(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）制限酵素を使ってデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を一本鎖の付着末端を持つ断片に切る段階及びこれとは独立的に、塩基配列を既に知っており、切断されるＤＮＡ断片の両末端と相補的に結合することができる一本鎖の付着末端を持つヘアピン輪構造のアダプタを製造する段階；
２）前記ＤＮＡ断片と前記へアピン輪構造のアダプタをＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を使って結合させる段階；
３）結合に参与しなかったＤＮＡ断片とヘアピン輪構造のアダプタをエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を使って除く段階；それから、
４）前記アダプタと結合されるＤＮＡ断片にアルカリ溶液、ＲＮＡ分解酵素または一本鎖選択性エキソヌクレアーゼ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を使って、前記アダプタのヘアピン輪部分だけを除く段階
を含む塩基配列が全然知られていないＤＮＡから両末端の塩基配列が知られるＤＮＡ断片のライブラリーを製造する方法。
【請求項２】
１）制限酵素を使ってデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を一本鎖の付着末端を持つ断片に切る段階及びこれとは独立的に、塩基配列を既に知っており、切断されるＤＮＡ断片の両末端と相補的に結合する一本鎖の付着末端を持つヘアピン輪アダプタを用意する段階；
２）前記ＤＮＡ断片と前記ヘアピン輪構造のアダプタをＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を使って結合させる段階；
３）前記ＤＮＡリガーゼによる結合反応に参与しないＤＮＡ断片とヘアピン輪アダプタをエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を使って除く段階；それから、
４）前記ヘアピン構造アダプタの一部分に相補的に結合するプライマーとＤＮＡポリメラーゼ酵素を使ってＤＮＡ断片を増幅する段階
を含む塩基配列が全然知られていないＤＮＡの一部の選択的増幅方法。
【請求項３】
前記段階２）でヘアピン輪アダプタと結合したＤＮＡ断片からヘアピン輪部分だけを除く段階を追加で含むことを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項４】
前記制限酵素がｔｙｐｅＩＩｓ制限酵素であることを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項５】
前記制限酵素がｔｙｐｅＩＩｐ制限酵素であることを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡリガーゼがＴ４ＤＮＡリガーゼであることを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項７】
前記段階３）のエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）がエキソヌクレアーゼＩＩＩであることを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項８】
アルカリ溶液を使って前記ヘアピン輪部分だけを除くことを特徴とする請求項３記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項９】
ＲＮａｓｅを使って前記ヘアピン輪部分だけを除くことを特徴とする請求項３記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項１０】
一本鎖選択性エキソヌクレアーゼ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を使って前記ヘアピン輪部分を除くことを特徴とする請求項３記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼ酵素がＴａｑポリメラーゼ酵素であることを特徴とする請求項２記載の塩基配列が全然知られていないＤＮＡ一部の選択的増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は生物体のデオキシリボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、より詳しくは生物体のDNAを増幅するのに必要なプライマーに対する情報がなくてもポリメラーゼ酵素連鎖反応 (Polymerase Chain Reaction)を通じて生物体のデオキシリボ核酸(DNA)を増幅させる方法に対するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一つの生物体が持つDNAとこれから転写されるmRNAは非常に多様で微量であるから、これらの塩基配列を明けるためには例外的な場合を除いては全部増幅過程を必要とするようになる。これのために一般的に二種類の技術が使用される。
【０００３】
一番目の方法はDNAを微生物で選択的にクローニングをしたり、ライブラリー形態で作って微生物を多量増殖させた後目的とするDNAを含む微生物で分離する。
【０００４】
二番目方法はポリメラーゼ酵素連鎖反応(PCR)を利用して望むDNA部位だけを選択的に増幅する。しかし、この方法は望む部位の両末端の一定の長さの塩基配列をまえもって知っていなければならないという問題点がある。従って、既に塩基配列が完全に明けられる生物体がない場合には、生物体が持つ前場のDNAまたは相補DNAを従来のポリメラーゼ酵素連鎖反応だけを通じて抜ける部分がなくて完全に増幅することは不可能である。
【０００５】
大規模のDNA塩基配列分析作業を遂行しにあって、一つの生物体が持つ全体DNAを比較的に均一の大きさで分割して、これを増幅用運搬体に入れて、増幅した後塩基配列を分析するようになる。
【０００６】
一般的に、これのために使う従来の技術は既に塩基配列が明けられるライブラリ(ordered library)を利用する技術である。しかし、この技術は非常に複雑でむずかしくて、多い時間と費用がかかる問題点によって、現在大規模の生物体塩基配列決定作業にあって一番大きい障害物中の一つである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は増幅しようとするDNAの塩基配列に対する情報が全然知られない生物体のDNAを抜ける部分を無くし増幅する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は生物体のデオキシリボ核酸(DNA)の選択的増幅方法に関するもので、より詳しくは制限酵素を使ってDNAを単一筋の粘着性末端を持つ数個の断片で切る段階及びこれとは独立的に、このようなDNA断片の単一筋の粘着性末端と相補的に結合する単一筋の粘着性末端とへアピンの輪部分で成るアダプタを用意する段階;
前記のDNA断片と前記へアピン輪構造を持つアダプタをDNAリガーゼを使って結合させる段階;
【０００９】
前記DNAリガーゼによる結合反応に参与しないDNA断片及びへアピン輪構造を持つアダプタをエキソヌクレアーゼを使って除く段階;
選択的段階として、アルカリ溶液、RNA分解酵素(RNase)または単一筋選択性エクソヌクレアーゼを使ってへアピン構造を除く段階;
前記アダプタのへアピン輪部分だけの除去した後に居残る部位に相補的結合するプライマーを使ってDNA断片を増幅する段階を含む塩基配列が全然知られないDNA一部の選択的増幅方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、制限酵素を使ってデオキシリボ核酸(DNA)を単一筋の粘着性末端を持つ断片で切る段階及びこれとは独立的に、塩基配列を既に知っている単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪構造のアダプタを製造する段階;
【００１１】
前記DNA断片とへアピン輪構造アダプタをDNAリガーゼ(ligase)を使って結合させる段階;それから、前記アダプタと結合されるDNA断片 にアルカリ溶液、RNA分解酵素または単一筋選択性エキソヌクレアーゼ(single strand specific exonuclease)を使って、前記アダプタのへアピン輪部分だけを除く段階を含む塩基配列が全然知られないDNAから両末端の塩基配列が知られるDNA断片のライブラリーを製造する方法を提供することである。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、4種のヌクレオチドの組合によって製造されるすべての種類の単一筋のDNAから成る単一筋の粘着性末端を持つへアピン輪のアダプタを含むへアピン輪のアダプタセットを提供することである。
【００１３】
以下本発明の方法、DNA断片、へアピン輪のアダプタ、制限酵素及びプライマーを図面を通じてより詳しく説明する。以下の図面内容は本発明の一つの例を説明するためのことであり、本発明の内容が下記の図面に出たことに限定されない。
【００１４】
図1に示すへアピン輪構造を持つアダプタは図3に示した配列に次の方式で分配する。例えば、図3で7行がCGであり、3列がAGである場合には、単一筋の粘着性末端部位がCGの配列を持つアダプタと単一筋の粘着性末端部位がAGの配列を持つアダプタを混合させておく。
【００１５】
単一筋の粘着性末端を構成する塩基の個数が2個である場合には、この時必要な試験管の個数は112個になる。もし、単一筋の末端部位を構成する塩基の個数がNなら、へアピン輪のアダプタの種類は(42n-2×4n)/2種類になる。
また、DNA断片の5'、3'の末端とアダプタの5'、3'の末端が相補的に結合しなければならない。
【００１６】
前述と同様に、各アダプタを試験管に分配した後、制限酵素で切断されるDNA断片を各試験管に対して適当な量に混ぜる。その後、ライゲーション反応を進行させる。ライゲーション反応が終ると、結合反応に参与しないDNA断片及びアダプタをエキソヌクレアーゼを使って除く。この時、末端がへアピン輪の構造を持つアダプタがライゲーションされるDNA断片はエキソヌクレアーゼによって切断されない。
【００１７】
アルカリ溶液、RNase、または単一筋の選択性エキソヌクレアーゼで処理しへアピン輪部位だけを分解して、一般的な形態の二本鎖のDNA断片を作る。このようにへアピン輪を除いた後、前記二本鎖のDNA断片に居残るアダプタの一部に相補的結合するプライマーを使ってポリメラーゼ酵素連鎖反応を遂行する。ポリメラーゼ酵素連鎖反応産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動するなどの方法で分離して、ゲルの各バンドから得られるDNAはDNA塩基配列を分析するために使用されることができる。
【００１８】
前記の過程を認識部位が異なる制限酵素を使って反復的に等しく遂行する。異なる二種類、またはそれ以上の制限酵素を使って得られる塩基配列をお互いに重畳させて、生物体が持つ全体DNAの塩基配列を得ることができる。mRNAの場合にも本発明による方法を使って一つの生物体が持つすべての種類のmRNAの塩基配列を決めることができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下で本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の権利範囲を本実施例に限定するものではない。
【００２０】
第１実施例：大腸菌ゲノムの選択的増幅
1)タイプIIsの制限酵素Hpy118IIIを利用する大腸菌ゲノムの制限酵素断片化。
観察しようとする大腸菌菌株DH5αとBL21で全体ゲノムを各分離する。分離される各ゲノム10μgにHpy118III制限酵素30unitを入れて50mM酢酸カリウム、20mM Tris-acetate、10mM酢酸マグネシウム、1mM DTT、pH7.9の緩衝溶液に入れて制限酵素反応を遂行する。
【００２１】
2)DNA断片とへアピン輪の構造を持つアダプタのライゲーション。
1)で得られるDNA断片を AccuprepTM PCR purification KIT(（株）バイオニア)で精製して、ここから得られるDNA断片1μgを50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT、2mM ATP、25mg/mL BSAが入る緩衝溶液で希釈して、ここに9種類の組合のi)へアピンアダプタ2μM、ii)へアピンアダプタ2μMを各々付け加えた後1unitのT4DNAリガーゼを入れて全体体積50μlで選択的に結合させる。本実施例では図3の行と列の双中AT+GA、CC+CG、CA+AA、CT+CC、GA+GC、AG+CA、GC+AC、AC+AT、CG+AGの各9双を利用した。
【００２２】
3)エキソヌクレアーゼIIIを利用する結合されないDNAの除去。
2)で得られる結合反応物 5μl各々に500mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM MgCl2、100mM 2-Mercaptoethanolが混合される緩衝溶液に入れて、20unitのエキソヌクレアーゼIIIを付け加えた後、全体の体積を30μlで合わせてから37℃で45分間反応させた。
【００２３】
4)ポリメラーゼ酵素連鎖反応を通じる増幅反応。
3)で得られる反応物中3μlを鋳型として図2に示す行のプライマーと列のプライマー各々1μMと100mM Tris-HCl(pH8.3)、400mM KCl、15mM MgCl2、10mM DTT、5ug/ml acetylated BSA、Taq DNA polymerase 1unitを全体の体積20μlに入れてから1回の94℃で5分、55℃で35秒、72℃で2分、30回の94℃で35秒、55℃で35秒、72℃で2分、1回の94℃で35秒、55℃で35秒72℃に上げて5分反応で増幅した。
【００２４】
5)染色方法を利用するポリアクリルアミドゲルで試料展開。
4)で得られる反応物の中10μlを8Mウレアが入る4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを固定液(10%)酢酸が入る溶液で30分間反応させる。その次にイオンを取り除いた蒸留水  てゲルを3回洗浄する。このようなゲルを1g AgNO3と1.5mL 37%ホルムアルデヒドが入る1L溶液で30分間染色させる。染色されたゲルを5秒間イオンを取り除いた蒸留水で洗った後、4℃に調整した現像液(40g炭酸ナトリウム、1.5mL 37% ホルムアルデヒド200μlチオ硫酸ナトリウム (10mg/mL)が入る1L溶液)で染色した後、また固定液で5分間反応させて、蒸留水で10分間洗って保管する。
【００２５】
その結果を図4に示している。ここでAT+GA等は 実施例2)で利用されるへアピンアダプタの各々の組合を意味してDNAバンドの右側の数字は相対的なDNAバンドの大きさであり矢印は二種類の大腸菌で出るDNA断片の差異である。
【００２６】
このような実施例の結果を総合すると、平均的に各々の組合で出るバンドの平均大きさは400bp程度であり一つの組合から出る平均バンド数は110個くらいである。120個のすべての反応を遂行する時結論的にこの方法は5.28mega bp程度に展開したから大腸菌の全体ゲノムの大きさ(4.72mega bp)全部を含むことができると判断される。
【００２７】
また図4で示したように、AA+CT双で11個、GC+AG双で3個、AC+AT、CG+AG双で各1個の異なるバンドを確かめたし、E。coli DH5αとE。coli BL21菌株間には約5000 bp程度がゲノム上で異なる配列を見られて、現在本実施例で探されるほかの配列はすべての反応を遂行すると、約7200 bp程度だから本方法で二種類の異なる個体のゲノムで異なる部位すべてを探すことができる 。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は行(a)または列(b)で示す塩基配列を持つへアピン構造アダプタの例であり(rNはリボヌクレオチドまたは輪状の構造を形成できるデオキシリボヌクレオチドを意味して、残りはDNAを構成する各ヌクレオチドを意味する。)
【図２】図2は行(a)または列(b)の試験管に盛られるアダプタに使用されるポリメラーゼ酵素連鎖反応及び塩基配列決定反応用プライマーの塩基配列の例である。
【図３】図3はライゲーション、エキソヌクレアーゼ反応、RNAまたは輪のDNA分解反応、ポリメラーゼ酵素連鎖反応に使用される16×16試験管配列の例である(ここで、AAなどは各試験管に使用されるへアピン構造のアダプタの単一筋の末端部位の2個の塩基配列である)を示す。
【図４】図4は、電気泳動方法を通じて分離されるDNAの断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表す。)
【図５】図5は、電気泳動方法を通じて分離されるDNAの断片を銀染色方法で現像させて得るDNAのバンドの写真である(ここで、AT+GA等はヘアピン構造のアダプタの末端の塩基組合を表して、DNAバンドの右側に表示される数字はDNAバンドの相対的大きさを表す。それから、矢印は2種類の大腸菌(E。coli)間に出るDNAの違いを表す。)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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