(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0004532740.tif 000014
（式中、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、またはＣ１〜Ｃ８アルキニルであり、
Ｘは、Ｈ、またはＦであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨである）のキラル非ラセミエステルを、加水分解酵素を用いて製造するための方法であって、
前記加水分解酵素が、リパーゼではなく、
前記方法が、
（ａ）式Ｉのエステルのエナンチオマー混合物を５％と４５％の間の濃度（重量／非均一系の体積）で有機溶媒系に分散させて、有機成分を製造する段階、
（ｂ）水性溶媒系を提供して、水性成分を製造する段階、
（ｃ）前記加水分解酵素を、前記有機成分、前記水性成分のいずれかまたは両方に分散させる段階、および
（ｄ）前記有機成分と前記水性成分を接触させて非均一系を形成する段階であって、ここで前記加水分解酵素がエナンチオ選択的に一方のエナンチオマーを加水分解し、これによって、式Ｉのキラル非ラセミエステルと式ＩＩ：
【化２】
0004532740.tif 000015
（式中、
Ｘは、Ｈ、またはＦであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨである）の非ラセミアルコールとを製造する段階を含んでなる方法。
【請求項２】
式Ｉのエステルが２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉのエステルが２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランであり、
（ａ）前記有機成分が５と９０％の間の前記非均一系を含み、
（ｂ）前記非均一系が１と２０％の間の界面活性剤を含んでなり、
（ｃ）前記界面活性剤濃度が前記非均一系の体積を基準として計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記加水分解酵素がブタ肝臓エステラーゼおよびサブチリシンから成る群から選択される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素が架橋酵素結晶である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋酵素結晶がグルタルアルデヒドで架橋されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解酵素が固定化酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解酵素が可溶性酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記加水分解酵素がブタ肝臓エステラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記キラル非ラセミエステルが前記有機成分から分離される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キラル非ラセミアルコールが前記水性成分から分離される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記エナンチオマー混合物が５％から１５％の間の濃度に前記有機成分に分散される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記エナンチオマー混合物が１０％から２０％の間の濃度に前記有機成分に分散される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機成分が５０％以下の水に混和性の有機溶媒を含んでなる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機成分がＣ４〜Ｃ８アルコール、ニトロメタン、ジクロロメタン、トルエン、メチルイソブチルケトン、酢酸ｔ−ブチルおよびアルカンから成る群から選択される一つ以上の溶媒を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機成分がｎ−アミルアルコールおよび３−メチル−３−ペンタノールの一方または両方を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記界面活性剤がカチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤および非イオン性界面活性剤から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性剤がグルコード−オキシコール酸、オクチルβ−グルコピラノシド、ジオクチルスルホスクシナート、デオキシコール酸、およびエトキシル酸アルコールから成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記界面活性剤がジオクチルスルホスクシナートである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記界面活性剤が前記有機成分に添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記界面活性剤が前記水性成分に添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤が前記非均一系に添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が前記加水分解酵素と配合される、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記水性溶媒系が水と、緩衝塩、アルカリ化剤、抗菌保存薬、安定剤、濾過助剤、補酵素、分散を促進する添加剤、および酵素の機能を促進する添加剤から成る群から選択される添加剤とを含んでなる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記水性溶媒系が７より大きいｐＨのリン酸緩衝液で緩衝された水を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記水性溶媒系が２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールで緩衝された水を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記エナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形を対応するアルコールへエナンチオ選択的に転化させることができる条件が５℃と４５℃の間の温度を含んでなる、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）加水分解酵素、
（ｂ）式Ｉ：
【化３】
0004532740.tif 000016
（式中、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、またはＣ１〜Ｃ８アルキニルであり、
Ｘは、Ｈ、またはＦであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨである）の疎水性エステルのエナンチオマー混合物、
（ｃ）有機成分、および
（ｄ）水性成分を含んでなる非均一系であって、
エナンチオマー混合物が５％と４５％の間の濃度（重量／非均一系の体積）で有機成分に分散される、加水分解酵素を用いてキラル非ラセミ疎水性エステルを製造するための非均一系。
【請求項２９】
前記加水分解酵素がブタ肝臓エステラーゼおよびサブチリシンから成る群から選択される、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３０】
前記加水分解酵素が架橋酵素結晶である、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３１】
前記架橋酵素結晶がグルタルアルデヒドで架橋されている、請求項３０に記載の非均一系。
【請求項３２】
前記加水分解酵素が固定化酵素である、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３３】
前記加水分解酵素が可溶性酵素である、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３４】
前記加水分解酵素がブタ肝臓エステラーゼである、請求項２９に記載の非均一系。
【請求項３５】
前記エナンチオマー混合物が２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランを含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３６】
前記エナンチオマー混合物が５％から１５％の間の濃度に前記有機成分に分散される、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３７】
前記エナンチオマー混合物が１０％から２０％の間の濃度に前記有機成分に分散される、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３８】
前記有機成分が５０％以下の水に混和性の有機溶媒を含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項３９】
前記５０％以下の水に混和性の有機溶媒が、Ｃ４〜Ｃ８アルコール、ニトロメタン、ジクロロメタン、トルエン、メチルイソブチルケトン、酢酸ｔ−ブチルおよびアルカンから成る群から選択される一つ以上の溶媒を含んでなる、請求項３８に記載の非均一系。
【請求項４０】
前記有機成分がｎ−アミルアルコールおよび３−メチル−３−ペンタノールの一方または両方を含んでなる、請求項３９に記載の非均一系。
【請求項４１】
界面活性剤をさらに含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項４２】
前記界面活性剤がカチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、および非イオン性界面活性剤から成る群から選択される、請求項４１に記載の非均一系。
【請求項４３】
前記界面活性剤がグルコード−オキシコール酸、オクチルβ−グルコピラノシド、ジオクチルスルホスクシナート、デオキシコール酸、およびエトキシル酸アルコールから成る群から選択される、請求項４２に記載の非均一系。
【請求項４４】
前記界面活性剤がジオクチルスルホスクシナートである、請求項４３に記載の非均一系。
【請求項４５】
前記有機成分が前記界面活性剤を含んでなる、請求項４１に記載の非均一系。
【請求項４６】
前記水性成分が前記界面活性剤を含んでなる、請求項４１に記載の非均一系。
【請求項４７】
前記界面活性剤が前記加水分解酵素と配合される、請求項４１に記載の非均一系。
【請求項４８】
前記水性成分が水と、緩衝塩、アルカリ化剤、抗菌保存薬、安定剤、濾過助剤、補酵素、分散を促進する添加剤、および酵素の機能を促進する添加剤から成る群から選択される添加剤とを含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項４９】
前記水性成分が７より大きいｐＨのリン酸緩衝液で緩衝された水を含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項５０】
前記水性成分が７より大きいｐＨの２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールで緩衝された水を含んでなる、請求項２８に記載の非均一系。
【請求項５１】
前記有機成分と前記水性成分を接触させ、前記接触が前記エナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形の対応するアルコールへのエナンチオ選択性転化をもたらし、および前記接触が５℃と４５℃の間の温度で行われる、請求項５０に記載の非均一系。
【請求項５２】
前記有機成分がＣ４〜Ｃ８アルコールから成る群から選択される一つ以上の溶媒を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、二相溶媒系を用いる、疎水性エステルのエナンチオマー混合物の生体触媒媒介エナンチオ選択性転化のための方法に関する。より詳細には、本発明は、非均一反応系中での２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＦＴＣ）およびそのアナログなどの抗ウイルス性化合物の酵素媒介エナンチオ選択性合成に関する。
【０００２】
発明の背景
疎水性エステルのエナンチオマー混合物の酵素による分割のための商業的に実行可能な方法には深刻な障害が存在する。例えば、有機溶媒の存在下で酵素による転化方法を用いると、水性溶媒中で行われた同じ方法に比べて酵素の不活性化率が非常に高くなる。混乱を増す問題は、触媒に対する分解性が小さい溶媒ほど、多くの場合、より疎水性が高い基質を溶解させることができないということである。理想的には、非混和性有機溶媒などのより疎水性の高い溶媒中で行えば、多くの方法がより有効となるであろう。本発明の一つの目的は、より高い濃度の疎水性基質を製品に変えることができる一方で、同時に触媒をさほど消費しない非均一系を提供することである。
【０００３】
エナンチオマー薬、抗ウイルス薬を製造するコストを削減するためには、上に挙げた障害を克服しなければならない。新たなウイルス疾患を克服するための奮闘に勝利するためには、こうした薬剤が不可欠である。例えば、ＨＩＶ感染率は、今日でさえ、世界中で一日あたり１６，０００の新たな感染を伴う驚異的なペースを続けている［Ｂａｌｔｅｒ，Ｍ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０号、１８６３〜１８６４頁（１９９８年）］。サハラ砂漠以南のアフリカの地域、例えば、ボツワナおよびジンバブエでは、人口の少なくとも２５％が感染している。しかし、抗ウイルス薬のコストは、現在、ほとんどのこうしたＨＩＶ感染の犠牲者の手にははるかに届かないものである。
【０００４】
３’−チアリボフラノンシル−βＬ−シトシン（「３−ＴＣ」）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）［Ｂｌａｉｒ，Ｅ．、Ｄａｒｂｙ，Ｇ．、Ｇｏｕｇｈ，Ｅ．、Ｌｉｔｔｌｅｒ，Ｄ．、Ｒｏｗｌａｎｄｓ，Ｄ．、Ｔｉｓｄａｌｅ，Ｍ．、「抗ウイルス療法（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ＢＩＯＳ  サイエンティフィック・パブリッシャーズ（ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、１９９８年］、（−）−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン（「ＦＴＣ」）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジンなどのヌクレオシドアナログは、重要な抗ウイルス剤である［Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、第２１６回  ＡＣＳ学会（２１６ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）、医薬品化学抄録、マサッチューセッツ州ボストン、１９９８年８月２３〜２７日；Ｈｏｏｎｇ，Ｌ．Ｋ．、Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｌ．Ｅ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、Ｋｏｓｚａｌｋａ，Ｇ．Ｗ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｌ．およびＳｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７号、５５６３〜５５６５頁］。３−ＴＣは、抗ＨＩＶ薬および抗ＨＢＶ薬の両方として注目されており、またＦＴＣは、抗ウイルス薬としての評価のための臨床試験下にある［Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．およびＣｈｏｉ，Ｗ．−Ｂ．、米国特許第５，２１０，０８５号、第５，７００，９３７号および第５，８１４，６３９号］。（−）−ＦＴＣおよび（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン、両方の（−）エナンチオマーは、対応する（＋）−異性体と比較して最も強い抗ウイルス活性および最も低い毒性を示すので、世界中で患者の治療の選択を拡大するために（−）−ＦＴＣおよび（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン異性体両方の、効率的で対費用効果に優れた製造方法が緊急に必要である［Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、第２１６回ＡＣＳ学会（２１６ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）、医薬品化学抄録、マサッチューセッツ州ボストン、１９９８年８月２３〜２７日；Ｈｏｏｎｇ，Ｌ．Ｋ．、Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｌ．Ｅ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、Ｋｏｓｚａｌｋａ，Ｇ．Ｗ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｌ．およびＳｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７号、５５６３〜５５６５頁］。
【０００５】
多くの加水分解酵素がＦＴＣエステルの分割に用いられてきた［Ｈｏｏｎｇ，Ｌ．Ｋ．、Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｌ．Ｅ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、Ｋｏｓｚａｌｋａ，Ｇ．Ｗ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｌ．およびＳｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７号、５５６３〜５５６５頁］。しかし、ＦＴＣおよび類似化合物を製造するための、酵素を媒介とする実際的な化学的方法の開発には障害が残っている。第一に、リパーゼを除く加水分解酵素は、二相性環境からの攻撃を受けやすいと考えられてきた（ＷＯ  ９７／４４４４５；Ｌａｌｏｎｄｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７号、６８４５〜６８５２頁（１９９５年）；Ｍｉｌｔｏｎら、ケミカルアブストラクト、１２４（５）、抄録＃５５３２（１９９６年）；Ｂｒａｎｄら、ケミカルアブストラクト、１２７（２０）、抄録＃２７８３９５（１９９７年））。第二に、多くのＦＴＣエステルの水性媒質への溶解度はあまりにも低く、経済的に実行可能な分割生成物の生産を達成することができない。一つの可能な解決法は、水混和性共有機溶媒を添加して、溶液中のエステル濃度を上昇させることであった。一つの例は、アセトニトリルと水との溶液の使用である［Ｈｏｏｎｇ，Ｌ．Ｋ．、Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｌ．Ｅ．、Ｌｉｏｔｔａ，Ｄ．Ｃ．、Ｋｏｓｚａｌｋａ，Ｇ．Ｗ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｌ．およびＳｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７号、５５６３〜５５６５頁；Ｌｉｏｔｔａら、米国特許第５，８２７，７２７号］。水混和性有機溶媒および水溶液の使用は、溶液中の基質の濃度を上昇させるが、酵素触媒転化および酵素安定性を徹底的に低下させる望ましくない影響を及ぼす。この問題は、基質が完全に溶解されない場合のみならず、不溶固体懸濁物としても存在する（高濃度の基質負荷）場合にも特に顕著に見られている。類似の結果が、当研究室で得られた。イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−メチル−２−ピロリジノン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、アセトニトリル、エタノール、１−プロパノールなどの水混和性有機溶媒を分割用共溶媒として用いた時、最大の基質負荷濃度は３％であった。基質濃度が３％を越えると、不溶基質の存在がエナンチオ選択性を低下させた。さらに、２０％より多い水混和性有機共溶媒濃度での水混和性有機溶媒および水溶液の使用は、酵素、特にブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）の活性に対して著しい悪影響を及ぼした。
【０００６】
本発明は、エナンチオマー混合物の酵素による分割を不経済にする影響を及ぼす当技術分野におけるいくつかの障害に特に取り組んでいる。第一に、二相系では再現性が悪いため、酵素による転化は均一状態のもとで実施すべきであると考えられていた［Ｌｉｏｔｔａらの米国特許第５，８２７，７２７号、第５，８９２，０２５号、第５，９１４，３３１号；または水性成分と有機成分を分離するために活性化膜が提案されているＭａｔｓｏｎの米国特許第４，８００，１６２号を参照のこと］。非均一系の使用に関する一つの潜在的な利点は、基質の溶解性を強化することにあるであろう。おそらく、非均一系において、より高い濃度の多くの疎水性基質を対処することができる。本発明以前は、アルコール溶媒は酵素を変性させるので避けるべきであると考えられていた［Ｌｉｏｔｔａら、米国特許第５，８２７，７２７号、第５，８９２，０２５号、第５，９１４，３３１号］。特に、水を伴う非均一系を形成するアルコール溶媒を使用する手だてとなるため、本発明は従来技術より進んでいる。さらに、非均一溶媒系の使用は、当技術分野において以前に対処することができたものより疎水性の高い基質の溶解性を増大させる。これは、基質自体をより水溶性にした後に水性成分に分散するその他の方法とは対照的である（Ｗａｌｄら、米国特許第５，０５７，４２７号）。さらに、本発明は、単位生成物当りの酵素をさほど必要としない方法を開示している。
【０００７】
本発明によって達成されるさらなる改善は、酵素的方法においていくつかのアルコール溶媒を使用することができることである。さらに、本発明は、界面活性剤の添加によって酵素および有機溶媒の要求量をさらに低減させる代替方法を提供する。最後に、本発明は、エナンチオ選択性を高レベルで維持するさらに効率的な酵素的方法を提供することに関する。
【０００８】
図面の簡単な説明
スキーム１（２３頁）は、ＦＴＣブチレートのエナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形の、対応するアルコールおよび所望の非ラセミエステルへのエナンチオ選択性転化を示している。
【０００９】
発明の要約
本発明は、キラル非ラセミエステルを製造するための方法におけるいくつかの改善に関する。さらに詳細には、本発明は、生体触媒を利用してＦＴＣエステルおよびＦＴＣエステルのアナログのエナンチオマー混合物を分割する二相非均一系を用いる改善された方法を提供することに関する。本発明は、さらに、高い基質負荷および低減された触媒消費量を可能にする改善に関する。
【００１０】
本発明による第一の改善された方法は、有機溶媒系にエステルのエナンチオマー混合物を分散させて、高い基質負荷量の有機成分を製造するためのものである。水性成分が提供され、これが分散された加水分解酵素を優先的に含んでいる。あるいは、加水分解酵素を非均一系全体に添加することもでき、または有機成分にさほど優先的にではなく添加することができる。さらに、本方法は、キラル非ラセミエステルと非ラセミアルコールを生じるように混合物を分割することができる条件のもとで、有機成分および水性成分を接触させて、非均一系を形成することを要する。有機成分および水性成分の組合わせによって、非均一系が形成される。非均一系を用いることによって、はるかに高い基質濃度が可能となる。一つの実施態様において、反応が行われた後、キラル非ラセミエステル化合物は有機成分から分割することができ、またキラル非ラセミアルコール化合物は水性成分から分割することができる。分割段階は特定の化合物および条件に依存して変化し得る。
【００１１】
本発明は、所定の製品を製造するために必要な酵素の量を徹底的に低減することによる改善された結果を生み出す代替法も提供する。こうした改善は、界面活性剤を前記非均一系に添加して、基質を溶解させるためにさほど有機溶媒を必要としない改善された非均一系を生成することによって達成される。
【００１２】
もう一つの実施態様において、本発明は、低下させた有機／水相比率を用いる方法を提供し、これは、必要な加水分解酵素のさらなる削減をもたらす。
【００１３】
本発明のもう一つの実施態様において、界面活性剤を系に添加することによって、酵素の反応率を増大させ、基質をより良好に溶解させることができる。反応率が高くなると、このプロセスを行うための酵素のコストが全体的に低くなる。
【００１４】
発明の詳細な説明
以下の説明において、用語を以下のように定義する：
生体触媒  −−  加水分解酵素などの蛋白質分子。例には、エステラーゼ、プロテアーゼおよびリパーゼが挙げられる。
【００１５】
キラル化合物  −−  その鏡像を重ね合わせることができず、且つ、同じ炭素に四つの異なる基が結合している不斉炭素原子を通常含有する化合物。
【００１６】
共溶媒  −−  有機溶媒。
【００１７】
転化  −−  一つのエナンチオマーを異なる化学単位に変化させる触媒を用いて化合物のエナンチオマー混合物を処理するプロセス。
【００１８】
ジアステレオマー  −−  互いの鏡面反射としての関係にない立体異性体。
【００１９】
分散  −−  溶媒に酵素またはエナンチオマー混合物を分配すること。酵素は、架橋酵素結晶の形態であってもよいし、固定化酵素の形態であってもよいし、あるいは可溶性酵素の形態であってもよく、またエナンチオマー混合物は、可溶性であってもよいし、あるいは残留粒子を含有していてもよい。分散系は、固体結晶および／または粒子材料と二つの異なる液体相とを有する三つまでの相を含むことができる。
【００２０】
エナンチオマー  −−  互いの鏡面反射である対の立体異性体。エナンチオマーは、その鏡像が互いに重なり合わない。エナンチオマーは、どのようにもう一方のキラル分子と反応するかという点および直線偏光に対する挙動という点でのみ異なるキラル立体異性体である。異なるエナンチオマーは、偏光面を同じように、しかし反対方向に回転させる。異なるエナンチオマーは、ＲおよびＳ記号、ならびに偏光面を右に回転させる（右旋の（＋））か、左に回転させる（左旋の（−））かによって区別される。
【００２１】
エナンチオマー過剰率  −−  一方のエナンチオマーがより多量に存在する二つのエナンチオマーの混合物（溶液）において、溶液は過剰に存在するエナンチオマーに対応する旋光性（＋または−回旋）を示すであろう。エナンチオマー過剰率は、ラセミ混合物での割合を越えて見出されるエナンチオマーの割合であり、以下のように計算される：
（混合物の比旋光度）÷  （純粋なエナンチオマーの比旋光度）Ｘ  １００  ＝  ％エナンチオマー過剰率。
【００２２】
エナンチオマー混合物  −−  二つのエナンチオマーの混合物。
【００２３】
エナンチオ選択性  −−  エナンチオマー混合物から一方のエナンチオマーを変化させるための優先性。
【００２４】
ＦＴＣブチレート  −−  化合物２’，３’−ジデオキシ−５’−ブチレート−５−フルオロ−３’−チアシチジン（すなわち、別名を用いると、この化合物は、２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン、あるいはあまり正式ではないが、２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランの５’酪酸エステルである）のエナンチオマー混合物を指す。
【００２５】
不完全水混和性有機溶媒  −−  ２５℃で水に完全には溶解せず、水との非均一溶液を形成する有機溶媒。完全にではない。
【００２６】
非均一系  −−  生体触媒、有機成分、水性成分および基質を含んでなる二相媒質。非均一系を非均一媒質または非均一状態もしくは非均一組成と呼ぶこともある。
【００２７】
有機溶媒系  −−  以下の溶媒のうち一つ以上を含んでなる溶液：  ｔ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、１−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔ−ブタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、３−エチル−３−ペンタノール、３−ヘプタノール、トルエン、酢酸ブチル、ニトロエタン、ニトロメタン、ジクロロメタン、メチルイソブチルケトン、硫化ジメチル、スルホランなどのＣ１〜Ｃ８非置換アルカン、アルコール、芳香族炭化水素、ケトンエーテル、ニトロ、ハロ−アルカンまたは−芳香族有機溶媒、あるいは酵素の作用能を損なうことなくエナンチオマー混合物の分割を促進する約５０％以下で水に混和性のその他一切の有機溶媒。
【００２８】
ラセミ混合物  −−  どちらのエナンチオマー生成物も優先されないキラル中心における化学反応の結果として通常生成される、ラセミ体としても知られる、二つのエナンチオマーの等モル混合物。
【００２９】
エナンチオマーを分割すること、すなわち分割  −−  エナンチオマー混合物から対のエナンチオマーを分割するプロセス。
【００３０】
ラセミ混合物の分割  −−  エナンチオマーのラセミ混合物の分割。
【００３１】
ＦＴＣおよびＦＴＣブチレートの立体化学  −−  本出願全体を通して言及するＦＴＣ化合物の立体化学を以下に示す：
【００３２】
【化３】
0004532740.tif 000002
立体異性体  −−  構成原子が別の化合物と同じ順に配列されているが、空間における原子の配列のみが異なる化合物。立体異性体の例には、エナンチオマーおよびジアステレオマーがある。
【００３３】
基質負荷  −−  エナンチオマー混合物の濃度。以下に示す実施例に関して、基質負荷は、％（重量／非均一系の体積）、すなわち、全溶媒量を基準として表わされる。何度も繰り返すが、基質配合率（％）（重量／体積）は、水性および有機成分の両方を含む非均一系全体の体積を基準としている。
【００３４】
界面活性剤  −−  前記溶液に溶解した時、溶液の表面張力を低下させる界面活性剤。界面活性剤は、二つの液体間、または液体と固体の間の界面張力も低下させる。界面活性剤は、類似した機構によって機能する三つのカテゴリーに属する。これらのカテゴリーには、関係する表面の性質に依存して、洗剤、乳化剤および湿潤剤が挙げられる。界面活性剤濃度は、百分率（％）（重量／体積）で表わされ、水性および有機成分の両方を含む非均一系全体の体積を基準としている。
【００３５】
水不混和性有機溶媒  −−  ２５℃で水に対する最大溶解度が１０％であり、水と非均一溶液を形成する有機溶媒。有機溶媒濃度は、百分率（％）（体積／体積）で表わされ、水性および有機成分の両方を含む非均一系全体の体積を基準としている。
【００３６】
約５０％以下で水に混和性の有機溶媒  −−  ２５℃で約５０％以下で水に溶解し、水との非均一溶液を形成する有機溶媒。
【００３７】
水混和性有機共溶媒  −−  ２５℃で完全に水に混和できる有機溶媒。
【００３８】
本発明は、式Ｉ：
【００３９】
【化４】
0004532740.tif 000003
（式中、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、
Ｘは、Ｈ、またはＦであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨである）のキラル非ラセミエステルを、加水分解酵素を用いて製造するための方法であって、
前記方法が、
（ａ）式Ｉのエステルのエナンチオマー混合物を約１〜約２５％の範囲の濃度（重量／非均一系の体積）で有機溶媒系に分散させて、有機成分を生成する段階、
（ｂ）水性溶媒系を提供して、水性成分を生成する段階、および
（ｃ）式Ｉのキラル非ラセミエステルと式ＩＩ：
【００４０】
【化５】
0004532740.tif 000004
（式中、
Ｘは、Ｈ、またはＦであり、
Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＨである）の非ラセミアルコールとを生じるように混合物を分割することができる条件のもとで、前記有機成分と前記水性成分を接触させて、非均一系を形成する段階を含んでなり、および
前記加水分解酵素が、前記有機成分、前記水性成分または前記非均一系のいずれかに分散される方法を提供する。
【００４１】
本発明は、加水分解酵素を用いてキラル非ラセミ疎水性エステルを製造するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記疎水性エステルのエナンチオマー混合物を約１と約２５％の間の濃度（重量／非均一系の体積）で有機溶媒系に分散させて、有機成分を製造する段階、
（ｂ）水性溶媒系を提供して、水性成分を製造する段階、および
（ｃ）前記エナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形を対応するアルコールへエナンチオ選択的に転化させることができる条件のもとで、前記有機成分と前記水性成分を接触させて、非均一系を形成する段階を含んでなり、および
前記加水分解酵素が、前記有機成分、前記水性成分または前記非均一系のいずれかに分散される方法も提供する。
【００４２】
あるいは、本発明は、式Ｉのエナンチオマー混合物または疎水性エステルのエナンチオマー混合物から、式Ｉのキラル非ラセミエステルを生成する方法であって、前記方法が界面活性剤をさらに含んでなる方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、加水分解酵素を用いて２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランのキラル非ラセミエステルを製造するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランのエナンチオマー混合物を約１と約２５％の間の濃度（重量／非均一系の体積）で有機溶媒系に分散させて、有機成分を製造する段階、
（ｂ）水性溶媒系を提供して、水性成分を製造する段階、および
（ｃ）前記エナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形を対応するアルコールへエナンチオ選択的に転化させることができる条件のもとで、前記有機成分と前記水性成分を接触させて、非均一系を形成する段階を含んでなり、および
前記加水分解酵素が、前記有機成分、前記水性成分または前記非均一系のいずれかに分散され、および
前記エナンチオマー混合物の濃度が、前記非均一系の体積を基準として計算される方法を提供する。
【００４４】
本発明の一つの好ましい実施態様は、加水分解酵素を用いて２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランのキラル非ラセミエステルを製造するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランのエナンチオマー混合物を約１〜約２５％の範囲の濃度（重量／非均一系の体積）で有機溶媒系に分散させて、有機成分を生成する段階、
（ｂ）水性溶媒系を提供して、水性成分を生成する段階、および
（ｃ）前記エナンチオマー混合物の一方のエナンチオマー形を対応するアルコールへエナンチオ選択的に転化させることができる条件のもとで、前記有機成分と前記水性成分を接触させて、非均一系を形成する段階を含んでなり、および
前記加水分解酵素が、前記有機成分、前記水性成分または前記非均一系のいずれかに分散され、
前記有機成分が、前記非均一系の約５〜約９０％の範囲を構成し、
前記非均一系が、約１〜約２０％の範囲の界面活性剤も含んでなり、および
前記界面活性剤濃度が、前記非均一系の体積を基準として計算される方法を提供する。
【００４５】
本発明のもう一つの目的は、
（ａ）加水分解酵素、
（ｂ）疎水性エステル基質、
（ｃ）有機成分、および
（ｄ）水性成分
を含んでなる、加水分解酵素を用いてキラル非ラセミ疎水性エステルを製造するための非均一系を提供することである。
【００４６】
エナンチオマー混合物から所望のエナンチオマーを分割するための方法を提供することは、本発明の一つの目的である。
【００４７】
疎水性エステルのエナンチオマー混合物から所望のエナンチオマーを分割するための方法を提供することも本発明の一つの目的である。
【００４８】
上記式Ｉを有する抗ウイルス化合物のエナンチオマーを分割するための方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００４９】
本発明の最も好ましい実施態様は、エナンチオマーＦＴＣブチレート（すなわち、式中、Ｒがプロピルであり、ＸがＦであり、およびＹがＳである上記式Ｉの化合物）を分割するための方法を提供する。
【００５０】
基質負荷は、有機溶媒系に疎水性エステルのエナンチオマー混合物を分散して、有機成分を生成することを必然的に伴う。％（重量／非均一系の体積）の単位で表わされる濃度範囲は、約０．５％〜約４５％の間、約１．０％〜約４５％の間、約５．０％〜約４５％の間、約１０％〜約４０％の間、約１０％〜約３０％の間、約５％〜約２０％の間、約１％〜約５％の間、および約１０％〜約２０％の間の範囲から成る群から選択される。
【００５１】
好ましい実施態様において、本発明の有機溶媒系は、エナンチオマー混合物の溶解を促進する、約５０％以下で水に混和性の有機溶媒を一つ以上含んでなる。
【００５２】
次に好ましい実施態様において、本発明の有機溶媒系は、一つ以上のＣ４〜Ｃ８アルコールを含んでなる。
【００５３】
最も好ましい実施態様において、本発明の有機溶媒系は、ｎ−アミルアルコールまたは３−メチル−３−ペンタノールの一方または両方を含んでなる。
【００５４】
好ましい実施態様において、本発明の水性溶媒系は、水、一つ以上の緩衝塩、アルカリ化剤、抗菌保存薬、安定化剤、濾過助剤、補酵素、または酵素の分散および機能を促進するその他の添加剤を含んでなる。
【００５５】
次に好ましい実施態様において、本発明の水性溶媒系は、水、一つ以上の緩衝塩、アルカリ化剤、または酵素の分散および機能を促進するその他の添加剤を含んでなる。
【００５６】
次に好ましい実施態様において、本発明の水性溶媒系は、水と、約７．０と約８．０の間のｐＨで約０．０１と約０．５モルの間のリン酸緩衝液とを含んでなる。
【００５７】
最も好ましい実施態様において、本発明の水性溶媒系は、水と、約７．２と約７．８の間のｐＨで約０．２と約０．４モルの間のリン酸緩衝液とを含んでなる。
【００５８】
本発明のもう一つの実施態様において、加水分解酵素は、一対のエナンチオマーを分割することができる。
【００５９】
本発明のもう一つの実施態様において、加水分解酵素は、酵素に触媒される一方のエナンチオマーとの立体選択的反応によって、一対のエナンチオマーを分割することができる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様において、加水分解酵素は、一方のエナンチオマーの酵素触媒立体選択性転化によって、一対のエナンチオマーを分割することができる。
【００６１】
本発明の最も好ましい実施態様において、加水分解酵素は、２−ブチリルオキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（すなわち、式中、Ｒがプロピルであり、ＸがＦであり、およびＹがＳである上記式Ｉの化合物、すなわちＦＴＣブチレート）の（＋）エナンチオマーの酵素触媒立体選択性転化によって、一対のエナンチオマーを分割することができる。
【００６２】
本発明の一つの実施態様において、生体触媒は酵素である。
【００６３】
本発明のもう一つの好ましい実施態様において、酵素は加水分解酵素である。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、酵素は、エステラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼから成る群から選択される。
【００６５】
本発明の最も好ましい実施態様において、酵素は、ブタ膵臓リパーゼ（「ＰＬ」）、シュードモナス属リパーゼ、クロカビ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）黒色アスペルギルスリパーゼ、ズブチリシン、またはブタ肝臓エステラーゼ（「ＰＬＥ」）から成る群から選択される。
【００６６】
本発明の一つの実施態様において、水性成分を有機成分と接触させて非均一系を生じさせた後に、生体触媒を非均一系に添加する。
【００６７】
本発明のもう一つの実施態様において、水性成分を有機成分と接触させて非均一系を生じさせる前に、生体触媒を有機成分の一部として有機相に添加する。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様において、水性成分を有機成分と接触させた後ではあるが、攪拌および混合して非均一系を生じさせる前に、生体触媒を水性相に添加して水性成分を生じさせる。
【００６９】
本発明の最も好ましい実施態様において、水性成分を有機成分と接触させて非均一系を生じさせる前に、生体触媒を水性相に添加して水性成分を生じさせる。
【００７０】
本発明の一つの実施態様において、エナンチオマー混合物を分割するために本方法において用いる非均一系は、界面活性剤を含有する。％（重量／非均一系の体積）単位での界面活性剤の濃度範囲は、界面活性剤の約１％と約３０％の間、界面活性剤の約１％と約２０％の間、界面活性剤の約１％と約１０％の間、界面活性剤の約１％と約５％の間、界面活性剤の約５％と約３０％の間、界面活性剤の約１０％と約２５％の間、界面活性剤の約１５％と約２５％の間、界面活性剤の約２０％と約３０％の間、界面活性剤の約５％と約１５％の間から成る群から選択される。
【００７１】
本発明の一つの実施態様において、酵素はマトリックス上に固定化されている。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様において、酵素形態は、例えば、ＰＣＴ特許出願  ＷＯ  ９２／０２６１７（Ｎａｖｉａら）に記載されているものなどの架橋酵素結晶の形態である。
【００７３】
本発明の次に好ましい実施態様において、酵素形態は、例えば、ＰＣＴ特許出願  ＷＯ  ９８／４６７３２（Ｍａｒｇｏｌｉｎら）に記載されているものなどの制御溶解架橋蛋白質結晶の形態である。
【００７４】
本発明の最も好ましい実施態様において、酵素は可溶性形態である。
【００７５】
本発明の一つの実施態様において、前記非均一系は、約１０％と９９％の間の有機成分を含んでなる。本発明のもう一つの実施態様において、前記非均一系は、約１０％と約９０％の間の有機成分を含んでなる。さらに好ましい非均一系は、約２０％と約８０％の間の有機成分を含んでなる。なおさらに好ましくは、前記非均一系は、約３０％と約７０％の間の有機成分を含んでなる。なおさらに好ましい実施態様において、前記非均一系は、約１０％と約５０％の間の有機成分を含んでなる。もう一つの好ましい実施態様において、前記非均一系は、約１０％と約６０％の間の有機成分を含んでなる。いっそう好ましい実施態様において、前記非均一系は、約２０％と約７０％の間の有機成分を含んでなる。なおもう一つの好ましい実施態様において、前記非均一系は、約５０％と約２０％の間の有機成分を含んでなる。
【００７６】
本発明の一つの実施態様において、所望のエナンチオマーを分割するための前記方法は、約０℃と約４５℃の間、約１０℃と約４５℃の間、約２０℃と約４５℃の間、約３０℃と約４５℃の間、約１０℃と約４０℃の間、約１０℃と約３０℃の間、約１０℃と約２５℃の間、約１５℃と約４０℃の間、約１５℃と約３５℃の間、約１５℃と約３０℃の間、約１５℃と約２５℃の間、約２０℃と約３５℃の間から成る群から選択される一つまたは複数の温度で行われる。
【００７７】
好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられる前記水性成分は、前記非均一系の少なくとも１０％（体積／体積）を構成する。
【００７８】
次に好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられる前記水性成分は、前記非均一系の少なくとも５０％（体積／体積）を構成する。
【００７９】
最も好ましい実施態様において、本発明の方法において用いられる前記水性成分は、前記非均一系の少なくとも９０％（体積／体積）を構成する。
【００８０】
本発明の一つの実施態様において、所望のエナンチオマーを分割するための前記方法は、界面活性剤を含んでなる非均一系で実施される。界面活性剤が前記非均一系の一部である時、％（体積／体積）単位での有機成分の濃度範囲は、前記非均一系の約５％と約９０％の間、前記非均一系の約５％と約８０％の間、前記非均一系の約５％と約７０％の間、前記非均一系の約５％と約６０％の間、前記非均一系の約５％と約５０％の間、前記非均一系の約５％と約３０％の間、前記非均一系の約５％と約２０％の間、前記非均一系の約５％と約１０％の間、前記非均一系の約１０％と約３０％の間、前記非均一系の約１０％と約２０％の間、前記非均一系の約２０％と約７０％の間、または前記非均一系の約２５％と約５０％の間、および前記非均一系の約３０％と約６０％の間から成る群から選択される。
【００８１】
エナンチオマー混合物の分割のためのスキームは図１（２３頁）に示す反応において説明し、この場合、基質は、ＦＴＣのエーテル、酢酸エステル、ギ酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、ペンタン酸エステル、もしくはその他のｎ−アルキルおよび分枝鎖またはアリールエステル、あるいはＦＴＣのこうしたエステルの誘導体であり、有機共溶媒は、ｎ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、ｔ−アミルアルコール、３−ペンタノール、１−または３−ヘプタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、３−エチル−３−ペンタノール、１−または２−ブタノール、ニトロメタン、ジクロロメタン、メチルイソブチルケトン、硫化ジメチル、スルホラン他などの約５０％以下で水に混和性のアルコール系、アルカン、芳香族系、ケトンエーテル、ニトロ、ハロ−アルカンまたは芳香族系有機溶媒のいずれかであった。
【００８２】
下記のスキーム１において、反応生成物は非ラセミエステルおよび非ラセミアルコールであった（スキーム１）。一実施例において、Ｘがフッ素であり、ＲがＣ３Ｈ７であり、Ｙがイオウである場合、化合物ＡはＦＴＣブチラートのエナンチオマー混合物を表す。様々な加水分解酵素（ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）、シュードモナス種のリパーゼ（ＰＳＬ）およびクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のリパーゼ（ＡＮＬ）など）が触媒として使用される［混合有機溶媒中におけるＰＬＥ触媒反応については、Ａｒｉｅｎｔｅ−Ｆｌｉｃｈｅ，Ｃ．、Ｂｒａｕｎ，Ｊ．およびＬｅ  Ｇｏｆｆｉｃ，Ｆ．、Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２、１１４９〜１１５３（１９９２）；Ｂａｓａｖａｉａｈ，Ｄ．およびＫｒｉｓｈｎａ，Ｐ．Ｒ．、Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍ．、６４、１０６７〜１０７２（１９９２）；Ｂａｓａｖａｉａｈ，Ｄ．、Ｐａｎｄｉａｒａｊｕ，Ｓ．およびＭｕｔｈｕｋｕｍａｒａｎ，Ｋ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、７、１３〜１６（１９９６）；Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ，Ｍ．、Ｂａｉｎｅｓ，Ｂ．Ｓ．、Ｄａｗｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．およびＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｇ．Ｃ．、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１４、９１１〜９１６（１９９２）；Ｉｚｕｍｉ，Ｔ．およびＫａｓａｈａｒａ，Ａ．、日本国特許ＪＰ０８０９２２６９Ａ（１９９６）を参照のこと］。
【００８３】
【化４】
0004532740.tif 000005
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ８のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり；Ｘ＝ＨまたはＦ；Ｙ＝ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＮＨ；生体触媒は、可溶性酵素、固定化酵素、または架橋型酵素の結晶形態のいずれであってもよく；有機共溶媒は、約５０％以下の水と混和し得る有機溶媒のいずれかであり、例えば、ｎ−アミルアルコール、ｉｓｏ−アミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、３−ペンタノール、１−ヘプタノールまたは３−ヘプタノール、３−Ｍｅ−３−ペンタノール、４−Ｍｅ−２−ペンタノール、３−Ｅｔ−３−ペンタノール、１−ブタノールまたは２−ブタノール、ニトロメタン、ジクロロメタンなどである。
【００８４】
上記の生体触媒は、可溶性酵素、固定化酵素、または酵素の架橋型結晶（ＣＬＥＣＴＭ）形態（Ａｔｌｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のいずれかであり得る。反応は、回分式反応装置、カラム式反応装置、中空繊維膜式反応装置［有機合成における酵素触媒反応（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（１３８頁〜１５０頁）、Ｄｒａｕｚ，Ｋ．およびＷａｌｄｍａｎ，Ｈ．編、ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９５年］または膜式反応装置［Ｄｏｄｄｓ，Ｄ．Ｒ．、Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．Ｌ．、Ｚｅｐｐ，Ｃ．Ｍ．およびＲｏｓｓｉ，Ｒ．Ｆ．、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／０４６４３（１９９０年５月）］で行うことができる。
【００８５】
どの特定の酵素が特定の基質対に最も良いかの選択は、エナンチオマー対のサンプルを、様々な酵素（ブタ肝臓エステラーゼ、ブタ膵臓リパーゼ、シュードモナス種のリパーゼ（ＰＳＬ）およびクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のリパーゼ（ＡＮＬ）、ならびにズブチリシンまたはα−キモトリプシンなどのプロテアーゼなど）で処理することによって決められる。エナンチオマー混合物を分割酵素で処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率をもたらす酵素が、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００８６】
このプロセスは、エナンチオマー混合物および分割酵素の特定の組み合わせを選び、そして反応について理想的な溶媒条件を決定することによってさらに改善することができる。二相系では、有機溶媒の選択を決めなければならない。最適な有機溶媒は、約５０％以下で水と混和し得る一連の有機溶媒が同量存在する条件下において、エナンチオマー混合物のサンプルを選択された酵素で処理することによって決定することができる。具体的な溶媒には、約５０％以下で水と混和し得る（溶解度が室温の水において５０％未満である）アルコール、アルカン、芳香族、ケトンエーテル、ニトロ、ハロアルカンまたは芳香族有機溶媒が含まれ、例えば、ｎ−アミルアルコール、ｉｓｏ−アミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、３−ペンタノール、１−ヘプタノールまたは３−ヘプタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、３−エチル−３−ペンタノール、１−ブタノールまたは２−ブタノール、ニトロメタン、ジクロロメタン、メチルイソブチルケトン、ジメチルスルフィド、スルホランなどが含まれる。等量の様々な溶媒の存在下においてエナンチオマー混合物を分割酵素で処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率をもたらす溶媒／酵素の対が、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００８７】
選択された有機溶媒の相対的な量もまた、最良の結果を達成するために評価しなければならない。この評価を行うために、上記に記載されたのと同様な手順が行われる。特定の酵素／ラセミ混合物を使用して、選択された有機溶媒／水性溶媒の比を、例えば、下記のように変化させる：９５：５、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０および５：９５（［有機溶媒］：［水性溶媒］）。エナンチオマー混合物の同一サンプルが、様々な比の有機溶媒対水性溶媒の存在下、所定の時間にわたって基準量の特定の酵素で処理される。総容量は一定に保たれる。エナンチオマー混合物を等量の様々な溶媒の存在下において分割酵素で処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率をもたらす溶媒系／酵素の対が、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００８８】
あるいは、いくつかのラセミ混合物：酵素：有機溶媒の組合せにおいて、界面活性剤を反応に加えることによって、酵素活性を高めることができ、そして有機溶媒のレベルを下げることができる。界面活性剤を特定のプロセスに加えるべきかどうかを評価するために、下記プロセスを若干変化させて行うことができる。最初に、界面活性剤が、約５０％以下で水と混和し得る有機溶媒および水性溶媒から構成される非均一系の存在下において、エナンチオマー混合物のサンプルを、選択された酵素および一連の界面活性剤を用いて処理することによって選択される。このような系は、界面活性剤の非存在下で反応を行うことができる系でなければならない。界面活性剤の例には、Ｔｗｅｅｎ類が含まれ、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０ＴＭ、Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、ＰｒｉｏｎｅｘＴＭ、Ｔｅｅｐｏｌ  ＨＢ７ＴＭ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＴＭＮ−６ＴＭ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＴＭＮ−１０ＴＭ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４ＴＭ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−３ＴＭ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０ＴＭ、ＴｙｌｏｘａｐｏｌＴＭ、グルコーデ−オキシコール酸、オクチルβ−グルコピラノシド、ＣＨＡＰＳＴＭ、ジオクチルスルホスクシナートまたはデオキシコール酸などが含まれる。二相溶媒系および一定量の様々な界面活性剤の存在下においてエナンチオマー混合物を分割酵素で処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率を所定の時間内でもたらす溶媒／酵素／界面活性剤の組合せが、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００８９】
界面活性剤は、どれほど多数のサンプルが一度に処理できるかに依存して、一定の濃度または濃度範囲で加えることができる。特定の溶媒／酵素／界面活性剤の組合せについて、最適な界面活性剤濃度を決定しなければならない。当業者は、一連の独立した反応を、界面活性剤の濃度だけが異なるように組み立てなければならないことを理解する。例えば、反応を、２０％のペンタノールおよび８０％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）または［２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール緩衝液（ｐＨ７．４）においてＰＬＥを使用して行うことができる。下記の界面活性剤濃度を有する１０個の同一の反応を組み立てることができる：１％、３％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％および３０％。二相溶媒系および増大する濃度の界面活性剤の存在下においてエナンチオマー混合物を分割酵素で所定の時間にわたって処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率を所定の時間内でもたらす溶媒／酵素／界面活性剤の組合せが、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００９０】
本発明を実施するために有用な界面活性剤には、カチオン性、アニオン性、非イオン性または両性あるいはそれらの混合物が含まれる。好ましい界面活性剤は、特定の酵素および／または基質成分に依存する。そのようなスクリーニング手順は当業者にはよく知られている。例示的なスクリーニング手順が実施例１４〜３０に示されている。
【００９１】
有用なカチオン性界面活性剤の例には、アミン、アミン塩、スルホニウム化合物、ホスホニウム化合物および四級アンモニウム化合物が含まれる。そのようなカチオン性界面活性剤の具体例を下記に示す：
メチルトリオクチルアンモニウム塩化物（Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６）
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパン（ＥＤＴ−２０、ＰＥＧ−１０タロウ）。
【００９２】
有用なアニオン性界面活性剤には、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルスルファート、アルコールエトキシスルファート、カルボン酸、硫酸エステルおよびアルカンスルホン酸が含まれる。アニオン性界面活性剤の例を下記に示す：
Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−３０（アニオン性）
Ａｅｒｏｓｏｌ  ２２
ジオクチルスルホスクシナート（ＡＯＴ）
アルキルナトリウムスルファート（Ｎｉａｐｒｏｏｆ）：
タイプ−４
タイプ−８
アルキル（Ｃ９〜Ｃ１３）ナトリウムスルファート（ＴＥＥＰＯＬ  ＨＢ７）。
【００９３】
安定化に有用な非イオン性界面活性剤には、ノニルフェノールエトキシラート、アルコールエトキシラート、ソルビタントリオレアート、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、ポリエチレンオキシド、あるいはフェノールアルコールまたは脂肪酸のポリエチレンオキシド誘導体が含まれる。非イオン性界面活性剤の例を下記に示す：
ポリオキシエチレンエーテル：
４ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）
２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３５）
オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）：
Ｔｘ−１５
Ｔｘ−１００
Ｔｘ−１１４
Ｔｘ−４０５
ＤＦ−１６
Ｎ−５７
ＤＦ−１２
ＣＦ−１０
ＣＦ−５４
ポリオキシエチレンソルビタン：
モノラウラート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）
ソルビタン：
セスキオレアート（Ａｒｌａｃｅｌ  ８３）
トリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５）
ポリグリコールエーテル（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）
タイプＮＰ−４
タイプＮＰ−９
タイプＮＰ−３５
タイプＴＭＮ−１０
タイプ１５−Ｓ−３
タイプＴＭＮ−６（２，６，８−トリメチル−４−ノニルオキシポリエチレンオキシエタノール）
タイプ１５−Ｓ−４０。
【００９４】
好適な界面活性剤を選択した後、有機溶媒の比率を、生成物の収率またはエナンチオ選択性を失うことなく著しく低下させることができる場合がある。当業者は、有機溶媒をどのくらい少なくするかを決めるそのような１つの手法が下記の通りであることを理解する。特定の酵素／ラセミ混合物／界面活性剤の組合せを使用して、選択された水性溶媒に対する有機溶媒の比率を下記のように変化させる：［％有機溶媒：％水性溶媒］、９５：５、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０および５：９５、ならびに必要に応じて他の比率。エナンチオマー混合物のサンプルが、様々な比率の有機溶媒対水性溶媒および界面活性剤の存在下、所定の時間にわたって基準量の特定の酵素で処理される。等量の様々な溶媒の存在下においてエナンチオマー混合物を分割酵素で処理した後、生成物が、標準的な抽出手法またはクロマトグラフィー手法を使用して単離される。所望する生成物の最大エナンチオマー過剰率をもたらす溶媒／酵素の対が、このプロセスで使用される最も良い候補であると考えられる。
【００９５】
本発明のプロセスを実施するためになされるさらなる検討は、製造される生成物の単位ユニットあたりの酵素コストである。本発明は、生成物の単位ユニット基準でプロセスの酵素必要量を低下させることに関する。１つの実施形態では、有機成分の量が非均一系において減らされる。別の実施形態では、界面活性剤を非均一系に加え、必要とされる酵素量をさらに減らし、プロセスの運転費用をさらに減らしている。
【００９６】
本発明は、特に、基質が疎水性エステルからなる酵素反応に関する。本発明はさらに、基質が水溶液において比較的不溶性である酵素反応に関する。水と完全に混和しない有機共溶媒を有する非均一系を使用することによって、疎水性エステルならびに他の疎水性化合物および不溶性化合物に対する溶媒和が、水と混和し得る有機溶媒を使用する系と比較して改善される。
【００９７】
本発明をさらに十分に理解するために、下記に実施例を示す。下記の実施例は、例示目的のためだけであり、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【００９８】
実施例
実施例１  ブタ肝臓エステラーゼ触媒によるＦＴＣブチラートの分割
ラセミ体のＦＴＣブチラート（１．０ｇ）を、７５℃に３０分間加熱することによって５．０ｍｌのｎ−アミルアルコールに溶解して、有機成分とした。次いで、この有機成分を、３．８ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む水性成分と混合して、この非均一系を３５℃に冷却した。その後、ブタ肝臓エステラーゼ溶液（１．２ｍｌの６５０Ｕ／ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ））を水層に加え、得られた懸濁物を穏やかな攪拌により攪拌した。温度を、外部の水浴により３２℃で維持した。ｐＨを、５０％水酸化ナトリウム水溶液を必要に応じて加えることによって７．５で維持した。未反応（−）−ブチラートエステルおよび（＋）−ＦＴＣアルコール生成物の光学純度を、キラルな定常相カラムを使用するＨＰＬＣ分析によってモニターした。２４時間後、ＦＴＣエステルの（＋）−エナンチオマーは、下記に記載されているＨＰＬＣ分析に基づいて完全に転化された。未反応のエステルを有機相から抽出し、有機溶媒を蒸発させることによって、所望する（−）−ＦＴＣエステルが得られた。回収率は単一の（−）−エナンチオマーに基づいて８９．４％であり、その光学純度は９９％を越えていた。
【００９９】
手順
キラルＨＰＬＣ条件：ＣＨＩＲＡＰＡＫ（登録商標）ＡＳ；０．４６ｃｍｘ２５ｃｍのＨＰＬＣカラム（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、移動相＝１００％アセトニトリル、流速＝１ｍｌ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出。保持時間：（−）−ＦＴＣブチラート、６．２分；（−）−ＦＴＣ、７．４分；（＋）−ＦＴＣブチラート、８．８分；および（＋）−ＦＴＣ、１１．４分。
【０１００】
酵素活性は、酸の生成を追跡するためにＲａｄｉｏｍｅｔｅｒ  ｐＨスタット装置を使用して、酪酸エチルの転化によって測定した。酪酸エチル（４０ｍｌ）を２０ｍｌの５ｍＭホウ酸（ｐＨ８）に加え、完全に溶解するまで２５℃で攪拌した（１０分）。ＰＬＥを加え、ｐＨを、０．０１ＮのＮａＯＨを加えることによって８．０で維持した。酸の生成速度を、５分間にわたる塩基の添加速度から求めた。
【０１０１】
酵素安定性を反応の途中で測定した。測定は、酵素溶液の一部を定期的に取り出し、酪酸エチルアッセイを使用して活性を求めることによって行った。
【０１０２】
実施例２  ８３％ｎ−アミルアルコール（または３−Ｍｅ−３−ペンタノール）／水性混合物におけるＦＴＣブチラートのＣＬＥＣＴＭ−ＰＬＥ触媒反応
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであったが、リン酸緩衝液の容量は１ｍｌであり、有機成分の容量は８．３ｍｌであった。転化率は、３６時間後において、ｎ−アミルアルコールの場合には３８％であり、３−メチル−３−ペンタノールの場合には２５％であった（表１参照、反応１２および１３）。
【０１０３】
実施例３  ５０％のｎ−アミルアルコール／水性混合物におけるＦＴＣブチラートのＰＳＬ触媒反応
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであったが、１００ｍｇの可溶性ＰＳＬ−３０（ＰＳＬ−３０はＡｍａｎｏから得られるＰＳ３０である）を使用した。転化率は２４時間後において５６％であり、（−）−エナンチオマーが優先的に加水分解された。残存エステルの光学純度は、転化率５６％で９２％であった（表１参照、反応２１）。
【０１０４】
実施例４  ５０％ｎ−アミルアルコール／水性混合物におけるＦＴＣブチラートのＡＮＬ触媒反応
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであったが、２００ｍｇの可溶性ＡＮＬを使用した。転化率は３６時間後において４５％であった。残存エステルの光学純度は、転化率４５％で６３％であった（表１参照、反応２２）。
【０１０５】
実施例５  基質濃度が２％である２０％イソプロパノール（または他の水混和性有機共溶媒）／水性混合物における（±）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
下記の実施例は、大量の酵素触媒が均一系において使用される現在の最高水準を例示する。Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から得られるＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０ユニット／ｍｌ）の１ｍｌと３９ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）との溶液に、イソプロパノール中の１０％ＦＴＣブチラート１０ｍｌを加えた。得られた混合物を２４℃〜２６℃で攪拌し、反応の進行をＨＰＬＣによりモニターした。２２時間の反応の後、転化率は５１％に達し、残存するキラルな非ラセミエステル化合物の光学純度は９９％を越えていた（４８％の化学収率）。これらの結果は、残存するキラルな非ラセミエステル化合物のＨＰＬＣ分析に基づいている。水層には、加水分解生成物の（＋）−ＦＴＣおよび（−）−ＦＴＣが含まれていた。（＋）−ＦＴＣと（−）−ＦＴＣとの比率は９６．６対３．４であった。有機層を蒸発させると、０．４５７ｇの（−）−ＦＴＣブチラートが得られた。
【０１０６】
同様の反応を、アセトニトリル、ＤＭＦ、１−メチル−２−ピロリジノン、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＳＯ、ピリジン、ジ（エチレングリコール）メチルエーテル、ＰＥＧ２００、およびＰＥＧ６００などを含む他の水混和性有機共溶媒を使用して行った。アセトニトリルは、イソプロパノールと同じ程度に高いエナンチオ選択性をもたらし、同様に大量の酵素を必要とした。他の溶媒はすべて、イソプロパノールよりも低いエナンチオ選択性をもたらした。
【０１０７】
実施例６  基質濃度が５％である２０％のイソプロパノール／水性混合物における（±）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から得られるＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０ユニット／ｍｌ）の２．５ｍｌと３７．５ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）との溶液に、イソプロパノール中の２５％ＦＴＣブチラート１０ｍｌを加えた。この条件下で、基質は完全に溶解しなかった。得られた混合物を２４℃〜２６℃で攪拌し、反応をＨＰＬＣによりモニターした。９６時間の反応時間の後、転化率は６０％に達し、残存エステルの光学純度は７４％であった（３８％の化学収率）。エナンチオ選択性は、基質濃度が２％の場合よりもはるかに低かった。
【０１０８】
実施例７  基質濃度が３％である３０％イソプロパノール／水性混合物における（±）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
Ａｌｔｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．から得られるＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０ユニット／ｍｌ）の１．５ｍｌと３３．５ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）との溶液に、イソプロパノール中の１０％ＦＴＣブチラート１５ｍｌを加えた。得られた混合物を２４℃〜２６℃で攪拌し、反応をＨＰＬＣによりモニターした。転化率は２時間後において８％であり、その後は増大しなかった。酵素は、３０％イソプロパノール中で急速にすべての活性を失った。
【０１０９】
表１は、約５０％以下で水と混和し得る様々な有機溶媒と水性緩衝液とを含む二相非均一系における様々な酵素によるＦＴＣブチラートの分割反応の結果をまとめたものである。
【０１１０】
【表１】
0004532740.tif 000006
実施例５〜７により、均一系で水混和性アルコールを本発明のプロセスに使用することに伴う問題がいくつか例示されている。そのような系は、光学純度が低下した生成物をもたらし、反応時間を長くし、かつ酵素を失活させる。
【０１１１】
実施例８〜１３  ｎ−アミルアルコールおよび水を使用する非均一系における（＋）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。この非均一系は１ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０Ｕ／ｍｌ）を触媒として含み、使用されたアミルアルコールおよびリン酸緩衝液の量は下記の表２に示されている。それぞれの場合、（＋）−異性体の転化選択性はほぼ絶対的であったので、５０％よりもわずかに大きな所望する転化率により、ほぼ１００％の未反応の（−）−エステルのエナンチオマー純度が得られていることに留意すること（表２参照）。
【０１１２】
【表２】
0004532740.tif 000007
【０１１３】
実施例１４〜３０  界面活性剤の存在下でｎ−アミルアルコールと水との混合物を含む非均一系における（±）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
実施例１４〜３０を表３に示す。反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。この非均一系は１ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０Ｕ／ｍｌ）を触媒として含み、１ｍｌの界面活性剤（実施例１４〜２１、２３、２４および３０）または０．１ｇの界面活性剤（実施例２５〜２９）が界面活性剤として反応混合物に加えられた。有機成分はｎ−アミルアルコールを含み、水性成分は０．３Ｍリン酸緩衝液を含み、５０：５０の比率であった。
【０１１４】
【表３】
0004532740.tif 000008
表３に示されているように、界面活性剤の広範囲のスクリーニングにより、そのいくつかが活性化すること（実施例１４、１５、１９、２０、２４、２８および３０を参照のこと）、およびいくつかが阻害すること（１６、２３、２７および２９を参照のこと）が明らかにされる。１５種の界面活性剤をさらなる分析のために選んだ。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｙｌｏｘａｐｏｌおよびジオクチルスルホスクシナートナトリウムの界面活性剤はすべて、ＰＬＥ活性をほぼ同じ程度高めた。割合の増大は、反応終了時に最も明らかであり、触媒効率に対する作用だけでなく、酵素の安定化および沈殿の防止のためであり得る。
【０１１５】
実施例３１〜３４  Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下でのｎ−アミルアルコール／水との二相混合物における（±）−ＦＴＣブチラートのＰＬＥ触媒転化
実施例３１〜３４を表４に示す。反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。この非均一系は、Ｔｗｅｅｎ  ８０を界面活性剤として含み、０．６ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０Ｕ／ｍｌ）を触媒として含む。使用されたアミルアルコールおよび０．３Ｍリン酸緩衝液の容量は下記の表に示される。
【０１１６】
【表４】
0004532740.tif 000009
【０１１７】
実施例３５  酵素および有機溶媒の両必要量の相補的減少
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。この非均一系は、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ  ８０を界面活性剤として含み、０．３ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０Ｕ／ｍｌ）を触媒として含み、２．０ｍｌのアミルアルコールおよび７．５ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液が溶媒であった。この非均一系には、２５％の有機成分および７５％の水性成分が含まれた。４８時間後において、転化度は５０％であり、残存エステルの光学純度は９９．３％であった。
【０１１８】
本実施例において、酵素および有機溶媒の両方の量を、実施例３１〜３４で使用されたレベルから約半分に減らしたが、生成物の収率は低下しなかった。さらに、酵素の必要量は、実施例１で必要とされた量の２５％にすぎなかった。
【０１１９】
実施例３６〜３９  界面活性剤としてのジオクチルスルホスクシナート（Ｄｉｏｃｔｙｌ  ＳＳ）
実施例３６〜３９を表５に示す。反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。この非均一系は、水の中に、８ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液、および２ｍｌのアミルアルコール、界面活性剤としてのジオクチルスルホスクシナート（Ｄｉｏｃｔｙｌ  ＳＳ）および０．４ｍｌのＡｌｔｕｓ  ＰＬＥ溶液（６５０Ｕ／ｍｌ）を含んだ。
【０１２０】
【表５】
0004532740.tif 000010
【０１２１】
実施例４０
反応条件および手順は、実施例１の場合と同じであった。触媒は、合計で７１４ユニットのブタ肝臓エステラーゼ（Ｓｉｇｍａ、ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からなった。この非均一系は、有機成分として５０％のｎ−アミルアルコール、および水性成分として５０％の０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含んだ。２４時間後において、転化度は５０％であり、残存エステルの光学純度は９７．５％であった。
【０１２２】
実施例４１  低酵素負荷およびアニオン性界面活性剤による割合の増大
Ｔｗｅｅｎ−８０の使用に加えて、アニオン性界面活性剤のジオクチルスルホスクシナートナトリウム塩を選び、割合を増大させた。表６に示されているように、この界面活性剤を非均一系に１％負荷することは、割合を顕著に増大させるには十分であった。
【０１２３】
反応条件は下記の通りであった：１ｇのＦＴＣブチラート、０．４％のＰＬＥ負荷、有機溶媒：１−ペンタノール、２：８の溶媒比、反応は３０℃で行われた（表６）。
【０１２４】
【表６】
0004532740.tif 000011
【０１２５】
実施例４２  酵素負荷および有機溶媒濃度に対する界面活性剤の影響
本発明の好ましい実施形態は、１０％の基質負荷とともに、ＦＴＣブチラートに対して０．３％〜０．４％の酵素負荷を包含する。反応毎の変動と光学純度に対する転化率の影響とをより正確に明らかにするために、多数の反応を、わずかに大きな規模で行った。結果を下記の表７に示す。
【０１２６】
【表７】
0004532740.tif 000012
【０１２７】
表８に示されているように、有機／水層の比が小さく、０．３％の酵素負荷で反応を行ったところ、高い光学純度が４８時間までに得られた。
【０１２８】
【表８】
0004532740.tif 000013
【０１２９】
本発明者らは上記に本発明の多数の実施形態を記載しているが、本発明者による基本的な構成を変化させて、本発明のプロセスおよび組成を利用する他の実施形態にできることは明らかである。従って、本発明の範囲は、例として上記に示されている特定の実施形態によってではなく、むしろ本明細書に添付されている請求項によって規定され得ることが理解される。