(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、細胞増殖抑制活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
請求項２に記載のDNAを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を抗原とする抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞増殖抑制遺伝子、およびその遺伝子がコードするタンパク質、およびその遺伝子を用いた遺伝子検査方法に関するものであり、例えば医薬品の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に静止期(G0期)及び老化状態にある細胞は、細胞周期を離れた状態にあり、一切の増殖が停止した状態にある。その状態を維持するために、何らかの強力な増殖抑制因子が発現・機能している可能性が、以前より指摘されていた。
しかし、細胞周期における静止期の研究は遅れており、静止期特異的に発現誘導を受ける遺伝子の報告はごく僅かである。老化細胞特異的に発現上昇の認められる遺伝子に関しては、現在までに多数の報告があるが、その中には癌抑制遺伝子の候補である可能性が示唆されているものも含まれている。故に、老化という現象が、細胞癌化の重要な防御機構であるという考え方が定着しつつある。従って、静止期(G0期)或いは老化状態で特異的に発現が誘導される遺伝子群の中で、強力な増殖抑制因子として機能しているものが癌細胞では失われている可能性がある。その様な遺伝子群を単離することができれば、未だ研究のあまり進んでいない静止期の解明、並びに未知の癌抑制遺伝子の発見につながることが十分に期待できる。また、そのような細胞増殖抑制因子は、臨床的な視点で考えてみても、以下のような利点が挙げられる。▲１▼現在の癌治療の主流である化学、放射線治療等は、癌細胞のみならずその周囲の正常細胞までも損傷させてしまうため、患者への副作用が大きいことが大きな問題となっている。しかし、G0期特異的な増殖抑制因子の発現を促すという方法に基づいた治療法であれば、多くの癌細胞の増殖を抑制することで有効的であるということは言うまでも無く、もともと静止期にある周囲の正常細胞にはほとんど影響(副作用)を与えないという点での利点は大きい。▲２▼また、癌抑制遺伝子p53による遺伝子治療が既に行われていることからも、新規の癌抑制遺伝子の発見が新たな遺伝子治療や遺伝子診断に繋がっていく可能性は十分考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記のような利点が考えられるにもかかわらず、これまでG0期において特異的に発現する遺伝子については研究が進んでおらず、細胞増殖抑制遺伝子を特定することができなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な細胞増殖抑制遺伝子、その遺伝子がコードするタンパク質、およびその遺伝子を用いた遺伝子検査方法等を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、静止期或いは老化細胞においてmRNAとして発現されている遺伝子ライブラリーと、対数増殖期にある細胞においてｍRNAとして発現されている遺伝子ライブラリーとの間でサブトラクションを行い、ライブラリー中の各クローンを解析するという手法と、この手法に加え、２次差分化法による高効率差分化 cDNA ライブラリー作製技術を駆使することで、従来クローニングできなかった新規の増殖抑制因子をコードする遺伝子を単離し、その遺伝子の構造解析、その遺伝子がコードするタンパク質の性質、およびそのタンパク質に特異的な抗体による細胞内でのタンパク質の分布状態等を解析することにより、基本的には本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において少なくとも一個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、細胞増殖抑制活性を有するタンパク質、（２）配列番号１に記載のDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、細胞増殖抑制活性を有するタンパク質、（３）上記（１）または（２）のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA、（４）配列番号１に記載のDNAとハイブリダイズするDNAであって、細胞増殖抑制活性を有するタンパク質をコードするDNA、（５）上記（３）または（４）のいずれかに記載のDNAを含む組換えベクター、（６）上記（５）に記載の組換えベクターを保持する形質転換細胞、（７）上記（１）または（２）のいずれかに記載のタンパク質を抗原とする抗体、（８）配列番号８、上記（３）または（４）のいずれかに記載のDNA配列の一部を含むDNAをプライマー、プローブまたはマーカとして使用し、被検査用DNAとハイブリダイズさせることを特徴とする遺伝子検査方法に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
（１）ｃDNAライブラリーの作製
正常ヒト胎児由来細胞株（TIG-1）を培養し、血清飢餓法により静止期（G0期）に誘導したTIG-1細胞、対数増殖期（Log期）にあるTIG-1細胞、および継代培養により分裂寿命に達したTIG-1細胞（老化期または、senescence）におけるｃDNAライブラリーをそれぞれ作成する。なお、老化期(senescence)に関しては、TIG-1細胞を分裂寿命(約60〜70PDL)まで継代培養し続け、1) 老化細胞特異的な形態学的特徴(細胞の巨大化、扁平化、密度低下)を示していること、および2)老化特異的なβガラクトシダーゼ活性の検出により老化状態を確認できる。ｃDNAライブラリーは、以下の方法によって作製することができる。
【０００６】
上記の各期にある培養TIG-1のそれぞれからTotalRNAを抽出しておき、そのTotalRNAをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムで処理することにより、Poly(A)+RNAを調整し、そのPoly(A)+RNAからｃDNAを作成後、さらにPCR法によってｃDNAを調整する。このｃDNAをベクターDNAに組み込んだ後、大腸菌ＤＨ１２Ｓ（GIBCO  BRL）に導入する。なお、このDNAが導入された大腸菌にヘルパーファージ（R408）を添加・培養することにより、一本鎖DNAを調整することができる。
【０００７】
（２）サブトラクションライブラリーの作製
サブトラクションライブラリーは、サブトラクションハイブリダイゼーション法を使用することにより作製できる。ここに、サブトラクションハイブリダイゼーションとは、二つの遺伝子ライブラリー間において、発現量に差のある遺伝子を得ることを可能にする方法であり、正常ヒト胎児由来細胞株（TIG-1）を培養中のG0期から抽出した mRNA を元にして、cDNAを合成し、この cDNA の両端にPCR用のリンカーを結合させた状態でPCRを行い、ベクターDNAに連結した後に、一本鎖（ss）DNAを調整可能な大腸菌株に導入しておく。この大腸菌株からサブトラクションに必要な量の一本鎖 cDNA を作製する（試料１）。
次に、前記のG0期とは別の時期（例えば、細胞増殖期（以下には、Log期と言うことがある。）または、老化期）から抽出した mRNA にビオチンを結合させたものを作製する（試料２）。
【０００８】
得られた２種類の核酸（試料１及び２）を混合させてハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジンを混合することにより、ビオチン化されたｍRNA（及びそのｍRNAにハイブリッドしたssｃDNA）と結合させる。その混合試料をフェノール／クロロホルム処理することにより、試料２と、試料２とハイブリッドした試料１とを除去する。
最終的に一本鎖のままで残っている cDNAから二本鎖DNAを合成し、大腸菌に導入することによりサブトラクションライブラリーを作製することができる。
【０００９】
（３）２次差分化法
２次差分化法は、ライブラリー中に含まれる各クローンのノザン解析を効率的に行うことを目的とした方法である。ノザン解析を行ったクローン(プラスミド)DNAの混合物を鋳型としてインサート由来のRNAを合成し、これを1本鎖DNAとハイブリした後、それらを有するssDNAを除去したライブラリーを作製する。この原理に従い、サブトラクション(1次差分化)ライブラリーにて解析を行った所定数のクローン(プラスミド)DNAを混合し、それらに含まれるインサート由来のRNAを合成後、ハイブリに使用できる。
【００１０】
（４）G0期特異的な細胞増殖抑制遺伝子のクローニング
差分化ライブラリーから適当数のクローンを任意に選択し、プラスミド、インサートDNAを回収した後に、そのインサートDNAをプローブとしてノザン解析を行う。その結果に基づいて、G0期特異的に発現している遺伝子を同定し、そのうちの一つの遺伝子（以下には、「TIGA1」と言うことがある。）について遺伝子の構造解析、TIGA1がコードするタンパク質の性質、およびそのタンパク質に特異的な抗体による細胞内でのタンパク質の分布状態を検討する。
【００１１】
（５）TIGA1遺伝子の構造解析
細胞または組織から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、TIGA1として同定されたDNAの配列の一部をセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして選択し、一次PCRを行う。また、一次PCRの反応溶液からPCRプライマーを除去した後に、さらにセンスプライマーとアンチセンスプライマー（一次PCRにて使用したアンチセンスプライマーよりも内側のもの）とを用いて二次PCR（nested PCR）を行うことにより、より高感度とすることができる。
また、ｍRNAからｃDNAを作製した後、そのｃDNAを鋳型として、TIGA1のDNAの配列の一部をセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして選択し、PCRを行うことができる。
ゲノムDNAおよびcDNAを用いたPCR法により、TIGA1遺伝子の全長ｃDNAおよび、ゲノムDNAにおける遺伝子構造を明らにする。なお、TIGA1遺伝子の塩基配列は、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定することができる。また、例えばABI社、Pharmacia社、島津社等の自動塩基配列決定装置等を用いることができる。また、遺伝子情報の解析には、例えばDNAsis配列解析ソフトウエア（日立）を使用することができる。
【００１２】
このようにして決定されるヒトTIGA1遺伝子のｃDNAの塩基配列を配列番号１に、また、TIGA1遺伝子によりコードされる TIGA1 タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、TIGA1遺伝子のゲノム中での塩基配列を配列番号８に示す。なお、本質的に本発明の遺伝子が TIGA1 タンパク質を発現し、細胞増殖抑制活性を備えている限り、そのタンパク質に含まれるアミノ酸配列又はその遺伝子の塩基配列の少なくとも１個（好ましくは１個又は数個）に欠失、置換、付加等の変異が生じたものであっても、本発明の技術的範囲に属する。
また、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。
【００１３】
（６）TIGA1遺伝子を含んだベクターおよびそのベクターを導入した形質転換細胞の作製
形質転換細胞の作製は、本発明の組み換えベクターを、その組み換えベクターを作製する際に用いた発現ベクターに適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、大腸菌（Escherichia coli) 、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の哺乳類細胞などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えDNAが宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18 等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、ＰL プロモーター、ＰR プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【００１４】
また、酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13 、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal1 プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNA3(INVITROGEN CORPORATION)等が挙げられる。TIGA1発現ベクタープラスミドを、例えばLipofectamine(GIBCO BRL社) を用いたリポソーム法にて細胞株に導入する。その後、ネオマイシンを含む選択培地にて約１ヶ月程度培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【００１５】
（７）TIGA1がコードするタンパク質に対する抗体の作製
TIGA1とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下、GSTという。）とをコードする遺伝子を連結させて、融合タンパク質を発現させるプラスミドベクター（例えば pGEX(Pharmacia社)）に組み込んだ後、そのプラスミドを大腸菌に導入し、その大腸菌にて目的とする融合タンパク質を発現させた後、精製したものを抗原として用い、公知の方法によってウサギに注射することにより抗血清を得ることができる。この抗血清から、アフィニティーカラムを利用して、TIGA1に対して特異的な抗体を精製することができる。
【００１６】
（８）TIGA1がコードするタンパク質の特性評価
TIGA1遺伝子がコードするタンパク質の特性を評価するためには、癌細胞株（例えば、肺癌細胞株であるEBC-1）にTIGA1遺伝子を組み込んだプラスミドを導入することにより行うことができる。使用するプラスミドとしては、例えばpcDNA3(INVITROGEN CORPORATION)等が挙げられる。TIGA1発現ベクタープラスミドを、例えばLipofectamine(GIBCO BRL社) を用いたリポソーム法にて癌細胞株に導入し、その細胞株を軟寒天中で培養し、コロニー形成能を判定することにより、TIGA1遺伝子の性質を評価することができる。また、個体においては、ヌードマウスを使用して造腫瘍性の検定を行うこともできる。
【００１７】
【実施例】
以下には、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例によって技術的範囲が限定されるものではない。
＜実施例１＞TIG-1(正常ヒト胎児由来2倍体繊維芽細胞)の培養
TIG-1(JCRB0501、20PDL)はヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入したものを用いた。コンフルエント〜セミコンフルエントとなったところで培地を除き、PBS(-)で洗浄後、0.05%トリプシン/ 0.02%EDTA /PBS(-)で細胞を剥がした。
これに培地(DMEM/10%FCS)を加え、細胞を懸濁し、滅菌チューブに移して遠心(室温、1000rpm、5min)した。上清を除き、再度PBS(-)に懸濁し遠心(室温、1000rpm、5min)した。上清除去後、培地(DMEM/10%FCS)によく懸濁して、直径60又は100mm dishにまいた。Split ratioは1:4又は1:8で、パッセージは5〜7日に一度行った。
70〜80%コンフルエントとなったところで対数増殖期(以後、Log期とする)由来のtotal RNAの調整を、以降のRNA調整のステップの通り行った。血清飢餓の実験には、継代数（PDL）が約40までの細胞を用いた。
【００１８】
＜実施例２＞細胞のβ-galactosidase活性の確認
細胞の老化状態を確認するために、βガラクトシダーゼの活性を検出した。
培地を除去後、PBS(-)で2回洗浄した。これに、培養皿(直径60mm)あたり5mlの0.25% Glutaraldehydeを加え、室温にて約5分静置し、細胞の固定を行った。1mM MgCl2の入ったPBS(-)で4回洗浄した後、5mlのSA-β-gal stain solution(1mg X-gal / 1mM MgCl2 / 0.12mM Potassium ferrocyanide[K4Fe(CN)6] / 0.12mM   Potassium ferricyanide [K3Fe(CN)6] / PBS(-) (pH 6.0)を加え、37℃で一晩保温した[CO2(-)] 。位相差顕微鏡にて細胞を観察することにより、老化状態を観察した。
【００１９】
＜実施例３＞TIG-1の血清飢餓培養
TIG-1が50〜60%コンフルエントとなったところで培地(DMEM/10%FCS)を除き、PBS(-)で2回洗浄後、これに培地(DMEM/0.5%FCS)を加え、細胞を培養した。静止期(以後、G0期とする)由来のtotal RNAの調整は、培地交換後、約96時間経過したものについて以降のRNA調整のステップの通り行った。
＜実施例４＞Total RNAの調整
以下には、二種類の調整法を掲げたが、適宜に適当な方法を使用してTotalRNAを調整した。
(1)CsTFA法
Total RNAはLog期 、G0期及び老化期（以降、「senescence期」と言うことがある）状態のTIG-1細胞について、それぞれ培養皿(直径100mm)100、200及び60枚分の細胞を用いて調整した。
各状態の細胞について、培地を除去し、PBS(-)で2回洗浄して死細胞や残査血清を除いた後、培養皿に直接0.8〜1mlの5.5M GTC（Guanidinethiocyanate  64.9gと、Sodium citrate・2H2O  0.74gと、Sodium lauryl sarcosinate  0.5gとに滅菌MilliQ水を加えて100mlとし、室温保存した。使用直前に2-mercaptoethanol(2-ME)を1/71(終濃度0.2M)加えて使用した。）を加えることで細胞を溶かし、ラバーポリスマンにてビーカーにそれぞれ回収した。30ml注射筒に18G注射針を付け、溶液を2個の乾熱滅菌済のビーカーの一方から他方へ移す要領で、溶液の粘性が減るまで数回注射針を通過させてDNAを細断した。遠心により細胞破片を除き、上清22〜23mlをオートクレーブ済みのポリアロマーチューブ(BECKMAN；40ml容 )に入れたCsTFA溶液（CsTFA (D=2.01；Pharmacia)  100mlと、0.5M EDTA(pH 7.0)  39.5ml (終濃度 100mM)とに滅菌MilliQ水  58.15mlを加えて使用した。4℃にて保存した。）15ml上にそっと重層した。超遠心(17℃、25000rpm、24時間)後、上清を静かに除き、沈澱を600μlの4M GTC溶液（5.5M GTC溶液  4mlと、滅菌MilliQ水  1.5mlと、2-ME  56μlとを加えて使用した。室温にて保存した。）にピペッティングにより溶解した。これをエッペンドルフチューブに移し、遠心(4℃、15000rpm、30sec)して不溶物を沈澱させた。上清600μlあたり15μlの1M酢酸、450μlのエタノールを加えvortexし、-20℃で3時間以上氷冷した。遠心(4℃、15000rpm、10min)して上清を除き、沈澱を330μlのTE（10mMTris・HCl(pH8.0)/1mMEDTA(pH8.0)をフィルター(孔径0.22μm；MILLIPORE)滅菌後、更にオートクレーブ滅菌した。-20℃で保存した。）に溶かした。遠心(4℃、15000rpm、30sec)して不溶物を沈澱させ、上清330μlあたり33μlの2M NaCl、990μlのエタノールを加え、vortexした。-20℃で3時間以上氷冷した後、遠心(4℃、15000rpm、10min)し、沈澱を直前に調整した70%エタノールで洗浄した。上清を完全に除き、得られたRNA沈澱をTEに溶解した。これは-80℃に保存しておいた。
【００２０】
(2)AGPC法
Log期 、G0期及びsenescence期のTIG-1細胞について、1×106細胞あたり1.6mlのsolution D（Guanidinethiocyanate  50gと、0.75M Sodium citrate(pH 7.0)  1.52mlと、10% Sodium lauryl sarcosinate  5.28mlとに滅菌MilliQ水を加えて100mlとし、室温保存した。使用直前に2-MEを1/142(終濃度0.1M)加えて使用した。）を加え、ピペッティング、vortexにより細胞を溶かした。ソニケーションによりDNAを細断後、遠心(4℃、15000rpm、30sec)して不溶物を沈澱させた。上清を500μlづつ3本のエッペンドルフチューブに移した。500μlあたり50μlの2M NaOAc(pH 4.0)、500μlの水飽和フェノール（65℃で溶解させたフェノール100gに、100mlの滅菌MilliQ水と0.1gの8-ヒドロキシキノリンを加え、スターラーで5分撹拌した。静置後水層を除去した。この操作を2〜3回繰り返すことで、水飽和状態とした。これは4℃にて遮光保存した。）、300μlのクロロホルムを加え、10秒間vortexした。氷上に15分放置した後、遠心(4℃、15000rpm、10min)した。
水層のみ採取し、等量のイソプロパノール約500μlを添加、vortex後、室温にて10分静置した。遠心(4℃、15000rpm、15min)によりRNAが沈澱するので上清を静かに捨て、Solution Dを100μl加え、沈澱を完全に溶解させた。これに100μlのイソプロパノールを加え、vortex後、-20℃にて30分静置した。遠心(4℃、15000rpm、10min)後、上清を捨て、150μlの70%エタノールにて洗浄した。遠心(4℃、15000rpm、3min)等によりエタノールを完全に除去後、30μlのTEを加え、沈澱を溶解させた。沈澱が溶けにくい場合は、更に適当量のTEを加え、沈澱を完全に溶解させた。
【００２１】
＜実施例５＞Poly(A)+RNAの調整
(1) オリゴ(dT)セルロースカラムの調整
0.2gのオリゴ(dT)セルロース(Type3；Collaborative Research)に20mlの滅菌MilliQを加え、室温で10分静置した。上清をデカンテーションにより除き、新たに10mlの滅菌水を加えた。この懸濁液をオートクレーブ済みのエコノカラム(直径0.6cm；Bio-Rad)に注ぎ込み、セルロースカラムの高さが約1cmになるようにした。滅菌水が流れ落ちた後、約8mlのTE/NaCl（TEと1M NaClを1:1の割合で混合した。-20℃にて保存した。）を加え、平衡化した。
(2) Poly(A)+RNAの調整
超遠心(CsTFA)法により得られたLog期、G0期とsenescence期由来のtotal RNAに等容のTE、及び2倍容の1M NaClを加え、総容量を約1mlとした。(1)で平衡化したカラムに全RNA溶液を加え、溶出してきた液を再度カラムに注いだ。溶出液をもう一度カラムに通した後、8mlのTE/NaClで洗浄した。0.5mlづつ6回に分けてTEをカラムに加え、poly(A)+RNAを溶出した。溶出液はすぐに氷上に置いた。各分画について2μlづつ、パラフィルム上で20μlのEtBr溶液(1μg/ml)と混合し、UVライト下で写真撮影した。RNAを含む分画250μlあたり50μlの2M NaCl、750μlのエタノール、1μlのGlycogenを加え、vortexした。-80℃のエタノール中で20分以上氷冷した後、遠心(4℃、15000rpm、15min)し、上清を静かに除いた。直前に調整した70%エタノールで洗浄し、遠心(4℃、15000rpm、5min)した後、上清をできるだけ除いた。30μlの5mM Tris・HCl(pH 7.5)に溶解し、一部をすぐにcDNAライブラリー作製に用いた。残りは-80℃で保存した。最終的にLog期、G0期とsenescence期について、それぞれ約49、55と12μgのpoly(A)+RNAを得た。
【００２２】
＜実施例６＞cDNAライブラリーの作製
cDNAライブラリー作製のスキームについて要約すると、次の通りである。まず、目的とするmRNAをNot I site等を有するリンカープライマーとアニーリング後、逆転写酵素によりFirst strand cDNAを合成する。次に、RNA鎖の分解と同時にSecond strand cDNAを合成し、T4 DNAポリメラーゼにより2本鎖cDNAの末端を平滑化した後、BamHI (Bgl II)-Sma Iアダプターを結合させる。これをNot Iで処理したものと、予めNot I/Bgl II処理を施しておいたpAP3neo ベクタープラスミドとの間でライゲーションを行う。その後、エレクトロポレーション法により濃縮大腸菌に導入するという方法でライブラリーを作製した。
Ａ．試験方法
(1) First strandの合成
Log期、G0期とsenescence期由来のPoly(A)+RNA7.5μl(4.5μg)をエッペンドルフチューブにとり、65℃で5分加熱した後、氷上で急冷し、変性させた。ここに2.5μlの10×First Strand Buffer(ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、2.5μlの0.1M DTT、1.5μlのFirst Strand Methyl Nucleotide Mixture(10mM dATP、dGTP、dTTP/5mM 5-methyl-dCTP；ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、1μlのリンカープライマー（5'-(GA)10ACGCGTCGACTCGAGCGGCCGCGGACCG(T)18-3'）(1.6μg/μl)、0.5μlのRNase Inhibitor(40U/μl；東洋紡)、8.5μlの滅菌MilliQ水を順に加えていった。室温に10分放置し、プライマーをアニーリングさせた。2μlの逆転写酵素(約20U/μl；生化学工業)を加え、ピペッティングにより混合し37℃で40分、反応させた。Superscript II RT(200U/μl；GIBCO BRL)を2μl加え、48℃で40分、さらに反応させた。遠心(4℃、15000rpm、5sec)後、氷上に置いた。
【００２３】
(2) Second strandの合成
氷上に置いた反応液に、20μlの10×Second Strand Buffer(ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、7.5μlの0.1M DTT、3μlのSecond Strand Nucleotide Mixture(10mM dATP、dGTP、dTTP/25mM dCTP；ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、132.5μlの滅菌MilliQ水(予め氷冷しておいたもの)を順に加えていった。氷上に5分置いた後、1.5μlのRNaseH(1.5U/μl；東洋紡)、6μlのE.coli DNA polymerase I(9U/μl；東洋紡)を加え(総容量約200μl)、16℃で150分反応させた。200μlのフェノール/クロロホルムを加え、vortex後、遠心(室温、15000rpm、7分)して上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。50μlの滅菌MilliQ水にて再抽出した後、クロロホルム処理を行った。50μlの滅菌MilliQ水にて再抽出した後、上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50；MILLIPORE)の上室にのせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000rpm、20min)した。下室のTEを除き、新たに上室に100μlのTEを加え、遠心(4℃、10000rpm、15min)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、30μlの1/10TEをフィルターの上室に加え、ピペッティングとvortexによりフィルターに付着したcDNAを溶かし出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000rpm、10sec)することでcDNA溶液を回収した。
【００２４】
(3) 2本鎖cDNAの末端平滑化
上述のcDNA溶液30μl(in 1/10TE)に、10μlの10×Second Strand Buffer(ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、5μlのblunting dNTP Mixture(KIT内のもの)、51.5μlの滅菌MilliQ水を順に加えた。ここに3.5μlのPfu DNA polymerase (2.5U/μl)を加え(総容量100μl)、軽くvortexした後、37℃で30分、反応させた。フェノール/クロロホルム処理を行い、100μlの滅菌MilliQ水で再抽出を行った。この後、クロロホルム処理を行い、100μlの滅菌MilliQ水で再抽出を行った。上清をミリポアフィルターにのせ、(2)の場合と同様にしてフリーのdNTPを除いた。最終的に20μlのTEに2本鎖cDNAを回収した。
(4) アダプターのライゲーション、Not Iによる切断
上記(3)で末端を平滑化した2本鎖cDNA 20μlのうち、4μlをとり、2μlの10×ligation buffer、2μlの10mM rATP、1μlのBam HI(Bgl II)-Sma Id(GATCCCCGGG)アダプター(0.35μg/μl)、10μlの滅菌MilliQ水を加えた。氷上に5分置いた後、1.5μlのT4 DNA ligase(4U/μl；東洋紡)を加え、ピペッティングにより混合した。8℃で24時間反応させた。70℃で30分加熱した後、遠心(4℃、10000rpm、10sec)して氷上に置いた。ここに27μlのNot I補充液（278mM NaCl/8mM MgCl2/1.8mM DTT/0.018% BSA/0.018% Triton X-100）、3μlのNot I(10U/μl；New England Biolabs社(以下、NEBと省略する。))を加え、ピペッティングにより混合した。37℃で90分保温し、Not Iで切断した。反応液に5μlの10×STE（1M NaCl/0.1M Tris・HCl(pH 8.0)/10mM EDTA(pH 8.0)）、5μlのtRNA(2μg/μl)を加え(総容量60μl)、10μlづつスピンカラム(CHROMA SPIN-400；Clontech)に加えた。遠心(BECKMAN J6-HC；4℃、2100rpm［700g]、5min)後、等量のフェノール/クロロホルムを加え、vortexした。これを遠心(室温、15000rpm、2min)後、上清を新しい0.6mlチューブに回収した。これに等量のクロロホルムを加え、vortexした後、遠心(室温、15000rpm、2min)により上清を回収した。これに4μlの5M NaCl、100μlのエタノールを加え、vortex後、-80℃に2〜3時間静置した。
【００２５】
(5) ベクターへのライゲーション
遠心(4℃、15000rpm、15min)後、上清を注意深く除き、直前に調整した100μlの70%エタノールを加えて再度遠心(4℃、15000rpm、7min)した。上清を注意深く除き、cDNAの沈殿に3μlの10×ligation buffer、3μlの10mM ATP、22μlの滅菌MilliQ水、1μlのベクター(pAP3neoをNot Iで切断後、BAP処理し、その後Bgl IIで切断したもの、1μg/μl)を直接加えた。氷上に5分置いた後、1μlのT4 DNA ligase(4U/μl；東洋紡)を加え、ピペッティングにより混合した。12℃で40時間、反応させた。70℃で30分加熱した後、遠心(4℃、10000rpm、10sec)し、70μlのTEを加えた。フェノール/クロロホルム処理を行い、50μlのTEで再抽出を行った。上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50)の上室にのせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000rpm、20min)した。下室のTEを除き、新たに上室に100μlのTEを加え、遠心(4℃、10000rpm、15min)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、30μlのTEをフィルターの上室に加え、ピペッティングとvortexによりフィルターに付着したDNAを溶かし出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000rpm、10sec)することでDNA溶液を回収した。これは、-20℃で保存しておいた。
【００２６】
(6) 大腸菌への導入
上記(5)で調整したライゲーション液のうち約15(5×3)μlを、エレクトロポレーション用濃縮大腸菌DH12S (GIBCO BRL) 150(50×3)μlに導入した。エレクトロポレーションはLog期、G0期とsenescence期のそれぞれについて、各5μlづつ3回に分けて行った。2mlのSOC培地(2ml×3本、計6ml)中、37℃で1時間、激しく振とう培養した。これを全て、アンピシリンを含む500mlのLB培地（Bacto-tryptone  10g、Bacto-yeast extract  5g、NaCl  10gにH2O  1000mlを加えて溶解し、10N NaOH  0.1mlを加えたもの。オートクレーブ滅菌の後、室温に保存した。）(3Ｌの三角フラスコ内)に移し、よく混合し、10、100μlをとってそれぞれアンピシリンを含むLBプレートにまいた。37℃で終夜培養し、titerを測定した。残りの培養液は37℃で激しく振とう培養した。約6時間後、200mlの培養液を新しい3Ｌの三角フラスコに移し、5mlのヘルパーファージ(R408)を加え37℃にて終夜培養した。残りの300mlの培養液については、そのまま終夜培養を行った。ヘルパーファージを加えた200mlの培養液については、1本鎖DNA(ssDNA)の調整を引き続き行った（後述する）。300mlの終夜培養液については、約275mlからプラスミド抽出キット(QIAGEN Maxi)を用い、総プラスミドを調整した。残りの約25mlについては、DMSOを7%となるように添加し、液体窒素中で保存した。
(7) Titerの測定、インサート分布の検査
Titer check用プレート上のコロニーをカウントし、各ライブラリーのtiterを算出した。また、Log期、G0期とsenescence期の各プレート上の任意の約20クローンについて、制限酵素処理(Eco RI/Kpn I)により、インサートサイズの分布を調べた。
【００２７】
Ｂ．試験結果
(1) Log期については、DMEM/10%FCSにて通常培養を続け、約30〜40PDLとなったTIG-1細胞(100mm dish×100枚分)について、70〜80%コンフルエントの状態からpoly(A)+RNAを回収し、続いてライブラリーを作製した。
(2) G0期由来のpoly(A)+RNAを回収するにあたっては、DMEM/10%FCSにて通常培養を続け、約30〜40PDLとなったTIG-1細胞について、培地をDMEM/10%FCSからDMEM/0.5%FCSに置換(血清飢餓)するという方法を適用した。従って、TIG-1細胞では、血清飢餓状態においてから約何時間後に増殖停止状態となっているかの条件設定を行うことが必要となった。そこで、増殖停止状態において、特異的に発現が上昇するものとしてgas-1遺伝子(マウス由来NIH3T3細胞にて)が既に報告されていたので、これをコントロールとすることとした。具体的な方法は、以下の通りである。まず、TIG-1細胞を血清飢餓状態とし、0,24,48,72,96,120,144時間後の各細胞からtotal RNAを回収した。これを元にノザンフィルターを作製し、PCRにてクローニングしたヒトgas-1遺伝子をプローブとし、ノザン解析を行った。結果的には、ヒトにおいてはgas-1の発現量はLog期とG0期の状態で顕著な差が認められず、これを指標として条件設定を行うことは困難であった(データは示していない)。静止期にて発現が上昇する様なポジティブコントロールとしては、他に適切なものがなかったため、逆に発現量が低下するようなネガティブコントロールを用いることで条件決めを行った。ネガティブコントロールとしてMCM 2〜7を使用し、同様にノザン解析を行った結果、TIG-1細胞では約96時間(4日)後に増殖停止状態に至っていることが確認された。従って、G0期由来のpoly(A)+RNAを同条件にて回収し、cDNAライブラリーの作製を行うこととした。なお、血清飢餓状態においたTIG-1細胞では、Log期の状態にある細胞と比べ、total RNAの回収量が約半分となってしまうことが条件設定の実験から経験的に分かっていたので、100mm dish×200枚分(Log期の2倍)の細胞からRNAを回収した。
【００２８】
(3) 結果としては、TIG-1細胞を約63PDLまで継代培養した時点でほとんど増殖停止していた。この時点において、上記の老化細胞特異的な形態学的特徴が観察された（データは示さない）。また、SA-β-gal stainingを行った結果、ネガティブコントロールのTIG-1(Log期)やHeLa S3細胞ではその活性が認められず、老化状態にあると思われた細胞のみに特異的であった。従って、senescence期由来のpoly(A)+RNAを同条件にて回収(結果的に、約100mm dish×60枚分)し、cDNAライブラリーの作製を行った。
【００２９】
以上の方法により各ライブラリーの作製を行った後、1) Titer測定用のプレート上のコロニー数をカウントすることより複雑度を、2) 任意の約20クローンについて、EcoRI/Kpn I処理によりインサート率及びその平均長を調べた結果を図１および表１に示した。
【表１】
0004567140.tif 000002
Log期における cDNA libraryの複雑度がやや低かったが、インサートの挿入率等に関しては何ら遜色はなく、これらのライブラリーを用いて以降のサブトラクションに使用した。
【００３０】
＜実施例７＞1本鎖DNA(ssDNA)の調整
200mlの培養液（Bacto tryptone  16gと、Bacto yeast extract  10gと、NaCl  5gとに水を加えて１Ｌとし、オートクレーブ滅菌したもの。）を新しい3Ｌの三角フラスコに移し、5mlのヘルパーファージ(R408)を加え37℃にて終夜培養後、培養液を滅菌ガラスチューブに移し、遠心(4℃、10000rpm、5min)して大腸菌を沈殿させた。上清を注意深く新しい滅菌ガラスチューブに移し、再度遠心(4℃、10000rpm、10min)した。上清を滅菌フィルター(孔径0.22μm；MILLIPORE)に通し、大腸菌を完全に除いた。25mlの上清あたり2.5mlの10×DNase buffer（0.1M Tris・HCl(pH 7.5)/0.1M MgCl2）、1μlのDNase I(20U/μlに希釈したもの；ニッポンジーン)を加え、37℃で30分反応させた。1/4容量の20% PEG(MW=6000)/2.5M NaClを加えてvortexし、滅菌ガラスチューブに移した。室温に20分置いた後、遠心(4℃、10000rpm、10min)し上清を除いた。再度遠心(4℃、10000rpm、5min)し、イエローチップを用いて上清を除いた。さらにもう一度遠心(4℃、10000rpm、1min)し、先細のチップを用いて上清を完全に除いた。得られたファージの沈殿を、総容量で400μlのTEに溶解し、25μlのproteinase K(2μg/μl  in  20%glycerol)、4μlの10% SDS(SDS 100gを900mlのH2Oに溶かし、数滴の濃塩酸を加えてpHを7.2に合わせた後、全体を1Ｌにしたもの。50〜100mlずつ分注して室温保存した。)を加えて42℃で1時間、反応させた。フェノール処理、フェノール/クロロホルム処理(5〜6回)、クロロホルム処理の後、エタノール沈殿を行った。70%エタノールで洗浄後、得られたssDNAを20〜30μl のTEに溶解した。このssDNAは、-20℃で保存した。
【００３１】
＜実施例８＞サブトラクションライブラリー（一次差分）の作製
Subtracted cDNA library作製のスキームは、図２に示した通りである。要約すると、まず作製した2本鎖cDNA library (G0期)から1本鎖cDNA library (G0期)を作製し、これとTIG-1(Log期)由来のpoly(A)+RNAをビオチン化したものをハイブリさせた後、ストレプトアビジンを添加する。ビオチン-ストレプトアビジン複合体(G0期とLog期の両者に共通して存在するもの)は、以降のフェノール／クロロホルム処理により有機層にトラップされ、ビオチン化RNAと複合体を形成しなかったもののみが、水層に回収される。この原理に従って、静止期にのみ特異的に存在する遺伝子を有するssDNAを回収する。これから、再度、2本鎖DNAを合成し、エレクトロポレーション用濃縮大腸菌に導入してサブトラクションライブラリーを作製した。
【００３２】
Ａ．試験方法
(1) Poly(A)+RNAのビオチン化
Log期由来のpoly(A)+RNA 10μgをエッペンドルフチューブにとり、滅菌MilliQ水を加えて容量を20μlとした。ここに10μlのPHOTOPROBE Biotin（0.5mgのPHOTOPROBE Biotin(Vector Laboratories)に、0.5mlの滅菌水(-20℃保存しておいたもの)を暗所で加え、溶解させたもの。）(1μg/μl)を暗所で加え、ピペッティングにより混合した。エッペンドルフチューブの蓋を開けて氷上に置き、約10cmの高さから水銀ランプ(アイセルフバラスト、BHRF160WH；岩崎電気)で20分照射してビオチン化を行った。70μlの0.1M Tris・HCl(pH 9.5)/1mM EDTAを加え、100μlの水飽和ブタノールを加えてvortexした。遠心(4℃、15000rpm、5min)後、上層(ブタノール層)を除いた。この操作をあと2回繰り返した。水層に100μlのクロロホルムを加えてvortexし、遠心(4℃、15000rpm、5min)後、水層を新しいエッペンドルフチューブに移した。クロロホルム抽出をもう一度行った後、水層に1/10容の3M NaOAc(pH 5.2)、3倍容のエタノール、1μlのglycogenを加えてvortexし、-80℃で30分以上置いた。遠心(4℃、15000rpm、15min)して上清を除き、RNAの沈殿が薄くオレンジ色をしていることを確認した。直前に調整した70%エタノールで洗浄した後、沈殿を20μlの滅菌MilliQ水に溶かした。ここに再度10μlのPHOTOPROBE Biotin(1μg/μl)を暗所で加え、上記の操作を繰り返した。cDNAとのハイブリダイゼーションまで、エタノール沈殿の状態で-80℃に置いた。
【００３３】
(2) cDNAとPAB-RNA(ビオチン化RNA)のハイブリダイゼーション
上記(1)で調整したPAB-RNA 5μg分を遠心(4℃、15000rpm、15min)により回収し、70%エタノールで洗浄後、上清を除き8μlの滅菌MilliQ水に溶かした。ここに、12.5μlの2×HB(脱イオンホルムアミド400μl、1M HEPES(pH 7.5)50μl、0.5M EDTA(pH 8.0)2μl、10% SDS 10μlおよび滅菌MilliQ水 38μlを混合したもの。)、2.5μlの2M NaCl、1μlのpoly(A) (1μg/μl；Pharmacia)、及び1μlのssDNA(0.5μg/μl；G0期由来のcDNAライブラリー)を加え、総容量を25μlとした。65℃で10分加熱した後、速やかに42℃のヒートブロックに移した。2〜3晩(42時間以上)、ハイブリダイゼーションを行った。
(3) ssDNAの回収、再ハイブリダイゼーション
サンプルをエッペンドルフチューブに移し、400μlのSB(1M HEPES(pH 7.5)50μl、0.5M EDTA(pH 8.0)4μl、2M NaCl  250μl、滅菌MilliQ水 696μlを混合したもの。)を加えてピペッティングで混合した。5μlのStreptavidin(2μg/μl；GIBCO BRL)を加え、ピペッティングで混合後、室温に5分置いた。フェノール/クロロホルム処理を行い、上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。100μlのTEで再抽出した後、水層に5μlのStreptavidin(2μg/μl)を加え、ピペッティングで混合後、室温に5分置いた。フェノール/クロロホルム処理を2回行い、クロロホルム処理を1回行った。水層をミリポアフィルター(UFCP3TK50；MILLIPORE)の上室にのせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000rpm)した。下室のTEを除き、新たに上室に300μlのTEを加え、遠心(4℃、10000rpm、20min)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、30μlの1/10 TEをフィルターの上室に加え、ピペッティングとvortexによりフィルターに付着したssDNAを溶かし出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000rpm、10sec)することでssDNA溶液を回収した。これを真空乾燥し、滅菌MilliQ水で調整して9μlとした。(1)で調整したPAB-RNA 3μg分を遠心して回収し、70%エタノールで洗浄後、上清を除き、上記のssDNA溶液9μlを加えた。ここに12.5μlの2×HB、2.5μlの2M NaCl、1μlのpoly(A) (1μg/μl)を加え、上記(2)の場合と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
【００３４】
(4) ssDNAの回収、2本鎖DNAの合成、大腸菌への導入
上記の様にしてPAB-RNAと2回ハイブリダイゼーションを行ったcDNAについて、上記(3)の方法に従いssDNAを回収した。30μl(in 1/10 TE)のssDNA溶液のうち15μlを以降の2本鎖DNA合成に使用し、残りは-20℃に保存した。ssDNA15μlに、14μlの滅菌MilliQ水、1μlの5'-APプライマー(塩基配列は、5'-GGAAGTGTTACTTCTGCTCT-3'である。0.2μg/μl、リン酸化済みのもの)を加え、65℃で10分加熱した。室温に5分置いてプライマーをssDNAにアニーリングした後、5μlの10×buffer(Bca BEST Dideoxy Sequencing Kit[宝酒造] 内のもの)、10μlの1mM dNTP mixture、0.5μlのSSB(3μg/μl)、2μlのBca BEST DNA polymerase(2U/μl；宝酒造)、3μlの滅菌MilliQ水を加えた。65℃で1時間反応することにより2本鎖DNAを合成した。反応液に50μlの滅菌水を加え、フェノール/クロロホルム処理を行った。100μlのTEで再抽出した後、クロロホルム処理を行った。100μlのTEで再抽出した後、上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50；MILLIPORE)にのせ、遠心(4℃、10000rpm、20min)した。下室のTEを除き、上室に300μlのTEを加えて遠心(4℃、10000rpm、20min)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、25μlのTEをフィルターの上室に加え、ピペッティングとvortexによりフィルターに付着した2本鎖DNAを溶かし出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000rpm、10sec)することで2本鎖DNAを回収した。この25μl(6.25μl×4)をエレクトロポレーション用濃縮大腸菌(50μl×4)に導入した。これに各々1.5mlのSOC培地を加え、37℃で1時間激しく振とうした後、4本を1本にまとめた。このうちの300μlにLB2mlを加え、230μlづつ10枚のLB/Ampプレートにまいた。また、この培養液のうち1、10、100μlをアンピシリンを含むLBプレートにまいた。37℃で終夜培養し、titerを測定した。残りをアンピシリンを含むLB培地500mlに加え、37℃で6時間、振とう培養した。この500mlのうち30mlからプラスミドを抽出した(G0期-Log期 dsDNA subtracted library)。残りの470mlについては、3mlのヘルパーファージ(R408)を加え、約6時間、37℃で振とう培養した後、前述の実施例７の方法と同様にしてssDNAを回収した(G0期-Log期 ssDNA subtracted library)。
【００３５】
Ｂ．試験結果
結果として、作製したライブラリーの複雑度は、約1×106であった（データは示さない。）。 コントロールとして、poly(A)+RNA (Log期)の代わりに滅菌MilliQ水を加え、以降のステップを同時に行ったものの複雑度は、約1×107であった。このことから、サブトラクションによるG0期特異的な遺伝子の濃縮は、約10倍程度と低値であると考えられた。
【００３６】
＜実施例９＞ノーザンハイブリダイゼーション
Ａ．試験方法
(1) RNAのブロッティング
Log期、G0期状態のTIG-1細胞から超遠心(CsTFAの代わりにCsClを使用)、又はAGPC法により得たtotal RNA 1μl (3μg/μlに調整)に1μl の10×MOPS（6.56gのNaOAcと4.2gのMOPSを約800mlの滅菌MilliQ水に溶かし、NaOHでpHを7.0に調整したものに、20mlの0.5M EDTA(pH 8.0)を加え、滅菌MilliQ水で容量を1Ｌとした。
フィルター滅菌(孔径0.22μm；IWAKI)後、4℃で遮光保存した。）、2μl のホルムアルデヒド溶液、5μl の脱イオンホルムアミド（30〜40mlの100%ホルムアミド(ナカライテスク、分子生物学特級)に0.5g程度のイオン交換レジン(AG 501-X8；Bio-Rad)を加え、軽く撹拌したもの。-20℃で保存し、使用前に緑色のレジンが残っていれば使用可能とし、すべてオレンジ色ならば新たにレジンを加えた。
）を加え、総容量を9μl とした。65℃で5分加熱した後、氷上に5分置いて急冷した。1μl の泳動用色素（Glycerol  2.5ml、0.5M EDTA(pH 8.0)  10 μl、BPB12.5mg、XC 12.5mgに滅菌MilliQ水  2.5mlを混合して、オートクレーブ滅菌後、エッペンドルフチューブに分注し、-20℃で保存したもの。）を加え、全量をMOPS/ホルムアルデヒドゲル（10×MOPS buffer  13mlと、滅菌MilliQ水  110.5mlと、アガロース  1.3gとを混合し、アガロースを溶かして50〜60℃に冷めた後、ホルマリン(35%ホルムアルデヒド溶液)を7.8ml加えた。）にアプライした。滅菌した1×MOPS bufferを用いて100Vで電気泳動した。BPBが2/3程度流れた時点で泳動を止め、滅菌MilliQ水で15分づつ3回洗うことによりゲルからホルムアルデヒドを除いた。20×SSC（NaCl  175.4gと、クエン酸ナトリウム2水和物  88.2gとに滅菌MilliQ水を加えて1Ｌとし、オートクレーブ滅菌したもの。）に30〜60分浸した後、20×SSCを用いたキャピラリートランスファーによりゲル中のRNAをナイロンメンブレン(Biodyne A、孔径0.2μm；PALL)にブロットした(一晩)。メンブレンを80℃で2時間ベイクすることにより、RNAをメンブレンに固定した。ハイブリダイゼーションまで室温で保存した。
【００３７】
(2) SephadexG-50カラムの作製
プローブをラベルした後、残存する[α-32P] dCTPを効率良く除くため、以下のようにしてカラムを作製した。0.6ml のチューブの底に21Gの注射針で軽く穴を開け、1.5mlのエッペンドルフチューブ上に置いた。TEで膨潤させオートクレーブ滅菌したSephadexG-50(Pharmacia)を250μlとり、上述の0.6mlチューブ内に入れた。遠心(室温、3000rpm、3min)して1.5mlチューブ内に落ちたTEを除き、再度遠心(室温、3000rpm、3min)してTEを除いた。0.6mlチューブ内にSephadexG-50をもう250μl加え、上記の操作を繰り返してTEを除いた。プローブ1個について、このカラムを2個作製した。
(3) プローブのラベリング
サブトラクションライブラリー中、インサートが0.4kb以上であるクローンについて、Sma IとNot Iで切断し、インサートを含むDNA断片を精製した。Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2(宝酒造)を用い、以下の様にしてプローブのラベリングを行った。精製したDNA断片25〜50ng程度に1μlのRandom Primerを加え、2.5μlとした。95℃で5分加熱後、急冷し、DNAを変性させた。ここに1.25μlの10×buffer、1.25μlのdNTP mixture、2μlの[α-32P] dCTP(3000Ci/mmol；Amersham)、0.5μlのExo-free klenow(2U/μl)を加え、滅菌MilliQ水で総容量を12.5μlとした。37℃で30分反応した後、65℃で10分加熱してKlenowを変性させた。反応液のうち1μlをとり、[α-32P] dCTPの取り込み率の測定に使用した。残りの反応液を(2)で作製したカラムに加え、遠心(室温、3000rpm、5min)した。溶出液を新しいカラムに加え、遠心(室温、3000rpm、5min)後、溶出液のうち1μlを取り込み率の測定に使用した。カラム処理の前後の反応液の放射能活性を測定することで、[α-32P] dCTPの取り込み効率を測定した。残りの反応液はハイブリダイゼーションに用いるまで-20℃で保存した。なお、この放射性プローブは、以下に述べるコロニーハイブリダイゼーションおよびプラークハイブリダイゼーションにおいても使用した。
【００３８】
(4) プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション
上記(1)で作製したメンブレンをハイブリバッグに入れ、直前に調整したハイブリダイゼーション液（50%ホルムアミド/5×Denhardt's/5×SSC/0.1% SDSを使用直前に調整し、ここに変性させたサケ精子DNA(5mg/ml)を1/50加えた(最終濃度0.1mg/ml)。なお、5xDenhardt'sは、50xDenhardt's溶液（フィコール(Type400；Pharmacia)  5gと、Polyvinylpyrrolidone(MW=360,000；SIGMA)  5gと、Bovine serum albumin(Fraction V；SIGMA)  5gとに滅菌MilliQ水を加えて500mlとし、フィルター(孔径0.22μm；MILLIPORE)により滅菌したもの。-20℃で保存した。）を１０倍希釈して用いた。）を加えた。このとき、6×1.5cm程度の短冊型のメンブレンの場合には、1枚あたり2ml加えた。泡が出来るだけ入らないようにシーリングし、42℃の湯浴中に2時間以上おいてプレハイブリダイゼーションを行った。上記(3)で調整したプローブを95℃で5分加熱後、急冷し、変性させた。これを0.2mlのハイブリダイゼーション液と混合し、プレハイブリダイゼーション後のメンブレンに加えた(0.2m/枚)。泡が出来るだけ入らないようシーリングし、42℃の湯浴中で24時間以上、ハイブリダイゼーションを行った。
【００３９】
(5) 洗浄、オートラジオグラフィー
メンブレンをハイブリバッグから注意深く取り出し、2×SSC/0.1% SDSの入ったガラストレイ(乾熱滅菌したもの)に移した。室温で10分、ゆっくり振とうしてハイブリダイゼーション液を出来るだけ除いた後、0.15×SSC/0.1% SDS中、42〜50℃で30分づつ2回洗浄した。メンブレンをサランラップに包み、増感紙2枚を用いて-80℃で数時間〜一晩、X線フィルムに感光した。
Ｂ．試験結果
作製したサブトラクションライブラリー中には、G0期非特異的な遺伝子も多く含まれていることが予測されたため、取りあえずライブラリー中の任意の約30クローンからプラスミド、更にインサートを回収し、それらをプローブとしてノザン解析を行ったが、G0期とLog期との両者間において発現量に顕著な差が認められるものは、それらの中には含まれていなかった（データは、示していない）。
そのままノザン解析を続けても効率が良くないと判断し、２次差分化法によりG0期-Log期 ２次差分化ライブラリーの作製を行うこととした。
【００４０】
＜実施例１０＞２次差分化ライブラリーの作製
Ａ．試験方法
作製したサブトラクションライブラリー（一次差分）中、ノーザン解析を行った約30クローンのプラスミドを混合し、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿により精製した。このうち20μgをとり、10μlの10×NEB buffer4(NEB)、10μlの10×BSA(NEB)、5μlのNot I(10U/μl；NEB)及び滅菌MilliQ水を加えて総容量を100μlとした。37℃で終夜反応させ、Not Iで切断した。このうち1μlを電気泳動して切断を確認した後、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理を行った。上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50)の上室にのせ、溶液が全て下に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000rpm、30min)した。
下室のTEを除き、新たに上室に300μlのTEを加え、遠心(4℃、10000rpm、20min)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行い、フリーのrNTP、dNTPを除去した。30μlのTEをフィルターの上室に加え、ピペッティングとvortexによりフィルターに付着したRNAを溶かし出した。ここに、10μlの10×TRL buffer(T7 RNA polymeraseに付属のもの)、10μlの10mM rATP、10μlの10mM rCTP、10μlの10mM rGTP、10μlの10mM rUTP、1μlのRNase inhibitor(40U/μl；東洋紡績)、3μlのT7 RNA polymerase(160U/μl；東洋紡績)を加え、滅菌MilliQ水にて総容量を100μlとし、37℃で90分反応させた。1μlのDNase I(70U/μl；宝酒造)を加え、37℃で15分保温して鋳型DNAを分解した。等量のフェノール/クロロホルムを加え処理した後、更に等量のクロロホルムにて処理を行った。上清を回収後、これに総容量が330μlとなるようにTEを加え、13μlの5M NaClと1μlのglycogen、990μlのエタノールを加え、-80℃に30分静置した。これを遠心(4℃、15000rpm、15min)後、沈殿に70%エタノールを加え洗浄し、更に遠心(4℃、15000rpm、5min)によりエタノールを完全に除去後、50μlのTEに溶解した。20μgの鋳型DNAから約100μgのRNAが合成された。このうちの5μgとLog期由来のpoly(A)+RNA 5μgを、前述の方法に従って、ビオチン化した。
【００４１】
(2) ハイブリダイゼーション、サブトラクション
Log期由来のpoly(A)+RNAとサブトラクション(一次差分)にて解析済みのクローン由来のRNA各 5μgをビオチン化したものに滅菌MilliQ水を加え、総容量を10μlとした。このうちの6μl(理論的には、各々のRNAが3μg含まれていることになる)に1.2μlのマスキングオリゴ(塩基配列は、5'-CCCGGGGATCTAGACGTCGAATTCCC-3'である。100pmol/μl)を加え、滅菌MilliQ水にて総容量を12μlとした。65℃で10分加熱した後、室温に30分置き、ビオチン化RNAにマスキングオリゴをアニーリングさせた。ここに20μlの2×HB(通常のサブトラクション時に用いるもの)、4μlの2M NaCl、2μlのpoly(A)、そして1μlのssDNA(0.1μg/μl；一旦増幅させたライブラリー)を加えた。65℃で変性せず、そのまま42℃のヒートブロックに移し、48時間ハイブリダイゼーションを行った。以下、通常のサブトラクション時と同様にしてssDNAを回収し、2本鎖DNAとした。これから、G0期-Log期 ２次差分化ds-、ss-cDNAライブラリーを前述と同様の方法により作製した。
【００４２】
Ｂ．試験結果
(1)２次差分化法は、ライブラリー中に含まれる各クローンのノザン解析を効率的に行うことを目的とした方法である。つまり、ノザン解析を行ったクローン(プラスミド)の混合物を鋳型としてインサート由来のRNAを合成、1本鎖DNAとハイブリし、それらを有するssDNAを除去したライブラリーを作製する。この原理に従い、サブトラクション(1次差分化)ライブラリーにて解析を行った約30クローン(プラスミド)を混合し、それらに含まれるインサート由来のRNAを合成、ハイブリに使用した。また、1次差分化ライブラリーでは、G0期特異的な遺伝子が十分に濃縮されていなかったことから、ssDNAの約30倍量に相当するpoly(A)+RNA (Log期)も同時に加え、 ２次差分化ライブラリーの作製を行った。その結果、作製した同ライブラリーの複雑度は、約1×105となった。つまり、２次差分化ライブラリーは、１次差分化ライブラリーの約10倍程度の濃縮がかかったライブラリーであると考えられた。
【００４３】
１次差分化ライブラリーの場合と同様、まず任意の約30クローンからプラスミド、更にインサートを回収し、それらをプローブとしてノザン解析を行った。その結果、これらの中にはgrowth arrest (G0期)特異的に発現量が上昇しているものが含まれていた。従って、２次差分化ライブラリー中の解析クローン数をさらに増やし、最終的に400クローンからプラスミド、更にインサートを回収し、ノザン解析を行うこととした。結果として、400クローン中、0.4kb以上のインサートを含むものが218個であった(インサートの挿入率；54.5%)。これらについて、静止期にて発現が上昇しているもののスクリーニングを行ったところ、そのようなクローンを約30個単離することができた。これらのクローンについて、その再現性の確認も兼ねて、各遺伝子について、Time course northern (Serum starve)を行った。その結果の一部を図３に示した。前述の約30クローンのうちの15個（TIGA1、TIGA3〜TIGA16）については再現性が確認され（表２を参照）、その発現パターンは、後述のType１かType２であり、Type１について2クローンが、Type２について13クローンが単離された。尚、Type１および、Type２の定義は、以下の通りである。
Type １；増殖状態の細胞(Log期)ではほとんど発現が認められず、増殖停止(G0期)状態にある細胞でmRNA転写量が著しく上昇しているもの。
Type ２；増殖状態の細胞(Log期)でもやや発現が認められるが、増殖停止(G0期)状態にある細胞の方がmRNA転写量が数倍程度高くなっているもの。
【００４４】
【表２】
0004567140.tif 000003
【００４５】
(2)次に単離された各クローンの塩基配列を決定し、それらとこれまでに知られている遺伝子のデータベースとの間でホモロジーサーチを行った。その結果、これらのクローンの中には、1) 新規遺伝子であると考えられるものが3種、2) 癌抑制遺伝子、或いはそのcandidateである可能性が示唆されているものが3種類、含まれていた。このうち、2)のうちの一つであるTIGA1は、癌抑制遺伝子の候補となる可能性が報告されているESTクローンと同一であった(なお、発表されたESTクローンについての機能は未解析である。)。
【００４６】
＜実施例１１＞TIGA1遺伝子の解析(1)
癌抑制遺伝子の候補遺伝子である可能性が報告されているESTクローンと相同性のあったTIGA1は遺伝子座が第5染色体長腕21-22であり、この領域は肺癌、特に小細胞癌の臨床サンプルの約80%と非常に高頻度でLOHが認められるとの報告がある（CANCER RESEARCH 54,1787-1790,April1,1994）。特に同遺伝子座には、他にAPCなどがあり、当初は大腸癌等と同様に肺癌に関しても、これらが癌化に寄与している原因遺伝子であると考えられていた。しかし、その後の解析の結果、肺癌ではこれらの蛋白は正常であることが分かり、この領域には新規の癌抑制遺伝子が存在している可能性が示唆されている。以上の背景から、TIGA1は新規の癌抑制遺伝子の候補遺伝子である可能性が十分に考えられた。
【００４７】
(1) TIGA1の各組織における発現について
各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、白血球、胃、甲状腺、脊髄、リンパ腺、気管支、副腎、骨髄）由来のmRNAを使用して、TIGA1の発現パターンについて確認したところ、図４に示すように、全ての組織においてTIGA1のバンドが確認され、TIGA1が各組織について恒常的に（ubiquitous）発現されていることが認められた。
(2) TIGA1のORFについて
▲１▼TIGA1 cDNA中のORF検索
次に、TIGA1にORFが存在し、蛋白をコードしているかどうかについて確認した。TIGA1の塩基配列をアミノ酸配列に置換したところ、この段階の塩基配列では、何れのフレームについても、ORFと思われる箇所は認められなかった。ノザンハイブリダイゼーションにおけるTIGA1の転写サイズが約0.7kb付近であったため、サブトラクションにより単離したクローン(約0.65kb)が全長ではないものと考えられたので、次に、G0期 cDNAライブラリーを用い、後述したコロニーハイブリダイゼーション法により全長と思われるクローンの単離を試みた。
【００４８】
＜実施例１２＞コロニーハイブリダイゼーション法
(1)ニトロセルロースフィルターとナイロン膜の前処理
ニトロセルロースフィルターとナイロン膜は決して素手では触らぬようにラテックス手袋をして作業するようにした。直径10cm以上のビーカー、あるいはプラスチック箱に滅菌水を入れ、ケースから1枚づつ取り出したニトロセルロースフィルター(ミリポア；HATF08250：トライトンフリー以外は不可)、あるいはナイロン膜(PALL：Byodyne Aなど)を浸した。フィルターを10cm角に切ったワットマン3MM濾紙(3枚に1枚はやはり滅菌水に浸す)に一枚ずつ挟んでいった。その後、アルミホイルで包み、90℃で10分間オートクレーブした。乾燥しないようビニール袋に包んで4℃に保存した。
(2)液体窒素中に保存しておいた前述のG0期特異的なcDNAライブラリーを室温で溶かし、中に含まれているコロニー濃度を測定するために、これをLBを用いて段階的に希釈して数枚のアンピシリン・プレート（LB培地をつくる際に、1Ｌあたり15gのbacto-agarを加えてオートクレーブした。この溶液が60〜70℃の温度に下がったところで1mlの50mg/mlのアンピシリン溶液(50%エタノール)を加え、9cm径のシャーレに25mlずつ分注して4℃に保存した。特に最初のcDNAライブラリーをニトロセルローズフィルターに蒔くときに使うプレートはコロニーの生えを良くするために7mm以上の厚さになるよう熱アガーを分注しておいた。）に蒔き、37℃で一晩培養した。ライブラリーの力価は約1×108cfu/mlであった。
前処理したニトロセルロースフィルターを10枚のアンピシリンプレートにまんべんなくのせた。泡が生じたら滅菌したピンセットでフィルターを撫でて除いた。泡が残るとそこにはコロニーが生えなくなるので、この操作は慎重に行うようにした。この上にシリコナイズ後、乾熱滅菌した径3〜5mmのグラスビーズを10〜30個のせておいた。前述のライブラリーを200μl蒔けば30万コロニーになるように2本の1ml LBに希釈した。1枚のフィルターに200μlの希釈液をのせ、すぐさまプレートを左右に動かしてグラスビーズをまんべんなくころがして大腸菌を分散させた。この作業を一枚ずつ、合計10枚のニトロセルロースフィルターについて行った。この時、実際にどのくらいのコロニーを蒔いたかを測定するため、1μlコロニー液を段階的に希釈して3枚のアンピシリンプレートに蒔き37℃で一夜培養し、明朝カウントしたところ、6×106cfu/mlであった。
10枚のプレートについてはこれらを37℃で6〜8時間培養しながらコロニーの出方を観察した。0.2mmくらいの大きさのコロニーがフィルター上一面に生えてきたところで培養を止め、4℃に保存しておいた。
【００４９】
(3)ナイロン膜へのトランスファー
明朝一番にプレートを4℃から取り出し、そのフィルターをワットマン3MMろ紙にのせ、その上に新しいナイロン膜をずれないように重ねてのせた。針先(20G程度)でフィルターとナイロン膜を貫通させるようなかたちで非対称に4ケ所穴をあけ目印とした。その後、爪楊枝の先に少量つけた墨汁でフィルターとナイロン膜の各々に番号をつけておいた。
フィルターとナイロン膜の全体が一様に合わさるようアルミ製円筒ブロックで上から押さえた。この時にも泡は不可なので、生じた泡はラテックス手袋をした手で撫でて除いた。ピンセットでフィルターとナイロン膜を剥がし、各々新しいアンピシリンプレート上に泡が立たないようにのせ、37℃で2〜3時間培養した。
元のプレート(フィルター)は4℃へ保存しマスターフィルターとした。トランスファーされた方のナイロン膜はクロマイ・プレート（LB培地をつくる際に、1Ｌあたり15gのbacto-agarを加えてオートクレーブした。この溶液が60〜70℃の温度に下がったところで5mlの34mg/mlクロラムフェニコール(エタノール中に溶かしたもの)を加え、9cm径のシャーレに25mlずつ分注して4℃に保存したもの。あるいは、アンピシリン・プレートに1mlの4mg/mlのクロラムフェニコールを染み込ませてから使用した。）にのせ、さらに37℃で培養を続けた。この際にもプレートとナイロン膜の間に空気が入らないよう気をつけた。
【００５０】
(4)第一次スクリーニング
明朝一番にピンセットを用いて培養したナイロン膜に新しいナイロン膜をずれないように重ねてのせ、上記(3)と同様にしてアルミ製円筒ブロックで上から押さえた。爪楊枝の先に少量つけた黒汁でナイロン膜に番号をつけるとともに4ケ所の位置目印をつけておいた。大きなガラス板かステンレスバットなどに変性液（0.5N NaOH、1.5M NaCl）を1.5mlずつ20個(プレート数が10枚の場合)スポットした。その上に10組(おのおの2枚)のナイロン膜を重ねたままのせて5分間置いた。ピンセットを用いナイロン膜がずれないように裏返しながら新しいスポットにのせ、さらに5分間置いた。紙タオルでナイロン膜を重ねたままブロットして変性液を除いた。別のガラス板に1.5mlずつ20個スポットした中和液(0.5M Tris-HCl(pH7.4)、1.5M NaCl)の上にナイロン膜を重ねたままのせ、5分間置いた。ピンセットを用いナイロン膜がずれないように裏返しながら新しいスポットにのせ、更に5分間置いた。紙タオルでナイロン膜を重ねたままブロットして中和液を除いた。別のガラス板に1.5mlずつ10個スポットした2×SSCの上に、ナイロン膜を重ねたままのせ5分間置いた。同様にして各組のナイロン膜を離し、コロニーの側を上に向けてろ紙の上で風乾してから高温乾燥機で80℃、1〜2時間熱処理した(ニトロセルロースフィルターは真空乾燥器を使わないと焦げることがあるがナイロン膜の場合は真空乾燥である必要はない)。ナイロン膜を100〜200mlの予洗液（5×SSC、0.5% SDS、1mM EDTA(pH8.0)）を含むタッパーウェア(10×10×5cm)に入れ、室温で10分間振とうした。ナイロン膜を紙タオルにのせ1枚ずつティッシュで数回強くこすり膜上の大腸菌破砕片を拭き取った。紙タオル上でブロット(あるいはしばらく風乾)してから9cm径のプラスチックシャーレにナイロン膜を10〜20枚重ねて入れ、この上にナイロン膜あたり1.0〜1.5mlのハイブリダイゼーション液(5×SSC、10×Denhardt's)(合計15〜25ml)を注ぎ込んだ。厚めのビニール袋をナイロン膜と同じ形に丸く切り、ナイロン膜の上に重ねて液が蒸発するのを防ぐ蓋とした。シャーレに蓋をし、ビニールテープでシールして約55℃で3〜6時間保温した。ハイブリダイゼーション液を捨て、標識したプローブを含む新しいハイブリダイゼーション液を10〜20ml注ぎ入れた。同様にシールして55℃で20時間程度保温した。ナイロン膜をタッパーウェア(10×10×5cm)に移し、100〜200mlの0.1%SDSを含む1×SSCを加え30〜60分間60℃でナイロン膜を洗浄した。洗浄液を0.1%SDSを含む0.3×SSCに替え、さらに30分間60℃でナイロン膜を洗浄した。洗浄液を0.1%SDSを含む0.1×SSCに替え、さらに30分間60℃でナイロン膜を洗浄した。ナイロン膜を少し湿った程度まで風乾し、X線フィルム(半切)の大きさに切ったサランラップの上にのせた（X線フィルムに露光後、位置合わせが簡単になるようにのせる順番に注意する）。径5mmの紙ラベルに[α-32P]dCTPを少量しみ込ませたマジックペンでマークし、それらを数カ所散りばめて位置合わせのガイドとした。これらの上を、1枚の大きなサランラップで覆い、超低温庫にて増感紙のもと、X線フィルムに露光した。
【００５１】
(5)第二次スクリーニング
X線フィルムを現像し、マークに従って位置合わせをし、元と写し(複製)の両方にほぼ同等の強度で見い出されるスポットを探した。アンピシリンプレート上に4℃で保存しておいたマスターフィルターをシャーレの蓋の方にコロニー側を上にして置き、前述のスポットとマークに従って位置合わせをした。スポット付近のフィルター上の大腸菌の1mm角程度をナイフを用いてフィルターごと切り取り、1mlのLB培地に移した。よく撹拌し、その1μlをとって新しい1mlのLB培地に移した。この液を1〜100μlとってアンピシリンプレートに蒔いて、プレートあたり100〜1000コロニーになるようにして二次スクリーニングに供した。37℃で一晩培養したプレートは4℃で3時間以上冷やした。ナイロン膜をプレートに直接のせ、前述と同様にしてアルミブロックで押さえ、墨汁をつけた爪楊枝でマークしてからピンセットで剥がし、新しいアンピシリンプレートにのせ、37℃で2〜3時間培養した。クロマイ・プレートに移し、さらに37℃で一夜培養した。第一スクリーニングの操作と同様にフィルター処理とハイブリダイゼーションを行った。
(6)第三次スクリーニング
X線フィルムのポジティブスポットと位置合わせをし、第二スクリーニングの操作と同様にしてアンピシリンプレートあたり10〜100コロニーとなるように大腸菌を蒔いた。第一スクリーニング操作と同様にしてフィルター処理とハイブリダイゼーションを行った。最終的にポジティブとなったシングルクローンを回収した。原液は、7% DMSO溶液とし、-80℃に保存しておいた。
【００５２】
＜実施例１３＞Polymerase chain reaction(PCR)
TIGA1遺伝子にかんするPCRは、Ex Taq PCR、またはLA Taq PCR kit(TakaRa)を使用した。なお、PCRにおいては、配列番号３〜配列番号７に示したセンスプライマー（配列番号３に示すＦ１「5'- AGAATTCGGCGCGCCGATGGTACAGCCCGCT -3'」、または配列番号４に示すＦ２「5'- TTTTTGCTCTGGGTCCTCTGGG -3'」）または、アンチセンスプライマー（配列番号５に示すＲ１「5'- TGTATTTACAGACTCCAGCAGG -3'」、配列番号６に示すＲ２「5'- ATACTCGAGGCGGCCGCACTCCTCAGACTCCCAGAAAT -3'」、または配列番号７に示すＲ３「5'- ATACTCGAGGCGGCCGCTCAGTTATACGGTAAGGC -3'」）のうち、適当な一組のプライマーセットを使用した。
Ａ．試験方法
(1) Genomic-PCR、nested-PCR
細胞または組織より抽出したゲノムDNA (1〜10ng/μl) 1μlを鋳型とし、これに滅菌水4.4μl(LA taq DNAポリメラーゼを使用する場合は、3.4μlの滅菌水と1μlの25mM MgCl2を使用)、0.5μlのDMSO、1μlの10×Ex buffer(或いは10×LA buffer)、1μlの2.5mM dNTP mix、検出したい遺伝子に特異的なセンスプライマーおよび、アンチセンスプライマー(ともに10pmol/μl)をそれぞれ1μl、Ex Taq DNAポリメラーゼ(或いはLA Taq DNAポリメラーゼ)(TakaRa；5U/μl) 0.1μlを加えた。95℃で3分間変性させた後、95℃で30秒、55〜60℃で30秒、72℃で30秒〜1分のサイクルを30回行い、最後に72℃で5分反応させた。これに滅菌水を90μl加えて10倍希釈し、総容量を100μlとした後、プライマー除去用のマイクロスピンカラム(S-200HR；ファルマシア)によりPCRプライマーを除いた。
さらにこの溶液を滅菌水により10倍希釈(最終100倍希釈)したもの1μlを鋳型とし、検出したい遺伝子に特異的なセンスプライマー、アンチセンスプライマー(1回目のプライマーの内側のもの)を用いてnested-PCRを行った。10μlの反応液のうち5μlを1.0〜2.0%アガロースゲルで電気泳動した。
【００５３】
(2) RT-PCR
Superscript Preamplification System (GIBCO BRL)を使用した。超遠心、あるいはAGPC法により得たtotal RNA約1μgを鋳型とし、オリゴ(dT)12-18プライマー(0.5μg/μl)を1μl加え、滅菌水で総容量を14μlとした。65℃で10分加熱した後、氷上で急冷し、2μlの10× synthesis buffer、1μlの10mM dNTP mix、2μlの0.1M DTT、1μlのsuperscript II (200U/μl；BRL社)を加え、ピペッティングにより混合した。室温に10分置いた後、42℃で50分反応した。90℃で5分加熱して逆転写酵素を変性させた後、氷上に10分置いた。RNase H(2U/μl)を1μl加え、37℃で20分反応した。この反応液1μlに13.3μlの滅菌水(LA taq DNAポリメラーゼを使用する場合は、11.3μlの滅菌水と2μlの25mM MgCl2を使用)、2μlの10×Ex buffer(或いは10×LA buffer)、1.6μlの2.5mM dNTP mix、検出したい遺伝子に特異的なセンスプライマー、アンチセンスプライマー(ともに10pmol/μl)をそれぞれ1μl、Ex Taq DNAポリメラーゼ(或いはLA Taq DNAポリメラーゼ)(TakaRa；5U/μl) 0.1μlを加えた。95℃で3分間変性させた後、95℃で30秒、55〜60℃で30秒、72℃で30秒〜1分のサイクルを30回行い、最後に72℃で5分反応させた。20μlの反応液のうち10μlを1.0〜2.0%アガロースゲルで電気泳動した。
【００５４】
Ｂ．試験結果
PCRの一例として、図５には、胎盤由来のcDNAライブラリーを鋳型として使用し、上述のプライマーセットを利用したときの結果を示した。図５（Ａ）は、プライマーＦ３（99年3月にESTデータベースに登録されたESTクローン(AI557437)の塩基配列が、5'末端付近の塩基配列が不明であった当時のTIGA1 cDNAの塩基配列と高い相同性を示しており、かつこのESTクローンが、当時は不明であったTIGA1 cDNAよりも5'上流の塩基配列情報を含んでいたため、このESTクローンの5'上流の塩基配列のシークエンスデータに基づいてプライマーＦ３を設計したものである。塩基配列は、5'-ATGGATTTTGGACGTGGAA-3'である。但し、結果としては、AI557437のクローンとTIGA1とは、同じ遺伝子ではなかったため、PCRのバンドは確認されなかったもの。）とＲ１▲１▼、プライマーＦ１とＲ３▲２▼、プライマーＦ１とＲ１▲３▼とを使用して一度目のPCRを行い、上記▲２▼の溶液を鋳型DNAとしてプライマーＦ２とＲ３、また上記▲３▼の溶液を鋳型DNAとしてプライマーＦ２とＲ３、プライマーＦ２とＲ２、プライマーＦ２とＲ１とをそれぞれ使用して二度目のPCRを行ったものである（nested-PCR）。
【００５５】
＜実施例１４＞プラークハイブリダイゼーション法によるTIGA1ゲノムの単離次に、TIGA1のゲノム上での構造を解明するために、プラークハイブリダイゼーション法による遺伝子の単離を行った。
Ａ．試験方法
(1)プラークリフティング
ライブラリーのファージ液をSMで適当に希釈して、1ml程度に4〜5×105pfuのファージが含まれるように調整した。10本の遠心管にファージ液を100μlずつ入れた。宿主菌の終夜培養液を500μlずつ加え、ボルテックスした。37℃で15分インキュベート後、駒込ピペットで7mlのソフトアガロースを加え、手早くボルテックスした。これを素早くプレート培地に広げた。そのまま動かさずに15分以上静置して、ソフトアガロースが固まるのを待った。プレート培地を逆さにして37℃のインキュベーターに入れ、6〜10時間ほど静置した。プレート培地を裏返して表面を上にし、フタをずらして乗せ、37℃でさらに30分間ほど静置した。プレート培地が冷えるまで冷蔵庫に入れておいた。この間に、13×9cmに切ったフィルターを20枚用意しておいた。先のあまり尖っていない鉛筆で、フィルターの右肩に▲１▼-1から(10)-1、▲１▼-2から(10)-2まで印を付けた。先の平らなピンセットを2本用いて、1組目(▲１▼-1から(10)-1)のフィルターを同じ番号(▲１▼から(10))のプレート培地の上に、気泡が入らないように静かに乗せた。そのまま室温で3分間ほど静置した。フィルターに注射針を非対称に4ケ所突き刺してマークした。プレート培地の裏側から、マークされた針穴の位置にサインペンで印を付けた。ベンチの上にラップフィルムを敷き、厚手の濾紙を3枚並べた。この厚手の濾紙の1枚に変性溶液（1.5M  NaCl/0.5M  NaOH）を、残り２枚に中和溶液（1.5M  NaCl/1.5M  Tris-HCl(pH7.5)）を注いだ。ピンセットを用いて、フィルターを角から静かに剥がした。フィルターを裏返し、プレート培地と接していた面を上にして、変性溶液を染み込ませた厚手の濾紙の上に3分間静置した。そのまま乾いた濾紙の上に乗せ、軽く水気を切った。フィルターを裏返したまま、中和溶液を染み込ませた厚手の濾紙の上に乗せ、3分間静置した。そのまま乾いた濾紙の上に乗せ、軽く水を切った。2×SSCを入れたバットにフィルターを入れ、3分間ほど静置した。乾いた濾紙の上に乗せて乾燥させた。2組目(▲１▼-2から(10)-2)のフィルターについても、同様の処理を行った。プレート培地をラップフィルムで包み、4℃で保存した。フィルターを1枚ずつ濾紙に挟んでオーブンに入れ、80℃で2時間ほど加熱した。このフィルターは濾紙に挟んだままラップフィルムで包み、4℃に保存しておいた。
【００５６】
(2)ハイブリダイゼーション
タイトボックスに4〜5ml/100cm2フィルターのハイブリダイゼーションバッファー（50% ホルムアミド、5×Denhardt's solution、5×SSPE、0.5% SDS）を入れた。4℃に保存しておいたフィルターを1枚ずつ浸した。42℃で2時間プレハイブリダイゼーションを行った。終濃度が5〜10×105/mlになるように、プローブ(TIGA1遺伝子を実施例9(3)に記載の方法によって、[α-32P]dCTPで放射能標識したもの。)を徐々に加えていった。42℃で16〜20時間ほどハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、バッファーをRI用廃液タンクに捨てた。少量の洗浄液A（2×SSC、0.1% SDS、予めインキュベーターなどに入れ、大体65℃にしておいたもの。）を入れたバットにフィルターを移し、軽くリンスした。洗浄液AはRI用廃液タンクに捨てた。各フィルターが自由に動ける以上の量の洗浄液Aをバットに注ぎ、65℃で15分間振とうした。洗浄液AをRI用廃液タンクに捨てた。この洗浄液Aによる洗いを再度、繰り返して行った。各フィルターが自由に動ける以上の量の洗浄液Bをバットに注ぎ、65℃で15分間振とうした。洗浄液BをRI用廃液タンクに捨てた。この洗浄液B（1×SSC、0.1% SDS、予めインキュベーターなどに入れ、大体65℃にしておいたもの。）による洗いを再度、繰り返して行った。各フィルターが自由に動ける以上の量の洗浄液C（0.1×SSC、0.1% SDS）をバットに注ぎ、65℃で15分間振とうした。洗浄液CをRI用廃液タンクに捨てた。この洗浄液Cによる洗いを再度、繰り返して行った。フィルターを濾紙の上に乗せて軽く水気を切った。後にポジティブシグナルの識別を行う際のことを考えてフィルターをサランラップ上に並べていき、これをラップで完全に包んだ。暗室内で、増感紙をセットしたカセットにX線フィルムと共に入れ、-70℃で一晩(15時間)ほど露光した。現像後、各々のX線フィルムをマーカーを指標に位置を合わせ、両方でシグナルの重なるものに目印をつけた。X線とプレートを針穴のマークが合うように重ね合わせ、プレート上のポジティブシグナルに目印を付けていった。マイクロピペッターを用いて、ダブルポジティブマークの付近のプラークをつつき、2mm角ぐらいを取った。マイクロチューブに入れた1mlのSMにソフトアガロースごと懸濁した。これにクロロホルムを一滴垂らし、ボルテックスで混合した。軽く遠心して4℃で保存した。
【００５７】
(3)第二次スクリーニング
SMバッファーに懸濁した第一次ポジティブクローン(No.1〜8) 10μl を宿主菌 XL1-Blue MRA(P2)の終夜培養液100μlと混合した。37℃、20分間プレインキュベートした後、駒込ピペットで予め53℃であたためておいた4mlのソフトアガロースを加え、手早くボルテックスした。これを素早くプレート培地(直径；9cm dish)に広げた。そのまま動かさずに15分以上静置して、ソフトアガロースが固まるのを待った。プレート培地を逆さにして37℃のインキュベーターに入れ、10〜16時間ほど静置した。プレート培地を裏返して表面を上にし、フタをずらして乗せ、37℃でさらに30分間ほど静置した。プレート培地が冷えるまで冷蔵庫に入れておいた。4℃にて十分に冷やしておいたプレート(3時間以上冷した)上に、バイオダインA フィルター(そのまま使用)を乗せた。この状態で1分間程度静置した。プレート上のフィルターの端の方に左右非対称に注射針で穴を開けた。その穴に、爪楊枝の先につけた墨汁で印をつけた。ピンセットでフィルターを一気にはがし、変性液に約20秒間浸した。ペーパータオルの上に乗せ水分を除去し、中和液に約20秒間浸した。別のペーパータオルにのせ、乾かした。フィルターは各2枚ずつ作製しておいた(各2枚目のフィルターは、1枚目と比較してプラークがトランスファーされにくいことを考慮し、5分間程度、コンタクトさせておいた)。
以下、同様の処理を行った。フィルターを1枚ずつ濾紙に挟んでオーブンに入れ、80℃で2時間ほど加熱した。このフィルターは濾紙に挟んだままラップフィルムで包み、4℃に保存しておいた。以降、一次スクリーニングと同様にしてポジティブクローンの選別を行った。ポジティブクローンはマイクロチューブに入れた1mlのSMにソフトアガロースごと懸濁し、これにクロロホルムを一滴垂らし、ボルテックスで混合した。軽く遠心して4℃で保存した。
【００５８】
(4)第三次スクリーニング
第二次スクリーニングのポジティブクローンについて、同様の方法で第三次スクリーニングを行った。三次スクリーニングでポジティブとなったクローンのうち、シグナルが強かった4つのシングルプラークをSMバッファー500μlに回収した。
(5)ファージの回収
SMバッファーに懸濁した第三次ポジティブクローン(No.1〜4) 50μl を宿主菌 XL1-Blue MRA(P2)の終夜培養液500μlと混合した。37℃、15分間プレインキュベートした後、駒込ピペットで予め53℃であたためておいた4mlのソフトアガロースを加え、手早くボルテックスした。これを素早くプレート培地(直径；9cm dish)に広げた。各クローンについて5枚ずつのプレートに蒔いた。そのまま動かさずに15分以上静置して、ソフトアガロースが固まるのを待った。プレート培地を逆さにして37℃のインキュベーターに入れ、ほぼComplete lysisの状態まで保温を続けた。5mlのSMバッファーを各プレート上に流し込み、4℃で終夜静置した。
翌日、各クローンごと50mlのコニカルチューブにSMバッファーを回収した(各、約20ml程度回収できた)。これを遠心(3000rpm、4℃、10分間)した。上清を新しい50mlコニカルチューブに回収した。このうち約4mlをファージの回収に使用し、残りは500分の1程度のクロロホルムを加え、4℃に保存しておいた。また、このうちの一部を80%グリセロール溶液として-80℃に保存しておいた。
4mlの回収液に対して、DNase I(70U/μl) 0.4μl、RNase A(10mg/ml) 2μl加え、37℃で1時間インキュベートした。これに2分の1倍量の30%PEG6000/3M NaCl (終濃度 PEG6000 10%)を加え、よく混ぜてからガラス製の30mlコレックスチューブに移し、氷上に1時間放置しておいた。J2-21(BECKMAN)ローターにて、遠心(9000rpm、4℃、5分間)した。上清を除き、ペレットを回収した(PEGが残らないようにチューブの中をキムワイプで拭き、上清を完全に除去した)。ペレットを500μlのSMバッファーに懸濁。1.5mlチューブに移し、TOMY遠心機にて遠心(11000rpm、4℃、5分間)し、上清を新しい1.5mlチューブに移した。10%SDSと0.5M EDTAを各5μl加え、65℃で15分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム処理を2回行った後、等量のイソプロパノールと混ぜ、遠心(15000rpm、室温、5分間)した。上清を捨て、ペレットに70% エタノールを1ml加えて洗浄後、各々100μlのTEに溶解させた。OD260/280を測定し、各サンプルの濃度を決定した。
(6)シークエンスのためのサブクローニング
プラークハイブリダイゼーションでポジティブとなったEMBL3ファージクローン(No.1〜4)について、MCS上のBam HI、EcoRIとSal Iを用いてインサートチェックを行った。適当なインサートをシークエンス用ベクターpBluescript SK(+/-)にサブクローニングし、シークエンスを行った。
【００５９】
Ｂ．試験結果
プラークハイブリダイゼーションにおいてTIGA1 cDNAをプローブとし、ポジティブなシングルクローンとしてEMBL3ファージ4クローンを回収した。マルチプルクローニングサイト(MCS)上のBam HI、EcoRIとSal Iを用いてインサートを切り出し、適当なインサートをシークエンス用ベクターpBluescript SK(+/-)にサブクローニングし、シークエンスを行った。
その結果、図６に示すように、TIGA1 cDNA中には少なくとも3個のエクソンと2個のイントロンが存在していることが明らかとなった。更に、TIGA1 cDNAの5'上流の塩基配列も明かとなった。このようにしてゲノム構造が明らかとなった genomic TIGA1の塩基配列を配列番号８に示した。
この5'上流の塩基配列を解析したところ、TIGA1 cDNAとして既知であった配列の約100塩基上流に翻訳開始のATGと思われる部位の存在が判明した。そこで既述のプライマーを使用して、cDNA libraryを鋳型としてPCRを行った。その結果、F1をセンスプライマーとしてPCRを行った時に、目的のサイズにバンドの増幅が確認された。以下1)、2)の点を考慮し、このプライマーF1中のATGがTIGA1の開始ATGであると結論付けた。
1) TIGA1のノザンハイブリダイゼーションにおける転写サイズは約0.7〜0.8kbであった。既に、TIGA1 cDNAとして約0.65kbを単離していたので、未知の5'上流はせいぜい100塩基程度と考えられた。
2) 開始ATGと考えられる部位のさらに約200塩基上流に別のATGが存在していたが、この両ATG間にRNAスプライシングのコンセンサス配列と考えられるものは存在していなかった。従って、TIGA1の転写サイズを考慮すると、より5'上流のATGが翻訳開始部位であるという可能性は極めて低いと考えられた。
【００６０】
(2)TIGA1 cDNAの塩基配列と相同性を有する各ESTクローンとの配列比較
単離されたTIGA1 cDNAの塩基配列を基としたESTデータベース検索の結果、相同性の認められた各ESTクローン(特に、その由来が腫瘍組織であるもの)との塩基配列の比較を行った。これにより、TIGA1 cDNA上の突然変異に関するホットスポットの存在の可能性についての検討した。正常組織由来のESTクローン8個と、腫瘍組織由来のESTクローン20個との塩基配列との比較を行った結果を図７に示した。図７には、上側の8個のクローンが正常組織由来のもの、そこから下方の20個のクローンが腫瘍組織由来のものを並べてある。また、TIGA1 cDNA 中において、変異の見られた位置と、塩基配列の置換を配列マップ上に示した。ORF中に確認された変異のうち、正常組織由来のものは、244位のもの（Ｔ→Ａ）のみであり、残りは全て腫瘍組織由来の変異であった。
このように、突然変異のホットスポットの存在は認められなかったものの、明らかに腫瘍組織由来のクローンではTIGA1のORF中に塩基置換が多いという傾向が認められた。このことからもTIGA1が図中のORFに対応するタンパク質をコードしており、この領域に変異が加わることによってその機能が失われ、癌化に寄与している可能性が強く示された。
【００６１】
＜実施例１５＞TIGA1タンパク質が大腸菌の増殖に与える影響
Ａ．試験方法
TIGA1を F1プライマーとR3プライマーとでPCR法によって増幅したフラグメントを AscI と NotI とで切断処理した精製済のフラグメントと、pGEX(Pharmacia)を AscI と NotI とで切断処理したフラグメントとをライゲースによってつなぎ合わせたプラスミドベクターを利用して、TIGA1がコードするタンパク質（より正確には、発現されるものは、GstとTIGA1との融合タンパク質である。）が大腸菌の増殖に与える影響を確認した。
大腸菌(PR745、またはBL21)において、GST-TIGA1およびGST-TIGA1(mt)(TIGA1において、二つのアミノ酸のみをコードし、停止コドンを導入させたもの。TIGA1のcDNAを鋳型として、PCR法によって作製した。)をコードする遺伝子をもつプラスミドベクターを導入して発現させた場合と、GSTのみをコードする遺伝子（元のプラスミドベクターのみ）を持つプラスミドベクターを導入して発現させたものとの間での大腸菌の増殖率の比較を行った。
Ｂ．試験結果
融合タンパク質が大腸菌の増殖率に与える影響を見ると、図８に示すように、IPTGにより各蛋白の誘導をかける前までは、全ての大腸菌において増殖率にほとんど差が認められなかったのに対し、誘導後はGST-TIGA1融合タンパク質を発現させた大腸菌では、明らかに宿主菌の増殖率の低下が観察された。なお、GST-TIGA1(mt)融合タンパク質を発現させた大腸菌では、元のベクター(pGEX8T)を導入して発現させた大腸菌とは、ほとんど増殖状態に変化がなかった。
また、同時にGST-TIGA1融合タンパク質の発現量についてCBB染色、またはWestern blotting法により調べたところ、その発現はWestern blotで確認できる程度であり、ごく少量であった。上記の実験から、大腸菌(PR745、またはBL21)においてGST-TIGA1融合タンパク質の発現がその増殖に抑制的に働く、或いはToxicである可能性が強いことが確認された。
＜実施例１６＞GSTとTIGA1との融合蛋白の発現
Ａ．試験方法
上記実施例１５において作製したプラスミドベクターを利用して、TIGA1がコードするタンパク質に対する特異抗体を検出するために、GSTとTIGA1との融合タンパク質を発現させた。このプラスミドを持った大腸菌(PR745)を、アンピシリン(10μg/ml)を含んだLB培地2ml中で37℃にて一晩培養し、終夜培養液の100μlをアンピシリン(10μg/ml)を含んだLB培地5mlと混ぜ、OD600値が0.5〜1.0になるまで約2時間程度、37℃で培養を続けた。OD600値が0.5〜1.0に到達したら、その培養液を予め20℃にしておいた水中に約10分間放置し、培養液を20℃とした。これに、IPTGを0.5〜1mMとなるよう培地に加えて融合タンパク質を発現させながら、20℃で一晩培養した。
大腸菌を遠心(5000×g、4℃、10分間)することにより集菌した。菌体ペレットに約100〜150μlの2×サンプルバッファー（0.5MTris-HCl (pH6.8)2mlと、10% SDS4mlと、β-メルカプトエタノール1.2mlと、グリセロール2mlに蒸留水0.8mlを混合し、1% BPB数滴を添加した後、総容量を10mlに調整したもの。）を加え、加熱処理(boiling、5分間)することでSDS-PAGE用のサンプルを調整した。IPTGにてGSTリコンビナント蛋白を発現させる前の菌体についても同様にSDS-PAGE用のサンプルを調整し、ネガティブコントロールとして使用した。
【００６２】
Ｂ．試験結果
IPTGを添加して培養した大腸菌の菌体をSDS-PAGEにより解析したところ、図９に示すように、GST-TIGA1融合タンパク質のサイズ（約40kDa）に顕著なバンドが確認された。なお、前述のように、TIGA1タンパク質は菌の増殖に対して抑制的に、または Toxic に働くようであり、一般的にGST融合タンパク質として発現されるタンパク量に比較すると、少ない量しか発現が見られなかった。しかしながら、TIGA1に対するポリクローナル抗体作製のための抗原として、大腸菌によるGST-TIGA1融合タンパク質の発現は可能であるものと考え、次のステップに進んだ。
【００６３】
＜実施例１７＞TIGA1がコードするタンパク質に対する特異抗体の作製
Ａ．試験方法
(1)抗原の調整およびウサギへの免疫
前述のようにして発現が確認されたGST-TIGA1融合タンパク質を発現する大腸菌について、IPTGを添加して培養した菌体ペレットをSDS - PAGE Sample bufferに溶解させたものを2分間 boil し、遠心して 10% アクリルアミドゲルにapplyした。50 〜 80mA で泳動を行い（約3〜４時間）、染色（0.05％Brilliant Blue )を行った後、GST-TIGA1融合タンパク質のバンドを切り出した。このバンドをカッターで1mm四方に細かく切った。15mlチューブの底部を切り取り透析チューブをつけ、フィルターでゲルがでないように押さえ、100Vで泳動しゲルから溶出した（10〜１５時間）。
透析チューブに溶出されてきたタンパクをPBS に透析したところ、図１０に示すように、高度に精製されたGST-TIGA1融合タンパク質を回収することができた。これを免疫源とし、0.1 mg / ml x 2.5 ml ( 0.25mg )でウサギ 1 羽に免疫 ( 40μg / 回 )し、TIGA1遺伝子がコードするタンパク質に対する特異抗体の作製を行った。なお免疫は、ウサギ（日本白色種またはニュージーランドホワイト、メス、3.5〜4.0kg）を免疫用木箱に入れ、背中の毛をバリカンまたは鋏で刈り上げ、アルコール綿で消毒後、皮下を針の先でつまみ上げるようにして10〜20 μlづつ、10箇所ぐらいに分けて注射した。
【００６４】
(2)抗体価の確認
抗体価は、抗原感作プレートを利用して、ＥＬＩＳＡ法により確認した。
▲１▼抗原感作プレートの作製
GST-TIGA1融合タンパク質をPBSまたは、0.1M 炭酸バッファー pH 9.0で5 μg/mlに希釈し、50 μl / wellづつ96穴マイクロタイタープレートに分注した。溶液が乾かないように蓋をして、室温に１〜２時間、または４℃ 一晩静置した後、抗原を捨て、ブロッキングバッファー(PBS/5% BSA/1 % Sucrose/0.1 % NaN3)を200 μl/well分注し、室温１〜２時間静置した。ブロッキングバッファーを捨て、扇風機または乾燥機等で１〜２時間風乾後、４℃に保存した。
▲２▼ELISA法
抗血清を段階的に10倍づつ希釈した後、抗原感作プレートに50 μl/wellづつ分注し、室温で１時間反応させた。抗血清溶液を捨て、PBSで４回洗浄した。抗ウサギ IgG-HRP標識抗体を標識抗体希釈液で1000倍希釈し、50ul/wellづつ分注した後、室温で１時間反応させた。反応液を捨て、PBSで４回洗浄した。
発色基質(SIGMA:T-8540)を50 μl/wellづつ入れ、室温10分反応させた後、反応停止液(1.5N リン酸)を入れ、マイクロプレートリーダーでO.D.450を測定した。
(3)血清分離と処理
適当な抗体価を備えた抗血清が得られたところで、免疫ウサギから血液を採取し、一晩４℃に放置した後に、血清画分を遠心チューブに移し、3000 回転10分遠心した。血清を新しいチューブに移し、防腐剤として最終濃度 0.1 % のNaN3を添加した。抗血清は、４℃に保存した。
(4)抗体の精製
▲１▼アフィニティーカラムの作製
アフィゲル（BIO RAD）1 ml (wet vol. 0.86g) 相当量を量り、グラスフィルター上で約200 mlの1 mM HClで洗った。１５ml遠心チューブにゲルを移し、抗原約２mgを加え、PBSで３mlにメスアップし、ディスクローターに取り付けた後、４℃で一晩ゆっくり回した。その後、ゲルをカラムに移し、PBSで洗浄後、5 mlの1M Tris-HCl pH7.5を流し、その後カラムを止めて、室温２時間静置して活性基をブロッキングした。ブロッキングバッファーをPBS/0.1% NaN3に置換し、4℃に保存した。
なお、TIGA1を組み込んでいないGSTのみを含むベクターを導入し、発現させた大腸菌の菌体成分について、上記と同様の処理を行い、吸着用カラムとした。
▲２▼アフィニティーカラムによる抗血清処理
抗血清は、沈殿物を除くために、再度 20000〜25000回転５分遠心した後、上清をNo.2ろ紙でろ過した。この血清30 mlをPBS/0.2% Triton X100で２倍希釈後、PBSを落としたアフィニティーカラムにかけ、す通りの血清を回収した。PBSでろ液のO.D.がなくなるまで洗浄した後、溶出バッファー(0.17 M Glycine-HCl pH 2.3/10% glycerol)で溶出液を１mlづつ分取した。各溶出液のO.D.280を測定し、抗体の溶出画分を集め、吸収操作を行った。
アフィニティー精製した抗体を、吸収用カラムにアプライし、O.D.値がなくなるまで、す通り画分を集めた。精製した抗体は、PBS/0.1% NaN3に透析した。また透析後、O.D.280を測定し、1O.D.=0.7mg/mlとして、抗体濃度を求めた。
(5)特異性の確認
精製した抗体は、もう一度ELISA及びウェスタンブロッティングで特異性を確認した。ELISAでは、抗血清のチェックのときと同様に、今度は5〜10μg/mlからの希釈系列を作り、どの程度希釈したところまで発色するかを目安に抗体価を測定した。また、このときコントロールとして、TIGA1を含まないGSTのみを発現させた大腸菌の抽出物を感作したプレートでも同時にELISAを行い、反応性の有無を確認した。
【００６５】
Ｂ．試験結果
ウサギに免疫を行い、得られたウサギ血清の抗体価のチェックを行った。図１１には、ウサギ血清とGST-TIGA1融合タンパク質または、GSTのみとの反応性を示した。この図から明らかなように、GST-TIGA1融合タンパク質を免役したウサギには、融合タンパク質に対する抗体が発現されていることが確認された。但し、TIGA1に融合させたGSTに対しても特異性を有する抗体成分も発現されていた。
次に、これらの血清中のGSTや大腸菌の菌体成分と反応する抗体と特異抗体を分離するため、アフィニティー精製及びベクターのみを発現させた大腸菌の菌体成分を固相とした吸収用カラムによる精製を行った。精製後の抗体の反応特異性を確認した結果を図１２に示した。この図から明らかなように、精製後の抗体は、GSTに対する反応性がほとんど消失しており、GST-TIGA1融合タンパク質に対して優れた特異性と強い力価を備えたものであることが判明した。このようにして、GST-TIGA1融合タンパク質に対し特異的なポリクローナル抗体を作製することができた。
【００６６】
＜実施例１８＞TIGA1タンパク質の細胞内分布状態の観察
Ａ．試験方法
(1)導入用プラスミドベクターの構築
TIGA1を F1プライマーとR3プライマーとでPCR法によって増幅したフラグメントをAscI と NotI とで切断処理した精製済のフラグメントと、pcDNA3-HA(INVITROGEN社より購入したpcDNA3(ネオマイシン耐性遺伝子を含有している)のMCSのうち、EcoR I と EcoR V との間に、Anti-HA mAB(Babco社より購入)の認識部位であるヘマグルチニン(HA)のアミノ酸配列（１１個）をコードするDNAを挿入したもの）を AscI と NotI とで切断処理したフラグメントとをライゲースによってつなぎ合わせたプラスミドベクターを構築した。このプラスミド（pcDNA3-HA-TIGA1）を利用して、HAとTIGA1との融合タンパク質を発現させた。
(2)哺乳類細胞への遺伝子導入
前日に、2×105個/直径60mmシャーレとなるようにCOS-7細胞をプレーティングしておき、翌日に、滅菌済みの1.5mlチューブに250μlのOPTI-MEM(Serum free)を入れ、ここにトランスフェクションしたい精製プラスミドpcDNA3-HA(TIGA1を導入しないプラスミドベクターのみ)またはpcDNA3-HA-TIGA1を1〜2μgとLipofectamine Plus Reagent(GIBCO BRL)を8μl加え、ピペッティングにより混合した。室温で15分静置した。この間に、250μlのOPTI-MEMにLipofectamine(GIBCO BRL)を12μl加え、ピペッティングにより混合しておいた。反応終了後、両者を混合し、ピペッティングにより十分に混ぜておいた。これも室温で15分静置した。この間に各プレーティングセル(直径；60mm)をPBS(-) 、OPTI-MEM 2mlにて洗浄し、最後にOPTI-MEM 2mlを加えておいた。各ディッシュにトランスフェクション混合液を全量(0.5ml)滴下した後、培養器(37℃、5% CO2)で3時間インキュベートした。普段の倍量のウシ胎児血清を含んだ適切な培地を2.5ml(最終的な血清濃度は同じになる)加え、培養器(37℃、5% CO2)で24時間インキュベートした。
24時間後、トランスフェクションしたCOS-7細胞を8穴チャンバースライドグラスに蒔きなおした。これを更に、24時間培養した。
(3)間接蛍光抗体法
デカンテーションにより、チャンバー内の培地を捨てた。これに4%パラホルムアルデヒド-PBS(-)溶液を0.5ml/well加え、室温で10分間放置することにより、細胞を固定した。デカンテーションにより、固定液を捨て、0.1% Triton X-100-PBS(-)溶液を0.5ml/well加え、室温で10分間放置することにより、細胞を浸透化させた。デカンテーションにより浸透化液を捨てた後、2% BSA-PBS(-)溶液を50μl/well加え、室温にて15分間静置することでブロッキングを行った。ブロッキング液を捨てた後、一次抗体Anti-HA mAb(Babco,clone 16B12) 1μg/μl (100倍希釈)を50μl/well加え、湿潤箱中で室温1時間、静置した。PBS(-)にて5分間×3回洗浄を行った後、二次抗体Texas-Red標識Anti-mouse pAb(25倍希釈)を50μl/well加え、湿潤箱中で暗所にて室温で1時間、反応させた。PBS(-)にて5分間×1回洗浄を行った後、核を染めるためにHoechst 33258 (1mg/ml)を500倍希釈(最終濃度2μg/ml)したものを50μl/well加え、湿潤箱中で暗所にて室温で5分間、反応させた。PBS(-)にて5分間×3回洗浄を行った後、封入した。このスライドグラスの観察は、共焦点レーザー顕微鏡(model 510,Carl Zeiss)にて行った。
【００６７】
Ｂ．試験結果
TIGA1がコードする蛋白質のアミノ酸配列中に唯一認められたモチーフはN末端の25-45番目に位置する膜貫通ドメインのみであった。TIGA1は蛋白としてのサイズが非常に小さく、リガンドとして機能していることも予測されたが、膜貫通ドメインを有していたことから膜蛋白として機能している可能性が示唆された。過去の実験データから増殖停止期にある細胞から膜成分を抽出し、それを増殖中の細胞にかけてやるとその増殖が抑制されることが証明されているが、TIGA1はまさにその様なものの一つであると考えられた。
また、哺乳動物細胞中のTIGA1の局在について調べたところ、その結果は図１３に示すようであった。Hoechst 33258で処理した細胞では、DNAが存在する部位に蛍光が観察された。また、プラスミドを導入した細胞において、一次抗体Anti-HA mAbと二次抗体Texas-Red標識Anti-mouse pAbとで蛍光を観察したところ、TIGA1を導入しないプラスミドベクターのみでは、ほとんど蛍光が観察されなかった。一方、TIGA1を導入したプラスミドでは、蛍光が細胞内小器官に局在して観察されたことから、TIGA1がコードするタンパク質が膜蛋白である可能性が支持された。以上から、TIGA1は一種のレセプターとして機能している可能性が示唆された。
【００６８】
＜実施例１９＞各肺癌細胞株におけるTIGA1の発現状態について
TIGA1は肺癌、特に小細胞癌の臨床サンプルの約80%と非常に高頻度でLOHが認められる領域5q21-22に位置している。そこで、実際の各肺癌細胞株におけるTIGA1の発現について、ノザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法によって調べたところ以下のような結果となった。
各種の肺癌細胞株(EBC-1,Lu-65,Lu-130,Lu-134-A,Lu-135,Lu-139,Lu-140)について、ノザンハイブリダイゼーション法によりTIGA1の発現について調べたところ、図１４に示すように、全体的にシグナルが弱く、EBC-1、Lu-140等ではほとんど発現が認められなかった。
しかし、TIGA1 cDNA上のセンスプライマーF2とアンチセンスプライマーR1との組み合わせでRT-PCRを行った結果、図１５に示すように、全ての肺癌細胞株でTIGA1の発現が認められた。また同時に、センスプライマーF1とアンチセンスプライマーR1の組み合わせでRT-PCRを行ったところ、全ての肺癌細胞株で目的のサイズにバンドの増幅は認められなかった(データは示していない)。但し、TIGA1 cDNA全長を単離するために行ったコロニーハイブリダイゼーション法や各種cDNAライブラリーを鋳型としたPCR法で全長が単離できなかったことから考慮して、TIGA1 cDNAのセンスプライマーF2より5'上流における高次構造形成の可能性が示唆され、この高次構造により逆転写反応が5'上流まで完全に進まないため、センスプライマーF1ではPCR反応がかからないという可能性があると考えられた。従って、次に各肺癌細胞株におけるTIGA1 ORF全長領域をPCRでスクリーニングするために、各肺癌細胞株から抽出したゲノムDNAを鋳型としたnested-PCR法を行った。
この結果、図１６に示すように、Lu-135、Lu-139およびLu-140において、センスプライマーF1とアンチセンスプライマーR3の組み合わせでは、目的のサイズにバンドの増幅が認められなかった。つまり、TIGA1 cDNAのセンスプライマーF2より5'上流の開始ATGを含む領域での欠失の可能性が示唆された。このことから、これらの肺癌細胞株では正常なTIGA1 タンパクを発現していない可能性が考えられた。
【００６９】
＜実施例２０＞TIGA1タンパク質のガン細胞に対する効果（ガン細胞を用いたコロニー形成阻止試験）
Ａ．試験方法
(1)癌細胞への遺伝子導入
前日に、3×105個/直径60mmシャーレとなるように肺癌細胞株EBC-1をプレーティングしておいた。翌日に、滅菌済みの1.5mlチューブに250μlのOPTI-MEM(Serum free)を入れ、ここにトランスフェクションしたい精製プラスミドpcDNA3-HA(ベクタープラスミドのみ。コントロールとして細胞に導入する。)またはpcDNA3-HA-TIGA1を1〜2μgとLipofectamine Plus Reagent(GIBCO BRL)を8μl加え、ピペッティングにより混合し、室温で15分静置した。この間に、250μlのOPTI-MEMにLipofectamine(GIBCO BRL)を12μl加え、ピペッティングにより混合しておいた。反応終了後、両者を混合し、ピペッティングにより十分に混ぜておいた。これも室温で15分静置した。この間に各プレーティングセル(直径；60mm)をPBS(-) 、OPTI-MEM 2mlにて洗浄し、最後にOPTI-MEM 2mlを加えておいた。各ディッシュにトランスフェクション混合液を全量(0.5ml)滴下した後、培養器(37℃、5% CO2)で3時間インキュベートした。普段の倍量のウシ胎児血清を含んだ適切な培地を2.5ml(最終的な血清濃度は同じになる)加え、培養器(37℃、5% CO2)で24時間インキュベートした。
24時間後、直径100mmシャーレにプレーティングしなおした。更に24時間培養した後、G418(800μg/ml)を含む選択培地に交換した。3〜4日ごとにG418入りの選択培地を交換し、約3週間培養を継続して行った。
(2)ギムザ染色
培地を除去後、約10mlのPBS(-)にて洗浄を一回行った。100%メタノールを約4〜5ml加え、細胞固定を行った。室温で約1分間放置した後、メタノールを完全に除去した。10%ギムザ-PBS(-)溶液をシャーレに十分量加えた。室温に約30分間静置した。デカンテーションによりギムザ液を除いた後、水道水で軽くすすいだ。
室温に一晩放置し、シャーレを乾燥させた。翌日、コロニーの観察を行った。
【００７０】
Ｂ．試験結果
図１７に示すように、コントロール（VectorのpcDNA3-HAを導入した細胞株）では、EBC-1細胞がシャーレ当たり、二百〜三百個程度のコロニーを形成した。一方、pcDNA3-HA-TIGA1を導入したEBC-1細胞では、シャーレ当たり、二十〜三十個程度のコロニーしか観察されず、コントロールに比べると約10分の1以下の個数であった。また、個々のコロニーについて見ると、コントロールのコロニーの大きさに比べると、明らかにTIGA1遺伝子を導入したEBC-1のコロニーの大きさが小さかった。以上のことから、TIGA1遺伝子が肺癌細胞株EBC-1のコロニー形成を抑制したことが判明し、肺癌細胞株EBC-1におけるTIGA1の増殖抑制能が認めれらた。
本発明の技術的範囲は、上記した実施形態によって限定されるものではない。
また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な細胞増殖抑制遺伝子、その遺伝子がコードするタンパク質、その遺伝子を含む組換えベクター、その組換えベクターを保持する形質転換細胞、その遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体、その遺伝子のDNA配列の一部を含むDNAをプライマー・プローブ・またはマーカとして使用し、被検査用DNAとハイブリダイズさせることを特徴とする遺伝子検査方法が提供される。
【００７２】
【配列表】
0004567140.tif 000004
0004567140.tif 000005
0004567140.tif 000006
0004567140.tif 000007
0004567140.tif 000008
0004567140.tif 000009
0004567140.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】  Log期、G0期または老化期におけるcDNAライブラリーのインサートDNAサイズを示すグラフ
【図２】  サブトラクションライブラリー作製のスキームを示す図
【図３】  TIGA1遺伝子の発現が日時の経過によって変化する様子をタイムコースを追ってノザンハイブリダイゼーションによって観察した写真
【図４】  各組織におけるTIGA1の発現を確認するためのノザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真
【図５】  胎盤由来cDNAライブラリーをTIGA1の塩基配列に基づく各種プライマーセットを使用して nested-PCR によりバンドの有無を確認したときの電気泳動パターンを示す写真
（Ａ）１ｓｔＰＣＲ後の産物を示す写真
（Ｂ）２ｎｄ（nested）ＰＣＲ後の産物を示す写真
【図６】  ゲノムTIGA1遺伝子の構造を示す図
【図７】  各種ESTクローンとTIGA1 cDNA との塩基配列を比較した図
【図８】  GST-TIGA1融合タンパク質の発現が大腸菌の増殖状態に与える影響を確認したグラフ
【図９】  大腸菌によって GST-TIGA1 融合タンパク質を発現させたときの様子を示すSDS-PAGEパターンの写真
【図１０】  GST-TIGA1融合タンパク質を精製したときのSDS-PAGEパターンの写真
【図１１】  ウサギ血清の特性と抗体価とを評価したグラフ
【図１２】  ウサギ血清から精製した抗TIGA1タンパク質ポリクローナル抗体の特性と抗体価とを評価したグラフ
【図１３】  蛍光抗体法を用いてTIGA1がコードするタンパク質の細胞内局在を確認するための写真
【図１４】  各種の肺癌細胞株におけるTIGA1の発現を確認するためのノザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真
【図１５】  各種の肺癌細胞株におけるTIGA1の発現を確認するための RT-PCR
（Ａ）TIGA1遺伝子におけるプライマーの位置を示す図
（Ｂ）ＰＣＲ後の産物を示す写真
【図１６】  各種の肺癌細胞株におけるゲノムTIGA1を確認するための nested-PCR
（Ａ）TIGA1遺伝子におけるプライマーの位置を示す図
（Ｂ）ＰＣＲ後の産物を示す写真
【図１７】  TIGA1がコードするタンパク質が肺癌細胞株EBC-1のコロニー形成に与える影響を確認したときのシャーレの写真
Vector：TIGA1遺伝子を含まないベクタープラスミドのみを導入したもの
hTIGA1：TIGA1遺伝子を含むベクタープラスミドを導入したもの
【図１】
0004567140.tif 000011
【図２】
0004567140.tif 000012
【図３】
0004567140.tif 000013
【図４】
0004567140.tif 000014
【図５】
0004567140.tif 000015
【図６】
0004567140.tif 000016
【図７】
0004567140.tif 000017
【図８】
0004567140.tif 000018
【図９】
0004567140.tif 000019
【図１０】
0004567140.tif 000020
【図１１】
0004567140.tif 000021
【図１２】
0004567140.tif 000022
【図１３】
0004567140.tif 000023
【図１４】
0004567140.tif 000024
【図１５】
0004567140.tif 000025
【図１６】
0004567140.tif 000026
【図１７】
0004567140.tif 000027