヌクレオチドを用い、これらは、制限部位ＳａｌＩ及びＭｌｕＩを導入する)。得られたＰＣＲ生成物において、これらの部位を制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩでの消化とその後の大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断片による処理で粘着末端を埋めることにより除去した。得られた断片を、次いで、酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄIIIで予め消化してからクレノウ断片で処理したE.Degryse等,1995により記載された発現ベクターｐＴＧ１００３１中にライゲートした。大腸菌でのトランスフォーメーションにより、こうして、プラスミドｐＴＧ１０８８５が得られ、ＰＣＲ生成物のＳａｌＩ部位のライゲーションから生じ、ベクターのＨｉｎｄIII部位を伴う配列GTCGAを得るためにクレノウ断片を用いて埋め、ＨｉｎｄIII部位(GTCGAAGCTT)(SEQ ID NO:１４)を再構築するために配列AGCTTを得るためにクレノウ断片を用いて埋め、そしてＣｌａＩ部位を失う。配列ATCGを得るためにクレノウ断片を用いて埋めたこのベクターのＣｌａＩ部位は、ＰＣＲ生成物へのライゲーション後に失われる。
次いで、ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermシグナルをプラスミドｐＴＧ１０８８８から１．８ｋｂのＮｏｔＩ断片の形態で切り出し、次いで、ＴＧＹ１５６株(ａｔｆ２−Δ：：ＵＲＡ３)中のＵＲＡ３マーカーと交換した。
実施例２で調製したＴＧＹ１５６株(宿主株として使用)を、プラスミドｐＴＧ１０８８８から切り出したＤＮＡ及びStruhl等,1979により記載されＹＲｐ７と呼ばれるＡＲＳオリジンを含む酵母ベクターで同時トランスフォームした(これは、ＴＧＹ１５６株のトリプトファン要求性を補うことができ、コロニーの選択的検出をそれらの５−フルオロ−オロチン酸(５−ＦＯ)から可能にする)。
プラスミドｐＴＧ１０８８８からＮｏｔＩ制限酵素での消化により及びプラスミドＹＲｐ７から切り出したＤＮＡ２〜５μｇを酢酸リチウム法(Ito等,1983)によりＴＧＹ１５６株中に導入した。次いで、この株のトリプトファン要求性に対する捕捉についての選択を、ヒスチジンとロイシン(各１００μｇ／ｍｌ)を富化したＹＮＧＢ培地(Difco)中の寒天皿上に広げた後に行った。つま楊枝を用いて集めた候補のコロニーを、次いで、Boeke等,1984により調製された５−ＦＯを含む培地上に置いてから、５−ＦＯに対する耐性を同じ培地上で確認した(５−ＦＯに耐性のものの内のＹＲｐ７ベクターの如何なる消失でもトリプトファン要求性により示される)。こうして選択されたコロニーの内で、ＡＴＦ２遺伝子のＴＥＦ１prom及びＰＧＫtermとの結合をＰＣＲによりモニターした。こうして、ＴＧＹ１８６株が得られる。
実施例５：  ＴＥＦ１prom及びＰＧＫtermにより破壊されたＡＴＦ２遺伝子を有する酵母株の構築及びＰ450１７αの発現
酵母複製起点ＡＲＳＨ４／ＣＥＮ６、ＵＲＡ３選択マーカーを含み且つウシシトクロームＰ450１７αをコードするｃＤＮＡをS.cerevisiaeのＴＥＦ１プロモーターの制御下に有するプラスミド(ｐＴＧ１０４３５)を図１０の概要に従って構築し、次いで、変異体酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１／ＰＧＫ(ＴＧＹ１８６)中にトランスフォームした。最初に、Zuber等,1986により記載されたウシシトクロームＰ450１７αをコードするｃＤＮＡ配列(ＳａｌＩ及びＭｌｕＩ部位に隣接して酵母プロモーターＣＹＣ１の下流に位置する)を含むプラスミドｐＴＧ１００５８を、図１１の概要に従って生成した。特許出願ＷＯ８９／１０９６３に記載されたウシシトクロームＰ450１７αをコードする配列を含むプラスミドｐＧＢ１７α−５をＸｈｏＩ制限酵素での消化により開いてからアルカリホスファターゼで処理した。リン酸化及びハイブリダイゼーション後に、下記の配列を有するオリゴヌクレオチド：
0004443636.tif 000013
をＸｈｏＩ部位に導入して、プラスミドｐＴＧ１０１０４を生成した。プラスミドｐＴＧ１０１０４を、次いで、制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩで処理し、次いで、E.Degryse等,1995により記載されたプラスミドｐＴＧ１００３１(予め、制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩで消化してアルカリホスファターゼで処理してある)に導入した。こうして、ウシシトクロームＰ450１７αをコードするｃＤＮＡを含むｐＴＧ１００５８ベクター(図１２)を得る。次いで、プラスミドｐＴＧ１００５８を、制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩにより消化してアルカリホスファターゼで処理した。ウシシトクロームＰ450１７αをコードする配列を含む１．７ｋｂのＳａｌＩ−ＭｌｕＩ断片を単離し、次いで、E.Degryse等,1995により記載された酵母プロモーターＴＥＦ１を含む発現ベクターｐＴＧ１００８５(予め、酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩで消化してある)中にライゲートした。こうして、シトクロームＰ450１７αをコードする配列がプロモーターＴＥＦ１の制御下にあるプラスミドｐＴＧ１０２９３(図１３)を得る。
第二に、発現プラスミドｐＴＧ１０４３５を、E.Degryse等,1995により記載された配列ＡＲＳＨ４／ＣＥＮ６を含む組換えプラスミドｐＴＧ１０４３４(予め、酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩにより消化してある)と、上で調製したプラスミドｐＴＧ１０２９３から出発して得られた２．８ｋｂのＮｏｔＩ断片との間での相同組換えにより生成した。
こうして得られたプラスミドｐＴＧ１０４３５(図１４)(ウシシトクロームＰ450１７αをコードする配列ををプロモーターＴＥＦ１の制御下に含む)を、次いで、親株ＦＹ１６７９又は実施例４で調製したＴＧＹ１８６株(ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１／ＰＧＫ)にそれぞれトランスフォームした。これらのトランスフォーマントを上記のように、トリプトファン、ヒスチジン及びロイシン(各１００μｇ／ｍｌ)を富化したＹＮＢＧ培地(Difco)にて単離した。こうして得られたコロニーを、次いで、２％のグルコース及び０．５％のカザミノ酸を含むＹＮＢ培地(Difco)中で１６時間にわたって予備培養し、次いで、新鮮な培地にてＡ６００＝０．２まで希釈した。６時間の生育後に、１００μ／ｍｌのプレグネノロン又はプロゲステロンを加えた。２８℃での４８時間の生育及び生物学的変換の後に、これらのステロイドを抽出して、実施例１に示したようにＲＰ−ＨＰＬＣにより、それぞれ、プレグネノロン及び１７α−ヒドロキシプレグネノロン又はプロゲステロン及び１７α−ヒドロキシプロゲステロンの標準を用いて測定した。
得られた結果をμｇ／ｍｌで表して下記の表４に示す：
0004443636.tif 000014
これらの結果は、ベクターｐＴＧ１０４３５から出発して発現されたシトクロームＰ450１７αの生物学的変換能力が、プロゲステロンを基質として用いた場合には、野生型株(ＦＹ)又はその変異体ａｔｆ２(ＴＧＹ１８６)において殆ど同じであるということを示している。他方、プレグネノロンを基質として用いた場合には、同生物学的変換は、プロゲステロンと比較して、変異体ａｔｆ２(ＴＧＹ１８６)についてのみ得られる。野生型株ＦＹにおいては、基質と生成物の両方がアセチル化され、遊離のヒドロキシプロゲステロンは検出されない。
改変された株ＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４３５の試料を、１９９９年１月２０日に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(ＣＮＣＭ)(パスツール研究所、フランス国、PARIS CEDEX 15, Rue du Docteru Roux 75724, 25在)に番号Ｉ−２１１９で提出した。
実施例６：  ＴＥＦ１prom／ＰＧＫtermにより破壊されたＡＴＦ２遺伝子を有する酵母株の構築並びに３β−ＨＳＤ及びＰ450１７αの同時発現
酵母レプリコン２μ及び２つの発現ブロック(その１つは、ヒト３β−ＨＳＤをコードし、他方はウシシトクロームＰ450１７αをコードしており、且つ両者は、S.cerevisiaeのプロモーターＣＹＣ１の制御下にある)を含み且つＵＲＡ３−ｄ選択マーカーを有するプラスミドｐＴＧ１０４１７(図２１)を下記のステージ１〜３(図１５Ａ及びＢ)に、次いでステージ４〜６に逐次従って構築し、その後、変異体酵母株ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫterm(ＴＧＹ１８６)中にトランスフォームした。
ステージ１：プラスミドｐＴＧ１０２１０の構築
E.Degryse等,1995により記載されたハイブリッド酵母プロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１を含む発現ベクターｐＴＧ１００３３(予め、制限酵素ＰｖｕIIで消化してある)をアルカリホスファターゼで処理し、次いで、下記の配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で再ライゲートした：
0004443636.tif 000015
{予め、リン酸化して、プロモーターＧＡＬ／ＣＹＣ１を含む発現ブロックの端にＥｃｏＲＩ部位を導入するためにそれ自身とハイブリダイズさせてある}。
ステージ２：プラスミドｐＴＧ１０２１４の構築
ベクターｐＴＧ１０２１０中に存在するプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１を含む発現ブロックを、次いで、E.Degryse等,1995により記載された選択マーカーＵＲＡ３−ｄを含む大腸菌−酵母シャトルベクターｐＴＧ１００１３中に導入した。このベクターｐＴＧ１００１３を、ＥｃｏＲＩ制限酵素での消化及びアルカリホスファターゼ処理の後に、ステージ１で調製したベクターｐＴＧ１０２１０(予め、酵素ＥｃｏＲＩで消化してある)中にライゲートした。こうして得られたベクターｐＴＧ１０２１４は、２μレプリコンに向けられたプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１を含む発現ブロックを含む。
ステージ３：プラスミドｐＴＧ１０２７４の構築
プラスミドｐＴＧ１０２１４において、次いで、制限酵素ＣｌａＩ及びＳａｌＩでの処理によるプラスミドの切り出しの後にプロモーターＧＡＬ１０／ＣＹＣ１を相同組換えによりプロモーターＣＹＣ１と交換した。E.Degryse等,1995により記載されたプロモーターＣＹＣ１を含む発現ベクターｐＴＧ１００３１を、制限酵素ＨｉｎｄIII及びＦｓｐＩにより消化し、次いで、ステージ２で調製したプラスミドｐＴＧ１０２１４(予め、制限酵素ＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化してある)と組換え、こうして、プラスミドｐＴＧ１０２７４(図１６)を生成した。
ステージ４：プラスミドｐＴＧ１０４０１の構築
プロモーターＣＹＣ１を含むプラスミドｐＴＧ１０２７４及びシトクロームＰ450１７αコードする配列をプロモーターＴＥＦ１の制御下に含むプラスミドｐＴＧ１０２９３から出発して、シトクロームＰ450１７αをコードする配列をプロモーターＴＥＦ１の制御下に含む新たなプラスミドｐＴＧ１０４０１を相同組換えにより生成した。
プロモーターＣＹＣ１及び大腸菌のレプリコンの一部を、プラスミドｐＴＧ１０２７４(ステージ３で調製)から制限酵素ＭｌｕＩ及びＤｒａＩでの消化によって切り出した。プラスミドｐＴＧ１０２９３(実施例５で調製)を制限酵素ＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIで消化してから、制限酵素ＭｌｕＩ及びＤｒａＩで消化したプラスミドｐＴＧ１０２７４と組み換えて、プラスミドｐＴＧ１０４０１(図１７)を生成した。
ステージ５：プラスミドｐＴＧ１０４０３の構築
II型ヒト３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡを、次いで、プラスミドｐＴＧ１０４０１にプロモーターＣＹＣ１の制御下に導入した。最初に、II型ヒト３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＴＧ１０２６２を、図１８の概要に従って、実施例３で調製したトランスファーベクターｐＴＧ１００９５と酵母レプリコン２μ、大腸菌由来のレプリコン、酵母の発現カセットＣＹＣ１prom−ＰＧＫterm及びＵＲＡ３−ｄ選択マーカーを含む組換えベクターｐＴＧ１０２５７から出発して構築した。このベクターｐＴＧ１０２５７は、E.Degryse等,1995により記載された組換えベクターｐＴＧ１００４２と同じである(但し、２μ領域に含まれるＸｂａＩ部位は別であり、これは、天然のＸｂａＩ部位をクレノウ断片を用いて埋めてから再ライゲートすることにより得られるマーカーＸｂａＩ0により置換されている)。
II型ヒト３β−ＨＳＤの発現ブロックをトランスファーベクターｐＴＧ１００９５から制限酵素ＮｏｔＩでの消化により切り出してから、組換えベクターｐＧＴ１０２５７(予め、制限酵素ＳａｌＩ及びＭｌｕＩで消化してある)に導入することにより、発現ベクターｐＴＧ１０２６２(図１９)を生成した。プラスミドｐＴＧ１００９５由来のブロックＧＡＬ１０／ＣＹＣ１−ｃＤＮＡの、プロモーターＣＹＣ１を含む組換えベクターｐＴＧ１０２５７中への組換えは、ブロックＣＹＣ１−ｃＤＮＡを含む発現ベクターを生成するということには注意すべきである。第二に、上で調製した発現ベクターｐＴＧ１０２６２を、制限酵素ＸｍｎＩで消化した。得られた３β−ＨＳＤをコードするｃＤＮＡを含む断片を、シトクロームＰ450１７αをコードするｃＤＮＡを含むステージ４で調製したプラスミドｐＴＧ１０４０１の断片(制限酵素ＳｃａｌＩでの消化により得たもの)と組み換えた。こうして得られたプラスミドｐＴＧ１０４０３(図２０)は、２つの発現ブロック(その１つは３β−ＨＳＤＨをプロモーターＣＹＣ１の制御下にコードし、他方はシトクロームＰ450１７αをプロモーターＴＥＦ１の制御下にコードする)を含んでいる。
ステージ６：プラスミドｐＴＧ１０４１７の構築
最初に、上記のプラスミドｐＴＧ１０４０３において、プロモーターＴＥＦ１をプロモーターＣＹＣ１と交換した。
一方において、実施例５に記載したプラスミドｐＴＧ１００５８を制限酵素ＰｖｕIIで消化した(これは、プロモーターＣＹＣ１と結合したシトクロームＰ450１７αをコードする配列の一部並びに大腸菌レプリコンの大部分を放出することを可能にする)。他方において、大腸菌レプリコンの部分を、ステージ５で調製したプラスミドｐＴＧ１０４０３から制限酵素ＤｒａＩでの消化によって除去した。この方法で予め消化した２つのプラスミドの組換えにより、最終的に、プラスミドｐＴＧ１０４１７が得られる。このプラスミドｐＴＧ１０４１７は、酵母レプリコン２μ、ＵＲＡ３−ｄ選択マーカー及び２つの発現ブロック(その１つはヒト３β−ＨＳＤをコードし、他方はウシ起源のシトクロームＰ450１７αをコードし、両者とも酵母プロモーターＣＹＣ１の制御下にある)を含んでいる(図２１)。
次いで、このプラスミドｐＴＧ１０４１７を、親株ＦＹ１６７９又は実施例４で調製したＴＧＹ１８６株(ａｔｆ２−Δ：：ＴＥＦ１prom／ＰＧＫterm)中にそれぞれトランスフォームした。
これらのトランスフォーマントを、０．５％のグルコースを含み、トリプトファン、ヒスチジン及びロイシンを富化した(各１００μｇ／ｍｌ)アガー処理したＹＮＢ培地(Difco)上で単離した。
こうして得られたコロニーを、次いで、０．５％のグルコース及び０．１％のカザミノ酸を含むＹＮＢ培地(Difco)中で、２８℃で２４時間にわたって予備培養し、次いで、新鮮な同培地(培地１)又は０．１％のグルコール、２％のグリセロール及び０．２％のカザミノ酸を含むＹＮＢ培地(Difco)(培地２)にて、Ａ６００＝０．１まで希釈し、プレグネノロンを１００μｇ／ｍｌに補った。４８時間の生育及び生物学的変換の後に、これらのステロイドを抽出して、実施例１に示したようにプレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、プロゲステロン及び１７α−ヒドロキシプロゲステロンの標準を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。得られた結果を、μｇ／ｍｌで表して、下記の表５(培地１)及び表６(培地２)に示す：
0004443636.tif 000016
0004443636.tif 000017
これらの結果は、プラスミドｐＴＧ１０４１７によりトランスフォームされた野生型株(ＦＹ)中の生物学的変換が、プレグネノロンアセテート及び１７α−ヒドロキシプレグネノロンアセテートの蓄積へと導く(これらは、その後、酵素３β−ＨＳＤＨ又はＰ450１７αにより変換されない)こと及びこの生物学的変換のバランスがトランスフォームされたａｔｆ２変異体(ＴＧＹ１８６)で認められたものより低いことを示している。
トランスフォームされた株ＴＧＹ１８６／ｐＴＧ１０４１７の試料を、１９９９年１月２０日に、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(ＣＮＣＭ)(パスツール研究所、フランス国、PARIS CEDEX 15, Rue du Docteru Roux 75724, 25在)に番号Ｉ−２１１８で提出した。
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0004443636.tif 000018
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【図１】
0004443636.tif 000022
【図２Ａ】
0004443636.tif 000023
【図２Ｂ】
0004443636.tif 000024
【図３】
0004443636.tif 000025
【図４】
0004443636.tif 000026
【図５】
0004443636.tif 000027
【図６】
0004443636.tif 000028
【図７Ａ】
0004443636.tif 000029
【図７Ｂ】
0004443636.tif 000030
【図７Ｃ】
0004443636.tif 000031
【図８】
0004443636.tif 000032
【図９】
0004443636.tif 000033
【図１０】
0004443636.tif 000034
【図１１】
0004443636.tif 000035
【図１２】
0004443636.tif 000036
【図１３】
0004443636.tif 000037
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
0004443636.tif 000040
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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