(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫における、腫瘍増殖の阻害、腫瘍退行の開始、自然の免疫防御の刺激、及び／又は転移の阻害のための、エリスロポエチンを含む医薬組成物。
【請求項２】
エリスロポエチンは組換えヒトエリスロポエチンである、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エリスロポエチンと癌の治療におけるその使用に関する。
【０００２】
（略語）
ＢＴＲ  −  輸血必要性；Ｅｐｏ  −  エリスロポエチン；Ｈｂ  −  ヘモグロビン；ＭＭ  −  多発性骨髄腫；ＰＳ  −  能力現状；ｒＨｕＥｐｏ  −  組換えヒトエリスロポエチン。
【０００３】
（発明の背景）
ヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、主に腎臓により産生され分泌される３０．４kDの糖タンパク質ホルモンである。Ｅｐｏは通常血流中を循環し、主要な赤血球系ホルモンとして機能し、従って赤血球シリーズの増殖と分化の刺激ならびに生存の維持を介して、赤血球産生の制御と調節に関与する（スピバック（Spivak）ら、１９９１；ミッテルマン（Mittelman）、１９９３）。Ｅｐｏは、骨髄（ＢＭ）赤血球系前駆体である、バースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）と主にコロニー形成単位赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）上に位置する特異的受容体と相互作用する。
【０００４】
イスラエル特許ＩＬ７３７８５号、９６５８１号、９６５８２号、１００９３５号、および対応する米国特許第５，４４１，８６８号、５，５４７，９３３号、５，６１８，６９８号および５，６２１，０８０号は、ヒトＥｐｏをコードするＤＮＡ配列、および天然に存在するＥｐｏの１次構造コンフォメーションの一部またはすべてと生物学的性質とを有する精製かつ単離されたポリペプチドを初めて記載した。骨髄細胞による網状赤血球や赤血球の産生を増加させるインビボの生物活性を有し、血液障害（例えば、貧血）の治療に有用な、単離されたＥｐｏ糖タンパク質が開示されている。国際ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０５８６７号は、真核宿主細胞中の外因性ＤＮＡの発現により得られ、網状赤血球や赤血球の産生を増加させることにより、哺乳動物においてヘマトクリットレベルを上昇させるのに有用であると言われているＥｐｏアイソフォームを記載している。
【０００５】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ３５８４６３号は、貧血（腎不全のための腎透析患者の貧血、癌に関連する貧血、悪性貧血、血液喪失による貧血、および慢性腎疾患に関連する貧血）の治療での使用を目的とするＥｐｏの精製法、および輸血前の赤血球量を増加させるための方法を開示している。ＵＳ４，７４５，０９９号は、悪性腫瘍により引き起こされる貧血を治療するためのＥｐｏを含んでなる組成物を開示している。日本特許第２６３２０１４号は、骨髄機能不全または放射線照射もしくは制癌剤の投与により引き起こされた貧血の治療のための活性成分として、ヒトＥｐｏを含有する治療物質を記載する。
【０００６】
Ｅｐｏ遺伝子（リン（Lin）ら、１９８５）のクローニングと組換えヒトＥｐｏ（ｒＨｕＥｐｏ）の導入は、多くの貧血患者に希望を与えた。ｒＨｕＥｐｏ療法により最初に恩恵を受けるものは、最終段階の腎不全患者であった、というのは、彼らは、機能しない腎臓のために内因性Ｅｐｏ産生が欠如しているためである（エシュバッハ（Eschbach）ら、１９８９）。これらの患者での高い成功率により、大規模な臨床治験が始まり、ヘモグロビン（Ｈｂ）の増加やＡＩＤＳ（ヘンリー（Henry）ら、１９９２）、慢性疾患（シュレイバー（Schreiber）ら、１９９６）、および種々の悪性腫瘍（例えば、固形腫瘍、骨髄異形成症候群および多発性骨髄腫）（ルドウィッヒ（Ludwig）ら、１９９０，１９９３ａおよび１９９３ｂ；スピバック（Spivak）、１９９４；ミッテルマン（Mittelman）ら、１９９２と１９９７；カッゾラ（Cazzola）ら、１９９５）に関連する貧血の改善で種々の成功が収められている。
【０００７】
上記のすべての特許文書および医学的文献において、Ｅｐｏは貧血の治療のみを適応症としている。最近の２つの論文は、Ｅｐｏによる腎細胞癌の治療を報告した：ルビンス（Rubins）（１９９５）は、貧血をＥｐｏで治療されてきた腎細胞癌の１人の患者で一過性の腫瘍退行を報告し、モレレ（Morere）ら（１９９７）は、ｒＨｕＥｐｏを投与された転移性腎細胞癌の２０人の患者の試験を報告した：１人の患者は「完全な抗腫瘍応答」を示した、もう１人の患者は、部分的応答を示し、さらに２つの小さい応答が観察された。腎細胞癌患者のこれらの独立の観察結果は、他の悪性腫瘍でのＥｐｏの広範な使用を示しても示唆してもいない。
【０００８】
（発明の要約）
本発明において、驚くべきことにエリスロポエチンが、腫瘍退行に影響を与える免疫応答を開始し、従って癌の治療に使用できることが、わかった。
【０００９】
従って本発明は、エリスロポエチンと薬剤学的に許容される担体とを含んでなる、腎細胞癌以外の癌の治療のための医薬組成物に関する。これらの組成物は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍退行の開始、癌に対する自然の免疫防御の刺激、および／または癌細胞転移の阻害のために有用である。
【００１０】
本発明の組成物は、特に限定されないが、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、大腸癌、食道癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌、または声帯癌などの固形腫瘍の治療、ならびに、特に限定されないが、白血病のような血液形成組織の新生物（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、網内系とリンパ系の新生物（例えばリンパ腫）、または形質細胞悪液質（例えば多発性骨髄腫）のような非固形悪性新生物の治療に有用であり得る。
【００１１】
本発明において、任意の型の生物活性のあるエリスロポエチンが使用できる。これらの型の生物活性のあるエリスロポエチンには、特に限定されないが、米国特許第５，４４１，８６８号、５，５４７，９３３号、５，６１８，６９８号および５，６２１，０８０号に記載の組換えエリスロポエチンおよび類似体、ならびにヨーロッパ特許公報ＥＰ６６８３５１号に記載のようにグリコシル化が増加および／またはアミノ酸配列が変化しているヒトエリスロポエチン類似体、そして国際ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０５８６７号に記載の１〜１４個のシアル酸基とアミノ酸配列の変化を有する高グリコシル化類似体がある。最も好適な実施態様において、エリスロポエチンは、組換えヒトエリスロポエチンである。
【００１２】
本発明はまた、腎細胞癌を除く癌の治療用医薬を製造するための、エリスロポエチンの使用に関する。
【００１３】
さらなる面において本発明は、患者の腫瘍増殖の阻害、腫瘍退行の開始、癌に対する自然の免疫防御の刺激、および／または癌細胞転移の阻害に有効な量のエリスロポエチンを、患者に投与することを特徴とする、腎臓細胞癌患者以外の癌の治療方法に関する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明において、従来は貧血の治療（貧血を患う癌患者を含む）にのみ使用されてきたエリスロポエチンが、マウスの腫瘍退行に影響を与えること、そして一部の多発性骨髄腫患者の生物学的および臨床経過を改善することがわかった。
【００１５】
本発明の最初の観察は、Ｅｐｏで貧血を治療されている多発性骨髄腫（ＭＭ）患者から得られた。ＭＭは、血清および／または尿中で検出可能なパラプロテインを分泌する骨髄（ＢＭ）形質転換形質細胞（ＰＣ）のクローン性増殖を特徴とする（カイル（Kyle）１９７５；、デュリー（Durie）とサルモン（Salmon）、１９７５；バーグサーゲル（Bergsagel）、１９９０）。ＭＭの発現症状と合併症には、貧血、再発性感染、出血を伴う血小板減少症、病的骨折、高カルシウム血症、腎不全、神経障害およびアミロイド症がある。多くの患者は、ＭＭまたはその合併症で亡くなり、中間生存率は１５ヶ月（化学療法に応答しない患者について）から応答者の４８ヶ月までの範囲である（バーグサーゲル（Bergsagel）、１９９０）。
【００１６】
ＭＭの約６０〜９０％の患者は、貧血を患っており、これが彼らのクオリティオブライフに影響を与えている（カイル（Kyle）、１９７５；デュリー（Durie）とサルモン（Salmon）、１９７５；バーグサーゲル（Bergsagel）、１９９０）。骨髄腫患者に発生する貧血は、不充分な内因性Ｅｐｏ産生が原因であり、これは、外因性Ｅｐｏ投与により改善され、Ｈｂレベルが有意に上昇し、クオリティオブライフが改善される（スピバック（Spivak）ら、１９９４；ミッテルマン（Mittelman）、１９９７；ミラー（Miller）ら、１９９０）。
【００１７】
不充分な内因性Ｅｐｏ産生が、癌関連貧血の大きな原因の１つである（ミラー(Miller)ら、１９９０）という証明は、ミッテルマン（Mittelman）（１９９７）に記載の我々のフェーズII／IIIＥｐｏ−ＭＭ臨床治験の理論的根拠である。この治験では、ＭＭと貧血の１７人の患者（Ｈｂ＜１１g/dl）が、ｒＨｕＥｐｏ、１５０U/Kg×３週間皮下投与で同時に治療された。４週間後に応答が観察されなかった場合、用量を倍にした。この試験は、１２週間で計画したが、数人の応答者については、ｒＨｕＥｐｏをさらに継続した。ミッテルマン（Mittelman）（１９９７）に報告され要約されているように、処理前の内因性血清Ｅｐｏレベルは、ＭＭ関連貧血を有する試験したすべての患者で比較的低く、これらの患者ではｒＨｕＥｐｏは充分許容され、ｒＨｕＥｐｏはＭＭの貧血の治療に非常に有効であり、ｒＨｕＥｐｏに対する応答は、Ｈｂレベルの上昇、輸血必要性（ＢＴＲ）の低下、およびＷＨＯ性能現状（ＰＳ）スコアの改善という特徴があった：１７人の患者のうち、１２人（７０．６％）は応答してＨｂレベルが有意に上昇し、輸血依存性の１１人の患者のうち６人は、ＢＴＲが完全に消失し、１２人の患者は、クオリティオブライフが改善し、低ＷＨＯ  ＰＳスコアであると解釈された。
【００１８】
ミッテルマン（Mittelman）（１９９７）に報告された臨床治験の５人の患者は、貧血のために数年間ｒＨｕＥｐｏを受け続けた。これらの患者はすべて、Ｈｂ増加を示し、全般にその疾患の重症度（高腫瘍含量）と比較して「非常に調子がよかった」。興味深いことに、患者は、高血清パラプロテインレベルを示し続けた。
【００１９】
臨床的観察に基づき、かつ少なくとも一部の患者では、Ｈｂレベルの上昇以外にＥｐｏは疾患（ＭＭ）自身の生物学と経過を変化させることに関与するかも知れないという仮定に基づき、ＭＭの過程と生物学に及ぼすＥｐｏの非赤血球または他の生物作用を試験するために、マウスモデルで追跡した。このために我々は、ヒトＭＭの臨床的および免疫学的側面を研究するための公知のマウスモデル（ポッター（Potter）とウォルターズ（Walters）、１９７３）である、Ｂａｌｂ／ｃマウスの鉱物油誘導性形質細胞腫（ＭＯＰＣ−３１５腫瘍と呼ぶ）を使用した。ヒトＭＭ細胞と同様に、マウスＭＯＰＣ−３１５腫瘍細胞は、モノクローナル性ＩｇＡ（λ２）免疫グロブリンを合成、分泌し、こうして腫瘍進行の間に測定可能な腫瘍マーカー（血清骨髄腫成分）を提供する。ＭＯＰＣ−３１５腫瘍細胞の増殖に及ぼすｒＨｕＥｐｏ処理のインビボ作用を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで試験した。以下の例に示すように、腫瘍細胞を接種しさらにＥｐｏで短期間処理したマウスの３０〜６０％では、顕著な腫瘍退行が観察され、３〜７．５ヶ月のフォローアップの間腫瘍の再発はなかった。この現象は、有効な抗腫瘍免疫応答の出現が原因と思われる。
【００２０】
本明細書において「リグレッサーマウス」または「リグレッサー」とは、腫瘍細胞を注入後、まず腫瘍が増殖し、Ｅｐｏ処理後に腫瘍細胞が大幅に消失したマウスを意味する。「プログレッサーマウス」または「プログレッサー」とは、腫瘍細胞を注入後、Ｅｐｏ処理の有無にかかわらず腫瘍が継続的に増殖したマウスを意味する。「ナル」とは、腫瘍細胞を注入しても腫瘍細胞の生着が起きなかったマウスを意味する。
【００２１】
ＭＭ患者とマウス骨髄腫モデルでの観察結果は、１つの具体例であるが、腎細胞癌を除くすべての種類の新生物疾患の治療のためのエリスロポエチンを含む薬剤の使用である本発明に包含される。
【００２２】
本明細書と請求の範囲において、「エリスロポエチン」は、天然のおよび組換えのエリスロポエチン、ならびにヒトでの投与に適したエリスロポエチン活性を示すエリスロポエチン類似体（例えば、高グリコシル化類似体、および１〜１４個のシアル酸基を有し上記アミノ酸配列の変化を有する類似体）のすべてのタイプのエリスロポエチンを含む。ある好適な実施態様において、エリスロポエチンは、組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥｐｏ）である。
【００２３】
本発明ではＥｐｏの任意の適当な投与経路（例えば、静脈内（i.v.）または皮下（s.c.））が使用できるが、体内での分布が良好でありバイオベイラビリティが良好であるため、皮下経路が好適である。Ｅｐｏの用量は、５，０００〜２０，０００Ｕ、好ましくは１０，０００Ｕ／注射（ほぼ１５０Ｕ/kgに対応する）の範囲である。投与プロトコールは、癌の種類、疾患の重症度、患者の年令や体調、および各症例の他の関連パラメータに従って、医師により決定される。例えばＭＭ患者では、約１０，０００Ｕの単位服用量が、週に３回で約４週間皮下投与され、続いて必要であれば、さらに治療が継続される。貧血実験から蓄積されたデータに従って、Ｅｐｏ処理によく応答する患者は、内因性Ｅｐｏレベルが２００mU/ml未満の患者である（正常な内因性Ｅｐｏレベル：１０〜２５mU/ml；貧血患者の内因性Ｅｐｏレベル：１００mU/mlより高く、数百または数千mU/mlのレベルである）。
【００２４】
本発明を、以下の非限定例により例示する。
【００２５】
例
【００２６】
材料と方法
材料
ｒＨｕＥｐｏ（エプレックス（Eprex））は、シラグ（Cilagp）（シャフハウゼン（Schaffhausen）、スイス）から得た。マウス腫瘍である形質細胞腫ＭＯＰＣ−３１５とＭＰＣ−１１、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）ＢＣＬ１、ルイス肺癌３ＬＬ、ＭＣＡ−１０５線維肉腫、Ｋ−１７３５黒色腫、そしてハイブリドーマＧＫ１．５（抗ＣＤ４モノクローナル抗体を産生する）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル（Rockville）、メリーランド州、アメリカ合衆国）から購入した。Ｃ−２６大腸癌とＭ−１０９肺癌は、イー・ケーダー（E. Kedar）教授（ヘブライ大学（Hebrew University）、エルサレム、イスラエル）から供与され、１０７−２０２乳腺癌、３８Ｃ−１３プレＢ細胞白血病、１２７Ｃリンパ肉腫、および１７Ａ−４４３急性骨髄性白血病は、我々の実験室で樹立した。
【００２７】
ＭＯＰＣ−３１５腫瘍接種
マウス骨髄腫ＭＯＰＣ−３１５を、８週令の同系のメスＢａｌｂ／ｃマウスに連続的に筋肉内接種して、インビボで維持した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１０4細胞を腹部に皮下（s.c.）注射した。１１〜１３日までに局所的腫瘍増殖（直径２〜５mm）が観察され、徐々にサイズが大きくなり、４０〜５０日までに９０〜１００％が死滅した。注射部位に小さな感知できる腫瘍が現れた時に、皮下ｒＨｕＥｐｏ処理を開始した。各マウスに番号を付け、各マウスの腫瘍増殖速度（直径mm）を、ノギスで測定した。Ｅｐｏ投与の間（通常４週間続いた）５日毎に各マウスの腫瘍サイズを追跡した。
【００２８】
ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
マウスの血清をＮａＣｌ  ０．９％で希釈（１：１）し、希釈血清２μｌを、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質バンドは、クマシーブルー染色により検出した（１０％酢酸、５０％メタノール中０．０５％v/vクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（バイオラッド（Bio-Rad））、次に１０％酢酸、２０％メタノール中で脱染色）。
【００２９】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析は、既に記載されているように行なった（ニューマン（Neumann）ら、１９９３）。０．９％ＮａＣｌで１：１希釈した２μｌの血清を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＭＯＰＣ−３１５免疫グロブリン（２０μg）を、陽性対照としてのせた。ゲルをニトロセルロース膜フィルターにブロットし、マウス免疫グロブリンλ軽鎖に対するウサギ抗体とプローブ結合させた。次にブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した２次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ）とともにインキュベートし、バンドを、製造業者の説明書に従って増強化学発光（ＥＣＬ）を使用して視覚化した。
【００３０】
例１．多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の長期ｒＨｕＥｐｏ処理
ミッテルマン（Mittelman）ら（１９９７）が記載した試験では、ＭＭを有する貧血患者のＥｐｏレベルを試験するための、ならびにこれらの患者の貧血の治療におけるｒＨｕＥｐｏの有効性と毒性を評価するための多施設オープン非比較試験に、ＭＭと貧血（Ｈｂ＜１１g/dl）を有する１７人の患者が参加した。患者の中間年令は７０才（範囲４４〜８８才）であり、男性６人女性１１人であった。すべての患者はステージII／III疾患であった。１５人の患者は、試験期間中化学療法を受けており、３人は、ビンクリスチン−アドリアマイシン−デキサメタゾン（ＶＡＤ）治療を受け、残りは経口メルファランとプレドニソン（ＭＰ）治療を受けた。
【００３１】
処理前内因性血清中間Ｅｐｏレベルは、１５０mU/ml（範囲１１〜２３２）であった。血清Ｅｐｏレベルは、ミッテルマン（Mittelman）ら（１９９７）が記載したように測定した。
【００３２】
患者に、通院でｒＨｕＥｐｏ  １５０U/kgを週３回皮下注射した。４週間後に応答が観察されない場合は、用量を倍にした。経口的に鉄を加えた（Ｓｌｏｗ−Ｆｅ、１６０mgの乾燥硫酸第一鉄、チバガイギー（Ciba-Geigy）、バーゼル、スイス）。ｒＨｕＥｐｏを用いる治療は１２週間で計画したが、６人の患者は、試験の終了後もｒＨｕＥｐｏ処理を続けた。試験中に１４g/dlを超えてＨｂレベルが上昇する場合は、用量の変更を必要とした。
【００３３】
完全な応答は、＞２g/dlのＨｂレベル（１２週で）の上昇（ベースラインから）、および／または輸血必要性（ＢＴＲ）の完全な消失として定義した。部分的応答は、Ｈｂレベルの１〜２g/dlの上昇および／またはＢＴＲの５０％の低下として定義した。１２人の患者（７０．６％）は、完全な応答を示し、１人（５．９％）は部分的応答を示し、これらを一緒にすると全体で７６．５％の応答率であった（治療目的ベースで）。中間Ｈｂレベルは、試験開始時の９．４g/dl（範囲７．３〜１０．７）から１２週目の１２．５g/dl（９．０〜１５．２）まで上昇した（試験を完了した者について）。
【００３４】
６人の患者は、計画した１２週間の試験期間後に１４〜８５週間ｒＨｕＥｐｏ処理を続け、正常またはほとんど正常なＨｂレベルを維持するために、かつ応答を得るのに必要であった初期の用量より低い（１５〜５０％）維持用量で良好なクオリティオブライフが得られようにした。
【００３５】
本発明において、上記試験の患者のうちの４人（Ｙ．Ｓ．、Ｏ．Ｇ．、Ｌ．Ｂ．およびＴ．Ｓ．）および新しい患者（Ｍ．Ｂ．）は、数年間ｒＨｕＥｐｏを受け続けた。これらの患者はすべて、Ｈｂレベルが上昇し、全般に疾患の重症度に比較して「非常に調子がよかった」。この５人の患者の特徴を表１に要約する。
【００３６】
これらの観察結果は、少なくとも一部の患者では、Ｅｐｏは、Ｈｂの上昇以外に、疾患の生物学と経過を変化させるかも知れないことを示しているようである。従って我々は、クオリティオブライフの改善は、貧血の治療にのみ関係しているのではないと仮定した。５人のすべての患者が共通に投与された物質はＥｐｏであり、これは実際、ここに報告されたフォローアップのほとんどの期間の唯一の治療であるため、我々は、Ｅｐｏがある用量で適切な期間投与されると、疾患の生物学と経過を変化させ、臨床基準とこれらのすべての患者の予後の悪さを考慮した時予測されるよりも長い生存率に至るかも知れないと仮定した。骨髄形質細胞および特にＭ−タンパク質（腫瘍の大きさを反映する）は、これらの患者で消失しなかったが、疾患の経過は、安定しているか、「凍結」または潜伏および無症候性になったようである。
【００３７】
0004456271.tif 000002
【００３８】
注：
*     データは、１９９９年４月現在で要約されアップデートされている。
**    貧血以外に予後が悪い特徴（デュリー（Durie）とサルモン（Salmon）、１９７５；バーグサーゲル（Bergsagel）、１９９０を参照）。
***   疾患の経過の間ＭＭについて患者が受けた他の治療法。
▼    患者２（ＯＧ）は、ＶＭＣＰをＶＢＡＰを交互に投与され、続いてＶＡＤと次にＨＤＣを投与された。略語については、下記を参照されたい。
●    総Ｖｓのみ：唯一の治療法としてｒＨｕＥｐｏのみを患者が投与された期間に対して、ｒＨｕＥｐｏ投与の総期間（ＭＭの治療のために患者が他の治療法を受けた期間を含む）。＋印は、これらのデータがまとめられた時（１９９９年４月）に、患者がまだｒＨｕＥｐｏを投与されていたことを示す。患者ＯＧとＬＢは、１９９８年半ばからパミドロネート（pamidronate）も投与されている。
●●  略語：ＬＣ  −  軽鎖；Ｌ  −  ラムダ；Ｋ  −  カッパ；ＲＦ  −  腎不全；ＣＨＦ  −  うっ血性心不全；ＭＰ  −  メルファラン＋プレドニソン；ＶＭＣＰ  −  ビンクリスチン＋メルファラン＋シクロホスファミド＋プレドニソン；ＶＢＡＰ  −  ビンクリスチン＋ＢＣＮＵ＋アドリアマイシン＋プレドニソン；ＶＡＤ  −  ビンクリスチン＋アドリアマイシン＋デキサメタゾン；ＨＣＳ  −  高用量シクロホスファミド；ＲＴ  −  放射線療法。
【００３９】
これらの臨床的観察に基づき、次に我々は、ＭＭの経過と生物学に及ぼすＥｐｏの可能な非赤血球または他の生物学的作用を調べるために、マウスモデルを追跡した。
【００４０】
例２．ＭＯＰＣ−３１５腫瘍細胞を接種したマウスへのｒＨｕＥｐｏ投与は腫瘍退行を誘発する
同系の増殖している骨髄腫を接種（１０4細胞を皮下で）したマウスを、ｒＨｕＥｐｏの全身性投与で処理した。２〜２．５週間の期間を超える腫瘍増殖は、すべてのマウスで同じであり、以後一部のＥｐｏ処理マウスの腫瘍サイズが低下し、処理マウスの３０〜６０％では永久的かつ完全な腫瘍退行が起きた（対照の０〜１０％と比較して）。異なるＥｐｏ療法の効果を試験した。４つの異なる代表的実験の結果を、表２に要約する。
【００４１】
実験Ｉでは、腫瘍細胞を接種した１１日後にＥｐｏ処理（３０Ｕ、皮下注射）を開始した。マウスには毎日５日間注射し、６日間の中断後、さらに週３回注射を３週間行なった。Ｅｐｏを投与されなかったほとんどの腫瘍注射マウスは死亡した。このＥｐｏ処理は、３０％の腫瘍退行を与え、Ｅｐｏ処理マウスの生存率をわずかに延長させた。
【００４２】
実験IIとIIIでは、最初のＥｐｏ処理（その開始は、腫瘍細胞皮下注射の１３または１１日後）を１０日間連続とし、次に週３回の注射をさらに２週間行なった。実験IIでは、Ｅｐｏの２つの用量（注射当たり３０Ｕと１００Ｕ）を試験した。高用量のＥｐｏ（１００Ｕ）を注射したマウスの腫瘍進行の発生率は、対照群で観察されたものと同様であった（それぞれ、１４％と１０％）。これに対して、低用量のＥｐｏ（注射当たり３０Ｕ）で処理したマウスでは、マウスの６０％で腫瘍退行が観察された。実験IIIでは、３０ＵのＥｐｏで処理したマウスの４０％に腫瘍退行が観察された。この腫瘍退行は、Ｅｐｏ処理が終了した時に完全に確立された。それ以来、リグレッサーマウスでは、Ｅｐｏの終了後でもフォローアップ期間（
実験IIでは７．５ヶ月、実験IIIとIVでは３〜４ヶ月）に腫瘍再発が観察されなかった。対照群の自然の腫瘍退行は、通常０〜１０％であることを指摘したい。
【００４３】
実験IVでは、種々の処方を試験した（注射当たり１０、２０および３０Ｕ、および週３回の注射を４週間、これに対して日に１０回の注射後に、さらに週３回の注射を２週間）。顕著な腫瘍退行（５０％）は、実験IIとIII（注射当たり３０Ｕ）の治療スケジュールでのみ観察された。同じ用量を週に３回４週間与えた時は、あまり有効ではなかった（対照群の９％の自然の退行に対してわずかに１８％の退行）。より低い用量（１０Ｕ、２０Ｕ）の投与は、治療の時間スケジュールにかかわらず、腫瘍進行を妨害しなかった。Ｅｐｏ処理は、Ｅｐｏ処理に応答しなかったこれらのマウスの腫瘍進行速度に何の効果もなかった。
【００４４】
従って、最適なｒＨｕＥｐｏ処理は実験IIに対応し、これは毎日３０Ｕの皮下注射を１０日間連続して投与し、次に同じ用量で週３回をさらに２週間行う。Ｅｐｏ処理を停止すると、完全な腫瘍退行が観察され、７．５ヶ月のフォローアップの間、骨髄腫の再発は観察されなかった。Ｅｐｏ処理に応答しないマウスでの腫瘍の進行（最終的には死亡）が、Ｅｐｏ処理の停止と同時にまたは停止後まもなくに観察された（これらのマウスでは、腫瘍増殖速度の低下は観察されなかった）。
【００４５】
実験II、IIIおよびIVにおける各マウスのプログレッサーとリグレッサーの腫瘍増殖の動力学は、それぞれ図１〜３に記載される。通常Ｅｐｏ投与から６日まで（腫瘍細胞接種から１７〜１８日）、プログレッサーまたはリグレッサーの間で腫瘍増殖速度の変化は観察されなかった。１２〜１５日までに、Ｅｐｏ処理に応答するマウスでは腫瘍サイズが明らかに低下して、最終的に腫瘍退行が起き、一方非応答マウスでは、腫瘍サイズは増加し、最終的にマウスは死亡した。図４は、リグレッサー（Ａ）とプログレッサー（Ｂ）の外観の差を示す：Ｂでは、明らかに腫瘍増殖が見られる。
【００４６】
0004456271.tif 000003
【００４７】
0004456271.tif 000004
【００４８】
注：
ａ）潜伏  −  プログレッサーマウスの腫瘍接種から死亡までの間隔（生存）日数。
ｂ）ＭＣ  −  骨髄腫細胞  −  １０4を皮下に注射。
ｃ）Ｅｐｏ処方：ｒＨｕＥｐｏ（エプレックス（Eprex）、ヤンセン／シラグ（Janssen/Cilag））を皮下に注射。
【００４９】
例３．腫瘍ＭＯＰＣ−３１５担持マウスの血清中のパラプロテイン
骨髄腫は、血清中で検出可能なパラプロテインを分泌する骨髄形質細胞のクローン性増殖を特徴とし、従って腫瘍細胞マーカーとして機能する。マウス骨髄腫ＭＯＰＣ−３１５細胞は、λ２軽鎖とα重鎖を有する免疫グロブリンＩｇＡを合成し分泌する。
【００５０】
骨髄腫リグレッサーとプログレッサーマウスおよび対照マウス中の血清パラプロテインは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した血清タンパク質のクマシービリリアントブルー染色を使用して検出した。正常Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＥｐｏで処理したあらかじめ腫瘍細胞接種をしなかったＢａｌｂ／ｃマウスからの血清と比較して、Ｅｐｏ処理の終了後骨髄腫リグレッサーまたはプログレッサーマウスの血清を採取した。プログレッサーおよびリグレッサーマウスの両方の血清に、明白な２７kDバンドが観察された（対照の健常マウスの血清でははるかに弱かった）。
【００５１】
次に我々は、１０4のＭＯＰＣ−３１５細胞を皮下注射し、１２日後にＥｐｏかＥｐｏ希釈溶液のみで処理した４０匹のマウスの血清を分析した。印を付けた各マウスから２回採血（眼窩静脈から）した  −  腫瘍細胞接種の１７日後のＥｐｏ処理の進行中と２週間後（Ｅｐｏ処理の終わり近く）に。この段階で、Ｅｐｏ処理に対して応答性のリグレッサーマウスと、これに対して非応答プログレッサーマウスおよびいくつかの「ナル」マウス（最初から腫瘍生着が観察されなかった）を明確に区別することができた。さらなるＥｐｏ処理を受けなかった骨髄腫担持マウス（いくつかの「自然の」退行も含む）の血清および対照マウスの血清もまた、この試験に加えた（図５）。骨髄腫接種の１７日後に、試験したすべての血清で、腫瘍細胞を接種しなかった対照マウスの血清ではほとんど検出されなかったはっきりした２７kDバンドが観察された。Ｅｐｏ処理後のプログレッサーとリグレッサーへの偏りは、血清中の２７kDバンドの存在に影響を与えなかった。すなわち、２７kDバンドは、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの最初の腫瘍細胞注射とのみ相関し、疾患の重症度とは相関しなかった。「ナル」マウスの血清中でも、２７kDバンドは観察された。
【００５２】
図５は、Ｅｐｏリグレッサー（レーン１〜２）、Ｅｐｏプログレッサー（レーン３〜４）、対照中のプログレッサー（Ｅｐｏ処理なし、レーン５〜６）、「ナル」マウス（レーン７）、非注射Ｂａｌｂ／ｃ対照マウス（レーン８）およびＥｐｏのみを注射したＢａｌｂ／ｃマウス（骨髄腫細胞無し、レーン９）中の血清タンパク質のプロフィールである。
【００５３】
我々はまた、腫瘍退行の２、４および７ヶ月後（この期間に、腫瘍再発の症候は観察されず、マウスはまったく正常に見えた）にＥｐｏ処理リグレッサーからの血清を試験した。これらのマウスの代表的な血清試料の試験を図６に示す。すべての血清は２７kbタンパク質を示し、従ってパラプロテインを産生し分泌し続ける骨髄腫リグレッサーマウス中での、「休眠」腫瘍細胞の存在を示唆している。
【００５４】
ＭＯＰＣ−３１５を含む皮下移植腫瘍を有するマウスの異なる臓器（脾臓を含む）での悪性腫瘍細胞の停止が、本発明者らの１人の実験室で数年前に証明された（ハラン−ゲーラ（Haran-Ghera）ら、１９８１）。移植腫瘍から得られた腫瘍細胞の隔離が、原発性腫瘍の初期の感知できる成長のわずかに前後に、すでに腫瘍移植の３〜７日以内に示された。従って我々は、リグレッサーマウスからの脾臓は、「休眠」ＭＯＰＣ−３１５腫瘍細胞のキャリアかも知れないと考えた。
【００５５】
本発明のこの可能性を試験するために、我々は，リグレッサーマウスの脾臓を摘出し（骨髄腫細胞接種の４．５ヶ月後）、脾臓細胞懸濁物または脾臓全体を同系受容体に移植した。７匹の各リグレッサーから脾臓懸濁物を調製し、脾臓細胞懸濁物の半分を、正常の同系Ｂａｌｂ／ｃマウス中に静脈内注射し、他の半分は、放射線照射したＢａｌｂ／ｃマウスに注射した（４００ｒの全身放射線照射後２時間）。
【００５６】
脾臓細胞移植の５０および７５日に、２／７の放射線照射脾臓細胞受容体マウスは腫瘍を発現し、正常受容体では腫瘍は観察されなかった。最初の骨髄腫細胞接種後７．５ヶ月目に、リグレッサー脾臓ドナーはまったく正常に見えた。脾臓細胞受容体の血清を分析すると、すべての脾臓細胞受容体で２７kDタンパク質の存在が明らかになった（図７）。別の実験では、８匹のリグレッサーマウスから取った脾臓全体を、正常な受容体に皮下移植した。３／８の移植脾臓は、移植の部位で局所的腫瘍を発現した。これらの脾臓受容体から、脾臓移植の１０日目と３週間後に採血すると、その血清は、２７kDタンパク質バンドが陽性であることが証明された（図７）。
【００５７】
ＭＯＰＣ−３１５を注射したマウスの血清中に特徴的に現れる２７kDバンドは、おそらくＭＯＰＣ−３１５骨髄腫細胞により分泌されるＩｇＡ免疫グロブリンのλ軽鎖である。この同一性を確認するために、２匹のリグレッサーＥｐｏ処理マウスの血清（図８、レーン３，４）、リグレッサーマウスからの脾臓を移植し、移植の１０日（レーン１）と３週間後（レーン２）に採血したマウスの血清（いずれも同じマウスから採血）、対照の非注射健常マウスの血清（レーン５、６）、およびＭＯＰＣ−３１５細胞から分泌された対照ＩｇＡ（レーン７）を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にゲルを抗λ免疫グロブリン軽鎖抗体と免疫ブロットした。図８から明らかなように、ドナーのリグレッサーマウスの脾臓を健常マウスに移植後まもなく（１０日）、２７kDバンドは抗λ軽鎖抗体（レーン１）と反応し、シグナルは、対照マウスの血清中で観察されたものより強かった（約２倍）（レーン５と６）。２週間後にこのマウスの血清でより強い２７kDバンド（レーン２）が観察され、骨髄腫細胞が増殖し、分泌ＩｇＡの量が増加したことを示していた（Ｅｐｏ処理リグレッサーマウス（レーン３〜４）の血清中と同様のレベル）。２７kDバンドは、ＭＯＰＣ−３１５ＩｇＡの対照抗体のレーン（レーン７）中で観察された対応するバンドと同様に泳動し、これが免疫グロブリンＡ軽鎖であることを疑いなく確立していた。
【００５８】
すなわちこれらの結果では、骨髄腫担持マウスの血清中のパラプロテインの同定は、これらのマウス中に腫瘍細胞が存在することに関連していることがわかった。２７kDタンパク質バンドは、これらの細胞が最終的に死亡するかまたは永久に退行するかに関係なく、骨髄腫細胞を接種したすべてのマウスで観察された。２７kDタンパク質バンドは、抗λ免疫グロブリン軽鎖抗体を用いるウェスタンブロット分析で、免疫グロブリンλ軽鎖に疑いなく対応することが証明された。
【００５９】
リグレッサーマウスの脾臓中の「休眠」腫瘍細胞の存在は、移植試験により証明された。すべての脾臓細胞受容体の血清中のパラプロテイン血症と脾臓受容体で発生するいくつかの腫瘍の出現は、Ｅｐｏ処理後の疾患の経過が増殖停止下にあることを明瞭に示している（「休眠」状態）。
【００６０】
例４．Ｂａｌｂ／ｃマウスのＥｐｏ処理により影響を受けるヘモグロビン（Ｈｂ）レベル
正常対照マウスならびにＥｐｏ処理が有るかまたは無い骨髄腫担持マウスで、リグレッサーおよびプログレッサーマウスに偏ってＨｂレベルを測定した（図９）。正常Ｂａｌｂ／ｃマウスのＨｂレベルは、１２．７〜１５．３g/dlの範囲（平均１３．６）であった。Ｅｐｏ処理した正常マウスは、Ｈｂレベルが上昇していた（１９．８〜２１．７g/dl、平均２０．９）。Ｅｐｏ処理リグレッサーの中で、試験したマウスの７／９はレベルが上昇（１７〜２１．５g/dl、平均１８．４）し、２／９はより低い正常値に近かった（１３．８と１４．５）。２匹の自然のリグレッサー（希釈剤を注射した骨髄腫担持マウス）のＨｂレベルは、１６．２と１６．４g/dlであった。Ｅｐｏ処理したプログレッサーマウスでは、試験した血液試料（大きな腫瘍の無いマウスから採取）の９／１１では、Ｈｂレベルは１１．５〜１３．４g/dl（平均１２．６）であり、一方小さな腫瘍を有した２／１１のプログレッサーでは、このレベルは１６．３と１６．７g/dlであった。希釈剤のみで処理した２匹のプログレッサーでは、Ｈｂレベルは１２．５と１３．４g/dlであった。従って、Ｅｐｏ処理に対するマウスの応答は、ヒトで観察されたものと同様であった。Ｅｐｏは、正常マウス中のＨｂレベルを上昇させる。Ｅｐｏ処理後の腫瘍退行はまた、Ｈｂ増加に関連しており、一方Ｅｐｏ処理骨髄腫プログレッサーでは、Ｈｂレベルは低く維持される。
【００６１】
例５．リグレッサーマウスは同じタイプの第２の腫瘍による再接種に抵抗する
上記例２〜４に記載の実験は、腫瘍担持マウスへのＥｐｏの投与は、腫瘍退行に影響を与える免疫応答を開始させることを示している。抗腫瘍免疫応答は、腫瘍退行と腫瘍の休眠の維持に寄与しているようである。リグレッサーマウス（数ヶ月この状態にある）に１０4のＭＯＰＣ−３１５を再度皮下に接種すると、接種後１０〜１４日で１００％の腫瘍生着を示した正常な対照マウスに対して、この第２の腫瘍細胞接種に抵抗した（データは示していない）。
【００６２】
この免疫学的開始耐性の特異性は、リグレッサーマウスの両側に接種することによりさらに証明された：左の腹部表面にＭＯＰＣ−３１５細胞を、右の腹部表面に無関係の骨髄腫の腫瘍細胞（ＭＰＣ−１１、ＭＯＰＣ−３１５について材料と方法で記載したようにＢａｌｂ／ｃマウスで誘導された）を接種。両方の腫瘍は、対照Ｂａｌｂ／ｃマウスで進行的に増殖した。これに対して７／７リグレッサーマウスではＭＯＰＣ−３１５増殖は拒絶され、一方ＭＰＣ−１１は、これらの同じ宿主で進行的に増殖した。図１０は、ＭＯＰＣ−３１５とＭＰＣ−１１骨髄腫腫瘍（左）の両方を有する対照マウスと、右の腹部表面に骨髄腫ＭＰＣ−１１腫瘍のみを有するリグレッサーマウス（右）を示す。
【００６３】
これらの結果は、Ｅｐｏ処理が、有効な抗腫瘍免疫応答の出現を促進することを示し、Ｅｐｏにより誘導される腫瘍退行は、これらのマウスを同じタイプの第２の骨髄腫細胞接種の増殖に対して耐性にすることを示唆し、従って腫瘍退行の原因となる抗腫瘍免疫応答の蓄積を示唆している。
【００６４】
免疫が障害（細胞免疫と液性免疫応答の両方）されているＳｃｉｄマウスとヌードマウス（細胞免疫が障害されている）を用いてさらなる実験を行ない、両方とも１０4 のＭＯＰＣ−３１５細胞接種後のＥｐｏ処理に非応答性であることがわかった。Ｅｐｏ群と対照群の両方で、すべてのｓｃｉｄマウスとヌードマウスは、腫瘍細胞接種の２４〜２６日以内に同時に死亡した（図１１〜１２）。対照群（正常Ｂａｌｂ／ｃマウス）では、Ｅｐｏ処理は３０〜４０％の腫瘍退行を引き起こした。
【００６５】
例６．Ｅｐｏ処理した腫瘍担持マウスにおける腫瘍退行は、ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞により仲介される
腫瘍特異的エフェクター細胞の表現型をさらに解明するために、我々は、ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔエフェクター細胞の枯渇が、腫瘍細胞接種後のＥｐｏ処理に応答するマウスの能力を消滅させるかどうかを試験した。ＣＤ８+細胞に対する抗体で処理したマウス（従って、すべてのＣＤ８+細胞を根絶したマウス）では、Ｅｐｏ処理に対する応答は観察されず、実際腫瘍増殖が増強された（データは示していない）。ＣＤ４+細胞に対する抗体で処理したマウスでは（従って、すべてのＣＤ４+細胞を根絶したマウス）では、腫瘍退行に対するＥｐｏ処理のより少ない根絶が観察された。対照群では、Ｅｐｏ処理は、放射能マウスの５０％に腫瘍退行を引き起こした（図１３）。
【００６６】
これらのデータは、腫瘍担持マウスのＥｐｏ処理は、ＭＯＰＣ−３１５骨髄腫腫瘍細胞を接種しＥｐｏでさらに処理されたマウスでのインビボの腫瘍退行において重要な役割を果たす、Ｔｈｙ−１+ＣＤ８+Ｔエフェクター細胞の生成を促進することを示している。
【００６７】
例７．異なる腫瘍を担持するマウスでのＥｐｏ処理の効果
骨髄腫ＭＯＰＣ−３１５についての材料と方法に記載のプロトコールに従って、以下の腫瘍細胞をマウスに注射することができる：１０７−２０２腺癌細胞を使用して乳癌、Ｃ−２６大腸癌細胞を使用して大腸癌、Ｍ−１０９または３ＬＬ肺癌細胞を使用して肺癌、ＢＣＬ１を使用して慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、黒色腫Ｋ−１７３５、ＭＣＡ−１０５線維肉腫、３８Ｃ−１３プレＢ細胞白血病、１２７−ＲａｄＬＶ  Ｔリンパ肉腫、１７Ａ−４４３−急性骨髄性白血病および１７Ｅ−２００  Ｂ細胞リンパ腫。腫瘍担持マウスを次に、前例で記載したようにＥｐｏで処理した。
【００６８】
予備的結果
１）Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、肺腺癌３ＬＬ細胞を接種し、次に骨髄腫プロトコールに従って（すなわち、３０ＵのＥｐｏを１０日間毎日皮下注射し、次に随時さらに週３回の注射を４週間）Ｅｐｏで処理した。図１１に示すように、３ＬＬ腫瘍担持マウスの生存で遅延が観察された：対照マウスの５０％は、初期腫瘍細胞接種の５４日後までに死亡し、３０ＵのＥｐｏで１０日間毎日処理した３ＬＬ腫瘍担持マウスの５０％は７５日間生存した。
【００６９】
２）Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｃ−２６大腸癌腫瘍細胞を皮下に接種した。腫瘍細胞接種の１日後に開始したＥｐｏ投与は、腫瘍担持マウスの生存を顕著に延長させた（対照群は３６日目に９０％が死亡したのと比較して、３０％が１００日間生存した）。腫瘍細胞接種の６日後に開始したＥｐｏ投与は、実際腫瘍増殖を増強させた（２３日目に９０％死亡、図１５に示す）。
【００７０】
考察
我々の臨床的観察結果は、少なくとも一部の骨髄腫患者では、Ｅｐｏはまた、疾患のより長いかつより安定な経過を誘発することを示唆している（例１，表１を参照）。疾患の出現に対する外因性Ｅｐｏ投与の可能な作用を、多発性骨髄腫モデルで試験し、徐々に増加する骨髄腫を接種しＥｐｏで処理したマウスは、比較的短期間、Ｅｐｏ処方の最適な用量を使用して処理したマウスの３０〜６０％で完全な腫瘍退行を示した。同様の注射スケジュールを使用して、腫瘍増殖速度に及ぼすＥｐｏ用量（５〜１００Ｕ）を比較すると、用量の閾値があることが明らかになった：外因性Ｅｐｏ投与に応答性のマウスでは、ある処方（少なくとも１０日間３０Ｕを毎日皮下注射、小さい感知できる腫瘍が発生した時にＥｐｏ処理を開始する）で最適の腫瘍退行が達成された。腫瘍退縮の維持は、さらなるＥｐｏ投与には依存しなかった。Ｅｐｏ処理に対して非応答性であることが証明されたマウスでは、進行性腫瘍増殖速度への効果は観察されなかった；従って、Ｅｐｏは、「すべてまたは全くなし」因子として作用するようである。
【００７１】
ヒト癌に関連した貧血は、少なくとも一部は、Ｅｐｏの相対的欠損が原因であり、外因性Ｅｐｏは貧血を治療することができる。ベースラインの内因性血清Ｅｐｏレベルと、ｒＨｕＥｐｏ処理に対する応答の間に相関がある。非応答者と比較して、Ｅｐｏに対する応答者は、通常低いＥｐｏレベル（２００U/l未満）を有する。すなわち２００U/lを超える血清Ｅｐｏレベルは、おそらくＥｐｏ療法に対する耐性の予測因子である。同様に、マウスでのＥｐｏに対する治療応答は、血中Ｈｂ濃度の上昇を伴う（図９）。Ｅｐｏ応答性マウスでは、Ｈｂレベルの上昇とともに腫瘍退行が観察され、これに対してＥｐｏ処理に非応答性のマウスでは、Ｈｂのレベルは変化しない。
【００７２】
骨髄腫は、基礎疾患とその関連する貧血との相互作用の可能性を調べるのに使用できる連続的に入手できる測定可能な腫瘍マーカーを含有するため、研究によく適したモデルである。Ｅｐｏ処理に応答する我々の患者では、血清骨髄腫パラプロテインの存在にもかかわらず、貧血の改善は、疾患のより長く安定な経過と一致し、優勢的に安定な腫瘍量を示している。同様に、リグレッサーマウスの血清中で我々は、目に見える腫瘍の消失にもかかわらず骨髄腫細胞により分泌される免疫グロブリンλ軽鎖に対応する２７kDタンパク質バンドを観察した。リグレッサーマウスで、異なる臓器（脾臓を含む）への骨髄腫細胞の隔離が、移植試験で証明されている。同系の正常なまたは放射線照射した受容体への脾臓細胞の移植は、あるマウスで骨髄腫を出現させた；すべての脾臓細胞受容体の血清は、２７kDタンパク質バンドを含有し、こうしてパラプロテインを分泌し続ける骨髄腫リグレッサーマウスでの「休眠」腫瘍細胞の存在を示している。従って、Ｅｐｏ処理後の疾患の経過は、増殖停止下にある（休眠状態）。実験モデルでの我々の観察結果は、Ｅｐｏ処理患者に関する同様の観察結果（表２を参照）と一致する。骨髄形質細胞と特に骨髄腫タンパク質（腫瘍の量を反映する）は、Ｅｐｏ処理患者では消失しないが、疾患の経過は、安定化、「凍結」または潜伏および無症候性になっているようである。
【００７３】
本発明のＥｐｏ開始腫瘍退行に関与する生物学的機序に関する研究は、抗骨髄腫免疫反応性が、腫瘍退行と腫瘍休眠の維持に関与していることを示唆している。一連の実験は、抗腫瘍免疫反応性が、腫瘍のＥｐｏ誘導性退行に関連していることを証明した。同じ腫瘍細胞（ＭＯＰＣ−３１５）で再接種したリグレッサーマウスは、この２回目の接種の増殖に抵抗した。すなわちこれらのリグレッサーでは、腫瘍抗原に対する記憶が確立された。この免疫開始抵抗の特異性もまた証明された（図１０）。
【００７４】
Ｅｐｏ開始腫瘍退行におけるＴ細胞の関与は、腫瘍細胞接種後のＥｐｏ処理に対する正常、ｓｃｉｄまたはヌードマウス（免疫障害）の応答を比較することにより証明された。Ｅｐｏ処理の効力は、免疫障害マウスでは顕著に低下していた。ｓｃｉｄとヌードマウスの両方では、Ｅｐｏ処理に対する応答がなかった（図１１、１２）。Ｅｐｏ処理した正常対照マウスで４０％の腫瘍退行があったのに比較して、すべてのＥｐｏ処理マウスは、腫瘍を発症した。
【００７５】
これらの実験は、上記Ｔ細胞枯渇マウスでは効果が観察されなかったため、Ｅｐｏは直接の細胞障害性または細胞静止作用を有するという可能性を排除している。腫瘍エフェクター細胞の表現型に関するさらなる試験は、ＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇により、Ｅｐｏの治療作用がなくなったことを示した。インビボでの腫瘍退行は、ＣＤ８+エフェクター細胞により仲介され、腫瘍担持マウスのＥｐｏ処理は、これらのエフェクター細胞の生成を促進するようであり、こうして有効な抗腫瘍応答の発生が増強される。予備試験において我々は、Ｅｐｏ処理リグレッサーの骨髄細胞中に造血前駆細胞数の増加と、造血前駆細胞数の増加を反映するかも知れない顕著な脾臓肥大を観察した。我々は、Ｅｐｏはインビボで、赤血球系統に限定されず、広範な原始的造血前駆細胞（ほとんど原始的なＬｉｎ-、Ｓｃａ+、Ｋｉｔ+、およびより特殊化したＬｉｎ-、Ｓｃａ-骨髄前駆細胞）を誘導すると考えた。すなわちＥｐｏは、その抗貧血活性以外に、特異的な抗腫瘍免疫応答の発生を介する抗癌免疫治療薬とみなすことができる。
【００７６】
動物データならびに予備的臨床的観察結果の確認は、ｒＨｕＥｐｏが、少なくとも一部の癌患者の生物学的および臨床的経路を改善することを示唆する。
【００７７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本明細書の例２に記載の実験IIのプログレッサー（progressor）マウスとリグレッサー（regressor）マウスにおける、腫瘍増殖速度を示す。マウス＃１、２、５、９、１０は、ｒＨｕＥｐｏ（１回の注射で３０Ｕ）で処理した。マウス＃１１、１２、１７は、対照。日数：ｒＨｕＥｐｏ処理後。
【図２】  本明細書の例２に記載の実験IIIのプログレッサーマウスとリグレッサーマウスにおける、腫瘍増殖速度を示す。マウス＃１、２、３、９、１４、１８は、ｒＨｕＥｐｏ（３０Ｕ）で処理した。マウス＃２３、２７は、対照。
【図３】  本明細書の例２に記載の実験IVのプログレッサーマウスとリグレッサーマウスにおける、腫瘍増殖速度を示す。マウス＃４、７、８、９、１０は、ｒＨｕＥｐｏ（３０Ｕ）処理後のリグレッサー。マウス＃１、２、５は、ｒＨｕＥｐｏ（３０Ｕ）処理したマウスの中のプログレッサー。
【図４】  ｒＨｕＥｐｏ（３０Ｕ）処理後のリグレッサー（Ａ）マウスとプログレッサー（Ｂ）マウスの外観を示す。
【図５】  リグレッサーマウスとプログレッサーマウスの両方で、血清中に明瞭な２７kDのパラプロテインバンドが検出されることを示す。０．９％ＮａＣｌで１：１希釈した２μlのマウス血清を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分子量マーカー（kD）を右に示す。レーン１〜２  −  リグレッサーマウス；レーン３〜４  −  処理したプログレッサーマウス（３０Ｕと２０Ｕ）；レーン５〜６  −  未処理プログレッサーマウス；レーン７  −  腫瘍を注射したが目に見える腫瘍を示さないマウス；レーン８  −  腫瘍を注射していない３０Ｕ  ＥＰＯで処理したマウス；レーン９  −  正常対照。
【図６】  腫瘍接種後の２週間、および２、４、７ヶ月でのリグレッサーマウスの血清中の２７kDバンドを示す。レーン１  −  正常対照；レーン２〜３  −  退行後２週間；レーン４〜５  −  腫瘍細胞接種後２ヶ月；レーン６〜７  −  ４ヶ月；レーン８〜９  −  ７ヶ月。
【図７】  リグレッサーマウスの脾臓中の「休眠」腫瘍細胞の証拠である。その血清中に２７kDバンドが存在するため、リグレッサーマウスから取った７つの個々の脾臓から脾臓細胞懸濁物を調製した。半分の脾臓細胞懸濁物を、正常な同系のＢａｌｂ／ｃマウスに注射（静脈内）し、他の半分は、放射線照射したＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。レーン１〜２  −  放射線照射した脾臓細胞受容体と、同じ個体の脾臓の正常な受容体からの血清。レーン３〜４、レーン５〜６、およびレーン７〜８  −  放射線照射または正常受容体への脾臓移植の同様の提供。レーン９  −  正常な非注射Ｂａｌｂ／ｃマウスの血清。
【図８】  免疫グロブリンλ軽鎖に対応する２７kDバンドを示すウェスタンブロット分析である：レーン１〜２  −  移植の１０日後と３週間後に採血したリグレッサーマウスの脾臓を移植したマウスの血清；レーン３〜４  −  ２匹のリグレッサーＥｐｏ処理マウスの血清；レーン５〜６  −  対照非注射の健常マウスの血清；レーン７  −  対照。ＭＯＰＣ−３１５細胞から分泌されたＩｇＡを、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にゲルをλ免疫グロブリン軽鎖抗体と免疫ブロットした。
【図９】  正常Ｂａｌｂ／ｃマウス；ｒＨｕＥｐｏ（Ｅ）を注射した正常マウス；Ｅｐｏ希釈剤のみを注射したプログレッサーマウスまたはリグレッサーマウス（Ｅｐｏ処理無し）；ｒＨｕＥｐｏ処理に応答しないプログレッサーマウスとＥｐｏ処理後のリグレッサーマウスの、ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを示す。
【図１０】  ＭＯＰＣ−３１５とＭＰＣ−１１骨髄腫腫瘍（左）を有する対照マウス、および右の腹の表面に骨髄腫ＭＰＣ−１１のみを有するリグレッサーマウスを示す。
【図１１】  腫瘍接種（ＭＯＰＣ−３１５）後のＥｐｏ処理に対する、ｓｃｉｄマウスでの応答の欠如を示す。１００％のマウスが２５〜２７日以内に死んだが、対照群では５０％の腫瘍退行があった。
【図１２】  対照マウスと比較したＭＯＰＣ−３１５骨髄腫細胞を接種したヌードマウスのＥｐｏ処理の治療効果の破壊を示す（対照では、４０％の腫瘍退行を示したが、Ｅｐｏ処理ヌードマウスでは１００％の腫瘍の進行が見られた）。
【図１３】  腫瘍退行に関与するＴ−エフェクター細胞の表現型を示す。ＣＤ８+Ｔ細胞を枯渇させると、ＭＯＰＣ−３１５骨髄腫細胞を接種したマウスの応答が破壊された（１００％腫瘍進行に対して、対照群では４０％の腫瘍退行）。
【図１４】  ３ＬＬ肺癌担持マウス（四角）の生存に及ぼすＥｐｏ投与の効果を、未処理対照マウス（三角）と比較して示す。
【図１５】  大腸腺癌担持マウスの生存に及ぼす腫瘍細胞接種の１日後に開始したＥｐｏ処理の効果を、腫瘍細胞接種の６日後に開始したＥｐｏ処理または対照群と比較して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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