(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え生物からのグリセロール産生方法であって、
（ｉ）適当な宿主細胞を、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットおよび（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットで形質転換することであって、
（１）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性遺伝子および
（２）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性遺伝子のいずれか一方または両方に破壊を有する、ここで該破壊は活性遺伝子産物の発現を妨げる、該適当な宿主細胞を形質転換することと、
（ｉｉ）単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源の存在下で（ｉ）の形質転換された宿主細胞を培養し、それによってグリセロールを産生することと、
（ｉｉｉ）任意選択で、（ｉｉ）で産生したグリセロールを回収することと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が内因性グリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子に破壊を含み、該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子に破壊を含み、該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞がａ）内因性グリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子における破壊と、ｂ）内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子における破壊とを含み、それぞれの遺伝子における該破壊がどちらか一方の遺伝子からの活性遺伝子産物の発現を妨げることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記適当な宿主細胞が細菌、酵母、および糸状菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記適当な宿主細胞が、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スヒゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記適当な宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記炭素源がグルコースであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列であって酵素の機能特性を変えるものではないアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでいてもよい該アミノ酸配列に対応することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列であって酵素の機能特性を変えるものではないアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでいてもよい該アミノ酸配列に対応することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｃ）内因性グリセロールキナーゼをコードする遺伝子における破壊と、（ｄ）内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換された宿主細胞であって、（ｃ）および（ｄ）の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げ、該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質から選択される少なくとも１つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とする、形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｃ）内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換された宿主細胞であって、（ｃ）の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げ、該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質から選択される少なくとも１つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とする、形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、（ｃ）内因性グリセロールキナーゼをコードする遺伝子における破壊と、を含む形質転換された宿主細胞であって、（ｃ）の遺伝子における該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げ、該宿主細胞が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質から選択される少なくとも１つの炭素源をグリセロールに変換することを特徴とする、形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野、ならびにグリセロールおよびグリセロール生合成経路から誘導される化合物を産生するための組換え生物の使用に関する。より具体的には、本発明は、グリセロールおよび炭素基質から誘導される化合物を産生するための組換え細胞の構築について記載するもので、前記細胞は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）およびグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）活性を有するタンパク質をコードする外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝子を含み、グリセロールを変換するグリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性をコードする内因性遺伝子は欠失している。
【０００２】
（背景）
グリセロールは、化粧品、液体石鹸、食品、医薬、潤滑油、不凍液、およびその他の数多くの応用分野で使用される工業的に極めて重要な化合物である。グリセロールのエステルは、油脂工業において重要である。歴史的に見ると、グリセロールは、動物脂肪および類似の原料から単離されてきたが、その方法は労力を要し、非能率的である。グリセロールの微生物産生が好ましい。
【０００３】
全ての生物がグリセロールを合成する本来的な能力を有しているわけではない。しかし、グリセロールの生物学的産生は、細菌、藻類、および酵母の種でいくつか知られている。バシルス・リシェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびラクトバシルス・リコペルシカ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃａ）といった細菌はグリセロールを合成する。グリセロール産生は、耐塩性藻類であるダナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属およびアステロモナス・グラシリス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）において、外部の高塩濃度に対する防御として見いだされる（Ｂｅｎ−Ａｍｏｔｚ他、Ｅｘｐｒｉｅｎｔｉａ、３８巻、４９〜５２ページ、１９８２年）。同様に、種々の耐浸透圧性（ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）酵母は、防御手段としてグリセロールを合成する。ほとんどのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株は、アルコール発酵の間にいくらかのグリセロールを産生し、浸透圧を与えることによってこの産生を増加させることができる（Ａｌｂｅｒｔｙｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４巻、４１３５〜４１４４ページ、１９９４年）。今世紀の初頭には、グリセロールは、亜硫酸塩またはアルカリなどのステアリング（ｓｔｅｅｒｉｎｇ）試薬を加えたサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）培養で商業的に製造されていた。不活性複合体の形成を介して、ステアリング試薬は、アセトアルデヒドからエタノールへの変換を遮断または阻害する。それによって、過剰の還元性等価体（ＮＡＤＨ）は、グリセロールを産生するための還元用に、ジヒドロキシアセトンリン酸エステル（ＤＨＡＰ）に利用されるか、あるいはＤＨＰＡに「ステアリング」する。この方法は、亜硫酸塩による酵母増殖の部分的阻害によって制限される。この制限は、異なる機構によって過剰のＮＡＤＨ等価体を生成するアルカリの使用により部分的に克服することができる。実際、アルカリは、Ｃａｎｎｉｚａｒｒｏ不均化反応を起こし、２当量のアセトアルデヒドからエタノールおよび酢酸を生成する。したがって、グリセロールの産生は、天然に存在する生物から可能であるが、培地の浸透圧ストレスおよび亜硫酸塩の生成を制御する必要に制約されることが多い。これらの制限のない方法が望まれる。グリセロール生合成経路における重要なステップをコードする外来遺伝子を含む組換え生物によるグリセロールの産生は、このような方法への１つの可能な経路である。
【０００４】
グリセロール生合成経路に関与するいくつかの遺伝子が単離されてきた。例えば、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）からグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＲ１、ＧＰＤ１）をコードする遺伝子がクローン化され（ｃｌｏｎｅｄ）、配列決定された（Ｗａｎｇ他、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７６巻、７０９１〜７０９５ページ、１９９４年）。ＤＡＲ１遺伝子は、シャトルベクターにクローン化され、該遺伝子を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換させて発現により活性酵素を産生した。Ｗａｎｇ他（同上）は、ＤＡＲ１が細胞の浸透圧環境によって調節されることを明らかにしているが、遺伝子をどのように使用すれば組換え生物におけるグリセロール産生を促進できるかは示唆していない。
【０００５】
他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離されている。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からｓｎ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがクローン化され、配列決定された（Ｌａｒａｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０巻、１１０１ページ、１９９３年）。Ａｌｂｅｒｔｙｎ他（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４巻、４１３５ページ、１９９４年）は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローン化について教示している。Ｗａｎｇ他と同様、Ａｌｂｅｒｔｙｎ他およびＬａｒａｓｏｎ他はいずれも、この遺伝子調節の浸透圧感受性を明らかにしているが、組換え生物におけるグリセロール産生にこの遺伝子をどのように使用するかは示唆していない。
【０００６】
Ｇ３ＰＤＨについても同様に、グリセロール−３−ホスファターゼがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離され、このタンパク質がＧＰＰ１およびＧＰＰ２遺伝子によってコードされていることが確認された（Ｎｏｒｂｅｃｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１３８７５ページ、１９９６年）。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子と同様、ＧＰＰ２は浸透圧により誘導されるようである。
【０００７】
Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子が単離されたが、当技術分野では、Ｇ３ＰＤＨ／Ｇ３Ｐホスファターゼが一緒にあるいは別々に発現する組換え生物からのグリセロール産生を証明する教示はない。さらに、細胞に対してあるストレス（塩またはオスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ））を加える必要のないこれら２つの酵素活性を用いて、任意の野生型生物から効率的にグリセロールを産生できるという教示もない。実際、当技術分野は、Ｇ３ＰＤＨ活性がグリセロール産生に影響を与えないことを示唆している。例えば、Ｅｕｓｔａｃｅ（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３巻、１１２〜１１７ページ、１９８７年）は、親菌株よりも多くのグリセロールを産生したハイブリダイズした酵母を教示している。しかしながら、Ｅｕｓｔａｃｅは、ハイブリダイズした株では、野生型に比べて、Ｇ３ＰＤＨ活性は一定のままか、わずかに低いことも明らかにしている。
【０００８】
グリセロールは、工業的に有用な材料である。しかし、商業的に重要性のあるその他の化合物も、グリセロール生合成経路から誘導することができる。例えば、グリセロール産生生物を設計し、ポリエステル繊維の製造およびポリウレタンおよび環状化合物の製造に潜在的有用性を有するモノマーである１，３−プロパンジオール（米国５６８６２７６）を産生することができる。例えば、いくつかの生物において、デヒドラターゼ酵素およびオキシドレダクターゼ酵素の作用により、グリセロールがそれぞれ、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、次いで１，３−プロパンジオールに変換することが知られている。１，３−プロパンジオールを産生することができる細菌株は、例えば、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群に見いだされている。グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼ系はそれぞれ、Ｓｅｙｆｒｉｅｄ他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、５７９３〜５７９６ページ、１９９６年）およびＴｏｂｉｍａｔｓｕ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻、７１４２〜７１４８ページ、１９９５年）によって述べられている。外因性デヒドラターゼ酵素を含む１，３−プロパンジオールを産生することができる組換え生物についても述べられている（米国５６８６２７６）。これらの生物は１，３−プロパンジオールを産生するが、グリセロール変換を最小限に抑えると考えられる系から恩恵を受けることは明らかであろう。
【０００９】
グリセロールの変換を最小限に抑えた、１，３−プロパンジオールを産生するためのグリセロール産生生物を設計することにはいくつかの利点がある。生理学的条件下でグリセロールを効率よく産生することができる微生物が工業的には望ましく、特に、浸透圧ストレスによりまたはステアリング試薬の添加によって撹乱され得るようなより複雑な異化経路または生合成経路の一部として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて基質として、グリセロール自体を使用する場合（例えば、１，３−プロパンジオールの産生）である。グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ変異体を作成するいくつかの試みが行われている。例えば、Ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ他（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻、６９３〜６９８ページ、１９９０年）は、ジヒドロキシアセトンキナーゼおよびグリセロールキナーゼが遮断されたメチロトローフ酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の突然変異体によるジヒドロキシアセトンのメタノール依存性産生を報告している。同化反応の補助基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるキシルロース−５−リン酸を補充するために必要なメタノールと別の基質を用いてグリセロールを産生させているが、ジヒドロキシアセトンレダクターゼ（グリセロールデヒドロゲナーゼ）も必要である。同様に、ＳｈａｗおよびＣａｍｅｒｏｎ（Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、２１１ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、ＬＡ、３月、２４〜２８ページ、１９９６年、ＢＩＯＴ−１５４  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）は、１，３−プロパンジオール産生を最適にするために、ｌｄｈＡ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ｇｌｐＫ（グリセロールキナーゼ）、およびｔｐｉＡ（トリオースリン酸イソメラーゼ）の欠失を検討している。彼らは、グリセロールまたは１，３−プロパンジオールの産生に関してＧ３ＰＤＨまたはＧ３Ｐホスファターゼに対するクローン化遺伝子の発現を示唆しておらず、グリセロールデヒドロゲナーゼの影響についても考察していない。
【００１０】
したがって、解決すべき問題は、ある種の酵素活性、特に、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への、次いでグリセロールへの変換をそれぞれ触媒するＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ活性の付加または促進により、グリセロール産生に炭素の流れを向かわせる方法が欠如していることである。この問題は、ある種の酵素活性、特に、グリセロールおよびＡＴＰからＧ３Ｐへの変換、およびグリセロールからジヒドロキシアセトン（またはグリセルアルデヒド）への変換をそれぞれ触媒するグリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの欠失または減少により、炭素の流れをグリセロールからそらすように制御する必要があることからより複雑になる。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、組換え生物からのグリセロール産生方法であって、適当な宿主細胞を（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つあるいは両方を含む発現カセットで形質転換することであって、（ａ）グリセロールキナーゼをコードする内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子、（ｂ）グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする内因性遺伝子のいずれか一方あるいは両方の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含む、この場合その破壊は活性遺伝子産物の発現を妨げる、前記宿主細胞を形質転換することと、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源の存在下で形質転換した宿主細胞を培養し、それによってグリセロールを産生させることと、産生するグリセロールを回収することとを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、組換え生物からの１，３−プロパンジオール産生方法であって、適当な宿主細胞を（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一方あるいは両方を含む発現カセットで形質転換することであって、デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有し、さらに（ａ）内因性グリセロールキナーゼをコードする遺伝子および（ｂ）内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうち１つあるいは両方の破壊を有する、ここで（ａ）または（ｂ）遺伝子における破壊は活性遺伝子産物の発現を妨げる、該宿主細胞を形質変換することと、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源の存在下で形質転換した宿主細胞を培養し、それによって１，３−プロパンジオールを産生させることと、産生する１，３−プロパンジオールを回収することとを含む方法を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、組換え生物からの１，３−プロパンジオール産生方法であって、内因性遺伝子の複数コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ）が導入される方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の実施形態には、グリセロール経路の異種遺伝子で形質転換された宿主細胞、ならびにグリセロール経路の内因性遺伝子を含む宿主細胞が含まれる。
【００１５】
さらに本発明は、グリセロールまたは１，３−プロパンジオールの産生に適当な組換え細胞であって、該宿主細胞が、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性およびグリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性のいずれか一方または両方を発現する遺伝子を有し、該宿主細胞がさらに、内因性グリセロールキナーゼをコードする遺伝子および内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のいずれか一方または両方の破壊を有し、遺伝子中の該破壊が活性遺伝子産物の発現を妨げる細胞を提供する。
【００１６】
（生物学的寄託、および配列リストの簡単な説明）
出願者他は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に従って以下の生物寄託を行った。
【００１７】
0004570775.tif 000002
【００１８】
「ＡＴＣＣ」は、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、１２３０１、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５２  Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）国際寄託機関を指す。国際寄託機関表示は寄託材料の寄託番号である。
【００１９】
出願人らは、Ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｎｎｅｘｅｓ  ＩおよびＩＩ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＰＯ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．２からＯＪ  ＥＰＯ、１２／１９９２）および３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ１．８２１〜１．８２５およびＡｐｐｅｎｄｉｃｅｓ  ＡおよびＢ（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に従って４５個の配列を提供した。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、組換え生物における発酵炭素源からの生物学的グリセロール産生方法を提供することにより、前述の問題を解決する。この方法は、化粧品および医薬産業で有用なグリセロールの迅速、安価で環境に責任のあるソースを提供する。この方法は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）および／またはグリセロール−３−ホスファターゼ（Ｇ３Ｐホスファターゼ）をコードするクローン化された相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子を含む微生物を使用する。これらの遺伝子は、内因性のグリセロールキナーゼおよび／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子に破壊を有する組換え宿主で発現する。この方法は、グリセロール、およびグリセロールを中間体とする任意の最終産物の産生に有用である。組換え微生物を炭素源と接触させて培養し、次いで、グリセロールおよびこれに由来する任意の最終産物をならし培地から単離する。グリセロール産生のために、遺伝子は別々にまたは一緒に宿主微生物に組み込むことができる。
【００２１】
出願人らの方法は、組換え生物に関してこれまで報告されたことはなく、２つの酵素をコードする遺伝子を単離することと、これに続いて内因性キナーゼおよびデヒドロゲナーゼ遺伝子中の破壊を有する宿主細胞で発現することを必要とした。出願人らの方法が、グリセロールを重要な中間体とする産生化合物、例えば、１，３−プロパンジオールに一般的に適用できることは、当業者には理解されるであろう。
【００２２】
本明細書では、特許請求の範囲および明細書の説明に以下の用語を使用する。
【００２３】
「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」および「Ｇ３ＰＤＨ」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを指す。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ３ＰＤＨは、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、またはＦＡＤ依存性である。ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．８）は、例えば、ＧＰＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）、またはＧＰＤ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ３５１６９ｘ１）、またはＧＰＤ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ９８４１８２）、またはＤＡＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）を含むいくつかの遺伝子によってコードされる。ＮＡＤＰＨ依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．９４）は、ｇｐｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３２１６４３、（ｃｄｓ  １９７９１１〜１９６８９２）、Ｇ４６６７４６およびＬ４５２４６）によってコードされる。ＦＡＤ依存性酵素（ＥＣ  １．１．９９．５）は、ＧＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ２３）、またはｇｌｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ１４７８３８）、またはｇｌｐＡＢＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２０９３８）によってコードされる。
【００２４】
「グリセロール−３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセロール−３−ホスファターゼ」、または「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」、および「Ｇ３Ｐホスファターゼ」という用語は、グリセロール−３−リン酸および水からグリセロールおよび無機リン酸への変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを指す。Ｇ３Ｐホスファターゼは、例えば、ＧＰＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ１２５）、またはＧＰＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１８８１３ｘ１１）によってコードされる。
【００２５】
「グリセロールキナーゼ」という用語は、グリセロールおよびＡＴＰからグリセロール−３−リン酸およびＡＤＰへの変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを指す。高エネルギーリン酸供与体であるＡＴＰは、生理学的置換体（例えば、ホスホエノールピルビン酸）と換えてもよい。グリセロールキナーゼは、例えば、ＧＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１１５８３ｘ１９）およびｇｌｐＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ１９２０１）によってコードされる。
【００２６】
「グリセロールデヒドロゲナーゼ」という用語は、グリセロールからジヒドロキシアセトン（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．６）への変換、またはグリセロールからグリセルアルデヒド（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．７２）への変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドを指す。グリセロールからジヒドロキシアセトンへの変換を触媒する酵素活性をもたらすポリペプチドは、「ジヒドロキシアセトンレダクターゼ」とも呼ばれる。グリセロールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．６）、ＮＡＤＰＨ（Ｅ．Ｃ．  １．１．１．７２）、またはその他の補因子（例えば、Ｅ．Ｃ．  １．１．９９．２２）に依存性である。ＮＡＤＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、例えば、ｇｌｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ００００６）によってコードされる。
【００２７】
「デヒドラターゼ酵素」という用語は、グリセロール分子を生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへと異性化または変換する能力を有する任意の酵素を指す。本発明の目的では、デヒドラターゼ酵素には、グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．１．３０）およびジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．１．２８）が含まれ、それぞれグリセロールおよび１，２−プロパンジオールという好ましい基質を有する。例えば、シトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）では、グリセロールデヒドラターゼは、遺伝子配列がｄｈａＢ、ｄｈａＣおよびｄｈａＥ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ０９７７１、それぞれの塩基対は、８５５６〜１０２２３、１０２３５〜１０８１９、および１０８２２〜１１２５０）で表される３種類のポリペプチドによってコードされる。例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）では、ジオールデヒドラターゼは、遺伝子配列がｐｄｄＡ、ｐｄｄＢおよびｐｄｄＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ４５０７１、それぞれの塩基対は、１２１〜１７８５、１７９６〜２４７０、および２４８５〜３００６）で表される３種類のポリペプチドによってコードされる。
【００２８】
「ＧＰＤ１」、「ＤＡＲ１」、「ＯＳＧ１」、「Ｄ２８３０」、および「ＹＤＬ０２２Ｗ」という用語は、互換的に使用され、サイトゾルのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号１に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００２９】
「ＧＰＤ２」という用語は、サイトゾルのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号２に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３０】
「ＧＵＴ２」および「ＹＩＬ１５５Ｃ」という用語は、互換的に使用され、ミトコンドリアのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号３に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３１】
「ＧＰＰ１」、「ＲＨＲ２」、および「ＹＩＬ０５３Ｗ」という用語は、互換的に使用され、サイトゾルのグリセロール−３−ホスファターゼをコードする遺伝子を指し、配列番号４に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３２】
「ＧＰＰ２」、「ＨＯＲ２」、および「ＹＥＲ０６２Ｃ」という用語は、互換的に使用され、サイトゾルのグリセロール−３−ホスファターゼをコードする遺伝子を指し、配列番号５に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３３】
「ＧＵＴ１」という用語は、サイトゾルのグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を指し、配列番号６に示す塩基配列によって特徴づけられる。「ｇｌｐＫ」という用語は、グリセロールキナーゼをコードする別の遺伝子を指し、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｌ１９２０１、塩基対７７３４７〜７８８５５に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３４】
「ｇｌｄＡ」という用語は、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を指し、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ００００６、塩基対３１７４〜４３１６に示す塩基配列によって特徴づけられる。「ｄｈａＤ」という用語は、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする別の遺伝子を指し、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ０９７７１、塩基対２５５７〜３６５４に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００３５】
本明細書では、「機能」および「酵素機能」という用語は、特定の化学反応を行うのに必要なエネルギーを変化させる酵素の触媒活性を指す。このような活性は、生成物および基質の双方の生成が適当な条件下で達成できるような平衡にある反応に適用することができる。
【００３６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用される。
【００３７】
「炭素基質」および「炭素源」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝を受ける能力を有する炭素源を指し、具体的には、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および一炭素基質またはその混合物からなる群から選択される炭素源を意味する。
【００３８】
「変換」は、化学反応により化合物または基質の複雑性を低下または変化させる生物または細胞の代謝プロセスを指す。
【００３９】
「宿主細胞」および「宿主生物」という用語は、外来または異種の遺伝子と、内因性遺伝子の追加のコピーとを受け入れる能力を有し、これらの遺伝子を発現して活性遺伝子産物を産生する微生物を指す。
【００４０】
「産生細胞」および「産生生物」という用語は、グリセロールまたはグリセロール生合成経路から誘導される化合物を産生するために設計された細胞を指す。産生細胞は組換え体であり、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、グリセロール−３−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれかまたは両方を含む。Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子の他に、宿主細胞は、内因性グリセロールキナーゼをコードする遺伝子および内因性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のいずれかまたは両方において破壊を含むこととする。産生細胞が１，３−プロパンジオールを産生するように設計する場合には、さらにデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むこととする。
【００４１】
「外来遺伝子」、「外来ＤＮＡ」、「異種遺伝子」、および「異種ＤＮＡ」はすべて、異なる宿主生物内に置かれている、ある生物生来の遺伝子材料を指す。
【００４２】
遺伝子または遺伝子によって発現するポリペプチドに関連して本明細書中で使用される「内因性」という用語は、産生細胞生来の遺伝子またはタンパク質であり、別の生物に由来するものではない遺伝子またはタンパク質を指す。したがって、「内因性グリセロールキナーゼ」および「内因性グリセロールデヒドロゲナーゼ」は、産生細胞生来の遺伝子によってコードされたポリペプチドを指す用語である。
【００４３】
「組換え生物」および「形質転換宿主」という用語は、異種または外来遺伝子で形質転換された任意の生物を指す。本発明の組換え生物は、適当な炭素基質からグリセロールを産生するためにＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼをコードする外来遺伝子を発現する。さらに、「組換え生物」および「形質転換宿主」という用語は、遺伝子のコピー数が増加するように、内因性（または相同）遺伝子で形質転換された任意の生物を指す。
【００４４】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域より上流（５’非コード）および下流（３’非コード）の調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）も含まれる。「生来の（ｎａｔｉｖｅ）」および「野生型」遺伝子という用語は、それ自身の調節配列を有する天然に見いだされる遺伝子を指す。
【００４５】
「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コーディング」という用語は、転写および翻訳の機構を介して、ある遺伝子がアミノ酸配列を産生するようなプロセスを指す。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスには、コードされているアミノ酸に変化を生じさせることがない塩基の変化を伴ってもよいＤＮＡ配列、あるいは１つまたは数個のアミノ酸を変化させるがＤＮＡ配列によってコードされているタンパク質の機能的特性に影響を与えない塩基変化を伴ってもよいＤＮＡ配列が含まれることを意味する。したがって、本発明は、特定の模例の配列以上の配列を含む。得られるタンパク質分子の機能的特性にほとんど影響を与えないサイレントな変化を生じる配列の欠失、挿入、または置換などの配列の改変も企図されている。例えば、遺伝暗号の縮重を反映する遺伝子配列の変化、または所定の部位における化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の変化が企図されている。したがって、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、グリシンなどの疎水性の少ない別の残基、あるいはバリン、ロイシン、またはイソロイシンなどのより疎水性である残基をコードするコドンによって置き換えることができる。同様に、ある正に荷電の残基を別の残基に置き換える変化、例えばアスパラギン酸からグルタミン酸に置き換える変化、あるいはある負に荷電の残基を別の残基に置き換える変化、例えばリジンからアルギニンに置き換える変化も、生物学的に等価な生成物を生ずることが予想される。タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化も、タンパク質の活性を変化させないことが予想される。実際、いくつかの場合に、タンパク質の生物学的活性に対する変化の影響を検討するために配列の変異体を作製することが望ましい。コードされた産物において生物学的活性の保持が決定されるように、上で述べたそれぞれの改変は当技術分野において通常の技術の範囲内にある。さらに、当業者は、本発明に包含される配列は、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）下で本明細書中に例示した配列とハイブリダイズする能力によっても定義されることを理解するであろう。
【００４６】
「発現」という用語は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳を指す。
【００４７】
本明細書では、「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、しばしば細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運び、通常環状の２本鎖ＤＮＡ分子の形をとる染色体外要素を指す。このような要素には、任意の供給源から得られる、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡがあり、これらの中には、多くのヌクレオチド配列が、プロモーター断片および選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を適当な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特有の構築物に結合または再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、該外来遺伝子の他に特定の宿主細胞の形質転換を容易にするような要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、該外来遺伝子の他に異種宿主で遺伝子の発現を促進させるような要素を有する特定のベクターを指す。
【００４８】
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、核酸の取り込みの後に細胞中に新たな遺伝子が獲得されることを指す。獲得遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれるか、染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換体」という用語は、形質転換によって得られる細胞を指す。
【００４９】
「遺伝的に変化した」という用語は、形質転換または突然変異により遺伝性材料を変化するプロセスを指す。遺伝子に適用される「破壊」および「遺伝子インターラプト」という用語は、ある遺伝子に付加させるか、あるいはある遺伝子からその遺伝子の重要な部分を欠失させることにより、その遺伝子によってコードされるタンパク質が発現されないように、あるいは活性型で発現されないように生物を遺伝的に変化させる方法を指す。
【００５０】
（グリセロール生合成経路）
ほとんどの微生物に見いだされるグリセロール生合成経路を操作することによって組換え生物においてグリセロールを産生できることが企図されている。通常、グルコースなどの炭素基質はＡＴＰの存在下でヘキソキナーゼを介し、グルコース−６−リン酸に変換される。グルコース−リン酸イソメラーゼは、グルコース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸、次いで６−ホスホフルクトキナーゼの作用によるフルクトース−１，６−ジリン酸への変換を触媒する。次いで、この二リン酸は、アルドラーゼを介してジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）となる。最後に、ＮＡＤＨ依存性Ｇ３ＰＤＨが、ＤＨＡＰをグリセロール−３−リン酸に変換し、これがＧ３Ｐホスファターゼによって脱ホスホリル化されてグリセロールとなる（Ａｇａｒｗａｌ、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｒｇ．、４１巻、１１４ページ、１９９０年）。
【００５１】
（Ｇ３ＰＤＨ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、Ｇ３Ｐホスファターゼおよびグリセロールキナーゼをコードする遺伝子）
本発明は、宿主細胞におけるＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現に好適な遺伝子を提供する。
【００５２】
Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＤ１はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から単離され、配列番号１に示す塩基配列を有し、配列番号７に示すアミノ酸配列をコードする（Ｗａｎｇ他、同上）。同様に、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする、配列番号２に示す塩基配列を有するＧＰＤ２によってコードされたサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から、Ｇ３ＰＤＨ活性が単離された（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１７巻、９５ページ、１９９５年）。
【００５３】
本発明の目的のために、Ｇ３ＰＤＨ活性をもたらすポリペプチドをコードする任意の遺伝子は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への変換を触媒する能力を有する場合に適当であることが企図されている。さらに、遺伝子ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＵＴ２、ｇｐｓＡ、ｇｌｐＤ、およびｇｌｐＡＢＣのαサブユニットそれぞれに対応する配列番号７、８、９、１０、１１および１２に示されるＧ３ＰＤＨのアミノ酸配列をコードする任意の遺伝子が、そのアミノ酸配列が酵素の機能を変化させないアミノ酸の置換、欠失または付加を含む場合には本発明で機能することが企図されている。当業者は、他の供給源から単離されたＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子も本発明で使用するのに適当であることを理解するであろう。例えば、原核生物から単離された遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３４３９３、Ｍ２０９３８、Ｌ０６２３１、Ｕ１２５６７、Ｌ４５２４６、Ｌ４５３２３、Ｌ４５３２４、Ｌ４５３２５、Ｕ３２１６４、Ｕ３２６８９、およびＵ３９６８２が含まれる。真菌から単離された遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ３０６２５、Ｕ３０８７６およびＸ５６１６２が含まれる。昆虫から単離された遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ６１２２３およびＸ１４１７９が含まれ、哺乳動物から単離された遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ１２４２４、Ｍ２５５５８、およびＸ７８５９３が含まれる。
【００５４】
Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、ＧＰＰ２はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離され、配列番号５に示す塩基配列を有し、配列番号１３に示すアミノ酸配列をコードする（Ｎｏｒｂｅｃｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１３８７５ページ、１９９６年）。
【００５５】
本発明の目的のために、Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードする任意の遺伝子は、その活性がグリセロール−３−リン酸および水からグリセロールおよび無機リン酸への変換を触媒する能力を有する場合に本発明の方法で使用するのに適当である。さらに、遺伝子ＧＰＰ２およびＧＰＰ１それぞれに対応する配列番号１３および配列番号１４に示されるＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードする任意の遺伝子が、Ｇ３Ｐホスファターゼの機能を変化させないアミノ酸の置換、欠失または付加を含む任意のアミノ酸配列を含めて本発明で機能する。当業者は、他の供給源から単離されたＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子も本発明で使用するのに適当であることを理解するであろう。例えば、グリセロールを得るためのグリセロール−３−リン酸の脱ホスホリル化は、次の一般的なまたは特定のホスファターゼの１つまたは複数によって行うことができる：アルカリホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１９１５９、Ｍ２９６６３、Ｕ０２５５０またはＭ３３９６５］、酸ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．２）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ５１２１０、Ｕ１９７８９、Ｕ２８６５８またはＬ２０５６６］、グリセロール−３−ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．−）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ３８０６０またはＵ１８８１３ｘ１１］、グルコース−１−ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１０）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３３８０７］、グルコース−６−ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．９）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ００４４５］、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１１）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ１２５４５またはＪ０３２０７］、またはホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．２７）［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２３５４６およびＭ２３６２８］。
【００５６】
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、グリセロールキナーゼをコードするＧＵＴ１はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から単離され、配列が決定され（Ｐａｖｌｉｋ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２４巻、２１ページ、１９９３年）、その塩基配列は配列番号６で示され、配列番号１５に示すアミノ酸配列をコードする。あるいは、ｇｌｐＫは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のグリセロールキナーゼをコードし、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｌ１９２０１、塩基対７７３４７〜７８８５５に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００５７】
グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、ｇｌｄＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のグリセロールデヒドロゲナーゼをコードし、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ００００６、塩基対３１７４〜４３１６に示す塩基配列によって特徴づけられる。あるいは、ｄｈａＤは、シトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）のグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする別の遺伝子を指し、ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ｕ０９７７１、塩基対２５５７〜３６５４に示す塩基配列によって特徴づけられる。
【００５８】
（宿主細胞）
Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの発現によるグリセロールの組換え産生に適当な宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよく、活性酵素を発現する能力によってのみ限定されるべきである。好ましい宿主細胞は、グリセロール産生に通常有用である、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スヒゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌、酵母、および糸状菌である。本発明では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が好ましい。
【００５９】
１，３−プロパンジオールの産生でグリセロールが重要な中間体である場合には、宿主細胞は、デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子を有するか、形質転換によってこのような遺伝子を獲得しなければならない。具体的に１，３−プロパンジオールの産生に適している宿主細胞は、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）であり、これらはデヒドラターゼ酵素をコードする内因性遺伝子を有している。さらに、このような内因性遺伝子を欠く宿主細胞には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【００６０】
（ベクターおよび発現カセット）
本発明は、適当な宿主細胞へのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼのクローン化、形質転換、および発現に適する種々のベクター、形質転換カセット、および発現カセットを提供する。適当なベクターは、使用する細菌に適合するものでなくてはならない。適当なベクターは、例えば、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来のファージ）、コスミド、酵母または植物に由来するものあってよい。このようなベクターを取得し使用するためのプロトコルは当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−１、２，３巻（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年））。
【００６１】
通常、ベクターまたはカセットは、適当な遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。適当なベクターは、５’領域の転写開始制御を有する遺伝子および３’領域の転写終結を制御するＤＮＡ断片を含む。両方の制御領域は、形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子に由来することが最も好ましい。このような制御領域は、産生宿主として選択された特定の種に由来する遺伝子から得られる必要はない。
【００６２】
開始制御領域、すなわちプロモーターは、所望の宿主細胞においてＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子の発現を作動するために有用であり、当業者に数多く知られている。これらの遺伝子を作動する能力を有するほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、これらには、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、λＰL、λＰR、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に有用）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
終結制御領域も、好ましい宿主生来の種々の遺伝子から得ることができる。任意選択で、終結部位は不必要なこともあるが、含まれていれば最も好ましい。
【００６４】
本酵素類の効果的な発現には、該酵素類をコードするＤＮＡは、発現が適当なメッセンジャーＲＮＡの生成をもたらすように、選択された発現制御領域に、開始コドンによる動作可能的に、結合される。
【００６５】
（適当な宿主の形質転換、およびグリセロール産生のためのＧ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの発現）
適当なカセットを構築したら、それらを用いて適当な宿主細胞を形質転換させる。Ｇ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子を含むカセットの宿主細胞への導入は、例えば、カルシウム透過化処理細胞または電気穿孔法などを用いた形質転換、または組換ファージウイルスを用いたトランスフェクションなどにより、知られている手順で行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、同上）。
【００６６】
本発明では、ＡＨ２１およびＤＡＲ１カセットを使用し、後述の一般的方法および実施例で十分に説明するが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αおよびＦＭ５を形質転換させる。
【００６７】
あるいは、内因性Ｇ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子を含む適当な宿主細胞は、関連遺伝子がグリセロール産生のためにアップレギュレートされるように操作することができることが企図されている。
【００６８】
内因性遺伝子のアップレギュレーションの方法は当技術分野で良く知られている。例えば、所望の遺伝子をアップレギュレートするために、構造遺伝子を通常、受容体微生物によって認識されるＤＮＡ上のプロモーター領域の下流に置く。プロモーターの他に、異種遺伝子からの発現を増加または制御する他の制御配列を含めることができる。さらに、同じ目的で任意の知られた遺伝的操作によって内因性遺伝子の制御配列を変化させることができる。微生物が、所望の代謝経路を完結するために必要な遺伝子を協調的に発現するように、インデューサーまたはリプレッサーによって発現を制御することができる。
【００６９】
本発明において、Ｇ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼ活性をコードする内因性遺伝子を含む宿主細胞を、調節プロモーター（例えば、ｌａｃまたはｏｓｍｙ）または構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターの制御下に置くことができるであろう。例えば、ターゲティングを可能にするのに十分な長さでありかつ生来の遺伝子に相同であるＤＮＡの側面に位置する特異的な誘導プロモーターまたは構成プロモーターを含むカセットを構築することができる。適当な生育条件下でのカセットの導入は、カセットと遺伝子の標的部分との間の相同性組換えと、関連のある生来のプロモーターから調節可能なプロモーターへの置換をもたらす。このような方法を使用し、グリセロール産生のためのＧ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼ活性をコードする内因性遺伝子のアップレギュレーションを行うことができる。
【００７０】
（酵素活性を破壊するためのランダムまたは部位特異的変異誘発）
図１のように、微生物がグリセロールを代謝する酵素経路は当技術分野で知られている。グリセロールは、ＡＴＰ依存性グリセロールキナーゼによってグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）に変換される。次いで、Ｇ３Ｐは、Ｇ３ＰＤＨによってＤＨＡＰに酸化される。第２の経路では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼによってジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）に酸化され、次いで、ＤＨＡは、ＡＴＰ依存性ＤＨＡキナーゼによってＤＨＡＰに変換される。第３の経路では、グリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼによってグリセルアルデヒドに酸化され、グリセルアルデヒドは、ＡＴＰ依存性キナーゼによってグリセルアルデヒド−３−リン酸にホスホリル化される。ＤＨＡＰおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸は、トリオースリン酸イソメラーゼの作用によって互いに変換し、中心代謝経路を経由してさらに代謝される。副生成物がはいりこむことから、これらの経路は、グリセロール産生に対しては有害である。
【００７１】
本発明の１つの態様は、グリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼのグルセロール変換活性を欠失させた、グリセロール産生のための産生生物を提供する能力である。欠失突然変異体を作成する方法は一般的なもので、当技術分野で良く知られている。例えば、野生型細胞を放射線または変異誘発化学物質などの種々の試剤に暴露し、次いで所望の表現型を選別することができる。放射線によって変異を起こすときには、紫外（ＵＶ）またはイオン化放射を使用することができる。遺伝子突然変異に好適な短波ＵＶ波長は、２００ｎｍから３００ｎｍの範囲内にあるが、２５４ｎｍが好ましい。この波長のＵＶ放射はグアニジンおよびシトシンからアデニンおよびチミジンまでの核酸配列内の変化を主に引き起こす。全ての細胞が、大部分のＵＶ誘発突然変異を修復すると考えられるＤＮＡ修復機構を有しているので、カフェインなどの試剤および他の阻害剤を加え、修復プロセスを妨害し、有効な突然変異数を最大限にすることができる。３００ｎｍから４００ｎｍの範囲の光を使用する長波ＵＶ突然変異もまた可能であるが、ＤＮＡと相互作用するソラレン染料などの種々の活性化物質を併せて使用しない限り、短波ＵＶ光ほど有効ではない。
【００７２】
化学薬品による突然変異誘発もまた、突然変異体を生成するのに有効であり、通常使用される物質には、ＨＮＯ2およびＮＨ2ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を与える薬品、ならびにアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響を与えフレームシフト突然変異を引き起こすことが顕著である薬品が含まれる。放射線または化学薬品を使用して突然変異体を作成する具体的方法は、当技術分野において十分に調べられている。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、１９８９年、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６巻、２２７ページ、１９９２年を参照されたい。これらの内容を参照により本明細書に取り入れる。
【００７３】
突然変異誘発が起きたら、所望の表現型を有する突然変異体を種々の方法によって選択することができる。ランダムスクリーニングが最も一般的で、変異誘発された細胞を所望の生成物または中間体を産生する能力によって選択する。あるいは、突然変異体の選択的単離は、耐性コロニーのみが成長できるような選択培地で、変異誘発された一団を増殖させることにより行うことができる。変異体の選択方法は極めて発展しており、工業微生物学の技術分野では良く知られている。Ｂｒｏｃｋ、同上、ＤｅＭａｎｃｉｌｈａ他、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、１４巻、３１３ページ、１９８４年を参照されたい。
【００７４】
遺伝子をランダムに標的とする生物学的突然変異誘発剤は、当技術分野で良く知られている。例えば、Ｄｅ  ＢｒｕｉｊｎおよびＲｏｓｓｂａｃｈ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（１９９４年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．を参照されたい。あるいは、遺伝子配列が知られているという条件で、特定の欠失または置換による染色体遺伝子破壊が、適当なプラスミドによる相同組換えによって行われている。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１巻、４６１７〜４６２２ページ、１９８９年、Ｂａｌｂａｓ他、Ｇｅｎｅ、１３６巻、２１１〜２１３ページ、１９９３年、Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４巻、２５１９〜２５２４ページ、１９９６年、およびＳｍｉｔｈ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻、２７０〜２７７ページ、１９９６年を参照されたい。
【００７５】
好ましい産生生物におけるグリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性の欠失または不活性化のために、前述の任意の方法を使用することが企図されている。
【００７６】
（培地および炭素基質）
本発明の発酵培地は、適当な炭素基質を含んでいなければならない。適当な基質には、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンなどの多糖類、セルロース、またはその混合物、およびチーズホエー浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープ（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）液、甜菜糖液、および大麦麦芽などの再生可能な原料の未精製混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、メタノールなどの、重要な生化学的中間体への代謝変換が証明されている一炭素基質であってもよい。
【００７７】
一炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、またはホルメート）からのグリセロール産生はメチロトローフの酵母（Ｙａｍａｄａ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３巻（２号）、５４１〜５４３ページ、１９８９年）および細菌（Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４巻、４１４８〜４１５５ページ、１９８５年）で報告されている。これらの生物は、メタンからホルメートまでの酸化状態にわたって一炭素化合物を同化（ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）し、グリセロールを産生することができる。炭素同化の経路は、リブロースモノリン酸、セリン、またはキシルロース−モノリン酸を介する（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８６年）。リブロースモノリン酸経路は、ホルメートとリブロース−５−リン酸の縮合で６炭糖を形成し、これがフルクトースとなり最終的に３炭素生成物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸になるものである。同様に、セリン経路は、メチレンテトラヒドロ葉酸を経由して一炭素化合物を解糖系に同化する。
【００７８】
１炭素基質および２炭素基質の他に、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性な種々のアミノ酸など、他のいくつかの炭素含有化合物を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を利用し、トレハロースまたはグリセロールを作ることが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ他（１９９３年）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７回、４１５〜３２ページ、著者、Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ、Ｋｅｌｌｙ、Ｄｏｎ  Ｐ．出版社、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）。同様に、種々のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ他、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５３巻（５号）、４８５〜９ページ、１９９０年）。したがって、本発明で利用する炭素源は、多種の炭素含有基質を包含し、生物の選択によってのみ限定されるものである。
【００７９】
前述の炭素基質およびその混合物はすべて、本発明に適しているが、好ましい炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質またはその混合物である。グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースなどの糖類、およびメタノールや二酸化炭素などの一炭素基質がより好ましい。炭素基質としては、グルコースが最も好ましい。
【００８０】
適当な炭素源とは別に、発酵培地は、培養の生育およびグリセロール産生に必要な酵素経路の促進に適した、当業者に知られている適当な無機化合物、塩、補助因子、緩衝液および他の成分を含まなければならない。
【００８１】
（培養条件）
一般に、細胞は適切な培地中で、３０℃で増殖する。好ましい増殖培地は、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈ、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ｂｒｏｔｈ、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ｂｒｏｔｈなど、一般に市販向けに調製された培地である。他の規定の増殖培地または合成増殖培地を使用してもよいし、特定の微生物が増殖するのに適切な培地が、微生物学または発酵学の分野の技術者に知られている。異化代謝産物の抑制を直接的または間接的に調節することが知られている、例えばサイクリックアデノシン３’，５’−一リン酸などの試薬の使用を、反応培地に取り入れてもよい。同様に、グリセロールの生成を増大させるように作用する酵素活性を、調節することが知られている試薬（例えば亜硫酸塩、亜硫酸水素塩およびアルカリ）の使用を、遺伝子操作と一緒に、または遺伝子操作の代わりに利用してもよい。
【００８２】
発酵に適切なｐＨの範囲は、ｐＨ５．０からｐＨ９．０であり、ここでｐＨ６．０からｐＨ８．０の範囲が初期条件には好ましい。
【００８３】
反応は、好気性または嫌気性条件下で行ってよいが、ここで嫌気性または微好気性条件が好ましい。
【００８４】
（Ｇ３ＰＤＨ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、Ｇ３Ｐホスファターゼおよびグリセロールキナーゼ活性の同定）
タンパク質Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼグリセロールデヒドロゲナーゼ、およびグリセロールキナーゼの発現レベルは、酵素検定で測定する。一般に、Ｇ３ＰＤＨ活性およびグリセロールデヒドロゲナーゼ活性の検定は、ＤＨＡＰがＧ−３−Ｐに、ＤＨＡがグリセロールにそれぞれ変換するときの、補助基質ＮＡＤＨが分光学的性質に基づく。ＮＡＤＨは固有のＵＶ／ｖｉｓ吸収を有し、その消費量を分光光度的に３４０ｎｍにてモニターすることができる。Ｇ３Ｐホスファターゼの活性は、反応中の遊離する無機リン酸塩を測定するいかなる方法でも測定することができる。最も一般的に使用される検出法は、青色のリンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を利用する。グリセロールキナーゼの活性は、グリセロールおよびＡＴＰからのＧ３Ｐの検出を、例えばＮＭＲによって、測定することができる。検定は、必要ならば、例えば代替の補因子を使用することによって、個々の酵素のより特定の特徴に照準を合わせることができる。
【００８５】
（グリセロールおよび他の生成物（例、１，３−プロパンジオール）の、同定および回収）
グリセロールおよび他の生成物（例えば１，３−プロパンジオール）は、セルフリーの抽出物を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、およびガスクロマトグラフィ／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって、同定および定量化してもよい。好ましいのはＨＰＬＣ法であり、ここで発酵培地は、移動相に０．０１Ｎの硫酸を使用してイソクラティク溶離して分析用のイオン交換カラム上で解析する。
【００８６】
発酵培地からグリセロールを回収する方法は、当技術分野で知られている。例えば、グリセロールは細胞培地から、反応混合物を以下の一連の手順に供することによって得ることができ、これらは濾過；水分の除去；有機溶媒の抽出；および分留（米国特許第２，９８６，４９５号）である。
【００８７】
（好ましい実施形態の説明）
（グリセロールの生成）
本発明は、組換え微生物を利用して、適切な炭素源からグリセロールを生成する方法を述べる。本発明に特に適するのは、グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、グリセロール三リン酸活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の一方または両方を有する発現カセットで形質転換された細菌の宿主細胞である。Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子に加えて、宿主細胞は、内因性のグリセロールキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている遺伝子のどちらか一方または両方に破壊を含んでいる。外来Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子（炭素源からグリセロールへの経路を提供する）を、遺伝子破壊（グリセロールの転換を阻害する）と一緒にする結果、効率的で確実なグリセロールを産生することができる微生物を生じる。
【００８８】
グリセロールを生産するのに最適な微生物は、上述したような遺伝子破壊を含んでいるが、このような破壊を欠いた状態で、外来Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子のどちらか一方または両方を含有する宿主細胞によって、グリセロールの生産は可能である。例えば、ＤＡＲ１遺伝子を有する組換え大腸菌株ＡＡ２００（実施例１）は、発酵パラメーターに依存して、０．３８ｇ／Ｌから０．４８ｇ／Ｌのグリセロールを生産することができた。同様に、ＧＰＰ２遺伝子を有し、発現することができる大腸菌ＤＨ５α（実施例２）は、０．２ｇ／Ｌのグリセロールを生産することができた。両方の遺伝子が存在する場合（実施例３および４）では、グリセロールの生産は約４０ｇ／Ｌに達した。両遺伝子が、内因性グリセロールキナーゼ活性を除去して存在する場合は、グリセロールの変換に減少が見られた（実施例８）。さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼの存在は、グルコースが限定された条件下で、グリセロールの変換と関連しており、したがってグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を除去すると、グリセロールの変換が減少することとなる（実施例８）。
【００８９】
（１，３−プロパンジオールの生成）
本発明は、外来Ｇ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子を発現し、内因性のグリセロールキナーゼおよび／またはグリセロールデヒドロゲナーゼの活性中に破壊を含有する組換え微生物を利用することによって、１，３−プロパンジオールを生成するのに適応させることもできる。あるいは、本発明は、内因性遺伝子の複数コピーが導入された組換え微生物から、１，３−プロパンジオールを生成する工程を提供する。こうした遺伝子改変に加え、生成細胞には、活性のあるデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子の存在が必要である。デヒドラターゼの酵素活性は、グリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼである。デヒドラターゼの酵素活性は、内因性遺伝子の発現、または宿主微生物にトランスフェクトした外来遺伝子の発現に起因するであろう。適切なデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子の単離および発現は、当技術分野において十分に知られており、本出願人によって１９９６年１１月５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９６／０６７０５、およびＵ．Ｓ．５６８６２７６、Ｕ．Ｓ．５６３３３６２によって教示され、この内容を参照によって本明細書中に取り入れる。グリセロールは１，３−プロパンジオールを生成するのに重要な中間体であるので、宿主細胞が、発現される外来Ｇ３ＰＤＨおよび／またはＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子と共にデヒドラターゼ活性を有し、さらにグリセロール変換グリセロールキナーゼまたはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を欠いている場合、その細胞は特に１，３−プロパンジオールの生成に好都合なことが分かるであろう。
【００９０】
本発明は、以下の実施例で更に定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示したものにすぎないことを理解されたい。上述およびこれらの実施例から、当分野の技術者は、本発明の基本的な特徴を把握することができ、その意図および範囲から逸脱せずに、本発明の種々の変更および修正を行い、さまざまな用法および条件に適応させることができる。
【００９１】
（実施例）
（一般的方法）
リン酸化、ライゲーション（連結反応）および形質転換の手順は、当技術分野で十分に知られている。以下の実施例の使用に適している技法は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に見出すことができるであろう。
【００９２】
細菌培養物の維持および増殖に適する材料および方法は、当技術分野で十分に知られている。以下の実施例での使用に適している技法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｐｓ、ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９４）または、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）に見ることができるであろう。細菌細胞の増殖および維持に使用する、すべての試薬および材料は、特に指定の無い限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【００９３】
略記の意味は以下のとおりである：「ｈ」は時間（複数時間）、「ｍｉｎ」は分（複数分）、「ｓｅｃ」は秒（複数秒）、「ｄ」は日（複数日）、「ｍＬ」はミリリットル（複数ミリリットル）、「Ｌ」はリットル（複数リットル）を意味する。
【００９４】
（細胞株）
以下の大腸菌株を、Ｇ３ＰＤＨおよびＧ３Ｐホスファターゼの形質転換、および発現に使用した。株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＡＴＣＣ、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）より入手した。
【００９５】
ＡＡ２００（ｇａｒＢ１０  ｆｈｕＡ２２  ｏｍｐＦ６２７  ｆａｄＬ７０１  ｒｅＬＡ１  ｐｉｔ−１０  ｓｐｏＴＩ  ｔｐｉ−１  ｐｈｏＭ５１０  ｍｃｒＢ１）（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（１９７０）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６２：３２９）
ＢＢ２０（ｔｏｎＡ２２  ΔｐｈｏＡ８  ｆａｄＬ７０１  ｒｅｌＡ１  ｇｌｐＲ２  ｇｌｐＤ３  ｐｉｔ−１０  ｇｐｓＡ２０  ｓｐｏＴＩ  Ｔ２Ｒ）（Ｃｒｏｎａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１１８：５９８）
ＤＨ５α（ｄｅｏＲ  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｈｓｄＲ１７  ｒｅｃＡ１  ｒｅＩＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−Ｉ  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦＶ１６９）ｐｈｉ８０ｌａｃＺΔＭ１５Ｆ-）（Ｗｏｏｄｃｏｃｋら、（１９８９）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７：３４６９）
ＦＭ５大腸菌（ＡＴＣＣ５３９１１）
【００９６】
（グリセロールの同定）
グルコースのグリセロールへの変換は、ＨＰＬＣおよび／またはＧＣによってモニターした。解析は、クロマトグラフィの分野の技術に利用可能な、標準的な技法および材料を使って行った。適切な方法の１つは、ＵＶ（２１０ｎｍ）およびＲＩ検出を使用する、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｘｉｍａ  ８２０  ＨＰＬＣシステムを利用した。試料は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１Ｐプレカラム（６ｍｍ×５０ｍｍ）を装備する、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍ×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に注入し、５０℃に温度調節を行い、移動相として０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を０．６９ｍＬ／分の流速にて使用した。定量分析が要求された時は、外標準物質として、既知量のトリメチル酢酸と共に試料を調製した。通常、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）、グリセロール（ＲＩ検出）およびグルコース（ＲＩ検出）の保持時間は、それぞれ２１．３９分、１７．０３分および１２．６６分であった。
【００９７】
グリセロールは、ＧＣ／ＭＳによっても解析を行った。グリセロールの単離および定量のためのガスクロマトグラフィ／質量分析による検出は、ＤＢ−ＷＡＸカラム（３０ｍ、０．３２ｍｍＩ．Ｄ．、０．２５ｕｍのフィルム厚、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｌｓｏｍ、ＣＡ）を使用して、以下の条件で行った：インジェクター：単離、１：１５；試料容積：１μＬ；温度分布：初期温度１５０℃を３０秒保持、４０℃／分から１８０℃、２０℃／分から２４０℃を２．５分保持。検出：ＥＩマススペクトロメトリー（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐｃｋａｒｄ  ５９７１、Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ、ＣＡ）、定量的ＳＩＭ、グリセロールおよびグリセロール−ｄ８の標的イオンとして、イオン６１ｍ／ｚおよび６４ｍ／ｚを、グリセロールのクォリファイア（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）イオンとしてイオン４３ｍ／ｚを使用。グリセロール−ｄ８を、内標準物質として使用した。
【００９８】
（グリセロール三リン酸、Ｇ３Ｐホスファターゼの検定）
酵素活性の検定は、ビス−トリス、またはＭＥＳおよびマグネシウム緩衝液ｐＨ６．５中で、抽出物を有機リン酸塩の基質と共にインキュベートして行った。使用した基質は、ｌ−α−グリセロールリン酸、またはｄ，ｌ−α−グリセロールリン酸であった。検定に使用する試薬の最終濃度は：緩衝液（２０ｍＭのビス−トリスまたは５０ｍＭのＭＥＳ）；ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）；および基質（２０ｍＭ）である。試料中の総タンパク質が少なく、酸によるクエンチングで可視の沈殿が起こらない場合、試料はキュベット中で都合よく検定された。この方法は、２０ｍＭの基質（５０μＬ、２００ｍＭ）、５０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ６．５の緩衝液を含有するキュベット中で、酵素試料をインキュベートすることを含んでいた。最終的なホスファターゼ検定体積は０．５ｍＬであった。酵素を含んだ試料を反応混合物に加え、キュベットの内容物を混合し、次にキュベットを、還流している水浴中に温度３７℃で５〜１２０分間置いたが、この時間の長さは、酵素試料中のホスファターゼ活性が、２〜０．０２Ｕ／ｍＬの範囲にあるかどうかに左右された。酵素反応は、酸性のモリブデン酸塩試薬（０．４ｍＬ）を添加することによって停止させた。Ｆｉｓｋｅ  ＳｕｂｂａＲｏｗ試薬（０．１ｍＬ）および蒸留水（１．５ｍＬ）を加えた後、溶液を混合し顕色させた。十分に発色させるため、１０分後に、Ｃａｒｙ２１９ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して試料の吸光度を６６０ｎｍで読み取った。放出された無機リン酸塩の量を、標準曲線と比較したが、この標準曲線は無機リン酸のストック溶液（０．６５ｍＭ）を使用し、０．０２６〜０．１３０μｍｏｌ／ｍＬの範囲内に最終無機リン酸濃度を持つ、６本の標準品を調製して作成した。
【００９９】
（グリセロール三リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性の、分光光度法による検定）
以下の手順は、Ｂｅｌｌら（１９７５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０：７１５３〜８によって掲載された方法から、次に示すように変更したものとして使用された。この方法は、０．２ｍＭのＮＡＤＨ；２．０ｍＭのジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）、および５ｍＭのＤＴＴを添加した０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中の酵素を含んだキュベット中の酵素試料を、総容積１．０ｍＬで３０℃でインキュベートすることを含むものとした。３４０ｎｍの定波長にて吸光度の変化をモニターするために、分光光度計を設定した。機器は、緩衝液のみを含有するキュベットでブランクにした。酵素をキュベットに添加後、吸光度を読んだ。第一の基質ＮＡＤＨ（５０μＬ  ４ｍＭのＮＡＤＨ；吸光度は約１．２５ＡＵ増加する）を、バックグラウンドレートを測定する為に加えた。バックグラウンドレートは、少なくとも３分間追跡すべきである。第二の基質ＤＨＡＰ（５０μＬ  ４０ｍＭのＤＨＡＰ）を次に加え、時間経過とともに吸光度の変化を少なくとも３分間モニターし、グロスレートを測定した。Ｇ３ＰＤＨの活性は、グロスレートからバックグラウンドレートを引いて特定した。
【０１００】
（グリセロールキナーゼ活性の13Ｃ−ＮＭＲによる検定）
適切な量の酵素、通常は無細胞粗製抽出物を、４０ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＭｇＳＯ4、一律に13Ｃで標識した２１ｍＭのグリセロール（９９％、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９を含有する反応混合物に、２５℃で７５分間加えた。グリセロールのグリセロール三リン酸への変換は、13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）で検出した：グリセロール（６３．１１ｐｐｍ、ｄ、Ｊ＝４１Ｈｚおよび７２．６６ｐｐｍ、ｔ、Ｊ＝４１Ｈｚ）；グリセロール三リン酸（６２．９３ｐｐｍ、ｄ、Ｊ＝４１Ｈｚ；６５．３１ｐｐｍ、ｂｒ  ｄ、Ｊ＝４３Ｈｚ；および７２．６６ｐｐｍ、ｄｔ、Ｊ＝６、４１Ｈｚ）
【０１０１】
（ＮＡＤＨと関連したグリセロールデヒドロゲナーゼの検定）
大腸菌株（ｇｌｄＡ）中のＮＡＤＨに関連したグリセロールデヒドロゲナーゼ活性は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、タンパク質を単離後に測定した。グリセロールおよびＮＡＤ+からジヒドロキシアセトンおよびＮＡＤＨへの変換は、フェナジンメトスルフェイト（ＰＭＳ）を媒介物として使用して、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）から濃く着色したホルマザンへの変換とカップリングした（Ｔａｎｇら．（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０：１８２）。
【０１０２】
電気泳動は、標準的な手順で未変性ゲル（８〜１６％ＴＧ、１．５ｍｍ、１５帯のゲル、Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して２回行った。残留のグリセロールは、５０ｍＭのトリスまたは炭酸カリウム緩衝液、ｐＨ９で３回、１０分間洗浄して、ゲルから除去した。２枚のゲルを、グリセロールの入った、または入っていない（約０．１６Ｍの最終濃度）、５０ｍＭのトリスまたは炭酸カリウム、ｐＨ９、６０ｍｇの硫酸アンモニウム、７５ｍｇのＮＡＤ+、１．５ｍｇのＭＴＴおよび０．５ｍｇのＰＭＳを含有する検定溶液１５ｍＬ中で展開した。
【０１０３】
大腸菌株（ｇｌｄＡ）中の、ＮＡＤＨと関連したグリセロールデヒドロゲナーゼ活性の有無もまた、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に、精製したＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｈｅｕｍｏｎｉａｅ）グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）に対するポリクロナール抗体と反応させることにより測定した。
【０１０４】
（プラスミドの構築および株の構築）
（大腸菌ＤＨ５αおよびＦＭ５中での、グリセロールの生成を増加させるための、グリセロース三リン酸のクローニングおよび発現）
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｎｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）第５染色体ラムダクローン６５９２（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ、寄託番号Ｕ１８８１３ｘ１１）は、ＡＴＣＣから入手した。グリセロール三リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）遺伝子は、５’末端にＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＸｂａＩ部位を、３’末端にＳｍａＩ部位を取り込んだ合成プライマー（配列番号１６および配列番号１７）を使用して、標的ＤＮＡとしてラムダクローンからクローニングによってクローン化した。生成物を、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｒｆＩ部位に入れ、サブクローン化し、ＧＰＰ２を含有するプラスミドｐＡＨ１５を生成した。プラスミドｐＡＨ１５は、ＧＰＰ２遺伝子を、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋中のｌａｃプロモーターからの発現に対して、不活性な向き（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１５由来のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋に挿入し、プラスミドｐＡＨ１９を生成した。ｐＡＨ１９は、ＧＰＰ２遺伝子を、ｌａｃプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９由来のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＰＨＯＸ２に挿入してプラスミドｐＡＨ２１を生成した。ｐＡＨ２１／ＤＨ５αは、発現プラスミドである。
【０１０５】
（大腸菌中でＤＡＲ１を過剰に発現するためのプラスミド）
ＤＡＲ１は、ゲノムＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡから、合成プライマー（配列番号１８および配列番号１９）を使用して、ＰＣＲクローニングによって単離した。成功したＰＣＲクローニングは、ＤＡＲ１の５’末端にＮｃｏＩ部位を配列するが、ここでＮｃｏＩ中のＡＴＧは、ＤＡＲ１のイニシエーターのメチオニンである。ＤＡＲ１の３’末端に、翻訳ターミネーターに続いて、ＢａｍＨＩ部位を挿入する。ＰＣＲ断片は、ＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中の同一部位にクローン化し、ｐＤＡＲ１Ａを生成した。
【０１０６】
ＤＡＲ１の５’末端に、より適切なリボソーム結合部位を生成するために、合成プライマー（配列番号２０および配列番号２１）をアニーリングして得たＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーを、ｐＤＡＲ１ＡのＮｃｏＩ部位に挿入してｐＡＨ４０を生成した。プラスミドｐＡＨ４０は、新しいＲＢＳおよびＤＡＲ１遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のｔｒｃプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含有する。ｐＤＡＲ１からのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、および合成プライマー（配列番号２２および配列番号２３）をアニーリングして得たＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーの別の一組を、ｐＢＣ−ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＡＨ４２を生成した。プラスミドｐＡＨ４２は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
【０１０７】
（ＤＡＲ１およびＧＰＰ２の発現カセットの構築）
ＤＡＲ１およびＧＰＰ２の発現カセットは、上述された個々のＤＡＲ１およびＧＰＰ２サブクローンから、標準的な分子生物学の方法を使って構築した。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９由来のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＡＨ４０に挿入してｐＡＨ４３を生成した。ＲＢＳおよびＧＰＰ２遺伝子を含有する、ｐＡＨ１９由来のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＡＨ４２に挿入してｐＡＨ４５を生成した。
【０１０８】
ＧＰＰ２の５’末端のリボソーム結合部位は、以下のように変更した。合成プライマーＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡ（配列番号２４）およびＣＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ（配列番号２５）を、ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９由来のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片とアニーリングして得た、ＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＳｐｅＩリンカーを、ｐＡＨ４０のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入してｐＡＨ４８を生成した。プラスミドｐＡＨ４８は、ＤＡＲ１遺伝子、変更されたＲＢＳ、およびＧＰＰ２遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のｔｒｃプロモーターからの発現に対して、正しい方向で含有する。
【０１０９】
（大腸菌の形質転換）
ここで述べた全てのプラスミドは、標準的な分子生物学の技法を用いて、大腸菌ＤＨ５αまたはＦＭ５中に形質転換した。形質転換細胞は、ＤＮＡ  ＲＦＬＰのパターンによって検証した。
【０１１０】
（実施例１）
（Ｇ３ＰＤＨ遺伝子で形質転換された大腸菌からのグリセロールの産生）
（培地）
ｐＤＡＲ１Ａで形質転換した大腸菌を使用する、嫌気性または好気性でのグリセロールの生成に、合成培地を使用した。培地は、１リットル当たり６．０ｇのＮａ2ＨＰＯ4、３．０ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＮＨ4Ｃｌ、０．５ｇのＮａＣｌ、１ｍＬの２０％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．０ｇのグルコース、４０ｍｇのカザミノ酸、０．５ｍｌの１％塩酸チアミン、１００ｍｇのアンピシリンを含有した。
【０１１１】
（増殖条件）
ｐＤＡＲ１ＡまたはｐＴｒｃ９９Ａベクターを有するＡＡ２００株を、３７℃で２５０ｍＬフラスコ中で、２５０ｒｐｍで振盪しながら、５０ｍＬの培地中で好気性条件下で増殖させた。吸光度６００で、０．２〜０．３のイソプロピルチオ−β−ガラクトシドを１ｍＭの最終濃度まで加え、インキュベーションを４８時間継続した。嫌気性の増殖については、、誘導細胞の試料を用いてＦａｌｃｏｎ＃２０５７管を充填し、これにキャップをし、３７℃で４８時間回転させて穏やかに混合した。グリセロールの生成は、培養上清をＨＰＬＣで解析して測定した。ｐＤＡＲ１Ａ／ＡＡ２００株は、嫌気性条件下で４８時間後に、０．３８ｇ／Ｌのグリセロールを、好気性条件下で０．４８ｇ／Ｌを生成した。
【０１１２】
（実施例２）
（Ｇ３Ｐホスファターゼ遺伝子（ＧＰＰ２）で形質転換された大腸菌からの、グリセロールの生成）
（培地）
大腸菌中のＧＰＰ２発現によって、グリセロールが増加することを実証するために、合成ｐｈｏＡを振盪フラスコに入れ使用した。ｐｈｏＡ培地は、１リットル当たり以下を含有した：Ａｍｉｓｏｙ１２ｇ、硫酸アンモニウム０．６２ｇ；ＭＯＰＳ１０．５ｇ；クエン酸Ｎａ１．２ｇ；ＮａＯＨ（１Ｍ）、１０ｍＬ；１Ｍ  ＭｇＳＯ4  １２ｍＬ；１００Ｘ微量元素１２ｍＬ；５０％グルコース１０ｍＬ；１％チアミン１０ｍＬ；１００ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−プロリン１０ｍＬ；２．５ｍＭ  ＦｅＣｌ3、５ｍＬ；混合リン酸緩衝液２ｍＬ（０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4  ５ｍＬ＋０．２Ｍ  Ｋ2ＨＰＯ4  ９ｍＬ）ｐＨ７．０。１Ｌ当たりのｐｈｏＡ培地中、１００倍希釈の微量元素は以下を含有した：ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５８ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．３４ｇ；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．４９ｇ；ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．４７ｇ；Ｈ3ＢＯ3、０．１２ｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．４８ｇ。
【０１１３】
（振盪フラスコ実験）
ｐＡＨ２１／ＤＨ５α（ＧＰＰ２遺伝子を含有）株、およびｐＰＨＯＸ２／ＤＨ５α株（対照）を、３７℃で２５０ｍＬの振盪フラスコに入れた４５ｍＬの培地中（ｐｈｏＡ培地、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１μｇ／ｍＬのビタミンＢ12）で増殖させた。培養物は好気性条件下で（２５０ｒｐｍの振盪）２４時間増殖させた。グリセロールの生成は、培養上清をＨＰＬＣ解析して測定した。ｐＡＨ２１／ＤＨ５αは、２４時間後、０．２ｇ／Ｌのグリセロールを生成した。
【０１１４】
（実施例３）
（ＧＰＰ２およびＤＡＲ１の両方を含有する組換え大腸菌を使用した、Ｄ−グルコースからのグリセロールの生成）
ｐＡＨ４３を含有する大腸菌ＤＨ５αによって、グリセロールの生成が増加することを実証するための増殖は、振盪フラスコ培地中（ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ、全容の１／５の液体容積）で３７℃で好気的に続ける。
【０１１５】
最小培地／１％グルコースを入れた振盪フラスコ中での培養は、抗生物質による選別を備えるＬＢ／１％グルコースを一晩培養したものを、接種することによって開始する。最小培地は、濾過−滅菌された合成培地、最終ｐＨ６．８（ＨＣｌ）であり、１リットル当たり以下のものを含有していた：１２．６ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１３．７ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．２ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１ｇのＮａＨＣＯ3、５ｍｇのビタミンＢ12、５ｍＬのＢａｌｃｈの微量元素溶液（この組成は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔら、ｅｄｓ、ｐ１５８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９４）の中で見ることができる）。振盪フラスコを３７℃で一晩激しく振盪しながらインキュベートし、次に、その上清をＧＣ解析の試料に供する。ｐＡＨ４３／ＤＨ５αは、２４時間後、３．８ｇ／Ｌのグリセロールを生成した。
【０１１６】
（実施例４）
（ＧＰＰ２およびＤＡＲ１の両方を含有する組換え大腸菌を使用した、Ｄ−グルコースからのグリセロールの生成）
実施例４は、ＧＰＰ２およびＤＡＲ１遺伝子の両方を含有する、組換え大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＨ４８からのグルコースの生成を例示する。
【０１１７】
ＤＨ５α／ｐＡＨ４８株は、一般的な方法の所で上述されたように構築した。
【０１１８】
（前培養）
ＤＨ５α／ｐＡＨ４８を、発酵操作に接種するために前培養を行った。前培養の成分およびプロトコールを以下に示す。
【０１１９】
前培養用培地
ＫＨ2ＰＯ4                                ３０．０ｇ／Ｌ
クエン酸                                    ２．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ２．０ｍＬ／Ｌ
９８％Ｈ2ＳＯ4                              ２．０ｇ／Ｌ
クエン酸第二鉄アンモニウム                  ０．３ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                          ０．２ｇ／Ｌ
酵母抽出物                                  ５．０ｇ／Ｌ
微量金属                                    ５．０ｍＬ／Ｌ
グルコース                                １０．０ｇ／Ｌ
カルベニシリン                            １００．０ｍｇ／Ｌ
【０１２０】
上記培地の成分を混合し、ｐＨをＮＨ4ＯＨで６．８に調整した。培地を次に濾過滅菌した。
【０１２１】
微量元素は、以下のレシピに従って使用した。
【０１２２】
クエン酸一水和物                            ４．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ３．０ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ                            ０．５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                    １．０ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ０．１ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                          ０．１ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2                                   ０．１ｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ０．１ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ                          １０ｍｇ／Ｌ
ＡｌＫ（ＳＯ4）2・１２Ｈ2Ｏ                 １０ｍｇ／Ｌ
Ｈ3ＢＯ3                                    １０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ                       １０ｍｇ／Ｌ
ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ                          １０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ2ＳｅＯ3                                １０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ                         １０ｍｇ／Ｌ
【０１２３】
培養は、５０μＬの凍結ストック（凍結保護物質として１５％グリセロール）を、２ＬのＥｒｌｅｎｍｃｙｅｒフラスコに入れた６００ｍＬの培地に接種して得た接種培地から開始した。培養物は、３０℃で２５０ｒｐｍの振盪機中で、約１２時間増殖させ、次にこれを使って発酵槽に播いた。
【０１２４】
（発酵増殖）
容器  １５−Ｌの攪拌タンク型発酵槽
培地
ＫＨ2ＰＯ4                                  ６．８ｇ／Ｌ
クエン酸                                    ２．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ２．０ｇ／Ｌ
９８％Ｈ2ＳＯ4                              ２．０ｍＬ／Ｌ
クエン酸第二鉄アンモニウム                  ０．３ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                          ０．２ｇ／Ｌ
消泡Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４                    １．０ｍＬ／Ｌ
【０１２５】
上記成分は、発酵容器中で合して滅菌した。ｐＨは、ＮＨ4ＯＨで６．７に上げた。酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）および微量元素溶液（５ｍＬ／Ｌ）は、濾過滅菌したストック溶液から無菌的に加えた。グルコースは、６０％供給から最終濃度１０ｇ／Ｌまで加えた。カルベニシリンは、１００ｍｇ／Ｌ加えた。接種後の容積は６Ｌであった。
【０１２６】
（発酵の環境条件）
温度は３６℃に調節し、空気の流速は１分間に６標準リットルに調節した。背圧は０．５バールに調節した。攪拌機は３５０ｒｐｍに設定した。アンモニア水は、ｐＨを６．７に調整するために使用した。グルコースの供給（６０％グルコース一水和物）速度は、過剰のグルコースを維持するように調節した。
【０１２７】
（結果）
発酵を実施した結果を表１に示す。
【０１２８】
【表１】
0004570775.tif 000003
【０１２９】
（実施例５）
（グルコースからグリセロールを生成するための大腸菌ＦＭ５のグリセロールキナーゼ変異体の設計）
（大腸菌ＦＭ５中でグリセロールキナーゼ遺伝子を置換するための組込みプラスミドの構築）
大腸菌ＦＭ５のゲノムＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）を使って調製した。部分的なｇｌｐＦおよびグリセロールキナーゼ（ｇｌｐＫ）遺伝子を含有する、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５〜３５０、１９８７）によって、ＦＭ５ゲノムＤＮＡから、プライマー配列番号２６および配列番号２７を使って増幅した。部分的なｇｌｐＫおよびｇｌｐＸ遺伝子を含有する１．１ｋｂのＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって、ＦＭ５ゲノムＤＮＡから、プライマー配列番号２８および配列番号２９を使って増幅した。ＭｕｎＩ部位をプライマー配列番号２８に挿入した。プライマー配列番号２８の５’末端は、次の重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲを可能にするためのプライマー配列番号２７のリバース・コムプレメントである。重複伸長の技法（Ｈｏｒｔｏｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：５２８〜５３５、１９９０）による遺伝子のスプライシングを用いて、鋳型としての上記２つのＰＣＲ断片、およびプライマー配列番号２６と配列番号２９を使って、ＰＣＲにより２．１ｋｂの断片を生成した。この断片は、１．５ｋｂのｇｌｐＫ遺伝子の中心領域から０．８ｋｂが欠損していることを示した。全体として、この断片は、ＭｕｎＩクローニング部位（部分的なｇｌｐＫ内）の両側に１．０ｋｂおよび１．１ｋｂのフランキング領域を有しており、相同組換えによる染色体の遺伝子置換を可能とした。
【０１３０】
上記２．１ｋｂのＰＣＲ断片を平滑末端にし（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ヌクレアーゼを使用して）、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローン化し、カナマイシンおよびＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を含有する５．６ｋｂのプラスミドｐＲＮ１００を生成した。ｐＬｏｘＣａｔ１（未公開産物）に由来し、バクテリオファージＰ１  ｌｏｘＰ部位（Ｓｎａｉｔｈら、Ｇｅｎｅ、１６６：１７３〜１７４、１９９５）に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する、１．２ｋｂＨｉｎｃＩＩ断片を用いて、プラスミドｐＲＮ１００中のｇｌｐＫ断片をＭｕｎＩで消化された（および平滑末端の）プラスミドｐＲＮ１００に連結することによってこの断片をインターラプトし、６．９ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０１−１を生成した。Ｒ６Ｋ起点を含有する３７６ｂｐの断片を、ベクターｐＧＰ７０４（ＭｉｌｌｅｒとＭｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊ．Ｂｅｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：２５７５〜２５８３、１９８８）からプライマー配列番号３０および配列番号３１を使用してＰＣＲによって増幅し、平滑末端化し、ｐＲＮ１０１−１由来の５．３ｋｂのＡｓｐ７１８−ＡａｔＩＩ断片（平滑末端化された）に連結し、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する５．７ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０２−１を生成した。ｐＲＮ１０１−１中のＣｏｌＥ１起点領域をＲ６Ｋ起点と置換して生成したｐＲＮ１０２−１はまた、大部分のＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を欠損している。ｐＲＮ１０２−１を複製するための宿主は、大腸菌ＳＹ３２７（ＭｉｌｌｅｒとＭｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：２５７５〜２５８３、１９８８）であったが、これはＲ６Ｋ起点が機能するのに必要なｐｉｒ遺伝子を含有する。
【０１３１】
（クロラムフェニコール耐性遺伝子を断続した、グリセロールキナーゼ変異体ＲＪＦ１０ｍの設計）
大腸菌ＦＭ５は、非複製組込みプラスミドｐＲＮ１０２−１で電気的に形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）し、クロラムフェニコール耐性（１２．５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン感受性（３０μｇ／ｍＬ）の形質転換細胞を、１ｍＭのグリセロールを含有するＭ９最小培地上でグリセロール非利用によってさらに選別した。ＲＪＦ１０ｍのような変異体に由来するゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩによる消化物は、サザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３〜５１７、１９７５）によってインタクトなｇｌｐＫでプローブすると、二重−交差組込み（ｇｌｐＫ遺伝子の置換）であったことを示した。これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子内に追加のＥｃｏＲＩ部位が存在することにより、２つの予想された７．９ｋｂおよび２．０ｋｂのバンドが観察されたためである。野生型の対照は、単一の予想された９．４ｋｂのバンドを生成した。変異体ＲＪＦ１０ｍの13ＣＮＭＲによる解析により、13Ｃで標識されたグリセロールおよびＡＴＰが、グリセロール三リン酸に変換するのは不可能であることが確認された。このｇｌｐＫ変異体を、予想された２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、および４．０ｋｂのＰＣＲ断片をそれぞれ生成するプライマーの組み合わせである配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、ならびに配列番号３２および配列番号３５を使用し、ゲノムＰＣＲによってさらに解析した。野生型の対照は、プライマー配列番号３２および配列番号３５を用いて、予想された３．５ｋｂのバンドを生成した。ｇｌｐＫ変異体ＲＪＦ１０ｍを、プラスミドｐＡＨ４８で電気的に形質転換して、グルコールからグリセロールを生成することが可能になった。ｇｌｐＫ変異体大腸菌ＲＪＦ１０ｍは、１９９７年１１月２４日のブタペスト条約の条項のもとに、ＡＴＣＣに寄託されている。
【０１３２】
（クロラムフェニコール耐性遺伝子インターラプトを除去した、グリセロールキナーゼ変異体ＲＪＦ１０の設計）
ＹＥＮＢ培地（０．７５％の酵母抽出物、０．８％の栄養ブイヨン）上で、３７℃で一晩増殖した後、水懸濁液中の大腸菌ＲＪＦ１０ｍをプラスミドｐＪＷ１６８（未公開の産物）で電気的に形質転換したが、該プラスミドは、ＩＰＴＧによる誘導が可能なｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でのバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子、温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコン、およびアンピシリン耐性遺伝子を含有した。３０℃のＳＯＣ培地中で十分に増殖した時、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）およびＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加したＬＢ寒天培地上で、形質転換細胞を３０℃で選択した。染色体クロラムフェニコール耐性遺伝子の切り出しをＣｒｅレコンビナーゼ（ＨｏｅｓｓとＡｂｒｅｍｓｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１：３５１〜３６２、１９８５）で媒介されたｌｏｘＰ部位で組換えにより行わせるために、プールしたコロニーの転移を、二晩、３０℃で、カルベニシリンおよびＩＰＴＧが添加された新鮮ＬＢ寒天培地上で行った。生じたコロニーは、レプリカプレート法により、カルベニシリンおよびＩＰＴＧを添加したＬＢ寒天培地およびクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天に植え、マーカー遺伝子の除去を示す、カルベニシリン耐性およびクロラムフェニコール感受性のコロニーを同定した。このようなコロニーを一晩３０℃で培養したものを、１０ｍＬのＬＢ寒天培地に接種した。３０℃で吸光度が０．６（６００ｎｍ）を示すまで増殖したら、培養物を３７℃で一晩インキュベートした。希釈液を数回、予め温めておいたＬＢ寒天培地に分注し、このプレートを一晩、４２℃（ｐＪＷ１６８の複製には、非許容温度）にてインキュベートした。生じたコロニーをレプリカプレート法により、ＬＢ寒天培地、およびカルベニシリン（７５μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に植え、プラスミドｐＪＷ１６８を失ったことを示す、カルベニシリン感受性のコロニーを同定した。このようなｇｌｐＫ変異体であるＲＪＦ１０を、プライマー配列番号３２および配列番号３５を使ってゲノムＰＣＲによってさらに解析し、マーカー遺伝子の切り出しを立証する予想された３．０ｋｂのバンドを生成した。変異体ＲＪＦ１０がグリセロールを利用しないことは、１ｍＭのグリセロールを含有するＭ９最小培地上で増殖が無いことから確認された。ｇｌｐＫ変異体ＲＪＦ１０は、プラスミドｐＡＨ４８で電気的に形質転換し、グルコースからグリセロールを生成することが可能になった。
【０１３３】
（実施例６）
（ＧＬＤＡ遺伝子をノックアウトした大腸菌株の構築）
ｇｌｄＡ遺伝子は、末端のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ取り込んだプライマー配列番号３６および配列番号３７を使用して、ＰＣＲ（Ｋ．Ｂ．ＭｕｌｌｉｓとＦ．Ａ．Ｆａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５〜３５０）によって、大腸菌から単離し、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位の間でクローン化（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ１９８２Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）し、ｐＫＰ８を生成した。ｐＫＰ８をｇｌｄＡ内で唯一のＳａｌＩおよびＮｃｏＩ部位で切断し、末端をＫｌｅｎｏｗで平滑化し連結したが、これによりｇｌｄＡの中ほどに１０９ｂｐの欠損と、唯一のＳａｌＩ部位の再生とをもたらし、このようにしてｐＫＰ９を生成した。カナマイシン耐性（ｋａｎ）を与える遺伝子を含有し、翻訳開始コドンのＤＮＡ上流約４００ｂｐｓおよび翻訳停止コドンのＤＮＡ下流約１００ｂｐｓを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片は、末端のＳａｌＩ部位を取り込んだプライマー配列番号３８および配列番号３９を使用して、ＰＣＲによってｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）から単離し、ｐＫＰ９の唯一のＳａｌＩ部位に入れサブクローン化して、ｐＫＰ１３を生成した。ｇｌｄＡ翻訳開始コドンの下流２０４ｂｐｓで始まり、ｇｌｄＡ翻訳停止コドンの上流１７８ｂｐｓで終わり、ｋａｎ（カナマイシン耐性）挿入を含有する２．１ｋｂのＤＮＡ断片は、末端のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ取り込んだプライマー配列番号４０および配列番号４１を使用して、ＰＣＲによってｐＫＰ１３から単離し、ｐＭＡＫ７０５（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位の間でサブクローン化し、ｐＭＰ３３を生成した。大腸菌ＦＭ５は、ｐＭＰ３３で形質転換し、ｐＭＡＫ７０５の複製に対する許容温度である３０℃で、２０μｇ／ｍＬでｋａｎを選別した。あるコロニーを一晩３０℃で、２０μｇ／ｍＬのｋａｎを添加した液体培地中で増殖させた。約３２，０００細胞を２０μｇ／ｍＬのｋａｎ上に播き、ｐＭＡＫ７０５の複製にとって抑制的な温度である４４℃で、１６時間インキュベートした。４４℃で増殖する形質転換細胞は、染色体に組み込まれたプラスミドを保持し、これは約０．０００１の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）で発生する。ＰＣＲおよびサザンブロット（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ１９７５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３〜５１７）解析を使用して、形質転換細胞中の染色体組込みの性質を確認した。ウェスタンブロット解析（Ｈ．Ｔｏｗｂｉｎら、（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０）を使用して、ｇｌｄＡの産物であるグリセロールデヒドロゲナーゼタンパクが形質転換細胞中で生成されているかどうかを確認した。活性の検定を使用して、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が形質細胞中に残っているかどうかを確認した。未変性ゲル上のグリセロールデヒドロゲナーゼバンド中の活性は、グリセロール＋ＮＡＤ（＋）からジヒドロキシアセトン＋ＮＡＤＨ���の変換を、テトラゾリウム染料、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］から濃く着色したホルマザンへの変換と、フェナジンメトサルフェートを媒介物としてカップリングして測定した。グリセロールデヒドロゲナーゼはさらに、３０ｍＭの硫酸アンモニウムおよび１００ｍＭのトリス、ｐＨ９の存在を要求する（Ｃ．Ｔ．Ｔａｎｇら、（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０：１８２）。解析した８例の形質転換細胞のうち、６例がｇｌｄＡをノックアウトしていることが確認された。大腸菌ＭＳＰ３３．６は、１９９７年１１月２４日のブタペスト条約の条項のもとに、ＡＴＣＣに寄託されている。
【０１３４】
（実施例７）
（ＧＬＰＫおよびＧＬＤＡ遺伝子のノックアウトされた大腸菌株の構）
ｇｌｄＡ遺伝子を含有し、翻訳開始コドンのＤＮＡ上流２２８ｂｐｓおよび翻訳停止コドンのＤＮＡ下流２２０ｂｐｓを含む、１．６ｋｂのＤＮＡ断片は、末端のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ取り込んだプライマー配列番号４２および配列番号４３を使用してＰＣＲによって大腸菌から単離し、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位の間でクローン化し、ｐＱＮ２を生成した。ｐＱＮ２は、ｇｌｄＡ内の唯一のＳａｌＩおよびＮｃｏＩ部位で切断し、末端をＫｌｅｎｏｗで平滑化し連結し、これによりｇｌｄＡの中ほどに１０９ｂｐｓの欠損と、唯一のＳａｌＩ部位の再生をもたらしたが、このようにしてｐＱＮ４を生成した。カナマイシン耐性（ｋａｎ）を与える遺伝子を含有し、ｌｏｘＰ部位に隣接する１．２ｋｂのＤＮＡ断片は、ｐＬｏｘＫａｎ２（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）からＳｔｕＩ／ＸｈｏＩ断片として単離し、Ｋｌｅｎｏｗで末端を平滑化し、さらにＫｌｅｎｏｗで平滑にした後ｐＱＮ４のＳａｌＩ部位に入れサブクローン化し、ｐＱＮ８を生成した。Ｒ６Ｋの複製起点を含有する０．４ｋｂのＤＮＡ断片は、ｐＧＰ７０４（ＭｉｌｌｅｒとＭｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：２５７５〜２５８３、１９８８）から、末端のＳｐｈＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ取り込んだ、プライマー配列番号４４および配列番号４５を使用して、ＰＣＲによって単離し、ｐＱＮ８由来のｇｌｄＡ：：ｋａｎカセットを含有する２．８ｋｂのＳｐｈＩ／ＸｂａＩ  ＤＮＡ断片と連結し、ｐＫＰ２２を生成した。クロラムフェニコール耐性（ｃａｍ）を与える遺伝子を含有し、ｌｏｘＰ部位に隣接した１．０ｋｂのＤＮＡ断片は、ｐＬｏｘＣａｔ２（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から、ＸｂａＩ断片として単離し、ｐＫＰ２２のＸｂａＩ部位に入れサブクローン化し、ｐＫＰ２３を生成した。大腸菌株ＲＪＦ１０（実施例５を参照）は、ｇｌｐＫ−であるが、ｐＫＰ２３で形質転換し、ｋａｎＲｃａｍＳの表現型を有する形質転換細胞を単離したが、これは二重交差組込みを示すことがサザンブロット解析によって確認された。グリセロールデヒドロゲナーゼのゲルの活性検定（実施例６で述べられたように）により、活性グリセロールデヒドロゲナーゼが、これらの形質転換細胞には存在しないことが証明された。ｋａｎマーカーを、実施例５で述べられたように、Ｃｒｅ−産生プラスミドｐＪＷ１６８を使って、染色体から除去し、ＫＬＰ２３株を生成した。表現型ｋａｎＳを有する数個の単離体は、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が無いことを証明し、またサザンブロット解析によりｋａｎマーカーを失ったことが確認された。
【０１３５】
配列番号４４：
ＣＡＣＧＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴＡＣ
配列番号４５：
ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧ
【０１３６】
（実施例８）
（ＧＰＰ２およびＤＡＲ１の両方を含有し、グリセロールキナーゼ（ＧＬＰＫ）活性を有するまたは有しない組換え大腸菌によって、Ｄ−グルコースから生産されたグリセロールの構築）
実施例８は、組換え大腸菌ＦＭ５／ｐＡＨ４８およびＲＪＦ１０／ｐＡＨ４８による、グリセロールの消費量を例示する。ＦＭ５／ｐＡＨ４８およびＲＪＦ１０／ｐＡＨ４８株は、上述したように一般的な手法で構築した。
【０１３７】
（前培養）
ＦＭ５／ｐＡＨ４８およびＲＪＦ１０／ｐＡＨ４８は、発酵槽に接種するために、発酵に使用したのと同一の培地、または１％グルコースを添加したＬＢ中で前培養した。カルベニシリンかアンピシリンのどちらかを、プラスミドを維持するために使用（１００ｍｇ／Ｌ）した。発酵用の培地は、実施例４で述べたとおりである。
【０１３８】
培養は、２ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに、６００ｍＬの培地を入れた中に、凍結ストック（凍結保護物質として１５％グリセロール）を入れて開始し、３０℃で２５０ｒｐｍの振盪機中で約１２時間増殖させ、発酵槽に植えるに使用した。
【０１３９】
（発酵増殖）
初期容積５〜７Ｌを入れた、１５Ｌの攪拌タンク型発酵槽は、実施例４に述べられたように調製した。カルベニシリンまたはアンピシリンを、プラスミドを維持するために使用（１００ｍｇ／Ｌ）した。
【０１４０】
（グリセロールキナーゼ（ＧｌｐＫ）活性を測定するための環境条件）
気温は３０℃に調整し、空気の流速は１分当たり６標準リットルに調整した。背圧は０．５バールに調整した。溶存酸素引張は、攪拌によって１０％に調整した。アンモニア水をｐＨ６．７に調節するために使用した。グルコースの供給（６０％グルコース）速度は、グリセロールが少なくとも２５ｇ／Ｌに蓄積するまで、過量のグルコースを維持するように調節した。グルコースを次に無くし、グリセロールの正味代謝をもたらした。表２に生じたグリセロール変換を示す。
【０１４１】
【表２】
0004570775.tif 000004
【０１４２】
表２のデータから分かるように、グリセロールの消費速度は、内因性のグリセロールキナーゼ活性が除去されると、４〜５倍減少する。
【０１４３】
グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｄＡ）活性を測定するための環境条件
気温は３０℃に調整し、空気の流速は１分当たり６標準リットルに調整した。背圧は０．５バールに調整した。溶存酸素引張は、攪拌によって１０％に調整した。アンモニア水をｐＨ６．７に調節するために使用した。最初の発酵では、発酵の間グルコースを過量に維持した。２番目の発酵では、最初の２５時間の後、残余のグルコースが無い状態で行った。ＧｌｐＫおよびＧｌｄＡ活性を測定するために、２つの発酵物から時間の経過とともに試料を採取した。表３に、ＧｌｄＡがグリセロールの選択率に及ぼす効果を示す、ＲＪＦ１０／ｐＡＨ４８の発酵を要約する。
【０１４４】
【表３】
0004570775.tif 000005
【０１４５】
表３のデータから分かるように、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｄＡ）活性の存在は、グルコースが限定された条件下でグリセロールの変換に関連している；したがって、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を除去すると、グリセロールの変換が減少することが予想される。
【０１４６】
（実施例９）
（ＧＰＰ２およびＤＡＲ１の両方を含有する組換えＥ．ＢＬＡＴＴＡＥを用いたＤ−グルコースからのグリセロールの生成）
実施例９は、ＧＰＰ２およびＤＡＲ１遺伝子の両方を含有する組換えＥ．ブラッテ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）によるＤ−グルコースからのグリセロール生成を例示する。
【０１４７】
ＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣ寄託番号３３４２９を持つＥ．ブラッテ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）は、３０℃で、培養が６００ｎｍで約０．６ＡＵの吸光度に到達するまで増殖させた。次にエレクトロポレーションを使って、培養物を、ＧＰＰ２およびＤＡＲ１遺伝子を構成するプラスミドｐＡＨ４８で形質転換した。形質転換細胞は、ＤＮＡ  ＲＦＬＰパターンおよび抗生物質耐性（２００μｇ／ｍＬのカルベニシリン）によって確認した。
【０１４８】
形質転換されたＥ．ｂｌａｔｔａｅは、振盪フラスコ培養中で３５℃で、好気的に増殖させた。培養物は、抗生物質による選別を備える２％グルコースを加えた合成培地中で増殖させ、抗生物質による選別を備える１％グルコースを加えたＬＢ中で一晩増殖させたものを接種して開始した。合成培地は１リットル当たり以下のものを含有した：２７．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、２ｇのクエン酸、２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．２ｍｌの９８％Ｈ2ＳＯ4、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１０ｇの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＬのＢａｌｃｈの微量元素溶液（この組成はＭｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔら、ｅｄｓ、ｐ１５８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、（９９４）の中で見ることができる）。合成培地は、濾過滅菌し、ＮＨ4ＯＨで最終ｐＨを６．８に調整した。振盪フラスコは、３５℃で一晩、激しく振盪しながらインキュベートした。上清を次に、グリセロールの存在を確認するためにＨＰＬＣ解析に供した。一晩インキュベーションした後、ｐＡＨ４８を含有するＥ．ｂｌａｔｔａｅは、グリセロール７．６３ｇ／Ｌを生成した。対照は、同一条件下で増殖させた野生型Ｅ．ブラッテ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）（ＡＴＣＣ３３４３９）であったが、これはグリセロール０．２ｇ／Ｌを生成した。
【０１４９】
（実施例１０）
（ＧＬＤＡおよびＧＬＰＫが欠損し、染色体に組込まれたＧＰＰ２およびＤＡＲ１の両方を含有する、組換え大腸菌を使用したＤ−グルコースからのグリセロールの生成）
この実施例は、ｇｌｄＡおよびｇｌｐＫ遺伝子がノックアウトされ、宿主細胞の染色体に組み込まれたＧＰＰ２、およびＤＡＲ１をコードする遺伝子を含有する、組換え大腸菌由来のＤグルコースから、グリセロールを生成するのを例示する。
【０１５０】
実施例７で述べられたように調製した大腸菌株ＫＬＰ２３は、グリセロールキナーゼ（ｇｌｐＫ産物）およびグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ産物）活性が欠損している。ＤＡＲ１、ＧＰＰ２、およびａｍｐＣ領域で染色体に組み込まれた、ｌｏｘＰ隣接クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するＫＬＰ２３を調製したが、これをＡＨ７６ＲＩｃｍと呼ぶ。
【０１５１】
組込みプラスミドは、ｃｒｅ−ｌｏｘ組込み系（Ｈｏｅｓｓ、ｓｕｐｒａ）に基づいて設計および構築した。組込みプラスミドを生成するために、ｐＬｏｘＣａｔＩのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ線形ｐＡＨ４８に挿入して、ｐＡＨ４８ｃｍ２を生成した。ｐＡＨ４８プラスミドは、ｔｒｃプロモーターの制御下に発現する、ＤＡＲ１およびＧＰＰ２遺伝子を含有する。ｐＡＨ４８ｃｍ２の３．５ｋｂのＡｐａＬ  Ｉ断片を、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）およびｄＮＴＰｓで平滑末端にし、大腸菌ＳＹ３２７（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５〜２５８３、１９９８）を宿主として使用して、ＮｒｕＩ  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｐＩｎｔ−ａｍｐＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＣＡ）に挿入し、ｐＡＨ７６およびｐＡＨ７６Ｒを生成した。「Ｒ」は、組込みカセットの逆向きを意味する。両プラスミド、ｐＡＨ７６およびｐＡＨ７６Ｒは、Ｒ６Ｋ複製起点を含有し、ＫＬＰ２３中で複製することができない。プラスミドｐＡＨ７６およびｐＡＨ７６Ｒを使用して、大腸菌の染色体のａｍｐＣ領域に組み込むようにＫＬＰ２３を形質転換した。形質転換細胞は、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで選別し、これはカナマイシン感受性であったが、二重交差組込みを生成した。これらの大腸菌形質転換細胞を、ＡＨ７６ＩｃｍおよびＡＨ７６ＲＩｃｍと命名した。
【０１５２】
ＡＨ７６ＲＩｃｍ培養を、合成培地（実施例９で述べた）に２．５％グルコースを添加した振盪フラスコ中に、一晩培養した、１％グルコースおよび抗生物質による選別を備えたＬＢ培地接種して開始し、増殖させた。振盪フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ、全容の１／５の液体容量）を、３７℃で激しく振盪しながら一晩インキュベートし、その上清を、Ｍｏｎａｒｃｈ２０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）で、色調測定酵素検定法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．３３７）を使用して、グリセロールを測定するための試料に供した。ＡＨ７７ＲＩｃｍは、２５時間後に、６．７ｇ／Ｌのグリセロールを生成したことを示した。
【０１５３】
大腸菌ｐＡＨ７６ＲＩは、ＡＨ７６ＲＩｃｍから削除された、クロラムフェニコール遺伝子を有する。クロラムフェニコール遺伝子は、Ｃｒｅ−生成プラスミドｐＪＷ１６８を使用して、実施例５に述べられたように染色体から除去した。３０℃で１ｍＭのＩＰＴＧの誘導下に、カルベニシリン耐性およびクロラムフェニコール感受性の形質転換細胞を選別した。クロラムフェニコール遺伝子を除去した後、ＡＨ７６ＲＩを、ｐＪＷ１６８を治療する抗生物質を含まないＬＢ培地上で増殖させた。ＡＨ７６ＲＩの最終型は、クロラムフェニコールまたはカルベニシリンの選択では、増殖できない。
【０１５４】
ＡＨ７６ＲＩ培養を、合成培地に２．５％グルコースを添加した振盪フラスコ中に、一晩培養したＬＢ／１％グルコースを接種して開始し、増殖させた。振盪フラスコを、３５℃で激しく振盪しながら一晩インキュベートし、その上清を、Ｍｏｎａｒｃｈ２０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）で、色調測定検定法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．３３７）を使用して、グリセロールを測定する試料に供した。ＡＨ７７ＲＩは、２４時間後に、グリセロール４．６ｇ／Ｌを生成したことを示した。
【０１５５】
この実施例で述べられたすべてのプラスミドは、標準の分子生物学的な技法を使って、大腸菌ＫＬＰ２３に形質転換した。形質転換細胞は、ＤＮＡ  ＲＦＬＰパターン、抗生物質耐性、ＰＣＲ増幅またはＧ３Ｐリン酸塩検定によって確認した。
【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、グリセロール代謝を含む代表的な酵素経路を例示している。
【配列表】
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