(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスに感染した哺乳類個体由来の生物学的試料から回収したレトロウイルス中に包まれた逆転写酵素の活性を検査することによって、レトロウイルスに感染した哺乳類個体における抗ウイルス薬感受性を検査する方法であって、
ａ）  ５，５′‐ジチオビス‐（２‐ニトロ安息香酸）を含むシステイン改質剤から選択される酵素不活性化剤を、試料に加えて、エンベロープビリオン中に存在するもの以外の逆転写酵素活性を不活性化し、
ｂ）  分離ゲルを使用することによって、酵素活性遮断抗体、内在性酵素活性阻害薬、抗ウイルス薬、および酵素不活性化剤を除去することによって、レトロウイルスを精製して濃縮し、
ｃ）  ウイルス粒子をリーシスしてレトロウイルス逆転写酵素を放出させ、
ｄ）  ｂ）およびｃ）から生成する濃縮して精製したレトロウイルス逆転写酵素を回収して、ポリメラーゼ活性酵素分析法を用いることによって、回収した逆転写酵素から該個体の抗ウイルス薬感受性プロフィールを決定する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
哺乳類個体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が血液試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血液試料が血漿試料である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、かつ、レトロウイルス逆転写酵素が、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
個体の抗ウイルス薬感受性プロフィールを用いて個体の抗ウイルス薬投与治療を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のレトロウイルスに感染した哺乳類個体における抗ウイルス薬感受性を検査するための、商業用パッケージであって、
５，５′‐ジチオビス‐（２‐ニトロ安息香酸）を含むシステイン改質剤から選択される酵素不活性化剤であって、ポリメラーゼ活性を不活性化するための酵素不活性化剤と、
固体支持体に共有結合したポリ（ｒＡ）、ポリメラーゼ反応混合物、改変ヌクレオシド−トリフォスフェート、改変ヌクレオシドに反応する標識抗体、標識抗体を検出する物質を含む、ポリメラーゼ酵素活性分析キットと、
レトロウイルス逆転写酵素を阻害することが知られた、少なくとも１種類の抗ウイルス薬と
を含んでなる、商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス薬剤感受性検査法に関し、詳しくは、薬剤投与したレトロウイルスのようなエンベロープウイルスに感染した、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に感染した、哺乳類個体由来の生物学的試料から回収したエンベロープウイルスに包まれた酵素を検査することによって、前記個体の表現型薬剤感受性を検査する方法に関する。
【０００２】
背景技術
ＨＩＶ薬剤感受性は、新規の治療法に対するウイルス学的応答と関連している。現在では、標準化した薬剤耐性試験が利用でき、臨床試験からのデータは、薬剤耐性試験の使用をウイルス学的成果の向上と関連させることができることを示唆している。しかしながら、薬剤耐性は、挙動、解釈および臨床応用に関して複雑である。
【０００３】
表現型検査は、ＨＩＶ単離物が薬剤の存在下で増殖する能力を測定し、様々な薬剤濃度でのウイルス複製の阻害の程度を評価する分析法を用いて行われる。結果を用いて、単離物に対する薬剤の５０％または９０％阻害濃度を計算する。この古典的な表現型分析法に関する潜在的な問題点としては、ウイルス単離の際のウイルス個体数における遺伝学的ズレの影響がある。最悪の場合には、単離されるウイルスクローンは、イン・ビトロ条件中では増殖に極めて適しているが、患者においては余り多量には存在しないものである。
【０００４】
表現型薬剤感受性の測定は、組換えＤＮＡ技術に基づく自動分析法によって行うことができる。これらの方法は、ＨＩＶプロテアーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）をコードする血漿ＲＮＡの増幅、および実験室構成体（カセットウイルス）由来の他の遺伝子を有する組換えウイルスの発生を伴う[1]。遺伝子型分析法では、抗レトロウイルス薬によってターゲッティングされた遺伝子におけるある種の突然変異の発生が測定される。表現型耐性はウイルス−薬剤感受性を測定するのに対して、遺伝子型は表現型耐性を付与する突然変異を検出する。１ｍｌ当たり５００〜１０００のＲＮＡコピーを含む血漿由来のＨＩＶ−１配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は、これらの分析法および組換えウイルス表現型分析法における初期段階である。評価した突然変異と実験室機能とによっては、遺伝子型分析法はウイルスの混合物において突然変異体を１０〜５０％のレベルで識別することができる。シークエンシングから得られたデータが複雑であるため、結果の解釈が困難になっている。特定の突然変異パターンによって付与される表現型耐性のレベルに関しては、様々な解釈を行うことができる。新しいデータが得られると、不適切なまたは不正確でさえある解釈がなされる危険性がある[2]。これまで用いられてきた総ての抗レトロウイルス薬についての反応機構は、ウイルスプロテアーゼまたはＲＴの酵素反応と干渉している。用いる酵素分析法とウイルス単離技術の能力によっては、薬剤感受性検査は、理論的には一次ウイルス単離であるウイルス培養増殖物からの上清について、または患者から直接回収したウイルス製剤について行うことができる。
【０００５】
一次ウイルス単離からのＲＴについての薬剤感受性検査は、伝統的なウイルスウイルス複製阻害試験と比較して２つの利点がある。ウイルス増殖の時間が減少し、更に重要なことには、ウイルス個体数に対する選択性が少なくなる。理想的状況は、患者の血液中を循環しているウイルスから直接抽出された酵素を最終的に特性決定することである。このような方法の利点は、試料が血液試料を採取した時点の患者に含まれているウイルス個体数を反映することである。これはこれまでは実際には可能でなかったが、この概念はＰＣＲに基づくＡｍｐ ＲＴ分析法を用いる耐性試験によって検討されてきた[3]。
【０００６】
ＨＩＶ−１ ＲＴ並びに他の逆転写酵素は、３種類の異なる酵素反応、すなわちＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡの分解（ＲＮアーゼＨ）を行う。ｐｏｌ遺伝子によってコードされたＨＩＶ  ＲＴは、ｐ６６とｐ５ｌサブユニットからなるヘテロ二量体である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合とＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合は、ｐ６６サブユニットに局在する同一活性部位によって行われる。ｐ５１は、ＲＮアーゼＨドメインに相当するｐ６６のＣ末端断片の除去によって産生される[4]。臨床使用について現在認可されている総てのＲＴ阻害薬は、酵素のポリメラーゼ活性を阻害する。これらの薬剤の反応機構は、主としてＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合反応に対するこれらの薬剤の作用によって定義されている。ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合反応に対する影響については、比較的余り研究されていない。
【０００７】
通常のＲＴ活性分析法は、人工的鋳型プライマー構築物と、ヌクレオチド基質として標識したデオキシヌクレオチド三リン酸とを用いることによって行われる。鋳型／プライマー対のポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）は、ＨＩＶの測定並びに他のレトロウイルスＲＴについて最も効率的且つ最も多く用いられる組合せである。薬剤感受性検査に関するときのこの種類の分析法の欠点は、非ヌクレオシド類似体またはｒＡと塩基対を組むことができる類似体しか試験できないことである。他のヌクレオチド塩基の類似体は、可変ポリマー鋳型に基づく分析法が必要である。
【０００８】
これまでに認可されている総ての抗レトロウイルス薬は、ウイルスプロテアーゼまたはＲＴのいずれの酵素反応とも干渉する。更に、パイプライン中にはレトロウイルスインテグラーゼの機能に影響を与える候補薬剤もある。
【０００９】
ＲＴ阻害薬は、ヌクレオシド類似体または非ヌクレオシド類似体である。非ヌクレオシド阻害薬は、活性部位に接近しているが接触はしていないＲＴ酵素の疎水性ポケットに結合している。ＨＩＶ−１複製は、ポリメラーゼ結合部位に関して触媒的なアスパルテート残基を置換することによってアロステリックに阻害される。耐性は、通常は非ヌクレオシドをモノセラピー（monotherapy）としてまたは不完全ウイルス抑制の存在下で投与するときに速やかに現れる。現在のところ、３種類の非ヌクレオシド阻害薬であるネビラピン（Nevirapine）、エファビレンツ（Efavirenz）、およびジラビルジン（Delavirdine）のみがＦＤＡによって認可されている。
【００１０】
現在用いられているヌクレオシド阻害薬は、それらが３′−ヒドロキシル基を欠いているので、ＤＮＡ鎖の伸長を終結させる。ヌクレオシド阻害薬を用いる長期間の治療により、通常は耐性ウイルスを発生させる。この過程は、ウイルスｐｏｌ遺伝子に突然変異が漸進的に出現し、それぞれが画定されたアミノ酸を置換することと関連している[5]。酵素レベルでのこれらの置換の影響は複雑であり、原始的なＤＮＡエディティング機能の増加が挙げられる。この反応はヌクレオチド依存性であり、ジヌクレオシドポリホスフェートと伸長性のＤＮＡの３′末端を生成する[6]。
【００１１】
ＨＩＶ治療は、現在は多剤療法に基づいている。この投薬計画は、利用可能な３種類総ての薬剤であるヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害薬の組合せに基づいている。この方策は、突然変異体ウイルスが生き残る確率を最小限にすることである。ウイルス学的失敗に直面すると、現行の治療指針では、全く新たな群の薬剤に切り替えることを推奨している。多くのＨＩＶ陽性患者は、選択したいと思う３種類以上の未試験薬剤を持っていないので、このことは苛立たしいことである。更に、実際には未だ有効な薬剤を除去することは、不経済な決定であることもある。薬剤耐性検査を改良することにより、所定の組合せでの（１または複数の）無効薬剤を除去することを可能とすることができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、患者の血漿試料から直接回収される酵素について表現型薬剤耐性試験を行うための手順を提供する。これは、細胞の相当物を本質的に含まないウイルス酵素を回収した後、感受性酵素分析法を用いてそれらを測定するための手法の組合せに基づいている。報告されている酵素単離技術をエンベロープウイルスに包まれている任意の酵素に用いることができるが、本明細書においては、その使用は、薬剤耐性検査の目的で血漿由来のＲＴを利用することによってのみ検討される。
【００１３】
従って、本発明の一つの態様は、エンベロープウイルスに感染した哺乳類個体由来の生物学的試料から回収したエンベロープウイルス中に包まれた酵素を検査することによって、エンベロープウイルスに感染した哺乳類個体における表現型薬剤感受性を検査する方法であって、
ａ）  酵素不活性化剤を試料に加えて、エンベロープビリオン中に存在するもの以外のポリメラーゼ活性を不活性化し、
ｂ）  酵素不活性化剤、酵素活性遮断抗体、内在性酵素活性阻害薬、および抗ウイルス薬を除去し、
ｃ）  ウイルス粒子をリーシスして酵素を放出させ、
ｄ）  ｃ）から生成する濃縮して精製したウイルス酵素を回収して、感受性酵素分析法を用いることによって、回収した酵素から該個体の薬剤感受性プロフィールを決定する
ことを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明の一つの態様では、哺乳類個体はヒトである。
好ましい態様では、目下のところ、生物学的試料は、血漿試料のような血液試料である。
【００１５】
もう一つの態様では、エンベロープウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルスである。前記の場合、酵素は、好ましくは、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）である。
【００１６】
本発明の方法を用いて得た個体の薬剤感受性プロフィールは、個体の薬剤投与治療の選択に用いることができる。実際には、エンベロープウイルスに感染した哺乳類個体を、幾つかの時点で薬剤感受性プロフィールを検査し、前記個体における感染およびウイルス薬剤治療の展開を観察する。
【００１７】
本発明はまた、本発明によるエンベロープウイルスに感染した哺乳類個体における表現型薬剤感受性を検査するための、書面またはデータ記録媒体の使用説明書と、ポリメラーゼ活性を不活性化するための酵素不活性化剤と、感受性酵素分析と、少なくとも１種類の対照薬とを含んでなる商業用パッケージにも関する。
【００１８】
本発明を、下記の本発明の態様および図面の非制限的記載によって説明する。
引用文献の教示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【発明の具体的説明】
【００１９】
用いる手順は、４つの異なる段階からなる。Ｉ） エンベロープビリオン中に存在するウイルス酵素に影響を与えるなく、試料中に存在する宿主ポリメラーゼ活性を不活性化すること。II） 酵素不活性化剤、酵素活性遮断抗体、内在性酵素活性阻害薬および抗ウイルス薬を除去すること。III） 濃縮して精製したウイルス酵素を回収すること。IV） 回収した酵素の薬剤感受性プロフィールを決定すること。
【００２０】
（段階Ｉ−III） 可溶性の細胞酵素の破壊後にミニカラムからウイルスＲＴを単離することに基づく、ＲＴ遮断抗体を含む材料からのウイルスＲＴの単離プロトコール
１）  用いる４．５ｍｌプラスチックチューブを標識する。Nalgeneボックスに入れる。試料（例えば、ＨＩＶ感染個体からのＥＤＴＡ血漿）１ｍｌをそれぞれの標識したチューブに加える。５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を緩衝水に溶解した６６ｍＭ溶液１００μｌを加え、試料を室温で１時間攪拌してインキュベーションする。
【００２１】
この手順中に、ビリオン内に含まれる酵素を損なわないままにしながら遊離の血漿酵素の活性を破壊する。次に、ビリオンを、幾つかの分離手順によって、５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、酵素活性遮断抗体およびウイルスＲＴの定量を妨害することがある他の物質から精製することができる。下記のプロトコールは、Fractogel EMD TMAE Hicap ゲル（商品名）の使用に基づいている。
【００２２】
２）  分離ゲルを注意深く懸濁し、１５００μｌのゲルスラリーをそれぞれの試料前処理チューブに移す。
【００２３】
３）  チューブをオービタルシェーカー（orbital shaker）上で水平に横倒しにして、試料をゲルスラリーと共に室温で９０分間インキュベーションする。
【００２４】
４）  所望量の１０ｍｌプラスチックミニカラムを標識して、分析を行う試料を同定する。カラム洗浄装置、すなわちSupelco Visiprep固相抽出真空マニホールドにカラムを設置する。結合チューブの内容物をそれらの相当するカラムに移す。移す前に、チューブを軽く攪拌して、ゲルを均等に分布させる。
【００２５】
５）  総てのカラムを充填したならば、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。真空を止め、それぞれのカラムに９ｍｌ緩衝液Ａを満たすことによって洗浄を開始する。総てのカラムが満たされたならば、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。
【００２６】
６）  工程５）を更に３回繰り返し、全部で４つの洗浄液を得る。それぞれの洗浄の後に、ゲルを吸引乾燥する。４回目の洗浄の後、ゲルを吸引乾燥した後、真空を止め、工程７）に進む。
【００２７】
洗浄段階では、未結合のＲＴ遮断抗体および５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を系から除去する。
【００２８】
７）  総ての乾燥ゲルにコンディショニング緩衝液（Ｂ）９ｍｌを加える。１分後、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。
【００２９】
８）  工程７）を繰り返す。真空を止める前に、総てのコンディショニング緩衝液（Ｂ）が総てのゲルから除去されたことをチェックする。
【００３０】
９）  カラム洗浄装置の上部を持ち上げる。標識したチューブを有するチューブホルダーを、清浄な容器に設置する。装置の上部を再装備する。それぞれのカラムからの小チュービングがそれらの相当するチューブに下ることを確認する。
【００３１】
１０）  ６００μｌのリーシス緩衝液（Ｃ）を、それぞれのカラムに加える。緩衝液をカラム中に５分間静止させる。次に、徐々に真空にして、ゲルを吸引乾燥する。これにより、それぞれのチューブに、結合したゲルからウイルス溶解物約６００μｌを生じる。
【００３２】
工程１０）からの溶解物における回収されたＲＴ活性は、本質的にＲＴ遮断抗体、薬剤および細胞ポリメラーゼ活性を持たず、感受性ＲＴ活性分析法、すなわちCavidi HSキットLenti RTであって、Ekstrand et al [7]によって報告された方法に基づくもので定量することができる。このプロトコールに準じて得られる２５μｌの溶解物は、試料中のＲＴ活性の測定に十分である。残りの５７５μｌの試料は、−７０℃以下で凍結して、後で薬剤感受性試験に使用するものとする。
【００３３】
注：  システイン改質剤に感受性でないＲＴ酵素、例えば、野生型ＨＩＶ １ ＲＴは、場合によっては５ｍＭまでの５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の存在下で分析することができる。他方、ＭＵＬＶ ＲＴおよびある種の治療耐性ＨＩＶ １株（例えば、突然変異Ｙ１ ８１Ｃを含む）由来のＲＴのような感受性酵素は、スルフヒドリル還元剤、例えば、システインまたはシステアミンをリーシス緩衝液に加える必要がある。
【００３４】
（段階ＩＶ）  溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール
Cavidi Tech（ウプサラ，スウェーデン）から発売されている比色によるＲＴ分析法(Cavidi HSキットLenti RT（商品名）)を用いて、検討を行ったウイルス製剤のRT活性のレベルを測定した。要約すれば、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに共有結合したポリ（ｒＡ）は、３３℃の逆転写段階中に５−ブロモ−デオキシウリジン５′−三リン酸（ＢｒｄＵＴＴ）の組込みの鋳型として働いた。ＤＮＡに組込まれたブロモデオキシウリジン一リン酸（ＢｒｄＵＭＰ）の量は、アルカリホスファターゼ（Ａｐ）に接合した抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体を用いて検出される。Ａｐ基質である４−メチルウンベリフェリルホスフェートを最後に用いて、蛍光検出を行う。ＩＣ５０測定に用いた単離ＲＴの量は、ウェル当たり５ｆｇ（４．３ｘ１０−２０モル）対照ＨＩＶ−１ ＲＴに相当する活性に対して標準化したヌクレオシド類似体についてのものであったが、非ヌクレオシド類似体については、１．７ｆｇ（１．５ｘ１０−２０モル）のＲＴを用いた。溶解物を、「ｍｏｃｋ溶解物」、すなわちウシ胎児血清のｍｏｃｋから得た溶解物で希釈した。
【００３５】
ＲＴ阻害研究は、２つの異なる改質型のHS Lenti RT分析法で行った。
非ヌクレオシド類似体をＲＴ反応混合物中で５倍段階で連続希釈し、２５μｌの分量をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに移して、１２５μｌのＲＴ反応混合物と混合し、２５μｌの溶解物希釈液を加えることによって、酵素反応を開始した。最終ヌクレオチド基質（ＢｒｄＵＴＰ）濃度は１６μＭであり、プライマー（ｏｄＴ２２）量は１２ｎｇ／ウェルであった。ｄＴ類似体を連鎖停止反応混合物中で５倍段階で連続希釈し、２５μｌの分量をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに移して、１２５μｌのＲＴ連鎖停止反応混合物と混合し、２５μｌの溶解物希釈液を加えることによって、酵素反応を開始した。最終ヌクレオチド基質（ＢｒｄＵＴＰ）濃度は１．５μＭであり、プライマー（ｏｄＴ２２）量は１２ｎｇ／ウェルであった。ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドＲＴ阻害薬のいずれについても、ＲＴ反応を一晩進行させた（１６〜２４時間、３３℃）。その後、反応を、プレートの洗浄によって停止した。ＩＣ５０値は、検討を行ったＲＴ活性を５０％阻害する薬剤の濃度と定義した。
【００３６】
材料
分離ゲル：  例えば、３１４ｍＭの（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）ｐＨ５．１，４１３ｍＭのヨウ化カリウムおよびヘパリン０．５ｍｇ／ｍｌにFractogel（商品名） EMD TMAEまたはFractogel（商品名） EMD TMAE Hicapを加えたもの。
ミニカラム、例えば、Biorad Poly-Prep（商品名）（７３１１５５３）
ミニカラム洗浄装置、すなわちSupelco Visiprep固相抽出真空マニホールド。
プラスチックチューブ、例えば、Ｎｕｎｃ ４．５ｍｌ低温チューブ。
固定prAを有するマイクロタイタープレート、すなわちNalge Nunc NucleoLinck（商品名）。
システイン改質剤、例えば、０．８７Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．３）で緩衝した６６ｍＭの５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）水溶液。
穏和なスルフヒドリル還元剤、例えば、３３ｍＭのシステアミン水溶液。
【００３７】
抗ウイルス薬：
３′−アジド−２′，３′−デオキシチミジン三リン酸（ＡＺＴ−ＴＰ）および（２′，３′−ジデヒドロ−３′−デオキシチミジン三リン酸（ｄ４Ｔ−ＴＰ）は、Moravek Biochemicals（カリフォルニア）から購入した。Nevirapine（１１−シクロプロピル−５，１１−ジヒドロメチル−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２′，３′−f］［１，４］ジアゼピン−６−オン）（ＮＶＰ）、Delaviridine、１−（５−メタンスルホンアミド−１Ｈ−インドール−２−イル−カルボニル）−４−［３−（１−メチルエチル−アミノ）ピリジニル］ピペラジンモノメタンスルホネート（ＤＬＶ）、およびEfavirenz、（−）６−クロロ−４−シクロプロピルエチニル−４−トリフルオロメチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンズオキサジン−２−オン（ＥＦＶ）は、Apoteksbolaget, ウプサラ, スウェーデンから購入した。
【００３８】
ＨＩＶ感染個体由来の血漿試料：
未治療患者または通常の組合せ治療で治療した患者由来の血漿試料を、遡及的に選択した。コード試料をそれぞれＮＮＲＴＩおよびＴ類似体に耐性を有する患者である２群の異なるパネルとして凍結送達した。それぞれの試料のＨＩＶ−１ ＲＮＡの量は標準ＨＩＶ １ ＲＮＡ ＰＣＲ（Cobas, Roche Diagnostica）によって測定し、存在するウイルス遺伝子型はTRUGENE（商標） HIV-1 Genotypingキット（Visible Genetics）で分析した。
【００３９】
組換えＲＴ酵素：
ＲＴのＮＮＲＴＩ耐性突然変異体の形態（L1001，K103N，L100I/K103N，Y181C）を生成した。突然変異の鋳型としては、ｐＥＴＲＴ発現ベクターであるＢＨ１０単離物から構築したものを用いた。市販の位置指定突然変異誘発キットQuikChange（Stratagene）を用いて、突然変異を行った。突然変異は、ＤＮＡ配列分析によって確かめた。ＲＴの突然変異した形態および本来の形態を、上記の方法で単離した[8]。
【００４０】
ＡＺＴ特異的突然変異を有する組換えＲＴは、発現ベクターｐＫＫ２３３−２（Amersham Biotech）にクローニングした野生型ＨＸＢ２−Ｄ ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ制限酵素断片のＲＴコード領域に突然変異を導入することによって生成した。突然変異は位置指定突然変異誘発キットQuikChange（Stratagene）を用いて生成した。クローニングした発現ベクター突然変異体をE. coli XL1-Blue株に形質転換し、遺伝子型をＤＮＡ配列分析によって確かめた。
【００４１】
使用緩衝液：
Ａ）  洗浄緩衝液：  ２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．４，５００ｍＭ酢酸カリウム（ＫＡｃ）。
Ｂ）  コンディショニング緩衝液：  ＲＴ分析適合性緩衝液、例えば、５０ｍＭの（Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）(Hepes) ｐＨ７．６，ＫＡｃ  ２５ｍＭ，塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）２０ｍＭ，エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）０．２ｍＭ，スペンニン２ｍＭ、および熱不活性化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．５ｍｇ／ｍｌ。
Ｃ）  リーシス緩衝液：  洗剤、例えば、１．２５％ポリオキシエチレン４ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）、１３ｎｇ／ｍｌのｏｄＴ２２およびコンディショニング緩衝液（Ｂ）と同一成分を含むＲＴ分析適合性緩衝液。ＳＨ酸化修飾に感受性のＲＴでウイルスを加工するときには、場合によってはスルフヒドリル還元剤、すなわち０．２ｍＭシステアミンを加える。
Ｄ）  ＲＴ反応混合物、例えば、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．６、１９μＭのＢｒｄＵＴＰ、８０ｎｇ／ｍｌのｏｄＴ２２、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｇ／ｌのデキストラン硫酸、２ｍＭのスペンニン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ０．５％(v/v)、ＥＧＴＡ０．２ｍＭ、およびＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ。
Ｅ）  連鎖停止反応混合物：  Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ，ｐＨ７．０、ＢｒｄＵＴＰ１．７５μＭ，ｏｄＴ２２ ８０ｎｇ／ｍｌ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＡＴＰ７ｍＭ、デキストラン硫酸０．０５ｇ／ｌ、スペルミン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ０．５％(v/v)、ＥＧＴＡ  ０．２ｍＭおよびＢＳＡ ０．５ｍｇ／ｍｌ。
【実施例】
【００４２】
例１
回収したＨＩＶ−１ ＲＴとＲＮＡ ＰＣＲで測定したウイルスＲＮＡとの相関
ＨＩＶ感染個体由来のＥＤＴＡ血漿の１ｍｌ試料を、「可溶性の細胞酵素を破壊後にミニカラムからウイルスＲＴを単離することに基づく、ＲＴ遮断抗体を含む材料からのウイルスＲＴの単離プロトコール」に準じて処理し、それぞれの試料から回収したＲＴ活性の量を、Cavidi（商標）HSキットLenti RTを用いる通夜ＲＴ分析法で測定した。得られたＲＴ活性を、内部標準曲線に準じてｆｇ ＨＩＶ １ ＲＴ／ｍｌ血漿に再計算した。それぞれの試料のＨＩＶ １ ＲＮＡの量を、標準ＨＩＶ １ ＲＮＡ ＰＣＲ (Roche Amplicor)によって測定した。プロットは、ＰＣＲ値＞５００コピー／ｍｌの試料に限定する。回収した血漿ＲＴの量とＰＣＲで測定したＨＩＶ ＲＮＡの量の間には、強い相関が見られた（ｒ＝０．９３，ｎ＝３３，ｐ＜＜０．００１）。図１参照。
【００４３】
例から、ＨＩＶ ＲＮＡコピー数が５００００／ｍｌ血漿の個体からの１ｍｌ血漿の処理により、約２００ｆｇ ＲＴ活性が回収されることを導き出すことができる。試験当たり１．７ｆｇ ＲＴを用いると、この量は１１８回の試験に相当し、単離したＲＴの薬剤感受性プロフィールの決定に用いることができる。
【００４４】
例２
薬剤感受性試験に用いるＲＴの量の影響
指示した組換えＨＩＶ １に対するＮＮＲＴＩ、ＡＺＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔ−ＴＰの影響を、指示したＲＴ濃度を用いる「溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール」に準じて測定した。図２は、薬剤感受性分析法に用いるＲＴの量とＩＣ５０実測値との関係を示している。EfavirenzのようなＮＮＲＴＩについてのＩＣ５０値は、検討した範囲内ではＲＴ量の変動によって全く影響されなかった。検討を行ったＮＲＴＩの中では、ＡＺＴ−ＴＰは分析法に含まれるＲＴの量に関して最も大きな変動を示す。この変動は野生型ＲＴに対して最大であり、ＲＴ量を２から１６２ｆｇ／ウェル（図２）に増加するときに、ＩＣ５０は０．１３から０．２２μＭまで増加した。
【００４５】
血漿試料で利用可能なＲＴ活性の量によって、この試験の限界が設定される。試験した薬剤について再現性のあるＩＣ５０値を得るには、バックグラウンドの少なくとも５倍のシグナルが必要である。増加ＲＴ量を試験に加えるときにＩＣ５０値の変動性が低いため、それぞれの分析法で用いるＲＴの量を予め標準化することなく薬剤感受性を測定することができる。
【００４６】
例３
画定した突然変異を有する組換えＨＩＶ １ ＲＴに対する非ヌクレオシド阻害薬の影響の比較
指示した組換えＨＩＶ １ ＲＴＴに対する３種類の非ヌクレオシド阻害薬の影響を、「溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール」に準じて測定した。それぞれのＲＴの量を、本発明者らの対照ＲＴの１．７ｆｇ／ウェルの活性に相当するように標準化した。ＲＴ反応の時間は１９時間であり、得られた活性を、阻害薬の非存在下でインキュベーションした同一ＲＴを用いる活性の％に再計算した。
【００４７】
表現型データは、文献から得た（インターナショナル・アンティバイラル・ニューズ、および http://stanford.edu/hiv database）(表１)。
【００４８】
ＲＴ阻害分析法からのＩＣ５０値と文献による表現型データとの間には、一般に強い相関があった。常に、ＲＴを高度または中位耐性ウイルスから識別することが可能であった（表１）。
【００４９】
例４
画定した突然変異体を有する組換えＨＩＶ １ ＲＴに対するｄＴ類似体の影響の比較
ＡＺＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔの指示した組換えＨＩＶ Ｉ ＲＴに対する影響を、「溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール」に準じて測定した。それぞれのＲＴの量を、本発明者らの対照ＲＴの５ｆｇ／ウェルの活性に相当するように標準化した。ＲＴ反応の時間は１９時間であり、得られた活性を、阻害薬の非存在下でインキュベーションした同一ＲＴを用いる活性の％に再計算した。
【００５０】
表現型データは、文献から得た（インターナショナル・アンティバイラル・ニューズ、および http://stanford.edu/hiv database）(表２)。
【００５１】
Ｔ類似体薬剤に対する感受性の測定に用いた連鎖停止反応混合物は、エネルギー依存性加リン酸分解反応を支持することができるものであるべきである。残念なことには、効率的な加リン酸分解反応は即座に重合速度の減少に反映され、結果として検出感度も減少する。従って、この分析法は、相当するＮＮＲＴＩについての分析法と比較して更にＲＴ活性を必要とする。もう一つの重要なことは、耐性且つ感受性ＲＴのスパンがＮＮＲＴＩ分析法におけるより小さいことである。しかしながら、一般にＲＴ阻害分析法からのＩＣ５０値と文献による表現型データとの間には強い相関があった。常に、ＲＴを高度または中位耐性ウイルスから識別することが可能であった（表２）。
【００５２】
例５
血漿由来のＲＴを用いるＮＮＲＴＩに対する感受性の測定
ストックホルム，スウェーデンの１７名のＨＩＶ感染個体からの血漿１ｍｌ試料を、「可溶性の細胞酵素の破壊後にミニカラムからウイルスＲＴを単離することに基づく、ＲＴ遮断抗体を含む材料からのウイルスＲＴの単離プロトコール」に準じて処理した。これらの１５は、薬剤感受性試験を行うのに十分なＲＴを含んでいた。これらの試料のＰＣＲ値は、１７０００コピー／ｍｌ以上であった。それぞれの血漿ＲＴおよび２個のコントロール酵素を、「溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール」に準じてNevirapine、EfavirenzおよびDelavirdineの連続希釈の組に対して滴定した。
【００５３】
それぞれのＲＴ抽出物からの１．７ｆｇ／ウェルの対照ＲＴ ＨＩＶ−１ ＲＴに相当する活性を用いて、１５の中の７個の試料が３種類のＮＮＲＴＩ総てに高度の耐性を有するＲＴを含むことを見出した（表３）。総てが置換Ｋ１０３Ｎを有し、または一例（試料６５６）では、それらのＲＴ遺伝子に置換Ａ９８ＧおよびＹ１８１Ｃの組合せを有していた。８個の試料は、３種類のＮＮＲＴＩ総てに感受性であった。それらの６個はそれらのＲＴ遺伝子に関連突然変異を持たなかったが、残りの２個はＶ１７９ＩまたはＶ１７９Ｔ／Ａ／Ｉ突然変異を有し、これはＮＮＲＴＩに対する感受性に影響を与えることは知られていない。
【００５４】
例６
血漿由来のＲＴを用いるＡＺＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔ−ＴＰに対する感受性の測定。
ストックホルム，スウェーデンの２７名のＨＩＶ感染個体からの血漿１ｍｌ試料を、「可溶性の細胞酵素の破壊後にミニカラムからウイルスＲＴを単離することに基づく、ＲＴ遮断抗体を含む材料からのウイルスＲＴの単離プロトコール」に準じて処理した。これらの１３だけが、薬剤感受性試験を行うのに十分なＲＴを含んでいた。これらの試料のＰＣＲ値は、４３０００コピー／ｍｌ以上であった。それぞれの血漿ＲＴおよび２個のコントロール酵素を、「溶解物中のＲＴ活性の薬剤感受性の測定プロトコール」に準じてＡＺＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔ−ＴＰの連続希釈の組に対して滴定した。表４参照。
【００５５】
それぞれのＲＴ抽出物および連鎖停止反応混合物からの５ｆｇ／ウェルの対照ＲＴ ＨＩＶ−１ ＲＴに相当する活性を用いて、いずれの薬剤に対するＩＣ５０値もＮＮＲＴＩに対する耐性に関与することが知られている突然変異の蓄積と平行して増加することを見出した（表４）。突然変異Ｄ６９ＮまたはＭ１８４Ｖのみが、予想したように、ＩＣ５０値が増加しなかった。試料６５６および１３２０は、ＲＴを含み、ＮＲＴＩに対する耐性に影響することが知られている幾つかのアミノ酸置換の存在にも拘わらず、ＡＺＴＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔ−ＴＰのいずれに対しても中位のＩＣ５０値を示した。これらの単離物は、Ｔ類似体薬剤に対して再感作を引き起こすことが知られている置換Ｙ１８１ＣまたはＭ１８４Ｖも含むことを見出した。このパネルの２種類のＲＴは、野生型のコントロールＲＴと比較して少なくとも２０倍に高められたＩＣ５０値を示した（表４）。これらの一つはＱ１５１Ｍ複合体[8]に典型的なアミノ酸（ａａ）挿入の組を有し、他のものは古典的なＫ７０Ｒ置換と更にＬ２１０Ｓ置換を含んでいた。それぞれＡＺＴ−ＴＰおよびｄ４Ｔ−ＴＰについての値のカットとしてＩＣ５０値１μＭおよび０．１μＭを用いて、抽出物を９個の感受性および４個の耐性ＲＴを含むものとして分類することができ、これは表現型分析法の結果と一致する。
【００５６】
参考文献
【化１】
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【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図は、回収したＨＩＶ−１ ＲＴとＲＮＡ ＰＣＲで測定したウイルスＲＮＡとの相関を示す。
【図２】図は、薬剤感受性分析法で用いたＲＴの量とＩＣ５０実測値との関係を示す。図中、(◇)(白抜き菱形)はEfavirenz野生型ＲＴ、(◆)(黒塗り菱形)はEfavirenz L1001 RT、(○)(白抜き丸型)はAZT-TP野生型ＲＴ、(●)(黒塗り丸型)はAZT-TP T215Y RTを示す。
【図１】
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【図２】
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