(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) 既知の方法に従って固体支持体上で、核酸塩基上に存在する環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されており、かつＤＢＵ（ジアザビシクロ〔５.４.０〕アンデカ−７−エン）、ＤＡＢＣＯ（ジアザビシクロ〔２.２.２〕オクタン）もしくはＤＢＮ（ジアザビシクロ−〔４.３.０〕ノナ−５−エン）から選択された非求核性強塩基により存在しているいずれのホスフェート保護基も除去することが可能であるヌクレオチドを連続的に合成し、
ｂ) 固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから保護基を除去し、そして
ｃ) 保護基を除去したオリゴヌクレオチドを固体支持体から分離する
ことによって固相合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法において、固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから適当な有機溶媒中でＤＢＵ（ジアザビシクロ〔５.４.０〕アンデカ−７−エン）、ＤＡＢＣＯ（ジアザビシクロ〔２.２.２〕オクタン）もしくはＤＢＮ（ジアザビシクロ−〔４.３.０〕ノナ−５−エン）から選択された非求核性強塩基の存在下に保護基を除去することを特徴とする上記の製法。
【請求項２】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから０〜７０℃で０.１〜１６時間ＤＢＵの０.１〜５Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから１０〜４０℃で０.１〜２時間ＤＢＵの０.３〜３Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから２０〜３０℃で０.２〜１.５時間ＤＢＵの０.５〜２.５Ｍ溶液で保護基を除去する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
式(Ｉ)
【化１】
0004435878.tif 000015
〔式中、
Ｒ1は互いに独立して、水素、ヒドロキシル、場合によりヒドロキシルもしくはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよいＣ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)s（ｓは１〜３の数である）、Ｏ−アリル、ハロゲン、アジドまたはアミノであり；
Ａはオキシであり；
Ｗは互いに独立してオキソ、チオキソまたはセレンオキソであり；
Ｖは互いに独立してオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｙは互いに独立してオキシ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｂはヌクレオチド化学で通常の塩基であって、その少なくとも１個は環外アミノ基を有する塩基であり；
ｎは１〜１００の整数であり；
Ｕは互いに独立してヒドロキシル、メルカプト、ＢＨ3、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式(II)
(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ2 (II)
の基であり、
ここで、
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、または−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ5Ｒ5（ｃは２〜６の整数であり、そしてｄは０〜６の整数である）であり；
Ｒ5は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルであり；
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであるか、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびＲ3とＲ4を担有している窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのさらに別の一つのヘテロ原子をさらに含有していてもよい５〜６員複素環式環であり；
ｐは１〜１００の整数であり；
ｑは０〜２２の整数であり；
Ｒ2は水素もしくはヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ6、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ7またはハロゲンであり、
ここで、
Ｒ6はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、そして
Ｒ7はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり；
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素もしくは結合体（アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの性質に対して好ましい効果を有するか、またはＤＮＡプローブのための標識として使用されるか、または、標的核酸と類似のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に関連して、結合または架橋中に標的核酸をアタックするような結合体）であり；
そして、
Ｒ1および隣接するホスホリル基は２′および３′−位または反転して３′および２′
−位に位置していてもよく；
各々のヌクレオチドはそのＤまたはＬ配置で存在していてもよく；
塩基Ｂはαまたはβ−位に位置していてもよく、またオリゴヌクレオチドが３′−３′−または５′−５′反転を含有することもできる〕
を有する化合物を製造するために、
(ａ)  式(III)
【化２】
0004435878.tif 000016
（式中、Ａ、ＹおよびＶは先の定義のとおりであり、そして
Ｒ1′はＲ1の定義のとおりであるが、Ｒ1がヒドロキシルもしくはアミノである場合Ｒ1′は相当する保護された基であり、
Ｓは酸の条件下で除去することができる５′保護基であり；
ＢPRは、いずれかの環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されている天然または非天然の核酸塩基である）を有する化合物を、既知の方法に従って、式(IV)
【化３】
0004435878.tif 000017
（式中、
Ｚ′はＯＲ13またはＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールもしくはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルであり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ5〜Ｃ12−シクロアルキル、ベンジルまたはフェニルであり；そして
Ｒ13はＤＢＵで除去することができる保護基であり、
Ｚは塩素もしくは臭素または式ＮＲ11Ｒ12（式中Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する基である）を有する化合物と、塩基、あるいはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルとＣ1〜Ｃ4−トリアルキルアミンとの混合物の存在下、または、Ｚが式ＮＲ11Ｒ12の基である場合、式
〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（式中、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル基であり、そしてＡはフッ素、塩素または臭素である）を有する化合物またはテトラゾールもしくは５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールの存在下、またはピリジン塩酸塩の存在下に反応させて式(Ｖ)
【化４】
0004435878.tif 000018
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPR、Ｚ′、Ｒ1′、Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する化合物を形成させ；
(ｂ)  式(III)の化合物を、既知の方法に従って、適当な有機溶媒中で、適宜触媒を加えた後、１〜１０当量のリンカーと反応させ、次いで既知の方法に従って後処理して式(VI)
【化５】
0004435878.tif 000019
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPRおよびＲ1は先の定義のとおりである）を有し、合成で使用される重合体支持体に対するリンカーとして役立つ３′位でのコハク酸残基を有する化合物を形成させ；
(ｃ)  式(VI)の化合物を、既知の方法に従って適当な溶媒中で反応させることにより、固体支持体ＳＳに結合させると式(VII)
【化６】
0004435878.tif 000020
を有する化合物が得られ；
(ｄ)  既知の方法に従って、式(VII)から５′保護基を除去し；
(ｅ)  得られた化合物を適当な有機溶媒中、式
〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（この式は先に定義したとおりである）を有する化合物、またはテトラゾール、５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールまたは５−（Ｃ6〜Ｃ12−アリール）−１Ｈ−テトラゾールの存在下、またはピリジン塩酸塩の存在下に式(Ｖ)の化合物と反応させ、そして
(ｆ)  得られた化合物を、既知の方法に従って、適宜追加の有機溶媒の存在下に酸化し、
(ｇ)  反応工程(ｄ)〜(ｆ)を所望の連鎖の長さが得られるまでくり返して行い；
(ｈ)  このようにして得られた化合物を適当な有機溶媒中でＤＢＵで処理することによって保護基を除去し；そして
(ｉ)  既知の方法によって、オリゴヌクレオチドを支持体から分離する
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｄ)からの未反応化合物をキャッピング工程によって非活性化する請求項５記載の方法。
【請求項７】
式(III)、(Ｖ)、(VI)および(VII)を有する化合物において、ＢPRが互いに独立して
【化７】
0004435878.tif 000021
（式中、
ｍは０〜４の整数であり、そして
Ｒ8は互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、ＣＮであり、
Ｒ9は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−(１−アルキン)、またはフッ素であり、そして
Ｒ10は互いに独立して水素またはβ−除去可能な保護基である）
である請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ1が水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシもしくはフッ素であり；
Ａがオキシであり；
Ｗがオキソまたはチオキソであり；
Ｖがオキシであり；
Ｙがオキシであり；
Ｂが互いに独立してアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５−プロピンウラシル、５−プロピンシトシン、５−ヘキシンウラシルまたは５−ヘキシンシトシンであり、
ｎが５〜４０の整数であり；
Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3であり、ここで
Ｒ3はＣ1〜Ｃ8−アルキルもしくはメトキシエチルであり、
Ｒ4はＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびＲ3とＲ4を担有する窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのさらに別の一つのヘテロ原子をさらに含有してもよい５〜６員環複素環であり、
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素である
式(Ｉ)の化合物を製造するための請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ1が水素であり、
ｎが５〜３０の整数であり、
ＵがヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
ＱおよびＱ′が水素であり、
そして残りの可変部分が請求項７に定義したとおりである
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式(Ｖ)
【化８】
0004435878.tif 000022
（式中、
Ｒ1′は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ（適宜ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよい）、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)1-3、Ｏ−アリル、フッ素、塩素、アジドまたは保護されたヒドロキシル基またはアミノ基であり；
Ａはオキシであり；
Ｖはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｓはジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチルまたはピキシルであり；
ＢPRは；
【化９】
0004435878.tif 000023
（ここで、
ｍは０〜４の整数であり；そして
Ｒ8は互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはＣＮであり、
そしてＲ9およびＲ10は請求項７で定義したとおりである）であり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールもしくはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルであり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ5〜Ｃ12−シクロアルキル、ベンジルまたはフェニルであり；そして
Ｒ13はｐ−ニトロフェニルエチルまたは２−シアノエチルである）
を有する化合物。
【請求項１１】
Ｒ1′は水素、保護されたヒドロキシル基、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはフッ素であり；
Ａはオキシであり；
Ｖはオキシであり；
Ｙはオキシであり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルである
請求項１０に記載の式(Ｖ)の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は固相合成によるオリゴヌクレオチドの製法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
モノヌクレオチドの化学的重縮合はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を製造するための重要な方法である。
オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の阻害剤として（J.F. Milligan, M.D. MatteucciおよびJ.C. Martin, J.Med. Chem. 36 (1993) 1923; E.UhlmannおよびA.Peyman, Chemical Review, 90 (1990) 543)、またはリボザイムとして(例えば、D.Castanotto, J.J. Rossi, J.O. Deshler, Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331)、または診断においてＤＮＡプローブとして(例えば、BeckおよびKoester. Anal. Chem. 62 (1990) 2258）使用の範囲が広がりつつある。従って、このような化合物を合成するのに適した方法が大いに必要とされている。
【０００３】
オリゴヌクレオチドに関する先行技術は、E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274；E. UhlmannおよびA. Peyman, Chemical Reviews, 90 (1990) 543；BeaucageおよびIyer, Tetrahedron 49 (1993) 10441-10488で検討されている。
ＤＮＡもしくはＲＮＡの化学的合成での基本的な問題は、ヌクレオシド塩基および糖残基のアミノおよびヒドロキシル基に対する適当な保護基を見い出す問題である。一方では、これらの保護基は重縮合反応の条件下、すなわち反応過程で安定でなければならないし、他方これらの保護基は、反応終了時にホスホジエステル結合を再切断することなく再び除去され得るように十分に不安定でなければならない〔H.G. Khorana；Pura Appl. Chem. 17 (1968) 349〕。
【０００４】
現在のＤＮＡ合成は実際には、本質的に次の三つの工程を備えているものである：(ａ)固体支持体での様々な保護基を有するヌクレオチドの連続合成；(ｂ)合成されたオリゴヌクレオチドの支持体からの分離；(ｃ)オリゴヌクレオチドの脱保護基（保護基の除去）。固体支持体でのオリゴヌクレオチドの合成は極めて迅速（２０量体（２０mer）について約１時間必要である）に行われ、また支持体からの分離も１時間以内に完了するが、オリゴヌクレオチドの最終の脱保護基に問題が残されている。標準的なオリゴヌクレオチド合成（例えば、M. Reddy, N.B. Hanna, F. Farooqui, WO 95/24413）では、ｄＡおよびｄＣについて確立されたベンゾイルまたｄＧについてブチロイル保護基を使用するときは、濃ＮＨ3による５５℃での約６時間の処理を要する。普通に保護されたヌクレオシド誘導体よりもアンモニア性アミノリシスに対して一層感受性を有する完全なシリーズの保護基が、最近になってこの後者の工程の迅速化のために提案されている（M. Reddy等、上記参照；BeaucageおよびIyer、上記参照）。これらの保護基は、例えば、フェノキシアセタール基(Schulhof等；Nucl. Acids Res. 15 (1987) 397)；ジメチルホルムアミジン基（Vu等、Tetrahedron Lett. 31 (1990) 7269；もしくはｔ−ブチルフェノキシアセチル基（Sinha等、Biochimie 75 (1993) 13）もしくはReddy等に記載のフェニルアセチル保護基（上記参照）を包含している。これらのアンモニア不安定保護基を用いる場合、５５℃での脱保護基の時間は１５〜６０分に減縮されるが、それらの使用には不利な点を伴っている：まず第一に、これらの基が不安定であるために、ＤＮＡ合成条件に対する例えばキャッピング工程中での不安定性がもたらされる（BeaucageおよびIyer、上記参照）。フェノキシアセチル保護基は例えばヌクレオチド誘導体の溶解性を低下させ、そのために溶媒混合物を使用しなければならない。
【０００５】
核酸塩基の環外アミノ官能基のために保護基を使用するに当たってのその他の基準は生成する生成物の純度である。アンモニアを使用し、かつ支持体からの分離後もしくは分離中に実施される保護基除去操作の場合、オリゴヌクレオチドと除去された保護基との混合物が常に得られる。それで、オリゴヌクレオチドは追加の精製工程で清澄化しなければならない。オリゴヌクレオチドが固体支持体上に存在している間に、オリゴヌクレオチドを固体支持体から分離することなしに、除去することができるような保護基がさらに有利なものである。かかる保護基の一例が、オリゴヌクレオチドが支持体上にある間にＤＢＵで除去することのできるｐ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル保護基である。次にアンモニアで支持体からオリゴヌクレオチドを分離することによって、すでに純粋なオリゴヌクレオチドが得られる（F. Himmelsbach等、 Tetrahedron 40 (1984) 59）。
【０００６】
核酸塩基の環外アミノ官能基に対して保護基を使用することについてのそれ以上の基準は、使用する酸条件、一般には、５′−ヒドロキシル保護基を除去するための各反応サイクルにおいては例えばジクロロメタン中の２％ジクロロ酢酸に対する安定性である。これらの条件は、特にデオキシアデノシンの場合、実質的な程度の脱プリンをもたらすものである。環外アミノ官能基に対する保護基として使用する場合、例えばフタロイル基もしくはスクシニル基のような環状ジアシル基が脱プリン条件に対して特に安定であることが見い出された（Kume等、Tetrahedron Lett. 23 (1982) 4365；Nucleic Acids Res. 12 (1984) 8525；Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 11 (1982) 26；Chemistry Letters 1983，1597）。しかしながら、これらの基はまたアンモニアで脱保護基される(Kume等、上記参照)。その他の環状ジアシル基の例はナフタロイル基であり（Dikshit等、Can. J. Chem. 66 (1988) 2989）、このものは同じく脱プリンに対して安定であり、またアンモニアで除去された。
【０００７】
【問題解決のための手段】
意外にも、これらの環状ジアシル基は脱プリン条件に対して特に安定であるばかりでなく、非求核性強塩基例えばＤＢＵで容易に除去し得ることが見い出された。これはなお一層驚くべきことである。その理由は、若干のフタロイル基はＤＢＵを用いて導入されたからである（これは比較的低いＤＢＵ濃度ではあるが）（Kamaibe等、 Tetrahedron Lett. 36 (1995) 91）。環状ジアシル基で保護されている核酸塩基の脱プリンに対する高度の安定性のために、また支持体からオリゴヌクレオチドを分離する前にこれらの基を容易に除去できる可能性のために、これらの環状ジアシル基は、オリゴヌクレオチド製造のための保護基として使用するのに申し分なく適合しているものである。
【０００８】
従って、本発明は、
ａ) 既知の方法に従って固体支持体上で、核酸塩基上に存在する環外アミノ基が環状ジアシル基で保護されており、かつ非求核性強塩基により存在しているいずれのホスフェート保護基も除去することが可能であるヌクレオチドを連続的に合成し、
ｂ) 固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから保護基を除去し、そして
ｃ) 保護基を除去したオリゴヌクレオチドを固体支持体から分離する
ことによって固相合成でオリゴヌクレオチドを製造する方法において、固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドから適当な有機溶媒例えばアセトニトリル、ピリジンもしくはＮ−メチルイミダゾール中非求核性強塩基の存在下に保護基を除去することを特徴とする上記の製法に関する。
【０００９】
非求核性の強塩基例えばＤＢＵ（ジアザビシクロ〔５.４.０〕アンデカ−７−エン）、ＤＡＢＣＯ（ジアザビシクロ〔２.２.２〕オクタン）、ＤＢＮ（ジアザビシクロ−〔４.３.０〕ノナ−５−エン）、エチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−エチルモルホリン、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）もしくはルチジンまたは荷電していない過アルキル化ポリアミノホスファビン塩基（R. Schwesinger, Angew. Chem. 99 (1987) 1212）は当業者に周知である。非求核性強塩基ＤＢＵが好ましい。
好ましくは、保護基の除去は、ＤＢＵの０.１〜５Ｍ溶液の存在下０〜７０℃で０.１〜１６時間、特に好ましくは、ＤＢＵの０.３〜３Ｍ溶液の存在下１０〜４０℃で０.１〜２時間、非常に特に好ましくは、ＤＢＵの０.５〜２.５Ｍ溶液の存在下２０〜３０℃で０.２〜１.５時間実施される。
【００１０】
「オリゴヌクレオチド」なる用語は、極めて一般的に、修飾および（または）２′−デオキシリボース構成ブロックを含有するポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）；修飾および（または）未修飾リボース構成ブロックを含有するポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）；修飾および（または）未修飾プリンまたはピリミジンベースのＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドから合成されるその他のポリヌクレオチドを包含し、ここで、ポリデオキシリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのホスフェート・ブリッジ（phosphato bridge）は修飾されていても、また他の構造で置換されていてもよく、該オリゴヌクレオチドは環外アミノ基を有する塩基を少なくとも１個を有している。
【００１１】
それら自体既知である方法を用いて導入されるこれらの修飾の例は次のとおりである：
ａ) ホスフェート・ブリッジの修飾
例示のために、次のものをあげることができる：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスフェート、エチルホスフェートおよびフェニルホスフェート。ホスフェート・ブリッジの好ましい修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートである。
【００１２】
ｂ) ホスフェート・ブリッジの置換
例示のために、次のものをあげることができる：アセトアミド、ホルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチルスルホンおよびシリル基。好ましくは、アセトアミド、ホルムアセタールおよび３′−チオホルムアセタールによる置換である。
【００１３】
ｃ) 糖の修飾
例示のために、次のものをあげることができる：α−アノマー糖、２′−Ｏ−メチルリボース、Ｏ−ブチルリボース、２′−Ｏ−アリルリボース、２′−フルオロ−２′−デオキシリボース、２′−アミノ−２′−デオキシリボース、α−アラビノフラノースおよび炭素環式糖類似体。２′−Ｏ−メチルリボースおよび２′−Ｏ−ｎ−ブチルリボースによる修飾が好ましい。これらの修飾は、Ｏ−リボースの２′および３′−炭素原子が二重結合によって連絡されていて、かつ各例において置換分として水素原子を担有している場合、非常に特に好ましい。
【００１４】
新規な方法はそれ故に例えば式(Ｉ)
【化１０】
0004435878.tif 000002
〔式中、
Ｒ1は互いに独立して、水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ（ヒドロキシもしくはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよい）、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)s（ｓは１〜３の数である）、Ｏ−アリル、ハロゲン、アジドまたはアミノであり；
Ａはオキシであり；
Ｗは互いに独立してオキソ、チオキソまたはセレンオキソであり；
Ｖは互いに独立してオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｙは互いに独立してオキシ、スルファンジイル、イミノまたはメチレンであり；
Ｂはヌクレオチド化学で通常の塩基、例えば天然塩基例えばアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミン、または非天然塩基例えばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−Ｃ1〜Ｃ3−アルキニルアデニン、７−デアザ−７−Ｃ1〜Ｃ3−アルキニルグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、プソイドイソシトシン、５−Ｃ2〜Ｃ6−アルキンウラシル、５−Ｃ2〜Ｃ6−アルキンシトシン、好ましくは５−プロピンウラシル、５−プロピンシトシン、５−ヘキシンウラシル、５−ヘキシンシトシンまたは５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシルまたは５−ブロモシトシンであり；Ｂの少なくとも１個は環外アミノ基を有する塩基であり；
ｎは１〜１００の整数であり；
Ｕは互いに独立してヒドロキシル、メルカプト、ＢＨ3、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式(II)
(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ2      (II)
の基であり、
【００１５】
ここで、
Ｒ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、または−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ5Ｒ5（ｃは２〜６の整数であり、そしてｄは０〜６の整数である）であり；
Ｒ5は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル好ましくはメトキシエチルであり；
Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキルそして特に好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであるか、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびそれらを担有している窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのそれ以上のヘテロ原子をさらに含有していてもよい５〜６員環複素環式基であり；
ｐは１〜１００、好ましくは３〜１０の整数であり；
ｑは０〜２２、好ましくは０〜１５の整数であり；
Ｒ2は水素または官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ6、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ7またはハロゲンであり、
ここで、
Ｒ6はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、そして
Ｒ7はＣ1〜Ｃ4−アルキル、好ましくはメチルであり；
【００１６】
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素または結合体（conjugates）であり、これらの結合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの性質に対して好ましい効果を有する（例えば、細胞浸透、ヌクレアーゼによる分解、標的ＲＮＡ／ＤＮＡに対する親和力もしくは薬物動態）か、またはＤＮＡプローブのための標識として使用されるか、または標的核酸と類似のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に関連して、結合または架橋中に標的核酸をアタックし、例えばポリリジンとの結合体、インターカレーター例えばピレン、アクリジン、フェナジンもしくはフェナントリジンとの結合体、蛍光化合物例えばフルオレセインとの結合体、架橋剤例えばプソラレンもしくはアジトプロフラビンとの結合体、親油性分子例えば（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキルとの結合体、脂質例えばrac−１,２−ジヘキサデシルグリセロールとの結合体、ステロイド例えばコレステロールもしくはテストステロンとの結合体、ビタミン例えばビタミンＥとの結合体、ポリエチレングリコールもしくはオリゴエチレングリコールとの結合体、（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキルホスフェートジエステルとの結合体または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキルとの結合体があり；特に好ましいのは、例えば（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキルのような親油性分子、例えばコレステロールもしくはテストステロンのようなステロイド、ポリエチレングリコールもしくはオリゴエチレングリコール、ビタミンＥ、例えばピレンのようなインターカレーター（Ｃ14〜Ｃ18）−アルキルホスフェートエステルまたは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−(Ｃ12〜Ｃ16)−アルキルとの結合体であり；
Ｒ1および隣接するホスホリル基は２′および３′−位または反転して３′および２′−位に位置していてもよく；各々のヌクレオチドはそのＤまたはＬ配置で存在していてもよく；塩基Ｂはαまたはβ−位に位置していてもよく、またオリゴヌクレオチドが３′−３′−または５′−５′反転を含有することもできる（Ch. Chaix等、 Bioorg. & Med. Letters 6 (1996) 872)〕の化合物を製造するのに適している。
【００１７】
この方法において、
(ａ)  式(III)
【化１１】
0004435878.tif 000003
（式中、Ａ、ＹおよびＶは先の定義のとおりであり、そして
Ｒ1′はＲ1の定義のとおりであるが、Ｒ1がヒドロキシルまたはアミノである場合Ｒ1′は相当する保護された基であり、
Ｓは酸の条件下で除去することができる５′保護基、例えばジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチルもしくはピキシル、好ましくはジメトキシトリチルおよびモノメトキシトリチルであり；
ＢPRは、存在することがあり得るいずれの環外アミノ基は環状ジアシル基で保護されている天然または非天然の核酸塩基である）を有する化合物を、
【００１８】
既知の方法に従って、式(IV)
【化１２】
0004435878.tif 000004
（式中、
Ｚ′はＯＲ13またはＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、Ｃ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、またはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、特に好ましくはＯＲ13であり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはイソプロピル、またはＣ5〜Ｃ12−シクロアルキル、好ましくはＣ8以下のシクロアルキル、ベンジルもしくはフェニルあるいは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、飽和または不飽和の、モルホリンのような適宜追加のヘテロ原子を有する複素環およびＯＣ(Ｏ)Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルエステルのような置換分を有する前記複素環であり；そして
Ｒ13は非求核性強塩基で除去することができる保護基であり、
Ｚは塩素または臭素または式ＮＲ11Ｒ12（式中Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する基である）を有する化合物と、塩基、好ましくはピリジンまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジクロロメタン(ＤＣＭ)、クロロホルムおよび（または）アセトニトリルとＣ1〜Ｃ4−トリアルキルアミン、好ましくはトリメチルアミン、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンとの混合物の存在下、または、Ｚが式ＮＲ11Ｒ12の基である場合、式
〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（式中、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル基であり、そして
【００１９】
Ａはフッ素、塩素または臭素、特に塩素である）を有する化合物またはテトラゾールもしくは５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールもしくは５−（Ｃ6〜Ｃ12）−アリール−１Ｈ−テトラゾールまたは他の活性化剤例えばピリジン塩酸塩の存在下、好ましくはテトラゾールまたはピリジン塩酸塩の存在下に反応させて式(Ｖ)
【化１３】
0004435878.tif 000005
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPR、Ｚ′、Ｒ1′、Ｒ11およびＲ12は先の定義のとおりである）を有する化合物を形成させ；
【００２０】
(ｂ)  式(III)の化合物を、既知の方法に従って、適当な溶媒例えば塩化メチレン中で、適宜触媒例えば４−ジメチルアミノピリジンを加えた後、１〜１０当量好ましくは１〜２当量のリンカー例えば無水コハク酸と反応させ、次いで既知の方法に従って、例えば抽出結晶化およびクロマトグラフィーの後処理して式（VI）
【化１４】
0004435878.tif 000006
（式中、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ａ、ＢPRおよびＲ1は先の定義のとおりである）を有し、合成で使用される重合体支持体に対するリンカーとして役立つ３′−位でのコハク酸残基を有する化合物を形成させ（ここでは、コハク酸リンカーの代替物として例えばSonveaux〔Bioorg. Chem. 14 (1986) 274〕に記載されているものもまた使用可能である）；
【００２１】
(ｃ)  式(VI)の化合物を、既知の方法に従って、固体支持体ＳＳ、例えばＣＰＧ(R)（ＣＰＧ＝制御気泡ガラス）もしくはtentagel(R)、好ましくはＤＢＵ−安定支持体例えば「長鎖メチルアミノアルキルＣＰＧ」〔Stengele, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2549〕に例えば適当な溶媒中でＤＣＣとｐ−ニトロフェノールとの反応により、または、適宜、例えばＮ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリンまたはエチルジイソプロピルアミンもしくはトリエチルアミンのような適当な塩基を加えて〔例えば、M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis-a practical approach, IRL Press, 1984に記載の如く〕、適当な溶媒中でＴＯＴＵ（Ｏ−〔（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ〕−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（W. Koenig, G. Breipohl, D. Pokorny, M. Birkner, Proceedings of the 21st European Peptide Symposium 1990, E. Giralt, D. Andreu編集, ESCOM, Leiden, 143頁）と反応させることにより、結合させて式(VII)
【化１５】
0004435878.tif 000007
を有する化合物が得られ；
【００２２】
(ｄ)  既知の方法例えば塩化メチレンまたはクロロホルム中１〜４％ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸で処理することにより、化合物(VII)から５′保護基を除去し；
(ｅ)  得られた化合物を適当な有機溶媒好ましくはアセトニトリル中、式〔ＨＮＲ14Ｒ15Ｒ16〕(+)Ａ(-)
（この式は先に定義したとおりである）を有する化合物、またはテトラゾール、５−（Ｃ1〜Ｃ4−アルキルチオ）−１Ｈ−テトラゾールもしくは５−(Ｃ6〜Ｃ12−アリール）−１Ｈ−テトラゾールまたはピリジン塩酸塩のようなその他の活性化剤の存在下、好ましくはテトラゾールまたはピリジン塩酸塩の存在下に式(Ｖ)の化合物と反応させ、
【００２３】
(ｆ)  得られた化合物を既知の方法により、例えば、水性ピリジン、ルチジンもしくはコリジンの存在下に、適宜さらに例えばテトラヒドロフランのような追加の有機溶媒の存在下に、ヨウ素反応させることにより、または例えばテトラヒドロフラン中ｔ−ブチルヒドロペルオキシドと反応させることにより、またはアセトニトリル中Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′-テトラエチルチウラムジスルフィドと反応させることにより、または例えばアルキルアミンまたはアリールアミンの存在下にヨウ素と反応させることにより酸化し、ここでこの種々の酸化法は当業者に周知であり、また天然および修飾オリゴヌクレオチドの製造に使用されており、そして例えばBeaucageおよびIyer〔Tetrahedron 49 (1993) 6123〕またUhlmannおよびPeyman〔Chem. Rev. 90 (1990) 543〕に要約され、そして酸化は水性ピリジン、ルチジンもしくはコリジンの存在下に、適宜さらに例えばテトラヒドロフランのような追加の有機溶媒の存在下に、ヨウ素との反応によって実施するのが好ましい；
【００２４】
(ｆ′)  工程(ｄ)から得られる未反応の化合物は適宜キャッピング工程により、例えばＴＨＦ中無水酢酸−ルチジン−Ｎ−メチルイミダゾールとの反応により不活性化し；
(ｇ)  反応工程(ｄ)〜(ｆ)を所望の連鎖の長さが得られるまでくり返して行い；
(ｈ)  このようにして得られた化合物を、例えばアセトニトリル、ピリジンまたはＮ−メチルイミダゾールのような適当な有機溶媒中でＤＢＵの０.１〜５Ｍ溶液で０〜７０℃で０.１〜１６時間、好ましくは０.３〜３Ｍ溶液で１０〜４０℃で０.１〜２時間、特に好ましくは０.５〜２.５Ｍ溶液で２０〜３０℃で０.２〜１.５時間処理することによって保護基を除去し；
(ｉ)  既知の方法例えば２０〜３０℃でＮＨ3により、支持体からオリゴヌクレオチドを分離し、そして式(Ｉ)の化合物をアンモニア性溶液の凍結乾燥によって得る。
【００２５】
非求核性強塩基で除去することのできる保護基は非求核性強塩基での処理によって除去され、しかも除去が一般にはβ−除去によって行われるような保護基である。これらの保護基の例としては、４−ニトロフェニルエチル、２−シアノエチル、ダンシルスルホニルエチル、アリールエチルおよびアリールスルホニルエチル（ここで、フェニルは適宜、塩素、臭素、ＣＮ、ＮＯ2またはＦによって一回もしくは二回以上置換されていてもよい）があり、好ましくは４−ニトロフェニルエチルまたは２−シアノエチルである。
【００２６】
式（VII）の化合物は、固体支持体をスクシノイル化し、次に式（III）の化合物に縮合させることによっても合成することができる。
基ＱおよびＱ′は、当業者に周知の方法により、適宜導入される（例えば、Uhlmann & Peyman, Chem. Rev. 90 (1990) 543；M. Manoharan “Antisense Research and Applications", CrookeおよびLebleu編，CRC Press, Boca Raton, 1993, 17章, 303頁以降およびEP-A0 552 766を参照）。
【００２７】
Ｒ1がＯＨまたはアミノであるときのＲ1′の保護基および相当する誘導化されたヌクレオシド構成ブロックの合成は、当業者に周知であり（例えば、Ｒ1がヒドロキシルの場合ジメメル−ｔ−ブチルシリル基もしくは１−（２−クロロ−４−メチルフェニル)−４−メトキシ−４−ピペリジニル基であり、またはＲ1がアミノの場合アセチル基である）、そして例えばUhlmannおよびPeyman, Chem. Rev. 90 (990) 543；BeaucageおよびIyer, Tetrahedron 48 (1993) 2223またはC. Hendrix等, Nucl. Acids Res. 26 (1995) 51に記載されている。
【００２８】
ＢPRの例には次のものがあげられる：
【化１６】
0004435878.tif 000008
（式中、
ｍは０〜４、好ましくは０の整数であり、そして
Ｒ8は、互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、またはＣＮであり、
Ｒ9は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−（１−アルキン）、好ましくは１−プロピニルおよび１−ヘキシニルまたはフッ素であり、そして
Ｒ10は互いに独立して水素もしくはβ−除去可能な保護基例えばｐ−ニトロフェニルエチルまたはフェニルスルホニルエチルである）、ここで環状ジアシル保護基および５′−保護基Ｓのヌクレオシドへの導入は当業者に周知である（例えばKume等, Tetrahedron Lett. 23 (1982) 4365；Nucleic Acids Res. 12 (1984) 8523；Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 11 (1982) 26；Chemistry Letters 1983, 1597もしくはDikshit等, Can. J. Chem. 66 (1988) 2989もしくはKamaike等, Tetrahedron Lett. 36 (1995) 91参照）。修飾ヌクレオシド構成ブロックは同じようにして保護することができる。Ｒ10保護基は同様に既知の方法例えばF. Himmelsbach等, Tetrahedron 40 (1984) 59またはBeaucageおよびIyer. Tetrahedron 49 (1993) 6123；BeaucageおよびIyer, Tetrahedron 48 (1993) 2223に従って、環状ジアシル基の導入前に、導入される。
【００２９】
式(Ｉ)において、
Ｒ1が水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはフッ素であり；
Ａがオキシであり；
Ｗがオキソもしくはチオキソであり；
Ｖがオキシであり；
Ｙがオキシであり；
Ｂが互いに独立してアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５−プロピンウラシル、５−プロピンシトシン、５−ヘキシンウラシルまたは５−ヘキシンシトシンであり、少なくとも１個のＢは環外アミノ基を有する塩基であり；
ｎが５〜４０の整数であり；
Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3であり、ここで
Ｒ3はＣ1〜Ｃ8−アルキルもしくはメトキシエチルであり、
Ｒ4はＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、または、ＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ3およびこれらを担有する窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの群からのそれ以上のヘテロ原子をさらに含有する５〜６員環複素環であり、
ＱおよびＱ′は互いに独立して水素である
式(Ｉ)の化合物の新規な製造方法が好ましい。
【００３０】
式(Ｉ)において、
Ｒ1が水素であり；
Ａがオキシであり；
Ｗがオキソまたはチオキソであり；
Ｖがオキシであり；
Ｙがオキシであり；
Ｂがアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５−プロピンウラシルおよび５−プロピンシトシン、５−ヘキシンウラシルまたは５−ヘキシンシトシンであり；少なくとも１個のＢは環外アミノ基を有する塩基であり；
ｎが好ましくは５〜３０であり；
ＵがヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、そして
ＱおよびＱ′が水素である
式(Ｉ)の化合物の新規な製造方法が特に好ましい。
【００３１】
新規な方法を用いて製造されるオリゴヌクレオチドは多くの様々な方法で使用することができ、例えば遺伝子発現の阻害剤として、リボザイムとして、もしくは診断プローブ（特にＤＮＡプローブとして）として、または一般的な方法で分子生物学での補助手段として使用することができる。
本発明はさらに式(Ｖ)
【化１７】
0004435878.tif 000009
（式中、
Ｒ1′は互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ（適宜ヒドロキシルもしくはＣ1〜Ｃ4−アルコキシで１〜３回置換されていてもよい）、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)1-3、Ｏ−アリル、フッ素、塩素、アジドまたは保護されたヒドロキシル基またはアミノ基であり；
Ａはオキシであり；
Ｖはオキシ、スルファンジイルまたはイミノであり；
Ｓは酸の条件下で除去することができる５′保護基、例えばジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチルもしくはピキシル、好ましくはジメトキシトリチルおよびモノメトキシトリチルであり；
ＢPRは環外アミノ基を有し、而して該アミノ基が環状ジアシル基で保護されている天然または非天然核酸塩基であり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキルであり；
Ｒ11およびＲ12は同一または異なって、Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはイソプロピルまたはＣ5〜Ｃ12−シクロアルキル、好ましくはＣ8以下のシクロアルキル、ベンジルもしくはフェニルであるか、または、それらが結合している窒素原子と共に、飽和または不飽和の、モルホリンのような適宜追加のヘテロ原子を有する複素環およびＯＣ(Ｏ)Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキルエステルのような置換分を有する複素環であり；そして
Ｒ13はｐ−ニトロフェニルエチルまたは２−シアノエチルである）
の化合物に関する。
【００３２】
式(Ｖ)において、
ＢPRが、
【化１８】
0004435878.tif 000010
（式中、
ｍは０〜４、好ましくは０の整数であり；そして
Ｒ8は互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはＣＮであり、
そしてＲ9およびＲ10は先に定義したとおりである）
である化合物が好ましい。
【００３３】
式(Ｖ)において、
Ｒ1′は水素、保護されたヒドロキシル基、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシまたはフッ素であり；
Ａはオキシであり；
Ｖはオキシであり；
Ｙはオキシであり；
Ｚ′はＯＲ13、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたはＣ6〜Ｃ14−アリール−Ｃ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはＯＲ13である
化合物が特に好ましい。
式(Ｖ)の化合物は、本発明に従って式(Ｉ)の化合物を製造するための重要な中間体である。
【００３４】
【実施例】
実施例１
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕)ホスフィトアミド
１.１  Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン
２′−Ｏ−デオキシアデノシンの５ｇ（２０ミリモル）をまず無水ピリジン中で共蒸発させ、次にピリジン８０mlに溶解する。クロロトリメチルシラン６ml（５０ミリモル）を加え、全体を室温（ＲＴ）で３０分間撹拌する。塩化フタロイル４ml（２８ミリモル）を次に加える。２時間後、氷水を用いて加水分解し、そして混合物を次に１０分間撹拌する。このものをＡｃＯＥｔの１５０mlで希釈し、そして塩化ナトリウムの飽和溶液１００mlで４回抽出する。水相をＡｃＯＥｔの５０mlで４回逆抽出する。精製のために、残渣をジクロロメタン５０mlにとり、石油エーテル１０００mlから沈殿させる。黄土色の固体７.３７ｇ（１８.５ミリモル；９３％）が得られる。
【００３５】
１.２  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン（文献：Akiko Kume, Mitsuo Sekine, Tsujiaki Hata, Tetrahedron Letters 23 (42), 4365-4368 (1982)）
Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン４ｇ（１０ミリモル）を無水ピリジン中で共蒸発させ、次に無水ピリジン５０mlおよびジクロロメタン５０mlにＮ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン２０mg（０.１６ミリモル）および４Å分子ふるいと共に溶解し、そして２.５時間４,４−ジメトキシトリチルクロライド２.７２ｇ（８ミリモル）と共に撹拌した。溶媒を留去した後、残渣をジクロロメタン１００mlに溶解し、そしてこの溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液１００mlで抽出する。合した有機相を硫酸マグネシウムで乾燥する。有機相を濾過し、ロータリーエバポレーターにかけ、そして残渣をトルエンと共に共蒸発させる。次に、これをトルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（４４〜８０％ＡｃＯＥｔ）を用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィー処理する。白色フォーム３.１２ｇ（４.５６ミリモル；４６％）が得られる。
【００３６】
１.３  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル〔２−(４−ニトロフェニル）エチル〕）ホスフィトアミド
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−デオキシアデノシン４００mg（０.５８ミリモル）をアセトニトリル５mlに溶解し、そしてビス（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−（４−ニトロフェニル）エトキシホスファン３１３mg（０.７９ミリモル）およびテトラゾール２０mg(０.２９ミリモル)を加える。１時間撹拌した後、混合物を保護ガス下にロータリーエバポレーターにかけ、そして残渣をジクロロメタン５０mlに溶解し、この溶液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液５０mlで抽出する。ＭｇＳＯ4で乾燥した後、ロータリーエバポレーターにかける。残渣をトルエン／ＡｃＯＥｔ（１：１）を用いてシリカゲル（ＳｉＯ2の６ｇ）でクロマトグラフィー処理し、白色フォーム３８０mg（０.３９ミリモル；６７％）を得る。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.79(トルエン/AcOEt 1:9)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.91 (s, 1H, H-C(2)), 8.80 (s, 1H, H-C(8)), 8.07 (m, 6H, 4H pth, 2H o から NO2), 7.46 (d, 2H, 2H m から NO2), 7.16 (m, 9H, DMTr), 6.80 (m, 4H, oから OCH3), 6.51 (t, 1H, H-C(1′)), 4.75 (m, 1H, H-C(3′)), 4.13 (m, 1H, H-C(4′)), 3.75 (m, 8H, CH2O, 2×O-CH3), 3.50 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 3.20 (m, 6H, CH2-フェニル, 2×N-CH, H-C(2′), H-C(2″)), 1.01 (m, 12H, 2×C(CH3)2)；31P-NMR (DMSO, 161.7 MHz)：1s 147.50；C53H54N7O10P1 (980.04)；計算値：C 64.95, H 5.55, N 10.00；実測値：C 64.15, H 5.53, N 9.72
【００３７】
実施例２
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−デオキシアデノシン（実施例１.２）５００mg（０.７３ミリモル）をアセトニトリル５mlに溶解し、そしてビス−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファン２８０mg（０.９２ミリモル）およびテトラゾール２６mg(０.３７ミリモル)を加える。混合物を保護ガス下に１.５時間撹拌した後、ジクロロメタン７０mlおよび炭酸水素ナトリウム溶液６０mlで抽出する。ＭｇＳＯ4で乾燥した後、ロータリーエバポレーターにかける。残渣をトルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（４０〜５０％ＡｃＯＥｔ）中シリカゲル（ＳｉＯ2の９ｇ）でクロマトグラフィー処理し、白色フォーム４３０mg（０.４９ミリモル；６７％）を得る。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.33/0.42(トルエン/AcOEt 1:1)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.92 (s, 1H, H-C(2)), 8.82 (s, 1H, H-C(8)), 8.09 (m, 4H, pth), 7.33 (m, 2H, DMTr), 7.21 (m, 7H, DMTr), 6.82 (m, 4H, o から OCH3), 6.55 (m, 1H, H-C(1′)), 4.82 (m, 1H, H-C(3′)), 4.27 (m, 1H, H-C(4′)), 3.65 (m, 10H, CH2O, 2×O-CH3, H-C(5′), H-C(5″)), 3.20 (m, 4H, 2×N-CH, H-C(2′), H-C(2″)), 1.10 (m, 12H, 2×C(CH3)2)；31P-NMR (DMSO, 161.7 MHz)：2s 148.51/147.99；C48H50N7O8P1(883.95)；計算値：C 65.22, H 5.70, N 11.09；実測値：C 64.94, H 5.78, N 10.87
【００３８】
実施例３
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシシチジン−３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
３.１  Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシシチジン
実施例１.１と同様にして合成を実施する：２′−Ｏ−デオキシシチジン５.８ｇ（２２ミリモル）をクロロトリメチルシラン７ml（５５ミリモル）と一緒にピリジン８０ml中で撹拌し、そして１時間後に乾燥ジオキサン１０ml中塩化フタロイル４.４ml（３３ミリモル）を６０分かけて滴加する。ＤＭＡＰ ５０mgを加え、そして４５分後に水で反応を停止させる。混合物をさらに１５分間撹拌する。混合物をジクロロメタン中の１０％ピリジンおよび水１００mlで抽出する。有機相を水１００mlで洗い、そして水相をジクロロメタン中の１０％ピリジン各５０mlで２回逆抽出する。乾燥し、そしてロータリーエバポレーターで蒸発させた後、残渣をトルエンと共に共蒸発させ、残渣をジクロロメタンでスラリーとし、そして吸引濾過する。黄土色粉末５.０７ｇ（１４.２ミリモル；６４％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.10(トルエン/AcOEt/MeOH 5:4:1)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.63 (d, 1H, H-C(6)), 8.01 (m, 4H, pth), 6.69 (d, 1H, H-C(5)), 6.10 (t, 1H, H-C(1′)), 5.30 (d, 1H, HO-C(3′)), 5.11 (t, 1H, HO-C(5′)), 4.23 (m, 1H, H-C(3′)), 3.91 (m, 1H, H-C(4′)), 3.63 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.38 (m, 1H, H-C(2′)), 2.14 (m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：〔331/3.68〕, 316/3.80, 〔306/3.79〕, 218/4.51；C17H15N3O6 (357.32)；計算値：C 57.14, H 4.23, N 11.76；実測値：C 57.21, H 4.45, N 11.66
【００３９】
３.２  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシシチジン
実施例１.２と同様にして合成を実施する：Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン５０mg（０.４１ミリモル）および４Å分子ふるいと共にピリジン６０ml中のＮ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシシチジン３ｇ（８.３９ミリモル）を２時間４,４−ジメトキシトリチルクロライド３.１３ｇ（９.２３ミリモル）と共に撹拌する。ジクロロメタン１００mlおよび炭酸水素ナトリウム溶液１００mlで抽出した後、トルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（３３〜７５％ＡｃＯＥｔ）を用いてシリカゲル（７.５ｇ）でクロマトグラフィー処理をする。白色フォーム３.３５ｇ（５.１０ミリモル；６１％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.39(トルエン/AcOEt/MeOH 5:4:1)；1H-NMR (DMSO, 250MHz)：8.42 (d, 1H, H-C(6)), 7.99 (m, 4H, pth), 7.30 (m, 9H, DMTr), 6.92 (m, 4H, o から OCH3), 6.53 (d, 1H, H-C(5)), 6.11 (t, 1H, H-C(1′)), 5.40(d, 1H, HO-C(3′)), 4.31 (m, 1H, H-C(3′)), 4.01 (m, 1H, H-C(4′)), 3.73 (s, 6H, 2×O-CH3), 3.33 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.40 (m, 1H, H-C(2′)), 2.20 (m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：〔331/3.68〕, 317/3.84, 〔306/3.83〕, 283/3.72, 〔275/3.69〕, 232/4.65；C38H33N3O8 (659.70)；計算値：C 69.19, H 5.04, N 6.37；実測値：C 69.29, H 5.35, N 6.17
【００４０】
３.３  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシシチジン−３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
実施例２と同様にして合成を実施する：５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−デオキシシチジン６６０mg（１ミリモル）をアセトニトリル７mlに溶解し、そしてビス−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファン３６２mg（１.２ミリモル）およびテトラゾール３５mg（０.５ミリモル）を加える。１.５時間後、ジクロロメタン１００mlおよび炭酸水素ナトリウム溶液６０mlで抽出をする。トルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（４０〜５０％ＡｃＯＥｔ）中シリカゲル(ＳｉＯ2の８ｇ）でクロマトグラフィー処理をする。白色フォーム６２０mg（０.７２ミリモル；７２％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.47/0.51(トルエン/AcOEt 1:6)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.45 (m, 1H, H-C(6)), 7.99 (m, 4H, pth), 7.30 (m, 9H, DMTr), 6.91 (m, 4H, o から OCH3), 6.55 (d, 1H, H-C(5)), 6.15 (m, 1H, H-C(1′)), 4.52 (m, 1H, H-C(3′)), 4.17 (m, 1H, H-C(4′)), 3.72 (s, 6H, 2×O-CH3), 3.60 (m, 6H, H-C(5′), H-C(5″), CH2O, 2×N-CH)), 2.70 (2t, 2H, CH2CN), 2.60 (m, 1H, H-C(2′)), 2.40 (m, 1H, H-C(2″)), 0.97-1.19 (m, 12H, 2×C(CH3)2)；31P-NMR (DMSO, 161.7 MHz)：2s 148.63/148.38；C47H50N5O8P1 (859.91)；計算値：C 65.65, H 5.86, N 8.14：実測値：C 64.16, H 6.04, N 8.23
【００４１】
実施例４
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
４.１  Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン
実施例１.１と同様にして合成を実施する。
変法Ａ：ピリジン／水によるトリメチルシリル基の除去
Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−２′−デオキシグアノシン８３３mg（２ミリモル）をピリジン１５ml中クロロトリメチルシラン０.６３ml（５ミリモル）と共に撹拌し、そして３０分後乾燥ジオキサン５ml中の塩化フタロイル０.４３ml（３ミリモル）を１５分間かけて滴加する。２時間後、水で反応を停止させ、それから混合物をさらに１５分間撹拌する。混合物を炭酸水素ナトリウム溶液５０mlおよびジクロロメタン５０mlで２回抽出し、次に水相を再びジクロロメタン５０mlで抽出する。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。残渣をトルエン／ＡｃＯＥｔ（５：４）−ＭｅＯＨ勾配（０〜５％ＭｅＯＨ）でフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム（ＳｉＯ2の２５ｇ）で精製する。若干黄色味を帯びたフォーム０.５６ｇ（１.０２ミリモル；５１％）が得られる。
【００４２】
変法Ｂ：フッ化アンモニウムによるトリメチルシリル基の除去
Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−２′−デオキシグアノシン８３３mg（２ミリモル）をピリジン１５ml中でクロロトリメチルシラン０.６３ml（５ミリモル）と共に撹拌し、そして３０分後に乾燥ジオキサン２ml中の塩化フタロイル０.５７ml（４ミリモル）を５分間かけて滴加する。２時間後、混合物をロータリーエバポレーターにかけ、そして残渣をトルエンと共に共蒸発させ、次にＭｅＯＨ ２０ml中のフッ化アンモニウム１６０mg（４.３ミリモル）で処理する。混合物を３分間撹拌し、次に炭酸水素ナトリウム溶液１００mlおよびジクロロメタン１００mlで２回抽出し、そして水相を再びジクロロメタン５０mlで抽出する。トルエン／ＡｃＯＥｔ（５：４）−ＭｅＯＨ勾配（０〜５％ＭｅＯＨ）中フラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム（ＳｉＯ2の２５ｇ）で精製する。若干黄色味を帯びたフォーム０.４５ｇ(０.８２ミリモル；４１％)が得られる。
【００４３】
変法Ｃ:テトラブチルアンモニウムフルオリドによるトリメチルシリル基の除去Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−２′−デオキシグアノシン８３３mg（２ミリモル）をピリジン１５ml中クロロトリメチルシラン０.７ml（５.５ミリモル）と共に撹拌し、そして３０分後に乾燥ジオキサン３ml中の塩化フタロイル０.５５ml（３.８ミリモル）を１０分間かけて滴加する。２時間後、テトラブチルアンモニウムフルオリド・三水和物１.２６ｇ（４ミリモル）を加え、そして混合物を５分間撹拌する。次にこれを炭酸水素ナトリウム溶液１００mlおよびジクロロメタン１００mlで抽出し、そして水相を再びジクロロメタン５０mlで抽出する。トルエン／ＡｃＯＥｔ（５：４）−ＭｅＯＨ勾配（０〜５％ＭｅＯＨ）でフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム（ＳｉＯ2の２５ｇ）で精製する。若干黄色味を帯びたフォーム０.３９ｇ(０.７１ミリモル；３６％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.42(クロロホルム/メタノール 9:1)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.71 (s, 1H, H-C(8)), 8.14 (d, 2H, 2H o から NO2), 8.00 (m, 4H, pth), 7.61 (d, 2H, 2H m から NO2), 6.39 (t, 1H, H-C(1′)), 5.32 (d, 1H, HO-C(3′)), 4.91 (t, 1H, HO-C(5′)), 4.83 (t, 2H, CH2O), 4.40 (m, 1H, H-C(3′)), 3.85 (m, 1H, H-C(4′)), 3.51-3.58 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 3.32 (t, 2H, CH2-フェニル), 2.74 (m, 1H, H-C(2′)), 2.32 (m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：262/4.34, 219/4.68；C26H22N6O8 (546.50)；計算値：C 57.14, H 4.06, N 15.38；実測値：C 57.27, H 4.37, N 15.11
【００４４】
４.２  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン
実施例１.２と同様の合成：Ｏ6−〔２−(４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン９９０mg（１.８１ミリモル）をピリジン２５mlに溶解し、４,４−ジメトキシトリチルクロライド６７４mg（１.９９ミリモル）を加え、そして混合物を３時間撹拌する。これをＡｃＯＥｔの１００mlおよび炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液１００mlで抽出する。次に、トルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（２０〜６６％ＡｃＯＥｔ）でシリカゲル（ＳｉＯ2の２５ｇ)でクロマトグラフィー処理し、白色フォーム１.００ｇ（１.１８ミリモル；６７％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.57(トルエン/AcOEt 1:6)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.59 (s, 1H, H-C(8)), 8.13 (d, 2H, 2H o から NO2), 8.00 (m, 4H, pth), 7.60 (d, 2H, 2H m から NO2), 7.10-7.26 (m, 9H, DMTr), 6.68 (m, 4H, o から OCH3), 6.43 (m, 1H, H-C(1′)), 5.36 (d, 1H, HO-C(3′)), 4.81 (t, 2H, CH2O), 4.46 (m, 1H, H-C(3′)), 3.95 (m, 1H, H-C(4′)), 3.67 (s, 6H, 2×O-CH3), 3.32 (t, 2H, CH2-フェニル), 3.05-3.25 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.85 (m, 1H, H-C(2′)), 2.38 （m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：262/4.38, 218/4.78；C47H40N6O10 (848.87)；計算値：C 66.50, N 4.75, N 9.90；実測値：C 66.65, H 4.90, N 9.52
【００４５】
４.３  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
テトラゾールの代わりにピリジン塩酸塩を用いる以外は、実施例１.３と同様の合成。収率：８７％。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.74/0.82(トルエン/AcOEt 1:6)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.63 (s, 1H, H-C(8)), 8.13 (s, 2H, 2H o から NO2), 8.00 (m, 4H, pth), 7.61 (s, 2H, 2H m から NO2), 7.08-7.24 (m, 9H, DMTr), 6.63-6.71 (m, 4H, DMTr), 6.45 (m, 1H, H-C(1′)), 4.80 (m, 3H, H-C(3′), CH2O), 4.10 (m, 1H, H-C(4′)), 3.66および3.67 (2s, 6H, 2×OCH3), 2.95-3.59 (m, 10H, NC-CH2O, H-C(5′), H-C(5″)), 2×N-CH, CH2CN, CH2-フェニル), 2.72 (m, 1H, H-C(2′)), 2.61 (m, 1H, H-C(2″)), 0.90-1.20 (m, 12H, 2×C(CH3)2)；31P-NMR (DMSO, 161.7 MHz)：2s 148.55/148.05；C56H57N8O11P1 (1049.09)；計算値：C 64.11, H 5.48, N 10.68；実測値：C 63.92, N 5.47, H 10.12
【００４６】
実施例５
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
５.１  Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン
実施例１.１と同様にして合成を実施する。
変法Ａ：ピリジン／水によるトリメチルシリル基の除去
Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−２′−デオキシグアノシン３００mg（０.６９ミリモル）をピリジン１０ml中でクロロトリメチルシラン０.２２ml（１.７ミリモル）と共に撹拌し、そして３０分後乾燥ジオキサン２ml中の塩化フタロイル０.１４ml（０.９７ミリモル）を７分間かけて滴加する。１時間後、水で反応を停止させ、次に混合物をさらに１５分間撹拌する。これを水２５mlおよびジクロロメタン２５mlで２回抽出し、そして水相を再びジクロロメタン２５mlで抽出する。石油エーテル／アセトン勾配（５０〜６０％アセトン）でフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム（ＳｉＯ2の７ｇ）で精製する。ほとんど無色のフォーム０.１４ｇ（０.２４ミリモル；３６％）が得られる。
【００４７】
変法Ｂ：フッ化アンモニウムによるトリメチルシリル基の除去
Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−２′−デオキシグアノシン０.８７ｇ（２ミリモル）を乾燥アセトニトリル１５mlおよびピリジン１.０３ml中でクロロトリメチルシラン０.５６ml（４.４ミリモル）と共に撹拌し、そして３０分後に塩化フタロイル０.２９ml（２ミリモル）を滴加する。３５分後、混合物をロータリーエバポレーターにかけ、残渣をトルエンと共に共蒸発させ、そしてＭｅＯＨ ２５ml中のフッ化アンモニウム１６０mgで処理する。この混合物を３分間撹拌し、炭酸水素ナトリウム溶液１００mlおよびジクロロメタン１００mlで２回抽出し、そして水相を再びジクロロメタン５０mlで抽出する。石油エーテル／アセトン勾配（３０〜７５％アセトン）でフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルカラム（ＳｉＯ2の２５ｇ）で精製する。若干黄色味を帯びたフォーム０.４５ｇ（０.７９ミリモル；４０％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.27(石油エーテル/アセトン 1:2)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.65 (s, 1H, H-C(8)), 7.96-8.7 (m, 4H, pth), 7.82 (m, 2H, o から SO2), 7.36-7.49 (m, 3H, 2H m から SO2, 1H p から SO2), 6.37 (t, 1H, H-C(1′)), 5.32 (d, 1H, HO-C(3′)), 4.92 (t, 1H, HO-C(5′)), 4.80 (t, 2H, CH2O), 4.41 (m, 1H, H-C(3′)), 4.12 (t, 2H, CH2SO2), 3.86 (m, 1H, H-C(4′)), 3.45-3.65 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.72 (m, 1H, H-C(2′)), 2.33 (m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：〔294/3.50〕, 259/4.26, 219/4.73；C26H23N5O8S1×H2O (583.58)；計算値：C 53.51, H 4.32, N 12.00；実測値：C 53.95, H 4.45, N 11.72
【００４８】
５.２  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン
実施例１.２と同様な合成：ピリジン２０ml中のＯ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ6−フタロイル−２′−デオキシグアノシン５６０mg（１ミリモル）を４,４−ジメトキシトリチルクロライド３７３mg（１.１ミリモル）と共に１６時間撹拌する。混合物をジクロロメタン１００mlおよび炭酸水素ナトリウム飽和溶液１００mlで抽出する。トルエン／ＡｃＯＥｔ勾配（３０〜８０％ＡｃＯＥｔ）でシリカゲル（ＳｉＯ2の２０ｇ）でクロマトグラフィー処理し、若干黄色味を帯びたフォーム５７０mg（０.６６ミリモル；６６％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.39(トルエン/AcOEt/MeOH 5:4:1)；1H-NMR (DMSO, 250MHz)：8.55 (s, 1H, H-C(8)), 8.01-8.07 (m, 4H, pth), 7.82 (m, 2H, 2H o から SO2), 7.32-7.38 (m, 3H, 2H m から SO2, 1H p から SO2), 7.05-7.27 (m, 9H, DMTr), 6.67-6.73 (m, 4H, o から OCH3), 6.41 (m, 1H, H-C(1′)), 5.37 (d, 1H, HO-C(3′)),  4.79 (t, 2H, CH2O), 4.46 (m, 1H, H-C(3′)), 4.10 (t, 2H, CH2SO2), 3.96 (m, 1H, H-C(4′)), 3.68 (s, 6H, 2×OCH3), 3.09-3.25 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.81 (m, 1H, H-C(2′)), 2.35 (m, 1H, H-C(2″))；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：261/4.26, 217/4.80；C47H41N5O1OS1 (867.93)；計算値：C 65.04, H 4.76, N 8.07；実測値：C 64.97, H 4.82, N 7.88
【００４９】
５.３  ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスフィトアミド
実施例２と同様の合成：５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（フェニルスルホニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン４７０mg（０.５４ミリモル）をアセトニトリル８mlに溶解し、そしてビス（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファン１９６mg（０.６５ミリモル）およびピリジニウムクロライドの０.５Ｍ溶液０.５４mlを加える。３時間後、さらにホスファン１５０mgおよびピリジニウムクロライド溶液０.２７mlを加え、そして混合物をさらに３.５時間撹拌する。このものをジクロロメタン５０mlおよび炭酸水素ナトリウム溶液５０mlで抽出する。トルエン／酢酸エチル勾配（３３〜５０％ＡｃＯＥｔ）でクロマトグラフィー処理し、白色フォーム４２０mg（０.３９ミリモル）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.49/0.60(石油エーテル/AcOEt/トリエチルアミン 1:9:1)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：8.57 (2s, 1H, H-C(8)), 7.98-8.03 (m, 4H, pth), 7.81 (m, 2H, 2H o から SO2), 7.31-7.40 (m, 3H, 2H m から SO2, 1H o から SO2), 7.08-7.25 (m, 9H, DMTr), 6.39-6.73 (m, 4H, DMTr), 6.43 (m, 1H, H-C(1′)), 4.78 (m, 3H, H-C(3′), CH2O), 4.10 (m, 3H, CH2SO2, H-C(4′)), 3.66および3.67 (2s, 6H, 2×OCH3), 3.30-3.60 (m, 4H, NC-CH2O, 2×N-CH), 3.23 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 3.00 (m, 1H, H-C(2′)), 2.62および2.73(2t, 2H, CH2CN), 2.50 (m, 1H, H-C(2″)), 0.86-1.19 (m, 12H, 2×C(CH3)2)；31P-NMR (DMSO, 161.7 MHz)：2s 148.54/148.06；C56H58N7O11P1S1 (1068.15)；計算値：C 62.97, H 5.47, N 9.18；実測値：C 62.25, N 5.65, H 8.82
【００５０】
実施例６
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−３′−Ｏ−スクシノイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−フタロイル−２′−Ｏ−デオキシアデノシン（実施例１.２）３４２mg（０.５ミリモル）を無水ジクロロメタン１０mlに溶解し、そして４,４−ジメチルアミノピリジン７９mg（０.６５ミリモル）および無水コハク酸１００mg（１ミリモル）を加える。１７時間後、混合物をジクロロメタン５０mlで希釈し、そして炭酸水素ナトリウム飽和溶液３０ml次いで１０％クエン酸で抽出する。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥した後、ロータリーエバポレーターにかけ、そして高真空下に残渣を乾燥すると、白色フォーム３９０mg（０.４９ミリモル；９８％）が得られる。
TLC(シリカゲル)：Rf=0.17(トルエン/AcOEt/MeOH 5:4:1)；1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：12.30 (s, 1H, COOH), 8.91 (s, 1H, H-C(2)), 8.82 (s, 1H, H-C(8)), 8.06 (m, 4H, pth), 7.17 (m, 9H, DMTr), 6.83 (m, 4H, o から OCH3), 6.56 (t, 1H, H-C(1′)), 5.45 (m, 1H, H-C(3′)), 4.25 (m, 1H, H-C(4′)), 3.70 (s, 6H, 2×O-CH3), 3.33 (m, 2H, H-C(5′), H-C(5″)), 2.58 (m, 6H, H-C(2′), H-C(2″), CH2CH2)；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：〔300/3.60〕, 271/4.17, 〔220/4.72〕；C43H37N5O10×H2O(801.82)；計算値：C 64.41, H 4.90, N 8.73；実測値：C 64.47, H 4.98, N 8.74
【００５１】
実施例７
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−３′−Ｏ−スクシノイル−２′−Ｏ−デオキシグアノシン
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−２′−デオキシグアノシン２１２mg（０.２５ミリモル）を無水ジクロロメタン５mlに溶解し、そして無水コハク酸５０mg（０.５ミリモル）および４,４−ジメチルアミノピリジン４０mg（０.３２ミリモル）を加える。混合物を２４時間撹拌した後、これをジクロロメタン６０mlで希釈し、そしてこの混合物を炭酸水素ナトリウム飽和溶液４０ml次に１０％クエン酸溶液４０mlで抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後、これをロータリーエバポレーターにかけ、そして残渣を高真空下で乾燥する。若干黄色味を帯びたフォーム２１０mg（０.２２ミリモル；８８％）が得られる。
1H-NMR (DMSO, 250 MHz)：12.27 (s, 1H, COOH), 8.61 (s, 1H, H-C(8)), 8.14 (d, 2H, 2H o から NO2), 7.96-8.05 (m, 4H, pth), 7.61 (d, 2H, 2H m から NO2), 7.05-7.27 (m, 9H, DMTr), 6.65-6.71 (m, 4H, o から OCH3), 6.44 (t, 1H, H-C(1′)), 5.36 (m, 1H, H-C(3′)), 4.82 (t, 2H, OCH2), 4.14 (m, 1H, H-C(4′)), 3.67 (s, 6H, 2×O-CH3), 3.16-3.42 (m, 4H, H-C(5′), H-C(5″), CH2-フェニル), 2.45-2.60 (m, 6H, H-C(2′), H-C(2″), CH2CH2)；UV (ACN)：λmax (nm)/logε：262/4.37, 216/4.78
【００５２】
実施例８
８.１  長鎖メチルアミノアルキル（ＬＣＭＡＡ）−ＣＰＧの支持体−誘導体合成
１０００Åもしくは１４００Å ＣＰＧ材料１ｇを高真空下に１.５時間乾燥する。カルボニルジイミダゾール１ｇ（１２.４ミリモル）を乾燥ジクロロメタン２０mlに溶解し、そして乾燥したＣＰＳ支持体材料を加え、そして全体を６時間バイブレーターで十分に混和する。上層の液を傾瀉し、そして乾燥ジクロロメタンによる消化を３回実施する。この後に、乾燥ジクロロメタン１５mlにとり、次に１,６−ビス（メチルアミノ）ヘキサン１ml（５.８ミリモル）を加える。バイブレーター上で３時間後に、上澄液を傾瀉し、そして次に吸引濾過し、ピリジン、ＤＭＦ、メタノール、アセトンおよびジエチルエーテルで順次洗浄する。次に、高真空下に乾燥する。
【００５３】
８.２  フタロイル保護スクシネートによるＬＣＭＡＡ−ＣＰＧのローディングＬＣＭＡＡ−ＣＰＧの４００mgを乾燥アセトニトリル５ml中で２時間７mgのＴＯＴＵ（Ｏ−〔（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ〕−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート：W. Koenig, G. Breipohl, P. Pokorny, M. Birkner, Proceedings of the 21st European Peptide Symposium 1990, E. Giralt, D. Andreu. Eds., ESCOM, Leiden. 143頁)（21μmol）、Ｎ−メチルモルホリン３μl（２７μmol）およびヌクレオシドスクシネート２３μmolと共に振盪する。吸引濾過し、フィルター残渣をＤＭＦ、メタノール、アセトンおよびジエチルエーテルで順次洗浄する。
【００５４】
キャッピング：
ヌクレオシドをローディングした支持体を０.５時間ＤＭＡＰ １０mg、無水酢酸０.５mlおよびピリジン１０mlと共に振盪する。次に、吸引濾過を行い、フィルター残渣をＤＭＦ、メタノール、アセトンおよびジエチルエーテルで順次洗浄する。５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ6−〔２−（４−ニトロフェニル）エチル〕−Ｎ2−フタロイル−３′−Ｏ−スクシニル−２′−デオキシグアノシンの場合、Ｎ−メチルイミダゾール０.５ml、無水酢酸０.５mlおよびピリジン５mlからなる混合物を用いてキャッピングを実施する。
次のとおりのローディングが得られる：
【００５５】
0004435878.tif 000011
【００５６】
８.３  無水コハク酸によるＬＣＭＡＡ−ＣＰＧの誘導体合成
１４００Å ＬＣＭＡＡ−ＣＰＧ ５００mgを乾燥ピリジン４ml中で２４時間ＤＭＡＰ １２mg（０.１ミリモル）および無水コハク酸４００mgと共に振盪する。吸引濾過を行い、フィルター残渣をピリジンおよびジクロロメタンで洗浄する。フタロイルで保護された５′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシドによるスクシニル−ＬＣＭＡＡ−ＣＰＧのローディング
乾燥ピリジン３mlおよびトリエチルアミン１２μlを、スクシニル化ＬＣＭＡＡ−ＣＰＧ １５０mg、ＤＭＡＰ １.８mg（０.０１５ミリモル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）エチルカルボジイミド２９mg（０.１５ミリモル）および５′−Ｏ−ＤＭＴｒ保護されたフタロイル化合物０.０１５ミリモルに加える。混合物を２４時間振盪し、次にペンタクロロフェノール２０mg（０.０７ミリモル）を加え、そして全体をさらに２３時間振盪する。次に、ピペリジン０.７５mlを加え、そして５分後直ちに吸引濾過し、そしてフィルター残渣をジクロロメタンおよびジエチルエーテルで引き続いて洗浄する。
【００５７】
キャッピング：
ヌクレオシドをローディングした支持体を、Ｎ−メチルイミダゾール０.５ml無水酢酸０.５mlおよびピリジン５mlからなる混合物と共に、１.５時間振盪し、次いでＤＭＦ、メタノール、アセトンおよびジエチルエーテルで洗浄する。
次のとおりのローディングが得られる：
0004435878.tif 000012
【００５８】
実施例９
オリゴヌクレオチド合成
未修飾オリゴヌクレオチドを標準ホスホルアミダイト合成サイクルを用いて自動ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems Model 392）で合成した。フタロイル方法により、含水酸化混合物ヨウ素／ピリジン／ＴＨＦ／水もしくはアセトニトリル中でｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用する無水の酸化の使用が可能となる。酸化時間はヨウ素については１５秒またｔ−ブチルヒドロペルオキシドについては９０秒である。合成サイクルが完了した後、保護基を除去し、一方オリゴヌクレオチドは１５分乃至１２時間の間、ｎ−メチルイミダゾールもしくはアセトニトリル中ＤＢＵ（下記を参照）（ＤＢＵ：１,８−ジアザビシクロ〔６.４.０〕ウンデカ−７−エン）と共に、なお支持体上に存在している。すべての保護基が除去されたオリゴヌクレオチドは次に濃アンモニア水（２５％）による処理によって支持体から遊離される。ここで、オリゴヌクレオチドはアンモニア溶液中に極めて純粋な形態で存在し、そしてアンモニア溶液を凍結乾燥することによって得られる。フタロイル方法では、アシル方法とは対照的に、保護基を除去するためのＨＰＬＣもしくはＰＡＧＥによる付加的な精製を必要としない。
【００５９】
実施例１〜５に記載のホスホルアミダイトおよび実施例８に記載の誘導化固体支持体を用いて、次のとおりの配列が合成された。個々の配列において、保護基を除去するために記載した条件を変えて好結果を得た。
【表１】
0004435878.tif 000013
【００６０】
実施例１〜５に記載のホスホルアミダイトおよび実施例８に記載の固体支持体を用いて、次のとおりの配列を合成した。この場合、アセトニトリル中０.５Ｍピリジン塩酸塩の溶液をテトラゾールに代わって賦活物質として使用し、縮合時間は１２〜３０秒であった。個々の配列において、保護基を除去するために記載した条件を変えて好結果を得た。
【００６１】
【表２】
0004435878.tif 000014
【００６２】
オリゴヌクレオチドの高純度（＞９５％）はＨＰＬＣで確認した。
ＨＰＬＣ：勾配：
（逆相；ＲＰ１８）；流速１ml／分
溶液Ａ：０.１Ｎ ＴＥＡＡｃ pH７
溶液Ｂ：０.１Ｎ ＴＥＡＡｃ：ＡｃＣＮ １：１
工程  分  容量％ 容量％
１       ０     ９５         ５
２       ２     ９５         ５
３     ３２     ６０       ４０
４     ４５       ０     １００
５     ５０     ９５         ５
６     ５５     ９５         ５