(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キシロース・レダクターゼおよびキシリトール・デヒドロゲナーゼ酵素についての遺伝子を担持しており、サッカロミセス（Saccharomyces）種またはシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種から選択される宿主微生物を、ＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素からなる群から選択された酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドによって形質転換すること、
（ｂ）該形質転換微生物をエタノール産生のために培養し、これにより、工程（ａ）で形質転換されていない微生物中で産生された場合のエタノールの収率と比較したときに、エタノールの収率が増加すること、
の工程を含む、微生物産生方法中に産生されるエタノールの収率を増加させるための方法。
【請求項２】
工程（ａ）で形質転換されていない微生物において産生される量よりも少なくとも５％高い量でエタノールが産生される、請求項１の方法。
【請求項３】
エタノールが炭水化物から産生される、請求項１の方法。
【請求項４】
炭水化物がグルコースまたはキシロースである、請求項３の方法。
【請求項５】
宿主微生物がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の株である、請求項１の方法。
【請求項６】
宿主微生物が、さらにキシルロースキナーゼに関する遺伝子を担持する、請求項１の方法。
【請求項７】
キシロース・レダクターゼおよびキシリトール・デヒドロゲナーゼ酵素に関する遺伝子を担持しており、サッカロミセス（Saccharomyces）種またはシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種の宿主微生物を、ＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素からなる群から選択された酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドにより、形質転換することによって得られる形質転換微生物であって、形質転換されていない微生物で産生された場合のエタノールの収率と比較したときに、該形質転換微生物が、エタノールの収率を増加させる、形質転換微生物。
【請求項８】
エタノールが炭水化物から誘導される、請求項７の形質転換微生物。
【請求項９】
炭水化物がグルコースまたはキシロースである、請求項８の形質転換微生物。
【請求項１０】
微生物がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の株である、請求項７の形質転換微生物。
【請求項１１】
宿主微生物が、さらにキシルロースキナーゼについての遺伝子を担持する、請求項７の形質転換微生物。
【請求項１２】
H1791（VTT C-98298，DSM 12213）、H1795（VTT -98300，DSM 12214）、H1803（VTT C-98302，DSM 12215）、H2193（VTT C-99317，DSM 12722）、H2195（VTT C-99320，DSM 12723）、H2222（VTT C-99322，DSM 12724）よりなる群から選ばれるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株。
【請求項１３】
H2369（VTT C-99323，DSM 12725）およびH2370（VTT C-99324，DSM 12726）よりなる群から選択されたシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）株。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジイで使用される微生物生産についての遺伝子工学に関し、微生物の性質を改良してより効率的に有用な産物をつくろうとするものである。特に、本発明は、ヘキソースやペントースあるいはこれらの重合体を含むバイオマスなどの炭素源および窒素源からのエタノールやアミノ酸などの産物について、生物工学的方法の生産性および収率を高めることに関する。
発明の背景
多くの生物工学的方法の効率は、代謝酸化還元反応を平衡に保つ生産生物の必要性によって制限される。特に、ピリジンヌクレオチドカップル(ＮＡＤ／ＮＡＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ)の各々について、酸化の全比率は還元の全比率と等しくなければならない。そうでなければ、カップルは完全に一方の型に変換され(例えば、すべてＮＡＤ型にまたはすべてＮＡＤＨ型に)、もう一方の型を要する反応は非常に遅くなり、反応の全代謝ネットワークが望ましくない方向に歪められてしまうことになる(つまり、所望の産物を提供しない)。
例えば、酵母菌サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)は、ヘキソースをエタノールに変換するのに非常に効率的であり、この方法にとって非常に都合がよいが(例えば、高濃度のエタノールと他のストレスの耐性)、キシロースをエタノールに醗酵させることはできない。キシロースは植物の主な構成要素であり、キシロースをエタノールに変換できないと、農業廃棄物などの再生可能バイオマスを使用するための効率が下がる。しかしながら、これらの酵母菌はキシルロースを使用できる。いくつかの酵母菌(例えば、Pichiastipitis)は、あまり効率的ではないが、キシロースをエタノールに変換することができ、キシロースレダクターゼ(ＸＲ)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)の酵素を含有する。これらの酵素は、連続的なキシロースのキシリトールへの還元およびキシリトールのキシルロースへの酸化を触媒する。形質転換されたS.cerevisiae株は、非相同的ＸＲおよびＸＤＨを含んで構築され、それでキシロースを醗酵可能キシルロースへ変換する経路を有する
0004573365.tif 000002
これらの株は生長とキシリトール形成のためにキシロースを使用できたが、エタノールをあまり産生しなかった。すべての既知ＸＤＨ酵素はＮＡＤに特異的であるが、一方、すべての既知ＸＲ酵素はＮＡＤＰＨに特異的であるか、またはＮＡＤＰＨを選択する。従って、この経路によってキシロースをキシルロースに変換すると、ＮＡＤＰＨの細胞プールがＮＡＤＰに変換され、ＮＡＤの細胞プールがＮＡＤＨに変換され、その後、キシロースがさらに代謝されるのが、非常に妨げられると考えられている(Bruinenberg et al.[1983];Bruinenberg[1986])。ＮＡＤＨは好気的条件下で再酸化され得るが、醗酵性代謝およびエタノール産生を維持するために、酸素レベルを正確に制御する必要がある。対照的に、キシロースをエタノールに効率的に醗酵させる細菌は、キシロースイソメラーゼを含み、キシロースを酸化還元反応なしに直接キシルロースに変換する。効率的にキシロースをエタノールに変換できる酵母菌をつくる試みでは、変更された補酵素特異性を有するＸＲまたはＸＤＨ酵素を発見することまたは設計すること(Metzger and Hollenberg[1995])、または酵母菌中にキシロースイソメラーゼ遺伝子を発現することが主に行われていた。しかしながら、酵母菌中に細菌性キシロースイソメラーゼ遺伝子を発現することによる良質のキシロース−醗酵株を構築するという、報告されたすべての試みは(参照、例えば、Amore et al.[1989];Ho et al.[1983];Sarthy et al.[1987];Walfridsson et al.[1996])、失敗に終わった。
２番目の例として、主な生物工学的方法は、ヘキソース糖類を酵母菌によりエタノールに醗酵させることである。グルコースからエタノールへの糖分解方法は、酸化還元の明確でない反応、つまり、グルコースからの一定量のピルビン酸形成における還元されたＮＡＤの量は、同量のピルビン酸からのエタノール形成における酸化されたＮＡＤＨの量と全く同じということであり、ＮＡＤＰ(Ｈ)はこの方法に直接関係しない。しかしながら、酵母菌生長は酸化還元の明確でない方法ではない；グルコースおよびアンモニアからの乾燥酵母菌材料１００ｇの形成は、ＮＡＤＨ１.３モルおよびＮＡＤＰ０.９モルの正味産生量を伴う(Oura[1972])。この過剰ＮＡＤＨは、主にエネルギー収率異化反応により産生されるが、過剰ＮＡＤＰは生合成経路により主に産生される(参照、Oura[1972])。他の生物と同様に、酵母菌は、代謝のこの２つの状況を容易にするように発達した別異のピリジンヌクレオチドシステム(ＮＡＤ(Ｈ)およびＮＡＤＰ(Ｈ))を有する。醗酵酵母菌により産生された過剰ＮＡＤＨは、主にグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼによりＮＡＤに再酸化され、グリセロールを産生する。蒸留醗酵において、これは３−５％の炭素源の無駄な変換を示す(Oura[1977])。醗酵の間に産生されるグリセロールとエタノールの割合を下げる試みは、ほとんどまたは全く成功していない。例えば、
0004573365.tif 000003
は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のどちらかおよび両方を欠失させた。しかしながら、この酵素を持たない酵母菌は好気的条件下で生長できないだけでなく、エタノール産生も停止してしまった。
３番目の例は、アミノ酸の生物工学的産生である。アミノ酸は食物、動物用試料、医薬および化学産業において幅広く適用される。醗酵方法が開発され、タンパク質中に発生するほとんどのアミノ酸を産生してきた。アミノ酸への代謝経路は、最初にグルコースなどの炭素源を３−ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸または２−オキソグルタル酸などの、グルコースよりも酸化されやすい中間体に変換する。その形成によりＮＡＤＨが産生される。ほとんどのアミノ酸は、中間体より還元されやすいが、中間体からアミノ酸を導く反応は、ほとんど例外無くＮＡＤＰを産生する。正味ＮＡＤＰＨ産生物質であるヒスチジンの経路、およびＮＡＤＰＨを消費も産生もしないグルタミン、グルタメート、チロシンおよびフェニルアラニンへの経路とは別に、グルコースからのすべての他の１５アミノ酸の生合成は、アミノ酸１モルに対しＮＡＤＰを１−８モル産生し、同時にＮＡＤＨを産生する(Neidhardt et al.[1990])。代謝平衡を得るのに、ＮＡＤＨを酸化しＮＡＤＰを還元する他の反応が必要である。これは、商業規模で大量のアミノ酸を産生するために修飾および/または選択されたコリネバクテリアなどの生産生物について主要因子となる。過剰ＮＡＤＨを処理するために、アミノ酸醗酵は好気的条件下で行われ、酸素が大量に消費される。最大の産物形成を保証するために、典型的には酸素豊富な空気の形態で、適量の酸素を常に提供することが必要である(Hirose[1986])。酸素欠乏、例えば、高い細胞密度での醗酵の場合または酸素補給が非経済的である場合、典型的には、炭素源の一部がサクシネート、ラクテートまたは両方の化合物に変換され、過剰ＮＡＤＨを除去するので、産物収率および生産性が低下する。
他の例には、産業規模でこれらの化合物を産生するために選択または設計された修飾微生物によるヌクレオチド、脂質および２次代謝物の高い生合成がある。これらの方法の中で、微生物は一般的にＮＡＤＨおよび、炭素源よりも酸化されやすい中心的代謝中間体(例えばピルビン酸)を産生し、ＮＡＤＰＨを使用してこの中間体を所望の産物に還元する。再度、微生物は過剰ＮＡＤＨを酸化し、過剰ＮＡＤＰを還元する必要があり、炭素源に対する収率の低下が酸化還元平衡を達成するのに必要な炭素源の付加的代謝形質転換により起きる。
これらすべての例において、過剰ＮＡＤＨは、効率的な曝気を要する呼吸作用またはグリセロールなどの望ましくない副産物の形成のいずれかにより再酸化される。産業的大規模の曝気は、コストがかかり、正確な制御が困難である。キシロースをエタノールに醗酵するようないくつかの方法において、過剰ＮＡＤＰの還元はまた、問題を引き起こす。ＮＡＤＰＨを再発生する重要な生化学的反応は、ペントースリン酸経路(ＰＰＰ)の酸化部門であり、つまりグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ、およびＮＡＤＰ−結合イソクエン酸デヒドロゲナーゼの連続反応である。両反応はＣＯ2を産生する。産業規模の生産活動において、炭素源の直接的損失と環境汚染となる。さらに、ＣＯ2はまた、培養基を酸性化するので、大量の中和剤を使用して醗酵ｐＨを制御せねばならず、一般に細胞生理機能および特にアミノ酸産生において重大な衝撃を与える。例えば、ＣＯ2は、メチオニンおよびプリン生合成における酵素を阻害し、イソロイシン、イノシン、フマル酸、ペニシリンおよび他の抗生物質および酵母菌バイオマスの産生を含む、いくつかの醗酵方法での産物形成を阻害することが報告されている(Hirose[1986])。
これらの問題を曝気を使用せずに軽減する一般的な方法は、非常に有益となるであろう。曝気はコストがかかり、最適レベルでの制御が困難である。可能性のある利益には、炭素源に対する収率の増加、エネルギー消費の低下、ＣＯ2産生の有意な減少および特異的な生産性の増加がある。固定微生物を使用する方法において特に重要である。
炭素および窒素代謝の主な経路において、大部分の異化作用方法は、酸化還元工程においてＮＡＤ／ＮＡＤＨ補酵素カップルを使用するのが一般的な通例であるが、同化的合成反応はより頻繁にＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨカップルを使用する。これら２つのカップルの還元ポテンシャル(Ｅ’０)は、両方とも−０.３２に近く(Kaplan[1960])、２つのカップルの還元型および酸化型の比率は、生存細胞で非常に異なるレベルに維持される。例えば、好気性S.cerevisiaeで、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＝０.９およびＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＝３.２
0004573365.tif 000004
である。
ほとんどのピリジンヌクレオチドデヒドロゲナーゼは、一方のまたはもう一方のピリジンヌクレオチドに顕著な、しばしばほぼ完全な特異性を有する。同じ基質を有するいくつかのデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−特異的酵素の両方として見出される。通常、該酵素の一つだけが、一定条件下で存在するか、または該酵素は異なる細胞区画に発現される。よい例に、グルタメートデヒドロゲナーゼがあり、通常、酵素の一つのみがいずれの生育条件下でも優性となる複雑な制御メカニズムを必要とする(例えば、Courchesne and Magasanik[1988];Coschigano et al.[1991];Miller and Magasanik[1991];ter Schure et al.[1995];Dang et al.[1996];Avendano et al.[1997])。S.cerevisiaeはＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−結合イソクエン酸デヒドロゲナーゼを含有する：細胞基質(単一の区画と考えられている)は、ＮＡＤＰ−結合酵素のみを含有し、ペルオキシソームには別のＮＡＤＰ−結合酵素があるが、ミトコンドリア(マトリックス、クリステ、膜間腔が３つのサブ区画を形成する)は、ＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−結合酵素の両方を含有する(Minard et al.[1998])。従って、細胞はＮＡＤＨ／ＮＡＤ比率をＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比率よりはるかに低く維持することができる。なぜなら、還元当量を２つのシステム間で移動させる(よってそれらを平衡化する結果となる)反応は、制限されるからである。いくつかの細菌細胞および動物細胞は、ＮＡＤ(Ｐ)トランスヒドロゲナーゼ(ＥＣ１.６.１.１.および１.６.１.２.)を含有する。トランスヒドロゲナーゼはしばしば、ピリジンヌクレオチドシステムの平衡化よりはエネルギー産生に関係するいくつかのサブユニットを有する細胞膜結合酵素である。本特許出願の目的のため、用語“デヒドロゲナーゼ”は、トランスヒドロゲナーゼＥＣ１.６.１.１および１.６.１.２を含まない。生物工学において使用される多くの生産生物、例えばS.cerevisiaeおよびコリネバクテリアは、ＮＡＤ(Ｐ)トランスヒドロゲナーゼを含有せず、よってそれらはＮＡＤＨおよびＮＡＤＰをＮＡＤおよびＮＡＤＰＨに直接変換することができず、またその逆も同様のようである。
２つのピリジンヌクレオチドシステムの存在およびそれらを平衡化する非標準的方法の不存在は、効率的な生育および現在発達した生存生物の再生産が２つの異なるシステムを必要とすることを示唆している。その理由は、高いＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ比率は生合成反応を行うのに必要であるが、低いＮＡＤＨ／ＮＡＤ比率はグリコリシスおよびトリカルボキシル酸サイクルなどの経路によるエネルギー発生により適しているためである(Metzler[1977])。
Boles et al.(1993)は、ホスホグルコイソメラーゼがない変異体S.cerevisiaeについて研究した。該酵素は、グルコース−６−リン酸(Ｇｌｃ６Ｐ)およびフルクトース−６−リン酸(Ｆｒｕ６Ｐ)を相互変換させる。この株(pgi1欠失変異体)は、ヘキソースまたはペントースのいずれにおいても生長しないが、フルクトースとグルコースの特定の混合物(例えば、２％フルクトースと０.１％グルコース)で生長可能である。Bolesらは、変異体自身から製造されたゲノムライブラリーで変異体を形質転換すると、特定の形質転換体が野生型より３−４倍遅いが、グルコース単独で生育可能となり、ＧＤＨ２遺伝子を含むプラスミドを含有することを発見した。この遺伝子はＮＡＤ−結合グルタメートデヒドロゲナーゼをコードする。Bolesらによると、ＮＡＤＰ−およびＮＡＤ−結合グルタメートデヒドロゲナーゼの両方の実質的活性が同時に存在すると、pgi1-欠失変異体がＰＰＰにより代謝されてグルコース上で生育し、生じたＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換することにより生長できる。ＮＡＤＨは、次いで、機能的ミトコンドリアにより再酸化され得る。従って、これらの変異体は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰＨをＮＡＤＨおよびＮＡＤＰに変換するために提案されており、産業的生産微生物に求められる形質転換とは逆である(上記参照)。さらに、変異体がグルコース上で生存し得る能力は、機能的ミトコンドリアと酸素の存在に完全に依存し、変異体は糖類を醗酵してエタノールにすることはできなかった(Boles et al.[1993])。
発明の概要
本発明によって、真菌類または細菌類などの微生物を、少なくとも１種の酵素の発現をコードするか、発現を起す少なくとも１種の組換えＤＮＡで形質転換する。この酵素またはこれらの酵素は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ補酵素カップルについて異なる特異性を有する２種のピリジンヌクレオチド結合デヒドロゲナーゼ反応によって基質の酸化と還元の機能的カップリングを起こして、該基質を介する２種の補酵素カップル間での電子の移動を容易にする酵素である。この酵素あるいはこれらの酵素は、１つ以上の１対のピリジンヌクレオチド結合デヒドロゲナーゼであって、少なくとも１種の共通の基質を有するが、異なるピリジンヌクレオチド特異性を有する。ピリジンヌクレオチド補酵素カップルの一方の正味酸化が他方の正味還元と一緒に起きる生物工学的方法は、本発明による形質転換微生物によって、相当する非形質転換微生物によるよりも効率よく実施することができ、該方法の曝気が低下されて、より柔軟に行い得る。この方法には、微生物による炭水化物のエタノールへの発酵、キシロースの有用産物への発酵、およびアミノ酸、ヌクレオチド、脂質および２次代謝物の商業的生産が含まれる。
本発明の目的に望ましい微生物は、酵母、線状の真菌および細菌である。好ましい酵母は、サッカロミセス(Saccharomyces)属、特定の種としてSaccharomyces cerevisiaeであり、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、特定の種としてShizosaccharomyces pombeであり、ピヒア(Pichia)属、特定の種としてピヒア・スティピティス(Pichia stipitis)およびカンジダ(Candida) spp.またはパキソレン(Pachysolen) spp.である。有用な線状真菌には、例えばトリコダルマ(Trichoderma)、アスペルギウス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、フサリウム(Fusarium)、パエシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)がある。特に好ましい細菌には、コリネバクテリア(Corynebacteria)属、特定の種としてコリネバクテリア・グルタミカム(Corynebacteria glutamicum)およびブレビバクテリア(Brevibacteria)属、特定の種としてブレビバクテリア・フラバム(Brebibacteria flavum)やブレビバクテリア・ラクトフェルメンタム(Brevibacteria lactofermentum)がある。
【図面の簡単な説明】
図１．関連遺伝子、発現カセットおよび制限部位。
図２．いくつかの既知リンゴ酸酵素含有のアスペルギウス・ニダランス(Aspergillus nidulans)のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の部分的配列から推論されるアミノ酸配列についての配置。既知リンゴ酸酵素のデータベース番号(SwissProt)は次のとおり：P23368(ヒトリンゴ酸酵素)、P40375(S.pombeリンゴ酸酵素)、P36013(S.cerevisiaeリンゴ酸酵素)。トリコダルマ・レセイ(Trichoderma reesei)のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の部分的配列はVTT,Biotechnology and Food Reseachで得た。少なくとも３つの配列が同じであるアミノ酸を影付けした。
図３．Saccharomyces cerevisiaeのGDH2を発現する組換え株(H1803、黒印)および対照株(H1805、白印)でのキシロース発酵：増殖およびキシロース利用率の比較。
図４．Saccharomyces cerevisiaeのGDH2を発現する組換え株(H1803、黒印)および対照株(H1805、白印)でのキシロース発酵：エタノールおよびキシリトールの生産率の比較。
図５．Saccharomyces cerevisiaeのGDH2を発現する組換え株(H1803、黒印)および対照株(H1805、白印)でのキシロース発酵：二酸化炭素発生率の比較。
図６．２６および９６時間における株H1805(対照)およびH1803についてのＮＡＤＰグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(NADP-GDH)およびＮＡＤグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(NAD-GDH)の特異的活性。
図７．Saccharomyces cerevisiaeのGDH2を発現する組換え株(H1791、実線)および対照株(H1793、点線)でのグルロース発酵：二酸化炭素発生率の比較。
図８．Saccharomyces cerevisiaeのMAE1を発現する組換え株(H2195)および対照株(H2191)のキシロースのバッチ発酵についてのバイオマスのプロファイル。
図９．Saccharomyces cerevisiaeのMAE1を発現する組換え株(H2195)および対照株(H2191)のバッチ発酵からの全般的な特異的代謝率(Ｃ−mmol/g-cell h)。
図１０．Saccharomyces cerevisiaeのMAE1を発現する組換え株(H2222)および対照株(H2221)のバッチ発酵におけるキシロースからのエタノール生産時間プロファイル。
図１１．Saccharomyces cerevisiaeのMAE1を発現する組換え株(H2222)および対照株(H2221)のバッチ発酵における全般的な特異的代謝率(C-mmol/g-cell h)。
図１２．Saccharomyces cerevisiaeのMAE1を発現する組換え株(H2222)および対照株(H2221)のキシロース・バッチ発酵におけるバイオマス時間プロファイル。
図１３．Schizosaccharomyces pombeのリンゴ酸酵素を発現する組換え株(H2369)および対照株(H2370)のキシロース・バッチ発酵におけるバイオマス時間プロファイル。
図１４．Schizosaccharomyces pombeのリンゴ酸酵素を発現する組換え株(H2369)および対照株(H2370)におけるキシロースからの容積測定エタノール生産の時間プロファイル。
図１５．実施例２１記載のコリネバクテリウム形質転換体由来のベクターのBamHI消費産物の単離。１枠：ATCC 21253形質転換体由来のベクターの消化、２枠：この実験に関係なし、３枠：ATCC 21799形質転換体(VTT E-99103)のベクターの消化。
発明の詳細な説明
本発明の中心的な教示は、生物工学的方法を向上するものであって、生細胞中に共存する２種のピリジンヌクレオチド系の均衡をとる酵素の遺伝子で生産微生物を形質転換することによりなされる。細胞が２種の別個のピリジンヌクレオチド系に関与し、この系は別個の酸化還元値で維持され、このような平衡反応は天然生育細胞で明らかに阻害されるものである。しかしながら驚くべきことに、本発明は、これらの反応が、多くの生物工学的方法で使用される微生物の工学的処理あるいは選択により、産物形成に適した代謝経路を促進し、該方法に利益をもたらすことを開示する。
第１実施態様において、本発明は、少なくとも１種の組換えＤＮＡ分子で形質転換された微生物を提供する。このＤＮＡ分子は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨに反対の補酵素特性を有するが、少なくとも１種の共通の基質(化学式(１)および(２)におけるＳ)を有する少なくとも１つの対のデヒドロゲナーゼの発現をコードするか、発現を起す。その場合、対の両者は同じ細胞区画、好ましくはサイトゾルで同時に発現される。このことにより、反応(１)および(２)を触媒するデヒドロゲナーゼの機能的カップリングが起きる。２種のデヒドロゲナーゼが形質転換細胞内で物理的に結合することは、本発明の必須事項ではないが、また除外されるわけでもない。機能的カップリングは次の反応を起し、ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ補酵素カップルを平衡にしようとする。
(１)    ＮＡＤＰ＋ＳＨ2←→Ｓ＋ＮＡＤＰＨ
(２)    Ｓ＋ＮＡＤＨ←→ＳＨ2＋ＮＡＤ
反応(１)および(２)の同時作動は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨがほぼ等しくなるまで進行すると考えられる。なぜなら２カップルの酸化還元値が非常に類似しているからである。しかし、本発明においては、生産微生物がこの様に形質転換されたとき、素材料が有用な産物に変換する効率およびバイオマスにおける産物の収量が実質的に増大する。
注意すべきことは、反応(１)および(２)により(下記の反応(３)〜(５)、(６)〜(８)および(１１)〜(１２)によっても)引き起こされる２種のピリジン・ヌクレオチドカップルを平衡にしようとする傾向が、ピリジン・ヌクレオチド結合デヒドロゲナーゼの基質(反応(１)および(２)ならびに反応(３)〜(５)におけるＳＨ2、(６)〜(８)におけるリンゴ酸、および(１１)〜(１２)におけるグルタメート)を介して電子の移行により起きることである。このことが、本発明を、電子がＮＡＤ(Ｐ)ＨからＮＡＤ(Ｐ)へ、いわゆるトランスヒドロゲナーゼ(例えば、EC 1.6.1.1.1および1.6.1.2)により移行される系と識別する。Kojima et al.(1996:EP 0 733 712 A1)は、トランスヒドロゲナーゼが特定の細菌においてＴＣＡサイクルを介して生じたＮＡＤＨをＮＡＤＰに換える手段として用いる系について記載している。
デヒドロゲナーゼのいくつかの対は、共通の基質を有するが、異なるピリジン・ヌクレオチド特性を有することが知られている。例えば、ＮＡＤ−とＮＡＤＰ−両者の結合形態で、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.2および1.4.1.4)、イソクエン酸・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.41および1.1.1.42)、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.3および1.2.1.4)、アルコール・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1および1.1.1.2)、リンゴ酸・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37および1.1.1.82)、グリセロール−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.8および1.1.1.94)、キシロース−１・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.175および1.1.1.179)、グリセルアルデヒド−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.12および1.2.1.13)、オロテート・リダクターゼ(EC 1.3.1.14および1.3.1.15)およびフェレドキシン・リダクターゼ(EC 1.18.1.2および1.18.1.3)であり、また、いかなる適当な対のデヒドロゲナーゼも用いることができる。多くのデヒドロゲナーゼは既知であり(例えば、Nomenclature 1992,Academic Press Inc.参照)、その性質は文献で分かるか、分光光度計による簡単なアッセイで調べられる(例えば、Bergmeyer,1974参照)。望ましいピリジン・ヌクレオチド特性を有する天然生育細胞のほかに、本発明では、変化したピリジン・ヌクレオチド特性を有する遺伝子工学処理酵素が使用される。補助因子特性の変化の例については、例えばChen et al.(1994)およびChen et al.(1997)を参照。
反応(１)および(２)に関与する触媒活性は、同一高分子タンパク質で生じまたは単一ポリペプチド鎖でも生じるか、遺伝子工学などによりそのような高分子タンパク質または単一ポリペプチド鎖中に組込まれる。本発明の実施は、両ピリジン・ヌクレオチド系で作動するデヒドロゲナーゼを過剰発現することでもなされる。両ピリジン・ヌクレオチドを受け入れるデヒドロゲナーゼは、既知であり、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.3)、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.5)およびアルコール・デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.71)のアイソザイムを含む。どのようにデヒドロゲナーゼ活性がインビボで調節され、ピリジン・ヌクレオチドの濃度を乱さないかについては、ほとんど分かっていない。
第２実施態様において、本発明は、少なくとも１種の組換えＤＮＡ分子で形質転換された微生物を提供する。このＤＮＡ分子またはこれらのＤＮＡ分子は、ＮＡＤＰのＮＡＤＰＨへの還元とＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化またはこの逆についての少なくとも１工程のサイクル反応を触媒する少なくとも１種の酵素の発現をコードするか、発現する。反応(３)〜(５)は、その一つのサイクルを示す。
(３)    ＮＡＤＰ＋ＳＨ2←→Ｓ＋ＮＡＤＰＨ
(４)    Ｓ＋Ｘ  ←→Ｚ＋Ｙ
(５)    ＮＡＤＨ＋Ｚ←→ＳＨ2＋ＮＡＤ
反応(３)〜(５)は、記述の方向にＮＡＤＰとＮＡＤＨをＮＡＤＰＨとＮＡＤに変換し、逆方向に反対の変換を行う。反応(３)〜(５)を触媒する酵素は、第１実施態様でのように、共通の基質(ＳＨ2)を有するが、反対の補酵素特性を有する１対のデヒドロゲナーゼであり、しかし反応産物(ＳおよびＺ)が異なる。本発明の目的のために、ＳがＺに変換されてＮＡＤまたはＮＡＤＰにおける正味変化がない場合にのみ、反応(４)は、単一工程の代わりに連続工程であってもよい。このように、本系の反応も、反応(１)および(２)と同様にＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨカップルを平衡化しようとする。ただ、本系はＸ←→Ｙの変換にカップルしている。このように平衡においてＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ比率がほぼ等しくなることは必ずしも必要でなく、代わりに比率はＸとＹと間の平衡に依存している。本発明のこの実施態様の一例は、リンゴ酸酵素、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼにより提供され、次の反応を触媒する。
(６)リンゴ酸酵素：  リンゴ酸＋ＮＡＤＰ←→ピルビン酸＋ＣＯ2＋ＮＡＤＰＨ
(７)ピルビン酸・カルボキシラーゼ：  ピルビン酸＋ＣＯ2＋ＡＴＰ→オキサロ酢酸＋ＡＤＰ＋Ｐｉ
(８)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ：  オキサロ酢酸＋ＮＡＤＨ←→リンゴ酸＋ＮＡＤ
反応(６)〜(８)において、ピルビン酸＋ＣＯ2は反応(３)〜(５)におけるＳに対応し、オキサロ酢酸はＺに対応し、ＡＴＰおよびＡＤＰ＋ＰｉはそれぞれＸおよびＹに対応する。
反応(３)〜(５)において、還元基質ＳＨ2は２種のデヒドロゲナーゼに共通する。本発明はまた、１種以上の酵素で微生物を形質転換して、反応(３’)〜(５’)のサイクル系をつくることができる。サイクル系では基質の酸化型が２種のデヒドロゲナーゼに共通である。
(３’)    ＮＡＤＨ＋Ｓ←→ＳＨ2＋ＮＡＤ
(４‘)    ＳＨ2＋Ｘ’←→ＺＨ2＋Ｙ’
(５’)    ＮＡＤＰ＋ＺＨ2←→Ｓ＋ＮＡＤＰＨ
さらに、本発明の目的のために、ＳＨ2がＺＨ2に変換されて、ＮＡＤまたはＮＡＤＰにおける正味変化がない場合にのみ、反応(４’)は、単一工程の代わりに連続工程であってもよい。
さらにまた、本発明の自明の展開として、サイクル式(３)〜(５)と(３’)〜(５’)とを組み合せることができ、基質の酸化型も還元型も２種のデヒドロゲナーゼにとって共通でないが、デヒドロゲナーゼの基質の酸化型が正味の酸化還元変化のない反応によって内変換され得る。還元型も同様である。
(３”)    ＮＡＤＰ＋ＳＨ2←→Ｓ＋ＮＡＤＰＨ
(４”)    ＺＨ2＋Ｙ’←→Ｘ’＋ＳＨ2  Ｓ＋Ｘ←→Ｙ＋Ｚ
(５”)    ＮＡＤＨ＋Ｚ←→ＺＨ2＋ＮＡＤ
このように、最も一般的な型において、本発明は、反応(３”)〜(５”)の一つを触媒する少なくとも１種の酵素の発現を起す遺伝子で微生物を形質転換することよりなり、これらのすべての反応が同じ細胞区画で起きる。反応が上記のように左から右へ起きるとき、還元当量がＮＡＤＨからＺＨ2およびＳＨ2を介してＮＡＤＰに移行され、ＮＡＤＰがＮＡＤＰＨに還元される。反応が右から左へ起きるときは、ＮＡＤＨがＮＡＤＰＨから形成される。
本発明のこの実施態様においても、変化した補酵素特性を持つ遺伝子工学的処理の酵素が利用できると考えられる。
本発明の第１局面において、宿主微生物は、優先的にＮＡＤＰＨを利用するＸＨ酵素および優先的にＮＡＤを利用するＸＤＨ酵素を保有する。宿主微生物は、これらの酵素によりキシロースをキシルロースに変換できる。しかし、上記したように、この方法は非効率的で、キシロースに対するエタノールの収量は低いかゼロである。本発明のこの局面の例は、実施例８である。ＸＲ、ＸＤＨおよびキシルロキナーゼ(ＸＫ)の遺伝子を保持するS.cerevisiaeの工学処理株を、S.cerevisiae由来のＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ＧＤＨ２およびマーカー遺伝子を保持する多複製プラスミドで形質転換する。形質転換体はマーカー遺伝子により選択する。形質転換体は、非形質転換宿主の酵母より効率的にキシロースをエタノールに発酵する。特に、キシロースに対するエタノールの高い収率、または低いＣＯ2産出、あるいはこの両方を有する。選んだ方法条件によって、改良効率が生産量の増加や特異的比率の増大などの形でもたらされる。特異的比率の増大は固定微生物を用いる方法において特に意味があり、この方法では担体が保有できるバイオマスの量に上限がある。効率の増加は次の反応式で説明される。
0004573365.tif 000005
このように、酸化還元の不均衡を回避し、キシロースからキシルロースへの円滑な転換が起こり得る。ＮＡＤＰＨを再生するＧ６ＰＤＨおよびイソクエン酸・デヒドロゲナーゼなどの脱カルボキシ反応の結果が低下し、ＣＯ2産生を減少し、発酵が空気なしで効率よく生じる。さらに驚くべきことに、キシリトール生産も、本発明のＧＤＨ２で形質転換した株では対照株に比して約２５％増加する。キシリトールの増加は下記で説明する。
この例では、宿主微生物はＸＲ、ＸＤＨおよびＸＫをコードする遺伝子で予め形質転換されている。宿主生物が形質転換体であることは本発明の要件でない。本発明によると明白に、エタノール収量の実質的な増加が実施例８の宿主微生物で起きる。この宿主におけるＸＲは、P.stipitis由来の酵素であり、ＮＡＤＰ(Ｈ)を好むが(Verduyn et al.,1985)、ＮＡＤ(Ｈ)に作動することができる。このように、本発明のこの局面は、ＮＡＤＨを利用し得るＸＲによっても実現される。さらに実質的な効果が生じ得るのは、宿主微生物がＮＡＤＰ(Ｈ)に高い特異性のＸＲを含有するとき、例えば、ＸＲ活性をコードするS.cerevisiaeオープンリーデングフレイムＸＨＲ１０４ｗが高度に発現されたときある。さらに、ＸＫをコードする遺伝子で酵母を形質転換すると、キシロースをエタノールに発酵する効率が改善される(HoおよびTsao、WO 95/13362)。注目すべきは、本発明において、宿主微生物が高いレベルのＸＫを含有するときでも、キシロースのエタノールへの発酵が改善されることである。しかし、本発明によって、キシロースのエタノールへの発酵が、ＸＫをコードする遺伝子で形質転換されていない宿主微生物においても改善される。S.cerevisiaeおよびSchiz.pombeがＸＤＨ、ＸＫおよび(S.cerevisiae)ＸＲをコードする相同遺伝子を含有することが本発明で分かった。キシロースをエタノールに発酵するＸＤＨ、ＸＫおよびＸＲの異型遺伝子を含有しない宿主酵母の能力も、本発明の形質転換により有用的に高められる。
イソメラーゼおよびエピメラーゼを含む種々の酵素が、相違のペントース糖および相違のペントースリン酸を内変換することが知られている。当業者は、本発明がキシロースからのみでなく他のペントースからのエタノール生産の効率をも改善する一般的な方法を提供することが理解できよう。
また、当業者は、同様の有益な効果が上記の本発明第１実施態様によるデヒドロゲナーゼの別の対を用いて得られることが分かるであろう。例えば、両ＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼがサイトゾル中で適当に発現されるように、ＧＤＨ２でS.cerevisiaeを形質転換する代わりに、同じ基質を共有するが、異なるピリジン・ヌクレオチドを利用する別の対のデヒドロゲナーゼの１または２で酵母を形質転換することによっても同じ効果が得られる。ただし、両酵素は可逆的であり、または少なくとも式(１１)および(１２)に示す方向に反応を触媒するものである。例えば、大部分のＮＡＤ結合イソクエン酸・デヒドロゲナーゼはアロステリック酵素であって、２−オキソグルタル酸の還元性カルボキシ化(反応式(１１)に相当)を触媒しないが、イソクエン酸の酸化性脱カルボキシ化のみを触媒するので、本発明のこの局面には不適当となろう。しかし、デヒドロゲナーゼのいくつかの他の対は使用でき、アルコールおよびアルデヒド・デヒドロゲナーゼが含まれる。必要な情報は、文献から得られるか、簡単な分光光度計によるアッセイで調べられる。デヒドロゲナーゼの活性は両方向(可逆的であれば)で容易に測定でき、適当な基質の存在でＮＡＤ(Ｐ)Ｈの出現の有無を調べて、問題の酵素が補酵素の不均衡を解消するのに要する反応を触媒するかどうかを判定する。
本発明の第２実施態様により、同様の有用な効果がＮＡＤ(Ｐ)結合リンゴ酸酵素をコードする組換えＤＮＡ分子でS.cerevisiaeを形質転換することにより得られる。S.cerevisiaeは前もってピルビン酸・カルボキシラーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有する。そして、酵母は上記反応(６)〜(８)を触媒し、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＨのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤへの変換をもたらす。実施例１４は、この形質転換の有用な効果を示す。対照株に比して、リンゴ酸酵素の遺伝子を過剰発現する株は、キシロース利用に５５％大きい特異的率を示し、エタノールおよびキシリトールの形成に２０％および２５％大きい特異的率を示した。
本発明の第１および第２実施態様において構築した株による実施例８および１４のキシリトールの比率が増加することは、これらの特定の株が異型のＸＤＨおよびＸＫをも含有していたので、予想外であった。ＸＤＨおよびＸＫは、キシロースのエタノールへの変換を助けるのが知られており、本発明がキシロースのエタノールへの発酵を実際的な条件で改善するのを示すのによい試験であった。ＸＤＨおよびＸＫは、キシロース誘導キシリトールのキシルロース−５−リン酸への変換を容易にすると考えられるので、意義のあるのは、これら２種の酵素の存在においてすら、本発明の形質転換によりキシロースの取りこみがエタノール産生の増加以上に増加したことである。この差違は、キシリトール産出の増加として現れる。キシリトールは、それ自体のみでまたはエタノールと共に、魅力的な産物である。異型のＸＤＨおよびＸＫを含有しない株の本発明による形質転換は、実施例８および１４で達成されたように、キシリトール生産に少なくともかなりの改善を提供する。
酵母および他の微生物は、別のペンチトール、特にアラビトールやリビトールをキシリトールと同様に生産する。これらのものは、素材料中に生じる他の天然のペントース(例えば、アラビノース)から、あるいは異なる補酵素特性を有しデヒドロゲナーゼ反応を介してしばしば進行するペンチトールの代謝性内変換によってつくられる。いずれの場合も類似の酸化還元均衡問題が上記のように生じ、生産性と収率の改善が本発明の実施で得られる。
当業者には容易に理解できるように、本発明は、基本的な生化学の原理を開発するものであり、非常に広い適用を有し、S.cerevisiaeと同様に他の微生物において実施できる。実施例１８によると、本発明によりリンゴ酸酵素をコードする遺伝子でShiz.pombeを形質転換すると、キシロースのエタノールへの発酵の効率が改善される。量的および特異的な生産性がこの微生物でも顕著に高められ、重要なことに、対照株のバイオマスが比較的速く低下するような製造条件でバイオマスおよび代謝性能力が保持され得る。
本発明の他の具体的な局面は、宿主微生物がヘキソース糖をエタノールへ発酵することである。微生物は、発酵中に生育するので、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰの両方を過剰に生産する(Oura,1972)。非形質転換微生物では、エタノール生産が、過剰のＮＡＤＨの再酸化を必要とするグリセロール生成、および過剰のＮＡＤＰの還元に要する１モルのエタノールにつき１モル以上のＣＯ2生成を伴う。これらの反応は発酵され得る炭水化物に対するエタノールの収率を低下する。形質転換微生物では、発酵され得る炭水化物に対するエタノールの収率が非形質転換微生物での収率に比して増加する。本発明のこの局面については、実施例９および１３に示す。
実施例９において、酵母S.cerevisiaeを、S.cerevisiae由来のＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ＧＤＨ２およびマーカー遺伝子を含有する多複製プラスミドで形質転換する。形質転換体はマーカー遺伝子により選択される。形質転換体は、グルコースのエタノールへの発酵における効率を改善し、特に発酵される炭水化物に対する収率を改善し、いくつかの望ましくない副産物、例えばＣＯ2などの生成を低下する。選択方法条件によって、改良効率が生産量の増加や特異的比率の増大などの別の形態でも実現する。効率の増加は次の反応式で説明される。過剰のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰの実質的な部分がＮＡＤおよびＮＡＤＰＨに変換され、発酵可能な糖の望ましくない消費を起こさない。
ＮＡＤＨ＋２−オキソグルタル酸＋ＮＨ3→グルタメート＋ＮＡＤ
ＮＡＤＰ＋グルタメート→２−オキソグルタル酸＋ＮＨ3＋ＮＡＤＰＨ
実施例１３において、S.cerevisiaeを、本発明の第２実施態様によりリンゴ酸酵素をコードする遺伝子で形質転換する。顕著な利点があり、(望ましくない)バイオマス生成の低下およびエタノール生成の特異的比率の増加などがある。
当業者は容易に分かるように、ヘキソースのエタノールへの発酵について同様の有用な効果が、上記の本発明第１実施態様よって別の対のデヒドロゲナーゼを用いて、あるいは本発明第２実施態様によって他の適当な酵素を用いて得られる。本発明はS.cerevisiaeと同様に他の微生物でも実施できる。
本発明のひとつの意義ある部分は、キシロースのエタノールへの発酵効率を増加する(実施例８，１４および１８)のと同じ形質転換がヘキソースのエタノールへの発酵効率をも増加する(実施例９および１３)ことである。このように、本発明はグルコースおよびキシロースの両方の改善された利用を提供する。グルコース等は、農業性や林業性の材料および都市性廃棄物などの多くの再製可能なバイオマスから誘導される主要な糖である。
エタノールの工業的生産のためには、工業用の株を使用して本発明の好ましい実施をなし得る。例えば、蒸留酒製造業者やビール醸造業者の酵母、ワイン酵母あるいはラム製造のSchiz.pombe株を使用する。工業用酵母を形質転換する方法はよく知られており、この酵母は倍数体であることが多く、栄養要求マーカーを欠く。KnowlersおよびTubbがこの方法を以前に報告している(1987)。本発明により形質転換された工業用株は、例えば非形質転換株と同じ工業的発酵法で使用され、上記したような利点、収率の増加、生産性の増加、望ましくない副産物の減少などをもたらす。形質転換株は、非形質転換株に比して、広範な素材料、例えばペントースまたはペントース重合物あるいはこの両者を高レベルで有する素材料の経済的発酵にも非常に有用である。
本発明の第３局面において、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリンなどのアミノ酸を過剰生産する微生物を少なくとも１つの組換えＤＮＡ分子で形質転換する。このＤＮＡ分子は、反対のピリジン・ヌクレオチド特性を有する少なくとも１つの対のデヒドロゲナーゼをコードするか(本発明の第１実施態様による)、反応(３)〜(５)、(３’)〜(５’)および(３”)〜(５”)によってＮＡＤＰがＮＡＤＰＨに還元され、ＮＡＤＨがＮＡＤに酸化される反応サイクルの少なくとも１つの工程で触媒作用を働く少なくとも１種の酵素をコードするものである。形質転換微生物は、改善効率を有する所望のアミノ酸を生産できる。特に、炭素源に対する収率の増加、生産性の向上、空気必要性の減少、二酸化炭素生成の低下などのいくつもの利点を有す。
例えば、リシンは、Corynebacterium glutamicumなどの種々のコリネバクテリアやBrevibacterium flavumに主に基づく微生物発酵法によって現在製造されている。これらの細菌についての遺伝子工学法はよく開発されており(参照、例えばFollettie et al.,1991;Follettie & Sinskey,1986;Jetten et al.,1994;Jetten & Sinskey,1995)、ＤＮＡベクターが多複製プラスミドまたは染色体組込みによって効率的にこれらの生産微生物を形質転換するのに使用される。例えば、使用可能なベクターに、C.glutamicum、Brevibacterum sppおよびC.glutamicumについてpAJ655、pAJ1844およびpCG11があり、Bacillus subtilis、Brevibacterium sppおよびC.glutamicumpについてAJ440プラスミドベクターがあり、Rhodococcus spp、Corynebacterium sppおよびE.coliについてpMS2プラスミドベクターがある。本発明によるリシン生産株の形質転換効果は、ATCC 31269、ATCC 21253、ATCC 21800、ATCC 21801およびATCC 21086などの株およびリシンなどのアミノ酸を多量に生産し工業的に使用される他の株で達成される。
本発明のこの局面は実施例１９から２３に示す。Corynebacterium glutamicumを、ＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするPeptostreptococcus asaccharolyticus由来の遺伝子で形質転換した。形質転換Corynebacterium glutamicumは、ＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を示し、ＮＡＤＰ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を天然に有する。したがって、この形質転換微生物は、ＮＡＤＰおよびＮＡＤをＮＡＤおよびＮＡＤＰＨに変換し得る本発明の第１実施態様によるデヒドロゲナーゼ対を有する。いくつかの細菌と異なり、Corynebacterium glutamicumは、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼを含有しないので、２種のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの一連の操作は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ補酵素カップルを平衡する新しい手段を細菌に提供する。よく知られていることであるが、リシン(および多くの他のアミノ酸)合成でＮＡＤＰＨが生成し、リシンが多量に過剰生産されると、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰへの再酸化の要求がアミノ酸生産を制限し得る。これもよく知られているように、実施例２３の培養条件では、リシンの生産は始まらないでトレオニンが培養基中に残り、細菌が成長を止めるまで収率が比較的低い(Vllino,J.J.,1991;p207-213を特に参照)。驚くべきことに、本発明による形質転換Corynebacterium glutamicumは、トレオニンが残っていても、また細菌が予測バイオマス収量の２５％にすら達する前に、すでに多量のリシンを生産する。これらの実施例は、アミノ酸の生産をエタノールやキシリトールなどの非窒素化合物の生産と同様に改善するのに、細菌および真菌において本発明を有益に実施できることを開示している。
アミノ酸の工業的製造のために、１以上のアミノ酸を多量に製造する細菌株を本発明に従って形質転換する。形質転換株は元の非形質転換株と同様に工業的方法で使用できる。例えば、使用される原料には、炭素源として種々の糖やクエン酸、酒石酸またはフマール酸などの有機酸があり、窒素源としてアンモニア、アンモニウム塩または安価なタンパク質加水分解物がある。少量の有機物(例えばチアミン)および無機物(例えば鉄やマクネシウムの塩)を、元の非形質転換株での方法と同様に加えることができる。非形質転換株に比較すると、本発明の形質転換株は、上記したように収率の増加、生産性の増加および酸素の必要性の低下などの利点がある。
ＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼもCorynebacterium glutamicum(および他のコリネバクテリア)に周知の方法で導入できる。例えば、Peptostreptococcus asaccharolyticus由来の遺伝子はＴａｃプロモーターの下にC.glutamicumに転移された(Marx et al.,1999)。注意すべきことは、MarxらがＮＡＤＰ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を最初に抹消した株Corynebacterium glutamicumを使用したのに対し、本発明は、ＮＡＤＰ結合−およびＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼの同時存在を教示していることである。本発明の実施はまた、リシン以外のアミノ酸を多量に生産する細菌株を形質転換して行う。形質転換は、ＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするこの遺伝子または別の遺伝子で、あるいはピリジン・ヌクレオチドカップルに相違する特性を有する２種のデヒドロゲナーゼの機能的カップリングを起すいくつかの他の酵素についての遺伝子でなされる。
ポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)がバイオ分解性のプラスチックをつくるのに商業的に用いられているが、その価格は法律で強制されている国(例えばドイツ)を除き広く用いられるには高すぎる。したがってＰＨＡを生産する微生物方法の効率を改善することが望まれる。ＰＨＡのバイオ合成において、グルコースがアセチルＣｏＡに代謝され、２種のＮＡＤＨ分子／アセチルＣｏＡ分子をつくり、次いでアセチルＣｏＡは、ＮＡＤＰＨによりヒドロキシブチリルＣｏＡに還元されるアセトアセチルＣｏＡとなる。したがって３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの各分子の合成が４分子のＮＡＤＨをつくり、１分子のＮＡＤＰＨを必要とする。次いで３−ヒドロキシブチリルＣｏＡをポリヒドロキシブチレート(ＰＨＢ)に重合化するか、プロピオニルＣｏＡなどの他のアシルＣｏＡで共重合して、混合ＰＨＢを形成する。単量体１単位につき１分子のＮＡＤＰＨの必要性および４分子のＮＡＤＨの生産は、上記したように、ＰＨＡを合成する微生物がその炭素の部分を、ＮＡＤＰＨをつくるためにグルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼまたはイソクエン酸・デヒドロゲナーゼなどの反応により除去する必要があり、結果的にＣＯ2の過剰生産または炭素源の廃棄が起きることを意味する。同時に、ＮＡＤＨは、さらに炭素の消失を起すか、酸素要求を増加するか、あるいは両方を起して、再酸化される。本発明の生産微生物を形質転換することで、この廃棄を低下し、過剰のＮＡＤＨ部分を必要なＮＡＤＰＨ生産に変える新しいメカニズムを微生物に提供する(総説として、参照Anderson et Dawes,1990;Poirier et al.,1995)。
本発明のこの局面において、１以上のＰＨＡを生成する微生物を第１または第２実施態様により形質転換し、形質転換微生物は、プロピオン酸またはバレリン酸などの有機酸の存在または不存在でグルコースを発酵するのに用いる。元の非形質転換微生物に比べると、本発明の形質転換微生物は上記のような利点がある。グルコースに対するＰＨＡの収率の増加、生産性の増加およびＣＯ2などの望ましくない副産物形成の減少等の利点である。実施例２４はその方法を示す。この実施例において、生産微生物は、Alcaligenes eutrophus由来のＰＨＢシンターゼおよびレダクターゼで形質転換された組換え株Saccharomyces cerevisiaeである。しかし、組換え酵母を用いる必要はない。ＰＨＡを生産するいかなる微生物、例えばAlcaligenes eutrophusやPseudomonas oleovaransあるいはＰＨＡを過剰に生産する工学処理細菌株を使用できる。本発明の形質転換微生物は、元の非形質転換微生物で用いるのと基本的に同じ条件で有機酸の有無でグルコースを発酵するのに使用する。
本発明の別の局面において、生産微生物は本発明により生物工学的な方法の条件で形質転換される。形質転換微生物は、対応する非形質転換微生物よりも該方法に要する高いレベルの代謝能を保持する。実施例１４はこの局面を示す。リンゴ酸酵素を発現する遺伝子で本発明により形質転換したS.cerevisiaeは、嫌気的条件でキシロースをエタノールへ発酵するのに用いる。酸化的工程によるエタノール収率の低下を防止するという利点がある。これらの方法条件において対照株のバイオマスは操作中の時間と共に低下し、対応して基質(キシロース)を産物(エタノール)に変換する代謝能が失われる。実際、このことから生産微生物を繰り返し追加するなどの不便で費用のかかる工程が必要となる。しかし、本発明の形質転換微生物は、そのバイオマスおよび必要な代謝能を保持し得る(図８)。形質転換微生物がバイオ形質転換法から十分なエネルギーを得て、それ自体の完全性と代謝能を保持できるのに対して、非形質転換微生物はできないと考えられる。実施例１４の条件で、単一細胞の生産微生物および均質液体培地でもって、対照微生物のバイオマスの減少および本発明の形質転換微生物のバイオマスの保持が容易にわかる。
しかし、当業者に明白なように、第１に、不均質培地または糸状真菌あるいは両方を用いる多くの方法において、バイオマスを保持するのが非常に難しい。第２に、意味のあるパラメーターがバイオマス自体でなく、基質を産物に変換する代謝能である。この点において、代謝能は、特定セットのバイオ形質転換を遂行する方法に存在する生産微生物の全能力(例えば、発酵物の単位容量につき)を意味し、すなわち特定の生物工学的方法が必要とするものであって、標準条件で基質の産物への変換比率を測定することで判定できる。
本発明の別の局面として、工業的な規模でヌクレオチド、脂質または種々のタイプの２次代謝物を多量に生産するように発育させた生産微生物の形質転換がある。本発明の上記実施態様による形質転換の後に、この微生物は、望む商業物質の収率の増加、特異的な生産比率の増加、望ましくない副産物形成(ＣＯ2や過剰のバイオマスなど)の低下またはこれらの利点を同時に提供する。
実施例は、生産微生物の形質転換により生物工学的方法の効率がいかに改善されるかを開示する。ＮＡＤ(Ｈ)とＮＡＤＰ(Ｈ)との補酵素系間における酸化−還元反応を容易にする酵素をコードする少なくとも１種の組替えＤＮＡ分子で微生物を形質転換するものである。本発明の達成には、単一の遺伝子で宿主を形質転換し(例えば、実施例３のＧＤＨ２、実施例１２のＭＡＥ１)、特定の条件で宿主中に自然に発現される酵素を用いて、反応式(すなわち、上記の反応(１)＋(２)または(３)＋(４)＋(５))を完了する。しかし、本発明の達成はまた、１以上のＤＮＡ分子で宿主を形質転換し、反応(１)および(２)または２以上の反応(３)、(４)および(５)(または(３’)、(４’)および(５’)、または(３”)、(４”)および(５”))を形質転換遺伝子から発現の酵素で行い得る。
ＧＤＨ２およびリンゴ酸をコードする遺伝子以外に、他の酵素をコードする遺伝子も利点を持ち得る。適当な酵素(例は上述)は既知であり、その遺伝子はクローンされて、データーバンクにあり、周知のＰＣＲ法により得られる(実施例６、７，１０から、酵母と糸状真菌の両方由来の遺伝子について容易に行えることが分かる)。微生物の生理および代謝の専門家は、反応(１)および(２)または(３)〜(５)または(３’)〜(５’)または(３”)〜(５”)に対応する代謝式をつくることができる。このような多くの代謝式は既知の酵素を必要とする。不可欠の酵素を見つけるためにデーターバンク(例えばSmissprot)を調べることもできる。例えば、次のアクセス番号でＮＡＤＰ結合デヒドロゲナーゼに対応するアミノ酸またはヌクレオチド配列がわかる：p00369、P31026、P00370、P50216、P08200、P14941、P75214、P27800、Q58820、P15719、P46919、P28861、L05667、U26463、YPL061w、P18819、M88600、X75327、P55804。これらの配列は、例えば配列特異的プライマーでのＰＣＲにより対応する遺伝子をクローンするのに用いられる。
他の適当な酵素活性は、適当な酵素アッセイ(参照、例えばBergmeyer,1974、当業者は他の適当なアッセイ系を容易に設計できる)を、細菌、真菌およびより高等な動植物を含む適当な生物からの抽出物に対して行い調べることができる。関与するタンパク質を標準的な方法により精製でき、それに対する抗体をつくり、そこからアミノ酸配列データーを得る。タンパク質をコードする遺伝子を標準的な方法でクローン化できる。発現ライブラリーをスクリーンする抗体、ＰＣＲクローニングのプライマーとして作用するアミノ酸配列から設計されたヌクレオチド、または遺伝子バンクをスクリーンするためのハイブリダイゼーション・プロ−ブなどを用いる。
適当な新しい酵素活性およびその遺伝子は、当業者によく知られ日常的に行われている別の方法によってもデーターバンク情報を調べることでわかる。例えば、リンゴ酸酵素をコードするいくつかの配列の配置は、いわゆる“リンゴ酸酵素の特徴”を表す。オリゴヌクレオチド混合物の製造が、例えば他の微生物におけるリンゴ酸酵素をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングを用いて可能となる。Aspergillus nidulansのリンゴ酸酵素について実施例７に記載する。
当業者によく知られているように、ＰＣＲによる遺伝子のクローニングにおいて点変異が起こることがあり、増殖法により永続させることができる。同じ微生物の異なる株において同じ遺伝子間で小さい配列相違が自然に起きることもある。これらの変異の多くは、コードタンパク質の機能に意味のある作用はなく、いわゆる中立突然変異である。例えば、リンゴ酸をコードする遺伝子において２つの点変異を実施例１０で認めたが、コードされたリンゴ酸酵素の活性に意味のある影響がなかった。このような中立突然変異を意識的に導入することもできる。本発明は、遺伝子のこのような中立突然変異株や天然遺伝子の利用を含む。
本発明によると、宿主生物を、本発明の第１実施態様の反応(１)および(２)または第２実施態様の反応(３)〜(５)(または(３’)〜(５’)または(３”)〜(５”))が同じ細胞区画、好ましくはサイトゾルで同時に起こるように形質転換する。反応が同じ区画で起す制限は、細胞区画間で代謝中間体を移動せしめながら反応(４”)が行き来するので、絶対的なものではない。本発明の教示によって、形質転換遺伝子は必要に応じて修飾されて、望む生産方法での生理的条件下に適当な区画において発現することがわかる。いわゆる「シグナル」あるいは「標的」配列は、ミトコンドリア、ペルオキシソームまたは外質部などの特殊な区画へタンパク質を導く比較的短いＮ末またはＣ末のアミノ酸配列を常にコードすることが知られている(McAlister-Henn et al.,1995)。これらの配列は、遺伝子工学の標準的方法によって遺伝子から除去または遺伝子へ添加でき、望む区画で望む酵素を発現する。完全なＭＡＥ１から発現されたリンゴ酸酵素(実施例１３、１４、１８)はミトコンドリア標的配列を有する酵素の例であって、その活性の少なくともいくつかがミトコンドリア内に存在すると考えられる。遺伝子が強く発現されると、実施例13および１４に示すように、酵素の一部がサイトゾルに残り、そこでは酵母リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸・カルボキシラーゼも存在する。リンゴ酸酵素(またはミトコンドリア標的配列を有する他の酵素)をサイトゾルにおいてのみ発現しようとするときは、遺伝子を適当に切除することにより標的配列を除去できる。さらに、異化代謝産物不活性化を受ける酵素は、この周期的な回転を遅くしたり、妨げたりするように修飾できる(Minard and McAlister-Henn,1992)。
本発明の実施は微生物を組換えＤＮＡ分子で形質転換することでも可能であり、反応(３”)〜(４”)の一つを触媒する適当な酵素をコードする宿主遺伝子の天然プロモーターを、該プロモーターよりも強い発現または異なる生理条件での発現を起し得る別のプロモーターで置き換える。形質転換ＤＮＡ分子が完全な機能的酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことは、必要でない。例えば、好ましい効果を得るには、宿主のＧＤＨ２の天然プロモーターをＰＧＫやＡＤＨなどのプロモーターでインビボ組換え中に置換のみを行うＤＮＡ分子でもって宿主S.cerevisiaeを形質転換すると、宿主のＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼが継続的に発現される。宿主を他の微生物由来の遺伝子で形質転換するときは、宿主から誘導のプロモーターを使用するのが望ましい。
多くの生産真菌および細菌について適当なプロモーターが知られている。例として、S.cerevisiae PGK、ACT、ENO1、GAPDH、MET25などのMETおよびADHのプロモーター、およびそれらの変異体がある(例えば、Rouhonen et al.,1995;Beier and Young,1982)。本発明で明らかなように、例えばS.cerevisiaeの場合、形質転換遺伝子が酵母から得られるときですら、これらのプロモーターの使用は利点がある。特に遺伝子が宿主のゲノムに統合されるものであるときは、遺伝子が生理的条件の範囲を超えて適当な発現を起すことが知られているので、使用に利点がある。例えば、いわゆる中程度の長さのADH1プロモーターは、S.cerevisiaeにおいて発酵性および糖新生性の成長条件で効果的な発現を起す。しかし、形質転換遺伝子の適当な発現も遺伝子天然プロモーターで、実施例３〜５に開示するように、例えば多複製プラスミドでの形質転換によって得ることができる。望ましい生理的条件での効率的な発現も、問題のプロモーターの修飾によって、または特定の遺伝子の発現に関与する(正または負の)トランス作用調節メカニズムの修飾によって得ることができる。
外部遺伝子を微生物内に形質転換するときは、例えば、ｃＤＮＡからまたは人工的合成により得られるイントロンなしのＤＮＡ配列で形質転換するのが望ましい。
遺伝子を宿主に導入または形質転換するための既知方法は、本発明に適しており、自動複製プラスミドベクターまたは人工染色体などの種々のタイプのベクターが用いられる。形質転換遺伝子の一つのまたは複数の複製を染色体に機能的で発現可能な形態で組込む既知の方法も本発明に適している。酵母、糸状真菌、コルネバクテリアなどの微生物についての方法が発表されている。適当なマーカー遺伝子を形質転換ベクターに含有せしめて、形質転換体を容易に選択できる。選択可能なマーカー遺伝子を含有する第２ベクターでの共形質転換も使用できる。広範なマーカー遺伝子が知られている。形質転換体は、望む表現型の発現、例えば嫌気条件でのキシロース上の発育能の向上の発現によっても選択できる。
本発明おいて明らかなように、ある場合には特殊な培養条件下でのみ形質転換遺伝子の発現が起きるという利点がある。例えば、最初に微生物を特定の細胞密度にまで生育し、次いで形質転換遺伝子の発現を起すことは、有用である。温度またはｐＨの変化により、特定の炭素または窒素源により、リン酸塩や銅などの特定の有機または無機の物質媒体の有無により、導入できるプロモーターが知られている。このようにして発現するのに用いられる酵母プロモーターの例には、GAL1、GAL10、CUP1およびPHO5がある。
本発明を下記の実施例でさらに説明する。本発明の生産株の構築や上記の特定の局面での使用を記述する。特に他に記載しない限り、すべてのバイオテクノロジー的手法は、既知の通常の方法で行う。
実施例１．キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするPichia stipitisのＸＹＬ１およびＸＹＬ２遺伝子の組込み株の構成
ＰＧＫ１プロモーターの下にＸＹＬ１および修飾ＡＤＨ１プロモーターの下にＸＹＬ２を含む、ｐＭＡ９１(Mellor et al.[1983])を基礎とした酵母発現ベクターｐＡＯＳ６６(Ruohonen et al.[1995])(図１)をＨｉｎｄIIIで消化し、ＰＧＫ１のプロモーターとターミネーターとの間にＸＹＬ１遺伝子を有する２.８ｋｂｐ発現カセットを単離し、そしてＢａｍＨＩで消化し、修飾ＡＤＨ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターとの間にＸＹＬ２遺伝子を有する２.２ｋｂｐ発現カセットを単離した。プラスミドＢ９５５(Toikkanen et al.[1998])を用い、組込みカセットを構成した。Ｂ９５５は、ＵＲＡ３遺伝子(オロチジン-５’-Ｐデカルボキシラーゼ、Rose et al.[1984]、をコードする)の２つのフラグメントを有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ細菌性クローニングベクター(Stratagene)であり、ポリリンカー領域のＳａｃＩ-ＸｂａＩ部位およびＸｈｏＩ-Ａｓｐ７１８部位の遺伝子のコーディング領域は、それぞれ７１-４５０および７８１-１１３５塩基対である。クローニングベクター内の残りのポリリンカー部位ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩを、粘着性末端結合による２つのＵＲＡ３フラグメント間のＸＹＬ１およびＸＹＬ２発現カセットの導入に用いた。得られた構成(５’ＵＲＡ３ ７１-４５０ｂｐ-ＸＹＬ２発現カセット３’-５’-ＸＹＬ１発現カセット５’-３’-ＵＲＡ３ ７８１-１１３５ ３’)をＳａｃＩ-ＮｓｉＩ消化によりＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫから分離し、アガロースゲルで単離した。フラグメント１μｇを用い、ＬｉＡｃ形質転換法(Hill et al.[1991],Gietz et al.[1992])により酵母株ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ-１Ｂ)(ＭＡＴα ｌｅｕ２-３,１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ｈｉｓ３−Δ１ ＭＡＬ２−８CＳＵＣ２)(Boles et al.[1996])を形質転換した。株ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ-１Ｂ)を“Ｈ１３４６”と名付けた。ＶＴＴ株コレクション番号はＶＴＴ Ｃ-９８３０４である。
組込みストラテジーは、酵母細胞に対する５-ＦＯＡ(５-フルオロ-オロチン酸)の毒性に基づく(Boeke et al.[1991])。野生型細胞は、５-ＦＯＡを５-ＦＵＭＰ(５-フルオロ-ウリジンモノリン酸)、チミジル酸シンセターゼの強力な阻害剤に変換する。それゆえ、ｕｒａ３(およびｕｒａ５)変異体は、ウラシルが変異株に供される限り、５-ＦＯＡの存在下で増殖し得る。上記フラグメントのＵＲＡ３配座への組み込みにより、野生型遺伝子は分断され、その株はウラシル要求性となり、５-ＦＯＡプレート上で増殖し得る。
正確で機能的な組込みは、サザンブロッティングにより、細胞抽出物中のＸＲおよびＸＤＨ活性を測定することにより、そして非形質転換ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ-１Ｂ)株と比べて、振とうフラスコ培養においてキシロース存在上で組込み株のみが増殖することにより確認した。組込み株をＨ１４６９と名付けた。
実施例２．Saccharomyces cerevisiaeキシルロキナーゼ遺伝子(ＳＧＤ番号ＹＧＲ１９４Ｃ)のクローニング
キシルロキナーゼ遺伝子(ＸＫ)は、フォワードプライマー５’ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＴＡ ＴＣＧ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＴＡ Ｃ３’およびリバースプライマー５’ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＴＡ ＴＣＴ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＧＧ ＧＣＡ Ｔ３’を用いたＰＣＲにより野生型酵母株の全ＤＮＡより増幅した。両プライマーは５’端にＥｃｏＲＶ制限部位を含む。ＰＣＲ反応条件は９４℃３’ホットスタート、９４℃１’、５５℃１’、７２℃２’、３０サイクル、７２℃１０’最終伸張反応である。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲルで精製した。ＸＫフラグメントを、クレノウ酵素で処理し平滑末端を形成したベクターＢ６０９(修飾ＡＤＨ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを有するBluescribe M13；Stratagene)に結合した。フラグメントの向きをＢｇｌIIおよびＥｃｏＲＩ酵素で調べた。右方向のクローンをＢａｍＨＩで消化し、フラグメントをアガロースゲルで精製した。ＢａｍＨＩフラグメントをＹＥｐｌａｃ１９５酵母発現ベクター(Gietz and Sugino[1988])のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
実施例３．２つの別々の多複写発現ベクターにおけるキシルロキナーゼ(ＸＫ)およびＮＡＤ依存性グルタミン酸デハイドロゲナーゼ(ＮＡＤ-ＧＤＨ)をコードする遺伝子による組込み株Ｈ１４６９の共形質転換
２つの酵母発現ベクター、上記のキシルロキナーゼをコードする遺伝子を有するＹＥｐｌａｃ１９５とＮＡＤ依存性グルタミン酸デハイドロゲナーゼ(Boles et al.[1993])をコードする遺伝子ＧＤＨ２を有するＹＥｐｌａｃ１８１とを、Ｈ１４６９組込み株に共形質転換した。ＹＥｐｌａｃ１９５ベクターを、増殖培地からウラシルを取り除くことにより選択し、ＹＥｐｌａｃ１８１を増殖培地からロイシンを省くことにより選択した。酵母形質転換体からのプラスミドは、２つの発現プラスミドを完全に組込んでいた。ＸＫおよびＮＡＤ-ＧＤＨをコードする両遺伝子を有する株をＨ１８０３(ＶＴＴ Ｃ-９８３０２)と名付けた。ＸＫをコードする遺伝子とＧＤＨ２のないＹＥｐｌａｃ１８１対照プラスミドとを有する対照株をＨ１８０５(ＶＴＴ Ｃ-９８３０３)と名付けた。
実施例４．多複写発現ベクターにおけるＮＡＤ依存性グルタミン酸デハイドロゲナーゼをコードする遺伝子による組込み株Ｈ１４６９の形質転換
ＮＡＤ依存性グルタミン酸デハイドロゲナーゼをコードするＧＤＨ２遺伝子を有する上記プラスミドＹＥｐｌａｃ１８１を、組込み株Ｈ１４６９に形質転換した。形質転換体の選択は上記の通り行った。酵母形質転換体からのプラスミドは、発現プラスミドを完全に組込んでいた。ＮＡＤ-ＧＤＨコード遺伝子を有する株をＨ１７９５(ＶＴＴ Ｃ-９８３００)と名付けた。ＹＥｐｌａｃ１８１対照プラスミドを有する対照株をＨ１７９７(ＶＴＴ Ｃ-９８３０１)と名付けた。
実施例５．多複写発現ベクターにおけるＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子による酵母株Ｈ１３４６(ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ-１Ｂ))の形質転換
ＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＤＨ２遺伝子を有する上記プラスミドＹＥｐｌａｃ１８１を、ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ-１Ｂ)(=Ｈ１３４６)株に形質転換した。形質転換体の選択は上記の通り行った。酵母形質転換体からのプラスミドは、発現プラスミドを完全に組込んでいた。ＮＡＤ-ＧＤＨをコードする遺伝子を有する株をＨ１７９１(ＶＴＴ Ｃ-９８２９８)と名付けた。ＹＥｐｌａｃ１８１対照プラスミドを有する対照株をＨ１７９３(ＶＴＴ Ｃ-９８２９９)と名付けた。
実施例６．Saccharomyces cerevisiae由来のリンゴ酸酵素相同体をコードするオープンリーディングフレームＹＫＬ０２９Ｃのクローニング
リンゴ酸酵素はＳ.cerevisiaeから特性が解析されている(Fuck et al.[1973])。酵母ゲノムの分析により、Saccharomyces pombe由来のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子(Viljoen et al.[1994])と相同性のある１つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ ＹＫＬ０２９Ｃ)を見つけた。S.cerevisiae ＯＲＦ ＹＫＬ０２９Ｃは、フォワードプライマー５’ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＡ３’およびリバースプライマー５’ＧＡＴ ＧＣＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＧ ＴＣＴ ＡＣ３’を用いたＰＣＲで酵母染色体ＤＮＡより増幅した。両プライマーは、５’端にＨｉｎｄIIIおよびＢｇｌII制限部位を含む。ＰＣＲ反応条件は、９４℃３’ホットスタート、９４℃１’、４０℃１’、７２℃２’、３０サイクル、７２℃１０’最終伸張反応であった。得られたＤＮＡフラグメントは予想されたものであった。ＰＣＲ産物を適当な制限酵素(ＢｇｌII)で消化し、酵母発現ベクターｐＭＡ９１中のＰＧＫ１プロモーターおよびターミネーターの間にクローニングした。
実施例７．糸状菌Aspergillus nidulans由来のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子のクローニング
別の生物からクローニングしたリンゴ酵素をコードする全遺伝子は、“リンゴ酵素の特徴”をコードするＤＮＡ配列を含む。この特定タンパク質(Ｐｒｏｓｉｔｅ：ＰＤＯＣ００２９４)の特有アミノ酸配列(ＦＮＤＤＩＱＧＴＧＡＶＶＭＡＳＬＩ)は、保存性が高い。特徴によって、特定の変性プライマーを、リンゴ酸酵素をコードする何れかの特定遺伝子のクローニングに設計し得る。
変性プライマーは、３’端プライマー用にリンゴ酸酵素の特徴(領域Ｄ)および２つめのタンパク質の相同領域、５’端プライマー用に領域Ｃ(Viljoen et al.[1994])を用い設計した。フォワードプライマーは、５’ＧＡ(Ｔ/Ｃ)ＧＴＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＡＡ(Ｔ/Ｃ)ＡＡ３’であり、リバースプライマーは５’ＧＴＩ ＣＣ(Ｔ/Ｃ)ＴＧ(Ａ/Ｇ/Ｔ)ＡＴ(Ａ/Ｇ)ＴＣ(Ａ/Ｇ)ＴＣ(Ａ/Ｇ)ＴＴ(Ａ/Ｇ)ＡＡ３’であった。ＰＣＲ反応条件は、９４℃３’ホットスタート；９４℃１’、３７℃１’、７２℃２’、７サイクル、９４℃１’、４０℃１’７２℃２’、２５サイクル、７２℃１０’最終伸張であった。Aspergillus nidulansの染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。予想される大きさのフラグメントが得られ(０.２４ｋｂｐ)、図２は幾つか既知のリンゴ酸酵素によるＰＣＲ産物の平衡整列を示す。A.nidulansリンゴ酸の部分的なアミノ酸配列を配列番号１に示す。得られた部分的な配列をさらにプライマーの設計に利用し、それ自身をサザンハイブリダイゼーションでプローブとして用い、何れかのＤＮＡバンク(例えば、ｃＤＮＡ、染色体、ラムダ)からリンゴ酸酵素全体をクローニングした。他の糸状菌のTrichoderma reesei由来のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子もクローニングできる。その部分的なアミノ酸配列は図２に含まれており、配列番号２である。
実施例８．キシロースからのエタノール生産
パート１．振とうフラスコ培養
株Ｈ１８０３およびＨ１８０５(実施例３参照)を、修飾したＳＣ-ＵＲＡ-ＬＥＵ(ウラシルおよびロイシンを省いた合成完全培地、Sherman et al.[1983])およびYeast Nitrogen Base without Amino Acids(Difco)および炭素源がＤ-グルコース(２０ｇ/ｌ)またはＤ-キシロース(２０ｇ/ｌ)からなる増殖培地中で培養した。細胞は、炭素源としてグルコースを含む培地の入ったフラスコ中で前-増殖した。細胞を遠心分離より回収し、炭素源としてキシロースを含む体積１００ｍｌの培地に懸濁した。細胞は、磁性ロッドでゆっくりと攪拌する１００ｍｌ エーレンメイアーフラスコ中に３０℃で維持した。嫌気状態をエアロックを用いてつくった。
キシロースとの２日間のインキュベーション後、ＮＡＤ-ＧＤＨレベルを上昇させた株は、乾燥重量ｇあたりエタノール２.３５ｇを生産し、対照株は乾燥重量ｇあたりエタノール１.４７ｇを生産した。エタノール量を自動化アナライザー(Ｃｏｂａｓ-Ｍｉｒａ)で酵素的に測定した。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を粗酵母細胞抽出物中で測定した。この抽出物は１００ｍＭ Ｎａ-リン酸、ｐＨ７.０ ５００μｌおよびガラスビーズ(直径0.4mm)１ｇ中で、新鮮な細胞５００ｍｇを１５分間ボルテックスすることにより得た。次いで、混合物を卓上遠心機で遠心分離し、上清を検定した。２００μＭ ＮＡＤ(Ｐ)Ｈおよび１００ｍＭ Ｎａ-リン酸、ｐＨ７.４を含む緩衝液２００μｌを、２０倍希釈した粗酵母抽出物１０μｌと混合した。反応開始に、α-ケトグルタル酸(最終濃度１０ｍＭ)および塩化アンモニウム(最終濃度２０ｍＭ)を添加した。３４０ｎｍの吸光度の減少率を測定し、これより活性を算出した。それは、ＢＩＯＲＡＤタンパク質検定により測定した酵母抽出物のタンパク質内容物と関係する。ＮＡＤＰ-ＧＤＨ活性を、基質としてＮＡＤＰＨを用い測定し、ＮＡＤ-ＧＤＨ活性を、基質としてＮＡＤＨを用い測定した。ＮＡＤ-ＧＤＨ活性は、過剰発現株では４-５ｎｋａｔ／ｍｇ、およびＧＤＨ２過剰発現しない対照では０.０４ｎｋａｔ／ｍｇであった。ＮＡＤ-ＧＤＨ活性は約２ｎｋａｔ／ｍｇであった。全検定は、Ｃｏｂａｓ-Ｍｉｒａ自動化アナライザーで行った。
パート２．発酵槽培養
エタノールへの嫌気性キシロース発酵は、Ｈ１８０３およびＨ１８０５と名付けられた遺伝子操作Saccharomyces cerevisiae株により、１.８リッターＣｈｅｍａｐ ＣＭＦ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で行った。両株は、S.cerevisiae CEN.PK2(VW-1B)(Boles et al.[1996])から得、Pichia stipitisの相当遺伝子の染色体組込みよりキシロースレダクターゼ(ＸＲ)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)を発現する。加えて、両株は、多複写プラスミド(ＹＥｐｌａｃ１９５＋ＸＫ)より天然キシルロキナーゼ(ＸＫ)を過剰発現する。Ｈ１８０３株は、S.cerevisiaeのＮＡＤ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ＮＡＤ-ＧＤＨ)を発現する追加プラスミド(ＹＥｐｌａｃ１８１＋ＧＤＨ２)を含むものであり、他方、Ｈ１８０５株は、クローニングベクター(ＹＥｐｌａｃ１８１)のみを含み、対照株とする。増殖培地からウラシル(ＵＲＡ)を省くことにより、ＹＥｐｌａｃ１９５ベクターのプラスミド分離が最小となり、ロイシン(ＬＥＵ)を省くことにより、ＹＥｐｌａｃ１８１のプラスミド分離が最小となり得る。
Ｈ１８０３およびＨ１８０５株の種培養は、２-３週間ごとに新しくするプレート上で繰り返し維持した。前接種は、ウラシルおよびロイシン(ＳＣ-ＵＲＡ-ＬＥＵ)を含まないが20ｇ/ｌグルコースを含む修飾合成完全培地(Sherman et al.[1983])50mlを含む250mlのエーレンメイアーフラスコに単一コロニーを移すことにより行った。各株用に３つの同様のフラスコを準備した。細胞を１５０ｒｐｍ、３０℃、ロータリーシェーカーで一夜増殖させ、次いで各フラスコの内容物を、ＳＣ-ＵＲＡ-ＬＥＵ＋５０ｇ／ｌ グルコース ５００ｍｌを含む３リットルの調節フラスコの中に全て移し、グルコースがなくなるまで１５０ｒｐｍ、３０℃で好気的に増殖させた(ＯＤ600：２０−２５)。
上記培養(６フラスコ)の細胞を４，５００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心分離により回収し、０.１ＭＰＯ42-緩衝液(ｐＨ＝５.５)で洗浄し、同じ緩衝液でそれぞれ最終体積３０ｍｌに再懸濁し、その後発酵槽に移した。発酵培地はＳＣ-ＵＲＡ-ＬＥＵ＋１０％キシロースを含む。発酵槽の温度を３０℃に維持し、ｐＨは２Ｍ ＮａＯＨの添加により５.５に調整し、攪拌を３００ｒｐｍに維持した。培養は、発酵槽の上部空間を０.２ｖｖｍの定常流速の窒素で一気に満たすことにより嫌気条件下で行った。発生気体を、オンライン分析のためにマルチ-ポートバルブを通じてBalzers quadrupole mass spectrometer(Sweden)に連結した。増殖、基質消費および細胞外産物の形成を測定するために、一定の間隔をおいて、液体試料を発酵槽から回収した。選択した試料の場合、ＮＡＤＰ-およびＮＡＤ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性もまた、標準的な酵素学的技術により測定した。増殖は、６００ｎｍの吸収と、濾過して、定常重量まで乾燥した乾燥細胞重量(ＤＣＷ)との両方を測定することによりモニターした。発酵槽ブロス中に存在するキシロース、エタノール、キシリトール、グリセロールおよび酢酸は、ＨＰＸ-８７Ｈカラム(５５℃)を用い、溶出液として５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4(０.６ｍｌ／ｍｉｎ)で分離し、屈折率(ＲＩ)検出で定量した。エタノール、グリセロール、キシリトールおよび酢酸の量は、自動化アナライザーで補助する適当な酵素学的検定により個別に検査した(Ｃｏｂａｓ-Ｍｉｒａ)。
培養当初３０時間のＨ１８０３およびＨ１８０５株の増殖およびキシロース消費を図３に要約する。両株は同じような速度で効率よくキシロースを消費できるが、ＮＡＤ-ＧＤＨ過剰発現株(Ｈ１８０３)はバイオマスの蓄積が約６％少ない(７.１３対６.７２ｇ／ｌ)。２つの株の最も顕著な違いはエタノール生産である。図４に示すように、３０時間の終わりまでに、ＧＤＨ２株はｇ ＤＣＷあたり約１.０２ｇのエタノールを蓄積し、一方、対照株は０.７３ｇである。これは、ＧＤＨ２株において約４０％の追加のエタノール生産が促進されたことを示す(０.５８対０.８３ｍｍｏｌ／ｇ ｃｅｌｌ ｈ)。容積測定の生産性もＧＤＨ２株では約３０％高い(３.９４対５.２０ｍｍｏｌ／ｌ ｈ)。キシロースに対するエタノールの収率は、対照およびＧＤＨ２株それぞれについて０.２１および０.２９(ｍｏｌ／ｍｏｌ)である。意外にも、図４に示すように、キシリトール生産もＧＤＨ２株において約２５％上昇した。
また他に、２つの組換え株の間での異常な相違を図５に示す。この二酸化炭素データは、流出ガスのマススペクトロメーター測定より得ている。図５に示すように、ＧＤＨ２の過剰発現は二酸化炭素の発生を有意に低下する。０から３０時間の総ＣＯ2生産値は、対照株およびＧＤＨ２株それぞれについて１００.４および８０.７ｍｍｏｌ／ｌであり、即ち、ＧＤＨ２株は、二酸化炭素生産についての炭素源消費が約２０％少ない。
ＮＡＤＰ-ＧＤＨおよびＮＡＤ-ＧＤＨ用の酵素学的検定を選択試料について行った。その２組の結果を図６に示す。検定混合物は、ｐＨ＝７.０の１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２００μＭ ＮＡＤＰＨ(ＮＡＤＰ-ＧＤＨ検定)または２００μＭ ＮＡＤＨ(ＮＡＤ-ＧＤＨ検定)の何れか、および最終濃度約０.５ｍｇ／ｍｌの細胞粗抽出液を含む。反応を２０ｍＭ α-ケトグルタル酸＋４０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌの添加により開始し、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ消費を３４０ｎｍで分光光度計によりモニターした。両株は、予測されるような顕著なＮＡＤＰ-ＧＤＨ活性を有するが、Ｈ１８０３は、この酵素に対し驚くべき高い特異的活性を有するようである(約４０％程度)。一方、ＮＡＤ-ＧＤＨ活性は、検定検出限界で対照株に基本的に近似するが、Ｈ１８０３はＮＡＤ酵素に対し明らかに高い特異的活性を有する。
これらの結果からして、ＮＡＤ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現する組換え体Ｈ１８０３株は、エタノール(およびキシリトール)生産の能力、即ち、炭素基質に対する高特異的生産性および高産物収率の両方を有意に促進する。また、組換え体は、(望ましくない)細胞マスの生産が有意に少なく、(望ましくない)二酸化炭素の生産も実質的に少量である。このことによって望ましい産物の収率が増大するばかりでなく、破棄物処理および汚染に対する負担もまた軽減する。
実施例９．グルコースからのエタノール生産
エタノールへのグルコース発酵は、Ｈ１７９３およびＨ１７９１と名付けられた遺伝子操作Saccharomyces cerevisiae株(両者はS.cerevisiae CEN.PK2(VW-1B)(Boles et al.[1996])より得られた株)より、１.８リットル Ｃｈｅｍａｐ ＣＭＦ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で行った。Ｈ１７９１株は、S.cerevisiae由来のＮＡＤ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ＮＡＤ-ＧＤＨ)を発現するプラスミド(ＹＥｐｌａｃ１８１＋ＧＤＨ２)で形質転換したものであり、他方、Ｈ１７９３株は、クローニングベクター(ＹＥｐｌａｃ１８１)のみを含み、対照株とする。プラスミド分離は、増殖培地からロイシン(ＬＥＵ)を省くことにより最小にし得る。接種は、ロイシン(ＳＣ-ＬＥＵ)を含まないが20ｇ/ｌグルコースを含む５０ｍｌ修飾合成完全培地を入れた２５０ｍｌ エーレンメイアーフラスコへ単一コロニーを移すことにより調製した。細胞を１５０ｒｐｍおよび３０℃のロータリーシェーカーで一夜増殖した(ＯＤ600：１０−１５)。上記培養の細胞を４，５００ｒｐｍおよび４℃の１０分間の遠心分離により回収し、０.１Ｍ ＰＯ42-緩衝液(ｐＨ＝５.５)で洗浄し、同じ緩衝液で懸濁し最終体積２５ｍＬとした後に発酵槽へ移した。発酵培地は、酵母-窒素源-ベース(アミノ酸およびアンモニアを含まず)３.４ｇ、ウラシル０.０４４ｇ；トリプトファン０.１６４ｇ、ヒスチジン０.１１６ｇ、ＫＮＯ3５.０５５ｇ、グルコース４０ｇ(リッターあたり)を含む。発酵槽の温度を３０℃に維持し、ｐＨを２Ｍ ＮａＯＨの添加により調整し、振とうを常に３００ｒｐｍで行った。培養は、発酵槽の上部空間を０.２ｖｖｍの定常流速の窒素で一気に満たすことにより嫌気条件下で行った。発生気体をオンライン分析のためにマルチ-ポートバルブを通じてBalzers quadrupole mass spectrometer(Sweden)に連結した。増殖、基質消費および細胞外産物の形成を測定するために、一定の間隔で液体試料を発酵槽から回収した。バイオマス、グルコース、エタノール、グリセロールおよび酢酸は上記実施例の通りに測定した。
表１は、これら２つの発酵の最初の発酵データを要約したものである。ＮＡＤ-ＧＤＨ過剰発現株(Ｈ１７９１)は、２１時間で、平均約１２%未満のバイオマス(０.５２対０.４６ｇ/ｌ)を蓄積する。特異的グルコース消費率は２つの株で類似している(５％以内)。しかしながら、ＧＤＨ２株は、容積測定(１１％)および特異的(２５％)なエタノール生産率が高い。また他に、２つの組換え株の間での異常な相違を図７に示す。この二酸化炭素データは流出ガスのマススペクトロメーター測定より得ている。図７に示すように、ＮＡＤ-ＧＤＨの過剰発現は二酸化炭素の発生を有意に低下する。０から２１時間の総ＣＯ2生産値は、対照株およびＧＤＨ２株それぞれについて９３.７および７０.６ｍｍｏｌ／ｌであり、即ち、ＧＤＨ２株は、二酸化炭素生産についての炭素源消費が約２５％低い。ＧＤＨ２株において特定ＣＯ2生産率も約１５％低い。他に、グルコースに対するエタノール収率(ｍｏｌ／ｍｏｌ)を調べると、ＧＤＨ２株では対照株よりも約１９％高い。
これらの結果からして、ＮＡＤ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ＮＡＤ-ＧＤＨ)を過剰発現する組換え体Ｈ１７９１株は、グルコースからのエタノール生産の能力、即ち、炭素基質に対する特異的生産性および高産物収率の両方を有意に促進する。また、組換え体は、(望ましくない)細胞マスの生産が有意に少なく、(望ましくない)二酸化炭素の生産も少量である。このことによって望ましい産物の収率が増大するばかりでなく、破棄物処理および汚染に対する負担もまた軽減する。
表１．ＮＡＤ-ＧＤＨ(Ｈ１７９１)を過剰発現するSaccharomyces cerevisiae組換え株および対照株(Ｈ１７９３)によるグルコース発酵：増殖、グルコース消費、エタノール生産および二酸化炭素発生についての比較。最後２つの列は、容積測定(Ｊv，ｍｍｏｌ／ｌ ｈ)または特異的(Ｊs，ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)期間で表わした計算平均流出を示す。グルコースおよびエタノール濃度は４回の測定の平均値を示す：ＨＰＬＣで２回および酵素学的検定で２回。
0004573365.tif 000006
実施例１０．Saccharomyces cerevisiae由来のリンゴ酸酵素相同体をコードするオープンリーディングフレームＹＫＬ０２９Ｃの他のクローニングストラテジー
制限酵素ＢｇｌIIを酵母発現ベクターｐＭＡ９１のＰＧＫ１プロモーターとターミネーターとの間へのリンゴ酸酵素相同体のクローニングに用いるときは、リンゴ酸酵素コーディング領域の＋２２７ｂｐに内部ＢｇｌII部位が存在するため、部分的酵素消化を行わねばならない。他のクローニングストラテジーは以下の通りであった：ＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄIII制限酵素で消化し、平滑末端をつくるためにクレノウ酵素で処理した。発現ベクターｐＭＡ９１(Mellor et al.[1983])をＨｉｎｄIII制限酵素で消化し、ＰＧＫ１プロモーターおよびターミネーターを含む１.８ｋｂｐフラグメントをアガロースゲルから単離した。プロモーター-ターミネーターカセットを、マルチクローニング部位のＨｉｎｄIIIで直鎖状としたＹＥｐｌａｃ１９５ベクター(Gietz and Sugino[1988])に結合した。発現ベクター内のプロモーター-ターミネーターの向きはＨｉｎｄIII-ＰＧＫ１プロモーター-ＰＧＫ１ターミネーター-ＥｃｏＲＩである。この発現ベクターをＢｇｌIIで消化しクレノウ酵素で処理し、ＰＧＫ１のプロモーターとターミネーター間のリンゴ酸酵素相同体のクローニングのために平滑末端を得た。
ＰＣＲによりクローニングされたＯＲＦ ＹＫＬ０２９Ｃを完全に配列決定した。ＰＣＲ増幅の間に作られ、酵素中の２アミノ酸が変わった２点突然変異が見られた；ロイシン３４１がバリンに、グルタミン酸６２０がロイシンに変化した。これらの点突然変異は、リンゴ酸酵素の保存されたアミノ酸の領域内(Viljoen et al.[1994])にあったわけでもなく、天然酵素と比較して変異によりＰＣＲ増幅酵素の見かけのＫm値が有意に変化したわけでもないので(Ｈ１３４６株から天然酵素の活性を測定した；表２およびFuck et al.[1973]参照)、中立であると考えられた。本発明は、この遺伝子変異体、リンゴ酸酵素をコードする天然遺伝子または他の作用のない変異体で実施し得る。
表２．S.cerevisiae由来の、天然およびＰＣＲ増幅のリンゴ酸酵素の、リンゴ酸、ＮＡＤ+およびＮＡＤＰ+の見かけのＫm値
0004573365.tif 000007
ＹＥｐｌａｃ１９５対照ベクター、およびＰＧＫ１プロモーターおよびターミネーターと共にS.cerevisiaeのリンゴ酸酵素相同体を有する同じベクターを酵母株ＣＥＮ.ＰＫ２(ＶＷ−１Ｂ，Ｈ１３４６)に形質転換し、それぞれ株Ｈ２１８９(ＶＴＴ Ｃ-９９３１６)およびＨ２１９３(ＶＴＴ Ｃ-９９３１７)を得た。
実施例１１．組込み株Ｈ１４６９へのキシルロキナーゼ遺伝子(ＹＧＲ１９４Ｃ)の組込み
キシルロキナーゼ遺伝子の組込み用のカセットを、選択用に、ＨＩＳ３フランキング領域およびカナマイシン耐性遺伝子ＫＭＸ２と共に構成した。
酵母シャトルベクターｐＲＳ４２３(Christianson et al.[1992])をＤｒａＩで消化し、イミダゾールグリセロール-ＰヒドラターゼをコードするＨＩＳ３遺伝子(Fink[1964])を含む１.５ｋｂｐフラグメントを得た。フラグメントをアガロースゲルから単離し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、Bluescript SK細菌性クローニングベクター(Stratagene)のＥｃｏＲＶ部位に結合した。
ｐＦＡ６-ｋａｎＭＸ２プラスミド(Wach et al.[1994])をＰｖｕIIおよびＳｐｅＩで消化し、１.４ｋｂｐカナマイシン耐性モジュールを単離した。ＫＭＸ２フラグメントをアガロースゲルから単離し、クレノウ酵素で平滑末端にした。ＨＩＳ３ ＤｒｄＩフラグメントを有するBluescript SKをＨＩＳ３遺伝子内のＮｈｅＩおよびＢｃｌＩで消化し(そのコーディング領域から５０ｂｐを除去する)、クレノウ酵素で平滑末端にし、エビアルカリホスファターゼで処理し、その後、単離したＫＭＸ２フラグメントで結合した。
ＹＥｐｌａｃ１９５(実施例２参照)中の、修飾されたＡＤＨ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターの下のキシルロキナーゼ遺伝子を、ＢａｍＨＩ消化後にアガロースゲルから単離した。ＫＭＸ２モジュールと共にＨＩＳ３ ＤｒｄＩフラグメントを有するBluescript SKをＨＩＳ３遺伝子内のＢｇｌII(コーディング領域から６０ｂｐを取り除く２つの近接ＢｇｌII部位)で消化し、エビアルカリホスファターゼで処理し、その後、ＡＤＨ１プロモーターおよびターミネーターを伴う単離キシルロキナーゼフラグメントと結合した。
このように構成された最終的組込みカセットは、９００ｂｐのＨＩＳ３配列、キシルロキナーゼ遺伝子(ＡＤＨ１ターミネーター、ＸＫ遺伝子、修飾ＡＤＨ１プロモーター)５０ｂｐ ＨＩＳ３コーディング領域、ＫＭＸ２カセット(プロモーター、遺伝子、ターミネーター)および５５０ｂｐのＨＩＳ３配列を含む。この構成体をＢｓｔＢＩおよびＢｓｓＨＩ消化によりBluescript SKから分離し、標的組込みのために何れかの部位に約４００ｂｐのＨＩＳ３配列を残した。
アガロースゲルから単離した１μｇの組込みカセットを用い、Ｈ１４６９株に形質転換し、Ｈ２２１７(ＶＴＴ Ｃ-９９３１８)株を得た。組込み形質転換体のスクリーニングは２００μｇ/ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤプレート上で行った。ＨＩＳ３配座へのＸＫカセットの正確な組込みは、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および野生型と比較した際のキシルロース上の増殖の促進により確認した。
実施例１２．多複写発現ベクターにおけるリンゴ酸酵素をコードする遺伝子による組込み株Ｈ１４６９およびＨ２２１７の形質転換
ＰＧＫ１のプロモーターおよびターミネーターの下にリンゴ酸酵素をコードするＭＡＥ１遺伝子を有する上記プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５(実施例６または１０参照)、および対照プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５を、組込み株Ｈ１４６９およびＨ２２１７に形質転換した。プラスミドは、増殖培地からウラシルを省くことにより選択した。酵母形質転換体からのプラスミドは、対照および発現プラスミドを完全に組込んでいた。得られた株を以下のように名付けた；対照プラスミド含有のＨ１４６９をＨ２１９１(ＶＴＴ Ｃ-９９３１９)、リンゴ酸酵素プラスミド含有のＨ１４６９をＨ２１９５(ＶＴＴ Ｃ-９９３２０)、対照プラスミド含有のＨ２２１７をＨ２２２１(ＶＶＴ Ｃ-９９３２１)およびリンゴ酸酵素プラスミド含有のＨ２２１７をＨ２２２２(ＶＴＴ Ｃ-９９３２２)。
実施例１３．リンゴ酸酵素の作用：グルコースからのエタノール生産
エタノールへのグルコース発酵は、Ｈ１３４６のように名付けられた遺伝子操作Saccharomyces cerevisiae株(S.cerevisiae CEN.PK2/VW-1b(Boles et al.[1996])より得られた株)により、１.８リットル Ｃｈｅｍａｐ ＣＭＦ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で行った。さらに具体的には、実施例で用いた２つの株は以下の通りである：(ｉ)Ｈ２１９３：S.cerevisiaeリンゴ酸酵素を発現するプラスミドで形質転換したＨ１３４６(ＭＡＥ１，ＯＲＦ ＹＫＬ０２９ｃ)、または(ｉｉ)Ｈ２１８９：クローニングベクター(ＹＥｐｌａｃ１９５)で形質転換したＨ１３４６であり、対照株とする。増殖培地からウラシル(ＵＲＡ)を省くことにより、プラスミド分離を最小限にする。
接種は、ウラシル(ＳＣ-ＵＲＡ)を含まないが20ｇ/ｌグルコースを入れた５０ｍｌ合成完全培地を含む２５０ｍｌ エーレンメイアーフラスコへ単一コロニーを移すことにより調製した。細胞を１５０ｒｐｍおよび３０℃のロータリーシェーカーで一夜増殖した(ＯＤ600：１０−１５)。上記培養の細胞を４，５００ｒｐｍおよび４℃の１０分間の遠心分離により回収し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ＝５.５)で洗浄し、同じ緩衝液で懸濁し最終容積２５ｍＬとした後に、発酵槽へ移した。発酵培地は、酵母-窒素源-ベース(アミノ酸を含まず)、アミノ酸補充、グルコース３０ｇ(リッターあたり)を含む。発酵槽の温度を３０℃に維持し、ｐＨを２Ｍ ＮａＯＨの添加により５.５に調整し、振とうを常に３００ｒｐｍで行った。培養は、０.１ｖｖｍの定常流速の窒素をブロスに分散することにより嫌気条件下で行った。増殖、基質消費および細胞外産物のの形成を測定するために、一定の間隔で、液体試料を発酵槽から回収した。バイオマス、グルコース、エタノール、グリセロールおよび酢酸は上記実施例の通りに測定した。
表３は、これら２つの発酵の発酵結果を要約したものである。ＭＡＥ１過剰発現株(Ｈ２１９３)は、バイオマス合成に約２０％未満の炭素を利用し(３.２７対２.６０Ｃ-ｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)、得られたバイオマス密度が対照と比較して有意に低かった(１.３３対２.２０ｇ／ｌ)。特異的グルコース消費率はＭＡＥ１株よりも約２０%高い。さらに重要なことに、ＭＡＥ１は、特異的エタノール生産率が約２５％高い(１８.８５対２３.６４Ｃ-ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)。高い特異的エタノール生産率は、利用し得る生物触媒の量により物理的に制約される方法、例えば細胞固定化発酵システムで有利となる。さらに、ＭＡＥ１過剰発現株におけるグルコースに対するエタノール収率は、対照と比べて約４％高い(０.４７８対０.４９９Ｃ-ｍｏｌ／Ｃ-ｍｏｌ)。
これらの結果からして、内在性リンゴ酸酵素(ＭＡＥ１)を過剰発現する組換え体S.cerevisiae株Ｈ２１９３が、炭素基質としてグルコースからのエタノール生産の能力を有意に促進する。また、組換え株は、(望ましくない)細胞マスの生産が有意に少ない。このことによって望ましい産物の収率が増大するばかりでなく、破棄物処理の負担もまた軽減する。
表３．Saccharomyces cerevisiaeのＭＡＥ１(Ｈ２１９３)を発現する組換え株および対照株(Ｈ２１８９)によるグルコース発酵：容積測定(Ｊv，Ｃ-ｍｍｏｌ／ｌ ｈ)または特異的(Ｊs，Ｃ-ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)期間(一定時間毎：３.３から２９時間)で表わした平均流出を示す。グルコースおよびエタノール濃度は４回の測定の平均値を示す：ＨＰＬＣで２回および酵素学的検定で２回。
0004573365.tif 000008
以前に記載された実験を以下の修飾を加えて行った：(１)バイオリアクター接種物の量を約０.１ｇ／ｌから約２ｇ／ｌに増やし、(２)多量の接種物(約２ｇ／ｌ)の使用に加えて、グルコース消費後(２４時間)に濃縮グルコース溶液を発酵槽に添加し、最終グルコース濃度を約４５ｇ／ｌとし、発酵をさらに２４時間行った(反復バッチ)。主な結果は以下の２つである：(１)リンゴ酸酵素の過剰発現によって、特異的エタノール生産率(＋９％)およびグルコース消費(＋２０％)が高くなり、グルコースのバイオマスへの転換(-１６％)が低下した、(２)リンゴ酸酵素の過剰発現によってフェーズＩおよびIIそれぞれについて、６および８％、特異的エタノール生産率を促進され、その一方、相当するグルコース取り込み率もこの２つのフェーズで１６および１７％高くなる。両株についての最初のバイオマス濃度２ｇ／ｌは、フェーズＩで、リンゴ酸酵素過剰産生株および対照株についてそれぞれ５.７３および６.３６ｇ／ｌに増加した(即ち、ＭＡＥ１について１０％未満)。フェーズIIに対応する値は、７.６６対８.１５ｇ／ｌである(即ち、ＭＡＥ１について６％未満)。
要約すると、これら三つの実験により、天然リンゴ酸酵素(ＭＡＥ１)過剰発現の組換え体S.cerevisiae Ｈ２１９３株が、炭素基質としてのグルコースからエタノールの生産能力を有意に促進することが分かる(特異的率は２５％まで増加し、収率は４％増加した)。また、組換え体は、(望ましくない)細胞マスの生産が有意に少ない。このことによって望ましい産物の収率が増大するばかりでなく、破棄物処理に対する負担もまた軽減する。
実施例１４．リンゴ酸酵素の作用：キシロースからのエタノール生産
エタノールへのキシロース発酵は、Ｈ１３４６のように名付けられた遺伝子操作Saccharomyces cerevisiae株(S.cerevisiae CEN.PK2/VW-1b(Boles et al.[1996])より得られた株)により、１.８リットル Ｃｈｅｍａｐ ＣＭＦ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で行った。さらに具体的には、この実施例で用いた４つの株は以下の通りである：(ｉ)Ｈ２１９５：キシロースレダクターゼ(ＸＲ)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)をコードする遺伝子の染色体組込みを有するＨ１３４６(Ｈ１４６９株)であり、S.cerevisiaeリンゴ酸酵素(ＭＡＥ１、ＯＲＦ ＹＫＬ０２９ｃ)を発現するプラスミドで形質転換した株、(ｉｉ)Ｈ２１９１：クローニングベクター(ＹＥｐｌａｃ１９５)で形質転換したＨ１４６９であり、Ｈ２１９５の対照株とする、(ｉｉｉ)Ｈ２２２２：キシロースレダクターゼ(ＸＲ)、キシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)およびキシルロキナーゼ(ＸＫ)をコードする遺伝子の染色体組込みを有するＨ１３４６(Ｈ２２１７株)であり、これはS.cerevisiaeリンゴ酸酵素(ＭＡＥ１、ＯＲＦ ＹＫＬ０２９ｃ)を発現するプラスミドで形質転換した株、(ｉｖ)Ｈ２２２１：クローニングベクター(ＹＥｐｌａｃ１９５)で形質転換したＨ２２１７であり、Ｈ２２２２の対照株とする。増殖培地からウラシル(ＵＲＡ)を省くことにより、プラスミド分離を最小にする。
接種は、ウラシル(ＳＣ-ＵＲＡ)を含まないが０.１Ｍリン酸および20ｇ/ｌグルコースを含む５０ｍｌ合成完全培地を入れた２５０ｍｌ エーレンメイアーフラスコへ単一コロニーを移すことにより調製した。細胞を１５０ｒｐｍおよび３０℃のロータリーシェーカーで一夜増殖し、次いで、５００ｍｌ ＳＣ-ＵＲＡ＋０.１Ｍ リン酸＋50g/lグルコースを含む２Ｌフラスコに全ブロスを移した。再び、培養を一夜、上記の通り増殖し、次いで、細胞を４，５００ｒｐｍおよび４℃の１０分間の遠心分離により回収した。次いで、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ＝５.５)で洗浄し、同じ緩衝液で再懸濁し最終体積１００ｍＬとし、その後、発酵槽へ移した。
発酵培地は、酵母-窒素源-ベース(アミノ酸を含まず)、アミノ酸補充、キシロース５０ｇ(リッターあたり)を含む。発酵槽の温度を３０℃に維持し、ｐＨを２Ｍ ＮａＯＨの添加により５.５に調整し、振とうを常に３００ｒｐｍで行った。培養は、０.１ｖｖｍの定常流速の窒素をブロスに分散することにより嫌気条件下で行った。増殖、基質消費および細胞外産物の形成を測定するために、一定の間隔で、液体試料を発酵槽から回収した。バイオマス、グルコース、エタノール、グリセロールおよび酢酸は上記実施例の通りに測定した。
ａ)Ｈ２１９５およびＨ２１９１を用いる嫌気性キシロース発酵
図８は、ＭＡＥ１過剰発現株(Ｈ２１９５)および対照株(Ｈ２１９１)についてのバイオマスおよび濁度に対する時間のプロファイルを示す。ＸＲおよびＸＤＨをコードする遺伝子を発現するSaccharomyces cerevisiaeはキシロースを利用し得るが、キシロースで嫌気的に増殖できないことに注意すべきである。図８に示したように、天然リンゴ酸酵素の過剰発現は、これらの条件下において細胞バイアビリティーに実に明確な効果を有する。Ｈ２１９５株は嫌気性条件下でさえキシロースで初期増殖を示し、その後、３２時間後のレベルにまでバイオマスは減少し、それは接種時に相当する。これに反して、対照のバイオマスは、この同じ期間に、初期値２.１１から１.４７ｇ／ｌに、単調に減少し、即ち、約３０％のバイオマス減少があった。
図９は、これら２つのバッチ発酵の全体の特異性代謝率(Ｃ-ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)を要約したものである。明らかに、細胞変性を防止するのに加えて、リンゴ酸酵素の過剰発現はまた、キシロース利用およびエタノールおよびキシリトールの両方の生産に明確な効果を与える。キシロースの利用は５５％以上促進され、エタノールおよびキシリトールの生産はそれぞれ約２０％および２５％増加する。
天然リンゴ酸酵素(ＭＡＥ１)を過剰発現する組換え体S.cerevisiae Ｈ２１９５株が、キシロース利用ならびにキシロースからのエタノールおよびキシリトール生産の能力を有意に促進することを、これらの結果は示す。また、組換え株は、長時間、そのバイアビリティーを維持し得る。
ｂ)Ｈ２２２２およびＨ２２２１株を用いる嫌気性キシロース発酵
この実験は、上記パート(ａ)の通りに行ったが、ただし、Ｈ２１９５およびＨ２１９１株に代えて、ＸＲおよびＸＤＨをコードする遺伝子に加え天然ＸＫをコードする遺伝子も染色体に組込まれているＨ２２２２およびＨ２２２１株を用いた。Ｈ２２２２株は天然リンゴ酸酵素を過剰発現する。
リンゴ酸酵素の過剰発現がキシロースからのエタノール生産に有意に促進する効果を与え、また、その効果が連続７日間維持されることが図１０から判る。
図１１中で示したように、特異的エタノール生産率の促進は対照と比較すると３０％近くになり、特異的キシロース利用は約５％上昇する。さらに、図１２に示したように、対照株は、この１４４時間を超える期間において、有意に高いバイオマス量を蓄積する(２.０３対１.４７ｇ／ｌ、即ち、約＋４０％)。この挙動は、上記パート(ａ)に記載のＨ２１９５およびＨ２１９１株を比べると異なるように思われる。この違いのもっともな原因が、キシロース利用で重要な役割をなし得るＸＫに関連している可能性がある(Ｈ２２２２およびＨ２２２１は天然ＸＫの染色体組込みを有することに注意)。しかしながら、パート(ｂ)で観察されたバイオマスの減少は、エタノールへのグルコース変換におけるＭＡＥ１の効果について実施例１３の観察された減少と一致する。加えて、キシロースに対するエタノールのモル収率は、リンゴ酸酵素を過剰発現する株で約２５％高かった：Ｃ-ｍｏｌエタノール０.１１４対Ｃ-ｍｏｌキシロース０.０９１。
要約すると、天然リンゴ酸酵素(ＭＡＥ１)を過剰発現する組換え体S.cerevisiae Ｈ２１９５およびＨ２２２２株は、ＸＫを有さない遺伝的バックグラウンドおよびＸＫを有する遺伝的バックグラウンドそれぞれにおいて、キシロース利用および炭素基質としてのキシロースからのエタノール生産(３０％まで)の能力を有意に促進することを、これらの実験は示す。加えて、Ｈ２２２２株では、(望ましくない)酢酸の生産が低下する(-３０％)。ＸＫを欠くバックグラウンドでは、本発明に従い形質転換した微生物(Ｈ２１９５)のみが、この方法条件下で生存し得る。他方、ＸＫを有するバックグラウンド(非形質転換微生物が生存できる)では、本発明に従い形質転換した微生物(Ｈ２２２２)は、(望ましくない)細胞マスの生産が有意に少なく(４０％まで)、それゆえ、望ましい産物の収率が増大するばかりでなく、破棄物処理に対する負担もまた軽減する。
実施例１５：Schizosaccharomyces pombeにおける、S.cerevisiae由来のリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の発現用の組込みベクターの構成
実施例１０のＰＧＫプロモーターおよびターミネーターを含むリンゴ酸酵素を有するＹＥｐｌａｃ１９５ベクターをＨｉｎｄIIIで消化し、３.７ｋｂｐフラグメントをアガロースゲルから単離した。このフラグメントをクレノウ酵素で処理して平滑末端とした。次いで、このフラグメントをベクターｐＪＫ２１０(ＡＴＣＣ８６９５７)のＳｍａＩ部位に結合した。ベクターをＵＲＡ４遺伝子の相同組換えによる組込みのためにＡｖｒIIで消化した。
実施例１６：Schizosaccharomyces pombeにおける、P.stipitisのキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現用の多複写ベクターの構成
ＰＧＫプロモーターおよびターミネーターの下にキシロースレダクターゼ遺伝子を含み、修飾ＡＤＨ１プロモーターおよびターミネーターの下にキシリトールデハイドロゲナーゼ遺伝子を含む、実施例１由来のＳａｃＩおよびＮｓｉＩフラグメントをアガロースゲルから単離した。次いで、それを、ＬＥＵ２遺伝子を含み、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩで消化することにより直鎖状としたベクターｐＳＰ１(ＡＴＣＣ７７４９７)に結合した。
実施例１７：Schizosaccharomyces pombeの形質転換
実施例１５の直鎖状ベクターを、エレクトロポレーション(http://www.bio.uva.nl/pombe/handbook)によりS.pombe株ＡＴＣＣ２０１４００に形質転換した。対照株は、空のベクターｐＪＫ２１０を組込むことにより同様の方法で作成した。形質転換体をＵＲＡ栄養要求性で選択した。実施例１６の多複写ベクターを同じ方法で形質転換した。形質転換体は補助的なＬＥＵ栄養要求性で選択した。得られた株を、Ｈ２３６９(ＶＴＴ Ｃ-９９３２３)およびリンゴ酸酵素活性のない対照株Ｈ２３７０(ＶＴＴ Ｃ-９９３２４)と呼ぶ。
実施例１８．リンゴ酸酵素の効果：Schizosaccharomyces pombeを用いたキシロースからのエタノール生産
エタノールへのキシロース発酵は、遺伝子操作Schizosaccharomyces pombe株(S.pombe Ｈ２１５３株(ＡＴＣＣ２０１４００)より得られた株)により、１.８リットル Ｃｈｅｍａｐ ＣＭＦ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ(Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中で行った。さらに具体的には、この実施例で用いた２つの株は以下の通りである：(ｉ)Ｈ２３６９：S.cerevisiaeのリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の染色体組込みを有する株Ｈ２１５３であり、Pichia stipitisのキシロースレダクターゼ(ＸＲ)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)をコードする遺伝子を発現する多複写プラスミドで形質転換した株、(ｉｉ)Ｈ２３７０：クローニングベクターｐＪＫ２１０の染色体組込みを有する株Ｈ２１５３であり、Pichia stipitisのキシロースレダクターゼ(ＸＲ)およびキシリトールデヒドロゲナーゼ(ＸＤＨ)をコードする遺伝子を発現する多複写プラスミドで形質転換した株である。増殖培地からウラシル(ＵＲＡ)およびロイシン(ＬＥＵ)を省くことによりプラスミド分離を最小にする。
接種は、２２５ｍｇ／ｌのアデニン、ヒスチジンおよびリシン塩酸塩(ＥＭＭ２＋ＡＤＥ＋ＨＩＳ＋ＬＹＳ)および20ｇ/ｌのグルコースを含むEdinburgh Minimal Medium(http://WWW.bio.uva.nl/pombe/handbook/section1/section1-8.html)２０ｍｌを入れた２５０ｍｌ エーレンメイアーフラスコへ単一コロニーを移すことにより調製した。細胞は、２００ｒｐｍおよび３０℃で５０時間増殖させ、次いで、同じ培地５０ｍｌを入れた他の２５０ｍｌ エーレンメイアーフラスコに全ブロスを移した。細胞を２００ｒｐｍおよび３０℃で２４時間増殖させ、次いで、ＥＭＭ２＋ＡＤＥ＋ＨＩＳ＋ＬＹＳ＋５０ｇ／ｌグルコース ７００ｍｌを入れた２Ｌ フラスコに全ブロスを移した。培養は上記の通りに４０時間増殖させ、次いで、細胞を４，０００ｒｐｍおよび４℃の１０分間の遠心分離により回収した。次いで、細胞を０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ＝５.５)で洗浄し、同じ緩衝液で再懸濁し最終体積１００ｍｌとし、両株のＯＤ６００を緩衝液で同じ値に調整し、その後発酵槽へ移した。発酵培地は、ＥＭＭ２＋ＡＤＥ(２２５ｍｇ／Ｌ)＋ＨＩＳ(４５０ｍｇ／Ｌ)十ＬＹＳ(４５０ｍｇ／Ｌ)＋５０ｇ／Ｌキシロースを含む。
発酵槽の温度を３０℃に維持し、ｐＨを１Ｍ ＫＯＨの添加により５.５に調整し、振とうを常に３００ｒｐｍで行った。培養は、窒素と空気の混合物(７：１)を０.５ＳＬＰＭの定常流速でブロスに分散することにより微好気条件下で行い、吸入口の酸素の割合は２.５％となった。増殖、基質消費および細胞外産物の形成を測定するために、一定の間隔をおいて、液体試料を発酵槽から回収した。バイオマスをＯＤ600で測定し、試料の乾燥重量を測定した。キシロース、エタノール、グリセロールおよび酢酸をＨＰＬＣで測定した。エタノールもまたＣｏｂａｓ-Ｍｉｒａを伴う酵素学的検定により測定した。
図１３は、Ｈ２３６９株および対照株Ｈ２３７０についてのバイオマスおよび濁度に対する時間プロファイルを示す。図１３に示したように、リンゴ酸酵素の発現は、これらの条件下において細胞バイアビリティーに実に明確な効果を与える。バイオマスの減少は、Ｈ２３６９では２.６から１.９ｇ／ｌであり、対照Ｈ２３７０株では２.４３から１.２ｇ／ｌである。同様のバイオマスレベルで開始すると、対照では５０％以上が減少し、本発明の形質転換株は３０％以上減少した。このことは次のことを開示する今一つの実例である。すなわち対照株が生存してバイオマスおよび代謝能力を保持する活力が低下する条件下、本発明の形質転換株はバイオマスおよび代謝能力を保持する活力を改善する。発酵の間のバイオマスの対数平均は、Ｈ２３６９では２.２３ｇ／ｌであり、Ｈ２３７０では１.７４ｇ／ｌである。
図１４は、Ｈ２３６９株および対照Ｈ２３７０株の容積測定エタノール生産率を示す。図１４に示したように、Ｈ２３６９の容積測定エタノール生産は、対照株Ｈ２３７０と比べて有意に高い(＋６２％)。特異的エタノール生産率は、２６％高い(０.３８６対０.３０５ Ｃ-ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ)。明らかに、細胞変性を防止するのに加えて、リンゴ酸酵素の過剰発現はまた、エタノール生産に陽性の効果を与える。容積測定キシロースの利用は４７％促進される(９.７ｇ／ｌ対６.６ｇ／ｌ)。特異的率も促進され(約１５％；１.４５対１.２６ Ｃ-ｍｍｏｌ／ｇ-ｃｅｌｌ ｈ、この明細書では結果を示さず)、形質転換株により維持される余分なバイオマスの代謝能力が対照株よりも優れていることを示す。
これらの結果によると、S.cerevisiaeリンゴ酸酵素を発現する組換え体S.pombeＨ２３６９株が、キシロース利用およびキシロースからのエタノール生産の能力を有意に促進することが分かる。また、組換え株は、長時間でバイアビリティーを維持し得る。加えて、Ｈ２３６９株は(望ましくない)酢酸の生産が低い(-４３％)。これらの結果は、天然リンゴ酸酵素を過剰発現するS.cerevisiaeによる発酵に類似する。S.cerevisiaeでキシロース利用は５５％促進され、エタノール生産は２０％促進された。
実施例１９：Peptostreptococcus asaccharolyticus由来のＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
Peptostreptococcus asaccharolyticus(ＡＴＣＣ １４９６３)を嫌気的に増殖させ、ゲノムＤＮＡを単離した。次いで、ＮＡＤ結合グルタミン酸デハイドロゲナーゼをコードする遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド：５’-ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＧＡＣ Ｃ-３’および５’-ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＴＡＣ ＴＣＣ-３’を用い、ＰＣＲにより、Snedcor et al(1991)に記載の順序に従いクローニングした。ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＥＸＴポリメラーゼ(Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ)を用い、生じた２.４ｋｂｐ ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)に結合し、製品説明書に従いＴＯＰ１０Ｆ’E.coli細胞に形質転換した。
実施例２０：Peptostreptococcus asaccharolyticus由来のＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むE.coli-Corynebacterium glutamicumシャトルベクターの構成
プラスミドｐＡＪ６５５、E.coli-Corynebacterium glutamicumシャトルベクターをCorynebacterium glutamicum株ＡＴＣＣ３９１３５から単離し、ＢａｍＨＩで消化した。ベクターをアガロースゲルで精製し、エビアルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。
実施例１９のPeptostreptococcus asaccharolyticus由来のＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有するｐＣＲ２.１ＴＯＰＯベクターをＢａｍＨＩで消化し、２.４ｋｂｐフラグメントをアガロースゲルから単離した。次いで、２.４ｋｂｐフラグメントを直鎖状のシャトルベクターに結合し、E.coli DH5α細胞に形質転換した。
実施例２１：Corynebacterium glutamicum株へのシャトルベクターの形質転換
Corynebacterium glutamicum ＡＴＣＣ２１７９９(Ｅ-９９１１９３)およびＡＴＣＣ２１２５３(Ｅ-９９１１９２)株を、エレクトロポレーション(Follettie[1989])によって実施例２０で得られたシャトルベクターで形質転換した。これらの株はリシンの過剰生産を発揮するため選択した。
プラスミドを形質転換株から回収し、ＢａｍＨＩで消化し、そして消化産物を図１５で示したようにアガロースゲルで分離した。１枠はＡＴＣＣ２１２５３の形質転換体由来の消化ベクターであり、３枠はＶＴＴ Ｅ-９９２１０３と呼ばれるＡＴＣＣ２１７９９の形質転換体由来の消化ベクターである。図は１０ｋｂｐベクターおよび２.４ｋｂｐ挿入部を示す。形質転換体ＡＴＣＣ２１７９９の２番目の単離体をＶＴＴ Ｅ-９９２１０４と名付け、この単離体から回収したプラスミドを図１５のＶＴＴ Ｅ-９９２１０３で示したのと同じ方法で取り扱った。
実施例２２：Corynebacterium glutamicumの細胞粗抽出物中のＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼの測定
Corynebacterium glutamicumの細胞粗抽出物は、１.５ｍｌ Eppendorfチューブ中で４℃で２０分間、細胞の湿重量５００ｍｇ、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.０ ５００μｌおよびガラスビーズ５００μｌをボルテックスすることにより調製した。チューブを卓上の遠心分離機で４℃、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。活性検定用の緩衝液は、１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.０、２０ｍＭ 塩化アンモニウムおよび２００μＭ ＮＡＤＨを含む。反応をα-ケトグルタル酸の添加により開始し、最終濃度２ｍＭとした。活性を３４０ｎｍのＮＡＤＨ吸収の変化から算出した。酵素活性は３０℃で行った。抽出したタンパク質量は、基準としてＩｇＧを用いるＢｉｏ Ｒａｄタンパク質検定で測定した。０.１-０.２ｎｋａｔ／ｍｇ間の酵素活性がＡＴＣＣ２１２５３株の形質転換体に見られ、０.１-０.２ｎｋａｔ／ｍｇ間の酵素活性がＶＴＴ Ｅ-９９１２０３およびＶＴＴ Ｅ-９９１２０４と呼ばれるＡＴＣＣ２１７９９株の形質転換体に見られた。
実施例２３：形質転換したCorynebacterium glutamicumによるリシン生産
振とうフラスコ内の発酵：ＶＴＴ Ｅ-９９１２０３およびＶＴＴ Ｅ-９９１２０４株を、Kiss(1991)に述べられているように振とうフラスコ発酵で分析した。ただし、使用した抗生物質はカナマイシンの代わりに１０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールであった。対照として、親株ＡＴＣＣ２１７９９を抗生物質のない状態で増殖した。１ｍｌの前培養をし、ＬＢにおいて増殖し、５０ｍｌ ＣＧＭ１培地に希釈し(Kiss[1991])、そして２５０ｒｐｍのシェーカーで２５０ｍｌ 調節エーレンメイアーフラスコ中で３０℃で増殖させた。上清のアミノ酸をＨＰＬＣで分析し、グルコースを酵素検定で分析した。結果を表４に示す。
表４．Corynebacterium glutamicumの対照株(ＡＴＣＣ２１７９９)および本発明による２つの形質転換体によるリシン生産
0004573365.tif 000009
２つの形質転換株ＶＴＴ Ｅ-９９１２０３およびＶＴＴ Ｅ-９９１２０４は、対照よりもゆっくりと増殖したが、(対照とは異なり)形質転換株がシャトルベクターを含み、クロラムフェニコールの存在下で培養されたからである。リシン生産を測定すると、形質転換体はまだ発酵のフェーズＩであり、即ち、トレオニンがまだ存在し、その一方、対照は定常フェーズかまたはそれに近い状態であり、殆ど全てのトレオニンを消費した。コリネバクテリア(Corynebacteria)では、Ｌ-リシンの過剰生産はトレオニンが使用された後にフェーズIIのみで始まる(Vallino[1991])。しがしながら、形質転換体は、フェーズＩで既にリシンを顕著に生産しており、バイオマスｇあたりに生じるリシンの量は、通常のリシン過剰生産段階(フェーズII)において対照が生産する場合より、わずかに１６％および１２％少ないに過ぎなかった。さらに、使用グルコースに対する形質転換体のリシン収率は、形質転換体がフェーズＩを通して増殖するにつれて、顕著な増加があった(４９％のトレオニンが消費されるときの０.１０５ｇ／ｇから６３％のトレオニンが消費されるときの０.１５ｇ／ｇまで)。通常のリシン過剰生産株Corynebacterium glutamicumの場合、使用グルコースに対するリシン収率は、発酵のこの段階では０に近いと予測される(Vallino[1991])。形質転換体がフェーズＩから通常のリシン過剰発現段階へ移行すると(増殖が完了し、グルコースがもはやバイオマス生産に転換しない)、リシン生産率および収率が対照の場合を超えることは明らかである。当業者に明白なように、形質転換体の遅い増殖を加速することは、ＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を形質転換体のゲノムに組込むことによってプラスミドを保持するという不利な条件を避け、増殖培地中におけるクロラムフェニコールの必要性を除くことで達成される。
本発明のＮＡＤ結合グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するCorynebacterium glutamicumリシン過剰発現株の形質転換が、少なくとも初期増殖段階における形質転換体によるリシン生産を促進することを、この実施例は開示している。グルコースにに対するリシン収率の実質的な上昇は、形質転換体の発酵フェーズIIまで継続するときに得られると考えられる。
実施例２４．S.cerevisiaeのＮＡＤ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子またはリンゴ酸酵素をコードする遺伝子と、ポリヒドロキシブチレート(ＰＨＢ)レダクターゼおよびＰＨＢシンターゼをコードするAlcaligenes eutrophus由来遺伝子との共発現
プラスミドｐＲＳ３０３(Sikorski and Hieter[1989])をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、０.７％アガロースゲルから単離した。ＳａｃＩ／ＸｂａＩカセット上の４.８ｋｂｐ ＧＤＨ２フラグメント(自身のプロモーターを有する遺伝子を含む)(Boles et al.[1993])をｐＲＳ３０３ベクターに結合し、プラスミドｐＧＤＨ２-３０３を作成した。２ミクロンの複製起点をＥｃｏＲＩでプラスミドｐＬＧＳＤ５(Guarente et al.[1982])から切断し、末端をクレノウ・ラージ・フラグメント・ポリメラーゼで平滑化した。プラスミドｐＲＳ３０３をＸｈｏＩで消化し、末端をクレノウ・ラージ・フラグメント・ポリメラーゼで平滑化した。次いで、複製起点をｐＲＳ３０３に結合し、プラスミドｐＴＬ９２を作成した。
プラスミドｐＧＤＨ２-３０３をＳｍａＩで消化し、ＧＤＨ２フラグメント(４.８ｋｂｐ)およびバックボーンベクター(４.５ｋｂｐ)の両方を含む４.８ｋｂｐの２重バンドをアガロースゲルから単離した。次いで、回収したフラグメントをＫｐｎＩで消化した。消化によりバックボーンベクター(ｐＲＳ３０３)を切断し、２つのフラグメントとする。このことで、ＧＤＨ２フラグメントを含む４.８ｋｂｐバンドの単離が可能となる。プラスミドｐＴＬ９２をＳｍａＩで直鎖状とし、アガロースゲルから単離した。直鎖状のベクターをＣＩＡＰ(ウシ腸管アルカリホスファターゼ)で３７℃、１時間で脱リン酸化し、次いでアガロースゲルで精製した。平滑末端のＧＤＨ２フラグメントおよび平滑末端のベクターｐＴＬ９２を結合し、ｐ２-ＧＤＨ２を作成した。
プラスミドｐ２-ＧＤＨ２は、S.cerevisiae株Ｄ６０３(MATα/MATα,ura3-52,lys2-801,met,his3,ade2-101,reg1-501;Srienc et al.[1986])に形質転換できる二方向性で誘導性のガラクトースプロモーター(Carlson[1999])を有する多複写プラスミドｐ２ＤＰＴによって、ＰＨＢレダクターゼおよびＰＨＢシンターゼをコードするAlcaligenes eutrophus由来の異種性遺伝子を発現する。適当な制御を伴う振とうフラスコおよびバイオリアクター培養は、それぞれ１０ｇ／ｌのグルコースおよびガラクトースを含む強化ＳＤ培地(DaSilva[1988])中で行うことが出来る。対照細胞および本発明に従い形質転換した細胞のＰＨＢ内容物の測定は、プロパノール分解(propanolysis)した乾燥細胞物質のジクロロエタン抽出物のＧＣ分析により行う(Riis and Mai[1988],Leaf et a1.[1996])。糖の消費およびガス交換を標準的な方法で測定する。この方法で、グルコースに対するＰＨＢの収率の増加、生産性の向上、ＣＯ2生産の減少および酸素要求の減少のような、本発明から予測される利点を明らかに出来る。
ＰＧＫ１のプロモーターとターミネーターの間にＭＡＥ１遺伝子を有する３.８ｋｂｐフラグメント(実施例１０参照)をクローニングし、ＧＤＨ２遺伝子に用いたものと同様のストラテジーで酵母Ｄ６０３中で発現できる。
同様のストラテジーを用い、本発明のデヒドロゲナーゼ遺伝子を他の微生物に導入し、ＰＨＢおよび他のＰＨＡｓを生産させることが出来、その微生物には、Alcaligenes eutrophusのようなＰＨＡｓの産業的生産に既に使用されている細菌を含む。有利な酵素には、他の細菌、Corynebacterium glutamicumを形質転換するため、実施例２１で用いたPeptostreptococcus asaccharolyticus由来のＮＡＤ結合グルタミン酸デハイドロゲナーゼを含む。
寄託した微生物
以下の微生物をDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germanyにブダペスト条約の規定に従い寄託した。
0004573365.tif 000010
参考文献
0004573365.tif 000011
0004573365.tif 000012
0004573365.tif 000013
0004573365.tif 000014
0004573365.tif 000015
0004573365.tif 000016
0004573365.tif 000017
0004573365.tif 000018
0004573365.tif 000019
0004573365.tif 000020
0004573365.tif 000021
【図１】
0004573365.tif 000022
【図２】
0004573365.tif 000023
0004573365.tif 000024
【図３】
0004573365.tif 000025
【図４】
0004573365.tif 000026
【図５】
0004573365.tif 000027
【図６】
0004573365.tif 000028
【図７】
0004573365.tif 000029
【図８】
0004573365.tif 000030
【図９】
0004573365.tif 000031
【図１０】
0004573365.tif 000032
【図１１】
0004573365.tif 000033
【図１２】
0004573365.tif 000034
【図１３】
0004573365.tif 000035
【図１４】
0004573365.tif 000036
【図１５】
0004573365.tif 000037