(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミゾリビンを生産するための発酵方法であって、炭素と窒素の同化源を含む栄養液体培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ菌株の存在下に好気条件で発酵を実施することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
菌株を予備培養する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２３℃〜３３℃の温度で３〜７日間実施する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２５℃〜２９℃の温度で４〜６日間実施する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付加無機塩の存在下に発酵を実施する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ミゾリビンの精製及び／又は医薬的に許容可能なその組成物の製造を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はミゾリビンの生産方法に関する。特に、本発明はミゾリビンを生産するための発酵方法に関し、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する微生物を培養することを特徴とする。
【０００２】
【従来技術】
ミゾリビンはブレジニン（５−ヒドロキシ−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボキサミド）としても知られ、細胞毒性及び免疫抑制活性をもつ公知ヌクレオシド抗生物質であり、一般にＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍにより生産され（米国特許第３，８８８，８４３号）、３５０μｇ／ｍｌの力価を示すブロスを提供すると報告されている（Ｍｉｚｕｎｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｖｏｌ．ＸＸＶＩＩ，Ｎｏ．１０，ｐｐ．７７５−７８２，１９７４）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らの菌株コレクションでＧＮ−８３と命名し、１９９８年９月２４日付けでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託（受託番号ＤＳＭ１２６１５）したＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍの発酵を想定する微生物学的方法によりミゾリビンを製造できることが今般判明した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
生産生物はＡｕｒａｎｇａｂａｄ（インド）で採取した土壌サンプルから単離し、Ｊ．Ｉ．Ｐｉｔにより“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９７９に提案されている基準に従って分類した。
【０００５】
微生物、コロニー及び形態の特徴を以下に説明する。麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）上の増殖過程を２５℃で７日間インキュベーション後に評価した。
【０００６】
コロニーは４３ｍｍの平均直径をもち、均質で毛羽だったベルベット様の縁の白い表面をもち、４〜５ｍｍのクラウンを示し、中心は一様に黄色である。多くの場合に、白色菌糸体を含むセクターの出現と、白色セクターに存在する浸出液の不在が観察された。
【０００７】
コロニーの裏面はクリームイエローであり、セクターは暗色の着色を示す。拡散性色素は認められない。
【０００８】
１５日間インキュベーション後に培養基質ＭＥＡ上のみで分化した閉子器が成熟する。閉子器は球形を示し、１００〜２００μｍの寸法をもち、クリームイエローであり、均質な菌糸下層を形成する。
【０００９】
子嚢果に含まれる子嚢胞子は曲線状であり、３．０〜３．５μｍの寸法をもつ。子嚢胞子は明白な表面刻紋も溝も示さない。
【００１０】
Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍにおいて、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属するとみなされる非晶質生殖構造の分化はＭＥＡ基質上のみで１５日間培養後に開始する。
【００１１】
数的に少ない分生子柄は気中菌糸にそれ自体形成され、３０μｍを越える可変長をもつ柄を分化する。
【００１２】
箒状体は単層であり、分生子柄頭当たり少数（３〜６）の瓶様分生子をもつ。分生子の頂部の分生子連鎖は可変長をもつ。
【００１３】
コロニーが成熟するにつれて、分生子柄の数と分生子連鎖長はコロニーの所定のセクターで増加する傾向がある。コロニーが１カ月齢の場合にＭＥＡ上に分生子柄が存在すると、コロニーの所定領域は薄緑色がかる。分生子は球形であり、平滑な壁をもち、１．５〜２．５μｍの寸法をもつ。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明はミゾリビンを生産するための発酵方法を提供し、該方法は炭素と窒素の同化源を含む栄養液体培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ菌株の存在下に好気条件で発酵を実施することを特徴とする。本発明の方法は２３℃〜３３℃の温度で３〜７日間実施すると有利である。更に、付加無機粉末組成物の存在下に発酵を実施すると有利な場合がある。
【００１５】
更に、本発明は発酵ブロスから生産されるにつれてミゾリビンを精製及び／又は医薬的に許容可能なその組成物を製造する段階を含む。
【００１６】
発酵は２３℃〜３３℃、好ましくは２５℃〜２９℃の温度で３〜７日間、好ましくは４〜６日間液相で撹拌下に実施する。
【００１７】
菌株を予備培養した後、通気ファーメンターに接種して多量のミゾリビンを得ることが好ましい。
【００１８】
Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍの増殖に使用する培地は炭素、窒素及び好ましくは無機塩源から構成される。炭素源としては例えば澱粉、デキストロース、デキストリン、グルコース、フルクトース、グリセリン、サッカロース、マンニトール、マンノース等が挙げられ、窒素源としては例えば麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼインの酵素水解物、大豆粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉エキス、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン等が挙げられる。硝酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を使用しても良好な結果が得られる。生産に使用する無機塩は培地によって異なり、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、硫酸、塩化物、硝酸イオン等を提供する可溶性無機塩を使用することができる。このような塩としては、例えば第一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、第一硫酸カリウム、硝酸ナトリウムが挙げられる。炭酸カルシウムを加えても有用である。
【００１９】
発酵は種々の容量のファーメンターでフラスコ中で実施することができる。
【００２０】
分析方法
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ｂｅｃｋｍａｎクロマトグラフィー装置システム：
−１２６ポンプ、−１６８デテクター、−５０７ｅオートサンプラー。
【００２１】
注入ループの容量は５０μｌとした。５μｍ  ＬＩＣＨＲＯＳＯＲＢを充填したステンレス鋼カラム（１５ｃｍ×６．０ｍｍ内径）を室温で使用した。移動相は７０ｍＭ第一リン酸カリウム（ｐＨ２．５）−アセトニトリル（３０：７０）を流速１．０ｍｌ／分で流した。カラム流出液を２８０ｎｍで０．０５０の吸光度感度で監視した。
【００２２】
試料調製
遠心（３０００ｒｐｍで１０分間）後に、透明上清の適当に希釈した５０μｌアリコートをＨＰＬＣシステムに注入した。
【００２３】
定量
水中濃度１００μｇ／ｍｌのミゾリビンストック溶液を調製した。ミゾリビン標準溶液を使用し、２５〜１００μｇ／ｍｌの濃度で培養ブロス試料を試験した。
【００２４】
有機相を場合により乾燥し、同一溶剤又は混合溶剤（例えば、ブタノール／酢酸／水）に再懸濁し、濃縮後にミゾリビンを含む粗沈殿が得られる。
【００２５】
発酵後の粗生成物の精製は、例えば水と有機溶剤（例えばアセトン、酢酸、メタノール、ブタノール、クロロホルム）の混合物を溶離剤として使用するクロマトグラフィーカラムを使用して実施することができる。
【００２６】
実施例１
菌株増殖
以下の組成（ＭＥＡ：麦芽エキス寒天）：
麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ）                    ２０．０ｇ／ｌ
ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）                        １．０ｇ／ｌ
デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）          ２０．０ｇ／ｌ
寒天（Ｄｉｆｃｏ）                          ２０．０ｇ／ｌ
蒸留水                                  １０００ｍｌ
をもつ寒天傾斜培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
【００２７】
傾斜培地を２６℃で１５〜１８日間インキュベートした。
【００２８】
蒸留水５ｍｌで表面を掻き取ることにより増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
【００２９】
予備培養
上記菌株増殖により得られた懸濁液を予備培養液として振盪フラスコに接種した。
【００３０】
振盪フラスコ中の培地は以下の組成：
カゼインの酵素水解物（Ｄｉｆｃｏ）                ３ｇ／ｌ
コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）        １ｇ／ｌ
デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）              ２０ｇ／ｌ
蒸留水                                      １０００ｍｌ
とした。１２１℃で２０分間滅菌した。
【００３１】
各々２個のバッフルをもつ５００ｍｌ容フラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。フラスコを２５０ｒｐｍの回転振盪器で２６℃で２４時間インキュベートした。
【００３２】
３個のバッフルをもつ２リットル容フラスコに上記培地７５０ｍｌを入れ、第１回予備培養液の２％に等しい量を接種することにより第２回目の予備培養を実施した。
フラスコを２００ｒｐｍの回転振盪器で２６℃で約４８時間インキュベートした。
【００３３】
発酵
第２回予備培養液の約２％を使用し、以下の組成：
硫酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ）                      １０ｇ／ｌ
硝酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ）                      １０ｇ／ｌ
第一リン酸カリウム（Ｍｅｒｃｋ）                      ２ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム・７水和物（Ｍｅｒｃｋ）              ０．２ｇ／ｌ
コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）          ２０ｇ／ｌ
デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）                  ５０ｇ／ｌ
水道水                                          １０００ｍｌ
をもつ栄養培地１５リットルを入れたジャーファーメンターに接種した。
【００３４】
発酵材料を２６℃〜２８℃で１ｖ／ｖ／分の通気下に６００ｒｐｍで撹拌しながら９６時間好気条件でインキュベートした。
【００３５】
培養ブロス濾液でＨＰＬＣによりミゾリビンの生産を定期的に試験した。
【００３６】
４〜５日後に６００〜７００μｇ／ｍｌの最高力価が記録された。
【００３７】
実施例２
菌株増殖
以下の組成：
麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ）                    ２０．０ｇ／ｌ
第一リン酸カリウム                            １．０ｇ／ｌ
デキストロース（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）          ２０．０ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム・７水和物（Ｍｅｒｃｋ）      ０．２ｇ／ｌ
コーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）  ２０．０ｇ／ｌ
寒天（Ｄｉｆｃｏ）                          ２０．０ｇ／ｌ
蒸留水                                  １０００ｍｌ
をもつ寒天傾斜培地でＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ菌株を保存した。
【００３８】
傾斜培地を２６℃で１５〜２０日間インキュベートした。
【００３９】
蒸留水５ｍｌで表面を掻き取ることにより増殖細胞の約３分の１を除去し、胞子懸濁液を得た。
【００４０】
予備培養
以下の組成：
カゼインの酵素水解物                              ２ｇ／ｌ
大豆ペプトン                                      ５ｇ／ｌ
デキストロース                                  １０ｇ／ｌ
蒸留水                                      １０００ｍｌ
をもつ栄養培地を入れた振盪フラスコに、上記菌株増殖により得られた胞子懸濁液を接種した。１２１℃で２０分間滅菌した。
【００４１】
各々２個のバッフルをもつ５００ｍｌ容フラスコに上記培地１００ｍｌを分配した。
【００４２】
フラスコを２５０ｒｐｍの回転振盪器で２６℃で約４０時間インキュベートした。
【００４３】
実施例１と同様に第２回予備培養液を調製し、インキュベートした。
【００４４】
発酵
増殖後、以下の組成：
硫酸アンモニウム                                      ５ｇ／ｌ
硝酸ナトリウム                                      １０ｇ／ｌ
第一リン酸カリウム                                    ２ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム・７水和物                            ０．２ｇ／ｌ
大豆ペプトン                                        ２０ｇ／ｌ
サッカロース                                        ６０ｇ／ｌ
水道水                                          １０００ｍｌ
をもつ栄養培地を入れた１５リットル容ジャーファーメンターに予備培養液を接種した。
【００４５】
発酵材料を実施例１と同一条件でインキュベートし、ＨＰＬＣによりミゾリビンの生産を試験した処、４日後に７５０〜８００μｇ／ｍｌの力価を示した。
【００４６】
実施例３
抽出
ｐＨ５．６をもち、７００μｇ／ｍｌのミゾリビンを含む（実施例１から得られた）培養ブロス５０リットルをＷａｔｈｍａｎ（登録商標）濾紙で濾過し、透明濾液４０リットルを得た。
【００４７】
流速３３０ｍｌ／分でＸＡＤ  １１８０（ＲＯＨＭ  ＆  ＨＡＡＳ）８リットルを使用して濾液をカラム（φ１２ｃｍ）に通し、ブロスを脱色した後、４２０ｎｍの吸光度を読み取った。次に、樹脂を上記と同一流速で水２０リットルで洗浄した。得られた脱色液（ｐＨ＝５．８）６０リットルに２０％ＮａＯＨを加えてｐＨ＝９．０に調整した。液体を流速５００ｍｌ／分で３０リットルＲｅｌｉｔｅ  ２ＡＳ（ＲＥＳＩＮＤＩＯＮ  Ｓ．Ｒ．Ｌ．）（ＯＨ−形態）カラム（φ２０ｃｍ）に通し、ミゾリビンを吸着させた。
【００４８】
樹脂を脱イオン水１２０リットルで洗浄した後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを集めた。
【００４９】
ＨＰＬＣ試験で活性であったフラクションを集め、減圧濃縮し、油状残渣２２０ｇを得た。
【００５０】
この残渣をメタノール４００ｍｌ及びアセトン１リットルと混合し、４℃で５時間放置して沈殿させた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥し、粗ミゾリビン１５０ｇを得た（純度１５％）。得られた粉末をブタノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラム（φ７ｃｍ）で精製した。
【００５１】
５００ｍｌフラクションを集め、油状残渣（純度４４％）３３ｇが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した後、メタノール３０ｍｌに再懸濁し、アセトン９０ｍｌで沈殿させた。
【００５２】
沈殿を減圧下にアセトンで洗浄して得られた灰色粉末２８ｇをメタノールに懸濁し、クロロホルム：メタノール：酢酸（３０：１：１）混合溶剤を充填した１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）に通し、１：７：７混合物が得られるまで勾配溶離した。５００ｍｌフラクションを集め、最高濃度フラクションを減圧濃縮し、油状残渣（純度８５％）１４．５ｇを得、等容量のアセトンを加え、一晩５℃で放置した。無色ミゾリビン結晶が得られた（１１ｇ）。
【００５３】
実施例４
抽出
ミゾリビン７００μｇ／ｍｌを含む（実施例１から得られたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットルをＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ  ＥＵＲＯＰＥ  ＳＵＤ）で減圧濾過した。
【００５４】
透明濾液４０リットルに２０％Ｈ２ＳＯ４を加えてｐＨ４．５に調整した後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０リットルを充填した５リットルＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷカラム（φ１２ｃｍ）に通した。濾液を流速８３ｍｌ／分で吸着させた後、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５リットルで洗浄し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５リットルを更に０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５リットル及び０．５Ｍ  ＮａＣｌと混合して勾配溶離した。
【００５５】
１リットルフラクションを集め、最高濃度フラクションを減圧濃縮し、灰色粉末（純度５５％）４５ｇを得た。
【００５６】
粉末をメタノールに懸濁し、クロロホルム／メタノール／酢酸（１：７：７）の混合溶剤を充填した１リットルシリカゲル６０カラム（φ４ｃｍ）で精製した。
【００５７】
５００ｍｌフラクションを集め、ミゾリビンの無色結晶（純度９７％）１８ｇが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した。
【００５８】
実施例５
抽出
ミゾリビン７００μｇ／ｍｌを含む（実施例１から得られたままの）培養ブロス（ｐＨ＝５．６）５０リットルをＤｉｃａｌｉｔｅ（ＤＩＣＡＬＩＴＥ  ＥＵＲＯＰＥ  ＳＵＤ）で減圧濾過した。
【００５９】
透明濾液４０リットルをスルホンポリエーテル膜で限外濾過精製した。２０％ＮａＯＨを加えて液体をｐＨ＝９．０に調整した。
【００６０】
液体を５００ｍｌ／分で３０リットルＲｅｌｉｔｅ（ＲＥＳＩＮＤＩＯＮ  Ｓ．Ｒ．Ｌ）に通し、ミゾリビンを吸着させた。
【００６１】
樹脂を脱イオン水１２０リットルで洗浄した後、２％酢酸で溶離し、１０リットルフラクションを集めた。
【００６２】
ＨＰＬＣ試験で活性であったフラクションを集め、減圧濃縮し、油状物１５０ｇを得た。
【００６３】
この残渣をメタノール１５０ｍｌ及びアセトン３００ｍｌと混合し、５時間４℃で放置して沈殿させた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥すると、粗ミゾリビン１１０ｇ（純度２０％）が得られた。得られた粉末をブタノール：酢酸：水（１０：１：２）混合溶剤に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル６０カラム（φ７ｃｍ）で精製した。
【００６４】
５００ｍｌフラクションを集め、油状残渣（純度５５％）３０ｇが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した後、メタノール１０ｍｌに再懸濁し、最後にアセトン３０ｍｌで沈殿させた。
【００６５】
沈殿をアセトンで減圧洗浄し、一晩減圧放置した。
【００６６】
無色ミゾリビン結晶が得られた（１３ｇ）。