(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むことを特徴とする、細胞が、少なくとも１つの非標準 (unconventional) アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を産生する能力を獲得することを可能にする方法。
a)該細胞の増殖のために必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンにミスセンス突然変異を安定的に導入し、このように変異させた遺伝子から合成されるタンパク質はもはや機能性でなく；
b)工程a)で得られる細胞が、このように変異させたタンパク質の機能の欠損により栄養素を必要とする場合、該細胞を、該栄養素を含有する培地で培養し、そして
c)工程a)またはb)で得られた細胞を、ミスセンス突然変異の導入の前の標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中で培養する。
【請求項２】
工程c)の培地が、前記変異させたタンパク質の機能性が失われることにより必要となる栄養素を含まないことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を培養するための工程c)が、前記標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中に前記細胞の一連の培養物を含み、この一連の培養物のそれぞれを定常期まで培養し、次いで得られた細胞を洗浄することを特徴とし、そしてこの一連の培養物の数は、前記変異した遺伝子のミスセンス突然変異の抑制を向上させる突然変異の選択を可能にするのに十分なものであることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ミスセンス突然変異が少なくとも1015に１つの生物体程度の非常に低い頻度でのみ自然に復帰するミスセンス突然変異から選ばれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ミスセンス突然変異が、前記細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンを、標的コドンに比べて少なくとも２塩基、好ましくは３塩基の変化を示すコドンに変換することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
標的コドンが、小さい立体的かさ高さを有するアミノ酸をコードすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
標的コドンが、両親媒性であるアミノ酸をコードすることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的コドンが、ミスセンス突然変異によりコードされるアミノ酸の立体的かさ高さより小さいかもしくは実質的に等しい立体的かさ高さを有するアミノ酸をコードすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
標的コドンがシステインをコードすることを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ミスセンス突然変異によりコードされるアミノ酸がバリンまたはイソロイシンであることを特徴とする、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ミスセンス突然変異を導入する工程a)が、前記ミスセンス突然変異を含む、前記細胞の増殖に必要とされるタンパク質をコードする前記遺伝子の配列を含むベクターを用いて行われることを特徴とする、請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの非標準アミノ酸をそのアミノ酸配列中に含むタンパク質を産生しうる細胞を選択する方法であり、請求項１〜12のいずれかに記載の方法の工程a)〜c)、さらに工程c)で増殖しうる細胞を選択する追加の工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
前記標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中で工程c)の細胞を培養する工程d) (このアミノ酸の濃度は工程c)で用いたアミノ酸の濃度より高くてもよい) 、および工程d)で用いるアミノ酸の濃度に感受性である細胞を選択することをさらに含むことを特徴とする、請求項13記載の細胞を選択する方法。
【請求項１５】
前記選択された細胞の前記ミスセンス突然変異によりコードされるアミノ酸を認識するアミノアシルtRNAシンテターゼが、関連tRNAの１つに非標準アミノ酸もしくは前記ミスセンス突然変異によりコードされる前記アミノ酸以外のアミノ酸を担当させることができることを特徴とする、請求項13および14のいずれかに記載の細胞の選択方法。
【請求項１６】
前記アミノアシルtRNAシンテターゼをコードする遺伝子の核酸配列が、対応する野生型遺伝子の配列と比べて少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする、請求項15記載の細胞の選択方法。
【請求項１７】
前記突然変異が遺伝子組換え技術によって導入されたものではないことを特徴とする、請求項16記載の細胞の選択方法。
【請求項１８】
請求項１〜17のいずれかに記載の方法を用いて得られる細胞。
【請求項１９】
所定のアミノ酸を認識し、関連tRNAの１つに非標準アミノ酸またはこの所定のアミノ酸以外のアミノ酸を担当させることができるアミノアシルtRNAシンテターゼを含み、このアミノアシルtRNAシンテターゼをコードする遺伝子の核酸配列が、対応する野生型遺伝子の配列に比べて少なくとも１つの突然変異を含み、この変異は遺伝子組換え技術により導入されたものではないことを特徴とする、少なくとも１つの非標準アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を産生しうる単離された細胞。
【請求項２０】
原核または真核細胞であることを特徴とする、請求項18または19に記載の細胞。
【請求項２１】
原核細胞であることを特徴とする、請求項20記載の細胞。
【請求項２２】
CNCM (Colleciton Nationale de Culture de Microorgamismes、フランス、パリ) に寄託された下記の細胞から選択される細胞。
a)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2025として寄託されたE.coli株、
b)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2026として寄託されたE.coli株、
c)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2027として寄託されたE.coli株、
d)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2339として寄託されたE.coli株、
e)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2340として寄託されたE.coli株、
f)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2341として寄託されたE.coli株。
【請求項２３】
少なくとも１つの非標準アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を生産するための、請求項１〜17のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２４】
少なくとも１つの非標準アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を生産するための、請求項18〜22のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２５】
下記の工程を含むことを特徴とする、少なくとも１つの非標準アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を生産する方法。
a)請求項13〜17のいずれかに記載の方法により細胞を選択し；
b)工程a)で選択された細胞または請求項18〜22のいずれかに記載の細胞を、該細胞の増殖を可能にする培地中および培養条件下で培養し；
c)工程b)で得られた培養液上清および／または細胞ペレットから少なくとも１つの非標準アミノ酸を含むタンパク質を分離する。
【請求項２６】
前記細胞の増殖を可能にする工程b)の前記培地が、前記非標準アミノ酸またはその前駆体を含むことを特徴とする、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記非標準アミノ酸が前記細胞により合成されることを特徴とする、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
前記非標準アミノ酸の合成が前記細胞の遺伝的改変により向上することを特徴とする、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が前記標的コドンによりコードされるアミノ酸に対して栄養要求性であることを特徴とする、請求項25〜28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、コーディング配列に少なくとも１つの標的コドンを含む、関心ある同種もしくは異種の遺伝子を含むことを特徴とする、請求項25〜29のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
工程b)がさらに前記関心ある遺伝子にコードされるタンパク質の合成を誘導するのに必要な化合物を含むことを特徴とする、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記関心ある遺伝子によりコードされるタンパク質の生物学的活性が、前記関心ある遺伝子の標的コドンのレベルでの非標準アミノ酸の取り込みの後、少なくとも部分的に保存されることを特徴とする、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３３】
非標準アミノ酸が式Ｉを有し、Ｌ形である非標準アミノ酸から選ばれることを特徴とする、請求項25〜32のいずれかに記載の方法。
【化１】
0004427902.tif 000008
式中、R1またはR2は、選択的に反応しうる官能基を含む基を表す。
【請求項３４】
官能基がアルデヒド、ケトン、エテニル、エチニルおよびニトリル基から選ばれることを特徴とする、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質機能化のための請求項25〜34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
下記工程を含むことを特徴とするタンパク質精製方法。
a)請求項25〜35のいずれかに記載の方法を用いて、選択的に反応しうる官能基を含有する非標準アミノ酸を該タンパク質のアミノ酸配列に導入し、
b)工程a)で得られたタンパク質を含む溶液を、該官能基と特異的に反応し、該タンパク質を特異的に連結しうる化合物を含む担体に接触させ、そして、
c)担体に連結した該タンパク質を単離する。
【請求項３７】
下記工程を含むことを特徴とする、タンパク質を、化学的または生化学的化合物に連結する方法。
a)請求項25〜35のいずれかに記載の方法により、該タンパク質のアミノ酸配列中に、選択的に反応しうる官能基を含有する非標準アミノ酸を導入し、
b)工程a)で得られたタンパク質を、反応を許容する培地中で該官能基と特異的に反応しうる基を含む化学的または生化学的化合物と接触させる。
【請求項３８】
前記化学的または生化学的化合物が、それ自身、固体担体に連結しているか、固体担体の成分化合物であることを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質複合体を製造するための請求項37記載の方法。
【請求項４０】
前記連結されたタンパク質または前記化学的もしくは生化学的化合物が、治療用、美容用または診断用化合物から選ばれることを特徴とする、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記化学的または生化学的化合物が、連結されたタンパク質の生物学的活性を変化させることができる化合物から選ばれることを特徴とする、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学的または生化学的化合物が、連結されたタンパク質により生物学的活性が変化しうる化合物から選ばれることを特徴とする、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学的または生化学的化合物が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂肪酸、糖または天然もしくは合成ポリマーを含む化合物から選ばれることを特徴とする、請求項39〜42のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、原核細胞または真核細胞が、少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を産生する能力を獲得することを可能にする方法、この細胞を選択する方法、このタンパク質を産生し、精製する方法、および本発明の方法および工程を用いて得られる細胞およびタンパク質に関する。本発明はまた、この細胞およびタンパク質の、治療、美容もしくは診断の分野、または有機化合物の生合成もしくは生分解の分野などの各種分野での使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
増加しつつある、組換え生物を用いて大量生産されるタンパク質は、化学工業における触媒として、あるいは治療用薬剤として用いられている。多様な機能をもつ新規タンパク質の検索は、好極限性生物のタンパク質をスクリーニングすること、または突然変異誘発によるタンパク質変異体を作製してスクリーニングすることのいずれかによる強い活性を対象とする。しかし、生体内で産生されうるタンパク質の化学的変動は、遺伝暗号の不変性により制限される、すなわち標準のセットの20種のアミノ酸の組み合わせに限定される。もし天然種の子孫が多種類の遺伝暗号を採用するように実験室において徐々に改変されることができれば、タンパク質の進化が再指示され、それにより生物多様性の人工的供給源が確立されうるだろう。
【０００３】
遺伝暗号の実験的逸脱が、このような制限の克服を可能にする唯一の方法である。別の遺伝暗号が、より小さいもしくはより大きいセットのアミノ酸、標準でない単量体で置換されたセット、またはその中でコドンが再配分される標準アミノ酸のセットを特定することがあるかもしれない。生物系列における追加のアミノ酸の特定が多くの用途に役に立つかもしれず、その最も一般的なものは人工的生物多様性の確立であろう。
【０００４】
通常のアミノ酸を変化させることなく反応しうる化学的モチーフを有する単一の追加アミノ酸の恒久的または一時的取り込みは、新規なタンパク質機能化 (functionalization)方法を確立するのに十分であろう。これはまさに本発明の主題である。
【０００５】
【発明の開示】
本発明の主題は、下記工程を含むことを特徴とする、細胞が、少なくとも１つの非標準 (unconventional、通常のものではない、非慣用) アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を産生する能力を獲得することを可能にする方法である。
a)該細胞の増殖のために必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンにミスセンス突然変異を少なくとも１つ導入することにより、該細胞を形質転換し、このように変異させた遺伝子から合成されるタンパク質はもはや機能性ではない；
b)場合により、工程a)で得られる細胞を、このように変異させたタンパク質の機能の欠損により必要とされる栄養素を含有する培地で培養し、そして
c)工程a)またはb)で得られた細胞を、前記標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中で培養する。
【０００６】
本明細書において、「タンパク質」なる用語は、ペプチドもしくはポリペプチドを意味し、またこのタンパク質がグリコシル化されている場合には対応する糖タンパク質も意味する。
【０００７】
本明細書において、「非標準 (unconventional) アミノ酸」なる用語は、原核もしくは真核の単細胞もしくは多細胞生物により合成されるタンパク質の生合成の間にリボソームにより取り込まれるアミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味し、また翻訳される核酸配列に関してその部位に正常では取り込まれるべきアミノ酸の代わりに取り込まれる任意のアミノ酸も意味する。
【０００８】
本明細書において「ミスセンス突然変異」なる用語は、あるアミノ酸を表すコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに変換する突然変異を意味し、この別のアミノ酸は、ある場合には、タンパク質中の本来のアミノ酸残基の部位で、本来のアミノ酸に代わって機能性タンパク質を提供することができない。
【０００９】
本明細書において「細胞の増殖に必要なタンパク質」という表現は、タンパク質が細胞により機能的に合成される場合、所定培養条件下でこの細胞が増殖するのを可能にし、タンパク質が細胞により非機能的に合成される場合、この細胞を増殖させるためにはこの培地中に追加の栄養素を添加することを必要とするタンパク質を意味する。この種の非機能性タンパク質は、例えば光感受性型突然変異などの条件突然変異の後に細胞により合成されうる。
【００１０】
限定はされないが１つの例によって説明するために、E.coliのチミジル酸シンターゼタンパク質に特に言及する。これは、アミノ酸配列の 146位がシステインにより占められる触媒的部位を有し、その遺伝子 (thyA) の対応する変異がチミンもしくはチミジンの栄養要求性を生じさせ、その他のアミノ酸ではこの部位のシステインに代わることができないものである。
【００１１】
本発明において、「標的コドン」なる用語は、ミスセンス突然変異により変換される３ヌクレオチドに基づくコドンを意味する。
本発明はまた、工程c)の培地が、前記変異させたタンパク質の機能性が失われることにより必要となる栄養素を含まないことを特徴とする本発明の方法を含む。
【００１２】
本発明によれば、前記細胞を培養するための工程c)は、前記標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中に前記細胞の一連の培養物を含み、この一連の培養物のそれぞれを定常期まで培養し、次いで得られた細胞を洗浄することを特徴とし、この一連の培養物の数は、前記変異させた遺伝子のミスセンス突然変異の抑制を向上させる突然変異の選択および前記変異させた遺伝子に対応する対立遺伝子の増殖を可能にするのに十分なものである。
【００１３】
本発明はまた、ミスセンス突然変異が少なくとも1015に１つの生物体という程度の非常に低い頻度でのみ自然に復帰するミスセンス突然変異から選ばれることを特徴とする本発明の方法に関する。
【００１４】
好ましくはミスセンス突然変異は、前記細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンを、標的コドンに比べて少なくとも２塩基、より好ましくは３塩基の変化を示すコドンに変換するミスセンス突然変異から選択されるであろう。
【００１５】
標的コドンが、小さいかさ (steric volume)を有する、および／または両親媒性である、および／またはミスセンス突然変異によりコードされるアミノ酸のかさより小さいかもしくは実質的に等しいかさを有するアミノ酸をコードすることを特徴とする本発明の方法も好ましい。
【００１６】
標的コドンの中で、特に、システインをコードする標的コドン、および標的コドンをバリンもしくはイソロイシンをコードするコドンに変換するミスセンス突然変異から選ばれるミスセンス突然変異が好ましい。
【００１７】
本発明はまた、前記細胞を形質転換する工程a)が、前記ミスセンス突然変異を含む、前記細胞の増殖に必要とされるタンパク質をコードする前記遺伝子の配列を含むベクター、特にプラスミドベクターを用いて行われることを特徴とする本発明の方法に関する。
【００１８】
このようなベクターは当業者に慣用的に用いられる方法により調製されるであろうし、それから得られるクローンは遺伝子組換えの通常の方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーションまたは熱ショックにより前記細胞中に導入することができる。
【００１９】
別の面では、本発明の主題は、少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列中に含むタンパク質を産生しうる細胞を選択する方法であり、本発明方法の工程a)、場合によりb)、およびc)、さらに工程c)で増殖しうる細胞を選択する工程を含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、本発明の細胞を選択する方法は、前記標的コドンによりコードされるアミノ酸を含む培地中で工程c)の細胞を培養する工程d) (このアミノ酸の濃度は工程c)で用いたアミノ酸の濃度より高くてもよい) 、および工程d)で用いるアミノ酸の濃度に感受性である細胞を選択することを含む。
【００２１】
「化学的もしくは生化学的化合物に、または所定濃度の該化合物に感受性である細胞」という表現は、この化学的もしくは生化学的化合物または所定濃度のこの化合物を含む培地中で培養した場合に、その増殖が部分的にもしくは全体的に阻害される細胞を意味する。
【００２２】
本発明はまた、前記選択された細胞の前記ミスセンス突然変異によりコードされるアミノ酸を認識するアミノアシルtRNAシンテターゼが、その関連tRNAの１つに、非慣用アミノ酸もしくは前記ミスセンス突然変異によりコードされる前記アミノ酸以外のアミノ酸を担当させることができることを特徴とする、本発明による細胞の選択方法も含む。
【００２３】
本明細書において、「関連tRNA」なる用語は、あるアミノ酸を認識するアミノアシルtRNAシンテターゼにより認識され、このアミノ酸を転移させうるtRNAを意味する。
【００２４】
本発明はまた、前記アミノアシルtRNAシンテターゼをコードする遺伝子の核酸配列が、対応する野生型遺伝子の配列と比べて少なくとも１つの突然変異を含み、この変異は遺伝子組換え技術によって導入されたものではないことを特徴とする、本発明による変異細胞の選択方法も含む。
【００２５】
別の面によれば、本発明の主題は、本発明の方法を用いて得られる原核または真核細胞である。
これらの目的に用いることができる細胞の中には、当然、E.coliのような細菌細胞だけでなく、酵母細胞、さらに動物細胞、特に哺乳動物細胞の培養物 (例えば特にチャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞) および昆虫細胞も挙げられる。
【００２６】
本発明はまた、所定のアミノ酸を認識し、関連tRNAの１つに非慣用アミノ酸またはこの所定のアミノ酸以外のアミノ酸を担当させることができるアミノアシルtRNAシンテターゼを含み、かつ該アミノアシルtRNAシンテターゼをコードする遺伝子の核酸配列が対応する野生型遺伝子の配列に比べて少なくとも１つの突然変異を含み、この変異は遺伝子組換え技術により導入されたものではないことを特徴とする、少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を産生しうる単離された原核または真核細胞にも関する。
【００２７】
従って、本発明は、細胞による、その増殖に必要な代謝経路の形成に基づく、非慣用アミノ酸を担当しうる正規ではないアシルtRNAを産生しうる細胞を得ることを可能にする細胞の選択方法に関する。
【００２８】
本発明の細胞の中で、CNCM (Colleciton Nationale de Culture de Microorgamismes [National Collection of Microorganism Cultures]、フランス、パリ) に寄託された下記の細胞から選択されることを特徴とする細菌細胞が好ましい：
a)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2025として寄託されたE.coli株、
b)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2026として寄託されたE.coli株、
c)1998年５月25日にCNCMに受託番号I-2027として寄託されたE.coli株、
d)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2339として寄託されたE.coli株、
e)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2340として寄託されたE.coli株、
f)1999年10月26日にCNCMに受託番号I-2341として寄託されたE.coli株。
【００２９】
CNCMに受託番号I-2025として寄託され、β5366の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３０】
CNCMに受託番号I-2026として寄託され、β8144の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３１】
CNCMに受託番号I-2027として寄託され、β8146の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３２】
CNCMに受託番号I-2339として寄託され、β5479の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−nrdD遺伝子座における欠失およびカナマイシン耐性遺伝子での置換、
−valS遺伝子のR233H 対立遺伝子を有し、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３３】
CNCMに受託番号I-2340として寄託され、β5485の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−nrdD遺伝子座における欠失およびカナマイシン耐性遺伝子での置換、
−valS遺伝子のVal 276 Ala 染色体性対立遺伝子を有し、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３４】
CNCMに受託番号I-2341として寄託され、β5486の表示の下で同定されたE.coli K12株は、MG1655 (wt E.coli K12)の子孫であり、下記の性質を有する：
−thyA遺伝子座における欠失およびエリスロマイシン耐性遺伝子での置換、
−nrdD遺伝子座における欠失およびカナマイシン耐性遺伝子での置換、
−valS遺伝子のAsp 230 Asn 染色体性対立遺伝子を有し、
−チミジル酸シンターゼのCys146GUA 対立遺伝子を有するプラスミドpTZ18 (col E1 replicon, bla + ) を含む。
【００３５】
本発明はまた、少なくとも１つの非慣用RNA をそのアミノ酸配列に含むタンパク質、特に組換えタンパク質を生産するための、本発明の方法または細胞の使用を含む。
【００３６】
別の面において、本発明は、下記の工程を含むことを特徴とする、少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を生産する方法に関する。
a)場合により、本発明の方法により細胞を選択し；
b)工程a)で選択された細胞または本発明の細胞を、培地中で該細胞の増殖を可能にする培養条件下で培養し；
c)工程b)で得られた培養液上清および／または細胞ペレットから少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を分離する。
【００３７】
本発明による方法で生産することできるタンパク質の中で、少なくとも１つの非慣用アミノ酸の取り込みを通じて、その配列が通常のアミノ酸のみを含むタンパク質では得ることができない所望の活性を得ることを可能にするタンパク質を例示できるが、それに限定されない。「活性」なる用語は、一般的に、単細胞または多細胞生物に関して、部分的であっても生理学的または生物学的活性、例えば構造的もしくは生化学的活性、例えば、酵素もしくは抗原活性、抗体型の活性、または生物学的活性を調整、調節もしくは阻害するような活性、または化学的もしくは生化学的化合物を生合成もしくは生分解するための方法において、その実施を可能にするような活性などの任意の活性を意味する。
【００３８】
本発明の方法により生産することができるタンパク質の中で、対応する非改変タンパク質の生物学的活性の実質的な改変が生じないように、少なくとも１つのの非慣用アミノ酸の取り込みが行われるタンパク質も挙げることができる。対応する非改変タンパク質の保存された生物学的活性に加え、本発明によるこれらのタンパク質は有利に活用されるかもしれない特異的性質を有する非慣用アミノ酸を含むであろう。
【００３９】
非慣用アミノ酸の存在により付与される特定の性質の中で、特に、タンパク質の活性を変化させないようにするか、または通常のアミノ酸の変化を避ける条件下で、化学的もしくは生化学的化合物と容易に特異的に反応しうる、非慣用アミノ酸上の官能基の存在に関連する性質が挙げられる。
【００４０】
この特異的官能基の存在は、例えば次のような場合に有利に用いることができる：
(i) 前記非慣用アミノ酸を取り込んでいる任意のタンパク質、特に組換えタンパク質を精製する、
(ii)前記タンパク質を固体担体に結合させる、
(iii) 前記タンパク質に、変化した性質の分光分析的プローブ等の、検出されうる分子を結合させる、
(iv)前記タンパク質に、溶媒中でその可溶化を可能にするか、または抗体による認識に対するマスキングを可能にする親油性または新水性ポリマーを結合する、
(v) 前記タンパク質をポリヌクレオチドに結合させる、
(vi)その存在により、前記タンパク質の生物学的活性の向上、低下、改変、調節もしくは標的化が可能となるか、または治療用の化合物としてのその生体利用性を変化させうる化学的もしくは生化学的化合物に、前記タンパク質を結合させる、あるいは、
(vii) 前記タンパク質に、そうでなければ溶液中に核酸する補酵素を恒久的に結合させる。
【００４１】
本発明によれば、少なくとも１つの非慣用アミノ酸の導入は、対応する非改変タンパク質の特異性もしくは活性を担う、あるいは立体配座、荷電、疎水性、もしくは多量体化能を担うアミノ酸に関与するかもしれない。このように、通常のアミノ酸を含む対応する非改変タンパク質と同等の、向上したもしくは低下した活性を有するか、またはそれと同等の、あるいはそれより制限されたもしくはより広い特異性を有するタンパク質を作り出すかもしれない。
【００４２】
「非改変タンパク質 (unmodified protein) 」なる用語は、通常のアミノ酸からなり、そして非慣用アミノ酸を含むタンパク質の起源となる野生型もしくは組換え型タンパク質を意味する。
【００４３】
好ましくは、本発明による製造方法は、前記細胞の増殖を可能にする工程b)の前記培地が、前記非慣用アミノ酸またはその前駆体を含むことを特徴とする。
１つのの具体的態様によれば、本発明による生産方法は、前記非慣用アミノ酸が前記細胞により合成され、この非慣用アミノ酸の合成がこの細胞の遺伝的改変により向上するかもしれないことを特徴とする。
【００４４】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含むタンパク質を生産する方法であり、該細胞が前記標的コドンによりコードされるアミノ酸に対して栄養要求性であることを特徴とする方法にも関する。
【００４５】
また、本発明には、前記細胞がそのコーディング配列に少なくとも１つの標的コドンを含む、関心ある同種もしくは異種の遺伝子を含むことを特徴とする本発明の方法が含まれる。
【００４６】
一般的に、関心ある遺伝子はメッセンジャーRNA をコードし、関心あるタンパク質に翻訳されるであろう。
関心ある対象遺伝子は、クローニングや PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) 等の任意の慣用手段で単離するか、あるいは化学的に合成することができる。これは、ゲノム性 (１または２以上のイントロンを有する) であっても、相補的 DNA(cDNA)型でもよい。関心あるタンパク質は、成熟タンパク質、前駆体、特に、分泌されることを意図され、シグナルペプチドを含む前駆体、先端切除 (truncated)タンパク質、各種起源の配列の融合体に由来するキメラタンパク質、または改善されたおよび／または改変された生物学的性質を有する変異タンパク質からなっていてもよい。
【００４７】
一般的に、関心ある同種もしくは異種遺伝子は、治療用もしくは美容用化合物として、診断用薬剤として、または生合成もしくは生分解過程に用いることができる化合物として使用することができる任意のタンパク質をコードする遺伝子から選んでもよい。
【００４８】
例えば、下記のような関心あるタンパク質をコードする関心ある遺伝子を例示することができる：
−サイトカインまたはリンホカイン (インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン、ならびに特にIL-2、IL-6、IL-10 もしくはIL12、腫瘍壊死因子 (TNF)、コロニー刺激因子  (GM-CSF, C-CSF, M-CSF 、等) ；
−細胞または核内受容体、特に病原性生物体 (ウイルス、細菌または寄生虫) により認識されるもの、またはそれらのリガンド；
−遺伝病に関与するタンパク質 (VII 因子、VIII因子、IX因子、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン、インスリン、CFTR (嚢胞性繊維症膜貫通調節) タンパク質、成長ホルモン (hGH)) ；
−酵素 (ウレアーゼ、レニン、トロンビン、等) またはタンパク質、脂質、核酸、糖類、アミノ酸、脂肪酸、もしくはヌクレオチドの代謝もしくは生合成に関与する任意の酵素；
−酵素阻害剤 (α1-アンチトリプシン、アンチトロンビンIII 、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、等) ；
−腫瘍またはがんの開始または進行を少なくとも部分的に阻害することができる、抗腫瘍作用のある化合物 (抗体、細胞分裂もしくは伝達シグナルに作用する阻害剤、がん抑制遺伝子発現産物、例えば、p53 もしくはRb、免疫系を刺激するタンパク質、等) ；
−クラスＩもしくはII主要組織適合遺伝子複合体タンパク質、または対応する遺伝子の発現に作用する調節タンパク質；
−ウイルス、細菌もしくは寄生虫感染またはその発生を阻害することができるタンパク質 (免疫原性を有する抗原性タンパク質、抗原性エピトープ、抗体等) ；
−毒素 (リシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素、等) またはイムノトキシン；
−マーカー (β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、等) ；ならびに
−ルシフェラーゼ、GFP(グリーン蛍光タンパク質) 。
【００４９】
本発明はまた、工程b)の培地がさらに前記関心ある遺伝子にコードされるタンパク質の合成を誘導するのに必要な化合物を含むことを特徴とする、本発明によるタンパク質を生産する方法を含む。これらの化合物は当業者に知られており、特に細胞および選ばれた同種もしくは異種遺伝子に依存する。
【００５０】
本発明はまた、前記関心ある遺伝子によりコードされるタンパク質の生物学的活性が、前記関心ある遺伝子の標的コドンのレベルでの非慣用アミノ酸の取り込みの後、少なくとも部分的に保存されることを特徴とする、本発明の方法に関する。
【００５１】
本発明はまた、非慣用アミノ酸が式Ｉを有し、Ｌ形である非慣用アミノ酸から選ばれることを特徴とする本発明の方法に関する。
【００５２】
【化２】
0004427902.tif 000002
【００５３】
式中、R1またはR2は、選択的に反応しうる官能基を含む基を表し、好ましくはアルデヒド、ケトン、エテニル、エチニルおよびニトリル基から選ばれる。
これらの基の中で、特に、タンパク質の化学的機能化を容易にするであろう選択的反応性を有するオキソ (アルデヒドまたはケトン) 基が好ましい。エチニル基等のその他の単純な基もまた、選択的反応に有用であろう。無細胞性の(ex vivo) 翻訳系およびin vitroで合成したアシルtRNAを用いて行った実験を広く集めて、非常に多様なアシル基がtRNAに読まれるコドンに応答してリボソーム上に転移されうることが実証された。簡単にいうと、アミノ酸の側鎖の修飾はすべて、翻訳と適合するようである (現在まで、翻訳を阻止するのに十分かさ高い側鎖を有するアミノ酸は見出されていない) ；アミノ酸モチーフのアルキルアミノ、ヒドロキシルおよびヒドラジノモチーフへの置換は、リボソームが触媒するペプチド転移の化学とは適合しうる (Bain et al., 1991) (リボソームは、通常のポリアミドに加えてポリエステルも形成しうることが知られている) ；一方、H2NCH(R)-COOH モチーフのα水素のアルキル (メチル) 基での置換、またはα炭素での立体配置の反転 (D-アミノ酸) は、リボソームに受け入れられない。
【００５４】
本発明の主題はまた、タンパク質機能化のための本発明の方法である。
本発明はまた、下記工程を含むことを特徴とするタンパク質精製方法に関する。
a)本発明の方法を用いて、選択的に反応しうる官能基を含有する非慣用アミノ酸を該タンパク質のアミノ酸配列に導入し、
b)工程a)で得られたタンパク質を含む溶液を、該官能基と特異的に反応し、該タンパク質に特異的に結合しうる化合物を含む担体に接触させ、そして、
c)担体に結合した該タンパク質を単離する。
【００５５】
当業者が通常用いる、天然でも組換え型でもよいタンパク質を精製する方法は、一般に分画、クロマトグラフィー法、特異的モノもしくはポリクローナル抗体等を用いた免疫親和性法などの方法を単独でもしくは組み合わせて用いる方法を採用する。これらの方法は時間がかかり、退屈であることがあり、常に、特異的活性、所望の精製レベルおよび収率を得られるとは限らない。タンパク質の活性を変化させることなく精製用担体と選択的に反応しうる、精製すべきタンパク質上の特異的官能基の存在は、それを使用する際に必要とされるタンパク質の精製を非常に容易にするであろう。
【００５６】
本発明はまた、下記工程を含むことを特徴とする、タンパク質を、化学的または生化学的化合物に連結させる方法に関する：
a)本発明の方法により、該タンパク質のアミノ酸配列中に、選択的に反応しうる官能基を含有する非慣用アミノ酸を導入し、
b)工程a)で得られたタンパク質を、反応を許容する培地中で該官能基と特異的に反応しうる基を含む化学的または生化学的化合物と接触させる。
【００５７】
好ましくは、タンパク質の化学的または生化学的化合物への連結は共有結合による連結である。
本発明によるこの連結方法に用いられる化学的または生化学的化合物は、導入された非慣用アミノ酸の官能基と反応しうるすべての化合物から選ぶことができる。
【００５８】
本明細書において「タンパク質複合体」なる用語は、化学的もしくは生化学的化合物に連結した本発明のタンパク質を含む、上記方法の工程b)で得られる生成物を意味する。
【００５９】
本発明はまた、該化学的もしくは生化学的化合物が、それ自身、固体担体に連結しているか、固体担体の成分化合物である。
本発明はまた、タンパク質複合体を製造する、本発明による方法に関する。
【００６０】
好ましくは本発明は、この連結されたタンパク質またはこの化学的もしくは生化学的化合物が、治療用、美容用または診断用化合物から選ばれることを特徴とする本発明の方法を含む。
【００６１】
この連結されたタンパク質は、特に、本発明の方法により非慣用アミノ酸をそのアミノ酸配列に含み、対応する野生型または非改変タンパク質が治療用もしくは美容用化合物または診断用薬剤として使用できるタンパク質から選ばれるようなタンパク質から選択されるであろう。
【００６２】
好ましくは本発明の方法は、化学的もしくは生化学的化合物が、連結されたタンパク質の生物学的活性を変化させることができる化合物から選ばれることを特徴とする。
【００６３】
「別の化合物の生物学的活性を変化させることができる化合物」という表現は、この別の化合物の生物学的活性を向上、低下または調節しうる化合物を意味する。
【００６４】
本発明はまた、化学的もしくは生化学的化合物が、連結されたタンパク質により生物学的活性が変化しうる化合物から選ばれることを特徴とする本発明の方法を含む。
【００６５】
本発明はまた、化学的もしくは生化学的化合物が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂肪酸、糖または天然もしくは合成ポリマーを含む化合物から選ばれることを特徴とする本発明の方法を含む。
【００６６】
別の面によれば、本発明の主題は、本発明方法により得られるタンパク質、特に組換えタンパク質およびタンパク質複合体である。
本発明はまた、本発明のタンパク質に結合しうる化合物または本発明のタンパク質複合体の化学的もしくは生化学的化合物に結合しうる化合物を選択する方法を含む。これらの方法の中で、一例として下記の工程を含むことを特徴とする方法が挙げられる：
a)選択されていてもよい該化合物を、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体に接触させ、該タンパク質またはタンパク質複合体は特に固体担体に連結していてもよい；
b)化合物の、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体と結合しうる能力を決定する。
【００６７】
選択されていてもよい化合物は、タンパク質または炭水化物等の有機化合物でも、その他の任意の既知の有機もしくは無機化合物でも、または分子モデリング法を用いて開発し、化学的もしくは生化学的合成により得られる新規有機化合物でもよく、これらの技術は当業者に既知である。
【００６８】
本発明の細胞はまた、有利にモデルとして機能し、本発明のタンパク質または所望の活性を有するかもしれない化合物を研究、同定および／または選択する方法において用いてもよい。
【００６９】
本発明はまた、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体の診断薬としての使用、および本発明タンパク質またはタンパク質複合体を用いた診断方法、特にポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを特異的に検出、同定、位置決定および／または解析するための方法に関する。
【００７０】
少なくとも１つの非慣用アミノ酸が導入され、部分的または全体的に、対応する非改変の野生型または組換え型タンパク質のもとの活性を保存しているタンパク質 (例、抗体、抗原、酵素または診断方法において使用できる既知の生物学的に活性なその断片) は具体的に本発明のタンパク質に含まれる。
【００７１】
同様に、本発明のタンパク質および化学的もしくは生化学的化合物から形成されるタンパク質複合体 (例、抗体、抗原、または酵素、基質もしくは検出されうる分子に結合したオリゴヌクレオチドプローブ) は本発明のタンパク質複合体に含まれる。
【００７２】
本発明の診断方法の中で、例えば、下記の工程を含む方法が挙げられる。
a)求める化合物を含むかもしれない生物学的試料を、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体に接触させる (該タンパク質またはタンパク質複合体は、特に固体担体に連結していてもよい) 、そして
b)求める化合物と、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体との間に形成される複合体を出現させ、同定、位置決定および／または解析を行う。
【００７３】
当業者であれば、本発明タンパク質またはタンパク質複合体に既知の標準的診断方法を適応させることができるであろう。
生成した複合体の出現、同定、位置決定および／または解析を可能にし、本発明の方法において使用してもよい具体的技術および薬剤はまた、当業者に周知であり、例えば、ELISA 、RIA 、免疫蛍光法、または PCR法もしくは当業者に既知の標的核酸を増幅するその他の方法である。
【００７４】
本発明はまた、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体を含むことを特徴とする、診断用キットもしくはパックに関し、特に、タンパク質またはポリヌクレオチドを特異的に検出、同定、位置決定および／または解析するためのものに関する。
【００７５】
本発明はまた、薬剤または美容用組成物を製造するための、本発明のタンパク質、タンパク質複合体または細胞の使用に関する。
最後に、本発明の主題は、本発明のタンパク質、タンパク質複合体または細胞を含む薬剤または美容用組成物である。
【００７６】
本発明のその他の特徴および利点は以下の実施例を含む明細書の残りの記載から明らかとなる。
【００７７】
【実施例】
【実施例１】
チミジル酸シンターゼ活性部位にCys →Val ミスセンス突然変異を含み、チミン、チミジンまたはシステインの栄養要求性を作り出すE.coli株の構築
thyA遺伝子の人工的対立遺伝子を、プラスミドpTS0 (Lemeignan et al., 1993) の位置指定突然変異誘発により作製する。このプラスミドは、E.coliの野生型thyA遺伝子の挿入によりプラスミドpTZ18R (BioRad) から得られる。オリゴヌクレオチドを用いる位置指定突然変異誘発を、Kunkel et al.,(1987)により記載の方法により、ファージミドpTS0上において行う。RZ1032株 (Kunkel et al., 1987)(Hfr KL16 PO45 [lysA(61-62)] dut1 ung1 thi1 relA1 supE44 zbd-279::Tn10) において増幅されたpTS0の一本鎖マトリックスの調製を、Sambrook et al., (1989) により記載のプロトコルにより行う。5'- リン酸化オリゴヌクレオチド(Genome Express より購入) を突然変異誘発プライマーとして用いる。
オリゴヌクレオチド１：
5'pTGGATAAAATGGCGCTGGCACCGGTACATGCATTCTTCCAGTTCTATGT  （配列番号１）
【００７８】
２つの構築物のそれぞれにおける一本鎖マトリックスとこのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを、オリゴヌクレオチド10ngおよび、20mMトリス-HCl、pH7.5 、2mM EDTAおよび50mM NaCl を含む緩衝液10μｌ中のマトリックス0.2 μｌを用いて行う。試験管を70℃で５分間インキュベーションし、次いで徐々に30℃に冷却する。各dNTP 0.5mM、ATP 1mM 、トリス-HCl 10mM 、pH7.5 、塩化マグネシウム10mM、ジチオトレイトール 2mMおよびT4ファージ DNAリガーゼと DNAポリメラーゼ酵素を各々１単位、この混合物に添加する。この反応液を最終容量20μｌとし、37℃で60分間インキュベーションし、次いでこの液５μｌをE.coli K12株 GT869 (Parsot, C. 1986) (thrB1004 pro thi strA hsdS lacZ ΔM15 [F' lacZ  ΔM15 laclq traD36 proA+ proB+])のコンピテント細胞にSambrook et al., (1989) に記載の方法に従って形質転換するのに用いる。形質転換した細胞を、100mg/l カーベニシリンを加えたＬＢ培地を含むシャーレ上で平板培養する。この抗生物質に耐性の12個のクローンを同じ培地上で再単離する。これらのクローンのファージミドに対応する一本鎖 DNAを調製し、ジデオキシ法 (Sanger et al., 1977)により配列決定する。M13 配列決定用キット (Boehringer Mannheim 、ドイツ、マンハイム) およびデオキシアデノシン5'-(α- チオ) 三リン酸 (1300ci/mmol 、Amersahm) を提供者の指示に従って混合する。thyA対立遺伝子の配列を決定するのに４つのプライマーを用いる。
オリゴヌクレオチド３：5'- GGTGTGATCATGATGGTC  （配列番号２）
オリゴヌクレオチド４：5'- CCTGCAAGATGGATTCCC  （配列番号３）
オリゴヌクレオチド５：5'- CGCGCCGCATTATTGTTTC （配列番号４）
オリゴヌクレオチド６：5'- GTCTGGACCGGTGGCGACA （配列番号５）
【００７９】
こうして得られるプラスミドpTS1は、野生型thyA遺伝子ではシステインのUGC コドンにより占められている146 位がバリンのGUA コドンで占められているthyA：Val146対立遺伝子を増やす。プラスミドpTS1を、Sambrook et al., (1989) の方法により行う形質転換によりE.coli K12  ΔthyA株、β1308 (Lemeignan et al., 1993)(染色体のチミジル酸シンターゼ遺伝子、thyA、が欠失している) に導入する。thyA：Val146プラスミド対立遺伝子を有する形質転換株β5366は、由来するβ1308株と同じく、培地に加えたチミンまたはチミジンがないと増殖できないことが示される。一方、β5366は、400mM L-システイン溶液0.1ml を含む中央のくぼみから始まる、グルコースMS無機培地25mlを含むシャーレ中で調製されるシステイン拡散勾配上で、30℃において周縁部の (marginal) 増殖を示す。同じ条件下でβ1308株は検出可能な増殖を示さない。このように、チミジル酸シンターゼの146 位の触媒的システインをバリンに変換するミスセンス突然変異は、外からのシステインを非常に多量供給することにより部分的に抑制することができる。シャーレ中の培地にバリンを0.1mM 加えると、システイン勾配上でのβ5366株の増殖を止める。従って、システインはバリルtRNAシンテターゼ活性部位に入り込み、チミジル酸シンターゼ活性部位におけるシステインのバリンによる置換を訂正することができる間違ったCys-tRNAVal を形成しうるかのようである。過剰なバリンはこれらの間違ったCys-tRNAVal の形成を防止するであろう。
【００８０】
【実施例２】
チミジル酸シンターゼ活性部位にCys →Ile ミスセンス突然変異を含み、チミン、チミジンまたはシステインの栄養要求性を作り出すE.coli株の構築
実施例１と同じプロトコルにより、オリゴヌクレオチド２を用いて位置指定突然変異誘発により、チミジル酸シンターゼの146 位のシステインを置換するために、対応する構築を行う。
オリゴヌクレオチド２：
5'pTGGATAAAATGGCGCTGGCACCGATACATGCATTCTTCCAGTTCTATGT  （配列番号６）
こうして得られるプラスミドpTS2は、野生型thyA遺伝子ではシステインのUGC コドンにより占められている146 位がイソロイシンのAUA コドンで占められているthyA：Ile146対立遺伝子を増やす。thyA：Ile146プラスミド対立遺伝子を増やす株、β5274は、由来するβ5366と同じく、チミン、チミジンまたは過剰のシステインの栄養供給を必要とすることが示される。システインによるβ5274株の表現型の抑制は、β5366ではバリンで止められるように、0.1mM イソロイシンにより止められる。このように、イソロイシルtRNAシンテターゼは、過剰のシステインの存在下で間違ったCys-tRNAIle を形成しうるかのようであり、この間違った形成は、過剰のイソロイシンの存在により防止される。
【００８１】
【実施例３】
連続液体培養により、バリンの代わりにシステインを誤取り込みする遺伝暗号変異体の選択およびこうして得られたバリルtRNAシンテターゼ変異体の遺伝的特性決定
プラスミドpTS1上にthyA：Val146ミスセンス対立遺伝子を有するβ5366株を、0.3mM チミジン加グルコースMS無機培地 (2g/l、Richaud et al., 1993) 中、好気条件下で30℃において24時間培養する。次いで細胞を、脱酸素化MS無機培地で２回洗浄する。1.5mM システインを加えたグルコースMS無機培地10mlを含む脱酸素化栄養培地に、洗浄した細胞を用いて1/100 で接種する。次いで、細胞を嫌気条件下で30℃において24時間培養し、脱酸素化システイン・グルコースMS無機培地10mlを含む新しい試験管に、定常期のもとの培養物の1/100 希釈物を接種する。この操作を26回繰り返す。この連続的増殖の最後に、培養液より12クローンを、チミジン (0.3mM)グルコース (2g/l)MS 無機培地を含むプレート上に好気条件下で単離し、同じ液体培地中の懸濁液で-80 ℃において保存する。12個のクローンを、栄養素を加えたグルコースMS無機培地を含むプレート上で試験する。これらのクローンはすべて、システインが培地中に少なくとも1.5mM 濃度で存在しない場合には、成長因子としてチミンまたはチミジンを要求することが示される。
【００８２】
このようなクローンを２つ、β8144およびβ8146を完全な遺伝的特性決定のために選択する。バリルtRNAシンターゼのvalS遺伝子に隣接するnrdD遺伝子座 (E.coli K12染色体の97分) に導入された、カナマイシン耐性の性質の、P1ファージを用いた形質導入を含む実験をβ8144およびβ8146株を用いて行う。両者の場合とも、約半数のカナマイシン耐性形質導入体はまた、チミジンに対して栄養的依存性を示し、これは外からのシステインにより少なくとも1.5mM の濃度で抑制されうる。この割合は、valSとnrdD遺伝子間の遺伝子距離 (0.4 分) と一致し、チミジル酸シンターゼ活性部位におけるCys →Val ミスセンス突然変異のシステインの低濃度での抑制の表現型が、valS遺伝子座の遺伝的改変により生じることを示唆する。
【００８３】
改変された細胞のvalS遺伝子における遺伝的改変の確立は、この遺伝子座の配列決定により確認される：２つの改変されたβ8144およびβ8146株においてＡがＣへと変化すると、277 位のリジンのグルタミンによる置換を生じる。配列決定はSambrook et al., (1989) により記載された条件下で行うポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により得られたマトリックス上で行う。増幅反応は、β8144およびβ8146株のゲノム DNA 10ng 、各プライマー20pmol、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の等モル混合物40 nmol および緩衝液 (100mM トリス-HCl、pH8.3 、500mM KCl および20mM MgCl2からなる)10 μｌを含む溶液100 μｌ中で、Ventポリメラーゼ (Biolabs)１〜２単位の存在下で行う。各反応について DNAアンプリファイア (amplifier)(Perkin-Elmer Cetus)を用いて以下のようにして30重合サイクル行う：変性は94℃で行い、最初のサイクルでは５分間、その後のサイクルでは１分間である、ハイブリダイゼーションは58℃で１分間、そして伸長は72℃において行い、最初の29サイクルでは３分間、最後のサイクルでは10分間である。オリゴヌクレオチド７および８を遺伝子の増幅のために用いる。
オリゴヌクレオチド７：
5'- GGGGAATTCGGTGTGTGAAATTGCCGCAGAACG （配列番号７）
オリゴヌクレオチド８：
5'- GGCAAGCTTCCAGTATTTCACGGGGAGTTATGC （配列番号８）
こうして得られた PCR断片を、QIAquickキット (Qiagen) を用いて精製し、その配列を決定するためにGenaxis 社へ送る。
【００８４】
【実施例４】
システインの代謝前駆体による表現型抑制
改変されたβ8144及びβ8146株のシステインに対する栄養要求性を利用して、酸化による分解を生じることなく培地中でシステインの代わりとなるかもしれない代謝前駆体を特性決定する。S-カルバミル-L- システイン(3 mM)、S-メチル-L- システイン(3 mM)及びL-チアゾリジン-4- カルボン酸(2 mM)が、チミジン又はチミンの代わりに、改変されたβ8144及びβ8146株に対する成長因子としてシステインに代わりうることが分かる。同じ化合物が、cys N::kan突然変異体 (JT1 株、米国イェール大学 Coli Genetic Stock Centerの M. Berlynにより提供 (Levh et al., 1988)) のシステイン要求性を満たしうることが判明する。しかし、これらの物質のいずれを添加しても、チミジル酸シンターゼのthy A 遺伝子の染色体性欠失を有するβ1308株の増殖を可能にして、痕跡量のチミン又はチミジンの混入を排除することはできない。
【００８５】
【実施例５】
固体培地における単離による、バリンの代わりにシステインを誤導入する遺伝暗号変異体の選択、及びシステインを誤導入するバリルtRNAシンテターゼ変異体の遺伝的特性決定
プラスミドpTS1上にthyA:Val146 ミスセンス対立遺伝子を有するβ5366株を、E.coki補助株 (β7170、Bouzon et al.,1997)(染色体にバリルtRNAシンテターゼ遺伝子のvalS遺伝子座に隣接するnrdD遺伝子座にカナマイシン耐性マーカーが、導入されている) 上で回収されるP1ファージ溶菌液で形質導入し、このようにしてβ5419株を作製する。dnaQ遺伝子のミューテーター対立遺伝子を、テトラサイクイリン耐性マーカーdnaQ::miniTn10を有する補助株(MS2131 、Shapiro 1990) 上で回収されるP1ファージ溶菌液を用いたβ5419株の形質導入により即座に導入する。約1000倍に向上した (ストレプトマイシン耐性の獲得について) 自然変異率を示すこのテトラサイクリン耐性クローンをチミジン(0.3mM) の存在下でグルコース最小培地で30℃において培養する。24時間後、細胞を回収し同量のチミジンを含まない培地で２回洗浄する。得られた懸濁液0.1ml 量( 約108 細菌に相当する) を、１mM増加した０〜８mMの範囲の濃度のS −カルバミル−Ｌ−システインを含み、グルコース(2g/l)MS無機培地を添加した一連のシャーレの表面で平板培養する。同じ操作を、非ミューテーターβ5419株、野生型dnaQ遺伝子に適用する。全シャーレを30℃で96時間培養する。dnaQ::miniTn10ミューテーター対立遺伝子が試験株に導入された場合のみ、２mMを超える濃度のS −カルバミル−Ｌ−システインを有するシャーレ上にコロニーが現われる。
【００８６】
このようなクローンから回収するP1ファージ溶菌液を、thyA:Val 146プラスシド対立遺伝子を有するβ5366株に形質導入するの用いる。約半数のカナマイシン耐性形質導入体、中でもβ5455株が、３mM S−カルバミル−Ｌ−システインの存在下で、チミン又はチミジンの不在下で増加しうることが示される。形質導入体の他の半数は増殖はできず、β5366株と同様、増殖するにはチミン又はチミジンを必要とする。この表現型間の割合は、valSとnrdD遺伝子座間の遺伝子距離(0.4分) と一致する。このように、低濃度の外からのシステインにより、Cys →Val thyAミスセンス突然変異を抑制することは、バリルtRNAシンテターゼ遺伝子の改変に起因するかもしれない。β5366の形質導入により得られる、３mM S−カルバミル−Ｌ−システインの存在下でチミン又はチミジンの不在下で増殖しうる株の１つ (β5455と称される) のvalS遺伝子座をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、実施例３に記載のようにして配列決定する。ＡのＣへの変換は、222 位のトレオニンのプロリンによる置換を生じ、β5455株のvalS遺伝子の遺伝的改変の確立を確認する。
【００８７】
【実施例６】
バリルtRNAシンテターゼ変異体の非標準アミノ酸に対する感受性
β5455、β8144及びβ8146株を、バリンへの立体的な類似を示す人工的アミノ酸への感受性について試験する。この試験は、チミジンを加えたグルコースMS無機培地を含むシャーレ上で行う。細胞を好気性培地 (グルコースMS型無機培地、0.3mM チミジン) 中で30℃において24時間培養し、MS無機培地中で1/250 に希釈する。この細胞懸濁液0.5ml を、グルコースMS無機培地25mlを含むシャーレ上で平板培養する。次いで、シャーレの中央に窪みを設け、下記のアミノ酸溶液0.1ml で満たす：
(1) 100mM L-2-アミノ酪酸
(2) 100mM L-2-アミノ吉草酸
(3) 100mM L-2,3-ジアミノプロピオン酸
(4)  50mM L-3-チオール-2- アミノ酪酸
次いで、シャーレを30℃において24時間インキュベートし、シャーレ上の窪みの周囲の阻害帯の起こりうる出現を記録する。シャーレ上の増殖阻害の限定された帯域の直径を測定する：
Ｌ−２−アミノ酪酸：5.2cm(β5455) 、5.7cm(β8144) 、6.7cm(β8146);
Ｌ−２−アミノ吉草酸：2.1cm(β5455) 、1.5cm(β8144) 、6.7cm(β8146);
Ｌ−2,3 −ジアミノプロピオン酸：2.3cm(β5455) 、2.7cm(β8144) 、1.9cm ( β8146);
Ｌ−３−チオール−２−アミノ酪酸：2.0cm(β5366) 、4.6cm(β5455) 、4.0cm( (β8144) 、4.0cm(β8146) 。
【００８８】
示した濃度において、Ｌ−２−アミノ酪酸、Ｌ−２−アミノ吉草酸及びＬ−2,3 −ジアミノプロピオン酸は、野生型valS対立遺伝子を含むβ5366株には何ら影響を及ぼさないが、変異valS遺伝子を有する株の増殖は阻害する。Ｌ−３−チオール−２−アミノ酪酸はすべての株の増殖を阻止するが、変異株に対してより顕著な阻止がみられるかもしれない。従って、バリルtRNAシンテターゼ変異体は、野生型形態の酵素により取り込まれることができないアミノ酸をtRNAVal に担当させることを可能にする幅広い特異性を有するかのようである。
【００８９】
【実施例７】
非標準アミノ酸、▲ae▼- アミノ酪酸の、バリルtRNAシンテターゼにおいて変異したE.coli株のタンパク質への導入
β5455株 (実施例５参照) から得られたP1ファージ溶菌液を、▲AE▼ilv CABD欠失とleu 変異 (バリン、イソロイシン及びロイシンに対して栄養要求性とする) を有するCU505 株に形質導入するのに用いた。CU505 株はイェール大学 (米国)Coli Genetic Stock Centerから得た。形質導入体クローンを、カナマイシンLBプレート上で選択し、バリン、イソロイシン及びロイシンの３種のアミノ酸を各々0.3mM 含む固体グルコース(2g/l)MS培地中でアミノ酪酸(3mM) に対する感受性を試験した。形質導入体クローンの約50％がこれらの条件下では増殖できず、これはvalS：T222P 対立遺伝子及び耐性マーカーnrdD::kan(実施例５参照) の共形質導入を示唆する。形質導入体クローンの１つでβ5498と称されるクローンは、バリンの代わりとしてのアミノ酪酸の取り込みを、CU505 と比較して示すために用いた。この２つの株を、Ile-Leu ジペプチドを0.3mM 濃度で及びILe-Val ジペプチドを0.02mM濃度で含むグルコース(2g/l)MS液体培地中で、0.2mM L-アミノ酪酸の存在下か、その類似体の不在下のいずれかで、30℃において培養した。各株に対応する接種物は、Ile-Leu ジペプチドを0.3mM 濃度で、Ile-Val ジペプチドを0.04mM濃度で含有するグルコース(2g/l)MS液体培地での予備培養物に由来した。30℃で24時間後の定常期における培養物(50ml)を遠心により回収した。次いで、各試験について、ペレットを、トリクロロ酸液100g/lの溶液 (10％TCA)25mlに４℃で再懸濁し、遠心し、10％TCA ５mlに再懸濁し、再び遠心し、ペレットを5% TCAに再懸濁し、懸濁液を95℃で30分間インキュベートし、遠心し、ペレットをアセトン５mlに再懸濁し、遠心し、ペレットをアセトン５mlに再懸濁し、遠心し、ペレットをアセトン５mlに再懸濁し、遠心し、そしてペレットを乾燥させた。こうして得られた残渣を、凍結乾燥するためにNH4HCO3 50mM溶液１ml中に溶解した。凍結乾燥物を２g/l フェノールを含む6N塩酸２mlに溶解し、混合物をバイアル中に密封し、次いで110 ℃20時間インキュベートした。次に、水解物のアミノ酸濃度を、Beckman 6300分析器の供給者により推奨される指示に従い、ニンヒドリンを用いた誘導化 (derivatization) により定量した。アミノ酪酸は、アミノ酪酸を培地に添加したときのみ、そしてβ5498株についてのみタンパク質水解物中に検出された。アミノ酪酸の割合はバリンの1/4 量に取って代わり、これは全タンパク質のアミノ酸100 に対してアミノ酪酸残基約５に相当する。２つの培養条件下で２つの株、CU505 とβ5498についての解析の詳細な結果を以下の表に示す。
【００９０】
バリンを制限してアミノ酪酸の存在下又は不在下で培養したバリン要求性の株から抽出されたタンパク質の化学的組成
0004427902.tif 000003
結果はLeu 換算で表わす。
【００９１】
【実施例８】
固体培地での単離のための、ミューテーター株を用いる新規な遺伝暗号変異体の選択
実施例５にその構築について記載したように、プラストミド上にthy A:Val 146 不活性対立遺伝子を発現し、染色体にマーカー▲AE▼nrdD::kan を有するβ5419株を、ミューテーターマーカー▲AE▼mutS::spc を有し、スペクチノマイシン耐性を与えるβ5555株を得るようにスペクチノマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地上で選択する、TAD 株上で回収されたP1ファージ溶菌液を用いて形質導入した。この株のミューテーター表現型が、リファマイシン耐性変異体の頻度の計測により示された。実施例５に記載の実験操作に従い、２〜５mMのＳ−カルバモイル−L −システイン(SCC) の存在下で30℃においてチミジンを含まないグルコース無機培地で増殖しうるクローンを得た。これらのクローンの３つを用いて、P1ファージ溶菌液を調製し、これをβ5366株を形質導入し、実施例５の操作によってカナマイシン耐性について選択するのに用いた。３つの溶菌液のそれぞれについて、約半数の形質導入体が３mM SCCを含む固体グルコース無機培地中で増殖可能であり、これはthy A:C146V ミスセンス対立遺伝子を抑制する変異とマーカーnrdD::kan の近接を示す。３つの株、β5479、β5485及びβ5486のvalS遺伝子座 (それぞれ３つの溶菌液の１つから得たSCC-抑制可能形質導入体に相当する) をPCR により増幅し、実施例３に記載のようにして配列決定した。異なる点突然変異が、３つの株のそれぞれについて見出された。即ち、β5479株ではArg 223 がHis に、β5485株ではVal 276 がAla に、β5486株ではAsp 230 がAsn に変化している。このようにthyAのcys 146 Val ミスセンス変異体の抑制の表現型を示す各クローンは、アミノ酪酸感受性も示す。これらのクローンの各々は、valS遺伝子において異なる点突然変異を有し、E.coliにおけるバリルtRNAシンテターゼの活性を多様化する一手段として選択的スクリーニングを有効にすることが示された。
【００９２】
【参考文献】
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【配列表】
0004427902.tif 000004
0004427902.tif 000005
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