(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む組成物であって、前記前駆体ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度が、総タンパク質に基づいて少なくとも９９％またはそれ以上であり、前記純度が逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法を使用して測定されたものである、組成物。
【請求項２】
前記前駆体ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度が、総タンパク質に基づいて少なくとも９９．２％またはそれ以上であり、前記純度が逆相ＨＰＬＣ法を使用して測定されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記前駆体ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼが、グリコシル化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記純度が９９．５％またはそれ以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記純度が９９．９％またはそれ以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記前駆体ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼが、組換え前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度が、総タンパク質に基づいて少なくとも９９％またはそれ以上であり、前記純度がサイズ排除クロマトグラフィ−ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）法を使用して測定されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度が、９９．５％またはそれ以上である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度が９９％またはそれ以上であり、前記ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度が９９．５％またはそれ以上である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物と薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
【請求項１１】
塩化ナトリウム溶液と非イオン性界面活性剤とをさらに含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼが、約１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
緩衝液が約１０〜５０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
ｐＨが約５．８に維持されている、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ポリオキシエチレンソルビタンをさらに含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記ポリオキシエチレンソルビタンが、ポリオキシエチレンソルビタン２０または８０であり、前記ポリオキシエチレンソルビタン２０または８０の濃度が、約０．００５％（重量／体積）である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
少なくとも９９％またはそれ以上の純度を有する前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの精製方法であって、
（ａ）前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む流動物を得るステップと、
（ｂ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを切断することができる前記流動物中のプロテアーゼのタンパク質分解活性を減少させるステップであって、前記減少が前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼに悪影響を与えない、ステップと、
（ｃ）前記流動物をCibracon blue dye相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、
（ｄ）前記流動物を銅キレート化クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、
（ｅ）前記流動物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、
（ｆ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記得るステップが、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをコードする遺伝子で形質転換した細胞培養物を成長させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子がヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記得るステップが、前記細胞培養物から流動物を回収するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記得るステップが、前記流動物を約２０倍に濃縮するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記減少ステップが、流動物のｐＨを８．０またはそれ以下に調整するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記減少ステップが、流動物のｐＨを約４．８〜５．５に調整するステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記減少ステップが、流動物のｐＨを約４．８〜５．２に調整するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）が、前記流動物をCibracon blue dye相互作用クロマトグラフィカラムに通過させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記Cibracon blue dye相互作用クロマトグラフィカラムが、Blue Sepharose 6 Fast Flowカラムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｄ）が、前記流動物を銅キレート化クロマトグラフィカラムに通過させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記銅キレート化クロマトグラフィカラムが、Chelating SepharoseFast Flowカラムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｅ）が、前記流動物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに通過させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィカラムが、Phenyl Sepharose6 Fast Flow High Subカラムである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の時間的な順序が、ステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）、およびステップ（ｅ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記回収ステップが前記流動物のダイアフィルトレーションを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記回収ステップが、ＤＮＡを除去するための前記流動物の濾過を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
前記回収ステップが、ウイルスを除去するための前記流動物の濾過を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
前記濾過が、前記流動物を０．２μｍフィルターに通過させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
回収された前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度が、少なくとも９９％またはそれ以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３９】
前記純度が逆相ＨＰＬＣ法によりを使用して測定されたものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記流動物がDEAE Sepharose樹脂と接触しない、請求項１７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１７に記載の方法を使用して精製された、純度が少なくとも９９％またはそれ以上の前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む組成物。
【請求項４２】
少なくとも９９％またはそれ以上の純度を有する前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼと、約０．００２％〜約０．００８％（重量／体積）の範囲の濃度のポリオキシエチレンソルビタンとを含む薬学的組成物。
【請求項４３】
前記ポリオキシエチレンソルビタンが、０．００５％の濃度（重量／体積）のポリオキシエチレンソルビタン８０である、請求項４２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2002年11月7日提出の米国特許出願番号10/290,908号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、臨床医学分野、生化学分野、および分子生物学分野に属する。本発明は、ＶＩ型ムコ多糖体症の治療薬および治療方法ならびにこのような治療薬の生産および生産のための精製手順を特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
ＭＰＳ  ＶＩ（マロトー−ラミー症候群）は、罹患患者が酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）を欠くリソソーム蓄積症である。この酵素は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸の硫酸塩部分を代謝する(Neufeld,et al.,「The mucopolysaccharidoses」The Metabolic Basis of Inherited Disease,eds.Scriver et al.,New York:McGraw-Hill,1989,p.1565-1587)。酵素の非存在下では、デルマタン硫酸の段階的分解が遮断され、広範な組織のリソソーム細胞内に基質が蓄積する。蓄積により複数の器官および組織で疾患が進行し、これは、乳児が正常に誕生するようであるが、通常思春期前に死亡することに関連する。通常、６〜２４月齢で児童の成長遅延の進行、肝臓および脾臓の肥大、骨の奇形、粗大化顔貌(coarse facial features)、上気道閉塞、および関節奇形を示す場合、ＭＰＳ  ＶＩと診断される。ＭＰＳ  ＶＩ児童は、進行性の角膜混濁、交通性水頭症、または心疾患を発症し得る。通常、呼吸器感染または心疾患で死亡する。ＭＰＳ  Ｉと異なり、ＭＰＳ  ＶＩは、典型的に、精神状態の進行性障害と関連しないが、物理的制約が学習および発達に影響を与え得る。ほとんどのＭＰＳ  ＶＩ患者は、通常は十代までに死亡する重症形態を有するが、数十年間生存することができる疾患の重症度の低い形態を有する罹患患者が説明されている。
【０００４】
いくつかの刊行物では、ＭＰＳ  ＶＩの発症率を推測している。Lowry et al(Lowry,et al.,Human Genet 85:389-390(1990))が発表した1990年に行われたブリティッシュコロンビア州で1952年と1986年との間に誕生した全新生児の調査での発症率はちょうど1/1,300,000と推定された。オーストラリアでの1980年〜1996年の出生時の調査(Meikle et al.,JAMA 281(3):249-54)では１８人の患者が認められ、発症率は1/248,000であった。北アイルランドでの調査(Nelson,et al.,Hum.Genet.101:355-358(1997))では、発症率は1/840,000と推定された。最後に、オランダにおける1970年〜1996年の調査では、出生率は、100,000人に対し0.24人と算出された(Poorthuis,et al.,Hum.Genet.105:151-156(1999))。これらの調査に基づいて、米国における全てのこの症候群型と診断された患者は５０人から３００人の間と推定される。
【０００５】
ＭＰＳ  ＶＩの満足の行く治療は存在しないが、少数の患者では骨髄移植（ＢＭＴ:bone marrow transplantation）が有益であった(Krivit,et al.,N.Engl.J.Med.311(25):1606-11(1984);Krivit,et al.,Int.Pediat.7:47-52(1992))。ＢＭＴは、適切なドナーの不足によって普遍的に利用できず、これが実質的な罹患率および死亡率に関連する。The European Group for Bone Marrow Transplantationの報告では、リソソーム障害における６３の移植症例の移植関連死亡率は１０％（ＨＬＡ同一）〜２０〜２５％（ＨＬＡミスマッチ）であった(Hoogerbrugge,et al.,Lancet 345:1398-1402(1995))。ＢＭＴ以外のほとんどの患者はその唯一の治療形態として特定の問題についての対症療法を受ける。本発明の目的は、組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を使用した酵素代償療法を提供することにある。ｒｈＡＳＢによるヒトの治療は試みられていない。同様に、許容可能な臨床投薬量または医学的処方物は提供されていない。ネコＭＰＳ  ＶＩモデルにおけるいくつかの酵素置換試験を行った。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、前駆体形態の高度に精製されたＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む組成物の生産、精製、および使用を含む。前駆体形態のＤＮＡおよびコードされたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に記載する。配列番号２のシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜３８と推定され、組換え生産により配列番号２のアミノ酸残基３９または４０のいずれかから開始される産物が得られた。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の欠損に全部または一部起因する疾患の新規の治療法を特徴とする。本方法は、有効量の薬学的組成物をこのような治療を必要とする被験体に投与するステップを含む。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、前駆体形態の高度に精製されたＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを単独または薬学的に適切なキャリアと組み合わせて含む。被験体は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ欠損に全部または一部起因する疾患を罹患している。他の実施形態では、本方法は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）またはその生物活性変異体もしくはアナログの全部または一部をコードする核酸のインビボでの１つまたは複数の宿主細胞への導入を特徴とする。好ましい実施形態は、治療すべき生物（好ましくは哺乳動物またはヒト）に必要な投薬量を病徴を有効に改善するように至適化することを含む。好ましい実施形態では、疾患はＶＩ型ムコ多糖体症（ＭＰＳ  Ｖ１）またはマロトー−ラミー症候群である。
【０００８】
本発明の第１の態様は、特に、治療有効量のヒトＡＳＢ、好ましくは組換えヒトＡＳＢの投与による、ＡＳＢ活性の欠損に全部または一部起因する疾患を罹患したヒトの治療方法を提供する。したがって、本発明は、ＡＳＢ活性欠損症の治療のための薬物の調製におけるヒトＡＳＢの使用およびＡＳＢ活性の欠損症の治療で使用するためのヒトＡＳＢを含む薬学的組成物を意図する。ＡＳＢ活性の欠損は、例えば、正常なＡＳＢ活性レベルと比較して５０％または以下、２５％またはそれ以下、または１０％またはそれ以下の活性レベルとして認められ、ムコ多糖体症（例えば、ＶＩ型ムコ多糖体症（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群）として現れ得る。治療有効量は、ヒト患者が有利な結果を得るのに十分な量であり、好ましくは、以下の任意の１つが改善する。関節可動性、痛み、または関節の堅さ（主観的または客観的のいずれか）；運動耐容能(exercise tolerance)または運動耐久力(exercise endurance)（例えば、歩行能力または上り能力によって測定）；肺機能（例えば、ＦＶＣ、ＦＥＶ1、またはＦＥＴによって測定）；視力；または日常生活動作（例えば、座っている状態から立ち上がる能力、衣類の出し入れ、または小物の拾い上げによって測定）。ヒトＡＳＢを、好ましくは、本明細書中に記載の高度に精製された組換え調製物として投与する。好ましい調製物は、逆相ＨＰＬＣで測定したところ、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％を越える純度のｒｈＡＳＢを含む。好ましい調製物はまた、純度の高い前駆体形態のＡＳＢを含み、その結果クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥでプロセシング形態のＡＳＢは検出されない。より好ましくは、前駆体形態のＡＳＢの純度は、サイズ排除クロマトグラフィ（（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ）で測定したところ、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％を越える。ヒトＡＳＢは、好ましくはまた、本明細書中に記載の界面活性剤または非イオン性界面活性剤を使用して処方される（必要に応じて任意に、０．００１％のポリオキシエチレンソルビタン２０および８０使用した処方物を除外する）。
【０００９】
１ｍｇ／ｋｇ／週未満（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ／週）の用量のｒｈＡＳＢの投与は、有利な効果が得られることを見いだされた。本発明は、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１．５ｍｇ／ｋｇ／週の用量を意図し、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ／週またはそれ以上の範囲であり得る。好ましい用量は、１ｍｇ／ｋｇ／週である。このような用量を１週間に１回送達させることが好ましいが、選択的により頻繁な（１週間に２回または毎日など）送達のために等分することができる。等しい投薬量を送達させる種々の非経口または経口投与経路（経口、経皮、経粘膜、肺内（エアゾール化が含まれる）、筋肉内、皮下、または静脈内が含まれる）が意図される。関節またはＣＳＦへのボーラス注射または直接的注入による投与が特に意図される（鞘内、大脳内、脳室内、腰椎穿刺経由、または大槽など）。このような鞘内投与達成のための種々の手段が当分野で公知である（ポンプ、リザーバ、シャント、または移植片が含まれる）。好ましくは、用量を、１、２、または４時間、最も好ましくは４時間継続する静脈内注入を介して送達させるが、静脈内ボーラスによって導入させることもできる。
【００１０】
ヒト被験体の他のＡＳＢ活性増加手段（患者の外因性または内因性ＡＳＢ発現を一過性または恒久的に増大させる遺伝子治療が含まれる）も意図される。当分野で公知の種々の手段（ウイルスベクター、相同組換え、または直接ＤＮＡ注入が含まれる）によって、外因性ｈＡＳＢ遺伝子または内因性ｈＡＳＢ遺伝子の発現を増大させるプロモーターの送達が可能である。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の欠損に全部または一部起因する疾患の治療に有用なＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを含む新規の薬学的組成物を特徴とする。好ましい実施形態では、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼは前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼである。このような組成物は、非経口、局所、鼻腔内、吸入、または経口投与などの多数の方法における投与に適切であり得る。Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）欠損の影響を受ける細胞にインビボで投与することができるＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の全部または一部をコードする核酸配列を特徴とする実施形態は態様の範囲内である。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量でのＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの生産方法を特徴とする。広範な実施形態では、本方法は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）またはその生物活性変異体もしくはアナログの全部または一部をコードするｃＤＮＡでその発現に適切な細胞をトランスフェクトするステップを含む。好ましい実施形態では、不変の培養または連続培養、または灌流培養で細胞を成長させる。別の実施形態では、Ｇ４１８を欠く培地で細胞を成長させる。いくつかの実施形態では、完全なＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、好ましくはヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）をコードするｃＤＮＡを使用する。しかし、他の実施形態では、その生物活性フラグメントまたは変異体をコードするｃＤＮＡを使用することができる。詳細には、酵素の生物活性を保持または強化しながら１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。別の好ましい実施形態では、発現ベクターを使用して、ｃＤＮＡをその発現に適切な細胞または細胞系統に移行する。１つの特に好ましい実施形態では、ｃＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統など）にトランスフェクトする。さらに他の好ましい実施形態では、生産手順は、以下のステップを含む。（ａ）ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルフェートの全部または生物活性フラグメントもしくは変異体をコードするＤＮＡでトランスフェクトした細胞を適切な成長培地中で適切な密度まで成長させるステップと、（ｂ）トランスフェクトした細胞をバイオリアクターに導入するステップと、（ｃ）前記バイオリアクターに適切な成長培地を供給するステップと、（ｄ）酵素を含む培地からトランスフェクトされた細胞を分離するステップ。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）を生産する能力を特徴とするトランスフェクトした細胞系統を提供する。好ましい実施形態では、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼは、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼである。好ましい実施形態では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを安定且つ確実に生産するＣＨＯ−Ｋ１細胞系統などの組換えＣＨＯ細胞系統を特徴とする。ＣＳＬ４Ｓ−３４２と呼ばれるトランスジェニックＣＨＯ−Ｋ１細胞系統が特に好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、トランスジェニック細胞系統は、１つまたは複数の発現構築物のコピーを含む。好ましくは、トランスジェニック細胞系統は、約１０またはそれ以上の発現構築物のコピーを含む。さらにより好ましい実施形態では、細胞系統は、少なくとも約２０〜４０μｇ／１０7細胞／日の量で組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを発現する。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの生産に適切な新規のベクターを提供する。
【００１５】
第６の態様では、本発明は、本発明の方法にしたがって生産され、それにより酵素治療で使用することができる量で存在する、新規のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを提供する。本発明のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の比活性は、好ましくは２０〜９０単位／ｍｇタンパク質、より好ましくは約５０単位／ｍｇタンパク質を越える範囲である。好ましい実施形態では、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼは、高度に精製された前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼである。
【００１６】
第７の実施形態では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの新規の精製方法を特徴とする。第１の実施形態によれば、トランスフェクトした細胞塊を成長させ、これを除去し、組換え酵素を放出させる。カラム汚染を防止するために、外因性物質を、通常、粗バルクから分離すべきである。好ましくは、組換え酵素を含む成長培地に対して限外濾過ステップを行う。別の好ましい実施形態では、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの精製方法は、（ａ）前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む流動物を得るステップと、（ｂ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを切断することができる前記流動物中のプロテアーゼのタンパク質分解活性を減少させるステップであって、前記減少が前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼに悪影響を与えない、ステップと、（ｃ）前記流動物をCibracon blue dye相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、（ｄ）前記流動物を銅キレート化クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、（ｅ）前記流動物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、（ｆ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを回収するステップとを含む。好ましくは、ステップ（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を連続的に実施することができる。当業者は、１つまたは複数のクロマトグラフィステップを省略または置換することができること、また、クロマトグラフィステップの順序を本発明の範囲内で変化させることができることを容易に認識する。他の好ましい実施形態では、最後のクロマトグラフィカラム由来の溶離物に対して限外濾過／ダイアフィルトレーションを行い、任意の残存ウイルスを除去するための適切なステップを行う。最後に、所望ならば、適切な滅菌ステップを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、前駆体形態の高度に精製されたＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む組成物の生産、精製、および使用を含む。前駆体形態のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度は、逆相ＨＰＬＣ法によって決定したところ、総タンパク質の少なくとも９５、９６、９７、または９８％またはそれ以上である。好ましくは、純度は、少なくとも９９％またはそれ以上である。より好ましくは、純度は、少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、または９９．４％またはそれ以上である。さらにより好ましくは、純度は、少なくとも９９．５、９９．６、９９．７、または９９．８％またはそれ以上である。なおさらにより好ましくは、純度は、少なくとも９９．９％またはそれ以上である。前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度は、逆相ＨＰＬＣ法を使用して測定される（実施例９を参照のこと）。前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度は、逆相ＨＰＬＣ法によって検出可能な本質的にいかなる夾雑細胞タンパク質または分解、成熟、またはプロセシングされたＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼも含まない組成物によるものである。全ての純度は、逆相ＨＰＬＣ法によって決定された総タンパク質に基づく。本明細書中に開示の精製プロセスを使用して得ることができる連続的に反復可能な高い純度により、治療毎（例えば、毎週）に投与される高純度ｒｈＡＳＢ調製物での長期慢性治療を必要とするこれらの患者を治療することが可能である。したがって、本発明は、長期間にわたる（例えば、１２週間、２４週間、４８週間、９６週間、またはそれ以上）このような高純度の前駆体ｒｈＡＳＢの投与を意図する。
【００１８】
第１の態様では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の欠損に全部または一部起因する疾患の新規の治療方法を特徴とする。１つの実施形態では、本方法は、組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの単独または薬学的に適切なキャリアとの組み合わせの投与を特徴とする。他の実施形態では、本方法は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）またはその生物活性変異体の全部または一部をコードする核酸のインビボでの１つまたは複数の宿主細胞への導入を特徴とする。好ましい実施形態は、治療すべき生物（好ましくは哺乳動物またはヒト）に必要な投薬量を、病徴を有効に改善するように至適化することを含む。好ましい実施形態では、疾患はＶＩ型ムコ多糖体症（ＭＰＳ  ＶＩ）、マロトー−ラミー症候群である。
【００１９】
前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度は、組成物が前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを投与された被験体によって免疫反応またはアレルギー反応を生じ得るいかなる夾雑細胞タンパク質も本質的に含まないことによるものである。被験体に投与された場合に組成物がいかなる免疫反応またはアレルギー反応も生じない場合、組成物は本質的にこのような夾雑宿主細胞タンパク質を含まない。前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼが高純度であることは、薬学的組成物中に存在する夾雑物に対する被験体による免疫反応またはアレルギー反応の回避に重要である。これは、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼが精製される細胞のタンパク質で特に真である。組換え前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼがチャイニーズハムスター卵巣細胞から発現および精製される場合、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質は、被験体の免疫反応またはアレルギー反応（例えば、蕁麻疹）を生じさせ得る。この反応型の唯一の回避手段は、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼがこのような反応を引き起こすのに十分な量の夾雑チャイニーズハムスター卵巣タンパク質を含まないように確実に十分に純粋であることである。被験体にはＭＰＳ  ＶＩを罹患している患者が含まれ、それによりすでに免疫力が低下しているので、薬学的組成物の純度は特に重要である。
【００２０】
組成物中でプロセシング形態または分解形態が微量であるような前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の純度も好ましい。宿主細胞中に存在するプロテアーゼは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをより低分子量の形態に分解する。これらいくつかの形態は酵素的に活性でもあり得る一方で、前駆体形態は細胞取り込みおよびリソソームターゲティングに好ましいので、最終調製物中により大量の非プロセシング前駆体ＡＳＢを含むことが望ましい。さらに、製剤中の分解形態のＡＳＢはまたＡＳＢ自体の抗体の発生数または量をより多くし得るので、患者が長期治療を必要とする場合などに全く望ましくない。本明細書中に記載の灌流精製プロセスにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＲＰＨＰＬＣと、ＳＥＣ−ＨＰＬＣとの組合わせによってアッセイしたところ、本質的に夾雑宿主細胞タンパク質またはプロセシング／分解形態のＡＳＢを含まない高純度の調製物が得られる。ヒトに投与した場合、本プロセスによって生産された産物の半減期はより長いようである。
【００２１】
マロトー−ラミー症候群としても公知のＭＰＳ  ＶＩの治療のために組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を示す。好ましい実施形態によれば、１ｍｇ／ｋｇ（約５０Ｕ／ｋｇ）の初回投与量を、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの欠損症を罹患している患者に投与する。好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを、注射によって毎週投与する。他の好ましい実施形態によれば、少なくとも５０％の尿中グリコサミノグリカン排出量の減少を示さない患者には、初回投与の約３ヶ月以内に投薬量を２ｍｇ／ｋｇ（約１００単位／ｋｇ）に変更する。好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを、好ましくは有意な疾患の臨床症状が持続する限り、１週間に１回約４時間にわたり静脈内に投与する。また、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を、最初に約３０ｃｃ／時間の生理食塩水注入から開始する橈側皮静脈または他の適切な静脈に留置した静脈内カテーテルによって投与する。さらに、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を、通常の生理食塩水で約２５０ｃｃに希釈する。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの欠損症の治療に有用なヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを含む新規の薬学的組成物を特徴とする。上記の好ましい実施形態に加えて、組換え酵素を多数の方法（非経口、局所、鼻腔内、吸入、または経口投与など）で投与することができる。本発明の別の態様は、固体、半固体、もしくは液体、または摂取可能なカプセル(ingestable capsule)であり得る薬学的に許容可能なキャリアを使用した酵素の処方による酵素の投与を提供することである。薬学的組成物の例には、錠剤、鼻腔用ドロップなどのドロップ、軟膏、ゼリー、クリーム、および懸濁液などの局所投与用組成物、吸入用エアゾール、鼻腔内スプレー、リポソームが含まれる。通常、組成物に対して０．０５重量％と９９重量％との間または０．５重量％と９９重量％との間（例えば、注射を意図する組成物に対して０．５重量％と２０重量％との間および経口投与を意図する組成物に対して０．１重量％と５０重量％との間）の組換え酵素を含む。
【００２３】
治療酵素を含む経口投与用のこの単位投与形態中に薬学的組成物を生産するために、酵素を、固体粉末キャリア（例えば、乳糖、サッカーロース、ソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、アミロペクチンなどのデンプン）、コンブ粉末もしくは柑橘類パルプ粉末、セルロース誘導体、またはゼラチンと混合することができ、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどの潤滑剤またはCarbowaxもしくは他のポリエチレングリコールワックスも含まれ、打錠して錠剤または糖剤のコアを形成することができる。糖剤が必要な場合、コアを、例えば、アラビアガム、タルク、および／または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液または揮発性有機溶媒もしくは有機溶媒混合物に溶解した被膜剤でコートすることができる。例えば、活性物質の異なる内容物を区別するためにこれらのコーティングに色素を添加することができる。ゼラチンおよび例えば可塑剤としてのグリセロールからなる軟ゼラチンカプセルまたは類似の密封カプセルの組成物のために、活性物質を、Carbowaxまたは適切なオイル（例えば、ゴマ油、オリーブ油、またはラッカセイ油）と混合することができる。硬ゼラチンカプセルは、乳糖、サッカーロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（ジャガイモデンプン、コーンスターチ、またはアミロペクチンなど）、セルロース誘導体、またはゼラチンなどのなどの固体粉末キャリアを含む活性物質の顆粒を含むことができ、潤滑剤としてステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸も含み得る。
【００２４】
本発明の治療酵素を、１回の注射もしくはポンプ注入のいずれかによる皮下、筋肉内、または静脈内注射または徐放性皮下移植片などによって非経口投与することもでき、治療酵素を吸入によって投与することができる。皮下、筋肉内、および静脈内注射では、治療酵素（有効成分）を、液体キャリア賦形剤に溶解または分散させることができる。非経口投与のために、活性材料を、許容可能な賦形剤（好ましくは、ピーナッツ油、綿実油などの種々の植物油）と適切に混合することができる。ソルケタール(solketal)、グリセロール、ホルマル、および水性非経口処方物を使用した有機組成物などの他の非経口賦形剤も使用することができる。
【００２５】
注射による非経口適用のために、組成物は、本発明の活性な酸の水溶性の薬学的に許容可能な塩の水溶液を、望ましくは０．５〜１０％の濃度で含むことができ、必要に応じて任意に、水溶液中に安定剤および／または緩衝液も含み得る。溶液の投薬単位をアンプルに密封することが有利であり得る。
【００２６】
治療酵素を皮下移植片の形態で投与する場合、化合物を当業者に公知のゆっくりと分散する物質に懸濁または溶解するか、浸透圧ポンプなどの一定駆動力の使用によって活性材料を徐放するデバイスで投与する。このような場合、長期投与が可能である。
【００２７】
局所適用のために、薬学的組成物は、軟膏、細胞、懸濁液、またはクリームなどの形態が適切である。活性物質の量は、例えば、活性物質の０．０５重量％と２０重量％との間で変化し得る。このような局所投与用薬学的組成物を、公知の様式における活性物質とイソプロパノール、グリセロール、パラフィン、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコールなどの公知のキャリア材料との混合によって調製することができる。薬学的に許容可能なキャリアには、公知の化学吸収促進剤も含まれ得る。吸収促進剤の例は、例えば、ジメチルアセトアミド（米国特許第3,472,931号）、トリクロロエタノール、もしくはトリフルオロエタノール（米国特許第3,891,757号）、一定のアルコール、およびその混合物（英国特許第1,001,949号）である。非損傷皮膚への局所投与のためのキャリア材料は、４０〜７０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールおよび０〜６０％（ｖ／ｖ）のグリセロール（存在する場合、希釈剤の不活性成分を総溶媒体積の４０％を越えないようにバランスをとる）を含む溶媒からなるキャリア材料を開示する、英国特許出願第1,464,975号にも記載されている。
【００２８】
薬学的組成物を含む治療酵素を投与する投薬量は広範囲で変化させることができ、例えば、疾患の重症度、患者の年齢などの種々の要因に依存し、個別に調整しなければならない。１日に投与することができる治療酵素量のおおよその範囲は、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇまたは約１ｍｇ〜約２０００ｍｇであり得る。
【００２９】
治療酵素を含む薬学的組成物を、単回投与単位または複数回の投与単位のいずれかとしてこれらの範囲内で用量が得られるように適切に処方することができる。治療酵素の含有に加えて、本発明の処方物は、組成物中の治療酵素によって触媒される反応のための１つまたは複数の基質または補因子を含み得る。治療酵素を含む薬学的組成物は、１つを超える治療酵素も含み得る。同様に、治療酵素は、別の部分（例えば、ＰＥＧ）に結合した抱合体形態(conjugate form)であり得る。さらに、治療酵素は、目的の組織、器官、またはオルガネラへの送達を補助するための１つまたは複数のターゲティング部分または輸送ペプチドを含み得る。
【００３０】
本発明の方法で使用される組換え酵素および組成物を、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログをコードする核酸での患者細胞の形質転換によって投与することもできる。このようなコードする核酸配列を、治療すべき患者の細胞への形質転換のためのベクターに組み込むことができる。このようなベクターの好ましい実施形態を本明細書中に記載する。被験体の染色体に組み込むか（例えば、レトロウイルスベクター）、宿主細胞中で自律複製するようにベクターをデザインすることができる。酵素の持続的または調節された発現が得られるようにコードするＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼのヌクレオチド配列を含むベクターをデザインすることができる。さらに、細胞ゲノムに安定に組み込まれるか一過性にのみ存在するように酵素をコードする遺伝子ベクターをデザインすることができる。従来の一般的な遺伝子治療の方法を、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをコードするポリヌクレオチド配列に適用することができる。従来の遺伝子治療技術の概説を、Ｆriedman,Science 244:1275-1281(1989);Ledley,J.Inherit.Aletab.Dis.13:587-616(1990);and,Tososhev,et al.,Curr.Opinions Biotech.1:55-61(1990)に見いだすことができる。
【００３１】
組換え酵素の特に好ましい投与方法は、静脈内である。特に好ましい組成物は、組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、通常の生理食塩水、ｐＨを約５〜７に維持するためのリン酸緩衝液、およびヒトアルブミンを含む。組成物は、さらに、安定性を改善し、保存期間を延長するためのポリソルベート２０または８０（Tween-20またはTween-80）などのポリオキシエチレンソルビタンを含み得る。あるいは、組成物は、当分野で公知の任意の界面活性剤または非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン４０または６０；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアレート；ポロクサマー１８またはポロクサマー４０７などのポロクサマー；オクトキシノール−９またはオクトキシノール４０が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００３２】
好ましくは、界面活性剤または非イオン性界面活性剤は、少なくとも０．０００１％、少なくとも０．０００５％、少なくとも０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、または０．００５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。好ましくは、濃度は、所望の安定性を達成するために必要な最低濃度であるが、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、または０．０２％（ｗ／ｖ）までであり得る。最も好ましくは、組成物は、０．００５％±０．００３％（例えば、０．００２％〜０．００８％）の濃度のポリソルベートを含む。これらの組成物の成分を、好ましくは以下の量で提供することができる。
【００３３】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ
１〜５ｍｇ／ｍｌまたは５０〜２５０単位／ｍｌ
塩化ナトリウム溶液          （ｌＶバッグ中に１５０ｍＭ、総体積５０〜２５０ｃｃ）
リン酸ナトリウム緩衝液      １０〜１００ｍＭ（ｐＨ５．８）（好ましくは１０ｍＭ）
ヒトアルブミン（選択的）    １ｍｇ／ｍＬ
Tween-20またはTween-80      ０．００１％〜０．００５％（ｗ／ｖ）
【００３４】
好ましい実施形態では、ＡＳＢを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ  ５．８）、０．００５％ポリソルベート８０中に１ｍｇ／ｍＬで処方する。
【００３５】
第３の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量でのＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの生産方法を特徴とする。広範な実施形態では、本方法は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）またはその生物活性変異体もしくはアナログの全部または一部をコードするｃＤＮＡでその発現に適切な細胞をトランスフェクトするステップを含む。いくつかの実施形態では、完全なＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、好ましくはヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）をコードするｃＤＮＡを使用する。しかし、他の実施形態では、その生物活性フラグメントまたは変異体をコードするｃＤＮＡを使用することができる。詳細には、酵素の生物活性を保持または強化しながら１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。
【００３６】
他の好ましい実施形態では、発現ベクターを使用して、ｃＤＮＡをその発現に適切な細胞または細胞系統に導入する。１つの特に好ましい実施形態では、ｃＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統など）にトランスフェクトする。さらに他の好ましい実施形態では、生産手順は、以下のステップを含む。（ａ）ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルフェートの全部または生物活性フラグメントもしくは変異体をコードするＤＮＡでトランスフェクトした細胞を適切な成長培地中で適切な密度まで成長させるステップと、（ｂ）トランスフェクトした細胞をバイオリアクターに導入するステップと、（ｃ）前記バイオリアクターに適切な成長培地を供給するステップと、（ｄ）組換え酵素を含む培地を回収するステップと、（ｅ）回収培地からトランスフェクトした細胞を実質的に除去するステップ。
【００３７】
トランスフェクトした細胞の成長に適切な培地は、Ｌ−グルタミン、グルコース、ヒポキサンチン／チミジンを補足し、選択的にＧ４１８を含むか含まないJRH Excell 302培地である。好ましい培地では、JRH Excell 302培地に、葉酸、セリン、アスパラギンをさらに補足するが、培地中にＧ４１８は存在しない。Ｇ４１８を補足しているが、葉酸、セリン、およびアスパラギンを補足していない培地の使用と比較して、細胞の培養のためのこの好ましい培地の使用により、より純度の高い前駆体ｒｈＡＳＢが得られる（図６のレーン２を参照のこと）。１０〜４０ｍｇ／ｍｌの活性酵素が得られる約１×１０7細胞／ｍｌの細胞密度を達成するためにこのような培地中で細胞を培養することが好ましい。さらに、トランスフェクトされた細胞をバイオリアクター中で約５〜１５日間成長させることが好ましい。より好ましくは、約９日間である。好ましくは、トランスフェクトした細胞を、最大３５日継続する回収しながらの(with collections)灌流ベースのプロセスを使用してバイオリアクター中で成長させる。より好ましくは、トランスフェクトした細胞を、最大(up to)４５日継続する回収しながらの灌流ベースのプロセスを使用してバイオリアクター中で成長させる。さらにより好ましくは、トランスフェクトした細胞を、最大６０日継続する回収しながらの灌流ベースのプロセスを使用してバイオリアクター中で成長させる。なおさらにより好ましくは、トランスフェクトした細胞を、最大９０日継続する回収しながらの灌流ベースのプロセスを使用してバイオリアクター中で成長させる。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、トランスフェクトした細胞を、１０μｍのメンブレン、１μｍのメンブレン、およびその後の０．２μｍのメンブレンなどの連続的メンブレンによる濾過によってバイオリアクター上清から実質的に除去することができる。任意の残存回収培地を、濾過前に破棄することができる。
【００３９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞中で組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを生産することができる(Peters,et al.J.Biol.Chem.265:3374-3381)。その取り込みは、全てではないがほとんどの細胞で発現する高親和性マンノース−６−リン酸受容体によって媒介される（Neufeld et al.,「The mucopolysaccharidoses」The Metabolic Basis of Inherited Disease,eds.Scriver,et al.New York:McGraw-Hill(1989)p.1565-1587)。一旦マンノース−６−リン酸受容体に結合すると、酵素は被覆小窩によってエンドサイトーシスを受け、リソソームに輸送される。リソソームのｐＨで、酵素は活性であり、蓄積された硫酸デルマタンから硫酸残基を除去し始める。ＭＰＳ  ＶＩ線維芽細胞では、貯蔵物のクリアランスは急速であり、酵素暴露から９２時間以内に容易に示される(Anson,et al.,J.Clin.Invest.99:651-662(1997))。図１に概説する流れ図によるプロセスにしたがって、１１０Ｌ（作業体積約９０Ｌ）の発酵規模で組換え酵素を生産することができる。
【００４０】
表１Ａ〜Ｃに記載の以下の方法を使用して組換え酵素を生産することができる。
【００４１】
【表１】
0004459059.tif 000002
【００４２】
１つの実施形態では、トランスフェクトした細胞を、１つの１１０Ｌバイオリアクターから１日あたり約４００Ｌの回収速度で最大３５日間またはそれ以上連続して回収しながらの灌流ベースのプロセスである細胞培養プロセスで成長させる。好ましくは、回収速度は、１つの１１０Ｌバイオリアクターから１日あたり約８００Ｌである。灌流細胞培養プロセスとバッチ細胞培養プロセスとを比較したプロセスの流れ図を表１Ｂに示す。フェッドバッチプロセスとの比較および灌流ベースの細胞培養プロセスのために実施した特定の変更の詳細を表１Ｃに示す。
【００４３】
【表２】
0004459059.tif 000003
【００４４】
【表３Ａ】
0004459059.tif 000004
【表３Ｂ】
0004459059.tif 000005
【００４５】
スケールアッププロセスのための接種調製物は、フェッドバッチプロセスおよび灌流プロセスのそれと同一である。１つの実施形態では、ワーキングセルバンク由来の１つのバイアルの解凍およびその内容物（約１ｍＬ）の約２５ｍＬのEX-CELL 302培地（Ｌ−グルタミンで修正、フェノールレッドなし）を含むＴ７５ｃｍ2細胞培養フラスコへの移行によって、ｒｈＡＳＢ細胞培養を開始する。各拡大ステップでは、約０．８×１０6細胞／ｍＬの生細胞数に達するまで細胞培養物を接種する。細胞成長（細胞密度）および生存率（トリパンブルー排除経由）について各細胞拡大ステップをモニタリングする。全EX-CELL 302培地（Ｌ−グルタミンで修正、フェノールレッドなし）の添加および細胞導入を層流フード中で個別に行う。細胞培養物を、Ｔ７５ｃｍ2フラスコから２５０ｍＬスピナーフラスコ、２つの２５０ｍＬスピナーフラスコ、２つの３Ｌスピナーフラスコ、最後に２つの８Ｌスピナーフラスコに連続的に拡大する。全スケールアッププロセスを約１４日間継続する。２つの８Ｌスピナーフラスコの密度が少なくとも１．０×１０6細胞／ｍＬである場合、フラスコを使用して１つの１１０Ｌバイオリアクターに播種する。
【００４６】
ｒｈＡＳＢの発現または生産もしくは製造のためのバイオリアクターの操作は、灌流ベースの細胞培養プロセスを使用することが好ましい。好ましくは、灌流プロセスを使用するバイオリアクターは、フェッドバッチプロセスを使用した４００〜５００万細胞／ｍＬと比較して３７００万細胞／ｍＬもの細胞密度に制御することができる。
【００４７】
フェッドバッチプロセス（１１〜１２日間）よりも長期間（３５日間）灌流ベースのプロセスを行い、フェッドバッチプロセス（１９０Ｌ／運転）と比較してより大量の回収細胞培養流動物（１日あたり５容器体積の灌流速度で約４００Ｌ／日）が生産される。好ましくは、約８４００Ｌの総上清回収のために３５日まで回収を行う。
【００４８】
ＩＣＨガイドラインに従って、遺伝的安定性、同一性、滅菌、および偶発的因子汚染について、産生終了細胞（ＥＰＣ:End of Production Cell）を評価する。好ましくは、ｃＧＭＰ条件下で産生された３５日間の長期バイオリアクター運転から得られたＥＰＣの結果物（ＡＣ６０１０８）は、成長しないか負の結果が得られるか、細菌、真菌、マイコプラズマ、偶発的ウイルス夾雑物、マウスウイルス、または類似の夾雑物もしくは粒子は検出されない。
【００４９】
第４の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを産生する能力を特徴とするトランスフェクトした細胞を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）を安定且つ確実に産生するＣＨＯ−Ｋ１細胞系統などの組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞系統を特徴とする。ＣＳＬ４Ｓ−３４２と呼ばれるＣＨＯ−Ｋ１細胞系統が特に好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、細胞系統は、１つまたは複数の発現構築物を含む。より好ましくは、細胞系統は、約１０またはそれ以上の発現構築物のコピーを含む。さらにより好ましい実施形態では、細胞系統は、少なくとも約２０〜８０または４０〜８０μｇ／１０7細胞／日の量で組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）を発現する。
【００５０】
組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を、ＣＳＬ４Ｓ−３４２と命名された安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系統から生産することができる。細胞系統は、文献(Crawley,J.Clin.Invest.99:651-662(1997))に記載されている。マスターセルバンク（ＭＣＢ）およびワーキングセルバンク（ＷＢＣ）を、Tektagen Inc.(Malvern,PA)で調製した。セルバンクを、組換え哺乳動物細胞系統についてのＩＣＨ推奨ガイドラインによって特徴づけた。
【００５１】
第５の態様では、本発明は、酵素治療で使用することができる量のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの生産に適切な新規のベクターを提供する。
【００５２】
第６の態様では、本発明は、本発明の方法にしたがって生産され、それにより酵素治療で使用することができる量で存在する、新規のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログを提供する。本発明のＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の好ましい比活性は、約２０〜９０単位／ｍｇタンパク質、より好ましくは約５０単位／ｍｇタンパク質を越える範囲である。好ましくは、脱グリコシル化酵素の分子量は、約５５〜５６ｋＤａ、最も好ましくは約５５．７ｋＤａである。好ましくは、グリコシル化酵素の分子量は、約６３〜６８ｋＤａ、最も好ましくは約６４〜６６ｋＤａである。本発明には、生物活性フラグメント（天然に存在するヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの短縮分子、アナログ、および変異体が含まれる）も含まれる。
【００５３】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼのヒトｃＤＮＡから４１アミノ酸のシグナルペプチドを含む５３３アミノ酸のタンパク質が予想される(Peters,et al.J.Biol.Chem.265:3374-3381)。シグナルペプチド切断後の推定分子量は約５５．９ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる炭水化物修飾に起因する組換え酵素の見かけ上の分子量は６４ｋＤａである。推定タンパク質配列は、６つの潜在的なＮ結合オリゴサッカリド修飾部位を含み、２，０００ｋＤａの平均分子量および推定分子量と見かけ上の分子量との間の８，０００ｋＤａの分子量の相違に基づくと、そのうちの４つが、使用されていると考えられる。成熟形態の細胞内タンパク質は、システイン結合によって結合した３つのペプチドを有する。最も巨大なペプチドの分子量は４７ｋＤａであり、他の２つの平均分子量はそれぞれ６ｋＤａおよび７ｋＤａである。
【００５４】
本発明の方法にしたがって製造および精製された製剤の説明を表２に示す。
【００５５】
【表４】
0004459059.tif 000006
【００５６】
第７の態様では、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）、またはその生物活性フラグメント、変異体、もしくはアナログの新規の精製方法を特徴とする。第１の実施形態によれば、トランスフェクトした細胞塊を成長させ、これを除去し、組換え酵素を放出させる。カラム汚染を防止するために、外因性物質を、通常、粗バルクから分離すべきである。好ましくは、組換え酵素を含む成長培地に対して限外濾過およびダイアフィルトレーションを行う。１つの方法では、濾過溶液を、DEAE Sepharoseクロマトグラフィカラム、その後Blue Sepharoseクロマトグラフィカラム、その後Cu++Chelating Sepharoseクロマトグラフィカラム、その後Phenyl Sepharoseクロマトグラフィカラムに通過させる。DEAE Sepharose、Blue Sepharose、Cu++Chelating Sepharose、およびPhenyl Sepharoseクロマトグラフィカラムの連続的使用を含むこのような４ステップカラムクロマトグラフィにより、特に高度に精製された組換え酵素が得られる。当業者は、１つまたは複数のクロマトグラフィステップを省略または置換することができるか、クロマトグラフィステップの順序を本発明の範囲内で変化させることができることを認識する。他の好ましい実施形態では、最後のクロマトグラフィカラム由来の溶離物に対して限外濾過／ダイアフィルトレーションを行い、任意の残存ウイルスを除去するための適切なステップを行う。最後に、所望ならば、適切な滅菌ステップを行うことができる。図２に概説したプロセスにしたがって組換え酵素を精製することができる。組換え酵素の性質は、患者への鍵となる。本方法によって生産されたｒｈＡＳＢは実質的に純粋である（９５％超）。
【００５７】
好ましい実施形態では、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液および約１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液（約ｐＨ７．３）を使用して限外濾過／ダイアフィルトレーションステップを行う。別の実施形態では、溶離液を適切な緩衝液、好ましくは塩化ナトリウム−リン酸ナトリウム緩衝液を使用して調整する、約ｐＨ７．３でのDEAE Sepharoseクロマトグラフィステップを行う。さらに好ましい実施形態では、溶離液を適切な緩衝液、好ましくは塩化ナトリウム−酢酸ナトリウム緩衝液を使用して調整する、約ｐＨ５．５でのBlue Sepharoseクロマトグラフィステップを行う。また、好ましい実施形態では、溶離緩衝液（塩化ナトリウム−酢酸ナトリウム緩衝液が含まれる）を使用してCu++Chelating Sepharoseクロマトグラフィステップを行う。特に好ましい実施形態では、組換え酵素を約ｐＨ５．５〜６．０、最も好ましくはｐＨ５．８の塩化ナトリウム−リン酸ナトリウムなどの組成から成る緩衝液中に約１ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮する、クロマトグラフィ由来の溶離液に対して第２の限外濾過／ダイアフィルトレーションステップを行う。リン酸緩衝液は酵素の重大な分解を防止し、且つ安定性を改善するので、リン酸緩衝液がプロセスで使用する好ましい緩衝液である。
【００５８】
本発明の範囲内の特に好ましい精製方法のより詳細な説明を表３に示す。
【００５９】
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【００６０】
処方したバルク製剤物質を、クラス１００層流フード中の０．０４ミクロン、好ましくは２μｍのフィルターにてＴｙｐｅ１ガラスバイアルに濾過滅菌することができる。半自動式液体充填装置を使用して、バイアルに約５ｍＬの最終濃度まで充填することができる。次いで、バイアルを手作業で栓をし、密封し、ラベルを付けることができる。
【００６１】
前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼのより好ましい精製方法は、（ａ）前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む流動物を得るステップと、（ｂ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを切断することができる前記流動物中のプロテアーゼのタンパク質分解活性を減少させるステップであって、前記減少が前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼに悪影響を与えない、ステップと、（ｃ）前記流動物をCibracon blue dye相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、（ｄ）前記流動物を銅キレート化クロマトグラフィ樹脂と接触させるステップと、（ｅ）前記流動物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂と接触指せるステップと、（ｆ）前記前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを回収するステップとを含む。好ましくは、ステップ（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を連続的に行う。この方法は、３つのクロマトグラフィのステップまたはカラムしか必要ない。高度に精製された前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを得るために、さらなるクロマトグラフィのステップおよびカラムは必要ない。この方法は、DEAE Sepharose樹脂を含む流動物を含まない。回収された前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの純度は、少なくとも９９％またはそれ以上である。総回収収率は、少なくとも４０〜６０％であり得る。
【００６２】
好ましくは、前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む流動物を得るステップは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをコードする遺伝子、好ましくはヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞培養物を成長させるステップを含む。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。得るステップは、細胞培養物から流動物を回収するステップをさらに含み得る。得るステップは、流動物を約２０倍に濃縮するステップをさらに含み得る。
【００６３】
この方法の特徴は、プロテアーゼ活性と前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼとの初期の分離である。この分離は、（１）プロテアーゼ活性の減少、阻害、もしくは相互作用、または（２）前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからのプロテアーゼの物理的分離のいずれかを含み得る。好ましくは、この分離は、精製プロセスの間にできるだけ早く行う。目的は、成熟もしくはプロセシング形態および／または他の分解形態に分割される前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの分子数を最小に維持することである。標的組織により容易に取り込まれてその後リポソームにターゲティングされるので、成熟またはプロセシング形態と対照的にＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの前駆体形態は好ましい形態である。前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからプロテアーゼ活性をより早く分離する。前駆体形態の分子数が少ないほど成熟形態またはプロセシング形態に分割される。
【００６４】
流動物のｐＨ値の約４．８〜８．０への調整によってプロテアーゼ活性を減少または阻害する。好ましくは、ｐＨ値は、約４．８〜５．５である。より好ましくは、ｐＨ値は、約４．８と５．２との間である。減少が望ましいプロテアーゼの比活性は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの前駆体形態を成熟形態またはプロセシング形態に特異的に切断するプロテアーゼ活性である。プロテアーゼ活性は、１つまたは複数のシステインプロテアーゼで見いだされる。前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを特異的に切断するシステインプロテアーゼはカテプシンＬである。不活性形態のカテプシンＬの分子量は約３６ｋＤａであり、５．０未満のｐＨへの暴露の際にサイズが２１〜２９ｋＤａの活性形態に変換される（図９Ｃを参照のこと）。ｐＨを、プロテアーゼはその不活性形態から活性形態に変換されず、且つ所望の前駆体Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼまたはその生物活性は悪影響を受けないか不可逆的に悪影響を受けない任意の値に調整することができる。
【００６５】
好ましくは、ステップ（ｃ）は、流動物をCibracon blue dye相互作用クロマトグラフィカラムに通過させることを含む。より好ましくは、Cibracon blue dye相互作用クロマトグラフィカラムは、Blue Sepharose 6 Fast Flowカラムである。好ましくは、ステップ（ｄ）は、流動物を銅キレート化クロマトグラフィカラムに通過させることを含む。より好ましくは、銅キレート化クロマトグラフィカラムは、Chelating Sepharose Fast Flowカラムである。好ましくは、ステップ（ｅ）は、前記流動物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに通過させることを含む。より好ましくは、フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィカラムは、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Subカラムである。好ましくは、ステップ（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）の時間的な順序は、ステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）、およびステップ（ｅ）である。
【００６６】
回収ステップは、流動物の限外濾過／ダイアフィルトレーションを含み得る。回収ステップは、ＤＮＡ除去のための流動物の濾過および／またはウイルス除去のための流動物の濾過を含み得る。ウイルス除去のための濾過は、流動物の０．０２μｍフィルターへの通過を含み得る。
【００６７】
この方法を使用して、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼまたはその生物活性フラグメント、アナログ、もしくは変異体を精製することもできる。
【００６８】
ｒｈＡＳＢの純度を、疎水性の相違に基づいてタンパク質を分離する逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ:reverse-phase high performance liquid chromatography）を使用して測定または決定する。このアッセイは、固定相としてＣ４カラム(Phenomenex Jupiter)を、移動相として水：アセトニトリルを使用する。タンパク質サンプルを最初に水を含むカラムに注入し、これらの条件下で、全てのタンパク質がカラムに結合する。次いで、漸増濃度のアセトニトリルを、カラムに注入する。このアセトニトリル勾配により、各タンパク質が移動相中で溶解するようになり、カラムから溶離する点まで移動相の疎水性が増加する。これらの溶離時間は、混合物中の各タンパク質で正確に再現可能である。２１０ｎｍでの紫外線吸収によってクロマトグラフィ上のピークとしてタンパク質を検出する。各ピーク領域を計算し、サンプルの純度をクロマトグラム中のｒｈＡＳＢピークと総ピーク領域との比として計算することができる。ＲＰ−ＨＰＬＣは、高分解能で再現可能な実績のあるｒｈＡＳＢの純度の決定方法である。
【００６９】
本願以前の研究で、夾雑タンパク質ＥＬＩＳＡの実施によってＡＳＢの純度が決定されることが示されている。この夾雑タンパク質ＥＬＩＳＡの使用方法（その詳細は開示されていない）は、おそらくタンパク質宿主−細胞夾雑タンパク質の混合物に対して惹起された抗体を使用している。抗体を作製するために使用した潜在的夾雑タンパク質の同一の混合物の検量線を使用して、ＥＬＩＳＡを行った可能性が高い。試験サンプルを、夾雑レベルについて標準的な混合物と比較して定量した可能性が高い。これらのアッセイはタンパク質精製で有益なツールであるが、以下の理由で生産物の純度の決定についてＲＰ−ＨＰＬＣよりも精度が低い。
【００７０】
（１）ＲＰ−ＨＰＬＣでは、ｒｈＡＳＢと夾雑物との比率を、同一の測定（ＵＶ吸収）で両方決定する。ＥＬＩＳＡでは、抗体結合によって夾雑濃度を決定するのに対して、標的タンパク質の含有量を別のアッセイ方法（通常、ＵＶ吸収またはBradford法）で決定する。「純度」値を、同一の方法によって実験的に決定された同一の単位を使用した２つの量の比として計算すべきである。
【００７１】
（２）ＥＬＩＳＡを十分に機能させるために、抗体によって検出されたサンプルは標準と同一のタンパク質組成を有さなければならない。これは、夾雑タンパク質ＥＬＩＳＡの場合、可能性は極めて低い。このアッセイ型のアッセイ標準は、抗体が産生された多数の各タンパク質の混合物である。しかし、夾雑物タンパク質は、精製ｒｈＡＳＢ生産物中に小集団でしか存在しないはずである。したがって、抗体試薬は、ここでは異なるタンパク質混合物を検出し、反応対標準はおそらくほとんど非直線形である。これが起こる場合、アッセイにより、各サンプル希釈について正味の値が異なるので、希釈物（存在する場合）は正確な値が得られるかわからない。
【００７２】
（３）さらに、全ての潜在的夾雑物タンパク質が、免疫原性を示すか、抗体作製に使用されるウサギなどの動物と同程度の免疫原性を示すわけではない。したがって、ＥＬＩＳＡによって決定された夾雑物レベルは、精製生産物中に存在する夾雑物の小集団にのみを反映し得る。全く検出できない生産物中の１つまたは複数の夾雑物を有することは十分可能である。対照的に、ＲＰ−ＨＰＬＣは、ＵＶ吸収はタンパク質分子の普遍的性質であるので、全てのタンパク質を検出する。
【００７３】
（４）最後に、精製製剤中に以下の２つの夾雑物型が存在する。生産物非関連夾雑物（上記考察の宿主細胞タンパク質）および生産物関連夾雑物（プロセシング形態および凝集物を含む分解生産物）。夾雑物ＥＬＩＳＡによって後者を検出することができないが、ＲＰ−ＨＰＬＣによって容易に検出することができる。
【００７４】
したがって、夾雑タンパク質ＥＬＩＳＡから得た実際の数には疑いの余地があり、ＲＰ−ＨＰＬＣはより確かな基礎に基づく。
【００７５】
さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、宿主細胞夾雑物と所望の薬物タンパク質生産物のプロセシング形態または分解形態との両方を検出可能である。ウェスタンブロットと組み合わせて使用した場合、宿主細胞汚染物由来の生産物非関連夾雑物を、生産物関連夾雑物と区別することができる。最後に、異なる分子量の夾雑物（低分子量のタンパク質のプロセシング形態または分解形態ならびに単量体、二量体、および他の多量体が含まれる）を検出することができるので、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、生産物関連夾雑物レベルを定量可能である。
【００７６】
この精製方法の実施形態を表４に示す。
【００７７】
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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【００７８】
このようにして得られた製剤の構成要素を表５に示す。本発明の範囲内の製剤組成物の構成要素を表６に示す。
【００７９】
【表７】
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【００８０】
【表８】
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【００８１】
記載の本発明の以下の実施例は例示のみを目的として提供しており、本発明を決して制限しない。
〔実施例１〕
【００８２】
［組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを使用した臨床評価］
〔まとめ〕
マロトー−ラミー症候群としても公知のＭＰＳ  ＶＩの治療のために組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）を示す。本発明者らは、代理および定義された臨床評価項目の安全性、薬物動態学、および初期応答について毎週の注入によって評価される初期の非盲検臨床試験からなるｒｈＡＳＢの臨床開発プログラムを提案する。５人の評価可能な患者についての十分な安全性の情報を収集するために、最低３ヶ月間試験を行う。この時、１ｍｇ／ｋｇの初期用量で過剰な尿中グリコサミノグリカンは産生されないか、有意な直接的な臨床上の利点を得ることができるはずであり、安全性を確立し、且つさらなる有効性を評価するために、さらに３ヶ月間用量を倍増するか維持する。
【００８３】
〔目的〕
本発明者らの主な目的は、最低３ヶ月間ＭＰＳ  ＶＩ患者におけるｒｈＡＳＢの毎週の注入の安全性を証明することである。安全性の測定には、副作用、免疫応答およびアレルギー反応（補体活性化、組換え酵素に対する抗体形成）、完全な臨床化学パネル（腎機能および肝機能）、尿検査、および差分ＣＢＣ(CBC with differential)が含まれる。
【００８４】
１つの二次的目的は、ＭＰＳ  ＶＩに影響を受けることが公知のいくつかのパラメーターの変化のモニタリングによって有効性を評価することである。これらには、６分間歩行試験（運動耐容能の基準として）、全肺機能（ＰＦＴ）評価、尿中グリコサミノグリカンレベルおよび肝腫脹レベル（腎臓および肝臓がＧＡＧ貯蔵の基準として）、発育速度、関節の可動範囲、児童健康評価質問表(Children's Health Assessment Questionnaire)（ＣＨＡＱ）、視力、心機能、睡眠検査、および２つの異なる全体的評価（一方は研究者、他方は患者／介護者によって実施される）が含まれる。第２の二次的目的は、循環における注入薬物の薬物動態パラメーター、ならびに組織源として白血球および口腔組織を使用した細胞内の酵素の全般的分布および半減期を決定することである。これらの測定は、細胞のリソソームに送達された酵素レベルに基づいた臨床反応と用量との関連を補助すると予想される。
【００８５】
〔方法〕
本発明者らは、ＭＰＳ  ＶＩ患者のｒｈＡＳＢを用いた治療の安全性を証明して臨床パラメーターを評価するために単一施設での非盲検試験を行う。２週間のベースライン評価（病歴および身体検査、心理検査、耐久力試験（トレッドミル）、標準的な臨床試験（ＣＢＣ、パネル２０、ＣＨ５０、ＵＡ）、身体のＭＲＩもしくはＣＡＴスキャン（肝臓および脾臓の適定、骨および骨髄の評価、ならびにリンパ節および扁桃のサイズ）、心臓学的評価（心エコー図、ＥＫＧ、ＣＸＲ）、気道評価（肺機能試験）、睡眠中の閉塞性事象を研究するための睡眠検査、関節制限分析（肘および指骨間関節の可動範囲を測定する）、ＣＮＰ圧でのＰＬ、および生化学研究（２つの原因における口腔Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ活性、２つの原因における白血球Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ活性、３つの原因二おける尿中ＧＡＧ、抗ｒｈＡＳＢ抗体のＥＬＩＳＡについての血清作製、および２４時間の尿中クレアチニンクリアランス）が含まれる）のために患者を入院させる。上記評価に加えて、いくつかの身体の運動（頭上への挙手および歩行など）を行った各患者を撮影およびビデオ録画する。酵素注入前に抗ヒスタミンでの前治療を有効に使用することができるように、患者への抗ヒスタミンを増量する。ヒト推奨用量（１ｍｇ／ｋｇ）（５０単位／ｋｇ）を、４時間にわたる静脈内注入によって毎週投与する。患者は、最初の２週間は病院に滞在し、その後の４週間は短期滞在する。最後の６週間の治療を、患者の自宅近くの施設で行う。３ヶ月後に、完全な評価のために患者を病院に戻す。用量を２ｍｇ／ｋｇに漸増する必要がある場合、患者を最初の１２週間は上記と同一のスケジュールに従わせる。いずれかのシナリオにおいて、試験開始から６ヶ月間完全な評価も行う。試験を通して、安全性をモニタリングする。試験を終了した患者は、安全および有効性の条件がＢＬＡ承認まで証明される限り、延長プロトコール後も治療を継続する。
【００８６】
〔患者数および登録〕
試験開始時に１人の患者を登録し、１ヶ月後に２人のさらなる患者を登録し、治療に関連する任意の予期せぬ合併症を罹患しているさらなる２人の患者を２週間後に登録した。任意の登録患者が重症になるか、患児が生命を脅かすか有害な病態のために緊急の臨床手順が必要である場合、さらなる患者を許可すべきである。
【００８７】
〔診断および対象／除外基準〕
患者は、測定可能な臨床的徴候およびＭＰＳ  ＶＩの徴候によって確認され、線維芽細胞の減少または白血球ＡＳＢ酵素活性レベルによって支持されたＭＰＳ  ＶＩの診断書を有する５歳またはそれ以上の男子または女子であり得る。出産能力を有する女性患者は、各投薬直前に妊娠検査（尿中β−ｈＣＧ）が陰性でなければならず、且つ研究を通して医学的に許容された避妊法を使用することを忠告しなければならない。患者が以前に骨髄移植を受けている場合、妊娠もしくは授乳している場合、研究登録前３０日以内に治験薬を受けている場合、または疾患、重篤な介入疾患、もしくは研究遵守を有意に減少し得る他の酌量すべき事情を有する場合、本研究から患者を除外する。
【００８８】
〔用量、経路、および投与計画〕
患者に１ｍｇ（約５０単位／ｋｇ）の用量のｒｈＡＳＢを本研究の最初の３ヶ月間投与する。過剰な尿中ＧＡＧが妥当な量に減少せず、且つ臨床上の利点が認められない事象では、用量を倍増する。５人の患者全員が３ヶ月間の治療を受けた後にのみ、用量を増大させる。このｒｈＡＳＢの投薬形態を、最低１２週間連続して毎週１回約４時間にわたり静脈内投与する。末梢静脈カテーテルを、橈側皮静脈または他の適切な静脈に留置し、３０ｃｃ／時間で生理食塩水の注入を開始する。試験前に完了した漸増試験に基づいて、患者に１．２５ｍｇ／ｋｇまでのジフェニルヒドラミンを静脈内に前投薬する。ｒｈＡＳＢを、１ｍｇ／ｍｌヒトアルブミンを補足した１００ｃｃの通常の生理食塩水で希釈する。心肺およびパルス酸素濃度計でモニタリングしながら、１ｍｇ／ｋｇ（約５０単位／ｋｇ）の希釈酵素を注入する。患者を臨床的および注入に対する任意の副作用についてモニタリングする。任意の異常な症状（倦怠感、息切れ、低酸素症、低血圧、頻脈、吐気、悪寒、熱、および腹痛が含まれるが、これらに限定されない）が認められる場合、直ちに注入を中止する。臨床症状および徴候に基づいて、さらなるジフェニルヒドラミンの投与、マスクによる酸素、静脈内への流動物のボーラス、またはステロイド治療などの他の適切な臨床介入を行うことができる。急性反応が生じた場合、血清中の補体消費を評価する。薬物動態学的分析に必要なサンプリングのために第２の静脈内部位を使用する。
【００８９】
〔評価可能な患者〕
１２週間の治療中に２回しか非連続注入を逃していない任意の所与の患者由来のデータを評価可能と見なす。初期評価、中間点評価、および最終評価を完了させなければならない。
【００９０】
〔安全性〕
酵素の投与速度の変更または抗ヒスタミンもしくはステロイド使用の急性投与によって防止することができない有意な急性反応が生じない場合、酵素療法は安全であると決定する。臨床試験、臨床検査、または他の研究で有意な異常が認められない場合、酵素の長期投与は安全と決定する。抗体の存在または補体活性化自体が危険と見なされるが、このような抗体はＥＬＩＳＡおよび免疫複合体病の可能性の臨床評価によるモニタリングが必要である。
【００９１】
〔有効性〕
本研究の１つの目的は、主試験のデザインのために潜在的評価項目を評価することである。代理および臨床評価項目の改良は、酵素の送達および体内からのグリコサミノグリカン貯蔵の除去の結果として予想される。平均の過剰尿中グリコサミノグリカンレベルが３ヶ月を超えて妥当な量が減少せず、且つ３ヶ月間有意な臨床上の利点が認められない場合に用量を増大させる。改善は、最近終了したＭＰＳ第１相臨床試験で認められたものに匹敵すると予想され、気道指数または睡眠時無呼吸の解決、関節可動性の改善、および耐久力の増大が含まれる。
〔実施例２〕
【００９２】
ＭＰＳ  ＶＩネコについての利用可能な情報ならびに関連する薬理学適研究および毒物学研究の包括的再検討を以下に示す。ゴーシェ病、ファブリー病、およびムコ多糖体症Ｉなどの種々の遺伝性代謝障害のための有望な治療として酵素代償療法を確立した。これらの障害のいくつかにおいて、天然の動物モデルにより前臨床研究時のヒト治療の臨床的有効性を予想することができる。ＭＰＳＩ（イヌモデル）においてこれは真であることが見いだされた。この点を考慮して、この疾患についてのヒト研究の開始前にＭＰＳ  ＶＩネコを用いて研究を行った。ヒトＭＰＳ  ＶＩ患者における臨床試験を進めるにあたり、十分な安全性および有効性データが存在する。
【００９３】
ｒｈＡＳＢを用いたＭＰＳ  ＶＩネコの研究は、薬物投与の結果として死亡したネコは存在しないことを示す。予想するように、ＭＰＳ  ＶＩネコにおける研究でも、ｒｈＡＳＢ取り込みがマンノース６リン酸修飾炭水化物側鎖の存在に依存することを示す。ＭＰＳ  ＶＩネコにおけるｒｈＡＳＢでも、種々の主要な器官から貯蔵物を除去し、骨密度を中程度に変化させることが示された。長期投与量範囲有効性研究により、有意な臨床上の利点が認められる最も低い濃度は１ｍｇ／ｋｇ／週の用量であることが示唆される。ボーラスおよび低速（２時間）注入後の酵素分布、組織グリコサミノグリカン貯蔵のクリアランス、および尿中グリコサミノグリカンレベルの減少を比較するための研究も行った。ＭＰＳ  ＶＩを罹患したネコにおける１ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＳＢの予測臨床用量の毎週の注入の安全性を評価するために研究を進行し続ける。
【００９４】
いくつかのシャムネコファミリーのＭＰＳ  ＶＩの自発的形態は１９７０年代に同定され(Jezyk,Science 198:834-36(1977))、これらの動物の病理学的変化の詳細なレポートが発表されている(Haskins,et al.,Am.J.Pathol.101:657-674(1980);Haskins,et al.,J.Am.Vet.Med.Assoc.182:983-985(1983);Konde,et al.,Vet.Radiol.28:223-228(1987))。これらのネコの臨床所見は幾らか異なるが、これらの変化は全て文献で報告されている一般的変化を示す。(Jezyk,et al.,Science 198:834-36(1977);Konde,et al.,Vet.Radiol.28:223-228(1987);Crawley,「Enzyme replacement therapy in a feline model of mucopolysaccharidosis type VI」PhD thesis,University of Adelaide,Adelaide,S.Australia,(1998))。表６を、非処置ＭＰＳ  ＶＩネコで見いだされると予想される「平均的」変化が得られるようにこれらの源から構築した。
【００９５】
【表９】
0004459059.tif 000013
【００９６】
他の生化学的／形態的決定因子は、３５日目までに非処置ネコの器官の組織中のグリコサミノグリカンの貯蔵が最大となることを示す(Crawley,et al.,J.Clin.Invest.99:651-662(1997))。尿中グリコサミノグリカンレベルを正常なネコおよびＭＰＳ  ＶＩネコの出生時に評価したが、約４０日後、正常なネコのレベルは減少した。ＭＰＳ  ＶＩネコの尿中グリコサミノグリカンは、上昇したままであるか、約５ヶ月後の定常状態に達するまで増加し続ける。
【００９７】
罹患同腹子において臨床所見の変化が認められる。特定の異常の発生のタイミングのいくつかの変動性に加えて、いくつかの臨床的および病理学的変化の進行の経時変化も変化し得る。さらに、典型的には、骨病変が進行するが(Konde et al.,Vet.Radiol.28:223-228(1987))、角膜混濁は進行しない。さらに、いくつかの麻痺したネコは、経時的に重篤な不全麻痺が改善することが認められた。各ネコにおける疾患の進行を詳述した研究は、臨床（またはＸ線写真の）所見に制限されない。これらのいくつかは、神経学的欠陥および胸腰領域における骨組織の増殖に続く髄圧迫などの明確な病理学的相関を示す(Haskins,et al.,J.Am.Vet.Med.Assoc.182:983-985(1983))。
【００９８】
６ヶ月の有効性研究では、新生児ＭＰＳ  ＶＩネコにおける組換えネコＡＳＢを使用した代償療法を行った。これは、いくつかの処置されたＭＰＳ  ＶＩネコがヒト酵素に対する抗体を産生したという所見によって促された（６．５節を参照のこと）。これらの抗体は、酵素の取り込みおよび安定性を変化させることができる(Brooks,et al.,Biochim.Biophys.Acta 1361:203-216(1997))。１ｍｇ／ｋｇのネコ酵素を毎週注入した。研究の主な結論は、尿中ＧＡＧ、体重／成長、骨の形態学、およびいくつかの組織からの貯蔵物質のクリアランスが以前の研究で使用された同用量のヒト組換え酵素と比較して改善されること、正常なネコで見いだされる範囲を超えた抗体が検出されること、および直接比較において疾患の逆転について１ｍｇ／ｋｇのネコ酵素用量が５ｍｇ／ｋｇのヒト酵素用量に匹敵することであった(Bielicki,et al.,J.Biol.Chem.,274:36335-43(1999))。これらの研究は、ネコ由来の酵素をネコに投与した場合に評価項目および免疫原性の改善を増大させることが可能であることを示す。これにより、１ｍｇ／ｋｇ／週のヒト酵素でのヒト患者の投与に対するさらなる支持が得られる。この研究結果を、表７に示す。
【００９９】
【表１０】
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【０１００】
表９は、ＭＰＳ  ＶＩネコモデルにおける組換えヒトＡＳＢを使用して実施した全ての研究のまとめを提供する。
【０１０１】
【表１１】
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〔実施例３〕
【０１０２】
［分布および実行可能性］
酵素の取り込みおよび分布を報告し、さらなる有効性研究のための潜在的評価項目のパイロット研究として役立たせるために最初の研究を行った(Crawley,et al.,J.Clin.Invest.97:1864-1873(1996))。ボーラス注射によって罹患ネコに週１回または２週間毎に１回０．５ｍｇ／ｋｇから１．５ｍｇ／ｋｇまでの組換えヒトＡＳＢを投与した。値の比較により非処置ＭＰＳ  ＶＩネコ（Ｃａｔ  Ｄ）および正常ネコを評価した。非処置ネコ由来のデータは、３８頭の非処置ネコの病歴の評価によってさらに支持された。正常なネコ酵素の存在下でヒトＡＳＢの検出可能な免疫アッセイ技術を使用して、正常なネコにおける急激な取り込みおよび分布の研究を行った。
【０１０３】
これらの研究により、主に、ＭＰＳ動物モデルにおける他の酵素代償研究で認められるように、広範に酵素が取り込まれ、肝臓および脾臓で主に取り込まれることが予想されると結論づけられた。取り込み効率は、酵素上のマンノース６リン酸修飾炭水化物側鎖の存在に依存していた。酵素の半減期は、２〜４日間であると決定された。治療的には、酵素は種々の主要器官から蓄積を除去せず、骨密度を中程度に変化させる。高齢のＭＰＳ  ＶＩネコでは、角膜、骨形態学、および軟骨欠損症は有効に治療されなかった。研究結果を表１０にまとめる。
【０１０４】
【表１２】
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〔実施例４〕
【０１０５】
［ＭＰＳ  ＶＩネコにおける出生時からの処置の有効性］
ＭＰＳ  ＶＩネコの出生時から開始する長期の種々の用量による有効性の研究を行い(Crawley,et al.,J.Clin.Invest.99:651-662(1997))、表１０にまとめる。ＭＰＳ  ＶＩネコを、出生時から０．２、１、および５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＳＢによる静脈内ボーラスで毎週処置した。全部で９頭のネコを５、６、または１１ヶ月間処置した。さらに、非処置コントロールとして１２頭のＭＰＳ  ＶＩネコおよび正常なネコを含んでいた。０．２ｍｇ／ｋｇの用量は研究した１頭のネコでは疾患の進行が変化せず、唯一の報告された臨床上の利点は肝臓クップファー細胞中の蓄積の減少であることに主に結論づけられる。尿中ＧＡＧレベルは、より高い用量群における試験時にほぼ正常値まで減少した。主要器官の改善に加えて、出生時からのより高用量の治療により脊椎の骨の奇形および多数の骨の異常な形態を防止または改善することができた。１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量でＬ−５椎骨無機質量、骨梁の厚さ、および骨表面密度の改善に用量依存性効果を示すが、５〜６ヶ月間のＥＲＴでの骨形成速度の改善は共に等価であった(Byers,et al.,Bone 21:425-431(1997))。僧帽弁および大動脈は用量に依存し、１ｍｇ／ｋｇでは完全ではないが、５ｍｇ／ｋｇでほぼ完全であった。いかなる用量においても軟骨および角膜の蓄積は改善されなかった。本研究により、１ｍｇ／ｋｇ／週の用量は有意な臨床上の利点を得るのに最も低い濃度であることが示唆される。研究結果を、表１１に示す。
【０１０６】
【表１３】
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〔実施例５〕
【０１０７】
［新生ＭＰＳ  ＶＩネコにおける組換えヒトＡＳＢの１週間に２回の注入の有効性］
１週間に２回０．５ｍｇ／ｋｇの注入を評価するために、新生ネコにおいて６ヶ月間の研究を行った。さらに、本研究で使用した酵素は、排他的にCSL-4S-342細胞系統に由来する。本研究では、主に、前に報告した毎週１ｍｇ／ｋｇの用量と比較した結果、本研究により、物理的、生化学的、神経学的、および放射線学的パラメーターが同様に改善されると結論づけられる。最も顕著な相違は、頚椎可動性のわずかな悪化ならびに心臓弁および大動脈などのより緻密な結合組織中のリソソーム蓄積のクリアランスの低さであった。結果を、表１２にまとめる。
【０１０８】
【表１４】
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〔実施例６〕
【０１０９】
［ＭＰＳ  ＶＩネコにおける酵素注入速度の関数としての酵素取り込みおよび分布の評価］
本研究の主な目的は、ボーラス注入および同一の１ｍｇ／ｋｇの用量の低速（２時間）注入後の酵素分布、組織ＧＡＧ蓄積、および尿中ＧＡＧレベルの減少を比較することである。低速投与の提案は、ＭＰＳ１処置のためのα−Ｌ−イズロニダーゼの前臨床研究および臨床研究由来の経験に基づく。さらに、本研究により、細胞系統CSL-4S-342からBioMarin社で産生された酵素が生物学的に活性であり、且つ安全であるという第１のデータが得られた。本研究により、主に、本研究で処置された４頭全てのネコ（２頭／群）が低速または高速注入のいずれかに対して急性副作用を示さず、且つ酵素の反復注入による有害な影響はないと結論づけられる。しかし、ボーラス注入により、肝臓への取り込みが多くなり、これは好ましくない。低速注入により、組織に良好に分布され、それにより臨床試験に好ましい方法である。
【０１１０】
本研究で得られたｒｈＡＳＢの組織分布により、２時間の注入により、肝臓から離れた他の器官の酵素レベルが増加する（脳内の活性増加が含まれる）ことが示唆された。第１および第２の注入の直後に非処置ＭＰＳ  ＶＩネコで認められた範囲未満の尿中ＧＡＧの減少が認められた。細網内皮細胞でリソソーム蓄積の相関が認められ、５回の注入後にいくつかの線維芽細胞（心臓弁）および平滑筋細胞（大動脈）で非常に軽度に認められた。注入に対する他の有意な臨床反応がいずれかの群でも認められないが、研究機関の短さおよび有意な疾患がすでに発症した後から開始したことによりこれは意外なことではない。２時間の注入の延長は安全であり、前の研究で使用したより短いプロトコールと比較しても十分に許容される。２時間の注入により、酵素組織分布について評価可能な１頭のネコに基づいて酵素分布を改善することができる。
〔実施例７〕
【０１１１】
［ＭＰＳ  ＶＩ罹患ネコにおける組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの６ヶ月の安全評価］
本発明の製造プロセスによって生産された酵素を使用して、ＭＰＳ  ＶＩネコにおける２回の６ヶ月研究を開始した。これらの研究の目的は、ＭＰＳ  ＶＩを罹患したネコにおける計画されたヒト臨床用量のｒｈＡＳＢの毎週の注入の安全性および有効性を評価することである。研究６は、最初に３〜５月齢の子ネコへの投与を含む。研究７は、出生時から子ネコに毎週計画されたヒト臨床用量のｒｈＡＳＢの注入を含む。本研究は、潜在的な毒性の評価を意図する。免疫応答の可能性を評価するために、組換え酵素の注入中の挙動の変化についてネコを観察する。補体枯渇および組換え酵素に指向する抗体の形成について血清をモニタリングする。完全な臨床化学パネル（腎機能および肝機能）、尿検査、および完全血球算定（ＣＢＣ）の相違によって全体的な器官機能をモニタリングする。酵素注入に対する設定測定点で尿中グリコサミノグリカンレベルを毎週モニタリングする。疾患の臨床上の改善の証明を報告する。これらのデータにより、処置の潜在的有効性をさらに評価し、インビボでの酵素の活性および取り込みを立証する。本研究を、できる限りＧＬＰ規則の原理および業務に一致する様式で行い、以後も行う。
【０１１２】
第１の研究の予備段階の結果は、ｒｈＡＳＢの投与により、いかなる動物に対してもいかなる有害な影響を与えず、体重および臨床化学は一般に基準範囲内で維持されることを示す。しかし、抗体力価が有意に増大した両方のネコは注入時に異常な臨床的徴候を示したが、一旦酵素注入を中止すると、両動物は正常に挙動し、長期間罹患しないようであった。長期間注入（４時間）および前投薬抗ヒスタミンの増量により、ネコにおいていかなる異常な臨床的徴候も示すことなく治療を継続することが可能である。尿中ＧＡＧレベルのわずかな減少により、組織または循環における蓄積グリコサミノグリカンの減少において治療が幾らか有効であるか示唆されるが、長期的にはこれらのレベルは変動し、解釈が困難である。５頭のネコはＥＲＴに対する応答に明確な臨床的改善が認められないが、以前の研究に基づいて23、これには少なくとも６ヶ月の処置が必要である。５頭のネコのうち４頭で抗体力価が発生し、力価の顕著な増加は、ＥＲＴの２ヶ月後に認められた。これらのネコのうちの２頭の力価は２または３ヶ月後に有意に増加した。
〔実施例８〕
【０１１３】
［ｒｈＡＳＢで処置したＭＰＳ  ＶＩネコの安全プロフィール］
生後２４時間以内に処置した登録罹患ネコに対して研究を開始した。ｒｈＡＳＢを用いて４１頭のＭＰＳ  ＶＩネコを処置した。有益な罹患動物の治療への暴露前に新規のバッチの急性安全性を確認するために、２頭のネコのうちの１頭に対して正常なネコへの酵素の投与を制限した。まとめると、薬物投与の結果としてＭＰＳ  ＶＩネコは死亡しなかったが、４頭のネコはウイルス感染または潜在的な先天性異常の結果として死亡した。本発明の生産方法にしたがって、研究用酵素を生産した。予備データを表１３に示す。
【０１１４】
【表１５】
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〔実施例８Ａ〕
【０１１５】
［低速注入での組織分布］
長時間注入（２時間）または短時間注入（１０〜１５分間）プロトコール（ＡＳＢ−ＰＣ−００４）を使用して、幼若ＭＰＳ  ＶＩネコ（開始時１０週齢未満）におけるｒｈＡＳＢの取り込み速度および組織分布を比較するために、個別の研究を行った。７頭の正常なネコ（１２〜２４月齢）を落ち着かせ、採血するために大腿動脈カニューレを移植した。橈側皮静脈に７ｍＬの体積の１．０ｍｇ／ｋｇまたは７．３ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＡＳＢを４０秒間注入した。投与から約２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、６０、および１２０分後に連続ヘパリン添加動脈血サンプルを得た。遠心分離によって血漿を回収し、分析まで凍結した。４時間後、動物を安楽死させ、組織を回収し、秤量し、分析まで凍結した。
【０１１６】
個別の研究では、３頭の正常なネコ（８〜６６月齢）に、７ｍＬの体積の１．０ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＡＳＢを静脈内ボーラスで投与した。投与から２、４、または７日後に測定点あたり１頭のネコを安楽死させた。選択組織を回収し、秤量し、分析まで凍結した。分析を比較するための組織中のネコＡＳＢレベルを得るために、ｒｈＡＳＢに暴露していない１頭のさらなる正常なネコを安楽死させた。ＥＬＩＳＡアッセイ技術を使用して、血漿中および組織中のｒｈＡＳＢまたはネコＡＳＢを定量した。サンプル中のｒｈＡＳＢを固定化抗ｒｈＡＳＢモノクローナル抗体に吸着させ、ネコＡＳＢをネコＡＳＢと交差反応するポリクローナル抗ｒｈＡＳＢ抗体に吸着させた。次いで、蛍光基質を使用して吸着したＡＳＢを定量した。
【０１１７】
血漿濃度分析は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＡＳＢの半減期は１３．７±３．２分間であり、７．３ｍｇ／ｋｇの用量では約４５分間であることを示した。１．０ｍｇ／ｋｇの投与後の組織の半減期は、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および心臓で２．４〜４．２日の範囲であった。投与から７日後までにこれらの組織（心臓以外）で低レベルであるが検出可能なレベルが認められた。１．０ｍｇ／ｋｇのＡＳＢの投与から４時間後、肝臓に送達された大部分の用量は、軟骨および角膜以外の全組織で検出され、肝臓が大部分を占めた。大脳および小脳以外で、非処置コントロールネコ中のネコＡＳＢレベルよりも４倍（大動脈）〜４９５倍（肝臓）高かった。本研究で決定された組織半減期（１．０ｍｇ／ｋｇで２．４〜４．２日間）は、毎週の臨床投与頻度を支持する。
【０１１８】
本研究の主な目的は、酵素分布、組織ＧＡＧ蓄積のクリアランス、および尿中ＧＡＧレベルの減少における注入速度を評価することであった。１０週齢のＭＰＳ  ＶＩネコ群（ｎ＝２／群）に、１．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＳＢを週１回５週間にわたり短時間（１０〜１５分間）または長時間（２時間）静脈内注入した。最後の注入から２日後に動物を安楽死させ、ＡＳＢ活性の決定および組織病理学的評価のために、選択組織（肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、皮膚、大動脈、大脳、小脳、軟骨、角膜、およびリンパ節）を回収した。分析まで組織を凍結して保存した。研究では、組織ＡＳＢレベルを決定するために上記と同一の免疫アッセイ（ＡＳＢ−ＰＣ−００１）を使用した。２時間注入群中の１頭のネコは、他の処置ネコと比較して組織酵素レベルが減少した。最後の投与後にカテーテル挿入部位付近で高レベルの酵素が検出される一方で、対側肢では低レベルで認められた。これらの所見により、早期にカテーテルを取り外したことがこの動物由来の組織中で認められたＡＳＢの組織レベルの低さに寄与することが示唆される。残りの３頭のネコにおける酵素活性の比較により、１０分間の注入動物と比較した２時間の注入ネコの肝臓、肺、腎臓、大脳、および小脳での酵素活性が増加し、腸間膜リンパ節での活性が減少することを示された。皮膚、軟骨、および角膜で酵素は見出されなかった。本研究由来のデータは限られているが、本研究由来の所見により、２時間の注入により、１０分間の注入と比較して組織（肝臓以外）中の酵素レベルを増大することができることが示唆され、長期注入によってより良好な組織分布が得られることを示す。
〔実施例９〕
【０１１９】
［製造および精製方法（灌流プロセス）］
フェッドバッチのための精製プロセスと灌流ベースの細胞培養プロセスとを比較したプロセスの流れ図を表１４に示す。フェッドバッチ精製プロセスとの比較および灌流精製プロセスのために実施された材料の特定の変更の詳細を表１５にまとめる。表１６は、灌流ベースの細胞培養で使用した精製方法を示す。
【０１２０】
【表１６】
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【０１２１】
【表１７Ａ】
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【表１７Ｂ】
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【表１７Ｃ】
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【表１７Ｄ】
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【０１２２】
【表１８Ａ】
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【表１８Ｂ】
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【０１２３】
表１５および１６に示すように、全ての精製カラムを使用前に再生し、使用後に浄化し、適切な緩衝液中で保存する。
【０１２４】
［精製原料］
全ての材料を、認定ベンダーから入手する。
【０１２５】
【表１９】
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【０１２６】
使用すべきグリセリンは、合成プロセスに由来する。使用した全ての原料は、高温高圧条件や、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）因子に最終的に有害であることが公知の化学反応を含む厳密なプロセスによって製造されるグリセロールおよび脂肪酸などの獣脂誘導体が、感染性である可能性は低いと考えられる「Minimising the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents Via Human and Veterinary Medicinal Products」というタイトルのガイダンスについてのＣＰＭＰ／ＣＶＭＰ注記の最新バージョンに従うべきである。したがって、グリセリン由来のＢＳＥ伝播リスクは低いと見なされる。
【０１２７】
ベンダーの選択および資格、原料の試験、細胞バンクの特徴づけ研究、ｒｈＡＳＢ精製プロセスのウイルス除去研究および不活化能力、ならびに日常的なロット許可試験の組み合わせによってｒｈＡＳＢのウイルス安全性を確認する。ｒｈＡＳＢのウイルス安全性を確実にするために、関連する米国、欧州、およびＩＣＨの規則およびガイドラインを参照した。
【０１２８】
［カラムクロマトグラフィ、ＤＮＡ除去、およびウイルス濾過］
ここでは一連のクロマトグラフィおよび濾過ステップを使用してｒｈＡＳＢを精製する。回収した流動物を限外濾過によって２０倍に濃縮し、ｐＨを調整し、濾過し、Blue Sepharose Fast Flowクロマトグラフィカラム（４５ｃｍ×１６ｃｍ）にロードする。Blue Sepharose Fast Flow流動物を濾過し、その後Copper Chelating Sepharoseカラムにロードする。Copper溶離物を濾過し、その後Phenyl Sepharose Fast Flow High Subカラムにロードする。３つ全てのカラムクロマトグラフィ精製ステップを、結合および溶離モードで運転する。Phenyl Sepharoseカラム溶離物を、陰イオン交換フィルターおよびウイルス減少フィルターに通し、その後濃縮し、限外濾過によって緩衝液を交換する。
【０１２９】
［ウイルス除去／不活化研究］
修正ｒｈＡＳＢ精製プロセスのウイルス減少能力を評価するために、２つの研究を行った。２つのモデルウイルス系（キセノトロピックマウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）およびマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）(Murine Minute Virus)）を使用したBioReliance(Rockvile,MD)で研究を行った。ＸＭｕＬＶは、物理化学的相互作用に対する耐性が低い包膜一本鎖ＲＮＡレトロウイルスである。ＭＭＶは、物理化学的因子に高い耐性を示す小さな非包膜一本鎖ＤＮＡウイルス。
【０１３０】
これらの研究は、２つのクロマトグラフィステップ(Copper Chelating Sepharose FFおよびPhenyl Sepharose FF High Sub）を評価し、ｒｈＡＳＢ精製プロセスでウイルスフィルター（０．０２μｍ）を使用した。プロセスステップの縮小バージョンを使用して、スパイクおよび回収研究を行った。維持された重要なパラメーターは、保持時間およびマトリクス−溶液相互作用であった。緩衝液の置換、線形流速、およびカラムの高さ（しかしカラム直径を調整）によってこれを行った。本研究で使用した材料（生産物および緩衝液）を、実際の実寸大の生産から回収した。
【０１３１】
クロマトグラフィカラム(Copper Chelating SeharoseおよびPhenyl Sepharose)を封入し、典型的なｒｈＡＳＢロード（ブランク）またはBioRelianceへの輸送前にウイルス緩衝液を使用してスパイクしたロードのいずれかを使用して予備運転を行った。ウイルス緩衝液の存在下でのクロマトグラムおよび生産物の収率は、ブランク運転と類似していた。クロマトグラフィの直前にＸＭｕＬＶまたはＭＭＶを使用して、同一のカラムロードをスパイクした。それぞれの評価されたステップについてのウイルス減少量を、カラムロードおよび溶離物中のウイルス負荷の比較によって決定した。本研究結果のまとめを表１８に示す。
【０１３２】
【表２０】
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【０１３３】
［プロセス中の試験］
プロセスを通してプロセス中の試験を行い、図３に例示する。回収細胞培養流動物および精製中間体のプロセス中の試験を、表１９および２０に記載する。
【０１３４】
【表２１】
0004459059.tif 000029
【０１３５】
【表２２】
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【０１３６】
［前駆体ｒｈＡＳＢの灌流精製方法の結果］
表２１は、表１５および１６に記載の精製方法を使用して得たｒｈＡＳＢの純度についてのデータを示す。「ＲＰ−ＨＰＬＣ」カラムによる純度は、ｒｈＡＳＢの前駆体と成熟形態の両方の組み合わせた量について得た純度を示す。
【０１３７】
【表２３】
0004459059.tif 000031
【０１３８】
図４Ａ〜４Ｃは、灌流精製方法の３つのクロマトグラフィステップの代表的クロマトグラムを示す（表１６）。表２２は、３つの各クロマトグラフィステップの前駆体ｒｈＡＳＢの平均回収率を示す。図５は、各クロマトグラフィステップのプロセス中のサンプルおよび精製最終生産物の純度分析についてのデータを示す（前駆体ｒｈＡＳＢ）。
【０１３９】
【表２４】
0004459059.tif 000032
【０１４０】
バッチプロセスおよび灌流プロセスを使用して得た精製生産物を比較した場合、灌流プロセスは明確により純度の高い前駆体ｒｈＡＳＢを生産する。異なる洗浄画分の選択または条件の変更によってバッチプロセスをさらに至適化する試みでさえ、灌流プロセスによって得ることができる純粋な生産物は一貫して得られなかった。灌流プロセスは、９９％またはそれ以上の純度の前駆体ｒｈＡＳＢを一貫して生産することができる一方で、バッチプロセスはできない（表２１）。図６は、細胞培養物をＧ４１８を補足し、且つ葉酸、セリン、およびアスパラギンを補足しない培地を使用して培養する古いバッチ方法を使用して得た生産物（レーン２）と灌流プロセスを使用して精製した精製生産物（レーン３〜９）との比較を示す。ｒｈＡＳＢサンプルを還元剤を含むＳＤＳ中で変性させ、４〜２０％ＰＡＧＥを含むＳＤＳランニング緩衝液による電気泳動に供した。バッチプロセス精製生産物は、灌流プロセス精製生産物よりも明らかに遥かに大量の夾雑物（特に、４８ｋＤａサイズ付近）を含む。バッチプロセスのｒｈＡＳＢは、検出可能な量のプロセシング形態を含むようである（１〜１５％と評価）（レーン２）。灌流プロセス精製ロットは互いに非常に類似し、バッチプロセス精製ｒｈＡＳＢ標準よりも複合体が有意に少なく、灌流プロセス物質の純度がより高いことを示す。
【０１４１】
表２３は、灌流プロセス精製方法を使用して精製した前駆体ｒｈＡＳＢの純度を示す。
【０１４２】
【表２５】
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【０１４３】
表２４は、純度をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（プロセシング形態または多量体などの異なる分子量の夾雑物を定量可能である）によって評価した、灌流プロセス精製方法を使用して精製した前駆体ｒｈＡＳＢロットの純度を示す。
【０１４４】
【表２６】
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【０１４５】
［灌流プロセスにおけるプロテアーゼ除去］
１８０Ｌのバッチスケールでは、ロットあたり２つの比較的巨大な２４ＬのDEAE Sepharose運転が必要である。灌流プロセスにより回収体積が１０倍になるが、実際的な大規模精製のために厳しい実際的でないDEAE Sepharoseカラムサイズおよび緩衝液体積が課される。したがって、新規の灌流精製ステップを合理化する目的で、特に支持できないDEAE Sepharose列(train)の排除を評価した。結果として、３つのカラム列（表１６に記載）により、この大規模生産における障害が克服される。
【０１４６】
主に総タンパク質（プロテアーゼが含まれる）およびｐＨ指示薬（フェノールレッド）を除去するために、バッチプロセスにおけるDEAE Sepharoseクロマトグラフィステップ（表１５に記載の）を使用した。３０２培地組成からのフェノールレッドの除去により、新規のプロセスにおける後者の問題に取り組む。DEAE Sepharoseステップによる総タンパク質の除去により、ｐＨ５．５でより高いBlue Sepharose能力が得られた。新しいプロセスでは、Blue Sepharose条件はバランスのとれた高ｒｈＡＳＢ能力を有する一方でプロテアーゼ活性が限定されることが必要である。能力およびタンパク質分解は共に低ｐＨで増大する。さらに、バッチプロセスにおいてプロテアーゼ（カテプシン）のクリアランスに問題がある場合、プロテアーゼのクリアランスは、その後のCopperクロマトグラフィステップの堅牢性の改良を証明することができるべきである。０．８ｍｇ  ｒｈＡＳＢ／ｍｌ樹脂のロードが許容可能な、低ｐＨでローディングが実施される条件が見出される一方で、洗浄および溶離条件はより高いｐＨ（プロテアーゼ（カテプシン）を有効に除去する条件）である所望の結果が得られる条件が見出された。プロテアーゼ活性（例えば、カテプシン）の除去は、図８のクロマトグラムにおいて証明される。
【０１４７】
新しいプロセス（DEAE FTクロマトグラフィを使用しない）または古いバッチ精製プロセス（ＰＳ溶離物）（ＯＰ）のいずれかを使用した灌流運転から精製されたｒｈＡＳＢ（１０２ＰＤ００５５）の比較は、銀染色および抗ＡＳＢ抗体によって検出可能なさらなるバンドによって証明されるように、（バッチ法を使用して）同一のリアクター運転から精製された古いプロセスの材料（レーンＰＳ溶離物（ＯＰ））は有用なより高いタンパク質分解性を有することを示す（図９参照のこと）。新しいプロセスは、バッチ標準と比較してさらにより純度が高い。Blueクロマトグラフィによってカテプシンプロテアーゼを除去する。新規のプロセスを使用したBlue Strip画分中で抗カテプシン交差反応性材料が認められる。
【０１４８】
以下の実施例１１に記載の薬物動態学の結果は、より純度の高いｒｈＡＳＢ調製物により以前のバッチ標準よりも半減期が長いことを示す。
〔実施例１０〕
【０１４９】
［粒子形成における界面活性剤の効果］
新規の灌流細胞培養プロセスを使用して作製したｒｈＡＳＢバイアルにおける粒子作製に対するポリソルベート８０の効果を決定するために、実験プロトコールを行った。目視アッセイおよび粒子計数アッセイを使用して、粒子作製範囲を決定した。さらに、未処理コントロールと比較したポリソルベート８０の存在下および／または震盪における生産物の質を確認するために、活性試験、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、免疫ブロッティング、およびサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を行った。ｒｈＡＳＢバッチプロセスのために使用したバイアルおよびストッパー（古い、Wheaton 5ml、2905-B24B/West S-127(4401/45)）も、灌流由来の材料のための使用が推奨されているバイアルおよびストッパー（新しい、Wheaton 5ml、2905-B8BA/West S-127(4432/50)）と比較した。
【０１５０】
１０ｍｌの使い捨てピペットを使用してｒｈＡＳＢを０．２μｍフィルターに通過させた後にバイアルに充填した。各ｒｈＡＳＢ汚染試験のために、２つのバイアルに充填した。両方を目視アッセイに使用し、これは一方を粒子計数に供し、他方を残りのアッセイのために保存した。１つの緩衝液コントロールバイアル／試験のみに充填した。準備、サンプル操作、濾過、または充填によって、粒子はほとんど移入しなかった。目視分析および粒子計数分析から（以下の表２５Ａ〜Ｃおよび２６Ａ〜Ｃに示した結果）、０、１、および１４日目に、緩衝液のみのコントロールと比較して配合薬の非震盪バイアルにおいて有意な粒子の形成は検出されなかった。
【０１５１】
４℃で１８時間の震盪後、ポリソルベートを含まない組成から成る緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８））のみにおいてｒｈＡＳＢと共に両バイアル形状で粒子の高い増加が認められた。細かいフレークが明らかに認められた。
【０１５２】
HIAC/ROYCO Model 9703 Particle Counterを使用して、粒子を計数した。液体粒子カウンターは、２．０μｍ〜１５０μｍの範囲の粒子のサイズを測定し、計数することができる。それぞれ５ｍＬ未満の３つのアリコートを、光不明瞭化センサー(light obscuration sensor)に入れる。運転２および３由来の平均粒子数をｍＬあたりの粒子数として報告する。粒子サイズ１０μｍのHIAC-Royko定量に基づいて、古いおよび新しいバイアル形状それぞれにおけるｍＬあたりの粒子数が２０６９および１１９０の粒子を計数した。０．００１％ポリソルベート８０の存在下で、ｍｌあたりの粒子数は２１および４９と顕著に減少した。０．００５％ポリソルベート８０では、震盪および非震盪バイアルの両方で本質的に有意な相違を検出することができなかった。
【０１５３】
ポリソルベート８０を使用しない古いバイアル／シールでは、ｍｌあたりの粒子数が震盪１〜１４日後に２０６９個から２６８個に予想外に減少した。ウイルスアッセイにより、より少数が認められた同一の１４日目のバイアルでより巨大なフレークが認められ、より巨大な粒子がＨＩＡＣ−Ｒｏｙｋｏアッセイを妨害するか、古いバイアル形状がより巨大であるが少数の粒子への最終的な合体および凝集を伴う粒子形成の増大に寄与する可能性がある。
【０１５４】
震盪後のタンパク質の完全性を確認するためにさらなる試験を行った。比活性は変わらなかった。サイズ排除クロマトグラフィ（機械的振動に影響をうけ得るタンパク質凝集の変化を検出することができる方法）では、より巨大な分子量種の増加は認められなかった。破壊生産物を検出するために、ｒｈＡＳＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色するか、ニトロセルロースに移して抗ｒｈＡＳＢ抗体でブロッティングした。いかなるサンプルにおいてもさらなるバンドは検出されなかった。
【０１５５】
【表２７】
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【０１５６】
【表２８】
0004459059.tif 000036
【０１５７】
【表２９】
0004459059.tif 000037
【０１５８】
【表３０】
0004459059.tif 000038
【０１５９】
【表３１】
0004459059.tif 000039
【０１６０】
【表３２】
0004459059.tif 000040
【０１６１】
結果は、手作業の充填手順により配合に無関係の粒子はほとんどないことを示した。１８０ｒｐｍで一定且つ激しい震盪後、ポリソルベート８０を使用しないで配合したｒｈＡＳＢを含むバイアル粒子は明確に認められた。
【０１６２】
ポリソルベート８０の存在は、機械的に誘導された粒子形態の阻害に非常に有効であった。０．００１％および０．００５％のポリソルベート８０では、震盪バイアルにおける粒子数は本質的にバックグラウンドレベルに維持されながら、保護は著しかった。０．００５％のポリソルベート８０濃度により、０．００１％のポリソルベート８０濃度よりも粒子数の減少においてわずかな改善が認められた。
【０１６３】
活性、タンパク質濃度、純度、または凝集率によって評価したところ、震盪または処方では決して生産物は不安定にならなかった。
〔実施例１１〕
【０１６４】
［ヒトの臨床試験］
本明細書中に記載のバッチプロセスにしたがって生産された製剤を使用して、ＶＩ型ムコ多糖体症（ＭＰＳ  ＶＩ）（マロトー−ラミー症候群）患者組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）の第１／２相の無作為な二重盲検臨床試験を行った。９ｍＭリン酸二水素ナトリウム・１Ｈ2Ｏ、１ｍＭ第二リン酸ナトリウム・７Ｈ2Ｏ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムでｒｈＡＳＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度（ｐＨ５．８）に配合した。患者に投与する場合、室温で通常の生理食塩水を含む静脈内（ＩＶ）バッグ中での適量の薬物溶液の希釈によってｒｈＡＳＢを調製した。注入関連反応の可能性を減少させるために、注入前に全患者に抗ヒスタミンを前投薬した。
【０１６５】
本研究の目的は、ＭＰＳ  ＶＩ患者のＥＲＴとして２つの用量のｒｈＡＳＢの安全性、有効性、および薬物動態学プロフィールを評価することであった。患者に二重盲検様式で２つの投与群（０．２および１．０ｍｇ／ｋｇ）の１つに無作為に選択した。４時間のＩＶ注入として、１週間に１回薬物を投与した。安全性の基準は、完全な化学パネル、尿検査、完全血球算定（ＣＢＣ）の相違、およびＡＥ追跡を含んでいた。全患者について免疫応答および注入関連反応、補体活性化、ならびに抗体形成を評価する。有効性パラメーターは、運動耐容能／耐久力（６分間歩行試験）、呼吸器の能力（肺機能試験）、関節運動範囲（ＪＲＯＭ）、機能的状態（Childhood Health Assessment Questionaire（ＣＨＡＱ））、尿中ＧＡＧレベル、肝腫脹の変化、視力、心機能、および睡眠時無呼吸を含んでいた。
【０１６６】
注入時および注入後の抗原（酵素）レベルを測定するために、１、２、１２、２４週間の注入後、およびその後定期的に薬物動態学的評価を行った。患者が、８４週間後から開始する０．００５％ポリソルベート８０を使用して配合した新規の灌流プロセス精製ｒｈＡＳＢに切り替えた場合、８３、８４、および９６週間後の非盲検期間において薬物動態学的評価を行った。
【０１６７】
７人全ての患者を登録し、急速に進行するか中程度に進行する疾患と一致する特徴範囲を有する患者を含んでいた。個人的理由により１人の患者は３週目で研究を停止し、交換した。残りの６人の患者について、２４週間の処置完了後に事前に指定していた中間分析を行った。２４週目の中間分析由来のデータは、ｒｈＡＳＢが十分に許容され、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でより高い臨床上の利点が得られ、且つ０．２ｍｇ／ｋｇの用量に匹敵する安全プロフィールを有することを示した。
【０１６８】
低用量群の患者に、１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルの処置を継続した。４８週間後に間隔をおいて（５９週および６９週）２人の患者により高い用量レベルの処置を開始した。９６週まで患者に計画した大多数のｒｈＡＳＢ注入を行った。この期間中に全部で２回を超えて注入しそこなった患者は存在しなかった。
【０１６９】
最初に処置から２４週後、その後４８週後に実施した安全性評価は、０．２または１．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＳＢでの毎週の処置は十分に許容され、２つの用量群で有意差はなないことを示した。より長期（９６週）の毎週１．０ｍｇ／ｋｇでの処置も十分に許容された。
【０１７０】
［抗ｒｈＡＳＢ抗体の生産および補体レベル］
６人の全患者は３０週目にｒｈＡＳＢに対する抗体を生産した。６人の患者のうち４人は比較的低いレベルのままであり、６０週までにピークレベルから減少した。他の４人の患者よりも高レベルで抗体を生生した２人の患者のうちの一方の患者の抗体レベルは２４週でピークレベルから減少、他方の患者のレベルは６０週でピークレベルから急速に低下した。９６週の処置においてＣＨ５０、Ｃ３、またはＣ４補体レベルの一貫した変化は認められなかった。患者によってはＣＨ５０レベルは断続的に適度に減少したが、補体消費またはこれらの低レベルと注入関連症状との間の相関の証拠は認められなかった。図１０は、９６週間にわたる処置における抗体レベルを示す。
【０１７１】
［尿中グリコサミノグリカン］
尿中ＧＡＧレベルは、ＭＰＳ罹患個体におけるリソソームの蓄積度の生化学的マーカーである。２４週までに、低用量群で５５％であるのに対し高用量群で平均７０％の尿中ＧＡＧが減少した。ＤＳ（ＭＰＳ  ＶＩの主な蓄積産物）の比率は、同様にそれぞれ４４％および１８％減少した。処置に対する週の関数としてのＧＡＧの尿中排出量の変化の経時変化の試験により、高用量群で６週までに総尿中ＧＡＧがより明白に減少した。これらのデータは、より高い用量の方が尿中ＧＡＧおよびＤＳの両方の変化が大きいことを確認する。本研究で残った両方の処置群の患者において９６週まで尿中ＧＡＧは減少し続けた。図１１は、９６週間にわたる総尿中ＧＡＧレベルの減少を示し、図１２は、９６週の年相応の正常レベルとの比較を示す。本研究で残った０．２ｍｇ／ｋｇの用量群の２人の患者（患者４１および４５）を、６９週および５９週それぞれでの１．０ｍｇ／ｋｇの用量に供することに留意のこと。９６週で、スクリーニングにより、これら２人の患者のＧＡＧは８５％および６３％減少した。これらは、９６週にわたり１．０ｍｇ／ｋｇの投与した患者で見出された減少と類似していた。患者４２、４３、および４４は、スクリーニングによりそれぞれ６４％、７７％、および８６％減少した。両群では、より高いベースラインＧＡＧレベルの患者は、正常範囲付近のＧＡＧレベルの患者より減少率が高かった（正常範囲の上限の５倍超（すなわち、平均＋２ＳＤ））。
【０１７２】
［耐久力］
耐久力の主な臨床基準を６分間歩行試験とした。１．０ｍｇ／ｋｇの研究薬物を投与するために無作為に選択したベースラインで１００ｍを超えて歩行できない２人の患者（番号４３および番号４４）は、２４週までに全歩行距離が非常に改善された。Ｃ１〜Ｃ２頚椎圧迫を発症した番号４４を除く全患者は、４８週および９６週までに歩行距離が改善された。図１３は、９６週にわたる処置による６分間歩行試験の結果の改善を示す。
【０１７３】
［有効性のさらなる基準］
９６週の研究薬物処置の間に多数の他の有効性パラメーターの適度な改善が認められた。肩のＲＯＭ（特に屈曲）は、２４週の評価で６人の患者のうち５人で改善された。９６週で評価した４人の患者のうちの３人（番号４１、４３、および４５）は、肩の屈曲が増加し続けた。９６週で４人の患者のうちの３人で、気道機能、強制肺活量（ＦＶＣ）、および１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）の測定においてわずかな改善も認められた。登録した６人の患者のうち４人で測定可能な視力はこれらの４人の患者の３人において１つまたは複数のラインによって改善されたが、１人の患者はこの期間中に処方レンズを変更した。特にベースラインでより大きな肝臓を有する患者において、ＣＴスキャンによって測定された肝腫脹（この疾患の顕著な特徴ではない）も適度に減少した。
【０１７４】
残りの有効性パラメーター（ＥＣＧによる心機能、握力およびピンチ力、ＣＨＡＱ質問表、身長および体重、骨ミネラル密度、ならびに睡眠検査が含まれる）でわずかな変化が認められた。９６週間にわたりこれらのいかなるパラメーターにおいても有意な悪化は認められなかった。
【０１７５】
［薬物動態学］
１、２、１２、および２４週の二重盲検ならびに８３、８４、および９６週の非盲検延長の間に薬物動態学的評価を行った。８４週から開始し、患者に実施例９に記載の灌流プロセスによって製造されたｒｈＡＳＢを投与し始めた。
【０１７６】
０、１５、３０、６０、９０、および１８０分の注入時、２４０分の注入終了時、ならびに注入から５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、および２４０分後に血液サンプルを採取した。非コンパートメント法(non-compartmental method)ｒｈＡＳＢの薬物動態学パラメーターを計算した。無限性および最初の瞬間に対する血漿濃度曲線下領域を、定量限度を超える濃度を含む最後の測定点に対して線形台形法を使用して計算した。
【０１７７】
０．２ｍｇ／ｋｇ／週投与した患者について、ＡＵＣ0-1の平均値は、１週から２４週で比較的一貫していた（１週で１０，００９±５，１０７、２週で１１，２３２±３，９１４、１２週で１３，８１２±９，２３０、および２４週で１３，８１２±９，２３０）。１．０ｍｇ／ｋｇ／週のコホートについて、ＡＵＣの平均値は、１週で９４，４７６±１３，７８５、２週で１８０，９０９±４６，３７７、１２週で１５７，８９０±４５，３８６、および２４週で２５１，９０７±２０１，７４７であった。この１．０ｍｇ／ｋｇ／週群について、ＡＵＣ0-1およびＡＵＣ∞の値の増加ならびに大きな標準偏差は、群内の他の２人の患者よりもＡＵＣが約２倍の１人の患者に起因した。
【０１７８】
０．２ｍｇ／ｋｇ／週コホートと１．０ｍｇ／ｋｇ／週コホートとの間のＡＵＣ0-1の平均値は、５倍を超える非常に過剰な用量で増加し、ｒｈＡＳＢの薬物動態学はこの投与範囲で線形ではないことを示す。
【０１７９】
以下の表２７に８３、８４、および９６週の薬物動態学パラメーターを示す。
【０１８０】
【表３３】
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【０１８１】
８３週のパラメーターは、２〜２４週から得たものに類似し（１人の高ＡＵＣ患者を除く）、約１８ヶ月の毎週の曝露後のｒｈＡＳＢの薬物動態学の一貫性を示す。８３週から８４週までの平均ＡＵＣ値は約２５％上昇する傾向がある一方で、総体内クリアランスは約２５％低下する傾向があった。８３週から８４週までの半減期は約８．５分間から１７〜１９分間に増加した。９６週のパラメーターは、８４週のそれに類似していた。この薬物動態学データは少数の患者に由来するが、各値は実質的に重複しており、これらの結果は、実施例９に記載の修正プロセスから得たＡＳＢ調製物の半減期は元のｒｈＡＳＢ調製物より長いことを示した。
〔実施例１２〕
【０１８２】
［さらなるヒトの臨床研究］
実施例９に記載の新しい灌流プロセスにしたがって生産された製剤を使用して、ＶＩ型ムコ多糖体症（ＭＰＳ  ＶＩ）（マロトー−ラミー症候群）患者における組換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）の第２相非盲検臨床試験を行った。９ｍＭリン酸二水素ナトリウム・１Ｈ2Ｏ、１ｍＭ第二リン酸ナトリウム・７Ｈ2Ｏ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％ポリソルベート８０でｒｈＡＳＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度（ｐＨ５．８）に配合した。
【０１８３】
本研究の目的は、１．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＳＢの毎週のＩＶ注入の安全性、有効性、および薬物動態学を評価することであった。本研究のために、比較的均一な耐久力障害患者組が含まれるように対象基準を修正した。患者は少なくとも１ｍ歩行することができなければならないが、ベースラインでの１２分間歩行試験の最初の６分間で２５０ｍしか歩行できなかった。他の対象基準および除外基準は、患者は少なくとも５歳であり、生化学的または遺伝的診断が報告されているという点で、第１／２相臨床研究の基準と類似していた。歩行試験に加えて、本研究ではＭＰＳ患者で前に研究されていない多数の測定点を含んでいた。
【０１８４】
安全性の基準は、臨床検査評価、尿検査、ＣＢＣの相違、ＥＣＧ、およびＡＥの追跡を含んでいた。全患者について注入関連反応ならびに補体消費および抗体断片化を評価する。有効性パラメーターは、耐久性および可動性の測定（１２分間歩行試験が含まれる）、長期間立ち上がり前進試験(Expanded Timed Get Up and Go Test)、３分間の階段上り試験、および身体活動を含んでいた。主観的効果（関節の痛みおよび関節の硬さなど）を問診票で評価し、デンバー式発達スケール(Denver Developmental scale)における他の測定（靴紐を結ぶ時間、頭頂に触れる時間、セーターを着る時間、コインを拾い上げてこれらをカップに入れる時間など）も評価した。さらなる有効性の基準は、視力の測定、骨密度の研究、握力およびピンチ力の評価、肩のＲＯＭ、機能の状態、尿中ＧＡＧ排出、目視試験、心機能、ならびに睡眠中の酸素飽和度を含んでいた。注入時および注入後の抗原（酵素）レベルを測定するために、１、２、１２、２４週間の注入後に薬物動態学的評価を行った。１０人の患者を登録した（米国人５人およびオーストラリア人５人）。全ての患者に２４週の処置を完了させた。死亡者や中断者は存在しなかった。全患者は全２４回の研究薬物注入を受けたので、全患者を安全性および有効性分析に含めた。
【０１８５】
第１／２相研究として、第２相研究で登録されたＭＰＳ  ＶＩ患者間で疾患の重症度が広範に異っていた。数人の患者は、疾患の神経学的特徴（交通性水頭症、頚椎の不安定、および椎間板疾患が含まれる）も有していた。
【０１８６】
［臨床検査評価］
２４週間にわたりこれらの患者で臨床的に有意な検査所見の異常は認められなかった。
【０１８７】
［抗ｒｈＡＳＢ抗体および補体研究］
２４週までに１０人の患者のうち８人がｒｈＡＳＢに対する抗体を産生した。他の患者より高いレベルで抗体を産生した３人の患者のうち、２人の患者の抗体レベルが２４週後に上昇し続けたが、４８週までに安定化するようであった。これら２人の患者は、「ヌル」遺伝子型であるかＡＳＢの推定主要抗原部位が変異していた。他の患者と比較して、これら２人の患者の尿中ＧＡＧの減少は低かった。図１４は、４８週にわたる処置における抗体レベルを示す。
【０１８８】
２４週で、１人の患者１２週注入前後のＣ４値およびＣＨ５０値が減少し、これは研究者によって臨床的に有意であると見なされた。Ｃ４およびＣＨ５０は、注入前にわずかに正常値の下限未満であり、注入後にさらに減少した。これらの結果により、補体消費の可能性が示唆されるが、このような消費と一致する臨床的徴候および臨床症状は認められなかった。本研究におけるいかなる他の患者においても臨床的に有意な補体レベルの異常は認められなかった。
【０１８９】
［尿中グリコサミノグリカン］
尿中ＧＡＧレベルの平均減少は急速であり、６週で最下点に達し、６週から２４週まで比較的一定なままであった。２４週までに尿中ＧＡＧは平均７１％減少し、４８週までに尿中ＧＡＧは平均７６％減少した。１０人全ての患者は、処置２４週後に正常範囲に近づく尿中ＧＡＧレベルに減少した。これらのデータは、１／２相研究における７人の患者で認められた結果と一致する。図１５は、４８週間にわたる総尿中ＧＡＧレベルの減少を示し、図１６は、４８週でのレベルと年相応の正常レベルとの比較を示す。
【０１９０】
［耐久性の基準］
ベースラインおよびその後６週間毎の全ての患者についての１２分間歩行試験において歩行距離を評価した。各評価で２つの異なる基準の平均として距離を記録し、６分間および１２分間の両方で決定した。
【０１９１】
ベースラインでは、６分間および１２分間の平均歩行距離は、それぞれ１５２．４（±７５．０）および２６４．０（±１６１．７）であった。２４週での６分間の平均歩行距離は５７．３（±５９．０）メートル改善される一方で（患者あたり６２％）、１２分間の平均歩行距離は平均１５５メートル改善された（患者あたり９８％）。全ての患者で１２分間の歩行距離が改善され、１人を除く全ての患者で歩行の最初の６分間で改善された。４８週で、１２分間の歩行距離における平均改善は２１２メートルであった（患者あたり１３８％）。図１７は、４８週にわたる１２分間の歩行距離の結果の改善を示す。
【０１９２】
３分間の階段上りは、耐久力の第２の試験基準であった。ベースラインで、患者は平均５０．３（±２９．５）段上ることができた。２４週までの平均階段上り数は、９８．１（±６．２５）段に増加し、４８段改善し、患者あたり１１０％（±１１６％）であった。４８週までの平均階段上り数は合計で１１１段で６１段増加し、患者あたり１４７％の改善であった。図１８は、４８週間にわたる３分間の階段上り結果の改善を示す。患者は、階段上り数に関して非常にばらつきがあり、ベースラインでのパフォーマンスは２４週での改善度と必ずしも相関しなかった。
【０１９３】
［さらなる有効性基準］
本研究の最初の２４週で多数のさらなる有効性パラメーターを評価した。全体的な機能的能力の基準として長期間立ち上がり前進試験を使用した。全体的に、ベースラインと２４週との間のこの試験に必要な全時間の有意な減少は認められなかったが、４８週で適度に改善した。図１９は、４８週間にわたる処置における長期間立ち上がり前進試験の結果を示す。
【０１９４】
肺機能を評価するために、努力呼気時間（ＦＥＴ）、ＦＶＣ、およびＦＥＶ１を行った。以下の表２８は、ベースライン、２４週、および４８週での肺機能値を示し、４８週では身長および肝臓肥大症の改善も示す。２４週間にわたりこれらのパラメーターの有意な変化は認められなかった。４８週では、１０人中５人の患者のＦＶＣおよびＦＥＶ1が改善し、この５人のうちの３人は成長における変化が２％未満にもかかわらず改善を示した。４８週では、努力呼気時間（１秒超）も平均４３％改善した。
【０１９５】
【表３４】
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【０１９６】
【表３５】
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【０１９７】
能動的および受動的な肩のＲＯＭ（屈曲、伸展、回転）を評価した。群全体で、能動的および受動的ＲＯＭの両方で増加率が適度に増加したが、患者によっては２４週での測定で減少した。４８週で、いくつかの外れ値に起因する結果の大きなばらつきが認められるが、特にベースラインでの９０°の屈曲未満の患者で認められる肩ＲＯＭが改善し続けた。上の表２９は、ベースライン、２４週、および４８週における肩の運動範囲を示す。
【０１９８】
問診票を使用して痛みおよび硬さを評価した。２人の患者は痛みのスコアが変化しなかったが、７人の患者は２４週で痛みの改善が認められた（１人の患者はベースライン評価を行っていなかった）。評価した９人全ての患者において２４時間で硬さが改善された。問診票を使用して評価した痛みおよび硬さは、４８週まで改善し続けた。４８週間にわたる関節の痛みの問診票および関節の硬さの問診票の結果を、それぞれ図２０および２１に示す。
【０１９９】
患者群全体で有意な握力の改善が認められた。７人の患者は、片手または両手の握力が改善した。２４週にわたるピンチ試験では、変化はほとんど認められなかった。４８週を除いて他の生活の質の評価で有意な変化はほとんど認められず、器用さおよび感覚（コインの拾い上げによって測定）は適度に改善した。
【０２００】
ベルトを取りつけたActiTrac（登録商標）デバイスを使用して活動レベルを評価した。活動レベルの有意な変化は認められなかった。
【０２０１】
心機能評価（ＥＣＧ）または身長および仰臥位の長さに有意な変化は認められなかった。患者の小集団で行った睡眠検査で臨床的に有意な変化は認められなかった。
【０２０２】
本発明を現在好ましい実施形態を参照して記載しているが、本発明の精神を逸脱することなく種々の修正形態を実施することができると理解すべきである。したがって、本発明は、特許請求の範囲のみによって制限される。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】本発明のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の生産方法の流れ図である。
【図２】バッチプロセス法によるヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の精製方法の流れ図である（表１４）。
【図３】灌流プロセス法によるヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（ＡＳＢ）の精製方法の流れ図である（表１４および１５）。
【図４】Blue Sepharoseカラム（図４Ａ）、Copper Chelating Sepharoseカラム（図４Ｂ）、およびPhenyl Sepharoseカラム（図４Ｃ）のクロマトグラムの結果を示す図である。
【図５】灌流プロセス精製方法の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲルを示す図である（表１４および１５）。
【図６】以下のサンプルの４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルの結果を示す図である。レーン１、ＮＥＢブロードレンジ予備染色分子量スタンダード（分子量をｋＤａで示す）；レーン２、５μｇのロットAS60001由来のＡＳＢ（オールドバッチプロセス）；レーン３、５μｇのロットAP60109 UF4由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；レーン４、５μｇのロットAP60109 UF10由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；レーン５、５μｇのロットAP60109 UF15由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；レーン６、５μｇのロットAP60109 AUF18由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；レーン７、５μｇのロットAP60109 AUF22由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；レーン８、５μｇのロットAP60109 AUF25由来のＡＳＢ（灌流プロセス）；およびレーン９、５μｇのロットAP60109 AUF27由来のＡＳＢ（灌流プロセス）。ゲルを、クーマシーＲ−２５０で染色するか、銀染色する。
【図７】図７Ａは、銀染色４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルの結果を示す図である。図７Ｂは、クーマシー染色４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルの結果を示す図である。レーン１、ロットAP60202 UF4；レーン２、ロットAP60202 UF10；レーン３、ロットAP60202 UF18；レーン４、ロットAP60202(BMK)；レーン５、ロット102PD0139x B3；レーン６、ロット102PD0139x B5；レーン７、灌流参照標準rhASB-202-002；レーン８，、ロット102PD0139 P1；レーン９、ロット102PD0139 P2；およびレーン１０、Mark 12標準（分子量をｋＤａで示す）。
【図８】Blue Sepharoseカラム（図８Ａ）、Copper Chelating Sepharoseカラム（図８Ｂ）、およびPhenyl Sepharoseカラム（図８Ｃ）から得たプロフィールを示す図である。図８Ｂでは、赤色の線でカテプシン活性を示す。
【図９】図９Ａは、銀染色４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルの結果を示す図である。図９Ｂは、ニトロセルロースに移し、抗ｒｈＡＳＢ抗体で探索した図９Ａのゲルから移したタンパク質の結果を示す。図９Ｃは、ニトロセルロースに移し、抗カテプシン抗体で探索した図９Ａのゲルから移したタンパク質の結果を示す。BioLabPreStainは分子量標準を示す（分子量をｋＤａで示す）。
【図１０】ヒトの第１相／第２相臨床試験における９６週間にわたるｒｈＡＳＢでの処置による血清抗ＡＳＢ抗体レベルを示す図である。
【図１１】ヒトの第１相／第２相臨床試験における９６週間にわたるｒｈＡＳＢでの処置による総尿ＧＡＧレベルの減少を示す図である。
【図１２】ｒｈＡＳＢで処置したヒトにおける９６週目の尿中ＧＡＣレベルと年相応の正常レベルとの比較を示す図である。
【図１３】ヒトの第１相／第２相臨床試験における９６週間にわたるｒｈＡＳＢでの処置による６分間の歩行試験の結果の改善を示す図である。
【図１４】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる処置による血清抗ＡＳＢ抗体レベルを示す図である。
【図１５】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる処置による総尿中ＧＡＧレベルの減少を示す図である。
【図１６】ｒｈＡＳＢで処置したヒトにおける４８週目のレベルと年相応の正常レベルとの比較を示す図である。
【図１７】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる１２分間の歩行試験の結果の改善を示す図である。
【図１８】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる３分間の階段上り試験の結果の改善を示す図である。
【図１９】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる処置による長期間立ち上がり前進試験(Expanded Timed Get Up and Go Test)の結果を示す図である。
【図２０】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる処置による関節の痛みの質問結果を示す図である。
【図２１】ヒトの第２相臨床試験における４８週間にわたる処置による関節の堅さの質問結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図６Ｅ−６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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