(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プロ−ブとのハイブリダイゼーション工程を具備した、所望の配列を有する標的核酸を検出する方法において：
（ａ）サンプル中の検出すべき特定の配列を有する標的核酸分子を、該核酸分子の配列に対して相補的な配列を有する複数種の核酸プローブの各々とハイブリダイズさせて、前記核酸分子のハイブリダイズした領域では線型コンホメーションを呈し、且つハイブリダイズしていない領域ではそのヌクレオチド配列に特有の高次構造を呈するハイブリッド核酸分子を形成する工程であって、前記複数種の核酸プローブの各々が前記核酸分子の異なる部分とハイブリダイズし、それによって前記線型コンホメーションおよび高次構造のそれぞれの数が異なるように、前記複数種の核酸プローブが選択される工程と；
（ｂ）工程ａで得られた複数種のハイブリッド核酸分子を走査型プローブ顕微鏡により画像化することにより、前記線型コンホメーションおよび前記特有の高次構造の、それぞれの数を測定する工程と；
（ｃ）工程ｂにおいて得られた測定データに基づいて、前記線型コンホメーションおよび前記特有の高次構造を含む核酸を決定することにより、前記ハイブリッド核酸分子を形成した前記核酸プローブが相補的に結合した核酸プローブであるか、または非特異的に結合した核酸プローブであるかを識別するとともに、前記複数種のプローブとハイブリダイズした前記核酸分子を識別して検出する工程とを具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記複数種の核酸プローブを、前記標的核酸分子に同時にハイブリダイズさせることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡を用いた核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特異的配列を有する核酸の検出においては、放射性同位体や蛍光物質で標識されたプロ−ブを使用する方法、プロ−ブに固定化された酵素の活性を測定する方法、及びPCR （ポリメラ−ゼ連鎖反応）法（EPO192168A2, WO91/14788, USP4,734,363 等参照）のように配列を酵素的に増幅させる方法等が用いられている。これらの方法は、なんらかの形でシグナルを増幅する過程を具備していて、増幅工程、またはその準備のための工程が煩雑であるために時間がかかるという問題点がある。
【０００３】
また、放射性同位体、蛍光物質、または酵素がプロ−ブに固定されている場合においては、シグナル増幅は、標識済、または固定化済のプロ−ブを用いて行っているが、プロ−ブの試料への非特異的結合によるシグナル増幅のため、検出精度が影響を受けるという問題がある。この問題を回避するには、ハイブリダイゼーション後に十分で適切な洗浄を行うことや、ハイブリダイゼーション時に他のDNA を混入させること等の措置をとることが必要である。しかしながら、これらの操作を加えることにより、簡潔でなかった実験操作が更に煩雑となるために、実験にかかる労力及び時間が増大するという難点が生じる。また、プロ−ブを標識すること自体も煩雑な操作を要する。更に、放射性同位体を使用する場合には、実験を行う場所や、実験者の資格等の問題が潜在的に存在している。
【０００４】
一方、ＰＣＲ法をＤＮＡ検出に用いる場合には、酵素的にDNA を増幅させる工程に時間がかかるのみならず、増幅工程の後に、ゲル電気泳動等でＤＮＡを分画する工程が必要があるという難点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したとおり、従来の核酸検出方法は、標識した核酸プローブを用いていたので、測定時のデータのバックグラウンドノイズを未結合の核酸プローブの洗浄によって除去する工程が必要であった。また、標識による検出は、非特異的な核酸分子との結合が生じても、その偽陽性データが識別困難であるために、あやまった判定がなされる可能性がある。一方、従来のPCR 法は、やはり標識を必要とするために、ゲル電気泳動のような煩雑且つ時間のかかる操作であった。従って、本発明の目的は、標識を用いることなく核酸分子の存在を可視化して検出することにある。また、本発明のほかの目的は、未結合成分を洗浄処理等により除去することなく容易に核酸分子を検出することにある。更に、本発明の目的は、短時間で確実に核酸分子を検出することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し、目的を達成するために、本発明の走査型プローブ顕微鏡を用いた核酸検出方法は、以下のごとく構成されている。
本発明の核酸検出方法は、核酸プロ−ブとのハイブリダイゼーション工程を具備した、所望の配列を有する核酸の検出方法であって、試料と、検出する核酸分子に相補的な配列を有する核酸プロ−ブとを混合した混合試料を加熱変性した状態で混合する第一工程と、該核酸プロ−ブと相補的な配列を有する核酸が試料中に存在する場合に、該核酸中の該配列と該核酸プロ−ブとがハイブリダイズするように、第一工程で熱変性された混合試料の温度を下げる第二工程と、第二工程で得た混合試料を走査型プローブ顕微鏡用の基板に固定化する第三工程と、第三工程で得た試料を画像化する第四工程を具備した特異的配列を有する核酸分子の検出方法である。
【０００７】
また本発明の核酸検出方法は、核酸プロ−ブとのハイブリダイゼーション工程を具備した、所望の配列を有する核酸の検出方法であって、検出する核酸分子に相補的な配列を有する核酸プロ−ブを、その一端で走査型プローブ顕微鏡用の基板に固定する第一工程と、該核酸プロ−ブが固定化された上記の基板上で、該核酸プロ−ブと該試料中の核酸分子とを加熱変性した状態で混合する第二工程と、上記核酸プロ−ブと相補的な配列を有する核酸が上記試料中に存在する場合に、該核酸中の該配列と該核酸プロ−ブとがハイブリダイズするように、第二工程で熱変性された接触試料の温度を下げる第三工程と、第三工程により形成された核酸分子の、形状、構造、及び長さに関する情報を、走査型プローブ顕微鏡により画像化する第四工程とを具備した、特異的配列を有する核酸分子の検出方法である。なお、上記の核酸プロ−ブは、少なくとも２以上に分割されていることを特徴としていてもよく、画像化したイメージは検査者が直接観察してもよいし、ソフトウエアを利用して自動解析してもよい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下において、試料及びプロ−ブの核酸分子がＤＮＡである場合についての、本願発明の実施の形態を示すが、これはあくまで本願発明を例示するにとどまり、本願発明を限定するものではないことは、当業者には自明である。また、本発明の方法は何れも、走査型プローブ顕微鏡（scanning probe microscopy ；ＳＰＭ）を用いることにより、分子の集合体としての全体的な性質ではなく、個々の核酸分子自体を観察することに基づいている。ここで、走査型プローブ顕微鏡とは、原子レベルでの観察が可能な走査型顕微鏡の総称であり、走査型トンネル顕微鏡（scanning tunneling microscopy ；ＳＴＭ）、原子間力顕微鏡（atomic force microscopy ；ＡＦＭ）が含まれる。ＡＦＭは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、アメリカ合衆国カリホルニア州サンタバーバラに所在するデジタルインスツルメント社の登録商標）等に大別されるが、この分野の研究は著しく進展している最中であり、摩擦力顕微鏡、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、フォトン走査型トンネル顕微鏡、走査型近接視野光学顕微鏡（near-field optical microscope;SNOM）等の新しい顕微鏡が開発されつつある。本発明における走査型プローブ顕微鏡とは、その趣旨に鑑み、現在知られている市販または公知の顕微鏡を単独ないし適宜組み合わせて使用する場合に限らず、原子レベルの分解能を有する顕微鏡であれば将来開発されるものをも含むものである。STM に関する技術は、例えば文献（G.Binning et al., IBM J.RES. DEVELOP., 30(4):355-369,1986 ； Conrad Schneiker et al., J.of Microscopy,152(2):585-596,1988 ； H.Kaisuka, Rev. Sci. Instrum., 60(10):3119-3122, 1989）を参考にすることができる。また、AFM に関する技術は、文献（G.Binnig et al., Phsical Review Letters, 56(9):930-933, 1986； T.R.Albrecht et al., J.Appl.Phys., 62(7): 2599-2602, 1987； A.L.Weisenhorn et al., Appl.Phys.Lett., 54(26):2651-2653, 1989 ； T.R.Alblecht et al., J.Vac.Sci.Technol., A8(4):3386-3396, 1990 ； R.C.Barrett et al., Rev.Sci.Instrum., 62(6),1991 ）を参考にすることができる。SNOMに関する技術は、例えば文献（Pohl et al., J. of Microscopy, 152(3):853-861, 1988 ； Constant A.J. Putman, et al., Appl. Phys. Lett., 64(18):2454-2456, 1994； N.F. van Hulst, Appl.Phys.Lett., 62(5):461-463, 1993 ）を参考にすることができる。また、上記種々の顕微鏡を組み合わせた例として、例えば文献（）には、STM とAFM とを併用した技術が報告されている。また、これらSPM の技術により、生物学的材料を測定し画像化する参考技術は、文献（Zasadzinski et al., Science, 239:1013-1015, 1988；Emch et al., J.of Microscopy, 152(1):85-92, 1988；Marti et al., J.of Microscopy,152(3):803-809, 1988；Drake et al., Science, 243:1586-1589, 1989；Gould et al., J.Vac. Sci. Technol., 8(1):369-373, 1990  ；Jericho et al., J.Vac. Sci. Technol., 8(1):661-666, 1990；Coragtger et al., Micron, 25(4):371-385, 1994 ；You et al., Micron, 26(4):311-315, 1995 ）に記載されている。さらに、核酸分子をSPM の技術により測定するための参考技術は、文献（Feng et al., J. of Microscopy, 152(3):811-816, 1988 ；Driscoll et al., Nature, 346:294-296, 1990；Firtel and Beveridge, Micron, 26(4), 347-362, 1995；Yang and Shao, Micron, 26(1):35-49, 1995；Rivetti et al., J.Mol.Biol., 264:919-932, 1996）に記載されている。本発明の方法に適用されるSPM の詳細な操作技術は、以上の文献から適宜参照できる。
【０００９】
図１は、核酸の存在状態（a ：２本鎖、b ：一部が２本鎖、c ：１本鎖）と、その形状との関係を表す模式図である。図１を用いて、従来技術との比較において本発明の特徴を説明する。まず図１の(a) は、試料中に存在する２本鎖の核酸（ＤＮＡ）の、直鎖状の形状を表している。これに対して、１本鎖の核酸の形状は、(c) に示されているように、分子内結合による３次元の複雑な構造を有し、これは配列により異なっている。このように１本鎖が配列に応じて高次構造（Single Strand Conformation Polymorphism ）をとることは、ＲＮＡに関しては古くから知られ、また研究されていたが、一方ＤＮＡに関しては、この高次構造の研究は比較的新しいものである（Orita, M. et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 86: 2766-2770 (1989) ：Orita, M. et al.,Genomics, 5:874-879 (1989) ）。オリタ（Orita ）らは、ヌクレオチド配列の異なる複数の一本鎖ＤＮＡを、ヌクレオチド配列に対応するコンフォーメーションの違いによってゲル電気泳動で分離した後に、ナイロン膜上に不動化し、異なる種類のラジオアイソトープで標識されたDNA プローブとRNA プローブとをハイブリダイズさせることによって、個々の一本鎖DNA を検出している。
【００１０】
しかしながら、本発明のように、一本鎖DNA （またはRNA ）に対する無標識のDNA プローブ（またはRNA プローブ）とのハイブリダイゼーションの報告はない。更に、一本鎖DNA （またはRNA ）をコンフォーメーションし得る自由な条件下で、ハイブリダイゼーションを行ったときの一本鎖DNA （またはRNA ）の挙動は未知であった。
【００１１】
一方、本発明では、検出すべきDNA （またはRNA ）コンフォーメーションを特異的な形状に変化させるために、DNA プローブ（またはRNA プローブ）によるハイブリダイゼーションを行っている。従って、試料中のDNA （またはRNA ）は、コンフォーメーションし得る自由な条件下でハイブリダイズさせる必要がある。一方、相補的な塩基対形成により、試料中の核酸分子とハイブリダイズした、プロ−ブ・核酸分子の複合体は、複合体部分が２本鎖に特有の構造をとり、残りのハイブリダイズしていない１本鎖部分は、上記したように１本鎖特異的な高次構造をとる。よって、３種類の分子種が存在することが可能である：プロ−ブとハイブリダイズさせていない核酸分子（図1a）（プロ−ブとハイブリダイズしなかったために再び元の二本鎖となった核酸分子を含む）、プロ−ブとハイブリダイズした核酸分子（図1(b)）、ハイブリダイズせずにオリタ（Orita ）らに報告されたような一本鎖のみによる高次構造を形成したプローブ分子と試料中の核酸分子（図1(c)）、である。これらの分子種の間には、形状、構造、及び長さに関する、顕著な差が見られる。よって、この差を直接的に観察して識別することにより、プロ−ブとハイブリダイズする配列を有する核酸が試料中にあるかどうかを調べることが可能であるというのが本発明の一つの特徴である。すなわち、従来、検出のために必要であったシグナル増幅工程を省くことが可能となり、ブロット法におけるプロ−ブの標識化やＰＣＲ法におけるＤＮＡの増幅に要していた時間を削減することができるようになった。更に従来のブロット法においては、プロ−ブの非特異的結合が、検出の精度に負の影響を与えていたが、本発明においては非特異的結合をしたプロ−ブ、すなわち相補的な配列に結合していないものは、その形状や構造を判断基準にして、相補的配列に結合したプロ−ブと識別することが可能であるという特徴を有している。
【００１２】
よって本発明では従来の核酸検出法で問題であった、煩雑な操作とそれにかかる時間、及びプロ−ブの非特異的な結合によるノイズの問題を一挙に解決することが可能となった。
【００１３】
（核酸検出方法の構成）
一つの態様において、本発明の核酸検出方法は以下の３つの工程より成り立っている：
第一工程：試料と、検出する核酸分子に相補的な配列を有するプロ−ブとを混合した混合試料を加熱変性させて、試料中の核酸分子の高次構造を解消する；
第二工程：該プロ−ブと試料中の核酸分子との間でハイブリダイゼーションが起きるように、第一工程で熱変性した混合試料の温度を下げる；
第三工程：第二工程後の試料を、走査型プローブ顕微鏡用の基板に固定化する；
第四工程：第三工程で得た試料を、走査型プローブ顕微鏡により画像化する。
以下では、第一工程から順次、それぞれの工程中の構成要素について説明する。本発明で用いる試料は、核酸を含むものであれば特に限定されない。例えば血液、唾液、精液、尿、髄液等の体液、並びにウイルス、細菌、真菌、寄生虫等の微生物から由来した核酸が含まれ、更に植物等から由来する核酸も試料として用いることが本質的に可能である。これら核酸分子は、公知の単離、または抽出技術（例えばUSP4,395,486）を用いて得ることができ、適宜の緩衝液に懸濁させた試料とするのが好ましい。核酸分子はDNA であってもRNA であってもよい。一方、試料中の核酸分子とハイブリダイズさせるプロ−ブは、該核酸分子中の検出したい配列に対して相補的な配列を有するものであれば、その調製方法は特に限定されるものではない。このようなプロ−ブには、例えばＤＮＡ合成技術により作成することが可能なものが含まれるが、プロ−ブ調製方法に関しては、当該技術分野でよく知られており、例えばUSP4,734,363に記載の技術を使用してもよい。プロ−ブ分子の長さは、検出すべき核酸分子と特異的に結合するのに有効な長さであればよい。試料とプロ−ブとの混合方法は、特に限定されるものではないが、試料中の核酸分子とプロ−ブの高次構造が解消されて、次いで相補的配列同士がハイブリダイズする必要があるので、加熱変性前に試料と核酸プローブとを混合するか、あるいは試料と核酸プローブとを別個に加熱変性した後に混合すればよい。混合試料の加熱変性時の温度上昇に関しては、混合試料中の核酸分子高次構造を解消して１本鎖にするものであれば特に限定されず、例えばＰＣＲ用の加熱冷却制御装置や、恒温糟等が使用可能である。また、アルカリ、尿素、及びホルムアミド等の変性剤を使用することも可能である。加熱変性にかける時間は、試料中の核酸分子、及びプロ−ブの性質により決まるが、当業者ならば適切な条件をすぐに困難なく決定できるであろう。通常、加熱変性は、８０〜１００℃の間、好ましくは１００℃で行なわれる。またこの加熱変性にかける時間は、少なくとも３分、より好ましくは１０分間行う。以上をまとめると、第一工程は、試料中の核酸分子、及びプロ−ブの高次構造を解消して、相補的配列同士がハイブリダイズすることが可能な状態にする工程であるが、この工程の反応条件等は、当業者ならば容易に設定できるものである。また、本願発明はハイブリダイゼーションに関する発明ではなく、ハイブリダイズした試料を観察することを具備した発明であるので、当業者に知られる方法であって、以下の第二工程の説明中で示めされた条件を満たすものであれば、ハイブリダイゼーションの方法を特に限定するものではない。
【００１４】
第二工程は、混合試料中のプロ−ブと相補的な配列を有する核酸が試料中に存在する場合に、核酸中のその配列と上記プロ−ブとをハイブリダイズさせるように、第一工程で加熱変性された混合試料の温度を下げる工程である。この温度低下の条件（温度の下げ方、下げた最終温度、反応溶液組成等）は、検出配列に応じて決定する必要がある。しかしこのことは当業者には自明であり、また必要に応じて決定することが可能である。通常、ハイブリダイゼーションの条件は、３０〜７０℃、２〜３時間である。ハイブリダイゼーションに関するその他の条件としては、ハイブリダイズする核酸分子が自由に構造変化することが可能であることが必要である。すなわち、本発明におけるハイブリダイゼーション方法は、核酸分子中のハイブリダイズしない部分が高次構造をとることを許容するものでなくてはならない。本発明に関連した従来技術であるものには、サザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ノ−ザン・ブロット・ハイブリダイゼーション法、及びプトマンらの文献（Putman, C.A.J. et l., Cytometry, 14:356-361(1993) ）で用いられている、in situ のハイブリダイゼーション法が含まれる。プトマン（Putman）らの文献（上記）では、in situ のハイブリダイゼーション法を使用して、染色体中の特定の配列に特異的なプロ−ブをハイブリダイズし、プローブ分子にビオチン・アビジン反応を介してジアミンベンジディン（DAB ）を中期染色体の特定領域に多量に標識することによって、増幅されたDAB の厚みを原子間力顕微鏡で測定している。DAB による厚みを強調するためには、DAB の濃度とインキュベーション時間の増加が要求される。一方、中期染色体は、アルバーツ（Alberts ）らが記載したとおり（Molecular  Biology  of  the  Cell 、３８５−４０６、１９８３、Garland  Publishing 、Inc.,  NEW  YORK）、二本鎖が複雑に絡み合った分子学的構造形成しているので、プローブ分子が結合しただけでは、複合体を識別できない。加えて、プトマン（Putman）らの方法では、試料となる細胞を、ＤＮＡを単離することなく、予め顕微鏡で観察するためのスライドガラス上に固定しているために、プローブとハイブリダイズする染色体のＤＮＡ分子は自由な高次構造をとることができない。また、このin situ のハイブリダイゼーション法では、非特異的結合が生じても、特異的結合の場合と同様に染色体上の厚みの変化として現れるために、この両者を識別することはできないと考えられている。したがって、ハイブリダイゼーションの最中も、ハイブリダイゼーションの後においても、検出する核酸分子中のハイブリダイズしていない部分が自由に高次構造をとることを可能にし、ハイブリダイゼーション後は非特異的な結合を起こしたプロ−ブ分子が、特異的な結合を起こしたプロ−ブとは異なる形状／構造、及び長さをとるようにハイブリダイゼーションを行い、またそのような違いが識別できる本発明とは本質的に大きく異なっている。更に、in situ のハイブリダイゼーション以外で、当該技術分野でよく知られた上記のハイブリダイゼーション法は何れも、核酸分子を、自由に形状／構造変化できない程度にフィルタ−等の担体に固定化しているため、本願発明のように非特異的結合と特異的結合���を識別することができない。また、PCR 法では、プライマとしてのＤＮＡプローブを試料中のＤＮＡとハイブリダイズさせた後に、ポリメラーゼを添加して、二本鎖に延長するための合成工程を備えるので、本発明のような一本鎖による高次構造を形成し得る工程を含まない。
【００１５】
最後に、第二工程でハイブリダイズした試料を走査型プローブ顕微鏡用の基板に固定化後、走査型プローブ顕微鏡で画像化する。第二工程でのハイブリダイゼーションが終了した試料を、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、該試料を走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化する。この固定化方法は、固定化される分子の形状及び構造変化を著しく阻害しないものであれば、特に限定されない。一つの好ましい例においては、表面が平坦な雲母の基板に、２価のカチオンで固定化を行う。固定化用の好ましいカチオンはMg2+であり、好ましい基板は、表面に劈開面を有する雲母基板であるが、基板に関してはシリコン基板、ガラス基板などの、走査型プローブ顕微鏡での観察に用いられ、尚且つプロ−ブの固定化を許容するものであればよい。
【００１６】
具体的な固定化方法は次のとおりである。核酸の濃度が１〜０. １μg ／mlの核酸試料（１０mM MgCl 2 、１０mM HEPES pH7.5) を、雲母の劈開面に１０μl 滴下して、５〜１０分間、室温で湿潤状態で静置し、純水で洗浄後、窒素またはアルゴンガスで乾燥して、観察まで真空デシケ−タ中で保存する。このようにして調製した試料を、原子間力顕微鏡にて画像化した例が、図２に示されている。試料中の核酸分子が２本鎖の場合、それぞれの分子は相補的であるため、試料中の核酸分子同士がハイブリダイズしたものが生じる場合がある（図２の(a) ）。これは第二工程でのハイブリダイゼーションの条件等によっては、生じにくいことがある。また、プロ−ブと特異的にハイブリダイズした、試料中の核酸分子は、ハイブリダイズした２本鎖部分と、ハイブリダイズしていない１本鎖部分とを有している。この１本鎖部分は１本鎖特有の球状構造をとるために、プロ−ブがハイブリダイズした、試料中の核酸分子は、ハイブリダイズした線状部分とハイブリダイズしなかった球状部分とからなる（図２の(b) ）。そしてハイブリダイズしなかった１本鎖プロ−ブ分子、及びハイブリダイズしなかった試料中の核酸分子は、全体が球状となる（図２の(c) ）。文献（Rivetti et al., J.Mol.Biol., 264:919-932, 1996）のように、PCR により試料中の核酸分子を予め増幅した後に、本発明のプロセスを通じて無標識の核酸プローブとハイブリダイズさせることで、基板上の測定視野範囲でのハイブリダイズした核酸分子の存在確率を高めてもよい。この場合、従来のPCR 法とは、標識を用いることなく、しかもゲル電気泳動のような長時間も要求されない改良ができる点で異なる。このような試料の画像化を行うには、好ましい走査型プローブ顕微鏡である原子間力顕微鏡があるが、走査型プローブ顕微鏡以外の装置、例えば文献（Thresher et al., J. Mol. Biol. 254:364-371, 1995）に記載の技術を参考にして電子顕微鏡を用いることも可能である。後者の場合には、分子の形状や長さ等をおおまかに識別できる。しかしながらこの場合には、真空状態で観察しなくてはならず、また導電性付加の金属コ−トサンプル処理が必要になるなどの、本発明と比較したときの不利な点が多くある。
【００１７】
このように、本発明においてはプロ−ブとのハイブリダイゼーションに応じて生じる、分子のユニ−クな形状、構造、及び長さを画像化して判断基準にすることで、プロ−ブと相補的な配列を有する核酸分子が試料中に存在するか否かを決定することが可能である。よって、本発明の検出方法は従来の検出方法と比較して、分子レベルでの検出を行う高感度な検出方法であり、またプロ−ブの非特異的結合と特異的結合を識別することが可能な、精度の高い検出方法である。
【００１８】
別の態様において、本発明の核酸検出方法は以下の４つの工程より成り立っている：
第一工程：プロ−ブを、その一端で走査型プローブ顕微鏡用の基板に固定する；
第二工程：プロ−ブが固定化された上記の基板に、試料を滴下してプロ−ブと接触させた後、該プロ−ブ及び該試料中の核酸分子のからなる上記接触試料を加熱変性させる；
第三工程：上記プロ−ブと相補的な配列を有する核酸が上記試料中に存在する場合に、該核酸中の該配列と該プロ−ブとがハイブリダイズするように、第二工程で熱変性された接触試料の温度を下げる；
第四工程：第三工程により形成された核酸分子の、形状、構造、及び長さに関する情報を、走査型プローブ顕微鏡により画像化して得る。
この態様においては、第一工程で、プロ−ブ核酸分子の一端に、アミノ基等の反応基をだしておき、また走査型プローブ顕微鏡用の基板上にも同様にアミノ基等の反応基をだしておき、これら反応基を共有結合させるようにし、ハイブリダイゼーションを起こした分子が高次構造を形成することを保証するような方法で固定化を行うことが好ましい。言い換えると、プロ−ブまたは試料中の核酸分子が、分子内の複数の部分で基板に固定化される方法を採用すると、ハイブリダイゼーション処理後の、分子の自由な形状／構造変化が阻害され、ハイブリダイズした部分としない部分との間の差異が見られなくなり、本発明の利点が損なわれるので、このような方法は好ましくないということである。具体的な方法は、次の通りである：
（i ）アミノ基を官能基として有するシランカップリング剤、例えば信越シリコ−ン社のアミノプロピルトリエトキシシランの蒸気中に、約１cm四方の雲母（日新EM株式会社）の劈開面を２時間静置する。これにより、シランカップリング剤のアルコキシル基（Ｓｉ−ＯＲ）が、湿気により加水分解したシラノ−ル基と、雲母劈開表面とを縮合させて、雲母劈開面にアミノ基を生成する。
【００１９】
（ii）次いで、上記のように処理した雲母劈開面上に１％のグルタルアルデヒドを含んだ水溶液２０μl を滴下し、５分間静置した後純水でよく洗浄する。
（iii ）適当なＤＮＡプロ−ブの末端にアミノ基を付与したもの（水、または10mM HEPES pH ７．５  緩衝液）を２０μl 滴下して、室温で２時間静置、または振動させながら保存して、ＤＮＡプロ−ブを雲母劈開面に固定する。この処理の後、純水で洗浄して、固定化されなかったＤＮＡプロ−ブを除去する。
【００２０】
（iv）雲母劈開面上の活性化されたアミノ基で、ＤＮＡが固定化されなかったものをブロッキングするために、１０mMのグリシン溶液、または１０mMのTris溶液等のアミノ基を含んだ溶液で処理する。
【００２１】
（v ）１０mM HEPES緩衝液中の試料ＤＮＡ（１０μｇ／ml）を２０μl 、ＤＮＡプロ−ブを固定化した上記の雲母劈開面へ滴下し、１００℃で５分間保温する。
【００２２】
（vi）ペルチェ素子を使用したヒ−トブロック上に上記の雲母基板を乗せて、５０℃まで急冷する。
（vii ）上記の工程（vi）で得られた基板を、原子間力顕微鏡での画像化に供する。その際、工程（vi）の後、１〜１０mlの純水で基板を洗浄することが好ましく、この洗浄後に、圧縮空気、窒素ガス、またはアルゴンガスで乾燥させることが更に好ましい。
なお、固定化以外の工程は、上記の実施の形態に示したもう一方の態様と本質的に同じであればよい。
【００２３】
図３は、本実施の形態で検出される核酸分子の構造を示す模式図である。図３の（a ）は、プロ−ブと試料中のＤＮＡがハイブリダイズしたものを表しており、ハイブリダイズした部分が２本鎖特有の直鎖状となり、ハイブリダイズしていない部分が１本鎖特有の高次構造をとっている。図で示されているように、プロ−ブ分子はその一方の末端のみで基板に結合されていて、これによってハイブリダイズしたときの分子の高次構造形成が保証されている。次に、図３の（ｂ）、及び（ｃ）は、それぞれ試料中の核酸分子にハイブリダイズしなかったプロ−ブ、及びプロ−ブにハイブリダイズしなかった試料中の核酸分子を表しており、ともにそれぞれの分子特有の高次構造をとる。このようにプロ−ブ分子を予め固定化しておいた場合にも、上記の実施態様で示した場合と同様に、走査型プローブ顕微鏡で識別のつく高次構造を作るようにハイブリダイゼーションを行うことが可能である。
【００２４】
図９は、一定の核酸分子に対して、異なるプローブでハイブリダイズを行った時に形成される、複合体の形状／形態の差異を模式的に表したものである。すなわち、核酸プローブの塩基配列及び長さを変更することにより、検出すべき核酸分子を種々の特異的な形状でもって画像化できる。図9(a)は、核酸分子の両方の末端から等しい距離だけ短い核酸プローブを用いた例である。図9(b)は、核酸分子の高次構造（図の左側）の大きさを強調するために、図９（a ）の核酸プローブについて強調したい部分とは反対側（図の右側）のプローブの長さを長くしたものである。図９（ｃ）は、同じく、核酸分子の高次構造（図の左側）の大きさを強調するために、図9(a)の核酸プローブについて強調したい側（図の左側）のプローブの長さを短くしたものである。これら、図9(a),(b), （ｃ）は、高次構造の数によっても識別できる。図９(d) は、図９（ｃ）の高次構造のうちの１個と直鎖状の核酸部分とを繋げた形状にするために、図９（ｃ）で用いた核酸プローブの高次構造とは反対側（図の右側）を核酸分子の末端まで長くしたものである。図9(e)は、図9(d)の直鎖状部分を識別し得る許容範囲で更に短くすることでより高次構造を大きく強調するために、図9(d)で用いた核酸プローブの高次構造側（図の左側）の長さを最大限短くしたものである。図９(f) および図９(g) は、同じ核酸分子に相補的に結合する核酸プローブを分割した例である。図9(f)は、図９(a) と同じ配列を有する核酸プローブであって、該プローブの中央部分の長さを、強調し得る程度の高次構造が形成できるだけの一本鎖にに相当する長さだけ除いたものである。この場合、高次構造の数が３個（両端に２個の高次構造と、その中央部分に１個の高次構造とからなるもの）である点及び／または直鎖状部分が２個である点を判断基準にして識別容易となる。図9(g)は、図9(f)の一方の末端部分（図の左側）のみが高次構造であって、他方の末端を図9(d)や図9(e)のように先端まで直鎖状部分となるように核酸プローブ塩基配列を末端側（図の右側）にずらしたものである。この場合、高次構造の数が２個（端部に１個の高次構造と中間部分に１個の高次構造とからなるもの）である点及び／または直鎖状部分が２個である点を判断基準にして識別容易となる。このように、検出すべき核酸分子について、中間部分の適宜の長さの相当の塩基配列を除いてその部分に高次構造を形成するような分割された核酸プローブを用いれば、直鎖状部分の中間に高次構造を有する特異的形状を形成することができる。ここで、分割数を３個以上にすることで多様性を増すことが可能である。また、分割された核酸プローブが、核酸分子の両端に結合するような塩基配列にすれば、核酸分子の中間部分にのみ１個または２個以上の高次構造を形成することもできる。このように、種々の形状の核酸分子・核酸プローブ複合体を形成するように、核酸プ塩基配列及び／または長さを変更したり、適宜組み合わせることにより、１種類のみならず複数種類の核酸分子を同時または別々に効率よく識別できる。
【００２５】
【実施例】
実施例１：ＤＮＡの状態と形状との関係
＜実験手順＞
（i ）配列認識番号１及び２に記載されている配列を有するＤＮＡを使用した。配列認識番号１のＤＮＡは、その末端７５１塩基対が、配列認識番号２の配列と共通している。まず、プラスミドpGEX-PH （ファルマシアのプラスミドｐGEX-３ＸのBamHI とEcoRI でプレクストリンドメインを挿入したもの）を制限酵素HincII、またはHincII及びBamHI を用いて３７℃で消化して、それぞれ１８３０塩基対、７５１塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００２６】
（ii）上記の切断されたＤＮＡ断片を１：１の比で、緩衝液（１mM EDTA 、、10mM  Tris-HCl  pH８．０）中で混合し、１００℃で１０分間加熱して変性させた後、５０℃で２時間ハイブリダイズさせた。この核酸試料を０．１μｇ/ml になるよう１０mMMgCl2 、１０mM HEPES  （pH７．５）にて希釈し、約１cm四方の雲母の基板に滴下して３０分間、室温で湿潤状態で静置し、純水で洗浄後、アルゴンガスで乾燥した。
【００２７】
（iii ）上記のようにして調製した試料を、原子間力顕微鏡にて画像化した。
＜実験結果＞
図２の(a) は、ハイブリダイズにより試料ＤＮＡ同士が元の二本鎖に戻ったもの（配列認識番号２の試料）である。図２の（ｂ）は、配列認識番号２のＤＮＡが配列認識番号１のＤＮＡとハイブリダイズしたものである。この分子は、プロ−ブと特異的にハイブリダイズした２本鎖部分と、ハイブリダイズしていない１本鎖部分とを有している。そしてハイブリダイズしなかったＤＮＡ分子は、全体が球状となる（図２の(c) ）
＜考察＞
上記の結果から分かるように、２本鎖部分と１本鎖部分の高次構造は異なっている。従って、直鎖状の２本鎖の検出により、プロ−ブが特異的にハイブリダイズしたことが証明できる。
【００２８】
実施例２：一本鎖ＤＮＡがその配列およびプローブの長さに応じて、異なる高次構造をとることの証明
＜実験手順＞
（ｉ）先ず、プラスミドｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して直鎖状にした。プラスミドｐＵＣ１１８は、緩衝液中の懸濁液として、例えば宝酒造株式会社から入手可能である。また、ｐＵＣ１１８で形質転換された大腸菌（例えば宝酒造株式会社から入手可能なＪＭ１０９大腸菌細胞をｐＵＣ１１８で形質転換しておき、この大腸菌から当該プラスミドを取り出し、イオンクロマトグラフィー（例えばQIAGEN GmbH 社製の QIAGEN Plasmid Kit ）を用いて精製したｐＵＣ１１８を用いてもよい。ｐＵＣ１１８は環状ＤＮＡであり、そのマルチクローニング部位には、一つのＥｃｏＲＩ制限酵素部位が含まれている。そこで、上記プラスミドｐＵＣ１１８を、５単位／μｇＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限酵素（東洋紡績株式会社から商業的に入手可能）を用いて３７℃で消化し、前記ＥｃｏＲＩ部位で切断することにより、３．２ｋｂｐの直鎖状ＤＮＡを得た。
【００２９】
（ii）次に、上記で得た５μｇの直鎖状ＤＮＡと、１５０単位のエキソヌクレアーゼIII （東洋紡績株式会社から商業的に入手可能）とを、２５℃において反応させた。この反応は、50mM Tris-HCl(pH 7.6) ，1mM MgCl2 ，1mM 2-メルカプトエタノールの溶液（２５μl ）中で行った。また、反応時間は、０分、５分、１０分および１５分とした。
【００３０】
図４は、この反応によって生じる直鎖状ｐＵＣ１１８の変化を模式的に示す説明図である。同図において、（a ）は反応前の二本鎖ＤＮＡを示している。この二本鎖ＤＮＡにエキソヌクレアーゼIII を作用させると、同図（ｂ）に示すように、各ＤＮＡ鎖の３′側からヌクレオチドが削り取られる結果、両端部分に一本鎖ＤＮＡが形成される。なお、一方の一本鎖部分はセンス鎖であり、他方の一本鎖部分はアンチセンス鎖である。こうして形成された夫々の一本鎖部分、は内部で対合を形成することにより、同図（ｃ）に示すように高次構造を形成することになる。
【００３１】
なお、図示のような反応が生じたことについては、次のようにして確認した。即ち、２３℃で１５分間、上記の反応生成物をＳ１ヌクレアーゼと反応させる。これによって一本鎖部分のみが消化されるから、元の二本鎖よりも短い二本鎖のみのＤＮＡが得られる。次いで、これをアガロース電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色を行って可視化する。こうして検出されたバンドの移動度から、元の二本鎖ＤＮＡよりも小さい二本鎖ＤＮＡが検出されれば、上記のエキソヌクレアーゼ反応が生じていていたことを確認することができる。
【００３２】
（iii ）上記のエキソヌクレアーゼIII との反応で得られた各ＤＮＡ鎖について、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた測定を行った。測定に際しては、まず、上記の工程（ii）で部分消化されたＤＮＡを、10mM MgCl 2 、10mM HEPES溶液中に約0.01μｇ／ｍｌの濃度で希釈した。このＤＮＡ希釈溶液１０μリットルを雲母劈開面（雲母板の大きさは１cm×１cm程度、形状は不問）に滴下し、３０分間静置することにより、ＤＮＡ分子を雲母劈開面に吸着させた。これを１ｍｌ程度の純水で洗浄し、ＡｒまたはＮ２等の不活性ガス雰囲気下で乾燥した後に、ＡＦＭ測定を行った。使用したＡＦＭ顕微鏡は、アメリカ合衆国カリホルニア州サンタバーバラに所在のデジタルインスツルメント社から市販されているナノスコープIII ａである。
【００３３】
なお、上記のＤＮＡ希釈溶液を形成する際には、HEPES 以外の緩衝液を用いてもよく、Ｍｇの代わりに他の２価の陽イオンを用いてもよい。また、ＤＮＡを雲母劈開面に吸着させるために静置する時間は、ＤＮＡ希釈溶液の濃度に応じて決まる。ＤＮＡの雲母劈開面への吸着法については、例えば Helen G. Hansma, et al. Nucleic Acids Reserch 1996,Vol.24,No.4 を参照されたい。
【００３４】
＜実験結果＞
上記の（ii）での測定結果は次の通りであった。
図５は、エキソヌクレアーゼIII と１０分間反応させたＤＮＡ試料についての測定結果示す。また、図６は、反応時間を１５分としたＤＮＡ試料についての同様のものである。これらは、二本鎖の直鎖状部分の両端に、一本鎖になった高次構造部分が存在していることを示している。更に、両端部に存在する高次構造は、夫々の塩基配列に起因して異なることを示している。また、図５と図６とを比較すると、反応の進行によって中央の二本鎖部分が短くなり、両端の高次構造部分が大きくなっていること、並びに両端の高次構造自体が変化していることが分かる。反応時間を５分としたＤＮＡ試料の場合は、中央部の直鎖状部分が図５よりも長く、両端の高次構造部部分は図５よりも小さかった（図７参照）。
【００３５】
図７は、反応時間を５分としたＤＮＡ試料（ＡＦＭ写真を省略したもの）について、ＡＦＭでの測定結果を市販のコンピュータソフトウエアで解析した結果を示している。この図から、一本鎖になったＤＮＡ分子の両端部では既に高次構造が形成されており、且つ夫々の高次構造はその塩基配列の相違に起因して異なっていることが分かる。なお、図中の数字はＤＮＡ試料のヌクレオチド番号を示している。
【００３６】
図８は、写真に示したＡＦＭでの測定結果（反応時間１０分）を、上記と同様のコンピュータソフトウエアで解析した結果を示している。この解析結果は、二本鎖部分の両端に存在する高次構造の相違を、図５の写真よりも更に明確に示している。なお、図中には、各高次構造および直鎖状部分の大きさ（塩基対数）、並びにヌクレオチド番号が付されている。
【００３７】
なお、参考までに上記の酵素反応を２０分継続させたものでは、全てが一本鎖になっており、それ以上反応させても変化はなかった。
＜考察＞
上記の結果から分かるように、夫々の一本鎖ＤＮＡの高次構造は、その塩基配列に対応して明確に異なっている。また、２本鎖部分は明らかに１本鎖部分の高次構造とは異なっている。従って、直鎖状の２本鎖の検出により、プロ−ブが特異的にハイブリダイズしたことが証明でき、また一本鎖ＤＮＡの高次構造の比較により、ハイブリダイズしなかった部分に関しての情報も得ることが可能である。また、プローブの配列およびプローブの長さを適宜変更することにより、プローブ・核酸分子の複合体の形状及び一本鎖ＤＮＡの高次構造の寸法を、特徴のあるものにすることができるので、検出すべき核酸の識別工程におけるデータベースを小規模にし、簡略且つ迅速に検出結果が得られる点で好ましい。
【００３８】
実施例３：プローブの固定化方法、及び固定化済みプローブを用いた核酸分子の検出。
＜実験手順＞
（i ）アミノ基を官能基として有するシランカップリング剤、信越シリコ−ン社のアミノプロピルトリエトキシシランの蒸気中に、約１cm四方の雲母（日新EM株式会社）の劈開面を２時間静置した。
【００３９】
（ii）次いで、上記のように処理した雲母劈開面上に１％のグルタルアルデヒドを含んだ水溶液２０μl を滴下し、５分間静置した後純水でよく洗浄した。
（iii ）ＤＮＡプロ−ブ（配列認識番号２）の末端にアミノ基を付与したもの（水、または10mM HEPES pH ７．５、１ｍＭ EDTA ）を２０μl 滴下して、室温で２時間静置して保存し、ＤＮＡプロ−ブを雲母劈開面に固定した。この処理の後、純水で洗浄して、固定化されなかったＤＮＡプロ−ブを除去した。
【００４０】
（iv）１０mMのグリシン溶液で、上記の雲母基板を処理した。
（v ）１０mM HEPES  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 緩衝液中の試料ＤＮＡ（１０μｇ／ml）を２０μl 、ＤＮＡプロ−ブを固定化した上記の雲母劈開面へ滴下し、１００℃で５分間保温した。
【００４１】
（vi）ペルチェ素子を使用したヒ−トブロック上に上記の雲母基板を乗せて、５０℃まで急冷し、その後、約１０mlの純水で基板を洗浄し、アルゴンガスで乾燥させた。
【００４２】
（vii ）上記の工程（vi）で得られた基板を、原子間力顕微鏡で画像化した。
＜実験結果＞
本実施例で検出される核酸分子の構造は、図３の模式図で示される分子のものと本質的に同じであった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明に係る核酸検出方法を実施すると、以下のような効果が生ずる：
・検出用のプロ−ブ分子に標識を入れる必要が本質的になくなる；
・プロ−ブの非特異的結合による検出時のノイズを低減するための操作が本質的にいらなくなる；
・試料中に１分子のみしか存在しないものでも検出することが原理的に可能である。
・分子を直接観察するため、微量の試料を使用しても検出が可能である。
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、核酸分子の存在状態の違いによって、形態が異なることを模式的に示す図である。
【図２】図２は、核酸分子の存在状態の違いがその形態の違いに現れることを、原子間力顕微鏡で観察した、顕微鏡写真である。
【図３】図３は、プロ−ブを予め基板上に固定化しておいてから、試料と接触させてハイブリダイズさせた場合の、核酸分子検出結果を模式的に表す図である。
【図４】本発明の方法の原理を示すために行った、予備的実験を模式的に示す説明図である。
【図５】図４（Ｃ）の状態になった一つのＤＮＡ分子のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図６】２本鎖部分の長さが図５のものよりも短い、図４（Ｃ）の状態になったもう一つのＤＮＡ分子のＡＦＭ顕微鏡写真である。
【図７】図４（Ｃ）の状態になったＤＮＡ分子のＡＦＭ測定で得られた情報を、コンピュータ解析して得たＤＮＡ分子の構造を示す図である。
【図８】図５のＡＦＭ顕微鏡写真に表された情報を、コンピュータで解析して得たＤＮＡ分子の構造示す図である。
【図９】一定の核酸分子に対して、異なるプローブでハイブリダイズを行ったときに形成される、複合体の形状／形態の差異を模式的に表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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