(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、カンタキサンチンおよびβ−カロテンを含むカロテノイド化合物を産生し、かつ１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と９９．４％以上の相同性を有する細菌を培養してカロテノイド化合物を製造する方法において、溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて培養槽内に供給する空気もしくは酸素の流量を調節するか、または溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて攪拌羽根の回転速度を調節し、培養中の培養液の溶存酸素濃度を１５〜３５％に制御して、通気攪拌培養することにより、総カロテノイド量に対するアスタキサンチンの生成比率を２９％以上に高めることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
細菌が、Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）および該株を変異処理して赤色の色調が濃いコロニーを選択することにより取得されたアスタキサンチンの生産性が向上した変異株、ならびにＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６７１）および該株を変異処理して赤色の色調が濃いコロニーを選択することにより取得されたアスタキサンチンの生産性が向上した変異株から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）またはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６７１）を培養してカロテノイド化合物を製造する方法において、溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて培養槽内に供給する空気もしくは酸素の流量を調節するか、または溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて攪拌羽根の回転速度を調節し、培養中の培養液の溶存酸素濃度を１５〜３５％に制御して、通気攪拌培養することにより、総カロテノイド量に対するアスタキサンチンの生成比率を２９％以上に高めることを特徴とする、上記方法。
【請求項４】
アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、カンタキサンチンおよびβ−カロテンを含むカロテノイド化合物を産生する細菌を培養してカロテノイド化合物を製造する方法において、以下のステップ：
（１）細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）またはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６７１）を変異処理するステップ、
（２）変異処理した細菌を培養して赤色の色調が濃いコロニーを選択するステップ、
（３）選択したコロニーの培養液中のカロテノイド化合物を分析し、アスタキサンチンの生産性が向上した変異株を選択するステップ、および
（４）溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて培養槽内に供給する空気もしくは酸素の流量を調節するか、または溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて攪拌羽根の回転速度を調節し、培養中の培養液の溶存酸素濃度を１５〜３５％に制御して、選択した変異株を通気攪拌培養するステップ
を含み、総カロテノイド量に対するアスタキサンチンの生成比率を２９％以上に高めることを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はカロテノイド化合物の微生物学的製造法に関する。詳細には，アスタキサンチン，アドニキサンチン，β−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，ゼアキサンチン，β−クリプトキサンチン，３−ヒドロキシエキネノン，アステロイデノン，アドニルビンなどのカロテノイド化合物を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド化合物は天然色素として飼料添加物，食品添加物，医薬品等として有用である。アスタキサンチンは養殖魚であるサケ，マス，マダイ等の体色改善剤のごとき飼料添加物として，また安全な天然食品添加物として産業上の価値が高い。またアドニキサンチンは工業的製造法が確立されることによりアスタキサンチンと同様に飼料添加物，食品添加物，医薬品等としての用途が期待される。さらにβ−カロテンは飼料添加物，食品添加物，医薬品等として使用され，カンタキサンチンは，食品添加物，飼料添加物，化粧品等として使用され，ゼアキサンチンは食品添加物，飼料添加物等として使用されている。さらにエキネノン，β−クリプトキサンチン，３−ヒドロキシエキネノン，アステロイデノン，アドニルビン等も飼料添加物，食品添加物等としての使用が期待される。これらカロテノイド化合物の製造方法としては，化学合成法，微生物による産生方法，天然物からの抽出法などが知られており，すでにアスタキサンチン，カンタキサンチン，β−カロテンについては化学合成法により得られたものが市販されている。
【０００３】
アスタキサンチンはマダイ，サケ，マス等の魚類およびエビ，カニ，ザリガニ，オキアミ等の甲殻類等に存在しており，これらより抽出することが可能である。また、アスタキサンチンを生産する微生物の例としては、赤色酵母ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ），ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎａｒａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２７，１９６９），新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（特開平７−１８４６８８号公報），緑藻類のヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１），が知られている。また化学合成法ではβ−カロテンの変換による方法（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，５７，７４１，１９８５）およびＣ１５ホスホニウム塩から合成する方法（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６４，２４３６，１９８１）が知られている。
【０００４】
カンタキサンチンは，ある種のきのこ（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｇａｚｅｔｔｅ，  １１２，２２８−２３２，１９５０），魚類および甲殻類などに存在していることが知られている（水産動物のカロテノイド，日本水産学会誌，１９７８）。また、カンタキサンチンを生産する微生物の例としては、ブレビバクテリウム属に属する微生物（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉｇｙ，５５（１０），２５０５，１９８９），ロドコッカス属に属する微生物（特開平２−１３８９９６号公報），新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，１８４２，１９９４）が知られている。また化学合成法ではβ−カロテンの変換による方法（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１４２７，１９５６）および新規な３−オキソ−Ｃ１５ホスホニウム塩から合成する方法（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，８７５，  １９７９）が知られている。
【０００５】
アドニキサンチンは金魚やコイ等の魚類に存在していることが知られているが，化学合成法による製造は困難と思われ，工業的製造法は知られていない。アドニキサンチンを生産する微生物の例としては、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ），シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ），ヒポモナス属（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ）およびカリオファノン属（Ｃａｒｙｏｐｈａｎｏｎ）に属する微生物（特開平６−１６５６８４号公報），新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，１８４２，１９９４）が知られている。
【０００６】
β−カロテンの製造法としてはβ−ヨノンからの合成（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１），  ４５，  １９７９），ニンジン，サツマイモ，カボチャ等緑黄色野菜からの抽出（天然着色料ハンドブック，光琳（１９７９），天然着色料ハンドブック編集委員会編）が知られている。β−カロテンを生産する微生物の例としては,（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７０，１８１，１９９１），新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５）が知られている。
【０００７】
エキネノンは、オニヒトデなどのヒトデ類，マダイ等の魚類の内臓，ウニ類，イセエビ等の甲殻類の内臓等，天然物から抽出されている。また，エキネノンを生産する微生物の例としては，新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９  ９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５）が知られている。
【０００８】
ゼアキサンチンの製造法としてはオキソイソホロンの不斉還元により得た光学活性なヒドロキシケトンを原料として用いる化学合成法（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１），４５，１９９１），  トウモロコシの種子から抽出する方法（生体色素，１９７４，朝倉書店）が知られている。  ゼアキサンチンを生産する微生物の例としては，フラボバクテリウム属細菌を用いる方法（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ，  Ｖｏｌ．１，  ５２９−５４４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６号公報，特開平８−９９６４号公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書），細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５）が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら，前述の化学合成法は，安全性が確証されてない，微生物による産生では生産性が低い，天然物からの抽出ではコストがかかりすぎる等の問題点があった。例えば，アスタキサンチンの製造においては，天然物のオキアミやザリガニからの抽出による製造では，含有量が極めて少なく，しかも抽出が困難なことからコストが高い。赤色酵母ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）は増殖速度が小さい，生産量が少ない，強固な細胞壁を持つためにアスタキサンチンの抽出が困難であるなどの問題があるので，工業化には問題点が多い。緑藻類ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）も増殖速度が極めて遅い，雑菌汚染を起こしやすい，抽出が困難などの欠点を有するので、この方法の工業化には問題点が多い。
【００１０】
新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）およびＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）（特開平７−７９７９６公報，特開平８−９９６４公報，米国特許第５，６０７，８３９号明細書，米国特許第５，８５８，７６１号明細書）は、生産性が高く，増殖速度が速い，抽出が容易であるなどの利点を有するが，それらは複数のカロテノイド化合物，すなわちアスタキサンチン，アドニキサンチン，β−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，ゼアキサンチン，β−クリプトキサンチン，３−ヒドロキシエキネノン，アステロイデノンおよびアドニルビンを同時に生成するので，それらの生成割合が培養毎に変動し，安定した比率で色素を生成させることが困難であった。このため，生成した色素混合物を動物飼料等に色調改善剤として使用する際の色調効果にばらつきを生じ，商業的生産に対する障害となっていた。
従って一定の比率のカロテノイド化合物を安定して生産する製造方法が求められていた。
【００１１】
本発明は，このような実状に鑑みなされたものであり，その目的は，カロテノイド化合物の生成割合を制御すると共に、その特定の比率のカロテノイド化合物を安定して生産する製造方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは，上記の課題を解決すべく種々検討した結果，カロテノイドを産生する微生物の培養において培養中の培養液の溶存酸素を適当な濃度に制御することにより，複数のカロテノイド化合物の生成比率を制御すると共に、その特定の比率のカロテノイド化合物を安定に生産することが可能であることを見いだし，本発明に到達した。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下，本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の方法においてはカロテノイド化合物を産生する微生物が用いられる。このような微生物としては，たとえばカロテノイドを産生する細菌，酵母，かびなどが挙げられる。細菌としては１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と９８％以上の相同性を有する細菌が挙げられる。具体的には，Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）およびＡ−５８１−１株（ＦＲＲＭ  ＢＰ−４６７１），ならびにＥ−３９６株あるいはＡ−５８１−１株を変異改良することで得られる各種変異株およびこれら２株の近縁種を挙げることができる。配列番号１のＤＮＡの塩基配列は，Ｅ−３９６株のリボソームＲＮＡに対応するものであり，また配列番号２のＤＮＡの塩基配列は、Ａ−５８１−１株のリボソームＲＮＡに対応するものである。
【００１４】
１６Ｓ  リボソームＲＮＡの塩基配列の相同性に基づいた微生物の分類は近年，微生物の分類の手段として主流になりつつあるが，これは、従来の運動性，栄養要求性，糖の資化性などに基づく分類では，自然突然変異による形質の変化等により誤った同定をされる場合もあるという問題点があったためである。１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の相同性に基づいた分類では，極めて遺伝的に安定な１６Ｓ  リボソームＲＮＡの塩基配列に基づくため，信頼度が格段に向上する。Ｅ−３９６株とＡ−５８１−１株の１６Ｓ  リボソームＲＮＡの塩基配列の相同性は９９．４％であり，極めて近縁な株であることが判明した。よって，これらの菌株はカロテノイドを生産する細菌として一つのグループを形成している。Ｅ−３９６株およびＡ−５８１−１株ならびに本発明の培養条件によって効果を発揮する菌株は，Ｅ−３９６株あるいはＡ−５８１−１株の変異株および近縁種としてＥ−３９６株の１６Ｓ  リボゾームＲＮＡの塩基配列と９８％以上の相同性を有する微生物として定義される。
【００１５】
本発明に使用する具体的な微生物として挙げられるＥ−３９６株について説明する。この株は，本発明者らが新しく単離したものであり，工業技術院生命工学工業技術研究所に平成５年４月２７日にＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３として寄託された。さらに具体的な他の微生物としてはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）を挙げることができる。この株は，発明者らが新しく単離したものであり，工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年５月２０日にＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１として寄託された。
【００１６】
本発明の培養方法は，例えばつぎのとおりである。すなわち，生産菌の生育に必要で，カロテノイド色素を生成する成分を含む培地で培養を行う。
培養方法は，通常の好気培養，例えば通気撹拌培養，気泡塔培養，流動層培養などいずれの方法でも良いが，通気撹拌培養が好ましい。例えば，Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）は，カロテノイド化合物としてβ−カロテン，エキネノン，β−クリプトキサンチン，３−ヒドロキシエキネノン，アステロイデノン，カンタキサンチン，ゼアキサンチン，アドニルビン，アドニキサンチン，アスタキサンチンを同時に生成する。
【００１７】
生合成はβ−カロテンを上流とし，ケト化酵素および水酸化酵素によりそれぞれ両端の６員環が修飾され最終的にはアスタキサンチンが生成すると推定されている。しかしながら培養時間を長くしても，全てがアスタキサンチンに変換されることはなく，それらの化合物が培養終了まで存在する現象が認められていた。またその生成割合は培養毎に一定ではなく，例えば，生合成で上流と思われるβ−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，アドニルビン，３−ヒドロキシエキネノンの生成割合が多い場合，アスタキサンチンの生成割合が多い場合，アドニキサンチンの生成割合が多い場合など様々であった。
【００１８】
このため，生成した色素混合物を動物飼料等に色調改善剤として使用する際の色調効果にばらつきを生じ，商品として販売できないことから商業生産のための障害となっていた。そこで種々検討を重ねた結果，生成色素の生成割合に影響を与える因子は，培養液中の溶存酸素であることを見いだした。撹拌回転速度を一定にした培養では，培養液中の溶存酸素濃度は微生物の微妙な酸素消費速度の差に左右され，その結果それぞれの色素の生成割合が培養ロット毎にばらついていたことが判明した。この問題を解決するために培養中の培養液中の溶存酸素を制御することにより，生成するカロテノイド化合物すなわちβ−カロテン，エキネノン，３−ヒドロキシエキネノン，アステロイデノン，カンタキサンチン，ゼアキサンチン，アドニルビン，アドニキサンチン，アスタキサンチンの生成比率を制御できる。
【００１９】
培養液中の溶存酸素濃度を低く制御すると，生合成で上流と思われるβ−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，３−ヒドロキシエキネノンおよびアドニルビンの生成割合を高めることができ，培養液中の溶存酸素濃度を中程度に制御すると，アスタキサンチンの生成割合を高めることができ，また培養液中の溶存酸素濃度を高く制御することによりアドニキサンチンの生成割合を高めることができる。
【００２０】
例えば，アスタキサンチンの生成比率を高めるためには培養液中の溶存酸素濃度を飽和酸素濃度の１５〜４０％，好ましくは２０〜３０％にコントロールする。溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の２０〜３０％の条件下，アスタキサンチンの生成割合を４０％以上に高めることができる。
【００２１】
溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の０〜１５％、好ましくは０〜１０％の範囲では，β−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，３−ヒドロキシエキネノンおよびアドニルビンが多く蓄積しアスタキサンチンの生成が抑制される。この条件下，β−カロテン，エキネノン，カンタキサンチン，３−ヒドロキシエキネノンおよびアドニルビンの生成量の合計は６０％以上であり，アスタキサンチンの生成割合を４０％以下にすることができる。
【００２２】
また，アドニキサンチンの生成比率を高めるためには培養液中の溶存酸素濃度を飽和酸素濃度の３５〜１００％、好ましくは４０〜１００％にコントロールする。この条件によりアドニキサンチンの生成割合を３５％以上にすることができる。
また培養フェーズにおいては，対数増殖期において溶存酸素濃度は重要であり，例えばこの時期に溶存酸素濃度を高くすると，その後に低い条件に変えてもアドニキサンチンの生成割合は高くなる。
【００２３】
溶存酸素濃度の制御は通常培養で用いられる方法，例えば溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて培養槽内に供給する空気あるいは酸素の流量を自動的に調節する方法あるいは溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて撹拌羽根の回転速度を自動的に調節する方法等いずれの方法も用いることができる。
【００２４】
【実施例】
以下，実施例により本発明をさらに詳しく説明するが，本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
〔実施例１〕
表１の組成からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ１２１℃，１５分間蒸気殺菌した。これにＥ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）を植菌し２８℃で１日間，１５０ｒｐｍの回転振とう培養を行った。次ぎに，この培養液６００ｍｌ分を表２の組成からなる培地が２０Ｌ入った３０Ｌ容量の通気撹拌培養槽に植菌し２８℃，１．０vvmの好気培養を９０時間行った。培養途中のｐＨは７．２に２０％ＮａＯＨで連続的に制御した。シュークロースは生育とともに消費されるので培養開始１日目および２日目にそれぞれ３００ｇずつ添加した。培養液中の溶存酸素は，溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ，溶存酸素の値に応じて回転速度を変化させる方法により自動制御した。また最低回転速度は８０ｒｐｍに設定した。
【００２５】
溶存酸素濃度は，その培地における酸素の飽和濃度の比率で，それぞれ５，１５，２０，２５，３０，３５％に設定した。
各条件における生成したカロテノイド（各化合物の記号を表３に示す）の生成濃度と比率は、表４および表５に示すとおりであった。
【００２６】
【表１】
0004427167.tif 000002
【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
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【００２９】
【表４】
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【００３０】
【表５】
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【００３１】
〔実施例２〕
上記表１の組成からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ１２１℃，１５分間蒸気殺菌した。これにＥ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）を植菌し２８℃で１日間，１５０ｒｐｍの回転振とう培養を行った。次ぎにこの培養液１００ｍｌ分を上記表２の組成からなる培地が２Ｌ入った５Ｌ容量の通気撹拌培養槽に植菌し２８℃，１．０vvmの好気培養を９０時間行った。培養途中のｐＨは７．２に２０％ＮａＯＨで連続的に制御した。シュークロースは生育とともに消費されるので培養開始１日目および２日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。培養液中の溶存酸素は，溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ，溶存酸素の値に応じて回転速度を変化させる方法により自動制御した。また最低回転速度は１００ｒｐｍに設定した。溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で，２５％に設定した。
【００３２】
比較のため溶存酸素を制御しない条件，すなわち撹拌回転速度を４５０rpm一定での条件での培養も行った。
各条件における生成したカロテノイドの生成濃度は，表６に示すとおりであった。
【００３３】
【表６】
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【００３４】
〔実施例３〕
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）をＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｏｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）で変異処理し，赤色の色調が濃いコロニーを選択した。これらの株の培養液中のカロテノイド化合物を分析し，アスタキサンチンの生産性が向上した変異株Ｙ−１０７１株を選択した。表１の組成からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ１２１℃，１５分間蒸気殺菌した。これにＹ−１０７１株を植菌し２８℃で１日間，１５０ｒｐｍの回転振とう培養を行った。
【００３５】
次ぎにこの培養液１００ｍｌ分を上記表２の組成からなる培地が２Ｌ入った５Ｌ容量の通気撹拌培養槽に植菌し２８℃，１．０vvmの好気培養を９０時間行った。培養途中のｐＨは７．２に２０％ＮａＯＨで連続的に制御した。シュークロースは生育とともに消費されるので培養開始１日目および２日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。培養液中の溶存酸素は，溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ，溶存酸素の値に応じて回転速度を変化させる方法により自動制御した。また最低回転速度は１００ｒｐｍに設定した。溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で，それぞれ５，１５，２０，２５，３０，３５％に設定した。
各条件における生成したカロテノイドの生成濃度と比率は，表７および表８に示すとおりであった。
【００３６】
【表７】
0004427167.tif 000008
【００３７】
【表８】
0004427167.tif 000009
【００３８】
〔実施例４〕
上記表１の組成からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ１２１℃，１５分間蒸気殺菌した。これにＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）を植菌し２８℃で１日間，１５０ｒｐｍの回転振とう培養を行った。次ぎにこの培養液１００ｍｌ分を上記表２の組成からなる培地が２Ｌ入った５Ｌ容量の通気撹拌培養槽に植菌し２８℃，１．０vvmの好気培養を９０時間行った。培養途中のｐＨは７．２に２０％ＮａＯＨで連続的に制御した。シュークロースは生育とともに消費されるので培養開始１日目および２日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。培養液中の溶存酸素は，溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ，溶存酸素の値に応じて回転速度を変化させる方法により自動制御した。また最低回転速度は１００ｒｐｍに設定した。溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で，それぞれ５，１５，２０，２５，３０，３５％に設定した。
各条件における生成したカロテノイドの生成濃度と比率は，表９および表１０に示すとおりであった。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
【表１０】
0004427167.tif 000011
【００４１】
【発明の効果】
複数種のカロテノイド化合物の微生物学的製造法において、培養中の培養液の溶存酸素濃度を制御することにより、産生するカロテノイド化合物の生成割合を変化させることができる。
【００４２】
【配列表】
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