(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離精製されたウロコルチンIII蛋白質であって、前記蛋白質が配列番号３のアミノ酸配列を有するヒト・ウロコルチンIIIであり、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を有し、かつ該受容体を発現する細胞に対してｃＡＭＰ生産を誘導する活性を有することを特徴とするウロコルチンIII蛋白質。
【請求項２】
蛋白質が配列番号２のアミノ酸配列のペプチド前駆体に由来するヒト・ウロコルチンIIIであることを特徴とする請求項１記載のウロコルチンIII蛋白質。
【請求項３】
請求項１記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端が、カルボキシル含有部分、スルホニル基含有部分、及びイソシアン酸塩で構成される群から選択されるアシル化剤で伸長され、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を有し、かつ該受容体を発現する細胞に対してｃＡＭＰ生産を誘導する活性を有することを特徴とするヒト・ウロコルチンIII蛋白質。
【請求項４】
請求項１記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端が、Ｄ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン−グリシン、及びＬ−チロシン−グリシンで構成される群から選択される付加アミノ酸又はペプチドで伸長され、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を有し、かつ該受容体を発現する細胞に対してｃＡＭＰ生産を誘導する活性を有することを特徴とするヒト・ウロコルチンIII蛋白質。
【請求項５】
請求項１記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端が、毒素分子に化学的に架橋され、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を保持していることを特徴とするヒト・ウロコルチンIII蛋白質。
【請求項６】
請求項１記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端が、Ｄ−ヨードチロシン、Ｌ−ヨードチロシン、Ｄ−ヨードチロシン−グリシン、及びＬ−ヨードチロシン−グリシンで構成される群から選択される付加アミノ酸又はペプチドで伸長され、位置１２及び３５のメチオニン残基がＮｌｅで置換され、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を有し、かつ該受容体を発現する細胞に対してｃＡＭＰ生産を誘導する活性を有することを特徴とするヒト・ウロコルチンIII蛋白質。
【請求項７】
ヨードチロシン残基が放射性同位元素125Ｉでラベルされることを特徴とする請求項６記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質。
【請求項８】
請求項１記載のヒト・ウロコルチンIII蛋白質が、Ｉｌｅ9、Ｇｌｙ10、Ｌｅｕ11、Ｌｅｕ12、Ａｒｇ13、Ｇｌｎ13、Ｌｅｕ16、Ｇｌｕ17、Ａｒｇ20、Ｉｌｅ34、Ｌｅｕ35、及びＶａｌ38で構成される群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換基を含み、受容体ＣＲＦ−Ｒ２に対して選択的に結合する活性を有し、かつ該受容体を発現する細胞に対してｃＡＭＰ生産を誘導する活性を有することを特徴とする合成ウロコルチンIII類似物。
【請求項９】
位置１２のメチオニン残基が、Ｎｌｅで置換されることを特徴とする請求項８記載の合成ウロコルチンIII類似物。
【請求項１０】
位置３５のメチオニン残基が、Ｎｌｅで置換されることを特徴とする請求項８記載の合成ウロコルチンIII類似物。
【請求項１１】
請求項８記載の合成ウロコルチンIII類似物及び薬学的に許容される基質で構成される医薬品組成物。
【請求項１２】
病理生理状態を治療するための請求項１１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
病理生理状態が高体温、食欲失調、鬱血性心不全、血管疾患、胃腸機能不全、ストレス、望ましくない低レベルのグルカゴン分泌又は活性、及び不安症で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府の資金援助について）
本発明は一部連邦政府からの資金援助第Ｐ０１−ＤＫ−２６７４１を用いて行われたものである。従って、本発明に対して連邦政府は一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的には神経内分泌学及び神経ペプチド化学の分野に関するものである。より具体的には、本発明はストレスに対する神経内分泌反応及び傍分泌反応の調節に関与する蛋白質因子に関するものである。最も具体的には、本発明はウロコルチンIIIと称されるコルチコトロピン放出因子関連ペプチドを開示するものである。
【０００３】
（関連技術の説明）
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）及びそのペプチド関連ファミリーは当初基底及びストレス条件下でそれらが持つ視床下部−下垂体−副腎軸（ＨＰＡ）の調整機能として認識された（１、２）。コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）はヒツジの視床下部（３）から初めて単離され、下垂体−副腎軸の調節、及びストレスに対する内分泌性、自律神経性、そして行動上の反応において重要な役割を果たすことが示された４１アミノ酸である（４）。神経ペプチドのＣＲＦファミリーはウロコルチン（Ｕｃｎ）、ラットの脳で初めて同定された４０アミノ酸ペプチド（５）、サカナ・ウロテンシンI（Ｕｒｏ）（６）、及び両生類ソーバジン（Ｓｖｇ）（７）のような構造的に関連する哺乳類及び非哺乳類ペプチドも含んでいる。
【０００４】
ＣＲＦファミリーのメンバーは多くの組織で神経内分泌反応及び傍分泌反応に関与すると想定されてきた。それらの下垂体及び中枢神経系への影響に加えて、ＣＲＦファミリーのメンバーはストレスに対する内分泌性、自律神経性、そして行動上の反応を統合するため哺乳類において心臓血管及び胃腸の機能と炎症作用を調節することが示されてきた。これらのペプチドは食欲調節、覚醒、及び認知機能にも関係しているかもしれない。精神的及び生理的に深刻な状態は不安症、拒食症、胃腸機能障害、及び鬱病のようなストレスの長期的影響の結果として生じることがある。
【０００５】
ＣＲＦファミリーのメンバーは高い親和性でＣＲＦレセプタに特異的に結合することによってそれらの生物学的作用を媒介する（８、９）。ＣＲＦレセプタは、アデニル酸シクラーゼを介して作用し、構造的にセクレチン・レセプタ・ファミリーに関連するＧ−蛋白質共役型レセプタである。このファミリーはＧＲＦ、ＶＩＰ、ＰＴＨ、及びカルシトニン・レセプタも含いんでいる。ＣＲＦレセプタは２つの異なる遺伝子、即ちＣＲＦレセプタ・タイプ１（ＣＲＦ−Ｒ１）（１０−１２）及びＣＲＦレセプタ・タイプ２（ＣＲＦ−Ｒ２）（１３−１５）に由来する。ＣＲＦ−Ｒ１とＣＲＦ−Ｒ２は異なる薬理学的特性を有し、解剖学的配置が異なる（１６）。タイプ１ＣＲＦレセプタ（ＣＲＦ−Ｒ１）遺伝子は１３個のエクソンを有しており、このレセプタのスプライス変異体がいくつか見つかっている。ＣＲＦ−Ｒ１は脳全体に分布し、感覚及び運動性中継サイトに見られる（１７）。マウス・タイプ２αレセプタ（ＣＲＦ−Ｒ２α）は側萼片、視床下部内腹側、孤束核、及び縫線背核に分布し、これらはＣＲＦ−Ｒ１がごくわずかに発現するか、あるいは全く発現しない領域である（１８）。マウス・タイプ２βレセプタ（ＣＲＦ−Ｒ２β）は主に心臓、血管、胃腸管、精巣上体、肺、及び皮膚など末梢部に見られる（９、１９）。
【０００６】
この２つのタイプのレセプタの薬理学的特性は、ＣＲＦはＣＲＦ−Ｒ２［Ｋｉ＝５−１００ｎＭ］に対して中程度の親和性を有するが、ＣＲＦ−Ｒ１［Ｋｉ＝１−２ｎＭ］に対しては高い親和性を有するという点で異なっている。コイ・ウロテンシン、カエル・ソ−バジン、及びウロコルチンのような他の関連ペプチドはＣＲＦ−Ｒ１及びＣＲＦ−Ｒ２の両方に対して高い親和性を有する。ＣＲＦ−Ｒ２ノックアウト・マウスはストレス因子に対する過敏性によって引き起こされる不安症状挙動の増大傾向を示す（５、２０）。
【０００７】
最近、公開されたヒトゲノム・データベースの検索によってＣＲＦ神経ペプチド・ファミリーにかなりの配列相同性を持つ領域が同定された。ヒトゲノム配列の全体が増幅され、配列決定された。しかしながら、ヒトゲノム配列にはペプチドのＣ末端プロセシングを可能にするコンセンサス蛋白質分解分裂サイトが欠失しており、従って、ウロコルチン関連ペプチド（ＵＲＰ）配列とみなされる。ヒトゲノム配列から推定される相同プライマーを用いて、予想された３８アミノ酸ペプチドをコードする全脳ポリ（Ａ＋）ＲＮＡからマウスｃＤＮＡが単離されてウロコルチンIIと称され、それは他の周知の哺乳類ファミリー・メンバー、ＣＲＦ、及びウロコルチン（Ｕｃｎ）と構造的に関連している。ヒト・ウロコルチン関連ペプチドがマウス・ウロコルチンII・オルトログに相当するかどうかという問題はさらにマウス遺伝子が同定されるまで未解決である。ウロコルチンIIはタイプ２ＣＲＦレセプタ（ＣＲＦ−Ｒ２）と選択的に結合し、ＣＲＦ−Ｒ１に対しては感知可能な程度の活性を持たない。ウロコルチンIIをコードする転写物は視床下部（傍室核及び弓状核）及び脳幹（青斑）におけるストレス関連細胞群などマウスＣＮＳの個々の領域で発現される。これらの知見はウロコルチンIIを神経ペプチドのＣＲＦファミリーの新しいメンバーとして確認するものであり、それは中枢部に発現し、ＣＲＦ−Ｒ２と選択的に結合する。機能に関する初期の研究は一貫して中枢自律神経、及び食欲の調節におけるウロコルチンIIの関与に関するもので、全般的な行動の活性化におけるものではなかった（２１）。
【０００８】
先行技術はヒト・ウロコルチンIIIの遺伝子及び蛋白質及びそれらの利用について認識が不十分である。本発明は本技術分野における長年のニーズと願望を果たすものである。
【０００９】
（要約）
周知のフグ・ウロコルチンと相同性を有するヒト・ウロコルチンであるヒト・ウロコルチンIII（Ｕｃｎ−III）が公開されたヒトゲノム・データベースから同定された。そのヒト遺伝子の塩基配列からマウス・オルトログが単離された。本発明はこれら新規な遺伝子及びその利用法に関するものである。
【００１０】
１つの形態で、本発明は単離精製されたウロコルチンIII蛋白質に関するものであり、それはマウス・ウロコルチンIIIまたはヒト・ウロコルチンIIIのいずれでもよい。そのマウス・ウロコルチンIII蛋白質は好ましくは配列識別番号Ｎｏ．５のアミノ酸配列を有し、それは配列識別番号Ｎｏ．４の前駆体ペプチド配列に由来する。ヒト・ウロコルチンIII蛋白質は好ましくは配列識別番号Ｎｏ．２の前駆体ペプチド配列に由来する配列識別番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明はまたマウスアミノ酸配列に由来する１個又は２個以上のアミノ酸置換基を含むヒト・ウロコルチンIIIにも関するものである。マウス・ウロコルチンIII（配列識別番号Ｎｏ．５）とヒト・ウロコルチンIII（配列識別番号Ｎｏ．３）の配列では４個のアミノ酸が異なっており、具体的にはＩｌｅ14、Ａｓｐ19、Ｌｙｓ27、及びＧｌｎ33である。ヒト・ウロコルチンIII蛋白質におけるＬｅｕ14残基がＩｌｅに置き換えられていることは特に有用と考えられる。
【００１２】
本発明はまたウロコルチンIII蛋白質からなる医薬品組成物、及びこの医薬品組成物を使って病理生理状態を治療するための方法にも関するものである。この医薬品組成物はＣＲＦ−Ｒ２レセプタを活性化して高体温、食欲失調、鬱血性心不全、血管疾患、ストレス、及び不安症のような病理生理状態を治療するために投与されることもあり得る。
【００１３】
本発明はまたウロコルチンIII蛋白質の修飾にも関している。ウロコルチンIIIのＮ末端はスレオニン−リジン（前駆体蛋白質における先行の２残基）、Ｄ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン−グリシン、又はＬ−チロシン−グリシンのような付加的アミノ酸あるいはペプチドで伸長されてもよい。さらに、配列識別番号Ｎｏ．３の位置１２及び３５のメチオニン残基のようなウロコルチンIIIにおける１個又は２個以上のメチオニン残基はＮｌｅ残基で置換されてもよい。あるいは、Ｎ末端はＤ−ヨードチロシン、Ｌ−ヨードチロシン、Ｄ−ヨードチロシン−グリシン、及びＬ−ヨードチロシン−グリシンで伸長され、位置１２及び３５のメチオニン残基はＮｌｅで置換されてもよい。ヨードチロシン残基は放射性同位元素125Ｉでラベルされてもよい。
【００１４】
ウロコルチンIIIという点で異なる他のウロコルチン及びウロコルチン関連蛋白質に保存されるアミノ酸残基によって付加的な置換基が示唆される。そのようなウロコルチン類似物はＩｌｅ3、Ｎｌｅ3、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ3、Ｉｌｅ5、Ｎｌｅ5、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ5、Ｌｅｕ7、Ｎｌｅ7、Ｔｈｒ8、Ｉｌｅ9、Ｐｈｅ9、Ｇｌｙ10、Ｈｉｓ10、Ｌｅｕ11、Ｎｌｅ11、Ｌｅｕ12、Ｎｌｅ12、Ａｒｇ13、Ｇｌｎ13、Ｎｌｅ14、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ14、Ｎｌｅ15、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ15、Ｌｅｕ16、Ｎｌｅ16、Ｇｌｕ17、Ａｓｐ17、Ａｒｇ20、Ｎｌｅ24、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ24、Ａｒｇ32、Ｉｌｅ34、Ｎｌｅ34、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ34、Ｌｅｕ35、Ｎｌｅ35、Ａｓｐ36、Ｇｌｕ36、及びＶａｌ38で構成される群から選択される１個又は２個以上のアミノ酸置換基を有するウロコルチンIIIで構成することができる。
【００１５】
本発明はまた、最初から５個から８個までのＮ末端アミノ酸が除去されたウロコルチンIII蛋白質又はウロコルチンIII類似物から成るＣＲＦ−Ｒ２レセプタ拮抗物質にも関している。この拮抗物質は医薬品組成物に組み込まれ、鬱血性心不全、血管疾患、胃腸機能不全、及び片頭痛の治療あるいは血管新生抑止剤として使うことができる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施の形態では、ウロコルチンIIIはまた、蛍光ラベル又は放射性核種に対する錯化剤を含むために修飾される。その結果ラベルされたウロコルチンIIIはウロコルチンIIIレセプタを発現する細胞を同定するために使うことができる。あるいは、ウロコルチンIIIは毒素分子に結合されてもよい。
【００１７】
本発明のさらに別の実施の形態では、ウロコルチンIIIに対抗する抗体が提供される。より好ましい実施の形態では、その抗体はモノクローナル抗体である。その抗体は蛍光ラベル、光親和性ラベル、または放射性標識のような分子ラベルに接合されることがある。あるいは、その抗体は免疫毒素を形成するため細胞毒性化合物に接合されることもあり得る。
【００１８】
（本発明の詳細な説明）
本発明では、すべてこの技術分野の技術範囲内の通常の分子生物学、微生物学、そして組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術については文献で十分に説明されている。例えば、Maniatis, Fitsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins Eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S. J. Higgins Eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)参照。その他に用いられる技術として、ペプチド合成（Stewart, J. M.; Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis. In Solid Phase Peptide Synthesis; Eds.; Pierce Chemical Co.: Rockford, IL, 1984; V. pp 176）、分析化学（Miller, C.; Rivier, J. Peptide chemistry: Development of high-performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis.  Biopolymers 1996, 40, 265-317）、構造活性相関方式（特にＮＭＲ、ＣＤ、Ｘ線結晶学を使ったｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験と構造分析を含む）（Gulyas, J.; Rivier, C.; Perrin, M.; Koerber, S. C.; Sutton, S.; Corrigan, A.; Lahrichi, S. L.; Craig, A. G.; Vale, W. W.; Rivier, J. Potent, structurally constrained agonists and competitive antagonists of corticotropin releasing factor (CRF). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92, 10575-10579）が考えられる。
【００１９】
従って、本明細書で使われた場合、以下の用語は以下に述べるような定義を有するものとする。
【００２０】
本明細書で使われる場合、『ｃＤＮＡ』という用語は遺伝子のｍＲＮＡ転写のＤＮＡコピーを意味する。
【００２１】
本明細書で使われる場合、『誘導アミノ酸配列』という用語はｃＤＮＡ内のヌクレオチド塩基の三連配列を読み取ることで判定されるアミノ酸配列を意味するものとする。
【００２２】
本明細書で使われる場合、『ライブラリをスクリーニングする』という用語は、適切な条件下で、特定のＤＮＡライブラリ内に存在しているプローブに対して相補的な配列が存在しているかどうかを調べるためにラベルされたプローブを用いることを指している。さらに、『ライブラリをスクリーニングする』ことはＰＣＲによっても行なうことができる。
【００２３】
本明細書で使われる場合、『ＰＣＲ』という用語はMullisに対する米国特許第４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２及びこの技術分野で周知の他の改良の主題であるポリメラーゼ連鎖反応を指している。
【００２４】
すべてのアミノ酸残基配列は、本明細書においては、左から右への向きがアミノ末端からカルボキシ末端への向きを示す通常の方式で示されている。さらに、アミノ酸残基配列の開始点あるいは終点のダッシュは１つ以上のアミノ酸残基の別の配列へのペプチド結合を示している。
【００２５】
ここに述べられているアミノ酸は好ましくは『Ｌ』異性体形態である。しかしながら、『Ｄ』異性体形態の残基も、ポリペプチドによって免疫グロブリン結合の望ましい機能的特性が保持される限り、いずれかのＬアミノ酸残基で置換することができる。ＮＨ２とはポリペプチドのアミノ末端に存在している遊離アミノ基を指している。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基である。標準的なポリペプチドの専門用語、J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) に従い、アミノ酸残基の略語はこの技術分野で周知である。
【００２６】
既存のアミノ酸の化学的修飾あるいは蛋白質／ペプチドのデノボ合成によって非標準的なアミノ酸を蛋白質に組み込むことができる。非標準的アミノ酸とは、化学構造が遺伝子コードでコードされる２０種類の標準的なアミノ酸とは異なるアミノ酸を指している。ｉｎ  ｖｉｖｏでの翻訳後の修飾も蛋白質内での非標準的なアミノ酸あるいはアミノ酸誘導体の存在をもたらす場合がある。１つの蛋白質のＮ末端ＮＨ２基とＣ末端ＣＯＯＨ基は、例えば、蛋白質の自然の、あるいは人為的翻訳後修飾によって修飾される場合もある。
【００２７】
蛋白質／ペプチドはアミノ酸置換によっても修飾できる。多くの場合、何らかの変化が蛋白質／ペプチドの活性（作用物質対拮抗物質）及び有効性／親和性の大幅な変化につながる場合があるが、逆にほとんど、あるいは全く影響を及ぼさない場合もある。保存性置換が蛋白質の活性を劇的に変えることは殆どない。『保存性アミノ酸置換』とは１つのアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸と取り替えること、つまり、非極性アミノ酸を他の非極性アミノ酸と置換すること、極性アミノ酸を他の極性アミノ酸と置換したり、酸性残基を他の酸性アミノ酸と置換したりすることなどを意味する。好ましい保存性置換の例を表１に示す。
【００２８】
【表１】
保存性アミノ酸置換
0004472256.tif 000002
Sar＝サーカシン、Nal＝ナフチルアラニン、Cpa＝４−クロロフェニルアラニン
【００２９】
『化学的誘導体』とは、官能側基の反応によって化学的に誘導された１つ以上の残基を有するポリペプチドを指している。こうした誘導ポリペプチドには、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて特定の塩類を形成しているもの、あるいは特にアルキル化及び／またはアシル化、ｐ−トルエン・スルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロシカルボニル基、クロロアセチル基、ホルミル基、あるいはアセチル基によって誘導体化されたものが含まれる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、有機あるいは無機塩類、メチル及びエチル・エステルあるいはその他のタイプのエステル又はヒドラジド、そして好ましくはアミド類（１次あるいは２次）を形成している場合もある。化学的誘導体は上記２０の標準的アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を１種以上含むペプチドを含んでいる場合もある。例えば、４−ヒドロキシプロリンをセリンで置換してもよく、オルニチンをリシンと置換してもよい。本発明の範囲に含まれるペプチドはその修飾ペプチドが必要な生物学的活性を維持している限り、その配列がここに示されているような特定のペプチドに関して１つ以上の残基が追加されていたり、あるいは欠失しているペプチドも含んでいる。
【００３０】
『レプリコン』とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自立的単位として機能する、つまりそれ自体の制御下で複製を行なうことができるすべての遺伝子要素（例えば、プラスミド、クロモソーム、ウィルス）である。
【００３１】
『ベクター』とは、別のＤＮＡセグメントを取り付けて、その取り付けられたセグメントの複製を起こさせることができるプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンである。
【００３２】
『ＤＮＡ分子』とは、１本鎖あるいは２重鎖らせんのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体の形状をとったものを意味する。この用語はその分子の一次及び二次構造のみを指しており、どの三次形態にも限定するものではない。従って、この用語は特に線形ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、そしてクロモソームなどに見られる二本鎖ＤＮＡを含んでいる。以下の検討では、構造はＤＮＡの非転写ストランド（つまり、ｍＲＮＡに相同の配列を有するストランド）に沿って５’末端から３’末端の方向の配列だけを示すという通常の方式に基づいて説明が行われる。
【００３３】
『複製の発生源』とはＤＮＡ合成に参加するＤＮＡ配列を指している。
【００３４】
ＤＮＡ『コード配列』とは、適切な調節配列の制御下に置かれるとｉｎ  ｖｉｖｏで転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列を指している。上記コード配列の境界は５’(アミノ）末端の開始コドンと３’(カルボキシル）末端によって決められる。コード配列は原核性配列、真核性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核性（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノム性ＤＮＡ配列、あるいは合成ＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。ポリアデニル化信号と転写停止配列は通常３’からコード配列の方向に配置されている。
【００３５】
転写及び翻訳制御配列はプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化信号、ターミネータなどホスト細胞内でコード配列の発現をもたらすＤＮＡ調節配列である。
【００３６】
『プロモータ配列』とは細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方向）コード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ配列はその転写開始サイトによってその３’末端を境界としており、上流方向（５’末端方向）に延びてバックグランドと対比して検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は元素を含んでいる。プロモータ配列内には転写開始サイトとＲＮＡポリメラーゼの結合に関与している蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核性プロモータは、常にではないが、多くの場合“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる。原核性プロモータは−１０及び−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガノ配列を含んでいる。
【００３７】
『発現制御配列』とは別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコード配列をｍＲＮＡに転写して、それが次にそのコード配列でコードされる蛋白質内に翻訳される場合に細胞内で転写及び翻訳制御配列の『制御下』に置かれている。
【００３８】
『信号配列』はコード配列の近くに取り込むことができる。この配列はホスト細胞にそのポリペプチドを細胞表面に向かわせるか、あるいは上記ポリペプチドを媒体内に分泌させるように伝える信号ペプチドで、Ｎ末端からそのポリペプチドまでをコードし、この信号ペプチドはその蛋白質が上記細胞を去る前にホスト細胞によってクリップ・オフされる。信号配列は原核生物あるいは真核生物に天然に存在している種々の蛋白質と結合した形態で見出される場合がある。
【００３９】
本発明のプローブについて言及する際に用いられる『オリゴヌクレオチド』という用語は２つ以上、好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドによって構成される分子と定義される。その正確なサイズはそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能及び使用法に依存する多数の因子に依存する。
【００４０】
ここで使われる場合、『プライマー』という用語は、精製された制限消化物の場合のように自然発生的なものであれ、合成されたものであれ、核酸ストランドに対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に、つまり、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在下で、適切な温度及びｐＨの環境下に置かれた場合に合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを示している。このプライマーは１本鎖でも二本鎖のいずれであってもよく、上記誘発剤の存在下で望ましい伸長生成物の合成を開始できるのに十分な長さでなければならない。このプライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源、その利用法などを含む多くの要因に依存する。例えば、診断目的の応用の場合、標的配列の複雑さによって、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５−２５個、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるが、それ以下の場合もある。
【００４１】
これらのプライマーはこの場合、特定の標的ＤＮＡ配列の種々のストランドと『ほぼ』相補的であるように選択される。このことは、これらのプライマーがそれらそれぞれのストランドとハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味している。従って、このプライマー配列はそのテンプレートの正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド・フラグメントをプライマーの５’末端に取り付けて、そのプライマー配列の残りをそのストランドに対して相補的にするようにしてよい。あるいは、そのプライマー配列がその配列と十分な相補性を有していたり、それとハイブリダイズしてそれによって伸長生成物合成のためのテンプレートを形成するのであれば、非相補的な塩基、より長い配列をそのプライマー内に組み込むこともできる。
【００４２】
ここで使われるように、『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』という用語は、それぞれ特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を指している。
【００４３】
ＤＮＡが細胞内に導入された場合に、その細胞は外因性あるいは異種ＤＮＡによって『形質転換』されている。形質転換ＤＮＡはその細胞のゲノムに一体化（共有結合）される場合もあるし、されない場合もある。例えば、原核生物、イースト菌及び哺乳動物の細胞においては、上記形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム性エレメント上に保持される場合もある。真核性細胞に関して言えば、安定的に形質転換される細胞とは、上記形質転換ＤＮＡがクロモソームと一体化されて、クロモソームの複製を通じて娘細胞によって継承されるものである。この安定性は上記形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の群で構成される細胞株あるいはクローンを確立することができる真核性細胞の能力によって示される。『クローン』とは、単一の細胞あるいは有糸分裂によって原種から誘導された細胞の群である。『細胞株』とは多くの世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定的な成長をすることができる一次細胞のクローンである。
【００４４】
少なくとも、ヌクレオチドの約７５％（好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％あるいは９５％）がＤＮＡ配列の限定された長さ上で一致する場合に２つのＤＮＡ配列は『ほぼ相同』である。ほぼ相同の配列は配列データ・バンクで利用できる標準ソフトウエアを用いてそれらの配列を比較するか、例えば、その具体的な系に対して定義されるような厳格な条件の下で、サザーン・ハイブリダイゼーション実験を行なうことによって確認することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は当業者の知るところである。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra参照。
【００４５】
ＤＮＡ構成物の『異種』領域とは自然ではそれより大型の分子と結合した状態では見いだされない大型ＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。従って、上記異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常供給源生物のゲノムでは哺乳動物ゲノム性ＤＮＡを側鎖しないＤＮＡによって側鎖されている。別の例で、上記コード配列は、そのコード配列事態が自然では見られない構成物（例えば、そのゲノム性コード配列がイントロンあるいは天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列を含んでいるｃＤＮＡなど）である。対立遺伝子変種あるいは自然発生的突然変異事象はここで定義されているようなＤＮＡの異種領域は発生させない。
【００４６】
これらの研究に最も一般的に用いられるラベルは放射性元素、酵素、紫外線を受けると蛍光を発する化学物質、その他である。多数の蛍光性物質が知られており、ラベルとして利用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー、そしてルシフェル・イエローなどがある。特定の検出物質はヤギ内でつくられ、イソチオシアネートを通じてフルオレセインと接合した抗ウサギ抗体である。
【００４７】
この技術分野で開発、利用されている１つの具体的なアッセイ・システムはレセプタ・アッセイとして知られている。レセプタ・アッセイにおいては、アッセイされる物質を適切にラベルして、そして、その後、一定の細胞テストコロニーが一定量のラベルされた物質とラベルされてない物質の両方で接種され、その後ラベルされた物質がその細胞レセプタに結合する程度を判定するために結合調査が行なわれる。このようにして、物質間の親和性の違いを確認することができる。
【００４８】
ここで使われる場合、『ホスト』という用語は原核生物だけでなく、イースト菌、植物及び動物細胞などの真核生物もその意味に含んでいる。本発明による蛋白質をコードする組み換え体ＤＮＡ分子あるいは遺伝子を用いて、この技術分野の当業者に一般的に知られている技術のいずれかを用いてホストを形質転換させることができる。原核性ホストには大腸菌、Ｓ．チムフィルリウム(S. tymphimurium)、セラチア・マルセスセンス(Serratia marcescens)、及びバシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)などが含まれる。真核性ホストにはピチア・パストリス(Pichia pastoris)、哺乳動物細胞及び昆虫細胞などがある。
【００４９】
一般的に、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的転写を促進するプロモータ配列を含む発現ベクターはそのホストとの組み合わせで用いられる。発現ベクターは通常、複製の発生源、プロモータ、ターミネータ、そして形質転換された細胞内で表現形選択を行なうことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質転換されたホストは最適な細胞成長を行なわせるために、この技術分野で周知の手段を用いて発酵、培養させることができる。
【００５０】
適切な転写性及び翻訳性制御信号を含む発現ベクターを構成するために、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N. Y.参照。遺伝子とその転写制御配列は、その転写制御配列がその遺伝子の転写を有効に制御できる場合に、『操作可能に結合されている』と定義される。本発明のベクターには、それらに限定されないが、プラスミド・ベクター及びウイルス性ベクターなどが含まれている。
【００５１】
本発明の１つの実施の形態で、単離精製されたウロコルチンIII蛋白質が提供される。この蛋白質はヒトあるいはマウスのウロコルチンIII蛋白質のどちらであってもよい。ヒト蛋白質はフグ・ウロコルチンとかなりの配列相同性を有するヒトＥＴＳ、遺伝子バンク登録番号ＡＷ２９３２４９によって部分的に構成されたＤＮＡによってコードされる。
【００５２】
本発明の別の実施の形態は配列識別番号Ｎｏ．２の前駆体ペプチドによってコードされるヒト・ウロコルチンIIIを対象としている。翻訳後修飾を行なった後、上記精製されたヒト・ウロコルチンIIIは好ましくは配列識別番号Ｎｏ．３に対応するアミノ酸配列を有している。
【００５３】
本発明はまたウロコルチンIII蛋白質の修飾も対象としている。上記ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端はカルボキシル含有部分、スルホニル含有部分、及びイソシアネートなどのアシル化剤で修飾することができる。あるいは、ウロコルチンIIIのＮ末端は毒素分子に化学的に架橋することもできる。ウロコルチンIIIのＮ末端はＤ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン−グリシン、あるいはＬ−チロシン−グリシンなどの付加的アミノ酸又はペプチドを用いて伸長させることもできる。加えて、配列識別番号Ｎｏ．３の位置１２及び３５などのウロコルチンIIIの１つ以上のメチオニン残基をＮｌｅで置換することも可能である。あるいは、Ｎ末端をＤ−ヨードシロシン、Ｌ−ヨードチロシン、Ｄ−ヨードチロシン−グリシン、及びＬ−ヨードチロシン−グリシンで伸長させたり、位置１２及び３５のメチオニン残基をＮｌｅで置換してもよい。ヨードチロシンは125Ｉでラベルすることもできる。
【００５４】
本発明の別の実施の形態で、ウロコルチンIII蛋白質で構成される医薬品組成物とその医薬品組成物を用いて病理生理状態を治療するための方法が提供される。この医薬品組成物は、例えば、個人のＣＲＦ−Ｒ２レセプタを活性化させるために投与することができ、従って、高体温、食欲失調、鬱血性心不全、血管疾患、ストレス、及び不安症などの種々の病理生理状態を治療することができる。
【００５５】
本発明の別の実施の形態はウロコルチンIII蛋白質の修飾を対象としたものである。ウロコルチンIIIのＮ末端はＤ−シロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン−グリシン、及びＬ−チロシン−グリシンなどの付加的なアミノ酸又はペプチドで伸長させることができる。さらに、配列識別番号Ｎｏ．３の位置１２及び３５などでウロコルチンIIIの１つ以上のメチオニン残基をＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕあるいは好ましくはＮｌｅ残基で置換することもできる。さらに、Ｎ末端をＤ−ヨードシロシン、Ｌ−ヨードチロシン、Ｄ−ヨードチロシン−グリシン、及びＬ−ヨードチロシン−グリシンで伸長させたり、位置１２及び３５のメチオニン残基をＮｌｅで置換してもよい。ヨードチロシンは125Ｉでラベルすることもできる。
【００５６】
他のウロコルチン及びウロコルチンIIIが異なっているウロコルチン関連蛋白質に保存されているアミノ酸残基による別の置換も示唆される。こうしたウロコルチン類似物は、Ｉｌｅ3、Ｎｌｅ3、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ3、Ｉｌｅ5、Ｎｌｅ5、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ5、Ｌｅｕ7、Ｎｌｅ7、Ｔｈｒ8、Ｉｌｅ9、Ｐｈｅ9、Ｇｌｙ10、Ｈｉｓ10、Ｌｅｕ11、Ｎｌｅ11、Ｌｅｕ12、Ｎｌｅ12、Ａｒｇ13、Ｇｌｎ13，Ｎｌｅ14、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ14、Ｎｌｅ15、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ15、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ16、Ｌｅｕ16、Ｎｌｅ16、Ｇｌｕ17、Ａｓｐ17、Ｎｌｅ18、Ｌｅｕ18、Ａｒｇ20、Ｎｌｅ24、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ24、Ａｒｇ32、Ｉｌｅ34、Ｎｌｅ34、ＣαＭｅ−Ｌｅｕ34、Ｌｅｕ35、Ｎｌｅ35、Ａｓｐ36、Ｇｌｕ36、及びＶａｌ38で構成される群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換基を有するウロコルチンIIIによって構成することができる。
【００５７】
本発明のさらに別の実施の形態においては、ＣＲＦ−Ｒ２拮抗物質が提供される。この拮抗物質はその蛋白質の最初の５つから８つのＮ末端アミノ酸が欠失しているウロコルチンIII蛋白質又はウロコルチンIII類似物で構成されている。この拮抗物質は医薬品組成物に組み込んで、鬱血性心不全、血管疾患、胃腸機能不全、糖尿病、及び片頭痛などの治療に用いることもできるし、あるいは血管新生抑止剤として用いることもできる。
【００５８】
本発明のさらに別の実施の形態で、蛍光性ラベルあるいは放射性核種のための錯化剤を含むようにウロコルチンIIIを修飾することができる。得られるラベルされたウロコルチンIIIはウロコルチンIIIレセプタを発現する細胞を識別するために用いることができる。さらに、ウロコルチンIIIを毒素分子に結合させることもできる。
【００５９】
本発明のさらに別の実施の形態で、ウロコルチンIIIに抗体が提供される。１つの好ましい実施の形態においては、上記抗体はモノクローナル抗体である。この抗体を蛍光性ラベル、光親和性ラベル又は放射性マーカーなどの分子ラベルに接合することもできる。
【００６０】
【実施例】
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明するためのもので、いかなる意味でも本発明の限定を意図するものではない。
【００６１】
実施例１
ヒト・ウロコルチンIIIの同定
遺伝子バンク(Genbank）のヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースをウロコルチンに関連したフグ（Takifugu ribripes）配列（Genbank登録番号ＡＪ２５１３２３）関連ウロコルチン（ウロコルチン関連ペプチド、ＵＲＰ）をプローブとして用いて検索した。この検索で、上記フグ・ウロコルチンに対し、かなりの配列相同性を有するヒトＥＳＴ，Genbank登録番号ＡＷ２９３２４９が確認された。ヒト・ウロコルチンIとヒト・ウロコルチンIIの配列相同性比較は、この配列がウロコルチンIIIと命名された新しいヒト・ウロコルチンをコードすることを明らかにした。この部分的ヒトＥＳＴは前駆体配列と、上記成熟したペプチド領域の最初の２９のアミノ酸を含んでいた。５’−ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＣＡＣＣＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ−３’（配列識別番号Ｎｏ．１６）及び５’−ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ−３’（配列識別番号Ｎｏ．１７）を含むこのヒトＥＳＴ配列を用いて、ウロコルチンIIIに対してネストされたプライマーを設計した。これらのプライマーをネストされアンカーされたプライマーと共に用いてＰＣＲでHuman GenomeWalker Kit (Clontech)によるスクリーニングを行なった。ネストされたＰＣＲは１サイクルを９５℃で５分間変性させ、ついで６６℃で１２分間配列伸長させるステップで構成されるものとして３５サイクル行なった。増幅されたフラグメントをｐＣＲＩＩＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローンして、配列決定したところ、全長成熟ペプチドをコードすることが分かった。
【００６２】
Ｃ末端での配列情報を伸長させるために、部分的ヒトＥＳＴ配列に基づいてプライマーを設計した。ＰＣＲによってhuman GenomeWalker Kit (Clontech)をスクリーニングするために。ヒト・ゲノムＤＮＡのライブラリー・プールを、ネストされたＰＣＲ方式で遺伝子固有の固定されたプライマーを用いてスクリーニングした。推定ペプチドに対する蛋白質をコードする全長ヒト遺伝子を同定した。ウロコルチンIII（ＵｃｎIII）と命名されたこの蛋白質は知られている他のＣＲＦファミリー・メンバーとの関連性を有している。
【００６３】
実施例２
ハイブリダイゼーション・スクリーニングによるマウス・ウロコルチンIIIの同定
全長ヒト・ウロコルチンIII配列に基づいて、マウス・オルソログを調べるために、上記成熟ペプチド領域にまたがる１４４塩基対プローブを発生させた。このプローブを用いて、低厳格度ハイブリダイゼーションによってマウス・ゲノム性λＦＩＸIIライブラリ（Stratagene）をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは２０％ホルムアミド／５ＸＳＳＣ／５Ｘ Denhardts／０．５％ＳＤＳ／５％硫酸デキストラン内で４２℃の温度で一昼夜行なった。１ＸＳＳＣ内で５５℃の温度で洗浄を行なった。精製されたプラークをpBluescript内にサブクローンして、配列決定した。全長マウス・ゲノム性クローンが同定され、配列決定された。マウス・ゲノム配列から設計されたプライマーを用いたＰＣＲによって全脳ｃＤＮＡから、マウス・ウロコルチンIIIｃＤＮＡが単離された。ＰＣＲは５５℃で３５サイクル行なわれ、さらに７２℃で２分間伸長させた。
【００６４】
実施例３
ヒト及びマウス・ウロコルチンIII遺伝子の分析
ヒト及びマウス・ウロコルチンIII遺伝子は両方とも翻訳のための２つの開始可能サイトを有している。ヒト遺伝子のヌクレオチド配列は用いられるＮ末端メチオニンに基づいて、１６１か１５９のいずれかのアミノ酸と推定される蛋白質をコードし、Netstart 1.0予想サーバー（２２）（図２Ａ）によれば、最初のメチオニンの方が優先される。マウス遺伝子は１６４か１６２のいずれかのアミノ酸前駆体と推定される蛋白質をコードし、第１のメチオニンで開始される翻訳の方が優先される（図２Ｂ）。ヒト遺伝子に対するＬｙｓ１１９のＣ末端側での切断、ついでマウス・ウロコルチンIIIに対するＬｙｓ１２２のＣ末端側での切断によって、推定３８アミノ酸成熟ペプチドを発生させるための前駆体分子の処理が起きると予想される。従って、ウロコルチンIIIはウロコルチン及びマウス・ウロコルチンIIの場合と同様、一塩基残基での処理に関する規則（２３）に合致する。Ｃ末端配列は１対の塩基性残基、ヒトの場合は（Ｒ−Ｋ）、そしてマウスの場合は（Ｋ−Ｋ）を含んでおり、その前にグリシンがあり、Ｃ末端アミド化に関与していると推定される。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIペプチドの予想される成熟ペプチド領域をボックスに入れて示してある（図２Ａ及び２Ｂ）。ヒト・ウロコルチンIIIとマウス・ウロコルチンIIIの成熟ペプチド領域は４つのアミノ酸残基が違っているだけであるから、それらは真正相同性（orthologous）である可能性が高い。これらの配列は遺伝子バンク・データベースにデポジットされた[登録番号ＡＦ３６１９４３（ヒト・ウロコルチンIII）及びＡＦ３６１９４４（マウス・ウロコルチンIII）]。
【００６５】
実施例４
ウロコルチンIIIと他のＣＲＦファミリー・メンバーとの比較
図２Ｃで、ヒト・ウロコルチンIII配列の３８アミノ酸成熟ペプチド領域を他のファミリー・メンバーと比較した。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIはマウス・ウロコルチンIIに対して４０％の同一性を有している。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIは、ヒトＵＲＰに対しては３７％の同一性を有している。それらとウロコルチン及びＣＲＦとの関連性はもっと遠い。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIはヒト・ウロコルチン及びマウス・ウロコルチンに対してはそれぞれ２１％と１８％の同一性を有している。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIはヒト／ラットＣＲＦに対してはそれぞれ３２％及び２６％の同一性を有している。哺乳動物のウロコルチンII及びIIIはＣＲＦファミリーの別個の、しかし関連性を有する進化ブランチのようであり、哺乳動物ウロコルチンあるいはＣＲＦに対してより２つのフグ・ウロコルチンとの結びつきの方が強いようである（図２Ｄ）。今日までのところ、遺伝子バンク・データベースに３つのＣＲＦ−族関連フグ配列が存在している。アミノ酸レベルでは、フグ・ウロコルチン関連ペプチド（ＵＲＦ）（Genbank登録番号Ｎｏ．ＡＪ２５１３２３）がヒト及びマウス・ウロコルチンIIIの両方と最も密接に関連しており(７６％の同一性)、ヒトＵＲＰ（４２％）及びマウス・ウロコルチンII（３７％）に対しては関係がやや遠い。第２のフグ・ウロコルチン配列（Genbank登録番号Ｎｏ．ＡL１７５１４３）も他の哺乳動物ＣＲＦファミリー・メンバーと比較してウロコルチンIII（５３％）により高い関連性を有している。第３のフグ・ペプチド（Genbank登録番号Ｎｏ．ＡＬ２１８８８６９）はサカナ・ウロコルチンIと最も類似しており、ヒラメ・ウロコルチン（６３％）に対するアミノ酸同一性が最も高い。
【００６６】
実施例５
ウロコルチンIIIの合成
ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIを４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂とBoc方式（２４）を用いて、固相方式で手作業で合成した。トリフルオロ酢酸（ジクロロメタンにＴＦＡ６０％）を用いてBoc基を除去した。ジイソプロピルカルボジイミドを用いて主鎖組み立てを行なった。このペプチドをフッ化水素酸内で切断、脱保護化して、ＲＰ−ＨＰＬＣと３溶媒系（トリエチルアンモニウム・ホスフェートｐＨ２．２５及びｐＨ６．５及び／又は０．１％ＴＦＡ）を用いて精製した（２５）。独立のＨＰＬＣ及び毛管ゾーン電気泳動基準を用いて調べたところ、ペプチドの純度は９５％以上であった。質量分光分析でこの調製物の組成を確認した。
【００６７】
上に述べた合成ウロコルチンIII（計算質量４１３６．３４、実際値４１３６．２）に加えて、同じ方法で以下の類似物を構成した。［Ｔｙｒ−Ｇｌｙ］−ウロコルチンIII（計算質量４３５６．３４、実際値４３５６．３）；[Ｎｌｅ12、35]−ウロコルチンIII（計算質量４１００．３４、実際値４１００．２）；[Ｔｙｒ０、Ｎｌｅ12、35]−ウロコルチンIII（計算質量４２６３．４１、実際値４２６３．２）、及び[Ｔｙｒ−Ｇｌｙ０、Ｎｌｅ12、35]−ウロコルチンIII（計算質量４３２０．４３１、実際値４３２０．４）。
【００６８】
実施例６
ウロコルチンIII結合アッセイ
合成されたウロコルチンIIIのＣＲＦ−Ｒ１、ＣＲＦ−Ｒ２α及びＣＲＦ−Ｒ２βレセプタに対する結合能力をそれぞれのレセプタ・タイプを安定して発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞から採取した125Ｉ[Ｔｙｒ0、Ｇｌｕ1、Ｎｌｅ17]ソーバジンの競合的置換によって評価した。安定的にトランスフェクトされたＣＲＦ−Ｒ２αを発現する細胞株はNeurocrine Biosciences Inc.のDemitri Grigoriadis氏から提供を受けた。クローンされたヒトＣＲＦ−Ｒ１あるいはマウスＣＲＦ−Ｒ２βのいずれかを安定的に発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞から、粗膜画分をこれまでに述べられている手順に基づいて作成した（５）。アッセイ用緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓ／２ｍＭＥＧＴＡ／０．１％ＢＳＡ／１０％サクロース、ｐＨ７．６）に希釈した供試ペプチド及びラジオ・リガンド、[125ＩＴｙｒ0、Ｇｌｕ1、Ｎｌｅ17]ソーバジンを０．１％ポリエチレンイミンで予備コーティングしたＭＡＧＶ微量滴定プレート内で粗膜画分（１０μg）と結合させた。室温で９０分間放置した後、その反応混合物をろ過して、アッセイ緩衝液で２度洗浄した。このラジオリガンド錯体をガンマー・カウンティングで定量した。抑制結合定数Ｋj'ｓをＧＲＡＰＨＰＡＤで定量した。ウロコルチンII及びウロコルチンIIIのＣＲＦ結合蛋白質（ＣＲＦ−ＢＰ）に対する親和性を文献（２６）に述べられている手法で[Ｄ125ＩＴｙｒ0]−ｈＣＲＦの置換に基づいて推定した。
【００６９】
少なくとも３回の実験から得られたデータを集計して、Graphpad PrismプログラムＥＣ50値を用いて抑制解離乗数(Ｋｊ)値を計算した。それらの常用対数(log10)値の平均を計算して、べきを求め、平均ＥＣ50値を求めた。常用対数(log10)値の標準偏差を計算し、累乗しエラー因子を求めた。計算されたＥＣ50値をそのエラー因子で割るか掛けて、それぞれ誤差下限及び上限を判定した。
【００７０】
結合親和性及びヒトＣＲＦ−Ｒ１、ラットＣＲＦ−Ｒ２α及びマウスＣＲＦ−Ｒ２βを安定して発現する細胞でのｃＡＭＰ蓄積を刺激する能力の比較結果を表２に示す。ウロコルチンはＣＲＦ−Ｒ１に対する結合においてはウロコルチンIIあるいはウロコルチンIIIのいずれよりもはるかに強力である。ウロコルチンII及びウロコルチンIIIの両方とも、ＣＲＦ−Ｒ１と比較して、ＣＲＦ−Ｒ２の両方のスプライス変種に対して選択的に結合した。ヒト・ウロコルチンIIIはウロコルチンあるいはウロコルチンIIと比較していずれのタイプ２レセプタに対しても親和性はかなり低かった。マウス・ウロコルチンIIIはヒト・ウロコルチンIIIと比較してマウスＣＲＦ−Ｒ２レセプタに対してかなり高い親和性を示す。ウロコルチンIIとウロコルチンIIIの両方とも、ＣＲＦ−Ｒ２αと比較してＣＲＦ−Ｒ２βに対してやや高い親和性を示す。ヒト・ウロコルチンIIIと比較してマウス・ウロコルチンIIIの能力が高いことはヒトＣＲＦ−Ｒ２αに対する結合においても観察される（データ示さず）。
【００７１】
【表２】
0004472256.tif 000003
【００７２】
実施例７
レセプタ・トランスフェクトされた細胞におけるアデニレート・サイクラーゼの活性化
ヒトＣＲＦ−Ｒ１あるいはマウスＣＲＦ−Ｒ２で安定的にトランスフェクトされたチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞を４８ウェル組織培養皿（Costar）に入れて、２４時間再生させた。措置の少なくとも２時間前に培地をＤＭＥＭ／０．１％ＦＢＳに交換した。細胞を０．１ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチンで３０分間予備培養して、その後、ペプチドに３７℃の温度で２０分間露出させた。ＣＲＦ−Ｒ１あるいはＣＲＦ−Ｒ２で安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞内の細胞内ｃＡＭＰ蓄積をレセプタ活性化の尺度として用いた。ウロコルチンIIとウロコルチンIIIの両方とも、ＣＲＦ−Ｒ１を活性化させる能力は非常に低かった（＞１００ｎＭ）が、これはそのＥＣ50が〜０．１５ｎＭであるウロコルチンのそれとは非常に対照的である。ウロコルチンIIIは非常に高い用量（１μＭ）でもＣＲＦ−Ｒ１の活性化は示さなかった。ＣＲＦ−Ｒ２α及びＣＲＦ−Ｒ２βを活性化させるウロコルチンII及びウロコルチンIIIの能力はほぼ同じで、ウロコルチンのそれとほぼ同じであった。従って、ｃＡＭＰ刺激アッセイにおいては、ウロコルチンIIとウロコルチンIIIの両方ともＣＲＦ−Ｒ２とＣＲＦ−Ｒ１に対する感作性を示すが、ＣＲＦ−Ｒ２α及びＣＲＦ−Ｒ２βに対する優先性はない。従って、ＣＲＦ−Ｒ２を機能的に活性化させるマウス及びヒトのウロコルチンIIとウロコルチンIIIの相対的能力はヒト・ウロコルチンIIIのＣＲＦ−Ｒ２に対する結合親和性が低いにもかかわらず重複している。
【００７３】
実施例８
内生レセプタを発現する細胞におけるアデニレート・サイクラーゼの活性化
内生ＣＲＦ−Ｒ１を発現する細胞（培養一次前下垂体細胞（５））あるいはＣＲＦ−Ｒ２βを発現する細胞（Ａ７ｒ５細胞（２７））におけるアデニレート・サイクラーゼを活性化するウロコルチンII及びウロコルチンIIIの能力について調べた。ラット大動脈平滑筋細胞、Ａ７ｒ５を４８ウェル培養皿に入れて、４８時間かけて通常の状態に回復させた。実験を開始する前に細胞を一昼夜ＤＭＥＭ／０．２％ＦＢＳ内で枯渇させた。これらの細胞を、０．１ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを用いて３０分間予備培養して、その後、３７℃でペプチドに２０分間露出させた。ラット前下垂体細胞を培養で確立して（２８）、３７℃の温度で４５分間、テスト・ペプチドで措置した。細胞内ｃＡＭＰをすべての細胞から抽出して、ラジオ免疫アッセイ・キット（Biomedical Technologies）を用いて３つ組ウェルから測定した。ＰＲＩＳＭ  ＧＲＡＰＨＰＡＤを用いて能力を判定した。その結果を図３に示す。
【００７４】
トランスフェクトされたレセプタに関する結果を保持して、ウロコルチンIIとウロコルチンIIIはリガンドがナノモル以下、あるいは低ナノモルの濃度で内生ＣＲＦ−Ｒ２βを活性化させることができる（図３Ａ）。予想されるように、ウロコルチンIIはＣＲＦ−Ｒ１を発現する培養下垂体細胞内で環式ＡＭＰを増大させる低い能力を示すが、ウロコルチンIIIは１μＭより高い濃度でもこのアッセイで活性を示さない（図３Ｂ）。
【００７５】
実施例９
ＣＲＦ結合蛋白質に対する結合
ＣＲＦ−ＢＰに対してナノモル以下の親和性を示すＣＲＦ及びウロコルチンとは反対に、ウロコルチンIIとウロコルチンIIIのいずれもこの蛋白質に対して有意な親和性を示さない（データ示さず）。ウロコルチンIIIはＣＲＦ−Ｒ１あるいはＣＲＦ−Ｒ２のいずれに対しても高い親和性を有していない。しかしながら、ＣＲＦ−Ｒ２に対する親和性はＣＲＦ−Ｒ１に対する親和性よりは高い。ＣＲＦ−Ｒ２α又はβを発現する細胞内で環式ＡＭＰ生成を促進させるその高い能力を考慮に入れると、その親和性は明らかにウロコルチンIIIがＣＲＦ−Ｒ２の天然作用物質として作用するのに十分な高さを有している。ウロコルチンIIIが今後同定されるべきレセプタのより強力な作用物質である可能性もある。
【００７６】
実施例１０
ウロコルチンIII  ｍＲＮＡ発現
マウス・ウロコルチンIII  ｍＲＮＡの組織分布を調べるためにＲＮａｓｅ保護アッセイを行った。ＲＮａｓｅ保護分析は従来述べられている手順（２９）に従って行われた。総ＲＮＡをＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH）を用いて抽出した。マウス・ウロコルチンIII及びグリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロジェナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルをマウスＧＡＰＤＨを内部負荷比較対象として用いて、ＲＮａｓｅ保護によって同時に測定した。
【００７７】
Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、マウス・ウロコルチンIIIｍＲＮＡに固有の５２８−ヌクレオチド・ウロコルチンIIIアンチセンス・リボプローブを合成した。マウスＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対して固有な２００ヌクレオチド・アンチセンス・リボプローブもＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。すべてのリボプローブは[α−32Ｐ]ＵＴＰ（３，０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）とウロコルチンIIIに対する２０μＭＵＴＰあるいはＧＡＰＤＨに対する２００μＭＵＴＰのいずれかの存在下で、これまでに述べられている手順（２９）に従って合成した。ウロコルチンIII及びＧＡＰＤＨリボプローブによって保護されたフラグメント・サイズはそれぞれ４１５及び１３５ヌクレオチドである。
【００７８】
ＲＮＡサンプル（末梢組織５０μｇあるいは脳組織２０−２５μｇ）を脱イオン化ホルムアミド２４μｌと１０7ｃｍｐのウロコルチンIII及び３ｘ１０４ｃｍｐＧＡＰＤＨアンチセンス・リボプローブを含む６μlのハイブリダイゼーション緩衝液内でハイブリダイズさせた。８５℃に５分間加熱した後、これらのサンプルを４２℃で１２時間ハイブリダイズさせ、その後、２４℃で６０分間、ＲＮａｓｅ（１７５μg／ｍｌＲＮａｓｅＡ及び５００Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＴ１）で消化させた。サンプルを５％ポリアクリルアミド尿素ゲル内に溶解した。PhosphorImagerシステム（Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA）とImageQuant４．０ソフトウエア・パッケージを用いて画像分析を行った。
【００７９】
ＣＮＳ及び末梢組織のいくつかの領域にまたがる組織からの総ＲＮＡを５２８塩基対ｃＲＮＡとハイブリダイズさせた。このプローブは成熟ペプチド領域を含んでおり、４１５塩基対の保護フラグメントを提供した。ＣＮＳではｍＲＮＡ発現サイトは視床下部、脳幹、及び側隔膜（ＬＳ）／線条末端基底核（ＢｎＳＴ）などである（図４）。下垂体、小脳、及び大脳皮質では検出可能なレベルのｍＲＮＡの発現は認められなかった。末梢部分では、ウロコルチンIIIｍＲＮＡは小腸と皮膚で発現されるが、心臓、大動脈血管、肝臓あるいは肺では検出可能な発現は認められない（図４）。
【００８０】
実施例１１
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
脳でのウロコルチンIIIの発現のより詳細なパターンを明らかにするために、ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを４１５塩基対マウス・ウロコルチンIIIｃＤＮＡテンプレートから発生させたアンチセンス及びセンスｃＲＮＡプローブを用いて、ラット及びマウスの脳の一連の箇所で行なった。成長したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）及びSprague-Dawleyラットからの脳及び末梢組織を迅速に取り出して乾燥した氷上で凍結させた。凍結した部分をクリオスタット上で２０μｍの厚さに切断して、ガラス・スライド上に解凍、戴置し、使用時まで−８０℃の温度で保存した。マウス・ウロコルチンIIIｃＤＮＡを含む線形化プラスミド（ｐＣＲIIＴＯＰＯ）から転写された33Ｐをラベルしたアンチセンス及びセンス（比較対照）ｃＲＮＡプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行なった（３０）。プローブを１−３ｘ１０9ｄｐｍ／μｇの特定の活性に対してラベルし、約２．８ｘ１０7ｃｐｍ／ｍｌの濃度でスライド上に戴置し、５６℃の温度で一昼夜ハイブリダイズさせた。刺激度を徐々に高めながらＳＳＣ内で洗浄して、その後３７℃の温度でＲＮａｓｅ措置を行い、そして最後に６５℃で０．１ｘＳＳＣで措置した。脱水後、それらのスライドを４℃の温度下で4日間Ｘ線フィルム（β−Max：Kodak）に露出させて、そして、Kodak NTB-2液縣濁液で被覆した後、４℃の温度で１０日間露出させた。
【００８１】
ポジティブ・ウロコルチンIIIｍＲＮＡ信号はアンチセンス・プローブとハイブリダイズさせた断片でだけ観察された。ウロコルチンIIIｍＲＮＡ発現の分布は主に腹側前脳のいくつかの個別領域に限定されていることが観察された（図５）。１つは中間視索前部核で、そこではポジティブにラベルされた細胞の１つながりの帯が逆Ｙ型中線グループを含んでいた。中間視索前部核が密接に関連している脳室周囲細胞群（終板の血管器官及び脳弓下器官）のいずれもポジティブなハイブリダイゼーション信号は含んでおらず、ウロコルチンIIIｍＲＮＡ発現が認められた箇所は中間及び腹側視索前領域上に分散して存在する細胞上だけであった。ウロコルチンIIIｍＲＮＡ発現の第２の主要な場所は嘴状の視床下部全体を通じて脳弓柱に結合している（および原則的にそれを取り囲んでいる）ラベルされた細胞の縦方向に組織されたクラスターであった。このクラスターは線状末端の基底核の後部部分、前部及び側方視床下部領域、及び視床下部の傍室核横の不健全な領域（めったにないが）に存在する細胞を含んでいる。このまとまりの後方への伸長部分は同様の位置、主に、視床下部背内核の嘴状部分の背面及び側方部分を占めていた。この『嘴状脳弓周囲』群とは別に、前部周室核及び逆交叉領域の腹面部分にポジティブにハイブリダイズされたニューロンが分散して観察された。ウロコルチンIIIｍＲＮＡ発現の第３の主な領域は中間扁桃核の前背面部分の細胞の小集団上にあった。脳幹では、ウロコルチンIIIが安定して発現された唯一の箇所は聴覚関連細胞群、上傍オリーブ核に局所化されていた（図５）。
【００８２】
実施例１２
ウロコルチンIIIのアシル化
本発明によるウロコルチンIII蛋白質のＮ末端をＤ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン−グリシン、及びＬ−チロシン−グリシンで構成される群から選択される付加アミノ酸又はペプチドを含む多数のカルボキシル−あるいはスルホニル−含有部分に由来するアシル化剤を用いて伸長させることができる。ウロコルチンIII蛋白質のＮ末端は毒素あるいはイソチアニンを用いて伸長させてもよい。アシル化剤の付加は（化学的あるいは酵素による）劣化に対する抵抗性を増大させ、上記蛋白質の可溶性を調節して治療形態でのそれらの蛋白質の放出をゆっくり進行させ、そして、（放射性、蛍光性、キレート化剤、毒素、光親和性、免疫固有などの）選択的ラベリングを可能にしてくれる。
【００８３】
実施例１３
ウロコルチンIII類似物
他のＣＲＦレセプタに対するリガンドを用いたこれまでの研究で、リガンドが適切なレセプタに結合する能力を失ったり、その生物学的活性を失うことなく多数のアミノ酸置換をこれらのリガンドに対して行なうことができることが示されている。ウロコルチンを用いたこれまでの多数の研究で、１つ、２つ、あるいは３つもの置換を簡単に行なうことができた。いくつかの例で、ウロコルチンに対する修飾を行なうとより望ましい薬学的特性を有するウロコルチンが得られた。ウロコルチンIIIは小型の蛋白質であるから、そうした修飾はこの技術分野の当業者に周知のペプチド合成によって簡単に組み込むことができる。そうした技術には固相法、部分固相法、フラグメント濃縮法、あるいは古典的な溶液添加法などの方法が含まれる。非標準的なアミノ酸をウロコルチンIIIに組み込む場合は、これらの方法が特に好ましい。あるいはまた、その修飾が天然のアミノ酸全体で行なわれる場合は、突然変異及びその後の就職されたウロコルチンIIIの発現のために組み換えＤＮＡ手法を用いることができる。
【００８４】
熟成ウロコルチンIIIはチロシン残基を含んでいない。チロシン残基は蛋白質の放射性ヨード化にとって有益であるから、ウロコルチンIIIの１つの可能な修飾はチロシンをその蛋白質内の別のアミノ酸と置換することであろう。これまでの実施例で、ウロコルチンのＮ末端へのＴｙｒ−Ｇｌｙで構成される配列を付加について述べた。得られた蛋白質はＣＲＦレセプタ結合能力と生物学的活性を保持しているが、蛋白質の放射性ヨード化には有益であろう。
【００８５】
ウロコルチンの最初から５個から８個の残基の欠失は有効なウロコルチン拮抗物質をもたらすことが分かっている。これらの蛋白質はＣＲＦレセプタには結合することができるが、それらのレセプタを相当刺激したり活性化させたりすることはない。ウロコルチンIIIから４個から８個のアミノ酸を欠失させても有効な拮抗物質ができるであろうと予想される。他のウロコルチンIIIフラグメントからＣＲＦ結合蛋白質の拮抗物質をつくることも可能であるかもしれない。これらの拮抗物質は通常はＣＲＦ結合蛋白質で除去されてしまう内生ペプチドのレベルを上昇させる上で有効である。そうしたＣＲＦ結合蛋白質と結合して、その蛋白質に結合するＣＲＦ、ウロコルチン、ウロコルチンII、及びウロコルチンIIIをブロックすることで、内生ＣＲＦ、ウロコルチン、ウロコルチンII及びウロコルチンIIIの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ濃度の増大を図ることができる。そうした拮抗物質はその効果を増大させるためにＣＲＦ、ウロコルチン、ウロコルチンII、あるいはウロコルチンIIIのその他の作用物質、あるいは拮抗物質と共に投与することができる。
【００８６】
図２ＣはウロコルチンIIIと、フグ・ウロコルチン関連ペプチド、マウス・ウロコルチンII、ヒト・ウロコルチン関連ペプチド、ラット・ウロコルチン、ラット・ウロコルチン放出因子、ヒツジ・コルチコトロピン放出因子、そしてカエル・ソーバジンの同等部分との相同性比較の結果を示している。その相同性は２０％から７０％の範囲である。図２Ｃの分析は、他のウロコルチン及びウロコルチン関連蛋白質に保存されているアミノ酸を明らかにしてくれる。他のウロコルチン及びウロコルチン関連蛋白質に保存されているアミノ酸残基の多くはウロコルチンIIIに保存されているが、その他のアミノ酸残基はこれら他の蛋白質に保存されているものとは異なっている。従って、これらの不一致のアミノ酸残基と他のウロコルチン関連蛋白質によって供給されているものとの置換は、作用物質及び拮抗物質として用いるためのウロコルチンIII類似物を設計するための手段を提供してくれる。例えば、リシン残基はウロコルチンの位置２０に存在しているが、アルギニン残基がラット・ウロコルチン、マウス・ウロコルチンII、ヒト・ウロコルチン関連ペプチド、及びラット・コルチコトロピン放出因子の同様の位置に存在している。従って、ウロコルチンのＬｙｓ20をアルギニン残基と置換すると、依然としてＣＲＦレセプタと結合するが、修飾された結合親和性を有するウロコルチンIII類似物ができるはずである。ウロコルチンIIIで他に示唆される置換はＩｌｅ3、Ｉｌｅ5、Ｌｅｕ7、Ｔｈｒ8、Ｉｌｅ9、Ｐｈｅ9、Ｇｌｙ10、Ｈｉｓ10、Ｌｅｕ11、Ｌｅｕ12、Ａｒｇ13、Ｇｌｎ13、Ｌｅｕ16、Ｇｌｕ17、Ａｓｐ17、Ａｒｇ20、Ａｒｇ32、Ｉｌｅ34、Ｌｅｕ35、Ａｓｐ35、Ｇｌｕ36、及びＶａｌ38などによるものであろう。これらの置換の多くはすべてのウロコルチン関連蛋白質のコンセンサス配列により近いウロコルチンIII蛋白質をもたらすので、これらの多くがＣＲＦレセプタとより強力に結合して、強力なＣＲＦレセプタ作用物質を形成することが予想される。あるいは、上に述べたように最初から４個から８個のアミノ酸のＮ末端を欠失させることで、これらの作用物質をＣＲＦレセプタ拮抗物質に転換することができる。
【００８７】
その他の可能な置換には位置１２及び３５でのメチオニン残基及び/又は位置３、５、１４、１５、２４及び３４でのロイシン残基のＮｌｅあるいはＣαＭｅ−Ｌｅｕ15残基への置換がある。ウロコルチンIII配列のその他のウロコルチン位置との比較は、位置７、１１、１２、１６及び３５あるいはロイシンあるいはウロコルチンIIIの置換を示唆しているので、ＮｌｅあるいはＣαＭｅ−Ｌｅｕ15残基をこれらの位置のＬｅｕと置換することも可能であろう。
【００８８】
上に述べた改変の１つ以上を含んでいるウロコルチンIII類似物を合成した。実施例５に示す一般的手順によるテストを実施したところ、それぞれのレセプタ・タイプを安定して発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞からの125Ｉ[Ｔｙｒ0、Ｇｌｕ1、Ｎｌｅ17]ソーバジンの競合的置換によってＣＲＦ−Ｒ１、ＣＲＦ−Ｒ２α、及び／又はＣＲＦ−Ｒ２βレセプタに対する結合性が改善され、細胞内でのｃＡＭＰレベルが変化した。別のテストはウロコルチンIII類似物が高体温、食欲失調、鬱血性心不全、血管疾患、その他の心臓血管不全、胃腸機能不全、ストレス、不安症及び片頭痛の治療に有効であり、脈管形成の強力な抑止剤としても有効であることを示した。
【００８９】
実施例１４
ウロコルチンIII及びその類似物の薬学的投与
医薬品組成物を形成する上で薬学的あるいは獣医学的に許容される基質と、ウロコルチンIII及びその類似物あるいはその非毒性塩を組み合わせて、ヒトを含む哺乳動物、あるいはその他の動物に対して鼻腔内、呼吸、脳脊髄、舌下、あるいは経口などの形態で、静脈、皮下、筋肉内、経皮などの方法で投与することができる。これらのペプチドは少なくとも約９０％の純度を持たねばならず、好ましくは、少なくとも約９７％の純度を有しているべきであるが、それ以下の純度でも有効であり、ヒト以外の動物に対して使用することもできる。この場合の純度は、ペプチド及びペプチド・フラグメントなどすべてのものの重量に対するペプチドの割合％を意味している。
【００９０】
高体温、食欲失調、鬱血性心不全、血管疾患、胃腸機能不全、ストレス、及び不安症を治療するために、医師はウロコルチンIII又はウロコルチンIII作用物質をヒトに投与することができる。ウロコルチンIII拮抗物質は鬱血性心不全、血管疾患、その他の心臓血管不全、胃腸機能不全、そして片頭痛を治療したり、脈間形成を阻止するために投与することができる。必要な投与量は治療される具体的な状態、その状態の重篤度、及び望ましい治療の継続期間によっても違うであろう。これらのペプチド類は、適切な投与を行い、その後体機能を観察することによって、内分泌あるいは中枢神経系に病理状態があることが疑われる動物における視床下部下垂体副腎機能を評価するために用いることができる。
【００９１】
これらのペプチドは酸添加塩あるいは亜鉛や鉄、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウムなどによる（こうした応用目的のための添加塩として適していると考えられる）金属錯体のような薬学的あるいは獣医学的に許容される非毒性塩の形態で投与されることが多い。そうした酸添加塩の例としては、塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。こうした活性成分が錠剤形態で投与される場合、その錠剤はトラガカント、コーン・スターチ、あるいはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの一体化防止剤、そしてステアリン酸マグネシウムなどの潤滑油を含むことができる。液体形態での投与が望ましい場合、甘味剤及び／又は風味料を加えてもよく、等張食塩水、燐酸干渉溶液などを用いた静脈投与を行なうことができる。
【００９２】
これらのペプチドは医師の指示に基づいて投与されるべきであり、医薬品組成物は通常、従来から用いられている薬学的あるいは獣医学的に許容される基質と組み合わされたペプチドを含んでいる。通常、用量はホスト動物の体重１キログラムあたりペプチド１−約２００マイクログラム程度である。
【００９３】
実施例１５
ウロコルチンIIIと膵臓機能
けっ歯類におけるウロコルチンIIIｍＲＮＡの発現に関する研究は、ウロコルチンIIIが中枢神経系と末梢部の両方で発現することを明らかにしている。末梢部では、膵臓と胃腸管がウロコルチンIII発現の主な場所である。別の組織学的調査は、膵臓内で、ウロコルチンIIIはインシュリンと共に局所化され、従って、ランゲルハンス島のβ細胞内にある。
【００９４】
この新しいβ細胞生成物の機能を調べるためにラットにウロコルチンIIIを静脈注射で投与したところ、グルカゴン分泌が急速に高まり、その後、血糖レベルが上昇した。グルカゴンがβ細胞に直接働きかけて傍分泌の形態でインシュリン分泌を刺激することが他の人々の研究で示されている。従って、ウロコルチンIIIは、β細胞がα細胞に信号を送り、α細胞がグルカゴンをつくりだし、それが結果としてβ細胞を作用させているという機序を提供しているのである。従って、ウロコルチンIII（あるいはいずれかのＣＲＦ−Ｒ２作用物質）は、島機能に刺激を与えそれを維持するために用いることができる。
【００９５】
インシュリンとグルカゴンは血糖レベルに対しては急性で反対の効果を示すので、ウロコルチンIIIが肝臓島機能には長期的に有益な効果を発揮する可能性がある。一方、島内でのウロコルチンIIIが果たす役割をＣＲＦ−Ｒ２拮抗物質が糖尿病患者のグルコース制御を悪化させることが知られている主要な高血糖因子であるグルカゴンの生成を低下させる上で有益であるかもしれない。
【００９６】
検討
ウロコルチンIIIをヒトGenbankデータベースの配列相同性スクリーニングによって同定した。ウロコルチンIII及びウロコルチンIIの推定成熟ペプチド領域の完全な蛋白質のペプチドあるいはヌクレオチド配列の分析は、それらが他のメンバーに対するよりも相互により密接に関連したＣＲＦファミリーの別個の系統枝であることを示唆している（図２Ｄ）。推定成熟ペプチド領域内で７６％の一致があるので、ウロコルチンIIIとフグＵＲＰは真正相同性（orthologous）である可能性がある。他のいずれの新ウロコルチン関連ペプチドとの同一性がないので、マウス・ウロコルチンIIと最も関連性が深いヒト・ウロコルチン関連ペプチド遺伝子がヒト・ウロコルチンII真正相同物である可能性がある。このことは、ヒトＵＲＰ遺伝子をヒト・ウロコルチンIIと命名し直すべきであることを示唆している。ヒト・ウロコルチンIIが（ポテンシャル・アミド提供グリシンは存在しているが）推定Ｃ末端領域にコンセンサス蛋白質分解性処理残基を有していないという事実は、ヒト・ウロコルチンIIプロホルモンが大きさでそのファミリーの他のメンバーと類似したペプチドを作り出していない可能性が示唆される。それにも係わらずマウスとヒトのウロコルチンIIには真正相同関係があり、ヒトにおけるウロコルチンIIの化学的性質及び機能については研究の余地が残っている。
【００９７】
マウスとヒトのウロコルチンIIIは両方ともタイプ２ＣＲＦレセプタに対して高度の選択性を示し、ウロコルチンIIの場合と同様、タイプ１レセプタに対する低い親和性を示すと同時に、内生（前部下垂体コルチコトロープ；図３Ｂ）あるいはトランスフェクト（表２）ＣＲＦ−Ｒ１のいずれかを発現する細胞内で環式ＡＭＰ生成を誘発する最低限の能力を示す。ヒト・ウロコルチンIIIはマウス・ウロコルチンIIIあるいはヒトやマウスのウロコルチンIIと比較してタイプ２レセプタに対してより低い親和性を示す。ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIの間では４つの残基が異なっているだけであり、高親和性ＣＲＦ−Ｒ２結合の要件に関する構造的／機能的洞察を与えてくれる。ヒト・ウロコルチンIIIはヒトＣＲＦ−Ｒ２に関してより作用が弱く（データ示さず）、このことはマウスとヒトのウロコルチンIII間の親和性の違いがレセプタの種供給源には無関係であることを示唆している。しかしながら、ＣＲＦ−Ｒ２に対しては結合親和性が比較的低いにも係わらず、ヒト・ウロコルチンIIIはこのレセプタを発現する細胞による環式ＡＭＰ生成を促進する上で、機能的に非常に強力である（ＥＣ50＜１ｎＭ）。従って、ヒト及びマウス・ウロコルチンIIIは両方とも、ＣＲＦ−Ｒ２に対する天然のリガンドとして機能する上で十分な能力を示す。ＣＲＦ−Ｒ２選択性リガンド、ウロコルチンIIIあるいはウロコルチンIIのいずれも、高い親和性でＣＲＦ−ＢＰによって結合されない。対照的に、ＣＲＦ−Ｒ１に対して高い親和性を有する２つのリガンドはＣＲＦ−ＢＰに対しても高い親和性を示す。
【００９８】
ＲＮａｓｅ保護分析から、ウロコルチンIIIが脳及び末梢部の両方で、ＣＲＦ−Ｒ２に由来するレセプタにもアクセスする可能性がある。末梢部では、ウロコルチンIIIｍＲＮＡは小腸、及び皮膚で見出されるが、ウロコルチンIIIｍＲＮＡが発現される細胞タイプについてはさらに研究が必要である。ＧＩ域では、ＣＲＦ−Ｒ２が腸の動きの調節に関与していることが示されている（３１）。
【００９９】
脳では、ウロコルチンIIIｍＲＮＡはいくつか別個の皮質下領域で見出されるが、その分布はＣＲＦ（３２）、ウロコルチン（３３）及びウロコルチンII（２１）のそれとは異なっている。ウロコルチンIIIがどのように作用するかについての確認は詳細な免疫組織学的及び機能的研究の結果を待たねばならないが、本明細書では腹側脳周辺領域と表現した中間視索前核及び小脳扁桃に置ける発現の主要サイトから考察の初期的な手がかりを得ることができる。終板及び脳幹の両方の脳室周囲構造から入力を受け取るので、中間視索前核が体液及び心臓血管ホメオスタシスに関連した内臓からの神経及び体液信号融合のキーサイトであると考えられる（３４）、（３５）。少なくともその一部がＣＲＦ−Ｒ２を発現することが知られている（３７）視床下部の傍室核及び／又は視神経交差上に位置する核の多数の関連する神経分泌及び前自律性細胞群は主な考察対象のひとつであろう（３６）。
【０１００】
ウロコルチンIII発現細胞の腹側脳周囲群の強力な役割を解明することは、これらのクラスターがいくつかの細胞構造にまたがっており、何人かの研究者によって認識された脳周辺視床下部核と異なるので（３８）、さらに決定的に困難である。しかしながら、脳周辺領域が摂取行動を刺激する際にいくつかの神経活性化剤の作用及び心臓血管応答で刺激性アミノ酸感作性サイトとして確認されている（３９−４１）ことは指摘しておかねばならない（４２）。脳周辺領域のいくつかの箇所は側方中隔及び腹側正中視床下部核などの主要なＣＲＦ−Ｒ２発現のサイトと関係していることが確認されており（４３−４５）、傍室核内のストレス関連神経内分泌及び自律性作用因子に対する局所的抑止（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ）投射源はその分布がウロコルチンIII発現ニューロンのそれと非常に類似している嘴状脳弓周囲成分（４６）を含んでいる。
【０１０１】
本明細書で確認されているウロコルチンIII発現の３番目の主要サイトに関しては、外科的及び機能的研究から、脳扁桃の中間核が（腹側正中核を含む）視床下部に広い範囲で突き出ており（４７）、挙動の調節（４８、４９）と特に生殖及びストレスに関連した神経内分泌機能（５０、５１）に関与していることを示している。全体として、ここで述べられているウロコルチン発現の中心的サイトは、このペプチド・ファミリーの他のメンバーとこれまで考えられているものも含めて、ストレスに関連した自律性、神経内分泌性、及び挙動機能の調節でこのペプチドが果たしている可能性がある役割と一致している。
【０１０２】
上記３つのマウス・ウロコルチンのそれぞれの分布はタイプ２ＣＲＦレセプタと相互作用する一定の可能性を示しており、それぞれこれらのレセプタに対して高い親和性を示す。対照的に、ＣＲＦ自体はＣＲＦ−Ｒ１に対して高度に選択性を示し、ＣＲＦ−Ｒ２に対してはより低い親和性を示す。これら３つのウロコルチン関連ペプチドに対する命名法が受け入れられることを前提にして、ＣＲＦ−Ｒ２が機能においても名称においてもウロコルチン・レセプタであると考えることは合理的であろう。従って、『ＣＲＦ系』は各レセプタ・タイプに対して選択性を有するリガンドと二価リガンドであるウロコルチンも含むことになる。
【０１０３】
本明細書には以下の文献が引用されている。
0004472256.tif 000004
0004472256.tif 000005
0004472256.tif 000006
【０１０４】
本明細書で触れられているすべての特許あるいは刊行物も本発明が関連する技術分野の当業者のレベルに対応するものである。これらの特許及び刊行物は引用によって、それぞれの文献が具体的、個別的に本明細書に組み込まれるのと同様に、全体としても本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
当業者であれば、上に述べた、及びそれらに本質的に付随した課題を実行し、目的と効果を達成する上で本発明がよく適合していることは容易に理解できるであろう。上に述べた実施例は、ここに述べられている方法、手順、治療、分子及び具体的な化合物と共に、現段階での好ましい実施の形態を示しており、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許請求の範囲で定義されている本発明の精神の範囲内に含まれる変更やその他の利用法は、当業者であれば容易に想起できるであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴、利点及び目的を達成し、より詳細に理解できるようにするために、添付図面に示すいくつかの実施の形態を参照して本発明を以下に詳しく説明する。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、その範囲の限定を意図するものではない。
【図１】  ヒト・ウロコルチンIIIのヌクレオチド及びペプチド配列を示す図。
【図２】  図２ＡはヒトＵｃｎIIIをコードする予想されたアミノ酸配列を示し、図２ＢはマウスＵｃｎIIIのアミノ酸配列を示す。アミノ酸には開始メチオニンで始まる番号が付されている。推定成熟ペプチド・コーディング領域はボックス内に示されている。完全なヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋにデポジットされている（ヒトＵｃｎIIIの登録番号ＡＦ３６１９４３、マウスＵｃｎIIIの登録番号ＡＦ３６１９４４）。
図２Ｃはヒト及びマウスＵｃｎIIIと相同性フグ・ウロコルチン、ヒト及びマウスＵｃｎII、ヒト及びヒツジＣＲＦ、フグ・ウロテンシン（Ｕｒｏ）、カエル・ソーバジン、ヒト及びマウスＵｃｎの推定成熟ペプチド領域の位置的整合を示している。ヒト・ウロコルチンIII配列と同一の残基はボックス内に入れて示してある。位置的整合はClustal Method of Megalign in DNASTARを用いて行った。■はアミド化サイトを示す（ヒトＵｃｎIIと推定される）。
図２Ｄはヒト及びマウスＵｃｎIIIをフグ・ウロコルチンとヒト及びマウスＵｃｎIIにグループ化する系統樹を示す。より遠い関係にあるグループはヒト及びヒツジＣＲＦ、ヒト及びマウスＵｃｎ、フグＵｒｏ、及びカエル・ソーバジンで構成される。この系統樹はＤＮＡＳＴＡＲによって作成された。
【図３】  図３Ａ及び図３ＢはＣＲＦＲ２β発現細胞株（図３Ａ）と一次ラット下垂体前葉細胞（図３Ｂ）におけるｃＡＭＰ蓄積上でのＵｃｎ関連ペプチドの効果を示す。図３ＡはＡ７ｒ５ラット大動脈筋細胞から得られた結果を示す。ＥＣ50：ｍＵｃｎII：０．１８ｎＭ；ｍＵｃｎIII：３．７ｎＭ；ｈＵｃｎIII：８０．９ｎＭ。図３Ｂは培地に固定され、種々のペプチドで４５分間刺激した一次ラット下垂体前葉細胞から得られた結果を示す。ＥＣ50：ｒＵｃｎ：２．３ｎＭ；ｈＵｃｎII：１μＭ＊；ｍＵｃｎII：０．７５μＭ＊（＊：ｒＵｃｎのプラトー期を使って推定）。
【図４】  図４は脳及び周辺組織におけるマウス・ＵｃｎIIIｍＲＮＡの発現を示す。ＵｃｎIIIｍＲＮＡのＲＮａｓｅ保護アッセイの代表的な画像が示されている。リストに記載された各組織からの単離されたＲＮＡ全体がマウスＵｃｎIIIアンチセンス・プローブ及びマウスＧＡＰＤＨでハイブリダイズされた。保護されたフラグメントは６％の尿素−ポリアクリルアミド・ゲル上で分解された。略語：ＢｎＳＴ：分界条床核。
【図５】  図５Ａ−５Ｆはラットの脳におけるＵｃｎIIIｍＲＮＡのハイブリダイゼーション組織位置測定を示す。ポジティブ・ハイブリダイゼーション信号は腹側前脳の３つの領域で最も顕著であった。これらは正中視索前核（図５Ａ、５Ｂ）、傍室核のすぐ側面の領域を取り囲む嘴状脳弓周囲領域(rostral perifornical area)（図５Ｃ）、分界条床核後部（図５Ｄ）、及び扁桃核正中部（図５Ｅ）を含んでいた。脳幹では、ポジティブ・ハイブリダイゼーション信号は主として上パラオリーブ核(paraolivary nucleus)で検出された（図５Ｆ）。略語：３Ｖ：第３脳質、ａｃ：前交連、ＢＳＴｐ：分界条床核後部、ｆｘ：脳弓、ＭｅＡ：扁桃体中心核、ＭｅＰＯ：正中視索前核、ＯＶＬＴ：終板血管器官(vascular organ of the lamina terminalis)、ｏｐｔ：視索、ＰＶＨ：視床下部傍室核、ＳＰＯ：上パラオリーブ核（superior paraolivary nucleus)、Ｔｚ：台形体核(nucleus of the trapezoid body)、線の尺度＝５０μｍ。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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