(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液滴の分散体の噴霧されたエアロゾルであり、ここで：
（ａ）上記液滴は、直径10ミクロン未満の粒子サイズをもち；そして
（ｂ）上記液滴は、以下の：
（ｉ）水性液体；
（ii）上記水性液体に難溶性である治療剤の粒子、ここで上記剤の粒子は、1000nm未満の有効平均粒子サイズをもち；そして
（iii）上記治療剤粒子の表面上に吸着された少なくとも１の表面改質剤、
を含む、
前記噴霧されたエアロゾル。
【請求項２】
哺乳動物の上気道又は肺に治療剤をデリバリーするために用いられる噴霧されたエアロゾルであり、ここで、上記エアロゾルは、液滴の分散体を含み、かつ、ここで：
（ａ）上記液滴は、直径50ミクロン未満の粒子サイズをもち；そして
（ｂ）上記液滴は、以下の：
（ｉ）水性液体；
（ii）上記水性液体に難溶性である治療剤の粒子、ここで上記剤の粒子は、1000nm未満の有効平均粒子サイズをもち；そして
（iii）上記治療剤粒子の表面上に吸着された少なくとも１の表面改質剤、
を含む、
前記噴霧されたエアロゾル。
【請求項３】
前記液滴が、直径１ミクロン未満の粒子サイズをもつ、請求項１又は２に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項４】
前記表面改質剤が、前記表面改質剤と前記治療剤の合計重量に基づき、0.1〜90重量％、１〜75重量％、及び20〜60重量％から成る群から選ばれる量で、存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項５】
前記治療剤が、前記治療剤と前記表面改質剤の合計重量に基づき、0.1〜60重量％、及び５〜30重量％から成る群から選ばれる量で、前記液体媒質中に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項６】
難溶性治療剤の前記粒子が、400nm未満、300nm未満、又は100nm未満の平均粒子サイズをもつ、請求項１〜５のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項７】
前記表面改質剤が、ゼラチン、カゼイン、アカシア・ガム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリル・アルコール、セトマクロゴール乳化性ワックス、ソルビタン・エステル、ポリオキシエチレン・アルキル・エーテル、ポリオキシエチレン・ヒマシ油誘導体、ポリエチレン・グリコール、ポリオキシエチレン・ステアレート、コロイド状２酸化ケイ素、ホスフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、カルシウム・カルボキシメチルセルロース、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・フタレート、非晶質セルロース、マグネシウム・アルミニウム・シリケート、トリエタノールアミン、ポリビニル・アルコール、ポリビニルピロリドン、チロキサポール、ポリオキシアミン、デキストラン、レシチン、ナトリウム・スルホコハク酸のジアルキルエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキル・アリール・ポリエーテル・スルホネート、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル、スクロース・ステアレートとスクロース・ジステアレートの混合物、Ｃ18Ｈ37CH2（CON9CH3）CH2（CHOH）4（CH2）Ｈ2、酸化エチレンと酸化プロピレンの硫酸化ブロック・コポリマー、及び3800〜5000の分子量をもつ構造…（PEO）（PBO）（PEO）…をもつトリブロック・コポリマー、から成る群から選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項８】
少なくとも２つの表面改質剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項９】
前記治療剤が、鎮痛剤、抗炎症剤、駆虫剤、抗−不整脈剤、抗生物質、抗血液凝固剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗てんかん剤、抗ヒスタミン剤、抗高血圧剤、抗ムスカリン剤、抗微生物剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、不安緩解鎮痛剤、収れん剤、ベーター受容体遮断剤、血液製剤及び代用血液、心臓筋収縮性剤、コルチコステロイド、咳止め薬、利尿薬、ドーパミン作動薬、止血剤、脂質調節剤、筋弛緩薬、副交感神経様作用薬、副甲状腺カルシトニン及びビホスホネート、プロスタグランジン、性ホルモン、抗アレルギー剤、食欲減退剤、交感神経様作用薬、血管抗張薬、及びキサンチンから成る群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１０】
前記治療剤が、ベクロメタゾン・ジプロピオネートである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１１】
前記エアロゾルを作るために、ジェット・ネブライザー又は超音波ネブライザーが使用される、請求項１〜10のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１２】
喘息、肺気腫、呼吸障害症候群、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、後天性免疫不全症候群（AIDS）、及びAIDS−関連肺炎から成る群から選ばれる呼吸器障害を治療するために用いられる、請求項１〜11のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１３】
前記液体が、水、及び水性塩溶液から成る群から選ばれる、請求項１〜12のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１４】
前記治療剤が、結晶形態にある、請求項１〜13のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１５】
肺の胞状領域への前記ナノ粒子のデリバリーに用いられる、請求項１〜14のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１６】
哺乳動物の治療に用いられる、請求項１〜15のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾル。
【請求項１７】
ベクロメタゾン粒子以外の治療剤粒子の分散体の噴霧されたエアロゾルを形成することを含む、請求項１〜16のいずれか１項に記載の噴霧されたエアロゾルの製法。
【発明の詳細な説明】
本発明の分野
本発明は、ナノ粒子及び特にエアロゾル形態にあるナノ粒子に関する。
本発明の背景
気管への治療剤のデリバリーは、疾患の局所的及び全身的治療のいずれにとっても重要である。慣用技術によっては、肺への剤のデリバリーは、極めて不十分である。難溶性化合物の呼吸できる水性懸濁液を開発する試みは、不成功に終っている。水性媒質中に懸濁されたミクロ化された治療剤は、エアロゾル化された水滴によりデリバリーされるには大きすぎる。慣用方法によっては、上記剤の約10〜20％だけが肺に達すると推定されている。特に、剤をデリバリーするために使用されるデバイスにおける損失、口及び咽喉における損失並びに呼気に伴う損失がある。これらの損失は、治療剤レベルにおける変動及び乏しい治療コントロールを導く。さらに、口及び咽喉への剤の沈着（deposition）は、全身的な吸収及び不所望の副作用を導くこととなる。
呼吸による薬物デリバリーの効率は、ほとんど、その粒子サイズ分布により決定される。大きな粒子（10μｍ）は、ほとんど咽喉の後部に沈着する。１〜10μｍの間のサイズをもつ粒子の60％以上は、気流により肺の気管上部領域内に入り、そこでほとんどが沈着する。約１μｍ未満の粒子に関しては、その粒子の本質的に全てが、肺に入り、そして末梢肺胞領域に入る；しかしながら、約70％は、はき出され、そしてそれ故、失われる。
沈着に加えて、吸収の相対速度及び治療剤のクリアランスの速度が、作用部位に到達する治療剤の量を決定するために考慮されなければならない。利用可能な領域の99.99％は末梢肺胞内にあるので、速い吸収は、末梢への粒子のデリバリーと共に具現化されることができる。クリアランスについては、肺の中央領域と末梢領域との間に差異がある。末梢肺胞領域は、繊毛細胞（ciliated cells）をもたないが、粒子クリアランスのためにマクロファージによる貧食に頼る。このかなり遅い過程は、粒子が肺に滞在する時間をかなり延長し、それにより治療的又は診断的効果を高めることができる。これに反し、気管上部に沈着した粒子は、粘膜繊毛エスカレーターにより速くクリアされる。すなわち、粒子は、肺表面をコーティングする粘膜の毛布内に捕獲され、そして咽喉に運ばれる。これ故、上記材料は、飲み込まれるか又は咳により除去されるかのいずれかである。
エアロゾルのより小さな滴は呼吸系内により深く到達することが長い間知られているけれども（Current Concepts in the Pharmacentical Sciences:Dosage and Bioarailability，J．Swarbrick Ed.，Lea and Febiger，Philadelphia，PA，1973，pp.97-148）、これらは、主として理論的に重要なものであった。エアロゾルのより小さな滴が呼吸系内により深くデリバリーされることがきることが単に知られていることは、特に、治療剤がエアロゾルのための液体中にほんの僅かしか溶解しない場合に、そのエアロゾル中への有効であるために十分な治療剤の取り込みの問題を解決するものではない。
米国特許第5,145,684号中に記載されたナノ粒子は、非架橋表面改質剤がその上に吸着されるところの難溶性治療又は診断剤から成る粒子であって、約400ナノメーター（nm）未満の平均粒子サイズをもつものについて記載している。しかしながら、上記組成物を噴霧（nebulize）する（エアロゾル化（aerosolize）又はアトマイズ（atomize）は、本明細書中等価な用語である。）ための試みは全く言及されておらず、そして上記化合物が有用なエアロゾルを提供するであろうことは又はそうすることについての何らかの利点が存在することは、自明ではない。
本発明の要約
本発明に従って、ナノ粒子水性分散体の滴を含むエアロゾルであって、そのナノ粒子が、その表面上に表面改質剤をもつ不溶性の治療又は診断剤を含むようなエアロゾルが提供される。
本発明の他の態様においては、ナノ粒子分散体のエアロゾルの形成方法であって、そのナノ粒子が、その表面上に表面改質剤をもつ不溶性の治療又は診断剤を含み、その方法が、以下の段階：
ａ）上記ナノ粒子の懸濁液を用意し；そして
ｂ）上記懸濁液を噴霧してエアロゾルを形成する、
を含むことを特徴とする形成方法が提供される。
本発明のさらに他の態様においては、以下の段階：
ａ）その表面上に表面改質剤をもつ不溶性の治療剤粒子を含むナノ粒子の水性分散体のエアロゾルを形成し；そして
ｂ）哺乳類の呼吸系に上記エアロゾルを投与する、
を含む哺乳類の治療方法が提供される。
さらに他の態様においては、以下の段階：
ａ）その表面上に表面改質剤をもつ不溶性の診断イメージング剤を含むナノ粒子の水性分散体のエアロゾルを形成し；
ｂ）哺乳類の呼吸系に上記エアロゾルを投与し；そして
ｃ）上記呼吸系内で上記イメージング剤を画像形成する、
ことを含む哺乳類の診断方法が提供される。
本発明の詳細な説明
本発明の組成物は、エアロゾルである。エアロゾルは、ガス内に分散し、そしてガスに取り囲まれたひじょうに細かく分けられた液体の滴から成るコロイド系として本明細書において定義されることができる。エアロゾル中の滴は、典型滴には、直径約50ミクロン未満のサイズをもつ。但し、より小さなサイズの滴であることもできる。
本発明のエアロゾルは、特に、呼吸関連疾患、例えば、喘息（asthma）、肺気腫（emphysema）、呼吸障害症候群（respiratory distress syndrome）、慢性気管支炎（chronic bronchitus）、嚢胞性繊維症（cystic fibrosis）及びAIDS関連肺炎を含む後天性免疫不全症候群の治療において有用である。
本発明のエアロゾルは、さまざまな公知の噴霧技術を使用してナノ粒子含有溶液を噴霧することにより作られる。たぶん、最も簡単な系は、活性成分の溶液又は懸濁液から成る“wo−相”系、本願においては、液体駆出剤中の治療又は診断剤を含むナノ粒子である。液体及びベーパー相のいずれも、加圧容器内に存在し、そしてその容器上の弁が開けられるとき、ナノ粒子分散体を含む液体駆出剤が放出される。成分の性質及び弁メカニズムの性質に依存して、細かいエアロゾルのミスト又はエアロゾルのウエット・スプレーが製造される。
小容量のネブライザーを含む本発明のエアロゾルを製造するために利用することができるさまざまなネブライザーが存在する。コンプレッサー駆動ネブライザーは、ジェット技術を取り込み、そして圧縮空気を使用して、エアロゾルを発生させる。商業的に入手可能な装置は、Healthdyne Technologies Inc;Invacare Inc.;Mountain Medical Equipment Inc.;Pari Respiratory Inc.;Mada Medical Inc.;Puritan-Bennet;Schuco Inc.;Omron Healthcare Inc.;De Vilbiss Health Care Inc.;及びHospitak Inc．から入手可能である。
超音波ネブライザーは、高投薬出力をデリバリーし、そして重度の喘息、又は他の重度の呼吸関連疾患を患う患者により使用される。
上記粒子は、治療又は診断剤を含む。（治療剤は、ときどき、薬物（drugs）又は医薬品（pharmacenticals）といわれる。診断剤は、典型的には、造影剤、例えば、Ｘ線造影剤といわれるが、他の診断剤であることもできる。）治療剤又は診断剤は、明確に区別できる結晶相として存在する。結晶相は、例えばEP0 275,796中に記載されたような、沈殿技術から得られる非結晶又は非晶質相とは異なる。
本発明は、多種多様な治療又は診断剤と共に実施されることができる。治療剤は又は診断剤は、好ましくは、本質的に純粋な形態で存在する。治療剤又は診断剤は、難溶性であり、かつ、少なくとも１の液体媒質中に分散性でなければならない。“難溶性（poorly soluble）”とは、治療剤又は診断剤が、約10mg／mL未満の、そして好ましくは、約１mg／mL未満の、液体分散媒質中での溶解度をもつことを意味する。好ましい液体分散媒質は水である。しかしながら、本発明は、治療剤又は診断剤が難溶性であり、かつ、分散性である他の液体媒質であって、例えば、水性塩溶液、サフラワー油及び溶媒、例えば、エタノール、ヒーブタノール、ヘキサン及びグリコールを含むものを用いても実施されることができる。水性分散媒質のpHは、本分野において知られた技術により調整されることができる。
好適な治療又は診断剤は、例えば、鎮痛薬、抗炎症剤、駆虫薬、抗不整脈剤、（ペニシリンを含む）抗生物質、抗血液凝固薬、抗うつ薬、抗糖尿病剤、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、抗高血圧剤、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤、抗新形成剤、免疫抑制薬、抗甲状腺剤、抗ウイルス剤、不安緩解鎮静薬（精神機能減退薬（hyporotics）及び神経弛緩薬）、収斂剤（astringents）、ベーターアドレノレセプター遮断剤、血液製剤及び代替物、心筋収縮剤、造影媒質、コルチコステロイド、せき止め抑制薬（去痰薬及びムコ多糖加水分解薬）、診断剤、診断イメージング剤、利尿薬、ドーパミン作動性薬（抗パーキンソン病剤）、止血薬、免疫学的剤、脂質調節剤、筋弛緩薬、副交感神経様作動薬、上皮小体カルシトニン及び２リン酸塩、プロスタグランジン、放射性医薬品、（ステロイドを含む）性ホルモン、抗アレルギー剤、興奮薬及び食欲抑制薬、交感神経様作動薬、甲状腺剤、血管拡張神経薬及びキサンチンを含むさまざまな公知クラスの治療剤又は診断剤から選ばれることができる。好ましい治療剤又は診断剤は、経口投与及び静脈内投与を意図されたものを含む。上記クラスの治療剤及び診断剤並びに各クラス内の種のリストの記載は、Martindale，The Extra Pharmacopoeia，Twenty-ninth Edition，The Pharmacentical Press，London，1989中にある。治療剤又は診断剤は、商業的に入手可能であり、そして／又は本分野において知られた技術により調製されることができる。
好ましい診断薬は、ジアトラゾン酸のエチル・エステル（EEDA）としても知られるＸ線イメージング剤WIN-8883（エチル３，５−ジアセトアミド−２，４，６トリヨードベンゾエート）、WIN 67722、すなわち、（６−エトキシ−６−オキソヘキシル−３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾエート；エチル−２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）ブチレート（WIN 16318）；エチル・ジアトリゾキシアセテート（WIN 12901）；エチル２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）プロピオネート（WIN 16923）；Ｎ−エチル２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ・アセトアミド（WIN 65312）；イソプロピル２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）アセトアミド（WIN 12855）；ジエチル２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ・マロネート（WIN 67721）；エチル２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）フェニルアセテート（WIN 67585）；プロパン二酸、〔〔３，５−ビス（アセチルアミノ）２，４，５−トリヨードベンゾイル〕オキシ〕−、ビス（１−メチル）エステル（WIN 68165）；及び安息香酸、３，５−ビス（アセチルアミノ）−２，４，６−トリヨード−，４−（エチル−３−エトキシ−２−ブテン酸）エステル（WIN 68209）を含む。好適な診断剤は、米国特許第5,260,478号；同第5,264,610号；同第5,322,679号及び同第5,300,739号中にも開示されている。
好ましい造影剤は、生理学的条件下で比較的速く崩壊すると予想され、これ故、いずれかの粒子関連炎症応答を最小化するものを含む。崩壊は、酵素による加水分解、生理学的pHにおけるカルボン酸の可溶化、又は他のメカニズムから生じることができる。従って、難溶性のヨウ素化されたカルボン酸、例えば、ヨージパミド（iodipamide）、シアトリゾン酸（diatrizoic acid）、及びメトリゾン酸（metrizoic acid）、並びに加水分解に不安定なヨウ素化種、例えばWIN 67721，WIN 12901，WIN 68165、及びWIN 68209その他が好ましい。
表面改質剤（Surface Modifiers）
好適な表面改質剤は、好ましくは、公知の有機及び無機医薬賦形剤から選ばれることができる。このような賦形剤は、各種ポリマー、低分子量オリゴマー、天然産物及び界面活性剤を含む。このましい表面改質剤は、非イオン性及びイオン性界面活性剤を含む。
表面改質剤の代表例は、ゼラチン、カゼイン、レシチン（ホスファチド）、アラビア・ガム、コレステロール、トラガント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリル・アルコール、セトマクロゴール乳化性ワックス、ソルビタン・エステル、ポリオキシエチレン・アルキル、エーテル、例えば、マクロゴール・エーテル、例えば、セトマクロゴール1000、ポリオキシエチレン・ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステル、例えば商業的に入手可能なTweenTM、ポリエチレン・グリコール、ポリオキシエチレン・ステアレート、コロイド状２酸化珪素、ホスフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース・カルシウム、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ・プロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・フタレート、非晶質セルロース、マグネシウム・アルミニウム・シリケート、ポリビニル・アルコール、及びポリビニルピロリドン（PVP）を含む。上記表面改質剤のほとんどが、公知の医薬賦形剤であり、そしてHand book of Pharmaceutical Excipients，The American Pharmacentical AssociationとThe Pharmacentical Society of Great Britainの共著、the Pharmacentical Press，1986中に詳細に記載されている。
特に好ましい表面改質剤は、ポリビニルピロリドン、チロキサポール、ポリキサマー、例えば、PluronicsTM  Ｆ68とＦ108であってエチレン・オキシドとポリエチレン・オキシドとのブロック・コポリマーであるもの、並びにポロキサミン、（PoloxamineTM908としても知られる）TetronicsTM908であってBASFから入手可能な、エチレンジアミンへのプロピレン・オキシド及びエチレン・オキシドの逐次的付加から得られる４価ブロック・コポリマーであるもの、デキストラン、レシチン、ナトリウム・スルホコハク酸のジアルキルエステル、例えば、Aerosol OTsTMであってAmerican Cyanimidから入手可能な、ナトリウム・スルホコハク酸のジオクチル・エステルであるもの、DuponolsTM  ＰであってDupontから入手可能な、ラウリル硫酸ナトリウムであるもの、Tritons TMＸ−200であってRohn and Haasから入手可能な、アルキル・アリール・ポリエステル・スルホネートであるもの、TweenTM 20及びTweenTM 80であってICI Specialty chemicalsから入手可能な、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エステルであるもの；CarbowaxsTM 3550及び934であってUnion Carbideから入手可能な、ポリエチレン・グリコールであるもの；CrodestasTM F-110であってCroda Inc.から入手可能な、ショ糖ステアリン酸とショ糖ジステアリン酸の混合物であるもの、CrodestasTM SL-40であってCroda，Inc．から入手可能なもの、そしてSA9OHCOであってC18H37CH2CON（CH3）CH2（CHOH）4（CH2OH）2であるもの、を含む。特に有用であることが判明している表面改質剤は、TetronicsTM 908、TweenssTM，PluronicsTM F-68及びポリビニルピロリドンを含む。他の有用な表面改質剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド；ｎ−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド；ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド；ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグルコシド；ｎ−ヘキシルβ−Ｄ−グルコピラノシド；ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド；ｎ−ノイルβ−Ｄ−グルコピラノシド；オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；オクチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド；その他を含む。
他の有用な表面改質剤は、チロキサポール（tyloxapol）（アルキル・アリール・ポリエーテル・アルコール・タイプの非イオン性液体ポリマー；superinone又はtritonとしても知られる）である。この表面改質剤は、商業的に入手可能であり、そして／又は本分野において知られた技術により調製されることができる。
他の好ましい表面改質剤は、Olin-10GTM又はSurfactant 10-Gとしても知られるｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）であり、Olin Chemicals，Stanford，Conneticutから10GTMとして商業的に入手可能である。
非イオン性表面改質剤
好ましい表面改質剤は、ポロキシアミン、例えば、（PoloxamineTM 908としても知られる）TetronicTM 908であってBASFから入手可能な、エチレンジアミンへのポリエチレン・オキシド及びエチレン・オキシドの逐次的付加から得られる４価ブロック・コポリマーであるもの、又はTetronicTM 1508（Ｔ−1508）、又はアルキル・アリール・ポリエーテル・アルコールタイプのポリマー、例えばチロキサポールを含む、公知の非イオン性界面活性剤から選ばれることができる。
上記表面改質剤は、商業的に入手可能であり、そして／又は本分野において知られた技術により調製されることができる。２以上の表面改質剤を、組合せて使用することもできる。
チロキサポール（Tyloxapol）
チロキサポール（エチレン・オキシド及びホルムアルデヒドとの４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール・ポリマー）は、好ましい表面改質剤であり、そしてアルキル・アリール・ポリエーテル・アルコール・タイプの非イオン性液体ポリマーである。“Superinone”としても知られるチロキサポールは、米国特許第4,826,821号中、肺界面活性剤組成物中非イオン性界面活性剤として有用であると、そして米国特許第3,272,700中、２−ジメチルアミノエチル４−ｎ−ブチルアミノベンゾエートのための安定化剤として有用であると開示されている。
チロキサポールは、ナノ粒子と会合されることができ、そして表面改質剤、安定剤、及び／又は分散剤として機能することができる。あるいは、チロキサポールは、他の目的のために役立つ。チロキサポールは、全部で３つの機能をもつことができる。チロキサポールは、安定剤及び／又は分散剤として役立つことができ、一方、他の化合物は、表面改質剤として作用する。
補助的表面改質剤
特に好ましい補助的表面改質剤は、滅菌の間の粒子凝集に対する抵抗性を付与するものであり、そしてジオクチルスルホスクシネート（DOSS）、ポリエチレン・グリコール、グリセロール、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル・トリメチル・アンモニウム・プロミド及び荷電リン脂質、例えば、ジミリストイル・ホスファチジル・グリセロールを含む。上記表面改質剤は、商業的に入手可能であり、そして／又は本分野において知られた技術により調製されることができる。２以上の表面改質剤を組合せて使用することもできる。
ブロック・コポリマー表面改質剤
１の好ましい表面改質剤は、少なくとも１のアニオン基に結合したブロック・コポリマーである。上記ポリマーは、分子当り、少なくとも１の、そしてより好ましくは２，３，４又はそれより多くのアニオン基を含む。
好ましいアニオン基は、スルフェート、スルホネート、ホスホネート、ホスフェート及びカルボキシル基を含む、。これらのアニオン基は、非イオン性ブロック・コポリマーに共荷結合により付着されている。非イオン性の硫酸化ポリマー界面活性剤は、1,000-50,000の、好ましくは2,000-40,000の、そしてより好ましくは3,000-30,000の分子量をもつ。好ましい態様においては、上記ポリマーは、少なくとも約50重量％の、より好ましくは、少なくとも約60重量％の親水性単位、例えばアルキレン・オキシド単位を含む。この理由は、親水性単位の大きな重量比の存在がそのポリマーに水性溶解性を付与するということである。
ここでの表面改質剤として有用なブロック・コポリマーの好ましいクラスは、エチレン・オキシド及びプロピレン・オキシドの硫酸化ブロック・コポリマーを含む。
非硫酸化形態の上記ブロック・コポリマーは、PluronicsTMとして商業的に入手可能である。非硫酸化ブロック・コポリマーの特別な例は、Ｆ68，Ｆ108及びＦ127を含む。
ここでの有用なブロック・コポリマーの他の好ましクラスは、エチレン・ジアミンへのエチレン・オキシド及びプロピレン・オキシドの逐次的付加から得られる４官能価ブロック・コポリマーを含む。非硫酸化形態の上記ポリマーは、TetronicsTMとして商業的に入手可能である。
表面改質剤の他の好ましいクラスは、その分子の親水性部分として少なくとも１のポリエチレン・オキシド（PEO）ブロック及びその疎水性部分として少なくとも１のポリブチレン・オキシド（PBO）ブロックを含む。特に好ましいこのクラスの界面改質剤は、エチレン・オキシドとブチレン・オキシドとのジブロック、トリブロック及びより多くのブロックのコポリマーであり、例えば、以下の構造式：
0004484247.tif 000002
により表される。
ここで有用なブロック・コポリマーは、既知化合物であり、そして／又は本分野において周知の技術により容易に調製されることができる。
ひじょうに好ましい表面改質剤は、Dow Chemical，Midland，Michiganから商業的に入手可能であり、そしてＢ20−3800とＢ20−5000といわれる、3800と5000の分子量をもつ
0004484247.tif 000003
のトリブロック・コポリマーを含む。これらの表面改質剤は、約80重量％のPEOを含む。好ましい態様においては、上記表面改質剤は、以下の構造：
0004484247.tif 000004
{構造中、Ｑは、アニオン基であり、
Ｒは、Ｈ又は金属カチオン、例えば、Na+，Ｋ+その他であり、
ｘは、15〜700であり、
ｙは、５〜200であり、そして
ｚは、15〜700である。}をもつ
トリブロック・コポリマーである。
粉砕（Grinding）
上記粒子は、液体分散媒質中に治療又は診断剤を分散させる段階と、その治療剤又は診断剤の粒子サイズを約400nm未満の有効な平均粒子サイズに減少させるために粉砕媒質の存在下で機械的手段を適用する段階を含む方法により、調製されることができる。粒子は、表面改質剤の存在下でサイズ減少されることがきる。あるいは、摩損後に表面改質剤と接触されることができる。
選ばれた治療剤又は診断剤は、商業的に入手可能であり、そして／又は慣用の粗い形態で本分野において知られた技術により調製されることができる。不可欠ではないが、選ばれた粗い治療剤又は診断剤の粒子サイズは、篩分析により測定されるとき約10μｍ未満であることが好ましい。治療剤又は診断剤の粗い粒子サイズが約100μｍより大きい場合、慣用の粉砕方法、例えば、エアージェット（airjet）又はフラグメンテーション粉砕（Fragmentation milling）を使用して治療剤又は診断剤の粒子を100μm未満にサイズ減少させることが好ましい。
選ばれた粗い治療剤又は診断剤は、次にそれがその中で本質的に不溶性であるところの液体媒質中に添加されて、プレミックスが形成されることができる。この液体媒質中の治療剤又は診断剤の濃度は、約0.1〜60％に変化することができ、そして好ましくは、５〜30％（w/w）である。不可欠ではないが、表面改質剤が上記プレミックス中に存在することが好ましい。表面改質剤の濃度は、治療剤又は診断剤と表面改質剤の合計重量に基づき、約0.1〜90重量％に変化することができ、そして好ましくは、１〜75重量％、より好ましくは20〜60重量％である。このプレミックス懸濁液の見掛け粘度は、好ましくは約1000センチポイズ（１Pa.S）未満である。
プレミックスは、分散体中で平均粒子サイズを1000nmに減少させるために、それを機械的手段に供することにより直接的に使用されることができる。ボール・ミルが摩損のために使用されるとき、プレミックスが直接的に使用されることが好ましい。あるいは、治療剤又は診断剤、及び場合により表面改質剤は、裸眼に見える大きな凝集物が存在しない均一分散が観察されるまで、好適な摩損、例えば、ローラー・ミル又はCowlesタイプのミキサーを使用して、上記液体媒質中で分散されることができる。循環媒質ミルが摩損のために使用されるとき、プレミックスを上記のような粉砕前分散段階に供することが好ましい。あるいは、治療又は診断剤及び場合により表面改質剤は、裸眼に見える大きな凝集物が存在しない均一な分散が観察されるまで、好適な摩損、例えば、ローラー・ミル又はCowlesタイプ・ミキサーを使用して、液体媒質中で分散されることができる。循環媒質が摩損のために使用されるときプレミックスを上記のような粉砕前分散段階に供することが好ましい。
治療又は診断剤の粒子サイズを減少させるために適用される機械的手段は、便利には、分散ミルの形態を呈することができる。好適な分散ミルは、ボール・ミル（ball mill）、アトリター・ミル（attritor mill）、バイブレートリー・ミル（vibratory mill）及び媒体ミル（media mill）、例えばサンド・ミル（sand mill）及びビーズ・ミル（bead mill）を含む。媒体ミルは、意図した結果、粒子サイズにおける所望の減少を提供するために必要な比較的短い粉砕時間のために好ましい。媒質粉砕のためには、プレミックスの見掛け粘度は、好ましくは、約100〜約1,000センチポイズ（0.1〜１Pa・S）である。ボール・ミル粉砕のためには、プレミックスの見掛け粘度は、好ましくは、約１〜約100センチポイズ（10-3〜10-1Pa・S）である。このようなレンジは、効率的な粒子断片化と媒質侵食との間の最適なバランスを与える傾向にある。
調製条件
摩損時間は、広く変化し、そして主に、特定の機械的手段及び選択された加工条件にすることができる。ボール・ミルのためには、５日間以上の加工時間が必要とされることができる。他方において、１日未満の加工時間（１分〜数時間の滞留時間）が高剪断媒質ミルを使用して所望の結果を提供している。
粒子は、治療又は診断剤を有意に分解しない温度においてサイズ減少されることができる。約30〜40℃未満の処理温度が通常好ましい。適宜、加工装置は、慣例の冷却装置により冷却されることができる。この方法は、便利には、周囲温度の条件下、及びその粉砕工程のために安全で、かつ、有効な処理圧力において行われる。例えば、周囲の処理圧力は、ボール・ミル、アトリター・ミル及びバイブレートリー・ミルに典型的である。例えば、氷水内に粉砕チャンバーを沈め又はジャケット冷却により、温度コントロールが企図される。約１psi（0.07kg／cm2）（6,895Pa）〜約50psi（3.5kg／cm2）（344,750Pa）の処理圧が企図される。約10psi（0.7kg／cm2）（60,895Pa）〜約20psi（1.4kg／cm2）（121,970Pa）の処理圧力も企図される。
表面改質剤は、それがプレミックス中に存在しない場合、先にプレミックスについて記載したような量で摩損後に上記分散体に添加されなければならない。その後、その分散体が、例えば、激しく振とうすることにより混合されることができる。場合により、分散体は、例えば、超音波電源を利用して、音波処理段階に供されることができる。例えば、分散体は、約１〜120秒の時間にわたり20〜80kHzの周波数をもつ超音波エネルギーを受けることができる。
摩損が終了した後、慣用の分離技術、例えば、濾過、メッシュ・スクリーンを通しての篩分けその他を使用して（乾燥又は液体分散形態のいずれかにおいて）粉砕された粒状製品から分離される。
粉砕媒質（Grinding Media）
粒子サイズ減少段階のための粉砕媒質は、約３mm未満の、そしてより好ましくは約１mm未満の平均サイズをもつ硬質媒質であって、好ましくは球状又は粒子状形態のものから選ばれることができる。このような媒質は、望ましくは、より短い処理時間をもって上記粒子を提供し、そして粉砕装置により小さな摩耗を与えることができる。粉砕媒質のための材料の選択は、決定的なものではないと信じられる。我々は、酸化ジルコニア、例えば、マグネシウムにより安定化された95％ ZrO2、珪酸ジルコニア、及びガラス粉砕媒質が、医薬組成物の調製のために許容できるものであると信じられている汚染レベルをもつ粒子を提供することを見い出している。しかしながら、他の媒質、例えば、ステンレス・スチール、チタニウム、アルミナ、及びイットリウムにより安定化された95％ ZrO2も有用であると予想される。好ましい媒質は、約３ｇ／cm3より大きな密度をもつ。
ポリマー粉砕媒質
粉砕媒質は、粒子、好ましくは、実質的に球の形状、例えば、本質的にポリマー樹脂から成るビーズを含むことができる。あるいは、粉砕媒質は、その上に接着されたポリマー樹脂のコーティングをもつコアを含む粒子を含むことができる。
一般的に、本発明における使用のために好適な樹脂は、化学的及び物理的に不活性であり、実質的に金属、溶媒及びモノマーを含まず、そして粉砕の間のチッピング又はクラッシングを回避するために十分な硬度及び破砕性をもつ。好適なポリマー樹脂は、架橋ポリスチレン、例えば、ビニルベンゼンにより架橋されたポリスチレン、スチレン・コポリマー、ポリカーボネート、ポリアセタール、例えば、DelrinTM、塩化ビニル・ポリマー及びコポリマー、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ（テトラフルオロエチレン）、例えば、TeflonTM、及び他のフルオロポリマー、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース・エーテル及びエステル、例えば、酢酸セルロース、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリヒドロキシエチル・アクリレート、シリコーン含有ポリマー、例えば、ポリシロキサンその他を含む。上記ポリマーは、生物分解性であることができる。例示的な生物分解性ポリマーは、ポリ（ラクチド）、ラクチドとグリコリドのポリ（グリコリド）コポリマー、ポリアンヒドリド、ポリ（ヒドロキシエチル・メタクリレート）、ポリ（イミノ・カーボネート）、ポリ（Ｎ−アシルヒドロキシプロリン）エステル、ポリ（Ｎ−パルミクル・ヒドロキシプロリン）エステル、エチレン−酢酸ビニル・コポリマー、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、及びポリ（ホスファゼン）を含む。生物分解性ポリマーの場合においては、その媒質自体からの汚染は、有利には、体から排除されることができる生物学的に許容される製品にインビボにおいて代謝される。
ポリマー樹脂は、0.8〜3.0ｇ／cm3の密度をもつことができる、高密度樹脂が好ましい。なぜなら、それらは、より有効な粒子サイズ減少を提供すると信じられているからである。
上記媒質は、約0.1〜３mmのサイズ範囲にあることができる。微粉砕のためには、粒子は、好ましくは、0.2〜２mm、より好ましくは、0.25〜１mmのサイズにある。
他の方法においては、治療又は診断剤は、その剤を約75ミクロン未満の平均粒子サイズをもつ粉砕媒質の存在下で粉砕することにより、サブミクロン粒子の形態で調製される。
上記粉砕媒質のコア材料は、好ましくは、球又は粒子として作られるとき粉砕媒質として有用であると知られている材料から選ばれることがきる。好適なコア材料は、酸化ジルコニウム（例えば、マグネシウム又はイットリウムにより安定化された95％酸化ジルコニウム）、珪酸ジルコニウム、ガラス、ステンレス・スチール、チタニウム、アルミナ、フェライトその他を含む。好ましいコア材料は、約2.5ｇ／cm3より大きな密度をもつ。高蜜度コア材料の選択は、有効な粒子サイズ減少を容易にすると信じられている。
コア上のポリマー・コーティングの有用な厚さは、約１〜約500ミクロンの範囲にあると信じられている。但し、この範囲外の他の厚さも、いくつかの適用においては有用であることができる。ポリマー・コーティングの厚さは、好ましくは、コアの直径未満である。
コアは、本分野において知られた技術により上記ポリマー樹脂によりコートされることができる。好適な技術は、スプレー・コーティング、流動床コーティング、及び溶融コーティングを含む。接着促進層又はつなぎ層（tie layers）も、場合により、コア材料と樹脂コーティングの間の接着を改善するために提供されることができる。コア材料へのポリマー・コーティングの接着は、接着促進手順、例えば、コア表面の粗面化、コロナ放電処理その他にそのコア材料を供することにより、高められることができる。
連続粉砕（Continuous Grinding）
好ましい粉砕手順においては、粒子は、バッチ方法よりもむしろ連続的に作られる。この連続方法は、治療又は診断剤及び硬質粉砕媒体を粉砕チャンバー内に連続的に導入し、チャンバー内でその剤とその粉砕媒質を接触させてこの剤の粒子サイズを減少させ、その粉砕チャンバーからその剤及び粉砕媒体を連続的に取り出し、そしてその後、その粉砕媒体からその剤を分離する、段階を含む。
治療又は診断剤及び粉砕媒体は、粉砕チャンバーから連続的に取り出される。その後、粉砕媒体は、慣用の分離技術を使用して、副次的プロセスにおいて、例えば、単純な濾過、メッシュ・フィルター又はスクリーンを通しての篩分けその他により、（乾燥又は液体分散形態のいずれかにおいて）その粉砕された粒子剤から分離される。他の分離技術、例えば、遠心分離も使用することができる。
好ましい態様においては、剤及び粉砕媒体は、粉砕チャンバーを通して再循環される。このような再循環を行うために好適な手段の例は、慣用のポンプ、例えば蠕動ポンプ、ダイアフラム・ポンプ、ピストン・ポンプ、遠心ポンプ及び他の正移動ポンプであって粉砕媒質に損傷を与えるために十分な公差限界を使用しないものを含む。
上記連続プロセスの他の変法は、混合された媒質サイズの使用を含む。例えば、大きな媒質が、このような媒質が粉砕チャンバーに制限される慣用のやり方において使用されることができる。より小さな粉砕媒質は、その系を通して連続的に再循環され、そしてより大きな粉砕媒質の揺動床を通過することを許容されることができる。この態様においては、より小さな媒質は、好ましくは、サイズ約１〜300μｍの間の平均粒子であり、そしてより大きな粉砕媒質は、約300〜1,000μｍの間の平均粒子サイズである。
沈殿方法
所望のナノ粒子分散体の他の形成方法は、ミクロ沈殿（microprecipitation）によるものである。
これは、以下の進行段階：
１．撹拌しながら水性塩基中に治療又は診断剤を溶解し、
２．上記１の配合物を撹拌しながら表面活性界面活性剤（又は表面改質剤）溶液に添加して清澄溶液を作り、そして
３．上記２の配合物を撹拌しながら適切な酸溶液で中和する、
により、
微量の毒性溶媒又は可溶化重金属不純物のいずれも含まない表面改質剤及びコロイド安定性強化表面活性剤の存在下で、治療及び診断剤の安定性分散体を調製する方法である。以下の手順：
４．透析又はダイアフィルトレーションによる形成された塩の除去、そして
５．慣用手段による分散体の濃縮、
がこれに続くことができる。
このマイクロ沈殿プロセスは、室温又は冷却条件下で保たれる間、粒子サイズにおいて安定である。（光子相関スペクトロスコピーにより計測されるとき）400nm未満のＺ−平均粒子直径をもつ治療又は診断剤の分散体を作り出す。このような分散体は、標準的な血液プール医薬剤のために使用されたオートフレーブ脱汚染条件の間の限定された粒子サイズ成長をも示す。
段階３は、半連続、連続バッチ、又は連続法において、反応pHがpH−スタット・システムを使用して一定に維持されることができるコンピュータ制御のリアクター又は管状リアクター内で反応成分の一定流速において、行われることができる。このような修正の利点は、それがナノ粒子分散システムの大規模製造のためのより安価な製造手順を提供するということである。
追加の表面改質剤が、沈殿後、上記分散体に添加されることができる。その後、その分散体は、例えば、激しく振とうすることにより混合されることができる。場合により、分散体は、例えば、超音波電源を使用して、音波処理段階に供されることができる。例えば、分散体は、約１〜120秒間にわたり、20〜80kHzの周波数をもつ超音波エネルギーに供されることができる。
好ましい態様においては、上記手順の後に、ダイアフィルトレーション又は透析により形成された塩を除去することを含む段階が続く。これは、透析の場合においては、標準的な透析装置により、そして本分野において知られた標準的なダイアフィルトレーション装置を使用するダイアフィルトレーションにより、行われる。好ましくは、最終段階は、その剤分散体の所望の濃度までの濃縮である。これは、本分野において知られた標準的な装置を使用してダイアフィルトレーション又は蒸発のいずれかにより行われる。
マイクロ沈殿の利点は、粉砕された分散体とは異なり、最終製品が、製品が配合される前のそれらの毒性のために除去されなければならない粉砕媒質から生じる重金属汚染物を含まないことである。
マイクロ沈殿方法のさらなる利点は、溶媒沈殿とは異なり、最終製品が、毒性であり、かつ、最終製品配合前に高価な処理により除去されなければならない微量溶媒のいずれをも含まないということである。
マイクロ沈殿プロセスの他の好ましい態様においては、結晶成長調節剤が使用される。結晶成長調節剤は、共沈過程において、医薬剤のマイクロ沈殿した結晶の結晶構造物中に取り込まれ、それによって、いわゆるOstwald成熟過程（ripening process）により、その微晶質沈殿の成長又は拡大を妨害するような化合物として定義される。結晶成長調節剤（又はCGM）は、化学構造において医薬剤と少なくとも75％同一である化学物質である。“同一”とは、その構造が、原子対原子及びそれらの結合について同一であることを意味する。構造同一性は、分子量基準に基づき、治療又は診断剤と同一である化学構造の75％をもつと特徴付けられる。その構造の残りの25％は、存在しないか又はCGM内の異なる化学構造により置き替えられることができる。結晶成長調節剤は、治療又は診断剤と共に段階１において溶解される。
粒子サイズ
本明細書中に使用するとき、粒子サイズは、当業者によく知られた慣用の粒子サイズ計測技術、例えば沈降野流れ分画（sedimentation field flow fractionation）、光子相関スペクトロスコピー（photon carrelation spectroscopy）、又はディスク遠心分離（disk centrifugation）により計測された数平均粒子サイズをいう。光子相関スペクトロスコピー（PCS）が粒子サイジング法として使用されるとき、その平均粒子直径は、当業者に知られたＺ−平均粒子直径である。“約1,000nm未満の有効平均粒子サイズ”とは、その粒子の少なくとも90％が、上記の技術により計測されるとき、約1,000nm未満の重量平均粒子サイズをもつことを意味する。好まし態様においては、有効平均粒子サイズは、約400nm未満、そしてより好ましくは約300nm未満である。いくつかの態様においては、約100nm未満の有効平均粒子サイズが達成されている。この有効平均粒子サイズを参照すると、その粒子の少なくとも95％、そしてより好ましくは、少なくとも99％が、その有効平均、例えば1000nm未満の粒子サイズをもつことが好ましい。特に好ましい態様においては、粒子の本質的に全てが、1,000nm未満のサイズをもつことが好ましい。いくつかの態様においては、粒子の本質的に全てが、400nm未満のサイズをもつ。
比（Ratios）
治療又は診断剤と表面改質剤の相対比は、広く変化し、そして表面改質剤の最適量は、例えば、選択された特定の治療又は診断剤と表面改質剤、それがミセルを形成する場合その表面改質剤の臨界ミセル濃度、安定剤の親水性疎水性バランス（hydrophilic lipophilic balance（HLB））、安定剤の融点、その水への溶解度、安定剤の水溶液の表面張力、等に依存することができる。表面改質剤は、好ましくは、治療又は診断剤の表面積１平方メーター当り約0.1〜10mgの量で存在する。表面改質剤は、乾燥粒子の全重量に基づき、0.1〜90重量％、好ましくは、20〜60重量％の量で存在することができる。
診断
本発明に従う医療手順における使用のための診断的イメージング方法は、診断画像の必要なテスト対象の体に、診断的画像造影組成物の有効造影剤製造量を投与することを含む。ヒト患者に加えて、テスト対象は、哺乳類種、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ動物その他を含むことができる。その後、投与された造影剤を含む体の少なくとも一部分が、その造影剤の存在に対応するＸ線又は磁気共鳴画像パターンを作り出すために、Ｘ線又は磁場に晒される。その後、画像パターンが、可視化される。
いずれかのＸ線可視化技術、好ましくは、高造影技術、例えば、コンピュータ・トモグラフィーが、慣用のやり方で適用されることができる。あるいは、画像パターンは、Ｘ線感光燐光体スクリーン（X-ray sensitive phosphor screen）−ハロゲン化銀写真フィルムの組合せ物上で直接的にか又は保存燐光体スクリーンの使用により、観察されることができる。
磁気共鳴イメージング・システムによる可視化は、商業的に入手可能な磁気イメージング・システム、例えば、General Electric 1.5 T Sigmaイメージング・システム〔１Ｈ共鳴周波数63.9メガヘルツ（MHz）〕を用いて達成されることができる。商業的に入手可能な磁気共鳴イメージング・システムは、典型的には、使用される磁場強度により特徴付けられ、そして最大電流として2.0Teslaそして最小電流として0.2Teslaの磁束密度（field strength）が使用される。所定の磁束密度について、検出された核の各々が、固有の周波数をもつ。例えば、1.0Teslaの磁束密度においては、水素についての共鳴周波数は42.57Hzであり；リン−31については、それは17.24MHzであり；そしてナトリウム−23については、それは11.26MHZである。
診断剤含有組成物の造影有効量は、例えば、磁気共鳴イメージング又はＸ線イメージングにより組織の可視化を提供するために必要な量である。特定の被験体における造影有効量を測定するための手段は、本分野においてよく知られているように、使用される磁気的に反応性の材料の性質、画像形成される被験者の質量、磁気共鳴の感度又はＸ線イメージング・システムその他に依存するであろう。
組成物の投与の後、対象哺乳類を、投与された組成物がその被験体の全体に分布し、そしてその哺乳類の組織に侵入するために十分な時間期間にわたり維持する。典型的には、十分な時間期間は、約20分〜90分間であり、そして好ましくは、約20分〜約60分間である。以下の実施例を、本発明のさらなる理解のために提示する。
実施例１  治療剤ベクロメタゾン（Beclomethasone）の使用
材料  ベクロメタゾン・ジプロピオネート（BDP）とポリビニル・アルコール（PVA）を、Sigma Chemical Co.
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から得て、これをそのまま使用した。他の化学物質の全ては、分析／試薬グレード又はそれ以上のものであった。
ナノ粒子調製及び特徴付け  ナノ粒子を、PVAの水溶液中に５％ベクロメタゾン・ジプロピオネートの懸濁液を媒質粉砕することにより調製した。このように、PVAは、表面改質剤であった。得られた粒子サイズ分布を、動的光散乱（dynamic light scattering）により測定した。粒子サイズ分布は、試験経過を通じて定期的に監視した。
噴霧（Nebulization）  圧縮空気のガス・シリンダーであって、圧力レギュレーターを備えたものを、源として使用した。酸素接続チューブは、そのレギュレーターからPuritan-Bennet Raindropネブライザー（Lenexa，KA）を結んだ。このネブライザーのＴ−コネクターの１の出口を、No.２ゴム栓で塞いだ。他の出口を、Tygonチューブ（１／２″内径）に接続した。これを次に、まず、それから流速が各実験前に設定されるところの換算流量計につなげた。換算後、ガスの流れを、主シリンダー弁を閉じることにより停止した。流量計を取り外し、そしてネブライザーを、チューブ（１／２″内径、６″長さ）により24／40ジョイントを用いてＹ−チューブに接続した。このＹ−チューブを、24／40すりガラス・ジョイント内にフィットされた傾斜スライド及びカスケード・インパクターの上部内にフィットされたゴムＯ−リング・ガスケットをもつ筒状セクションから成る構築されたステンレス・スチール・アダプターにより、カスケード・インパクター（cascade impactor）（Andersen MarkI，Andersen Samplers Ind．Atlanta，GA）に接続した。インパクターを通る空気の流速は、真空ポンプにより吸収され、そして換算された流量計により、推奨された28.3Ｌ／分に調節された。
初期の研究は、20〜40psigの間の圧力が、ネブライザーの性能又は得られたエアロゾルのサイズ分布のいずれに対してもほとんど影響を及ぼさなかったことを示した。従って、圧力を40psigに一定に保った。ネブライザー性能及びエアロゾル・サイズ分布に対する流速の効果の研究も行った。流速が５から２Ｌ／分に減少されたとき、エアアロゾル粒子は、漸進的に大きくなる平均空気力学的直径をもつ。流速８Ｌ／分においては、過度な発泡があった。従って、全ての研究を、６Ｌ／分の流速で行った。
懸濁液及びナノ粒子の噴霧  噴霧のための配合物は、PVAをもつ0.2％ベフロメタゾン・ジプロピオネート分散体から成っていた。ネブライザーは、２mL又は６mL容量のいずれかを含んでいた。PVAの２つの濃度であって、元の分散濃度と同一のPVA濃度をもつPVA溶液又は水で、元の５％（w/v）ナノ粒子分散体を希釈することにより調製されたものを、使用した。ネブライザーを満たし、そして溶液のアリコートを、薬物濃度のその後の測定のために採取した。その重量をも測定した。噴霧プロセスを、主ガス・シリンダー上の弁を開けることにより開始し、そしてそのネブライザーが発泡し又はぶつぶついう（sputtering）までの時間の長さを測定し、そして追加のアリコートを、分析のために採取した。ネブライザーを出て行く塊の画分を、噴霧の前後のネブライザーの重量の差異から計算した。これを、その分散体の噴霧のために要した時間と合わせて、噴霧された分散体のミリリッター／単位時間で表した質量排出速度を得て、そして噴霧された分散体の容積／空気１リッターで表したネブライザー排出量を測定した。
ネブライザーから採取したアリコートを、水中50％（v/v）エタノールで希釈し、そしてその吸光度を、240nmで測定した。適切な標準の吸光度の計測を用いて、BDPの濃度を計算した。噴霧の前後におけるネブライザーの質量及びBDP濃度から、そのネブライザー内に残るBDPの画分／分数（fraction）を、計算した。カスケード・インパクター上に集められたBDPの質量及びエアロゾル粒子のサイズ分布を、10mLのエタノール／水溶液でそのインパクター・ステージを抽出することにより、測定した。アリコートを採取し、そして吸光度及びその後の濃度を測定した。質量メジアン空気力学的直径及び粒子分布の幾何学的標準偏差を、そのカット−オフ直径の対数（log）の関数としてそのインパクターのステージ上の累積質量をプロットすることにより、得た。カスケード・インパクターから測定された累積質量およびネブライザー内に入れられたBDPの初期量を用いて、そのインパクターに到達したBDPの画分／分数を計算した。
分散体の分別（fractionation）を評価するために、ナノ粒子と懸濁液を、0.1％フルオレセイン・ナトリウムを含むPVAで希釈した。噴霧を上記のように行った。フルオレセインは、490と240nmの両方においてかなりの吸収をもち、一方、BDPは、240nmにおいてのみ吸収をもつので、その希釈されたアリコートの吸収は、上記の２つの波長において測定された。フルオレセインの濃度は、490nmにおける吸収及びその計測された吸収率から、決定された。BDPの濃度の測定においては、240nmにおけるフルオレセインの吸収からの寄与を、490において測定された吸収及び上記２つの波長における吸収率の差異についての補正に基づいて差し引いた。
走査電子顕微鏡（Scanning Electron Microscopy）  SEMを、噴霧後のナノ粒子について行った。２つの分散体であって、0.1及び2.5％界面活性剤を含むものを調製した。これらを、ネブライザー内に入れ、そして２cmの直方形のガラス顕微鏡スライドを、インパクターの各ステージ上に置いた。これらのガラス・スライドを取り出し、そして白金でスパッタリングした。顕微鏡写真を、
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（Peabody，Mass.）を用いて得た。
結果
2.5％ポリビニル・アルコール中でのベクロメタゾン・ジプロピオネートのナノ粒子は、0.26±0.13mmの粒子サイズ分布をもっていた。このサイズは、試験の全過程において一定であり；化学的不安定性の証拠は全くなかった。さらに、希釈された分散体の粒子サイズは、少なくとも、実験の間は、一定であった。
噴霧について、４つの配合品をテストした。これらを、表Ｉ中に列記する。第１は、２mLの容積をもつ、2.5％界面活性剤中の生医薬物質BDPの懸濁液であった。第２は、ナノ粒子の分散体から成り、それにより上記懸濁配合品との直接的な比較を可能にした。第３も、コロイド分散体であったが、その界面活性剤濃度は、0.1％よりも低かった。第４は、第３と類似したが、６mlのより大きな容量を含んでいた。
表II中に、上記４つの配合品の噴霧からの結果を与えた。第２列は、分散体の全質量がネブライザーを出ていく速度である質量排出速度を提供する。配合品ＩとIIは、配合品IIIとIVのものと類似する。上記２セットの配合品の間の差異は、ＩとIIが、2.5％の界面活性剤濃度をもち、一方、IIIとIVが0.1％の界面活性剤濃度をもつことである。
第３列は、ネブライザー内に残る分散体の全質量画分を反映する。この質量残存画分は、0.27〜0.69の間にあり、ネブライザー内にかなりの量の材料が残っていることを示している。さらに、配合品Ｉ，IIとIIIは、類似したが、配合品IVは、ネブライザー内にかなり低い質量画分が残っていた。配合品IVは、それが６mLの初期容量を含む点で、他のものと区別される。
次の列は、ネブライザー内に残るBDPの画分を与える。これらの画分は、0.29〜0.89の範囲にある。これらの残存画分の比較において、懸濁体を含む配合品Ｉは、ネブライザー内に約90％のBDPが残っていた。これに反し、0.1％界面活性剤を含む配合品IIIは、ネブライザー内に有意に低いBDP画分が残っていた。残存画分におけるさらに劇的な低下が、低い界面活性剤濃度とより大きな容量をもつ配合品IVを用いて観察された。
ネブライザー内に残存する全質量画分に対して残存BDP画分を比較することも有益である。配合品Ｉを用いた場合、残存全質量に対して有意に大きなBDP画分があった。数値的には、これは、配合品IIについても確かである：しかしながら、残存画分において統計的な差異を全くもたない上記計測治療剤においてより大きな偏差があった。配合品IIIとIVにおいては、差異は全く存在しなかった。
ネブライザーに到達するBDPの画分も表IIに与える。懸濁液又は生医薬物質として提示されたBDPのたった７％がインパクターに到達することが分かる。比較すると、ナノ粒子の使用は、有意に高い画分がインパクターに到達することを導く。これらは、0.17から0.34を超えるまでの範囲にある。２mLの分散体を含む配合品IIとIIIにおいては、約18％のBDPがインパクターに到達する。より大容量の配合品IVにおいては、BDPのほぼ35％がインパクターに到達した。
最後に、ネブライザー内に元々入れられたBDPの量は、インパクター上のBDPの量に添加されたネブライザー内に残るBDPの量に等しくなるべきことが明らかである。
画分に関してのマス・バランスを表すと、ネブライザー内に残るBDPの画分に、インパクター上のBDPの画分を足すと、１に等しくなるはずである。表II中に与えた画分から演澤されることができるように、配合品IIにおいて、のみそうであった。他の場合においては、BDPの正味のロスがあった。特に、配合品IIIについては、BDPのほんの80％が計算されることができ、そして配合品IVにおいては、計算されたパーセントは、約60％に低下した。
インパクター・ステージ上に集められたBDPの画分が、そのステージのカット・オフ直径の関数としてプロットされるとき、生医薬物質の懸濁液が、より大きなサイズをもつ粒子分布をもち、そしてその分布が、より多分散であることが明らかである。ナノ粒子は、それらの粒子の80％が2.5mm未満であるような粒子サイズ分布をもつ。
表III中に、フルオレセイン試験からの結果を与える。排出質量を比較すると、両配合品が、約0.75の類似の結果を与えた。また、BDPの画分とネブライザー内に残るフルオレセインの間に有意な差異はなかった。懸濁液については、BDPの画分と残存フルオレセインは、それぞれ、88と89であった。ナノ粒子については、パーセントは、81と85であり、これらは、互いに統計的に差異はなかった。さらに配合品ＩとIIの間において、BDPの画分と残存フルオレセインにおいて統計的な差異はなかった。しかしながら、BDPの画分と残存フルオレセインは、懸濁液とナノ粒子配合品について、残存全質量の画分より有意に大きい。
インパクターに到達するBDPの画分は、上記２つの配合品間で差異があった。懸濁液については、インパクター上に集められたフルオレセインの画分は、BDPの画分よりほぼ２倍高いものであった。ナノ粒子については、フルオレセインの画分は、懸濁液を用いて見られたものと類似していた。インパクター上に集められたBDPの画分は、懸濁液を用いて観察されたものよりもかなり高いものであったが、フィルオレセインを用いて観察されたものよりも僅かに低いものであった。
最後の試験は、ネブライゼーションのプロセスに供された後の粒子の検査である。走査電子顕微鏡観察が、2.5と0.1％のナノ粒子についてインパクターの第６ステージ上にデポジットされたナノ粒子について行われた。
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