(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．完全なまたは分割したトランスジェニック植物材料を得るステップと、
ｂ．前記トランスジェニック植物材料を脱水するステップと、
ｃ．前記脱水ステップの前又は後に、前記トランスジェニック植物材料を混合してホモジネートにするステップと
を含み、これらのステップによりＺＰ３またはそのエピトープと大腸菌エンテロトキシンＢサブユニットとを含む異種タンパク質を発現するトランスジェニック植物の安定な乾燥ホモジネートが産生される、前記異種タンパク質を発現するトランスジェニック植物の安定な乾燥ホモジネートの産生方法であって、トランスジェニック植物の前記安定な乾燥ホモジネートおよびサポニンアジュバンドの動物への投与が、前記動物において前記ＺＰ３に対する粘膜免疫応答を誘導する、方法。
【請求項２】
ＺＰ３またはそのエピトープと大腸菌エンテロトキシンＢサブユニットとを含む異種タンパク質を含有する脱水されたトランスジェニック植物材料を含む、安定な乾燥ホモジネートであって、トランスジェニック植物の前記安定な乾燥ホモジネートおよびサポニンアジュバンドの動物への投与が、前記動物において前記ＺＰ３に対する粘膜免疫応答を誘導する、ホモジネート。
【請求項３】
薬学的に許容可能なキャリアと混合されている、請求項２の安定な乾燥ホモジネートを含む医薬組成物。
【請求項４】
ＺＰ３またはそのエピトープと大腸菌エンテロトキシンＢサブユニットとをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物材料を含む食用トランスジェニック植物であって、前記トランスジェニック植物材料およびサポニンアジュバンドの動物への投与が、前記ＺＰ３に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記核酸が植物染色体に組み込まれている、植物。
【請求項５】
ＺＰ３またはそのエピトープと大腸菌エンテロトキシンＢサブユニットとをコードする核酸分子を含む、避妊を誘導するのに効果的な量のトランスジェニック植物材料を、サポニンアジュバンドとともにヒトを除く動物に投与するステップを含み、前記投与により前記ＺＰ３に対する粘膜免疫応答が前記動物に誘導される、避妊方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は、トランスジェニック植物由来のワクチン、抗体、または他の治療化合物などの薬学的に活性なタンパク質を産生するための処理技術ならびに免疫避妊のためのヒトおよび動物への投与、疾患に対するワクチン接種、または他の免疫反応性化合物の感染に対する治療に関する。植物ベースのワクチンの開発は、ヒトおよび動物のワクチン接種に利用可能なアプローチを有意に進歩させた。ワクチン、抗体、ならびに他のヒトおよび動物治療の開発のためのトランスジェニック植物の使用により、治療タンパク質産生の有効性を増大させるだけでなく、初期産生費用を実質的に減少させた。
【背景技術】
【０００２】
植物ベースのワクチンの産生に関して、トランスジェニック植物におけるタンパク質発現が有意に進歩した。例えば、米国特許第５，６７９，８８０号、同第５，４８４，７１９号、同第５，６８６，０７９号、および米国特許出願２００２／０００６４１１号に記載のように、種々の発現形態、凝集体、または融合物を使用して、ワクチンサブユニット、抗体、および治療または避妊タンパク質の産生が増大されている。しかし、トランスジェニック植物ワクチンテクノロジーの現在の状況では、トランスジェニック植物材料から医薬品タンパク質を精製して取り出すか、画一の未処理粗植物組織を消費することが依然として必要である。不運なことに、投与可能な植物由来の医薬品産生のためのこれらの選択肢は、固有の欠点を有する。
【０００３】
好ましい植物由来の医薬品は、経口投与することができる標準化植物組織である。より詳細には、植物材料を周囲温度で保存、輸送、および投与することができることが好ましい。しかし、非精製トランスジェニック植物ベースのワクチンは、以下の固有の問題を有する。ｉ）植物によってタンパク質発現レベルが変化すること、およびｉｉ）腐敗性（すなわち、タンパク質分解）。果実、塊茎、根、葉、または任意の他の植物組織などの新たに採取した産物は、従来の薬学的要件と比較してその比較的短い貯蔵寿命に制限される。さらに、異なる植物、クローン、または植物組織の間で見出されるトランスジェニックタンパク質の蓄積レベルの変動により薬学的適用で必須である用量の一貫性の達成が非常に困難である。
【０００４】
従来の薬学的テクノロジーにより、医薬品タンパク質の抽出、精製、および濃縮方法が得られるが、これは高価であり、精製生成物を冷蔵する必要があり、植物細胞自体によってトランスジェニックタンパク質の保護的封入が不可能である。従って、植物によって異なるタンパク質発現の欠点を回避し、元の植物材料からさらに精製する必要のない安定なトランスジェニック植物ベースの医薬品の産生方法が当分野で必要である。本明細書中に記載の処理方法により、広範な種々の適用にわたって使用することができる室温で安定且つ均一な処方物の産生手段が得られる。さらに、環境に対して安定なホモジネートを固有にプールし、バッチベースでバッチの品質管理試験を行うことができる。さらに、記載されたトランスジェニック処理方法により、広範な薬学的処方物を有効且つ費用効果的に産生することができる処理全体にわたってアジュバント、緩衝液、抗酸化剤、安定剤、または抗原粉末を都合よく添加することが可能である。安定な乾燥ホモジネートを、ワクチン接種および疾患治療に使用することができるだけでなく、受精の防止にも使用することができる。
【０００５】
受精は、精子と卵の表面上での重要な調節分子間の複雑な相互作用である。これらの分子が生殖過程で果たす極めて重要な役割は、哺乳動物種の受胎能の制御をターゲットとできると思われる。
【０００６】
全ての哺乳動物の卵は、透明帯（卵の精子受容体を提供する３つの糖タンパク質（ＺＰ１、ＺＰ２、およびＺＰ３）から構成される比較的単純な被覆）で囲まれている。いくつかの非哺乳動物種の透明帯もまた、第４の糖タンパク質（ＺＰ４）を含む。透明帯の糖タンパク質成分は、マウスで十分に定義されている受精および初期発達の際に特定の機能を果たす。ＺＰ１は、ＺＰ２およびＺＰ３のフィラメントと架橋する構造タンパク質である。受精時に、精子は最初にＺＰ３と結合し、精子アクロソーム反応を誘導する。アクロソームの誘導後、ＺＰ２は、精子の透明帯の貫通に必要な第２の精子受容体として作用する。受精後、ＺＰ２のタンパク質分解およびＺＰ３の修飾は、多精阻止に関与すると考えられる。
【０００７】
受精時の透明帯の重要な役割、卵母細胞の成長におけるその固有の発現、および強力な免疫原性により、透明帯は免疫避妊ワクチンの開発のための魅力的な標的となっている（Ｅｐｉｆａｎｏ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．、１９９４、６、３１９に概説されている）。透明帯の組織全体または構成要素の免疫化により、霊長類、ウサギ、げっ歯類、およびイヌを含むいくつかの種で受精が阻害されることが示されている（Ｐｒａｓａｄら、１９９６、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ．、５０、１４３に概説されている）。これらの引例に記載の組成物は受精を阻害できる一方で、ダーティングまたは注射により非経口投与しなければならず、したがって、経済的で広範に使用するには実用的ではない。これらの引例に記載の組成物は、本発明と対照的に、摂取用の未処理の餌（すなわち、食物）または処理材料として有効に経口投与することができない。
【０００８】
Ｆｉｔｃｈｅｎら（１９９５、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３、１０５１）は、注射による標的またはモデル動物種に精製送達するための植物中の避妊タンパク質の産生を試みた。この例では、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）外殻タンパク質配列内でマウスＺＰ３エピトープを操作し、ＴＭＶ感染時にタバコ中で発現させた。ウイルス粒子（ウイルスの外表面上のＺＰエピトープを表示する）を、非経口投与のために植物材料から疎精製した。しかし、ウイルス粒子は、マウスモデルの産仔数の減少に有効ではなかった。Ｆｉｔｃｈｅｎらは、動物の避妊の誘導方法や経口投与によって平均産仔数が少なくとも５０％減少するトランスジェニック植物の動物への経口投与方法については言及していない。
【０００９】
摂取用の未処理の餌または食品として動物に好適に経口投与することができ、投与した動物の産仔数が有意に減少する植物組成物が当分野で必要とされている。発現のための植物ウイルスの使用を回避することが当分野で必要である。従って、植物細胞自体によって直接的に避妊タンパク質を発現し、それにより動物による植物材料の消費の際に粘膜免疫応答が得られることが当分野で必要である。
【００１０】
推定人口が６０億人の水準を越えて拡大するにつれて、先進国の環境活動によって他の野生動物種の個体数の分布が重大に影響を受けつづけている。２０世紀の間に、人類の陸地および水資源の使用は、動物種の個体群動態によりいっそう深刻な影響を与えた。世界自然保護基金は、現在、今後２０年以内に世界の１／３もの種が絶滅し得ると予測している。特定の動植物集団の減少による絶滅または生命にかかわる危機に加えて、特定の種の過剰な増加もまた現代人類に影響を受けている。特定の例として、草食動物の生存は、時代を超えて、地理的封じ込め、天敵、気候条件、および食物の利用可能性などの自然力によって利用されている。多すぎて列挙できないが、影響のうち、工業世界は、農業および建築のために森林を伐採し、肉食動物の個体数および天然の範囲を減少させ、地理的障壁を越えて種を導入し、気候極限に対して不自然なシェルターを作製し、動物の権利および人間の利害が対立する文化を生み出した。現在、過剰な草食動物がヒトとの共存および農業生産と直接的に対立している哺乳動物の例が存在する。種々の理由のために、これらの哺乳動物種の個体数抑制が達成できなくなり、代替方法を探されている。
【００１１】
従って、動物種の無計画な増殖に起因する経済的、環境的、または動物の繁栄に対する損害を緩和するための人道的な人口管理技術の開発が必要である。さらに、効率的かつ費用効果的に作製することができる処方物を使用してこれを行うことが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、トランスジェニック植物生物医薬品の作製方法を提供する。本明細書中に記載の方法により、室温で安定であり、均一で、薬学的に強力な乾燥トランスジェニック植物材料を産生可能である。一般に、完全な（ｉｎｔａｃｔ）または分割した（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）トランスジェニック植物のいずれかを、当分野で公知の食物処理技術によって乾燥または凍結乾燥させる。医薬品タンパク質をさらに抽出、精製、または沈殿させることなく、生物医薬品生成物を含む乾燥ホモジネートを治療に使用することができる。安定な乾燥ホモジネートを、ワクチン接種、疾患の治療、および避妊薬として使用することができる。本発明は、さらに、受精および繁殖力を制御するための安全且つ有効なワクチンを提供する。したがって、本発明は、当分野の安定な植物ベースの医薬品の有効な作製方法の要求ならびに家畜、フィードロット種、捕獲動物標本、鳥獣保護区の個体、およびヒトの便利で費用効果のある個体数抑制方法の要求に応えるものである。
【００１３】
本明細書中に記載の植物ベースの医薬品の産生および使用方法を開示する。
【００１４】
本発明は、ｉ）完全なまたは分割したトランスジェニック植物材料を得るステップと、ｉｉ）前記トランスジェニック植物材料を脱水するステップと、およびｉｉｉ）前記トランスジェニック植物材料を前記脱水ステップの前後に混合してホモジネートにするステップとを含み、それにより異種医薬品タンパク質を発現するトランスジェニック植物の安定な乾燥ホモジネートが作製される、異種タンパク質を発現するトランスジェニック植物の安定な乾燥ホモジネートの作製方法を提供する。
【００１５】
１つの実施形態では、脱水を、前記材料の凍結乾燥、風乾、または噴霧乾燥によって行う。
【００１６】
別の実施形態では、前記方法は、混合ステップの前に脱水材料を分割するステップをさらに含む。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、前記方法は、賦形剤を添加するステップをさらに含む。
【００１８】
本発明は、さらに、上記方法によって作製された安定な乾燥ホモジネートを提供する。
【００１９】
１つの実施形態では、安定な乾燥ホモジネートは抗原または抗体を含む。
【００２０】
本発明は、トランスジェニックタンパク質を含む脱水トランスジェニック植物材料を含む安定な乾燥ホモジネートを提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、薬学的に許容可能なキャリアと混合したトランスジェニックタンパク質を任意選択的に含む、脱水トランスジェニック植物材料を含む安定な乾燥ホモジネートを提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、薬学的に許容可能なキャリアと混合したトランスジェニックタンパク質を任意選択的に含む、脱水トランスジェニック植物材料を含む安定な乾燥ホモジネートを含む医薬組成物を投与するステップを含む、動物の疾患の予防方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、薬学的に許容可能なキャリアと混合したトランスジェニックタンパク質を任意選択的に含む、脱水トランスジェニック植物材料を含む安定な乾燥ホモジネートを含む医薬組成物を動物に投与するステップを含む、動物にトランスジェニックタンパク質を送達する方法を提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、安定な乾燥ホモジネート中に存在するトランスジェニックタンパク質はワクチンである。
【００２５】
本発明は、さらに、トランスジェニック植物ベースの医薬品を使用した避妊方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ウイルス中間体の非存在下での避妊タンパク質の植物染色体発現を使用する。
【００２７】
本発明は、避妊ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物材料を動物に投与するステップを含み、および前記投与により前記動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する避妊方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、避妊誘導有効量の避妊ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物材料を動物に投与するステップを含み、および前記投与により前記避妊タンパク質に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導される避妊方法を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、避妊ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物材料を動物に投与するステップと、前記核酸が植物染色体に組み込まれるステップを含み、前記避妊方法により前記トランスジェニック植物材料を投与した前記動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する避妊方法を提供する。
【００３０】
本発明は、さらに、避妊誘導有効量の避妊ペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物材料を動物に投与するステップと、前記核酸が植物染色体に組み込まれ、
前記避妊方法により前記トランスジェニック植物材料を投与した前記動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する避妊方法を提供する。
【００３１】
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料は、葉、根、芽（ｓｈｏｏｔ）、茎、果実、塊茎、花、および種子からなる群から選択される。
【００３２】
さらに好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料は食用である。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、核酸によってコードされる避妊ポリペプチドは、透明帯糖タンパク質、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ、ＬＨ、ＬＤＨ、および抗精子抗原からなる群から選択される。
【００３４】
より好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４からなる群から選択される。
【００３５】
より好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ３である。
【００３６】
好ましい実施形態では、避妊タンパク質は、種特異的である。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、避妊タンパク質をコードする核酸は、粘膜標的タンパク質をコードする配列をさらに含む。
【００３８】
より好ましい実施形態では、粘膜標的タンパク質は、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢである。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料を完全な植物として投与する。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料を粘膜送達によって投与する。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態では、粘膜投与は、経口、鼻腔、または眼への送達である。
【００４２】
本発明は、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物材料を動物に投与するステップを含み、前記投与により前記避妊タンパク質に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記投与により動物の繁殖周期あたりの平均出生が数少なくとも５０％減少する、粘膜免疫応答の誘導方法を提供する。
【００４３】
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料は、葉、根、芽、茎、果実、塊茎、花、および種子からなる群から選択される。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、トランスジェニック植物材料が食用植物の形態である。
【００４５】
さらに別の実施形態では、核酸によってコードされる避妊ポリペプチドは、透明帯糖タンパク質、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ、ＬＨ、ＬＤＨ、および抗精子抗原からなる群から選択される。
【００４６】
好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４からなる群から選択される。
【００４７】
さらに好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ３である。
【００４８】
別の実施形態では、避妊タンパク質は、種特異的である。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、避妊ポリペプチドをコードする核酸は、粘膜標的タンパク質をさらにコードする。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、粘膜標的タンパク質は、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢである。
【００５１】
本発明は、トランスジェニック植物材料の動物への投与により前記避妊タンパク質に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記投与により動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物材料を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００５２】
本発明はまた、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列がウイルス粒子上に発現されず、前記トランスジェニック植物材料の動物への投与により前記避妊タンパク質に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導される、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物材料を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００５３】
本発明は、さらに、投与により前記トランスジェニック植物材料を投与した動物による繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物材料を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００５４】
本発明は、さらに、トランスジェニック植物材料の動物への投与により前記避妊タンパク質に対する前記動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記核酸が植物染色体に組み込まれる、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するトランスジェニック植物材料を含む食用トランスジェニック植物を提供する。
【００５５】
１つの実施形態では、避妊ポリペプチドは、透明帯糖タンパク質、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ、ＬＨ、ＬＤＨ、および抗精子抗原からなる群から選択される。
【００５６】
好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４からなる群から選択される。
【００５７】
より好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質またはそのフラグメントは、種特異的である。
【００５８】
別のより好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ３またはそのフラグメントである。
【００５９】
１つの実施形態では、核酸配列は、粘膜標的タンパク質をさらにコードする。
【００６０】
好ましい実施形態では、粘膜標的タンパク質は、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢである。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、植物は、単子葉植物である。
【００６２】
さらに別の好ましい実施形態では、植物は、双子葉植物である。
【００６３】
さらに別の好ましい実施形態では、植物は、トマト植物、イネ植物、小麦植物、トウモロコシ植物、ニンジン植物、ジャガイモ植物、リンゴ植物、ダイズ植物、アルファルファ植物、ウマゴヤシ属（ｍｅｄｉｃａｇｏ）植物、食用野菜植物、および果実植物からなる群から選択される。
【００６４】
本発明は、核酸ベクターが避妊ポリペプチドをコードし、前記核酸ベクターが前記植物細胞の染色体に組み込まれて発現し、前記植物細胞の動物への投与により前記動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する、核酸ベクターを含む植物細胞を提供する。
【００６５】
１つの実施形態では、核酸ベクターによってコードされる避妊ポリペプチドは、透明帯糖タンパク質、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ、ＬＨ、ＬＤＨ、および抗精子抗原からなる群から選択される。
【００６６】
さらなる実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４からなる群から選択される。
【００６７】
なおさらなる実施形態では、避妊ポリペプチドは、種特異的である。
【００６８】
好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ３である。
【００６９】
１つの実施形態では、核酸ベクターは、粘膜標的タンパク質をさらにコードする。
【００７０】
好ましい実施形態では、粘膜標的タンパク質は、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢである。
【００７１】
１つの実施形態では、植物細胞は、単子葉植物から得られる。
【００７２】
１つの実施形態では、植物細胞は、双子葉植物から得られる。
【００７３】
好ましい実施形態では、植物細胞は、トマト植物細胞、イネ植物細胞、小麦植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ニンジン植物細胞、ジャガイモ植物細胞、リンゴ植物細胞、ダイズ植物細胞、食用野菜植物細胞、および果実植物細胞からなる群から選択される。
【００７４】
本発明は、さらに、避妊ポリペプチドをコードする核酸配列と、植物細胞中の避妊ポリペプチドの合成を指示することができる避妊ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された植物機能性プロモーターとを含み、前記プラスミドベクターを含む植物細胞の動物への投与により動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記投与により動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％に減少する、植物細胞を形質転換するためのプラスミドベクターを提供する。
【００７５】
１つの実施形態では、核酸配列によってコードされる避妊ポリペプチドは、透明帯糖タンパク質、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ、ＬＨ、ＬＤＨ、および抗精子抗原からなる群から選択される。
【００７６】
好ましい実施形態では、透明帯糖タンパク質は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４からなる群から選択される。
【００７７】
さらなる実施形態では、植物細胞は、食用植物から得られる。
【００７８】
１つの実施形態では、プラスミドベクターは、粘膜標的タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
【００７９】
好ましい実施形態では、粘膜標的タンパク質は、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢである。
【００８０】
本発明は、さらに、動物が摂取することができる上記のトランスジェニック植物の少なくとも一部を含み、前記トランスジェニック植物の摂取により動物の粘膜免疫応答が誘導され、前記摂取により動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する、食品組成物を提供する。
【００８１】
本発明は、さらに、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた上記のトランスジェニック植物の少なくとも一部を含み、前記医薬組成物の動物への投与により動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも５０％減少する、医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、組成物の投与により動物の繁殖周期あたりの出生数が少なくとも５０％減少する、動物への経口投与用に処理したトランスジェニック植物材料を含む混合物中にサポニンアジュバントを含む組成物を提供する。
【００８３】
本明細書中で使用される、「避妊薬」は、避妊のために使用される薬剤をいう。「避妊」は、１繁殖周期あたりの動物の出生数の減少または有性生殖における精子による卵母細胞の受精阻止と定義する。受精の「阻止」を、「避妊薬」が下記のように投与された雌動物の出生数の減少によって確認することができる。本明細書中で使用される、「避妊薬」は、最低でも１繁殖周期における記載の受精の減少もしくは受精阻止、または接合子着床の防止をいう。
【００８４】
本明細書中で使用される、「有性生殖」は、哺乳動物のための唯一の生殖形態をいう。これは、生殖細胞（配偶子：雌では卵および雄では精子）の一方のタイプが、他方のタイプと受精して、新しい細胞（接合子と呼ばれる）を産生して、新しい生物を発生させることを含む。雌または雄の生殖器官で卵（複数の卵）または精子が産生される。精子が卵と受精した後、１回の有性生殖過程において、通常、受精卵を保有する雌は、子孫が再生する（誕生する）までより成熟した卵を産生することができない。
【００８５】
本明細書中で使用される、１「繁殖周期」は、次の生殖を行うことができる前の成熟卵の受精および子孫の誕生を含む有性生殖の１回の過程をいう。本発明の１「繁殖周期」はまた、別の方法で起こり得る避妊によって遮断された潜在的な１回の生殖過程をいう。
【００８６】
本明細書中で使用される、「避妊タンパク質」は、繁殖周期あたり動物の出生数を減少させるポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントをいう。同腹子の平均出生数が３匹以上である動物種では、「避妊タンパク質」は、産仔数を少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、さらに１００％まで減少させるポリペプチドである。同腹子の平均出生数が１匹または２匹である動物種では、「避妊タンパク質」は、産仔数を少なくとも５０％（すなわち、２匹から１匹に減少）および１００％まで（すなわち、１匹または２匹から０匹に減少）減少させるタンパク質またはポリペプチドをいう。あるいは、「避妊タンパク質」は、精子による卵母細胞の受精を防止するか、受精卵の動物の子宮への着床を妨げることにより平均産仔数が上記のように減少するポリペプチドをいうことができる。あるいは、「避妊タンパク質」は、動物の粘膜免疫応答を刺激することができ、免疫応答は「避妊タンパク質」に対して惹起するポリペプチドをいう。抗体は、性ホルモン、卵母細胞、または精母細胞上の部位に結合し、性的成熟、卵母細胞の受精、および／または動物の子宮への受精卵母細胞の着床を防止し、それにより産仔数を減少させることができる。本発明で有用な「避妊タンパク質」の例には、透明帯糖タンパク質、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、および抗精子抗原が含まれる。「抗精子抗原」には、ＳＰ５、ＳＰ５６、フェルチリン、ＰＨ３０、ＬＤＨ−Ｃ４、およびＰ１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書中で使用される、「避妊誘導有効量」は、避妊を誘導するトランスジェニック植物材料の量をいう。好ましくは、「避妊誘導有効量」のトランスジェニック植物材料は、産仔数を１０％、３０％、６０％、８０％、および１００％まで減少させる植物材料の量である。繁殖周期あたりの同腹子の平均出生数が１匹または２匹である動物種では、「避妊有効量」のトランスジェニック植物材料は、産仔数を少なくとも５０％および１００％まで減少させる植物材料の量をいう。本明細書中で使用される、「避妊誘導有効量」は、重量で１ｇの乾燥トランスジェニック植物材料あたり少なくとも約５μｇの避妊タンパク質、好ましくは１ｇの乾燥トランスジェニック植物重量あたり少なくとも１０μｇ、４０μｇ、６０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１２０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、またはそれ以上の避妊タンパク質であるトランスジェニック植物材料の量をいう。
【００８８】
本明細書中で使用される、「トランスジェニック植物」は、その細胞が「異種」外来遺伝子を安定に発現し、前記外来遺伝子は植物細胞染色体に組み込まれ、且つウイルスに固有のウイルスベクター配列を保有せず、前記外来遺伝子は植物の次の世代に継承されて宿主植物細胞染色体から発現することができる植物をいう。「トランスジェニック植物」は、「複数のトランスジェニック細胞」を含む。「トランスジェニック植物」は、完全な植物、またはその一部（根、茎、葉、柄、種子、果実、塊茎、花、および花粉などが含まれるが、これらに限定されない）をいう。異種外来遺伝子の例には、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）、トリインフルエンザ血球凝集抗原（ＡＩＶ−ＨＡ）、ニューキャッスル病ウイルスフラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＨＮ）、透明帯糖タンパク質３（ＺＰ３）、およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
本明細書中で使用される、「異種タンパク質」は、「異種遺伝子」から発現したタンパク質をいう。「異種遺伝子」は、最終的に発現される植物内の植物種のゲノム以外の１つまたは複数の供給源から得られるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントである。供給源は天然由来のものであり得る（例えば、遺伝子を、細菌、ウイルス、酵母、および真菌などの生命体または異なる植物種の別の供給源から得ることができる）。供給源はまた、合成物であり得る（例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントを、化学合成によってインビトロで調製することができる）。「異種」という語を、遺伝子フラグメントの供給源が最終的に発現する植物ゲノムの他の場所に存在する状況でも使用することができる。「異種タンパク質」は、抗原または他の治療タンパク質（エンドスタチンまたはアンギオスタチンなどが含まれるが、これらに限定されない）でもよい。「異種タンパク質」はまた、抗体または抗体複合体（例えば、「プランチボディ」（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ））でもよい。「プランチボディ」は、植物中で作製される抗体である。
【００９０】
本明細書中で使用される、「トランスジェニック植物材料」は、本明細書中に定義されているように処理されているトランスジェニック植物または処理されていないトランスジェニック植物をいう。本発明の「トランスジェニック植物材料」は、完全なトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部（「トランスジェニック葉」、「トランスジェニック根」、「トランスジェニック芽」、「トランスジェニック茎」、「トランスジェニック果実」、「トランスジェニック塊茎」、「トランスジェニック花」、および「トランスジェニック種子」が含まれるが、これらに限定されない）でもよい。「トランスジェニック植物材料」はまた、１つまたは複数の「トランスジェニック植物細胞」をいう。「トランスジェニック植物細胞」は、外来遺伝子を安定に発現し、前記外来遺伝子は植物細胞染色体に組み込まれ、且つウイルスに固有のウイルスベクター配列を保有せず、前記外来遺伝子は細胞の次の世代に継承されて宿主植物細胞染色体から発現することができる植物細胞をいう。さらに、「トランスジェニック植物材料」は、周知の細胞培養技術（Ｓｔｒｅｅｔ、ＨＥ、１９７３、「植物組織および細胞培養：植物モノグラフ」、第ＩＩ巻、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｙ）によって得られる１つまたは複数の「トランスジェニック植物細胞」を含む「トランスジェニック細胞懸濁液」をいう。
【００９１】
本明細書中で使用される、「完全な」（ｉｎｔａｃｔ）トランスジェニック植物材料は、例えば、スライス、ダイスカット、カット、または裏ごしされることによって植物のサイズを減少させるような処理を受けていない完全な植物または植物の一部をいう。一般に、植物材料は、収穫した場合、「完全な」であるか「完全」であるが、単純にトランスジェニック植物の一部であり得る。例えば、完全な「トランスジェニック葉」、「トランスジェニック根」、「トランスジェニック芽」、「トランスジェニック茎」、「トランスジェニック果実」、「トランスジェニック塊茎」、「トランスジェニック花」、または「トランスジェニック種子」である。
【００９２】
本明細書中で使用される、「分割」トランスジェニック植物材料は、当分野で公知の手段によってサイズが減少した「完全な」植物または「完全な」植物の一部をいう。「分割」手段には、角切り、四分割、みじん切り、薄切り、ダイスカット、裏ごし、またはパルプ化、ミルでひくこと、粉砕、圧縮、または粗砕が含まれるが、これらに限定されない。カットまたはカットしていない加熱または非加熱のトランスジェニック植物材料を、当業者に公知の任意のプロセス（室温で２０分までの調理用ブレンダーでの果汁を絞ること、混合、または裏ごしが含まれるが、これらに限定されない）によってパルプ化することができる。パルプ化した植物材料を、薬学的に許容可能でトランスジェニックタンパク質と適合する適切な賦形剤と混合することができる。トランスジェニック植物材料を、微粉末に「分割する」ことができる。
【００９３】
本明細書中で使用される、「均一化」は、組織ごとの相同なタンパク質量のばらつきを材料の均一なバッチに組み合わされる、より大きな植物器官の均一な混合物への変形をいう。したがって、用語「均質な」または「ホモジネート」はまた、組織ごとに異なる量の植物タンパク質および／またはトランスジェニックタンパク質を含み得る植物組織が均一な量のこのようなタンパク質を含む材料のバッチに組み合わされるように分割または変形された植物材料をいう。
【００９４】
本明細書中で使用される、「食用植物」は、動物が消費することができ、栄養価が高く、毒性のない植物をいう。「食用植物」は、人または他の動物によって摂取される植物またはこの植物から得られる材料である「食品」であり得る。用語「食品」は、ヒトおよび他の動物が食することができる植物材料またはヒトおよび他の動物が食する加工植物材料を含むことを意図する。植物から得られる材料は、ヒトまたは他の動物によって最終的に摂取される植物成分を含むことを意図する。「食用植物」の例には、トマト植物、イネ植物、小麦植物、トウモロコシ植物、ニンジン植物、ジャガイモ植物、リンゴ植物、ダイズ植物、アルファルファ植物、ウマゴヤシ属植物、食用野菜植物、および果実植物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
いくつかの場合、「食用植物」は、「栄養価のために摂取することができ」、動物が摂取した場合に代謝エネルギー、補助的もしくは必須のビタミンまたは補因子、繊維質、または他の有益な効果の供給源を提供する植物またはその一部という。したがって、本発明の方法によって処理される動物がセルロースの細菌補助消化を行うことができる草食動物である場合、このような食品は、トランスジェニック草本を意味し得る。他の食用植物には、野菜および果実が含まれる。同様に、例えば、トランスジェニックレタス植物は実質的にエネルギー源、タンパク質、炭水化物、または脂肪などの基礎的要素にも他の必須または補助的なビタミンもしくは補因子とならないにもかかわらず、動物用の食品として使用される本明細書中に記載された核酸分子にトランスジェニックなレタス植物は、動物がレタスのセルロース成分を摂取できない場合でさえも、レタスが動物に有益な繊維質を提供する場合、本明細書中では食品の定義の範囲内に含まれる。したがって、「食用植物」では、タバコは除外される。
【００９６】
本明細書中で使用される「処理」トランスジェニック植物材料は、「カット」（「カット」は「こま切り」、「みじん切り」、「ダイスカット」、または植物材料を最小サイズ約１ｍｍ2のより小さな一片に縮小する方法をいう）された植物材料をいうことができる。「カット」しているかカットしていないトランスジェニック植物材料を、当分野で公知の任意の技術（ボイル、焼き、およびソテーが含まれるが、これらに限定されない）を使用した、植物材料の温度を少なくとも約５分間および約３０分間まで少なくとも１４０℃、１６０℃、１８０℃、および２００℃まで上昇させる植物材料の「加熱」によってさらに処理することができる。「加熱した」植物材料は破壊した植物細胞を含み得るので、本発明で有用な「加熱した」トランスジェニック植物材料を、避妊タンパク質を精製することなく投与する。「カット」している、またはカットしていない「加熱」または非加熱トランスジェニック植物材料を、例えば、混合による植物材料と非トランスジェニック植物もしくは非植物材料との「組み合わせ」によってさらに処理することができ、トランスジェニック植物材料は、トランスジェニック植物材料と非トランスジェニック植物材料または非植物材料との組み合わせの少なくとも５０重量％含む。例えば、トランスジェニックトウモロコシを、トウモロコシ穀粒と他の野菜との「組み合わせ」によって「処理する」ことができるか、トランスジェニックダイズ植物を、植物材料とスパイスおよび／または他の香味料などの他の成分との「組み合わせ」によって「処理」して、例えば、ダイズバーガー、ダイズシェイク、または豆乳を製造することができる。
【００９７】
あるいは、本発明で有用なトランスジェニック植物材料を、当業者に公知の任意のプロセス（室温で２０分までの調理用ブレンダーでの果汁を絞ること、混合、または裏ごしが含まれる）によるカットしているまたはカットしていない加熱または非加熱トランスジェニック植物材料の「液化」によって「処理」することができる。ついで、「液化」植物材料を、動物に直接投与するか、「液化」植物材料と薬学的許容可能で避妊タンパク質と適合する適切な賦形剤との混合によってさらに処理することができる。「液化」植物材料を、液体植物材料と薬学的許容可能なクリーム、軟膏、または軟膏との混合によってさらに「処理」することができる。トランスジェニック植物材料の「液化」の際に、トランスジェニック植物が破壊され、それによりその成分が「液化」混合物中に遊離する可能性がある。この性質の「液化」混合物は、トランスジェニック植物細胞によって発現した避妊タンパク質が「液化」植物材料から精製されない場合、本発明で有用である。
【００９８】
あるいは、本発明で有用なカットまたはカットしていない加熱または非加熱トランスジェニック植物材料を、植物材料の「凍結乾燥」または「脱水」によって「処理」して、水を除去することができる。風乾、噴霧乾燥、または「凍結乾燥」によって「脱水」を行うことができ、「凍結乾燥」は、急速凍結および凍結状態での脱水（「昇華」という場合もある）による乾燥状態での植物材料の調製をいう。このプロセスを、室温で周囲温度の封入容器を使用した凍結生成物の維持に十分な圧力（好ましくは約５００ｍＴｏｒｒ未満、より好ましくは約２００ｍＴｏｒｒ未満、さらにより好ましくは約１ｍＴｏｒｒ未満）での真空下で約１時間〜７２時間行うことができる。植物材料を、約６０℃と２００℃との間の温度で約１時間〜７２時間オーブン中に植物材料を置くことによって「脱水する」ことができる。植物材料の重量が長期間変化しなくなった場合、植物材料が十分に「凍結乾燥された」か「脱水された」とみなす。例えば、上記の温度でオーブン中に置かれた植物材料の重量が水の蒸発につれて長期間減少する。重量が変化しなくなり、全ての水が蒸発し場合、植物材料を「脱水した」ということができる。好ましくは、どのような乾燥方法を使用しても、最終材料は全含水量の少なくとも９０重量％の除去に十分に脱水される。「凍結乾燥」または「脱水」植物材料を、薬学的に許容可能で避妊ポリペプチドに適合する賦形剤での「凍結乾燥」または「脱水」植物材料の乳化によってさらに「処理する」ことができる。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなどおよびその混合物が含まれ、「凍結乾燥」または「脱水」植物材料は、賦形剤混合物の少なくとも４０重量％、および好ましくは少なくとも５０重量％含まれる。さらに、所望ならば、「凍結乾燥」または「脱水」植物材料は、湿潤剤もしくは乳化剤などの助剤、ｐＨ調整剤、または植物材料の効果を高めるアジュバントを含み得る。本明細書中で使用される、「凍結乾燥」または「脱水」植物材料を、薬学的許容可能なクリーム、軟膏、軟膏、または座剤との植物材料の混合によってさらに処理することができ、植物材料は混合物の少なくとも４０重量％、好ましくは５０重量％含まれる。あるいは、「脱水」植物材料を、液体（フルーツジュース、野菜ジュース、ミルク、水、または多価または多成分ワクチンを形成するための他のワクチン処方物などが含まれるが、これらに限定されない）での植物材料の再構成によってさらに処理することができる。
【００９９】
本明細書中で使用される、「賦形剤」は、任意の処理段階で添加された外来の材料をいう。例えば、賦形剤を、トランスジェニック植物材料の分割時に添加するか、脱水中に添加するか、脱水前後の混合の際に添加することができる。適切な賦形剤には、アジュバント、緩衝液、糖、抗酸化剤、安定剤、または抗原粉末が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
本明細書中に使用される、「ポリペプチド」は、１つのアミノ酸残基のαカルボキシル炭素と隣のα窒素との間のペプチド結合によって結合した一連のアミノ酸残基をいう。本明細書中で使用される、「ポリペプチド」は、完全なタンパク質、タンパク質のフラグメント、またはタンパク質の免疫抗原エピトープをいうことができる。
【０１０１】
本明細書中で使用される、「透明帯糖タンパク質」は、哺乳動物の透明帯を含む３つの硫酸化糖タンパク質をいう。透明帯は、さらに、卵母細胞の微絨毛からなる層および濾胞細胞の細胞的作用を含む。１つの「透明帯糖タンパク質」（特に、ＺＰ３）は、哺乳動物の精子の主な結合部位として機能する。透明帯（特に、透明帯糖タンパク質ＺＰ３）を、ＺＰ３特異的抗体および当分野で十分に説明されている標準的な免疫組織化学的技術を使用して同定することができる（Ｅａｓｔら、１９８５、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１０９、２６８）。ＺＰ糖タンパク質を記載するために当分野で使用される名称はさまざまである。ＺＰ糖タンパク質の例には、ブタから単離されたＺＰタンパク質（ＰＺＩ、ＰＺＩＩＩ、９０Ｋ、６５Ｋ、５５Ｋ、２５Ｋ、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３（ＰＰＺＡ）、ＺＰ４、８７Ｋ（ＺＰ１／ＺＰ２）、５８Ｋ）、ウサギから単離されたＺＰタンパク質（ＲＺＩ、ＲＺＩＩ、ＲＺＩＩＩ、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、ＲＺＩＩ）、マウスから単離されたＺＰタンパク質（ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３）、ネコから単離されたＺＰタンパク質（ＣＺＩおよびＣＺＩＩ）、イヌから単離されたＺＰタンパク質（ＤＺＩ、ＤＺＩＩ、およびＤＺＩＩＩ）、リスザルから単離されたＺＰタンパク質（ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４）、ヒトから単離されたＺＰタンパク質（ＺＰ１、ＺＰ２、およびＺＰ３）が含まれるが、これらに限定されない。上記のＺＰペプチドに加えて、多数の種（例えば、マウス、ヒト、ハムスター、ウサギ）のＺＰ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列が明らかとなっており、ヌクレオチド配列は避妊タンパク質をコードするので本発明で有用である。本発明は、３つのＺＰ糖タンパク質のＺＰ１、２、または３の記号表示を使用する。しかし、当分野の他にＺＰ糖タンパク質をＺＰＡ、Ｂ、およびＣに分類しており、ＺＰＡにはＺＰ１およびＺＰ２と記載のペプチドが含まれ、ＺＰＢにはＺＰ３αおよびｒｃ５５と記載のペプチドが含まれ、ＺＰＣにはＺＰ３βおよびＺＰ３と記載のペプチドが含まれる（例えば、米国特許第５，９８９，５５０号を参照のこと）。
【０１０２】
本明細書中で使用される、「免疫避妊」は、避妊タンパク質に対する免疫応答に起因する一過性の可逆的避妊をいい、不変で不可逆的な避妊（すなわち、不妊）もいう。本明細書中で使用される、「免疫避妊」は、平均産仔数が３匹またはそれ以上の動物種について動物の繁殖周期あたりの平均出生数が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％までである場合、「有効」であるとみなされる。平均産仔数が３匹未満である動物種では、「有効な」免疫避妊によって少なくとも５０％および１００％まで産仔数が減少する。
【０１０３】
本明細書中で使用される、「免疫応答」は、物質（外来タンパク質または自己タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）に対する生物の免疫系による応答をいう。３つの一般的な「免疫応答」型（粘膜、体液性、および細胞性の「免疫応答」が含まれるが、これらに限定されない）が存在する。「粘膜免疫応答」は、気道、胃腸管、および尿生殖路の全粘膜表面を浸す分泌および全分泌腺由来の分泌における分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の産生に起因する（ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．ら、１９８３、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４０９）。これらのｓＩｇＡ抗体は、粘膜表面上の病原体のコロニー形成を防止するように作用し（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７７、６９７、１９７２；ＭｃＮａｂｂ，Ｐ．Ｃ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３５、４７７、１９８１）、それにより、コロニー形成または粘膜表面からの侵入を防止するための第１の防衛線として作用する。ｓＩｇＡの産生を、分泌腺または分泌組織の局所的免疫化または消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴまたはＰｅｙｅｒパッチ）または気管支関連リンパ系組織（ＢＡＬＴ；Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、４１、２１０、１９７６；Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１０７、５３、１９７８；Ｗｅｉｓｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３、１７０５、１９７９；ＭｃＣａｕｇｈａｎ，Ｇ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８、１３１、１９８３）のいずれかに対する抗原提示によって刺激することができる。膜性ミクロフォールド細胞（Ｍ細胞としても知られる）は、ＧＡＬＴおよびＢＡＬＴ表面を覆い、他の分泌性粘膜表面と会合することができる。Ｍ細胞は、粘膜表面に隣接する管腔空間由来の抗原サンプリングするように作用し、このような抗原を抗原提示細胞（樹上細胞およびマクロファージ）に移動させ、その後Ｔリンパ球（Ｔ依存性抗原の場合）に抗原を提示し、コミット性Ｂ細胞への提示のために抗原をプロセシングする。次いで、Ｂ細胞を、増殖、移動、および最終的には提示された抗原に対する抗体分泌形質細胞産生ＩｇＡに形質転換するように刺激する。抗原がＧＡＬＰおよびＢＡＬＴに被せられたＭ細胞によって取り込まれた場合、全身性粘膜免疫により、体内の全分泌組織によって産生された抗原に対してｓＩｇＡが得られる（Ｃｅｂｒａら、前出；Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋら、前出；Ｗｅｉｎｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、前出；ＭｃＣａｕｇｈａｎら、前出）。したがって、経口免疫化は、全身性粘膜免疫応答の重要な刺激経路であり、さらに、口腔および胃腸管における分泌性免疫応答を局所的に刺激する。
【０１０４】
「免疫応答」を、当業者に公知の技術を用いて測定することができる。例えば、血清、血液、または他の分泌物を、「免疫応答」が提示されたと疑われる生物から獲得し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、米国特許第５，９５１，９８８号；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学ショートプロトコール」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）を使用して上記免疫グロブリンの存在についてアッセイすることができる。本発明によれば、ＥＬＩＳＡによって検出された避妊タンパク質で処理した動物における免疫グロブリンの定量的測定値が避妊タンパク質で処理されない動物で検出された免疫グロブリンの測定値と統計的に異なり、免疫グロブリンが避妊タンパク質に特異的である場合、本発明の避妊タンパク質を、「免疫応答」を刺激するということができる。当分野で公知の統計的検定（ＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ検定（Ｐ値は少なくとも０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１未満）などが含まれるがこれらに限定されない）を使用して、測定した免疫グロブリンレベルの相違を決定することができる。
【０１０５】
「免疫応答」を、「免疫応答」の際に惹起した免疫グロブリンの一部に特異的な標識抗体を使用した免疫組織化学などの他の技術を使用して測定することができる。本発明にしたがって避妊タンパク質を投与された動物由来の組織（例えば、卵巣組織）を獲得し、当分野で周知の技術（Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学ショートプロトコール」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）を使用して免疫組織化学のために処理することができる。免疫組織化学によって得られた顕微鏡データを、免疫組織化学的に染色した組織サンプルのスキャニングおよび当業者に公知のコンピュータソフトウェア（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅが含まれるが、これに限定されない）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用した染色レベルの定量によって定量することができる。本発明によれば、避妊タンパク質で処理した動物における免疫組織化学的染色の定量的測定値が避妊タンパク質で処理されない動物で検出された免疫組織化学的染色の測定値と統計的に異なり、組織化学的染色が避妊タンパク質に特異的な結合を必要とする場合、本発明の避妊タンパク質を、「免疫応答」を刺激するということができる。当分野で公知の統計的検定（ＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ検定（Ｐ値は少なくとも０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１未満）などが含まれるがこれらに限定されない）を使用して、測定した免疫組織化学的染色レベルの相違を決定することができる。
【０１０６】
「粘膜免疫応答」を、上記の参照技術を使用して「検出する」ことができる。例えば、抗ＩｇＡ抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイを使用して、粘膜特異的免疫グロブリンを検出および測定することができる（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．＆  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｄ．、「ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性由来の大腸菌熱不安定性エンテロトキシンアジュバント活性の分離」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３、１６１７〜１６２３、１９９５）。
【０１０７】
本明細書中で使用される、「アジュバント」は、抗原と組み合わせて投与した場合に抗原に対する免疫応答が増強する化合物である（Ｃｏｌｉｇａｎ  ＬＧら編、「現代の免疫学プロトコール」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５）。アジュバントは抗原破壊の遅延および組織中での低いが有効なレベルの抗原の持続または炎症反応または免疫感受性を増大させる他の免疫反応の誘発によって有効であり得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される、「種特異的」は、由来する種に固有の核酸またはアミノ酸をいう。例えば、透明帯糖タンパク質をコードする「種特異的」核酸配列は、異なる種由来の対応する透明帯糖タンパク質をコードする核酸配列と少なくとも９５〜７０％ほど配列が同一、８０〜５０％ほど配列が同一、および６０〜４０％ほど配列が同一の核酸配列をいう。特定の核酸配列またはアミノ酸配列の「種特異性」を、ＢＬＡＳＴ分析を含む当業者に公知の技術を使用して決定することができる。
【０１０９】
本明細書中で使用される、「粘膜標的タンパク質」は、第２のペプチドに結合するか第２のペプチドとの融合タンパク質として発現した場合に粘膜免疫応答を誘発するためのペプチドと組み合わせる可能性が増大するポリペプチドをいう。「粘膜標的タンパク質」は、移入される生物に対して内因性ではないポリペプチドであり得る。証拠（Ｂｌａｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５、１１１６、１９８７）は、「粘膜標的タンパク質」は、抗原（例えば、ＺＰ糖タンパク質）とともに経口投与された場合、保護免疫応答を増強させるためのアジュバントとして作用することを示す。したがって、「粘膜標的タンパク質」は、少なくとも１０μｇの用量、１μｇの用量、５００ｎｇの用量、および１ｎｇの用量で投与した場合に粘膜上皮に対するガングリオシドの結合親和性を有し、それにより粘膜上皮膜を越えてタンパク質が移送されるタンパク質であり、その結果、「粘膜標的タンパク質」は分泌免疫応答の誘発に重要であり得るということである。次いで、避妊タンパク質および「粘膜標的タンパク質」の遺伝子融合産物をより容易に粘膜細胞に輸送して、局所分泌免疫応答が増強されるということを認識することができる。「粘膜標的タンパク質」の例には、大腸菌エンテロトキシンサブユニットＢおよびＡ、コレラ毒素、シガ毒素Ｂ（ＳｔｘＢ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）、およびＢ型肝炎表面抗原が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドが第２のペプチドの免疫原性を粘膜に標的する能力を、ペプチドの組み合わせの投与によって刺激し、免疫応答の測定のための上記の統計技術を使用した「粘膜標的タンパク質」を使用しないで第２のペプチドを投与した場合に認められる免疫応答と比較して免疫応答が優位に増加したかどうかを決定する、例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学による「粘膜免疫応答」の測定（すなわち、ｓＩｇＡレベルの測定）によって試験することができる。
【０１１０】
本明細書中で使用される、「動物」は、系統発生界の動物界に分類される生物をいう。本明細書中で使用される、「動物」はまた、哺乳動物をいう。本発明で有用な動物には、哺乳動物、有袋動物、マウス、イヌ、ネコ、牛、ヒト、シカ、ウマ、ヒツジ、カチク、家禽類、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、魚類、ナガスクジラ、甲殻類が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本明細書中で使用される、「単子葉植物」は、胚が１つの子葉または子葉を有する植物型をいう。「単子葉植物」の例には、ユリ、イネ、トウモロコシ、穀類（カラスムギ、コムギ、およびオオムギを含む）、ラン、アヤメ、タマネギ、およびヤシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本明細書中で使用される、「双子葉植物」は、胚が２つの子葉または子葉を有する植物型をいう。「双子葉植物」の例には、タバコ、トマト、アルファルファを含むマメ科植物、オーク、カエデ、バラ、ミント、スカッシュ、ヒアンギク、クルミ、サボテン、スミレ、およびキンポウゲが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書中で使用される、「核酸ベクター」は、連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、さらなる核酸セグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖核酸ループと呼ばれる「プラスミド」である。一定のベクターは、移入された宿主細胞で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への移入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、一定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書中では「発現ベクター」という。一般に、組換え核酸技術で使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドはもっとも一般的に使用されるベクター形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。
【０１１４】
本明細書中で使用される、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位および転写開始に必要であり得る他の因子を提供することによりコード領域の発現を調節するＤＮＡ配列（通常、構造遺伝子のコード領域の上流（５’））をいう。プロモーターの選択は、目的の核酸配列に依存する。「植物機能性プロモーター」は、植物細胞における転写開始を支持することができる「プロモーター」をいう。本発明で有用な「植物機能性プロモーター」には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター；Ｚｍａ１０ＫｚまたはＺｍａｇ１２などの種子貯蔵タンパク質のプロモーター；リブロースカルボキシラーゼ二リン酸小サブユニット（ｒｂｃＳ）などの光誘導遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）などのストレス誘導遺伝子、または全細胞で発現される「ハウスキーピング遺伝子」（Ｚｍａｃｔ（メイズアクチン遺伝子）などの）のプロモーター；タバコＥ８プロモーター；ユビキチン；マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）；イネアクチン１；ダイズ種子タンパク質グリシン（Ｇｙ１）；ダイズ植物貯蔵タンパク質（ｖｓｐ）；および顆粒結合デンプンシンターゼ（ｇｂｓｓ）が含まれるが、これらに限定されない。他の「植物機能プロモーター」には、食用植物の一部において高発現が得られることが公知の遺伝子プロモーター（ジャガイモ由来のパタチン遺伝子プロモーターなど）が含まれる。
【０１１５】
本明細書中で使用される、「作動可能に連結された」は、記載の成分が意図する様式で機能するような関係で存在する並列をいう。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列は、コード配列が調節配列と適合する条件かで発現するような方法でライゲーションされている。遺伝子の転写開始部位が遺伝子転写の制御に十分に近くに存在する場合、プロモーター配列は、遺伝子に「作動可能に連結されている」。
【０１１６】
本明細書中で使用される、「投与された」は、「送達された」材料が投与された動物の粘膜表面に接触することが保証させるような様式での動物への本発明の植物材料、細胞、組成物、および薬学的処方物の送達をいう。本発明で有用な「送達」経路には、経口送達、経鼻送達、直腸もしくは膣送達（例えば、座剤、すなわち局所投与）、または送達した材料が粘膜表面に直接接触する送達経路（すなわち、「粘膜送達」）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される、「薬学的に許容可能な」は、有効成分の生物活性の有効性を妨害しない無毒の材料を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存する。
【０１１７】
本明細書中で使用される、「粘膜表面」、「粘膜」、または「粘膜」は、上皮、固有層、および消化管では平滑筋層の表面または裏打ちであるこれらの構造の周知の医学的定義をいう。「粘膜表面」の例には、気管支の内被、鼓室の粘膜層、結腸の粘膜内被、精管の内層、食道の内被、小腸の粘膜、咽頭の粘膜、舌の粘膜、下垂体膜、口腔の粘膜、咽頭の粘膜、気管の粘膜内層、耳管の裏打ち、卵管の粘膜層、卵管の内層、尿道の内層、子宮内膜、膣の粘膜、胃の粘膜、膀胱の内被、および精嚢の粘膜が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書中で使用される、「種」は、種内の全生物の一般的形態、ボディプラン、発達などの基本的特長が密接に類似している生物の属と各生物との間の生物学的区分をいう。
【０１１９】
本明細書中で使用される、「安定な」は、植物材料が室温で保存されたままであることをいう。本明細書中の「安定なトランスジェニック植物材料」は、「異種」タンパク質または「トランスジェニックタンパク質」が、Ｅｌｉｓａ、定量ウェスタンブロット、または凝集などのアッセイによって測定された免疫反応性が著しく喪失することなく強力でありつづける植物材料をいう。「異種」タンパク質は、本発明のプロセスによって産生時に認められた免疫反応性の少なくとも４０％が少なくとも５ヶ月、および１０ヶ月、１２ヶ月、または１８ヶ月までまたはそれ以上のより長い期間存在したままである場合に安定である。
【０１２０】
表１は、処理材料の均一性の改良を示す図である。互いにプールした植物の「バッチ」中または特定の植物系統由来の非混合サンプル中に存在する処理または未処理トランスジェニック植物材料の抗原含有量である。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
表２は、異なる組織中の抗原の回収率および異なる方法によって得られた抗原の濃度を示す図である。ピューレ化および凍結乾燥によるジャガイモ生物医薬品の処理により、平均４．２倍の抗原濃度を検出可能である。同一の材料を角切りまたは四つ切りおよびその後の凍結乾燥によって処理した場合、検出可能な抗原濃度が平均１５．２倍増加する。トランスジェニックトマトなどの他の材料は、凍結前の材料の均一化方法としてピューレ化を使用した場合に抗原に対して類似の破壊効果を示す。トランスジェニックニンジン材料を凍結乾燥（ピューレ状またはスライスにしない）で処理した場合、未処理材料と適合する抗原の濃度は、質量の減少と直接的に比例し、このプロセスによって検出可能な抗原の保持をさらに示す。
【０１２３】
【表２】
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【発明を実施するための最良の形態】
【０１２４】
本発明は、トランスジェニック生物医薬品の産生方法に関する。本明細書中に記載の方法により、室温において安定かつ均一で、薬学的に強力な乾燥トランスジェニック植物材料を産生可能である。一般に、生物医薬品を産生する完全なまたは分割したトランスジェニック植物を、当分野で公知の食品処理技術によって凍結／乾燥する。乾燥均一産物を、医薬品タンパク質をさらに抽出、精製、または沈殿することなく治療で使用することができる。
【０１２５】
得られたトランスジェニック植物材料は、容易に取り扱うことができ、１２ヶ月保存した場合に周囲温度で安定な処方粉末を含む。さらに、本明細書中に記載のバッチ処理により、植物または植物組織の間での検出可能な抗原の一貫性が増し、効力が改良された抗原が濃縮される。
【０１２６】
トランスジェニック植物種
本発明で使用することができる植物には、双子葉型および単子葉型の両方が含まれる。これらには、ニンジン、ホウレンソウ、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、リンゴ、コムギ、ライムギ、ダイズ、イネ、メイズ、トウモロコシ、ベリー類（ストロベリーおよびラズベリーなど）、アルファルファ、およびバナナが含まれるが、これらに限定されない。ヒトの食用または動物飼料の成分として使用される食用植物は双子葉植物であるので、典型的には双子葉植物を使用するが、単子葉植物は動物飼料に有用である。これらの植物ワクチン由来の細胞および種子もまた、本発明で有用である。
【０１２７】
当分野で公知の任意の手段によって、トランスジェニック植物を産生することができる。１つの実施形態では、トマト、ジャガイモ、およびニンジンを含む種々のトランスジェニック植物種を、いかなる殺虫剤または除草剤を適用しないバイオセイフティレベル１の温室封じ込め条件下で成長させ、成熟するまで成長させた。
【０１２８】
本発明で有用なトランスジェニック植物は、異種タンパク質を発現する。適切な異種タンパク質の例には、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）、トリインフルエンザ血球凝集抗原（ＡＩＶ−ＨＡ）、ニューキャッスル病ウイルスフラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＨＮ）、透明帯糖タンパク質（ＺＰ３）、およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、植物中で作製された抗体（例えば、「プランチボディ」）、および他の治療タンパク質（例えば、エンドスタチンおよびアンギオスタチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
採取
トランスジェニック植物材料を、手もしくは機械または当分野で公知の任意の手段によって採取することができる。採取方法は、植物種によって変化し得る。１つの実施形態では、トランスジェニックジャガイモまたはニンジンを、完全なバッチとして採取し、処理まで４℃で保存することができる。別の実施形態では、中程度の成熟または成熟したと考えられるトランスジェニックジャガイモ果実を６週間にわたり２週間毎に採取し、採取日に処理する。さらなる実施形態では、手によってトマト果実、ジャガイモ塊茎、またはニンジンの根から葉または茎材料を除去し、その後トマト果実、ジャガイモ塊茎、またはニンジンの根を０．１％塩素溶液（１％Ｃｌｏｒｏｘ）で洗浄して土および生物学的負荷物を除去する。記録保持の目的で、各バッチを計数および秤量し、採取および処理記録シートに書き加える。
【０１３０】
均一化
乾燥前または乾燥後にトランスジェニック植物材料の均一化を行うことができる。１つの実施形態では、乾燥前に均一化を行い、均一化は、新たに採取した植物材料の粗いパルプ化および混合、その後の混合材料の凍結および凍結乾燥を含む。第１のスライス、混合、または粉砕処理により、未処理植物組織（果実、塊茎、葉、種子など）がパルプ混合物に減少する。この混合物は、完全な植物細胞および粉砕した細胞破片の両方を含むとみなされる。このプロセスの利点は、果実または塊茎などのより大きな植物器官の処理しやすい混合物への減少であり、これにより組織間の相同タンパク質含有量のばらつきがより均一な材料のバッチに組み合わされる。全ての植物細胞の完全性を完全に破壊することなく均一なバッチを得る能力により、その後の処理段階において相同タンパク質の安定な保存環境が得られる。別の実施形態では、均一化には、処理前の植物材料を最小に処理する必要がある。スライス、四つ切り、または完全な材料の凍結乾燥後に均一化を行う。得られた材料を、微粉末に砕き、１つのバッチ容器に合わせ、震盪または乾燥混合などの機械的手段によって完全に混合して、均一な混合物を得る。
【０１３１】
分割（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）
分割のために、完全な植物または完全な植物部分を、当分野で公知の手段によってサイズを減少させることができる。分割方法には、角切り、四つ切り、みじん切り、薄切り、ダイスカット、ピューレ化、パルプ化、ミルで挽くこと、破壊、圧縮、または粗砕が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ピューレ化が好ましい場合、新たに採取した果実、塊茎、または根を、Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ｍｉｘｅｒ／Ｓｌｉｃｅｒを約１分間使用してピューレ化する。約２０ｌｂｓの最小体積の材料を１度にピューレ化することが好ましい。ジャガイモをピューレ化する場合、ピューレ化処理を補助するために大量の水（５００ｍｌまで）を添加することができる。ピューレ化材料の温度は２℃を超えないことが好ましい。１つの実施形態では、ホモジネートを明確に標識したフリーザートレイに入れ、−４０℃で保存する。任意の遺伝子改変パルプまたは種子の喪失を回避するために、ミキサー／スライサーを、紙タオルでふき取ることができる。
【０１３３】
当分野で公知の任意の手段によって、材料を四つ切りにするか、皮をむくか、薄切りにすることができる。
【０１３４】
脱水
１つの実施形態では、四つ切りか、皮をむくか、薄切りにしたトランスジェニック植物材料を、フリーザートレイに移し、産業用凍結乾燥機に入れ、２５℃の最高シェルフ温度にて−３０℃で２〜６日間凍結乾燥する。次いで、得られた材料を、標識したコンテナに合わせ、完全な採取および処理記録シートに記録する。別の実施形態では、トランスジェニック植物材料を１ガロンのステンレススチール製のＷａｒｉｎｇブレンダーで薄切りにし、サンプルを５００ｍｌまたは１リットルのフラスコに移し、実験用凍結乾燥機を使用して凍結乾燥する。この場合、材料を−３０℃の温度で１〜６日間乾燥させた。
【０１３５】
抗原濃度の決定
目的の抗原濃度を決定するための植物材料の分析を、植物組織中に服される抗原に適切な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または凝集アッセイを使用して行うことができる。未処理および処理材料の両方を評価する場合、特異的抗原のために選択したアッセイ方法を一貫して適用すべきである。
【０１３６】
安定性および賦形剤の使用
周囲温度での処理材料の安定性を評価するために、１０〜１５ｇの材料サンプルを、凍結乾燥直後に取り出し、密閉バッグに入れ、実験用シェルフでの保存前に第２の容器に入れた。周囲温度を、２３℃±２℃に維持した。残りの処理材料を、４℃または−２０℃のいずれかで保存した。サンプルを、各条件下で保存した材料から定期的に採取し、適切なアッセイによって抗原含有量を比較して、周囲温度で保存した材料の相対的安定性を決定した。
【０１３７】
避妊
本発明はまた、避妊を誘導することができるタンパク質を発現するトランスジェニック植物が作製され、トランスジェニック植物材料の動物への投与は避妊タンパク質に対する粘膜免疫応答の誘導に十分であり、有効な避妊を達成するという発見に基づく。本発明は、避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物を動物に投与するステップを含み、前記トランスジェニック植物の投与により投与された動物で粘膜免疫応答が誘導される免疫避妊方法を提供する。本発明は、さらに、本発明での動物への投与に有用な避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物の作製方法、および動物に投与した際にその動物で避妊を誘導することができるトランスジェニック植物を提供する。
【０１３８】
避妊タンパク質
本発明は、トランスジェニック植物材料を提供し、その細胞は、植物材料を投与した動物で避妊を誘導することができるタンパク質またはポリペプチドを発現する。本発明で有用な避妊タンパク質には、透明帯糖タンパク質、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、および抗精子抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
透明帯糖タンパク質
透明帯は、卵母細胞を包む、丈夫で、屈折性のある細胞外糖タンパク質基質である。その特徴的な溝のある外観は、透明帯を貫通する多数の細管に起因する。濾胞細胞由来の細胞質突起はＺＰを通り抜けて伸長し、時折卵母細胞の原形質膜に陥入している。濾胞細胞の細胞質突起はまた、卵母細胞表面に栄養物を輸送する。さらに、卵母細胞の微絨毛はＺＰに伸長し、卵母細胞表面での吸収能力を増大させる（一般に、Ｗ．Ｊ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ編、「Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＢｏｙｄおよびＭｏｓｓｍａｎのヒト胎生学」、２７〜３２頁および５４〜６４頁、１９７２；Ｊ．Ｂ．Ｗａｒｓｈａｗ編、「生殖の生物学的基礎および薬物開発」、１９７３を参照のこと）。本発明で避妊タンパク質として有用な透明帯（ＺＰ）糖タンパク質には、ＺＰに対する抗体を誘発することができる全糖タンパク質基質形態（ＺＰ糖タンパク質１、２、３、および４が含まれる）が含まれる。これらは、腔および排卵前の時期に卵発達の後期で認められるＺＰエピトープならびに排卵後に発現するエピトープを含む。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明の避妊タンパク質は、ＺＰ３糖タンパク質またはそのエピトープである。本発明の避妊タンパク質の「エピトープ」は、少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、および３０までのアミノ酸長である。本明細書中で使用される、本発明で有用な避妊タンパク質の「エピトープ」は、粘膜免疫応答を刺激することができる避妊タンパク質の一部である。避妊タンパク質のエピトープが粘膜免疫応答を刺激する能力を、避妊エピトープを当業者に公知の技術を使用して投与した動物に存在する分泌型ＩｇＡ量の測定によって決定することができる。例えば、避妊エピトープが投与された動物に存在する分泌型ＩｇＡ量を、抗ＩｇＡ抗体を使用し、エピトープを投与していない動物におけるｓＩｇＡレベルと比較するＥＬＩＳＡによって測定することができる。当分野で公知の統計的検定を使用して測定した２つの動物のｓＩｇＡレベル間の統計的に有意な相違は、エピトープによる粘膜免疫応答の刺激の指標である。本発明で有用な統計的検定のＰ値は、少なくとも０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００１、０．０００５であり、好ましくは０．０００１である。
【０１４１】
異なる種のＺＰの形態学的特性が共通しているにもかかわらず、異なる動物種のＺＰは、免疫学的に異なる領域または「エピトープ」を有する（Ｔｉｍｍｏｎｓら、「免疫生殖の見通し：概念および避妊」、Ｍａｔｈｕｒら編、Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｐｕｂｌ．、２４２〜２６０頁、１９８８）。多数のＺＰタンパク質が異なる動物種から単離されており、本発明の避妊タンパク質として有用である。
【０１４２】
ブタから単離された透明帯タンパク質には、以下が含まれる。Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２４、１１１１、１９８１によって単離された、ＰＺＩ（４０から１０ｋＤのタンパク質）；Ｄｕｎｂａｒら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、３２、６１９、１９８５）によって単離された、ＰＺＩＩ（７０〜１１０ｋＤのタンパク質）、ＰＺＩＩＩ（９５〜１１８ｋＤのタンパク質）、およびＰＺＩＶ（１８〜２５ｋＤのタンパク質）；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｒｄｒｉｐ，Ｎ．Ｊ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５７、６３、１９８６）によって単離された、９０Ｋ（８９〜１１９ｋＤのタンパク質）、６５Ｋ（６１〜８３ｋＤのタンパク質）、５５Ｋ（４７〜６６ｋＤのタンパク質）、および２５Ｋ（１８〜２６ｋＤのタンパク質）、；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２４、９３３、１９８１）によって単離された、ＺＰ１（８２〜１１８ｋＤのタンパク質）、ＺＰ２（５８〜９６ｋＤのタンパク質）、ＺＰ３（ＰＰＺＡ）（４０〜７４ｋＤのタンパク質）、およびＺＰ４（２１ｋＤのタンパク質）；Ｙｕｒｅｗｉｃｚら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２９、５１１、１９８３）によって単離された、８７Ｋ（ＺＰ１／ＺＰ２）（７７〜９７ｋＤのタンパク質）、５８Ｋ（４０〜７０ｋＤのタンパク質）；Ｓｋｉｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｎｂａｒ（「避妊および受精能の促進への免疫学的アプローチ」、Ｇ．Ｐ．Ｔａｌｗａｒ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ、２５１〜２６８頁、１９８６）によって単離された、脱グリコシル化ＰＺ１（３５ｋＤのタンパク質）、ＰＺＩＩ（５５ｋＤのタンパク質）、およびＰＺＩＩＩ（８０ｋＤのタンパク質）；ならびにＳａｃｃｏら（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．、７６、５７５、１９８６）によって単離された、分子量４５ｋＤの脱グリコシル化ＺＰ３。
【０１４３】
単離ウサギ透明帯タンパク質には、以下が含まれる。Ｄｕｎｂａｒら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２４、１１１１、１９８１）によって単離された、ＰＺＩ、ＲＺＩＩ、およびＲＺＩＩＩ（分子量はそれぞれ６８〜１２５ｋＤ、８０〜１００．５ｋＤ、および１００〜１３２ｋＤ）；Ｓａｃｃｏら（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１６７、３１８、１９８１）によって単離された、ＺＰ１、ＺＰ２、およびＺＰ３（分子量はそれぞれ１００〜１１８ｋＤ、８３〜１１０ｋＤ、および８０〜９２ｋＤ）；Ｓｋｉｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｎｂａｒ（「避妊および受精能の促進への免疫学的アプローチ」、Ｇ．Ｐ．Ｔａｌｗａｒ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ、２５１〜２６８頁、１９８６）によって単離された、脱グリコシル化ＲＺＩおよびＲＺＩＩ（分子量はそれぞれ６５ｋＤおよび８０ｋＤ）；ならびにＴｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｕｎｂａｒ（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、３６、１２７５、１９８７）によって単離された、脱グリコシル化ＲＺＩＩＩ（９０ｋＤのタンパク質）。
【０１４４】
以下を含む多数のマウス透明帯タンパク質が単離されている。Ｗａｓｓａｒｍａｎ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、７６、１８５、１９８０）によって単離されたＺＰ１、ＺＰ２、およびＺＰ３（分子量はそれぞれ２００ｋＤ、１２０ｋＤ、および８３ｋＤ）；ならびにＳａｃｃｏら（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１６７、３１８、１９８１）によって単離された、ＺＰ１およびＺＰ２（分子量はそれぞれ１６６〜１２２ｋＤおよび９０〜９２ｋＤ）。ＢｌｅｉｌらおよびＳａｃｃｏらによって報告されたマウスＺＰ１およびＺＰ２の分子量の相違は、Ｂｌｅｉｌが非還元条件下で二次元ＰＡＧＥを使用したのに対し、Ｓａｃｃｏは還元条件下で二次元ＰＡＧＥを使用したという事実によるのであろう。
【０１４５】
ネコ透明帯タンパク質ＣＺＩおよびＣＺＩＩは、Ｍａｒｅｓｈ  ａｎｄ  Ｄｕｎｂａｒ  （Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．、２４４、２９９、１９８７）によって単離され、分子量はそれぞれ５０〜１１０ｋＤおよび９０〜１１０ｋＤである。
【０１４６】
Ｍａｒｅｓｈ  ａｎｄ  Ｄｕｎｂａｒ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．、２４４、２９９、１９８７）はまた、イヌ透明帯タンパク質ＤＺＩ、ＤＺＩＩ、およびＤＺＩＩＩ（分子量はそれぞれ５０〜１１０ｋＤ、７０〜９５ｋＤ、および９０〜１００ｋＤ）を単離した。
【０１４７】
Ｓａｃｃｏら（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１６７、３１８、１９８１）は、リスザルＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＺＰ４（分子量はそれぞれ６３〜７８ｋＤ、６３〜７０ｋＤ、４７〜５１ｋＤ、および４３〜４７ｋＤ）を記載していた。同一の刊行物では、Ｓａｃｃｏらは、ヒトＺＰ１、ＺＰ２、およびＺＰ３（分子量はそれぞれ８０〜１２０ｋＤ、７３ｋＤ、および５９〜６５ｋＤ）を記載していた。
【０１４８】
上記のＺＰペプチドに加えて、多数の種のＺＰ糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列が解明されており、これらは避妊タンパク質をコードするので本発明で有用である。例えば、Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９８８、１２７、２８７〜２９５）およびＬｉａｎｇら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、１０、１５０７〜１５１５）は、透明帯タンパク質ＺＰ３およびＺＰ２をそれぞれコードするマウスＤＮＡのクローニングを報告していた。抗ＺＰ３抗体および抗ＺＰ２抗体を使用したマウスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、クローンを得た。マウスＺＰ３とＺＰ２との間で配列相同性は認められなかった。
【０１４９】
Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６、８３、４３４１〜４３４５）は、マウスＺＰ３の部分的ｃＤＮＡクローンの単離を報告しており、ハイブリッド形成が非常に低いストリンジェンシーで行われない限り、クローンは、マウス、ラット、イヌ、ウシ、およびヒトの全ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するが、ブタまたはウサギのゲノムＤＮＡとはハイブリッド形成しない。Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９８８、１２７、２８７〜２９５）によって特徴付けられた全長ＺＰ３  ｃＤＮＡは、比較的短い５’および３’非翻訳領域ならびに２００〜３００個のヌクレオチドポリＡテールを含む約１３１７ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する生殖系列特異的ｍＲＮＡを示す。Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅはまた、ラット、ウサギ、イヌ、およびウシの卵巣はマウスＺＰ３  ｃＤＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡを転写し、ＺＰ３転写物はより低い分子量を有することを見出した。Ｌｉａｎｇら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、１０、１５０７〜１５１５）は、ＺＰ２の核酸配列および推定アミノ酸配列がＺＰ３のそれらと明らかに異なるにもかかわらず、５’および３’非翻訳領域の同一の短いモチーフを有することを示した。ＺＰ２  ｍＲＮＡは、７１３個のアミノ酸を示す８０，２１７ダルトンのポリペプチドをコードする２，１３９個のヌクレオチドの１つのオープンリーディングフレームを有することが報告されている。
【０１５０】
Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９８９、１３１、２０７〜２１４）およびＫｉｎｌｏｃｈ，Ｒ．Ａ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８、８５、６４０９〜６４１３）は、マウスＺＰ３遺伝子のクローニングを報告している。マウスＺＰ３遺伝子は、８．６ｋｂｐの転写単位中に８個のエクソンおよび７個のイントロンを有すると報告されている。
【０１５１】
Ｋｉｎｌｏｃｈら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、１４２、４１４〜４２１）は、プローブとしてマウスＺＰ３  ＤＮＡを使用してスクリーニングしたハムスターゲノムＤＮＡライブラリー由来のハムスターゲノムＺＰ３  ＤＮＡのクローニングを報告していた。ハムスターＺＰ３遺伝子は、７９００ヌクレオチドの転写単位を有し、７個のイントロンおよび８個のエクソンを含むことが見出された。ハムスターＺＰ３タンパク質は、マウスＺＰ３タンパク質と約８１％相同である。ハムスター転写物は、マウスＺＰ３のｍＲＮＡより６個少ない１２６６個のヌクレオチドを含んでいた。
【０１５２】
Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７、６０１４〜６０１８）は、プローブとしてマウスＺＰ３のｃＤＮＡを使用したヒトゲノムＤＮＡライブラリー由来のヒトＺＰ３のクローニングを報告していた。ヒトＺＰ３遺伝子は、８個のエクソンを含む１８．３ｋｂｐの転写単位から構成されている。エクソンはマウスＺＰ３の８個のエクソンとサイズがほぼ同一であり、コード領域のヌクレオチド配列は、７４％相同である。ヒトＺＰ３転写物は、マウスＺＰ３のｍＲＮＡと非常に類似している。これらはともに短い５’および３’非翻訳領域を有し、４２４個のアミノ酸を含むタンパク質をコードする１２７２個のヌクレオチドの１つのオープンリーディングフレームを有する。
【０１５３】
Ｄｕｎｂａｒに付与された米国特許第４，９９６，２９７号は、スクリーニングプローブとして抗ＺＰ１抗体および抗ＺＰ２抗体を使用したウサギＺＰ１およびＺＰ２タンパク質をコードする３つのウサギ透明帯クローンの単離を報告していた。Ｄｕｎｂａｒに付与された特許の図４でＰ２およびＰ３と命名された配列は、それぞれ８１２および１７０５ヌクレオチドのウサギＺＰｃＤＮＡを示す。
【０１５４】
Ｓｃｈｗｏｅｂｅｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６、７２１４〜７２１９）は、異種間親和性精製抗血清を使用した５５ｋＤのウサギ透明帯タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ（ｒｃ５５と命名）を単離および特徴付けていた。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、Ｌｉａｎｇによって記載されたマウスＺＰ２タンパク質とある程度類似性を有する。しかし、ｒｃ５５とマウスＺＰ３タンパク質との比較により、相同性がないことが明らかになった。
【０１５５】
本発明で有用な他のＺＰ糖タンパク質のヌクレオチド配列には、ヒト黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０１０５９）、ヒトＺＰ３Ａ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ００４６１６）、ヒトＺＰＢ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ００１７７９）、ウシＺＰＡおよびＢ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４２６５３；ＡＢ０４２６５２）、ニワトリＺＰ１および３糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２８９６９７；ＡＢ０３１０３３）、マウスＺＰ１、２、および３糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ０１１７７６；ＮＭ０１１７７５；ＮＭ００９５８０）、ハリネズミＺＰ３糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３０４４８７）、ポッサムＺＰＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２６３０２５）、フクロギツネＺＰＡおよびＢ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２６３０１４；ＡＦ２６３０１３）、フクロギツネＺＰ２および３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７９５２５；ＡＦ０７９５２４）、ブタＺＰ１、２、および３糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｓ７４６５１；Ｅ０７７３７；Ｄ４５０６４）、ラットＺＰ１、２、および３糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ７８４８２；ＡＢ０００９２９；ＡＢ０００９２８）、マーモセットＺＰ１および２糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１０８２２；Ｙ１０７６７）、ネコＺＰ２および３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｅ０７９３０；Ｅ０６５０６）、イヌＺＰ２および３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ４５０６４；Ｄ４５０７０）、およびワラビーＺＰ３糖タンパク質（オーストラリア特許番号ＡＵ７８５５４／９８）、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本明細書中で使用される、用語「透明帯糖タンパク質」には、完全なＺＰタンパク質、ＺＰの酵素分解または化学的変性形態、またはその組み合わせが含まれる。さらに、透明帯糖タンパク質には、本来免疫原性を示さないが、下記の免疫原性キャリア分子（例えば、ＬＴ−Ｂ）と化学的に結合した場合に免疫原として使用することができる単離ＺＰ抗原決定基が含まれる。ＺＰ抽出物には、完全な抽出物またはＺＰを含む１つまたは複数の３つの各糖タンパク質画分が含まれる。
【０１５７】
他の避妊タンパク質
上記のＺＰ糖タンパク質またはそのフラグメントに加えて、他のタンパク質が本発明の避妊タンパク質として有用である。例えば、１つの実施形態では、避妊タンパク質を、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、および抗精子抗原からなる群から選択することができるが、決してこれらに限定されない。これらの避妊タンパク質に加えて、本発明で有用な避妊タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた、コードされた避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物の作製で有用である。例えば、本発明で有用なＧｎＲＨをコードするヌクレオチド配列には、ヒトＧｎＲＨ１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ００５０４１）、ラットＧｎＲＨ１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ３１６７０）、フクロギツネＧｎＲＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９３５１６）、およびトガリネズミＧｎＲＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１０７３１５）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で有用なＬＨをコードするヌクレオチド配列には、ラットＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ００５７６）、ブタＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ００５７９）、サイＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４５２１）、バクＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４７６０６）、ウマＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１６３２６；Ｙ１６２６５）、ウシＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１５０６）、およびイヌＬＨ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ００５１８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
１つの実施形態では、本発明の避妊タンパク質には、抗精子抗原が含まれる。完全な精子抽出物での雄および雌動物の免疫化により、不妊症を発症することが以前に示されている（Ｔｕｎｇら、１９７９、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０、９３１）。したがって、本発明の避妊タンパク質は、精子関連タンパク質またはこのようなタンパク質をコードする核酸配列（ＰＨ３０（米国特許第５，９３５，５７８号）、ＰＨ３４（米国特許第５，７２３，３０５号）、ＳＰ１７（米国特許第５，８１４，４５６号）、ＳＰ２２（米国特許第６，１９７，９４０号）、ＳＰ５６（マウスＳＰ５６：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ１７１０８、ＬＤＨＣ4（ヒトＬＤＨＣ4：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２９３８；米国特許第５，８９１，９９２号；Ｇｏｌｄｂｕｒｇ、「精子特異的抗原としてのＬＤＨ−Ｘ」、Ｔ．Ｗｅｇｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｇｉｌｌ編、「生殖免疫学」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８１）、フェルチリン（マウスフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６７４０６；ヒトフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ１３３００５；ツバイフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１５９６５；ヒヒフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１５５２０；ゴリラフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１５４９２；タマリンフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１５５１２；ウシフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８０８；およびラットフェルチリン：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ０８６１６）が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１５９】
粘膜を標的とするタンパク質
本発明の１つの実施形態では、トランスジェニック植物を動物に投与し、前記植物は１つまたは複数の上記避妊タンパク質の一部またはエピトープを発現する。免疫原性物質の粘膜標的は、Ｍ細胞の確実な認識に十分な程度の粒子サイズまたは天然の結合親和性に非常に依存することが当分野で認識される。さらに、粘膜免疫系を、低用量の一定のタンパク質クラスの供給により刺激することができることが見出された。特に、粘膜上の細胞表面に存在する種々の糖脂質および糖タンパク質に特異的に結合することができる性質を共有するタンパク質を使用してこれを行うことができる。したがって、本発明は、複雑な免疫避妊タンパク質または所望ならば避妊エピトープの免疫原性を増強するためのそのより小さな可溶性避妊抗原（ＺＰ３エピトープまたはＧｎＲＨなど）に融合した補助的免疫原性タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
【０１６０】
本発明の粘膜免疫応答の刺激に有用な補助タンパク質には、シガ毒素Ｂ（ＳｔｘＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ１３２７６１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１１１８）、大腸菌易熱性エンテロトキシンＢ（ＬＴ−Ｂ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１６７７）、大腸菌易熱性エンテロトキシンＡサブユニット（ＬＴ−Ａ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１６７７）、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９３７９７）、およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９０８４２）が含まれる。免疫原性の付与に会合が必要な場合、このような抗原タンパク質が抗原粒子および／または複合体として会合することが好ましい。本発明で有用な避妊タンパク質および粘膜免疫原性を増強するタンパク質を含む融合タンパク質の構築を、以下に記載する。
【０１６１】
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
植物中でのウイルス様粒子（ＶＬＰ）としてのＨＢｓＡｇを発現可能性が示されている（Ｍａｓｏｎら、１９９２）。ＶＬＰは、非経口投与が許可されている組換え酵母由来ワクチンに類似している。ＨＢｓＡｇ粒子の形成には、４つの膜貫通ドメインを含む小胞体（ＥＲ）膜へのペプチドの挿入およびその後のＥＲ管腔への粒子の出芽が必要である。植物由来のＨＢｓＡｇは、マウスモデルで研究した場合、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープの両方を保持する（Ｔｈａｎａｖａｌａら、１９９５）。植物細胞が免疫原性ＨＢｓＡｇを産生することができるという所見は、植物が複合体構造に組み立てられる動物、ウイルス、または細菌タンパク質の可能な発現系であることを示す。したがって、免疫原性ＨＢｓＡｇ粒子に必要な遺伝子エレメントを同定した。これらのエレメント（例えば、調節領域およびコード領域）を、本明細書中に記載の避妊タンパク質をコードするベクターに組み込んで、植物中でのこの抗原の発現を増幅する方法を提供することができる。
【０１６２】
ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）
ＮＶＣＰの植物中での発現およびＶＬＰアセンブリおよびマウス中でのその経口免疫原性が報告されている（Ｍａｓｏｎら、１９９６）。ＮＶＣＰは全タンパク質の０．３％であり、タバコ葉およびジャガイモ塊茎中で約６０％の有効性でＶＬＰに構築される。ネガティブ染色電子顕微鏡で観察した場合、空のキャプシドは昆虫細胞系で産生されたキャプシドと事実上区別することができない。さらに、各回が１０μｇほどで４回の強制飼養で投与するか、各回が５０μｇほどで４回のジャガイモ塊茎スライスの直接採餌によって投与した場合、マウスでは材料は経口免疫原性であった。血清ＩｇＧおよび腸粘膜ＩｇＡは共に植物ワクチンによって刺激された。したがって、免疫原性量のＮＶＣＰ抗原のＶＬＰの作製手段を同定した。本発明と共にこれらを使用して、本明細書中に記載の遺伝子増幅方法によって植物中でより高い免疫原レベルを得ることができる。
【０１６３】
大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）
ＬＴは、同時投与抗原に対する免疫応答を刺激する強力な粘膜免疫原およびアジュバントである（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９８８）。植物中で発現するＬＴのＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）を、ガングリオシドＣM1結合能力を保有する活性オリゴマーに構築する（Ｈａｑら、１９９５）。ＬＴ−Ｂのカルボキシル末端でのミクロソーム保持配列（ＳＥＫＤＥＬ）の付加により、植物組織中でのその蓄積が増加する一方で、ＣM1結合および免疫原性が可能であることが見出された。マウスに投与した植物由来のＬＴ−Ｂを使用した経口試験では、強制飼養または未調製（スライス以外）のジャガイモ塊茎の採餌によって投与したいずれのタバコ葉抽出物も、ＬＴ−Ｂに対する血清および腸粘膜抗体を刺激した（Ｈａｑら、１９９５）。これらの動物由来の血清抗ＬＴ−ＢはＬＴ活性の阻害を示し、保護ワクチンとしてのその潜在的な価値を示す。
【０１６４】
避妊タンパク質発現用のワクチン
本発明の使用の中心は、避妊タンパク質をコードする核酸配列および任意選択的に粘膜標的タンパク質をコードする核酸配列を含み、目的の植物細胞に移入して避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物を産生することができる核酸構築物の作製および／または使用である。好ましい実施形態では、核酸構築物は、植物発現ベクター（植物細胞中で調製および増殖することができるプラスミド）である。構築物の核酸配列は、当分野で公知のＤＮＡ、ＲＮＡ、合成核酸、またはその組み合わせを含み得る。核酸構築物が避妊タンパク質および粘膜標的タンパク質の両方を含む実施形態では、各成分をコードする配列を必要な他の配列（例えば、調節配列）と共に散在し得る。
【０１６５】
本発明で有用な核酸配列を、本発明の植物細胞中での避妊タンパク質発現を媒介するために使用することができる当業者に公知のプラスミド骨格を使用して作製することができる。出発材料として使用することができる適切なベクターは、当分野で公知である。植物組織の形質転換に適切なベクターは、ｄｅＦｒａｍｏｎｄら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８３、２６３）、Ａｎら（ＥＭＢＯ、１９８５、２７７）、およびＲｏｔｈｓｔｅｉｎら（Ｇｅｎｅ、１９８７、５３）に記載されており、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＩＢＴ２１０（Ｈａｑら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、７１４）、ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＰＴＶ．ｋａｎ（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０、１１９５〜１１９７）、アグロバクテリウム−Ｔｉプラスミド（Ｗｈｉｔｅら、「植物バイオテクノロジー」、Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ａｒｎｔｚｅｎ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９８９）が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターに加えて、本発明での使用に適切な哺乳動物他のベクターが当分野で産生されている。
【０１６６】
本発明で有用なベクター構築物は、好ましくは、避妊タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。従来の手段によって避妊タンパク質をコードするＤＮＡ配列を獲得し、植物形質転換に適切なベクターに挿入する。例えば、ＤＮＡ配列を、ゲノムクローンの遺伝子バンクから単離することができる。あるいは、ＤＮＡ配列を、逆転写によって調製することができる。次いで、細胞、組織、および植物を形質転換する下記の公知の種々の技術によって、ベクターを植物に移入する。
【０１６７】
避妊タンパク質またはその一部のアミノ酸配列中に化学合成することができるＤＮＡ配列は公知である。いくつかの先行技術を使用して、避妊タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学ショートプロトコール」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５を参照のこと）。
【０１６８】
避妊タンパク質またはその一部をコードするＤＮＡ配列を、避妊タンパク質が性格に発現される様式で適切なベクターに挿入する。言い換えれば、植物組織中でのＤＮＡ配列の発現時に正確なアミノ酸配列が産生されるように、ＤＮＡ配列を適切な方向およびオープンリーディングフレームに位置させる。従来技術によれば、一般に、植物組織で作動可能なプロモーターおよび避妊タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ配列を構築する。ＤＮＡ配列は、さらに、植物組織中で作動可能な３’非コード配列を含み得る。１つの実施形態では、キメラＤＮＡ配列は、さらに、発現時に融合タンパク質が産生されるようにＬＴ−Ｂなどの避妊タンパク質の粘膜標的を増強することができるポリペプチドのコード配列を含み得る。キメラＤＮＡ配列を、公知の植物形質転換ベクターの制限部位への避妊タンパク質またはその一部をコードするＤＮＡ配列の挿入によって適切なベクター内にインサイチューで調製することができる。あるいは、キメラ遺伝子を最初に構築し、その後ベクターに挿入して、植物形質転換ベクターを産生することができる。一般に、本発明で有用なベクターを、大腸菌などの原核生物宿主細胞に挿入し、ベクター数を複製によって増幅させる。次いで、ベクターを、当分野で公知の技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）を使用して原核生物宿主細胞から単離し、これを使用して、目的の宿主植物細胞を形質転換することができる。
【０１６９】
本発明のプロモーター配列には、本発明の選択された植物宿主細胞で作動可能なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは、目的のヌクレオチド配列の５’末端に作動可能に連結された植物機能性プロモーターを有する。好ましいプロモーターは、ＣＶＭＶ、γＳｅｉｎ、Ｇｅｌｖｉｎプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ、トマトＥ８、パタチン、ユビキチン、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、イネアクチン１、ダイズ種子タンパク質グリセリン（Ｇｌｙ１）、ダイズ植物貯蔵タンパク質（ｖｓｐ）、および顆粒結合デンプンシンターゼ（ｇｂｓｓ）から選択される。本発明の構築物はまた、他で（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９０）記載されているタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）エンハンサーなどの翻訳エンハンサー領域を含み得る。任意選択的に、本発明の構築物は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたαＳまたはαＬ配列（Ｍａｓｏｎら、１９８８）などの少なくとも１つの植物貯蔵タンパク質（ＶＳＰ）シグナルペプチドコード配列を含み得る。
【０１７０】
好ましくは、避妊タンパク質および任意選択的に粘膜標的タンパク質をコードするＤＮＡ構築物配列は、これらは全て１つのプロモーター配列の調節下にあり、得られた融合タンパク質の発現は、それぞれ３つのエレメントを含む。これにより、避妊タンパク質および粘膜標的タンパク質が化学量論的比率で合成され、避妊タンパク質および粘膜標的タンパク質が類似のレベルで発現することが確保される。あるいは、粘膜標的タンパク質の発現は、双方向様式または避妊タンパク質をコードする配列の３’構築物に挿入されるが、粘膜標的タンパク質をコードする配列の５’に挿入されない第２のプロモーターから駆動することができる。
【０１７１】
上記のＤＮＡ構築物の保有に加えて、本発明で有用なベクターは、選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。本発明で有用なマーカー遺伝子には、選択マーカーをコードする遺伝子（例えば、細菌テトラサイクリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子）を含み得る。テトラサイクリン耐性遺伝子の組み込みにより、本発明のプラスミド調製手順で選択因子としてテトラサイクリンを使用することが可能である。テトラサイクリン耐性遺伝子使用の１つの利点は、テトラサイクリンが大腸菌によって分解されず、培養時により多数のテトラサイクリン添加なくてよいことである。さらに、テトラサイクリンは薬物が使用される状況で抗生物質として処方される頻度が低く、それにより薬物が使用される状況下におけるプラスミド耐性遺伝子を通した読み取りが抗生物質の使用に妨害される可能性が低いので、アンピシリンをコードする遺伝子よりもテトラサイクリン耐性遺伝子が好ましい。
【０１７２】
本発明で有用なさらなるマーカー遺伝子には、殺菌薬（特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールなどの抗生物質）への耐性が含まれる。本発明で有用なさらなるマーカー遺伝子には、有機リン殺虫剤およびｂｉａｌａｐｈｏｓｐｈａｔｅなどの除草剤への耐性が含まれる。本発明で有用なさらなるマーカー遺伝子には、βグルコリニダーゼ（ＧＵＳ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視マーカータンパク質をコードするものも含まれる。使用した特異的のマーカーは、移入した核酸を欠く細胞と比較して形質転換細胞を選択可能なマーカーである。
【０１７３】
ベクターはまた、この系を使用した後期形質転換のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス中でベクターを保持することを所望する場合などにアグロバクテリウム・ツメファシエンス複製起点を含み得る。この事象では、目的のタンパク質（すなわち、避妊タンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、宿主植物細胞に導入するための左側および右側のＴ−ＤＮＡ境界領域に隣接している。
【０１７４】
大腸菌などの細菌の菌株を、本発明の発現ベクターでトランスフェクトして当分野で周知の方法（Ａｕｓｕｂｅｌ、前出）で即時発現カセットを成長／増殖することができる。精製発現カセットを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに付加し、電気パルスまたは熱ショックに供してカセット中にベクターを移入することができ、このベクターはシャトルベクターとして完全なで存在することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のヘルパーＴｉプラスミドは、シャトルベクターから植物細胞にＴ−ＤＮＡを直接導入するために必要なｖｉｒ遺伝子を提供することができる。あるいは、ベクターを、腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドで相同組換えして、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの即時カセットを交換することができる。好ましい実施形態では、本発明は、植物細胞に移入されたＤＮＡ構築物が染色体に安定に組み込まれた、植物細胞の安定な形質転換方法を提供する。
【０１７５】
トランスジェニック植物
本発明は、本発明で有用な１つまたは複数の避妊タンパク質を発現する植物細胞を含むトランスジェニック植物および植物材料（例えば、葉、果実、根）を提供する。好ましい実施形態では、目的の植物細胞を１つまたは複数の上記のＤＮＡ構築物で形質転換し、形質転換植物細胞内での構築物の発現により、植物細胞により避妊タンパク質が産生される。
【０１７６】
植物細胞への核酸の移入方法
植物への遺伝子導入方法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ｔｉプラスミド系）の使用が含まれるが、これに限定されない。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドは、植物宿主ゲノムに組み込む導入ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれるプラスミドＤＮＡのセグメントを含む。第１に、大腸菌中で複製されるプラスミドベクターを構築する。このプラスミドは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含み、このＤＮＡは、植物細胞に導入され、植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡセグメントの限度を定義するＴ−ＤＮＡ境界配列に隣接する。通常、選択マーカー（カナマイシンなどの抗生物質への耐性をコードする遺伝子など）をコードする遺伝子もまた、左境界（ＬＢ）と右境界（ＲＢ）配列との間に挿入される。形質転換植物細胞中でのこの遺伝子の発現により、組み込まれたＴ−ＤＮＡ領域を有する植物または植物細胞を同定するためのポジティブ選択法が得られる。第２に、プラスミドをアグロバクテリウムに導入する。アグロバクテリウムによるプラスミドＤＮＡの直接取り込みによってこれを行うことができる。その後の植物へのＴ−ＤＮＡの導入のために、使用するアグロバクテリウム株は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に不可欠な一組の誘導性の毒性（ｖｉｒ）遺伝子セットを含まなければならない。
【０１７７】
上記のアグロバクテリウム・ツメファシエンス遺伝子導入系は、クラウンゴール（植物組織の感染部位に腫瘍または擦り傷を形成する広範な双子葉植物および裸子植物の病気）の病原因子である（ＤｅＣｌｅｅｎｅ，Ｍ．ら、Ｂｏｔ．Ｒｅｖ．、４２、３８９、１９７６）。アグロバクテリウム系は、種々の植物組織の日常的な形質転換が可能なように開発された（例えば、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１、１７５、１９８３；Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ−Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、２４８、５０、１９８３を参照のこと）。この様式で形質転換された代表的な組織には、タバコ（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋら、Ｃｅｌｌ、３２、１０３３、１９８３）；トマト（Ｆｉｌｌａｔｔｉ，Ｊ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、７２６、１９８７）；ヒマワリ（Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｎ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、１２０１、１９８７）；ワタ（Ｕｍｂｅｃｋ，Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、２６３、１９８７）；ナタネ（Ｐｕａ，Ｅ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、８１５、１９８７）；ジャガイモ（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、２４１、１９８５）；ポプラ（Ｐｙｔｈｏｕｄ，Ｆ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、１３２３、１９８７）；およびダイズ（Ｈｉｎｃｈｅｅ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、９１５、１９８８）が含まれる。他の植物を、日常的な方法の延長またはこれらの方法の修正形態によって形質転換することができる。
【０１７８】
アグロバクテリウム株およびプラスミド構築物ストラテジーの複数の選択肢を使用して、植物の遺伝子形質転換を至適化することができる。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのみが使用されるアグロバクテリウム株ではない。アグロバクテリウム・リゾゲネスなどの他のアグロバクテリウム株は、いくつかの適用においてより適切であり得る。双子葉植物種の根毛形成を誘発するアグロバクテリウム・リゾゲネスは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドと類似の様式で機能するＲｉ（根に含まれる）プラスミドと呼ばれる巨大な染色体外エレメントを保有する。アグロバクテリウム・リゾゲネスを使用した形質転換をアグロバクテリウム・ツメファシエンスと同様に開発し、これを首尾よく使用して、例えば、アルファルファが形質転換されている（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ，Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０９、１９８７）。
【０１７９】
植物組織の接種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達系によって変化する。都合のよいアプローチはジャガイモ形質転換用の葉ディスク手順であるが、完全な植物の分化および再生のための良好な供給源を提供する組織移植片を使用してアグロバクテリウム媒介形質転換を行うことができる。一定の条件下ではナース組織の添加が望ましいであろう。アグロバクテリウム・ツメファシエンスでの再生プロトプラストのインビトロ形質転換などの他の手順により、同様に形質転換植物を得ることができる。
【０１８０】
アグロバクテリウム中間体を使用しないで植物および植物組織を形質転換するためのいくつかのいわゆる「直接的」遺伝子導入手順（例えば、プロトプラストからの植物再生）が開発されている（Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ａ．ら、「植物細胞培養ハンドブック」、１、１２４、１９８３）。プロトプラストから植物種を再生することができる場合、直接的遺伝子導入を使用することができ、形質転換はアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用に依存しない。プロトプラストの直接的形質転換では、外因性遺伝物質のプロトプラストへの取り込みを、化学物質または電場の使用によって増強することができる。その後、外因性材料を、核ゲノムに組み込むことができる。
【０１８１】
双子葉植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）で初期の研究が行われ、外来ＤＮＡが組み込まれて子孫植物に伝達されることが示された（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３、２７１７、１９８４；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９、１６９、１９８５）。単子葉植物プロトプラストがこの手順によって形質転換されている（例えば、一粒小麦（Ｌｏｒｚ  Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９、１７８、１９８５）；Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ（イタリアンライグラス）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９、１８３、１９８３）；メイズ（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５、５６、１９８８）；およびブラックメキシカンスイートコーン（Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１９、７１９、１９８６））。プロトプラストから再生した他の植物には、イネ（Ａｂｄｕｌａｈ，Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１９８７、１９８７）；ナタネ（Ｋａｎｓｈａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、５、１０１、１９８６）；ジャガイモ（Ｔａｖａｚｚａ，Ｒ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、５、２４３、１９８６）；ナス（Ｓｉｈａｃｈａｋｉ，Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ、Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１１、１７９、１９８７）；およびキュウリ（Ｊｉａ，Ｓ−Ｒ．ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２４、３９３、１９８６）が含まれる。他の種類のプロトプラストの直接的形質転換方法が明らかである。
【０１８２】
エレクトロポレーションと呼ばれるプロセスでの適切なＤＮＡの存在下での電気パルスを使用したプロトプラストの処理によって、植物プロトプラストへのＤＮＡの移入を行うことができる。この方法では、プロトプラストを単離し、マンニトール溶液に懸濁する。超らせん状または環状プラスミドＤＮＡを添加する。溶液を混合し、室温で１０〜１００μ秒未満の約４００Ｖ／ｃｍのパルスに供する。膜の可逆的な物理的破壊によりＤＮＡがプロトプラストに取り込まれる。
【０１８３】
リポソーム融合もまた、植物細胞の形質転換方法であると示されている。この方法では、所望の遺伝子を保有するリポソームと共にプロトプラストが運ばれる。膜が融合するにつれて、外来遺伝子はプロトプラストに導入される（Ｄｅｈａｙｅｓ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４、２７３１、１９８５）。
【０１８４】
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ（双子葉植物）およびＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ（単子葉植物）においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換が行われている。これは、Ｍｇ2+、ＰＥＧ、およびおそらくＣａ2+との間の相乗的相互作用に基づいた直接的遺伝子導入の化学的手順である（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ，Ｒ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、８、３６３、１９８７）。あるいは、外因性ＤＮＡを、微量注入によって細胞またはプロトプラストに移入することができる。プラスミドＤＮＡ溶液を、細く引いたガラスニードルを使用して細胞に直接注入する。
【０１８５】
別の開発された直接的遺伝子導入手順は、ＤＮＡを保有するマイクロプロジェクタイルの細胞の打ち込みを含む（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７、７０、１９８７）。「遺伝子銃」手順では、外因性ＤＮＡをコートしたタングステン粒子または金粒子を、標的細胞に向かって加速させる。タマネギで少なくとも一過性発現が得られた。この手順を使用して、懸濁培養でのブラックメキシカンスイートコーンおよびメイズ未熟胚ならびにダイズプロトプラストにもＤＮＡが移入されている（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、５５９、１９８８）。マイクロインジェクタイルボンバードメントによって、メイズ、タバコ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、イネ、ニンジン、バナナ、およびダイズの安定に形質転換された培養物が得られている。安定に形質転換された植物を再生し、この手順で回収することもできる（ＭｃＣａｂｅ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、９２３、１９８８）。
【０１８６】
形質転換された種子を産生するために、シロイヌナズナの花を、以下の手順で形質転換する。アグロバクテリウムを、成長した花に真空で侵入させ、得られた種子をマーカー耐性および外来遺伝子発現についてスクリーニングする。おそらく、雄蘂／花粉、子房／卵、またはすでに受精している場合はさらに成長した接合子を形質転換する。この方法（Ｃｌｏｕｇｈ  ＆  Ｂｅｎｔ、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１６、７３５に記載されている）を使用して、Ａｔ２Ｓ−２種子プロモーターの転写調節下でｒｅｐ遺伝子を含む構築物でシロイヌナズナを形質転換する。
【０１８７】
形質転換後、形質転換細胞または植物組織を、従来の技術によって選択またはスクリーニングする。上記のキメラＤＮＡ配列を含む植物組織の形質転換細胞を、上記で引用されたものを含む公知の手順を使用して再生する。これらの技術によって最も容易に再生することができ、それにより本発明で好ましい植物種には、メイズ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナスビ、キュウリ、およびダイズが含まれるが、これらに限定されない。再生した植物を、下記の標準的な方法によって形質転換についてスクリーニングする。再生植物の子孫をスクリーニングし、改良された植物および種子系列を開発するために組み込んだＤＮＡ配列の継続した存在についてスクリーニングおよび選択する。ＤＮＡ配列を、種々の技術（古典的交配、プロトプラスト融合、核導入、および染色体導入が含まれる）によって他の遺伝子系列に移動させることができる。
【０１８８】
本発明で有用な植物、細胞、および種子
本発明の実施で使用することができる植物には、双子葉植物および単子葉植物が含まれる。これらには、タバコ、ニンジン、ホウレンソウ、トウガラシ、ジャガイモ、トマト、リンゴ、コムギ、ライムギ、ダイズ、イネ、メイズ、トウモロコシ、ベリー類（ストロベリーおよびラズベリーなど）、アルファルファ、およびバナナが含まれるが、これらに限定されない。ヒトの食品または動物飼料の成分として使用する哺乳動物食用植物は双子葉植物であるので、典型的には双子葉植物を使用するが、特に動物飼料に有用な一定の穀類の産生において単子葉植物の形質転換を適用することができる。これは、トマト、ダイズ、およびニンジンのジュースまたはミルクなどのヒトが容易に投与するためのジュース中に避妊タンパク質を産生するためにヒト免疫避妊で特に有利である。これらの植物ワクチン由来の細胞および種子もまた、本発明で有用である。
【０１８９】
上記のベクターで形質転換したトランスジェニック植物は、本発明の別の態様である。特に好ましいベクター用植物宿主には、バナナ、トマト、ジャガイモ、ニンジン、アルファルファ、ウマゴヤシ、メイズ、およびタバコが含まれる。
【０１９０】
ジャガイモ変種ＦＬ１６０７（「Ｆｒｉｔｏ  Ｌａｙ  １６０７」）およびＤｅｓｉｒｅｅ、およびトマト変種Ｔａｎｋｓｌｅｙ  ＴＡ２３４ＴＭ２Ｒは、本明細書中に記載の方法を使用してバイナリベクターで形質転換された特に好ましい変種である。これらの形質転換変種のうち、Ｄｅｓｉｒｅｅのみが市販されている変種であり、他の変種は、Ｆｒｉｔｏ−Ｌａｙ（Ｒｈｉｎｅｌａｎｄｅｒ、ＷＩ）およびＳｔｅｖｅ  Ｔａｎｋｓｌｅｙ（Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖ．）から入手することができる。トマトは遺伝子形質転換が容易であり、発現の調節に果実特異的な成熟依存性プロモーターを利用することができるので、外来タンパク質発現のモデル系としてトマトが好ましい（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら、１９８９）。Ｅ８プロモーターを使用して、成熟トマト果実中でのポリガラクツロナーゼ（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら、１９８９）および野生型トマト果実中でのモネリン（Ｐｅｎａｒｒｕｂｉａら、１９９２）の高レベル産生を媒介されている。
【０１９１】
植物細胞懸濁培養物は、広く一般に公知であり、当業者が利用可能である。完全な植物系よりも形質転換、成長、およびタンパク質産生を迅速に行うことができるので、外来タンパク質発現用のモデル系として植物細胞培養が好ましい。植物細胞懸濁培養物を液体中で成長させるか、カルス産生のために固体培地に移すことができる。本発明で記載されている目的に使用することができる細胞懸濁培養物の一般例には、ニンジン、タバコ（例えば、ＮＴ−１またはＢＹ−１細胞株）、およびメイズが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
形質転換植物材料の検出
本発明は、避妊タンパク質をコードする核酸配列および避妊タンパク質自体を検出する方法（サザンブロットおよびノーザンブロット分析、ＰＣＲベースの検出方法、および本発明の目的のタンパク質の免疫学的検出方法が含まれるが、これらに限定されない）を提供する。本発明にしたがってこれらの技術使用して、避妊タンパク質および任意選択的に粘膜標的タンパク質をコードする核酸配列の存在を確認し、避妊タンパク質および粘膜標的タンパク質自体を確認することができる。
【０１９３】
目的のヌクレオチド配列の検出
１．サザンブロット分析
サザンブロット分析を使用して、ＰＣＲ増幅産物または非ＰＣＲベースのアッセイを介して全ゲノムＤＮＡ試験サンプルから目的のヌクレオチド配列を検出することができる。サザンブロット分析方法は、当分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｏｋら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。この技術は、電気泳動ゲルから膜支持体へのＤＮＡフラグメントの移行およびそれによるＤＮＡフラグメントの固定を含む。得られた膜により、ゲルの結合パターンが半永久的に再現される。
【０１９４】
以下の方法に従って、サザンブロット分析を行う。本発明の方法によって核酸ベクターで形質転換した植物から得たゲノムＤＮＡ（５〜２０μｇ）を、適切な制限酵素で消化し、０．６〜１．０％のアガロースゲル上でＴＡＥ緩衝液中で分離する。ＤＮＡを、当分野で周知の方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）によって市販のナイロンまたはニトロセルロースメンブレン（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移す。移行およびＵＶ架橋後、メンブレンを６５℃のハイブリッド形成溶液（例えば、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳでのストリンジェントな条件下）中で標識プローブとハイブリッド形成させる。あるいは、６８℃または塩濃度を減少させた（例えば、０．１×ＳＳＣ）ハイブリッド緩衝液中で高ストリンジェンシーハイブリッド形成を行うことができる。ハイブリッド形成条件は、当分野で公知のパラメーターにしたがって必要に応じて変化させることができる。ハイブリッド形成後、メンブレンを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、フィルムに露光する。洗浄緩衝液のストリンジェンジーもまた、バックグラウンドシグナルの量によって変化し得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。
【０１９５】
核酸プローブ−標的核酸ハイブリッドの検出は、核酸プローブをＤＮＡ標的とハイブリッド形成させるステップを含み、前記プローブは上記のＤＮＡ構築物の核酸配列の一部と相補的である。共有結合がハイブリッド形成の特異性を妨害しないように、このプローブを放射性標識するか、酵素に共有結合させることができる。植物ＤＮＡとプローブとの間に得られたハイブリッドを検出することができる。プローブの標識方法には、ランダムオリゴヌクレオチドプライミング合成、ニック翻訳、キナーゼ反応、またはポリメラーゼ連鎖反応（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）が含まれる。あるいは、非同位体法によってハイブリッドを検出することができる。非同位体標識プローブを、ビオチンもしくはジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に誘発ジオキセタン）、酵素、または抗体の添加によって産生することができる。典型的には、蛍光法または酵素法によって非同位体プローブを検出する。遊離プローブからの複合体の分離およびオートラジオグラフィーまたはシンチレーション計数による複合体レベルの測定によって放射性標識プローブ−標的核酸複合体の検出を行うことができる。プローブが酵素に共有結合している場合、酵素−プローブ−標的核酸複合体を、遊離酵素結合物から単離し、酵素検出のために基質を添加する。感度が１０3〜１０6増加した発色または発光の変化として酵素活性を観察する。調製物の例およびハイブリッド形成プローブとしての核酸プローブ−酵素結合物（酵素はアルカリホルファターゼである）の使用は、（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉら、１９８６、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４、６１１５）に記載されている。
【０１９６】
２ステップ標識増幅法は、当分野で公知である。これらのアッセイは、小リガンド（ジゴキシゲニンまたはビオチンなど）が目的の遺伝子（すなわち、避妊タンパク質またはその一部をコードする遺伝子）に特異的に結合することができる核酸プローブに結合する原理に基づく。
【０１９７】
２ステップ標識増幅方法によれば、核酸プローブに結合した小リガンドが、抗体−酵素結合物によって特異的に認識される。例えば、ジゴキシゲニンを、核酸プローブに結合させ、アルカリホスファターゼが化学発光基質と反応する抗体−アルカリホスファターゼ結合物によって検出する。核酸プローブ−小リガンド結合物の調製方法については、（Ｍａｒｔｉｎら、１９９０、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９、７６２）を参照のこと。あるいは、小リガンドを、第１のリガンドと特異的に複合体形成することができる第２のリガンド−酵素結合物によって認識する。この小リガンド相互作用様式の周知の例は、ビオチン−アビジン相互作用である。核酸プローブの標識方法およびビオチン−アビジンベースのアッセイでのその使用は、Ｒｉｇｂｙら、１９７７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１３、２３７およびＮｇｕｙｅｎら、１９９２、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｅｓ、１３、１１６に記載されている。
【０１９８】
基本的なハイブリッド検出プロトコールの変形形態は当分野で公知であり、検出すべきハイブリッドの外来物質からの分離を促進し、そして／または標識部分からのシグナルを使用する修正形態が含まれる。多数のこれらの修正形態は、例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＆  Ｋｒｉｃｋａ、１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６９：１；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：２２９；Ｍｉｔｔｌｉｎ、１９８９、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、３５、１８１９；米国特許第４，８６８，１０５号、およびＥＰＯ公開番号２２５，８０７号に概説されている。
【０１９９】
２．ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、当分野で周知である。この技術は、ＲＮＡ調製物中の特定の配列を検出するための電気泳動ゲルからメンブレン支持体へのＲＮＡの移行を含む。
以下の方法にしたがってノーザンブロット分析を行う。上記のＤＮＡ構築物で形質転換した植物組織から得たＲＮＡサンプル（ＭＯＰＳ緩衝液、ホルムアルデヒド、およびホルムアミドの添加によって調製）を、１×ＭＯＰＳ緩衝液を含むアガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離した。ＲＮＡの完全性を決定するための臭化エチジウムでの染色および紫外線光下での視覚化後、ＲＮＡを、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌでの処理およびその後の０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１．５Ｍ  ＮａＣｌとのインキュベーションによってハイブリッド形成させる。ＲＮＡを、当分野で周知の方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）によって市販のナイロンまたはニトロセルロースメンブレン（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移す。移行およびＵＶ架橋後、メンブレンを４２℃のハイブリッド形成溶液（例えば、５０％ホルムアミド／２．５％Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１００〜２００ｍｇの変性サケ精子ＤＮＡ／０．１％ＳＤＳ／５×ＳＳＰＥ）中で標識プローブとハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載のように、必要に応じて変化させることができる。ハイブリッド形成後、メンブレンを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、４２℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、フィルムに露光する。洗浄緩衝液のストリンジェンジーもまた、バックグラウンドシグナルの量によって変化し得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。
【０２００】
３．ＰＣＲ
本発明の目的の核酸配列（すなわち、避妊タンパク質をコードする核酸配列）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってゲノムＤＮＡまたは他の天然供給源から増幅する。ＰＣＲ法は、当業者に周知である。
【０２０１】
ＰＣＲは、目的の標的配列を増幅させるために熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のＤＮＡ複製サイクルの使用によって特定のＤＮＡ配列を迅速に増幅する方法を提供する。ＰＣＲには、増幅すべき核酸、増幅すべき配列に隣接した２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液、および塩が必要である。
【０２０２】
ＰＣＲ法は、当分野で周知である。ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、３３５（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のように行う。
【０２０３】
テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ；より有用には、１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲを行う。典型的な反応混合物には、以下が含まれる。２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、０．４μｌの１．２５μＭ  ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、および全体積を２５μｌにする量の脱イオン水。プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行う。
【０２０４】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度ならびにサイクル数を、実際のストリンジェンシー要件にしたがって調整する。アニーリングの温度およびタイミングを、プライマーがアニーリングするのに有効な温度および耐え得るミスマッチの程度の両方によって決定する。プライマーアニーリングのストリンジェンシーを至適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃と７２℃との間のアニーリング温度を使用する。テンプレート分子の最初の変性は、通常、９２℃と９９℃との間で４分間で起こり、その後の２０〜４０サイクルは、変性（９４〜９９℃で１５秒間〜１分間）、アニーリング（上記で考察して決定した温度、１〜２分間）、および伸長（７２℃での１分間）からなる。最終伸長ステップを、一般に、７２℃で４分間行い、その後４℃で任意の時間（０〜２４時間）保持することができる。
【０２０５】
電気泳動を使用しないでＰＣＲ産物を定量的に検出するためのいくつかの技術は、本発明で有用であり得る。これらの技術（Ｔａｑｍａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの市販のキットが存在する）のうちの１つを、転写物特異的アンチセンスプローブを使用して行う。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、目的の遺伝子由来の核酸フラグメント）に特異的であり、消光剤およびオリゴヌクレオチドの５’末端と複合体形成した蛍光レポータープローブを使用して調製する。異なる蛍光マーカーを、異なるレポーターに結合させて、１つの反応で２つの産物を測定することができる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化された場合、その５’−３’核酸分解活性によってテンプレートに結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。消光剤の存在しない場合には、レポーターは、蛍光を発する。レポーターの色の変化は、各特異的産物の量に比例し、この変化を蛍光光度計によって測定し、それにより、各色の量を測定することができ、ＰＣＲ産物を定量することができる。９６ウェルプレートでＰＣＲ反応を行って、複数のサンプルを同時に処理および測定することができる。Ｔａｑｍａｎ（商標）システムは、ゲル電気泳動を必要とせず、検量線を使用した場合に定量することができるというさらなる利点を有する。
【０２０６】
目的のタンパク質配列の検出
１．抗体の調製
本発明の避妊タンパク質に特異的な抗体は、タンパク質の精製および検出に有用である。抗体により、このような抗体の結合（可変）領域を使用した構築および他の抗体修飾が含まれる。したがって、本発明で有用な抗体は、完全な抗体、抗体フラグメント、多機能性抗体凝集物、または一般に抗体由来の１つまたは複数の特異的結合部位を含む物質を含み得る。抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、もしくはＦ（ａｂ’）2フラグメントなどのフラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントなどのその誘導体であり得る。抗体または抗体フラグメントは、非組換えであるか、組換えであるか、ヒト化することができる。抗体は、免疫グロブリンイソ型（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭなど）であり得る。さらに、適切な場合、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの凝集体、ポリマー、誘導体、および結合物を使用することができる。
【０２０７】
抗体産生に有用な本発明の目的の遺伝子のタンパク質産物（またはそのフラグメントもしくはオリゴペプチド）生物活性を必要としないにもかかわらず、抗原性を示さなければならない。特異的抗体の誘導に使用するペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、ペプチドは、天然のタンパク質領域と同一なはずであり、天然に存在する小分子の全アミノ酸配列を含み得る。本発明の避妊タンパク質の種特異的エピトープに対応するアミノ酸の短いストレッチを、ＬＴ−Ｂなどの別のタンパク質（すなわち、粘膜標的タンパク質）由来のアミノ酸と融合することができ、キメラ分子に対して抗体が産生される。当分野で周知の手順を、本発明の目的のタンパク質に対する抗体の産生のために使用することができる。
【０２０８】
抗体産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む種々の宿主を、本発明の目的の遺伝子のタンパク質産物（または免疫原性を保持するその一部、フラグメント、またはオリゴヌクレオチド）での注射によって免疫化することができる。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させることができる。このようなアジュバントには、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウム−パルヴムは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０２０９】
ａ．ポリクローナル抗体
抗原タンパク質を、その免疫原性を増大させるために従来のキャリアに結合させ、ペプチド−キャリア結合物に対する抗血清を惹起する。ペプチドのキャリアタンパク質へのカップリングおよび免疫化を、記載のように行うことができる（Ｄｙｍｅｃｋｉら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、４８１５）。ＥＬＩＳＡ（以下）またはドットブロッティングまたはスポットブロッティングによって血清の力価を測定することができる（Ｂｏｅｒｓｍａ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５１、３１７）。同時に、抗血清を、記載のように調製した組織切片で使用することができる。有用な血清は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２８、４７７の手順後のＥＬＩＳＡによって適切なペプチドと協力に反応する。
【０２１０】
ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体の調製技術は周知であり、モノクローナル抗体を、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９４、２７８に記載のように、そのレベルが測定されているか不活化されているか親和性精製されており、好ましくはキャリアに結合した候補抗原を使用して調製することができる。
【０２１１】
モノクローナル抗体を、典型的には、ハイブリドーマ組織培養物またはハイブリドーマ組織が移入された動物から得た腹水から得る。
【０２１２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）を、標的タンパク質に結合する抗体についてスクリーニングすることができる。
【０２１３】
２．抗体検出方法
特に好ましい免疫学試験は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用に依存し、これらには、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロッティング、免疫組織化学、および免疫沈降（Ｈｕｍａｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．、１９７９、Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｙｎｉｑｕｅｓ、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｖｏｌｌｅｒ、１９８７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ、２：１、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒら、１９７８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、３１、５０７；米国特許再発行第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂｕｔｌｅｒ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３、４８２；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．編、１９８０、「酵素免疫アッセイ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照のこと）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、「放射免疫アッセイの原理」、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月、１〜５、４６〜４９および６８〜７８頁）が含まれる。本発明の目的のタンパク質の有無についての植物の分析のために、免疫組織化学技術を使用することができる。標的タンパク質が容易な検出を促進するように抗体分子を標識しなければならないかもしれないことが当業者に明らかである。抗体分子の標識技術は、当業者に周知である（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、１９８９、「抗体」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。
【０２１４】
トランスジェニック植物材料の投薬量および投与
本発明は、トランスジェニック植物材料の投与により避妊タンパク質に対する粘膜免疫応答が誘導される、避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物材料の動物への投与による動物の避妊の誘導法を提供する。１つの特定の理論に拘束されないが、本発明は、トランスジェニック植物材料の動物への投与に依存し、その結果、トランスジェニック植物細胞によって発現された避妊タンパク質は、投与された動物の１つまたは複数の粘膜表面に接触する。避妊タンパク質（抗原）がＧＡＬＴおよびＢＡＬＴに被さったＭ細胞によって取り込まれる場合、全身粘膜免疫により、体内の全分泌組織によって産生された避妊タンパク質に対する分泌型ＩｇＡが得られる（Ｃｅｂｒａら、前出；Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋら、前出；Ｗｅｉｎｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、前出；ＭｃＣａｕｇｈａｎら、前出）。したがって、経口投与は、全身粘膜免疫応答の刺激、さらに、口腔および胃腸管における分泌免疫応答の局所的刺激のために好ましい経路である。
【０２１５】
好ましい実施形態では、本発明の方法によって産生された避妊タンパク質を、避妊タンパク質を産生するトランスジェニック植物または植物細胞培養物から作製した食材の経口消費によって投与する。１つの実施形態では、本発明のトランスジェニック植物の食用部分を、食品成分として投与する一方で、避妊タンパク質がこのプロセスで投与される。
【０２１６】
１つの実施形態では、トランスジェニック植物材料を、未処理形態で動物に投与するが、植物材料を、カット、粗みじん切り、みじん切り、ダイスカット、ピューレ化、または動物による摂取を容易にするためのトランスジェニック植物材料のより小さな断片への減少（家畜による摂取のためのトランスジェニック牧草のサイレージへの減少など）によって処理することができる。未処理形態で投与することができるトランスジェニック植物材料には、果実、葉、茎、根、塊茎、および種子が含まれるが、これらに限定されない。トランスジェニック植物材料が牧草または穀物の形態であるさらなる実施形態では、避妊タンパク質を植物が成長する環境において植物材料を経口で消費するような動物への投与によって動物に植物を投与することができる（例えば、トランスジェニック牧草はウシによって食べられる牧場で成長するので、避妊タンパク質がウシに投与される）。
【０２１７】
別の実施形態では、トランスジェニック植物材料を、動物への投与前にさらに処理することができる（すなわち、粗みじん切りまたはカット以外）。トランスジェニック植物材料を、本発明のトランスジェニック植物材料が、経口、経鼻、または吸入投与のために精製する、当業者に公知の技術によって処理することができる。植物材料を、薬学的に許容可能で抗原と適合する賦形剤での乳化によって処理することができる。適切な賦形剤には、アジュバント、緩衝液、糖、抗酸化剤、安定剤、または抗原粉末（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、Ｑｕｉｌｌａｊａ抽出物、水、生理食塩水、デキストロース、グルコース、スクロース、グリセロール、またはエタノールなどおよびその組み合わせ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、所望ならば、ワクチンは、一定量の潤滑剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ調整剤、またはワクチンの有効性を増強させるアジュバントを含み得る。さらに、動物による摂取を容易にするために、植物材料を、非トランスジェニック植物または非植物材料と混合することができる。トランスジェニックトウモロコシを他の野菜と混合するか、トランスジェニックダイズ植物をダイズバーガー、ダイズシェイク、または豆乳を作製するためにスパイスまたは他の香味料などの他の成分と混合することができる。さらなる例として、トランスジェニックタバコ培養物をろ過紙、および混合、噴霧、またはトップコートなど（これらに限定されない）の手段によって標準的な飼料材料に添加することができる。さらに、トランスジェニック植物材料を乾燥させ、粉末形態での単独またはジュースまたは水などの許容可能な液体との懸濁液として投与することができる。
【０２１８】
さらなる実施形態では、植物材料および／または細胞が薬学的許容可能なクリーム、軟膏、軟膏、または座剤に組み込まれるように植物材料を処理することができる。したがって、薬学的手段を含むトランスジェニック植物材料を、薬学的に運搬された植物材料の粘膜表面（経口、経鼻、直腸、または膣が含まれるが、これらに限定されない）への接触によって動物に投与することができる。本発明のトランスジェニック植物材料に接触することができるさらなる粘膜表面には、気管支の内被、鼓室の粘膜層、結腸の粘膜内被、精管の内層、食道の内被、小腸の粘膜、咽頭の粘膜、舌の粘膜、下垂体膜、口腔の粘膜、咽頭の粘膜、気管の粘膜内層、耳管の裏打ち、卵管の粘膜層、卵管の内層、尿道の内層、子宮内膜、膣の粘膜、胃の粘膜、膀胱の内被、および精嚢の粘膜が含まれる。
【０２１９】
投薬量
本発明のトランスジェニック植物材料を、上記の多数の異なる形態（例えば、未処理、粉末など）で動物に投与することができる。好ましい実施形態では、本発明で有用なトランスジェニック植物材料は、１ｇの乾燥植物材料あたり少なくとも８μｇの避妊タンパク質または避妊タンパク質／粘膜標的タンパク質融合物、１ｇの乾燥植物材料あたり好ましくは少なくとも１０μｇ、および最も好ましくは少なくとも２０μｇの避妊タンパク質を発現する。
【０２２０】
１つの実施形態では、制御された環境下（実験室、犬小屋または個人の家など）で収容された動物および野外に収容されているが飼料の摂取は規則的な動物（例えば、家畜）に１週間毎にトランスジェニック植物材料を少なくとも１２週間与える（すなわち、０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７日目）。各採食において、処理する動物のサイズおよび平均摂食量に依存して動物に４ｇと１００，０００ｇとの間のトランスジェニック植物材料を与えた（例えば、平均的なウシは、１日あたり約９０ポンドの飼料を消費する）。
【０２２１】
別の実施形態では、一次避妊ワクチン接種を達成するために上記の家畜動物集団に毎日（例えば、０、１、２、３、４、５、６日目）トランスジェニック植物材料を与え、その後十分な避妊免疫状態を維持するために規則的な追加スケジュール（例えば、毎月）でトランスジェニック植物材料を与える。
【０２２２】
別の実施形態では、トランスジェニック植物材料の送達を使用して、避妊調製物の不変送達を増加させる。例えば、避妊調製物（植物、細菌酵母、または哺乳動物細胞などの系によって産生）を発育期の比較動物に獣医が送達させ、規則的なスケジュール（例えば、毎月）で本明細書中に記載のトランスジェニック植物材料由来の処方避妊飼料を追加することができる。
【０２２３】
ヒトへの適用のための別の実施形態では、トランスジェニック植物材料を、カプセルまたは錠剤に処方し、自己投与計画に組み込み、それにより避妊および非避妊錠剤またはカプセルを別の日に投与するか投与しないように包装することができる。
【０２２４】
別の実施形態では、天然の環境に置かれた餌の形態で野生動物にトランスジェニック植物材料を投与することができる。最良の餌の送達方法および投与あたりの集団効果のモデリングは、野生集団抑制分野の当業者に利用可能であり、各標的種のための最良の特異的餌療法を決定する。あるいは、本発明の避妊タンパク質を発現するトランスジェニック植物を、避妊タンパク質を投与される動物が生息する領域に野生で成長させることができる。本明細書中に記載の技術を使用して植物を試験して、植物によって発現される避妊タンパク質量を測定することができる。好ましい実施形態では、野生で成長したトランスジェニック植物は、１ｇの乾燥植物材料あたり少なくとも８μｇの避妊タンパク質または避妊タンパク質／粘膜標的タンパク質融合物、１ｇの乾燥植物材料あたり好ましくは少なくとも１０μｇ、および最も好ましくは少なくとも２０μｇの避妊タンパク質を発現する。これらの条件下で、野生動物にトランスジェニック植物材料が自由に与えられる。
【０２２５】
アジュバント
抗原応答を増大させるために、免疫学的抗原と共にアジュバントを添加することができることが当分野で周知である（Ｃｏｌｉｇａｎ  ＬＧら編、「現代の免疫学プロトコール」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５）。数十年間にわたり、フロイント完全アジュバントが免疫学的アジュバントの主力であった。通常有効であるが、アジュバントは、望ましくない副作用を誘導し得るので、その使用が改良され、代替物が開発されている。
【０２２６】
他のアジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない。解毒エンドトキシン（ＭＰＬ）およびマイコバクテリア細胞壁成分（ＴＤＷｍＣＷＳ）の２％スクアレン溶液を含む水中油滴型乳濁液であるＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）；ＴｉｔｅｒＭａｘ（安定で代謝可能な油中水滴型アジュバント）（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ）；Ｓｙｎｔｅｘアジュバント処方物（ＳＡＦ）3（Ｔｗｅｅｎ８０およびｐｌｕｒｏｎｉｃポリオキシレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーＬ１２１によって安定化された水中油滴型乳濁液）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）（フロイント完全アジュバントの低炎症性代替物）（Ｎｏｖａｖａｘ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；ＡＬＵＭ−水酸化アルミニウム（特にワクチンなどの市販品において広範に使用されれているアジュバント）（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋからＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとして市販されている）；ＳｕｐｅｒＣａｒｒｉｅｒ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ｅｌｖａｘ４０Ｗ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（オレイン酸マニド化合物）（ＩＳＡ  Ｓｅｐｐｉｃ  Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）；ニトロセルロース吸収タンパク質（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＢＯ、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ａ．「免疫化用の不活性キャリア」、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３、５５３〜５５７、１９９２）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｃ−Ｃ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）（Ｃｏｌｉｇａｎ  ＬＧら編、「現代の免疫学プロトコール」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５）。
【０２２７】
非経口ワクチン接種のためにサポニンアジュバントが長年にわたり使用されている（製品には、「ＱｕｉｌＡ」または「ＱＳ−２１」が含まれる）。サポニンは、二次代謝産物として産生されるグリコシド化合物である。サポニンは、高等植物および棘皮動物門のいくつかの海洋無脊椎動物に広範に分布する（ＡｐＳｉｍｏｎら、Ｓｔｕｄ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１７、２７３〜２８６、１９８４）。その抗菌活性のために、植物サポニンは微生物（特に、真菌）に対する有効な化学的防御である（Ｐｒｉｃｅら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．、２６、２７〜１３５、１９８７）。サポニンは、多数の海洋無脊椎動物の毒性を担う（ＡｐＳｉｍｏｎら、Ｓｔｕｄ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１７、２７３〜２８６、１９８４）。サポニンの化学構造により、広範な薬理活性および生物活性（いくつかの強力且つ有効な免疫学的活性を含む）が得られる。さらに、化合物のこのファミリーのメンバーは、発砲性（同定された特徴）、界面活性（溶血活性を担う）、コレステロール結合活性、真菌毒活性、軟体動物駆除活性、避妊活性、成長遅延活性、去痰活性、抗炎症活性、鎮痛活性、抗ウイルス活性、心筋活性、酵素阻害活性、および抗腫瘍活性を有する（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ，Ｋ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７、４３５〜４７１、１９９１；Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．Ａ．＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２、３６３〜３８６、１９９６；Ｐｒｉｃｅ，Ｋ．Ｒ．ら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．、２６、２７〜１３５、１９８７）。
【０２２８】
さらに、サポニン溶液を界面活性剤として使用して、粘膜を横切るポリペプチド送達が増大されている。例えば、Ｐｉｌｌｉｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．、３２、３０２１〜２７、１９９１は、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ由来の非精製サポニンを含む１％溶液としての目薬でのインスリンの投与によりラットの血中Ｄ−グルコースレベルが迅速且つ再生可能に減少することを開示している。サポニンを欠くインスリン目薬は無効であった。日本国要約番号ＪＰ６２１２６１３５（１９８７）は、ステロイドまたはトリテルペン構造を有するサポニンを使用した成長ホルモン放出因子の鼻腔投与を開示している。Ｃｈｉｏｕ，Ｇ．Ｃ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、７８、８１５〜８１８、１９８９；およびサポニン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手）を含む目薬の成分としてのその投与によるインスリンの全身送達を開示するＣｈｉｏｕ，Ｇ．Ｃ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍ．５：８１〜９１、１９８９もまた参照のこと。サポニンのこの界面活性はまた、生体膜の透過性を促進し、それにより免疫応答を増大させることができる。
【０２２９】
Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅの樹皮由来のサポニンアジュバント（Ｑｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎｉｎ）は、化学的および免疫学的に十分に特徴付けられた製品である（Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｋ．Ａｒｃｈ．Ｇｅｓａｒｎｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．、４４、２４３、１９７４；Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｋ．、Ａｃｔａ  Ｖｅｔ．Ｓｃａｎｄ．、１９（増補６９版）：１、１９７８；Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６、２２９、１９８７；前出、２６、２５７、１９８７；前出、２７、１１６８、１９８８；Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６、４３１、１９９１；Ｋｅｎｓｉｌら、米国特許第５，０５７，５４０号、１９９１；Ｋｅｎｓｉｌら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、９２、３５、１９９２；Ｂｏｒｎｆｏｒｄ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０、５７２、１９９２；およびＫｅｎｓｉｌ，Ｃ．ら、米国特許第５，２７３，９６５号、１９９３）。
【０２３０】
サポニンはまた、ダイズなどの他の植物中に存在する（Ａｎｄｒｚｅｊｅｗｓｋａ  Ｅ．、１９８４、Ｒｏｃｚ  Ｐａｎｓｔｗ  Ｚａｋｌ  Ｈｉｇ．、３５、１３５〜８）。
【０２３１】
Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンは、わずかに異なる約２０種の密接に構造が関連したトリテルペノイドグリコシドの混合物として見出され（Ｈｉｇｕｓｈｉ，Ｒ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６、２２９、１９８７；前出、２６、２３５７、１９８７；前出、２７、１１６９、１９８８；Ｋｅｎｓｉｌら、米国特許第５，０５７，５４０号、１９９１；Ｋｅｎｓｉｌら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、９２、３５、１９９２）、このことが分離を困難にしている。Ｑｕｉｌｌｉａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物は、市販されている（例えば、Ｇａｒｕｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｍｏｎ  Ｃｏｖｅ、ＣＡ９３２４４）。米国特許第５，２７３，９６５号および同第５，６５０，３９８号は、粗サポニン抽出物を開示しており、米国特許５，０５７，５４０号は、実質的に純粋なサポニン抽出物を開示している。粗および純粋なサポニンの抽出プロセスは、クロマトグラフィーによる化合物の精製を含む。
【０２３２】
本発明の有用なサポニンアジュバントには、粗および純粋なサポニン抽出物が含まれる（Ｇａｒｕｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｍｏｎ  Ｃｏｖｅ、ＣＡ９３２４４）。有用なサポニンアジュバントには、サポニンを含む植物の一部（例えば、葉、根、果実、または他の部分）または処理植物も含まれる。「処理した」は、動物による摂取を容易にするためのカット、粗みじん切り、みじん切り、ダイスカット、またはサポニン含有植物をより小さな断片への減少をいう。
【０２３３】
好ましい実施形態では、サポニンアジュバントを、トランスジェニック植物材料と共に経口投与する。
【０２３４】
免疫化の検出
本発明は、粘膜免疫応答が惹起された避妊タンパク質の投与による動物の避妊の誘導方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の避妊タンパク質を含むトランスジェニック植物材料の投与後、避妊タンパク質に対する免疫応答が惹起されているかどうかを決定するために動物を試験する。植物材料の投与後に一度に避妊タンパク質に対する免疫応答について動物を試験することができる。
【０２３５】
以下は、ＺＰ抗原の評価を記載しているが、記載の技術を、本明細書中に記載の避妊タンパク質に関する動物の免疫状態に使用することができる。１つの実施形態では、当業者は、ＺＰ抗原に関する動物の免疫状態の決定によって動物が免疫化されているかどうかを決定することができる。例えば、血液、血清、尿、唾液、涙などのサンプル中のＺＰ結合抗体の力価のアッセイによってこの評価を行うことができる。より好ましくは、ＺＰ免疫原またはその等価物に対する抗体を検出することができる酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）を、この目的に使用することができる（Ｄｒｅｌｌら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、３０、４４５、１９８４：ＥＬＩＳＡおよび他の固相免疫アッセイ（Ｋｅｍｅｎｙ，Ｄ．Ｍ．ら編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８８）（本明細書中で参考として組み込まれる）。
【０２３６】
免疫アッセイの周知の原理から理解されるように、免疫測定アッセイ（「２部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても公知）などの別の形態（「正方向」、「同時」、および「逆方向」アッセイを含む）を使用することができる（Ｆａｃｋｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、８、２１３〜２１９、１９８５；Ｙｏｌｋｅｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、４、３５、１９８２；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｐ．、「代替免疫アッセイ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８５；Ｎｇｏ，Ｔ．Ｔ．ら、「酵素媒介免疫アッセイ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８５）。
【０２３７】
例えば、「正方向」アッセイでは、ＺＰ抗原を、固体支持体（マイクロタイタープレート、試験管、計深棒など）結合させ、２固相ＺＰ抗体複合体が形成される条件下で、抗ＺＰ抗体の存在について評価したサンプルと最初に接触させる。インキュベーションおよび洗浄後、一定量の標識ＺＰ抗原（「レポーター分子」として機能する）と接触させて支持体を置く。標識ＺＰ抗原を非標識抗原を介した固定ＺＰと複合体形成させるための第２のインキュベーション後、固体支持体を第２の時間洗浄して、未反応標識ＺＰ抗原を除去する。この正方向サンドイッチアッセイ型は、抗ＺＰ抗体が存在するか残存標識ＺＰ抗原の量と既知量の抗ＺＰ抗体を含む標準から得られた量との比較によって定量することができるかどうかを決定するための単純な「イエス／ノー」アッセイであり得る。「２部位」または「サンドイッチ」アッセイは、Ｗｉｄｅ、「放射免疫アッセイ法」（Ｋｉｒｋｈａｍら編）、Ｅ．＆Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、１９９〜２０６頁、１９７０（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
【０２３８】
好ましい実施形態では、正方向ＥＬＩＳＡを使用して、粘膜免疫応答を測定することができる。上記のように、粘膜免疫グロブリンについて評価したサンプルとのインキュベーション後、動物から得られたサンプル中のＩｇＡの存在のレポーターとして機能する標識抗ＩｇＡ抗体と接触して支持体が存在する修飾を使用して、アッセイを行う。
【０２３９】
「同時」アッセイでは、結合ＺＰおよび標識ＺＰの両方を同時に試験サンプルに添加する１つのインキュベーションステップを使用する。インキュベーションの完了後、固体支持体を洗浄して、流動物サンプルの残渣および非複合体形成標識抗体を除去する。従来の「正方向」サンドイッチアッセイと同様に、固体支持体に会合した標識抗体の存在を決定した。
【０２４０】
「逆方向」アッセイでは、標識ＺＰ溶液をサンプルとインキュベートし、非標識ＺＰが先に結合された固体支持体に接触させて反応物を置く。第２のインキュベーション後、従来の様式で固相を洗浄して固相から試験サンプルの残渣および未反応標識ＺＰ溶液を除去する。「同時」および「正方向」アッセイと同様に、抗体力価の決定を行う。
【０２４１】
最も好ましい実施形態では、本発明のＥＬＩＳＡは、モノクローナル抗体を使用する。最も好ましくは、このような抗体を、ＺＰ抗原での異種動物（マウス、ラット、ウサギなど）の免疫化、およびその後の動物の脾臓白血球の採取、および上記の様式でのこれらと適切な骨髄腫細胞との融合によって上記のように作製する。
【０２４２】
特に好ましい固体支持体に関して免疫アッセイが記載されているにもかかわらず、種々の別の固体支持体を使用することができる。適切な固体支持体は、例えば、ガラス、紙、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、またはマグネタイトなどから構成され得る。支持体の性質は、本発明の目的のためにある程度の範囲で可溶性であるか不溶性であり得る。支持材料は、ＺＰ分子が抗体に結合することができる限り、事実上可能な構造形を有し得る。したがって、支持体の形は、球状（ビーズとして）または円筒形（試験管の内表面またはロッドの外表面として）であり得る。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどの平面であり得る。当業者は、モノクローナル抗体の結合に適切な哺乳動物他のキャリアに留意するか日常的な実験によってこれを確認することができる。
【０２４３】
さらなる実施形態では、本発明のトランスジェニック植物材料が投与された動物の免疫状態を、免疫組織化学技術によって評価することができる。簡単に述べれば、上記の投与経路によるトランスジェニック植物材料の投与後、雌動物を屠察し、卵巣を取り出すことができる。卵巣からの卵の放出後にファロピウス管で受精が起こるので、本発明の避妊タンパク質に対する抗体の存在が卵巣の卵で検出されることが好ましい。動物から除去後、卵巣を冷凍切断する。切片を、当分野で公知の固定剤（ホルムアルデヒド、アセトン、パラホルムアミド、およびグルタルアルデヒドが含まれるが、これらに限定されない）中に固定する。その後切片を洗浄し、避妊タンパク質に応答する動物によって惹起された抗体に結合する抗体とインキュベートする。切片を、レポーター分子（例えば、蛍光色素）を含む二次抗体とさらにインキュベートし、顕微鏡下で試験する。投与したトランスジェニック植物によって発現された避妊タンパク質に指向する抗体の同定は、避妊タンパク質に対して動物によって惹起された免疫応答の指標である。例えば、本発明のトランスジェニック植物材料をマウスに投与した場合、植物によって発現された避妊タンパク質に対する粘膜免疫応答を、マウス卵巣の組織切片の獲得およびマウス免疫グロブリンのκ鎖に指向する抗体での組織の処理によって測定することができる。抗マウスκ鎖抗体の局在を、蛍光色素などのレポーターに結合した二次抗体での組織の処理によって視覚化することができる。次いで、組織を、標識抗体を視覚的に局在するために顕微鏡下試験し、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）などの当分野で公知の形態計測コンピュータソフトウェアを使用して抗体標識画像を定量した。次いで、定量データを、本発明の避妊タンパク質で処理していないマウスから得た類似の抗体標識データと統計的に比較する。動物間の統計的に有意な相違は、避妊タンパク質でのマウスの免疫化の指標であり、統計的検定のＰ値は、少なくとも０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００１、０．０００５であり、好ましくは０．０００１である。
【０２４４】
避妊効果の決定
最も好ましい実施形態では、投与した本発明の避妊タンパク質の避妊効果を、本発明の方法によってトランスジェニック植物材料を投与された雌動物におる繁殖周期あたりの出生数の評価によって決定する。例えば、例えば、マウスへのトランスジェニック植物材料の投与から５〜６週間後、各雌マウスを、雄マウスのケージに入れる。次いで、１０日〜２０日後に雄マウスを取り出す。次いで、雌マウスの出生数を毎日観察する。投与した避妊タンパク質の避妊効果を、投与後の産仔数の減少によって決定する。例えば、平均出生数が３匹以上の動物種（例えば、マウス）では、産仔数の減少が１０％〜１００％、３０％〜９０％、または６０％〜８０％である場合に、避妊タンパク質が有効とみなすことができる。平均出生数が１匹または２匹の動物種（例えば、オジロジカ）では、産仔数の減少が少なくとも５０％、好ましくは１００％である場合に、避妊タンパク質が有効とみなすことができる。
【０２４５】
あるいは、本発明の避妊タンパク質の有効性を、上記のように血液、血清、粘膜、分泌物、排泄物などにおける避妊タンパク質に対する抗体レベルの測定によって決定することができる。避妊タンパク質の有効性を、上記の免疫組織化学技術による卵に結合した避妊タンパク質に対する抗体の視覚化によって評価することもできる。しかし、本発明の避妊タンパク質の有効性を正確に決定するために、避妊タンパク質に対する抗体の測定または視覚化を、観察された産仔数の減少と組み合わせて評価しなければならない。例えば、繁殖力が減少しない場合、避妊タンパク質を、動物の血清中のタンパク質に対する抗体の検出と無官営に有効でないとみなすことができる。
【実施例１】
【０２４６】
実施例１．植物至適化合成ＬＴ−Ｂ遺伝子への植物至適化マウスＺＰ３エピトープの融合
合成ＬＴＢ配列を含むＴＨ２１０（Ｍａｓｏｎら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６、１３３６）由来のＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）の対応部位に挿入して、ｐＢｌｕｅＬＴＢを作製した。ｐＢｌｕｅＬＴＢ内のＬＴＢコード領域の３’末端に６つのアミノ酸リンカー（翻訳）を融合させるために、固有のＢｂｓＩ部位の使用によってプラスミドｐＬＴＢ−Ｌを作製した。変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって精製した２つの市販の合成オリゴマー５’ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＴ（配列番号１）および５’ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＡＧ（配列番号２）を使用してリンカーを構築した。オリゴマーを、異なる反応においてＴ４キナーゼでリン酸化し、等モルで混合し、９０℃で５分間の加熱によってアニーリングし、その後１時間にわたり２３℃まで段階的に冷却した。ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩでの連続消化および子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）での脱リン酸化によってマウスＺＰ３エピトープの挿入のためにプラスミドｐＬＴＢ−Ｌを調製した。
【０２４７】
マウスＺＰ３（３３６〜３４２）エピトープのコード配列を、植物遺伝子と比較したそのコドン使用頻度について分析した（Ｗａｄａら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８、２３６７）。オリゴのアセンブリの際にＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ適合フラグメントを作製する５’および３’末端にさらなるヌクレオチドを含む天然のエピトープのアミノ酸配列を保持した植物至適化エピトープをデザインした。オリゴヌクレオチドＭｚｅｐＡ  ５’ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＴＡＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＣ（配列番号３）およびＭｚｅｐＢ  ５’ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＡ（配列番号４）を合成し、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって精製した。ｐＬＴＢ−Ｌの構築において、先に記載したようにエピトープを構築した。エピトープを氷上におき、その後ｐＬＴＢ−ＬのＢｂｓＩ、ＫｐｎＩフラグメントへのライゲーションによってｐＬＴＢＬ７を作製した。プラスミドｐＬＴＢ−ＬおよびｐＬＴＢ７を、ジデオキシ鎖終結法によって配列決定した。ｐＬＴＢ７のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩフラグメントが得られ、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＩＢＴ２１０（Ｈａｑら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、７１４）に挿入してｐＡＷ７を作製した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩでの消化後に発現カセットをｐＡＷ７から精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＧＰＴＶ．ｋａｎ（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０、１１９５）とライゲートしてｐＡＷＢｉｎ７を得た。
【実施例２】
【０２４８】
実施例２．トマト形質転換
大腸菌ＤＨ５αの培養物から調製したｐＡＷＢｉｎ７を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス  ＥＨＡ１０５にエレクトロポレーションした。種子を７０％エタノールで２分間の浸漬によって滅菌し、その後滅菌水でリンスし、１０％ドメストスと１％Ｔｗｅｅｎ−２０の混合物で２２時間洗浄すること以外は、Ｆｒａｒｙ  ａｎｄ  Ｅａｒｌｅ（Ｆｒａｒｙ  ａｎｄ  Ｅａｒｌｅ、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１６、２３５）のようにトマト子葉（変種Ｔａｎｋｓｌｅｙ  ＴＡ２３４ＴＭ２Ｒ）のアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。種子を滅菌蒸留水で３回リンスし、その後半分の強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（半分の強度のＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１５、４７３）、５０ｍｇ／ｌミオイノシトール、２ｍｇ／ｌチアミンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌピリドキシンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌニコチン酸、１０ｇ／ｌスクロース、および８ｇ／ｌｄｉｆｃｏ  ｂａｃｔｏ寒天（ｐＨ５．８））にプレートした。３００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む培地上に胚を再生させた。各株を、ガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡによって葉および果実でのＬＴＢ発現についてスクリーニングした。最良の果実を発現した株を自己受粉させ、得られた種子を、３００ｍｇ／ｌのカナマイシンを補足したＭＳ培地上で発芽させた。生存している苗木を土壌および温室に移し、自己受粉させた。各Ｔ１植物由来の果実を、凍結乾燥し、粉末にし、プールし、乾燥条件下で保存した。
【実施例３】
【０２４９】
実施例３．タンパク質抽出およびＥＬＩＳＡ
温室で成長させた植物由来の葉サンプルおよび新鮮な果実または乾燥果実サンプルを、Ｂｉｏ  １０１Ｆａｓｔ  ｐｒｅｐ装置にて２（新鮮なサンプル）または５０（乾燥果実）ｍｌ／ｌ（それぞれ）の氷冷抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で均一化した。不溶性物質を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｃにて、４℃で５分間の１４０００ｒｐｍでの微量遠心分離によってペレット化した。分析の間上清を氷上に保持し、−８０℃で保存した。植物サンプルの総タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用したクーマシー色素結合アッセイ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を使用して決定した。記載のように（Ｈａｑら、前出）各抽出物を１００倍希釈した２つのサンプルに対してガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡを行った（図１ａ、ｂ、ｃ）。
【実施例４】
【０２５０】
実施例４．融合タンパク質の精製および検出
１ｇの乾燥重量あたり８μｇを超えるＬＴＢを発現するＴ１植物由来の乾燥果実サンプルをプールした。材料を２０ｍｌ／ｇの氷冷抽出緩衝液で均一化すること以外は以前に記載のように乾燥サンプル由来の抽出物を作製した。得られた上清を、プラットフォームロッカーでＰＢＳ平衡化セファデックスと共に４℃で一晩インキュベートした。セファデッス溶液を静置し、１ｍｌのサンプルを回収し、４℃で保存した。セファデックス溶液の体積を、焼結ガラス漏斗を使用して減少させ、６０ｍｌの氷冷ＰＢＳでフラッシュした。５ｍｌ  ＰＢＳを使用してセファデックススラリーを作製し、真空デシケーターによって脱気し、Ｂｉｏ  ＲａｄＸカラムに注いだ。カラムを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのサンプルを第１および第５のミリリットル通過から回収した。融合タンパク質を、０．２Ｍ  Ｄ−（＋）−ガラクトースのＰＢＳ溶液を使用して溶出し、４℃で保存した。その後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に融合タンパク質に対応するバンドが検出された。融合タンパク質の存在を、実施例３に記載のＥＬＩＳＡによって確認した。
【実施例５】
【０２５１】
実施例５．ゲノム核酸の単離
液体窒素およびくぎを使用した１．５ｍｌ微量遠心分離チューブ中での２００〜２５０ｍｇの材料の粉砕によってＴ１植物の若葉組織からゲノム核酸を単離した。粉末を５００μｌの抽出緩衝液（４２０ｇ／ｌ尿素、３１２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％サルコシン）に再懸濁し、５００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）と共にサンプル回転機で３０分間インキュベートした。得られたスラリーを、１４０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離した。上部の水相を回収し、同体積の４Ｍ  ＬｉＣｌの添加によってＲＮＡを沈殿させ、−２０℃で少なくとも８時間インキュベートした。サンプルを、１５０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離し、上清を除去してチューブと分けた。ＲＮＡペレットを、５０μｌのＲｎアーゼ滅菌水に再懸濁した。１０体積％の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、１体積の氷冷イソプロパノールの添加によってゲノムＤＮＡを確保した上清から沈殿させ、−２０℃で少なくとも８時間インキュベートした。ＤＮＡを、７０％氷冷エタノールで洗浄し、５分間風乾し、５０μｌの滅菌水＋ＲＮアーゼ（５０μｇ／ｍｌ）中で再懸濁した。
【実施例６】
【０２５２】
実施例６．サザン分析
融合ＤＮＡの染色体組み込みを確認するためにサザンブロット分析を行った。
【０２５３】
１５μｇのＤＮＡを含むサンプルを、１μｇのＤＮＡあたり３．４単位のＨｉｎｄＩＩＩにて３７℃で一晩消化した。消化サンプルを、１％ＴＡＥアガロースゲルで一晩泳動した。ゲルを浄化し（０．２５Ｍ  ＨＣｌ）、アルカリ移行についての製造者の説明書にしたがって、ζプローブメンブレン（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）に移す。ＵＶ架橋によってＤＮＡを固定した。
【０２５４】
ｐＡＷ７テンプレート上でプライマー組ＴＥＶ（５’−ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ）（配列番号５）およびＶＳＰ（５’−ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  Ｃ）（配列番号６）を使用して、ＰＣＲ標識プローブを作製した。ＤＩＧ標識ｄＣＴＰを、製造者の説明（ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）にしたがって５８８ｂｐアンプリコンに組み込んだ。Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓサーモサイクラーを使用して、増幅を行った。テンプレートを、最初に９４℃で４分間融解し、その後９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３０サイクル行った。７２℃で５分間最終伸長ステップを行い、その後４℃で浸漬させた。
【０２５５】
ハイブリッド形成ボトルおよびメンブレンあたり１０ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ハイブリッド形成オーブンで４５℃に予備加温した。メンブレンを、少なくとも９０分間予備ハイブリッド形成させ、５μｌ／ｍｌＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂのプローブ濃度で一晩ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、製造者の説明にしたがって洗浄および検出を行った（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ−ＤＩＧ洗浄およびブロック緩衝液セットおよびＤＩＧ発光検出キット）。標識メンブレンを、フィルムに露光後視覚化した。融合ＤＮＡの植物宿主染色体への融合の組み込みを確認した。
【実施例７】
【０２５６】
実施例７．ノーザン分析
ノーザンブロット分析を使用して、ｍＲＮＡレベルで融合タンパク質の発現を確認した。
【０２５７】
「分子クローニング」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載のようにノーザン分析を行った。簡単に述べれば、ゲノムＲＮＡサンプルを、ホルムアルデヒド／ホルムアミドで変性させ、１％アガロースを含むＭＯＰＳ−酢酸−ＥＤＴＡゲルで２時間泳動した。次いで、ＲＮＡを、上方毛管現象によってζプローブメンブレン（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）に移し、ＵＶ架橋で固定した。ハイブリッド形成ステップを４２℃で行う以外は、サザン分析と同様に膜ハイブリッド形成および検出を行った。融合タンパク質ｍＲＮＡの存在を確認した。
【実施例８】
【０２５８】
実施例８．マウスへの採餌およびサンプルの採取
トランスジェニック植物の避妊効果の有効性を、実験用マウスを使用してインビボで試験した。
【０２５９】
マウスを、雄／雌ペアで収容する一方で、１匹の雄に対して３匹の雌をケージに入れた。実験を通して、雌あたりの出産数に留意した。
【０２６０】
１ｇの乾燥質量あたり８μｇを超えるＬＴＢを発現するトマト植物の凍結乾燥した粉末果実をプールおよび混合した。各採餌のために、トマト粉末をリンゴサイダーと１：２（ｗ／ｖ）で混合した。採餌を、２週間間隔で１２週間行った（０、３、１４、１７、２８、３１、４２、４５、５６、５９、７０、７３、８４、８７日目）。動物を３つの群に分け、４〜６匹に４ｇの野生型トマト＋リンゴサイダーを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックトマト＋リンゴサイダーを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックトマト＋リンゴサイダー＋Ｑｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）を与えた。開始から３１日目に、雌マウスを、正午に各ケージに移して水および睡眠のみを与える絶食プロトコールに供した。午後４時に試験食を与え、一晩放置した。翌朝午前８時に雌マウスを通常のケージに戻した。
【０２６１】
０日目および７０日目に、尾静脈由来の血清サンプルを各雌から採取し、さらなる抗体分析のために−８０℃で保存した。最終血清サンプルを、９６日目に心穿刺によって採取し、上記のように保存した。糞便サンプルを、７０および８７日目に採取し、−８０℃で凍結した。凍結ペレットサンプルを、凍結乾燥し、０．８ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）に再懸濁し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、アッセイまで上清を−２０℃で保存した。
【実施例９】
【０２６２】
実施例９．抗ＬＴＢおよび抗ＺＰ３エピトープのＥＬＩＳＡおよび実験マウスの受精能
サンプルを、記載のように、血清中の抗ＬＴＢおよび抗ＺＰ３エピトープＩｇＧ糞便ペレット中の抗ＬＴＢおよび抗ＺＰ３エピトープＩｇＡについてアッセイした（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３、１６１７）。結果を、図２ａおよび図２ｂに示す。サンプルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で連続希釈した。抗ＬＴＢ抗体の検出のために、マイクロタイタープレートを、混合ガングリオシド（ＩＩＩ型）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でコートし、０．２５％ＢＳＡでブロックし、精製組換えＬＴＢと１時間インキュベートした。抗ＺＰ３エピトープの検出のために、マイクロタイタープレートを、ＢＳＡに結合させた組換えエピトープでコートし、０．２５％ＢＳＡでブロックした。血清抗ＬＴＢまたは抗ＺＰ３エピトープを、マウスまたはハタネズミＩｇＧに対するウサギ抗血清およびアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）に結合したシカ抗ウサギ抗血清を使用して検出した。糞便抗ＬＴＢおよび抗ＺＰ３エピトープ抗体のレベルを、マウスまたはハタネズミ免疫グロブリンに対するヤギ抗血清およびアルカリホスファターゼに結合したウサギ抗ヤギ抗血清を使用して決定した。
【０２６３】
試験材料の経口送達効果を、コントロールおよび実験群由来の同腹子の数およびサイズの比較によって試験した（図３）。各群に６匹のマウスを使用した。マウスの実験群に、トランスジェニックトマトペーストを与えた。非標的種（Ｖｏｌｅ）に対する試験材料の効果もまた試験した（図４）。
【実施例１０】
【０２６４】
実施例１０．避妊タバコ懸濁培養物の産生
マウスＺＰ３エピトープ、ポッサム（フクロネズミ）ＺＰ３エピトープ、および一般的なＧｎＲＨエピトープのコード領域を、ＬＴＢ（下記の構築物、図５ａ、ｂ、ｃ）に融合した。マウスおよびポッサムエピトープを、ＬＴＢのカルボキシル末端から離れて翻訳されるようにそれぞれＬＴＢに融合した。ＧｎＲＨエピトープを使用して、３つの融合を行った。ＧｎＲＨエピトープを、アミノ末端、カーボイ末端からなはれて、またはＬＴＢ五量体の外側に存在すると予想される位置でのＬＴＢ単量体内で翻訳されるように、ＬＴＢに融合した。これらの融合タンパク質のコード領域を、ｐＩＢＴ２１０．１の植物発現カセットに置き、アグロバクテリウム媒介形質転換のためにバイナリベクターｐＧＰＴＶに挿入した。ＮＴ１細胞（タバコ細胞懸濁液）を、マウスＺＰ３−ＬＴＢ融合物、ポッサムＺＰ３−ＬＴＢ融合物、ＧｎＲＨカルボキシル融合物、およびＧｎＲＨ内部融合物で形質転換した。
【０２６５】
マウスおよびＧｎＲＨ融合形質転換体のＬＴＢ特異的およびＧｎＲＨ特異的ＥＬＩＳＡ分析を行った（図６）。カルボキシル末端融合について検出を確認し、ＬＴＢレベルは、内部融合物において低かった。本発明者らは、内部融合は五量体の形成を妨害し、それにより検出されると結論付けた。発現が低いにもかかわらず、ＧｎＲＨエピトープを、植物細胞によって発現させることができる。
【実施例１１】
【０２６６】
実施例１１．トランスジェニックニンジンの産生
全形質転換に、ニンジン品種Ｎａｎｃｏ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．ｃｖ．Ｎａｎｃｏ）を使用する。Ｎａｎｃｏは、Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９６（以下の引例）におって試験された３つの品種のうちの１つであり、形質転換頻度および再生速度が優れていた。種子を、種子供給業者（Ｈｅｒｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手し、Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＢＴＩ）に持ち込んだ。全ての種子は、２０分間の漂白、その後の発芽前の７０％エタノールで２０分間により表面を滅菌した。発芽、形質転換、または再生段階でのさらなる細菌または真菌感染で汚染した材料を、破棄した。無菌発芽から７〜１５日後にニンジンの胚軸を切り出した。外植片を液体成長培地に移し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５株（下記のように適切な発現ベクターを含む）とゆっくり震盪しながら室温の暗所で３６〜４８時間同時培養した。次いで、外植片を、さらなる植物オーキシン２，４−Ｄ（胚形成カルス産生を刺激する）、抗生物質チメンチン（残存するアグロバクテリウムの痕跡を全て回復させる）固体成長培地に移し、室温の暗所で保存した。
【０２６７】
５週間後、外植片が有意にカルスに成長し、非形質転換細胞に対して選択圧を誘導するためのカナマイシンを含む新たに調製した固体成長培地に移した。さらに５週間後、健康なカルスを、２，４−Ｄの非存在下で新鮮な固体培地に移し、胚再生を誘導するための明所に置いた。さらに、いくつかのカルスを、新鮮な培地（２，４−Ｄを含む）に移し、後期の再生のためにさらなるカルス産生を刺激するために暗所に移した。カナマイシン選択培地で適切に成長しなかったか（非トランスジェニックと考えられる）、細菌または真菌の汚染サインを示した全組織を破棄した。
【０２６８】
十分に明るくした再生／選択培地上で約１０〜１４週間後、初期の根および芽を有するニンジン胚を、制御された温室成長条件に移すことができる。植付けから８〜１０週間後、トランスジェニック根材料の採取を行った。
【実施例１２】
【０２６９】
実施例１２．トランスジェニックニンジン懸濁培養物の産生
カナマイシン培地（上記）から選択した２〜５ｇの健康なニンジンカルスを、５０ｍｌの液体培養培地に入れた。標準的な液体培地は、４００ｍｌの水、４００μＬ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇビタミン、１．７ｇＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ塩、１２ｇグルコースを含み、加圧滅菌によって滅菌し、その後微生物汚染を制御するために最終濃度の２，４−Ｄ（２．２ｍｇ／Ｌ）および抗生物質チメンチン（３００ｍｇ／Ｌ）を添加した。次いで、混合物を周囲温度のオービタルシェーカーに置き、１００〜１２０ｒｐｍで震盪した。カルスは、段階的により小さな各細胞または細胞クランプに分割された。７〜１０日毎に、５ｍｌの懸濁培養物を４５ｍｌの新鮮な液体成長培地に添加し、健康な細胞成長を維持した。
【実施例１３】
【０２７０】
実施例１３．粉末ニンジン細胞の産生
７〜１０日の成長後、液体懸濁培養を、ろ紙でろ過し、最低２４時間−８０℃で凍結させた。回収して長期間凍結した材料を、凍結乾燥チューブに入れ、凍結乾燥装置に最低４８時間接続する。得られた材料を秤量し、手で砕き、約３５０ｇのアリコートでの密封プラスチックバッグ中にて−２０℃で保存した。粉末材料は、高度に無水であり、触れるとヒトの皮膚に突き刺さる。粉末材料は、新鮮な収穫重量の１０％未満に減少していた。粉末材料のサンプルを、使用される構築物に特異的なＥＬＩＳＡおよびＰＣＲによってアッセイした。測定可能な抗原含有量は、１ｇの乾燥重量あたり５０〜１００μｇの範囲内であることが見出され、これは検出可能な抗原濃度の約１０〜１５倍であった。
【実施例１４】
【０２７１】
実施例１４．特異的構築物
ｐＴＨ１１０
この構築物は、大腸菌易熱性エンテロトキシン由来のＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）の発現をコードする。この構築物は、マウスへの経口送達（Ｍａｓｏｎら、前出）およびヒトの臨床試験（Ｔａｃｋｅｔら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｍｅｄ．、４、６０７）のためにすでに発現されている。この構築物を、ジャガイモ中で発現させ、ＭＡＦ輸入許可番号１９９９００７０３５の対象物であり、その後、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＺのＬａｎｄｃａｒｅ研究施設でポッサムに経口到達された。ＬＴ−Ｂを発現するニンジンを、下記の避妊材料の免疫学的試験および受精能試験のためのネガティブコントロール材料として使用される。
【０２７２】
ＬＴ−Ｂ分子は、天然の形態（および植物細胞中で）で五量体を形成し、生殖器官、気道、および消化管の粘膜表面を裏打ちする上皮細胞に結合親和性を提供する。この親和性により、避妊エピトープなどより小さなタンパク質の送達ストラテジーが得られた。以下の哺乳動物構築物は、ＬＴ−Ｂと免疫避妊ペプチドとの間の遺伝子融合をコードする。ＥＬＩＳＡによる葉および根材料の分析は、得られた分子は、候補ペプチドを同時に示す五量体であることを示した。
【０２７３】
ｐＧＰＴＶ−ＭｕＺＰ３
ｐＴＨ１１０と対照的に、この構築物は、ＶＳＰターミネーターの前にＬＴ−Ｂ遺伝子のカルボキシル末端に挿入されたさらなる配列を有する。さらなる配列には、リンカーペプチド（Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ）（配列番号７）および最小Ｂ細胞エピトープ、マウス透明帯糖タンパク質３（ＭｕＺＰ３）由来のアミノ酸残基３３５〜３４２（Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）（配列番号８）が含まれる。
【０２７４】
ｐＧＰＴＶ−ＧＮＲＨ１
ｐＧＰＴＶ−ＭｕＺＰ３と対照的に、この構築物は、ＭｕＺＰ３エピトープの代わりにブタゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のデカペプチドをコードする配列を有する。リンカーが保存されている。このデカペプチド配列（Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）（配列番号９）は、ほとんどの哺乳動物で一般的である。
【０２７５】
ｐＧＰＴＶ−ＧＮＲＨ３
ｐＴＨ１１０と対照的に、この構築物は、ＬＴ−Ｂ遺伝子のアミノ末端に（リンカーを介して）融合したＧｎＲＨデカペプチドを有する。シグナルペプチドは、ＬＴ−Ｂ内に含まれ、翻訳後プロセシングの際に切断されて、成熟単量体タンパク質を遊離する。この切断は、チロシンとグリシン（残基２０および２１）との間で起こる。ＧｎＲＨエピトープは、グリシン残基の後に直接挿入されている。短いリンカー（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）（配列番号１０）を使用して、ＧｎＲＨエピトープをＬＴ−Ｂのアミノ末端に結合し、成熟タンパク質のグリシン−アラニン開始配列を維持する。
【０２７６】
ｐＧＰＴＶ−ｐＡＷ６
ｐＧＰＴＶ−ＧｎＲＨと対照的に、この構築物は、ＧｎＲＨデカペプチドの代わりに、オーストラリアフクロギツネ透明帯糖タンパク質３（ＰｏｓｓＺＰ３）由来の推定Ｂ細胞エピトープをコードする配列を有する。エピトープは、２７個のアミノ酸（天然の配列由来の３３４〜３６１）からなり、リンカーが保存されている。
【０２７７】
ｐＧＰＴＶ−ｐＡＷ４
ｐＴＨ１１０と対照的に、ＬＴ−Ｂ遺伝子がポッサムＺＰ３をコードする全長遺伝子に置換されている。
【０２７８】
ｐＧＰＴＶ−ｐＡＷ４−Ａ２
ｐＧＰＴＶ−ｐＡＷ４と対照的に、この構築物は、推定切断ペプチドが除去されたＰｏｓｓＺＰ３の末端切断バージョンを含む。短いリンカー（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）（配列番号１１）および大腸菌易熱性エンテロトキシンサブユニットＡ（ＬＴ−Ａ）由来のＡ２領域をコードするフクロギツネＺＰ３遺伝子のカルボキシル末端にさらなる配列が挿入されている。毒素原性大腸菌によるコロニー形成により、ＬＴ−ＡおよびＬＴ−Ｂが分泌される。その天然の状態（および植物細胞中）では、これらは互いに結合して安定なホロトキシンを形成する。ＬＴ−Ｂが上皮の裏打ちに分子を標的する一方で、これはＡＤＰリボシル化およびその後下痢を引き起こす有毒なＡサブユニットである。ＬＴ−Ａサブユニットは、２つの領域Ａ１およびＡ２からなる。Ａ２と呼ばれる領域は、Ａ１領域の下方からＬＴ−Ｂによって形成される五量体まで伸長したαへリックスを形成し、２つのサブユニットの間に結合を形成する。Ａ１タンパク質は、五量体の上に固定される。ｐＧＰＴＶ−ｐＡＷ４−Ａ２の場合、植物細胞がｐＴＨ１１０（または上記の誘導体）で同時形質転換された場合、Ａ２へリックスは、ＰｏｓｓＺＰ３たんぱく質とＬＴ−Ｂ五量体との間にアンカーを提供する。
【実施例１５】
【０２７９】
実施例１５．ニンジンサンプルを使用したマウス避妊実験
実施例１４の構築物の１つを含むトランスジェニックニンジンを、実施例１１に記載のように産生し、実施例１２および１３のように処理した。マウスを、雄／雌ペアとして収容する一方で、１匹の雌に対して３匹の雌のマウスをケージに入れた。実験を通して、雌あたりの出産数に留意した。
【０２８０】
１ｇの乾燥質量あたり５０μｇを超えるＬＴＢを発現する粉末ニンジンをプールおよび混合した。各採餌のために、ニンジン粉末をリンゴサイダーと１：２（ｗ／ｖ）で混合した。採餌を、２週間間隔で１２週間行った（０、３、１４、１７、２８、３１、４２、４５、５６、５９、７０、７３、８４、８７）。動物を３つの群に分け、４〜６匹に４ｇの野生型ニンジン＋リンゴサイダーを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックニンジン＋リンゴサイダーを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックニンジン＋リンゴサイダー＋１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）を与えた。
【０２８１】
開始から３１日目に、雌マウスを、正午に各ケージに移して水および睡眠のみを与える絶食プロトコールに供した。午後４時に試験食を与え、一晩放置した。翌朝午前８時に雌マウスを通常のケージに戻した。
【０２８２】
０日目および７０日目に、尾静脈由来の血清サンプルを各雌から採取し、さらなる抗体分析のために−８０℃で保存した。最終血清サンプルを、９６日目に心穿刺によって採取し、上記のように保存した。糞便サンプルを、７０および８７日目に採取し、−８０℃で凍結した。凍結ペレットサンプルを、凍結乾燥し、０．８ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）に再懸濁し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、アッセイまで上清を−２０℃で保存した。
【実施例１６】
【０２８３】
実施例１６．新鮮な植物材料を使用したマウスの採餌
新鮮な植物も使用して、実験マウスに与えた。トマトおよびニンジン植物の葉または新鮮なトマトおよびニンジンを使用した。
【０２８４】
１ｇの乾燥質量あたり５０μｇを超えるＬＴＢを発現する乾燥粉末に対応する新鮮な葉またはトマトおよびニンジンをプールおよび混合した。いくつかの場合、新鮮な材料を小片に粗みじん切りにした。採餌を、２週間間隔で１２週間行った（０、３、１４、１７、２８、３１、４２、４５、５６、５９、７０、７３、８４、８７）。動物を３つの群に分け、４〜６匹に４ｇの野生型トマトまたはニンジンを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックトマトまたはニンジンを与え、４〜５匹に４ｇのトランスジェニックトマトまたはニンジン＋１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）を与えた。
【０２８５】
開始から３１日目に、雌マウスを、正午に各ケージに移して水および睡眠のみを与える絶食プロトコールに供した。午後４時に試験食を与え、一晩放置した。翌朝午前８時に雌マウスを通常のケージに戻した。
【０２８６】
０日目および７０日目に、尾静脈由来の血清サンプルを各雌から採取し、さらなる抗体分析のために−８０℃で保存した。最終血清サンプルを、９６日目に心穿刺によって採取し、上記のように保存した。糞便サンプルを、７０および８７日目に採取し、−８０℃で凍結した。凍結ペレットサンプルを、凍結乾燥し、０．８ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）に再懸濁し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、アッセイまで上清を−２０℃で保存した。
【実施例１７】
【０２８７】
実施例１７．粉末ホモジネートにおける抗原濃度のばらつきの減少
植物由来ワクチンの適用は、一貫した用量を提供する能力および適用すべき最小および最大用量を補助するための臨床データの達成に依存する。ワクチン材料が許容範囲内で一貫した抗原濃度を提供する場合、バッチ製造およびＱＣの正確さのみを評価することができる。３つの最近のヒト臨床試験（Ｔａｃｋｅｔら、１９９８、Ｔａｃｋｅｔら、２０００、Ｔｈａｎａｖａｌａら、私信）では、ヒトボランティアに、目的の抗原タンパク質を発現する未処理で角切りのトランスジェニックジャガイモ材料を与えた。各臨床試験における実験用量は、消費した材料の無作為化したサンプルのアッセイの結果によって示されるように、３００％もばらつきが認められた。本明細書中に記載の方法によって脱水粉末に減少した類似のジャガイモ材料により、無作為化サンプルを通してばらつきが１／１０まで減少した等価なインビトロ免疫原性反応（適切なアッセイ検出による）が得られた。この結果は、同一の抗原（ＨＢｓＡｇ）ならび表１に示したいくつかの他のモデル植物種および抗原を発現する処理したトランスジェニックトマト材料でも同一であった。
【０２８８】
実施例では、２つのいずれかの方法によって均一化を行った。第１の方法を凍結乾燥前に適用し、この方法は、新たに採取した植物材料の粗パルプ化および混合ならびにその後の混合材料の凍結および凍結乾燥を含む。第１のスライス、混合、または粉砕プロセスにより、未処理植物組織（果実、塊茎、葉、種子など）をパルプ混合物に減少させた。この混合物は、完全な植物細胞と粉砕された細胞破片の両方を含むと見なされる。このプロセスの利点は、より大きな器官（果実または塊茎など）の処理しやすい混合物への減少であり、それにより組織間の相同なタンパク質のばらつきが材料の均一なバッチに組み合わされる。全植物細胞の完全性を完全に破壊することなく均一なバッチを得る能力により、その後の処理段階で相同タンパク質の安定な保存環境が得られる。第２の均一化方法には、処理前の植物材料の処理を最低限にすることが必要であった。上記のように、スライス、四つ切り、または完全な材料の凍結乾燥を行った。次いで、得られた材料を、手で破壊して微粉末にし、１バッチのコンテナに入れ、震盪または乾燥混合などの機械的手段によって完全に混合した。
【０２８９】
任意のピューレ化ステップの除去により、全ステップに必要な労働密度が減少した。前乾燥処理（ピューレ化、皮むき、四つ切り、またはスライス）の効果を、ジャガイモの全乾燥時間に対するその効果について評価した。図７に示すように、完全な凍結乾燥状態への減少は、ジャガイモ材料の皮をむかないかいくつかの手段（四つ切り、ダイスカット、スライス、またはピューレ化）でカットしない場合に限り、制限される。
【実施例１８】
【０２９０】
実施例１８．ジャガイモ塊茎サンプルを、非ピューレ化プロトコールを使用してトランスジェニックタンパク質の損失を最小にしながら脱水によって乾燥重量対湿重量を基準として１１倍まで濃縮することができる
以前の採餌試験は、所望の抗原の十分な用量を送達させるために比較的大量の材料を使用していた。例えば、上記で参照された３つのヒト臨床試験は、ボランティアが各セッションで１００ｇ〜１５０ｇの範囲の未処理ジャガイモを消費することが必要であり、ボランティアによっては単回用量を３０分以上かけて消費していた。１００ｇまたはそれ以上の未処理材料の経口投与は、おそらくワクチンを投与される者が十分に許容できず、より大きな規模のワクチンには耐えられないであろう。本明細書中に記載のプロセスの主な利点は、達成されたタンパク質濃度である。表２で示すように、材料の質量を、９４％（ジャガイモの最終重量は１１％、トマトの最終重量は６％）も減少させた。上記で参照した臨床試験と比較して、このような質量の減少により、理論的には、たった６グラムの粉末の消費によって等価な用量が得られ、処理による抗原の顕著な損失はないとみなされる。さらに、この粉末材料の物理量は、テーブルスプーン数杯のペーストまたは混合飲料の消費などのより親しみやすい方法によって経口摂取物の処方に便利である。
【０２９１】
記載のデータは、いくつかの抗原の例を提供し、いくつかの植物種および組織にわたる。９０％を超える水分の除去により、湿重量に対する乾燥重量の基準として植物サンプルを１１倍まで濃縮される。しかし、材料の質量が１／１１に減少するにもかかわらず、抗原濃度は一般に評価した植物種に依存して４〜８倍増加し、処理の結果としての抗原の顕著な損失（または少なくとも抗原検出の減少）を示す。使用した例は、一般に、未処理材料のピューレ、さらなる任意の賦形剤（抗酸化剤、安定剤、アジュバントなど）、その後の凍結、凍結乾燥、および得られた材料の微粉末への減少を含んでいた。表２にまとめたように、等価な特徴の材料を得ることができる一方で、いくつかの植物種において抗原損失を最小限にすることができる上記の非ピューレプロトコールを示した。
【０２９２】
この手順の実践的結果は、有意により低い投与体積で、それにともなって抗原濃度が増大した処方および経口投与ができることである。さらに、この方法は、細胞構造および目的のトランスジェニックタンパク質を著しく破壊することなく湿式混合による均一化に影響を受けやすい葉または茎などの広範な植物組織由来のワクチンまたは治療薬の安定化のための都合のよい機構を提供する。
【実施例１９】
【０２９３】
実施例１９．ホモジネート処方物の周囲安定性および抗原回収率および安定性に対する賦形剤の効果
植物由来の医薬品の抽出に依存する以前の研究では、粗植物抽出物中の標的タンパク質の安定性を評価した。アルファルファから産生されたモデル抗体の抽出により、水抽出物で２時間まで、乾燥アルファルファで１２週間までの安定性を示した（Ｋｈｏｕｄｉら、１９９９）。特に経口ワクチンストラテジーとして植物由来の治療薬の価値を最大に高めるために、いくつかの腐敗しにくい食品形態の安定性を、少なくとも６ヶ月、好ましくは２〜３年に延長する必要がある。
【０２９４】
目的のモデル抗原を発現するいくつかの処方物を、１２ヶ月までの規則的な期間で所望のタンパク質の周囲安定性について評価した。図９に示すように、大部分の材料は周囲保存下で抗原が著しく分解しなかった。これは、有効な非熱分解は、乾燥同時植物材料であるか、植物細胞内に封入されたままであり、部分的に破壊された細胞破片である抗原に保護状態を提供する有効な手段であることを示す。植物酵素または構造タンパク質の存在が、抗原が非トランスジェニックホモジネートに急増する処方物のこの保護の付与に十分であるかどうかを決定するためにさらなる試験を完了すべきである。
【０２９５】
免疫原性の評価ならびに植物材料処理、抗原回収率、および抗原安定性に対するその効果を調査するためにいくつかの賦形剤をこれらのモデル処方物に添加した。以前の報告（Ｌｅｏｐｏｌｄ、１９８８）では、単純なガラス状の糖は天然のタンパク質変性に対する保護によって植物酵素を安定化することができると結論付けられた。食品グレードの供給源をピューレ化時にトランスジェニックトマトホモジネートに添加して、植物材料中にカプセル化された抗原の安定性に対する効果を評価した。糖に加えて、実験アジュバントを臨床評価のために液相（ピューレ後）のジャガイモまたはトマトに添加し、アスコルビン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）をいくつかのサンプルに添加して、抗酸化剤のピューレ化ジャガイモ中での抗原の損失を最小にする能力を評価した。抗原回収率および安定性に対するこれらの賦形剤の効果は一貫していないが、いずれの場合も重大ではない。供給源の添加におり適切な脱水産物に到達するために必要な乾燥時間が著しく増加する。ピューレ化ジャガイモの視覚可能な酸化（褐変）を有効に遮断するためには、１：１５０未満（質量）の濃度でのアスコルビン酸の添加が必要であるが、この濃度は試験サンプル内の記録可能な抗原レベルに対して一貫した効果がなかった。
【０２９６】
一般に、全ての凍結乾燥材料は、周囲温度で少なくとも６ヶ月間、いくつかの場合では１２ヶ月まで周囲温度での抗原の安定性が示された。凍結乾燥がこれらの例での主な脱水方法である一方で、粗くパルスした材料を、保存前に風乾または噴霧乾燥によって安定化することもできる。理想的には、どのような乾燥方法によっても、最終材料を全水分含有量の少なくとも９０重量％の除去に十分に脱水し、密封バッグまたはコンテナで保存する。一旦密封すると、均一な粉末を、測定可能なレベルの標的タンパク質レベルのいかなる顕著な減少もせずに相当な期間室温で保存することができる。
【実施例２０】
【０２９７】
実施例２０．乾燥免疫避妊トランスジェニックトマトを与えられた動物はコントロール動物と比較して産仔数が減少した
この研究内で、サポニンアジュバントと同時投与された経口送達される植物由来のＬＴＢマウスＺＰ３エピトープ融合タンパク質は、種特異性を示し、マウスの受精能が４５．３％減少した。
【０２９８】
本研究で使用されたトランスジェニックトマト果実は、Ｍｉｌｌａｒらに記載のマウスＺＰ３遺伝子由来のエピトープに融合したＬＴＢを発現した。以下の３つの試験食を使用した。野生型トマト（コントロール）、トランスジェニックトマト（トランスジェニック）、およびＱｕｉｌｌａｊａ抽出物を含むトランスジェニックトマト（トランスジェニック＋アジュバント）。凍結乾燥した粉末トマト果実を、１：２（重量）で低温殺菌リンゴサイダー（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｏｒｃｈａｒｄｓ）と混合した。トマト果実中のＬＴＢ濃度を、融合タンパク質濃度に関する概算として得た。１ｇの乾燥質量あたり８ｇを超えるＬＴＢを発現するトマト果実を、２つのトランスジェニック群の試験食で使用した。トランスジェニック果実のプール後、計算した平均ＬＴＢまたは融合タンパク質は、３７．８ｇ．ｇ-1であった。トランスジェニック＋ｑｕｉｌｌ群のために、４ｇの飼料あたり１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）も添加した。採餌時に、雌に４ｇの試験飼料をペトリ皿で与えた。トランスジェニック果実からなる治療では、これは、飼料あたりのＬＴＢ融合タンパク質の全部で１００．８ｇとなった。
【０２９９】
マウスおよびハタネズミの両方に２週間毎に１２週間試験食を与えた（０、３、１４、１７、２８、３１、４２、４５、５６、５９、７０、７３、８４、および８７日目）。
【０３００】
マウスのために、試験食を与える最初の５日間（０日目〜２８日目）に、雌をホームケージから取り出し、試験食を含む個別のケージに入れ、４〜６時間放置し、その後ホームケージに戻した。開始から３１日目に、雌マウスを、正午に各ケージに移して水および睡眠のみを与える絶食プロトコールに供した。午後４時に試験食を与え、一晩放置した。翌朝午前８時に雌マウスを通常のケージに戻した。両採餌計画を使用して、消費された試験食の最終重量を記録した。
【０３０１】
ハタネズミについては、雌に試験飼料を与える直前に、ホームケージから雄および任意の子を取り出し、試験食の消費を防止するために一時的に保持ケージに移した。分離によって生じたいかなるストレスも軽減させるために最大１時間雌を戻した。雌がこの時間内に全トマト混合物を消費しない場合、残存部分を除去し、同一の採餌手順にしたがって４時間後に再度勧めた。使用された最終の重量を記録した。
【０３０２】
マウスおよびハタネズミの両方の実験を通して雌が出産した同腹子および子の数を記録した。
【０３０３】
マウスでは、出生数に関して食餌処理間で有意差は認められなかった（α＝０．０５）。しかし、コントロール食を与えたメスの産仔数（平均５．３匹／同腹子）と比較してトランスジェニック＋アジュバント食を与えたメスの産仔数（平均２．９匹／同腹子）は４５．３％減少した。これは、信頼区間を使用して有意な減少と証明される（α＝０．１）。
ハタネズミでは、出生数に関して食餌処理間で有意差は認められなかった（α＝０．０５）。９５％の信頼区間を使用しても同腹子に関する食餌処理の間に有意差は認められなかった（α＝０．０５およびα＝０．１）。
【実施例２１】
【０３０４】
実施例２１．抗原含有量の処理効果
質量および抗原含有量に対する凍結乾燥の効果を決定するために、５つのＴ2植物由来の２つの果実を秤量し、処理前後にＬＴＢ含有量についてアッセイした。凍結乾燥前後サンプル質量の比較により、サンプルをその元の質量の６％に減少させる（データ示さず）プロセスが明らかとなった。新鮮な材料および処理した材料のＬＴＢ含有量のＥＬＩＳＡ分析により、類似の１６倍濃縮を示す抗原が示され、これにより、使用した処理方法（図１０）によって抗原があまり喪失していないことが示唆される。
【実施例２２】
【０３０５】
実施例２２．植物由来のワクチンを使用した経口免疫化により、子孫が受動的に免疫化される
動物
試験食を与える場合以外は水および標準的な実験用飼料を準備したケージにマウスを維持した。各処理群には、５〜６匹の成体雌マウスを含んでいた。雌を、ケージあたり１匹雄に対して雌３匹または１匹の雄に対して雌２匹のいずれかの比でパートナーと組ませた。離乳時に子を取り出し、ケージで１つの性を維持した。
【０３０６】
試験食
ＬＴＢを発現するトランスジェニックトマト株を、承認された温室施設内で成長させた。採取したトマトを、粉末形態に処理し、均一なワクチンバッチとして組み合わせた。このバッチを、使用前に４℃で保存した。トランスジェニックトマト粉末とリンゴサイダーとの１：２（重量）の比での混合によってワクチンを処方した。４ｇのトランスジェニック粉末に対して１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｉａ抽出物を含む基本ワクチン処方物の増加によって、アジュバント化処方物を達成した。
【０３０７】
ワクチン接種療法
採餌を、２週間間隔で１２週間行った（０、３、１４、１７、２８、３１、４２、４５、５６、５９、７０、７３、８４、８７）。開始から３１日目に、雌マウスを、試験食を与える前に４時間、各ケージに移して水および睡眠のみを与える絶食プロトコールに供した。ジャガイモ食を雌とともに一晩放置し、翌朝午前８時に取り出し、その時点で雌を通常のケージに戻した。上記のように、非トランスジェニック処方物（ｎ＝４）、トランスジェニック処方物（ｎ＝５）、またはアジュバント処方物（ｎ＝５）のいずれかを動物に投与した。
【０３０８】
血清サンプリング
０日目および７０日目に、尾静脈由来の血清サンプルを各雌から採取し、分析のために−８０℃で保存した。最終血清サンプルを、９６日目に心穿刺によって採取し、上記のように保存した。試験から４２日後、各実験群で誕生した子（群あたり２匹またはそれ以上の母から群あたり最少で１３匹）を、その後の受動抗ＬＴＢ力価の決定のために良好な健康状態を維持した。最少年齢２１日間で、これらの子から心穿刺によって血清を採取した。
【０３０９】
抗ＬＴＢ抗体のためのＥＬＩＳＡ
記載のように血清抗ＬＴＢ  ＩｇＧについてサンプルをアッセイした（８）。簡単に述べれば、サンプルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで連続希釈した。マイクロタイタープレートを、混合ガングリオシド（ＩＩＩ型）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でコートし、０．２５％ＢＳＡでブロックし、精製組換えＬＴＢと１時間インキュベートした。希釈血清をウェルに添加し、洗浄前に１時間インキュベートし、マウスＩｇＧに対するウサギ抗血清およびアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）に結合した抗ウサギ抗血清を使用して検出した。母および対応する同腹子の終点希釈の比較によって母と子との間の力価の関係を調査した。子の誕生日が最も近い（７０日または９６日）ものの血清サンプルの終点希釈として母の希釈を得た。２１日齢で交配した子のみを、この分析に用いた。このデータセットは、７匹の母、９つの同腹子、および４１匹の子からなる。
【０３１０】
処理および同腹子
ＬＴＢ力価決定のためにサンプリングされた子のうち、４つの同腹子由来の１８匹の子がコントロール群由来の３匹の異なる母親から生まれ、４つの同腹子由来の１７匹の子がトランスジェニックトマト群由来の４匹の異なる母親から生まれ、３つの同腹子由来の１３匹の子がトランスジェニックトマト＋アジュバント群由来の２匹の異なる母親から生まれた。
【０３１１】
抗ＬＴＢ抗体のＥＬＩＳＡ
トランスジェニックトマト食群またはトランスジェニックトマト＋アジュバント食群内の親マウスは、接種あたり平均７５．６μｇのＬＴＢを含むトマトの１４個の経口接種物を投与された。サンプリングした子の出産前に母親が投与された接種物数はさまざまであるが、少なくとも８回採餌された。トランスジェニックトマト食を投与された全母親は、試験７０日目までのコントロール群よりも有意に高い抗ＬＴＢ血清ＩｇＧ力価を産生した（図１１、α＝０．０５）。２つのトランスジェニック材料の試験食（Ｑｕｉｌｌａｊａ抽出粉末を含むか含まないトランスジェニックトマト粉末）の間で力価の有意差は認められなかった。コントロール群の母親から生まれた１８匹の子のうち、２５を超える終点希釈を有する子はいなかった（図１２）。トランスジェニックトマト群の母親から誕生した１７匹の子の平均終点希釈は５５８．８である一方で、トランスジェニックトマト＋アジュバント群の母親から誕生した１３匹の子の平均終点希釈は４４８．１であった。トランスジェニックトマトとトランスジェニックトマト＋アジュバントの母親由来の子の平均終点希釈の間で有意差は認められなかったが（α＝０．０５）、両トランスジェニック食由来の子の平均終点希釈は、コントロール群よりも有意に高かった（α＝０．０５）。母親とその対応する同腹子との間に正の直線関係が認められた（ｒ２値は０．９２８９）（図１３）。
【実施例２３】
【０３１２】
実施例２３．安定性研究
多数の異なるトランスジェニック植物材料を、本明細書中に記載の手段によって処理した。材料には、ＡＩＶ−ＨＡ（ＨＡＯＮＴ）または改変大腸菌エンテロトキシン（ＳＬＴ１０２）のいずれかを発現するトランスジェニックＮＴ−１細胞培養物、ＡＩＶ−ＨＡ、ＮＶＣＰ、ＨＢｓＡｇ、もしくは大腸菌エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）のいずれかを発現するトランスジェニックジャガイモ、およびＮＶＣＰもしくはＨＢｓＡｇのいずれかを発現するトランスジェニックトマトが含まれていた。処理した材料を、種々の温度で６ヶ月保存した。この間一定間隔で無作為化サンプルを抗原含有量について評価した（目的の抗原についての適切なアッセイによる）。図１４〜１７は、サンプリング期間中にこれらの材料中で保持された検出可能な抗原レベルを記載する。
【０３１３】
他の実施形態
他の実施形態が当業者に自明である。前述の詳細な説明は明確にするためのみに提供し、例示のみを意図すると理解すべきである。本発明の精神および範囲は上記実施例に制限されず、以下の特許請求の範囲に含まれる。全ての特許、特許出願、および本明細書中で引用された公表された引例は、参考文献および表を含むその全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【０３１４】
参照文献
【表３Ａ】
0004500493.tif 000004
【表３Ｂ】
0004500493.tif 000005
【表３Ｃ】
0004500493.tif 000006
【表３Ｄ】
0004500493.tif 000007
【表３Ｅ】
0004500493.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０３１５】
【図１ａ】Ｅｌｉｓａで決定した、Ｔ0植物由来の葉および果実サンプルのＬＴＢ含有量を示す図である。
【図１ｂ】Ｅｌｉｓａで決定した、Ｔ1植物由来の葉および果実サンプルのＬＴＢ含有量を示す図である。
【図１ｃ】Ｅｌｉｓａで決定したＬＴＢ含有量に関する葉および果実順位の比較を示す図である。
【図２ａ】試験したマウスの抗ＬＴＢ抗体希釈の平均終点を示す図である。バーは、ＯＤ450の読み取りが同一処理内の６匹の動物で０．１に等しくなった場合の平均血清希釈を示す。処理には、非トランスジェニックトマトペーストを与えたマウス（コントロール）、トランスジェニックトマトペーストを与えたマウス（試験区）、および１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）と混合したトランスジェニックトマトペーストを与えたマウスが含まれる。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図２ｂ】マウスＺＰ３エピトープと融合させたＬＴ−Ｂからなる融合タンパク質を発現する未処理トマト材料の経口投与後の抗ＬＴＢ力価の増加（シリーズ１）と繁殖力（シリーズ２）との間の関係を示す図である。第３のデータセットは、トマト材料に混合したさらなるアジュバントを投与した実験群を示す。
【図３】マウスの受精能に対する試験材料の経口送達の効果を示す図である。各バーは、コントロールが非トランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示し、試験区がトランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示し、試験区＋ａｄｊが１０ｍｇのアジュバント粉末（Ｇａｒｕｄａ）と混合したトランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示す、特定の処理における６匹の動物の平均を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図４】ハタネズミの受精能に対する試験材料の経口送達の効果を示す図である。各バーは、コントロールが非トランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示し、試験区がトランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示し、試験区＋ａｄｊが１０ｍｇのＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末（Ｇａｒｕｄａ）と混合したトランスジェニックトマトペーストを与えた動物由来の結果を示す、特定の処理における６匹の動物の平均を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図５ａ】ＬＴＢ融合構築物を示す図である。
【図５ｂ】さらなるＬＴＢ融合構築物を示す図である。
【図５ｃ】Ｎ末端融合カセットを示す図である。
【図６】トランスジェニックタバコ（ＮＴ−１）細胞懸濁培養で発現した３つの免疫避妊融合物の平均および「エリートライン」の発現データを示す図である。エピトープ検出は、最初の捕捉がＬＴ−Ｂに特異的であり、第２の反応が融合避妊エピトープ（マウスＺＰ３エピトープまたは使用した構築物によるＧｎＲＨデカペプチド）に特異的であるサンドイッチＥＬＩＳＡに基づいた。ＬＴＢ−ＧｎＲＨ２のデータにより、融合タンパク質の構造は天然のオリゴマー形成を妨害し、それにより完全に形成された五量体の検出（サンドイッチＥＬＩＳＡによる融合エピトープの検出能力）を著しく減少させることが示唆される。
【図７】異なる切開方法による乾燥時間の効果を示すグラフである。
【図８】種種の材料における長期間の水分再吸収を示す図である。
【図９】抗原安定性を示す図である。
【図１０】Ｔ２果実材料内のＬＴＢ含有量に対する処理効果を示す図である。黒べたのバーはプールした果実の平均ＬＴＢ濃度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１１】成体血清サンプルの抗ＬＴＢ終点希釈を示す図である。コントロールバーは野生型トマト粉末を与えたマウスの平均終点血清希釈を示し、トランスジェニックバーはトランスジェニックトマト粉末を与えたマウスの平均終点血清希釈を示し、トランスジェニック＋アジュバントはＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末を含むトランスジェニックトマト粉末を与えたマウスの平均終点血清希釈を示す。終点希釈を、ＯＤ４５０ｎｍ読み取りが０．１の血清の第１の希釈とした。コントロール：ｎ＝３、トランスジェニック：ｎ＝４、およびトランスジェニック＋Ａｄｊ：ｎ＝２。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１２】子血清サンプルの抗ＬＴＢ終点希釈を示す図である。コントロールバーは野生型トマト粉末を与えられたマウスの子の平均終点血清希釈を示し、トランスジェニックバーはトランスジェニックトマト粉末を与えられたマウスの子の平均終点血清希釈を示し、トランスジェニック＋アジュバントバーはＱｕｉｌｌａｊａ抽出粉末を含むトランスジェニックトマト粉末を与えられたマウスの子の平均終点血清希釈を示す。終点希釈を、ＯＤ４５０ｎｍ読み取りが０．１の血清の第１の希釈とした。コントロール：ｎ＝１８、トランスジェニック：ｎ＝１７、およびトランスジェニック＋Ａｄｊ：ｎ＝１３。*使用した最小希釈（１／２５）での０．１未満のＯＤの血清サンプルを含む。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図１３】母と子孫の力価との間の関係を示す図である。母の終点希釈は、対応する同腹子の誕生の最も近くで採取した血清サンプルの終点であり、子の終点希釈は同腹子の平均終点を示す。終点希釈を、ＯＤ４５０ｎｍ読み取りが０．１の血清の第１の希釈とした。母：ｎ＝７、同腹子：ｎ＝９、および子：ｎ＝４１。
【図１４ａ】凍結乾燥ＬＴ−Ｂジャガイモチャートの安定性研究を示す図である。
【図１４ｂ】凍結乾燥ＬＴ−Ｂジャガイモグラフの安定性研究を示す図である。
【図１５】凍結乾燥ＨＡＯ  ＮＴ細胞の安定性研究を示す図である。
【図１６】凍結乾燥ＨＡ１１Ｏ−Ａ１１ジャガイモの安定性研究を示す図である。
【図１７】凍結乾燥ＳＬＴ１０２細胞の安定性研究を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ−１】
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【図５ｃ−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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