(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FZRサブファミリーに属し、
SEQ ID NO:2の配列を有し、
ペプチドモチーフTPEK、RSPYK及びSPKで規定されるサイクリン依存性キナーゼでのリン酸化のための部位を含有し、
分裂サイクリンの分解を活性化し、内複製を促進する
ことを特徴とする反復WD40モチーフを有する植物タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載するタンパク質をエンコードする配列の全て、又はその相補配列を含むことを特徴とする精製核酸フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸フラグメントを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸フラグメントの少なくとも１つで形質転換された細胞。
【請求項５】
植物細胞であることを特徴とする請求項４に記載の形質転換された細胞。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸フラグメントの少なくとも1つで形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項７】
植物細胞の分化と増殖を調節するための請求項１に記載のタンパク質、又は請求項２に記載の核酸配列の使用。
【請求項８】
タンパク質又はその核酸配列が、植物又は植物組織の細胞の核内倍数性を促進するのに用いられることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
タンパク質又はその核酸配列が、培養中のカルスからの植物のインビトロでの再生を促進するために用いられることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
植物細胞の分化と増殖を調節するための、
FZRサブファミリーに属し、
SEQ ID NO:2の配列を有し、
ペプチドモチーフTPEK、RSPYK及びSPKで規定されるサイクリン依存性キナーゼでのリン酸化のための部位を含有し、
分裂サイクリンの分解を活性化し、内複製を促進するタンパク質もしくは該タンパク質の全てをエンコードする核酸配列又はその相補配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物における細胞分裂の調節に関与する遺伝子のクローニング及びその使用に関する。
【０００２】
大部分の植物器官は、分裂組織からの分化によって発芽後に成育する。分化前に、分裂組織で細胞分裂周期は減速し、次いで停止する。同時に、細胞の大きさの増大化と「内複製(endoreplication)」と呼ばれる有糸分裂を伴わないゲノムの複製が、頻繁に認められる。内複製は、貯蔵組織の成育中において周知の現象である。例えば、KOWLES [Genome, 35, pp. 68-77, (1992)]は、トウモロコシにおける内胚乳の成育中での6Cから384Cへの倍数性を指摘している。
分化に先立つ細胞分裂の停止に関与した現象は、植物の成育と個体発生に本質的な役割を果たしている。これらの現象に関与している機序は、依然としてあまり知られていない。M期促進因子の阻害及びS期のプロテインキナーゼの誘導(GRAFI, Science, 269, pp. 1262-1264, (1995))が関与していると考えられる。しかし、この機序に直接関与している因子は、これまでのところ植物では同定されていない。
【０００３】
発明者らは、植物の成育と個体発生における制御及び作用手段を見出すことを目的として、この機序の研究を行った。
発明者らは、研究モデルとして、根粒菌(Rhizobium)/マメ科植物の共生系を選択した。天然でリポオリゴ糖であり、根粒菌によって産生されるNod因子は、この系において新しい分裂組織の形成を局部的に誘導する分裂促進シグナルであり、この新しい分裂組織から、根瘤を形成する細胞が分化する[TRUCHET, Nature, 351, pp. 670-673, (1991); YANG, Plant Cell, 6, pp. 1415-1426, (1994); SAVOURE, EMBO.J., 13, pp. 1093-1102, (1994)]。根瘤は、3つの主要な領域からなる：分裂組織細胞からなる成長点領域；侵入又は分化のための中間領域(領域II)、ここで細菌による細胞の感染ならびに内複製と細胞の大きさの増大を伴い分化に続く細胞分裂の停止が生じる；及び細菌に感染した分化細胞からなる固定領域(領域III)、ここで窒素が固定される。
【０００４】
この研究中、発明者らは、アルファルファ(Medicago sativa)瘤から、以後ccs52と呼ぶ遺伝子を単離した。この遺伝子は、細胞周期の停止と内複製の誘導に必須の役割を果たしている。Medicago sativa ccs52遺伝子のcDNAプローブを用いて、発明者らは、Medicago truncatulaの同族遺伝子も単離した。
Medicago sativa (ccs52Ms)とMedicago truncatula (ccs52Mt)のccs52遺伝子は、理論分子量52kDaで475アミノ酸のポリペプチドをエンコードしている。これらのポリペプチドは、以降、それぞれCCS52Ms及びCCS52Mtと呼ぶ。CCS52Ms及びCCS52Mtの配列は、16 (R/G)と141 (V/I)の位置の2残基のみを異にしている。
これらの2つのタンパク質は反復WDモチーフを含み、したがって反復WDモチーフを有するタンパク質のスーパーファミリーに属する可能性がある。
【０００５】
反復WDモチーフは、反復モチーフの一方の端に頻繁に位置するWDモチーフ(Trp-Asp)を含む保存アミノ酸を幾つか含む約40アミノ酸からなる[NEER ら、Nature, 371, pp. 297-300, (1994)]。このファミリーに属するものは種々の機能、例えばシグナル導入、転写、プレ-mRNAスプライシング、細胞骨格の形成、小胞融合又は細胞周期を調節する。一般的な構造はこのファミリーの全タンパク質で全体に似通っているが、反復WDモチーフの広範囲な機能的な多様性は、これらのモチーフが分化し、機能的に特化していることを示唆している。機能的なホモロジーは、種々のタンパク質の等価な位置の反復WDモチーフと、同じタンパク質の他の反復モチーフとを比較したホモロジーの強度及びC-ならびにN-終末末端の著しい類似性によって、反復WDモチーフの数に反映されている。
【０００６】
CCS52Msの配列を、GENETICSコンピューターグループGAPプログラム[パラメータ: gap重量: 1000; 長さ重量: 0.100;マッチ平均: 0.540;ミスマッチ平均: 0.396] を用いて既知のタンパク質配列と比較したところ、細胞周期の調節に関与している反復WD40モチーフを含むタンパク質、より詳細には、「フィジー(fizzy)-関連」(FZR)ファミリーに属するDrosophila FZRタンパク質(57％同一)、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae) HCT1 (46％同一)、及びシゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe) SRW1 (52％同一)との高いホモロジーが示された。BLASTプログラム[ALTSCHUL ら、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, (1997)]を用いた配列データベースについて行った研究からは、上記のDrosophila FZRタンパク質(56％同一; 70％類似)及びシゾサッカロマイセス・ポンベSRW1タンパク質(51％同一; 67％類似)ならびに X. laevis fzr 遺伝子産物(58％同一; 73％ 類似)とのCCS52Msの強力なホモロジーが分かっている。
【０００７】
FZRタンパク質は、分裂サイクリン(mitotic cyclin)の崩壊を誘導し、細胞の増殖から分化への移行に関与する。したがって、fzr遺伝子は胚形成中に細胞増殖の最後で発現することが、ショウジョウバエで明らかにされている。この遺伝子産物は分裂サイクリンの減少を引起こし、細胞増殖の停止とエンドサイクル(endocycle)の開始に必要である [SIGRIST 及び LEHNER, Cell, 90, pp. 671-681, (1997)]。サッカロマイセス・セレビジエでは、HCT1は、分裂サイクリンClb2 のタンパク質分解に必要である [SCHWAB ら、Cell, 90, pp. 683-693, (1997)]。シゾサッカロマイセス・ポンベでは、swr1遺伝子産物が、Cdc2/CDCl3 (分裂型サイクリン)複合体をネガティブに調節することによって、細胞周期と分化を制御している [YAMAGUCHIら、Mol. Biol. Cell., 8, 2475-2486, (1997)]。したがって、FZRタンパク質は、細胞の増殖に関与している反復WDモチーフのある他のタンパク質とは異なる役割を果たしている。
植物で、FZRファミリーのタンパク質は、CCS52Ms以前には記載されていない。
【０００８】
反復WD40モチーフを有するタンパク質をエンコードする遺伝子の存在とニンジンcDNAからのその単離は、最近記載されている [LUOら、Plant Mol. Biol., 34, pp. 325-330, (1997)]。しかし、この遺伝子産物は、無脊椎動物及び酵母のFZRタンパク質よりも、CCS52Msタンパク質とのホモロジーが低い(BLASTプログラムを用いて行った配列比較によれば44％同一かつ63％類似)。このニンジンタンパク質はcdc20、p55及びフィジータンパク質に関与し、それ故にFZRサブグループと異なる反復WDモチーフを有するタンパク質のサブクラスに属している。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ゲノムのデータベースでのCCS52Msの同族体検索から、CCS52Msと64％の同一性を示すゲノムクローン(AB005230)から推定されるペプチド配列が明らかになっており、これは、他の植物におけるccs52Ms 遺伝子の同族体の存在を示している。シロイヌナズナのゲノムクローンから推定される別のペプチド配列(AL031018、1998年9月17日公表)も、CCS52Msと80％の同一性(BLASTプログラムを用いて行った配列比較に基づけば44％同一かつ63％類似)を示している。
【０００９】
図１Aは、反復WDモチーフを有するタンパク質ファミリーの系統樹を示している。これから、CCS52 タンパク質が、他のFZRタンパク質とともに、CDC20、P55及びフィジータンパク質それぞれからなる分枝とは別に進化した分枝を示すサブファミリーを構成していることは、明らかである。
図１Bと１Cは、Medicago sativa CCS52 (MsCCS52)配列とDrosophila FZY 及びFZR (DmFZY 及び DmFZR)配列、サッカロマイセス・セレビジエHCT1 (ScHCT1) 配列、シゾサッカロマイセス・ポンベSRW1 (SpSRW1)配列、シロイヌナズナ FZY (AtFZY)配列及び2つのシロイヌナズナ ポリペプチド(AtCCS52A = AL031018から推定されるペプチド、及びAtCCS52B = AB005230から推定されるペプチド)について、「PRETTYBOX」ソフトウエアを用いて行ったアラインメントを示す。
【００１０】
CCS52Msタンパク質は、反復WDモチーフが分子の中央とC-末端部位に位置したドメイン7個を含む(I〜VIIの番号の付いたこれらのドメインの位置は、上記の配列のアラインメントで図1Bと１Cに示す)。これらのドメインは互いにわずかなホモロジーしか示さず、そのために異なるタンパク質との相互作用のための部位を示しているものと結論づけられる。後者のドメイン(VII)は、サイクリン用の潜在的な結合部位を含む。
CCS52Msタンパク質のN-末端部位には、FZRタンパク質ならびにcdc20、p55及びフィジーのような反復WD40モチーフを有する他のタンパク質に存在するモチーフに相当するペプチド配列(DRFIPSR)、ならびに反復WD40モチーフを有する他のタンパク質には欠ける、FZRファミリーに特異的なモチーフ(それぞれI及びIIと呼ばれるこれらのモチーフの位置は配列のアラインメントの図１Bに示す)に相当するペプチド配列(AYTTLLRTALFG)が局在する。
【００１１】
CDK(サイクリン-依存性キナーゼ)でのリン酸化のための潜在的な部位は、 CCS52Ms のN-末端部位、位置43 (SPSR)、99 (TPEK)、144 (SPVK)、154 (RSP) 及び155 (SPYK)ならびにC-末端部分、位置454 (SPK)に位置する。位置43及び144に位置する部位は他のFZRタンパク質でも存在するが、位置99、154及び155に位置する部位は、植物のCCS52タンパク質により特異的であると考えられる。位置454のC-末端部位も、植物のCCS52 タンパク質に特異的であると思われる。
16番目の残基で始まり、タンパク質変性モチーフPESTに相当する15個のアミノ酸 RDNSPPPEPSPESLRの配列も、CCS52MsのN-末端部位に存在する。このモチーフは、CCS52の変性を介して、おそらく他のタンパク質とのその相互作用を制御することができる。
CCS52Msタンパク質の構造は図２に概略して示している。ここには、WD40モチーフ、リン酸化部位(P)、PESTモチーフ及びI及びIIモチーフの位置を示している。
発明者らによってクローンされたMedicago sativa cDNAの配列は、別紙に番号 SEQ ID NO:1; で配列リストに示している。相当するCCS52Msタンパク質の配列は、番号 SEQ ID NO:2で示している。
【００１２】
このDNAの転写物の非翻訳3'領域は、mRNAの不安定性に対する配列に相当する2つの AUUUA 配列を含み、このためにccs52の転写量の調節に役割を果たし得る。
発明者らは、ウマゴヤシ属の二倍体及び四倍体種ならびに他の植物、詳しくはタバコ、トマト、ポテト、大豆、小麦及び米でサザントランスファーによってccs52Ms同族体の有無を研究した。全てのケースで幾つかのバンドが検出され、ccs52が、実際にfzrファミリーに関連する植物遺伝子のファミリーを示していることが分かった。
発明者らは、CCS52Msタンパク質の活性をインビボで研究し、それが細胞分化の調節と内複製の促進に関与していることを明らかにした。特に、トランスジェニック植物では、CCS52Msタンパク質の発現は、そこで内複製と植物細胞の倍数レベルの増大を誘導する。この作用は、分裂サイクリンの崩壊を活性化することによる有糸分裂阻止の結果であり、分裂周期がG1-S-G2期からなるエンドサイクルに転化する。エンドサイクルを反復した結果、細胞容量の増大に伴ってゲノムが増幅し、倍数性が増す。
【００１３】
本発明の対象は、FZRサブファミリーに属することを特徴とするCCS52と呼ばれる、反復WD40モチーフを有する植物タンパク質である。
本発明の好ましい例によれば、この植物タンパク質は、配列SEQ ID NO:2のポリペプチドと少なくとも45％、好ましくは少なくとも55％の同一性を示すか、又は配列SEQ ID NO:2のポリペプチドと少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％の類似性を示す。
この発明は、特にCCS52Msタンパク質、そのイソ型ならびにFZRタンパク質ファミリーに属し得るウマゴヤシ属のオートロガスタンパク質及び他の植物のオルソロガス(orthologous)タンパク質を含む。
【００１４】
また、この発明は、1以上のアミノ酸又は1以上のアミノ酸配列の付加、欠失又は置換によってCCS52 タンパク質から誘導されるタンパク質を含む。これは、例えば修飾が機能領域外でなされているタンパク質、又は代替的には、修飾がその活性を変えるようになされているタンパク質、例えばPESTモチーフの欠失で安定化されているタンパク質を含んでいてもよい。
本発明の対象は、上述のCCS52タンパク質をエンコードする配列の全て又はその一部、又はその相補配列を含むことを特徴とする精製核酸フラグメントでもある。この明細書で、本発明は、特にCCS52タンパク質のcDNAとゲノムDNAを含む。
本発明によれば、核酸フラグメントは、ccs52Ms配列由来のオリゴヌクレオチド、特にFZRタンパク質、詳しくはCCS52タンパク質に特異的なこの配列領域由来のオリゴヌクレオチドを用いて、植物cDNA又はゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、容易に同定しクローンすることができる。
CCS52タンパク質は、詳しくは宿主細胞中でこれらの核酸配列を発現することによって製造することができる。
【００１５】
また、本発明の対象は、植物細胞の分化と増殖を調節するための、上記するCCS52タンパク質又は該タンパク質の全てもしくは一部をエンコードする核酸配列、又はその相補配列の使用である。
本発明の対象は、植物細胞の分化と増殖を調節するための、FZRサブファミリーのタンパク質又は該タンパク質の全てもしくは一部をエンコードする核酸配列又はその相補配列の使用である。
かかるタンパク質のうち、Drosophila FZRタンパク質又は酵母FZRタンパク質が挙げられる。
植物細胞におけるCCS52タンパク質の発現及び/又は活性の変更は、増殖又は分化のいずれかを促進させて細胞周期を変えることによって発生処理を制御し、例えば体細胞の胚形成を刺激したり、胚への転化を増してカルスからの植物のインビトロの再生を増したり、又はある器官の成育を促進し、例えば核内倍数性を増すことによって貯蔵組織の生産性を増すことができる。
【００１６】
特に、CCS52タンパク質のcDNA配列又はこれらのcDNA配列の一部又はそのセンスもしくはアンチセンス転写を用いることができる。これは、例えばCCS52Msタンパク質をエンコードする全配列又はこのコーディング配列の一部及び/又は非翻訳5'及び3'領域の全てもしくは一部であってもよい。これらの配列はセンスの方向で用いることができ、CCS52Msタンパク質の発現が植物又はその組織もしくは器官で阻害されることが望ましい場合には、アンチセンスの方向で用いてもよい。
また、本発明は、本発明による核酸配列を少なくとも１つ含む組換えDNA構造物を含む。
一般に、核酸配列は、適当なプロモーターの転写コントロールの下流に位置する。
したがって、宿主細胞中でのCCS52タンパク質の発現レベルを増すために、強力なプロモーターを用いることが有利である。これは、誘導プロモーター又は構成的プロモーター、偏在性プロモーター又は組織特異性プロモーターを含み得る。
【００１７】
誘導プロモーターの使用により、所望の時に有糸分裂を阻害し、内複製を誘導することができる。組織に特異的なプロモーターを用いると、ある組織や器官(例えば貯蔵組織)でCCS52タンパク質を作用させることができる。
本発明に関連して使用できる強力なプロモーターの例としては、CaMV35S [BENFLYら、Science, 250, pp. 959-966, (1990)]、35Sプロモーター；アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) T-DNAプロモーター：ノパリンシンセターゼ、オクトピンシンセターゼ、マンノピン(mannopine)シンセターゼ、1'、2' [SANDERSら、Nucleic Acid Res., 15, pp. 1543-1558, (1987); HOOYKAAS 及びSCHILPEROORT, Plant. Mol. Biol., 19, pp. 15-38, (1992)]が挙げられる。
【００１８】
本発明に関連して使用できる誘導プロモーターの例としては、テトラサイクリンで誘導可能なプロモーター [WEINMANNら、Plant J., 5, pp. 559-569, (1994)]；銅で誘導可能なプロモーター [METTら、Transgenic Res., 5, pp. 105-113, (1996)]；グルココルチコイドで誘導可能なプロモーター [AOYAMA及びCHUA, Plant. J., 11, pp. 605-612, (1997)]が挙げられる。
本発明に関連して使用できる組織特異的なプロモーターの例としては、内胚乳に特異的なプロモーター [OPSAHL-FERSTADら、Plant J., 12, pp. 235-246, (1997); DOAN ら、Plant Mol. Biol., 31, pp. 877-886, (1996); 瘤に特異的なプロモーター(enod12A/B又はレグヘモグロビン) [TRINHら、Plant Cell Reports, (17, pp. 345-355, (1998); VIJNら、Plant Mol. Biol., 28, pp. 1103-1110, (1995)) 又はNod因子により誘導可能な初期プロモーター及び後期プロモーター(サイクリンD又は後期瘤(late nodulins)(レグヘモグロビン型)プロモーター)及びホルモン、例えばparA/B [TAKAHASHIら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87, pp. 8013-8016, (1990)]、GH3 [LIUら、Plant Cell, 6, pp. 645-657, (1994)]によって調節されるプロモーターが挙げられる。
【００１９】
本発明は、詳しくは、本発明によるDNAフラグメントを含むインサートを少なくとも1つ有する組換えベクターを含む。これらのベクターは、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
また、本発明の対象は、本発明によるDNA配列の少なくとも1つで形質転換された細胞及び多細胞生物である。これは、特に植物細胞又は植物を含む。
本発明は、以下の付加的な記載によりさらに明確に理解されるが、以下は、CCS52Ms遺伝子の同定、クローニング及び発現の例示を示す、非限定的な例である。
【００２０】
実施例１：CCS52MS cDNAのクローニングとシークエンス
CCS52MsのcDNAクローンは、瘤の器官形成中に高度に刺激したMedicago sativa瘤のcDNAライブラリーから特異的なスクリーニングによって得た。
以下のプロトコルを用いた：
Medicago sativa ccs52MsのcDNAは、RNAイメージ(登録商標)キット(GENHUNTER CORPORATION)を用いてDD-RT-PCR (示差ディスプレイRT-PCR)技術[LIANG及び PARDEE, Science, 257, pp. 967-971, (1992)]により単離した。RNA試料は、細菌がないか、又は Nod+ (EK1433)もしくはNod- (EK133)のR. meliloti株で4日間接種している若いアルファルファ植物(窒素制限培地で成長)のNod因子に感受性の根茎領域から単離した。瘤の発現増大を示すDD-RT-PCR ccs52Msフラグメントはクローニングベクター pCT-TRAP(GENHUNTER CORPORATION) にクローンし、γ-ZAP(STRATAGENE)で構成される、Medicago sativa sp. varia A2の瘤のcDNAライブラリーから完全なクローンを単離するためのプローブとして用いた(CRESPIら、EMBO J., 1994, 13, 5099-5112)。
【００２１】
2.105 個のファージから得た7個のcDNAクローンは、互いに4アミノ酸(16R-G、17D-N、33S-N、 52R-G)と3'UTRフラグメントの長さのみを異にしている2タイプのcDNAを示す。アミノ酸配列のレベルで、クローンについて99％の同一性は、それらが他殖性の四倍体M. sativa中で同じ遺伝子のアレレ(allels)を示していることを示唆している。
ccs52Ms cDNAのシークエンスは、PERKIN-ELMER ABIprism系で行う。
ゲノムクローンccs52Ms及びccs52Mtは、ハイブリダイゼーションプローブとしてccs52Ms cDNAを用いて、M.sativa cv. Nagyszenasi 及びM. trucatula ecotype GHORのゲノムライブラリーから単離する。これらのゲノムライブラリーは、制限酵素MboIでゲノムDNAを部分消化し、15〜20kbの大きさのDNAフラグメントをλ-EMBL4のBamHI部位にクローニングして構築する。
【００２２】
実施例２：ウマゴヤシ属におけるCCS52MS遺伝子ファミリーの同定及び種々の植物器官におけるその発現
ccs52遺伝子の多コピーの存在は、野菜研究のモデル植物である、M.sativa     NagyszenasiとCardinalの四倍体品種及びM. truncatulaの自家生殖性二倍体で、サザンタイプのハイブリダイゼーションにより試験する。
植物DNAは、NUCLEON PHYTOPURE DNA抽出キット(AMERSHAM)を用いて若葉から単離する。
DNA試料はEcoRIで消化し、BIOTRANSナイロン膜(+) (ICN)に移す。
サザンハイブリダイゼーションは、65℃でストリンジェントな条件(CG緩衝液中でハイブリダイゼーション；洗浄：15分2回、2xSSC、0.1％ SDS、次いで30分2回、0.5xSSC、0.1％ SDS)で、従来のプロトコル [(SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989); AUSUBEL, Current Protocols in Molecular Biology, (1989)) にしたがって行う。
ccs52Msの発現は、ノーザン解析で研究する。
【００２３】
全 RNAは、M.sativa Sitel品種の種々の器官から単離する:
-  R. meliloti Nod- 突然変異体(EK133)及びNod因子を過剰生産する株(EK1433)で4日間接種した根茎から；
-  R. melilotiに感染して12、19、23及び30日後の瘤から、及び
-  3日齢及び7日齢の茎、胚軸、葉、芽、花、植物の根、窒素を使っておらず(deprived of nitrogen)先端のない根茎、硝酸塩の存在する培養液中に入れた根茎の先端部のない7日齢の根茎、R. meliloti不在下で自発的に成長した瘤、及びM.sativa sp. varia A2の根茎の先端部又は細胞培養物から。
各試験器官100mgは、液体窒素下で回収し、RNAの抽出に用いる(RNEASY PLANT, QUIAGEN)。
変性ゲル(ホルムアルデヒド)にRNAをのせる(10μg/レーン)[SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)]。
【００２４】
DNAは、10xSSCトランスファー溶液に移す [CHOMCZYNSKIら、Analytical Biochemistry, 221, pp. 303-305, (1994)]。
サザンハイブリダイゼーションとノーザンハイブリダイゼーションの双方の場合に、ccs52Ms cDNAフラグメントは、[α32P]dCTP (キットMEGAPRIM, AMERSHAM)で標識する。Msc27プローブでのハイブリダイゼーションは、RNAを加えたもののコントロールとして役立つ[SAVOUREら、EMBO J., 13, pp. 1093-1102, (1994)]。
サザントランスファーの結果は、プローブが、M.sativa又はM. truncatulaのゲノムDNAの種々のEcoRIフラグメントとハイブリダイズし、 ウマゴヤシ属のccs52Msが多遺伝子ファミリーを示すことを示している。
R. meliloti のNod- EK133突然変異体又はNod因子を過剰生産するEK1433株を接種した根茎の全RNA、及びR. melilotiに感染してから12、19、23及び30日後の瘤から抽出したRNAを用いて得たノーザントランスファーの結果は、根茎の全RNAには、ごくわずかな量の転写しか認められないことを示している。これは、根茎の全細胞数に比較して瘤の器官形成に関与している細胞が少数であることを反映している。対照的に、古さの異なる瘤では、高レベルの転写が認められる。これは、成長点の分裂組織と分化領域の持続性を反映している。
【００２５】
１: M. sativa sp. varia A2の細胞培養物、２: 茎、３: 胚軸、４: 葉、５: 花芽、６:花、７:3日齢の苗条根、８: 窒素を使わない先端を欠く7日齢の苗状根、９: 硝酸塩の存在下で培養した、先端を欠く7日齢の根茎の先端部、１０: R. meliotiの不在下で自発的に成育した瘤、１１: 窒素固定瘤、１２: 根茎先端部の先端の全RNAを用いて得たノーザントランスファーの結果は、瘤はもっとも高い転写レベルを含むが、ccs52Msの発現は瘤に制限されないことを示している。
実際に、これらの転写物は、事実上は全ての器官に種々の量で存在しており、これは、このタンパク質が各器官の成育に関与していることを示している。瘤とは別に、転写レベルは若い苗条及び細胞培養物中でも高く、さらに細胞培養物中では、異なるポリアデニル化又は遺伝子の同族コピーの発現のいずれかに相当する大きさの小さいmRNAが見られる。
インサイトゥハイブリダイゼーションによっても分析を行い、ccs52MsのmRNAは、分化の領域、特に分化がもっとも活性な領域である瘤領域IIとIIIの中間に主に位置することが分かった。
同時に、G1及び分裂型サイクリンならびにS期に特異的なH3ヒストンの発現が、同じ領域で確認されている。
これは、CCS52Msが、おそらくは酵母やdrosophila同族体に似た様式、つまり分裂サイクリンをタンパク質分解することによって細胞周期の調節に関与し、これが有糸分裂を阻害し、内複製周期を誘導することを示している。
【００２６】
実施例３：シゾサッカロマイセス・ポンベにおけるCCS52MSの発現
CCS52Msの発現は、機能同族体(SRW1)が最近指摘されている(YAMAGUCHI、上記文献)エス・ポンベで研究した。CCS52Msをエンコードする遺伝子は、チアミンで制御可能な nmt1プロモーターの制御下でpREP1にプラスミドをクローンした。
γ-ZAP (STRATAGENE)の切断後に得られるccs52MsのcDNAは、 AgeIで消化し、EcoRVで部分的に消化した。コーディング領域を示す1.6kbのAgeI-EcoRVフラグメントは、最初の4コドンを除いてXmaI (AgeIに適合性)とEcoRVで消化したベクターSKII BLUESCRIPT (STRATAGENE)にクローンする。このプラスミド(pSK52B)から、ccs52Ms のcDNAをBamHI-EcoRV消化で切断し、プラスミドpREP1のBamHI-SmaI部位にクローンした[MAUNDRELLら、Gene, 123, pp. 127-30, (1993)]。nmtI プロモーター制御下でベクターに存在する翻訳用ATGコドンにオープンリーディングフレームを合わせるために、DNAをBamHIで消化し、クレノウ酵素とdNTPの存在下で5'末端を完全にした。ブラント末端の再連結により、シークエンスによっても確認される正確な融合が生じる。pREP52と呼ばれるこのプラスミドは感応性のエス・ポンベSP-Q01細胞を形質転換するのに用い、その形質転換体を、ESPキット(STRATAGENE)を用いてEMM-チアミン寒天プレートで選択する。ベクターpREP1 [MAUNDRELLら、Gene, 123, pp. 127-30, (1993)]とpESP1 (STRATAGENE)はネガティブコントロールとして用い、pREP1にクローンしたsrw1をポジティブコントロールとする[YAMAGUSHIら、Mol. Biol. Cell., 8, pp. 2475-2486, (1997)]。
【００２７】
エス・ポンベSP-Q01の形質転換体は、30℃で32時間5μMの EMM-チアミン培地2mlで培養する。細胞は滅菌水10mlで2回洗浄し、EMM培地5mlに再懸濁する。細胞懸濁液は1/2ずつに分ける。2.5mlは30℃でチアミンで培養し、2.5mlはチアミンなしで30℃で培養する。培養アリコートは培養から16〜24時間後に回収し、エタノールで固定し、フローサイトメトリー又は顕微鏡による分析用のDAPI又はヨウ化プロピジウムで染色する[BEACHら、Curr. Genet., 10, pp. 297-311, 1985]]。
チアミンの存在下で、CCS52Msの発現は抑制され、正常な成長が認められる。
チアミンの不在下で、CCS52Msの発現は、図３Ｂに示される内複製を伴ってエス・ポンベの成長阻害を引起こす。これは、4C以上の核(nuclei)の存在を示し、空のベクターpREP1を有するエス・ポンベのコントロール細胞中では認められない(図３Ａ)。
細胞の形態は、CCS52Msの発現によっても変えられる。SRW1の発現中に認められるのと同一の細胞の長化と核の大きさの増大が認められる[YAMAGUSHIら、Mol. Biol. Cell., 8, pp. 2475-2486, (1997)]。しかし、エス・ポンベがベクターpREP1しか持たない場合には、形態的な変化は認められない。
【００２８】
エス・ポンベで、SRW1は、分裂サイクリンCDC13の分解に必須である。CCS52が同様に作用するか否かを確認するために、srw1遺伝子を欠失させ、CDC13を分解しないエス・ポンベの株(SY1)の培養物中で、CDC13量を評価した。
pREP1(コントロール)又はpREP1-ccs52を用いて形質転換したSY1培養物から得た全タンパク質はウエスタントランスファーで分析し、抗-CDC13抗体を用いて可視化した。
同時に、抗-PSTAIR及び抗-α-チュービュリン抗体それぞれを用いて、CDC2キナーゼとα-チュービュリンの発現を可視化して評価した。
得られた結果は、コントロールの細胞と比較して、pREP1-ccs52で形質転換した細胞では、CDC13の減少が極めて高かったことを示している。対照的に、CDC2とα-チュービュリンでは、変化はない。
これらの結果から、CCS52がSRW1の機能に等価であることが確認される。
【００２９】
実施例４：CCS52MS遺伝子で形質転換したトランスジェニック植物の生産
1.  アンチセンス転写物の発現及びMedicago truncatulaの倍数レベルにおけるその作用
第一に、Medicago truncatula (この植物は天然に二倍体である)の種々の器官の倍数レベルは、非形質転換植物でフローサイトメトリーにより測定した。
用いた技術は、以下のとおりである：
新たに収穫した植物の核DNAは、BROWNらの方法(A laboratory guide for Cellular and Molecular plant Biology, 1991, 326-345, Negrutiuら編集、Birkhauser, Basel)にしたがって、核を最終濃度5μg/mlでDAPIで染色するよう変えて、フローサイトメトリー(EPICS V, Coulter)で分析する。核緩衝液Iは、瘤用に1％Triton X-100で用いる。
若い苗条では、根茎と子葉で2C〜8CのDNA量がみられるが、胚軸も16Cの核を含む。植物成体では、葉は、2Cの核95％と4Cの核5％を含む二倍体である。葉柄と瘤では、2C〜32Cの核が見出された。しかし、葉柄は、2Cの核を優勢に含むが、瘤は4Cの核を優勢に含有する。
【００３０】
ccs52Msコーディング配列の3/4を含む1.2kbのSstI-PvuIIフラグメントは、ベクターpGPTV-BARから得られるバイナリーベクター(選択マーカーとして除草剤BASTAに耐性のbar遺伝子とマルチクローニング部位を有する)中で、35S プロモーターの制御下アンチセンス方向に位置していた。この構造物は、35SプロモーターをHindIII-XbaIフラグメント(pBI121由来、CLONTECH)に挿入し、ベクターpGPTV-BAR のHindIII-XbaI部位に挿入して得られる。uidA遺伝子は、次いで、マルチクローニング部位のレベルで、XbaI-SstI消化によりプラスミド pGPTV-BARから除く。
ccs52Msのアンチセンス構造物を得るために、このようにして得たバイナリーベクターのSmaI-SstI部位に、SstI-PvuIIフラグメント1.2kbをクローンする。
これらのプラスミドならびに、アンチセンスccs52構造物の代わりにgus遺伝子を含むコントロールプラスミドは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(EHA105)に導入し、HOFFMANNら[Mol. Plant Microbe Interaction, 10, pp. 307-315, (1997)]; TRINHら、[Plant Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)]により記載されているプロトコルにしたがってMedicago truncatula R108-1 を形質転換するのに用いた。
【００３１】
得られたトランスジェニック植物の倍数レベルは上記のようにして分析し、内因性転写のレベルはRT-PCRで評価した。アンチセンス転写とccs52Mtの内因性転写とを区別するために、プライマー対P55CL/P55CRを内因性転写に用い、プライマー対P55BL/P55CRをアンチセンス転写に用いる。
P55BL   :       TTTGGGGGTTGATGATTGTG
P55CL   :       CTCTCTACCGTTCTATCTCTTGGGA
P55CR   :       GGTAAAGATGCTACTTTGGTGGTGT
これらのプライマーの位置を、図４に概略して示す。
図５Ａは、内因性ccs52Mt転写の量の評価結果を示している:
-  トランスジェニック系A1、A3、A4、A7及びA32ならびにgus 遺伝子を含むコントロール植物(C2n)におけるRT-PCR(□) 、及び
-  A4及びC2n植物におけるノーザントランスファー
0004588876.tif 000002
。
gus遺伝子を含むコントロール植物の葉柄、A4系の二倍体(C2n)又は四倍体(C4n)及び植物についてのフローサイトメトリーによる分析結果は、図５Ｂに示す。
【００３２】
再生トランスジェニック植物38個のうち、3個(A4、A7及びA32)、特にA4植物が、核内倍数性を著しく減じた。図５Ｂに示されているようにccs52Msの内因性転写の発現レベルがもっとも低いのも、この系である。核内倍数性の減少が他のトランスジェニック植物ではこれまで全く認められず、コントロール植物で認められないという事実から、この現象は、CCS52Msの発現損傷に帰することができ、トランスジェネシスの二次作用には帰することができない。
加えて、A4植物は、コントロール植物よりも極めて少ない量の種子を生産する。さらに、生じる分枝もより少なく、同じ条件下で培養したコントロール植物によって成長した平均50個の瘤の代わりに根茎レベルで2個の瘤を生じるにすぎない。
植物器官の成長におけるccs52の発現の部分的な抑制の影響も測定した。この目的のため、葉柄の幅を測定し、A4系由来のT1世代とC2n及びC4nコントロール植物で、内複製した核(＞4C)の割合と相関づけた。
結果を図６に示す。多倍数細胞の割合の関数として葉柄の幅を示す図６Ａは、C2nコントロール植物(18植物)で、葉柄の幅が倍数細胞の数に相関して変化することを示している。A4由来植物(36植物)では、葉柄の大きさのばらつきのかなりの減少と多倍数細胞の低割合が認められ、これは、核内倍数の程度が植物器官の最終的な大きさに直接影響を及ぼしていることを示している。
【００３３】
A4由来の12〜36のT1植物は、その葉柄に6％未満の内複製した核(＞4C)を含む (図6B)。これらの植物[A4(ｓ)]を１グループとし、実質的な表現形の損傷を示さない残りのA4 T1植物[A4(w)]とは個別に分析した。
図６Ｃは、A4(w)植物の葉柄の幅が二倍体C2nコントロール植物の幅に匹敵していることを示している。 対照的に、A4(s)植物の葉柄の幅は、二倍体C2n コントロール植物の幅よりかなり小さく、四倍体C4nコントロール植物の葉柄の幅は二倍体植物で認められた幅よりも著しく大きい。
葉の大きさ(内複製細胞を含まず、それ故に、その核内倍数性はCCS52の発現レベルにより影響されない)も測定した。この場合、A4(w)植物、A4(s)植物及び二倍体C2n コントロール植物に著しい相違はない。対照的に、葉の大きさは、四倍体C4n コントロール植物で著しく大きい。
これらの結果は、核内倍数性が植物器官の大きさに影響を及ぼし、CCS52の発現の修飾が核内倍数性の修飾を介してこのレベルで作用することを示している。
【００３４】
2.  トランスジェニック植物におけるCCS52Msタンパク質の発現
35Sプロモーターの制御下でccs5Ms遺伝子を含む発現ベクターならびに組織特異的なプロモーターの制御下でccs52Ms遺伝子を含む発現ベクターは、以下のプロトコルにしたがって構築した：
CCS52Msの組織特異的な発現については、TRINHらによって記載されているenod12Ams及び Srglb3プロモーター [Plant Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)] の制御下にcDNAを置いた。但し、pISV-BMCS ベクターとしてpISV2301誘導体を用い、完全なenod12Amsプロモーターの代わりに、瘤特異的な発現に十分と考えられる[VIJNら、Plant Mol. Biol., 28, pp. 1103-1110, (1995)] 0.3kbフラグメント１個のみを用いた。
pISV-BMCSの構築: pISV2301は、2X35S-AMVプロモーター配列を除くために、HindIII 及びSstIで消化し、それを以下の二重鎖BMCSオリゴヌクレオチドで置換する:
AGCTTCCCGGGGGAGCTCTAGACTCGAGCAGCT
AGGCCCCTCGAGATCTGAGCTCG。
このオリゴヌクレオチドは、SmaI、SstI、XbaI及びXhoI部位を含む。
【００３５】
pISV-BMCS12Aは、pISV-BMCSに、プラスミドpPR89から得た0.3kbのendo12Amsプロモーターのフラグメントをクローニングして構築する[BAUERら、Plant J., 10, pp. 91-105, (1996)]。
pISV-BMCS-LB3は、pISV-BMCSをHindIII-SstIで消化し、pLP32からの Sesbania rostrataのレヘモグロビンプロモーターを含むHindIII-SstI フラグメントをクローニングして構築する[TRINHら、Plant Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)]。
これらのベクターは、アンチセンス配列のために上記プロトコルにしたがって Medicago truncatulataを形質転換するのに用いた。
トランスジェニック植物の再生中、カルスの胚へのかなり多い転化が、 ccs52Ms遺伝子を発現する構築物で形質転換した植物で、コントロール構築物で形質転換した植物よりも認められる。これは、体細胞胚形成におけるCCS52Msのポジティブな作用を示している。
【配列表】
0004588876.tif 000003
0004588876.tif 000004
0004588876.tif 000005
0004588876.tif 000006
0004588876.tif 000007
【図１Ａ】
0004588876.tif 000008
【図１Ｂ】
0004588876.tif 000009
【図１Ｃ】
0004588876.tif 000010
【図２】
0004588876.tif 000011
【図３Ａ】
0004588876.tif 000012
【図３Ｂ】
0004588876.tif 000013
【図４】
0004588876.tif 000014
【図５Ａ】
0004588876.tif 000015
【図５Ｂ】
0004588876.tif 000016
【図６Ａ】
0004588876.tif 000017
【図６Ｂ】
0004588876.tif 000018
【図６Ｃ】
0004588876.tif 000019