(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＰ２４の配列ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰを、脂質化及び／又はグリコシル化を無視した場合の配列において含むＭＵＣ−１リポペプチドであって、
前記ＭＵＣ−１リポペプチドが共有結合的に脂質化されたアミノ酸を少なくとも１つ有する、ＭＵＣ−１リポペプチド。
【請求項２】
ＢＰ２５の配列ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰを、脂質化及び／又はグリコシル化を無視した場合の配列において含む、請求項１に記載のリポペプチド。
【請求項３】
各脂質化されたアミノ酸が、脂質化されたＬｙｓ（Ｋ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、及びＨｉｓ（Ｈ）からなる群より独立して選択される、請求項１又は２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
各脂質化されたアミノ酸が、Ｃ2からＣ30の飽和脂肪族アシル基、モノ飽和脂肪族アシル基またはポリ不飽和脂肪族アシル基で独立して脂質化されている、請求項１〜３のいずれかに記載のリポペプチド。
【請求項５】
各脂質化されたアミノ酸が、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基、及びデカノイル基からなる群から独立して選択される脂質基で脂質化されている、請求項４に記載のリポペプチド。
【請求項６】
前記脂質化されたアミノ酸が追加のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれかに記載のリポペプチド。
【請求項７】
前記脂質化されたアミノ酸が、前記リポペプチドのカルボキシ末端付近に位置する、請求項６に記載のリポペプチド。
【請求項８】
グリコシル化アミノ酸を少なくとも１つ含む、請求項１〜７のいずれかに記載のリポペプチド。
【請求項９】
前記グリコシル化アミノ酸がＭＵＣ−１において天然にグリコシル化されているアミノ酸に対応する、請求項８に記載のリポペプチド。
【請求項１０】
ＢＬＰ−２４又はＢＬＰ−２５である、請求項１に記載のリポペプチド。
【請求項１１】
−Ｋ（脂質）−ＧがＢＰ２４又はＢＰ２５の配列のカルボキシ末端に結合している、請求項１又は２に記載のリポペプチド。
【請求項１２】
インビトロでＴ細胞の応答を引き起こす、請求項１〜１１のいずれかに記載のリポペプチド。
【請求項１３】
Ｍａｂ  ＢＣＰ８のＭＣＦ−７細胞から精製されたクラスＩ  ＭＨＣ分子への結合を競合的に阻害する、請求項１〜１２のいずれかに記載のリポペプチド。
【請求項１４】
リポソームと、前記リポソームに被包されている請求項１〜１３のいずれかに記載のＭＵＣ−１リポペプチドとを含む組成物。
【請求項１５】
前記リポソームが多層リポソームである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームが単層リポソームである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントが、ＭＰＬＡ、デトックス、アルム、ＱＳ２１、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＤＰ、及びリピッドＡからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
抗原特異的主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）制限Ｔ細胞反応は、ウイルス性感染および腫瘍に対する免疫応答の重要な構成要素である。免疫療法の設計および開発は、標的抗原と、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子と共にＴ細胞に有効に提示される能力を理解すること依存している。
現代の技術では、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の抗原結合溝（antigen binding groove）に対する標的抗原ペプチドの親和性を測定することが可能である。しかし、我々がもっている異なるＴ細胞のレパートリーを考えると、異種交配したヒトの集団においてある抗原性ペプチドの免疫原性を推定することは容易な仕事ではない。さらに、複雑さは、しばしば「自己」ペプチドとして認識されるある種の腫瘍抗原によってさらに増大する。したがって、腫瘍抗原をコードする遺伝子は、ヌクレオチド配列に何らの変化も伴わずに正常な自己由来細胞において発現される。
胸、子宮、膵臓、および結腸直腸性のもののような多くのアデノ癌腫は、細胞表面でかなり発現され、異常（グリコシル化不足の）ＭＵＣ−１ムチンを分泌する。グリコシル化不足の結果として、これらのアデノ癌腫上のＭＵＣ−１ムチンは、ペプチドエピトープを露出する。Ｈｕｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１巻：２６１−２６７頁（１９８９年）；Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４７巻：５４７６−５４８２頁（１９８７年）。これは、ＭＵＣ−１ムチンが、先端表面に発現され、そしてかなりグリコシル化され、したがって隠れた（潜在性）ペプチドコアを有する２０個のアミノ酸単位の保存的縦列反復のペプチドコアを有する、正常な管状上皮細胞と対照的である。この正常な状況で、ＭＵＣ−１の抗原性領域は、免疫学的に遮断されていると思われる。
ＭＵＣ−１ムチンペプチドコアの縦列反復領域におけるペプチドエピトープは、ある種のアデノ癌腫の免疫療法用の強力な標的抗原として認識されてきた。Ｇｅｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３巻：１２８２０−１２８２３頁（１９８８年）；Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５巻：２３２０−２３２３頁（１９８８年）；Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，１巻：８９−９５頁（１９９３年）。ＭＵＣ−１ペプチド特異的Ｔ細胞が、ＭＵＣ−１ムチンを担持している腫瘍細胞を死滅させる潜在力を有することが示された。Ａｇｒａｗａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６巻：２０８９−２０９５頁（１９９６年）。以下の許容ペプチドエピトープも規定されている。すなわち、（１）クラスＩＩ制限ＣＤ４+Ｔ細胞応答についてのＭＵＣ−１ペプチドコアのエピドープと、（２）ＨＬＡ．Ａ１１、ＨＬＡ．Ａ２．１、ＨＬＡ．Ａ３およびＨＬＡ．Ａ１に結合する能力を示すエピトープである。Ａｇｒａｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５巻：２２５７−２２６１頁（１９９５年）；Ｄｏｍｅｎｅｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５巻；４７６６−４７７４頁（１９９５年）。様々の癌の免疫療法のための強力なワクチン候補としてこれらのペプチドの利用性は、強力なＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を発生するそれらの能力に依存する。一般に、インビボ初回感作（プライミング）後に、マウスにける標的ペプチドの免疫原性を測定することは可能であろう。
ＭＵＣ−１抗原ペプチド特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を、健全な多重産の供与体から得られたＰＢＬから単離できたが、未産の女性または男性からは得られないことが報告されている（Ａｇｒａｗａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．およびＡｇｒａｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．上記）。しかし、それらの研究では、対象をインビボで初回感作し、そして単離Ｔ細胞を、抗原として溶解性ＭＵＣ−１抗原ペプチドを用いてインビトロで刺激した。
最近の研究では、ペプチドで処理させたか、または「負荷させた」変異体Ｔ２またはＲＭＡ−ＳセルラインでＴ細胞を刺激することによって、一次ＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）応答をインビトロで生じることが示唆されている。ＤｅＢｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１巻：２９６３−２９７０頁（１９９２年）；ＤｅＢｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２巻：３０１３−３０２０頁（１９９２年）；Ｓｔａｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９巻：７８７１−７８７５頁（１９９２年）；Ｈｏｕｂｔｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３巻：２０７２−２０７７頁（１９９３年）。本明細書で使用される場合、ペプチドを「負荷した（loaded）」リポソームは、膜関連または血管内のペプチド抗原のいずれかにより調製された製品である。このような「負荷リポソーム」は、ペプチド抗原を細胞に「負荷（load）」する送達媒体として使用される。したがって、「負荷細胞（load cell）」は、ペプチド抗原を有効に受けるか、または摂取したものである。負荷された抗原提示細胞（antigen presenting cell:APC）は、ペプチド抗原を摂取し、そしてＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の状況において細胞表面において抗原を発現するものである。さらに、高濃度の外因性ペプチドを有するネズミ脾臓細胞を用いて、抗原特異的ＣＴＬをインビトロで生成することができることが示された。Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３巻：８４９−８５８頁（１９９１年）；Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７巻：１７６７−１７７９頁（１９８８年）。
外因的に供される可溶性ペプチドは、一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状況での提示のための内因性リソソーム性提示経路を通過する。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７巻；６０１−６２４頁（１９８９年）；Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６巻：５５１−５５７頁（１９８７年）。ｐＨ非感受性リポソームが、クラスＩＩ制限提示のためのＡＰＣを感作することが示された。さらに、高濃度の被包抗原ペプチドで、ｐＨ非感受性リポソームが、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方による提示のための外因性および細胞質位置の両方に抗原を送達できることが示された。Ｈａｒｄｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻；２８６０−２９６３頁（１９９１年）；Ｚｈｏｕら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：２２９−２３５頁（１９９４年）。
可溶性ペプチドでパルス標識したＰＢＬは、インビトロで一次Ｔ細胞を誘導する能力に欠けることを示した。Ｇｅｒｍａｉｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＩＩ巻：４０３−４５０頁（１９９３年）。リポソーム被包抗原を、マクロファージではないＤＣによって有効に出現させて、一次ＣＴＬを刺激することも示された。Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：４０６２−４０６９頁（１９９３年）。しかし、樹状細胞（ＤＣ）の精製および単離は、困難な仕事であり、そして多数のＰＢＬまたは胸腺幹細胞を必要とする。
当初、樹状細胞は、無垢なＴ細胞を初回免疫するＡＰＣである可能性があると考えられた。Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：２７１−２９６頁（１９９１年）。一次抗原特異的ＣＴＬ応答をインビトロ刺激するためのＡＰＣとして樹状細胞を使用している（ＤｅＢｒｕｊｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２巻、上記、Ｎａｉｒら、上記）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９巻：１２５５−１２６４頁（１９８９年）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．７４巻：３９９−４０６頁（１９９１年）；Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３巻：９９６−１００３頁（１９９４年）、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５巻：６０９−６１２頁（１９９２年）。ＤＣは、未感作Ｔ細胞で強力な凝集の能力があり、そしてＢ７．１およびＢ７．２のような高密度の補助分子を発現することが示唆された。このような補助分子は、無垢の休止Ｔ細胞の刺激に重要である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、上記）。Ｂ７．１は、共刺激分子と称される「二次シグナル」レセプターの１つである。それは、ＣＤ２８のためのリガンドであり、そしてＴH１応答の誘導に重要である。Ｂ７．２は、ＣＤ２８リガンドでもあり、そしてＴH２応答性に関連がある。さらに、共刺激分子のカテゴリーに入るのは、ＩＣＡＭ−１であり、それはＬＦＡの天然のリガンドであるが、ＭＵＣ−１に結合することも示される。Ｒｅｇｉｎｂａｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６巻：４２４４頁（１９９６年）。
しかし、ＤＣは、（１）免疫療法のための種々のペプチドの免疫原性を測定すること、そして（２）養子細胞療法用の延長のためのＴ細胞の刺激のための良い候補ではない。この点で、先行技術は、ＤＣを用いた抗原特異的ＣＤ８+ＣＴＬ応答の発生に関する。この先行技術では、どのように抗原特異的ＣＤ４+ＣＴＬ応答を生じさせるかが示唆されない。当業者は、ＣＤ４+細胞毒性Ｔ細胞が、クラスＩＩ制限ペプチド提示を介して存在することを認識しよう。さらに、これらの先行技術では、ＣＤ８+（Ｔ細胞毒性）およびＣＤ４+（Ｔヘルパー）である抗原特異的Ｔ細胞の混合物をどのように生成するかは示唆されていない。
発明の要約
本発明は、
（ａ）リポソーム被包ペプチド抗原を複数の末梢血リンパ球と混合して、抗原負荷抗原提示細胞（antigen-loaded antigen-presenting cell）を生成することと、
（ｂ）無垢（naive）のまたは免疫性欠如（anergic）のＴ細胞を該抗原負荷抗原提示細胞と混合することと、
（ｃ）段階（ｂ）の混合物から活性化Ｔ細胞を単離することと
を含んでなる活性化Ｔ細胞を生成する方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、上記活性化Ｔ細胞が、Ｔヘルパー細胞であるような方法を提供し、そして上記活性化Ｔ細胞が細胞毒性Ｔ細胞である方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、上記リポソームがモノホスホリル脂質Ａを含むような方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、上記ペプチド抗原がＢＬＰ−２５であるような方法を提供する。
本発明は、段階（ｂ）の混合が、ＩＬ−７とＩＬ−１２を含むような方法も含む。
本発明は、さらに、上記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４レセプターを含むような方法、および上記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ８レセプターを含む方法を含む。
さらに他の実施形態では、本発明は、上記活性化Ｔ細胞が抗原特異的であるような方法を含む。
他の実施形態では、本発明は、上記抗原がＭＵＣ−１であるか、または上記抗原がＢＬＰ−２５であるような方法を含む。
他の実施形態では、本発明は、リポソーム被包ペプチド抗原を複数の末梢血リンパ球と混合して抗原負荷抗原提示細胞を産生させることを特徴とする細胞ワクチンを生成する方法を提供する。
本発明は、複数の末梢血リンパ球をリポソーム被包ペプチド抗原と混合して抗原負荷抗原提示細胞を産生させることによって生成される細胞性ワクチンの薬学的有効量によって患者を処置することを特徴とする、癌に罹った患者を治療する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１：リポソーム被包抗原ＢＬＰ−２５に対する種々の正常な供与体の末梢血リンパ球由来のＴ細胞の増殖応答。
総数１７種の供与体からのＴ細胞応答を、（１Ａ）高い、（１Ｂ）中程度、（１Ｃ）応答なし、に等級分けした。「材料および方法」の記載に従って、増殖アッセイを行った。Ｔ細胞を、ＢＬＰ−２５を１μｇ□、１０μｇ○および
0004480800.tif 000002
で含むリポソームで負荷した自己由来ＡＰＣの存在下で育成した。
図２：３種の高応答動物の正常供与体からのＴ細胞増殖応答から得た代表試験。これらのＴ細胞を、可溶性ペプチドＢＬＰ−２５および自己由来ＡＰＣの存在下で育成した。自己由来ＡＰＣの存在下で可溶性ペプチドに対するＴ細胞増殖応答を測定した。Ｔ細胞を、１μｇ□、１０μｇ○、および
0004480800.tif 000003
のＢＬＰ−２５および自己由来ＡＰＣの存在下で成長させた。
図３：リポソームＢＬＰ−２５で負荷された自己由来ＡＰＣで刺激したＴ細胞の抗原特異性。正常な供与体のＰＢＬから単離されるＴ細胞を、２週間、ＰＬＢ−２５（１０μｇ）を含むリポソームで負荷した自己由来ＰＢＬの存在下で培養した（「材料および方法」に示すとおり）。これらのＴ細胞を、（３Ａ）リポソーム抗原ペプチドまたは（３Ｂ）溶解性ペプチド負荷自己由来ＡＰＣに対するそれらの増殖応答について試験した。不適切な抗原対照として、ＨＬＡ．Ａｗ６８．１（残渣６１〜８４）からの２４種のアミノ酸ペプチドを可溶性形態で使用した。
図４：ＣＤ４、ＣＤ８およびＭＨＣクラスＩ分子に対して特異的であるＭａｂによる抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の増殖応答の遮断。全ての遮断Ｍａｂおよびイソタイプ対照抗体を、２０μｇ／ｍｌで使用した。Ｔ細胞を、「材料および方法」に示すとおり、２週間、ＢＬＰ−２５（１０μｇ）で負荷した自己由来ＡＰＣの存在下で培養し、そして増殖応答を、抗体を伴うかまたは伴わないＢＬＰ−２５（１０μｇ）で、またはリポソーム負荷ＡＰＣを含む対照ペプチドＢＬＰ２４Ｍで負荷した自己由来ＡＰＣについて試験した。
図５Ａ：自己由来ＡＰＣに負荷したリポソームＢＬＰ−２５（１０μｇ）で培養したＴ細胞の表現型。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の存在が観察された。Ｔ細胞の全ては、ＣＤ２８＋であった。上部（Ｉ）および下部（ＩＩ）パネルは、２種の別々の供与体から得た培養Ｔ細胞から得たデータを表す。
図５Ｂ：空のリポソームを含む自己由来ＡＰＣ（左のパネルＩ、抗原なし）、またはリポソームを含むＢＬＰ−２５（１０μｇ）（右のパネルＩＩ）の存在下で培養したＴ細胞の表現型（ＴＣＲおよび活性化分子）。パネルＩに比べてより高い含有率のＣＤ２５＋およびＣＤ６９＋Ｔ細胞は、これらのＴ細胞の抗原特異的刺激を表す。
全てのドットブロットグラフでのマーカーを、イソタイプ対照抗体染色細胞の９８％以上を排除するための手段で設定し、同様の方法で処置した（イソタイプ対照データは示されず）。培養細胞の同定を確認するためにロイコゲート（ＣＤ１４／ＣＤ４５）およびＴＣＲ（ＣＤ３／αβ）染色を行った。
図６Ａ：ＭＵＣ−１ペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶおよびＳＡＰＤＴＲＰＡＰによってＴ２変異体細胞でのＨＬＡ．Ａ２発現の上昇制御。ＳＩＩＮＦＥＫＬを、正の対照として使用し、そしてＨ−２Ｋｂ（６１−６９）ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２上昇制御のための負の対照として使用した。ｘ軸は、蛍光強度を表し、そしてｙ軸は、細胞数を表す。ＨＬＡ．Ａ２の増加発現を可視的に試験するためにマーカーＭ１およびＭ２を設定した。平均チャネル強度（ＭＣＩ）を、各ヒストグラムに示す。
図６Ｂ：自己由来ＡＰＣに負荷したリポソームＢＬＰ−２５（１０μｇ）で培養したＴ細胞の細胞毒性活性。３種の供与体全てが、ＨＬＡ．Ａ２+であった。標的は、指示ペプチドで負荷したＴ２細胞であった。負の対照から得た51Ｃｒ放出、ＳＩＩＮＦＥＫＬ負荷Ｔ２細胞を、各データの点から減じた。
図６Ｃ：抗−ＨＬＡクラスＩＭＡｂ（Ｗ６／３２）は、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ負荷Ｔ２細胞のＴ−細胞（供与体番号２由来）による死滅を阻害する。供与体番号１および番号３でこの遮断試験を行って、同様の結果を伴った。イソタイプ対照抗体は、Ｗ６／３２と同様の濃度であった。
図７：固相で希釈画分を被覆することによって検出されるときの１８  ２２分溶出、ＢＣＰ８反応性を示す一次ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。ＧαＭＩgＧ2bＨＲＰ基礎ＥＬＩＳＡを介して結合ＢＣＰ８ＭＡｂを検出した。ＭＣＦ−７由来ＨＬＡクラスＩ分子（Ｗ６／３２精製）を、酸溶出させ、そしてＺＯＲＢＡＸ  Ｃ８マトリックスを用いたＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。
図８：図１でＢＣＰ８反応性について同定した１７分ピークの二次ＺｏｒｂａｘＣ８ＲＰ−ＨＰＬＣの結果。貯蔵ＢＣＰ８正の画分の二次ＲＰ−ＨＰＬＣでの１６−１９分での強力なＢＣＰ８反応性。
図９：合成ＭＵＣ−１ペプチドによる、単離ペプチドに対するＢＣＰ８の結合の阻害。
図１０：二次ＲＰ−ＨＰＬＣから得た１７−１９分ピークのＢＣＰ８親和性単離によってサンプルを得た。親和性単離ペプチドを、ＢＣＰ８から酸溶出させ、そしてＺＯＲＢＡＸ  Ｃ８で再クロマトグラフィーにかけた。電気スプレー質量スペクトルは、酸溶出の間、より長い配列の分解産物であると推定される、ＭＨＣクラスＩタンパク質から溶出した３つのフラグメントを示す。これらのフラグメントは、ＭＵＣ−１ムチン（配列データから得た。示さない）に関連した唯一のものであった一方で、他は起源が分からないものであった。
図１１：間接染色手段で、モノクローナル抗体ＭＡ２．１（抗−ＨＬＡ．Ａ２．１）を用いてＴ２細胞で測定した蛍光の平均チャンネル強度（δＭＣＩ）（＝ＭＣＩ(サンプル)−ＭＣＩ(未供給対照)）での改変。２０μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリンの存在下で、ＭＵＣ−１縦列反復から得た合成９マーまたは１０マーの４０μモルを用いて、３×１０5Ｔ２細胞を一晩培養した。正の対照ペプチドＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶ  δＭＣＩ＝９５１．３。ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶも示される。
図１２：ＭＵＣ−１ペプチド刺激Ｔ細胞の細胞毒性活性。データを、３種のＩＩＬＡ．Ａ２+供与体で示す。
詳細な説明
本発明は、活性化Ｔ細胞の生成に関する。異なる実施形態は、抗原提示細胞として、（ａ）無垢（naive）または免疫性欠如（anergic）のＴ細胞または両方の混合物と、（ｂ）リポソーム被包抗原と、（ｃ）自己由来性全末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（autologous whole peripheral blood lympocyte）とを用いて活性化細胞を生成することに関与する。
好ましい実施形態では、本発明は、ＭＵＣ−１ペプチド特異的で、活性化されたＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の集団の生成に関し、それは、無垢のＴ細胞を、先にリポソーム被包ペプチド抗原で負荷したＰＢＬ（ＡＰＣとして）で活性化させてインビトロで生成される。一般に、得られた抗原特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞と関連した表層分子を有し、そして培養物中に高濃度のγ−ＩＦＮおよび中程度の濃度のＩＬ−１０を産生するが、ほんの痕跡量のＩＬ−４を産生する。
本明細書で使用される場合、「活性化Ｔ細胞（activated T-cell）」は、細胞周期のＧ1相、Ｓ相、Ｇ2相またはＭ（有糸分裂）相にあるものである。したがって、「活性化Ｔ細胞」は、有糸分裂および／または細胞分裂を行いつつあるものである。活性化Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（ＴH）細胞または細胞毒性Ｔ細胞（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬまたはＴC））であってよい。無垢のＴ細胞の活性化は、ＡＰＣ（抗原／ＭＨＣ複合体を含む）に、そしてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、γ−ＩＦＮおよび類似のリンホカインのような分子にこのような細胞を露出することによって開始されうる。抗原／ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞の表面にあるレセプター（Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ））と相互作用する。Ｇｏｌｕｂら編、Immunology:A Synthesis，第２章：「The T-cell Receptor」（１９９１年）。
本明細書で使用される場合、「初回感作（priming）」は、活性化および／または記憶を生じるようなやり方で、抗原に動物（ヒトを含めた）または培養細胞を露出することを意味するために使用される。標的抗原に対するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答の生成は、通常、自然の感染を介するか、または意図的免疫化を介するかのいずれかでインビボ感作による。
本明細書で使用される場合、「無垢な（naive）」Ｔ細胞は、外来抗原（非自己由来性）抗原に露出されなかったものであるか、または潜在性自己由来抗原に露出させなかったものである。「無垢な」Ｔ細胞は、しばしば、「未感作（unprimed）」Ｔ細胞と称される。当業者は、「休止（resting）」細胞が、細胞周期のＧ0相にあり、したがって、有糸分裂を分割または経過していないことを認識できる。当業者は、さらに、「免疫性欠如（anergic）」Ｔ細胞が、特性を機能させる能力がないものである、すなわち正常な免疫応答を指向する抗体を欠く細胞のようなものであることも認識できる。疾患に罹った患者から得たＴ細胞は、感作されたが、免疫性を欠如するＴ細胞を含む可能性がある。
当業者は、適切な補助分子が、Ｔ細胞の活性のために使用される可能性もあることを認識する。補助分子は、Ｔ細胞レセプターにおいて抗原−ＭＨＣ相互作用を促進する分子である。補助分子は、それに限定されないが、当初の結合を促進または増大させること、結合を安定化すること、シグナル移入および分離を含めた様々な役割を示す。このような補助分子の例としては、限定されないが、Ｂ７．１（ＣＤ２８に結合する）、Ｂ７．２（ＣＤ２８に結合する）、およびＩＣＡＭ−１（ＬＦＡ−１に結合する）が挙げられる。
他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞として、リポソーム被包抗原および自己由来性末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と一緒に、無垢のＴ細胞、記憶Ｔ細胞、および免疫性欠如Ｔ細胞、またはそれら３種の細胞型の混合物を用いた活性化Ｔ細胞の生成に関する。本明細書に使用される場合、「記憶表現型（memory phenotype）」Ｔ細胞としても知られる「記憶Ｔ細胞（memory T-cell）」を、先にペプチド抗原に遭遇したが、現在休止しており、そして活性化される能力のあるＴ細胞のクラスを明示するために使用する。記憶Ｔ細胞は、抗原に露出されて、そしてその後、刺激抗原の存在なしに体内で、長期にわたって生存するＴ細胞である。しかし、これらの記憶Ｔ細胞は、「回想（recall）」抗原に応答する。
一般に、記憶Ｔ細胞は、ペプチド抗原に対する無垢なＴ細胞応答と比較した場合、「回想」抗原にいっそう敏感である。記憶細胞を、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ５８、ＣＤ１１α、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ２６のような、分化Ｔ細胞用のマーカーであるある種の細胞表面抗原の存在によって認識することができる。
当業者に既知の技術によって、記憶Ｔ細胞を単離する。簡便には、総Ｔ細胞集団を単離し、続いて抗ＣＤ４５Ｒ０、抗ＣＤ４４または抗ＣＤ２６のモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を行う。Ｈｏｌｌｓｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９巻：１７０頁（１９９３年）；Ｂｒｕｎｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２（１）巻：３７頁（１９９５年）；およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５０巻（パート１）：３１１９頁（１９９３年）参照。
Ａ．抗原
１ 一般的に有用な抗原
抗原特異的ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩ制限ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答は、種々の病原性症状に対する重要な宿主免疫応答である。特に興味があるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答の生成である。本明細書において使用される場合、「抗原特異的」Ｔ細胞応答とは、異なるアミノ酸配列を有するペプチド（対照ペプチド）のような他の刺激によっては明らかでない、ペプチドのようなある特定の抗原刺激物に対するＴ細胞応答（増殖、細胞毒性、サイトカイン分泌）である。限定されないが、ＣＤ２５およびＣＤ６９を含めたＴ細胞活性化の特徴である細胞表面分子の外観を評価することによってＴ細胞の応答性を測定する。そのようなアッセイは、当該技術分野において知られている。
本方法は、一般に、非常に様々な抗原に使用する。これらの抗原は、それがＴ細胞特異的免疫応答を引出すことができる限り、ほとんどあらゆる化学構築物のものでありうる。それらは、少なくとも１種のＴ細胞特異的エピトープを含みうる。例示の抗原は、ペプチド、炭化水素、脂質および特にそれらの組合せから誘導しうる。特に重要な抗原は、ペプチド、リポペプチドおよびグリコペプチドである。イデオタイプおよび抗イデオタイプが特に含まれる。
それに対する対象の方法を使用するのに非常に有利である抗原としては、腫瘍抗原が挙げられる。腫瘍抗原は、通常、腫瘍の存在と相互に関係している天然または外来の抗原である。腫瘍抗原が正常な組織から異常組織を分化させるのに有用である限り、それらは、診断のみならず、治療を行うのための標的としても有用である。したがって、腫瘍抗原に対するＴ細胞特異的免疫応答を生じる本発明の方法を使用することは、本発明の重要な態様である。
腫瘍抗原は、当業界で既知である。実際、数種の例は、十分に特徴づけされ、そして最近、腫瘍特異的療法を生じさせる上で非常な興味の対象となっている。腫瘍抗原の非限定的な例としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、プロステート特異的抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）、およびＭＵＣ−１のようなムチンである。
ＭＵＣ−１ムチン抗原は、多数のアデノ癌腫に対する免疫性を生じる強力な免疫療法標的として認識してきた。Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ  １巻：８９頁（１９９３年）。したがって、本発明の１つの実施形態は、ＡＰＣの表面にあるクラスＩおよびクラスＩＩ分子のいずれか、または両方に結合する能力がある「ＭＵＣ−１誘導体」に関する。
「ＭＵＣ−１誘導体」は、一般に、ペプチドまたはペプチドを基礎とするものである。１つの実施形態では、このペプチドは、ＭＵＣ−１のコアのタンデム反復を含む。さらに他の実施形態では、本発明は、配列ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰをもつこのコア領域から得られる２５種のアミノ酸ペプチドに関する。このコア領域は、誘導体がＴ細胞活性化の特徴を残す方法で、以下に詳細に記述される修飾を行うこともできる。
ＭＵＣ−１誘導体は、ＭＵＣ−１タンパク質のフラグメントである可能性がある。このようなフラグメントは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていないものでもよい。本発明にしたがって、本発明の範囲内のフラグメントは、精製ＭＵＣ−１または、ペプシンまたはパパインのようなプロテアーゼでの消化を含む方法を用いて、組換えＤＮＡ法によるＭＵＣ−１から得ることができる。もちろん、ＭＵＣ−１フラグメントは、組換え法によって直接的に作製することもできる。さらに、本発明に含まれるＭＵＣ−１フラグメントは、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって市販で供給されるもののような自動ペプチド合成機、多重ペプチドシステムおよび他のものを用いて合成することができるか、または当業界で既知の技術を用いて、手作業により製造することができる。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０２巻：２５９頁（１９７８年）参照。
ＭＵＣ−１誘導体としては、グリコシル化または非グリコシル化合成ペプチドも挙げられる。さらに、本発明の範囲内のＭＵＣ−１誘導体としては、タンパク質分解性切断耐性ＭＵＣ−１フラグメントまたは、Ｄ−アミノ酸のような１種またはそれ以上の非天然のアミノ酸を含むＭＵＣ−１フラグメントが挙げられる。そのような誘導体は、有益なＴ細胞特異性を残しながら、増加した半減期の循環の利益を得ることが予測される。
他の実施形態では、ＭＵＣ−１誘導体は、アミノ酸配列ＤＴＲ（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ）またはＤＴＲＰ（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を伴う、ＭＵＣ−１の細胞外縦列反復領域の一部を含む。好ましくは、これは、配列ＳＡＰＤＴＲＰ（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）を含む。特に好ましいペプチドは、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡである。
いくつかの好ましいＭＵＣ−１誘導体は、基本的に、ＭＵＣ−１ムチンの１種のペプチドコアの反復体から構成される。元来のＭＵＣ−１分子中のＭＵＣ−１ペプチドコア反復体は、２０種のアミノ酸配列ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ（Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ）を含む。有用な合成誘導体としては、この配列の「直鎖の順列（linear permutations）」、例えば、反復が単にＰＤＴＲよりむしろＧＶＴＳまたはＴＳＡＰで始まるＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨまたはＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶが挙げられる。他の類似の順列も可能である。
さらに、不可欠のＴ細胞活性化活性が維持されるように、コア配列の１種またはそれ以上のアミノ酸を、好ましくは当業界で知られる保存的手段で改変しうる。以下の群のアミノ酸：（ａ）Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ、（ｂ）ＧおよびＰ、（ｃ）Ｓ、Ｃ、Ｔ、Ｍ、（ｄ）Ｆ、ＹおよびＷ、（ｅ）Ｈ、ＫおよびＲ、（ｆ）Ｄ、Ｅ、ＮおよびＱの中で、典型的な置換を行うことができる。ある種の好ましい置換は、以下の群：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；および（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩによって行うことができる。
他のＭＵＣ−１誘導体は、基本的に、ＭＵＣ−１ムチンの１種の切断ペプチドコアの反復体、例えばＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡから構成される。もちろん、この切断コア配列は、上述のとおり変更、そしてさもなければ改変できる。
いくつかの実施形態は、コア反復体およびそれの誘導体（上述のとおり）の多量体（multimer）を意図する。多量体は、同じコア反復体または誘導体の複数コピーを含むことができるか、またはそれらは、混合および組合わせることができる。これらの多量体は、大きさを厳密に限定しないが、通常、それらの免疫刺激特性を失い、そして、反復の数が増加するにつれて、免疫抑制をも現実に起こしうる。したがって、使用される反復の数は、３より少ないことが好ましい。いくつかの好ましいＭＵＣ−１誘導体は、ＭＵＣ−１コアペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰから誘導される７−２０のアミノ酸長ペプチドの１から３のコピーを含む。
上述のとおり、これらの好ましいＭＵＣ−１誘導体は、当業界で知られる方法にしたがって、グリコシル化されるか、または部分的にグリコシル化されうる。さらに、ＭＵＣ−１およびＭＵＣ−１誘導体を、ポリエチレングリコールのような大型分子量高分子で修飾することができる。さらに、脂質修飾は、それらがリポソームを有する誘導体の被包または相互作用を促進しうるので好ましい。この目的のために有用な例示の脂質部分としては、限定されないが、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイルおよびデカノイル基が挙げられるか、またはさらに一般的には任意のＣ2からＣ30の飽和、モノ飽和またはポリ不飽和脂肪族アシル基が挙げられる。
化学修飾するのに好都合には、ＭＵＣ−１ペプチドに修飾になじみ易い側鎖を有する１種またはそれ以上のアミノ酸を含めることのがしばしば有用である。好ましいアミノ酸は、６−アミノ酸で容易に修飾できるリシンである。アスパルテートおよびグルタメートの側鎖カルボキシルは、セリン、トレオニンおよびチロシン水酸基、シスチンスルフィニル基およびヒスチジンアミノ基である場合、容易に修飾する。
本発明の範囲内のＭＵＣ−Ｉ誘導体の例示も、非ペプチド「模擬」、すなわちＭＵＣ−１タンパク質の１つまたはそれ以上の機能的特徴を模倣する化合物である。模擬は、一般に、水溶性で、タンパク分解に耐性があり、そして非免疫性がある。形態的に制限した、ＭＵＣ−１を模倣する環状有機ペプチドは、例えばＳａｒａｇｏｖｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３巻：７９２頁（１９９１年）によって記述される公知の方法によって生成できる。
「ＭＵＣ−１炭化水素誘導体」をも意図する。ここに使用される場合、このような誘導体は、ＭＵＣ−１誘導体の免疫刺激特性を残すグリコペプチドに該当する。このような炭化水素誘導体は、ＭＵＣ−１タンパク質に付着する炭化水素の全てまたは一部を含むことができる。ＭＵＣ−１炭化水素の少なくとも１つの特性を模倣する模擬物も使用できる。
当業者は、活性化Ｔ細胞を生成させるために他の抗原を使用できることを認識する。このような抗原の例としては、限定されないが、非自己（外来）ペプチド抗原、およびウイルス、腫瘍、細菌または他の病原体由来のペプチド抗原が挙げられる。
２．他の有用な抗原の同定
本方法に有用な全抗原を、種々のＴ細胞応答を測定する確認済みの方法を用いて同定することができる一方、特定のエピトープと関連したさらに特異的な応答を生成させることも有用である。このアプローチにより、より小さく、いっそう経済的に製造される抗原性刺激剤の使用が可能になる。したがって、好ましい抗原は、小型分子、特に、約１００アミノ酸未満、そして通常約６０アミノ酸未満の桁数でのペプチドまたはペプチド誘導体である。
当該技術分野において知られる方法によって、いったん天然（大型）の抗原を同定したら、その抗原性は１個または数個の特異的エピトープに対するものに高めることができる。１つの古典的な方法は、より小型の抗原を誘導する大型の抗原のタンパク分解処理を含む。さらに、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質抗原のフラグメントを製造し、分析して、特定のエピトープを同定できる。さらに、インビトロ合成法によって小さいペプチドを製造し、分析できる。
手をつけていない（intact）抗原の部分を作成し、それらを分析するランダムアプローチに対する代替法として、さらに生物学的に関連の深いアプローチが可能である。ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に結合する抗原性フラグメントは、特に重要であるので、１つの例示のアプローチは、ＭＨＣ分子自身を単離し、そしてその後それに関連したペプチドを単離することである。一般に、この方法によって、腫瘍抗原の特に有用なエピトープをさらに規定することがうまくできる。
典型的な方法では、目的の抗原を発現する一次腫瘍細胞またはセルラインのいずれかを提供する。さらに、マクロファージのような食作用性抗原提示細胞（またはあらゆるＡＰＣ）に大型抗原（またはそれの一部）をあたえることができ、したがってこれらの細胞は、これらの方法の出発材料として使える。ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子は、抗体アフィニティー（ＭＨＣ特異的抗体）およびクロマトグラフィー技術のような公知の方法を用いてこれらの出発細胞から単離することができる。
その後、単離ＭＨＣ分子を、処理して結合ペプチドを放出させる。これは、例えば、洗剤、尿素、塩化グアニジニウム、二価陽イオン、種々の塩、そしてｐＨで極値のもののような結合ペプチドおよびＭＨＣ分子の間の相互作用を中断させる剤で処置することによって達成できる。放出されるペプチドは、常套のクロマトグラフィーおよび抗体アフィニティー（抗原特異的抗体を用いた）方法論を用いてさらに精製することができる。その後、例えば、ペプチドシーケンシング、ガスクロマトグラフィーおよび／または質量光学顕微鏡を用いて、精製ペプチドを配列および構造決定にかけることができる。
この方法では、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に関連した最も有効なペプチドエピトープの配列／構造を決定できる。この配列／構造の情報で供給されると、上で詳述されるとおり、決定配列の変更を行い、公知のＴ細胞アッセイを用いて分析することができる。
以下に示される例で、この方法をＭＵＣ−１系に適用した。ＭＵＣ−１コア反復の一部に対応する７マー配列ＴＳＡＰＤＴＲを、有効なクラスＩ関連ペプチドとして同定した。ＧＶＴＳＡＰＤＴＲ、ＶＴＳＡＰＤＴＲＰ、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡ、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ、ＡＰＤＴＲＰＡＰＧ、ＰＤＴＲＰＡＰＧＳおよびＤＴＲＰＡＰＧＳＴを含む関連する９マーのペプチドを作成した。これらの内の各々を、ＭＵＣ−１特異的細胞毒性Ｔ細胞応答について分析し、そしてＴＳＡＰＤＴＲＰＡが例外的によく作用することが分かった。したがって、この配列は、本発明によってＭＵＣ−１特異的活性化Ｔ細胞を生成する好ましい抗原を表す。
Ｂ．リポソーム被包抗原
本発明の１つの実施形態では、リポソーム中に抗原を被包する。リポソームを製造し、リポソーム中にペプチドを含めた種々の分子を被包する技術は、技術者にとって既知である。リポソームは、水性区分を囲む１つまたはそれ以上の脂質二重層から構成される顕微鏡下の小胞である。一般に、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２巻（補足版１）：Ｓ６１（１９９３年）、およびＫｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６巻：６１８頁（１９９３年）参照。リポソームは、細胞膜に対する組成で類似し、そして結果として、リポソームは、一般に、安全に投与することができ、そして生物分解性がある。
製造の方法によって、リポソームは、単層または多層であってよく、そして０．０２μｍから１０μｍより大きい範囲にある直径を示す大きさで変化しうる。種々の剤は、リポソーム中で被包することができる。内部水性空間（複数の空間）内の二層中の疎水性剤部分および親水性剤部分。例えば、Ｍａｃｈｙら、ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＨＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ、１９８７年）およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６巻：１５７６頁（１９８９年）参照。
リポソームは、実質的にあらゆる型の細胞に吸着でき、そしてその後被包剤を放出する。代替的に、リポソームは、標的細胞を融合し、それによってリポソームの内容物が、標的細胞に注ぐ。代替的に、吸収リポソームを、食作用のある細胞によって細胞内取込みを行うことができる。リポソーム脂質のリソソーム内分解および被包剤の放出によって、細胞内取込み作用を行う。Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４４６巻：３６８頁（１９８５年）。
以下の手段は、多重層（ＭＬＶ−型）、ｐＨ無感応なリポソームを製造するのに使用できる。リポソームの塊状液体組成物は、約３：１：０．２５のモル比で、約３０ｍＭの最終総脂質濃度で、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を含む。モノフォスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミルトン）（またはアバンティ・リキッドＡ（登録商標）；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）；エイ・アール  ３５００７、アラバスター、インダストリアル・パーク・ドライブ７００番）は、約１％から約５％（ｗ／ｗ）のバルク脂質の濃度で脂質混合物に含まれ、そしてリポペプチド濃度は、約５０から約１０００μｇ／ｍｌである。ＭＰＬＡは、有効なアジュバントとしての役割を果たして、Ｔリンンパ球に特異的なＡＰＣによってリポソーム抗原の出現が増加することを生じることが示された。Ａｌｖｉｎｇ．Ｃ．Ｒ．、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１８７巻：４３０−４４６頁（１９９３年）（２１）。
技術者は、デトックス・アルム、ＱＳ２１、完全および／または不完全フロイントアジュバント、ＭＤＰおよびリピッドＡのような他のこのようなアジュバントも適切であることを認識する。塊状脂質、ＭＰＬＡおよびリポペプチド（約１２ｍＬの最終産物について約１９２ｍｇＤＰＰＣ、約３３ｍｇＣｈｏｌ、約１５ｍｇＤＭＰＧ、約２．４から１２ｍｇＭＰＬＡおよび約０．６から１２ｍｇのＢＬＰ−２５（ＭＵＣ−１から２５ａａペプチド）を、約５．３ｍＬのエタノールに溶解する。本明細書に使用されるとおり、リポペプチドは、パルミチン酸、ミリスチン酸および同等物のようなアミノまたはカルボキシ末端脂質部分を含むペプチドである。
１つの実施形態では、ＢＬＰ−２５（マルミトイル化ＭＵＣ−１ペプチド誘導体）のようなリポペプチドは、リポソームでの被包のための抗原ペプチドとして使用する。したがって、ＭＵＣ−１のこのリポペプチド誘導体を、ＭＰＬＸと一緒に、小型のｐＨ不感応リポソームに被包する。
エタノール溶液を約５０℃に暖め、そして３０ｇ針を介して、同じ温度で迅速に攪拌したＰＢＳのような約１００ｍＬの適切な緩衝液に注入する。生じたリポソーム懸濁液（主に小型の単層小胞、ＳＵＶ）は、エタノールを激減させ、そして約３００ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を示すサルトリウス細胞でダイアフィルトレーションによって濃縮される。最初、容量を約１０−２０ｍＬに減少させ、そしてその後、その産物を、約１００ｍＬのＰＢＳでダイアフィルトレーション物を連続置換することによって洗浄する。容量を、約１２ｍＬ未満まで減少させ、そしてダイアフィルトレーションセルから除去した後、約１２ｍＬの最終容量まで再構築する。
都合により、その後、産物を、３回、２０，０００ポンド／平方インチでフレンチ圧力セル（SLM Aminco、ニューヨーク州ロチェスター）に通過させて、全てのリポソーム粒子を、滅菌に使用される０．２２μｍフィルターを通過する大きさに減少させることを確認する。サイズ分析では、平均粒子サイズは、わずかに０．１μｍより下であることが示される。
陰イオンリポソームベクターも試験した。これらには、細胞内取込みおよびエンドソーム酸化を伴うエンドソーム膜を分離または融合するｐＨ感受性リポソームが含まれる。
リポソームベクターの中でも、陽イオン性リポソームは、インビトロで哺乳類細胞感染を指示する上でのそれらの効力のため、最も研究されている。それらは、しばしば、核酸の送達に使用されるが、他の治療剤の送達に使用することができる。それらは、医薬またはホルモンである。
陽イオン性脂質は、これらの複合体が、インビボで、陰イオン分子が豊富である生理学的環境に不適合であるように見える場合、自然には見られず、そして細胞毒性である可能性がある。リポソームは、細胞内皮系に優先的に食作用される。しかし、細胞内皮系を、大用量のリポソーム粒子での飽和、または製薬学上の手段による選択的マクロファージ不活性化を含めた数種の方法によって包囲する。Ｃｌａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８０２巻：４２８頁（１９８４年）。さらに、グリコリピッドまたはポリエチレンゲル誘導リン脂質をリポソーム膜に取込むと、細胞内皮系による摂取が明らかに減少することが示された。Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８巻：１３３頁（１９９１年）；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０巻：９頁（１９９３年）。
陽イオンリポソーム調製物は、常套の方法論によって作成できる。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４巻：７４１３頁（１９８７年）；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ、Ｊ．ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２巻：１４５頁（１９９２年）；Ｃｈａｎｇら、上記（１９８８年）参照。リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ▲Ｒ▼）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ゲイザースバーグ）も利用可能である。リポソームの量およびＤＮＡの量は、用量応答曲線に基づいて各細胞型について最適化することができる。Ｆｅｌｇｎｅｒら、上記。使用した方法についてのある種の最初の検討については、Ｗａｓｓｅｆら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２１７−２２２頁（１９９４年）およびＷｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２１７−２２２頁（１９９４年）参照。
本発明の方法で使用される他の適切なリポソームとしては、多重層小胞（ＭＬＶ）、オリゴ層小胞（ＯＬＶ）、単層小胞（ＵＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、中程度の大きさの単層小胞（ＭＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、巨大単層小胞（ＧＵＶ）、多重層小胞（ＭＶＵ）、逆相蒸散法（ＲＥＶ）によって生じる単一またはオリゴ層小胞、逆相蒸散法によって生じる多重層小胞（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定な複数層小胞（ＳＰＬＶ）、凍結および解凍ＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押出法によって製造した小胞（ＶＥＴ）、フレンチプレスによって製造した小胞（ＦＰＶ）、溶解よって製造した小胞（ＦＵＶ）、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）、およびバブルソーム（ＢＳＶ）が挙げられる。技術者は、これらのリポソームを作成するための技術が当業界で既知であることを認識する。ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、６６巻（Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９４年）参照。
Ｃ．Ｔ細胞
技術者に既知の技術を用いて、無垢の、記憶および免疫性欠如のＴ細胞を作成する。例えば、以下の手段を使用する。Ｔ細胞増強については、約３０−５０×１０6ＰＢＬを、１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁させ、そして予備調整した５ｍＬナイロンウールカラム（ロビンズ・サイエンティフィック、カリフォルニア州サニーバール）を培地に負荷する。負荷ナイロンウールカラムを、約３７℃で、約４５分間インキュベートし、そしてその後、穏和な（約３７℃）ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄することによって、非粘着Ｔ細胞を溶出する。溶出Ｔ細胞を、「無垢の」または免疫性欠如Ｔ細胞として使用する。
技術者は、他の既知の技術が、Ｔ細胞を製造するのに使用できることを認識する。多くのこのような技術は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年）の３．１．２から３．６．４頁に記述されている。市販で入手可能なカラムを、Ｔ細胞増強のために一般に使用し、そのいくつかは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増強に特異性がある。他の方法としては、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ、レイク・サクセス、ニューヨーク１１０４２）およびＭｉｎｉＭＡＣＳ（ミルテニ・バイオテック，インク．（Ｍｉｌｔｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州９５６０３アーバン）のような親和性ビーズが挙げられる。
Ｄ．抗原提示細胞
本発明の１つの実施形態では、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＡＰＣとして使用する。ＰＢＬを、当業界で認識された手段を用いて単離する。例えば、「軟層」を、フィコール−ハイパーク勾配遠心分離のような方法を用いて末梢血サンプルから収集し、他の構成要素からＰＢＬ（末梢血リンパ球）を分離するのに使用する。ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年）の７．０．５から７．１．５頁に記述される技術を参照のこと。
Ｅ．活性化Ｔ細胞の作成
ＰＢＬ、無垢なまたは免疫性欠如のＴ細胞およびリポソーム被包抗原を、上述のとおり作成する。ＰＢＬの内のいくつかを凍結し、そして後期再刺激用の自己由来ＡＰＣとして使用する。全細胞のインキュベーションを、約３７℃の温度を示し、そしてＣＯ2および湿気を供給したインキュベーターで行った。１つの実施形態では、活性化のために使用したＴ細胞およびＡＰＣのために使用したＰＢＬは自己由来のものである。したがって、本発明の１つの実施形態で、以下の手段を、活性化Ｔ細胞を作成するのに使用する。
１）ＰＢＬを、リポソーム被包抗原と混合して、リポソーム抗原負荷ＰＢＬを作成する。例えば、０．９ｍｌのＡＩＭ  Ｖ（血清不含リンパ球培地）（ライフ・テクノロジーズ）中の約１０4から約１０9ＰＢＬＳ（例えば、〜２×１０6ＰＢＬ）を、リポペプチド配合物（例えば、ＰＢＳ中で０．１ｍｌの容量で約０．１μｇから約１ｍｇリポペプチド、および約０．１μｇから約１ｍｇのＭＰＬＣのような脂質）を含む１用量のリポソームに添加し、そしてＣＯ2供給インキュベーター中で約３７℃で、約１時間から約１８時間インキュベートする。他の適切な細胞培地は、当業界で既知である。このような培地としては、限定されないが、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭおよびマッコイのものが挙げられる。すなわち、ＰＢＬを、マイトマイシンＣ（または３０００ラッドでのガンマ照射）で処理し、そしてその後洗浄する。
２）（〜１×１０6細胞および１×１０6リポソーム抗原負荷ＰＢＬ）／ｍｌ（段階（１）から）を、２５ｃｍ2組織培養容器（フラスコまたはプレートのような）中で総量約〜１０ｍｌ  ＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁させ、そして３７℃インキュベーターに入れる。Ｔ細胞およびＰＢＬを、ウエル当たり約１０3から１０7個の細胞の範囲内で使用できる。
３）約２４時間後、組換えＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）（インターメディコ、オンタリオ州マークハム）およびＩＬ−１２（１００ｐｇ／ｍｌ）（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）を、段階（２）の混合物に添加し、そしてＣＯ2を用い、３７℃で５−７日間インキュベートする。ＩＬ−１２は、生成中のＣＤ４+Ｔ細胞のサイトカインプロフィールでのＴＨ１パターンへの移動を好むことが示された。Ｈｓｉｅｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：５４７−５４９頁、１９９３年（２７）。技術者は、ＴＨ１応答パターンが、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の相対的不在下でＩＬ−２およびガンマ−ＩＦＮの産生によって特徴づけられることを認識する。ＩＬ−１２も、ＣＤ８+Ｔ細胞の一次活性化の間じゅうγ−ＩＦＮ産生の導入で共同に作用する。Ｇａｊｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻：５６３７−５６４８頁、１９９５年。組換えＩＬ−７（ｒＩＬ−７）は、前駆体ＣＴＬの成長および分化を増強することが先に例示された。Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２巻：５７７−５８７頁、１９９０年；Ｋｏｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２巻：３１８３−３１８５頁、１９９２年。
他の適切なサイトカインも、この段階に使用する。例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ガンマインターフェロンまたはＩＬ−１５を、あらゆる組合わせで使用する。適切な組合わせとしては、限定されないが、ＩＬ−２とＩＬ−４；ＩＬ−２とＩＬ−５；ＩＬ−２とガンマ−ＩＦＮ；ＩＬ−２とＩＬ−１が挙げられる。技術者は、活性化に使用したサイトカインの濃度および組合わせは、細胞、実験条件および選択したサイトカインによって変化することを認識する。最適なＴ細胞刺激について分析によって、最適レベルを測定しうる。
４）段階（３）に続いて、全Ｔ細胞およびＰＢＬを収集し、そして新鮮なＡＰＣを添加し、そして混合物を、約２４時間インキュベートする。この段階で添加したＡＰＣを、段階（１）で記述されるとおり、ペプチド抗原で負荷したリポソームで負荷する。
５）段階（４）の後、追加のＩＬ−７（約１から約５０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（約１０から約５００ｐｇ／ｍｌ）を培養用培地に加える。１つの実施形態では、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２を使用する。
６）細胞混合物を、３７℃で、ＣＯ2および湿気を用いて、インキュベーターで約５−７日間インキュベートする。この時点で、上清をサイトカインスクリーニングのために収集する。このような材料を、スクリーニングに使用するまで、−８０℃で保持する。
７）取得物である活性化Ｔ細胞を、技術者に既知の手段を用いて収集する。典型的な手段では、組織培養フラスコに存在する細胞および培地を単離し、そして細胞を、ＡＭＶ培地で二回洗浄し、そして収穫細胞として使用する。代替的に、ＰＢＬを単離するためのものに類似するフィコールの手段を用いて、生細胞を分離する。
Ｆ．Ｔ細胞の特徴
１．増殖アッセイ
Ｔ細胞増殖アッセイは、当業界で既知である。このようなアッセイを、特異的結合抗原がＴ細胞増殖を刺激するかどうかを測定するのに使用する。例えば、ＡＩＭ  Ｖ培地中の約１０5Ｔ細胞および５×１０4ＡＰＣ／ウエル／２００μｌを用いた９６穴プレートを用いて、このようなアッセイを設定する。他のＴ細胞およびＡＰＣ濃度を使用できる。ＡＰＣを、マイトマイシンＣで予備処理して、増殖を阻害する。対照または試験溶解性ペプチドで負荷したＡＰＣ、およびペプチドまたはリポペプチドを含むリポソームを、Ｔ細胞の刺激のための剤として使用する。約５−６日後、細胞に、3Ｈ−Ｔｄｒ（約１μＣｉ／ウエル）でパルス標識する。パルス標識の１２−１８後、細胞を収穫し、そしてＴ細胞への3Ｈ−Ｔｄｒ組込みを測定する。
適切な細胞収穫機が、フィルター紙上の細胞を収集する。フィルター紙に結合したか、または捕捉された放射活性を結合することによって、放射活性のＴ細胞への取込みを評価する。
２．Ｔ細胞表面でのＣＤ抗原の評価
どのＣＤ抗原が、活性化Ｔ細胞の表面に存在することを決定するために、当業界で認識されている技術を使用する。一般に、蛍光顕微鏡を介して、または血球計算法モードで使用される蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を介してＴ細胞を「染色」するのにフルオロクロムで標識した抗−ＣＤ抗原抗体を、使用する。ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５年）１巻、第５章を参照のこと。
３．サイトカイン産生
当業界で認識された技術を用いて、細胞によるサイトカイン産生の測定を行う。技術者は、ＥＬＩＳＡ技術を用いて、細胞培養培地中でインターロイキンまたはインターフェロンのようなサイトカインの濃度を測定することを知っている。あるサイトカインが特異的細胞型の刺激を導くバイオアッセイによって、インターロイキンのようなサイトカインを検出する。適切なサイトカイン検出技術は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイであり、そしてフローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン決定法である。ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年）１巻、第２章を参照のこと。
Ｇ．研究技術
本発明の１つの実施形態では、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を生成するのに有効である抗原およびエピトープを同定する方法に関する。この方法は、
（１）抗原およびエピトープ候補である種々のペプチドでの、適切な培養細胞（Ｔ細胞、ＰＢＬ）を初回感作する段階と、
（２）段階（１）で感作した細胞の増殖およびサイトカイン産生を評価する段階とを含む。
増殖およびサイトカイン産生を、上述のとおり評価する。代替的に、サイトカイン産生を、以下の方法を用いて評価する。分析物（分析されるべきサイトカイン）に対する１つの抗体を、固相（９６穴プレートのような）に付着させ、したがってサイトカインに結合（または捕捉）するのに使用する、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイを使用する。分析物について分析されるべきサンプルを、固相に露出する。結合および洗浄後、二次抗−分析物抗体（レポーター基を含む）を加える。適切なレポーター基としては、限定されないが、放射活性アイソトープ、蛍光基、および酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ）が挙げられる。レセプター標識抗体を、適切な時間インキュベートし、そして固相を洗浄して未結合レポーターを除去する。その後、公知の標準法でサンプル値を比較することによってサンプル（例えば、放射活性測定；色素原または比色評価（酵素接合抗体について））内の分析物の量を測定するのに適切な検出技術を使用する。
技術者は、十分に公知な技術を、ある抗原中の特異的アミノ酸の欠失および突然変異について使用することができることを認識する。このような技術を用いて、所望のＴ細胞活性化について必要とされるエピトープを同定する。例えば、重複配列地図作成技術を使用する。特に、候補抗原から得た９つのアミノ酸長ペプチドを、Ｔ細胞刺激活性について試験する。その時に公知のタンパク質配列を介して、１つのアミノ酸を進行することによって重複９ａａ配列を作成することによって、一連のペプチドを作成する。この方法では、最高のＴ細胞刺激活性を示すペプチドを同定する。
他の実施形態では、本発明は、
（１）目的の抗原に対するＴ細胞応答を生成し、
（２）細胞表面抗原相同性、サイトカイン産生、および技術者に十分に知られるパラメーターを評価することによって、Ｔ細胞応答を特徴づけること
を特徴とする、Ｔ細胞免疫応答を特徴づける方法に関する。例えば、１型、２型、３型、および０型は、公知のＴ細胞応答型である。
Ｈ．治療方法
本発明による方法を用いて、種々のペプチドを、免疫療法用の細胞ワクチンを生成するのに使用する。このようなワクチンは、例えば、自己由来ＰＢＬのようなペプチド抗原負荷ＡＰＣである。さらに、抗原刺激Ｔ細胞を、「適合Ｔ細胞移入療法」として知られる技術であるワクチン化するのに使用することもできる。本発明によるワクチンを、（ａ）患者へのワクチン投与に伴う疾患発生の回避および／または（ｂ）疾患に罹った患者の治療のために使用する。
例えば、ＢＬＰ−２５ペプチド抗原を、リポソーム内に組込み、そして上述のとおり、ＰＢＬに抗原を負荷するのに使用する。負荷ＰＢＬは、細胞ワクチンとして患者に注入しなおすことができる。負荷ＰＢＬも、上述のとおり、インビトロで自己由来Ｔ細胞を活性化するのに使用することができる。これは、抗原特異的Ｔ細胞の集団の拡張をする。その後、これらの活性化Ｔ細胞を、例えばアデノ癌腫に罹った患者に再投与する。適合Ｔ細胞移入療法について当業界で認識されている技術の説明については、Ｂａｒｔｅｌｓら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３（１）巻：６７頁（１９９６年）を参照のこと。
本発明によるＴ細胞活性化法は、免疫療法でワクチンとして使用するため、または癌、腫瘍、ウイルス感染、および細菌感染のような種々の病態のための候補である抗原に対する細胞毒性およびヘルパーＴ細胞応答を生じさせるために使用される。したがって、本発明による方法を使用して、候補抗原を選択し、リポソームに被包し、自己由来ＰＢＬを負荷するのに使用し、そして負荷ＰＢＬを患者に注入するか、または代替的に、ＰＢＬを、自己由来Ｔ細胞を活性化するのに使用する。刺激されたＴ細胞を、前述の障害の内の１つに罹っている患者に再投与する。技術者は、ペプチド抗原が、患者に影響を及ぼす疾患の型に基づいて選択されることを認識する。例えば、ＭＵＣ−１抗原を、アデノ癌腫の治療に使用される抗原特異的Ｔ細胞を作成するのに使用する。他の例としては、限定されるものではないが、以下の抗原が挙げられる。
１つの実施形態では、エピトープは、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バジシア症、住血吸虫症に連結したエピトープのような寄生関連エピトープである。適切な寄生関連エピトープとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
0004480800.tif 000004
他の実施形態では、エピトープは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、または肝炎ウイルスに関連したエピトープのようなウイルスエピトープである。適切なウイルス性エピトープとしては、限定されるものではないが、次のようなものがある。
0004480800.tif 000005
エピトープは、細菌性抗原と関連している可能性もある。適切なエピトープとしては、限定されるものではないが、次のものがある。
0004480800.tif 000006
したがって、充分なＴ細胞応答を、インビトロで腫瘍関連自己抗原性ペプチド（潜在的自己）に対するヒトで生じさせる。上述のとおり、ＭＵＣ−１ペプチドを、アデノ癌腫を治療するために使用する。
特定の型の癌およびウイルス感染に罹っている患者のＴ細胞が、ペプチド抗原での刺激に対して不感応性、または免疫性欠如になることが観察された。多数の研究では、Ｔ細胞応答性のこの欠如は、ペプチド抗原での刺激を伴うＩＬ−２産生での欠陥に起因すると考えた。外来性ＩＬ−２の添加によって、Ｔ細胞は、抗原に応答できるようになる。Ｂｅｖｅｒｌｙら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４（６）巻：６６１頁（１９９２年）、およびＷｏｔｔｏｎら、Ｉｌｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２（２）巻：９５頁（１９９５年）参照。しかし、インビボでのＩＬ−２の高レベルの投与は、毒性のある副作用を示す。これらの副作用は、ＩＬ−２が投与前にリポソームに被包されるときに際立って減少される。
したがって、他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞免疫応答を高め、そしてペプチド抗原に対するインビトロでのＴ細胞抗原を逆行させる方法を含む。一般的方法は、遊離ＩＬ−２またはオンコリピン（リポソームに被包したＩＬ−２）と一緒に免疫性欠如または無垢のＴ細胞を同時培養し、続いて抗原負荷ＡＰＣを有する結果物であるＴ細胞を活性化させることを含む。
前述の詳細な説明および以下の例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
例
例１
本例は、クラスＩ制限抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞応答を生じるＭＵＣ−１モデルの使用法を例示する。
１．材料および方法
ペプチド。種々の合成ペプチドを、ミリガン／バイオリサーチ・モデル９０５０ペプチド合成機（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州マルボロー）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸での自動化固相合成によって生成した。以下のペプチドを、ＨＰＬＣによって測定したとおり９５％純度であるこれらの研究に使用した：先にｐ−２４Ｈと称されたヒトＭＵＣ−Ｉ  ２４−アミノ酸ペプチド（ＢＰ２４）（Ａｇｒａｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５年）（ＢＰ２４についてのアミノ酸配列：ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ）；ＢＰ−２５（ＢＰ−２５についてのアミノ酸配列：ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ）、マウスＭＵＣ−１、２４アミノ酸ペプチド（ＢＰ−２４Ｍ）ＤＳＴＳＳＰＶＨＳＧＴＳＳＰＡＴＳＡＰＥＤＳＴＳ。先行のペプチドのいずれもが、そのペプチド（脂質ペプチド）のカルボキシ末端に加えられたリシン残基においてパルミトイル基を含む。例えば、ＢＬＰ−２４およびＢＬＰ−２５は、それぞれ、カルボキシ末端の付近に加えたリシンのイプシロン・アミノ酸基にパルミトイル基を有するＢＰ−２４およびＢＰ−２５の脂質ペプチド版である。ＢＬＰ−２５は、ＢＰ−２５と、追加のリシンおよびグリシン残基のアミノ酸配列を示し、そしてＢＬＰ−２４は、ＢＰ−２４の類似体である。
抗体。Ｗ６／３２（ｐａｎの抗ＨＬＡクラスＩ抗体）。ＯＫＴ８（抗ＣＤ８）およびＯＫＴ４（抗ＣＤ４）抗体を、Ｔ細胞応答を遮断するのに使用した。抗体（Ｗ６／３２、ＯＫＴ４、ＯＫＴ８）およびそれらのイソタイプ対照抗体を、ＡＴＣＣから得たハイブリドーマの培養上清から精製した。ＦＡＣ染色については、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８−ＰＥ、抗ＣＤ２５−ＰＥおよび抗ＣＤ３−ＰＥ、抗ＣＤ２８−ＰＥ、抗ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ６９−ＰＥおよびイソタイプ対照抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州マウンテン・ビュー）から得た。
リポソームの製造−エタノール注入プロセス。リポソームの塊状液体組成物は、３：１：０．２５のモル比で、そして３０ｍＭの総脂質濃度で、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（ジェンザイム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から構成される。モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）（ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ・インク、モンタナ州ハミルトン）を、約１％から約５％（ｗ／ｗ）の塊状脂質の濃度で脂質混合物に含ませ、そしてリポペプチド濃度は、約５０から約１０００μｇ／ｍＬであった。１２ｍＬの最終産物のための塊状脂質、ＭＰＬＡおよびリポペプチド（１９２ｍｇＤＰＰＣ、３３ｍｇＣｈｏｌ、１５ｍｇＤＭＰＧ、２．４から１２ｍｇＭＰＬＡおよび０．６から１２ｍｇのリポペプチド）を、５．３ｍＬのエタノールに溶解させた。エタノール溶液を、５０℃に加温し、そして３０ｇ針を介して、同じ温度で迅速に攪拌した１００ｍＬのＰＢＳに注入した。生じたリポソーム懸濁液（おおむね小型単層小胞、ＳＵＶ）から、エタノールを激減させ、そして３００ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を示すサルトリウスセルでのダイアフィルトレーションによって濃縮した。最初、量を、１０−２０ｍＬに減少させ、そしてその後産物を、１００ｍＬのＰＢＳを用いたダイアフィルトレーション物の連続置換によって洗浄した。量を、１２ｍＬ未満に減少させ、そしてダイアフィルトレーションセルから除去した後、１２ｍＬの最終量まで再構築した。その後、産物を、３回、２０，０００ポンド／平方インチでフレンチ圧力セル（SLM Aminco、ニューヨーク州ロチェスター）を介して通過させ、全リポソーム粒子が、滅菌に使用される０．２２μフィルターを通過する大きさまで減少したことを確認した。サイズ分析では、平均粒子サイズが０．１μよりわずかに下であることが示された。
サイトカイン。ヒト組換えサイトカイン、ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、ＩＬ−７（インターメディコ、オンタリオ州マークハム）を、使用直前に、血清不含ＡＩＭ−Ｖ培地（ライフ・テクノロジーズ）に希釈した。
リポソーム被包ペプチドを用いたＡＰＣを負荷するための一般的手段
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、フィコール−ハイパーク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で遠心分離することによって、ヘパリン化血液から精製した。遠心分離によって得たフィコール−血液干渉層を、収集し、そして使用前にＲＰＭＩで二回洗浄した。
簡潔には、０．９ｍＬ  ＡＩＭ−Ｖ培地中に２−１０×１０6ＰＢＬまで、リポペプチド配合を含むリポソームの１用量を添加し、そしてＰＢＬを、ＣＯ2供給インキュベーターを用いて、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＬを、マイトマイシンＣまたはγ−照射（３０００ラッド）で処理し、続いてＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄した。
バルクでのＴ細胞培養  Ｔ細胞増強については、３０−５０×１０6ＰＢＬを、１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁させ、そして予備調整した５ｍＬナイロンウールカラムＲｏｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、（カリフォルニア州サニーバール）を培地に負荷する。負荷ナイロンウールカラムを、約３７℃で、約４５分間インキュベートし、その後、穏和な（約３７℃）ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄することによって、非粘着Ｔ細胞を溶出する。最初に、バルク培養を、２５ｃｍ2組織培養滅菌フラスコ（コーニング・グラス、ニューヨーク州コーニング）で開始した。負荷した１０7抗原、１６−２４時間、ＡＩＭ−Ｖ培地中の１０ｍＬの総量でガンマ照射自己由来ＰＢＬの存在下で１０7Ｔ細胞を培養し、その時点で、培養に、ヒトｒＩＬ−７（１０μｇ／ｍＬ）およびヒトｒＩＬ−１２（１００ｐｇ／ｍｌ）を供給し、そしてさらに６−８日間以上放置した。培養の７−１０日の終わりに、生存Ｔ細胞を収集し、そしてリポソーム抗原で負荷した自己由来ＡＰＣで再刺激した。再刺激の２回の保存的サイクル（１４−１６日）の後、Ｔ細胞を収集し、計数した。上清を、サイトカインスクリーニングの１４日目にバルク培養物から収集し、そしてアッセイに使用されるまで、−８０℃に凍結したままにした。反復した凍結／解凍を避けた。
Ｔ細胞増殖アッセイ  上述のとおり、培養の１４−１６日の終わりに得たＴ細胞（５×１０4−１×１０5）を、５日間の期間、３７℃、７％ＣＯ2および湿気で、９６穴平底組織培養プレート中でＡＩＭ−Ｖ培地中２００μＬの総量での、種々の抗原含有リポソーム、溶解性ＢＰ２４、溶解性ＢＬＰ−２４Ｍ、負荷または未負荷自己由来性リポソーム、およびマイトマイシンＣ処理ＡＰＣ5（５×１０4−１０5）の存在下でインキュベートした。各群を、５複写ウエルで培養した。５日目の終わりに、１００μｌの培養上清を、各ウエルから収集し、そして以下に記載するとおり、ＥＬＩＳＡによってγ−ＩＦＮまたはＩＬ−４の存在について試験した。サイトカインについて上清を収集した後、１μＣｉ3Ｈ−Ｔｄｒ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、（オンタリオ州オークスビル）を、各ウエルに加え、そして一晩インキュベートした。プレートを収集し、マトリックスベータ計数計で計数した後に、細胞を増殖するＤＮＡへの3Ｈ−Ｔｄｒの取込みを測定した。
細胞毒性Ｔリンパ球アッセイ。ＣＴＬアッセイについては、３つの（ＨＬＡ．Ａ２+）正常なドナーのＰＢＬを使用した。Ｔ細胞を、上述のとおり、バルク培養で２週間育成した。２週目の終わりに、生きたＴ細胞を、フラスコから収穫し、そして計数した。標的は、突然変異体Ｔ２細胞であった。Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：２０７２−２０７７頁（１９９３年）；Ｓｔａｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９巻：７８７１−７８７５頁（１９９２年）。公知の方法を用いてＭＵＣ−１ミニマーペプチドＡＴＡＰＰＡＩＩＧＶおよびＳＡＰＤＴＲＰＡＰを用いて、ＨＬＡ．Ａ２発現のＭＵＣ−１ペプチド依存性上昇制御を試験した。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６巻：４７６頁（１９８９年）。Ｔ２細胞に、種々のＭＵＣ−１合成ペプチドを、外来性β２ｍの存在下２００μＭで一晩負荷した。Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：２０７２−２０７７頁（１９９３年）；Ｓｔａｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９巻：７８７１−７８７５頁（１９９２年）。その後、これらのペプチド負荷Ｔ２標的細胞に、９０分間、51Ｃｒ（ＮａＣｒＯ4を用いて）を負荷し、そして厳密に洗浄した。先に記述されるとおり、ＣＴＬアッセイを行った。Ａｇｒａｗａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６巻：２０８９頁（１９９６年）。比死滅率を、実験的放出−自然発生的放出／最大放出−自然発生的放出×１００として計算した。使用したエフェクター対標的比は、１０：１、２０：１、６０：１、および１２０：１であった。各群を、４つの複写物で設定し、そして平均比死滅率を計算した。
培養で生成されたγ−ＩＦＮ、ＩＬ−１０およびＩＬ−４のＥＬＩＳＡによる概算
上清  バルク培養物から収集した上清画分を、別々にγ−ＩＦＮおよびＩＬ−４およびＩＬ−１０について試験した。増殖アッセイプレート中で、上清を個別に収集し、そしてその後γ−ＩＦＮおよびＩＬ−４の存在について試験した。
γ−ＩＦＮアッセイによって、９６穴ＮｕｎｅＥＬＩＳＡプレートを一晩、４℃で、ＮａＨＣＯ3緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中のマウス抗−ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体（ジェンザイム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いて被覆した。その後、正の対照ヒトγ−ＩＦＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および組換えγ−ＩＦＮ対照標準と同様に試験サンプルを、２時間インキュベートし、続いて二次抗体（ヤギ抗−ヒトγ−ＩＦＮ）によって２時間行い、続いて三次抗体（ビオチン・ロバ抗−ヤギＩｇＧ）で４５分間室温で行った。３０分間、接合体（ペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州バー・ハーバー）とインキュベートし、そしてＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質およびＨ2Ｏ2（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーラント州ゲーサーズバーグ）を添加することによって、このインキュベーション段階を行った。この時点で、プレートを、動態モード［分子サーモマックス二重波長（４０５−４９０ｎｍ）］でＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州メンロー・パーク）で読取った。
ＩＬ−４アッセイについては、ＥＬＩＳＡは、２段階手段であり、そしてペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン段階は、二次抗体（ビオチンマウス抗−ヒトＩＬ−４）とインキュベーションした後に来た。試薬およびモノクローナル抗体のほとんどは、（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。検出されたサイトカインの定量の範囲は、ＩＬ−４については３１−１０００ｐｇ／ｍｌであり、そしてγ−ＩＦＮについては２５−８００ｐｇ／ＭＬであった。
ＩＬ−１０アッセイについては、ＥＬＩＳＡは、二次抗体（ビオチンラット抗−ヒトおよび細菌性ＩＬ−１０ポリクローナル抗体）とのインキュベーションを、ペルオキシド接合ストレプトアビジンとのインキュベーションに続けた二段階手段であった。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の全ては、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ））から得た。ＩＬ−１０検出の範囲は、１００−６４００ｐｇ／ｍＬであった。
細胞表面免疫蛍光染色。細胞表面抗原の検出については、バルク培養から得たＴ細胞収穫（先に記述されるとおり）を、１％ＢＳＡを含む冷ＰＢＳで一回洗浄し、続いて１０μｌヤギＩｇ（３ｍｇ／ｍｌ）を細胞ペレットに加え、そして氷上で１０分間インキュベートし、それに１％ＢＳＡおよび３％ヒトＡＢ血清を含む５０μｌのＰＢＳを添加した。
間接染色については、細胞を、３０−４５分間、氷上で試験抗体またはイソタイプ対照抗体（２μｇの５×１０5Ｔ細胞）とインキュベートした。１０％ＢＳＡを含むＰＢＳの１００μｌを添加し、そして細胞は、４℃で、冷ＰＢＳで一回洗浄した。二次抗体である、１％ＢＳＡおよび３％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで希釈したヤギ抗マウスＩｇＧＩ−ＰＥ（７０μｌの１：１００希釈）を添加し、そして４℃で、氷上で３０−４５分間インキュベートした。１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（２００μｌ）を添加し、そして細胞を、４℃で、ＰＢＳで一回洗浄した。直接的に標識した試験抗体については、唯一単一のインキュベーション段階を行った。単一染色については、細胞を、ＰＢＳを含む２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に再懸濁させた。二重染色については、１０μｌのマウスＩｇ（３ｍｇ／ｍｌ）を細胞ペレットに添加し、そして１０分間氷に載せ、そして１％ＢＳＡおよび３％ヒトＡＢ血清を含む５０μｌのＰＢＳで添加した。１０μｌの二次間接標識抗体を添加し、そして氷上に３０−４５分間インキュベートし、続いてＰＢＳを含む１０％ＢＳＡの１０μｌを添加し、冷ＰＢＳに一回洗浄し、そしてＰＢＳを含む２％ＰＦＡ中で再懸濁した。平行して、適切なイソタイプ対照抗体を、同様の方法で細胞を染色するのに常に使用した。一般に、サンプルを、ＦＡＣＳｏｒｔR（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた流動細胞計測法によって稼動および分析した。正の細胞含有率は、対照イソタイプ適合抗体染色細胞の少なくとも９８％で排除するために設定された領域を越えた蛍光強度を表す細胞の画分として規定した。
２．結果
Ａ．合成ＭＵＣ−１リポペプチドに対するインビトロＴ細胞応答の導入
これらの研究で使用した合成ＭＵＣ−１リポペプチド（ＢＬＰ−２５）を、数種のＨＬＡクラスＩ分子、例えばＨＬＡ−Ａ１１、Ａ３、Ａ２．１およびＡ１に結合する許容量を有するという事実により選択した。Ｄｏｍｅｎｅｃｈら、Ｊ．Ｉｎｎｕｎｏｌ．１５５巻：４７６６頁（１９９５年）。さらに、ＭＵＣ−１ペプチドＢＰ−２４（ＢＬＰ−２５の配列の範囲内で含まれる）は、ＨＬＡクラスＩＩ制限ＣＤ４+Ｔ細胞応答のための許容エピトープである。Ａｇｒａｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５巻、上記。ＢＬＰ−２５は、ペプチドのカルボキシ末端に付着したパルミトイル鎖を有する、アミノ酸配列ＢＰ−２５である。脂質側鎖は、リポソームへのＢＰ−２５ペプチドの結合を促進する。
ＢＰ−２４は、ＢＬＰ−２５（およびＢＰ−２５）のアミノ末端セリンを欠く。ＢＬＰ−２５（およびＢＰ−２５）に存在するアミノ末端セリンは、数種のＨＬＡクラスＩ分子に結合する追加の能力を付与することが示された。Ｄｏｍｅｎｅｃｈら、上記。
Ａｇｒａｗａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５巻：２２５７頁（１９９５年）に記載される方法を用いて、可溶性形態でのＢＬＰ−２５に対する、正常な赤十字のドナー（ｎ＝４）の軟層から単離したＰＢＬの一次、二次および三次インビトロＴ細胞増殖応答を測定した。一次、二次および三次刺激全てで、抗原特異的Ｔ細胞増殖（Ｓ．Ｉ．＜３）は目立って観察されなかった。
上述したエタノール注入手段を用いて、ＢＬＰ−２５リポペプチドおよびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）を含むｓｕｖを作成した。無垢なＴ細胞を、上述のとおり正常な赤十字のドナーのＰＢＬから単離し、そしてＢＬＰ−２５で負荷した自己由来ＰＢＬまたは対照抗原含有ＳＵＶリポソームの存在下で培養した。種々の濃度のペプチドを含有するＢＬＰ−２５リポソーム調製物で予備負荷した自己由来でマイトマイシンＣ処理したＰＢＬでＴ細胞を培養した。培養は、自己由来ＡＰＣ（ＢＬＰ−２５抗原／リポソーム負荷）と週ごとに再刺激しながら、１週間、２週間または３週間行った。
無垢のＴ細胞を刺激するために可溶性ペプチド抗原を使用する場合、一次および二次刺激の間にペプチド特異的増殖反応は観察されなかった。しかし、Ｔ細胞を、二週間の期間、抗原−リポソーム負荷自己由来ＰＢＬで二回刺激し、そしてその後、多数の試験または対照抗原ペプチドリポソーム負荷自己由来ＡＰＣに対する増殖応答について試験する場合、3Ｈ−チミジウム取込みによって測定されるとおり、強力な抗原特異的Ｔ細胞増殖応答があった。Ｔ細胞の増殖応答は、リポソーム調製物中の抗原ペプチドＢＬＰ−２５の用量に依存した。したがって、リポソーム被包ＭＵＣ−１ペプチドで処理した無垢のＴ細胞で強力な増殖応答を観察した。
以下の対照を使用した。ＢＬＰ−２５リポソームで負荷したＡＰＣで培養したＴ細胞の応答を、（１）可溶性抗原ペプチド；ＢＰ２４、ＢＰ２４Ｍおよび（２）ＢＬＰ−２５のマウス相同物を含むリポソーム、ＢＬＰ−２４Ｍリポペプチドと比較した。これらの対照抗原ペプチドに対する増殖性Ｔ細胞応答はなかった。ＢＬＰ−２５／リポソームに対する、ドナーＰＢＬから得たＴ細胞の増殖応答を３つの群に等級分けした。１７名のドナー以外に、６名は、ＢＬＰ−２５に対する「高い応答動物」であった（図１Ａ）。７名のドナーは、「中程度の応答」（図１Ｂ）であり、そして４名のドナーから得たＴ細胞は、ＢＬＰ−２５（図１Ｃ）に対して何らＴ細胞増殖応答を示さなかった。Ｔ細胞応答性での差異は、個々のドナーの様々なＭＨＣハプロタイプに起因する可能性がある。
可溶性ＢＬＰ−２５ペプチドでの、高応答動物から得たＴ細胞の刺激により、ペプチド特異的増殖は観察されなかった。
（１）ＢＬＰ−２５リポソームで負荷した自己由来ＰＢＬ；（２）ＢＬＰ−２４リポソームで負荷した自己由来ＰＢＬ；および（３）ＢＬＰ−２４Ｍリポソームの存在下で、Ｔ細胞の応答を研究するために、別の実験を行った（図３Ａおよび３Ｂ）。ＢＬＰ−２４Ｍリポソームに対してでなく、ＢＬＰ−２４に対する増殖応答があることが観察された。ＢＬＰ−２４の応答は、ＢＬＰ−２５に対する応答と同じほど強くなかった。これは、ＢＬＰ−２５でのアミノ末端セリンによって供される追加のエピトープによる可能性があった。このセリン残基は、ＢＬＰ−２５での追加のＨＬＡ−結合許容量に寄与することが知られている。Ｄｏｍｅｎｅｃｈら、上記。
Ｂ．ＭＵＣ−１ペプチドＢＬＰ−２５応答性Ｔ細胞は、抗体依存手段で上清にタイプ１サイトカインを産生する。
２回の刺激の終わり（すなわち、培養の２週間後）に、ＢＬＰ−２５リポソーム負荷自己由来ＰＢＬで刺激されたバルク培養Ｔ細胞の培地から培養上清を収集した。上述のとおり、ＥＬＩＳＡアッセイによって、上清を、分泌サイトカインγ−ＩＦＮ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の存在について試験した。際立った濃度のγ−ＩＦＮおよびいくらかのＩＬ−１０があった（表Ｉ）。検出不可能かまたは少量のＩＬ−４のみが、培養上清で検出された。γ−ＩＦＮの量は、抗原ペプチドの用量および特異性に関連性を示した。
0004480800.tif 000007
この表に示されているデータは、＞３の反復実験（３つの異なる高応答動物ドナーで）の代表である。サイトカインＥＬＩＳＡアッセイの感受性の範囲は、（ＩＦＮ−γについては）２５−１６００ｐｇ／ｍｌであった。３１−２０００ｐｇ／ｍｌ（ＩＬ−４については）および１００−６４００ｐｇ／ｍｌ（ＩＬ−１０については）であった。上清を、安定した抗原負荷自己由来ＡＰＣの存在下でインビトロ培養のおよそ２週間で収集した。
応答動物Ｔ細胞群のない培地から得た上清において生成されるγ−ＩＦＮ（〜１００−２００ｐｇ／ｍｌ）は相当に少なかった。空のリポソームで負荷した（ＭＰＬＡとともにではあるが、ペプチドなしで）自己由来ＰＢＬの存在下で培養したＴ細胞から得た上清は、ペプチド含有リポソーム（約４５０から約１２００ｐｇ／ｍｌのγ−ＩＦＮレベル）で負荷したＰＢＬで培養した細胞から得た上清に比較して、非常に低いレベルのγ−ＩＦＮ（〜１００ｐｇ／ｍｌ）を示した。
表ＩＩは、増殖アッセイの間じゅう９６穴マイクロタイタープレート中の上清で分泌されたサイトカインを示す。生成したγ−ＩＦＮの量を、ペプチド特異的Ｔ細胞増殖応答の用量と特異性に一致した。しかし、おそらくこれらのＴ細胞培養を刺激するのに使用したリポソーム調製物中のＭＰＬＡの存在により、ペプチドまたは可溶性ペプチド対照なしのリポソームで刺激したＴ細胞中においてγ−ＩＦＮ（〜２００ｐｇ／ｍｌ）の低レベル産生があった。全体的に、上清において生成されたＩＬ−４の量は、γ−ＩＦＮに比較してより低く、そして＜１００ｐｇ／ｍｌの範囲内であった（表ＩＩ）。
0004480800.tif 000008
この表に示されるデータは、＞３反復実験（３つの異なる高応答動物のドナーでの）の代表である。サイトカインＥＬＩＳＡアッセイの感受性の範囲は、２５−１６００ｐｇ／ｍｌ（ＩＦＮ−γについては）、３１−２０００（ＩＬ−４については）であった。上清を、４−５の複写ウエルの個々のウエルから、増殖アッセイの６日目に収集し、そして結果は、平均ＳＤとして示される。二週間リポソーム抗原負荷ＡＰＣで生育したαＴ細胞を、培養の６日目に９６穴プレート中で可溶性ペプチドで負荷した自己由来ＡＰＣの存在下で培養した。上清を収集し、そして分泌サイトカインの存在について試験した。
Ｃ．ＣＤ４およびＣＤ８に対する、モノクローナル抗体によるＢＬＰ−２５ペプチド特異的Ｔ細胞増殖応答を遮断する。
（１）ＣＤ４；（２）ＣＤ８；および（３）ＨＬＡクラスＩ分子に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、およびそれらの各自のイソタイプ対照抗体を、インビトロ培養でＢＬＰ−２５ペプチドに対応するＴ細胞の型を試験する増殖アッセイで使用した。図４で示されるとおり、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８ｍＡｂの両方が、抗原特異的Ｔ細胞増殖応答を部分的に遮断した。抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）も、Ｔ細胞増殖応答を部分的に遮断した。対照的に、各自のイソタイプ対照抗体は、Ｔ細胞増殖応答を遮断しなかった。これらの結果は、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を生じることを示した。
Ｄ．ＡＰＣとしてリポソーム処理済み自己由来ＰＢＬとして存在したＢＬＰ−２５ペプチドに対応するＴ細胞の表現型。
応答動物培養でのＴ細胞の表現型を試験するフローサイトメトリー実験を行った（図５Ａおよび５Ｂ）。ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の状況での活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の存在を試験した。当業者は、ＣＤ３およびαβＴＣＲが、Ｔ細胞用のマーカーであることを認識する。ＣＤ２８は、Ｂ７．１およびＢ７．２についてのリガンドである。ＣＤ６９は、「初期」Ｔ細胞活性化抗原である。ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）は、ＩＬ−２について高い親和性を示すＴ細胞活性化抗原でもある。
インビトロ培養Ｔ細胞の表面上でのＣＤ３、αβＴＣＲおよびＣＤ２８の存在は、抗原特異的でもある正常なＴ細胞が、インビトロ技術を用いた本研究で生じることを示唆する。これは、現在の方法論が、非生理学上の人為構造を生じないことも示す。フローサイトメトリーを用いて測定した培養Ｔ細胞での高密度ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）の存在は、これらの細胞が活性化され、そしてＩＬ−２に応答することを示唆する。
さらに、ＢＬＰ−２５応答動物の培養物から得たＴ細胞を、αβＴＣＲの存在およびＣＤ２８分子の発現について試験した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＣＤ３+Ｔ細胞のほとんどは、ＴＣＲαβ+およびＣＤ２８+であった。これらのインビトロ培養物でのＣＤ４／ＣＤ８比は、およそ２１であった（図５Ａ）。ＣＤ４+細胞集団の中で、その細胞のおよそ５０％は、ＣＤ２５+であり、２５％細胞は、ＣＤ６９+であった（図５Ｂ）。ＣＤ２８+Ｔ細胞集団の中で、その細胞のおよそ３０−４０％がＣＤ２５+であり、およそ５０−６０％細胞がＣＤ６９+であった。ＣＤ４+およびＣＤ８+細胞集団の全ては、ＴＣＲαβ+およびＣＤ２８+であった。
可溶性ＭＵＣ−１ペプチドで処理した培養物と比較した場合、培養でのある時間でのＣＤ２５およびＣＤ６９発現を伴う活性化Ｔ細胞の含有率が、リポソーム抗原ペプチドで負荷した自己由来ＡＰＣで刺激された培養物でより高いことも示された。Ａｇｒａｗａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、上記も参照。
Ａｇｒａｗａｌらは、比較的低い含有率の刺激Ｔ細胞はＣＤ６９+であったことを報告した。しかし、先にＴ細胞上での初期活性化マーカーとして認識されたＣＤ６９+は、現在、抗原刺激と相互関係があることを示さなかった。Ｇｉｂｂｏｎｓら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２３巻：２６０−２６１頁、１９９６年。ＰＨＡ刺激Ｔ細胞が、３０分で高いＣＤ６９発現を示し、ＣＤ６９発現は、培養３  ４日目まで現れていることが示された。ＰＨＡ応答と対照的に、抗原刺激Ｔ細胞では、ＣＤ６９は、初期（１時間−３日）に発現しない一方で、高いＣＤ６９発現は、インビトロ培養のおよそ６日後にＴ細胞表面で見られた。ＭＵＣ−１抗原特異的Ｔ細胞で、刺激後６日目でのＣＤ６９発現が、これらのＴ細胞でのＣＤ８およびＣＤ４の発現に相互関係があることが分かった。
本研究では、そのいくつかがＣＤ４＋であり、そのいくつかはＣＤ８＋である抗原特異的Ｔ細胞の混合集団の生成が示される。増殖応答を、抗−ＣＤ４および抗−ＣＤ８抗体の両方によって遮断されたので、これは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、抗原刺激に応答していることを示唆する。技術者は、一般に、ＣＤ４＋（Ｔヘルパー）およびＣＤ８＋（Ｔ細胞毒性）Ｔ細胞の両方が、病原体に対する有効な保護応答を生じる、すなわち腫瘍に対する免疫性を付与する上で必要であることを認識する。しかし、技術者は、ある種のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の助けなしに、病原体に対して有効であることも認識する。
２つの型のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞がある。タイプ１のＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（細胞毒性応答）で助けるサイトカインを生じる。タイプ２のＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗体を生じるＢ細胞を助ける。病原体の特性によって、タイプ１またはタイプ２のＣＤ４＋Ｔ細胞を必要とする。しかし、あるＣＤ４＋Ｔ細胞それら自身は、細胞毒性であり、そしてエフェクター機能を生じることができる。
Ｅ．ＭＵＣ−１ペプチド（ＢＬＰ−２５）含有リポソームで培養したＡＰＣで刺激したＴ細胞のインビトロ細胞毒性応答
前述の方法を用いて、リポソームＢＬＰ−２５でパルス標識した自己由来ＡＰＣで刺激したＴ細胞の細胞毒性活性を測定した。Ｔ細胞の源は、３つのＨＬＡ．Ａ２+ドナーから得たＰＢＬであった。標的Ｔ２細胞（ＨＬＡ．Ａ２+）を、ＢＬＰ−２５のペプチド配列内に含まれる９マーのペプチド（ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ）で負荷した。ＳＴＡＰＰＡＨＧＶでの負荷が、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰでするよりＴ２細胞でのＨＬＡ．Ａ２発現のより高い上昇制御にいたることが観察される（図６Ａ）。
３名のドナーの中で、リポソームＢＬＰ−２５で刺激したＴ細胞は、種々のエフェクター：標的比でＴ２標的を溶解する能力を示した（図６Ｂ）。負の対照は、８マーのオボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）であり、それは、Ｔ２細胞でのＨＬＡ．Ａ２発現を強力に上昇制御する（図６Ａ）。さらに、イソタイプ対照抗体（ＩｇＧ1）でなくキンマの葉（ｐａｎ）抗クラスＩ  ＨＬＡ  ＭＡｂ（Ｗ／３２）の添加は、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ負荷Ｔ２細胞の比死滅を減少させる（図６Ｃ）。これらのデータは、本方法が、細胞毒性のような特異的な生物学的に適切なＴ細胞応答を生じるために使用できる。
例２
この例は、Ｔ細胞抗原の小さな抗原部分を同定するための決定する例示技術を提供する。上に検討されるとおり、小さな抗原は、いっそう指向されたＴ細胞応答およびいっそう経済的な生成の利益を示す。これらの方法は、基本的に、細胞から得たクラスＩまたはクラスＩＩ分子を単離し、そして加工抗原のどの部分が、Ｔ細胞に存在するかを決定することに関与する。いったん加工抗原の構造を決定すると、それらは、Ｔ細胞エピトープのさらなる精製についての概念を形成することができる。
１．材料および方法
化合物。ヤギの抗−マウスＩｇＧ2b−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧαＭ−ＩｇＧ2bＨＲＰＯ）は、（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、アラバマ州バーミンガム）から購入し、そして製造業者の説明にしたがって使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ、Ｈ2Ｏ2基質およびＡＢＴＳ色素原を、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、メリーラント州ゲーサーズバーグ）から得たキットとして得た。マキシソーブマイクロタイタープレートを、ＮＵＮＣ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から得た。
ＮＰ４０、アプロチニン、リューペプチンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手し、ヨードアセトアミドは、メルク（Ｍｅｒｃｋ）（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ  Ｓｔｒｒａｓｓｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から、ＰＭＳＦはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から得た。ＣＮＢｒ−セファロースおよびセファロース４ｂは、Ｐａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入し、ジエタノールアミンは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニュージャージー州フェアー・ローン）から得た。他の全ての化合物は、ＢＤＨ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。
癌腫セルライン由来のＨＬＡクラスＩの単離  各候補セルラインのおよそ２−３×１０9細胞を、ローラーボトルで育成した。ＰＢＳ洗浄後、１０ｍｌの溶菌緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＮａＮ3、１％ＮＰ４０、１０μｇ／ｍｌのリューペプチンおよびアプロトニン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１．８ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを含むＰＢＳ）で２−８℃で４５分間それらを回転させることによって、細胞をローラーボトル中で溶解させた。溶解物を貯蔵し、そして３６００ｇで１５分間回転させ、その後、上清を、２８℃で、１００，０００ｇで４５分間回転させた。等級分けした溶解物を、さらに使用するまで−２０℃で凍結保存した。ＤＡＵＤＩ（粘着性なし）を、スピナーフラスコで育成した。上述のとおり、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして溶菌緩衝液で洗剤抽出することによって、細胞を収集した。
ＨＬＡクラスＩの単離のための方法は、Ｍｅｓｈｅｒおよび共同研究者の方法から適合させた。Ｍｅｓｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９２巻：８６頁（１９８３年）。製造業者の説明にしたがって、１０ｍｇのモノクローナル抗体を５ｍｌの膨張ＣＮＢｒ−セファロースに結合させることによって、ＨＬＡクラスＩ特異的親和性カラム（Ｗ６／３２およびＭＡ２．１）を作成した。セファロース４ｂプレカラムを、ＨＬＡクラスＩ特異的親和性カラムと縦列に結合させ、カラム洗浄緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＮａＮ3、および０．１％ＮＰ４０を含むＰＢＳ）で平衡化し、溶出緩衝液（０．１％ＮＰ４０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ１１．０）を伴う５０ｍＭジエタノールアミン）で予備溶出させ、その後カラム洗浄緩衝液で再平衡化させた。ＣＡＰＡＮ−１については、ＨＬＡ．Ａ２特異的ＭＡｂ  ＢＢ７．２を、Ｗ６／３２カラムと縦列で使用した。
溶解物を溶かせ、そして０．３ｍｌ／分でカラムに負荷した。予備カラムを切離した後、アフィニティーカラムを、カラム洗浄緩衝液で頻繁に洗浄し、その後溶出緩衝液で個々に溶出した。１ｍｌの画分を収集し、そしてすぐに未滴定の１Ｍトリス／ＨＣｌで中和させた。その画分でのＨＬＡクラスＩ活性を、一般に、固相キャッチャーとしてのアフィニティーカラムとして同じ抗体を用い、そして検出剤としてビオチニル化９Ｈ１（抗−β２−マイクログロブリン）またはビオチニル化Ｗ６／３２（適切には、モノモルヒン性抗−ＨＬＡクラスＩ−Ａ、Ｂ、Ｃ）を用いて２部位ＥＬＩＳＡアッセイによって観察した。ＥＬＩＳＡによるクラスＩ反応性画分を貯蔵し、１ｍＭ  ＰＭＳＦの最終濃度にし、そして次に使用するまで凍結した。
癌腫セルラインから得た親和性精製ＨＬＡクラスＩ材料からのＭＵＣ−１ペプチドの単離および同定。使用した方法は、以下に記述するとおり、セルラインからセルラインまでわずかに変化した。一般に、アフィニティー精製ＨＬＡクラスＩ材料を溶かし、そして１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ１から２まで酸性にし、その後０．４５μ、続いて０．２２μを介して濾過して、不純物を除去した。ある場合には、セントリコン３（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州マールボロ）フィルター（３０００ダルトンを切捨て）を使用して、酸溶出物からあらゆる高分子量タンパク質を除去した。放出ペプチドを、ウォーターズ９９６ＤＡ検出機（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州マールボロ）を具備するウォーターズ６００Ｅ  ＨＰＬＣ上でゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８カラム（４．６×２５０ｍｍ）で、逆相ＨＰＬＣによって分離した。サンプルを、可動相（０．０５％ＴＦＡ）に負荷し、そして同じ可動相上で、３０分かけて、１ｍｌ／分の流速で、０−６０％アセトニトリルの勾配で溶出した。１ｍｌ画分を収集し、そして一晩、マイクロタイターのウエル（＜１５％アセトニトリルを含むまで希釈した）上に１／１０希釈で、画分を被覆することによって直接ＥＬＩＳＡでＭＵＣ−１活性について試験した。
画分被覆ウエルを、ＥＬＩＳＡ希釈剤中２０ｎｇ／ウエル  ＢＣＰ８モノクローナル抗体で釣上げた。ＢＣＰ８正の画分を、ＧαＭ  ＩｇＧ2b  ＨＲＰＯ（サザン・バイオテック）によって検出した。これらを貯蔵し、凍結乾燥し、そして二次ＲＰ−ＨＰＬＣの前に少量の０．０５％ＴＦＡに再懸濁させた。二次ＨＰＬＣは、一次ＨＰＬＣの反復であるか、または、同じ修飾剤で、２００μｌ／分の流速で、５０分かけて、０から１００％アセトニトリル勾配で、Ｈ2Ｏ中．１％ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）（ｐＨ８．１）で平衡化した狭孔のハイペリシルＣ１８カラムを使用するかのいずれかであった。Ｎｉｊｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：１２１５頁（１９９３年）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０巻：１０２７５頁（１９８３年）。さらに、上述のとおり、画分を、直接ＥＬＩＳＡでのＢＣＰ８活性について試験し、貯蔵し、そして凍結乾燥した。
二次ＰＲ−ＨＰＬＣ（貯蔵画分）を、ＢＣＰ８モノクローナル抗体を用いて溶液中でアフィニティー精製した。凍結乾燥して貯蔵した画分を、少量のＰＢＳに再懸濁させた。材料を、一晩、２−８℃で、２５０−３００μｇのＢＣＰ８で回転させた。ＢＣＰ８および結合ペプチドを、プロテインＧ−セエファロースの１ｍｌカラムで遊離ペプチドから分離し、その後８％酢酸（ｐＨ２）で溶出させた。プロテインＧ溶出画分を、二次ＲＰ−ＨＰＬＣ当たりのようにゾルボックスＣ８を用いて再クロマトグラフィーにかけた。ＥＬＩＳＡによるＢＣＰ８反応性画分を、電気スプレー質量分析法によって分析した。
ペプチドの質量スペクトラム分析およびシーケンシング。正のイオンモードで操作するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を具備するマイクロマスＶＧクアトロ三重四重極質量分析計で、溶出画分の質量スペクトラム分析を行った。
質量スペクトラムシーケンシング。二次四重極に衝突セルを具備するサイエックス（Ｓｓｃｉｅｘ）のエレクトロスプレー三重四重極質量分析計でペプチドフラグメントのシーケンシングを行った。これらのフラグメントの配列特性を、衝突セル中の衝突活性化壊変を介して試験し、そして配列を、娘イオンからコンピュータ取込みし、三次四重極で分析した。
合成ＭＵＣ−１ペプチドによるクラスＩのＭＨＣの推定ＭＵＣ−１ペプチドモチーフへのＭＡｂ  ＢＣＰ８の結合の競合阻害。ＭＣＦ−７から単離したペプチドに対するＢＣＰ８抗体の結合の特異性を示すために、二次ＨＰＬＣの１９分後に溶出する画分を、ＰＢＳで１／６に希釈し、そして一晩、マイクロタイターウエルに被覆し、その後上述のとおり遮断した。ウエルを、１００μｌ  ＥＬＩＳＡ希釈剤中の２ｎｇのＢＣＰ８でインキュベートし、それによりさらに０−１０μＭで変化する量のペプチドを含んだ。この実験に使用したペプチドは、９マー：ＳＡＰＤＴＲＰＡＰおよびＧＶＴＳＡＰＤＴＦＲ、および１６マー：ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡであった。その後、上述のとおりＥＬＩＳＡを進行させた。
ペプチド被覆固相上でのＭＡｂ  ＢＣＰ８ペプチド特異性の確認。一晩、１ｍｇ／ｍｌのＮａＮ3を含む１００μｌＰＢＳ中０−４０００ナノモル／ウエルで、マイクロタイタープレート上に合成ペプチドを被覆させた。５０ｎｇ／ウエルのＢＣＰ８抗体を使用する以外は上述のとおり、直接ＥＬＩＳＡを行った。
Ｔ２細胞培養。Ｔ２突然変異セルラインを、Ｋｅｖｉｎ  Ｋａｎｅ博士、免疫学科、アルバータ大学、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ｃａｎａｄａによって無理なく供した。Ｔ２セルラインは、５％ＦＢＳ、１％ニュートリドーマーＨＵ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）、１％Ｌ−グルタミンを有するＲＰＭＩ１６４０で培養した。
合成ペプチド。これらの実験に以下の合成ペプチドを使用した。ＭＵＣ−１ペプチドを、ＭＵＣ−１のタンデム反復由来の滑り配列であった（表ＩＩＩ）：９マー：ＧＶＴＳＡＰＤＴＲ、ＶＴＳＡＰＤＴＲＰ、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡ、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ、ＡＰＤＴＲＰＡＰＧ、ＰＤＴＲＰＡＰＧＳ；１０マー：ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰ、ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡ、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰ、ＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧ、ＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳ、ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴ；７マー；ＴＳＡＰＤＴＲ。正の対照ペプチド（インフルエンザウイルス由来）：ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶおよびオバルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬから。ヒトＭＵＣ−Ｉ  ２５アミノ酸ペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ、および上述のとおり、カルボキシ基末端リシン残基にパルミトイル基を含むそのリポペプチド誘導体。ミリガン／バイオリサーチ・モデル９５００ペプチド合成機（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州マールボロ）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた自動化固相合成によって種々の合成ペプチドを製造した。ペプチドは、ＨＰＬＣによって測定されるとおり＞９５％純度であった。
0004480800.tif 000009
Ｔ２摂食実験およびＦＡＣＳ分析。ペプチド摂食実験の前に、Ｔ２細胞を、回転沈降させ、そして１％ニュートリドーマ、１％Ｌ−グルタミン、および０、５、１０または２０μｇ／ｍｌβ２−マイクログロブリンを有するＰＲＭＩ１６４０で再懸濁させた。３×１０5細胞／ウエルで、０−１６０μモルのペプチドを用いて、３７℃および７％ＣＯ2で、一晩マイクロリッタープレートに細胞を載せた。その後、ＭＡ２．１または負の対照であるＩｇＧ1の０．５μｇ／ウエルで細胞を染色させた。ＧαＭ  ＩｇＧ1、ＦＩＴＣでインキュベーションすることによって、結合ＭＡ２．１モノクローナル抗体を検出した。５日以内にＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテン・ビュー）流動細胞計測計で、蛍光を４８８ｎｍで測定した。
リポソーム抗原。ヒトＭＵＣ−１の２５アミノ酸ペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰのリポペプチド誘導体を用いて、リポソーム抗原を配合した。脂質担体は、ジパルミトイルホスファチジルクロリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（ジェンザイム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）（Ｒｉｂｉイムノケム・リサーチ・インク、モンタナ州ハミルトン）を、アジュバントとして脂質混合物中に含んだ。
ＡＰＣとのリポソームペプチドのインキュベーション。リポソームを、例１で上述されるとおりペプチドに負荷した。
バルクでのＴ細胞培養。Ｔ細胞培養は、例１に上述されるとおりであった。
細胞毒性Ｔリンパ球アッセイ。ＣＴＬアッセイについては、３つ（ＨＬＡ．Ａ２+）の正常なドナーのＰＢＬを使用した。上述のとおり、Ｔ細胞をバルク培養で二週間育成した。二週間の終わりに、生きたＴ細胞を、フラスコから収集し、そして計数した。ＣＴＬ標的として使用したＴ２細胞を、外来のβ２ｍの存在下で、２００μＭで、一晩、種々のＭＵＣ−１合成ペプチドに負荷した。Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３巻：２０７２−２０７７頁（１９９３年）；Ｓｔａｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９巻：７８７１−７８７５頁（１９９２年）。その後、これらのペプチド負荷Ｔ２標的細胞を、９０分間、51Ｃｒ（ＮａＣｒＯ4を用いた）で負荷し、そして厳密に洗浄した。先に記述されるとおり、ＣＴＬアッセイを行った。Ａｇｒａｗａｌら、上記。比死滅率を、実験放出−自発的放出／最大放出−自発的放出×１００として計算した。エフェクター対標的比は、（１、１０、５０、１００および１５０）として使用した。各群を、４重の複写に設定し、そして平均比死滅率を計算した。負の対照ＯＶＡペプチドとして、ＳＩＩＮＦＥＫＬ負荷標的Ｔ２細胞を、細胞毒性アッセイで使用し、そしてＭＵＣ−１ペプチド特異的な比死滅率を得る前に、ＳＩＩＮＦＥＫＬ負荷標的の比死滅率を、各データ点から減じた。
２．結果
Ａ．ＭＵＣ−１+腫瘍セルラインから単離したＭＨＣクラスＩ関連ペプチド
ＭＣＦ−７細胞からクラスＩ  ＭＨＣ分子のＷ６／３２アフィニティー精製後、Ｗ６／３２正のピークでのペプチドを、酸性化により遊離させ、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。２１０ｎｍで測定した一般的クロマトグラムは、１８−２３分間の画分溶出中でＢＣＰ８抗体と強力な反応性を示した（図７）。負の対照抗体Ｂ１９５．３との反応性は注目されなかった。Ｌｉｕら、Ｇｌｙｃｏｃｏｕｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２巻：６０７−６１７頁（１９９５年）；Ｒｅｄｄｉｓｈら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１３巻：１−１２頁（１９９６年）。画分１８−２３を、同じ条件下でゾルバックＣ８カラムで再クロマトグラフィーにかけ、それにより、１６．５から１７．５分で溶出する画分に、１７から１７．５分で強いＢＣＰ８反応性を示す可視ピークで、いっそう明瞭なクロマトグラムを生じた（図８）。二次ＨＰＬＣのわずかに異なる溶出プロフィールは、二次ＨＰＬＣにわずかに異なる勾配の溶出を使用するためである（「材料および方法」参照）。さらに、負の対照ＭＡｂ  Ｂ１９５．３で反応性は注目されなかった。
ＢＣＰ８反応性画分由来のペプチド貯蔵物の質量スペクトラム分析法は、長さおよびペプチドの数の両方で、多数の変異を示した。それらの大半が、長さで１０から２０のアミノ酸の間に入りながらも、これらのペプチドが、長さで５から２０アミノ酸の間の範囲にあることは、分子量から明らかである。溶出したクラスＩ関連ＭＵＣ−１ペプチドについてのＭＡｂ  ＢＣＰ８の特異性を試験した。抗−ＭＵＣ−１  ＭＡｂ  ＢＣＰ８（Ｘｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２巻：２３１０−７（１９９２年））が、最小エピトープＰＤＴＲＰＡと反応することは、最近のＩＳＯＢＭ仕事（Ｍ．Ｒ．Ｐｒｉｃｅら、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９巻：１−２０頁（１９９８年）でのＩＳＯＢＭ  ＴＤ−４ワークショップでの要旨報告：ＭＵＣ−１ムチンに対する５６モノクローナル抗体の分析）で示された。図９では、最小エピトープＰＤＴＲＰＡを含む２つの合成ペプチドが、単離ＭＵＣ−１ペプチドへのＰＣＰ８の結合を阻害する一方で、合成ペプチドＧＶＴＳＡＰＤＴＲは、結合を阻害しないことが示される。
第二のアプローチでは、ＭＣＦ−７由来のＷ６／３２正の材料を、酸処理し、そしてＢＣＰ８でアフィニティー精製にかけた。プロテインＧカラムから溶出した後に得たＡ２８０ピークの画分では、アフィニティー精製したペプチドを、酸性化によって抗体から遊離させ、そして上述のとおりゾルバックＣ８  ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで分離した。１７−１８分で溶出する画分は、強力なＢＣＰ８を示し、そして質量スペクトラム分析およびシーケンシングにかけた。
質量スペクトラム（図１０）は、３つの目立ったフラグメントが、長さで少なくとも７つのアミノ酸の大型ペプチドの分解産物であることが分かったことを示した。おそらくＴＳＡで出発するこの配列の長さが、不明確なままであるが、２つのトリペプチドフラグメントＨ+（ＴＳＡ）およびＨ+（ＤＴＲ）は、それらが、それぞれ、ＭＵＣ−１縦列反復の７アミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端フラグメントを構築することを示す。フラグメントＨ+（ＴＳＡＰＤＴ）の存在およびアルギニンの向うに他のあらゆるフラグメントの不在が、そのペプチドが７マー（ＴＳＡＰＤＴＲ）か、または長いペプチドのいずれかである可能性があるという結論になる。
Ｗ６／３２を用いたクラスＩ分子の連続アフィニティー精製、続いてＨＬＡ２．１特異的ＭＡｂ、ＭＡ２．２を行う、ＣＡＰＡＮ−１（ＨＬＡ．Ａ２）のためのプロトコールを行った。その後、酸溶出ペプチドを、３０００ダルトンのセントリコン３回転フィルターで回転させて、可能性のある高い分子量の混入物を排除した。ペプチド溶出物は、それぞれ、再度１７−１８分で、ＭＡｂ  ＢＣＰ８検出ＭＵＣ−１ペプチド活性の単一ピークを示しもするゾルボックスＣ８カラム上でＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。
Ｂ．ＭＵＣ−１負の対照細胞
ダウディ（Ｄａｕｄｉ）の細胞が、ＭＵＣ１発現に陰性であるが、ＨＬＡクラスＩ重鎖（Ｗ６／３２抗−ＨＬＡクラスＩＡ、Ｂ、Ｃ）および軽鎖（９Ｈ１抗−ヒトβ２−マイクログロブリン）については陽性であることが（ＦＡＣＳ分析によって）示された。それらは、それらの非粘着性成長パターンによる修飾を除いてＣＡＰＡＮ−１セルラインと同一に加工した。Ｗ６／３２でのアフィニティー精製、酸性化、続いてサイズ排除（セントリコン３の回転）し、そしてゾルボックスＣ８カラムでの濾過液のＲＰ−ＨＰＬＣの後、ＢＣＰ８との際立った反応性は観察されなかった。
Ｃ．ＭＵＣ−１誘導合成ペプチドによるＴ２突然変異体細胞表面でのＨＬＡ．Ａ２発現の上昇抑制
チェッカーボード実験では、Ｔ２細胞でのクラスＩ上昇抑制についてのβ２−マイクログロブリンの最適な濃度が２０μｇ／ｍｌ（Ｎｉｊｉｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３巻：１２１５頁（１９９３年））であり、そしてペプチドの量は、２０μモル／ウエル（結果は示されない）として最適化されると決定された。エレクトロスプレー質量分析法によるＭＵＣ−１の７マーＴＳＡＰＤＴＲ  ＭＨＣクラスＩ関連ペプチド配列の知見（図１０）に基づいて、我々は、合成ＴＳＡＰＤＴＲペプチドが、Ｔ２細胞でのＨＬＡ．Ａ２発現を上昇抑制できるかどうかを試験した。ＴＳＡＰＤＴＲ合成ペプチドを、他の９および１０マーペプチドについて類似の他の条件と共に５０μＭ／ウエルで過剰に使用した。７マーペプチドＴＳＡＰＤＴＲは、Ｔ２細胞表面でのＨＬＡ．Ａ２の発現を際立って上昇抑制しない（δＭＣＩ＝２、データは示されず）。その後、我々は、ＴＳＡＰＤＴＲＰＡの９マーがＴ２細胞でクラスＩ発現を上昇抑制するかどうかを試験した。図１１は、ＴＳＡ９マーが、クラスＩ発現の強力な上昇抑制を起こさせることを示す。反復実験では、他のＭＵＣ−１の９マーによるクラスＩ発現の上昇抑制より強力であるＴＳＡ９マーによるＴ２細胞でのクラスＩ発現の強力な上昇抑制が認識された（表ＩＩＩ）。
Ｄ．インビトロ細胞毒性Ｔリンパ球応答
Ｔ２突然変異体細胞でのＨＬＡ．Ａ２への結合の能力があるべきであることが示されるＭＵＣ−１ペプチドが、標的細胞でのＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ．Ａ２分子の状況でＣＰＬエピトープとして認識できるかどうかを決定するために、我々は、インビトロＣＴＬアッセイを行った。ＡＰＣとしてリポソームパルス標識した自己由来ＰＢＬでの２５アミノ酸ＭＵＣ−１ペプチドのリポソーム誘導体を用いて、３つのＨＬＡ．Ａ２+ドナーのＰＢＬから得たＴ細胞を、ＭＵＣ−１抗原に対してインビトロで初回感作させた。２週間のインビトロ培養に続いて刺激Ｔ細胞を回収し（２週毎に再刺激）、そして５時間の51Ｃｒ放出アッセイでの標的としてのＭＵＣ−１誘導合成ペプチド（９マーおよび７マー）負荷Ｔ２細胞に対するそれらの細胞毒性活性について試験した（図６）。試験された７つのＭＵＣ−１誘導合成ペプチドのなかでも、９マーＴＳＡ．．．およびＳＡＰ．．．ペプチドで負荷された標的は、同じ２ドナーにより最高程度に特異的に死滅した。７マーＴＳＡ．．．ペプチドに負荷された標的は、高いＥ／Ｔ比でドナー２により一週間で死滅された。他のペプチド負荷Ｔ２標的は、比死滅の程度をすぐに低くすることを示した。
【図１Ａ】
0004480800.tif 000010
【図１Ｂ】
0004480800.tif 000011
【図１Ｃ】
0004480800.tif 000012
【図２】
0004480800.tif 000013
【図３Ａ】
0004480800.tif 000014
【図３Ｂ】
0004480800.tif 000015
【図４】
0004480800.tif 000016
【図５Ａ−１】
0004480800.tif 000017
【図５Ａ−２】
0004480800.tif 000018
【図５Ａ−３】
0004480800.tif 000019
【図５Ａ−４】
0004480800.tif 000020
【図５Ｂ−１】
0004480800.tif 000021
【図５Ｂ−２】
0004480800.tif 000022
【図５Ｂ−３】
0004480800.tif 000023
【図５Ｂ−４】
0004480800.tif 000024
【図５Ｂ−５】
0004480800.tif 000025
【図５Ｂ−６】
0004480800.tif 000026
【図５Ｂ−７】
0004480800.tif 000027
【図５Ｂ−８】
0004480800.tif 000028
【図６Ａ−１】
0004480800.tif 000029
【図６Ａ−２】
0004480800.tif 000030
【図６Ａ−３】
0004480800.tif 000031
【図６Ａ−４】
0004480800.tif 000032
【図６Ａ−５】
0004480800.tif 000033
【図６Ａ−６】
0004480800.tif 000034
【図６Ｂ−１】
0004480800.tif 000035
【図６Ｂ−２】
0004480800.tif 000036
【図６Ｃ】
0004480800.tif 000037
【図７】
0004480800.tif 000038
【図８】
0004480800.tif 000039
【図９】
0004480800.tif 000040
【図１０Ａ】
0004480800.tif 000041
【図１０Ｂ】
0004480800.tif 000042
【図１１Ａ】
0004480800.tif 000043
【図１１Ｂ】
0004480800.tif 000044
【図１２Ａ】
0004480800.tif 000045
【図１２Ｂ】
0004480800.tif 000046
【図１２Ｃ】
0004480800.tif 000047
【図１２Ｄ】
0004480800.tif 000048
【図１２Ｅ】
0004480800.tif 000049
【図１２Ｆ】
0004480800.tif 000050
【図１２Ｇ】
0004480800.tif 000051