(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）血液学的試料に、
以下の、互いに区別可能な蛍光を発する蛍光色素で標識された蛍光標識抗体；
(a)白血球細胞に特異的に結合する第一の蛍光標識抗体、
(b)好中球系細胞の成熟段階に応じて細胞表面において密度が変化する抗原を認識して結合する第二の蛍光標識抗体及び
(c)幼若顆粒球系細胞の成熟段階に応じて細胞表面において密度が変化する抗原を認識して結合する第三の蛍光標識抗体、
を添加して白血球細胞を蛍光染色し、血液学的試料中の赤血球を除去し、
(２)得られた血液学的試料をフローサイトメータに供して、少なくとも１つの散乱光と３つの蛍光を測定し、
(３)散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団を特定し、
(４)特定された顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第二の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて好中球系細胞集団を特定し、
(５)特定された好中球系細胞集団について、第二の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて成熟度の異なる幼若顆粒球を分類計数することからなる白血球の分類計数方法。
【請求項２】
工程(３)において、散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団に加えて全白血球集団を特定し、かつ計数し、工程(５)で計数された成熟度の異なる各幼若顆粒球の全白血球に占める比率を算出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一の蛍光標識抗体が、抗CD45抗体である請求項１記載の方法。
【請求項４】
測定する散乱光が、側方散乱光である請求項１記載の方法。
【請求項５】
蛍光色素が、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、テキサスレッド、PE-CY5、ペリジンクロロフィルプロテイン(PerCP)からなる群から選択される色素である請求項１記載の方法。
【請求項６】
第一蛍光標識抗体、第二の蛍光標識抗体及び第三の蛍光標識抗体における区別可能な蛍光を発する蛍光色素が、FITC、PE及びPE-CY5の組み合わせ又はFITC、PE及びPerCPの組み合わせである請求項４記載の方法。
【請求項７】
血液学的試料が、哺乳動物の末梢血液、骨髄液、尿又はアフェレーシス等で採取した試料のいずれかである請求項１記載の方法。
【請求項８】
工程（１）において、血液学的試料中の赤血球を除去した後に、白血球を蛍光染色する請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白血球の分類計数方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリーを用いて成熟度の異なる幼若顆粒球(immature granulocyte)を分類計数しうる白血球の分類計数方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
臨床検査の分野において、成熟度の異なる顆粒球を分類計数をすることは、疾患の診断及び疾患の経過の観察を行う上で極めて有用な情報を得ることができるため有利である。
例えば、通常、幼若顆粒球は、骨髄中に存在し、末梢血液中に存在しないため、末梢血中に幼若顆粒球が出現すれば、その患者は、感染症、炎症性疾患、慢性又は急性骨髄球性白血病、その他の悪性腫瘍等の疾患である可能性を示している。従って、成熟度の異なる各顆粒球を分類計数することは、これらの疾患の診断及び経過観察の観察に非常に有用である。
【０００３】
従来、幼若顆粒球の分類計数を行うには血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら、細胞を、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球の各成熟度ごとに分類し、計数する方法が一般的であった。しかし、この方法では、観察のための煩雑な前処理が必要となるとともに、細胞計数数が少ないために精度が悪く、さらに、正確な分類を行うためには観察技師のかなりの熟練が必要となる。
【０００４】
一方、様々な成熟段階の血液細胞が含まれている骨髄液中の血液成分の分析については、フローサイトメトリの原理を応用した種々の方法が提案されている。例えば、白血球を特定するための第一抗体と白血球をサブポピュレーションに分けるための第二抗体とを使用して、骨髄液細胞の異なる細胞系列と成熟段階を特定する方法が提案されている（米国特許5,137,809号）。しかし、この方法は、第二抗体というただひとつのパラメータにより成熟段階を特定するため、顕微鏡観察のように、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類することができないという問題があった。
【０００５】
また、Bowenらは、骨髄中の顆粒球系細胞の成熟度が、CD16とCD11bとの発現強度に反映されることを発表している（Abnormal patterns of expression of CD16 (FcRgIII) and CD11b (CRIII) antigens by developing neutrophils in the bone marrow of patients with myelodysplastic syndrome（Laboratory Hematology.，Vol. 3，No. 4，292〜298，1997）。この方法によれば、まず、顆粒球系細胞をCD45とSSC（側方散乱光：Side Scatter）とで特定し、その顆粒球系細胞におけるCD16とCD11bとの発現強度を調べることにより、成熟段階を推定することができる。しかし、この方法では、成熟好酸球と幼若顆粒球とを区別することができず、測定結果の信頼性は低くなる。つまり、成熟好酸球は、幼若顆粒球と同様にCD16陰性、CD11b陰性のため、両者を分離することができない。
【０００６】
一方、末梢血サンプル中の白血球成分分析に関しても種々の方法が提案されている。
例えば、非イオン性界面活性剤とアミノ酸とを含む試薬により成熟した白血球を溶血させることによって、幼若顆粒球を測定する方法が提案されている（米国特許5,413,938号）。しかし、この方法では、幼若顆粒球以外の白血球は全て溶血してしまうため、全体の白血球が特定できず、したがって、この方法単独では、白血球に対する幼若顆粒球の分類比率を算出することができない。
【０００７】
また、Hublらは、CD16の発現に基づいた幼若な好中球の検出方法に関して報告している（Value of neutrophil CD16 expression for detection of left shift and acute-phase response（Am. J. Clin. Pathol.， 107(2):187-196，Feb.1997)。しかし、この方法も、幼若顆粒球を成熟度に応じて分類する方法については記載されていない。
このような現状から、末梢血中の幼若顆粒球を他の白血球細胞の影響を受けないように精度よく計数し、かつ幼若顆粒球を成熟度によって分類するための方法が要求されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、（１）血液学的試料に、
以下の、互いに区別可能な蛍光を発する蛍光色素で標識された蛍光標識抗体；
(a)白血球細胞に特異的に結合する第一の蛍光標識抗体、
(b)好中球系細胞の成熟段階に応じて細胞表面において密度が変化する抗原を認識して結合する第二の蛍光標識抗体及び
(c)幼若顆粒球系細胞の成熟段階に応じて細胞表面において密度が変化する抗原を認識して結合する第三の蛍光標識抗体、
を添加して白血球細胞を蛍光染色し、血液学的試料中の赤血球を除去し、
(２)得られた血液学的試料をフローサイトメータに供して、少なくとも１つの散乱光と３つの蛍光を測定し、
(３)散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団を特定し、
(４)特定された顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第二の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて好中球系細胞集団を特定し、
(５)特定された好中球系細胞集団について、第二の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて成熟度の異なる幼若顆粒球を分類計数することからなる白血球の分類計数方法が提供される。
【０００９】
【発明実施の形態】
本発明において、工程(1)で用いる血液学的試料とは、哺乳動物、ことにヒトの末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシス（apheresis)等で採取した試料などの体液試料を意味する。これらの血液学的試料は、採取した試料をそのまま本発明の工程に付してもよいし、例えば、適量のへパリンを添加したものを本発明の工程に付してもよい。
【００１０】
白血球細胞に特異的に結合する第一の蛍光標識抗体の抗体は、白血球を構成する各種細胞、つまり、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等に特異的に結合する抗体であれば特に限定されるものではなく、例えば、抗CD45抗体などが挙げられる。この抗体は、一般に市販されているものを使用することができる。
【００１１】
好中球系細胞と結合する第二の蛍光標識抗体の抗体は、成熟段階に応じて細胞表面において密度が変化する抗原を認識して、好中球系細胞と結合することができる抗体であり、例えば、前骨髄球(promyelocyte)、骨髄球(myelocyte)、後骨髄球(metamyelocyte)、杆状核球（band form）、分節核球（segmented form）等の１種又は２種以上に結合する抗体であれば特に限定されるものではない。具体的には、抗CD11b抗体、抗CD16抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙げられる。また、この抗体は、上記抗原に結合する限り、他の細胞、例えば、単球、好酸球、リンパ球等に結合するものであってもよい。これらの抗体は、一般に市販されているものを使用することができる。
【００１２】
幼若顆粒球系細胞と結合する第三の蛍光標識抗体は、成熟段階に応じて顆粒球の表面において密度が変化する抗原を認識して、幼若顆粒球系細胞と結合することができる抗体であり、例えば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球等の１種又は２種以上に結合する抗体であれば特に限定されるものではない。具体的には、抗CD11b抗体、抗CD16抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体等が挙げられる。ただし、第二の蛍光標識抗体における抗体とは異なる抗体であることを要する。また、この抗体は、上記抗原に結合する限り、他の細胞、例えば、単球、好酸球、リンパ球等に結合するものであってもよい。
【００１３】
本発明においては、第二と第三の蛍光標識抗体における抗体は、例えば、
抗CD16抗体と抗CD11b抗体、抗CD16抗体と抗CD66b抗体、抗CD16抗体と抗CD66c抗体、抗CD11b抗体と抗CD66b抗体又は抗CD11b抗体と抗CD66c抗体のいずれかの組み合わせが挙げられる。なかでも、抗CD16抗体と抗CD11b抗体の組み合わせが好ましい。
【００１４】
上記抗体を蛍光標識抗体とするための蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate:FITC)、フィコエリスリン(phicoerythrin:PE)、アロフィコシアニン(allophicocyanin：APC)、テキサスレッド(Texas Red)、PE-CY5、ペリジンクロロフィルプロテイン(Peridinin Chlorophyll Protein :PerCP)などによる標識化合物が挙げられる。本発明で使用する3つの抗体に結合させる蛍光標識化合物は、互いに異なるスペクトルを有していることが必要である。例えば、FITC、PE及びPE-CY5の組み合わせ、FITC、PE及びPerCPの組み合わせなどが挙げられる。
【００１５】
血液学的試料に蛍光標識抗体を添加する際の混合比は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識抗体の種類等により適宜調整することができるが、血液学的試料と各蛍光標識抗体とが容量比で、例えば、20：1〜2:1程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間は、血液学的試料と各蛍光標識抗体との混合比などにより適宜調整することができるが、例えば、室温で15〜30分間、０〜１０℃で30〜40分程度が好ましい。血液学的試料に各蛍光標識抗体を添加する方法としては、血液学的試料に、第一抗体、第二抗体、第三抗体を順次添加してもよいし、任意の順序で添加してもよい。また、各抗体を別途混合し、この混合物を血液学的試料に添加してもよい。
【００１６】
また、血液学的試料において、赤血球を除去する。赤血球の除去は、後工程のフローサイトメトリにおいて、白血球の測定の障害となる赤血球の影響を排除することを目的として行うものである。赤血球を除去する方法としては、得られた血液学的試料をデキストラン溶液により処理し、赤血球を沈降させる方法、Ficoll-Hypaqueのような比重液により処理し、白血球と赤血球を分離する方法、赤血球に傷害を与えるような試薬を用いて処理し、赤血球を溶血する方法などが挙げられる。なかでも、例えば、得られた血液学的試料を塩化アンモニウムをベースとした溶血剤によって処理し、赤血球を溶血する方法が、簡便性と白血球の流出が少ないことから、好ましい。
なお、本発明では、後述する工程（３）〜工程（６）を行うために支障が生じない限り、工程（１）において、血液学的試料の白血球を蛍光染色した後に、赤血球を除去してもよいし、赤血球を除去した後、白血球の蛍光染色をしてもよいし、第一から第三の蛍光標識抗体を添加する各サブ工程の間に赤血球を除去してもよい。
【００１７】
工程(２)において使用するフローサイトメータは、一般に市販されているものであれば、特に限定されるものではなくどのようなものでも使用することができる。このようなフローサイトメータにより、上記で得られた血液学的試料について、少なくとも1つの散乱光信号と３つの蛍光信号を測定する。
一般的にフローサイトメータで測定することのできる散乱光は前方散乱光(Forward Scatter : FSC)、側方散乱光(Side Scatter: SSC)が挙げられるが、本発明では、細胞の大きさと、細胞中に存在する顆粒に応じて信号強度を増す側方散乱光が好ましい。蛍光は、使用する蛍光標識抗体の標識化合物の種類により異なるが、例えば、緑蛍光、オレンジ蛍光、赤蛍光の組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
工程(３)〜(５)において、少なくとも1つの散乱光信号と3つの蛍光信号から、成熟度の異なる幼若顆粒球を分類計数することができる。
まず、工程(３)において、散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とに基づいて顆粒球系細胞集団（幼若顆粒球、成熟好中球及び好酸球）を特定する。具体的には、散乱光強度と第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを測定し、両強度を２軸とする２次元分布（例えば、スキャッタグラム）を得る。これにより、幼若顆粒球を含む顆粒球集団を、単球、リンパ球、好塩基球及び、試料中に残存する赤血球又は溶血処理によって発生した赤血球破砕物（デブリス）から分離することができる（図２参照）。
なお、この際得られる２次元分布においては、上述したように、幼若顆粒球を含む顆粒球集団のほかに、単球、リンパ球、好塩基球及びデブリスをそれぞれ特定することができるため、顆粒球集団、単球、リンパ球及び好塩基球を含む集団を特定し、計数することにより、全白血球数を計数することができる（図１参照）。
【００１９】
次いで、工程(４)において、特定された顆粒球系細胞集団について、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを測定することにより、好中球系細胞（成熟好中球及び幼若顆粒球）を特定する。これには、好酸球の有する抗原密度の特異性を利用することができる。例えば、第一抗体に抗CD45抗体、第二又は第三抗体に抗CD16抗体を用いた場合、成熟好中球は抗CD16抗体に陽性であり、好酸球と幼若顆粒球とは抗CD16抗体に陰性であり、また、好酸球の抗CD45抗体の抗原密度は幼若顆粒球よりも高い。よって、第一の蛍光標識抗体からの蛍光強度と、第二又は第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度とを２軸とする２次元分布を得ることにより、好中球系細胞は好酸球と容易に分離することができる（図３参照）。
【００２０】
さらに、工程(５)において、特定された好中球系細胞集団（成熟好中球及び幼若顆粒球）について、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を測定することにより、幼若顆粒球を特定し、さらに、この幼若顆粒球を成熟度に応じて分類する。この目的に用いる第二抗体と第三抗体は、対応する抗原の発現が、好中球系細胞の成熟過程に応じて変化するものを選択することができるが、成熟度による分類を効果的に行うためには、両者の発現時期が異なっているものが好ましい。このためには、例えば、第二及び第三抗体として、抗CD16抗体と抗CD11b抗体との組み合わせが挙げられる。つまり、好中球系細胞の成熟過程において、好中球系細胞の表面の抗原CD11bとCD16とはともに成熟するに従って発現するが、CD11bはCD16よりも発現時期が早い。よって、第二抗体に抗CD16抗体、第三抗体に抗CD11b抗体を用い、第二及び第三の蛍光標識抗体からの蛍光強度を２軸とする２次元分布を得ることにより、第二抗体の蛍光強度の差から幼若顆粒球を成熟好中球と分離することができ（図４参照）、さらに、第三の蛍光標識抗体の蛍光強度の差から成熟度の異なる幼若顆粒球に分類することができる（図５参照）。
【００２１】
なお、ここで成熟度の異なる幼若顆粒球に分類するとは、たとえば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球等を少なくとも２つの幼若顆粒球グループに分類計数することをいう。
このように分類計数された全幼若顆粒球及び成熟度の異なる各幼若顆粒球は、工程（３）において得られる全白血球の細胞数で除算することにより、全白血球に対する細胞比率を求めることができる。
【００２２】
以下に本発明の幼若顆粒球の分類計数方法の実施例を具体的に説明する。
実施例1
まず、以下の組成の試薬を調製した。
（１）蛍光標識抗体
・PerCP標識抗CD45抗体（Becton  Dickinson社製、Anti-Hle-1，赤蛍光を有する第一抗体）
・FITC蛍光標識抗CD16抗体（Becton  Dickinson社製、Leu-11b，緑蛍光を有する第二抗体）
・PE標識抗CD11b抗体（Becton  Dickinson社製、Leu-15，オレンジ蛍光を有する第三抗体）
（２）塩化アンモニウムをベースとした溶血剤
・塩化アンモニウム(NH4Cl) 8.26g/L
・炭酸水素カリウム(KHCO3) 1.0g/L
・EDTA-4Na 0.037g/L
・精製水
【００２３】
まず、ヘパリンを添加することにより抗凝固剤処理した末梢血液100μLにFITC標識抗CD16抗体、PE標識抗CD11b抗体、PerCP標識抗CD45抗体をそれぞれ10μL加え、室温で約３０分間インキュベーションし、白血球を蛍光染色した。
その後、塩化アンモニウムをベースとした溶血剤を2mL加え、室温で５分間インキュベーションすることにより、白血球の測定の障害となる赤血球を除去するために、赤血球を溶血させた。
【００２４】
得られた血液学的試料について、光源として488nmのアルゴンイオンレーザを装備したフローサイトメータで、側方散乱光及び530nm（緑）、585nm（オレンジ）、650nm（赤）の波長の蛍光を測定した。
側方散乱光強度及び赤蛍光強度を座標軸とする個々の細胞の分布を描いたスキャッタグラムを図６に示す。図６では顆粒球、単球、リンパ球、好塩基球、デブリスの５集団が認められた。解析は、図７に示したように、白血球全体をウィンドウ(W1)によって囲み、白血球全体の数を計数した。
さらに同一のスキャッタグラム中で顆粒球をウィンドウ（W2）によって囲んだ（図７）。
【００２５】
また、緑蛍光強度及び赤蛍光強度を座標軸とし、ウィンドウ(W2)内の細胞のみの細胞分布を描いたスキャッタグラムを図８に示す。図８には好酸球、幼若顆粒球、成熟好中球の３集団が認められた。解析は、図８に示したように、好中球系細胞（幼若顆粒球及び成熟好中球）をウィンドウ（W3）によって囲んだ。
さらに、緑蛍光強度及びオレンジ蛍光強度を座標軸とし、ウィンドウ（W3）内の細胞のみの細胞分布を描いたスキャッタグラムを図９示す。図９には幼若顆粒球ステージI、幼若顆粒球ステージII、成熟好中球の３集団が認められた。解析は図９に示したように、２つの幼若顆粒球をウィンドウ（W4）で囲み、全幼若顆粒球数を計数した。
【００２６】
次に、全幼若顆粒球数を、上記で求めた全白血球で除算することにより、白血球数に対する幼若顆粒球比率を求めた。
なお、実施例1とは別に、実施例1と同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワルド-ギムザ染色、800カウント）により、幼若顆粒球を分類計数した。
本実施例１のフローサイトメータで測定した幼若顆粒球比率と用手法で測定した幼若顆粒球比率との相関図を図１０に示す。
図１０に示すように、相関係数ｒ2は0.87となり、実施例1の方法が幼若顆粒球の分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【００２７】
実施例２
実施例1と同様の方法により末梢血液を用い幼若顆粒球の測定を行った。解析は図１１に示したように２つの幼若顆粒球集団を個々のウィンドウ（W5,W6）で囲み、幼若顆粒球ステージI及び幼若顆粒球ステージIIの細胞数を計数して、白血球に対する細胞比率を求めた。
また、実施例２とは別に、実施例２と同様の血液学的試料を用いて、用手法（メイグリュンワルド-ギムザ染色）により各幼若顆粒球の測定を行った。なお、用手法における幼若顆粒球ステージIは前骨髄球及び骨髄球、幼若顆粒球ステージIIは後骨髄球に対応する。
幼若顆粒球ステージIでは図１２に示すように、相関係数r2は0.87となった。また、幼若顆粒球ステージIIでは図１３に示すように相関係数r2は0.80となった。これらのことから、実施例２の方法が幼若顆粒球の各ステージにおける分類計数について非常に精度が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の白血球の分類計数方法における血液学的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図２】  本発明の白血球の分類計数方法における血液学的試料の側方散乱光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図３】  本発明の白血球の分類計数方法における血液学的試料の第一抗体の蛍光強度と第二抗体の蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図４】  本発明の白血球の分類計数方法における血液学的試料の第三抗体の蛍光強度と第二抗体の蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図５】  本発明の白血球の分類計数方法における血液学的試料の第三抗体の蛍光強度と第一抗体の蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図６】  本発明の白血球の分類計数方法における実施例１の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図７】  本発明の白血球の分類計数方法における実施例1の血液学的試料の側方散乱光強度と赤蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図８】  本発明の白血球の分類計数方法における実施例１の血液学的試料の赤蛍光強度と緑蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図９】  本発明の白血球の分類計数方法における実施例1の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図１０】  本発明の白血球の分類計数方法と用手法とによる幼若顆粒球比率の相関関係を示す図である。
【図１１】  本発明の白血球の分類計数方法における実施例２の血液学的試料のオレンジ蛍光強度と緑蛍光強度とのスキャッタグラムである。
【図１２】  本発明の白血球の分類計数方法と用手法とによる幼若顆粒球比率（ステージI）の相関関係を示す図である。
【図１３】  本発明の白血球の分類計数方法と用手法とによる幼若顆粒球比率（ステージII）の相関関係を示す図である。
【図１】
0004435948.tif 000002
【図２】
0004435948.tif 000003
【図３】
0004435948.tif 000004
【図４】
0004435948.tif 000005
【図５】
0004435948.tif 000006
【図６】
0004435948.tif 000007
【図７】
0004435948.tif 000008
【図８】
0004435948.tif 000009
【図９】
0004435948.tif 000010
【図１０】
0004435948.tif 000011
【図１１】
0004435948.tif 000012
【図１２】
0004435948.tif 000013
【図１３】
0004435948.tif 000014