(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体を同定するための方法であって、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析して該ＣＡＧ反復領域内のＣＡＧ反復を検出するステップを含んでなり、
単離された脊髄小脳性運動失調７型遺伝子は、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体は前記ＣＡＧ反復領域内に少なくとも３０のＣＡＧ反復を有する、方法。
【請求項２】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体が前記ＣＡＧ反復領域内に少なくとも３７のＣＡＧ反復を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体が前記ＣＡＧ反復配列内に少なくとも３８のＣＡＧ反復を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分析するステップが、脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に位置したＣＡＧ反復領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ鎖反応を行うステップと、前記ＣＡＧ反復領域を含む増幅されたＤＮＡフラグメントを検出するステップとを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１６ヌクレオチドを有するとともに、
配列番号：１に記載の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、及び
配列番号：１に記載の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号：５及び配列番号：６に記載される配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１６ヌクレオチドを有するとともに、配列番号：２に記載の配列のヌクレオチド１〜１００２に相当する領域である配列番号：１３に記載の領域、及び配列番号：２に記載の配列のヌクレオチド１０３３〜１８６４に相当する領域である配列番号：１４に記載の領域から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項１の方法に従って、個体が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があるか否かを検出するためのキットであって、請求項５に従い選択されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項９】
ＳＣＡ７遺伝子の影響をうけた対立遺伝子内に位置したＤＮＡ分子の存在を検出するための方法であって、
（ａ）ＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含むＤＮＡ分子であって、配列番号：９の配列又は配列番号：１０の配列を含んでなるＤＮＡ分子の離れた相補鎖を、過剰なモル量の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて処理するステップと、
（ｂ）前記ＣＡＧ反復領域を含む要求される分子を合成するためのテンプレートとして機能する相補性プライマー伸長産物を形成するために前記オリゴヌクレオチドを伸長させるステップと、
（ｃ）増幅された分子を検出するステップと、
（ｄ）ＳＣＡ７異常の特性を示すＣＡＧ反復領域について前記増幅されたＤＮＡ分子を分析するステップとを含んでなり、
ＳＣＡ７異常の特性を示すＣＡＧ反復領域は、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３０である）である、方法。
【請求項１０】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３８である）について分析することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３７である）について分析することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３０である）について分析することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含むＤＮＡ分子の存在を検出するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡフラグメントを得るために制限エンドヌクレアーゼでゲノムＤＮＡを消化するステップと、
（ｂ）少なくとも１１ヌクレオチドを有する単離されたＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含む核酸分子にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用い、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で、前記ＤＮＡフラグメントをプローブするステップと、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブＤＮＡを検出するステップとを含んでなり、
単離されたＳＣＡ７遺伝子は、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
前記正常な形態は（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは１９未満である）であり、
前記影響を受けた形態は（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは３０超である）である、方法。
【請求項１４】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも１５である）について分析することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも５である）について分析することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３８である）について分析することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３７である）について分析することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析するステップが、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは少なくとも３０である）について分析することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１に記載の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は
配列番号：１に記載の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
個体が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険があるか否かを決定するための方法であって、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析するステップを含んでなるとともに、
単離された脊髄小脳性運動失調７型遺伝子は、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のない個体が前記ＣＡＧ反復領域内に１９未満のＣＡＧ反復を有する、方法。
【請求項２１】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のない個体が前記ＣＡＧ反復領域内に１５未満のＣＡＧ反復を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のない個体が前記ＣＡＧ反復領域内に５未満のＣＡＧ反復を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体を同定するための方法であって、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析して前記ＣＡＧ反復領域内のＣＡＧ反復を検出するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体は前記ＣＡＧ反復領域内に少なくとも３０のＣＡＧ反復を有し、
前記検出ステップが、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に存在するＣＡＧ反復領域を増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程と、
ＣＡＧ反復領域を含有する増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とを含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、方法。
【請求項２４】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体を同定するための方法であって、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析して前記ＣＡＧ反復領域内のＣＡＧ反復を検出するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体は前記ＣＡＧ反復領域内に少なくとも３０のＣＡＧ反復を有し、
前記検出ステップが、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に存在するＣＡＧ反復領域を増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程と、
ＣＡＧ反復領域を含有する増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とを含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：６の配列を有するオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項２５】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体を同定するための方法であって、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析して前記ＣＡＧ反復領域内のＣＡＧ反復を検出するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体は前記ＣＡＧ反復領域内に少なくとも３０のＣＡＧ反復を有し、
前記検出ステップが、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に存在するＣＡＧ反復領域を増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程と、
ＣＡＧ反復領域を含有する増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程とを含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域と、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域とを含んでなる、方法。
【請求項２６】
個体が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があるか否かを検出するためのキットであって、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択されるオリゴヌクレオチドを、プライマーとして含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、前記患者が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があることを示す、キット。
【請求項２７】
ＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含有するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、
ａ）ＤＮＡフラグメントを得るために制限エンドヌクレアーゼでゲノムＤＮＡを消化するステップと、
ｂ）少なくとも１１ヌクレオチドを有する単離されたＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含む核酸分子にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用い、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で、前記ＤＮＡフラグメントをプローブするステップと、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブＤＮＡを検出するステップと、
（ｄ）ＳＣＡ７遺伝子の正常な形態及び影響を受けた形態の特性を示すＣＡＧ反復領域について前記オリゴヌクレオチドを分析するステップとを含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択され、
前記正常な形態は（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは１９未満である）であり、
前記影響を受けた形態は（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは３０超である）である、方法。
【請求項２８】
ヒトにおける拡大したトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するための方法であって、
前記ヒトの核酸サンプル中の脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域における拡大したトリヌクレオチド反復の存在を決定することを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
前記拡大したＣＡＧ反復領域が、（ＣＡＧ）n領域（ここでｎは３０以上である）を含んでなる、方法。
【請求項２９】
拡大したトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸を増幅し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
拡大したトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５及び配列番号：６を含んでなる、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
ヒトの患者における多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するための方法であって、
前記患者の核酸サンプル中の脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域における多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在を決定することを含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、前記患者が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があることを示し、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなる、方法。
【請求項３５】
多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸を増幅し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
多様な形態のＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、反復拡大検出（ＲＥＤ）アッセイにより行なわれる、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列及び配列番号：６の配列を含んでなる、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
ヒトが脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があるか否かを検出するための方法であって、
前記ヒトの核酸サンプルをアッセイして、脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域における拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在を決定することを含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、前記患者が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険性があることを示し、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなる、方法。
【請求項４２】
ｎが３７以上である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ｎが３８以上である、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記アッセイが、反復拡大検出（ＲＥＤ）アッセイ、プローブハイブリダイゼーション、直接配列決定、制限酵素断片分析、及び断片電気泳動運動性からなる群より選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイが、
ａ）ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記核酸の標的部位を増幅するステップ、及び、
ｂ）得られた増幅産物のヌクレオチド配列における拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するステップ
を含んでなる、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
単離された脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が配列番号：９の配列を含んでなる、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
単離された脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が配列番号：１０の配列を含んでなる、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
前記標的領域が適切なオリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応により増幅される、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列及び配列番号：６の配列である、請求項４１記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項５２】
ヒトが脊髄小脳性運動失調７型について陰性か否かを決定するための方法であって、
ａ）脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域におけるＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記ヒトの核酸試料を増幅し、増幅産物を得るステップと、
ｂ）前記増幅産物中における拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するステップとを含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは１９未満である）を有するＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、前記ヒトが脊髄小脳性運動失調７型について陰性であることを示し、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなる、方法。
【請求項５３】
ｎが１５未満である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ｎが５未満である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に正常なＣＡＧトリヌクレオチド反復を有するヒトを同定するための方法であって、
前記ヒトの核酸試料中の脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域におけるＣＡＧトリヌクレオチド反復領域を分析するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子中の正常なＣＡＧトリヌクレオチド反復は、配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは１９未満である）を有する、方法。
【請求項５６】
ヒトの患者が脊髄小脳性運動失調７型を有するか否かを同定するための方法であって、
前記ヒトの核酸試料中の脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域における拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するステップ、及び、
前記ヒト患者が未知の病因の失調症を有するか否かを決定するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、脊髄小脳性運動失調７型であることを示す、方法。
【請求項５７】
ｎが３７以上である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ｎが３８以上である、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、反復拡大検出（ＲＥＤ）アッセイ、プローブハイブリダイゼーション、直接配列決定、制限酵素断片分析、及び断片電気泳動運動性からなる群より選択されるアッセイにより行なわれる、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸を増幅し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列及び配列番号：６の配列である、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
ヒトが脊髄小脳性運動失調７型であるか否かを決定するための方法であって、
前記ヒトの核酸試料中の脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域エクソンＩにおける拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在又は不在を決定するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在が、脊髄小脳性運動失調７型になる傾向が高いことを示す、方法。
【請求項６６】
ｎが３７以上である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
ｎが３８以上である、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する核酸を増幅し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の存在の決定が、拡大したトリヌクレオチド反復を含有する核酸領域を特異的に増幅する一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ＣＡＧトリヌクレオチド反復を含有する増幅産物を検出することにより行なわれる、請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列及び配列番号：６の配列である、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
ヒトにおける脊髄小脳性運動失調７型を検出するための方法であって、
ａ）前記ヒト由来の核酸を、脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域におけるＣＡＧトリヌクレオチドを含有する核酸領域を増幅するオリゴヌクレオチドと接触させるステップ、及び、
ｂ）拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復領域を含んでなる増幅産物を検出するステップを含んでなり、
脊髄小脳性運動失調７型遺伝子が、配列番号：９のヌクレオチド配列又は配列番号：１０のヌクレオチド配列を含んでなり、
配列（ＣＡＧ）n（ここでｎは３０以上である）を有する拡大したＣＡＧトリヌクレオチド反復の検出が、前記ヒトにおける脊髄小脳性運動失調７型を示す、方法。
【請求項７４】
前記オリゴヌクレオチドが、
配列番号：１の配列由来の配列番号：９に記載の領域であるＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧに相当する領域、又は、
配列番号：１の配列由来の配列番号：１０に記載の領域であるＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡに相当する領域
から選択される、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：５の配列及び配列番号：６の配列である、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：２の配列の塩基１から１００２に由来する配列番号：１３の配列に対応する領域、及び、配列番号：２の配列の塩基１０３３から１８６４に由来する配列番号：１４の配列に対応する領域から選択される、請求項７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
トリヌクレオチド反復拡大物は、次第に増加する病気、例えば脆Ｘ精神遅滞、脊髄延髄筋萎縮、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、ハンティングトン病（ＨＤ）、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）１，２，３及び６型、歯状核赤核パルリドルイシアン萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ  ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎａｔｒｏｐｈｙ）及びフリートライヒ運動失調の原因となる変異メカニズムであることが示されている。これらの病気のほとんどの顕著な特徴は、予兆の存在、又は始まりの年齢の早期化及び第１世代から次の世代に移る時に不安定なトリヌクレオチド反復領域が長くなる傾向があることによる引き続く世代における病気の激しさの増加である（Ｗａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，１３７４〜１３７５（１９９６））。
【０００２】
【従来の技術】
１９９３年に、Ｓｃｈａｌｌｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４，１３５〜１３９（１９９３））は、反復拡大検出（ＲＥＤ）アッセイを開発した。ＲＥＤは染色体の位置又は隣接するＤＮＡ配列の予備知識なしに潜在的な病原性のトリヌクレオチド反復拡大物を検出するエレガントな技術である。ヒトゲノムＤＮＡは、拡大したトリヌクレオチド配列がゲノム内に存在する時に配列特異的〔（ＣＡＧ）n ，（ＣＧＧ）n 等〕オリゴヌクレオチドマルチマーを作り出す２ステップ連結サイクル方法のためのテンプレートとして用いられる。そのアッセイは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）及び脆Ｘ症候群の患者からのゲノムＤＮＡ中に存在する極めて大きなトリヌクレオチド反復拡大物（２，０００反復まで）を検出するためにもとは開発された。この時から、Ｌｉｎｄｂｌａｄらは、ＳＣＡ１，ＳＣＡ３，ＨＤ、及びＳＢＭＡについての病原性の大きさの範囲（４０〜１００のＣＡＧ反復）のより小さなトリヌクレオチド反復を検出するためにその手順を改良した（Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１２４（１９９４）Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６））。
【０００３】
この改良されたアッセイは、ＳＣＡ７（Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６）、双極性情動障害（Ｏｒｕｃ，Ｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６０，７３２〜７３５（１９９７）及び精神分裂症（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，ＤＭら、Ｎｅｕｌｏｌｏｇｙ，４７，（１９９６））のような病気におけるＣＡＧ反復拡大物の関連を示唆する相互関係を確立するのに用いられている。
【０００４】
脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡｓ）は、小脳皮質の神経の進行性の退縮を特徴とする神経系の進行性退縮性神経病である。退縮は、深い小脳核、脳幹及び脊髄においても見られる。臨床的には、病気にかかった個体は激しい失調及び構語障害を、並びにかなりの程度の運動障害及び神経障害を患う。その病気は、通常、完全な無能状態となり、最終的には症状開始後１０〜３０年で死ぬ。ＳＣＡ１，２，３及び６型についての遺伝子が同定されている。それら全ては、反復領域が拡大された時に病気を引きおこすＣＡＧ  ＤＮＡ反復を含む。ＣＡＧ反復拡大及びポリグルタミン領域の伸長は神経退縮に関する。ＳＣＡ７遺伝子の同定は、新しいタンパク系システムにおいてこの現象を研究するための機会を供するであろう。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
運動失調遺伝子を同定する重要性は、病気の個体の診断のための改良された方法を供し、出生前／予兆的診断又は運動失調のより優れた分類の可能性を増加させる。現在同定されている他のＳＣＡ遺伝子を含むコード化領域内の反復拡大物に関連する遺伝子のほとんどは周知の遺伝子と相同性を示さない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体及び危険のない個体を同定するための方法に関する。これらの方法は、脊髄小脳性運動失調７型遺伝子のＣＡＧ反復領域を分析するステップであって、脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体が、典型的には少くとも約３０、より典型的には少くとも約３７、そして更により典型的には少くとも約３８のＣＡＧ反復を有する。危険性のないヒトは典型的には約１９未満、より典型的には約１５未満、そして更により典型的には約５未満のＣＡＧ反復を有する。その方法は、脊髄小脳性運動失調７型遺伝子内に位置したＣＡＧ反復領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーでのポリメラーゼ鎖反応を行い、そのＣＡＧ反復領域を含む増幅されたＤＮＡフラグメントを検出するステップを含む。そのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：９のヌクレオチド領域及び配列番号：１０の領域から選択される。好ましいオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：５及び配列番号：６である。
【０００７】
脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある固体を同定するための方法は、単離されたＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含む核酸分子を検出するため、制限エンドヌクレアーゼで消化したゲノムＤＮＡをプロービングし、そのＤＮＡフラグメントを、検出可能に標識されたプローブでハイブリダイズ条件下でプロービングすることにより、ＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含むＤＮＡ分子の存在を検出することも含み得る。
【０００８】
本発明は、ヒトＳＣＡ７タンパク質をコードする単離された核酸及びその一部、並びに該核酸配列によりコードされる単離されたタンパク質及びその一部を提供する。本発明は、本発明の核酸を含む単離されたＤＮＡフラグメント、ベクター及び単離された組換えベクター、前記ＳＣＡ７核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー、ＳＣＡ７又はそのフラグメントで形質転換され又はそれが移入された宿主細胞、ＳＣＡ７核酸の全部又は一部によりコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物、生物サンプルを用いて抗体−抗原複合体を形成することを含むＳＣＡ７異常を検出するための方法、並びにＳＣＡ７タンパク質を発現するモデルシステムにも関する。
【０００９】
本発明は、個体が脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険があるか否かを検出するためのキットを提供する。１つの好ましいキットは、配列番号：９の核酸領域及び配列番号：１０の領域から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の他の態様において、本発明は、拡大した反復を含む個々のクローンのＲｅｐｅａｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｏｏｌｅｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎの方法（ＲＡＰＩＤクローニング）を用いる、少量のゲノムＤＮＡから直接、拡大した反復及び対応する隣接ヌクレオチド配列を迅速に同定及び単離するための方法に関する。その方法は、ＤＮＡフラグメントの集団を分画し、拡大した反復を含む画分を検出し、拡大した反復を含むＤＮＡの画分内に含まれるＤＮＡフラグメントをクローニングし、そして拡大した反復を含むクローンを同定するステップを含む。その分画ステップは、ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化してＤＮＡフラグメントを得て、ゲル電気泳動でそのＤＮＡフラグメントを分離し、大きさに基づいて画分に分け、そして各々の大きさの画分内の拡大した反復の存在を検出することを含み得る。次に拡大した反復に隣接するヌクレオチド配列を決定し、特定の反復が所定の病気と関連するか否かを決定するためにＰＣＲアッセイをデザインするのに用いることができる。
【００１０】
本発明は、変性温度からの温度変化の速度を減少させ、そして連結緩衝液がホルムアミドを含む反復拡大検出アッセイの改良型にも関する。好ましくは、変性温度の温度変化の速度は一度当り２秒に減少させ、連結緩衝液は４％ホルムアミドを含む。
【００１１】
【発明の実施の形態】
遺伝性失調は、小脳及び小脳の経路の疾患又は病気をもたらす種々のバランスの異常を全て特徴とする神経退縮性の異常の複雑なグループである。これらの疾患の多くにおいて、機能不全又は構造上の異常が小脳に達し、基底神経節機能、眼の運動の異常及び神経病に関連し得る。脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）の遺伝子的基礎を決定するために実質的な努力が払われている。全てが反復か拡大した時に病気に関連するＣＡＧ  ＤＮＡ反復を含むが、その神経退縮を導くメカニズムは未知である。更に、一つのＳＣＡ系統内での高い表現型変化性は異なる形態の失調症の臨床的分類を困難にしている。
【００１２】
ＳＣＡ７型についての遺伝子は同定され、単離されている、ＳＣＡ７遺伝子の単離は１つの型の脊髄小脳性運動失調の容易な診断を可能にする。診断は、病気の家系的歴史がない場合の個体の同定を含む、失調症の危険のある個体の症状発症前の同定であり得る。
本発明の１つの態様において、拡大した反復を有する遺伝子を同定するための方法が供される。本明細書に用いる場合、“拡大した反復”又は“反復拡大物”とは、核酸の単一の短い反復単位をいう。反復ユニットは、典型的には２〜８ヌクレオチドの間であり得る。これらの反復は、正確に機能するポリペプチドをコードする遺伝子のコード化配列中に存在し得る。いくつかの個体において、反復の数は増加又は拡大し、その拡大した反復を含む遺伝子の翻訳は、病気を引きおこすポリペプチドを生じ得る。反復は、連続的反復の数が病気に関連する場合に拡大した反復であると考えられる。拡大した反復は、例えば２ヌクレオチド（ジヌクレオチド反復）、３ヌクレオチド（トリヌクレオチド反復）等、及び８ヌクレオチドまでの反復を含む。
【００１３】
拡大した反復を含むいずれかの遺伝子をこの方法により同定することができる。好ましくは、この方法により同定される遺伝子は、トリヌクレオチド反復、例えばＳＣＡ１，２，３，６及び７型についての遺伝子を含むであろう。異なるオリゴヌクレオチドの利用により１０の潜在的なトリヌクレオチド反復のいずれかを検出することができる（Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１２４（１９９４））。好ましくは、ＣＡＧ反復が同定される。好ましくは、ＣＡＧ反復はＳＣＡ７遺伝子又は配列番号：３のヌクレオチドを含む遺伝子中に存在する。この方法は、最初に、反復拡大検出アッセイを最適化し、拡大したＣＡＧ反復を含むＤＮＡ及び隣接ＤＮＡを豊富にし、単離するための方法を提供する。好ましくは、ＣＡＧ反復の数は２０超である。より好ましくはＣＡＧ反復の数は３０超である。
【００１４】
拡大した反復を検出するための１つの方法は、反復拡大検出（ＲＥＤ）アッセイである。ＲＥＤ分析は、これらの患者集団のいくつかに基づいて行われており、トリヌクレオチド拡大物と病気との間の相関関係を報告している。しかしながら、所定のゲノムＤＮＡ対照テンプレートでのＲＥＤ分析は矛盾した結果を生じ、典型的にはゲノムサンプル内で最も大きな周知のＣＡＧ拡大物と相関しない。ＲＥＤ分析の他の制限は、新規のトリヌクレオチド拡大物を検出することができるが、ＲＥＤのみでは拡大した反復が病気を引きおこすのか単に一般的集団内で見い出されたいくつかのバックグラウンド反復拡大物の１つであるのかを直接決定できないことである。結果として、病気関係における潜在的な病原性変異としての拡大したトリヌクレオチド反復の役割は結論として確認されなければならない。このことは、これらの集団内に存在する拡大物の単離及び拡大したトリヌクレオチド反復が病気に関連するか否かを評価するための詳細なＰＣＲ分析を要求する。
【００１５】
Ａ．トリヌクレオチド反復拡大物及び診断の方法。
病気に関連するトリヌクレオチド反復拡大物を同定するための改良された方法の同定はその病気の改良された診断を許容する。これにより、本発明は、トリヌクレオチド反復拡大物により引きおこされる病気を進展させる危険のある固体を診断する方法に関する。本発明は、危険のない個体を診断する方法にも関する。これらの診断法は、遺伝子のトリヌクレオチド反復領域を分析することにより、脊髄小脳性運動失調１，２，３，６及び７型を進展させる危険のある個体を同定するのに用いることができる。好ましくは、ＣＡＧ反復が同定される。好ましくは、ＣＡＧ反復はＳＣＡ７遺伝子内に存在する、脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のない個体のＳＣＡ７遺伝子は、典型的には約１９未満、より典型的には約１５未満、更により典型的には約５未満のＣＡＧ反復を含む。脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体のＳＣＡ７遺伝子は、典型的には少くとも約３０、より典型的には少くとも約３７そしてより典型的には少くとも約３８のＣＡＧ反復を含む。
【００１６】
これらの診断法は、ＤＮＡの特定のフラグメントを検出するためのいずれかの周知の方法に関連し得る。これらの方法は、ＤＮＡの直接的検出又は例えばＲＮＡ又はタンパク質の検出による間接的な検出を含み得る。例えばＲＥＤ分析を用いることができる。あるいは、標識されたプローブを用いるサザン又はノーザンブロッティングハイブリダイゼーションを用いることができる。トリヌクレオチド反復拡大物を含む遺伝子のＣＡＧ反復領域を増幅する新規のプライマーと共にＲＣＲ技術を用いることができる。トリヌクレオチド反復の数を決定する直接的方法として核酸配列決定を用いることもできる。
【００１７】
本明細書に用いる場合、“ハイブリダイズ”、“ハイブリダイズする”及び“ハイブリダイゼーション”とは、オリゴヌクレオチドが標準条件下でストリンジェンシー標的核酸分子と非共有結合を形成することを意味する。ハイブリダイズ性オリゴヌクレオチドは、非共有結合の形成妨害しない非ハイブリダイズ性ヌクレオチド、例えばクローニングを容易にするための制限酵素認識部位を含み得る。
【００１８】
ＳＣＡ７についての遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩでの候補領域の消化により生産される１．８６kbフラグメント内に位置した高度に多様な形態のＣＡＧ反復を含む。ＣＡＧ反復領域は、好ましくは、コード化領域内にあり、ポリグルタミンをコードする。このＣＡＧ反復配列の領域は不安定であり、ＳＣＡ７のある個体で拡大する。（ＣＡＧ）n 反復のＰＣＲ分析は、例えば反復拡大物の大きさとＳＣＡ７の開始年齢及び病気の激しさとの間の相関関係を証明する。即ち、より多くの反復ユニット（又はより長い反復領域）を有する個体は早い症状開始年齢及びより激しい病気過程の両方を有する傾向がある。これらの結果は、ＳＣＡ７は、ＳＣＡ１関連の遺伝子性失調、脆Ｘ症候群、筋緊張性ジストロフィー、Ｘ関連脊髄延髄筋運動失調、及びハンティングトン病のように、不安定なトリヌクレオチド反復の拡大に関連する変異メカニズムを示す。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ＳＣＡ７遺伝子の影響を受けた対立遺伝子のＤＮＡセグメントを同定するためのＤＮＡプローブを用いることができる。ＤＮＡプローブは、同定しようとする遺伝子由来の相補的一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズし又は非共有結合するであろう標識された一本鎖ＤＮＡのセグメントである。そのプローブは、放射性及び非放射性ラベルを含む、当業者に周知のいずれかの適切なラベルで標識することができる。典型的な放射性標識は、32Ｐ， 125Ｉ，35Ｓ等を含む。非放射性標識は、例えばリガンド、例えばビオチン又はジゴキシゲニン及び酵素、例えばホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、又は種々の化学発光体、例えばルシフェリン、又は蛍光化合物、例えばフルオレセイン及びその誘導体を含む。そのプローブは、分離の容易のため、異なる型のラベルで両端に標識することもでき、例えば一端でアイソトープラベル及び他方の端でビオチンラベルを用いることにより標識することができる。
本発明は、ＣＡＧ反復領域を含むＤＮＡ分子の存在を検出するための方法であって、ゲノムＤＮＡのサンプルを制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして生じたＤＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドプローブでプロービングする方法に関する。ＤＮＡプローブ分析を用いて、標的ＤＮＡは、酵素消化、分画、及びゲノムＤＮＡの変性により得て、ＳＣＡ７座を含む第３染色体の短腕からのＤＮＡを含む多くの異なる遺伝子からのＤＮＡを組み込む複合混合物を生成することができる。特異的ＤＮＡ遺伝子プローブはその標的遺伝子又は遺伝子フラグメント由来のＤＮＡのみとハイブリダイズであろう。そして生じた複合体は、当該技術で周知の技術により単離して同定することができる。一実施形態において、本方法は、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメントを得て、そのフラグメントを、ハイブリダイズ条件下で、少くとも約１１ヌクレオチドを有する単離されたＳＣＡ７遺伝子のＣＡＧ反復領域を含む核酸分子とハイブリダイズする検出可能な標識された遺伝子プローブでプロービングし、そのＤＮＡフラグメントとハイブリダイズしたプローブＤＮＡを検出し、そしてＳＣＡ７遺伝子の正常の又は影響を受けた形態の特徴であるＣＡＧ反復領域についてＤＮＡフラグメントを分析することに関する。
【００２０】
プローブは、ＣＡＧ反復トリヌクレオチドに隣接するＤＮＡ配列の領域にハイブリダイズすることができ、そして任意に、ＣＡＧ反復をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズする合成又は天然のオリゴヌクレオチドである。好ましくは、そのプローブは、第３染色体の短腕のＳＣＡ７座にハイブリダイズする。そのプローブは、（ＣＡＧ）n 領域を有するＳＣＡ７遺伝子のフラグメント（好ましくは、１．８６kb  ＥｃｏＲＩフラグメント）の影響を受け又は正常な対立遺伝子の鎖の一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。そのプローブ配列は、少くとも約１１ヌクレオチド、好ましくは少くとも１５ヌクレオチドで約３５以下のヌクレオチドを有する。そのプローブは、そのヌクレオチド配列が（ＣＡＧ）n 領域に直接隣接したものを含む（ＣＡＧ）n 領域の５’約１０００ヌクレオチド以内の影響を受けた又は正常な対立遺伝子の鎖の一部と実質的に相補的であるように選択される。あるいは、そのプローブは、ヌクレオチド配列が、（ＣＡＧ）n 領域に直接隣接したものを含む（ＣＡＧ）n 領域の３’約８００ヌクレオチド以内の影響を受けた又は正常な対立遺伝子の鎖の一部に実質的に相補的であるように選択される。そのプローブは、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１３又は配列番号：１４からの少くとも１５ヌクレオチドも含み得る。
【００２１】
一般に、ＳＣＡ７遺伝子内に位置したＤＮＡ配列の存在を検出するために、ゲノムＤＮＡはＤＮＡフラグメントを得るために制限エンドヌクレアーゼで消化される。テストされるべきゲノムＤＮＡのソースは、ＤＮＡを含むいずれかの生物試料であり得る。例には、血液、精液、膣ふき取り物、組織、髪、及び体液の試料を含む。制限エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡのフラグメントにゲノムＤＮＡを切断するであろういずれかのものであり得る。多数のエンドヌクレアーゼの特異性は公知であり、種々の出版物、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）において見い出すことができる。好ましい制限エンドヌクレアーゼ酵素は、ＥｃｏＲＩ，ＴａｑＩ、及びＢｓｌＮＩを含む。ＥｃｏＲＩが特に好ましい。
【００２２】
病気の診断は他に、新規のプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応配列増幅法（ＰＣＲ）の使用に関する。米国特許第４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７年７月２８日発行）は、核酸配列を増幅し、検出し及び／又はクローン化するための方法を記載する。この方法は、抽されたＤＮＡを処理して一本鎖相補鎖を形成し、その分離したＤＮＡの相補鎖を過剰モルの２つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、それらプライマーを伸長して要求される核酸分子を合成するためのテンプレートとして機能する相補伸長産物を形成し、その増幅されたＤＮＡ分子を検出し、そしてＳＣＡ７異常を特徴とするＣＡＧ反復領域のための増幅された分子を分析することを含む。より詳しくは、プライマーでＤＮＡを処理し、プライマーを伸長させる方法ステップは、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを加えるステップであって、その対の一方のプライマーはセンス鎖内の配列の一部と実質的に相補的であり、その各々の対の他方のプライマーは相補的アンチセンス鎖内で同じ配列の異なる部分と実質的に相補的であるステップと；それら対のプライマーをその相補性分子にアニーリングするステップと；各々のプライマーの３’末端からそのアニーリングしたプライマーを同時に伸長させて各々のプライマーにアニーリングした鎖に相補的な伸長産物を合成するステップであって、前記相補物からの分離の後の前記伸長産物が各々の対の他方のプライマーのための伸長産物の合成のためのテンプレートとして機能するステップと；該テンプレートから前記伸長産物を分離して一本鎖分子を作り出すステップと、を含む。その方法のバリエーションは、米国特許第４，６８３，１９４（Ｓａｉｋｉら、１９８７年７月２８日発行）に記載される。ポリメラーゼ鎖反応配列増幅法は、Ｓａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０〜１３５４（１９８５））及びＳｃｈａｒｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４，１６３〜１６６（１９８６））によっても記載される。
【００２３】
本明細書に用いる場合、用語“増幅されたＤＮＡ分子”及び“増幅されたＤＮＡフラグメント”とは、ＤＮＡの一部の複製であるＤＮＡ分子及びその相補配列をいう。それら複製はヌクレオチド配列内でもとのＤＮＡ配列及びその相補配列に対応する。本明細書に用いる用語“相補物”及び“相補的”とは、特定のＤＮＡ配列に相補的である（６５％超の相同性を有する）ＤＮＡ配列をいう。本明細書に用いる用語“プライマー対”とは、増幅されるべきＤＮＡ分子の５’端とハイブリダイズする５’上流プライマー及び増幅されるべき分子の３’端の相補物とハイブリダイズする３’下流プライマーを含む一セットのプライマーを意味する。
【００２４】
プライマーは、第３染色体の短腕のＳＣＡ７座のＣＡＧ反復トリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の領域に相補的である産物の合成開始の点として機能することができる合成又は天然のオリゴヌクレオチドである。プライマーは、（ＣＡＧ）n 領域を有するＳＣＡ７遺伝子のフラグメント（好ましくは１．８６kb  ＥｃｏＲＩフラグメント）の影響を受けた又は正常の対立遺伝子の鎖の一部分に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。そのプライマー配列は少くとも約１１ヌクレオチド、好ましくは少くとも約１６ヌクレオチド、そして約３５以下のヌクレオチドを有する。プライマーは、それらが約７０〜３５０塩基対、好ましくは約１００〜３００塩基対の主な産物を作り出すように選択される。より好ましくは、プライマーは、ヌクレオチド配列が（ＣＡＧ）n 領域に直接隣接したものを含む（ＣＡＧ）n 領域のいずれかの側上の約１５０ヌクレオチド以内の影響を受けた又は正常な対立遺伝子の鎖の一部分に実質的に相補的であるように選択される。
【００２５】
本発明は、ＳＣＡ７のＣＡＧ反復領域に隣接する保存された領域を開示する。ポリメラーゼ鎖反応増幅に適したオリゴヌクレオチドは、ＣＡＧ反復領域に対して５’及び３’の両方のＣＡＧ反復領域に隣接する領域から選択することができる。オリゴヌクレオチドプライマーをそれから選択することができるＳＣＡ７遺伝子の領域は、配列番号：９及び配列番号：１０のヌクレオチドからのものである。好ましいプライマーは配列番号：５及び配列番号：６である。このプライマーセットは、ＰＣＲ技術を用いて関心のＣＡＧ反復ユニットを上手く増幅する。これらのオリゴヌクレオチドは脊髄小脳性運動失調を有すると予想される個体からとったＤＮＡからのＳＣＡ７遺伝子からのＣＡＧ反復領域を増幅するのに役立つ。オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１３及び配列番号：１４のヌクレオチドからも選択することができる。その増幅されたフラグメントは、ＣＡＧ反復領域の長さを検出するためにゲルに流すことができる。脊髄小脳性運動失調７型を進展させる危険のある個体は、典型的には、少くとも約３０、より典型的には少くとも約３７、そして更により典型的には少くとも約３８のＣＡＧ反復を有する。危険のないヒトは、典型的には、約１９未満、より典型的には約１５未満、そして更により典型的には約５未満のＣＡＧ反復を有する。あるいは、プライマー対は、ＳＣＡ７遺伝子を配列決定するために種々の周知の技術に用いることができる。
【００２６】
本発明は、個体が、拡大した反復に関連する病気を進展させる危険があるか否かを検出するためのキットにも関する。個体が拡大した反復に関連する病気を進展させる危険があるか否かを検出するためのキットに用いられる方法は、本明細書に開示される拡大した反復を検出するための全ての方法を含む。好ましくは、検出される拡大した反復はＣＡＧである。好ましくは、ＣＡＧ反復はＳＣＡ７遺伝子内に存在する。
【００２７】
先に言及されるように、診断の他の方法を更に用いることができる。それらは、ゲノムＤＮＡの反復領域（ＣＡＧ反復領域）、ｃＤＮＡ（ＣＡＧ反復領域）、ｍＲＮＡ（ＣＡＧ反復領域）、及びタンパク質産物（グルタミン反復領域）の単離及び同定に基づき得る。これらは、例えば、ＳＣＡ７遺伝子のヌクレオチド配列内でわずかな変化を検出するための種々の電気泳動技術を用いることを含む。更なる非限定的例は、変性勾配電気泳動、一本鎖コンホメーショナル多形性ゲル、及び非変性ゲル電気泳動技術を含む。
【００２８】
ＳＣＡ７遺伝子のマッピング及びクローニングにより単純な血液テストを用いて優性遺伝の失調の１つの型の信頼できる診断を行うことができる。これは、優先の失調症の確かな分子分類に対する第１のステップを供する。失調症のための簡単かつ信頼できる分類システムは、臨床的症状がその病気のＳＣＡ７及び非ＳＣＡ７形態の間を付加的にオーバーラップするので重要である。更に、唯一周知のＳＣＡ７変異についての分子テストは、周知のＳＣＡ７ファミリーにおける病気の発症前診断を許容し、病気の家系的歴史がない場合の散発性の又は単離されたＣＡＧ反復拡大物の同定を許容する。これにより、本発明は、ファミリーカウンセリング、計画的医療処置、及び未知の病因の失調症の患者の標準的な精密検査に用いることができる。
【００２９】
Ｂ．ゲノムＤＮＡからの拡大した反復の同定
本発明の一態様は、ＤＮＡサンプル内で拡大した反復の存在及び大きさを評価するためにＲＥＤ分析を行う改良された方法に関する。
本発明の他の態様は、ゲノムサイズ画分を同定するための（２Ｄ−ＲＥＤとして言及される）方法であって、前記画分を、拡大した反復を含むＤＮＡフラグメントについて豊富化することを特徴とする方法に関する。この方法が拡大したトリヌクレオチド反復の同定に限られないことが理解されるが、この議論の目的のため、拡大したトリヌクレオチド反復のみが考慮されるであろう。ＲＥＤ分析を多重のトリヌクレオチド拡大物を含むゲノムＤＮＡサンプルで行う場合、各々の拡大物が生じたＲＥＤラダーは互いに重ねあわせられ、最も大きな連結産物の大きさが最も大きな拡大物のおよその大きさに対応する。２Ｄ−ＲＥＤ分析において、ゲノムサンプル中に存在する多重の拡大物は、好ましくはゲノムの制限フラグメントのサイズ分画を用いて、ＲＥＤ分析の前に互いに物理的に分離される。後のクローニング及び単離手順に用いるための豊富化されたゲノムサイズ画分を同定することに加えて、２Ｄ−ＲＥＤアッセイはゲノム中に存在する拡大物の数及び大きさの両方を測定する。２Ｄ−ＲＥＤ分析を用いるＣＡＧトリヌクレオチド反復の分析は、ヒトゲノムＤＮＡサンプルが、ＣＡＧ  ＲＥＤ３０産物を典型的に作り出す２〜４のサイズ画分、ＲＥＤ４０産物を典型的に作り出す単一サイズ画分、及びより大きなＲＥＤ産物を作り出す小さいが種々の数の画分を含むことを示した。
【００３０】
本発明の他の態様は、ゲノムＤＮＡから、拡大したトリヌクレオチド反復及び対応する隣接配列を単離するための方法に関する。この個々のＲＥＤ−陽性クローンの繰り返し分析プール単離及び検出（ＲＡＰＩＤクローニング）は、単一のＲＥＤ陽性クローンが得られるまでの一連のプールした豊富化ステップを通しての拡大した反復に従うＲＥＤアッセイを用いる。この方法は、１）ＤＮＡフラグメントの集団を分画して拡大した反復を含む画分を検出し；２）拡大した反復を含むＤＮＡの画分内に含まれるＤＮＡフラグメントをクローニングし；そして拡大した反復を含むクローンを同定することに分けることができる。分画ステップは、更に、１）ＤＮＡフラグメントを得るために制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し；２）ゲル電気泳動によりそのＤＮＡフラグメントを分離してサイズに基づいて画分に分け；そして各々のサイズ画分内の拡大したトリヌクレオチド反復の存在を検出することに分けることができる。好ましくは、ＲＥＤアッセイは、各々のサイズ画分内の拡大したトリヌクレオチド反復の存在を検出するのに用いられる。
【００３１】
この技術を用いて、失調症及び網膜退縮の個体のゲノムＤＮＡからの拡大したＳＣＡの対立遺伝子を精製し、クローン化することができる。更に、新規の拡大した反復を含むＤＮＡフラグメントは、筋緊張性ジストロフィーに似た臨床的特徴の個体のゲノムＤＮＡから精製し、クローン化することができる。単一の個体のゲノムＤＮＡから直接のＳＣＡ７及びＭｎ１  ＣＡＧ反復拡大物並びに各々の隣接ＤＮＡの単離は、大きな系統図が利用できない場合のための病原性の反復拡大物の同定のためのＲＡＰＩＤクローニングの利点を示し、そして予想されるトリヌクレオチド病遺伝子を単離し、キャラクタライズし、そして評価することができる劇的に改良された効能を示す。
【００３２】
多くの点において、ＲＥＤ分析を行う正確に最適化された方法は、精製及びクローニング過程を通して新規トリヌクレオチド反復拡大物を追跡するための理想的なアッセイを供し、開示されている他のクローニングアッセイ（例えばストリンジェントハイブリダイゼーション及びポリグルタミン領域に対する抗体）より明白な利点を有する。ゲノムＤＮＡの使用は、その発現パターンにかかわらずいずれかの潜在的なトリヌクレオチド反復拡大物の単離を許容する。ＲＥＤアッセイにおける異なるオリゴヌクレオチドの利用は、可能性あるトリヌクレオチド反復のいずれかが検出されるのを許容し、その反応のサイクルの性質はそれを極めてセンシティブになる。最も重要なのは、このアッセイの連結構成物は、ＲＥＤがＤＮＡテンプレート内に存在する拡大物のおおよその反復の長さを測定するのを許容する。ＲＥＤにより供される反復長識別は、テンプレートの増加における標的配列の濃度として維持される。この情報は、精製過程を通して拡大標的を区別的に同定する明白かつ強力な手段を供する。
【００３３】
１．ＤＮＡフラグメントの分画及び拡大した反復を含む画分の検出（２Ｒ−ＲＥＤ）
ＲＥＤ分析は、拡大した反復の存在についてゲノムＤＮＡのサンプルを直接テストすることに関する。ＲＥＤ分析を多重のトリヌクレオチド拡大物を含むゲノムＤＮＡサンプルで行う場合、各々の拡大物から生じたＲＥＤラダーは互いに重ね合わされ、最も大きな連結産物の大きさは最も大きな拡大物のおおよその大きさに対応する。これにより、ゲノムＤＮＡが１超の拡大した反復を含むか否かを評価することは困難である。２Ｄ−ＲＥＤ分析において、ゲノムサンプル中に存在する多重の拡大物は、ゲノム制限フラグメントのサイズ分画を用いてＲＥＤ分析の前に互いから物理的に分離される。後のクローニング及び単離手順に用いるための豊富化されたゲノムサイズ画分を同定することに加えて、２Ｄ−ＲＥＤアッセイは、ゲル中に存在する拡大物の数及び大きさの両方を測定する。分画ステップの最終的な結果は、そのＤＮＡフラグメントの少くとも１つが拡大した反復領域を含むＤＮＡフラグメントの集団の同定である。
【００３４】
２Ｄ−ＲＥＤに用いるゲノムＤＮＡはいずれかの個体から単離することができる。好ましくは、ゲノムＤＮＡは反復の拡大に関連し得る病気を患うヒト個体から単離される。ゲノムＤＮＡを単離するための当該技術で周知のいずれかの方法を用いることができる。
ゲノムＤＮＡはＤＮＡフラグメントを生成するために制限酵素で消化される。いずれかの制限酵素を用いることができる。好ましくは、制限酵素は、Ｓａｕ３Ａ，ＭｂｏＩ又はＥｃｏＲＩであろう。ＤＮＡを消化するための制限酵素の使用を詳述する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））に見い出すことができる。
【００３５】
消化されたＤＮＡは分離されてサイズによりＤＮＡフラグメントの集団に分けられる。そのＤＮＡフラグメントはいずれかの利用できる方法により分離することができる。好ましくは、消化されたＤＮＡはゲル電気泳動により分離されるであろう。より好ましくは、低融点アガロースでのゲル電気泳動による、その分離されたＤＮＡは、別個のサイズ画分に分離される。例えば、ＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動により分離する場合、そのＤＮＡフラグメントを含むゲルの部分は、レーザープレードで切り出すことができる。次にこのゲル断片は、例えばゲルスライス装置を用いて、不均一なスライスに切断することができる。ＤＮＡフラグメントの別個の画分への分離の後、各々の画分内のＤＮＡフラグメントを精製することができる。
【００３６】
拡大した反復を含む少くとも１のＤＮＡフラグメントを含む画分を検出するために、拡大した反復を検出するためのいずれかアッセイを用いることができる。好ましくは、各々の画分はＲＥＤ分析にかけられる。ＲＥＤ分析に用いるオリゴヌクレオチドは好ましくは、５’リン酸化される。分析されるべき反復に相補的であるいずれかのオリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、ＣＡＧ反復の存在を検出するために、配列ＣＴＧの多重の反復のオリゴヌクレオチドが用いられるであろう。好ましくは、反復がトリヌクレオチド反復である場合、オリゴヌクレオチドの全長は３０ヌクレオチドであろう。ＲＥＤ分析は、開示されるように行うことができる（Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ，Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４，１３５〜１３９（１９９３），Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１２４（１９９４），Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋら、Ｇｅｎｏｍｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６））。この発明の一態様は、ゲノムＤＮＡのサンプルでＲＥＤ分析を行うことを含むゲノムＤＮＡから、拡大したトリヌクレオチド反復を同定することであって、変性温度からの温度変化の速度を一度当り約０．１秒に減らし、連結緩衝液がホルムアミドを含むことを特徴とすることに関する。これにより、変性温度からの温度変化の速度は一度当り約０．１秒未満であり、好ましくは変性温度からの温度変化の速度は一度当り２秒に減らされ、そして連結緩衝液は４％のホルムアミドを含む。
【００３７】
各々の画分中の拡大した反復の存在を検出するためのアッセイの産物が分離される。これは、アッセイの産物が検出されるのを許容する。例えば、ＲＥＤ分析を行うなら、ＲＥＤ産物はゲル電気泳動により分離される。産物の検出はいずれかの方法により得る。好ましくは、産物は、膜に移し、拡大した反復を検出するのに用いられるオリゴヌクレオチドの配列に相補的である標識されるＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。例えば、ＲＥＤ分析が（ＣＴＧ）10３０−ｍｅｒで行われる場合、ＲＥＤ分析の産物を検出するのに用いられるプローブは（ＣＡＧ）10３０−ｍｅｒであろう。
【００３８】
２．ＣＡＧ反復に隣接する配列のクローニング
少くとも１の拡大した反復を含むＤＮＡ画分の同定の後、その画分内のＤＮＡフラグメントはクローン化される。クローニングは、拡大した反復を含む単一のＤＮＡフラグメントの最終的な単離を供する。更に、拡大した反復を含む単一のＤＮＡフラグメントのクローニングは、拡大した反復に隣接するヌクレオチドが決定されるのを許容する。
【００３９】
少くとも１の拡大した反復を含むＤＮＡ画分内に反応するＤＮＡフラグメントは、好ましくは、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）のための複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターを利用することができ、各々の複製ベクターは、それが適合可能である宿主細胞により種々の構造的構成物を含む。これらの構成物は以下に詳細に説明される。
【００４０】
適切なベクターの作製は、当該技術で周知である標準的な連結技術を用いる。単離されたベクター及びＤＮＡフラグメントは開裂され、調整され、そして要求される組換えベクターを生成するのと要求される形態において再度連結される。典型的には、連結混合物は、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換するのに用いられ、成功した形質転換耐体は、適切なら、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性により選択される。形質転換体からのプラスミドは調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析され、及び／又は当該技術で周知の方法により配列決定される。例えばＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，９，３０９（１９８１）及びＭａｘａｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｅｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）を参照のこと。
【００４１】
あるいは及び好ましくは、少くとも１の拡大した反復を含むＤＮＡ画分中に存在するＤＮＡフラグメントはλベクターに挿入される。生じた組換えベクターは、適切なバクテリア株を導入するのに用いられる。
本明細書に記載されるベクターをクローニング及び発現するための適切な宿主細胞は、原核生物、例えばユーバクテリア、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えばＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えばＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ  タイフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又はセラリア  マルセカンス（Ｓｅｒｒａｌｉａ ｍａｒｃｓｅｃａｎｓ）である。好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌ＸＬ１  ＢｌｕｅＭＲＦ’、大腸菌ＳＯＬＲ、及び大腸菌ＣＪ２３６であるか、他の株、例えば大腸菌Ｂ大腸菌χ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）も適切である。これらの例は限定することなく示される。
【００４２】
宿主細胞は、本発明のこの態様のための上述のクローニングベクターで形質転換され、好ましくは導入され、適切に改良された慣用的な栄養培地中で培養され、導入体を選択し、そして要求される配列をコードする遺伝子を増幅する。
導入とは、ＤＮＡが染色体外要素又は染色体一体化物として複製可能であるように生物内にＤＮＡを導入することを意味する。導入に用いるベクターは、典型的には、バクテリオファージ、好ましくはλファージから得られる。挿入ＤＮＡフラグメントのバクテリアファージベクターとの連結の後、組換えバクテリアファージベクターは適切なタンパク質ファージ粒子にパックされる。生じたファージ粒子の集団は、適切なバクテリア株に感染させるのに用いられる。用いる宿主細胞及びファージにより、これらの細胞に適した標準的技術を用いて導入が行われる。
【００４３】
少くとも１の拡大した反復を含む画分中に存在するＤＮＡフラグメントをクローニングした後、拡大した反復を含む個々のクローンが同定され、単離される。個々のクローンを同定するための１つの方法は、適切な媒体上にクローンのライブラリーを含む宿主細胞をプレートすることによりクローンの全体のライブラリーをスクリーニングすることに関する。その媒体は、任意に、適切な選択剤、好ましくは抗生物質を含む。その個々のクローン又はプラークは、次に当該技術で公知の方法により、例えば拡大した反復を検するのに用いるオリゴヌクレオチドの配列に相補的である標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによりアッセイされる。
【００４４】
あるい及び好ましくは、クローンのライブラリーは、いくつかのクローニング後豊富化ステップに用いられるであろう。これらのステップは、当該技術で公知の手順に似る（Ｏｓｔｒａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，３４１２〜３４２３（１９９２），Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７〜３８２（１９８７））。その結果は、その各々がトリヌクレオチド反復を含むＤＮＡフラグメントを含む個々のクローンの同定である。
【００４５】
個々のクローンの単離の後、ＣＡＧ反復に隣接するＤＮＡのヌクレオチド配列は、当該技術で公知である技術により決定することができる。隣接ＤＮＡの配列を用いて当該技術で公知である技術を用いて物理的地図上にＤＮＡの位置を決定することができる。隣接ＤＮＡの配列も全長の遺伝子をクローン化するのに用いることができる。
【００４６】
３．拡大した反復に隣接する配列を用いる全長の遺伝子のクローニング
本発明は、拡大した反復を含む全体の遺伝子又はその一部に対応する核酸分子を含む拡大した反復を含む核酸分子に関する。好ましくは、拡大した反復は単離した脊髄脳失調７型のＣＡＧ反復領域、並びに完全なＳＣＡ７遺伝子に相当する核酸分子及びその一部である。本発明は、更に、完全なＳＣＡ７遺伝子又はその一部を含むベクター及び単離された組換えベクター、例えば、異種ベクター配列に作用可能に連結された配列番号：１又は配列番号：２のヌクレオチドを含む単離された組換えベクターに関する。
【００４７】
本明細書に用いる場合、用語“単離”とは、核酸分子、遺伝子、又はオリゴヌクレオチドがヒトゲノムの残りのもの及び関連する細胞又は他の不純物が本質的にないことを意味する。これは、その産物がヒトゲノムから抽出されていなければならないことを意味せず；むしろその産物が例えば合成又はクローン化産物であり得るであろうことを意味する。本明細書に用いる場合、用語“核酸分子”とは、いずれかの一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを意味する。
【００４８】
ＤＮＡの適切な複製可能なベクターへのクローニングは、拡大した反復に隣接する配列を決定し、次に全長の遺伝子を単離することを供する。クローニングは、遺伝子産物の発現を許容し、遺伝子を更なる遺伝子工学に利用できるようにする。遺伝子産物又はその一部の発現は、これらの遺伝子産物が、以下に及び米国特許出願通し番号０８／２６７，８０３号（１９９４年６月２８日出願）に記載されるように抗体を生産するために抗原として用いることができるので役立つ。
【００４９】
１．ＤＮＡの単離
拡大した反復を含む遺伝子を含むＤＮＡは、その遺伝子によりコードされたｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルまで発現すると信じられる組織から調製したいずれかのｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。任意に、ＳＣＡ７遺伝子は、ゲノムＤＮＡライブラリーから、又は完全なヌクレオチドもしくはアミノ酸配列から試験管内オリゴヌクレオチド合成により得ることができる。
【００５０】
ライブラリーは、関心の遺伝子又はそれによりコードされるタンパク質を同定するようにデザインされた適切なプローブでスクリーニングされる。好ましくは、そのプローブは、拡大した反復に隣接するヌクレオチド配列から得られる。選択されたプローブでのｃＤＮＡはゲノムライブラリーのスクリーニングは、標準的手順を用いて行うことができる。プローブとして合成オリゴヌクレオチドを用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングが本発明を実施する好ましい方法である。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分に長く誤った陽性物を最小にするのに明白に十分なものであるべきである。異なる種からのＤＮＡを含むライブラリーをスクリーニングする場合、そのプローブの実際のヌクレオチド配列は、通常、最も小さいコドン重複を有する拡大した反復に隣接するヌクレオチドの領域に基づいてデザインされる。オリゴヌクレオチドは、１又は２の位置において縮重し得、即ち２又はそれ超の異なるヌクレオチドを所定の位置でオリゴヌクレオチドに組み込み、多重の合成オリゴヌクレオチドを生じさせることができる。有利なコドン用法が知られていない種からライブラリーをスクリーニングする場合、縮重オリゴヌクレオチドの使用は特に重要である。
【００５１】
そのオリゴヌクレオチドは、それがスクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより検出され得るように標識することができる。標識する好ましい方法は、オリゴヌクレオチドの５’末端を放射能標識するためにＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いることである。しかしながら、他の方法、例えばこれらに限られないが、ビオチニル化又は酵素標識化を用いてオリゴヌクレオチドを標識することができる。
【００５２】
本発明の核酸分子の実施形態は、配列番号：１の塩基１〜１２８、配列番号：１の塩基２８６〜４７６、配列番号：１の塩基１〜１２８を含む単離されたＤＮＡフラグメント及び更にベクター内にＣＡＧ反復領域及び配列番号：１の塩基１〜１２８を含む単離されたＤＮＡフラグメントを含む。本発明の核酸分子の他の実施形態は、配列番号：２の塩基９２２〜１００２、配列番号：２の塩基１０３３〜１８６４、配列番号：２の塩基９２２〜１００２を含む単離されたＤＮＡフラグメント及び更にＣＡＧ反復領域及び配列番号：２の塩基９２２〜１００２をベクター内に含む単離されたＤＮＡフラグメントを含む。
【００５３】
特に関心のものは、遺伝子産物アタキシン−７（ａｔａｘｉｎ−７）のための完全なコード化領域を含む全長のｍＲＮＡ転写物をコードするＳＣＡ７核酸である。完全なコード化領域を含む核酸は、縮重したアミノ酸配列を用いて所定のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
拡大した反復を含む遺伝子を単離するためのかわりの手段は、ＰＣＲ法を用いることである。この方法は、ＳＣＡ７遺伝子とハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプライマープローブの使用を要求する。ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドの選択のためのストラテジーを以下に示す。
【００５４】
２．ＤＮＡのベクターへの挿入
拡大した反復を含む遺伝子を含む核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、好ましくは、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、又は遺伝子産物の発現のため、複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターを利用でき、そして適切なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅又はＤＮＡ発現のために用いられるか否か；２）挿入されるべき核酸の大きさ；及び３）ベクターで形質転換されるべき宿主細胞によるであろう。
【００５５】
適切なベクターの作製は、当該技術で周知の標準的連結技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡフラグメントは開裂され、調整され、そして要求されるプラスミドを生成するように要求される形態で再度連結される。典型的には、連結混合物は、大腸菌Ｋ１２株２９６（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換するのに用いられ、成功した形質転換体は、適切なら、マンピシリン又はテトラサイクリン耐性により選択される。形質転換体からのプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析され、及び／又は当該技術で周知の方法により配列決定される。例えばＭｅｓｓｉｎｇら（Ｎａｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，９，３０９（１９８１））及びＭａｘａｍら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））を参照のこと。
【００５６】
複製可能なクローニング及び発現ベクター構成物は、一般に、これらに限られないが、１又は複数の次のもの：一本鎖配列、複製の源、１又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終了配列を含む。この時に、種々の潜在的な宿主細胞により認識されるこれらの構成物の各々の多数は当該技術で公知である。構成物は標準的な分子生物学技術を用いてそのソースＤＮＡから除去することができ、特定の種、例えば原核生物、糸状菌、イースト、原生動物、及び脊髄動物、無脊椎動物並びに植物細胞培養物に対して内因性である他の構成物と組み合わせて用いることができる。あるいは、異種構成物を一緒に用いてクローンされたＤＮＡの安定な複製、又はクローンされたＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現を行うことができる。拡大したトリヌクレオチド反復を含む遺伝子をクローン化するのに用いることができる構成物の非限定的記載は、米国特許出願通し番号０８／２６７，８０３号（１９９４年６月２８日出願）において見い出すことができる。
【００５７】
３．宿主細胞
本明細書のベクターをクローン化し又は発現させるための適切な宿主細胞は原核生物、糸状菌、原生動物及び高等真核細胞、例えば脊椎動物、無脊椎動物及び植物細胞である。好ましくは、宿主細胞は最小量の原核細胞酵素を分泌するべきである。
【００５８】
拡大した反復を含む遺伝子によりコードされたグリコシル化タンパク質の発現のための適切な宿主細胞は多細胞生物から得られる。これらの宿主細胞は、複合プロセッシング及びグリコシル化活性の能力を有する。原則として、いずれかの高等真核細胞が、脊椎動物又は非脊椎動物培養物にかかわらず用いることができる。
【００５９】
宿主細胞内にクローンされたＤＮＡを含むベクターの繁殖は近年、慣用的な手順となり、当該技術で公知である。
あるいは、クローニングの試験管内法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
４．移入及び形質転換
宿主細胞は、本発明の上述の発現又はクローニングベクターが移入されそして好ましくはそれで形質転換され、そしてプロモーターを誘導するために適切に改良された慣用的な栄養培地中で培養され、形質転換体が選択され、又は要求される配列をコードする遺伝子が増幅される。
【００６０】
クローン化されたＤＮＡを含むベクターの取り込みを促進するために宿主細胞を処理する多数の方法は当該技術で周知であり、例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、塩化カルシウム処理、核注入、プロトプラスト融合又はマイクロプロジェクティルボンバードメントも用いることができる。
宿主細胞の生存能及びクローニングベクターの運搬性を促進するような適切な培地内にクローニングベクターを含む宿主細胞の培養は当該技術で公知である。いずれかの必要な補給物も、当業者に周知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、pH等のような培養条件は当業者に明らかであろう。本開示内に言及される宿主細胞は、試験管内培養物及び宿主動物内にある細胞を包含する。
【００６１】
Ｃ．タンパク質
拡大した反復を含む遺伝子は、組換え体遺伝子を発現する宿主細胞から精製することができるタンパク質をコードする。例えば、ＳＣＡ７遺伝子は新規のタンパク質アタキシン−７（ａｔａｘｉｎ−７）をコードし、そのタンパク質の代表例を配列番号：１２に示し、そしてその一部を配列番号：１１に示す。これにより、本発明は、拡大したトリヌクレオチド反復を含む遺伝子の核酸、好ましくは配列番号：１又は配列番号：２の核酸によりコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに関する。本発明は、ポリグルタミン領域を含むタンパク質のアミノ酸を含むポリペプチドを発現することができる単離された組換えベクター及び単離された核酸フラグメントにも関する。好ましくは、アミノ酸は配列番号：１１又は配列番号：１２のアミノ酸１〜２７を含む。本発明は、更に、ＳＣＡ７によりコードされるタンパク質であって、該タンパク質か５〜１１０のＣＡＧ反復を含み、そして約９５〜１０８kDの分子量を有することを特徴とするタンパク質に更に関する。
【００６２】
アタキシン−７はその不安定なＣＡＧ領域と共にＳＣＡ７遺伝子から生産される一セットのタンパク質を示すことが理解されるはずである。アタキシン−７は、細胞培養物から生産することができる。組換えＤＮＡ技術により、アタキシン−７をコードする合成ＤＮＡ及びｃＤＮＡを微生物に導入することができ、次にそれをペプチドを生産するようにすることができる。ペプチド合成について知られているのと同様にアタキシン−７を合成的に製造することもできる。
【００６３】
アタキシン−７は、分泌シグナルで発現させた時に分泌されるポリペプチドとして回収することもできるが、好ましくは細胞質ポリペプチドとして培養培地から回収される。
アタキシン−７は、当該技術で公知の技術を用いてアタキシン−７として実質的に相同である調製物を得るために組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することができる。以下の手順は適切な精製手順の例である：イムノアフィニティー又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン性交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲルろ過；例えばＩｇＧのような汚染物を除去するためにタンパク質Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いるリガンドアフィニティークロマトグラフィー。
【００６４】
残基が削除され、挿入され、又は置換されているアトキシン−７変異体は、その変異により生じた特性のいずれかの実質的な変化を考慮に入れてネイティブアタキシン−７と同様に回収される。フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターも、精製の間のタンパク質分解を阻害するのに役立ち、外来的な汚染物の増殖を防ぐために抗生物質が含まれ得る。
【００６５】
ネイティブアタキシン−７及びアタキシン−７のアミノ酸配列変異体の両方の共有結合的修飾は共有結合により修飾され得る。アタキシン−７又はそのフラグメントの共有結合的修飾は、選択された側鎖又はＮもしくはＣ末端残基と反応することができる誘導化剤と、アタキシン７又はそのフラグメントの標的化アミノ酸残基を反応させることにより分子内に導入することができる。
【００６６】
Ｄ．抗体
本発明は、拡大した反復を含む遺伝子によりコードされた全長のタンパク質もしくはそのフラグメント（好ましくはホールドしたタンパク質の表面を形成する８〜４０のアミノ酸、より好ましくは１０〜２０アミノ酸を有するフラグメント）又はその変異体に対して生じたポリクローナル又はモノクローナル抗体に、並びにこれらに限られないが、ウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルバントアッセイ）を含む。これらの抗体の使用に基づく診断法にも関する。例えば、本発明は、アタキシン−７又はアタキシン−７フラグメントに対して生じたポリクローナル又はモノクローナル抗体に、及びこれらの抗体の使用に基づく診断法に関する。
【００６７】
ＳＣＡ７ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、アタキシン−７、アタキシン−７フラグメント、又はその変異体及びアジュバントの当該技術で公知の方法を用いての多重の皮下（Ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注入により動物において生ずる。ホスト動物を免疫化し、又は抗体生産細胞を除去し、培養する経路及びスケジュールは種々であり、一般に、抗体刺激及び生産のための確立された慣用的な技術で維持することである。血清抗体（ＩｇＧ）は、当該技術で公知であるタンパク質精製プロトコルにより精製される。
【００６８】
モノクローナル抗体は、免疫化した動物（通常マウス）から、免疫細胞、典型的には脾臓細胞又はリンパ節組織からのリンパ球を回収し、慣様的な様式で、例えばミエローマ細胞との融合により細胞を固定化することにより調製される。Ｋｏｈｌｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６））により記載されるハイブリドーマ技術は、多くの特定の抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を生産するために広く適用されている。モノクローナル抗体の生産及び精製は当該技術で公知である。
【００６９】
本発明の抗アタキシン−７抗体はアタキシン７に特異的であり、所定の使用を妨げないであろう様式で他の物質と免疫学的に反応しない。例えば、それらは、アタキシン−７の組織特異的発現レベルを決定するために組織抽出物中のアタキシン−７の存在についてスクリーニングするのに用いることができる。
本発明は、アタキシン−７に対する抗体をサンプル中に存在するアタキシン−７と反応させてこれにより（アタキシン７／抗アタキシン−７）免疫複合体を形成し、ここでその形成及び量は各々サンプル中に存在するアタキシン−７の質的及び量的基準であることに関する免疫化学アッセイも包含する。分析的に検出可能な基が供された抗−抗体のようなタンパク質／抗体複合体の構成物と生物特異的に反応することができる他の試薬の添加は、生物サンプル中のアタキシン−７の検出及び定量を容易にし、特に、生物サンプル中のアタキシン−７のレベルを定量するのに役立つ。アタキシン−７／抗アタキシン−７複合体は、ポリグルタミン領域の長さを決定し、それにより脊髄小脳性運動失調にかかる可能性及び発症の予想年齢についての情報を供するために、当該技術で公知の方法を用いてアミノ酸配列決定にかけることもできる。競合阻害及び非競合法、沈殿法、異種及び同種法、用いる分析的に検出可能な基に従って命名された種々の方法、免疫電気泳動、粒子凝集、免疫拡散及び標識された抗体を用いる免疫組織化学法を、上述の免疫アッセイと共に全て用いることができる。
【００７０】
本発明は、種々の特定の好ましい実施形態を引用して記載されており、以下の詳細な実施例を引用して更に記載されるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内である実施例及び詳細な説明に示されるものを超えて本発明の基本的テーマへの多くの拡大、バリエーション、及び改良があることが理解される。
【００７１】
【実施例】
２つの新規ＣＡＧ拡大物を同定し、キャラクタライズし、そして評価するためにＲＡＰＩＤクローニングを用いた。第１のＣＡＧ拡大物は筋緊張性ジストロフィーの遺伝的に明白な形態の個体のゲノムＤＮＡから単離した。第２のＣＡＧ拡大物は、運動失調及び網膜症の個体のゲノムＤＮＡから単離した。これらの結果は、大きな系図が利用できない場合のための病原性反復拡大物の同定のためのＲＡＰＩＤクローニングの利点を示し、そして予想されるトリヌクレオチド病遺伝子を単離し、キャラクタライズし、そして評価する劇的に改良された効能を示す。
【００７２】
Ａ．方法
１．臨床的資源
運動失調の患者を集め、記載される（Ｒａｎｕｍ，Ｌ．Ｐ．Ｗ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５７，６０３〜６０８（１９９５））ように検査した。筋緊張性ジストロフィーの遺伝的に明白な形態の家系について、神経学的検査及びＥＭＧ’ｓを、影響を受けたＭＮＩファミリーの分類についての診断基準として用いる筋緊張性解放の存在で行った。インフォームドコンセントを行った後、血液を２つの酸シトレートデキストロース（ＡＣＤ）チューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＃４６０６）及び１つのナトリウムヘパリンチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＃６４８０）に集めた。ＡＣＤチューブ内の血液からＤＮＡを単離し（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＃Ｄ−５００３，Ｇｅｎｔｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎａｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎｅ）、ＥＢＶ形質転換したリンパ芽球細胞系（ＬＣＬｓ）を、ヘパリンチューブからの血液を用いて確立した。
【００７３】
４０のＣｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｌｏｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  Ｈｕｍａｎ（ＣＥＰＨ）リフェレンスファミリーのパネルの祖父母からのＤＮＡサンプルをＳＣＡ７  ＰＣＲアッセイのための正常な対照として用いた（Ｍａｒｙ，Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，１５０〜１５１（１９８５））。
２．最適化ＲＥＤ条件
次の改良を加えてＳｃｈａｌｌｉｎｇら、及びＬｉｎｄｂｌａｄら（Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４，１３５〜１３９（１９９３），Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１２４（１９９４）、及びＬｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６））により記載されるようにＲＥＤアッセイを行った：２mgのゲノムＤＮＡを用い；４％ホルムアミドをその反応に加え、その反応条件に９４℃（４分５０秒）で変性、次に１０秒、９４℃、４０秒、７０℃〜７８℃の４９５サイクルであり；その反応温度が９４℃から下がった時に２秒／度ランプを用いた。ＲＥＤ反応に用いたオリゴヌクレオチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）により合成したＰＡＧＥ精製した５’リン酸化（ＣＴＧ）10３０−ｍｅｒである。加熱したふたと共にＯｍｎｉｇｅｎｅ  Ｈｙｂａｉｄ熱サイクラーを用いて全ての反応を行った。ＲＥＤ産物を、６Ｍ尿素を含む変性６％ポリアクリルアミドゲルでサイズにより分離し、記載される（Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４，１３５〜１３９（１９９３），Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１２４（１９９４）、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６））ようなＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、３’標識化（ＣＡＧ）10３０ｍｅｒとハイブリダイズさせた。
【００７４】
３．ゲノムＤＮＡの２次元ＲＥＤ（２Ｄ−ＲＥＤ）分析
１０mgのゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、１×ＴＡＥ緩衝液中で１．５％  Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ  ＧＴＧ（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）低融点アガロースゲルでサイズ分離した。そのＤＮＡを臭化エチジウム染色の後、ＵＶトランスイルミネーターで見て、ＤＮＡを含むゲルの部分をレーザーブレードで切除した。次にこのゲルセグメントを、顕微鏡カバースリップを使い捨て切断ブレードとして用いるゲルスライシング装置を用いて均一な２mmのスライスに切断した。これらのスライスを別個の０．５ml  ＰＣＲチューブ内に入れ、７２℃で１０分、加熱して溶かし、次に４２℃で平衡化した。１μｌのＡｇａｒ  ＡＣＥ酵素（０．２Ｕ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加え、そのサンプルを完全にアガロースを消化するために３時間、インキュベートした。そのサイズ分離したＤＮＡをＥｔｏＨ沈殿により濃縮し、乾燥させ、７μｌの１０mM  Ｔｒｉｓ，１mM  ＥＤＴＡ（pH７．５）緩衝液に再度懸濁した。サイズ画分がＲＥＤ陽性ゲノムフラグメントについて最も高く豊富化されていることを決定するために、各々の画分からの３．５μｌのＤＮＡでＲＥＤ分析を行った。
【００７５】
４．ゲノムフラグメントのクローニング
ＲＥＤ陽性ゲル画分から回収したＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを、プレ消化Ｌａｍｂｄａ  ＺａｐII／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰクローニング及びパッケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてクローン化した。最初のライブラリーを形成し、適定した後、５×１０4 の一次クローン／プレートを含む８のプレートを、製造元により供されるプロトコルに記載されるように別個に増幅した。次にこれらのライブラリーのｓｓＤＮＡ誘導体を、大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に、増幅したラムダライブラリーとＥｘＡｓｓｉｓｔ  Ｍ１３ヘルパーファージとの両方を同時感染させることにより作った。ＳＫ- Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを、大腸菌のＳＯＬＲ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に感染させるのに用い、それから、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍ１３  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｏａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて二本鎖プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＤＮＡを精製した。次に各々のクローンプールを示すプラスミドＤＮＡを、拡大した反復の存在についてのＲＥＤ分析によりアッセイした。
【００７６】
５．クローニング後豊富化
ＣＡＧ含有クローンの豊富化は、Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７〜３８２（１９８７））により確立された選択スキームに基づくＯｓｔｒａｎｄｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，３４１９〜３４２３（１９９２））により記載される一般的なアプローチの適応である。クローンのＲＥＤ陽性プールを示すプラスミドＤＮＡ（約０．１mg）を大腸菌株ＣＪ２３６（ｄｕｔ- ，ｕｎｇ- ，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にエレクトロポレートしてウラシル置換化ＤＮＡを形成した。抗生物質なしでの１時間の回収の後、その細胞を４０mg／mlアンピシリンを含むＬＢ２００mlに接種し、振とうしながら３時間、インキュベートした。プラスミドｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに移すために、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（１×１０10 pfu）を加え、その培養物を更に２時間、振とうしながら３７℃でインキュベートした。次にカナマイシンを１％まで加え、その培養物を１８時間、インキュベートし、ファージ沈殿の前にＤＮａｓｅＩの添加処理（２０００Ｕ，１時間、３７℃）を行った他は本質的に記載（Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，３〜１１（１９８７）されるように精製した。その精製したｓｓＤＮＡを、プライマーとして機能し得る汚染するＤＮＡを除去するために、ｄＮＴＰなしで一晩、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｒｅｒｌ，ＭＡ）と共にインキュベートした。次にＣＴＧ反復を含むｓｓＤＮＡを、４％ホルムアミドを含む緩衝液中で７２℃でａｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及び（ＣＡＧ）10プライマーを用いるプライマー伸長によりｄｓＤＮＡに変えた。残りのｓｓＤＮＡを分解するために、伸長の後、１μｌのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ，ＧＩＢ  Ｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えた。抽出（１×フェノール：ＣＨＣｌ3 及び１×ＣＨＣｌ3 ）及びＥｔｏＨ沈殿の後、そのＤＮＡを大腸菌のＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にエレクトロポレートした。
【００７７】
６．配列分析
ＳＣＡ７  ＥｃｏＲＩフラグメントの端からのゲノム配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースのヌクレオチドＢＬＡＳＴサーチに用い、３つの関連するＥＳＴ配列（アクセス番号Ｈ４０２８５，Ｈ４０２９０，Ｈ４１７５６）とのオーバーラップを示した。メトＥＳＴマップのサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｒ／ＳＣＩＥＮ（Ｅ９６／）（Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，５４０〜５４６（１９９６））は、これらのＥＳＴは、ＳＣＡ７変異がマッピングされた３ｐ染色体の同じ領域にマッピングされていることを示した（Ｇｏｕｗ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，８９〜９３（１９９５），Ｂｅｎｏｍａｒ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，８４〜８８（１９９５）、及びＤａｖｉｄ，Ｇ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１３２８〜１３３６（１９９６））。ＳＣＡ７  ＣＡＧ反復に隣接するヌクレオチド配列でのＢＬＡＳＴサーチは、ＣＡＧ反復を有する拡大していない対立遺伝子がデータベース内に存在し、第３染色体ＮｏｔＩジャンピングクローン（アクセス番号Ｘ９５８３１）として報告されていることを示した。ＭＮ１  ＣＡＧについてのアクセス番号に隣接する配列はデータベース中に存在するいずれのものにも適合しなかった。
【００７８】
７．拡大したトリヌクレオチド反復のＰＣＲアッセイ
３５×（９４℃５０秒、５５℃１分１５秒、７２℃１分）のサイクルでのＰＣＲ反応（５０ngゲノムＤＮＡ，２００mM  ｄＮＴＰ，１０mM  Ｔｒｉｓ  pH９．０，５０mM  ＫＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．５mM  ＭｇＣｌ2 ，１０％  ＤＭＳＯ，０．１ｕｎｉｔｓ  ＡｍｐｌｉＴａｑ）においてＳＣＡ７−Ｆ１（５’TTTTTTGTTACATTGTAGGAGCG)（配列番号：５）及びＳＣＡ７−Ｒ１（５’CACTTCAGGACTGGGCAGAG) （配列番号：６）プライマーを用いてＳＣＡ７反復拡大アッセイを行った。
【００７９】
３５×（９４℃４５秒、５２℃１分、７２℃１分）のサイクルのＰＣＲ反応（２０mgゲノムＤＮＡ，２００mM  ｄＮＴＰ，１０mM  Ｔｒｉｓ  pH９．０，５０mM  ＫＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０１％ゼラチン、１．５mM  ＭｇＣｌ2 ，１０％  ＤＭＳＯ，０．１ｕｎｉｔ  ＡｍｐｌｉＴａｑ）においてプライマーＭＮ４Ｆ（５’GCCAGATGAGTTTGGTGTAAGAT)（配列番号：７）及びＭＮ４Ｒ（５’AAGCCATTTCTCCAAAAGAAGGTC) （配列番号：８）を用いてＭＮ１ＣＡＧ反復アッセイを行った。
【００８０】
Ｂ．結果
１．ＲＥＤアッセイの最適化
（ＣＴＧ）10ＲＥＤ分析が十分に働くか否かを決定するために、利用できるプロトコル（Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４，１３５〜１３９（１９９３），Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１２４（１９９４）、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，９６５〜９７１（１９９６））を所定のゲノムＤＮＡ対照テンプレートでテストした。これらのテンプレートでのＲＥＤの結果は矛盾しており、典型的には、ゲノムサンプル中の最も大きな周知のＣＡＧ拡大物の大きさと、相関しなかった。アニーリングの間の温度変化の速度を減少させること及び連結緩衝液中に４％ホルムアミドを含むことが、非中断性ＣＡＧ拡大物ゲノム対照を検出するためのこのアッセイの感度及び再現性を増加させることが見い出された。この最適化プロトコルを用いるＳＣＡ７，ＳＣＡ３，ＨＤ、及びＤＭ病座における周知の大きさのＣＡＧ拡大物の個体からのゲノムＤＮＡのＲＥＤ分析を図２に示す。示される陽性ゲノム対照サンプルの各々について、最も大きなＲＥＤ産物の大きさは、ＰＣＲアッセイにより測定して、周知のＣＡＧ拡大物の大きさとよく対応する。ホルムアミドを含まない連結緩衝液を用いるＳＣＡ３，ＨＤ、及びＤＭゲノムサンプルのＲＥＤ分析を図３に示す。この型の反応から得られた結果は図２の同じサンプルについて示されるものと劇的に異なる。我々は、異なる熱サイクル及び悪いＤＮＡの質の使用を含む、最適反応条件にかわる多重の他のものも我々が得たＲＥＤ結果に同様の有害な影響を有し得ることを見い出した。
【００８１】
２．２次元ＲＥＤ分析
この方法の第２部において、ゲノムＤＮＡサンプル内の多重の拡大した対立遺伝子を特異的に同定するためにＲＥＤ陽性ゲノムＤＮＡ消化フラグメントの物理的大きさを用いる２次元反復拡大検出アッセイ（２Ｄ−ＲＥＤ）を開発した（図４〜６を参照のこと）。図４に概略的に示される２Ｄ−ＲＥＤプロトコルにおいて、ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化してアガロースゲルに流し、別個の大きさの画分に分離した。各々の画分からのアガロースを酵素により除去し、そのＤＮＡを沈殿により濃縮し、そしてそれら画分でＲＥＤ分析を行った。ＳＣＡ３／ＭＪＤの個体からのＭｂｏＩ消化ゲノムＤＮＡから生じたサイズ画分の一部分のアガロースゲル分析を図５に示す。これらの画分の対応するＲＥＤ分析を図６に示す。この例において、約５００bpの長さのＤＮＡフラグメントからなるサイズ画分は、もとのゲノムサンプル中に存在する拡大したＳＣＡ３対立遺伝子について予想されるＲＥＤ７０産物を作り出す。
【００８２】
３．新規の拡大したＣＡＧ反復のクローニング及び評価
筋緊張性ジストロフィーに極めて似た臨床的特徴を有するがその病気の座は第１９染色体ＣＴＧ反復拡大に関連せず、第１９染色体のＤＭ領域に遺伝的に関連しないファミリー（ＭＮ１）を同定した。図７は８の配偶者の対照グループ及びＭＮ１ファミリーの１の影響を受けたメンバーからのゲノムＤＮＡで行ったＲＥＤ分析の結果を示す。影響を受けた個体からのゲノムＤＮＡサンプルは、配偶者ＤＮＡサンプルにより生じた産物のいずれよりも実質的に大きい（１１０以上のＣＡＧ反復）ＲＥＤ産物を作り出した。更なるファミリーメンバーからのゲノムＤＮＡのＲＥＤ分析は、同様の大きさのＣＴＧ拡大物が少くとも５の他の影響を受けた個体中に存在し、影響を受けていないファミリーメンバーからのいずれのサンプルからも検出できなかった。ＲＥＤ陽性サンプルのうちの２つの２Ｄ−ＲＥＤ分析は、その拡大が両方のゲノム内でほぼ同じ大きさのＭｂｏＩフラグメント上に存在することを示した。これらのデータは、ＤＭから明らかな座におけるＣＴＧ反復拡大物が筋緊張性ジストロフィーのＭＮ１形態を引きおこすという興味をそそる可能性を示唆した。ＣＴＧ拡大物がその病気に関連するか否かを直接、評価するため、我々はＲＡＰＩＤ手順を用いてこの拡大物を含むゲノムフラグメントをクローン化し、その反復に隣接するＤＮＡを配列決定し、そして血縁を広げて反復のＰＣＲ分析を行った。
【００８３】
ＭＮ１血族の影響を受けたメンバーからのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、ＲＥＤ陽性サイズ画分を同定するために２Ｄ−ＲＥＤを行った。次にこの画分からのＤＮＡフラグメント（約２kbの大きさ）をラムダ２ＡＰIIクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。各々約５×１０4 の一次クローンからなる８のプールを増幅し、各々のプールで別個にマス切断を行い、ラムダクローンをプラスミドに移した（方法の節を参照のこと）。クローンされた反復を含むものを決定するためにこれらの８のプールからの単離したプラスミドＤＮＡでＲＥＤ分析を行った（図８）。８のプールのうち４はＲＥＤ陽性であり、これらのうちの２つ（プール３及び８）からのＤＮＡはＣＡＧ含有クローンについて選択的に豊富化されていた（図９、方法の節を参照のこと）。この豊富化されたライブラリーからの個々に接腫されたクローン（各々２０のクローン）の小さなプールからのＤＮＡをＲＥＤによりアッセイした（図１０）。個々の反復含有クローンを、ＲＥＤ陽性プレートから接腫した行及びカラムプールから調製したＤＮＡのＲＥＤ分析により同定した。これらのクローンのうち４つからのゲノム挿入物を配列決定した。４つ全てがＣＡＧ反復の大きさのみ変化する同一のヌクレオチド配列を有するゲノム挿入物を含んでいた。
【００８４】
ＭＮ１ファミリーから単離したＣＡＧ拡大物に隣接するゲノム配列を図１１に示す。ＣＡＧ反復（下線）の大きさは、それが単離された個体のゲノムＤＮＡから得られたＲＥＤ結果と十分に対応する長さである１１０の非介在配列の最大の長さまで得られたクローンにおいて種々であった。しかしながら、単離されたクローンを得た後、挿入物は安定になった。各々の場合、配列決定により決定した反復の大きさはＲＥＤにより示されるおおよその大きさに対応した（図１０を参照のこと）。
【００８５】
この配列から、ＣＡＧ反復を通して増幅するためにＰＣＲプライマーをデザインし、ＭＮ１血族のＰＣＲ分析を行った（方法の節を参照のこと）。その結果が図１２に要約されるこの分析は、不安定な拡大物がその病気と分離させないことを示す。拡大していない対立遺伝子に非常に多形性であり、１１〜２４の連続的なＣＡＧ反復を有していた（いくつかの対立遺伝子の配列分析により確認）。拡大した対立遺伝子は個体間で種々の大きさであり、最も大きな拡大の個体で約１３０までの反復を有していた。この対立遺伝子の拡大を有するファミリーメンバーの各々を、比較的悪い質のＤＮＡサンプルしか利用できない２つの死亡した個体を除いて、もとのゲノムＲＥＤ分析において検出した。
【００８６】
４．拡大したＳＣＡ７  ＣＡＧ反復のクローニング
本発明は、以後ＳＣＡ７と呼ぶＣＡＧ反復領域を含む核酸の単離にも関する。過去４年間、我々は成人の運動失調の兆候の優性的、劣性的又は散発性の形態の３３５の異なるファミリーを示す影響を受けた個体からの血液サンプルを収集した（Ｒａｎｕｍ，Ｌ．Ｐ．Ｗ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１  ５７，６０３〜６８８（１９９５））。その運動失調が新規のトリヌクレオチド反復拡大により引きおこされる可能性のある個体を同定するために、我々は、周知の優性運動失調遺伝子拡大物（ＳＣＡ７，２，３、及び６）について陰性であり、優性の家系的歴史を有すると予想される患者を選択した。系図Ａ（図１６）の出発点の人は上述の基準に合致する。３２歳の家庭看護介護を要するオリーブ橋小脳退縮の激しい形態を有することに加えて、その患者はＳＣＡ７の患者に特徴的である網膜退縮も有していた。
【００８７】
系図Ａ（図１０）の出発点の人からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＲＥＤ陽性サイズ画分を同定するために２Ｄ−ＲＥＤを行った（図１３）。次にＲＥＤ６０産物を作り出した画分からのＤＮＡフラグメントをラムダベクターにクローン化した。各々約５×１０4 一次ラムダクローンからなる１０のプールをプール内で増幅し、プラスミドにラムダクローンを移すために各々のプールにおいて別個にマス切断を行い、これらのプールからの単離したプラスミドＤＮＡでＲＥＤ分析を行った。ＲＥＤ陽性クローンプールからのＤＮＡをＣＡＧ含有クローンについて選択的に豊富化し、この豊富化されたライブラリーからのクローン（各々のプール３６のクローン）の小さなプールからのＤＮＡをＲＥＤによりアッセイした（図１４）。ＲＥＤ陽性プレートから個々に接種したクローンから調製したＤＮＡのＲＥＤ分析は、拡大したＣＡＧ反復を含む２つのクローンを同定し、これらのクローンからのゲノム挿入物を配列決定した。配列分析（方法の節を参照のこと）は、ゲノムＥｃｏＲＩフラグメントの一端が３ｐ染色体のＳＣＡ７領域にマッピングされている一セットのＥＳＴとオーバーラップし、それは次に同じ領域にこのゲノムフラグメント上のＣＡＧ拡大物を物理的にマッピングされることを示した。
【００８８】
運動失調症及び網膜退縮の患者から単離されたＣＡＧ拡大物に隣接するゲノム配列を図１５に示す。ＣＡＧ反復を横切って増幅するようにこの配列からＰＣＲプライマーをデザインし、網膜症と診断されている我々の運動失調ファミリーコレクションにおける５の血族及び影響を受けていない対照ゲノムＤＮＡ対照テンプレートの大きなパネルからのサンプルでＰＣＲ分析を行った。その結果を図１７に要約するこの分析は、ＣＡＧ反復配列はこれらの運動失調血族において影響を受けた及び危険のある個体（３７〜６８の反復）において拡大しているが、影響を受けていない対照のいずれにおいてもそうでないことを示す。他の運動失調ＣＡＧ変異の場合のように、拡大した対立遺伝子は不安定であり、症状の始まる年齢及び反復の大きさは逆に相関する。男性及び女性の伝達の両方について著しい予測を観察した。
【００８９】
本明細書に開示される特許、特許出願及び出版物は、個々に組み込まれているのと同様に本明細書に組み込まれる。先の記載は詳述することを意図したものであり、限定することを意図したものでないことが理解されるはずである。本発明の種々の改良及び変換は、本発明の範囲及び精神から離れることなく先の記載から当業者に明らかになるであろうし、本発明は本明細書に記載される具体的な実施例に過度に限定されないことが理解されるはずである。
【００９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡからの拡大したトリヌクレオチド反復のＲＡＰＩＤクローニングの概略である。一般に、繰り返し伸長検出（ＲＥＤ）アッセイは、単一な精製されたクローンが得られるまで、一連の豊富化ステップを通してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれか中に存在する拡大したトリヌクレオチド反復に従って用いられる。ゲノムＤＮＡは制限酵素で消化し、そのフラグメントをゲル電気泳動でサイズ分画し、そして拡大したＣＡＧ反復を含むことを決定するためにサイズ分画に基づいてＲＥＤ分析が行われる（図４〜６）。ＲＥＤ陽性画分をクローン化し、各々約５×１０4 クローンからなるクローンプールからのＤＮＡをアッセイし、そしてＲＥＤ陽性クローンプールがクローン化後ＣＡＧ豊富化手順（図８〜１０）にかけられる。次にその豊富化されたライブラリーからのクローンは、クローンがＣＡＧ拡大物を含むことを決定するために個々に又は各々約２０のクローンの小さなプールにおいてアッセイされる。
【図２】ゲノムＤＮＡ対照サンプルのＲＥＤ分析を示す、最適化ＲＥＤ手順を、周知の大きさのＣＡＧ拡大物を有する個体からのゲノムＤＮＡで行った。ＰＣＲアッセイにより測定したＳＣＡ１（４７  ＣＡＧ反復）、ＳＣＡ３（７１反復）、ＨＤ（６６反復）及びＤＭ（８０反復）対立遺伝子の大きさをホスホイメージパネルの下に示す。ＲＥＤ産物の大きさをパネルの横に示し、連結反応に用いたアニール温度を上に示す。アッセイした各々のゲノムサンプルについて、最も大きなＲＥＤ産物は周知の拡大したＣＡＧ対立遺伝子の大きさにほぼ対応する。
【図３】ゲノムＤＮＡ対照サンプルのＲＥＤ分析を示す。ホルムアミドを含まないが他は図２に用いたものと同一の反応緩衝液中でＳＣＡ３，ＨＤ、及びＤＭゲノムサンプルについてＲＥＤアッセイをくり返した。
【図４】２次元ＲＥＤ（２Ｄ−ＲＥＤ）分析を示す。２Ｄ−ＲＥＤ手順の概略を示す。ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロースゲルで分離する。ＤＮＡを含むレーンを切り出し、ゲルスライシング装置を用いてその長軸に沿って各々２mmに均一に切断する。各々のスライスを別個のエッペンドルフチューブに入れ、アガロースを消化し、そしてＤＮＡを沈殿させて少量の緩衝液に再度懸濁する。次に個々のサイズ画分でＲＥＤ分析を行う。概略的に示される例において、ＲＥＤ７０産物を作り出すゲノムＤＮＡサンプル（左）を２Ｄ−ＲＥＤにより別個のＲＥＤ４０及びＲＥＤ７０サイズ画分（右）に分解する。
【図５】周知のＳＣＡ拡大物を有する個体からのゲノムＤＮＡをＭｂｏＩで消化してサイズ分画する。アガロースゲル上の一部に流すことにより測定した重要な画分のサイズ分布を示す。
【図６】図５に示すサイズ画分のＲＥＤ分析を示す。画分３及び４は、もとのゲノムサンプル中に存在する拡大したＳＣＡ３対立遺伝子について予想されるＲＥＤ７０産物を作り出す。
【図７】ＭＮ１血族からのゲノムＤＮＡサンプルのＲＥＤ分析を示す。保有者（影響を受けた者）の個体の１つ及び８人の配偶者から作られたＲＥＤ産物を示す。
【図８】ＭＮ１血族からの拡大したＣＡＧ反復のクローニング及びクローン化後豊富化を示す。豊富化されていないクローンプールから単離したプラスミドＤＮＡのＲＥＤ分析を示す。長いＭＮ１  ＣＡＧ反復を含む２Ｄ−ＲＥＤサイズ分画したゲノムＤＮＡをラムダベクターにクローン化した。生じたライブラリーを約５×１０4 の一次クローンからなるプール内で増幅し、次にプラスミドライブラリープールにひとまとめにして移した。
【図９】クローン化後豊富化手順の概略を示す。ｄｓＤＮＡライブラリーを、ラウシルをＤＮＡ鎖に組み込んだｓｓＤＮＡライブラリーに変換する。（ＣＡＧ）10オリゴ（配列番号：４）を、長いＣＡＧ反復を含むこれらのクローンにおいて第２鎖合成を始めるのに用いる。次にもとのＤＮＡ鎖からウラシル残基を除くために、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加える。この混合物の大腸菌への形質転換によりＣＡＧ含有ｄｓＤＮＡクローンを修復及び複製し、ｓｓＤＮＡバックグラウンドを分解し、除去する。
【図１０】一次プール３及び８【図９】由来のＣＡＧ豊富化クローンプールのＲＥＤ分析を示す。各々のプールは２０の個々のクローンからのＤＮＡを含む。
【図１１】ＭＮ１  ＣＡＧ反復に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＣＡＧ反復（下線）は拡大物を有さないＭＮ１血族からの個体内に１１〜２４の反復で種々であり、拡大物を有する個体は１００を超える反復を有する。
【図１２】ＭＮ１血族の系統図を示す。ＭＮ１  ＣＡＧ反復配列の各々の対立遺伝子内のＣＡＧ反復の数を数字で示し、拡大したＣＡＧが単離された個体を星印で示す。
【図１３】ＳＣＡ７拡大ＣＡＧ反復のＲＡＰＩＤクローニングを示す。網膜症を伴う常染色体優性運動失調の個体（図１６のＡ１）から単離したＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡの２Ｄ−ＲＥＤ分析を示す。ＣＡＧ拡大物を含むゲノムＤＮＡサイズ画分（＊で示す）をラムダベクターにクローン化した。生じたライブラリーをプール内で増幅し、それをまとめてプラスミドライブラリーに移した。
【図１４】ＲＥＤ陽性一次クローン由来のＣＴＧ豊富化クローンプールのＲＥＤ分析を示す。各々のプールは３６の個々のクローンからのＤＮＡを含む。プール４中の個々のクローンからのプラスミドＤＮＡのＲＥＤ分析により拡大したＣＡＧ反復を含む２つのクローンを同定した。
【図１５】クローン４−２内のＳＣＡ７拡大物に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ＣＡＧ拡大物は下線で示す。
【図１６】網膜症を伴う常染色体優性運動失調と診断された系図におけるＳＣＡ７  ＣＡＧ対立遺伝子のＰＣＲ分析を示す。（カッコ内の）見積もられた発症年齢及びＳＣＡ７拡大物中のＣＡＧ反復の数を各々の血族に数字で示す。拡大したＣＡＧが単離された個体を星印で示す（Ａ１）。
【図１７】図１６に示す個体のゲノムＤＮＡから生じたＰＣＲ産物のアガロースゲル分析を示す。拡大した対立遺伝子は影響を受けた又は危険性のある個体においてのみ存在し、拡大物の大きさは発症年齢と逆比例する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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