(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光活性化可能な前駆体組成物を提供する工程と、
前記前駆体組成物の少なくとも１つの第１の位置における多光子励起を用いて前記前駆体組成物を活性化し、小規模構造の少なくとも１つの第１の部分を形成する工程であって、該少なくとも１つの第１の部分のＸ−Ｙ方向の寸法は３００ナノメートル未満である工程と、
を含み、前記光活性化可能な前駆体組成物は、アミノ酸類、ペプチド類、蛋白質類、脂肪酸類、脂質類、ヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類、合成ヌクレオチド類似体類、核酸類、糖類、炭水化物類、サイトカイン類、ホルモン類、レセプター類、成長因子類、薬物類、及びこれらの混合物からなる群から選択される光活性化可能な前駆体を含む小規模構造の製作方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１の部分のＺ方向の寸法は、５００ナノメートル未満である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第１の部分のＸ−Ｙ方向の寸法は、２５０ナノメートル未満である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第１の部分のＺ方向の寸法は、３００ナノメートル未満である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの第１の部分のＺ方向の寸法は、１００ナノメートル未満である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第１の部分のＸ，Ｙ，Ｚ方向の寸法は、５０ナノメートル未満である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記第１の部分の点体積の少なくとも１つの寸法は５００ナノメートル未満である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１の部分の点体積の少なくとも１つの寸法は２５０ナノメートル未満である請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記第１の部分の点体積の少なくとも１つの寸法は１００ナノメートル未満である請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の部分の点体積の少なくとも１つの寸法は５０ナノメートル未満である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
活性化は、バルク中、溶液中、基板に吸着されて、懸濁液中、あるいはエマルジョン中である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
活性化は、２光子、３光子、あるいは４光子励起による請求項１記載の方法。
【請求項１３】
活性化により、前記前駆体組成物の重合または架橋が起こる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の部分は、第１の前駆体組成物から製作され、第２の部分は第２の前駆体組成物から製作される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の部分は、第１の波長で製作され、第２の部分は第２の波長で製作される請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は一般に、ナノスケールの構造を形成する方法及びこの方法により形成されたナノスケールの構造に関する。特に、この発明はナノメートルレベルの精度の構造を製作するための、多光子励起を用いた方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微小規模の微細構造を有する三次元物体は、特有のかつ技術的に魅力的な特性を備える。最近、ナノメートルレベルの精度を備えた構造、すなわち、ナノメートルレンジで測定可能な構造あるいは構造特徴を有する物体の製造に対し、特に関心が高まっている。そのようなナノスケールの構造は、約２から約１００ｎｍ（ナノメートル、１ｎｍ＝１０オングストローム）の範囲の寸法あるいは特徴を有し、その範囲は、大体、蛋白質及び蛋白質錯体などの巨大分子のサイズである。
【０００３】
小スケールの特徴を有する２次元構造を製造するには、Ｘ線及び遠紫外線を使用する方法を含むフォトリソグラフィーが周知である。しかしながら、この技術では、ｚ−方向で達成可能な複雑性が非常に限られているので、複雑な、湾曲した３次元表面を作製することができない。そのため、フォトリソグラフィーにより作製される３次元物体は、本質的には、円柱構造に限定されてきた。１５０ｎｍより小さい特徴を有する物体は、容易に作製することができない、あるいはごく普通に得ることができない。ジョージ  Ｍ．ホワイトサイデス（Whitesides）はまた、マイクロコンタクト印刷及び自己集合単一層を用いた表面化学の改良を基本とするマイクロスケールの作製方法のいくつかについて説明している。しかしながら、これらの方法は、第３次元、及びその化学において構築するのに非常に限定される。２光子励起を用いたポリエステルの反応による三次元光データ記憶及び検索構造を製造するための方法が、ストリクラー（Strickler）らに付与された米国特許第５，２８９，４０７号において開示されている。この内容は全て、この中で引用され参照される。
【０００４】
小規模特徴、例えば基底膜組織などのバイオミメティックマトリクストポグラフィーを有する３次元物体の合成について、多くの他の、異なるアプローチが説明されている。米国特許第５，７００，２４１において説明されているように、そのような構造は、上皮または内皮細胞層を除去し、支持基底膜またはマトリクスを暴露させることにより製造される。その後、暴露されたトポグラフィーは、ポリマー鋳造のための鋳型として使用される。得られたマトリクストポグラフィーの鋳造された負のレプリカの表面は、それ自体、選択された最終的な（生物）材料と共に鋳造される。この方法を用いると、三次元バイオミメティックマトリクスが、細胞生物学の実験研究のために、及び移植された生物材料に対する細胞及び組織応答を改善する可能性のために、調製されることが可能である。この方法では非常に複雑な三次元トポグラフィーが作成されるが、トポグラフィーの設計融通性が提供されない。というのは、すべての構成が、生物表面から開始しなければならないからである。さらに、多くの材料を製作に使用してもよいが、この手順では、化学の空間的制御が提供されない。
【０００５】
走査型トンネル顕微鏡もまた、表面上の原子を移動させるために、使用されていた。しかしながら、この技術は、製作される領域のサイズ及び化学において著しく限定される。マイクロスケールの構造の固体フリーフォーム製作について説明されている他の技術としては、流動媒質または他の床の表面での物体の連続する、隣接、断面薄層の形成が挙げられ、この連続薄層は、ハルに付与された米国特許第４，５７５，３３０において開示されているように、形成されるにつれ、自動的に統合され、所望の３次元物体を規定する。シーマ（Cima）らに付与された米国特許第５，５１８，６８０号においてもまた、溶剤中の粉末の層の連続印刷が開示されており、これにより、連続層が結合され、約１００μｍのオーダーの厚さを有する薬物供給装置の形成が可能となる。
【０００６】
３次元物体はまた、３次元体積の流体媒質内の所定の交差点に選択的に焦点が合わせられた紫外線（ＵＶ）照射ビームにより反応性流動媒質を選択的に硬化させることにより生成されている。このような合成の欠点には、ＵＶ照射を使用することが含まれ、ＵＶ照射では、高価で厄介な光学機械やレンズ、及び関連する焦点合わせ品質の悪いエキシマーや他のＵＶレーザ源が必要である。
【０００７】
３次元マイクロスケール物体を生成させる他の技術は、Ｓ．マルオ、Ｏ．ナカムラ、Ｓ．カワタらの「２光子吸収光重合を用いた３次元微小製作」と題する、光学レター、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２、ｐｐ．１３２−１３４（１９９７）において説明されている。この内容は、全体として、この中で引用され参照される。マルオらは、マイクロスケール構造は、ウレタンアクリレートモノマー及びオリゴマーを、非溶剤系において、近赤外レーザ光にさらすことにより形成されることを開示している。反応を開始させるのに２光子吸収を使用すると、直径６μｍ、軸方向ピッチ１０．３μｍ、幅約１．３μｍのらせんワイヤが得られる。小さいが、そのような構造はナノスケール範囲にはない。マルオらは、さらに、ほとんどの生物分子と不適合な非溶剤系における合成について説明しているだけである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、マイクロメートル及びナノメートル範囲の寸法または特徴を有する２次元または３次元構造のフリーフォーム製作方法、とりわけ蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどの生物分子サブユニット、及びホルモン、サイトカイン、薬物などの生物活性小分子を用いた合成に適する技術に対する必要性がまだある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
従来の技術の上記欠点及び他の欠点、及び欠陥は、本発明の方法及び装置により克服される、あるいはある程度軽減される。この発明では、小さな２次元または３次元構造が、前駆体組成物の多光子吸収光重合及び／または架橋、すなわち、多光子励起を用いた光重合により形成される。多光子励起の使用により、バルク相において及び溶液中で、蛋白質、脂質、オリゴヌクレオチドなどの合成ポリマー及び生物ポリマーを含む、広範囲にわたる有機及び無機前駆体サブユニットから、少なくとも１つの寸法が約１μｍ未満、好ましくは約５００ｎｍ未満、より好ましくは約２５０ｎｍ未満、最も好ましくは約１００ｎｍ未満である構造及び構造特徴の製作が可能となる。
【００１０】
１つの実施の形態では、２光子遠視野光学機械を用いると、Ｘ−Ｙ次元が約３００ｎｍ未満、Ｚ次元が約５００ｎｍ未満の構造を形成することができ、一方、３光子遠視野光学機械を用いると、Ｘ−Ｙ次元が約２５０ｎｍ未満、Ｚ次元が約３００ｎｍ未満の構造を形成することができる。特に好ましい実施の形態では、２光子遠視野励起と共に４ｐｉ光学構成を用いると、Ｘ−Ｙ次元が約１５０ｎｍ未満、Ｚ次元が約１００ｎｍ未満の構造を形成することができる。他の実施の形態では、多光子近視野光学機械を使用すると、Ｘ，Ｙ，Ｚ次元が約５０ｎｍ未満の構造が得られる。この実施の形態では、ファイバプローブによる２光子励起により、近視野製作が達成される。関連する実施の形態では、近視野の実施の形態の光学素子が多バレルピペットと結合され、複数の領域に同時にあるいは連続して成分が正確に配送されるようにされる。
【００１１】
この中で説明されている方法は、様々な小規模構造を形成するのに有効である。１つの実施の形態では、非架橋作用物質が、多光子励起により形成されたゲルまたはマトリクス内に（永久的にまたは一時的に）トラップされる。そのようなゲルまたはマトリクスは制御された、放出、分解、及び／または拡散係数特性を有する。作用物質には、蛋白質、ペプチド、炭水化物、薬物、酵素、リポソーム、ヌクレオチド、及び細胞が含まれる。関連する実施の形態では、様々な架橋密度及び／または化学的性質を有する装置を製作するのに多光子励起が使用され、薬物供給、生物材料、組織工学、及び環境適用における制御された放出装置として使用するための様々な分解特性を有する材料が生成される。
【００１２】
他の実施の形態では、多光子励起が使用され、生物材料あるいは従来通りに製作された材料が改良される。材料は複雑な表面特徴を有してもよく、あるいはこの方法を使用して、材料に複雑な特徴を付与してもよい。例示的な適用としては、集積回路（ＩＣ）チップに１つ以上の生物活性機能を追加すること、組織細胞培養物と共に使用するためのバイオミメティック表面を製造すること、外植した組織を再移植または他の用途のために修飾することが含まれる。顕微鏡と多光子励起を組合せると、１つの表面上に１つ以上の特徴のマイクロ配置が可能となる。関連する実施の形態では、多光子励起が使用されて、繊毛のある表面または運動性蛋白質を使用する他のマイクロサイズの輸送装置が製造される。
【００１３】
他の実施の形態では、多光子励起が使用されて、収縮または拡張効果と共に、動的形状変化効果（すなわち、ポアソン比効果）、及び／または所定の化学条件下で活性な官能基により、より複雑な構造となる構造が作製される。そのような構造は、可変フィルタとして、または物理的力を働かせ、流体流を変化させるなどのスモールスケールアクチュエータとして、使用されてもよい。関連する実施の形態では、光学装置は、光学的に活性でキラルな化合物を配列させることにより、層状に、及び／または他の２次元または３次元構成で製造される。
【００１４】
他の実施の形態では、多光子励起が使用され、基質上または基質内での酵素の空間的な配向または製造構築物が提供される。組織化は、静電場、選択的吸着、せん断力の適用により、及び光学的及び磁気的トラップにより、提供される。
【００１５】
他の実施の形態では、蛋白質は、光増感剤及び化学架橋剤を使用せずに、直接架橋される。
【００１６】
他の実施の形態では、多光子励起が使用され、光ファイバを介して遠隔部位でのナノ製作が達成される。そのような光ファイバは、例えば、カテーテルの内部に配置してもよい。この実施の形態におけるナノ製作は、薬物または他の生物学的に活性な作用物質の供給、組織工学足場（scaffolding）薬、成長因子などの制御された供給、及びステントなどの構造要素または装置の最小侵襲性組立てを含む。
【００１７】
この発明の方法及び装置により、以前に可能であったものより小さな寸法の構造の形成が可能となる。この発明の上述の特徴及び他の特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図面により、当業者に理解されるであろう。
【００１８】
図において、同様の要素には同様の符号が付してある。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、前駆体組成物の多光子誘起重合または架橋により小さな２次元または３次元構造が形成される。便宜上、この中で使用されるように「構造」及び「構成」は、全体としてマイクロスケー−ル及びナノスケールの物体の両方、すなわち、全部のＸ−ＹまたはＸ−Ｙ−Ｚ寸法がμｍ及びｎｍ範囲内にある物体、及びＸ−ＹまたはＸ−Ｙ−Ｚ寸法がμｍ及びｍｍ範囲内にある特徴を有するより大きな物体を示す。この中で使用されているように、「多光子励起」は、反応分子による多数の光子の同時吸収を意味する。この方法は特に、μｍ及びｎｍスケールの寸法を有する３次元物体または構造、すなわち約１μｍ未満の寸法を有する点体積の要素、好ましくは少なくとも１つの寸法が約５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ未満である要素、最も好ましくは約５０ｎｍ未満の要素から構築された構造の形成に適している。構造形状は、最終構造の所望の形態により規定されるように、前駆物質の光励起及び反応のために使用される光学的方法、レーザ及び／またはステージの移動、前駆物質の選択に依存するであろう。以下の説明はレーザー励起に関するものであるが、十分な光子密度を達成するための他の方法もまた本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。
【００２０】
図１において概略が示されているように、光子源、例えばパルス近赤外レーザー１２は、光学機械１３を介して、放射線誘起光重合または架橋が可能な前駆体組成物１４内に焦点が合わせられる。特に好都合な特徴では、前駆体組成物１４は水溶液である。前駆体組成物１４は、ステージ１６上に配置され、このステージはＸ，Ｙ及び／またはＺ方向に移動することができる。焦点が合わされた波長は、線形光学機械で反応種の光活性化を行うのに必要なものの大体偶数の倍数であり、多光子励起が得られる。しばしば、単一光子吸収により通常到達される現実の励起状態はまた、２量子の吸収により励起されてもよい。この場合、それぞれが単一光子のエネルギーの半分を有する。あるいは３量子の吸収により励起されてもよい。この場合、それぞれが単一光子のエネルギーの３分の１を有する。多光子励起状態は、しばしば、単一光子励起状態のために必要とされる波長の正確な偶数倍数ではない。重要なことは、光子が同時に分子上に衝突しなければならないことであり、そのため、励起速度は、入射強度の２乗に比例する。そのため、励起は、強度が非常に高い楕円焦点体積に制限される。このように、励起に必要な波長の２倍の波長の２光子、あるいは励起に必要な波長の３倍の波長の３倍長い光子、あるいは反応種の励起に必要な波長の４倍の波長の４光子が、活性化に使用される。
【００２１】
２光子レーザー吸収または３光子レーザー吸収に、それぞれ、関連する２乗または３乗点−広がり関数（スプレッドファンクション：spread function）により、小体積の反応種だけが印加された放射エネルギーに暴露される。光子密度が高い場合、ＵＶまたは短波長光子を吸収することができる焦点の分子は、２（または３）の近赤外光子を同時に吸収し、これにより、ラジカルまたはラジカルイオンなどの少なくとも１つの反応種が形成される。この反応種はその後反応し、あるいはラジカル、あるいはカチオン系連鎖反応を介して伝播し、これが連鎖停止段階に達するまで続き、これにより、重合または架橋領域が形成される。
【００２２】
２次元または３次元物体１８は、光子ビーム及び／またはステージ１６を、逐一所望の構造が構築されるまで、連続して移動させ続けることにより形成される。例えば、レーザーの連続移動により、光をＸ−Ｙ面上に向けてもよい。その後、ステージをＺ方向に適当な量だけ移動させると、第２、第３、それ以上のＸ−Ｙ層状構造が形成される。この３次元構造形成方法は、シーマ（Cima）らにより説明されている連続層形成と同様であるが、この方法では、３つの全ての面でより小さな特徴を有する構造を形成することができる。この方法はさらに、この形成順序に限定されず、レーザー／ステージ移動のどのような組み合わせを使用してもよい。このように、ステージの移動のみを開示しているマルオらの方法は、１μｍより大きな構造の形成に制限される。これはおそらく、光学機械及び他の条件によるためであり、さらに、ステージの移動が遅いからでもある。マルオらにより説明されているステージ移動を基本とする最も速い体積形成は、１、あるいは１０、ｍｓあたり１ピクセルである。一方、レーザーの移動はより速く、１ｍｓあたり１ピクセルの形成のオーダーである。このように、３次元複雑度の高い構造が、より短い時間で達成可能である。
【００２３】
多くの利点が、本発明にかかる多光子励起の使用により得られ、ｘ−、ｙ−、ｚ−方向における新たな程度の制御ができる、バルクまたは溶液相サンプル深くでのプローブ探査が可能となり、焦点より上または下での光学的効果は最小となる。このように、多光子励起を使用すると、様々な生物分子を用いて合成することができる。というのは、赤外光、赤色光、遠赤色光、可視光照射では、ＵＶ光に比べ、ＩＲ及び赤色光の吸収及び散乱が最小に抑えられるため、焦点近傍の蛋白質、酵素、または有機分子への損傷が最小に抑えられるからである。ＩＲ及び赤色光を使用すると、組織内、あるいは血液などの混濁した媒質を通して、製作することもできる。他の利点は、活性化ゾーン（高光子密度領域）の焦点を部分的に不活性基板内または活性化が起こらない他の場所内に合わすことにより、製作される特徴のサイズを光子源の焦点よりもずっと小さな領域に制限することができることである。
【００２４】
他の利点は、遠赤色、赤色、赤外及び他の可視光光学機械は、ＵＶ照射を使用する活性化の場合に比べ、より安価で、煩わしさが少ない。これらの波長で作動させるレーザーはまた、従来のＵＶエキシマーレーザーとは異なり、回折制限光源を提供する。ＵＶ活性化を使用すると起こりうる損傷あるいは望ましくない副反応無しで、より広い範囲の分子活性化が有効である（遠紫外）。光の伝達に光ファイバを使用することが容易で、ＵＶ関連光学機械を使用する場合に比べ、より高いエネルギー、より少ないビームの広がり、より良好な視準、より少ない色の広がりが得られる。
【００２５】
本発明の実行においては、現在のところ、非線形光学機械が好ましい。フリーフォームの製作においては非線形光学機械を使用すると多くの利点がある。最も重要な利点１つは、線形赤外光学機械により達成可能な領域よりも小さな領域に制限されるより高いエネルギーピーク出力が得られることである。２光子レーザー走査顕微鏡の実際の実現については、Ｗ．デンク（Denk）、Ｊ．Ｈ．ストリックラー（Strickler）及びＷ．Ｗ．ウエッブ（Webb）らが、サイエンス、Ｖｏｌ．２４８、ｐ７３（１９９０）において説明している。この内容はこの中で引用され参照される。２光子励起の他の使用および説明については、Ｏ．ナカムラがオプティーク（Optik）、Ｖｏｌ．９３，ｐ．３９以下参照（１９９３）において、Ｏ．ナカムラ及びＴ．タカダがオプティーク、Ｖｏｌ．１００，ｐ．１６７以下参照（１９９５）において、Ｅ．Ｓ．ウ（Wu）、Ｊ．Ｈ．ストリックラー、Ｗ．Ｒ．ハーレル（Harrell）及びＷ．Ｗ．ウエッブがＰｒｏｃ．ＳＰＩＥ、Ｖｏｌ．１３９８，ｐ．１０７以下参照（１９９０）及びストリックラー及びウエッブに付与された米国特許第５，２８９，４０７号において、ワタナベ、Ｍ．オカワ、Ｕ．ウカチ、Ｆ．クリハラ、Ｈ．ハリマヤがＲａｄＴｅｃｈ，Ｊａｐａｎ（１９９３）により刊行されたＲａｄＴｅｃ  Ａｓｉａ  １９９３の会報、ｐ．４６２において、さらに説明している。これらの関連箇所もまた、この中で引用され参照される。Ｋ．リーバーマン（Liebermann）、Ｓ．ハルシュ（Harush）、Ａ．ルイス（Lewis）及びＲ．コペルマン（Kopelman）による「光波長よりも小さな光源」、サイエンス、Ｖｏｌ．２４７、ｐｐ．６１（１９９０）もまたこの中で引用され参照される。
【００２６】
好ましい実施の形態では、２光子広視野（遠視野）励起を使用することにより、Ｘ−Ｙ寸法が約３００ｎｍ未満で、必要に応じてＺ寸法が約５００ｎｍの個々の点体積を有する構造が形成される。一方、３光子遠視野励起では、Ｘ−Ｙ寸法が約２５０ｎｍ未満で、必要に応じてＺ寸法が約３００ｎｍの個々の点体積を有する構造が形成される。２光子または３光子遠視野（非線形）光学機械と共に使用するのに適した装置２０の概略図が、図２に示してあり、ステージ１６は開口数（ＮＡ）の高い対物レンズ２２の真下に配置される。ＰＣ制御装置２６は、レーザーシャッター２８とステージ１６の制御を行う。好ましい光子源は、Ｔｉ：サファイアレーザー２５と縦に並んだアルゴンイオンポンプレーザー２３を含む。光学ガルボ（galvo）スキャナ２７により活性化ゾーンの微調整が可能となる。
【００２７】
他の好ましい実施の形態では、２光子励起と共に４ｐｉ遠視野光学構成により、Ｘ−Ｙ寸法が約２５０ｎｍ未満で、Ｚ寸法が約１００ｎｍの個々の点体積を有する構造が形成される。蛍光顕微鏡と組み合わせた４Ｐｉ光学機械については、Ｓ．ヘル（Hell）及びＥ．Ｈ．Ｋ．ステルツァ（Stelzer）が、「２光子励起を用いた４Ｐｉ−共焦蛍光顕微鏡による分解能の基本的な改善」、光学通信（Optics Communication）、Ｖｏｌ．９３、ｐｐ．２７７−２８２８（１９９２）において説明している。この内容は、全体として、この中で引用され参照される。図３の装置は、この実施の形態の実行に適しており、光子源３２、ステージの上及び下に配置された２つの高ＮＡレンズ３２，３４を備える。第２の可動ステージ３６により、光学レベル未満までレーザビームの位置の微調整が可能となり、フェムト秒の光子パルスが、一時的に製作部位で重なるように調整することができる。サンプルの上下両方の対物レンズからの励起を使用することにより、光学分解能が改良される。２つのビームは空間的にかつ時間的に正確に整合され、出力レベルは注意深く、どちらかのビーム単独で有意な励起が起こらないように調整される。
【００２８】
４Ｐｉ光学機械は、サンプルの上下両方に、対物レンズ要素を必要とする。このように、背の高いあるいは厚い物体の製作は、この点から約２００μｍまで最も高い分解能で、対物レンズ要素の作動距離により制限される。さらに、支持材料及び作製される品目は、適当な可視、赤色または赤外波長で透明でなければならない。しかしながら、この方法ではまた、２つの対物レンズ要素の共通の焦点における高い光子密度により、優れた空間精度で非常に迅速に、非常に小さな特徴を作製することができる。このように、この実施の形態は、複雑な特徴を有する薄い物体、例えばフォトリソグラフィー用のマスク、コーティング、膜、及びセンサの製造に特に有効である。
【００２９】
他の実施の形態では、多光子近視野光学機械を使用することにより、Ｘ，Ｙ，Ｚ寸法が約５０ｎｍ未満である点体積を有する構造が形成される。図４の装置４０は、この実施の形態の実行に適しており、近視野光ファイバ要素４２と共に結合される光ファイバカプラ−４２，４６を備える。近視野光学励起では、励起波長よりもずっと短い距離にある小さな開口から光を用いてサンプルに信号を送ることにより、光学顕微鏡の回折制限（λ／２）分解能が回避される。走査型近視野光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）の制限面は、光ファイバ開口を通過する光子束である。典型的には、プローブはアルミニウムでコートされ、光は近視野に制限される。しかしながら、これらのプローブは、連続波励起の数ナノワット上の出力レベルで損傷される。コートされていないプローブは、ずっと高いレーザー出力を伝達することでき、外（エピ−：epi-）照射構造において使用しても、光学回折制限より下の分解能を提供することができる。ＳＮＯＭはまた、固定サンプル上のコートされていないプローブを介する連続波２光子励起を用いて説明されている。これにより、１プロトン励起（ＯＰＥ）により可能なものより良好な軸方向の制限が示された。近視野製作では、例えば、コートされていない片持ちファイバプローブが使用される２光子励起が採用される。必要に応じて光学顕微鏡４８がイメージング要素として提供されてもよい。この方法は、レーザまたはステージ走査により製造されるより大きな物体上に部分光学特徴（５０−１００ｎｍ）を書き込むのに効果的である。この技術は、単一蛋白質または酵素分子を統計学的に局在化させるなどの生物学的プロセスの制御に、特に適用することができる。
【００３０】
他の実施の形態では、近視野の実施の形態の光学要素を多バレル（マルチプル−バレル：multiple-barrel）ピペット（図４の陰で示されている）と共に結合させ、認識された領域に特定の成分を非常に正確に供給させる。光供給ピペットの内側を不透明な材料でコートすることにより、あるいはその逆に、試薬供給ピペットの内側を不透明材料でコートすることにより、多バレルピペットの１つのバレルを通って光の供給を起こしてもよい。非常に少量の材料をミクロピペットで取ることは当分野では周知であり、例えば、シリンジポンプ、超微量シリンジポンプ、あるいはイオン導入法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。複数の作用物質を同時にあるいは逐次供給するために、あるいは、１回以上の洗浄、作用物質の供給、再び１回以上の洗浄という順序のために、抱き合わせ（バンドルド：bundled）マイクロピペットが使用される。その代わりに、イオン導入法を用いて、より細かい（より少量の）供給を達成してもよい。供給される作用物質の量は、マイクロピペットのサイズ、または供給時間を変えることにより変更してもよい。
【００３１】
様々な前駆体物質が、そのような組成が、焦点近くでの重合及びまたは架橋のために使用される放射線を実質的に吸収しない限り、本発明において使用するのに適している。実質的に透明であるため、レーザービームのより正確な焦点合わせ、望ましくない副反応の抑制が可能となる。可視、近赤外、赤外、あるいは遠赤色照射を使用することにより、焦点に隣接する前駆体への損傷が最小に抑えられる。というのは、ほとんどの有機分子、ポリマー、蛋白質、核酸、脂質の吸光度及び散乱断面は、赤色及び近ＩＲ波長では、最小であるからである。本発明にかかる前駆体溶液の反応は、バルク中（液体または固体相において）、溶液中、基板に吸着されて、あるいは懸濁液またはエマルジョン中で、起こってもよい。構造を製作するのに使用される放射線に対し、どの溶剤も、実質的に透明でなければならない。
【００３２】
１つの型の適した前駆体組成物は、光開始で、（通常、フリーラジカルまたはカチオンメカニズムにより）重合可能あるいは架橋可能である。そのため、光開始可能な重合可能あるいは架橋可能前駆体組成物は、通常、フリーラジカルまたはカチオン連鎖成長工程及び連鎖停止工程が可能なモノマー、オリゴマー、及び／またはポリマー及び／または架橋剤と共に、反応を開始するための開始剤を含む。この開始剤は、架橋剤、モノマー、オリゴマー及び／またはポリマーに、共有結合により結合してもよく、あるいは結合しなくてもよい。
【００３３】
ラジカル重合に適した光開始剤としては、アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ化合物、過酸化ベンゾイルなどの過酸化物、ケトン及びジケトンなどの脂肪族カルボニル化合物、ベンゾフェノン及びその誘導体などの芳香族ジケトン、及び９−フルオレノン２−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の光開始系としては、水溶液系で有効な酸化還元型光開始剤（例えば、Ｆｅ3+ＯＨ-、及びＰｂ2+Ｃｌ-などのイオン対）、エオシン、ローズベンガル、及びエリトロシンなどの感光染料、有機ハロゲン化物の存在下でのＭｎ2（ＣＯ）10などの遷移金属誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
適したフリーラジカル重合可能化合物としては、少なくとも１つのオレフィン（不飽和）結合を有する架橋剤、モノマー、オリゴマー及び／またはポリマー、例えば、ポリアルキレン類及びハロゲン化ポリアルキレン類、ポルアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリアクリルアミド類及びスチレン類を形成する架橋剤、モノマー、オリゴマー及び／またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
カチオン重合用の光開始剤としては、複雑な金属ハロゲン化物アニオンとのトリアリールスルホニウム及びジアリールヨードニウム塩類、及び複雑な金属ハロゲン化物アニオンのアレーンシクロペンタジエニル金属塩類、例えば（６−ベンゼン）（５−シクロベンタジエニル）Ｆｅ（ＩＩ）ヘキサフルオロホスフェートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。適したカチオン重合可能な化合物としては、シクロヘキセンオキシドなどのエポキシド類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
光重合可能な前駆体組成物はまた、この発明と共に使用するのに適している。光重合組成物においては、各成長工程は、入射放射線の影響を受け、光重合は、ビスアリールアジドなどの光架橋剤または光架橋可能なオリゴマー及びポリマーを用いて達成しても良い。そのようなオリゴマー及びポリマーは、互いに、光誘起化学結合を受ける発色基を含む。発色基は、ポリマーバックボーン内に存在しても良く、例えばバックボーンカルコン基、あるいは吊り下がっていても良く、例えばポリ（ビニル桂皮酸）である。
【００３７】
適した前駆体の上記説明は、便宜上の目的のみにより、反応機構により分類される。他の重合可能なあるいは架橋可能な前駆体もまた、それだけで、あるいは他の光開始剤と共に組合され、それらは本発明の範囲内にあり、重合の正確な機構（例えば、ラジカル重合、一電子重合、あるいは光重合）は明確には知られていない。このように、本質的には、光活性化され、中間の架橋剤と共にあるいは無しで、製作される構成と共に架橋を形成し、焦点の外側では放射線に対し実質的に透明である前駆体組成はいずれも本発明の範囲内にある。そのような前駆体としては、上述の、あるいは他の有機モノマー（染料及びキラル種を含む）、オリゴマー及びポリマー（生物ポリマーを含む）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
生物学的モノマー及びポリマーは特に興味ぶかく、アミノ酸類、ペプチド類、蛋白質類；脂肪酸類及び脂質類；ヌクレオチド類、オリゴヌクレオチド類、及びそれらの合成類似物質；核酸類；糖類及び炭水化物類；サイトカイン類、ホルモン類、レセプター類、成長因子類、薬物などの生物活性作用物質；光活性合成作用物質（無機化合物を含む）；ケージ化合物及び発蛍光団などの光活性生物化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの分子はナノ製作には容易には適さない、というのは、これらの分子はＵＶ光にしばしば感応し、溶液中で反応させなくてはならないからである。これらの問題は、この発明により解決される。
【００３９】
以下の実施例で説明されるように、様々な構造の多くの有機ポリマーが製作されている。ポリウレタン構造は、ノーランド（Norland）からオプティカルアドヒーシブ（Optical Adhesive）＃８３Ｈという商標名で市販されている光接着剤製品を用いて組立てられ、架橋されている（図５，６，７Ａ−Ｂ）。図５は、実施例１で説明されているポリウレタン前駆体水溶液の２光子誘起重合により形成された複数のポリウレタンロッドのＳＥＭ像である。図６は、２光子励起により製作したポリウレタンシートの走査型電子顕微鏡写真である。製作後直ちに透過光顕微鏡を用いて行った観察に基づくと、シートは製作時には単一であった。このように、ＳＥＭにおいて観察されるでこぼこは、ＳＥＭイメージングのための調製において、洗浄及び空気乾燥により引き起こされた人為構造である。最後に、図７Ａ及び７Ｂは、ポリウレタン前駆体の２光子励起を用いて製作されたピラミッド構造の連続層構造を示す、低倍率（７Ａ）、高倍率（７Ｂ）でのＳＥＭ像である。
【００４０】
トリメチロールプロパントリアクリレートは、ローズベンガル（２光子励起）またはフルオレノン（３光子励起）と共に重合されている。図８は、９−フルオレノン−２−カルボン酸及びトリエタノールアミンの存在下、３光子活性化により重合されたトリメチロールトリアクリレートのロッドにより形成された格子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。図９は、多格子励起により製作された重合トリメチロールトリアクリレートシートの積層された層の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。像中のトップ層は、ＳＥＭ用に調製する間に後に剥がれ、内側の層状構造が現れている。製作は、トリエタノールアミンの存在下、９−フルオレノン−２−カルボン酸の３光子活性化により開始された。
【００４１】
いくつかの活性化剤の存在下、２光子励起を用いるアクリルアミドの重合は、図１０の３次元構造を製作するのに使用されている。この図では、４０％のポリアクリルアミドの３層から製作されたピラミッドが示されている。
【００４２】
製作はまた、生物学的に活性な分子を用いて説明されている。水溶液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、可溶性球状血漿蛋白質）は、ローズベンガルの存在下（図１１，１２，１４）及び光開始剤９−フルオレノン−２−カルボン酸及びトリエタノールアミンの存在下（図１３）において、重合されて、合成構成となる。図１１は、重合されたウシ血清アルブミン（垂直線）及びポリウレタン（水平線）を含む複合格子のＳＥＭ像である。図１２は、テキサスレッド（分子プローブ）を用いて標識したＢＳＡの幾つかのロッドを示す蛍光顕微鏡写真である。ロッドは、活性化剤としてローズベンガルを用いて、ＢＳＡの水溶液から２光子励起により製作された。図１３Ａ（低倍率）及び１３Ｂ（高倍率）は、９−フルオレノン−２−カルボン酸及びトリエタノールアミンの存在下、３光子励起により形成されたロッドのＳＥＭ像である。図１４は、ローズベンガルの存在下、２光子活性化を用いて重合ＢＳＡから製作したピラミッドのＳＥＭ像である。
【００４３】
形成された構成の最終的な寸法及び重合または架橋度、最終構造の最終的な特性及び寸法には多くの因子が影響する。このような因子はしばしば相互に関係付けられ、例えば、焦点のサイズ、前駆体の正体、架橋またはポリマー形成のメカニズム、反応基の置換パターン、中間体の安定性、中間体または前駆体の拡散、競争反応、反応促進剤または阻害剤の存在、などが挙げられる。例えば、理論に縛られずに、より小さな構造寸法は、より安定でない反応中間体が生成されると、あるいは連鎖成長反応の数が制限されると、本発明の方法により得られると仮定される。より大きな構造は、より安定な中間体を使用して合成しても良く、これにより、ラジカル種の１つまたは組み合わせがレーザーの焦点から拡散して離れることができ、あるいは連鎖重合がレーザーの焦点を超えて起こることができ、連鎖停止工程が起きた時のみ終結する。より小さな種はまた、レーザーの焦点を超えて拡散することがあり、これにより最終的により大きな構造が得られる。部分的に、他の不活性な位置の不活性基質内にある光子密度の焦点により、より小さな構成が得られるであろう。
【００４４】
しかしながら、ポリウレタンとアルブミンの場合、フリーラジカル（あるいは一電子）重合または架橋が起きてもよいが、形成されるフリーラジカルの不安定性または連鎖停止工程のエネルギー学的な優待性のため、限られた程度までのみ起こすことができる。その代わりに、光重合のみが起きても良く、これは本来レーザーの焦点に限定されるものである。とにかく、形成された構造のサイズは、レーザー焦点のサイズだけでなく、前駆体組成物の性質にも依存し、安定性の低いラジカルまたは他の中間体により、より小さな寸法を有する構造が得られる。
【００４５】
本発明の重大な利点は、ほとんど制限のない形状を有するマイクロ及びナノサイズの構造の製作が可能なことである。上述したように、２次元または３次元物体は、レーザービーム及び／または反応種を含むステージを連続的に移動させ、それを所望の構造が逐一形成されるまで続けることにより形成される。このように、最終構造の形態は、少なくとも部分的には、重合のために使用するビームまたはステージの位置制御に依存する。
【００４６】
前駆体を逐次変化させることにより、複数の材料を含む物体も製作することができる。その代わりに、異なる波長感度を有する前駆体を、１つの可変波長レーザーまたは複数のレーザーと共に使用してもよい。波長を変えることにより、同時に２以上の構成要素の選択製作が可能となる（このプロセスは、図１に概略が示されている）。本発明の製作方法は、また、他の製作方法、例えば、光学的にナノ製作されたケージ、ゲル、またはマトリクス内での化合物の物理的トラッピングと共に使用してもよい。
【００４７】
１つの実施の形態では、多光子フリーフォーム製作が使用されて、活性な（好ましくは生物活性な）作用物質が３次元光架橋及び／または光重合されたゲルまたは構成中に配置され、このゲルまたは構成は、制御された放出、分解及び／または拡散特性を有する。そのように配置することができる生物活性作用物質としては、成長因子類、ヌクレオチド類（ＤＮＡ、ＲＮＡ，アンチセンス）、イオン類、緩衝薬、染料類、蛋白質類、ペプチド類、炭水化物類、グリコサミノグリカン類、酵素類、ヌクレオチド類、リポソーム類、細胞及び薬物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。作用物質または作用物質類の構成からの拡散は、制御された放出が実行されるように、あるいはトラップされた作用物質または作用物質類を暴露させ、あるいはそうでなければ構成表面または他の界面に運び、生物活性を可能とするように調整される。拡散は、１つの方法または方法の組み合わせにより、例えば、作用物質または作用物質類の構成に対する親和性の制御、構成の架橋密度の程度の制御、あるいは構成の分解速度の制御により、制御される。作用物質または作用物質類の構成に対する親和性の程度の制御は、構成成分、例えばバックボーン及び／または架橋成分の適当な選択により達成してもよい。異なる架橋部分の使用により、２以上の作用物質の相対的な親和性の調整が可能となる。異なる構成親和性を有する作用物質のエントラップメントにより異なる速度での制御された放出が可能となる。
【００４８】
拡散及び分解特性の制御は、局所的に架橋または重合密度を変化させることにより、化学的に均一なゲル内で最も容易に達成される。これはまた、照射時間、強度（光子エネルギー密度）を変化させることにより、及び／または、ゲルの空間寸法の変動、トラップされた試薬を含まないゲルのオーバー層の追加、他の３次元パターニングを含む、ゲル構造を変えることにより達成してもよい。拡散及び分解の制御はまた、ゲルの化学的性質を変化させることにより、例えば、異なるモノマーを用い架橋化学的性質を変化させることにより、及び他の反応成分を変化させることにより、重合または架橋速度を変化させることにより、達成させることができる。
【００４９】
他の実施の形態では、多光子フリーファーム製作が使用されて、活性な（好ましくは生物活性な）作用物質が、３次元光架橋及び／または光重合ゲルまたは構成内により永久的に配置される。アルカリホスファターゼが、実施例７で説明されているようにポリアクリルアミドゲル内にトラップされている。より密度の高いゲルは縁からゲル内への試薬の拡散を阻害する。酵素活性はまた、構成が基板により接近して接触している領域では減少する。試薬の拡散はこれらの領域では阻害されると仮定される。
【００５０】
この実施の形態の１つの型では、そのようなトラップされた作用物質には、ゲルまたは構成体内に拡散する分子上で、その分子がゲルまたは構成体から拡散して出て行くまで連続的に作用する酵素が含まれる。他の型では、そのようなトラップされた作用物質には、ゲル内に拡散する分子上で作用し、この作用によりゲルまたは構成から離れることができない、トラップされた酵素、キレート化剤、または他の分子が含まれる。トラップされた作用物質は、濾過またはトラップ機能を提供し、この機能はバイオセンサ及び他の検出への適用において有効であるかもしれない。この実施の形態の他の型では、そのようなトラップされた作用物質として、トラップされた運動性蛋白質類、ペプチド類、あるいは、特定の分子、イオンまたは他の作用物質がゲル内に拡散すると製作された構成が振動し、形状が変化し、拡散特性が変化することができるようにする非生物化学構造が挙げられる。この実施の形態の他の型では、そのようなトラップされた作用物質としては、所定の波長、偏光または他の光の状態で照射されると、色、屈折、拡散、輸送、形状または他の物理特性あるいは生物化学活性を変化させるトラップされた光力学的分子が挙げられる。この実施の形態の他の型では、そのようなトラップされた作用物質として、イオン、ｐＨ、生物分子などのゲルまたは他の構成体内に拡散する化学作用物質の活性により、色、屈折、拡散、輸送または他の物理的及び／または生物化学的特性を変化させるトラップされた化学活性分子が含まれる。
【００５１】
トラップされた蛋白質を含むゲルの製造は特に、ナノメートルからミクロメートルスケールで機能する検出及び分離システムの製作に有効である。この型の製作されたゲルの例としては、ナノ−オクタローニー（Ochterlony）−様免疫拡散アッセイ（抗原―抗体沈降に対する）、ナノスケールポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル、光学的に製作されたナノスケールの勾配密度を有するＰＡＧＥゲル、及びサザーンブロット、ウエスタンブロット、ノーザンブロット及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ウエルなどのナノスケール分離及び検出システムからなる群から選択される蛋白質類のエントラップメントが含まれる。
【００５２】
特に、生細胞のエントラップメント（またはエンキャプシュレーション）は、組織工学、細胞培養、細胞バイオリアクター及び検出（バイオセンサ）システムにおいて適用できる。そのようなエントラップメントは一時的なものでも永久的なものでもよい。多光子顕微鏡の細胞の生存度に対する影響は、一般に、使用される波長が長く、励起ゾーンが空間的に高い制限を受けるため、最小である。このように、製作の光学的側面は、細胞エントラップメントに大きな妨害を与えないように思われる。
【００５３】
エントラップメントには、構成、例えばゲルまたは足場などの構成内での細胞の物理的エントラップメント、細胞表面の構成への化学的架橋あるいは１つの細胞の他の細胞への架橋の両方が含まれる。細胞のエンキャプシュレーションは、細胞の周囲での構成の重合によるものである。必要であれば、光損傷の可能性は、そのようにトラップされる細胞に直接接触せずに細胞の周りに「箱（ボックス）」を構築することにより、最小に抑えられる。製作のための光学ゾーンは数百ナノメートルに限られており、これは、１つの細胞よりもずっと小さいので、光励起は特定の細胞領域に限定することができる。このように、この発明は、直接構成を、例えば、細胞表面糖蛋白質類に直接結合させることにより、細胞を構成に直接架橋させるまたは「つなぐ」ことを含む。これにより、足場上に細胞を確実に配置する手段が提供される。この適用のための好ましい細胞は、丈夫な細胞壁を有する細胞、例えば、細菌及び植物細胞である。多光子励起はまた、トラップされている細胞内または細胞間の架橋を提供するのに使用してもよい。
【００５４】
他の実施の形態では、多光子励起を用いて、複雑な組織、化学的性質、あるいは生物化学的性質を有する材料の表面が修飾される、あるいは複雑な組織、化学的性質、あるいは生物化学的性質が表面に提供される。例示的な表面修飾としては、多光子媒介架橋による細胞表面への活性作用物質の直接付着が挙げられる。これにより、作用物質の特定の細胞への供給が容易になり、飲作用プロセスにより補われ、これらの作用物質は細胞内に取り込まれる。他の実施例は、１以上の生物活性機能または検出要素を、集積回路や他のデバイスなどの基板に追加するものである。そのような機能または要素の細密な位置決めを、装置の顕微鏡部分を用いて行う点に、この技術の重要な利点がある。そのような表面修飾の例は、血小板の付着用のフィブリノーゲンの足場の製作である。図１５Ａは、架橋したフィブリノーゲンを含む線に付着したヒト血小板のＳＥＭ像であり、このフィブリノーゲン自体が、製作されたアルブミンの長方形領域のトップ上で製作される。ほとんど全ての血小板が、フィブリノーゲン特徴に付着し、あるいはフィブリノーゲンに付着する他の血小板に付着している。ＢＳＡバックグラウンドに付着した血小板は最小の拡散を示す。対照的に図１５Ｂでは、ＢＳＡまたはフィブリノーゲン構成を有しておらず、ランダムな付着パターンが現れ、広範な血小板拡散が見られる。
【００５５】
表面修飾を採用するとりわけ有効な適用は、組織細胞培養と共に使用するためのバイオミメティックな表面の製造であり、とりわけ、内皮下及び外皮下細胞外マトリクス及び基底膜などの生物組織、及び他の組織トポグラフィーを模写する表面の提供である。米国特許第５，３８０，５８９号及び５，７００，２４１号が、このことについて、関連している。骨インプラントの表面は、フィンク（Fink）らに付与された米国特許第５，３７０，６９２号において説明されているように修飾されてもよい。この内容はこの中で引用され参照される。
【００５６】
多光子励起を用いた表面修飾の他の例は、空間的に組織化されるように、例えば、製作された構成にキネシン、微小管、アクチン、アキソネム、鞭毛、または他の運動性構造体を付着させることにより、運動性蛋白質を用いてマイクロマシンを製造するものである。これは、繊毛のある表面、または分子を所望の経路に沿って輸送する装置を製造するのに使用され、あるいは生物化学的駆動メカニズムを使用して移動する装置を製造するのに使用される。
【００５７】
他の実施の形態では、多光子製作が使用されて、バイオセンサ、環境センサ及び化学センサが製造される。例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドを使用するバイオセンサアレイチップの概略図を、図１６に示す。現在の技術では、１平方センチメートルあたり１．５×１０3のアッセイ部位を達成することができる。この発明のナノ製作技術は、控えめに言っても、多光子励起を用い、２次元で、１．６×１０9アッセイ部位／ｃｍ2の密度を達成することができ、あるいは、控えめに言っても、多光子励起を用い、３次元で、６．４×１０11アッセイ部位／ｃｍ2までの密度を達成することができる。ロックハート（Lockhart）らに付与された米国特許第５，５５６，７５２号は、スクリーニングのために有効な固体支持体上の二本鎖オリゴヌクレオチドの１つのアレイが開示されている。この内容はこの中で引用され参照される。
【００５８】
他の実施の形態では、この発明は、基板に対する、あるいは製造された構成内における、酵素、抗体、レセプター、リボソームなどの空間的な配向を提供し、そのような組立てから有効な生物化学的または化学的な仕事を生成するように使用される。これらの「生物化学工場」は、全体の組織または人口品において、新規構造が生成されるという意味で、バイオミメティックでもよい。このような工場は酵素のアレイを含み、電子伝達を実行し、生物化学合成を実行し、分離を実行し、溶液中の生物分子を特定の配向を有する製作装置内の生物分子と相互作用させる。
【００５９】
適当な空間及び生物化学組織を用いた製作により、幾つかの酵素は、合成、分解、輸送、形質導入、及び／または他の機能のために、添加された反応物上で順番に作用することができる。製作中に酵素の適当な配向などを達成するために、静電場及び磁場、せん断力、レーザーピンセット及び磁気ピンセットなどの外力を印加してもよい。適した配向は、また、チャペロン（chaperone）などの他の分子を用いることによる自己組織化を認めることにより、及びフレキシブルなつなぎを用いて酵素などを基板に結合させることにより、容易になる。他の方法は、溶解性巨大分子を結合させ、溶液中で構造を互いに連結させ、その後、全ユニットを所望のように製作された装置に連結させ、それから、巨大分子配位子の放出を行った。巨大分子配位子の放出は、イオン強度の変更、可溶生酵素の使用、あるいは他のプロセスにより、媒介されても良く、これにより、所望の分子が、適当な配向で表面上に残され、配位子が結合される。
【００６０】
他の実施の形態では、多光子励起が使用され、外植された組織が再移植する前に、修飾される。生体外での組織修飾では、例えば、同種移植、異型移植または異種移植により、組織がまず除去される。除去された組織の特性はその後、適した架橋剤を用いた多光子励起による架橋を実行することにより、及び／または、作用物質内で拡散させ特異的に活性を組み入れる、または他の処理を実行することにより、修飾される。その後、組織は移植され、あるいは他に使用される。この方法の特定の例は、物理的特性の改良、及び組織ベースの異種心臓弁の潜在的な感染及び石灰化の減少である。強度の増加、可撓性の変化、あるいはアルデヒドに対する必要性の減少または排除及び他の化学的な架橋固定などの他の特性の改良が、多光子励起を用いて架橋を所定の領域に選択的に組み入れることにより達成される。異種組織に作用物質（例えばキレート化剤）または抗菌性物質を組み入れることにより、それぞれ、石灰化の減少、感染性の減少が得られる。
【００６１】
他の実施の形態では、多光子励起が使用されて、多重製造のための鋳型、スタンパー、マスクまたは他の型が製作される。特に、現在市販されているものよりも小さな寸法を有するフォトリソグラフィーのマスクがこの方法により得られる。現在のところ、約１５０ｎｍの範囲の特徴を有する研究目的の高解像度マスクは非常に高価である。この技術により、同等のサイズのあるいはより小さな特徴を有する、及び複数の前駆体の型を有するそのようなマスクの迅速で効率のよい製造が可能となる。この型の他の適用は、組織培養、組織工学、生物材料のためのバイオミメティックな細胞外基質組織化表面用の表面鋳型である。
【００６２】
図１７は、Ｘ−Ｙ方向におけるガルボ走査及びガルボ走査移動を用いて達成可能な広範囲のトポロジーを示したものであり、（Ａ）連続ファイバ出力、（Ｂ）パルスファイバ出力（例えば、ビームシャッタリングによる）である。他の実施の形態では、多光子励起による製作が使用されて、図１７に示された例示的な構造（及び他の構造）の重合時の収縮または膨張効果が制御される。また、多光子励起による製作が使用されて、より単純な２次元前駆体からより複雑な３次元構造体が作成されてもよい。構造の複雑度は、照射強度、化学的性質、走査時間、走査パターンを変化させることによりゲル／ポリマー密度を変化させることにより達成されてもよい。例えば、図１８は、ポリアクリルアミドの２光子製作により形成された約３５０ｎｍの線厚を有する一連のらせんの透過光顕微鏡像である。製作は、直線をバルクモノマー溶液中で走査させることによるものであった。重合時のアクリルアミド体積の減少により、線がねじれらせんとなった。空間振動数は、ドゥエル（dwell）時間を変化させることにより異なる架橋密度を光学的に誘起することにより、及び基板と部分的に接触させることにより物理的にらせんを束縛することにより、変化させた。「二重らせん」（図１８の上から三番め）は、１つのらせんをもう１つのらせんの内側に配置しようとする試みから生じたものである。
【００６３】
他の実施の形態では、ポアソン比効果、制御された収縮／膨張効果を用いることにより、及び／または化学官能基、蛋白質及び他の要素を重合または架橋により膨張しあるいはそうでなければ形状変化する前駆体組成物何組み入れることにより、形成された物体内で力学的形状変化が達成される。そのような要素には、必要に応じて、「スマートな」ポリマーまたは生物ポリマー、例えば、酵素や運動性蛋白質が含まれ、これらは、媒質条件（例えば、温度、溶剤、イオン強度、特定の配位子の添加）が変化すると形状が変化する（例えば、曲がる、伸長する、収縮する、移動するまたはコイル状となる）。そのような材料は、アクチュエータとして使用してもよく、すなわち、動力学的に形状を変化させ、物理的力を働かせ、流体流を変動させ、あるいは他の特性を変化させるのに使用してもよい。この方法の例として、ナノ製作したロッドの端にチュービュリン（tubulin）モノマーを配置し、動的細胞骨格様要素を作製することにより生物合成機械構造を製造してもよく、動原体を組み入れて微小管を形成してもよく、あるいはプロフィリンを組み入れてアクチンを形成してもよい。さらに、構造の形状変化を使用して、孔を開けても閉じてもよく（すなわち、可変フィルタとして作用するように）、あるいは１以上の抗体または細胞表面レセプター配位子などの活性機能を暴露させてもよい。そのような構造は第２の機能要素として、抗原または特性の細胞を「トラップ」する。
【００６４】
他の実施の形態では、図１９に示されるように、増感剤及び化学架橋剤を添加せずに、直接蛋白質架橋を行うために多光子励起が使用される。芳香族残基を含む蛋白質またはペプチドのπからπ*への遷移（２６６ｎｍ）は、１００フェムト秒パルス幅の３つの８００ｎｍ光子の同時吸収により励起される。この励起後、第２の時間遅れビームにより、イオン化限界より上に、発色団が励起される。これは、８００ｎｍの２光子プロセスにより、あるいは４００ｎｍの１光子により行われる。一時的に、発色団は双性イオンを形成し、このイオンは第２の蛋白質またはペプチドに共有結合により結合する。多光子吸収プロセスの電力依存性により、顕微鏡スケールで、活性化の３次元制限が導かれる。そのような制限は、最初の３光子プロセスにより規定され、そのため、第２の工程は１以上の光子励起と同様の意味合いで進行してもよい。
【００６５】
この発明の方法はさらに、特定の組織を有するキラル及び光学的に活性な化合物を用いて、層状の、及び他の２次元及び３次元構造の光学装置を製造するために使用される。ほとんどの可視光学波長よりも小さな要素の組立てのおかげで、そのような組立て品は、回折、屈折を変化させ、光導波管となり、そうでなければ、光学特性を操作するのに有効である。
【００６６】
他の実施の形態では、少なくとも１つの光ファイバ要素が使用されて、そうでなければアクセスすることができない位置での多光子励起によるナノ製作が、好ましくは、カテーテルと組合された製作装置を使用して、実行される。図２０Ａに概略が示されているように、光子源、好ましくはＴｉ：サファイアレーザ２５と組合されたアルゴンイオンパルスレーザ２３が、光ファイバカップラー２５を介して、赤色または赤外光を単一モード光ファイバ５４内に送りこむ。群速度遅延自己位相変調（ＧＶＤ／ＳＰＭ）補償装置５８が使用されて、光学的な分散が補償され、ファイバ内でのスペクトルの広がりが最小に抑えられる。光ファイバは可撓性管内に配置され、支持と保護が提供される。医療への適用では、この管は、カテーテル６０とすることができ、内臓へのアクセスが可能となる。図２０Ｂは、カテーテル５０の断面の詳細を示したものであり、光ファイバ５４用のカテーテルハウジング６２と、試薬管６８とを備える。単一モードファイバ５４が、光ファイバカップラー６４を介してレンズ６６に結合され、このレンズにより多光子製作プロセスに必要な微小点に焦点が合わせられる。レンズ６６の開口数（ＮＡ）は、多光子活性化のための領域サイズ及光子密度を達成するためには、水溶液浸漬適用では、０．１ＮＡから１．２ＮＡまでの範囲内であればどのようなものでもよく、例えば、生体内で遭遇するようなものである。
【００６７】
製作が望まれる点からの焦点距離にレンズを配置するためには、幾つかのメカニズムを使用してもよい。この空間を提供するためにカウリング（cowling）７０が使用されてもよい。その代わりに、カテーテルを介してイメージング能力を組み入れ、光学機械手段を提供し、アセンブリを移動させることにより空間を供給してもよく、焦点距離が調整され、及び／またはビームが走査される。組立て及び製作用の試薬は、カテーテル内の試薬管６８を介して導入されてもよい。複数のそのような試薬管を用いて、複数の化合物が供給され、多成分構成の製作が可能となり、異なる位置に異なる機能を提供することができる。製作の他に、多光子プロセスはまた、表面を清浄にすることが望ましい場合に、あるいは他の試薬を適用する前の準備手順として、剥離のために使用してもよい。そのようなカテーテルまたは光ファイバシステムは、最小侵襲性血管及び他の外科的処置、歯科医術、及び、人工の構造体及び機器内のパイプ及び導管の修理用などの他の適用において使用される。
【００６８】
カテーテル内の単一モード光ファイバを用いるビーム走査を提供するたに、２つの方法を使用してもよい。１つは、ファイバを基本としない装置においてされいるけれども、鏡７０（走査検流計）の使用である。２番目（図２０）は、より簡単であり、ファイバは対物レンズの後の焦点面内を移動する。単一モードファイバは３μｍの開口を有し、結合効率は約５０％である。近視野光ファイバプローブについて以上で説明したように、ポストレーザプリズムまたは回折格子対が、ファイバ内のＧＶＤ及びＳＰＭを補償するために使用される。
【００６９】
この装置は基本的には光ファイバ顕微鏡であるので、この特徴が利用されて、製作開始前に、１つの領域の像が映される。例えば、装置は走査型顕微鏡として使用され、最小侵襲性法によりｉｎ  ｓｉｔｕで、損傷を受けた組織（例えば、傷、慢性のただれ、角膜の欠損あるいは裂傷した関節軟骨）の像が示される。像は、高い反射率を有する歯や他の硬い組織に対し適しているように、反射モードで得られてもよく、あるいは、反射率の低い柔らかい組織では、多光子蛍光イメージングを用いてもよい。ローズベンガル、エオシン及びエリトロシンは、例示的な非特異的蛍光ラベルである。というのは、これらは拡散性で、無毒で、製作のための光開始剤としても適しているからである。他の試薬及び固有蛍光を使用してもよい。
【００７０】
ｉｎ  ｓｉｔｕ組織修復には、走査型顕微鏡として光ファイバ装置システムが使用され、損傷された組織内の外傷が３次元で画像化される工程であって、該画像化は、２光子画像化を用い反射モード（共焦）及び／または蛍光モードである工程と、共焦／３光子像を用いて損傷の３次元デジタルマップを作成し修復のための計画を計算する工程と、直接走査システムを用いて修復サブユニット配置する工程と、必要に応じて、修復材料の縁を周囲の組織に架橋させその材料を定位置に固く保持させる工程と、を含む。
【００７１】
多光子製作方法は、生体外及びｉｎ  ｓｉｔｕシステムの両方において、組織内のある深さで製作するのに使用することができる。ほとんどの軟組織は、近ＩＲにおいてかなりの伝達を示すので、組織修飾は、軟組織、例えば皮膚及び歯肉内の約３５０μｍの深さまで行うことができる。（毒性の低い）製作用材料は、その後、低分子量前駆体の型で組織内に拡散される。有効製作深さに影響する因子は、製作用材料の拡散、振動数の４乗として表されるレイリー散乱、及び長い作動距離での光子密度、これはレーザ出力と開口数の関数である、である。このため、かなりの深さを達成するには近赤外光を使用するのが好都合である。
【００７２】
ｉｎ  ｓｉｔｕで及び表面下で製作することができる能力は、医学及び歯科学において広く適用されてもよい。いくつかの例としては、ａ）アンチセンス、抗血管形成化合物、細胞毒の直接腫瘍内または腫瘍上への供給、この場合、必要に応じて、制御された放出処方または構成で供給される、ｂ）組織光学足場作用物質、成長因子、及び細胞を、ｉ）慢性のただれにおいて傷の治癒を容易にする、ｉｉ）損傷された関節軟骨における軟骨細胞成長のためのマトリクスを提供するために、制御して供給するための装置の使用、ｃ）溝空間で直接光学製作を実行するために、抗菌剤、成長因子及び他の作用物質を最小侵襲性アプローチにおいて病気にかかった組織に供給し付着させるために、あるいは病気の及び損傷した歯肉及び他の上皮外傷に治療薬を供給するために、腫瘍を殺し、慢性の傷の治癒を促進するために、歯肉に対し配置された光ファイバ装置をもちいて行うマトリクスの製作、ｄ）例えば、Ｊ．ブハワルカー（Bhawalkar）及びＮ．クマール(Kumar)らの「２光子光力学治療」と題する、臨床レーザー医学＆外科治療ジャーナル、Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０１−２０４（１９９７）により開示されているような、ｉｎ  ｓｉｔｕ光力学治療、ｅ）例えば、関節軟骨の誘導再生及び／または軟骨細胞の再生マトリクス内への同時エントラップメントのためのマトリクスのｉｎ  ｓｉｔｕ製作、ｆ）皮膚、角膜及び表面のまたは表面下の他の組織における上皮傷修復のための足場の製作、ｇ）腱の回復、修復あるいは強化及び靭帯結合のための最小侵襲性足場の組立て、ｈ）心臓血管医療のための最小侵襲性再建による尿閉または出血性動脈の部位指定修復及び再構築、ｉ）放出が制御された薬剤及び生物活性作用物質の悪疫、腫瘍、外傷及び慢性の傷への供給、及びｊ）ステントなどの構造要素または装置の最小侵襲性組立てが含まれる。
【００７３】
光ファイバ中へのファイバ結合のための構成は、連続波またはナノ秒パルスレーザーに対しては簡単であるが、フェムト秒レーザではずっと複雑になる。群速度分散（ＧＶＤ）及び自己位相変調（ＳＰＭ）の両方が、短レーザパルスを結合させるのに考慮されなければならない。ＧＶＤは、光がシリカファイバなどの分散媒質を通って進む場合に起こる。単色光では、この問題は無視できる。しかしながら、１００フェムト秒のレーザパルスは、約１０ｎｍ半値全幅（ＦＷＨＭ）のスペクトル幅を有し、その成分は典型的には、ファイバ内で異なる屈折率を有し、正振動数「チャープ（chirp）」となり、ここでは赤い成分が青い成分よりも速く進む。長いファイバを通って伝播した後、パルスは広がり数ピコ秒となる。ＳＰＭは、高いピーク電力のスペクトル的に広がったパルスがきちんと焦点合わせされ、１０μｍ単一モード偏り保存ファイバにされると、起こる。ピーク電力は屈折率を変調させ、振動数成分を赤色及び青色に添加し、１０ｎｍスペクトル幅はかなり広がる。解決策は、格子対を用いてパルスを予めチャープさせることであり、これにより負の分散が提供され、ピーク電力が減少し、これによりＳＰＭが最小に抑えられる。ファイバプローブの正の分散により、パルスは近１００フェムト秒に再圧縮される。２次及び３次分散の両方共が、適当な光学機械を選択することにより、このプロセスにより補償されることが可能であり、これについては最近、ルイス（Lewis）らにより証明された。顕微鏡は、この実施形態を実行するための装置の一体化された一部であるので、多光子製作された特徴または装置を組織の表面上または組織内に正しく配置することは、容易に達成することができる。
【００７４】
上述の実施の形態はまた、所望であれば、複雑な装置及び構造を生成するために結合させてもよい。例えば、酵素、運動性蛋白質、及び光学特性の組み合わせを備えた装置を、バイオセンサ適用に使用してもよい。組織損傷のカテーテル方式の修復に、あるいは腫瘍を殺すために生物分解可能な化合物を供給するために、光ファイバ製作システムを使用してもよい。
【００７５】
この発明についてさらに以下の実施例により説明するが、これらの実施例は限定するものではない。
【００７６】
装置
以下の実施の例で使用する装置の概略を図２１に示す。この装置は、コンピュータ２６を有する修飾バイオラッド（BioRad）レーザ走査共焦顕微鏡（バイオラッド  ＭＲＣ６００）と、ガルボスキャナ２７と、ステージ１６上に焦点を合わすための０．５−１．４対物レンズ２２と、を備える。製作は、光電子増倍管８２及び／または集光レンズ８４と光電子増倍管８６により、蛍光検出を用いてモニタする。顕微鏡には、フェムト秒チタン：サファイアレーザ８０（コヒーレント  ミラ  ９００−Ｆ）が取付けられている。
【００７７】
実施例１．ＵＶ−活性化ポリウレタン系接着剤前駆体系の反応
ポリウレタン−系光接着剤前駆体系を、ノーランドプロダクト社（Norland Products Inc.）、Ｎ．ブルンスウィック、ＮＪから、ノーランドオプティカルアドヒーシブ８３Ｈという商標名で、入手した。この接着剤系は、普通、３２０−３８０ｎｍで、３６５ｎｍのピーク強度を有するＵＶ光に接着剤前駆体を暴露することにより、活性化される。接着剤前駆体はステージ上の顕微鏡スライド上に配置され、このステージは手動によりＸ−Ｙ面内で走査させることができた。焦点が合わせされたビームは、波長７９０または７８５ｎｍ、パルス長１００フェムト秒、平均出力１０ｍＷで、７６メガヘルツ（ＭＨＺ）繰り返し速度で、前駆体上で走査させた。バイオラッドレーザ走査共焦顕微鏡の検流計スキャナを使用して、０．５または０．７５ＮＡの２０倍倍率のツァイスネオフルオア（Zeiss Neofluor）対物レンズを通って、約６００μｍの長さの線に沿って、焦点が合わされた回折制限スポットを導いた。製作を行うために、走査線を最低約１００回、引き及び再び引いた。ロッドは直ちに、約１−２秒で製作された。製作後、エタノールとアセトンを用いた洗浄により、未反応樹脂が構造から除去された。その後、サンプルを空気乾燥させ、１０ｎｍのＡｕＰｄでスパッタコートし、走査型電子顕微鏡用に準備を行った。
【００７８】
図５は、上記方法により製造したいくるかのポリウレタンロッドのＳＥＭ像である。図６は、上記方法により製造したポリウレタンシートの走査型電子顕微鏡写真である（シートの折りは、ＳＥＭサンプル準備の人為構造である）。図７Ａ及び７Ｂは、ピラミッド構造を示した図である。
【００７９】
実施例２．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の重合
ウシ血清アルブミンを水に溶解し、濃度１０ｍｇ／ｍＬとした。それから、１ｍＬのＢＳＡ溶液を０．５ｍＬのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）に添加し、光開始剤ローズベンガル、約１×１０-4とした。十分な水酸化カリウム水溶液を添加し、光開始剤を溶解するために、わずかに塩基性の混合物を生成させた。その後、この溶液に、実施例１で説明したように２光子励起を受けさせ、重合させた。重合はまた、トリエタノールアミン無しで、ローズベンガルの存在下、２光子励起により達成した。図１２および１４は、それぞれ、２光子励起により製作されたロッド及びピラミッドを示す図である。
【００８０】
３光子励起のために、ローズベンガルを約１ｍｇの９−フルオレノンカルボン酸に換えて、上記溶液を調製した。この溶液の他のアリコートをステージ上の顕微鏡スライド上に置き、焦点を合わせたビームを７８０ｎｍの波長、１００フェムト秒のパルス長で、溶液上で走査させた。バイオラッドレーザ走査共焦顕微鏡の検流計スキャナを用いて、焦点が合わされたスポットを約６００μｍの長さの線に沿って誘導した。０．５ＮＡ  ２０Ｘ  ツァイスネオフルオア（Zeiss Neofluor）対物レンズを使用した。平均出力レベルは、定位置に対物レンズを配置せずに測定すると、７６ＭＨＺ繰り返し速さで１３０ｍＷであり、対物レンズを通過するエネルギー損失は約２５ｍＷであると評価された。製作には、約１−２秒の光学的に目に見える製作に必要な総ドウェル時間で、最低１００回の走査線の線引き、再線引きが必要であった。７８０ｎｍの波長は、フルオレノン光開始剤の３光子励起を表し、この開始剤は、約２７０ｎｍのπ→π*遷移に対する１光子吸収極大を有する。１重項に励起されると、フルオレノンは直ちに三重項に変換され、水素引抜きを介して架橋が開始される。
【００８１】
（１）フルオレノン（三重項）＋ＢＳＡ→ＢＳＡ・＋Ｈ
ＢＳＡ・＋ＢＳＡ→（ＢＳＡ）2・
（ＢＳＡ）2・＋ＢＳＡ→（ＢＳＡ）3・など
（２）フルオレノン（三重項）＋ＴＥＡ→ＴＥＡ・＋Ｈ
ＴＥＡ・＋ＢＳＡ→ＢＳＡ・＋ＴＥＡ
ＢＳＡ・＋ＢＳＡ→（ＢＳＡ）2・
（ＢＳＡ）2・＋ＢＳＡ→（ＢＳＡ）3・など
トリエタノールアミンラジカルの動力学的安定性の増加は、架橋反応の効率の増加に寄与するかもしれない。図１３Ａ、（低倍率）及び１３Ｂ（高倍率）は、ＢＳＡの３光子重合により製造したロッドのＳＥＭ像であり、このロッドの直径は約５００ｎｍである。
【００８２】
実施例３．トリメチロールプロパントリメタクリレートの重合
トリメチロールプロパントリメタクリレート（アルドリッチ）をローズベンガル１×１０-5、トリエタノールアミン０．１Ｍとし、約１滴のジメチルスルフィド（ＤＭＳＯ）を添加し溶解度を向上させた。実施例１で説明した２光子プロセスを用いてピラミッド型のアクリレートポリマー（図１０）を形成した。
【００８３】
上記反応混合物中でローズベンガルを２×１０-5  ９−フルオレノン−２−カルボン酸に置き換えると、実施例２で説明されているように３光子励起を用いた処理により、重合が起きた。この方法により形成された層状構造を図９に示す。この構造は、重合されたトリメチロールプロパントリメタクリレートの５つの積み重ねられた層（物体は水平から約８５°回転されている）を含む。上部２層は、ＳＥＭサンプルの調製中に剥離され、内部層が現れている。
【００８４】
実施例４．アクリルアミドの重合
ある比率のアクリルアミド：ビスアクリルアミドを含む４０％水溶液を、ローズベンガル１×１０-4、トリエタノールアミン０．１Ｍとした。実施例１で説明されているような２光子プロセスを用いて、ピラミッド型のポリアクリルアミドポリマー（図１０）を形成した。アクリルアミドゲルは、放出を持続させるための生物活性化合物及び他の化合物のエントラップメントに対し有効である。
【００８５】
実施例５．フィブリノーゲンの重合
５ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと１×１０-4のローズベンガルを含む水溶液を、実施例１で説明されているような２光子励起を用いて重合させた。重合はまた、ローズベンガルの存在下、トリエタノールアミン無しで、２光子励起により達成した。
【００８６】
実施例６．製作されたマトリクス内での作用物質の短時間エントラップメント
多光子励起により製作したマトリクス中での作用物質の短時間エントラップメントについて、ポリアクリルアミドゲル／ロダミン６１０とＢＳＡマトリクス／デキストランを用いて説明した。２９：１の比率のアクリルアミド：ビスアクリルアミドと、１×１０-4Ｍのローズベンガルと、０．１Ｍのトリエタノールアミンと、を含み、２×１０-3Ｍのロダミン６１０が添加された１７．５％の水溶液の２光子活性化により、ポリアクリルアミドゲルを形成させた。形成されたゲルは約７０μｍ×１００μｍ×１．５μｍであり、その架橋密度は、実行した連続走査の数（５０及び７５）により照射時間を変動させることにより、異なるものとした。ロダミン１０の放出は、長方形ゲルにわたる蛍光強度の積分により光学的にモニタした。図２２に示した２つのレプリカント（replicant）実験からのデータが示すように、架橋密度が高いとロダミン放出が遅くなる。
【００８７】
ＢＳＡマトリクスを、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１×１０-4ローズベンガルを含み、１×１０-4Ｍのテトラメチルロダミン標識１０キロダルトン（ｋＤ）デキストラン（モレキュラープローブ、ユージーン、ＯＲ）が添加された水溶液の２光子活性化により製作した。長方形ＢＳＡマトリクスは約１４０μｍ×１７５μｍ×１．５μｍであり、その架橋密度は、マトリクスを形成する連続走査の数が異なっていたため（５、１０及び２０）、異なっていた。１０ｋＤのデキストランの放出は、長方形ゲルにわたる蛍光強度の積分により光学的にモニタした。２つのレプリカント実験からのデータを図２３に示す。この図から、架橋密度が高いと作用物質の放出が遅くなることが示される。
【００８８】
実施例７．アルカリホスファターゼの長期エントラップメント
酵素などの反応性作用物質の永久的なまたは長期エントラップメントにより、可溶性反応物質がゲルまたは構成内に拡散することが可能となり、そのゲルまたは構成はその後、トラップされた作用物質の作用を受ける。この実施例では、アルカリホスファターゼのエントラップにより、可溶性反応物質から燐酸部分が除去される。アルカリホスファターゼ活性は、モレキュラープローブ社から製造されている酵素結合蛍光（ＥＬＦ）試薬（Ｂ６６０１、ユージーン、ＯＲ）を用い、蛍光顕微鏡により、容易に分析すること及び空間的に局在化させることができるので、アルカリホスファターゼをモデル酵素として選択した。ＥＬＦ試薬から燐酸基が開裂すると、その蛍光発光波長波長が変化し、その蛍光強度が大きく増加し、不溶性となり、これにより、活性酵素のすぐ近くで沈殿が生じた。約８２５ｎｍでの２光子励起蛍光による沈殿した作用物質の励起により、像が形成された。
【００８９】
したがって、アルカリホスファターゼ（シグマＰ−０５３０）は、１×１０-4のローズベンガルと、０．１Ｍのトリエタノールアミンと２μｍｏｌのウシアルカリホスファターゼとを含む２９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミドの４０％水溶液の２光子励起により、長方形−ポリアクリルアミドゲル（１３４μｍ×８９μｍ×１．５μｍ）内に組み込まれた。重合時間を変えると、異なる密度を有するゲルが得られた。１つのゲルは５０走査（総光子線量＝２×１０20光子／ｃｍ2）を受け、他のゲルは７５走査（光子線量＝３×１０20光子／ｃｍ2）を受け、過飽和により２光子励起ゾーンの制限が減少するので、光子線量がより高いと重合された面積がわずかに大きくなった。図２４Ａは、透過光によるゲルを示し、図２４Ｂ，２４Ｃは、蛍光像である。下側のゲル中のアクリルアミドは、より大きな架橋密度で、光学的に製作されたものである。図２４Ｂは、３０分での酵素活性が、トップ付近に焦点面を有する両方のゲル内でかなり均一であることを示し、一方、図２４Ｃは、ガラス基板に近い焦点面での、より高い架橋密度のゲル（下側のゲル）の中央における酵素活性はより低いことが示される（６０分）。このように、高密度ゲルは、ＥＬＦ試薬が、縁からゲル内に拡散するのを阻害する。
【００９０】
より小さな構成を用いてエンキャプシュレーションを達成しても良い。図２５Ａ−Ｃには、単一アルカリホスファターゼ添加アクリルアミドファイバが示されており、各ファイバの直径は約３５０ｎｍである。図２５Ａ及び２５Ｃは、約３０分離したＥＬＦ蛍光を示し、図２５Ｂは透過光像である。時と共に行った観察により、ファイバ構成は変化することが示され、これは、ファイバは可撓性ではないこと、基板に固く付着されていないことから驚くに値しない。像はまた、酵素活性は、ファイバが基板に近接触している領域（ファイバの左手及び右手側）では減少することが示される。ＥＬＦ試薬の拡散がこの領域では阻害されると仮定される。
【００９１】
好ましい実施の形態について図示し説明してきたが、本発明の精神及び範囲内であれば、様々な変更及び置換が可能である。したがって、この発明について、実例として説明してきたが限定するものではないことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この中で説明しているような多光子励起を用いる製作の概略図である。
【図２】  多光子励起による製作に適した広視野光学機械を有する装置の概略図である。
【図３】  多光子励起による製作に適した広視野４ｐｉ光学機械を有する装置の概略図である。
【図４】  多光子励起による製作に適した近視野光学機械を有する装置の概略図である。
【図５】  ２光子励起により製作された複数のポリウレタン棒の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。
【図６】  この発明に従い製造されたポリウレタンシートの走査型電子顕微鏡像である。
【図７Ａ】  ポリウレタン前駆物質の２光子励起を用いて製作したピラミッド構造の連続層板を示す低倍率（７Ａ）、高倍率（７Ｂ）でのＳＥＭ像である。
【図７Ｂ】  ポリウレタン前駆物質の２光子励起を用いて製作したピラミッド構造の連続層板を示す低倍率（７Ａ）、高倍率（７Ｂ）でのＳＥＭ像である。
【図８】  トリメチロールトリアクリレートの３光子活性化により製作した格子構造のＳＥＭ像である。
【図９】  多格子励起により製作した重合トリメチロールトリアクリレートシートの積み重ね層のＳＥＭ像である。
【図１０】  ４０％ポリアクリルアミドの３層から製作したピラミッドを示す透過光顕微鏡写真である。
【図１１】  重合させたウシ血清アルブミン（垂直線）とポリウレタン（水平線）を含む複合格子のＳＥＭ像である。
【図１２】  ＢＳＡの水溶液から２光子励起により製作し、テキサスレッドでラベルしたＢＳＡのいくつかのロッドを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】  ３光子励起を用いてＢＳＡから作成したロッドの、低倍率及び高倍率でのＳＥＭ像である。
【図１４】  重合ＢＳＡから製作したピラミッドのＳＥＭ像である。
【図１５Ａ】  ヒト血小板のＳＥＭ像であり、（Ａ）は、架橋フィブリノーゲンを含む線に付着しており、（Ｂ）は、ＢＳＡ及びフィブリノーゲン製作溶液に暴露されたが、光学的に誘起された製作は起こっていないガラス基板の非製作領域である。
【図１５Ｂ】  ヒト血小板のＳＥＭ像であり、（Ａ）は、架橋フィブリノーゲンを含む線に付着しており、（Ｂ）は、ＢＳＡ及びフィブリノーゲン製作溶液に暴露されたが、光学的に誘起された製作は起こっていないガラス基板の非製作領域である。
【図１６】  バイオセンサアレイチップの概略図である。
【図１７】  （Ａ）連続繊維出力及び（Ｂ）パルス繊維出力（例えば、ビームシャッタリングによる）に対するＸ−Ｙ方向におけるガルボ走査及びガルボ走査移動を使用して達成可能な広範囲のトポロジーを示す概略図である。
【図１８】  ポリアクリルアミドの２光子製作により形成した約３５０ｎｍの線厚を有する一連のらせんの透過光顕微鏡像である。
【図１９】  増感剤及び化学架橋剤を添加しない、多光子励起による直接蛋白質架橋を示した概略図である。
【図２０Ａ】  遠隔地点での多光子励起による製作に適した装置を示した概略図である。
【図２０Ｂ】  遠隔地点での多光子励起による製作に適した装置を示した概略図である。
【図２０Ｃ】  遠隔地点での多光子励起による製作に適した装置を示した概略図である。
【図２１】  本発明において使用される装置の概略図である。
【図２２】  ポリアクリルアミドゲルからのローダミンの放出を示すグラフである。
【図２３】  架橋ＢＳＡマトリクスからのローダミン標識デキストランの放出を示すグラフである。
【図２４】  トラップされたアルカリホスファターゼを有するゲルを示したものであり、透過光像と、酵素結合蛍光により示される酵素活性の蛍光像であり、下部ゲル中のアクリルアミドは、より大きな架橋密度で光学的に制作されたものである。
【図２５】各繊維の直径が約３５０ｎｍの単一アルカリホスファターゼ付加アクリルアミド繊維を示し、約３０分離れた酵素結合蛍光と、透過光像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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