(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）画分Ｖペースト（コーン分画）の再構成、
（ｂ）段階（ａ）で得られた画分の濃縮段階を実行すること、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた画分を、５０℃ないし７０℃の範囲で少なくとも９時間加熱し画分を低温殺菌すること、
（ｄ）低温殺菌した段階（ｃ）の画分をバイアルに充填すること、
（ｅ）充填されたバイアルの低温殺菌を実行すること、および
（ｆ）インキュベーションが実施されること
：の段階を含む、クロマトグラフィーの手法を用いずに、プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）含量の低減されたアルブミン濃縮画分を製造する方法。
【請求項２】
段階（ｃ）の低温殺菌が、少なくとも９時間、温度５８ないし６５℃にて実施される、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明の方法に従って得ることができるプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の低減されたアルブミン濃縮画分およびプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の低減されたアルブミン含有画分を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルブミン含有調製物はそれを必要とする患者用の輸液として用いられる。より生理的な環境を持たせるために、患者に輸液される置換液は生理的濃度の塩類だけでなく増量剤としてアルブミンも含む。アルブミン調製物はプレカリクレイン活性化因子を含みうるが、プレカリクレイン活性化因子は、レニン−アンギオテンシン系におけるプレカリクレイン活性化因子の干渉が原因でありうる、好ましくない副作用に繋がる可能性がある。
【０００３】
本発明の目的は、アルブミンを含む血漿由来画分中のＰＫＡ含量を低下させることであった。低いＰＫＡ値を持つアルブミン含有画分を提供することがもう１つの目的であった。
【０００４】
その目的は、
（ａ）画分Ｖペースト（paste V）（コーン(Cohn)分画）の再構成、
（ｂ）段階（ａ）で得られた画分の濃縮段階を実行すること、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた画分を、５０℃ないし７０℃の範囲で、画分を低温殺菌するのに十分な時間加熱すること、および
（ｄ）随意的に、得られた画分を使用のために充填すること
：の段階を含む、プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の低減されたアルブミン濃縮画分を製造する方法によって解決した。
【０００５】
本発明の一実施形態では第２の低温殺菌段階が充填後に実施される。
【０００６】
特に、インキュベート段階は５０ないし７０℃にて少なくとも５時間，特に１０時間の間、実施される。
【０００７】
画分Ｖペーストの再構成および随意的に濾過助剤の追加に続いて、好ましくは０．２μｍの孔径を有するフィルターを用いて、濾過を実施する。必要に応じて、ｐＨ調整を実施しなければならない。ｐＨは７．２〜７．６の範囲になるようにすべきである。タンパク質の濃縮のために、典型的にはタンパク質含量８％（ｗ／ｖ）への限外濾過を実施し、次いでダイアフィルトレーション（diafiltration）およびもう１回の限外濾過を行う。この結果、タンパク質濃度は少なくとも２０％となる。次いで、好ましくは約０．２μｍの孔径を有するメンブレンを用いて、もう１回の濾過を実施することができる。
【０００８】
たとえばアルブミンｇ当たり０．０８ｍｍｏｌのＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンおよびカプリル酸ナトリウムといった安定剤を添加し、その後６．７ないし７．３の範囲にさらにｐＨ調整を行う。タンパク質およびナトリウム含量の調整を達成し、および一括低温殺菌が好ましくは５８℃ないし６５℃の範囲で少なくとも９時間実施する。この段階の後に濾過滅菌を行う。試料は２週間未満、２℃ないし２５℃にて保存する。そのアルブミン滅菌バルクをさらに最終濾過滅菌に供しおよび充填する。充填後、前述と同様の条件下で第２の低温殺菌段階を実施することができる。さらにインキュベート段階を追加することができる。目視検査後、調製物は保存および投与の準備が完了している。
【０００９】
本発明の方法はまた、プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）の低減されたアルブミン含有画分を提供する。
【００１０】
本発明のアルブミンのＰＫＡ含量は、１２ＩＵ／ｍｌ未満、好ましくは１０ＩＵ／ｍｌ未満であり、ここでＰＫＡは第四改正欧州薬局方、２．６．１５、ｐ．１４７〜１４８に従って測定する。
【００１１】
本発明を下記の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００１２】
実施例１：
画分Ｖペーストをその重量の１．６倍の注射用水に６時間より長く−２±２℃にて懸濁する。濾過助剤を本品に加え、およびその調製物を３０分間攪拌する。デプスフィルターを注射用水で、およびその後に１０％（ｖ／ｖ）エタノールで予備洗浄する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。フィルターを、１０％エタノールを含む注射用水で後洗浄する。３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．４±０．２に調整する。
【００１３】
１０キロダルトンの排除限界を有する膜を通した限外濾過によって、８％のタンパク質濃度を得る。濃縮液を、３倍量以上の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液、続いて３倍量以下の注射用水に対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後に、アルブミン溶液を約２２％のタンパク質濃度へ、＋１５℃以下での限外濾過によって濃縮する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。デプスフィルターは注射用水で予備洗浄する。
【００１４】
続いて、カプリル酸０．０１０６ｇ／ｇタンパク質およびＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン０．０１８２ｇ／ｇタンパク質を１０％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウムに溶解し、および緩やかな攪拌下でアルブミン溶液に加える。ｐＨを７．０±０．３に調整する。アルブミン溶液を、注射用水を加えることによってタンパク質濃度２００±１０ｇ／ｌへ調整する。ナトリウム含量を、塩化ナトリウムを加えることによって１５０±７．５ｍｍｏｌ／ｌへ調整する。溶液を少なくとも９時間、５８〜６５℃にて攪拌する。アルブミン溶液を、典型的には公称孔径０．２μｍの、滅菌用グレードフィルターメンブレンを通して濾過滅菌する。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性について使用前後に試験する。濾過滅菌したアルブミンは、＋２℃〜＋２５℃にて２週間以下で保存する。滅菌溶液を、末端０．２μｍ滅菌フィルターを用いて無菌条件下で、パイロジェン除去済み輸液バイアルへ充填し、バイアルは滅菌ブチル栓で密栓しおよびアルミニウムキャップでシールする。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性(integrity)について使用前後に試験する。充填過程を通じて充填容量を監視する。低温殺菌を欧州薬局方に従って実施する。最終容器を欧州薬局方に従ってインキュベートする。インキュベート期間後に、粒子状混入物、濁度、バイアルおよび密閉の欠陥に関して、すべてのバイアルを目視検査する。欠陥のある調製物は不合格とする。すべてのバイアルを＋２℃ないし＋２５℃にて保存する。
【００１５】
実施例２：
画分Ｖペーストをその重量の１．６倍の注射用水に６時間より長く−２±２℃にて懸濁する。濾過助剤を本品に加え、およびその調製物を３０分間攪拌する。デプスフィルターを注射用水で、およびその後に１０％エタノールで予備洗浄する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。フィルターを、１０％エタノールを含む注射用水で後洗浄する。３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．４±０．２に調整する。１０キロダルトンの排除限界を有する膜を通した限外濾過によって、８％のタンパク質濃度を得る。濃縮液を、３倍量以上の０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液、続いて３倍量以下の注射用水に対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後に、アルブミン溶液を約２６％のタンパク質濃度へ、＋１５℃未満での限外濾過によって濃縮する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。デプスフィルターは注射用水で予備洗浄する。続いて、カプリル酸０．０１０６ｇ／ｇタンパク質およびＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン０．０１８２ｇ／ｇタンパク質を１０％水酸化ナトリウムに溶解し、および緩やかな攪拌下でアルブミン溶液に加える。ｐＨを７．０±０．３に調整する。アルブミン溶液を、注射用水を加えることによってタンパク質濃度２５０±１２ｇ／ｌへ調整する。ナトリウム含量を、塩化ナトリウムを加えることによって１５０±７．５ｍｍｏｌ／ｌへ調整する。溶液を少なくとも９時間、５８〜６５℃にて攪拌する。アルブミン溶液を、典型的には公称孔径０．２μｍの、滅菌用グレードフィルターメンブレンを通して濾過滅菌する。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性について使用前後に試験する。濾過滅菌したアルブミンは、＋２℃〜＋２５℃にて２週間以下で保存する。滅菌溶液を、末端０．２μｍ滅菌フィルターを用いて無菌条件下で、パイロジェン除去済み輸液バイアルへ充填し、バイアルは滅菌ブチル栓で密栓しおよびアルミニウムキャップでシールする。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性について使用前後に試験する。充填過程を通じて充填容量を監視する。低温殺菌を欧州薬局方に従って実施する。最終容器を欧州薬局方に従ってインキュベートする。インキュベート期間後に、粒子状混入物、濁度、バイアルおよび密閉の欠陥に関して、すべてのバイアルを目視検査する。欠陥のある調製物は不合格とする。すべてのバイアルを＋２℃ないし＋２５℃にて保存する。
【００１６】
実施例３：
画分Ｖペーストをその重量の１．６倍の注射用水に６時間、−２±２℃にて懸濁する。濾過助剤を本品に加え、およびその調製物を３０分間攪拌する。デプスフィルターを注射用水で、およびその後に１０％エタノールで予備洗浄する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。フィルターを、１０％エタノールを含む注射用水で後洗浄する。３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．４±０．２に調整する。１０キロダルトンの排除限界を有する膜を通した限外濾過によって、８％のタンパク質濃度を得る。濃縮液を、３倍量を超える０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液、続いて３倍量未満の注射用水に対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後に、アルブミン溶液を約２２％のタンパク質濃度へ、＋１５℃未満での限外濾過によって濃縮する。溶液を、デプスフィルターおよび次いで０．２μｍメンブレンフィルターに通すことによって清澄化する。デプスフィルターは注射用水で予備洗浄する。続いて、カプリル酸０．０１０６ｇ／ｇタンパク質およびＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン０．０１８２ｇ／ｇタンパク質を１０％水酸化ナトリウムに溶解し、および緩やかな攪拌下でアルブミン溶液に加える。ｐＨを７．０±０．３に調整する。アルブミン溶液を、注射用水を加えることによってタンパク質濃度２００±１０ｇ／ｌへ調整する。ナトリウム含量を、塩化ナトリウムを加えることによって１５０±７．５ｍｍｏｌ／ｌへ調整する。溶液を少なくとも１０時間、５８〜６５℃にて攪拌する。アルブミン溶液を、典型的には公称孔径０．２μｍの、滅菌用グレードフィルターメンブレンを通して濾過滅菌する。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性について使用前後に試験する。濾過滅菌したアルブミンは、＋２℃〜＋２５℃にて２週間以下で保存する。アルブミン溶液を、注射用水を加えることによってタンパク質濃度５０±２．５ｇ／ｌへ調整する。ｐＨを７．０±０．３に調整する。ナトリウム含量を、塩化ナトリウムを加えることによって１５０±７．５ｍｍｏｌ／ｌへ調整する。アルブミン溶液を、＋２℃〜＋２５℃にて２４時間以下、充填まで保存する。滅菌溶液を、末端０．２μｍ滅菌フィルターを用いて無菌条件下で、パイロジェン除去済み輸液バイアルへ充填し、バイアルは滅菌ブチル栓で密栓しおよびアルミニウムキャップでシールする。滅菌フィルターは、取扱説明書で推奨される通りの適当な試験方法によって、完全性について使用前後に試験する。充填過程を通じて充填容量を監視する。低温殺菌を欧州薬局方に従って実施する。最終容器を欧州薬局方に従ってインキュベートする。インキュベート期間後に、粒子状混入物、濁度、バイアルおよび密閉の欠陥に関して、すべてのバイアルを目視検査する。欠陥のある調製物は不合格とする。すべてのバイアルを＋２℃ないし＋２５℃にて保存する。
【００１７】
プレカリクレイン活性化因子
プレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）はプレカリクレインをカリクレインへ活性化し、および、切断の速度が分光学的に測定できるようにおよび国際単位で較正された参照調製物との比較によってＰＫＡの濃度が計算できるように、合成ペプチド基質から発色団を切断する能力によって測定することができる。
【００１８】
国際単位は、凍結乾燥プレカリクレイン活性化因子から成る国際標準品の規定量の活性である。国際標準品の国際単位での当量は世界保険機関によって規定されている。
【００１９】
プレカリクレイン基質の調製
凝固活性化を回避するため、プレカリクレインの調製に使用する血液または血漿はプラスチックまたはシリコン処理ガラス表面としか接触させてはならない。９容のヒト血液を１容の抗凝固剤溶液（ＡＣＤ、ＣＰＤまたは３８ｇ／ｌクエン酸ナトリウム）中へ採血し、これに臭化ヘキサジメトリン１ｍｇ／ｍｌを加える。混合物を３６００ｇにて５分間遠心分離する。血漿を分離し、および再び６０００ｇにて２０分間遠心分離し、血小板を沈澱させる。血小板の少ない血漿を分離し、および１０容の緩衝液Ａに対して２０時間透析する。透析した血漿を、緩衝液Ａで平衡化してありおよび血漿の容量の２倍に等しい、イオン交換クロマトグラフィー用のアガロース−ＤＥＡＥを含むクロマトグラフィーカラムに加える。緩衝液Ａを用いて２０ｍｌ／ｃｍ2／時間にてカラムから溶出する。溶出液を分画回収し、および２８０ｎｍでの吸光度を記録する（２．２．２５）。プールの容量が血小板の少ない血漿の容量の約１．２倍になるように、最初のタンパク質ピークを含む画分をプールする。
【００２０】
基質プールを、カリクレイン活性が存在しないことについて、１容を測定法に用いる予温した発色基質溶液２０容と混合し、および３７℃にて２分間インキュベートすることによって試験する。吸光度における増加が毎分０．００１未満である場合、基質は適当である。プールした溶液に、塩化ナトリウム７ｇ／ｌを加え、およびメンブレンフィルター（０．４５(ｍ孔）を用いて濾過する。濾液を小分けして凍結し、および−２５℃にて保存する；基質は保存の前に凍結乾燥することができる。
【００２１】
クロマトグラフィーの開始から小分けして凍結までのすべての手順を単一の作業日の間に実施する。
【００２２】
測定法
測定法は、好ましくは自動化酵素分析装置を用いて３７℃にて、反応速度が少なくとも最大３５ＩＵ／ｍｌまで直線であるように、基質の容量および濃度、およびインキュベート時間を調整して実施する。標準品、試料およびプレカリクレイン基質は、必要に応じて緩衝液Ｂを用いて希釈することができる。
【００２３】
インキュベート混合物中のイオン強度およびｐＨの変動によって生じる誤差を回避するため、未希釈試料の容量がインキュベート混合物の総容量の１／１０を超えないように、希釈した標準品または試料をプレカリクレイン基質と共に１０分間インキュベートする。その混合物またはその一部を、カリクレインに特異的であることが知られている適当な合成発色基質（たとえば、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリドアセテートＲまたはＤ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド−ジヒドロクロリドＲ）の、緩衝液Ｂに溶解した溶液の少なくとも等量とインキュベートする。毎分の吸光度変化の速度を２分間ないし１０分間、使用した基質に特異的な波長で記録する。試料または標準品の混合物それぞれについて、プレカリクレイン基質の代わりに緩衝液Ｂを用いてブランクを調製する。
【００２４】
対応するブランクについて得られた値を引くことによってΔＡ／分を補正する。参照調製物および各濃度についてそのように得られた値を用いて較正曲線をプロットする；その曲線を用いて、調べる調製物のＰＫＡ活性を測定する。
【００２５】
緩衝液Ａ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン                      ６．０５５ｇ
塩化ナトリウム                                              １．１７ｇ
臭化ヘキサジメトリン                                        ５０ｍｇ
アジ化ナトリウム                                            ０．１００ｇ
成分を水に溶解し、２Ｍ塩酸を用いてｐＨ８．０に調整し、および水で１０００ｍｌに希釈する。
【００２６】
緩衝液Ｂ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン                      ６．０５５ｇ
塩化ナトリウム                                              ８．７７ｇ
成分を水に溶解し、２Ｍ塩酸を用いてｐＨ８．０に調整し、および水で１０００ｍｌに希釈する。
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