(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
冬眠心筋の治療のための薬剤組成物であってGLP-1(7-36)アミドの治療有効量を含有してなることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２】
前記冬眠心筋が更に虚血性心筋症を伴うものである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記冬眠心筋が更にうっ血性心不全を伴うものである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
虚血性心筋症の治療のための薬剤組成物であってGLP-1(7-36)アミドの治療有効量を含有してなることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項５】
糖尿病性心筋症の治療のための薬剤組成物であってGLP-1(7-36)アミドの治療有効量を含有してなることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項６】
前記治療有効量が血漿又は心臓のノルエピネフリンレベルを減少させるのに有効なものである請求項１ないし５のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項７】
更に、カルベヂオール、ＡＣＥ抑制剤、ニトレート、ヒドラジン、ビソプロロール、又はこれらの組合せを含むものである請求項１ないし５のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項８】
連続投与用に調剤されている請求項１ないし７のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項９】
非経口投与用に調剤されている請求項１ないし７のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
静脈注射、皮下注射、微小圧注射、外部ポンプ、インプラントポンプ、デポット注射、経皮、経膜、経口又は経肺投与用に調剤されている請求項１ないし７のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
０．１pmol/kg/minないし１０pmol/kg/minの用量で静脈内投与用に調剤されている請求項１ないし５のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
０．５pmol/kg/minないし５０pmol/kg/minの用量で皮下投与用に調剤されている請求項１ないし５のいずれかに記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、アメリカ特許仮出願第６０／２４１，８３４号（２０００年１０月２０日出願）、同第６０／２４２，１３９号（２０００年１０月２３日出願）及び同第６０／２４５，２３４号（２０００年１１月３日出願）の優先権を主張し、これらを組み込むものである。
（発明の背景）
心不全は、依然として主たる健康上の問題となっている。米国の人口において約四百万人もの人が心不全を有している。着実な高齢化と共に、毎年、40万人もの人が心不全の始まりを経験しており、5年死亡率は５０％に近づいている。
この心不全は単一の病的存在と言うよりは、心臓の効果的機械的作動の根本的異常を反映する多数の異なる病因を伴った臨床上の症候群であり、従って心臓が人体の要求を満足させることができないものと定義することができる。心不全には種々の形態のものがある。例えば、「前方」および「後方」心不全である。後方心不全はうっ血性心不全と同じであり、これは脈圧の増加（すなわち、血液を心臓に戻す静脈内の圧力増加）によるもので、これは心臓がその内容物を正常に排出することができないことからもたらされ、肺うっ血および全身性うっ血につながる。これと対照的に、前方心不全は心臓が正常な組織灌流を維持できないことからもたらされ、疲労、虚弱、体重減少、脳機能障害などにつながる。
【０００２】
冬眠心筋：
「冬眠心筋」は前方心不全の可なりの部分を構成するもので、肺うっ血又は全身性うっ血を伴うこともあり、伴わないこともある。この病状は、慢性的非重度の虚血（血液供給減少から生じる低酸素症）の結果として、局所的心筋機能低下を反映するものである。虚血の程度は壊死（梗塞）を生じさせるのに十分ではないが、心筋への酸素添加、燃料供給を局所的に制限し、心筋の一部が活動低下又は休止する。冬眠筋細胞は生き続けるが、心臓のポンプ作用には寄与しない。心筋損傷の重度は冬眠の期間に依存する。最終的には、その損傷は不可逆的となり、心筋機能不全の程度が心臓能力を妥協させ、心拍出量を減少させるのに十分なものとなったとき、心不全を発病させる。すなわち、虚血性心筋症は、冬眠心筋が適当に治療されない限り、冬眠心筋の究極的結果として現れる。
【０００３】
伝統的に、冬眠心筋は冠状動脈バイパス手術又は血管形成術による外科的血管再生術により治療されてきた。しかし、手術の煩わしさおよびこれら技術と関係する死亡発生又は再狭窄などにより、補足的又は他の薬理学的介入に対する必要性が強く望まれている[例えば、Fath-Ordoubadi等、Heart  82:210-216（1999）および、Pagano等、Curr. Opin. Cardiol.  14:506-509（1999）]。効果的な薬理学的介入は、外科手術が禁忌の場合、例えば冬眠心筋が軽度の場合、患者の病状が外科手術に耐えられない程度に重症と思われる場合などには特に有用である。
【０００４】
うっ血性心不全は最初に、心筋収縮性を増大させる血管拡張神経薬および筋変力剤を用いて薬理学的に治療された（WO  99/40788参照）。これらの薬剤は短期間では血行動態を改善させるが、最近の研究では改善された血行動態と臨床結果との間に相違があることが見出された。事実、うっ血性心不全に関連する死亡の唯一の危険要因はカテコラミン・ノルエピネフリンの血漿レベルである[Cohn等、“慢性うっ血性心不全の患者を経過予測するためのガイドとしての血漿ノルエピネフリン”、N. Engl. J. Med.  311：819-823（1984）；  Lahiri等、J. Cardio. Pharm. 33 (Suppl. 3): S9-S16（1999）参照]。従って、うっ血性心不全の場合、筋変力剤の長期間の投与は禁忌である。うっ血性心不全を治療するのに最も有用な化合物は、血管拡張作用があるACE抑制剤と、抗アドレナリン作用を示すカルベディロールのような多機能性β-ブロッカーであることが証明された[Lahiri等、（1999）参照]。
【０００５】
うっ血性心不全と同様に、筋変力剤の投与は冬眠心筋に関連する虚血症を悪化させるという証明がある。或る研究では、筋変力性ドブタミンを用い、低レベルで治療した場合、冬眠心筋において心筋機能が増大したが、ドブタミンを高レベルで使用した場合、心筋要求が、虚血閾値を超える点まで増大することを示している[Senioer等、“低および高投与量のドブタミン輸液の間における、心臓壁厚増大の「二期」応答を利用したドブタミン応力超音波心臓造影による心筋虚血症の検出強化”、 J. Am. Coll.Cardiol.  26：26-32（1995）参照]。この研究ならびに類似した研究により、ドブタミンの短期の血行動態についての利益にも拘らず、筋変力剤の死亡率に対する長期の利益については疑問が投げかけられている。特に、心筋要求の更なる増加は冬眠心筋に関係する虚血を高め、壊死およびアポトーシスを悪化させることが提案されている[Lahiri等、（1999）参照]。
【０００６】
従って、冬眠心筋については筋変力剤も禁忌されること、および冬眠心筋はうっ血性心不全の治療に使用されているものと同様の非変力剤又は抗アドレナリン製剤を用いて治療されるべきことが示唆されている。このうっ血性心不全から類推して、ノルエピネフリンと同様に、カテコラミンの高血漿レベルは冬眠心筋の臨床結果についても、その変力特性のために有害であることが示唆されている[Lahiri等、（1999）参照]。
冬眠心筋の長期治療について限られた効能を有する薬剤はほんの僅かしか知られていないことから、冬眠細胞を活性化させる能力を有する新規な治療薬についての必要性が強く求められている。特に、カテコラミンの血漿レベルを減少させることができる薬剤の必要性が強く求められている。
【０００７】
糖尿病性心筋症：
糖尿病の患者は糖尿病性心筋症（DCM）を発達させる危険性が大きい。この病気の正確な病因については、糖尿病に関係する多数の心筋異常があるためなどからして、依然として議論の余地がある。しかし、DCMは冠状アテローム性動脈硬化の欠乏の際に発生する可逆的心筋症として明確に定義されている[Bell、Diabetes Care, 18: 708-714（1995）参照]。DCMは虚血症に一部起因する心筋繊維症により特徴づけられる［同上］。糖尿病の特徴である高血圧も繊維症を悪化させ、DCMが重症になり、致命的になることもある。
【０００８】
この高血圧は少なくとも一部は交感神経系の異常な活性化によるものである[Pallab等、Am. J. Physiol. 252:  E734-739]。この異常活性化の兆候として心臓におけるノルエピネフリンレベルの増加と、心臓による代謝異常を挙げることができる。ノルエピネフリンのようなカテコラミンの心臓又は循環系における高レベルはDCMの発展をもたらす。これに伴う心筋損傷は一部、ノルエピネフリンの酸化分解生成物によりもたらされると信じられている［同上］。従って、糖尿病患者のための理想的抗高血圧剤は、高血糖症又は低血糖症を悪化させることなく交感神経系の活性化を減少させるものであると言うことができる。しかし、現時点では、そのような特徴を与える化合物は殆ど見当たらない。
【０００９】
（発明の概要）
GLP-1の投与がノルエピネフリンの血漿レベルを抑制することが意外にも見出された。このうっ血性心不全から類推して、ノルエピネフリンの血漿レベルの減少は冬眠心筋の虚血性ストレスを和らげ、それにより臨床結果を改善することが予測される。従って、GLP-1の投与は、それ単独、若しくは現存の治療養生法と関連させた形で、冬眠心筋の治療方法として有用である。同様に、GLP-1は、糖尿病性心筋症の発展に関係する心臓および/又は血漿におけるノルエピネフリンレベルを減少させるのに有用である。
GLP-1は、冬眠心筋又は糖尿病性心筋症の治療方法において、ノルエピネフリンレベルを減少させる。従って、冬眠心筋又は糖尿病性心筋症の治療方法は、GLP-1分子の治療有効量を患者に投与することからなる。GLP-1分子はうっ血性心不全又は虚血性心筋症を患っている患者、特に更に冬眠心筋を有する患者に対しその治療有効量を投与してもよい。GLP-1分子の治療有効量は、血漿および/又は心臓におけるノルエピネフリンレベルを減少させる。GLP-1分子は静脈注射又は皮下注射により投与することが好ましい。前者の方法はGLP-1分子による急性治療に適し、後者の方法は慢性治療法として好ましい。
本発明において、GLP-1分子の好ましい例はGLP-1(7-36)アミド、GLP-1(7-3７)アミドおよびエクセンジン（exendin）-4である。GLP-1分子にはGLP-1レセプターと特異的に結合し、活性化させる分子が含まれる。
【００１０】
（発明の具体的説明）
本発明は冬眠心筋（HM）の治療のための新規な方法および組成物を提供するものである。特に、本発明は、GLP-1分子の治療有効量を患者に投与することからなるHMを患っている患者の治療方法を提供することを含む。本発明者は、HMを患っている哺乳動物において、GLP-1分子を投与することにより、非投与動物と比較して心臓機能の急速な回復がもたらされることを意外にも見出したものである。この発見は、治療哺乳動物におけるノルエピネフリンの血漿レベルの意外な減少にも関係する。
【００１１】
本明細書で、「うっ血性心不全（CHF）」とは、心臓がその内容物を正常に排出することができないことからもたらされる脈圧の増加により特徴づけられる病状を表すものであって、これは肺うっ血および全身性うっ血につながる。CHFの患者の心筋はポンプとしての作用が減少している。CHFは循環系および神経液の変化を伴い、その結果、十分な血液および酸素供給を末梢組織および生命維持器官に対し行うことができない。
「冬眠心筋」とは、灌流減少により機能が損傷した生活能力のある心筋を意味する。HM は細胞の完全性を維持しているが、収縮のための高エネルギー要求を維持することができない。HMは傷形成による不可逆的心筋損傷である梗塞心筋とは区別され、更に、灌流の正常化にも拘らず収縮性機能不全を示す気絶（stunned）心筋とは区別される[Jadvar等、Radio Graphics, 19: 915-926（1999）参照]。
【００１２】
臨床上、HMはドブタミン応力超音波心臓造影法を使用することにより検出することができる[Shan等、In Cardiology Clinics、G. Aurigemma. ed., W.B. Saunders Co.,フィラデルフィア. Vol. 17、 No.3,  539-553（1999）参照]。HMは更に、心臓の陽電子放射断層撮影法（PET）により検出することができ、これは単一光子放射断層撮影法（SPECT）よりも正確である。２−（フッ素-18）フルオロ-2-デオキシ-D-グルコースを用いたPETは、血管再生後に生活力のある冬眠心筋を識別するための地域的又は左心室の機能を判定する評価の基準と考えられている。応力磁気共鳴映像法は冬眠心筋症を更に診断し、その病気を他の心筋病状を区別するのに使用されてきた。HMは左心室（LV）機能の低下により特徴づけられ、不可逆的機能不全又は傷跡と関係する顕著な機能低下と比較して穏やかである。心室の収縮期の壁厚（SWT）の程度も心筋冬眠の特徴である。SWTは、正常、不可逆的損傷又は傷付いた心筋と比較して、休息時には著しく減少し、SWT機能不全はストレス下では顕著に改善する[Sensky等、Radiology, 215: 608-614参照]。
【００１３】
「糖尿病性心筋症（DCM）」は、冠状アテローム性動脈硬化の欠乏の際に発生する糖尿病における可逆的心筋症として定義されている[Bell、Diabetes Care, 18: 708-714（1995）; Fein、Diabetes Care, 13: 1169-1179（1990）参照]。DCMは心筋肥大および繊維症により特徴づけられる。微小血管疾患も存在し、或る場合には、うっ血性および制限的心筋症の双方が存在することもある。
【００１４】
以下の実施例で使用された「ペーストドッグ」モデルは、HMを研究するためのシステムを提供する。なぜならば、心臓の応答能力を超えて心臓が働き、それによりエネルギーが制限される状況が生じるからである。他の適当な動物モデルも、例えばイヌおよびブタにおいて慢性的機能不全生活性心筋を研究するために利用することができ、これらは治療法について実験室での研究を可能にする。例えば、ブタにおける固定LAD（左前方降下動脈）狭窄モデルでは、心筋灌流減少による心不全が実証され、これは梗塞のないHM症のヒトに類推させることができる[Canty等、Am. J. Physiol. 277: H417-H422(1999)参照]。糖尿病のイヌ、マウス、ラットなどの類似した動物モデルがDCMの研究に利用することができる[Bell(1995)；Fein(1990)参照]。
【００１５】
「GLP-1分子」には以下のものが含まれる。哺乳類GLPペプチドおよびグルカゴンは同一の遺伝子で符号化される。回腸において、表現型はGLPペプチドホルモンの2つの主たる類、すなわち、GLP-1およびGLP-2に処理される。GLP-1（1-37）は配列、His  Asp  Glu  Phe  Glu  Arg  His  Ala  Glu  Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg  Gly  （配列ID No.1）を有する。GLP-1（1-37）は翻訳後処理によりアミド化されGLP-1（1-36）NH２を生じ、これは配列、His  Asp  Glu  Phe  Glu  Arg  His  Ala  Glu  Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg（NH２）（配列ID No.2）を有する。或いは、GLP-1（1-37）は酵素的に処理されてGLP-1（7-37）を生じ、これは配列、His  Ala  Glu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg  Gly（配列ID No.3）を有する。GLP-1（7-37）もアミド化されGLP-1（7-36）アミドを生じ、これはGLP-1分子の自然型であり、配列、His  Ala  Glu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg（NH２）（配列ID No.4）を有する。同様に、GLP-1（1-36）（NH２）も処理することによりGLP-1（7-36）（NH２）とすることができる。
【００１６】
腸管L細胞はGLP-1（7-37）（配列ID No.3）およびGLP-1（7-36）（NH２）（配列ID No.4）をそれぞれ1対５の割合で分泌する。これらのGLP-1の切頭型は自然位での半減期は短く、すなわち、10分未満であり、アミノジペプチダーゼIVにより不活性化されGlu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg  Gly（配列ID No.5）およびGlu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg（NH２）（配列ID No.6）をそれぞれ生じさせる。これらペプチドGlu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg  Gly（配列ID No.5）およびGlu   Gly  Thr  Phe  Thr  Ser  Asp  Val  Ser  Ser  Tyr  Leu  Glu  Gly  Gln  Ala  Ala  Lys  Glu  Phe  Ile  Ala  Trp  Leu  Val  Lys  Gly  Arg（NH２）（配列ID No.6）は肝臓グルコース生産に影響を及ぼすことが推測されているが、すい臓からのインシュリンの生産又は放出を刺激することはない。
【００１７】
本明細書において、「GLP-1分子」の用語は、GLP-1（1-37）、GLP-1（1-36）NH２、GLP-1（7-37）、GLP-1（7-36）NH２、（GLP-1（7-36）アミド）（これらを「GLP-1ペプチド」と総称する）。本発明は組換えヒトGLP-1ペプチドおよび他の種から得られるGLP-1ペプチド（組換え又は合成）の使用を含む。
「GLP-1分子」は、更にGLP-1ペプチドの生物学的に活性の変異体、類似体および誘導体を表示するものである。この場合の「生物学的に活性」とは、GLP-1（7-36）生物学的活性を有することを意味するが、この変異体の活性が天然のGLP-1（7-36）アミドよりも小さい場合および大きい場合でもよいと理解されるべきである。GLP-1（7-36）アミドはGLP-1の天然の生物学的活性型である[Goke等、Diabetic Medicine, 13: 854-860（1996）参照]。本発明のGLP-1分子は、GLP-1の作動物質を発現するポリヌクレオチドを含む。すなわち、GLP-1レセプター分子の活性体および、とりわけインシュリン生産β-細胞に見られる二次メッセンジャー活性を発現するものを含む。同じく、β-細胞におけるGLP-1レセプターの作動物質であるGLP-1擬似体は、GLP-1レセプターを活性化させるべく特に設計された化合物を例えば含む。
【００１８】
GLP-1分子の生物学的活性は、当業者に公知のように、in vitroにより、更にin vivoで動物モデルおよびヒトを用いた試験により判定することができる。GLP-1分子としては、ペプチド、ペプチド擬似体、あるいは他の分子であっても、それがGLP-1レセプター（例えばGLP-1（7-36）アミドレセプターおよびその二次メッセンジャーカスケード）に結合する、あるいはこれを活性化する任意の分子が含まれる。GLP-1レセプターは細胞表面たんぱく質であって、例えば、インシュリン生産すい臓β-細胞に見られるものである。GLP-1（7-36）レセプターの特徴は公知である。薬品又はペプチドが、GLP-1レセプターに対し結合ないし活性化するか否かの判定方法は当業者に公知のものであり、これは結合化学ライブラリーおよび高スループット・スクリーニング法の助けを借りて行うことが好ましい。GLP-1分子には、向インシュリン活性を有する種（species）が含まれ、これら種はGLP-1レセプター分子の作動物質であり、とりわけ、インシュリン生産β-細胞に対し二次メッセンジャー活性を有する種が含まれる。
【００１９】
GLP-1の生物学的活性は標準的方法で判定することができる。つまり、一般に、レセプター結合活性スクリーニング手法により行われ、これには表面にGLP-1レセプターを発現する適当な細胞、例えば、RINmSF細胞又はINS-1細胞のようなインスリノーマ細胞ラインが使用される[Mosjor、Int. J. Peptide Res., 40: 333-343（1992）およびEP 708170参照]。GLP-1レセプターを発現するよう作成された細胞も使用することができる。放射免疫定量法を用いて膜に対するトレーサーの特異的結合を測定することに加えて、ｃAMP活性又はグルコース依存インシュリン生産も測定することができる。1つの方法として、本発明のレセプターを符号化するポリヌクレオチドを用い、細胞を感染させ、それによりGLP-1レセプターたんぱく質を発現させる。従って、例えば、これらの方法を用い、このような細胞を選別されるべき化合物と接触させることによりレセプター作動物質について選別を行い、その化合物がレセプターを活性化させ、信号を発生させるか否かを判定する。
【００２０】
多クローン性および単クローン性抗体を利用して、本明細書に記載の方法に使用するため、GLP-1様ペプチドを検出し、精製し、識別することができる。ABGA1178のような抗体は、完全な、継ぎ合わせていないGLP-1（1-37）、又はN-末端切頭GLP-1（7-37）又は（7-36）アミドを検出することができる。他の抗体は、先駆体分子のＣ-末端の先端を検出し、それにより減法によって生物学的に活性の切頭ペプチド、例えばGLP-1（（7-37）アミドの量を計算することができる[Orskov等、Diabetes, 42: 658-661（1993）; Orskov等、Ｊ. Clin. Invest., 87: 415-423（1991）参照]。
他の選別法として、GLP-1レセプターを発現する細胞、例えば感染CHO細胞を使用する方法があり、これは細胞外ｐH又はレセプター活性化によるイオン変化を測定するシステムに使用することができる。例えば、潜在的作動物質をGLP-1たんぱく質レセプターを発現する細胞と接触させ、二次メッセンジャー応答、例えば信号変換、イオン又はｐH変化を測定し、潜在的作動物質が有効か否かを判定する。
【００２１】
GLP-1（（7-36）アミドレセプターを介して活性を示すグルカゴン様ペプチドの作動物質については、以下の文献に示されている。すなわち、EP 0708179;  Hjorth等、J. Biol. Chem., 269(48): 30121-30124（1994）; Siegel等、Amer. Diabetes Assoc., 57th Scientific Sessions, Boston (1997); Hareter等、Amer. Diabetes Assoc., 57th Scientific Sessions, Boston (1997); Adelhorst等、J. Biol. Chem., 269(9): 6275-6278（1994）; Deacon等、16thInternational Diabetes Federation Congress Abstracts, Diabetologia Supplement (1996);  Irwin等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 7915-7920（1997）;  Mosjov、Int. J. Peptide Protein. Res. 40: 333-343（1992）。更に、Goke等、Diabetic Medicine, 13: 854-860（1996）参照のこと。最近の文献には、Black  Widow  GLP-1およびSer２GLP-1が開示されている[Holz等、Comparative Biolochemistry and Physiology, Part B, 121: 177-184（1998）およびRitzel等、A synthetic glucagons-like peptide-1 analog with improved plasma stability, J. Endocrinol., 159（1）: 93-102（1998）参照]。
【００２２】
「GLP-1分子」には、本明細書に定義する生物学的活性GLP-1変異体を発現するポリヌクレオチドにより符号化されるペプチドが含まれる。更に、本発明で含まれるものは、GLP-1（7-36）アミドと比較して、1又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は削除を含むペプチドであるところのGLP-1分子である。1例として、アミノ酸置換、付加又は削除の数は、30アミノ酸又はそれ以下、25アミノ酸又はそれ以下、20アミノ酸又はそれ以下、15アミノ酸又はそれ以下、10アミノ酸又はそれ以下、5アミノ酸又はそれ以下、或いは、これらの数の中間の任意の整数である。本発明の１つの態様において、上記置換には1以上の保守的置換が含まれる。この「保守的」置換とは、アミノ酸残基が他の生物学的に活性の同様の残基により置換されていることを示すものである。この保守的置換の例として、疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンを他のものと置換するもの、１つの極性残基を他のものと置換するもの、例えばアルギニンをリシンと置換するもの、グルタミン酸をアスパラギン酸と置換するもの、グルタミンをアスパラギンと置換するものなどである。以下の表は保守的アミノ酸置換を説明するものであるが、これに制限されるものでない。
【００２３】
当初の残基              置換基の例
ＡＬＡ                  ＳＥＲ，ＴＨＲ
ＡＲＧ                  ＬＹＳ
ＡＳＮ                  ＨＩＳ，ＳＥＲ
ＡＳＰ                  ＧＬＵ，ＡＳＮ
ＣＹＳ                  ＳＥＲ
ＧＬＮ                  ＡＳＮ，ＨＩＳ
ＧＬＵ                  ＡＳＰ，ＧＬＵ
ＧＬＹ                  ＡＬＡ，ＳＥＲ
ＨＩＳ                  ＡＳＮ，ＧＬＮ
ＩＬＥ                  ＬＥＵ，ＶＡＬ，ＴＨＲ
ＬＥＵ                  ＩＬＥ，ＶＡＬ
ＬＹＳ                  ＡＲＧ，ＧＬＮ，ＧＬＵ，ＴＨＲ
ＭＥＴ                  ＬＥＵ，ＩＬＥ，ＶＡＬ
ＰＨＥ                  ＬＥＵ，ＴＹＲ
ＳＥＲ                  ＴＨＲ，ＡＬＡ，ＡＳＮ
ＴＨＲ                  ＳＥＲ，ＡＬＡ
ＴＲＰ                  ＡＲＧ，ＳＥＲ
ＴＹＲ                  ＰＨＥ
ＶＡＬ                  ＩＬＥ，ＬＥＵ，ＡＬＡ
ＰＲＯ                  ＡＬＡ
【００２４】
GLP-1ペプチド変異体には、上記ペプチドの化学的誘導体、変異体が含まれると理解されるべきである。例えば、非天然のアミノ酸残基を有するペプチド（例えば、タウリン残基、ベータおよびガンマアミノ酸残基、D-アミノ酸残基）、C-末端官能基変性体、例えばアミド、エステルおよびC-末端ケトン変性体およびN-末端官能基変性体、例えば、アシル化アミン、シッフ塩基、環化体、例えばアミノ酸ピログルタミン酸などが挙げられる。
【００２５】
更に、本発明に含まれるものとして、（１）上記配列ID No. 1, 2, 3, 4および（２）これらの切頭配列に対し、50％以上の配列同一性を有するペプチド配列、より好ましくは90％以上の配列同一性を有するペプチド配列を挙げることができる。なお、ここで配列同一性とは、周知の標準アルゴリズムを用いて２つの分子間の比較を指すものである。本発明において配列同一性を計算するための好ましいアルゴリズムはスミス-ウォーターマンアルゴリズムであり、その場合、上記配列ID No. 1が参照配列として用いられ、ポリヌクレオチド相同物の百分率同一性をその全長に亘って明確にする。適合、不適合、挿入又は削除についてのパラメータ値の選択は、或るパラメータ値が他のものよりも生物学的により現実的結果を生じさせるものであったとしても、それは任意である。スミス-ウォーターマンアルゴリズムについてのパラメータ値の好ましいセットは「最大類似区分（similarity segments）」アプローチに示されており、この場合、適合した残基については、1の値が、非適合の残基については、1/3の値が用いられる[この残基は単一のヌクレオチド又は単一のアミノ酸であってもよい（Waterman, Bulletin of Mathematical Biology, 46:473-500(1984)）]。挿入および削除（indels）、xは以下のように重みが付けられている。
ｘｋ  ＝  １＋ｋ／３
ここで、ｋは与えられた挿入又は削除(Id)における残基の数である。
例えば、18個のアミノ酸置換と、3個のアミノ酸挿入を除いて、上記配列ID No. 1の42個のアミノ酸残基配列に対し同一性がある場合、百分率同一性は以下の式により与えられる。
[(1x42適合)  (1／3x18不適合)−（１＋3/3indels）]/42 ＝ 81%同一性
【００２６】
本発明の「GLP-1分子」には、アメリカドクトカゲの毒液中の6個のペプチドが含まれ、これらはGLP-1に対し同族体である。これらの配列が表１にGLP-1の配列と比較して示されている。
【００２７】
【表１】
位置１
a.  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（ＮＨ２）
b.  ＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＮＨ２）
c.                  ＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＮＨ２）
d.  ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＮＨ２）
e.  ＨＳＤＡＴＦＴＡＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＥＳＩＬＧＳＳＴＳＰＲＰＰＳＳ
f.  ＨＳＤＡＴＦＴＡＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＥＳＩＬＧＳＳＴＳＰＲＰＰＳ
g.  ＨＳＤＡＩＦＴＥＥＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＡＳＩＬＧＳＲＴＳＰＰＰ（ＮＨ２）
h.  ＨＳＤＡＩＦＴＱＱＹＳＫＬＬＡＫＬＡＬＱＫＹＬＡＳＩＬＧＳＲＴＳＰＰＰ（ＮＨ２）
a = GLP-1(7-36)アミド（配列ID  No.4）
ｂ = イクセンジン（Exendin）３（配列ID  No.７）
ｃ = イクセンジン４（９−３９（NH2（配列ID  No.8）
d = イクセンジン４（配列ID  No.9）
e = へロスペクチン（Helospectin）I（配列ID  No.10）
ｆ = へロスペクチンII（配列ID  No.11）
ｇ = へロデルミン（Helodermin）（配列ID  No.12）
ｈ = Q８Q９へロデルミン（配列ID  No.13）
【００２８】
ペプチド（a, b, d, e, f およびｇ）は、位置１，７，１１および１８において一致する。GLP-1およびイクセンジン（Exendin）は更に、位置４，５，６，８，９，１５，２２，２３，２５，２６および２９において一致する。位置２において、Ａ,Ｓ およびＧは構造的に類似する。位置３において、残基Ｄ およびＥ（ＡｓｐおよびＧｌｕ）は構造的に類似する。位置２２および２３において、Ｆ（Ｐｈｅ） およびＩ（Ｉｌｅ）は構造的にＹ（Ｔｙｒ） およびＬ（Ｌｅｕ）に類似する。同様に、位置２６において、Ｌ およびＩは構造的に同一である。
従って、GLP-1の残基３０のうち、イクセンジン３および４は１５個の位置で同一であり、別の５個の位置で等価である。根本的に構造の明らかに異なる唯一の位置は、残基１６,１７，１９，２１，２４，２７，２８および３０である。イクセンジンは更に９個の余分の残基をカルボキシル末端に有している。
【００２９】
ペプチドからなる本発明のGLP-1分子は、固相ペプチド化学合成により作ることができる。これらのペプチドは、標準的手法を用い従来の組換え技術を用いて作成することもできる（例えば、Sambrook等、"Molecular Cloning，a Laboratory  Manual", Cold Spring Harbor Press, N.Y.(1989)）。ここで「組換え」とは、遺伝子が組換え(例えば微生物又は哺乳類の)発現システム(本明細書に記載のようにGLP-1分子を符号化するポリヌクレオチドを含むように遺伝子的に変性されたもの)から得られるということを意味する。
【００３０】
GLP-1様ペプチドは、組換え細胞培養から回収、精製することができ、その場合の方法としては、特に制限はないが、硫酸アンモニウム又はエタノール析出、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、フォスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は最終精製工程で用いることができる。
【００３１】
本発明のGLP-1分子ペプチドは、自然に精製された生成物であっても、化学的に合成された製品であっても、あるいは原核生物又は真核生物(例えば、バクテリア，酵母、高級植物、昆虫、培養した又はin vivoの哺乳類細胞)から組換え技術により製造されたものであってもよい。組換え技術において使用された宿主の種類によっては、本発明のポリペプチドは一般に非グリコシル化されているが、グリコシル化されていてもよい。本発明で特に好ましいGLP-1分子はGLP-1（7-36）アミドおよびGLP-1（7-3７）アミド、更にイクセンジン-４である。
【００３２】
治療方法：
本発明の治療方法はHMを患っている患者の治療に有用である。このような患者はうっ血性心不全も患っていることがある。その他、その患者はDCMを患っているか、あるいはその危険性がある。一般に、本発明のGLP-1分子は非経口用調剤として投与される。HMを患っている患者に対し、本発明のGLP-1分子はその他の公知の任意の手段により投与することができる。その投与の方法の例としては、皮下注射、微小圧注射、外部又はインプラントポンプによる方法、デポット注射、その他の長期分配投与装置による方法などを挙げることができるが、これらに限定されない。その他の投与方法、例えば経皮、経膜投与、パッチ又は頬を利用する方法も用いることができる。口からの投与も適当なこともある。肺を介しての投与、例えば吸入などを用いることもできる。
【００３３】
投与のルートも特定の治療法について最適化することができる。もし、慢性のHMの治療が必要なときは、投与を外部輸液装置を用い連続的な皮下灌流を介して行うことができる。これと対照的に、急性のHMの治療が必要なときは、関係する心不全の場合と同様に、静脈内輸液が好ましい。
GLP-1分子の投与の時期は治療されるべき病状に応じて選択することができる。GLP-1分子の投与はHM又はDCMが診断されたとき、直ちにおこなってもよい。その投与の方式は、必要に応じ連続的でも、間歇的でもよい。心不全は急速に悪化する急性疾患の場合、数時間又は数日の連続的投与が好ましい。慢性治療の場合、GLP-1分子を数週間ないし数ヶ月に亘って連続的輸液により投与してもよい。
投与量は病気の重度、患者の状態に応じて選択される。GLP-1（7-36）アミドを使用する利点は、後の高血糖症の恐れなく高投与量を使用することができることである。なぜならば、GLP-1（7-36）アミドの作用はグルコースレベルに依存するからである。従って、悪影響の恐れなく、１０．０nmol/kgを使用することができる。静脈投与の場合は、GLP-1分子の典型的投与量は１．５pmol/kg/minである。この投与の範囲は、約０．１ないし１０pmol/kg/minの間で選択することができる。皮下投与の場合、最適投与量は５pmol/kg/minであり、同じく約０．５ないし５０pmol/kg/minの間で選択することができる。
【００３４】
GLP-1は、HM又はDCMの治療に用いられている公知の他の治療薬と同時に投与することもできる。HMについて言うと、そのような治療薬にカルベヂオール、ACE抑制剤、その他の抗HM剤、例えばニトレート（nitrates）、ヒドラジン、ビソプロロール、メトプロロールが含まれる（Lahiriら）。GLP-1はHMの外科的治療、例えば心臓バイパス手術、血管形成手術における付属物として投与することもできる。GLP-1の投与は、外科手術の前後又はその間において行うことができる。外科手術が行われない場合又は好ましくない場合、GLP-1を他の治療手段として投与してもよい。GLP-1を用いた治療は、冬眠心筋が軽度の場合など外科手術が禁忌の場合のみならず、患者の状態が手術を行えないような重症の場合にも有用である。ACE抑制剤もDCMの治療に好ましい化合物の１つである（Bell(1995)）。
【００３５】
なお、「治療」とは、存在している病状の改善を意味するものである。また、治療が病状の完全な排除、除去に必ずしもつながらないことも理解されるであろう。また、治療は緩和作用も意味するものである。つまり、病状の悪化を減少させることである。より重大な状態を生じさせる病状の軽減もこの用語に包含される。従って、糖尿病性心筋症の治療方法は、糖尿病患者におけるノルエピネフリンレベルを減少させる方法からなるものである。なぜならば、これが心筋症につながり又はそれを悪化させることになるからである。
【００３６】
実施例１
ビーグル犬に、有知覚動物における歩行データを長期に亘って収集できるよう、遠隔装置を装着させた。この装置は、LV圧、心筋酸素消費量（MVO２、心筋の能率を表す）、冠動脈流（CBF）および心拍出量（CO）を測定するものである。このイヌにペースを強制し、３−４週間に亘り、心拍速度が約２４０ビート／分に上昇するようにした。それにより、予測どおり軽度のHMを誘起させた。このHMイヌモデルはHMの治療効果を評価するための承認されたモデルである[Kiuchi等、“Myocardial beta-adrenergic receptor function during the development of pacing-induced heart failure.", J. Clin. Invest. 91:907-914(1993)]。
【００３７】
HFを誘起させた後、５匹のイヌにGLP-1（7-36）アミドの静脈注射（１．５pmol/kg/min）を48時間行い、４匹のイヌは対照として用いた。この治療の間、“ペーシイング”は中断した。この輸液の前後において血漿カテコラミンを測定すると共に、LV圧、冠動脈および全身血行動態、およびMVO２について測定した。その結果を表１に示す。GLP-1治療により血漿ノルエピネフリンレベル(NE)レベルが、2.30±0.15nmol/mlから1.62±0.11nmol/mlに減少した(＊p＜0.05)。更に、左心室圧（LVP）、左心室収縮性（LV dP/dt）、心拍出量(CO)、冠動脈流(CBF)および心筋酸素消費（MVO２）がそれぞれ可なり増加した(＊p＜0.05)。他方、LV最終心拡張圧（LVEDP）が可なり減少した。これらのデータから、GLP-1治療のイヌはGLP-1治療後48時間以内に心臓機能の顕著な回復が判明した。これはMVO２の測定による酸化性ホスホリル化の増加と関連づけることができ、心筋活力の改善を示唆するものである。すなわち、GLP-1輸液は、血漿NEの減少と関係し、心筋活力を著しく改善させる。プラシーボ処置の対照イヌはこの実験では、治療前においてはGLP-1治療群と同程度の心不全を示さなかったが、これら対照イヌは血行動態が明らかに悪化し、48時間のプラシーボ処置の後も改善は見られなかった。
【００３８】
図１−４は２つの代表的動物、イヌA(治療)  およびイヌB (プラシーボ)から得られた結果を要約したものである。図１は左心室（LV）収縮性の変化を示したグラフ図であって、LV圧の変化の割合（ｄP/dt）により測定したものである。治療動物（イヌA）では、HMモデルで予測したように、ペーシングにより収縮性が６０％減少した。しかし、意外にもGLP-1治療の24時間後には基線の８０％まで収縮性が回復し、GLP-1治療の48時間後には基線の９０％まで収縮性が回復した。これと対照的に、対照動物（イヌB）ではペーシングにより収縮性が４０％減少した。しかし、プラシーボ輸液の48時間後でも改善は認められなかった。すなわち、GLP-1は、ペーシング誘起心不全(又は冬眠心筋症)後の心筋収縮性を著しく改善させることができる。
【００３９】
図２は、LV駆出画分（EF）の変化を示したグラフ図であって、心収縮期のおけるLVの空化率により測定したもの。治療動物（イヌA）では、ペーシングによりLVEFが４０％減少した。しかし、GLP-1治療の24時間および48時間後には基線の８８％および９５％まで収縮性がそれぞれ回復した。これと対照的に、対照動物（イヌB）ではペーシングによりLVEFが約３０％減少した。しかし、48時間後でも改善は僅かしか認められなかった。すなわち、GLP-1は、ペーシング誘起心不全後のLVEFを改善させることができる。
【００４０】
図３は、壁厚の程度により反映されるLV収縮を示したグラフ図である。治療動物（イヌA）では、ペーシングにより壁厚が２０％減少した。しかし、GLP-1治療の24時間には回復し、GLP-1治療の48時間には基線の１４７％まで増加した。これと対照的に、対照動物（イヌB）ではペーシングにより壁厚が約２５％減少した。しかも、プラシーボ輸液の48時間後には、この減少が基線の６２％まで下がってしまった。すなわち、GLP-1は、ペーシング誘起心不全後のLV収縮を改善させることができる。
【００４１】
図４は、毎分、汲み出される血液の量（ｍL）を示す心拍出量（CO）により測定された全体的心臓機能の変化を示した図である。COは脈拍出量（1回の心収縮期で排出される血液の量（ｍL））と、心臓速度(1分間の鼓動数)との積である。すなわち、COは心筋の収縮性(すなわち、収縮の内部応力)および全身的血行動態を反映するものであり、これには前負荷(すなわち、血管の充填圧)および後負荷(すなわち、平均動脈圧および全身的管脈抵抗)が含まれる。治療動物（イヌA）では、ペーシングによりCOが３０％減少した。しかし、GLP-1治療の24時間後には基線まで回復し、GLP-1治療の48時間後には基線の１１６％まで増加した。これと対照的に、対照動物（イヌB）ではペーシングによりCOが僅か７％しか減少しなかった。これは、この特定の動物においては、減少した心筋収縮性(図１)およびLVEF(図２)を補償する血行動態があることを示唆している。しかし、それにも拘らず、プラシーボ輸液の48時間後では、COが更に基線の８９％まで減少してしまった。すなわち、GLP-1は、ペーシング誘起心不全(又は冬眠心筋症)後の心拍出量を著しく改善させることができる。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  左心室（LV）収縮性の変化を示したグラフ図であって、LV圧の変化の割合（ｄP/dt）により測定したもの。
【図２】  LV駆出画分（EF）の変化を示したグラフ図であって、心収縮期のおけるLVの空化率により測定したもの。
【図３】  壁厚の程度により反映されるLV収縮を示したグラフ図。
【図４】  毎分、汲み出される血液の量（ｍL）を示す心拍出量（CO）により測定された全体的心臓機能の変化を示したグラフ図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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