(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可視光に感光性の蛍光色素が入れられたびんであり、
該びんの少くとも側壁は、２００〜９００nmの光スペクトル放射に対する遮蔽を形成し、可視光放射の少くとも９５％をさえぎる構造を有し；
該びんは、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネートで形成されており、その容量は５０μＬ〜５０ｍＬであり；
該蛍光色素はフルオロセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒｃＰから選ばれるか、またはフィコエリスリン−シアニン７（ＰＣ７）、フィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５）およびフィコエリスリン−テキサスレッド（ＥＣＤもしくはＰＥＴＲ）タンデムの一部である、
びん。
【請求項２】
びんの底も可視光放射に対する遮蔽を形成する請求項１記載のびん。
【請求項３】
放射に対する遮蔽効果が静電粉末化による被覆により、スリーブでびんを覆うことにより、γ線放射によりある種のガラスを照射することにより、または注型成形により得られる請求項１もしくは２記載のびん。
【請求項４】
貯蔵の間に可視光に感光性の蛍光色素を保護する方法であり、該蛍光色素はフルオロセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒｃＰから選ばれるか、またはフィコエリスリン−シアニン７（ＰＣ７）、フィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５）およびフィコエリスリン−テキサスレッド（ＥＣＤもしくはＰＥＴＲ）タンデムの一部であり、該蛍光色素はびんの中に入れられ、該びんは、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネートで形成されており、その容量は５０μＬ〜５０ｍＬであり、その少くとも側壁は２００〜９００nmの間の光スペクトル放射に対して遮蔽を形成し、可視光放射の少くとも９５％をさえぎる構造を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は感光性染料のための新しい包装および細胞計測法（ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）のための試薬にもとづく蛍光色素の包装のための新しい方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
流動細胞計測法（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は何１０年間も多く使用されてきた細胞の分析法である。この方法は少くとも１つの蛍光色素を用いる。
【０００３】
それは抗原細胞分析において強力な道具である。この方法は蛍光色素へ接合された抗体の組合わせのおかげで同時にいくつかの抗原標的を分析することを可能にする。細胞計測法に用いられる主要な蛍光色素はフルオレセインイソシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒｃＰ、フィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５）、フィコエリスリン−シアニン７（ＰＣ７）およびフィコエリスリン−テキサスレッド（ＥＣＤもしくはＰＥＴＲ）タンデムである。これらの蛍光色素は細胞計測計で使用されるレーザーの主要な放出波長である、特に４８８nmおよび６３３nmで光放射を吸収する。ＰＣ５，ＰＣ７，ＥＣＤタンデムはエネルギー転移法則を使用する。すなわち、細胞計測計は、フィコエリスリンのスペクトル範囲の分子を励起し、フィコエリスリンはアクセプター分子（シアニン５、シアニン７もしくはテキサスレッド）により吸収されたエネルギーをもどし、アクセプター分子は放出波長における放射形態にそれをもどす。
【０００４】
それにもかかわらず、その染料タンデムは、全スペクトル範囲にわたって、特に可視光範囲（４００〜８００nm）で光を吸収し、そして出願人はこれらの蛍光色素が単独でもしくはタンデムで（ペアで）、貯蔵の間にかなりの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を受けることに気づいた。
【０００５】
この分解は５８０nmでフィコエリスリンの蛍光強度の増加を導くエネルギー転移効率の劣化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を誘起する。この現象はフィコエリスリン管（ｃａｎａｌ）（ＦＬ２）における蛍光の増加（消耗（ｌｏｓｓ）と呼ばれる）により細胞計測法で翻訳されるが、異なった問題をもたしうる：
−偽の陽性細胞の出現
−初期の蛍光強度値を回復するために補償を増加させる必要性
最後の点はコンピュータ化された自動補償システムの場合に特に重大である。
【０００６】
フィコエリスリン−アロフィコシアニンタンデムは約２０年前に記載され（ＧｌａｚｅｒらのＢｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９８３）８３，３８３〜３８６頁）、そしてフィコエリスリン−シアニン５タンデムは約１０年前に記載された（ＬａｎｉｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ（１９９１）Ｖｏｌ２  Ｎｏ．３，１９２〜１９９頁）。その後ずっと、この種の製品はＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ，ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ，ＤＡＫＯ，ＩＱＰ、もしくはＣＡＬＴＡＧ社により茶色もしくはコハク色のガラスびんで市販されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、延長された期間にわたって該蛍光色素の貯蔵を確保する蛍光色素のために利用しうる包装を有することが望ましい。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
いくつかの試験の後に、出願人はこれらの蛍光色素が可視光に感光性でありうるという仮説を提案した。そして出願人は可視光を吸収する熱収縮しうるスリーブで蛍光色素を含むびんの側壁を覆った。すると、非常に明らかな改良が観察されたが、それは十分に満足すべきものではなかった。そこで出願人は他の試験を開始したが、さらなる進展はみられなかった。
【０００９】
再びその検討を続けて、出願人は、驚くべきことに、次の事実を見出した。すなわち、スリーブをつけたびんの底は、びんが底を下にして置かれる代わりに側面を下にして取り扱われ、もしくはひっくり返されたときには、蛍光色素が分解するのを十分には保護されないことである。そして、出願人は、これらの蛍光色素は、２００〜９００nmの波長、特に可視光、特に４００〜７００nm、そして著しくは４００〜６００nmの波長に非常に感光性であることを理解した。
【００１０】
出願人によればタンデムの分解の源は誘起された光酸化現象であり、そこではその分子は光増感剤の役割を演じ、すなわち、それらは酸素を活性化しうる：
−一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）の発生で吸収された光エネルギーの移動により（いわゆるII型のメカニズム）、
−酸素化されたラジカルの発生で励起状態への電子移動により（いわゆるＩ型のメカニズム）。
【００１１】
本発明は、タンデム励起光放射、すなわち約２００〜９００nm、そして特に４００〜８００nm、に鈍い（ｏｐａｑｕｅ）びんの使用に関する。
【００１２】
それは、なぜ本発明が、２００〜９００nm、そして特に４００〜６００nmの波長に感光性の蛍光色素およびびんを含む包装に関し、そのびんの少くとも側壁が２００〜９００nmの光スペクトル放射に対して、特に４００〜８００nm、もっと好適には４００〜７００nm、特に４００〜６００nmの波長に対して、有効な遮蔽を形成し、その中に該蛍光色素が入れられるかの理由である。
【００１３】
本発明において、「可視光に感光性の蛍光色素」という用語は、その構造が述べられた波長における放出により分解される蛍光色素をいい、たとえばフルオロセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒｃＰ、フィコエリスリン−シアニン７（ＰＣ７）、フィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５）およびフィコエリスリン−テキサスレッド（ＥＣＤもしくはＰＥＴＲ）タンデム、好ましくは最後の２つである。「放射に対して有効な遮蔽を形成する」（“ｆｏｒｍｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ａｇａｉｓｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ”）という用語は、可視光放射の少くとも９５％、好ましくは少くとも９８％、特に９９％、そしてもっと好ましくは１００％が、びんの側壁により、その構造（自然、処理もしくはスリーブ）のためにさえぎられることを意味する。「びん」という用語は、小さいびんを意味し、好適にはねじぶた（ｓｃｒｅｗ−ｔｏｐｐｅｄ）を有し、隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）のある、もしくはない、栓（ｓｔｏｐｐｅｒ）を備える。そのびんはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートでつくられていてもよいが、好ましくはガラスである。その容量は好ましくは５０μＬ〜５０mL、特に１００μＬ〜２０mL、さらに特に５００μＬ〜１０mL、そしてもっと好ましくは１mL〜１０mLである。たとえば、５mLびんは１〜２mLの溶液により充填される。約５mLのガラスびんは特に好適である。
【００１４】
本発明の実施のための好適な条件下で、びんの底も可視スペクトル放射に対して有効な遮蔽を形成する。
【００１５】
びんを覆いもしくは被覆するために、香料製造技術において、可視スペクトル放射に対して有効な遮蔽を形成することは、美的な目的にも使用され、すでに知られている。
【００１６】
被覆されるべきびんにはめ込まれる電極により貫かれる隔壁を有するびんの周囲からなる静電粉砕（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｐｏｗｄｅｒｉｎｇ）による被覆が、たとえば挙げられうる。びんは粉砕された粉末を含む密閉空間内に置かれ、びんの空間で反対の態様に帯電される。ついで、粉末はびんに堆積され、たとえば、約１８０℃で炉において焼成することにより固定される。本発明の範囲内で、上述の波長、特に６００〜８００ｎｍ、特に黒もしくは青の色で好ましくはエポキシ樹脂吸収剤が、たとえば使用されうる。
【００１７】
さらにびんは、好ましくはびんの底を被覆した熱収縮可能なスリーブで被覆されうる。
【００１８】
いくつかの種類のガラスもγ線で照射されうる。
【００１９】
プラスチックフィルムを用いる注型成形も実施され得、びんの底を被覆することのできる利点を提供する。
【００２０】
本発明が係わる包装は非常に有用な性質を有する。上述のような被覆もしくは処理されたびんの使用は光誘起酸化の現象を抑制し、蛍光色素−抗体もしくはタンデム−抗体接合体に優れた安定性を与える。
【００２１】
これらの性質は以下に実験の部で示される。
【００２２】
さらに本発明は、上述以外の抗体−タンデム接合体ならびに流動細胞計測法で用いられるすべての蛍光色素に適用される。
【００２３】
さらに、本発明は可視光に、特に４００〜６００ｎｍで、貯蔵の間に感光性である蛍光色素を保護する方法に関し、そこで該蛍光色素はびん内におかれ、その少なくとも側壁は２００〜８００ｎｍ、特に４００〜７００ｎｍ、そして特に４００〜６００ｎｍ、の光スペクトル放射に対して有効な遮蔽を形成する。
【００２４】
さらに上述の包装の実施のための好適な条件は、上述の発明の他の目的に、特に蛍光色素保護方法に適用される。
【００２５】
【発明の実施の形態】
次の例は本願発明を例示する。
実施例１：エポキシ樹脂を用いるガラスびんの被覆
抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体を収容するように意図された、ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんが次の段階を用いる製造ラインに置かれる：
びんが洗浄される。
【００２６】
それらは乾燥オーブンを通過する。
【００２７】
それらは、ついでびんが電極により貫かれる隔壁で被覆される。
【００２８】
チャンバーにおいて粉末電極の電荷を反対の電荷を有するマットブラック（Ｍａｔｔｅ  ｂｌａｃｋ）ＡＫＺＯエポキシ樹脂粉末対照ＮＯＩＲ  ＭＡＴ  １Ｐ２００８３９１（新対照ＡＮ０５２）が、びんの表面に静電現象により付着され、ついで１８０℃で焼成炉を通過する。
実施例２：熱収縮可能なポリエチレンスリーブを用いるガラスびんの被覆
抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体を収容するように意図されたＩＯＴＥＳＴ範囲から市販の６ｍＬのＢｅｋｍａｎ  Ｃｏｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんの側部および首部がＳＬＥＥＶＥＲ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＯＩＯＮＡＬ社により市販された熱収縮可能なポリエチレンスリーブを用いて被覆された。
実施例３：抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体のＰＢＳ，２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，０.１％アジ化ナトリウム溶液で充填されたエポキシ樹脂で被覆されたガラスびんの製造。
【００２９】
実施例１により製造されたびんは抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体のリン酸塩／子ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）／０．１％  窒化ナトリウムバッファー溶液２ｍＬを充填された。
実施例４：抗−ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体
本発明方法の有効性を示すために、ＰＣ５およびＥＣＤに接合された抗ＣＤ３抗体を含む、市販および変更されたびんが米国食品医薬品局のＧＭＰに記載された方法による強制分解試験に供された。
【００３０】
異なる包装が試験された：
−ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｋ  びん
−Ｃｙｔｏｓｔａｔ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｋびん
−静電粉砕法によりエポキシワニス層で被覆されたＩＯＴＥＳＴから市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｋびん
−市販ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎびん抗体タンデム接合体を含むこれらのびんは蛍光管を備えたチャンバに導入され、１．２×１０６Ｌｕｘ．ｈ．の合計光照射に供された。
【００３１】
図１〜５は本発明を実施することによりびんの中味に与えられた優れた保護を示す。実際、静電粉砕法によりエポキシワニス層で被覆された、ＩＯＴＥＳＴ範囲からのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈに導入されたタンデムは照射されていない対照の自己蛍光と同一の、ＦＬ２蛍光を示す。一方、他のすべての種類のびんはＦＬ２の「消耗」（“ｌｏｓｓ”），すなわち偽の陽性細胞の出現による自己蛍光の増加、により翻訳される光への透過性を示す。
実施例５：抗ＣＤ１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体の試験
その方法は、抗ＣＤ１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体を用いることを除いて実施例４と同一の方法で実施される。結果は図６〜９に示される。その結果の分析は実施例４におけるのと同一の結論を導く。
【図面の簡単な説明】
【図１】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、対照として役に立つ、光から保護された接合体に関する。
【図２】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんに包装された接合体に関する。
【図３】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、Ｃｙｔｏｓｔａｔ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんに包装される接合体に関する。
【図４】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、市販ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎガラスびんに包装された接合合体に関する。
【図５】本発明によるびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ３−フィコエリスリン−シアニン５抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、実施例１の静電粉砕法によりエポキシワニス層で被覆された、ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｋガラスびんに包装された接合体に関する。
【図６】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ−１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、対照として役に立つ、光から保護された接合体に関する。
【図７】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ−１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんに包装された接合体に関する。
【図８】もとのびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ−１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、Ｃｙｔｏｓｔａｔ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈガラスびんに包装される接合体に関する。
【図９】本発明によるびん内に含まれ、そして光の作用を受けた抗ＣＤ−１９−フィコエリスリン−テキサスレッド抗体接合体の試料で得られた蛍光成績を示す。さらに詳しくは、実施例１の静電粉砕法によりエポキシワニス層で被覆された、ＩＯＴＥＳＴ範囲からの市販Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｋガラスびんに包装された接合体に関する。
【図１】
0004421154.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004421154.tif 000008
【図８】
0004421154.tif 000009
【図９】
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