(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡ型ウイルスの分子量５５〜７０ｋＤの核タンパク質と抗原抗体反応し、インフルエンザＢ型ウイルスとは実質的に抗原抗体反応せず、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列５９から１３０のアミノ酸領域のエピトープと反応し、インフルエンザＡ型ウイルスのH1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、 H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8及びH5N1の各亜型ウイルスと抗原抗体反応する、抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
移動可能な標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を有する標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン、展開液供給ゾーン、展開液吸収ゾーン及び抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体をマトリクスに不動化させたインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンをマトリクスに設けた器具であって、前記標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び検出ゾーンに不動化した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の少なくとも一方の抗体が請求項１記載のモノクローナル抗体である免疫測定器具。
【請求項３】
標識試薬ゾーンに更に標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を含み、且つインフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を不動化させたインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンの近傍に、更にインフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体を不動化させたインフルエンザＢ型ウイルス検出ゾーンを有する請求項２記載の免疫測定器具。
【請求項４】
標識物が酵素であり、展開液中及び／又は展開液供給ゾーンの近傍に酵素に対する基質を含有する請求項２又は３記載の免疫測定器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具に関する。
【背景技術】
【０００２】  インフルエンザは、古くから世界的な流行を周期的に繰り返し、そのたびに多くの死者を出してきたが、１９３１年に原因ウイルスが検出され原因解明への道が開かれた。インフルエンザ病原体のウイルスはウイルス内部にある可溶性の核タンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＰ）の抗原性によってＡ型、Ｂ型又はＣ型の３種のタイプに分類されている。インフルエンザＡ型は、更にウイルス表面に存在する赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＮＡ）という２つのｅｎｖｅｌｏｐｅ糖タンパク質の抗原性によって亜型に分類されている。【０００３】  １９７２年よりインフルエンザの予防には、エーテル処理後ホルマリンで不活化したワクチンが用いられてきた。近年、予防に用いられるワクチン以外に治療薬として抗インフルエンザ薬が見出され広く用いられるようになった。これらの治療薬としては、インフルエンザＡ型ウイルスに適応する塩酸アマンタジンや、インフルエンザＡ型ウイルスとＢ型に適応するザナビル、リン酸オセルタミビル等である。【０００４】  これらの治療薬を選択するにあたっては、検体中のインフルエンザウイルスを検出し、感染がインフルエンザウイルスによるものであって、ウイルスのタイプがＡ型又はＢ型であるかを特定することが重要である。また、インフルエンザＡ型ウイルスは、インフルエンザウイルスＢ型に比べ感染力が強く、重篤な症状を引き起こすため、早期の治療には感染ウイルスの特定が更に重要である。【０００５】  従来、インフルエンザウイルスを抗インフルエンザウイルス抗体によって検出することが行われてきた。これまでインフルエンザＡ型ウイルスに対する抗体としては、流行が予想されるウイルスの亜型を判別してワクチン製造に役立てるため、ウイルスのＨＡやＮＡを特異的に認識し、ウイルスの亜型を識別するための抗体が知られていた（例えば、（特許文献１），（特許文献２）参照）。また、インフルエンザウイルスＡ型各亜型について核タンパク質のアミノ酸配列が決定され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ等に報告されている。【０００６】  更に、インフルエンザウイルスを検出する装置としては、例えばインフルエンザウイルス抗原を結合しうる固相を用意し、検体中のインフルエンザウイルスを反応させた後、更に第一酵素が結合しているインフルエンザＡ型ウイルス抗体及び第二酵素が結合しているインフルエンザウイルスＢ型抗体を前記固相と反応させ、基質を加えて反応を行い、固相上の発色を目視で観察するフロー・スルー型装置が知られていた（（特許文献３）参照）。この装置は、試薬中の抗体にはインフルエンザウイルスの核タンパク質に対する抗体を使用するものの、測定操作が煩雑であり、簡便な測定装置ではなかった。また更に、インフルエンザウイルス核タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用した免疫測定器具（以下「イムノクロマト器具」という）が知られている（（非特許文献１）参照）。【０００７】  一方、輸液可能な帯状のマトリックスを用いるイムノクロマト器具が開発され、所定の箇所に検体を点着する��けで、特別な検出装置、熟練した測定技術を必要とせず短時間に簡便に検体中の抗原又は抗体の測定ができるようになった。イムノクロマト器具には、その測定対象物質によって、例えば検出ゾーンに複数の梅毒トレポネマ抗原（ＴＰ抗原）を結合し、検体中の複数の抗ＴＰ抗体を別々の検出ゾーンで検出することのできるイムノクロマト器具が開発されている（（特許文献４）参照）。この器具の検出ゾーンには、異なったＴＰ抗原を結合させた複数のゾーンを有し、１回の測定で異なる抗ＴＰ抗体を別々の検出して感染時期を特定し、治療薬の選択等に利用されている。【０００８】
【特許文献１】特開平６−１００５９４号
【特許文献２】特開平７−３０４７９９号
【特許文献３】特開２００１−１２４７７５号
【特許文献４】特開平９−２２９９３８号
【非特許文献１】感染症誌  ２００１；７５；７９２−７９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  従来の抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体は、核タンパク質に対する抗体がイムノクロマト法などで用いられるものの、インフルエンザＡ型ウイルスに対する特異性及び反応性が低く、高感度の免疫測定には満足できるものではなかった。また、インフルエンザ治療薬を選択するためインフルエンザＢ型ウイルスとは反応しないが、インフルエンザウイルスのＨＡとＮＡが変異した亜型を含む全てのインフルエンザＡ型ウイルスに反応する抗体が求められていた。【００１０】  また更に、インフルエンザＡ型ウイルス又はＢ型ウイルスの判別を特別な診断機器設備や測定装置用いずに、短時間に測定結果が得られ、１回の操作でＡ型又はＢ型の判別できる装置が求められていた。【００１１】  従って、本発明の目的は、特異性が高い抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を提供することである。また、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスを特異的に検出することができる免疫測定器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本願発明者らは、鋭意研究の結果、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を抗原とし、インフルエンザＡ型ウイルスと特異的に反応する抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を作出することに成功し、本発明を完成した。また、このインフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を利用することにより、インフルエンザＡ型ウイルスをインフルエンザＢ型ウイルスと識別して検出することが可能な免疫測定器具を提供できることに想到した。【００１３】
すなわち、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスの分子量５５〜７０ｋＤの核タンパク質と抗原抗体反応し、インフルエンザＢ型ウイルスとは実質的に抗原抗体反応せず、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列５９から１３０のアミノ酸領域のエピトープと反応し、インフルエンザＡ型ウイルスのH1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8及びH5N1の各亜型ウイルスと抗原抗体反応する、抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。また、本発明は、移動可能な標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を有する標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン、展開液供給ゾーン、展開液吸収ゾーン及び抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体をマトリクスに不動化させたインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンをマトリクスに設けた器具であって、前記標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び検出ゾーンに不動化した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の少なくとも一方の抗体が上記本発明のモノクローナル抗体である免疫測定器具を提供する。
【発明の効果】
【００１４】  本発明により、インフルエンザＡ型ウイルスと免疫反応するが、インフルエンザＢ型ウイルスとは反応しない抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体が提供された。本発明の抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を用いる免疫測定により、インフルエンザＡ型ウイルスをインフルエンザＢ型ウイルスと識別して検出又は定量することができる。本発明により、さらに、上記本発明の抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体を用いた免疫測定器具が提供された。本発明の免疫測定器具を用いることにより、インフルエンザＡ型ウイルスを、簡便に、かつ、インフルエンザＢ型ウイルスと識別して検出することができる。従って、本発明は、インフルエンザの診断及び治療に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウエスタンブロット法によって分画した抗原について、本発明のモノクローナル抗体を反応させた時の結果を示す図である。
【図２】実施例４で用いた発現用プラスミド（ｐＷ６Ａ）の制限酵素地図を示す図である。
【図３】インフルエンザＨ１Ｎ１のＡ断片をさらに細分化した断片Ａ１からＡ７のアミノ酸を示す図である。
【図４】ＦＶＡ２−１１との反応性を確認するＣＢＢ染色パターンとウエスタンブロットを示す図である。
【図５】インフルエンザＡ型ウイルス亜型の核タンパク質アミノ酸配列（８０〜１４０）を示す図である。
【図６】本発明の測定器具態様の一例を模式的に示す断面図である。
【図７】本発明の測定器具をカセットにセットしたときの一例を示す平面図である。
【図８】図７のＡ−Ａ‘の断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  上記の通り、インフルエンザＡ型ウイルスの分子量５５〜７０ｋＤの核タンパク質と抗原抗体反応するものである。インフルエンザＡ型ウイルスの分子量５５〜７０ｋＤの核タンパク質と抗原抗体反応することは、インフルエンザＡ型ウイルスを試料とし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組み込んだウェスタンブロット法により確認することができる。ウェスタンブロット（下記実施例参照）を行なうと、本発明のモノクローナル抗体は、分子量５５〜７０ｋＤの核タンパク質を認識する。【００１７】  上記のとおり、本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＢ型ウイルスとは実質的に抗原抗体反応しない。ここで、「実質的に抗原抗体反応しない」とは、検出可能なレベルで抗原抗体反応しないか又は抗原抗体反応を起こしても、その反応の程度が、インフルエンザＡ型ウイルスとの抗原抗体反応よりも明らかに弱く、インフルエンザＡ型ウイルスと抗原抗体反応していないことが当業者にとって明瞭な程度にしか反応しないことを意味する。また、ここで、「インフルエンザＢ型ウイルスとは実質的に抗原抗体反応しない」とは、インフルエンザＢ型ウイルスの核タンパク質をはじめ、該ウイルスの各構成要素のタンパク質と実質的に抗原抗体反応しないという意味である。好ましい形態では、本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＣ型ウイルスとも実質的に反応しない。【００１８】
本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列の５９番目のアミノ酸残基（以下、「59aa」のように記載）から130aaのアミノ酸領域内のエピトープと反応する。インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列は既に公知であり、例えば、GenBank Accession No. ITY238021等に記載されている。インフルエンザＡ型ウイルスの種々の亜型の核タンパク質の59aa〜140aaのアミノ酸配列を図５に示す。また、好ましい形態では、本発明のモノクローナル抗体は、各亜型のインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質と抗原抗体反応することから、図５に示すアミノ酸配列中、共通する配列を有し、親水性構造を有する例えば90aa〜95aa、111aa〜115aa若しくは120aa〜123aa等の領域又はこれらの各領域を含み、かつ、共通する配列を有する領域をエピトープとするものである。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスの各亜型の核タンパク質と抗原抗体反応する。すなわち、インフルエンザＡ型ウイルスは、そのウイルス粒子表面に、ヘマグルチニン（Ｈ）とノイラミニダーゼ（Ｎ）を有するが、これらのＨ及びＮの構造の相違により種々の亜型に分類されている。本発明のモノクローナル抗体は、次の亜型の核タンパク質と抗原抗体反応するものである。H1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8、H5N1。
【００２０】  また、好ましい形態では、本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザと症状が少なくとも部分的に類似している他の感染症の病原体とも実質的に抗原抗体反応しない。例えば、アデノウイルス（１〜７型）、コクサッキーウイルス（Ａ１６，Ｂ１〜Ｂ６型）、単純ヘルペスウイルス１型、エコーウイルス（３型、４型、７型、２２型、３０型）、エンテロウイルス（７１型）、ムンプスウイルス、ポリオウイルス（１〜３型）、ＲＳウイルス（サブグループＡ、サブグループＢ）、パラインフルエンザウイルス（１〜３型）、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、霊菌、表皮ブドウ球菌、変形菌、黄色ブドウ球菌、コリネバクテリア、ジフテリア、カンジダ・アルビカンス、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカスｓｐ．（グループＢ，Ｃ，Ｇ，Ｆ）、肺炎連鎖球菌、ヘモフィルス属インフルエンザ、リステリア・モノサイトゲネス、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエと実質的に抗原抗体反応しない。【００２１】  また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）が得られることが知られているが、本発明のモノクローナル抗体の抗原結合性断片も本発明のモノクローナル抗体と同様に用いることができ、本発明の範囲内に入る。【００２２】  本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を免疫原い、常法であるハイブリドーマ法により作製することができる。免疫原として用いられるインフルエンザＡ型の核タンパク質としては、核タンパク質が多量に存在しその免疫原作用を発揮できれば、培養ウィルス液、インフルエンザＨＡワクチン、ＨＩ用ＨＡ抗原、リコンビナント抗原のいずれもが使用可能である。抗原に含まれる免疫原性の高いＨＡやＮＡの作用を抑えるために、超遠心による核タンパク質精製（例えばＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；１０２：１２４１−１２４９，１９８７参照）やプロテアーゼ処理（例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；１８０：１０７−１１６，１９９５参照）をした抗原を使用することもできる。【００２３】  上記モノクローナル抗体は、上記インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を含む抗原を免疫原として用いて動物を免疫し、そのインフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合することによって得られるハイブリドーマにより産生させることができる。【００２４】  上記ハイブリドーマは、以下の方法で得ることができる。即ち、上述のようにして得た前記抗原のインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をフロイントの完全アジュバンドとともに、数回に分けて、マウス等の動物に、２〜３週間おきに、腹腔内又は静脈投与することによって免疫する。次いで、脾臓等に由来する抗体産生細胞と、骨髄腫ラインからの細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖可能な腫瘍細胞とを融合させる。【００２５】  上記融合方法としては、ケーラーとミルシュタインの常法（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁、１９７５年）に従ってポリエチレングリコールによって行うことができ、又はセンダイウイルス等によって行うことができる。【００２６】  上記融合した細胞からインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては、例えば以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から、限界希釈法によって、ＨＡＴ培地及び／又はＨＴ培地中で、生存している細胞をハイブリドーマとして選択することができる。次いで、上記ハイブリドーマの培養培地を、高純度に精製したインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質を固定化したアッセイプレート上で反応させた後、抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）等と更に反応させるＥＩＡ法等によって、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。【００２７】  下記実施例において、本発明の好ましいモノクローナル抗体が複数得られ、そのうちの３種をそれぞれ、ハイブリドーマＦＶＡ２−３、ハイブリドーマＦＶＡ２−６及びハイブリドーマＦＶＡ２−１１と命名した。これらのハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１、中央第６）に、ハイブリドーマＦＶＡ２−３は、識別表示ＦＶＡ２−３、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００６６（受託日；２００３年７月１８日、２００４年７月１４日に国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３７から国際寄託に移管）として、ハイブリドーマＦＶＡ２−６は、識別表示ＦＶＡ２−６、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００６７（受託日；２００３年７月１８日、２００４年７月１４日に国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３８から国際寄託に移管）として、及び、ハイブリドーマＦＶＡ２−１１は、識別表示ＦＶＡ２−１１、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００６８（受託日；２００３年７月１８日、２００４年７月１４日に国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３９から国際寄託に移管）としてそれぞれブダペスト条約に基づき国際寄託されている。【００２８】  上記各ハイブリドーマは、通常、細胞培養に用いられる培地において培養し、培養上清からモノクローナル抗体を回収することができる。また、ハイブリドーマが由来する動物に投与することによって、腹水を貯留させ、この腹水から回収することもできる。【００２９】  上記モノクローナル抗体の回収方法としては、通常行われている精製方法を用いることができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。【００３０】  上記方法に従い製造されたモノクローナル抗体はインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質との反応し、インフルエンザＡ型ウイルスの各種亜型と反応することが確認された。現在保存されて入手可能なヒト、ウマ、カモ、七面鳥、アザラシ、ニワトリ、カモメ、マガモ等のインフルエンザＡ型ウイルス保存株３８種（以下の表３を参照）とは反応し、本発明のモノクローナル抗体で検出可能であった。一方、交差反応性が考えられる微生物として、例えばアデノウイルス（１〜７型）、コクサッキーウイルス（Ａ１６，Ｂ１〜Ｂ６型）、単純ヘルペスウイルス１型、エコーウイルス（３型、４型、７型、２２型、３０型）、エンテロウイルス（７１型）、ムンプスウイルス、ポリオウイルス（１〜３型）、ＲＳウイルス（サブグループＡ、サブグループＢ）、パラインフルエンザウイルス（１〜３型）、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、霊菌、表皮ブドウ球菌、変形菌、黄色ブドウ球菌、コリネバクテリア、ジフテリア、カンジダ・アルビカンス、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカスｓｐ．（グループＢ，Ｃ，Ｇ，Ｆ）、肺炎連鎖球菌、ヘモフィルス属インフルエンザ、リステリア・モノサイトゲネス、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエ等との反応性を確認したが、反応は認められなかった。【００３１】  本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスの検出又は定量のための免疫測定に用いることができる。免疫測定方法自体は、周知であり、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、測定形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法などがあり、用いる標識で分類すれば蛍光法、酵素法、放射法、ビオチン法等があるが、これらのいずれをも用いることができる。さらに、免疫組織染色によって診断することもできる。免疫測定方法に標識抗体を用いる場合、抗体の標識方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができる。また、周知のとおり、抗体をパパイン分解やペプシンで分解することにより、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、対応抗原との結合性を有する抗体断片（本明細書において「抗原結合性断片」という）が得られることが知られているが、本発明の抗体の抗原結合性断片も本発明の抗体と同様に用いることができる。【００３２】  なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、本発明の抗体又はその抗原結合性断片を第１抗体として固相に不動化し、検体と反応させ、洗浄後、本発明の酵素と抗原抗体反応する第２抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した第２抗体を測定する。第２抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより固相に結合した第２抗体を測定することができる。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。なお、第１抗体と第２抗体を上記の説明と入れ替えてもよい。また、凝集法では、ラテックス等の粒子に本発明の抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標準試料中の本発明の酵素の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の本発明の酵素を定量することができる。【００３３】  本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体を利用し、インフルエンザＡ型ウイルスを、簡便に、かつ、インフルエンザＢ型ウイルスと識別して検出することができる、免疫測定器具をも提供する。【００３４】  本発明の免疫測定器具は、移動可能な標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を有する標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン、展開液供給ゾーン、展開液吸収ゾーン及び抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体をマトリクスに不動化させたインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンをマトリクスに設けた器具であって、前記標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び検出ゾーンに不動化した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の少なくとも一方の抗体が上記本発明のモノクローナル抗体である免疫測定器具である。検体点着ゾーンに点着された検体は、標識試薬ゾーンに含有される標識抗体と抗原抗体反応し、標識された抗原抗体複合物が形成される。該抗原抗体複合物は、展開液供給ゾーンから供給された展開液により流され、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンに至る。ここで、マトリクスに不動化された抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体と、前記標識抗原抗体複合物が抗原抗体反応し、前記標識抗原抗体複合物がマトリクスに不動化される。インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンに標識抗原抗体複合物が不動化されたか否かは、標識の有無により判定される。なお、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンを通過した展開液は、展開液吸収ゾーンに吸収される。なお、検体点着ゾーンと標識試薬ゾーンは同一であってもよい（この場合、検体は、標識試薬ゾーンに点着される）。本発明の免疫測定器具では、標識抗体又はインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンに不動化された抗体の少なくともいずれか一方が、本発明のモノクローナル抗体である。また、一方の抗体はポリクローナル抗体であってもよい。なお、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質は、通常、複数の分子が会合ないしは付着しているため、標識抗体又はインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーンに不動化された抗体の両者が同一のモノクローナル抗体であってもインフルエンザＡ型ウイルスを検出することができる。【００３５】  以下、本発明の免疫測定器具の各構成要件について分説する。【００３６】マトリクス
本発明の免疫測定器具における帯状のマトリクスは、毛細管作用によって液体を輸液可能な吸収性の材料で構成される。この吸収性材料としては、例えばセルロース、ニトロセルロース等のセルロース又はその誘導体、ガラス繊維等を単独又は混合して製造したろ紙、膜、多孔性材料である。このマトリックスの大きさに制限はないが、幅３ｍｍ〜１０ｍｍ程度、長さ３０ｍｍ〜１００ｍｍ程度のストリップ状のものが取り扱いが容易で好ましい。マトリックスの厚さは１００μｍ〜１ｍｍのものを用いることができる。またマトリックスは、その一部又は全体を測定時に検体由来のタンパク質のマトリックスへの非特異反応による吸着を防止するために、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物血清、カゼイン、シュークロース等でブロッキングして用いることができる。【００３７】検出ゾーン
検出ゾーンには、前記マトリクス上に抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を不動化したインフルエンザＡ型ウイルス検出部を設けることができる。この検出部に不動化する抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、後述する標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体とともに、少なくと一方が本発明の抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体であり、両方の抗体が抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体であることが好ましい。検出部の前記インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、マトリクス上にあり、マトリクスを展開する液体の輸液方向（マトリクスの長手方向）に直交する方向にライン状に設けることが感度よく測定するためには好ましい。抗インフルエンザＡ型ウイルスポリクローナル抗体としては、市販され容易に入手可能なポリクローナル抗体から適宜選択して用いることができる。【００３８】  この検出ゾーンの抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、前記した抗体であり、モノクローナル抗体を単独又は混合して用いることもできる。抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、更にこれらの抗体の抗原結合性フラグメントであるＦａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２等であってもよい。【００３９】  検出部に不動化される抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、直接マトリクスの検出ゾーンに物理吸着させてもよいが、共有結合などの化学結合によって固定することによって設けることもできる。また、抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を水不溶性の担体に結合させ、これをマトリクス内に含有させてもよい。この不溶性の担体としては、ゼラチン、アラビアゴム及びヘキサメタリン酸ナトリウムからなる混合物を不溶化して得られる粒子（特公昭６３−２９２２３）、ポリスチレンラテックス粒子、ガラス繊維等を挙げることができる。不溶性の担体と抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体と結合させるには、前記化学結合又は物理吸着により結合させることができる。【００４０】  検出ゾーンには、抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体によるインフルエンザＡ型ウイルス検出部のほか、抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体によるインフルエンザＢ型ウイルス検出部を設けることができる。このインフルエンザＢ型ウイルス検出部は、前記インフルエンザＡ型ウイルス検出部の近傍であれば、展開液の輸液方向で前記インフルエンザＡ型ウイルス検出部上流側又は下流側のいづれであってもよい。インフルエンザＢ型ウイルス検出ゾーン不動化させる抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよく、前記抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体と同様に化学結合又は物理吸着によって、マトリクスに不動化することができる。【００４１】  前記した如くマトリクス上の検出ゾーンには、少なくとも抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体によるインフルエンザＡ型ウイルスの検出部を設け、更にインフルエンザＢ型ウイルスの検出部を設けることが、インフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルスを同時に測定する上で好ましい。これらの検出部は、マトリクスの輸液方向において、酵素標識試薬ゾーン、検体点着ゾーン及び展開液供給ゾーンの下流側であって、添加液吸収ゾーンの上流側である。検出部���、マトリクスに巾０．５ｍｍから５ｍｍ程度のライン状に近接して複数のラインを設けることができる。巾５ｍｍ程度のマトリクスであれば、前記抗体及び抗原を通常それぞれ０．１μｇから１０μｇ程度点着し、乾燥させることにより検出部を作成することができる。【００４２】標識試薬ゾーン
標識試薬ゾーンは、マトリックス上に設けられたゾーンに標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を移動可能に点着して設けることができる。このゾーンは展開液供給ゾーンからの展開液の輸液方向で前記検出ゾーンの上流側に設けることができる。このゾーンは、マトリックスに酵素標識試薬を点着する方法、酵素標識試薬を含む吸水性のパッドをマトリックス上に積層する方法、又はパッドと密着するマトリクス部分の一部又は全部にパッドとともに酵素標識試薬を含有させることにより構成される。吸水性のパッドとしては、後述する検体点着ゾーンのパッドを用いることができる。【００４３】  標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の抗体としては、前記検出ゾーンに設けられる抗体ととともに、少なくと一方が抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体であり、両方の抗体が抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体であることが好ましい。標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体の抗体としては、前記検出ゾーンの抗体と同様にそのフラグメントを用いることもできる。【００４４】  前記標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体は、前記抗体と標識物とを結合させて製造することができる。標識物としては、酵素、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子、発光物質、蛍光物質などを挙げることができる。酵素としては酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いられる各種酵素であり、その酵素としては例えばアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。また、金属コロイド粒子としては、例えば金コロイド粒子、セレンコロイド粒子などを用いることができる。【００４５】  また、標識物と抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体との結合方法は、公知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して製造することができる。結合の方法には、例えばグタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。架橋剤を用いる結合方法では、架橋剤としては例えばＮ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等を用いることができる。共有結合による方法では、抗体に存在する官能基を用いることができる他、例えばチオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を常法により導入したのち、前記結合法により標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を製造することができる。また非共有結合による方法としては物理吸着法等を挙げることができる。【００４６】  前記の通りインフルエンザＡ型ウイルスを検出する他、同時にインフルエンザＢ型ウイルスを検出する場合には、標識試薬ゾーンに標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を添加して器具を作製する。標識試薬ゾーンに含有される標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体は、マトリクス又は吸水性パッドのどちらか一方に含有させる方法、若しくはマトリクスと吸水性のパッドの両方に標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗��及び標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を含有させることができる。インフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルスの同時測定を行う場合には、標識試薬を多く用いるため、マトリクスとパッドの両方に酵素標識試薬を単独又は混合して含有させることが高感度測定を行う上で有利である。標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体量は、通常検査対象物の予測される量に応じて適宜変更することができるが、通常乾燥重量で０．０１μｇ〜５μｇ程度である。標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体及び標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体は、酵素標識ゾーンに含有させる場合に試薬の安定化剤、溶解調節剤等とともに塗布することができる。【００４７】検体点着ゾーン
検体点着ゾーンは、展開液供給ゾーンの展開液の輸液方向の下流側で検出ゾーンの上流側のマトリクスに特に試薬等を含まずに設けることができる。さらに検体点着ゾーンは、１）展開液ゾーンの展開液輸液方向の下流側で酵素標識試薬ゾーンの上流側の所定箇所、２）標識試薬ゾーンの下流側で検出ゾーンの上流側の所定箇所、３）標識試薬ゾーン上の所定箇所等に設けることができる。また、前記酵素標識試薬ゾーンに検体点着ゾーンを設けた装置では、前記した如く酵素標識を含有する吸水性パッドを付設することが効率よく分析を行う上で好ましい。このパッドを付加する装置では、多量の検体液を点着することができるため、検体中の微量成分を検出感度よく測定を行うことができる。この吸水性のパッドとしては、標識試薬や検体中のインフルエンザウイルスを吸着することの少ない材料から選択され、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、不織布、セルロース等の多孔質の合成又は天然の高分子化合物からなる材料を単独又は組み合わせて構成することができる。このパッドの大きさ、厚さ、密度等は限定されないが、通常縦と横が３ｍｍ〜１０ｍｍ程度で厚さが０．５ｍｍ〜４ｍｍ程度のパッドを用いることが効率よく測定を行うためには好ましい。【００４８】展開液供給ゾーン
展開液供給ゾーンは、マトリクスの長手方向の一端に設けられ展開液が供給されるゾーンである。測定を開始するには、このゾーンを少なくとも展開液吸収ゾーンに達する量の展開液の入った容器に浸し行うとができる。さらに展開液の供給には展開液ゾーンに展開液の入った液槽を付加し、この液槽のカバーを破り展開液とマトリクスを接触させることにより測定を開始することもできる。展開液には、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、抗菌剤等を適宜含有することができる。また、標識物として酵素も用いる場合には、後述する基質試薬ゾーンとともに展開液に基質を添加することもできる。緩衝剤を含む緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液等を挙げることができる。また展開液供給ゾーンには展開液のマトリクスへの供給を安定して連続的に実施するため展開液パッドを付設するができる。展開液パッドとしては、例えばセルロース又はセルロース誘導体等のろ紙用いることができる。【００４９】  展開液吸収ゾーン
展開液吸収ゾーンは、マトリクスの一端に設けられた前記展開液ゾーンに対して他端に設置される。このゾーンはマトリクスに供給される展開液を吸収し分析を円滑に行うために設けられる。展開液吸収ゾーンはマトリクスを長く形成してこのゾーンを確保するともできる。また、マトリクスに吸水性材料を付設し展開を促進することもできる。この吸水性材料には、天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができる。展開液吸収ゾーンは、展開液を全て吸収する容積をもったパッド状の吸収性材料あるが、吸収性材料をマトリクスの上又は下に積層することにより、小型化した免疫測定器具を製造することができる。【００５０】基質試薬ゾーン
更に、標識試薬ゾーンの標識物として酵素を用いる場合には、前記した通り展開液に基質を含有させるか、基質試薬ゾーンをマトリクスの前記展開液供給ゾーン近傍に設けることができる。基質試薬ゾーンは、展開液供給ゾーンに付設した前記展開液パッドに含有させ設けることが基質量を多くして高感度測定を行う上で好ましい。【００５１】  基質としては標識試薬の酵素に対応して以下に示す各種発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。【００５２】  （ａ）発色基質パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組合せた２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）アルカリホスファターゼ用：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）
（ｂ）蛍光基質アルカリホスファターゼ用：４−メチルウムベリフェニル−ホスフェート（４ＭＵＰ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：４−メチルウムベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）
（ｃ）発光基質アルカリホスファターゼ用：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組み合わせたルミノール、イソルミノール【００５３】  前記基質を基質ゾーンとして設ける場合には、通常前記基質を水溶液に溶解して展開液パッドにライン状に塗布した後、乾燥させることにより形成することができ、所望により基質のシグナル増強剤、安定化剤、溶解調節剤等を添加することもできる。基質ゾーンは、マトリクスの端部に付設した展開液パッド内であれば、特に限定されない。展開液及び展開液パッドに添加する基質量は、測定条件により決定することができるが、１個の器具当たり通常５〜５００μｇ程度を用いることができる。【００５４】各ゾーンの配置
本発明の免疫測定器具の好ましい１例を図６ないし図８に模式的に示す。図６中、参照番号２がマトリクス、４が標識試薬ゾーン、８が検体点着ゾーン、３が展開液供給ゾーン、５が展開液吸収ゾーン、６ａがインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン、７が基質試薬ゾーン、９が検体である。この例では、検体点着ゾーン８と標識試薬ゾーン４が同一である。なお、参照番号６ｂはインフルエンザＢ型ウイルス検出ゾーン、１０は展開液確認ゾーン、１１は展開液槽である（下記実施例６参照）。【００５５】測定器具の使用方法
本発明の測定器具により各種検体試料中のインフルエンザＡ型ウイルスの測定を行うことができる。測定は、まず検体を本発明の測定器具の検体点着ゾーンに供給した後、展開液を展開液パッドに供給し、マトリクスに展開して行う。なお、検体の希釈液として、試料希釈液として、界面活性剤を含む緩衝液を用いることができる。展開液は毛細管作用によりマトリクスを移動し、展開液吸収ゾーンに達し、検出ゾーンに結合されなかった検体中の成分、酵素標識試薬等が吸収され展開が完了する。所定時間（通常１０分から２０分）経過後、検出ゾーンを観察し、検体液中のインフルエンザＡ型ウイルスにより検出部に固定化された標識物を測定することにより、インフルエンザＡ型ウイルスの測定を行うことできる。この検出は標識物又は標識物と用いる酵素とによりそれぞれ対応する目視又は比色計、蛍光光度計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定装置を用いて実施することができる。測定では、例えば検出ゾーンの発色を目視で測定する方法が簡便である。また、この方法ではインフルエンザＡ型ウイルスの濃度に対応した色票（カラーチャート）を用いることにより半定量的な分析が可能となる。更に、比色計等により検出ゾーンの発色を数値化して、定量を行うこともできる。【００５６】  図６ないし図８に示す、本発明の免疫測定器具の好ましい１例を例としてさらに測定原理を説明する。検体９を検体点着ゾーン８に点着すると共に、展開液槽１１中の展開液を展開液供給ゾーン３に供給する。展開液は、毛管現象によりマトリクス２中を横向きの白抜き矢印の方向へ移動していく。基質試薬ゾーン７に含有された基質が展開液に溶解され、展開液と共に移動していく。一方、検体９は、標識試薬ゾーン４中の標識抗体と反応し、標識抗原抗体複合物が形成される。ここに展開液が到着すると、標識抗原抗体複合物は展開液中の基質と反応しながらマトリクス２中を移動し、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン６ａに到達すると、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン６ａに不動化されている抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体と反応して、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン６ａに不動化される。検体中にインフルエンザＡ型ウイルスが含まれている場合には、標識酵素と基質との反応により、発色が起きる。一方、検体中にインフルエンザＡ型ウイルスが含まれていない場合には、標識抗体は抗原抗体反応することができず、標識がインフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン６ａに不動化されないため発色が起きない。従って、インフルエンザＡ型ウイルス検出ゾーン６ａが発色するか否かで検体中にインフルエンザＡ型ウイルスが含まれるか否かを知ることができる。展開液確認ゾーン１０には、展開液中の試薬と反応して発色する酵素が不動化されており、展開液確認ゾーン１０が発色すれば、そこまで展開液が到達していることがわかる。あるいは、展開液確認ゾーン１０には、標識酵素に対する抗体が不動化されており、展開液確認ゾーン１０に到達した標識試薬が該抗体にトラップされ、さらに展開液が到達すると、トラップされた標識と展開液中の基質が反応して発色するようにしてもよい（下記実施例では抗アルカリフォスファターゼ抗体を不動化）。また、標識試薬ゾーン���中に、標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を含めておき、一方、抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を不動化した抗インフルエンザＢ型ウイルス検出ゾーン６ｂを設けておけば、インフルエンザＢ型ウイルスの検出も同時に行うことができ、インフルエンザウイルスがＡ型かＢ型かを単一の測定操作で調べることができる。【００５７】  また、前記マトリクスはプラスチック、金属、紙等の支持部材上に積層し固定して用いることもできる。前記マトリクスは、プラスチック等のケースに固定し、展開液を含む液槽を展開液供給ゾーンに付設し前記各ゾーン部分に穴の開いたケースでカバーをすることにより取扱の容易な器具を構成することができる。本発明の免疫測定器具に用いられる検体としては、ヒト、動物等から採取したインフルエンザが含まれると考えられる検体であり、各種体液例えば鼻腔ぬぐい液（鼻腔スワブ）、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液（咽頭スワブ）等の体液抽出液を挙げることができる。【００５８】  以下参考例、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、発明を本実施例に限定するものではない。
【実施例】
【００５９】  実施例１  抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体の作製
免疫原にはインフルエンザ核タンパク質抗原を含有するインフルエンザＨＡワクチン（化血研製：Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（ＩＶＲ−１１６）株、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）ＮＩＢ−４１）株）を使用した。免疫原に等量のフロインド完全アジュバント（ヤトロン社製）を加え完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間間隔で計４回免疫した。細胞融合の３日前にマウス腹腔内に免疫原を注射し、ＰＥＧを用いてマウス脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約２週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供した。１次スクリーニングには、インフルエンザ核タンパク質抗原を含有するインフルエンザＨＡワクチン、インフルエンザＡ型リコンビナント核タンパク質抗原（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ１Ｎ１）、Ａ／北九州／１５９／９３由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ３Ｎ２）；ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース）を固相化したＥｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ法）を使用した。すなわち、インフルエンザＨＡワクチンは０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．６でｘ３００倍に、同じくＡ型リコンビナント核タンパク質抗原は１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、マイクロプレートモジュール（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに１００μｌずつ加え、４℃一晩インキュベートし固相化した。次に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で各ウエルを洗浄後、ＰＢＳで希釈した１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３００μｌを加え４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除いた後、培養上清を１００μｌ加え３７℃１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、０．２％ＢＳＡ、０．２％エマルゲン９８５、１％ショ糖、１％ＫＣｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（反応用液）で２０００倍希釈した酵素標識抗マウスＩｇｓ抗体（ＤＡＫＯ社製）を各ウエルに１００μｌずつ加え３７℃１時間反応させた。反応後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、２，２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を各ウエルに１００μｌずつ加え、室温で３０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１００μｌずつ加え主波長４１５ｎｍ副波長４９０ｎｍで発色レベルを測定した。【００６０】  陽性と判定された培養上清については、インフルエンザＢ型リコンビナント核タンパク質（Ｂ／山梨／１６６／９８（ｒ−ＮＰ／Ｂ）ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース）を抗原としたＥＬＩＳＡで２次スクリーニングを行い、最終的にインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質抗原に反応し、インフルエンザＢ型核タンパク質抗原とは反応しない抗体を産生するハイブリドーマ３株（ハイブリドーマＦＶＡ２−３、ハイブリドーマＦＶＡ２−６及びハイブリドーマＦＶＡ２−１１）を得た。これらのハイブリドーマは、前述の通り特許微生物寄託センターに寄託されている。該ハイブリドーマ３株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスは全てＩｇＧ１であった。表１にハイブリドーマの反応性の結果を示す。【００６１】
【表１】
0004595810.tif 000002
【００６２】  実施例２  モノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法における反応性
リコンビナント抗原、インフルエンザＨＡワクチン（核タンパク質抗原含有）、ウイルス液用いてウエスタンブロッティング法により反応性を確認した。各試料を、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、５％２ＭＥ（２−メルカプトエタノール）、１０％グリセロール、０．００５％ＢＰＢ（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ）を含む０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、１００℃に加熱処理した後、電気泳動に供した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、ｅ−パジェル１０％ゲル濃度（アトー社製）を使用し常法に従った。泳動後ＰＶＤＦ膜（アトー社製）に転写し、ブロックエース（大日本製薬製）にて４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除きＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度に調整したモノクローナル抗体を加え室温４５分反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、反応用液で４０００倍に希釈した酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を室温４５分させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてＸ線フィルム（コダック社製）に１〜１５分間露光しシグナルを検出した。【００６３】  モノクローナル抗体ＦＶＡ２−３、ＦＶＡ２−６、ＦＶＡ２−１１では全ての抗原に対して、５５〜７０ｋＤ付近を中心にバンドが認められた。この結果を図１に示す。【００６４】  実施例３  モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡでの抗原測定
３種の精製モノクローナル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５で２μｇ／ｍｌの濃度でマイクロプレートモジュール（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに１００μｌずつ加え、４℃一晩インキュベートし固相化した。次に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で各ウエルを洗浄後、ＰＢＳで希釈した１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３００μｌを加え４℃一晩ブロッキングを行った。反応用液で希釈したインフルエンザＡ型ウイルス液を各ウエルに１００μｌ加え３７℃１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、反応用液で調整した３種のアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を各ウエルに１００μｌずつ加え３７℃１時間反応させた。反応後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、４−ニトロフェニルフォスフェイト（４−ＮＰＰ）を各ウエルに１００μｌずつ加え、室温で３０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１００μｌずつ加え、主波長４１５ｎｍ副波長４９０ｎｍで発色レベルを測定した。陽性はｂｕｆｆｅｒ  ｂｌａｎｋの発色レベルの２．１倍以上とし、陽性となる最終希釈倍率で反応性の強さを表した。
取得した３種のモノクローナル抗体での組み合わせ全９通りにおいて、市販抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体よりも２〜８倍高い反応性を示した。この結果を表２に示す。【００６５】
【表２】
0004595810.tif 000003
【００６６】  実施例４  抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体の反応部位の測定  ４−１  プラスミドの作製
モノクローナル抗体ＦＶＡ２−１１の認識部位を決定するために、４９８アミノ酸からなるインフルエンザＨ１Ｎ１株（ニューカレドニア／２０／９９）を、ＰＣＲ法にて、１〜１５９アミノ酸（Ａ断片）、１６２〜３２７アミノ酸（Ｂ断片）および３２７〜４９８アミノ酸（Ｃ断片）の３断片を増幅した。プライマーにはあらかじめ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位を付加していた。増幅断片をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、図２のに示す発現用プラスミドｐＷ６ＡのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にＧＳＴを組み込みんだ発現用プラスミドｐＷＧ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−ＢおよびｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ｃを作製した。これらを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ｂおよび
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ｃを得た。【００６７】  ４−２  組換え蛋白質（ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−ＢおよびＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ｃ）の発現
４−１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした後０．４ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行い、更に３時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とする。【００６８】  菌体試料８μｌに３倍濃度のＳＤＳポリアクリルアミド緩衝液（０．１５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、２４％グリセロール、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ブロモフェノールブルー）４μｌを加え十分攪拌した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターにウエスタンブロットを行って転写を行い、１％ＢＳＡによりブロッキング後、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で１０００倍に希釈したモノクローナル抗体ＦＶＡ２−１１を反応させた。更に、ペルオキシダーゼ酵素標識された抗マウスイムノグロブリンウサギポリクローナル抗体（ダコ社製）を反応させ、洗浄後１０ｍｌの基質発色液（０．０１％過酸化水素水、０．６ｍｇ／ｍｌ４−クロロ−１−ナフトール）を添加し発色させた。その結果、モノクローナル抗体ＦＶＡ２−１１はＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａのみと反応することが判明した。【００６９】  ４−３  プラスミドの作製
次にインフルエンザＨ１Ｎ１のＡ断片をさらに細分化した断片Ａ１（１〜９０アミノ酸）、Ａ２（８５〜１５９アミノ酸）、Ａ３（４４〜１３０アミノ酸）、Ａ４（５９〜１０３アミノ酸）、Ａ５（４４〜１０３アミノ酸）、Ａ６（５９〜１３０アミノ酸）およびＡ７（１〜１３０アミノ酸）（図３））をＰＣＲ法で増幅した。増幅断片をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、前記発現用プラスミドｐＷＧ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ１，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ２，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ３，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ４，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ５，ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ６を作製した。Ａ７断片は図２に示すｐＷ６ＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入しプラスミドｐＷＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ７を作製した。これらを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手）を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ１．Ｂｌ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ２，
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ３，
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ４，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ５，
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＧＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ６およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＷＩｎｆ．Ｈ１Ｎ１−Ａ７を得た。【００７０】  ４−４組変え蛋白質（ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ１，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ２，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ３，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ４，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ５，ＧＳＴ＋Ｈ１Ｎ１−Ａ６およびＨ１Ｎ１−Ａ７）の発現
４−３で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中３７℃で培養した。予備培養にて６００ｎｍでＯＤを０．６〜０．８にした後０．４ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行い、更に３時間培養した。１．５ｍｌ量の菌体培養液を５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して菌体を集め、１００μｌの緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、１５分間の超音波破砕により完全に菌体を破砕した。これを菌体試料とする。【００７１】  菌体試料８μｌに３倍濃度のＳＤＳポリアクリルアミド緩衝液（０．１５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、２４％グリセロール、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ブロモフェノールブルー、分子量マーカー（１１７．６，１１３．９，８１．２，６０．７，４７．４，３６．１，２５．３，１９．０，１４．７，６．１ＫＤ））４μｌを加え十分攪拌した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターにウエスタンブロットを行って転写を行い、１％ＢＳＡによりブロッキング後、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で１０００倍に希釈したモノクローナル抗体ＦＶＡ２−１１を反応させた。更に、ペルオキシダーゼ酵素標識された抗マウスイムノグロブリンウサギポリクローナル抗体（ダコ社製）を反応させ、洗浄後１０ｍｌの基質発色液（０．０１％過酸化水素水、０．６ｍｇ／ｍｌ４−クロロ−１−ナフトール）を添加し発色させた。各断片を図３に示す。泳動後のＣＢＢ染色パターンとウエスタンブロットの結果を図４に示す。以上の結果から抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体（ＦＶＡ２−１１）の認識部位は、インフルエンザＨ１Ｎ１のアミノ酸５９〜１３０領域であることがわかる。また、更に図５に示すインフルエンザＡ型亜型の核タンパク質アミノ酸配列から、アミノ酸番号５９〜１３０番目の反応部位で共通する配列を有し、親水性構造を有する例えば９０〜９５番目、１１１〜１１５番目又は１２０〜１２３番目等のアミノ酸配列がエピトープであることが予想される。【００７２】  参考例１  アルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体の作製
抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体（ＦＶＡ２−１１）をペプシン処理してＦｃ領域を切断しＦ（ａｂ’）２を得、次に２ＭＥ（２−メルカプトエタノール、ナカライテスク社製）を用いて、ジスルフィド結合を切断し、フリーのチオール基を露出させたＦ（ａｂ’）を得た。次に、マレイミド基を導入した、アルカリホスファターゼとＦ（ａｂ’）をカップリングし、ゲル濾過で精製アルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を得た。【００７３】  参考例２  抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体の作製）
免疫原にはインフルエンザ核タンパク質抗原を含有するインフルエンザＨＡワクチン（Ｂ／山梨／１６６／９８株）あるいはインフルエンザＡ型リコンビナント核タンパク質抗原（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ１Ｎ１）、Ａ／北九州／１５９／９３由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ３Ｎ２）を使用した。【００７４】  免疫原に等量のフロインド完全アジュバント（ヤトロン社製）を加え完全に混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間間隔で計４回免疫した。細胞融合の３日前にマウス腹腔内に免疫原を注射し、ＰＥＧを用いてマウス脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約２週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供した。１次スクリーニングには、インフルエンザＨＡワクチン、インフルエンザＢ型リコンビナント核タンパク質（ｒ−ＮＰ／Ｂ）を固相化したＥｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ法）を使用した。すなわち、インフルエンザＨＡワクチンは０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．６でｘ３００倍に、同じくＢ型リコンビナント核タンパク質抗原は１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、マイクロプレートモジュール（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに１００μｌずつ加え、４℃一晩インキュベートし固相化した。次に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で各ウエルを洗浄後、ＰＢＳで希釈した１％のＢＳＡ  ３００μｌを加え４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除いた後、培養上清を１００μｌ加え３７℃１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、０．２％ＢＳＡ、０．２％エマルゲン９８５、１％ショ糖、１％ＫＣｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５（反応用液）で２０００倍希釈した酵素標識抗マウスＩｇｓ抗体（ＤＡＫＯ社製）を各ウエルに１００μｌずつ加え３７℃１時間反応させた。反応後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、２，２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を各ウエルに１００μｌずつ加え、室温で３０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１００μｌずつ加え主波長４１５ｎｍ副波長４９０ｎｍで発色レベルを測定した。【００７５】  陽性と判定された培養上清については、インフルエンザＡ型リコンビナント核タンパク質抗原（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ１Ｎ１）、Ａ／北九州／１５９／９３由来（ｒ−ＮＰ／Ｈ３Ｎ２））を抗原としたＥＬＩＳＡで２次スクリーニングを行い、最終的にインフルエンザＢ型核タンパク質抗原に反応し、インフルエンザＡ型核タンパク質抗原とは反応しない抗体を産生するハイブリドーマ３株（ＦｒＢ１−０３，ＦｒＢ１−０７，ＦＶＢ２−１６）を得た。上記各ハイブリドーマは産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき、ハイブリドーマＦｒＢ１−０３、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７０、ハイブリドーマＦｒＢ１−０７、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７１、ハイブリドーマＦＶＢ２−１６、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００６９として寄託されている。該ハイブリドーマ３株から得られたモノクローナル抗体のサブクラスは全てＩｇＧ１であった。【００７６】��モノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法における反応性）
リコンビナント抗原、インフルエンザＨＡワクチン（核タンパク質抗原含有）を用いてウェスタンブロッティング法により反応性を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｅ−パジェル１０％ゲル濃度（アトー社製）を使用し常法に従った。泳動後ＰＶＤＦ膜（アトー社製）に転写し、ブロックエース（大日本製薬社製）にて４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除きＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度に調整したモノクローナル抗体を加え室温４５分反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、反応用液で４０００倍に希釈した酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を室温４５分させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてＸ線フィルム（コダック社製）に１分間露光しシグナルを検出した。【００７７】  モノクローナル抗体ＦｒＢ１−０３、ＦｒＢ１−０７では、６０〜７５ｋＤ付近に強いバンドが認められた。【００７８】  参考例３  アルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体の作製
前記参考例２で製造した抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体（ＦｒＢ１−０３）を用い、前記実施例参考例１と同じ処理を繰り返すことにより、アルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体を得た。【００７９】  実施例５  インフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルス同時免疫測定器具
図６に示すように、巾５ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）のマトリクス２の展開液吸収ゾーン５側の末端から１６ｍｍと１３．５ｍｍの位置に実施例２で製造した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体（ＦＶＡ２−１１）と参考例２で製造した抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体（ＦｒＢ１−３）を含む水溶液０．７μｌをニトロセルロース膜にそれぞれ点着し乾燥させ、検出ゾーン６ａ及び６ｂを作成した。更にマトリクス２の展開液吸収ゾーン５側の末端から１１ｍｍの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体（ダコ社製）を点着し乾燥させ、展開液確認部１０を作成した。次いで、マトリクスに参考例１で製造したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体（５μｇ／ｍｌ）と参考例３で製造したアルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体（５μｇ／ｍｌ）との混合水溶液５μｌを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド４からなる標識試薬ゾーンを作成した。【００８０】  展開液パッド３は、巾５ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社製）上に、基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）１００μｇを巾６．１ｍｍのライン状に点着して乾燥させて作成した。前記マトリクス２、展開液パッド３、酵素標識試薬パッド４及び展開液吸収パッド５（巾１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ１ｍｍのろ紙（ミリポア社製））を、展開液槽１１を有するプラスチックケースに固定して、図７及び８に示すインフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルス同時免疫測定器具１を製造した。【００８１】  参考例４  インフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルス同時免疫測定器具（従来法器具）
実施例３で製造した作成したインフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルス同時免疫測定器具１の検出ゾーン６ａ及び６ｂ、アルカリホスファターゼ標識抗インフルエンザウイルス抗体について、それぞれ購入した抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体及び抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体を用いて作成し、インフルエンザＡ型ウイルス及びＢ型ウイルス同時免疫測定器具（エスプラインインフルエンザＡ＆Ｂ（富士レビオ社製）；従来測定器具）を作成した。【００８２】  実施例６  インフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルスの測定
前記実施例５で製造したインフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルス同時測定器具１（本発明測定器具）の検体点着ゾーン８に表３に記載されたインフルエンザＡ型ウイルスの亜型試料（試料希釈液として、界面活性剤を含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を使用）各３０μｌを点着した後、変形部材に設けた押し込み部１２を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部１３によって展開液パッド３を展開液槽１１に挿入して展開液を展開液パッド３に供給して測定を開始した。測定開始１５分後、対象試薬ゾーン１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン６ａ及び６ｂの発色を目視で測定した。その結果を表３に示す。【００８３】  また、対照として、参考例４で作成した従来測定器具によって表３に記載の前記試料３０μｌについて同様にウイルスの検出を行った。その測定結果を表３に示す。【００８４】
【表３】
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【００８５】  結果から従来測定器具では検出できなかったインフルエンザＡ型ウイルスの亜型検体について、本発明測定器具では全て検出可能であった。【００８６】  実施例７
前記実施例５で製造したインフルエンザＡ型ウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルス同時測定器具１（本発明測定器具）を用い、実施例６と同様にして、アデノウイルス（１〜７型）、コクサッキーウイルス（Ａ１６，Ｂ１〜Ｂ６型）、単純ヘルペスウイルス１型、エコーウイルス（３型、４型、７型、２２型、３０型）、エンテロウイルス（７１型）、ムンプスウイルス、ポリオウイルス（１〜３型）、ＲＳウイルス（サブグループＡ、サブグループＢ）、パラインフルエンザウイルス（１〜３型）、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、霊菌、表皮ブドウ球菌、変形菌、黄色ブドウ球菌、コリネバクテリア、ジフテリア、カンジダ・アルビカンス、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカスｓｐ．（グループＢ，Ｃ，Ｇ，Ｆ）、肺炎連鎖球菌、ヘモフィルス属インフルエンザ、リステリア・モノサイトゲネス、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエとの交差反応性を調べた。その結果、これらのいずれのウイルス又は菌とも反応しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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