(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
0004427639.tif 000023
からなる群から選択され、中枢神経系におけるヒトアセチルコリンエステラーゼ産生を選択的に変調させることができる合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
上記中枢神経系におけるヒトアセチルコリンエステラーゼのＥ１−Ｅ４−Ｅ６スプライシング変異体ＡＣｈＥｍＲＮＡ中のＥ４−Ｅ６部位を標的とする、請求項１に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項３】
上記中枢神経系におけるヒトアセチルコリンエステラーゼのリードスルースプライシング変異体ＡＣｈＥｍＲＮＡ中のＥ４−Ｉ４部位を標的とする、請求項１に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項４】
生理学的に許容可能な担体または希釈液中に、請求項１乃至請求項３に記載の少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを活性成分として含む医薬または医学組成物。
【請求項５】
脳内にバランスのとれたコリン作動性シグナリングを回復する薬剤を作製するための、請求項１乃至請求項３に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用方法。
【請求項６】
0004427639.tif 000024
からなる群から選択され、神経筋接合部におけるヒトアセチルコリンエステラーゼ貯留を選択的に減少させることができる合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項７】
生理学的に許容可能な担体または希釈液中に、請求項６に記載の少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを活性成分として含む医薬または医学組成物。
【請求項８】
神経筋接合部におけるアセチルコリンエステラーゼの貯留を減少させる薬剤を作製するための、請求項６に記載の少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、４つの３’−末端ヌクレオチド間を結ぶホスホロチオエート結合を有する、請求項１乃至請求項３又は請求項６に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項１０】
ヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、ヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）を有する、請求項１乃至請求項３又は請求項６に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項１１】
ヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、ヌクレオチドがＯ−メチル化されている、請求項１乃至請求項３又は請求項６に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項１２】
ヌクレアーゼ抵抗性を与えるために、ヌクレオチドがフッ素化されている、請求項１乃至請求項３又は請求項６に記載の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明の分野は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類およびそれらをベースとする医薬品である。
２．関連技術の説明
アセチルコリン加水分解酵素アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、ＥＣ  ３．１．１．７）をコードするＡＣＨＥ遺伝子は、筋肉、神経、造血細胞、胚組織および生殖細胞で発現される。ＡＣＨＥは、染色体７ｑ２２上にマップされており、シナプスおよび神経筋接合部で神経伝達を終了させる主要な酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、ＥＣ  ３．１．１．７）をコードする。
ＳｏｒｅｑおよびＺａｋｕｔ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９３年）著Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓには、ヒトコリンエステラーゼ遺伝子の生化学的および生物学的背景、ならびに分子生物学についての概要が述べられている。同書の全体を、参照により本明細書中で援用する。さらにＳｅｉｄｍａｎおよびＳｏｒｅｑ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）著Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｘｅｎｏｐｕｓには、ツメガエルトランスジェニック動物モデルの開発についての概要が述べられている。同書の全体を、参照により本明細書中で援用する。Ｂｅｅｒｉ他、１９９５年；Ｋａｒｐｅｌ他、１９９６年による論文、およびＬｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９７年およびＧｒｉｆｍａｎ他、１９９５年、１９９７年による総説には、アンチセンスＡＣＨＥオリゴマーの開発、配列選択および有効性試験のためのパラメータに関する情報が述べられており、これらを参照により本明細書中で援用する。
要するに、ＡＣｈＥには、ペプチド単位Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｘ−Ｚが含まれ、それがＡＣｈＥを細胞周期の一般的コントローラであるｃｄｃ２キナーゼによるリン酸化の強力な基質にしている。ｃｄｃ２キナーゼの他の大部分の基質は、細胞周期関連プロセスに必要な生物学的機能を果たしている。したがって、ＣＨＥまたはｃｄｃ２転写プロセスの妨害は細胞分裂を方向転換および／または停止させると考えられ、これらのプロセスを制御することは、多くの医学的に重要な手順に有用であると考えられる。
生化学的および組織化学的分析から、細胞増殖および分化に関してコリンエステラーゼ類（ＣｈＥｓ）が調和しながら調節されている複数真核生物種の種々の胎児組織において、ＡＣｈＥが高濃度に発現されることが明らかにされている。したがって、胚の発達においてＣｈＥが寄与する具体的役割は細胞分裂と関連し、これらの組織中におけるＣｈＥの生物学的機能は、器官形成の制御に関係していると考えられる。
成熟赤血球の膜中に存在するばかりでなく、ＡＣｈＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生する血液細胞でも盛んに産生され、その活性は成長するマウス巨核球の許容可能なマーカーとして役立つ。さらに、アセチルコリン類似体ならびにコリンエステラーゼ阻害薬の投与は、マウスにおける巨核球形成および血小板数増加を誘発し、これらの造血細胞の役割および発生に、この酵素が関わっていることが明らかとなった。
非触媒的サブユニットを「尾部」とする潜在能力を有する大部分の親水性型ＡＣｈＥは、中枢神経系および筋肉で発現し、一方、疎水性のホスホイノシチド（ＰＩ）結合型の酵素は、赤血球に見出される。ＡＣｈＥにおいてＣ末端ペプチドをコードする選択的エクソンは、デンキナマズの電気器官における両親媒性（ＰＩ）結合型および親水性「尾部」型ＡＣｈＥの分子源を提供することが分かった。哺乳動物における、対応する選択的エクソンおよび相同の酵素型の存在は、ヒトＡＣｈＥの分子多型に同様のメカニズムが働いていることを示唆した。今日まで報告された、哺乳動物の脳および筋肉から得られるｃＤＮＡは、親水性ＡＣｈＥ型をコードする。
より具体的には、哺乳動物において３種類の選択的ＡＣｈＥをコードするｍＲＮＡが報告されている（図１１）。神経筋接合部（ＮＭＪ）に見出される主要な中枢神経系および筋肉ＡＣｈＥ（ＡＣｈＥ−Ｔ）は、エクソンＥ１および選択的エクソンＥ６にスプライシングされるインバリアントコードエクソンＥ２、Ｅ３、およびＥ４を運ぶｍＲＮＡによってコードされる（Ｌｉ他、１９９１年；Ｂｅｎ  Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ他、１９９３年）。エクソンＥ１〜４および選択的エクソンＥ５を持つＡＣｈＥｍＲＮＡは、脊椎動物赤血球（ＡＣｈＥ−Ｈ）に特徴的な糖脂質ホスファチジルイノシトール（ＧＰＴ）結合型ＡＣｈＥをコードする（Ｌｉ他、１９９３年；Ｌｅｇａｙ他、１９９３ａ）。さらに、３’からエクソンＥ４に直接結合するイントロン配列Ｉ４を保持するリードスルーｍＲＮＡ種は、齧歯類の骨髄および赤白血病細胞（Ｌｉ他、１９９３年；Ｌｅｇａｙ他、１９９３年ａ）およびヒト由来の種々の腫瘍細胞系（Ｋａｒｐｅｌ他、１９９４年）で報告された。
ＡＣｈＥは、神経系細胞における主要なコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）である。アセチルコリンは、そのほとんどがＣＮＳで産生されることから、ＡＣｈＥの変化は精神状態と関連しているはずである。
アルツハイマー病のコリン作動性理論（Ｃｏｙｌｅ他、１９９３年；Ｓｌｏｔｋｉｎ他、１９９４年）は、アルツハイマー病におけるコリン作動性ニューロンの選択的欠損が、学習および記憶機能を媒介しそのためにアセチルコリンを要求する脳の特定領域において、アセチルコリンの相対的欠乏を招くことを示唆している。したがって、アルツハイマー病を治療するための主要なアプローチは、コリン作動性システムの強化に向けられた。アルツハイマー病患者の脳におけるアセチルコリン濃度の減少は、使用されたアセチルコリンを処理することによって正常な脳活動における神経インパルスを終了させる役割を持つ酵素であるアセチルコリンエステラーゼの相対的過剰を招く（ＳｏｒｅｑおよびＺａｋｕｔ、１９９３年）。アセチルコリンエステラーゼの相対的過剰は、アセチルコリンの利用をさらに減少させることによって、コリン作動性欠乏の進行をさらに助長する。アルツハイマー患者のコリン作動性神経伝達を強化しようとして今日までに最も成功した戦略は、アセチルコリンエステラーゼの薬理学的阻害である。実際、アルツハイマー病における現在唯一の承認薬は、強力なアセチルコリンエステラーゼ阻害薬（Ｗｉｎｋｅｒ、１９９４年）、すなわち、アセチルコリン加水分解酵素アセチルコリンエステラーゼ（アセチルコリンアセチルヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．１．１．７、ＡＣｈＥ）の触媒活性を抑制する薬物である（Ｋｎａｐｐ他、１９９４年）。これは、コリン作動性ニューロンの選択的欠損により損なわれた、これら患者におけるコリン作動性神経伝達の増加をもたらす。しかし、このような阻害薬は、ＡＣｈＥタンパク質の量を減少させず、その触媒活性とは無関係な、プロセス拡大（Ｓｍａｌｌ他、１９９５年；Ｌａｙｅｒ他、１９９５年；Ｊｏｎｅｓ他、１９９５年；Ｄａｒｂｏｕｘ他、１９９６年；Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ他、１９９７年）およびアミロイド細線維形成（Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ他、１９９６年）におけるＡＣｈＥの作用が最近報告されている。
タクリンは、アルツハイマー病の治療に初めて用いられ、最もよく調べられたアセチルコリンエステラーゼ阻害薬であり、６カ月までの間に、軽度〜中等度に罹患したアルツハイマー患者の３０〜５０％に限られた一時的な寛解をもたらす（Ｗｉｎｋｅｒ、１９９４年；Ｋｎａｐｐ他、１９９４年）。部分的とはいえ、タクリンの明確な成功は、アルツハイマー病に対するコリン作動性理論の有用性および改良した抗コリンエステラーゼ治療の潜在的な価値を証明している。別の承認薬、Ｅ−２０２０（Ａｒｉｃｅｐｔ）は、タクリンと同一の作用機作であるが、より低用量でよいと報告された（Ｒｏｇｅｒｓ他、１９９６年）。他の多くの化合物がアセチルコリンエステラーゼの阻害を目的に開発中である（ＪｏｈａｎｓｓｏｎおよびＮｏｒｄｂｅｒｇ、１９９３年）。これらすべては、完全に折りたたまれたタンパク質がアセチルコリンを分解するのを阻止することを意図している。
部分的とはいえ、タクリンの明確な成功は、アルツハイマー病に対する改良した抗コリンエステラーゼ治療の潜在的な価値を証明している。しかし、アルツハイマー病の抗アセチルコリンエステラーゼ療法は、高用量の薬物を必要とし、全身的なコリン作動性毒性に関連する副作用を生む。例えば、タクリンには、ある数の患者で肝臓損傷および血液障害が伴った（ＪｏｈａｎｓｓｏｎおよびＮｏｒｄｂｅｒｇ、１９９３年）。さらに、最近のＡＣｈＥ阻害薬は、ＡＣｈＥと相同の血清タンパク質ブチリルコリンエステラーゼと非特異的に相互作用し、調節性フィードバック経路を刺激してＡｃｈＥ発現の亢進をもたらす。
アセチルコリンエステラーゼに対してより大きな特異性を有するＥ−２０２０などのより新しい阻害薬は、低用量でよいが（Ｒｏｇｅｒｓ他、１９９６年）、２種類のタンパク質間の大きな類似性がもたらす、ブチリルコリンエステラーゼとの交差反応性の問題を完全に克服していないようである（Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ他、１９９６年）。さらに、肝機能、赤血球数、およびアセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼ双方をコードする遺伝子中の自然変異は、個々の患者における量的および質的な薬物捕捉能力のいずれも決定してしまう。すでに、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子におけるいくつかの突然変異は、抗コリンエステラーゼ類に対する有害反応という遺伝的体質を作り出すことがすでに示唆されていた（Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ他、１９９５年）。このことは、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬をベースとする療法による最善の治療計画においてさえも、患者毎に個別の処方をデザインする際に、種々の要素を考慮しなければならないことを意味している。
重症筋無力症（ＭＧ）は、神経筋接合部（ＮＭＪ）の運動終板でニコチン酸アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に向かった抗体がＡＣｈＲと結合することにより、直接またはＮＭＲ分解により神経筋コミュニケーションを害する自己免疫疾患である。現在のＭＧ治療の戦略には、抗コリンエステラーゼ薬、免疫抑制薬、胸腺摘出および血漿瀉血が含まれる（ＭＧ疾患の病因論および治療戦略の理解についての進歩および発展の概観には、Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  Ｇｒａｖｉｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６８１巻（１９９３年）、５０５巻（１９８７年）、３７７巻（１９８１年）、２７４巻（１９７６年）、および１３５巻（１９６６年）を、ならびに１９９８年の巻（投稿中）を参照のこと）。
ＡＣｈＥは、神経筋接合部に蓄積し（Ｓａｌｐｅｔｅｒ、１９６７年）、そこでコリン作動性神経伝達を変調するという生命機能を果たす（ＳｏｒｅｑおよびＺａｋｕｔ、１９９３年、に概説されている）。ＡＣｈＥおよび他のシナプスタンパク質がＮＭＪの標的となる分子機構は、あまり分かっていない。おそらく、連結核中および周辺に区画形成された転写および翻訳が、ＡＣｈＥのＮＭＪ局在化に寄与している（Ｊａｓｍｉｎ他、１９９３年）。したがって、抗コリンエステラーゼ療法は、ＡＣｈＥを減少させるためにほぼすべての患者に用いられ、それによってアセチルコリンの半減期を増加させ、神経筋伝達を強化する。この療法は、免疫抑制療法（一般に、ステロイド類）と協力して用いられることが多い。副作用のある免疫抑制療法から患者を解放することが一般的な目標である。
ピリドスチグミン（メスチノン（登録商標））は、その有効性と患者の許容度により、筋無力症治療の第１選択薬である。アンベノニウム（ミテラーゼ（登録商標））は、ピリドスチグミンを許容しないＭＧ患者に用いられる。しかし、用量を２４時間にわたり、しばしば調整する必要があるため、患者は薬物の用量決定に関わっていなければならない。月経周期、感染症および感情的ストレスなどの項目が用量に影響を及ぼし、患者は、これらおよびその他の要素を考慮に入れて用量を改変するために教育を受けなければならない。ピリドスチグミンの過量は、コリン作動性発症を招き、患者に対する教育が十分であってもこのような過量は起こる。さらに、本明細書中で前に述べた、抗コリンエステラーゼ類に対する有害反応という遺伝的体質も考慮しなければならない（Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ他、１９９５年）。
抗コリンエステラーゼ薬の過量に起因するコリン作動性発症には、筋脱力の増加という特徴があり、呼吸筋が関わると、筋無力性の発症および死に至る。疾患の重症度の増加による筋無力性の発症も、同一の症状を伴って起きる。コリン作動性発症の治療は抗コリンエステラーゼ薬の中止であり、一方、薬物関連ではない筋無力性の発症は抗コリン作動性薬の用量の増加を意味することから、この２つを区別するのは極めて重要である。したがって、ＭＧにおける抗コリンエステラーゼ薬療法の代替法を見出すことが有用であろう。
これらの考慮は、標的特異性の増加、有効性の改善、および副作用の減少を示す新世代の抗アセチルコリンエステラーゼ薬を開発する必要性を示している。
分子生物学の大発見およびヒトゲノム計画は、かつて予期し得なかった哺乳類遺伝子発現の標的妨害の可能性を開いた。これらの可能性には、トランスジェニック過発現または特定の遺伝子の組換え破壊などの永久的アプローチ、ならびに遺伝子機能の一過性の抑制という新規なアプローチが含まれる。標的ｍＲＮＡ内の特定の配列とハイブリッド形成するようにデザインされた短い合成アンチセンス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）は、後者の系列に属している。
多くの優れた総説が、アンチセンス技術およびその無数の治療的可能性の主な側面を扱ってきた。文献も、この急速に発展する技術の化学的側面（Ｃｒｏｏｋｅ、１９９５年）から、細胞（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４年）および治療的側面（Ｈａｎａｎｉａ他、１９９５年；Ｓｃａｎｌｏｎ他、１９９５年）へと自然に進行した。比較的短時日に、培養一次細胞および細胞系におけるＡＳ−ＯＤＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、ならびに特定のプロセスを抑制し、一過性に体の機能を変化させるためにこれらのＯＤＮをｉｎ  ｖｉｖｏで投与することに関する十分な情報が蓄積された。現在蓄積された豊富な実験は、アンチセンスアプローチの解析、すなわち、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用をｉｎ  ｖｉｖｏでの使用と比較するという新規な方法を提供する（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９７年）。さらに、本出願の実施例に示すように、ヒトでの有効性を予測するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルで十分な実験が利用できる。
特定の遺伝子の発現におけるＡＳ妨害は、合成ＡＳ−ＯＤＮを用いることによって達成できる（最近の報告に関しては、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔ他、１９９５年；Ａｇｒａｗａｌ、１９９６年；Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９７年を参照）。ＡＳ−ＯＤＮは、重要な標的ｍＲＮＡと相補をなすようにデザインされた短い配列のＤＮＡ（平均１５〜２５量体）であり、ＲＮＡ：ＯＤＮ二本鎖を形成する。この二本鎖形成は、関連するｍＲＮＡのプロセシング、スプライシング、移行または翻訳を妨害することができる。さらに、ある種のＡＳ−ＯＤＮは、その標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成したときに細胞のＲＮアーゼＨ活性を誘発することができ、ｍＲＮＡ分解がもたらされる（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ他、１９９６年）。この場合、ＲＮアーゼＨは、二本鎖のＲＮＡ成分を開裂し、ＡＳ−ＯＤＮを強く放出して、標的ＲＮＡの別の分子へさらにハイブリッド形成させることができる。別の作用機作は、ＡＳ−ＯＤＮのゲノムＤＮＡとの相互作用によってもたらされ、転写に対して不活性な三重らせんを形成する。ＡＳ−ＯＤＮの作用機作に関する図式的発現は図１を参照されたい。
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、顕著な毒性を示さず、動物において十分な薬力学的半減期を示す（Ａｇａｒｗａｌ他、１９９１年、１９９６年）。細胞発生に関連するアンチセンス誘発機能消失発現型は、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の場合に見られ、星状膠細胞−ニューロン共存培養における星状膠細胞成長に深く関わり（Ｗｉｎｓｔｅｉｎ他、１９９１年）、シュワン細胞におけるミエリン結合糖タンパク質の場合は、これらの細胞周囲の密集したミエリン鞘形成の形成に役割を果たし（ＯｗｅｎｓおよびＢｕｎｇｅ、１９９１年）、微小管結合タウタンパク質の場合は、海馬ニューロンの極性およびそれら軸索形成に関わり（ＣａｃｅｒｅｓおよびＫｏｓｉｋ、１９９０年）、β1インテグリンの場合は、放射状グリア細胞に沿ったニューロンの移動、およびニワトリの蓋板形成の確立にとって重要であり（Ｇａｌｉｌｅｏ他、１９９１年）、さらにＮ−ｍｙｃタンパク質の場合には、神経外胚葉の培養における細胞の異質性の維持に役割を果たす（上皮細胞対神経芽細胞で、それらのコロニー形成能、腫瘍形成性および接着が異なる）（Ｒｏｓｏｌｅｎ他、１９９０年；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ他、１９９１年）。有糸分裂誘発性および脈管形成性の性質を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦｇＦ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、飽和可能および特異的様式で神経膠腫細胞の成長を８０％抑制した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１年）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｂＦｇＦｍＲＮＡの開始およびスプライシング部位を標的とし、得られるタンパク質の活性を低下させ、センスオリゴマーは不活性のままである。軟寒天培養において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、グリアコロニーのサイズを減少させ、それらの中のより大きな細胞の出現を誘発した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９２年）。疎水性であることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜とよく相互作用する（Ａｋｈｔｅｒ他、１９９１年）。細胞の形質膜と相互作用したあとで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的受容体に関係すると予測される飽和可能な機構（Ｙａｋｕｂｏｖ他、１９８９年）で、生体細胞中に盛んに移行する（Ｌｏｋｅ他、１９８９年）。
発明の概要
本発明により、ヒトアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）産生を選択的に変調することができる下記配列を有する合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを開示する。
0004427639.tif 000002
さらに、追加の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを以下に開示する。
0004427639.tif 000003
スプライシングメッセージ後のＡＣｈＥｍＲＮＡ中のスプライシング部位を標的とするヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスを開示する。１つの実施形態において、Ｅ２−Ｅ３−Ｅ４−Ｅ６スプライシング変異体ＡＣｈＥｍＲＮＡ中のＥ４−Ｅ６部位がＡＣｈＥの筋肉および中枢神経系スプライシング変異体に非常に特異的であるので、これを開示する。
中枢神経系においてヒトアセチルコリンエステラーゼ産生を選択的に変調することができる、または神経筋接合部においてヒトアセチルコリンエステラーゼ貯留を選択的に減少させることができる下記配列を有する合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドも開示する。
0004427639.tif 000004
本発明は、生理学的に許容可能な坦体または希釈剤中に、これらの合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの少なくとも１つを活性成分として含む医薬組成物または医学組成物も開示する。
さらに、本発明は、このような治療を必要とする患者の脳内において、特に学習および記憶障害、ならびにストレス障害およびパーキンソン病に関連するバランスのとれたコリン作動性シグナリングを回復する方法を開示する。この方法には、治療有効量の本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性ＡＳ−ＯＤＮのうち少なくとも１つを、このような治療を必要とする患者に投与するステップが含まれる。
さらに、本発明は、このような治療を必要とする患者、特に重症筋無力症の患者において、神経筋接合部におけるアセチルコリンエステラーゼの産生および貯留を減少させる方法を開示する。この方法には、治療有効量の本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのうち少なくとも１つを、このような治療を必要とする患者に投与するステップが含まれる。
具体的に、生化学的活性とは逆に、この技術は脳細胞におけるアセチルコリンエステラーゼの産生を阻止し、神経筋接合部における貯留を予防および／または減少させる。この技術は、極めて低用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによるアセチルコリンエステラーゼ生合成に至る経路の破壊に基づいている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最終の遺伝子産物（すなわち、タンパク質）よりもむしろ、アセチルコリンエステラーゼをコードする遺伝子を特異的に標的とする。したがって、これらアンチセンスオリゴヌクレオチドのアセチルコリンエステラーゼに対する分子標的は、関連酵素であるブチリルコリンエステラーゼと相互作用をせず、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子発現を抑制することもない。したがって、この強力な薬物は、低用量で有効に働く一方で、アルツハイマー病に対するタクリンおよび関連するコリン作動性薬物、および重症筋無力症に対するピリドスチグミンおよび関連薬物に関連する多くの副作用を回避する。
図面の説明
本発明の他の利点は容易に理解できる、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて参照することによってより良く理解されよう。
図１は、アンチセンス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の作用機作の概略図であり、遺伝子がｍＲＮＡに転写され、ＡＳ−ＯＤＮの取り込みの後、三重らせん形成による転写の阻害、ＲＮＡスプライシングまたは翻訳の妨害が生じるか、またはＲＮＡ：ＯＤＮ二本鎖がＲＮアーゼＨ活性を誘発することができ、ＲＮＡ分解がもたらされ、タンパク質産生を妨害することを示している。
図２は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処理したマウス皮質中のＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ濃度の減少を示すゲルの写真を挿入したチャートである。ｈＡＣＨＥ、ｍＡＣＨＥまたはシナプトフィジン（Ｓｙｎ）ｍＲＮＡを検出するために、特異的なプライマーを用い、ｃＤＮＡ産物は、サイクル２１〜３６の間に３サイクル毎に採取し、ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色に供した。サイクル２１〜３６から得た産物を、図の左から右に示す。緩衝液またはＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを注射したマウスの皮質中のＡＣｈＥ活性のレベルは、加水分解された基質ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／タンパク質ｕｇで示す。
図３は、ｉ．ｃ．ｖ．で注射されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが皮質下領域におけるＡＣｈＥ触媒活性の減少をもたらすことを示すグラフである。それぞれの円は、単回注射したマウスの皮質下領域で測定したＡＣｈＥ活性を示す。緩衝液注射マウスの欄は、年齢をマッチさせたマウスで行った２つの独立した実験のデータを示す。各グループ毎に算出した平均活性を水平線で示す。
図４Ａ〜Ｂは、ＡＣＨＥｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏアンチセンス抑制を示し、ここで、図４Ａは、そのプロモーター（Ｐ）、６種類のエクソン（１〜６の番号）および４種類のイントロンを有するマウスのＡＣＨＥ遺伝子を模式的に示す。選択的スプライシングにより、Ｃ−末端ペプチド配列の異なるポリペプチドをコードする３種類の変異体ｍＲＮＡ転写物が得られる。図４Ｂは、種々のサイクルにおけるＰＣＲ産物のゲル電気泳動の写真であり、共通エクソンＥ２（ｍＥ２）または選択的エクソンＥ５（ｍＥ５）を標的とするアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドの全ＡＣＨＥｍＲＮＡに対する効果を、相同のヒトＡＣＨＥ遺伝子配列に基づくセンス（Ｓ）オリゴまたはＰＢＳの擬注射の効果と比較して示す。βアクチンｍＲＮＡは、転写に対する非特異的効果の制御に役立った。ＡＳ−ｍＥ２およびＡＳ−ｍＥ５はいずれも、投与用量において、筋肉ではなく骨髄中のＥ６含有ＡＣＨＥｍＲＮＡの特異的減少をもたらし、一方、アクチンｍＲＮＡはいずれの処理によっても影響を受けなかったことに注意されたい。ゲルは、３匹の処理動物中の単一の代表的動物から得られたデータを示している。
図５Ａ〜Ｂは、抗ＡＣＨＥ  ＯＤＮおよびそれらが標的とするＡＣＨＥｍＲＮＡ配列を示し、ここで、図５Ａは、成獣（２月齢）マウスの脳、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔ．Ｄ）０．５μｇ／ｍｌ存在下、または存在させずに３日間培養生育したマウス胚（胚１３日目）から得た脳一次ニューロン、または未分化ＰＣ１２細胞の全ＲＮＡ調製物から誘導されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のゲルの写真である。Ｅ５、Ｅ６またはＩ４／Ｅ５配列を３’末端とするＡＣＨＥｍＲＮＡ転写物に対する選択的プライマーと培養した２００ｎｇのＲＮＡについて、ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の１０％を、アガローススラブゲル上の電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色したものを示す（詳細は、Ｋａｒｐｅｌ他、１９９６年を参照のこと）。Ｅ６−ＡＣＨＥｍＲＮＡ転写物が、これらの材料すべてで最も顕著であること、および新規な転写物の存在なしにアクチノマイシンＤ存在下で３日間後に、ほとんど変化しないままであることに注意されたい。マウス脳ニューロンと同様に、ＰＣ１２細胞は、３種類の選択的ＡＣＨＥｍＲＮＡを発現する。図５Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮの位置と種々のパラメータの概略図である。それぞれのＡＳ−ＯＤＮ（１〜７）（太い下線）の位置を、ＡＣＨＥ遺伝子に沿って記入し、模式的に表す。偽イントロン４（Ｉ４）を影付きとした以外は、白い囲みはイントロン（Ｉ）を示し、黒い囲みはエクソン（Ｅ）を示す。下側の破線は、選択的スプライシング選択権を表す。遺伝子５’末端の最初のＡＵＧコドンから開始する読み取り枠（ＯＲＦ）領域は、前記実線で記入した。ＯＤＮ構造は、予想される二次構造を持たないもの（Ｎ）およびループを形成すると予想されるもの（図示）に分類する。Ｇ、Ｃ含有量も記録する。ＯＤＮの予測融点および自由エネルギーをそれぞれの位置の下に示す（ＰＲＩＭＥＲプログラム、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ）。
図６Ａ〜Ｂは、ＡＳ−ＯＤＮの神経毒性を示し、ここで、図６Ａは、それぞれのＯＤＮの１μＭ（黒棒）または１０μＭ（白棒）存在下、２４時間後における未分化ＰＣ１２細胞の生存率の棒グラフである。３培養の平均の標準誤差は、誤差棒で示す。１μＭであってもＡＳ２が比較的高毒性であること、他の大部分のＯＤＮについても１０μＭで神経毒性が増加することに注意されたい。図６Ｂは、細胞数および遊離チオール基間の直線関係を示すグラフである。マイクロタイターウエルに貯留された未分化ＰＣ１２細胞の数は、位相差顕微鏡および血球計による手動計数により測定した。緩衝Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＤＴＮＲに暴露した６培養について、１０００細胞あたりの４０５ｎｍにおける平均吸収を示す。
図７は、ＮＧＦ誘発に依存するが、ＡＣＨＥｍＲＮＡ配列中のコード領域に沿った標的位置には依存しない、１μＭにおけるＡＳ−ＯＤＮの有効性を示すグラフである。未処理培養におけるＡＣｈＥ活性に対するパーセント阻害を示す。ＮＧＦ処理培養中のＡＣｈＥの値を黒丸、未分化ＰＣ１２細胞の値を白丸で示す。それぞれのＡＳ−ＯＤＮのデータ位置は、上のグラフに図式的に示したＡＣＨＥｃＤＮＡ中の位置の下に置く。誤差棒は、それぞれの試験における３ウエルの平均の標準誤差を示す。ＡＳ５に対応する値は、右の別の囲み、選択的Ｅ５エクソンの下に置いた。大部分のＡＳ−ＯＤＮについて、阻害有効性は未処理培養に比較してＮＧＦ処理培養で高いということに注意されたい。
図８Ａ〜Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲの速度論的追跡によるＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの半定量的測定のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＣｈＥ（Ａ）およびアクチン（Ｂ）のｍＲＮＡについて行った。未処理分化ＰＣ１２細胞（なし）またはＯＤＮ（ＡＳ１、ＡＳ３、ＡＳ４、ＡＳ６またはＡＳ−Ｂ）で処理した細胞から抽出した全ＲＮＡの増幅産物は、ゲル電気泳動およびＣＣＤ定量に供した。サイクル１８、２０、２２、２４、２６、２８（アクチンｍＲＮＡの場合）および２６、２８、３０、３２、３４、３６（ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの場合）で採取した臭化エチジウム染色産物１２μｌの最大蛍光強度のパーセントを示す。挿入図：蓄積速度の直線回帰分析は、産物の蓄積が一定の速度で進行する（ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの場合、サイクル２８、３０および３２、アクチンｍＲＮＡの場合、サイクル２０、２２および２４）時点でのみ行った。対照細胞と比較してＡＳ−ＯＤＮ処理細胞から得られる曲線の右方シフト、およびアクチンｍＲＮＡ曲線にはこのようなシフトが見られないことに注意されたい。
図９Ａ〜Ｂは、社会探検テスト（ｓｏｃｉａｌ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）（Ａ）およびタクリンによる是正（Ｂ）におけるＡＣｈＥトランスジェニックマウスの不十分な反応の棒グラフである。図９Ａは、未知の幼若動物に対面した成獣のトランスジェニックマウスまたは対照マウス、および臭覚による認識に費やされる時間（ｔ１）を示す。決められた間隔（分）の後、それぞれのマウスを同一、または異なる幼若動物に対面させ、認識時間を測定した（ｔ２）。５〜８匹のマウス群についてｔ２／ｔ１の平均±ＳＤを示す。アスタリスクはｔ２対ｔ１における統計的な有意差を示す。対照マウスの３０分に比較して、トランスジェニックマウスは１０分以内に「同一」マウスの認識能力を喪失することに注意されたい。図Ｂは、タクリンの単回投与（１ｍｇ／ｇ体重）および対面との間に２０分の間隔をおいた場合のトランスジェニックマウスで観測された記憶能力の改善を示す。
図１０は、味覚嫌悪テスト（ｔａｓｔｅ  ａｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）におけるＡＣｈＥトランスジェニックマウスの不十分な反応の棒グラフであり、ｈＡＣｈＥトランスジェニックマウスは学習するが長期の記憶は持たないことを証明している。
図１１は、３種類のＡＣｈＥスプライシング変異体の概略図である。
図１２は、３種類の変異体、Ｅ１−４，６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２１）、Ｅ１−５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２）、Ｅ１−４−Ｉ４−Ｅ５（リードスルー；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３）における、Ｅ４の末端からタンパク質の末端までのヒト（ＩＩ）ＡＣｈＥ変異体のアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）および神経筋接合部（ＮＭＪ）においてヒトアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）産生を選択的に変調することができる合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）を提供する。本明細書中で用いるように、変調するという用語は、アセチルコリンエステラーゼ産生の選択的阻害および／または刺激、すなわち、産生の速度を変化させ、または停止することができる相互作用を意味する。
このような選択的変調、すなわち産生速度の変化は、例えば、（１）ニューロン活性の変化、（２）学習および記憶の変化、または（３）ＮＭＪにおけるＡＣｈＥの減少、すなわちＮＭＪにおけるＡＣｈＥ貯留の減少をもたらすことができる。
ＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮの具体的配列を決定し、本明細書中で以下に述べるように有効性試験を行う。配列は、中枢神経系および／または筋肉で活性／支配的であるＡＣｈＥｍＲＮＡのスプライシング変異体が標的となり、それによって他の組織におけるＡＳ−ＯＤＮ活性が減少または消失するように選択される。標的配列は、ＡＳ−ＯＤＮに利用しやすく、標的組織中のスプライシング変異体に特異的であるように選択する。スプライシング変異体に特異的ではないが他の組織中のＡＳ−ＯＤＮには利用されない配列を選択することも可能である（実施例を参照）。要するに、ＡＳ−ＯＤＮは非毒性で、ＡＣＨＥ遺伝子に高い選択性を有し、配列依存的な様式で働き、特定の組織および／または細胞を標的とすることができる。
１つの実施形態において、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは以下の配列のうち１つを有する。
0004427639.tif 000005
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１は、１１１９位で始まるヒトＡＣＨＥ配列に向けられたものである（ヌクレオチドの番号付けは、Ｓｏｒｅｑ他、１９９０年を参照のこと）。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２は、１５０７位で始まるヒトＡＣＨＥ配列に向けられたものである。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：４〜７および１７〜１８は、実施例４〜８で試験されるｍＡＳ配列のヒト等価体であり、ｍＡＳ−１〜４、６〜７（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：８、１０、１１、１２、１３、１４）に対応する。配列中の当該位置で両種の間の相同性が欠如しているため、ｍＡＳ３およびｈＡＳ３のアンチセンス配列の間にはほとんど相同性がないことに注意されたい。対照ｈＡＳ配列は、逆ｈＡＳ−１  ５’ＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９）、および逆ｈＡＳ−６  ５’ＣＣＣＧＡＣＣＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０）とした。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（バックボーン）結合から構成されるヌクレオチドまたはヌクレオシド単量体のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語にはまた、天然に存在しない単量体またはその部分が含まれ、同様に機能する修飾または置換されたオリゴマーが含まれる。置換オリゴマーの導入は、細胞への取り込みの亢進、またはヌクレアーゼ抵抗性の増大を含む要素に基づき、当技術分野で知られているようにして選択される。この全体のオリゴヌクレオチドまたはそのほんの一部が、置換オリゴマーを含んでもよい。
特定の遺伝子発現におけるアンチセンス妨害は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を用いることによって達成できる（最近の報告に関しては、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ−ｄ’Ｈｅｌｌｅｎｃｏｕｒｔ他、１９９５年；Ａｇｒａｗａｌ、１９９６年；Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９７年を参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、重要な標的ｍＲＮＡと相補をなすようにデザインされた通常１５〜３０量体の短い配列のＤＮＡであり、７量体という小さなものであってもよく（Ｗａｇｎｅｒ他、１９９６年）、ＲＮＡ：ＡＳ二本鎖を形成する。この二本鎖形成は、関連するｍＲＮＡのプロセシング、スプライシング、移行または翻訳を妨害することができる。さらに、ある種のＡＳヌクレオチド配列は、その標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成したときに細胞のＲＮアーゼＨ活性を誘発することができ、ｍＲＮＡ分解がもたらされる（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ他、１９９６年）。この場合、ＲＮアーゼＨは、二本鎖のＲＮＡ成分を開裂し、ＡＳを強く放出して、標的ＲＮＡの別の分子へさらにハイブリッド形成させることができる。別の作用機作は、ＡＳのゲノムＤＮＡとの相互作用によってもたらされ、転写に対して不活性な三重らせんを形成する。
細胞発生に関連するアンチセンス誘発機能消失発現型は、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ニワトリの蓋板形成の確立（Ｇａｌｉｌｅｏ他、１９９１年）、およびＮ−ｍｙｃタンパク質の場合に見られ、神経外胚葉の培養における細胞の異質性の維持に役割を果たす（上皮細胞対神経芽細胞で、それらのコロニー形成能、腫瘍形成性および接着が異なる）（Ｒｏｓｏｌｅｎ他、１９９０年；Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ他、１９９１年）。有糸分裂誘発性および脈管形成性の性質を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦｇＦ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、飽和可能および特異的様式で神経膠腫細胞の成長を８０％抑制した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１年）。
必要な場合、ヌクレアーゼ抵抗性は、使用および送達方法に必要なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの生物活性を本質的に妨害することのない当技術分野で知られている方法によって得られる（Ｉｙｅｒ他、１９９０年；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ他、１９９０年；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、１９８５年；ＳｐｉｔｚｅｒおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｗｏｏｌｆ他、１９９０年；Ｓｈａｗ他、１９９１年）。ヌクレアーゼ抵抗性を高めるためにアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して行うことのできる修飾には、リン酸エステルバックボーンのリンまたは酸素ヘテロ原子の修飾、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子または複素環糖間結合が含まれる。これらは、２’フッ素化、Ｏ−メチル化、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびモルホリノオリゴマーを含む。非限定的な実施形態において、４から６の３’末端ヌクレオチド塩基間を結ぶホスホロチオエート結合を有することによって得られる。あるいは、ホスホロチオエート結合はすべてのヌクレオチド塩基を結ぶ。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、有効な濃度において顕著な毒性を示さず、動物において十分な薬力学的半減期を示し（Ａｇａｒｗａｌ他、１９９６年）ヌクレアーゼ抵抗性である。あるいは、ヌクレアーゼ抵抗性は、ヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）を有する、３’末端で９ヌクレオチドループ形成配列を有することによって得られる。アビジン−ビオチン結合反応の使用も、血清ヌクレアーゼ分解に対するＡＳ−ＯＤＮの保護を改善するために用いることができる（ＢｏａｄｏおよびＰａｒｄｒｉｄｇｅ、１９９２年）。この概念に従い、ＡＳ−ＯＤＮ試薬を、その３’末端でモノビオチン化する。アビジンと反応した場合、非結合のＯＤＮを６倍上回る安定性が改善された堅固なヌクレアーゼ抵抗性複合体を形成する。
他の検討から、ＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける伸展が判明した（Ａｇａｒｗａｌ他、１９９１年）。循環から異質のＡＳ−オリゴヌクレオチドを除去するための捕捉機構として有用と考えられるこのプロセスは、伸展が生じる結合したオリゴヌクレオチドの遊離３’末端の存在に左右される。したがって、この重要な部位における部分的ホスホロチオエート、ループ保護またはビオチン−アビジンはこれらのＡＳ−オリゴデオキシヌクレオチドの安定性を保障するのに十分でなくてはならない。
本発明には、オリゴヌクレオチドの機能に本質的に影響を及ぼさない本発明のオリゴヌクレオチドのすべての類似体、またはオリゴヌクレオチドの修飾も含まれる。このような置換は、例えば、当技術分野で知られているように細胞の取り込みを増加させ、またはヌクレアーゼ抵抗性を増すために選択することができる。この用語はまた、類似体が置換された２つ以上の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
ヌクレオチドは、天然または合成的に修飾された塩基から選択することができる。天然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。オリゴヌクレオチドの修飾塩基には、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、プソイドウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン類、８−ヒドロキシアデニンおよび他の８−置換アデニン類、８−ハログアニン類、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン類、８−ヒドロキシグアニンおよび他の置換グアニン類、他のアザおよびデアザアデニン類、他のアザおよびデアザグアニン類、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンが含まれる。
さらに、ヌクレオチドの類似体も調製でき、ここで、ヌクレオチドの構造は、根本から変化を受け治療薬または実験薬としてより適当となる。ヌクレオチド類似体の一例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、ここで、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸エステルバックボーンは、ペプチドで見られるのと同様なポリアミドバックボーンで置換される。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に抵抗性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの寿命が延長することが分かった。さらに、ＰＮＡはＤＮＡ分子よりも相補ＤＮＡ配列により強く結合することが分かった。この観察は、ＰＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖の間の電荷的反発がないためである。オリゴヌクレオチドに対して行うことのできる他の修飾には、ポリマーバックボーン、モルホリノポリマーバックボーン（米国特許第５，０３４，５０６号）、環状バックボーン、または非環式バックボーン、糖模倣体またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善できる他の修飾が含まれる。
本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、当技術分野で知られているいかなる方法によっても合成することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成装置を使用することができる。オリゴヌクレオチドの最終純度は、当技術分野で知られているようにして測定する。
本発明は、生理学的に許容可能な坦体または希釈剤中に、中枢神経系または神経筋接合部においてヒトアセチルコリンエステラーゼ産生を選択的に変調することができる少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを活性成分として含む医薬組成物または医学組成物も開示する。１つの好ましい実施形態において、合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、２および７であるが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４〜６、１７および１８も適当な標的には用いることができる。
本発明はまた、学習および記憶障害をもつ患者、またはストレス障害およびパーキンソン病の患者など、このような治療を必要とする患者において、中枢神経系にバランスのとれたコリン作動性シグナリングを回復する方法を開示する。この方法は、生理学的に許容可能な坦体または希釈剤中に、治療有効量の中枢神経系においてヒトアセチルコリンエステラーゼ産生を選択的に変調することができる少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性ＡＳ−ＯＤＮをこのような治療を必要とする患者に投与することを含む。本発明はまた、生理学的に許容可能な坦体または希釈剤中に、治療有効量の神経筋接合部においてヒトアセチルコリンエステラーゼ産生を選択的に変調することができる少なくとも１つの合成ヌクレアーゼ抵抗性ＡＳ−ＯＤＮをこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、このような治療を必要とする患者の神経筋接合部におけるアセチルコリンエステラーゼの貯留を減少させる方法を提供する。
許容可能な担体、賦形剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩緩衝食塩水などの生理学的に許容可能な緩衝液などの緩衝液、およびより一般的には当技術分野で知られているすべての適当な担体を含む。組成物は、任意選択で、抗酸化剤；単糖および二糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオンおよび／または非イオン性界面活性剤などの生理学的に許容可能な添加物を含んでもよい。徐放組成物も本出願の範囲内に意図されている。それらには、フィルムまたはマイクロカプセルなどの形のある半透過性高分子マトリックスが含まれていてもよい。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよび本発明の組成物は殺菌されていなければならない。アンチセンス送達は、リポソームを用いても行われている（ＪｕｌｉａｎｏおよびＡｋｈｔａｒ、１９９２年）。
一実施形態において、合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１、２、６および７であるが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４〜５、１７および１８も適当な標的には用いることができる。
本ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド発明の重要な特徴は、単純皮下、筋肉内、静脈内または腹膜組織内注射が可能なこと、およびその効果が少なくとも数週間続くことである。本発明のＡＳ−ＯＤＮの限られた毒性も、その治療用途にとっては特に重要である。
ＡＳ−ＯＤＮは、個々の患者の臨床状態、投与部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重および医学従事者に知られている他の要素を考慮し、優れた医療行為（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って投与される。したがって、本明細書中の目的に関する治療「有効量」は、当技術分野で知られているように、このような考慮の上で決定される。その量は、ＣＮＳまたは神経筋接合部におけるＡＣｈＥ濃度の変化、症状、および当業者によって適当な手段として選択されるその他の指標の改善または消失を含むが、これらに限定されない改善を遂行するために有効なものでなくてはならない。
ＣＮＳ内に特定して送達する場合、例えば、オムマヤレザバーによる鞘内送達を用いることができる。米国特許第５，４５５，０４４号はＣＮＳ送達の場合の分散系の使用を提供している。ＣＮＳ送達の考察に関しては、米国特許第５，５５８，８５２号を参照されたい。さらに、血液脳関門を通過する薬理学的処方を投与することができる（Ｂｅｔｚ他、１９９４年；Ｂｒｅｍ他、１９９３年）。このような処方は、本発明が、脳移行ベクターと結合して関門を通過させるようにしたキメラ分子を精製するために現在用いることができる方法を利用できる（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他、１９９２年；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、１９９２年；Ｂｉｃｋｅｌ他、１９９３年）。さらに、同一の譲受人に譲渡され１９９７年１１月２０日に出願提出され、そのすべてを参照により本明細書中に援用する、出願人の同時係属の米国特許出願第０８／９７５，０８４号は、ストレス様誘発薬または治療が、ＡＣＨＥ−Ｉ４リードスルースプライシング変異体またはＩ４ペプチドまたはアドレナリンまたはアトロピンのように関門を開けることを明らかにした。
産生を変調し、それによって神経筋接合部におけるＡＣｈＥの貯留を変調させる場合には、筋肉型を標的とするＡＳ−ＯＤＮが用いられる、一般に、疎水性であることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜とよく相互作用する（Ａｋｈｔｅｒ他、１９９１年）。細胞の形質膜と相互作用したあとで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的受容体に関係すると思われる飽和可能な機構（Ｙａｋｕｂｏｖ他、１９８９年）で、生体細胞中に盛んに移行する（Ｌｏｋｅ他、１９８９年）。したがって、ＡＳ−ＯＤＮは、神経筋接合部に貯留（移行、放出）するＡＣｈＥを産生する筋肉細胞に利用可能である。
どのような薬物に関しても、アセチルコリンエステラーゼを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの潜在的治療有用性をテストするには、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの適当なモデルが必要である。マウスは、ヒトの痴呆に類似する疾患を自然には発症しないため、出願人は、この目的に供するため、アルツハイマー病の特殊なトランスジェニックマウスモデルを生み出した（Ｂｅｅｒｉ他、１９９５年、同一の譲受人に譲渡された同時係属の米国特許出願第０８／３７０，１５６号。そのすべてを、参照により本明細書中で援用する）。これらの遺伝的操作によるマウスは、コリン作動性脳細胞内でヒトアセチルコリンエステラーゼを過剰産生する。脳細胞内の過剰なアセチルコリンエステラーゼは、アルツハイマー病に伴う認識不全を促進すると考えられているものと同様のアセチルコリン欠乏を誘発する。そして、実際、出願人のトランスジェニックマウスは、空間的学習および記憶のための標準化された水泳テスト、本明細書の実施例７に記載する社会的認識テスト、および味覚嫌悪テストによって最初に測定される、認識反応における年齢依存性悪化を示す。これらマウス脳内の過剰のアセチルコリンエステラーゼは、ヒトＤＮＡ由来であることから、ヒトアセチルコリンエステラーゼ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して感受性がある。したがって、この動物システムおよびそれに由来する脳スライスは、脳内にバランスのとれたコリン作動性シグナリングを回復させ、それによってアルツハイマー病患者の悩みである認識機能障害をいくらか軽快させるための抗アセチルコリンエステラーゼアンチセンス技術をｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの手段でテストし、また前症状段階で始める治療の有効性をテストする能力をもたらす。一般に、有効性の初期のスクリーニングはｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、好ましくは脳スライスで行われる。このスクリーニングの後、ＡＳ−ＯＤＮはｈＡＣＨＥトランスジェニックマウスにおいてその有効性をテストされる。ヒトによる試験の適当な候補者は、それによって決定する。このモデルシステムは、ヒトと同一の様式でタクリンにも反応し（実施例を参照）、ＡＳ−ＯＤＮをテストするためのモデルシステムとしての使用が支持される。
筋無力症性動物におけるＡＳ−ＯＤＮのテストの場合には、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  Ｇｒａｖｉｓモデルが利用できる。さらに、出願人は、ｉｎ  ｖｉｖｏ行動テスト（ロープ握り）およびｉｎ  ｓｉｔｕ組織検査（シナプスはＭＧ様構造を有する）により、ＡＣｈＥを過剰発現するトランスジェニックマウスのＭＧの模倣モデルが、新規なＡＳ−ＯＤＮのテストに用いることができることを明らかにした（Ａｎｄｒｅｓ他、１９９７年）。
出願人は、静脈内、腹膜組織内、および直接脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）経路を用い、オリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏで投与するための方法を確立した。結果は、トランスジェニックマウス脳組織中のＡＣｈＥ触媒活性の低下に、ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴヌクレオチドが有効であることを示している。これらの検討から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチドの治療上有用な剤形および用量をテストし、決定するための基礎が得られる。
実施例に示すように、ヒトおよびマウスのＡＣｈＥｍＲＮＡの双方を標的とするＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮを製造し、注射した（表ＩおよびＩＩを参照）。ＡＳ−ＯＤＮは、示すように、ヌクレアーゼ抵抗性であった。
ＡＳ−ＯＤＮ処理したヒトトランスジェニックマウスのいずれにも急性の毒性効果は観察されず、すべての処理動物で行動は正常に見えた。ｈＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮは、ｈＡＣｈＥ−ｍＲＮＡおよびｍＡＣｈＥ−ｍＲＮＡ双方の濃度の減少をもたらし（図２）、２匹のうち１匹の動物ではタンパク質濃度を劇的に減少させた。ｍＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮは、１匹の動物でＲＴ−ＰＣＲ産物の出現に３サイクルの遅れをもたらした（ｍＲＮＡで約８分の１に減少）。ｈＡＣｈＥ−またはｍＡＣｈＥ−ｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮ  １００ｐｍｏｌｅ（約１ｕｇ）を１５日齢マウスにｉ．ｃ．ｖ．投与した場合、各群３匹のうち２匹のマウスが、注射から４０時間後に、緩衝液を注入した動物で測定した平均活性を＞１Ｓ．Ｄ．下回る全ＡＣｈＥ活性を示した（図３）。
標的細胞中でＡＣＨＥｍＲＮＡに対するＡＳ−ＯＤＮをデザインするにあたり、哺乳動物で発現される３種類の選択的転写物のどれがこれらの細胞に存在しているかを確認する必要がある。それぞれの転写物に選択的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、どの転写物か、いかなる強度かが決定される。通常、標的組織中で最大強度を有する転写物が選択される。実施例に示すように、組織差がある（図４および５を参照）。前に述べたように、神経筋接合部（ＮＭＪ）に見出される主要な中枢神経系および筋肉ＡＣｈＥ（ＡＣｈＥ−Ｔ）は、エクソンＥ１および選択的エクソンＥ６にスプライシングされるインバリアントコードエクソンＥ２、Ｅ３、およびＥ４を運ぶｍＲＮＡによってコードされている（Ｌｉ他、１９９１年；Ｂｅｎ  Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ他、１９９３年）。実施例に示すように、特定のエクソンを標的とするＡＳは、スプライシング前後いずれのＡＣｈＥｍＲＮＡも標的にする。スプライシング後のＡＣｈＥｍＲＮＡを特異的に標的とするためには、スプライシングが起きた後で、３種類の形のうち唯一のスプライシング部位をアンチセンスの標的とすることができる（図１１〜１２）。２０量体ＡＳ−ＯＤＮが好ましいが、スプライシング部位の特異な配列に相補的な他の長さのものも用いることができる。通常、アンチセンス配列は、部位の両側１０ヌクレオチドの広がりを持つが、特異なスプライシング部位配列が判明している限り、両側の他の領域を用いることができる。ある実施形態において、Ｅ４−Ｅ６部位配列（図１２）を標的とするＡＳ−ＯＤＮは、実施例に示すように、中枢神経系および神経筋接合部型（ＡＣｈＥ−Ｔ）に特異的である。
興味あることに、本明細書中に記載するように、ｍＡＳ６およびｍＡＳ７を除くｍＡＳ−ＯＤＮは、読み取り枠のＡＣＨＥｍＲＮＡに含まれる翻訳可能な配列を標的とした。エクソン６の３’領域を標的とするｍＡＳ７は、選択的スプライシングされたＡＣＨＥｍＲＮＡ転写物のすべてに共通な配列に対してデザインされたものに比べ、有意に有効性が劣っていた。これは一般的ルールではなく、反対に、他のｍＲＮＡの３’領域を標的とするＡＳ−ＯＤＮは、すべてのｍＲＮＡ配列の破壊を効果的に誘発することが分かった（例えば、Ｂｅｎｎｅｔ他、１９９４年）。しかし、哺乳動物のＡＣＨＥｍＲＮＡはＧ、Ｃ塩基対が特に豊富である（ヒトＡＣＨＥ中６７％、Ｓｏｒｅｑ他、１９９０年）。したがって、堅固に折りたたまれているようである。エクソン２、３および４のみを有する切形ヒトＡＣＨＥｍＲＮＡは、ツメガエル胚で翻訳可能であることが見出されたことから（Ｓｅｉｄｍａｎ他、１９９７年）、Ｅ６−ＡＣＨＥｍＲＮＡが堅固に折りたたまれているため、３’エクソンに対するＲＮアーゼＨ作用がエクソン２、３および４の破壊をもたらさず、触媒活性なＣ−末端切形タンパク質をコードするｍＲＮＡが残る可能性もある。したがって、Ｅ４−Ｅ６接合部配列を標的とするＡＳが作用し、３’領域を標的とするＡＳは作用しないのであろう。
前記の考察により、ＡＳ−ＯＤＮの使用に関する事実に基づく基礎が得られる。使用する方法および本発明の有用性は、以下の非限定的実施例および添付の図によって明らかにすることができる。
実施例
一般法
分子生物学における一般法：
当技術分野で知られており、具体的に記載しない標準的分子生物学技術は、通常Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年、１９９２年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９年）に従った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、通常「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）のように行った。
特にことわらない限り、他の核酸技術を含む反応および操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓの一般的記述、および参照により本明細書に援用する米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に記載の方法論に従って行った。
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの合成：
オリゴデオキシヌクレオチドは、製造会社の使用説明書に従い、同社のホスホロアミダイトを使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成装置で合成した。ヌクレオチドは、Ｗａｔｅｒｓ自動グラジエントコントローラ、およびオリゴデオキシヌクレオチドにまだ結合している５’保護のジメトキシトリチル基で２６０ｎｍにおいて操作する４８１型ＵＶ分光光度計を備えたＷａｔｅｒｓデュアルポンプ６０００Ａシステムによる逆相ＨＰＬＣで精製した。保護基は、８０％酢酸水溶液による標準的処理で除去した。得られたオリゴデオキシヌクレオチドは、再びＨＰＬＣにより純度をチェックした。
ヌクレアーゼ抵抗性のためにホスホロチオエート基を導入する場合には、ヨウ素を用いる酸化ステップを３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシドとの反応で置き換えた（Ｉｙｅｒ他、１９９０年）。この処理は、ヌクレアーゼからオリゴデオキシヌクレオチドを保護し（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、１９８５年；ＳｐｉｔｚｅｒおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９８８年）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける存続時間を延長する（Ｗｏｏｌｆ他、１９９０年；Ｓｈａｗ他、１９９１年）。部分的保護が必要な場合、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシドとの反応は、通常の合成を続けた後、最初の３ステップに対して行った。したがって、得られた部分的に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドは、３’末端の最後の３つのヌクレオチド間結合でのみ、ホスホロチオエート基で保護された。
ループを含む場合、オリゴデオキシヌクレオチドの合成は、３’末端で延長し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３を得た。
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、−２０℃において４ｍＭ濃度で保存し、マウスへ投与する前にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。
実施例１
造血系においてＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮを用いた先行する研究の要約
その独特な性質から、造血系は、複数の細胞および分子プロセスのアンチセンス妨害に特に適している。造血細胞の急速な増殖および短い半減期、ならびにＡＳ−ＯＤＮの効率の良い取り込みおよび近づきやすさは、造血細胞におけるＡＳ−ＯＤＮの効率の良い効果の理由の１つである（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ他、１９９６年；Ｇｅｒｗｉｒｚ他、１９９３年）。
一般的には、造血組成物の制御、および具体的には、巨核球（ＭＫ）発生の制御におけるＡＣｈＥの役割を調べるため、雌性成熟マウスをｉｎ  ｖｉｖｏにおいてホスホロチオエートＡＳ−ＡＣＨＥで処理した。この処理の効果をモニターするため、異なる組織中のポリメラーゼ連鎖反応産物（ＲＮＡ−ＰＣＲ）の速度論的追跡とともに、骨髄細胞の分化細胞数を求めた（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年）。35Ｓ標識ＡＣＨＥおよびＢＣＨＥ  ｃＲＮＡプローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成と、それに続くハイブリッド形成データのコンピュータによる定量を用い、ｍＲＮＡ濃度を特定の細胞タイプに結びつけた。ＲＮＡ−ＰＣＲ分析によれば、処理後１２日目でＡＣＨＥ  ｍＲＮＡはすべて明らかに廃棄され、処理マウスの骨髄中のリンパ球および赤血球系分画は劇的に減少した。このことは、ＡＣＨＥが、この酵素を発現する２種類の細胞系であるリンパ球および赤血球の発生、ならびにＡＳ−ＯＤＮ処理の有効性を示すことに関わっていることを示している。
数が少なく、寿命が長いため、ＭＫの一部は処理前の期間からの細胞ということもあることから、１２日目におけるＭＫ分画の差を評価することは有益ではなかろう。しかし、骨髄中のアクチンｍＲＮＡの二次的減少は、ＭＫがこのｍＲＮＡ種で満たされることから、ＭＫ減少の指標となった。ＭＫおよび赤血球系細胞は共通の前駆細胞を共有していると考えられており、これらの知見は、これらの前駆細胞がＡＳ−ＡＣＨＥ処理によって同様の影響を受けることを示唆している。
骨髄細胞と同様に、組織が連続的置換を受けていることから、ＲＴ−ＰＣＲ実験の追加組織としてリンパ節を選んだ。処理後１２日のリンパ節ＡＣＨＥ  ｍＲＮＡ濃度の劇的減少は、投与されたＡＳ−ＡＣＨＥオリゴの効率の良い組織分布を証明した。
これらの知見は、ＡＳ−ＡＣＨＥ処理後の造血細胞成分の一過性変化、具体的には、骨髄性分画の増加を示している（Ｐａｔｉｎｋｉｎ他、１９９０年、１９９４年；Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年）。
本明細書中で先に考察したように、骨髄中の骨髄性分画の増加に見られるＡＳ−ＡＣＨＥオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果は、前駆細胞の膨張を反映するもののようであり、これはより早く発生する骨髄性細胞の増加からまず確かなようである。それに加え、または別に、骨髄球新生の亢進または赤血球生成の抑制に起因するのかもしれない。これらの可能性を区別するため、および造血におけるＡＣＨＥ遺伝子の機能をさらに詳しく検討するため、ＡＳ−ＡＣＨＥを、一次造血細胞にｅｘ−ｖｉｖｏで投与した。マウスＣＦＵ−ＭＫおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの遺伝子発現、前駆細胞の膨張、および細胞組成百分率における効果を調べた（Ｓｏｒｅｑ他、１９９４年）。これらの実験も、同様に、骨髄性細胞分画の増加をもたらし、前駆細胞の膨張、およびそれらの子孫細胞の発生の増加を反映した（Ｓｏｒｅｑ他、１９９４年）。
一次マウス骨髄培養を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ実験には、成長因子の効果が個々に検討できるといったｉｎ  ｖｉｖｏ実験を上回る追加の利点がある。例えば、これら一次培養において、インターロイキン３（ＩＬ−３）は、元の多能性幹細胞分画の多能性前駆細胞への膨張を誘発し、これは、顆粒球、巨核球、およびマクロファージからなる巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＭＫ）に分化できる（Ｐａｔｉｎｋｉｎ他、１９９０年；Ｌａｐｉｄｏｔ−Ｌｉｆｓｏｎ他、１９９２年）。ＩＬ−３にエリスロポイエチンおよびトランスフェリンを加え、より長時間培養すると、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーが誘発され、これは、顆粒球、赤血球系細胞、巨核球およびマクロファージを含む。これは、コロニー数が、子孫のもとになった前駆細胞の膨張および生き残りを反映し、一方、細胞数は、増殖速度を反映していることを意味し、細胞組成百分率数は、どの細胞系が発生し、どれが死をプログラムされていたかを示している。ＡＳ−ＯＤＮ試薬による造血に重要な遺伝子発現の妨害（ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３年）は、これらの培養のそれぞれまたはすべての特徴を変化させることができ、さらに、出願人が示したように、ｃｄｃキナーゼ（Ｌａｐｉｄｏｔ−Ｌｉｆｓｏｎ他、１９９２年）、ＡＣＨＥ関連遺伝子ＢＣＨＥ（Ｌａｐｉｄｏｔ−Ｌｉｆｓｏｎ他、１９８９年；ＳｏｒｅｑおよびＺａｋｕｔ、１９９３年）を標的とするＡＳ−ＯＤＮは、ＣＦＵ−ＭＫコロニー中の巨核球生成を妨げる（Ｌａｐｉｄｏｔ−Ｌｉｆｓｏｎ他、１９９２年；Ｐａｔｉｎｋｉｎ他、１９９４年；Ｓｏｒｅｑ他、１９９４年）と考えられる。
実施例２
造血系においてＡＳ−ＢＣＨＥ−ＯＤＮを用いた先行する研究の要約
一次マウス骨髄培養に投与したＡＳ−ＢＣＨＥ  ＯＤＮの効果を、ＡＳ−ＡＣＨＥ  ＯＤＮの場合と比較することにより、造血におけるＢｕＣｈＥの役割を検討した。ＡＳ−ＢＣＨＥ  ＯＤＮが投与されたＣＦＵ−ＭＫおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ培養のいずれにおいても、骨髄性細胞分画の一定の亢進および対応する巨核球分画の抑制が見られた。このエリスロポイエチン非依存性効果は、配列依存性であって一般的なアポトーシス的変化を伴わない。補足的なｉｎ  ｖｉｖｏ検討から、２週間以上にわたってＢＣＨＥｍＲＮＡのアンチセンス誘発破壊が継続するが、巨核球の生存に対しては効果がなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ処理後にＣＦＵ−ＭＫ膨張容量のｅｘ−ｖｉｖｏ抑制のあることが分かった。したがって、ＡＳ−ＡＣＨＥおよびＡＳ−ＢＣＨＥ試薬は、互いの標的に交差反応することはないが、巨核球生成に対して同様の効果を与えると予想できた。
オリゴヌクレオチドの非特異的細胞毒性を避けるため、関連オリゴの保護のために部分ホスホロチオエート化を用い、３つの３’末端ヌクレオチド間結合のみをホスホロチオエート基で置換した（Ｅｈｒｌｉｃｈ他、１９９４年）。断片化されたＤＮＡのはしご型ダイアグラムに変化がないことで実証されるように、実験的細胞培養におけるアポトーシス率に異常が見られないのは、検討による効果が計画された細胞死の非特異的誘発によるものではないことを示している。同様に、骨髄性細胞分画の増加は、主として標的ＢＣＨＥｍＲＮＡおよびＡＳ−ＯＤＮの選択的破壊によるものであることを示唆している。
このシリーズの他の実験では、ｅｘ  ｖｉｖｏの造血に対するＡＳ−ＯＤＮ試薬の非配列依存性効果が証明された。ＣＦＵ−ＭＫおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭ培養のいずれにおいても、センス配向性配列のＳ−ＢＣＨＥではなく、部分的に保護されたＡＳ−ＢＣＨＥが骨髄球および顆粒球数を上昇させ、一方、初期の巨核球分画を減少させた。しかし、ＣＦＵ−ＭＫ培養では、用いたＳ−ＢＣＨＥオリゴの配列非依存性効果は、コロニー数の変動を増加させた。反対に、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー数の変動はＡＳ−ＢＣＨＥ処理のもとで巨核球の抑制とともに減少した。これらの観察は、出願人の従来の知見を裏付け、拡大し（Ｐａｔｉｎｋｉｎ他、１９９０年；Ｌａｐｉｄｏｔ−Ｌｉｆｓｏｎ他、１９９２年；Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年；Ｅｈｒｌｉｃｈ他、１９９４年）、一方、ＡＳ−ＢＣＨＥによって誘発された巨核球生成系列から骨髄球生成系列に向かう造血転換が、エリスロポイエチン非依存性であり、骨髄性の増殖の増加を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件でも生じることを示している。これらの知見はまた、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの前駆細胞が、ＣＦＵ−ＭＫの前駆細胞に比べより変化の少ない状態でＡＳ−ＢＣＨＥに応答することを示している。したがって、個々の前駆細胞は、問題のオリゴおよび細胞タイプに依存しながら、異なる変動レベルで特定のＡＳ−ＯＤＮ試薬に応答すると予想できる。
ＡＳ−ＡＣＨＥの効果と同様に、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの用量反応曲線全体に、ＡＳ−ＢＣＨＥによる巨核球生成抑制が見られた。
ＡＳ−ＢＣＨＥ効果の長期のｉｎ  ｖｉｖｏ−ｅｘ  ｖｉｖｏ存続期間は特に重要である。これは、幼若前巨核球におけるＢＣＨＥｍＲＮＡのＡＳ−ＢＣＨＥ誘発破壊が、少なくとも２週間、これら細胞の発育を低下させることが可能であることを示し、ＢＣＨＥ抑制を補完し巨核球の正常な産生を回復させるためのフィードバック反応が生じなかったことを証明している。
一般に、ＡＳ−ＢＣＨＥの効果は、ＡＣＨＥ発現を阻害する平行するＡＳ−ＡＣＨＥによるｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ処理によって生ずる明らかな効果に比べると、限定されている。ＡＳ−ＢＣＨＥと同様、ＡＳ−ＡＣＨＥも巨核球形成を抑制する。しかし、ＡＳ−ＢＣＨＥとは異なり、ｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの赤血球生成も抑制し（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年；Ｓｏｒｅｑ他、１９９４年）、アセチルコリンエステラーゼが赤血球生成プロセスにも関与していることを示唆している。さらに、ＡＳ−ＡＣＨＥは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー生成および細胞増殖の劇的なｅｘ  ｖｉｖｏ膨張を誘発し、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ一次骨髄培養中のアポトーシスを減少させるが、ＡＳ−ＢＣＨＥでは、このようなことはない（Ｓｏｒｅｑ他、１９９４年）。これらの違いは、哺乳動物の造血における２種類のコリンエステラーゼの果たす役割の違いを示している。本出願で述べるように、これらのｍＲＮＡを標的とする新規抗コリンエステラーゼ薬およびＡＳ−ＯＤＮ薬の開発は、これらのｍＲＮＡのタンパク質産物の造血系の関与、ならびに造血プロセスにおける異なった役割を考慮に入れている。
実施例３
マウスの神経筋接合部におけるＡＳ−ＯＤＮ
ＣｈＥ活性のもう１つの重要部位は、神経筋接合部であり、ＣｈＥは、運動機能のコリン作動性刺激を制御する。したがって、特定のＡＳ−ＯＤＮの全身投与により、所望の組織のみが影響を受けることを確かめることは重要であろう。
ＡＳ−ＡＣＨＥオリゴのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、本明細書中の前記実施例１および２で述べたように、注射されたマウスにおける造血を変化させた（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年）。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用まで拡大されたこの技術を応用するため、出願人は、ある種のＡＳ−ＯＤＮの注射が、他の組織の標的ｍＲＮＡにも同様に影響を与えるかどうかを調べた（図４）。
５週齢の雌性白色Ｓａｂｒａマウスに、ＰＢＳ０．２ｍｌまたはマウスＡＣＨＥ遺伝子を標的とする３’末端をホスホロチオエート化したオリゴデオキシヌクレオチド（５μｇ／ｇ体重）を含むＰＢＳを３日間、１日１回注射（ｉ．ｐ．）した。２種類のアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを用いた。共通のエクソンＥ２（ｍＥ２；マウスＥ２；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）または選択的造血エクソンＥ５（ｍＥ５；マウスＥ５；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）を標的とするヌクレオチドを、相同のヒトＡＣＨＥ遺伝子配列に基づくセンス（Ｓ）オリゴまたはＰＢＳの擬注射と比較した。βアクチンｍＲＮＡは、転写に対する非特異的効果の制御に役立った。最後の注射後２４時間でマウスを致死せしめ、全ＲＮＡを筋肉および骨髄（ＢＭ）から調製した。マウスＡＣＨＥ遺伝子エクソンＥ４（＋）およびＥ６（−）に結合するプライマー対（＋１３６１／−１８４４）を用い、ＲＮＡ試料１００ｎｇについて半定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。サイクル２４および３３の間で３サイクル毎に分析のための試料を除いた。ＡＳ−ｍＥ２およびＡＳ−ｍＥ５のいずれも、投与した用量においてＥ６含有ＡＣＨＥｍＲＮＡの特異的な減少を骨髄でもたらすが、筋肉ではもたらさず、一方、アクチンｍＲＮＡは、いずれの処理でも影響を受けなかった。
ＡＳ−ｍＥ２  ＯＤＮは、Ｃ−末端ペプチド配列の異なるポリペプチドをコードする３種類の選択的スプライシング型のＡＣＨＥｍＲＮＡ転写物（図４Ａ）、すなわち、エクソンＥ２−Ｅ３−Ｅ４−Ｅ６を含む「シナプス型」、エクソンＥ２−Ｅ３−Ｅ４−Ｉ４−Ｅ５を含む「リードスルー型」、およびＥ２−Ｅ３−Ｅ４−Ｅ５を含む「造血型」と潜在的にハイブリッド形成する。したがって、ＡＳ−ｍＥ２（Ｅ２エクソンで選択されたアンチセンス配列）は、ＡＣｈＥが発現されるすべての組織で非常に効率が良いことが予想された。一方、ＡＳ−ｍＥ５（Ｅ５エクソンで選択されたアンチセンス配列、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９）は、最後の２種類の型とハイブリッド形成できるだけであり、その潜在的有効性がＣＮＳにおいては制限される。
ＲＮＡを使用するＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）は、種々のＰＣＲプライマーを用い、注射された動物の骨髄（ＢＭ）、筋肉および脳から抽出されたＲＮＡについて行った。これらのＡＳ−ＯＤＮが全ＲＮＡ分解に対して非特異的毒性効果をもたらすかどうかをテストするため、βアクチンに対するプライマー（プライマーの配列に関しては、Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ他、１９９４年を参照）を用いるＲＴ−ＰＣＲを用いた。ＡＳ−ｍＥ２  ＯＤＮの注射後、筋肉における僅かな減少に比べると、ＢＭにおいてはＥ６−ＡＣＨＥ濃度の効果的な減少が生じたが、脳では生じなかった（図４Ｂ）。ＡＳ−ｍＥ５  ＯＤＮで処理した動物については、Ｅ６−ＡＣＨＥ  ｍＲＮＡのより限られた減少が筋肉および骨髄で認められたが、脳では認められなかった。これは、脳への接近が限られたこと、ならびに筋肉の核および骨髄の細胞中のＡＣｈＥｍＲＮＡの一次転写物とのハイブリッド形成が、分解またはスプライシングプロセスおよび細胞質への移行の阻害をもたらすことを反映していると考えられる。これらの結果は、すでに考察した骨髄のＡＳ−ＯＤＮに対する高い感受性と一致する。したがって、ＡＳ−ＯＤＮのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、標的タンパク質を発現する種々の組織で、同一の効果をもたらすとは限らない。このことは、特定の組織を標的とする特異的なＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮのデザインを可能にする。
実施例４
ＡＳ−ＯＤＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ラットのクロム親和性細胞腫由来のＰＣ１２細胞系は、神経成長因子（ＮＧＦ）によって分化を誘発することができる脊椎動物のコリン作動性ニューロンの研究にとって、十分確立されたモデルである。ＮＧＦ処理は、ＰＣ１２細胞の増殖を停止させ、その遺伝子発現パターンを変え（Ｌｅｅ他、１９９５年）、ＡＣｈＥ活性の増加および神経突起様プロセスでコリン作動性発現型への分化を誘発する（ＧｒｅｅｎｅおよびＴｉｓｃｈｌｅｒ、１９７６年；Ｔａｏ−Ｃｈａｎｇ他、１９９５年）ことが分かっている。したがって、ＮＧＦで前処理したＰＣ１２細胞は、膜の性質、細胞構造およびＡＣＨＥｍＲＮＡ濃度において未処理の細胞と著しく異なることになる。
これらの細胞は、核溶解性分解に対して保護されたＡＳ−ＯＤＮの神経毒性をスクリーニングし、細胞分化の段階に依存する反応に差があるかどうかを判断するモデルとして用いることができる。ＮＧＦによる分化の誘発前、その間、誘発後に、一連のＡＳ−ＡＣＨＥ  ＯＤＮをＰＣ１２細胞でテストした。
材料と方法：
細胞系：ラットのクロム親和性細胞腫ＰＣ１２細胞は、テル−アビブ大学のＲ．Ｓｔｅｉｎ博士より提供を受けた。８％ウシ胎仔血清、８％ウマ血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地中で成育させる。細胞は、５％二酸化炭素の十分加湿した雰囲気中、３７℃に保つ。分化には、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）を加える。すべての組織培養試薬は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からのものである。
一次培養：一次マウスニューロン培養は、胚の（ｅ１４）マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）全脳から調製する。脳を除去し、Ｐａｓｔｅｕｒピペットで吸引することにより細胞を機械的に解離させる。ポリ−Ｌ−オルニチンおよび１０％ウシ胎仔血清を含む培地で順次コーティングした２４−ウエル（ウエルあたり１ｍｌ）Ｃｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）培養皿中、血清を含まない培地に細胞をプレートする（２．５×１０6細胞／ｍｌ）（Ｗｅｉｓｓ他、１９８６年）。記載ある場合、０．５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを７２時間添加する。
オリゴヌクレオチド：ＡＳ−ＯＤＮはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により合成した。ＯＤＮは、最後の３つの３’ヌクレオチド間がホスホロチオエート化された２０ヌクレオチドの長さであった。試験した７種類のＯＤＮは、エクソンスプライシング変異体を考慮し、マウスＡＣＨＥｍＲＮＡ鎖に沿った種々の部位を標的とした（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８〜１４）。脳で最も量の多い成熟転写物は、エクソン４がエクソン６にスプライシングされたものである。ｍＡＳ−ＯＤＮは、以下の配列を有する。
実験的配列：
0004427639.tif 000006
ｍＡＳ１（神経細胞マウス転写物７０の位置）およびｍＡＳ２（８８０）は、エクソン２の翻訳開始部位に極めて近い。ｍＡＳ３（６５８）およびｍＡＳ４（１４５４）は、すべてのスプライシング変異体に共通のエクソン２および３に位置する。ｍＡＳ５（２３４）はエクソン５を標的とし、このＯＤＮは、選択的Ｅ５ＡＣＨＥｍＲＮＡとハイブリッド形成するが、成熟Ｅ６転写物とはハイブリッド形成しない。ｍＡＳ６（１９３２；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１３）およびｍＡＳ７（２０６８；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７）は、エクソン６とハイブリッド形成するようにデザインされた。哺乳動物で配列が最も変化するため（Ｋａｒｐｅｌ他、１９９４年）、Ｉ４に対するｍＡＳ−ＯＤＮはデザインしなかった。ｍＡＳ６およびｍＡＳ７以外のすべてのｍＡＳ−ＯＤＮは、ＡＣＨＥｍＲＮＡのオープン読み取り枠に含まれる翻訳可能な配列を標的とした。（遺伝子中のＡＳ−ＯＤＮの図式的位置に関しては、図５Ｂを参照のこと）
アンチセンス処理；ＰＣ１２細胞は、９６−ウエルＮｕｎｃｌｏｎ（商標）（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）マイクロタイタープレート中、５０％の集密度（ウエルあたり約１０5細胞）まで成育させる。２４時間の培養後、ウシ胎仔およびウマ血清をそれぞれ２％まで減少させ、１あるいは１０μＭのＯＤＮを、さらに２４時間培地に加える。ある実験では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を、ほぼ製造者（ＧｉｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の指示の通りにＯＤＮとともに加えたが、ただし１μＭのＯＤＮはウエルあたり２．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）とともに用いる。
比色測定：ＯＤＮ処理の後、細胞をリン酸塩緩衝食塩水で１回洗浄し、０．５ｍＭジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を含むｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸緩衝液２００μｌ中の１％Ｔｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間溶解する。ウエル表面に接着していない死んだ細胞を、洗浄して除去する。ＡＳ−ＯＤＮ処理後に生き残った細胞を評価するため、これら細胞中の遊離チオール基の含有量を測定する。これらの基はＤＴＮＢと反応して黄色の５−チオ−２−ニトロ安息香酸アニオンを生じ、これは、４０５ｎｍの吸収によって同一のマイクロタイターウエル中で定量することができる（ε405＝１３，６００Ｍ-1ｃｍ-1）。これらの吸光度は、それぞれのウエル内の細胞濃度に比例することが分かり、細胞数の測定に役立った（図６Ａ）。次いで、９６−ウエルマイクロタイタープレートを使用した場合（Ｓｅｉｄｍａｎ他、１９９４年）に適応するＥｌｌｍａｎの定量法（Ｅｌｌｍａｎ他、１９６１年）を用い、同一のウエル内のＤＴＮＢ溶液にアセチルチオコリン１ｍＭを加えた後、ＡＣｈＥ活性を測定した。ＡＳ−ＯＤＮ−ＡＣｈＥ相互作用をテストする場合、記載量のＯＤＮとともに培養した高度に精製された組換えヒトＡＣｈＥ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）で同様の分析を行った。
ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ：全ＲＮＡは、ＲＮａｚｏｌ（商標）（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を用い、別に詳しく述べられているように（Ｋａｒｐｅｌ他、１９９４年）、全脳、胚の脳ニューロンおよびＰＣ１２細胞から抽出した。逆転写と、続くＰＣＲ増幅はＫａｒｐｅｌ他、１９９４年による記載に従って行った。
ＲＴ−ＰＣＲ産物の蓄積速度論は、ＰＣＲ手順中、６回の別個のサイクルで１２μｌのアリコートを除いて検討する。採取したＤＮＡは、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上で電気泳動した。これらのゲルのＵＶ像を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いてデジタル化する。４倍ＰＣＲ反応の場合には、ＩｐＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍプログラム（Ｓｉｇｎａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｖｉｅｎｎａ、ＶＡ、米国）を使用して、蛍光強度を定量する。得られた値を、ＰＣＲ反応の対照群がプラトーに達する時点で得られる最大強度に対する百分率としてプロットする。理想的な条件下では、調べたｍＲＮＡの出発量に依存する曲線間で縦方向に分離しながら、この速度論的追跡を通じて指数関数的に蛍光強度が増加するはずである。したがって、相対的蛍光単位対サイクル数の直線回帰分析から、もともと存在したテンプレートの量の推定値が得られるはずである。選択的ｍＲＮＡ破壊が生じた場合には、不適当な対照ｍＲＮＡではなく、標的ｍＲＮＡの濃度が、ｙ軸の種々の切片を反映して、速度論的蓄積曲線に縦方向のシフトを示すはずである。
結果：
Ｐ１２細胞には、３種類の選択的ＡＣＨＥｍＲＮＡスプライシング変異体が存在し、Ｅ６＞Ｉ４＞Ｅ５（図５Ａ）というパターンは、胚のマウス脳ニューロンおよびマウス成獣の脳で見出されるものと同様である。
本明細書中で報告される実験では、ＡＳ−ＯＤＮを３’ホスホロチオエート化によって保護した。もとのＡＣＨＥ転写物は選択的にスプライシングされて３種類の異なるｍＲＮＡを生成することから、本検討では、種々の成熟ｍＲＮＡアイソフォームを標的とするＡＳ−ＯＤＮについて、分化した（ＮＧＦ処理）および未分化の細胞におけるＡＣｈＥ産生の抑制に対する有効性を検討した。
３種類の異なる投与計画を用いた。すなわち、未分化のＰＣ１２細胞を、ＡＳ−ＯＤＮ１μＭのみ、あるいはＮＧＦとともに２４時間処理するか、あるいはＡＳ−ＯＤＮに２４時間暴露する前に２４時間のＮＧＦ誘発分化を先行して行った。
神経毒性を評価するため、ｉｎ  ｓｉｔｕで溶解した細胞中の遊離チオール基含有量から生存細胞数を測定した。アセチルチオコリン加水分解の速度をＡＣｈＥ活性の尺度とした。それぞれのＯＤＮの細胞生存に対する効果は、細胞数の尺度としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した細胞中の反応性遊離チオール基を定量することにより検討した。この測定は、迅速に、便利で簡単に行えた。個々のウエルに加えた細胞数および培養中の遊離チオール基の含有量の間には直線関係が見られた（図６Ａ）。同様の関係は、ＮＧＦ処理細胞でも観察された。遊離チオール基の＞２０％の減少を毒性の指標とした。１μＭの濃度では、ｍＡＳ２を除き、培養中の遊離チオール基の含有量を５％を超えて減少させるＯＤＮはなかった。しかし、１０μＭの濃度では、９種類のＯＤＮのうち５種類（Ｎｏ．１、３、５、６および７）が遊離チオール基の含有量を２０〜４０％減少させる毒性が観察された（図６Ｂ）。
ＯＤＮのＰＣ１２細胞への取り込みを促進するため、反応性リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標））をテストした。これらの実験条件で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）は細胞、特に分化後の細胞に極めて毒性があるようで、２４時間以内にその数を１０％という低さまで減少させた。したがって、その使用を中止した。
これらのＯＤＮのＡＣｈＥ活性を抑制する能力は、３種類の成育条件で別々にテストした。すなわち、（１）ＮＧＦを存在させない細胞の場合、（２）ＡＳ−ＯＤＮおよびＮＧＦの同時投与の場合、および（３）ＮＧＦによる２４時間分化後であり、表ＩＩＩは、テストしたＯＤＮのそれぞれについて、種々のＰＣ１２培養におけるＡＣｈＥ活性の抑制に対する有効性を示している。
対照のＯＤＮ処理未分化細胞におけるＡＣｈＥ活性は、未処理の細胞に比べ９および１０％低かった。７種類のＡＳ−ＯＤＮのうちの１種類、ｍＡＳ３は、未分化のＰＣ１２細胞におけるＡＣｈＥ活性を２０％以上抑制した（Ｐ≦０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テスト）（表ＩＩＩ、Ａ欄）。予想通り、ＮＧＦの添加後２４時間でＡＣｈＥ比活性の約１３％の増加が観察され、アセチルチオコリン加水分解濃度もこれらの条件下で７．８から９．０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／１０3細胞へ増加した。ＡＳ−ＯＤＮのＮＧＦとの同時投与は、変化はあるが明らかに有効な（１２〜２８％）抑制をもたらした。しかし、対照ＯＤＮで処理した細胞でも１６％の阻害が観察された。このことと、種々の培養における阻害値間の大きな変動は、ＡＳ−ＯＤＮの効果が、これらの条件下ではもともと、配列非依存性であることを示した。
１種類のＡＳ−ＯＤＮ、ｍＡＳ５だけが、同時処理条件下で対照の２倍を超える有意な（２８％、Ｐ≦０．０１）阻害をもたらした（表ＩＩＩ、Ｂ欄）。２４時間後、ＡＣｈＥ活性は、さらに１１．７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／１０3細胞へ増加した。湿重量ｍｇあたり１０6細胞で１０％がタンパク質と仮定すると、これは、１．２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質に等しく、Ｂｅｒｒｉ他（１９９５年）によって見出されたマウス脳皮質のホモジェネートにおける０．２２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質という比活性に比べかなり高い。興味あることに、この増加の顕著な部分は、ＮＧＦで２４時間前処理した細胞にＡＳ−ＯＤＮを加えたときに妨げられる。これらの細胞では、他の２種類のＡＳ−ＯＤＮ、ｍＡＳ１およびｍＡＳ４が、ＡＣｈＥ活性をそれぞれ２５％および３６％以上抑制し、これに対し対照ＯＤＮでは限られた抑制（１１％まで）であった（Ｐ≦０．０１）。
未分化のＰＣ１２細胞に有効なｍＡＳ３、およびＮＧＦおよびＡＳ−ＯＤＮの同時投与で有効なｍＡＳ５は、ＮＧＦ前処理細胞中のＡＣｈＥ活性をそれぞれ２１および２０％阻害した（表ＩＩＩ、Ｃ欄）。これらのうち、ｍＡＳ３は、ｍＡＳ５に比べ有意に有効であった（Ｐ≦０．０１対Ｐ≦０．０５）。
図７は、ＡＣＨＥｍＲＮＡ鎖に沿った標的配列の位置の関数として、ＡＳ−ＯＤＮそれぞれの有効性を示している。ＡＳ−ＯＤＮが標的としている配列位置に関するパターンは、未分化またはＮＧＦ前処理細胞のいずれにおいても、ＡＣＨＥｍＲＮＡ鎖およびＡＣｈＥ活性の抑制における有効性の範囲で検出されなかった。不活性なＯＤＮは、ＡＣｈＥ活性をまったく抑制せず、明らかに毒性のあるｍＡＳ２  ＯＤＮ、３種類の成育条件すべてで比較的効果のないＥ６を標的とした３’末端ＡＳ−ＯＤＮ（ｍＡＳ−７）であった。興味深いことに、ｍＡＳ５は、同時処理細胞（表ＩＩＩ、Ｂ欄）および一次培養の分化したマウスニューロン（Ｇｒｉｆｍａｎ他、１９９７年）で有効であるが、未分化のＰＣ１２細胞では比較的効果がなかった。ｍＡＳ４は、ＮＧＦ前処理細胞でＡＣｈＥ活性を３６％抑制したが、未分化細胞および同時投与条件のいずれにおいてもむしろ無効であった。
ＡＳ−ＯＤＮ処理細胞中のＡＣｈＥ活性の阻害が、酵素の触媒活性に対する被験オリゴのアプタマー効果に起因するという可能性をテストするため、精製した組換えヒトＡＣｈＥを、１％ウシ血清アルブミンおよび適切なＡＳ−ＯＤＮ１μＭを含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２４時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳのみでインキュベートしたＡＣｈＥ調製物と比較して触媒活性を測定すると、ｍＡＳ１、ｍＡＳ３、ｍＡＳ４、ｍＡＳ５、およびｍＡＳ６は３％を超えて触媒活性を変化させないことが証明された。
ＡＣｈＥの発現阻害についての独立した手段を得るため、ＮＧＦと２４時間前培養し、次いで、ｍＡＳ１、ｍＡＳ３、ｍＡＳ４、ｍＡＳ６、対照ＯＤＮ（ＡＳ−Ｂ）あるいはＯＤＮなしに予め２４時間インキュベートしたＰＣ１２細胞から、全ＲＮＡを抽出した。これらの細胞のＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ濃度は、ＰＣＲ増幅と結合する逆転写の速度論的追跡によって評価した（図８）。この半定量的分析は、類似の速度論（蓄積プロットの平行線）、ならびに対照細胞または対照ＯＤＮで処理した細胞ではなくＡＳ−ＯＤＮ処理細胞におけるＡＣｈＥ  ｍＲＮＡ濃度の減少を明らかに示した（蓄積曲線の右方シフトに反映されている）。さらに、同一の分析にかけた場合、アクチンｍＲＮＡ濃度は、これらすべての細胞培養で変化せず、有効なＡＳ−ＡＣＨＥ  ＯＤＮによるＡＣＨＥｍＲＮＡ減少の選択性を示している。
まとめると、ラットＡＣＨＥｍＲＮＡ（ｍＡＳ１およびｍＡＳ４）とハイブリッド形成するようにデザインされた７種類のＡＳ−ＯＤＮのうち２種類が、ＮＧＦで前処理したＰＣ１２細胞中のＡＣｈＥ活性を２５％以上抑制したが、細胞数には影響を与えなかった。これらは、未分化ＰＣ１２細胞およびＮＧＦ同時処理細胞のいずれにおいても有効ではなく、対照ＯＤＮと比べて有意にＡＣｈＥ活性を抑制することはなかった。これら２種類のＯＤＮは、選択的スプライシング型のＡＣＨＥｍＲＮＡのすべてに共通し、その高い有効性に関連する位置を占める因子であるエクソンを標的としている。対照的に、ｍＡＳ３およびｍＡＳ４（それぞれ、ΔＧ＝−４．７および−２．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に関し理論的考察によって予測された限定された二次構造、またはその低いＧ、Ｃ含有量（４０％）は、同様の性質を有する他のＡＳ−ＯＤＮ試薬（例えば、ＡＳ７）でかなり有効性が劣るように、アンチセンスの有効性にとって意義がないように見える。ＦＯＬＤＲＮＡプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ）は、ｍＡＳ４が、比較的ゆるやかと予想されるステムループ組成を有する領域を標的とすることを示している（表示せず）。しかし、ＮＧＦ前処理細胞でも有効なｍＡＳ１は、堅固に折りたたまれたステム領域を標的としている。さらに、この２．３ＫｂおよびｍＲＮＡで描かれた構造が生物学的に重要であるかどうか明らかではない。したがって、ＡＳ−ＯＤＮの特徴を表すために用いられる標準的な、いずれの物理的パラメータも、他のＡＳ−ＯＤＮと比べたｍＡＳ１およびｍＡＳ４の明らかな優位性を説明していない。
実施例の興味をそそる結果は、ニューロンが、その未分化の前駆体に比べＡＳ−ＯＤＮ阻害に対する感受性がかなり高いことである。この性質は、比較的効率の良いＯＤＮの取り込み、ニューロンのＲＮアーゼＨ活性の亢進、より進行した真実のＡＳメカニズムに対する感受性、またはこの３つすべての組合せを反映しているのかもしれない。対照ＯＤＮは、ＮＧＦで前処理したあるいはしなかったＰＣ１２細胞で同様に不活性であることから、始めの２つの可能性はやや少ない。このことは、ＯＤＮの取り込みまたは非特異的ＲＮアーゼＨ活性に差がないことを示唆した。同様に、第３の選択は、分化の種々の段階でニューロンに特異的なＡＳ−ＯＤＮ機能化のための異なるメカニズムを示している。この選択は、ＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞ではｍＡＳ４が最も効果的であるが、未分化のＰＣ１２細胞ではｍＡＳ３が最も効果的であるという知見によって支持される。ＡＳメカニズムの可能性は、ＮＧＦ刺激ＰＣ１２細胞においてＡＣｈＥ濃度が有意に増加するという事実にもかかわらず、これらの細胞における有効なＡＳ−ＯＤＮ抑制によってさらに支持される。これは、翻訳の亢進に起因するもので、それが、ＡＳ−ＯＤＮ媒介性破壊に対するＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの感受性を高めると考えられる。その前駆細胞と比べると、Ｐ１９胚のニューロン細胞系で見られ（ＣｏｌｅｍａｎおよびＴａｙｌｏｒ、１９９６年）、裏付けられているように、分化したニューロンにおけるＡＣＨＥｍＲＮＡの安定性の増加も考慮すべきである。しかし、未分化ニューロンにおける余り活性でないＡＣＨＥｍＲＮＡに比較すると、分化したニューロン中のＡＣＨＥｍＲＮＡは、ＲＮアーゼＨ攻撃に対し細胞タンパク質による保護が余りされていない。結局、ＮＧＦ前処理ニューロンにおけるＡＣｈＥ蓄積の明らかな阻害は、これらの細胞における活性酵素のより速いターンオーバーを反映しているのかもしれない。したがって、分化したニューロンではＡＣＨＥｍＲＮＡのターンオーバーが遅いにもかかわらず、ＡＳ−ＯＤＮがＮＧＦ処理ニューロンでより効率が良いのは、これらの細胞におけるＡＣｈＥ産生の強い亢進および速いターンオーバーで支持されるアンチセンスメカニズムによるものであろう。
エクソン６の３’領域を標的とするｍＡＳ７は、選択的スプライシングされたＡＣＨＥｍＲＮＡ転写物のすべてに共通な配列に対してデザインされたものに比べると、有意に有効性が劣った。これは、ＮＧＦが存在せず、同時処理条件下で分化誘発剤による２４時間処理後の場合であった。これは一般則ではない。対照的に、他のｍＲＮＡの３’領域を標的にするＡＳ−ＯＤＮは、全ｍＲＮＡ配列の破壊を効果的に誘発することが分かった（例えば、Ｂｅｎｎｅｔ他、１９９４年）。実際、Ｆａｌｋｌｅｒ他（１９９４年）による秩序だった研究は、ｍＲＮＡ中の標的配列の位置と関係なく、ＯＤＮの有効性を証明した。しかし、哺乳動物のＡＣＨＥｍＲＮＡはＧ、Ｃ塩基対が特に豊富である（ヒトＡＣＨＥ中６７％、Ｓｏｒｅｑ他、１９９０年）。したがって、堅固に折りたたまれているようである。エクソン２、３および４のみを有する切形ヒトＡＣＨＥｍＲＮＡは、ツメガエル胚で翻訳可能であることが見出されたことから（Ｓｅｉｄｍａｎ他、１９９７年）、Ｅ６−ＡＣＨＥｍＲＮＡが堅固に折りたたまれているため、３’エクソンに対するＲＮアーゼＨ作用がエクソン２、３および４の破壊をもたらさず、触媒活性なＣ末端切形タンパク質をコードするｍＲＮＡが残る可能性もある。
これらの知見は、標的細胞として分化したニューロン、およびＡＣＨＥ発現のいずれの場合にもいくつかのＡＳ−ＯＤＮに特異性があることを証明し、特定のＡＳ−ＯＤＮを用い、コリン作動性機能障害に関連する疾患またはコリン作動性発現の制御を必要とする疾患の治療でＡＣｈＥ濃度を抑制できることを示している。
実施例５
トランスジェニックマウスにおけるＡＳ−ＯＤＮのテスト
ヒトおよびマウスＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮを製造し、注射した（表ＩおよびＩＩを参照）。ＡＳ−ＯＤＮは、２種類の修飾のうちの１つで保護した。ａ）最後の３つのヌクレオチドのホスホロチオエート修飾（３’ホスホロチオエート化）またはｂ）ヌクレアーゼ抵抗性ループを作り出すためにデザインされた９塩基パリンドローム的配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）の３’への追加（３’ループ化）。これらの修飾の科学的基礎は、Ｅｈｒｌｉｃｈ他（１９９４年）に示される。
材料および方法
酵素活性の測定：脳半球を、皮質および皮質下領域に解剖し、液体窒素で冷凍し、使用するまで−７０℃に保存した。ＡＣｈＥ活性測定では、ガラス−ガラスホモジェナイザーを用い、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液１０倍量（ｗｔ／ｖｏｌ）中で抽出物を調製し、氷上で１時間インキュベートし、冷所で３０分間マイクロ遠心した。透明なホモジェネートを１：１０に希釈し、その１０μｌを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭジチオビス−ニトロ安息香酸、０．１ｍＭアセチルチオコリンを添加した最終容量２００μｌにして分析した。タンパク質定量は、市販の分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。酵素−抗原イムノアッセイは種特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ  １０１−１）を用いて行い、ホモジェネート中のヒト由来のＡＣｈＥを同定した。
ＲＮＡ抽出：ＲＮＡの分離は、ＲＮＡ−Ｃｌｅａｎ（商標）法（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｅ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。試料は、ＲＮＡ−Ｃｌｅａｎ０．８ｍｌ中で均質化し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移した。ホモジェネートにクロロホルム８０μｌを加え、４℃で５分間保存した。次いで、試料を１５分間遠心分離し、水相を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に採取した。イソプロパノール０．４ｍｌを、４℃で４５分間に加えた。次いで、ＲＮＡ沈殿を１５分間遠心分離し、７０％エタノール０．８ｍｌで１回洗浄した。
ＲＴ−ＰＣＲ増幅：ＲＴ−ＰＣＲは、ヒトＡＣｈＥおよびマウスＡＣｈＥ、ＣＨＡＴ、アクチンおよびシナプトフィジンに特異的なプライマーを用いほぼ記載（Ｂｅｅｒｉ他、１９９５年）通りに行った。サイクル反応は６９℃で行った。ＲＴ−ＰＣＲは、熱サイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）中で行った。それぞれの管の最終的容量は１０μｌで、ＲＮＡ試料２μｌ、ＤＤＷ  ３μｌ、ｄＮＴＰ（４ｍＭ）１μｌ、６量体（２．５μＭ）０．５μｌ、５Ｘ  ＰＣＲ緩衝液２μｌ、ＨＰＲＩ  ０．２５μｌ、ＤＤＴ（１００ｍＭ）１μｌおよびＲＴ酵素０．２５μｌから構成される。３７℃で４０分後、ＰＣＲ試薬４０μｌを加え、管内の総容量を５０μｌとした。ＰＣＲ試薬は、１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液４μｌ、ＤＤＷ  ３０．７５μｌ、プライマー（＋、１０μＭ）２．５μｌ、プライマー（−、１０μＭ）２．５μｌおよびＴａｇＤＮＡポリメラーゼ０．２５μｌで構成した。得られたＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色後、ＵＶ照射して視覚化した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ注射：静脈内（ｉ．ｖ．；尾静脈）、腹膜組織内（ｉ．ｐ．）、および脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）経路によりアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスジェニックマウスにｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための方法を開発した。これら種々の投与経路の妥当性をテストするため、１２〜１５日齢マウスを用い、これらは後の初期予防スキームのテストにも用いることができた。
ｉ．ｖ．：１２週齢ＡＣＨＥトランスジェニックマウスを短時間、暖房ランプの下に置き、０．１ｍｌ容量のＰＢＳ中のオリゴヌクレオチド５μｇ／ｇ体重を尾静脈に注射し、１８時間後に断頭死させた。
ｉ．ｐ．：マウスの腹膜組織内にオリゴヌクレオチド５μｇ／ｇ体重（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注射した。単回注射および連続注射いずれのプロトコルも調べた。連続投与の場合、２４時間間隔で３日間動物に注射した。最後の注射から１８時間後にマウスを致死せしめた。
ｉ．ｃ．ｖ．：１０〜１２日齢ＡＣＨＥトランスジェニックマウスの左外側脳室に、注射の正確性をモニターするためのマーカーとしてエバンスブルーを含むＰＢＳ中のオリゴヌクレオチド０．２〜０．４μｌ（５０〜２００μＭ）をｉ．ｃ．ｖ．により注射した。手術に関しては、エーテルで動物を麻酔し、頭皮を小さく切開した。２５ゲージの注射針で小さな穴を開け、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて注射を行った。１〜２時間の回復期の後、マウスを母親のところに戻し、注射後１８〜４０時間後に断頭死させた。脳を切り取り、小脳は廃棄した。
結果：表ＩＩに記載するように、生きた動物へのｉｎ  ｖｉｖｏ注射を含む６種類の実験を行った。
緩衝液、またはｈＡＣＨＥ（ＡＳ１１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１；ＡＳ１５００、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）またはｍＡＣＨＥ（ＡＳｍＥ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）を標的とするＡＳオリゴデオキシヌクレオチドをｉ．ｖ．で注射したマウスの皮質から得られたＲＮＡ（２００ｎｇ）を、本明細書中で前に述べたように、ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の半定量的速度論的追跡に供した。ｈＡＣＨＥ、ｍＡＣＨＥまたはシナプトフィジン（Ｓｙｎ）ｍＲＮＡを検出するため、特定のプライマーを用いた。ｃＤＮＡ産物は、サイクル２１〜３６の間に３サイクル毎に採取し、ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色に供した。サイクル２１〜３６から得た産物を、図２の左から右に示す。ｃＤＮＡ産物の最初の出現および／またはバンドの強度を、もとのｍＲＮＡ濃度の尺度とした。ｈＡＣＨＥに関しては、緩衝液を注射した対照に比べ、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理マウスのすべてで最初の２つのバンド（サイクル２７、３０）の強度が低いことに注意されたい。ｍＡＣＨＥに関しては、ＡＳｍＥ２処理マウスにおける産物の最初の出現が、緩衝液およびｈＡＳを注射したマウスに比べ、３サイクル遅れていることに注意されたい。対照のシナプトフィジンｍＲＮＡ濃度は、すべての試料で一致し、ほぼ同量のＲＮＡがそれぞれのＰＣＲ反応に導入されたこと、およびＡＳ−ＯＤＮは非配列依存性細胞毒性をもたらさなかったことを示している。
緩衝液またはＡＳオリゴデオキシヌクレオチドを注射されたマウス皮質におけるＡＣｈＥ活性のレベルは、図２のチャートで、ｎｍｏｌ加水分解基質／ｍｉｎ／ｕｇタンパク質で表す。ＡＳ１５００を注射された２匹のマウス皮質中のＡＣｈＥ活性に低下が見られた。図３に示すように、ｉ．ｃ．ｖ．によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの注射は、皮質下領域におけるＡＣｈＥ触媒活性の減少をもたらす。
ＡＳ−ＯＤＮ処理したヒトトランスジェニックマウスのいずれにも急性の毒性効果は認められず、すべての処理動物で行動は正常に見えた。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、同腹子のみで行った。ｈＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮはｈＡＣｈＥ−ｍＲＮＡおよびｍＡＣｈＥ−ｍＲＮＡ双方の濃度の減少をもたらし（図２）、二匹のうち一匹の動物ではタンパク質濃度を劇的に減少させた。ｍＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮは、一匹の動物でＲＴ−ＰＣＲ産物の出現に３サイクルの遅れをもたらした（ｍＲＮＡで約８倍の減少）。ｈＡＣｈＥ−またはｍＡＣｈＥ−ｍＲＮＡを標的とするＡＳ−ＯＤＮ  １００ｐｍｏｌｅ（約１ｕｇ）を１５日齢マウスにｉ．ｃ．ｖ．投与した場合、各群３匹のうち２匹のマウスが、注射後４０時間後に緩衝液を注入した動物で測定した平均活性を＞１Ｓ．Ｄ．下回る全ＡＣｈＥ活性を示した（図３）。
本明細書中の以下の実施例７および８と合わせた前記の結果は、ヒトトランスジェニックマウスモデルがヒトＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮの有効性をテストするモデルになることを証明している。
実施例６
哺乳動物の脳におけるアンチセンス−ＡＣＨＥ−ＯＤＮの有効性を評価するｅｘ  ｖｉｖｏシステムとして皮質海馬脳スライスが有用である
アンチセンス（ＡＳ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）療法の開発の第１段階が、脳内のヒトＡＣＨＥ遺伝子に向けられたことから、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）の異種細胞の集団において候補となるＯＤＮをスクリーニングする迅速で便利なモデルのあることが不可欠である。この目的のため、出願人は、ヒトＡＣＨＥ遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを含むマウスから得られる皮質海馬脳スライスを用い、電気生理学的、生化学的および分子分析を合わせた分析システムを確立した。
この分析では、マウスの脳スライス４００μＭを少なくとも１１時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ維持することができ、その後、もとのＰＣＲ増幅可能なＲＮＡおよび触媒活性なＡＣｈＥタンパク質を調製できる。さらに、脳スライスは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、細胞化学的活性およびＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの正確な位置および種々の脳領域におけるタンパク質発現を測定する免疫組織化学的染色を含む細胞組織化学的分析にも利用できる。このシステムを用い、出願人は、ＦＤＡが承認したはじめてのアルツハイマー病（ＡＤ）薬であるタクリン（ＴＨＡ、テトラヒドロアミノ−アクリジン、Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標））を含む種々のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害薬の投与が、特異的にＡＣｈＥをコードするメッセンジャーＲＮＡ濃度の亢進に付随するＡＣｈＥ活性の２倍の増加を誘発することを証明した。このＡＣｈＥ活性の上昇は、亢進したニューロンの興奮性を伴い、ニューロン活性に重要な追加遺伝子の発現の変化を伴う。
したがって、細胞培養システムに比べ、この皮質海馬脳スライスは、少なくとも部分的に変化のない多くの本来のコリン作動性シグナリング経路を維持しながら自然の周辺組織の中で、一次ＣＮＳニューロン上のＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性および作用機作を決定するための便利なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験と比べたこのアプローチの主な利点は、薬物の投与に関して脳組織への直接の接近を促進することにより、血液脳関門によって制約される技術的制限を克服していることである。さらに、単一のマウスから抽出した組織で多くの実験的分析が可能であり、この研究のために犠牲となる動物数を劇的に減らすことができる。
方法：脳スライスの調製のため、マウスをネンブタール（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、断頭する。９５％Ｏ2／５％ＣＯ2を絶えず通気しながら、氷冷したＮＳＲ緩衝液（１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１．２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2；ｐＨ７．４）中で、脳を除去する。Ｖｉｂｒｏｔｏｍｅ切片（４００μｍ）を調製し、通気したＮＳＲ緩衝液中に室温で維持する。さらに操作を行う前に、スライスを少なくとも１時間静置した。２片のスライスあたり少なくとも２．５ｍｌの緩衝液中のスライスを、通気した個別のビンに移し、阻害剤の添加に先立って、ＫＣｌ濃度を８ｍＭまで高めて細胞を過分極させた。
結果：コリン作動性機能亢進後のコリン作動性神経伝達の転写調節シャットオフ：急性ストレス反応の間、中枢のコリン作動性経路は十分活性化されている。コリン作動性機能亢進の分子的結果を調べるため、正常ＦＶＢ／Ｎマウスを強制泳ぎストレス法を受けさせ、皮質海馬脳スライスをコリンエステラーゼ阻害薬に暴露し、それによる脳遺伝子の発現の変化を調べた。ｉｎ  ｖｉｖｏストレスおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＣｈＥ阻害のいずれも、古典的なシナプス型酵素に比べて大きな細胞間接近能を伴い、可溶性親水性ＡＣｈＥをコードする「リードスルー」ＡＣｈＥｍＲＮＡの急激で特異的な増加を刺激した。
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、抗ＡＣｈＥピリドスチグミンを注射したマウスから得られた脳切片中の皮質層２、３、４および５内の細胞体および錐体ニューロンの尖端プロセスに「リードスルー」ＡＣｈＥｍＲＮＡ転写物を示したが、これに対し対照動物から得た層２および層５のニューロンに位置する細胞体中の標識はより限られていた。ＡＣｈＥｍＲＮＡ濃度の増加は、５時間以内に海馬および皮質における触媒活性酵素の３倍にのぼる濃度増加を誘発したが、小脳ではそのようなことはなかった。ストレスによって亢進するＡＣｈＥ活性には、不均一性の増加および非変性ゲル電気泳動における全体的な移動の速さという特徴があった。対照的に、ストレスおよびＡＣｈＥ阻害は、ＣｈＡＴｍＲＮＡ濃度の顕著な減少を刺激し、アセチルコリン合成の抑制およびアセチルコリン加水分解の亢進からなる二方性機構が働き、急性の機能亢進後にコリン作動性神経伝達がシャットダウンされたことを示唆している。いずれの処理も、ニューロン興奮性を示すｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡ濃度の増加をもたらしたが、シナプトフィジン−ｍＲＮＡ濃度にはなんらの変化も観察されず、この「コリン作動性」フィードバック反応の選択性を証明した。ＡＣｈＥ阻害薬で処理した脳スライスでは、ニューロン興奮性、パルス対促進性が増加し、ｍＲＮＡの変化はＢＡＰＴＡ−ＡＭおよびテトロドトキシンの双方で阻害を受けたが、これは、これらのプロセスが、細胞内のＣａ++および／またはＮａ+流入の増加によって媒介されていることを示している。
これらの実験は、ＡＣＨＥ遺伝子発現の変化をモニターする際の脳スライスシステムの有用性、およびＡＳ−ＡＣＨＥ−ＯＤＮの有効性の検討における新規なモデルとしてのＡＣＨＥトランスジェニックマウスの有用性を証明している。
ＡＣｈＥ発現のタクリン誘発上昇：
タクリンは、強力で可逆性のＡＣｈＥ阻害薬で、軽度から中等度に罹患したＡＤ患者の３０〜５０％で認識症状を軽快させる。ＤＦＰまたはピリドスチグミンなどの不可逆な阻害薬が、ＡＣｈＥ濃度を上昇させるフィードバック経路を含むコリン作動性経路に関係する遺伝子発現の永続的変化を誘発するという観察は、タクリンも同様な反応を誘発することを示唆していた。この可能性を調べるため、タクリンを、５×１０-7Ｍの濃度で７５〜９０分間、脳スライスに適用し、界面活性剤抽出物におけるＡＣｈＥ活性を調べた。これらの条件で、対照の未処理スライスの測定値を２６〜１８６％上回るＡＣｈＥ活性が観察された。
これらの観察は、ＡＣｈＥ遺伝子発現の検討における皮質海馬脳スライスの有用性を高め、感度の良い、短時間フレームモデルにおいて、ＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのＡＣｈＥ生合成抑制における有効性を検討する場合にタクリンを用いることを提供している。さらに、ＡＤ治療に対する今日のコリンエステラーゼ阻害薬アプローチの代替法を見出すことの重要性を強調している。
実施例７
社会探検または味覚に基づく記憶テストにおけるｈＡＣＨＥトランスジェニックマウスの欠損反応
社会探検：
かつて、出願人は、コリン作動性脳ニューロン中のヒトアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を発現するトランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスが、空間的学習および記憶に関するＭｏｒｒｉｓ水迷路で欠損機能のあることを証明した（Ｂｅｅｒｉ他、１９９５年）。１月齢のトランスジェニックマウスは対照マウスと同様の能力を示すが、６〜８月齢になるとトランスジェニックマウスの機能に進行性の悪化が観察され、その時点で、すべての仕事を行うのが困難になる。神経病理学的分析と合わせ（Ｂｅｅｒｉ他、同上）、これらの知見は、後期発現の進行性認識欠損をもたらす慢性コリン作動性不均衡、すなわちアルツハイマー病に関連するコリン作動性欠損の新規なモデルを示しているように見える。しかし、最近の研究は、約２週齢からのＡＣｈＥトランスジェニックマウスにおける重度の視覚障害を明らかにした。Ｍｏｒｒｉｓ水迷路における反応は、主に視覚的手がかりによるものであり、このモデルが有効であるとするためには、変化していない視覚組織を要求しない学習／記憶例を用いる追加の検討を行うことが重要になった。
実験的アプローチ：視覚機能に依存しないアプローチによってＡＣｈＥトランスジェニックマウスで観察される進行性の認識欠損を検討するため、社会探検のテストにおけるこれらのマウスの行動を観察した。テストには、未知の幼若動物に、トランスジェニックまたは対照のマウス成獣を対面させることが含まれる。約２４０秒続く臭いかぎの臭覚反応を始める。幼若マウスを引き離し、次いで、直ちに対面させたとき（二度目の出会い）、臭いかぎの時間は約８０秒に短縮する。これは記憶を働かせるテストであり、トランスジェニックマウスおよび対照マウスの双方で同様に見られる。二度目の出会いの際に別の幼若マウスに置き換えると、約２００秒の臭いかぎを行い、「同一」および「異なる」という探検の間に明らかな区別を示す。
１０分後、対照成獣マウスは、認識するのに１５０秒を必要とする。２０分後には、２００秒を必要とし、３０分後には、まるで同一のマウスを知らなかったように同じ儀式をすべて繰り返す。トランスジェニックマウスの場合には、１０分間という短時間後でさえ、「同一」を「異なる」として扱い、この行動における明らかな欠損を示す（図９Ａ）。
タクリンの効果
この短期行動は、コリン作動性経路に依存することが文献に記載されており、コリンエステラーゼ阻害薬が探検記憶を延長すると強調している。実施例６に示すように、タクリンは、ＡＣｈＥ発現の上昇を誘発することから、このテストに用い、ｈＡＣｈＥトランスジェニックマウスに対するタクリンの効果をテストした。図９Ｂに示すように、タクリン１ｍｇ／ｍｌのｉ．ｐ．注射は幼若（６週齢）トランスジェニックマウスにおいて短期記憶を２０分まで延長した。
この実施例は、ｈＡＣｈＥトランスジェニックマウスが、しばらくの間抗コリンエステラーゼ療法に少なくとも部分的に反応するコリン作動性機能不全としてトレースできる進行性認識欠損に罹っているという追加のデータを提供する。さらに、社会探検テストは、ヒトＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む抗コリンエステラーゼ療法の有効性を調べる比較的簡単で、迅速なテストを提供する。
味覚嫌悪記憶
社会探検テストとは異なり、味覚嫌悪は、学習および長期記憶の欠損を区別するためにデザインする。非トランスジェニックおよびトランスジェニックマウス（群あたり１０匹のマウス）群、食塩水を注射する対照群を構成した。マウスを２０時間、のどが渇く状態におき、次いで、サッカリンで甘みを付けた水を飲ませた。マウスは、２ｍｌを飲んだ（体重の約１０％）。３０分後、めまいの原因となる塩化リチウム溶液を注射した。３日後、サッカリンチャレンジで、学習および短期記憶をテストした。全般に、マウスは１．２ｍｌだけ飲み、この甘い味がめまいを引き起こすことを学習および記憶していた。次いで、塩化リチウムにより２回目の条件付けを行った。この時点まで、対照およびトランスジェニックマウスとも同じ反応をした（図１０）。
長期記憶をテストするため、初回のチャレンジおよび条件付けをした後、週１回で数週間、マウスにサッカリン水を与えた（リチウムは与えない）。対照マウスは、数週間の間、それまでより少なく飲み続け、長期記憶を示した。しかし、トランスジェニックマウスは、徐々に忘れ、一カ月未満の間に全量を飲むようになった（図１０）。
味覚嫌悪の経験を安定化するのに必要な対照記憶機能は、トランスジェニックマウスで障害を受けているコリン作動性機能に依存する。
実施例８
社会探検テストにおけるＡＳ−ＯＤＮのトランスジェニックマウスに対する効果
社会探検の学習および記憶テストにおけるＡＣＨＥトランスジェニックマウスの反応改善を促進し、行動の変化とＡＣｈＥタンパク質および／またはＲＮＡ濃度の変調を関連付ける、ＡＣｈＥｍＲＮＡを標的とする２−Ｏ−メチルＡＳ−ＯＤＮの評価。この実験は、同一の結果で２回繰り返した。以下は、代表的な実験の１例の結果である。
方法：
カニューレ挿入：実験の約２週間前、５月齢ＨｐＡＣＨＥマウスの脳室に立体空間的にカニューレを埋め込み、回復期間中は単独で飼育した。
オリゴヌクレオチドおよびｉｎ  ｖｉｖｏ投与：マウスＡＣｈＥまたはＢｕＣｈＥを標的とする５ｍＭ  ２−Ｏ−メチル（最後の３つの３’ヌクレオチド）オリゴヌクレオチド（ＡＳｍＡＣＨＥ３−Ｍｅ；ｍＡＳ３；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１１またはＡＳｍＢＣＨＥ−Ｍｅ；ｍＡＳＢ）を、リン酸塩緩衝食塩水中の親油性トランスフェクション試薬ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１３ｍＭと混ぜ、最初の注射の前に３７℃で１５分間インキュベートした。２４時間間隔で２回、１〜２分間でＯＤＮ１μｌ（２５ｎｇ）をｉｃｖで注入した。マウスを社会探検テストにかけ、ＯＤＮの最終投与の２４時間後に致死せしめた。
配列：
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社会探検テスト：マウスを、ガラス製前面パネルのケージ中で４分間、未知の幼若マウスとともに置き、成獣マウスが幼若マウスと探検接触するのに要した時間を、観察者が記録した。「基準値」テストの終了後、幼若マウスをケージから取り出した。１０分後、同一の幼若マウスを再びケージに入れ、探検時間を記録した（「テスト」）。テスト：基準時間の比を「反応比」（ＰＲ）とした。ＰＲ＜１は「学習および記憶」を示す。
カニューレを挿入したマウスについて、ＯＤＮの初回投与前２４時間（ＰＲ１）および最終投与後２４時間（ＰＲ２）に社会探検を評価した。ＰＲ２：ＰＲ１を学習および／または記憶におけるオリゴヌクレオチド誘発改善の尺度とした。
生化学：動物を頸部脱臼により致死せしめ、脳を除去した。海馬および皮質をそれぞれの半球から切り離し、ドライアイスで冷凍して使用するまで−７０℃で保存した。低塩界面活性剤抽出物を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍ冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１：９ｗｔ／ｖｏｌ）中で調製し、アセチルチオコリン（１ｍＭ）の加水分解に基づいて比色定量によりＡＣｈＥ活性を定量した（本明細書中の前記参照、Ｅｌｌｍａｎ他、１９６１年）。タンパク質定量は、Ｌｏｗｒｙの定量に基づく、Ｂｉｏｒａｄの界面活性剤適合（ＤＣ）キットを用いて行った。
結果：
表４（実験）および５（対照）に結果を示す。抗コリンエステラーゼ療法に少なくとも部分的に反応するコリン作動性機能不全としてトレースできる進行性認識欠損（実施例７を参照）に罹っているＡＣｈＥ−トランスジェニックマウス。示されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３のＡＳ−ＯＤＮは、トランスジェニックマウスにおける反応を改善した。投与４８時間後、抗ＡＣｈＥ−ＡＳＯＤＮは、学習の改善を促進できる。ＡＣｈＥタンパク質濃度のＯＤＮ媒介性変調は投与の２４時間以内で可逆である。
本出願を通じ、米国特許を含む種々の出版物を引用または数字で参照している。出版物の全体は、以下に列挙する。本発明が関係する技術分野の状況をより詳しく記述するため、これら出版物および特許の開示のすべてを参照により本出願に援用する。
本発明は例示的方法で記述してきたので、用いた用語が、限定のためというより、むしろ説明のための言葉という性格を意図したものであることは理解されるであろう。
前記教示に照らして、本発明の多くの改変および変形形態が可能であることは明らかである。したがって、付属の請求の範囲内で、具体的に記載されている以外に本発明が実施できることは理解されるであろう。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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