(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１Ｆ７ｂおよびＩＬ−１８ＢＰを含む、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病の治療または予防用医薬。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｆ７ｂが全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与される請求項１記載の医薬。
【請求項３】
ＩＬ−１Ｆ７ｂのコーディング配列を含むベクターおよびＩＬ−１８ＢＰを含む、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病の治療または予防用医薬。
【請求項４】
ＩＬ−１Ｆ７ｂのコーディング配列を含むベクターが全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与される請求項３記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１８結合タンパク質を結合することができ、第２サイトカイン（該第２サイトカインはＩＬ−１ファミリーの一員である）の活性を阻害することができるサイトカインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８９年に、マウスの脾臓細胞から得られたインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を誘導するエンドトキシン誘導血清の活性が説明された（Nakamura et al., 1989）。この血清活性は、直接的なＩＦＮ−γの誘導因子として機能するのではなく、むしろＩＬ−１２、ＩＦＮ−α／β、ＴＮＦまたはマイトジェンとの共刺激剤として機能した。後エンドトキシンマウス血清から活性を精製しようとする試みにより、見かけ上均質な５０〜５５ｋＤａのタンパク質が明らかにされた（Nakamura et al. 1993）。他のサイトカインは、ＩＦＮ−γ産生に対して共刺激剤として作用することができるので、血清活性を中和するためのＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＴＮＦに対する中和抗体がその血清の活性を中和できないということにより、それが別の因子であることが示唆された。１９９５年には、同科学者らによって、Ｐ．アクネス（P. acnes）で前処理されたマウス由来の肝臓の抽出物中に、ＩＦＮ−γ産生に対するエンドトキシン誘導共刺激剤が存在することが証明された（Okamura et al., 1995）。このモデルにおいて肝臓のマクロファージ集団（クッパー細胞）は増加し、これらのマウスにおいては、低投与量の細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）（前処理されていないマウスでは致死ではない）で致死にいたる。ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）と名づけられ、のちにインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）と呼ばれるその因子が、１，２００グラムのＰ．アクネス処理されたマウスの肝臓から均質的に精製された。精製されたＩＬ−１８のアミノ酸配列から誘導された変性オリゴヌクレオチドが、マウスＩＬ−１８ｃＤＮＡをクローン化するために使用された（Okamura et al., 1995）。ＩＬ−１８およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のメッセンジャーＲＮＡは、活性化マクロファージにおいて容易に検出された。ＩＬ−１８は単独ではＩＦＮ−γを誘導しないが、主にマイトジェンまたはＩＬ−１２との共刺激剤として機能する。ＩＬ−１８に対するヒトｃＤＮＡ配列は、１９９６年に報告された。
【０００３】
インターロイキンＩＬ−１８は、ＩＬ−１ファミリータンパク質と構造的特徴を共有している（Nakamura et al. 1993, Okamura et al. 1995, Ushio et al. 1996 and Bazan et al. 1996）。４つのへリックスバンドル構造を示すほとんどの他のサイトカインとは異なり、ＩＬ−１８およびＩＬ−１βはすべてβプリーツシート構造を有する（Tsutsui et al. 1996）。ＩＬ−１βと同様に、ＩＬ−１８は、シグナルペプチドを欠いた生物学的に不活性な前駆体（プロＩＬ−１８）として合成される（Ushio et al 1996）。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８前駆体は、Ｐ１位のアスパラギン酸残基の後ろで前駆体を切断するカスパーゼ−１（ＩＬ−１β変換酵素、すなわちＩＣＥ）により切断される。得られる成熟サイトカインは、細胞から速やかに放出される（Ghayur et al. 1997 and Gu et al. 1997）。
【０００４】
ＩＬ−１８は、ヘルパーＴ細胞Ｉ型（Ｔｈ１）によるサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および顆粒細胞−マクロファージ刺激因子）の共刺激剤であり（Kohno et al. 1997）、またマウスナチュラルキラー細胞クローンのＦＡＳリガンド媒介性細胞毒性の共刺激剤でもある（Tsutsui et al. 1996）。
【０００５】
Ｔｈ１リンパ球は腫瘍に対する免疫応答に関与している（Seki et al. 2000）。Ｔｈ１応答は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γの分泌、ならびに特定の腫瘍抗原を認識する特定の細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を包含する。Ｔｈ１応答は、多くの微生物に対する宿主防御の重要な武器でもある。しかしながら、Ｔｈ１応答は、重度の自己免疫疾患、炎症および臓器移植拒絶反応の発症など、望ましくない作用とも関係付けられ得る。
【０００６】
タンパク質に結合するサイトカイン（可溶性サイトカイン受容体）は、通常、それらそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。それらは、選択的スプライシングか細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のいずれかによって生産される。これらの可溶性受容体は、たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体（Novick et al. 1989）、ＴＮＦの可溶性受容体（Engelmann et al. 1989 and Engelmann et al. 1990）、ＩＬ−１およびＩＬ−４の可溶性受容体（Maliszewski et al. 1990）、ＩＦＮ−α／βの可溶性受容体（Novick et al. 1994, Novick et al. 1992） など、これまでに報告されている。オステオプロテゲリン（Osteoprotegerin）（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子ＯＣＩＦとしても既知である）と名づけられたＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーの一員のあるサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の初めての例のようである（Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998）。
【０００７】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８カラムで尿からアフィニティー精製された（Novick et al. 1999）。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−８のＩＬ−１８誘導、インビトロでのＮＦ−ｋＢの活性化、ならびにインビボでのＩＦＮ−γの誘導を廃する（abolishes）。ＩＬ−１８ＢＰは、本質的に脾臓で発現し、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する可溶性循環タンパク質である。もっとも豊富なＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームであるスプライス変異体アイソフォームａは、急速な吸着速度、遅い離脱速度、および約４００ｐＭの解離定数（Ｋｄ）により、ＩＬ−１８に対して高い親和性を示す（Kim et al. 1999）。
【０００８】
ＩＬ−１８ＢＰとＩＬ−１８の相互作用に関与する残基は、コンピューターモデリングの使用を通して（Kim et al. 1999）、またＩＬ１ＲＩ型とＩＬ−１βとの相互作用に基づいて（Vigers et al. 1997）説明されている。ＩＬ−１８ＢＰに結合するＩＬ−１８に対するモデルにおいては、ＩＬ−１８の４２位のＧｌｕ（Ｅ）残基と８９位のＬｙｓ（Ｋ）残基が、ＩＬ−１８ＢＰのＬｙｓ−１３０およびＧｌｕ−１１４にそれぞれ結合すると提案されている（Kim et al. 1999）。
【０００９】
ＩＬ−１８ＢＰは、本質的に多くの細胞に存在し（Puren et al. 1999）、健康なヒトでは循環している（Urushihara et al. 2000）。ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８への高い親和性と同様に、循環血液に見出されるＩＬ−１８ＢＰの高い濃度（ＩＬ−１８に対して２０倍モル過剰）も、サイトカイン生物学における独特な立場を表わしている。したがって、すべてとは限らないが、ほとんどの循環血液中のＩＬ−１８分子はＩＬ−１８ＢＰに結合していると推測される。循環ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＬ−１８に対して細胞表面受容体と競合するため、天然の抗炎症性分子および免疫抑制分子として作用し得る。
【００１０】
ＩＬ−１８ＢＰ様タンパク質をコードするウイルス薬剤（たとえば、Ｍ．contagiosumウイルスタンパク質 ＭＣ５３およびＭＣ５４）は、哺乳類ＩＬ−１８ＢＰに有意な相同性を有している（Novick et al. 1999）。Ｍ．contagiosumタンパク質 ＭＣ５３およびＭＣ５４は、ＩＬ−１８ＢＰの能力と同様にｓｉｔｅ、ヒトＩＬ−１８に結合し中和する能力を有する（Xiang and Moss 1999）。ＩＬ−１８ＢＰに相同なエクトロメリアポックスウイルスｐ１３タンパク質は、インビトロでヒトＩＬ−１８に結合し、その活性を阻害する。ｐ１３欠失変異体ウイルスに感染させたマウスは、感染力の低下を示した（Born et al. 2000）。したがって、感染力の程度は、ウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの存在と相関しているようである。
【００１１】
循環ＩＬ−１８ＢＰの高いレベルは、感染への過剰のＴｈ１応答や自己免疫疾患の発症に対する天然の防御に相当し得る。
【００１２】
ＩＬ−１８を含むＩＬ−１ファミリーのサイトカインは、感染への第一線および第二応答のあいだに多様な炎症特性および免疫調整特性を有する（Dinarello 1996 and Nakanishi 2001）。インターロイキン−１（ＩＬ−１）遺伝子ファミリーの６つの新しいメンバーは、発現配列タグデータベースサーチから発見された（Barton 2000, Busfield 2000, Debets 2001, Kumar 2000, Lin 2001, Mulero 1999, Pan 2001 and Smith 2000）。これらのタンパク質は、１２β−ストランドからなる共通したβ−バレルパターンと、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８と有意なアミノ酸相同性を有する。ＩＬ−１ファミリーのこれらの新しいメンバーは、ＩＬ−１およびＩＬ−１８がそうであるように、共通した原種（ancestor）から誘導される（Nicklin 2002, Taylor 2002）。ＩＬ−１８以外はそれぞれヒト染色体２の同じ領域に位置する（Nicklin 2002, Mulero 2000, Taylor 2002 and Busfield 2000）。これらＩＬ−１相同体のそれらの生物学的機能は現在知られていない。新規なＩＬ−１相同体ＩＬ−１Ｈ４（ＩＬ−１Ｆ７ａ−ｅ）の５つの異なるスプライス変異体も説明されている（Busfield 2000, Kumar 2000, Pan 2001, Smith 2000, Taylor 2002）。記載された第１のアイソフォーム、ＩＬ−１Ｆ７ａは、ＩＬ−１Ｆ７遺伝子のエクソン３から構成される独自のＮ−末端を有する。このＮ−末端は、この遺伝子の他のスプライス変異体には存在しない。短いアイソフォームＩＬ−１Ｆ７ｃ、ＩＬ−１Ｆ７ｄおよびＩＬ−１Ｆ７ｅは、それぞれエクソン４、２またはその両方が欠失している。エクソン１および２を含むＩＬ−１Ｆ７ｂおよびｃのみが、潜在的なカスパーゼ−１（ＩＣＥ）切断部位を有するＮ−末端プロドメインを発現する（Kumar 2002）。これらのスプライス変異体に加えて、アミノ酸多形（Ｖ３１ＧおよびＡ４２Ｔ）が、エクソン２における２つの塩基対変異にもとづいてＩＬ−１Ｆ７ｂに存在する（Kumar 2000, Pan 2001）。広範なデータベースサーチとＩＬ−１遺伝子座の配列決定にもかかわらず、ＩＬ−１Ｈ４のマウス相同体はまだ見つかっていない。ＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８と有意な配列相同性を有する。ＩＬ−１８活性の顕著な特徴は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においてＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５の存在下で共刺激剤としてＩＦＮγを誘導するその能力である。ＩＬ−１８の活性は、ＩＬ−１８Ｒαと呼ばれるリガンド結合鎖（Torigoe 1997）とＩＬ−１８Ｒβと呼ばれるシグナル伝達鎖（３（Born 1998, Kim 2001）とで構成されるＩＬ−１８Ｒ複合体により媒介される。ＩＬ−１８Ｒα鎖への結合およびＩＬ−１８Ｒβ鎖とのヘテロ複合体の形成の際、ＩＬ−１８はＩＬ−１受容体関連キナーゼおよびＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ−６）の活性化を誘導する。これらの活性化キナーゼは、最終的には核因子κ−Ｂ（ＮＦ−κＢ）の転座をもたらす（Matsumoto, Robinson）。ＩＬ−１Ｆ７ｂは、受容体プルダウンアッセイ（Pan 2001）またはコンピュータチップにもとづく結合試験（ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標））（Mulero 2000）を用いてＩＬ−１８Ｒαに結合することが報告されている。Ｋｄ＝１３０ｍＭという有意ではあるが低い親和結合が、プロペプチドをもたないＩＬ−１Ｆ７ｂの成熟型に対してのみ観測されたことは、ＩＣＥによるＩＬ−１Ｆ７ｂプロセッシングへの生物学的関連性を示唆した（Kumar 2002）。ＩＬ−１８Ｒαへの結合にかかわらず、プロまたは成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂのいずれかのＩＬ−１８様またはアンタゴニスト様活性は証明されなかった（Pan 2001, Kumar 2002）。
【００１３】
インターロイキンＩＬ−１８は、内毒素ショック、肝炎および自己免疫性糖尿病などの慢性炎症性疾患において病原性の悪化に関与している（Kahiwamura and Okamura, 1998）。肝傷害の発症におけるＩＬ−１８の考えられる役割のさらなる指示が、Tsuijらによって公表された実験（マウスモデルにおけるリポ多糖−誘導急性肝傷害でのＩＬ−１８の濃度の上昇を示す）から生じた（Tsuij et al., 1999）。しかしながら、肝傷害の発症における多−機能因子ＩＬ−１８の機序は、いまだ明らかにされていない。
【００１４】
肝臓損傷または傷害は様々な原因を有し得る。それは、ウイルスもしくは細菌感染、アルコール乱用、免疫障害または癌などによるものであり得る。
【００１５】
たとえば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスなどのウイルス性肝炎は、世界中で多くの人々を苦しませている扱いにくい疾患である。既知の肝炎ウイルスの数は、継続的に増加している。Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス以外に、これまでにウイルス関連肝炎を引き起こすウイルスが少なくとも他に４つ発見されており、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【００１６】
アルコール肝疾患は、アルコールの慢性消費に関連したもう１つの広範な疾患である。免疫性肝炎は、扱いにくく珍しい自己免疫疾患である。肝臓傷害は胆管の損傷をも含む。原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、肝内の胆管の破壊に特徴付けられる自己免疫肝臓疾患である。
【００１７】
いくつかの試験により、アルコール肝炎、肝硬変、ウイルス性肝炎および原発性胆汁性肝硬変などの疾患における肝臓への損傷は、ヘルパーＴ細胞−１（Ｔｈ１）応答と関連付けられる。ある研究では、新規の肝傷害モデルがオボアルブミン含有リポソームの肝臓へのターゲッティングとそれに続くオブアルブミン特異的Ｔｈ１細胞の養子免疫によりマウスで確立された。オブアルブミン含有リポソームとＴｈ１細胞移転（transfer）とによるマウスの併用処置は、血清ＩＦＮ−γ濃度の上昇と平行した血清トランスアミナーゼ活性の増加を招いた。全く対照に、オブアルブミン特異的Ｔｈ２細胞導入は、結果として血清ＩＬ−４濃度の増加を引き起こしたが、肝傷害を誘導しなかった。肝傷害は、抗−ＩＦＮ−γ抗体および抗−腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α抗体によって阻止された。これらの知見は、Ｔｈ１細胞は急性肝傷害における主要なエフェクター細胞であることを指示する（Nishimura and Ohta, 1999）。他の１組の研究では、マウスの過剰発現ＩＦＮ−γが任意の病原または任意の他の刺激なしで自然に肝炎を発症するということが示された（Okamoto et al., 1998）。
【００１８】
もう１つの試験は、Ｔｈ１応答が原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）に関係しているとみなした。ＰＢＣは、肝内胆管の破壊で特徴付けられる自己免疫肝臓疾患である。一般には、細胞免疫の機序、特にＴ細胞に関する機序がこの胆管の損傷をもたらしていると考えられている。近年、Ｔｈ１およびＴｈ２応答の相対的な強度が様々な自己免疫疾患の病理生理において重要な因子であると提案されている。この研究では、ＰＢＣにおける亜集団の平衡（subset balance）は、２つのＴ細胞亜集団に特異的なサイトカイン、すなわちＴｈ１細胞に対してはＩＦＮ−γ、Ｔｈ２細胞に対してはＩＬ−４を検出することにより評価された。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）陽性細胞は、１８人のＰＢＣの患者由来の肝臓部分と、慢性Ｃ型肝炎、肝外の胆道閉塞を含む３５個の病気のコントロール、および正常肝臓で、非同位体インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を用いて計測された。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４ｍＲＮＡを発現する単核細胞は、ＰＢＣ肝臓の炎症門脈路に集められ、肝外胆道閉塞、アルコール線維症または正常細胞部分にはめったに存在しない。ＰＢＣ肝臓中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４ｍＲＮＡ陽性細胞は、コントロール肝臓におけるよりも有意に数多く検出された（Ｐ＜０．０１）。さらに、ＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現は、ＰＢＣ肝臓においてＩＬ−４発現よりもよく検出され、そのＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現のレベルは、門脈炎症活性の程度に大いに相関していた。ＩＦＮ−γｍＲＮＡ陽性細胞は、リンパ系集合体で取り囲まれた損傷した胆管周辺で主に検出された。データは、Ｔｈ１細胞が、ＰＢＣのリンパ系浸潤物におけるより顕著なＴ細胞亜集合であることを示している（Harada et al., 1997）。
【００１９】
ウイルス抗原認識のサイトカインパターンは、ウイルス感染とウイルス一掃（clearance）の解決に意味深い影響を発揮するとも考えられている。ある研究では、Ｔｈ２型応答の方に傾いたサイトカインの不均衡が慢性Ｂ型肝炎に影響を与えるかどうかを調べた。慢性Ｂ型肝炎に関係する末梢血単核細胞のサイトカインプロフィールをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）刺激直後、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の発現を、それぞれ４１％、８％、４１％および５０％の患者で検出した。これらのサイトカインのなかで、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γの発現は、肝臓損傷の典型的なマーカーを代表する血清ＡＳＴ／ＡＬＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／アラニンアミノトランスフェラーゼ）の高いレベルと関連付けられた。Ｔｈ２型サイトカインは、肝細胞に保護効果を発揮することは示されていなかった。結論として、ＨＢｓＡｇ−反応性細胞によるＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γの産生は、慢性Ｂ型肝炎における肝細胞の損傷と関連付けられた（Lee et al., 1999）。高レベルのＦＡＳリガンドとその受容体（ＣＤ９５）は、Ｂ型肝炎の患者の肝臓で報告された（Luo et al., 1997）。ＦＡＳリガンドは、肝細胞のアポトーシスを導く主要なサイトカイン試薬の１つであるとみなされている。
【００２０】
もう１つの研究は、３０人の慢性肝炎を患うＣ型肝炎ウイルス／ＲＮＡ（ＨＣＶ／ＲＮＡ）陽性未治療患者において肝臓傷害の進行に関係する因子を同定した。壊死性炎症（necroinflammatory）および構造上の損傷は、Ｉｓｈａｋ’ｓスコアを用いて評価した。活性化肝性星細胞（ＨＳＣ）を、α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）に対する免疫組織化学により視覚化し、形態計測により計量した。血漿ＨＣＶ／ＲＮＡは、競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した。肝傷害の進行に関与する免疫応答の種類を調べるために、ＩＦＮ−γ−陽性細胞（Ｔｈ１様応答の発現として）を、免疫組織化学により評価し、形態計測により計量した。ＨＳＣは主に小葉の壊死性炎症または裏線維症中隔（lining fibrotic septa）の領域の近くで検出されるということが見出された。αＳＭＡ−およびシリウスレッド−陽性実質組織は、有意に壊死性炎症および構造上のスコアに関係付けられる。ＩＦＮγ陽性細胞は、炎症性浸潤物と関係し構造上の損傷と有意に関係付けられる門脈周囲領域において検出された。したがって、ＨＳＣ活性化と肝傷害の進行は、Ｔｈ１−様応答と関連すると結論付けられた（Baroni et al. 1999）。Ｂ型肝炎の場合と同様に、ＦＡＳリガンドとその受容体がＣ型肝炎患者の肝臓および血清に見られた（Hiramatsu et al, 1994; Okazaki et al, 1996; Lio et al., 1998）。
【００２１】
Ｔｈ１サイトカインおよび他のＴｈ１マーカーは、アルコール性肝炎および肝硬変と関係することが見出された。炎症性の刺激および脂質の過酸化は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し、前炎症性サイトカインとケモカインとをアップレギュレーションする。ある研究では、病的な肝傷害、内毒素血症、脂質の過酸化およびＢＦ−κＢ活性化と、前炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとのあいだの不均衡との関係を評価した。ラット（各群５匹）に消化管注入によりエタノールと飽和脂肪、パーム油、コーン油または魚油を含有する食事を与えた。コントロールラットではエタノールを等カロリーのＤグルコースに代えた。病理分析を行ない、エンドトキシン、過酸化脂質、ＮＦ−κＢ、ならびに前炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１ベータ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２）、Ｃ−Ｃケモカイン（活性化の際に調節される、正常Ｔ細胞発現および分泌［ＲＡＮＴＥＳ］、単球走化性タンパク質［ＭＣＰ］−１、マクロファージ炎症性タンパク質［ＭＩＰ］−１−α、）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（サイトカイン誘導好中球化学誘引物質［ＣＩＮＣ］、ＭＩＰ−２、ＩＰ−１０、および上皮好中球活性化タンパク質［ＥＮＡ］−７８）、および抗−炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＬ−１３）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルの測定を行なった。ＮＦ−κＢの活性化と前炎症性サイトカインＣ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃケモカインの発現増加とが壊死性炎症性傷害を示すラットにおいて見られた（魚油−エタノール、およびコーン油−エタノール）。これらの群は最も高いレベルのエンドトキシンと過酸化脂質をも有した。ＩＬ−１０およびＩＬ−４ｍＲＮＡのレベルは、炎症性肝傷害を示す群においてより低かった。したがって、ＮＦ−κＢの活性化が前炎症性刺激の存在下で生じ、結果としてＴｈ１前炎症性サイトカインおよびケモカインの発現が増加する（Naji et al. 1999）。ＦＡＳリガンドとその受容体は、アルコール性肝疾患においても上昇し、再度、Ｔｈ１サイトカインはアルコール性肝炎において誘導される自己免疫過程に関与することが示唆される（Galle et al., 1995; Taieb et al, 1998; Fiore et al., 1999）。
【００２２】
ＴＮＦ−αは、アルコール−関連肝臓壊死性炎症の病因における共通経路としても浮上している。肝臓および血清ＴＮＦレベルの増加は、アルコール性肝疾患の動物モデルおよびヒトアルコール性肝疾患において記録されている。この異常調節されたＴＮＦ代謝は、多くの代謝の合併症やアルコール性肝疾患の肝傷害に影響を与えることが前提とされている（Grove et al., 1997; McClain and Cohen, 1989）。たとえば、ある研究において、アルコール性肝炎の患者は正常の被験者（６．４ｎｇ／Ｌ；ＣＩ，５．４から７．４）より高いＴＮＦ−αレベル（平均、２６．３ｎｇ／Ｌ；９５％ＣＩ、２１．７から３０．９）を有するということが見出された。後に死亡した患者は、生存者（１６．６ｎｇ／Ｌ；ＣＩ、１４．０から１９．２）より高いＴＮＦ−αレベル（３４．７ｎｇ／Ｌ；ＣＩ、２７．８から４１．６）を有した。アルコール性肝炎の患者において、ＴＮＦ−αレベルは血清ビリルビン（ｒ＝０．７４；Ｐ＝０．０００９）および血清クレアチニン（ｒ＝０．８１；Ｐ＝０．０００３）と確実に相関した。アルコール性肝炎の患者は、不活性なアルコール性肝硬変の患者（１１．１ｎｇ／Ｌ；ＣＩ、８．９から１３．３）や肝疾患を患っていない深刻なアルコール中毒者（alcoholic person）（６．４ｎｇ／Ｌ；ＣＩ、５．０から７．８）より高いＴＮＦ−αレベルを有した。異常な腎臓機能の患者は、アルコール性肝炎の患者より低いＴＮＦ−αレベル（１４．１ｎｇ／Ｌ；ＣＩ、５．４から２２．８）を有した。したがって、アルコール性肝炎におけるＴＮＦ−αの上昇が、重篤なケースにおいて最も見込まれ、ＴＮＦ−αが病因に関係しているということを示唆していると結論付けられる（Bird et al., 1990）。
【００２３】
ＴＮＦは、エンドトキシンの生物学的作用の多くを仲介する。近年の研究では、ＴＮＦの投与により肝傷害を引き起こし得ること、およびＴＮＦは肝細胞毒素のガラクトサミンの致死性を仲介し得ることが示されている。最も強力なＴＮＦ誘導因子の１つはエンドトキシンである。アルコール性肝疾患の患者は高い頻度で内毒素血症であること、およびアルコール性肝炎の臨床的徴候の多くはＴＮＦの既知の生物学的作用であることから、アルコール性肝炎患者においてその活性が評価された。ＴＮＦ産生の主要な源である末梢血単球からの基礎ＴＮＦおよびリポ多糖刺激ＴＮＦの放出は、１６人のアルコール性肝炎患者および１６人の健常ボランティアにおいて測定された。１６人のアルコール性肝炎患者のうちの８人と１６人の健常ボランティアのうちのたった２人で、自発的なＴＮＦ活性が検出された（ｐ＜０．０５）。リポ多糖刺激後、アルコール性肝炎患者からの平均単球ＴＮＦ放出は健常コントロールの２倍以上に有意に増加した（２５．３±３．７対１０．９±２．４単位／ｍｌ、ｐ＜０．００５）。したがって、アルコール性肝炎患者由来の単球は、自発的ＴＮＦ放出およびリポ多糖刺激ＴＮＦ放出を健常ボランティア由来の単球と比較して有意に増加したと結論付けられる（McClain and Cohen, 1989）。
【００２４】
リポ多糖（ＬＰＳ）結合タンパク質（ＬＢＰ）およびＣＤ１４は、エンドトキシンによる細胞の活性化において重要な媒介的役割を果たしている。Ｇｕｔ派生ＬＰＳは、アルコール性肝臓疾患における病的な肝傷害の助長に関与することを前提としている。４週間油にエタノールを加えたもので消化管内に給餌されたラットは、それらのクッパー細胞および肝細胞においてそれぞれＣＤ１４およびＬＢＰのレベルが上昇するということが証明された。上昇したＬＢＰおよびＣＤ１４発現は、種々の前炎症性サイトカインのＬＰＳ−誘導発現を急速に増加させ、そしてアルコール性肝傷害における病的な肝傷害の存在と相関した（Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999）。
【００２５】
関節炎は間接の炎症に関する疾患である。間接は、腫脹、硬直、圧痛、赤みまたは温かみを示す。症状は、体重減少、発熱または衰弱を伴う。これらの症状が２週間より長く続く場合、炎症性関節炎、たとえばリウマチ性関節炎がその原因であり得る。関節の炎症は、感染性関節炎を引き起こすことができる感染によってももたらされ得る。関節炎の非常に一般的な型は変形性関節疾患（変形性関節症（osteoarthritis））である。
【００２６】
関節炎およびその関連症状に一般に処方される医薬は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）である。ＮＳＡＩＤｓは、アスピリンやアスピリン様薬を包含する。それらは、関節痛、関節の硬直および腫れの原因である炎症を軽減する。しかしながら、ＮＳＡＩＤｓは、胃の出血などの多数の副作用を有する非特異的薬物である（関節炎についてのワシントン大学整形外科研究室のホームページ、フレデリック  マッツエン（委員長）、www.orthop.washington.edu）。ＮＳＡＩＤｓに加えて、セレブレックス（Celebrex）（商標）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）阻害剤が、成人の変形性関節症やリウマチ性関節炎の徴候や症状を和らげるために使用されている。それはまた、家族性大腸腺腫症の患者の治療にも示されている。
【００２７】
国際公開第０１／００２２９号パンフレットは、炎症治療のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストとＣＯＸ−２阻害剤との組み合わせを開示している。
【００２８】
ＴＮＦアンタゴニストは、関節炎の治療にも使用されている。ＴＮＦアンタゴニストは、たとえば国際公開第９１０３５５３号パンフレットに記載されている。
【００２９】
インターロイキンＩＬ−１８は関節の代謝に前炎症性の役割を果たしていることが研究により示されている。Oleeら（１９９９）は、ＩＬ−１８は関節の軟骨細胞によって産生され、前炎症性応答および異化応答を誘導することを示した。ＩＬ−１８ｍＲＮＡは、ＩＬ−１βによって軟骨細胞において誘導された。軟骨細胞はＩＬ−１８前駆体を産生し、ＩＬ−１の刺激に応答してＩＬ−１８の成熟型を分泌する。軟骨細胞に対するＩＬ−１８の効果についての研究は、それがＴＧＦ−β誘導増殖を阻害し、一酸化窒素の産生を高めるということをさらに示した。ＩＬ−１８は、正常ヒト間接軟骨細胞において、誘導一酸化窒素シンターゼ、誘導シクロオキシゲナーゼ、ＩＬ−６およびストロメライシン（stromelysin）などのいくつかの遺伝子の発現を刺激した。遺伝子の発現は、対応するタンパク質の合成と関係付けられる。ＩＬ−１８による正常ヒト関節軟骨の処置は、グルコサミノグリカンの放出を増加する。これらの知見により、ＩＬ−１８を軟骨細胞応答を制御し、軟骨の分解に寄与するサイトカインと認めた。
【００３０】
ヒト変形性関節症の組織におけるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）／カスパーゼ−１の局在化と、インターロイキン−１βおよびインターロイキン−１８の成熟化におけるその役割は、Sahaら（１９９９）により示されている。Sahaらは、ヒトの正常および変形性関節症（ＯＡ）の軟骨および滑膜におけるカスパーゼ−１の発現と産生を調べ、ＯＡ軟骨細胞におけるＩＣＥのレベルを定量し、そしてＩＣＥ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、およびＩＬ−１８の局所的分布と軟骨細胞のアポトーシスとの関係を検討した。この研究において行なわれた実験により、ＩＣＥがヒトの滑膜および軟骨の両方において、正常組織においてよりもＯＡ組織において極めてより多数の細胞染色陽性を伴い、発現および合成されることを示した。ＩＣＥ産生は、関節軟骨の表面および上方中間層（upper intermediate layers）に位置付けられた。ＯＡ軟骨外殖片および軟骨細胞における成熟ＩＬ−１βの産生は、ＩＬ−１８陽性細胞の数も目立って減少させる特異的ＩＣＥ阻害剤による治療によって完全に遮断された。活性ＩＬ−１βおよびＩＣＥの関係は、ＩＣＥがこの前炎症性サイトカインを活性化することによりＯＡ進行を助長し、ＩＬ−１８が軟骨の病状に関与し得ることを示唆する。
【００３１】
Gracieら（１９９９）は、ＩＬ−１８についてリウマチ性関節炎における前炎症性の役割を示唆した。Gracieらは、リウマチ性関節炎の滑膜組織内に変形性関節症のコントロールよりも有意に高いレベルでＩＬ−１８ｍＲＮＡおよびタンパク質を検出した。ＩＬ−１８とＩＬ−１２またはＩＬ−１５との組み合わせは、インビトロで滑膜組織によってＩＦＮ−γ産生を誘導することも示された。さらに、コラーゲン／不完全フロイントアジュバント免疫マウスのＩＬ−１８の投与は、びらん性、炎症性関節炎の発症を促進し、ＩＬ−１８がインビトロにおいて前炎症性であり得ることを示唆している。
【００３２】
しかしながら、これまでのところ、化学物質を除いては、可溶性受容体またはモノクローナル抗体を用いることによるＴＮＦαおよびＩＬ−１βの遮断のみが、マウスのコラーゲン誘導関節炎を減ずることが示されており（ＣＩＡ、リウマチ性関節炎のマウスモデル）（Williams et al., 1994）、したがって、リウマチ性関節炎のための治療と示唆された。
【００３３】
用語「慢性または特発性炎症性腸疾患」は、クローン病と潰瘍性大腸炎との少なくとも２つの症状を包含する。両方ともに胃腸管の疾患であり、クローン病は最も一般的には小腸に影響を与える。結腸にも影響をおよぼす場合、潰瘍性大腸炎との鑑別診断（以下参照）が問題となり得る。
【００３４】
クローン病において慢性的な炎症と潰瘍は、通常小腸閉塞か急性虫垂炎と似ている腹痛のいずれかと共に始まり、他の提示（presentation）はその合併症に関する。疾患の経過は、慢性であり、治療にもかかわらず悪化および寛解となり得る。発症は通常成年人生前半であり、全体の約半分の症例で２０歳と３０歳のあいだ、そして９０％は１０歳と４０歳のあいだに始まる。女性よりわずかに男性の方が多く罹患する。
【００３５】
顕微鏡による検査は、肉眼で見える様子（gross appearances）を反映する。炎症の関与は不連続：つまり限局性でつぎはぎである。リンパ球と血漿細胞の堆積は、主に粘膜および粘膜下組織で見出されるが、通常全層に影響を及ぼす（全層性炎症）。クローン病の古典的微視的特長は、リンパ球のカフに囲まれた顆粒細胞の存在である。特発性炎症性大腸疾患の発生率は、かなり地理的変動を示す。これらの疾患は、更なる都市化と繁栄が南欧と日本の一部で高い発生率につながっているとはいえ、南欧、アフリカ、南アメリカおよびアジアよりも北欧およびアメリカ合衆国でより高い発生率を示す（General and Systematic Pathology, Churchill Livingston, 3rd edition 2000, JCE, Underwood, Ed.）。
【００３６】
クローン病では、臨床的に２つの主な群、発症から３年以内に永続的な寛解に移行する患者を含む第１群と３年を超えて執拗な疾患の患者を含む第２群とがある。
【００３７】
どんな原因論でも、前炎症性サイトカイン、特にインターロイキン（ＩＬ）１、２、６および８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの産生の増加を伴うクローン病においては、持続的で不適切なＴ細胞およびマクロファージの活性化との証拠がある。クローン病は、線維形成を伴う持続した（慢性の）炎症によって特徴付けられる。線維芽細胞の増殖およびコラーゲン沈着の過程は、特定の抗炎症作用、すなわち、線維芽細胞の補充（recruitment）、マトリックスの合成および炎症細胞のダウンレギュレーションを有するトランスフォーミング成長因子βによって媒介され得るが、多くのほかの媒介物が関係しているようである。
【００３８】
潰瘍性大腸炎は大腸の非特異的炎症性疾患であり、通常、直腸で始まり、種々の範囲に近縁的に広がる。クローン病とは異なり、潰瘍性大腸炎は大腸に限定される。
【００３９】
潰瘍性大腸炎は、変化した自己免疫反応性の結果であるということを示すための成長徴候があるが、粘膜損傷も不適切なＴ細胞の活性化ならびにマクロファージおよび好中球由来のサイトカイン、プロテアーゼおよび反応性酸素代謝物によって引き起こされる間接的な損傷の結果生じる。この後者の大腸上皮への損傷の機序は、「傍観者（innocent bystander）」損傷と呼ばれている。自己免疫の恩恵の証拠は、自己反応性Ｔリンパ球と大腸上皮細胞および内非細胞の自己抗体と抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）の存在である。しかしながら、潰瘍性大腸炎は、粘膜損傷が自己抗原への免疫学的な反応の直接的な結果である自己免疫疾患と考えられる（General and Systematic Pathology、前出）。
【００４０】
クローン病の治療に関しては、ほとんどの人々がまず、メサラミンを含む薬物（炎症の制御を助ける物質）で治療される。その薬物により恩恵を受けなかった患者またはその薬物を許容できなかった患者は、一般的に５−ＡＳＡ試薬として知られる他のメサラミン含有薬物を受け得る。メサラミン製剤の可能性のある副作用は、悪心、嘔吐、胸やけ、下痢および頭痛である。
【００４１】
一部の患者は炎症を制御するためにコルチコステロイド類を服用する。これらの薬物は、活性クローン病に最も効果的であるが、非常に感染を受けやすいなどの深刻な副作用をもたらす。
【００４２】
免疫系を抑制する薬物もクローン病の治療に使用される。最も一般的に処方されるのは、６−メルカプトプリンおよび関連薬アザチオプリン（azathioprine）である。免疫抑制剤は、炎症に寄与する免疫反応を遮断することによりはたらく。これらの薬物は、悪心、嘔吐および下痢などの副作用を引き起こし得、感染への人の抵抗を低下させ得る。患者はコルチコステロイドと免疫抑制薬との組合せにより治療される場合、コルチコステロイドの用量は、最終的に低くすることができる。いくつかの研究により、免疫抑制薬はコルチコステロイドの有効性を高め得ることが示唆されている。
【００４３】
アメリカ合衆国食品医薬品局は、標準的な治療（メサラミン物質、コルチコステロイド、免疫抑制剤）に反応しない中程度から重篤なクローン病の治療、および開放性（open）、ドレーン瘻の治療に薬物、インフリキシマブを承認している。クローン病に特異的に承認された最初の治療であるインフリキシマブは、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）モノクローナル抗体である。抗ＴＮＦは、ＴＮＦが腸に達する前に血流からＴＮＦを除去し、それにより炎症を予防する。
【００４４】
抗生物質は、狭窄、瘻により引き起こされる小腸における微生物の過剰増殖を治療するため、または手術の前に使用される。この共通の問題に対して、医師は、１つ以上の次の抗生物質：アンピシリン、スルホンアミド、セファロスポリン、テトラサイクリンまたはメトロニダゾールを処方し得る。
【００４５】
下痢と痙攣性腹痛（crampy abdominal pain）は、炎症が治まるとたいてい治まるが、別の医薬も必要とされ得る。いくつかの下痢止め薬、たとえばジフェノキシレート、ロペラミドおよびコデインなどが使用され得る。下痢による脱水の患者は、通常液体と電解質で治療される。
【００４６】
炎症性大腸疾患、特にクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療および／または予防のための、副作用を軽減し、理想的には副作用のない有効な治療の必要性は依然として残されている。
【００４７】
組織学的および免疫学的観測の両方は、細胞が免疫を媒介し、Ｔ細胞の活性化がＣＤの重要な特徴であるということを示している。ヒトおよび実験的モデルからの研究により、ＣＤでは、局所免疫反応が優先的にＴｈ１型である傾向があり（Desreumaux et al, 1997）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなどの局所的に放出されるサイトカインが炎症応答の促進および拡大に寄与する（Reimund et al. 1996）ということを示唆している。
【００４８】
サイトカインＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γ分泌の刺激、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性の促進、そしてＴＨ１細胞の分化の刺激によりサイトカインＩＬ−１２との共同研究でＴｈ１媒介性免疫応答において重要な役割を果たしている（Uschito et al 1996）。
【００４９】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、抗原、マイトジェン、および可能な別の因子と共に、ＩＦＮ−γの産生を誘導するために作用する。ＩＬ−１８はまた、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２の産生を高め、抗−ＣＤ３誘導Ｔ細胞増殖を増強し、そしてナチュラルキラー細胞のＦａｓ媒介殺害（killing）を増加させる。成熟ＩＬ−１８は、その前駆体からＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ、カスパーゼ−１）により産生される。ＩＬ−１８受容体は、リガンドの結合において協同する少なくとも２つの成分からなる。ＩＬ−１８に対する高−および低−アフィニティー結合部位がマウスＩＬ−１２刺激Ｔ細胞に見出され（Okamoto et al., 1998）、多重鎖受容体複合体であることを示唆する。２つの受容体サブユニットがこれまでに同定され、両方ともＩＬ−１受容体ファミリーに属する（Okamoto et al., 1999）。ＩＬ−１８のシグナル伝達は、ＮＦ−κＢの活性化を伴う（Matsumoto et al, 1997）。
【００５０】
近年、ＩＬ−１８は炎症性腸疾患にいくつかの密接な関係を有すると示唆されている（Pizarro et al, 1999; Monteleone et al, 1999）。
【００５１】
Pizarroら（１９９９）は、クローン病の患者由来の大腸試料および単離粘膜細胞集団におけるＩＬ−１８の発現と局在性を特徴付けた。半定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて、ＩＬ−１８ｍＲＮＡ転写物が、潰瘍性大腸炎および非炎症コントロールの患者と比較してＣＤ由来の新鮮な単離腸管上皮細胞および固有層単核細胞において増加することが見出された。ＩＬ−１８ｍＲＮＡ転写物は、固有層単核細胞と比較して腸管上皮細胞においてより豊富であった。外科的に切除された大腸組織の免疫組織化学分析は、腸管上皮細胞のみならず固有層単核細胞（特にマクロファージおよび樹状細胞）の双方にＩＬ−１８を局在化した。ウエスタンブロット分析は、１８．３ｋＤａバンド（組換えおよび成熟ヒトＩＬ−１８タンパク質に一致）がＵＣに対してＣＤの腸管粘膜生検において優勢に見出され；２４ｋＤａの二番目のバンド（不活性ＩＬ−１８前駆体に一致）はＣＤおよびＵＣの両方の生検由来の非炎症領域において検出され、非炎症コントロールにおいて見られた唯一のものであったということを示した。
【００５２】
Monteleoneら（１９９９）は、これらの知見を確認した。１２人のクローン病の患者および９人の潰瘍性大腸炎の患者および１５人の非炎症性腸疾患のコントロールの粘膜腸管組織全体および固有層単核細胞を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によりＩＬ−１８について調べた。ＩＬ−１８の転写物は、すべての被検試料において見られた。しかしながら、ＩＬ−１８ｍＲＮＡ蓄積の増加は、潰瘍性大腸炎およびコントロールと比較してクローン病由来の粘膜および固有層単核細胞試料の両方において検出された。クローン病では、ＩＬ−１８の転写物は、関係領域から採取した粘膜試料に最も豊富であった。成熟ＩＬ−１８と一致する１８ｋＤバンドは、クローン病の粘膜試料において主に見出された。非−ＩＢＤコントロール由来の粘膜試料において、ＩＬ−１８は２４ｋＤａポリペプチドとして存在した。常に、活性ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）サブユニット（ｐ２０）が、ＣＤまたはＵＣのいずれか由来の試料で発現したのに対して、非−ＩＢＤコントロール由来の大腸粘膜においてはＩＣＥは前駆体（ｐ４５）としてのみ合成された。
【００５３】
Ohtaら２００１は、ＩＬ−１８の発現が、正常な皮膚における発現と関連して、乾癬病変皮膚において増加したことを示した。それらの知見は、ケラチノサイト由来のＩＬ−１８は、乾癬病変におけるＴｈ１応答の発症に参加すること、およびその生物活性は、皮膚炎症において厳しく調節されるようであることを示す。
【００５４】
いくつかの動物モデルにおいて、内因性ＩＬ−１８を中和する抗体は、疾患の深刻性を減少する。エンドトキシン致死症は抗−ＩＬ−１８によって妨げられる。インターフェロン−γ非依存のモデルにおいてさえ、ＩＬ−１８の中和は生存を延長する。抗−ＩＬ−１８はまた、毒素または活性Ｔ細胞により誘導される細胞性傷害に対して肝臓を保護する。肝臓のメラノーマ転移のモデルにおいて、ＩＬ−１８遮断は、血管内皮接着分子１の発現のＩＬ−１８のアップレギュレーションの防止により悪性細胞の接着を減少する。ＩＬ−１８およびＩＬ−１２は、ＩＦＮγを産生するためにＴ細胞およびナチュラルキラー細胞を刺激するために相乗的に作用するが、ＩＬ−１８の中和はＩＦＮγのＩＬ−１２誘導を妨げる。ＩＬ−１８は、いくつかのサイトカインのように、その機序は最もしばしばＩＦＮγ依存である、マウスにおける腫瘍に対する宿主の防御を高めるために使用することができる。それにもかかわらず、それはＩＬ−１８の前炎症性ポートフォリオであり、おそらく宿主防御を高めるために寄与する。モデルまたは関節炎、肺傷害または炎症性腸疾患において、ＩＬ−１８の中和は炎症の媒介におけるこれらサイトカインの重要な役割を明らかにする（Dinatrello 2000）。
【００５５】
公開されたデータは、ＩＬ−１８が炎症性ＣＮＳ疾患において病理学の役割を果たし得ることを暗示する。ＩＬ−１８の中和は、動物モデルにおいて、脳傷害（Yatsiv et al. 2002）、虚血性傷害（Mallat et al. 2002）、心臓の機能障害（Raeburn 2002）および神経炎（Yu et al 2002）から保護することが示された。
【００５６】
しかしながら、ＩＬ−１８がマウスにおいて腫瘍に対する宿主の防御を進めるという証拠がある。たとえば、同系のマウスにおいて、マウスＩＬ−１２またはマウスＩＬ−１８を発現するマウス乳癌細胞は、発癌性がほとんどなく、コントロールである非発現細胞よりもよりゆっくりと腫瘍を形成した（Coughlin et al. 1998）。抗体の中和研究は、その抗腫瘍効果がＩＦＮγを必要とすることを明らかにした。Tasakiによる研究において、インターロイキン−１８の発現によりマウスの大腸癌細胞に引き起こされた感染防御免疫が観察されている。ＩＬ−１８遺伝子をコードするベクターで形質転換された大腸癌細胞は、免疫不全マウスに導入された場合、皮下腫瘍を形成できず、非形質転換接種（non-transduced inoculated）大腸癌細胞に耐性となった。免疫組織化学分析は、ＩＬ−１８ベクターにより形質転換された細胞での大腸腫瘍における血管の数は、目立って減少することを明らかにした。大腸ＩＬ−１８形質転換細胞の腫瘍形成性の喪失が、免疫不全マウスにおいて観察されなかった。したがって、腫瘍細胞から分泌されたＩＬ−１８は、抗腫瘍反応を誘導するためにヘルパーＴ細胞Ｉ型を刺激するので、アジュバントとして作用する。
【００５７】
ＩＦＮ−αは、慢性Ｃ型肝炎において、とりわけＩＬ−１８ＢＰの誘導によってインビボでその抗炎症作用を発揮するということが示唆されている（Kaser et al. 2002）。
【００５８】
前述の研究では、健常な個体と比較して、敗血症（Novick 2001）、急性移植片対宿主病（Zecchina 2001）、クローン病（Corbaz 2002）などの多くの疾患においてＩＬ−１８ＢＰのレベルが目立って上昇したということが見出された。しかしながら、これらの患者において、ＩＬ−１８の循環（circulation）レベルが非常に高く、したがって循環に存在するＩＬ−１８ＢＰのレベルは、ＩＬ−１８の完全な中和に充分でないかもしれないということも見出された。
【００５９】
したがって、ＩＬ−１８などのＩＬ−１ファミリーのサイトカインがその病因に関与している疾患を治療および／または予防するための手段を提供する必要がある。
【発明の開示】
【００６０】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体を阻害することができるサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１ファミリー由来のサイトカイン−１、より好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用であって、該サイトカイン−２の受容体の誘導により発症または悪化する疾患の治療または予防のための医薬の製造における使用に関する。
【００６１】
より詳細には、サイトカイン−１は、サイトカイン−２の受容体のシグナル伝達鎖に結合することによりサイトカイン−２活性を阻害する。したがって、サイトカイン−１は、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎から選択される炎症性疾患の治療または予防のため、または転移形成の治療または予防のために用いられる。所望の場合、本発明の医薬は、さらにＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを含有することができる。
【００６２】
サイトカイン−１タンパク質の代わりに、そのようなサイトカイン−１をコードするベクターを、該サイトカイン−２の受容体の誘導により発症または悪化する疾患の治療または予防のための医薬の製造において使用することができる。
【００６３】
本発明の前記タンパク質および／またはベクターは、全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与することができる。
【００６４】
さらに、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体を阻害することができるサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１ファミリー由来のサイトカイン−１、より好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂの内因性遺伝子活性化のためのベクターであって、該サイトカイン−２の受容体の誘導により発症または悪化する疾患の治療または予防のためのベクターを提供する。より詳細には、サイトカイン−１は、サイトカイン−２の受容体のシグナル伝達鎖に結合することによりサイトカイン−２活性を阻害する。より具体的には、本発明は、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎から選択される炎症性疾患の治療または予防のため、または転移形成の治療または予防のためのサイトカイン−１の使用に関する。所望の場合、本発明の医薬は、さらにＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを含有することができる。
【００６５】
本発明の内因性遺伝子活性化のためのベクターは、全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与することができる。
【００６６】
もう１つの側面において、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体を阻害することができるサイトカイン−１の阻害剤の使用であって、該サイトカイン−２の受容体の誘導により予防または軽減される疾患の治療または予防のための使用を提供する。より詳細には、本発明は、ウイルス性疾患の治療または予防のための、または癌の治療または予防のための本発明のサイトカイン−１の阻害剤の使用に関する。
【００６７】
サイトカイン−１の阻害剤は、たとえば、サイトカイン−１を結合することができる抗体、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、または可溶性サイトカイン−２受容体もしくはそのフラグメントを包含する。
【００６８】
さらに、本発明は、必要とする患者におけるＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体の阻害方法であって、ＩＬ−１８Ｐまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質またはフラグメントを結合することができる、治療的に有効量のサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質もしくはフラグメントの投与を含む方法を提供する。より詳細には、サイトカイン−１は、サイトカイン−２の受容体のシグナル伝達鎖に結合することによりサイトカイン−２活性を阻害する。より具体的には、本発明は、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎から選択される炎症性疾患の治療または予防のため、または転移形成の治療または予防のためのサイトカイン−１の使用に関する。所望の場合、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントをサイトカイン−１と同時投与することができる。本発明の方法によるサイトカイン−１は、全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与することができる。
【００６９】
あるいは、本発明の方法は、前記サイトカイン−１をコードするベクターの投与を含む。
【００７０】
また、本発明は、必要とする患者におけるＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体の阻害方法であって、ＩＬ−１８Ｐまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質もしくはフラグメントを結合することができる、サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質またはフラグメントの遺伝子活性化のための治療的に有効量のベクターの投与を含む方法を提供する。より詳細には、サイトカイン−１は、サイトカイン−２の受容体のシグナル伝達鎖に結合することによりサイトカイン−２活性を阻害する。サイトカイン−１は、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎から選択される炎症性疾患の治療または予防のため、または転移形成の治療または予防のために用いられ得る。所望の場合、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントをサイトカイン−１と同時投与することができる。本発明の方法による遺伝子活性化のためのベクターは、全身的、皮下的および／または筋肉内的に投与することができる。
【００７１】
もう１つの側面では、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体、好ましくはＩＬ−１８の受容体を阻害することができるサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１ファミリー由来のサイトカイン−１、より好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの阻害方法であって、該サイトカイン−２の受容体の誘導により予防または軽減される疾患の治療または予防のための方法に関する。より詳細には、本発明の方法は、ウイルス性疾患の治療または予防、または癌の治療または予防のためのサイトカイン−１の阻害剤を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１受容体ファミリーの一員であるサイトカイン−２の受容体（たとえば、ＩＬ−１８Ｒ）を阻害することができるサイトカイン−１（たとえば、ＩＬ−１Ｆ７ｂ）の使用であって、該サイトカイン−２の受容体の誘導により発症または悪化する疾患の治療または予防のための医薬の製造における使用に関する。本明細書において、用語「サイトカイン−２の受容体を阻害する」と「サイトカイン−２の活性を阻害する」とは置き換え可能である。したがって、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントに結合することができ、ＩＬ−１ファミリーサイトカインの一員であるサイトカイン−２の活性を阻害することができるサイトカイン−１の使用に関する。本発明は、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８活性の阻害を増強することが明らかにされたという知見にもとづく。ＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８ＢＰに結合し、その複合体は、ＩＬ−１８、あるいはＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達鎖（すなわちＩＬ−１８Ｒβ）を補充（recruiting）することによるＩＬ−１８Ｒの活性化を阻害することが見出された。
【００７３】
本発明のサイトカイン−１は、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１およびＩＬ−１ＲａなどのＩＬ−１ファミリーの一員であり得る。本発明によれば、サイトカイン−１およびサイトカイン−２は、２つの異なるサイトカインである。たとえば、以下のサイトカイン−１および２の組み合わせは、ＩＬ−１Ｆ７ｂ（サイトカイン−１）およびＩＬ−１８（サイトカイン−２）、ＩＬ−１Ｆ７ｂ（サイトカイン−１）およびＩＬ−１（サイトカイン−２）、ＩＬ−１８（サイトカイン−１）およびＩＬ−１（サイトカイン−２）、ＩＬ−１（サイトカイン−１）およびＩＬ−１８（サイトカイン−２）、ＩＬ−１Ｆ７ｂ（サイトカイン−１）およびＩＬ−１Ｒａ（サイトカイン−２）、ＩＬ−１Ｒａ（サイトカイン−１）およびＩＬ−１８（サイトカイン−２）、ならびにＩＬ−１８（サイトカイン−１）およびＩＬ−１Ｒａ（サイトカイン−２）から選択される。
【００７４】
ＩＬ−１Ｆ７ｂ（ＩＬ−１Ｈ４とも呼ばれる）は、近年、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１８（ＩＬ−１ファミリー）に配列相同性を有するタンパク質の増加するファミリーの新規なメンバーとして発見された。ＩＬ−１Ｆ７ｂはＩＬ−１８受容体のサブユニットの１つであるＩＬ−１８Ｒαユニットに結合するが、この結合はＩＬ−１８のアゴニスト様またはアンタゴニスト様作用をもたらすものではない。本発明によれば、化学交差結合を用いることにより、ＩＬ−１Ｆ７ｂはＩＬ−１８Ｒαに結合するが、ＩＬ−１８とは異なり、ＩＬ−１Ｆ７ｂは機能的に活性な三重複合体を形成するためにＩＬ−１８Ｒβ鎖を補充できない。
【００７５】
ＩＬ−１Ｆ７ｂおよびＩＬ−１８の配列は比較され、それらのタンパク質は２つの保存されたアミノ酸、すなわちＩＬ−１Ｆ７ｂではアミノ酸Ｅ３５およびＫ１２４そしてＩＬ−１８ではＥ４２およびＫ８９を共有することが見出された。ＩＬ−１８の残基Ｅ４２およびＫ８９は、それらがＩＬ−１８Ｒα（活性化）およびＩＬ−１８ＢＰ（阻害）への結合に関与しているので、ＩＬ−１８の活性と阻害の両方にとって重要である。
【００７６】
さらに、我々は、交差結合実験により、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰに結合すること、そしてＩＬ−１８と同様にＩＬ−１Ｆ７ｂも、ＩＬ−１８Ｒαへの結合に重要である同じ２つの保存されたアミノ酸残基（すなわち、Ｅ３５およびＫ１２４）によりＩＬ−１８ＢＰに結合し得るということを見出した。したがって、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰと複合体となったのち、ＩＬ−１Ｆ７ｂは、もはやＩＬ−１８Ｒαと結合できないであろう。ＩＬ−１Ｆ７ｂはＩＬ−１８ＢＰに結合するのみならず、その活性を増強する、すなわちＩＬ−１８活性の阻害を増強するということが見出された。この活性は、成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂタンパク質のみならずその前駆体においても見られた。ＩＬ−１８ＢＰとの複合体におけるＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８Ｒαに結合できないので、ＩＬ−１８活性の阻害は、おそらくその複合体のシグナル伝達ＩＬ−１８Ｒβ鎖への結合に起因する。したがってβ鎖は複合体に編成され得、β鎖がＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８と機能的受容体複合体を形成できないようにする。
【００７７】
したがって、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、対立遺伝子変異体もしくはフラグメントを結合することができる種々のサイトカイン（サイトカイン−１）、またはそのアイソフォーム、ムテイン、対立遺伝子変異体もしくはフラグメントによる、ＩＬ−１ファミリーのメンバーであるサイトカイン−２の受容体を介したシグナル伝達の阻害を包含する。
【００７８】
免疫組織化学的局在化研究で、単球集団におけるＩＬ−１Ｆ７ｂの存在が証明されたことにより、ＩＬ−１８の生物学的活性の天然発現モジュレーターとしてのＩＬ−１Ｆ７ｂの役割が示唆された。
【００７９】
本明細書に使用される場合、「ムテイン」という用語は、ＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１の類似体を意味し、該類似体においては、ＩＬ−１Ｆ７ｂと比較して得られる産物の活性を目立って変化させることなく、サイトカイン−１（たとえば、ＩＬ−１Ｆ７ｂ）の１つ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で置換されているか、もしくは欠失されているか、または１つ以上のアミノ酸残基がＩＬ−１Ｆ７ｂに付加されている。より詳細には、ＩＬ−１Ｆ７ｂの１つ以上のアミノ酸であって、３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、もっとも好ましくは１つまたは２つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、または除去され、または追加され得る。これらのムテインは、既知の合成法によっておよび／または位置指定突然変異誘発技術、またはそれに好適な任意の他の既知の技術によって製造される。
【００８０】
本発明によるムテインは、本発明によるＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされたタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が従来から「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3および6.4（1987, 1992）、およびSambrook et al., supra参照。制限なく、ストリンジェントな条件の例は、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍの１２〜２０℃低い洗浄条件など、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３７℃で３０〜６０分間、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを６８℃で３０〜６０分間などである。当業者であれば、ストリンジェントな条件がＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（たとえば１０〜４０塩基）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することは理解される。もし混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。上記Ausubel参照。
【００８１】
任意のこのようなムテインは、好ましくは、ＩＬ−１Ｆ７ｂと実質的に同様の活性を有するほど、ＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１の配列に充分に重複するアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１Ｆ７ｂの１つの活性は、ＩＬ−１８ＢＰを結合するその能力である。したがって、任意の所定のムテインが、ＩＬ−１Ｆ７ｂと実質的に同じ活性を有するかどうかは、適切に標識されたＩＬ−１８ＢＰに結合するか否かを決定するための、たとえば、単純なサンドイッチ阻害アッセイ（たとえば、放射免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ）に、そのようなムテインを供することを含むルーチンの実験方法によって決定することができる。
【００８２】
好ましい態様において、任意のこのようなムテインは、ＩＬ−１Ｆ７ｂのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。より好ましくは、それは、ＩＬ−１Ｆ７ｂのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％同一性または相同性を有する。
【００８３】
本発明により使用され得るＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１のムテイン、あるいはそれをコードする核酸は、本明細書中で示された教示および指導に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によってルーチンな手順で得られる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドに実質的に相当する配列の有限の一群を含む。
【００８４】
本発明によるムテインの好ましい変更は、「保存的（な）（conservative）」置換として公知である。ＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１の保存的なアミノ酸置換とは、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸を含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
【００８５】
好ましくは、同義のアミノ酸群は、表１に規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表２に規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表３に規定される群である。
【００８６】
【表１】
0004563813.tif 000002
【００８７】
【表２】
0004563813.tif 000003
【００８８】
【表３】
0004563813.tif 000004
【００８９】
本発明における使用のための、ＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１ポリペプチドもしくはタンパク質のムテインを得るために使用できるタンパク質のアミノ酸置換の製造例としては、Markらによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；Kothsらによる同第５，１１６，９４３号明細書、Namenらによる同第４，９６５，１９５号明細書、Chongらによる同第４，８７９，１１１号明細書、Leeらによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shawら）に示されたリジン置換タンパク質を含む。
【００９０】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、サイトカイン−１（好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂ）またはそのムテインもしくは断片からなるポリペプチドを意味する。ＩＬ−１Ｆ７ｂは、このようにたとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００９１】
本明細書中で用いられる「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から製造され得るサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂの誘導体、ならびに、そのムテインおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−１Ｆ７ｂの活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００９２】
これらの誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含むことができ、該側鎖は、抗原部位を覆い、かつサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂの体液中での滞留を拡大し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級アミンもしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル基またはトレオニル基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００９３】
サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂおよび／またはムテインおよび融合タンパク質の「フラグメント」として、本発明は、該画分がＩＬ−１８ＢＰに結合し、サイトカイン−２受容体を阻害するなどのＩＬ−１Ｆ７ｂと実質的に類似の活性を有するならば、タンパク質分子単独または関連分子やそこに結合する残基（たとえば糖またはリン酸残基、またはタンパク質分子の集合体、または糖残基単独）などと一緒のタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体を包含する。
【００９４】
本発明はまた、サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂアイソフォーム、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分または円順列変異誘導体に関する。これらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的誘導体は、サイトカイン−１の生物学的活性、とりわけＩＬ−１８ＢＰへの結合、および好ましくは、サイトカイン−２阻害の促進を保持する。たとえば、ＩＬ−１Ｆ７ｂのムテインは、ＩＬ−１８ＢＰへ結合する能力、および好ましくはＩＬ−１８阻害を促進する能力を保持する。ムテインは、サイトカイン−１のＩＬ−１８ＢＰへの結合に関与するアミノ酸を保持する。たとえば、ＩＬ−１Ｆ７ｂの場合は、そのムテインはアミノ酸Ｅ３５およびＫ１２４を保持する。理想的には、そのようなムテインは非修飾サイトカイン−１と比較して増強された生物学的活性を有する。好ましい活性画分は、サイトカイン−１の活性よりも優れた活性、または優れた安定性または低い毒性または免疫原性などのさらなる利点を有するか、または大容量での生産が容易である、または精製が容易であるなどの利点を有する。
【００９５】
サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂは、サイトカイン−２、好ましくはＩＬ−１８により発症または悪化する免疫性疾患または転移形成の治療または予防のための医薬組成物において使用することができる。いくつかの免疫性疾患においては、患者の循環ＩＬ−１８ＢＰのレベルが高いが、ＩＬ−１８ＢＰの濃度は、該患者の循環（circulation）に見出される高濃度のＩＬ−１８を完全に中和するために充分なものではないことが分かっている。したがって、サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂをすでにＩＬ−１８ＢＰの上昇したような患者に投与することは、ＩＬ−１８作用の完全な阻害に有効であり得る。あるいは、ＩＬ−１Ｆ７ｂおよびＩＬ−１８ＢＰは、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎から選択される炎症性疾患の治療または予防のため、または転移形成の治療または予防のために患者に同時投与することができる。
【００９６】
ＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８ＢＰに結合するのみならず、その活性（ＩＬ−１８活性の阻害）を高めるということが見出されたので、ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８ＢＰとの同時投与は、低容量のＩＬ−１８ＢＰの投与が望まれる場合に有効であり得る。
【００９７】
サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂは、疾患によって好適な方法で投与される。したがって、たとえば、局所的、全身的、皮下的および筋肉内的に投与し得る。
【００９８】
動物モデルにおけるＩＬ−１８の中和は、このサイトカインの媒介炎症における重要な役割を明らかにした（インターロイキン−１８、前炎症性サイトカイン、Dinarello CA. Eur Cytokine Netw 2000 Sep; 11(3):483-6）。したがって、本発明はさらに、サイトカイン−１、またはサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂのコード配列を含有する発現ベクターの、炎症を治療または予防するための医薬の製造のための使用に関する。このように、サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂは、エンドトキシン致死症（敗血症）、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬、炎症性腸疾患、脳傷害、虚血性傷害、心臓機能障害および神経炎などのＩＬ−１８がそれらの病因に関与していることが知られている炎症性疾患の治療または予防のために投与することができる。
【００９９】
ＩＬ−１８の遮断は、血管内皮接着分子−１の発現のＩＬ−１８アップレギュレーションを妨げることにより悪性腫瘍細胞の接着を低減するので、本発明はさらに、転移形成を予防するための医薬の製造のための発現ベクターの使用に関する。したがって、遺伝子治療アプローチが、サイトカイン−１を必要な部位に送達するために考慮される。障害を治療するために、サイトカイン−１（たとえばＩＬ−１Ｆ７ｂ）の配列を含有する遺伝子治療ベクターは、直接患部組織に注射してもよく、このため、ベクターの希釈、標的細胞または組織の到達や標的化、および副作用などの遺伝子治療ベクターの全身投与に関わる問題が回避される。あるいは、本発明のサイトカイン−１のコード配列を含有する発現ベクターは、筋肉内注射により投与することもできる。
【０１００】
前述したサイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体または活性画分は、医薬組成物の好ましい活性成分である。前述したＩＬ−１８ＢＰおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体または活性画分は、さらにその医薬組成物の活性成分として含めることができる。
【０１０１】
「薬学的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与される宿主に有害でない任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与に対しては、活性タンパク質は、注射剤のため生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などのビヒクル中で単位投与量形態に処方され得る。
【０１０２】
本発明の医薬組成物の活性成分は、多様な方法で個体に投与することができる。投与経路は、皮内、経皮（たとえば、徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内（全身的）、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所および鼻腔内経路である。任意のほかの治療的に有効な投与経路、たとえば、上皮もしくは内皮組織を通した吸収、または活性薬剤をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえば、ベクターを介し）、インビボで該活性薬剤が発現および分泌するようにした遺伝子治療などが使用できる。さらに、本発明のタンパク質は、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどのほかの生物学的に活性な薬剤成分と一緒に投与することができる。
【０１０３】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内など）投与については、活性タンパク質は、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）と共同して、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般的に使用される技術により滅菌される。
【０１０４】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティーも、人体において分子の半減期を増加させる共役前駆体を使用すること、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように分子をポリエチレングリコールに連結することなどにより改善することができる。
【０１０５】
サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂまたは前述のそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは活性画分は、敗血症、毒素または活性化Ｔ細胞またはＣ型肝炎により引き起こされる肝臓傷害、関節炎、肺傷害、乾癬または炎症性腸疾患などの炎症性疾患を患う患者においてサイトカイン−２活性を阻害するために使用することができる。ＩＬ−１８遮断は、血管内皮接着分子−１の発現のＩＬ−１８アップレギュレーションを防止することにより、ＩＬ−１８悪性腫瘍細胞の接着を減少させるので、本発明のサイトカイン−１または前述のそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは活性画分は、転移形成を予防するためにも使用することができる。前記の方法は、治療的有効量のサイトカイン−１（たとえばＩＬ−１Ｆ７ｂ）の必要とする患者への投与を含む。サイトカイン−１は、ＩＬ−１８ＢＰまたは前述のそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは活性画分と同時投与し得る。
【０１０６】
活性タンパク質の治療的有効量は、ムテインの種類、ムテインのＩＬ−１８ＢＰに対する親和性、変異体によって示される任意の残留細胞毒性活性、投与経路、患者の臨床状態などを含む多くの変数の関数となるであろう。
【０１０７】
「治療的有効量」は、投与した際に、ＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１が結果として、ＩＬ−１８ＢＰまたは前述のそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは活性画分のＩＬ−１８阻害活性を高めるような量である。単回または複数回投与として個体に投与される服用量は、投与経路、患者の状態や特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時治療、治療の頻度ならびに望ましい効果などの多様な因子に依存して変化する。確立される服用量の範囲の調整や操作は、サイトカイン−１の活性を測定するインビトロおよびインビボ測定法と同様に、当業者の能力の範囲内である。
【０１０８】
通常サイトカイン−１が発現されていない細胞、またはサイトカイン−１の発現量が充分ではない細胞において、サイトカイン−１、好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂの内因的な産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用もまた、本発明より検討される。そのベクターは、サイトカインを発現することが所望される細胞において機能する調節配列を含有する。そのような調節配列はプロモーターまたはエンハンサーを含有し得る。その調節配列は、そののち相同組換えによってゲノムの適当な座に導入されてもよく、したがって作動可能に調節配列を遺伝子と連結させることにより必要とされる発現が誘導または増強される。その技術は、通常「内在性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【０１０９】
たとえばサイレンシングエレメントのような負の調節エレメントをサイトカイン−１の遺伝子座に導入することによって、サイトカイン−１発現のダウンレギュレーションまたは予防を誘導するなどの同じ技術で、サイトカイン−１の発現を抑えることが可能であることは、当業者によって理解されるであろう。そのようなサイトカイン−１発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または治療するためのサイトカイン−１阻害剤の使用と同じ効果を有することは、当業者に理解されるであろう。
【０１１０】
したがって、炎症性疾患において、または転移形成の阻害のためになど、ＩＬ−１８の作用を減少させたい場合、細胞においてＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１の量または活性を増加させることが好ましいであろう。ＩＬ−１８ＢＰは、それを必要とする被験者の治療のために、たとえばＩＬ−１Ｆ７ｂなどのサイトカイン−１と同時投与され得る。
【０１１１】
しかしながら、サイトカイン−１の量または活性の減少は、たとえば腫瘍の治療／予防またはウイルス性疾患の治療または予防のため、たとえばＩＬ−１８効果の増強が追及される状況で望まれるであろう。したがって、標的としてのサイトカイン−１および好ましくはＩＬ−１Ｆ７ｂの使用も本発明により考慮される。
【実施例１】
【０１１２】
ＩＦＮγ産生の刺激に対するＩＬ−１Ｆ７ｂの効果
ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８Ｒα鎖への報告された結合（Pan 2001, Kumar 2002）に基づいて、ＩＬ−１Ｆ７ｂ（類似ＩＬ−１８）が、ＩＬ−１８α受容体への結合の際、細胞におけるＩＦＮγ産生を刺激するかどうかを評価するために実験を設計した。全長分子（プロＩＬ−１Ｆ７ｂ）または推定ＩＣＥ切断部位でＮ末端としてＥ２１を用いる成熟分子（成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂ）（図１参照）の両方を以下の実験に使用した。ヒトＮＫＯ細胞（Kim 2000）、ヒト全血の培養物、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（プレプロテク（Preprotech）製のＩＬ−１２  １ｎｇ／ｍｌと共刺激された）（ＰＢＭＣの調製は実施例８参照）またはＫＧ−１細胞（ＴＮＦα  １０ｎｇ／ｍｌで共刺激された）（細胞株はＡＴＣＣロックビル（Rockville）、ＭＤから入手された）を、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えＩＬ−１Ｆ７ｂ（実施例５のプロ型または成熟型）またはＩＬ−１８で刺激した。ＩＦＮγは、刺激後１８時間（ＫＧ−１は４８時間）の細胞の調整培地中で（Puren 1998記載の液相電気化学発光（ＥＣＬ）により）測定された。一方、ＩＬ−１８は、顕著にＩＦＮγ産生を刺激したが（図２Ａ）、プロＩＬ−１Ｆ７ｂおよび成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂのいずれも、これらの細胞においてはＩＦＮγ産生を全く刺激しなかった。
【０１１３】
したがって、ＩＬ−１８とは異なり、ＩＬ−１８Ｒα鎖へのＩＬ−１Ｆ７ｂの結合は、ＩＦＮγ産生を誘発しなかった。すなわち、ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８Ｒα鎖への結合はＩＬ−１８Ｒβ鎖を採用せず、したがって機能的に活性な三重複合体は形成されない。
【０１１４】
実験は、ＩＬ−１Ｆ７ｂが、ＩＬ−１８Ｒα鎖へのＩＬ−１８の結合を妨げ、結果としてその生物学的活性とＩＦＮγ産生を阻害するＩＬ−１８アンタゴニストとして作用するかどうかを試験するために行なった。ヒトＮＫ細胞株を、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下、プロＩＬ−１Ｆ７ｂまたは成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂの濃度を上げながらＩＬ−１８で刺激し、産生されたＩＦＮγをモニターした。得られた結果は、ＩＬ−１Ｆ７ｂをＩＬ−１８の４０倍のモル過剰までの濃度で使用した場合（図２Ｂ）またはＩＬ−１Ｆ７ｂをＩＬ−１８の添加の前に試験細胞と長期間前培養した場合でさえ、プロＩＬ−１Ｆ７ｂまたは成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂによるＩＬ−１８誘導ＩＦＮγの阻害を示さなかった。同様の結果がヒトＰＢＭＣについても得られた（データは示さない）。
【０１１５】
これらの結果より、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８により誘導されるＩＦＮγ産生を刺激も阻害もしないことが示唆された。
【実施例２】
【０１１６】
ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８受容体への結合の特徴付け
ＩＬ−１８はＩＬ−１８Ｒαにその第３の細胞外ドメイン（ＩＬ−１８Ｒα：Ｄ３）を介して結合することが報告されている（Azam 2002）。ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８Ｒαへの結合の特徴付けを行なうために、ＩＬ−１８Ｒαの第３の細胞外ドメイン（ＣＤ３）を個別にＥ．ｃｏｌｉでｈｉｓ６標識化タンパク質として発現させ、Ｔａｌｏｎアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製した。ついで、ＩＬ−１Ｆ７ｂをそのように精製したＩＬ−１８Ｒα：Ｄ３とインキュベートし、化学的に交差結合させた（実施例７）。図３Ａに示すように、ＳＤＳ−ＲＡＧＥおよびウエスタンブロッティング分析により、交差結合されたＩＬ−１Ｆ７ｂとＩＬ−１８Ｒα：Ｄ３に相当する４３ｋＤａの複合体が示された。ＩＬ−１８Ｒαへの交差結合は、プロＩＬ−１Ｆ７ｂおよび成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂの両方で観察された。これらの結果から、ＩＬ−１８ＲαＤ３はＩＬ−１Ｆ７ｂへの結合のための重要な部分であり、ＩＬ−１８に結合するために重要であることが以前に証明されたものとまさに同じドメインであることが示唆される。
【０１１７】
ＩＬ−１８のＩＬ−１８Ｒαへの結合の際、ＩＬ−１８Ｒβが補充され、活性な三重複合体が形成される：ＩＬ−１８／ＩＬ１８Ｒα／ＩＬ−１８Ｒβ。したがって、次の実験は、ＩＬ−１８と同様に、ＩＬ−１Ｆ７ｂによるＩＬ−１８Ｒαへの結合が三重複合体：ＩＬ−１Ｆ７ｂ／ＩＬ１８Ｒα／ＩＬ−１８Ｒβの形成を誘発するかどうかを調べるために設計された。ＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβの両方の細胞外ドメインを、グリコシル化などの正確な翻訳後修飾を確実にするためにＣｏｓ細胞において産生した（Azam 2002）。ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβのインキュベーションと化学的交差結合ののち、ＩＬ−１８Ｒα、ＩＬ−１８ＲβおよびＩＬ−１８からなる高分子量の複合体が、交差結合されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において観察された（図３Ｂ）。しかしながら、ＩＬ−１８とは異なり、プロＩＬ−１Ｆ７ｂまたは成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂをＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβとインキュベートした場合、そのような三重複合体は観察されなかった（図３Ｂ）。
【０１１８】
したがって、これらの結果は、活性な三重複合体はＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８Ｒαへの結合の際には形成されない、すなわちＩＬ−１８Ｒβは採用されないということを示す。
【実施例３】
【０１１９】
ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８ＢＰへの結合
ＩＬ−１８とＩＬ−１Ｆ７ｂとのアミノ酸配列を比較した。図１に示すように、ＩＬ−１Ｆ７ｂはＩＬ−１８とＩＬ−１８においてＥ４２およびＫ８９として保存されている２つのアミノ酸を共有している。Ｅ４２およびＫ８９は、ＩＬ−１８の活性とＩＬ−１８ＢＰ結合にとって重要であることが示されている（Novick 1999）。したがって、ＩＬ−１Ｆ７ｂのＩＬ−１８との配列類似性に基づき、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰに結合する可能性を調べた。
【０１２０】
ＩＬ−１Ｆ７ｂ（プロまたは成熟  １．５μｇ）またはＩＬ−１８（１．５μｇ）をＩＬ−１８ＢＰの存在下または不存在下でインキュベートし、交差結合試薬ＢＳ３を加えた（実施例７）。２つのコントロール群をそれぞれＩＬ−１８ＢＰタンパク質のみを含有するように調製し、１つのコントロール群は交差結合試薬ＢＳ３の存在下で、もう１つは不存在下でインキュベートした。タンパク質は、還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離されニトロセルロース上にブロットされた。タンパク質をＩＬ−１Ｆ７ｂまたはＩＬ−１８に特異的なポリクローナル抗体を用いてブロット上で検出した。図４Ａにまとめた結果より、新しいバンドが、ＩＬ−１８ＢＰに加えてプロＩＬ−１Ｆ７ｂ、成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂまたはＩＬ−１８を含有する群においてのみ検出され、コントロール群では検出されないことが示される。ＩＬ−１８ＢＰに結合されたプロＩＬ−１Ｆ７ｂを含有する約６６ｋＤａの新しいバンドと、ＩＬ−１８ＢＰに結合された成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂを含有する約６４ｋＤａの新しいバンド（図４Ａ）とは、ブロット上で同一であった。
【０１２１】
さらに、免疫沈降試験は、ＩＬ−１８ＢＰ（１０μｇ）の存在下または不存在下でインキュベートされ、交差結合されたＬ−１Ｆ７ｂ（１０μｇ）またはＩＬ−１８（１０μｇ）で実施された。ＩＬ−１８ＢＰに結合および交差結合されたタンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰに特異的なモノクローナル抗体を用いて共沈殿した。免疫複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離され、ニトロセルロース中にブロットした。ブロットはＩＬ−１Ｆ７ｂまたはＩＬ−１８特異的抗体のいずれかに展開された。
【０１２２】
ＩＬ−１８ＢＰとの共沈殿試験において、同じ６４および６６ｋＤａバンドが得られた（図４Ｂ）。これらの交差結合バンド６４および６６ｋＤａは、それぞれ成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂ／ＩＬ−１８ＢＰおよびプロＩＬ−１Ｆ７ｂ／ＩＬ−１８ＢＰの複合体を反映している。これらの結果は、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰに結合することを確認している。
【実施例４】
【０１２３】
ＩＬ−１８ＢＰにより媒介されるＩＬ−１８活性の阻害に対するＩＬ−１Ｆ７ｂの効果
ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰに結合する（前実施例）、おそらくＩＬ−１８が結合する正に同じドメインに結合するという知見に鑑み、ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８活性の阻害に対するＩＬ−１Ｆ７ｂの効果を調査した。作業仮説は、ＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８ＢＰへの結合に関してＩＬ−１８と競合し得、したがってＩＬ−１８はＩＬ−１Ｆ７ｂの存在下でＩＬ−１８ＢＰによりほとんど中和されないであろうということである。
【０１２４】
成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂ  ２５０ｎｇ／ｍｌまたはプロＩＬ−１Ｆ７ｂ  ２５０ｎｇ／ｍｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−１８ＢＰ（１．５６〜５０ｎｇ／ｍｌ）の濃度を上昇させながら１時間インキュベートし、ＮＫＯ細胞（０．５×１０6／ｍｌ）にＩＬ−１２と共に添加した。１６時間インキュベーションしたのち、上清を回収し、ＩＦＮγを観測した（Puren 1998に記載される液相電気化学発光（ＥＣＬ）により）。
【０１２５】
その結果は、仮説とは逆に低濃度のＩＬ−１８ＢＰでは、ＩＬ−１Ｆ７ｂの存在はＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８誘導ＩＦＮγを阻害する能力を増加したことを示す（図５ＡおよびＢ）。６．２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８ＢＰでは、成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂの存在下でＩＬ−１８の活性は７６から５５％に減少した（２１％のさらなる活性の減少）。３．１２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８ＢＰでは、成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂの存在下でＩＬ−１８の活性は、５９から４０％に減少した（１９％のさらなる活性の減少）。プロＩＬ−１Ｆ７ｂは、このアッセイにおいては、成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂより活性ではなかった（図５Ｂ）。ＩＬ−１Ｆ７ｂのこの効果には高い再現性があり、低濃度のＩＬ−１８ＢＰでのみ見られた。同様の結果がＰＢＭＣを用いて得られた（データは示さない）。
【実施例５】
【０１２６】
ＩＬ−１Ｆ７ｂの局在化
ＩＬ−１Ｆ７ｂに特異的なＩｇＧをポリクローナルウサギ抗ＩＬ−１Ｆ７ｂ血清から精製し、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１Ｆ７ｂの発現を調べるために使用した。ウサギ抗ＩＬ−１Ｆ７ｂ血清とＩｇＧ沈殿の特異性を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞のＩＬ−１Ｆ７ｂｃＤＮＡによるトランスフェクションを用いて２つの異なる方法で調べた。第一に、ＩＬ−１Ｆ７ｂ抗血清は、ＩＬ−１Ｆ７ｂトランスフェクトＲＡＷ２６４．７細胞の溶解物においてＩＬ−１Ｆ７ｂを特異的に認識した（図６）。第二に、共焦点デジタル顕微鏡を使用して、アフィニティー精製抗ＩＬ−１Ｆ７ｂＩｇＧはトランスフェクトＲＡＷ２６４．７ではＩＬ−１Ｆ７ｂ発現を認識したが、模擬コントロール細胞では認識しなかった（示さない）。新たに単離したヒトＰＢＭＣ（実施例８）を、ＩＬ−１Ｆ７ｂについてアフィニティー−精製ポリクローナルウサギ抗−ヒトＩＬ−１Ｆ７ｂＩｇＧを１μｇ／ｍｌで使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を使用して、ＩＬ−１Ｆ７ｂを発現するヒト血液単球の積層図を作成した。ＩＬ−１Ｆ７ｂが、血漿膜の内部表面に局在する細胞質ならびに核の両方で発現されることが観察された（示さない）。リンパ球集団の染色は観察されなかった。
【実施例６】
【０１２７】
タンパク質の発現と精製
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ヒト脾臓ライブラリー（クローンテック（Clontech）（登録商標）ＨＬＯＯ１１Ｂ、ＢＤ バイオサイエンス  クローンテック（Biosciences Clontech）、パロ  アルト、ＣＡ）からＩＬ−１Ｆ７ｂｃＤＮＡをクローン化するために使用した。センスプライマー５′ＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＣＧ（配列番号１）、リバースプライマー５′ＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号２）（クローンＡＦ２００４９６（ジーンバンク（登録商標））（Kumar 2000）に特異的）。ＩＬ−１Ｆ７ｂｃＤＮＡは、５′端にＥｃｏＲＩ、３′端にＸｂａＩのための断部位を導入する２番目の対のプライマー（センスプライマー５′−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧ（配列番号３）；リバースプライマー５′−ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＴＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＣ（配列番号４））を用いて再増幅された。ＴＡ−クローニングを使用して、ＩＬ−１Ｆ７ｂｃＤＮＡを、製造元の使用書にしたがってｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）（プロメガ社（Promega Corp.）、マディソン、ＷＩ）に移し、正しい配列を確認した。ＩＬ−１Ｆ７ｂｃＤＮＡを、ついでＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を用いて細菌による発現のためにｐＰＲＯＥＸＴＭＨＴａ（ギブコ−ＢＲＬ）にライゲートした。ｐＰＲＯＥＸＴＭＨＴａベクターは、発現されるタンパク質のアフィニティー精製のためのＮ−末端Ｈｉｓ×６タグを含有する。ｐＰＲＯＥＸＴＭＨＴａ／ＩＬ−１Ｈ４プラスミドをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａ（ギブコ−ＢＲＬ）に形質転換した。一晩培養した培養物（１０ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２００ｍｌのＬＢ培地に添加し、０．６〜１ＯＤ600の密度まで増殖させた。
【０１２８】
イソプロピルチオガラクトシド（０．３ｍＭ）を添加し、振とうしながら３７℃で３時間インキュベートすることによりタンパク質の発現を誘導した。遠心分離（５，０００×ｇ、４℃で１５分間）によりバクテリアを回収し、ペレットを２５ｍｌのＴａｌｏｎ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁した。細胞を氷上で超音波（４×１０秒バースト）により溶解し、ついで遠心分離（４，０００×ｇ、４℃で３０分間）した。ＩＬ−１Ｆ７ｂを８Ｍの尿素での処理により封入体から回収した。尿素処理後の上清から遠心分離により不要物を取り除き、Ｔａｌｏｎ緩衝液に対して透析し、２ｍｌミニＴａｌｏｎカラムに通した。カラムを３０ベッド容量のＴａｌｏｎ緩衝液で洗浄し、５ｍｌの１００ｍＭイミダゾールＴａｌｏｎ緩衝液で溶出した。アフィニティー精製ＩＬ−１Ｆ７ｂを含有する溶離液を分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。ゲルをクーマシーブルー（登録商標）（バイオラッド  ラボラトリー  社（Bio-Rad Laboratories Inc.）、ハーキュリーズ、ＣＡ）で染色し、ＩＬ−１Ｈ４を含むバンドを切り出した。ゲルを含むＩＬ−１Ｆ７ｂは、標準的なプロトコール（ロックランド社（Rockland Inc.）、ギルバートビレ（ Gilbertsville）, AP）にしたがって、ウサギでポリクローナル血清を産生するために使用された。バイオアッセイおよび交差結合研究において使用された全長（プロ）および成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂ（Ｎ−末端Ｅ２１）を、前述したようにE. coliにおいて産生した（Kumar 2002）。
【実施例７】
【０１２９】
タンパク質の交差結合
精製タンパク質を３０μｌのＰＢＳと混合し、氷上で２時間インキュベートした。
【０１３０】
ついで、ＢＳ３（ビス（スルホスクシニニジル）スベレート（Bis (sulfosuccininidyl)suberate））（ピアス  バイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology Inc.）、ロックフォード、ＩＬ）を、最終濃度１ｍＭまで添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４（最終濃度２０ｍＭ）を添加して反応を停止した。５分間煮沸したのち、還元条件（５０ｍＭ  ＤＴＴ）下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、ニトロセルロース上にブロットした。ヒトＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１Ｆ７ｂまたはＩＬ−１８に対するウサギ抗血清を１：５００の希釈度で用いて、交差結合されたタンパク質を検出した。
【実施例８】
【０１３１】
ＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣは、健常ドナーの血小板除去残渣白血球（platelet-depleted residual leukocytes）またはヘパリン添加血液のいずれかから精製した。血小板除去白血球または全血を生理食塩水で１：１に希釈し、前述のように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）グラジエント（シグマ）に適用した（Kim 2001）。遠心分離ののち、界面から細胞を集め、生理食塩水で３回洗浄し、ＲＰＭＩに再懸濁させた。単離したＰＢＭＣを分析を開始するまで氷上に保持した。
【０１３２】
以下に引用し本願全体にわたって組み込まれている参考文献は、参考文献として本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１Ｆ７ｂの配列類似性を示す。ヒトＩＬ−１８（登録番号Ｄ４９９５０）およびヒトＩＬ−１Ｆ７ｂ（登録番号ＡＦ２００４９６）が示される。アライメントはエキスパート  プロテイン  アナリシス  システム（Expert Protein Analysis System）（ＥｘＰａｓｙ（登録商標））を用いて付加的な手動の修正を加えて作成された。ＩＬ−１８のＩＬ−１Ｆ７ｂとのアミノ酸同一性は２８％で類似性は５５％である。下線を付したアミノ酸はＩＬ−１８のＩＣＥ切断部位とＩＬ−１Ｆ７ｂの予想される切断部位を表わしている。
【図２】ＩＬ−１Ｆ７ｂは、ＩＬ−１８によって誘導されるＩＦＮγ産生を刺激も阻害もしないことを示す。図２Ａ  ヒトＮＫＯ細胞、ヒト全血の培養物、ＰＢＭＣ（ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）と共刺激される）およびＫＧ−１細胞（ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）と共刺激される）は、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えＩＬ−１Ｆ７ｂ（プロまたは成熟型）またはＩＬ−１８で処理した。１８時間後（ＫＧ−１については４８時間後）、ＩＦＮγを上清中で測定した。結果は、３つの独立実験の平均＋／−ＳＥＭで示す。図２Ｂ  ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）存在下でＩＬ−１８（２０ｎｇ／ｍｌ）によるＮＫ細胞誘導、およびプロまたは成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂの濃度の増加。データは３つの独立実験の平均＋／−ＳＥＭで示す。
【図３】ＡおよびＢはＩＬ−１Ｆ７ｂとＩＬ−１８Ｒａ細胞外ドメイン３との交差結合を示す。図３Ａ  ＩＬ−１８Ｒａ：Ｄ３に交差結合したＩＬ−１Ｆ７ｂの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ニトロセルロース上へのブロッティング後、交差結合したタンパク質をＩＬ−１８Ｒαに対するモノクローナルｍＡｂにより可視化した。図３Ｂ  化学的交差結合後のＩＬ−１８の存在下でＩＬ−１Ｆ７ｂの不存在下でＩＬ−１８Ｒα−およびβ−ＥＣＤの三重複合体の形成。ウェスタンブロッティングののち、複合体はｈｉｓ6標識化ＩＬ−１８Ｒβに対する抗ｈｉｓ6タグモノクローナル抗体により可視化した。
【図４】ＡおよびＢはＩＬ−１Ｆ７ｂとＩＬ−１８ＢＰとの交差結合を示す。図４Ａ  ウサギ抗ＩＬ−１８ＢＰ血清を用いたウエスタンブロット上の交差結合したタンパク質（各１．５μｇ）の検出。図４Ｂ  ＩＬ−１８ＢＰに対するｍＡｂを用いた交差結合したタンパク質（各１０μｇ）の免疫沈降。交差結合ＩＬ−１Ｆ７ｂ／ＩＬ−１８ＢＰおよびコントロールレーン（ＩＬ−１８ＢＰ＋／−ＢＳ３、交差結合試薬）を、ウサギ抗−ＩＬ−１Ｆ７ｂ血清で染色した。ＩＬ−１８／ＩＬ−１８ＢＰ複合体はウサギ抗−ＩＬ−１８血清で検出した。
【図５】ＡおよびＢは、ＩＬ−１Ｆ７ｂがＩＬ−１８ＢＰのＮＫＯ細胞によるＩＬ−１８誘導ＩＦＮγ放出を阻害する能力を高めることを示す。成熟ＩＬ−１Ｆ７ｂ２５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ、０＝９）（図５Ａ）、またはプロＩＬ−１Ｆ７ｂ（図５Ｂ）２５０ｎｇ／ｍｌ（Ｂ、０＝８）、ＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１８ＢＰのＲＰＭＩ／ＦＣＳ１０％の希釈液を９６ウェルマイクロタイタープレートでＮＫＯ細胞（０．５×１０6／ｍｌ）およびＩＬ−１２  １ｎｇ／ｍｌを添加する前に１時間インキュベートした。細胞との１６時間のインキュベーション後、上清を集め、ＩＦＮγを測定した。値は、ＩＬ−１Ｆ７ｂまたはＩＬ−１８ＢＰの不存在下で２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８および１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２で刺激されたＮＫＯ細胞により産生されたＩＦＮγの割合として表わされる。統計学的分析はスチューデントの対ｔ検定（Student's paired t-test）（***ｐ−値＜０．００１）を用いて行なった。
【図６】トランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７におけるＩＬ−１Ｆ７ｂの発現を示す。安定なトランスフェクトののち、個々のクローン（５×１０6細胞）の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロットアッセイを用いてＩＬ−１Ｆ７ｂ発現を調べた。ウサギ抗ＩＬ−１Ｆ７ｂ血清（１：５００希釈）はＩＬ−１Ｆ７ｂ陽性クローンを特異的に染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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