(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として式（Ｉ）
【化１】
0004598203.tif 000007
［式中、Ｒ１が水酸基を示す場合にはＲ２は水素原子を示し、または、Ｒ１およびＲ２が合わしてオキソ基を示す。Ｒ３は、水素原子、アルカリ金属塩または１〜３価アルコール残基を示す。Ｒ１が水酸基を、Ｒ２、Ｒ３が共に水素原子を示す場合には、２〜１０量体からなるオリゴマーであってもよい］で示される化合物、及び薬学的に許容される担体を含有することからなる脳浮腫抑制剤。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよびβ−ヒドロキシ酪酸エステルから選ばれる化合物である請求項１に記載の脳浮腫抑制剤。
【請求項３】
有効成分として式（Ｉ）
【化２】
0004598203.tif 000008
［式中、Ｒ１が水酸基を示す場合にはＲ２は水素原子を示し、または、Ｒ１およびＲ２が合わしてオキソ基を示す。Ｒ３は、水素原子、アルカリ金属塩または１〜３価アルコール残基を示す。Ｒ１が水酸基を、Ｒ２、Ｒ３が共に水素原子を示す場合には、２〜１０量体からなるオリゴマーであってもよい］で示される化合物、及び薬学的に許容される担体を含有することからなる脳梗塞巣縮小剤。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム、およびβ−ヒドロキシ酪酸エステルから選ばれる化合物である請求項３に記載の脳梗塞巣縮小剤。
【請求項５】
非経口輸液、非経口注射または経腸輸液の水溶液としての形態にある請求項１ないし４に記載の製剤。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物を５〜５００ｍＭ含有する請求項１〜５のいずれに記載の製剤。
【請求項７】
頭部外傷、脳腫瘍、脳出血、頭蓋内血腫及び脳虚血後期から選択される血管原性浮腫；脳虚血、重傷頭部外傷及び低酸素血症から選択される細胞傷害性浮腫に使用する請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳機能改善剤に係り、詳細には、脳浮腫抑制作用、脳機能保護作用、脳エネルギー代謝改善作用または脳梗塞巣縮小作用等を示す脳機能改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、脳血管疾患や交通事故等による頭部外傷患者が増加してきており、この場合には脳浮腫や、脳エネルギー代謝障害を伴うことが多い。このような原因としては、脂肪を多く摂取するように変化してきた食生活や、老齢人口の増加により脳血管障害等が増加していることが考えられている。
【０００３】
ところでこの脳機能障害のひとつである脳浮腫は、種々の病因により脳実質の水分含量が増加し、これにより脳容積の増加が惹起された状態をいい、脳浮腫は一時的に神経細胞の代謝、機能障害を起こすだけでなく、頭蓋内圧を亢進させ、脳循環障害や代謝障害を引き起こす。これらの変化は脳浮腫をさらに増悪させ、脳ヘルニアに進行し致命的な結果をもたらす場合もある。
このような脳浮腫は、その発生の原因により、以下の血管原性浮腫と細胞原性浮腫の２種に大きく分類される。
【０００４】
▲１▼  血管原性浮腫：脳毛細血管の血液脳関門が破綻することにより、血管から血液成分が脳組織内に漏出して細胞間隙に貯留することにより発生する。脳挫傷、脳腫瘍、脳膿腫、脳出血、頭蓋内血腫等を原因とする。
▲２▼：細胞障害性浮腫：脳実質のエネルギー代謝が障害され、乳酸が蓄積し細胞が障害を受けることにより発生する。脳虚血、低酸素血症、乳酸アシドーシス等を原因とする。
【０００５】
このような病態に対して行われている脳浮腫の治療法、薬剤としては以下のようなものがあげられる。
▲１▼  高張溶液：高張溶液の投与により血液浸透圧を上昇させ、脳組織内の水分を血管内に引き込むことを利用して脳浮腫を軽減する。しかしこの方法では、血液中の薬剤濃度が低下すると血液浸透圧も低下するため、逆に組織内に水が引き込まれるリバウンド現象が認められる。
【０００６】
▲２▼  副腎皮質ステロイド：血液脳関門の維持・膜の安定・抗炎症作用、髄液産生抑制作用により脳腫瘍や脳膿瘍による血管原性浮腫の治療に用いられる。しかしながら、虚血性神経細胞障害を悪化させたとする報告がある。
【０００７】
▲３▼  抗酸化剤：虚血時や細胞障害時に発生するフリーラジカルを消去することにより脳浮腫を軽減する。
【０００８】
▲４▼  カルシウム拮抗剤：浮腫が起きると脳組織内にカルシウムが流入して遅発性の神経細胞死が起きるため、これを阻害する目的で投与する。しかしながら、カルシウム拮抗剤には血管拡張作用があるため、脳血流量を増加しかえって脳浮腫を増悪する場合もある。
【０００９】
▲５▼  バルビタール療法：脳の代謝を抑制し、脳の酸素およびブドウ糖消費を低下させ、虚血に対する抵抗性を高め、乳酸蓄積とアシドーシスの進展を抑制し、脳を保護する。しかしながら、バルビタールが効力を示す用量では、呼吸抑制および循環毒性が現れるため、呼吸管理、循環管理が必要である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、脳浮腫の抑制・治療に用いる優れた薬剤、特にリバウンド等の副作用がない薬剤の開発が求められているのが現状である。
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意検討した結果、β−ヒドロキシ酪酸またはその塩もしくはそのエステル誘導体について脳機能改善作用を検討したところ、これら化合物が脳浮腫に対して、脳中電解質および脳エネルギー代謝を改善することにより脳浮腫抑制作用を示すこと、さらには脳エネルギー代謝改善により脳内ミトコンドリアの保護が行われ、脳虚血により引き起こされた脳梗塞巣の縮小作用があることを確認した。
したがって、本発明は、脳機能改善剤を提供するものであり、特に、脳機能改善作用が、脳浮腫抑制作用、脳機能保護作用、脳エネルギー代謝改善作用または脳梗塞巣縮小作用としての改善作用である脳機能改善剤を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
しかして本発明は、式（Ｉ）
【００１２】
【化２】
0004598203.tif 000002
【００１３】
［式中、Ｒ1 が水酸基を示す場合にはＲ2 は水素原子を示し、または、Ｒ1 およびＲ2 が合してオキソ基を示す。Ｒ3 は、水素原子、アルカリ金属または１〜３価アルコール残基を示す。Ｒ1 が水酸基を、Ｒ2 、Ｒ3 が水素原子を示す場合には２〜１０量体であってもよい。］で表される化合物を有効成分として含有する脳機能改善剤を提供する。
【００１４】
すなわち、本発明は式（Ｉ）で表される化合物［以下、化合物（１）と称する場合もある］を含有することを特徴とする脳機能改善剤を提供するものであり、特に、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよび／またはβ−ヒドロキシ酪酸エステルを用いることを特徴とする脳機能改善剤を提供するものである。
【００１５】
その態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物（１）の脳機能改善作用が、脳浮腫抑制作用、脳機能保護作用、脳エネルギー代謝改善作用、脳梗塞巣縮小作用等の改善作用を示す脳機能改善剤を提供する。
したがって、本発明はその具体的態様においては、上記式（Ｉ）で表される化合物（１）を有効成分として含有する脳浮腫抑制剤、脳機能保護剤、脳エネルギー代謝改善剤さらには脳梗塞巣縮小剤を提供するものでもある。
【００１６】
式（Ｉ）で表される化合物（１）の代表的化合物たるβ−ヒドロキシ酪酸（以下、ＢＨＢと略記する場合もある）はケトン体（アセトン、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸）の一つであって、脂肪酸の分解により肝臓で生成される化合物である。β−ヒドロキシ酪酸は糖尿病患者の尿中から発見されたこと、飢餓時に血中の値が高くなることから代謝の最終産物であり、生体にとって不必要な物と考えられていた。しかし、オウエン（Owen）らの肥満症の患者による５〜６週間絶食時の代謝の研究［J. Clin. Invest. 46(10), 1589-1595(1967)］により、β−ヒドロキシ酪酸がブドウ糖にかわって、脳でエネルギーとして利用されていることが明らかとなった。
【００１７】
β−ヒドロキシ酪酸は水溶性でありその分子量は１０４と小さく、β−ヒドロキシ酪酸１ｇあたり３．８ｋｃａｌのエネルギーを持つが、正常時においてはその血中濃度は０−３ｍｇ／ｄｌと低い値を示し、利用されることもなく尿中、呼気中に排泄される。絶食時、飢餓時には血中濃度が２０−３０ｍｇ／ｄｌ以上に上昇し、利用が始まる。これにより、β−ヒドロキシ酪酸が絶食時、飢餓時においてはブドウ糖にかわりうるエネルギー物質となることができる。生成されたβ−ヒドロキシ酪酸は肝臓を除く心臓、腎臓、脳、筋肉で代謝、利用される。
【００１８】
特開昭５８−２０１７４６号では、「３−ヒドキロシ酪酸から誘導された塩及び該塩を含有する薬剤組成物」を用いて、心筋代謝保護作用のあることを報告している。また、藤井らは［日本救急医学会雑誌  4(5), 484 (1993)］は、頭部外傷時にβ−ヒドロキシ酪酸を静脈内投与することにより、髄液中のケトン体濃度の上昇と乳酸濃度の減少を報告している。
しかしながら、式（Ｉ）で表される化合物（１）に脳エネルギー代謝障害時にエネルギー代謝改善効果があり、脳浮腫抑制作用、脳機能保護作用または脳梗塞巣縮小作用等の脳機能改善作用があることは知られていない。
【００１９】
本発明者らは、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムを静脈内に投与した後致死量のシアン化カリウム（ＫＣＮ）を静脈内投与する時、延命作用があることを見いだした。
シアン化カリウムは細胞内ミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼを阻害し、電子伝達系の酸素利用を抑制し、ＡＴＰの産生を停止させるために細胞毒性を発現すると考えられている。この作用を阻害するには、脳内へのグルコース取り込み促進、ミトコンドリアのコハク酸酸化促進、脳血流量増加等の作用が必要であるという報告がある。本発明者らは、β−ヒドロキシ酪酸を静脈から持続的に注入することにより、延命作用を認めたが、これは、β−ヒドロキシ酪酸の血中濃度が高まり、脳ＡＴＰの産生能が高まり、その結果、脳内にＡＴＰが蓄積されると考えられる。すなわち、β−ヒドロキシ酪酸の持続投与の後、致死量のシアン化カリウムを投与してアノキシアを誘導しても脳内ミトコンドリアの抵抗性が増加しているため、延命効果が認められていると考えられる。
【００２０】
更に本発明者らの検討によれば、動物モデルの両側総頸動脈を結紮して脳虚血を誘発させ、脳浮腫を惹起する段階でβ−ヒドロキシ酪酸を静脈より投与することにより、脳浮腫の発生を抑制することができることを見出した。
このときの脳内のＡＴＰ濃度を測定すると、高レベルに保持されていることから、β−ヒドロキシ酪酸が代謝され、ＴＣＡサイクルに組み込まれることによりＡＴＰの産生の増加あるいは消費の抑制が行われ、これによりＮａ+ ／Ｋ+ −ＡＴＰａｓｅ活性保持されることで、細胞内に滞留するナトリウム塩および水が汲み出された結果、脳浮腫が抑制されたものと考えられる。
【００２１】
また本発明者らは、中大脳動脈閉塞による局所脳虚血後、再潅流することにより局所に梗塞巣を作製する動物モデルにおいて、閉塞と共にβ−ヒドロキシ酪酸を投与すると、脳梗塞巣の明らかな縮小が確認された。このことは、β−ヒドロキシ酪酸が脳エネルギー代謝を改善し、ミトコンドリアの保護を行ったためである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、式（Ｉ）で表される化合物（１）を有効成分として含有することを特徴とする脳機能改善剤を提供するものであるが、式中、アルカリ金属としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムなどを示し、１〜３価のアルコール残基としては、メチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール等のＣ1 〜Ｃ12の１価アルコール、エチレングリコール、１，３−ブタンジオール、２−ブテン−１，４−ジオール等の２価アルコール、グリセリン等の３価アルコール、酒石酸、コハク酸等の酸をあげることができる。
【００２３】
このような化合物（１）としては、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸、β−ヒドロキシ酪酸のナトリウム塩、エステルなどを用いることができる。エステルとしては、たとえばメチルエステル、エチルエステル、グリセリルエステル（モノエステル、ジエステル、トリエステル）等であってもよい。また、Ｒ1 が水酸基の場合には、２〜１０量体等のオリゴマーであってもよい。
【００２４】
本発明の脳機能改善剤は、例えば、頭部外傷、脳腫瘍、脳出血、頭蓋内血腫、脳虚血後期などの血管原性浮腫（Vasogenic edema)や、脳虚血、重傷頭部外傷、低酸素血症などの細胞障害性浮腫（Cytotoxic edema)の患者等に適用することができる。
【００２５】
本発明の脳機能改善剤は、例えば点滴静注される輸液中に一定濃度ずつ加えて投与するのが好ましいほか、経腸輸液や静脈注射することもできる。また、これらの薬剤は、特に水溶液として使用されることが望ましい。
【００２６】
このように輸液に用いる場合の薬液の濃度は、患者の体重にも左右されるが、一般的には５〜５００ｍＭの濃度の薬液を投与速度毎時１〜２ｍｌ／ｋｇの範囲で投与することが好ましく、１０〜３００ｍＭ、望ましくは２０〜１００ｍＭの濃度の薬液を投与するのが特に好ましい。
これらの薬剤を投与する期間は、患者の状態にも左右されるが、一般的には、１〜７日以内の期間に亘って投与するのが好ましい。
【００２７】
【実施例】
以下の本発明の化合物（１）の脳機能改善作用を実施例にて説明する。
Ａ）：脳浮腫抑制作用：
実施例１：β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与量と作用の関係：
雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（体重：１５８．８±１．２ｇ）を用いて、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムを投与して両側総頚動脈結紮・切断時における脳浮腫抑制作用を検討した。用量は３．１，６．３，１２．５，２５，５０，１００，２００および４００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒとし（それぞれ２．５，５．０，１０，２０，４０，８０，１６０および３２０ｍＭに調製したβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウム溶液を、１０ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度で投与）、５時間の投与を行った。
【００２８】
ラットにエーテルで導入麻酔を行い、０．５％イソフルレン・７０％笑気・３０％酸素の維持麻酔下に頚部正中線に沿って切開し、迷走神経を傷つけないように注意深く結合組織を剥離して、両側総頚動脈を露出した。
【００２９】
次に右外頚静脈に輸液投与用カニューレを挿入して、他端を背部に導出した。露出した総頚動脈を縫合糸で頭側と心臓側の二箇所で結紮し、その間で切断した。切開部を縫合し、直ちに１０ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度でインフュージョンポンプを用いて静脈内に５時間持続投与した。
【００３０】
動物は投与終了後に断頭し、直ちに全脳を摘出し、小脳および延髄を除去し、大脳湿重量を測定した。次に１０５℃で２４時間乾燥し、大脳乾燥重量を求め、脳水分含量を次式に従って求めた。
脳水分含量（％）＝（大脳湿重量−大脳乾燥重量）／大脳湿重量×１００
【００３１】
β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの用量と脳水分含量の関係は、図１に示すとおりであった。
（但し、図中、ＢＨＢＮａはβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウムを表し、ＢＨＢＭｅはβ−ヒドロキシ酪酸メチルエステルを表す。）
【００３２】
偽手術群の脳水分含量は７９．５６±０．０５％であった。両側総頚動脈結紮・生理食塩液投与群では８１．８９±０．１３％と偽手術群に比し有意に高値を示し、明らかな脳浮腫が認められた。
【００３３】
β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの各投与群における脳水分量は、いずれも生理食塩液群に比して低値を示し、６．３ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ以上の用量で有意差（ｐ＜0.01）が認められ、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムによる脳浮腫の抑制・治療効果が認められた。
【００３４】
実施例２：β−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの投与量と作用の関係：
実施例１と同様にして２５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの投与量で５時間投与した。その結果を図１に併せて表示した。
【００３５】
実施例３：
以下に掲げる処方量を採り、輸液剤の製造方法により調製を行った。
β−ヒドロキシ酪酸メチルエステル    ２．４２ｇ
塩化ナトリウム                      ２．０５ｇ
塩化カリウム                        １．４７ｇ
ブドウ糖                          ５０．００ｇ
上記の処方量を約９５０ｍｌの水に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調整し、１０００ｍｌにメスアップをし、０．４５μｍメンブランフィルターを用いてろ過を行った後、５００ｍｌ宛ガラス製バイアル瓶に充填し、高圧蒸気滅菌を行い、着色、沈殿のない良好な輸液剤が得られた。
この輸液剤を用いて実施例１と同様の動物実験を行った結果、脳水分含量はいずれも生理食塩液投与群に比して低値を示し、脳浮腫抑制効果が認められた。
【００３６】
Ｂ）：脳機能保護作用：
実施例４：
（試験材料および方法）
１．使用動物
試験には、６〜９週齢の雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（日本エスエルシー株式会社）を用いた。これらの動物は温度２３±３℃、湿度５５±１５％、照明時間１２時間（７時点灯、１９時消灯）の環境下で飼育した。飼料は固形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業株式会社）、水は水道水を自由摂取させた。本試験は１群６〜８匹のラットを用いて行った。
【００３７】
２．被験物質および対照物質
１）被験物質
名称：β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（純度９９．８％）
β−ヒドロキシ酪酸は、試験終了後の品質に変化はなかった。また、投与液は調製後１週間は安定であり、所定濃度に調製されていることを確認した。
２）対照物質
（１）製品名：生理食塩液
製造元：株式会社大塚製薬工場
（２）製品名：グレノール注（商品名）
製造元：清水製薬株式会社
【００３８】
３．用量および投与法
β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの用量は５０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒおよび１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒとし（８０ｍＭおよび１６０ｍＭに調製した溶液を使用）、グレノールの用量は臨床用量である５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒとした。投与速度は各群とも５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒとし、右外頚静脈に留置したカニューレより１時間投与した。また、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与時間による効果を検討するため、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを３時間投与（１６０ｍＭに調製した溶液を使用）した群を設けた。
【００３９】
４．試験方法
ラットはエーテルで導入麻酔後、０．５％イソフルレン・７０％笑気・３０％酸素の維持麻酔下に手術を行った。投与用カニューレは右外頚静脈に挿入し、他端を背部に導出後、背部筋肉に固定した。このカニューレより被験物質および対照物質を所定量投与し、投与後直ちにシアン化カリウム（ＫＣＮ：３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。生存時間はシアン化カリウムを投与した直後から呼吸停止までの時間を測定することにより算出した。
【００４０】
５．統計処理
測定値は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表わした。群間における有意差検定は一元分散分析を行い、有意な場合はダンネット（Dunnett)の多重比較検定により行った。また危険率はｐ＜０．０５を有意差ありとした。
【００４１】
（試験結果）
図２にβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与量と生存時間の関係を、図３にβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与時間と生存時間の関係を示した。
シアン化カリウム誘導アノキシアによる生存時間は、生理食塩液投与群と比較してβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウム５０および１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの１時間投与により有意に延長した（４４．６±１．６秒ｖｓ．５８．８±２．４秒，５８．８±１．２秒、図２）。しかしながら、グレノール投与群は生存時間が延長する傾向を示したものの、生理食塩液投与群と比較して有意な差は認められなかった。（４４．６±１．６秒ｖｓ．５２．８±２．３秒、図２）。
β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの３時間投与は、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの１時間投与と有意な差はなかった。（５８．２±２．２秒，６１．０±１．６秒、図３）。
【００４２】
シアン化カリウムは細胞内ミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼを阻害し、電子伝達系での酸素利用を抑制してＡＴＰ産生を停止させるために細胞毒性を発現すると考えられており、脳内へのグルコース取り込み促進作用、ミトコンドリアのコハク酸酸化の促進作用、脳血流増加作用などの作用が抗アノキシア作用の発現に関与すると報告されている。今回の実験で用いた両側総頚動脈結紮（ＢＬＣＯ）６時間による脳水分含量の増加を有意に抑制する用量のβ−ヒドロキシ酪酸は、シアン化カリウム誘導アノキシアに対しても有意な生存時間の延長を示した。しかしながら、グレノール投与群では生存時間に有意な延長はみられなかった。したがって、ＢＬＣＯ誘導脳浮腫に対してβ−ヒドロキシ酪酸が等張溶液にもかかわらず、グレノールと同様に脳水分含量の増加を抑制したのは、脳循環代謝改善作用により発現した可能性が考えられ、グレノールとは作用機序が異なると考えられる。
【００４３】
Ｃ）：脳エネルギー代謝改善作用：
実施例５：
（試験材料および方法）
１．使用動物
試験には、雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（日本エスエルシー株式会社）を、入荷後１週間の予備飼育ののち試験に用いた。これらの動物は温度２３±２℃、湿度５５±１０％、照明時間１２時間（７時点灯、１９時消灯）の環境下で飼育した。飼料は固形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業株式会社）、水は水道水を自由摂取させた。試験使用時の体重は１７２．１±６．７ｇであった。
【００４４】
２．被験物質および対照物質
１）被験物質
名称：β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（以下、ＢＨＢＮａと略す）
ＢＨＢＮａは室温、５か月の保存で安定であり、試験終了後の品質に変化はなかった。また、投与液は調製後１週間は安定であり、所定濃度に調製されていることを確認した。
２）対照物質
名  称：日本薬局方  生理食塩液
製造元：株式会社大塚製薬工場
【００４５】
３．試験群および投与量
２５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの用量について検討した。なお、試験群には２０ｍＭに調製したＢＨＢＮａ溶液を、対照群には生理食塩液を、１０ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度で５時間投与した。
【００４６】
４．試験方法
ラットにエーテルで導入麻酔を行い、０．５％イソフルレン・７０％笑気・３０％酸素の維持麻酔下に頚部正中線に沿って切開し、迷走神経を傷つけないように注意深く結合組織を剥離して両側総頚動脈を露出した。次に右外頚静脈に輸液投与用カニューレを挿入して他端を背部に導出した。露出した総頚動脈を縫合糸で頭側と心臓側の二箇所で結紮し、その間で切断した。切開部を縫合し、直ちに１０ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度でインフュージョンポンプを用いて静脈内に５時間持続投与した。偽手術群は試験群同様に両側総頚動脈を露出し、結紮・切断することなく縫合した。動物は投与終了後に断頭し、直ちに全脳を摘出し、小脳および延髄を除去し、大脳湿重量を測定した。次に１０５℃で２４時間乾燥し、大脳乾燥重量を求め、脳水分含量を次式に従って求めた。
脳水分含量（％）＝（大脳湿重量−大脳乾燥重量）／大脳湿重量×１００
脳は乾燥質量秤量後、脳１００ｍｇに対し１ｍｌの精密分析用ＨＮＯ3 （０．６Ｎ）に溶解し、１２５℃で無色透明になるまで湿式灰化した。灰化後、最終液量を１ｍｌに精製水でメスアップし、溶液中のＮａ+ およびＫ+ 含量を炎光光度計（ＦＬＡＭＥ−３０Ｃ：日本分光メディカル株式会社）を用いて測定した。測定には各群９例のラットを用いた。
【００４７】
５．統計処理
測定値は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表わした。群間における有意差検定は一元分散分析を行い、ダンネット（Dunnett)の多重比較検定により行った。また危険率は５％未満を有意差ありとした。
【００４８】
（試験結果）
両側総頚動脈結紮ラットにおけるＢＨＢＮａによる脳水分および脳内電解質（Ｎａ+ ，Ｋ+ ）含量の関係を表１および図４〜６に示した。
【００４９】
【表１】
0004598203.tif 000003
【００５０】
両側総頸動脈切断によって、生理食塩液群では対照群に比し脳水分およびＮａ+ 含量の有意（ｐ＜０．０１）な増加およびＫ+ 含量の有意（ｐ＜０．０１）な減少がみられた。ＢＨＢＮａを持続投与することにより、生理食塩液群に比し脳水分および脳内Ｎａ+ 含量の増加に有意（ｐ＜０．０１）な抑制がみられた。しかし、脳内Ｋ+ 含量に対し有意差はみられなかった。
【００５１】
実施例６：
（試験材料および方法）
１．使用動物
試験には、雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（日本エスエルシー株式会社）を試験に用いた。これらの動物は温度２３±３℃、湿度５５±１５％、照明時間１２時間（７時点灯、１９時消灯）の環境下で飼育した。飼料は固形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業株式会社）、水は水道水を自由摂取させた。試験使用時の体重は１６１．７〜２４９．０ｇであった。
【００５２】
0004598203.tif 000004
【００５３】
３）媒体
（１）媒体１
媒体名：日本薬局方  生理食塩液（Ｓａｌｉｎｅ）
発売元：大塚製薬株式会社
（２）媒体２
媒体名：日本薬局方  注射用蒸留水
発売元：大塚製薬株式会社
【００５４】
３．被験液の調製
ＢＨＢＮａ０．２ｇを秤量し、注射用蒸留水に溶解し、全量を１０ｍｌとし２．０％ＢＨＢＮａ溶液を調製した。次に２．０％ＢＨＢＮａ溶液９ｍｌに生理食塩液を加え全量を３０ｍｌとし、０．６％ＢＨＢＮａ溶液を調製した。なお、各溶液はディスミック−２５ＣＳ（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ；０．２μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ東洋製）で濾過滅菌し、被験液とした。
【００５５】
４．脳虚血モデルの作製
動物にエーテルで導入麻酔を行い、０．５％イソフルレン・７０％笑気・３０％酸素の維持麻酔下に両側総頚動脈（以下ＢＬＣと略す）を露出した。次に右外頚動脈に投与用カニューレを留置した。露出したＢＬＣを縫合糸で頭側と心臓側の二箇所で結紮し、その間で切断した。切開部を縫合後、直ちにインフュージョンポンプを用いて、生理食塩液、０．６％ＢＨＢＮａ（３０ｍｇ／ｋｇ）あるいはグリセオールを５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度で持続投与を行った。偽手術群はＢＬＣを露出するが、結紮・切断することなく縫合した。
【００５６】
虚血３時間後、動物の頭部にマイクロウエーブ・アプリケーター（ＴＭＷ−６４０２Ｃ、東芝製）を用いて、５ｋＷ、２秒間の照射条件でマイクロウエーブを照射して瞬間加熱処理し、脳組織中の酵素活性、代謝産物の変動および分解を停止させた。あらかじめ秤量しておいた氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）３ｍｌ入りの試験管に小脳と延髄を除いた大脳組織を投入して再び秤量した後、ホモジナイザー（Physcotron、日音医科器械製作所）を用いて氷冷下に粉砕した。ホモジネート液を１５分間の遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ）を行い、上清を採取した。沈渣はさらに２ｍｌの１０％ＴＣＡを加えホモジナイズし、これを遠心分離して得られた上清を前記の上清と合わせて攪拌し試料液とした。試料液は二分し、その一方に水飽和エーテル３ｍｌを加え、攪拌後に１５分間の遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ）を行い、エーテル層（上層）を除去した。このエーテル処理は３度繰り返して行った。この抽出液についてＡＴＰを測定した。乳酸の測定用試料として、もう一方のエーテル未処理の試料を使用し測定した。なお、大脳重量は上記の秤量値の差から求めた。
ＡＴＰはLumat ＬＢ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  ＢＥＲＴＨＯＬＤ製）を用いて酵素法（Luciferin-Luciferase法）にて測定し、測定値はμmoles ／脳湿重量ｇで表した。
乳酸はデタミナーＬＡ（協和メディクス製）を用いて酵素法（Lactate dehydrogenase 法）にて測定し、測定値はμmoles ／脳湿重量ｇで表した。
【００５７】
５．統計処理
測定値は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で表わした。群間における有意差検定は一元分散分析を行い、有意な場合はシィッフェ（Scheffe)の多重比較検定により行った。また危険率は５％未満を有意差ありとした。
【００５８】
（結果）
脳組織ＡＴＰおよび乳酸量の変化をそれぞれ図７、８に示した。
１．正常ラットにおけるＢＨＢＮａの影響
ＢＬＣを結紮することなしに３時間持続投与しても脳組織ＡＴＰおよび乳酸量に有意な変化は認められなかった。
【００５９】
２．ＢＬＣ結紮ラットにおけるＢＨＢＮａおよびＧｌｙｃｅｏｌの影響
１）脳組織ＡＴＰの変化
脳組織ＡＴＰ量は偽手術群の１．８５±０．１３μmoles ／脳湿重量ｇから結紮３時間後には生理食塩液群で０．５２±０．１０μmoles ／脳湿重量ｇと有意に減少した。ＢＨＢＮａ３０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを結紮直後から持続投与すると結紮３時間後の脳組織ＡＴＰ量は１．５６±０．１０μmoles ／脳湿重量ｇで生理食塩液群に比し有意に減少が抑制され、その程度は偽手術群とほぼ同等であった。グリセオールを結紮直後から持続投与すると３時間後の脳組織ＡＴＰ量は１．００±０．０４μmoles ／脳湿重量ｇで生理食塩液群との間に有意差は認められなかった。
【００６０】
２）脳組織乳酸の変化
脳組織乳酸量は偽手術群の０．６１±０．１２μmoles ／脳湿重量ｇから結紮３時間後には生理食塩液群で１１．３９±０．８５μmoles ／脳湿重量ｇと有意に増加した。ＢＨＢＮａ３０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを結紮直後から持続投与すると結紮３時間後の脳組織乳酸量は１．３６±０．１７μmoles ／脳湿重量ｇで生理食塩液群に比し有意に増加が抑制された。グリセオールを結紮直後から持続投与すると３時間後の脳組織乳酸量は７．１６±０．５４μmoles ／脳湿重量ｇで生理食塩液群に比し有意に増加が抑制されたが、偽手術群と比較すると有意に高値を示した。
【００６１】
Ｄ）：脳梗塞巣縮小作用：
実施例７：
（試験材料および方法）
１．使用動物
試験には、８週齢の雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（日本チャールス・リバー株式会社）を試験に用いた。これらの動物は温度２３±３℃、湿度５５±１５％、照明時間１２時間（７時間点灯、１９時間消灯）の環境下で飼育した。飼料は固形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母株式会社）、水は水道水を自由摂取させた。使用時動物の体重は２７０．６〜３３８．９ｇであった。
【００６２】
２．被験物質および対照物質
１）被験物質
名称：β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（以下、ＢＨＢＮａと略す）
２）媒体
（１）媒体１
媒体名：日本薬局方  生理食塩液（Ｓａｌｉｎｅ）
発売元：大塚製薬株式会社
（２）媒体２
媒体名：日本薬局方  注射用蒸留水
発売元：大塚製薬株式会社
【００６３】
３．被験液の調製
ＢＨＢＮａ０．２ｇを秤量し、注射用蒸留水に溶解し、全量を１０ｍｌとし、２．０％ＢＨＢＮａ溶液を調製した。次に２．０％ＢＨＢＮａ溶液９ｍｌに生理食塩液を加え全量を３０ｍｌとし、０．６％ＢＨＢＮａ溶液（３０ｍｇ／ｋｇ）を調製した。なお、各溶液はディスミック−２５ＣＳ（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ；０．２μｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ東洋製）で濾過滅菌し、被験液とした。
【００６４】
４．中大脳動脈閉塞・再潅流モデルの作製
１）中大脳動脈閉塞モデル
動物をエーテル麻酔下に頚部正中切開を加え、迷走神経の保持に留意しつつ右頚動脈分岐部に達した。右頚動脈分岐部を中心に総頚動脈および外頚動脈を周囲結合組織および脂肪組織より剥離した。外頚動脈より分岐する後頭骨動脈および上甲状腺動脈をそれぞれ剥離して、６−０絹糸にて二重結紮・切断後、外頚動脈を５−０絹糸にて二重結紮・切断した。さらに右頚動脈分岐部より内頚動脈の周囲の結合組織を剥離し、その先で分岐する翼突口蓋動脈を露出した。次いで外頚動脈を切開し、同部より塞栓糸を内頚動脈に向けて２１ｍｍ挿入した。以上の操作により、塞栓糸の先端は中大脳動脈分岐部を越えて、前大脳動脈内に約１〜２ｍｍ入り、塞栓糸の体部で中大脳動脈を閉塞する。
なお、偽手術群は、内頚動脈に塞栓糸を入れることなしに縫合し、屠殺時間まで飼育した。
【００６５】
２）再潅流モデル
中大脳動脈を閉塞した塞栓糸を２時間留置後、エーテル麻酔下で抜き去り、血流を再開通した。
【００６６】
５．被験薬および対照薬の投与
塞栓糸挿入後から直ちにインフージョンポンプを用いて、試験前日に大腿静脈に挿入したカニューレより生理食塩液および０．６％ＢＨＢＮａを５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度で屠殺時間（２４時間）まで持続投与を行なった。
【００６７】
６．脳組織標本の作製および染色法
動物は再潅流処置２４時間後に屠殺し、大脳を摘出した。摘出した大脳はＢｒａｉｎ  Ｓｌｉｃｅｒ（ＭＵＲＯＭＡＣＨＩ  ＫＩＫＡＩ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で前脳より耳介間側（終脳側）へ７ｍｍの場所から厚さ２ｍｍで冠状切断した。切り出した脳切片は、正常ミトコンドリアを染色する２％２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム  クロライド（ＴＴＣ）の生理食塩液に３０分間浸し、その後、脳切片を１０％ neutral-buffered folmalinで固定した。
【００６８】
７．梗塞巣の計測
ＴＴＣ染色を施した脳冠状断切片をフィルムスキャナーを用いてコンピューター上に取り込み、画像解析ソフト（NIH Image)により行った。脳切片面積に占めるミトコンドリア死滅率（脳梗塞率）の算出は非染色部位の面積を計測し全脳切片面積に対する百分率（％）として表した。
【００６９】
（結果）
得られた脳梗塞率の結果を表２に示した。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
表中の結果からも明らかなように、中大脳動脈を２時間閉塞・２４時間再潅流条件下に生理食塩液を閉塞直後から持続投与すると、脳梗塞率は全例平均で３５．１８±２．６９％となり、その脳梗塞の分布範囲は、塞栓糸挿入側と同側（右側）において中大脳動脈潅流域皮質（側頭葉）、前大脳動脈潅流域皮質（頭頂葉）および線条体内・外部に至り、虚血中心部だけにとどまらず、虚血周縁部と思われる頭頂葉および線条体内部まで広がることが示唆された。
これに対して、ＢＨＢＮａ（３０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ）を虚血処理後から同様に連続投与すると、脳梗塞率は全例平均で１８．９９±１．５９％となり、生理食塩液投与群に比較して縮小された。この時の脳閉塞巣は、主に虚血中心部にみられ、虚血周縁部への梗塞範囲の拡大はほとんど観察されなかった。
【００７２】
実施例８：毒性試験：
（ａ）  ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラットを使用し、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（以下、ＢＨＢＮａと略す）を経口投与し、その観察を行った。
ＢＨＢＮａは、雄性ならびに雌性ラットにおける２０００ｍｇ／ｋｇの単回投与で、いずれも異常なく生存したことが観察された。
（ｂ）  ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）系雄性ラットを使用し、ＢＨＢＮａを２週間にわたる反復経口投与を行った。その結果、ＢＨＢＮａの５００ｍｇ／ｋｇ〜２０００ｍｇ／ｋｇの投与ですべて異常なく生存したことが観察された。
【００７３】
実施例９：
以下に掲げる処方量を採り、輸液剤の製造方法により調製を行った。
β−ヒドロキシ酪酸モノグリセリルエステル  １６．０  ｇ
塩化ナトリウム                              ３．１５ｇ
塩化カリウム                                ０．３０ｇ
上記の処方量を約９５０ｍｌの水に溶解し、塩酸もしくは水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に調整し、１０００ｍｌにメスアップをし、０．２０μｍメンブランフィルターを用いてろ過を行った後、５００ｍｌ宛ガラス製バイアル瓶に充填し、高圧蒸気滅菌を行い、着色、沈殿のない良好な輸液剤が得られた。
【００７４】
実施例１０：
以下の表３に掲げる処方量を採り、実施例３と同様の方法により、着色、沈殿のない良好な輸液剤が得られた。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
［表中、ＢＨＢはβ−ヒドロキシ酪酸を、ＢＨＢＮａはβ−ヒドロキシ酪酸ナトリウムを、ＢＨＢＭｅはβ−ヒドロキシ酪酸メチルエステルを、ＢＨＢ−oligo （３mar)はβ−ヒドロキシ酪酸重合体（３量体）を示す。］
【００７７】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明の式（Ｉ）で表される化合物（１）を有効成分として含有することを特徴とする薬剤は、脳浮腫の抑制作用、脳機能の保護作用、脳エネルギー代謝障害の抑制作用ならびに脳梗塞巣縮小等の作用を有し、したがって脳機能改善治療剤として大きな効果を持つものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよびβ−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの投与量と脳水分含量の関係図である。
【図２】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与量と生存時間の関係図である。
【図３】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの投与時間と生存時間の関係図である。
【図４】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムと脳水分含量の関係図である。
【図５】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムとナトリウムイオン含量の関係図である。
【図６】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムとカリウムイオン含量の関係図である。
【図７】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムと脳内ＡＴＰ濃度示す図である。
【図８】β−ヒドロキシ酪酸ナトリウムと脳内乳酸濃度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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