(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列からなり、５'末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【請求項２】
核酸プローブが、配列番号１２または１３からなる請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは、請求項１または２に記載の核酸プローブである前記方法。
【請求項４】
試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅をＤＮＡポリメラーゼを用いる方法により行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅を核酸プローブの存在下で行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列からなり、５'末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、請求項３記載の方法のためのキット。
【請求項８】
核酸プローブが、配列番号１２または１３からなる請求項７記載のキット。
【請求項９】
膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異を含む領域を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む請求項７または８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵ラ氏島アミロイドタンパク質（Islet Amyloid Polypeptide（IAPP））は２型糖尿病患者の膵ラ氏島に高頻度に沈着しているアミロイドの主要構成成分で、膵β細胞からインスリンと共に血中に分泌されている。IAPPのアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換するミスセンス変異（S20G変異）は日本人２型糖尿病患者の約2.6%、その中でも若年発症者の約10%に存在しており、この変異が存在することで糖尿病の発症リスクが高まるといわれている。
【０００３】
IAPPにS20G変異をもたらす塩基の変異（以下、「IAPP S20G変異」ともいう）が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、PCRで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（PCR-RFLP）で検出を行うことが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
PCRは数分子の鋳型から数10億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。PCR-RFLPはPCR反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことがある。さらに、PCR終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
【０００５】
一方、一般に、変異を含む領域をPCRで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（非特許文献２、特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】
日本糖尿病学会編、「糖尿病遺伝子診断ガイド」、文光堂、ｐ．５６−５９
【非特許文献２】
クリニカルケミストリー(Clinical Chemistry)、2000年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【特許文献１】
特開２００２−１１９２９１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、IAPP S20G変異を検出するのに有効な消光プローブを特定し、IAPP S20G変異を検出する方法及びそのためのキットを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述のプローブを用いる方法に関する文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのGとCのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。本発明者らは、IAPP S20G変異に関し、上記条件を満たす消光プローブを設計し、検出を試みたが、容易に検出を可能とする消光プローブは得られなかった。
【０００９】
本発明者らは、IAPP S20G変異を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりIAPP S20G変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１０】
（１）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号247で終わる13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【００１１】
（２）核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する（１）の核酸プローブ。
【００１２】
（３）一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは、（１）または（２）の核酸プローブである前記方法。
【００１３】
（４）試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む（３）の方法。
【００１４】
（５）増幅をDNAポリメラーゼを用いる方法により行う（４）の方法。
【００１５】
（６）増幅を核酸プローブの存在下で行う（５）の方法。
【００１６】
（７）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号247で終わる13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、（３）の方法のためのキット。
【００１７】
（８）核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する（６）のキット。
【００１８】
（９）膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異を含む領域を、DNAポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む（７）または（８）のキット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明プローブ及び本発明検出方法
本発明プローブは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号247で終わる13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
【００２０】
本発明プローブは、配列番号１に示す塩基配列（IAPP S20G変異における変異型の塩基を有する配列）において塩基番号247で終わる13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有する他は、特許文献１に記載された消光プローブと同様でよい。本発明に使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号１２及び１３が挙げられる。蛍光色素としては、特許文献１に記載されたものが使用できるが、具体例としては、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標) FL等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明検出方法は、一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは本発明プローブであることを特徴とする。
【００２２】
本発明検出方法は、IAPPをコードするDNAのIAPP S20G変異を含む領域を増幅すること、及び、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅及び融解曲線分析（Tm解析）の方法に従って行うことができる。
【００２３】
核酸増幅の方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのTmを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００２４】
以下、PCRを用いる場合を例として、さらに説明する。PCRに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のPCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びTmは、通常には、10mer〜40merで40〜70℃、好ましくは15mer〜25merで55〜60℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのTmはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Tm値は最近接塩基対(Nearest Neighbor)法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号２及び３に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００２５】
PCRは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなくTm解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのTmやPCRの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００２６】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２７】
【表１】
ＤＮＡ断片                101〜108分子／反応
プライマー                200〜1000Ｍ
プローブ                  100〜1000ｎＭ
ヌクレオチド            各20〜200μＭ
DNAポリメラーゼ           0.01〜0.03単位／μｌ
Tris-HCl(pH 8.4〜9.0)     5〜20ｍＭ
ＭｇＣｌ2                 1.5〜3ｍＭ
ＫＣｌ                    10〜100ｍＭ
グリセロール              0〜20％
（最終液量：10〜100μｌ）
【００２８】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常25〜40回繰り返す。
(1) 変性、90〜98℃、1〜60秒
(2) アニーリング、60〜70℃、10〜60秒
(3) 伸長、60〜75℃、10〜180秒
【００２９】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、60〜70℃、10〜180秒の条件が挙げられる。
【００３０】
Tm解析は、本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従って行うことができる。蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。Tm解析における昇温速度は、通常には、0.1〜1℃／秒である。Tm解析を行うときの反応液の組成は、プローブとその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が1.5〜5 mM、pHが７〜９である。PCR等のDNAポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままTm解析に用いることができる。
【００３１】
Tm解析の結果に基づくIAPP S20G変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出の他、変異型DNAの定量、野生型DNAと変異型DNAの割合の測定も包含する。
【００３２】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号247で終わる13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含むことを特徴とする。
【００３３】
消光プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００３４】
本発明検出キットは、消光プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にDNAポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明検出キットにおいて消光プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３７】
【実施例１】
ヒトIAPP遺伝子のS20G変異を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、S20G変異を含む部分を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００３８】
【表２】
プライマー
名称  配列(5'→3')                      mer    位置  配列番号
F   cacatgtgcaacgcagcg                  18    192-209    2
R   ctcttgccatatgtattggatccc            24    296-273    3
【００３９】
次に、表３に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表３中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、IAPP S20G変異の部位を示し、3'末端の(P)は、リン酸化されていることを示す。BODIPY(商標) FL及びTAMRA(商標)による標識は、常法に従って行った。
【００４０】
【表３】
プローブ
名称          配列(5'→3')                            mer 位置 配列番号
5FL-mt-5-14 (BODIPY FL)-cattccGgcaacaa-(P)            14  229-242    4
5FL-mt-5-15 (BODIPY FL)-cattccGgcaacaac-(P)           15  229-243    5
5FL-wt-5-22 (BODIPY FL)-cattccAgcaacaactttggtg-(P)    22  229-250    6
5FL-mt-5-22 (BODIPY FL)-cattccGgcaacaactttggtg-(P)    22  229-250    7
3FL-wt-4-25 caccaaagttgttgcTggaatgaac-(BODIPY FL)     25  250-226    8
3FL-mt-3-22 gaatggcaccaaagttgttgcC-(BODIPY FL)        22  256-235    9
5FL-wt-2-24 (BODIPY FL)-cTggaatgaactaaaaaatttgcc-(P)  24  236-213   10
5FL-mt-2-24 (BODIPY FL)-cCggaatgaactaaaaaatttgcc-(P)  24  236-213   11
5FL-mt-1-21 (BODIPY FL)-caaagttgttgcCggaatgaa-(P)     21  247-227   12
5T-mt-1-21  (6-TAMRA)-caaagttgttgcCggaatgaa-(P)       21  247-227   12
5FL-mt-1-18 (BODIPY FL)-caaagttgttgcCggaat-(P)        18  247-230   13
5T-mt-1-18  (6-TAMRA)-caaagttgttgcCggaat-(P)          18  247-230   13
5FL-wt-1-18 (BODIPY FL)-caaagttgttgcTggaat-(P)        18  247-230   14
【００４１】
IAPP S20G周辺領域約600bp（配列番号１）を組み込んだプラスミドをサンプルとして、Smart Cycler System（Cephied)を用い、以下の条件でPCR及びTm解析を行った。Tm解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ450〜495nm及び505〜537 nm(BODIPY FL)、527〜555 nm及び565〜605 nm(TAMRA)であった。
【００４２】
【表４】
反応液組成
H2O                             15.95μL
10×Gene Taqバッファー           2.5μL
40% グリセロール                 3.125μL
各10mM dATP,dUTP,dGTP,dCTP       0.5μL
2U/μL ウラシル-N-グリコシラーゼ 0.05μL
5μM プローブ                    1μL
100mM MgCl2                      0.375μL
100μM プライマーF               0.25μL
100μM プライマーR               0.125μL
5U/μL Gene Taq                  0.125μL
サンプル（0〜2000コピー）        1μL
合計                            25μL
【００４３】
【表５】
0004454249.tif 000002
【００４４】
各プローブを用いてPCR及びTm解析を行った結果、プローブ5FL-mt-1-18、5T-mt-1-18、5FL-mt-1-21および5T-mt-1-21を用いたときのみ、Tm解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。なお、各プローブのIAPP S20G変異を含む塩基配列に対する配置を図１及び２に示す。図中、Wild配列（配列番号１５）及びmutant配列（配列番号１６）は、配列番号１の塩基配列の塩基番号213〜262に相当する。また、図中、Ｆは蛍光色素を示す。図１及び２に示す配置からみて、プローブがTm解析で使用できるかどうかは、蛍光色素を結合させたCの位置に依存すると考えられ、プローブの長さは、多型部位を含む限り、あまり重要でないと考えられる。
【００４５】
以下、プローブ5FL-mt-1-21を用いて、ゲノムDNAの絶対量に関する感度、再現性、及び、変異型の割合に関する検出感度を検討した。
【００４６】
上記プラスミドの代わりに、ゲノムDNA（野生型）をそれぞれ、０、20、200及び2000コピー含むサンプルを用いて、上記の方法を繰り返した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、20コピーであっても検出可能であることが示された。
【００４７】
次に、野生型の塩基配列（配列番号１の塩基配列において塩基番号285がAである他は上記プラスミドと同じ）を有するプラスミドを調製した。野生型プラスミドとこの変異型プラスミドとを混合したサンプル(wt/mt)を１０個調製し、野生型プラスミドのみのサンプル(wt/wt)及び変異型プラスミドのみのサンプル(mt/mt)とともに、上記の方法を繰り返した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、本方法は再現性に優れることが示された。
【００４８】
さらに、野生型プラスミドと変異型プラスミドとの比率を変えて、上記の方法を繰り返した。結果を図５に示す。比率に応じて、両ピークの高さが変化し、両ピークの高さの比に基づいて、比率を求めることが可能なことが示された。
【００４９】
なお、図３〜５において縦軸は、蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（-dF/dt）、横軸は温度（℃）である。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、IAPP S20G変異を検出するのに有効な消光プローブが提供され、さらに、それを用いるIAPP S20G変異を検出する方法及びそのためのキットが提供される。Tm解析は数十秒で完了するため、検出に必要な時間も大幅に短略化出来る。プローブの存在下での核酸の増幅とTm解析を組み合わせる本発明の好ましい態様によれば、核酸の増幅後にプローブのTmを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００５１】
【配列表】
0004454249.tif 000003
0004454249.tif 000004
0004454249.tif 000005
0004454249.tif 000006
0004454249.tif 000007
0004454249.tif 000008
0004454249.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】  変異の識別不可能な消光プローブの位置を示す。
【図２】  変異の識別可能な消光プローブの位置を示す。
【図３】  実施例１の方法のゲノムDNAの絶対量に関する感度を示す。
【図４】  実施例１の方法の再現性を示す。
【図５】  実施例１の方法の変異型の割合に関する検出感度、定量性を示す。
【図１】
0004454249.tif 000010
【図２】
0004454249.tif 000011
【図３】
0004454249.tif 000012
【図４】
0004454249.tif 000013
【図５】
0004454249.tif 000014