(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ様関節炎の存在を示す試薬としての組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）の使用であって、該蛋白が配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）の使用。
【請求項２】
体液をテストするテスト試薬が配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）である、リウマチ様関節炎用の予後又は診断キット。
【請求項３】
ＥＬＩＳＡアッセイである請求項２記載の診断キット。
【請求項４】
ウエスタンブロットである請求項２記載の診断キット。
【請求項５】
リウマチ様関節炎の治療に使用される、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）。
【請求項６】
リウマチ様関節炎の治療に使用される、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）をコードするｃＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む請求項６記載のｃＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のｃＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項９】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）又は該蛋白をコードするｃＤＮＡ配列を使用して該蛋白に対する抗体の存在を決定する、リウマチ様関節炎のテスト方法。
【請求項１０】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する組換え免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）を有効成分として含む、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に使用する医薬組成物。
【請求項１１】
投与が、静脈内、経鼻、経口又は皮下の経路による請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
リウマチ様関節炎の存在を示めすための又はリウマチ様関節炎を治療するための薬剤として使用するために、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する蛋白ＢｉＰ（ＧＲＰ７８）を発現することができるヒトを除く組換え生物。
【請求項１３】
生物が原核生物である請求項１２記載の生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炎症疾患に関し、そしてさらに特にリウマチ様関節炎に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとしている課題】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、関節の破壊、不能そして若死に導く滑膜性関節の慢性の炎症疾患である。ＲＡの原因は現在知られていないが、関節軟骨に特有的に見いだされるタイプＩＩコラーゲンがＲＡに対する可能な自己抗原であることが示唆されている。ｇｐ３９即ち３９ＫＤ糖蛋白とそれから由来するペプチドとがこれら自己抗原であることが、最近提案されている。しかし、この仮説を支持するデータは限られており、それに対するｇｐ３９の役割は、不確かのままである。
【０００３】
本発明は、関節軟骨の特殊化された細胞である軟骨細胞の研究に基づく異なるアプローチに基づく。本発明者らは、ＲＡ患者の血清に存在する抗体と反応しそして推定自己抗原に関する認められた基準に適合するヒト軟骨細胞及びヒト軟骨肉腫細胞系からの蛋白を単離した。この精製された蛋白は、Ｔ細胞の増殖についてテストされ、そしてＲＡの患者から滑膜Ｔ細胞を選択的に増殖することが示されている。この蛋白は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）である。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ９９／１８１３１号は、ＲＡの診断上の指標としてヘラ細胞から由来するＢｉＰに対する抗体の検出を提案している。しかし、この従来の文献は、再現可能なやり方でヘラ細胞からのＢｉＰの抽出を記述しておらず、そのため実際の適用には不十分である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、正確なＲＡ自己抗原を入手し同定し、そしてこの発見がこの疾患に関する予後及び診断のテスト並びに特異的な治療の開発を導く。本発明者らは、この蛋白に関するＤＮＡを単離し配列を明らかにした。本発明者らは、またこのＤＮＡをクローンし発現した。アミノ酸及びＤＮＡ配列は新規であり、そしてこの明細書の配列リストに示される。ＢｉＰ蛋白のアミノ酸配列は、二つのパージョンＳＥ１とＳＥ２との配列リストとして示され、その何れも本発明によりテスト試薬として使用できる。ＳＥ１に関するｃＤＮＡは、配列リストＳＥ３として示される。この配列は、寄託番号ＡＦ１８８６１１としてＧＥＮＢＡＮＫに寄託されている。この配列とＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｘ８７９４９のそれとの比較は、以下に与えられる。
【０００６】
以下の記述の第一のパートは、この自己抗原の分析に関し、第二のそれは、蛋白のクローニング、配列決定及び発現に関し、そして第三のパートは、自己抗原に対する疾患（リウマチ様関節炎）及び組織（滑膜区画）のＴ細胞特異性の立証に関する。
【０００７】
パート１：自己抗原の分析
軟骨細胞／軟骨肉腫細胞
軟骨細胞は、関節の置換中に得られた軟骨から単離された。軟骨は、細かくミンチされ、そして１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により消化された。消化後、細胞を３００ｇで遠心分離し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英国）により強化されたＤｕｌｂｅｃｃｏｓ最低必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒａｉｓｌｅｙ、英国）に再懸濁した。２４時間後、細胞の破砕物を洗って付着した細胞を除き、そして密集になるまで成長させた。細胞をトリプシン（０．２５％）を使用して継代培養をし、１：３に分けた。
【０００８】
軟骨肉腫の細胞（ＨＴＢ９４）（ＳＷ１３５３）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）によりそしてＪ．Ｂｌｏｃｋ博士、Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国（個人的に贈与）により得た。これらの細胞を１０％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭで培養し、そして密集になったとき、おだやかなトリプシン化（０．２５％のトリプシン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒａｉｓｌｅｙ、英国）後１：３に分けた。
【０００９】
細胞ライゼートの製造
細胞をフラスコの表面からはがし、ホモゲナイズし、プロティナーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（２ｍＭ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（２００μｇ／ｍＬ）及びアプロチニン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、英国）の存在下超音波処理した。
【００１０】
ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、英国）を添加して最終濃度を１％とし、そして蛋白を１時間室温で溶解した。蛋白の濃度は、標準の蛋白としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）アッセイにより評価され、そして細胞ライゼートは１０μｇ／穴当量で使用された。
【００１１】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット
Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎシステム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、英国）を使用してゲルを処理した。５、７．５又は１０％のＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル（厚さ１．５ｍｍ）を作った（付録１参照）。ゲルを１０μｇ蛋白／穴で負荷するか、又は同等物を調製ゲルに負荷した。電気泳動を一定の１００Ｖで行い、広域カレイドスコープマーカー（ＢｉｏＲａｄ）を細胞ライゼートと平行に流した。
【００１２】
電気泳動後、蛋白を１時間一定の１００Ｖでニトロセルローズ上にブロットした（付録１参照）。ニトロセルローズを次に３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ、英国）によりブロックし、１晩４℃で放置した。標品ゲル膜を必要時に１６枚の薄い片に切断したが、それぞれは、同じ蛋白プロフィルを有した。膜を、室温で１時間患者の血清（１／１００希釈）又は特定のモノクローナル抗体（要求された濃度で）によりプローブし、次にＴＴＢＳで１時間３回洗った（付録１参照）。二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ2）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役物（Ｓｉｇｍａ）を１／１０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。膜を次にＴＴＢＳで１時間３回洗った。増強した化学蛍光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してシステムを現像し、抗原−抗体ＨＲＰ錯体が、現像されたとき写真フィルムに明確なバンドとして現れた。
【００１３】
推定自己抗原ｐ７８の単離
問題のバンドは、前記のように細胞ライゼートをスクリーンするのに使用されたリウマチ様関節炎の血清の約３０％に見られた。
【００１４】
蛋白を単離するために、細胞ライゼートを、３００００ＭＷカットオフフィルター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して２３倍に濃縮した。この蛋白を次に平行で５％及び７．５％ゲルに負荷した。それぞれの一つのレーンは１規定（ｎｏｒｍａｌ）濃度で負荷され、一方二つの他のレーンは蛋白を過剰に負荷された。カレイドスコープマーカーは、テストレーンの何れかのレーンに負荷された。７００００ＭＷ蛋白が流去（ｒｕｎ−ｏｆｆ）点に可能な限り近くゲルの底の３分の１にあることをカレイドスコープマーカーが示すまで、ゲルを次に前述のように処理した。ゲルを次にＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）上にブロットし、それは蛋白の移動が完了した後蒸留水に直ぐに入れた。正常の負荷を有する片を蛋白のバンドの免疫検出のために使用した。この免疫検出の現像されたフィルム及び過剰に負荷された片のＰｏｎｃｅａｕレッド染色を使用して次に風乾された膜上のバンドを同定した。
【００１５】
これらの片を、次にマトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）分光法を使用して蛋白を分離し配列決定するために採取した。
【００１６】
エレクトロブロットされた蛋白を、急速染色プロトコール（１）を使用してＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（０．０５％ｗ／ｖ水性メタノール／０．１％酢酸）により染色した。乾燥し染色した蛋白を次にトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，変性）によりその場で消化し、ペプチドを１：１ｖ／ｖギ酸：エタノールにより抽出した（２）。一つの０．２μＬの部分（全消化物の約５％）をサンプルとし、ＬａｓｅｒＭａｔ  ２０００質量分析計（Ｔｅｒｍｏ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ、英国）を使用してマトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型質量分析により直接分析した。第二の０．２μＬの部分をメタノール中１％ｖ／ｖ塩化チオニルを使用して定量的にエステル化し、そしてまたＭＡＬＤＩにより分析して酸性の残存物の組成をえた（４）。未処理とエステル化とのペプチドを次にＭＯＷＳＥペプチドマスフィンガープリントデータベースについてスクリーニングした（５）。残りの消化したペプチド（全消化物の９０％）を次にｂ−イオン存在量を増加させそしてタンデム質量分析による配列の分析を助けるために、Ｎ−サクシンイミジル−２（３−ピリジル）アセテート（ＳＰＡ）と反応させた（６）。乾燥したペプチドのフラクションを、氷上２０分間１５％ｖ／ｖアセトニトリルを含む０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによりｐＨ７．８）中の１％ｗ／ｖＮ−サクシンイミジル−２（３−ピリジル）アセテート７μＬにより処理した。反応を１μＬのヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）により停止させ、溶液を、３μＬ／分で流れる２％ｖ／ｖアセトニトリル／０．０５％ｖ／ｖＴＦＡで平衡したＰＯＲＯＳ  Ｒ２／Ｈ物質（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡ）を充填した毛管逆相カラム（３００μｍ×１５ｃｍ）に直ぐに注入した。吸着されたペプチドを、３μＬ／分で３０分間１０％ｖ／ｖアセトニトリル／０．０５％ｖ／ｖＴＦＡにより無勾配的に洗って、過剰の試薬とＨＥＰＥＳバッファーとを溶離した。誘導体化されたペプチドを次に単一段階の勾配で７５％ｖ／ｖアセトニトリル／０．１％ｖ／ｖギ酸に対して溶離し、そして単一の４μＬのフラクションを集めた。誘導体化されたペプチドを次にナノエレクトロスプレイ源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ＴＳＱ７０００を使用して低エネルギー衝突作動解離（ＣＡＤ）により配列決定した（７、８）。ＣＡＤは、−１８Ｖと−２８Ｖとの間の衝突オフセット電圧で２．５ｍトルのアルゴンを使用して行われた。生成物−イオンのスペクトルを５００ａｍｕ／秒でスキャニングしたＱ３で集めた。
【００１７】
結果
７．５％ゲル（単一バンド）から得た配列のデータ
ＧＲ７８  ヒト
特定の同定ペプチド：
ＮＱＬＴＳＮＰＥＮＴＶＦＤＡＫ  ８２−９６
ＳＤＩＤＥＩＶＬＶＧＧＳＴＲ  ３５３−３６６
ＴＷＮＤＰＳＶＱＱＤＩＫ  １０７−１１３
同定したヒト蛋白  ＧＲ  ７８：
Ｋｄグルコース関連蛋白プレカーサー（ＧＲＰ７８）
免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白（ＢＩＰ）
【００１８】
パート２：ｐ７８のクローニング、シーケーシング及び発現
１）同定されたｍＲＮＡ単離及びＰＣＲ増幅
ヒト軟骨細胞を前記のように単離しそして３週間培養した。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（１−２μｇ）を、合計１−２×１０6 細胞からＭｉｃｒｏ−Ｆａｓｔｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により抽出した。得られたｍＲＮＡ１ミクロｇを、１μＬのモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（２００ｕ／μＬ）；５×一次鎖バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、２５０ｍＭ；ＫＣｌ３７５ｍＭ；ＭｇＣｌ  １５ｍＭ）；０．１Ｍ  ＤＴＴ；オリゴｄＴ（１２−１８）２０ｎｇ／μＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；及びｄＮＴＰミックス１００ｍＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して１時間４５℃で２０μＬの容積でｃＤＮＡ中に逆転写した。
【００１９】
ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓサーマルサイクラーＰＥ２４００を使用して標準条件（下記参照）下５０μＬの反応容積で行った。プライマー配列は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白Ｂｉｐ（ｇｒｐ７８）に関するヒト遺伝子に相当するＧｅｎＢａｎｋデータベース配列から由来した（寄託番号Ｘ８７９４９）。特定のプライマーを合成して、軟骨細胞ｃＤＮＡから推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）自己抗原遺伝子を増幅した。領域をコードするｇｒｐ７８の殆どからなる得られたＰＣＲ生成物は、未翻訳領域、シグナル配列及び停止コドンを含まない（ｇｒｐ７８データベース配列のヌクレオチド位置２７９−２１６９）。
【００２０】
ＰＣＲに関するプライマーのセットは、組み込まれた制限部位によりデザインされて、細菌の発現ベクターへのｃＤＮＡの急速なサブクローニングを行った。前進プライマーはＮｄｅｌ部位をエンコードし、そして逆プライマーはＸｈｏｌ制限部位を含んだ。前進プライマーに関する配列リストは、以下においてＳＥ４として示され、逆プライマーに関するそれはＳＥ５として示される。
【００２１】
Ｂｉｐ前進プライマー  ５´ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧ３´（３２ｍｅｒ）
Ｂｉｐ逆プライマー  ５´ＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡ３´（３２ｍｅｒ）
【００２２】
２分間９６℃での最初の変性後、ＰＣＲを、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃そして２分間７２℃のサイクルプロフィル、さらに７分間７２℃での最後の伸張を使用して２８サイクルを行った。ＰＣＲの反応は、１８９０ｂｐの単一の特異的なＢｉｐフラグメントを生じた。
【００２３】
２）ＰＣＲ発生フラグメントのクローニング
ＰＣＲ反応に使用された前進及び逆プライマー中に作成した制限部位は、それらの特定のエンドヌクレアーゼ（Ｎｄｅｌ及びＸｈｏｌ）により認識されるようにそれらに関するフランキングＤＮＡを要した。このフランキングＤＮＡをもたらすために、ＰＣＲ発生フラグメントをＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンした。リゲートされたプラスミドを、ミニプレップ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した免疫応答を起こしうるＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びプラスミドＤＮＡ中に変換した。クローンのための精製されたプラスミドＤＮＡをＢｉｐ−Ｔｏｐｏと命名した。これらのＤＮＡサンプルを−２０℃で貯蔵した。Ｂｉｐ−Ｔｏｐｏのための精製されたプラスミドＤＮＡをＮｄｅｌ及びＸｈｏｌにより消化した。制限されたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡゲル抽出キットを使用して精製した。
【００２４】
３）細菌発現ベクター中への制限された遺伝子フラグメントのサブクローニング
クローンのための精製されたフラグメントを、Ｎｄｅｌ／Ｘｈｏｌ予備消化細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にリゲートした。リゲーションは、Ｔ４リガーゼ（２０単位）及び１／１０容量の１０×リガーゼバッファー（ＰｒｏｍｅｇａからＴ４リガーゼ酵素とともに提供される）の存在下１晩１２℃で行われた。リゲートされたプラスミドは、免疫応答を起こしうるＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に変換され、Ｂｉｐ特定プライマーを使用してコロニー−ＰＣＲによりスクリーニングされた。必要な組み換えプラスミドを有する正の形質転換細胞を精製し、免疫応答を起こしうるＥ．ｃｏｌｉ発現株ＢＬ２１−（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に変換した。クローニングが、細菌、昆虫の細胞及び哺乳動物の細胞を含む原核又は真核の宿主で行うことができることは、もちろん理解されるだろう。好ましい宿主は、発現された生成物のグリコシル化を確実にするものである。
【００２５】
４）１８９０ｂｐ  ｐＥＴ：：Ｂｉｐサブクローンの配列決定
ｐＥＴ：：Ｂｉｐクローンの５´及び３´末端の配列決定は、組み換えＤＮＡ分子がｐＥＴ３０ベクターのＡＴＧ出発コドンとイン・フレームであること、そしてこの部位からのリードスルーがＢｉｐ遺伝子を経て続き、発現ベクターの３´アームに位置する停止コドン及び６ＸＨｉｓ残基で終わることを確認した。
【００２６】
拡張ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｐサブクローンの全長に及ぶ合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われた。新しくサブクローンしたＢｉｐ遺伝子フラグメントの配列分析は、データベースからの現存のｇｒｐ７８配列（寄託番号Ｘ８７９４９）に対する比較の列により行った。二つの配列間の多数の相違が、ＤＮＡと蛋白のレベルとの両者で検出された（付録２参照）。不一致のこれらの領域は、（ｇｒｐ７８の）初めのＤＮＡ配列における誤りの結果であるか、又はそれらがゲノムにおける追加の関連するがわずかに異なるＢｉｐ遺伝子の存在を示すかの何れかであろう。
【００２７】
すべてのＤＮＡ配列決定は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅダイ・ターミネーターキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ３７７自動化ＤＮＡシーケンサーで行われた。
【００２８】
細菌及び精製組み換え体の蛋白の発現
組み換えｐＥＴ３０ａ−Ｂｉｐプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ発現株ＢＬ２１−（ＤＥ３）を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で３７℃で成長させた。細胞が０．６単位のＯＤ600に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を培地に添加して、発現ベクターのＩＰＴＧ誘導可能なプロモーターにより駆動される組み換え蛋白の発現を誘導した。組み換え蛋白の最大の発現を行うために、培養物を３７℃でさらに４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレットにし、−７０℃で貯蔵した。
【００２９】
組み換え細菌蛋白の精製のために、細菌のペレットを結合バッファー（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4 、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム、５単位／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ、０．１％  トリトン  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）で溶解した。ライゼートを、不溶物及び細胞破砕物を除くために遠心分離により透明にした。透明にしたライゼートを、５ｍＬの床容積の結合バッファーにより平衡にされたキレート化Ｈｉ−ｔｒａｐアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。非特異的に結合した蛋白を、一連の３回の洗浄バッファーを使用して厳密な条件下カラムから洗った。最初の洗浄は、１００ｍＬの結合バッファーを使用して行った。これは、高緊縮低ｐＨ洗浄（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4 、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトン  Ｘ−１００、ｐＨ５．５）、そして１００ｍＬの２０ｍＭ  ＮａＰＯ4 、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  トリトンＸ−１００、５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を使用する追加の高緊縮洗浄を伴った。
【００３０】
ヒスチジン標識組み換え蛋白を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡによりストリッピングすることによってカラムから溶離した。溶離された蛋白を１×ＰＢＳで１晩透析してＥＤＴＡ及びＮｉ混入物を除いた。精製された蛋白を濃縮し、５００００ＭＷカットオフ濃縮カラム（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して滅菌ＰＢＳで洗った。蛋白の合計量を、ビシンコニン酸アッセイにより標準としてＢＳＡを使用して分光測光により測定した。
【００３１】
実験的関節炎における免疫学上の検討
実験的関節炎におけるｐ７８に対する抗体反応
コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）及びプリスタン関節炎（ＰＩＡ）を、本発明者の既に記述したプロトコールに従ってＤＢＡ／１マウスに誘発した。マウスを、関節炎の誘発前（１５匹）、ＣＩＡの開始時（１６匹）そしてＰＩＡの開始時（１４匹）に飼育した。ｐ７８に対するマウス血清の抗体を、組み換えｐ７８により酵素結合免疫イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ヌンク９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）を、１穴あたり５００ｎｇ（５％脱脂牛乳／ＰＢＳの１００ｍＬ）で、ｐ７８により４℃で１晩被覆した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）により３回洗浄した後、プレートを、４℃で１晩５％脱脂牛乳／ＰＢＳによりブロックした。マウスの血清を、牛乳／ＰＢＳ中１：２００希釈で穴中に加え、４℃で１晩インキュベートした。プレートを洗い、１００ｍＬのアルカリ性ホスファターゼと共役したヤギ抗マウスＩｇ（抗−Ｉｇ−ＡＫ；牛乳／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０中１：５００希釈、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ）を３７℃で６０分間添加した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０による３回の洗浄後、ジアチルアノラミンバッファー中のパラニトロフェニルホスフェート溶液（ＰＮＰＰ錠剤、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１００ｍＬを各穴に添加した。反応を暗所で３０分間続けさせ、プレートを分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）で４０５ｎｍで読みとった。データを、ＳＯＦＴｍａｘ分析ソフトウェアパッケージを使用して分析した。特異的結合は、非被覆ブランク及び非血清ブランクからのＯＤを減じたｐ７８コート穴からのＯＤ読み取りであった。抗体のレベルは、ＯＤ405 単位として表示された。
【００３２】
結果
自己抗原の同定
ＲＡとコントロールとの血清を軟骨細胞抽出物に対してブロットしたとき、１０％のコントロールの血清に比較して、３０％のＲＡの血清が７８Ｋｄ蛋白と反応した（図１）。低エネルギーＣＡＤによる３種のトリプシン関連のペプチドの配列決定は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白（Ｂｉｐ）としても知られている、７８ｋＤグルコース調節蛋白として７８ｋＤバンドの一つの成分を同定した。関節の軟骨細胞ｃＤＮＡからのｐ７８のＤＮＡ配列分析は、発表された配列（寄託番号Ｘ８７９４９）から多くの偏りを示した。合計６個の単一のヌクレオチド置換及びコドン挿入は、ｐ７８の位置８３４−８３６におけるアルギニン挿入及び３個のアミノ酸置換を生ずる（寄託番号ＡＦ１８８６１１）。
【００３３】
リウマチ様関節炎の免疫学的テスト
Ｔ細胞増殖反応は、リウマチ様関節炎の２３人の患者から得た一対の末梢血及び滑液のサンプル、並びに１２人の疾患コントロールからの単核細胞の標品について測定された。ＲＡにかかった２３人の患者の１２人（５２％）そして疾患コントロールの１２人の２人のみ（１７％）が、増加した滑膜の増殖を示した（図２）。ＲＡ滑膜Ｔ細胞のｐ７８に対する増殖反応は、一対の末梢血のそれよりも有意に高かった（刺激指数、平均±ＳＥＭ；ＳＦ３．５±０．７；ＰＢ１．６±０．２；ｐ＜０．０１  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ対比テスト）。有意な差は、またＲＡ患者と疾患コントロールとの間のｐ７８に対する滑液の反応間に見られた（ＳＩ：ＲＡ３．５±０．７；ＯＩＪＤ１．４±０．２；ｐ＝０．０３Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテスト）。５０％の応答個体及び非応答個体がＨＬＡ−ＤＲ４ポジティブであった（データは示さず）ので、ＨＬＡ−ＤＲと関連がなかった。ｐ７８に対するリウマチ様滑液Ｔ細胞増殖は、抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ２４３（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により６６−８４％阻害された（データは示さず）。
【００３４】
０．０１ｎｇ／ｍＬに感受性のＥＬＩＳＡを使用したにもかかわらず、ＩＦＮｇは、一対の滑液及び末梢血の単核細胞からの上清では測定できなかった（データは示さず）。ＩＦＮｇは、ｐ７８による刺激後、ＲＡ患者（ｎ＝７）又は健康なコントロール（ｎ＝２）の末梢血Ｔ細胞中の細胞内蛍光により検出できなかった（データは示さず）。これらの結果は、対応するＴ細胞がＴＨ１サブセット｛１４６１｝を生成する典型的なＩＦＮｇに属さないと思われることを意味する。
【００３５】
実験的関節炎における免疫学的研究
ｐ７８による実験的関節炎の誘発
Ｆｒｅｕｎｄの完全なアジュバント（ＣＦＡ）のｐ７８によるＤＢＡ／１、Ｃ５７ＢＬマウス及びＬｅｗｉｓラットの免疫化は、関節炎の発生を導かなかった（データは示さず）。ＨＬＡ−ＤＲ１+/+ （０／１０マウス）中又はＨＬＡ−ＤＲ４+/- （０／５）マウス中に注入されたとき、ｐ７８の関節炎原性（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を同様に欠いた。
【００３６】
実験的関節炎におけるｐ７８に対する免疫応答
ｐ７８により動物を免疫化することにより関節炎を誘発することに失敗したが、本発明者らは、ＤＢＡ／１マウスがコラーゲン（ＣＩＡ）又はプリスタン（ＰＩＡ）誘発関節炎の間ｐ７８に対する抗体を発生させるかどうかを検討した（図４）。マウスは、採血前の血清（０．０７０±０．０１９；それぞれｐ＜対ＣＩＡ及びｐ＜対ＰＩＡ）と比較したとき、コラーゲン関節炎（ＯＤ405 ０．１８９±０．０４２、ｍ±ｓｅｍ）そしてプリスタン誘発関節炎（０．５０４±０．０７４）の開始時血清抗−ｐ７８抗体を発生した。さらに、これらの抗体の濃度は、ＣＩＡマウスに比較してＰＩＡにおいて有意に高かった（ｐ）。各グループにおいて１４匹のマウスが存在した。
【００３７】
ｐ７８の静脈内投与によるコラーゲン誘発関節炎の予防
ＣＩＡ又はＰＩＡによるマウスの血清中のｐ７８に対する抗体の存在は、ｐ７８に対する免疫応答を操作することが傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）現象によりＣＩＡの次の発生を予防するかもしれないことを示唆した。ＨＬＡ−ＤＲ１+/+トランスジェニックマウスに、１週間後ＣＦＡ中のタイプＩＩコラーゲンによる免疫化前に、１ｍｇのｐ７８を静脈内注射した（表６）。８３％の動物が、塩水により予備処理されたとき８週でそれらの四肢の４６％が関節炎にかかったが、静脈内にｐ７８を既に投与されたグループではわずか１０％の動物がそれらの四肢の３％が関節炎にかかったに過ぎなかった。これらの相違は、極めて有意である（ｐ≦０．００８そしてｐ≦０．０００１）。表６は、またコントロールに対して３分の１のレベルでｐ７８予備処置動物の抗コラーゲン抗体に有意な低下があったことを示す。低下は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２イソタイプにおいて等しかった（表７）。これらの動物の関節の組織（図６）は、ｐ７８予備処置マウスの関節では滑膜炎がなかったという臨床上の所見を確かなものにした。
【００３８】
本発明者らは、ＲＡにかかった患者の３０％がヒトシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）Ｂｉｐ／ＧＲＰ７８に対するウエスタンブロットにより検出され、そして本発明者らによりｐ７８と命名された抗体を有することをこの研究により示した。その上、リウマチ滑液からのＴ細胞はｐ７８に選択的に増殖した。同じ患者の末梢血からのＴ細胞では、最低の応答が存在した。他の炎症性関節炎にかかった患者からのＴ細胞は、滑液からでも又は末梢血からでも、ｐ７８に対して有意に増殖しなかった。最後に、増殖性の応答は、抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体により阻害され、それは、ＣＤ４＋ポジティブＴ細胞がＨＬＡ−ＤＲに関連してもたらす抗原ペプチドに応答しつつあることを示唆した。このポリクローナルＴ細胞応答は、ＨＬＡ−ＤＲ４により制限されなかった。従って、Ｔ細胞増殖のｐ７８刺激は、リウマチ自己抗原を予想させる二つの特徴、即ちそれが関節と疾患とに特異的であるということを有する。
【００３９】
これらの観察に基づいて、本発明者らは、ｐ７８に対する免疫応答からはずれることが傍観者メカニズムによりＣＩＡの発生を予防するであろうという仮説をテストするために、ｐ７８によるマウスの静脈内免疫化を行った。これは、ＨＬＡ−ＤＲ１+/+トランスジェニックマウスにおけるＣＩＡの誘発に対する殆ど完全な予防のケースであることをまさに証明するものであった。過去において、種々のタイプの実験的関節炎が、細菌性そして特にマイコバクテリア性の熱ショック蛋白例えばＨＳＰ６０、又は全ＨＳＰ６０或いは特定のペプチド｛２１０３、２２８０、２２８２、２２８３、２２８４、２２８１｝に応答するＴ細胞の投与により予防又は治療されてきている。しかし、自己ＨＳＰ６０ペプチドはこれらの保護的作用を示さないことに注意することが重要である｛２２８１｝。それゆえ、ＣＩＡを予防するｐ７８の能力は、基本的に重要である。この研究で記述された観察は、本発明者らの知るところでは、ＲＡの発生機序及び実験的関節炎の免疫治療において内在性シャペロンを意味する最初のものである。ＲＡの免疫治療の可能性は、明確に明らかである。
【００４０】
２．生物学的液体又は培養液上清におけるｐ７８に対する抗体の検出のためのテストの使用
いくつかの手法例えば凝集、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡが使用できる。
血清中のｐ７８に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡプロトコール
ＥＬＩＳＡプレートを、室温で４時間、重炭酸塩バッファー中のｐ７８で半分そして重炭酸塩バッファーのみで半分覆う。ＰＢＳによる２回の洗浄後、プレートを、蛋白の非特異性結合を停止させるために、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の１０％ヤギ血清によって、室温で２時間ブロックする。さらに２回洗浄した後、希釈した血清（ＰＢＳ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中）を、プレートのｐ７８を覆ったそして覆ってない面の両方にまったく同一で加える。４回の洗浄後、ビオチン共役抗ヒト免疫グロブリン（ＰＢＳ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で１／１００００希釈）をプレートに添加する。プレートを６回洗う。結合したビオチニル化抗体を、ストレプタビジン共役セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＢＳ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中１／８００）及び好適な基体により検出する。ｐ７８に対する抗体を含む血清は、分光測光で測定する。このテストは、リウマチ様関節炎に関する診断及び／又は予後のテストの基礎を形成する。
【００４１】
３．治療上の応用
組み換え蛋白又はベクターの投与の多くの経路が可能であり、静脈内、筋肉内、経鼻、経口、皮下、そして局所を含む。治療の目的でｐ７８又は誘導体を使用するいくつかのアプローチが存在し、以下のものを含む。
【００４２】
（ａ）粘膜の寛容性の誘発
例えば小腸又は鼻の粘膜を通る粘膜の経路によるｐ７８自己抗原又はそれから由来するペプチドの伝達は、患者の免疫系をそのままにしたまま疾患の活性を下方に調節することにより免疫応答を変える。別に、ｐ７８又はｐ７８ペプチドは、適切な哺乳動物の発現ベクターによりそれらをエンコードするＤＮＡプラスミドとして伝達できる。
【００４３】
（ｂ）ＴＣＲペプチドによるワクチン化
Ｔ細胞受容体Ｖアルファ及びＶベータ鎖のＣＤＲ３領域のペプチドは、合成できそして経皮又は筋肉内の注射による伝達のワクチンとして使用できる。これらのペプチドをエンコードするプラスミドは、同じやり方で使用できる。
【００４４】
（ｃ）未処理又は変化したペプチドによるＭＨＣ閉鎖
ｐ７８ペプチドは、ＭＨＣそして特にＨＬＡ−ＤＲ４をブロックしそれによりＴ細胞の活性化及び疾患の抑制を導くようにアミノ酸置換及び／又は化学基の付着により変性されているか又は変性されていない適切な場合に、非経口的又は経口的に投与できる。未処理か又は変化されたかの何れかのｐ７８ペプチドは、可溶性ＨＬＡ−ＤＲ４分子と結合し、そして非経口的又は経口的に適用できる。
【００４５】
（ｄ）プラスミドＤＮＡ免疫化による寛容性の誘発
全ｐ７８蛋白についてコードしたＤＮＡからなるプラスミド、又は哺乳動物発現ベクターに結合したそのペプチドは、注射により与えることができる。単一で又は任意の組合せで配合されるヒトＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１１又はＴＧＦ−ベータについてコードしたＤＮＡは、疾患を抑制するためにＴＨ２モードに向かってｐ７８への免疫応答を変更するのに使用できる。
【００４６】
上記の治療処方において、蛋白又は誘導ペプチドは、約０．１ミクロｇ−約１ｇに及ぶ量又はプラスミド又はワクチンの製剤の場合はその相当量を伝達する適切な組成物で投与できる。
【００４７】
付録  １
ゲル電気泳動の方法
アクリルアミド  ゲル：１０％
６．０７５ｍＬ  アクリルアミド（４０％）（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
３．３５ｍＬ  メチレンビスアクリルアミド（２％）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）
６．２５ｍＬ  アクリルアミド  ゲル  バッファー（下記参照）
９ｍＬ  蒸留水（実験室内で生成）
２５０μＬ  過硫酸アンモニウム（ＡＭＰＥＲＳ）（２５０μＬの蒸留水中の０．０２５ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
２５μＬ  ＮＮＮ´Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
アクリルアミド  ゲル  バッファー：ｐＨ８．８
１．５Ｍトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
濃塩酸によるｐＨ滴定
０．４％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００４８】
濃縮用ゲル：
１．２ｍＬ  アクリルアミド（４０％）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
０．６５ｍＬ  ビスアクリルアミド（２％）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）
３．１５ｍＬ  濃縮用ゲルバッファー（下記参照）
７．５ｍＬ  蒸留水（実験室内で生成）
１２５μＬ  過硫酸アンモニウム（ＡＭＰＥＲＳ）（０．０２５ｍｇ／２５０μＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１２．５μＬ  ＮＮＮ´Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００４９】
濃縮用ゲルバッファー：ｐＨ６．８：
０．５Ｍトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
濃塩酸によるｐＨ滴定
０．４％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００５０】
負荷用バッファー：
２ｍＬ  グリセロール
２ｍＬ  １０％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
０．２５ｍｇ  ブロモフェノール・ブルー
２．５ｍＬ  ４倍に濃縮した濃縮用ゲル  バッファー（０．５Ｍ  トリス；０．４％ＳＤＳ；ｐＨ６．８）
０．５ｍＬ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００５１】
電気泳動／ランニングバッファー：
３ｇ／Ｌ  トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１４．４ｇ／Ｌ  グリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１ｇ／Ｌ  ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００５２】
転移用バッファー：
３ｇ／Ｌ  トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１４．４ｇ／Ｌ  グリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１ｇ／Ｌ  ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１４．４ｇ／Ｌ  グリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１０％メタノール（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００５３】
トリスＴｗｅｅｎ緩衝塩水（ＴＴＢＳ）：
２．４ｇ／Ｌ  トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
２９ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
５００μＬ  Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ソルビタン  モノ−ラウレート）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
【００５４】
３％ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ）：
３ｇ  アルブミンウシフラクション５（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）
１００ｍＬ  ＴＴＢＳ（上記参照）
【００５５】
付録  ２
発現されたＢｉｐ組み換えヒト蛋白のアミノ酸配列。合計１９１７ヌクレオチド。メチオニンで始まり（出発コドン）、６×Ｈｉｓ  ｔａｇで終わる。
分子量７０９３７．５０ダルトン
６３９アミノ酸
８６強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）
１０８強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）
２０４疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）
１４２極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）
５．１７３等電点
ｐＨ７．０で−２０．０４１電荷
【００５６】
【表１】
0004435422.tif 000002
【００５７】
付録  ３
組み換えヒト蛋白の発現に使用されるＲＴ−ＰＣＲクローン化且つ配列決定されたｇｒｐ７８（Ｂｉｐ）フラグメント。合計１９１７ヌクレオチド。ＡＴＧ出発コドンで始まり、６×Ｈｉｓ  ｔａｇで終わる。
【００５８】
【表２】
0004435422.tif 000003
【００５９】
付録  ４
組み換えヒト蛋白の発現に使用されるＲＴ−ＰＣＲクローン化且つ配列決定されたｇｒｐ７８（Ｂｉｐ）フラグメント。合計１９１７ヌクレオチド。ＡＴＧ出発コドンで始まり、６×Ｈｉｓ  ｔａｇで終わる。
【００６０】
【表３】
0004435422.tif 000004
【００６１】
データベースからのＢｉｐ（ｇｒｐ７８）に関する元の全ｃＤＮＡ。寄託番号Ｘ８７９４９。全長２５５４ヌクレオチド。（既に発表）。
【００６２】
【表４】
0004435422.tif 000005
【００６３】
【表５】
0004435422.tif 000006
【００６４】
a ＨＬＡ−ＤＲ１+/+ トランスジェニックマウスは、ＰＢＳ（負のコントロール）又は組み換えｐ８の何れかを静脈内に注射された。０．１ｍＬのＰＢＳに溶解した蛋白１ｍｇ又は０．１ｍＬのＰＢＳの何れかを静脈内に投与し、マウスを静脈内投与後７日間ＣＦＡ中のタイプＩＩコラーゲンにより免疫化した。
b 関節炎の頻度は、免疫化後８週で報告されている。
c 抗体は、免疫後８週で集められた血清を使用して１グループあたり平均の単位を表す。ＥＬＩＳＡが行われ、結果を５０単位の活性を有するものとして恣意的に定義された標準の血清とのテスト血清の比較により誘導される活性の単位として報告される。血清は、個々に分析されそして結果は動物の各グループについて平均±ＳＤとして示される。
* ｐ≦０．００８（フィッシャーの直接法）  **  ≦０．０００１（フィッシャーの直接法）  *** ＜０．０５（スチューデントテスト）
【００６５】
【表６】
0004435422.tif 000007
【００６６】
a ＨＬＡ−ＤＲ１+/+トランスジェニックマウスは、ＰＢＳ（負のコントロール）又は組み換えｐ８の何れかを静脈内に注射され、次に１週間後ＣＦＡ中のコラーゲンタイプＩＩにより免疫化した。
b ＥＬＩＳＡは、表５に記載されたように行われた。
* ｐ＜０．０５（スチューデントテスト）
【００６７】
【表７】
0004435422.tif 000008
【００６８】
【表８】
0004435422.tif 000009
【００６９】
【表９】
0004435422.tif 000010
【００７０】
【表１０】
0004435422.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  軟骨肉腫と反応する６種のリウマチ血清（レーン１−６）、５種の正常な血清（レーン７−１１）及び４種の疾患コントロール（レーン１２−１５）を示すウエスタンブロッティング。分子量マーカーを示す。
【図２】  刺激指数として表される６日間培養された単核細胞におけるリンパ球の増殖。ｐ７８の存在下の増殖／培地のみの存在下の増殖。≧２．５の刺激を有意と考えた。ＲＡＰＢ、リウマチ様関節炎の末梢血；ＲＡＳＦ、リウマチ様関節炎の滑液；ＯＩＪＤＰＢ、他の炎症性関節疾患の末梢血；ＯＩＪＤＳＦ、他の炎症性関節疾患の滑液。
【図３】  ＥＬＩＳＡにより測定されそしてＯＤ405として表示されるマウスの血清中の組み換えヒトｐ７８に対する抗体。示されているのは、実験的関節炎の誘発前（前採血）、そしてコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の開始時及びプリスタン誘発関節炎（ＰＩＡ）の開始時に採血された動物の値である。
【配列表】
0004435422.tif 000012
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0004435422.tif 000015
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0004435422.tif 000018
0004435422.tif 000019
【図１】
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【図２】
0004435422.tif 000021
【図３】
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