(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のサンプルの分子量を決定するための装置であって、以下：
該目的のサンプルおよびマトリックス物質を含むためのサンプルプレート；
該プレートに隣接するイオン化領域内にサンプルイオンのパルス化プルームを発生させるために、該プレートに指向されたパルスレーザー；
該イオン化領域および該サンプルプレートを囲み、該イオン化領域内に気体流を導入するための入口、および該チャンバからの気体流を制限するためのイオンサンプリング開口を有し、該イオン源内の気体圧力は、０．１ｔｏｒｒと１０ｔｏｒｒとの間である、イオン源チャンバ；
該チャンバに結合した質量分析器；
該チャンバから該イオンサンプリング開口を経て該質量分析器までサンプルイオンを移行するための輸送モジュール；および
該輸送モジュールに結合した温度制御器、
を備え、
該輸送モジュール内の温度は、１５０℃と３００℃との間に制御される、装置。
【請求項２】
前記質量分析器が、以下のタイプ：四重極型質量分析器、イオントラップ質量分析器、フーリエ変換質量分析器または扇形磁場型質量分析器のうちの１つである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記質量分析器が、飛行時間型質量分析器である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記飛行時間型分析器が、前記輸送モジュールを通るイオン移動の方向と実質的に同軸であり、ここで、イオンがレーザーパルスの開始後に時間遅延を伴って、該輸送モジュールから引き出されるパルスである、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記飛行時間型分析器が、前記イオン輸送モジュールを通るイオン移動の方向に対して実質的に直交する、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記レーザーパルスと同調した気体のパルスを発生するように適合された圧力制御器を備え、ここで、ポンプが、気体パルス間に前記イオン源チャンバを排気する、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記輸送モジュールが、長い管を備え、該管が前記温度制御器によって加熱される、請求項５に記載の装置。
【請求項８】
前記輸送モジュールが、それらの間で差動的にポンピングされる第１および第２のＲＦ励起多重極ガイドを備える、請求項５に記載の装置。
【請求項９】
前記多重極ガイドの少なくとも１つが、温度供給源によって加熱される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記サンプルプレートと前記イオン輸送モジュールとの間に配置される遮蔽電極を備える、請求項５に記載の装置。
【請求項１１】
前記レーザーが、サンプルイオン化のために必要とされる閾値エネルギーより少なくとも２倍大きいレーザーエネルギーで発射される、請求項３に記載の装置。
【請求項１２】
前記質量分析器が、データ収集デバイスを備えるイオン検出器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記レーザーの反復率が、シグナル強度を最大化するために制御され、一方で前記データ収集デバイスの飽和を回避する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記マトリックス物質が、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡＣ）、３−ヒドロキシピコリン酸、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン、２，３，４−トリヒドロキシアセトフェノン、および２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン、４−ニトロフェノール、６−アザ−２−チオチミン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジスラノール（ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）、２−アミノ安息香酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、フェルラ酸、コハク酸、水、水／アルコール混合物、水と多価アルコールとの混合物、芳香族アミン、ならびにヒドロキシル官能基を含む芳香族アミンからなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記マトリックス物質が揮発性物質である、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記イオン源チャンバ内の圧力が１ｔｏｒｒに維持される、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記管の直径と、前記イオン源チャンバ内の圧力との積が、５０ｍｍ・ｔｏｒｒを超える、請求項７に記載の装置。
【請求項１８】
前記レーザーの反復率を制御するための手段、および前記レーザーに対して前記サンプルをスキャニングするための手段をさらに備え、その結果、単一サンプルスポットが、５００未満のレーザーショットで該レーザーに対して露光される、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
気体入口およびイオンサンプリング出口を有し、そしてサンプルプレートを囲む、イオン源チャンバを備えるＭＳ装置を使用して、目的のサンプルの分子量を決定するための方法であって、以下：
該サンプルプレート上に、該目的のサンプルおよびマトリックス物質を堆積する工程；
該サンプルプレートに隣接するイオン化領域内にイオンのパルス化プルームを発生するために、レーザーを用いて該サンプルおよび該マトリックス物質をパルス化する工程；
該イオン源チャンバ内に０．１ｔｏｒｒと１０ｔｏｒｒとの間の圧力を生成するために、該イオン化領域に隣接する該イオン源チャンバ内に気体の供給を導入する工程；
該イオンサンプリング開口を通って、輸送モジュールを通って、質量分析器までサンプルイオンを輸送する工程；および
該輸送モジュール内の温度を１５０℃と３００℃との間に制御する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記質量分析器が飛行時間質量分析器である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルプレート温度を５０℃未満に制御する工程、および前記輸送モジュール内の気体温度を１５０℃と２５０℃との間に制御する工程、をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記飛行時間型分析器が、前記輸送モジュールを通るイオン移動の方向と実質的に同軸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
レーザーパルスと同調して気体パルスを発生する工程、および気体パルス間の前記イオン源チャンバを排気する工程、を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記飛行時間型分析器が、前記イオン輸送モジュールを通るイオン移動の方向に対して実質的に直交し、ここで、レーザーパルス間の期間より広くなるように、イオンビームが該イオン輸送モジュール内で時間拡散する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記レーザーが、２０Ｈｚと２ｋＨｚとの間の反復率で進行する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記レーザーが、イオン化のために要求される閾値エネルギーより、少なくとも２倍大きいレーザーエネルギーで発射される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＳ装置が、データ収集デバイスを備える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
シグナル強度を最大化するために前記レーザーの反復率を制御し、一方で該データ収集デバイスを飽和することを回避する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記レーザーの反復率を制御する工程、および前記レーザーに対して前記サンプルをスキャニングする工程をさらに包含し、その結果単一のサンプルスポットが５００未満のレーザーショットで該レーザーに露光される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９９年６月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／１３８，９２８号に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に質量分析計（ＭＳ）機器に関し、詳細には、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源を利用する質量分析計に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質およびペプチドのような不安定な分子のＭＳ分析において支援するために約０．１ｔｏｒｒ〜約１０ｔｏｒｒの高圧力にて作動されるＭＡＬＤＩ源に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ＭＡＬＤＩ法、すなわち生体高分子の分析のための確立された技術（例えば、Ｍ．Ｋａｒａｓ，Ｄ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｕ．ＢａｈｒおよびＦ．Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ７８（１９８７），５３；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ６０（１９８８）２２９９，Ｋ．Ｔａｎａｋａ，Ｈ．Ｗａｋｉ，Ｙ．Ｉｄｏ，Ｓ．Ａｋｉｔａ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２（１９９８）１５１−１５３およびＲ．Ｃ．Ｂｅａｖｉｓ  およびＢ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ４（１９８９）２３３および４３２−４４０を参照のこと）は、一般に、ほとんど分子イオンを含むスペクトルを伴うソフトなイオン化法（ｓｏｆｔ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）であると考えられるが、迅速フラグメンテーションプロセスおよび準安定なフラグメンテーションプロセスの両方が起こることが公知である。フラグメンテーションは、反射分析器を用いて最も容易に観察され、「ポストソースディケイ（ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅ  ｄｅｃａｙ）」（ＰＳＤ）として知られている技術は、ペプチドおよび他の小分子に関する構造的情報を提供するために開発されてきた（例えば、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｂ．ＳｐｅｎｇｌｅｒおよびＦ．Ｌｕｔｚｅｎｋｉｒｃｈｅｎ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍ．Ｍ  Ｓｐ７（１９９３）９０２−９１０（ＰＳＤ）、およびＲ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｐ．Ｃｈａｕｒａｎｄ，Ｄ．Ｋｉｒｓｃｈ，Ｂ．Ｓｐｅｎｇｌｅｒ，ＲＣＭＳ，１０（１９９６）１１９９−１２０８を参照のこと）。タンパク質および大きなＤＮＡオリゴマーは、イオン源と検出器との間でＴＯＦ質量分析計内で広範囲にフラグメントすることが多く、そして幾つかの場合、親イオンは反射分析器内で十分に検出可能でない。分子イオンは、このようなイオンの有意なフラクションが加速を存続させる場合、線形分析器内で観察されるスペクトルをさらに支配し得る。
【０００４】
イオン励起の全てが脱離プロセス自体から生じるわけではない。イオンは、加速電場によるマトリックスプルームを通してドラッグ（ｄｒａｇ）される間、励起される（Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｐ．Ｃｈａｕｒａｎｄ，Ｄ．Ｋｉｒｓｃｈ，Ｂ．Ｓｐｅｎｇｌｅｒ，ＲＣＭＳ，１０（１９９６）１１９９−１２０８，Ｒ．Ｃ．ＢｅａｖｉｓおよびＢ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１８１（１９９１），４７９，Ａ．Ｖｅｒｅｎｔｃｈｉｋｏｖ，Ｗ．Ｅｎｓ，Ｊ．ＭａｒｔｅｎｓおよびＫ．Ｇ．Ｓｔａｎｄｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．４０th  ＡＳＭＳ  Ｃｏｎｆ．（１９９２）３６０頁、およびＪ．Ｚｈｏｕ、Ｗ．Ｅｎｓ，Ｋ．Ｇ．ＳｔａｎｄｉｎｇおよびＡ．Ｖｅｒｅｎｔｃｈｉｋｏｖ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，６（１９９２）６７１を参照のこと）。結果として、減少したフラグメンターションに関する限り、イオン化／脱離閾値放射度の真近で最も優れた性能が得られ、これは、マトリックス結晶上の特定の「スィートスポット（ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔ）」に依存する。
【０００５】
遅延イオン引き出し（ＤＥ）（例えば、Ｒ．Ｓ．ＢｒｏｗｎおよびＪ．Ｊ．Ｌｅｎｎｏｎ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ６７（１９９５，１９９８）、およびＭ．Ｌ．Ｖｅｓｔａｌ、Ｐ．ＪｕｈａｓｚおよびＳ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ９（１９９５）１０４４−１０５０を参照のこと）は、フラグメンテーション問題を部分的に克服し、そしてＭＡＬＤＩ法をより強力にする。ＤＥにおいて、加速電場の印加が遅延され、その結果レーザーによって脱離される中性分子のプルームは、電場が印加されその結果衝突が比較的起こりそうもない時間まで十分に広がっている。結果として、安定なイオンはレーザーエネルギーの広範囲にわたって得られ得る。ＤＥ技術の導入は、ペプチド、中間質量タンパク質およびＤＮＡに対するＭＡＬＤＩの性能を著しく改良した。しかし、ＤＥ法が適用される場合でさえ、性能は、３０ｋＤを超えるタンパク質および６０量体より大きい混合ＤＮＡに対してさらに低下する。ピーク形状は、小さな基の分解されない損失によって、および付加体によって影響される。分子イオンの存続は、特にＤＮＡ分子の場合、サイズと共に悪くなる。さらに、ＭＡＬＤＩ法は、得られるスペクトルを悪化する、タンパク質イオンのマトリックス分子とのクラスターを形成することが公知である。
【０００６】
大きな分子、特にタンパク質およびＤＮＡオリゴマーの分子量を正確に決定し得るＭＳ機器のための改良したＭＡＬＤＩ源の必要性が存在する。このような源が、過度のフラグメンテーションおよび所望されないクラスター化を回避して「明確な」スペクトルを生成することによって正確な分子量測定をを達成することが所望される。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の種々の実施態様によれば、ＭＡＬＤＩ技術は、不安定な分子の分子量を決定するために拡張され、それによってペプチド、タンパク質、およびＤＮＡオリゴマーのような生物学的に重要な分子に対して、この技術を特に有用にする。本発明は、ＭＡＬＤＩ技術を採用する装置および方法に関して先行技術の制限を克服し、従って幾つかの場合の制御されないフラグメンテーション、ならびにマトリックスおよび不純物分子との所望されないクラスター化までも回避することによって不安定な生体高分子に対するこの技術の有用性を拡張する。これらの両方の効果は、従来において、約３０，０００Ｄａより大きい生体高分子の分子量を確実に決定するためのＭＡＬＤＩ技術の有用性を制限してきた。
【０００８】
本発明は、励起イオンの中性分子との低エネルギー衝突が、迅速な衝突冷却を引き起こし得、従って内部励起を緩和し得、そしてＭＡＬＤＩで生成したイオンの安定性を改良し得るという認識に基づく。本発明の特徴によれば、発明者による最近の実験的研究は、小さな基の損失および骨格フラグメンテーションが実際には約１ｔｏｒｒのＭＡＬＤＩ源圧力において除去されることを見出した。本発明の別の特徴によれば、室温および０．１ｔｏｒｒ〜約１０ｔｏｒｒの気体圧力において、タンパク質イオンのマトリックス分子とのクラスターの形成は、１５０℃と２５０℃との間で下流気体温度を増加することによって、タンパク質をフラグメント化することなく、効率的に破壊され得る。サンプルの分解を回避するためにイオン源チャンバ内の温度を５０℃未満に制御することが所望されることも見出された。イオンの安定化おおびマトリックス複合体（ｍａｔｒｉｘ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の除去は、タンパク質スペクトルの質を改良する。４７ｋＤタンパク質エノラーゼの場合、同位体を制限した分解能が達成され得る。
【０００９】
一旦、タンパク質の準安定性フラグメンテーションが気体衝突によって回避されると、ＭＡＬＤＩのイオン化プロセスの定量的局面がレーザー流束量に対して非常に非感受性になる。広範囲にわたるレーザーパワー（ほとんど１０年）スペクトルがほとんど同じままである。本発明の別の特徴によれば、中間気体圧と組み合わせた高レーザーエネルギーでの作動は、有意にイオンシグナル強度を増加させる。イオンシグナル強度およびデータ収集の速度のさらなる最適化はまた、高反復率でのレーザーの同時操作する工程およびデータ収集システムを飽和することなくサンプルプレートのスキャン速度を制御する工程をによって達成され得る。従って、本発明は、レーザーエネルギーの変化に対して非常に低感度である機器システムおよびサンプル調製技術を提供する。
【００１０】
本発明の目的は、ＭＡＬＤＩによって生成される分子イオンのフラグメンテーションを制御し、そして軽減することである。
【００１１】
別の目的は、ＭＡＬＤＩによって生成される分子イオン上での中性分子のクラスター化の量を制御し、そして軽減することである。
【００１２】
他の目的は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による大きな分子の分子量決定のための感度、分解能、および質量精度を改良することである。
【００１３】
別の目的は、ＤＮＡ配列を決定するために使用され得るこのようなフラグメントの混合物を含む大きなＤＮＡフラグメントの分子量を決定するための装置および方法を提供することである。
【００１４】
これらの目的は、ＭＡＬＤＩイオン源内の中性気体の圧力および温度を制御するための装置および方法を提供することによって達成される。
【００１５】
好ましい実施態様は、源からイオン輸送の方向に対して直交して、飛行時間型質量分光計へのイオンの導入に特に適用可能であるように記載される。他の実施態様は、イオン導入の方向がＴＯＦ分析器内のイオンの動きの方向に対して実質的に平行である、より従来の「同軸」飛行時間型質量分析計にも適用可能であるように記載される。
【００１６】
他の目的、特徴および利点が、本発明の好ましい実施態様の以下の説明および添付の図から、当業者に対して明らかとなる。
【００１７】
（発明の好ましい実施態様の詳細な説明）
簡潔な概観における、図１を参照して、不安定分子の分子量を決定するための重量分析計装置１０の好ましい実施態様は、レーザー１２、サンプルプレート１３、サンプルプレートを取り囲み、そしてイオン採取開口１５を含むイオン源チャンバー１４、サンプルプレートに隣接する領域内に気体流を導入するための気体入口モジュール１６、気体入口モジュール１６とイオン源チャンバー１４との間のバルブ１６Ａ、および源１１を重量分析計（ＭＳ）１８に結合するイオン輸送モジュール１７を含む。
【００１８】
操作において、タンパク質またはＤＮＡオリゴマーのような不安定な分子のサンプルは、サンプルプレート１３上に堆積され、そしてレーザー１２によって発生される収束光子ビームに曝される、結晶性マトリックス材料内に組み込まれる。レーザーパルスは、サンプルからのイオンおよび中性分子のプルームを発生する。このプルームは、緩衝気体中にゆっくりと広がる。イオン源チャンバー１４内の気体圧力は、バルブ１６Ａの調整を介して入口モジュール１６によって供給される不活性気体の流束の調整によって、調節される。気体流および差動排気（以下に記述される）との間の釣り合いは、イオン源チャンバー１４の気体圧力を規定する。レーザーパルスの時間において、チャンバー１４内の気体圧力は、少なくとも、約０．１〜約１０ｔｏｒｒの範囲に維持される。レーザーパルスから発生したイオンは、不活性気体との衝突において、本質的に緩和され、その結果、イオンを安定化し、従って、フラグメンテーションを除去する。このことが、従来のＭＡＬＤＩにおける典型的な問題である。イオンは、適度な電場および輸送モジュール内への気体流によって、穏やかに引っ張られながら、イオン採取開口１５を通って、イオン輸送モジュール１７へゆっくりと移動する。開口１５は、チャンバー１４から輸送モジュール１７への気体流を制限し、そして、差動的に汲み上げられたイオン輸送モジュールと一緒に、ＭＳ重量分析計１８のより低い圧力要求に対して、増加した圧力において操作する気体状イオン源に適合する。その結果、イオン源１１における気体圧力は、ＭＳ分析器１８の操作に影響せず、広い範囲に渡って制御され得る。損失を減少するために、イオン輸送モジュール１７は、イオン収束光学要素を組込み、そして、サンプルイオンとマトリックス材料との複合体を、適度な加熱によって壊す温度調節（例えば、制御された加熱要素を用いて）を含み得る。複合体はまた、適度な電場をかけることによって、壊され得る。
【００１９】
重い、単電荷のイオンの広い重量−電荷比（Ｍ／Ｚ）に渡るサンプルイオンの分析のために十分適切なＭＳ分析計１８の１つの好ましい形態は、飛行時間型重量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）である。初期の低いイオンエネルギーおよび準安定フラグメンテーションの不在は、ＴＯＦ  ＭＳ装置における低い化学的な背景ノイズおよび重量スペクトルの良好な分解能を達成することを援助する。しかし、本発明のＭＡＬＤＩイオン源発生の原理を、他の重量分析器（例えば、四重極、イオントラップ、フーリエ変換または扇形磁場型重量分析器）を用いるインターフェイスに直接拡張することが可能である。例えば、高反復率レーザーを使用する場合、生成されるイオンビームは、ほぼ連続ビームである。四重極重量分析器の操作において、四重極にかけられる低周波数ＲＦ場を使用することは、分析されるイオンの重量範囲を広くする。
【００２０】
図２を参照して、本発明の１つの実施態様は、ポート２０を介して真空ポンプ（示されていない）に接続されて、差動的にポンピングされ、ポート２１を通ってパルス化バルブ１６Ａによってパルス化気体流を供給されるＭＡＬＤＩイオン源１１ａを含む。この実施態様において、イオン輸送モジュール１７ａは、分離した電極２２を含み、この電極は開口２３を含む。開口２３は、直列の線形ＴＯＦ  ＭＳ２８の真空チャンバー２４内への気体流を制限し、この真空チャンバーは、真空ポンプ（示されていない）に接続された個別のポンピングポート２０Ａおよびビームのパルス化加速を提供するための一連のメッシュ２５を有する。
【００２１】
操作において、ＭＡＬＤＩイオン源で発生したプル−ムを、プルームが広がった時点で、少なくとも約１００ｍｔｏｒｒの局所的気体圧力に曝すために、不活性気体のパルスは、レーザー１２からのショットに同調される。パルス化された気体入口は、ポンピングシステムにおける平均充填を減少し、そしてＴＯＦ分析器において十分な真空を維持することを可能にする。例えば、３００ｍｔｏｒｒの最高圧力および１％よりも小さい気体充填のデューティサイクルにおいて、開口２３のサイズを、１ｍｍの適切なサイズに維持しながら、１０-6ｔｏｒｒよりも良好な真空が、３００ｌ／ｓの適度なポンピング容量のポンプによってＴＯＦ分析器２８において維持され得る。パルス化イオン源がない場合には、開口のサイズを、約０．１ｍｍに減少させなくてはならず、これは、イオン損失、従って、感度の減少を生じ得る。
【００２２】
イオンの運動（並進）エネルギーは、気体衝突において緩和される。イオンは、開口２３を通る気体流と共に移動し、そして真空チャンバー２４内に採取される。イオン採取は、サンプルプレート１３と開口２３との間に適度の電場をかけることによって、支援され得る。レーザースポットが十分小さい場合（約０．１ｍｍ）、開口２３のサイズは、約１ｍｍであるか、または多少小さくあり得、イオンビームの完全な輸送を保証するのに十分なサイズであり得る。イオンのエネルギーは、気体との衝突において減衰するが、イオン群は、なお短い（長さ数ミリメートル内）。一旦、イオン群が、差動ポンピングの中間段階に採取されると、電気パルスが、イオンをＴＯＦ重量分析計内に排出するために適用される。パルス化加速は、適切なサイズの線形ＴＯＦ分析器でさえ、Ｒ〜１００の範囲の適切な分解能（Ｒ）を得るために、このようなイオン群の時間収束を提供し得る。この分解能は、より長い分析器の使用およびイオンミラーの採用により改善され得る。
【００２３】
以下は、時間収束スキームの簡単な理論的解釈であり、ビームパラメータの熟練した評価に基づいている。線形ＴＯＦＭＳ分析器の分解能は、パルスイオンビームの同時に起こる空間広がり（Δｘ）、速度広がり（ΔＶ）および時間広がり（Δｔ）によって、制限される。パルス加速がかけられるので、時間広がり（Δｔ）は除去される。気体ジェット中での衝突減衰は、熱速度よりも小さいイオン速度広がり（ΔＶ）に減少する。速度広がりは、以下の計算によって、線形ＴＯＦ分析器の分解能を制限する：ΔＶ／Ｖ＊Ａ／Ｌ、ここで、Ｖは自由飛行におけるイオン速度であり、Ａは加速場の長さであり、そしてＬは電場が存在しない領域の長さである。イオン速度は、重量＝１０ｋＤであり、そして加速電圧＝１０ｋＶであると仮定して、計算され得る。そして、Ｖ＝１００００ｍ／ｓである。Ａ＝３０ｍｍであり、Ｌ＝１ｍであり、およびΔＶ＜３００ｍ／ｓであると仮定すると、分解能限界は、Ｒ＞１０００である。数ミリメーターの空間広がりは、ＷｉｌｅｙおよびＭｃＬａｒｅｎによって記述される方法を使用して収束される（Ｗ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｉ．Ｈ．ＭｃＬａｒｅｎ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ，２６，１１５０，１９５５）。
【００２４】
空間収束の分解能は、本参照において、８＊（Ａ／Δｘ）2と記述されるように制限され、ここで、Ａは加速場の長さである。Δｘ＝３ｍｍであり、およびＡ＝３０ｍｍであると仮定する（先の計算におけるように）と、期待される分解能は、Ｒ〜１０００程度である。このような分解能は、現存する方法に匹敵し、そして、少なくとも、分解能は、重イオンの同位体分布によって制限されるので、重分子のＴＯＦ  ＭＳにおいて、よく受け入れられる。
【００２５】
図３を参照して、本発明の別の実施態様は、入口モジュール１６からポート２１を通って供給される一定圧力の気体で満たされるＭＡＬＤＩ源１１ｂを備える。入口気体流は、調節可能な弁１６Ａによって典型的に調節される。イオン源チャンバー１４ｂ中の気体圧力は、分離した真空ゲージ（示されていない）によって計測され、そして入口気体流および制限開口２３の伝導性との間の釣り合いによって規定される。図２の実施態様におけるように、サンプルプレート１３と開口２３との間にかけられる弱い電場は、イオン輸送モジュール１７ｂを通り、次いで飛行時間型分析計２６の真空チャンバー２４に入る、イオン採取を補助し、この場合、飛行時間型分析計は、イオン輸送モジュール１７ｂ（ｏ−ＴＯＦ  ＭＳ）を通過するイオンの注入に直交するように操作する分析器である。前のように、開口２３は、独立してイオン源内の気体圧力を制御し得、従って、イオンの内部エネルギーを緩和する。イオン輸送モジュール１７ｂは、温度源１９によって加熱され、これは、熱を気体流に送り、そして、従って、イオンとマトリックス分子との間の複合体（クラスター）を壊すためである。特定の場合、サンプルの分解を避けるために、イオン源チャンバー１４ｂ中の温度を調節する（例えば、イオンチャンバー１４ｂまたはサンプルプレート１３を冷却することによって）ことがまた、望ましい。十分な熱交換を提供するために、イオン輸送モジュール１７ｂ内のイオンの滞留時間は、より弱い電場、より高い気体圧力およびより長い輸送システムを選択することによって、延長される。
【００２６】
パルスイオン群は実質的な広がりを経験するので、ｏ−ＴＯＦは、もはやれレーザーパルスと同調しない。その代わり、準連続ビームが、高反復率レーザー、増加される流束量でレーザーを走らせ、そして、イオンビームを減速することによって形成される。このような操作の様式は、イオンシグナルを強く増強し、そして、スペクトルの収集を加速する。本発明により、ＭＡＬＤＩイオン源は、実質的な電流を生成し得ることが分かった。強い外部電場が存在しない場合、イオンビームは、それ自身の空間電荷によって駆動される。軸方向に制御されるイオン流を誘導することによって、空間電荷を減少することが好都合であり、このイオン流は、気体流または軸方向の弱い電場のいずれかによって、達成され得る。ビームの放射状の広がりは、高周波四重極２７の使用によって、効果的に防止され得る。四重極２７と出口開口２８との間に弱い反発電位をかけることによって、ビームのパルス化性質は、完全に平滑化される。完全に減衰されるエネルギー分布を有する得られた連続ビームは、ｏ−ＴＯＦ質量分析計の操作に完全に適合する。この連続ビームは、ビームの最初の方向に直交して加速されるイオン群に、公知の方法で転換される。イオン群は、イオンの損失を最小にすることによって、ビームを効率的に利用するために、高反復率において形成される。ｏ−ＴＯＦ  ＭＳの典型的な効率、つまり「パルサーデューティーサイクル」は、１０〜３０％程度である。図２に示されるような直列ＴＯＦ  ＭＳと比較されるように、より低い感度は、均一な分解能および直線質量較正によって、十分に補償される。
【００２７】
図４Ａ、ＢおよびＣを参照して、本発明のイオン輸送モジュールの複数の実施態様が示される。輸送モジュールのタイプは、ＭＡＬＤＩ源にかけられる気体圧力の範囲に従って選択される。圧力要求量は、レーザーの波長、サンプルおよびマトリックス材料の特性に依存して変化し得る。この圧力は、十分な速度でイオンを冷却するために調節されることを必要とする。必要な速度は、イオンの安定性、およびサンプルから放出されるイオンの温度に依存する。波長、マトリックス材料、およびサンプルの性質の非常に多くの実用的組合わせを試験した後、約１ｔｏｒｒ〜１気圧の圧力が、最も良好な結果を与えることが分かった。利用可能なレーザーの波長範囲は広い。しかし、赤外線（ＩＲ）脱離は、紫外線（ＵＶ）よりもソフトであるが、しかしＩＲは、レーザーは、市販のシステムにおいて使用される場合、しばしば問題が存在する。ＭＡＬＤＩイオンの温度は、レーザー照射およびイオンの特性には依存しないが、しかしマトリックスの化学組成によってほぼ規定されることがまた、分かった。このマトリックスの性質は、相転換の温度を固定する。例えば、アルファシアノマトリクスから放出されるイオンの温度は、約５００℃であり、３−ＨＰＡからの放出では、約３５０℃である。幾つかのヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質イオンの熱安定性が測定され、そして全てのペプチドおよびタンパク質は、同様の安定曲線を有することが分かった。分解速度（ＨＮ3／Ｈ2Ｏ基が損失される速度として定義される）は、分子のサイズに比例した。その結果、より大きいタンパク質は、１７／１８の損失より大きいピークを有した。図１０〜１２によって例示されるように、１ｔｏｒｒでの性能は良好であった。また、図１５によって例示されるように、ヌクレオチドは、あまり安定でないことが分かった。しかし、ヌクレオチドの安定性は、それらのイオンは非常に「冷たい」マトリックスから通常生成されるので、熱不安定性自体によって制限されないことが分かった。
【００２８】
１つの好ましい実施態様において（図４Ａ）、イオン源１１ｃ中の気体圧力は、３ｔｏｒｒ〜１気圧の範囲にあるように選択される。２段階の差動的にポンピングされる輸送モジュール１７ｃは、開口４１によって分離される長い管４０および多重極４２を備える。このチューブ４０は、直径数ｍｍであり、そしてレーザー脱離の間に形成され得るイオンとマトリックス分子の任意のクラスターを壊すために、約２００℃に加熱される。本発明によりまた、チューブの伝送は、ある値より小さい圧力に、突然減少することが発見された。この閾値は計算され得、そして積Ｐ×ｄ（Ｐ×ｄ）に対応し、この実施態様において、この値は、５０ｍｍ＊Ｐに近似的に等しく、ここで、Ｐは、気体圧力（ｔｏｒｒ）であり、ｄはチューブの直径である。その結果、このような輸送モジュールは、チューブ４０を通過する高い気体流で操作し、従って、後部末端のｏ−ＴＯＦ質量分析計４４中の真空を維持するために、ポート４８を介して、さらなるポンピング段階を必要とする。多重極４２は、高周波（ＲＦ）専用多重極ガイドであり、これは輸送モジュールの最後の段階のイオン伝送を増強する。本発明者らは、チューブ４０の直径が、ＴＯＦ質量分析計４４中の真空を維持するために、比例的に減少される限り、ＭＡＬＤＩ源内の気体圧力は、大気圧まで上昇され得ることが、実験的に証明された。例えば、直径０．４ｍｍの管は、１気圧のＭＡＬＤＩ中で使用された。しかし、数十の試験されたマトリックスについて、１０ｔｏｒｒよりも大きい気体圧力は、クラスター形成を加速するが、しかしタンパク質およびＤＮＡの衝突冷却を改善しないことが分かった。輸送システムにチューブを使用する主な利点は、マトリックス材料による汚染から輸送システムを保護することである。この実施態様の輸送システムは、揮発性マトリックスを許容する。特に、水マトリックスが使用され、そして成功した結果が、１気圧の圧力において得られた。
【００２９】
ＵＶレーザーが、１気圧の源圧力で使用される場合、以下のような固体材料の使用が、うまく説明されてきた：α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡＣ）、３−ヒドロキシピコリン酸、２，５−ジヒドロキシ−、２，３，４−トリヒドロキシ−、および２，４，６−トリヒドロキシ−アセトフェノン、４−ニトロフェノール、６−アザ−２−チオチミン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジスラノール（ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）、２−アミノ安息香酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、フェルラ酸、コハク酸など。クラスター形成によって、大気圧領域での操作は、０．１〜１０ｔｏｒｒの圧力範囲の場合よりも劣る。
ＩＲレーザーが、１気圧の源圧力で使用される場合、上と同じマトリックス、ならびに水、水／アルコール混合物、水およびポリアルコール（例えば、エチレングリコール、グリセリンなど）、ヒドロキシル官能基（例えば、２−ヒドロキシピリジン）などを有する異なる芳香族化合物などを使用し得る。ＵＶおよびＩＲの両方における全てのマトリックスは、ペプチド／タンパク質およびＤＮＡ解析の両方におけるアルカリ金属付加物の形成を防止するために、幾つかの塩の添加物を、アンモニア対イオンまたは異なるアルキルアンモニア誘導体と共に含み得る。１気圧でのＩＲレーザーの使用は、１分当たりマイクロリットルからミリリットルの流速を有する連続流中で流れる液体マトリックスの使用を可能にする。この場合、水、水−アルコール混合物およびグリセロールのような液体マトリックスは、うまく説明されてきた。
【００３０】
図４Ｂに示される特定の別の実施態様において、ＭＡＬＤＩ源１１ｃ中の気体圧力は、約１００ｍｔｏｒｒと約３ｔｏｒｒとの間に調整可能である。源中のこのような圧力に適応するために、輸送モジュール１７ｄは、２つの差動的にポンピングされるステージを備え（ポート４７および４８に適切なポンプを接続することによって創り出される）、そして四重極の様式であるＲＦ専用多重極イオンガイドが、両方のステージの送達を増強するために使用され得る。四重極ガイド４３、４５は、フィルムの形成およびこれらのフィルムの変化を防止し、そしてイオンとマトリックス物質または他の不純物との任意のクラスターを壊すために、１５０〜２００℃に加熱される。約１ｔｏｒｒのかけられた圧力は、重いタンパク質および中程度のサイズのＤＮＡの内部エネルギーの効率的な緩和を提供する。このような圧力における電気放電を防止するために、第１の多重極４３内のＲＦシグナルの振幅が、２５０Ｖより小さく維持され、そしてＲＦ周波数は、１０ｋＨＺ〜１ＭＨｚに保持される。Ｍ／Ｚが約１５０，０００であるイオンは、四重極ガイドの使用によって、３００ｋＨｚの周波数で輸送された。四重極が、真空中で作動される場合、このようなＲＦシグナルは、約１ｋＤより小さい低質量イオンの排除を引き起こす。しかし、１ｔｏｒｒの圧力において、衝突減衰の効果は、中程度の質量のイオンを安定化し、低質量イオンの「カット−オフ質量」を約２００のＭ／Ｚに実質的に低下させる。この効果は、重イオンの観測において重大ではないが、しかし、マトリックスイオンおよびイオン形成の特性をモニターするために有用である。本発明により、四重極ガイドを有する２段階システムが、単一の四重極で、有意なイオン損失がなく、圧力を約８００ミリｔｏｒｒから数ｔｏｒｒまで上げることを可能にすることが見出された。必要に応じて、円錐形の分離電極５２が、イオンを空間的に収束し、そしてまたレーザービームがサンプルプレート１３へ進むことを容易にすることを補助する。
【００３１】
図４Ｃに示される特定の別の実施態様において、ＭＡＬＤＩ源１１ｃ中の気体圧力は、約３０ｍｔｏｒｒ〜約３００ｍｔｏｒｒの範囲にあり、そして輸送モジュール１７ｅは、単一の四重極ガイド４６によって形成される。もう一度、円錐形の分離電極が使用される。このような圧力範囲は、ペプチドイオンの衝突減衰の対して十分であるが、しかし、タンパク質イオンに対しては範囲外である。圧力効果は、以下の実験の節で議論される。
【００３２】
上に記載された全ての輸送モジュールにおいて、出口開口２３を通るイオン輸送と関係する保護的な遮蔽を提供するために、付加的な電極を使用することがしばしば所望され得る。長いチューブのインターフェイスの場合（図４Ａ）、このチューブは、出口開口の役割を果たす。この主な目的は、ＴＯＦ分析器を真空に維持しつつ、ＭＡＬＤＩイオン源内の気体圧力の独立な制御を可能にすることである。発明者らは、開口２３を有する電極２２がまた、保護シールドの重要な機能を提供することを実現させてきた。このシールドは、マトリックスフィルムの発達に対して、多重極ガイドを保護することを補助する。この機能は、遅いイオンビームでモジュールを操作する場合に、特に所望される。四重極内の変化が重イオンの排除を引き起こすことが実験的に見出された。電極２２、５２上でのマトリックスフィルムの発達と変化は、イオンビームの排除または質量識別を引き起こさない。付加的な電極は、チューブ４０または多重極ガイド４２、４３、４５または４６が加熱されてクラスターを破壊する場合に、サンプルプレート１３を加熱から保護するために使用され得る。このことは、マトリックス物質の急激なエバポレーションまたはサンプルの熱的分解を防止するために重要である。
【００３３】
（実験結果）
（ペプチドイオンの衝突冷却）
図５に示される１つの好ましい実施態様において、発明者らは、フラグメンテーション無しのイオン化は、イオン源の気体圧力が１００ｍｔｏｒｒより大きい場合、中程度のレーザーエネルギー（１〜３μＪ／パルス）で達成され得ることを示した。イオン源気体圧力の効果の系統的な研究を実施するために、付加的なターボポンプが、イオン源に添え付けられ、そして窒素の付加的な制御された漏出が、第２の四重極内の圧力を調整するために使用された。イオン源中の圧力を１０−４〜１ｔｏｒｒに変化させながら、必要な衝突減衰度が、第２のＲＦ専用四重極内を１０〜３０ｍｔｏｒｒに維持することによって、輸送システムにおいて提供された。
【００３４】
ペプチドのフラグメンテーションは、気体圧力の関数であることが見出されたが、他の実験条件が、送達または異なる効率の差によって、もしくは源内衝突誘起解離（ＣＩＤ）によっては引き起こされないことを立証するために、調整されるべきであった。ステージ当たりの電圧差は、Ｕ（Ｖ）＝１＋５０＊Ｐ（ｔｏｒｒ）のように調整された。ＣＩＤの不在は、１０ｍｔｏｒｒ以上の圧力において、立証された。フラグメンテーション度は、作動条件近傍での電圧勾配に依存しなかった。より低い（０．１ｍｔｏｒｒ）圧力において、第２の四重極に入るイオンのエネルギーは、２ｅＶより小さかった、すなわち、それは、測定できる量のフラグメントを生じなかった。同じサンプルが、サンプルプレートの多重極スポット上に堆積され、サンプルレーザーエネルギーは、完全な進行のために使用された。これらの実験において、窒素レーザーは、２０Ｈｚの反復率で進行した。約２μＪ／パルスのレーザーエネルギーは、イオン観測の閾値よりも約１．５倍も高い。ペプチドサンプルは、α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックス内で、１０〜１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度で調製された。
【００３５】
ペプチドイオンの衝突冷却の効果は、０．１ｍｔｏｒｒ（図６Ａ）、１０ｍｔｏｒｒ（図６Ｂ）、１００ｍｔｏｒｒ（図６Ｃ）および１ｔｏｒｒ（図６Ｄ）の種々の気体圧力で捕獲されるペプチド物質Ｐのスペクトルによって説明される。低圧（図６Ａの０．１ｍｔｏｒｒ）では、かなりの量の小さいフラグメントが存在する。さらに、１７の損失（ＮＨ3基の損失を表している）のピークは、分子ピークとほぼ同じ高さである。圧力の増加につれて、フラグメントの量は減少する。最も顕著な骨格フラグメントａ7（８３８原子質量単位）およびＮＨ3基の損失に対応するフラグメントの両方は、１００ｍｔｏｒｒで強く抑制される（図６Ｃ）。
【００３６】
冷却に対する必要性は、レーザーエネルギーに依存せず、そしてペプチドのサイズおよび組成と共に変化するようである。レーザーエネルギーの効果は、図７Ａの物質Ｐの例で説明され、これは、０．１ｔｏｒｒの気体圧力で、ＣＨＣＡマトリックス中のペプチド物質Ｐを説明する。図７Ａは、Ｍ−１７およびＡ７骨格フラグメントの相対強度の片対数プロットであり；そして、図７Ｂは、シグナル強度対レーザーエネルギーの両対数プロットである。これらの実験において、２０Ｈｚ窒素レーザーが使用された。１０ｐｍｏｌｅ／μｌのサンプルが、ＣＨＣＡマトリックス中で調製された。フラグメントａ７およびＭ−１７の相対強度は、レーザーエネルギーと共に増加する。両方のフラグメントは、他の中程度の質量のフラグメントが増加するにつれて、比例的に増加する（図には示していない）。ＭＨ−ＮＨ3ピークは、分子ピークに接近しており、そして選定することが容易であるので、これらは、プロセスの粗さの指標として使用され得る。
【００３７】
より低いレーザーエネルギーにおいて、フラグメンテーションはほとんど存在しない。よりきれいなスペクトルを得るために、誰も、典型的に閾値に接近して操作し、これは従来の真空中のＭＡＬＤＩに対して全く一般的な戦略である。しかし、これは感度の点で妥協する。本発明の重要な特徴は、源内の衝突冷却を利用することによって従来の考えを無視することであり、これは、より高いレーザーエネルギーで操作し、従って、感度およびシグナル安定性を改善するためである。一旦、レーザーエネルギーが、図７Ｂに示されるようにイオン生成における閾値の約３倍に調整されると、シグナルの強度は、ほぼ４のオーダーの大きさで改良され得る。以下に記載されるように、シグナル強度は、高反復率レーザーを使用することによって、さらに増加される。この結果、中程度の圧力でのイオン生成は、従来の真空中のＤＥ  ＭＡＬＤＩと比較して、より大きいシグナルおよびより速いデータ捕捉を提供する。
【００３８】
（パルス当たりのより高いエネルギーでの高反復率レーザー）
シグナル損失がレーザーの反復率によって補償される場合、レーザーエネルギーは、低くされ得る。この効果は、６ｋＨｚでそして約０．６ｍＪ／パルスのエネルギーで非制御Ｑスイッチを進行する、ナノレーザー「ＮａｎｏＵＶ３５５」（Ｕｎｉｐｈａｓｅ，ＣＡ）において、最初に観測された。低エネルギーと水平面内での勾配との組合わせは、レーザービームを十分にしっかりと収束することを困難にする。円柱状レンズの使用により、このフルエンスはＣＨＣＡマトリックスにおける閾値をわずかに超えた。他のマトリックスにおいて、このフルエンスは十分ではなかった。このスキームは、より強力な高反復レーザー、アクティブＱスイッチを有する３５５ｎｍのＥＰＯ−５０００Ｎｄ−ＹＡＧで、完全に作動し、これは外部の引き金デバイスによって、反復率を制御することが可能である。２ｋＨｚの反復率までは、そのレーザーは、窒素レーザーのエネルギーと比較して、ショット当たりのエネルギーを一定に維持し得る。このレーザーエネルギーは、全ての試験マトリックスにおいて最大シグナルに達するほどに十分である。２Ｈｚ〜２ｋＨｚの全範囲に対して、サンプルが、レーザービーム下で、サンプルプレートを移動することによって絶えず新しくされる場合、シグナル強度は、レーザーの反復率と共に比例的に増加することが見出された。サンプルステージ（サンプルホルダー）は、ステッパーモーターによって移動され、そしてステッパーモーターを制御するソフトウェアは、ヘビ状パターンにおける連続的な走査のためにプログラムされる。３ｍｍ／秒直線速度において、いずれの０．１５ｍｍのスポットももはや、２ｋＨｚレーザー反復率での１００個のショットに対して曝されなくなった。このような走査速度は安全であり、これはＣＨＣＡマトリックスの単一スポットが、レーザーエネルギーの１つの１０個からなる組（ｏｎｅ  ｄｅｃａｄｅ）の内に４００〜５００個のショットに対して存続することが見出された。レーザー作動の高反復率は、データ捕捉を劇的に加速する。０．２５秒の捕捉時間で、そして１００ｆｍｏｌのサンプルにおいてでさえ、スペクトルは良好な統計量および信号対雑音比を有する（図８Ｂ〜８Ｄ）。このような迅速な捕獲は、複数のサンプルの全域に渡る連続的な走査を可能にする。図８Ａは、一定の掃引モードにおいて捕捉される全イオン電流を示す。小さい、そして中程度の質量のタンパク質において、滑らかなスペクトルを収集するために、数秒要する（図９）。さらなる全ての実験において、高周波数レーザーが使用された。
【００３９】
上昇した圧力でのＭＡＬＤＩ源の作動の本発明の記載された方法は、より粗暴で、そしてＤＥ  ＭＡＬＤＩにおいてスペクトルを収集する従来の方法よりも、自動化し易く、ここで、経験を積んだユーザーは、堆積されたサンプル上のいわゆる掃引スポットを選択し、そして「不良な」スポットからのデータを退けるべきである。イオン源の中程度の圧力を使用することは、イオンのフラグメント化なしに、レーザーエネルギーを増加させることを可能にし、それにより、サンプルに渡るより均一な応答を可能にする。この結果、サンプルプレートは、自動的に移動され得、そしてスペクトルは、ユーザーのフィードバック無しに、高反復率で収集され得る。このようなモードは、ゲルおよび組織に渡るプロフィールを収集するために、または複数のサンプルの自動走査のために都合がよい。
【００４０】
データ収集をさらに促進し、従って、系のスループットを増加することが所望され得る。本明細書中に記載される発明者らの実験より前に、市販のレーザーは、より高い反復率を可能にするが、スペクトルの質を落とすことなく、どのくらいまで、レーザーの反復率を増加させ得るのかということが未知であった。上に示されるように、サンプル分解は、サンプルプレートを適切な速度で移動することによって防止され得、そして全ての試験されるイオン輸送インターフェイスは、飽和のサインを示さなかった、すなわち、シグナル応答は、レーザー率に比例した。明らかに、レザー反復率の上限は、使用される計数データ収集システム、時間−デジタル変換機（ＴＤＣ）の飽和によって設定された。この制限は、より高価なアナログデータ収集システム（例えば、高速平均化トランジェントレコーダー（ＴＲ））を使用することによって回避され得る。しかし、レーザー反復率が、ＴＤＣのダイナミックレンジを増加させるために、調整パラメータとして使用される場合、良好な結果がＴＤＣを用いて得られる。より低い率は、ＴＤＣを飽和することなく、強いピークの良好な統計量を提供し、そしてより高い率は、スペクトル中の弱いピークに対して同様に提供する。
【００４１】
高い反復率における作動は、他の利点、すなわちパルスビームが平滑化され、そして連続ビームに対して設計された質量分析器とより良好に適合可能である。
【００４２】
（タンパク質イオンの冷却）
タンパク質イオンの冷却は、ペプチドの冷却と非常に類似しているようである。しかし、中程度のレーザーエネルギーにおいてさえ、冷却における要求は、タンパク質のサイズが増加するにつれて厳しくなる。図１０Ａは、Ｍ−１７フラグメント対タンパク質サイズの相対強度を示し、そして図１０Ｂは、フラグメント対イオン源中の気体圧力相対強度を示す。Ｍ−１７フラグメントの相対強度は、ペプチドと比較して（図１０Ａ）、タンパク質においてより高い。これらのデータは、１００ｍｔｏｒｒの圧力および２μＪ／パルスのレーザーエネルギーにおいて収集され、これは、イオン化に対する閾値よりも約１．５倍高い。小さいサイズのペプチドにおいて、安定性の強い変動が存在する。より大きなサイズにおいて、この変動は平均化され、小さな基が失われる確率は、サイズに依存する。励起、すなわちアミノ酸当たりの内部エネルギーは、タンパク質サイズに依存せず、そしてアミノ酸当たり等しい確率が存在し、ＮＨ3またはＨ2Ｏ基を失い得る。このプロットの最も重要な実際的局面は、小さい基の損失は、タンパク質のサイズの増加と共により重大な問題となるということである。同様な問題が、真空中で作動するＭＡＬＤＩ源を有するイオントラップおよび反射ＴＯＦ質量分析計において観測された。線形ＴＯＦにおいてさえ、低質量側のタンパク質ピークは、小さな基の損失のために不鮮明となる。
【００４３】
この問題は、源中の気体圧力のさらなる増加によって有効に解決される。イオン源気体圧力は、全てのサイズのタンパク質における小さい基の損失を実質的に減少する約１〜３ｔｏｒｒにまで増加する（図１０Ｂ）。
【００４４】
衝突冷却効率は、数ｔｏｒｒあたりの気体圧力で強く改善する。その結果、良好な質のスペクトルが、より高いレーザーエネルギー、従って、より高いシグナル強度で収集され得る。衝突冷却は、イーストエノラーゼ（４７ｋＤタンパク質）の例を使用して観測されるように（図１１Ａ〜Ｃ）、より重いタンパク質の形状を改善し、イオン源内の種々の気体圧力での衝突冷却を説明する：０．２５ｔｏｒｒ（図１１Ａ）、０．５ｔｏｒｒ（図１１Ｂ）および２ｔｏｒｒ（図１１Ｃ）。より高い圧力において、フラグメンテーションが減少され、そして質量分解能が改善される（図１１Ｃ）。幾つかの未解決の小損失ピークが、０．２５ｔｏｒｒでの左側のピークを不鮮明にしている（図１１Ａ）。これらの付随体は、０．５〜２ｔｏｒｒのより高い圧力で、強く抑制される。従って、Ｒが約２０００の分解能に制限された同位体が得られる。多くの試験されたより大きなタンパク質（モノクローナルマウスＩｇＧ、トランスフェリンおよびフェリチン）において、分解能は、８０〜１２０のオーダーであるようである。この効果は、タンパク質の異質性に関係され得る。ＢＳＡ（６６ｋＤ）の場合（図１２）、異質形態が分解され、これは、この６６ｋＤにおける１０００を超える分解能を示す。
【００４５】
（クラスター破壊）
説明されてきたように、イオン源圧力の増加は、タンパク質イオンを安定化する。気体圧力の増加と共に、タンパク質イオンは緩和され、そしてＭ−１７フラグメントの量が減少する（図１３ＡおよびＢ）。しかし、より高い圧力においてさえ、クラスターが形成されるために（図１３Ｃ）、さらなる圧力の増加が制限される。これらのクラスターは、ＣＩＤによって除去され得る（図１３Ｄ）。ミオグロビン（１７ｋＤ）において、０．２ｔｏｒｒから０．５ｔｏｒｒに増加する圧力は、Ｍ−１７損失の顕著な減少を引き起こした（図１３ＡおよびＢ）。圧力のさらなる増加は、Ｍ−１７ピークをよりいっそう抑制する（図１３Ｃ）。同時に、このような圧力増加は、ミヨグロビンイオンとＣＨＣＡマトリックスの分子とのクラスターの迅速な形成を提供する。同様なプロセスが、他の試験マトリックス、シナピン酸（ＳＡ）および２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）においても観測された。クラスター発生量は、レーザーエネルギーと共に増加し、これはより多数の中性種に照射されるためである。所望されないクラスターピークは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって源内に除去され得る。ミオグロビンの例において、クラスターは、１．５ｔｏｒｒで、サンプルプレートに１００Ｖをかけることによって除去される（または、形成することを防止する）。しかし、ＣＩＤを使用することは、脱クラスター形成のための最も有効な解答ではない。これは、混合物の分析を可能にするからである。必要とされる電圧は、分析物イオンのサイズに依存する。記載される条件（１．５ｔｏｒｒにおいて１００Ｖ）は１５ｋＤのタンパク質に最適である（図１３Ｂ）が、中程度のサイズのペプチドは、有意な衝突的に誘導された解離を示す（図１４Ｂ）。図１４ＡおよびＢは、穏やかな条件がステージ当たり５Ｖの電位勾配（図１４Ａ）で達成され、そして過酷な条件がサンプルプレート上の５０Ｖのバイアスで達成され得る（図１４Ｂ）ことを説明する。発明者らは、熱によるクラスターの除去がより有効であることを観測した。このような脱クラスター形成は、より小さなイオンの開裂なしで、なされ得る。輸送システムにおける脱クラスター形成は、ＭＡＬＤＩイオン源の分析器からの脱結合を促進する。
【００４６】
図１５ＡおよびＢを参照して、クラスターを、タンパク質および小さいペプチドを開裂せずに、タンパク質から取り除く温度の領域が存在する。図１５Ａは、タンパク質ミヨグロビン、そのＭ−１７フラグメントおよびそのマトリックス分子との複合体の分子イオンの相対強度を示し、そして、図１５Ｂは、タンパク質ミヨグロビンおよび２８量体混合塩基ＤＮＡのフラグメントの相対強度を示す。加熱四重極が、輸送システムにおいて使用される場合、この範囲は、１５０℃と３００℃との間であった。しかし、この温度は、サンプルプレート上のサンプルの可能な分解のために、イオン源チャンバー内で維持され得ない。従って、イオン源を５０℃より低い温度に保持することが所望され得る。図１５ＡのＭ−１７の相対強度の曲線によって示されるように、より高い温度において、タンパク質自身が崩壊し、そして小さい基を失う。ＤＮＡ分子は、図１５Ｂに示されるように、より壊れ易く、従って、より穏やかな加熱が要求される。推奨される温度範囲は、１５０℃と２５０℃との間である。
【００４７】
図１６を参照して、中間質量のＤＮＡ分子、すなわち混合塩基５８量体の代表的なスペクトルが示される。分子ピークが、スペクトル中で、なおも主要なピークである。さらに、スペクトルは、種々の塩基の損失（配列中の全てのモノマーからの）に対応するピークを含む。より小さな質量ピークの次の組は、１つのヌクレオチドだけ短くなったＤＮＡに対応する。これらのフラグメントは、ＤＮＡ合成の間に起こり得る。また、切断は、全配列を通してランダムである。塩基損失は、気体衝突におけるＤＮＡイオンの不完全な安定化を示す。衝突冷却は、ＤＮＡフラグメンテーションを防ぐために、すべてに有効であるわけではないが、本発明の方法は、１８００の分解能（Ｒ）を提供し、これは、従来の技術（例えば、ＤＥ  ＭＡＬＤＩによる）を使用する同じサイズのＤＮＡの分析から得られる値を遥かに超える。
【００４８】
（結論）
タンパク質におけるＭＡＬＤＩ法の実施は、イオン源内の気体圧力を０．１ｔｏｒｒより大きく増加することによって改善される。
【００４９】
気体衝突は、ＭＡＬＤＩ内に発生するペプチドおよびタンパク質イオンのフラグメンテーションを抑制することが示される。骨格フラグメンテーションおよび小さい基の損失は、約１ｔｏｒｒの気体圧力においてほぼ排除される。衝突冷却は、より重いタンパク質の分析において特に重要である。これは、フラグメントの量が、分析物の質量と共に増加するからである。この衝突冷却効果は、イオンの内部エネルギーの緩和に帰属される。
【００５０】
有効な冷却は、イオン化のための閾値エネルギーよりも典型的に３倍高い、より高いレーザーエネルギーでの操作を可能にし、それによって、イオンシグナルおよびスポットからスポットへの（ｓｐｏｔ−ｔｏ−ｓｐｏｔ）再現性を改善する。
【００５１】
１ｔｏｒｒより大きいイオン源気体圧力の増加は、タンパク質イオンとマトリックス分子とのクラスター形成を引き起こし、これは、気体圧力が１０ｔｏｒｒより小さい場合、下流側の気体温度を上昇することによって制御され得る。
【００５２】
ペプチドおよび小さいタンパク質において、クラスターの形成は、源内での衝突的に誘起されるフラグメンテーションによって抑制され得る。従って、クラスターは、源内で形成される。より大きいタンパク質において、下流側の気体の加熱を利用することはより有効である。タンパク質イオンを開裂せずに、クラスターを有効に抑制する温度の範囲が存在する。
【００５３】
イオン輸送システムにおける衝突冷却およびクラスター除去は、イオン源のいっそう強い脱結合を提供し、そして源条件の選択において、いっそう高い柔軟性を可能にする。
【００５４】
イオンの励起度の制御は、タンパク質スペクトルの質を改善する。
【００５５】
ＤＮＡ分子の衝突緩和は、フラグメンテーションの幾つかの証拠にも関わらず、幾つかの成功をもって達成されてきた。しかし、本発明の方法は、中間質量のＤＮＡ分子を分析する場合、分解能を有意に改善する。
【００５６】
本発明の特定の特徴は、幾つかの図面に示され、そして他のものには示されていないが、これは便宜上のみであり、そしてこの特徴は、当業者に明らかであるものとして、組合わされ得る。別の実施態様が、先の説明から、当業者に思いつかれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の実施態様のブロック線図である。
【図２】  図２は、直列ＴＯＦＭＳにおける本発明の実施態様の概略図である。
【図３】  図３は、直交ＴＯＦＭＳにおける本発明の実施態様の概略図である。
【図４Ａ】  図４Ａは、本発明において有効なｏ−ＴＯＦに対する種々のインターフェイスの概略図である。
【図４Ｂ】  図４Ｂは、本発明において有効なｏ−ＴＯＦに対する種々のインターフェイスの概略図である。
【図４Ｃ】  図４Ｃは、本発明において有効なｏ−ＴＯＦに対する種々のインターフェイスの概略図である。
【図５】  図５は、本発明に従う実験的研究を実施するために使用される装置の概略図である。
【図６Ａ】  図６Ａは、本発明の理解に有用な、衝突冷却の効果を源中の気体圧力の関数として説明する飛行時間型質量スペクトルの比較である。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、本発明の理解に有用な、衝突冷却の効果を源中の気体圧力の関数として説明する飛行時間型質量スペクトルの比較である。
【図６Ｃ】  図６Ｃは、本発明の理解に有用な、衝突冷却の効果を源中の気体圧力の関数として説明する飛行時間型質量スペクトルの比較である。
【図６Ｄ】  図６Ｄは、本発明の理解に有用な、衝突冷却の効果を源中の気体圧力の関数として説明する飛行時間型質量スペクトルの比較である。
【図７Ａ】  図７Ａは、本発明の理解に有用な、レーザーエネルギーの効果を説明するプロットである。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、本発明の理解に有用な、レーザーエネルギーの効果を説明するプロットである。
【図８Ａ】  図８Ａは、イオンの全電流プロフィールを示す。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、サンプルプレートを動かし、そして２ｋＨｚの反復率でＮｄ−ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）を操作して得られる一連ＴＯＦスペクトルであり、本発明の理解に有用である。
【図８Ｃ】  図８Ｃは、サンプルプレートを動かし、そして２ｋＨｚの反復率でＮｄ−ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）を操作して得られる一連ＴＯＦスペクトルであり、本発明の理解に有用である。
【図８Ｄ】  図８Ｄは、サンプルプレートを動かし、そして２ｋＨｚの反復率でＮｄ−ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）を操作して得られる一連ＴＯＦスペクトルであり、本発明の理解に有用である。
【図９】  図９は、本発明の理解に有用な、１成分当たり１ｐｍｏｌでのタンパク質混合物のＴＯＦスペクトルである。
【図１０Ａ】  図１０Ａは、本発明の理解に有用な、タンパク質サイズのフラグメンテーション度に対する効果を説明するプロットである。
【図１０Ｂ】  図１０Ｂは、本発明の理解に有用な、タンパク質サイズのフラグメンテーション度に対する効果を説明するプロットである。
【図１１Ａ】  図１１Ａは、本発明の理解に有用な、タンパク質についての一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１１Ｂ】  図１１Ｂは、本発明の理解に有用な、タンパク質についての一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１１Ｃ】  図１１Ｃは、本発明の理解に有用な、タンパク質についての一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１２】  図１２は、６６ｋＤのタンパク質ＢＳＡのＴＯＦスペクトルである。挿入された図は、ＢＳＡの不均一性を説明するために３荷電したのピークの範囲を拡大する。
【図１３Ａ】  図１３Ａは、本発明の理解に有用な、イオン源中の種々の気体圧力における冷却およびクラスター形成の相対効果を説明する一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１３Ｂ】  図１３Ｂは、本発明の理解に有用な、イオン源中の種々の気体圧力における冷却およびクラスター形成の相対効果を説明する一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１３Ｃ】  図１３Ｃは、本発明の理解に有用な、イオン源中の種々の気体圧力における冷却およびクラスター形成の相対効果を説明する一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１３Ｄ】  図１３Ｄは、本発明の理解に有用な、イオン源中の種々の気体圧力における冷却およびクラスター形成の相対効果を説明する一連のＴＯＦスペクトルである。
【図１４Ａ】  図１４Ａは、本発明の理解に有用な、１００ｍｔｏｒｒでのペプチドアンギオテンシンＩＩの源内でのＣＩＤを説明する２つのＴＯＦスペクトルを示す。
【図１４Ｂ】  図１４Ｂは、本発明の理解に有用な、１００ｍｔｏｒｒでのペプチドアンギオテンシンＩＩの源内でのＣＩＤを説明する２つのＴＯＦスペクトルを示す。
【図１５Ａ】  図１５Ａは、本発明の理解に有用な、生体分子およびそれらのクラスターの熱安定性を表すプロットである。
【図１５Ｂ】  図１５Ｂは、本発明の理解に有用な、生体分子およびそれらのクラスターの熱安定性を表すプロットである。
【図１６】  図１６は、分子ピークに対して１８００の分解能（Ｒ）を有する５３量体の混合塩基ＤＮＡのスペクトルである。
【図１】
0004564696.tif 000002
【図２】
0004564696.tif 000003
【図３】
0004564696.tif 000004
【図４Ａ】
0004564696.tif 000005
【図４Ｂ】
0004564696.tif 000006
【図４Ｃ】
0004564696.tif 000007
【図５】
0004564696.tif 000008
【図６Ａ】
0004564696.tif 000009
【図６Ｂ】
0004564696.tif 000010
【図６Ｃ】
0004564696.tif 000011
【図６Ｄ】
0004564696.tif 000012
【図７Ａ】
0004564696.tif 000013
【図７Ｂ】
0004564696.tif 000014
【図８Ａ】
0004564696.tif 000015
【図８Ｂ】
0004564696.tif 000016
【図８Ｃ】
0004564696.tif 000017
【図８Ｄ】
0004564696.tif 000018
【図９】
0004564696.tif 000019
【図１０Ａ】
0004564696.tif 000020
【図１０Ｂ】
0004564696.tif 000021
【図１１Ａ】
0004564696.tif 000022
【図１１Ｂ】
0004564696.tif 000023
【図１１Ｃ】
0004564696.tif 000024
【図１２】
0004564696.tif 000025
【図１３Ａ】
0004564696.tif 000026
【図１３Ｂ】
0004564696.tif 000027
【図１３Ｃ】
0004564696.tif 000028
【図１３Ｄ】
0004564696.tif 000029
【図１４Ａ】
0004564696.tif 000030
【図１４Ｂ】
0004564696.tif 000031
【図１５Ａ】
0004564696.tif 000032
【図１５Ｂ】
0004564696.tif 000033
【図１６】
0004564696.tif 000034