(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４つのヒトｘウシ系統再類別体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルス及び生理学的に許容可能な担体を含む、生後６ヶ月未満の乳児用多価免疫原性組成物であって、該各ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスは、血清型１、２、３又は４の抗原的に異なるヒトＶＰ７血清型を含み、かつ、該各再類別体ロタウイルスの残りの１０個の遺伝子は、ウシロタウイルスがＵＫ系統に由来し、そして上記組成物は、該ロタウイルス再類別体の構成成分の各々が１０6.0プラーク形成単位未満の用量で生後６ヶ月未満の乳児に投与されるとき、一過性低レベル発熱を引き起こすことなく抗原的に異なるヒトロタウイルスＶＰ７血清型の各々に対して免疫原性応答を誘導する前記組成物。
【請求項２】
前記親ヒトロタウイルスが、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、ＶＰ７血清型５、及びＶＰ７血清型９から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヒトｘウシＵＫ系統ロタウイルスのＶＰ７血清型抗原が、再類別体ロタウイルスにより与えられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＶＰ７血清型１０のヒトロタウイルスと免疫学的に交差反応性であるウシロタウイルスｘウシＵＫロタウイルス再類別体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウシｘウシ再類別体ロタウイルスが、ウシロタウイルスＫＣ−１系統からのＶＰ７血清型１０抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウシｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスが、寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１５を持つＫＣ−１ｘＵＫクローン３２−１−１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、及びＶＰ７血清型５のヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、及びＶＰ７血清型９のヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、ＶＰ７血清型５、及びＶＰ４血清型１ＡのヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、ＶＰ７血清型９、及びＶＰ４血清型１ＡのヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、ＶＰ７血清型５、及びＶＰ７血清型９のヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＶＰ７血清型１、ＶＰ７血清型２、ＶＰ７血清型３、ＶＰ７血清型４、ＶＰ７血清型５、ＶＰ７血清型９、及びＶＰ４血清型１ＡのヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスを含む多価組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＶＰ７血清型１０のウシｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスをさらに含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウシｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスが、ウシロタウイルスＫＣ−１系統からのＶＰ７血清型１０抗原を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記再類別体ロタウイルスが、寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１７を持つＨＤｘＢＲＶ−１クローン４７−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１６を持つＨＤＳ１ｘＢＲＶ−１クローン６６−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１１を持つＨＰｘＢＲＶクローン２２−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１２を持つＨＳＴ３ｘＢＲＶ−２クローン５２−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１３を持つＩＡＬＳｘＵＫクローン３３−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１４を持つＡＵ３２ｘＵＫクローン２７−１−１；又は寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１５を持つＫＣ−１ｘＵＫクローン３２−１−１である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記親ヒトロタウイルスが、血清型１を持つＤ系統、血清型２を持つＤＳ−１系統、血清型３を持つＰ系統、及び血清型４を持つＳＴ３系統である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒトｘウシＵＫ再類別体ロタウイルスが、寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１７を持つＨＤｘＢＲＶ−１クローン４７−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１６を持つＨＤＳ１ｘＢＲＶ−１クローン６６−１−１；寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１１を持つＨＰｘＢＲＶクローン２２−１−１；又は寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６１２を持つＨＳＴ３ｘＢＲＶ−２クローン５２−１−１である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生理学的に許容可能な担体が、クエン酸塩緩衝液である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が凍結乾燥形態である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒトｘウシＵＫ再類別体の各々が、103〜105プラーク形成単位の用量を提供するよう処方される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
ヒトｘウシＵＫ再類別体の各々が、10４〜106プラーク形成単位の用量を提供するよう処方される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ヒトｘウシＵＫ再類別体の各々が、10５〜106プラーク形成単位の用量を提供するよう処方される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
有意な一過性の低レベル発熱を伴わずにヒトロタウイルスＶＰ７血清型抗原に対する免疫原性応答を生成するよう免疫系を刺激するための方法に使用されるための、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の多価免疫原性組成物であって、該方法は、前記多価免疫原性組成物を投与することを含み、ここで、各ＶＰ７血清型は、106.0プラーク形成単位未満の用量で投与される、前記多価免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、４つのヒトｘウシ再類別体ロタウイルスを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスが、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型１ｘウシロタウイルスＵＫ系統、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型２ｘウシロタウイルスＵＫ系統、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型３ｘウシロタウイルスＵＫ系統、及びヒトロタウイルスＶＰ７血清型４ｘウシロタウイルスＵＫ系統を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、前記免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、103〜105プラーク形成単位の用量で投与される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、105〜106プラーク形成単位の用量で投与される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスの各々が逐次個体に投与される、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ロタウイルスは、乳児および幼児の急性脱水性下痢の主因である。ロタウイルス疾患は、開発途上国における乳児および幼児の胃腸炎死の25％〜30％を占め、そして米国における５歳未満の小児の約50,000〜100,000件の入院を引き起こしている。このため、乳児および幼児における重症ロタウイルス疾患を予防するための安全な有効ワクチンが必要とされている。
【０００２】
ロタウイルスワクチン開発のための主な戦略は、ヒトおよび動物ロタウイルスの抗原関連性およびヒトにおける動物ロタウイルス系統のビルレンス低減を利用する「ジェンナー」法に基づいている（Kapikian et al., inVaccines, Chanock et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York, pp.151-159（1987））。このアプローチを用いていくつかの候補経口ロタウイルス生ワクチンが開発されてきたが、この場合、非ヒト宿主に由来する抗原的関連生ウイルスはそのヒトウイルス対応物に対する免疫感作のためのワクチンとして用いられる。ヒトにワクチン接種するために用いられてきた動物ロタウイルスの例としては、ウシロタウイルスＮＣＤＶ系統（RIT4237, Vesikari et al., Lancet, 2:870-811（1983））、ウシロタウイルスＷＣ３系統（Clark et al., Am. J.Dis. Child., 140:350-356（1986））およびアカゲザルロタウイルス（ＲＲＶ）ＭＭＵ18006系統（米国特許第4,571,385号、Kapikian et al., Vaccine 85, eds., Lerner et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp.357-367（1985））が挙げられる。
【０００３】
異なる一価ウシおよび一価サルロタウイルスワクチンの間の防御効力は、可変性であることが立証されている（Vesikari in Viral Infections of the Gastrointestinal Tract (Kapikian, Ed., Marel Dekker, Inc., pp.419-442（1994）; Kapikian （同上）pp.443-470（1994））。さらに、ヒトでの満足のいく免疫応答（107〜108プラーク形成単位（pfu)）を産生するために、高濃度のウシロタウイルスが必要とされてきた（Vesikari et al., Ped. Inf. Dis. 4:622-625（1985）; Bernstein et al., J. Infect. Dis. 162:1055-1062（1990））。これらの組成物の可変性効力は、一部は、生後２〜５ヶ月の乳児の標的集団がワクチン接種後にホモタイプ免疫応答を特徴的に発現する、という事実によると考えられる（Kapikian et al., Adv. Exp. Med. Biol., 327:59-69（1992）; Bernstein et al., J. Infect. Dis., 162:1055-1062（1990）; Green et al., J. Infect. Dis., 161:667-679（1990）;およびVesikari, Vaccine, 11:255-261（1993））。
【０００４】
臨床的に関連のあるヒトロタウイルスは、Ａ群ロタウイルスの成員である。これらのウイルスは、ウイルス中間殻上に位置するタンパク質であるＶＰ６により媒介される共通群抗原を共有する。さらに、血清型特異性は、ウイルス外殻（しばしばウイルスキャプシドとも呼ばれる）上に位置するＶＰ４（プロテアーゼ感受性またはＰ型）およびＶＰ７（糖タンパク質またはＧ型）タンパク質の存在によっており、これらはともに、別々に中和抗体を誘導する（Kapikian et al.,In Virology, Fields, ed. pps.1353-1404（1995））。
【０００５】
ヒトに感染するＡ群ロタウイルスは、中和検定により10種類の異なるＶＰ７血清型に分類されている。アミノ酸配列分析は、各血清型内では、２つの主要可変部内のアミノ酸同一性は高い（85〜100％）が、しかしながら、異なる血清型の系統間のアミノ酸同一性は有意に低い（Green et al., Virol. 168:429-433（1989）; Green et al., Virol. 161:153-159（1987）;およびGreen et al., J. Virol. 62:1819-1823（1988））、ということを示している。ウイルス中和検定またはＶＰ７の配列分析により確定した場合のロタウイルス間の関係における一致が実証されている。したがって、臨床試験では、その血清型内の代表的ロタウイルス系統として参照系統がルーチンに用いられ得る。
【０００６】
４つの疫学的および臨床的に重要なＧ血清型（ＶＰ７）（１、２、３および４と番号を付けた）の各々に対する防御を達成するために、再類別体ロタウイルスの産生により、ジェンナー法が修正された。再類別体ロタウイルス系統は、動物起源のロタウイルス（即ちアカゲザルまたはウシロタウイルス）およびヒトロタウイルス系統で組織培養細胞を同時感染させることにより構築された。動物系統のＶＰ７に向けられる一組のモノクローナル抗体に同時感染の子孫を曝露することにより、ヒト系統殻のＶＰ７をコードする単一ヒトロタウイルス遺伝子および動物系統殻の１０の残りのロタウイルス遺伝子を含有する同時感染中に産生される再類別体ウイルスが選択された（例えば、米国特許第4,571,385号；Midthun et al., J. Clin. Microbiol.24:822-826（1986）;およびMidthun et al., J. Virol. 53:949-954（1985）参照）。
【０００７】
ヒト系統殻のＶＰ遺伝子を含有するヒトｘアカゲザルロタウイルス再類別体およびヒトｘウシ再類別体の研究は、動物ロタウイルス親のＶＰ４中和タンパク質がこれらのヒトｘ動物ロタウイルス再類別体をワクチン接種された乳児における免疫応答を支配する、ということを実証した。これは、おそらくは、子宮内で母親から子供に譲渡された抗体の中に動物ロタウイルスＶＰ４が存在しないことを反映する。それにもかかわらず、母親由来ＶＰ７抗体により部分的に鈍化されるヒトロタウイルスＶＰ７に対する免疫応答は、防御を提供するのに十分であり、したがって、ＶＰ７抗体は変法ジェンナー法の基礎を形成する（Flores et al., J.Clin.Microbiol. 27:512-518（1989）; Perez-Schael et al., J. Clin. Microbiol. 28:553-558（1990）; Flores et al., J. Clin. Microbiol. 31:2439-2445（1993）; Christy et al., J. Infect. Dis. 168:1598-1599（1993）; Clark et al., Vaccine 8:327-332（1990）; Treanor et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 14:301-307（1995）; Madore et al., J. Infect. Dis. 166:235-243（1992）;and Clark et al., J. Infect. Dis. 161:1099-1104（1990））。
【０００８】
単一ヒトロタウイルス遺伝子、即ちＶＰ７をコードする遺伝子を保有する単一アカゲザル再類別体を用いた試験において、このような再類別体の防御免疫学的応答が生後６ヶ月未満の乳児においては特徴的にホモタイプであるということが観察された（Green et al., J. Inf. Dis. 161:667-679（1990））。この観察は、ロタウイルス疾患に対する免疫感作におけるＶＰ７関連免疫の重要性に関するさらなる証拠を提供した。
【０００９】
一価および四価ヒトｘアカゲザルロタウイルス再類別体ワクチンを用いた一般的経験は、一過性低レベル有熱性エピソードがワクチン接種後３〜４日目に年少幼児の約３分の１に起こるというものであった（Bernstein et al., JAMA 273:1191-1196（1995）; Flores et al., Lancet 336:330-334（1995）; Perez-Schael et al., J. Clin. Microbiol. 28:553-558（1990）; Flores et al., J. Clin. Microbiol. 31:2439-2445（1993）; Halsey et al., J. Infect. Dis. 158:1261-1267（1988）; Taniguchi et al., J. Clin. Microbiol. 29:483-487（1991）; Simasathien et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 13:590-596（1994）; Madore et al., J. Infect. Dis. 166:235-243（1992）;and Joensuu et al., Lancet 350:1205-1209（1997））。
【００１０】
ウシロタウイルスＮＣＤＶおよびＷＣ３系統（ＶＰ７血清型６）を用いたヒトにおける研究の結果は、これらの特定のウシロタウイルス系統が発熱またはその他の反応を引き起こすとは考えられないことを示す。血清型６  ＶＰ７は、ヒトロタウイルス疾患において重要であるヒトロタウイルス上に存在することが知られているということに留意すべきである。さらに、ウシロタウイルスは、ヒトに投与された場合にアカゲザルロタウイルスと同様に免疫原性であることは見出されなかった。ウシロタウイルスＮＣＤＶ系統（ＲＩＴ４２３７ワクチン）は、乳児および幼児において５つより多い効能試験で評価された。これらの試験では、ウシＲＩＴ４２３７ワクチンが107.8〜108.3組織培養感染用量50（ＴＣＩＤ50）の用量範囲で、通常は108.0ＴＣＩＤ50を上回る投与量で、投与された。さらに、用量−応答試験において、Vesikari等（Ped. Infect. Dis., 4:622-625（1995））は、106.3ＴＣＩＤ50の用量でワクチンを投与された場合に生後４〜６ヶ月の乳児の15％（2/13）がホモタイプ抗体応答を発現し、107.2ＴＣＩＤ50の用量では71％（10/14）、そして108.3ＴＣＩＤ50の用量では100％が発現したことを観察した。したがって、最適免疫原性を生じるこのウシロタウイルス系統の用量は、108.0ＴＣＩＤ50の範囲であることが確定された。
【００１１】
ヒトにおけるアカゲザルロタウイルスとウシロタウイルスの感染性および免疫原性の直接比較では、105プラーク形成単位（pfu）のアカゲザルロタウイルス（ＲＲＶワクチン）または108.3pfuのＲＩＴ4237が生後６〜８ヶ月の小児に投与された（Vesikari et al., J. Infect. Dis. 153:832-839（1986））。ＲＲＶワクチンは、被ワクチン接種者の81％にホモタイプ中和抗体応答を誘導し、一方2000倍より多い用量のウシＲＩＴ4237ワクチンは被ワクチン接種者の45％にホモタイプ中和抗体を誘導しただけであった（これは統計学的有意差であった）。
【００１２】
効能試験は、ＷＣ３ウシロタウイルス系統を用いても実施された。これらの試験では、ＷＣ３系統は、107.0〜107.3pfuの用量範囲で乳児および幼児に投与された（Clark et al., Am. J. Dis. Child. 140:350-356（1986））。有意の免疫原性に必要とされる用量に関するデータは提供されなかったが、Clark等は、ＷＣ３系統がＲＩＴ4237の場合と同様の安全特性を保有すると考えられることに、さらに、ウシＲＩＴ4237とともに用いた場合の少なくとも５分の１の用量で免疫原性であったが、しかしこの免疫原性は、アカゲザルロタウイルスワクチンよりかなり高い用量を必要としたことに注目した。
【００１３】
ＷＣ３ロタウイルス系統は、種々のヒトロタウイルス系統を用いて再類別体を生成するための親系統の１つとして用いられてきた（Clark et al., J. Infect. Dis.（補遺）174:73-80（1996））。一効能試験では、ＷＣ３およびヒトロタウイルスＶＰ７血清型１の107.3pfuの一価再類別体が３用量計画で乳児および幼児に投与された（Treanor et al., Ped. Inf. Dis. J. 14:301-307（1995））。免疫原性データは、この試験に関しては報告されなかった。別の効能試験では、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型１、２または３を有するウシロタウイルスＷＣ３の３つのヒトＶＰ７再類別体を、そして第四番目の構成成分として、ウシロタウイルスＷＣ３由来の残りの遺伝子を有するヒトロタウイルスＶＰ４タンパク質を保有するヒトｘウシ再類別体を含有する四価処方物が用いられた。３つのＶＰ７再類別体の各々は107.0pfuの量量で用いられたが、一方ＶＰ４再類別体は5 x 106.0pfuの投与量で投与された（Clark et al., Arch. Virol.（補遺）12:187-198（1996）; Clark et al., J. Infect. Dis.（補遺）174:73-80（1996）; Vesikari et al., Arch. Virol.（補遺）12:177-186（1996））。この試験に関する免疫原性データは報告されていないが、しかしこれらの試験は、アカゲザルロタウイルスまたはヒトｘアカゲザル再類別体ワクチンを用いて得られたものと同様の防御応答を特徴的に生じるためには、107〜108.3pfuの投与量を要したことを示す（Clark et al., Arch. Virol.（補遺）12:187-198（1996）; Vesikari et al., Arch. Virol.（補遺）12:177-186（1996））。この投与量は、アカゲザルロタウイルスおよびヒトｘアカゲザルロタウイルス再類別体ワクチン処方物に関する値の10〜100倍である。
【００１４】
多価ロタウイルスワクチン組成物が開発された。特に、ヒト血清型１、２および３を示す三つのヒトｘアカゲザルロタウイルス再類別体はアカゲザルロタウイルス系統（ＲＲＶ）と併合されて（後者はヒト血清型３と中和特異性を共有する）、四価ワクチン組成物を生成する（Perez-Schael et al., J. Clin. Microbiol. 28:553-558（1990）; Flores et al., J. Clin. Microbiol. 31:2439-2445（1993））。一価アカゲザルロタウイルスを用いた場合と同様に、ヒトｘアカゲザル再類別体ロタウイルスワクチン組成物は、ワクチン接種された乳児の約15％〜33％に一過性低レベル有熱性症状を生じることが判明した（Perez-Schael et al.,同上）。この一過性有熱性エピソードまたは症状は、一般的には親および臨床試験のヘルスケアプロバイダーに許容可能であるとみなされるけれども、ある状況では、例えばロタウイルスに対する低レベルの受動的獲得母親抗体等を有し得る未熟乳児においては、おそらくは妨害物であり得る。
【００１５】
米国食品医薬品局により現在認可されている動物ロタウイルスベースのロタウイルスワクチン組成物は、ロタウイルス感染に対するヒトにおける重要レベルの防御を提供するが、しかし高感染性を有し、ほとんどまたは全く有熱性応答を生じない多価ワクチン組成物が、特にある種の臨床状況に関しては望ましい。
発明の要約
本発明は、ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスの免疫原性組成物を提供する。ヒトｘウシ再類別体は、ヒト宿主における一過性低レベル発熱を引き起こすことなく当業界の従来の実際的制限を克服するのに十分な感染性を有する用量での現在および将来的臨床的重要性を有するヒトロタウイルスの各血清型に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で多価組成物中に提供される。免疫原性組成物のさらに別の構成成分としては、生理学的に許容可能な担体および任意に宿主の免疫応答を増強するためのアジュバントが含まれ得る。ある実施態様では、ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスＶＰ７抗原は、ヒト親ロタウイルス系統から、例えば血清型１、血清型２，血清型３，血清型４，血清型５，血清型９のヒトロタウイルスから、または血清型１０のウシ親ロタウイルス系統から得られる。その他のロタウイルスタンパク質をコードする残りの遺伝子は、ウシロタウイルス系統から得られる。好ましい実施態様では、ウシロタウイルスUK-Compton系統が用いられる。ＶＰ血清型１、２、３および４に関する適用範囲を提供する特に好ましい免疫原性組成物は、それぞれヒトｘウシロタウイルス再類別体ＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫ、ＰｘＵＫおよびＳＴ３ｘＵＫを含む四価組成物を包含する。
【００１６】
さらに別の実施態様では、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型５および／または９に対応する付加的ヒトｘウシロタウイルス再類別体、あるいはヒトロタウイルスＶＰ７血清型１０と交差反応性のウシｘウシ再類別体、あるいはヒトロタウイルスＶＰ４血清型１Ａを含有するヒトｘウシ再類別体ロタウイルスが、広範囲の用途を有する免疫原性組成物を提供するために含まれ得る。中でも特に興味深いのは、ロタウイルス再類別体ＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫ、ＰｘＵＫ、ＳＴ−３ｘＵＫおよびＷａ（ＶＰ４）ｘＵＫ系統を包含する五価組成物；前記の五価組成物＋ＶＰ７血清型９ｘＵＫ系統を包含する六価組成物、ならびに前記の六価組成物＋ＶＰ７血清型５ｘＵＫを包含する七価組成物、または前記の七組成物＋ＶＰ７血清型１０ｘＵＫ系統である。それらがヒトにおける有意の疾患を生じることが認識されている場合のロタウイルスのさらに別の系統は、ウシロタウイルス再類別体に作製されて、本発明の免疫原性組成物に付加され得る。本発明の免疫原性組成物は、典型的には、各ロタウイルスＶＰ７またはＶＰ４再類別体の約106.0プラーク形成単位未満の用量で処方される。投与量が約105〜約106未満プラーク形成単位であるのが特に好ましい。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、一過性低レベル発熱をほとんどまたは全く伴わずにヒトロタウイルス抗原に対する免疫原応答を生じるために免疫系を刺激するための方法を提供する。これらの方法は、ヒトロタウイルスの少なくとも４つのＶＰ７血清型を包含する免疫原的に十分な量の多価ヒトｘウシ再類別体ロタウイルス組成物を個体に投与することを包含する。好ましい実施態様では、組成物を包含するヒトｘウシ再類別体ロタウイルスとしては、ヒトロタウイルス血清型１ｘウシロタウイルスＵＫ系統、ヒトロタウイルス血清型２ｘウシロタウイルスＵＫ系統、ヒトロタウイルス血清型３ｘウシロタウイルスＵＫ系統およびヒトロタウイルス血清型４ｘウシロタウイルスＵＫ系統が挙げられる。多価組成物としては、即ち、血清型５および／または血清型９のヒトｘウシ再類別体ロタウイルス、あるいはヒトロタウイルスＶＰ７血清型１０特異性を有するウシｘウシ再類別体ロタウイルス、あるいはヒトロタウイルス血清型ＶＰ４  １ＡｘウシロタウイルスＵＫ再類別体等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、付加的ロタウイルス血清型はヒト疾患において重要であると認識されているので、それらは、臨床的意義を有する現在認識されておりそして新たに認識されたロタウイルスに対する免疫原性応答を生成するために本発明の免疫原性組成物に付加され、免疫系を刺激するための方法にも用いられ得る。
【００１８】
特定の実施態様の説明
本発明は、ヒトに用いるための免疫原性ロタウイルス組成物を提供する。本明細書中に記載した組成物は、付随する一過性低レベル発熱応答を伴わずにロタウイルス特異的抗体応答を誘導する処方物中にＡ群ヒトロタウイルスのほとんどの臨床的に関連する血清型の各々のうちの１つを提供するために、一価再類別体ヒトｘ動物等尾多得るを併合することにより生成される。
【００１９】
したがって、本発明の免疫原性組成物は、特に、多価組成物を生成するために、再類別体ヒトｘウシロタウイルスと生理学的に許容可能な担体の組合せを包含する。特定の実施態様では、多価免疫原性組成物は、四価組成物を生成するために、世界中で最も流布しているヒトロタウイルスの臨床的に関連のある血清型の４つの再類別体ヒトｘウシロタウイルスの組合せを包含する。免疫原性組成物は、ロタウイルスに対する免疫学的防御を必要とする個体、例えば乳児、小児または成人に、免疫学的に十分な量で投与される。個体がその後に野生型ヒトロタウイルス系統に感染した場合に、組成物は、重症ロタウイルス疾患、例えば重症下痢および脱水の症状に対して少なくとも部分的に防御性である免疫応答の生成を引き出す。免疫原性組成物の再類別化ウイルスは宿主栄養路に感染するので、ワクチン接種の結果、何らかの軽症疾患が起こり得るが、しかし典型的には本発明の免疫原性組成物は、被ワクチン接種者において臨床的に関連する発熱または反応を引き起こさない。ワクチン接種後、免疫原生組成物を構成する血清型のロタウイルスを中和し得る検出可能レベルの宿主産生血清抗体が存在する。特に、本発明の多価免疫原性組成物は、異なる環境において流布している臨床的に関連するＡ群ヒトロタウイルスの、すべてではないとしても、ほとんどに対して免疫学的応答を生じる。本発明の教示は、臨床的に関連することが現在認識されているヒトロタウイルス血清型に限定されず、将来、臨床的に関連があるとして出現するヒトロタウイルスすの血清型も含む。
【００２０】
本発明の多価免疫原性組成物の一構成成分である再類別化ロタウイルスは、単離化、そして典型的には精製化形態である。単離化とは、細胞培養またはその他の系の野生型ウイルスおよびその他の異種構成成分のような、その製造のその他の細胞およびウイルス生成物から単離された再類別化ロタウイルスを指す。
一般に、ロタウイルス再類別体は、組織培養適応動物ロタウイルス、即ちウシ、アカゲザル等と、組織培養適応ヒトロタウイルスとを用いた培養中の哺乳類細胞の同時感染により生成される。典型的には、アフリカミドリザル腎臓（ＡＧＭＫ）細胞が、同時感染のための宿主細胞として用いられる。動物およびヒトロタウイルス系統による同時感染後、所望の再類別体の選択は、典型的には、同時感染化培養の増殖収量を、ヒトロタウイルス遺伝子に置き換えられるものである動物ロタウイルス遺伝子のタンパク質生成物に特異的な中和抗体に曝露することにより成し遂げられる（米国特許第4,571,385号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照）。特に、ウシロタウイルスＶＰ７および／またはＶＰ４タンパク質に特異的なポリクローナル血清またはモノクローナル抗体が用いられ得る。数回のプラーク精製および継代培養後、選定再類別体が、血清型および遺伝子型に関して特性化される。血清型は、典型的には、プラーク低減中和（ＰＲＮ）検定または酵素イムノアッセイにより確定される。遺伝子型は、典型的には、ウイルスゲノムのゲル電気泳動およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより確定される。ヒトＶＰ７またはＶＰ４遺伝子のみを有するロタウイルス再類別体は、典型的には、本発明の多価免疫原性組成物のために選択される。多数のヒトロタウイルス遺伝子を包含する再類別体も用いられ得る。この点では、当該再類別体ロタウイルスは、特に、ヒトロタウイルスＶＰ７および／またはヒトロタウイルスＶＰ４遺伝子生成物をコードするものである。
【００２１】
本発明において、特に好ましいロタウイルス再類別体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｓ）は、ＶＰ７をコードするヒトロタウイルス遺伝子およびウシロタウイルス起源の残りの１０個のロタウイルス遺伝子を包含するヒトロタウイルスおよびウシロタウイルス再類別体である。ウシロタウイルスＵＫ系統（Woode et al., Res. Vet. Sci. 16:102-105（1974）; Bridger and Woode, Br. Vet. J., 131:528-535（1975））は、その由来のために、そして本発明により実証されるように、ヒトにおけるその高レベルの感染性のために、特に好ましい。本明細書中で実証されるＵＫウシロタウイルス再類別体の高感染レベルは、より低レベルの用量が必要とされることを意味し、したがって、用量当たりの製造コストはその他の現在知られているウシロタウイルス再類別体ワクチンより有意に低くされるはずである。他の動物ロタウイルス系統も、各ロタウイルスに関して106.0プラーク形成単位未満の投与量で投与された場合に、組成物が被ワクチン接種者において血清学的応答を誘導し得る、そして一過性低レベル発熱応答を生じない限り、再類別体ロタウイルスを製造するために用いられ得る。例えば、ある実施態様では、再類別体ロタウイルスは、ヒトＶＰ７血清型１０と免疫学的に交差反応性である動物ＶＰ７抗原を包含する。この再類別体ロタウイルスは、ウシｘウシ再類別体であり得る。
【００２２】
代替的実施態様では、特定血清型の再類別体ロタウイルスは、予め得られた再類別体を用いて生成され得る。例えば、付加的ウシＵＫ再類別体を生成するためには、ヒトロタウイルスＶＰ７血清型１Ｄ系統ｘウシＵＫ再類別体ＨＤ／ＢＲＶ−１（ATCC VR-2069）を用いて、ヒトＶＰ７血清型２、３、４、９および／またはウシロタウイルスＶＰ７血清型１０を有するヒトロタウイルスｘウシＵＫ再類別体を生成し得る。用いられる方法は前記のものと同様であるが、但し、親ヒトロタウイルス再類別体のＶＰ７血清型に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル中和抗体を用いて、所望のヒト（および／またはウシ）ロタウイルスＶＰ７血清型の新規の再類別体を選択する。他の臨床的に関連するヒトＶＰ４またはＶＰ７血清型が単離および同定される場合、新規に発見される血清型の再類別体ロタウイルスが所望の方法により生成され得るということも、本発明の一部として意図される。
【００２３】
再類別化ロタウイルスの増殖は、ロタウイルス増殖を支持する多数の細胞培養中で生じ得る。ワクチン用途のためのロタウイルス再類別体の増殖のために好ましい細胞培養としては、一次または二次サルアフリカミドリザル腎細胞（ＡＧＭＫ）、定性化二倍体サルＦＲｈＬ−２細胞および定性化サル異数体ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞が含まれる。細胞は、典型的には、約0.1〜1.0／細胞またはそれ以上の範囲の感染多重度でロタウイルス再類別体を接種され、ウイルス複製に適した条件下で約３〜５日間、あるいはウイルスが適切な力価に達するのに必要な期間培養される。ロタウイルス再類別体は感染細胞培養から収穫され、典型的には周知の清澄化手法により、例えば遠心分離によって細胞構成成分から分離され、そして所望により当業者に周知の手法を用いて精製され得る。
【００２４】
免疫原性組成物として用いるための好ましい実施態様では、血清型１、血清型２、血清型３および血清型４のヒトｘウシ再類別体ロタウイルスは四価ワクチンとして用いられる。典型的には、４つの血清型の各々のヒトｘウシ再類別体ロタウイルスは混和されて、同時投与のための併合組成物を形成する。各ロタウイルス血清型の最終比率は、個々のロタウイルス再類別体の免疫原性により確定される。好ましくはないけれども、ヒトｘウシ再類別体の各々またはそれらの組合せも、逐次方式で投与されて、有効ワクチン処方物を提供し得る。
【００２５】
その他の好ましい実施態様では、血清型１、血清型２、血清型３および血清型４のヒトｘウシ再類別体ロタウイルスは、ＶＰ７血清型５および／または９のヒトｘウシ再類別体ロタウイルス、ＶＰ７血清型１０のウシｘウシ再類別体ロタウイルス、および／またはＶＰ４血清型１Ａのヒトｘウシ再類別体ロタウイルスと組合されて、多価免疫原性組成物を産生する。今記載した付加的再類別体ロタウイルスは、六価、七価または八価免疫原性組成物として用いるためにあらゆる組合せで用いられ得る。
【００２６】
本発明のヒトｘウシ再類別体ロタウイルス多価免疫原性組成物は、活性成分として、本明細書中に記載したようなヒトロタウイルスの免疫学的有効量の少なくとも４つの臨床的に最も重要なＶＰ７血清型の各々を含有する。特に、抗原的に異なる比とロタウイルス再類別体の各々は、106.0プラーク形成単位未満の投与量で投与される。免疫原性組成物は、生理学的に許容可能な担体および／またはアジュバントとともに、宿主、特にヒト中に導入され得る。有用な担体としては、例えばクエン酸塩−重炭酸塩緩衝液、緩衝化水、正規食塩水等が挙げられる。その結果生じる水性溶液は、現状のままで、または所望により、当業者に周知の凍結乾燥プロトコールを用いて凍結乾燥されて、使用のために包装され得る。凍結乾燥化ウイルスは、典型的には、約4℃で保持される。使用する準備ができたら、前記のように、投与前に凍結乾燥調製物は滅菌溶液と併合される。
【００２７】
組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な場合に、製薬上許容可能な補助物質例えばｐＨ調整剤および緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリ−エタノールアミンオレエート、クエン酸塩−重炭酸塩等を含有し得る。組成物が経口的に投与される場合、胃酸を部分的に中和し、腸を通過する間再類別体ロタウイルスを防御するために緩衝溶液を個体に提供することも必要である。この使用に適した緩衝溶液としては、重炭酸ナトリウム、クエン酸塩重炭酸塩等が挙げられる。本発明のヒトｘウシ再類別体ロタウイルス組成物による免疫感作時に、特に経口経路を介して、宿主の免疫系は、ロタウイルスタンパク質に特異的な局所分泌および血清抗体の両方を産生することにより組成物に応答する。組成物の投与の結果、免疫感作血清型（単数または複数）に対応する野生型系統により引き起こされるヒトロタウイルス疾患に対して、宿主は少なくとも部分的にまたは完全に免疫になる。野生型ウイルス感染が起きた場合には、宿主は、特に消化管の中等度または重症ロタウイルス疾患の発症に耐性である。
【００２８】
ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスを含有する本発明の多化免疫原性組成物は、ロタウイルス疾患に罹り易いか、そうでなければその危険性のあるヒト、特に乳児に投与されて、個体自身の免疫応答能力を誘導する。このような量は、「免疫学的有効用量」と定義される。免疫原性または「免疫学的有効用量」とは、本発明で用いる場合、ワクチン組成物に対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の被ワクチン接種者における発現を意味する。通常は、このような応答は、本発明のワクチン組成物中に含まれる単数または複数の抗原に特異的に向けられる被ワクチン接種者産生血清抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞から成る。ロタウイルス群特異的またはロタウイルス血清型特異的検定により測定される免疫感作後の接種前抗体を４倍またはそれ以上上回る上昇は、有意の応答であるとみなされる。
【００２９】
この使用において、特定の免疫原性組成物中の各ヒトｘウシ再類別体ロタウイルス血清型の的確な量は、患者の年齢、健康状態および体重、投与方式、処方物の性質等によっているが、しかし一般に、その範囲は、約104〜約106プラーク形成単位、好ましくは約105〜約106プラーク形成単位（pfu）の各血清型／患者であった。
【００３０】
あらゆる場合に、免疫原性組成物のための処方は、ロタウイルス疾患に対する個体の免疫応答を誘導するのに十分な量の本発明の各ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスを提供する必要がある。好ましくは、この免疫応答は、「反応原性」にならないよう、重症のまたは致命的ロタウイルス疾患に対して個体を有効に防御する。本明細書中で用いる場合、「反応原性の」または反応原性とは、免疫原性組成物の投与後、その週の間に生じる軽症一過性発熱を意味する。発熱は、本発明の情況では、成人では、38℃以上の口腔温度の、または小児科被ワクチン接種者においては38.1℃以上の直腸温度の発症と定義される。
【００３１】
いくつかの場合には、本発明の好ましい四価ヒトｘウシ再類別体ロタウイルス組成物を人ロタウイルスのその他の血清型またはその他の感染性作因、特にその他の胃腸性ウイルスと併用するのが有益であり得る。例えば、本発明の四価ヒトｘウシ再類別体ロタウイルス組成物は、例えば血清型５（Timenetsky et al., J. General Virol. 78:1373-1378（1997））および／または血清型９（Nakagomi et al., Microbiol. Immunol. 34:77-82（1990））のヒトｘウシ再類別体ロタウイルス、および／またはヒトロタウイルス血清型１０と交差反応性のウシｘウシ再類別体濾多得る、および／またはＶＰ４血清型１Ａのヒトｘウシ再類別体ロタウイルスをさらに含み得る。投与は、別の考え得る胃腸ウイルスワクチン、例えばヒトカリシウイルス（例えば、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス）または関連ワクチンと同時的（しかし典型的には別々に）または逐次的であり得る。
【００３２】
本発明の免疫原性組成物の１回または多数回投与が実行され得る。新生児および乳児においては、特にロタウイルスに対する高レベルの母親由来抗体が存在する場合に、十分レベルの免疫性を引き出すためには多数回投与が必要とされ得る。投与は、生後２〜４ヶ月以内に開始し、初回免疫感作後、またはヒトロタウイルス感染に対して十分レベルの免疫性を誘導および保持する必要がある場合に、１〜２ヶ月またはそれ以上の間隔で継続すべきである。同様に、反復性または重症ロタウイルス疾患に特に罹り易い成人、例えばヘルスケア従事者、デイケア従事者、年少小児の家族成員、老齢者等は、有効免疫応答を確立および／または保持するために多数回投与が必要である。誘導免疫のレベルは、血清または分泌物中のロタウイルス群特異的抗体または血清型特異的中和抗体の量を測定することによりモニタリングされ、そして投与量が調整され、あるいは望ましいレベルの免疫性を保持する必要がある場合には本発明の多価再類別体ロタウイルス組成物の１つ又はそれ以上の血清型を用いてワクチン接種が反復され得る。
【００３３】
以下の実施例は説明のために提示されるものであり、本発明を限定するものではない。
実施例Ｉ
本実施例は、ヒトロタウイルスＤ（ＶＰ７：１）、ＤＳ−１（ＶＰ７：２）、Ｐ（ＶＰ７：３）おｙびＳＴ３（ＶＰ７：４）系統、およびウシＵＫコンプトン（ＵＫ）ロタウイルス由来のロタウイルス再類別体の製造、ならびに成人、小児および乳児における各再類別体の安全性、免疫原性および反応原性の評価を記載する。
【００３４】
ＶＰ７血清型１、２、３および４を示すヒトｘウシ再類別体ロタウイルス系統を、ウシＵＫコンプトン（ＵＫ）系統から、およびヒトロタウイルスＤ（ＶＰ７血清型１、ATCC VR-970）、ＤＳ−１（ＶＰ７血清型２；Wyatt et al., Perspect. Virol. 10:121-145（1978））およびＰ（ＶＰ７血清型３；Wyatt et al., Science 207:189-171（1983））ならびにＳＴ３（ＶＰ７血清型４；Banatvala et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 173:527-530（1978））系統から得た。ヒトロタウイルスＤ、ＤＳ−１およびＰ系統を、下痢で入院した小児の便から回収した。ＤおよびＤＳ−１系統を増殖させて、ノトバイオート仔ウシ中で継代させ（Wyatt et al., 1978,同上；およびMidthun et al., 1985, J. Virol. 53:949-954）、その後組織培養中でのみ増殖させたが、一方Ｐ系統はＡＧＭＫ組織培養中でのみ増殖させた。ヒトロタウイルスＳＴ３系統を無症候性新生児の便から単離し、ＡＧＭＫ細胞中で増殖させた。ウシＵＫコンプトンロタウイルス系統を、下痢を有する初乳剥奪仔ウシの糞から一次仔ウシ腎細胞中に単離した（Woode et al., Res. Vet. Sci. 16:102-105（1974））。一次仔ウシ腎細胞中でのこのウイルスのさらなる継代は、Flewett等により英国バーミンガムのRegional Virus Laboratory, East Birmingham Hospitalで実行され、National Institutes of Health（Bethesda, MD）に送られた。ＮＩＨでは、一次ウシ胎仔腎細胞、一次ＡＧＭＫ細胞および二倍体サルＤＢＳ−ＦＲｈＬ細胞中で、ウイルスを連続的に継代させた。シードプールは、ＡＧＭＫ細胞中で精製され、一次仔ウシ腎細胞培養中で継代されたプラークであるウイルスを含有した。
【００３５】
ヒトロタウイルスＤ、ＤＳ−１、ＰまたはＳＴ３系統から得られる単一ＶＰ７コード遺伝子およびウシＵＫ系統から得られる残りの10遺伝子を有する個々のヒトｘウシロタウイルス再類別体（ロットBR-3、クローン22）が記載されている（Midthun et al., J. Clin. Microbiol. 24:822-826（1986）およびMidthun et al., J. Viol. 53:949-954（1985）、米国特許第4,571,385号）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。これらの臨床試験に用いられたＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫ、ＰｘＵＫおよびＳＴ３ｘＵＫワクチン懸濁液、即ち、それぞれロットHD BRV-1、クローン47-1-1（ATCC VR-2069およびATCC VR-2617）、105.8pfu/ml；ロットHDS1 BRV-1、クローン66-1-1（ATCC VR-2616）、105.3pfu/ml；ロットHP BRV-2、クローン22-1-1（ATCC VR-2611）、105.3pfu/ml；およびロットST3 BRV-2、クローン52-1-1（ATCC VR-2612）、105.8pfu/mlを調製し、安全性を首尾よく検査して、当業者に周知のように米国食品医薬品局のガイドラインにしたがって、外因性作因が含まれていないことを確証した。
【００３６】
ＤｘＵＫヒトｘウシ再類別体ロタウイルスを用いたすべての小児科試験および成人における一試験を、無作為プラセボ対照法で実行して、各候補ロタウイルスワクチン系統の安全性および免疫原性を査定した。各ヒトｘウシ再類別体ロタウイルスの安全性を、18〜45歳の成人、生後6〜60ヶ月の小児、そして最後に生後1.5〜5.9花月の乳児において、引き続き評価した。Johns Hopkins University Center for Immunization Research, Baltimore, MDまたはVaccine Clinic, Vanderbilt University, Nashville, TNで、種々の試験を実行した。
【００３７】
ロタウイルスワクチン試験のための成人および小児科被験者の選択の判定基準は、Halsey et al., J. Infect. Dis. 158:1261-1267（1988）に記載されている。非稀釈用量の各ロタウイルス再類別体を、最初に成人で評価した。その後、各再類別体の1:10稀釈物を、その後、未稀釈用量（105.3pfu）のＰｘＵＫを、生後6〜60ヶ月の小児で評価した。各再類別体の安全性がこれらの小児で実証された後、1:10用量および未稀釈用量のＤｘＵＫおよびＤＳ−１ｘＵＫも、生後6ヶ月未満の乳児でその後評価した。未稀釈用量のこれらの再類別体は年少乳児の大多数を感染させるために必要であったため、ＰｘＵＫまたはＳＴ３ｘＵＫ再類別体を6ヶ月未満の乳児に未稀釈投与した。
【００３８】
最初に、105.8pfuのＤｘＵＫ再類別体ロタウイルス系統の安全性を、その血清中に低レベルのＶＰ７血清型１特異的中和抗体を有する５名の健常成人志願者で評価した。成人に関する試験のための臨床的手法は、２〜３の例外を除いて、Halsey等（上記）に前記されたものであった。要するに、全被験者が、ロタウイルスの各々の摂取の前後少なくとも１時間、絶食した。各成人志願者は、120 mlの蒸留水を2 gのＮａＨＣＯ3とともに、その１分後に、30 mlの緩衝溶液中に懸濁した1 mlの未稀釈候補ワクチンまたは31 mlのプラセボ（ワクチンを含有しない緩衝溶液）を飲んだ。口腔温度を1日2回記録し、あらゆる温度上昇を20分以内に再点検した。ロタウイルス投与後7日間、便試料を収集し、便の粘稠度および回数を記録して、いかなる症状も、ワクチン接種後７日間毎日記録した。
【００３９】
小児科試験のための臨床手法のほとんどが、これも２〜３の例外を除いて、Halsey等（上記）に前記された手法と同一であった。要するに、小児の年齢に適したルーチン小児免疫感作を、時間表通りに、そしてロタウイルスまたはプラセボ投与の少なくとも２週間前および投与後に施した。１時間絶食後、各小児科被験者を無作為化して、2:1の比でロタウイルスまたはプラセボを摂取させた。各小児は、0.4 gのＮａＨＣＯ3を混合した30 mlの乳児処方物（Similac; Ross Laboratories, Columbus, OH）を飲み、その後1 mlのロタウイルス再類別体またはプラセボ（緩衝化処方物またはイーグル最小必須培地）を飲んだ。105.8pfuのＤｘＵＫロタウイルス再類別体を摂取した生後６ヶ月未満の乳児は、免疫原性を増大するための試験における最初の投与後４〜12週目に、このウイルスの二回目の投与を受けた。
【００４０】
ＤｘＵＫおよびＤＳ−１ｘＵＫ再類別体の試験では、直腸温度を１日１回または２回検温し、症状を、もしあれば、毎日記録した。親たちは、便試料を毎日収集し、彼等の小児が毎日排出する便の回数および粘稠度を記録するよう教えられた。ＰｘＵＫおよびＳＴ−３ｘＵＫの小児科試験のための手法は、わずかな修正を有して、同一であった。
【００４１】
被験者は、彼等が下痢を有する場合、またはロタウイルスの経口投与後７日間、明白な嘔吐または発熱のあらゆるエピソードを有する場合に、「ロタウイルス様疾病」（即ち、おそらくロタウイルスにより引き起こされたと思われる疾病）を有するとみなされた。下痢は、48時間以内に３回またはそれ以上の非定形便と定義した。発熱は、10〜20分以内に確証された成人における≧37.8℃の口腔温度または小児科被験者における≧38.1℃の直腸温度と定義した。
【００４２】
ロタウイルス特異的抗体および血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの測定のために、ロタウイルス投与前および投与後４〜６週目に、各試験参加者から血液を採取した。血清レベル測定血液を用いて、ワクチンが肝機能に悪影響を及ぼすか否かを確かめた。成人においては、ロタウイルス投与後１週目に付加的血液検体も採取し、ＡＬＴレベルの測定のために用いた。
【００４３】
Midthun et al., J. Clin. Microbiol. 27:2799-2804（1989）およびHoshino et al., J. Clin. Microbiol. 21:425-430（1985）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように群特異的抗原としてアカゲザルロタウイルスを用いて、ＥＬＩＳＡにより、ロタウイルス特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体に関して、ワクチン接種前およびワクチン接種後血清を検査した。 Midthun et al., J. Clin. Microbiol. 27:2799-2804（1989）に記載されているように、プラーク低減中和（ＰＲＮ）抗体検定により、対合血清も検査した。ＰＲＮ検定に用いられたロタウイルスには、Ｗａ（血清型１）、ＤＳ−１（血清型２）、Ｐ（血清型３）およびＳＴ３またはＶＡ７０（血清型４）ヒトロタウイルス系統＋：ＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫ、ＰｘＵＫおよびＳＴ３ｘＵＫ再類別体系統ならびにＵＫ（コンプトン）ウシロタウイルス系統が含まれた。ＥＬＩＳＡ  ＩｇＡまたはＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ、あるいはＰＲＮ抗体検定により測定したワクチン接種前血清と比較したワクチン接種後血清中の抗体力価の４倍以上の上昇は、有意の応答とみなされた。
【００４４】
凍結便試料を解氷し、仔ウシ肉注入ブロス中の10％便懸濁液とした。便懸濁液をサルＭＡ１０４細胞培養管に摂取して、回転ドラム中で37℃で7日間インキュベートした。細胞培養からの上清を新鮮なサルＭＡ１０４細胞培養管上に盲検継代させて、37℃で7日間インキュベートした。その後それらを解氷し、ＥＬＩＳＡによりロタウイルスに関して検査するときまで、10％便懸濁液および各組の培養からの上清を-20℃で保存した。ワクチン接種後に収集した選定ロタウイルス陽性便検体をポリメラーゼ連鎖反応により血清型化して、流出したロタウイルスの血清型を確定した（Gouvea et al., J. Clin. Microbiol. 28:276-282（1990）およびGouvea et al., J. Clin. Microbiol. 32:1333-1337（1994））（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に含まれる）。
【００４５】
卵および寄生虫に関して被験者の下痢便を調べた。それらを、サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、キャンピロバクター（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アエロモナス（ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属およびロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）属に関して検査した。ロタウイルスおよびその他のウイルス粒子に関して電子顕微鏡によっても、下痢便を調べた。介入性疾患に関連した外因性作因を検出するために、ＰｘＵＫおよびＳＴ３ｘＵＫ再類別体の試験において７日間観察期間中に発熱および呼吸器症状を有した被験者から鼻腔スワブまたは鼻腔洗浄検体を収集して、これらの検体を呼吸器ウイルスに関して細胞培養で検査した。
【００４６】
被ワクチン摂取者とプラセボレシピエントの疾病の比率および年齢群内のおよび各試験におけるこれらの群に関する血清学的応答の比率を、両側フィッシャー精密検定を用いて比較した。
ＶＰ７血清型特異的ヒトｘＵＫウシロタウイルス再類別体の各々の１回経口投与後にその便中に検出されたロタウイルスを有した、または血清抗体力価の４倍以上の上昇を発現した成人、小児および乳児のパーセンテージを、表１に示す。成人被ワクチン接種者、未稀釈ＰｘＵＫ再類別体を摂取した生後６ヶ月未満の乳児、またはプラセボレシピエントのいずれかの便からの細胞培養中に、ロタウイルスは回収されなかった。（ｉ）ＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫまたはＰｘＵＫ再類別体の1:10稀釈物を投与された生後6〜60ヶ月の小児、あるいは（ｉｉ）ＤｘＵＫまたはＤＳ−１ｘＵＫ系統の未稀釈用量を投与された生後6ヶ月以下の乳児の小部分のみがロタウイルスを流出した。ほとんどの場合、ロタウイルスは、１つまたは２つの便試料のみの二次細胞培養継代後に検出された。これに対比して、ＳＴ３ｘＵＫウイルスは、乳児および幼児の便から、より高頻度に、そしてより長期間回収された（通常は、特にワクチン接種後５〜７日目に３日以上の期間に亘って収集された便）。ワクチン接種後30日目の生後23ヶ月の小児１名の便からＳＴ３ｘＵＫウイルスを単離し、ＰＣＲにより確証した。ＳＴ３ｘＵＫロタウイルス再類別体レシピエント９名の便から回収されたウイルスの定量は、最大量の流出ウイルスは、10％便懸濁液1 ml当たり4.7 x 102プラーク形成単位（pfu）であった。
【００４７】
10名のワクチンレシピエントからの10％便懸濁液（９例中９例）または便の組織培養継代（１例中１例）のＰＣＲによる検査は、10名の被ワクチン接種者全員におけるＳＴ３ｘＵＫロタウイルス再類別体の流出を確証した。しかしながら、これらの被ワクチン接種者のうち３名は、野生型ロタウイルスも流出した：ＶＰ７血清型１一ロタウイルス毛糸（乳児１名）またはＶＰ７血清型３系統（小児１名および乳児１名）。ロタウイルス様疾患を有さなかったこれら３名の小児患者からのデータは、血清学的分析から除外した。
【００４８】
ロタウイルスに対する血清学的応答は、成人および年長小児（おそらく以前に野生型ロタウイルスに感染したことがある）においては年少乳児よりしばしば少なく検出された（表１）。血清学的応答は、それぞれＤｘＵＫ、ＤＳ−１ｘＵＫまたはＳＴ３ｘＵＫ再類別体を摂取した成人の23％、18％および15％に検出されたが、しかしＰｘＵＫを接種された成人においては全く検出されなかった。1:10稀釈物を摂取した生後6〜60ヶ月の小児では、ロタウイルスに対する血清学的応答は、ＤｘＵＫレシピエントの33％、ＤＳ−１ｘＵＫレシピエントの40％およびＳＴ３ｘＵＫレシピエントの57％に検出された。104.3pfu用量のＰｘＵＫ再類別体は、生後6〜60ヶ月の小児においてはいかなる抗体応答も引き出せなかったが、しかしこの組成物の10倍用量は中等度に免疫原性で、この再類別体を経口的に投与されたこの年齢群の小児11名のうち5名（45％）において、抗体応答が検出された。
【００４９】
【表１】
0004414095.tif 000002
【００５０】
ロタウイルスを摂取した生後６ヶ月未満の乳児では、血清学的応答（免疫原性の測定値）は、Ｄ（50〜63％）、ＤＳ−１（82％）またはＰ（63〜80％）ヒトロタウイルス系統から得られる1:10用量または未稀釈用量のヒトｘウシＵＫ再類別体を摂取した者よりもＳＴ３ヒトロタウイルスから得られる未稀釈用量のヒトｘウシＵＫ再類別体のレシピエントにおいてより高頻度（93％）に検出された。用量に関するこれらの差は、統計学的に有意でなかった。全体的に、抗体応答は、抗体応答がＩｇＡ  ＥＬＩＳＡにより最も高頻度に検出されたＤｘＵＫワクチン群を除いて、すべてのワクチン群において、ＥＬＩＳＡ  ＩｇＡまたはＩｇＧ検定（群特異的抗原としてアカゲザルロタウイルスを使用）によるよりも、プラーク低減中和（ＰＲＮ）検定（抗原として同種再類別体ウイルスを使用）による法がより高頻度に検出された。３つの再類別体に関しては、ワクチン接種乳児の免疫感作後血清中の中和抗体は、ヒトロタウイルス親系統より再類別体ロタウイルスに対してより高頻度に向けられたが、これは、ウシロタウイルスのＶＰ４中和抗原が免疫優性であったことを示唆する。これは、105.3pfuのＤＳ−１ｘＵＫを摂取した、そしてそれぞれ55％および82％の割合でＵＫウシロタウイルス親系統（データは示されていない）またはＤＳ−１ｘＵＫ再類別体に対する中和抗体の有意の増大を発現した11名の乳児の免疫感作後血清に関するＰＲＮ検定の結果において特に明白であり、一方、それらはどれも、ＤＳ−１ヒトロタウイルス親系統に対する中和抗体の有意の増大を発現しなかった。
【００５１】
しかしながら、１（Ｄ）型ヒトｘウシロタウイルス再類別体の１回投与を受容した小児被ワクチン接種者は、50％の症例でヒトロタウイルス血清型１親に対するＶＰ７特異的中和抗体応答を発現したため、ＶＰ７およびＶＰ４応答のこの絶対解離は常態ではなかった。さらに、ヒトロタウイルス３型（10％）および４型（8％）に関して、低頻度にもかかわらず、ホモタイプＶＰ７中和抗体応答も観察された。四価処方物に関して下記の実施例ＩＩにおけると同様に、ヒトｘウシロタウイルス再類別体の免疫原性は、再類別体の３つの連続用量が２ヶ月間隔で投与された場合、かなり高くなる、ということに留意すべきである。したがって、この拡大免疫感作計画は、血清型２、３および４の場合には再類別体の１回投与後に観察される応答を有意に卓越する再類別体のヒトロタウイルス親の各々に対するＶＰ７特異的中和抗体応答を誘導した。特に、乳児被ワクチン接種者の32％が血清型２に対して、33％が血清型３に、そして42％が血清型４に応答した。この再類別体の１回投与後に免疫原性がすでに高い血清型１に関しては、改善は認められなかった。
【００５２】
ロタウイルスがプラセボレシピエントの便中に流出されるという証拠はなく、この群におけるロタウイルス血清学的応答に関する証拠もないが、但し、生後6ヶ月のプラセボレシピエントはＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ抗体の力価の４倍の上昇を示したが、他の検定においては、その他の血清学的応答は認められなかった。
成人における胃腸疾患の非存在、ならびに各ワクチン群および年齢群における小児被ワクチン接種者とプラセボレシピエントとの間の「ロタウイルス様疾患」の比率における統計学的有意の増大の欠如により立証されているように、ロタウイルス再類別体の各々は、安全で且つ良好に耐容されると考えられた（表２）。３名の成人志願者（ＰｘＵＫまたはＳＴ３ｘＵＫワクチンのレシピエント）だけは、「ロタウイルス様疾患」に関する判定基準を満たす何らかの症状（発熱）を有したが、しかしながら、これらの疾病被ワクチン接種者のうち、ロタウイルス感染の証拠を有したものはなかった。ロタウイルスの投与後に発熱を発症した３名の成人はすべて、共在呼吸器疾患を有するか、または鼻咽頭吸わずの組織培養検定により検出された呼吸器ウイルスを流出した。副鼻腔炎、咳および鼻漏を有する１名のＰｘＵＫレシピエントは、Ａ型インフルエンザウイルスに関して陽性培養を有した。別のＰｘＵＫレシピエントは、呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）に関して陽性培養を有し；１名のＳＴ３ｘＵＫレシピエントは咳、鼻漏および嗄声を有した。これらの志願者における共在呼吸器疾患、呼吸器病因の回収およびロタウイルス感染の証拠の欠如は、これらの発熱が、おそらくは介入性気道感染によるものであったことを示唆する。
【００５３】
介入性疾患は、小児被験者における４つのロタウイルスワクチン候補のほとんどの研究中にも起きた。咳に関連した嘔吐、および中耳炎または呼吸器症候群に関連した発熱が一般的であった。介入性疾患の高バックグラウンドにもかかわらず、各ワクチン群内の生後6〜60ヶ月の小児および生後6ヶ月未満の乳児における「ロタウイルス様疾患」（発熱、下痢または嘔吐）の比率は、プラセボレシピエントの場合と統計学的有意に異ならなかった（表２）。全体的に、再類別体ロタウイルスを投与された生後6〜60ヶ月の小児48名中8名、およびプラセボのレシピエント27名中3名は、接種後7日以内に「ロタウイルス様疾患」を経験した。これらのロタウイルス様疾患のうち、２例のみがロタウイルス感染に関連していた。ＤＳ−１ｘＵＫ再類別体の経口投与後に起きた両疾患は、軽症で且つ自己制限性であった。１名の小児は２日目に発熱した（最高38.5℃）。他の小児は2および3日目に３回嘔吐した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
【表３】
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【００５６】
ＳＴ３ｘＵＫを摂取した生後6〜60ヶ月の小児２名から、コクサッキーＢ５またはエコーウイルスおよびサイトメガロウイルスを単離した。さらに、同一試験においてプラセボレシピエント３名から、アデノウイルスまたはパラインフルエンザ３型ウイルスを単離した。
生後6ヶ月未満の被験者では、ワクチンレシピエント71名中23名およびプラセボレシピエント36名中8名が、ロタウイルス再類別体の初回用量の経口投与後７日以内に「ロタウイルス様疾患」を経験した。呼吸器症候群または中耳炎を伴わない乳児の発熱（38.2〜38.3℃の範囲）は、呼吸器症候群または中耳炎を伴う場合（38.4〜40℃の範囲）より低かった。嘔吐した乳児の大多数（12名中8名）は、１つまたは２つのエピソードのみを有した。摂食を妨げたり、または脱水を引き起こした嘔吐を有するものはいなかった。乳児（感染被ワクチン接種者、非感染被ワクチン接種者またはプラセボレシピエントとして分類）における「ロタウイルス様疾患」および気道疾患または中耳炎の比率を、表３に示す。感染被ワクチン接種者は、ワクチン接種後にロタウイルス感染の証拠を有するワクチンレシピエントであった。非感染被ワクチン接種者は、ワクチン接種後にロタウイルス感染の証拠が認められなかったワクチンレシピエントであった。感染被ワクチン接種者の間では症状に一貫したパターンは認められず、各ワクチン群に関して感染被ワクチン接種者または非感染被ワクチン接種者またはプラセボレシピエントにおける疾患率の間に有意差は認められなかった。観察された症状は、下記で詳述するような介入性疾患の発現を示唆した。
【００５７】
ロタウイルス様疾患を有する生後6ヶ月未満の被ワクチン接種者のうち、14名がワクチン応答者であった。ワクチン応答者のうち３名以外は全員、軽症ロタウイルス様疾患を有し、１つまたは２つの症状を示した：２名が発熱単独、３名は呼吸器疾患または中耳炎を伴う発熱を有した：９名は１回またはそれ以上（最高６回）嘔吐し、そのうち３名は咳の後に嘔吐した。３名のワクチン応答者は、105.8pfuのＳＴ３ｘＵＫの摂取後に中等度〜重症の「ロタウイルス様疾患」を有したが、しかし彼等は介入性呼吸器ウイルス感染も有した。鼻腔洗浄検体からアデノウイルスおよびサイトメガロウイルスを単離した。さらに、３日間高熱（最高40℃）を発症した小児１名の便から適切なロタウイルス再類別体を回収したが、この小児は鼻漏、咳および中耳炎も５日間有した。この小児を入院させ、敗血症が除外されるまで、経験的にバンコマイシンおよびセファロスポリンで処置した。彼女は無事に回復した。発熱（最高39.3℃）および中耳炎を２日間有した乳児１名の鼻腔検体から、パラインフルエンザウイルスおよびアデノウイルスを培養した。この小児も便中に適切なロタウイルス再類別体を流出した。発熱（最高38.6℃）、下痢（水様便９回）を３日間、喘鳴、咳および鼻漏を３〜４日間有した別の乳児から、Ａ型インフルエンザウイルス（しかしロタウイルスではない）を単離した。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
表３に示すように、ロタウイルス感染の証拠を有さなかった生後6ヶ月未満の被ワクチン接種者22名中9名は、「ロタウイルス様疾患」を経験した。105.3pfuのＤＳ−１ｘＵＫを摂取後に発熱し、34回の赤痢便を有した乳児１名から、キャンピロバクター属のCampylobacter jejuniを単離した。105.3pfuのＤｘＵＫを摂取後に発熱および中耳炎を有した別の乳児１名の下痢便から、アエロモナス属のAeromonas hydrophilaを単離した。ＤｘＵＫ再類別体を摂取した乳児２名から、ならびにプラセボレシピエント１名から、呼吸器シンシチウムウイルスを単離した。彼等は各々、鼻漏を有し、喘鳴を伴うこともあった。
【００６０】
ロタウイルス再類別体による感染に起因する肝臓損傷の証拠は認められなかった。接種後４〜６週目にＡＬＴ上昇を示した小児参与者の割合は、プラセボレシピエントより被ワクチン接種者の方が多くなかった。２名の小児被ワクチン接種者（１名の乳児はＳＴ３ｘＵＫを１回接種され、もう１名は２回目投与のＤｘＵＫを摂取した）は、ＡＬＴ値の上昇を示した。この値は正常値の２倍未満で、１週間以内に反復すると正常になった。２名のプラセボレシピエントも、接種後４〜６週目に軽度のＡＬＴ値上昇を示した。ＡＬＴ値の一過性の軽度の増大は、ＤｘＵＫまたはＳＴ３ｘＵＫ再類別体の摂取後、成人志願者（そのうちの何名かは、アルコール消費を報告した）で時折検出された。これらの志願者で、ロタウイルス感染の証拠を有したものはいなかった。４名の成人がＤｘＵＫ投与後１週間目にＡＬＴ上昇を示した。彼等のＡＬＴレベルは、３週間後に反復した場合、清浄化または正常値の２倍未満（２名の志願者）になった。他の２名の成人は、ＳＴ３ｘＵＫ再類別体摂取後１週間目にＡＬＴレベルの上昇を示した。彼等のＡＬＴ値は、ロタウイルス投与後４週間目には正常であった。
【００６１】
105.3pfuのＤｘＵＫ再類別体ロタウイルスを摂取した乳児20名のうち10名（50％）のみが１回投与後にロタウイルス特異的抗体を発現したが、この再類別体を用いの14名の乳児のブースター免疫感作は、4〜12週間後に、14名（86％）の乳児のうちの12名に抗体力価の４倍以上の増大を引き出した。このうち7名の乳児は、初回投与後に抗体応答を増していた。両投与を摂取した14名の乳児の間では、２回目投与の正味作用は、14名の被ワクチン接種者全員に抗体を引き出すこと、そしてロタウイルス再類別体に対する中和抗体のレベルを、初回投与後の1:66の幾何学平均力価から２回目投与後の1:336に押し上げることであった。
【００６２】
ＤｘＵＫによるブースター免疫感作後、ロタウイルス再類別体レシピエント１名のみがロタウイルスを流出し、これは１日間だけで、その後ウイルスは小児からは回収され得なかった。14名の乳児（そのうち5名は初回投与後に感染していなかった）のうち2名のみが２回目投与後にロタウイルス様疾患を経験した。初回投与後にロタウイルス再類別体に感染していなかった小児１名は、２回目投与後に軽症発熱（最高38.1℃）を鼻漏とともに有した。初回投与後再類別体ウイルスに感染していた別の小児は、２回目投与摂取後に4回嘔吐した。この群における被ワクチン接種者のうちの１名は、ブースター投与後に高ＡＬＴ値を有したが、これは反復すると正常になった。
【００６３】
実施例ＩＩ
本実施例は、成人、年少小児および乳児におけるその臨床的安全性および免疫原性に関して評価した四価ヒトｘウシ再類別体ロタウイルス免疫原性組成物を記載する。
実施例Ｉで記載した４つのヒトｘウシ再類別体ロタウイルスを等容量で併合して、単一四価ワクチン組成物を生成した。試験はすべて、プラセボ対照方式で実施して、併合組成物の安全性および免疫原性を査定した。血清学的および微生物学的試験はすべて、実施例Ｉと同様に実行した。
【００６４】
Johns Hopkins University Center for Immunization Researchで、再類別体当たり105.3〜105.8PFUを含有する非稀釈ヒト（ＶＰ７血清型１、２、３および４）−ウシＵＫロタウイルスワクチンの１回投与を、17名の成人（ワクチンレシピエント11名、プラセボレシピエント6名）で評価した。被験者は、ワクチンまたはプラセボの投与前後少なくとも１時間、絶食した。彼等は120 mlの緩衝溶液（重炭酸ナトリウム）を摂取して、胃の酸性度を中和し、その１分後に、緩衝液と混合した四価免疫原性組成物またはプラセボを摂取した。成人被ワクチン接種者11名のうちの１名は、ワクチン接種後２および３日目に嘔吐の１回エピソードと、３回の下痢便を、そして４〜５日目に咽頭炎および鼻漏を報告した。この志願者はロタウイルス感染の証拠を有さず、彼の便は、培養および電子顕微鏡検査によりロタウイルスに関して陰性で、ロタウイルスに対する血清学的応答は検出されなかった。下痢便の細菌培養も陰性であった。他の10名の被ワクチン接種者および6名のプラセボレシピエントは、ワクチン摂取後、無症候性であった。ワクチンまたはプラセボレシピエントの誰もワクチン摂取後にＡＬＴ上昇を示さず、彼等の便中にロタウイルスは検出されなかった。ロタウイルス抗体応答は、11名の被ワクチン接種者（5名はＥＬＩＳＡ  ＩｇＡ検定そして4名はＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ検定による）のうち6名（55％）の血清中に検出された。したがって、四価ワクチンは安全且つ免疫原性であって、生後6〜60ヶ月の小児におけるさらなる評価を可能にすると考えられた。
【００６５】
その後の試験中に、生後6〜60ヶ月の乳児および小児20名は、緩衝化処方物を、その後非稀釈四価ヒトＶＰ７血清型１ｘＵＫ、ヒトＶＰ７血清型２ｘＵＫ、ヒトＶＰ７血清型３ｘＵＫおよびヒトＶＰ７血清型４ｘＵＫロタウイルス再類別体ワクチン（12名の小児）およびプラセボ（8名の小児）の1回投与を、個体の年齢に適したルーチン小児期免疫感作の前後少なくとも２週間に摂取した。「ロタウイルス様疾患」は、被ワクチン接種者１名（ウイルス摂取後最初の24時間中に発熱、そして4日目に嘔吐１回）と、プラセボレシピエント１名（2日目に発熱、ならびに2〜7日目に鼻漏および咳）に観察された。別の被ワクチン接種者は7日目に鼻漏を有した。疾病小児でロタウイルス感染の証拠を示したものはなかった。ロタウイルスは、単一日に、２名の無症候性被ワクチン接種者から収集した２つの便検体中に検出されただけであった。ロタウイルスは、電子顕微鏡により、または他の被ワクチン接種者またはプラセボレシピエントの便の培養によっては、検出されなかったが、この中にはワクチンレシピエントの同胞である小児4名が含まれた。四価ロタウイルス再類別体の投与後にＡＬＴ上昇を示した被ワクチン接種者またはプラセボレシピエントはいなかった。ロタウイルス抗体応答は、被ワクチン接種者12名（4名はＥＬＩＳＡ  ＩｇＡ検定そして6名はＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ検定による）のうち6名で検出された。被ワクチン接種者12名のうち7名はともにロタウイルス感染の証拠を有した。したがって、候補ワクチンは安全且つ免疫原性で、ワクチンの３回投与を受けた生後6ヶ月未満の乳児の標的集団への進行を可能にする。
【００６６】
次に、３回投与の非稀釈四価ヒトｘウシロタウイルス再類別体ワクチンまたはプラセボの安全性および免疫原性を、生後約２、４および６ヶ月で同時にそのルーチン小児免疫感作を受けた年少乳児30名で評価した。20名の乳児を無作為化して、候補ロタウイルスワクチンを投与し、10名の乳児にはプラセボを投与した。医学的理由のために、２回目のワクチン接種前に、被ワクチン接種者１名およびプラセボレシピエント１名を、試験から撤退させた。ルーチン小児期免疫感作（全細胞百日咳予防接種を含む）を伴うワクチンまたはプラセボの初回、２回目または３回目投与後、発熱が、被ワクチン接種者20名中1名、19名中6名、19名中6名およびプラセボレシピエント10名中2名、9名中0名、9名中3名でそれぞれ報告された。発熱のエピソードはすべて、多数のルーチン小児免疫感作と同時発生させた四価ロタウイルス処方物の経口投与後最初の48時間以内に起きたが、但し、３つの有熱性エピソードのうち２つは被ワクチン接種者において呼吸器疾患に伴うもので、第三のエピソードはプラセボレシピエントで起きた。下痢は、プラセボレシピエント１名で報告されたが、しかし被ワクチン接種者では誰も報告されなかった。被ワクチン接種者１名は、嘔吐を２回、ならびに呼吸器症候群および結膜炎を、２回目投与後７日目に有した。別の小児は、ワクチン接種後最初の24時間中に咳により引き起こされた嘔吐を１回有した。軽度の発熱（38.2℃）を有する患者１名だけが、便試料中に検出可能なロタウイルスを有したが、これは、発熱がロタウイルス感染に関連したことを示唆する。呼吸器症候群または発疹は、２回目投与後および３回目投与後に被ワクチン接種者19名のうち4名に、そして初回投与後プラセボレシピエント10名のうち1名に、ならびに２回目および３回目投与後のプラセボレシピエント9名のうちの1名に観察された。報告された疾病はすべて、軽症であった。ＡＬＴは、それぞれ被ワクチン接種者20名のうち5名、および20名のうちの2名において、そしてプラセボレシピエント10名のうちの1名および10名のうちの2名において、初回ワクチン接種の前および後にわずかに上昇した。ロタウイルスは、初回投与後の被ワクチン接種者20名のうちの2名で、２回目投与後の被ワクチン接種者19名のうち０名で、ならびに３回目投与後の被ワクチン接種者19名のうち2名に関して、細胞培養での検定により、便中に検出された。
【００６７】
ロタウイルス流出および／またはウイルス特異的血清抗体応答の証拠に基づいて、被ワクチン接種者19名のうち12名（63％）が１回目投与後に、19名のうち19名（100％）が3回投与を受けた後にロタウイルスに感染した。2〜3名の乳児だけが、初回投与後3、5および７日目に、そして2回目および３回目投与後４日目に収集された彼等の便中に検出されたロタウイルスを有した。特に、20名のうち3名（15％）が、ワクチンの初回投与後に、そして19名のうち1名（11％）が３回目投与後にロタウイルスを流出した。初回投与前後のＡＬＴの上昇のために試験から撤退させた２名の乳児（被ワクチン接種者１名、プラセボレシピエント１名）はいずれも、ロタウイルス感染のいかなる証拠も有さなかった。ワクチンの３回投与を受けた被ワクチン接種者19名の間では、抗体応答はワクチンの初回および／または３回目投与後に以下の検定により検出された：ＥＬＩＳＡ  ＩｇＡ（50％）、ＥＬＩＳＡ  ＩｇＧ（63％）およびＵＫウシ系統（100％）、あるいはヒトロタウイルス１型（Ｗａ、32％）、２型（ＤＳ−１、32％）、３型（Ｐ、32％）または４型（ＶＡ70、32％）に対するプラーク低減中和検定（表４）。
【００６８】
【表５】
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【００６９】
試験終了時に、生後8.25〜9.25ヶ月のプラセボレシピエント7名に四価ロタウイルスワクチンを１回投与した。このワクチンは、良好に耐容されると思われた。ロタウイルス様疾患は、３、４および７日目に発熱を、３〜７日目に鼻漏を有した乳児１名においてのみ観察された。呼吸器疾患（発熱および胃腸炎を伴わない）は、他の5名の被ワクチン接種者で観察された。この年長年齢群におけるウシＵＫロタウイルスベースのワクチンに関する有意の発症の非存在は、一価アカゲザルロタウイルスワクチンが、すべてではないにしてもほとんどが受動的に獲得されたロタウイルスに対する母親抗体が失われる時期である生後6〜8ヶ月の乳児における有熱性応答を引き出す傾向がかなり大きいことが示されたために、かなりの重要性を有する。
【００７０】
ウシＵＫベースの四価組成物に対するこれらの血清学的応答を、105.0pfuの各構成成分で投与されたアカゲザルロタウイルスベースの四価ワクチンを生後２、４および６ヶ月に接種された乳児において誘導された中和抗体応答と比較した場合（Rennels et al., Pediatrics 97:7-13（1996））、いくつかの重要な特徴が認められた。アカゲザルロタウイルスベースのワクチンにより誘導される中和抗体応答としては、ワクチン接種された乳児の90％における、再類別体の親系統の１つであるアカゲザルロタウイルスに対する応答が挙げられる。さらに、中和抗体応答は、小児の14％でヒトロタウイルス血清型１に対して、31％でヒト血清型２に対して、29％でヒト血清型３に対して、そして14％でヒト血清型４に対して誘導された。したがって、ウシＵＫロタウイルスベースのヒト再類別体免疫原性組成物は、血清型１（P<0.005，フィッシャー精密検定）に対する、そして血清型４（ P<0.05，フィッシャー精密検定）に対する、アカゲザルロタウイルス四価組成物よりも有意に高頻度の中和抗体応答を含有した。ヒトロタウイルス血清型２および３系統に、ならびにホモタイプ動物ロタウイルス親系統に対する応答は、有意に異ならなかった。
【００７１】
ヒトｘアカゲザルロタウイルス再類別体ワクチンと比較した場合の四価ヒトｘウシＵＫロタウイルス再類別体ワクチンの免疫原性の等価性および考え得る優位性は、アカゲザルロタウイルスベースのワクチンにより付与される高レベルの防御効力の状況において検討した場合、有意であると思われる。
米国における多施設効力試験において、アカゲザルロタウイルスワクチンは、非常に重症のロタウイルス下痢に対して80％の効力を、そしてロタウイルスにより引き起こされる脱水症状に対しては100％の効力を有することが立証された（Rennels et al. Pediatrics 97:7-13（1996））。このワクチンは、その臨床プロフィールがＦＤＡAdvisory Committeeにより1997年12月に承認された後、1998年8月に食品医薬品局により認可された。このワクチンは、U.S. Advisory Committee for Immunization Practiceにより、1997年６月に生後２、４および６ヶ月目の乳児のルーチン免疫感作のために推奨され、認可係属中であった。それは、1999年5月、欧州共同体の15の国々で認可された。
【００７２】
ウシＵＫロタウイルスベースの多価免疫原性組成物は、ヒトにおいて一過性低レベル発熱を誘導するとは思えない。ウシＵＫロタウイルスベースの多価組成物は、いくつかの臨床的状況では好ましい。したがって、本発明のウシＵＫロタウイルスベースの多価免疫原性組成物は、独特の型の特性、例えば（１）認可四価アカゲザルロタウイルスワクチンと同様の感染性および免疫原性、（２）一過性低レベル発熱を誘導する能力の低減、（３）ウシロタウイルスベースのワクチン組成物に関して前記したのと同様の、しかし必要とされる低用量から判断した場合に有意に大きい感染性および免疫原性を伴う弱毒化、そして（４）重症ロタウイルス性疾患において大きい臨床的重要性を有するヒトロタウイルス血清型のすべてに関する抗原性適用範囲を提供する。
【００７３】
実施例ＩＩＩ
本実施例では、本発明の好ましい四価ヒト−ウシ再類別体ロタウイルス組成物と認可済四価アカゲザル−ヒトロタウイルス再類別体ワクチンROTASHIELDとの比較を可能にする進行中の臨床試験からのデータの予備暫定分析についての要約を提示する。分析は、２つの組成物の低レベル発熱応答とロタウイルス性下痢に対する防御効力の比率を検査する。
【００７４】
安全性およびロタウイルス性下痢に対する防御効力に関して、本発明の四価ヒト−ウシロタウイルス組成物と四価アカゲザル−ヒトロタウイルス再類別体ワクチン（ROTASHIELD、米国ならびに欧州共同体の15カ国において用いるために、近年認可された）とを比較するための暫定２年臨床試験が目下進行中である。本試験はフィンランドで実施中であり、172名の四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体レシピエント、86名の対応するプラセボ対照、161名のROTASHIELD被ワクチン接種者および79名の対応するプラセボレシピエントを含む。論理学的理由のために、本試験はフィンランドの隣接する２つの小都市TampereとLahtiで実施され、したがって、２つのプラセボ群を用いる必要があった。２つのプラセボ群は、組成物用容器が外見が異なったために、両試験群の個体が同一位置である場合にも必要であった。
【００７５】
本試験は、組成物に対する有熱性応答の発生率低減（30％から15％への）を80％パワーで検出し得る各組成物に十分な被験者を補充するために、両都市で同時に実行するよう確立された（プラセボ群間の非有意差を仮定。0.05有意レベルおよび10％脱落での両側検定）。四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物およびその対応するプラセボは、Tampereにおいてのみ無作為化され、一方、ROTASHIELDワクチンおよびその対応するプラセボは、LahtiとTampereの両方で無作為化された。
【００７６】
各組成物投与に関して、免疫感作後７日間、直腸温度として定義して38℃以上の発熱に関して、被験者をモニタリングした。免疫感作後７日間の嘔吐エピソード、軟便、被刺激性およびその他の全身性事象に関しても、モニタリングを保持した。胃腸炎、重症副作用または入院に関するモニタリングは、２年試験の全期間、保持されるべきことであった。２シーズンの胃腸炎を含むよう試験を計画した。
【００７７】
試験チームの非盲検成員を含まずに、各四価再類別体組成物またはプラセボの初回投与後の有熱性応答に関して予備データが得られている。さらに、各群に関するデータだけが、全体として、発熱の発生および防御効力に関して、２つの組成物、即ち四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物とROTASHIELDを比較するために分析された。試験群間の比較可能性を、定性二倍体サル胎仔アカゲザルはい（ＦＲｈＬ）細胞中で増殖したロタウイルスを含有するよう両組成物を処方することにより、細胞培養基質に関して保持した。
【００７８】
無作為化後、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物（105.3〜105.8pfu／構成成分）、ROTASHIELD（105pfu／構成成分）またはプラセボを健常２ヶ月乳児に、そして２ヶ月後に再び、経口投与した。乳児の親は、１日１回または２回、直腸温度を記録し、症状を毎日記録した。便試料を収集し、便通回数および便の粘稠度の記録を保持した。ロタウイルス再類別体組成物の初回投与後７日間に起きた発熱の累積率を要約する利用可能データおよびロタウイルス性胃腸炎の最初のシーズン中の防御効力を要約する予備データを、表５および表６に提示し、以下に要約する。
【００７９】
ROTASHIELDレシピエントの中で、46.2％が、再類別体組成物の初回用量投与後１週間に、低レベル一過性有熱性応答（≧38℃（100.4゜Ｆ））を発現した（表５）。この頻度は、その発熱率が11.4％（p<0.0001）であったそのプラセボ群の場合より有意に大きかった。これに対比して、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物レシピエントに関して観察された発熱（≧38℃）率（15.2％）は、そのプラセボ群（11.0％）と有意に異ならなかった。ROTASHIELDワクチンに関する>38.4℃（101.1゜Ｆ）という発熱の頻度は、依然として評価可能な程度（20.3％）で、そのプラセボ群（1.3％）より有意に大きかった（P<0.0001）。これに対比して、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物のレシピエントが経験した>38.4という発熱の頻度は1.8％で、これはそのプラセボ群（0％）と有意に異ならなかった。したがって、これら２つの比較において、 ROTASHIELDはそのプラセボ群より有意に高い評価可能な頻度を有する発熱を誘導し、一方、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物に対する有熱性応答はそのプラセボの場合とは異ならず、ROTASHIELDに関して観察されたより有意に低かった。全体的に、ROTASHIELDは、発熱が≧38℃と定義されようと、>38.4℃と定義されようと、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物より有意に多く免疫感作後７日間の発熱に関連した（p<0.0001）。親鸞度試験におけるヒトｘウシ再類別体組成物に対する有熱性応答の本質的に全体的な欠如は、試験群におけるバックグラウンド疾患の非存在を反映する。これは、バックグラウンド疾患が非常に高頻度であった実施例ＩおよびＩＩと鮮明に対比する。フィンランド試験では、バックグラウンド疾患の相対的非存在が、早期臨床試験において可能であったより高い精度での発熱の発症の、または有熱性応答の評価を可能にした。
【００８０】
四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物とROTASHIELDとのロタウイルス性下痢に対する比較可能な防御効力に関する予備データも得られた。このデータは、前者組成物の観察された有熱性応答の欠如および前記ののウシロタウイルスおよびヒト−ウシ再類別体組成物の場合の10〜100分の１のウイルス用量の使用により、現在の組成物は弱毒化されすぎて天然ロタウイルス疾患に対する防御を誘導し得ないと考えられるため、このデータは特に重要であった。一方、ヒト−ａかげざるロタウイルス再類別体ワクチンROTASHIELDは、重症ロタウイルス性疾患に対して80％〜100％の防御効力を示すことが、特徴的に判明した。
【００８１】
防御効力に関する概算は、監視の最初のシーズン中に被験者間で実証されたあらゆる重症度のロタウイルス性胃腸炎の計48のエピソードの分布を分析することにより、本試験から得られる。ロタウイルス性胃腸炎の診断は、胃腸炎を有する被験者の大便中のロタウイルスの同定により確定された。同定は、（１）ロタウイルス群特異的および血清型特異的抗血清を用いた標準免疫学的方法であるＥＬＩＳＡ法（Joensuu et al., Lancet 350:1205-1209（1997）;およびHoshino et al., J. Clin. Microbiol. 21:425-430（1985））、ならびに（２）ロタウイルス群特異的保存配列またはロタウイルス血清型特異的保存配列を認識するプライマーを用いるＰＣＲ（Gouvea et al., J. Clin. Microbiol. 28:276-282（1990））により実行した。
【００８２】
最初のシーズン中の防御効力の分析は、場所試験チーム、ならびに臨床および試験モニタリングスタッフは個々の被験者の試験群（即ち、四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物、ROTASHIELDまたは対応するプラセボ群）への割当に対してブラインドされたままで、彼等は、試験の残りのチームに関してもブラインドされたままであるような方法で実行した。この制限は、第二胃腸炎シーズンの終了時の試験終結まで、継続監視およびデータ収集を可能にするためにこの予備分析に適用した。その結果、疾患の重症度によるワクチン効力の分析は、２年の監視の終結後に実行されるため残されている。それでも、最初のシーズン中の各試験群に関するあらゆる重症度のロタウイルス性胃腸炎の比率を確定し、盲検にすることなく多の試験と比較し得た。
【００８３】
最初のシーズン中の２つのプラセボ群に関するあらゆる重症度のロタウイルス胃腸炎エピソードの比率は、顕著に同様で、17.7％と17.4％であって、これは、２つの試験場所の、そしてこれらの場所でのロタウイルス感染の疫学的知見の比較可能性を示す。そのプラセボ群と比較した場合、ROTASHIELDは、あらゆる重症度のロタウイルス性胃腸炎に関して65％の防御効力を示した。四価ヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物に関して匹敵する概算は70％で、防御効力は認可済ワクチンと同様であった。このレベルの防御効力は、その効力は疾患の重症度によっては分析できなかったという事実を考慮すると、十二分に満足できるものであった。重症疾患に対するヒト−ウシロタウイルス再類別体組成物の防御効力は、ロタウイルスワクチン効力が疾患の重症度の増大に伴って増大した従来のROTASHIELD臨床試験中に得られた経験を基礎にして70％より有意に高いと考えられる。ROTASHIELDに関しては特徴的に、80％〜100％の防御効力がほとんどの重症疾患に関して観察されたが、一方あらゆる重症度のあらゆる疾患に関して算出した防御効力は、48〜68％に達するに過ぎなかった。
【００８４】
【表６】
0004414095.tif 000007
【００８５】
【表７】
0004414095.tif 000008
【００８６】
本発明のワクチンは、免疫原性および防御効力に関して、四価アカゲザルロタウイルス処方物のすべての有益な特性を示す。同様に、本発明の多価免疫原性組成物は、前記のウシロタウイルス処方物により示される有意の有熱性応答の欠如という有益な特性を共有する。しかしながら、それは、一過性低レベル有熱性応答の発現に関する四価アカゲザルロタウイルスワクチンの、そしてそれらの低感染性に関する前記のウシロタウイルス処方物の不利益な特徴を示さない。
【００８７】
微生物寄託情報
ヒトロタウイルス系統は、アメリカ培養細胞コレクション、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209に、1998年6月4日に、ブダペスト条約の条件下で、以下のように命名されて、寄託された。
再類別体名                                ATCC寄託番号
HDxBRV,クローン47-1-1（VP7:1［D］）        ATCC VR-2617
HDS1XBRV-1,クローン66-1-1（VP7:2［DS-1］）ATCC VR-2616
HPxBRV,クローン22-1-1（VP7:3［P］）        ATCC VR-2611
HST3XBRV-2,クローン52-1-1（VP7:4［ST3］） ATCC VR-2612
IAL28XUK,クローン33-1-1（VP7:5［IAL28］） ATCC VR-2613
AU32XUK,クローン27-1-1（VP7:9［AU32］）   ATCC VR-2614
KC-1xUK,クローン32-1-1（VP7:10［KC-1］）  ATCC VR-2615
前記では本発明を、理解を容易にするために説明および実施例により多少詳細に記載したが、しかし添付の特許請求の範囲内ではある種の変更および修正が成され得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、前記の説明を参照するのではなく、添付の特許請求の範囲をそれらの十分な範囲の等価物とともに参照することにより確定されるべきである。
【００８８】
本出願中に引用した出版物および特許文書はすべて、個々の出版物または特許文書が個別に意味するのと同程度に、すべての目的に関して、その記載内容は参照により本明細書中に含まれる。