(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）植物材料を調製し、次いで
２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる、
ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、少なくとも上記２）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
金属塩が、硫酸銅またはグルコン酸銅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属塩が、硫酸銅である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）において、硫酸銅またはグルコン酸銅の濃度を高めた培地を用いる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地が、１〜５０μＭの硫酸銅またはグルコン酸銅を含む培地である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地が、１〜１０μＭの硫酸銅またはグルコン酸銅を含む培地である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物材料を調製する工程１）、および／または、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）において、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からなる群から選択される、少なくとも１の処理を植物材料に行うことをさらに含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
植物が、単子葉植物である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
植物が、トウモロコシである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
植物が、イネである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
植物材料が未熟胚である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）に次いで、さらに、
３）形質転換細胞を選抜し、
４）所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含む、請求項１ないし１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）に次いで、さらに、
少なくとも以下の１の段階において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いて、
３）形質転換細胞を選抜し、
４）所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含む、請求項１ないし１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法を使用することを特徴とする、形質転換植物の製造方法。
【請求項１５】
１）植物材料を調製し、
２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させ、
３）形質転換細胞を選抜し、そして
４）選抜された形質転換体を再分化する、
ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、上記２）および４）の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項１６】
１）植物材料を調製し、
２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させ、
３）形質転換細胞を選抜し、そして
４）選抜された形質転換体を再分化する、
ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、上記２）の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を効率よく行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  アグロバクテリウム法による遺伝子導入は、アグロバクテリウムの機能を利用した植物の形質転換方法である。土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、植物に感染すると、アグロバクテリウムの病原性に関与しているＴｉ（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれる機能を有している。アグロバクテリウム法による植物の形質転換方法は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域を植物ゲノムに導入を所望する遺伝子に置き換えた形質転換用プラスミドを調製し、当該形質転換用プラスミドをＴｉプラスミドの代わりに有するように調製したアグロバクテリウムを用いて、上記のアグロバクテリウムの機能を利用することにより、当該植物ゲノムに導入を所望する遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法である。【０００３】  アグロバクテリウム属細菌は双子葉植物のみを宿主とし、単子葉植物には寄生しないとされていたため、当初、アグロバクテリウム法による植物の形質転換法は主として双子葉植物の形質転換法として発展した。その後、単子葉植物へのアグロバクテリウム法による遺伝子導入についても様々な試みがなされ、強病原性アグロバクテリウムの病原性遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターが開発され、このベクターを用いた方法においては、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても安定して、比較的効率よく形質転換されることが報告された（例えば、特許第２，６４９，２８７号公報；特許第３，３２９，８１９号公報；Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６，ｐ．２７１−２８２；および、Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０を参照）。さらに、コムギ、オオムギおよびソルガムといった単子葉植物についてもアグロバクテリウム法による形質転換の成功例が報告され（例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐ．９７１−９８０；Ｔｉｎｇａｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１１，ｐ．１３６９−１３７６；および、Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４４，ｐ．７８９−７９８を参照）、単子葉植物についてもアグロバクテリウム法による形質転換が広く行われるに至った。【０００４】  アグロバクテリウムによる形質転換法は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝子のコピー数が少ない、Ｔ−ＤＮＡという特定の領域を断片化させることなく導入できる、短期間の培養により形質転換体を得ることができるため培養変異が少ないなど、多くの優れた特徴を持っている。このため、現在では双子葉、単子葉を問わず多くの植物種で最も有用な形質転換の手段として広く用いられている。【０００５】  アグロバクテリウムによる形質転換方法は、植物種により供試材料、培養培地の組成は異なるが、いずれの植物においても材料となる組織にアグロバクテリウム懸濁液を接触させ、共存培養の後に形質転換細胞の選抜を行い、形質転換植���を作出する点は共通している。一般に、材料となる植物組織は、必要に応じ滅菌処理がなされるが、それ以外に特別な処理をすることなくアグロバクテリウムの感染が行われる（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．４２３−４３６，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．；Ｖｉｓｓｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｆ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ５：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ６：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；および、Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ７：１−１３，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、を参照）。【０００６】  アグロバクテリウムによる形質転換は多くの植物種で報告されているが、その形質転換効率は植物の種、遺伝子型そして材料となる組織により大きく異なる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＹ：Ｍｅｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ｐ．１１９−１５９を参照）という問題点もある。実用遺伝子を導入した品種を育成する場合、多数の形質転換植物を作出する必要があり、一年を通じて高い効率で安定して形質転換植物の得られる技術の開発は重要である。また、植物の種や遺伝子型によらない形質転換法は、効率的に実用品種を育成する上で極めて有用である。さらに、材料となる植物の組織によらない形質転換法の開発も、形質転換を効率的に進める上で必要である。【０００７】  このように遺伝子導入効率を向上させる、あるいは遺伝子導入が困難な植物種や遺伝子型も形質転換できる方法の開発は重要である。現在までに、培地組成の検討、マーカー遺伝子もしくはプロモーターの改変、供試材料の検討、供試材料の処理方法の検討など、様々な側面から、効率よく形質転換植物を得るための多くの技術が報告されている。例えば、供試材料の処理方法では、組織を付傷することで感染効率を向上させたり、または、組織を付傷せずに植物組織を遠心処理（例えば、国際公開第０２／１２５２０号パンフレット；特開２０００−３４２２５６を参照）、加熱処理（例えば、特開２０００−３４２２５５；特開２０００−３４２２５３を参照）したりする方法などが報告されている。また、本発明者らは、植物組織を加圧処理することが遺伝子導入効率の向上に有用であることを見いだしている（結果は未発表である）。【０００８】  また、特に単子葉植物の中でもトウモロコシについては、アグロバクテリウム法による形質転換における形質転換効率がイネと比較して低いことが問題であった。これまでにも、アグロバクテリウム法によるトウモロコシの形質転換において形質転換効率を向上させるための種々の試みがなされてきた（例えば、Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏ���．１９，ｐ．７９８−８０３；Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３２３−３３３；Ｆｒａｍｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２９，ｐ．１３−２２；および、Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４，ｐ．５７−６６、を参照）。アグロバクテリウム法でのトウモロコシの形質転換効率を向上させる種々の試みとしては、Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（例えば、Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３２３−３３３を参照）、培地への硝酸銀およびカルベニシリンの添加（例えば、Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３２３−３３３；および、Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４，ｐ．５７−６６を参照）、共存培地へのシステインの添加（例えば、Ｆｒａｍｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２９，ｐ．１３−２２を参照）等がなされてきたが、その効果はまだ低い。トウモロコシのような主要な穀物であって形質転換効率の低い植物については、特に、実用的な形質転換植物を作出する場合のみならず、新規な遺伝子の効果を確認する場合にも、更に形質転換効率の高い形質転換方法が望まれている。【０００９】  硫酸銅は植物組織培養の多種の培地に微量無機塩として含まれている。通常、植物の組織培養培地に含まれる硫酸銅の濃度は０．１μＭである。近年、単子葉植物の組織培養および形質転換試験において培地に通常の５０〜５００倍以上の硫酸銅を添加することにより種々の効果のみられることが報告されている。Ｇｈａｅｍｉら（Ｇｈａｅｍｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６，ｐ．３５５−３５９を参照）はコムギの葯を１０ｍｇ／ｌの硫酸銅および２．５〜５ｍｇ／ｌの硝酸銀を含む培地で培養することにより胚状体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ）の形成率が高まることを報告した。Ｚｈａｎｇら（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．１８，ｐ．９５９−９６６を参照）はオオムギの完熟種子から発芽したシュートを５μＭ  硫酸銅および３０ｇ／ｌ  マルトースを含む培地で培養することにより苗条分裂組織培養（ｓｈｏｏｔ  ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＳＭＣｓ）の誘導率が高まること報告した。マルトースは褐変組織の減少に効果があり、硫酸銅は苗条分裂組織培養が誘導されたときのシュートの発育の促進に効果があるとしている。また、未熟胚を硫酸銅を含む培地で培養することにより得られたカルスでは再分化率やカルス当たりの再分化植物数が増大することがオオムギ（例えば、Ｄａｈｌｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．，（１９９５），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３，ｐ．２６７−２６９；および、Ｃｈｏ，Ｍ−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．��（１９９８），Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１３８，ｐ．２２９−２４４を参照）やイネ（例えば、Ｓａｈｒａｗａｔ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｄ，Ｓ．，（１９９９），Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．５１７−５２２を参照）で報告されている。さらに硫酸銅を含む培地で誘導された緑色の再分化能を有する組織は形質転換の材料として適したものであるとされている（例えば、Ｖｉｓｓｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｆ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ５：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；および、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ６：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。【００１０】  Ｉｓｈｉｄａら（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４，ｐ．５７−６６を参照）はアグロバクテリウムを接種し、共存培養を行ったトウモロコシ（品種Ｈ９９）の未熟胚を１〜１００μＭの硫酸銅を含む培地で培養し未熟胚からのカルス形成を調査した。１〜１０μＭの硫酸銅を含む培地でカルス形成率の向上がみられたが、その効果はわずかであった。【００１１】  以上のように高濃度の硫酸銅を培地に添加することにより単子葉植物の組織培養において種々の効果のみられることが報告されている。しかし、銅イオンを含む金属塩の添加が遺伝子導入効率および／または形質転換効率に及ぼす効果を調査した報告はこれまでにない。
【特許文献１】特許第２，６４９，２８７号公報
【特許文献２】特許第３，３２９，８１９号公報
【特許文献３】国際公開第０２／１２５２０号パンフレット
【特許文献４】特開２０００−３４２２５６
【特許文献５】特開２０００−３４２２５５
【特許文献６】特開２０００−３４２２５３
【特許文献７】米国特許第６，２３５，５２９号明細書
【特許文献８】米国特許第６，５４１，２５７号明細書
【特許文献９】国際公開第９５／０６７２２号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６，ｐ．２７１−２８２．
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０．
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐ．９７１−９８０．
【非特許文献４】Ｔｉｎｇａｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１１，ｐ．１３６９−１３７６
【非特許文献５】Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４４，ｐ．７８９−７９８．
【非特許文献６】Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．４２３−４３６，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．
【非特許文献７】Ｖｉｓｓｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｆ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ５：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．
【非特許文献８】ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ６：１−９，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．
【非特許文献９】Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂ７：１−１３，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．
【非特許文献１０】Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＹ：Ｍｅｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ｐ．１１９−１５９．
【非特許文献１１】Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．１９，ｐ．７９８−８０３．
【非特許文献１２】Ｚｈａｏ，Ｚ−Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．３２３−３３３．
【非特許文献１３】Ｆｒａｍｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２９，ｐ．１３−２２．
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４，ｐ．５７−６６．
【非特許文献１５】Ｇｈａｅｍｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６，ｐ．３５５−３５９．
【非特許文献１６】Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．１８，ｐ．９５９−９６６．
【非特許文献１７】Ｄａｈｌｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．，（１９９５），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３，ｐ．２６７−２６９．
【非特許文献１８】Ｃｈｏ，Ｍ−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１３８，ｐ．２２９−２４４．
【非特許文献１９】Ｓａｈｒａｗａｔ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｄ，Ｓ．，（１９９９），Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．５１７−５２２．
【非特許文献２０】Ｔｒｉｃｋ，Ｈ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｉｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．，（１９９７），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，ｐ．３２９−３３６．
【非特許文献２１】Ａｍｏａｈ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５２，Ｐ．１１３５−１１４２．
【非特許文献２２】Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０３，ｐ．１７９−１８０．
【非特許文献２３】Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｕｂｏ  Ｔ．，（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｉｎ  Ｖａｓｉｌ，Ｉ．Ｋ．（ｅｄ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒｅａｌ  ｃｒｏｐｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，ｐ．４３−８２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明が解決しようとする課題は、従来のアグロバクテリウム属細菌を介した植物への遺伝子導入方法における植物の遺伝子導入効率よりも、高い効率で遺伝子導入のなされる方法を開発することにある。また、従来のアグロバクテリウム属細菌を介した植物への遺伝子導入方法における植物の供試組織からの形質転換細胞の増殖率よりも高い効率で、形質転換細胞の増殖のなされる方法を開発することにある。さらに、本発明が解決しようとする課題は、前記方法を使用した、形質転換植物の製造方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  本発明者らは上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、金属塩の濃度を高めた培地を用いてアグロバクテリウム属細菌を介した植物への遺伝子導入を行うことにより、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いたときと比較して、安定して高い効率で遺伝子導入のなされること、および安定して高い効率で遺伝子導入した組織からの細胞の増殖がみられることを見いだした。さらに、金属塩の濃度を高めた培地を用いて遺伝子導入を行うことに加えて、アグロバクテリウム属細菌に植物材料を感染させる前に、加熱・遠心処理を行うと、安定してさらに高い効率で遺伝子導入のなされることを見いだした。また、遺伝子導入された植物材料について、さらに形質転換体の選抜を行い、金属塩の濃度を高めた培地を用いて遺伝子導入を行った植物材料は、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いたときと比較して、飛躍的に形質転換効率が向上することを見いだした。【００１４】  したがって、本発明は、
１）植物材料を処理し、
２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる、
ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、上記１）および／または２）の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法に関する。【００１５】  本発明の方法において、培地に高い濃度で添加される金属塩は、銅イオンを含む金属塩である。本発明に用いる好ましい金属塩は、硫酸銅またはグルコン酸銅であり、最も好ましくは硫酸銅である。硫酸銅には、無水塩および含水塩があるが、いずれかに限定されるものではない。【００１６】  本発明の方法において、金属塩の濃度を高めた培地とは、当業者によく知られているＮ６基本培地、ＭＳ（ＬＳ）基本培地、Ｂ５基本培地、ＮＮ基本培地、ＮＴ基本培地、Ｋａｏの基本培地、Ｗｈｉｔｅの基本培地などの基本培地に含まれる金属塩の濃度と比較して高濃度の金属塩を含む培地をいう。高濃度とは、当該基本培地に含まれる金属塩の濃度よりも高いことを言う。【００１７】  具体的には、各基本培地の金属塩の濃度、例えばＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ濃度は、Ｎ６基本培地では０ｍｇ／ｌ、ＭＳ（ＬＳ）基本培地では０．０２５ｍｇ／ｌ、Ｂ５基本培地では０．０２５ｍｇ／ｌ、ＮＮ基本培地では０．０２５ｍｇ／ｌ、ＮＴ基本培地では０．０２５ｍｇ／ｌ、Ｋａｏの基本培地では０．０２５ｍｇ／ｌ、Ｗｈｉｔｅの基本培地では０ｍｇ／ｌであり、これらの基本培地をもとに作成した培地において、当該基本培地に含まれる硫酸銅の濃度よりも高濃度の硫酸銅を含む場合には、その培地は金属塩の濃度を高めた培地である。【００１８】  本発明における、銅イオンを含む金属塩とは、例示した基本培地に一般に、含まれていないか、または微量に含まれる銅イオンを含む金属塩を意味する。【００１９】  好ましい濃度の例を挙げると硫酸銅およびグルコン酸銅では１〜１００μＭ、好ましくは１〜５０μＭ、さらに好ましくは１〜１０μＭである。【００２０】  本発明の方法において、金属塩の濃度を高めた培地を用いる工程は、１）植物材料を調製する工程、および／または２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程のいずれか１の工程である。好ましくは少なくとも２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程で金属塩の濃度を高めた培地を用いる。さらに好ましくは、少なくとも２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程に含まれる、共存培養の段階で金属塩の濃度を高めた培地を用いる。【００２１】  本発明の方法においては、さらに遺伝子導入効率を向上させるために、植物材料を調製する工程１）、および／または、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）において、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からなる群から選択される少なくとも１の処理を植物材料に行うことを更に含んでもよい。植物材料の加圧処理は、当該植物を液体培地中で１．７〜１０ａｔｍで０．１秒間〜４時間、好ましくは２．４〜８ａｔｍで１秒間〜３０分間、加圧することで行う。植物材料の加熱処理は、当該植物材料を文献（特開２０００−３４２２５５；および、特開２０００−３４２２５３）に記載の方法により処理することができ、たとえば、３３〜６０℃で５秒間〜２４時間、好ましくは４６℃、３分間加熱する���とで行う。植物材料の遠心処理は、当該植物材料をＨｉｅｉらの方法（国際公開第０２／１２５２０号パンフレット；および、特開２０００−３４２２５６）により処理することができ、たとえば、１００Ｇ〜２５万Ｇで１秒間〜４時間、好ましくは２万Ｇで１０分間遠心することで行う。超音波処理については、文献（例えば、Ｔｒｉｃｋ，Ｈ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｉｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．，（１９９７），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，ｐ．３２９−３３６；および、Ａｍｏａｈ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．１１３５−１１４２）に記載されている方法により処理することができる。
これらの加圧処理、加熱処理、遠心処理、および超音波処理の処理はいずれか１つを行ってもよく、また複数組み合わせて行ってもよい。【００２２】  本発明の方法は、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）に次いで、さらに、
３）形質転換細胞を選抜し、
４）所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含んでいてもよい。【００２３】  また、本発明の方法は、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程２）に次いで、さらに、少なくとも以下の１の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いて、
３）形質転換細胞を選抜し、
４）所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含んでいてもよい。【００２４】  本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入効率を向上させるとともに、形質転換効率を向上させ、結果として形質転換された植物を効率よく得ることができる。したがって、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を使用することを特徴とする、形質転換植物の製造方法にも関する。【００２５】  さらに本発明者らは、形質転換された植物材料について、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いて形質転換体を再分化させることにより、通常の濃度の銅イオンを含む金属塩を含む培地を用いたときと比較して再分化植物の生長が促進されることを見いだした。【００２６】  したがって、本発明はさらに、
１）植物材料を調製し、
２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させ、
３）形質転換細胞を選抜し、
４）選抜された形質転換体を再分化する、
ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換植物の製造方法であって、上記４）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法に関する。【００２７】  または、本発明は、脱分化した植物細胞から植物体を再分化させる工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、再分化植物の生長を促進させる方法、に関する。この場合、脱分化した植物細胞は、形質転換細胞であってもなくてもよく、また、形質転換細胞であった場合には、アグロバクテリウム法により形質転換されていてもされていなくてもよい。
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入および形質転換方法
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入は、一般には以下の工程を含む：
ａ）植物材料を調製する工程；
ｂ）所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程；
ｃ）工程ａ）で調製した植物材料をｂ）で調製したアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程。【００２８】  さらに、形質転換体を得るために、上記工程ｃ）に次いで
ｄ）形質転換細胞を選抜する工程；および
ｅ）所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
を施してもよい。【００２９】  具体的には、単子葉植物においては、文献（特許第２，６４９，２８７号公報）に記載されているように、上記ａ）の工程でオーキシン（例えば、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸））またはサイトカイニン等を含む培地で培養して植物材料を脱分化の状態または脱分化過程にある状態にし、上記ｃ）の工程でアグロバクテリウムに感染させることを特徴とする方法；または、文献（特許第３，３２９，８１９号公報）に記載されているように、植物材料として当該植物の未熟胚を用い、上記ａ）の工程では未熟胚を脱分化処理せず、上記ｃ）の工程においてオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）またはサイトカイニン等を含む培地で培養することを特徴とする方法を用いることができる。【００３０】 工程ａ）について
本明細書において、遺伝子導入に供される「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。単子葉植物には、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、アスパラガス、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。双子葉植物にはタバコ、ダイズ、ジャガイモ、ワタ、ヒマワリ、その他が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、植物は単子葉植物であり、最も好ましくはトウモロコシである。【００３１】  また、「植物材料」とは、非限定的に、アグロバクテリウム法による植物の形質転換に供するための当該植物の細胞、葉、根、茎、実、その他いずれの部位の植物組織、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体など植物のあらゆる態様を包含する。【００３２】  本発明の方法に用いる植物の形態として好ましいのは未熟胚またはカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後２日以降のものが好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、脱分化し、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間のＦ１、インブレッドと自然受粉品種間のＦ１、市販Ｆ１品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。【００３３】  工程ａ）において、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り出し、形質転換に好適な材料を調製する。また、所望により植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。【００３４】  本発明では、工程ａ）で植物材料を調製する過程、および／または、工程ｃ）でアグロバクテリウムに感染させる過程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする。加えて、工程ａ）で植物材料を調製する過程において加圧処理を行ってもよい。【００３５】 工程ｂ）について
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（ｃｒｏｗｎ  ｇａｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすことは古くから知られており、１９７０年代には、Ｔｉプラスミドが病原性に関与すること、さらにＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このＴ−ＤＮＡには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。Ｔ−ＤＮＡの切り出しと植物への伝達にはＴｉプラスミド上のヴィルレンス領域（ｖｉｒ領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またＴ−ＤＮＡが切り出されるためにはＴ−ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓもＲｉプラスミドによる同様なシステムを有している（例えば、特開２０００−３４２２５６の図３および図４）。【００３６】  アグロバクテリウムの感染によってＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれるので、Ｔ−ＤＮＡ上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが期待された。しかしながら、Ｔｉプラスミドは１９０ｋｂ以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学手法ではプラスミド上のＴ−ＤＮＡ上に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、Ｔ−ＤＮＡ上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。【００３７】  まず、腫瘍性のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系（ｄｉｓａｒｍｅｄ  ｓｔｒａｉｎｓ）であるＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０３，ｐ．１７９−１８０参照）、Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ３８５０）、ＧＶ３Ｔｉ１１ＳＥなどが作製された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に、あるいは所望の遺伝子を有するＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウムに導入する２種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中に、三系交雑法（ｔｒｉｐａｒ  ｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ）を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。【００３８】  もう一つは、バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）法とよばれるもので、Ｔ−ＤＮＡの植物への組み込みにｖｉｒ領域が必要であるが、機能するために同じプラスミド上に存在する必要はないという結果に基づいている。このｖｉｒ領域にはｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会社発行（１９８９）））、ｖｉｒ領域とはこのｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧの全てを含むものをいう。したがって、バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディスアーム型Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。【００３９】  アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入には、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２などがあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている。また、Ｒｉプラスミドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。【００４０】  アグロバクテリウムＡ２８１は、強病原性（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｔ）の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、Ａ２８１が有するＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２によるものである。ｐＴｉＢｏ５４２を用いて、これまでに２つの新しいシステムが開発されている。一つはｐＴｉＢｏ５４２のディスアーム型のＴｉプラスミドを有する菌系ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５を用いたものであり、これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。【００４１】  もう一つは、スーパーバイナリーベクター（‘ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ’  ｖｅｃｔｏｒ）（Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６，ｐ．２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０；Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｕｂｏ  Ｔ．，（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｉｎ  Ｖａｓｉｌ，Ｉ．Ｋ．（ｅｄ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒｅａｌ  ｃｒｏｐｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，ｐ．４３−８２；および国際公開第９５／０６７２２号パンフレットを参照）システムである（例：特開２０００−３４２２５６の図４）。このシステムは、ｖｉｒ領域（ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧ（以下、これらをぞれぞれ「ｖｉｒ断片領域」ということもある。））を持つディスアーム型のＴｉプラスミドおよびＴ−ＤＮＡを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、Ｔ−ＤＮＡを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターにｖｉｒ断片領域のうち、少なくとも一つのｖｉｒ断片領域を実質的に取除いたｖｉｒ領域の断片（このうち好ましくは少なくともｖｉｒＢまたはｖｉｒＧを含む断片、さらに好ましくはｖｉｒＢおよびｖｉｒＧを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡ領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる。【００４２】  本発明の方法においては、宿主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、Ａｇｒ��ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（例えば上述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０３，ｐ．１７９−１８０を参照））およびＥＨＡ１０１を好ましく用いることができる。【００４３】  本発明の方法によれば、アグロバクテリウム属細菌における病原性（ｖｉｒ）領域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく有意な効果を得ることができる。したがって、上述の中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれのベクターシステムに対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができる。これらのベクター類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、ｖｉｒ領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導入するなど）。また、本発明の方法によれば、野生型のアグロバクテリウム属細菌においても、植物へ野生型のＴ−ＤＮＡ領域の導入効率を高め、事実上感染効率を向上することができる。【００４４】  植物に導入しようとする所望の遺伝子は、上記プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若しくは別途組込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝子等の適当な選抜マーカーに基づいて選抜することができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望のＤＮＡをＴ−ＤＮＡ領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換えを利用することで目的のＤＮＡを導入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好ましくは約１００ｂｐないし２００ｋｂｐである。【００４５】  また、プラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法などが含まれる。【００４６】  植物に導入しようとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的にはＴ−ＤＮＡの左右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が３個以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中で、ＴｉまたはＲｉプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。【００４７】 工程ｃ）について
アグロバクテリウム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物材料をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、１０６〜１０１１細胞／ｍｌ程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物材料を３〜１０分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。【００４８】  好ましくは、植物材料をアグロバクテリウムに感染させると同時に、あるいは感染後、アグロバクテリウムを除去する前に、植物材料をアグロバクテリウムと共存培養させる。共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、実施例で使用したＬＳ−ＡＳ培地、ｎＮ６−Ａｓ培地、あるいはその他、Ｎ６Ｓ３−ＡＳ培地、２Ｎ６−ＡＳ培地（Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６，ｐ．２７１−２８２を参照）等の培地が知られている。【００４９】  本発明において、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる工程ｃ）の前または最中に、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からなる群から選択される、少なくとも１つの処理を植物材料に行ってもよい。これらの処理も、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入する方法において、遺伝子導入の効率を高めることが知られている。例えば、遠心処理については、文献（例えば、国際公開第０２／１２５２０号パンフレット；および、特開２０００−３４２２５６）に記載されており、好ましくは、１００Ｇないし２５万Ｇで１秒間ないし４時間、遠心することで行う。熱処理については、文献（例えば、特開２０００−３４２２５５）に記載されており、好ましくは、３３℃ないし６０℃の温度範囲で、５秒間ないし２４時間の熱処理を行う。さらに、超音波処理については、文献（例えば、Ｔｒｉｃｋ，Ｈ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆｉｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．，（１９９７），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，ｐ．３２９−３３６；および、Ａｍｏａｈ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．１１３５−１１４２）に記載されている。【００５０】  これらの加圧、加熱、遠心、および超音波等の処理はいずれか１つを行ってもよく、また複数組み合わせて行ってもよい。例えば、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．４２３−４３６，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．は、熱処理と遠心処理を組み合わせて行うことについて記載している。【００５１】 工程ｄ）およびｅ）について
さらに所望により、形質転換体を得るためには、上記工程ｃ）に次いで
ｄ）形質転換細胞を選抜する工程；および
ｅ）所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
が必要である。即ち、一般に植物の形質転換を行うためには、植物細胞に外来遺伝子を導入した後に、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれた植物細胞を選抜することが必要である。【００５２】  本発明では、工程ｄ）で形質転換細胞を選抜する工程、および／または、工程ｅ）で所望により選抜された形質転換体を再分化する工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いてもよい。【００５３】  形質転換された細胞を選抜する工程は、表現型のデータおよび／または物理的データにより、目的の形質を有する細胞を選抜することを意味する。【００５４】  表現型のデータは、例えば、形質転換効率は植物への導入を所望する遺伝子と共に、マーカー遺伝子および／または選抜マーカー遺伝子を導入してその発現を評価することで行うことで得ることができる。マーカー遺伝子および／または選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、および／または、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ＰＰＴ（フォスフィノスライシン）耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）など、を用いることができる。マーカー遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を用いた場合、形質転換効率の評価はＸ−ｇｕｌｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸）のＧＵＳによる切断に伴う発色から評価することができる。選抜マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、形質転換した後、抗生物質を加えた選抜培地上での成長の度合いから評価することができる。【００５５】  さらに、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれたことを確認するために、サザンブロット等の物理的データを得てもよい。また、有性生殖による子孫への伝達、並びに子孫集団への遺伝的および分子的分析に基づく選抜、の工程を行ってもよい。【００５６】  所望により選抜された形質転換体の再分化を行い、再分化個体を生育させ、そして完全な植物体を得てもよい。選抜した形質転換細胞から完全な植物体を再生するには、公知の方法（例えば、Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６，ｐ．２７１−２８２；および、Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０）により行うことができる。【００５７】  本発明の方法は、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と比較して、遺伝子導入効率および／または形質転換効率を向上させ、および／または再分化植物の生長を促進させる。遺伝子導入効率は、例えば、導入した遺伝子の一過性の発現の範囲を評価することにより行うことによって評価できる。後述の実施例では、未熟胚の胚盤でのＧＵＳ遺伝子の一過性の発現を１（スポット状の発現が散見）〜５（胚盤の全面で発現）の５段階の指数で評価した。あるいは、全体の発現量が低い場合には、全てのスポット数を数えることにより評価することもできる。【００５８】  形質転換効率は、例えば、接種した未熟胚から得られた再分化植物のうちＧＵＳ遺伝子の発現を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数で除すことによって算出できる。あるいは、再分化植物のうち、選抜圧に対して��抗性を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数で除することにより算出することもできる。【００５９】  再分化植物の生長促進は、例えば再分化植物の葉長、葉面積、および／または重量を、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と、金属塩の濃度を高めた培地を用いた場合とで比較することにより、評価することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、共存培地への硫酸銅の添加による、トウモロコシ（Ａ１８８）のＧＵＳ遺伝子の一過的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位の範囲を数値化した値であり、０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の範囲で数値化した。グラフの横軸に示す“Ｃｕ  ｘ”（ここで、ｘは数字を表す）は、共存培地中の硫酸銅濃度がｘμＭであることを示す。
【図２】図２は、共存培養後のトウモロコシ（Ｈ９９）のカルス形成に及ぼす、共存培地中の硫酸銅濃度の効果を示すグラフである。グラフの横軸における、“Ａｇ  ｘ”および“Ｃｕ  ｘ”（ここで、ｘは数字を表す）はそれぞれ、共存培地中の硝酸銀および硫酸銅の濃度がｘμＭであることを示す。
【図３】図３は、共存培養後のトウモロコシ（Ａ１８８）のフォスフィノスライシン（ＰＰＴ）抵抗性カルス形成に及ぼす、共存培地中の硫酸銅濃度の効果を示すグラフである。縦軸は、カルス形成を数値化した値であり、０（カルス形成なし）から３（胚盤全体がカルス化）の段階で数値化した。グラフの横軸に示す“Ｃｕ  ｘ”（ここで、ｘは数字を表す）は、共存培地中の硫酸銅濃度がｘμＭであることを示す。
【図４】図４は、共存培地への硫酸銅の添加による、イネ（ＩＲ６４）のＧＵＳ遺伝子の一過的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位の範囲を数値化した値であり、０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の範囲で数値化した。グラフの横軸に示す“Ｃｕ５”は、共存培地中の硫酸銅濃度が５μＭであることを示す。
【図５】図５は、共存培地へのグルコン酸銅の添加による、トウモロコシ（Ａ１８８）のＧＵＳ遺伝子の一過的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位の範囲を数値化した値であり、０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の範囲で数値化した。
【図６】図６は、共存培地へのグルコン酸銅の添加による、トウモロコシ（Ａ１８８）のカルス形成に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、カルス形成を数値化した値であり、０（カルス形成なし）から３（胚盤全体がカルス化）の段階で数値化した。
【図７】図７は、共存培地への硫酸銅あるいはグルコン酸銅の添加による、イネ（ゆきひかり）の未熟胚の増殖に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、カルス化した未熟胚の重量の１未熟胚あたりの平均値である。横軸の実験１、２、３はそれぞれ独立に行われた実験を示す。ｃｏｎｔ．は硫酸銅あるいはグルコン酸銅を含まない対照を、Ｃｕは硫酸銅を、ＣＧはグルコン酸銅をそれぞれ示す。ＣｕおよびＣＧの後の数値はそれぞれの共存培地中の濃度（μＭ）を示す。
【図８】図８は、再分化培地への硫酸銅あるいはグルコン酸銅の添加による、トウモロコシ（Ａ１８８）形質転換カルスから再分化した形質転換植物の生長に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、再分化した植物の葉長の平均値である。横軸ｃｏｎｔ．は硫酸銅あるいはグルコン酸銅を含まない対照を、Ｃｕは硫酸銅を、ＣＧはグルコン酸銅をそれぞれ示す。硫酸銅およびグルコン酸銅それぞれの共存培地中に１０μＭで添加した。
【図９】図９は、再分化培地への硫酸銅あるいはグルコン酸銅の添加による、イネ（ゆきひかり）形質転換カルスから再分化した形質転換植物の生長に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、再分化した植物の葉長の平均値である。横軸ｃｏｎｔ．は硫酸銅あるいはグルコン酸銅を含まない対照を、Ｃｕは硫酸銅を、ＣＧはグルコン酸銅をそれぞれ示す。硫酸銅およびグルコン酸銅それぞれの共存培地中に１０μＭで添加した。
【実施例】
【００６１】実施例１  共存培地への硫酸銅の添加がトウモロコシの形質転換に及ぼす効果
材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８、Ｈ９９）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／ｌ  ミオ−イノシトール、１ｇ／ｌ  カザミノ酸、１．５ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、６８．５ｇ／ｌ  シュークロース、３６ｇ／ｌ  グルコース、ｐＨ５．２；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０を参照）で１回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理）を一部の未熟胚で行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３１）（Ｔ−ＤＮＡ領域にカリフラワーモザイクウイルス  ３５ＳプロモーターでドライブされたＰＰＴ（フォスフィノスライシン）耐性遺伝子、およびカリフラワーモザイクウイルス  ３５Ｓプロモーターにヒマ  カタラーゼイントロンを結合したＧＵＳ遺伝子を有する；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０を参照）を懸濁し接種源とした。採取・洗浄した未熟胚および熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。５μＭ  ＡｇＮＯ３を含むＬＳ−ＡＳ培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／ｌ  ミオ−イノシトール、７００ｍｇ／ｌ  Ｌ−プロリン、１．５ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、２０ｇ／ｌ  シュークロース、１０ｇ／ｌ  グルコース、５００ｍｇ／ｌ  ＭＥＳ、１００μＭ  アセトシリンゴン、８ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ５．８；Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０を参照、固化剤は８ｇ／ｌアガロース）に０−１０μＭの濃度でＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。【００６２】  ２５℃、暗黒下で３日間培養した後、一部の未熟胚を０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを除去した後、１．０ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する組織の範囲を調査した。【００６３】  共存培地上で３日間培養した未熟胚をＬＳＤ１．５培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／ｌ  チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／ｌ  ミオ−イノシトール、７００ｍｇ／ｌ  Ｌ−プロリン、１．５ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、２０ｇ／ｌシュークロース、５００ｍｇ／ｌ  ＭＥＳ、８ｇ／ｌ寒天、ｐＨ５．８；Ｉ��ｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，ｐ．７４５−７５０を参照）に置床し、２５℃、暗黒下で約４週間培養した後、増殖したカルスの直径を測定した。また、共存培地上で７日間培養した未熟胚を５ｍｇ／ｌのフォスフィノスライシン（ＰＰＴ）を含むＬＳＤ１．５培地に置床し、２５℃、暗黒下で１週間培養した後、顕微鏡下で観察し、カルス形成の程度を調査した。さらにこれらのカルスを１０ｍｇ／ｌ  ＰＰＴを含む同培地で６週間、同条件で培養した。増殖したＰＰＴ抵抗性カルスをＬＳＺ再分化培地（ＬＳＤ１．５培地から２，４−Ｄを除き、５ｍｇ／ｌ  ゼアチンを添加）に置床し、２５℃、照明下で２〜３週間培養した。再分化した植物の葉片を切り取り、ＧＵＳ遺伝子の発現をＸ−ｇｌｕｃにより調査した。【００６４】 結果
各種共存培地で３日間培養した未熟胚（品種Ａ１８８）をＸ−ｇｌｕｃにより染色し、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位（青色を呈する部位）の範囲を０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の５段階で評価した。【００６５】  １、５および１０μＭの硫酸銅を含む共存培地で３日間培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚に比べ胚盤の広い範囲でＧＵＳ遺伝子の一過的な発現を示した。共存培地に硫酸銅を添加することによるＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す範囲の増大は熱・遠心の前処理の有無に関わらず認められた（図１）。これらのことから、共存培地に硫酸銅を添加することにより遺伝子導入効率が高まることが明らかとなった。【００６６】  各種の共存培地で３日間培養を行った未熟胚（品種Ｈ９９）を選抜圧を含まない培地で約４週間培養した後、形成されたカルスの直径を調査した。５μＭ  硝酸銀を含む共存培地で培養した未熟胚は対照の培地で培養したものとほぼ同様のカルス増殖を示した。これに対し、１０μＭ  硫酸銅および５μＭ  硝酸銀を添加した共存培地で培養した未熟胚は直径の平均が対照の共存培地で培養した未熟胚に比べ２ｍｍ以上も大きく、硫酸銅の添加によりカルスの増殖が促進することが示された（図２）。【００６７】  １週間の共存培養後、ＰＰＴを含む選抜培地で１週間培養した未熟胚（品種Ａ１８８）から増殖したカルスを０（カルス形成なし）から３（胚盤全体がカルス化）の４段階で評価した。硫酸銅を添加した培地で培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚に比べ高いカルス形成を示し、硫酸銅の添加により形質転換カルス形成の効率が向上することが明らかとなった（図３）。さらにＰＰＴを含む培地で選抜を行い得られたカルスをＰＰＴを含む再分化培地で培養することによりＰＰＴ抵抗性植物を得た。これらの植物の葉片を切り取り、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。その結果、５および１０μＭ  硫酸銅を含む共存培地で培養した未熟胚では硫酸銅を含まない共存培地で培養した未熟胚に比べ２〜３倍の高い形質転換効率を示した（表１）。【００６８】
【表１】
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以上のように共存培地への硫酸銅の添加はアグロバクテリウムによる遺伝子導入効率を高め、カルス形成および増殖を促進し、形質転換効率を向上させる効果のあることが示された。
実施例２  共存培地への硫酸銅の添加がイネへの遺伝子導入に及ぼす効果
材料および方法
５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンおよび５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＡＢ培地（３ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、３００ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ２、２．５ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌ  グルコース、１５ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ７．０；Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ．−Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９７４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７１：３６７２−３６７６）上で３〜４日間培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓスーパーバイナリーベクター  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）（Ｔ−ＤＮＡ領域にトウモロコシユビキチンプロモーターでドライブされたユビキチンイントロンを結合したＨＰＴ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターでドライブされたヒマカタラーゼイントロンを結合したＧＵＳ遺伝子を有する；ｐＳＢ１３４の作成はｐＫＹ２０５（ＷＯ  ０３／０２７２９０を参照）に発現マーカーとしてｐＳＢ３２由来の３５Ｓ−ｉｎｔｒｏｎ  ＧＵＳ−ｎｏｓ断片をＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより行った）を白金耳でかきとり、約１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で１００μＭアセトシリンゴンを含むＡＡ１液体培地（ＡＡ主要無機塩、ＬＳ微量無機塩、ＭＳビタミン、ＡＡアミノ酸、０．２ｇ／ｌカザミノ酸、４ｇ／ｌシュークロース、２ｇ／ｌグルコース、ｐＨ５．２）１ｍｌに懸濁した。無菌的に採取した未熟胚（品種ＩＲ６４）を入れたエッペンドルフチューブにアグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを加え、３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、室温で５分間静置した。未熟胚をｎＮ６−Ａｓ培地（Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン、０．５ｇ／ｌカザミノ酸、０．５ｇ／ｌ  Ｌ−プロリン、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ  ６ＢＡ、２０ｇ／ｌシュークロース、１０ｇ／ｌグルコース、１０μＭ  ＡｇＮＯ３、１００μＭアセトシリンゴン、８ｇ／ｌアガロース、ｐＨ５．２）および５μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを含むｎＮ６−Ａｓ培地に置床し、暗黒下、２５℃で１週間培養した。【００６９】 結果
共存培養後の未熟胚をＸ−ｇｌｕｃにより染色し、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位（青色を呈する部位）の範囲を０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の５段階で評価した。【００７０】  ５μＭの硫酸銅を含む共存培地で１週間培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚に比べ胚盤の広い範囲でＧＵＳ遺伝子の一過的な発現を示した（図４）。このことから、共存培地への硫酸銅の添加による遺伝子導入効率の向上はトウモロコシだけでなく、イネにおいてもみられることが明らかとなった。
実施例３  共存培地へのグルコン酸銅の添加がトウモロコシへの遺伝子導入に及ぼす効果
材料および方法
受粉後７から１４日目のトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）を無菌的に採取し、ＬＳ−ｉｎｆ液体培地で１回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（４６℃、３分間の熱処理および１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理）を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＳ−ｉｎｆ液体培地に約１．０ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３１）を懸濁し接種源とした。熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、３０秒間撹拌した後、５分間室温で静置した。５μＭ  ＡｇＮＯ３を含むＬＳ−ＡＳ培地に０−１０μＭの濃度でグルコン酸銅を添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。【００７１】  ２５℃、暗黒下で３日間培養した後、一部の未熟胚を０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを除去した後、１．０ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する組織の範囲を調査した。【００７２】  また、共存培地上で７日間培養した未熟胚におけるカルス形成を０（カルス形成なし）、１（胚盤の一部がカルス化）、２（胚盤の約半分がカルス化）、３（胚盤の３／４以上がカルス化）の指数で評価した。【００７３】 結果
各種共存培地で３日間培養した未熟胚（品種Ａ１８８）をＸ−ｇｌｕｃにより染色し、ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を示す部位（青色を呈する部位）の範囲を０（無発現）から４（胚盤のほぼ全面で発現）の５段階で評価した。１、５および１０μＭのグルコン酸銅を含む共存培地で３日間培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚に比べ胚盤の広い範囲でＧＵＳ遺伝子の一過的な発現を示した（図５）。【００７４】  共存培地で１週間培養した未熟胚のカルス形成を調査した。１、５および１０μＭのグルコン酸銅を含む共存培地で培養した未熟胚はいずれもグルコン酸銅を含まない培地で共存培養した未熟胚に比べ高いカルス形成を示した。特に５および１０μＭのグルコン酸銅を含む共存培地では対照に比べ有意に高いカルス形成を示した（図６）。【００７５】  これらのことから、共存培地にグルコン酸銅を添加することにより硫酸銅を添加した時と同様に遺伝子導入効率及びカルス形成率が高まることが明らかとなった。
実施例４  接種源液体培地への硫酸銅およびグルコン酸銅の添加がイネへの遺伝子導入に及ぼす効果
材料および方法
５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンおよび５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むＡＢ培地上で３〜４日間培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓスーパーバイナリーベクター  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）を白金耳でかきとり、約１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で１００μＭアセトシリンゴンおよび０〜５０μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏあるいはグルコン酸銅を含むＡＡ１液体培地１ｍｌに懸濁した。無菌的に採取した未熟胚（品種ゆきひかり）を入れたエッペンドルフチューブにアグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを加え、３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、室温で５分間静置した。未熟胚をｎＮ６−Ａｓ培地に置床し、暗黒下、２５℃で１週間培養した。【００７６】 結果
共存培養後の未熟胚の重量を測定した。３回の試験を行ったが、いずれの試験においても接種源液体培地に硫酸銅あるいはグルコン酸銅を加えた場合、無添加の対照の未熟胚に比べ、旺盛な増殖を示した（図７）。このことから、硫酸銅およびグルコン酸銅の添加によるカルス増殖の促進は共存培地だけでなく接種源の液体培地に添加した時にも同様にみられることが明らかとなった。
実施例５  再分化培地への硫酸銅、グルコン酸銅の添加がトウモロコシ形質転換植物の生育に及ぼす効果
材料および方法
トウモロコシ（品種：Ａ１８８）の未熟胚（大きさ１．０−１．５ｍｍ）にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３１）を接種し、ＰＰＴを含むＬＳＤ１．５培地で培養することにより形質転換カルスを得た。形質転換カルスを約２ｍｍの大きさに刻み１０μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏあるいはグルコン酸銅、およびＰＰＴを含むＬＳＺ再分化培地に置床した。照明下、２５℃で３週間培養し、再分化した植物の葉長を測定した。【００７７】 結果
硫酸銅あるいはグルコン酸銅含む再分化培地で再分化した植物の葉長は対照の再分化培地で再分化した植物に比べ有意に長く、硫酸銅あるいはグルコン酸銅に再分化植物の生長を促進する効果のあることが示された（図８）。
実施例６  再分化培地への硫酸銅、グルコン酸銅の添加がイネ形質転換植物の生育に及ぼす効果
材料および方法
イネ（品種：ゆきひかり）の未熟胚にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）を接種し、ハイグロマイシンを含むｎＮ６ＣＣ培地（Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン、０．５ｇ／ｌカザミノ酸、０．５ｇ／ｌ  Ｌ−プロリン、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ  ６ＢＡ、２０ｇ／ｌ  シュークロース、５５ｇ／ｌ  ソルビトール、２５０ｍｇ／ｌ  セフォタキシム、２５０ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、５ｇ／ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８）で培養することにより形質転換カルスを得た。形質転換カルスを約２ｍｍの大きさに刻み１０μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏあるいはグルコン酸銅、およびハイグロマイシンを含むＮ６Ｒ再分化培地（主要無機塩を１／２に減じたＮ６無機塩、Ｎ６ビタミン、ＡＡアミノ酸、１ｇ／ｌカザミノ酸、０．５ｍｇ／ｌ  カイネチン、２０ｇ／ｌ  シュークロース、３０ｇ／ｌ  ソルビトール、４ｇ／ｌ  ゲルライト、ｐＨ５．８）に置床した。照明下、２５℃で３週間培養し、再分化した植物の葉長を測定した。【００７８】 結果
硫酸銅あるいはグルコン酸銅含む再分化培地で再分化した植物の葉長は対照の再分化培地で再分化した植物に比べ有意に長く、硫酸銅あるいはグルコン酸銅に再分化植物の生長を促進する効果のあることがイネにおいても示された（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００７９】  本発明は、従来のアグロバクテリウム法よりもより高い効率で遺伝子導入のなされる安価で簡便な方法を開発する。また、従来のアグロバクテリウム法では遺伝子導入が困難とされていた植物種および品種にも適応できる方法を提供する。本発明の方法は、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と比較して、遺伝子導入効率および／または形質転換効率を向上させ、および／または再分化植物の生長を促進させる。【００８０】  図１に示したように、硫酸銅を高濃度含む共存培地を用いることにより、単子葉植物であるトウモロコシについての遺伝子導入効率が、硫酸銅を含まない培地を用いたときと比較して２倍ないし２．５倍に向上した。また、さらに加熱・遠心処理を加えることで、遺伝子導入効率は硫酸銅を含まない培地および未処理の植物材料を用いたときと比較して１．５倍ないし３倍に向上した。【００８１】  本発明により、植物のアグロバクテリウム法による遺伝子導入効率が向上したことから、多数の形質転換植物を効率よく得ることができ、実用遺伝子を導入した品種の育成を効率よく、容易にするのに貢献する。特に、単子葉植物、なかでもトウモロコシは従来のアグロバクテリウム法では形質転換効率が低かったため、本発明の方法により形質転換効率が向上したことの意義は大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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