(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000008
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係に（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。］で表される化合物の一つである５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンと、コリンエステラーゼ阻害作用を有するドネペジルとを含有する神経変性疾患治療剤。
【請求項２】
５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンとドネペジルとの重量比が、４００：１である請求項１に記載の神経変性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、フラボン誘導体もしくはその光学異性体、その酸付加塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む学習障害治療剤および神経変性疾患治療剤等に関する。
【背景技術】  高齢化社会となりつつある我が国において高齢に起因する学習障害や神経変性疾患、特にその代表的な疾患であるアルツハイマー病の予防および治療は重大な問題である。当該疾患の治療薬の代表的なものとして現在コリンエステラーゼ阻害を主作用に持つドネペジル等が上市されているが（Ｓ．Ｌ．Ｒｏｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ  ５０：１３６−１４５（１９９８））、本化合物は記憶学習機能に関連するコリン作動性神経を賦活することにより一過的に症状を緩和するいわば対処療法的な位置づけにあり、神経の変性の進行抑制ないしは神経再生を誘導する機序やアルツハイマー病発症原因自体を取り除く原因療法的治療薬は未だ存在していない。
アルツハイマー病の発症機序として現在最も有力な説は、アミロイドベーター蛋白が脳内に異常沈着することにより神経変性が誘導され、その結果痴呆症状が発症するというものである。即ちアミロイドベーター蛋白の脳内での異常沈着を抑制することによりアルツハイマー病の発症および進行を抑制することが可能と考えられている。現在多くの研究者により当該蛋白の沈着を抑制する治療法が研究されているが、臨床上有効なものは未だ見出されていない。
現在アルツハイマー病治療薬として臨床で最も利用されている化合物は上述したドネペジルであるが、当該治療薬との併用によってより効果的な記憶障害改善作用を有する化合物が存在すれば臨床応用上大変有益な治療法となりうる。現在のところこのような作用を明確に示す治療薬は存在しない。
フラボン誘導体はフラボノイドの１種である。フラボノイドは植物を起源とする物だけでも四千種類以上が報告されている。ほとんど全ての植物の全器官に存在し、特に、緑葉や白色野菜、柑橘類の皮の中に多く存在し、それらの多くは配糖体の形で存在している。
フラボノイドの生理作用として、毛細血管を保護し、その吸収力を調整する作用がある事が知られている。更に、フラボノイドの生理機能に関する研究の進展によって、抗酸化作用の他様々な作用が報告されている。またアルツハイマー病による記憶障害の防止に効果があること等も報告されている（ＲＷ．Ｓｔａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｏｖ；１８４（１）：５１０−２０（２００３））。
フラボン誘導体の一つである５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンは抗炎症作用を有することや（Ｎ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｕｎ  １５；６５（１２）：２０６５−７１（２００３））、抗癌作用を有することが報告されている（Ａ．Ｍｉｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｄｅｃ；９２（１２）：１３２２−８（２００１））。
しかしながら５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンが学書障害、神経変性疾患等の治療に有効であるとの報告はない。
【発明の開示】
本発明の課題は、学習障害または神経変性疾患、特に好ましくはアルツハイマー病を改善するために有用な医薬を提供することにある。
本発明者らは、学習障害等に対する有用な薬剤を開発すべく鋭意検討を重ねた結果、フラボン誘導体が学習障害モデルに効果を示すことを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000002
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係にＣ１〜Ｃ６アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。］
で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物。
（２）学習障害の予防および／または治療薬である、（１）記載の医薬組成物。
（３）神経変性疾患の予防および／または治療薬である、（１）記載の医薬組成物。
（４）一般式（Ｉ）で表される化合物が、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（５）神経変性疾患がアルツハイマー病である（３）または（４）に記載の医薬組成物。
（６）一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000003
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係にＣ１〜Ｃ６アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。］
で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物。
（７）学習障害の予防および／または治療薬である、（６）記載の医薬組成物。
（８）神経変性疾患の予防および／または治療薬である、（６）記載の医薬組成物。
（９）一般式（Ｉ）で表される化合物が、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンである、（６）〜（８）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１０）コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネペジルである（６）〜（９）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１１）神経変性疾患がアルツハイマー病である（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１２）一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000004
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係にＣ１〜Ｃ６アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。］
で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする学習障害の予防および／または治療方法。
（１３）一般式（Ｉ）で表される化合物が、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンである、（１２）記載の学習障害の予防および／または治療方法。
（１４）コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネペジルである（１２）または（１３）に記載の学習障害の予防および／または治療方法。
（１５）一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000005
［式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係にＣ１〜Ｃ６アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。］
で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする神経変性疾患の予防および／または治療方法。
（１６）一般式（Ｉ）で表される化合物が、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンである、（１５）記載の神経変性疾患の予防および／または治療方法。
（１７）コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネペジルである（１５）または（１６）に記載の神経変性疾患の予防および／または治療方法。
（１８）神経変性疾患がアルツハイマー病である（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の予防および／または治療方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｅ−１単独２回投与による学習障害への影響を示す図である。
図２は、Ｅ−１と０．５ｍｇ／ｋｇドネペジル併用投与による学習障害への影響を示す図である。
図３は、薬物投与１１日後の学習障害への影響を示す図である。
図４は、ＩＢＯおよびＡβで処理したラットにおけるＥ−１前投与による３Ｈ−ＮＡＮＡ発現量の変化を示す図である。
図５は、ＩＢＯおよびＡβで処理したラットにおける３Ｈ−ＮＡＮＡ発現量に対するＥ−１前投与の効果を示す図である。
図６は、ＩＢＯおよびＡβで処理したラットにおけるＥ−１前投与および後投与による３Ｈ−ＮＡＮＡ発現量の変化を示す図である。
図７は、ＩＢＯおよびＡβで処理したラットにおける３Ｈ−ＮＡＮＡ発現量に対するＥ−１前投与および後投与の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明の医薬組成物は、本明細書に定義する一般式（Ｉ）で示されるフラボン誘導体若しくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含む。また、本発明の医薬組成物は、上記一般式（Ｉ）で示されるフラボン誘導体もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を、有効成分として含む。本発明において、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物は、好ましくはドネペジルである。
本発明の医薬組成物は、学習障害の予防および／または治療薬として、あるいは、神経変性疾患の予防および／または治療薬として有用である。
本発明において、神経変性疾患は、例えばアルツハイマー病である。
本発明の医薬組成物に含まれるフラボン誘導体は、以下の一般式（Ｉ）で示される。
一般式（Ｉ）
0004505555.tif 000006
一般式（Ｉ）において、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。
一般式（Ｉ）において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ無関係に独立してＣ１〜Ｃ６アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基を示す。
本発明で使用されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４におけるＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル等のＣ１〜Ｃ４のアルキル基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４における（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基としては、好ましくはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、一般式（Ｉ）で表される化合物の中で好ましいものは、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンである（式（ＩＩ））。
0004505555.tif 000007
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、光学異性体を有する場合があり、それらもまた本発明の有効成分である化合物に包含される。
本発明において一般式（Ｉ）で表される化合物の酸付加塩での酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸が挙げられる。一般式（Ｉ）で表される化合物と上記酸とで形成する、投与される酸付加塩は薬学的に許容されるものである。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物およびその酸付加塩などの薬学的に許容される塩は、水和物または溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物および溶媒和物も本発明の医薬組成物の有効成分である化合物に含まれる。
本発明の薬剤、医薬組成物に有効成分として含まれる一般式（Ｉ）等の化合物の製法は、特に限定されないが、当該化合物は当業者であれば公知の方法により合成することができるし、あるいは、実施例１に記載の方法に従い植物から精製することができる。
本発明の医薬組成物は、学習障害の予防および／または治療に、あるいは、神経変性疾患の予防および／または治療に用いることができる。したがって、本発明の医薬組成物に有効成分として含まれる上記化合物、あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物との併用は、学習障害の治療等に、あるいは神経変性疾患の治療等に有効である。
上記化合物が学習障害等の治療に有効であるかをｉｎ  ｖｉｖｏで証明するためには、学習障害の動物モデルに上記化合物を投与することにより、当該モデルの学習障害が改善されることを示せば良い。
学習障害の動物モデルとしては例えば嗅球摘出モデルがある。嗅球摘出モデルにおいては神経変性疾患症状として学習障害の亢進が認められる。この動物に上記化合物を投与することにより、学習障害の亢進が抑制されれば、当該化合物が神経変性疾患の治療において有効であることを示すことが出来る。
上記化合物が既存のコリンエステラーゼ阻害薬と併用した場合に学習障害等の治療に有効であることをｉｎ  ｖｉｖｏで証明するためには、学習障害の動物モデルに上記化合物およびコリンエステラーゼ阻害薬を投与することにより、当該モデルの学習障害が改善されることを示せば良い。
ここで、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物としては、例えばドネペジルを挙げることができる。ドネペジルの塩酸塩は、商品名アリセプト（エーザイ株式会社）を購入して入手することができる。
神経変性疾患の一つである、アルツハイマー病の原因の一つとしてアミロイドベーターの脳における蓄積が考えられている。従って、上記化合物あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物の併用がアルツハイマー病の治療に有効であるかをｉｎ  ｖｉｖｏで証明するためには、上記化合物の投与、あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物との投与により、脳におけるアミロイドベーターの層状沈着形成が改善されることを示せば良い。
アミロイドベーターの層状沈着形成が改善されることを示すには、例えば、実施例３に記載の細胞膜面ガングリオシド判定法がある。アミロイドベーターの層状沈着形成がある場合は、これによりガングリオシドがシアリダーゼ処理により切り出されず、アミロイドベーターの層状沈着形成がない場合は、ガングリオシドがシアリダーゼ処理により切り出される。従って、化合物を投与しガングリオシドの量を測ることにより、アミロイドベーターの層状沈着形成が改善されることを示すことができる。
本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与する学習障害の予防および／または治療方法をも含むものである。また、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与する神経変性疾患の予防および／または治療方法を含むものである。
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である一般式（Ｉ）で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重であり、非経口投与の場合には一日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２〜３回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。
本発明の医薬組成物としては、上記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的および製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して薬剤として投与することが好ましい。
薬理学的および製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を用いることができる。
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、または結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、またはカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤または崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウムまたはタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコールまたは酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、またはハードファット等の基剤を用いることができる。
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剖または溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基または有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
本発明の医薬組成物の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粉剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、またはトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。
本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与することができる。
以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  （実験１）５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボン（以下Ｅ−１と略する場合がある）の分離、精製方法
シークワーシャミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓａ）の乾燥果皮（５００ｇ）をメタノール（２Ｌ）で２回還流抽出した（各２時間）。抽出エキスを減圧下濃縮後、メタノール−水混液（３：７）に懸濁させ、多孔質ポリスチレン樹脂（Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０、三菱化学社製）を充填したカラムに通じ、メタノール−水混液（３：２）、メタノール−水混液（４：１）、メタノール、エタノール、酢酸エチル（各２Ｌ）で順次溶出させた。酢酸エチル溶出画分（１０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール混液（１９：１）で溶出させ、５画分に分画した（フラクションＩ−Ｖ）。フラクションＩＩＩ（１．６３ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−アセトン混液、２：１）で繰り返し精製して、Ｅ−１、７２５ｍｇを単離した。
【実施例２】  （実験２）嗅球摘出マウスにおける投与による学習障害改善効果
（嗅球摘出手術）
２３ｇ〜２６ｇのｄｄｙ系雄マウスにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、麻酔後、歯科用ドリルで両側の嗅球上部の頭蓋骨に穴をあけ、アスピレーターを用いて嗅球を吸引した。止血後縫合し、傷口を外科用アロンアルファで塗り固めた。その後１４日間ケージ内で飼育した。嗅球を吸引せずに同様の操作を行ったマウスをｓｈａｍ群とし、これをコントロールとして用いた。
（薬物の投与）
Ｅ−１を乳鉢ですりつぶし、ｔｗｅｅｎ−８０液で懸濁させて嗅球摘出後１４日目のマウスに腹腔内投与した。Ｅ−１単独２回投与の場合は、１回目投与の翌々日に２回目の投与を行った。また、代表的なアルツハイマー病治療薬であるドネベジルとＥ−１との併用実験では、ドネペジルを生理食塩水に溶かし、Ｅ−１投与の翌日に経口投与した。
（学習障害の測定方法）
Ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔａｓｋを行った。嗅球を摘出する前に、明室と、電流を流すことのできる暗室との２部屋が連結されたｐａｓｓｉｖｅ装置の明室側にマウスを入れ、暗室にマウスが入ると同時に、２秒間隔で１．０ｍＡの電流を流して電撃ショックを与え、これを記憶させた。すぐに嗅球を摘出し、１４日間飼育後、薬物を投与し、再びマウスを明室側に入れ、暗室に入るまでの秒数を測定し、平均値をｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅとした。測定時聞は最大３００秒までとし、薬物投与後１１日目まで数回測定を行った。なお、嗅球摘出後の測定ではマウスが暗室に入っても電流は流さなかった。
この測定法では、学習障害が起こっていないマウスは電撃ショックの記憶を保持しているため明室側に長く留まるが、学習障害の起こっているマウスは電撃ショックの記憶を保持しておらず、すぐに暗室側に入る。この違いを利用して、ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅを学習障害の指標とした。
（Ｅ−１単独２回投与の学習障害への影響）
嗅球を摘出して１４日目のマウスを測定し、学習障害が誘発されているかの確認を行なった。その後直ちにＥ−１を腹腔内投与し、２日後に再びＥ−１を腹腔内投与した。１回目のＥ−１を投与してから３日後、５日後、７日後、１１日後に再び測定を行い、Ｅ−１の学習障害への影響を検討した。時間の経過と共にｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅが上昇し、濃度依存的に学習障害が改善される傾向が認められた。また、Ｅ−１投与量２００ｍｇ／ｋｇでは学習障害の改善効果が確認された（図１）。
したがって、Ｅ−１、すなわち、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンが学習障害の治療に有効であることが、ｉｎ  ｖｉｖｏのレベルで初めて示された。
（Ｅ−１と０．５ｍｇ／ｋｇドネペジルとの併用投与による学習障害への影響）
嗅球摘出１４日目のマウスにＥ−１または生理食塩水を腹腔内投与し、翌日にドネペジル０．５ｍｇ／ｋｇを経口投与した。コリンエステラーゼ阻害薬であるドネペジルは、投与１時間後に脳内アセチルコリン濃度がピークを迎えるため、投与の１時間後に測定を行った。さらにＥ−１投与から３日後、５日後、７日後、１１日後に再び測定を行い、Ｅ−１と０．５ｍｇ／ｋｇのドネペジルとの併用による学習障害への影響を検討した。ドネペジル単独投与では学習障害改善作用は認められなかったが、２００ｍｇ／ｋｇ  Ｅ−１との併用投与では顕著な学習障害改善作用が確認された（図２）。
（Ｅ−１単独投与、ドネペジルとの併用投与それぞれの１１日後の学習障害の様子）
Ｅ−１の投与量を上げるとｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅが上昇することから、Ｅ−１は濃度依存的に学習障害を改善することが確認された。Ｅ−１単独、ドネペジル単独投与の場合に比べて、Ｅ−１とドネペジルの併用投与では学習障害改善作用が増強した（図３）。
これらの結果により、Ｅ−１、すなわち、５，６，７，８，３’，４’−ヘキサメトキシフラボンと、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、すなわち、ドネペジルとの併用が、学習障害の治療に有効であることが、ｉｎ  ｖｉｖｏのレベルで初めて示された。
【実施例３】  （実験３）細胞膜面ガングリオシドに対するＥ−１のアミロイドベーター（以下Ａβと略する場合がある）沈着抑制効果の検討
細胞膜面ガングリオシド判定法は、ＩＤＯＳ法と呼ばれる。３Ｈラベルされたｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ（以下３Ｈ−ＮＡ−Ｍａｎと略する場合がある）をラットの脳内に直接投与すると、約２日後にはｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅの量はほとんどなくなり、４日後には約９３％の３Ｈラベルされたｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（以下３Ｈ−ＮＡＮＡと略する場合がある）がガングリオシドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に使われ、細胞膜面に３Ｈラベルされたガングリオシドが発現してくる。これをシアリダーゼ処理により切り出された３Ｈ−ＮＡＮＡをマイクロダイアリシス法で回収し、放射能を測定することでガングリオシドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を指標にできる方法である。
本実験では、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞膜面ガングリオシド判定法（ＩＤＯＳ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、Ｉｂｏｔｅｎｉｃ  Ａｃｉｄ（以下ＩＢＯと略する場合がある）の興奮毒性作用である生合成ｂ経路ガングリオシドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成増加の結果生じると考えられているＡβの層状沈着形成に対する、Ｅ−１の投与による影響を検討した。
ガイドカニューレを嗅球と海馬にそれぞれ固足手術した２日後にＥ−１またはコントロールとしてＰＢＳを海馬に投与し、その２月後、ＩＢＯを嗅球に投与すると同時に３Ｈ−ＮＡ−Ｍａｎを海馬に投与した。更にその２日後、Ａβ４０またはコントロールとしてＰＢＳを海馬に投与した。その２日後、シアリダーゼを海馬に投与し、切り出された３Ｈ−ＮＡＮＡをマイクロダイアリシスによって集め、液体シンチレーションカウンタで測定した。３Ｈ−ＮＡ−Ｍａｎの量は投与２日後には、その活性はすでにバックグランドレベルまで顕著に減少し、一方、３Ｈ−ＮＡＮＡは増加して４日後に最高値に達しその後徐々に減少した。また、ＴＬＣによって興奮性アミノ酸のＩＢＯの影響を検討した際、特にｂ経路ガングリオシドはＩＢＯ投与４日後に増加することが確認されていることから、ガングリオシドｄｅ  ｎｏｖｏ合成を評価する実験では、ラットの海馬に３Ｈ−ＮＡ−Ｍａｎ投与した４日後以降にマイクロダイアリス実験を行った。また、全ての実験においてラットはフリームービングの状態で行った。
（前投与によるＥ−１の効果の検討）
ＩＢＯ投与より前段階の２日前にＥ−１（２００μＭ）またはコントロールとしてＰＢＳを投与した動物群において、シアリダーゼ投与前４０分間、投与後１４０分間に収集した放射能の経時的変化を図４示す。Ｅ−１の前投与によって得られた放射能は、コントロール（ＰＢＳ投与動物群）と比較すると、Ｅ−１前投与動物群の３Ｈ−ＮＡＮＡ量は時間経過によって変化はなく一定で、コントロールより低いかまたは同量であった。
シアリダーゼ投与後１４０分間に収集した放射能の総量を図５に示す。Ｅ−１の前投与によって得られた放射能の総量は、コントロールの放射能の総量より低くまた有意差はなかった。
（前投与および後投与によるＥ−１の効果）
Ｅ−１の前投与では、神経細胞の軸索進展効果やシナプス樹状突起形成効果および生合成ａ経路ガングリオシドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成増加効果がみられると証明されている濃度の２倍の２００μＭで実験を行ったために、その効果よりも高濃度の薬物投与による細胞毒性の影響が強かった可能性が考えられた。よって、この実験では、以前の研究で生合成ａ経路であるＧＭ１の増加が確認できたＥ−１の濃度である１００μＭを投与量とし、Ｅ−１をＩＢＯ投与の前後に行うというスケジュールに変更して、研究を進めた。
ＩＢＯ投与の前後の２回に分けてＥ−１（１００μＭ）またはコントロールとしてＰＢＳを投与し、その２日後にＡβまたはコントロールとしてＰＢＳを投与し、更にその２日後にシアリダーゼを投与した。この動物群におけるシアリダーゼ投与前４０分間および投与後１４０分間収集した３Ｈ−ＮＡＮＡの経時的変化を図６に示す。Ａβを投与しない動物群においては、Ｅ−１の前後投与によって得られた動物群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（−））の放射能は、Ｅ−１を投与しない動物群（Ｅ−１（−）、Ａβ（−））と比較すると放射能のレベルは常に高く、シアリダーゼ投与６０分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。一方、Ｅ−１を投与しない動物群（Ｅ−１（−）、Ａβ（−））では、シアリダーゼ投与４０分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。Ａβを投与した動物群においては、Ｅ−１の前後投与によって得られた動物群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（＋））の放射能は、Ｅ−１を投与しない動物群（Ｅ−１（−）、Ａβ（＋））と比較するとは常に高く、シアリダーゼ投与４０分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。しかし、一方のＥ−１を投与しない動物群（Ｅ−１（−）、Ａβ（＋））では、放射能のレベルは常に低く、ピークは現れなかった。また、Ｅ−１の前後投与をした動物群で比較すると、Ａβ非投与群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（−））では、Ａβ投与群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（＋））より常に放射能のレベルは高かった。
シアリダーゼ投与後１４０分間に収集した放射能の総量を図７に示す。Ａβを投与しない動物群においては、Ｅ−１を前後投与した場合（Ｅ−１（＋）、Ａβ（−））の放射能の総量は、Ｅ−１を投与しない場合（Ｅ−１（−）、Ａβ（−））と比較すると有意に約１．５倍高かった。一方、Ａβを投与した動物群においては、Ｅ−１を前後投与した場合（Ｅ−１（＋）、Ａβ（＋））の放射能の総量は、Ｅ−１を投与しない場合（Ｅ−１（−）、Ａβ（＋））と比較すると、有意に約２倍高かった。また、Ｅ−１の前後投与をした動物群で比較するとＡβ非投与群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（−））の放射能の総量は、Ａβ投与群（Ｅ−１（＋）、Ａβ（＋））の放射能の総量より有意に約１．７倍高かった。シアリダーゼ投与後１４０分間に収集した放射能の総量の高い順に並べると
Ｅ−１（＋）、Ａβ（−）＞Ｅ−１（−）、Ａβ（−）≧Ｅ−１（＋）、Ａβ（＋）＞Ｅ−１（−）、Ａβ（＋）となった。
過去の様々な研究から、Ａβが蓄積を開始した脳の不溶性画分の中には種々の画分が存在すると考えられ、そのうちの低密度膜ドメインは神経細胞以外ではカベオラと呼ばれており、コレステロール、スフインゴ脂質が多く存在することが知られている。また、神経細胞においてスフインゴ糖脂質であるガングリオシドは、ほかの細胞に比べてシナプスや軸索にかなり多く存在し、神経栄養因子や神経伝達物質における受容体の活性の調節や神経栄養因子様作用などの様々な機能を有するこという報告がなされている。また、最近ではガングリオシドとＡβの関連性が注目されており、特に、Ａβ初期の老人斑形成に先行する変化では、ガングリオシドがＡβのβ−シート構造への変化に大きく関与していることが知られている。しかし、正常脳においてガングリオシドは１種だけではなく、様々な分子種のガングリオシドが混合されて細胞膜上で並んでおり、また、脳の発達段階、短期間の刺激、温度順応の過程などにおいて中枢神経系のガングリオシドは組成や量の特殊な局所的変化を起こすことが知られている。そこで、ガングリオシドの組成とＡβの沈着の関連性を調べたところ、Ａβの細胞膜沈着にはガングリオシドの単一組成もしくは生合成ｂ経路が優勢のガングリオシドを有する膜組成が必要であり、しかも生合成ａ経路が優勢なガングリオシド組成ではＡβ時沈着を起こさないことが証明された。一方、植物由来化合物Ｅ−１は神経突起や軸索、シナプス形成の指標となるガングリオシドの合成を活性化させる。また、ＩＢＯ処置によるｂ経路活性状態においてＥ−１を海馬に投与すると、ＩＢＯとは違った組成のガングリオシドの合成を活性化させることが分かっている。これらのことから、Ｅ−１がガングリオシド生合成に顕著に影響を与え、Ａβの層状沈着を抑制するような組成に変化させる可能性が考えられた。
本実験では、マイクロダイアリシスによって収集される３Ｈ−ＮＡＮＡ量は図６、７で示すようにシアリダーゼ投与後に変化し、１４０分間で集められた全体の放射能は、Ａβを投与した場合はＥ−１の前後投与によって有意に約２倍に増加した。また、Ａβを投与しない場合は、Ｅ−１の前後投与によって有意に約１．５倍高くなった。これは、過去の実験でも同様の結果が得られていることから、実験の手技的問題はないと考えられる。これらのことから次のことが示唆される。シアリダーゼ投与前後で放射能が変化しないかあるいは減少したのは、ＩＢＯの投与により海馬膜でｂ経路ガングリオシドが増加し、ついでＡβが海馬に投与されると、そのｂ経路ガングリオシドが増加した細胞膜上でＡβが層状沈着を形成する。このＡβ沈着体が立体的にシアリダーゼの作用を妨げるためにガングリオシドの糖鎖の切断がされず、その結果として、マイクロダイアリシスプローブによって収集される放射能が低くなったと考えられる。一方、放射能がシアリダーゼ投与前と比べて増加したのは、細胞膜のガングリオシド組成は正常のままであり、Ａβの投与によっても細胞膜上でＡβの層状沈着は起こらず、Ａβ分子のいくらかは溶液中で凝集するが、それはシアリダーゼの作用を妨げないために細胞膜表面のガングリオシドの３Ｈ−ＮＡＮＡは切り出され、マイクロダイアリシスによって収集された放射能は高くなったということが考えられる。本実験では、ＩＢＯ投与により生合成ｂ経路ガングリオシドが優勢の異常な膜組成になるが、Ｅ−１の投与によってａ経路ガングリオシドの合成が活性化され、その結果としてガングリオシドの異常組成が正常組成に近くなったために、Ａβの沈着が抑制されたと考えられる。
しかし、図６、７で示すように、Ｅ−１投与群の放射能は、Ｅ−１非投与群の放射能と比較すると有意に増加したが、Ａβ非投与群と比較すると有意に減少している。このことは、Ｅ−１にはＩＢＯによるガングリオシドの異常組成を、正常組成へと完全には回復させなかったためにＡβの沈着が起こったか、もしくは、本実験のスケジュールではＥ−１を投与してからＡβ投与までの間隔が短かすぎたために、Ｅ−１の効果を完全に発揮させるには回復期間が不十分であったという可能性が考えられる。また、ＩＢＯの前段階におけるＥ−１  ２００μＭ濃度の投与では、そのＥ−１投与効果よるガングリオシドの変化は未だ検討されていない。そのため、細胞毒性が起きたかあるいはＡβ沈着の予防効果は期待できないか、そのどちらであるかは断言できないためにさらなる検討が必要である。
以上のことから、本実験は脳内では可溶性Ａβが細胞外に沈着するにはガングリオシドの組成が関与しているという以前の研究結果を支持し、また、ＮＧＦ様作用を有する植物由来化合物Ｅ−１はＡβ沈着抑制効果があり、この化合物がアルツハイマー病等の治療薬になりうることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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