(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡で観察する標体の作製方法であって、
水分を含む試料を、電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体に浸漬する浸漬工程と、
上記イオン液体に浸漬された試料に含まれる水分を除去する水分除去工程と、
を含み、上記浸漬工程および水分除去工程によって上記試料に含まれる水分をイオン液体により置換する、標体の作製方法。
【請求項２】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオン、第４級アンモニウムカチオンであり、Ａ−は、テトラゾール化合物アニオンまたはトリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである）で示されるイオン液体である請求項１記載の標体の作製方法。
【請求項３】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、第４級アンモニウムカチオン、又は第４級ホスホニウムカチオンであり、Ａ−は、ビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン、又はビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１記載の標体の作製方法。
【請求項４】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、
【化１】
0004581100.tif 000015
からなる群から選択されたカチオンであり、Ａ−は、［Ｂ（ＯＲ７）ｎ（ＯＲ８）ｍ（ＯＲ９）ｏ（ＯＲ１０）ｐ］−により示されるアニオン（Ｂはホウ素、Ｒ７〜Ｒ１０は、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基）である）で示されるイオン液体である請求項１記載の標体の作製方法。
【請求項５】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、ベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオンであり、Ａ−は、スルホコハク酸ビス−２―エチルヘキシルアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１記載の標体の作製方法。
【請求項６】
電子顕微鏡で標体を観察するときに用いるセルであって、
カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体と、
上記イオン液体を収容する絶縁性セルと、
上記イオン液体に浸漬された正負の電極と、
一端部が上記セル内に配置された導通部材と、
を含む試料用セル。
【請求項７】
電子顕微鏡で標体を観察するときに用いるセルであって、
導体からなる試料台の上に設けられた絶縁性セルと、
上記絶縁性セル内に設けられた電極と、
一端部が上記試料台に接続され、他端部が上記セル内に配置された導通部材と、
カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であって上記電極と上記導通部材の他端部とを電気的に接続するイオン液体と、
を含む試料用セル。
【請求項８】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオン、第４級アンモニウムカチオンであり、Ａ−は、テトラゾール化合物アニオンまたはトリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである）で示されるイオン液体である請求項６又は７記載の試料用セル。
【請求項９】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、第４級アンモニウムカチオン、又は第４級ホスホニウムカチオンであり、Ａ−は、ビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン、又はビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである）で示されるイオン液体である請求項６又は７記載の試料用セル。
【請求項１０】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、
【化２】
0004581100.tif 000016
からなる群から選択されたカチオンであり、Ａ−は、［Ｂ（ＯＲ７）ｎ（ＯＲ８）ｍ（ＯＲ９）ｏ（ＯＲ１０）ｐ］−により示されるアニオン（Ｂはホウ素、Ｒ７〜Ｒ１０は、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基）である）で示されるイオン液体である請求項６又は７記載の試料用セル。
【請求項１１】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、ベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオンであり、Ａ−は、スルホコハク酸ビス−２―エチルヘキシルアニオンである）で示されるイオン液体である請求項６又は７記載の試料用セル。
【請求項１２】
標体を観察するときに用いる電子顕微鏡であって、
標体を収容し、真空引きされる真空チャンバと、
上記真空チャンバ内に収容され、電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体を収容可能な絶縁性セルと、
上記絶縁性セルに充填されるイオン液体に浸漬された正負の電極と、
上記標体に電子線を照射する電子銃と、
上記電子銃から上記標体に電子を照射したことにより発生する二次電子を検出する検出器と、
を含む電子顕微鏡。
【請求項１３】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオン、第４級アンモニウムカチオンであり、Ａ−は、テトラゾール化合物アニオンまたはトリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである）で示されるイオン液体である請求項１２記載の電子顕微鏡。
【請求項１４】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、第４級アンモニウムカチオン、又は第４級ホスホニウムカチオンであり、Ａ−は、ビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン、又はビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１２記載の電子顕微鏡。
【請求項１５】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、
【化３】
0004581100.tif 000017
からなる群から選択されたカチオンであり、Ａ−は、［Ｂ（ＯＲ７）ｎ（ＯＲ８）ｍ（ＯＲ９）ｏ（ＯＲ１０）ｐ］−により示されるアニオン（Ｂはホウ素、Ｒ７〜Ｒ１０は、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基）である）で示されるイオン液体である請求項１２記載の電子顕微鏡。
【請求項１６】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、ベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオンであり、Ａ−は、スルホコハク酸ビス−２―エチルヘキシルアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１２記載の電子顕微鏡。
【請求項１７】
電子顕微鏡によって標体を観察する方法であって、
カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体に、被観察物を浸漬させる工程と、
上記被観察物に正負の電極を接触させる工程と、
上記被観察物に電気を印加しながら、上記被観察物に電子を照射し、照射された電子による二次電子若しくは透過電子を検出して、上記被観察物の像を得る工程と、を備える標体観察方法。
【請求項１８】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオン、第４級アンモニウムカチオンであり、Ａ−は、テトラゾール化合物アニオンまたはトリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである）で示されるイオン液体である請求項１７記載の標体観察方法。
【請求項１９】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、第４級アンモニウムカチオン、又は第４級ホスホニウムカチオンであり、Ａ−は、ビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン、又はビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１７記載の標体観察方法。
【請求項２０】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、
【化４】
0004581100.tif 000018
からなる群から選択されたカチオンであり、Ａ−は、［Ｂ（ＯＲ７）ｎ（ＯＲ８）ｍ（ＯＲ９）ｏ（ＯＲ１０）ｐ］−により示されるアニオン（Ｂはホウ素、Ｒ７〜Ｒ１０は、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基）である）で示されるイオン液体である請求項１７記載の標体観察方法。
【請求項２１】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、ベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオンであり、Ａ−は、スルホコハク酸ビス−２―エチルヘキシルアニオンである）で示されるイオン液体である請求項１７記載の標体観察方法。
【請求項２２】
電子顕微鏡によって標体を観察する方法であって、
標体は、被観察物と、電子顕微鏡による観察時に液体であり、当該液体に上記被観察物が浸漬されるイオン液体とを含み、
上記標体に電子を照射し、照射された電子による二次電子若しくは透過電子を検出して、上記被観察物の像を得る工程を備えることを特徴とする標体観察方法。
【請求項２３】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオン、第４級アンモニウムカチオンであり、Ａ−は、テトラゾール化合物アニオンまたはトリアゾール化合物アニオン、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである）で示されるイオン液体である請求項２２記載の標体観察方法。
【請求項２４】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、第４級アンモニウムカチオン、又は第４級ホスホニウムカチオンであり、Ａ−は、ビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン、又はビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである）で示されるイオン液体である請求項２２記載の標体観察方法。
【請求項２５】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、
【化５】
0004581100.tif 000019
からなる群から選択されたカチオンであり、Ａ−は、［Ｂ（ＯＲ７）ｎ（ＯＲ８）ｍ（ＯＲ９）ｏ（ＯＲ１０）ｐ］−により示されるアニオン（Ｂはホウ素、Ｒ７〜Ｒ１０は、水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基）である）で示されるイオン液体である請求項２２記載の標体観察方法。
【請求項２６】
上記イオン液体が、一般式：Ｋ＋Ａ−（式中、Ｋ＋は、ベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオン、アルキルピリジニウムカチオンであり、Ａ−は、スルホコハク酸ビス−２−エチルヘキシルアニオンである）で示されるイオン液体である請求項２２記載の標体観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型電子顕微鏡、若しくは透過型電子顕微鏡等の電子顕微鏡による試料観察に用いられ、試料観察面のチャージアップを防止する液状媒体、及びそれを用いる試料観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、ナノレベル、マイクロレベルの微小構造を高精度に観察することが要請されているが、微細な構造等を観察する手段として、一般的に走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope;以下ＳＥＭと称す）が用いられている。【０００３】
ここで、ＳＥＭとは、電子線を走査しながら、観察試料に照射し、電子線が観察試料に衝突することにより発生する、二次電子、反射電子、特性Ｘ線、蛍光等のうち、例えば二次電子を検出器により検出し、検出された電子の電荷量に対応する輝度と、電子が照射された位置情報とを処理することにより、観察試料を三次元的に画像表示することができる電子顕微鏡である。【０００４】
一般に、観察試料に照射される一次電子の入射量と、一次電子の照射により観察試料から放出される二次電子の放出量との比率を表した二次電子放出利得は、上記一次電子の加速電圧、即ち入射エネルギーに依存する。上記二次電子放出利得と一次電子の加速電圧とは、図３に示すように、一次電子の加速電圧の中間領域に、二次電子放出利得の最大値を有し、一次電子の加速電圧が０に近づくに従って、また無限に大きくなるに従って上記二次電子放出利得が０に近づくような関数となっている。ここで、上記二次電子放出利得が１以上となる、一次電子の加速電圧の領域を中間領域Ｂとし、上記二次電子放出利得が１以下となる、２つの、一次電子加速電圧の領域のうち、上記中間領域より小さい領域を低領域Ａ、そして、上記二次電子放出利得が１以下となる、２つの領域のうち、上記中間領域より大きい領域を高領域Ｃとすると、一次電子の加速電圧の低領域Ａ、及び高領域Ｃにおいては、上記二次電子放出利得が１以下であり、一次電子の入射量が、二次電子の放出量より多くなるため、試料表面において、負の電荷を有する電子が相対的に増加し、一次電子を入射するに従って試料表面は負に帯電する。また、一次電子の加速電圧の中間領域Ｂにおいては、上記二次電子放出利得は１以上となり、一次電子の入射量が、二次電子の放出量より少なくなるため、試料表面において電子量が相対的に減少し、一次電子を入射するに従って試料表面は正に帯電する。【０００５】
観察しようとしている試料が導電性からなり、この試料が接地されていれば、上記のように帯電した電荷を試料外に放出することができるが、上記試料が、絶縁体からなる物体又は絶縁体で囲まれた物体である場合には、その表面に帯電した電荷を放出することができないため、ＳＥＭにより試料を観察する場合、チャージアップにより、試料の像を正確に観察することができない。特に、一次電子の加速電圧が中間領域Ｂにある場合、一次電子入射量に対して二次電子放出量の方が多いため、ＳＥＭ観察像において、濃淡がつきにくく、全体的に白く表示されてしまう。そのため、一次電子の入射量を減少させて、チャージアップを防止することが試みられているが、上記のように一次電子の入射量を減少させると解像度が低下し、像がぼやけることとなる。一方、一次電子の加速電圧が、低領域Ａ若しくは高領域Ｃにある場合、試料表面は負に帯電することとなり、このため、この試料表面に帯電した負の電荷により、電子銃から入射される一次電子の軌道が歪められ、正確な測定を行うことができない。【０００６】
そのため、観察しようとする試料表面が絶縁体からなる場合において、チャージアップを防止するため、試料表面にカーボン（Ｃ）、アルミニウム（Ａｌ）、又は白金（Ｐｔ）等を蒸着することにより、試料表面において帯電した電荷を放出することが試みられている。【０００７】
また、特許文献１においては、チャージアップを防止するため、上述の二次電子放出利得が１となるような加速電圧で一次電子を試料表面に照射する走査型電子顕微鏡が提案されている（特許文献１）。このような装置は、上記二次電子放出利得が１であるため、即ち、入射される一次電子と放出される二次電子の量が同じであるため、試料表面が帯電せず、チャージアップを防止することができる。【０００８】
さらに、特許文献２においては、試料表面の裏面からイオンシャワーを照射して、電子により負に帯電した試料表面を上記イオンシャワーにより中和させることが提案されている（特許文献２）。【０００９】
他方、微小構造を観察する場合、ＳＥＭによる以外にも、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;以下ＴＥＭと称す）によっても観察されている。【００１０】
ここで、ＴＥＭとは、電子線を観察試料に照射し、透過させ、観察試料の観察位置により異なる電子線の透過量を検出し、この透過量の違いと電子線を照射した観察位置とを処理することにより、試料を二次元的に画像表示することができる電子顕微鏡である。【００１１】
観察試料に電子を照射し、試料を透過させて像を観察することになるため、対象となる試料をできるだけ薄く切断したり、電子を透過するフィルム上に薄く塗りつけて観察されている。また、ＴＥＭ用試料は、電子を透過するようにおよそ１００ｎｍ以下の厚さにスライスされる。さらに、観察試料が、例えば生体試料である場合、生体試料は一般に多量の水分を含んでおり、これを真空下に置いたときに水分が一瞬で蒸発するとともに、試料の形状が変形してしまうため、試料を完全に乾燥させることが必要とされている。
【特許文献１】特開平３−１６３７３６号公報
【特許文献２】特開平２−１５５４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、ＳＥＭによる観察においては、絶縁体からなる試料表面に、カーボン（Ｃ）、アルミニウム（Ａｌ）、又は白金（Ｐｔ）等を蒸着することにより、チャージアップを防止する方法では、試料を観察する前に、別途蒸着工程を行わなければならないため、工程が複雑となり、蒸着のための装置等を用意する必要がある。【００１３】
また、特許文献１のような、二次電子放出利得が１となる加速電圧で一次電子を試料表面に照射するＳＥＭでは、電子線が照射されている部分が、ある材質の部分にある場合においては、上記二次電子放出利得が１に保たれているとしても、この部分が別の材質の部分に移行した場合には、上記二次電子放出利得は変化してしまうため、完全にはチャージアップを防止することができない。電子線照射部分が、材質が異なる部分に移行した瞬間に、上記二次電子放出利得が１となるように補正することも考えられるが、そのためには、上記の補正を可能とする補正手段を設けなければならず、測定が複雑となるという問題があった。【００１４】
さらに、試料表面の裏面からイオンシャワーを照射して、電子照射により負に帯電した試料表面をイオンシャワーにより中和するＳＥＭ（特許文献２）では、イオンシャワーを試料表面に照射するため、試料自体がイオンシャワーにより加工され、損傷を受けるという問題があった。【００１５】
また、ＳＥＭ観察及びＴＥＭ観察の両方において、生体試料に含まれる水分を完全に蒸発させ、生体試料を乾燥させなければならないため、生体の本来有するありのままの形状等を観察することができないという問題があった。そのため、凍結乾燥や臨界点乾燥により、試料が有する形状をできるだけ維持したまま試料を乾燥させることが試みられているが、形状を完全に維持したまま試料を作製することは困難であり、時間と手間が掛かるという問題があった。【００１６】
従って、本発明は、簡易にチャージアップの問題を解決することができ、さらに試料作製が容易であって、試料のありのままの形状等をＳＥＭ、又はＴＥＭ等により観察することを可能とする液状媒体、及びそれを用いた観察方法を提供することを第１の目的とする。また、上記の問題を解決することができる標体およびその作製方法を提供することを第２の目的とする。さらに、上記の問題を解決することができる試料用セルを提供することを第３の目的とし、同様の問題を解決しうる電子顕微鏡を提供することを第４の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った結果、イオン液体をＳＥＭ、又はＴＥＭ用試料に含浸させ、又は上記試料の表面上に塗布させた場合、ＳＥＭ、ＴＥＭに内蔵された電子銃から照射された電子が、その入射エネルギーがそれ程高くないにも拘わらず、試料に充填されたイオン液体を透過し、それにより二次電子又は透過電子を検出することができ、それによりＳＥＭ、ＴＥＭ等により観察することができること、及び試料表面に溜まった電荷がイオン液体を介して放出され、チャージアップの問題が発生しないことを見出した。ここで、イオン液体とは、常温において液状であって、イオンで構成される液体である。このイオン液体は、不揮発性、不燃性、熱安定性、化学的安定性、高イオン伝導性、耐電気分解性などにより特徴付けられる。そのため、イオン液体を含浸若しくは塗布させた試料を真空下に置いたとしても試料からイオン液体が殆ど揮発しないため、特に生体試料を観察する場合、この生体試料が収縮等せず、生体試料のありのままの形状を観察することができる。【００１８】
したがって、本発明は、カチオンおよびアニオンから構成され、真空中で揮発し難いか、若しくは殆ど揮発しないイオン液体を必須成分とし、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用試料または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用試料の全体に含浸させ、又はその電子照射面に塗布し、少なくとも電子照射面に導電性を付与することを特徴とする、電子顕微鏡用チャージアップ防止液状媒体にある。【００１９】
また、イオン液体を被観察物に含浸又は塗布すれば、ＳＥＭ若しくはＴＥＭ等の電子顕微鏡で観察可能な標体とすることができる。したがって、本発明に係る標体は、電子顕微鏡で観察する標体であって、被観察物と、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体と、を含むことを特徴とする。ここで、電子顕微鏡による観察時に液体であるとは、ＳＥＭやＴＥＭ等の真空チャンバ内の真空下においても全く若しくは殆ど揮発せず、ＳＥＭやＴＥＭ等で観察している間液体の状態を保っていることをいい、全く若しくは殆ど揮発しないこと、さらには沸騰しないことを意味する。また、電子顕微鏡とは、ＳＥＭ若しくはＴＥＭ等が例示されるが、真空下にて被観察物を観察するものであればこれに含まれるものとする。【００２０】
また、上記標体は、下記の方法により作製することができる。したがって、本発明に係る第１の標体の作製方法は、電子顕微鏡で観察する標体の作製方法であって、水分を含む生体試料を、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体に浸漬する浸漬工程と、上記イオン液体に浸漬された生体試料を真空下に置き、上記生体試料に含まれた水分を除去する乾燥工程と、を含むことを特徴とする。【００２１】
また、イオン液体をこのイオン液体に比較して揮発しやすい溶媒によって希釈すれば、微細な構造を有する被観察物であっても当該微細な構造の中にもイオン液体を被覆することができ良好な観察をすることができる。したがって、本発明に係る第２の標体の作製方法は、電子顕微鏡で観察する標体の作製方法であって、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体を該イオン液体に比較して揮発しやすい溶媒によって希釈する希釈工程と、上記溶媒によって希釈されたイオン液体を被観察物に塗布する塗布工程と、上記溶媒によって希釈されたイオン液体が塗布された被観察物を真空下に置き、上記溶媒を除去する乾燥工程と、を含むことを特徴とする。【００２２】
さらに、被観察物をイオン液体に浸漬させ、当該被観察物に正負の電極から電気を印加することにより、被観察物の挙動を観察することができ、以下の試料用セルを用いることにより、上述の挙動を観察することができる。したがって、本発明に係る試料用セルは、電子顕微鏡で標体を観察するときに用いるセルであって、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体と、上記イオン液体を収容する絶縁性セルと、上記イオン液体に浸漬された正負の電極と、を含むことを特徴とする。【００２３】
また、本発明に係る電子顕微鏡は、標体を観察するときに用いる電子顕微鏡であって、標体を収容し、真空引きされる真空チャンバと、上記真空チャンバ内に収容され、電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体を収容可能な絶縁性セルと、上記絶縁性セルに充填されるイオン液体に浸漬された正負の電極と、上記標体に電子線を照射する電子銃と、上記電子銃から上記標体に電子を照射したことにより発生する二次電子を検出する検出器と、を含むことを特徴とする。【００２４】
また、本発明に係る試料観察方法は、上記液状媒体を用いる電子顕微鏡による試料観察方法であって、
カチオンおよびアニオンから構成され、真空中で全く揮発しないか、若しくは殆ど揮発しないイオン液体を、被観察物に含浸させ、又は上記被観察物の観察面に上記イオン液体を塗布し、それにより少なくとも観察面に導電性を付与する工程と、
上記のようにイオン液体が含浸若しくは塗布された被観察物に、電子を照射し、照射された電子による二次電子若しくは透過電子を検出して、上記被観察物の像を得る工程と、を備えることを特徴とする。
本発明において、生体とは、水分を含む生物を意味し、動物のみならず植物（花、葉、茎、種子等）も含まれるものとする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る電子顕微鏡用チャージアップ防止液状媒体によれば、簡単に試料表面に溜まった電荷を放出させ、チャージアップの問題を解決することができる。さらに、本発明に係る液状媒体を用いた観察方法によれば、イオン液体が含浸若しくは塗布させた試料を真空下に置いたとしても試料からイオン液体が揮発しないため、特に生体試料を観察する場合、この生体試料が収縮等していない、ありのままの形状を観察することができる。
また、本発明に係る標体及びその作製方法によれば、イオン液体が含浸若しくは塗布されるため、上記同様、チャージアップを防止することができ、試料のありのままの形状を観察することができる。
さらに、本発明に係る試料用セル及び電子顕微鏡によれば、非揮発性のイオン液体が当該セル内に注入され、当該イオン液体が電子を試料外へ放出するため、上記同様チャージアップの問題なく試料を観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に係る観察方法により観察された星の砂のＳＥＭ写真である。
【図２】ＳＥＭ装置の概略図である。
【図３】一次電子加速電圧と二次電子放出利得との関係を示した図である。
【図４】イオン液体であるテトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（ＢＭＩ−ＢＦ４）にエタノールを混合して、これを被観察物（サンドペーパー）に塗布して観察した際のＳＥＭ写真である。
【図５】金属スパッタにより被覆した被観察物のＳＥＭ写真である。
【図６】エタノールで希釈されてないテトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（ＢＭＩ−ＢＦ４）を被観察物（サンドペーパー）に塗布して観察した被観察物のＳＥＭ写真である。
【図７】本発明のある実施の形態に係る試料用セルを示した概略図である。
【図８】本発明の別の実施の形態に係る試料用セルを示した概略図である。
【図９】親水性のＢＭＩ−ＢＦ４が含浸されたわかめのＳＥＭ写真（３００倍）である。
【図１０】従来のようにＡｕスパッタされた乾燥わかめのＳＥＭ写真（３００倍）である。
【図１１】疎水性のＢＭＩ−ＴＦＳＩが含浸されたわかめのＳＥＭ写真（３００倍）である。
【図１２】電気を印加した場合のポリピロール膜のＳＥＭ写真である。
【図１３】電気を印加しない場合のポリピロール膜のＳＥＭ写真である。
【符号の説明】
【００２７】
１  電子銃
２  集束レンズ
３  走査コイル
４  対物レンズ
５  対物レンズ絞り
６  基板
７  ステージ
８  検出器
９  映像増幅器
１０  表示装置
１１  電子光学系駆動用走査回路
１２  真空チャンバ
１３  絶縁性セル
１４  正の電極
１５  負の電極
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、イオン液体を必須成分として含んでなり、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、若しくは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用試料の全体に含浸させ、又はその電子照射面に塗布し、少なくとも電子照射面に導電性を付与する、顕微鏡用液状導電性付与媒体にある。【００２９】
以下に、ＳＥＭ用試料にイオン液体を含浸若しくは塗布し、含浸若しくは塗布された試料をＳＥＭにより観察する場合に関して説明する。概略的には、試料を所望の形状に切断等し、これにイオン液体を含浸させて試料を作製し、作製された試料をＳＥＭ装置にセットし、試料表面に電子線を走査させることにより試料表面を観察する。【００３０】
（イオン液体）
以下に、試料に含浸又は塗布する液状導電性付与媒体に含まれるイオン液体に関して説明する。イオン液体とは、上述のように、常温及び／又は真空中において液状であって、イオンで構成される液体である。このイオン液体は、不揮発性、不燃性、熱安定性、化学的安定性、高イオン伝導性、耐電気分解性などにより特徴付けられる。ＳＥＭ及びＴＥＭ観察においては、試料は真空下に置かれるため、この試料に含浸されるイオン液体は、全く揮発（蒸発）しないか、殆ど揮発しないものであることが好ましい（ａ）。また、試料に入射された一次電子及び一次電子の入射により放出される二次電子若しくは透過電子が、イオン液体を透過しなければ、ＳＥＭ像、ＴＥＭ像が得られないので、このイオン液体は、電子透過性を有することが必要である（ｂ）。従って、被観察物である試料を電子顕微鏡で観察する際、イオン液体は、その試料表面に薄く塗布されるか、少なくとも表面層において偏りなく、試料に含浸されていることが好ましい。
また、チャージアップを防止すべく、試料表面に帯電した電荷を試料外へ放出しなければならないため、このイオン液体は電子伝導性を有することが必要である（ｃ）。【００３１】
上記（ａ）〜（ｃ）を満たすイオン液体として以下のものが挙げられる。
例えば、Ｋ＋Ａ−（１）からなり、Ｋ＋は、一般式（２）；
【化１】
0004581100.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、炭素数１〜１０のアルキル基又は水素原子を示し、これらは同一であっても良く、又は異なっていても良い。ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではない。）で表されるＮ−アルキルイミダゾリウムカチオン、
又は、一般式（３）；
【化２】
0004581100.tif 000003
（式中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキル基又は水素原子を示す。Ｒ３は、同一であっても良く、又は異なっていても良い。）で表されるアンモニウムカチオンであり、
Ａ−は、一般式（４）；
【化３】
0004581100.tif 000004
（式中、Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、フェニル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、テトラゾリル基又はスルホン酸基を示す。水素原子以外のＲ４で示される各基は、それぞれ置換基を有していてもよい。）で表されるテトラゾール化合物アニオン、
又は、一般式（５）；
【化４】
0004581100.tif 000005
（式中、Ｒ５およびＲ６は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、フェニル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、テトラゾリル基又はスルホン酸基を示す。水素原子以外のＲ５およびＲ６で示される各基は、それぞれ置換基を有していてもよい。Ｒ５およびＲ６は、同一であっても良いし又は異なっていてもよい。）で表されるトリアゾール化合物アニオン、
又は、一般式（６）；
【化５】
0004581100.tif 000006
（式中、Ｒ７およびＲ８は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、フェニル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、テトラゾリル基又はスルホン酸基を示す。水素原子以外のＲ７およびＲ８で示される各基は、それぞれ置換基を有していてもよい。Ｒ７およびＲ８は同一であっても良いし又は異なっていても良い。）で表されるトリアゾール化合物アニオンであることを特徴とするイオン液体が挙げられる。【００３２】
上記一般式（２）で表されるＮ−アルキルイミダゾリウムカチオンおよび上記一般式（３）で表されるアンモニウムカチオンにおけるアルキル基は、炭素数１〜１０のものであり、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等であることが好ましい。【００３３】
Ｎ−アルキルイミダゾリウムカチオンの具体例としては、１−メチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−メチル−３−エチルイミダゾリウムカチオン、１−メチル−３−プロピルイミダゾリウムカチオン等が挙げられる。【００３４】
アンモニウムカチオンの具体例としては、アンモニウムカチオン、トリメチルアンモニウムカチオン、エチルジメチルアンモニウムカチオン、ジエチルメチルアンモニウムカチオン、トリエチルアンモニウムカチオン、テトラメチルアンモニウムカチオン、トリエチルメチルアンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウムカチオン等が挙げられ、トリエチルメチルアンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウムカチオンであることが好ましい。【００３５】
上記一般式（４）で表されるテトラゾール化合物アニオン、上記一般式（５）で表されるトリアゾール化合物アニオン、および上記一般式（６）で表されるトリアゾール化合物アニオンにおけるアルキル基は、炭素数１〜１０のものであり、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。シクロアルキル基は、炭素数３〜１０のものであり、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。また、水素原子以外の各基が有していてもよい置換基としては、アルキル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基等が挙げられる。【００３６】
テトラゾール化合物アニオンの具体例としては、１，２，３，４−テトラゾールアニオン、１Ｈ−５−カルボキシテトラゾールアニオン、１Ｈ−５−メルカプトテトラゾールアニオン、１Ｈ−５−アミノテトラゾールアニオン、１Ｈ−５−フェニルテトラゾールアニオン、１Ｈ−テトラゾールアニオン、１Ｈ−５−メチルテトラゾールアニオン、５，５'−ビ−１Ｈ−テトラゾールアニオン、１，５−ビ−１Ｈ−テトラゾールアニオン、Ｎ−１Ｈ−テトラゾール−５−イル−１Ｈ−テトラゾール−５−アミンアニオン等が挙げられ、１，２，３，４−テトラゾールアニオン、５，５'−ビ‐１Ｈ−テトラゾールアニオンであることが好ましい。【００３７】
トリアゾール化合物アニオンの具体例としては、１，２，３−トリアゾールアニオン、４−メルカプト−１，２，３−トリアゾールアニオン、１，２，４−トリアゾールアニオン、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールアニオン、３−メルカプト−５−メチル−１，２，４−トリアゾールアニオン、３，５−ジメチル−１，２，４−トリアゾールアニオン等が挙げられ、特に１，２，４−トリアゾールアニオンであることが好ましい。
上記のアニオン成分は、テトラゾール化合物、トリアゾール化合物又はその混合物から１個のプロトンがはずれて生ずるアニオンである。【００３８】
また、アニオンＡ−は、テトラフルオロホウ酸アニオン、テトラクロロホウ酸アニオン、テトラアルキルホウ酸アニオン、テトラアリールホウ酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロアンチモン酸アニオン、フルオロスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、フルオロアルキルスルホン酸アニオン、ビス（フルオロアルキルスルホニル）イミドアニオン、アレーンスルホン酸アニオンである。【００３９】
また、イオン液体の別の具体例としては、例えば、以下に示すＡ−及びＫ＋からなるＫ＋Ａ−が挙げられる。ここで、Ａ−は、一般式（７）；
【化６】
0004581100.tif 000007
により示されるビス（ハロゲン化アルキルスルホニル）イミドアニオン若しくはビス（ハロゲン化スルホニル）イミドアニオンである。上記Ａ−の先端に結合したＲ９若しくはＲ１０に含まれるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素が挙げられ、特にフッ素であることが好ましい。また、Ｒ９若しくはＲ１０がハロゲン化アルキルである場合、ハロゲン化アルキルの炭素数としては１〜３のものが好ましく、具体的にはトリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基が挙げられる。ハロゲン化アルキルの炭素数は同一であっても良いし、異なっていても良い。非常に電子吸引性の強いハロゲンやハロゲン化アルキルを有することによりアニオンの電荷が分散され、アニオンの安定性が増加しカチオンとの解離を容易にする効果がある。
上記Ａ−の好ましい具体例としては、
【化７】
0004581100.tif 000008
が挙げられる。【００４０】
また、Ｋ＋は、
【化８】
0004581100.tif 000009
により示される第４級アンモニウムイオンおよび第４級ホスホニウムイオンである（ただし、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、それぞれ独立で、アルキル基、アリール基、複素環基、アラルキル基をそれぞれ表す。これらのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、その構造中に置換基、ヘテロ原子を持っていてもよく、またＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、それぞれが結合して環を形成していてもよく、さらには隣接するカチオンのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、それぞれが結合して、ポリマー状になってもよい。）。【００４１】
アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等の炭素数３０までの直鎖又は分枝を有するものが挙げられる。アリール基としては、フェニル、ナフチル、トルイル、キシリル等が挙げられ、該アリール基は、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、水酸基、アルコキシ基（メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、カルボキシル基、アセチル基、プロパノイル基、チオール基、アルキルチオ基（メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ等）、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基等の置換基を１ないし複数個有していてもよい。複素環基としては、ピリジル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。また、これらのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は、一分子内で結合して環を成したピロリジニウム、ピペリジニウムなども良く、さらにはＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４が隣接する他のカチオンのＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４と結合して鎖を成した、一般式（１０）により示される構造でも良い。【００４２】
【化９】
0004581100.tif 000010
【００４３】
上記イオン液体において、好ましいカチオン成分の具体例を次に示す。
トリメチルヘキシルアンモニウム、トリメチルフェニルアンモニウム、トリメチルシクロヘキシルアンモニウム、ジメチルエチルヘキシルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、トリメチルベンジルアンモニウム、トリメチルビニルアンモニウム、トリメチル（メトキシカルボニルエチル）アンモニウム、トリメチルエチルアンモニウム、トリメチル（ヒドロキシエチル）アンモニウム、トリエチルメチルアンモニウム、ジエチルメチルヘキシルアンモニウム、トリメチル（ペンタメチルフェニル）アンモニウム、トリエチルベンジルアンモニウム、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチルピペリジニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルピペリジニウム、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルピペリジニウム、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチルピロリジニウム、Ｎ−メチル−Ｎ−プロピルピロリジニウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルピロリジニウム、トリエチルブチルアンモニウム、トリエチルアミルアンモニウム、トリブチルメチルアンモニウム、トリブチルフェニルアンモニウム、トリブチルベンジルアンモニウム、トリメチルアリルアンモニウム、トリメチルヘキシルホスホニウム、トリメチルフェニルホスホニウム、トリメチルシクロヘキシルホスホニウム、ジメチルエチルヘキシルホスホニウム、テトラエチルホスホニウム、トリメチルベンジルホスホニウム、トリメチルビニルホスホニウム、トリメチル（メトキシカルボニルエチル）ホスホニウム、トリメチルエチルホスホニウム、トリメチル（ヒドロキシエチル）ホスホニウム、トリエチルメチルホスホニウム、ジエチルメチルヘキシルホスホニウム、トリメチル（ペンタメチルフェニル）ホスホニウム、トリエチルベンジルホスホニウム、トリエチルブチルホスホニウム、トリエチルアミルホスホニウム、トリブチルメチルホスホニウム、トリブチルフェニルホスホニウム、トリブチルベンジルホスホニウム、トリメチルアリルホスホニウム、【００４４】
【化１０】
0004581100.tif 000011
等が挙げられる。【００４５】
さらにイオン液体の別の具体例としては、Ｋ＋Ａ−で示され、Ｋ＋が一般式（１２）に示されたカチオンであり、
【化１１】
0004581100.tif 000012
（式中、Ｒ１５からＲ２０は同一であっても良いし又は異なっていても良い。これらのＲ１５からＲ２０は、単結合又は二重結合により直接結合しており、それぞれは独立に又は同時に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜８のアルキル基である。このアルキル基は、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｎ（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）２、Ｏ（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）、ＳＯ２（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）又はＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ（式中１＜ｎ＜６かつ０＜ｘ≦１３である）により部分的に又は完全に置換されていてもよい。）、また、Ａ−が、［Ｂ（ＯＲ２１）ｎ（ＯＲ２２）ｍ（ＯＲ２３）ｏ（ＯＲ２４）ｐ］−（式中、Ｂはホウ素であり、０≦ｎ、ｍ、ｏ、ｐ≦４であり、かつｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＝４であるものからなる群から選ばれるアニオンであり、式中、Ｒ２１からＲ２４は異なっていても良いし又は同一であっても良く、単結合又は二重結合により互いに直接結合している。また、Ｒ２１からＲ２４のそれぞれは、置換されていないか、また、単独で又は同時に、ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ（式中１＜ｎ＜６かつ０＜ｘ≦１３である）もしくはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ又はＢｒ）により置換された、フェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントレニルからなる群から選択された芳香族環、又は、置換されていないか若しくはＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ（式中１＜ｎ＜６かつ０＜ｘ≦１３である）もしくはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ又はＢｒ）により置換されたピリジル、ピラジルおよびピリミジルからなる群から選択された芳香族複素環、又は炭素数１〜８のアルキル基（このアルキル基は、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｎ（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）２、Ｏ（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）、ＳＯ２（ＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ）又はＣｎＦ(２ｎ＋１−ｘ)Ｈｘ（式中１＜ｎ＜６かつ０＜ｘ≦１３）により部分的に又は完全に置換されていてもよい。）である。）により示されるアニオンであることを特徴とするイオン液体が挙げられる。【００４６】
また、イオン液体の別の具体例としては、一般式（１３）：
【化１２】
0004581100.tif 000013
【００４７】
あるいは、一般式（１４）：
【化１３】
0004581100.tif 000014
により示されるイオン液体が挙げられる。【００４８】
上記一般式（１３）及び（１４）中のアニオンは、スルホコハク酸ビス−２−エチルヘキシルアニオンであり、アルキル基として２本の２−エチルヘキシル基を有するものである。このように、イオン液体において炭素数８の分岐鎖状アルキル基を２本有するスルホコハク酸アニオンが用いられるが、アルキル基が直鎖状のものの場合には、融点が室温以上となるか、生成する化合物の粘度が非常に高くなる。また、アルキル基が分岐鎖状のものであっても炭素数が９以上のものの場合は生成する化合物の粘度が非常に高くなり、他方、炭素数が７以下のものの場合は融点が室温以上となる。【００４９】
また、上記一般式（１３）中のカチオンＫ＋はベンジルジメチルアルキルアンモニウムカチオンであり、同式中のＲ２５は炭素数８〜２０のアルキル基を表している。このようなアルキル基（Ｒ２５）としては、具体的には、直鎖又は分岐鎖状のオクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基が挙げられ、低粘度及び低融点という観点からは特にドデシル基が好ましい。【００５０】
また、上記一般式（１４）中のカチオンＫ＋はアルキルピリジニウムカチオンであり、同式中のＲ２６は炭素数が１２〜１８のアルキル基を表している。このようなアルキル基（Ｒ２６）としては、具体的には、直鎖又は分岐鎖状のドデシル基、直鎖又は分岐鎖状のトリデシル基、直鎖又は分岐鎖状のテトラデシル基、直鎖又は分岐鎖状のペンタデシル基、直鎖又は分岐鎖状のヘキサデシル基、直鎖又は分岐鎖状のヘプタデシル基、直鎖又は分岐鎖状のオクタデシル基が挙げられ、低粘度及び低融点という観点からは特にヘキサデシル基が好ましい。【００５１】
以上のように、イオン液体に関して説明したが、上述のイオン液体は、単に例示したものであって、上記（ａ）〜（ｃ）の全て若しくは一部を満たすイオン液体であって観察時において液状のものであれば、本発明の液状導電性付与媒体に含有されるイオン液体として用いることができる。【００５２】
また、上述の具体的なイオン液体は、本発明に係る電子顕微鏡用チャージアップ防止液状媒体として用いられるが、上記媒体としてだけでなく、本発明に係る標体、標体の作製方法、試料用セル、電子顕微鏡、試料作製方法にも用いることができる。【００５３】
（標体及びその作製方法）
続いて、ＳＥＭ若しくはＴＥＭ等の電子顕微鏡で観察される標体について説明する。本発明に係る標体は、被観察物と、イオン液体と、を含み、このイオン液体は、カチオン及びアニオンを含んでいて、電子顕微鏡による観察時において液体である。このように構成された標体を用いれば、真空下にあるＳＥＭ等の試料室に置いても蒸発せず、不揮発性を有するイオン液体が被観察物に塗布又は含浸されているため、イオン液体の導電性により、絶縁性の被観察物の表面に溜まる電荷をその外に放出してチャージアップを防止できる。また、ＳＥＭ等の装置に悪影響を及ぼすことはない。
本発明に係る標体を作製するに際し、水分を多く含む生体試料を真空下に置き真空乾燥させて、これを被観察物としてもよい。また、アルコール、ベンゼン、トルエン、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ペンタン、及びヘキサン等により希釈されたイオン液体を塗布することもできる。以下に生体試料を標体とする場合、及びアルコール等により希釈されたイオン液体を塗布して被観察物を標体とする場合について説明する。【００５４】
Ａ．生体試料
１．浸漬工程
まず、親水性を有するイオン液体を準備する。そして、その親水性のあるイオン液体に、水分を含む生体試料を浸漬する。浸漬中、生体試料に含まれる水分が上記イオン液体で徐々に置換される（１〜３時間）。ここで、親水性のあるイオン液体の具体例として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、臭化  １−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム、塩化  １−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム若しくは塩化  １−デシル−３−メチルイミダゾリウム等が挙げられる。
２．水分除去工程
次に、イオン液体に浸漬された生体試料を真空チャンバ内に置き、生体試料に含まれていた水分を除去する（２０分〜１時間）。これにより、生体試料中の水分がイオン液体により置換された標体が得られる。【００５５】
Ｂ．被希釈イオン液体を用いた標体
表面に凹凸がある被観察物や粒子の集合体からなる被観察物を観測するときには、イオン液体を微細構造の中に含浸させて、その微細な表面をイオン液体で覆う必要がある。このような場合、イオン液体をアルコール等で希釈し、希釈されたイオン液体を被観察物に塗布することにより微細構造の中や粒子の集合体の隙間等を覆うことができる（図６）。以下に被希釈イオン液体を用いた標体の作製方法に関して説明する。
１．希釈工程
まず、カチオンとアニオンとを含み、電子顕微鏡による観察時に液体であり、略真空下においても全く若しくは殆ど揮発しないイオン液体を該イオン液体に比較して揮発しやすい溶媒によって希釈する。上記溶媒としては、イオン液体を希釈しうるものであれば、全ての無機、有機の液体物質が含まれ、具体的には、アルコール、ベンゼン、トルエン、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ペンタン、及びヘキサン等が挙げられる。
２．塗布工程
上記溶媒によって希釈されたイオン液体を被観察物に含浸若しくは塗布する。
３．溶媒除去工程
溶媒によって希釈されたイオン液体が含浸若しくは塗布された被観察物を真空チャンバ内に置き、溶媒を除去し（数分〜数十分）、標体とする。このようにして、被観察物の表面が、薄い均一のイオン液体膜で覆われた標体を作製する。【００５６】
図４は、親水性のイオン液体であるテトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（ＢＭＩ−ＢＦ４）にエタノールを混合して、これを被観察物（サンドペーパー）に塗布して観察されたＳＥＭ写真である。イオン液体をアルコール等の溶媒により希釈させこれを被観察物に塗布した場合、被観察物のより微細な部分にイオン液体を含浸させることができ、金属スパッタにより被観察物を作製して当該被観察物を観察した場合（図５）と同様超微細な細部に亘って観察することができる。したがって、本発明は、電子顕微鏡で観察する標体の作製方法であって、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体を該イオン液体に比較して揮発しやすい溶媒によって希釈する希釈工程と、上記溶媒によって希釈されたイオン液体を被観察物に塗布する塗布工程と、上記溶媒によって希釈されたイオン液体が塗布された被観察物を真空下に置き、上記溶媒を除去する乾燥工程と、を含む標体の作製方法にある。図６は、エタノールで希釈されてないテトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（ＢＭＩ−ＢＦ４）を被観察物（サンドペーパー）に塗布して被観察物を観察したＳＥＭ写真である。エタノールを混合したイオン液体を塗布した場合（図４）、エタノールを混合しない場合（図６）に比して、サイドペーパーの細部まで観察することができる。したがって、イオン液体を上述の溶媒で希釈して用いると、細かな凹凸のある表面、粉体の集合体から成る表面を観察することができる。【００５７】
（試料観察方法）
１．試料の作製
ＳＥＭによる観察では試料最表面から出てくる二次電子を検出して画像を作成するので、観察したい対象表面を電子ビームに対して露出しておくことが必要である。観察対象が最初から露出している試料では表面のコンタミネーションの除去程度で良いが、内部に存在する構造を観察したい場合には、洗浄、切断、割断、化学的溶解などを行って対象表面を露出することが必要である。例えば生体試料の観察面を露出するためには以下の試料作製方法を用いることができる。
１）ＤＭＳＯ凍結割断法；
５０％ＤＭＳＯ(dimetyl sulfoxide)に浸漬した固定試料を、液体窒素で冷却した金属板の上で凍結・固化し、カミソリ刃で割って内部を露出させる。ＤＭＳＯの他、１００％エタノールや酢酸イソアミルを用いることもできる。この方法によれば、良好な断面を形成することができる。
２）膠原線維除去法；
２％グルタルアルデヒドで固定した試料を６０℃の６Ｎ ＮａＯＨで１０分程度処理する。膠原線維や基底膜が除去され、結合組織に覆われていた細胞表面を観察することができる。
３）膠原線維観察法；
２％グルタルアルデヒドで固定した試料を２０℃の２Ｎ ＮａＯＨで１０分程度処理する。細胞成分が除去され、結合組織線維網を観察することができる。
４）血管鋳型観察法；
メタクリレート樹脂モノマーを血管に注入し、樹脂の重合後に軟部組織をＮａＯＨで溶かし、残った血管鋳型を観察する。
５）細胞内構造観察法；
この細胞内構造観察法は、二重固定（０.５％グルタルアルデヒドと０.５％ホルムアルデヒドの混合液・１％オスミウム）した試料を凍結割断する方法である。二重固定後、０.１％オスミウム処理（２０℃、７２時間）で割断面から観察に不要な部分を除去して、細胞内構造を剖出できる。【００５８】
上述のようにして得られた観察表面に、上述のイオン液体を含浸又は塗布することにより試料を作製する。具体的には、上記Ａの方法で作製する。コンタミネーションや粘液培養液などを洗浄液で除去した後、固定操作を行う。続いて、上述のようにイオン液体が含浸若しくは塗布された試料をＳＥＭ用試料台に接着剤で接着し、試料が接着されたＳＥＭ用試料台を上記ＳＥＭ装置にセッティングする。その後、電子顕微鏡試料室内を真空引きする。【００５９】
２．パラメータ設定
続いて、ＳＥＭ装置のパラメータを設定する。このパラメータの主なものに、加速電圧、コンデンサーレンズ電流値、対物絞り径、作動距離がある。それぞれのパラメータは、分解能の設定に大きく関与している他、像質にも影響を与えるため、所望の値に設定することが好ましい。以下、これらのパラメータに関して説明し最適な設定値に関して言及する。
１）加速電圧；
この加速電圧の値が高いほど分解能が高くなる。また、加速電圧の値が高いほど入射電子の試料内部への透過性が高くなる。２０〜２５ｋＶを選択すると分解能の高い像が得られる。
２）収束レンズ電流値；
この収束レンズ電流値は、ビーム電流を大きく変える。この電流値を増やすと分解能を高めることができる。
３）対物絞り径；
この対物絞り径の値は、電子ビームの径を変えることになるので分解能を左右する。小さい絞りほど分解能が高くなると同時に、焦点深度は深くなる。
４）作動距離；
この作動距離の値が小さいほど分解能は向上し、焦点深度は浅くなる。また、この値が大きいほど分解能は低下し、焦点深度は深くなる。【００６０】
３．撮影
上述のパラメータを設定した後、撮影を行い、画像データを取得する。コントラストを付けるため、試料の角度を変えて複数回撮影することが好ましい。【００６１】
（試料用セル）
現在、例えば電気化学反応を直接観察することが要請されているが、これまで行われてきた電子顕微鏡による観察方法では、被観察物を乾燥させた後スパッタ等により被観察物の表面を金属により被覆する必要があるため、上述のような電気化学反応や電気の印加による生体試料の変化等を直接見ることができなかった。しかし、本発明に係る試料用セルを用いれば、イオン液体が生体試料に溜まった電荷を放出しチャージアップを引き起こすことなく被観察物を観察することができる。【００６２】
すなわち、本発明に係る試料用セルは、被観察物に電気を流しながら、又は電気の印加・解除を繰り返しながら、ＳＥＭ観察するための試料用セルであって、本発明のある実施の形態に係る試料用セルは、カチオンとアニオンとを含み、電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体１７と、上記イオン液体を収容する絶縁性セル１３と、上記絶縁性セル１３の下に設けられた、導体からなる試料台１６と、一端部が上記試料台１６に接続され、他端部が上記セル内に配置された導通部材１８と、上記イオン液体１７に浸漬された正負の電極１４、１５と、を含む（図７）。【００６３】
本実施の形態に係る試料用セルのイオン液体１７は、上述のイオン液体と同様のものである。また、絶縁性セル１３は、上記イオン液体１７を収容することができるように、有底円筒状の形状をしており、導体からなる試料台１６が有底円筒状体の下に配置されている。イオン液体１７が上記導通部材１８により、導体からなる試料台１６に導通するため、ＳＥＭ内の電子銃１から、イオン液体１７に浸漬された被観察物に照射された電子は、イオン液体１７及び導通部材１８を介して、導体からなる試料台１６から放出される。上記導体からなる試料台１６は、上述のように被観察物に照射された電子を放出することができるものであり、上記試料台１６としては導電性を有する限り、金属であっても、半導体であってもプラスティックであってもよい。上記正負の電極１４、１５は、被観察物に電気を流すことができるため、被観察物に電気を印加することにより、当該セルにおいて被観察物の収縮・拡大等を観察することができる。例えば、導電性高分子であるポリピロール膜に電気の印加・解除を繰り返すことにより、当該ポリピロール膜の収縮・拡大を観察することができる。【００６４】
また、別の実施の形態に係る試料用セルは、導体からなる試料台１６の上に設けられた絶縁性セル１３と、一端部が上記試料台１６に接続され、他端部が上記セル内に配置された導通部材１８と、カチオンとアニオンとを含み、上記電子顕微鏡による観察時に液体であって上記電極と上記導通部材の他端部とを電気的に接続するイオン液体１７と、を含む（図８）。当該絶縁性セル、イオン液体は、上記のものと同様のものである。上記電極からの電気の印加・解除により上記の実施形態と同様、被観察物の縮小・拡大等を観察することができる。上記２つの実施の形態に係る試料用セルは、反応の経時観察、例えば結晶成長、ナノ材料の合成等の観察にも用いることができる。【００６５】
（イオン液体を収容可能な絶縁性セルを備える電子顕微鏡）
イオン液体を被観察物に含浸させれば、上述のようにイオン液体は非揮発性を有し、さらに導電性を有するため、チャージアップを防止しつつ被観察物を観察することができる。また、被観察物に正極及び負極を接続させれば、観察物に電気を流すことによる挙動を観察することができる。【００６６】
したがって、本発明は、標体を観察するときに用いる電子顕微鏡であって、標体を収容し、真空引きされる真空チャンバと、上記真空チャンバ内に収容され、電子顕微鏡による観察時に液体であるイオン液体を収容可能な絶縁性セルと、上記絶縁性セルに充填されるイオン液体に浸漬された正負の電極と、上記標体に電子線を照射する電子銃と、上記電子銃から上記標体に電子を照射したことにより発生する二次電子を検出する検出器と、を含む電子顕微鏡にある。【００６７】
本発明に係るＳＥＭ装置の一例を図２に示す。このＳＥＭ装置は、真空チャンバ１２、イオン液体を収容可能な絶縁性セル１３、正の電極１４、負の電極１５、電子銃１、集束レンズ２、走査コイル３、対物レンズ４及び対物レンズ絞り５を有し、さらに基板６に載置された試料上を走査する電子光学系と、基板６を載置するステージ７と、試料からの二次電子を検出する検出器８と、検出器８の出力を増幅する映像増幅器９と、ブラウン管（ＣＲＴ）などの表示装置１０と、電子光学系を駆動させるための走査回路１１とから構成されている。【００６８】
電子銃１から放出された電子線は、集束レンズ２と走査コイル３と対物レンズ４を通ってステージ７上に載置されている試料に照射される。検出器８は、上記電子線照射の走査によって試料から発生した二次電子を検出する。この検出器８の検出信号は、映像増幅器９を経て、表示装置１０に表示される。【００６９】
本発明に係る電子顕微鏡の真空チャンバ１２は、この中に試料観察用セルが挿入された後、高真空状態まで真空引きされる。真空チャンバ１２の上部には、被観察物に電子を照射するための電子銃１を備え、当該電子銃１の下付近に試料観察用セル１３が配置され、上記電子銃から当該セル内の被観察物に電子が照射される。また、上記電子銃１は、上述のように試料用セル内の被観察物に電子を照射するためのものであり、数ｅＶ〜数十ｅＶの範囲のエネルギーを有する電子を照射することができる。さらに、二次電子の検出器８は、一次電子を照射することにより発生する二次電子を検出するためのものであり、発生した二次電子に電場等を加えることにより二次電子を収集することができる。また、絶縁性セル１３、及び正負の電極１４、１５は、上記のものと同様のものである。【００７０】
以上のように、イオン液体をＳＥＭ用試料に用いることに関して説明したが、本発明は、イオン液体をＳＰＭ用試料に用いてもよい。即ち、本発明は、イオン液体を必須成分として含んでなり、走査型プローブ顕微鏡（Scanning Probe Microscope;以下ＳＰＭと称する）用試料の全体に含浸させ、又はその走査面に塗布し、少なくとも上記走査面に導電性を付与する、走査型プローブ顕微鏡用、液状導電性付与媒体としても良い。これにより、長時間観察したとしてもＳＰＭ用試料に含浸させたイオン液体が蒸発せず、試料の形状を長時間保持することができる。
【実施例１】
【００７１】
本発明に係る実施例を以下に示す。以下の実施例は例示するものであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７２】
実施例１では、親水性のテトラフルオロホウ酸  １-ブチル-３-メチルイミダゾリウム（ＢＭＩ−ＢＦ４）を用いた。
まず、乾燥わかめを水で戻した。その後、水で戻したわかめを親水性のＢＭＩ−ＢＦ４に２時間浸漬させ、わかめ中に含まれる水分をＢＭＩ−ＢＦ４で徐々に置換した。その後、３０分間略真空下（２ｍｍＨｇ以下）に置き、真空乾燥させた。図９は、ＢＭＩ−ＢＦ４を含浸させたわかめをＳＥＭにより観察したＳＥＭ写真（３００倍）である。本発明に係る観察方法では、水で戻した状態のわかめ、すなわち、生のわかめを観察することができた。
図１０は、従来のように、乾燥わかめをＡｕスパッタした後、当該わかめをＳＥＭにより観察したＳＥＭ写真（３００倍）である。
本発明に係る方法により観察したわかめでは、その厚さが、従来方法で観察したわかめの約３．５倍の厚さであった。しかも、従来方法により観察したわかめでは、ひだ状の部分が観察されたのに対し、本発明に係る方法により観察したわかめでは、ひだ状の部分は見られず、本来のわかめの有する形状が観察された。
図１１は、疎水性の１-ブチル-３-メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（ＢＭＩ−ＴＦＳＩ）を含浸させたわかめをＳＥＭにより観察したＳＥＭ写真（３００倍）である。この場合、親水性のイオン液体を含浸させたわかめと比較して、わかめの肉厚が薄くなり、ひだ状の部分が多く見られた。これは、わかめに含まれる水分と疎水性のイオン液体とが上手く置換されなかったためと考えられる。したがって、水分を多く含む生体材料を観察する場合は、親水性のイオン液体を用いることが好ましい。【００７３】
（実施例２）
実施例２では、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。イオン液体は、ランカスター（Lancaster）社製のテトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムを用いた。まず、星の砂に付着したコンタミネーションなどを洗浄液で除去した後、試料（星の砂）をＳＥＭ用試料台に接着剤で接着・固定し、続いて、試料にテトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムを含浸させた。このＳＥＭ用試料台をＳＥＭ装置にセッティングし、電子顕微鏡試料室内を真空引きした。ＳＥＭの加速電圧を２０ｋＶ、作動距離（ＷＤ）を２１.１ｍｍに設定し、上記条件の下、星の砂を観察したところ、星の砂の像を得ることができた。
図１は、上述のようにイオン液体を含浸させた星の砂（左）と、イオン液体を含浸させていない星の砂（右）とを並べて撮影したものである。イオン液体を含浸させていない星の砂（右）の場合、チャージアップのため像が真白になった。しかし、イオン液体を含浸させた星の砂（左）の場合、星の砂は絶縁体により構成されているにも拘わらず、チャージアップを防止することができた。また、上記イオン液体は、真空下においても揮発することなく、長時間良好に観察することができた。【００７４】
（実施例３）
実施例３では、テトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウムをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。本実施例３においては、イオン液体として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムの代わりに、テトラフルオロホウ酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウムを使用したこと以外実施例２と同様に行った。この実施例３においても、上記同様良好に観察することができた。【００７５】
（実施例４）
実施例４では、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。本実施例４においては、イオン液体として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムの代わりに、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを使用したこと以外実施例１と同様に行った。この実施例４においても、実施例２と同様、良好に観察することができた。【００７６】
（実施例５）
実施例５では、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。本実施例５においては、イオン液体として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムの代わりに、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを使用したこと以外実施例２と同様に行った。この実施例５においても、実施例２と同様、良好に観察することができた。【００７７】
（実施例６）
実施例６では、ヘキサフルオロリン酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウムをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。本実施例６においては、イオン液体として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムの代わりに、ヘキサフルオロリン酸  １−ブチル−３−メチルイミダゾリウムを使用したこと以外実施例２と同様に行った。この実施例６においても、実施例２と同様、良好に観察することができた。【００７８】
（実施例７）
実施例７では、トリメチル−ｎ−プロピルアンモニウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドをイオン液体として用いて、これを星の砂に含浸させて、このように含浸させたものをＳＥＭ装置により観察した。本実施例７においては、イオン液体として、テトラフルオロホウ酸  １−エチル−３−メチルイミダゾリウムの代わりに、トリメチル−ｎ−プロピルアンモニウム  ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドを使用したこと以外実施例２と同様に行った。この実施例７においても、実施例２と同様、良好に観察することができた。【００７９】
（実施例８）
実施例８では、導電性高分子であるポリピロール膜を薄膜金属の電極の一方の面に形成し、当該ポリピロール膜に電気を印加・解除した場合の、ポリピロール膜の収縮・膨張を観察した。
まず、白金Ｐｔからなる２つの電極、作用極（ＷＥ）と対極（ＣＥ）を絶縁性セルにおいて０．１Ｍピロール及び０．１Ｍ  ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムからなる電解液に浸漬し、当該２つの電極に、定電流３ｍＡを２時間印加して、電解重合を行い、ポリピロール膜を上記白金板上に形成した。その後、当該ポリピロール膜を超純水、及びアセトニトリルにて洗浄し、続いてイオン液体ＢＭＩ−ＢＦ４を電解液として加えた。その後、水分除去のため、セル全体を２時間真空下に置き真空乾燥させた。このセルをＳＥＭ装置内に配置し、当該ＳＥＭ装置によりポリピロール膜を観察した。図１２は、電気を印加した場合の、上記セル内におけるポリピロール膜のＳＥＭ写真であり、図１３は、電気を印加しない場合の、ポリピロール膜のＳＥＭ写真である。電気を印加した場合においては、印加しない場合に比して、ポリピロール膜の膜厚が大きく、膜厚の増加量は、電気を印加しない場合のポリピロールの全膜厚の１％〜２０％に及ぶ。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明に係る、イオン液体を含む導電性付与媒体は、試料をＳＥＭ、若しくはＴＥＭ等により観察する場合に、これらの電子顕微鏡により観察される試料に含浸させ、又はその観察表面上に塗布し、試料に導電性を与えるために用いられる。
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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