(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレバイオティクスとして短鎖フルクトオリゴ糖を含む、ほ乳類の食細胞の活性を減少させるための薬剤。
【請求項２】
プレバイオティクスに加えてプロバイオティクスを含み、前記プロバイオティクスはビフィドバクテリウムビフィダム及びストレプトコッカスサーモフィルスから成る群から選択される請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ほ乳類の食細胞の活性を減少させるための薬剤の製造における、プレバイオティクスとしての短鎖フルクトオリゴ糖の使用。
【請求項４】
前記プレバイオティクスはプロバイオティクスとの混合物で提供され、前記プロバイオティクスが、ビフィドバクテリウムビフィダム及びストレプトコッカスサーモフィルスからなる群より選択される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
プレバイオティクスとして有効量の短鎖フルクトオリゴ糖を含む組成物を投与することを含み、ペットの食細胞の活性を減少させる方法。
【請求項６】
プレバイオティクスに加えて有効量のプロバイオティクスを投与することを含み、前記プロバイオティクスが、ビフィドバクテリウムビフィダム及びストレプトコッカスサーモフィルスからなる群より選択される請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的免疫防御パラメータ及びリンパ球亜集団の生体恒常性を改善することによって炎症過程を減少させるためのプレバイオティクス（プレバイオティクスアジュバント）を含む組成物に関する。本発明はまた、炎症過程及び／又は非特異的免疫パラメータ、たとえば食細胞の異常活性化を減少させる薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造におけるプレバイオティクス調合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
プレバイオティクスは炭化水素、より具体的にはオリゴ糖類を含むことはよく知られている。さらに、これらは機能性食品成分として広く使用されてきたことが知られている。これらはヒト消化管酵素による加水分解に耐性で、分解されずに結腸に到達することができ、特にビフィズス菌の増殖に適した炭水化物物質を提供することができる。オリゴ糖類は、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム又はそれらの混合物から生成することが可能である。フルクトオリゴ糖類などの精製された市販品には約９５％以上の固形物がオリゴ糖の形態で含まれている。
【０００３】
フルクトオリゴ糖類は、無機質の生物学的利用率、脂質代謝及び排便習慣の調節に関する機能的要求のために主にヒトで試験されてきた（Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｍ．Ｂ．Ｄｅｌｚｅｎｎｅ、Ｎ．Ｍ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １９９８；１８：１１７〜１４３）。それらの免疫学的機能に対する効果についてはほとんど関心が持たれていなかったが、発癌性を変化させ、消化管関連リンパ系組織を刺激するという示唆が動物での試験によって得られている（Ｐｉｅｒｒｅ、Ｆ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；５７：２２５〜２２８）。
【０００４】
実際には、フルクトオリゴ糖類、長鎖（イヌリン）及び短鎖（オリゴフルクトース）は上部胃腸管での消化を免れる炭水化物である。これらは次いで結腸で発酵し、ビフィズス菌の増殖を選択的に刺激する。
【０００５】
重要な代謝活性を備えたヒト腸内フローラは、おそらく腸管恒常性の維持、生体異物の代謝及び腸管免疫の刺激などの多くの健康に関する機能に関連している。これは、疾患、食事、ストレス及びおそらく加齢によっても影響を受ける。大腸には、１０１２細菌／ｇ糞便に達する細菌数が含まれ、属にして約４０〜５０個、種にして約１０３の異なる細菌が含まれる。そのほとんどが偏性嫌気性菌であるが、多数の通性嫌気性菌も存在する。主な偏性嫌気性菌はバクテロイド属、ビフィズス菌、真性細菌で、糞便フローラ全体の９９％を占め、次にクロストリジウム属、乳酸桿菌及びグラム陽性球菌、腸球菌、腸内バクテリア、メタン細菌が多く、硫酸還元細菌も極めて低濃度で存在する（Ｈｉｌｌ、Ｍ．Ｊ．Ｎｏｒｍａｌ  ｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌｏｒａ．１９９５；３〜１７）。
【０００６】
成人の微小フローラの特徴は、約２才から見られる。成人の腸内微小フローラはかなり安定なようであるが、加齢によっていくらかの変化が報告されており、主にビフィズス菌及びバクテロイド属の濃度が低下する（Ｈｏｐｋｉｎｓ、Ｍ．Ｊ．他、Ｇｕｔ  ２００１；４８：１９８〜２０５）。腸内フローラは、ビフィズス菌などの有益な影響を及ぼす種、又はシュードモナス  エルジノーサ、プロテウス種、ブドウ球菌、いくつかのクロストリジウム属及びベイヨネラ属などの有害な影響を及ぼす種、及び腸球菌、大腸菌、エンテロコッカス及びバクテロイド属などの実際には中間的な種に分けることができる。ビフィズス菌及び乳酸桿菌は特定の免疫機能に有益な影響を及ぼすことが報告されている（Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ、Ｅ．Ｊ．他、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  １９９５；７８：４９１〜４９７）。
【０００７】
加齢と共に、ビフィズス菌は消失し、一方クロストリジウム  パーフリンジェンス、腸球菌及び腸内細菌科は増大することが一般的に報じられている（Ｍｉｔｓｕｏｋａ、Ｔ．Ｈａｙａｋａｗａ、Ｋ．Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ（Ｏｒｉｇ  Ａ）１９７３；２２３：３３３〜３４２）。高齢者では萎縮性胃炎及び低塩酸症の罹患率が高いため、細菌の過剰増殖がより頻繁に生じる。健康な高齢者では細菌の過剰増殖による臨床症状はないようであるが、７５才以上の虚弱な高齢者ではいくらか重要となる可能性があり、クロストリジウムディフィシレに関係する下痢は、抗生物質治療及び免疫応答を減少させる可能性のある急性期治療中又は長期治療中の高齢者ではより頻繁に見られる。加齢は免疫機能の消失に関係しており、栄養と免疫機能との間の関係の存在が認識されてきた（Ｍｅｙｄａｎｉ、Ｓ．Ｎ．栄養状態と免疫の試験（Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）：Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４；２：９３〜９７）。
【０００８】
免疫応答の変化（サイトカイン産生のリモデリング及び免疫機能の調節不能）は、感染の発症率及び感染に関連した死亡率の増加に関係する。栄養学的介入、主にビタミン及び無機質の補給によって虚弱な高齢者の免疫応答を改善することができる（Ｌｅｓｏｕｒｄ、Ｂ．Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  １９９７；６６：４７８Ｓ〜４８４Ｓ  ４１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、免疫機能の調節不能、より具体的には非特異的免疫応答、たとえば食細胞及び単核細胞マクロファージ細胞系の異常活性化を制限することができ、かつリンパ細胞亜集団の正常レベルの活性化を維持できる他の組成物を提供することが目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明の第１の態様では、ほ乳類の食細胞の活性を減少させる少なくとも１種類のプレバイオティクスを含み、前記プレバイオティクスが短鎖フルクトオリゴ糖を含む組成物を提供する。
【００１２】
驚くべきことに、プレバイオティクス補給によって炎症過程の減少を誘導することができ、特に非特異的免疫の変化、たとえば食細胞作用の減少並びに末梢血単核細胞のインターロイキン−６  ｍＲＮＡの発現の減少を誘導することができることがわかってきた。
【００１３】
第２の態様では、本発明はほ乳類の食細胞の活性を減少させるための薬剤又は食品又はペット飼料組成物の製造における、短鎖フルクトオリゴ糖を含む少なくとも１種のプレバイオティクスの使用を提供する。
【００１５】
第４の態様では、本発明はペットの食細胞の活性を減少させる方法であって、有効量のプレバイオティクス又は少なくとも１ 種のプレバイオティクスを含み、前記プレバイオティクスが短鎖フルクトオリゴ糖を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の利点は、炎症過程の減少、特に末梢血単核細胞におけるインターロイキン−６  ｍＲＮＡの発現減少をもたらすことである。
【００１８】
本発明の他の利点は、特に慢性炎症状態の虚弱な患者において顆粒球及び単核細胞の食細胞作用の減少をもたらすことである。
【００１９】
本発明のさらに他の利点は、ほ乳類の炎症状態を改善するために使用でき、したがって本発明による食品組成物を単純に消費することによって、有害な感染を悪化させる危険性を減少することができることである。薬剤の静脈内投与又は皮下投与には専門的技術が必要で、経口投与と比較して安全ではなく、便利でもなく、患者にも許容されないことは理解されるであろう。これらの観点から、本発明によって経口的に投与できる栄養素及び／又は治療製品の明らかな利点がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の態様では、組成物は少なくとも１種のプレバイオティクス又はプレバイオティクス混合物を含むことが好ましい。
【００２１】
好ましくは、プレバイオティクスはグルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、澱粉、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、ゴム（たとえば、アカシアゴム）又はそれらの混合物から生成されたオリゴ糖を含む。より好ましくは、オリゴ糖はフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）を含む。最も好ましくは、プレバイオティクスはフルクトオリゴ糖とイヌリンの混合物を含む。好ましくは、この混合物はＰＲＥＢＩＯ１（登録商標）又は市販のＲＡＦＴＩＬＯＳＥ（登録商標）とＲＡＦＴＩＬＩＮＥ（登録商標）の混合物を含む。
【００２２】
好ましくは、このプレバイオティクスはＦＯＳを約５０％から約９５％含む。より好ましくは、ＦＯＳを約６０％から約８０％含む。最も好ましくはＦＯＳを約７０％含む。
【００２３】
好ましくは、このプレバイオティクスはイヌリンを約１０％から約５０％含む。より好ましくは、イヌリンを約２０％から約４０％含む。最も好ましくはイヌリンを約３０％含む。
【００２４】
このプレバイオティクスは、フルクトオリゴ糖とイヌリンの混合物を重量に基づいてフルクトオリゴ糖を７０％及びイヌリンを３０％含むことが可能である。
【００２５】
好ましくは、この組成物はプレバイオティクスに加えてプロバイオティクスを含む。プロバイオティクスは、たとえばビフィドバクテリウムビフィダム又はストレプトコッカスサーモフィルスである。ビフィドバクテリウムビフィダムは、ビフィドバクテリウムラクティスであることが好ましい。
【００２６】
一実施形態では、この組成物は完全で、栄養学的にバランスのとれた食品又はペット飼料であることが可能である。たとえば、栄養補助食品であることができる。好ましくは、高齢のヒト、高齢のペット、又は慢性炎症を有する重症な病気の患者を対象とする。
【００２７】
したがって、栄養学的に完全なペット飼料を調製することができる。栄養学的に完全なペット飼料は、任意の適切な形態、たとえば乾燥形態、半湿潤形態又は湿潤形態であることが可能である。冷蔵又は長期保存ペット飼料製品であることが可能である。これらのペット飼料は、慣用の通りに製造することができる。プレバイオティクスは、プレバイオティクスを含有した植物材料の形態で形成することが好ましい。適切な植物材料には、アスパラガス、アーティチョーク、タマネギ、小麦、ヤーコン又はチコリ、又はこれらの植物材料の残渣が含まれる。あるいは、プレバイオティクスは、イヌリン抽出物として、又は通常、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖又は澱粉のオリゴ誘導体として知られるその加水分解物として提供することができる。チコリの抽出物が特に適している。ペット飼料中のプレバイオティクスの最高濃度は、好ましくは約２０重量％、特に約１０重量％である。たとえば、プレバイオティクスはペット飼料の約０．１重量％から約５重量％を構成することが可能である。プレバイオティクスとしてチコリを使用するペット飼料では、チコリは飼料混合物に約０．５重量％から約１０重量％、より好ましくは約１重量％から約５重量％で含まれることが可能である。
【００２８】
本発明のプレバイオティクス以外に、これらのペット飼料は１種又は複数の炭水化物源、蛋白質源及び脂質源を含むことが可能である。
【００２９】
任意の適切な炭水化物源を使用することができる。炭水化物源は穀粒、穀粉及び澱粉の形態で提供されることが好ましい。たとえば、炭水化物源は米、オオムギ、モロコシ、アワ、オーツ麦、挽き割りトウモロコシ又は小麦粉であることが可能である。スクロース、グルコース及びコーンシロップなどの単純糖類もまた使用することができる。炭水化物源によってもたらされる炭水化物の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料には、約６０重量％の炭水化物を含めることができる。
【００３０】
適切な蛋白質源は、適切な動物蛋白質源又は植物蛋白質源、たとえば、筋肉又は骨格肉、肉及び骨粉、鳥肉粉、魚粉、ミルク蛋白質、トウモロコシグルテン、小麦グルテン、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離物、卵蛋白質、乳清、カゼイン、グルテンなどから選択することができる。高齢の動物には、蛋白質源として高品質の動物蛋白質を含めることが好ましい。蛋白質源によってもたらされる蛋白質の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料には乾燥重量をベースとして約１２重量％から約７０重量％の蛋白質を含めることができる。
【００３１】
ペット飼料は脂肪源を含有することができる。適切な脂肪源には、動物脂肪及び植物脂肪の両者を使用することができる。脂肪源は、獣脂などの動物脂肪源であることが好ましい。植物油、たとえばトウモロコシ油、ヒマワリ油、ベニハナ油、ナタネ油、大豆油、オリーブ油及びモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸に富んだその他の油もまた使用することができる。必須脂肪酸（リノレン酸及びアルファ−リノレン酸）に加えて、脂肪源には長鎖脂肪酸を含めることができる。適切な長鎖脂肪酸には、ガンマリノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸が含まれる。魚油は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の適切な原料である。ルリヂサ油、ブラックカレント油及びマツヨイグサ油は、ガンマリノレン酸の適切な原料である。ナタネ油、大豆油、アマニ油及びクルミ油は、アルファ−リノレン酸の適切な原料である。ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油及び大豆油は、リノレン酸の適切な原料である。オリーブ油、ナタネ油（キャノーラ）高オレイン酸ヒマワリ油、ベニハナ油、ピーナッツ油、米ぬか油はモノ不飽和脂肪酸の適切な原料である。脂肪原料によってもたらされる脂肪の量は、所望するように選択することができる。たとえば、ペット飼料は、乾燥重量をベースにして脂肪を約５重量％から約４０重量％含むことができる。ペット飼料の脂肪の量は比較的少ない方が好ましい。
【００３２】
ペット飼料は、長鎖脂肪酸など他の活性成分を含んでよい。適切な長鎖脂肪酸には、アルファ−リノレン酸、ガンマリノレン酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸が含まれる。魚油はエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の適切な原料である。ルリヂサ油、ブラックカレント油及びマツヨイグサ油は、ガンマリノレン酸の適切な原料である。ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油及び大豆油は、リノレン酸の適切な原料である。
【００３３】
炭水化物源、蛋白質源及び脂質源の選択は重要ではなく、動物が必要とする栄養、嗜好性を考慮し、製造する製品の形態に基づいて選択する。さらに、様々な他の成分、たとえば、糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン、無機質、矯臭剤、ガム、及びプロバイオティクス微生物もまた、所望するならばペット飼料に取り込ませることができる。
【００３４】
プロバイオティクス微生物もまた添加することができる。動物消費に適し、腸内の微生物のバランスを改善することができる１種又は複数の微生物から選択することができる。適切なプロバイオティクス微生物には、酵母、たとえばサッカロマイセス、デバロマイセス、カンジダ、ピキア及びトルロプシス、カビ類、たとえばアスペルギルス、リゾープス、ムコール、及びペニシリウム及びトルロプシス及び細菌、たとえば、ビフィズス菌属、バクテロイド属、クロストリジウム属、フゾバクテリウム属、メリソコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、バシラス属、ペジオコッカス属、ミクロコッカス属、リューコノストック属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、アエロコッカス属、エノコッカス属及びラクトバシラス属が含まれる。プロバイオティクス微生物は、粉末形態又は乾燥形態、特に胞子を形成する微生物では胞子形態であってよい。さらに、所望するならば、プロバイオティクス微生物は、生存の可能性を高めるために、たとえば、糖基質、脂肪基質又は多糖基質内にカプセル化することができる。プロバイオティクス微生物を使用する場合、ペット飼料はプロバイオティクス微生物を好ましくはペット飼料１グラム当たり約１０４細胞から約１０１０細胞、より好ましくは１グラム当たり約１０６から約１０８細胞含有する。ペット飼料は、プロバイオティクス微生物の混合物を約０．５重量％から約２０重量％、好ましくは約１重量％から約６重量％、たとえば約３重量％から約６重量％含むことができる。
【００３５】
高齢ペット用のペット飼料は、若年ペット用のペット飼料と比較して脂肪が少ない方が好ましい。さらに、澱粉源はオーツ麦、米、大麦、小麦及びトウモロコシの１種又は複数を含むことが可能である。
【００３６】
乾燥ペット飼料に適した方法は、押し出し調理法であるが、焼くか、その他の適切な方法を使用することが可能である。押し出し調理の場合、乾燥ペット飼料は通常粗挽き粉の形態で形成する。プレバイオティクスを使用する場合、プレバイオティクスは加工する前に乾燥ペット飼料のその他の成分と混合することができる。適切な方法が欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティクス微生物を使用する場合、微生物は乾燥ペット飼料上に被覆するか、又は内部に充填することが最も良い。適切な方法は欧州特許出願第０８６２８６３号に記載されている。
【００３７】
湿潤ペット飼料については、米国特許第４７８１９３９号及び第５１３２１３７号に記載された方法を使用して模造肉製品を製造することができる。厚切り型の製品を製造する他の方法、たとえば蒸気釜での調理もまた使用することができる。あるいは、塊型の製品は、適切な肉材料を乳化して肉エマルジョンを生成し、適切なゲル化剤を添加し、缶又はその他の容器に充填する前に肉エマルジョンを加熱することによって製造することができる。
【００３８】
他の実施形態では、ヒトが消費するための食品組成物を調製する。この組成物は栄養学的に完全な調合物、乳製品、冷蔵又は長期保存飲料、スープ、栄養補助食品、代用食品、及び栄養バー又は菓子であることが可能である。
【００３９】
本発明のプレバイオティス以外に、栄養調合物には蛋白質源を含めることができる。食品蛋白質を蛋白質源として使用することが好ましい。食品蛋白質はいかなる適切な食品蛋白質、たとえば動物性蛋白質（たとえば、ミルク蛋白質、肉蛋白質及び卵蛋白質）、野菜蛋白質（たとえば、大豆蛋白質、小麦蛋白質、米蛋白質及びエンドウ蛋白質）、遊離アミノ酸混合物、又はそれらの組み合わせであってもよい。カゼイン、乳清蛋白質などのミルク蛋白質及び大豆蛋白質が特に好ましい。この組成物はまた、炭水化物源及び脂肪源を含むことができる。
【００４０】
栄養調合物に脂肪源を含める場合、脂肪源は栄養調合物のエネルギーの約５％から約５５％、たとえばエネルギーの約２０％から約５０％をもたらすことが好ましい。脂肪源を構成する脂質は、いかなる適切な脂肪又は脂肪混合物であってもよい。植物性脂肪、たとえば、大豆油、ヤシ油、ココナツ油、ベニハナ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、キャノーラ油、レシチンなどが特に好ましい。牛乳脂肪などの動物性脂肪はまた、所望するならば添加することが可能である。
【００４１】
炭水化物源を栄養調合物に添加することができる。これは、栄養組成物のエネルギーの約４０％から約８０％をもたらすことが好ましい。適切な炭水化物源、たとえばスクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、固形コーンシロップ、及びマルトデキストリン、及びそれらの混合物を使用することができる。食物繊維もまた所望により使用することができる。使用する場合、栄養調合物のエネルギーの約５％まで含めることが好ましい。食物繊維は、たとえば大豆、エンドウ、オーツ麦、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、及びフルクトオリゴ糖を含めた適切な原料から得ることができる。適切なビタミン及び無機質を適切な指針に見合った量で栄養調合物に含めることができる。
【００４２】
１種又は複数の食品等級の乳化剤、たとえばジアセチル酒石酸のモノグリセリド又はジグリセリドエステル及びレシチン及びモノグリセリド及びジグリセリドを所望するならば栄養調合物に取り込むことができる。同様に適切な塩及び安定剤を含めることができる。
【００４３】
栄養調合物は、たとえば粉末、錠剤、カプセル、濃縮液体、固形製品又はすぐに飲用できる飲料の形態で腸で溶解するように投与することが好ましい。粉末栄養調合物を製造することが所望される場合は、ホモジナイズした混合物を噴霧乾燥又は凍結乾燥などの適切な乾燥装置に移し、粉末に変換する。
【００４４】
他の実施形態では、栄養組成物はミルクをベースとしたシリアルと共にプレバイオティクス調合物を含む。ミルクをベースとしたシリアルは、プレバイオティクス調合物の担体として役立つ乳児用シリアルであることが好ましい。
【００４５】
他の実施形態では、通常の食品が少なくとも１種の本発明のプレバイオティクスに富んでいることができる。たとえば、発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネットミルク、菓子製品、たとえば甘味飲料又は加糖飲料、菓子バー、朝食用シリアルフレーク又はバー、飲料、粉末乳、大豆をベースとした製品、非ミルク発酵製品又は臨床栄養学的栄養補助食品である。次に、添加する組成物の量は少なくとも約０．０１重量％であることが好ましい。
【００４６】
以下の実施例は例示するためのみに挙げられており、決して本出願の主題を制限するものではない。他に指示がなければ、パーセント及び部は重量に基づく。実施例の後に図面の簡単な説明がある。
【実施例１】
【００４７】
高齢者における糞便フローラ及び非特異的免疫系に対するオリゴ糖の効果
材料及び方法
試験計画
この試験は、老人ホームの１９人の高齢者に対する試験前／試験後の試験である（試験スキーム参照）。
0004456329.tif 000002
【００４８】
体重測定と糞便、血液及び尿の試料収集は１（試験前又はウォッシュアウト期間開始時）、２（プレバイオティクス摂取前）、３（プレバイオティクス摂取中）及び４（追跡期間後）の時点で実施した。
【００４９】
試験全体を通じて、発酵乳製品の摂取は禁止し、フルクトオリゴ糖含有食品（タマネギ、ニラ、チコリ根）は制限した。
【００５０】
被験者
老人ホームの１９人の高齢の被験者をこの試験のために動員した。以下の基準の１つ又は複数を満たす被験者はこの試験の参加者から除外した。
この１カ月抗生物質治療を受けた。
慢性腸疾患である。
特定の食事療法（すなわち、菜食主義）をしている。
消化器癌と診断されている。
鼓腸である。
【００５１】
倫理委員会団体から承認を受けた。被験者全員から同意書を得た。この試験は地方の老人ホーム、Ｌｅ  Ｍｏｎｔ−Ｐｅｌｅｒｉｎ、スイスで実施した。
【００５２】
栄養状態
試験開始時、以下の項目、身体測定（ふくらはぎ及び腕の周径、身長、体重及び体重減少）、一般的評価（生活様式、薬物療法、運動）、食事調査（食事回数、液体及び食品摂取、摂食の自主性）及び主観的評価（健康及び栄養に関する自己認識）を含めた簡易栄養評価法（ＭＮＡ）によって栄養状態の評価を行った（Ｇｕｉｇｏｚ、Ｙ他、Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  １９９６；５４：Ｓ５９〜Ｓ６５）。ＭＮＡでは３０点の尺度を使用して高齢者の栄養状態を分類した。ＭＮＡ≧２４＝栄養状態良好、ＭＮＡ１７〜２３．５＝栄養不良の危険性有り、ＮＭＡ＜１７＝栄養不良。
【００５３】
プレバイオティクス補給
１日当たり短鎖フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）８グラムを以下の通りに投与した。１日２回ＦＯＳ粉末（Ａｃｔｉｌｉｇｈｔ  ９５０Ｐ、Ｂｅｇｈｉｎ−Ｍｅｉｊｉ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｎｅｕｉｌｌｙ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ、フランス）４ｇを看護士が食事時に食事に入れた。服薬遵守を推定するために、毎日の補給物消費を看護士が毎日の記録表に記録した。
【００５４】
微生物検査
ラクトバシラス、バクテロイド、エンテロバクター、エンテロコッカス、ビフィズス菌及びクロストリジウムパーフリンジェンスの内在集団数を計数した。
【００５５】
糞便試料を各被験者から０、２１、４２及び６３日目に収集した。糞便試料を直ちに（３０分以内）無酸素瓶に入れ、分析するまで４℃に維持した（最長６時間）。システイン０．５％を含有する予備還元リンガー溶液で、−２から−８まで１００倍連続希釈を実施した。種々の培地のペトリ皿に接種し、Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ  Ａ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用して無酸素雰囲気中で３７℃で４８時間インキュベートし、エンテロコッカス及びエンテロバクターについては有酸素雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。細菌は以下の通りに選択的又は半選択的培地で検出した。ドリガルスキー培地（Ｓａｎｏｆｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ、フランス）でエンテロバクターを、ユーゴントマト培地（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖ．Ｓｕｔｅｒ、Ｄ．Ｃｉｔｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆｉｎｅｇｏｌｄ  ３版）でビフィズス菌を、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ、ＭＩ．米国）及び抗生物質（ホスホマイシン（７９．５ｍｇ／ｌ）＋スルファメトキサゾール（０．９３ｍｇ／ｌ）＋トリメトプリム（５ｍｇ／ｌ））でラクトバシラスを、ＮＮ寒天（Ｌｏｗｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｙ、１９９５）でクロストリジウム  パーフリンジェンスを、シェドラーＮｅｏ−Ｖａｎｃｏ培地（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ−ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）でバクテロイドを、及びアジド寒天（Ｄｉｆｃｏ）でエンテロコッカスを検出した。
【００５６】
インキュベートした後、コロニーを計数して、必要であればさらに同定した。ラクトバシラス及びビフィズス菌株は顕微鏡によって、及びＡＰＩ  ｇａｌｌｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して、ラクトバシラスはＡＰＩ５０ＣＨＬギャラリー、ビフィズス菌はＡＰＩ  ＩＤ  ３２Ａギャラリーでそれぞれ生化学的に同定した。細菌数は新鮮糞便試料１グラム当たりｌｏｇ１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）として表し、検出限界を３．３０ｃｆｕ／ｇとした。
【００５７】
糞便のｐＨ
糞便排出直後に看護士が微量電極（Ｏｒｉｏｎ）で粗糞便の３カ所について糞便のｐＨを測定した。平均ｐＨを各時点について算出した。
【００５８】
血液試料
各被験者から空腹時の血液試料を試験開始前（４ｍｌ）及び０、２１、４２及び６３日目（２３ｍｌ）に採取した。一晩絶食した後、朝（午前１０時前）に血液を採取した。ヴァキュテイナー管に収集した試料１３ｍｌをヘパリン管に収集し、１０ｍｌを室温で３０〜６０分間凝固させた。血清試料を分析するまで−７０℃で凍結維持した。ヘパリン化血を免疫機能パラメータ（食作用、以下参照）及び血液学用に使用した。
【００５９】
免疫学的分析
末梢血単核細胞の集団及びその食作用活性をヘパリン化血の新鮮試料についてＳｉｍｕｌｓｅｔ及びＰａｇｏｔｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を使用して分析した。
【００６０】
インターロイキン−６  ｍＲＮＡ発現のＰＣＲによる分析。末梢血単核細胞中のｍＲＮＡ発現の分析をＰＣＲによってＤｅｌｎｅｓｔｅ、Ｙ．他（Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  １９９８；５６：Ｓ９３〜Ｓ９８）で記載された方法によって評価した。プライマー配列は、
５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＣＴ−３’及び
インターロイキン−６（ＩＬ−６）用には５’−ＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧ−３’及び
５’ＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣ−３’及び
β−アクチン用には５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣ−３’である。
【００６１】
生化学的測定
血清アルブミン、トランスチレチン（プレアルブミン）、Ｃ反応性蛋白質、及びα１−酸糖タンパク質濃度は、免疫比濁分析法によってＢｅｈｒｉｎｇ比濁計（ドイツのＢｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇの方法及び試薬）で分析した。血清中の葉酸及びビタミンＢ１２（コバラミン）濃度は、放射免疫測定法（Ｄｕａｌ  Ｃｏｕｎｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、カリフォルニア、米国）によって分析した。
【００６２】
統計学的分析
１標本ｔ検定又はウィルコクソン符号順位検定を、平均差について算出し、測定した様々なパラメータについてプレバイオティクスの影響はあったかという主な仮説について０．０５％で統計学的有意を評価した。さらに、１標本ｔ検定を平均差について算出し、試験期間前及び試験期間後を含めた試験計画に関する２つの問題について、０．０２５％で統計学的有意を評価した（自由度の損失について補正）。測定した様々なパラメータについて発酵乳停止（＝ウォッシュアウト期間）の影響はあったか。測定した様々なパラメータについてプレバイオティクス停止（＝追跡期間）の影響はあったか。全ての統計学的分析は、ＮＣＳＳ６．０．２２統計ソフトウェアを使用して実施した。
【００６３】
結果
被験者
男性４人及び女性１５人の１９人の被験者の平均年齢は８５±６．０才（７７〜９７才）であった。女性は男性よりも有意に体重が少なかった。試験開始時の被験者の特徴を表１に挙げる。
【００６４】
【表１】
0004456329.tif 000003
【００６５】
【表２】
0004456329.tif 000004
【００６６】
１人のみ栄養不良であった。栄養不良の危険性がある７人の女性では、上部スコア範囲は２１．５〜２３であり、平均ＮＭＡスコアは栄養状態が良好な範囲内にあり、２４．６±３．０点であった。
【００６７】
血清アルブミン（正常範囲３５〜５５ｇ／Ｌ）及びトランスチレチン（プレアルブミン、正常範囲０．１６〜０．４０）は正常範囲内の低い方であったが、男性２人（Ｃ反応性蛋白質が高い）及び女性２人（アルブミン濃度が低いが、トランスチレチンは正常で、Ｃ反応性蛋白質は境界線上である）以外では、急性期蛋白質、α１−酸糖蛋白質（正常範囲０．５〜１．３）及びＣ反応性蛋白質（正常値＜１０ｍｇ／Ｌ及び高齢者の異常値＞２０ｍｇ／Ｌ）は炎症過程の存在を示していなかった。これらの結果は、まだ栄養状態は良好であるがかなり虚弱な高齢者の群であることを示唆している。
【００６８】
細菌学的分析及び糞便のｐＨ
ビフィズス菌の細菌数は、ＦＯＳ補給３週間の間に平均２．８±０．５７ｌｏｇ１０ＣＦＵ増加したが（ｐ＜０．００１）、バクテロイドの細菌数もまた増加した（ｐ＜０．０３２）（表２ａ及び２ｂ及び図１参照）。
【００６９】
【表３】
0004456329.tif 000005
【００７０】
エンテロバクター、エンテロコッカス及びラクトバシラスの細菌数は発酵乳製品の補給及び／又はフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の摂取によって有意な影響を受けなかった。一方、ビフィズス菌はＦＯＳの摂取に特異的に応答するようであり、主に、ＦＯＳ開始前、ｌｏｇ１０  ＣＦＵが７よりも低かった被験者でビフィズス菌細菌数の増加が生じた。ＦＯＳ補給を抑制するとビフィズス菌細菌数が有意に１．１±０．３９ｌｏｇ１０ＣＦＵ減少したが、開始濃度にはならなかった（表２ａ及び２ｂ及び図１）。図２では、この試験で得られたビフィズス菌の変化を以前の試験と比較すると、高齢者は少なくとも若年成人と同様にＦＯＳの影響に感受性であることが示された。発酵乳製品の制限も、ＦＯＳの摂取も、糞便ｐＨを変化させなかった（表２ａ）。
【００７１】
非特異的免疫
ＦＯＳ摂取により、末梢Ｔリンパ球並びにリンパ球亜集団、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の有意な増加がもたらされた（表３ａ及び３ｂ）。白血球細胞の総数、活性化Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＦＯＳ細胞の摂取によって影響を受けなかった（表３ａ及び３ｂ）。
【００７２】
【表４】
0004456329.tif 000006
【００７３】
【表５】
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【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
0004456329.tif 000009
【００７６】
顆粒球及び単核球の食作用活性は、ＦＯＳの摂取によって有意に減少した。蛍光強度中央値で表された食作用活性は、顆粒球では１３０±１０から５２±２（ｐ＜０．００１）に、単核球では７５±５から２６±２（ｐ＜０．００１）に変化した。
【００７７】
このような炎症過程の減少の可能性はまた、ＦＯＳ摂取後の末梢血単核細胞のインターロイキン−６  ｍＲＮＡの有意な減少によっても示唆される（図３）。
【００７８】
ビタミンＢ１２及び葉酸状態
ビタミンＢ１２及び葉酸の血清濃度はいずれも、ＦＯＳの補給によって影響を受けなかった。血清ビタミンＢ１２は、補給前は２７１±１４３ｎｇ／Ｌで、補給中は２８９±１６０ｎｇ／Ｌであった。しかし、３人の被験者ではビタミンＢ１２が欠乏していた。２人の被験者では試験期間中に正常状態に回復したが、もう１人は試験期間中欠乏したままであった。血清葉酸濃度は、補給前は５．９±２．０μｇ／Ｌで、補給中は５．７μｇ／Ｌであった。
【００７９】
虚弱で高齢な被験者は試験開始時にビフィズス菌数が少なかったので、我々の結果は、高齢の被験者においてフルクトオリゴ糖のビフィズス発生効果によってビフィズス菌数が２ｌｏｇ増加することを強く示唆している。炎症過程の減少は、末梢血単核球におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現の減少によって示唆される。
【００８０】
実際に、本試験によって成人及び高齢者ではビフィズス菌に対してＦＯＳ補給の正の影響が見られることが確認され（図２）、高齢者はプレバイオティクス（ＦＯＳ）摂取に応答して若年成人のようにビフィズス菌が増加し、ビフィズス菌数が低い場合はさらに増加することが示された。さらに、ＦＯＳ８ｇ以下でもビフィズス菌数に対する最大効果を実現するために十分なようである。別の試験では用量応答が存在するようであるが、単一の試験では閾値である４〜５ｇ／日を上回ると最大応答が得られ、ビフィズス菌の増加は最初の数により依存するらしいことが示された（図１及び２）。食事に添加したＦＯＳは、有害な可能性がある細菌、主にクロストリジウム及びバクテロイドに代わってビフィズス菌の濃度を増加させることが多かった。しかし、試験全体を通じてバクテロイドの有意な増加が認められた（表２ａ及び２ｂ）。
【００８１】
食作用活性の重大な減少が認められた。この食作用活性の減少は、病原菌を抑制する可能性に関与したマクロファージの活性の減少を反映しており、したがって少量の内毒素負荷による炎症の減少が示唆される。しかし、驚いたことに、この炎症過程の減少の可能性は、末梢血単核細胞のインターロイキン−６  ｍＲＮＡ濃度の減少によっても示唆される（図３）。
【実施例２】
【００８２】
補助食品
補助食品は、フルクトオリゴ糖とイヌリンをフルクトオリゴ糖約７０％、イヌリンが約３０％の重量比で混合又はブレンドすることによって調製した。得られたプレバイオティクス混合物を適切な担体、たとえば発酵乳、ヨーグルト、フレッシュチーズ、レンネットミルク、菓子バー、朝食用シリアルフレーク又はバー、飲料、粉末乳、大豆をベースとした製品、非ミルク発酵製品又は臨床栄養学的栄養補助食品に添加又はブレンドすることが可能である。
【実施例３】
【００８３】
乾燥ペット試料
飼料混合物は、トウモロコシ約５８重量％、トウモロコシグルテン約５．５重量％、鶏肉約２２重量％、乾燥チコリ２．５％、カルニチン１％から構成され、残部は塩類、ビタミン及び無機質から構成される。
【００８４】
飼料混合物を予備調製器に送り込み、水分を入れる。次に、水分を含んだ飼料を押し出し調理器に送り込み、糊化する。押し出し器から排出した糊化基質をダイに入れ、押し出し成形する。成型物をイヌに与えるのに適した切片に切断し、約１１０℃で約２０分間乾燥し、冷却してペレットを形成する。
【００８５】
この乾燥ドッグフードは特に炎症過程及び／又は非特異的免疫パラメータ、たとえば食細胞の異常活性化を減少させるためのものである。
【実施例４】
【００８６】
湿性缶入りペットフード
混合物は、鶏ガラ、ブタ肺及びブタ肝臓（磨砕）５６％、魚１３％、小麦粉１６％、血漿２％、水１０．８％、色素２．２％、半精製カッパカラギーナン１％、無機塩、及びモノ不飽和脂肪酸に富んだ油（オリーブ油）９％及びチコリ３％から調製する。この混合異物を１２℃で乳化して、プディング型に押し出し、次に９０℃の温度で調理する。これを３０℃まで冷却して塊状に切断する。
【００８７】
これらの塊（水分含量５８％）の３０％を鶏ガラ２３％、グアーガム１％、色素及び香料１％及び水７５％から調製された基質に取り込ませる。次に、ブリキ缶に充填し、１２７℃で６０分間滅菌する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】老人ホーム高齢者の新鮮糞便中のビフィズス菌の生菌数に対する短鎖フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）８ｇ投与の効果。時点は、ＦＯＳ３週間摂取の摂取前（２）、摂取中（３）、及び摂取後（４）であった。（Ａ）個々の値。（Ｂ）四角。四角は２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示し、四角内の実線は中央値を示し、ｔ型は５パーセンタイル及び９５パーセンタイルを示し、実線の点は範囲外の値を示す。
【００８９】
【図２】成人及び高齢者のビフィズス菌に対するフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の効果。参照文献２４（Ｂｏｕｈｎｉｋ  Ｙ他、Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９９；１２９：１１３）は１８〜４７才の成人における２．５ｇから２０ｇ  ＦＯＳ／日に対する用量応答である。参照文献２５（Ｍｅｎｎｅ  Ｅ他、Ｊ  Ｎｕｔｒ  ２０００；１３０：１１９７）は２０〜５０才の中年成人における８ｇ  ＦＯＳ／日に対する応答である。参照文献２６（Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９９；１２９：１４３８Ｓ）は若年成人における１５ｇ  ＦＯＳ／日に対する応答である。参照文献２７（Ｋｒｕｓｅ  ＨＰ他、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９９；８７：３２５）は、２６〜５３才の中年成人におけるイヌリン３４ｇ／日までに対する応答である。参照文献２８（Ｋｌｅｅｓｅｓｅｎ  Ｂ他、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  １９９７；６５：１３９７）は、６８〜８９才の便秘の高齢被験者における２０ｇ  ＦＯＳ／日に対する応答である。本試験：老人ホームの７７〜９１才の被験者における８ｇ  ＦＯＳ／日に対する応答である。
【００９０】
【図３】ＦＯＳを補給した高齢者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−６ｍＲＮＡ発現の差違。ＰＢＭＣにおけるＩＬ−６ｍＲＮＡ発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。定量的変化は、ＮＩＨイメージプログラムを使用してバンドの強度を走査し、ＩＬ−６ｍＲＮＡのβ−アクチンｍＲＮＡに対するパーセントによる密度比として算出することによって推定した。時点はＦＯＳ３週間摂取の摂取前（２）、摂取中（３）、及び摂取後（４）であった。（Ａ）臭化エチジウム染色したゲルにおける個々の変化の代表的なイメージ。（Ｂ）ＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現の定量的推定。ＦＯＳ摂取中のＩＬ−６  ｍＲＮＡの変化はＦＯＳ摂取前と有意に異なっている（ｐ＝０．０１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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