(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用の１以上のマルチモードリガンドの製造方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を準備する段階と、
【化１】
0004570052.tif 000007
（式中、Ａ、Ｂ及びＸは互いに独立に炭素原子又は酸素、硫黄、窒素及び／もしくはシリカであり、ｍは１〜３であり、官能基Ｎは窒素であって、いずれかのＸを置換或いはＡ、Ｂ及びＸのいずれかに結合している。）
（ｂ）骨格の窒素を、残基Ｒに結合した反応性基Ｚを含む試薬（ただし、Ｚは骨格の窒素と反応し得る基であり、Ｒは疎水性基である。）で誘導体化して第一の相互作用を導入する段階と、
（ｃ）得られた誘導体をアミノ分解することによってカルボニルとチオールの間で環構造を開環し、カルボニルに隣接して第二の相互作用を導入する段階とを含み、
第一の相互作用及び第二の相互作用の少なくとも一方が疎水性基を含み、前記相互作用がいずれもイオン交換リガンドを含まない方法。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ａ、Ｂ及びＸが炭素原子であり、ｍが１である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）において、骨格がホモシステインチオラクトンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）で使用される試薬が一般式（II）で定義される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
−Ｚ−Ｒ−    （II）
式中、Ｚは骨格の窒素と反応し得る基であり、Ｒが線状、枝分れ、環状の飽和、不飽和又は芳香族炭化水素基である。
【請求項５】
段階（ｂ）がアルキル化、アシル化又はスルホニル化である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
段階（ｂ）が、アシル化又はスルホニル化、アルキル化とアシル化の組合せ、或いはアルキル化とスルホニル化の組合せを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
段階（ｃ）から得られる生成物のチオールを、反応性基を含むベースマトリックスと反応させる段階（ｄ）も含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
誘導体化骨格のチオール基がベースマトリックスのアリル基と結合する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ベースマトリックスがアガロースなどの多糖類から作製され、分離媒体がＨＩＣ媒体である、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベースマトリックスがジビニルベンゼン又はスチレンなどの合成高分子から作製され、分離媒体がＲＰＣ媒体である、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造された、標的分子と疎水性相互作用し得る１以上の基と、同一の標的分子と相互作用し得る１以上の別の基とを含む、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用マルチモードリガンド。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造された、ベースマトリックスに固定化された複数のリガンドを含み、各リガンドが標的分子と疎水性相互作用し得る１以上の基と、同一の標的分子と相互作用し得る１以上の別の基とを含む、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用分離媒体。
【請求項１３】
請求項１２において定義された分離媒体を充填した、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用クロマトグラフィーカラム。
【請求項１４】
請求項１２において定義された分離媒体を提供する段階と、前記媒体を液体と接触させて目標物質をリガンドへ吸着させる段階とを含む、液体から目標物質を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）など、標的とリガンドの疎水性相互作用に基づく分離のためのリガンド及び媒体の製造法に関する。本発明は、こうしたリガンドを含む分離媒体、並びにタンパク質及びペプチドなどの分子を単離するための、その使用も包含する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーという用語は、密接に関連した一群の分離法を包含する。他の大半の理化学的分離法と区別されるクロマトグラフィーの特徴は、非混和性の２つの相を接触させ、一方の相を固定相とし、他方を移動相とすることである。移動相に導入された試料混合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で何度も一連の相互作用（分配）を受ける。相互作用は試料中の成分の理化学的性質の差異を利用する。こうした差異が、固定相を収容したカラム内を移動する移動相の影響下での各成分の移動速度を支配する。分離された成分は、固定相との相互作用の低いものから高いものへと順次流出する。妨害の最も少ない成分が最初に溶出し、最も強く保持された物質が最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際に、ある成分の流出速度が隣接する溶質のゾーンと重ならないように十分に遅くなった場合に達成される。
【０００３】
タンパク質の分離用に高い関心が寄せられたクロマトグラフィーの１種は、表面疎水性の差に基づく疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。タンパク質及びペプチドは、通常、ドメインの疎水性アミノ酸を分子表面から遠くに隔離しているが、それでも通常、固定相に付加した疎水性リガンドと相互作用し得るのに十分な疎水基が露出している。ＨＩＣの有利な点は、溶出条件が温和なことである。これにより生物活性が保存される。利用できるＨＩＣ媒体の１種は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））など、芳香族相互作用モードに基づくものである。こうした芳香族誘導体化媒体は、例えば、ルイス酸触媒下、アガロースベースマトリックスへのフェニルグリシジルエーテルの固定化によって製造することができる。
【０００４】
利用できるＨＩＣ媒体の別の種類は、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））など、脂肪族相互作用モードに基づくものである。こうした脂肪族リガンドも、例えば、上記と同様な方法で、但し今回は脂肪族グリシジルエーテルを使用して製造することができる。
【０００５】
疎水性相互作用を利用するが、通常のＨＩＣよりはるかに疎水性のベースマトリックスを使用することが多い、別の特殊なクロマトグラフィー法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）である。ＲＰＣでは、ベースマトリックスは、通常のＨＩＣにおけるより耐流れ性も有する。従って、分離時の流速を高くすることができる。ＲＰＣにおける溶出は、有機溶媒を使用して行われる。ＲＰＣ媒体は市販もされている。例えば、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）ｍｅｄｉａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））である。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術の発展と共に、タンパク質は高い関心を引きつけるようになり、その結果、その効率的な精製方法の必要性が高くなった。現在に至るまで、イオン交換は最も普及しているタンパク質精製用クロマトグラフィー法である。タンパク質は固体相との複数の相互作用の可能性がある複合分子であるが、タンパク質の疎水性と他の相互作用の両方を同時に利用できる一般の分離媒体は無い。したがって、かかる１以上の追加の相互作用モードを提供する基を追加したＨＩＣ媒体の分野が必要である。その結果、ＨＩＣ及びＲＰＣで使用するための、こうしたマルチモード媒体を製造する効率的な方法も必要である。
【０００７】
最後に、Ｆｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｎａ  （”Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｍｅｒｃｕｒａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．  Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｌ．  Ｆｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｊ．  Ｄａｎｎａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０（１５），  ｐ．  ４２４３−４２４６）は、スルフヒドリルセルロースの製造法を開示している。この方法は、アミノエチルセルロースをＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと混ぜる方法を含む。活性スルフヒドリル基の濃度は、スルフヒドリルセルロースをＥｌｌｍａｎ’ｓ試薬と反応させることによって測定する。
【特許文献１】国際公開第８８／０７４１４号パンフレット（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ）
【非特許文献１】Ｆｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｎａ  （”Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｍｅｒｃｕｒａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．  Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｌ．  Ｆｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｊ．  Ｄａｎｎａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０（１５），  ｐ．  ４２４３−４２４６）
【非特許文献２】Ｋａｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９７３）  ｐａｇｅ  ４２
【非特許文献３】Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），  ３９３−３９８  （１９６４）
【非特許文献４】”Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  （Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），  ７０−７５  （１９８８））
【非特許文献５】Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＮＣ，  １９９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の１つの目的は、疎水性相互作用クロマトグラフィー用のリガンドの製造法を提供することである。この方法は、単純で堅調な２工程の合成法である。具体的な目的は、各リガンドに複数の官能基の導入を可能にする方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、明確に定義されたリガンドを形成する、上記の方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、所望の置換度で固体坦体上に固定することができる、上記の方法を提供することである。
【００１１】
本発明の以上の目的は、上記請求項のいずれか１以上によって達成できる。本発明のその他の目的、利点及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の態様において、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用の、１以上のマルチモードリガンドの製造方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を準備する段階と、
【００１３】
【化１】
0004570052.tif 000002
【００１４】
式中、Ａ、Ｂ及びＸは互いに独立に炭素原子又はヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素及び／又はシリカであり、ｍは０〜４の整数、例えば１〜３、好ましくは１又は２であり、官能基Ｎは窒素であって、いずれかのＸを置換或いはＡ、Ｂ及びＸのいずれかに結合している。
（ｂ）骨格の窒素を、残基Ｒに結合した反応性基Ｚを含む試薬で誘導体化して第一の相互作用を導入する段階と、
（ｃ）得られた誘導体をアミノ分解することによってカルボニルとチオールの間で環構造を開環し、カルボニルに隣接して第二の相互作用を導入する段階とを含み、
第一の相互作用及び第二の相互作用の少なくとも一方が疎水性基を含み、前記相互作用がいずれもイオン交換リガンドを含まない方法である。
【００１５】
これに関して、イオン交換リガンドは、クロマトグラフィーで使用される条件下で荷電した化学種に変換される基も含む。したがって、本方法に従って製造されるリガンドでは、前記第一及び第二の相互作用を介する標的化合物とのイオン相互作用は不可能である。前記第一及び第二の相互作用は、同一の標的分子と相互作用し得る基であることも知られている。
【００１６】
定義
「分離媒体」という用語は、本明細書では、例えばクロマトグラフィーカラムの充填材として有用な材料、具体的には、ベースマトリックスに１以上のリガンドが結合したものからなる材料に用いる。ベースマトリックスは担体として作用し、リガンドはクロマトグラフィーで目標物質と相互作用する官能基を与える。
【００１７】
「スペーサー」という用語は、ベースマトリックスからリガンドを離隔するための化学物質に用いる。
【００１８】
「リガンド」という用語は、本明細書では、目標物質に結合し得る化学物質をいう。かかる目標物質は、クロマトグラフィーでの単離又は除去が望まれる化合物でもよいし、或いは分析の目標物質でもよい。
【００１９】
「イオン交換リガンド」という用語は、クロマトグラフィーの吸着相において荷電している基を意味する。
【００２０】
「混成モードのアニオン交換リガンド」及び「マルチモードリガンド」という用語は、結合すべき物質と相互作用する２以上の異なる（ただし、協働的な）部位を与え得るリガンドをいう。これらの部位の一方は、リガンドと目標物質との疎水性相互作用を与える。第二の部位は、通例、電子受容体−供与体相互作用及び／或いは疎水性及び／又は親水性相互作用を与える。電子供与体−受容体相互作用としては、水素結合、π−π、電荷移動、双極子−双極子、誘発双極子などの相互作用が挙げられる。
【００２１】
「電子供与体−受容体相互作用」は、非共有電子対を有する電気陰性原子が供与体として作用し、この供与体の電子対の受容体として作用する電子不足原子に結合することを意味する（例えば、Ｋａｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９７３）４２頁参照）。典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロの窒素などの電子不足原子又は基であり、ヒドロキシ及びカルボキシの−ＯＨ、アミド及びアミンの−ＮＨ−、チオールのＨＳ−などの、電気陰性原子と結合した水素も挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
したがって、本方法は多数の利点を提供する３官能性骨格の使用に基づく。これにより、異なる相互作用を順次選択的に導入すること、並びにいくつかの追加の相互作用の導入と同時に最後の工程においてチオール基を再生して固体坦体上にさらに固定化することが可能になる。チオール基は高い求核性を有するので、この基を介してのマルチモードリガンドの固定化は、容易に制御且つ分析できるレベルの置換を可能にする均質な媒体を保証する。これらの特定の特徴により、さもなければ官能基を保護及び脱保護する多数の工程を経由して製造されたであろうマルチモードＨＩＣ媒体を、より短く、はるかに効率的且つ経済的に製造することが可能になる。
【００２３】
最も有利な実施形態では、式（Ｉ）のＡ、Ｂ及びＸは炭素原子であり、ｍは１である。しかしながら当業者が容易に理解している通り、ｍはもう１つの選択肢として、リガンドの所望の大きさに応じて、５〜５００などの４より大きい整数、例えば１０〜２５０又はさらに具体的には５０〜１００であってもよい。さらに、Ｎは、分離媒体において通常使用されるようなリンカーを介して環構造に結合されてもよい。このリンカーは、例えば、炭素原子１〜１０個など、炭素原子１〜２０個の線状、枝分れ、環状の飽和、不飽和又は芳香族炭化水素基を含むことができる。
【００２４】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の骨格はホモシステインチオラクトンである。当業者がよく理解している通り、ホモシステインチオラクトンは光学的に純粋な形又はラセミ化合物の形で使用することができる。ホモシステインチオラクトンは、例えばＡｌｄｒｉｃｈが市販している。カタログＮｏ．Ｈ１，５８０−２及びＣＡＳ  Ｎｏ．６０３８−１９−３である。
【００２５】
特定の実施形態では、第一の相互作用を提供するために段階（ｂ）で使用される試薬は、一般式（II）で定義される。
【００２６】
−Ｚ−Ｒ−    （II）
式中、Ｚは骨格の窒素と反応し得る基である。またＲは第一の相互作用を提供する基であり、好ましくは炭素原子数約１〜２０、例えば１〜１０の線状、枝分れ、環状の飽和、不飽和又は芳香族炭化水素基である。
【００２７】
さらに具体的には、Ｚ基はどんな求電子基を含んでもよく、Ｃ＝Ｃ；Ｃ−Ｙによって例示することができる。式中、Ｙは、例えばＢｒ、Ｉ、Ｃｌなどのハロゲン又はメシラート若しくはトシラート基を表す。或いはＷＣ＝Ｏ若しくはＷＳＯ２などの酸若しくは活性酸によって例示することができる。式中、Ｗは、例えばハロゲン原子、Ｎ−ヒドロスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、ｐ−ニトロフェノール又はイソプロピルクロロフォーメートから形成される。
【００２８】
したがって、Ｒ基は第一の相互作用を提供する。一実施形態では、Ｒは芳香族若しくは脂肪族基などの疎水性基を提供する。代替の実施形態では、第二の相互作用が１以上の疎水性基を提供する場合には、Ｒは、電子受容体−供与体相互作用、水素結合など、標的化合物との追加の相互作用を提供する、使用される吸着条件下で荷電していない任意の他の基を提供する。例えば、Ｒはヒドロキシ基、ハロゲン、アルコキシ若しくはアリールオキシ及び対応するチオ類似体、並びに／又はアミノ基を保持してもよい。エーテル酸素、チオエーテル硫黄などのある種の用途については、１以上の位置でヘテロ原子が炭素鎖に割り込んでもよい。アミド及びケトンなどのカルボニル基、並びに加水分解に対して同等の安定性を有する他の基もあり得る。最終の分離媒体が、疎水性相互作用クロマトグラフィーで機能し得る全体的に疎水性の全間隔枠を示す限り、Ｒは事実上どんな基を含んでいてもよい。当業者には自明であろうが、本方法は結合して官能性を有する２以上の部分からなるＲ基を使用してもよい。したがって、特定の実施形態では、Ｒは第一の相互作用を可能にする２つの官能基Ｌ１及びＬ２を提供する。
【００２９】
本発明の一実施形態では、段階（ｂ）はアルキル化、アシル化又はスルホニル化である。有利な実施形態では、段階（ｂ）はアシル化又はスルホニル化、アルキル化とアシル化の組合せ、或いはアルキル化とスルホニル化の組合せを含む。したがって、この段階において２種類の異なる相互作用を導入することができる。
【００３０】
第二の相互作用を提供するために、アミノ分解による開環である上記段階（ｃ）を、第二の相互作用、即ち標的化合物と相互作用し得る１以上の官能基を保持する任意の好適なアミンを添加することによって行う。したがって、段階（ｂ）では、２つの部分、即ち１つはアミン部分及び所望の相互作用を可能にする１以上の官能基を提供するもう１つの部分からなる試薬を添加する。前記相互作用の１以上が疎水性相互作用を提供すること、並びに使用される吸着条件下でこれらはいずれも荷電基ではないことを条件として、第二の相互作用は第一の相互作用に関して上述したものの任意の１つであってもよい。
【００３１】
特的の実施形態では、添加されるアミンは、一般式（II）で定義される。
【００３２】
【化２】
0004570052.tif 000003
【００３３】
式中、Ｌ３及びＬ４は同一又は異なってもよい官能基を含む。
【００３４】
有利な実施形態では、本発明は、段階（ｃ）から得られる生成物のチオールを、反応性基を含むベースマトリックスと反応させる段階（ｄ）も含む。したがって、この実施形態の生成物は、複数のマルチモードリガンドが好適なベースマトリックスに固定化されたＨＩＣ用分離媒体である。
【００３５】
段階（ｄ）のベースマトリックスは一般にビーズ状又は一体形状である。ベースマトリックスは、例えばゲル状、好ましくは多孔質ゲル又は多孔質ビーズとすることができる。別の実施形態では、ベースマトリックスは、例えば膜、フィルター、１以上のチップ、面、毛管であってもよい。
【００３６】
本方法の第一の実施形態では、段階（ｄ）のベースマトリックスは天然高分子から作製される。天然高分子の好適な多孔質高分子ビーズは、逆懸濁ゲル化（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），  ３９３−３９８  （１９６４））又は回転円板法（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｄｉｓｋ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（例えば国際公開第８８／０７４１４号パンフレット（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ）参照）などの常法に従って当業者が容易に行うことができるか、或いはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）などのメーカーから得られる。こうした有用な天然高分子ビーズの商品名の例を挙げると、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）として知られている種類がある。
【００３７】
塩濃度を低下させることによって溶出を行う通常のＨＩＣに特に好適な有利な実施形態では、ベースマトリックスはアガロースである。特定の実施形態では、リガンドを置換レベル約１０〜５０、例えば約２０μモル／ｍｌベースマトリックスまで粒状ベースマトリックスに固定化してＨＩＣ媒体を得る。
【００３８】
本方法の第二の実施形態では、段階（ｄ）のベースマトリックスは、スチレン若しくはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの合成高分子、好ましくは架橋合成高分子から作製される。こうした高分子は、常法に従って容易に製造される。例えば、”Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  （Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），  ７０−７５  （１９８８））を参照されたい。或いは、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））などの市販の製品を本発明に従って表面変性してもよい。
【００３９】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）に特に好適な有利な実施形態では、ベースマトリックスは、ジビニルベンゼン及び／又はスチレンなどの高度に疎水性の材料から作製される。特定の実施形態では、リガンドを置換レベル約１０〜２００、例えば約２０〜１００、例えば約４０μモル／ｍｌベースマトリックスまで粒状ベースマトリックスに固定化してＲＰＣ媒体を得る。
【００４０】
一実施形態では、ベースマトリックスの反応性基はアリル基、即ち炭素−炭素二重結合である。したがって、一実施形態では、チオール基はベースマトリックスのアリル基と結合する。
【００４１】
一実施形態では、既にアリル基を有する市販のベースマトリックスが使用される。
【００４２】
別の実施形態では、アリル基は、周知の方法に従って形成される。したがって、一実施形態では、本方法は、ベースマトリックスをアリル化して反応性基を得る段階も含む。本方法は、例えば臭素化によってベースマトリックスの反応性基を活性化する段階も含むことができる。具体的な例として、リガンドのチオール基は、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）のアリル基を介してベースマトリックスと結合する。（固定化技術の一般概要については、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＮＣ，  １９９２を参照されたい。）
特定の実施形態では、本方法の段階（ａ）及び（ｂ）は早くから行われ、既誘導体化骨格（ｒｅａｄｙ−ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）が得られている。したがって、本発明は、骨格の誘導体化が早くから、即ち各々段階（ｃ）及び段階（ｄ）のアミノ分解及びベースマトリックスへの固定化とは別に、行われている方法も包含する。
【００４３】
第二の態様では、本発明は、複数のマルチモードリガンドを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー用分離媒体の製造におけるホモシステインチオラクトンの使用である。本態様に好適な詳細は、例えば本方法に関して上述した通りである。
【００４４】
第三の態様では、本発明は、複数のマルチモードリガンドを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー用分離媒体を製造するためのキットである。このキットは、ホモシステインチオラクトン、１以上の誘導体化剤及び１以上のアミンを別々の区画に備え、さらにこれを使用するための説明書を備えている。別の実施形態では、本キットは、既に誘導体化されたホモシステインチオラクトン及び１以上のアミンを別々の区画に備え、さらにこれを使用するための説明書を備えている。
【００４５】
第四の実施形態では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において、両方とも１つの標的分子と相互作用することができる１以上の疎水性基と１以上の別の基を含むという点でマルチモードのリガンドである。相互作用する基に関する詳細は、例えば本方法に関して上述した通りである。特定の実施形態では、本リガンドは、本発明による上記の方法を用いて製造された。
【００４６】
第五の態様では、本発明は、ベースマトリックスに固定化された複数のリガンドを含む分離媒体に関する。この場合、各リガンドは１以上の疎水性基と１以上の別の基を含み、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において両方とも１つの標的分子と相互作用することができる。ベースマトリックス並びにその上へのリガンドの固定化に関する詳細は、例えば本方法に関して上述した通りである。特定の実施形態では、本リガンドは、本発明による上記の方法を用いて製造された。
【００４７】
本発明による分離媒体は、上述の通り、通常の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）においても、或いは逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）として知られる特定の種類の疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいても好適に使用することができる。本分離媒体の大きな利点は、標的と相互作用することができる複数の官能性基を含んでいることである。これはＨＩＣの分野では新規な特徴である。こうした複数の官能性基を設けることによって、改良された吸着が実現し、第一及び第二の相互作用のいずれか或いは両方を選択することによって、その性質を所望通りに選択することができる。
【００４８】
したがって、本方法はマルチモードＨＩＣ媒体の適切な製造を可能にするものであり、これは我々の知る限りでは今まで提案されたことがない。さらに、本方法の普遍性は、マルチモードＨＩＣ媒体のライブラリー作成への容易なアクセスを提供する。これらのライブラリーは、特定のクロマトグラフィー特性で選別する可能性をもたらす。本発明はこうしたライブラリーも包含する。
【００４９】
最後に、本発明は、本発明による媒体を充填したクロマトグラフィーカラムも包含する。カラムは、大規模生産用又はラボスケール、或いは分析目的に好適なものなど、どんな材料及び大きさのものでもよい。特定の実施形態では、本発明によるカラムは、ルアーアダプター、チューブコネクター及びドームナットを備えている。生体分子単離用のキット使用法を記載している説明書と共に、別々の区画にクロマトグラフィーカラム、本明細書に記載のマルチモードリガンドを含む分離媒体及び場合によっては液体を備えたキットも包含される。
【００５０】
さらに、本発明は、目標物質を液体から分離する方法にも関する。この方法は、ベースマトリックスに固定化された複数のリガンドを含む分離媒体を提供する段階であって、各リガンドが１以上の疎水性基と１以上の別の基を含み、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において両方とも１つの標的分子と相互作用することができる段階と、前記媒体を液体と接触させて目標物質をリガンドへ吸着させる段階とを含む。有利な実施形態では、本方法は、標的化合物を分離媒体から脱着させる液体を添加することによって、目標物質を分離媒体から溶出させる段階も含む。目標物質は、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、ウイルス、ＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの核酸、プラスミドなどの生体分子である。上述した目標物質分離用のＨＩＣやＲＰＣなどのクロマトグラフィーの一般原理は当分野で周知であり、当業者は本方法を使用するために必要なパラメータを容易に取り入れることができる。
【００５１】
図１は、本発明に従い且つホモシステインチオラクトンを骨格として使用して、マルチモードＨＩＣ／ＲＰＣ媒体の多様なライブラリーをいかにして製造することができるかをスキーム１によって示した図である。マルチモードＨＩＣリガンドは、２つの合成工程で効率的に製造される。ここでは、初めに骨格のベンゾイル化によってＨＩＣ相互作用が導入される。次いで、任意の適切なアミンによって環構造を開環することによって、追加の相互作用を好都合に導入することができる。こうして得られたマルチモードＨＩＣリガンドはすべてチオール基を含み、その後これを使用して、通常の条件下で活性化されたベースマトリックスにリガンドを固定化することができる。
【００５２】
図２は、以下に述べる先行技術の分離媒体Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いた、４種のタンパク質（ミオグロビン（１）、リボヌクレアーゼＡ（２）、α−ラクトアルブミン（３）及びα−キモトリプシン（４））の比較溶出プロファイルを示す図である。
【００５３】
図３は、以下に述べる本発明によるゲル２を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【００５４】
図４は、以下に述べる本発明によるゲル４ｂを用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【００５５】
図５は、以下に述べる本発明によるゲル７を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【００５６】
図６は、以下に述べる本発明によるゲル９を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【００５７】
図７は、以下に述べる先行技術の分離媒体Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の比較溶出プロファイルを示す図である。
【００５８】
図８は、以下に述べる本発明によるゲル１１を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【００５９】
さらに具体的には、図２から８は、先行技術の分離媒体（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））（上記）、並びに本発明に従って製造されたマルチモードＨＩＣ媒体（下記）を用いた、４種のタンパク質（リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、α−キモトリプシン及びα−ラクトアルブミン）の溶出プロファイルを比較した図を示す。試料を同一条件でカラムに通液し、何れの場合も塩濃度を低下させるリニアグラジエントを用いて溶出を行った。通常のフェニル誘導ＨＩＣ媒体を用いて得られた溶出プロファイルは２つのピークしか示さないが、チオラクトン骨格から本発明に従って製造されたマルチモードリガンドのいくつかは、４種のタンパク質の各々に相当するピークが明瞭に分離されている。
【００６０】
図９は、異なるマルチモード媒体、即ちゲル１、２、４、５、８、１０を用いて得られた溶出プロファイルの差を示す。この一連の媒体では、芳香族置換基によって最初に第一の疎水性相互作用を導入し（スキーム１も参照）、次いでこの中間体を、各々並行してジエチレングリコールアミン（ゲル１０）、フルフリルアミン（ゲル８）、３−（アミノエチル）ピリジン（ゲル５）、チオフェン−２−メチルアミン（ゲル４ａ）、ブチルアミン（ゲル２ａ）、ベンジルアミン（ゲル１）と反応させることによって他の相互作用を得た。デオキシコルチコステロンを同一条件下ですべてのカラムに通液し、何れの場合も有機溶媒の量を上昇させるリニアグラジエントを用いて溶出を行った。デオキシコルチコステロンの溶出において観察された差は、明らかにＲＰＣモードにおける第二の相互作用の影響を強調している。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいずれかの箇所で引用した文献の記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００６２】
Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトンを用いて新しい媒体を生成させる一般的手順
【００６３】
【化３】
0004570052.tif 000004
【００６４】
一般的手順
段階１：
ＤＬ−ホモシステインチオラクトンＩａとｄｉ−イソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液Ａを０℃に冷却した。塩化アシル又はスルホニルクロリド又は酸無水物又は活性酸をＤＣＭ中に含有する溶液Ｂを０℃に冷却し、これを０〜５℃に保持した溶液Ａに滴下した。この混合物を室温で一晩かき混ぜた。減圧下で溶媒を除去した。必要に応じて、得られた生成物を酢酸エチルに溶解し、クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）及び炭酸カリウム溶液（１０重量％の水溶液）で洗浄してもよい。有機相を水洗した後硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで溶媒を蒸発させた。
【００６５】
段階２：
得られた生成物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、１０分間窒素を吹き込んで脱気した。この溶液にＴＨＦに溶かしたアミンを室温で加えた。反応混合物をさらに１７時間かき混ぜた。減圧下で溶媒を蒸発させた後、酢酸エチル及びクエン酸溶液（１０重量％の水溶液）を混合した。有機相を水洗した後硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで溶媒を蒸発させた。
【００６６】
必要な場合には、段階３の前に生成物をＨＰＬＣによって精製する。
【００６７】
段階３：
周知の手段を用いて得られた臭素化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを、段階２で得られた生成物のアルカリ性溶液と混合し、一晩５０℃に温めた。反応後、ゲル（１容量）をろ過し、水（１５容量×２回）、エタノール（１５容量×２回）、０．２Ｍ酢酸（１５容量×２回）及び水（１５容量×２回）で洗浄した。ゲル上のリガンド濃度は、硫黄の元素分析によって測定した。
【００６８】
リガンドの構造及び濃度は以下の表１に要約して示した。
【００６９】
実施例１〜１０
異なる基Ｒ１、Ｒ２及びＲ３を用いた本発明による分離媒体の生成
以下の実施例は、骨格としてＤ，Ｌ−ホモシステインチオラクトンＩａ及び既に説明した化学反応（上記のスキーム１参照）を用いている。ホモシステインチオラクトンＩａを、塩化アシル、スルホニルクロリド、酸無水物又は活性酸と反応させることによってアミド又はスルホンアミドを形成した後、アミンを用いてチオラクトン環の開環を行う。得られた化合物を、さらに活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ又は活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅに結合させる。
【００７０】
表１において、アリル濃度が６６μモル／ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いたゲルの結果をａ）で示し、一方アリル濃度が３１μモル／ｍｌの結果をｂ）で示した。アリル濃度が１１５μモル／ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅを用いたゲルの結果はｃ）で示した。
【００７１】
実施例１
段階１：１１．５ｇ（７５．０ミリモル）のＤＬ−ホモシステインチオラクトン塩酸塩を、１２０ｍｌのＤＣＭ及び１６．１ｍｌ（１５０．０ミリモル）のＤＩＰＥＡに溶解した。この溶液に、ＤＣＭ３０ｍｌに溶かした８．７ｍｌ（７５．０ミリモル）の塩化ベンゾイルを、段階１に従って室温でゆっくり加えた。減圧下で溶媒を除去し、酢酸エチル（３００ｍｌ）を加えた。有機相を、クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）及び炭酸カリウム溶液（１０重量％の水溶液）で洗浄した（１００ｍｌ×２回）。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を蒸発させ、１３．８ｇの白色粉末を回収した。収率：８３％。
【００７２】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．５３３ｍｌ（４．９ミリモル）のベンジルアミンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００７３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００７４】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル１を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【００７５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．３８
（リガンドの計算濃度：２９．１μモル／ｍｌ）。
【００７６】
実施例２ａ
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【００７７】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．４８２ｍｌ（４．９ミリモル）のｎ−ブチルアミンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００７８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００７９】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル２ａを、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【００８０】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：２．４
（リガンドの計算濃度：５３．７μモル／ｍｌ）。
【００８１】
実施例２ｂ
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【００８２】
段階２：段階１で得られた８２．３ｍｇ（０．３７ミリモル）の生成物を５ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．１８４ｍｌ（１．８６ミリモル）のｎ−ブチルアミンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００８３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００８４】
濃度３１μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル２ｂを、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【００８５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．４７
（リガンドの計算濃度：２４．８μモル／ｍｌ）。
【００８６】
実施例３
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【００８７】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．６４６ｍｌ（４．９ミリモル）のｎ−ヘキシルアミンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００８８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００８９】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル３を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【００９０】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．７７
（リガンドの計算濃度：４１．２μモル／ｍｌ）。
【００９１】
実施例４ａ
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【００９２】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．５００ｍｌ（４．９ミリモル）の２−アミノメチルチオフェンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００９３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００９４】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル４ａを、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【００９５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：４．４
（リガンドの計算濃度：５７．０μモル／ｍｌ）。
【００９６】
実施例４ｂ
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【００９７】
段階２：段階１で得られた８２．３ｍｇ（０．３７ミリモル）の生成物を５ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．１９１ｍｌ（１．８６ミリモル）の２−アミノメチルチオフェンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【００９８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【００９９】
濃度３１μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル４ｂを、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１００】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．８７
（リガンドの計算濃度：１８．３μモル／ｍｌ）。
【０１０１】
実施例５
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１０２】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．４９６ｍｌ（４．９ミリモル）の３−（アミノメチル）ピリジンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、この粗材料に酢酸エチル（１０ｍｌ）を加えた。１０％クエン酸溶液（５ｍｌ×２回）を用いて過剰のアミンを抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を減圧下で除去した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１０３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１０４】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル５を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１０５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：２．１
（リガンドの計算濃度：６１．６μモル／ｍｌ）。
【０１０６】
実施例６
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１０７】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．５４１ｍｌ（４．９ミリモル）の１−メチルピペラジンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によってこの粗材料を精製した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１０８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１０９】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル６を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１１０】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：２．２
（リガンドの計算濃度：４６．１μモル／ｍｌ）。
【０１１１】
実施例７
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１１２】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．５９１ｇ（４．９ミリモル）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩と３．７６ｍｌのＤＩＰＥＡを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によってこの粗材料を精製した。無色の油状固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１１３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１１４】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル７を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１１５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．３０
（リガンドの計算濃度：２１．９μモル／ｍｌ）。
【０１１６】
実施例８
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１１７】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．４３１ｍｌ（４．９ミリモル）のフルフリルアミンを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によってこの粗材料を精製した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１１８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１１９】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル８を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１２０】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：２．６５
（リガンドの計算濃度：５５．３μモル／ｍｌ）。
【０１２１】
実施例９
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１２２】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．８１７ｇ（４．９ミリモル）のＧＬＹ−ＧＬＹアミド塩酸塩と４．７６ｍｌのＤＩＰＥＡを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によってこの粗材料を精製した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１２３】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１２４】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル９を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１２５】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：０．９７
（リガンドの計算濃度：１７．１μモル／ｍｌ）。
【０１２６】
実施例１０
段階１：実施例１−段階１に記載のものと同じ手順。
【０１２７】
段階２：段階１で得られた２２０ｍｇ（０．９８ミリモル）の生成物を７ｍｌのＴＨＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、０．４８９ｍｌ（４．９ミリモル）の（２アミノエトキシ）エタノールを加え、この混合物を室温で１６時間かき混ぜた。溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によってこの粗材料を精製した。白色固体を回収した。純度はＬＣ−ＭＳによって求めた（＞９０％）。
【０１２８】
段階３：段階２からの生成物をＴＨＦ５ｍｌに溶解した。このリガンド溶液に、１ｍｌの水と２ｍｌの５０％ＮａＯＨをさらに加えた。
【０１２９】
濃度６５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンドに加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル１０を、ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、水、０．２Ｍ酢酸で洗浄した。
【０１３０】
乾燥ゲルの元素分析：Ｓ％：１．９６
（リガンドの計算濃度：４２．８μモル／ｍｌ）。
【０１３１】
実施例１１
段階１：１０．０ｇ（６５．０ミリモル）のＤＬ−ホモシステインチオラクトン塩酸塩を、１２０ｍｌのＤＣＭ及び２３．９ｍｌ（１３６ミリモル）のＤＩＰＥＡに溶解した。この溶液に、ＤＣＭ３０ｍｌに溶かした７．７ｍｌ（６５．０ミリモル）のバレリルクロリドを、段階１に従って室温でゆっくり加えた。減圧下で溶媒を除去し、酢酸エチル（４００ｍｌ）を加えた。有機相を、クエン酸溶液（１０重量％の水溶液）及び炭酸カリウム溶液（１０重量％の水溶液）で洗浄した（１００ｍｌ×２回）。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した後溶媒を蒸発させ、８．８６ｇの白色粉末を回収した。収率：６８％。
【０１３２】
段階２：段階１で得られた２．０ｇ（９．９ミリモル）の生成物を３０ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。これを脱気した溶液（１０分間窒素吹き込み）に、３．０ｇ（２４．８ミリモル）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを加え、この混合物を９０℃で４時間かき混ぜた。溶媒を除去し、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ：９／１から始めてフラッシュクロマトグラフィーを行い、２．７ｇの白色固体を得た。収率：８４％。
【０１３３】
段階３：段階２からの生成物７８．２ｍｇを、２．５ｍｌの水と２．５ｍｌの５０％ＮａＯＨに溶解し、この溶液を室温で１時間かき混ぜた。
【０１３４】
濃度１１５μモル／ｍｌゲルのアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ６ｍｌを、臭素を用いて活性化しこのリガンド溶液に加えた。反応混合物を５０℃で一晩振盪した。次いでこのゲル１１を、水、エタノール、０．２Ｍ酢酸及び水で順次洗浄した。
【０１３５】
乾燥ゲルの元素分析によりＳ百分率を得た。リガンドの計算濃度をμモル／ｍｌで求めた。
【０１３６】
【表１】
0004570052.tif 000005
【０１３７】
【表２】
0004570052.tif 000006
【０１３８】
ＰＲＣ試験用基準実験方法
クロマトグラフィー系
すべての実験は、ソフトウェアＵｎｉｃｏｒｎ  ３．１を備えたＡＫＴＡ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００クロマトグラフィー系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用して室温で行った。
【０１３９】
試験１：デオキシコルチコステロン
注入体積：１０μｌ（５ｍＭデオキシコルチコステロンのメタノール溶液）
流速：１．０ｍｌ／分
溶出液Ａ：１０ｍＭリン酸アンモニウムのＭＱ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水溶液、ｐＨ７
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出：リニアグラジエント（０〜８０％Ｂ）
グラジエント条件：カラム平衡＝１０カラム体積（ＣＶ）、グラジエント体積＝２０ＣＶ及び８０％Ｂを用いてカラムを洗浄（グラジエント後）＝２ＣＶ
検出波長：２０５、２３６，及び２８０ｎｍ
試験２：ペプチドの分離
４つの異なるｐＨ値、ｐＨ２、３、７及び１２で４種のアンギオテンシン誘導体の混合物を分離することによってクロマトグラフィー評価を行った。
アンギオテンシン−Ｉ  Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ  （Ｓｉｇｍａ  Ａ９６５０）
アンギオテンシン−ＩＩＩ  Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＩＣＮ  １９１２３７）
Ｉｌｅ７−アンギオテンシン−ＩＩＩ  Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａ０９１１）
Ｖａｌ４アンギオテンシン−ＩＩＩ  Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａ６２７７）
注入体積：１０μｌ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で製造した試料混合物中、各ペプチド０．１２５ｍｇ／ｍｌ）
流速：１．０ｍｌ／分
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡのＭＱ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水溶液（ｐＨ２）、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ３及び７）
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出：リニアグラジエント（３〜１００％Ｂ）
グラジエント条件：カラム平衡＝５カラム体積（ＣＶ）、グラジエント体積＝１０ＣＶ及び１００％Ｂを用いてカラムを洗浄（グラジエント後）＝２ＣＶ
検出波長：２１５ｎｍ
この場合のカラム体積は２．４９ｍｌである（この方法は鋼製カラムＳＴ４．５／１５０用に開発された）。
【０１４０】
ＨＩＣ試験用基準実験方法
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ製の５／５ＨＲカラムに充填したゲル１〜２ｍｌを１ｍｌ／分で運転する。本方法では、２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋０．１Ｍリン酸Ｋの緩衝液Ａ（ｐＨ７）及び０．１Ｍリン酸Ｋの別の緩衝液Ｂ（ｐＨ７）を使用する。ミオグロビン０．５ｍｇ／ｍｌ、リボヌクレアーゼＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、α−キモトリプシノゲンＡ（０．８ｍｇ／ｍｌ）及びα−ラクトアルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）の４種のタンパク質を緩衝液Ａに混ぜてカラムに通液する。次いでカラムを２ｍｌの緩衝液Ａで運転し、次いでＡ１００％からＢ１００％へ変化する２０ｍｌのグラジエント溶出を適用した。
【０１４１】
基準ゲルＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのクロマトグラムを図２に、基準ゲルＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅのクロマトグラムを図７に示した。
【０１４２】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗベースマトリックスを用いて作製したゲル２ｂ、４ｂ、７及び９のクロマトグラムを、各々図３、４、５及び６に示した。これら４つのゲルは上記のＨＩＣ試験条件下で作用し、異なる溶出プロファイルを示す。
【０１４３】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅベースマトリックスを用いて作製したゲル１１のクロマトグラムを、図８に示した。このゲルは上記のＨＩＣ試験条件下で作用する。
【０１４４】
クロマトグラムの符号：
１：ミオグロビン
２：リボヌクレアーゼＡ
３：α−ラクトアルブミン
４：α−キモトリプシン
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明に従い且つホモシステインチオラクトンを骨格として使用して、マルチモードＨＩＣ／ＲＰＣ媒体の多様なライブラリーをいかにして製造することができるかをスキーム１によって示した図である。
【図２】以下に述べる先行技術の分離媒体Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いた、４種のタンパク質（ミオグロビン（１）、リボヌクレアーゼＡ（２）、α−ラクトアルブミン（３）及びα−キモトリプシン（４））の比較溶出プロファイルを示す図である。
【図３】以下に述べる本発明によるゲル２を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【図４】以下に述べる本発明によるゲル４ｂを用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【図５】以下に述べる本発明によるゲル７を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【図６】以下に述べる本発明によるゲル９を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【図７】以下に述べる先行技術の分離媒体Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ））を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の比較溶出プロファイルを示す図である。
【図８】以下に述べる本発明によるゲル１１を用いた、４種のタンパク質（図２で定義したもの）の溶出プロファイルを示す図である。
【図９】異なるマルチモード媒体を用いて得られた溶出プロファイルの差を示し、且つＲＰＣモードにおいて第二の相互作用の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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