(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＰ−糖タンパク質エピトープの細胞外部分と結合することができる抗原結合領域からなる単鎖Ｆｖ抗体であって、前記抗原結合領域は、配列番号２に示される核酸配列によってコードされ、前記単鎖Ｆｖ抗体は、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項２】
前記多剤耐性細胞はガン細胞である請求項１に記載の単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項３】
前記多剤耐性細胞はヒトガン細胞である請求項２に記載の単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４】
前記単鎖Ｆｖ抗体は検出可能な成分で標識される請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項５】
前記検出可能な成分は、発色成分、蛍光発生成分、発光成分および放射性成分からなる群から選択される請求項４に記載の単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖Ｆｖ抗体を有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
【請求項７】
化学療法薬物をさらに含む請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化学療法薬物はガン細胞に対して毒性である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を診断するためのキットであって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単鎖Ｆｖ抗体と、前記単鎖Ｆｖ抗体を検出するための試薬とを含むキット。
【請求項１０】
細胞外Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を診断する際に使用される前記単鎖Ｆｖ抗体を識別する包装材をさらに含む請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の単鎖Ｆｖ抗体に細胞をさらすこと、および
（ｂ）前記Ｐ−糖タンパク質の前記細胞外部分に結合した前記単鎖Ｆｖ抗体を検出し、それにより、細胞外Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を同定すること
を含む方法。
【請求項１２】
個体から得られた細胞を使用する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単鎖Ｆｖ抗体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸構築物を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞に関連するＰ−糖タンパク質に結合することができる抗体フラグメントに関する。本発明はまた、ＭＤＲガン細胞における薬物排出活性を阻害するためにかかる抗体フラグメントを利用する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガン化学療法は、多くの場合、広範囲の様々な抗ガン薬物（コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびドキソルビシンなど）に対するガン性細胞における後天的または固有な耐性の発達のために失敗している。この現象は、多剤耐性（ＭＤＲ）として知られており、ガン化学療法に対する主要な障害である。
【０００３】
ＭＤＲの重要な機構は、多剤輸送体として既知のエネルギー依存性排出ポンプの過剰発現である。この排出ポンプは、ＭＤＲ１遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａのＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）である。Ｐｇｐにより媒介されるＭＤＲは化学療法に対する様々な腫瘍細胞の耐性において重要な役割を果たしている。様々な研究により、明らかな相関が、ｍｄｒ１発現と、化学療法に対する応答の喪失との間に示されている（６、７）。
【０００４】
ガン細胞におけるＭＤＲ表現型の阻害剤は、ＭＤＲに関与する輸送体タンパク質の薬物排出機能の発現の改変または妨害のいずれかをもたらし得る。既知のＭＤＲ阻害剤には、ベルパミル（カルシウムチャネル遮断剤であり、白血病を治療するために使用されている）、シクロスポリン類、各種ステロイド、およびカルモジュリン阻害剤（Ｐｇｐにより輸送された薬物の細胞内蓄積および細胞傷害性作用を高める）が含まれる。しかしながら、臨床的適用のために現在利用可能な既知のＭＤＲ調節薬物はほとんどが、それらの治療的価値を実質的に制限する大きな副作用を有する。
【０００５】
最近、様々なＰｇｐ特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が、ＭＤＲ阻害における使用を意図した薬剤として開発されている。米国特許第４８３７３０６号には、Ｐｇｐの細胞内ドメインのＣ末端部分に対して向けられた様々な抗体が記載される。これらの抗体は、ＭＤＲ細胞において薬物排出活性に対する阻害効果を有することは知られていない。
【０００６】
米国特許第５７６６９４６号には、ヒトＰｇｐの４番目の細胞外ループに存在するエピトープを認識する、ＭＭ．１７と名付けられたモノクローナル抗体が記載される。このＭＭ．１７抗体は、ヒトＴリンパ芽球様細胞のＭＤＲ変化体でマウスを免疫化することによって作製された。この抗体は、ＭＤＲ細胞において薬物排出活性に対する阻害効果を有することは知られていない。
【０００７】
米国特許第６４７９６３９号には、Ｐｇｐの細胞外ドメインに対して向けられた、ＵＩＣ２と名付けられたモノクローナル抗体が記載される。このＵＩＣ２抗体は、Ｐｇｐを発現するトランスフェクションされた繊維芽細胞でマウスを免疫化することによって作製された。ＵＩＣ２  Ｍａｂは、ＭＤＲ細胞の薬物排出活性をインビトロで阻害することができることが見出されていた。
【０００８】
ＨＹＢ−２４１およびＨＹＢ−６１２と名付けられたモノクローナル抗体はＰｇｐの外側エピトープを認識する。これらのＭａｂは、腫瘍細胞における化学療法薬物のビンクリスチンおよびアクチノマイシンＤの蓄積を増大し、それにより細胞毒性を増大させることが報告されている［Ｍｅｙｅｒｓ，Ｍ．Ｂ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９：３２０９（１９８７）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｐ．他、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３０：Ａｂｓ２１１４（１９８９）］。
【０００９】
モノクローナル抗体Ｍａｂ６５７はＭＤＲ細胞と反応することが報告されている［Ｃｉｎｃｉａｒｅｌｌｉ，Ｃ．他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７：５３３（１９９１）］。この抗体は、ヒト末梢血リンパ球により媒介される細胞毒性に対するＭＤＲ細胞の感受性を増大させることが報告されていたが、Ｐｇｐの薬物排出活性に対する阻害効果を有することは知られていない。
【００１０】
モノクローナル抗体のＭＲＫ−１６およびＭＲＫ−１７が、ＭＤＲヒト白血病細胞でマウスを免疫化することによって作製されていた。これらの抗体はともにＰｇｐを認識し、ＭＤＲ細胞における薬物排出活性をインビトロおよびインビボで調節することができる［Ｈａｍａｄａ  Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ＰＮＡＳ、８３：７７８５（１９８６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．他、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８８：１３８６（１９９１）；Ｔｓｕｒｕｏ，Ｔ．、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８０：６２７（１９８９）］。ＭＲＫ−１６の可変領域をヒト抗体のＦｃ部分と組み合わせる組換えキメラ抗体が、ＭＤＲ細胞に対する細胞毒性をインビトロで増大させることにおいて元のＭＲＫ−１６  Ｍａｂよりも効果的であることが報告されていた［Ｈａｍａｄａ  Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０：３１６７（１９９０）］。
【００１１】
上記抗体の実質的な制限は、これらの分子のサイズが大きいことから生じている。薬剤の送達効率は、典型的には、そのサイズに反比例することが広く知られている。従って、上記に記載された大きい抗体分子は、治療的効果を得るために大きい投与投薬量を必要とする腫瘍細胞の内部に効率的に浸透せず、また、分布しないと考えられる。
【００１２】
現在利用可能なＰｇｐ特異的抗体の別の大きな欠点は、Ｐｇｐが、腎臓、肝臓、結腸、精巣、リンパ球および血液脳関門を含む正常なヒト組織において構成的に発現されるという事実である（２７）。大きな抗体分子は、典型的には、長期間にわたって循環し、循環からゆっくり排出され、これにより、Ｐｇｐを生理学的に発現する正常な組織に対する起こり得る毒性効果をもたらしている。
【００１３】
加えて、上記に記載されたＰｇｐ特異的抗体はほとんどが、Ｐｇｐに対する大きい親和性のために選択されていた。しかしながら、治療におけるＰｇｐ特異的抗体の実際の使用は、Ｐｇｐに対する抗体の結合親和性が大きいときには実質的に制限され得る。これは、Ｐｇｐを生理学的に発現する正常な組織に対して及ぼされ得る毒性作用のためである。
【００１４】
従って、上記の制限を有しないＰｇｐ特異的抗体が必要であることが広く認識されており、そのようなＰｇｐ特異的抗体を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の１つの態様によれば、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを有効成分として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明のなお別の態様によれば、個体におけるガンを治療する方法が提供され、この方法は、（ａ）多剤耐性ガン細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを個体に与えること、および（ｂ）治療効果的な量の抗ガン剤を個体に投与し、それにより個体におけるガンを治療することを含む。
【００１８】
本発明のさらに別の態様によれば、Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を診断するためのキットが提供され、このキットは、前記Ｐ−糖タンパク質と結合することができる抗原結合領域を含有する抗体フラグメントと、前記抗体フラグメントを検出するための試薬とを含む。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含む抗体フラグメントに細胞をさらすこと、および（ｂ）前記Ｐ−糖タンパク質の前記細胞外部分に結合した前記抗体フラグメントを検出し、それにより、細胞外Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を同定することを含む。
【００２０】
本発明のなおさらなる態様によれば、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００２３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントはＦｖフラグメントであり、好ましくは単鎖Ｆｖである。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントはＦａｂである。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）２である。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）である。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントは、ｍｄｒ１遺伝子によって発現される１７０ｋＤａのポリペプチドの細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、好ましくは、前記抗原結合領域は、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分の第１のループに存在するエピトープに対して向けられており、より好ましくは、前記エピトープは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の抗体フラグメントは、多剤耐性ガン細胞（好ましくは、ヒトガン細胞）における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の医薬組成物はさらに、化学療法薬物（好ましくは、ガン細胞に対して毒性である化学療法薬物）を含む。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、個体におけるガンを治療する方法は、多剤耐性ガン細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを個体に与えることを含み、この場合、前記抗体フラグメントは、医薬的に許容され得るキャリアとともに投与される。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、個体におけるガンを治療する方法は、多剤耐性ガン細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを個体に与える前に、または、多剤耐性ガン細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを個体に与えるのと同時に、または、多剤耐性ガン細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体フラグメントを個体に与えた後に、治療効果的な量の抗ガン剤を個体に投与することを含む。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、個体におけるガンを治療する方法は、本発明の抗体フラグメントと複合体化された抗ガン剤の治療効果的な量を個体に投与することを含む。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、個体におけるガンを治療する方法は、個体の細胞内において本発明の抗体フラグメントを発現させることを含む。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明のキットはさらに、細胞外Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を診断する際に使用される抗体フラグメントを識別する包装材を含む。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明のキットは、検出可能な成分で標識された本発明の抗体フラグメントを含み、好ましくは、前記検出可能な成分は、発色成分、蛍光発生成分、発光成分および放射性成分からなる群から選択される。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する個体の細胞を検出する方法はさらに、細胞を本発明の抗体フラグメントにさらす前に個体から生物学的サンプルを得ることを含む。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｐ−糖タンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法はさらに、検出可能な成分で標識された本発明の抗体フラグメントに細胞をさらすことを含み、この場合、好ましくは、検出可能な成分は、発色成分、蛍光発生成分、発光成分および放射性成分からなる群から選択される。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の単離されたポリヌクレオチドは配列番号２に示される通りである。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の核酸構築物はさらに、前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む。
【００４０】
本発明は、抗体フラグメント、抗体フラグメントを利用する医薬組成物、ポリヌクレオチド、核酸構築物、キットおよび方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。本発明の抗体フラグメントは、Ｐ−糖タンパク質の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、それにより、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することができる。
【００４１】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４２】
図面の簡単な記述
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけのものであり、従って、本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図１ａ〜図１ｄは、精製されたＡ２単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の特異性および結合特質を明らかにする。図１ａは、中央および右側のレーンにおいてＡ２ｓｃＦｖが単一バンドであることを表し、同時に、左側レーンが分子量サイズ標準のバンドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図１ｂは、ビオチン化された標的のＰｇｐ由来ペプチド（配列番号１のアミノ酸配列を含む；Ｐｇｐ）、またはビオチン化された非標的ペプチド（ＰＲＰ）、またはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔＡ）に対するＡ２ｓｃＦｖ結合のＥＬＩＳＡの棒グラフである。グラフは、Ａ２ｓｃＦｖが標的のＰｇｐ由来ペプチドと用量依存的な様式で反応したことを示している。Ａ２ｓｃＦｖは非標的ペプチドまたはストレプトアビジンとは反応しなかった。図１ｃは、ビオチン化標的のＰｇｐ由来ペプチドに対するＡ２ｓｃＦｖの結合の用量応答曲線を表すＥＬＩＳＡのプロットである。５０％の結合のために要求されるＡ２ｓｃＦｖの濃度は約１５０ｎＭとして内挿された。図１ｄは競合放射免疫アッセイプロットである。このプロットは、一定量の［１２５Ｉ］標識されたＡ２ｓｃＦｖと、増大する量の標識されていないＡ２ｓｃＦｖ（競合剤として）とを使用することに基づいている。Ａ２ｓｃＦｖの５０％の結合阻害のための要求される濃度は約１３０ｎＭとして内挿された。
図２ａ〜図２ｈは、多剤耐性（ＭＤＲ）を示し、かつＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）を過剰発現する腫瘍細胞に対するＡ２ｓｃＦｖ結合の能力および選択性を明らかにする。図２ａは、薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。このプロットは、Ａ２ｓｃＦｖ処置が蛍光強度に対して何ら影響を有しなかったことを示しており、これは、抗体−細胞の結合がないことを示している。図２ｂは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲと反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。このプロットは、Ａ２ｓｃＦｖ処置が蛍光強度の１０倍の増大をもたらしたことを示しており、これは抗体−細胞の強い結合を示している。図２ｃは、薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢ３−１と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。このプロットは、Ａ２ｓｃＦｖ処置が蛍光強度に対して何ら影響を有しなかったことを示しており、これは、抗体−細胞の結合がないことを示している。図２ｄは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１（薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢ３−１に由来する）と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。このプロットは、Ａ２ｓｃＦｖ処置が蛍光強度の実質的な増大をもたらしたことを示しており、これは抗体−細胞の強い結合を示している。図２ｅは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲ（薬物感受性の卵巣ガン腫細胞株２７８０に由来する）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。この顕微鏡写真は、陽性の抗体−細胞反応を示す染色された細胞を示している。図２ｆは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された薬物感受性細胞２７８０の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。細胞は染色されないままであった。これは、抗体−細胞の反応がないことを示している。図２ｇは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢ３−１（薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１に由来する）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。この顕微鏡写真は、陽性の抗体−細胞反応を示す染色された細胞を示している。図２ｈは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１（ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢ３−１の親株）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。細胞は染色されないままであった。これは、抗体−細胞の反応がないことを示している。
図３ａ〜図３ｅはＭＤＲ細胞における薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を明らかにする。図３ａは、カルセインの蓄積速度を、（ｉ）薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０（黒塗り棒により表される）、および（ｉｉ）ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲ（灰色棒により表される）において比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、５分間または１５分間のインキュベーションの後において蛍光強度の１／５および１／１０への低下（これはカルセイン取り込みの低下を示す）をそれぞれ示している。図３ｂは、カルセインの蓄積を、（ｉ）薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０、および（ｉｉ）ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒト卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲにおいて比較するフローサイトメーターアッセイを表すプロットである。このプロットは、２７８０ＡＤＲ細胞が実質的に低下した平均蛍光強度を示したことを示している。これは、薬物感受性の２７８０細胞によるカルセイン取り込みと比較して、ＭＤＲ細胞によるカルセイン取り込みのレベルが実質的に低下していることを示している。図３ｃは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する２７８０ＡＤＲ細胞におけるカルセインの蓄積に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を蛍光計アッセイにおいて明らかにする棒グラフである。このグラフは、２７８０ＡＤＲ細胞によるカルセインの取り込みに対する、カルセイン添加前に投与されたＡ２ｓｃＦｖの正の用量応答効果を示している。図３ｄは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する２７８０ＡＤＲ細胞によるカルセイン取り込みに対するＡ２ｓｃＦｖの影響を明らかにするプロットである。Ａ２ｓｃＦｖをカルセイン添加前に投与した。このプロットは、蛍光強度の平均値が実質的に大きくなっていること（４倍〜５倍）を示している。これは、Ａ２ｓｃＦｖで処置されていない細胞と比較して、Ａ２ｓｃＦｖで処置されたＭＤＲ細胞によるカルセイン取り込みの実質的な増大を示している。図３ｅは、ｓｃＦｖの特異性を例示する棒グラフである。このグラフは、蛍光計アッセイによって得られたデータを表しており、２７８０ＡＤＲ細胞に対するＡ２ｓｃＦｖの投与、続くカルセインの添加は、細胞の蛍光強度を実質的に増大させたことを示している。これは、細胞におけるカルセイン取り込みが増大していることを示している。比較において、２７８０ＡＤＲ細胞に対する非標的ｓｃＦｖ  Ｇ１（これはメラノーマ腫瘍抗原に対して単離された）の投与は細胞におけるカルセイン取り込みを増大させなかった。
図４ａ〜図４ｅは様々なＭＤＲ細胞株およびそれらの薬物感受性の親細胞株における薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を明らかにする。図４ａは、齧歯類（ＣＨＯ）ＭＤＲ細胞株ＥＭＴＲ１におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、Ａ２ｓｃＦｖで処置され、続いてカルセインが添加された細胞が、実質的に大きくなったレベルの蛍光を示したことを示しており、これは、非処置（陰性）コントロールと比較したとき、細胞におけるカルセイン取り込みが大きくなっていることを示している。Ａ２ｓｃＦｖの効果はベラパミル（陽性コントロールとして使用された基準のＭＤＲ調節剤）の効果と類似していた。図４ｂは、ＭＤＲヒト類表皮細胞株ＫＢ−Ｖ１におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、Ａ２ｓｃＦｖで処置され、続いてカルセインが添加された細胞が、実質的に大きくなったレベルの蛍光を示したことを示しており、これは、非処置（陰性）コントロールと比較したとき、細胞における大きくなったカルセイン取り込みを示している。Ａ２ｓｃＦｖの効果はベラパミル（陽性コントロールとして使用された基準のＭＤＲ調節剤）の効果と類似していた。図４ｃは、薬物感受性の２７８０細胞株（２７８０ＡＤＲの親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、Ａ２ｓｃＦｖによって処置された細胞、非処置（陰性）コントロール、またはベラパミル（陽性）コントロールにおいて観測された蛍光強度が類似していることを示した。従って、これは、薬物感受性細胞におけるカルセイン取り込みに対して、Ａ２ｓｃＦｖは影響を及ぼさなかったことを示している。図４ｄは、薬物感受性のヒト類表皮細胞株ＫＢ３−１（ＫＢＶ−１の親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、Ａ２ｓｃＦｖによって処置された細胞、非処置（陰性）コントロール、またはベラパミル（陽性）コントロールにおいて観測された蛍光強度が類似していることを示している。従って、これは、薬物感受性細胞におけるカルセイン取り込みに対して、Ａ２ｓｃＦｖは影響を及ぼさなかったことを示している。図４ｅは、薬物感受性の齧歯類（ＣＨＯ）細胞株Ａ８（ＥＭＴＲ１の親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。このグラフは、Ａ２ｓｃＦｖによって処置された細胞、非処置（陰性）コントロール、またはベラパミル（陽性）コントロールにおいて観測された蛍光強度が類似していることを示している。従って、これは、薬物感受性細胞におけるカルセイン取り込みに対して、Ａ２ｓｃＦｖは影響を及ぼさなかったことを示している。
図５は様々な濃度のＡ２ｓｃＦｖで処置された２７８０ＡＤＲ細胞におけるカルセイン取り込みを表すプロットである。このプロットは、カルセイン取り込みを示す蛍光強度の用量応答曲線を示している。推定される飽和（ＩＣ１００）濃度およびＩＣ５０濃度はそれぞれ、１ｍｌあたり０．１ｍｇおよび０．０６５ｍｇのＡ２ｓｃＦｖである（すなわち、それぞれ、４μＭおよび２．６μＭ）。
図６は様々な濃度のドキソルビシンで処置された２７８０ＡＤＲ細胞の生存性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を表す棒グラフである。細胞生存性が細胞タンパク質内への［３Ｈ］−ロイシン取り込みによって測定された。グラフは、ドキソルビシン添加前に細胞をＡ２ｓｃＦｖで処置することにより、Ａ２ｓｃＦｖで処置されていない細胞と比較して、細胞生存性の実質的な喪失がもたらされたことを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、細胞外Ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）と結合することができる抗原結合部位を含む抗体フラグメントに関するものであり、そのため、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞における薬物排出活性を阻害するために、または、ＭＤＲ細胞を検出するのに使用することができる。
【００４４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、従って、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「Ｐ−糖タンパク質」は、ヒトｍｄｒ１遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通タンパク質を示し、このタンパク質は多剤耐性細胞におけるエネルギー依存性の生物学的ポンプとして機能する。
【００４６】
本明細書中で使用される表現「多剤耐性」は、細胞傷害性薬物に対する一部の細胞（例えば、Ｐｇｐを過剰発現するガン細胞など）の抵抗性を示す。
【００４７】
本明細書中で使用される表現「抗体フラグメント」は、天然の抗体分子の任意の活性な部分を示す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’が含まれるが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、完全な抗体から酵素的もしくは化学的に作製することができ、または、合成的に作製することができる。あるいは、抗体フラグメントは、抗体フラグメントの配列をコードするポリヌクレオチド配列から発現させることができる。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「Ｆｖ」は、非共有結合的相互作用によってつながれた、抗体分子の１つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインおよび１つの可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含むポリペプチドを示す。Ｆｖは抗体分子の抗原結合領域を含む。
【００４９】
本明細書中で使用される表現「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが好ましくはポリペプチドリンカーによってつながれているＦｖを示す。ｓｃＦｖは、完全な抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントである。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「Ｆａｂ」は、抗体を酵素パパインで消化することによって得られるフラグメントと本質的には同等である抗体フラグメントを含むポリペプチドを示す。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、抗体をｐＨ４．０〜４．５において酵素ペプシンで消化することによって得られるフラグメントと本質的には同等である抗体フラグメントを含むポリペプチドを示す。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２の２つの重鎖片をつなぐジスルフィド架橋の還元によって得られるフラグメントと本質的には同等である抗体フラグメントを含むポリペプチドを示す。
【００５３】
Ｐｇｐと結合することができ、かつ、それによりＭＤＲ細胞における薬物排出活性を回避することができるいくつかのＰｇｐ特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が先行技術において記載されている［米国特許第４８３７３０６号、同第５７６６９４６号および同第６４７９６３９号；Ｍｅｙｅｒｓ、Ｍ．Ｂ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９：３２０９（１９８７）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｐ．他、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３０：Ａｂｓ２１１４（１９８９）；Ｃｉｎｃｉａｒｅｌｌｉ，Ｃ．他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７：５３３（１９９１）；Ｈａｍａｄａ  Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ＰＮＡＳ、８３：７７８５（１９８６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．他、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８８：１３８６（１９９１）；Ｔｓｕｒｕｏ，Ｔ．他、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８０：６２７（１９８９）；Ｈａｍａｄａ  Ｈ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０：３１６７（１９９０）］。それにもかかわらず、これまで、そのような抗Ｐｇｐ  Ｍａｂの実用的な治療的使用は、主に、その移動性および組織浸透を制限するこれらの分子の大きなサイズによって妨げられている［Ｙｏｋｏｔａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２：３４０２〜３４０８（１９９２）］。細胞浸透および移動性の制限に加えて、これらの大きなＭａｂ分子は、体循環から排出されることが遅く、結果として、標的以外の組織を潜在的には損傷し得る（１２）。そのうえ、Ｐｇｐに対して大きな親和性を典型的には示すこれらのＭａｂはまた、Ｐｇｐを生理学的に発現する正常な細胞に対しても毒性であり得る。
【００５４】
これらの制限を回避する１つの方法は、抗体フラグメントを使用することである。好都合には、抗体フラグメントは、分子サイズが小さいにもかかわらず、Ｐｇｐに対する大きな特異性および中程度の親和性を有しており、従って、ＭＤＲ細胞における薬物排出活性を阻害することにおいて非常に効率的であるにもかかわらず、上記の制限を有しない。
【００５５】
モノクローナル抗体分子（Ｍａｂ）の欠陥を克服するための抗体フラグメントの考えられる使用がＳｃｈｏｄｉｎおよびＫｒａｎｚ［Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．、２６８：２５７２２〜２５７２７（１９９３）］によって例示されていた。モノクローナル抗体はＴ細胞の活性化をインビトロで効率的に阻害する一方で、モノクローナル抗体はまた、インビボで使用されたときには相当の望ましくない副作用を引き起こすことが見出されていた。これらの副作用は、Ｍａｂを小さいサイズのｓｃＦｖで置き換えることによって効果的に回避された。
【００５６】
米国特許第６４７９６３９号は、Ｐｇｐ特異的なＭａｂ、および治療においてその一部分を使用することの可能性を開示する。米国特許第６４７９６３９号はさらに、抗体フラグメントを作製するために利用することができる、この分野で既知の酵素的技術、化学的技術および遺伝子操作技術を記載する。それにもかかわらず、この特許は、実際のＭａｂ由来フラグメントの何らかの例、またはそのようなフラグメントを作製するための具体的な方法論を提供していない。
【００５７】
Ｐｇｐと特異的に結合することができ、かつ、細胞のＭＤＲ活性を調製することもできる抗体フラグメントがこの先行技術文書または何らかの他の先行技術文書に記載されていないという事実は、既存のＭａｂ配列から機能的な抗体フラグメントを作製することが慣用的でないことを示している。
【００５８】
この指摘は、Ｎｉｖおよび共同研究者（１９）によって行われた最近の研究によって裏付けられる。この研究では、「９Ｆ１１」と名付けられたＰｇｐ特異的なＭａｂ、およびこのＭａｂに由来するｓｃＦｖが作製され、特徴づけられた。両方の分子、すなわち、完全な９Ｆ１１ＭａｂならびにそのｓｃＦｖ誘導体は、ＭＤＲ細胞における細胞外Ｐｇｐを特異的に標的化した。しかしながら、９Ｆ１１の完全な抗体はまたＭＤＲ細胞における薬物排出活性を阻害することができた一方で、そのｓｃＦｖ誘導体は阻害することができなかった（未発表データ）。
【００５９】
従って、そのような抗体フラグメントがＭＤＲ細胞における薬物排出活性を阻害することにおいて活性であることを実際に明らかにすることなく、Ｍａｂ配列を、それぞれの抗体フラグメントを作製するために利用することができるという米国特許第６４７９６３９号の単なる示唆は、成功が妥当な程度で保証され得ないので、そのような抗体フラグメント配列を作製するための動機付けを当業者に提供していない。
【００６０】
本発明は、多剤耐性細胞における薬物排出活性を効果的に阻害することができる新規なＰｇｐ特異的な抗体フラグメントを提供する。
【００６１】
従って、本発明の１つの態様によれば、Ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）の細胞外部分と結合することができる抗原結合領域を含み、かつ、多剤耐性細胞における薬物排出活性を少なくとも部分的に阻害することもできる抗体フラグメントを提供する。
【００６２】
好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、ヒトｍｄｒ１遺伝子によって発現される１７０ｋＤａのＰｇｐに対して向けられる。このタンパク質のいくつかの領域が潜在的には標的化され得るが、本発明の抗体フラグメントは、好ましくは、ヒトｍｄｒ１遺伝子によって発現される１７０ｋＤａのポリペプチドＰｇｐの１番目の細胞外ループに存在するエピトープに対して向けられる。最も好ましくは、本発明の抗体フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列に対して向けられる。
【００６３】
本発明の抗体フラグメントは、下記の参考文献などに記載されるファージディスプレイ技術を使用して作製することができる：米国特許第５６９８４２６号、同第５６５８７２７号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５７５０７５３号、同第５８２１０４７号、同第５５７１６９８号、同第５４２７９０８号、同第５５１６６３７号、同第５７８０２２５号、同第５６５８７２７号、同第５７３３７４３号および同第５９６９１０８号；ならびにＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／０２８０９、同ＷＯ９１／１０７３７、同ＷＯ９２／０１０４７、同ＷＯ９２／１８６１９、同ＷＯ９３／１１２３６、同ＷＯ９５／１５９８２、同ＷＯ９５／２０４０１；ならびにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４：１〜２０（１９９８）；Ｂｒｉｎｋｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ他、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ他、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１〜２８０（１９９４）。
【００６４】
従って、標的抗原を、この分野で広く知られている免疫化プロトコルを使用して宿主動物を免疫化するために利用することができる。好ましくは、標的抗原はＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）に由来し、より好ましくは、標的抗原は、ヒトｍｄｒ１遺伝子によって発現される１７０ｋＤａのＰｇｐに由来する。最も好ましくは、標的抗原は１７０ｋＤａのＰｇｐの最初のループに由来し、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
免疫化後、Ｂ細胞のｍＲＮＡを、免疫化動物の脾臓、末梢血リンパ球、骨髄または扁桃から抽出することができる。その後、ｍＲＮＡは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他［Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４：１〜２０（１９９８）］、Ｋａｎｄ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：４３６３（１９９１）］、Ｂａｒｂａｓ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：７９７８（１９９１）］、Ｇａｒｒａｒｄ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３７３〜１３７７（１９９１）］、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３〜４１３７（１９９１）］、およびＳｈａｒｏｎ他［Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、３：１８５〜１９６（２０００）］によって記載される方法論などの方法論を使用して抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築するために利用することができる。
【００６６】
望ましい抗体結合特性を有する組換えファージを、過剰な非結合性クローンからの、特異的な標的と結合するファージの逐次濃縮によって選択することができる。この選択は、固定化された抗原に対するパンニング、特異的な溶出を使用するパンニング、ビオチン化された抗原を使用すること、カラムにおけるアフィニティー精製、または、細胞上での直接的なパンニングを含む、状況に応じて使用される数多くの技術によって達成することができる。好適な選択技術が、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｍ［Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻：ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９頁〜３１５頁（１９９４）］およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他［Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４：１〜２０（１９９８）］によって記載される。
【００６７】
選択後、非特異的な抗体フラグメントを有するファージを洗浄により除くことができ、そして、標的特異的な抗体フラグメントを有する結合したファージが溶出され、大腸菌の感染によって増幅される。標的特異的な抗体フラグメントを呈示する組換えファージが単離されると、抗体をコードするポリヌクレオチド配列をファージディスプレイパッケージから回収し、その後、Ａｕｓｕｂｅｌ他編［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ］などによって記載されるこの分野で既知の標準的な方法を使用して組換え発現ベクターにクローン化することができる。
【００６８】
上記に記載されるように作製された抗体フラグメントは、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイまたは免疫蛍光アッセイ（これらに限定されない）を含むこの分野で既知の任意の従来の免疫アッセイ技術によってＰｇｐの特異性および親和性について特長づけすることができる。ＭＤＲ細胞における薬物排出活性を阻害することに対する抗体フラグメントの影響を、目的とする薬物の細胞内蓄積または排出を抗体フラグメントの存在下または非存在下でモニターすることによって評価することができる。例えば、Ｃｏｌｅ他［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５４：５９０２〜５９１０（１９９４）］は、薬物および／またはトキシン（例えば、ドキソルビシン、ビンクリスチン、コルヒチン、ＶＰ−１６、ビンブラスチン、ベラパミル、ミトキサントロン、タキソール、シクロスポリンＡ、キニジン、プロゲステロン、タモキシフェン、エピルビシン、ダウノルビシンおよびＭＸ２など（これらに限定されない））の排出を評価するために使用することができる細胞蓄積アッセイおよび排出アッセイを記載する。さらなる好適な特性アッセイには、ドキソルビシンまたはダウノルビシンなどの薬物の蛍光特性を利用するフローサイトメーターアッセイまたは蛍光計アッセイ［米国特許第５５５６８５６号；Ｋｒｉｓｈａｎ、Ｍａｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３３：４９１〜５００（１９９０）］、あるいは、ローダミンまたはカルセインなどの蛍光色素に基づくフローサイトメーターアッセイまたは蛍光計アッセイ［米国特許第５４０３５７４号；Ｈｏｌｌｏ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１１９１：３８４〜３８８（１９９４）］が含まれる。ＭＤＲ細胞に対する増大する細胞毒性に対する抗体フラグメントの影響を、細胞毒素に対する一定期間の暴露の後、生体染色色素の細胞取り込みをモニターすることによって、例えば、米国特許第５５４３４２３号に記載される方法などによって；または、［３Ｈ］ロイシンの取り込みの評価によって、例えば、下記の実施例の節の実施例３に記載される方法などによって評価することができる。
【００６９】
下記の実施例の節の実施例１には、抗Ｐｇｐ単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の単離が記載される。
【００７０】
簡単に記載すると、アミノ酸配列（配列番号１）を、コートタンパク質をコードする遺伝子に融合してｆ８８糸状ファージにバッチクローン化した。その後、この分野で既知の標準的な方法を使用して標的抗原（配列番号１）に対する免疫応答を生じさせるために、組換えディスプレイファージを使用して、マウスを免疫化した。免疫化後、脾臓を免疫化マウスから取り出し、ｍＲＮＡを脾臓のＢ細胞から抽出した。その後、単離されたｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを、標準的なＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して作製し、増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ後、増幅された配列を使用して、ファージディスプレイライブラリーを作製し、このファージディスプレイライブラリーを、標的抗原を使用してスクリーニングした。ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を、標準的な分子技術を使用して陽性のファージクローンから単離した。単離されたポリヌクレオチド配列（配列番号２）を原核生物発現ベクターにクローン化し、大腸菌において発現させた。その後、発現したｓｃＦｖを、標準的な精製方法を使用してこれらの細胞のペリプラズム画分から精製した（ｓｃＦｖの発現および精製のさらなる記載が本明細書中下記に示される）。
【００７１】
下記の実施例の節の実施例２および実施例３において例示されるように、本発明の教示に従って作製された新規な単鎖Ｆｖ（これは「Ａ２」と称される）は、細胞外Ｐｇｐおよび多剤耐性細胞に対する結合の大きな特異性を示し、かつ、Ｐｇｐに対する中程度の結合親和性（約１５０ｎＭ）を示す比較的小さい分子（約３０ｋＤａ）である。さらに、このｓｃＦｖは、ＭＤＲ細胞における薬物排出活性を効果的に阻害することができ、また、結果として、ＭＤＲ細胞における薬物の細胞毒性を効果的に増大させることができる。
【００７２】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の抗Ｐｇｐ  ｓｃＦｖを合成するための好ましい方法は、ｓｃＦｖのコード配列を単離および発現することである。
【００７３】
本明細書中で使用される用語「発現する（させる）」は、ポリペプチドへのポリヌクレオチド配列の変換を示す。
【００７４】
従って、ｓｃＦｖポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を適切な調節エレメントに連結して、核酸構築物を作製することができる。好ましくは、核酸構築物は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列の転写を特定の宿主細胞において行わせるために好適な選択されたプロモーターを含む発現構築物（すなわち、発現ベクター）である。
【００７５】
任意の好適なプロモーター配列を本発明の核酸構築物によって使用することができる。好ましくは、核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換されている特定の細胞において活性である。本発明の核酸構築物はさらに、プロモーター配列に対して隣接し得るか、または遠位に存在し得る、プロモーター配列からの転写を調節することができるエンハンサーを含むことができる。
【００７６】
本発明の核酸構築物は、好ましくはさらに、適切な選択マーカーおよび／または複製起点を含む。好ましくは、利用される核酸構築物はシャトルベクターであり、この場合、シャトルベクターは大腸菌において増殖することができ（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）、かつ、細胞における増殖のために適合性を有し得る。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
【００７７】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、ポリペプチドコード配列を発現させるための宿主−発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌など；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞システム、または、ポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）で形質転換された植物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムもまた、本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる。細菌システムは大きな製造量を低コストで可能にするので、細菌システムが好ましくは、組換えポリペプチドを作製するために使用される。
【００７８】
細菌システムでは、数多くの発現ベクターを、発現されるポリペプチドについて意図される使用に依存して都合よく選択することができる。例えば、多量のポリペプチドが所望されるとき、おそらくは、疎水性のシグナル配列との融合体として、高レベルのタンパク質産物の発現を行わせるベクターが所望され得、これによりタンパク質産物が容易に精製される細菌のペリプラズムまたは培養培地に発現産物を向かわせることができる。ポリペプチドの回収を助けるために特異的な切断部位を有する操作されたある種の融合タンパク質もまた望ましい場合がある。そのような操作に適合し得るそのようなベクターには、大腸菌発現ベクターのｐＥＴシリーズ［Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５：６０〜８９（１９９０）］が含まれるが、これに限定されない。
【００７９】
酵母では、米国特許第５９３２４４７号に開示されるように、構成的または誘導可能なプロモーターを含有する数多くのベクターを使用することができる。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターを使用することができる。
【００８０】
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドコード配列の発現が数多くのプロモーターによって駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４（１９８４）］、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ他、ＥＭＢＯ  Ｊ、６：３０７〜３１１（１９８７）］など）を使用することができる。あるいは、植物プロモーターを使用することができる（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０（１９８４）；Ｂｒｏｇｌｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３（１９８４）］、または熱ショックプロモーター（例えば、ダイズのｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５（１９８６）］）など）。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および、当業者に広く知られている他の技術を使用して植物細胞に導入することができる。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、セクションＶＩＩＩ、４２１頁〜４６３頁（１９８８）］を参照のこと。この分野で広く知られている他の発現システム（例えば、昆虫および哺乳動物宿主細胞システムなど）もまた本発明によって使用することができる。
【００８１】
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有する以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するために操作された配列を含む得ることが理解される。
【００８２】
形質転換された細胞は、大量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的には、資化可能な炭素源、窒素源およびリン酸塩源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えばビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートにおいて培養することができる。培養は、組換え細胞について適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行われる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【００８３】
産生のために使用されたベクターおよび宿主のシステムに依存して、本発明の得られるポリペプチドは、組換え細胞の内部に留まり得るか、または発酵培地に分泌され得るか、または２つの細胞膜の間の空間（例えば、大腸菌におけるペリプラズム空間など）に分泌され得るか、または細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得る。
【００８４】
培養における所定の時間の後、組換えポリペプチドの回収が行われる。
【００８５】
本明細書中で使用される表現「組換えポリペプチドを回収すること」は、ポリペプチドを含有する全発酵培地を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を含む必要はない。
【００８６】
従って、本発明のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化などの様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。
【００８７】
回収を容易にするために、発現されるコード配列は、本発明のポリペプチドと、融合された切断可能な成分とをコードするために操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な成分について特異的なカラムにおける固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位が、ポリペプチドと、切断可能な成分との間で操作される場合、ポリペプチドは、融合タンパク質をこの部位において特異的に切断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０（１９８８）；Ｇａｒｄｅｌｌａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９（１９９０）を参照のこと］。
【００８８】
本発明のポリペプチドは好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収することができる。
【００８９】
本明細書中で使用される表現「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【００９０】
宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のポリペプチドはまた、インビトロ発現システムを使用して合成することができる。これらの方法はこの分野では広く知られており、そのようなシステムの成分が市販されている。
【００９１】
さらにあるいは、本発明のポリペプチドはまた、例えば、標準的な固相技術を使用して合成することができる。そのような技術には、完全な固相合成、部分的な固相合成法、フラグメント縮合、古典的な溶液合成が含まれ、また、組換えＤＮＡ技術による方法さえも含まれ、これらは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．［Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６３）］などによって記載される。固相ポリペプチド合成手法はこの分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ［Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）］によってさらに記載される。
【００９２】
合成ポリペプチドは、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．［Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９８３）］などによって記載される調製用高速液体クロマトグラフィー手法によって精製することができ、また、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【００９３】
本発明の抗体フラグメントはＰｇｐ特異的であるので、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞を検出するために使用することができる。ＭＤＲの重要な機構はＰｇｐの過剰発現であり、明らかな相関が、Ｐｇｐの過剰発現と、ガン患者の化学療法に対する応答の喪失との間において明らかにされていた（６、７）。従って、化学療法が効果的に適用されないならば、相当の損傷が、より効果的な別の治療を提供する機会が失われたことと合わせて、標的以外の毒性から生じ得る。従って、ガン患者におけるＭＤＲ細胞の正確で、特異的かつ確実な診断は、選択肢を決定し、施すべき最も適切な治療を選択するための非常に有用な臨床的手段である。
【００９４】
従って、本発明の別の態様によれば、多剤耐性細胞を検出するための方法が提供される。この方法は、細胞を本発明の抗体フラグメントにさらし、その後、Ｐｇｐを過剰発現する細胞に結合した板抗体フラグメントを検出し、それにより、多剤耐性細胞を検出することを含む。好ましくは、抗体フラグメントは、この分野で既知の標準的な免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、放射免疫アッセイおよび免疫組織化学的染色など）を使用して検出することができる検出可能な成分（下記に記載される）で標識される。
【００９５】
最初に、ＭＤＲ細胞であることが疑われる細胞を含有する生物学的サンプル（例えば、腫瘍細胞など）が、エクスビボ分析のために個体から得られる。サンプリングされた細胞が分解することを防ぐために、細胞は、分析されるまで、−２０℃未満の温度で保存することができる。分析時に、細胞は抗体フラグメントにさらされ、抗体−細胞の結合が、この分野で既知の従来のインビトロ免疫アッセイ技術のいずれかを使用して明らかにされる。例えば、腫瘍切片を顕微鏡スライドガラスにおいて本発明の抗体フラグメントにさらすことができ、標準的な免疫組織化学的技術を使用して分析することができる。
【００９６】
多剤耐性細胞を有することが疑われる個体（例えば、ガン患者など）の細胞はまた、インビボで抗体フラグメントにさらすことができる。そのような場合、抗体フラグメントは、標準的な技術を使用して放射活性成分（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐまたは１２５Ｉなど）の検出可能な成分で標識され、標識された抗体フラグメントが、Ｐｇｐを過剰発現する細胞を有することが疑われる個体に、好ましくは非経口投与により投与される。所定の期間の後、宿主細胞における放射能レベルの変化が、シンチレーション計数、オートラジオグラフィーまたは画像化技術を使用して評価される。
【００９７】
本明細書中上記に記載される方法論は好ましくは、検出キットを使用して実施される。そのようなキットは、検出可能な成分（例えば、発色成分（例えば、ビオチン）、蛍光発生成分（例えば、フルオレセイン）、発光成分（例えば、ルミノール）または放射活性成分（例えば、１２５Ｉ）など）で好ましくは標識される本発明の抗体フラグメントを含む。キットはまた、容器に詰められ、また、多剤耐性細胞を診断する際の使用のために包装物上または包装物内において印刷されて特定される検出可能な成分を検出するために好適な試薬を含む。抗体をそのような検出可能な成分で標識するための手法が、例えば、“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”［Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）］に記載されており、また、そのような標識された抗体の検出を、この分野で広く知られている標準的な免疫アッセイ手法を使用して達成することができる。
【００９８】
下記の実施例の節において例示されるように、本発明の抗Ｐｇｐ抗体フラグメントは、特に下記の属性のために、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞における薬物排出活性の阻害剤としての使用のために非常に好適である：（ｉ）本発明の抗Ｐｇｐ抗体フラグメントは比較的小さい分子サイズを有しており、それにより、標的以外の細胞との所望されない相互作用を最小限に抑える体液における短い循環だけでなく、標的細胞への改善された移動性および送達をもたらす；（ｉｉ）本発明の抗Ｐｇｐ抗体フラグメントは、標的以外の細胞との相互作用をさらに最小限に抑える、Ｐｇｐに対する中程度の親和性を有する；そして（ｉｉｉ）本発明の抗Ｐｇｐ抗体フラグメントはエクスビボおよびインビボで発現させることができる。
【００９９】
従って、本発明の抗体フラグメントは、多剤耐性ガン細胞を有する個体の化学療法を実質的に改善するために効果的に使用することができる。
【０１００】
従って、本発明の別の態様によれば、個体におけるガンを治療する方法が提供され、この方法は、ガンを有する個体に本発明の抗体フラグメントを与えること、および、治療効果的な量の抗ガン剤（好ましくは、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬剤）を個体に投与することを含む。抗ガン薬物は、抗体フラグメントを与える前に、または抗体フラグメントを与えるのと同時に、または抗体フラグメントを与えた後に投与することができる。好ましくは、抗体フラグメントは、抗ガン剤を投与するよりも前に、十分に、患者に与えられ、その結果、抗体フラグメントが、ＭＤＲ細胞を含有する個体の腫瘍に浸透し、ＭＤＲ細胞と結合し、かつ、そのような細胞の薬物排出能力を損なうことを可能にするようにされる。必要とされる時間間隔は、日常的な薬物動態学的方法によって決定することができ、個体の年齢、体重および身体の大きさ、ならびに、標的のＭＤＲ細胞を含有する腫瘍の存在位置および状態とともに変化することを予想しなければならない。
【０１０１】
表現「抗ガン剤」および表現「化学療法薬物」は本明細書中では交換可能に使用され、ガンを治療するために使用することができる薬物を示す。
【０１０２】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、ガンなどの疾患の進行を実質的に阻害するか、または実質的に遅くするか、または実質的に逆転させることを示す。
【０１０３】
抗体フラグメントは、抗体フラグメントを個体に対して直接的に投与することによって与えることができ、あるいは、抗体フラグメントを個体の細胞の内部において発現させることによって与えることができる。
【０１０４】
直接的に投与されるとき、抗体フラグメントは好ましくは、非経口的に導入される。抗体フラグメントは、静脈内投与、腹腔内投与、腹膜後投与、槽内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、眼窩内投与、鼻腔内投与、または吸入によって投与することができる。１回または複数回の投薬を、標的のＭＤＲ細胞に結合した抗体フラグメントの十分なレベルを達成し、その結果、化学療法によって根絶されるべきＭＤＲ細胞における薬物排出活性の効果的な阻害をもたらすようにするために、適するように施すことができる。抗体フラグメントおよび抗ガン剤による治療のための投薬量および投与の全体的なプロトコルは、日常的な臨床技術の適用により臨床医によって設計および最適化することができる。
【０１０５】
本発明の抗体フラグメントはまた、個体の細胞において発現させることによって与えることができる。好ましくは、発現している抗体フラグメントは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。さらに好ましくは、抗体フラグメントは、ＭＤＲガン細胞（これに限定されない）など標的細胞において、または、ＭＤＲガン細胞を取り囲む細胞（例えば、非ＭＤＲ腫瘍細胞）において、または、ＭＤＲガン細胞に到達している造血系細胞において選択的に発現させられている。ヒト細胞における抗体フラグメントの発現は、一過性または安定的な形質転換および発現を可能にする様式で本発明のポリヌクレオチド配列を標的細胞に導入することによって行うことができる。
【０１０６】
標的細胞への本発明のポリヌクレオチド配列の導入はエクスビボまたはインビボのいずれでも達成することができる。エクスビボ方法では、細胞が個体から取り出され、培養されながら本発明のポリヌクレオチド配列で形質転換される。形質転換された細胞が培養でさらに拡大され、その後、個体に戻される。エクスビボ方法は、自家骨髄移植と一緒での使用のために非常に好適である。そのような手法では、骨髄細胞ガン患者の身体から取り出され、造血幹細胞が濃縮され、患者は徹底的な化学療法で治療され、そして最後に、造血細胞の再生を可能にするために、培養された幹細胞が患者に再移植される。
【０１０７】
そのような手法では、化学療法は、多くの場合、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞が生存するために、すべてのガン細胞を根絶させることができない。そのような徹底的な化学療法の後でのガンの再発は、身体が劇的に免疫抑制されているときには、非常に壊滅的である。自家骨髄移植と一緒での本発明の方法の使用は、ＭＤＲ活性を阻害することができ、かつ、ガン再発の可能性を実質的に低下させることができる。
【０１０８】
抗体フラグメントをコードする配列を、身体から取り出された造血幹細胞に導入し、続いて、これらの細胞からインビボで発現および分泌させ、それにより、ＭＤＲガン細胞を標的化し、かつ、化学療法の効力を実質的に改善することができる。
【０１０９】
インビボ方法では、ポリヌクレオチドが個体内の標的細胞に対して直接的に導入される。本発明のポリヌクレオチドは、この分野で既知の様々な方法のいずれかによって細胞に導入することができる。様々なそのような方法を見出すことができ、一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）］、Ａｕｓｕｂｅｌ他［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）］、Ｃｈａｎｇ他［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ（１９９５）］、Ｖｅｇａ他［Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ（１９９５）］、Ｖｅｃｔｏｒｓ［Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（１９８８）］、およびＧｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２（１９８６）］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、中枢神経系を伴うベクターについては米国特許第４８６６０４２号を参照のこと。また、相同組換えを誘導するための陽性・陰性の選択方法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１１０】
本発明の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを個体の細胞に導入するための好ましい方法は、ウイルスベクターを使用することによる方法である。ウイルスベクターはいくつかの利点を提供しており、そのような利点には、形質転換のより大きい効率、ならびに、特定の細胞タイプに対する標的化および特定の細胞タイプにおける増殖が含まれる。ウイルスベクターはまた、特異的な細胞受容体（例えば、ガン細胞受容体など）を介して標的特異性を変化させるために、特異的な受容体またはリガンドを用いて改変することができる。
【０１１１】
レトロウイルスベクターは、本発明とともに使用される好適なベクターの１つのクラスを表す。欠陥レトロウイルスが哺乳動物細胞への遺伝子の移入のために日常的に使用されている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ、７６：２７１（１９９０）を参照のこと）。本発明の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスを、広く知られている分子技術を使用して構築することができる。レトロウイルスのゲノムの一部分を取り除いて、レトロウイルスを複製欠陥にすることができ、その後、複製欠陥レトロウイルスをビリオンにパッケージングすることができ、このビリオンを使用して、ヘルパーウイルスの使用によって、また、標準的な技術を用いながら標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスを作製するためのプロトコル、およびそのようなウイルスをインビトロまたはインビボで細胞に感染させるためのプロトコルを、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他編［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）］に見出すことができる。様々なレトロウイルスが、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞および骨髄細胞を含む多くの異なる細胞タイプに様々な遺伝子を導入するために使用されている。
【０１１２】
別の好適な発現ベクターはアデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、広範囲に研究され、かつ、日常的に使用されている遺伝子移入ベクターである。アデノウイルスベクターの重要な利点には、分裂中の細胞および休止細胞の比較的大きい形質導入効率、広範囲の様々な上皮組織に対する自然の親和性、ならびに、高力価物の容易な製造が含まれる［Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．［Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、８１：５７〜６３（２０００）］。アデノウイルスのＤＮＡは核に輸送されるが、核には組み込まれない。従って、アデノウイルスベクターによる変異誘発の危険性は最小限であり、一方、短期間の発現は、多剤耐性ガン細胞などのガン細胞を治療するために特に好適である。実験的なガン治療において使用される様々なアデノウイルスベクターがＳｅｔｈ他［ガン遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター、Ｐ．Ｓｅｔｈ（編）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂａｓｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｌａｎｄｅｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ（１９９９）、１０３頁〜１２０頁］によって記載される。
【０１１３】
好適なウイルス発現ベクターはまた、レトロウイルスの成分およびアデノウイルスの成分を併せ持つキメラなアデノウイルス／レトロウイルスベクターであり得る。腫瘍細胞を形質導入するためにそのようなベクターを使用する予備的な結果は、この新しいタイプのウイルス発現ベクターが従来の発現ベクターよりも効率的であることを示唆している［Ｐａｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１８４：１７９〜１８８（２００２）］。
【０１１４】
個体において本発明のポリヌクレオチド配列を導入および発現するための好適なウイルスベクターの具体的な例が、アデノウイルスに由来するベクターのＡｄ−ＴＫである。このベクターは、正または負のいずれかの選択のためにヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現し、かつ、所望の組換え配列のための発現カセットを含む。このベクターは、上皮起源のほとんどのガンが含むアデノウイルス受容体を有する細胞に感染させるために使用することができる［Ｓａｎｄｍａｉｒ他［Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、１１：２１９７〜２２０５（２０００）］。
【０１１５】
特定の細胞タイプに発現を制限する特徴もまた含めることができる。そのような特徴には、例えば、所望の細胞タイプについて特異的であるプロモーターおよび調節エレメントが含まれる。ウイルスベクターはまた、抗体フラグメントを細胞の外側に分泌させるためのシグナルをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。分泌シグナルは一般には、疎水性アミノ酸の短い配列（７残基〜２０残基）を含有する。本発明における使用のための様々な好適な分泌シグナルを広範囲に利用することができ、それらはこの分野では広く知られている（例えば、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８４：９９〜１０５（１９８５）］およびＬｅｊ他［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９：４３７９（１９８７）］を参照のこと）。
【０１１６】
組換えベクターをいくつかの方法で投与することができる。ウイルスベクターが使用される場合、その手法はその標的特異性を利用することができ、従って、そのようなベクターは腫瘍部位において局所的に投与する必要はない。しかしながら、局所的投与は、より迅速で、より効果的な治療をもたらし得る。ウイルスベクターの投与はまた、例えば、対象への静脈内注射または皮下注射によって行うことができる。注射後、ウイルスベクターは、感染のための適切な標的特異性により宿主細胞を認識するまで循環する。
【０１１７】
本発明の抗体フラグメント、または、本発明の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、それ自体で、または、好適なキャリアもまた含む医薬組成物の有効成分として個体に与えることができる。
【０１１８】
本発明の医薬組成物はさらに、化学療法薬物、好ましくは、ガン細胞に対して毒性である化学療法薬物、例えば、ドキソルビシン、ビンクリスチン、コルヒチン、ＶＰ−１６、ビンブラスチン、ベラパミル、ミトキサントロン、タキソール、シクロスポリンＡ、キニジン、プロゲステロン、タモキシフェン、エピルビシン、ダウノルビシンおよびＭＸ２など（これらに限定されない）を含むことができる。
【０１１９】
医薬組成物は、局所的な治療または全身的な治療のいずれかが好まれるかに依存して、また、治療される領域に依存して、様々な方法の１つまたは複数のいずれでも投与することができる。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内を含む）に、経口的に、吸入により、または非経口的に、例えば、静脈内滴注、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射によって行うことができる。好ましくは、医薬組成物は非経口投与される。
【０１２０】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。また、抗体フラグメントの懸濁物を適切な油性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために抗体フラグメントの溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１２１】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴いことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、さらには上記において詳述されているかのように、適応される状態を治療するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０１２２】
本発明のいくつかの特徴は、明確化のために別個の実施形態に関連して記載されているが、１つだけの実施形態における組合せでもまた提供され得ることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴は、簡略化のために１つだけの実施形態に関連して記載されているが、別個にでもまた提供され得るか、または、任意の好適な部分的組合せでもまた提供され得る。
【０１２３】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１２４】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１２５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ���ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１２６】
（実施例１）
Ａ２単鎖Ｆｖの単離
免疫化のためのペプチドディスプレイ構築物の作製：
ヒトＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００９２７．２）の１番目の推定される細胞外ループのアミノ酸７３〜８５に対応するペプチド配列ＧＥＭＴＤＩＦＡＮＡＧＮＬ（配列番号１）を、Ｎｉｖ他（１９）によって記載されるように合成した。このアミノ酸配列を呈示する組換えファージを、ＦｒｅｎｋｅｌおよびＳｏｌｏｍｏｎ（１７）によって記載されるように、繊維状バクテリオファージｆ８８のＨｉｎＤＩＩＩおよびＰｓｔＩのクローニング部位を使用して作製した。組換え繊維状バクテリオファージｆ８８を使用して、１４日間隔で、１回の注射につきＰＢＳでの１０１１ファージユニットの３回の腹腔内注射でマウスを免疫化した。免疫化マウスから集められた血清サンプルを、このペプチドとの免疫反応性についてＥＬＩＳＡによって調べた。標的ペプチドに対する特異的な免疫応答を示したマウスを選択して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーを構築した。
【０１２７】
ｓｃＦｖライブラリーの構築およびスクリーニング：
ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを、Ｃｌａｃｋｓｏｎ他［Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）］によって記載される手法に従って、上記に記載されるファージ免疫化マウスの脾臓細胞から抽出されたＲＮＡを使用して作製した。簡単に記載すると、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対応するポリヌクレオチド配列を、縮重プライマーの特定のセットを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって免疫化マウスの脾臓Ｂ細胞のｍＲＮＡから増幅した。ＶＨおよびＶＬのＰＣＲプールをＰＣＲ重複伸長反応によって単鎖Ｆｖレパートリーに組み立て、続いてＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＣＡＮＴＡＢ６ファージミドベクターにクローン化した。ライブラリーの複雑性は１ｘ１０７個の独立したクローンであった。パンニングのために、ライブラリーを最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁石ビーズとのインキュベーションによってストレプトアビジン結合物質の枯渇処理に供した。その後、配列番号１のアミノ酸配列を含むビオチン化ペプチド（１μＭ）を１０１１ｃｆｕの枯渇化ライブラリーと（１時間、室温で）インキュベーションし、その後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁石ビーズを加えた。結合したファージを、室温で５分間、１ｍｌのトリエチルアミン（１００ｍＭ、ｐＨ１２）を使用することによって溶出し、その後、０．１ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。溶出されたファージを指数増殖中の大腸菌ＴＧ１細胞において拡大し、その後、大腸菌ＴＧ１細胞に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他（１６）によって記載されるように、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを重複感染させた。
【０１２８】
下記の表１に例示されるように、配列番号１のペプチドと結合するファージの累進的かつ著しい濃縮が３回のパンニングの後で観測された。３回目のパンニングの後で分析された８４個のうちの２０個のファージクローンは、このペプチドに対する結合活性を示した（データ示さず）。１０個のペプチド特異的なクローンの多切断酵素での制限酵素消化によるフィンガープリント分析により、これらは、類似した消化パターンを有することが明らかにされた。これは、すべてが類似しているか、または同一であることを示唆している（データ示さず）。これらのクローンから得られたＶＨドメインおよびＶＬドメインのＤＮＡ配列決定により、すべてが同一であることが明らかにされた。これは、これらはすべて、ＶＨ／ＶＬの組合せ事象のときの１つだけの生産的抗体に由来したことを示唆している。配列分析、および、Ｋａｂｂａｔデータベースとの比較により、Ａ２のＶＨドメインはマウス重鎖のサブグループＩＩに属し、ＶＬドメインは軽鎖のマウスκＩＩサブグループに属することが明らかにされた。これらのＶＨドメインおよびＶＬドメインから構築されたｓｃＦｖの核酸配列が配列番号２に示される。
0004576375.tif 000002
【０１２９】
可溶性の組換えｓｃＦｖの発現および精製：
Ａ２ｓｃＦｖ配列（配列番号２）をＰＣＲによってファージクローンから回収し、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩクローニング部位を使用してファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にサブクローン化した。Ｍｙｃタグ（配列番号３）およびヘキサヒスチジンタグをｓｃＦｖ遺伝子のＣ末端に融合した。ｓｃＦｖ抗体をＢＬ２１（λＤＥ３）細胞において発現させ、そして、Ｃ末端に融合されたヘキサヒスチジンタグを使用して、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによってペリプラズム画分から精製した。精製されたＡ２ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が図１ａに示される。
【０１３０】
（実施例２）
Ａ２ｓｃＦｖの特異性および結合特性
Ａ２ｓｃＦｖ抗体の分子プロフィルをサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、約３０ｋＤａの予想分子量を有するモノマー形態での単一タンパク質ピークが明らかにされた（データ示さず）。Ａ２ｓｃＦｖの収率は約２％であった（１リットルの培養において２ｍｇの高純度タンパク質）。
【０１３１】
精製されたＡ２ｓｃＦｖ抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡによって明らかにした。配列番号１のアミノ酸配列を有するビオチン化された標的ペプチド、または非標的ＭＲＰ１コントロールペプチド（１００μｌあたり１０μｇで提供される）をそれぞれ、ＢＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジンを使用して柔軟なマイクロタイタープレートに固定化した。その後、精製Ａ２ｓｃＦｖを種々の濃度でペプチドコーティングプレートに加えて、抗Ｍｙｃタグ−ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて検出した。
【０１３２】
図１ｂに示されるＥＬＩＳＡ結果は、Ａ２ｓｃＦｖ抗体が標的のＰｇｐ由来ペプチド（配列番号１）と陽性に反応し、かつ用量依存的な様式で反応したことを示している。比較により、Ａ２ｓｃＦｖは非標的のＭＲＰ１コントロールペプチドとは反応しなかった。
【０１３３】
Ａ２ｓｃＦｖの結合特性を、飽和ＥＬＩＳＡを使用してさらに特徴づけた。この実験では、ビオチン化されたＰｇｐ由来ペプチド（配列番号１）を、ＢＳＡ−ビオチンで事前にコーティングされたプレートに結合させ、増大する量のＡ２ｓｃＦｖにさらした。図１ｃに図示されるＥＬＩＳＡ結果は、標的ペプチドに対するＡ２ｓｃＦｖの結合が用量依存的であり、かつ飽和可能であったことを示している。最大結合の５０％のために必要なＡ２ｓｃＦｖの量を内挿することによって、親和性定数が１５０ｎＭにおいて見積もられた。これは中程度の親和性を示している。
【０１３４】
競合結合放射免疫アッセイにおいて、精製Ａ２ｓｃＦｖ（１００μｇ）を最初に、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を使用して［１２５Ｉ］で標識した。［１２５Ｉ］標識されたＡ２ｓｃＦｖ抗体を、上記に記載されるように、ＢＳＡ−ビオチンおよび標的ペプチド（配列番号１）で事前にコーティングされた柔軟なマイクロタイタープレートにトレーサー（３〜５ｘ１０５ｃｐｍ／ウエル）として加えた。その後、標識されていない（すなわち、コールド）Ａ２ｓｃＦｖを、事前にコーティングされたプレートに増大する濃度で競合剤として加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションし、その後、洗浄し、ガンマカウンターによって分析した。図１ｄに図示される放射免疫アッセイ結果は、標的のＰｇｐ由来ペプチド（配列番号１のアミノ酸配列を有する）に対する［１２５Ｉ］標識Ａ２ｓｃＦｖ抗体の結合が用量依存的であったことを示している。最大結合の５０％のために必要な競合剤（コールド）Ａ２ｓｃＦｖの量を内挿することによって、親和性定数が１３０ｎＭにおいて見積もられた。これは中程度の親和性を示している。
【０１３５】
別の一連の実験において、ＭＤＲ細胞の表面に発現したＰｇｐに対するＡ２ｓｃＦｖの反応性および特性を評価した。これらの実験では、安定なＰｇｐ依存性のＭＤＲ表現型を呈示するヒトガン腫細胞株、ならびに、それらのそれぞれの薬物感受性の親細胞を利用した。これらの実験で使用されたＭＤＲ細胞株および薬物感受性細胞株が下記の表２に記載される。
0004576375.tif 000003
【０１３６】
薬物感受性細胞およびＭＤＲ細胞（５ｘ１０５個）をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁した。６ウエル組織培養プレートで成長している細胞を２回洗浄し、その後、可溶性の精製されたＡ２ｓｃＦｖ（５０μｇ／ｍｌ）と氷上で９０分間インキュベーションした。検出を、抗Ｍｙｃ（３０μ／ｍｌ）およびＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて行った。蛍光性細胞の検出をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において行った。
【０１３７】
図２ａ〜図２ｄは競合的免疫蛍光フローサイトメーター分析を明らかにしており、Ａ２ｓｃＦｖと、ＭＤＲ細胞株の１７８０ＡＤＲ（図２ｂ）およびＫＢＶ−１との強い反応性を例示し、その一方で、反応性が薬物感受性細胞株の２７８０（図２ａ）およびＫＢ３−１（図２ｃ）に関しては観測されなかったことを例示している。
【０１３８】
ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する細胞に対するＡ２ｓｃＦｖ抗体の特異性および反応性が競合的免疫組織化学分析によってさらに明らかにされた。薬物感受性細胞およびＭＤＲ細胞を、ＰＢＳにおける４％のゼラチンで事前にコーティングされたガラス製スライドガラス上で５０％のコンフルエンスに成長させて、ＰＢＳにおける２％ホルムアルデヒドで固定処理し、ＰＢＳにおける１％のＢＳＡで室温においてブロッキング処理し、次いで、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおけるＡ２ｓｃＦｖ（０．２ｍｇ／ｍｌ）と９０分間インキュベーションした（室温）。その後、スライドガラスをＨＲＰ標識の抗Ｍｙｃ抗体（１：５００、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて）で１時間覆い、水で洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ基質（ａｅｃ）で２分間〜３分間覆った。その後、スライドガラスを水で洗浄し、対比染色をヘマトキシリンで行った。図２ｅ〜図２ｈに図示されるように、Ａ２ｓｃＦｖ抗体は、ＭＤＲの２７８０ＡＤＲ細胞およびＫＢＶ−１細胞の強いインシチュウ染色を示し（それぞれ、図２ｅおよび図２ｇ）、他方で、Ａ２ｓｃＦｖはそれぞれの薬物感受性親細胞の２７８０細胞およびＫＢ３−１細胞を染色しなかった（それぞれ、図２ｆおよび図２ｈ）。
【０１３９】
従って、本明細書中上記に記載される結果は、Ａ２ｓｃＦｖ抗体が、ヒト細胞表面に発現するＰｇｐと選択的に結合し、Ｐｇｐを有しないか、またはＰｇｐをわずかに発現するヒト薬物感受性細胞とは結合しないことを明確に明らかにしている。
【０１４０】
（実施例３）
Ａ２ｓｃＦｖの生物学的機能
Ｐｇｐの薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を一連の発色体排出アッセイで評価した。逆の関係が、ＭＤＲ細胞におけるＰｇｐ活性のレベルと、カルセインの蓄積との間には存在する［Ｈｏｌｌｏ他、（２０）］ので、アッセイでは、蛍光性のＰｇｐ疎水性基質カルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を利用した。Ａ２ｓｃＦｖを、下記の表３に記載されるような、安定なＰｇｐ依存的ＭＤＲ表現型を呈示するヒト細胞株および齧歯類（ＣＨＯ）細胞株、ならびに、それらのそれぞれの薬物感受性の親細胞に加えた。
0004576375.tif 000004
【０１４１】
薬物感受性細胞およびＭＤＲ細胞（５ｘ１０５個）をＰＢＳで洗浄し、ＨＰＭＩ緩衝液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、および１０ｍＭのグルコースを含有する１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞懸濁物を様々な濃度のＡ２ｓｃＦｖと様々な時間プレインキュベーションし、その後、１μＭのカルセイン−ＡＭ（蛍光性のＰｇｐ疎水性基質；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を補充し、３７℃で５分間〜１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、処置された細胞および処置されていない細胞をカルセインにさらし、標準的な蛍光計またはフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって蛍光強度（４９３ｎｍ〜５１５ｎｍ）について分析した
【０１４２】
図３ａは、ＭＤＲ細胞株２７８０ＡＤＲが、薬物感受性親細胞株の２７８０細胞株と比較して、１／５および１／１０のカルセインを（それぞれ、５分間または１５分間のインキュベーションの後で）蓄積したことを図示する。同様に、図３ｂに図示されるフローサイトメーターアッセイの結果は、ＭＤＲ細胞株２７８０ＡＤＲが、それぞれの薬物感受性親細胞株の２７８０細胞株よりも実質的に低い平均蛍光強度を示したことを示している。これらの結果は、カルセイン−ＡＭのような発色性基質を排出する、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する細胞の機能的能力を明確に明らかにしている。
【０１４３】
同様な実験において、Ａ２ｓｃＦｖを、カルセイン−ＡＭを加える前の１０分間〜３０分間、２７８０ＡＤＲ細胞に加えた。Ａ２ｓｃＦｖ処置は細胞の蛍光強度の実質的な増大をもたらした。これは薬物排出活性の実質的な低下を示している。従って、図３ｃは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された細胞におけるカルセインの蓄積が、Ａ２ｓｃＦｖで処置されていない細胞におけるカルセインの蓄積よりも４倍〜５倍大きかったことを示している。図３ｃに図示される結果はさらに、２７８０ＡＤＲ細胞の薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの阻害効果が用量依存的であり、１００μｇ／ｍｌ（すなわち、４μＭ）において最大阻害活性を示したことを示している。Ａ２ｓｃＦｖの薬物排出阻害効果は、１５μＭのベラパミル（Ｐｇｐ薬物排出の既知の調節剤（８））を用いて観測された薬物排出阻害効果と類似していた。同様の効果が、図３ｄに図示されるように、フローサイトメーター分析によって観測された。これらの結果は、Ａ２ｓｃＦｖ抗体が、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒト細胞の薬物排出活性を効果的に阻害し得ることを示している。
【０１４４】
別のアッセイにおいて、Ａ２ｓｃＦｖの薬物排出調節活性をＧ１ｓｃＦｖ［これはメラノーマ関連腫瘍抗原に対して単離された（２２）］と比較した。図３ｅに図示されるアッセイ結果は、Ａ２ｓｃＦｖは２７８０ＡＤＲ細胞の薬物排出活性を実質的に阻害したが、Ｇ１ｓｃＦｖ抗体による処置は効果がなかったことを示している。
【０１４５】
ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する他の細胞株、ならびに、それらの薬物感受性親細胞株の薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を一連のアッセイで評価した。図４ａ〜図４ｂは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するＥＭＴＲ１細胞およびＫＢＶ−１細胞の薬物排出活性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を図示する。結果はカルセイン蓄積の実質的な増大を示しており、これは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された細胞における薬物排出阻害を示している。
【０１４６】
Ａ２ｓｃＦｖ分子の阻害効果が非特異的な細胞毒性のためではないことを確認するために、さらなる実験を行い、それにより、Ａ２ｓｃＦｖを、カルセイン添加前に、薬物感受性の２７８０細胞株、ＫＢ３−１細胞株およびＡ８細胞株とプレインキュベーションした。図４ｃ〜図４ｅに図示される結果は、Ａ２ｓｃＦｖ処置はこれらの細胞のいずれにおいてもカルセイン蓄積レベルに影響しなかったことを示している。これは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された薬物感受性細胞の薬物排出活性に対する効果がないことを示している。
【０１４７】
Ａ２ｓｃＦｖの薬物排出阻害効率を別のアッセイでさらに評価し、このアッセイでは、Ａ２ｓｃＦｖがＭＤＲの２７８０ＡＤＲ細胞に増大する濃度で与えられ、その後、カルセイン−ＡＭが添加された。図５に図示される結果は、Ａ２ｓｃＦｖは細胞におけるカルセインの蓄積を用量依存的かつ飽和可能な様式で増大させたことを示している。検出可能な最小阻害活性が０．０２５ｍｇ／ｍｌ（１μＭ）のＡ２ｓｃＦｖ濃度に関して観測された。飽和阻害活性が、０．１ｍｇ／ｍｌ（４μＭ）を超えるＡ２ｓｃＦｖ濃度に関して観測された。５０％の薬物排出活性を阻害するＡ２ｓｃＦｖ分子の濃度（ＩＣ５０）が６５μｇ／ｍｌ（２．６μＭ）において見積もられた。
【０１４８】
ドキソルビシン（化学療法薬物）にさらされた２７８０ＡＤＲの生存に対するＡ２ｓｃＦｖ分子の影響を、細胞における［３Ｈ］ロイシンのレベル（細胞生存性の指標）に基づいて評価した。細胞をＡ２ｓｃＦｖと０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でプレインキュベーションし、その後、５μＭ〜１０μＭのドキソルビシンにさらして、［３Ｈ］ロイシン含有量について分析した。図６に図示されるように、Ａ２ｓｃＦｖ処置は、Ａ２ｓｃＦｖで処置されていない細胞と比較して、ドキソルビシンにさらされた細胞の生存性を効果的に低下させた。これらの結果は、Ａ２ｓｃＦｖは、多剤耐性細胞におけるＰｇｐ媒介の薬物排出活性を阻害することができ、それにより、薬物耐性を回避することができることを示している。
【０１４９】
従って、結論として、本明細書中に示される結果は、本発明のＡ２ｓｃＦｖ抗体はＰｇｐ過剰発現細胞と選択的に反応し、従って、多剤耐性細胞における薬物排出活性の効果的な阻害剤であることを明確に明らかにしている。
【０１５０】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１５１】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願は、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１５２】
0004576375.tif 000005
0004576375.tif 000006
0004576375.tif 000007
0004576375.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１ａは、中央および右側のレーンにおいてＡ２ｓｃＦｖが単一バンドであることを表し、同時に、左側レーンが分子量サイズ標準のバンドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。図１ｂは、ビオチン化された標的のＰｇｐ由来ペプチド（配列番号１のアミノ酸配列を含む；Ｐｇｐ）、またはビオチン化された非標的ペプチド（ＰＲＰ）、またはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔＡ）に対するＡ２ｓｃＦｖ結合のＥＬＩＳＡの棒グラフである。図１ｃは、ビオチン化標的のＰｇｐ由来ペプチドに対するＡ２ｓｃＦｖの結合の用量応答曲線を表すＥＬＩＳＡのプロットである。図１ｄは競合放射免疫アッセイプロットである。
【図２】図２ａは、薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。図２ｂは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲと反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。図２ｃは、薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢ３−１と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。図２ｄは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１（薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢ３−１に由来する）と反応するＡ２ｓｃＦｖの免疫蛍光フローサイトメーター分析を表すプロットである。図２ｅは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲ（薬物感受性の卵巣ガン腫細胞株２７８０に由来する）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。図２ｆは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された薬物感受性細胞２７８０の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。図２ｇは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢ３−１（薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１に由来する）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。図２ｈは、Ａ２ｓｃＦｖで処置された薬物感受性のヒトガン腫細胞ＫＢＶ−１（ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒトガン腫細胞ＫＢ３−１の親株）の免疫組織化学的染色を例示する顕微鏡写真である。
【図３ａ−ｃ】図３ａは、カルセインの蓄積速度を、（ｉ）薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０（黒塗り棒により表される）、および（ｉｉ）ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲ（灰色棒により表される）において比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。図３ｂは、カルセインの蓄積を、（ｉ）薬物感受性のヒト卵巣ガン腫細胞２７８０、および（ｉｉ）ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現するヒト卵巣ガン腫細胞２７８０ＡＤＲにおいて比較するフローサイトメーターアッセイを表すプロットである。図３ｃは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する２７８０ＡＤＲ細胞におけるカルセインの蓄積に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を蛍光計アッセイにおいて明らかにする棒グラフである。
【図３ｄ−ｅ】図３ｄは、ＭＤＲの、Ｐｇｐを過剰発現する２７８０ＡＤＲ細胞によるカルセイン取り込みに対するＡ２ｓｃＦｖの影響を明らかにするプロットである。図３ｅは、ｓｃＦｖの特異性を例示する棒グラフである。
【図４ａ】図４ａは、齧歯類（ＣＨＯ）ＭＤＲ細胞株ＥＭＴＲ１におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。
【図４ｂ−ｅ】図４ｂは、ＭＤＲヒト類表皮細胞株ＫＢ−Ｖ１におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。図４ｃは、薬物感受性の２７８０細胞株（２７８０ＡＤＲの親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。図４ｄは、薬物感受性のヒト類表皮細胞株ＫＢ３−１（ＫＢＶ−１の親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。図４ｅは、薬物感受性の齧歯類（ＣＨＯ）細胞株Ａ８（ＥＭＴＲ１の親株）におけるカルセイン取り込みを比較する蛍光計アッセイによって得られたデータを表す棒グラフである。
【図５】様々な濃度のＡ２ｓｃＦｖで処置された２７８０ＡＤＲ細胞におけるカルセイン取り込みを表すプロットである。
【図６】様々な濃度のドキソルビシンで処置された２７８０ＡＤＲ細胞の生存性に対するＡ２ｓｃＦｖの影響を表す棒グラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列番号１は多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）由来のペプチドの配列である。
配列番号２はＡ２単鎖Ｆｖコード配列である。
配列番号３はＭｙｃ−ｔａｇコード配列である。
【図３ａ−ｃ】
0004576375.tif 000009
【図３ｄ−ｅ】
0004576375.tif 000010
【図４ａ】
0004576375.tif 000011
【図４ｂ−ｅ】
0004576375.tif 000012
【図５】
0004576375.tif 000013
【図６】
0004576375.tif 000014
【図１】
0004576375.tif 000015
【図２】
0004576375.tif 000016
【配列表】
0004576375000001.xml