(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を固相に結合すること、該分析対象物にマーカーを付けること、及び前記固相に付けられたマーカーを検出すること、を含む、表面に吸着された又は液状試料中に存在する分析対象物を分析するためのイムノアッセイ法において、マーカーが付けられた固相上に沈澱を生じさせることができ、且つ、前記沈澱の形成による前記固相の表面マスの変化をｉｎ  ｓｉｔｕで測定することにより検出される、マーカーと検出手段の組み合わせが使用されること、但し、該検出が、フラッシング、乾燥、又はリンスを行うこと無く実施されることを特徴とする、イムノアッセイ法。
【請求項２】
前記検出手段による検出が、沈殿の生成と並行して及び／又は沈殿生成後所定の時に行われる、請求項１に従うイムノアッセイ法。
【請求項３】
試料中の分析対象物の濃度を分析するための定量分析法である、請求項１〜２のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項４】
固体表面上、生物学的膜上、もしくは生物学的モデル膜上に吸着され又は結合された分析対象物の表面濃度を測定するための定量分析法である、請求項１〜３のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項５】
固相の表面マスの変化が偏光解析法により測定される、請求項１〜４のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項６】
均一にアクセス可能である表面で偏光解析法が実施される、請求項５に従うイムノアッセイ法。
【請求項７】
均一にアクセス可能である表面が、回転ディスクである、請求項６に従うイムノアッセイ法。
【請求項８】
固相の表面マスの変化が表面プラズモン共鳴により測定される、請求項１〜４のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項９】
固相の表面マスの変化が全内反射蛍光法により測定される、請求項１〜４のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項１０】
前記マーカーが酵素であり、且つ、前記検出手段が前記酵素の基質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項１１】
酵素として西洋ワサビパーオキシダーゼが使用され、且つ、基質として3,3'-ジアミノベンジジンが使用される、請求項１０に従うイムノアッセイ法。
【請求項１２】
酵素としてアルカリフォスフォターゼが使用され、且つ、基質として5-ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムが使用される、請求項１０に従うイムノアッセイ法。
【請求項１３】
1段階 ELISAとして実施される、請求項１〜４のいずれか1項に従うイムノアッセイ法。
【請求項１４】
固相としてケイ素スライドが使用される、請求項１〜１３のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【請求項１５】
固相としてクロムがスパッタされたスライドガラスが使用される、請求項１〜１３のいずれか１項に従うイムノアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分析対象物、特に、表面に吸着された分析対象物、又は、溶解している液状試料において起こるような分析対象物、又はそれらの特定の位置、例えば特定の表面、の分析対象物を分析するためのイムノアッセイ法に関する。
【０００２】
より特には、本発明は、試料中の全濃度、もしくは、特定表面における濃度を含む、液状試料中の分析対象物の濃度を測定するための酵素と組み合わされた（リンクされた）免疫吸着分析法（ELISA）に関する。詳細には、本発明は、新しいイムノアッセイ法及びこれらの新しいイムノアッセイ法を行うために特に適合されたキットに関する。
【０００３】
【従来の技術】
イムノアッセイ、例えばELISAは、ほとんど無制限の種類の有機物質、例えばペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、ビタミン、医薬、炭水化物等の天然又は合成化学物質を、種々の目的、例えば特に診断目的だけでなく法医学用途、食品品質管理、及び広く何らかの分析目的で、定性的、もしくは大抵の場合、定量的に分析するために広く使用されている。分析されるべき該物質総てを、本明細書において、広く分析対象物という。
【０００４】
多くの異なった別形のELISA法が存在する。以下の記載は、典型的なELISA技術を説明することを目的とする。該記載は、決して完全ではなく、且つ、本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。例えば、以下の記載において、ELISA法は試料を分析対象物の第１の結合相手（パートナー）と供にインキュベートする工程、形成された反応生成物を、分析対象物の第２の結合相手（本明細書において、分析対象物の結合相手を、分析対象物のための結合相手という場合がある）、と供にインキュベートする工程の、別個の工程を含むものとして記載される。しかし、いくつかの現存するELISAの態様は、そのような別個のインキュベーション工程を含まず、分析対象物が同時に、又は、僅かな時間間隔で次々と、その第１および第２結合相手と反応することが許容される。競合ELISAは、ELISAの他の別形例であり、本明細書においては詳述しない。本発明は、原理的には、何らかの及び総てのELISAの別形、及び、例えば酵素の使用を含まないという理由から、厳密にはELISA法ではない、類似のイムノアッセイ法に適用できる。
【０００５】
典型的なELISAにおいて、特に液状試料中の（該試料は体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰等であってよい）対象の分析物の存在を検出するため、もしくは濃度を測定するために、試料が分析対象物のための第１結合相手と接触させられ、そして、該試料および分析対象物のための結合相手が、試料中に含まれている分析対象物が該結合相手と結合するのに十分な時間インキュベートされる。
【０００６】
該結合相手の典型的な例は、分析対象物に特異的な抗体、例えば問題の分析対象物との特異性を有するモノクローナル抗体である。しかし、他の種類の物質及び構造も結合相手としての資格を有し得る。例えば、問題の分析対象物の、天然のレセプター並びに分析対象物が結合し得る他の物質および構造も結合相手として有用であり得る。結合相手は、通常、特異的な結合相手であるが、それは必須ではない。第１の結合相手無しで実施すること及び分析対象物を直接（例えば吸着により）又は不特定の結合リンカー物質によって固定化する、すなわち、固相に結合することが可能でさえある。このような別形の総ては、本発明の範囲に含まれることが明白に意図される。本明細書において、用語「表面に吸着された分析対象物」は、分析対象物の表面への取り付けもしくは結合をもたらす何らかの方法によるものを意味する。
【０００７】
通常、前記第１の結合相手は固定化された形態で、すなわち固相、例えばポリスチレンビーズ、または反応容器の内表面（例えば反応管、もしくはミクロタイターのプレート）に取り付けられて、使用される。該結合相手は、固相表面に物理的に吸着されていてよく、又は、通常、共有結合で取り付けられていてよい。ELISAのいくつかの態様によれば、該結合相手は好適なカップリング剤を用いて、及び他の態様では、リンカー物質、例えばビオチン及び（ストレプト）アビジン、を用いて取り付けられる。ELISAのいくつかの態様では、結合相手の固定化は、試料と結合相手とのインキュベーションの後で行われ、それにより、分析対象物と結合相手の間の反応が液相内で進行することが可能となる。その後の固定化を可能にするために、前記結合相手はビオチン化形態で適用されてよい。そうすれば、固定化は、（ストレプト）ビオチンを担持した固相を用いて達成できる。
【０００８】
第１の反応の結果、試料中に存在する何らかの分析対象物が、その結合相手に結合され、及びそれを介して固相に結合されるようになる。通常、液体が除去されて、固相が洗浄された後、結果物を検出可能にする工程が行われる。分析対象物が存在する場合には、該分析対象物と結合相手とが取り付けられた固相が、分析対象物のための第２の結合相手と接触させられる。再び、特異的な結合相手であることが原則であるが、厳格な要件ではない。通常、この第２の結合相手は、その検出を可能にする標識／マーカーを担持する。ELISAのいくつかの態様では、しかし、第２の結合相手は、標識がつけられていない形態で使用され、第２の結合相手のための標識された結合相手を用いて、結合後に標識される。その例として、第２の結合相手は、問題の分析対象物に対するマウス抗体（ポリクローナルもしくはモノクローナル）であってよく、及び、それが第１の結合相手を介して、固相に取り付けられている分析対象物に結合した後に、標識されたヤギ抗マウスIgGが、固定化された錯体に標識を付する。
【０００９】
ELISAにおいて、該標識は基質を検出可能に転化することができる酵素、例えばパーオキシダーゼ、からなってよく、例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で、基質、例えば3,35,5−テトラメチルベンジジンを着色生成物に転換できる。
【００１０】
通常は、酵素で標識された反応物が、固定化された錯体に取り付けられた後、該錯体が結合されている固相が、実際の検出段階に入る前に洗浄される。
【００１１】
検出段階において、錯体が取り付けられている固相に、基質溶液が添加され、そして、基質の転換があれば、検出される。分析対象物の定量測定を可能にするために、固相が基質溶液と供に、固定時間インキュベートされ、該時間は、基質の着色物への実質的な酵素的転換を許容するのに十分長い時間でなければならない。基質転換の終了後、着色の強度、それは固定化された酵素の量に比例する、が光学的手段、例えば選択された波長、例えば450nm、での吸光度を測定する分光光度計により測定される。
【００１２】
現存するELISA技術の欠点は、低い分析対象物濃度において、吸着および検出段階が、分析感度を確保するために、非常に長い時間を要することである。分析対象物の表面への吸着速度は、溶液中の分析対象物の濃度に比例し、従って、非常によく攪拌された系においても、非常に遅い。液体１ml中にナノグラムまたはピコグラムでさえ存在する分析対象物の信頼できる測定を可能にするために、吸着段階は１〜数時間を要する。
【００１３】
現存するELISA技術の他の欠点は、それらが、分析対象物の非常に低い表面濃度、例えば生物学的（モデル）膜の表面におけるような、の測定を許容しないことである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、吸着及び／又は検出段階でのインキュベーション時間の低減または分析感度の向上、またはその両方を許容する修飾されたイムノアッセイ、例えばELISA、技術を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、特定の表面における分析対象物の濃度の測定を許容する、修飾されたイムノアッセイ、例えばELISA、技術を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、該修飾されたイムノアッセイ技術を実施するのに特に適合された製品を提供することである。
【００１７】
本発明は、イムノアッセイ、例えばELISA、の分析原理の基本的な修飾に関し、溶液（バルク相）中の酵素生成物の蓄積の測定を、固体表面上への沈殿の蓄積のｉｎ  ｓｉｔｕ（以下、インシチュともいう）測定によって置き換える。本発明は、沈殿形成系、例えば固体表面上への沈殿形成に結びつく酵素-基質の組み合わせの使用、及び、表面マスの測定、例えば偏光解析法又は他の表面マス測定技術を含む。
【００１８】
本発明を使用することによって、固体表面上に吸着された非常に低い濃度の分析対象物を定量することができ、分析対象物の液体から表面への吸着過程が、実質的に短くなる。さらに、時間のかかる、バルク液相中での生成物濃度の蓄積が、もはや必要ではなく、分子の大きさ程度に過ぎない薄層の沈殿の吸着により置き換えられる。この修飾は、分析感度の多大な増加を意味し、及び、ずっと短時間の分析の可能性を提供する。それは、また、生物学的（モデル）膜表面で起き得るような非常に低い表面濃度の定量を可能にする。
【００１９】
分析対象物濃度の免疫沈澱法による定量は、周知の技術である。分析対象物-抗体の結合体の沈殿は、該方法では沈澱させる抗体の添加後に形成され、通常、単に沈降させられ、集められ、及び重さが計られる。分析対象物又は抗体が大過剰存在する中での僅かな沈殿にもかかわらず、非常に良く規定された条件下では、データの定量的解釈が可能である（欧州特許願第０368462号を参照されたい）。 この方法の、より感度が高く、及び速い別形では、抗体で覆われた（ラテックス）粒子が添加され、結合体形成が光散乱法により測定される。このようにして、時間のかかる沈降段階が除かれ、測定は秒単位で完結できる。本発明は、これらの方法と本質的に異なる。前記方法では、分析対象物が、固体／液体界面で濃縮されず、及び、酵素により沈殿が生成される場合のような、該沈殿物の量が時間と供に継続的に増加することがない。これらの要因により、及び非特定的な結合体のために、これらの方法は、限定された感度しか有さず、且つ、分析対象物濃度がng/ml範囲未満の測定ができない。
【００２０】
酵素に誘導された、（着色された）沈殿物の形成を含む分析方法は、自体公知である。該方法は、例えば免疫細胞化学分野において知られている。この公知法において、組織学の研究における、種々の組織細胞の存在及び/又は局在化を示すために、まず組織の薄い切片を調製し、該組織を凍らせた後、又は、種々の形態の化学的固定を用いた後、タンパク質を特異的に認識して結合する抗体を加えて、組織中の特定のタンパク質が検出される。過剰の抗体が除去され、そして、第２の、酵素結合された抗体、例えばIgG−HRPコンジュゲートが添加される。過剰のコンジュゲートを除去した後、好適な基質、例えば3,3-ジアミノベンジジン（DAB）が添加される。繊維中に特定のタンパク質が存在すれば、DABから誘導された沈殿の形成による、局所的着色が起こる。
【００２１】
本発明は、しかし、局在化された及び繊維中のタンパク質の検出には関与せず、固体表面に吸着された、または溶液中に存在する分析対象物（濃度）の検出および測定に関する。さらに、本発明は表面マス（ng/cm2範囲）の（好ましくは定量）測定に関するが、公知の免疫細胞学法では、目視または顕微鏡観察による定性的結果が得られる。ある研究では、光学濃度測定の適用により着色の強度が測定されているが、該技術は、表面マスの定量測定、例えば偏光解析法等、とは組み合わされていない。これは、繊維切片の厚み（マイクロメーター）が、本発明の方法で測定される沈殿層の厚み（ナノメーター）とは、オーダー異なるので、実施が大変に困難であるためであろう。
【００２２】
先行技術は、オキサイド、ナイトライド、またはポリマーフィルムでコートされた、特別に調製された光学的に活性な受容表面上での光学的干渉に基づくイムノアッセイを使用することを示唆する。そのような予備コートを使用すると、追加の沈殿物層の吸着は目視で検出可能な色の変化をもたらす。該方法は、米国特許第5,418,136号明細書に提示されている。沈殿形成の目視検出の他に、偏光解析による沈殿の測定も適用されている。しかし、要求される種々のリンス及び/又は乾燥工程がインシチュ測定で得られる高い感度を排除する。血漿、血清、血、ミルク、または尿のような生物学的体液中の非常に低い分析対象物濃度の検出のためには、他のバルク物質、例えばアルブミン、の非特定的に吸着されたマスがしばしば吸着された沈殿物のわずかな量を超え、リンスまたは乾燥は、特定の効果をはるかに超える表面マスの変化をもたらす。インシチュ法は、分析対象物、コンジュゲート、及び、クロムジェニック基質が洗浄または乾燥工程の挿入無しに、いっしょに添加される、1段階ELISAの可能性を提供する。普通のELISAでは、これは不可能である。なぜなら、過剰な非結合コンジュゲートによる色の生成が、表面上の、僅かな量の、分析対象物が結合されたコンジュゲートによる色の生成をはるかに超えるからである。それに対して、提供される技術は、表面に結合されたコンジュゲートにより生成された沈殿だけを測定する。より高い感度に加え、本発明におけるインシチュ法の使用は、より速い分析を可能にする。なぜなら、時間がかかる、リンス及び/又は乾燥工程、後続する別個の沈殿の測定工程が無くなるからである。
【００２３】
上述の２つの特許に記載されている方法からの、他の基本的な相違は、本発明に従い、特別に調製された光学的に活性な又は、ポリマーでコートされた表面を何ら必要としないことである。該表面は、丁度、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づく技術で使用される光学的に活性なスライドのように高価であるが、本発明では、安価な（使い捨て可能な）反射する表面、例えばシリコンウェーハーまたはクロムスパッタされたスライドガラスを使用することができる。
【００２４】
先行技術は、タンパク質吸着測定の感度を増強する手段として増幅された偏光解析法の使用を示唆する[5]。関連ある先行技術法では、標識付けする抗体のマスは、それをケイ素スライドにカップリングすることで増大される。局在研究においては、抗体がコートされた金粒子も、又、主に電子顕微鏡と組み合わされて使用されている。表面マスの増幅のための他の先行技術は、ビオチン化された又は分析対象物がコートされたリポソームが使用される[７，8]。
【００２５】
これらの技術は、本発明と基本的に異なる。なぜなら、それらは標識付けする分子毎の沈殿の継続的な蓄積を測定せず、単に、より重い標識を使用するだけである。該重たい標識のより良い検出可能性は、それらの遅い表面への拡散によるより遅い吸着により相殺されなければならず、及び、このことは、高速分析へのこれらの方法の使用を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、分析対象物を固相に結合すること、該分析対象物にマーカーを付けること、及び前記固相に付けられたマーカーを検出すること、を含む、表面に吸着された又は液状試料中に存在する分析対象物を分析するためのイムノアッセイ法において、マーカーが付けられた固相上に沈澱を生じさせることができ、且つ、前記沈澱の形成による前記固相の表面マスの変化をインシチュで測定することにより検出される、マーカーと検出手段の組み合わせが使用されることを特徴とする、イムノアッセイ法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、表面に吸着された、もしくは、液状試料中に存在する分析対象物を分析するためのイムノアッセイ法を実施するためのキットにおいて、該キットが上記本発明に従う方法を実施するための固相を含むことを特徴とするキットを提供する。好ましくは、該固相がケイ素スライドもしくはクロムスパッタされたスライドガラスである。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明は、分析対象物を固相に結合すること、該分析対象物にマーカーを付けること、及び前記固相に付けられたマーカーを検出すること、を含む、表面に吸着された又は液状試料中に存在する分析対象物を分析するためのイムノアッセイ法において、マーカーを担持する固相上に沈澱を生じさせることができ、且、前記沈澱の形成による前記固相の表面マスの変化をインシチュで測定することにより検出される、マーカーと検出手段の組み合わせが使用されることを特徴とする、イムノアッセイ法を提供する。
【００２９】
用語「インシチュ検出」は、沈澱が形成されるに従い、表面マスの変化が測定されることを表すことが意図される。換言すれば、表面マスに追加の効果を及ぼすために、測定結果における誤差を招き得る、フラッシング、乾燥、リンス、又は他の処理が、実施されない。さらに、該インシチュ検出は、溶液相における過剰の酵素による基質の転換の存在下においても、表面に固定された酵素による沈澱形成の測定を有利に許容する（一段階 ＥＬＩＳＡ）。
【００３０】
先行技術の項において説明したように、本発明は広汎な種々のイムノアッセイ法に関する。ほとんどの方法において共通するのは、分析対象物が、仮に試料中に存在する場合には、該分析対象物の結合相手（パートナー）、通常、特異的な結合相手、例えば、前記分析対象物と特異的に結合する抗体、を介して固相に結合される。しかし、ある実施態様においては、分析対象物が、吸着によって、又は非特異的な結合手段によって、固相に直接結合されてよい。
【００３１】
前記結合相手が、仮に使用される場合には、予め固相に取り付けられていてよい。又は、反応対象物が存在したとすれば、反応対象物と反応した後に固相に取り付けられてよい。
【００３２】
イムノアッセイの実施態様のほとんどは、さらに、分析対象物にマーカーを取り付けるために、分析対象物質の第2の結合相手が使用されることを共通とする。再び、結合相手は、仮に使用される場合には、好ましくは特異的な結合相手、例えば分析対象物質と特異的に反応する抗体である。
【００３３】
この、分析対象物質の第2の相手は、マーカーを担持（キャリー）してよい。又は、該マーカーは分析対象物質の前記第２の結合相手と結合可能である物質により担持される。例えば、分析対象物質の前記第２の結合相手が、分析対象物質に対するネズミのモノクローナル抗体であるとすれば、マーカーはこのモノクローナル抗体に直接取り付けられてよく、又は、抗マウス Ig 抗体（すなわち、ネズミの免疫グロブリンに特異的に結合する抗体）に取り付けられてもよい。
【００３４】
分析対象物質へのマーカーの取り付けは、該分析対象物質を固相に取り付けるのと同時に、又は、その前に、又は、その後に、のいずれにおいても、行なうことができる。大抵のイムノアッセイ法では、最初に分析対象物質を固定化し、その後において初めて、該固定化された分析対象物質にマーカーを結合することが好ましい。
【００３５】
好ましくは、本方法は試料中の分析対象物質の濃度を測定するための定量方法である。他の好ましい実施態様において、本発明の方法は、特定表面上の分析対象物質の濃度を定量する、定量方法である。問題の表面は、生物学的（モデル）膜、すなわち、細胞膜表面又は人工表面、例えば、天然の表面を模すことを意図された人工表面であり、好ましくは均一にアクセス可能な表面上に析出されており、且つ、沈澱形成の定量的解釈を可能とするものであり得る。本発明は、しかし、定量方法には限定されず、試料全体中、又は特定位置、例えば特定の表面位置において、極度に低濃度で存在する分析対象物質を定性的に分析するために有用であってよい。
【００３６】
好ましくは、固相の表面マスの変化が、偏光解析法により求められる。しかし、本発明は、固相の表面マスの変化を求める他の方法、例えば表面プラズモン共鳴及び全内反射蛍光、にも及ぶ。
【００３７】
最も好ましい実施態様において、前記マーカーは酵素であり、且つ、前記検出手段が前記酵素の基質を含む。好ましくは、イムノアッセイ法はELISA法である。好ましくは、酵素として西洋ワサビパーオキシダーゼが使用され、及び、基質として3，3’-ジアミノベンジジンが使用される。しかし、本発明は、沈澱を作ることができる、他の酵素−基質の組み合わせ、例えば酵素としてアルカリフォスフォターゼーおよび基質として5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム、にも及ぶ。さらに、本発明は、前記マーカーを担持する固相上で、沈澱形成可能な、他の何らかのマーカーと分析手段の組み合わせをも含む。例えば、沈澱の形成は、金属もしくは非金属粒子の核生成成長による核生成の結果、又は、連鎖もしくは重合反応の結果、例えば紫外線照射への暴露により重合可能である不飽和炭化水素等、であってよい。従って前記マーカーは不飽和炭化水素を、及び、前記検出手段は、同種、もしくは、異種の炭化水素の追加量と重合開始手段（例えばUV照射）とを共に含み得る。又は、前記マーカーは、金属、例えば金、銀等、もしくは、非金属、例えばセレン、テルル、炭素、ケイ素等、のコロイド状粒子、を含んでよく、前記検出手段は、同種または異種の金属もしくは非金属の追加量と、マーカーとして使用されるコロイド粒子の成長を促進する手段（例えば、前記金属を含む化学化合物から金属を遊離することができる、好適な還元剤、例えば水素化ホウ素化合物）を共に含んでよい。
【００３８】
本発明に従い、固相としてケイ素製のスライドガラス（ケイ素スライド）が使用されることが好ましい。しかし、本発明は、表面マスの変化を測定するための技術において使用に適する他の固相、例えばクロムスパッタされたスライドガラス、にも及ぶ。原理的には、該固相は何らかの簡易且つ安価な反射性の表面から成っていてよく、米国特許第5,418,136号明細書に記載されている特別の光学的活性層の析出のような前処理は要しない。
【００３９】
固相に吸着した分析対象物の量は、一般に、系内の輸送条件（拡散及び攪拌）に依存する。通常の層流系において、このことは、吸着量は下流方向で減少し得ることを意味する。なぜなら、流体境界層から、次第に分析対象物が無くなっていくからである。この、分析対象物の吸着量の位置依存性は、例えば、先ず膜上に吸着されたタンパク質の僅かな量の生物学的効果が測定され［4］、次いで、この効果に対応するタンパク質の量が決定される場合における、沈澱形成速度の定量描写性を妨げる。この問題は、いわゆる均一にアクセス可能な表面上で、本発明の方法を定量的に行なうことによって、すなわち、全表面に亘って同一の吸着条件とすることで克服されることが見出された。そのような表面を用いることにより、生物学的効果が、単位表面積当たりの量で表された吸着された分析対象物の量に関連付けられることができる。均一にアクセス可能な表面、溶液中の回転ディスク、が開発され、その表面上の分析対象物の偏光解析法が可能である［9］。回転ディスク上の偏光解析法との組み合わせは、従って、本発明の好ましい実施態様である。
【００４０】
加えて、第2の点として、本発明は、液状試料中の分析対象物を測定するイムノアッセイ法を実施するためのキットを提供する。該キットは、本発明に従う方法を実施するために特別に適合された手段の少なくとも１つを含む。
【００４１】
特に、前記手段は固相の表面マスの変化を求めるための技術を適用するのに適する固相、例えばケイ素、またはクロムスパッタされたスライドガラス、を含む。好ましくは、前記固相は分析対象物の結合相手を、最も好ましくは、特異的な結合相手を担持する。
【００４２】
該キットは、種々の従来の構成成分をさらに含むことができるが、但し、それは、沈澱形成可能な、マーカーと検出手段の組み合わせ、最も好ましくは、組み合わされると、沈澱形成可能な酵素と基質を含む。
【００４３】
分析対象物の、緩衝液から平面への吸着、及び、より一般的には平面上への固体物質の蓄積が、偏光解析法により検出及び定量されてよい。これは単色光の吸着表面での反射を利用した光学的な技術であり、分析対象物の吸着量の定量的測定を、検出限界１〜５ng/cm2で許容する。
【００４４】
反射表面は、本実施例においては前処理されたケイ素スライドが使用されており、例えば、5mlの緩衝液で満たされたセル等の中に置かれる。632.8nmの波長のHe−Neレーザーからの単色光が、最初に偏光プリズムPを、次いで、その高速軸(fast axis)が入射面に対して４５度である四分の１波長板を通過する。光は、次いでセルに入り、ケイ素スライドで反射して、セルを出て、第2の偏光プリズムAを通過し、最後にフォトダイオードで検出される。P及びAの位置は、フォトダイオードに到達する光の強度が最小であるようにコンピュータにより調整される。固体物質が、反射表面に吸着すると、最小強度を維持するために、P及びAの位置が変えられる。該吸着は、従って、偏光子Pと分析計Aの位置の変化をもたらす。反射表面がケイ素スライドであり、及び吸着している分析対象物が有機物質、例えばタンパク質、リピッド、糖もしくは有機沈澱物である特別の場合には、吸着された表面マスの変化は、偏光子における変化に直接比例する。実施例で使用されたスライドは、シリコンウェハー（Wacker Chemitronic製、ｎ型、リンがドープされている）から切出された。測定は、回転攪拌子によって継続的に攪拌しながら、室温で行なわれた（20℃±1℃）。装置および分析データーは、本出願人による先の文献に記載されている［1，2］。
【００４５】
典型的な実験においては、前処理されたスライドが偏光解析法セル中に置かれ、ゼロ測定が為される（P0、A0）。次いで、分析されるべきタンパク質が緩衝液に添加され、適当な時間、例えば5分間、スライドに吸着させられる。本発明におけるような、非常に低いタンパク質濃度では、この間に吸着するタンパク質の量は、偏光解析法の検出限界未満であるので、位置P0、A0は本質的に変化されずに、維持される。次いで、セルが新しい緩衝液でフラッシュされて、スライド上の自由な表面がアルブミンまたは他の大きなタンパク質でブロックされる。抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート（conjugate）が添加され、適当な時間、例えば２分間、吸着させられる。再び、セルがフラッシュされ、そして、3，3’−ジアミノベンジジン（DAB）及びH2O2を含む基質溶液が添加される。該コンジュゲートが、吸着されたタンパク質と結合した場所において、HRPの酵素的活性によりDABの沈澱が形成される。継続的なDABの転換により、沈澱物の表面マスはもとのタンパク質マスよりも、すぐに大きくなり、偏光解析法で検出可能になる。
【００４６】
非常に低濃度のタンパク質の定量を目的とする他の設定においては、分析対象物、コンジュゲート及び沈澱形成基質を追加する間のフラッシングを無くして、分析対象物、コンジュゲート及びDAB−基質がいっしょに添加され、又は互いに短時間の後に次々と添加される。このようにして、１段階ELISAが得られる。
【００４７】
本発明に従い、固定表面上への沈澱形成速度の測定は、好ましくは、偏光解析法により行われる。しかし、本発明の分析原理は、表面マスの定量測定のための他の技術、例えば偏光解析以外の形態の反射法、表面プラズモン共鳴（SPR）、及び全内反射蛍光（TIRF）にも同じように適用し得る。偏光解析法は、反射法の特別の形態であり、より簡易な形態、例えば四分の一波長板を除いた態様、もまさに存在する。これらの方法は、光反射が分析対象物が吸着した反射表面と同じ側で起こるという共通の特徴を有する。SPR及びTIRFについては、このことは正しくなく、光反射は、スライドの非吸着面で起こる。
【００４８】
SPRでは、いわゆるエバネッセント波が、スライドの他の面に現れ、吸着された分析対象物質層の屈折率に感度を有する。或る入射角度において光共鳴が起き、そして、分析対象物の吸着マスが、これらのデータから計算できる。SPRは、偏光解析法とほぼ同じ検出限界を有するが、反射スライドが、スライドの分析対象物が吸着する面、通常は薄い金層、上に、高い屈折率を有する物質の薄い層を必要とする。この層は、狭い仕様を満たさなければならないので、SPRスライドは高価である。それに対して、偏光解析法で使用されるケイ素スライドは安価であり、使い捨て可能である。
【００４９】
TIRFについては、全反射となる入射角度において、エバネッセント波が生じる。該波は、溶液中に短い距離で侵入し、分析対象物に結合させた蛍光プローブを励起する。蛍光信号の強度は、分析対象物の吸着量に比例する。高価なスライドは必要ないが、偏光解析法またはSPRに比べて、感度が悪い。
【００５０】
表面マスの他の測定方法とは別に、異なる酵素−基質の組み合わせも、又、沈澱を生じる限り、本発明において使用できる。例示された西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)と3，3’−ジアミノベンジジン(DAB)に代えて、例えばアルカリフォスフォターゼ（AP）を酵素として、及び、5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート(BCIP)とニトロブルーテトラゾリウム(NBT)を基質として使用できる。他の何らかの酵素／基質の組み合わせ、又は、酵素転換に基づくのではなく、例えば、核生成に基づく沈澱形成をも使用できる。
【００５１】
加えて、本明細書において挙げる実施例は、緩衝液中のタンパク質濃度の定量を説明するが、本原理は他の何らかのタイプの溶液もしくは懸濁物、とりわけ医療目的で使用されるもの、例えば尿、血漿または全血にも、有効である。
【００５２】
本発明を説明するために、本明細書において挙げる実施例は、３つの異なるタンパク質の分析、分析されるべきタンパク質（分析対象物）に関して異なるだけでなく、表面調製および検出原理において異なるものに関する。
【００５３】
実施例１は、アネクシン Vの分析に関する。アネクシン Vは、未だ生物学的作用が不明の、細胞内タンパク質である。アネクシン Vは、そのリン脂質膜への吸着についての、非常によく定義されたパラメータによって、モデルタンパク質として使用されてきた。それは、カルシウムの存在下で、膜がアミノリン脂質、例えばフォスファチジルセリン（PS）を含む場合には、リン脂質膜への高い結合アフィニティを有するタンパク質である。吸着プロセスは、輸送で制限され、アネクシンVの吸着は、攪拌条件及びアネクシンVの溶液中濃度から、正確に計算することができる。実施例１に示すように、アネクシンVは、リン脂質２重層で予備コートされた、ケイ素スライド上に直接吸着され、そして、本発明に従う２段階イムノ法により検出される。前記リン脂質２重層は、分析対象物に対する抗体ではない、特異的な結合相手の例である。この例は、アネクシンVの膜への吸着は、血漿中のアネクシンVの正常な生理学的濃度、１〜５ng/mlにおいて、本発明の方法により分析することができること示す。
【００５４】
実施例２においては、検出について、サンドイッチ原理を用いて、脂肪酸−結合性タンパク質（FABP）（及びアネクシンVも）が、ポリ塩化ビニルコーティングされたケイ素スライド上で定量された。FABPは、正常な血漿中濃度１〜２ng/mlの、心臓のマーカータンパク質であり、現在、急性心筋梗塞の早期マーカーとして、及び急性心筋梗塞の後の成功した再灌流治療のマーカーとして研究されている。今日、このタンパク質のためのELISAは、約1時間の分析時間がかかるが、本発明の技術により、この時間を数分に減じることができた。専用の機器を使用することによって、迅速な、ベッドサイド測定が可能となろう。
【００５５】
実施例３はインターロイキン６（IL6）の分析のための本発明の利用を示す。IL6は、炎症性反応の重要なメディエイターであり、正常な血漿中の濃度が10pg/ml未満である。従来のELISAによる該濃度の決定は、数時間かかるが、本明細書で示すように、本発明の新しい方法を使用することによって、30分以内に行なうことができる。IL6については、キャッチャー抗体が強疎水性（シラン化された）ケイ素スライド上に15分間のみ吸着され、ビオチン−ストレプトアビジン系が検出のために使用される。
【００５６】
これらの実施例は、本発明の方法が広い範囲の表面及び検出原理に使用できることを実証する。シリコンスライド以外の他の反射性表面、例えばクロムスパッタされたスライドガラス、も同様に使用し得、実際過去に発明者らの研究班において使用されている[1，2]。
【００５７】
これらの事情を考えると、以下の側面が、本発明として考慮される部分である：
１）表面に結合された分析対象物に直接的に結合する、又は、これらの分析対象物に結合する他の分子へカップリングされた（酵素）−分子の継続的な作用により形成された沈澱の蓄積（速度）の、インシチュ偏光解析測定法による特定の分析対象物、例えばタンパク質、ペプチド、糖など、の溶液中濃度の定量的測定。
２）何らかのタイプの溶液又は懸濁物、例えば蒸留水、緩衝液、生理的食塩水、尿、血漿、全血等、の中の該分析対象物の濃度の測定のための原理１）の使用。
３）表面マスの定量測定のための他の技術、例えば偏光解析法以外の形態の反射分光法、表面プラズモン共鳴、全内反射蛍光等、と組み合わせた原理１）の使用。
４）何らかの他の形態の反射表面又は他の形態の表面調製、例えばリン脂質もしくはポリマーによる反射表面のプレコーティングと組み合わせた原理１）の使用。
５）検出原理の何らかの修飾、例えば他の酵素／基質の組み合わせ、もしくは沈澱形成反応、サンドイッチ技術、単一対複数酵素分子タグ、直接もしくは競合結合等、と組み合わせた原理１）の使用。
６）分析対象物、コンジュゲート、及び沈澱形成基質を同時に添加し、あるいは、互いに短時間後に次々に添加して、リンスまたはフラッシング工程を挿入しない（一段階ELISA）イムノアッセイにおける原理１）の使用。
７）沈澱形成速度の定量的描写のため、及び、表面に結合された（生物学的）活性を単位表面積当たりの結合された活性剤の量で表現するために、均一にアクセス可能な表面、好ましくは回転ディスクの、使用と組合わせた原理１）の使用。
【００５８】
実施例１ アネクシンV濃度の定量
文献に記載されているように[3，4]、20％DOPS／80％DOPC混合物を超音波処理して得た 20μMのリン脂質小疱を添加して、リン脂質2重層でケイ素スライドを覆った。表面上に安定なリン脂質2重層が形成された後に、緩衝液でセルをフラッシュして過剰なリン脂質を除き、ヒトアネクシンVを添加した。200秒の吸着の後、セルをフラッシュして、ウサギのポリクローナル抗アネクシンVを120秒添加した。セルを再びフラッシュして、HRPにコンジュゲートされた豚抗ウサギIgGを120秒加えた。セルを再びフラッシュして0.278mMのDAB及び0.834mMのH2O2を添加して、表面上への沈澱形成を偏光解析法により測定した。結果を表１に示す。
【表１】
0004412849.tif 000002
検出限界を、ブランクについての偏光子の変化に標準偏差の３倍を加えた大きさを超える偏光子の変化として定義すると、表１から、最低表面濃度は0.01ng／cm2であり、これは直接偏光解析法による検出可能な量の約100倍低く、300秒のインキュベーション時間内で既に測定できた。
【００５９】
実施例２  FABP濃度の定量
ケイ素スライドを、シクロヘキサン中のPVC溶液にスライドを自動浸漬する方法によって、厚み20〜25nmの均一なPVC層でコートした。該スライドを、抗FABP（及びアネクシンV）モノクローナル抗体で、一昼夜の吸着により、コートし、及び、自由表面空間をアルブミン又はスキムミルクパウダーでブロックした。該スライドを10分間種々の濃度のFABP（またはアネクシンV）に曝し、吸着されたタンパク質をモノクローナル抗体／HRPコンジュゲートにより直接、又はアネクシンVについては、上述の２段階法で検出した。偏光解析法で測定した、DABを添加した後の沈殿形成を図に示す。0.5ng/ml
の濃度をDABの転換時間120秒内で測定することができた。
【００６０】
実施例３  IL6濃度の定量
抗IL6モノクローナルキャッチャー抗体を、15分間だけ、強疎水性（シラン化された）ケイ素スライドに吸着させ、種々の濃度のIL6を、10分間だけ添加した。次いで、ビオチン化された抗IL6抗体及びストレプトアビジン標識された（マルチ）HRPを用いた２つの短いインキュベーション工程を行った。DABを添加した後の沈殿形成の、偏光解析法による測定結果を表２に示す。10pg/mlの濃度のIL60を、DABの転換時間300秒未満で、及び、総分析時間30分未満で測定することができた。
【表２】
0004412849.tif 000003
【００６１】
引用文献
１．Cuypers PA、Corsel JW、Janssen MP、Kop JMM、Hermens WTh、Hemker HC、プロトロンビンのフォスファチジルセリン多重層への吸着、偏光解析法による定量、J Biol Chem 1983年、第258巻、第2426〜31頁。
２．Corsel JW、Willems GM、Kop JMM、Cuypers PA、Hermens WTh、プロトロンビン、アルブミン、及びフィブリノーゲンのリン脂質2重層への吸着における固有結合速度および輸送速度の役割、J Colloid Interface Sci 1986年、第111巻、第544〜54頁。
３．Giesen PLA、Willems GM、Hemker HC、Hermens WTh、プロトロンビナーゼ錯体の、膜を介したアセンブリ、J Biol Chem 1991年、第266巻、第18720〜5頁。
４．Giesen PLA、Hemker HC、Hermens WTh、固体支持体上のにおけるリン脂質の混合についてのプローブとしてのトロンビンの生成、Biochim Biophys Acta 1995年、第1237巻、第43〜8頁。
５．Mandenius CF、Mosbach K、増幅された偏光解析法を用いた、生特異的反応の検出、Anal Biochem 1988年、第170巻、第68〜72頁。
６．Nygren H、吸着されたタンパク質膜における及び表面に固定化された抗原に結合された金−抗体錯体膜における横方向の密着性の実験的実証、J Immunol Meth 1988年、第114巻、第107〜114頁。
７．Rongen HAH、van der Horst HM、Hugenholtz GWK、Bult A、van Bennekom WP、ヒトインターフェロン−ガンマのためのリポゾーム抗体吸着分析、Anal Chim Acta 1994年、第287巻、第191〜199頁。
８．Reeves SG、Siebert STA、Roberts MA、Durst RA、環境汚染物質スクリーニングのためのリポゾームイムノセンシングデバイス、Trends in Anal Chem 1995年、第14巻、第351〜355頁。
９．Willems GM、Giesen PLA、Hermens WTh、回転ディスク上でのプロトロビンの吸着および転換、Blood 1993年、第82巻、第497〜504頁。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、脂肪酸が結合したタンパク質(a)及びアネクシンV（ｂ）の、PVCコートされたケイ素スライド上への沈殿によって、増感された偏光解析法測定を示す。
【図１】
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