(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を少なくとも一つのチオールと接触させることからなる、酵素触媒作用の際にグルタリルアミダーゼの失活を遅らせる方法。
【請求項２】
グルタリルアミダーゼがポリマー担体に結合されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用するポリマー担体がオキシラン−活性化ポリアクリレートである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
使用するチオールが２−メルカプトエタノールである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
反応混合物中の２−メルカプトエタノールの濃度が１〜１００mMの範囲である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
使用するチオールがシステインである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
システイン濃度が１〜１００mMの範囲である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素触媒作用の際に少なくとも一つのチオールが基質溶液中に連続的に存在する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酵素を基質溶液から除去した後、それを少なくとも一つのチオールと接触させる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
使用する酵素触媒作用の基質がグルタリル−７−アミノセファロスポリン酸である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
グルタリル−７−アミノセファロスポリン酸を５〜５００mMの濃度範囲で使用する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１に記載の方法によってグルタリルアミダーゼの失活を遅らせることからなる、酵素触媒としてグルタリルアミダーゼを用いる７−アミノセファロスポリン酸の製造法。
【請求項１３】
グルタリルアミダーゼの失活を遅らせるための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法における少なくとも一つのチオールの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、酵素触媒作用の際にグルタリルアミダーゼの失活を遅らせる方法に関する。
【０００２】
図１に示したような抗生物質の前駆体７−アミノセファロスポリン酸（7-ACS）の酵素的合成は、２つの反応工程で実施される。セファロスポリンＣは、まず最初にＤ−アミノ酸オキシダーゼ（DAO）の作用によってα−ケトアジピル−ＡＣＳに酸化される。次の工程で、この化合物は、グルタリルアミダーゼ（GAE）によって７−ＡＣＳに加水分解される。７−ＡＣＳは、半合成セファロスポリン抗生物質の製造にとって商業的に非常に重要である。
【０００３】
合成は、一般に担体上に固定された酵素Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびグルタリルアミダーゼを用いて実施される。これらの酵素は、反応が終わったあと、生成物の溶液から分離して次のバッチに再利用することができる。しかし、酵素を繰り返し使用すると、それらは失活して酵素が消費されたのと同じことになる。
【０００４】
文献から、タンパク質の構造が変化する酸化反応は、チオール試薬、例えば２−メルカプトエタノールを使用することによって抑制することができることが知られている(P. Golini 等 Enzyme and Microbial Technology, 17, 1995, 324-329; Int. J. Peptide Protein Res 48 1996, 532-538)。例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（DAO）は、チオールを用いて再生することができる。例えば、フラビンタンパク質ＤＡＯは、Ｄ−アミノ酸の対応するα−ケト酸とアンモニウムへの立体特異的な脱アミノ化、例えば図１に示したようにセファロスポリンＣのα−ケトアジピル−７−アミノセファロスポリン酸（α−ケトアジピル−７−ＡＣＳ）への転化に触媒作用を及ぼす。α−ケトアジピル−７−ＡＣＳはその場でグルタリル−７−ＡＣＳへ脱カルボキシル化される(P. Golini 等 Enzyme and Microbial Technology 17, 1995, 324-329)。産業界では、酵素は、可溶性の形態で使用することはほとんどなく、例えばアミノアルキル化されたポリマーまたはオキシラン−活性化ポリマーといったようなポリマーに結合して固定されている。したがって、反応後、酵素触媒は濾過によって分離することができ、このようにして再利用に使用することができる。固定されたＤＡＯ触媒は部分的に失活する。一度すでに使用した酵素触媒をその他の点では同じ条件下のさらなる反応で再使用する場合、基質の最大転化率に必要な反応時間はより長くなる。このような再利用ごとに生じる反応時間の延長は、例えばグルタリル−７−ＡＣＳの製造過程における触媒の安定性の基準である。複数の製造サイクルにわたって測定された基質の最大転化率までの反応時間の変化の範囲を操作安定性と称する。固定されたＤＡＯの操作安定性は、反応後、濾過によって酵素触媒を反応混合物から分離して、それをチオール、例えば２−メルカプトエタノールで処理することによって改善することができる。ＤＡＯは、容易に酸化できるいくつかのスルフヒドリル基を、主にタンパク質のシステインアミノ酸の官能基として含んでいる。２−メルカプトエタノールの作用は、酸化を受けやすいシステインのスルフヒドリル基上のチオールの還元作用に基づいている。これらの酸化されたスルフヒドリル基を再生すると操作安定性が著しく改善される。特定のＤＡＯの場合、酵素触媒作用の際にＨ2Ｏ2が形成されるので、再生は反応混合物から酵素を分離した後に実施しなければならない。Ｈ2Ｏ2は、強い酸化剤として、添加されたすべてのチオールを不活化する。
【０００５】
また、チオールを添加すると、タンパク質の活性が減少することがある。この効果は、システイン基の存在によっても説明することができる。この一例がアミノアシラーゼである。アミノアシラーゼは、サブユニット当たり一つのＺｎ2+原子を有する二量体酵素である。酵素の各サブユニットは、２つのシステインＳＨ基と２つのジスルフィド結合を含んでいる。ＳＨ基を化学的に修飾する、例えばジスルフィド結合を切断すると酵素が失活することになる。アミノアシラーゼの活性は、２−メルカプトエタノールの付加によって減少するが、これに対して２−メルカプトエタノールを透折またはゲル濾過によって除去するときは、最初の酵素活性をほとんど完全に回復することができることが立証されている(W. Kordel and F. Schneider Biochem. Biophys. Acta 445, 1976, 446-457)。
【０００６】
チオールの作用は、システイン基のスルフヒドリル基の酸化または還元が介在しているので、システイン基をまったく含まないことが知られている酵素にチオールを添加すると、酵素活性はまったく変化しないはずである。
【０００７】
触媒作用による触媒転化においてＧＡＥを繰り返し使用する際に、酵素は、７−ＡＣＳの合成（図１参照）の初めに記載したように、消費に対応して失活する。触媒の安定性は、方法の重要な製造コスト、例えば所要時間、生じる廃棄物および触媒の費用に相互に関連している。ＤＡＯについて上記方法に匹敵し、そしてＧＡＥの安定化に適した、すなわちその操作上の安定性が高められた方法は、これまでのところ開示されていない。酵素ＧＡＥは、２つのペプチド鎖（プロテインＡおよびＢ）を含んでいる。鎖の相互作用は、水素結合ならびにタンパク質ドメインの親水性および疎水性相互作用によるものである。
【０００８】
シュードモナス（Pseudomonas）からの遺伝子のクローニングと大腸菌の発現は、例えば、EP-P-0504798（US5830743）およびEP-A-0708180（US5766881）に記載されている。７−ＡＣＳを製造するためのこれらの微生物または酵素の使用は、EP-A-0275901（US4990444）およびEP 0525861 B1（US5332663）に記載されている。過剰生産している大腸菌の菌株を用いた酵素の精製方法は、D. Bianchi 等, Enzyme and Microbiological Technology 20,1997, 368-372に記載されている。
【０００９】
本発明の目的は、酵素触媒作用の際にグルタリルアミダーゼの失活を遅らせる方法を提供することである。
【００１０】
アミノ酸分析（表３）から分かるように、グルタリルアミダーゼ（GAE）には、アミノ酸システインがない。したがって、安定化のためにチオール試薬を使用しても、この生体触媒の操作安定性が高められることはないはずである。予想に反して、実験的に反対のことを立証することができた。ＧＡＥの場合、種々のチオール含有試薬（例えば２−メルカプトエタノール、システイン）を添加すると、濃度に応じて操作安定性が劇的に増加することになった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、酵素を少なくとも一つのチオールと接触させることからなる、酵素触媒作用の際にグルタリルアミダーゼの失活を遅らせる方法によって達成される。酵素は、場合により遊離形態または支持された形態で存在することができる。例えば、好ましい担体は、オキシラン−活性化ポリアクリレートである。
【００１２】
チオールまたはメルカプタンは、２−メルカプトエタノール、グルタチオンまたはアミノ酸システインといったような化学的な化合物を意味するものとして理解され、これらの一般的な特徴は、それらが分子内にチオール基を（-SH）含むことである。担持されたＧＡＥは、例えばオキシラン−活性化または他にアミノアルキル化されたポリアクリレート（＝担体）に付いた酵素触媒ＧＡＥからなる。担持されたＧＡＥを製造するための方法は、D. Bianchi 等, Enzyme and Microbiological Technology 20, 1997, 368 - 372に記載されている。担体の例は、Eupergit(R)、Amberlite(R) XAD7およびDuolite(R) A365（すべてRohm and Haasから）である。
【００１３】
本発明は、酵素を少なくとも一つのチオールと接触させることからなる、酵素触媒作用の際にグルタリルアミダーゼの失活を遅らせる方法に関する。方法の好ましい実施態様においては、グルタリルアミダーゼはポリマー担体に結合されており、これは特にオキシロン−活性化ポリアクリレートであってよい。使用するチオールは好ましくは２−メルカプトエタノールであり、これは１〜１００mMの濃度範囲で使用するのが好ましい。方法のさらなる好ましい実施態様においては、使用するチオールはシステインであり、それは１〜１００mMの濃度範囲で使用するのが好ましい。
【００１４】
上記の特徴を有するチオールは、連続的にまたは不連続的に使用することができる。連続使用の場合、反応中にチオールが存在するが、不連続使用の場合、反応工程の間で処置を行う。本発明の方法の好ましい実施態様において、使用する基質は、グルタリル−７−アミノセファロスポリン酸である。グルタリル−７−セファロスポリン酸は、５−５００mMの範囲で存在するのが好ましい。
【００１５】
本発明の方法は、上記のようにグルタリルアミダーゼが失活する、酵素触媒グルタリルアミダーゼを用いた７−アミノセファロスポリン酸の製造に特に適している。
さらに、本発明は、上記の方法に従ってグルタリルアミダーゼの失活を遅らせるための少なくとも一つのチオールの使用に関する。
【００１６】
【実施例】
グルタリルアミダーゼを用いた酵素触媒作用を実際に適用したものは、例えば、グルタリル−７−アミノセファロスポリン酸からの７−アミノセファロスポリン酸（7-ACS）の製造である（図１参照）。酵素触媒作用は、次のように実施した：基質グルタリル−７−アミノセファロスポリン酸（G-7-ACS）を４０mMの濃度、４０℃およびpH８.３で、１２０mlの反応容量で、固定されたＧＡＥ（Pseudomonas diminutaから）と反応させた。自動化された周辺システムを用いて、プロセス関連のパラメータ（pH、温度）をオンラインで測定し、適切な制御システムを用いてそれらを制御することができる。したがって、反応のために生じるｐＨの酸性領域へのシフトは、自動滴定により塩基で中和した。塩基の添加速度は、反応速度と相関関係にあり、基質（G-7-ACSy）の転化率の程度の基準として使用される。パソコンを用いたデータ処理により、転化率のオンライン測定が可能となり、反応の終了基準が得られる。最大転化率に到達したときに、反応を終了した。最大転化率に達したことが明らかになれば、もはや塩基を添加する必要はない。一旦、最大転化率に達したら、触媒を生成物溶液から濾過し、次いで新しい基質溶液を添加した。個々の逐次反応（＝バッチ）の反応時間は、バッチの関数として、プロットすることができる。線形回帰により、勾配（＝Ｘ係数［分／バッチ］）が得られ、これは触媒劣化の基準として使用できる。この値が低いほど、触媒の操作安定性が高くなる。
【００１７】
実施例１
システインを用いないまたは用いたバッチ数の関数としての定量的転化率までの反応時間
一連の複数の試験において、チオール試薬としてシステインを種々の濃度で基質溶液に添加し、記載されたように反応を実施した。下の表から分かるように、勾配、すなわちＸ係数は、システイン濃度の増加と伴に減少した。実施した反応では失活が線形であったと仮定すると、各一連の測定について、反応時間が二倍になるまでの可能なバッチ数を測定することができる。値は下の表に示した。反応バッチが追加的にシステインを含む場合、操作安定性がかなり高まることは明白である。これは、個々の反応バッチの数の増加によって示され、最大基質転化率までの反応時間が二倍になるまで実施することができる。
反応パラメータを次のように選んだ：
反応パラメータ：
ＶR＝１２０ml
Ｔ＝４０℃
ｐＨ＝８.３ [アンモニア１.６６％ ]
［Ｇ−７−ＡＣＳ］＝４０mM [ ＫＰＰ １００mM ]
［システイン］基質中＝変数
量（GAE）＝５００Ｕ
【００１８】
【表１】
0004598333.tif 000002
基質溶液中のシステイン濃度の関数として、定量的な転化率に達するためのＸ係数（すなわちバッチ当たり時間の増加）または反応時間が二倍になるまでのバッチ数の比較である。
【００２０】
実施例２
メルカプトエタノールを用いないまたは用いた、バッチ数の関数としての定量的な転化率までの反応時間
チオール試薬として２−メルカプトエタノールを使用するとＧＡＥの操作安定性が高まる。下の表は、２−メルカプトエタノールを用いたおよび用いない試験運転の比較を示している。操作安定性の安定化に関して、チオールの結果はシステインのものに類似していた。
反応パラメータを次のように選んだ：
反応パラメータ：
ＶR＝１２０
Ｔ＝４０℃
ｐＨ＝８.３［アンモニア１.６６％］mM
［Ｇ−７−ＡＣＳ］＝４０mM
量（GAE）＝５００Ｕ
［メルカプトエタノール］＝１μl／ml
【００２１】
【表２】
0004598333.tif 000003
メルカプトエタノールを用いないまたは用いた定量的な転化率に達するためのＸ係数（すなわちバッチ当たり時間の増加、すなわち勾配）の比較である。
【００２３】
【表３】
0004598333.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】  ７−アミノセファロスポリン酸（７−ＡＣＳ）の酵素合成の反応スキームである。
【図１】
0004598333.tif 000005