(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターフェロンγ生産のための、ヒトインターフェロンγを産生するハムスター由来の遺伝子組み換えＣＨＯ細胞 ＨＩＩＦ−Ｄ（ＡＴＣＣのＣＲＬ−８２００）培養用培地の添加剤であって、ホスファチジン酸及びツイーン８０からなることを特徴とするヒトインターフェロンγ生産量増加用添加剤。
【請求項２】
細胞培養用培地が、無血清培地である請求項１ 記載の添加剤。
【請求項３】
ホスファチジン酸及びツイーン８０からなる添加剤を加えた細胞培養用培地に、ヒトインターフェロンγを産生するハムスター由来の遺伝子組み換えＣＨＯ細胞 ＨＩＩＦ−Ｄ（ＡＴＣＣのＣＲＬ−８２００）を播種し、細胞を増殖させながらヒトインターフェロンγを生産させることを特徴とする、ヒトインターフェロンγの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用物質生産量増加用添加剤に関する。さらに詳しくは、細胞培養用培地への添加剤であって、有用物質の生産量増加用の添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、培地中にリン脂質をノニオン界面活性剤で分散させて添加することによって、遺伝子組換えしていない細胞の増殖性が促進されることが研究発表されている［坂井，林，山地，福田、ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング（Journal of Bioscience and Bioengineering）92,2001年、256-261頁）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記研究発表において、我々はノニオン界面活性剤を用いて分散させたリン脂質が細胞増殖を促進することを示したが、今回の我々の研究では、ノニオン界面活性剤のうち、環状構造をもたない界面活性剤を使用しても有用物質の生産量は殆ど増加しないことが明らかとなった。
すなわち、本発明は、有用物質の生産量を増加させるための添加剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、複合脂質と特定構造の界面活性剤の組合せが有用物質の生産量を増加させることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明のヒトインターフェロンγ生産量増加用添加剤の特徴は、ヒトインターフェロンγ生産のための、ヒトインターフェロンγを産生するハムスター由来の遺伝子組み換えＣＨＯ細胞 ＨＩＩＦ−Ｄ（ＡＴＣＣのＣＲＬ−８２００）培養用培地の添加剤であって、ホスファチジン酸及びツイーン８０からなる点にある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において、複合脂質としては、リン脂質、糖脂質、Ｎ−アシルスフィンゴシン及びスフィンゴシン−１−リン酸等が使用できる。
リン脂質としては、ホスファチジン酸類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、スフィンゴミエリン類、リゾホスファチジン酸類、リゾホスファチジルコリン類、リゾホスファチジルセリン類、リゾホスファチジルイノシトール類、グリセロホスフォリルコリン類及びレシチン類等が用いられる。
【０００６】
リン脂質は、大豆、小麦、卵黄、動物（ウシ等）及び大腸菌等の天然物に由来のもの、天然物を水素化して不飽和結合部分を飽和にしたもの、並びに化学合成のもののいずれも使用できる。
これらリン脂質のグリセロールの２位又は３位の置換基は、天然のものはその由来によって種々変化し特定されない。化学合成の場合、この置換基は、水酸基、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和のアシル基又はアルキル基等である。なお、２位又は３位の置換基は同じものであっても異なるものであってもよい。
アシル基又はアルキル基の炭素数は、６〜２０が好ましく、さらに好ましくは１０〜１８である。
【０００７】
アシル基としては、例えば、アセチル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、アラキドイル基、アラキドノイル基、リノレオイル基、オクタデシエノイル基及びオレオイル基等が挙げられる。
アルキル基としては、メチル基、ヘキサデシル基、ブチル基、ヘキキル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、アラキドイル基、リノレイル基、オクタデシルジエニル基及びオレオイル基等が挙げられる。
【０００８】
ホスファチジン酸類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、リゾホスファチジン酸類、リゾホスファチジルセリン類及びリゾホスファチジルイノシトール類は、アルカリ金属塩であることが好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩であることである。
ホスファチジン酸類としては、例えば、鶏卵黄身由来のホスファチジン酸ナトリウム、β−アラキドノイル−γ−ステアロイルホスファチジン酸ナトリウム、ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジオレイルホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸ナトリウム及びジオレオイルホスファチジン酸ナトリウム等が挙げられる。
【０００９】
ホスファチジルコリン類としては、鶏卵黄身由来ホスファチジルコリンの水素添加物、β−アセチル−γ−ヘキサデシルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジイリノレオイルホスファチジルコリン、ジ−トランス−２，トランス−４−オクタデカジエノイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、β−メチル−γ−ヘキサデシルホスファチジルコリン及びβ−オレオイル−γ−パルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
【００１０】
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ウシ脳由来のＩ型ホスファチジルエタノールアミン、大腸菌由来のＶ型ホスファチジルエタノールアミン、鶏卵黄身由来のホスファチジルエタノールアミン、大豆由来のホスファチジルエタノールアミン及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロール類としては、ホスファチジルグリセロールナトリウム、ホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンナトリウム及びウシ心臓由来のカルジオリピン２ナトリウム等が挙げられる。
【００１１】
ホスファチジルセリン類としては、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンナトリウム及びウシ脳由来のホスファチジルセリンナトリウム等が挙げられる。
ホスファチジルイノシトール類としては、小麦由来のホスファチジルイノシトールナトリウム等が挙げられる。
スフィンゴミエリン類としては、ウシ脳由来のスフィンゴミレリン等が挙げられる。
リゾホスファチジン酸類としては、オレイルリゾホスファチジン酸ナトリウム及びステアリルリゾホスファチジン酸等が挙げられる。
【００１２】
リゾホスファチジルコリン類としては、鶏卵黄身由来のリゾホスファチジルコリン、デカノイルリゾホスファチジルコリン及びステアロイルリゾホスファチジルコリン等が挙げられる。
リゾホスファチジルセリン類としては、ウシ脳由来のリゾホスファチジルセリン２ナトリウム等が挙げられる。
リゾホスファチジルイノシトール類としては、大豆由来のリゾホスファチジルイノシトールナトリウム等が挙げられる。
グリセロホスフォリルコリン類としては、鶏卵黄身由来のグリセロホスフォリルコリン二塩化カドミウム等が挙げられる。
レシチン類としては、鶏卵レシチン、大豆レシチン及び大豆由来のアソレシチン等が挙げられる。
【００１３】
糖脂質としては、アシアロガングリオシド、ガングリオシド、シアリルルイス、シアリルラクトテトラオシルセラミド、シアリルネオラクトテトラオシルセラミド、ガラクロシルセラミド、グロボテトラシルセラミド、グルコセレブロシド、グルコシルセラミ及びラクロシルセラミド等が挙げられる。
【００１４】
Ｎ−アシルスフィンゴシンとしては、ウシ脳由来のＮ−アシルスフィンゴシン、Ｎ−アセチルスフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチススフィンゴシン、Ｎ−エイコサノイルスフィンゴシン、Ｎ−パルミトイルヒヒドロスフィンゴシン及びＮ−テトラコサノイルスフィンゴシン等が挙げられる。
これらの複合脂質は、２種以上の混合物として使用してもよい。
これらのうち、リン脂質、糖脂質及びスフィンゴ−１−リン酸が好ましく、さらに好ましくはリン脂質及びスフィンゴ−１−リン酸、特に好ましくはホスファチジン酸類、リゾホスファチジン酸類及びスフィンゴ−１−リン酸、より特に好ましくはホスファチジン酸類及びリゾホスファチジン酸類、最も好ましくは鶏卵黄身由来のホスファチジン酸類である。
【００１５】
複合脂質の含有量は、複合脂質及び環状構造含有界面活性剤の合計重量に基づいて、０．１重量％以上が好ましく、さらに好ましくは１重量％以上、特に好ましくは１０重量％以上、最も好ましくは３０重量％以上であり、また、９９．９重量％以下が好ましく、さらに好ましくは９９重量％以下、特に好ましくは９８重量％以下、最も好ましくは９７重量％以下である。
【００１６】
環状構造含有界面活性剤としては環状構造を有する界面活性剤であればアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン界面活性剤のいずれも使用できる。
環状構造としては、環状炭化水素構造及びヘテロ環状炭化水素構造のいずれでもよい。
環状構造含有界面活性剤は、複合脂質を培地に可溶化又は分散させることを補助する役割を果たす。
【００１７】
環状構造を有するアニオン界面活性剤としては、胆汁酸塩、炭素数１２〜２４のアルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数１６〜３４のアルキルナフタレンスルホン酸塩、炭素数１８〜３６のアルキルフェノキシベンゼンスルホン酸塩等が用いられる。
胆汁酸塩としては、ケノデオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸カリウム、デオキシコール酸リチウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、グリコリソコール酸ナトリウム、ハイオデオキシコール酸ナトリウム、リソコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウログリココール酸ナトリウム及びタウロリソコール酸ナトリウム等が挙げられる。なお、これらの塩の対イオンは、リチウムイオン、ナトリウムイオン又はカリウムイオンと例示したが、これらに限定されるものではなく、それぞれ他のアルカリ金属（リチウム、ナトリウム及びカリウム等）イオン、アルカリ土類金属（マグネシウム及びカルシウム等）イオン、アンモニウムイオン、又は炭素数１〜８のアルキルアンモニウム（メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、エチルアンモニウム及びトリスヒドロキシエチルアンモニウム等）イオンであってもよい（以下同じである）。
【００１８】
炭素数１２〜２４のアルキルベンゼンスルホン酸塩としては、例えば、ヘキシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、オクタデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム及びジノニルベンゼンスルホン酸カリウム等が挙げられる。
炭素数１６〜３４のアルキルナフタレンスルホン酸の塩としては、例えば、ヘキシルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウム及びジドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。
炭素数１８〜３６のアルキルジフェニルエーテルスルホン酸の塩としては、ヘキシルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム及びジドデシルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００１９】
これらのうち、胆汁酸塩が好ましく、さらに好ましくはデオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩及びグリコケノデオキシコール酸塩、特に好ましくはデオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩、グリコケノデオキシコール酸塩、ハイオデオキシコール酸塩及びタウロデオキシコール酸塩、最も好ましくはデオキシコール酸塩である。
【００２０】
環状構造を有するカチオン界面活性剤としては、イミダゾリン型カチオン界面活性剤等が使用できる。
イミダゾリン型界面活性剤としては、炭素数１１〜２４のアルケニルヒドロキシエチルイミダゾリン（例えば、ヘキセニルヒドロキシエチルイミダゾリン、ヘプタデセニルヒドロキシエチルイミダゾリン及びエイコセニルヒドロキシエチルイミダゾリン等）が挙げられる。
【００２１】
環状構造を有するノニオン界面活性剤としては、例えば、アルキルフェノール（炭素数１４〜２４）のエチレンオキシド付加物、炭素数１２〜６０のソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（炭素数１２〜６０）のエチレンオキシド付加物、ソルバイト脂肪酸エステル（炭素数１２〜４２）のエチレンオキシド付加物、炭素数１８〜３２の砂糖又はショ糖の脂肪酸エステル及び胆汁酸のエチレンオキシド付加物等が用いられる。
【００２２】
アルキルフェノール（炭素数１４〜２４）のエチレンオキシド付加物としては、例えば、ヘキシルフェノールエチレンオキシド６モル付加物、ドデシルフェノールエチレンオキシド４０モル付加物フェノール及びオクタデシルフェノールエチレンオキシド６０モル付加物等が挙げられる。
炭素数１２〜６０のソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ソルビタンヘキサン酸モノエステル、ソルビタンラウリン酸モノエステル、ソルビタンオレイン酸モノエステル及びソルビタンオレイン酸トリエステル等が挙げられる。
ソルビタン脂肪酸エステル（炭素数１２〜６０）のエチレンオキシド付加物としては、上記ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキシド１０モル付加物及び同じく２０モル付加物等が挙げられる。
【００２３】
ソルバイト脂肪酸エステル（炭素数１２〜４２）のエチレンオキシド付加物としては、例えば、ソルバイトヘキサン酸モノエステルのエチレンオキシド１０モル付加物、ソルバイトラウリン酸モノエステルのエチレンオキシド２０モル付加物及びソルバイトオレイン酸ジエステルのエチレンオキシド３０モル付加物等が挙げられる。
炭素数１８〜３２の砂糖又はショ糖の脂肪酸エステルとしては、砂糖ヘキサン酸モノエステル、ショ糖オレイン酸モノエステル及び砂糖ラウリン酸トリエステル等が挙げられる。
胆汁酸のエチレンオキシド付加物としては、前記胆汁酸のエチレンオキシド１０モル付加物及び同じく２０モル付加物等が挙げられる。
【００２４】
これらの環状構造含有界面活性剤は、２種以上の混合物として使用してもよい。
これらのうち、アニオン界面活性剤及びノニオン界面活性剤が好ましく、さらに好ましくはアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物、ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物、ソルバイト脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物、砂糖又はショ糖の脂肪酸エステル及び胆汁酸塩、特に好ましくはソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物、砂糖又はショ糖脂肪酸エステル及び胆汁酸塩、より好ましくはソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物及び砂糖又はショ糖の脂肪酸エステル、よりさらに好ましくはソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物（商品名：ツイーン８５、ツイーン８０及びツイーン６０）、最も好ましくは商品名：ツイーン８０である。
【００２５】
環状構造含有界面活性剤の含有量は、複合脂質及び環状構造含有界面活性剤の合計重量に基づいて、０．１重量％以上が好ましく、さらに好ましくは１重量％以上、特に好ましくは２重量％以上、最も好ましくは３重量％以上であり、また、９９．９重量％以下が好ましく、さらに好ましくは９９重量％以下、特に好ましくは９０重量％以下、最も好ましくは７０重量％以下である。
【００２６】
本発明の添加剤には、複合脂質及び環状構造含有界面活性剤以外に、その他の界面活性剤及び培地の栄養源等を含有させることができる。
その他の界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン界面活性剤が使用できる。
アニオン界面活性剤としては、カルボン酸塩（カプリン酸ナトリウム、ヤシ油ナトリウム等）、硫酸エステル塩（オクチルアルコール硫酸エステルナトリウム、ステアリルアルコール硫酸エステル塩等）、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩（ラウリルアルコールエチレンオキサイド２モル付加物硫酸エステルナトリウム等）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）、スルホコハク酸ジエステル型（スルホコハク酸ジ−２−エチルヘキシルエステルナトリウム等）、高級アルコールリン酸エステル塩（ラウリルアルコールリン酸モノエステルジナトリウム、ラウリルアルコールリン酸ジエステルナトリウム等）及び高級アルコールエチレンオキサイド付加物リン酸エステル塩（オレイルアルコールエチレンオキサイド５モル付加物リン酸モノエステルジナトリウム等）等が挙げられる。
【００２７】
カチオン界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤（ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド等）及びアミン塩型界面活性剤（ラウリルアミン塩酸塩、トリエタノールアミンモノステアレー塩酸塩等）等が挙げられる。
【００２８】
ノニオン界面活性剤としては、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル［ポリエチレングリコール（分子量＝２００）ラウリン酸モノエステル等］、アルコールのエチレンオキシド付加物（オレイルアルコールエチレンオキシド２５モル付加物、ノニルフェノールエチレンオキシド４０モル付加物等）、ポリプロピレングリコールのエチレンオキシド付加物［ポリプロピレングリコール（分子量＝９５０）のエチレンオキシド２.４モル付加物等］及び３価以上のアルコールの脂肪酸エステルのエチレンオキシド付加物（グリセリンモノステアリン酸エステルエチレンオキシド２０モル付加物等）等が挙げられる。
培地の栄養源としては、通常の培養に使用する、糖、アミノ酸、核酸関連物質、ビタミン、微量元素及びプロテア−ゼ阻害剤等が用いられる。
【００２９】
本発明における有用物質としては特に制限はないが、遺伝子非組換え細胞、遺伝子組換え細胞又はウィルス感染細胞が産生する物質（タンパク質等）又はウィルスであって、医薬品、ワクチン、臨床検査又は生化学等の研究用に使用され得る物質である。
このような物質又はウィルスとしては、例えば、サイトカイン［インターフェロン（インターフェロン-α、インターフェロン−β及びインターフェロン−γ等）、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン（インターロイキン-２、インターロイキン１１及びインターロイキン１２等）、腫瘍壊死因子、マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、脳由来神経栄養因子、インスリン様成長因子、アルブミン、繊維芽細胞成長因子及びテデルジン等］、酵素類［血栓溶解剤（ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ及びプロウロキナーゼ等）、β-ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ及び各種抗生物質等］、ホルモン（ヒト成長ホルモン、インスリン、グルカゴン及び利尿ポリペプチド等）、ワクチン（Ｂ型肝炎ウィルスワクチン及びインフルエンザウィルスワクチン等）、モノクロナル抗体（抗ヒトＴＮＦキメラ型モノクロナル抗体、ＯＫＴ−３、抗血小板モノクロナル抗体及び抗がんモノクロナル抗体等）及び血液凝固因子（血液凝固第ＩＶ因子等）等の他、ワクチンの原料となるウィルス類（Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ハシカウィルス、ポリオウィルス及び風疹ウィルス等）及びウィルスを構成するタンパク質が挙げられる。
【００３０】
これらは、天然の細胞から得られたものでも、遺伝子組換え細胞から得られたものでもよいが、遺伝子組換え細胞から得られたものが好ましい。
これらのうち、サイトカイン及び酵素が好ましく、さらに好ましくはインターフェロン、エリスロポエチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター及びガラクトシダーゼ、特に好ましくインターフェロン及びガラクトシダーゼである。
【００３１】
本発明に適用できる細胞としては、有用物質を産生する細胞であれば特に制限はなく、遺伝子組換えされていない細胞及び遺伝子組換えされた細胞のいずれも使用できる。
遺伝子組換えされていない細胞としては、哺乳類由来細胞｛ハムスター由来細胞（ＣＨＯ及びＢＨＫ等）、マウス由来細胞（３Ｔ３，Ｌ９２９，ＭＰＣ−１１，Ｐ３Ｘ６３，Ｓｐ２／０及びＮＳ０等）、ラット由来細胞（ヤンセンサルコーマ及びＭＨ１Ｃ１等）、サル由来細胞（Ｖｅｒｏ及びＣＯＳ等）、イヌ由来細胞（ＭＤＣＫ等）及びヒト由来の細胞（チャングリバー，ダウディ，ＨＥＫ−２９３，Ｈｅｌａ，ＨｅｐＧ２，Ｋ−５６２，ナマルヴァ及びＷＩ３８等）｝、昆虫由来細胞｛ヤガ由来細胞（Ｓｆ９，Ｓｆ２１，ＴＮ−３６８及びＢＴ−ＴＮ−５Ｂ１−４等）、カイコ由来細胞（Ｂｍ，Ｂｍ５，ＢｍＮ，ＢｍＮ４及びＢｏＭｏ等）及びショウジョウバエ由来細胞（シュナイダー２等）、並びに魚類由来細胞｛コイ由来細胞 (EPC 等)、ファットヘッドミソウ由来細胞 (FHM 等)、ブルーギル由来細胞 (BF-2 等)、ニジマス由来細胞(RTG-2 等)及びマスノスケ由来細胞 (CHSE-214 等)｝ 等が挙げられる。
【００３２】
これら株化された細胞のほかに、動物組織から分離した初代細胞やこれらを継代したもの（幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、実質細胞、繊維芽細胞、リンパ球系細胞及び角質細胞等）等が挙げられる。
また、遺伝子組換えされた細胞としては、インターフェロン産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ−８２００，ＣＲＬ-８０３１，ＣＲＬ−１４２７，ＣＲＬ−８０６６及びＣＲＬ−１１３８６等）、インターロイキン産生細胞（ＡＴＣＣのＣＤＬ−８１６３，ＣＲＬ-１９９０，ＣＲＬ−８１３１，ＣＲＬ−８１２９及びＣＲＬ−８６２９等）、アルブミン産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ-１０７４１およびＣＲＬ−１９９５等）、インスリン産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ−１７７７，ＣＲＬ−２０５５，ＣＲＬ−２０５８及びＣＲＬ−２０５７等）、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーター産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ−９６０６，ＣＲＬ−９４４６，ＣＲＬ−１３９２及びＣＲＬ−１７１５等）、β-ガラクトシダーゼ産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ−９５６０等）、及びＢ型肝炎ウィルス抗体産生細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ−８３９９等）等の他に、大日本製薬（株）のカタログや、ＡＴＣＣの細胞リストに記載されている細胞並びに前記株化された細胞に遺伝子組換えキット等を用いて遺伝子組換えした細胞等が挙げられる。
【００３３】
これらのうち、哺乳類由来細胞及び昆虫由来細胞が好ましく、さらに好ましくはハムスター由来細胞、サル由来細胞、ヒト由来細胞、ヤガ由来細胞及びカイコ由来細胞、特に好ましくはハムスター由来細胞及びヤガ由来細胞である。
【００３４】
本発明の添加剤を添加できる培地としては、従来から知られている動物細胞培養用の基本培地、基本培地に血清（牛胎児血清、仔ウシ血清、ウマ胎児血清等）を０．１〜２０重量％含有した血清培地、及び日水製薬（株）、味の素（株）又はインビトロジェン社等から市販されている無血清培地等のいずれも用いることができる。
基本培地としては、例えば、イ−グル最小必須培地、ダルベッコ変法イ−グル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地及びハムＦ−１２培地等が挙げられる。これらの基本培地は複数種を適当な割合で混合したり、インスリンやトランスフェリン、セレニウム、アルブミン等の培地添加物や各種抗生物質を添加して使用することもできる。
これらのうち、血清を含まない培地、すなわち無血清培地が好ましい。
【００３５】
本発明の添加剤を培地に添加する方法としては特に制限はなく、培地に、撹拌下で添加剤を添加する方法、無撹拌下で添加剤を添加する方法、及び添加後に超音波分散機や乳化機を用いて微分散させる方法等が適用できる。
本発明の添加剤の添加量は、培地の単位容量に基づいて、０．０１ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上、最も好ましくは５ｍｇ／Ｌ以上であり、また、１０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは３０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００３６】
有用物質を生産するための有用物質生産細胞の培養方法は特に限定されるものではなく、通常の細胞培養の方法で行うことができる。例えば、マルチウエルプレ−ト、ペトリ皿、組織培養用フラスコ、ロ−ラ−ボトル、スピナ−フラスコ、ジャ−ファ−メンタ−や、マイクロキャリヤ−、ホロ−ファイバ−などを用い、本発明の添加剤を加えた培地に細胞の適当量を播種し、細胞を増殖させながら生理活性物質を生産させる方法等が挙げられる。
本発明の添加剤を培地に添加することによって、細胞の増殖性が増加するとともに、細胞１個当りの生理活性物質の産生量も増加するため、生理活性物質を効率的に大量生産することができる。
【００３７】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の記載において、実施例３は、参考例１である。
【００３８】
＜実施例１＞
ホスファチジン酸（ＰＡ）（卵黄レシチン由来；シグマ社製）を１ｇ／Ｌ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイト（商品名；ツイーン８０、シグマ社製）を０.１ｇ／Ｌとなるように、（ＰＡ）及びツイーン８０をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）に加えたものを超音波処理して懸濁させ、ＰＡ分散液Ａを得た。
市販無血清培地ＵＣ２１２（日水製薬（株）製）１５.４ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム２．０ｇ／Ｌ、メトトレキサート２５０ｎＭ、カナマイシンスルフェート０．１ｇ／Ｌ、インスリン１０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン５．５ｍｇ／Ｌ、エタノールアミン２ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム６．７μｇ／Ｌ及びフィブロネクチン（牛血漿由来；シグマ社製）１０ｍｇ／Ｌの割合で、それぞれを蒸留水１リットルに配合・溶解して、無血清培地Ａを得た。
ホスファチジン酸濃度が１０ｍｇ／ＬになるようにＰＡ分散液Ａを無血清培地Ａに加えたもの５ｍＬを直径６０ｍｍの細胞培養用ディッシュに加えた。
次いで、このディッシュにヒトインターフェロンγを産生するハムスター由来の遺伝子組換えＣＨＯ細胞（ＨＩＩＦ−Ｄ）；ＡＴＣＣのＣＲＬ−８２００）を２万個／ｍＬで播種した後、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素／空気＝５／９５体積比）中で、３７℃で３日間細胞培養を行なった。
【００３９】
培地中のヒトインターフェロンγの濃度（ｈＩＦＮ濃度）を、ウサギ抗ヒトインターフェロンγ抗体（ペプロテック社製）を用いて、酵素免疫測定法で測定し、その結果を表１に示す。
また、培地を除いたディッシュをトリプシンで処理し、血球計数盤で細胞数を測定することによって、生細胞密度を測定し、その結果を表１に示す。
【００４０】
＜実施例２＞
ＰＡを１ｇ／Ｌ、ツイーン８０を０.５ｇ／Ｌとなるように、ＰＡ及びツイーン８０をＰＢＳに加えたものを超音波処理して懸濁させ、ＰＡ分散液Ｂを得た。ＰＡ分散液Ａの代わりにＰＡ分散液Ｂを用いること以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った。実施例１と同様にして、培地中のヒトインターフェロンγの濃度（ｈＩＦＮ濃度）及び細胞数を測定し、その結果を表１に示す。
【００４１】
＜比較例１＞
ＰＡ分散液Ａを添加しない以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った。実施例１と同様にして、培地中のヒトインターフェロンγの濃度（ｈＩＦＮ濃度）及び細胞数を測定し、その結果を表１に示す。
【００４２】
＜比較例２＞
ＰＡを１ｇ／Ｌとなるように、ＰＡをＰＢＳに加えたものを超音波処理して懸濁させ、ＰＡ分散液Ｃを得た。ＰＡ分散液Ａの代わりにＰＡ分散液Ｃを用いること以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った。実施例１と同様にして、培地中のヒトインターフェロンγの濃度（ｈＩＦＮ濃度）及び細胞数を測定し、その結果を表１に示す。
【００４３】
＜比較例３＞
ＰＡを１ｇ／Ｌ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（商品名；プルロニックＦ−６８、シグマ社製）を０.５ｇ／Ｌとなるように、ＰＡ及びプルロニックＦ−６８をＰＢＳに加えたものを超音波処理して懸濁させ、ＰＡ分散液Ｄを得た。ＰＡ分散液Ａの代わりにＰＡ分散液Ｄを用いること以外は実施例１と同様にして細胞培養を行った。実施例１と同様にして、培地中のヒトインターフェロンγの濃度（ｈＩＦＮ濃度）及び細胞数を測定し、その結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
0004522032.tif 000002
【００４５】
以上の評価結果から、本発明の添加剤を用いた場合、添加剤を加えない場合（比較例１）よりもｈＩＦＮの総生産量も高く、単位細胞数当りのｈＩＦＮ生産量が倍増していることが判る。これは、ＰＡだけを添加した場合（比較例２）には無添加の場合（比較例１）と比較して、細胞数は増えるものの単位細胞数あたりのｈＩＦＮ生産量は殆ど変わらないこと、及び遺伝子組換えしていない細胞の増殖には有効であったプルロニックＦ−６８とＰＡを組み合わせた場合（比較例３）でも同様に、細胞数は増えるものの単位細胞数あたりのｈＩＦＮ生産量は殆ど変わらないことと対照的であり、ＰＡとツイーン８０を組み合わせた本発明の添加剤が、有用物質の生産量増加に有用であることが判る。
【００４６】
＜参考例＞
ＹＮＭ−ＦＨ培地（シグマ社製）５１．１９ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム０．３５ｇ／Ｌ、ゲンタマイシンスルフェート１０ｍｇ／Ｌの濃度となるように、それぞれを蒸留水１リットルに配合・溶解して、無血清培地Ｂを得た。
ホスファチジン酸濃度が１０ｍｇ／ＬになるようにＰＡ分散液Ｂを無血清培地Ａに加えたもの１５ｍＬを１００ｍＬのマイヤーフラスコに加えた。
次いで、このマイヤーフラスコにβ-ガラクトシダーゼの遺伝子を組換えしたバキュロウィルスを感染多重度が２ｐｆｕ／細胞となるように感染させたヤガ由来のＳｆ９を１４０万個／ｍＬで播種し、ねじ口キャップを空気が通過できる程度に閉めて、２７℃で４日間振盪しながら細胞培養を行なった。
【００４７】
細胞懸濁液１００μＬに対して、０．５５６重量％オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むＺ緩衝溶液（０．０６Ｍ−Ｎａ2ＨＰＯ4，０．０４Ｍ−ＮａＨ2ＰＯ4，０．０１Ｍ−ＫＣｌ，０．０１Ｍ−ＭｇＳＯ4，０．０５Ｍ−メルカプトエタノール）９００μＬを加え、細胞内のβ-ガラククトシダーゼを液中に放出させたあと、ｏ-ニトロフェニル−β−ガラクトサイドの還元性を評価することによって、β-ガラクトシダーゼの産生量を測定した。その結果を表２に示す。なお、１Ｕは、１μモルのｏ−ニトロフェニル−β-ガラクトサイドを１分間に還元できる酵素活性である。
細胞懸濁液を血球計数盤に入れ、細胞数を測定することによって、生細胞密度を測定し、その結果を表２に示す。
【００４８】
＜比較参考例＞
ＰＡ分散液Ｂを添加しない以外は参考例と同様にして細胞培養を行い、β-ガラクトシダーゼの産生量を測定し、その結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
0004522032.tif 000003
【００５０】
以上の評価結果からも、本発明の添加剤を用いた場合、添加剤を加えない場合と比較して、単位細胞数当りのガラクトシダーゼ活性が高くなる結果、ガラクトシダーゼ活性が高くなる、つまり単位細胞数当りのガラクトシダーゼの生産量が高くなり、その結果として、ガラクトシダーゼの総生産量が増加していることが判る。このことからも、本発明の添加剤が、有用物質の生産量増加に有用であることが判る。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の有用物質生産量増加用添加剤を使用することによって、細胞を増殖させると共に、単位細胞数当りの有用物質の生産量を増加させることができるため、有用物質を極めて大量に得ることができるようになる。
さらに、血清を一切使用しなくても有用物質を効率的に生産できることから、血清中の未知のウィルス等の危険を回避できる。従って、有用物質の生産に非常に有用である。