(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化成熟後に脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させるための再分化方法であって、
下記成分からなる再分化用培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養することにより、Ｘ型コラーゲンの発現を抑制しながら、前記脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させることを含んでなる方法：
(1)インスリン；
(2)ＢＭＰ−２（bone morphogenetic protein-2）および／またはＢＭＰ−４；および
(3)Ｔ３（Triiodothyronine）；
(4)基礎培地。
【請求項２】
前記再分化用培地が０．０５〜５００μｇ／ｍＬの前記インスリンを含有する、請求項１に記載の再分化方法。
【請求項３】
前記再分化用培地が１ｎｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの前記ＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−４を含有する、請求項１または２に記載の再分化方法。
【請求項４】
前記再分化用培地が１０−９〜１０−５ＭのＴ３を含有する、請求項１〜３の何れか１項に記載の再分化方法。
【請求項５】
前記軟骨細胞が、ガラス軟骨細胞および弾性軟骨細胞から選択される、請求項１〜４の何れか１項に記載の再分化方法。
【請求項６】
前記培養が平面培養、三次元培養、およびペレット培養の何れかである、請求項１〜５の何れか１項に記載の再分化方法。
【請求項７】
前記培養が３〜６週間行われる、請求項１〜６の何れか１項に記載の再分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させるための、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、耳、鼻、気管、関節、椎間板などを構成し、骨と並んで体の形態保持や日常生活動作を行う上で重要な役割を果たしている。このような軟骨が、関節軟骨損傷などの外傷、変形性関節症などの加齢性疾患、関節リウマチなどの炎症性疾患、腫瘍手術後の大型疾患、先天異常などで障害を受けると、歩行などの生活動作が困難になったり、体の外形が保持できなくなるなど、日常生活に著しい障害をきたしてしまう。軟骨に関するこれらの疾患等の患者数は多く、前記変形性関節症の発症者数は年間９０万人ともいわれており、これらの疾患等に有効な解決策が望まれている。
従来においては、これらの疾患等に対し、人工関節の利用、自己軟骨の移植などの処置が行われてきたが、耐久性、感染、ドナーサイトトラブルなどの問題があるため、このような問題のない解決策が必要であり、軟骨再生医療を可能にする技術の開発への期待が高まっている。【０００３】
前記軟骨再生医療には、軟骨細胞の効率的な培養技術の確立が必須であり、軟骨細胞の培養・増殖方法については、多数報告されているものの（特許文献１及び２参照）、軟骨細胞は培養中に極めて高い確率で脱分化し、線維芽細胞様に変化するが、該軟骨細胞が脱分化し線維芽細胞様の脱分化型軟骨細胞に変化してしまった場合の対応策・解決策としては、静水圧を利用して脱分化型軟骨細胞を再分化させる方法、３次元培養を行って脱分化型軟骨細胞に再分化させる方法などが提案されてはいるものの、これらの方法の場合、前記脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に効率良くかつ容易に再分化させることができていないのが現状である。前記軟骨再生医療を実現するためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に効率良くかつ容易に再分化させることができる技術の提供が望まれている。【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５３４７９２号公報
【特許文献２】特表２００４−５０２４０１号公報
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを目的とする。即ち、本発明は、鼻、耳、咽喉、関節等の軟骨の欠損・損傷部位の移植用素材、美容整形等の美容用素材等の効率的な生産に重要であり、軟骨再生医療の発展に貢献可能であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して線維芽細胞様に変化してしまった脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に効率よくかつ容易に再分化させることができる、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地及び脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法を提供することを目的とする。
【０００６】
上述した現状に鑑み、本発明の発明者等が鋭意検討した結果、インスリンとＢＭＰ−２とを併用した時に、好ましくは更にＴ３をも併用した時に、脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に効率良くかつ容易に再分化させることができることを知見した。本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させるために用いられ、インスリンと、ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種とを含むことを特徴とする脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜２＞  Ｔ３を含む前記＜１＞に記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜３＞  ＢＭＰ−２の類似体が、ＢＭＰ−４である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜４＞  インスリンを０．０５〜５００μｇ／ｍＬ含む前記＜１＞から＜３＞いずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜５＞  ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種を１ｎｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬ含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜６＞  Ｔ３を１０−９〜１０−５Ｍ含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜７＞  線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、インスリン様成長因子類（ＩＧＦ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、グルココルチコイド、ビタミンＤ、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、エストロゲン、アンドロゲン、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、骨形態形成タンパク類（ＢＭＰ）、表皮成長因子、血小板由来成長因子類、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、アルブミン、アスコルビン酸、軟骨モジュリン類、ヘパリン結合因子、α線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、細胞分裂促進ホルモン、結合組織成長因子、肝細胞成長因子、アラキドン酸、プロスタグランジンＡ、プロスタグランジンＢ、プロスタグランジンＥ、プロスタグランジンＦ、及び、ヒスタミンから選択される少なくとも１種を含む前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜８＞  再分化した軟骨細胞が、硝子軟骨細胞及び弾性軟骨細胞から選択される前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜９＞  再分化した軟骨細胞が、平面培養、三次元培養、及びペレット培養のいずれかにより培養される前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて、脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を培養することにより、該脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させることを特徴とする脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法である。
＜１１＞  培養が３〜６週間行われる前記＜１０＞に記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法である。
＜１２＞  再分化した軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲン発現・産生量値Ｃと、脱分化型軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲン発現・産生量値Ｄとの比（Ｃ／Ｄ）が、１以上である前記＜１０＞から＜１１＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法である。
＜１３＞  脱分化型軟骨細胞における、Ｉ型コラーゲン発現・産生量が生体内の軟骨細胞のＩ型コラーゲン発現・産生量以上であり、かつＩＩ型コラーゲン産生量が生体内の軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン発現・産生量以下であり、かつＩＩ型コラーゲン発現・産生量が脱分化型軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン発現・産生量以上である前記＜１０＞から＜１２＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法である。
＜１４＞  脱分化型軟骨細胞における、圧迫強度、破断強度及びヤング率が、再分化した軟骨細胞における、圧迫強度、破断強度及びヤング率よりも大きい前記＜１０＞から＜１３＞のいずれかに記載の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、左図が、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）の写真であり、右図が、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）の写真である。上図が、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）と、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）とにおける遺伝子の発現状態を示す電気泳動におけるバンドの有無を示す写真である。
【図２】図２は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む培地と、インスリンとＢＭＰ−２とを含む培地とを用いて培養した前記脱分化型軟骨細胞における、Ｉ型コラーゲンの発現量の測定結果を表すグラフである。
【図３】図３は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む培地と、インスリンとＢＭＰ−２とを含む培地とを用いて培養した前記脱分化型軟骨細胞における、ＩＩ型コラーゲンの測定結果を表すグラフである。
【図４】図４は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む培地と、インスリンとＢＭＰ−２とを含む培地とを用いて培養した前記脱分化型軟骨細胞における、Ｘ型コラーゲンの発現量の測定結果を表すグラフである。
【図５】図５は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、該ＢＭＰ−２の含有量の好ましい範囲を比較検討した結果を表すデータである。
【図６】図６は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、該インスリンの含有量の好ましい範囲を比較検討した結果を表すデータである。
【図７】図７は、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、該Ｔ３の含有量の好ましい範囲を比較検討した結果を表すデータである。
【図８】図８は、培養した脱分化型軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２、Ｔ３の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１０−７Ｍである場合と、前記ＢＭＰ−２をＢＭＰ−４に代えた以外は同様の組成の培地における、Ｉ型コラーゲンの遺伝子発現量の測定結果を表すグラフである。
【図９】図９は、培養した脱分化型軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２、Ｔ３の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１０−７Ｍである場合と、前記ＢＭＰ−２をＢＭＰ−４に代えた以外は同様の組成の培地における、ＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現量の測定結果を表すグラフである。
【図１０】図１０は、培養した脱分化型軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２、Ｔ３の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１０−７Ｍである場合と、前記ＢＭＰ−２をＢＭＰ−４に代えた以外は同様の組成の培地における、Ｘ型コラーゲンの遺伝子発現量の測定結果を表すグラフである。
【図１１】図１１は、３次元培養による３次元培養物における、機械的性質としての圧縮強度の測定結果を表すグラフである。
【図１２】図１２は、３次元培養による３次元培養物の写真データである。
【図１３】図１３は、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた培養物を、ヌードマウスの皮下に２ヶ月間移植した際の培養物の機械的性質として、圧縮強度を測定した結果を表すグラフである。
【図１４】図１４は、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた培養物を、ヌードマウスの皮下に２ヶ月間移植した際の培養物の写真データである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地、及び、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法）
本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させるために用いられ、インスリンと、ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種とを含んでなり、好ましくは更にＴ３を含んでなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含んでなる。
本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法は、本発明の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を培養することにより、該脱分化型軟骨細胞を元の軟骨細胞に再分化させることを含み、必要に応じて適宜選択したその他の処理等を含む。
以下、本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地と、それを用いた本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法とについて説明する。【０００９】
前記インスリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品であってもよいし、適宜合成したものであってもよい。
前記インスリンの前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、０．０５〜５００μｇ／ｍＬであるのが好ましい。
前記インスリンの含有量が、０．０５μｇ／ｍＬ未満であると、再分化が誘導されないことがあり、５００μｇ／ｍＬを超えると、再分化の誘導が阻害されることがある。【００１０】
前記ＢＭＰ−２は、骨形成蛋白（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）を意味する。該ＢＭＰ−２としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品であってもよいし．適宜合成したものであってもよい。
前記ＢＭＰ−２の類似体（アナログ）としては、特に制限はなく、公知のものの中から適宜選択することができ、例えば、ＢＭＰ−４、などが好適に挙げられる。
前記ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種としては、例えば、前記ＢＭＰ−２と前記ＢＭＰ−４とを併用してもよいし、前記ＢＭＰ―２又は前記ＢＭＰ−４を単独で使用してもよいが、前記ＢＭＰ−２を単独で使用するのが好ましい。【００１１】
前記ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬであるのが好ましい。
前記ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種の含有量が、１ｎｇ／ｍＬ未満であると、再分化が誘導されないことがあり、４０μｇ／ｍＬを超えると、再分化の誘導が阻害されることがある。【００１２】
前記Ｔ３は、甲状腺ホルモン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｒｙｏｎｉｎｅ）を意味する。該Ｔ３としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を使用してもよいし、適宜合成したものを使用してもよい。
前記Ｔ３が前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地に含有されていると、前記インスリンと、前記ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種とを含む場合に比し、前記脱分化型軟骨細胞をより効率的に再分化させることができるだけでなく、更に、骨になるときに発現が多く観られるＸ型コラーゲンの発現を効果的に抑制させることができる点で有利である。
前記Ｔ３の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０−９〜１０−５Ｍであるのが好ましい。
前記Ｔ３の含有量が、１０−９Ｍ未満であると、再分化が効率的に誘導されないことがあり、１０−５Ｍを超えると、再分化の誘導が阻害されることがあり、前記数値範囲内であると、前記インスリンと、前記ＢＭＰ−２及びその類似体から選択される少なくとも１種とを含む場合に比し、前記脱分化型軟骨細胞をより効率的に再分化させることができるだけでなく、更に、前記Ｘ型コラーゲンの発現を効果的に抑制させることができる。【００１３】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化に影響を与え得るもの、溶媒等、が好適に挙げられる。【００１４】
前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化に影響を与え得るものとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、インスリン様成長因子類（ＩＧＦ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、グルココルチコイド（デキサメタゾなど）、ビタミンＤ、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、エストロゲン、アンドロゲン（テストステロンなど）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、骨形態形成タンパク類（ＢＭＰ）、表皮成長因子、血小板由来成長因子類、トランスフェリン、亜セレン酸、リノール酸、アルブミン、アスコルビン酸、軟骨モジュリン類、ヘパリン結合因子、α線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、細胞分裂促進ホルモン、結合組織成長因子、肝細胞成長因子、アラキドン酸、プロスタグランジンＡ、プロスタグランジンＢ、プロスタグランジンＥ、プロスタグランジンＦ、及び、ヒスタミンなどが挙げられる。
これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。【００１５】
前記溶媒等としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、などが好適に挙げられる。
前記水としては、滅菌水、ミリポアＱ水、などが挙げられる。【００１６】
前記その他の成分の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における含有量（合計量）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００１７】
本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地による培養対象である、前記脱分化型軟骨細胞は、軟骨細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した細胞である。【００１８】
本発明において、前記軟骨特性とは、生体内での前記Ｉ型コラーゲン及び前記ＩＩ型コラーゲンの発現・産生量を意味し、該軟骨特性が減弱とは、前記Ｉ型コラーゲンの発現・産生量（Ａ）と、該脱分化型軟骨細胞に脱分化する前の前記軟骨細胞（脱分化前軟骨細胞）における前記Ｉ型コラーゲンの発現・産生量（Ｂ）との比（Ａ／Ｂ）が１以上であること、あるいは前記ＩＩ型コラーゲンの発現・産生量（Ｃ）と、該脱分化型軟骨細胞に脱分化する前の前記軟骨細胞（脱分化前軟骨細胞）における前記ＩＩ型コラーゲンの発現・産生量（Ｄ）との比（Ｃ／Ｄ）が１以下であることを意味する。
なお、前記脱分化前軟骨細胞とは、前記脱分化型軟骨細胞が由来する生体内の軟骨細胞を意味する。【００１９】
前記軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞であるのか、又は、前記脱分化前軟骨細胞、若しくは前記脱分化型軟骨細胞から再分化した軟骨細胞（再分化軟骨細胞）であるのかについては、前記Ｉ型コラーゲン発現・産生量、前記ＩＩ型コラーゲン発現・産生量、前記Ｘ型コラーゲンの発現・産生量、圧迫強度、破断強度、ヤング率、平衡圧迫係数等に基づいて判断することができる。【００２０】
即ち、前記ＩＩ型コラーゲンの発現・産生量が生体内の軟骨細胞より少なく、前記Ｉ型コラーゲンの発現・産生が生体内の軟骨細胞より多く、圧迫強度、破断強度、ヤング率、平衡圧迫係数等が生体内の軟骨組織より低い値となる細胞は、前記脱分化型軟骨細胞である可能性が高く、一方、前記Ｉ型コラーゲン発現・産生量が少なく、前記ＩＩ型コラーゲン発現・産生量が多く、圧迫強度、破断強度、ヤング率、平衡圧迫係数等が刺激前の脱分化型軟骨細胞に比較して高い値となる細胞は、前記再分化軟骨細胞である可能性が高いと判断することができる。【００２１】
ここで、前記軟骨細胞は、軟骨基質を産生し、トルイジンブルーによる染色に対しては異染色性を有し、トルイジンブルー染色による識別が可能である。
前記軟骨細胞においては、一般に、Ｉ型コラーゲンの発現・産生量が少なく、骨になるときに発現が多く観られるＸ型コラーゲンの発現・産生量が少なく、ＩＩ型コラーゲンの発現・産生量が多く、また、一般に、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、及びＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子のうち少なくとも１つが、前記脱分化型軟骨細胞よりも高度に発現している。
このため、前記軟骨細胞における、前記Ｉ型コラーゲン発現・産生量が見られると、該軟骨細胞が脱分化し線維芽細胞様の脱分化型軟骨細胞への変化が生じている可能性がある。なお、前記ＣＯＬ２Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ９Ａ１遺伝子、前記ＣＯＬ１１Ａ２遺伝子、前記Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、前記Ｍａｔｒｉｌｌｉｎ３遺伝子、及び前記Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ１遺伝子は、前記軟骨細胞で高度に発現する遺伝子であり、これらの遺伝子と、これらの遺伝子の発現結果としてのＩＩ型コラーゲン等の蛋白質とは、正常な軟骨細胞のマーカーとなり得る。なお、これら以外に、プロテオグリカンなども正常な軟骨細胞のマーカーとなり得る。【００２２】
前記軟骨細胞の具体例としては、例えば、関節軟骨細胞（関節軟骨非荷重部由来の軟骨細胞）、肋軟骨細胞（肋軟骨由来の軟骨細胞）等の硝子軟骨細胞、耳介軟骨細胞（耳介軟骨由来の軟骨細胞）等の弾性軟骨細胞、などが挙げられる。
これらは、通常、１種単独で使用されるが、２種以上を併用してもよい。【００２３】
前記再分化軟骨細胞は、前記脱分化前軟骨細胞と同様であり、該再分化軟骨細胞においては、その前記ＩＩ型コラーゲン発現・産生量値Ｃと、前記脱分化型軟骨細胞における前記ＩＩ型コラーゲン発現・産生量値Ｄとの比（Ｃ／Ｄ）が、１を超えていれば特に制限はないが、１０以上が好ましく、１００〜１０００がより好ましい。【００２４】
前記脱分化型軟骨細胞の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地に対する接種細胞量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０５〜１０９個／ｍＬ程度が好ましく、１０６〜１０８個／ｍＬがより好ましい。
前記脱分化型軟骨細胞の接種細胞量が、１０５個／ｍＬ未満であると、細胞が低栄養状態になる可能があり、１０９個／ｍＬを超えると、細胞が低酸素・低栄養状態になる可能がある。【００２５】
前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地に接種する前記脱分化型軟骨細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟骨細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中に脱分化して前記脱分化型軟骨細胞に変化したもの、前記脱分化型軟骨細胞として抽出等したもの、などが挙げられるが、前者のものが好適に挙げられる。【００２６】
前記脱分化型軟骨細胞の前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地での培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養における培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、通常、１週間以上であり、３〜６週間が好ましい。
前記培養時間が、１週間未満であると、再分化が十分に起こらないことがある。
前記培養における温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常、３２〜４２℃であり、３４〜３９℃が好ましい。
前記培養温度が、３２℃未満であると、再分化障害あるいは細胞死を来たすことがある。
前記倍長における酸素分圧としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、１０〜３０％であり、１５〜２５％が好ましい。
前記酸素分圧が、１０％未満であると、再分化障害あるいは細胞死を来たすことがある。
前記培養におけるｐＨ値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常、６〜８程度であり、６．５〜７．５が好ましい。
前記ｐＨ値が、６未満あるいは８を超えると、再分化障害あるいは細胞死を来たすことがある。【００２７】
前記培養の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平面培養（単層培養）、３次元培養、ペレット培養、などが挙げられる。
これらは、１種単独で採用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、３次元培養が好ましい。【００２８】
前記平面培養（単層培養）は、例えば、プレート、シャーレ上で行う２次元的な培養である。【００２９】
前記３次元培養は、例えば、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸等で形成された３次元基材（足場素材）の上あるいは内部で行う培養である。
前記３次元培養には、例えば、アテロコラーゲン（川研社製）等の市販の材料を用いて行うことができる。【００３０】
前記３次元基材（足場素材）としては、特に制限はなく、目的に応じてその素材、性状、形状、構造、大きさ等について適宜選択することができる。
前記素材としては、例えば、ポリ−Ｄ−ラクチド、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−ＤＬ−ラクチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、アテロコラーゲン、コラーゲン、フィブリン、アルジネート、寒天、ゼラチン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アテロコラーゲンなどが好適に挙げられる。
前記性状としては、例えば、ゲル状などが好適に挙げられる。
前記形状としては、例えば、移植に用いる移植用素材、美容用素材等の形状に基づいて適宜選択することができる。
前記構造としては、通常、多孔質構造、メッシュ構造、スポンジ構造、などが好適に挙げられる。【００３１】
前記ペレット培養は、前記平面培養した軟骨細胞を剥がして培養液中で軽く遠心して行う培養である。該ペレット培養によると、丸いペレット状の培養細胞が得られる。該ペレット培養は、培養細胞を高密度で凝集させることができる。【００３２】
本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法により、前記脱分化型軟骨細胞から再分化させた前記軟骨細胞（再分化軟骨細胞）は、鼻、耳、咽喉、関節等の軟骨欠損・損傷部位の移植用素材、美容整形等の美容用素材等を形成することができる。【００３３】
前記再分化した軟骨細胞（再分化軟骨細胞）の培養乃至増殖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した、平面培養（単層培養）、３次元培養、ペレット培養、などが挙げられる。
これらは、単独で行ってもよいし、２以上を行ってもよいが、これらの中でも３次元培養が好適に挙げられる。【００３４】
前記軟骨細胞は、軟骨再生医療等を目的としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養・増殖等させると、比較的容易に脱分化して線維芽細胞様の脱分化型軟骨細胞に変化してしまうという問題があるが、本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地又は本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法により、該脱分化型軟骨細胞を効率良くかつ容易に前記軟骨細胞に再分化させることができる。このため、本発明により、再分化させた軟骨細胞（再分化軟骨細胞）を更に培養して得られた軟骨（軟骨細胞塊）は、軟骨欠損部位等に埋めることにより、軟骨に関する各種疾患を治療するのに好適に使用することができる。本発明は、前記軟骨（軟骨細胞塊）として患者の軟骨細胞を培養して得たものを用い、これを該患者に戻すことに利用することができ、軟骨再生医療等において好適に利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００３６】
−軟骨細胞の脱分化による脱分化型軟骨細胞への分化−
５質量％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）中に、ＦＧＦ−２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）と、ＩＧＦ−Ｉ（ｉｎｕｓｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）、インスリン、トランスフェリン、セレン酸等を含む軟骨細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）をシャーレ中に１０ｍＬ添加し、該シャーレ内で軟骨細胞（ヒト耳介軟骨由来、２０万細胞）を適宜継代しながら３０日間、平面培養（単層培養）した。なお、前記平面培養（単層培養）は、３７℃、３０日間、ｐＨ７、酸素分圧２０％、の条件にて行った。【００３７】
図１の左図は、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）の写真であり、図１の右図は、培養開始から３０日、４回の継代を経た軟骨細胞（Ｐ４）の写真である。図１の上図は、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）と、培養開始から３０日、４回の継代を経た軟骨細胞（Ｐ４）とにおけるＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド−６−リン酸脱水素酵素）の遺伝子発現を示す電気泳動におけるバンドの有無を示す写真である。
これらの写真より、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）では、ＩＩ型コラーゲンが発現しており、Ｉ型コラーゲンは発現していなかった。これは軟骨細胞（脱分化前軟骨細胞）の特徴を表すものであり、培養開始直後の軟骨細胞（Ｐ０）は脱分化していないことが確認された。一方、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）では、ＩＩ型コラーゲンの発現量が減り、Ｉ型コラーゲンが発現していた。これは脱分化型軟骨細胞の特徴を表すものであり、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）は脱分化していたことが確認された。【００３８】
−脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化−
次に、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）、即ち脱分化型軟骨細胞を、基礎培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ
Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  ＨＡＭ  (ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製)中に、インスリン(ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製ｉｎｓｕｌｉｎ)５μｇ／ｍＬと、ＢＭＰ−２（山之内製薬社製ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）２００ｎｇ／ｍＬとを含む培地（実施例１の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地）と、これらに加えて更にＴ３（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  社製Ｌ−３，３‘，５’−Ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）１０−７Ｍとを含む培地（実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地）とをそれぞれ用いて、前記脱分化型軟骨細胞２０万細胞を７日間、アテロコラーゲン三次元包埋培養した。この培養は、本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法に該当する。【００３９】
これら２つの培地を用いて培養した前記脱分化型軟骨細胞における、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ−Ｉ）、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ−ＩＩ）及びＸ型コラーゲン（Ｃｏｌ−Ｘ）の発現量を測定した。これらの結果を、前記脱分化型軟骨細胞（対照、ｃｏｎｔｒｏｌ）における、Ｉ型コラーゲンの発現量を図２に、ＩＩ型コラーゲンの発現量を図３に、及びＸ型コラーゲンの発現量を図４にそれぞれ示した。なお、図２〜４における「ＢＩ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンとを含む場合を意味し、「ＢＩＴ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンと前記Ｔ３とを含む場合を意味する。
図２〜４に示す結果からも明らかなように、インスリンとＢＭＰ−２とを含む実施例１（ＢＩ）の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養した場合には、前記対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の脱分化型軟骨細胞と比べて、前記脱分化型軟骨細胞に特徴的に観られるＩ型コラーゲンの発現量が減り、前記軟骨細胞に特徴的に観られるＩＩ型コラーゲンの発現が増え、軟骨が骨に置換される際に発現が見られるＸ型コラーゲンの発現量がやや増加する傾向があった。インスリンとＢＭＰ−２とを含む実施例１（ＢＩ）の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養した場合のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｃと、前記対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の脱分化型軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｄとの比（Ｃ／Ｄ）が、約１０であった。【００４０】
また、インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２（ＢＩＴ）の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養した場合には、前記対照（コントロール）の脱分化型軟骨細胞と比べて、前記脱分化型軟骨細胞に特徴的に観られるＩ型コラーゲンの発現量が大幅に減少し、前記軟骨細胞に特徴的に観られるＩＩ型コラーゲンの発現量が大幅に増加し、軟骨が骨に置換される際に発現が見られるＸ型コラーゲンの発現量は減少傾向にあった。インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２（ＢＩＴ）の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養した場合のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｃと、前記対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の脱分化型軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｄとの比（Ｃ／Ｄ）が、２０以上であった。
これらの結果より、脱分化して前記脱分化型軟骨細胞に分化したものを、前記実施例１及び実施例２に係る各脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いて培養することにより、軟骨細胞に再分化させることができることが判った。また、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた場合には、実施例１の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた場合に比し、前記脱分化型軟骨細胞を効率良くかつ容易に前記軟骨細胞に再分化させることができることが判った。【００４１】
−脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における成分配合量の検討−
インスリンとＢＭＰ−２とＴ３とを含む実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、該インスリン、該ＢＭＰ−２及び該Ｔ３の各含有量の好ましい範囲を、以下の３種の比較検討により明らかにした。
即ち、まず、インスリン含有量を５μｇ／ｍＬとし、Ｔ３含有量を１０−７Ｍとし、ＢＭＰ−２含有量を、それぞれ４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬと変化させたところ、該ＢＭＰ−２の含有量が２００ｎｇ／ｍＬである場合が最もＩＩ型コラーゲンの発現量が多かった（図５）。
次に、インスリン含有量を５μｇ／ｍＬとし、ＢＭＰ−２含有量を２００ｎｇ／ｍＬとし、Ｔ３含有量を、それぞれ１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍとしたところ、該Ｔ３含有量が１０−７Ｍである場合が最もＩＩ型コラーゲンの発現量が多かった（図６）。
次に、ＢＭＰ−２含有量を２００ｎｇ／ｍＬとし、Ｔ３含有量を１０−７Ｍとし、インスリン含有量を、それぞれ５０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬとしたところ、該インスリンの含有量が５μｇ／ｍＬである場合が最もＩＩ型コラーゲンの発現量が多かった（図７）。【００４２】
以上の結果より、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２、Ｔ３の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１０−７Ｍである場合が、脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化能に優れることが判った。【００４３】
−アナログの影響の検討−
次に、本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における前記ＢＭＰ−２をそのアナログであるＢＭＰ−４に置換した場合における、前記脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化への影響を以下のようにして調べた。即ち、実施例１の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬである場合と、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における、インスリン、ＢＭＰ−２、Ｔ３の各含有量が、それぞれ５μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１０−７Ｍである場合と、該実施例２の培地における前記ＢＭＰ−２をＢＭＰ−４に代えた以外は同様の組成の培地とを用いて、前記同様に脱分化型軟骨細胞の培養を行った。培養した該脱分化型軟骨細胞における、Ｉ型コラーゲン発現量、ＩＩ型コラーゲン発現量、及びＸ型コラーゲン発現量を測定した。その結果を、対照（コントロール）である脱分化型軟骨細胞における、Ｉ型コラーゲン発現量を図８に、ＩＩ型コラーゲン発現量を図９に、及びＸ型コラーゲン発現量を図１０に示した。なお、図８〜１０における「ＢＩ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンとを含む場合を意味し、「ＢＩＴ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンと前記Ｔ３とを含む場合を意味し、「ＢＭＰ−４」は、前記ＢＭＰ−４と前記インスリンと前記Ｔ３とを含む場合を意味する。
インスリン、ＢＭＰ−４とＴ３を含む培地を用いて前記脱分化型軟骨細胞を培養した場合のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｃと、前記対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の脱分化型軟骨細胞のＩＩ型コラーゲン発現・産生量の値Ｄとの比（Ｃ／Ｄ）が、２０以上であった。
図８〜１０の結果からも明らかな通り、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地における前記ＢＭＰ−２をそのアナログであるＢＭＰ−４に代えた場合であっても、実施例２における場合と略同等の軟骨細胞への再分化能を示すことが判った。【００４４】
−再分化させた軟骨細胞の培養物の機械的性質−
次に、培養開始から約３０日間、４回継代した軟骨細胞（Ｐ４）、即ち脱分化型軟骨細胞に分化したものを、基礎培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  ＨＡＭ  (ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製)中に、インスリン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製ｉｎｓｕｌｉｎ）５μｇ／ｍＬと、ＢＭＰ−２（山之内製薬社製ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）２００ｎｇ／ｍＬとを含む培地（実施例１の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地）と、これらに加えて更にＴ３（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  社製Ｌ−３，３‘，５’−Ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）１０−７Ｍとを含む培地（実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地）とを用いて、前記脱分化型軟骨細胞２０万細胞を２１日間、アテロコラーゲン三次元包埋培養した。この培養は、本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法に該当する。【００４５】
図１１に示すように、この３次元培養による３次元培養物における、機械的性質としての圧縮強度（ｇｒ）（アキシム社製ビーナストロンにより測定）は、インスリン、ＢＭＰ−２及びＴ３を含有しない培地で同様に培養した対照（コントロール）である軟骨細胞の培養物にくらべ、増加傾向を示した（図１１及び図１２参照）。なお、図１１及び図１２における「ＢＩ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンとを含む場合を意味し、「ＢＩＴ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンと前記Ｔ３とを含む場合を意味する。【００４６】
−再分化させた軟骨細胞の培養物の機械的性質−
次に、実施例１の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地と、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地とを用いて、前記脱分化型軟骨細胞２０万細胞を２１日間、アテロコラーゲン三次元包埋培養し、前記培養物を、２ケ月間、ヌードマウスに移植させてから、移植した該培養物の圧縮強度（ｇｒ）を、上記同様にして測定した。
図１３に示す通り、実施例２の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地を用いた培養物においては、前記圧縮強度（ｇｒ）が、前記対照（コントロール）である軟骨細胞の培養物よりも高い結果となり、生体内の耳介軟骨（ｎａｔｉｖｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）にとほぼ同等の圧迫強度を示した（図１３及び図１４参照）。なお、図１３及び図１４における「ＢＩ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンとを含む場合を意味し、「ＢＩＴ」は、前記ＢＭＰ−２と前記インスリンと前記Ｔ３とを含む場合を意味する。【００４７】
本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地及び脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中等において脱分化して軟骨特性が減弱した脱分化型軟骨細胞を効率よくかつ容易に軟骨細胞に再分化させ、培養を継続させるのに好適に使用することができる。本発明の脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化用培地及び脱分化型軟骨細胞の軟骨細胞への再分化方法により、脱分化型軟骨細胞から再分化されて培養・増殖された軟骨細胞は、鼻、耳、咽喉、関節等の軟骨欠損・損傷部位の移植用素材、美容整形等の美容用素材等に好適に利用することができ、軟骨再生医療に極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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