(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素化学的特性を有するα−グルコシダーゼ。
（１）作用および基質特異性：マルトース、マルトトリオース、ショ糖、フェニルα−グルコシド及びｐ−ニトロフェニルα−グルコシドに作用し、イソマルトース及び可溶性澱粉には作用しない。マルトース、フェニルα−グルコシド及びｐ−ニトロフェニルα−グルコシドに対しては、基質濃度の増加に伴い活性化され、負の協同性を示す。
（２）分子量：８２,０００（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定）
（３）至適ｐH：５.１
（４）ｐH安定性：４.９〜１２
（５）温度安定性：４５℃、１５分間処理で９０％以上の残存活性を示す。
（６）カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンにより酵素活性が活性化される。
【請求項２】
酵素起源がマルハナバチである請求項１に記載のα−グルコシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高基質濃度下においても阻害を受けず、基質濃度の増加に伴い、酵素反応が活性化され、負の協同性を示す新規なα−グルコシダーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼは、微生物から動植物まで広く天然界に存在する酵素で、基質の非還元性末端のα−グルコシド結合を水解してα−D−グルコースを生成する。また、α−グルコシダーゼは水解反応のみならず、糖転移反応をも触媒し、様々なオリゴ糖や配糖体の酵素合成にも用いられている。しかし、通常のミカエリス−メンテン型酵素は、高基質濃度下においては反応速度が飽和し、さらに高い基質濃度下では触媒作用が阻害を浮け、反応速度が低下することが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これに反し、ミツバチのα−グルコシダーゼは、高基質濃度において阻害を受けずに、反応が活性化されるα−グルコシダーゼとして知られている。しかし、ミツバチのα−グルコシダーゼも、カルシウムイオンにより阻害を受けるなどの問題点があった。また、基質に対する親和性がミツバチのα−グルコシダーゼよりも、より高いものが求められていた。
【０００４】
そこで本発明の目的は、高基質濃度下においても阻害を受けず、基質濃度の増加に伴い、酵素反応が活性化され、負の協同性を示し、カルシウムイオンにより阻害を受けない新規なα−グルコシダーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、様々な起源のα−グルコシダーゼを鋭意研究し、高基質濃度下においても阻害を受けず、基質濃度の増加に伴い、酵素反応が活性化され、負の協同性を示す新規なα−グルコシダーゼを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記酵素化学的特性を有することを特徴とする新規α−グルコシダーゼである。
▲１▼作用および基質特異性：マルトース、マルトトリオース、ショ糖、フェニルα−グルコシド及びｐ−ニトロフェニルα−グルコシドに作用し、イソマルトース及び可溶性澱粉には作用しない。マルトース、フェニルα−グルコシド及びｐ−ニトロフェニルα−グルコシドに対しては、基質濃度の増加に伴い活性化され、負の協同性を示す。
▲２▼分子量：８２,０００
▲３▼至適ｐH：５.１
▲４▼ｐH安定性：４.９〜１２
▲５▼温度安定性：４５℃、１５分間処理で９０％以上の残存活性を示す。
▲６▼カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンにより酵素活性が活性化される。
【０００７】
上記酵素化学的特性を有する新規α−グルコシダーゼの起源としては、マルハナバチが挙げられる。マルハナバチ（Bombus terrestris L.）は、膜翅目ミツバチ科マルハナバチ類に属するハナバチであり、近年、限定訪花性や振動集粉行動といった性質を持っていることから、温室トマトやナスの受粉に用いられ、注目されるようになった種である。
【０００８】
これまでに報告されているα−グルコシダーゼは、その基質特異性から次の３種に分類されている。
１）ショ糖や合成基質であるフェニルα−グルコシドのような“heterogeneous”な基質に対して高い水解力をもつグループ
２）マルトオリゴ糖のような“homogeneous”な基質に対して高い水解力をもつグループ
３）低分子基質に対しては２）のグループに近いが、澱粉やグリコーゲンのような高分子基質に対しても加水分解力をもつグループ
【０００９】
本発明の新規α−グルコシダーゼは、マルトオリゴ糖、ショ糖やフェニルα−グルコシドなどの合成基質に作用し、イソマルトースや可溶性澱粉には作用しないので、上記の分類法に当てはまらない例外的な酵素である。このようなα−グルコシダーゼは、これまでにもミツバチのα−グルコシダーゼが知られている。
しかしながらミツバチのα−グルコシダーゼと本発明の新規α−グルコシダーゼでは、分子量が異なる（ミツバチ起源α−グルコシダーゼは分子量８８,０００）。さらに、酵素活性がカルシウムイオンにより阻害を受け、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンに影響を受けないミツバチ起源のα−グルコシダーゼに対して、本発明の新規α−グルコシダーゼではカルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンにより酵素活性が活性化されるという違いがある。また、ミツバチ起源のα−グルコシダーゼに比較して、本発明の新規α−グルコシダーゼの方が、マルトース、マルトトリオースやショ糖に対するKｍ（ミカエリス定数）が小さく、基質に対する親和力が高いことを示している。これらの特性と、マルトースや合成基質に対して、基質濃度の増加に伴い活性化され、負の協同性を示すことは、糖転移反応により、オリゴ糖や配糖体を生成させる際に非常に有効な特性であり、工業的な利用価値も高いものである。このような酵素化学的特性を有するα−グルコシダーゼは、これまでに知られていないので、新規な酵素であるといえる。
【００１０】
なお、本発明の新規α−グルコシダーゼは、マルハナバチから各種クロマトグラフィーなどの手段を経て分離精製することができる。この分離精製方法の具体例は、後述する実施例に示す。
【００１１】
また、本発明において、酵素の力価の測定は、０.２％マルトースを基質として、ｐH ５.０、３７℃で反応を行ない、１分間に１μmolのマルトースを加水分解する酵素量を１単位とした。酵素反応により、フェニルα−グルコシドから生ずるフェノールの定量は、２,６−ジブロモ−N−クロロ−ｐ−ベンゾキノンモノイミンを用いて測定を行なった。また、酵素反応により、ｐ−ニトロフェニルα−グルコシドから生ずるｐ−ニトロフェノールの定量は、酵素反応溶液に炭酸ナトリウム溶液を添加して測定を行なった。
【００１２】
【実施例】
以下に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
(酵素の精製)
マルハナバチ（アピ株式会社製：はなまるくん）２８.２ｇを−２０℃で凍結させ、２００ｍｌの３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH ６.３）を加えて超音波処理を行なった後、４℃にて一晩攪拌した。この液を遠心分離（４℃，１０,０００×ｇ，１５分）し、上清を得た。沈澱には、２００ｍｌの３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH ６.３）に懸濁し、４℃にて一晩攪拌した後、遠心分離（４℃，１０,０００×ｇ，１５分）し、上清を得た。沈澱は再度同様の処理を行ない、上清を得た。
以上の３つの上清を混合し（５００ｍｌ）、全飽和（３５４ｇ）の硫安を添加して４℃にて一晩攪拌した。
【００１４】
硫安全飽和溶液を遠心分離（４℃，２２,０００×ｇ，２０分）し、得られた上清を上清▲１▼とした。沈澱は３０ｍｌの３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH ６.３）に懸濁し、超音波処理後、遠心分離（４℃，１４,０００×ｇ，１５分）を行ない、上清▲２▼を得た。沈澱は、３０ｍｌの３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH ６.３）に懸濁し、遠心分離（４℃，１４,０００×ｇ，１５分）を行ない、上清▲３▼を得た。上清▲１▼はそのまま、上清▲２▼と▲３▼には９５％飽和となるように硫安を加え、４℃にて一晩放置した。
【００１５】
硫安９５％飽和溶液を遠心分離（４℃，２５,０００×ｇ，３０分）し、得られた沈澱を予め硫安９５％飽和溶液で平衡化したセライトと混合した。また、上清▲１▼は予め同硫安飽和溶液で平衡化したセライトで減圧濾過して、沈澱画分を回収した。これらのセライトをカラム（φ２.８×２８cm）に充填し、硫安９５％飽和から０％までの直線濃度勾配で塩析クロマトグラフィーを行なった。図１はその結果を示しており、マルターゼ活性は高濃度硫安に可溶な画分と、低濃度硫安に可溶な画分とに分離した。図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は硫安の飽和濃度（％）を示す。
【００１６】
高濃度硫安に可溶な画分のうち、フラクション番号５０〜１１０（１８０ｍｌ）を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐH ７.８）に対して透析した。得られた透析液（２７５ｍｌ）を予め同緩衝液で平衡化したDEAE−Sepharose CL-6B（アマシャムフルマシアバイオテク（株）製）を充填したカラム（φ２.１×４１cm）に供した。図２に結果を示したが、マルターゼ活性はその大部分を含む非吸着部分と、活性の低い２つの吸着部分とに分離した。図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は食塩（Ｍ）を示す。
【００１７】
非吸着画分（フラクション番号１〜２０：４００ｍｌ）を集め、５０mM酢酸緩衝液（ｐH ４.７）に対して透析し、予め同緩衝液で平衡化したCM−Sepharose CL-6B（アマシャムフルマシアバイオテク（株）製）を充填したカラム（φ２.１×４１cm）に供した。同緩衝液で未吸着のタンパク質を十分に洗浄後、０.０５〜１Ｍの酢酸緩衝液（ＰH ４.７）直線濃度勾配により溶出を行なった。図３に結果を示した。図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は酢酸緩衝液の濃度（Ｍ）を示す。フラクション番号１１５〜１２１（３５ｍｌ）を、コロジオンバックにて０.５ｍｌまで濃縮し、０.１Ｍ食塩を含有する５０mM酢酸緩衝液（ｐH ５.７）に対して透析した。この透析液を予め同緩衝液で平衡化したBio-Gel P-100（日本バイオラッドラボラトリーズ（株）（株）製）を充填したカラム（φ１.３×４０cm）に供した。図４に結果を示した。活性画分（フラクション番号３１〜３８：４ｍｌ）を集め、精製酵素標品とした。図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を示す。
【００１８】
以上の精製操作により得られた精製酵素標品は、ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）およびSDS−PAGEにおいて単一のタンパク質染色バンドを与えた。
【００１９】
(精製酵素標品の分子量)
精製酵素標品（１.４μｇ）を、標準タンパク質（LIFE-TECHNOLOGIES製）と共にSDS-PAGEに供し、分子量の推定を行なった。その結果、精製酵素標品の分子量は８２,０００と推定された。
【００２０】
(精製酵素標品の至適ｐH)
５０μLの精製酵素溶液、５０μLの２％マルトース溶液と４００μLの各種ｐHのBritton-Robinson緩衝液を混合して、３７℃にて１０分間酵素反応を行なった際の酵素活性の相対比を求めた。図５に示したように、ｐH ５.１付近で最大活性を示し、反応至適ｐHはｐH ５.１と求められた。
【００２１】
(精製酵素標品のｐH安定性)
１０μLの精製酵素溶液と１００μLの各種ｐHのBritton-Robinson緩衝液を混合して、５℃，２４時間保持した。処理後の溶液１００μLに５０μLの２％マルトース溶液と３５０μLの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５.０）を混合して、３７℃にて１０分間酵素反応を行い、処理前の酵素活性に対する比を求めた。図６に示したように、ｐＨ ４.９〜１２の範囲で９０％以上の残存活性を示した。
【００２２】
(精製酵素標品の温度安定性)
１００μＬの精製酵素溶液と２００μＬの０.１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５.０）を混合して、各種温度で１５分間処理を行なった。処理後、冷却して２００μＬの０.５％マルトース溶液を添加して３７℃，１０分間酵素反応を行い、処理前の酵素活性に対する比を求めた。図７に示したように、４５℃まで９０％以上の残存活性を示した。
【００２３】
(金属塩の酵素活性に対する影響)
５０μＬの各種濃度の金属塩溶液、５０μLの精製酵素溶液、２００μLの０.５％マルトース溶液と２００μLの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５.１）を混合して、３７℃，１０分間酵素反応を行い、金属塩無添加の酵素活性に対する比を求めた。図８〜１１に結果を示した。図８中の−●−は塩化カルシウムを、−◆−は硝酸カルシウムの結果を示す。図９中の−●−は塩化マグネシウムを、−▲−は硫酸マグネシウムの結果を示す。塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム（図１０）、塩化カリウム（図１１）のいずれの金属塩においても、金属塩無添加の場合に比較して１０〜２０％程度、酵素活性が上昇した。
【００２４】
(基質特異性)
マルトース、マルトトリオース、ショ糖、フェニルα−グルコシド、ｐ−ニトロフェニルα−グルコシドを基質として、それぞれの基質の濃度を変化させて初速度を測定した。その結果をもとにLineweaver-Burkプロットから、速度パラメーターを求めた。図１２〜１６にLineweaver-Burkプロットの結果を、表１に速度パラメーターを示した。図１５中、−●−はグルコースの生成速度を、−○−はフェノールの生成速度を示す。図１６中、−●−はグルコースの生成速度を、−○−はｐ−ニトロフェノールの生成速度を示す。
【００２５】
マルトースからのグルコースの生成速度（図１２）は、基質濃度が低い場合にはミカエリス−メンテンの反応式に従ったが、基質濃度が高くなると活性化され、負の協同性を示した。マルトトリオース（図１３）とショ糖（図１４）からのグルコースの生成速度は、ミカエリス−メンテンの反応式に従った。フェニルα−グルコシドを基質とした場合（図１５）には、グルコースの生成速度はミカエリス−メンテンの反応式に従ったが、フェノールの生成速度は高基質濃度では活性化され、負の協同性を示した。ｐ−ニトロフェニルα−グルコシドを基質とした場合（図１６）には、グルコースの生成速度は、高基質濃度で阻害が確認されたもののミカエリス−メンテンの反応式に従った。しかし、ｐ−ニトロフェノールの生成速度は高基質濃度で活性化され、負の協同性を示した。
【００２６】
【表１】
0004576031.tif 000002
【００２７】
また、マルトース、イソマルトース、可溶性澱粉に対する経時変化を求めた結果を、図１７に示す。イソマルトースと可溶性澱粉の加水分解はほとんど認められなかった。図中の−●−はマルトースの結果を、−▲−は可溶性澱粉の結果を、−□−はイソマルトースの結果を示す。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の新規α−グルコシダーゼは、高基質濃度下においても阻害を受けず、基質濃度の増加に伴い、酵素反応が活性化され、負の協同性を示すという特性を有している。従って、本発明の新規α−グルコシダーゼは、糖転移反応により、オリゴ糖や配糖体を生成させる際に非常に有効な特性であり、工業的な利用価値も高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】塩析物を塩析クロマトグラフィーにかけた溶出パターンを示す図で、図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は硫安の飽和濃度（％）を示す。
【図２】塩析クロマトグラフーの高濃度硫安に可溶な画分をDEAE-Sepharose CL-6Bを用いたイオン交換クトマトグラフィーにかけた溶出パターンを示す図で、図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は食塩（Ｍ）を示す。
【図３】DEAE-Sepharose CL-6Bを用いたイオン交換クトマトグラフィーに非吸着画分をCM-Sepharose CL-6Bを用いたイオン交換クトマトグラフィーにかけた溶出パターンを示す図で、図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を、−▲−は酢酸緩衝液の濃度（Ｍ）を示す。
【図４】CM-Sepharose CL-6Bを用いたイオン交換クトマトグラフィーにおける活性画分を、Bio-Gel P-100を用いたゲル濾過クトマトグラフィーにかけた溶出パターンを示す図で、図中の−◆−は２８０ｎｍにおける吸光度を、−○−はマルターゼ活性を示す。
【図５】反応至適ｐHのパターンを示す図である。
【図６】ｐH安定性のパターンを示す図である。
【図７】温度安定性のパターンを示す図である。
【図８】カルシウム塩の酵素活性に与える影響を示す図で、図中の−●−は塩化カルシウムを、−◆−は硝酸カルシウムの結果を示す。
【図９】マグネシウム塩の酵素活性に与える影響を示す図で、図中の−●−は塩化マグネシウムを、−▲−は硫酸マグネシウムの結果を示す。
【図１０】塩化ナトリウムの酵素活性に与える影響を示す図である。
【図１１】塩化カリウムの酵素活性に与える影響を示す図である。
【図１２】マルトースを基質として用いた際のLineweaver-Burkプロットである。
【図１３】マルトトリオースを基質として用いた際のLineweaver-Burkプロットである。
【図１４】ショ糖を基質として用いた際のLineweaver-Burkプロットである。
【図１５】フェニルα−グルコシドを基質として用いた際のLineweaver-Burkプロットで、−●−はグルコースの生成速度を、−○−はフェノールの生成速度を示す。
【図１６】フェニルα−グルコシドを基質として用いた際のLineweaver-Burkプロットで、−●−はグルコースの生成速度を、−○−はｐ−ニトロフェノールの生成速度を示す。
【図１７】マルトース、イソマルトース、可溶性澱粉に対する経時変化を示す図である。図中の−●−はマルトースの結果を、−▲−は可溶性澱粉の結果を、−□−はイソマルトースの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004576031.tif 000009
【図８】
0004576031.tif 000010
【図９】
0004576031.tif 000011
【図１０】
0004576031.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
0004576031.tif 000014
【図１３】
0004576031.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
0004576031.tif 000017
【図１６】
0004576031.tif 000018
【図１７】
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