(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タクサス・スピーシーズ植物から、１０−デアセチル・バッカティンＩＩＩを単離する方法であって、
（ａ）  タクサス・スピーシーズ植物の粉砕物を、脂肪族アルコールで抽出して、アルコール抽出物を調製する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で得たアルコール抽出物から、１０−ＤＡＢ及びパクリタクセル（paclitaxel)を含む一部濃縮されたアルコール抽出物を調製する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）で得た一部濃縮されたアルコール抽出物を、アセトン中で攪拌して母液を得て、得られた母液から、生成した不溶物を遠心分離又は濾過により分離する工程、
（ｄ）  工程（ｃ）の母液を真空下に蒸発させた後に得られる残留物を、水と水性脂肪族ケトン溶媒との混合液中で攪拌し、そしてシーライト床を通す濾過により又は遠心分離により、濃化された単離可能なパクリタクセルを含む不溶物を分離して、含水ケトン溶液を得る工程、
（ｅ）  工程（ｄ）においてパクリタクセルを含む不溶物を分離した含水ケトン溶液を、極性のより小さな芳香族炭化水素で抽出した後、残留した含水ケトン溶液を水不溶性の脂肪族エステル又は塩素化溶媒で抽出して、有機層を得る工程、
（ｆ）  工程（ｅ）において水不溶性の脂肪族エステル又は塩素化溶媒で抽出した有機層を蒸発乾燥して、粗１０−ＤＡＢを含有する半固体残留物を得る工程、
（ｇ）  工程（ｆ）で得られた半固体残留物から、選択的結晶化により１０−ＤＡＢを単離精製する工程、
を含む方法。
【請求項２】
アルコール抽出物を調製するために用いられる脂肪族アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びブタノールから成る群より選択されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルコール抽出物を調製するために用いられる該脂肪族アルコールがメタノールである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該アルコール抽出物が、タクサス・スピーシーズ植物の粉砕物を、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール又はブタノール中で攪拌することにより得られるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１０−ＤＡＢの選択的結晶化が、脂肪族ニトリル溶媒、または脂肪族ニトリルと脂肪族アルコールもしくは脂肪族エステルとの混合溶媒で、該半固体残留物から１０−ＤＡＢを選択的結晶化させるものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該脂肪族ニトリル溶媒が、アセトニトリル又はプロピオニトリルから選択されるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪族ニトリルと混合される脂肪族アルコールは、メタノール、イソプロパノール、ブタノールからなる群より選択され；前記脂肪族ニトリルと混合される脂肪族エステルは、酢酸エチル、酢酸プロピオニル及び酢酸イソアミルから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
工程（ｇ）において、選択的結晶化された１０−ＤＡＢは遠心分離または濾過により単離精製される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該タクサス・スピーシーズ植物が、タクサス・バッカータ（Taxus baccata)である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該タクサス・スピーシーズ植物の葉から、１０−ＤＡＢを単離する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物化学の分野に関する。りよ具体的には、本発明はタクサス・バッカータの葉から化合物１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）を単離するための単純な且つ費用に対して効果の高い方法を提供する。１０−ＤＡＢはパクリタクセル (paclitaxel) やドセタクセル (docetaxel)及びそれらの類似化合物の調製に有用な骨格となる中間体化合物である。
【０００２】
本出願は１９９８年１２月１５日に出願された、１４β−ヒドロキシ−１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩの単離方法を記述する、先の米国特許出願第０９／２１２，３２１号の部分係属出願である。
【０００３】
発明の背景
１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）は、ヒトの卵巣癌、肺癌、結腸癌、及び乳癌の細胞系に対する優れた細胞毒性を示すパクリタクセル及びドセタクセル類似化合物の合成のための極めて重要な前駆体である（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４０，２６７−２７８を参照のこと）。
【０００４】
１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩは下記の構造式により表される。
【０００５】
【外１】
0004435988.tif 000002
【０００６】
化合物１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩはタクサス・スピーシーズの植物の幹及び葉に主として高濃度に見出される。この植物の他の部分もこの化合物を含むが、その濃度はより少ない。
【０００７】
１０−ＤＡＢの最も普通の単離法はバイオマスをアルコール又は任意のプロトン性溶媒で抽出して溶媒分配／粉砕により部分精製される抽出物を得、そして最後に選択的結晶化又はクロマトグラフィーにより１０−ＤＡＢを得る工程を含む。１０−ＤＡＢを抽出するため当分野で用いられる普通の方法の一部は本明細書でも以下に示される。
【０００８】
米国特許第５３９３８９５号は脂肪族アルコールでバイオマスを抽出し、ついで水で希釈することにより不溶物を分離する方法に関する。その後、アルコールを全て除去して水溶液とし、有機溶媒を用いてそれを分配にかけ、次いで選択的結晶化を行って１０−ＤＡＢを得る。
【０００９】
米国特許第５７３６３６６号は１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを得るための方法に関する。この方法はバイオマスを水で抽出した後、それを適当な基体に吸着させ、次いで有機溶媒を用いて脱離させ、最後に選択的結晶化を行う工程に関する。
【００１０】
米国特許第５４５３５２１号はバイオマスを脂肪族アルコールで処理し、水で希釈し、水性アルコール溶液から不溶物を分離し、その後、アルコールを完全に除去し、得られる水性溶液を有機溶媒で抽出した後選択的結晶化を行うことにより１０−ＤＡＢを得る工程に関する。
【００１１】
米国特許第５３９３８９６号はバイオマスを水で処理した後、該水性抽出物を有機溶媒で処理し、該有機相をさらに選択的結晶化に付して１０−ＤＡＢを得る工程に関する。
【００１２】
ＷＯ９４／０７８８１はバイオマスを水で抽出し、その後適当な基体に吸着させ又は吸着させずに、有機溶媒で処理し、次いで選択的結晶化を行うことにより１０−ＤＡＢを得る工程に関する。
【００１３】
ＷＯ９４／０７８８２はバイオマスをメタノールで抽出し、次いで水で希釈して不溶物を除く。この可溶性部分のアルコールを全て除去して水性溶液とし、これを適当な有機溶媒で分配させた後、選択的結晶化を行うことにより１０−ＤＡＢを得る工程に関する。
【００１４】
上記の先行技術はいずれもバイオマス中に存在する、卵巣癌や乳癌の治療に重要な薬物であるパクリタクセルの単離を教示しない。さらに、上記の方法は、１０−ＤＡＢから一次抽出物中に存在するパクリタクセルを完全に分離することはできない。さらに、本発明はタクサス・スピーシーズから１０−ＤＡＢを単離する最も経済的で環境に優しい方法を提供する。
【００１５】
本発明の目的
従って、本発明の目的はパクリタクセル及びドセタクセル類似化合物の合成の中間体として使用するための１０−ＤＡＢ（１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ）を単離するための単純で且つ費用に対して効果の高い方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は１０−ＤＡＢ単離のためのどの段階でもクロマトグラフィー技術による単離という長たらしい工程を含まない方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は種々の工程で使用される溶媒がリサイクルできる方法を提供することである。
【００１８】
タクサス・スピーシーズ植物の任意の部分から１０−ＤＡＢを抽出するために使用できる新規な方法を提供することも本発明の一つの目的である。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、一次抽出物中に存在する１０−ＤＡＢからパクリタクセルを完全に分離する方法であって、それにより如何なる長たらしい方法をも用いることなく両者を得ることができる方法に関する。
【００２０】
発明の概要
上記の及びその他の目的に従って、本発明は、クロマトグラフィー分離を用いることなく、溶媒結晶化により、タクサス・スピーシーズの植物抽出物から商業的規模で、該一次抽出物中に存在する１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）の新規な単離方法及びパクリタクセルの完全な分離方法をも提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、パクリタクセル及びドセタクセル類似化合物の合成に使用される化合物である１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを単離する新規な方法を提供する。
【００２２】
タクサス・スピーシーズの植物抽出物から商業的規模で、その一次抽出物中に存在する１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）の単離及びパクリタクセルの完全な分離を行うための新規な方法が提供される。該方法はタクサス・バッカータの乾燥した葉のアルコール抽出物を調製する工程、それを脂肪族ケトンで処理する工程、母液を蒸発させて残留物を得次いでこれを水性ケトン溶媒混合液で処理する工程、不溶物を分離する工程、該水性ケトン溶媒を有機溶媒で抽出した後選択結晶化により１０−ＤＡＢを単離する工程を含む。
【００２３】
この方法は単純であり、１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩはタクサス・スピーシーズ植物の回収可能部分から結晶化により選択的に単離できる。本方法は下記の工程、すなわち
（ａ）  タクサス・スピーシーズ植物の、粉砕しそして必要に応じ乾燥させた部分を脂肪族アルコールで抽出する工程、
（ｂ）  １０−ＤＡＢを含む、部分的に濃縮されたアルコール抽出物を調製する工程、
（ｃ）  該抽出物を脂肪族ケトンで処理し、次いで遠心分離又は濾過により母液から不溶物を分離する工程、
（ｄ）  工程（ｃ）の母液を蒸発させた後に得られる残留物を脂肪族ケトンと水の混合液で処理し、次いでシーライト床を通す濾過又は遠心分離により、パクリタクセル含量が豊富になった不溶物を除去する工程、
（ｅ）  パクリタクセルを全く含まない水性ケトン溶液を芳香族炭化水素で抽出して着色物質を除去し、次いで脂肪族エステル溶媒又は塩素化溶媒で抽出する工程、
（ｆ）  工程（ｅ）の有機層を蒸発乾固させて半固体の残留物を得、これから選択的結晶化により１０−ＤＡＢを得る工程、及び
（ｇ）  １０−ＤＡＢを単離し精製する工程、
を含む方法である。
【００２４】
脂肪族ケトンと水の混合液で処理した後に工程（ｄ）で得られる不溶物は、一次アルコール抽出物中に存在する１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩからパクリタクセルを専ら分離するという利点を有する。この不溶物は分離のための精製に付し、純粋のパクリタクセルを単離する。こうして、上の方法は天然資源からのパクリタクセルと１０−ＤＡＢの単離をもたらす。
【００２５】
さらに、本方法の工程（ｃ）におけるアセトンの使用は、より少ない百分率の不純物しか伴わずに、一次アルコール抽出物から１０−ＤＡＢとパクリタクセルを分離するという特に優れた長所を有する。
【００２６】
一つの態様では、アルコール抽出物の調製のために使用される脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びターシャリブタノールから成る群より選択される。
【００２７】
一つの特徴としては、該脂肪族アルコールはメタノールである。
【００２８】
別の一態様では、該アルコール抽出物はタクサス・スピーシーズ植物の、粉砕しそして必要に応じ乾燥させた部分を、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール又はブタノール中で攪拌することにより得られる。
【００２９】
本発明の別の特徴では、１０−ＤＡＢの結晶化は、メタノール、イソプロパノール又はブタノールから成る群より選択される脂肪族アルコール、又は酢酸エチル、酢酸プロピオニル及び酢酸イソアミルから選ばれる脂肪族エステルと必要に応じ混合された脂肪族ニトリルで該残留物を処理することにより行われる。該脂肪族ニトリルはアセトニトリル及びプロピオニトリルから選択しうる。
【００３０】
さらに別の特徴では、ＤＡＢはタクサス属の任意の植物の任意の部分から抽出される。
【００３１】
別の特徴では、１０−ＤＡＢは結晶化後の遠心分離により単離される。別の特徴では、該植物の該部分は葉である。
【００３２】
別の特徴では、パクリタクセルは一次抽出物中に共存している１０−ＤＡＢから完全に分離される。
【００３３】
１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ（１０−ＤＡＢ）の分離について上述した方法はどの段階でもクロマトグラフィー技術を全く含まない。
【００３４】
好ましい方法は下記の工程を含むものである。すなわち
１．  タクサス・バッカータの葉を粉砕し、必要に応じ乾燥する。メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールから選択される水と混ざり合う脂肪族アルコールをすり潰した葉に加え、この混合物を１２時間攪拌する。このプロセスに用いられる好ましい脂肪族アルコールはメタノールである。
２．  こうして得られる半濃縮アルコール抽出物は１０−ＤＡＢ、パクリタクセル及び他のタクサン類（taxanes)を含む。該抽出物を脂肪族ケトンと共に１時間攪拌する。次いで、不溶性物質をシーライト床を通す濾過又は遠心分離により分離する。後に残った液体は母液であり、次にその母液がさらなる処理のために使用される。
３．  工程（２）の母液を真空下で蒸発させて残留物を得、これを水性ケトン溶媒の混合液で処理し、濃縮されたパクリタクセルを含む不溶物をシーライト床を通す濾過又は遠心分離により除去し、該不溶物をさらに処理してパクリタクセルを得る。ここで得られる澄明な水性ケトン溶液は１０−ＤＡＢを単離するためのさらなる処理に用いうる。
４．  得られたパクリタクセルを全く含まない澄明な水性ケトン溶液を芳香族炭化水素で抽出して１０−ＤＡＢ以外の極性の小さな物質を除去する。次いで、残留する水性ケトン相を水と混ざらない溶媒、好ましくは脂肪族エステル又は塩素化溶媒で処理して１０−ＤＡＢを完全に抽出する。
５．  その後、該有機溶媒抽出物を真空下に８０℃−９０℃で蒸発乾固させて半固体の残留物を得る。続いて、上で得られた該残留物を、必要に応じメタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなどの脂肪族アルコール又はアセトン、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪族エステルと混合したアセトニトリル、プロピオニトリルなどの脂肪族ニトリルで処理することにより、粗１０−ＤＡＢを該残留物から選択的に結晶化させる。エタノール、メタノール又は酢酸エチル及び／又は酢酸ブチルの任意選択的存在下にアセトニトリル中で選択的結晶化を行うことが有利である。この１０−ＤＡＢは結晶化後の遠心分離などの任意の従来法により精製される。
【００３５】
１０−ＤＡＢを単離するための上記の新規な方法は、タクサス・スピーシーズ植物、とりわけ、ティー．バッカータ、ティー．ブレビフォリア、ティー．カンナデンシス、ティー．クスピダータ、ティー．フロリダーラ、ティー．メディア、又はティー．ワリキアーナの任意の部分から抽出する場合に適用できる。上述の方法は単純であり、如何なる段階でも如何なるクロマトグラフィーも含まず、溶媒のみを用いて得ることができる。
【００３６】
本発明の他の利点は種々の工程で使用される溶媒を再利用できることである。さらに、本出願人は、本発明に用いられる原料物質が１０−ＤＡＢとパクリタクセルを含み、且つ後者の単離が商業的にも首尾よく達成できるが、この様な成功にもかかわらず、本発明に先行する技術では予見されていないことを確認した。
【００３７】
上記の新規な方法は以下の実施例により詳細に説明されるが、これらの実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲を制限するものと解すべきでない。
【００３８】
実施例−Ｉ
タクサス・バッカータの葉を粉砕しそして必要に応じ乾燥させる。該葉の平均粒子サイズは０．６ｍｍから０．８ｍｍに近いことが好ましい。アルコール抽出物は、反応容器中で、１００ｋｇのすり潰した葉を１０００Ｌのメタノールと共に周囲温度（１５から４５℃）で１２時間攪拌（１分当たり５８回転）することにより調製する。遠心分離後回収したメタノール溶液を、蒸発用反応器中で、減圧下（１５０ｍバール）に４０−５０℃で蒸発させて、葉の重量の２０−３０％の間の重量を持つ半濃縮抽出物を得る。
【００３９】
（上述の条件下で調製された）０．１２％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩ、２０％の水、及び１０％のメタノールを含む２５ｋｇの半濃縮メタノール抽出物を周囲温度で１から２時間、１７５Ｌ（リットル）のアセトンと共に攪拌（５８ｒｐｍ）する。生ずる不溶性の固体を濾過又は遠心分離により分離する。半濃縮抽出物の重量の３５％を占める母液中のアセトン可溶物を真空下（１５０ｍバール）に４０−５０℃で蒸留し乾固する。
【００４０】
得られる８．７５ｋｇの乾燥残留物を４３．７５Ｌのアセトンと脱ミネラル水（ＤＭ）の混合液（好ましくは２対８の比率）と共に周囲温度で２時間高ｒｐｍ（１分間当たり７２回転）で攪拌する。その不溶性物質をシーライト床上で濾過又は遠心分離により除去する。濃縮されたパクリタクセルを含むこの不溶物をさらに処理して市販レベルのパクリタクセルを単離する。回収された水性ケトン性母液は澄明な暗赤色である。
【００４１】
パクリタクセルを全く含まないこの水性ケトン層を１７．５Ｌのトルエンで２回次いで８．７５Ｌのトルエンで１回抽出する。各抽出は（１分あたり４０回転）で１時間攪拌することにより行う。
【００４２】
トルエン抽出後に得られる水性ケトン層は、次に周囲温度（１５から４５℃）で３０分間塩化メチレン（４×１６．５Ｌ）で抽出する。各抽出は１分あたり４０回転で攪拌することにより行う。塩化メチレン層を集め、硫酸ナトリウム上で乾燥し、次いで蒸留フラスコ中で、２５から６５℃で真空下（１５０ｍバール）に蒸発乾固する。塩化メチレン残留物の重量は、通常、４．５から６％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを含む半濃縮メタノール抽出物の１．５から１．８ｗ／ｗ％の間にある。
【００４３】
実施例ＩＩ
５．１％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを含む４６８．７ｇの乾燥抽出物が実施例Ｉで記述した条件下に得られる。この抽出物を５０−６０℃で９７５ｍＬのアセトニトリル共に１分あたり４０回転で攪拌する。該抽出物が完全に溶解すると、この混合液を０−５℃で１２−１６時間冷却し、極めて低いｒｐｍ（２０ｒｐｍ）で攪拌する。その固体不溶物を濾過又は遠心分離で分離し、５０ｍＬのアセトニトリルで洗浄する。６０−７０℃で１２時間、減圧下（０．５ｍバール）に乾燥した後、７６．１％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを含む粗固体（２９．４３ｇ）が得られる。
【００４４】
実施例ＩＩＩ
実施例ＩＩで記述した条件下で得られる粗固体２９．４３ｇを攪拌（５８ｒｐｍ）しながら７０℃で１時間還流することにより７３５．５ｍＬのメタノールに溶解する。この溶液を周囲温度（１５から４５℃）まで冷却し、次いでシーライト床を通して濾過して澄明な溶液を得る。この濾液を極めて低いｒｐｍ（２０ｒｐｍ）で攪拌し、これに２９５ｍＬのアセトニトリルを徐々に添加する。この混合液を次に０−５℃まで冷却し、１２−１５時間維持する。濾過又は遠心分離により、沈殿物を分離し、メタノールとアセトニトリル（１：１）の混合液１０ｍＬで洗浄する。その生産物を９０−９５℃で２０−３０時間減圧下（０．５ｍバール）で乾燥する。こうして２２．２ｇの灰白色の最終産物が得られる。それは９４．１％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを含む。
【００４５】
最終結晶化の後に得られる母液は蒸発乾固し、１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩの精製のためにリサイクルされる。
【００４６】
実施例ＩＶ
実施例ＩＩで記述した条件の下で得られる粗固体の３０ｇを６５℃で１から２時間還流することにより７５０ｍＬのアセトンに溶解する。この溶液を室温まで冷し、次いでシーライト床を通して濾過する。濾液を極めて低いｒｐｍ（２０ｒｐｍ）で攪拌し、アセトニトリル（２００ｍＬ）をそれに徐々に添加する。この溶液の温度を０−５℃まで下げ、１５−２０時間まで維持する。遠心分離により、沈殿物を分離し、アセトンとアセトニトリルの１：１混合液を用いて該固体を洗浄する。この最終生産物を真空下（０．５ミリバール）に温度８０−９０℃で１２−２０時間乾燥する。こうして、最終生産物（２３．１ｇ）が得られる。それは９３．５％の１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩを含む。
【００４７】
新規方法の利点
ａ）  本方法は単純、且つ費用に対し高い効果を有し、商業的な実施可能性を有する。
ｂ）  本方法はそのプロセスのどの段階においてもクロマトグラフィー技術の長たらしい処理を含まない。
ｃ）  本方法では、多くの工程で溶媒の再利用が可能である。
ｄ）  本方法はタクサスの異なる種の植物の任意の部分の抽出に適用できる。
ｅ）  本方法は一次アルコール抽出物中に存在する天然のパクリタクセルを分離するために使用できる。
ｆ）  原料物質の品質に依存して、１０−デアセチルバッカティン−ＩＩＩの収率は原料物質の含量の６０％から９０％まで変動する。