(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのエピトープを含む抗原ドメイン、および転送ドメインを含むキメラ蛋白質であって、当該転送ドメインはリソソーム膜ポリペプチドのリュメナルドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含み、膜蛋白質及び非膜蛋白質の双方を細胞内のエンドソーム／リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内小器官へ向けるものであり、前記抗原ドメインが、前記リソソーム膜ポリペプチドのリュメナルドメインのＣ末端側に結合し、かつ前記抗原ドメインのＣ末端側には前記膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが結合されていることを特徴とする、キメラ蛋白質。
【請求項２】
少なくとも一つのエピトープを含む抗原ドメイン、および転送ドメインを含むキメラ蛋白質であって、当該転送ドメインはリソソーム膜ポリペプチドのリュメナルドメイン及びエンドサイティック受容体のエンドソーム転送ドメインを含み、膜蛋白質及び非膜蛋白質の双方を細胞内のエンドソーム／リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内小器官へ向けるものであり、前記抗原ドメインが、前記リソソーム膜ポリペプチドのリュメナルドメインのＣ末端側に結合し、かつ前記抗原ドメインのＣ末端側には前記エンドサイティック受容体のエンドソーム転送ドメインが結合されていることを特徴とする、キメラ蛋白質。
【請求項３】
エンドサイティック受容体が、Fc-受容体、補体受容体、スキャベンジャー受容体、インテグリン、レクチン、DEC-205ポリペプチド、gp200-MR6ポリペプチド、Toll-like受容体、熱ショック蛋白質受容体、アポトーシスあるいはネクローシス性物質受容体からなるグループから選択される受容体の転送ドメインを含むものである、請求項２に記載のキメラ蛋白質。
【請求項４】
リソソーム膜ポリペプチドのリュメナルドメインが、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3、DC-LAMP、あるいはLIMPポリペプチドに由来するものである、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項５】
蛋白質が、蛋白質をエンドソーム／リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内小器官に標的化するための標的化ドメイン、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、ジロイシンドメイン、Tyrモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ser-Val-Valドメインからなるグループから選択される一つもしくはそれ以上のドメインをさらに含むものであって、前記Tyrモチーフドメインが、Xaaはいかなるアミノ酸であってもよく、Xbbは疎水性アミノ酸である、テトラペプチド配列Tyr-Xaa-Xaa-Xbbを含むものである、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項６】
区画および／または細胞内小器官がMHCクラスII分子を含むものである、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項７】
区画および／または細胞内小器官への転送が抗原の処理をもたらす、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項８】
処理された抗原がMHCクラスII分子に結合して細胞表面において発現される、請求項７に記載のキメラ蛋白質。
【請求項９】
抗原が、病原体由来の抗原性物質の一部、ガン特異的ポリペプチド由来の抗原性物質の一部、異常な生理学的応答と関連のある分子由来の抗原性物質の一部からなるグループから選択されるものである、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項１０】
病原体がウイルス、微生物あるいは寄生虫である、請求項９に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１１】
ウイルスがHIVウイルスである請求項１０に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１２】
異常な生理学的応答が、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、移植への反応、過敏症応答、あるいは先天性疾患である、請求項９に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１３】
エンドソーム区画が、MIIC、CIIV、メラノソーム、分泌顆粒、溶解（lytic）顆粒、血小板密集顆粒、好塩基性（basophil）顆粒、バーベック（Birbeck）顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソームからなるグループから選択されるものである、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラ蛋白質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のキメラ蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含み、当該核酸分子が操作可能に発現制御配列に結合された、ベクター又は運搬媒体。
【請求項１６】
ベクター又は運搬媒体が脂質に基づくもの、ウイルスに基づくものあるいは細胞に基づくものである、請求項１５に記載の運搬媒体。
【請求項１７】
請求項１５に記載のべクター又は運搬媒体を含む細胞。
【請求項１８】
細胞が抗原提示細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
抗原提示細胞がプロフェッショナルな抗原提示細胞、あるいは、作り出された抗原提示細胞であり、かつMHCクラスII分子を発現するものである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
少なくとも二つの細胞が異なるMHCクラスII分子を発現し、個々の細胞が同じベクター又は運搬媒体を含むものである、請求項１５に記載のベクター又は運搬媒体を含む複数の細胞を含むキット。
【請求項２１】
請求項１５に記載のベクター又は運搬媒体と、当該ベクター又は運搬媒体を受け入れるための細胞を含むキット。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の少なくとも一つの細胞を含む、ヒト以外の形質転換動物。
【請求項２３】
抗原に対する免疫応答を誘発する請求項１５に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２４】
ベクター又は運搬媒体が動物の細胞に感染可能なものである、請求項２３に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２５】
抗原が、病原体由来の抗原性物質の一部、ガン特異的ポリペプチド由来の抗原性物質の一部、異常な生理学的応答と関連のある分子由来の抗原性物質の一部からなるグループから選択されるものである、請求項２３又は２４に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２６】
病原体がウイルス、微生物あるいは寄生虫である、請求項２５に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２７】
ウイルスがHIVウイルスである請求項２６に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２８】
異常な生理学的応答が、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、あるいは先天性疾患である、請求項２５に記載のベクター又は運搬媒体。
【請求項２９】
請求項２５〜２８のいずれかに記載のベクター又は運搬媒体と薬学的担体とを含む、ＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン。
【請求項３０】
ＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチンが、ウイルス、微生物あるいは寄生虫からなる病原体に由来する疾患の治療又は予防のためのものである、請求項２９に記載のＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン。
【請求項３１】
ＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチンが、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、あるいは先天性疾患の治療又は予防のためのものである、請求項２９に記載のＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン。
【請求項３２】
請求項９〜１３のいずれかに記載のキメラ蛋白質と薬学的担体とを含む、ペプチドワクチン。
【請求項３３】
ペプチドワクチンが、ウイルス、微生物あるいは寄生虫からなる病原体に由来する疾患の治療又は予防のためのものである、請求項３２に記載のペプチドワクチン。
【請求項３４】
ペプチドワクチンが、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、あるいは先天性疾患の治療又は予防のためのものである、請求項３２に記載のペプチドワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2001年4月5日に出願された米国特許仮出願第60/281607号、米国特許仮出願第60/281608号、および、米国特許仮出願第60/281621号に、35U.S.C.119(e)に基づく優先権を請求するものである。これらの仮出願の内容は参考としてここに挿入される。
【０００２】
（政府資金）
本出願に含まれる研究は国立衛生研究所からの政府助成金A141908のもとで遂行された。米国政府は本発明に一定の権利を有するだろう。
【０００３】
本発明は抗原配列と転送（トラフィッキング（trafficking））ドメインからなるキメラワクチン、当該ワクチンをコードする核酸、及び、当該ワクチンの使用方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物における免疫系での抗原認識と応答は、部分的には、T細胞と抗原提示細胞との間の相互作用により支配されている。ヘテロダイマーのT細胞受容体を通じて、T細胞は主要組織適合抗原（MHC分子）との複合体として提示された抗原のペプチド断片を認識する（YewdellおよびBennenk, Cell 62: 203, 1990; DavisおよびBjorkman, Nature 334: 395, 1988）。（外来化学物質や、バクテリア、毒素のような）細胞外から導入された外来抗原と、（ウイルスやガン遺伝子産物のような）細胞内で生成された内在性抗原との２つのタイプの抗原を区別できる、T細胞と抗原提示分子との２つの対応した細胞システムが存在する（Bevan, Nature, 325: 192, 1987; Bracialeら、Immunol. Rev. 98: 95, 1987; Germain, Nature 322: 687,1986）。
【０００５】
MHC分子には、MHCクラスI分子とMHCクラスII分子の２つの概括的なクラスが存在する。ＭＨＣクラスＩ分子は、一般的に、内在的に産生された蛋白質に由来するペプチド抗原を、抗原に特異的な主な細胞傷害性T細胞であるCD8＋Tc細胞に提示する。MHCクラスI関連蛋白質の加水分解系は、非常に異常である蛋白質や短命分子やウイルス蛋白質を分解するために、ほとんどすべての細胞に存在する。この蛋白質の加水分解は、非リソソーム系であり、ユビキチンポリペプチドへのATP依存共有結合による抱合を含むと考えられている（Goldbergら., Nature, 357: 375, 1992）。ペプチド断片は、おそらくより大きなプロテアソーム複合体とともに小胞体（ER）や他のタイプの（エンドサイティック/リソソーム区画（endocytic/lysosomal compartment）以外の）エキソサイティック区画（exocytic compartment）に入ることを要求される。そこでペプチド断片はMHCクラスI分子に結合し、小胞体からゴルジ体を通じて、MHCI蛋白質を介してCD3-CD8細胞傷害性T細胞抗原受容体にペプチド断片が提示される細胞表面へという、構成性分泌経路へ従う。
【０００６】
MHCクラスII分子は一般に、抗原を含む分子を細胞外から取り込み、エンドソーム/リソソーム細胞内器官（細胞のエンドサイトーシスにより形成された小胞の後のやや大きな小胞構造をしている細胞内器官）で抗原性ペプチド断片を生成することを含む工程により、細胞外から導入された抗原を提示する。外来抗原が抗原提示細胞（APC）において処理されるというMHCクラスII関連の工程は、一般的にエンドサイトーシス経路で起こると信じられている。液性ピノサイトーシス、吸着性エンドサイトーシス、あるいは食作用(phagocytosis)により細胞内へと取り込まれた抗原は、プロテアーゼや他の加水分解酵素により消化されて大きな分子がペプチドへと変換される後期エンドソーム/リソソーム区画（late endosomal/lysosomal compartment）へと移行する。この工程の間に、免疫原となる小さいペプチドがMHCクラスII分子と接触して結合し、そのペプチドは細胞表面へと運ばれる。APCの細胞表面では、これらの短鎖ペプチドがMHCクラスII分子とともに、ヘルパーT細胞の表面上のCD3-CD４複合体に結合し、これらの細胞の複製と免疫機能を活性化する。この反応に続いて、ヘルパーT細胞は白血球の増殖と分化を刺激するリンフォカインを放出し、感染部位からの白血球の移動を阻害する。一般にヘルパーT細胞のペプチドが提示されたAPCによる活性化は、適切なB細胞とT細胞の活動にとって必要であり、それゆえ適切な免疫システムが機能するために必要である。
【０００７】
エンドソーム/リソソーム経路での抗原処理と、処理されたペプチドがMHCクラスIIと結合する正確な部位は、いまだ解明されていない。MHCクラスII分子は初期エンドソーム区画 においてエンドサイトーシスされた蛋白質に出会うことを示唆するデータが公報されている（Guagliardiら、Nature 343: 133, 1990）。部分的に処理された抗原や容易に分解可能な抗原は、初期エンドソーム区画（early endosomal compartment） においてMHCクラスIIと結合するペプチドを生じることができるだろう。しかしながら、後期エンドソーム、リソソーム、あるいはリソソームに関連する異なる小胞（区画）のいずれかに、抗原処理と、MHCクラスIIとの結合の主要な部位があることを示す証拠がある (Neefjesら、Cell 61: 171, 1990)。
【０００８】
T細胞の２タイプの機能は、その名前が示すように全く異なっている。細胞傷害性T細胞は、細胞の直接的可溶化や、γインターフェロンのようなサイトカインを分泌することにより、細胞内病原体や腫瘍を根絶する。ヘルパーT細胞もまた細胞を可溶化するが、その第一の機能はB細胞（抗体産生細胞）や他のT細胞を活性化するサイトカインを分泌し、抗体介在性やTc介在性の応答機構を含む外来抗原への免疫応答を広く活性化することである。
【０００９】
CD4＋T細胞は免疫応答における主要なヘルパーT細胞の表現型である。その主な機能は、免疫応答の本質的にすべてのほかの機能を制御するサイトカインを産生することである。CD4＋の枯渇した動物や、（AIDS患者のような）CD4＋細胞の枯渇したヒトは、抗体反応、細胞傷害性T細胞応答、あるいは遅延型過敏症応答を生じることができない。ヘルパーT細胞が免疫応答制御において重要であることは当該分野においてよく知られている。
【００１０】
CD4＋MHCクラスII制限細胞は多くのシステムにおいて細胞傷害性能力を有することが示されている。CD4＋細胞傷害性T細胞の能力が証明される最も重要な疾病関連の例の一つは、HIV gp120蛋白質への応答にある（Polydefkisら、J. Exp. Med. 171: 875, 1990）。CD4＋MHC クラスII制限細胞はまた、腫瘍に対する全身性の免疫応答を発揮するのに重要であることが示されている。採用された輸送モデル（Adoptive transfer model）において、CD4＋細胞はマウスのFBL腫瘍を減少させる上で重要である。GolumbekらのScience 254: 713, 1991に記載される活性の免疫治療モデルでは、CD4＋細胞はまた多くの異なる固形の悪性腫瘍（solid malignancies）に対する全身性の免疫応答において重要であることが示されている。
【００１１】
CD4＋MHCクラスII制限細胞は、免疫応答のT細胞戦略における重要な記憶細胞のようであり、適当なワクチン手法はCD4＋抗原特異的MHCクラスII制限記憶T 細胞集団を産生することである。
【００１２】
伝統的なワクチンは、殺傷された病原性の系統（pathogenig strains）であろうと、弱毒化された病原性を有する系統（strains with attenuated pathogenicity）であろうと、生物体全体に依存する。一方、これらのワクチンはもし弱毒化が不十分であった場合、あるいは、ワクチン調製間の殺傷ステップにおいて生物が十分生存できた場合には、防御のためにデザインされた病気を引き起こすという危険性を有している。一方で、このようなワクチンは感染性が低減され、しばしば不十分な免疫原性しか有さず、その結果ワクチンによる不十分な防御しかもたらさない。
【００１３】
最近、病原性生物に由来する個々の抗原性蛋白質に基づく新しいワクチンを開発する試みにおいて、分子生物学的手法が用いられてきている。概念的には、生物体全体よりも抗原性ペプチドを使用する方が、最も免疫原性の高いエピトープを含むワクチンを提供できる場合には、発病を避けることができるだろうというものである。しかしながら純粋なペプチドや炭水化物は免疫原性が弱い傾向にあり、適切に処理されて免疫系に効果的に提示されるために化学的アジュバントを必要とすると考えられる。T細胞の応答に依存するワクチンは、様々なMHCタイプの標的集団において免疫を賦活化するのに必要なだけ多くのT細胞エピトープを有してなければならない。さらにT細胞認識には細胞内の蛋白質処理が必要なことから、抗原の細胞内在化と処理を促進するワクチンの調製が、より効果的な免疫応答を引き起こすこととなるだろう。MHC分子へ抗原を向ける以前の試みは（米国特許第４４００２７６号参照）、抗原の処理段階が行われなかったため、効果的でなかった。成功したB型肝炎のワクチンでは、B型肝炎ウイルスのクローン化された表面抗原を用いてワクチンが調製されていたが、この成功は肝炎の表面抗原分子が凝集しやすい傾向にあり、高い免疫原性を有する正規の粒子（regular particle）を形成することによるものと考えられる。
【００１４】
遺伝子（DNA）ワクチンは、予防用及び治療用のワクチン開発において新しくて将来有望な候補である。それらは安全であることが証明されており、ベクター骨格への免疫応答の欠如は、ワクチンの繰り返し投与が治療効果を達成するために必要とされる場合には、絶対的な利点となる。しかしながら、慣用的なDNAワクチンのひとつの潜在的な欠点は、ヒトにおける免疫原性の低さである。この低免疫原性のひとつの推定される理由は、細胞内で形成された抗原の、抗原処理とヘルパーＴ細胞への提示のためのMHCII経路へのアクセスが制限されているためである。
【００１５】
米国特許第５６３３２３４号には、抗原性ドメインと、抗原をエンドソーム/リソソーム区画に効果的に標的化する細胞質エンドソーム/リソソーム標的化シグナル（Cytoplasmic endosomal/lysosomal targeting signal）からなるキメラ蛋白質が記載されている。抗原性ドメインが処理され、それ由来のペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子とともに細胞表面に提示される。LAMP-1の細胞質末端（cytoplasmic tail）が、キメラ蛋白質のエンドソーム/リソソーム標的化ドメイン（endosomal/lysosomal targeting domain）を形成するのに使用された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、免疫原性が高められた、特に、ＤＮＡワクチンやＲＮＡワクチンのような遺伝子ワクチンを提供することを目的とする。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、免疫原が処理されＭＨＣクラスII分子へ提示されることでヘルパーＴ細胞が優先的に刺激される、リソソーム/エンドソーム区画や、（たとえば、ＭIIＣ，ＣIIＶ，メラノソーム、分泌顆粒、バーベック顆粒（Birbeck granules）等のような）関連した細胞内器官へ向けられる（膜蛋白質由来であるか非膜蛋白質由来であるかにかかわらない）免疫原を使用することで、より効果的なワクチン手法を提供することである。
【００１８】
さらに、ヘルパーＴ細胞の刺激を通じて抗腫瘍免疫応答を誘導することで、改良されたガン治療法を提供することを、目的とする。
【００１９】
ある態様（aspect）において、本発明は抗原の少なくともひとつのエピトープを含むN末端ドメイン（N terminal domain）、および、膜蛋白質と膜非結合性蛋白質の両方を細胞内の（たとえばリソソームのような）エンドソーム区画へ向けることができる転送（トラフィッキング(trafficking)）ドメインを含むキメラ蛋白質を提供することである。好ましくは転送ドメインは、LAMP-1やLAMP-2ポリペプチドのようなLAMPのリュメナル（lumenal) ドメインを含むものである。
【００２０】
他の態様において、キメラ蛋白質は、Xaaはいかなるアミノ酸でもよくXbbは疎水性のアミノ酸であるという条件下のTyr-Xaa-Xaa-Xbbという4ペプチド配列のような、蛋白質の処理とMHCIIへのペプチドエピトープの結合のために、エンドソーム/リソソーム区画（endosomal/lysosomal compartment）あるいは関連する細胞内器官に蛋白質を向ける標的化配列を含むものである。さらに他の態様として、標的化配列はジロイシン配列を含むものである。さらに他の態様では、標的化配列はエンドサイティック（endocytic）受容体由来の細胞質ゾル（シトソール）（cytosolic）蛋白質標的化ドメインを含む。好ましいドメインとしては、Cタイプレクチン受容体、DEC-205ポリペプチド、gp200-MR6、あるいはそれらの相同体、オーソログ（ortholog）、変異体、あるいは修飾体の標的化ドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。MR6。また好ましい態様としては、キメラ蛋白質はさらにGagポリペプチドを含むものである。ある態様では、GagポリペプチドはLAMPポリペプチドのリュメナルドメインの部分に挿入される。さらに好ましくは、蛋白質はさらに膜貫通ドメインおよび／またはシグナルドメインを含むものである。
【００２１】
ひとつの特に好ましい態様では、蛋白質はLAMPポリペプチドのリュメナルドメインと、Xaaはいかなるアミノ酸でもよくXbbは疎水性アミノ酸であるという条件下のTyr-Xaa-Xaa-Xbbという４ペプチド配列を含む細胞質ドメインを含む。キメラ蛋白質は好ましくはさらに膜貫通蛋白質を含む。さらに好ましくは、キメラ蛋白質はまたシグナルドメインを含む。
【００２２】
いかなるタイプの抗原でもキメラ蛋白質の製造に使用できるであろう。ひとつの態様において、抗原は、病原性生物由来の抗原性物質の一部、ガン特異的ポリペプチド由来の抗原性物質の一部、異常な生理学的応答（たとえば、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、先天的疾患等）や移植への応答と関連のある分子由来の抗原性物質の一部からなる集団から選択することができる。他の態様では、抗原性物質は、ウイルス、微生物あるいは寄生虫である病原性生物に由来するものである。さらなる態様では、ウイルスはHIVウイルスである。ひとつ以上の抗原がいかなるキメラ蛋白質においても含まれることができるだろう。
【００２３】
本発明は上述のいかなるキメラ蛋白質をもコードする核酸分子を提供するものである。本発明はまた発現制御配列に操作可能に結合された核酸分子を含むベクターを提供するものである。ひとつの好ましい態様では、ベクターは抗原に対する患者にワクチンを投与するのに適したワクチンベクターである。他の態様では、本発明は細胞に核酸分子を導入することを促進するための核酸分子を含む運搬媒体（delivery vehicle）を提供する。この運搬媒体は、脂質を基礎とする（たとえばリポソーム処方物）、ウイルスを基礎とする（たとえば核酸分子を包みこむウイルス蛋白質を含む）、あるいは細胞を基礎とするものであり得る。ひとつの好ましい態様では、ベクターはワクチンベクターである。
【００２４】
本発明はまた、上述のいかなるベクターをも含む細胞を提供する。ひとつの態様では、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は（たとえば樹状（dendritic）細胞、マクロファージ、B細胞等の）プロフェッショナル（professional）抗原提示細胞でも、（たとえば、MHCクラスII分子のような、抗原提示に必要な分子を発現するように作られたプロフェッショナルでない抗原提示細胞である）調製された抗原提示細胞であってもよい。抗原提示に必要とされる分子は、たとえば天然にある、もしくはそれら自身が作り出された（たとえば抗原性エピトープへのより高いあるいは低い親和性というような好ましい性質を発現するように変異あるいは修飾された）ものであってもよい。ひとつの態様では、抗原提示細胞はいかなる共刺激シグナルも発現せず、抗原は自己抗原である。
【００２５】
本発明はさらに上述のいかなるベクターを含む多数の細胞を含むキットを提供するものである。少なくとも２つの細胞は、異なるMHCクラスII分子を発現し、個々の細胞は同じベクターを含むものである。ひとつの態様ではキットはベクターとベクターを受容するための細胞を含むものである。
【００２６】
本発明はまた上述の少なくともひとつの細胞を含むトランスジェニック動物を提供するものである。
【００２７】
本発明はさらに、動物において細胞がキメラ蛋白質を発現もしくは発現するように誘導され得るように、上述の細胞を動物に投与することを含む、動物において抗原に対する免疫応答を産生する方法を提供する。ひとつの態様では、細胞は、その動物がMHCクラスII分子に対して免疫応答を引き起こすことができないように、動物のMHC蛋白質と一致したＭＨＣクラスII分子を含むものである。あるひとつの好ましい態様では、動物はヒトである。
【００２８】
ひとつの態様では、本発明は動物に上述のいかなるベクターを投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供するものである。好ましくは、ベクターは動物細胞に感染性のものである。たとえば、ベクターはワクシニアベクターのようなウイルスベクターである。抗原は、病原性生物由来の抗原性物質の一部、ガン特異的ポリペプチド由来の抗原性物質の一部、異常な生理的応答と関連する分子由来の抗原性物質の一部、あるいは移植抗原からなる集団から選択されることができる。ひとつの態様では、病原性生物はウイルス、微生物、あるいは寄生虫である。他の態様ではウイルスはHIVウイルスである。さらに他の態様では異常な生理的応答は、自己免疫疾患、アレルギー反応、ガン、あるいは先天性疾患である。
【００２９】
さらに他の態様では、細胞は患者から得られ、ベクターはその細胞へ導入され、当該細胞あるいはその細胞の子孫が患者に再導入される。ひとつの態様では、細胞は抗原提示細胞へと分化できる幹細胞である。他の態様では、細胞は共刺激シグナルを発現せずに、抗原は自己抗原である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、選択された抗原に対するワクチンの生産に使用されるキメラ蛋白質およびそれをコードする核酸を提供する。ひとつの態様において、キメラ蛋白質は、抗原が膜蛋白質に由来するものであるか否かにかかわらず、抗原配列と、エンドソーム/リソソーム区画（endosomal/lysosomal compartment）あるいは関連する細胞内器官へ蛋白質を転送するためのドメインを含んでいる。ひとつの好ましい態様では、転送ドメインはLAMPポリペプチドのリュメナルドメインを含んでいる。もしくは、あるいは追加的に、キメラ蛋白質はエンドサイティック（endocytic）受容体（たとえば、Cタイプレクチン、DEC-205、gp200-MR6）の転送ドメインを含んでいる。ワクチンは免疫応答を調節もしくは高めるために使用することができる。ひとつの好ましい態様では、本発明はガン特異的抗原を含むキメラ蛋白質、もしくは、その蛋白質をコードする核酸を患者に提供することで、ガン患者を治療する方法を提供するものである。
【００３１】
定義
次の定義は以下の記載において使用される特別の用語のために提供される。
【００３２】
明細書と請求の範囲で使用されるように、文脈や状況が明らかにそうでないことを規定しない限り、単数形の「a」、「an」、「the」も複数形を包含するものである。たとえば、「ひとつの細胞（a cell）」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞をも含むものである。「ひとつの核酸分子（a nucleic acid molecule）」という用語は、複数の核酸分子を含むものである。
【００３３】
ここで使用されるように、「含む（comprising）」という用語は、記載された要素を含む構成もしくは方法を意図するが、他の要素が含まれることを除外するものではない。「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、構成や方法を定義するために使用される場合には、組み合わせにおいて本質的に重要な他の要素を除外することを意味するだろう。ここで定義されるように、本質的にある要素からなる構成は、燐酸緩衝食塩水や保存剤等のような単離精製法や薬学的に許容される担体由来の少量混合物を除外するものではない。「〜からなる（consisting of）」という用語は、少量の他の成分の残渣や、本発明の構成を規定するために本質的な方法段階以外のものを除外することを意図するだろう。これらのトランジッション（transition）用語の個々により定義される態様は本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
ここで使用されるように、「リソソーム/エンドソーム区画（lysosomal/endosomal compartment）」は、膜におけるＬＡＭＰ分子、抗原処理において機能する加水分解酵素、抗原の認識および提示のためのMHCクラスIIを含む膜結合性酸性小胞を意図している。この区画はエンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、ピノサイトーシスを含むさまざまな機構により細胞表面から内在化された外来物質や、特別な自己可溶化現象（de Duve, Eur. J. Biochem. 137: 391, 1983）によりこの区画に運ばれた細胞内分子の分解のための部位として機能する。「エンドソーム（endosome）」という用語はここおよび請求の範囲で使用されるように、リソソームを含んでいる。
【００３５】
ここで使用されるように、「リソソーム関連（lysosome-related）細胞内器官」とは、リソソームを含むいかなる細胞内器官をも意図し、ＭIIＣ、ＣIIＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解型顆粒（lytic granules）、血漿板密集顆粒、好塩基性顆粒、バーベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソーム等を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくはこのような細胞内器官はマンノース６燐酸受容体を欠いており、LAMPを含むものであって、MHCクラスII分子を含んでも含まなくてもいいものである。総説としては、たとえばBlottおよびGriffiths, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 2002; Dell’Angelicaら、The FASEB Journal 14: 1265-1278, 2000を参照されたい。
【００３６】
ここで使用されるように、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」とは、いずれもいかなる長さのヌクレオチドのポリマーをも意図するものである。ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及び／または  それらの類似体も含まれる。ヌクレオチドは三次元構造をとっており、既知のあるいは未知のいかなる機能をも遂行するものである。「ポリヌクレオチド」という用語には、たとえば一本、二本、あるいは三本鎖らせん（helical）分子、遺伝子あるいは遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、tRNA、rRNA、リボザイム、アンチセンス分子、cDNA、組換えポリヌクレオチド、枝分かれしたポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、単離されたいかなる配列をも有するDNA、単離されたいかなる配列をも有するRNA、核酸プローブ、プライマーが含まれる。核酸分子とは、（たとえば、修飾された塩基、糖鎖、及び／または  核酸間リンカーを含む）修飾された核酸分子をも包含する。
【００３７】
ここで使用されるように、「ペプチド」という用語は2つあるいはそれ以上のアミノ酸サブユニット、アミノ酸類似体、あるいはペプチドの疑似体の化合物を意図する。サブユニットは、ペプチド結合あるいは（たとえばエステル、エーテル等のような）他の結合様式で結合されているだろう。
【００３８】
ここで使用されるように、「アミノ酸」とは、グリシン、D体またはL体の光学異性体、アミノ酸類似体及びペプチドの疑似体を含む、天然、及び/または、非天然、あるいは、合成アミノ酸を意図するものである。３あるいはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドは、ペプチド鎖が短い場合には、通常オリゴペプチドと呼ばれている。もしぺプチド鎖が長い場合には（たとえばアミノ酸約１０個以上）、ペプチドは通常ポリペプチドあるいは蛋白質と呼ばれる。「蛋白質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含する一方で、「ポリペプチド」という用語は全長蛋白質よりも短いものであろう。
【００３９】
ここで使用されるように、「LAMPポリペプチド」とは、LAMP-1、LAMP-2、CD63/LAMP-3、DC−LAMP、あるいはリソソーム膜蛋白質(lisosomal associated membrane protein)、あるいは相同体、オーソログ（ortholog）、変異体（たとえばアレル変異体）、および修飾体（たとえば、天然に起こるものであっても作られたものであっても、一つもしくはそれ以上の変異を含むもの）を意図する。一つの態様において、LAMPポリペプチドは、たとえばヒトもしくはマウスのリソソーム膜蛋白質のような、哺乳動物のリソソーム膜蛋白質である。より一般的に、「リソソーム膜蛋白質」とは、エンドソーム/リソソーム区画あるいは リソソーム関連細胞内器官の膜において見出されるドメインを含み、さらにリュメナルドメインを含むいかなる蛋白質をも意図するものである。
【００４０】
ここで使用されるように、「エンドサイティック（endocytic）受容体」とは、細胞質に面しているC末端もしくはN末端を有する膜貫通蛋白質であって、ポリペプチドもしくはそれに接着したペプチド（たとえば化学結合により）を、MHCクラスII分子あるいはMHCクラスII分子との引き続く結合のための細胞内区画に移送するための転送ドメイン（たとえばリュメナルドメイン）を含む膜貫通蛋白質を意図する。エンドサイティック受容体の例としては、Fc受容体、補体受容体、スキャベンジャー受容体、インテグリン、レクチン（たとえばＣタイプレクチン）、DEC-205ポリペプチド、gp200-MR6ポリペプチド、Toll-like受容体、ヒートショックプロテイン受容体（たとえばCD91）、アポトーシスあるいはネクローシス性物質受容体（たとえばCD14のような）、あるいはそれらの相同体、オーソログ（ortholog）、変異体（アレル変異体）及び修飾体（たとえば、天然に起こるものであっても作られたものであっても、一つもしくはそれ以上の変異を含むもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
ここで使用されるように、「発現」とは、ポリヌクレオチドがmRNAに転写され、及び／または、ペプチド、ポリペプチド、あるいは蛋白質へと翻訳される過程を意図する。ポリヌクレオチドがゲノムDNA由来の場合には、発現とはゲノムDNAから転写されたmRNAのスプライシングを含むものであろう。
【００４２】
ここで使用されるように、「転写制御下」 あるいは「操作可能に結合された」とは、発現調節要素とコード配列の適切な配置で調節されたポリヌクレオチド配列の発現（たとえば転写あるいは翻訳）を意図する。一つの態様では、発現制御配列がDNA配列の転写を調節及び制御する場合において、DNA配列は発現制御配列に「操作可能に結合され」ている。
【００４３】
ここで使用されるように、「コード配列」とは適切な発現制御配列の調節下におかれた場合に、転写されポリペプチドへ翻訳される配列である。コード配列の境界は、5’（アミノ）末端の開始コドンと、3’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、原核細胞由来の配列、真核細胞のｍRNA由来のｃDNA、（たとえば哺乳動物である）真核細胞由来のゲノムDNA、さらに合成されたDNA配列を包含するものであるが、これらに限定されるものではない。ポリアデニレーションシグナルと翻訳終了配列は通常コード配列の3’側に位置している。
【００４４】
ここで使用されるように、もし配列もしくはその相補的な配列が同一のアミノ酸配列をコードする場合には、二つのコード配列は互いに「対応（correspond）」する。
【００４５】
ここで使用されるように、「シグナル配列」は、小胞体トランスロケーション配列を意味する。この配列は、（たとえば化学結合により）シグナルペプチドに結合されたポリペプチドが、小胞体の小胞区画に方向づけられ、エキソサイティック/エンドサイティック細胞内器官に入り、細胞性小胞区画あるいは細胞表面のいずれかに運搬されるか、もしくはポリペプチドを分泌することを、細胞へ伝えるシグナル配列をコードする。このシグナル配列は、時々蛋白質の成熟過程において細胞により切り取られる。シグナル配列は原核細胞から真核細胞に至る様々な天然蛋白質と結合して見出されることができる。
【００４６】
ここで使用されるように、「転送（トラフィッキング(trafficking)）」とは、滑面小胞体から、抗原の処理とＭＨＣIIへの結合が起こるエンドソーム/リソソーム区画あるいは関連する細胞内器官へという経路における、すべての細胞性器官あるいは区画（compartment）を通じたポリペプチドキメラ抗原の移動あるいは進行を意味する。「輸送（transport）」とは、キメラ蛋白質をある特定のタイプの細胞区画へ運ぶことを意図する。
【００４７】
ここで使用されるように、「標的化（targeting）」とは、好ましい部位、あるいは抗原処理とMHCIIへの結合が起こる細胞性器官や区画への、ポリペプチドキメラ抗原の転送を指示するポリペプチド配列を意味する。
【００４８】
ここで使用されるように「転送（トラフィッキング(trafficking)）ドメイン」とは、一つもしくはそれ以上の細胞性区画/細胞内器官を通じた蛋白質の小胞の動きに必要とされる、蛋白質内の連続あるいは非連続の一連のアミノ酸を意図する。転送ドメインは、好ましくはこの流れを仲介するための適切な蛋白質のフォールディングに必要な配列を含んでいる。一つの態様では、転送ドメインはリュメナル配列を含んでおり、好ましくは、シャペロンのような細胞性フォールディング蛋白質と相互作用するための一つもしくはそれ以上の部位を含むものである。
【００４９】
対照的に、ここで使用されるように、「標的化ドメイン」とは、細胞性区画/細胞内器官への運搬に必要な一連のアミノ酸配列を意図する。好ましくは、標的ドメインは、アダプターやAPプロテイン（たとえばAP1、AP2、AP3プロテインのような）へ結合する配列である。代表的な標的ドメイン配列は、Dell’Angelica, 2000,に記載されている。
【００５０】
「キメラDNA」とは、天然ではこのようなより大きな分子となることが知られていない、より大きなDNA分子内の、同定可能なDNA断片である。このように、キメラDNAが蛋白質断片をコードする場合には、コード配列断片はいかなる天然に存在するいかなるゲノムにおいてもコード配列として形成されていないDNAによって形成される。アレル変異体あるいは天然に生じる変異は、ここで定義されるキメラDNAを生じさせない。
【００５１】
ここで使用されるように、「核酸運搬ベクター」とは、特定のポリヌクレオチドを細胞へ輸送できる核酸分子である。好ましくはそのようなベクターは、発現調節配列に操作可能に結合されたコード配列を含んでいる。しかしながら、興味あるポリヌクレオチド配列は、必ずしもコード配列を含んでいる必要はない。たとえば、一つの態様では、興味ある核酸配列は、標的分子に結合するアプタマーである。他の態様では、興味ある配列は、制御配列による制御を阻害するために制御配列に結合する、制御配列に対して相補的な配列である。さらに他の態様では、興味ある配列はそれ自身が制御配列である（たとえば細胞における制御因子を定量的に評価するためのものである）。
【００５２】
ここで使用されるように、「核酸運搬媒体（delivery vehicle）」とは、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞へと運ぶことのできるいかなる分子、分子集団、あるいは高分子（たとえば遺伝子、遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー等）として定義され、上述の核酸ベクターと関連して存在するものである。
【００５３】
ここで使用されるように、「核酸運搬」あるいは「核酸輸送」とは、導入で使用される方法がどのような方法であるかに関わらず、外来性のポリヌクレオチド（たとえば外来遺伝子のような）を、宿主細胞に導入することを意図する。導入された核酸は、宿主細胞において安定にあるいは一時的に保持される。安定に保持することは、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と一致した複製起点を有しているか、染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）あるいは、核、もしくはミトコンドリアの染色体のような宿主細胞のレプリコンへ統合されることを必要とする。
【００５４】
ここで使用されるように、「ウイルスベクター」とはin vivo、ex vivo、あるいはin vitroにおいて宿主細胞に運ばれるポリヌクレオチドを含むウイルスもしくはウイルス粒子を意図する。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子の運搬がアデノウイルスベクターにより仲介される場合には、ベクター構築物はアデノウイルスのゲノムもしくはその一部、及び、選択された非アデノウイルス遺伝子を、アデノウイルスキャプシド蛋白質とともに含むポリヌクレオチドを意図する。
【００５５】
ここで使用されるように、「アデノウイルス仲介性遺伝子運搬」、あるいは、「アデノウイルスによる形質導入」とは、遺伝子あるいは核酸配列が、アデノウイルスが細胞に侵入する力で宿主細胞に移行する過程を意図する。好ましくは、ウイルスは複製可能で、および／または、統合されて、細胞内で転写される。
【００５６】
ここで使用されるように、「アデノウイルス粒子」とは、キャプシドがさらにアデノウイルスのエンベロープ蛋白質に含まれるという状況下で、外部のキャプシドと内部の核酸物質を含む個々のアデノウイルスビリオンである。アデノウイルスエンベロープ蛋白質は、たとえばアデノウイルス粒子を特定の細胞、及び／または、組織タイプに標的化するために、ウイルス蛋白質に共有結合されたポリペプチドリガンドを含む融合蛋白質を含むように修飾されることができるだろう。
【００５７】
ここで使用されるように、「分子を細胞に投与する」とは（たとえば、発現ベクター、核酸、アクセサリー因子、運搬媒体、試薬等）、細胞に分子を形質導入、トランスフェクト、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、あるいは注入することを意図する。ある態様において、運搬細胞と標的細胞を接触させることで（たとえば細胞融合、あるいは、標的細胞に接近した運搬細胞を溶解することで）、分子は標的細胞に導入される。
【００５８】
ここで使用されるように、「ハイブリダイゼーション」とは、一つあるいは複数のポリヌクレオチドが、核酸残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成するような反応を意図する。水素結合は、ワトソン−クリック塩基ペアリング、フーグスティン結合、あるいは他のいかなる配列特異的な様式により生じるだろう。複合体には、二本鎖構造を形成する二つの鎖、複数鎖複合体を形成する三本もしくはそれ以上の鎖、自己ハイブリダイズを起こす一本鎖、あるいはこれらのいかなる組み合わせが含まれるだろう。ハイブリダイゼーション反応は、PCR反応の開始、あるいはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的な開裂のようなより広範な工程における段階を構成するだろう。
【００５９】
ここで使用されるように、他の配列に対してあるパーセンテージの（たとえば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）「配列同一性」を有するポリヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドあるいはポリペプチド領域）とは、当該技術分野において日常的なソフトウエアプログラムを使用して、最大限に整列させた際に、そのパーセンテージの塩基（あるいはアミノ酸）が二つの配列を比べた際に同じであることを意味する。
【００６０】
二つの配列は、DNA配列の決められた長さにおいて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％あるいは９５％の配列同一性を示すときに、「本質的に相同である」あるいは「本質的に類似」である。同様に、二つのポリペプチド配列は、ポリペプチド配列の決められた長さにおいて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％あるいは９５％のアミノ酸残基の同一性を示すときに、「本質的に相同」あるいは「本質的に類似」である。本質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウエアを使用して配列を比較することにより同定することができる。本質的に相同な核酸配列はまた、たとえば特定の系のために定義されたようなストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション試験で同定することも可能である。適切なハイブリダイゼーション条件を決定することも、当該分野の技術の範囲内である。
【００６１】
ここで使用されるように、他の転送配列と本質的に相同な「転送（トラフィッキング(trafficking)）配列」とは、他の転送配列と本質的な相同性を有するものである。しかしながら、本質的な相同性の究極テストとは、転送配列と本質的に相同な配列を含むポリペプチドが、転送配列と同じエンドソーム区画（endosomal compartment）に共局在化可能であるという、機能的なアッセイである。
【００６２】
ドメイン配列の「保存的に修飾された変異体」という表現もまた使用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体とは、同一のもしくは基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、あるいは核酸分子がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を意図する。特に、縮重コドン置換は、一つもしくはそれ以上の選択された（もしくはすべての）コドンの３番目が混合塩基、及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作ることにより達成される。（Batzerら、1991, Nucleic Acids Res. 19: 5081; Ohtsukaら、1985, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Rossoliniら、1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98）
【００６３】
天然型の蛋白質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な均等物」、「機能的な誘導体」とは、活性を検出するのに適したアッセイを使用して測定した際に、天然型の蛋白質の生物学的活性と少なくとも本質的に等しい（たとえばかなり異なるものではない）生物学的活性を有するものである。たとえば、転送ドメインを含む生物学的に活性な断片は、その転送ドメインを含む全長ポリペプチドと同じ区画に共局在化できるものである。
【００６４】
ここで使用されるように、「生体内（インビボ（in vivo））」核酸運搬、核酸輸送、核酸治療等は、外来のポリヌクレオチドを含むベクターを、ヒト、もしくは非ヒト哺乳動物のような生物の体内に直接導入し、それによって個体内でそのような生物の細胞に外来性のポリヌクレオチドが導入されることを意図する。
【００６５】
ここで使用されるように、「その場（インサイチュ（in situ））」とは、標的細胞の近くに核酸が運ばれる（たとえば、核酸は全身には投与されない）インビボ核酸運搬のタイプを意図する。たとえば、インサイチュ運搬法には、核酸をある部位（たとえば腫瘍あるいは心筋のような組織）に直接注入すること、切開手術によって細胞や組織に核酸を接触させること、もしくはカテーテルのような医学的な導入器具を使用して核酸をある部位に運搬することなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
ここで使用されるように、「単離された」とは、天然においてポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、抗体、あるいはそれらの断片が、通常存在している部位、細胞あるいは他の状態から分離されたことを意味する。たとえばポリヌクレオチドに関しては、単離されたポリヌクレオチドとは、染色体内において通常結合している5’及び3’配列から分離されたものである。当該分野における当業者にとって明らかなように、非天然に生じるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、抗体、あるいはそれらの断片は、天然に存在する対象物から区別するために「単離」することを必要としない。
【００６７】
ここで使用されるように、「標的細胞」あるいは「受容細胞」とは、外来の核酸分子、ポリヌクレオチド、及び／または蛋白質の受け手となることが要求される、あるいは受け手である個々の細胞を意図する。この用語はまた単一細胞の子孫をも含むものであり、その子孫の細胞は、天然の、偶然の、あるいは故意の変異によって、そのもととなる親細胞と（形態あるいはゲノムもしくは全DNAにおいて）完全に同一である必要はない。標的細胞は（たとえば組織におけるように）他の細胞と接触し、または生物の生体内を循環することが見出されるだろう。
【００６８】
ここで使用されるように、「対象（subject）」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜用動物、スポーツ用動物、そしてペットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
「ガン(cancer)」、「新生物・狭義の腫瘍（neoplasm）」、あるいは「腫瘍(tumor)」とは、単数形もしくは複数形で使用され、宿主細胞に対して病的な悪性の形質転換を受けた細胞を意図する。原発性ガン細胞（つまり、悪性形質転換部位の近傍から得られた細胞）は、よく確立された技術、特に組織学的（histrogical）試験により、非ガン性細胞から容易に区別することができる。ここで使用されるように、ガン細胞の定義には、原発性ガン細胞に限らず、がん細胞の祖先から生じたかなる細胞も含まれる。これには、転移したガン細胞、ガン細胞から得られたインビトロ培養物やセルラインも含まれる。普通固形腫瘍として示されるタイプのガンを意図するときには、臨床的に検出可能な腫瘍は、腫瘍の大きな塊を基準として、たとえばCATスキャン、MRイメージング、X線、超音波、触診により検出可能なもの、および／または、患者から得られるサンプルにおける一つもしくはそれ以上のガン特異的抗原の発現により検出可能なものである。
【００７０】
ここで使用されるように、「薬学的に許容な担体」とは、リン酸緩衝食塩水、水、油／水  あるいは  水／油エマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの液性の試薬のようないかなる標準的な薬学的担体をも含むものである。その組成にはまた、安定剤や保存剤を含むことができる。担体、安定剤、アジュバントの例としては、Martin Remington’s Pharm.Sci., 15ｔｈ Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975))を参照されたい。
【００７１】
外来のあるいは異種の核酸が細胞内に導入された際に、細胞はそれらの核酸により「形質転換」、「形質導入」、あるいは「トランスフェクト」されたことになる。形質転換DNAは、染色体DNAと統合（共有結合）された細胞のゲノムを構成することもしないこともできる。たとえば、原核生物、酵母、哺乳動物細胞では、形質転換DNAはプラスミドのようなエピソーマルな成分として維持される。真核細胞では、安定に形質転換された細胞では形質転換DNAが染色体DNAに統合されて染色体の複製を通じて娘細胞へと継代される。この安定性は、真核細胞が形質転換DNAを含む娘細胞の集団を含むセルラインやクローンを確立できる能力によるものである。クローンとは、単細胞あるいは有糸分裂により共通の祖先に由来する細胞集団である。「セルライン」とは多くの世代（たとえば少なくとも約１０代）をインビトロで安定に成長できる初代の細胞のクローンである。
【００７２】
ここで使用されるように、「有効量」とは、たとえば、効果的な量の核酸の運搬、及び／または、発現、及び／または、望まれる治療目的の達成のような、有益なあるいは望まれる結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、一もしくはそれ以上の投与、措置あるいは投与量で与えられることができる。ある態様では、核酸運搬ベクターの有効量とは、少なくとも２つの細胞を含む細胞集団において、少なくとも一つの細胞を形質転換/形質導入/トランスフェクトするのに十分な量である。
【００７３】
ここで使用されるように、「治療的な有効量」とは、異常な生理学的応答を予防、治療、及び／または、正常化するのに十分な量を意味するために使用される。ひとつの態様では、「治療的に有効な量」とは、少なくとも約３０％、より好ましくは約５０％、さらに好ましくは約９０％まで、たとえば腫瘍の塊の大きさ、抗体産生、サイトカイン産生、熱、あるいは白血球数等のような、臨床的に重要な病理の特徴を低減するのに十分な量である。
【００７４】
「抗体」とは、特定のエピトープに結合する抗体もしくはその断片を含む免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ抗体（たとえばバイスペシフィック抗体）をも含む。「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する重鎖及び軽鎖の可変及び超可変領域を含む抗体分子の構造的な部分である。典型的な抗体分子とは、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、及び、ここで記載される治療方法において使用されるのに好ましいFab、Fab’、F(ab’)２、F(v)部分を含むパラト−プを含む免疫グロブリン分子の部分である。
【００７５】
「エピトープ」とは、免疫系の構成、成分により特異的に認識あるいは特異的に結合される短鎖ペプチド配列あるいはオリゴサッカライドから通常構成される構造である。T細胞エピトープとは一般に直鎖オリゴペプチドを示している。二つのエピトープが同じB細胞受容体あるいは、同じT細胞受容体に結合でき、一つの抗体のエピトープへの結合が、他のエピトープによる結合を実質的に妨げる（たとえば他のエピトープの結合が約３０％以下、好ましくは、約２０％以下、より好ましくは、約１０％、５％、１％もしくは約０．１％以下）場合には、これらの二つのエピトープは互いに対応している。
【００７６】
ここで使用されるように、「抗原性分子」とは、先天的なあるいは後天的な免疫応答を引き出すいかなる物質をも包含する。
【００７７】
ここで使用されるように、「抗原提示細胞」とは、MHC分子あるいはその部分、もしくは代替的には、一つもしくはそれ以上の非典型的なMHC分子あるいはその部分とともに、抗原を表面に提示する細胞である。適切なAPCの例は、以下で詳しく議論されるように、マクロファージのような全細胞（whole cell）、樹状（dendritic）細胞、B細胞、ハイブリッドAPCs、抗原提示細胞の子孫を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
ここで使用されるように、「作られた抗原提示細胞」とは、表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を意図する。たとえば、そのような細胞は天然には表面に共刺激体を有さず、あるいは、その表面に天然の共刺激体に加えて追加の人工的な共刺激体を有し、もしくはその表面に非天然クラスII分子を発現するものであろう。
【００７９】
ここで使用されるように、「免疫エフェクター細胞」とは、抗原に結合できて免疫応答を仲介する細胞を意図する。これらの細胞は、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、（たとえばCTLラインの例としては、CTLクローン、腫瘍、炎症、あるいは他の浸潤性のCTL等の）細胞傷害性T細胞（CTL）を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
「単離された」あるいは「精製された」細胞集団とは、天然に存在する形態から細胞や物質が分離されたものである。実質的に不純物を含まない、もしくは、実質的に精製されたAPCとは、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、天然に存在している非APC細胞を含まないAPCであることを意味する。
【００８１】
ここで使用されるように、「遺伝的修飾」とは、細胞の通常の核酸に付加、欠失、あるいは中断・破壊が生じたものを意図する、APCの遺伝的修飾を達成できるいかなる方法も、本発明の思想及び範囲の中に含まれる。当該分野で知られた方法には、たとえば、レトロウイルスベクターと同様に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスウイルスベクターのようなウイルス仲介性遺伝子輸送、リポソーム仲介性輸送、形質転換、トランスフェクション、および、形質導入が含まれる。
【００８２】
本発明の実施には、他に言及されないかぎり、慣用的な分子生物学、微生物学、当該分野における周知技術である組換えDNA技術が使用される。このような技術は文献に十分に記載されている。たとえばManiatis, Fritsch、および、Sambrook, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumn I and II (D.N.Glover, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及びS. J. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. D. Hames及びS. I. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cell and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)を参照のこと。
【００８３】
キメラワクチン
米国特許第5633234号では、抗原性配列は「抗原／LAMPキメラ」を生成するために、LAMPの細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル配列に結合された。このキメラはエンドソーム/リソソーム転送経路へと向けられることがわかった。いくつかの膜蛋白質とともに、抗原／LAMPキメラは天然型抗原に比べてより大きな免疫応答を引き起こすことがわかった。
【００８４】
このアプローチは、ヒトパピローマウイルスE7、デング熱ウイルス膜蛋白質、HIV-1 gp160膜蛋白質、HIV-1 p55 Gag、ウエストナイルウイルス膜蛋白質、C型肝炎ウイルスNS3蛋白質、及び、サイトメガロウイルスpp65（たとえばBoniniら、 J. Immunol. 166: 5250-5257, 2001を参照のこと）等のいくつかのウイルス抗原への細胞性および体液性応答を増加させるのに有用であることを証明した。この増幅された免疫応答は、LAMPをMHCIIとともに局在化させ、抗原性ペプチドのより効率的な処理と運搬に寄与することができる。加えて、LAMP-標的化は、より多くの免疫原性エピトープを提示し、標的化されていない抗原に比べて質的に広がった免疫応答を起こすことが報告されている。たとえばFernandesら、2000, Eur.J.Immunol., 30(8),: 2333-43には、ワクチニアベクターにおいてコードされたLAMP-転送されたOVA抗原の提示されるペプチド数の増加が示されている。外部から供給されたOVA由来の１２ポリペプチドのうち、LAMPなしの構築物では２しか提示されないのに比べて、OVA/LAMPキメラでは９つが提示された。
【００８５】
しかしながら、LAMPの細胞質ドメインが（シグナル配列と膜貫通ドメインと結合して）必要である一方で、それはエンドソーム/リソソーム転送には十分でない。LAMPポリペプチドのようなリソソーム膜蛋白質のリュメナルドメイン配列もまた、リソソーム小胞経路へいくつかの蛋白質を転送するために必要であることが、本発明において見出された。
【００８６】
たとえば、ウイルスキャプシドもしくは非構造蛋白質、および膜構造に通常提示されない他の蛋白質は、LAMPとMHCIIにより占められた小胞区画には運ばれず、増強された免疫応答を誘発しない。小胞経路における蛋白質の運搬には、標的化シグナルのほかに、蛋白質のフォールディングや、蛋白質の小胞 転送に含まれるほかの蛋白質と反応するような配列が必要であることが明らかである。
【００８７】
それゆえ本発明は、抗原と、抗原処理と抗原エピトープのMHCIIとの結合のためにエンドソーム/リソソーム区画にキメラを転送できるポリペプチドのリュメナル配列を含むキメラを提供するものである。一つの態様において、キメラ蛋白質はさらにキメラをエンドソーム/リソソーム区画に向ける細胞質標的化配列を含む。さらに、このキメラ蛋白質はまた、シグナル配列および／または膜貫通配列を含んでいてもよい。好ましい転送ドメインは、LAMP-1、LAMP-2、DC-LAMP、Trp-1、DEC-205、gp200-MR6及び、以下に記載されるような他のペプチドにより提供される。シグナル配列と膜貫通配列はこれらのペプチドから得られるだろうが、必ずそうである必要はない。しかしながら一つの態様では、抗原／LAMPキメラは全長のLAMPポリペプチドを含んでいる。
【００８８】
抗原をコードする配列
本発明は、ワクチンあるいは他の状況において使用される抗原性物質に広く適用される。抗原性物質は一般に、リソソーム酵素により放出され、放出された際にはMHCクラスIIエピトープに対応するペプチド断片を含んでいてもよい。抗原性物質はまたすべてのイムノグロブリン応答、及び、MHCI応答を含むほかの免疫応答系の構成要素を刺激する領域を含んでいてもよい。
【００８９】
本発明の構築物は、リソソーム区画へ転送される前に翻訳後修飾区画を通過するので、抗原性ドメインは細胞性修飾由来のエピト−プを含んでいるかもしれない。本質的に、哺乳動物細胞により合成されることができ、アミノ酸一次配列に直接抗原性があるか、もしくは、翻訳後プロセッシングの間に抗原性を作り出すことを指示するシグナルで、抗原性ドメインへ内包されるBおよびT細胞エピトープを含むいかなるポリペプチドも、抗原性物質の由来として使用できる。
【００９０】
抗原性ドメインとして使用するための好ましい抗原蛋白質のもっとも適切な部分の選択は、機能的スクリーニングで行うことができる。広くいえば、このスクリーニング方法は、一つもしくはそれ以上の抗原蛋白断片、及び、少なくとも抗原処理と抗原エピトープのMHCIIとの結合のためにエンドソーム/リソソーム区画にキメラを転送するためのドメインをコードするDNAをクローニングすることを含む。好ましくは、そのような構築物は、シグナル配列、および／または膜貫通ドメイン、及び／または、細胞質標的化ドメイン（たとえば、LAMPポリペプチドの細胞質末端のような）をコードする一つもしくはそれ以上のDNA配列を有しているだろう。クローニングされたDNAは、好ましくは抗原提示細胞（しかしながら必ずしもプロフェッショナルな抗原提示細胞である必要はない）において発現される。
【００９１】
特有のスクリーニング方法は、抗原のタイプと抗原性活性のアッセイに依存する。抗原性は、抗原特異的MHCクラスII特異的T細胞もしくはクローンの刺激により測定されるだろう。もしくは抗原性は、抗体産生能やインビボにおける抗原特異的なT細胞の測定により決定されるだろう。これらのおよび他の抗原性活性試験は当該技術分野においてよく知られている。
【００９２】
好ましい抗原性物質の由来となる抗原には、腫瘍抗原、自己抗原、移植抗原、哺乳動物細胞において見出される細胞表面蛋白質、ガン特異的蛋白質、異常な生理学的応答と関連のある蛋白質、特に細胞壁もしくは細胞膜において見出される蛋白質を含む、バクテリア、原生動物、あるいは菌やカビ類の蛋白質、HIVやヘパドナウイルスのようなレトロウイルスを含むウイルスゲノムによりコードされる蛋白質が含まれる。
【００９３】
特に好ましい抗原は、肝炎、狂犬病、マラリア、（たとえば住血吸虫症のような）寄生虫感染、ガン、AIDS、黄熱、デンゲ熱、日本脳炎、ウエストナイル熱、はしか、天然痘、炭疽病、エボラ、ウマの脳炎（equine encephalitis）、リフトバレー（Rift valley）熱、ネコひっかっき（cat scratch）熱、ウイルス性髄膜炎、ペスト、野兎病（tularemia）、他の病原性生物による疾病の原因もしくは関連する生物の、ゲノムによりコードされる抗原である。特に好ましいウイルス抗原は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコ、あるいは、ニワトリに対して病原性であるウイルスのゲノムによりコードされるウイルス性蛋白質である。限定されない例としては、365-80残基（NP365-80）、NP50-63、NP147-158で構成されるインフルエンザ核蛋白質由来のペプチド、以前にクラスI制限細胞傷害性アッセイ（Perkinsら、1989, J. Exp. Med. 170: 279-289）により決定されたインフルエンザヘマグルチニンHA202-21、HA523-45由来のペプチドが包含される。マラリア寄生虫プラスモディウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)により提示されるエピトープを表すペプチドが記載されている（たとえば米国特許第5609872号参照のこと）。
【００９４】
抗原性物質にはまた、移植拒絶、アレルギー、過敏症応答、自己免疫疾患において認識される自己抗原が含まれるだろう。たとえば、重症筋無力症で認識されるアセチルコリン受容体は、抗原性物質の由来となるだろう。抗原性エピトープが記述される自己抗原の他のクラスは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（コリオゴナドトロピン）βサブユニット（たとえば米国特許第5733553号参照）である。このエピトープは避妊方法において有用である。
【００９５】
合成されたもしくは変異された抗原もまた、ここに記載の方法において使用されることができる。合成された抗原性ペプチドエピトープは、それらの天然の対応物（カウンターパート）に関連する修飾されたアミノ酸配列を有している。さらに合成された抗原性ペプチドには、それに介在するアミノ酸配列を含んでいてもよい、合成された抗原性ペプチドのマルチマー（concatemer）が含まれる。たとえば本発明の合成された抗原性ペプチドは、抗原性ペプチドエピトープの既知のアミノ酸配列に基づいてデザインされることができる。
【００９６】
他の特に好ましい抗原には、Gag、Env、Rev、Tat、及び/またはNefポリペプチド、gp160等のようなHIVポリペプチド、パピローマウイルスコア抗原、HCV構造及び非構造蛋白質、CMV構造及び非構造蛋白質などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
また、たとえばリン酸化、グリコシル化、クロスリンキング、アシル化、蛋白質加水分解開裂、抗原分子、膜分子、あるいは他のリガンドへの結合等により、翻訳中もしくは翻訳後に異なるように修飾された抗原性ペプチドも、本発明の範囲に含まれる（Fergusonら、 Ann. Rev. Biochem. 57: 285-320, 1998）。
【００９８】
新しい抗原及び新規なエピトープも当該分野の周知技術により同定できる。たとえば、サブトラクティブライブラリー、正常及び腫瘍細胞のコンパラティブノーザン、及び／または、ウイエスタンブロット解析、遺伝子発現の一連の分析（Serial Analysis of Gene Expression）（米国特許第5695937号）やSPHERE（PCT WO 97/35035号に記載）等のいかなる慣用的な方法も、候補となる抗原を同定するために使用できる。
【００９９】
たとえばKawakamiら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3515-19に記載されるように発現クローニングもまた、新規な腫瘍関連抗原を同定するのに使用されることができる。端的には、この方法においては、腫瘍細胞に由来するｍRNAに対応するｃDNAライブラリーが発現ベクターにクローンされ、続いて細胞傷害性T細胞とインキュベートされる標的細胞へと導入される。T細胞応答を刺激できるcDNA集団は同定され、連続希釈法およびより複雑でないcDNA集団の再試験を通じて、T細胞を刺激でき、腫瘍抗原をコードする特有のDNA配列が同定される。対応するｍRNAの腫瘍特異性は、正常細胞と腫瘍細胞のコンパラティブノーザン及び／またはウエスタンブロット解析により確認できる。
【０１００】
ＳＡＧＥ分析も、抗原提示細胞において発現される核酸配列を同定することにより、CTLのような広義の免疫エフェクター細胞により認識される抗原を同定するのに使用できる。SAGE分析はｃDNAを抗原発現集団および、抗原を発現していない細胞から得ることからはじめられる。両者のｃDNAはプライマー部位に結合される。配列のタグは、たとえばDNAの増幅に適したプライマーを用いて合成される。２つの細胞のタイプ間でのこれらのタグセットにおける違いを測定することで、抗原発現細胞集団において異常に発現される配列が同定される。
【０１０１】
適切なエピトープ及び新しい抗原性ペプチドを同定するためのほかの方法としては、固相エピトープ回収（Solid PHase Epitope REcovery（SPHERE））として知られる技術がある。この方法は詳しくはPCT WO 97/35035号に記載されている。本方法はＭＨＣクラスI制限CTLエピトープをスクリーニングするために使用されているが、たとえばCTL以外の抗原特異的MHCクラスII特異性Tセルラインの刺激をスクリーニングすることで、クラスIIエピトープのスクリーニング方法として改変できるだろう。SPHEREでは、制御された様式で放出される特有のペプチドを含む個々のビーズにおいて、ペプチドライブラリーが合成される。溶出されたペプチドは好ましい複合体とともに各ウエルに集めることができる。ビーズからある割合のペプチドを分離した後、上述したようなMHCクラスII応答を刺激する能力がアッセイされる。陽性の個々のビーズは配列決定（decode）されて、反応性のアミノ酸配列が同定される。すべての陽性の分析は、試験されたT細胞応答を刺激する保存的に置換されたエピトープの部分的なプロファイルを与えるだろう。ペプチドは再合成され、応答を確かめるために再び試験されることができる。また、（複雑さが最低限の）第2のライブラリーが、特有の反応に寛容である誘導体の完全なスペクトルを列挙するために、すべての保存的置換の代表とともに合成されるだろう。複数のTセルラインを同時にスクリーニングすることで、交差反応性エピトープの検出を容易にできるだろう。
【０１０２】
単離されたペプチドは適切な固相合成反応を用いて合成されることができる。（Steward 及びYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, CA 1968）好ましい方法はメリーフィールド（Merrifield）プロセスである（Merrifield, Recent progress in Hormone Res. 23: 451, 1967）。ペプチドの抗原性活性は、たとえばここに記載されるようなアッセイ法を用いて、簡単に試験されるだろう。
【０１０３】
いったん単離されたペプチドが得られれば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、サイズ除去クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、あるいは他の標準的な蛋白質精製技術を含む、標準的な手法により精製されるだろう。イムノアフィニティークロマトグラフィーでは、ペプチドあるいは関連したペプチドに対して得られ、支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより、エピトープを単離することができる。あるいは、ヘキサヒスチジン（hexa-His（Invitrogen））、マルトース結合ドメイン（New England Biolabs）、インフルエンザコート配列（Kolodziejら、Methods Enzymol. 194: 508-509, 1991）、およびグルタチオンSトランスフェラーゼを、適切なアフィニティーカラムの通過による簡便な精製のために、ペプチドに結合させることもできる。単離されたペプチドはまた、蛋白質の加水分解、核磁気共鳴（NMR）、X線結晶のような技術を使用することで、物理学的に特徴付けられることができる。
【０１０４】
所望のエピトープのペプチド配列を単離同定することで、これらのエピトープをコードする配列を含む核酸の配列を容易に決定できるだろう。
【０１０５】
エンドサイティック転送配列
MHCクラスII分子の細胞内転送において、以下の連続的な出来事が起こることが入手可能なデータにより示めされる。不変鎖を伴うMHCクラスII分子は、小胞体に集められ、MHCクラスIを含むほかの膜蛋白質と共通のゴルジ体を通過して転送される。分子は次に、未知の機構により特定のエンドソーム/リソソーム細胞内器官へ標的化され、細胞表面への保存的経路（constitutive route）に従うMHCクラスI分子から分離される。エンドサイティック/リソソーム経路では、不変鎖は酸性環境下で活性なプロテアーゼによりMHCクラスII分子から取り除かれる。同時に、エンドサイティック/リソソーム経路に入った蛋白質の抗原性断片がプロテアーゼにより産生され、生じたペプチドはクラスII分子に結合して細胞表面へと運ばれる。
【０１０６】
リソソーム/エンドソーム区画に存在する加水分解酵素の生合成と小胞の標的機構については、広く研究がなされている（Kornfeld及びMellman, Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483, 1989）。ゴルジ体で新たに合成された加水分解酵素は、ある未知の手段でプレリソソーム小胞へ標的化されるマンノース６リン酸受容体へこれらの酵素を結合させるための特別な認識マーカーとして機能するマンノース６リン酸グループを獲得する。その場合、受容体酵素複合体は低いｐHで分離され、受容体はゴルジ体に再循環し、一方酵素含有小胞はリソソームへと成熟する。
【０１０７】
リソソーム膜グリコプロテインの局在化は、よく明らかにされたリソソームの加水分解酵素ためのマンノース６リン酸受容体（MPR）経路に依存しない標的機構により制御される（Kornfeld及びMellman, 1989, 前述）。最近の研究では、リソソームの性質を有し、高濃度のリソソーム膜蛋白質（LAMP-1）及びMHCクラスII分子により特徴づけられる全く別の小胞区画が記述されている（Petersら、EMBO J. 9:3497, 1990）。リソソーム/エンドソーム区画の細胞内転送と、新たに合成されたLAMP-1及び他の類似蛋白質の標的化を速度論的に解析することにより、分子は小胞体で合成され、ゴルジ嚢（cisternae）で処理され、生合成から一時間以内に、形質膜における検出可能な蓄積を伴うことなく、リソソームへ転送されることが示されている（Barriocanalら、J. Biol. Chem. 15: 261(35): 16755-16763, 1986; D’Sousaら、Arch. Biochem. Biophys. 249: 522, 1986; Greenら、J. Cell Biol., 105: 1227, 1987）。
【０１０８】
リソソーム膜の構造及び機能の研究は、1981年にAugustらによって、リソソームに顕著に局在化するために、リソソーム膜蛋白質１及び２（LAMP-1及びLAMP-2）と後から名づけられた主要な細胞性グリコプロテインの発見とともにはじめられた（Hughesら、J. Biol.Chem. 256: 664, 1981; Chenら、J.Cell. Biol. 101: 85, 1985）。類似の蛋白質がラット、ニワトリ、ヒト細胞において後に同定された（Barriocanalら、1986, 前述; Lewisら、J. Cell. Biol. 100: 1839, 1985; Fambourghら、J. Cell. Biol. 106: 61, 1988; Maneら、Arch. Biochem. Biophys. 268: 360, 1989）。
【０１０９】
典型的には、ｃDNAクローン（Chenら、J. Biol. Chem. 263: 8754, 1988）から 演繹されるように、LAMP-1は、２４残基の疎水性膜貫通領域と、短い（１２残基）細胞質C末端に続く、巨大（346残基）リュメナルアミノ末端ドメインとともに、約３８２アミノ酸のコアポリペプチドからなる。リュメナルドメインは非常にグリコシル化されており、約２０のアスパラギン結合複合体タイプオリゴサッカライドで置換され、プロリン/セリンリッチ領域により分断される２から約１６０残基の相同なユニットからなる。これらの個々の相同性ドメインは、４つの均等に配置されたシステイン残基を含み、リュメナルドメインの２つの半分内に均整が取れて存在する４つの３６−３８残基ループを形成するようにジスルフィド結合されている（Arterburnら、J. Biol. Chem. 265: 7419, 1990、また、Chenら、J. Biol. Chem. 25: 263(18): 8754-8, 1988を参照のこと）。LAMP-2分子は全長アミノ酸配列にわたってLAMP-1と非常に類似している（Chaら、J. Biol. Chem. 265: 5008, 1990）。
【０１１０】
LAMP-1とLAMP-2は特別に抗原提示細胞（樹状細胞）において見出されるものではない。それらの正確な機能は知られていないが、おそらくリソソームの機能にある様式で含まれるものだろう。LAMP-1及びLAMP-2の多層MIIC 小胞区画におけるMHCIIとの局在化は、抗原処理あるいは提示との既知の機能的な関連性を有していない。しかしながら、上述したようにLAMP細胞質ドメインを含むキメラ抗原は、増強された免疫原性を有している（米国特許第5633234号参照）。
【０１１１】
本発明はLAMPポリペプチド、生物学的なその断片あるいは修飾体（集約して「LAMP-リュメナルドメイン」と呼ばれる）のようなリソソーム膜蛋白質のリュメナルドメインを含むキメラ蛋白質を提供する。一つの態様において、LAMP リュメナルドメインは、少なくとも２つの相同なユニットを含んでいる。好ましくは、個々の相同なドメインは、プロリン/セリンリッチ領域により分離されている。さらに好ましくは、個々の相同なドメインは、ジスルフィド結合によりリュメナルドメインの２つの半分内に均整が取れて存在する４つの３６−３８残基のループを形成できる４つのシステインを含んでいる。より好ましくは、リュメナルドメインは、MHCクラスII分子に結合するために、あるいは、MHCクラスII分子に結合するほかの区画/細胞内器官に運搬するためにドメインに結合された（たとえば化学結合により）、ポリペプチドをエンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官に標的化および転送するために必要な配列を含んでいる。
【０１１２】
他の態様において、キメラ蛋白質は追加的に、あるいは代わりに、少なくとも一つのロイシン−ロイシン対、あるいは少なくとも一つのロイシン−イソロイシン対を含むジロイシンに基づくシグナルを含んでいる。好ましくは、この蛋白質はさらにそのペアの４−５残基上流に酸性残基を有している。より好ましくは、シグナルドメインがAP複合体ポリペプチドに結合する（たとえば、Bonafacino及びDell’Angelica, J. Cell. Biol. 145: 923-926, 1999参照）。適したジロイシンをに基づくドメインは、たとえばチロシナーゼ（TM-X１０-EKQPLL-X５-YHSL-X５）、TRP-2（TM-X７-EANQPLL-X１２）、Pme17(TM-X３４-ENSPLL-X５)、P-蛋白質（たとえばDell’Angelica, 2000, 前述参照）内に見出すことができる。
【０１１３】
好ましい態様では、キメラ蛋白質はまた、キメラ蛋白質をエンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官に標的化及び／または転送するための細胞質ドメインを含んでいる。一つの態様では、細胞質ドメインはLAMPポリペプチドの末端を含んでいる。LAMP-1及び他の類似したリソソーム膜グリコプロテインの細胞質末端の１１アミノ酸配列は、以下の配列である。Arg-Lys-Arg-Ser-His-Ala-Gly-Tyr-Gln-Thr-Ile-COOH（Chenら、1988, 前述）。LAMP-1において、これらの配列は全長ポリペプチドの372-382位に由来する。
【０１１４】
リソソーム膜蛋白質、LAMP-1（Chenら、1988, 前述）、LAMP-2（Chaら、1990,前述 ）、CD63（Hottaら、Cancer Res., 48: 2955, 1988）の既知の細胞質末端の配列が、本発明者らによって表１にLAP（Pohlmanら、EMBO J., 7: 2343, 1988）の細胞質末端におけるTyr含有内在化シグナルととも示されている。このTyr残基は、エンドソーム/リソソーム標的化に必要であることが知られており、米国特許第5633234号では、他の分子をリソソームに標的化するために必要な完全長配列は、Tyr-X-X-Hyd配列（すなわち、「Tyrモチーフ」）という、チロシンが疎水性残基へと続く２つのアミノ酸に連結されている配列が必要であることが示されている。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
C末端およびその周辺領域における疎水性残基の必要性は、LAMP-1のTyr-Gln-Tyr-Ile配列を修飾することで得られた結果により示されている。Ileが二つのほかの疎水性残基であるLeuあるいはPhe、または、極性残基であるThrに置換された変異cDNA分子において、Leu（Tyr-Gln-Thr-Leu）およびPhe（Tyr-Gln-Thr-Phe）への置換はリソソーム標的化に影響を及ぼさなかった一方で、Thr含有変異蛋白質（Tyr-Gln-Thr-Thr）は細胞表面へ蓄積した。GlnあるいはThrにかえてAlaを有する（Tyr-Ala-Thr-Ile）、（Tyr-Gln-Ala-Ile）、もしくは両方がAlaに置換されている（Tyr-Ala-Ala-Ile）変異体においては、リソソーム膜への標的化に影響がなく、このことは、これらの位置は電荷をもつ、極性のあるいは非極性の残基で占められていればよいことを示している。
【０１１７】
したがって、好ましいリソソーム/エンドソーム区画への標的化シグナルは、膜貫通ドメイン及びまたC末端の近くの細胞質ドメインにテトラペプチドを含んでいる。細胞質ドメインは好ましくは短いアミノ酸配列であり（７０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、より好ましくは２０アミノ酸以下）、遊離したカルボキシル基で終わっている。より好ましい態様では、テトラペプチドは、標的化シグナルを含む短い細胞質末端のC末端にあるか、もしくは、LAMP-1と類似した状況にある。
【０１１８】
テトラペプチドに適した4アミノ酸配列は、モチーフがTyr-X-X-Hyd（Xはいかなるアミノ酸であってもよく、Hydは疎水性アミノ酸を示す）を含み、リソソーム/エンドソームを標的化する能力が保持される限りにおいて、アミノ酸置換により得られるだろう。特に好ましいテトラペプチド配列は、Tyr-Gln-Thr-Ileである。最も好ましい態様では、膜貫通ドメインに結合した完全なLAMP細胞質末端、より好ましくはそのリュメナルドメインが、非常に効率的なMHCクラスII処理及び提示のために、抗原性ドメインの一次配列と連結されている。しかしながら細胞質ドメインは、LAMPポリペプチドのリュメナルドメインが提供される限りにおいて、転送を促進するために必要ではない。
【０１１９】
他の態様では、エンドソーム標的化ドメインは膜貫通配列を含んでいる。特定の免疫刺激構築物（construct）のための抗原性ドメインの由来となるであろう多くの蛋白質が、それらの一次（primary）配列において膜貫通ドメインを含む表面抗原であるだろう。そのような膜貫通ドメインは保持され、ここで記載されるように細胞質ドメインはリソソーム/エンドソーム標的化ドメイン（たとえばLAMP リュメナルドメインを含むドメイン）と置換される。
【０１２０】
一つの好ましい態様では、LAMPの膜貫通ドメイン（Chenら、J. Biol. Chem. 263: 8754, 1988参照）は好ましい抗原性ドメインの一次配列とリュメナルドメインの配列と連結される。ポリペプチドにおける膜貫通ドメインの構造は当該分野において非常によく知られている（たとえば、Bangham, Anal. Biochem., 174: 142, 1988; Kleinら、Biochem. Biophys. Acta 815: 468, 1985; Kyle & Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105, 1982参照）。通常膜貫通領域は、より親水的な領域にに形成される２０−２５の疎水性アミノ酸残基のような一次配列内に現れる。たとえばそのような配列は、他の多くの膜蛋白質と同様にGenbankに掲載されるほとんどの細胞表面抗原において見出される。膜貫通配列は、抗原性ドメインをリュメナルドメインと細胞質末端に結合させ、膜画分に構築物を固定できる限り、特別な配列である必要はない。
【０１２１】
加えて、あるいは、代わりに挿入されるモチーフには、標的化ドメイン、上述したようなチロシンモチーフドメイン、ジロイシンおよびチロシンに基づくドメイン、プロリンリッチドメイン、S-V-Vドメイン（たとえば、Blott及びGrifitts, Nature 3: 122-131, 2002参照）の一つもしくはそれ以上が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
樹状細胞のような抗原提示細胞のMHCII 小胞区画への抗原の接近は、普通外来抗原のエンドサイトーシスによるものである。エンドサイティック受容体の転送ドメインが、MHCクラスII分子と会合して続いて処理されるために、エンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官へ抗原を運ぶためのキメラポリペプチドを産生するために使用できることが、本発明により見出された。
【０１２３】
それゆえ一つの態様において、本発明はエンドサイティック受容体の転送ドメインへ抗原を結合させること（たとえば転送ドメインと抗原をコードする核酸配列のフレーム内の融合により）を提供する。転送ドメインは、抗原をエンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官に、その区画／細胞内器官もしくは抗原が運ばれ、それに続く区画におけるMHCクラスII分子との会合のために局在化される。
【０１２４】
本発明によるエンドサイティック受容体には、微生物のための受容体、Fc受容体（たとえば、CD64、CD32、CD16、CD23、CD89）、補体受容体（たとえば、CR1、CD35、CR3、CR4）、スキャベンジャー受容体、あるいはアセチル化されたもしくは修飾されたリポ蛋白質、ポリRNA、リポポリサッカライド、及びシリカ粒子（たとえばSRA、MARCOのような）に結合する受容体、インテグリン（CD49e/CD29、CD49d/CD29、CD51/CD61）、レクチン（たとえば、デクティン-１、C型レクチンのような）、Toll-like受容体（たとえばTLR）が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような受容体の総説としては、たとえばUnderhill及びOzinsky, Annu. Rev. Immunol. 20: 825-852, 2002を参照されたい。
【０１２５】
一つの態様において、エンドサイティック受容体は樹状細胞のようなプロフェッショナルな抗原提示細胞から得ることができる。マクロファージマンノース受容体（MMR）、フォスフォリパーゼA2受容体、エンド180（Endo 180）、DEC-205及びそのヒト相同体、gp200-MR6（McKayら、1998）を含む多数の樹状細胞のエンドサイティック受容体が同定されている。DEC-205は少なくともそれがLAMPとMHCIIの共局在化するエンドソーム/リソソーム区画に抗原性物質を標的化するのに対して、MMRはLAMPとMHCIIの欠損した末梢のエンドソームで見出されるという点で、MMRとは異なることが報告されている（Mahnkeら、J. Cell. Biol. 151(3): 673-684, 2000）。
【０１２６】
DEC-205はまたMMRに比べて、エンドサイトーシスされた抗原をCD4＋T細胞へかなり増強して提示することができる。この２つの分子の、転送と抗原のMHCIIへの運搬における違いは、被覆小窩取り込み配列に加え、MMRでは欠如しているEDE トリアド（triad）がDEC-205の細胞質ゾル（cytosolic）末に存在するためであると報告されている。EDE配列を含む細胞質ゾル末の末端部分は、LAMPとMHCIIを含むより深いエンドソーム/リソソーム区画への標的化に必要とされ、EDEはAAA配列によって置換されない。前述のMahnkeら、2000、は、またこれらの細胞質末端転送シグナルは、CD16キメラをＭＨＣＩＩ／LAMP部位に転送させ及び再循環させ、100倍増強された抗原提示を仲介するのに十分であることを示している。
【０１２７】
DEC-205とgp200-MR6間の配列の類似性は、特に細胞質ドメインでgp200-MR6配列を適切な転送配列とする。さらにgp200-MR6はIL-4制御というさらなる重要な性質を有していることがわかっている。McKayら、Eur. J. Immunol. 28(12): 4071-83, 1998は、gp200-MR6のライゲーションはIL-4に類似して、抗増殖（proliferative）性で前成熟（pro-maturational）な影響を免疫系に及ぼし、Bリンパ球における共刺激性分子の発現亢進（up-regulation）の原因となることを示している。
【０１２８】
しかしながら、LAMPとDEC-205の融合はエンドソーム区画に転送せずにむしろ細胞表面に局在化することが本発明により見出された。しかし、LAMPドメイン、少なくとも一つのエピトープを含む抗原配列、DEC-205ドメインのようなエンドサイティック受容体ドメインを結合する融合蛋白質は、エンドソーム区画に運ばれ、内在性LAMPと共局在化できる。
【０１２９】
それゆえ、好ましい態様では、本発明のキメラ蛋白質は、リソソーム膜蛋白質の（たとえばLAMP リュメナルドメインのような）リュメナルドメインと、エンドサイティック受容体（たとえばDEC-205あるいはgp200-MR6ポリペプチドのような）の標的化ドメインを含む。そのような構築物は正しい標的化を行うのみならず、抗原性を改良する。さらなる態様では、エンドサイティック受容体の標的化及び転送ドメインが、少なくとも一つのエピトープを含む抗原ドメインとともに提供される。キメラ蛋白質はさらに、あるいは代わりに、エンドサイティック受容体のリュメナルドメインを含むこともできる。さらなる態様では、キメラ蛋白質は全長エンドサイティック受容体ポリペプチドを、少なくとも一つの抗原性ドメインとともに含むものである。
【０１３０】
ある態様では、エンドサイティック受容体の標的化ドメインはDECポリペプチドの３１アミノ酸からなる細胞質ドメイン（たとえば、Manhkeら、2000、前述参照）を含む。他の態様では、標的化ドメインはDEC-205細胞質末端の７−９残基を含む。好ましくはこのドメインはTyrモチーフを含む。さらに好ましくは、標的化ドメインはまた、DEC-205細胞質末端の１８−２７残基を含む。さらなる態様では、標的ドメインはEDEドメインを含む。たとえばDEC-205の配列はKatoら、Immunogenetics 47(6): 442-50, 1998において記載され、gp200-MR6の配列はたとえばMcKayら、1998、前述に記載される。
【０１３１】
キメラ蛋白質は、さらにエンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官へポリペプチドを標的化するための細胞質標的化ドメイン（たとえば細胞質LAMPドメインのような）を、上述した一つまたはそれ以上のドメインと同様に（たとえばシグナル配列、膜貫通配列等）含むことができる。上述したように、さらに、もしくは代わりに挿入されるモチーフには、M６Pドメイン、チロシンモチーフドメイン、ジロイシン及びチロシンに基づくドメイン、プロリンリッチドメイン、SVVドメイン（たとえば、Blott及びGrifitts, Nature 3: 122-131, 2002参照）の一つもしくはそれ以上が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
ワクチン組成物
腫瘍は、個体の正常細胞において発現されない、発達段階あるいは未発達の遺伝子を再発現する。ガンの免疫治療の主要な方向は、腫瘍特異的抗原の同定と、その抗原に対するT細胞依存性免疫をより効果的に引き起こす免疫手法の開発である。たとえば、SV40 T抗原遺伝子もしくは、HPVあるいはインフルエンザ核蛋白質由来のE6及びE7遺伝子を含むワクチニアウイルス形質転換ワクチンは、腫瘍抗原としてこれらの蛋白質を発現する腫瘍細胞による攻撃に対して動物を防御するという研究成果がでている。この防御は宿主におけるT細胞内での抗原特異的応答の生起と関連している。
【０１３３】
腫瘍特異的抗原性ポリペプチドをコードする多数の遺伝子が同定されている。このような抗原には、腫瘍抗原、たとえばgp100、MAGE1、MART、MUCI、チロシナーゼ関連蛋白質１及び２（TRP-1、TRP-2）（たとえば、Boonら、Immunol. Today 16: 334-336, 1998参照）に由来するエピトープを含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。MARTIとgp100はメラノーマ患者由来のHLA-A2制限腫瘍浸潤性リンパ球（Tumor-infiltrating lymphocytes（TIL））により特異的に認識されるメラノサイト分化抗原であり、腫瘍の退化にかかわるようである（Kawakamiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 645 8-62, 1994; Kawakamiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515-9）。
【０１３４】
エプスタイン-バー（EBV Epstein-Barr）ウイルス遺伝子はまた、バーキット（Burkits）リンパ腫や他のリンパ腫と同様にホジキンリンパ腫(Hodgkin’s lymphoma）において発現される抗原性ポリペプチドをコードする。HTLV-1ゲノムの産物は成熟T細胞白血病細胞において見出され、一方でヒトパピローマウイルス（HPV）のE6およびE7遺伝子産物は子宮頚管のガン細胞で見出される。
【０１３５】
二つのセルラインで発現される核酸配列のディファレンシャルスクリーニングは、がん細胞に特異的な抗原、さらにはがん細胞の特殊な段階に特異的な抗原をコードする配列を選択するために使用できる。非標的細胞が正常細胞の場合には、ディファレンシャルスクリーニングは正常細胞に共通の核酸分子を消去もしくは軽減することができ、それによって正常細胞において提示される抗原に対する免疫応答を避けることができる。
【０１３６】
多くの場合、変異された遺伝子配列由来のペプチドが、MHCクラスIもしくはMHCクラスII分子と会合し、適切なヘルパーあるいは細胞傷害性T細胞により認識されることが示されている。K rasにおける12位の変異のような様々な腫瘍遺伝子における変異は、他の悪性腫瘍と同様に結腸ガンの主要な遺伝的変異として示されている。P53のような腫瘍抑制遺伝子における変異は、多くの悪性腫瘍においてかなり共通している。加えて、慢性骨髄性白血病でのBCRとabl遺伝子間の並べ替えのような、腫瘍遺伝子の活性化をもたらす並べ替えは、新規な蛋白質配列を生み出す。それゆえ、本発明の一つの好ましい態様では、使用される抗原性物質は、ガン特異的ポリペプチドもしくは変異されたポリペプチド配列（たとえば、遺伝的変異及び/または染色体変異に由来するもの）を含むもの、もしくはより一般的には異常な生理学的応答（たとえば自己免疫応答、過敏症反応、移植に対する反応等）と関連するものである。
【０１３７】
実際、宿主の抗原提示細胞のMHC分子に特異的な抗原を提示するのを増強するいかなる手法であっても、ガンのような疾病や、他の異常な生理学的応答に対する手法によりウイルスなどに対する免疫力を増強させるだろう。同様な議論がＨＩＶなどのウイルス感染症に対するワクチンの有効性を増強することについてなされている。
【０１３８】
それゆえ一つの態様では、本発明は哺乳動物において抗原への免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。その組成物は、抗原の少なくとも一つのエピトープを含む配列を含むキメラDNA断片を含んでいるワクチンベクターを含んでいる。一つの態様では、抗原をコードする配列は、蛋白質のリュメナルドメインに由来する。好ましくは、DNA断片はさらにリソソーム膜蛋白質（たとえばLAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体あるいは修飾体のような）のリュメナルドメインあるいはエンドサイティック受容体の転送ドメインをコードする配列を含んでいる。好ましくはリュメナルドメインあるいは転送ドメインは、抗原がMHCクラスII分子に結合する、もしくは、続いてMHCクラスII分子に結合する他の区画/細胞内器官への転送のために処理される、エンドソーム/リソソーム区画あるいは細胞のリソソーム関連細胞内器官へ抗原を転送する。より好ましくは、抗原は区画/細胞内器官（あるいは運ばれるそれに続く区画）内で、細胞表面に提示されてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するエピトープを産生するように処理される。
【０１３９】
ベクターはまた、膜貫通ドメイン、蛋白質をエンドソーム/リソソーム区画もしくはリソソーム関連細胞内器官へ向けるエンドソーム/リソソーム標的化シグナルを含む細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、チロシンモチーフ、プロリンリッチドメイン、SVVドメインの一つもしくはそれ以上をコードしてもよい。
【０１４０】
ドメインは連続して、もしくはリンカーポリペプチドをコードする核酸、あるいは好ましい機能（たとえば蛋白質安定化配列等）を有する他のアミノ酸配列をコードする核酸で分断されてもよい。一般に、リンカー配列が含まれる場合、核酸は、１から５０アミノ酸の長さのリンカーポリペプチドをコードする。ベクターにとって最小限必要なことは、それが好ましい転送の性質を有するキメラ蛋白質をコードすることである。そのような性質は当該分野における慣用的なアッセイで容易に試験できる。
【０１４１】
たとえば、免疫蛍光顕微鏡は適切な区画/細胞内小細胞内器官へのキメラ蛋白質の転送を確認するために使用できる。S35メチオニンパルスチェイス標識分析は、キメラ蛋白質と抗原ドメインを含む内在性蛋白質の合成速度が本質的に等しいか、及び／または、キメラ蛋白質の処理が適切に行われているかを証明するために、キメラ蛋白質の合成と分解をモニターするのに使用できる。
【０１４２】
特別の態様では、キメラDNA断片によりコードされる蛋白質は、MHCクラスII分子と複合体を形成するペプチドの少なくとも一つのエピトープ、上述したようなエンドソーム/リソソーム転送配列、及びエンドソーム/リソソーム標的化シグナルを含む細胞質ドメインを含むイントラリュメナル（intralumenal）ドメインを含んでいる。好ましくは標的化配列は、Xbbが疎水性アミノ酸であるテトラペプチド配列Tyr-Xaa-Xaa-Xbbを含んでいる。
【０１４３】
他の態様では、キメラDNA断片によりコードされる蛋白質は、LAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体あるいは修飾体のような、膜結合および膜非結性抗原性物質をエンドソーム/リソソーム区画へ標的化及び転送するための配列を含んでいる、全長リソソーム膜結合ポリペプチドを含んでいる。
【０１４４】
HIV-1 Gag蛋白質の組換えキメラ蛋白質仲介性発現
一つの態様では、キメラ蛋白質はHIVポリペプチド由来の抗原を含んでいる。ウイルスの構造遺伝子に対する応答を含む、潜在的な体液性及び細胞性免疫応答の誘導は、HIVウイルスのクリアランスにおいて決定的であることが示されている。CD4特異的な抗Gag抗体は、HIV感染患者及びSIV感染アカゲザル（マカク）における治療ワクチンのモデルにおいて、ウイルスに対する増強された臨床での抵抗性をもって応答した。それゆえ、一つの好ましい態様では、キメラ蛋白質の抗原ドメインは、Gagエピトープを含有する。
【０１４５】
Gagは比較的様々なHIV系統及びサブタイプにおいて保存されており、広範なクロスクラッド（cross-clad）抗Gag抗体の CTL応答がHIV感染患者において証明されている。Gag-特異的CTLは持続性のHIV感染の確立に対する防御にかかわるであろうことが、抗原に曝露されたが血清中に特異的抗体がない対象の研究において示されている。加えて、Gag-特異的CD8＋CTLは、感染の無症候な段階中と同様に、急性感染の間のウイルス負荷を制御する上で重要である。複数の別々のGagエピトープが、細胞傷害活性を有することが示されている。さらに、感染した未治療のヒトのp24-特異性CTL 増殖応答のレベルは、Gag-特異的CTLのレベルと正の関係を有し、血漿HIV-1のRNAレベルとは負の関係を有している。
【０１４６】
HIV-1遺伝子が哺乳動物細胞に導入された際の発現は、様々な段階においてしっかりと制御されている。翻訳後の過程では、スプライシングされていないもしくは一度スプライシングされたHIV-1 mRNAにおいて見出されるGag mRNAの要素であるRev応答性要素（RRE）へのHIV-1 Revの結合は、ｍRNAの核からの送出と、Gag、Gag-Pol、Env、Vif、Vpr、Vpuの翻訳をもたらす。Revの非存在下では、GagをコードするDNAでトランスフェクトされた細胞は、Gag蛋白質をほとんどもしくは全く産生しない。Revはまた、高AU含量の不安定配列におけるその影響、及びシスに作用する（cis-acting）ある不安定配列（instabiligy sequence（INS））への影響によって、HIV-1のｍRNAを安定化するだろう（最近の報告として、たとえばKorsopoulouら、2000参照）。
【０１４７】
Gag蛋白質の発現におけるRevへの依存性は、スプライシングされていないレトロウイルスｍRNAの核からの送出のためにはアクセサリー因子を提供する必要があることから、DNAプラスミドベクターにより、HIV-1に対するGagに基づくワクチンの開発においてこの蛋白質を使用する上で重大な問題である。このRev依存性を打破するためにいつくかの工程が他の研究者らにより使用されてきた。HIV-1遺伝子は、ヒト遺伝子のコドンとは非常に異なる普通でないコドンバイアス（codon bias）を有しており、遺伝子配列をヒトのものに類似させることでHIV-1 mRNAの翻訳が増強されることが見出された（Haasら、Curr. Biol. 6(3): 315-324, 1996）。同様に、INS配列の除去が翻訳効率を増強させた（Schneiderら、J Virol. 71(7): 4892-903, 1997）。あるシスアクティブ保存的輸送エレメント（cis active constitutive transport element (CTE)）がサルのDタイプレトロウイルスとレンチウイルスの非コード領域に存在することもまた見出されている（総説として、Cullen, Virology 248: 203-210, 1998参照）。この配列は、ｍRNAの核細胞質輸送を促進する輸送関連蛋白質（Transport associated protein(TAP)）と結合する拡張されたRNAステムループ構造へと折りたたまれる。
【０１４８】
一つの態様では、本発明は、HIV-1 mRNA翻訳と核からの送出における役割のために通常必要とされる遺伝子産物であるHIV-1 Revの非存在下で、HIV-1 gagの蛋白質発現を増強させる組成物を提供する。HIV-1 gag DNAプラスミドでトランスフェクトされた細胞におけるgagの発現は、他の高度に発現される細胞性蛋白質へgag配列が挿入されたキメラDNAのようなgag遺伝子を合成することにより達成できる。一つの非常に好ましい態様では、HIV-1 gag配列は、リソソーム膜蛋白質のリュメナルドメインに、好ましくは膜貫通ドメインの付近に挿入される。このようなキメラはgag遺伝子を含む抗HIV-1 DNAワクチンの開発に使用できる。
【０１４９】
樹状細胞特異的DEC-205エンドサイティック受容体の標的化ドメインをコードする核酸と、LAMPのリュメナル転送ドメインをコードする核酸に結合された抗原配列をコードする核酸を含むDNAキメラワクチンが製造されることができる。一つの態様では、エンドサイティック受容体は、DEC-205のような樹状細胞エンドサイティック受容体である。以下の例でみられるように、LAMPのリュメナルドメイン、HIV p55 gag、DEC-205の膜貫通および細胞質末端に融合されたDEC-205は、内在性LAMP蛋白質とのキメラ蛋白質部分として提供されたHIV抗原との共局在化を示した。LAMP/Gag/DEC構築物はLAMP/Gag構築物と等価の免疫原性を提示した。
【０１５０】
キメラ蛋白質をコードする配列の構築
キメラ蛋白質の構築工程は当該分野においてよく知られている（たとえば、Williamsら、J. Cell. Biol. 111: 955, 1990参照）。好ましい断片をコードするDNA配列は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, USA、あるいは所望のDNAを含むDNAライブラリーから入手できるような、容易に入手可能な組換えDNA分子から得ることができる。
【０１５１】
このようなDNA断片は最小限、抗原性ドメイン、リュメナルドメインに結合されたポリペプチドをエンドソーム/リソソーム区画もしくはリソソーム関連細胞内器官に転送するためのリソソーム膜結合ポリペプチドのリュメナルドメイン、および／または、エンドソーム/リソソーム区画もしくはリソソーム関連胞内器官に転送するためのエンドサイティック受容体の転送ドメインを含む。さらに、キメラ蛋白質をエンドソーム/リソソーム区画もしくはリソソーム関連細胞内器官に標的化するための細胞質標的化シグナル、膜貫通配列、シグナル配列、ジロイシン配列、チロシンモチーフ、プロリンリッチドメイン、M6P配列、Ser-Val-Val配列等をコードするさらなるDNA断片が含まれることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１５２】
所望のドメイン配列に対応するDNA断片は、慣用な組換えDNA技術を用いて適切な制御およびシグナル配列とともに構築される。たとえば、米国特許第4593002号、および、Langfordら、Molec. Cell. Biol. 6:3191, 1986に記載される。これらを参照のこと。
【０１５３】
蛋白質あるいはポリペプチドをコードするDNA配列は、化学合成されることも、いくつかの手法の一つにより単離されることもできる。合成されるDNA配列は、所望のアミノ酸配列の適切なコドンでデザインされる。一般にその配列の発現に使用される目的の宿主において好ましいコドンが選択される。完全な配列は標準的な方法により調製されたオーバーラップするオリゴヌクレオチドから構築され、完全なコーディング配列へと構築される。たとえばEdge, Nature 292: 756, 1981; Nambairら、Science 223: 1299, 1984; Jayら、J. Biol. Chem. 259: 6311, 1984参照のこと。
【０１５４】
一つの態様では、キメラ蛋白質のドメイン配列をコードする一つもしくはそれ以上の核酸がPCRにより個々に単離される（M. A. Innisら、In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990）。ドメインは好ましくは核酸を含むことが知られている公に入手可能なクローンから単離されるが、それらはまたゲノムDNAもしくはｃDNAライブラリーからも単離可能である。好ましくは、単離された断片は免疫原性蛋白質配列をコードするキメラDNAを構築するために相応する制限酵素部位により境界が形成される。本技術は当該分野において広く知られている。ドメイン配列は直接互いに（たとえば介在配列なしに）、あるいは互いに挿入されて（たとえばドメイン配列は非連続で）、あるいは介在配列により分離されて（たとえばリンカー配列のような）、融合させられることができる。
【０１５５】
核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニングと同様に、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、DNAライブラリーを調製する基本的手法は、当該分野における周知技術である。たとえば、Sambrookら、1989、（前述）、及び、Perbal, 1984, （前述）参照。適切なゲノムDNAあるいはcDNAライブラリーの構築は、当該分野の技術の範囲内である。たとえば、Perbal, 1984, （前述）参照。もしくは、好ましいDNAライブラリーや公的に入手可能なクローンが、ATCCのような公的寄託機関からと同様に、クローンテック（Clonetech）やストラタジーン（Stratagene）にような生物学的研究物質提供者から得ることができる。
【０１５６】
DNAの発現ライブラリーからの発現及び発現されたペプチドの免疫学的な検出により、選択が可能である。MHCII分子、好ましい抗体／T細胞受容体に結合する発現されたペプチドが選択される。これらの選択手法は当該分野における当業者にとって周知技術である（たとえばSambrookら、1989, （前述）参照）。
【０１５７】
いったん所望のポリペプチド配列をコードする配列を含むクローンが調製されて単離されれば、その配列はいかなる適したベクター、好ましくは宿主細胞においてその配列を保持するための複製起点を含むものにクローニングできる。
【０１５８】
核酸運搬媒体（vehicle）
一つの態様では、キメラワクチンをコードする核酸ベクターは細胞へ挿入される。細胞はその核酸の複製、あるいはキメラワクチンを発現させるための宿主細胞である。好ましくはキメラワクチンを発現するための宿主細胞は、（以下にさらに記述されるように）抗原提示細胞である。
【０１５９】
核酸ベクターは最小限、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列、及び、細胞内でのポリヌクレオチド配列の発現制御のために（たとえば転写及び/または翻訳）操作可能に結合された発現制御配列を含む。例としては、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ARS）、セントロメラ、インビトロあるいは宿主細胞（たとえばバクテリア、酵母、昆虫細胞のような）、および/または、標的細胞（たとえば哺乳動物細胞、このましくは抗原提示細胞）において複製可能な、および/または、標的細胞内の好ましい部位にキメラワクチンをコードする配列を運ぶことができるほかの配列が含まれる。
【０１６０】
組換え発現ベクターはまた、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコあるいはニワトリを含む動物に容易に感染する微生物由来のものであってもよい。好ましいベクターには、ワクチニアのようにすでに生ワクチンとして使用されているものが含まれる。これらの組換え体は、宿主に直接摂取され、微生物ベクターのみならず、発現された外来抗原に対する免疫を授与する。ここで組換え生ワクチンとして想起される好ましいベクターには、たとえばFlexner, Adv. Pharmacol. 21: 51, 1990で提示されるような、RNAウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ワクチニアおよび他のポックスウイルスが含まれる。
【０１６１】
発現制御配列には、RNAポリメラーゼに結合するためのプロモータ配列、翻訳アクティベータ及びリプレッサーのそれぞれに結合するエンハンサー配列あるいはネガティブ制御配列、及び／または、リボゾーム結合のための翻訳開始配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。たとえばバクテリア発現ベクターは、lacプロモータのようなプロモータ、転写開始のため、SD配列や開始コドンAUG（Sambrookら、1989, （前述））を含むことができる。同様に、真核細胞発現ベクターは好ましくは、RNAポリメラーゼIIのため異種の、又は同種の若しくはキメラのプロモータ、下流のポリAシグナル、開始コドンAUG、リボゾームが離れるための終止コドンを含む。
【０１６２】
発現制御配列は、天然の遺伝子又はデザインされたものから得ることができる。デザインされた発現制御配列には、変異および／またはキメラ発現制御配列、あるいは、合成されたもしくはクローンされた共通配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。プロモータとポリヌクレオチドが操作可能に結合されるクローニング部位を含むベクターは、当該分野においてよく知られている。そのようなベクターは、インビトロあるいはインビボにおいてRNAを転写でき、ストラタジーン（Stratagene（La Jolla, Calf.））やプロメガバイオテク（Promega Biotech(Madison, Wis.)）のような供給源から購入可能である。
【０１６３】
発現及び/または転写を最適化するためには、余分のまたはかわりとなる翻訳開始コドンや、転写あるいは翻訳のいずれかのレベルにおいて発現を妨害または減じる他の配列を除去するために、ベクターの5’及び/または3’の非翻訳部分を除去、追加、あるいは改変することが必要であろう。もしくは、共通のリボゾーム結合部位が、発現を増強させるために開始コドンのすぐ5’側に挿入されることができる。非常に様々な発現制御配列が、これらは操作可能に結合されたDNA配列の発現を制御する配列であり、本発明のDNA配列を発現するためのベクターにおいて使用されることができる。そのような有用な発現制御配列には、たとえばSV40の初期あるいは後期プロモータ、CMV、ワクチニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、哺乳動物細胞の遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、それらの様々な組み合わせが含まれる。
【０１６４】
一つの態様では、核酸運搬ベクターは、ベクターの複製のための複製起点を含む。好ましくは、その起点は、標的細胞に運搬するために使用される配列の十分なコピーを産生するために使用されることができる少なくとも一つのタイプの宿主細胞において機能する。それゆえ好ましい起点には、バクテリア細胞（たとえばエッシェリヒアエスピー（Escherichia sp.）、サルモネラエスピー（Salmonella sp.）、プロテウスエスピー（Proteus sp.）、クロストリジウムエスピー（Clostridium sp.）、クレブシエラエスピー（Klebsiella sp.）、バチルスエスピー（Bacillus sp.）、ストレプトマイセスエスピー（Streptomyces sp.）、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）のような）、酵母（たとえばサッカロマイセスエスピー（Saccharomyces sp.）あるいはピキアエスピー（Pichia sp.）のような）、昆虫細胞、哺乳動物細胞において機能するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。一つの好ましい態様では、核酸運搬媒体が導入される標的細胞（たとえば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞）において機能する複製起点が提供される。他の態様では、一つは宿主細胞で、もう一つは標的細胞において機能する、少なくとも二つの複製起点が提供される。
【０１６５】
核酸運搬ベクターは、代わりにもしくは追加的に標的細胞の染色体に核酸運搬ベクターの少なくとも部分を統合することを促進するための配列を含む。たとえば核酸運搬ベクターは、標的細胞の染色体DNAと相同的な配列を含んでいるだろう。一つの態様では、運搬ベクターは、キメラワクチンをコードする核酸部位を形成する二つもしくはそれ以上の組換え部位を含んでいる。
【０１６６】
ベクターは追加的に、標的細胞に目的どおりに導入された、および/または、標的細胞により発現されたベクターを確かめるための、検出可能な、および/または、選択可能なマーカーを含んでいるだろう。これらのマーカーは、RNA、ペプチド、あるいは蛋白質のような活性な産物をコードするものであるがこれらに限定されるものではなく、あるいは、RNA、ペプチド、蛋白質、無機あるいは有機物質、または組成物等の結合部位を提供できるものである。
【０１６７】
検出可能な/選択可能なマーカー遺伝子の例としては、ある状態では毒性がある物質（たとえば抗生物質）に対して耐性な産物をコードするDNA断片、受容細胞において他の状態では欠損している（たとえばtRNA遺伝子、栄養要求性マーカー）産物をコードするDNA断片、遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNA断片、容易に同定できる産物（たとえばβガラクトシダーゼ、蛍光蛋白質（GFP、CFP、YFG、BFP、RFP、EGFP、EYFP、EBFP、dsRed、これらの変異、修飾、あるいは増強された形態等）、細胞表面蛋白質）をコードするDNAセグメント、細胞の生存および/または機能に他の状態では有害な産物に結合するDNA断片、他の核酸セグメントの活性を他の状態では阻害する（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）DNA断片、基質を修飾する産物（たとえば制限酵素）に結合するDNA断片、所望の分子を単離あるいは同定するために使用できるDNA断片（たとえば特定の蛋白質結合部位をコードする断片）、プライマー配列、欠損した場合に直接的あるいは非直接的に特定の物質に対する抵抗性もしくは感受性を与えるDNA断片、及び/または、受容細胞において毒性の産物をコードするDNA断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
マーカー遺伝子は、遺伝子の輸送が目的を達したかを確かめるためのマーカーとして、及び/または、輸送された遺伝子を発現する細胞を単離するために、および/または、細胞由来の輸送された遺伝子を回収するために使用されることができる。たとえば、一つの態様では、マーカー遺伝子はキメラワクチンを発現する抗原提示細胞を単離精製するために使用される。
【０１６９】
以上、議論してきたように、個々のドメイン機能を保持できる限りにおいて、ドメイン配列のいかなる相同体、変異体、修飾体を使用されることができる。たとえば、修飾されたリュメナル配列は、本来のドメイン配列と比較して、少なくとも約５０％、約６０％、約８０％、９０％、あるいは少なくとも１００％の有効性、すなわち、免疫応答を生じるためにキメラ配列を含む細胞において十分な抗原提示をもたらす効率で、膜結合性および膜非結合性抗原性物質をエンドソーム区画に転送する能力を保持していなければならない。一つの態様では、適切な転送シグナルを含む配列は、よく特徴づけられた（性質の知られた）卵アルブミンの抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び推定のリソソーム/エンドソーム標的化シグナルを含む蛋白質の細胞質ドメインを含むキメラDNAを構築することで同定されることができる。標的化の有効性は、キメラ蛋白質を発現する抗原提示細胞の、HAエピトープ特異的、MHCクラスII制限T細胞を刺激する能力を測定することにより決めることができる。（たとえば米国特許第5633234号の実施例５参照。）
【０１７０】
たとえば、既知の遺伝子に対して約50％以上、約70％以上、約90％以上、好ましくは約90％以上同一な、本質的に類似した遺伝子も提供されるだろう。同一性の割合は、たとえばCurrent Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubelら、eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1に記載されるような当該分野で知られたソフトウェアプログラムを用いて決定されることができる。好ましくはアラインメントにはデフォルトのパラメータが使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するBLASTである。特に好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータ、Genetic Code= standard; filter=none; strand=both; Cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIRを使用するBLASTNとBLASTPである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出すことができる。http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/cgi-bin/BLAST。
【０１７１】
遺伝子の「保存的に修飾された変異体」もまた提供される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体とは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列である核酸を意図する。特に、一つもしくはそれ以上の選択された（あるいはすべての）第3番目が、混合塩基（mixed-base）およびまたはデオキシイノシン残基に置換された配列を産生することにより、縮重コドン置換は達成されるだろう（Batzerら、1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsukaら、1985, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Rossoliniら、1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。
【０１７２】
本質的に類似したドメイン配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で興味のあるドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより、最初に同定される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５〜約３７℃でのインキュベーション、約６×ＳＳＣから約１０×ＳＳＣの濃度のハイブリダイゼーション緩衝液、約０から約２５％のフォルムアミド濃度、約６×ＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。中程度のハイブリダイゼーション条件には、約40〜約50℃でのインキュベーション、約９×ＳＳＣから約２×ＳＳＣの濃度のハイブリダイゼーション緩衝液、約３０から約５０％のフォルムアミド濃度、約５×ＳＳＣから約２×ＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。高度にストリンジェントな条件には、約５５〜約６８度でのインキュベーション、約１×ＳＳＣから約０．１×ＳＳＣの濃度の緩衝液、約５５から約７５％のフォルムアミド濃度、約１×ＳＳＣ、約０．１×ＳＳＣ、もしくは脱イオン水である洗浄溶液が含まれる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーションの時間は５分から２4時間であり、１，２あるいはそれ以上の洗浄工程を含み、洗浄時間は約１，２あるいは１５分である。SSCは、0.15Mの塩化ナトリウム（NaCl）と15mMのクエン酸緩衝液である。他の緩衝作用を利用するSSCと等価物も使用できることが理解される。類似性は配列決定により確かめられるが、好ましくまたあるいはかわりに、問題となる特定のドメインに適したアッセイ法を使用して、機能（たとえばエンドソーム区画への転送能力等）により確かめることができる。
【０１７３】
相同体、変異体あるいは修飾されたドメイン配列の適性を決定するためアッセイは、単に、適切な活性を発現する配列をスクリーニングすることである。そのようなスクリーニングは当該分野において慣用である。
【０１７４】
核酸運搬ベクターは、むきだしの（naked）核酸としてあるいは、核酸の細胞内への導入を促進する一つもしくはそれ以上の分子を伴う運搬媒体内に提供される。好ましい運搬媒体には、リポソーム処方物、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、ウイルス性処方物（たとえばウイルス、ウイルス粒子、人工的なウイルスエンベロープのような）、細胞運搬媒体等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７５】
脂質に基づく処方物
生物学的に活性な分子を細胞内に運搬するのを促進するためにデザインされた運搬媒体は、非極性及び極性環境の双方（たとえば、形質膜、組織液、細胞内の区画のような）と相互作用しなければならない。それゆえ好ましくは、運搬媒体は極性及び非極性ドメインを含み、あるいは、核酸を細胞に移動させるためのトランスロケーティング配列を含むように設計される。
【０１７６】
極性及び非極性ドメインを有する物質は、両親媒性と呼ばれる。カチオン性の両親媒性は、DNAのようなマイナスに荷電されたポリヌクレオチドと相互作用するための生理学的なpHおよびその周辺pHにおいて、プラスに帯電されることができる極性基を有する。
【０１７７】
上述したような核酸ベクターは、ベクターが細胞膜を通過させることを促進するために、脂質単層膜あるいは二重層を含む処方物において提供されることができる。リポソームあるいは、平らな脂質膜やたとえば赤血球細胞のような完全な細胞の細胞膜のような、あらゆる形の脂質膜が使用できる。リポソーム処方物は静脈注射あるいは経口投与を含むあらゆる手段で投与されることができる。
【０１７８】
リポソームとリポソーム処方物は、標準的な方法により調製され、それらは当該分野における周知技術である。たとえばRemingron’s; Akimaru, 1995, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-10; Alving, 1995, Immunol. Rev. 145: 5-31; Szoka, 1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; 米国特許第4235871号、米国特許第4501728号、米国特許第4827028号参照のこと。ひとつの態様では、リポソームは、特定の細胞型にリポソーム核酸ベクター複合体を標的化するための標的化分子を含んでいる。特に好ましい態様では、標的化分子は、血管表面上の生体分子（たとえば受容体やリガンド）への結合パートナー（たとえばリガンドや受容体）、あるいは、標的組織において見出される細胞を含む。
【０１７９】
リポソームの電荷は、血液からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、マイナスに荷電されたリポソームは網内細胞システムによりより迅速に吸収され（Juliano, 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 651）、それゆえ血流内でより短い半減期を有する。フォスファチジルエタノールアミン誘導体の挿入により、リポソーム凝集を阻害することで循環時間は延長される。たとえばN-（オメガカルボキシ）アシラミドフォスファチジルエタノールアミンを大きいL-α-ジステアロイルフォスファシジルコリンの単層小胞へ挿入することで、インビボでリポソーム循環の生存時間を劇的に増加させる（たとえばAhl, 1997, Biochim. Bipphys. Acta 1329: 370-382参照）。延長された循環半減期を有するリポソームは、典型的に治療や診断の用途において好ましいものである。薬物動態に関する一般的な議論については、たとえばRemington’s, Chapters 37-39, Leeら、In Pharmacokinetic Analysis: Apractical Approach (Technomic Publishing AG, Basel, Switzerland 1996)を参照されたい。
【０１８０】
典型的には、リポソームはホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、あるいはホスファチジルイノシトールのようなマイナスに荷電したリン脂質を約５ないし１５モル％で含むように調製される。添加されるホスファチジルグリセロールのようなマイナスに帯電したリン脂質はまた、リポソームの自発的な凝集を抑制することに寄与し、小型のリポソーム凝集形成の危険性を最小限にする。スフィンゴミエリンや飽和中性リン脂質のような膜固定試薬は、少なくとも約５０モル％、そしてモノシアリルガングリオシドの５ないし１５モル％で、固定性のようなリポソームの好ましい性質を付与することができる。（たとえば、米国特許第4837028号参照）
【０１８１】
加えて、リポソーム懸濁液は、保存中のフリーラジカルおよび過酸化水素脂質によるダメージから脂質を守る、脂質保護試薬を含むことができる。アルファトコフェロールや、フェリオキシアニンのような水溶性鉄特異的キレーターのような、親油性のフリーラジカルクエンチャーが好ましい。
【０１８２】
本発明の核酸運搬媒体は、異なる大きさの多層小胞を含むことができる。たとえば小胞を形成する脂質は、適切な有機溶媒あるいは溶媒システムにおいて溶解され、うすい脂質フィルムを形成するために真空もしくは不活性ガス下で乾燥することができる。望むならば、フィルムはターシャリーブタノールのような適した溶媒で再度溶解され、より簡単に水和された粉状体のより均一な親油性の脂質混合物を形成するようにすることができる。このフィルムはペプチドもしくはポリペプチド複合体の水溶液で覆われ、典型的には15−60分間の撹拌で水和される。より活発な撹拌条件での脂質の水和、あるいはデオキコレートのような可溶化界面活性剤を添加することにより、生じた多層小胞のサイズ分布をより小さいサイズへと移行できる。水和溶媒は好ましくは最終的なリポソーム懸濁液でのリポソームの内容量において好ましい濃度の核酸分子を含む。
【０１８３】
リポソームの調製に続いて、リポソームは好ましいサイズ範囲そして比較的狭いリポソームサイズの分布を達成するためにそのサイズで分けることができる。一つの好ましいサイズ範囲は、約0.2-0.4ミクロンであり、これは、典型的には0.22ミクロンである慣用のフィルターを通じてろ過することによりリポソーム懸濁液を殺菌することを可能にする。フィルター殺菌はリポソームが約0.2-0.4ミクロンのサイズであれば、ハイスループットに行われることができる。リポソームの好ましいサイズへの大きさによる分離に利用可能ないくつかの技術がある（たとえば米国特許第4737323号参照）。
【０１８４】
適切な脂質には、DOTMA（Felgnerら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417）、DOGSあるいはトランスフェクタイン（商標）（TransfectainＴＭ）（Behrら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986））、DNERIEあるいはDORIE（Felgnerら、Methods 5: 67-75）、DC-CHOL（GaoおよびHuang, 1991, BBRC 179: 280-285）、DOTAPTM（McLachlanら、1995, Gene Therapy 2: 614-622）、リポフェクタミンＲ(LipogectamineＲ)、および、グリセロリピッド化合物（compound）（たとえばEP901463号あるいはWO98/37916参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
核酸運搬ベクターとの複合体として適したほかの分子には、ポリアミドアミン（Haensler およびSzoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4: 372-379）、樹状ポリジン（polysine）（WO95/24221参照）、ポリエチレンイリニンあるいはポリプロピレンh-ナイン（WO96/02655）、ポリリジン（米国特許第5595897号、FR2719316）、キトサン（米国特許第5744166号）、DNAゼラチンコアセルベート（DNA-gelatin coarcervates）（米国特許第6207195号、米国特許第6025337号、米国特許第5972707号）、あるいはDEAEデキストラン（Lopataら、1984, Nucleic Acid Res. 12: 5707-5717）のような、カチオン性分子が含まれる。
【０１８６】
ウイルスに基づく遺伝子伝達媒体
一つの態様では核酸運搬媒体は、ウイルスあるいはウイルス粒子を含んでいる。この態様では好ましくは、核酸ベクターはウイルスベクターである。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスのようなウイルスベクターは、時々ウイルスベクターはむきだしの系で、あるいはウイルス蛋白以外の蛋白質で被覆されて導入されるが、しばしば修飾されたウイルスゲノムとそれをとりまくコート構造という二つの部分から形成される（たとえばSmithら、1995, Ann. Rev. Microbiol. 49: 807-838参照）。最近のベクターは天然型ウイルスと類似したコート構造を有している。この構造はウイルスの核酸をパッケージして保護し、標的細胞へ結合および侵入する手段を提供する。
【０１８７】
好ましくは、ウイルスベクターは、天然型のウイルスゲノムから、感染性粒子を生産するために使用される宿主細胞（たとえばパッケージングあるいはヘルパー細胞のような）におけるウイルスの成長を可能にする一方、標的細胞でウイルスが成長できないように修飾される。ベクター核酸は一般に、ヘルパーセルラインにおける複製とパッケージングのための本質的にシス作用を有するウイルス配列と、標的細胞に運ばれるポリヌクレオチドの発現を制御するための発現制御配列を有している。他のウイルス機能は、当該分野において知られるように特定のパッケージングあるいはヘルパーセルラインにおいて、トランスに発現される。
【０１８８】
好ましいベクターは、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキフォレスト（Semliki forrest）ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスからなる集団から選択されるウイルスに由来する。そのようなウイルスベクターは当該分野においてよく知られている。
【０１８９】
一つの好ましい態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスのゲノムは、ウイルスの複製サイクルを完了するのに必要な約３０以上の遺伝子を含む約36kbの直鎖状二本鎖DNAからなる。初期の遺伝子はE3領域を除いてウイルス複製に必要な４つの領域（E1ないしE4）へ分断され、E3は抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると信じられている。E1領域（E1A及びE1B）はウイルスゲノムの転写制御を司る蛋白質をコードする。E2領域遺伝子（E2A及びE2B）の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成へつながる。E3領域によりコードされる蛋白質は細胞傷害性T細胞及び腫瘍ネクローシス因子によるサイトーシスを防御する（Wold及び Gooding, 1991, Virology 184: 1-8）。E４領域によりコードされる蛋白質は、DNA複製、後期の遺伝子発現、スプライシング、及び宿主細胞を切り離すことにかかわる（Halbertら、1985, J. Virol. 56: 250-257）。後期の遺伝子は一般に、ウイルスのキャプシドに寄与する構造遺伝子をコードする。加えてアデノウイルスゲノムは、シスアクティングな5’及び3’ITR(Inverted Terminal Repeat)及びDNA複製に必要なパッケージング配列を有している。キャプシド化領域が感染された粒子へのアデノウイルスDNAのパッケージングに必要とされる一方で、ITRはDNA複製の起点を宿している。
【０１９０】
アデノウイルスベクターは、Heise及びKim（2000, J. Clin. Invest. 105: 847-851）において記述されるように、特異的な細胞（たとえば増殖性細胞のような）において選択的に複製するために特定の条件下で複製可能なように（CRAdベクター）作ることができる。他の態様では、アデノウイルスベクターは（たとえばE1の完全あるいは部分的欠損や変異による）E1の機能のために複製欠損である。アデノウイルスベクター骨格には、さらなる修飾（一つもしくはそれ以上のウイルス遺伝子における欠損、挿入あるいは変異）を含むことができる。E2変異の例としてはDBP(DNA結合蛋白質)エンコーディング遺伝子における熱感受性変異により説明される（Ensingerら、1972, J. Virol. 10: 328-339）。アデノウイルス配列はまた、E4領域のすべてあるいは一部を欠損することもできる（たとえばEP974668; Christら、2000, Human Gene Ther. 11: 415-427; Luskyら、 1999, J. Virol. 73:8308-8319参照）。非本質的なE3領域内でのさらなる欠損は、運搬されるポリヌクレオチドの大きさを増加させるだろう(Yehら、1997, FASEB Journal 11: 615-623)。しかしながら、E3のすべて、あるいはウイルスが免疫系（Goodingら、1990, Critical Review of Immunology 10: 53-71）あるいは炎症反応（EP00440267.3）から逃れることを可能にするポリペプチド（たとえばgp19kのような）をコードするE3の部分を保持することは、利点があるだろう。
【０１９１】
ITRとパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の副生成を避けるような本質的遺伝子修飾を含む第2世代のベクターもまた、形質導入された細胞における遺伝子発現の長期発現を改良するために使用されるであろう。（たとえばWO 94/28152; Luskyら、1998, J. Virol. 72: 2022-2032参照）
【０１９２】
細胞に導入されたポリヌクレオチドは、シス作用を有する配列の例外を除いて、ウイルスゲノムのいかなる部分にも挿入されることができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは欠損領域（E1,E3及びまたはE4）のかわりに、好ましくは欠損されたE1領域内に挿入される。
【０１９３】
アデノウイルスは、とくにイヌ（たとえばCAV-1あるいはCAV-2、 Genbank ref. CAVIGENOMおよびCAV77082をそれぞれ参照）、鳥類（Genbank ref. AAVEDSDNA）、ウシ（BAV3のような、Reddyら、1998, J. Virol. 72: 1394-1402）、マウス（Genbank ref. ADRMUSMAVI）、ヒツジ、ネコ、ブタあるいはサルあるいは他の、いかなるヒトもしくは動物由来のものであってもよく、あるいは、ハイブリッドウイルスであってもよい。いなかる血清型も使用されることができる。しかしながら、Cサブグループのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ad2）及びアデノウイルス５（Ad5）が好ましい。そのようなウイルスはたとえばATCCから入手可能である。
【０１９４】
米国特許第5928994号において示されるように、ウイルス仲介性共内在化経路により核酸運搬ベクターを輸送するために、アデノウイルス粒子あるいは空のアデノウイルスキャプシドもまた使用されることができる。この工程はポリカルベンあるいは一つもしくはそれ以上の脂質層を含む脂質小胞のようなカチオン試薬の存在下で達成されることができる。
【０１９５】
アデノウイルス粒子は、ウイルスの複製に必要な欠損したウイルス遺伝子をトランスで供給する相補性セルライン、あるいは、ヘルパーウイルスを使用する、当該分野におけるいかなる慣用な方法（たとえばWO96/17070）にしたがって、調製および増殖されるだろう。セルライン293（Grahamら、1977, J. Gen. Virol. 36: 59-72）及びPERC6(Fallaux ら、1998, Human Gene Therapy 9: 1909-1917)は共通にE1欠損を補足するために使用される。他のセルラインは欠損したベクターを補うために作られる（Yehら、1996, J.Virol. 70: 559-565; KroughakおよびGraham, 1995, Human Gene Ther. 6: 1575-1586; Wangら、1995, Gene Ther. 2: 775-783; Luskyら、1998, J. Virol. 72: 2022-203; EP919627およびWO97/04119）。アデノウイルス粒子は培養上清及び可溶化後の細胞から回収でき、標準的な技術（たとえばWO96/27677, WO98/00524, WO98/26048 and WO00/50573に記載されるような、クロマトグラフィーや超遠心分離）によってさらに精製することもできる。
【０１９６】
細胞タイプ特異的な標的は、ウイルス表面蛋白質の修飾により宿主範囲を広げたアデノウイルス由来のベクターを用いて達成できるだろう。たとえば、アデノウイルス感染の特異性は、許容細胞の表面に提示される細胞性受容体への結合により決定される。この観点において、アデノウイルスキャプシドの表面に提示されるファイバー（fiber）とペントン（penton）が、細胞接着において重要な役割を果たしている（Deferら、1990, J. Virol. 64: 3661-3673）。このようにアデノウイルスの細胞標的は、特有の細胞表面受容体との特別な相互作用を可能にするように修飾されたファイバー（fiber）および/またはペントン（penton）を産生するために、ファイバー（fiber）及び/またはペントン（penton）をコードするウイルス遺伝子を遺伝子工学的に修飾することにより遂行されることができる。このような修飾の例は、Wickarnら、1997, J. Virol. 71: 8221-8229; Arribergら、Virol. Chem. 268: 6866-6869; Rouxら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9079-9083; MillerおよびVile, 1995, FASEB J. 9: 190-199; WO 93/09221およびWO 95/28494に記載されている。
【０１９７】
特に好ましい態様では、アデノ随伴ウイルス配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスAAV-2（アデノ随伴ウイルスタイプ２）由来のベクターは、なかでも最近開発された最も将来有望な遺伝子運搬媒体である。一本鎖DNAをパッケージングするためのこのシステムのいくつかの特徴は、遺伝子ワクチンの運搬のためのむきだしの（naked）DNAの可能性のある代替品としてのその媒体を示唆している。ワクチニアあるいはアデノウイルスのようなほかのウイルスベクターと比べた第一の魅力的な特徴は、AAVベクターはいかなるウイルス遺伝子も発現しないということである。ワクチン構築物に含まれる唯一のウイルスDNA配列は、145bpの逆方向末端反復配列（invert terminal repeats（ITR））である。それゆえ、むきだしの（naked）DNAによる免疫でみられるように、発現される遺伝子は、抗原、あるいは抗原キメラの遺伝子のみである。加えて、AAVベクターは、持続的な組換え遺伝子発現と、粘膜の免疫の産生のための経口および経鼻運搬の可能性とともに、ヒト末梢血液単球由来の樹状細胞のような分化および非分化細胞の両方において形質導入することが知られている。さらに、必要とされるDNAの量は、50μgあるいは〜10１５コピーというむきだしのDNA容量と比べると、最大限の応答が10１０から10１１粒子あるいはDNAコピーという容量で起こることから、数乗数（magnitude）オーダーも、かなり少ないようである。
【０１９８】
一つの態様では、AAVベクターは、AAV ITRキメラ蛋白質をコードする構築物に含まれるDNAと、ITRなしのAAVコード領域（AAV rep 及びcap遺伝子）を含むAAVヘルパープラスミドACG2とで、適切なセルライン（たとえばヒト293細胞）をコトランスフェクションすることによりパッケージされる。細胞は続いてにアデノウイルスAd5に感染される。ベクターは、当該分野で知られた方法（たとえばセシウムクロライド密度勾配超遠心分離のような）を用いて細胞溶解物から精製されることができ、それらは検出可能な複製可能な（replication-competent AAV）あるいはアデノウイルスを含まないことを保証するために（たとえば細胞傷害効果アッセイにより）確認される。AAV力価は、プロテナーゼKによる切断後に調製されたウイルスDNAサンプルとの定量的PCRにより決定することができる。好ましくは、そのような手法により産生されたベクター力価は、1mlあたり約5x10１２から1x10１３のDNase抵抗性粒子である。
【０１９９】
他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは、感染された細胞（たとえば標的細胞）の染色体DNAに統合される二本鎖DNA内にウイルスRNAゲノムを複製するために、ウイルスによりコードされる逆転写酵素を使用して複製を行う、統合可能なウイルスのクラスである。そのようなベクターには、マウス白血病ウイルス、特にMoloney（Gilboaら、1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 29）あるいはFriend’s FB29系統（WO 95/01447）由来のものが含まれる。一般に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子のgag、pol、envの全部あるいは一部を欠損し、5’および3’LTRとキャプシド化配列を保持している。これらの要素は、レトロウイルスベクターの発現レベルや安定性を増加させるために修飾されることができる。そのような修飾には、レトロウイルスキャプシド化配列の、VL30(たとえば米国特許第5747323号参照)のようなレトロトランスポゾンの一つによる置換が含まれる。好ましくは興味あるポリヌクレオチドがキャプシド化配列の下流、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して逆の方向に挿入される。細胞特異的な標的化は、当該分野において知られているようにレトロウイルスのエンベロープ蛋白質への、抗体や抗体断片の接合によって達成されることができる。
【０２００】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下、あるいは、レトロウイルスベクターが欠損しているレトロウイルス遺伝子（たとえばgag/pol、env）がゲノムに統合されたものを含む、適切な相補性（complementation（パッケージング））セルラインにおいて調製される。そのようなセルラインは先行技術に記載されている（MillerおよびRosman, 1989, BioTechniques 7: 980; DanosおよびMulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460; Markowitzら、1988, Virol. 167: 400）。Env遺伝子の産物は、ウイルス粒子が標的細胞表面に存在するウイルス受容体に結合するために重要であり、それゆえレトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明においては、PA317細胞（ATCC CRL 9078）あるいは293EI6(WO 97/35996)のようなアンフォトロピックなエンベロープ蛋白質を含み、ヒトおよび他の種の標的細胞へ感染できるパッケージング細胞を使用することが有利である。レトロウイルス粒子は好ましくは培養上清から回収され、標準的な方法（たとえばクロマトグラフィー、超遠心分離）にしたがってさらに精製されることもできる。
【０２０１】
他の適したウイルスにはポックスウイルスが含まれる。ポックスウイルス科（Poxviridae）に属するいくつかのメンバーのゲノムがマップされ配列決定されている。ポックスウイルスベクターはポックスウイルス科のいかなるメンバーからも得ることができ、特にカナリポックス、ファウルポックス、ワクチニアウイルスから得ることができる。好ましいワクチニアウイルスには、コペンハーゲン系統（Goebelら、1990, Virol. 179: 247-266; Johnsonら、1993, Virol. 196: 381-401）、Wyeth系統、修飾されたAnkara(MVA)系統（Antoineら、1998, Virol. 244: 365-396）が含まれるがこれらに限定されるものではない。ワクチニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は当該分野において知られている（たとえばEP83286, EP206920; Mayrら、1975, Infection 3: 6-14; SutterおよびMoss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851参照）。好ましくは興味あるポリヌクレオチドは、nOD７コーディング遺伝子間（intergenic）領域、あるいは、その不活性化や欠失がウイルスの成長や複製に重大な減少をもたらさない遺伝子のような、非本質的な領域に挿入される。
【０２０２】
ポックスウイルス粒子は、当該分野の文献に記述されるように調製される（Picciniら、1987, Methods of Enzumology 153: 545-563; 米国特許第4769330号、米国特許第4772848号、米国特許第4603112号、米国特許第5100587号、米国特許第5179993号）。一般に、ドナープラスミドが構築され、大腸菌内での成長により増幅され、慣用的な方法で単離される。それから、プラスミドは適した培養細胞（たとえばチキン胎児繊維芽細胞）へ、ポックスウイルスゲノムとともに、相同組換えによりポックスウイルス粒子を産生するために導入される。これらは細胞上清あるいは可溶化工程（たとえば化学的な溶解、凍結/溶解、浸透圧ショックやソニケーションのような）を経た細胞培養物から回収できる。溶菌斑（プラーク）精製の連続的な繰り返しは、混在する野生型ウイルスを取り除くために使用される。ウイルス粒子はそれから当該分野で知られた技術（たとえばクロマトグラフィー法あるいはセシウムクロライドでの超遠心分離あるいはシュクロース勾配）を用いて精製されることができる。
【０２０３】
ワクチニアウイルスの、天然痘を撲滅するための世界的キャンペーンにおける生ウイルスワクチンとしての使用は、ワクチニアウイルスを組換え生ワクチンベクターとしての開発における明らかな選択に至らしめた。100近くの異なる外来蛋白質を発現する組換え生ワクチニアウイルスが報告されており、それらの多くが効果的な実験的ワクチンである（MossおよびFlexner, 1987で概説されている）。ワクチニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも２５０００塩基対の外来DNAを許容できること、昆虫細胞を含むほとんどの真核細胞に感染できる能力（同書）から、発現ベクターとして特に多才である。他のDNAウイルスと異なり、ポックスウイルスは感染細胞の細胞質で排他的に複製し、宿主染色体とウイルスDNAの遺伝的組換えの可能性を減少させる。組換えワクチニアベクターは、ヒト、他の哺乳動物、寄生虫、RNAおよびDNAウイルス、バクテリア、バクテリオファージを含む様々な由来の蛋白質を適切に処理して発現することが示されている。
【０２０４】
このウイルスはほとんどの哺乳動物に感染することができるので、ヒトや動物の疾病の広範な研究のための有用なベクターとなる。外来蛋白質をコードするDNAの発現は、上流プロモータ配列と、必要であればRNAプロセッシングシグナルを含む、宿主ウイルスの制御要素により制御される。外来DNAのワクチニアウイルスゲノムの必須でない領域への挿入は、相同組換えにより起こる（Panicaliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927, 1982; Mackettら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415, 1982）。
【０２０５】
DNA内での外来遺伝子の発現は、挿入部位またはその近傍の転写制御要素、あるいは、より精密な遺伝子組換え技術により起こるだろう。外来遺伝子の挿入及び発現を非常に促進するプラスミドベクターが構築されている（Mackettら、J. Virol., 49: 857, 1982）。これらのベクターは、ワクチニア転写プロモータと、一つもしくはそれ以上のワクチニアゲノムの必須でない領域に由来するDNAと並んでいる外来コード配列を挿入するための、一つまたはそれ以上の独特な制限酵素部位から構成される、発現部位を含んでいる。プロモータの選択が、時間（たとえば早いあるいは遅い）及び発現レベルの両方を決定する一方で、続いて並んでいるDNAの配列は相同組換えの位置を決定する。
【０２０６】
この方法により産生された1000のウイルス粒子における約一つのみが組換え体である。組換えウイルスプラークはDNAハイブリダイゼーションにより同定されるが、効率的な選択方法も開発されている。必須でないワクチニアウイルスのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の断片を続いて並ぶ遺伝子として使用することで、外来遺伝子をTK部位へ組換え、その挿入によりTK遺伝子を不活性化する。TKウイルスの選択は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でTK細胞におけるウイルスプラークアッセイを行うことにより達成される。ヌクレオチド類似体のリン酸化及びウイルスDNAへの致死効果の導入は、TK.sup.と親ウイルスとともに感染された細胞において起こる。トランスフェクションと組換えの効率に依存して、80までのプラークが要求される組換え体であり、残りは自発的なTK変異体である。
【０２０７】
第二の遺伝子の発現部と同様に、大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターは、親ウイルスからの組換え体を区別する他の方法を提供する（Chakrabartiら、Mol. Cell. Biol., 5: 3403, 1985）。そのような組換え体により形成されたプラークは、適切な標識の追加で形成される青色により陽性を同定できる。TK選択とβガラクトシダーゼ発現を組み合わせることで、組換えウイルスは容易にかつ迅速に単離される。組換え体はそれから適切なセルラインにおける繁殖により増幅され、挿入された遺伝子の発現は、適切な酵素的、免疫的あるいは物理的手段により確かめられる。
【０２０８】
ワクチニアウイルスゲノムに加えられる遺伝的情報の量の上限はまだ知られていない。しかしながら、25000塩基対近くの外来DNAの添加は、ウイルスの収率に明らかに有害な効果をもたらさなかった（Smithら、Gene, 25: 21, 1983）。必要であれば、ワクチニアウイルスゲノムの大きな断片が、追加するための容量を空けるために欠損させられるだろう（Mossら、J. Virol. 40: 387, 1981）。
【０２０９】
ウイルスキャプシド分子は、標的化を容易にするため及び/または細胞に入るための標的化部分を含んでいてよい。適した標的化分子としては、化学的付加体（conjugate）、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（たとえばPEG,ポリリジン、PEI等）、ペプチド、ポリペプチド（たとえばWO 94/40958参照）、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。好ましくは、そのような標的化分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞性受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープ、あるいは抗原性エピトープあるいは腫瘍関連マーカーを認識して結合する。
【０２１０】
ウイルス粒子に基づく組成物は、10から10１４感染ユニット（i.u）、好ましくは10i.u.と10１１i.u.の間という容量で明確に処方される。力価は慣用的な技術で決定することができる。核酸運搬ベクターの容量は好ましくは0.01から10mg/kgの間であり、より特に好ましくは0.1と２mg/kgの間である。
【０２１１】
細胞に基づく運搬媒体
本発明の核酸ベクターは、ベクターを含むほかの細胞（運搬細胞）により標的細胞に運ばれることができる。細胞にベクターを挿入する方法は当該分野において知られており、DNAの細胞核へのマイクロインジェクション（Capechiら、1980, Cell 22: 479-488）、CaPO４とともにトランスフェクション（ChenおよびOkayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752）、エレクトロポレーション（Chuら、1987, Nucleic Acid Res. 15: 1311-1326）、リポフェクション/リポソーム融合（Felgnerら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417）、及びパーティクルガン（Yangら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568-9572）が含まれる。適切な細胞には、自己（autologous）及び非自己（non-autologous）細胞が含まれ、異種移植細胞も含まれる。運搬細胞は、それらの死を誘導して（たとえば誘導可能な自殺遺伝子を細胞に提供して）、標的細胞へのその内容物の運搬のために誘導されることができるだろう。
【０２１２】
アクセサリー分子
本発明の構成は、核酸運搬ベクターの細胞への導入を容易にするため、および/または特有の治療効果を増強するために、一つもしくはそれ以上のアクセサリー分子を含むことができる。
【０２１３】
加えて本発明の構成は、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ヒドロジェル、ヒアルロニダーゼ（WO 98/53853）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート試薬（EP 890362）のような、一つもしくはそれ以上の安定化物質を、動物やヒトの体内における分解を防ぐため、および/またはベクターの標的細胞へのトランスフェクション/感染を改良するために、含むことができる。そのような物質は単独でもしくは組み合わせて使用されることができる（たとえばカチオン性および中性脂質）。
【０２１４】
アデノウイルス蛋白質は、エンドソームを不安定化して、細胞へのDNAの取り込みを増強することができることが示されている。アデノウイルスを、脂質複合DNAベクターを含む溶液へ混合すること、あるいは蛋白質のクロスリンキング試薬を使用してアデノウイルスに共有結合されたポリリジンにDNAを結合することは、本質的に核酸運搬ベクターの取り込みと発現を改良するだろう（たとえばCurielら、1992, Am. I. Respir. Cell. Mol. Biol. 6: 247-252参照）。
【０２１５】
宿主細胞
本発明の核酸ベクターは、原核細胞（たとえば、大腸菌（E.coli）、スタフィロコッカスエスピー（staphylococcus sp.）、バチルスエスピー（Bacillus sp.））、酵母細胞（たとえばサッカロマイセスエスピー（Saccharomyces sp.））、昆虫細胞、線虫（nematode）細胞、植物細胞、両生類細胞（たとえばXenopus）、鳥類細胞、そして哺乳動物細胞（たとえばヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物セルライン、解剖された組織由来のような初代培養哺乳動物細胞）が含まれる様々な宿主細胞において発現されるが、宿主細胞はこれらに限定されるものではない。
【０２１６】
生物、生物の部分である宿主細胞、あるいは生物に導入された宿主細胞から単離された宿主細胞において、分子は発現することができる。一つの態様では、融合分子はたとえば培養物のような、インビトロで宿主細胞において発現される。他の態様では、融合分子は、融合分子をコードする核酸配列を含む体細胞および/または生殖細胞を含むトランスジェニック生物（たとえばトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長目の動物（primate）など）において発現される。トランスジェニック動物の作成方法は、当該分野においてよく知られており、慣用である。
【０２１７】
核酸ベクターはまた、インビトロにおいて細胞に導入され、その細胞（たとえば幹細胞、造血細胞、リンパ球等のような）は、宿主生物へ挿入されることができる。細胞は宿主生物に関して異種（heterologous）あるいは自己（autologous）である。たとえば細胞は、核酸ベクターがインビトロにおいて細胞へ導入されそれから宿主生物に再導入された宿主生物から得ることができる。
【０２１８】
抗原提示細胞
本発明の好ましい態様では、上述したような核酸運搬媒体は天然のもしくは作成された抗原提示細胞へ導入される。
【０２１９】
ここで使用される「抗原提示細胞（APC）」という用語は、MHC、好ましくはクラスII分子あるいはその部分とともに抗原を細胞表面に提示するいかなる細胞をも意図する。適したAPCの例としては、以下において議論され、マクロファージのような全細胞、樹状細胞、B細胞、ハイブリッドAPC、育成抗原提示細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。ハイブリッドAPCの製造方法は当該分野において記載されており、また、知られている。
【０２２０】
樹状細胞(DC)は潜在的な抗原提示細胞である。DCsはT細胞の活性化と増殖に必要なすべてのシグナルを含んでいる。これらのシグナルは二つのタイプに分けられる。第一のタイプは、免疫応答に特異性を与えるものであり、T細胞受容体/CＤ3（TCR/CD３）複合体と、APCの表面上の主要組織適合遺伝子複合体（上記において「MHC」と定義される）クラスIあるいはII蛋白質により提示される抗原性ペプチド間の相互作用を通じて仲介されるものである。この相互作用は、T細胞の活性化を生じるために必須であるが十分でない。実際に、第２のタイプのシグナルがない場合には、第一のタイプのシグナルはT細胞アネルギー（anergy）を生じる。第２のタイプのシグナルは、共刺激シグナルと呼ばれるもので、抗原提示でもMHC制限でもなく、第一タイプのシグナルの存在下において、T細胞の完全な増殖応答を導き、T細胞エフェクター機能を誘導することができる。
【０２２１】
いくつかの分子が共刺激活性を増強させることがわかっている。これらには、熱安定性抗原（HAS）、コンドロイチン硫酸修飾MHC不変鎖（Ii-CS）、細胞内固着分子1（ICAM-1）、APCの表面におけるB7共刺激分子と、そのT細胞上のカウンター受容体CD28あるいはCTLA-4が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２２】
他の重要な共刺激分子は、CD40、CD54、CD80、CD86である。ここで使用されるように、「共刺激分子」という用語は、T細胞の表面のTCRにより結合されたペプチド/MHC複合体とともに働く際に、ペプチドに結合するT細胞の活性化を達成する共刺激効果をもたらす単独の分子あるいはその組み合わせを包含する。この用語は、B7あるいは他のAPC上での共刺激分子、ペプチド/MHC複合体とともに同種のリガンドに結合して、T細胞の表面上のTCRが特異的にペプチドに結合する際にT細胞の活性化をもたらすそれらの断片（単独で、他の分子との複合体で、あるいは融合蛋白質の部分として）を包含する。共刺激分子は、たとえばベックマンクールター（BeckmanCoulter）を含むあらゆる供給源から購入できる。
【０２２３】
本発明の一つの態様では、Romaniら、J. Immunol. Methods 196: 135-151, 1996およびBenderら、J. Immunol. Methods 196: 121-135, 1996に記載される方法が、マウス、サル、あるいはヒトのような哺乳動物の末梢血液単核細胞(PBMCs)由来の非成熟及び成熟した樹状細胞を産生するために使用される。端的に、単離されたPBMCはイムノマグネティック（immunomagnetic）技術によりT細胞およびB細胞を枯渇するために前処理される。リンパ球枯渇PBMCは、それからヒト血漿（好ましくは自己血漿）及びGM-CSF/IL-4が添加されたRPMI培地において（たとえば約7日間）、樹状細胞を産生するために培養される。樹状細胞は、単球先祖（monocyte progenitor）と比較すると、非固着性である。このように、適切な７日で、非固着性細胞はさらなる工程のために得られる。
【０２２４】
GM-CSFおよびIL-4存在下でPBMCから生じた樹状細胞は、非固着的な性質を失い、培養物からサイトカインの刺激がなくなればマクロファージ細胞の運命へ戻ることができるという点で、未成熟である。未成熟な段階での樹状細胞は、MHCクラスII制限経路へ天然の蛋白質抗原を処理するうえで非常に効果的である（Romaniら、J. Exp. Med. 169: 1169, 1989）。培養された樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含むマクロファージコンディションド培地（CM）で、３日間培養することで達成される。成熟樹状細胞は、提示するための新しい蛋白質をより捕獲する能力は減少しているが、休止T細胞（CD4およびCD８）の成長および分化をより刺激することができる。
【０２２５】
成熟した樹状細胞は、より運動型の細胞質プロセスの形成のような形態における変化、非固着性、少なくとも一つの以下のマーカー、CD83、CD68、HLA-DR、またはCD86の存在、あるいは、CD115のようなFc受容体の欠損（Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9: 271, 1991に概説される）により、同定される。成熟した樹状細胞は集められ、典型的なサイトフルオログラフィーや、FACScanやFACStarのようなセルソーティング技術及び機械を用いて分析される。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的であり、購入可能なものである。二次抗体は、FITC-あるいはPE-結合ストレプトアビジンに続いて、ビオチン化されたイムノグロブリン(Ig)を用いることができる。
【０２２６】
もしくは、他のグループが樹状細胞の活性化（up-regulating）および単球を活性化された樹状細胞表現型に変換させる方法を報告している。この方法には、単球を活性化された樹状細胞に変換させるために、培地にカルシウムイオノファーを添加することが含まれている。たとえばカルシウム21イオノファーA23187を24−28時間の培養期間のはじめに添加することで、集められた「単球陽性DC」画分の一様な活性化と樹状細胞表現型への変換がもたらされる。特徴としては、活性化された集団は、一様にCD14（LeuM3）陰性で、HLA-DR、HLA-DQ、IAM-1137.1、I37.2を活性化する。さらにこの活性化された巨大な（bulk）集団は、さらに精製されたものと同様に、少数集団で機能する。サイトカインの特別な組み合わせが、カルシウムイオノファーとともに達成された活性化/変換のための増幅（あるいは部分的置換）を達成させるために使用された。これらのサイトカインには、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4が含まれるがこれらに限定されるものではない。個々のサイトカインは単独で与えられた場合には、適した活性化にとって不十分である。
【０２２７】
APCを単離する二番目の方法は、血液中にすでに循環する比較的多くの前々駆体の APCを集めることである。ヒトの末梢血液から前駆体APCを単離する以前の方法には、メトリザミド（metrizamide）勾配、固着/非固着ステップ（Feudenthalら、PNAS 87: 7698-7702, 1990）、パーコール勾配分離（Mehta-Damaniら、J. Immunol. 153: 996-1003, 1994）、蛍光活性化細胞ソーティング技術（Thomasら、J. Immunol. 151: 6840-52, 1993）のような物理学的手法の組み合わせが含まれている。
【０２２８】
プロフェッショナルな抗原提示細胞（あるいはその前駆体）を単離するための、当該分野におけるたくさんの慣用技術が存在することは、当業者にとって明らかであり、そのような技術及び開発される他の技術は、本発明の範囲に含まれるが、それを限定するものではない。
【０２２９】
一つの態様では、APCと一つもしくはそれ以上の抗原を提示する細胞は自己的である。他の態様では、抗原提示APCは同種（allogenic）である、すなわち異なる対象由来である。
【０２３０】
上記において議論されたように、キメラ分子をコードする核酸は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスに基づく運搬、あるいは細胞に基づく運搬を含む、上述されたあるいは他の当該分野で知られた方法により、APCへ挿入されることができる。Arthurら、Cancer Gene Therapy 4(l): 17-25, 1997はヒト樹状細胞における遺伝子運搬の方法の比較を報告している。
【０２３１】
ヒトMHCの遺伝的名称である、既知で、部分的で、推定のヒト白血球抗原（HLA）の、共通配列を含むアミノ酸および核酸配列が報告されており（たとえばZemmourおよびParham, Immunogenetics 33: 310-320, 1991参照）、また、HLA変異体発現セルラインがよく知られており、一般的に同様に入手可能であり、多くはATCCから入手可能である。それゆえ、PCRを用いて、MHCクラスIIをコードする核酸は容易に操作可能に、ここでの発現に適した細胞を形質転換するのにその後使用される、本発明の発現ベクターに結合される。
【０２３２】
マクロファージ、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞のようなプロフェッショナルなAPCが使用される。これらは、１）自己的供与体の、２）異なるHLA特異性を有する処理される宿主となる供与体の、血液もしくは組織から集められて、または、３）異なる種の異種ドナーから、標準的な方法で集められる（Coliganら、Current Protocols in Immunology, section 3 and 14, 1994）。細胞は正常な宿主、あるいは感染疾患、ガン、自己免疫疾患あるいはアレルギー患者から単離されるだろう。
【０２３３】
プロフェッショナルなAPCは、ロイコフェレシス（leukopheresis）とフィコール/ハイパーク（FICOLL/HYPAQUE）密度勾配遠心分離フィコールと非連続なパーコール密度度勾配を通じた段階的な遠心分離）を用いて、末梢血液から得られるだろう。APCにより内在化されて興味ある抗原に特異的でないT細胞の活性化を導く抗原への、APCの露出を避ける方法が使用される。
【０２３４】
天然で抗原を提示しない細胞は、適切な分子をコードする配列を導入することで抗原を提示するように作られる。たとえばMHCクラスII分子、アクセサリー分子、共刺激分子、抗原提示補助分子をコードする核酸配列が、合成、クローニング、そのような遺伝子を含む細胞からのDNAの精製等の後に導入される。ここに記載される構成および方法において使用される分子をコードする遺伝子を得るための一つの手段は、選択されたオリゴヌクレオチドプライマーペアで、選択された核酸鋳型をPCRにより増幅することである。たとえば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、繊維芽細胞、活性化T細胞、好酸球（eosinophils）、ケラチノサイト、星状細胞、ミクログリア細胞、皮質上皮細胞、シュバイン（Schwann）細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、エンテロサイト（enterocytes）、チロサイト（thyrocytes）、腎細管細胞などが使用される。これらは、宿主から最近外植された初代細胞であって、確立されたセルラインもしくは、比較的均一で多くの世代あるいは確実に増殖できる確立されたセルラインを形成するための細胞培養で過剰に継代されていないものである。
【０２３５】
プロフェッショナルなAPCでない細胞は、様々な公知の分離方法を使用して（Darling, Animal Cells: Culture and Media. J. Wiley, New York, 1994; Freshney, Culture of Animal Cells. Alan R. Liss, Inc., New York, 1987）、自己（autologous）供与体、異なる（heterologous）供与体、あるいは異種（xenogeneic）供与体のいかなる組織からでも単離される。たとえば異なるあるいは異種細胞など、自己でない細胞は、既知のヒトHLA特異性と合致するHLAクラスIおよびクラスII分子をエキソビボで発現するように作り出されることができる。これらの細胞は作り出された細胞のHLA特異性と合致するヒトを対象に導入されることができる。細胞はさらに本発明にしたがって一つもしくはそれ以上のキメラワクチンをエキソビボで発現するように作られる。
【０２３６】
作り出された細胞は標準的な細胞培養法（Darling, Animal Cells: Culture and Media. J. Wiley, New York, 1994; Freshney, Culture of Animal Cells. Alan R. Liss, Inc., New York, 1987）により、細胞培養で保持される。本発明で使用されるセルラインは、様々な由来（たとえば、セルラインとハイブリドーマのATCCカタログ、アメリカンタイプカルチャーコレクション  第８版  1995）から得られ、あるいは標準的な方法により（Freshney, Culture of Immortalized Cells, Wiley-Liss, New York, 1996）産生される。ヒト対象においては非形質転換セルラインが使用されるのに好ましい。
【０２３７】
一つの態様では、GM-CSFの影響下で樹状細胞へ分化するCD34＋前駆体は、対象の体内から得られ、本発明によるキメラワクチンをコードする核酸を細胞へ導入し、細胞は対象へ再導入される。エンドソーム/リソソーム標的化シグナル（そして好ましくはLAMP様リュメナルポリペプチドを含む）に結合された抗原性配列を含む構築物を使用することで、形質導入された抗原提示細胞上のMHCクラスII分子と、特有の抗原から生じるペプチドの会合を増強し、より潜在的にシステム化されたT細胞依存性免疫応答を生じるだろう。本方法でトランスフェクトされる抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であり、効率的に宿主において抗原を提示するMHCクラスII細胞が上述されたように使用されるだろう。
【０２３８】
ペプチドワクチン
また本発明の範囲には、細胞不含ペプチド免疫原を含むワクチンが含まれ、その免疫原は、抗原ドメインとリソソーム膜ポリペプチド（たとえばLAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体あるいは修飾体）配列、あるいはMHCクラスII分子に結合させるために、エンドソーム/リソソーム区画/リソソーム関連細胞内器官に抗原を標的化および転送するための、もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合させるためにほかの区画/細胞内器官へ運搬するためのエンドサイティック受容体の配列を含んでいる。好ましくは、抗原は区画/細胞内器官（あるいは運搬されるそれにつづく区画/細胞内器官）内で免疫応答を調節できるMHCクラスII分子に結合するエピトープを産生するために処理される。
【０２３９】
キメラワクチンはまた、膜貫通領域、及び/または、リソソーム標的化領域（好ましくはLAMPポリペプチド由来の）を伴う細胞質末端、及び/または、ジロイシンドメイン、Tyrモチーフ、MR6ドメイン、プロリンリッチドメイン、及び/またはSer-Val-Valドメインを含んでよい。キメラワクチンはまた生物の体内に投与することを容易にする膜構造において結合されてもよい。たとえばキメラワクチンは、米国特許第4448765号に記載されるようにリポソームへ組み入れられるだろう。
【０２４０】
蛋白質あるいはポリペプチドが抗原として使用されるときには、上述されたDNA構築物の一つあるいはそれ以上の形質転換細胞における発現により産生されるか、あるいは化学合成により調製される。たとえばメリーフィールド（Merrifield）の技術（Journal of American Chemical Society, vol.85, p.2149-2154, 1968）が使用されることができる。
【０２４１】
投与法
本発明のワクチン物質は、上述された免疫刺激構築物を含むか、もしくは、組換え微生物、あるいは免疫刺激構築物を発現する抗原提示細胞である。本発明のワクチン物質を含む組成の調製、および、個人の免疫のためのそのような組成の投与は、当該分野における当業者によく知られた免疫原理に従って達成される。
【０２４２】
大量なこれらの物質は、上述したキメラDNAを発現するレプリコン（replicon）を含む組換えあるいは形質転換細胞を培養することにより得られる。培養方法は当該分野における当業者によく知られており、上記で引用された一つもしくはそれ以上の文献において教示されている。ワクチン物質は一般に組換えあるいは形質転換細胞を培養することで産生され、薬学的に許容できる溶液あるいは懸濁液として処方され、それは通常、たとえば参照としてここに挿入されるたとえば米国特許第4446128号において記載されるような生理学的水溶液、あるいは被覆された錠剤、錠剤、カプセル、座薬あるいはアンプルである。投与は、経口、直腸、経鼻、あるいは、たとえば経皮、皮下、筋注、あるいは静注などの注入を含む、いかなる適した手段でも行われるだろう。
【０２４３】
ワクチン組成物は哺乳動物において免疫応答を誘導するのに十分な量が哺乳動物に投与される。最小限の好ましい投与量は、投与前に存在する量の少なくとも約４倍の濃度まで抗体形成を誘導するのに必要な量である。典型的な最初の投与量は、ワクチンと免疫応答を引き起こすほかの試薬の投与において普通生じるように、投与を行う臨床医により調整されるものであるが、静注、筋注、皮下に投与された場合には、この量というのは、10−5000μg、あるいは組換えベクターの10５から10１１のプラーク形成ユニットであろう。単一投与は普通免疫誘導には十分であるが、複数回投与は応答を確実にし、または、高めることができるだろう。
【０２４４】
ワクチンははじめに非ヒト哺乳動物（たとえばマウスあるいは霊長目）において試験される。たとえば獲得されたマウスの免疫応答アッセイは、天然型抗原に対するよりもリソソーム標的化キメラ蛋白質に対して、より大きな、抗体、T細胞増殖、細胞傷害性T細胞応答を証明するのに使用されることができる。キメラ蛋白質はまた、マウスにおいて高度に効果的であるDNAワクチン処方物がサルの適切な免疫応答をも引き起こすかいなかを決定するために、Rhesusサルにおいて評価されることができる。一つの態様では、個々のサルは、１免疫あたりに総量で5mgのDNAを、筋肉に投与し、2群に分けられて受け、０日、および、必要に応じて追加量で４週、８週、２０週後に免疫を受ける。抗体応答、ADCC、CD4＋およびCD8＋T細胞サイトカイン産生、CD4＋およびCD8＋T細胞抗原特異的サイトカイン染色は、ワクチンに対する免疫応答をモニターするために、測定されることができる。
【０２４５】
本発明による適切な処方と投与の方法のさらなる記載は、米国特許第4454116号（構築物）、米国特許第4681762号（組換えバクテリア）、米国特許第4592002号及び4920209号（組換えウイルス）において見出されるだろう。
【０２４６】
免疫寛容および自己免疫
多くの自己免疫疾患は、あるMHCクラスIIハプロタイプとの関連を示し、異常な自己抗体産生と関連があり、このことは自己反応性MHCクラスII制限CD4＋T細胞の産生は、重要な発病の段階であることを示唆している。ある環境下においてCD４＋T細胞は、第２のシグナル（リガンドB7によるCD28との共同作業のような）の非存在下で、T細胞受容体の作業により不活性化あるいはアネルギー化（anergize）されることができるということは、適切な第２のシグナルを発現しないMHCクラスII細胞上のMHCクラスII制限抗原の効率的な提示は、効果的な寛容性を表すことにつながるだろう。この寛容性の産生、あるいはあるCD4＋T細胞の不活性化は、自己免疫疾患における異常な免疫応答をなくすのに使用されることができるだろう。
【０２４７】
この原理の態様には、（いかなる共刺激シグナルをも発現しない）弱い抗原提示細胞が、MHCクラスIIを発現するために誘導されるかあるいは、適切なMHCクラスII遺伝子でトランスフェクトされるだろう。この細胞は追加的に、重症筋無力症の場合におけるアセチルコリン受容体のような、興味のある自己抗原で形質導入され、エンドソーム/リソソーム標的化シグナルに結合されるだろう。これらの細胞の宿主への注入は、適切な共刺激シグナル（効果的な抗原提示細胞により提供されるシグナル）の非存在下で、CD4＋T細胞上のT細胞受容体に、MHCクラスII分子上のペプチド配列を効率的に提示することに基づいて、抗原に対するT細胞の応答をなくすことになるだろう。
【０２４８】
ガン免疫治療
予防および治療の候補（candidate）
ガン免疫治療の候補は、ここで記載されるように、その遺伝子がクローン化され、LAMPリソソーム/エンドソーム標的化配列により修飾された、決定されて同定された腫瘍特異的抗原を有するいかなるガン患者であってもよい。例としては、報告されているエプスタインバーウイルス関連リンパ腫（Epstein-Barr virus associated lymphomas）患者、HPV関連子宮頚管癌腫患者、慢性HCV患者、ガン遺伝子あるいは腫瘍抑制遺伝子における特徴的な（defined）再配列あるいは変異のある患者が含まれる。ウイルスワクチンにおいてエンドソーム/リソソーム転送および標的配列に結合された腫瘍抗原を有するワクチンによる治療は、いったん同定されれば、個人のガンの段階におけるいかなる時期においても使用できるであろうことが想像されるだろう。非常に危険な患者において、特徴的な腫瘍特異的抗原によるガンの引き続く発現を予防するためのワクチン投与もまた行われることができる。
【０２４９】
治療方法
一つの態様では、ワクチニアのようなウイルスワクチンに挿入されるリソソーム/エンドソーム転送および標的化シグナルに結合された抗原を含む組換えウイルスワクチンは、上述されたように大量に生産され、悪性腫瘍の間のいかなる適切な時期においても患者に注入されるだろう。好ましくは、ワクチンは腫瘍の程度が低い段階で注入されるだろう。この構築物が個々の抗原提示細胞へ導入される他の態様では、抗原提示細胞の前駆体あるいは成熟した抗原提示細胞が個人の骨髄あるいは末梢血液から静脈穿刺により取り出される。これらの細胞は培養が確立され、キメラ構築物での形質導入へと続く。いったん形質導入が起これば、これらの抗原提示細胞は患者へ再度注入される。
【０２５０】
特に好ましい態様では、本発明は、疾病初期、新形成の腫瘍の切除後、あるいは腫瘍細胞の程度がそうでなければ減じられたときのような、低い腫瘍の程度のガン患者の治療方法を提供する。この方法においては、いったん患者の腫瘍の腫瘍特異的な細胞表面抗原の特徴が同定されれば、MHCクラスII分子を発現するであろう抗原提示細胞へと分化することができる自己幹細胞を含む細胞集団を患者から得ることができる。これらの細胞は培養され、エンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官に抗原が標的化され、また、当該区画/細胞内器官あるいは抗原が運ばれるほかの区画/細胞内器官内でMHCクラスII分子と会合するために、患者の腫瘍細胞において見出される腫瘍特異的抗原の少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質、リソソーム膜ポリペプチド（たとえばLAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体、または修飾体）のリュメナル転送ドメインあるいはエンドサイティック受容体のリュメナル転送ドメイン、LAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体または修飾体の細胞質標的化ドメイン、あるいは、エンドサイティック受容体の細胞質標的化ドメインをコードする、異種あるいはキメラDNA分子を導入することで形質転換される。そのようなキメラDNA分子は上述したような（たとえば膜貫通ドメインをコードする配列、シグナル配列、エンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官への標的のための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、チロシンモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ser-Val-Valドメイン等）追加のドメインをコードすることができる。
【０２５１】
形質転換された幹細胞集団はそれから患者に再導入され、そこで幹細胞は腫瘍特異的抗原由来のThエピトープと複合体を形成するMHCクラスII分子を発現する抗原提示細胞へと分化する。腫瘍特異的抗原への免疫応答は、ヘルパーT細胞集団の増強された刺激により増強されるだろう。
【０２５２】
さらに一般的には、一つの態様では、本発明は抗原への哺乳動物における免疫応答を調節する（すなわちそのような応答を刺激、増強、あるいは減じる）ワクチン組成を提供する。エンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官に抗原が標的化され、また、当該区画/細胞内器官あるいは抗原が運ばれるほかの区画/細胞内器官内でMHCクラスII分子と会合するために、患者の腫瘍細胞において見出される腫瘍特異的抗原の少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質、リソソーム膜ポリペプチド（たとえばLAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体、または修飾体）のリュメナル転送ドメインあるいはエンドサイティック受容体のリュメナル転送ドメイン、LAMPポリペプチド、その相同体、オーソログ、変異体または修飾体の細胞質標的化ドメインのような標的化ドメイン、あるいは、エンドサイティック受容体の標的化ドメインをコードする、キメラDNA断片を含むワクチニアベクターが好ましい。そのようなキメラDNA分子は上述したような（たとえば膜貫通ドメインをコードする配列、シグナル配列、エンドソーム/リソソーム区画あるいはリソソーム関連細胞内器官への標的のための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、チロシンモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ser-Val-Valドメイン等）追加のドメインをコードすることができる。
【０２５３】
キット
本発明はさらに、ここに記載される方法の遂行を容易にするためのキットをさらに含むものである。一つの態様では、キットは上述したような核酸ベクターとベクターを受容するための細胞を含む。キットは追加的に、プロフェッショナルなAPCへ細胞を作り出すための一つまたはそれ以上の核酸を含んでもよい。細胞は共刺激分子を発現してもしなくてもよい。一つの好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しないときには、ベクターによりコードされる抗原は自己抗原である。他の態様では、細胞のパネルは異なるMHC分子（たとえばヒトにおいて発現されることが知られている）を発現して提供される。さらなる態様では、キットは、細胞にベクターを挿入することを容易にする試薬（たとえば脂質に基づく処方物）、ウイルスパッケージング物質、細胞など）を含んでいる。さらなる態様では、ベクターによりコードされる抗原に特異的な一つもしくはそれ以上のTセルラインが、ベクターが免疫応答を誘導、調節あるいは増強させる能力を確かめるために提供される。
【０２５４】
実施例
本発明は以下の実施例を参照してさらに説明される。以下は単なる例証に過ぎず、本発明の範囲に含まれる限りにおいて、各部に修飾が施され得るだろう。
【０２５５】
実施例１
全長LAMP配列に挿入された抗原及びアデノ随伴ウイルスITR配列を含むプラスミドによるインビトロでのHIV-1の高レベル発現
【０２５６】
多くの異なる核酸構築物がキメラワクチンをコードするために使用される。
【０２５７】
形質転換された細胞においてLAMPとの融合蛋白質として高いレベルのGag発現を誘導できるプラスミドが、図１に示されている。このプラスミドによるGagの発現は、他の多くのプラスミド構築物による発現と、図１において比較されている。たとえば、プラスミド１はｐｃDNA3.1（インビトロジェン）ベクター骨格に天然型の[HIV-1]Gag遺伝子を含んでいる。プラスミド２はｐｃDNA3.1にLAMPシグナル配列、膜貫通及び細胞質ドメインを含むgagキメラを含んでいる。プラスミド３はpcDNA3.1に全長LAMP cDNAの、リュメナルドメインと膜貫通/細胞質ドメインの間にGagが挿入されたキメラを含んでいる。プラスミド４は、pcDNA3.1にGag阻害配列の変異を含むHIVGagΔINS１５を示す。プラスミド５は、pcDNA3.1にLAMPシグナル配列、膜貫通及び細胞質ドメインとともに、HIVGagΔINS１５を含む。プラスミド６はAAV-ITRと天然型Gagを含むp43ベクター骨格を含む。プラスミド７はプラスミド３のように全長LAMPへ挿入されたgagを含むp43ベクター骨格を示す。
【０２５８】
このデータは、予想通り、対照プラスミド(#1)と、Gag/LAMP膜貫通及び細胞質末端キメラを含むプラスミド(#2)は、顕著な蛋白質の発現を示さなかったことを示している。対照的に、本実験により、全長LAMP遺伝子内にgag遺伝子を含む（#3）場合には、強力なGagの発現が見られるという新たな知見がもたらされた。その発現されたGag蛋白質の量は、修飾されたINS配列とともにgagをコードするプラスミド(#4)や、LAMP膜貫通及び細胞質末端を伴うキメラ(#5)に比べて顕著に多かった。さらに、AAV ITR配列と全長LAMP配列に導入されたgag遺伝子を含むp43プラスミド(#7)により比較的大量のgag蛋白質が発現されたことは、より顕著な知見であった。LAMP配列を有さない同じp43プラスミド構築物はほとんどGagを発現しなかった(#6)。本実験でプラスミド#7でみられた蛋白質発現と同様の発現が、いくつかのセルライン（COS、293T、3T3）のトランスフェクションの後にも観察された。
【０２５９】
このように全長マウスLAMP-1の膜貫通ドメインの細胞外領域に近い部分にHIV Gagを挿入することで、LAMPの小胞体トランスロケーションシグナル配列のみを伴う天然型のGagもしくは修飾体のGagと比較して、LAMPとの融合蛋白質としてより多くのHIV Gagが発現され、Gagの発現量は修飾されたINS配列を伴うGagをコードするプラスミドによるものに比べても高いものであった。加えて、われわれの新規なHIV Gag-LAMPキメラのGag発現は、AAVのITRの非翻訳配列を含むプラスミドDNAベクター（p43ベクター）によりさらに顕著に増強された。
【０２６０】
実施例２
完全長LAMP/HIV-1 Gagキメラ蛋白質をコードするプラスミドへのマウスの免疫応答の評価
トランスフェクトされた細胞における約200kDa（抗Gag抗体によりアッセイされた）のキメラ蛋白質としてのGag蛋白質の高レベル発現は、LAMP リュメナルドメイン（1113bp）のコード配列の下流にHIV-1 p55Gag配列を挿入することで生じることが見出された（図７, 構築物#3）。Gag発現は発現ベクターにAAV ITRsを挿入することで、さらに顕著に増加した。デンシトメトリー（densitometry）により決定されるようにそのような配列のないLAMP/Gag構築物に比べて、本構築物では約40倍増加した発現が見られた。この発現は天然型Gagの発現の約200倍である（図７、構築物#7）。ITRを含んでいるプラスミドにおいてさえ、LAMP リュメナルドメインを欠如したプラスミドでトランスフェクトされた細胞においては最小限のGag蛋白質の発現が見られた（図７、構築物#1,2,6）。このようにGagの高レベル発現には、LAMPドメインが必要である。
【０２６１】
LAMP/Gagの細胞内局在性が、MHCクラスII  I-Ek分子、ICAM-1、B7-1を発現し、原始的なCD４T細胞へすでに処理されたペプチドを提示できるマウス繊維芽セルラインDCEK.ICAM.Hi7にトランスフェクトすることにより分析された。このセルラインのクラスII分子は、LAMP-1とともに局在化することが示されている。天然型GagでトランスフェクトされたDCEK細胞の抗Gagモノクローナル抗体染色により、天然型蛋白質の拡散した細胞質分配が明らかになった。対照的に、LAMP/Gag構築物でトランスフェクトされ、抗Gag抗体で染色されたたDCEKは、いくつかの高度にラベルされた小胞においてMHCIIとLAMP/Gagキメラが著しく共局在化することを示した。
【０２６２】
キメラ蛋白質の免疫応答を調節する能力も評価された。6匹のマウスの集団が、以下に記載するように、下記のプラスミド構築物により、０，３０，６０，９０日に、尾の根元（base）に50μグラムのDNAを免疫された。血液サンプルは、１，２９，５９，８９日に得られ、半分のマウスは70日と100日にさばかれた。以下の様々な構築物の効果が試験された。１）pcDNA天然型Gag、２）pcDNA  LAMPシグナル配列/Gag/LAMP膜貫通及び細胞質ドメイン、３）pcDNA  LAMPのリュメナルドメイン/Gag/LAMP膜貫通および細胞質ドメイン、４）pcDNA  変異されたGag阻害配列（INS）、５）pcDNA  シグナル配列/変異された阻害配列/LAMP膜貫通及び細胞質ドメイン、６）ｐ43（AAV-ITR）天然型Gag、７）p43（AAV-ITR）LAMPのリュメナルドメイン/Gag/LAMP膜貫通および細胞質ドメイン。
【０２６３】
個々のマウスにおけるHIV特異的抗体応答が、2回の免疫の後に59日目に集められた血漿の１００倍希釈でアッセイされた。個々のアッセイ(n=5)の平均としてのデータが示されている（図２参照）。全長LAMP cDNAにおいてコードされるGag遺伝子、特にp43ベクターに含まれるものは、他のいかなる構築物よりも、かなり強い免疫応答を誘発した。天然型Gag遺伝子構築物のいかなるものに対しても応答がないのに対して、GagINS（阻害配列）構築物は、小さい応答を誘発した。全長LAMP/gagキメラとAAVプラスミドの組み合わせは、他のいかなる慣用的なDNAワクチン構築物よりも、顕著に高く免疫原性である。
【０２６４】
２ないし４回目の免疫の後に、５９、８９、１１９日目に集められた血清集団は、また抗体応答の力価を試験された（図３参照）。P43ベクターにおいて完全LAMP配列と結合されたGag配列で免疫されたマウスのGag特異的抗体は、複数回の実験において〜300000の力値を示し、他のいかなる免疫原によるものより顕著に大きかった。さらに、抗Gag抗体応答の力価は２回の免疫において最大であった。完全なLAMP配列にGag配列を含むPcDNA3.Iプラスミドはまた、重大な、ただしより低い力価を誘発した。PcDNA3.1GagΔINSを含む残りのプラスミドは、本実験においてほとんど免疫原性を示さなかった。
【０２６５】
膜貫通及び細胞質ドメインを欠如する分泌されたLAMP/Gag構築物、および、YQTIリソソーム標的化配列を欠如する形質膜LAMP/Gag構築物に関する追加の実験は、LAMP/GagDNAの増強された抗体応答にはリソソームへの転送が必要なことを示した。このように、分泌されたGagの高い蛋白質発現は、分泌されたGagは抗体応答に都合がよいであろうという予測にもかかわらず、LAMP 転送されたGagに匹敵する応答を誘発できなかった。加えてここではLAMP/GagをコードするDNAとGag天然型蛋白質を共注入しても、大きな抗体応答は見られず、これはリソソームに転送されない追加のGag蛋白質は抗体応答において効果を有さず、この免疫における制限的な要素は、CD4＋ヘルパーT応答であったことを示している。
【０２６６】
P55Gag組換え蛋白質による脾臓の刺激における、CD4介在性IL-2ならびにIL-4ｍRNA発現、及びIFN-γ蛋白質産生のアッセイは、完全なLAMPを欠如するプラスミドによるよりも、LAMP/Gagプラスミドによる免疫により強い応答を示す（図７A〜D参照）。この違いはGagの天然型DNAにより免疫された場合におけるGag蛋白質発現の欠如によるものであろう一方、LAMP/分泌Gagもまた免疫原としては劣っていた。この結果は、抗CD8モノクローナル抗体であらかじめ脾臓細胞（splenocyte）をインキュベートしてもIFN-γ産生は阻害されなかった一方で、抗CD4抗体で細胞を処置することでIFN-γ産生が完全に阻害されたことから、CD4＋細胞に特異的であった。天然型GagとLAMP/Gagの組み合わせ免疫は、増加したCD4応答を導かなかった。
【０２６７】
DNAワクチンはCD8＋T細胞応答を産生できるが、元のCD8＋細胞の最大限のプライミング（priming）はCD4＋活性を必要とする。５０μgのDNAの単独免疫に対するGag特異的CD8＋介在応答が、5日間の組換えワクチニアGag-Pol（rVVGag-Pol）の生体内（in vivo）拡大（expanion）と、免疫原性のあるH2Kd制限Gagペプチドによる2時間の活性化により測定された。LAMP/GagDNAで免疫されたマウスは均一に天然型gagあるいは分泌されたLAMP/Gagキメラで免疫されたものに比べて、非常に大きなCD8＋応答を示した。この結果はGagテトラマー結合、細胞内IFN-γ染色、及びGag-特異的細胞死という３つのアッセイの各々と合致するものである。エフェクター集団からのCD8＋細胞の除去はその効果をなくした。トランスフェクトされた細胞のMHCI経路へ運搬されるGag蛋白質を増加させるために、天然型Gagをコードするプラスミドと共免疫することは、CD8＋介在応答を増強させず、このことは、抗原のLAMP標的に関わらず、十分なMHCI抗原提示があることを示した。
【０２６８】
pITR/LAMP/Gagによる免疫に対する容量応答
２回の筋肉注射（i.m.）で0.1−50mgのLAMP/gagDNAを免疫されたマウスは、Gag特異的抗体応答、CD4＋IFN-γ産生、IFN-γ＋％、CD8＋T細胞アッセイにおいて、10-50mgに相当する応答を示した。細胞応答には、最大限のCD4＋とCD8＋の応答には10mgのDNA、顕著なCD8＋の応答にはたった1mgと、少量のDNAが必要であることが明らかになった。他のグループが、細胞性応答に比較して体液性免疫を誘発するには、より多量の免疫原が必要であることを報告している。
【０２６９】
実施例３
p43プラスミドベクターにおいて全長LAMPキメラとしてコードされるHIV-1 Gagに対する、マウスの免疫応答のさらなる評価、反復研究とさらなる対照
６匹のマウスの集団が下記のプラスミド構築物により、０日、30日に尾の根元（base）に50μgのDNAを免疫された。血液サンプルは、１，２９，４５日後に得られ、マウスの半数は４５日後にさばかれた。この実験の第一の目的は、p43(AAV-ITR)LAMP/Gag/TMCDプラスミドのはじめの結果を確かめ、さらなるコントロール免疫を含むことである。下記の多数の異なる構築物が評価された。１）ｐ43（AAV-ITR）（プラスミド陰性コントロール）、２）p43（AAV-ITR）LAMP（gagのないLAMP陰性コントロール）、３）ｐ43（AAV-ITR）天然型Gag、４）p43（AAV-ITR）LAMPのリュメナルドメイン/Gag/LAMP膜貫通および細胞質ドメイン、５）pVax天然型Gag、６）pVax LAMPのリュメナルドメイン/Gag/LAMP膜貫通および細胞質ドメイン。
【０２７０】
最初の免疫後の２９日および二番目の免疫の後１５日での抗HIV特異的抗体応答は、血漿サンプルの１３００希釈で個々のマウスに由来する結果の平均として与えられる（n=6）（図４A参照）。データは再度、顕著な応答が、LAMP リュメナルドメイン/Gag/LAMP 膜貫通及び細胞質ドメインを含むp43（AAV-ITR）を接種されたマウスの二番めの免疫後であることを示す。陽性の応答は、二つの要因、すなわちLAMP配列へ挿入されたGag遺伝子を含むp43プラスミドによるGagの増加した蛋白質発現、及び、蛋白質のLAMP 転送に起因するものである。
【０２７１】
トータルのIgG、IgG1及びIgG２aの力価が決定された。LAMP リュメナルドメイン/Gag/LAMP 膜貫通及び細胞質ドメインを含むp43（AAV-ITR）を接種されたマウスは、1:24300のトータルのIgGとIgG1の力値を提示する一方、天然型Gag（WT）は1:900の力価を提示した（図４Ａ  参照）。加えて、LAMP リュメナルドメイン/Gag/LAMP 膜貫通及び細胞質ドメインを含むp43（AAV-ITR）は、1:300のIgG2aの力価を提示した一方で、天然型Gag（WT）はいかなるIgG2aも示さなかった。
【０２７２】
図５に記載されるように、免疫されたマウスのGag特異的T細胞IL-4及びIFNγ応答は、リアルタイムPCRアッセイにより４５日目に測定された（図７及び８）。脾臓細胞は、一晩、培地（コントロール）、および５μgのGag蛋白質を含む培地で刺激された。P43 LAMP/Gagプラスミドで免疫されたマウス由来の細胞の強力なGag特異的応答が観測され、Th2細胞の刺激を示した。あわせて、IFNγ及びIL-4のT細胞産生は、バランスのとれたT細胞の免疫応答を示唆する。
【０２７３】
実施例４
MHCIIへの細胞Cタイプレクチン受容体/Gag DNAキメラ標的（LAMP/Gag/DCLR）
樹状細胞Cタイプレクチン受容体（DCLR）は、吸着性のエンドサイトーシスにより結合された抗原を内在化し、多細胞（multicellular）及びDC-LAMP分子と共局在化するMHCII区画へ転送する。DCLRはまた免疫応答の特徴を制御する上で働くだろう。キメラLAMP/p55Gag/DCLR蛋白質の転送のためのシグナルとしてのDEC-205（DEC）膜貫通及び細胞質配列の研究も行われた。LAMP リュメナルドメイン配列はGag蛋白質の発現を増強させるために構築物において保持される。予備的なデータは、LAMP/Gag/DCLR構築物でトランスフェクトされた細胞は、高レベルのGag蛋白質を発現し、Gagはトランスフェクトされた細胞においてLAMPとMHCIIとともに共局在化し、免疫されたマウスは効果的な抗体及び強いCD4＋応答を誘導するが、おそらく制限されたCD8＋T細胞応答を誘発することを示している。
【０２７４】
プラスミド構築物
C57BL/6マウス骨髄細胞由来のRNAは、DCLRシステムモデルとしてのDEC205の膜貫通ドメイン及び細胞質３１アミノ酸末端をクローニングするために鋳型として使用された。これらのDECドメインは、対応するLAMP膜貫通断片およびpITRベクター骨格におけるLAMP/Gag構築物の細胞質ゾルの１１アミノ酸末端を置換するために使用された。DEC205の膜近位の被覆小窩およびDEC205の遠位のEDE配列は、形質膜と後期エンドソーム/リソソーム区画間でのDEC205の再循環における役割を果たすと信じられている（Mahnkeら、2000）。
【０２７５】
この配列の以下の組み合わせはAAV-ITR-含有ベクター骨格（pITR）において合成された（図８参照）。ｍLAMP/DEC（抗原なしの陰性コントロール）、p55Gag（天然型HIV-1 Gag）、mLAMP/p55Gag（陽性コントロールとしての多細胞（multicellular）ｍLAMP/p55 Gag構築物）、mLAMP/p55Gag/DEC（実験構築物）、LAMP/p55Gag/DEC７（DECの細胞質ドメインのアミノ酸７で終了し、それゆえMHCII標的配列を欠いているコントロール構築物）。
【０２７６】
LAMP/Gag/DCLRキメラ蛋白質発現
Gagの発現はトランスフェクトされたCOS-7細胞で分析された（図９参照）。予期されたように、pITR/gagプラスミド（レーン２）により検出可能な天然型Gagが発現され、非常に増加したレベルのLAMP/Gag/DCLR（レーン３及び４）およびLAMP/Gag（レーン５）蛋白質キメラが見られた。この過剰に露光されたゲルはまた、抗Gag抗体と反応するLAMP/Gagキメラの分解した多くの断片を表している。
【０２７７】
DEC DCLR細胞質ドメインを含む蛋白質キメラの細胞性転送
LAMP/DCLRとLAMP/Gag/DCLRキメラのトランスフェクトされたヒト２９３細胞における細胞内局在性が免疫蛍光顕微鏡により調べられた。予測されたように、リソソーム標的化シグナルを欠くｍLAMP/DCLRキメラは（抗マウスLAMP抗体で染色された）、内在性のヒトLAMPのリソソーム局在性（抗マウスLAMP抗体で染色された）とは対照的に、形質膜で見出された（図１０A〜F参照）。しかしながら驚くべきことに、mLAMP/Gag/DCLRキメラは細胞内小胞に局在化し、特にヒト細胞の内在性LAMPと共局在化した。
【０２７８】
LAMP/Gag/DCLR DNAキメラを接種されたマウスの免疫応答
BALB/cマウス(n=8)を、５０μグラムのDNA（初回（prime））を筋肉を経由して免疫した後、続いて10μgのDNA（追加）を３週間免疫された。追加投与２週間後のサンプルの抗体力価は、GagDNA構築物によりコードされた天然型Gagへの検出可能な応答がないのに対して、LAMP/Gag/DCLR構築物への高い力価応答を示した（図１１Ａ，Ｂ，Ｃ１〜Ｃ３参照）。IL-4mRNA合成とIFN-γ産生のELISAアッセイにより測定されたCD4＋介在応答は、標準的なLAMP/Gag構築物への高レベルの応答と匹敵するものであった。対照的に、CD8＋のLAMP/Gag/DCLRへの応答は、Gag特異的テトラマー結合及び細胞内IFN-γ染色により測定され、LAMP/Gagにより誘発された応答よりも一致して低かった。この低いCD8＋と高いCD4＋と抗体応答の違いは、さらなる研究への主題とされる。おそらく、このDCLRキメラワクチン構築物への免疫応答にはTh2バイアスがあるのだろう。
【０２７９】
実施例６
AAVベクター構築物
以下のAAVベクターDNAワクチン構築物が合成された。AAV/LAMP（陰性コントロール）、AAV/Gag（天然型Gag）、AAV/LAMP/Gag（LAMP/Gagキメラ）、AAV/hDC-LAMP/Gag(hCD-LAMP/Gagキメラ)、AAV/LAMP/Gag/DCLR（LAMP/Gag/DCLRキメラ）。
【０２８０】
免疫プロトコール、はじめの実験
二つの最初の免疫研究がわれわれの慣用的なプロトコールの条件にしたがって遂行された：DNA-初回（prime）が初日に50μg  筋肉を経由して（IM）、続いて２１日にDNA  追加  10μg  筋肉を経由して（IM）又は、AAV  追加  ５x10９ゲノムコピー。動物はまた、一度だけAAVベクターで免疫された。動物はCD8＋応答アッセイのために31日目に、CD4＋応答アッセイのために３９−４０日目に、そしてCD4＋とCD8＋アッセイのために９０日目にさばかれた。抗体アッセイの実験を通じて、免疫前と３−４週の間隔で血液が採取され、残りのマウスにおいては現在まで6ヶ月間にわたり、一ヶ月毎に血液採取が継続された。二匹の個々のマウスを用いた免疫実験が、今まで続けられており、一匹は6ヶ月間、もう一匹は２ヶ月間にわたった。
【０２８１】
マウスの免疫応答と、免疫持続  最初の実験
細胞性免疫応答：
一般にこのプロトコールの条件下で上述した時間間隔のアッセイでは、追加免疫としてむきだしのDNAとAAVベクターを比較すると、９０日まではむきだしのDNAの追加に比較してAAVの追加の明らかの利点は見られなかった。
【０２８２】
抗体応答
AAVベクター系に関する文献を追ってみると、むきだしのDNAとの一つの明らかな相違点は、おそらく抗原の長期発現による、保持された体液性応答であるようにみえる（表１）。われわれの以前の実験において見られたように、LAMP/gagキメラの接種は、追加免疫の２週間後に７２０００の本実験での力価で、迅速なGag特異的IgG応答を誘発した。追加的な免疫なしでは、このIgG応答は３−４月後に実質上バックグラウンドレベルまで急速に減少した。対照的に、AAVベクターによる免疫は、ゆっくりした始まりであるが、保持されたより高力価のIgG応答をもたらした。特に、DNA初回後、一回のAAV追加を伴うAAV/LAMP/Gag/DCLRキメラは、AAV/LAMP/Gag構築物への応答に比べて約１０倍である200000以上のIgG力価を保持した。このデータはさらにDCLRシステムのTh2バイアスを示唆している。
【０２８３】
【表２】
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【０２８４】
ここに記載されたことの改変、修飾あるいは他の形態が、本発明の思想と本発明の範囲と請求の範囲に記載の事項の範囲内において、当業者に想起されるだろう。
【０２８５】
明示された特許、特許出願、国際出願、参考文献の全ては、それらの完全な内容が参照としてここに明確に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
本発明の目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明と付随する図面を参照することにより、よりよく理解されることができるだろう。
【図１】Aは異なるプラスミド構築物の模式的な説明である。Bは異なるプラスミドで形質転換されたCOS細胞の、抗Gag抗体でプローブされたウエスタンブロット解析である。垂直の矢印はプラスミドのプロモータ領域を指し、四角で囲まれた領域はオープンリーディングフレームを示す。分けられたボックスは下記の説明で示されるキメラ蛋白質の異なる部分を示す。ＴＭ／ＣＹＤボックスは構築物の膜貫通ドメインと細胞質ドメインを示す。赤いダイヤモンドは発現ベクターに加えられたAAV-ITRを示す。
【図２】個々のマウス（n=5）の平均の抗HIV 溶解物抗体応答を示す。HIV-1ウイルス蛋白質のトリトン-X-100 溶解物へ結合する抗体のELISA解析である。プレート（plate）に5μg/mlの50μlが添加されたものである。
【図３】個々の免疫における抗HIV 溶解物抗体の力価を示す。
【図４】A及びBは、最初の免疫から29日後、および、2回目の免疫から15日後の、抗HIV 溶解物抗体応答を示す。個々のマウス（n=6）の平均である。
【図５】０日目と30日目に50μgのDNAで免疫した45日後のインターフェロンγおよびIL-4のアッセイを示す。脾臓細胞は培地（コントロール）、5μgのGag蛋白質により刺激された。左側は、p55 Gag特異的IL4の産生であり、右側は、p55 Gag特異的INFγの産生である。
【図６】０日目と30日目に50μgのDNAで免疫した45日後のIL-4のリアルタイムPCRアッセイを示す。脾臓細胞は、培地（コントロール）、5μgのGag蛋白質により刺激された。
【図７】A〜Dは、抗原特異的CD4-介在性サイトカイン応答へのLAMP/Gagキメラの影響を示す。図7Eはそのキメラをコードする様々なベクターを示す。
【図８】本発明の一つの態様によるLAMP/Gag/DECキメラの転送をモニターするために使用されるベクターを示す。
【図９】LAMP/Gag/DCLRキメラによりトランスフェクトされたCOS細胞のウエスタンブロット解析を示す。
【図１０】A〜Fは、LAMP/Gag/DCLRキメラによりトランスフェクトされた細胞の免疫蛍光を示す。
【図１１】A〜B、C1〜C3は、LAMP/Gag/DCLR 転送により誘導された免疫応答の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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