(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒレグリンの変異体であり、上記変異体は、天然で見出されないアミノ酸配列、および天然ヒトヒレグリン−β１と比較して増大した親和性でＥｒｂＢレセプターと結合する能力を有し、上記変異体は上記ヒレグリン中のものとは異なるアミノ酸：
残基番号１８１において上記異なるアミノ酸が、A；
残基番号１９８において上記異なるアミノ酸が、A；
残基番号２０５において上記異なるアミノ酸が、A；あるいは
残基番号２０８において上記異なるアミノ酸が、A；
を含み、上記残基番号は天然ヒトヒレグリン−β１のＮ末端から数えた残基番号に相当することを特徴とする、ヒレグリン変異体。
【請求項２】
上記ヒレグリンがヒトヒレグリン−β１であることを特徴とする、請求項１記載のヒレグリン変異体。
【請求項３】
ヒトヒレグリン−β１の変異体であり、上記変異体は、天然で見出されないアミノ酸配列、および天然ヒトヒレグリン−β１と比較して増大した親和性でＥｒｂＢレセプターと結合する能力を有し、上記変異体は：
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M226I;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; および
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I;
から選択された一連のアミノ酸置換を含み、上記残基番号は天然ヒトヒレグリン−β１のＮ末端から数えた残基番号に相当することを特徴とする、ヒレグリン変異体。
【請求項４】
上記ヒレグリン変異体が：
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
N223H, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; および
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I;
から選択された一連のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項３記載のヒレグリン変異体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項記載のヒレグリン変異体をコードする核酸分子。
【請求項６】
請求項５記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
修飾されたヒレグリン変異体を生産するために、請求項１から４のいずれか一項記載のヒレグリン変異体を修飾することを含む、ヒレグリン変異体を生産する方法であり、該修飾されたヒレグリン変異体がＥｒｂＢレセプターと結合する能力を維持することを特徴とする方法。
【請求項９】
ヒレグリンの変異体であり、上記変異体は、天然で見出されないアミノ酸配列、および天然ヒトヒレグリン−β１よりＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについてのより大きな特異性を有し、上記変異体は上記ヒレグリン中のものとは異なるアミノ酸：
残基番号１７８において上記異なるアミノ酸が、A；
残基番号１７９において上記異なるアミノ酸が、A；あるいは
残基番号２０７において上記異なるアミノ酸が、A；
を含み、上記残基番号は天然ヒトヒレグリン−β１のＮ末端から数えた残基番号に相当することを特徴とする、ヒレグリン変異体。
【請求項１０】
上記ヒレグリンがヒトヒレグリン−β１であることを特徴とする、請求項９記載のヒレグリン変異体。
【請求項１１】
上記アミノ酸置換が、H178EおよびR207Pから選択されることを特徴とする、請求項１０記載のヒレグリン変異体。
【請求項１２】
ヒレグリン変異体であり、上記変異体は、天然で見出されないアミノ酸配列、およびＥｒｂＢレセプターと結合する能力を有し、上記変異体は、アミノ酸置換H178Lを含み、且つアミノ酸残基２２８−２３１が欠失されて単一のメチオニン残基で置換されており、上記残基番号は天然ヒトヒレグリン−β１のＮ末端から数えた残基番号に相当し、さらに、上記変異体は、天然ヒトヒレグリン−β１よりＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについてのより大きな特異性を有することを特徴とする、ヒレグリン変異体。
【請求項１３】
上記ヒレグリンがヒトヒレグリン−β１であることを特徴とする、請求項１２記載のヒレグリン変異体。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載のヒレグリン変異体をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
ＥｒｂＢレセプターを発現する組織の修復および／または再生を促進するための、請求項１から４のいずれか一項記載のヒレグリン変異体、および製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬学的組成物。
【請求項１８】
皮膚の外傷の治療のための、請求項１から４のいずれか一項記載のヒレグリン変異体、および製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬学的組成物。
【請求項１９】
ヒト胃腸、呼吸器、生殖器、または尿路における再上皮形成を促進するための、請求項１から４のいずれか一項記載のヒレグリン変異体、および製薬学的に許容可能なキャリアーを含む製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
政府の実施権の主張
米国政府は、この発明に対して支払い済みの実施権を有し、国立衛生研究所によって与えられた許可番号ＧＭ１６５４９−０１の規定によるという適正な条件下で、特許権者が他者に実施権を供与しなければならないという制限された状況における権利を有する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒレグリン変異体、上記変異体をコードする核酸分子、並びに関連するベクター、宿主細胞、製薬学的組成物、および方法に関する。
特に、本発明は、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターに対して増大した親和性を有するヒトヒレグリン−β１のアミノ酸置換変異体に関する。
関連分野の説明
細胞増殖および分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化によって一部調節されている。タンパク質チロシンキナーゼは、このプロセスを触媒する酵素である。レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、細胞内タンパク質のリガンド刺激性チロシンリン酸化を介して、細胞増殖を導くものと考えられている。クラスＩサブファミリーの増殖因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされる１７０キロダルトン（ｋＤａ）の上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を含む。ｅｒｂＢ１は、ヒト悪性腫瘍において通常関連している。特に、この遺伝子の増大した発現は、乳、膀胱、肺及び胃の比較的進行性のガンにおいて観察されている。
クラスＩサブファミリーの第二のメンバーであるｐ１８５neu（ＥｒｂＢ−２レセプターまたはｐ１８５HER2とも呼ばれる）は、化学的に処理されたラットの神経芽腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として、もともと同定された。ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２またはＨＥＲ２）遺伝子は、１８５ｋＤａのレセプタータンパク質チロシンキナーゼをコードする。
ヒトｅｒｂＢ２遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳ガンおよび卵巣ガンにおける貧弱な予後と相関している。Slamonら,Science 235:177-82（1987）;Slamonら,Science 244:707-12（1989）。ｅｒｂＢ２の過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸および膀胱の各ガンを含む他のガンと相関している。したがって、米国特許第４，９６８，６０３号において、Slamonらは、腫瘍細胞におけるｅｒｂＢ２遺伝子の増幅または発現を測定するための様々な診断アッセイを記載し、権利化を主張している。Slamonらは、腫瘍細胞におけるｅｒｂＢ２ガン遺伝子の複数のコピーの存在は、該疾患が一次腫瘍部位から特に広がる傾向にあり、それ故該疾患がさもなければ他の診断因子により示されるものより、より急速な治療の必要があることを示すことを発見した。Slamonらは、リンパ節状態の測定と共に、ｅｒｂＢ２遺伝子増幅試験が、非常に改良された予後の有用性を提供すると結論付けた。
ＥｒｂＢ−３レセプター（ｐ１８０HER3）をコードするｅｒｂＢ３（またはＨＥＲ３）と呼ばれるさらなる関連遺伝子もまた記載されている。米国特許第５，１８３，８８４号；Krausら,PNAS USA 86:9193-97（1989）;欧州特許出願第４４４，９６１Ａ１号；Krausら,PNAS USA 90:2900-04（1993）参照。Krausら（1989）は、著しく上昇したレベルのｅｒｂＢ３ ｍＲＮＡが、特定のヒト乳腫瘍細胞系に存在し、ｅｒｂＢ１およびｅｒｂＢ２と同様にｅｒｂＢ３が、ヒト悪性腫瘍において役割を果たしていることを発見した。また、Krausら（1993）は、キメラＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３レセプターのＥｒｂＢ−３触媒ドメインのＥＧＦ依存性活性化が、トランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞において増殖応答を引き起こすことを示した。さらにこれらの研究者は、あるヒト乳腫瘍細胞系が、安定状態ＥｒｂＢ−３レセプターチロシンリン酸化の有意な上昇を示し、さらにヒト悪性腫瘍においてこのレセプターが関与していることを示した。ガンにおけるｅｒｂＢ３の役割は他の者によっても調査されており、この遺伝子が乳房（Lemoineら,Br.J.Cancer 66:1116-21［1992］）、胃腸（Pollerら,J.Pathol.168:275-80［1992］;Rajkumerら,J.Pathol.170:271-78［1993］;Sanidasら,Int.J.Cancer 54:935-40［1993］）、および膵臓（Lemoineら,J.Pathol.168:269-73［1992］,およびFriessら,Clinical Cancer Research 1:1413-20［1995］）の各ガンにおいて過剰発現されていることが見出されている。
増殖因子レセプタータンパク質チロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーは、ｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）遺伝子の産物であるＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）レセプター含むようにさらに拡張されている。欧州特許出願５９９，２７４号；Plowmanら,PNAS USA 90:1746-50（1993）;およびPlowmanら,Nature 366:473-75（1993）参照。Plowmanらは、増大したｅｒｂＢ４発現が、乳腺ガンを含む上皮起源の特定のガンと緊密に関連していることを見出した。ｅｒｂＢ４発現を評価するヒト腫瘍性疾患（特に乳ガン）の検出のための診断法が、欧州特許出願第５９９，２７４号に記載されている。
ｅｒｂＢ２ガン遺伝子のアクチベーターに対する探求は、ヒレグリンポリペプチドのファミリーの発見を導いた。それ故今までのところ特徴付けされたヒトにおけるヒレグリンポリペプチドは、LeeおよびWood,Genomics 16:790-91（1993）によって第８染色体の短腕にマップされた単一の遺伝子の選択的スプライシングから由来する。
Holmesらは、ヒレグリン−α（ＨＲＧ−α）、ヒレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）、ヒレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）およびヒレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）と彼らが呼ぶＥｒｂＢ−２レセプターに対するポリペプチドアクチベーターのファミリーを単離しクローン化した。Holmesら,Science 256:1205-10（1992）;国際特許出願WＯ ９２／２０７９８;および米国特許第５，３６７，０６０号参照。これらの研究者は、ＭＣＦ７乳ガン細胞におけるＥｒｂＢ−２レセプターのチロシンリン酸化を活性化する精製ヒレグリンポリペプチドの能力を示した。さらに、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（それは高レベルのＥｒｂＢ−２レセプターを発現する）に対するヒレグリンポリペプチドのマイトジェン活性もまた調べられた。
ヒレグリンは、「プロ−ヒレグリン」として典型的に発現される大きなマルチドメインタンパク質である。プロ−ヒレグリンは、成熟可溶性形態（通常約４４−４５ｋＤａ）へとタンパク質溶解性プロセシングを受けることが示されている。プロセシングは、細胞内または細胞表面で生じることが示されている。可溶性形態におけるドメインは、イムノグロブリンホモロジー（Ｉｇ様）ドメイン、グリコシル化部位の豊富なスペーサー領域、およびＥｒｂＢレセプター結合および活性化に必要であるEGFに見出されるドメインと同様なドメインを、（ＮからＣ末端に向かって順番に）含む。Barbacciら,J.Biol.Chem.270:9585-89（1995）参照。
ヒレグリンＥＧＦ様ドメインは、ＥＧＦ残基１−４８（Holmesら,上記参照）に対する実質的な構造的相同性（Jacobsenら,Biochemistry 35:3402-17［1996］）およびそれに対する制限的な配列ホモロジーによって特徴付けされている。ヒレグリンＥＧＦ様ドメインとＥＧＦの間の構造的相同性は、ヒレグリン−β１内に置換されたＥＧＦ配列のブロックが、ＥｒｂＢ−３とＥｒｂＢ−２を共発現する細胞に対する結合を損傷しないことを示すデータによって確立されている。Barbacciら,上記参照。
ヒレグリンは最初の２１３アミノ酸残基において実質的に同一である一方で、それらはそのＣ末端部分が異なる二つのＥＧＦ様ドメインに基づいて、αおよびβという二つの主要な型に分類される。例えば、ヒレグリン−αＥＧＦ様ドメインは、Ｃ末端近傍の９個の置換によってβ１アイソフォームのものとは異なる。βアイソフォームは、αアイソフォームよりおよそ８から１０倍高い親和性を有してＥｒｂＢレセプターに結合することが報告されている。Wenら,Mol.Cell.Biol.14:1909-19（1994）。
ヒレグリン−αＥＧＦドメインの溶液構造は、ＮＭＲによって高分解能で最近測定されている。Jacobsenら,上記参照;Nagataら,EMBO J.13,3517-3523（1994）。このドメインの顕著な性質は、（１）周期的なヘリックスを有する中心的な３つのストランドのβシートを含むＮ末端サブドメイン、および（２）短い長さのβシートを含むより小さいＣ末端サブドメインを含む。ＥＧＦドメインは、３つのジスルフィド結合によって安定化され、それはＮ末端サブドメイン中に２つ存在し、Ｃ末端サブドメイン中に１つ存在する。システイン残基に相当する６個のペアは、全てのヒレグリンおよびＥＧＦから由来するＥＧＦ様ドメインで保存されている。
ヒトＨＲＧのラット同等物である４４ｋＤａ ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）は、Pelesら,Cell,69:205-16（1992）およびWenら,Cell,69:559-72（1992）によって最初に記載された。ヒトヒレグリンポリペプチドと同様に、ＮＤＦは、ＥＧＦ様ドメインに続くＩｇ様ドメインを有し、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いている。後に、Wenらは、ＮＤＦのファミリーを拡張するために、「徹底的なクローニング」を実施した。Wenら,Mol.Cell.Biol.,14:1909-19（1994）。この仕事により、６の別個の線維芽細胞プロＮＤＦが明らかにされた。Holmesらの呼称を採用して、ＮＤＦは、ＥＧＦ様ドメインの配列に基づいてそれぞれαおよびβポリペプチドとして分類された。アイソフォーム１から４は、ＥＧＦ様ドメインおよびトランスメンブランドメインの間の可変領域を基礎として特徴付けされる。また、アイソフォームａ、ｂおよびｃは、可変長細胞質ドメインに基づいて定義される。これらの研究者は、様々なＮＤＦアイソフォームが、選択的スプライシングによって生じ、組織特異的機能を実行していると結論付けている。欧州特許出願ＥＰ ５０５ １４８；国際特許出願ＷＯ ９３／２２４２４；および国際特許出願ＷＯ ９４／２８１３３（ＮＤＦを議論している）もまた参照。Fallsら,Cell 72:801-815（1993）は、「アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）ポリペプチド」と呼ばれるヒレグリンファミリーのもう一つのメンバーを記載する。ニワトリ由来ＡＲＩＡポリペプチドは、筋アセチルコリンレセプターの合成を刺激する。国際特許出願ＷＯ ９４／０８００７参照。ＡＲＩＡは、β型ヒレグリンであり、ＨＲＧ−αおよびＨＲＧβ１−β3のＩｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間の全部のスペーサー領域を欠いている。
Marchionniら,Nature 362:312-318（1993）は、「グリア増殖因子（ＧＧＦ）」と呼ばれるいくつかのウシ由来タンパク質を同定した。これらのＧＧＦは、上記記載の他のヒレグリンタンパク質とＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを共有するが、アミノ末端クリングルドメインもまた有する。ＧＧＦは一般的に、Ｉｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間の完全なスペーサー領域を有しない。ＧＧＦの一つ、ＧＧＦＩＩのみが、Ｎ末端シグナルペプチドを有する。国際特許出願ＷＯ ９２／１８６２７；ＷＯ ９４／００１４０；ＷＯ ９４／０４５６０；ＷＯ ９４／２６２９８；ＷＯ ９５／３２７２４（ＧＧＦおよびその使用を記載する）もまた参照。
Hoらは、「感覚および運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）」と呼ばれるヒレグリンファミリーのもう一つのメンバーを記載する。Hoら,J.Biol.Chem.270:14523-32（1995）。このタンパク質は、全ての他のヒレグリンポリペプチドの特徴であるＥＧＦ様ドメインを有するが、独特なＮ末端ドメインを有しない。さらに、ＳＭＤＦは、他のヒレグリンポリペプチドで見出されるＩｇ様ドメインおよびスペーサー領域の両者を欠いている。ＳＭＤＦのもう一つの特徴は、Ｎ末端近傍の二つの領域の疎水性アミノ酸の存在である。
ヒレグリンポリペプチドは、ＥｒｂＢ−２レセプターを活性化する能力に基づいて最初に同定された（Holemsら,上記参照を参照）一方で、ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）を発現する特定の卵巣細胞、およびｎｅｕトランスフェクト線維芽細胞は、ＮＤＦを結合も交差反応もせず、またそれらはＮＤＦに応答してチロシンリン酸化も受けないことが発見されている。Pelesら,EMBO J.12:961-71（1993）。この発見は、もう一つの細胞構成要素が、十分なヒレグリン応答性を与えるために必要であることを示した。
Carrawayらは後に、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞に結合した125Ｉ−ｒＨＲＧ−β１ １７７−２４４が、ウシｅｒｂＢ３を用いて安定にトランスフェクトするが、元の細胞をトランスフェクトしないことを示した。これらの研究者はまた、昆虫細胞においてウシＥｒｂＢ−３レセプターを発現し、ＨＲＧ−β１ １７７−２４４が、これらの細胞から溶解されたＥｒｂＢ−３レセプターの調製物に結合することを示した。彼らは、ＥｒｂＢ−３が、ヒレグリンに対するレセプターであり、固有のチロシン残基のリン酸化を介在するのと同様に、両レセプターを発現する細胞におけるＥｒｂＢ−２レセプターのリン酸化も介在すると結論付けた。Carrawayら,J.Biol.Chem.269:14303-06（1994）。Sliwkowskiらは、ｅｒｂＢ３単独でトランスフェクトされた細胞が、ヒレグリンに対する低親和性を示す一方で、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３の両者でトランスフェクトされた細胞は、より高い親和性を示すことを見出した。Sliwkowskiら,J.Biol.Chem.269:14661-65（1994）。
Plowmanおよびその共同研究者は、ＥｒｂＢ−４／ＥｒｂＢ−２レセプター活性化を同時に研究した。彼らは、ＥｒｂＢ２レセプターを単独で、ＥｒｂＢ４レセプターを単独で、または二つのレセプターを共に、ヒトＴリンパ球において発現し、ヒレグリンがＥｒｂＢ−４のチロシンリン酸化を刺激することができるが、両レセプターを発現する細胞においてのみＥｒｂＢ−２リン酸化を刺激することができることを示した。Plowmanら,Nature 336:473-75（1993）。
これらの観察は、Kokaiら,Cell 58:287-92（1989）,Sternら,EMBO J.7:995-1001（1988）,およびKingら,4:13-18（1989）によって以前に記載された「レセプタークロストーキング」概念に一致する。これらの研究者は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合が、ＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化、およびＥｒｂＢ−２レセプターの交差リン酸化を引き起こすことを見出した。これは、リガンド誘導性レセプターヘテロダイマー化、および該ヘテロダイマー内のレセプターの同時的なクロスリン酸化の結果であると考えられる。Wadaら,Cell 61:1339-47（1990）。
それ故、ＥｒｂＢレセプターは、リガンド誘導性レセプターダイマー化によって活性化されると考えられる。特異的に、ヒレグリンは、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターに別々に結合することができるが、ＥｒｂＢ−２レセプターには結合できない。しかしながら、ＥｒｂＢ−２は、シグナリングに必要であり、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４と組み合わせてＥｒｂＢ−２を含むヘテロダイマーは、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４を含むホモダイマーよりも高い親和性を有してヒレグリンを結合する。Plowmanら,Nature 366:473-75（1993）;Sliwkowskiら,J.Biol.Chem.269:14661-65（1994）。
ヒレグリンの生物学的活性は、いくつかのグループによって調査されている。例えば、Holmesら（上記参照）は、ヒレグリンが乳房細胞系（ＳＫ−ＢＲ−３およびMＣＦ−７のような）に対するマイトジェン効果を発揮することを見出した。Lewisらは、ヒレグリン−β１が数多くのヒト乳房および卵巣腫瘍細胞系においてソフトアガーで増殖を刺激し、コロニー形成を増大することを報告した。Lewisら,Cancer Research 56:1457-65（1996）。これらの研究者はまた、ＥｒｂＢ−２がヒレグリン応答性の重要なメディエーターであることを示した。
Pinkas-Kramarskiらは、ＮＤＦ（ラットヒレグリン）が、胚および成人ラット脳におけるニューロンおよびグリア細胞、並びにラット脳細胞の一次培養物において発現されていることを見出し、ＮＤＦが星状細胞に対する生存および成熟因子として機能することを示唆した。Pinkas-Kramarskiら,PNAS USA 91:9387-91（1994）。Danilenkoらは、ＮＤＦおよびＥｒｂＢ−２レセプターの相互作用が、傷の修復の間の上皮の移動および分化を導くことにおいて重要であることを報告した。Danilenkoら,Abstract 3101,FASEB 8（4-5）:A535（1994）。
MeyerおよびBirchmeirは、in situハイブリダイゼーションおよびＲＮアーゼ保護実験を使用して、胚形成の間、および周産期の動物におけるマウスヒレグリンの発現を分析した。MeyerおよびBirchmeier,PNAS USA 91:1064-68（1994）。これらの著者は、この分子の発現に基づいて、ヒレグリンが間葉因子及び神経因子としてイン・ビボで役割を演じることを結論付けている。彼らの発見はまた、ヒレグリンが上皮の形成において機能することを示した。
Fallsら（上記参照）は、ニワトリＡＲＩＡが、運動ニューロンのシナプス後部の筋細胞において神経伝達物質レセプターの合成および濃度に主に影響する、筋管分化において役割を演じていることを見出した。CorfasおよびFischbachは、ＡＲＩＡがまた、ニワトリ筋肉におけるナトリウムチャネルの数を増大することを示した。CorfasおよびFischbach,J.Neuroscience 13:2118-25（1993）。
ウシＧＧＦは、シュヴァン細胞に対してマイトジェン性であることが報告されている。例えば、Brockesら,J.Biol.Chem.255:8374-77（1980）;LemkeおよびBrockes,J.Neurosci.4:75-83（1984）;Brockesら,J.Neuroscience 4:75-83（1984）;Brockesら,Ann.Neurol.20:317-22（1986）;Brockes,Methods in Enzym.147:217-225（1987）;Marchionniら,上記参照を参照。シュヴァン細胞は、ミエリン化ニューロンの軸索の周りを覆うミエリンを提供し、それ故末梢神経の形成、機能および再生において重要な役割を演じる。治療上の観点からこの役割の意味は、Leviら,J.Neuroscience 14:1309-19（1994）によって注意が向けられている。Leviらは、損傷された脊髄の領域内に移植できるシュヴァン細胞を含む細胞性人工器官の構築に対する可能性を議論した。エクス・ビボでシュヴァン細胞を培養するための方法が記載されている。国際特許出願ＷＯ ９４／００１４０;Liら,J.Neuroscience 16:2012-19（1996）参照。
ＧＧＦＩＩは、融合しかかった休止ヒト骨髄芽細胞に対してマイトジェン性であることが示されており、ＧＧＦＩＩの継続的な存在下で、クローン性ヒト骨髄芽細胞の分化は、分化の６日後に、より多い数の筋管を引き起こす。Sklarら,J.Cell Biochem.,Abst.W462,18D,540（1994）;国際特許出願ＷＯ ９４／２６２９８もまた参照。
新規なタンパク質の構造と機能の間の関係は、いかなる様々な利用可能なミューテーション分析法を用いても調べることができる。上記方法の例としては、アラニンスキャニングミュータジェネシスおよびファージミドディスプレーが含まれる。アラニンスキャニングは、タンパク質またはタンパク質ドメインにおける活性残基（すなわちタンパク質機能に対して有意な効果を有する残基）を同定するために使用され得る。例えば、CunninghamおよびWellsは、レセプターを結合するのに重要であるヒト成長ホルモンにおける残基を同定するために、アラニンスキャニングを使用した。CunninghamおよびWells,Science 244:1081-85（1989）。アラニンスキャニングにおいては、スキャンされるタンパク質またはドメインをコードする遺伝子を発現ベクター内に挿入し、連続的な残基がアラニンに変換されたタンパク質またはドメインをコードする一連のベクターを生産するためにミュータジェネシスを実施する。コードされたタンパク質またはドメインをこれらのベクターから発現し、それからアラニン置換変異体の活性を、改変された活性を有するものを同定するために試験する。活性の改変は、アラニン置換部位での残基が活性残基であることを示す。
ファージミドディスプレーは、特定の結合活性のための数多くの変異体ポリペプチドのスクリーニングを許容するために開発された。SmithおよびParmleyは、外来ペプチドが、ファージｆｄの遺伝子ＩＩＩ内に短い遺伝子断片を挿入することによって、繊維状ファージの表面上に効率的に「ディスプレー」され得ることを示した。Smith,Science 228:1315-17（1985）;ParmleyおよびSmith,Gene 73:305-18（1985）。遺伝子ＩＩＩコートタンパク質は、ファージ粒子の一つの末端で約５個のコピーで存在する。修飾されたファージは、遺伝子ＩＩＩコートタンパク質に融合した外来ペプチドをディスプレーするために、「融合ファージ」と名付けられた。各融合ファージ粒子は、融合タンパク質のおよそ５個のコピーをディスプレーするので、この形態のファージディスプレーは「多価ディスプレー」と名付けられた。
ScottらおよびCwirlaらは、融合ファージライブラリーが、「パンニング」として周知である連続的な親和性選択によってスクリーニングすることができることを示した。Scottら,Science 249:386-90（1990）;Cwirlaら,PNAS USA 87:6378-82（1990）。しかしながら、高親和性融合ファージを選択する早期の努力は、おそらくファージ粒子の多価性のため失敗した。この問題は、融合タンパク質がファージミドから低レベルで発現され、ヘルパーファージが野生型コートタンパク質の大過剰を提供するという「一価」ファージディスプレー系の開発により解決された。Bassら,Proteins 8:309-14（1990）;Lowmanら,Biochem.30:10832-38（1991）。一価ファージディスプレーは、興味あるターゲットに高親和性を有して結合するものを単離する目的で、数多くの変異体ポリペプチドを生産しスクリーニングするために使用することができる。
発明の概要
本発明は、天然では見出されないアミノ酸配列を有し、およびＥｒｂＢレセプターを結合する能力を有するヒレグリン変異体を提供する。一つの実施態様として、該変異体は、以下のものより成る群から選択された６４５アミノ酸天然ヒトヒレグリン−β１の残基に相当する選択された残基でアミノ酸置換を有する：
0004515542.tif 000002
この実施態様の変異型として、アミノ酸置換が、選択された残基に相当する上皮増殖因子（ＥＧＦ）残基と選択された残基を交換するものではない。
ヒレグリン変異体は、いかなる種から由来するヒレグリンファミリーのいかなる数の変異体でもあり得る。一つの実施態様として、ヒレグリン変異体は、例えばヒトヒレグリン−β１のようなヒトヒレグリンの変異体である。本発明は、以下のものより成る群から選択されたアミノ酸置換を含むヒトヒレグリン−β１変異体を提供する：
0004515542.tif 000003
この実施態様の変異型として、ヒレグリン変異体は、この群から選択されたアミノ酸置換のセットを含む。アミノ酸置換のセットを有する本発明のいくつかのヒレグリン変異体は、ＥｒｂＢ−３レセプター親和性の少なくとも５０倍の増大を示し、ＥｒｂＢ−４レセプター親和性の増大もまた伴う。
本発明はまた、ヒレグリン変異体が由来するヒレグリンよりも、ＥｒｂＢ−３レセプターに対してＥｒｂＢ−４レセプターについてのより大きい特異性を有するヒレグリン変異体を含む。一つの実施態様として、このヒレグリン変異体は、Ｈ１７８，Ｌ１７９およびＲ２０７より成る群から選択された６４５アミノ酸天然ヒトヒレグリン−β１の残基に相当する選択された残基でアミノ酸置換を有する。
もう一つの実施態様として、ＥｒｂＢ−３レセプターに対してＥｒｂＢ−４レセプターについてのより大きい特異性を有するヒレグリン変異体は、６４５アミノ酸天然ヒトヒレグリン−β１のＳ２２８からＫ２３１残基に相当するアミノ酸残基の欠失を有し、欠失した残基に対して単一のメチオニンの置換を有する。
ここで開示された一つ以上のミューテーションを含むことに加えて、ヒレグリン変異体は、アミノ酸置換、少なくとも一つのアミノ酸の挿入、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、または化学的修飾のような、一つ以上の他の修飾を有することができる。例えば、本発明は、断片であるヒレグリン変異体を提供する。この実施態様の変異型として、該断片は、約１７５残基から約２３０残基（すなわちＥＧＦ様ドメイン）に広がるヒトヒレグリン−β１の部分に相当する残基を含む。この実施態様のさらなる変異型として、該断片は、約１７５残基から約２４５残基に広がるヒトヒレグリン−β１の部分に相当する残基を含む。
本発明の一つの態様は、上記修飾されたヒレグリン変異体を提供するための方法である。修飾（類）は、修飾された変異体がＥｒｂＢレセプターに対する能力を維持するように選択される。
ヒレグリン変異体に加えて、本発明は、関連する核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、ヒレグリン変異体を発現することが可能な発現ベクターを含む宿主細胞を、ヒレグリン変異体の発現を許容する条件下で培養し、それからヒレグリン変異体を培養物から回収するという、ヒレグリン変異体の生産法を提供する。
本発明の他の態様は、ヒレグリン変異体の様々な使用に関する。例えば、本発明は、ヒレグリン変異体をＥｒｂＢレセプターを発現する細胞と接触させるという、ＥｒｂＢレセプターの活性化のための方法を提供する。ヒレグリン変異体は、例えばグリア細胞、シュヴァン細胞または筋細胞のような、細胞のエクス・ビボでの生存、増殖または分化を促進するために、培養物中の細胞と接触させることができる。
代わりに、ヒレグリン変異体を、製薬学的に許容可能なキャリアーと組み合わせ、広範囲のガンの一つ、同様に神経系、筋系および上皮に影響する疾患および疾病を治療するために使用することができる。それ故、本発明は、製薬学的な組成物および治療法を提供する。
本発明はまた、サンプルがヒレグリンを結合するＥｒｂＢレセプターを含むかどうかを測定する方法を含む。特に、ヒレグリン変異体をサンプルと接触させ、ヒレグリン変異体とサンプルの構成要素の間の特異的な結合を、サンプル中に存在するＥｒｂＢレセプター（類）の存在及び／または量の指標として測定する。
【図面の簡単な説明】
図１は、数多くのヒレグリンポリペプチドのＥＧＦ様ドメインにおけるアミノ酸配列、およびヒトヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメイン（”ｂｅｔａ１”）のアミノ酸配列の間の整列を示す。並べられた配列は以下の通りである：ヒトヒレグリン−α（ａｌｐｈａ）、ヒトヒレグリン−β２および−β３（ｂｅｔａ２およびｂｅｔａ３）、ｎｅｕ分化因子ａ２およびｂ１からｂ４（ｎｄｆａ２およびｎｄｆｂ１−４）、グリア増殖因子ＩＩ（ｇｇｆ）、感覚および運動ニューロン由来因子（ｓｍｄｆ）、ヒトヒレグリン−γ、およびアセチルコリンレセプター誘導性活性ポリペプチド（ａｒｉａ）。各配列について示された数字は、配列が示されている天然のポリペプチドのＮ末端から数えた、示された最初のアミノ酸の残基数である。”＃”は、αおよびβ型ＥＧＦ様ドメインの間の差異を示す。
図２は、ヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメイン（ヒレグリン−β１ １７７−２２８残基）のアラニンスキャンの結果を示す。このドメイン内の個々のアミノ酸をアラニンにミューテートし、実施例２に記載されているように、ｇＩＩＩ融合タンパク質としてファージ上に一価的にディスプレーした。ヒストグラムは、ファージＥＬＩＳＡによって測定された、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプター−Ｉｇ融合物（ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇ）に対する各アラニン変異体の結合親和性の変化を示す。Ｘ軸は、アラニンに変化された各アミノ酸とその位置を示す。Ｙ軸は、ファージ上にディスプレーされてもいる、野生型ヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメインについてのＥＣ50に対する、各変異体についてのＥＣ50の比である。ＥＣ50は、固定化されたレセプター融合物に対して結合されたファージの全量の５０％を移し替えるのに必要とされる可溶性レセプター融合物の濃度として計算された。ＥｒｂＢ−３結合結果は、黒い棒グラフで示され、ＥｒｂＢ−４結合結果は、白い棒グラフで示されている。
図３は、実施例３に記載されたファージディスプレー研究でランダム化されたヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメイン（ヒレグリンβ１ １７７−２２８残基）中の各位置でのＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する結合に対して選択されたアミノ酸を示す。バーの長さは、配列が測定されたファージディスプレーライブラリーＡ−ＥおよびＧ−Ｉ由来の変異体中の各位置での特定のアミノ酸の出現頻度を示す（すなわち、バーが長いほど高頻度を示す）。１２のクローンを各ライブラリーから並べたが、ライブラリーＨにおいては、１２のクローンのうち一つのみが、望ましいランダム化ウインドウにおいてミューテーションを有する変異体を表した（実施例３参照）。”ＷＴ”は、ヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメインの野生型アミノ酸配列を示す。
図４は、実施例３に記載された組み合わせ変異体のＥＧＦ様ドメイン中のアミノ酸置換を示す。野生型ヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメイン（ＨＲＧ８）、ヒレグリンβ１ ２０２−２０４残基の欠失を含むこのドメインの変異体（ＨＲＧ６３）、およびＥＧＦ中の類似体ドメインの各アミノ酸配列が上部に示されている。示されたヒレグリン−β１アミノ酸配列の部分に対する残基のナンバーは、この配列の上部に示されている（天然のヒトヒレグリン−β１のＮ末端から数字が打たれている）。示されたＥＧＦアミノ酸配列の部分に対する残基のナンバーは、この配列の下部に示されている（天然ヒトＥＧＦのＮ末端から数字が打たれている）。”.”は、特定の位置で野生型残基と同一である残基を示す。”−”は、残基の不存在を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、選択された残基で一つ以上のアミノ酸置換を有するヒレグリン変異体を提供する。本発明の範囲には、ヒトヒレグリンの変異体、及び特にヒトヒレグリン−β１の変異体が含まれる。本発明にかかるヒレグリン変異体は、選択された残基での単一のアミノ酸置換、または上記置換の組み合わせを有することができる。
ここで特定されるアミノ酸置換に加えて、本発明にかかるヒレグリン変異体は、例えばアミノ酸の欠失を含むさらなる修飾を有することができる。一つの実施態様として、ヒレグリン変異体は、ＥｒｂＢレセプターの結合および活性化に十分である、「最小ＥＧＦ様ドメイン」に相当するアミノ酸だけを残して、ＮおよびＣ末端での欠失を有する。
本発明のヒレグリン変異体は、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４のようなＥｒｂＢレセプターを結合することが可能である。一つの実施態様として、変異体は、最も相同的な天然ヒレグリンの親和性と比較して、ＥｒｂＢレセプターに対する増大した親和性を有する。ＥｒｂＢレセプター結合に加えて、ヒレグリン変異体は、天然ヒレグリンの一つ以上の他の生物学的活性を所有することができる。
本発明はまた、ヒレグリン変異体に関する核酸分子、ベクター、および宿主細胞を提供する。本発明の核酸分子は、本発明のヒレグリン変異体またはその断片をコードする核酸分子をコードする、またはそれに相補的である。核酸分子は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本発明の核酸分子は、コードされたヒレグリン変異体の増殖および／または発現のための適切なベクター内に挿入することができる。上記ベクターは、例えば、ヒレグリン変異体の組換え生産を許容する適切な宿主内に導入される。
本発明のヒレグリン変異体は、様々な治療上及び非治療上の応用において有用である。特に、ヒレグリン変異体は、ガンおよび様々な疾患、並びに神経系、筋系および上皮の疾患を治療するために用いることができる。したがって、本発明は、ヒレグリン変異体を含む製薬学的組成物、および関連する治療法を包含する。
ヒレグリン変異体はまた、細胞培養法および診断法のような、様々な非治療上の応用において使用することができる。例えば、ヒレグリン変異体は、グリア細胞および筋細胞を含む、細胞のエクス・ビボでの生存、増殖および分化を促進するために使用することができる。例示的な診断の応用として、ヒレグリン変異体は、ｅｒｂＢ（例えばｅｒｂＢ２）の過剰発現によって特徴付けされるガンの診断において使用される。したがって、本発明はまた、上記記載の方法を実施するために有用なキットを含む。
定義
ここで使用される、以下の語または表現は、他に示すところがなければ、以下に示される定義を有する。
「アミノ酸」および「残基」なる語は、ここで互換的に使用される。
「野生型アミノ酸」または「野生型残基」なる語は、天然のポリペプチドにおいて所定の位置で存在するアミノ酸を意味する。
アミノ酸は、標準的な三文字コードまたは一文字コードでここで表される。
二つ以上のポリペプチドにおける残基は、もし該残基がポリペプチド構造における類似の位置を占めるのであれば、「相当する」といわれる。本分野で周知のように、二つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列または構造的相同性に基づいて、ポリペプチド配列を並べることによって決定することができる。満足な整列を得るために、各配列中にギャップを導入することが必要であることは、当業者に理解されるであろう。例えば、ヒトヒレグリン−β１における残基に相当するヒトＥＧＦ中の残基は、ヒレグリン−β１ ＥＧＦ様ドメイン（ヒレグリン−β１ １７７−２２８残基）および図４中の類似するＥＧＦドメイン（ＥＧＦ １−４８残基）の間の整列において示される。
二つ以上のヒレグリンにおける残基は、もし該残基が最適な配列整列において並べられたならば、「相当する」といわれる。二つのポリペプチドの間の「最適な配列整列」は、最大の数の並べられた同一の残基が提供される整列として定義される。数多くのヒレグリンポリペプチドに対する最適な配列整列が、図１に示されている。
ヒレグリン−β１における残基位置は、アミノ酸に対する三文字または一文字コードによってここで名付けられており、引き続き、天然ヒトプロヒレグリン−β１（それは長さにおいて６４５アミノ酸である）のＮ末端から数えられた位置番号が付されている。例えば、ヒレグリン−β１の１７７位でのセリンは、”Ｓｅｒ１７７”または”Ｓ１７７”と表される。
以下では、他に示すところがなければ、ヒレグリン、ヒレグリン変異体、またはＥＧＦのような関連するタンパク質における残基位置は、天然ヒトヒレグリン−β１のアミノ酸番号を参考としてここで特定化される。例えば、ヒレグリン−β１変異体は、１−１７６残基のＮ末端欠失を有することができる。この変異体における最初のアミノ酸は、ヒレグリン変異体の最初の残基とヒレグリン−β１のＳｅｒ１７７が、二つのポリペプチドの間の最適な整列で並べられるので、「６４５アミノ酸ヒトヒレグリン−β１のＳｅｒ１７７に相当する残基」としてここで同定される。
実施例３は、「最小ＥＧＦ様ドメイン」と名付けられたヒレグリン−β１の１７７から２２８残基に相当する残基を含むヒレグリン−β１変異体を開示する。これらの変異体については、最小ＥＧＦ様ドメイン（以下では「ヒレグリン−β１ ＥＧＦ」または「ＨＲＧ−β１ ＥＧＦ」）における残基の位置、すなわち１−５２残基の観点から、カッコにおいて、残基番号もまた表される。天然ヒトヒレグリン−β１にしたがって打たれた残基位置は、前者の位置の数字から１７６を差し引くことによって最小ＥＧＦ様ドメインにおける残基位置に変換することができる。例えば、ヒレグリン−β１ Ｓｅｒ１７７については、１７７から１７６を差し引くことで１が与えられ、それ故ヒレグリン−β１ ＥＧＦ Ｓｅｒ１は、ヒレグリン−β１ Ｓｅｒ１７７と同じ位置であると同定される。同じナンバーリング系が、実施例４で使用されている。
アミノ酸置換は、残基位置、引き続きヒレグリンポリペプチド内に置換されたアミノ酸に対するコードによって示される。それ故、ヒレグリン−β１のＳｅｒ１７７でのアラニンの置換は、「ヒレグリン−β１ Ｓｅｒ１７７Ａｌａ」、「Ｓｅｒ１７７Ａｌａ」または「Ｓ１７７Ａ」として表される。この例において、セリンは「置換されたアミノ酸」であり、アラニンは「置換アミノ酸」である。
二つのアミノ酸配列を記載するために用いられる、「相同」なる語は、アミノ酸配列が、ある程度のアミノ酸配列同一性を有することを示す。
ヒレグリン変異体
本発明は、ヒレグリン変異体を含む。「ヒレグリン変異体」なる語は、天然のヒレグリンのポリペプチド変異体を意味する。天然のヒレグリンは、天然で生じるヒレグリンポリペプチドのいかなるファミリーのものであれ、その全長のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして定義される。このファミリーは、プロヒレグリン、同様にこれらのタンパク質の可溶性形態を包含する。本発明は、ヒトヒレグリン−β１の変異体を用いて例示される。実施例１−３参照。しかしながら、ヒレグリンファミリーは、最適な整列で並べられた場合、ヒレグリン−β１のＥＧＦ様ドメインと、少なくとも７０％の配列同一性を有するＥＧＦ様ドメインを有する、いかなる天然で生じるポリペプチドをも包含する。それ故、天然のヒレグリンは、いかなる種、および数多くの天然で生じるアイソフォームまたは対立遺伝子形態の一つ由来でもあり得る。例示的なヒレグリンポリペプチドとして、ｎｅｕ分化因子、グリア増殖因子、感覚および運動ニューロン由来因子、およびアセチルコリンレセプター誘導性活性ポリペプチドが含まれる。
一つの実施態様として、ヒレグリン変異体は、哺乳動物ヒレグリンの変異体である。この実施態様の変異型として、ヒレグリン変異体はヒトヒレグリンの変異体である。ヒトヒレグリンの例として、ヒレグリン−α（ＨＲＧ−α）、ヒレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）、ヒレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）、ヒレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）、およびヒレグリン−γ（ＨＲＧ−γ）が含まれる。
本発明にかかるヒレグリン変異体は、天然のヒレグリン中の野生型残基が、異なる残基によって置換されている、天然では見出されないアミノ酸配列を有する。このアミノ酸置換は、天然ヒトヒレグリン−β１の残基に相当する一つ以上の選択された残基で生じる。選択された残基は、以下の群から選択される：
0004515542.tif 000004
しかしながら、一つの実施態様として、アミノ酸置換は、選択された残基に相当するＥＧＦ残基を用いた選択された残基の置換ではない。アラニンを用いたヒレグリン−β１中のいかなる上記の残基の置換も、ファージＥＬＩＳＡによって測定されるＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターについての親和性に対する少なくとも２倍の効果を有する。実施例２参照。
一つの実施態様として、選択された残基は以下の群から選択される：
0004515542.tif 000005
アラニンを用いたヒレグリン−β１中のいかなるこれらの残基の置換も、ファージＥＬＩＳＡによって測定されるＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターについての親和性に対する少なくとも５倍の効果を有する。実施例２参照。
この実施例の変異型として、選択された残基は以下の群から選択される：
0004515542.tif 000006
アラニンを用いたヒレグリン−β１中のいかなるこれらの残基の置換も、ファージＥＬＩＳＡによって測定されるＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターについての親和性に対する少なくとも１０倍の効果を有する。実施例２参照。
一般的に、もし機能が置換のために選択された位置で保存されているのであれば、選択された残基を置換するために使用された残基は、野生型残基と性質において実質的に異ならない、すなわち、アミノ酸置換は保存的な置換である。アミノ酸は、表１に示されるように性質にしたがってグループ分けし得る。
0004515542.tif 000007
それ故、機能を保存するために、野生型残基を置換するために使用される残基は、通常同じ群または関連する群から選択される。さらに、セリンまたはアラニンは、ほとんどの他の残基を置換するために使用することができる。表２は各アミノ酸に対する保存的な置換を示し、それぞれに対する関連する群を同定し、アミノ酸がセリンまたはアラニンを用いて置換できることを示す。表２はまた、好ましいアミノ酸置換をも示す。
0004515542.tif 000008
一つの実施態様として、ヒレグリン変異体はヒトヒレグリン−β１の変異体であり、以下の群から選択されるアミノ酸置換（類）を含む：
0004515542.tif 000009
本発明のもう一つの態様は、実施例３に記載された何れかのヒレグリン変異体のような、アミノ酸置換のセットを含むヒトヒレグリン−β１の変異体である。アミノ酸置換のセットは、以下に示された群から選択される（実施例３由来の変異体ナンバーが左側の欄に示されており、引き続き当該変異体のアミノ酸置換のセットが示されている）：
0004515542.tif 000010
これらのアミノ酸置換のセットのそれぞれは、ファージＥＬＩＳＡによって測定すると、ＥｒｂＢ−３レセプター親和性の少なくとも５倍の増大を生ずる。実施例３参照。
この実施態様における変異体では、アミノ酸置換のセットは、以下の群から選択される：
0004515542.tif 000011
これらのアミノ酸置換のセットのそれぞれは、ファージＥＬＩＳＡによって測定すると、ＥｒｂＢ−３レセプター親和性の少なくとも２０倍の増大を生ずる。実施例３参照。
この実施態様のもう一つの変異型として、アミノ酸置換のセットは、以下の群から選択される：
0004515542.tif 000012
これらのアミノ酸置換のセットのそれぞれは、ファージＥＬＩＳＡによって測定すると、ＥｒｂＢ−３レセプター親和性の少なくとも５０倍の増大を生ずる。実施例３参照。
本発明はまた、ヒレグリン変異体が由来するヒレグリンよりも、ＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについてのより大きい特異性を有するヒレグリン変異体が含まれる。上記増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性は、ＥｒｂＢ−３レセプターに対する結合よりも、ＥｒｂＢ−４レセプターに対する結合についてより小さい変異体：野生型ＥＣ50比として測定され得る。一般的に、増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性を有するヒレグリン変異体は、ＥｒｂＢ−４レセプターに対するほぼ野生型の親和性を有し、またはＥｒｂＢ−３レセプターに対する有意に減少した親和性（すなわち少なくとも５−１０倍）を好ましくは共に有する。
一つの実施態様として、増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性を有するヒレグリン変異体は、Ｈ１７８，Ｌ１７９およびＲ２０７より成る群から選択された６４５アミノ酸天然ヒトヒレグリン−β１の残基に相当する選択された残基でアミノ酸置換を有する。例えば、本発明は、アミノ酸置換Ｈ１７８ＥまたはＲ２０７Ｐを含むヒトヒレグリン−β１を提供する。
もう一つの実施態様として、増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性を有するヒレグリン変異体は、６４５アミノ酸天然ヒトヒレグリン−β１のＳ２２８からＫ２３１残基に相当するアミノ酸残基の欠失を有し、欠失された残基の代わりに単一のメチオニンの置換を有する。この実施態様の変異型として、ヒレグリン変異体はまた、アミノ酸置換Ｈ１７８Ｌを含む。
上記アミノ酸置換に加えて、ヒレグリン変異体は、任意に以下の修飾のいずれかを単一にまたは組み合わせて有する；
（１）一つ以上のさらなるアミノ酸の置換；
（２）ヒレグリン変異体のアミノ酸配列のＮまたはＣ末端に加えられた、または上記配列中に挿入された一つ以上のアミノ酸；
（３）ヒレグリン変異体から欠失された一つ以上のアミノ酸；および
（４）ヒレグリン変異体中のアミノ酸の一つ以上の共有結合修飾。
それ故、ヒレグリン変異体は、「実質的に全長」であり得、それはここにおいて、変異体が最も相同である天然のヒレグリンと少なくとも９０％、ヒレグリン変異体が同じ長さであることを意味する。代わりに、ヒレグリン変異体は、最も相同な天然ヒレグリンの９０％未満の長さである「断片」でもあり得る。断片であるヒレグリン変異体は、一般的に約３０から約１００アミノ酸、より一般的に約４０から約６０アミノ酸、さらにより一般的に約４５から約６５アミノ酸、そして最も一般的に約５０アミノ酸の長さである。
例えば、ヒレグリン変異体は、「最小ＥＧＦ様ドメイン」に相当するアミノ酸を含むことができる。最小ＥＧＦ様ドメインは、ＥｒｂＢレセプターの結合および活性化に対して十分である天然のヒレグリンの部分である。一般的に、最小ＥＧＦ様ドメインは、約７０アミノ酸未満であり、通常約６０アミノ酸未満の長さである。ヒトヒレグリン−β１を参考として用いると、最小ＥＧＦ様ドメインは１７７−２２８残基にわたっている。他に示すところがなければ、「ＨＲＧ−β１ ＥＧＦ」は、最小ＥＧＦ様ドメインを指す。
本発明にかかるヒレグリン変異体の適した共有結合修飾の例として、検出可能な標識との接合、「ペグ化」および細胞毒性試薬との接合が制限されることなく含まれる。ヒレグリン変異体は、サンプル中のＥｒｂＢレセプターの存在を検出するために有用な接合物を生産するために、広範囲の様々な利用可能な標識の何れかに接合することができる。適切な標識には、放射性同位元素、蛍光標識、および酵素標識が含まれる。例示的な放射性同位元素標識として、35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉが含まれる。ヒレグリン変異体は、Current Protocols in Immunology Vols.1 & 2（Coligenら,Wiley Publishers）に一般的に記載されているように、放射性同位元素に接合することができる。
ヒレグリン変異体に対する接合物として適した蛍光標識には、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッド、並びにそれらの誘導体が含まれる。接合物は例えば、Current Protocols in Immunology上記参照に記載されているように調製される。
様々な酵素−基質系が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのいくつかのレビューを提供する。一般的に、上記系に有用な酵素は、基質の容易に検出可能な化学的改変を触媒する。例えば、酵素は、分光学的に測定され得る色素の変化を触媒し、あるいは蛍光計または化学発光計を用いてそれぞれ検出し得る蛍光または化学発光の変化を触媒することができる。例示的な酵素標識には、ルシフェラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。ヒレグリン変異体は、O’Sullivanら,Methods in Enzym.73:47-166（1981）およびCurrent Protocols in Immunology（上記参照）に一般的に記載されているように、酵素標識に接合することができる。所定の酵素標識と共に使用される適切な基質は、当業者に周知である。
本発明のヒレグリン変異体のもう一つの例示的な修飾はペグ化であり、それはポリペプチドのε−アミノ基（類）に、一つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を接合することを指す。ペグ化は、イン・ビボ半減期を増大し、および／または治療上のタンパク質の免疫原性および潜在的な毒性を減少するので、ヒレグリン変異体が製薬学的な使用を企図される場合、ペグ化は望ましい。Abuchowskiら,J.Biol.Chem.252:3582-86（1977）参照。
細胞毒性試薬を用いたヒレグリン変異体の接合は、その表面で適切なＥｒｂＢレセプターを発現する細胞を特異的に結合するターゲット化細胞毒性試薬を提供する。「細胞毒性試薬」なる語は、細胞の機能を阻害または妨げ、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、例えば放射性活性同位元素（例えばＩ、Ｙ、Ｐｒ）および化学療法試薬を含む。
「化学療法試薬」とは、ガンの治療に有用ないかなる化学的化合物をもここで指す。「ガン」なる語は、非制御的な細胞増殖によって特徴付けされる哺乳動物における生理学的疾患を指す。ガンの例としては、ガン腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が制限されることなく含まれる。上記ガンのより特異的な例としては、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃ガン、膵臓ガン、グリア芽細胞腫および神経線維腫のようなグリア細胞腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝細胞ガン、乳ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、腎性ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン腫、および様々な型の頭と頸のガンが含まれる。化学療法試薬の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タクソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンプラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン、メルファランおよびいかなる関連するナイトロジェンマスタード、および内分泌系治療薬（ジエチルブチルベストロール［ＤＥＳ］、タモキシフェン、黄体形成ホルモン放出ホルモン−拮抗薬剤、プロゲスチン、抗プロゲスチン等のような）が含まれる。
化学的化合物に対する接合に加えて、いかなる上記記載のヒレグリン変異体も、「キメラヒレグリン変異体」を生産するために異種ポリペプチドに対する融合によって修飾することができる。（キメラヒレグリン変異体はまた、「融合タンパク質」としてもここで示される。）典型的には、ヒレグリン変異体の生物学的活性を妨げるために、異種ポリペプチドをヒレグリン変異体のＮまたはＣ末端で融合する。しかしながら、異種ポリペプチドはまた、生物学的活性に重要ではないヒレグリン変異体の領域に導入される。一般的に、キメラヒレグリン変異体は、組換え法によって生産される。キメラヒレグリン変異体の例としては、「シグナル配列」、「精製ハンドル」、および免疫グロブリン配列に融合されたヒレグリン変異体が含まれる。
「シグナル配列」とは、キメラタンパク質を発現するする細胞から、それらを融合したポリペプチドの分泌を導くアミノ酸配列である。それ故、シグナル配列に対するヒレグリン変異体の融合は、キメラヒレグリン変異体を宿主細胞培養培地内に分泌させ、そこからキメラヒレグリン変異体を比較的容易に回収することができるため、ヒレグリン変異体の組換え生産を容易にする。
適切なシグナル配列は、シグナル配列を有するいかなるタンパク質からも得ることができ、典型的にヒレグリン変異体のＮ末端に融合される（がいつもそうであるわけではない）。原核生物シグナル配列をコードするＤＮＡは、例えばｌａｍＢまたはｏｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡおよび他の遺伝子から得ることができる。本発明を実施するための簡便な原核生物シグナル配列は、大腸菌熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列である。
「精製ハンドル」とは、「結合パートナー」と呼ばれるもう一つのポリペプチドを結合するポリペプチドの部分である。ヒレグリン変異体に対する精製ハンドルの融合は、該変異体に結合パートナーを結合する能力を与え、それは、結果として生じるキメラヒレグリン変異体の精製を容易にする。一般的に、精製ハンドルは、結合パートナーが、キメラヒレグリン変異体が精製される混合物に存在する他の構成要素と実質的に交差反応しないように選択される。ここで用いられる、「実質的に交差反応しない」なる語は、精製ハンドルに対する結合パートナーの親和性が、混合物中に存在するいかなる他の構成要素に対するいかなる親和性の少なくとも約２０倍、一般的に少なくとも約１００倍、より一般的に少なくとも約１０００倍であることを意味する。
一つの実施態様として、精製ハンドルは、抗体によって認識されるエピトープであり、それ故該キメラヒレグリン変異体は、「エピトープタグ化ヒレグリン変異体」と呼ばれる。適切なエピトープは一般的に、少なくとも５アミノ酸、一般的に約１０から約５０の間のアミノ酸、より一般的に約１０から約３０の間のアミノ酸を有する。
イムノグロブリン配列に融合したヒレグリン変異体を含むキメラ分子は、「ヒレグリン変異体イムノアドヘシン」と呼ばれる。一つの実施態様として、イムノグロブリン配列は、イムノグロブリン定常ドメインである。ヒレグリン変異体イムノアドヘシン中のイムノグロブリン配列は、ＩｇＧ1，ＩｇＧ2，ＩｇＧ3またはＩｇＧ4サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。一つの実施態様として、イムノグロブリン配列は、ＩｇＧ1またはＩｇＧ3から得られる。
キメラヒレグリン変異体の他の例としては、チオレドキシン、「サルベージレセプター結合エピトープ」、または細胞毒性ポリペプチドに融合されたヒレグリン変異体を含む。チオレドキシンとのヒレグリン変異体の融合は発現を増大させ、アガロースのような固体の支持体に共有結合することができるフェニルアルシンオキシドを使用した精製を容易にする精製ハンドルを提供する。（フェニルアルシンと官能化したアガロースは、Invitrogen Corp.,San Diego,CAからThibondTM樹脂として商業的に入手可能である）。例示的なチオレドキシン−変異体融合タンパク質は、実施例２に記載されている。
「サルベージレセプター結合エピトープ」なる語は、ＩｇＧのイン・ビボでの血清半減期を増大するＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ1，ＩｇＧ2，ＩｇＧ3またはＩｇＧ4）のＦｃ領域のエピトープを指す。本発明にかかるヒレグリン変異体に対する融合物として適切なサルベージレセプター結合エピトープには、いかなる周知のサルベージレセプター結合エピトープもが含まれる。
「細胞毒性ポリペプチド」なる語は、細胞機能を阻害するまたは細胞を殺傷するポリペプチドを指す。ヒレグリン変異体に対する融合物として適切な細胞毒性ポリペプチドには、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素およびその断片、並びにＳＨ２含有基質タンパク質に対するチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチドのようなガン遺伝子産物／チロシンキナーゼインヒビターが含まれる（例えば国際特許出願ＷＯ ９４／０７９１３参照）。
一つの実施態様として、キメラヒレグリン変異体は、「プロドラッグ」を活性薬剤に変換する酵素に融合したヒレグリン変異体を含む。典型的には、「プロドラッグ」は、薬剤自体よりも細胞毒性の少ない、および細胞毒性薬剤に酵素学的に活性化または変換されることができる細胞毒性薬剤の前駆体または誘導体形態である。本発明のプロドラッグには、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、５−フルオロウリジンプロドラッグ、およびそれらの誘導体が含まれる。本発明の使用のためのプロドラッグを生産するために誘導化することができる細胞毒性薬剤の例として、上記記載の化学療法試薬が制限されることなく含まれる。
本発明にかかるヒレグリン変異体は、ＥｒｂＢレセプターを結合することができる。「ＥｒｂＢレセプター」なる語は、哺乳動物クラスＩチロシンキナーゼレセプターの何れかを指す。上記レセプターの例としては、ＥｒｂＢ−１レセプター（「ＥＧＦレセプター」としても周知である）、ＥｒｂＢ−２レセプター（ＨＥＲ２レセプター」とも呼ばれる）、ＥｒｂＢ−３（または「ＨＥＲ３」）レセプター、およびＥｒｂＢ−４（または「ＨＥＲ４」）レセプターが含まれる。「結合できる」なる語は、少なくとも１ｍＭの解離定数（Ｋd）をもってもう一つのポリペプチドを結合するポリペプチドを記載するために使用される。
ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターを結合可能な例示的なヒレグリン変異体は、上記および実施例中に議論されている。さらなる修飾（たとえばさらなるアミノ酸の置換、付加、挿入、または欠失、あるいは共有結合修飾）を有するさらなるヒレグリン変異体の生産、およびキメラヒレグリン変異体の生産は、当業者の範囲内に存在する。
さらに、ここでの教示に照らして、当業者は、本発明のヒレグリン変異体の結合活性を保存する数多くのさらなる変異体をデザインすることが可能である。例えば、ヒレグリン変異体の非重要な残基における保存的置換（実施例２に同定される）は、ＥｒｂＢレセプター結合を有意に改変するとは期待されない。さらに、ＥｒｂＢレセプター結合に対するいかなる効果も、実施例１−３に記載されているもののような、簡単な結合アッセイで容易に測定され得る。それ故、本発明は、存在するいかなるさらなる修飾にも関わらず、上記議論されている特異的な位置でアミノ酸置換を有する全てのヒレグリン変異体を包含する。
ＥｒｂＢレセプター結合に加えて、本発明のヒレグリン変異体は、一つ以上の他の天然のヒレグリンの生物学的活性を所有することができる。例えば、ヒレグリン変異体はまた、ＥｒｂＢレセプターを活性化する能力を有する。「ＥｒｂＢレセプターを活性化する能力」なる用語は、ＥｒｂＢレセプターの細胞内キナーゼドメインがチロシン残基をリン酸化するように引き起こす能力を指す。一般的に、レセプター活性化は、二つ以上のＥｒｂＢレセプターのレセプター複合体（例えばＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４複合体）に対するヒレグリンの結合に関与する。レセプター結合は、一つ以上のレセプターのキナーゼドメインを活性化し、それは一つ以上のレセプターにおけるチロシン残基のリン酸化、および／またはさらなる基質ポリペプチド（類）におけるチロシン残基のリン酸化を活性化する。ＥｒｂＢレセプターリン酸化は、実施例３に記載されるチロシンリン酸化アッセイを使用して定量することができる。
さらに、本発明のヒレグリン変異体は、適切なＥｒｂＢレセプターを有する細胞の生存、増殖および／または分化を増大することができる。「細胞の生存を増大する」なる用語は、ヒレグリン変異体にさらされていない細胞（「非処理細胞」）の生存の期間に対して、イン・ビトロまたはイン・ビボのそれぞれで、細胞の生存の期間を増大することを指す。
「細胞の増殖を増大する」なる用語は、非処理細胞に対して、イン・ビトロまたはイン・ビボのそれぞれで、有糸分裂の速度または数を増大することを意味する。細胞培養物における細胞増殖の増大は、ヒレグリン変異体にさらす前後の細胞数のカウントによって、または集合の程度の顕微鏡による観察によって検出することができる。細胞増殖は、細胞による3Ｈ−チミジン取り込みを測定することによっても定量することができる。
「細胞の分化を増大する」なる用語は、細胞特異化の程度を増大することを指す。細胞特異化は、もともとの細胞のものとは異なる一つ以上の性質の獲得によって特徴付けされる。それ故、細胞特異化の程度は、細胞の表現型の変化（例えば細胞形態の変化を同定する）に対してスクリーニングすることによって、典型的に測定される。
ＥｒｂＢレセプターを発現し、それ故ヒレグリンに対して応答的な例示的な細胞には、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、グリア細胞、グリア芽細胞、シュヴァン細胞、肝細胞、上皮細胞、、および筋細胞が含まれる。グリア細胞は、中枢神経系から由来し、稀突起膠細胞および星状細胞を含む。ＥｒｂＢレセプターを発現する筋細胞には、筋細胞前駆体（筋芽細胞）、同様により特異化した骨格筋、心筋、平滑筋細胞が含まれる。
本発明のヒレグリン変異体が所有することができる他の生物学的活性には、イオンチャンネル（例えばＮａ+チャンネル）形成の誘導；神経筋接合部でのアセチルコリンレセプター合成の誘導；ニューロン、および筋肉、神経または腺細胞の間のシナプス接合部の形成の促進；エストロゲンレセプターの下流調節；および細胞内在化（核の局在とおそらく関連する）が含まれる。
ヒレグリン変異体は、ペプチド合成及び組換え生産を含むいかなる適切な方法によっても生産される。一般的に、以下に詳細に記載される組換え法は、約５０より長いヒレグリン変異体またはアミノ酸に対して使用される。
ＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについての増大した特異性を有するヒレグリン変異体は、一つ以上のヒレグリン残基をミュータジェナイズし、増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性を有する変異体を選択することによって調製することができる。一般的に、この文脈によってミュータジェネシスのために選択された残基は、ＥｒｂＢ−３レセプターに対する結合の効果と比較して、ＥｒｂＢ−４レセプターに対して結合する効果の差異によって特徴付けされる。上記残基は、例えば実施例２に提示されているアラニン−スキャニングから明らかである。
増大したＥｒｂＢ−４レセプター特異性を有する変異体は、実施例４に記載されている、一価ファージディスプレーのような、いかなる適切なスクリーニング法を使用してもＥｒｂＢ−４レセプターに対する結合についてスクリーニングすることによって選択される。該結果は、この場合ＥｒｂＢ−３レセプターに対する高親和性を有して結合する変異体の除去を引き起こす「カウンター選択」に変異体を受けさせることによって改良することができる。実施例４は、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するカウンター選択が、野生型ＨＲＧ−β１のものよりも、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対してＥｒｂＢ−４−Ｉｇについてのより大きい特性を示す変異体の有意な豊富化を提供する。
核酸分子
本発明はまた、ヒレグリン変異体に関する核酸分子を含む。「核酸分子」なる語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応［”ＰＣＲ”］のような）によって生産されるＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチド合成によって生産されるＤＮＡを含む一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ分子、同様にｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子を包含する。ゲノムＤＮＡは、非転写および翻訳領域を含む（５’および３’非コード領域、イントロン、およびヒレグリン変異体コード領域のような）。ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ分子は、転写される領域に相当する配列を含む。
本発明にかかる核酸分子は、天然では見出されないヌクレオチド配列を有し、本発明のヒレグリン変異体またはその断片をコードする核酸分子をコードするまたはそれに相補的である。相補的なヌクレオチド配列は、その構成要素を用いてワトソン−クリック結合を形成することが可能であり、その場合アデニンはチミンまたはウラシルとペアを形成し、グアニンはシトシンとペアを形成する。二本鎖ＤＮＡ分子は、ヒレグリン変異体の一つをコードし、一方一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖の何れかである。核酸分子がヒレグリン変異体の断片をコードする（またはコードする核酸分子に対して相補的である）場合、該断片は少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
遺伝学的コードの縮重のため、各ヒレグリン変異体に関連する数多くの考え得る核酸分子が存在する。より特異的には、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードするため、多数の異なる核酸分子が同じヒレグリン変異体をコードする（またはコードする核酸分子に対して相補的である）。
一般的には、本発明のヒレグリン変異体は、ヒレグリン変異体アミノ酸配列内に望ましいミューテーションを導入するように、天然で生じるＤＮＡ配列をミューテートすることによって生産される。しかしながら、コードされるアミノ酸を改変することなく核酸分子中の一つ以上のコドンを変化することも有利である。本発明の範囲にある上記「サイレントミューテーション」の例として、例えば、望ましいベクターの構築を容易にするために制限エンドヌクレアーゼ部位を作出するまたは破壊するミューテーション、およびコードされるヒレグリン変異体の発現を増大するミューテーションが含まれる。後者の例としては、転写されたｍＲＮＡ中の５’ステムおよびループ構造の形成を減少するように、または選択された宿主によって容易に転写されるコドンを提供するように（例えば大腸菌または酵母の発現に対して周知の好ましいコドン）デザインされたヌクレオチド置換が含まれる。
本発明の核酸分子は、ベクター（以下にさらに記載される）内に取り込むことができ、例えばハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして使用することができる。本発明にかかるハイブリダイゼーションプローブは、例えば、ミューテートされた核酸分子を含むクローンを同定するための細菌形質転換体をスクリーニングすることのような、望ましいミューテーションを含む核酸分子を検出するために有用である。
上記プローブは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、通常２キロベース未満である。該プローブは、使用されるハイブリダイゼーション条件の下で、検出されるミューテートされた配列とハイブリダイズし、他の配列とのハイブリダーゼーションから実質的にフリーであるために十分なヌクレオチドの数を含む。典型的には、本発明のプローブは、少なくとも５０ヌクレオチド、通常約１００ヌクレオチドの長さである。
本発明にかかる増幅プライマーは、所望のミューテーションを含む核酸分子を検出するために、またはシークエンシング、ベクター内への挿入のための分子のような十分な量を生産するために、ＰＣＲのような簡便な増幅プロトコールにおいて使用することができる。増幅プライマーは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマー、および増幅される配列の３’末端の構成要素とハイブリダイズする３’下流プライマーを含む、数多くのプライマーペアとして典型的に使用される。
一般的に、本発明にかかるプライマーは、使用されるハイブリダイゼーション条件の下で、ミューテートされた配列とハイブリダイズし、および他の配列とのハイブリダイゼーションから実質的にフリーであるのに十分なヌクレオチドの数を含む。プライマーの特異性は、ミューテートされた配列とハイブリダイズする分子の数と共に増大する。さらに、特異性は、ミューテートされた配列とハイブリダイズするプライマー中の残基の割合と相関する。本発明のプライマーは、一般的に少なくとも約１５ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２０ヌクレオチドを含む。該プライマーは約３０ヌクレオチドを越える必要はなく、通常約２５ヌクレオチドを越えない。この実施態様の一つの変異型として、該プライマーは、約２０から約２５ヌクレオチドを含む。一般的に、該プライマーは、約５５℃から約７５℃の範囲でＴmを有すべきである。特に、Ｔmは、緊縮条件の下での増幅を容易にするために約６０℃から約６５℃の間である。
ベクターおよび宿主細胞
本発明の核酸分子は、宿主細胞における増殖および／または発現のためのベクター内に取り込ませることができる。上記ベクターは、適切な宿主細胞内でベクターの効率的な複製が可能である複製配列（すなわち複製のオリジン）、同様に抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカーをコードする配列を含む。適切な宿主のトランスフォーメーションにおいて、該ベクターは宿主のゲノムとは独立に複製し機能することができ、または宿主ゲノム内に挿入されることができる。ベクターのデザインは、その他の中では、ベクターについて企図される使用および宿主細胞に依存し、特定の使用および宿主細胞に対するヒレグリン変異体ベクターのデザインは、当業者の範囲内にある。
もしベクターがヒレグリン変異体の発現を企図された場合、該ベクターは、実施可能に結合したヒレグリン変異体コード配列の発現を効果的にするおよび／または増大することが可能な一つ以上の制御配列を含む。原核生物における発現のための適切な制御配列は、例えばプロモーター配列、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物における発現のための制御配列は、プロモーター、エンハンサー、および転写終結配列（すなわちポリアデニル化シグナル）を含む。
「実施可能に結合」なる語は、二つの核酸配列がお互いに機能的に関係していることを意味する。例えば、プロモーター（エンハンサー）は、もし配列の転写を有効にする（または促進する）ならば、コード配列と実施可能に結合している。リボソーム結合部位は、もし翻訳を容易にするように位置していれば、コード配列と実施可能に結合している。実施可能に結合した核酸配列は大抵連続しているが、これは必須ではない。例えば、エンハンサーはコード配列の転写を増大するために、コード配列と連続している必要はない。
ヒレグリン変異体発現ベクターはまた、シグナル配列または増幅可能遺伝子をコードする核酸配列のような他の配列を含む。上述されているように、シグナル配列は、キメラタンパク質を発現する細胞からの、それに融合されたポリペプチドの分泌を引き起こす。発現ベクターにおいては、シグナル配列をコードする核酸は、ヒレグリン変異体コード配列のリーディングフレームを保存するように、ヒレグリン変異体コード配列に結合している。ヒレグリン変異体発現ベクターに増幅可能遺伝子（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ［ＤＨＦＲ］遺伝子）を含ませることは、ヒレグリン変異体をコードする核酸分子の複数のコピーを含む宿主細胞の選択を許容する。
本発明のベクターは、ありきたりの制限部位での結紮によって所望の要素と結合することで生産される。もし上記部位が存在しないのであれば、適切な部位を標準的なミュータジェネシス（例えば部位特異的またはカセットミュータジェネシス）または合成オリゴヌクレオチドアダプターによって導入することができ、あるいはリンカーを通常の方法にしたがって使用することができる。
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。広範囲の様々な宿主細胞が、ベクターの増幅および／または発現のために利用可能である。例としては、原核生物（大腸菌並びにバチルス、シュードモナスおよび他の細菌の株のような）酵母または他の真菌類、昆虫細胞、植物細胞、およびファージ、同様に高等真核細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞および他の哺乳動物細胞のような）が含まれる。本発明にかかる宿主細胞には、培養物中の細胞、トランスジェニックマウスのような生存動物中の細胞が含まれる。ヒレグリン変異体の組換え生産の使用のために適したベクターおよび宿主細胞についてのさらなる情報は、米国特許第５，３６４，９３４号を参照。
本発明のベクターは、いかなる通常の方法によっても宿主細胞内に導入され、該方法は使用されるベクター−宿主系に依存して変化するであろう。一般的に、ベクターは、トランスフォーメーション（「また「トランスフェクション」としても知られる）またはベクターを所有するウイルス（例えばファージ）を用いた感染によって宿主細胞内に導入される。もし宿主細胞が原核生物（または細胞壁を有する他の細胞）であるならば、簡便なトランスフォーメーション法には、Cohenら,PNAS USA 69:2110-14（1972）に記載されたカルシウム処理法、およぶChungら,Nuc.Acids.Res.16:3580（1988）のポリエチレングリコール法が含まれる。もし原核生物が宿主として使用され、ベクターがファージミドベクターであるならば、実施例１に記載されているように、ベクターは感染によって宿主細胞内に導入することができる。酵母細胞は、例えばHinnen,PNAS U.S.A.75:1929-33（1978）に教示されているように、ポリエチレングリコールを使用してトランスフォーム可能である。哺乳動物細胞は、Grahamら,Virology 52:546（1978）、およびGormanら,DNA and Protein Eng.Tech.2:3-10（1990）に記載されたリン酸カルシウム沈殿法を使用して簡便にトランスフォームされる。しかしながら、核への注入、エレクトロポレーション（実施例１参照）、およびプロトプラスト融合のような、宿主細胞内にＤＮＡを導入するための他の周知の方法も、本発明での使用に適している。
一つの実施態様として、ヒレグリン変異体をコードする核酸分子を含む宿主細胞は、国際特許出願ＷＯ ９１／０６６６７に記載されている相同的組換えによって生産される。略記すると、この方法は導入される配列を含む相同的組換えベクターを用いて、内因性ヒレグリン遺伝子を含む宿主細胞をトランスフォームすることを含む。相同的組換えベクターはまた、内因性ヒレグリン遺伝子と並んだ内因性配列と相同である少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さの少なくとも一つの配列を含む。適切な横に並んだ配列は、例えば開始時点として周知の天然のヒレグリン核酸配列を使用した、ゲノムウォーキングの方法によって、容易に同定される。相同的組換えベクターはさらに、ＤＨＦＲ遺伝子のような増幅可能遺伝子を含む。
トランスフォーメーションは、ベクターが組換えによって宿主細胞ゲノム内に挿入されるような条件下で実施される。それから、ベクターを挿入する細胞を、増幅可能遺伝子の増幅のために選択する条件下で培養する。それから結果として生じた細胞を、高レベルのヒレグリン変異体生産についてスクリーニングする。
ヒレグリン変異体の組換え生産
組換え的にヒレグリン変異体を生産するために、ヒレグリン変異体発現ベクターを含む宿主細胞を調製し、細胞増殖およびヒレグリン変異体の発現のために適した条件下で培養する。特に、培養培地は、使用される宿主のための適切な栄養素および増殖因子を含む。選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養素および増殖因子は、多くの場合周知であり、当業者は経験的に容易に決定することができる。哺乳動物宿主細胞についての適切な培養条件は、例えばMammalian Cell Culture（Mather編.,Plenum Press 1984）並びにBarnesおよびSato,Cell 22:649（1980）に記載されている。
さらに、培養条件は、転写、翻訳、および細胞区画の間のタンパク質輸送を許容するべきである。これらの過程に影響する因子は周知であり、例えばＤＮＡ／ＲＮＡコピー数；ＲＮＡを安定化する因子；細胞培地中に存在する栄養素、補給物、および翻訳誘発物または抑制物；培養の温度、ｐＨおよび浸透圧；並びに細胞密度を含む。特定のベクター−宿主細胞系における発現を促進するこれらの因子の調節は、当業者の範囲内にある。イン・ビトロの哺乳動物細胞培養物の生産性を最適化するための原理および実施法は、例えばMammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach（Butler編,IRL Press 1991）中に見出すことができる。
本発明のヒレグリン変異体の生産に使用される細胞培養法は、タンパク質の大規模または小規模生産のための数多くの周知の方法の何れかである。これらには、流動床バイオリアクター、中空ファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養系、および拡散タンクバイオリアクター系の使用が、制限されることなく含まれる。ヒレグリン変異体は、例えば、バッチ、フェッド−バッチ、または連続的な形態の方法で生産することができる。
上記記載のように生産される組換えタンパク質の回収のための方法は周知であり、使用される発現系に依存して変化する。例えば、もし典型的なように、ヒレグリン変異体が単一の配列に融合されているのであれば、ヒレグリン変異体は、培養培地またはペリプラズムから回収される。便利には、該変異体は、成熟タンパク質としてペリプラズム空間に分泌される。ヒレグリン変異体はまた、細胞内で発現され、細胞溶解物から回収することができる。
ヒレグリン変異体は、宿主細胞の区画または培養培地から該変異体を分離することが可能ないかなる方法によっても、培養培地または細胞溶解物から精製することができる。典型的にはヒレグリン変異体は、ヒレグリン変異体の企図された使用を妨げるであろう宿主細胞および／または培養培地構成物から分離される。第一の段階として、培養培地または細胞溶解物は、細胞破片を除去するために通常遠心分離または濾過される。それから典型的には、さらなる精製のための調製物を調節するために、該上清は、所望の容量に濃縮または希釈され、あるいは適切なバッファー内に二重濾過される。
ヒレグリン変異体は、二つの分子の間の性質のいかなる実質的な差異をも説明するために、最も相同な天然ヒレグリンと同じ方法で典型的にはさらに精製される。例えば、もしヒレグリン変異体が、エピトープタグ化ヒレグリン変異体であるならば、精製は該エピトープタグに対する抗体を含むイムノアフィニティーカラムを使用して実施することができる。ヒレグリンを精製するための以下の例示的な方法が、本発明のヒレグリン変異体を精製するために使用または適用される：イムノアフィニティーカラム上での分画、イオン交換カラム上での分画、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィー、カチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびゲル濾過（例えばHigh Load Superdex 75TMプレップグレードカラムを使用する）。
もしヒレグリン変異体が、初めに不溶性の凝集形態で発現されるのであれば（特に細菌宿主細胞において）、組換えタンパク質伸縮体を可溶化し変性するための本分野で利用可能な方法を使用して、ヒレグリン変異体を可溶化し変性することが必要である。例えば米国特許第４，５１１，５０２号参照。
この実施態様の一つの変異型として、ヒレグリン変異体を、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部のアミノ酸の少なくとも１５残基、および好ましくは２０残基を得るのに十分な程度に、（２）クマシーブルー染色を使用して非還元または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製する。ここで記載される「均質」なる語は、クマシーブルーを使用した染色によって測定すると、他のソース由来のタンパク質が約５％未満であることを意味する。
ヒレグリン変異体の均質性
概して、本発明にかかるヒレグリン変異体は、天然のヒレグリンと同様な応用で使用することができる。もちろん、本発明の範囲内にあるいくつかのヒレグリン変異体は、他の応用よりも一つの応用によりよく適している。しかしながら、当業者は、どのヒレグリン変異体が所定の要用に適しているかを、該変異体の生物学的活性を測定する一つ以上のありきたりのアッセイを使用することによって、容易に突き止めることが可能である。
製薬学的組成物および治療法
ヒレグリンは、神経系、筋系および上皮に影響する広範囲の疾患および疾病を治療するために有用である。さらに、ヒレグリンは、ガンの治療において使用することができる。ここで用いられる「治療」なる語は、存在している疾患または疾病を治療することと同様に、予防手段をも包含する。
したがって、本発明は、様々な疾患または疾病の何れかを治療するのに有用であるヒレグリン変異体を含む製薬学的組成物を提供する。一つの実施態様として、製薬学的ヒレグリン変異体組成物は、哺乳動物を治療するために使用される。特に、該組成物は、ヒト、家畜（例えばウシおよびヒツジ）、動物園の動物、運動に使用される動物（例えばウマ）、およびペット（例えばイヌおよびネコ）を治療するのに有用である。この実施態様の一つの変異型として、該組成物はヒト患者を治療するために使用される。
本発明にかかるヒレグリン変異体は、イン・ビボでのニューロンの形成、維持、および／または再生を促進するために有用である。上記変異体に応答するニューロンは、中枢神経系（脳および脊髄）ニューロン、末梢神経系ニューロン（交感神経系、副交感神経系、感覚、および内臓の各ニューロンを含む）、および運動ニューロンを含む。ヒレグリン変異体治療に服しやすい疾患または疾病は、例えば、外傷、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養欠損、悪性腫瘍、または毒性薬剤に対する神経系の損傷に苦しんでいるヒトで生じる。
ヒレグリン変異体は、ニューロンの生存、増殖、または分化を促進することによって上記患者に対して治療上の利益を提供することができる。例えば、ヒレグリン変異体は、外傷または手術によって損傷した運動ニューロンの生存または増殖を促進するために使用することができる。ヒレグリン変異体はまた、筋萎縮性側面硬化症（ルーゲーリグ病）、ベル麻痺、脊髄筋萎縮症または麻痺を含む様々な疾患を治療するためにも使用することができる。さらに、ヒレグリン変異体はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、感音難聴、およびメニエール病のような、ヒト神経変性疾患を治療するためにも有用である。
さらに、本発明のヒレグリン変異体は、神経障害、特に末梢神経障害を治療するために使用することができる。ここで使用される、「末梢神経障害」なる語は、末梢神経系に影響する疾患を指し、運動、感覚、感覚運動、または自律神経失調症の一つまたは組み合わせとして最も頻繁に明らかにされる。例としては、胃腸管の減少した運動性または膀胱のアトニーのような、遠位感覚運動神経障害、および自律神経失調症が、制限されることなく含まれる。ヒレグリン変異体治療に服しやすい末梢神経障害は遺伝的であり、全身性の疾患から由来し、または毒性物質によって誘発され得る。遺伝的な神経障害の例としては、シャルコー-マリー-ツース病、レフサム病、無β-リポタンパク血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、およびドゥジュリーヌ-ソッタ病が含まれる。全身性疾患と関連する神経障害の例としては、ポストポリオ症候群が含まれる；並びに毒性物質によって誘発される神経障害の例として、化学療法試薬を使用した治療によって引き起こされるものが含まれる。
ヒレグリン変異体はまた、神経機能を改良するために使用することができる。ヒレグリン変異体治療の有益的な効果は、細胞膜中のイオンチャンネルの形成の誘導、およびシナプス接合部の形成の増大に寄与する。
本発明にかかるヒレグリン変異体は、筋細胞、および筋細胞に影響する医学的病状を治療するために使用することができる。特に、上記ヒレグリン変異体は、筋肉の損傷の治療、筋細胞の萎縮症の減少、および筋細胞の生存、増殖および／または再生の増大に対して有用である。ヒレグリン変異体を使用する治療に対して服しやすい筋肉組織の病態生理学的な疾患の例としては、骨格筋疾患（例えばミオパシーまたはジストロフィー）、心筋疾患（心房不整脈、心筋症、虚血性損傷、先天性疾患、および心臓外傷）、および平滑筋疾患（動脈硬化、血管病変、または先天性血管疾患）が含まれる。ヒレグリン変異体はまた、高血圧を減少するために、および筋細胞における機能的アセチルコリンレセプターを増大するために（例えば重症筋無力症または筋頻拍を有する患者における）使用することができる。
本発明のヒレグリン変異体はまた、ＥｒｂＢレセプター、特にＥｒｂＢ−２レセプターおよびＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターのそれぞれを発現する組織の修復および／または再生を促進するために使用することができる。したがって、ヒレグリン変異体は、皮膚の外傷、胃腸疾患、バレット食道、嚢胞性または非嚢胞性末期腎疾患、または炎症性腸疾患の治療において有用である。ヒレグリン変異体はまた、ヒト胃腸、呼吸器、生殖器、または尿路における再上皮形成を促進するために使用することができる。
さらに、本発明にかかるヒレグリン変異体は、腫瘍細胞侵入および転移を阻害するために有用である。特に、減少した内因性ヒレグリンレベルによって特徴付けされる腫瘍（Parkら,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.34:521［1993］）は、本発明のヒレグリン変異体を使用した治療に応答性である。さらに、ＥｒｂＢレセプターを過剰発現する腫瘍は、細胞毒性試薬を腫瘍組織に向けるために、細胞毒性試薬（上記記載）の接合したヒレグリン変異体を使用することによって治療することができる。ヒレグリン変異体−酵素接合体はまた、ＥｒｂＢレセプターを発現する細胞に対してプロドラッグ治療（上記記載）をターゲット化するために使用することができる。
本発明にかかる製薬学的組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第１６版（Osol編、1980）に記載されているような、適宜に生理学的に許容可能なキャリアー、賦形剤、または安定剤と、所望の純度を有するヒレグリン変異体を混合することによって貯蔵のため調製される。該組成物は、凍結乾燥塊、または水溶液の形態で貯蔵することができる。製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量で受容者に非毒性であり、バッファー（リン酸バッファー、クエン酸バッファー、および他の有機酸から調製されるバッファーのような）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、およびイムノグロブリンのような）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンのような）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、およびリシンのような）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノースおよびデキストリンを含む）、キレート剤（例えばエチレンジアミンテトラ酢酸［ＥＤＴＡ］）、糖アルコール（マンニトールおよびソルビトールのような）、塩形成カウンターイオン（例えばナトリウム）、および／または非イオン性界面活性剤（ＴｗｅｅｎTM、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓTM、およびＰＥＧのような）を含む。一つの実施態様として、生理学的に許容可能なキャリアーは、水性ｐＨ緩衝溶液である。
イン・ビボでの投与のために企図されるヒレグリン変異体組成物は、典型的には無菌的である。もし該組成物が凍結乾燥形態で貯蔵されていると、該組成物は、凍結乾燥および再構成の前後で濾過することができる。
本発明の製薬学的ヒレグリン変異体組成物は、例えば皮下注射針によって穴を開けることが可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアルのような、滅菌アクセスポートを有する容器内に一般的に置かれる。
製薬学的なヒレグリン変異体組成物の投与法は、治療上のタンパク質の周知の投与法と異ならない。投与の適切な経路には、例えば静脈内、腹膜内、大脳半球内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内の各経路が含まれる。製薬学的なヒレグリン変異体組成物は、点滴またはボーラス注射によって継続的に投与することができる。
もし望ましければ、持続放出調製物もまた、ヒレグリン変異体を投与するために使用することができる。例示的な持続放出調製物は、ヒレグリン変異体が付着した固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを有する。適したポリマーの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。上記物質は、フィルムまたはマイクロカプセルのような、成形人工物の形態で存在する。
一つの実施態様として、持続放出ヒレグリン変異体調製物は、リポソーム中に封入されたヒレグリン変異体を含む。リポソームは、様々なタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤より成る小粒子である。これらの構成成分は、生体膜の脂質整列と同様な、二重層形態で典型的に整列している。ヒレグリン変異体を含むリポソームは、例えば、Epsteinら,PNAS USA 82:3688-92（1985）、およびHwangら,PNAS USA 77:4030-34（1980）に記載されているもののような周知の方法によって調整される。一般的に、上記調製物中のリポソームは、脂質含有量が約３０モルパーセントコレステロールより大きい小（約２００−８００オングストローム）単一層タイプのものであり、特異的なパーセントは最適な治療を提供するために調節される。有用なリポソームは、例えばホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用して、逆相蒸発法によって生産することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生産するために所定のポアサイズのフィルターを通して成形される。
神経学的疾患または疾病の治療のために、ヒレグリン変異体は、サイラスティック膜のような膜上に吸着され、該膜は国際特許出願ＷＯ ９１／０４０１４に記載されているように、損傷した神経組織に近接して移植することができる。
治療学的に使用されるヒレグリン変異体組成物の投与量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の疾患に依存する。したがって、臨床医は投与量を滴定し、最適な治療効果が必ず得られるように投与経路を修正する必要がある。典型的な一日の投与量は、約１μｇ／体重のｋｇから１００ｍｇ／体重のｋｇまでの範囲であるが、典型的には約１０μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。一般的に、臨床医は、低投与量の製薬学的ヒレグリン変異体組成物を使用して始め、所望の治療効果が達成されるまで投与量を増大する。
本発明のヒレグリン変異体の投与は、他の治療上の摂生を組み合わせることができる。神経学的疾患の治療については、ヒレグリン変異体は、所望の治療効果を達成するためにもう一つの神経栄養因子を適宜組み合わせる、または該因子と同時に投与する。例えば、ヒレグリン変異体は、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（例えばＮＴ−３，−４または−５）、骨由来神経因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子（例えばＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２）、ｇａｓ６、またはニューロンに対する共同刺激効果を達成するためのもう一つの神経栄養因子と共に使用することができる。神経栄養因子についての適切な投与量は、上記分子の本分野で周知のものとは異ならない。
ガンの治療のため、放射線および／または化学療法試薬を、ヒレグリン変異体と同時的に投与することができる。上記化学療法試薬の適切な調製物及び投与スケジュールは、製造者によって推奨される、または臨床医によって経験的に決定される。標準的な化学療法試薬の調製物および投与量については、Chemotherapy Service（Perry編,Williams & Wilkins 1992）を参照。化学療法試薬の投与は、ヒレグリン変異体の投与に先行または引き続き、あるいは化学療法試薬は、そこで同時に与えることができる。例えばＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−２，ＥｒｂＢ−３，またはＥｒｂＢ−４レセプター、あるいは血管内皮因子（ＶＥＧＦ）を結合する抗体のような、腫瘍関連抗原に対する抗体を、一つ以上のサイトカインのようにヒレグリン変異体と共投与することができる。
非治療的方法
本発明にかかるヒレグリン変異体はまた、細胞培養法および診断法のような、様々な非治療的な応用において使用することができる。例えば、ヒレグリン変異体は、グリア、シュヴァン、および筋細胞のような、細胞のエクス・ビボでの生存、増殖、または分化を促進するために使用することができる。上記細胞の培養物は、例えばシュヴァン細胞特異的因子である神経成長因子レセプター（Ｐ７５NGFR）のような、細胞特異的因子を生産するために有用である。細胞特異的因子は、診断の手段として直接的に使用することができ、または診断での使用のため抗体を生産する目的で使用することができる。
エクス・ビボでの細胞培養物はまた、移植のための細胞性人工器官として使用することができる。例えば、シュヴァン細胞培養物は、切断された中枢軸索の再生を促進するために損傷した脊髄の領域内に移植することができ、または末梢神経損傷の修復を助けるために使用することができる。
したがって、本発明は、ヒレグリン応答性細胞が適切な細胞培養培地で提供される細胞培養法を提供する。適切な組織培養培地は、当業者に周知であり、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、およびダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）が制限されることなく含まれる。これらの組織培養培地は、Sigma Chemical Company（St.Louis,MO）およびGIBCO（Grand Island,NY）から商業的に入手可能である。細胞を、ヒレグリン変異体の存在下で細胞の成育を許容する条件下で、細胞培養培地中で培養する。細胞培養のための適切な方法は、周知の方法と異なるところはなく、例えば液体培養、寒天中での培養、および塊中での培養が含まれる。
細胞は、有効量のヒレグリン変異体の存在下で培養される。ヒレグリン変異体の量は、細胞型および細胞培養条件に依存して変化するが、一般的に、約１０ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。所定の細胞培養に対する適切な濃度は、当業者によって経験的に容易に測定されることができる。
エクス・ビボでのシュヴァン細胞の培養法は、Liら（上記参照）によって記載されており、およびSklarら（上記参照）は、クローン化ヒト筋芽細胞のエクス・ビボ培養を記載する。本発明のヒレグリン変異体は、これらの方法で使用される他のヒレグリンポリペプチドの代わりになる。
ヒレグリン変異体はまた、ｅｒｂＢ（例えばｅｒｂＢ２）過剰発現によって特徴付けされるガンの診断で使用することができる。本発明にかかる診断法においては、サンプルは患者から得られ、該変異体とサンプル中に存在するＥｒｂＢレセプターの間の特異的な結合を許容する条件下でヒレグリン変異体と接触される。サンプルは組織サンプル、体液サンプル、または細胞である。固い腫瘍の場合には、組織サンプルは、外科的に取り出された腫瘍から由来し、簡便な方法で試験のため調製することができる。リンパ腫および白血病の場合には、リンパ球、白血球、またはリンパ組織を含むサンプルが得られる。尿、涙、血清、脳脊髄液、便、痰、細胞抽出物等のサンプルを含む他のサンプルは、特定の腫瘍を診断するために有用である。この方法に関して使用される、「特異的な結合」なる語は、ヒレグリン変異体が、適切な反応条件の下でサンプル中に存在する他の構成成分と実質的に交差反応しないのに十分な高い親和性を有してＥｒｂＢレセプターを結合することを意味する。
サンプルに特異的に結合するヒレグリン変異体の量は、ＥｒｂＢレセプター含有量の指標として測定される。例えば、組織サンプルは一次腫瘍から得られ、ホルマリン固定、パラフィン埋没ブロックを調整するために使用することができる。Mussら,上記参照；Pressら,Cancer Research 54:2771-77（1994）参照。それから組織切片を、周知の方法にしたがって調製する。
ヒレグリン変異体は、ヒレグリン変異体と切片中に存在するＥｒｂＢレセプターの間の特異的な結合を許容する条件下で組織切片と接触される。結合は一般的に、放射性同位元素、蛍光標識、または酵素−基質標識化系のような標識を使用して検出される。該標識は、上記記載のようにヒレグリン変異体に直接的に結合することができる。
代わりに、該標識をヒレグリン変異体に間接的に結合することができる。Current Protocols in Immunology（上記参照）に一般的に記載されているように、例えば、標識は抗ヒレグリン変異体抗体に接合することができ、またはビオチンまたはアビジンに接合し、アビジンまたはビオチン（それぞれ）に接合した抗ヒレグリン変異体抗体と共に使用することができる。ビオチンおよびアビジンの間の選択的な結合は、ヒレグリン変異体に対する標識と結び付く。
イン・ビトロの分析が通常企図される一方で、適切な検出可能標識に接合したヒレグリン変異体を使用したイン・ビボの分析（例えばイメージングのための）もまた実施可能である。例えば米国特許第４，９３８，９４８号参照。
本発明の診断法は、リンパ節状態、一次腫瘍サイズ、組織学的状態、エストロゲンまたはプロゲステロン状態、腫瘍ＤＮＡ含有量（倍数性）、または細胞増殖（Ｓ期画分）の測定のような他の診断／予後評価と組み合わせて使用することができる。Mussら,New Eng.J.Med.330:1260-66（1994）参照。
本発明にかかるヒレグリン変異体はまた、ヒレグリンのためのアッセイ（ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイのような）、親和性精製法（例えばＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターのようなＥｒｂＢレセプターのための）、および競合的レセプター結合アッセイにおける標準としても有用である。ヒレグリン変異体はまた、ヒレグリン変異体の検出および／または精製において有用な抗ヒレグリン変異体抗体を生産するための免疫原として使用することができる。
上記記載の応用に加えて、ＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについての増大した特異性を有するヒレグリン変異体を、ＥｒｂＢ−３レセプター以上に好ましくＥｒｂＢ−４レセプターを結合および刺激するために使用することができる。上記変異体は、サンプル中のＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターの存在の間を区別するために、または特定の生物学的機能が一方または両方のレセプターによって介在されるかを調べるためにデザインされた研究において有用である。例えば、比較的少数のＥｒｂＢ−４レセプターを有し、多数のＥｒｂＢ−３レセプターを有する細胞型において、レセプター特異的ヒレグリン変異体の不存在下では、異なるレセプターによって達成されるシグナル伝達経路を同定すること、および一方または両方のレセプターと特定の生物学的機能を結びつけることは困難である。好んでＥｒｂＢ−４レセプターに結合する変異体は、ヒレグリン機能におけるＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターの役割を解明する助けとして使用することができる。
診断キット及び製造品
本発明はまた、上記記載の方法を実施するために有用なキットを提供する。一つの実施態様として、本発明は、診断キット、すなわちサンプルを試験するのに使用される試薬を組み合わせたパッケージを提供する。キットの構成要素は、所定の割合で典型的に提供される。ＥｒｂＢレセプターを検出するためのキットには、例えば適切な標識を使用して標識化されたヒレグリン変異体、または間接的な標識化のための標識化試薬（類）を有するヒレグリン変異体が含まれる。もし標識が酵素であるならば、キットには該酵素標識に必要とされるいくつかの基質または補因子が典型的に含まれる。安定剤、バッファー等のような他の添加剤もまた、キット中に含まれる。キットの試薬は、適切な濃度のキットの試薬溶液を調製するための賦形剤と共に、通常凍結乾燥されている乾燥パウダーとして提供される。キットはまた、キットがデザインされているアッセイを実施するための説明書を、典型的に含む。
本発明はまた、上記記載の疾患の治療のために有用な製薬学的ヒレグリン変異体組成物を含む製造品を提供する。製造品には、容器およびラベルが含まれる。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験チューブが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な物質のいずれからも作製され、滅菌アクセスポートを有する。容器上のまたはそれに関連するラベルは、該組成物が治療のため使用されるべき疾患を示す。
製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、またはブドウ糖溶液のような、生理学的に許容可能なバッファーを含む第二の溶液を含むキットの構成物であり得る。キットはまた、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための説明書を有するパッケージ挿入物のような、商業的見地または使用者の見地から望ましい他の物質を含む。
以下の実施例は、説明のために提供され、制限するためではない。本明細書中の全ての引用文献の開示は、参考としてここに完全に取り込まれる。
実施例１
ヒレグリン−β１最小ＥＧＦ様ドメインの決定
ファージディスプレーの関係で高親和性レセプター結合を提供するＨＲＧ−β１ＥＧＦの最小部分を、Ｍ１３ｐＩＩＩのＣ末端に融合したＨＲＧ−β１ １４７−２２７，１４７−２４４，１７７−２２７または１７７−２４４を生産するファージミドベクターを調製することによって決定した。これらのＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメイン断片を、ＮｓｉＩ／ＸｂａＩ含有突出部を有するプライマーを使用したＰＣＲによって、ベクターｐＨＬ８９（Holmesら,Science 256:1205-10［1992］に記載されている）から増幅した。
これらの断片を、構築物ｐＨＲＧ１−ｇ３（１７７−２２７）、ｐＨＲＧ２−ｇ３（１７７−２４４）、ｐＨＲＧ４−ｇ３（１４７−２２７）およびｐＨＲＧ５−ｇ３（１４７−２４４）を生産するために、同じ部位での制限切断−結紮によって、ファージミドディスプレーベクターｐａｍ−ｇ３内に挿入した。ｐａｍ−ｇ３はｐｈＧＨａｍ−ｇ３の誘導体であり、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のファージミドディスプレーのためにデザインされ、Lowmanら,Biochemistry 30:10832-38（1991）に記載された。ｐｈＧＨａｍ−ｇ３中に存在するｈＧＨ遺伝子を除去し、この遺伝子を、クローニングのために使用される制限部位での切断のためのスペースを提供する挿入断片を用いて置換することによって、ｐａｍ−ｇ３を生産した。
ｐＨＲＧ１−ｇ３は、該構築物を生産する際に導入されたＡｌａ２２７Ｖａｌミューテーションを含んだ。一本鎖ウラシル含有テンプレートを、この構築物から生産し、Ａｌａ２２７を回復するために特定部位の突然変異誘発において使用し、ｐＨＲＧ６−ｇ３（１７７−２２７）を生産した。上記記載の構築物のそれぞれにおいて、ＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメイン断片をｐＩＩＩの２４７残基に結合した。
ＨＲＧ−β１ＥＧＦおよびｐＩＩＩの間の接合部で、伸長した柔軟なリンカーを含ませることが、ＥｒｂＢ−３に結合する潜在的なｐＩＩＩの干渉を軽減するかどうかを測定する目的として、この接合部でリンカーを有する二つの構築物を、ｐＨＲＧ１−ｇ３テンプレートから調製した。ｐＨＲＧ８−ｇ３は、３個の連続したＧＧＧＳ（配列番号３４）繰り返しを含むリンカーを通じてｐＩＩＩ３２３に付着したＨＲＧ−β１ １７７−２２８を発現し、ｐＨＲＧ１１−ｇ３は、一つのＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号３５）結合を通じてｐＩＩＩ２４７に付着したＨＲＧ−β１ １７７−２３０を発現した。
上記記載の構築物から発現されるＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメインは、構築物の名前を表す”ｐ”および”−ｇ３”を取り除いてここで名付けられる。それ故、ｐＨＲＧ２−ｇ３構築物から発現されたＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメインは、”ＨＲＧ２”と名付けられる。
該ドメインは、Bassら,Proteins 8:309-14（1990）に記載されているように、ｐＩＩＩ融合タンパク質としてファージ上に一価的にディスプレーされ、それからわずかな変化を有するCunninghamら,EMBO J.13:2508-15（1994）に記載されたファージＥＬＩＳＡ法を使用して、高親和性ＥｒｂＢ−２／３レセプター−Ｉｇ融合物（ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇ）に対するその結合について分析された。該ドメインをディスプレーするファージを生産するために、ミュータジェネシス反応混合物を、製造者のプロトコールにしたがって、ＸＬ−１ＢｌｕｅTM細胞（Stratagene,Inc.,La Jolla,CA）内に電気的トランスフォームした。それからトランスフォームされた細胞を、１０11プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Promega Corp.,Madison,WI）を使用して感染させた。SambrookおよびManiatis,Molecular Cloning a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press 429（1989）の方法にしたがって、２０％ＰＥＧ（２０００）／２．５Ｍ ＮａＣｌを使用して、１８−２４時間（ｈ）の増殖の後の細胞から培養液を沈殿させることによって、ファージストック（約１０4ファージミド／ｍＬ）を調製した。該ファージをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）内に再懸濁した。
ヒトＩｇＧ定常ドメインに融合したＥｒｂＢ−２，ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を発現するベクターを使用して、ＥｒｂＢレセプター−Ｉｇ融合物を調製した。最初に、イムノグロブリンのヒンジドメインをコードする領域で、ヒトＩｇＧ重鎖を発現するベクター（ｐＤＲ２）内に、唯一のＭｌｕＩ部位を導入した。また、これらのレセプターのＥＣＤ／トランスメンブラン接合部をコードする領域で、一連のＥｒｂＢ発現ベクター内に、ＭｌｕＩ部位を導入した。全てのミュータジェネシスは、Kunkelら,Methods Enzymol.154:367-82（1987）の方法にしたがって実施した。
所望のＥｒｂＢレセプター−Ｉｇ融合物を発現する構築物を作製するために、ＭｌｕＩ部位を使用した。様々なレセプター融合物の融合接合部は以下の通りであった（Ｎ末端からＣ末端の順）：ＥｒｂＢ−２については、ＥｒｂＢ２のＧｌｕ６４６が、ＶＨのＨｉｓ２２４（Ｈ２２４VH）に融合されたＴｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（ＴＲＤＫＴ；配列番号３６）に融合された；ＥｒｂＢ−３については、ＥｒｂＢ−３のＬｅｕ６１７が、ＴＲＤＫＴ−Ｈ２２４VHに融合された；ＥｒｂＢ−４については、ＥｒｂＢ−４のＧｌｙ６４０が、ＴＲＤＫＴ−Ｈ２２４VHに融合された。ＥｒｂＢレセプター残基数は、Plowmanら,PNAS USA 90:1746-50（1993）のナンバーリング系にしたがって示されている。保存されたＴＲ配列はＭｌｕＩ部位から由来し、保存されたＤＫＴ配列はリンカーから由来した。最終発現構築物はｐＲＫ型のプラスミド骨格を有し、一方で真核生物発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって実施された。
レセプター融合物をこれらの構築物から発現し、精製し、ジスルフィド結合ダイマーを形成させた。ホモダイマー性ＥｒｂＢ−２，ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプター−Ｉｇ融合物を、適切なレセプター融合物をコードする構築物を使用してトランスフェクトされた細胞によって生産した。ヘテロダイマー性レセプター融合物を、同じ細胞内に異なるレセプター融合物をコードする二つの発現ベクターを共トランスフェクトすることによって生産した。結果として分泌されたレセプター融合物は、二つの型のホモダイマーおよび予期されたヘテロダイマーの混合物であった。
レセプター融合物を発現するために、Gormanら,DNA and Protein Eng.Tech.2:3-10（1990）に記載されたリン酸カルシウム沈降法を使用して、適切な発現ベクター（類）を用いて付着性ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）をトランスフェクトした。血清含有培地を、トランスフェクション後１５時間で血清フリー培地と交換し、トランスフェクト細胞を５−７日間血清フリーで培養した。
生じた調節培地を回収し、プロテインＡカラム（１ｍＬ Pharmacia HiTrapTM,Piscataway,NJ）を通過させた。精製レセプター融合物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を含むチューブ内に０．１Ｍ クエン酸（ｐＨ４．２）を使用して溶出した。それから溶出されたタンパク質をＰＢＳに対して透析し、Ｃｅｎｔｒｉ−ｐｒｅｐ−３０TMフィルター（Amicon,Beverly,MA）を使用して濃縮した。２５％の最終濃度にグリセリンを加え、調製物を−２０℃で貯蔵した。レセプター融合物濃度を、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡを介して測定した。
ファージＥＬＩＳＡのためのミクロタイタープレート（Nunc MaxisorpTM ９６穴プレート,Inter Med,Denmark）を、以下のように調製した。１００μＬ ５０ｍＭ ＮａＣＯ3（ｐＨ９．６）中の０．５μｇのウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃガンマ断片特異的）抗体（Jackson Immunoresearch,West Grove,PA）を使用して、ウェルを一晩プレコートした。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２００μＬ ＰＢＳを使用して３０分（ｍｉｎ）該ウェルをブロックし、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TMを含むＰＢＳ）を使用してリンスした。それから結合バッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TM）中の０．１μｇ ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇを使用して１時間、該ウェルをコートし、再び洗浄した。
可溶性ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇの連続的な希釈物（競合物）および６０％飽和を与えるような所定のファージ濃縮物（競合物なし）を、１００μＬ結合バッファー中でウェルに加えた。室温で２時間のインキュベーションに引き続き、プレートを徹底的に洗浄し、抗Ｍ１３セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合物（Pharmacia,Piscataway,NJ）の１：９００希釈物を使用して２０分処理した。ファージ結合の量を、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質溶液（Sigma Chemical Company,St.Louis,MO）を使用してセイヨウワサビペルオキシダーゼ活性をアッセイすることによって測定した。プレートのファージの半分に競合するのに必要な可溶性ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇの濃度として、ＥＣ50値を計算した。
その結果が表３に示されている。
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全てのファージストックは、固定化ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇに特異的に結合し、同じＥＣ50値（５−４２ｎＭ）で競合することができた。これらの値は、以前に測定された解離定数（Ｋd）よりも約１００倍高かった。Holmesら,上記参照。しかしながら、ファージＥＬＩＳＡから得られたＥＣ50値は、特に親和性相互作用の場合、真のＫd値よりもしばしば高い。これは、結合ファージに対する理にかなったシグナルを与えるのに必要とされる高いレセプターコート濃度、競合物溶液中の活性レセプターの低いパーセント、またはｐＩＩＩに対するタンパク質の結合からの妨害のためであろう。
いかなる場合でも、ＨＲＧ−β１ １４７−１７６は、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメインをディスプレーするファージの結合を増大しないようであり、一方でＨＲＧ−β１ ２２８−２４４は、結合親和性にわずかに寄与した。それ故、ＨＲＧ−β１の最小ＥＧＦ様ドメインは、ＨＲＧ−β１ １７７−２２８として定義された。
ＨＲＧ−β１ＥＧＦとｐＩＩＩ断片の間に挿入されたリンカーを含むＨＲＧ−β１ＥＧＦ−ｐＩＩＩ融合物をコードする構築物について、ファージＥＬＩＳＡをまた実施した。ファージストックの結合滴定によって測定されたように、機能的融合物の増大した発現と共に、結合親和性における穏やかな増大が、リンカー含有融合物について観察された。残基２４７（ｐＨＲＧ８−ｇ３）の代わりに、ｐＩＩＩ３２３残基に対するリンカーを介したＨＲＧ−β１ＥＧＦの融合物は、わずかな親和性増大を引き起こした。それ故、この構築物は、ファージディスプレーライブラリーの構築のためのテンプレートベクターとして使用された。
実施例２
アラニンスキャニングによるヒレグリン−β１ＥＧＦドメインにおける活性残基の同定
本実施例は、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４レセプターに対するＨＲＧ−β１の結合における役割を演じるヒレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）ＥＧＦ様ドメイン（ＨＲＧ−β１ １７７−２２９）中の活性残基の同定を記載する。活性残基は、このドメイン中の個々のアミノ酸をアラニンにミューテートすることによって同定された。ミューテートされたドメイン（以下では「変異体」）は、ｐＩＩＩ融合タンパク質としてファージ上に一価的にディスプレーされ、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４に対する変異体親和性をファージＥＬＩＳＡによって測定した。選択された変異体は、チオレドキシン融合タンパク質として発現され、それもＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４親和性についてアッセイされた。
アラニンスキャニングミュータジェネシスおよびファージディスプレー
ｐＨＲＧ２−ｇ３から調製されたウラシル含有一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して、Kunkelら,Methods Enzymol.154:367-82（1987）に記載された特定部位の突然変異誘発によって、アラニン置換変異体を作製した。実施例１に記載されたｐＨＲＧ２−ｇ３は、ｐＩＩＩ２４７に融合されたＨＲＧ−β１ １７７−２４４を発現した。連続した残基がアラニンにミューテートされた一連の変異体を発現する一連の構築物を生産するために、一連のオリゴヌクレオチドを使用した。ファージストックを、ＰＥＧ（８０００）をファージの沈降に使用したことを除いて実施例１に記載されたようにこれらの構築物から調製した。ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対するアラニン置換変異体の親和性を、実施例１に記載されたようにファージＥＬＩＳＡによって測定した。その結果が図２に示されており、それはファージ上にディスプレーされている野生型ＨＲＧ−β１ １７７−２４４に対するＥＣ50と比較した、各変異体についてのＥＣ50の割合を示す。このプロットにおいて、１の割合は、野生型ＨＲＧ−β１ １７７−２２４と比較した変異体結合についての親和性において差異が存在しないことを示し、例えば５の割合は、その変異体が、野生型ＨＲＧ−β１ １７７−２２４のものより５倍小さい親和性を有してレセプターを結合することを示す。
可溶性アラニン置換変異体の発現、精製、およびアッセイ
数多くのアラニン置換変異体を、チオレドキシン（Ｔｒｘ）融合タンパク質として可溶性形態で発現した。適切な発現ベクターを調製するために、Ｔｒｘ発現ベクターを、ｐＥＴ２３ａ（Novagen,Inc.,Medison,WI）から最初に生産した。ｐＥＴ２３ａを、ＮｄｅＩ（２３８ベースで切断する）およびＨｉｎｄＩＩＩ（１７３ベースで切断する）を使用して切断し、Ｔｒｘをコードする断片を挿入した。この断片は、ｐＴｒｘＦｕｓ（２７２２−３１８０ベース；Invitrogen Corp.,San Diego,CA）から得た。それから、Ｔｒｘ翻訳開始部位を含むＮｄｅＩ部位を、ＮｄｅＩを使用して切断し、Ｋｌｅｎｏｗを使用して再びラーゲーションすることによって破壊した。これはＮｄｅＩ部位を除去し、一方でＴｒｘ翻訳開始を維持した。
ＨＲＧ−β１アラニン置換変異体をコードするベクターは、ｐＲＫ５．ｇＤｈｒｇＢ１ベクター（Gormanら,DNA Prot.Eng.Tech.2:2-10［1990］に記載されている）中のＫｕｎｋｅｌミュータジェネシスによって初めに生産された。該変異体をコードする配列は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを使用してこれらのベクターから切断できた。Ｔｒｘ発現ベクター内への上記断片のクローニングを容易にするため、ＮｄｅＩ部位のすぐ上流（５４０７ベース）で、野生型ＨＲＧ−β１ １４６−２２４をコードするｐＲＫ５．ｇＤｈｒｇＢ１ベクター内にＫｐｎＩ部位を導入するために、Ｋｕｎｋｅｌミュータジェネシスを使用した。それから野生型ＨＲＧ−β１ １４６−２２４をコードするＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＲＫ５．ｇＤｈｒｇＢ１から切断し、Ｔｒｘをコードする配列の３’末端のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位でＴｒｘ発現ベクターに挿入した。これは、ＫｐｎＩ部位のすぐ上流でＮｄｅＩ部位を導入した。結果として生じたベクターは、野生型ＨＲＧ−β１配列を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して切断することによって取り出すことができ、変異体をコードするＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片と置換することができた。それ故、得られた一連のＴｒｘ−変異体発現ベクターは、Ｔｒｘと変異体配列の間でエンテロキナーゼプロテアーゼ認識部位（ＤＤＤＤＫ；配列番号３７）を含むＴｒｘ−変異体融合物を発現した。
Ｔｒｘ−変異体融合タンパク質の発現は、ｐＥＴ２３ａ由来の誘導可能Ｔ７プロモーターによってなされた。クローニング、細胞増殖、および発現は、Novagen pET系マニュアルに記載されているように実施された。略記すると、クローニングはＸＬ１−ＢｌｕｅTM細胞（Stratagene,Inc.,La Jolla,CA）中でなされ、可溶性タンパク質の発現はＢＬ２１ＤＥ３宿主細胞（Novagen,Inc.,Madison,WI）中でなされた。Ｔｒｘ−変異体発現ベクターを含むＢＬ２１ＤＥ３細胞を、ＯＤ550が０．３−０．６に到達するまでＬＢ培地中で３７℃で成育させた。それから０．４ｎＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、Ｔｒｘ−変異体の発現を誘導し、２８℃で２−４時間継続して増殖を許容した。細胞を遠心分離によって回収し、細胞培養容量の１／２０である容量の０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。
細胞をドライアイス上で凍結し、３７℃で解凍し、引き続き強力な超音波細胞破壊を実施して溶解した。凍結、解凍、超音波細胞破壊のサイクルを三度繰り返した。さらにタンパク質を、６Ｍ ＧｄＨＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中で可溶化し、０．１Ｍ Ｎａ2ＳＯ4、０．２Ｍ Ｎａ2Ｓ4Ｏ6の添加によって亜硝酸化し、室温で１．５時間攪拌した。タンパク質を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１Ｍ メチオニン中で透析した。透析後、不溶性物質を３５Ｋ×ｇで１５分遠心分離することによって除去した。
上清を、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用して平衡化した１５ｍｌカラムを使用してＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（Pharmacia,Piscataway,NJ）クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質を、５ｍＬ／分の流速で０−２Ｍ ＮａＣｌ勾配を使用して溶出した。Ｔｒｘ−変異体融合物は０．５−０．６Ｍ ＮａＣｌの間で溶出され、１ｍＭ システインの添加の後室温で一晩リホールディングされた。生じた調製物を、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１Ｍ メチオニン内で透析した。Ｔｒｘ−変異体融合物は、アミノ酸分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したところ、本質的に均一であることが見出された。
ＥｒｂＢレセプター−Ｉｇ融合物に対するＴｒｘ−変異体融合物の親和性を、ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対して結合する125Ｉ−ＨＲＧ−β１ １７７−２４４の阻害を測定することによって測定した。レセプター融合物を、ファージＥＬＩＳＡについて実施例１に記載されたように、抗ヒトＩｇＧを介してプレート（Nunc Maxisorp CTMブレイクアパートストリップウェル、Inter Med,Denmark）上にコートした。一定量の１２５Ｉ−ＨＲＧ−β１ １７７−２４４（１００−３００ｐＭ）および変化する濃度（１００ｐＭ−４μＭ）の非標識Ｔｒｘ−変異体融合物を使用して、結合アッセイを実施した。室温で１−３時間のインキュベーションに引き続き、プレートを洗浄し、各ウェル中の結合125Ｉ−ＨＲＧ−β１ １７７−２４４の量を、ガンマカウンター（Isodata,ICN Biomedic Systems,Huntsville,AL）上でカウントした。ＥｒｂＢ−３結合アッセイについては、ブロッキングバッファーは１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０TM）であった；結合バッファーは２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）、０．２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０TM細胞培養培地（Gibco-BRL,Gaithersburg,MD）であった；そして洗浄バッファーはＴＢＳＴであった。ＥｒｂＢ−４結合アッセイについては、１％ＢＳＡを含むＰＢＳをブロッキングバッファーおよび結合バッファーとして使用し、洗浄バッファーは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TMを含むＰＢＳであった。
その結果が表４および５に示されている。
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実施例３
一価ファージディスプレーを使用したヒレグリン−β１ＥＧＦドメイン変異体の選択
本実施例は、最小ＥＧＦ様ドメイン（ＨＲＧ−β１ １７７−２２８）に相当する残基を含むＨＲＧ−β１変異体の選択を記載する。これらの変異体のために、最小ＥＧＦ様ドメイン中の残基の位置に関して（すなわちＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−５２）、カッコ内で残基数も表される。
ＨＲＧ−β１ＥＧＦの変異体を調製し、Bassら,Proteins 8:309-14（1990）の方法にしたがって、一価ファージディスプレーを使用してＥｒｂＢ−３に対する結合について選択した。以下に詳細に議論されるように、ＨＲＧ−β１ＥＧＦファージミドベクターを調製し、その場合ＨＲＧ−β１ＥＧＦをＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩのＣ末端断片に融合した。ランダム化のために選択された部位でこのベクター内に終止コドンを導入するために、ＫｕｎＫｅｌミュータジェネシスを実施した。この工程は、開始ベクターが野生型ポリペプチドを発現することを不可能にすることを確実にした。ライブラリー当たり４から６残基の断片を、６個のシステイン、Ｐｈｅ１８９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ Ｐｈｅ１３）および２個の最もＣ末端の残基（図３参照）を除いて、直線状の方式でランダム化した。Ｐｈｅ１８９は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αにおける芳香族残基として保存されており、Ｔｙｒ２０８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ Ｔｙｒ３２）と重なった相互作用を形成するために、Ｐｈｅ１８９は改変しなかった。Jacobsenら,Biochemistry 35:3402-17（1996）。それ故ＨＲＧ−β１ＥＧＦは、Ａ−Ｅ、Ｇ、ＨおよびＩと名付けられた８個のライブラリーで変換された。
ＨＲＧ−β１ ２０２−２０９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２６−３３）を変換されているライブラリーＥは、３残基の欠失を含んだ。欠失領域は、ＨＲＧ−β１ＥＧＦの第二および第三のβシートの間の乱れたターンに相当し、同等なアミノ酸はＥＧＦおよびＴＧＦ−α内に存在しなかった。ＨＲＧ８のＨＲＧ−β１ ２０２−２０４（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２６−２８）が欠失されている（ＨＲＧ６３）ＨＲＧ−β１ＥＧＦコントロール変異体は、野生型のものと同様な親和性でＥｒｂＢ−３−Ｉｇに結合した（表１３）。
さらなるライブラリー（Ｆ）は、ＨＲＧ−β１ １７８，１８０，１９８および２００（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２，４，２２および２４）を含む第一および第二のβシート由来の側鎖より成る表面パッチをランダム化するために作製された。
開始ベクター中の選択された部位を、ＨＲＧ−β１ＥＧＦライブラリーを生産するためにＫｕｎｋｅｌミュータジェネシスによってランダム化した。ミューテート化ＨＲＧ−β１ＥＧＦをディスプレーするファージを、統計学的に各ファージ粒子がミューテート化ＨＲＧ−β１ＥＧＦの１コピーより多くはディスプレーしないような条件下で、ライブラリーから生産した。Bassら,上記参照を参照。それからこれらのファージを、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化したＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する結合（これらに対して選択された）について選択した。結合ファージを溶出し、宿主細胞を再感染するために使用し、それはもう一周の選択について新たなファージを生産するために使用した。それから、各ライブラリーから選択されたファージ由来の１２のクローンをシークエンスした。
ファージライブラリーの構築
ｐＨＲＧ８−ｇ３から調製されたウラシル含有一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して、Ｋｕｎｋｅｌミュータジェネシスによってファージライブラリーを構築した。実施例１に記載されたｐＨＲＧ８−ｇ３は、ｐＩＩＩ３２３残基に対してリンカーを介して融合されたＨＲＧ−β１ １７７−２２８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−５２）を発現した。各ライブラリーについて、ＴＡＡおよびＴＧＡ終止コドンを、プールから野生型骨格を除去するカスタムテンプレートを生産するために、ランダム化のために選択された位置で挿入した。位置は、ＮＮＳコドン（この場合Ｎは４つのベースのいずれでもよく、ＳはＧまたはＣの何れかである）に対するミューテーションによって十分にランダム化された。一つのオリゴヌクレオチドをライブラリーＦに対する場合を除いて各ライブラリーミュータジェネシス反応で使用し、Ｆについては二つのオリゴヌクレオチド（一方はＨＲＧ−β１ １７８および１８０［ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２および４］をランダム化し、他方はＨＲＧβ１ １９８および２００［ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２２および２４］をランダム化した）を同時に使用した。１８ベースを含むミュータジェネシスオリゴヌクレオチドは、ランダム化残基の各側で突出している。
ミュータジェネシス反応混合物を、製造者のプロトコールにしたがって、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene,Inc.,La Jolla,CA）内に電気的にトランスフォームした。それからトランスフェクトされた細胞を、１０11ｐｆｕ Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Promega Corp.,Madison,WI）を使用して感染し、およびファージストック（約１０14ファージミド／mL）を実施例１に記載されるように調製した。
１．０×１０8から６．４×１０8の間の形質転換体を各ライブラリーから得、そのことは５以下のランダム化コドンを含むライブラリーが、考え得るアミノ酸配列の組み合わせ（３．３６×１０7の考え得るDNA配列；３．２×１０6の考え得るアミノ酸配列）の優れた表示を有することを意味した。６のランダム化コドン（１．１×１０9ＤＮＡ配列）を含むライブラリーＢは、４．８×１０8の全形質転換体を有した。
ＥｒｂＢ−３−Ｉｇ結合のためのファージの選択
一価ファージを調製し、実施例１に記載されたように、ヒトＦｃ断片に対するポリクローナル抗体を使用した捕捉を介してミクロタイタープレートに前もって結合されたＥｒｂＢ−３−Ｉｇ上で選択を実施した。１００μＬ結合バッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TM）中のおよそ１０12のファージを、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇコート化ウェル、およびＥｒｂＢ−３−Ｉｇが加えられていない対照ウェルに適用した。室温で２時間のインキュベーションに引き続き、該プレートを激しく洗浄し（１２×）５０ｍＭ ＨＣｌおよび０．０５％ＴｗｅｅｎTMの１００μＬの溶液を加え、１０分攪拌することによって、ファージを溶出した。
溶出物を１０μＬ１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して中和し、２０μＬを対数増殖期のＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞に対する滴定のために使用した。残りのものを、１ｍＬの対数増殖期ＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞を感染するために使用し（３７℃で３０分）、それからそれを２×１０10ｐｆｕ Ｍ１３Ｋ０７ファージを使用して過剰感染し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２５ｍＬ ２ＹＴ溶液（１６ｇ／Ｌトリプトファン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で成育させた。ファージを上記記載のように回収し、サイクルを繰り返した。ライブラリーは、選択の６周で陰性（抗ヒトＦｃプレコートのみ）ウェルに対する陽性（ＥｒｂＢ−３−Ｉｇコート化）ウェルから溶出したファージの割合が、３９から９２００の間であるように、急速に豊富化した。
６周（ライブラリーＡ、Ｂ、Ｄ−Ｆ）または７周（ライブラリーＣ、Ｇ−Ｉ）の選択の後、各ライブラリーから１２のクローンをランダムに拾い、ジデオキシ法によってシークエンスした。Sangerら,PNAS USA 74:5463-67（1977）。ＤＮＡ配列から推定されたランダム化位置でのアミノ酸は、表６−１２に示されている（”.”は野生型残基と同一の残基を示す）。各位置での一致した選択された残基は、図３に図式的に示されている。一般的に、数多くのミューテーションが存在し、ある場合には側鎖の性質の劇的な変化を伴った。特定の残基に分類されたいくつかの位置では、ライブラリーが大きな多様性を有し、選択がタンパク質レベルで存在する証拠を提供する、ＤＮＡの混合物が見出された。ライブラリーのいくつかにおいて、ＨＲＧ−β１Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ（ＨＲＧ−β１ＥＧＦＭｅｔ５０Ｉｌｅ）の自発的ミューテーションが、このコドンの１ベースの変化のため存在した。このミューテーションは、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇ結合に対する有意な親和性の増大を引き起こす。各ライブラリーに対するシークエンスの結果は、以下に要約されている。
ライブラリーＡ−ＨＲＧ−β１ １７７−１８１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−５）
ＨＲＧ−β１ １７７−１８１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−５）は、野生型Ｎ末端サブドメイン中の第一のβ鎖中に存在する。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化は、表６に示されている。
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ランダム化において、Ｓｅｒ１７７（Ｓｅｒ１）は極端にＴｒｐを選択した。Ｈｉｓ１７８（Ｈｉｓ２）は混合した親水性残基を選択したが、野生型残基はこの中に存在しなかった。Ｌｅｕ１７９（Ｌｅｕ３）はシークエンスされた全ての変異体中で保存された。Ｖａｌ１８０（Ｖａｌ４）は、１２の変異体中の８で野生型を選択し、残りの変異体は、Ｖａｌ１８０Ｇｌｕ（Ｖａｌ８Ｇｌｕ）ミューテーションを除き、この位置で保存的な置換を有した。Ｌｙｓ１８１（Ｌｙｓ５）では、Ｐｒｏが８の変異体で現れ、野生型残基が２の変異体で見出された。
ライブラリーＡ由来の４の変異体は、ライブラリーＡ中のランダム化された位置でのアミノ酸置換を含まなかった。代わりに、これらの変異体は、ライブラリーＢ中でランダム化された位置でアミノ酸置換を含み、それ故、これらの変異体は表７中で変異体Ｂ１−Ｂ４として挙げられた。同様に、ライブラリーＢ由来の４の変異体はライブラリーＢ中でランダム化されらが、ライブラリーＡ中でランダム化された位置での置換をむしろ含んだ。これらの変異体は、表６で変異体Ａ５−Ａ８として挙げられている。
ライブラリーＢ−ＨＲＧ−β１ １８３−１８８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ７−１２）
ＨＲＧ−β１ １８３−１８８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ７−１２）は、野生型タンパク質中でヘリックスの性質を有する。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化は、表７に示されている。
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この領域のランダム化は、野生から配列から最も劇的な変化を生じたが、この領域の一般的な親水性性質は、シークエンスされた変異体中で維持された。特にこの６残基の断片は、最初と最後の位置、Ａｌａ１８３およびＴｈｒ１８８（Ａｌａ７およびＴｈｒ１２）でＧｌｙ残基を選択した。ＧｌｕおよびＡｓｐを選択するＬｙｓ１８５（Ｌｙｓ９）で正及び負の電荷の記録の変化もまた存在し、他の中では、、極端にＡｒｇを選択するＧｌｕ１８６（Ｇｌｕ１０）、ＧｌｕおよびＡｓｐを選択するＬｙｓ１８７（Ｌｙｓ１１）が存在する。Ｇｌｕ１８４（Ｇｌｕ８）は、様々な異なる型の残基を選択し、この側鎖がＥｒｂＢ−３レセプター結合において重要な役割を果たしていないことを示した。
ライブラリーＣ−ＨＲＧ−β１ １９１−１９５（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１５−１９）
ＨＲＧ−β１ １９１−１９５（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１５−１９）は、ヘリックスと第二のβストランドの間のβターンを含む。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化は、表８に示されている。
0004515542.tif 000018
ランダム化および選択により、この領域中の野生型アミノ酸配列がほぼ完全に保存された変異体が生産された。ミューテーションは、２の変異体、両方Ｇｌｕ１９５（Ｇｌｕ１９）のみで見出された。この結果は、ＥｒｂＢ−３レセプター結合におけるこの領域の野生型残基についての重要な役割と一致する。
ライブラリーＤ−ＨＲＧ−β１ １９７−２０１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２１−２５）
ＨＲＧ−β１ １９７−２０１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２１−２５）は、Ｎ末端サブドメイン中の第二のβストランドに存在する。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化が、表９に示されている。
0004515542.tif 000019
この領域でのランダム化は、５の残基の２で増加または減少の変化のそれぞれを生産した。Ｐｈｅ１９７（Ｐｈｅ２１）は、１２の変異体の１０でＴｙｒを選択し、この位置の芳香族性を維持した。Ｍｅｔ１９８（Ｍｅｔ２２）は、１２の変異体の１１で正に電荷した残基を選択した。Ｖａｌ１９９（Ｖａｌ２３）は、全ての変異体で保存され、Ｌｙｓ２００（Ｌｙｓ２４）は、野生型またはＡｒｇのそれぞれを選択し、この位置での正の電荷を維持した。Ａｓｐ２０１（Ａｓｐ２５）は、ＴｈｒまたはＩｌｅの非電荷残基を選択し、この位置でのβ枝性質を維持した。変異体Ｄ１，Ｄ２，Ｄ８，Ｄ１２はまた、自発的親和性増大Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）ミューテーションを誘導した。
ライブラリーＥ−ＨＲＧ−β１ ２０５−２０９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２９−３３）
ＨＲＧ−β１ ２０５−２０９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２９−３３）は、Ｎ末端サブドメイン中の第三のβストランド中に存在する残基を含む。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化が、表１０に示されている。
0004515542.tif 000020
ランダム化において、Ｐｒｏ２０５（Ｐｒｏ２９）はＴｈｒまたはＴｙｒを選択した。Ｓｅｒ２０６（Ｓｅｒ３０）は、主に塩基性側鎖を有する混合した残基を選択したが、Ｇｌｙもまた二度現れる（同じ変異体由来の配列において）。側鎖の変換はＡｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）およびＴｙｒ２０８（Ｔｙｒ３２）で出現し、Ｔｙｒに極端に変化する第一のもの、および主にＡｒｇ（７の変異体）およびＬｕｅ（４の変異体）に変化する第二のものが存在した。Ｔｙｒ２０８が構造中でＰｈｅ１８９（Ｐｈｅ１３）と重なり、ＥＧＦ配列で保存されているため、この発見は特に予期されなかった。Jacobsenら,Biochemistry 35:3402-17（1996）参照。Ｌｅｕ２０９（Ｌｅｕ３３）では、比較的保存されたＭｅｔ置換が、多くの変異体で見出されたが、Ｇｌｙもまた見出された。
ライブラリーＧ−ＨＲＧ−β１ ２１１−２１６（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ３５−４０）
ＨＲＧ−β１ ２１１−２１６（ＨＲＧ−β１EGF３５−４０）は、ＨＲＧ−β１ＥＧＦのＣ末端サブドメインの最初のβストランドを含む。このライブラリーから選択された変異体中のアミノ酸変化が、表１１に示されている。
0004515542.tif 000021
ランダム化において、１２の変異体のうち１０がＬｙｓ２１１Ａｒｇ（Ｌｙｓ３５Ａｒｇ）ミューテーションを含み、それ故二つのシステイン残基の間に存在するこの位置での正の電荷を維持した。Ｐｒｏ２１３（Ｐｒｏ３７）は、混合した親水性残基を選択し、Ａｓｎ２１４（Ａｓｎ３８）は、ＬｅｕおよびＶａｌが最も頻繁に現れる残基に混合物を選択した。Ｇｌｕ２１５（Ｇｌｕ３９）は全ての残基で保存されており、Ｐｈｅ２１６（Ｐｈｅ４０）は１２の残基のうち８で維持され、残りの残基の３では保存的なＴｙｒ置換を有した。
ライブラリーＨ−ＨＲＧ−β１ ２１７−２２０（ＨＲＧ−β１ ４１−４４）
ＨＲＧ−β１ ２１７−２２０（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ４１−４４）ライブラリーは、ライブラリーＢ（変異体Ｂ５）由来の抗親和性変異体によって混ざりやすいことが明らかとなった。この変異体は１２の変異体のうち１１で見出された。唯一の影響を受けない変異体では、野生型アミノ酸配列がＡｓｐ２１９Ｇｌｕ（Ａｓｐ４３Ｇｌｕ）ミューテーションを除いて保存された。この結果は、この領域が最適な結合のため野生型または同様な配列を必要とすることを示唆した。
ライブラリーＩ−ＨＲＧ−β１ ２２２−２２６（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ４６−５０）
ＨＲＧ−β１ ２２−２２６（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ４６−５０）は、ＨＲＧ−β１ ２１３−２１６（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ３８−４０）でβシートのストランドと並ぶβシートの短いストランドを含む。このライブラリーから選択された変異体のアミノ酸変化が、表１２に示されている。
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ＨＲＧ−β１ ２２２−２２６のランダム化において、二つの型の変異体がシークエンスされた１２のうちで見出され、両者は、Ｇｌｎ２２２（Ｇｌｎ４６）、Ｔｙｒ２２４（Ｔｙｒ４８）およびＶａｌ２２５（Ｖａｌ４９）で保存された野生型残基を有し、両者はＭｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）ミューテーションを有する。Ａｓｎ２２３（Ａｓｎ４７）は、Ｈｉｓ（９の変異体）またはＴｒｐ（３の変異体）を選択した。Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅの強力な親和性増大効果は、このライブラリーからシークエンスされた全ての変異体で存在し、およびいくつかの他のライブラリー由来の変異体での高頻度の出現によって証拠付けられる。
ライブラリーＦ−ＨＲＧ−β１ １７８，１８０，１９８および２００（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２，４，２２および２４）
Ｈｉｓ１７８（Ｈｉｓ２）、Ｖａｌ１８０（Ｖａｌ４）、Ｍｅｔ１９８（Ｍｅｔ２２）およびＬｙｓ２００（Ｌｙｓ２４）を同時にランダム化した場合、一つの型の変異体のみが見出された。Ｈｉｓ１７８，Ｖａｌ１８０，およびＬｙｓ２００は、野生型残基を選択し、Ｍｅｔ１９８はＬｙｓを選択した。これらの変異体は、自発的なＭｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）ミューテーションをさらに含み、それは他の配列よりも有意に選択される利点を該変異体に与えた。ライブラリーＡからシークエンスされた１２の変異体のうち全てがＨｉｓ１７８を含んでいなかったため、野生型Ｈｉｓは１７８位で見出されたことは際だっている。
ファージディスプレーおよびアラニンスキャニングの結果におけるＨＲＧ−β１ＥＧＦ残基の保存
アラニン置換が結合親和性に強力に影響する位置は、野生型残基を選択する傾向が存在した。例えば、ＮおよびＣ末端サブドメインの間の接合部での位置のデータ参照（すなわちＨＲＧ−β１ １９１−１９５［ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１５−１９］でのβターン、およびＨＲＧ−β１ ２１７−２２０［ＨＲＧ−β１ＥＧＦ４１−４４］でのループ）。さらに、アラニン置換があまり有意な効果を有しない位置は、ＨＲＧ−β１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ７−１２）でのヘリックス断片に見られるように、ファージディスプレーにおいて実質的なミューテーションを受けやすい傾向にあった。
レセプター親和性および特異性に対する選択されたミューテーションの影響の分析
各ライブラリー由来の個々の変異体を、ファージ生産、およびファージ上にディスプレーされたミューテートされたＨＲＧ−β１ＥＧＦ（「変異体」）のさらなる特徴付けに対して選択した。さらなる特徴付けに対する変異体の選択は、有利なＭｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）置換を含まない配列に対する偏向を有して、選択される傾向に基づいた。さらに、上記記載の様々な組み合わせを含むミューテートされたＨＲＧ−β１ＥＧＦ（「組み合わせ変異体」）をディスプレーするファージを生産するための使用されファージミドベクターを、いくつかの上記記載の変異体から調製されたテンプレートを使用して、Ｋｕｎｋｅｌミュータジェネシスによって調製した。組み合わせ変異体中のアミノ酸置換は、図４に示されている。ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する変異体および組み合わせ変異体の親和性（野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦの親和性に対して）を、実施例１に記載されているようにファージＥＬＩＳＡによって測定した。その結果が表１３に示されている。いくつかの変異体および組み合わせ変異体もまた、特異性を評価するために相対的ＥｒｂＢ−４−Ｉｇ親和性について試験した。
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ライブラリーＡ由来の変異体は、野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦと大変似たＥＣ50値を有した。ライブラリーＢおよびＤ由来の変異体は、Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）を含まない選択された変異体に対する野生型親和性の３から５倍の範囲で、ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する有意に増大された親和性を有する。（変異体Ｂ３およびＤ４を参照）。親和性における実質的により大きい増大（野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦの２６倍まで）が、Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）を含む変異体について測定された。（変異体Ｂ５，Ｂ１０およびＤ１を参照）。
ライブラリーＥ由来の変異体は、さらにより大きい増大を示した。例えば、ＨＲＧ−β１ ２０６および２０８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ３０および３２）でライブラリーコンセンサス配列（図３）とは異なる変異体Ｅ２は、２８倍の親和性の増大を有した。Δ２０２−２０４（Δ２６−２８）対照変異体（ＨＲＧ６３）のＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する親和性は、野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦのものと同様である（表１３）ため、近接した３つの欠失よりもむしろ、ＨＲＧ−β１ ２０５−２０９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２９−３３）でのアミノ酸置換と、該効果は関連するように思える。
Ｍｅｔ１９８Ｌｙｓ（Ｍｅｔ２２Ｌｙｓ）およびＭｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）置換を有するライブラリーＦ由来の単一の変異体は、Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ単独のものよりわずかにだけ増大を示し、Ｍｅｔ１９８Ｌｙｓミューテーションの寄与が小さい効果であることを示す。ライブラリーＧ由来の変異体は、どんなものでもＥｒｂＢ−３−Ｉｇ親和性増大をほとんど示さなかった。唯一のライブラリーＨ変異体由来の単一のＡｓｐ２１９Ｇｌｕ（Ａｓｐ４３Ｇｌｕ）ミューテーションは、親和性のおける穏やかな増大を提供した。２つのライブラリーＩ変異体は、ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する親和性における有意な増大を有した。該増大は、Ｍｅｔ２２６Ｉｌｅ（Ｍｅｔ５０Ｉｌｅ）ミューテーション（変異体ＨＲＧ９０参照）由来のおよそ６倍の効果に寄与し、Ａｓｎ２２３（Ａｓｎ４７）からＴｒｐまたはＨｉｓミューテーションへの２から３倍のさらなる増大に寄与した。
変異体Ａ３ミューテーションを含む組み合わせ変異体をディスプレーするファージは、わずかしか実施しなかった。Ａ３＋Ｂ３組み合わせは、変異体Ｂ３のものと同様なＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するＥＣ50を有したが、試験された他の組み合わせは、検出可能な親和性を有して結合しなかった。これは、他のライブラリー由来のミューテーションと、Ｓｅｒ１７７Ｔｒｐ、Ｈｉｓ１７８ＧｌｕまたはＬｙｓ１８１Ｐｒｏ（Ｓｅｒ１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ２ＧｌｕまたはＬｙｓ５Ｐｒｏ）ミューテーションとの不利な相互作用のためであろう。Ｂ３およびＥ２ミューテーションの組み合わせは、変異体Ｅ２のものに対してわずかに減少した親和性を生じた。
他のライブラリー由来の変異体からのミューテーションの組み合わせは、さらなる挙動を緊密に与え、５０倍より大きいＥＣ50値の増大を引き起こした。最適な組み合わせ変異体に対するＥＣ50値は、使用されたレセプターコーティング濃度（およそ４ｎＭ）でのアッセイのより低い制限に近かった。レセプターコートのより低いレベルを使用することは、これらの組み合わせ変異体に対するナノモル以下のＥＣ50値を生じたが、野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦファージの最小結合のため、野生型親和性の測定を許容しなかった。最適な組み合わせ変異体は、Ｄ４配列、Ｂ３またはＥ２配列の何れか、および単一Ｍｅｔ５０ＩｌｅミューテーションまたはＩ２配列の何れかを含んだ。
一般的に、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する親和性の増大を示す変異体は、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する親和性の同様な増大をも示した。
可溶性ＨＲＧ−β１ＥＧＦ変異体の発現、精製、およびアッセイ
数多くの変異体が、可溶性形態で発現された（すなわちミューテートされたＨＲＧ−β１ＥＧＦは、Ｍ１３ｐＩＩＩからフリーで発現された）。可溶性変異体のペリプラズムでの発現を容易にするために、ＴＡＧコドンをＫｕｎｋｅｌミュータジェネシスによって相当するファージミド内にＨＲＧ−β１ ２２６（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ５２）に導入し、生じた構築物を、３４Ｂ８細胞（表現型：ｔｏｎＡΔ ＰｈｏＡΔＥ１５ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｏＣ２ ｏｍｐＴΔ ｄｅｇＰ４１（ΔＰｓｔＩ−ｋａｎＲ））内にトランスフォームした。該構築物は、変異体Ａ３，Ｅ２およびＦ１を発現するもの、並びに組み合わせ変異体ＨＲＧ５〜８（Ｄ４＋Ｅ２＋Ｍ５０Ｉ）およびＨＲＧ７３（Ｂ３＋Ｄ４＋Ｅ２＋Ｉ２）、同様に野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦ（ＨＲＧ８）を発現する構築物を含んだ。
約１ｍｇ／Ｌの濃度の発現が、以下のように達成された。５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地内でＯＤ550＝１．０の密度に細胞培養物を成育させ、１／１００希釈で修飾ＡＰ５培地に植菌するために使用した（修飾ＡＰ５培地は以下のものを含む：１．５ｇ／Ｌグルコース、１１ｇ／Ｌ Ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、０．６ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．１９ｇ／Ｌ無水ＭｇＳＯ4，または０．３９４ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ，１．０７ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、３．７３ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１２０ｍＬ／Ｌ １Ｍトリエタノールアミン［ｐＨ７．４］。）
野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦおよびその変異体は、単一の逆相ＨＰＬＣ工程においてペリプラズム破壊から均質に精製された。略記すると、細胞を３０℃で２４時間の増殖の後（ＯＤ550＝１．２）４５００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、ペレットを５時間エタノール／ドライアイス中で凍結した。５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７５ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、および１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中での再懸濁および解凍に引き続き、破壊された細胞を遠心分離で取り出し、破壊破片にした。破壊破片を濾過し、３ｍＬ／分の流速で８０分かけて０−４０％アセトニトリル由来の勾配を用いて半予備Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによってクロマトグラフィーにかけた。ＨＲＧ−β１ＥＧＦ（またはその変異体）を含むことがエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって示された画分を凍結乾燥し、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で再懸濁した。アミノ酸分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、タンパク質は本質的に均質であることが見出された。
ＥｒｂＢ−Ｉｇに対する可溶性変異体の親和性を、実施例１で以前に記載されたようにＥｒｂＢ−２／３，−３および−４レセプター−Ｉｇ融合物に対する125Ｉ−ＨＲＧ結合の阻害を測定することによって測定した。ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇ調製物もまたＥｒｂＢ−２／２および３／３ホモダイマーを含むが（ＥｒｂＢ−２−および−３−Ｉｇの共発現の結果として）、125Ｉ−ＨＲＧの置換は、２／３ヘテロダイマー対３／３ホモダイマーについての野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦのおよそ１００倍高い親和性のため、有意にＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇ由来であるはずである。
その結果が表１４に示されている。
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該変異体は、野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦが示すものよりＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する高い親和性を示す（４倍まで）が、親和性の増大はファージＥＬＩＳＡによって測定されたものより劇的ではなかった。このフォーマットにおける分析もまた、Ｅ２ミューテーションが大きな増大した親和性を与えること、並びにさらなるＤ４およびＭｅｔ５０Ｉｌｅミューテーション（構築物ＨＲＧ５８中で）がさらには寄与しないことを明らかにした。ファージＥＬＩＳＡで観察されるように、該変異体は、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する親和性増大と同様であるＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する親和性の増大を示した。ＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇに対する変異体親和性は、２／３−ヘテロダイマーに対する野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦの親和性と同様であるが、最大に置換された構築物（ＨＲＧ７２）は野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦが結合するよりＥｒｂＢ−２／３−Ｉｇに対して６倍弱く結合した。
可溶性変異体もまた、ＭＣＦ７乳ガン細胞上のＥｒｂＢ−２レセプターのチロシンリン酸化を刺激するその能力についてアッセイされた。これは、Sadickら,Analyt.Biochem.235:207-214に記載されているようにＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて達成され、その場合検出されるＥｒｂＢ−２リン酸化は、主にＥｒｂＢ−２／３ヘテロダイマーの形成のためであると考えられる。
略記すると、２×１０5ＭＣＦ−７細胞を、平底９６穴培養プレートの各ウェルに加え、一晩培養した。翌朝、培養培地を０から１０ｎＭの範囲の濃度で変異体またはＨＲＧ８（野生型）を含む培地と交換した。細胞を３０分で３７℃で刺激し、培養培地を捨てた。細胞を溶解しレセプターを可溶化するために、１００μｌの溶解バッファーを各ウェルに加えた。溶解バッファーは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｎＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．０１％チメロゾール、３０ｋＩＵ／ｍｌアプロチニン（ICB Biochemicals,Aurora,OH）、１ｍＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフロリドヒドロキシクロリド（ＡＥＢＳＦ；ICN Biochemicals）、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムより成った。それからプレートを室温で６０分、プレートシェイカー（Bellco Instruments,Vineland,NJ）上で穏やかに攪拌した。
細胞を可溶化する一方、アフィニティー精製ポリクローナル抗ＥｒｂＢ−２ＥＣＤ抗体（５０ｍＭカルボン酸バッファー（ｐＨ９．６）中で１．０μｇ／ｍｌ）を使用して4℃で一晩コートしたＥＬＩＳＡミクロタイタープレー（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉｓｏｒｐTM、Inter Med,Denmark）を注ぎ、穏やかな攪拌を用いて室温で６０分ブロックバッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ［Intergen Co.,Purchase,NY］、０．０１％チメロゾール）を使用してブロックした。６０分後、抗ＥｒｂＢ−２ＥＣＤ抗体コート化プレートを、自動プレート洗浄器（Scan Washer 300,Skatron Instruments,Inc.,Sterling,VA）を使用して洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TM、０．０１％チメロゾール）を用いて６回洗浄した。
各細胞培養ミクロタイター由来の可溶化ＥｒｂＢ−２を含む溶解物を、各抗ＥｒｂＢ２ＥＣＤ抗体コート化およびブロック化ＥＬＩＳＡウェルに移し、穏やかな攪拌と共に室温で２時間インキュベートした。非結合レセプターを洗浄バッファーで洗浄することによって除去し、希釈バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TM、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％チメロゾール）中に０．２μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌのビオチン化４Ｇ１０を各ウェルに加えた。室温で２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、希釈バッファー中で１：５００００に希釈した１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ストレプタビジン（Zymed Laboratories,S.San Francisco,CA）を各ウェルに加えた。プレートを穏やかな攪拌と共に室温で３０分インキュベートした。有利アビジン接合物を洗浄し、１００μｌの新鮮に調製された基質溶液（テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ、二構成成分基質キット、KirkegardおよびPerry、Gaithersburg,MD）を各ウェルに加えた。反応を１０分進行させ、その後色素形成を１．０Ｍ Ｈ3ＰＯ4を添加することによって停止させた。
その結果が表１４に示されている。ＥＣ50は、５０％最大チロシンリン酸化を達成するのに必要な変異体（またはＨＲＧ８）の濃度である。一般的に、試験された変異体によるリン酸化の刺激に対するＥＣ50は、野生型ＨＲＧ−β１ＥＧＦのＥＣ50と実質的に異ならなかった。さらに、該値は、上記のレセプター融合物に結合するＩＣ50とよく相関した。
実施例４
一価ファージディスプレーを使用したＥｒｂＢ−４レセプター結合に対するヒレグリン−β１ＥＧＦドメイン変異体の選択
本実施例は、ＥｒｂＢ−４レセプターに対する結合のためのＨＲＧ−β１変異体、特に、野生型ＨＲＧ−β１よりも、ＥｒｂＢ−３レセプターに対して、ＥｒｂＢ−４レセプターについての大きい特異性を有する変異体の選択を記載する。上記変異体は、例えば、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する結合よりも、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する結合についての低い変異体：野生型ＥＣ50比を有する。研究された変異体は、最小ＥＧＦ様ドメイン（ＨＲＧ−β１ １７７−２２８）を含むＨＲＧ−β１ １７７−２４４に相当する残基を含む。本実施例において、「ＨＲＧ−β１ＥＧＦ」とは、１７７−２４４残基にわたるＥＧＦ様ドメインの領域を指す。残基数は、６４５アミノ酸天然ヒトＨＲＧ−β１中の位置の観点から、およびカッコ内でＨＲＧ−β１ＥＧＦ中の位置の観点から（すなわちＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−６８）、表されている。
該変異体は、Ｈｉｓ１７８，Ｌｅｕ１７９およびＡｒｇ２０７（Ｈｉｓ２，Ｌｅｕ３およびＡｒｇ３１）でランダム化によって生産された。アラニンスキャニング（実施例２）がこれらの位置でのアラニンの置換が、ＥｒｂＢ−４レセプターと比較して、ＥｒｂＢ−３レセプターに対する親和性の有意に大きい損失を引き起こすため、これらの残基が選択され、これらの残基はＥｒｂＢ−４レセプター結合に対するよりもＥｒｂＢ−３レセプター結合に対して重要であることを示唆する。さらに、これらの残基は、潜在的に結合部位を形成するＨＲＧ−β１分子の表面上互いに近接して位置していると予測される。
ＥｒｂＢ−４−Ｉｇ結合に対するファージライブラリースクリーニング
ＨＲＧ−β１ＥＧＦの変異体を調製し、Bassら,Proteins 8:309-14（1990）の方法にしたがって一価ファージディスプレーを使用して、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する結合について選択した。略記すると、ＨＲＧ−β１ＥＧＦファージミドベクターは、ＨＲＧ−β１ １７７−２４４がＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩのＣ末端断片に融合された、ｐＨＲＧ２−ｐ３（実施例１に記載）であった。開始ベクターが野生型ポリペプチドを発現しないことを確かにするために、Ｈｉｓ１７８，Ｌｅｕ１７９およびＡｒｇ２０７（Ｈｉｓ２，Ｌｅｕ３およびＡｒｇ３１）でこのベクター内に終止コドンを導入する目的で、Ｋｕｎｋｅｌミュータジェネシスを実施した。
それからこれらの部位を、ＨＲＧ−β１ＥＧＦライブラリーを生産するためにＫｕｎｋｅｌミュータジェネシスによってランダム化した。ミューテート化ＨＲＧ−β１ＥＧＦを一価的にディスプレーするファージを、該ラブラリーから生産した。Bassら,上記参照を参照。それからこれらのファージを、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化したＥｒｂＢ−４−Ｉｇホモダイマーに対して選択した。結合ファージを溶出し、新たなファージを生産するために使用される宿主細胞に再感染するために使用した。選択の第一周由来のファージの半分は、さらなる３周の選択のために固定化ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対して選択させた。第一周由来のファージのもう半分は、可溶性ＥｒｂＢ−３−Ｉｇ（１０ｎＭ）の存在下でさらなる３周のために固定化ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対して選択した。可溶性ＥｒｂＢ−３−Ｉｇの存在下での選択（すなわちＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する「カウンター選択」）は、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するより高い親和性を有する変異体を取り出すことが期待され、選択の各周でＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対するより高い親和性を有するものを豊富にすることを許容した。選択後、二つの生じたライブラリーのそれぞれから由来する１２のクローンをシークエンスした。
初めのファージライブラリーの構築
初めのファージライブラリーを、ウラシル含有一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用してＫｕｎｋｅｌミュータジェネシスによって構築した。ＴＡＡおよびＴＧＡ終止コドンを、プールから野生型骨格を除去するカスタムテンプレートを生産するために、ランダム化に対して選択される位置で導入した。位置は、ＮＮＳコドン（この場合Ｎは４つの塩基の何れかであり、ＳはＧまたはＣの何れかである）へのミューテーションによって十分にランダム化された。二つのミュータジェネシスオリゴヌクレオチドを使用し、一つはＨｉｓ１７８およびＬｅｕ１７９（Ｈｉｓ２およびＬｅｕ３）をランダム化し、もう一つはＡｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）をランダム化した。該オリゴヌクレオチドは、ランダム化残基のそれぞれの側で１５ベースの突出部を含んだ。
最終ミュータジェネシス反応混合物を、製造者のプロトコールにしたがって、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene,Inc.,La Jolla,CA）中に電気的トランスフォームした。それからトランスフォームされた細胞を、１０11ｐｆｕ Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Promega Corp.,Madison,WI）を使用して感染し、ファージストック（約１０14ファージミド／ｍＬ）を実施例１に記載のように調製した。
少なくとも１０8の形質転換体が得られ、該ライブラリーが考え得るアミノ酸配列組み合わせの適切な代表物を有することを示した。
ＥｒｂＢ−４−Ｉｇ結合に対するファージの選択
一価ファージを調製し、実施例１に記載されているように、ヒトＦｃ断片に対するポリクローナル抗体を使用した捕捉を介して、ミクロタイタープレート上に前もって結合されたＥｒｂＢ−４−Ｉｇ上で選択を実施した。１００μＬ結合バッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０TM）中のおよそ１０12ファージを、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇコート化ウェル、およびＥｒｂＢ−４−Ｉｇが添加されていない対照ウェルに適用した。選択の第一周の後、生じたファージの半分（以下では「カウンター選択ライブラリー」）を、結合バッファー中の１０ｍＭ ＥｒｂＢ−３−Ｉｇの存在下で選択した。室温で２時間のインキュベーションに引き続き、該プレートを強烈に洗浄し（１２×）、１００μＬの５０ｍＭ ＨＣ１および０．０５％ＴｗｅｅｎTM２０の溶液を加え、１０分攪拌することによって、ファージを溶出した。
溶出物を１０μＬ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して中和し、２０μＬを対数増殖期ＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞に対する滴定のため使用した。残りのものを１ｍＬの対数増殖期ＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞を感染するために使用し（３７℃で３０分）、それからそれを２×１０10ｐｆｕ Ｍ１３Ｋ０７ファージを使用して過剰感染し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２５ｍＬの２ＹＴ溶液（１６ｇ／Ｌトリプトファン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で１８−２４時間増殖させた。ファージを上記記載のように回収し、サイクルを繰り返した。
選択の４周後、各ライブラリー由来の１２のクローンをランダムに拾い、ジデオキシ法によってシークエンスした。Sangerら,PNAS USA 74:5463-67（1977）参照。ＤＮＡ配列から推定されるランダム化の位置でのアミノ酸が、表１５に示されている（”.”は野生型残基と同一である残基を示す）。
0004515542.tif 000026
一つの変異体が各ライブラリーにおいて際だっており、各ライブラリーからシークエンスされた１２のクローンの７つで表された。ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対してカウンター選択されたライブラリー由来の際だった変異体は、Ｈｉｓ１７８およびＬｅｕ１７９（Ｈｉｓ２およびＬｅｕ３）の位置で野生型残基を選択し、Ａｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）でＰｒｏを有した。カウンター選択なしで選択されたライブラリー由来の際だった変異体は、Ｈｉｓ１７８およびＡｒｇ２０７（Ｈｉｓ２およびＡｒｇ３１）の位置で野生型に選択し、Ｌｅｕ１７９（Ｌｅｕ３）でＭｅｔを有した。ライブラリーのそれぞれ由来の変異体において、ＨＲＧ−β１ ２２８−２３１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ５２−５５）の自発的な置換が存在した。
レセプター親和性および特異性に対するミューテーションの影響の分析
レセプター結合親和性を、実施例１に記載されているように、各ライブラリー由来の全ての独特な変異体についてファージＥＬＩＳＡによって測定した。その結果が表１５に示されている。ＥｒｂＢ−３−ＩｇおよびＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する変異体の親和性を、特異性を評価するために測定した。
ＥｒｂＢレセプター−Ｉｇ融合物に対するほとんどの変異体の親和性は、約１．２倍から約２．２倍の間で減少した。一つの変異体だけが、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対してのみ、親和性におけるわずかな増大を示した。しかしながら、３つの変異体が、野生型ＨＲＧ−β１の親和性より２倍未満小さいものである、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇに対する親和性を有し、一方でＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するその親和性は、野生型ＨＲＧ−β１の親和性より６から９倍小さかった。これらの変異体の全てが、Ｌｅｕ１７９（Ｌｅｕ３）で野生型残基を選択した。一つの変異体は、Ｈｉｓ１７８（Ｈｉｓ２）でＧｌｕを選択し、Ａｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）で野生型を選択した。もう一つの変異体は、Ｈｉｓ１７８（Ｈｉｓ２）で野生型を選択し、Ａｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）でＰｒｏを選択した。これが、カウンター選択ライブラリーにおける際だった変異体であった。
第三の変異体は、Ｈｉｓ１７８（Ｈｉｓ２）でＬｅｕを選択し、Ａｒｇ２０７（Ａｒｇ３１）でＰｒｏを選択し、またＨＲＧ−β１ ２２８−２３１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ５２−５５）に対してＭｅｔの自発的な選択を有したが、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するほぼ野生型の親和性を維持して、自発的な置換を欠いていた。それ故、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対する親和性の減少は、この自発的置換に大きく寄与していた。ＨＲＧ−β１ ２２８−２３１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ５２−５５）は、ＨＲＧ−β１分子の表面でのランダム化領域に近接しているようなので、該データはＨＲＧ−β１の少なくとも二つの別々の領域が、主にＨｉｓ１７８，Ｌｅｕ１７９およびＡｒｇ２０７（Ｈｉｓ２，Ｌｅｕ３およびＡｒｇ３１）の各残基およびＨＲＧ−β１ ２２８−２３１（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ５２−５５）でのＥｒｂＢレセプター結合について重要であることを示唆する。
ＥｒｂＢ−４−Ｉｇ結合に対する増大した特異性を示す３つの変異体のうち２つは、カウンター選択ライブラリーから単離された１２のクローンのうち８を説明した。他の変異体は、カウンター選択なしで選択されたライブラリーから単離された１２のクローンのうち２つだけを説明した。それ故、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対するカウンター選択は、野生型ＨＲＧ−β１のものよりも、ＥｒｂＢ−３−Ｉｇに対して、ＥｒｂＢ−４−Ｉｇについてのより大きな特異性を示す変異体の有意な豊富化を生じた。
配列表
（1）一般情報:
（i）出願人:Ballinger,Marcus D.
Jones,Jennifer T.
Fairbrother,Wayne J.
Sliwkowski,Mark X.
Wells,James A.
Genentech,Inc.
（ii）発明の名称:ヒレグリン変異体
（iii）配列数:92
（iv）連絡先:
（A）住所:Skjerven,Morrill,MacPherson,ら.
（B）通り:25 Metro Drive,Suite 700
（C）街:San Jose
（D）州:California
（E）国:USA
（F）郵便番号:95110
（v）コンピュータ読み取り形態:
（A）メディアタイプ:フロッピーディスク
（B）コンピューター:IBM PC互換機
（C）オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェアー:PatentIn Release #1.0,Version #1.30
（vi）現出願のデータ:
（A）出願番号:係属中
（B）出願日:1998年2月10日
（vi）現出願のデータ:
（A）出願番号:08/799,054
（B）出願日:1997年2月10日
（C）分類:
（viii）弁理士／代理人情報:
（A）名前:Haliday,Emily M.
（B）登録番号:38,903
（C）参照／登録番号:M-4761-1P PCT
（ix）遠距離通信情報:
（A）電話:（408）453-9200
（B）テレファックス:（408）453-7979
（2）配列番号１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:71アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子タイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号１:
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（2）配列番号２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:66アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号２:
0004515542.tif 000028
（2）配列番号３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:63アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号３:
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（2）配列番号４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:65アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号４:
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（2）配列番号５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:66アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Rattus rattus
（xi）配列の記載:配列番号５:
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（2）配列番号６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:71アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Rattus rattus
（xi）配列の記載:配列番号６:
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（2）配列番号７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:63アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Rattus rattus
（xi）配列の記載:配列番号７:
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（2）配列番号８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:64アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Rattus rattus
（xi）配列の記載:配列番号８:
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（2）配列番号９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:81アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Rattus rattus
（xi）配列の記載:配列番号９:
0004515542.tif 000035
（2）配列番号１０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:65アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号１０:
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（2）配列番号１１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:65アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号１１:
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（2）配列番号１２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:65アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号１２:
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（2）配列番号１３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:71アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:タンパク質
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Gallus domesticus
（xi）配列の記載:配列番号１３:
0004515542.tif 000039
（2）配列番号１４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号１４:
0004515542.tif 000040
（2）配列番号１５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:48アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号１５:
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（2）配列番号１６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号１６:
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（2）配列番号１７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号１７:
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（2）配列番号１８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号１８:
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（2）配列番号１９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号１９:
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（2）配列番号２０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２０:
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（2）配列番号２１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２１:
0004515542.tif 000047
（2）配列番号２２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２２:
0004515542.tif 000048
（2）配列番号２３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２３:
0004515542.tif 000049
（2）配列番号２４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２４:
0004515542.tif 000050
（2）配列番号２５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２５:
0004515542.tif 000051
（2）配列番号２６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２６:
0004515542.tif 000052
（2）配列番号２７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２７:
0004515542.tif 000053
（2）配列番号２８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２８:
0004515542.tif 000054
（2）配列番号２９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）関係なし:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号２９:
0004515542.tif 000055
（2）配列番号３０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３０:
0004515542.tif 000056
（2）配列番号３１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３１:
0004515542.tif 000057
（2）配列番号３２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３２:
0004515542.tif 000058
（2）配列番号３３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:49アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３３:
0004515542.tif 000059
（2）配列番号３４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:4アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３４:
0004515542.tif 000060
（2）配列番号３５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:7アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３５:
0004515542.tif 000061
（2）配列番号３６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３６:
0004515542.tif 000062
（2）配列番号３７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３７:
0004515542.tif 000063
（2）配列番号３８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号３８:
0004515542.tif 000064
（2）配列番号３９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号３９:
0004515542.tif 000065
（2）配列番号４０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４０:
0004515542.tif 000066
（2）配列番号４１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４１:
0004515542.tif 000067
（2）配列番号４２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４２:
0004515542.tif 000068
（2）配列番号４３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４３:
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（2）配列番号４４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４４:
0004515542.tif 000070
（2）配列番号４５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４５:
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（2）配列番号４６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４６:
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（2）配列番号４７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４７:
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（2）配列番号４８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号４８:
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（2）配列番号４９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号４９:
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（2）配列番号５０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５０:
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（2）配列番号５１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５１:
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（2）配列番号５２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）TYPE:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５２:
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（2）配列番号５３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５３:
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（2）配列番号５４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５４:
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（2）配列番号５５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５５:
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（2）配列番号５６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５６:
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（2）配列番号５７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５７:
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（2）配列番号５８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５８:
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（2）配列番号５９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号５９:
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（2）配列番号６０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６０:
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（2）配列番号６１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号６１:
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（2）配列番号６２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６２:
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（2）配列番号６３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６３:
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（2）配列番号６４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６４:
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（2）配列番号６５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号６５:
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（2）配列番号６６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６６:
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（2）配列番号６７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６７:
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（2）配列番号６８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６８:
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（2）配列番号６９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号６９:
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（2）配列番号７０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７０:
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（2）配列番号７１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７１:
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（2）配列番号７２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号７２:
0004515542.tif 000098
（2）配列番号７３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７３:
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（2）配列番号７４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７４:
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（2）配列番号７５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７５:
0004515542.tif 000101
（2）配列番号７６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７６:
0004515542.tif 000102
（2）配列番号７７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７７:
0004515542.tif 000103
（2）配列番号７８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７８:
0004515542.tif 000104
（2）配列番号７９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号７９:
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（2）配列番号８０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８０:
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（2）配列番号８１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo spiens
（xi）配列の記載:配列番号８１:
0004515542.tif 000107
（2）配列番号８２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８２:
0004515542.tif 000108
（2）配列番号８３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８３:
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（2）配列番号８４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８４:
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（2）配列番号８５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８５:
0004515542.tif 000111
（2）配列番号８６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８６:
0004515542.tif 000112
（2）配列番号８７の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８７:
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（2）配列番号８８の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:6アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号８８:
0004515542.tif 000114
（2）配列番号８９の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号８９:
0004515542.tif 000115
（2）配列番号９０の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号９０:
0004515542.tif 000116
（2）配列番号９１の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:5アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:関係なし（組換え体）
（xi）配列の記載:配列番号９１:
0004515542.tif 000117
（2）配列番号９２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）長さ:52アミノ酸
（B）タイプ:アミノ酸
（C）鎖の状態:関係なし
（D）トポロジー:関係なし
（ii）分子のタイプ:ペプチド
（iii）仮定:なし
（vi）起源:
（A）生物:Homo sapiens
（xi）配列の記載:配列番号９２:
0004515542.tif 000118
【図１】
0004515542.tif 000119
【図２】
0004515542.tif 000120
【図３】
0004515542.tif 000121
【図４】
0004515542.tif 000122