(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むがアミノ末端メチオニンを欠くDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の24〜468位のアミノ酸配列を含むDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的な、ヌクレオチド配列
からなる群から選択される配列に対して少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含み、アポトーシス誘導活性を有するDR4ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の2〜468位のアミノ酸配列を有するDR4ポリペプチドをコードする、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により作製される、組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製するための方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により産生される、組換え宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の単離された核酸分子のいずれかによってコードされるDR4ポリペプチドを産生するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項７に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、組換え方法。
【請求項９】
単離されたDR4ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含み、アミノ末端メチオニンを欠く、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｃ）配列番号２の24〜468位のアミノ酸配列を含む、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列、
からなる群から選択される配列に対して少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含み、アポトーシス誘導活性を有する、DR4ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のDR4ポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ここで、ポリヌクレオチドが、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むがアミノ末端メチオニンを欠くDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の24〜468位のアミノ酸配列を含むDR4ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的な、ヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、核酸分子であって、（ａ）〜（ｄ）の該核酸分子によってコードされる該ポリペプチドは、アポトーシス誘導活性を有する、核酸分子。
【請求項１２】
単離されたDR4ポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含み、アミノ末端メチオニンを欠く、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｃ）配列番号２の24〜468位のアミノ酸配列を含む、DR4ポリペプチドのアミノ酸配列；
からなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドであって、（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドは、アポトーシス誘導活性を有する、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、レセプターの腫瘍壊死因子ファミリーの新規なメンバーに関する。より詳細には、ヒト死ドメイン（death domain）含有レセプター４と呼ばれ、本明細書では時として「DR4」とも呼ばれる、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。DR4ポリペプチドもまた提供され、ベクター、宿主細胞、およびポリペプチドを作製する組換え方法も同様である。さらに本発明は、DR4活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
発明の背景
多くの生物学的作用（例えば、特定の刺激および天然の生物学的プロセスに対する応答）は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカインは、レセプターと連動し、そして細胞内応答を生じることにより、レセプターを介して作用する。
例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αおよび腫瘍壊死因子βは、多数の生物学的プロセス（感染ならびにショックおよび炎症性疾患の誘発に対する防御を含む）を調節するようにTNFレセプターを介して作用するサイトカインである。TNF分子は「TNFリガンド」スーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプターまたは対のリガンド（「TNFレセプター」スーパーファミリー）と共に作用する。現在までに、TNFリガンドスーパーファミリーの９個のメンバーが同定されており、そしてTNFレセプタースーパーファミリーの10個のメンバーが特徴付けられている。
リガンドには、TNF-α、リンホトキシン-α（TNF-βとしても公知である、LT-α）、LT-β（複合体ヘテロ三量体LT-α2-β中に見出される）、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、OX40L、および神経成長因子（NGF）が含まれる。TNFレセプターのスーパーファミリーは、p55TNFレセプター、p75TNFレセプター、TNFレセプター関連タンパク質、FAS抗原またはAPO-1、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX40、低親和性p75、およびNGFレセプターを含む（Meager, A., Biologicals, 22: 291-295（1994））。
TNFリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化Ｔ細胞により発現される。これは、これらが細胞個体発生および機能の根底にある他の細胞型とのＴ細胞の相互作用に必要であることを意味する（Meager, A.、前出）。
TNFレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についてのかなりの洞察が、これらのタンパク質の発現を消滅させる変異体の同定および作製により得られている。例えば、FAS抗原およびそのリガンド中の天然に存在する変異は、リンパ球増殖疾患を生じ（Watanabe-Fukunaga, R.ら、Nature 356:314（1992））、これはおそらく、プログラムされた細胞死の失敗を反映する。CD40リガンドの変異は、血漿中の高レベルの免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧにより特徴付けされるＸ連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全なＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化を示す（Allen, R.C.ら、Science 259: 990（1993））。低親和性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な知覚神経支配（innovation）により特徴付けられた障害を生じる（Lee, K.F.ら、Cell 69: 737（1992））。
TNFおよびLT-αは、２つのTNFレセプター（55kdおよび75kdのTNFレセプター）へ結合し得る。それらのレセプターを通して作用するTNFおよびLT-αにより誘発される多くの生物学的効果は、移植された腫瘍の出血性壊死、細胞傷害性、エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線の有害な効果に対する防御を含む。TNFおよびLT-αは、エンドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、エイズ、および移植片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因に関与する（Beutler, B.およびVon Huffel, C., Science 264: 667-668（1994））。p55レセプター中の変異は、微生物感染に対して増加された感受性を生じる。
さらに、TNFR１（p55）およびFasのC-末端付近の約80アミノ酸ドメインが、プログラムされた細胞死についてのシグナルを伝達する原因である「死ドメイン（death domain）」として報告された（Tartagliaら、Cell 74: 845（1993））。
アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達およびホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである（H. Steller, Science 267, 1445-1449（1995））。アポトーシスの撹乱は、ガン、神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病因に寄与する（C.B.Thompson, Science 267, 1456-1462（1995））。最近、多くの注目が、２つの細胞表面の死レセプター（Fas/APO-1およびTNFR-1）のシグナル伝達および生物学的機能に集中している（J.L. Clevelandら、Cell 81, 479-482（1995）; A. Fraserら、Cell 85, 781-784（1996）; S. Nagataら、Science 267, 1449-56（1995））。両方とも、とりわけTNFR-2、低親和性NGFR、CD40、およびCD30もまた含むTNFレセプターファミリーのメンバーである（C.A.Smithら、Science 248, 1019-23（1990）; M.Tewariら、Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl編（Chapman and Hall, London, 1995）。ファミリーのメンバーはこれらの細胞外ドメイン中のシステインリッチ反復の存在により定義されるが、Fas/APO-1およびTNFR-1はまた、ショウジョウバエ自殺遺伝子reaper（P. Golsteinら、Cell 81, 185-6（1995）; K. Whiteら、Science 264, 677-83（1994））の遠縁にあたる、「死ドメイン（death domain）」と適切に命名された、細胞内相同性の領域を共有する。この共有された死ドメインは、両レセプターが、最近まで未同定のままであった関連するセットのシグナル伝達分子と相互作用することを示唆する。Fas/APO-1の活性化は、死ドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1を補強し（A.M. Chinnaiyanら、Cell 81, 505-12（1995）;M.P.Boldinら、J. Biol Chem 270, 7795-8（1995）;F.C. Kischkelら、EMBO 14, 5579-5588（1995））、死ドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1は次いで、プロアポトーシスプロテアーゼのICE/CED-3ファミリーのメンバーであるFLICE/MACH1へ結合し、そしておそらく活性化する（M.Muzioら、Cell 85, 817-827（1996）; M.P.Boldinら、Cell 85, 803-815（1996））。Fas/APO-1の中心的役割は細胞死を誘発することであるが、TNFR-1は、整然とした多様な生物学的活性（その多くは、NF-kBを活性化する能力に由来する）のシグナルを送り得る（L.A. Tartagliaら、Immunol Today 13, 151-3（1992））。従って、TNFR-1は、多価アダプター分子TRADDを補強し、このTRADOはFADDと同様に、また死ドメインを含む（H. Hsuら、Cell 81, 495-504（1995）; H. Hsuら、Cell 84, 299-308（1996））。FADD、TRAF2、およびRIPを含む多くのシグナル伝達分子との会合を通して、TRADDは、アポトーシスおよびNF-kB活性化の両方へシグナルを送り得る（H. Hsuら、Cell 84, 299-308（1996）; H. Hsuら、Immunity 4, 387-396（1996））。
最近、新規のアポトーシス誘導リガンドが発見された。Wiley, S.R.らは、この分子をTNF関連アポトーシス誘導リガンドまたは簡潔に（「TRAIL」）という（Immunity 3,673-682（1995））。Pitti, R.M.らはこの新規な分子を、Apo-2リガンドまたは（「Apo-2L」）という。この分子はまた、同時係属出願の米国暫定特許出願第60/013,405にも開示された。便宜上、この分子はTRAILとして本明細書中では呼ぶことにする。
FASリガンド（この転写物は、刺激されたT-細胞に大部分が制限されているようである）とは異なり、有意なレベルのTRAILは多くの組織中で検出され、そしていくつかの細胞株により構成的に転写される。TRAILは、FASリガンドから独立して作用することが示されている（Wiley, S.R.ら、（1995）前出）。Marsters, S.A.らによって、TRAILは、Fas/Apo-1Lによる死のシグナル伝達に類似する時間枠内で、しかしTNF誘導性アポトーシスよりも非常に早く、アポトーシスを急速に活性化させることもまた示されている（Current Biology 6,750-752（1996））。今日までに至る全ての研究により、TRAILのレセプターは、多くの既知のTNFレセプターのどれにも当てはまらないことが示唆される。
TNFファミリーリガンドおよびTNFファミリーレセプターの効果は変化し、哺乳動物システムの生物学的プロセス中で、正常および異常の両方の多数の機能に影響を与える。従って、正常および疾患状態の両方において生物活性に影響を与えるようなレセプターおよびリガンドの同定ならびに特徴付けについての明確な必要性が存在する。特に、新規に発見されたTRAILリガンドについてのレセプターの単離および特徴付けを行う必要性がある。
発明の要旨
本発明は、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または1997年1月21日にATCC受託番号97853として寄託されたcDNAクローン化物によりコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載された核酸分子の組換え発現のためのベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によるDR4ポリペプチドまたはペプチドの産生のためにそれらを使用する方法を提供する。
本発明は、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する単離されたDR4ポリペプチドをさらに提供する。
本発明はまた、診断アッセイ（例えば、検出レベルのDR4タンパク質についての定量的アッセイ、および診断的なアッセイ）を提供する。従って、例えば、正常なコントロールの組織サンプルと比較し、DR4またはその可溶性形態の過剰な発現を検出するために、本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出するために使用され得る。
腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーのリガンドは、多くの細胞性応答（細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）を誘導する最も多面的なサイトカインの間にあることが公知である。TNFファミリーリガンドに対する細胞性応答は、正常な生理的応答だけではなく、アポトーシスの増加またはアポトーシスの阻害に関連する疾患をも含む。アポトーシス−プログラムされた細胞死−は、免疫系の末梢性Tリンパ球の欠失に関与する生理学的な機構であり、そしてその調節不全は多くの異なる病原性のプロセスを導き得る。細胞生存の増加またはアポトーシスの阻害に関連する疾患は、ガン、自己免疫障害、ウイルス感染、炎症、移植片対宿主性疾患、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶を含む。アポトーシス増加に関連する疾患は、AIDS、神経変性障害、脊髄形成異常症候群、虚血性傷害、毒素誘導性肝臓疾患、敗血症性ショック、悪液質、および摂食障害を含む。
従って、本発明は、TNFファミリーのリガンドにより誘導されるアポトーシスを増強させる方法をさらに提供し、これはDR4ポリペプチドを発現している細胞に対して、DR4が媒介するシグナル伝達を増加させ得る有効量のアゴニストを投与することを含む。好ましくは、DR4が媒介するシグナル伝達は、アポトーシスの減少が示される疾患の処置のために増加される。
さらなる局面において、本発明は、TNFファミリーのリガンドにより誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関し、これはDR4ポリペプチドを発現している細胞に対して、DR4が媒介するシグナル伝達を減少させ得る有効量のアンタゴニストを投与することを含む。好ましくは、DR4が媒介するシグナル伝達は、アポトーシスの減少が示される疾患の処置のために減少される。
本発明のいずれの候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」がアポトーシスを増強し得るか、または阻害し得るかは、当該分野で公知であるTNFファミリーのリガンド／レセプター細胞性応答アッセイ（以下により詳細に記載されるものを含む）を使用して決定され得る。従って、さらなる局面において、スクリーニングの方法は、候補のアゴニストまたはアンタゴニストがTNFファミリーのリガンドに対する細胞性応答を増強し得るか、または阻害し得るかどうかを決定するために提供される。この方法は、DR4ポリペプチドを発現する細胞と、候補の化合物およびTNFファミリーのリガンドとを接触させる工程、細胞性応答をアッセイする工程、ならびにこの細胞性応答を標準的な細胞性応答に対して比較する工程（標準は、接触が、候補化合物の不在下でリガンドと行われる場合にアッセイされる）を含み、それによって、標準を超える増加した細胞性応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少した細胞性応答は、候補の化合物がリガンド／レセプターシグナル伝達経路のアンタゴニストであることを示す。本発明により、DR4ポリペプチドを発現する細胞は、内因性または外因性の投与されたTNFファミリーのリガンドのいずれかと接触され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、DR4のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸1〜23はシグナルペプチドを構成し、アミノ酸24〜238は細胞外ドメインを構成し、アミノ酸239〜264は膜貫通ドメインを構成し、そしてアミノ酸265〜468は細胞内ドメイン（アミノ酸379〜422が死ドメインを構成する）を構成することが予想される。
図２は、DR4、ヒト腫瘍壊死因子レセプター１（配列番号３）、ヒトFasタンパク質（配列番号４）、および死ドメインを含むレセプター３（DR3）（配列番号５）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。
図３は、DR4アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数、および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson-Wolf」のグラフでは、図１中のアミノ酸残基35〜92、114〜160、169〜240、267〜298、330〜364、391〜404、および418〜465は、示されたDR4タンパク質の抗原性の高い領域に対応する。
図４は、関連する核酸フラグメントHTOIY07R（配列番号６）およびHTXEY80R（配列番号７）のヌクレオチド配列を示す。
図５Ａおよび５Ｂは、MCF7細胞株および293細胞株におけるアポトーシスを誘導するDR4の能力を示す。図５Ｃは、DR4のアポトーシス作用を阻止する死プロテアーゼインヒビターz-VAD-fmkおよびCrmAの能力を示す。
図６Ａは、TRAILのアポトーシス誘導能力をブロックする可溶性細胞外DR4-Fc融合物の能力を示す。図６Ｂは、可溶性細胞外DR4-Fc融合物がTNF-αのアポトーシス誘導能力をブロックする能力がないことを示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、アミノ酸配列が図１（配列番号２）中に示されるDR4ポリペプチド、またはそのポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。本発明のDR4ポリペプチドは、ヒトTNFR-1、DR3およびFasリガンドと配列相同性を共有する（図２）。図１（配列番号１）で示されるヌクレオチド配列は、HCUDS60（アメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852に1997年1月21日に寄託され、そして、受託番号97853が与えられた）のようなcDNAクローンを配列決定することにより得られた。寄託されたクローンは、pBKプラスミド（Stratagene, La Jolla, CA）に含まれる。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied Biosystems, Inc.からのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％同一、より代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、このような挿入または欠失の点にて始まる。
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質によって、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現される組換え的に産生したポリペプチドおよびタンパク質は、例えば、SmithおよびJohnson, Gene 67:31-40（1988）中に開示される単一工程精製方法のような任意の適切な技術により実質的に精製されている天然のポリペプチドまたは組換えポリペプチドであるので、本発明の目的のために単離されていると考えられる。
図１に示される核酸配列のような、本明細書中で提供される情報を使用して、DR4ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、出発物質としてmRNAを使用してcDNAをクローニングするための手順のような標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を使用して得られ得る。本発明の実例となる、本発明の遺伝子はまた、以下の組織のcDNAライブラリー中で同定された：羊膜細胞、心臓、肝臓ガン、腎臓、白血球、活性化Ｔ細胞、K562およびPMA、W138細胞、Th2細胞、ヒト扁桃およびCD34枯渇バフィコート（臍帯血）。
DR4遺伝子は、約23アミノ酸残基（すなわち、468アミノ酸の全タンパク質長）のリーダー配列、および約50kDaの推定分子量を有する、図１（配列番号１）中に示されるヌクレオチド配列の19〜21位に開始コドンがある、約445アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。TNFレセプターファミリーの公知のメンバーのうち、本発明のDR4ポリペプチドは図２に示されるヒトTNFR1およびDR3ポリペプチド（複数のシステインリッチドメインにわたり有意な配列相同性を含む）と最も高い程度の相同性を共有する。
DR4と他の死ドメインを含むレセプターとの間で示される配列相同性に加えて、DR4はTRAILに結合し、そして一過性に発現される場合、アポトーシスを誘導することが示されている。MCF7ヒト乳ガン細胞および293細胞は、実施例５に記載されるように、DR4発現構築物を用いて、一過性にトランスフェクトされた。図５Ａおよび５Ｂ中に示されるように、実質的割合のトランスフェクトされた細胞は、アポトーシスの特徴である形態学的変化を受けた。推定されたように、死ドメインの欠失は、死経路に携わるDR4の能力を破壊した。図５Ｃ中に見られ得るように、DR4誘導性アポトーシスは、z-VAD-fmk、広範なスペクトルの不可逆性カスパーゼインヒビターおよびCrmA、FLICE/MACH-1（カスパーゼ-8）のような頂部（apical）カスパーゼを優先的に阻害するセルピンをコードする牛痘ウイルスを含む死プロテアーゼのインヒビターにより効率的にブロックされた。TNFR-1、CD-95およびDR3誘導性アポトーシスはまた、これらの同じインヒビターにより弱毒化されるので、下流の死エフェクター分子は本質的に同じようである。
DR4がTRAILと結合することが可能であるかを決定するために、DR4の細胞外リガンド結合ドメインが、ヒトIgGのFc領域に対する融合物（DR4-Fc）として発現された。DR4-Fcに選択的に結合するが、TNFR-1の対応する細胞外ドメインにもCD-95の対応する細胞外ドメインにも結合しないTRAILはまた、Fc融合物として発現される（データは示さない）。さらに、DR4-Fcは、TNFαリガンドまたはFasリガンドの両方がこれらのコグネイトレセプターと結合した条件下で、TNFαリガンドまたはFasリガンドのどちらとも結合しなかった。
MCF7細胞中でアポトーシスを誘導する、TRAILの能力は、DR4-Fcにより特異的にブロックされたが、TNFR1-Fc、CD95-FcまたはFc単独により影響されなかった（図6A）。さらに、推定されるとおりに、TNFα誘導性アポトーシスは、TNFR-1-Fcによりブロックされたが、DR4-Fc、CD95-FcまたはFc単独によりブロックされなかった（図6B）。
ひとまとめにして考えると、上記のデータは、DR4が、アポトーシスを誘導する能力を有する、死ドメインを含むレセプターであり、TRAILについてのレセプター（公知のアポトーシス誘導性リガンド）であることを示す。
示されるように、本発明はまた、本発明のDR4タンパク質の成熟型を提供する。シグナルの仮説によれば、粗面小胞体を通して成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が一旦開始されると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、成熟タンパク質から切断されるシグナルまたは分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ特異性で分泌性タンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌性タンパク質の切断は、完全には均一ではなく、これによってタンパク質の２つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌性タンパク質の切断特異性が完全なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断特異性はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長い間知られている。従って、本発明は、ATCC受託番号第97853号として同定された宿主中に含まれるcDNAクローンによってコードされる、および図１（配列番号２）中に示される通りの、アミノ酸配列を有する成熟DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。ATCC受託番号第97853号として同定された宿主中に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟DR4タンパク質により、寄託される宿主中のベクター中に含まれるクローンのヒトDNA配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレームを哺乳動物細胞（例えば、以下に記載されるCOS細胞）中で発現させることにより産生されるDR4タンパク質の成熟形態が意味される。以下に示されるように、ATCC受託番号第97853号中に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟DR4は、コンピューター分析に基づいて推定される切断部位の精度に依存して、図１（約24〜約468のアミノ酸）に示される推定される「成熟」DR4タンパク質と異なっていてもよいし、異ならなくてもよい。
分泌リーダーおよびそのリーダー配列のための切断点をタンパク質が有するか否かを推定する方法が利用可能である。例えば、McGeoch（Virus Res. 3:271-286（1985））の方法、およびvon Heinje（Nucleic Acids Res. 14:4683-4690（1986））の方法が使用され得る。これらの各方法についての既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定することの精度は、75〜80％の範囲である（von Heinje、前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質について常に同じ推定される切断点を生じるわけではない。
本発明の場合において、本発明の完全なDR4ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、コンピュータープログラム（「PSORT」）によって分析された。（K.NakaiおよびM.Kanehisa, Genomics 14:897-911（1992）を参照のこと）。PSORTはアミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞位置を推定するためのエキスパートシステムである。このコンピューターによる局在の推定の一部として、McGeochおよびvon Heinjeの方法が組み込まれている。PSORTプログラムによる分析は、図１（配列番号２）におけるアミノ酸23と24との間に切断部位を推定した。その後は、完全なアミノ酸配列は、目視検査によってさらに分析され、von Heinjeの（-1,-3）法則の簡略な形態を適用される。von Heinje、前出。その後は、DR4タンパク質についてのリーダー配列は、図１（配列番号２）における下線部の１〜23のアミノ酸残基からなると推定され、一方、推定される成熟DR4タンパク質は、残基24〜468からなる。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはDNA（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成される、cDNAおよびゲノムDNAを含む）の形態であり得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖DNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。
「単離された」核酸分子により、その天然の環境から取り出された核酸分子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたDNA分子のさらなる例は、異種宿主細胞中に保持される組換えDNA分子または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロのRNA転写物を含む。本発明による単離された核酸分子は、合成により産生されるこのような分子をさらに含む。
本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるオープンリーディングフレーム（ORF）を含むDR4 DNA分子を含み、そしてその開始コドンが図１（配列番号１）中に示されるヌクレオチド配列の19〜21位にあるこのORFの全体または部分と実質的に異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、なおDR4ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするDNA分子をさらに含む。当然のことながら、遺伝コードは当業者に周知である。従って、当業者にとって、このような縮重改変体を作製することは日常的である。
別の局面において、1997年１月21日にATCC受託番号第97853号として寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するDR4ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を、本発明は提供する。好ましくは、これらの核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする。本発明はさらに、図１（配列番号１）中に示されるヌクレオチド配列、または上記の寄託されたクローン中に含まれるDR4 cDNAのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離されたDNA分子およびそのフラグメントは、ノーザンブロット分析によるヒト組織におけるDR4遺伝子のインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのためのDNAプローブとして有用である。
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。図１（配列番号１）中に示されるヌクレオチド配列を有する単離されたDNA分子のフラグメントによって、少なくとも20bp、そしてより好ましくは少なくとも30bpの長さのDNAフラグメントが意図され、これらは上で議論されるようなDNAプローブとして有用である。当然のことながら、50〜1500bpの長さの、より長いDNAフラグメントもまた、図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列の、全てではないにしても、そのほとんどに対応するDNAフラグメントと同様、本発明によるDNAプローブとして有用である。例えば、少なくとも20bp長のフラグメントにより、図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列由来の20以上の塩基を含むフラグメントが意図される。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：DR4細胞外ドメイン（図１（配列番号２）中の約24〜約238のアミノ酸残基）を含むポリペプチド；DR4膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）中の約239〜約264のアミノ酸残基）を含むポリペプチド；DR4細胞内ドメイン（図１（配列番号２）中の約265〜約468のアミノ酸残基）を含むポリペプチド；およびDR4死ドメイン（図１（配列番号２）中の約379〜約422のアミノ酸残基）を含むポリペプチド。これらのドメインの位置はコンピューターグラフィックにより推定されているので、当業者はこれらのドメインを構成するアミノ酸残基が、このドメインを規定するために使用される判断基準に依存して、わずかに（例えば、約１〜15残基）変化し得ることを理解する。
メチオニンは自然に切断されること、そしてこのような配列はDR4発現ベクターを遺伝子操作するのに有用であり得ることが公知であるので、本発明の好ましい核酸フラグメントは、アミノ末端メチオニンをコードするヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド19〜21）を欠損する全長DR4ポリペプチドをコードする。このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって意図される。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、DR4タンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸分子をさらに含む。詳細には、本発明のこのような核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：図１（配列番号２）中の約35〜約92のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約114〜約160のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約169〜約240のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約267〜約298のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約330〜約364のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）中の約391〜約404のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および図１（配列番号２）中の約418〜約465のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントは、DR4タンパク質の抗原性領域であると決定した。DR4タンパク質の他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は以下に詳細に記載される。
さらに、本発明は次の配列番号１の広範な領域に関するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：図４中で示されるHTOIY07R（配列番号６）およびHTXEY80R（配列番号７）の両方。
さらに、本発明は、配列番号１の残基365〜1,424の少なくとも約30ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチドのいずれかの部分を含むポリヌクレオチドを含む。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第97853号に含まれるcDNAクローン）中のポリヌクレオチドの部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、50％ホルムアミド、５×SSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハルト溶液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サケ精子DNA、を含む溶液中での42℃での一晩のインキュベーション、続いて約65℃にて0.1×SSC中でのフィルターの洗浄が意図される。
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド（nt）、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらにより好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはRNAのいずれか）が意図される。これらは、先に議論され、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号３）に示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図される。
当然のことながら、ポリA配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるDR4 cDNAの3末端ポリ（A）トラクト）にのみ、またはT（もしくはU）残基の相補的なストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の部分にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A）ストレッチまたはその相補体（例えば、実際には、任意の二本鎖cDNAクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
示されるように、DR4ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含み得るがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列自体；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、リーダー配列または分泌配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列）；上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない、例えば、イントロンおよび非コード5’および3’配列（例えば、転写、mRNAプロセシング（例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）リボソーム結合およびmRNAの安定性において役割を担う転写された非翻訳配列）を含むがこれらに限定されない、さらなる非コード配列とともに、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる機能性を提供するアミノ酸のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドのようなマーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカー配列は、とりわけ、pQEベクター（Qiagen,Inc.）中に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドであり、これらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824（1989）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応し、これは、例えば、Wilsonら、Cell 37: 767（1984）によって記載されている。
本発明は、さらに、DR4ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、対立遺伝子改変体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される。Genes II, Lewin, B.編、John Wiley & Sons, New York（1985）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生される改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチドが含まれ得る。改変体は、コード領域もしくは非コード領域、または両方において変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸の置換、欠失、または付加を生じ得る。
本発明のさらなる実施態様には、以下に対して少なくとも90％同一、そしてより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である単離された核酸分子が含まれる：（ａ）図１（配列番号２）中の完全なアミノ酸配列（推定されるリーダー配列を含む）を有する全長DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）中の完全なアミノ酸配列（推定されるリーダー配列を含む）を有するが、アミノ末端メチオニンを欠損した全長DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）図１（配列番号２）中の約24〜約468位のアミノ酸配列を有する成熟DR4ポリペプチド（リーダ配列が除去された全長ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ATCC受託番号第97853号に含まれるcDNAクローンによってコードされるリーダーを含む完全なアミノ酸配列を有する全長DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ATCC受託番号第97853号に含まれるcDNAクローンによってコードされる、リーダーを含むがアミノ末端メチオニンを欠損している完全なアミノ酸配列を有する全長DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ATCC受託番号第97853号中に含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟DR4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）DR4細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）DR4膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）DR4細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）DR4死ドメインをコードするヌクレオチド配列；または（ｋ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
DR4ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば、95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、DR4ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までのある数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照配列中のヌクレオチド間で個々にもしくは参照配列内の１つ以上の連続したグループ中のいずれかに散在して、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置において、またはこれらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Bestfitは、SmithおよびWaterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489（1981）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、本発明による参照配列に例えば95％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
本願は、DR4活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図１（配列番号１）に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がDR4活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマーとして使用するかをなお知るからである。DR4活性を有するポリペプチドをコードしない、本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ（1）DR4遺伝子またはその対立遺伝子改変体をcDNAライブラリーから単離すること；（2）Vermaら，Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York（1988）に記載の、DR4遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「FISH」）；および、（3）特定の組織におけるDR4 mRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
しかし、図１（配列番号１）に示される核酸配列、あるいは寄託されたcDNAの核酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する核酸分子であってDR4タンパク質活性を有するポリペプチドを実際にコードする核酸分子が好ましい。「DR4活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明のDR4タンパク質（全長タンパク質もしくは好ましくは成熟型タンパク質のいずれか）の活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、DR4タンパク質活性は、本質的に、これまでに記載のように（A.M.Chinnaiyanら、Cell 81、505-12（1995）;M.P.Boldinら、J Biol Chem 270、7795-8（1995）;F.C.Kischkelら、EMBO 14、5579-5588（1995）;A.M.Chinnaiyanら、J Biol Chem 271、4961-4965（1996））か、または以下の実施例５に記載のように実施される細胞死アッセイを用いることによって測定され得る。MCF7細胞において、完全長DR4をコードするプラスミド、またはレセプターを含む候補死ドメインが、グリーン蛍光タンパク質をコードするpLanternレセプター構築物とともに同時トランスフェクトされる。DR4でトランスフェクトされた細胞の核は、DAPI染色で評価される場合、アポトーシス性の形態を示す。TNFR-1およびFas/APO-1（M.Muzioら、Cell 85、817-827（1996）;M.P.Boldinら、Cell 85、803-815（1996）;M.Tewariら、J Biol Chem 270.3255-60（1995））と同様に、DR4誘導性アポトーシスは、ICE様プロテアーゼ、CrmAおよびz-VAD-fmkのインヒビターによって阻害される。
もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配列、または図１（配列番号１）に示される核酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が「DR4タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセイを行うことすら必要なく、当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がDR4タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることもまた、当該分野でさらに認識される。これは、当業者が、タンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸での置換）を十分に知っているからである。
例えば、表現型がサイレントなアミノ酸置換をいかにして作製するかに関する指針は、Bowie,J.U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions.」Science 247:1306-1310（1990）で提供され、ここで筆者らは、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容性であることを記す。
ポリヌクレオチドアッセイ
本発明はまた、例えば、診断試薬としてのように、相補的なポリヌクレオチドを検出するためのDR4ポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害に関係するDR4の成熟形態の検出は、DR4またはその可溶性形態の過小発現、過剰発現、または変更された発現によって生じる疾患（例えば、腫瘍、または自己免疫疾患のような疾患）の診断またはこの疾患に対する感受性を追加または規定し得る診断手段を提供する。
DR4遺伝子中に変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、生検、および検死解剖材料に由来する）から入手し得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得、または分析の前にPCRを用いることによって酵素学的に増幅され得る（Saikiら、Nature 324:163-166（1986））。RNAあるいはcDNAもまた、同様に使用され得る。例として、DR4をコードする核酸と相補的なPCRプライマーがDR4の発現および変異を同定ならびに分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較での、増幅させた産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅したDNAを放射標識したDR4 RNAまたはあるいは放射標識したDR4アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、ミスマッチした２重鎖から、RNaseA消化によって、または融解温度の差によって区別され得る。
参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異はまた、直接的なDNA配列決定によって示され得る。さらに、クローン化されたDNAセグメントは特定のDNAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。このような方法の感受性は、PCRまたは別の増幅方法を適切に使用することにより非常に増強され得る。例えば、配列決定プライマーは、改変したPCRによって産生された２本鎖PCR産物または１本鎖テンプレート分子とともに使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来手順によって、または蛍光タグを用いた自動配列決定手順によって行われる。
DNA配列の差異に基づく遺伝学的試験は、変性剤の存在下または非存在下でのゲル中のDNAフラグメントの電気泳動度の変化を検出することによって、達成され得る。小さな配列の欠失または挿入は、高分離度ゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは変性ホルムアミド勾配ゲル（このゲル中において異なるDNAフラグメントの移動度は、その特定の融解温度、または部分的融解温度に従って、異なる位置へと遅延させる）上で区別され得る（例えば、Myersら、Science 230:1242（1985））。
特定の位置における配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNase保護およびS1保護）または化学的切断方法（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397-4401（1985））によって、示され得る。
従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNAse保護、化学的切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（「RFLP」）およびゲノムDNAのサザンブロッティング）のような方法によって達成され得る。
より従来のゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によって検出され得る。
染色体アッセイ
本発明の配列はまた、染色体の同定について価値がある。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に、特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。本発明に従う染色体に対するDNAのマッピングは、疾患に関連する遺伝子とこれらの配列を相関付ける際の重要な最初の工程である。
この点に関する特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcDNAは、DR4遺伝子のゲノムDNAをクローン化するために用いられる。このことは、一般的に市販されている種々の周知の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。ゲノムDNAは本目的のために周知の技術を用いてインサイチュ染色体マッピングのために使用される。
さらに、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは、15〜25bp）を調製することによって、染色体に対してマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析は、ゲノムDNA中の１つのエクソンより多くにわたらないプライマーを迅速に選択するのに使用され得る。従って、これは増幅手順を複雑にする。次いで、これらのプロモーターは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために使用される。
cDNAクローンの、中期染色体の広がりに対する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「FISH」）が、１つの工程において、染色体の正確な位置を提供するために用いられ得る。この技術は、50または60の短さのcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説について、Vermaら、Humman Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York（1988）を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色定位置にマップされると、染色体上の配列の物理的な位置が遺伝子マップデータに相関付けられ得る。このようなデータは、例えば、Johns Hopkins University、Welch Medical Libraryを介してオンラインで利用可能なV.McKusick、Mendelian inheritance in Man中に見出される。同じ染色体上にマップされている遺伝子と疾患との関係が、次いで連鎖解析を介して同定される（物理的に近接した遺伝子の共同の遺伝）。
次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のcDNA配列またはゲノム配列中の差異を決定することが必要である。変異が、いくらかまたは全ての罹患個体中に見出されるが、正常個体中には見出されないなら、変異はおそらくこの疾患の原因因子である。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のDNA分子を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
宿主細胞は遺伝子操作されて、核酸分子を取り込み得、そして本発明のポリペプチドを発現し得る。ポリヌクレオチドは、単独で、または他のポリヌクレオチドと共に導入され得る。そのような他のポリヌクレオチドは独立して導入され得、同時導入され得、または本発明のポリヌクレオチドに連結されて導入され得る。
本発明のこの局面に従って、ベクターは、例えば、プラスミドベクターであり得、一本鎖または二本鎖ファージベクターであり得、一本鎖または二本鎖RNAまたはDNAウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、DNAおよびRNAを細胞中に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド（好ましくはDNA）として細胞中に導入され得る。ウイルスベクターは複製適格または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に補完性宿主細胞においてのみ生じる。
特定の局面において、ベクターの中でも好ましいのは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現のためのベクターである。一般的にこのようなベクターは、宿主中での発現に有効なシス作用制御配列を含む、発現されるように作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。宿主中に導入される際には、適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、補完性ベクターによって供給されるか、またはベクター自体によって供給されるかのいずれかである。
非常に種々の発現ベクターが本発明のポリペプチドの発現に用いられ得る。このようなベクターには、染色体性ベクター、エピソーム性ベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、バクテリオウイルスのようなウイルス由来、パポーバウイルス、SV40のようなウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス）およびレトロウイルスならびにそれらの組合せ由来ベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられ、全てが本発明のこの局面に従って、発現のために使用され得る。一般的に、宿主において、ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するに適切な任意のベクターが、この点に関して発現に用いられ得る。
発現ベクター中のDNA配列は、例えば、mRNA転写を導くプロモーターを含む適切な発現制御配列に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表例には、周知のプロモーターの名を少し挙げると、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーターが含まれる。一般的に、発現構築物は、転写、開始、および終結のための部位、ならびに、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始AUGを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドン（UAA、UGA、またはUAG）を含む。
さらに、構築物は、発現を調節および引き起こす制御領域を含み得る。一般的にこのような領域は、転写を制御することによって作動する（例えば、とりわけリプレッサー結合部位およびエンハンサー）。
増殖および発現のためのベクターは、一般的に選択マーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅のために適切であり得るか、またはこのベクターは本発明の目的のためのさらなるマーカーを含み得る。この点に関して、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主の細胞の選択のための表現型形態を提供するために一つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。好ましいマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
本明細書中の他に記載するような適切なDNA配列、および適切なプロモーター、および他の適切な制御配列を含むベクターは、適切な宿主に、所望のポリペプチドの配列中での発現に適した種々の周知の技術を用いて導入され得る。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞）;動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。非常に種々の発現構築物のための宿主が周知であり、そして当業者は本発明のこの局面に従って、ポリペプチドの発現のための宿主を本開示により容易に選択し得る。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9（Qiagenから入手可能）;pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pharmaciaから入手可能）がある。これらのベクターは、当業者が利用可能な、多数の市販され、かつ周知であるベクターの例示のためにのみ列挙される。
宿主細胞における発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順であり、そして発現ベクター構築、ベクターの宿主への導入、および宿主での発現のために必要な技術は、当業者にとって日常的である。
本発明はまた、上記で議論した上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）であり得、または下等真核生物（例えば、酵母細胞）であり得、あるいは、宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Davisら，Basic Methods in Molecular Biology（1986）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、精製の間の、または続く取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。あるいは、精製を容易にするための領域もまた、ポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化のために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カナダ対応第2045869号）は、別のヒトタンパク質、またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（EP-A 0232 262）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）に正しい。薬物探索において、例えばhIL-5のようなヒトタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でFc部分と融合されている。D.Bennettら，Journal of Molecular Recognition Vol.8:52-58（1995）、およびK.Johansonら，The Journal of Biological Chemistry Vol.270 No.16:9459-9471（1995）を参照のこと。
DR4ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のために用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性されている場合、タンパク質の再折り畳みのための周知の技術を使用して活性な高次構造を再生させ得る。
本発明のポリペプチドは以下を含む：精製された天然の産物；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得る。
DR4ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って、種々の適用、特にDR4の化学的および生物学的特性を利用する適用のために使用され得る。これらの中で、腫瘍の処置、寄生動物、細菌およびウイルスに対する抵抗力における、アゴニストによるDR4の刺激後の、Ｔ細胞、内皮細胞、および特定の造血細胞の増殖の誘導、再狭窄、対宿主移植片疾患の処置、抗ウイルス応答の調節、および特定の自己免疫疾患の予防のための適用がある。さらなる適用は、細胞、組織、および生物の障害の診断および処置に関する。本発明のこれらの局面は、さらに以下において議論される。
DR4ポリペプチドおよびフラグメント
本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有する単離されたDR4ポリペプチド、または上記のポリペプチドの部分を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
DR4ポリペプチドの特徴を改良または変更するために、タンパク質工学が使用され得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、もしくは融合タンパク質を含む、新規の変異体タンパク質すなわち「ムテイン」を作製するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、少なくとも特定の精製条件および保存条件の下では、これらは対応する天然のポリペプチドより高い収率で精製され得、そしてより良好な可溶性を示し得る。
例えば、膜会合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態を含む多くのタンパク質について、１つ以上のアミノ酸が実質的な生物学的機能の損失なしでＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることは、当該分野で公知である。例えば、Ronら、J.Biol.Chem.,268:2984-2988（1993）は、３個、８個または27個のアミノ末端のアミノ酸残基を失ったとしてもヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質を報告している。本発明の場合、本発明のタンパク質は死ドメイン含有レセプター（DDCR）ポリペプチドファミリーのメンバーであることから、配列番号２の109位のシステイン残基までのＮ末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性（例えば、アポトーシスを誘導する能力）を保持し得る。この残基がファミリーメンバー間で保存され（図２を参照のこと）、レセプター結合で必要とされる構造安定性を提供するためのジスルフィド架橋を形成するために必要とされ得るために、配列番号２の109位のシステイン残基（C-109）を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持するとは期待されない。
しかし、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の欠失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、タンパク質の完全ドメインまたは細胞外ドメインを認識する抗体を誘発し、そして／またはその抗体に結合する短縮型タンパク質の能力は、一般に、完全ドメインまたは細胞外ドメインタンパク質の過半数未満の残基がＮ末端から除去される場合、保持される。完全タンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載の日常的な方法、そうでなければ当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。
従って、本発明はさらに、C-109残基までの、配列番号２に示されるDR4のアミノ酸配列のアミノ末端からの１つ以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオリドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基ｎ〜468のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ｎは、１〜109の範囲の整数であり、ここでC-109は、DR4ポリペプチド（配列番号２に示される）の細胞外ドメインのＮ末端からの最初の残基であり、これはDR4タンパク質のレセプター−リガンド結合（例えば、TRAIL結合）活性に必要であると考えられている。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
同様に、生物学的に機能的なC末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端からの8〜10アミノ酸残基を欠失させることによって10倍に達するより高い活性を示す
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ら、J.Biotechnology 7:199-216（1988））。本発明の場合では、本発明のタンパク質はDDCRポリペプチドファミリーのメンバーであることから、配列番号２の221位のシステイン（C-221）までのＣ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合のようないくらかの生物学的活性を維持し得る。配列番号２のC-221を含むＣ末端欠失をさらに有するポリペプチドは、この残基が、DDCRファミリーメンバー間で保存され、そしてレセプター−リガンド結合に必要とされる構造的安定性を提供するためのジスルフィド架橋の形成に必要とされるので、このような生物学的活性を維持することは期待されない。
しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、タンパク質の完全または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／またはその抗体に結合する短縮型タンパク質の能力は、一般に、完全または細胞外ドメインの大部分ではない残基がＣ末端から除去されている場合、維持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠失した特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中で記載される日常的な方法、そうでなければ当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。
従って、本発明はさらに、配列番号２のC-221までの、配列番号２で示されるDR4のアミノ酸配列のカルボキシル末端由来の１つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍは221〜468の範囲での任意の整数であり、そして残基C-221は、完全なDR4ポリペプチド（配列番号２に示される）のＣ末端からの最初の残基の位置であり、DR4タンパク質のレセプター結合活性に必要とされると考えられている。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
本発明はまた、１つ以上のアミノ酸を、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失させたポリペプチドを提供し、これらは一般には、配列番号２の残基ｎ〜ｍ（ｎおよびｍは上記のような整数）を有するとして記載され得る。
ATCC受託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全DR4アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた含まれ、ここで、この部分はATCC受託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端由来の１〜約108のアミノ酸、またはATCC受託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列のカルボキシル末端由来の１〜約247のアミノ酸、あるいはATCC受託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全アミノ酸配列の上記のアミノ末端およびカルボキシル末端欠失の任意の組合せを含まない。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
Ｎ末端欠失変異およびＣ末端欠失変異体のなかで好ましいのは、細胞外ドメインの部分のみを含む変異である；すなわち、残基24〜238である。なぜなら、その任意の部分は、可溶性であると予測されるからである。
DR4のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に有意な効果なしに変化し得ることが、当該分野で認識される。配列中でのこのような差違を意図する場合、活性を決定するタンパク質の決定的な領域が存在することに留意すべきである。そのような領域は、通常、リガンド結合部位、もしくは死ドメインを構成するか、またはこれらのドメインに影響する3次構造を形成する残基を含む。
従って、本発明はさらに、実質的なDR4ポリペプチド活性を示すDR4タンパク質改変体、または以下で議論されるタンパク質フラグメントのようなDR4の領域を含むDR4タンパク質改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、反転、反復、および、型置換を含む。先に示されるように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであるようであるかに関するガイダンスは、Bowie,J.U.ら、Science 247:1306-1310（1990）で見い出され得る。
特定の目的は、荷電アミノ酸の、別の荷電したアミノ酸および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸での置換である。後者は、DR4タンパク質の特徴を改良するために正の電荷を減少したタンパク質を生じる。凝集の阻止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけではなく、薬学的処方物を調製する場合に問題を生じる。なぜなら、それらは免疫原性であり得るからである（Pinckardら、Clin Exp. Immunol. 2: 331-340（1967）; Robbinsら、Diabetes 36: 838-845（1987）; Clelandら、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377（1993））。
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させる。Ostadeら、Nature 361: 266-268（1993）は、２つの公知の型のTNFレセプターのうちの１つのみへの、TNF-αの選択的結合を生じる特定の変異を記載する。従って、本発明のDR4レセプターは、天然の変異または人工操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。
示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、マイナーな性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。
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本発明のDR4タンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085（1989））により同定され得る。後者の手順は、分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロもしくはインビトロでの増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識化のような構造分析によって決定され得る（Smithら、J. Mol. Biol. 224: 899-904（1992）およびde Vosら、Science 255: 306-312（1992））。
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製される。DR4ポリペプチドの組換え産生型は、SmithおよびJohnson,Gene 67:31-40（1988）に記載される１工程法により実質的に精製される。
本発明のポリペプチドはまた、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチドを含む。これには、リーダー、リーダーを除いた寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）、リーダーを含む図１（配列番号２）のポリペプチド；アミノ末端メチオニンを除いた図１（配列番号２）のポリペプチド、リーダー、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、死ドメインを除いた図１（配列番号２）のポリペプチド、膜貫通ドメインを欠くが、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのすべてまたは部分を含むポリペプチド、ならびに寄託されたcDNAクローンによってコードされるポリペプチドに対して、図１（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも80％同一、より好ましくは、少なくとも90％または95％同一、なおより好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％同一であるポリペプチドが含まれ、そしてまた、少なくとも30アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分が含まれる。
DR4ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば95％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、このポリペプチド配列がDR4ポリペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列における総アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以上の隣接した基内のいずれかで散在した、これらの末端位置の間のどこかで起こり得る。
実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix、Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に95％同一であるか否かを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性の百分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターが設定される。
本発明者らは、DR4ポリペプチドが、３つの主要な構造ドメインを示す468残基タンパク質であることを発見した。第１に、リガンド結合ドメインは、図１（配列番号２）の約24〜約238の残基内において同定された。第２に、膜貫通ドメインは、図１（配列番号２）の約239〜約264の残基内で同定された。第３に、細胞内ドメインは、図１（配列番号２）の約265〜約468の残基内で同定された。重要なことには、細胞内ドメインは、約379〜約422残基に死ドメインを含む。図１（配列番号２）に示されるポリペプチドのさらに好ましいフラグメントは、約24〜約468の残基由来の成熟タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くが細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのすべてまたは部分を含む可溶性ポリペプチドを含む。
本発明はさらに、リーダーおよび成熟タンパク質、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、および死ドメインから選択されたDR4ポリペプチドフラグメントを含む、寄託されたcDNAクローンによってコードされるDR4ポリペプチドを含む。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全体のタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002（1983）を参照のこと。
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcliffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.（1983）Antibodies that react with predetermined sites on proteins, Science 219:660-666を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され、１セットの単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。
それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起するために有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778（1984）の777頁を参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは少なくとも約15〜約30個の間のアミノ酸の配列を含む。
DR4特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの例は、以下を含むがこれらに限定されない：図１（配列番号２）の約35〜約92のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約114〜約160のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約169〜約240のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約267〜約298のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約330〜約364のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）の約391〜約404のアミノ酸残基を含むポリペプチド；図１（配列番号２）約418〜約465のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがDR4タンパク質の抗原性領域であることを決定した。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段により産生され得る。Houghten,R.A「General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids.」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135（1985）を参照のこと。この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis（SMPS）」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211号（1986）にさらに記載される。
当業者が理解するように、本発明のDR4ポリペプチドおよびその上記のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの部分と結合し得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（EPA 394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86（1988））。IgG部分によるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体DR4タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和において効率的であり得る（Fountoulakisら、J. Biochem. 270:3958-3964（1995））。
ペプチドアッセイ
本発明はまた、細胞および組織におけるDR4タンパク質、またはその可溶性形態のレベル（正常レベルおよび異常レベルの決定を含む）を検出するための定性的および診断的アッセイのような診断的アッセイに関する。従って、例えば、正常コントロール組織サンプルと比較して、DR4またはその可溶性形態の過剰発現を検出するための本発明に従った診断的アッセイを使用して、例えば、腫瘍の存在が検出され得る。宿主由来のサンプルにおけるタンパク質（例えば、本発明のDR4タンパク質）またはその可溶性形態のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびELISAアッセイを含む。
生物学的サンプルにおけるDR4タンパク質レベルをアッセイすることは、任意の当該分野で公知の方法を用いて可能であり得る。生物学的サンプル中のDR4タンパク質レベルをアッセイするために好ましいのは、抗体に基づいた技術である。例えば、組織中のDR4タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る。（Jalkanen, M.ら、J. Cell. Biol. 101: 976-985（1985）; Jalkanen, M.ら、J. Cell. Biol. 105: 3087-3096（1987））。
DR4タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA））を含む。
適切な標識は、当該分野で公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、およびヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテクニチウム（99mTc）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、およびビオチンを含む。
治療法
腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーリガンドが、細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、および数種の遺伝子の転写調節を含む、大多数の細胞応答を誘導する、最も多面的なサイトカインに属することは、公知である（Goeddel, D.V.ら、「Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities,」Symp. Quant. Biol. 51:597-609（1986）,Cold Spring Harbor; Beutler, B.,およびCerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57:505-518（1988）; Old, L.J., Sci. Am. 258:59-75（1988）; Fiers, W., FEBS Lett. 285:199-224（1991））。TNF-ファミリーリガンドは、本発明のDR4を含む、TNF-ファミリーレセプターに結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。DR4ポリペプチドを発現し、そしてDR4リガンドに対する強力な細胞応答を有すると考えられる細胞は、羊膜細胞、心臓、肝臓ガン、腎臓、末梢血白血球、活性化Ｔ細胞、Th2細胞に対応する組織、ヒト扁桃、およびCD34枯渇軟膜（臍帯血）を含む。「TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答」によって、TNF-ファミリーリガンドによって誘導される、細胞、細胞株、組織、組織培養物、または患者に対する、任意の遺伝子型、表現型、および／または形態学的変化が意図される。示されているように、このような細胞応答は、TNF-ファミリーリガンドに対する正常な生理学的応答のみならず、増大されたアポトーシスまたはアポトーシス阻害に関連する疾患も包含する。アポトーシスプログラム化細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠損に関与する生理学的機構であり、そしてその調節不全は、多数の異なる病原性プロセスを導き得る（Ameisen, J.C., AXDS 8: 1197-1213（1994）；Krammer, P.H.ら、Curr. Opin. Immunol. 6: 279-289（1994））。
増大された細胞生存性、またはアポトーシス阻害に関連する疾患は、ガン（例えば、濾胞性リンパ腫、p53変異による癌腫、ならびに、乳ガン、前立腺ガン、カポジ肉腫、および卵巣ガンのようなホルモン依存性腫瘍）；自己免疫障害（例えば、全身紅斑性狼瘡、および免疫関連糸球体腎炎、慢性関節リウマチ）、およびウイルス感染症（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルス）、情報移植片対宿主疾患（information graft v. host disease）、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶を包含する。アポトーシスの増大に関連する疾患は、AIDS；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症、網膜色素変性、小脳変性）；脊髄異形成症候群（例えば、再生不良性貧血）、虚血損傷（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流損傷に起因するもの）、毒素誘発肝疾患（例えば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、悪液質、および摂食障害を包含する。
従って、１つの局面において、本発明は、TNF-ファミリーリガンドにより誘導されるアポトーシスを増強するための方法に関し、この方法は、DR4ポリペプチドを発現する細胞への、DR4媒介シグナリングを増大し得るDR4リガンド、アナログ、またはアゴニストの有効量の投与を包含する。好ましくは、DR4媒介シグナル伝達は、減少したアポトーシス、または減少したサイトカイン、および接着分子発現が示される疾患を処置するために増大される。アゴニストは、可溶性形態のDR4、およびDR4ポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体を包含し得る。
さらなる局面において、本発明はDR4媒介性シグナリングを減少させ得る有効量のアンタゴニストのDR4ポリペプチドを発現する細胞への投与を含む、TNFファミリーリガンドにより誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関する。好ましくは、DR4媒介性シグナリングは、増加されたアポトーシス、または増加されたNFkB発現が示される疾患の処置のために減少される。アンタゴニストには、DR4の可溶性形態およびDR4ポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体が含まれ得る。
「アゴニスト」によって、アポトーシスを増強または可能にし得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。「アンタゴニスト」によって、アポトーシスを阻害し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。本発明のいずれの候補「アゴニスト」または「アンタゴニスト」が、アポトーシスを増強または阻害し得るかどうかは、下記により詳細に記載されているアッセイを含む、当該分野で公知のTNF-ファミリーリガンド／レセプター細胞応答アッセイを用いて決定され得る。
１つのこのようなスクリーニングの手順は、本発明のレセプターを発現するためにトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を包含する。このようなスクリーニングの技術は1992年２月６日に公開されたPCT WO92/01810に記載されている。このようなアッセイは、例えば、レセプターをコードするメラニン保有細胞をTNFファミリーリガンドおよび候補アンタゴニスト（またはアゴニスト）の両方と接触させることにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害（または増強）する化合物についてのスクリーニングのために使用され得る。リガンドにより生じるシグナルの阻害または増強は、その化合物がリガンド／レセプターシグナリング経路のアンタゴニストまたはアゴニストであることを示す。
他のスクリーニング技術は、例えば、Science 246:181-296（1989年10月）に記載されているような、レセプター活性化によって引き起こされる、細胞外pH変化を測定するシステムでの、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を包含する。例えば、化合物は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そして、第二メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が測定されて、潜在的な化合物が、レセプターを活性化するかまたは阻害するかが決定され得る。
別のこのようなスクリーニング技術は、レセプターを一時的に発現するために、レセプターをコードするRNAのXenopus卵母細胞への導入を包含する。次に、レセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物と接触させられ、その後、レセプターの活性化を阻害すると考えられる化合物についてのスクリーニングの場合には、カルシウムシグナルの阻害または活性化が検出され得る。
別のスクリーニング技術は、レセプターがホスホリパーゼCまたはDに連結されている構築物の、細胞での発現を含む。このような細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎細胞などを包含する。スクリーニングは、本明細書中上記のように、ホスホリパーゼシグナルからのレセプターの活性化またはレセプターの活性化の阻害を検出することにより達成され得る。
別の方法は、標識リガンドの細胞表面上にレセプターを有する細胞への結合の阻害を検出することにより本発明のアゴニストであるレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物についてのスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面上でレセプターを発現するように、そのレセプターをコードするDNAで真核生物細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の既知リガンドの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射活性によって標識され得る。レセプターに結合された標識リガンドの量は、例えば、レセプターの放射活性を測定することによって測定される。化合物がレセプターに結合する場合、レセプターに結合する標識リガンドの減少によって決定されるように、レセプターに対する標識リガンドの結合は阻害される。
本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニングアッセイは、Tartaglia, L.A.,およびGoeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267（7）:4304-4307（1992）に記載されている。
従って、さらなる局面では、スクリーニング方法は、候補アゴニストまたは候補アンタゴニストが、TNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答を増強または阻害し得るかを決定するために提供される。その方法は、DR4ポリペプチドを発現する細胞と、候補化合物およびTNF-ファミリーリガンドとを接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、および、その細胞応答を標準細胞応答と比較する工程を包含し、標準は、リガンドとの接触を候補化合物の非存在下で実施したときにアッセイされ、そのことによって、標準を超えて増大された細胞応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナリング経路のアゴニストであることを示し、そして標準と比較して減少された細胞応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナリング経路のアンタゴニストであることを示す。「細胞応答をアッセイする」ことによって、候補化合物および／またはTNF-ファミリーリガンドに対する細胞応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、T細胞増殖またはトリチウム化チミジン標識の増加または減少の決定または評価）が意図される。本発明によって、DR4ポリペプチドを発現する細胞は、内因的または外因的に投与されたTNF-ファミリーリガンドのいずれかと接触され得る。
本発明によるアゴニストは、例えば、TNFファミリーリガンドペプチドフラグメント、形質転換増殖因子、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、ドーパミン、N-メチル-D-アスパラギン酸）、腫瘍抑制物質（p53）、細胞溶解性T細胞、および抗代謝拮抗物質のような、天然に存在する化合物および合成化合物を含む。好ましいアゴニストは、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン（bleomycin）、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセート、およびビンクリスチンのような化学療法薬を含む。その他は、エタノールおよびアミロイドペプチドを含む（Science 267:1457-1458（1995））。さらに好ましいアゴニストは、DR4ポリペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを包含する。TNFファミリーレセプターに対して惹起された、このようなアゴニスト抗体は、Tartaglia,L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9292-9296（1991）:ならびにTartaglia,L.A.,およびGoeddel,D.V.、J.Biol.Chem.267（7）:4304-4307（1992）に開示される。PCT出願WO 94/09137もまた参照のこと。
本発明のアンタゴニストは、例えば、CD40リガンド、中性アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスElB、バキュロウイルスp35およびIAP、牛痘ウイルスcrmA、エプスタイン-バーウイルスBHRF1、LMP-1、アフリカブタ熱ウイルスLMW5-HL、およびヘルペスウイルスyl 34.5）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、および腫瘍プロモーター（例えば、PMA、フェノバルビタール、および-ヘキサクロロシクロヘキサン）のような、天然に存在する化合物および合成化合物を含む。
その他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を包含する。アンチセンス技術は、アンチセンスDNAまたはRNAを介して、または三重ヘリックス形成を介して、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Okano, J. Neurochem. 56:560（1991）; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL（1988）に考察されている。三重ヘリックス形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Research 6:3073（1979）; Cooneyら、Science 241:456（1988）;および、Dervanら、Science 251:1360（1991）に考察されている。その方法は、ポリヌクレオチドの相補的DNAまたはRNAへの結合に基づく。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’コード部分は、長さ約10塩基対から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、そのことによって、転写およびレセプター産生を阻む。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRNAにハイブリダイズし、mRNA分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAが、レセプター産生を阻害するために、インビボで発現され得るように、細胞へ送達され得る。
本発明によるさらなるアンタゴニストは、DR4の可溶性型（すなわち、全長レセプターの細胞外領域からリガンド結合ドメインを含むDR4フラグメント）を含む。レセプターのこのような可溶性型（天然に存在するか、または合成であり得る）は、TNF-ファミリーリガンドへの結合について細胞表面DR4と競合することにより、DR4媒介性シグナリングに拮抗する。従って、リガンド結合ドメインを含むレセプターの可溶性型は、TNF-ファミリーリガンドによって誘導されるアポトーシスを阻害し得る、新規サイトカインである。これらは、好ましくは、二量体または三量体として発現される。なぜなら、これらはアンタゴニストとしての可溶性レセプターの単量体の形態（例えば、IgGFc-TNFレセプターファミリー融合体）より優れるからである。その他のこのようなサイトカインは当該分野で公知であり、Fasリガンドにより誘導されるアポトーシスを制限するように生理学的に作用する、Fas B（マウスFasレセプターの可溶性形態）を含む（Hughes,D.P.およびCrispe,I.N.,J.Exp.Med.182:1395-1401（1995））。
実施例５に示される実験は、DR4が、免疫系の調節に重要であるアポトーシスを誘発し得る、死ドメイン含有の分子であることを示す。さらに、以下に示される実験は、DR4誘導性アポトーシスがICE様プロテアーゼのインヒビター（CrmA、およびz-VAD-fmk）によりブロックされることを示す。従って、ICE様プロテアーゼのインヒビター（FADD-DNおよびFLICE-DN/MACHalC360S）はまた、DR4活性についてのアンタゴニストとして使用され得る。
本明細書で使用される用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（mAb）は、抗原に結合し得るインタクトな分子ならびにそれらのフラグメント（例えば、FabおよびF（ab’）2フラグメント）を含むことを意味する。FabおよびF（ab’）2フラグメントはインタクトな抗体のFcフラグメントを欠落し、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体の非特異的な組織へのより少ない結合を有し得る（Wahlら、J.Nucl.Med.24:316-325（1983））。
本発明による抗体は、本発明のDR4免疫原を使用する種々の方法のいずれかにより、調製され得る。示されるように、このようなDR4免疫原は、全長DR4ポリペプチド（リーダー配列を含むか、または含まなくとも良い）およびDR4ポリペプチドフラグメント（例えば、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび死ドメイン）を含む。
DR4ドメインに結合するタンパク質および他の化合物はまた、本発明の候補アゴニストおよび候補アンタゴニストである。このような結合化合物は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて「捕捉され」得る（FieldsおよびSong,Nature 340:245-246（1989））。酵母ツーハイブリッドシステムの改変型は、Roger Brentおよび彼の共同研究者らによって記載されている（Gyuris,J.ら、Cell 75:791-803（1993）;Zervos,A.S.ら、Cell 72:223-232（1993））。好ましくは、酵母ツーハイブリッドシステムは、DR4リガンド結合ドメインまたはDR4細胞内ドメインのいずれかに結合する化合物を捕捉するために、本発明に従って使用される。このような化合物は、本発明の良い候補アゴニストおよび良いアンタゴニストである。
「TNF-ファミリーリガンド」によって、TNFレセプターファミリーのメンバーに結合し、そして、リガンド／レセプターシグナリング経路を誘導し得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成のリガンドが意図される。TNFリガンドファミリーのメンバーは、DR4リガンドを含み、TRAIL、TNF-α、リンホトキシン-α（LT-α、TNF-βとしても公知である）、LT-β（ヘテロ三量体複合体として見出されたLT-α2-β）、FasL、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX40、および神経成長因子（NGF）を包含するが、これらに限定されない。
本発明の代表的な治療適用は、下記により詳細に考察される。AIDSを規定する免疫不全の状態は、CD4+Tリンパ球の数および機能の減少に副次的である。最近の報告は、CD4+T細胞の日々の減少が、3.5×107と2×109との細胞の間であると評価している（Wei X.ら、Nature 373:117-122（1995））。HIV感染の環境下でのCD4+T細胞枯渇の１つの原因は、HIV誘導アポトーシスであると考えられている。事実、HIV誘導アポトーシス細胞死は、インビトロだけでなく、より重要なことに、感染した個体でも実証された（Ameisen, J.C., AIDS 8:1197-1213（1994）; Finkel, T.H.，およびBanda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615（1995）; Muro-Cacho, C.A.ら、J.Immunol. 154:5555-5566（1995））。さらに、アポトーシスおよびCD4+T-リンパ球枯渇は、AIDSの異なる動物モデルで密接に相関し（Brunner, T.ら、Nature 373:441-444（1995）; Gougeon, M.L.ら、AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563（1993））、そしてアポトーシスは、ウイルス複製がAIDSをもたらさないこれらの動物モデルでは認められない（Gougeon, M.L.ら、AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563（1993））。さらなるデータは、HIV感染個体からの非感染だが感作または活性化されたTリンパ球が、TNF-ファミリーリガンドFasLと遭遇した後に、アポトーシスを受けることを示す。HIV感染後に死をもたらす単球細胞株を使用して、U937細胞のHIVによる感染が、FasLの新規発現をもたらすこと、およびFasLが、HIV誘導アポトーシスを媒介することが実証されている（Badley, A.D.ら、J. Virol. 70:199-206（1996））。さらに、TNF-ファミリーリガンドは、非感染マクロファージで検出可能であり、その発現は、HIV感染後にアップレギュレートされ、非感染CD4 Tリンパ球の選択的殺傷をもたらした（Badley, A.D.ら、J. Virol. 70:199-206（1996））。従って、本発明によって、HIV+個体を処置するための方法が提供され、この方法は、本発明のアンタゴニストを、CD4 Tリンパ球の選択的殺傷を減少させるために投与することを包含する。投与様式および投与量は、下記に詳細に考察されている。
同種移植片拒絶では、レシピエント動物の免疫系は、応答するように前もって感作されていない。なぜなら、免疫系はほとんどの場合環境抗原によってのみ感作されるからである。同種のその他のメンバーからの組織は、例えば、ウイルスおよび細菌が提示されるのと同じようには、提示されていない。同種移植片拒絶の場合、免疫抑制療法は、免疫系がエフェクター期に到達することを阻むように設計される。しかし、異種移植片拒絶の免疫プロフィールは、同種移植片拒絶よりも疾患再発により類似し得る。疾患再発の場合、免疫系は、天然の島細胞の破壊によって示されるように、すでに活性化されている。従って、疾患再発では、免疫系はすでにエフェクター期にある。活性化され、エフェクター細胞へ分化されたリンパ球は、DR4ポリペプチドを発現するので、本発明のアゴニストは、同種移植片および異種移植片の両方に対する免疫応答を抑制し得、そのことによって、アポトーシスを増強する化合物に感受性である。従って、本発明はさらに、免疫寛容組織を作製するための方法を提供する。本発明のアンタゴニストはさらに、炎症性腸疾患の処置に使用され得る。
DR4アンタゴニストは炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬、敗血症および炎症性腸疾患）を処置するのに有用であり得る。
さらに、リンパ芽球腫のDR4および可溶性DR4の発現のために、アゴニストmABまたはアンタゴニストmABは、この形態のガンの処置のために使用され得る。さらに可溶性DR4または中和mABが、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬、敗血症、および炎症性腸疾患のような、種々の慢性形態および急性形態の炎症のために使用され得る。
投与様式
本明細書中に記載のアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のレセプターを発現する細胞に対し、インビトロ、エキソビボまたはインビボで投与され得る。アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」での投与により、TNFファミリーリガンドに対する細胞応答の増強または阻害に十分である化合物（ポリペプチドを含む）の量が意図される。詳細には、アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」の投与によりDR4媒介性アポトーシスの増強または阻害に有効な量が意図される。当然、アポトーシスが増強されるべき場合、本発明のアゴニストはTNFファミリーリガンドと同時投与され得る。当業者は、アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」が経験的に決定され、そして純粋な形態または薬学的に受容可能な塩、エステル、もしくはプロドラッグ形態で使用され得ることを理解する。アゴニストまたはアンタゴニストは、一つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた組成物で投与され得る。
ヒト患者に投与される場合、本発明の化合物および組成物の全１日の用量は、信頼できる医学的判断の範囲内で担当医により決定されることが理解される。いずれの特定の患者も、特異的な、治療的に有効な用量レベルは、医学の分野で周知の要因に依存する。
一般的な提案として、用量あたり非経口的に投与されるDR4ポリペプチドの薬学的に有効な全体量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であるが、上記に示されているように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましくは、この用量は、ホルモンについて、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましくは、ヒトに対して、約0.01と1mg/kg/日との間である。継続的に投与される場合、DR4アゴニストまたはDR4アンタゴニストは、代表的には、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、1日あたり1〜4回注入によって、または、例えば、ミニポンプを使用した継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。
投薬はまた、RIAの技術により決定されるように、アゴニストまたはアンタゴニストが所定の濃度で血液中に供給するために、患者に特異的な様式で準備され得る。従って、患者への投薬は、RIAにより測定される、規則正しい継続した血中濃度（すなわち50〜1000ng/ml、好ましくは150〜500ng/mlのオーダー）を達成するように調整され得る。
アゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物が提供され、これは、経口、直腸内、非経口、槽内（intracistemally）、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチによるように）、経頬に（bucally）、もしくは経口または経鼻スプレーとして、投与され得る。重要なことには、アゴニストおよびTNFファミリーリガンドの同時投与により、臨床的な副作用が、リガンドおよびアゴニストの両方を低用量での使用することにより減少され得る。アゴニストは、特定の治療の適応における緊急性に依存して、TNFファミリーリガンドの前もしくは後、またはTNFファミリーリガンドとともに同時投与されることが理解される。「薬学的に受容可能なキャリア」によって、非毒性の固体、半固体、または液状充填剤、希釈物、カプセル化材料、または任意の型の処方補助剤が意味される。本明細書で使用されている用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（intrasternal）、皮下、および関節内の注射および注入を包含する投与様式のことである。
非経口投与のための本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な滅菌水または非滅菌水、分散液、懸濁液、またはエマルジョンならびに使用直前に滅菌注入溶液または分散液中で再構成される滅菌粉末を含み得る。
可溶性DR4ポリペプチドに加えて、膜貫通領域を含むDR4ポリペプチドもまた、界面活性剤（例えば、CHAPSまたはNP-40）を含むことにより緩衝液によって適切に溶解されて、使用され得る。
実施例１：E.coliにおける発現および精製
寄託cDNAクローン（ATCC番号97853）における成熟DR4タンパク質をコードするDNA配列を、DR4タンパク質のアミノ末端配列に、およびベクターの遺伝子に対して3’の配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするために制限部位を含む付加的なヌクレオチドを、5’および3’の配列にそれぞれ付加する。
以下のプライマーを、E.coliにおいて、DR4細胞外ドメインの発現のために使用する。5’プライマー5’-GCGGCATGCATGATCAATCAATTGGCAC-3’（配列番号８）は、下線を付したSphI部位を含み、3’プライマー5’-GCGAAGCTTTCAATTATGTCCATTGCCTG-3’（配列番号９）は、下線を付したHindIII部位を含む。ベクターはpQE60である。
その制限部位は、これらの実施例における細菌性発現のために使用する細菌発現ベクターpQE60に簡便である（Qiagen,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311）。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ampr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ori」）、IPTG誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）を含む。
増幅したDR4 DNAおよびpQE60ベクターの両方を、SphIおよびHindIIIを用いて消化し、次いで、消化したDNAを互いに連結した。制限化pQE60ベクターへのDDCRタンパク質DNAの挿入により、DR-4タンパク質コード領域を、ベクターのIPTG誘導性プロモーターの下流に、作業可能に連結し、そしてDR4タンパク質の翻訳のために適切に配置した開始AUGを伴いインフレームで配置する。
連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換する。このような手順は、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1989）に記載される。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coli株M15/rep4を本明細書中に記載の実施例を行うにあたって使用する。この株（これは、DR4タンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一の株である）は、Qigenから市販されている。
形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化されたDNAの同定を、制限分析により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）およびカナマイシン（25μg/ml）の両方を補充したLB培地中での液体培養で一晩（「O/N」）増殖させる。
O/N培養物を、およそ1:100〜1:250の希釈で大量培養に播種するために使用する。細胞を、0.4〜0.6の間の600nmでの吸光度（「OD600」）まで増殖させる。次いで、イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を1mMの最終濃度で添加し、lacIリプレッサーを不活化させることによりlacリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに3〜4時間引き続きインキュベートする。次いで、細胞を遠心分離により回収し、そして標準的方法により破砕する。封入体を、日常的な回収技術を使用して破砕細胞から精製し、そしてタンパク質を封入体から8M尿素へ可溶化する。可溶化タンパク質を含有する8M尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「PBS」）のPD-10カラムに通し、これにより尿素を除去する。緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再びフォールディングさせる。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程により精製し、内毒素を除去する。次いで、それを滅菌濾過する。滅菌濾過したタンパク質調製物を、2×PBSで95μ/mlの濃度で保存する。
実施例２：哺乳動物細胞での発現
哺乳動物細胞での所定の遺伝子配列の一過性発現について使用されるベクターの大半は、SV40複製起点を有する。これは、ウイルス性DNA合成の開始に必要とされるT抗原を発現する細胞（例えば、COS細胞）での高いコピー数のベクターの複製を可能にする。任意の他の哺乳動物細胞株もまた、この目的について利用され得る。
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセプター部位に隣接される介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例えば、RSV、HTLVI、HIVI）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性シグナル（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた使用され得る。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、pSVLおよびpMSG（Pharmacia, Uppsala, Sweden）、pRSVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela細胞、283細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1アフリカミドリザル細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞などが挙げられる。
あるいは、目的の遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株において発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされたタンパク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。このマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択のための漸増量のメトトレキサート中で増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LTR）（Cullenら、Molecular and Cellular Biology, 438：44701（1985年３月））およびCMVエンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、およびAsp718を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3’イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。
CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4を、DR4ポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドpC4は、プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスMEM、Life TechnoIogies）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R.、およびSchimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370、Hamlin, J.L.およびMa, C.1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143、Page, M.J.およびSydenham, M.A.1991, Biotechnology 9:64-68を参照のこと）。漸増濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFRを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がDHFR遺伝子と連結する場合、通常、それは同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の1,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれると、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Cullenら、Molecular and Cellular Biology,1985年3月:438-447,）の長末端反復（LTR）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Boshartら、Cell 41:521-530（1985））の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位が存在する：BamHI、XbaI、およびAsp718。プラスミドは、これらのクローニング部位の後ろに、ラットプレプロインスリン遺伝子の3’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）由来の長末端反復）もまた、発現のために使用され得る。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および同様の系は、哺乳動物細胞において調節された方法でDR4ポリペプチドを発現するために使用され得る（Gossen, M.，およびBujard, H. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551）。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）もまた、使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を含む安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、G418およびメトトレキサート）を使用することが、有利である。
プラスミドpC4を、制限酵素BamHIで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼ（phosphate）を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
完全ポリペプチドをコードするDNA配列を、遺伝子の所望の部分の5’および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。下線を付したBamHI部位,kozak配列、およびAUG開始コドンを含む5’プライマーは、以下の配列を有する：
0004450870.tif 000004
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（Felgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。細胞を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/ml G418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Greiner, Germany）に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を用いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μM、２μM、５μM、10mM、20mM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって、または逆相HPLC分析によって分析する。
実施例３
バキュロウイルス発現系におけるDR4の可溶性細胞外ドメインのクローニングおよび発現
寄託されたクローン（ATCC番号97853）のDR4タンパク質の可溶性細胞外ドメインをコードするcDNA配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する：DR4についての５’プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位を含む配列５’GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA３’（配列番号10）を有する。以下に記載されるように発現ベクターへ挿入した、DR4をコードする増幅したフラグメントの５’末端は、効果的な切断シグナルペプチドを提供する。真核生物細胞での翻訳開始に効果的なシグナルは、Kozak.M.,J.Mol.Biol.196:947-950（1987）により記載されるように、構築物中のベクター部分に適切に配置される。
両方のDR4についての３’プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いて図１に示すDR4ヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド、続いて停止コドンを含む配列５’GCGGGATCCTCAATTATGTCCATTGCCTG３’（配列番号１２）を有する。
増幅したフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.）を使用して１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントをBamHIおよびAsp718で消化し、そして再び１％アガロースゲルで精製する。
ベクターpA2を、標準的な方法である、例えば、Summersら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures.Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555（1987）に記載されているバキュロウイルス発現系で、DR4タンパク質を発現させるために使用する。この発現ベクターは、Autograph California核多角体ウイルス（ACMNPV）の強力な多角体プロモーター、続いて都合の良い制限部位を包含する。組換えウイルスの容易な選択については、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体プロモーターと同一の配向で挿入し、そして多角体遺伝子のポリアデニル化シグナルがあとに続く。この多角体配列の両側には、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存ウイルスを産生するための野生型ウイルスDNAの細胞媒介性の相同的な組換えのためのウイルス配列が隣接する。
当業者が容易に理解するように、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）を、構築物が、転写、翻訳、細胞内輸送などについての適切に配置されたシグナル（例えば、必要に応じてインフレームAUG、およびシグナルペプチド）を提供する限りpA2の代わりに使用し得る。このようなベクターは、とりわけ、Luckowら、Virology 170:31-39、他のものに記載される。
このプラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで、当該分野で公知である日常的な手順を使用してウシ腸のホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いでDNAを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.）を使用して１％アガロースゲルから単離する。
フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、T4 DNAリガーゼにより連結し、E.coli HB101細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレートに塗布する。ヒトDDCR遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を、BamHIを使用して個別のコロニー由来のDNAを消化することにより同定し、次いでゲル電気泳動により消化生成物を分析する。クローン化フラグメントの配列を、DNA塩基配列決定法により明らかにする。このプラスミドを、本明細書ではpBacDR4と称する。
５μgのプラスミドpBac DR4を、1.0μgの市販の線状バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」,Pharmingen,San Diego,CA.）と一緒にリポフェクション法（Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417（1987）により記載される）を使用して同時形質転換する。１μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac DR4を、50μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチン＋90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして15分間室温でインキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、１mlの無血清グレース培地を加えた35mm組織培養プレート中に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に一滴ずつ添加する。このプレートを振盪させ、そして新たに添加した溶液を混合させる。次いで、このプレートを５時間、27℃でインキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎仔血清を添加した１mlのグレース昆虫培地上清を加える。このプレートをインキュベーターに戻し、そして27℃、４日間培養を続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmithらの記載（上記に引用される）のようにプラークアッセイを実施する。「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,Gaithersburg）を含むアガロースゲルを、gal発現クローン（これは青色に染まるプラークを産生する）の容易な同定および単離を可能にするために使用する。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な記載はまた、Life Technologies Inc.,Gaithersburgより配布される、user’s guide for insect cell culture and baculovirology,9-10頁にて見出され得る）。
連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加える。適切なインキュベーションの後に、青色に染まったプラークをエッペンドルフピペットのチップでつつく。次いで、組換ウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁する。寒天を簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm培養ディッシュに播種したSf9細胞を感染させるために使用する。４日後に、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いで、それらを４℃で保存する。適当に挿入されたDR4を確実に含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むDNA分析により同定する。これを、本明細書ではV-DR4と称する。
Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で培養する。この細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「MOI」）で組換えバキュロウイルスV-DR4を感染させる。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを欠いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.,Gaithersburgより入手可能）に交換する。42時間後、5gCiの35Sメチオニンおよび5μCiの35Ｓシステイン（Amershamより入手可能）を加える。細胞をさらに16時間インキュベートし、次いで遠心分離によりこれらを回収し、溶解し、そして標識されたタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。
実施例４：DR4遺伝子発現の組織分布
ノーザンブロット分析を、とりわけ、Sambrookら（上記で引用される）により記載される方法を使用して、ヒト組織中でのDR4遺伝子（ATCC番号97853）発現を試験するために実施する。DR4タンパク質（配列番号１）の完全なヌクレオチド配列を含むcDNAプローブを、rediprimeTM DNA labeling system（Amersham Life Science）を使用して、製造元の説明書に従って32Pで標識する。標識後、製造者のプロトコル番号PT1200-1に従い、プローブをCHROMA SPIN-100TMカラム（Clontech Laboratories,Inc.）を使用して精製する。次いで、精製した標識プローブを、DR4 mRNAについて、種々のヒト組織において試験するために使用する。
種々のヒト組織（H）またはヒト免疫系組織（IM）を含む、多組織（Multiple Tissue）ノーザン（MTN）ブロットをClontechより入手し、そして製造者のプロトコル番号PT1190-1に従い、ExpressHybTMハイブリダイゼーション溶液（Clontech）を使用し、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後に、ブロットをマウントし、-70℃、一晩フィルムに曝露し、そして標準的手順に従ってフィルムを現像する。DR4の発現を、羊膜細胞、心臓、肝臓癌、腎臓、末梢血白血球、活性化T細胞、K562プラスPMA、W138細胞、Th2細胞、ヒト扁桃腺、およびCD34枯渇バフィーコート（臍帯血）を含む、リンパ球で富化された組織において検出した。これは、DR4が、白血球のホメオスタシスで役割を果たすことを認識し得る。
実施例５：DR4誘導性アポトーシス
哺乳動物細胞でのFas/APO-1およびTNFR-1の過剰発現は、レセプター活性を擬態する（M.Muzioら、Cell 85.817-827（1996）:M,P.Boldinら、Cell 85.803-815（1996））。従って、この系をDR4の機能的役割を研究するために利用した。MCF7ヒト乳ガン細胞および293ヒト胚性腎臓細胞でのDR4の一過性発現は、迅速なアポトーシスを誘導した。
細胞死アッセイを、本質的に、以前に記載されたように実施する（A.M.Chinnaiyanら、Cell 81,505-12（1995）;M.P.Boldinら、J.Biol.Chem 270.7795-8（1995）:F.C.Kischkelら、EMBO 14,5579-5588（1995）;A.M.Chinnaiyanら、J.Biol.Chem 271,4961-4965（1996））。簡潔には、ベクター単独、またはCrmA発現構築物（M.Tewariら、J.Biol.Chem 270.3255-60（1995））のいずれかにより安定にトランスフェクトしたMCF-7ヒト乳癌クローン細胞株を、リポフェクタミン（GIBCO-BRL）を使用して、指摘されるタンパク質をコードするpcDNA3発現構築物の10倍過剰存在下で、pCMV-DR4-ガラクトシダーゼ（またはpCMV-DR4-ガラクトシダーゼ（死ドメインを欠如する））を、一過的にトランスフェクトする。293細胞を、CaPO4法を使用して同様にトランスフェクトする。ICEファミリーインヒビターz-VAD-fmk（Enzyme Systems Products.Dublin,CA）を、トランスフェクションの５時間後に10μMの濃度で細胞に加える。トランスフェクションの32時間後、細胞を固定し、そして以前に記載したようにX-Galで染色する（A.M.Chinnaiyanら、Cell 81.505-12（1995）:M.P.Boldinら、J.Biol.Chem 270,7795-8（1995）:F.C.Kischkelら、EMBO 14,5579-5588（1995））。
細胞は、アポトーシスを経験している細胞に典型的な形態学的な変化を示し、円形になり、凝縮し、そしてディッシュから剥離した。TNFR-1およびFas/APO-1（M.Muzioら、Cell 85,817-827（1996）;M.P.Boldinら、Cell 85,803-815（1996）;M.Tewariら、J.Biol.Chem 270,3255-60（1995））と同様に、DR4誘導性アポトーシスは、ICE様プロテアーゼのインヒビター、CrmAおよびz-VAD-fmkによりブロックされた。
本発明が、前述の説明および実施例に特に記載される以外の方法で実施され得ることは明白である。
本発明の多くの修飾および改変が、上記の教示を考慮して可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内にある。
本明細書中に参照される全ての特許、特許出願、出版物の開示の全体が、本明細書中に参考として援用される。
配列表
（1）一般的情報：
（i）出願人：ニ，  ジアン
ローゼン，  クレイグ  エイ．
パン，  ジェイムズ  ジー．
ジェンツ，  ライナー  エル．
ディキシット，  ビシュバ  エム．
（ii）発明の名称：死ドメイン含有レセプター−４
（iii）配列数：１１
（iv）連絡住所：
（A）名称：ヒューマン  ジノーム  サイエンシーズ，
インコーポレイテッド
（B）番地：キー  ウエスト  アベニュー  9410
（C）市：ロックビル
（D）州：メリーランド
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：20850
（v）コンピューター読み出し形態：
（A）媒体型：フロッピー ディスク
（B）コンピューター：IBM PC  互換用
（C）OS：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン  リリース  #1.0，バージョン  #1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：US
（B）出願日：1997年1月28日
（C）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（A）氏名：ブルックス，アンダーズ  エイ
（B）登録番号：36,373
（C）照会／記録番号：PF355
（ix）電話回線情報：
（A）電話：（301）309-8504
（B）テレファックス：（301）309-8512
（2）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：2152塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：19..1422
（xi）配列：配列番号１：
0004450870.tif 000005
0004450870.tif 000006
0004450870.tif 000007
（2）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：468アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号２：
0004450870.tif 000008
0004450870.tif 000009
（2）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：669アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号３：
0004450870.tif 000010
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0004450870.tif 000012
（2）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：909アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号４：
0004450870.tif 000013
0004450870.tif 000014
0004450870.tif 000015
0004450870.tif 000016
（2）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：833アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号５：
0004450870.tif 000017
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（2）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：426塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号６：
0004450870.tif 000020
（2）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：339塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号７：
0004450870.tif 000021
（2）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：28塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号８：
0004450870.tif 000022
（2）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：36塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号９：
0004450870.tif 000023
（2）配列番号１０の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：33塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号１０：
0004450870.tif 000024
（2）配列番号１１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）長さ：29塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ゲノムDNA
（xi）配列：配列番号１１：
0004450870.tif 000025
0004450870.tif 000026
【図１Ａ】
0004450870.tif 000027
【図１Ｂ】
0004450870.tif 000028
【図１Ｃ】
0004450870.tif 000029
【図２Ａ】
0004450870.tif 000030
【図２Ｂ】
0004450870.tif 000031
【図２Ｃ】
0004450870.tif 000032
【図２Ｄ】
0004450870.tif 000033
【図２Ｅ】
0004450870.tif 000034
【図２Ｆ】
0004450870.tif 000035
【図３】
0004450870.tif 000036
【図４】
0004450870.tif 000037
【図５Ａ】
0004450870.tif 000038
【図５Ｂ】
0004450870.tif 000039
【図５Ｃ】
0004450870.tif 000040
【図６Ａ】
0004450870.tif 000041
【図６Ｂ】
0004450870.tif 000042