(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節要素、および全フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその抗原エピトープをコードしている配列を含むが、全Ｅ−タンパク質をコードしている配列を含まない発現カセットを含むＤＮＡを含有するポックスウイルスベクターであって、前記組換えウイルスベクターを生成するためのポックスウイルスが、番号第Ｖ０００８３００８号下で、欧州菌培養収集所にて寄託された改変（修飾）ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）ＢＮ株であるか、またはその誘導体（誘発体）であって、以下の特徴、
（ｉ）ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）において増殖複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ができること、ただし、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂおよびヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにおいては増殖複製ができないこと、および
（ｉｉ）成熟ＢおよびＴ−細胞の産生が不可能であるマウスモデルにおいて複製ができないこと、および／または
（ｉｉｉ）ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、同一のレベルの免疫性を誘発すること、
を持つことによって特徴づけられる誘導体である、ポックスウイルスベクター。
【請求項２】
フラビウイルスＮＳ１タンパク質が、天然に存在するフラビウイルスＮＳ１タンパク質に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列における同一性を持ち、免疫応答を誘発するＮＳ１タンパク質誘導体である、請求項１に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項３】
前記フラビウイルスが、蚊媒介性フラビウイルスである、請求項１または２のいずれか１つに記載のポックスウイルスベクター。
【請求項４】
前記蚊媒介性フラビウイルスがデングウイルスである、請求項３に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項５】
前記デングウイルスが、デングウイルスセロタイプ２である、請求項４に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項６】
フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその抗原エピトープをコードしている配列の５’上流に、ＡＴＧコドンおよびＥ−タンパク質の糖鎖形成シグナル配列をコードしている配列があり、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその抗原エピトープをコードしている前記の配列が、翻訳の終止コドンによって終止する、請求項１から５のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項７】
前記転写調節要素が、ポックスウイルスプロモーターである、請求項１から６のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項８】
前記ポックスウイルスベクターが凍結乾燥される、請求項１から７のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項１０】
ヒト細胞である、請求項９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス、とりわけデングウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分で、前記フラビウイルスに対する、および１つまたはそれ以上の他のフラビウイルスに対するワクチン化に有用なタンパク質またはその部分に関する。本発明はさらに、１つのデングウイルスセロタイプ、とりわけセロタイプ２のＮＳ１タンパク質またはその部分で、すべてのセロタイプからの、デングウイルスに対するワクチン化に有用なタンパク質またはその部分に関する。本発明はさらに、フラビウイルスＮＳ１またはその部分をコードしている発現カセットを含むＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、およびフラビウイルスＮＳ１を含んでいるか、発現しているワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱の病因物は、デングウイルスであり、これはフラビウイルス科ファミリーのフラビウイルス属に属している（Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ，２００１）。フラビウイルスのとりわけ重要な亜群は、蚊媒介性フラビウイルスと呼ばれる群、すなわち蚊によって伝達されるフラビウイルスである。この群には、以上で言及したデングウイルス以外に、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病（黄色熱）ウイルスのような他の重要なウイルスが含まれる（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９６，ＩＳＢＮ：０−７８１７−０２５３−４，９３１−１０３４ページ）。これらのウイルスによって伝達される典型的な疾患は、西ナイルウイルスによって誘発される西ナイル熱および西ナイル脳炎、日本脳炎ウイルスによって誘発される脳炎、黄色熱ウイルスによって誘発される黄色熱およびデングウイルスによって誘発されるデング熱、デング出血性熱（ＤＨＦ、以下を参照のこと）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）である。
【０００３】
フラビウイルスは、３つの構造タンパク質、ウイルスゲノムに結合してヌクレオカプシドを形成するカプシドタンパク質（Ｃ）、およびその周辺のＭ（膜）およびＥ（エンベロープ）タンパク質に結合する脂質二重膜によって形成される、エンベロープ、一本鎖、ポジティブ−センスＲＮＡウイルスである。ゲノムは、１１ｋｂ長であり、約３４００アミノ酸残基のポリタンパク質前駆体をコードしている単一のリーディングフレームを含む。個々のウイルスタンパク質は、細胞およびウイルスプロテアーゼの活性によって、この前駆体より産生される。３つの構造タンパク質（Ｃ、ＭおよびＥ）は、ポリタンパク質のＮ末端部分より由来し、その後に７つの非構造タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５が続く（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｃｅ，２００１）。
【０００４】
すべてのフラビウイルスに存在する糖タンパク質ＮＳ１は、ウイルス生存性に関して重要であるようである。デングウイルスＮＳ１は、可溶性六量体形態にて、哺乳動物感染細胞より分泌される（Ｆｌａｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。この非共有結合六量複合体は、３つの二量体サブユニットにより形成され、３１０ｋＤａの分子量を持つ。二量体化は、ＮＳ１タンパク質の細胞質膜への輸送のために必要条件であり、その際、感染細胞表面の固有のウイルス常駐タンパク質として残る。
【０００５】
デング感染を支持する昆虫細胞ではなく、哺乳動物細胞において、輸送ＮＳ１の部分は、細胞外環境に放出される。細胞外ＮＳ１は、より高次の六量体オリゴ体形態として存在するか、またはビリオンとではなく、微小粒子と結合して存在するかいずれかで、可溶性タンパク質として分泌される。さらに、ＮＳ１は、デングウイルス感染患者からの血清中で循環することがわかってきており、このことは、ＮＳ１の分泌が、ヒト宿主でのフラビウイルス感染における重要な事象である可能性を示唆している。フラビウイルス感染の過程の間、ＮＳ１タンパク質は、強力な抗体応答を誘発し、おそらく補体仲介経路（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、および抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を介した宿主から感染ウイルスを除去することを助ける。
【０００６】
その４つのセロタイプ、デングウイルスセロタイプ１（Ｄｅｎ−１）〜デングウイルスセロタイプ４（Ｄｅｎ−４）までを持つデングウイルスが、ヒトの感染に関して、フラビウイルス属のもっとも重要なメンバーであり、インフルエンザ様症状から、重度または致命的な病気である、ショック症状を伴うデング出血性熱までの範囲の疾患を産生する。デング発生は、蚊ベクターが豊富である、熱帯および亜熱帯地帯の人口密度の高い領域における、主要な公衆の健康問題であり続けている。
【０００７】
世界の大部分において、デング感染および蚊伝染性フラビウイルスによって誘発される他の疾患の普及において懸念が存在するので、結果として、デング熱（ＤＦ）およびデング出血性熱（ＤＨＦ）両方を予防する、デングワクチンの発展へと導く、さらなる努力がされ、また、いくつかまたはすべての蚊伝染性フラビウイルスによって誘発される感染に対するワクチン化された個体を保護するために有用なワクチンが考えられる。
【０００８】
ＤＦのほとんどの場合が、任意の４つのセロタイプによる第一感染の後に顕著化する一方で、大きな割合のＤＨＦの場合、デングウイルスの第一感染セロタイプからはことなるセロタイプによる、二回目として感染した対象において起こる。これらの観察により、適切な間隔において、異なるウイルスセロタイプによる、１つのデングセロタイプに対する抗体を持つ個体における連続感染が、結果として、特定の数の場合で、ＤＨＦとなりうるという仮説が生じる。抗体依存増強（抗体依存性増強）（ＡＤＥ）が、デングウイルスならびに他のエンベロープウイルスに関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて示されてきており、ＤＨＦの病因における重要な機構であると考えられる。
【０００９】
ＤＨＦが通常、多数（３または４）のウイルスセロタイプが一緒に循環する、地理上区域で問題になることがまた観察されてきた。東南アジア諸国のような風土性ＤＨＦのある領域で、年齢特異的な発病率は、子供において非常に高く、より高年齢群でのＤＨＦケース数は減少する。これは、デングへの血清有病率の増加と大まかに相関し、天然の感染が、保護免疫を誘発することを示している。この現象は、Ａ型肝炎ウイルスのような他のウイルス感染で観察されたものと同じではない。ケーススタディ臨床観察により、患者が２回ＤＨＦを経験する可能性がある（Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）が、これはまれであり、第二および続く感染を引き起こすセロタイプを実際に同定することは難しい。いままでに、すべての４つのデングウイルスセロタイプが、同一の領域で循環するにも関わらず、同一の個体での、第四の感染の報告はなかった。このことは、本質的に、２または３デングウイルスセロタイプによる、同一個体での感染が、結果として、交差反応抗体となるか、または交差反応細胞毒性リンパ球応答となりうることが示唆される。これは、本質的に、残っているデングウイルスセロタイプによる感染に対して、調整または保護しうる。
【００１０】
現在、許可されたデングワクチンは存在しない。今日、デングウイルス感染の予防は、主要な蚊ベクター、ネッタイシマカ  エジブティ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の制御に依存している。殺虫剤抵抗性、地元の健康局の、効果的な蚊制御プログラムを維持可能である技術的および経済的サポートの欠如、およびベクター蚊とデングウイルス両方の持続する地域的な広がりにより、現在の蚊制御プログラムによってデング感染を予防することは、実際不可能となる。したがって、デングウイルス４つすべてのセロタイプに対する安全で、効果的なワクチンの開発が、デングウイルス感染を予防するために、もっとも費用効果的な方法として、第一のものとしてＷＨＯによって指定されてきている。ＷＨＯは、デングおよびＤＨＦに対する理想的なワクチンは、連続感染が起こらないような、全てのセロタイプによって引き起こされる感染を予防可能な種類であるべきであることを推奨してきた。
【００１１】
この目的のために、国際公開第９８／１３５００号公報は、全てのデングウイルスセロタイプからの抗原を発現している、組換え体改変（修飾）ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））を使用すること、または各組換え体ＭＶＡが、１つのデングウイルスセロタイプの少なくとも１つの抗原を発現するような４つの組換え体ＭＶＡを使用すること、を提案している。両方の戦略により、全てのデングウイルスセロタイプに対してワクチン化するための、非常に前途有望な戦略が提供される。しかしながら、投与に際し、１つ以上のフラビウイルスに対する、または１つ以上のデングウイルスのセロタイプに対する、好ましくはすべてのデングウイルスセロタイプに対する免疫応答となる、単一のサブユニットワクチンを提供することが望ましい。さらに、国際公開第９８／１３５００号公報は、デングウイルスＮＳ１をコードしている組換え体ＭＶＡを開示している。国際公開第９８／１３５００号公報は、１つのデングウイルスセロタイプから由来する抗原が、抗原が由来するデングウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のデングウイルスセロタイプに由来する抗原に対しても、免疫応答を誘発することは開示していない。
【００１２】
国際公開第９９／１５６９２号公報は、免疫増強または抗体依存増強に影響を与え得ない、デングウイルス抗原をコードしている１つまたはそれ以上のＤＮＡ配列を含み、発現可能な、組換え体ＭＶＡを開示している。国際公開第９９／１５６９２号公報は、１つのデングウイルスセロタイプから由来した抗原が、抗原が由来するデングウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のデングウイルスセロタイプに由来する抗原に対しても、免疫応答を誘発することは開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、安定であり、簡単に産生可能であり、ワクチンが由来するフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対しても、ワクチンを接種した（ワクチン化した）個体を保護する免疫応答を導く、フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプから由来するワクチンを産生することが、本発明の目的である。ワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対してのみでなく、他の蚊媒介性フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対しても、ワクチン化した個体を保護する、蚊媒介性フラビウイルスから由来するワクチンを提供することが、本発明の特定の目的である。デングウイルスセロタイプから由来し、少なくとも２つ、好ましくは全てのデングウイルスセロタイプとの感染に対して、個体を保護する、ワクチンを提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための課題】
【００１４】
これらの目的は、それぞれ、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、およびフラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている発現カセットを含んでいるＤＮＡ配列を用いて解決されてきた。とりわけ、蚊媒介性フラビウイルスから由来する、およびワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスによる感染に対して、また少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスの感染に対して、個体を保護するワクチンを提供する目的は、それぞれ、蚊媒介性フラビウイルス、とりわけデングウイルス、好ましくはデングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質またはその部分、および相当するＤＮＡ断片配列を用いることによって解決されてきた。よりとりわけ、１つのデングウイルスセロタイプから由来する、そして少なくとも、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてのデングウイルスセロタイプとの感染に対して、および好ましくはまた、他のフラビウイルス、とりわけ、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスおよび西ナイルウイルスのような蚊媒介性ウイルスでの感染に対しても、個体を保護するワクチンを提供する目的は、それぞれ、デングウイルス、とりわけデングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質またはその部分、および相当するＤＮＡ断片配列を用いることによって解決されてきた。
【００１５】
実験項にてより詳細に示されているように、ワクチン化ののち、ｄｅ  ｎｏｖｏにて発現した１つのセロタイプのデングウイルスから由来するＮＳ１タンパク質が、デングウイルスセロタイプ１、２、３および４のＮＳ１タンパク質＋日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスおよび西ナイルウイルスのような他のフラビウイルスのメンバーからのＮＳ１と交差反応する可能性のある、抗体応答を誘発可能である。したがって、１つのデングウイルスセロタイプ源からのＮＳ１タンパク質は、少なくとも２つ、より好ましくは３つ、さらにより好ましくは４つすべてのデングウイルスのセロタイプに対する、さらに、１つまたはそれ以上の他のフラビウイルス属のフラビウイルスに対する、同時保護のための万能ＤＨＦサブユニットワクチンである。このサブユニットワクチン戦略において、Ｅタンパク質は含まれないので、デングの任意のセロタイプへの続く暴露における抗体依存的増強（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；ＡＤＥ）のリスクはきっとなく、したがって、ワクチン関連ＤＨＦは、デング感染の天然の発現の間、誘発されないであろう。
【００１６】
ＮＳ１タンパク質は、核酸、好ましくは、少なくともフラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている発現カセットを含むＤＮＡ断片配列から発現しうる。本文脈中の「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」は、発現カセットが、さらに、以下でより詳細に定義したように、分離タンパク質／ペプチドとして、またはＮＳ１タンパク質またはその部分に融合してのいずれかで、さらなるタンパク質／ペプチドをコードしうると解釈されるべきである。本発明の文脈中、語句「ＤＮＡ」は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、直鎖または環状ＤＮＡ、またはプラスミドまたはウイルスゲノムの形状でのＤＮＡのような、任意の型のＤＮＡを意味する。フラビウイルスはＲＮＡウィルスであるので、フラビウイルスＮＳ１タンパク質をコードしているＤＮＡは、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡのような、天然には存在しないＤＮＡである。
【００１７】
語句「フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｒ  ｐａｒｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、転写、とりわけ転写の開始を制御する要素によって、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分の配列のコード配列が処理されることと解釈されるべきである。そのような転写調節要素の例は、原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーター／エンハンサーである。好ましい真核生物プロモーター／エンハンサーは、実施例項で開示したような、ヒトサイトメガロウイルス前早期プロモーター／エンハンサー、および７．５プロモーターのようなポックスウイルスプロモーター、およびポックスウイルス最小プロモーターである。ポックスウイルス最小プロモーターは、図２ならびにＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．９にて示されている。発現カセットはさらに、必要ならば、真核生物終止要素または原核生物ポリＡシグナル配列のような転写の終止を制御する要素を含みうる。
【００１８】
発現カセットは、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分のみを発現しうるか、または１つまたはそれ以上のさらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドと一緒に、ＮＳ１タンパク質またはその部分を発現しえ、その際ＮＳ１タンパク質またはその部分、およびさらなるタンパク質／ペプチドは、分離タンパク質／ペプチドとして、または融合タンパク質／ペプチドとして産生される。本文献で他に言及しない限り、本発明の文脈上、語句「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも２５アミノ酸の、連続アミノ酸配列ストレッチを意味する。
【００１９】
さらなるフラビウイルスタンパク質は、このタンパク質が、ＤＨＦの発達に関与しないように見えることから、全Ｅタンパク質ではない。したがって、さらなるフラビウイルスペプチドが、Ｅ−タンパク質から由来する場合、含まれるアミノ酸は、４０アミノ酸以下、好ましくは３５アミノ酸以下である。Ｅ−タンパク質から由来するアミノ酸配列ストレッチが、ＮＳ１タンパク質またはその部分と一緒に発現する場合、このアミノ酸ストレッチが、ＡＤＥおよびＤＨＦの発生に関与するエピトープを含まないことが確認されるべきである。
【００２０】
ＮＳ１タンパク質またはその部分に加えて、発現カセットが、分離タンパク質／ペプチドとして、さらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドを発現する場合、発現カセットは、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列と、さらなるフラビウイルスタンパク質をコードしている配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含みうる。ＩＲＥＳ要素は、当業者に公知である。ＩＲＥＳ要素に関する例は、ピコルナウイルスＩＲＥＳ要素またはＣ型肝炎ウイルスの５’非コード領域である。
【００２１】
あるいは、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているヌクレオチド配列は、ＮＳ１タンパク質またはその部分と、さらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドの間の融合タンパク質が産生される様式で、さらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドをコードしているＤＮＡ配列に融合可能である。ＮＳ１タンパク質またはその部分、およびさらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドが、融合タンパク質／ペプチドとして産生されるべき場合、それぞれのコード配列は、インフレームに融合する。
【００２２】
好ましい実施様態において、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているＤＮＡ配列の上方に、Ｅ−タンパク質の糖鎖付加（形成）シグナル配列（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードしている配列が存在する。この実施様態にしたがって、融合タンパク質は、ＮＳ１タンパク質またはその部分に融合したＥ−タンパク質糖鎖形成シグナル配列を含むように産生される。以上で指摘したように、Ｅ−タンパク質由来アミノ酸ストレッチは、可能な限り短いべきであり、このアミノ酸ストレッチが、ＡＤＥおよびＤＨＦの産生に関与するエピトープを含むことを排除すべきである。Ｅ−タンパク質の糖鎖形成シグナル配列は、この要求を満たす。
【００２３】
他の好ましい実施様態において、本発明にしたがって使用される発現カセットには、フラビウイルス配列のみとして、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードする配列が含まれる。したがって、この好ましい実施様態において、本発明にしたがった発現カセットは、フラビウイルスゲノムの他の部分からの他のペプチド／タンパク質、とりわけＮＳ２ＡまたはＥタンパク質を発現しない。
【００２４】
さらなる他の実施様態において、本発明にしたがったＤＮＡは、フラビウイルスから由来しないタンパク質／ペプチドとの融合タンパク質として、ＮＳ１タンパク質またはその部分を発現する。そのようなタンパク質／ペプチドは、非フラビウイルスシグナル配列または、タグのような、発現した融合タンパク質の検出または精製のために有用である配列を含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施様態にしたがって使用した発現カセット中のフラビウイルス配列の一般的な構造を理解するために、フラビウイルスのゲノム構造を簡単に要約することが役に立つ。天然のフラビウイルス感染の間、ウイルスは、まず宿主細胞プロテアーゼによって、ついでウイルスにコードされたプロテアーゼによって、以下のタンパク質、Ｃ、ＰｒＭおよびＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５（ポリタンパク質前駆体に沿ったタンパク質順）に切断される、単一ポリタンパク質を産生する。したがって、ＤＮＡ配列、とりわけ、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているｃＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンを必要とするはずである。好ましい実施様態において、開始ＡＴＧに、糖鎖付加シグナルをコードしている配列が続き、新規に合成したＮＳ１タンパク質が、小胞体内で糖付加される。そのようなシグナル配列が、当業者に公知である。最終的に、タンパク質コードカセットは終止コドンが必要であり、ｃＤＮＡ配列をコードしているタンパク質の３’末端に付加したＴＡＧでありうる。本発明で使用した例において、「ＡＴＧ＋シグナル配列」要素は、アミノ酸Ｍ（ＡＴＧ）で始まるＥタンパク質の疎水性Ｃ末端（デングウイルスニューギニア株「ＮＧＣ株」に関する、ＧｅｎｅＢａｎｋ受け入れ番号第ＡＦ０３８４０３号の最後の２８アミノ酸）をコードしている配列から由来した。本発明にしたがった典型的な発現カセットは、図２およびＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ９およびＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ１０にて示されている。
【００２６】
したがって、まとめると、この実施様態は、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含むＤＮＡの使用を考慮しており、その際、コード配列は、開始コドン（「ＡＴＧ」）および糖付加のためのシグナル配列をコードしている配列が上方にあり、好ましくは以上で定義したように、Ｅ−タンパク質から由来し、前記コード配列は、翻訳終止コドンによって終止する（図１Ａ、１Ｃおよび２、ＳＥＱ：ＩＤ  ５〜１０）。
【００２７】
本発明にしたがって使用しうるＤＮＡ配列は、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている。語句「フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）」は、任意のフラビウイルスを意味している。より好ましくは、語句「フラビウイルス」は、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスおよびデングウイルスのような、蚊媒介性フラビウイルスを意味する。本発明にしたがったＤＮＡによってコードされた、１つの蚊媒介性ウイルスから由来するＮＳ１タンパク質またはその部分は、ワクチンが由来するウイルスまたはウイルスセロタイプでの感染だけでなく、ワクチンが由来するのとは異なる蚊媒介性ウイルスまたはウイルスセロタイプの感染に対しても、ワクチン化した個体を保護すべきである。ＮＳ１タンパク質は、好ましくは任意のデングウイルスセロタイプである。より好ましくは、ＮＳ１タンパク質コード配列は、デングウイルスニューギニア株（「ＮＧＣ株」、ＧｅｎｅＢａｎｋ受け入れ番号第ＡＦ０３８４０３号）のような、デングウイルスセロタイプ２から由来する。語句「サブタイプ」および「セロタイプ」は、本明細書を通して、相互互換的に使用される。
【００２８】
語句「ＮＳ１タンパク質またはその部分（ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｒ  ｐａｒｔ  ｔｈｅｒｏｆ）」の文脈中の語句「その部分（ｐａｒｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、ＮＳ１タンパク質のアミノ酸ストレッチを意味し、「その部分」が由来するＮＳ１タンパク質に対する特異的免疫応答を誘発するのに十分長い。フラビウイルスがデングウイルスである場合、アミノ酸ストレッチは、すべてのデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対して、ヒトを含むワクチン接種（ワクチン化）動物中で、免疫応答を誘発する、アミノ酸ストレッチであるべきである。実施例項において、当業者が、どのようにして、ＮＳ１タンパク質またはその部分が、すべてのデングウイルスセロタイプに対して特異的な免疫応答を誘発するかどうかを決定可能であるかを示している。好ましい実施様態にしたがって、フラビウイルスＤＮＡ配列は、全ＮＳ１タンパク質をコードしている。したがって、語句「ＮＳ１タンパク質またはその部分」は、天然に存在するＮＳ１タンパク質の全配列、および免疫応答を誘発する、より短いエピトープストレッチを意味する。
【００２９】
さらに、語句「ＮＳ１タンパク質」はまた、天然に存在するＮＳ１タンパク質の誘導体（誘発体）に関する。そのような誘発体は、天然に存在するＮＳ１タンパク質に関連して、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を持つタンパク質でありうる。実施例の方法によって、そのような誘発体は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列における相同性を持つ。したがって、語句「その部分」もまた、そのようなＮＳ１タンパク質誘発体の部分に関する。
【００３０】
まとめとして、本発明のもっとも好ましい実施様態の１つは、蚊媒介性フラビウイルスＮＳ１またはその部分をコードしている発現カセットを含むＤＮＡを使用することであって、その際フラビウイルスは、好ましくはデングウイルス、とりわけデングウイルスセロタイプ２であり、ＮＳ１タンパク質またはその部分の発現は、転写制御要素によって制御されている。より好ましくは、本発明にしたがったＤＮＡは、糖鎖形成シグナル配列との融合タンパク質として、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている。
【００３１】
本発明はさらに、上述したようなＤＮＡを含むベクター、および本発明にしたがった免疫応答を誘発するための、前記ベクターの使用に関する。語句「ベクター」は、当業者に公知の任意のベクターを意味する。ベクターは、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、またはｐＵＣシリーズのベクターでありうる。より好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターである。本発明の文脈において、語句「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、ウイルスゲノムを含む感染性ウイルスを意味する。この場合、本発明のＤＮＡは、それぞれのウイルスベクターのウイルスゲノム内にクローン化されるべきである。組換え体ウイルスゲノムがついでパッケージされ、したがって、得られた組換え体ベクターは、細胞および細胞株の感染のため、とりわけヒトを含む生動物の感染のために使用可能である。本発明にしたがって使用しうる典型的なウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）に基づいたベクターである。もっとも好ましいのは、ポックスウイルスベクターである。ポックスウイルスは、好ましくはカナリア痘ポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、鶏痘ポックスウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルスである。より好ましいのは、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．［１９９４］、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３１−４０）である。典型的なＭＶＡ株は、寄託番号第ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７号にて欧州菌培養収集所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された、ＭＶＡ５７５である。もっとも好ましいのは、ＰＣＴ明細書国際公開第０２／４２４８０号（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８）にて記述された、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体である。この明細書の内容は、本明細書に参考文献にて組み込まれている。ＭＶＡ−ＢＮは、寄託番号第ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８号にて、欧州菌培養収集所に寄託された。ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターが、極度に弱毒化されたウイルスであることが示されたので、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体を使用することによって、フラビウイルスに対するとりわけ安全なウイルスワクチンを提供するためのさらなる技術的な問題が解決された。とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮは、本技術分野で以前より公知のＭＶＡ株よりもより弱毒化されたことが示された。ＭＶＡ−ＢＮは改変ワクシニアアンカラウイルスより由来し、ヒト細胞株における増殖複製のその能力の欠如により特徴づけられる。ＭＶＡ−ＢＮは、ヒトにおける複製の欠如により、他の公知のワクシニアウイルス株よりも安全である。好ましい実施様態において、本発明は、以上で定義したようなＤＮＡを含むウイルスベクターとして、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮの誘発体に関する。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、ＭＶＡ株が、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体であるかどうかを評価可能である生物学的アッセイの記述、またはＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体を得ることを可能にする方法の記述は、国際公開第０２／４２４８０号にて開示されている。
【００３２】
第ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８号にて寄託したようなウイルスの「誘導体（誘発体）（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」という語句、すなわちＭＶＡ−ＢＮの誘発体を、国際公開第０２／４２４８０号公報にて定義したように、本発明で使用する。以下で、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体の特徴を簡単に要約する。ＭＶＡ−ＢＮの誘発体の定義に関するより詳細な情報、とりわけ、ＭＶＡウイルスが、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体であるかどうかを決定するために使用した生物学的アッセイに関する詳細な情報に関して、参考文献が、国際公開第０２／４２４８０号公報に対して作製される。したがって、前記語句は、寄託された株ＭＶＡ−ＢＮの以下の特徴のうち少なくとも１つを示し、そのゲノムの１つまたはそれ以上の部分で相違が見られるワクシニアウイルスを意味する。好ましくは、誘発体は、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、もっとも好ましくはすべての、以下のＭＶＡ−ＢＮの４つの特徴を持つ。
−ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）、幼児ハムスター腎臓細胞株ＢＨＫ（第ＥＣＡＣＣ８５０１１４３３号）における増殖複製の能力、ただし、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１）における増殖複製の能力はない。
−生体内における複製の失敗
−致死チャレンジモデルにおける、公知の株ＭＶＡ５７５（第ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７号）と比較した場合の、より高い免疫原性の誘発、および／または
−ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一のレベルの誘発
とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体は、ＭＶＡ−ＢＮと比べて、本質的に同一の複製特性を持つ。寄託されたウイルスに比べて、同一の「複製特性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」を持つウイルスは、ＣＥＦ細胞および細胞株ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂにおいて、寄託された株と比べて、同様の増幅比で複製され、ＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデルにおいて決定されたように、生体内にて同様の複製を示すウイルスである。
【００３３】
語句「増殖複製の能力無し（Ｎｏｔ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」が、国際公開第０２／４２４８０号にて定義されたように、本明細書で使用される。したがって、「増殖複製の能力無し」であるウイルスは、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１）において、１より少ない増幅比を示すウイルスである。好ましくは、本発明にしたがったベクターとして使用したウイルスの増幅比は、ヒト細胞株ＨａＣａｔにて、０．８またはそれ以下である。ウイルスの「増幅比（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）」は、第一の位置で細胞を感染させるために元々使用した量（Ｉｎｐｕｔ）に対する、感染細胞から産生されるウイルス（Ｏｕｔｐｕｔ）の比である（「増幅比」）。ＯｕｔｐｕｔおよびＩｎｐｕｔ間の「１」の比は、感染細胞から産生されるウイルス量が、細胞を感染させるために最初に使用した量と同一である、増幅状態を定義する。
【００３４】
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体の定義の文脈において、語句「生体内における複製の失敗（ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」が、国際公開第０２／４２４８０号にて定義されたように、本明細書で使用される。したがって、前記語句は、国際公開第０２／４２４８０号において説明したように、ヒトおよびマウスモデルにおいて、複製しないウイルスである。国際公開第０２／４２４８０号にて使用したマウスは、成熟ＢおよびＴ−細胞の産生が不可能である（ＡＧＲ１２９マウス）。とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体は、腹腔（腹膜）内に投与された１０７ｐｆｕウイルスでのマウスの感染の後、少なくとも４５日以内、より好ましくは少なくとも６０日以内、もっとも好ましくは９０日以内、ＡＧＲ１２９マウスを殺さない。このましくは、「生体内における複製の失敗」が、マウスに１０７ｐｆｕウイルスを腹膜内投与した後、少なくとも４５日間、より好ましくは少なくとも６０日間、もっとも好ましくは９０日間、ＡＧＲ１２９マウスの器官または組織から、ウイルスが回収されないことでさらに特徴づけられる。
【００３５】
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体は、好ましくは、国際公開第０２／４２４８０号にて説明したような致死チャレンジマウスモデルにおいて測定されたように、公知の株ＭＶＡ５７５と比較して、より大きな免疫原性によって特徴づけられる。そのようなモデルにおいて、ワクチン化されていないマウスは、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株Ｌ９２９  ＴＫ＋またはＩＨＤ−Ｊのような、複製能力を有するワクシニア株の感染の後、死亡する。複製能力を有するワクシニアウイルスの感染は、致死チャレンジモデルの記述の文脈中、「チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」として参照される。チャレンジの４日後、マウスを通常殺し、卵巣におけるウイルスタイターを、ＶＥＲＯ細胞を用いる標準のプラークアッセイによって決定する。ウイルスタイターは、ワクチン化していないマウス、およびＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体でワクチン化したマウスに関して決定する。よりとりわけ、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体が、１０２  ＴＣＩＤ５０／ｍｌウイルスでのワクチン化の後、この試験にて、卵巣ウイルスタイターが、ワクチン化していないマウスと比較して、少なくとも７０％まで、好ましくは少なくとも８０％まで、より好ましくは少なくとも９０％まで減少することで特徴づけられる。
【００３６】
ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体は、好ましくは、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一のレベルの免疫原を誘発することによって特徴づけられる。ワクシニアウイルスは、国際公開第０２／４２４８０号にて開示されたような、「アッセイ１」および「アッセイ２」の１つで、好ましくは両方のアッセイで測定されたような、ＣＴＬ応答が、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一である場合に、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一のレベルの免疫原性を誘発すると見なされる。より好ましくは、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト投与の後のＣＴＬ応答が、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較したときに、少なくとも１つのアッセイでより高い。もっとも好ましくは、両方のアッセイにて、ＣＴＬ応答応答がより高い。
【００３７】
国際公開第０２／４２４８０号は、以上で定義したような、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体の特徴をもって、どのようにワクシニアウイルスを得るか、開示している。
【００３８】
以上で定義したようなＤＮＡを、ポックスウイルスＤＮＡ内に挿入するための方法、および組換え体ポックスウイルスを得るための方法は、当業者に公知である。組換え体ワクシニアウイルスにおいて、本発明にしたがったＤＮＡの発現が、好ましくは、しかし排他的ではなく、ポックスウイルスプロモーターの、より好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下である。本発明にしたがったＤＮＡの挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域内である。本発明の他の好ましい実施様態において、異種核酸配列を、（第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６号明細書にて開示された）ＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位にて挿入する。
【００３９】
まとめると、以上で定義したＤＮＡを含むベクターを提供することが、本発明のもっとも好ましい実施様態の１つであり、その際、前記ベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体であり、前記ＤＮＡは、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている発現カセットを含み、前記フラビウイルスは、好ましくはデングウイルス、より好ましくはデングウイルスセロタイプ２である。
【００４０】
好ましい実施様態において、本発明は、数種のフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対するワクチン化のための、本発明にしたがったＤＮＡによって、または本発明にしたがったベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分の実用性に関する。本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分の定義に関しては、参考としては、ＮＳ１をコードしているＤＮＡが、前記ＤＮＡから発現した産物によって定義された、以上の記述部分である。本発明にしたがったタンパク質に関する以下の要約はしたがって、本発明の制限としては認識されるべきでない。まとめとして、ＮＳ１タンパク質は、任意のフラビウイルスによってコードされた単離ＮＳ１タンパク質またはその部分でありうる。ＮＳ１タンパク質またはその部分は、好ましくはデングウイルス、より好ましくはデングウイルスセロタイプ２から由来する。タンパク質は、ウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分のアミノ酸配列のみを含みうる。好ましい実施様態において、ＮＳ１タンパク質は、タンパク質の効果的な発現のために必要な追加アミノ酸を含みうる。そのようなアミノ酸／アミノ酸配列に関する例は、以上で示しており、追加ＡＴＧコドンによってコードされたタンパク質のＮ−末端におけるメチオニン、およびＮＳ１タンパク質またはその部分の糖付加のためのシグナル配列としてはたらく、Ｅ−タンパク質のＣ−末端から由来するアミノ酸配列である。他のシグナル配列もまた、本発明の範囲内である。他の実施様態において、ＮＳ１アミノ酸配列またはその部分は、他のタンパク質／ペプチドに融合可能である。融合パートナーに関する例としては、タグのようなタンパク質の同定を可能にする配列、または他のフラビウイルスタンパク質またはその部分である。
【００４１】
好ましい実施様態において、本発明は、ワクチンとしての、とりわけ数種のフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対するワクチンとしての、本発明にしたがった、ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分に関する。「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」は、特定の免疫応答を誘発する化合物、すなわちＤＮＡ、タンパク質、ベクターまたはウイルスである。
【００４２】
１つの他の本実施様態にしたがって、本発明にしたがった「ワクチン」は、すべてのデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対する免疫応答を誘発する、デングウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分に基づく。とりわけ、１つのデングウイルスセロタイプ、とりわけセロタイプ２のＮＳ１タンパク質が、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、もっとも好ましくはすべてのデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対する、および好ましくは、少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスに対する免疫応答を誘発することが示されてきた。
【００４３】
以上で説明したように、本発明の発明者らは、１つのフラビウイルスの本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分が、他のフラビウイルスのＮＳ１タンパク質に対する免疫応答を誘発することを発見した。以上で指摘したように、「フラビウイルス」は、好ましくは蚊媒介性フラビウイルスである。言い換えれば、本発明の発明者らは、他の実施様態において、１つの蚊媒介性フラビウイルスの本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分が、ワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質に対する、およびまた他の蚊媒介性フラビウイルスに対する免疫応答を誘発することを発見した。したがって、蚊媒介性フラビウイルスから由来するワクチンは、１つまたはそれ以上の蚊媒介性フラビウイルスに対するワクチンとして有用である。本明細書の文脈中の語句「フラビウイルスから由来したベクター（ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）」または同様の語句は、以上で定義したようなベクター（たとえばポックスウイルスベクターまたはプラスミド）が、以上で定義したようなＤＮＡを含むことを意味する。したがって、この語句は、ベクターの挿入部分を意味し、ベクター骨格を意味しない。「フラビウイルスに由来したベクター」の例は、ポックスウイルスプロモーター、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分を含む発現カセットを含む、ＭＶＡのような、ポックスウイルスベクターであって、その際フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列は、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方にあり、前記コード配列は翻訳の終止コドンにて終止する。
【００４４】
したがって、ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分でのワクチン化は、広い範囲のフラビウイルスまたは少なくともフラビウイルスセロタイプに対する、単一サブユニットワクチンとして有用である。フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプからのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているＤＮＡまたはベクター、または前記フラビウイルスまたはセロタイプからのＮＳ１タンパク質またはその部分はしたがって、それぞれ他のフラビウイルスおよびフラビウイルスセロタイプに対するワクチン接種のためのワクチンとして使用することができる。たとえば、デングウイルスセロタイプ２から由来したワクチンは、１つ、２つまたはすべてのセロタイプ１、３および４に対するワクチンとして、ならびセロタイプ２に対するワクチンとして使用可能である。さらに、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスのような、他のフラビウイルスに対して、個体を保護するためにも、さらに有用であり得る。
【００４５】
好ましい実施様態において、本発明にしたがったＤＮＡをワクチンとして使用する。本発明でのように、真核細胞発現カセットを含む裸のＤＮＡの投与、とりわけ、ＤＮＡの筋肉内注射が、発現カセットによってコードされたタンパク質の発現を導くことは、当業者によって知られている。タンパク質は、免疫システムに暴露され、特定の免疫応答が起こる。
【００４６】
他の実施様態において、ワクチン化は、本発明にしたがったベクター、とりわけウイルスベクター、より好ましくはポックスウイルスベクター、もっとも好ましくはワクシニアウイルスベクター、たとえばＭＶＡベクターを投与することによって実施される。
【００４７】
ワクシニアウイルスに基づくワクチンの調製のために、本発明にしたがったウイルス、とりわけＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体は、生理学的に許容可能な形態に変換される。このことは、（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２によって記述されたような）スモールポックスに対するワクチン化のために使用されたポックスウイルスワクチンの調製での経験に基づいて行うことができる。たとえば、精製したウイルスを、約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４中で処方した、５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌのタイターで、−８０℃にて保存する。ワクチンショットの調製に関しては、たとえばウイルスの１０２〜１０９粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプル中で、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下、１００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥する。
【００４８】
ワクチン接種（ワクチン化）のために使用される、ワクシニアウイルスに基づくワクチン、とりわけＭＶＡ−ＢＮに基づくワクチンを、凍結乾燥状態で保存することが、とりわけ好ましい。１つのフラビウイルスのＮＳ１タンパク質によって誘発される、それぞれ異なるフラビウイルスおよびフラビウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対する、免疫応答並びに免疫応答の交差反応の割合は、ワクチン化に使用されるウイルスを、凍結乾燥ウイルスとして保存したときに、とりわけ高いことが実施例において示されている。したがって、ワクチンショットは、好ましくは、製剤化においてウイルスの段階的凍結乾燥によって産生することが可能である。この製剤（処方）は、生体内投与に好適な、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのような追加添加物、または抗酸化剤、不活性気体、安定剤、または組換え体タンパク質（たとえば  ヒト血清アルブミン）を含みうる。凍結乾燥に好適な典型的なウイルス含有処方は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌデキストラン（ＭＷ３６０００−４００００）、４５ｇ／ｌスクロース、０．１０８ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物  ｐＨ７．４を含む。凍結乾燥の後、ついでガラスアンプルを密封し、４℃〜室温の間で、数ヶ月間保存可能である。しかしながら、必要性がない限り、アンプルは、好ましくは−２０℃以下の温度で保存する。ワクチン化のために、凍結乾燥物を、水、生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液のような水性の溶液０．１〜０．５ｍｌ中に溶解可能であり、そして、全身または局所いずれかで、すなわち、非経口、筋肉内または実施者に公知の他の任意の投与経路にて投与可能である。投与の様式、投与の用量と回数は、公知の様式で当業者によって最適可能である。ポックスウイルスベクターに対してもっとも好ましいのは、皮下または筋肉内投与である。もっとも好ましくは、ワクチン化は、たとえば３〜５週間の間隔での、２ワクチンショットの投与によって実施する。
【００４９】
ワクチンが、本発明にしたがったＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘発体である場合、本発明の特定の実施様態は、第一バイアル／容器内における第一ワクチン化（「初回（ｐｒｉｍｉｎｇ）」）のための、および第二バイアル／容器内における第二ワクチン化（「追加 （ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のための、本発明にしたがったＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターを含むワクチン化のためのキットに関する。
【００５０】
ワクチンが、以上で定義したようなＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘発体である場合、本発明の特定の実施様態は、第一接種（初回接種）（「初回接種」）および第二接種（「追加 接種」）における、治療的に効果的な量のワクチンの接種に関する。初回接種と追加 接種の間の間隔は、たとえば２〜１２週間、好ましくはたとえば３〜６週間、より好ましくはたとえば約３週間である。ワクチン化に使用するウイルス量は、少なくとも１×１０２ＴＣＩＤ５０、好ましくはたとえば１×１０７ＴＣＩＤ５０〜１×１０９ＴＣＩＤ５０であるべきである。さらに、本発明の特定の実施様態は、第一バイアル／容器内における第一ワクチン化（「初回（ｐｒｉｍｉｎｇ）」）のための、および第二バイアル／容器内における第二ワクチン化（「追加 （ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のための、本発明にしたがったＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターを含むワクチン化のためのキットに関する。
【００５１】
したがって、本発明は、ワクチン実施様態において、以上で定義したようなＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分を含むワクチン、および、ワクチンの調製のための、前記ＤＮＡ、ベクターまたはタンパク質の使用に関する。好ましい実施様態にしたがって、本発明は、ワクチンの調製のための、前記ＤＮＡ、ベクターまたはタンパク質の使用に関し、その際ＮＳ１タンパク質またはその部分、ＤＮＡまたはベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分が、１つのデングウイルスセロタイプより由来し、前記ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分が、２つ、３つまたはすべてのデングウイルスセロタイプに対するワクチンとして使用される。もっとも好ましくは、デングウイルスセロタイプは、セロタイプ２である。
【００５２】
本発明はさらに、接種が必要である、ヒトを含む動物に、以上のようなＤＮＡ、以上のようなベクター、または以上のようなＮＳ１タンパク質またはその部分を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法に関する。とりわけ、本発明は、以上のような方法に関し、その際、ＮＳ１タンパク質またはその部分、またはＤＮＡまたはベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分が、１つのデングウイルスセロタイプより由来し、前記ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分が、２つ、３つまたはすべてのデングウイルスセロタイプに対するワクチンとして使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、単独または組み合わせて、とりわけ以下に関する。
【００５４】
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、蚊媒介性フラビウイルスに対する、および少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスに対するワクチンの調製のための、
−転写調節要素および、少なくとも蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸。
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、
の使用。
【００５５】
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記蚊媒介性フラビウイルスが、デングウイルスである、前記のような使用。
【００５６】
すべてのデングウイルスセロタイプに対する、そして任意に少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスに対する、ワクチンの調製のための、
−転写調節要素および、少なくともデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸。
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記デングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分、
の使用。
【００５７】
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記デングウイルスが、デングウイルス  セロタイプ２である、前記のような使用。
【００５８】
蚊媒介性フラビウイルスまたはデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列に、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方に存在し、前記コード配列が、翻訳の終止コドンによって終止する、前記のような使用。
【００５９】
前記他の蚊媒介性フラビウイルスが、西ナイルウイルス、黄色熱ウイルスおよび日本脳炎ウイルスより選択される、前記のような使用。
【００６０】
前記ベクターがポックスウイルスベクターである、前記のような使用。
【００６１】
前記ポックスウイルスベクターが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）、とりわけ、番号第Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されたＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体である、前記のような使用。
【００６２】
前記ポックスウイルスベクターが凍結乾燥され、投与の前に、薬学的に許容可能な希釈液中で再構成される、前記のような使用。
【００６３】
前記転写調節要素が、ポックスウイルスプロモーターである、前記のような使用。
【００６４】
前記ワクチンが、第一接種（初回接種）「初回 接種」および第二接種「追加 接種」にて、治療的に効果的な量で投与される、前記のような使用。
【００６５】
接種を必要としているヒトを含む動物に、
−転写調節要素および、少なくとも蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸、
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、
を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法であって、前記フラビウイルス感染が、核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、蚊媒介性フラビウイルスによる感染、および／または他の蚊媒介性フラビウイルスによる感染である、方法。
【００６６】
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記蚊媒介性フラビウイルスが、デングウイルスである、前記のような使用。
【００６７】
接種を必要としているヒトを含む動物に、
−転写調節要素および、少なくともデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸、
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記デングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分、
を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法であって、前記フラビウイルス感染が、核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、デングウイルスセロタイプによる感染、および／または他のデングウイルスセロタイプによる感染および／または他の蚊媒介性フラビウイルスによる感染である、方法。
【００６８】
ＤＮＡまたはタンパク質またはその部分が由来する、前記デングウイルスが、デングウイルス  セロタイプ２である、前記のような方法。
【００６９】
蚊媒介性フラビウイルスまたはデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列が、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方に存在し、前記コード配列が、翻訳の終止コドンによって終止する、前記のような方法。
【００７０】
前記ベクターがポックスウイルスベクターである、前記のような方法。
【００７１】
前記ポックスウイルスベクターが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）株である、前記のような方法。
【００７２】
前記ＭＶＡ株が、番号第Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されたＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体である、前記のような方法。
【００７３】
前記ポックスウイルスベクターが凍結乾燥され、投与の前に、薬学的に許容可能な希釈液中で再構成される、前記のような方法。
【００７４】
前記転写調節要素が、ポックスウイルスプロモーターである、前記のような方法。
【００７５】
前記ポックスウイルスベクターまたは薬学的調合物が、第一接種（初回接種）「初回接種」および第二接種「追加 接種」にて、治療的に効果的な量で投与される、前記のような方法。
【００７６】
転写調節要素および、少なくともフラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含むＤＮＡを持つポックスウイルスベクターであって、前記ポックスウイルスが、番号第Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されたＭＶＡ株ＢＮまたはその誘発体である、ポックスウイルスベクター。
【００７７】
前記フラビウイルスが、蚊媒介性フラビウイルス、とりわけデングウイルスである、上記のようなポックスウイルスベクター。
【００７８】
前記デングウイルスが、デングウイルスセロタイプ２である、上記のようなポックスウイルスベクター。
【００７９】
フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列に、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方に存在し、前記コード配列が、翻訳の終止コドンによって終止する、前記のようなポックスウイルスベクター。
【００８０】
前記転写調節要素が、ポックスウイルスプロモーターである、前記のようなポックスウイルスベクター。
【００８１】
前記ポックスウイルスベクターが凍結乾燥される、前記のようなポックスウイルスベクター。
【００８２】
ワクチンとしての、前記のようなポックスウイルスベクター。
【００８３】
前記のようなポックスウイルスベクター、および薬学的に許容可能な担体、希釈液および／または添加剤を含む薬学的調合物 。
【００８４】
フラビウイルス感染の処置および／または予防のための、前記のようなポックスウイルスベクターまたは前記のような薬学的調合物 であって、前記ポックスウイルスベクターまたは薬学的調合物 が、第一接種（初回接種）（「初回接種」）および第二接種（「追加接種」）にて、治療的に効果的な量で投与される、前記ポックスウイルスベクターまたは前記薬学的調合物 。
【００８５】
接種を必要としているヒトをふくむ動物に、前記のようなベクターまたは前記のような薬学的調合物 を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法。
【００８６】
前記のようなポックスウイルスベクターを含む、細胞、好ましくはヒト細胞。
【００８７】
フラビウイルス感染を処置または予防するための、ワクチンの調製のための、前記のようなポックスウイルスベクターの使用。
【００８８】
第一バイアル／容器内における第一接種（初回接種）（「初回接種」）のための、および第二バイアル／容器内における第二接種（「追加接種」）のための、前記のようなポックスウイルスベクターまたは前記のような薬学的調合物を含む、初回／追加免疫のためのキット。
【００８９】
図面の簡単な説明
図１Ａ：
本発明において例として使用したコンストラクトの、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」ｃＤＮＡタンパク質コード配列。通常の文脈におけるＮＳ１遺伝子の開始を、矢印によって示す。重要な特徴は、ＡＴＧ開始コドンおよび終止コドン（本例では「ＴＡＧ」）の添加である。ヌクレオチド配列数字は、ＮＧＣ株ゲノム中の位置を意味する（Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号第ＡＦ０３８４０３号）。図１Ａにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．５に相当する。アミノ酸は別に、ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．６として示す。
【００９０】
図１Ｂ：
デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」タンパク質コード配列を含むプラスミドｐＡＦ７ＮＳ１のダイアグラム。
【００９１】
図１Ｃ：
ｏＢＮ４５およびｏＢＮ３３８でのカセットのＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を示している、プラスミドｐＡＦ７内のＮＳ１カセットのヌクレオチド配列。図１Ｃにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．７に相当する。アミノ酸は別にＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．８にて示す。
【００９２】
図１Ｄ：
上段：デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ０３８４０３号のデングＮＣＧポリタンパク質のアミノ酸７７６〜１１２７）のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロット。ゼロより上の値＝疎水性。
下段：Ｅタンパク質のＣ−末端の最後の２８アミノ酸から由来するシグナル配列を含む、デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（アミノ酸７４８〜７７５）の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロット。全アミノ酸配列は、この株に関して、「ＡＴＧ」開始コドンにて開始するが、終止コドンを欠く、デングＮＣＧポリタンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  第ＡＦ０３８４０３号）のアミノ酸７４８〜１１２７を表している。Ｓｉｇ＝シグナル配列。ゼロより上の値＝疎水性。
【００９３】
図２：
「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」発現カセットのヌクレオチド配列。図２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．９に相当する。アミノ酸は、ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．１０として別に示す。簡単に記すと、最小のポックスウイルス早期／後期プロモーター要素が、デングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質の発現を制御し、その際、ＮＳ１タンパク質のＮ−末端は、Ｅ−タンパク質の２８Ｃ−末端アミノ酸に融合する。翻訳は、核酸配列内へ挿入されたＴＡＧ終止コドンにて終止する。
【００９４】
図３Ａ：
クローンｐＢＮ４１を産生するための、ＮＳ１発現カセットの、ｐＢＮＸ０７の平滑末端化ＸｈｏＩ部位内へのクローニング（平滑末端クローニング）。ＰＰｒ＝ポックスウイルスプロモーター、Ｄ２Ｆ１＝欠失部位２のフランク１、ＮＰＴ＝ネオマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ＝内部リボソーム結合部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）、ＥＧＦＰ＝増強グリーンフルオレセンスタンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、（ｐＢＮ４１中）ＮＳ１＝シグナル配列＋ＮＳ１、Ｄ２Ｆ２＝欠失部位２のフランク２、Ｓｉｇ＝シグナル配列。ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子。
【００９５】
図３Ｂ：
ＭＶＡの６つの欠失部位（Deletion site）の局所を示している、ＭＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ９４８４８）のＨｉｎｄ  ＩＩＩマップ（−Ｊ−＝欠失部位の連結）。「ＰＰｒ＋ＮＰＴ  ＩＩ＋ＩＲＥＳ＋ＥＧＦＰ＋ＰＰｒ＋ＮＳ１」カセットを、ＭＶＡの欠失２部位内へ挿入した。ＰＰｒ＝ポックスウイルスプロモーター、ＮＰＴ  ＩＩ＝ネオマイシン耐性遺伝子（タンパク質コード配列）、ＩＲＥＳ＝内部リボソーム結合部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）、ＮＳ１＝シグナル配列＋デング２  ＮＧＣ株のＮＳ１タンパク質コード配列。
【００９６】
図４：
すべての３匹のウサギに関する、免疫後血清滴定の、エライザ（ＥＬＩＳＡ）吸光度（吸収）読み取りのプロット。
【００９７】
図５：
エライザ交差反応研究。第３８日（上部）および第６６日（下部）のウサギ血清の、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ＪＥＶおよびＷＮＶが感染した細胞の溶解物との交差反応を、エライザアッセイで試験した。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するであろう。実施例は、本発明によって提供される技術の適用を、これらの実施例に限定するとは解釈されないことが、当業者によってよく理解されるであろう。
【００９９】
例１：
ｍＢＮ０７の構築
１．ＮＳ１抗原の詳細（図１）
本実施例は、ニューギニア（Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａ）Ｃ株−ＮＧＣ株から由来するセロタイプ２のＮＳ１に関する（例：Ｇｅｎｂａｎｋ配列第ＡＦ０３８４０３号）。フラビウイルスのＮＳ１タンパク質は、ポリタンパク質前駆体の部分として産生されるので、相当するＤＮＡ内のＮＳ１遺伝子は、「ＡＴＧ」開始コドンが上方に存在しない。
【０１００】
したがって、ＮＳ１タンパク質をコードしているｃＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンの添加が必要でなければならない。ついで、新規に合成されたＮＳ１タンパク質が、小胞体中で糖付加されるように、シグナル配列を付加（添加）する。最終的に、タンパク質コードカセットは、終止コドンが必要であり、この実施例では、タンパク質コードｃＤＮＡ配列の３’末端に、ＴＡＧを添加した。本発明で使用した実施例において、「ＡＴＧ＋シグナル配列」要素が、Ｅタンパク質の疎水性Ｃ末端から由来した（最後の２８アミノ酸、ＮＧＣに関して、アミノ酸Ｍ（ＡＴＧ）によって開始）。
【０１０１】
図１Ａは、本発明のための実施例として使用した、実際のシグナル配列＋ＮＳ１配列を示している（また、ＳＥＱ：ＩＤ５および６を参照のこと）。「シグナル配列＋ＮＳ１タンパク質」ヌクレオチドコード配列は、以下のプライマー
Ｄ２ＮＳ１−１ｕｐ：５’−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＡＧＣＡＣＣＴＣＡ−３’（ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．４）
イタリック：ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位
下線は開始コドン
Ｄ２ＮＳ１−２ｄｏｗｎ：５’−ＡＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．３）
イタリック：ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位
下線は終止コドン、
を用いる、デングＮＧＣゲノムＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た。
【０１０２】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ロッシュ  モレキュラー  バイオケミカル（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）からのＴｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号１−９３９−８２３）を用いて、取扱説明書にしたがって実施した。しかしながら、代わりに本質的に任意の市販されている、または市販されていないＲＴ−ＰＣＲキットを使用可能である。
【０１０３】
ＲＴ−ＰＣＲ産物をついで、多くの市販されている入手可能な細菌クローニングプラスミドに存在する任意のマルチクローニングサイト（多重クローニング部位）のＢａｍＨＩ部位内にクローン化可能であり、ただし本実施例では、ｐＡＦ７内にクローン化して、ｐＡＦ７Ｄ２ＮＳ１を作製した。ｐＡＦ７Ｄ２ＮＳ１に関する配列の詳細に関しては、図１Ｂおよび１Ｃを参照のこと。図１Ｄは、ＮＳ１アミノ酸配列、およびＥタンパク質のＣ−末端アミノ酸コード配列からの付加（添加）シグナル配列を含むＮＳ１の、疎水性プロットを示している。短いＮ−末端疎水性ドメインが、シグナル配列を示している。
２．ＮＳ１発現カセットの詳細（図２）
カナリア痘ポックス、鶏痘ポックス、ワクシニアまたはＭＶＡのようなポックスウイルスベクターからのこの「シグナル配列＋ＮＳ１」を発現するために、ポックスウイルスプロモーターが、本ｃＤＮＡの５’末端に添加される必要がある。ポリアデニル化シグナル配列は、すべてのポックスウイルス合成ＲＮＡが、この機能を実施するために、ポリＡ添加シグナル配列を必要としない、ウイルスがコードした酵素によってポリアデニル化されるので、必要ない。このカセットの発現のために、任意のポックスウイルスプロモーターが使用可能である。図２およびＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．９および１０は、本発明の実施例として使用した、「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」カセットのヌクレオチド配列を示している。
【０１０４】
本発明で使用した実施例のために、「シグナル配列＋ＮＳ１」をさらに、プライマーｏＢＮ３３８およびｏＢＮ３４５を用いて、ＮＳ１プラスミドクローンよりさらにＰＣＲ増幅した。ｏＢＮ３４５プライマーは、クローニングプラスミド内の標的配列に対する、ポックスウイルス最小プロモーター要素のヌクレオチド配列を含んでいる。ｏＢＮ３４５プライマー結合のための、プラスミド標的配列は、シグナル配列開始コドンのおよそ４０ヌクレオチド上方である。このことは、ＲＮＡ転写物が、シグナル配列ＡＴＧ開始コドンの前の、非タンパク質コード配列のストレッチを含むことを確かにするためのものであった。
【０１０５】
ＰＣＲプライマーはＰｓプロモーターを持つ。
ｏＢＮ３３８：５’−ＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡ（３０マー）（ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．１）
ｏＢＮ３４５：
５’−ＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ：ＩＤ  Ｎｏ．２）
（下線ヌクレオチドは、ポックスウイルス最小プロモーター配列を表している。）
最初の５サイクルのための、ＰＣＲ増幅反応に関するアニーリング温度は、ｏＢＮ３４５のクローニングベクター内の相同配列に結合するヌクレオチド配列より計算した。
３．ＭＶＡ内へのＮＳ１発現カセットの組み込み
ＰＣＲ増幅産物の、切断され、平滑末端化されたプラスミドｐＢＮＸ０７（図３ａを参照のこと）のＸｈｏＩ部位への平滑末端クローニングにより、プラスミドｐＢＮ４１（図３ａを参照のこと）が形成した。ｐＢＮ４１は、相同組換えによって、ＭＶＡの欠失部位２内へ「ポックス  プロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」カセットを組み込むためのベクターである。
【０１０６】
ｐＢＮ４１（図３ａを参照のこと）の必須の特徴は、以下のようである。
−プラスミド骨格は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−プラス（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＶＢ００７８）である。
−Ｄ２Ｆ１：欠失２フランク１相同組換えアーム。これは、ＭＶＡ  Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ９４８４８の２０１１７〜２０７１７のヌクレオチド配列を表している。
−ＰＰｒ：ポックスウイルスプロモーター
−ＮＰＴ  ＩＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質コード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｖ００６１８のタンパク質コード配列）
−ＩＲＥＳ：脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）からの内部リボソーム侵入配列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ１６８０２）
−ＥＧＦＰ：増強グリーンフルオレセンスタンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）コード配列（タンパク質コード配列−Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ５７６０９からのヌクレオチド６７５〜ヌクレオチド１３９４）
−ＮＳ１：デングＮＧＣ株からの「シグナル配列＋ＮＳ１」タンパク質コード配列
−Ｄ２Ｆ２：欠失２フランク２相同組換えアーム。これは、ＭＶＡ  Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ９４８４８の２０７１９〜２１３４３のヌクレオチド配列を表している。
−ＡｍｐＲ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのアンピシリン耐性遺伝子
３．１  相同組換えによる、ＭＶＡの欠失部位内へのデング「ポックスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」の組み込み
３．１．１  相同組換えによる、ＭＶＡゲノム内への組み込み
上記組み込みベクターｐＢＮ４１を使用して、ｐＢＮ４１のフランク１とフランク２アーム、およびＭＶＡゲノム内の相同標的配列間の相同組換えによって、ＭＶＡゲノム内へ、デングＮＳ１発現カセット＋さらにレポーターカセット（Ｐｏｘプロモーター＋ＮＰＴＩＩ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）を挿入する。これは、先に低い感染多重度（ＭＯＩ、たとえば０．０１感染ユニット／細胞）で、ＭＶＡを先に感染させた、ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）内へ、直線化組み込みベクターをトランスフェクトすることによって達成する。感染後４８時間の時点、または感染が密に達成されたときに、ウイルス抽出物を調製し、望む組換え遺体ＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の選別およびクローン精製の準備のために、−２０℃にて保存する。
３．１．２  ｒＭＶＡの選別およびクローン精製
非組換え体ＭＶＡ（空ベクターウイルス）の除去およびｒＭＶＡの増幅は、Ｇ４１８の存在下で、低いＭＯＩにて、コンフルエントな（コンフレント）ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）の感染によって達成する（Ｇ４１８の量は、ＣＥＦ細胞を殺さない、もっとも高い用量を決定するために最適化されなければならない）。ＮＰＴＩＩ遺伝子を含まず、挿入されていない任意のウイルスは、細胞維持培地に加えたＧ４１８の存在下で複製はしない。Ｇ４１８は、ＤＮＡ複製を阻害するが、ＣＥＦ細胞が、静止非複製状態であるので、Ｇ４１８の活性によって影響を受けないであろう。ｒＭＶＡが感染したＣＥＦ細胞は、増幅フルオレセントグリーンタンパク質の発現のために、蛍光顕微鏡下で可視化可能である。
【０１０７】
相同組換え段階からのウイルス抽出物を、連続希釈し、Ｇ４１８の存在下で、新鮮なＣＥＦ細胞を感染させるために使用し、低融点アガロースでオーバーレイした。感染２日後、アガロース感染プレートを、緑色感染細胞の単一叢（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｏｃｉ）に関して、蛍光顕微鏡下で観察する。これらの細胞をマークし、細胞の感染叢を含むアガロースプラグをとり、無菌細胞保持培養液を含む１．５ｍｌ微小遠心チューブに入れる。ウイルスを、チューブを３回、−２０℃にて凍結融解することによって、アガロースプラグより放出させる。
【０１０８】
もっともよいクローンまたはクローン類をさらに、ＰＣＲ解析によって、空のベクターの汚染の兆候がないまで（３〜３０ラウンドのクローン精製）、アガロース下でクローン精製する。これらのクローンを次いで、正確な挿入配置、プロモーター外来遺伝子カセットの配列確認、およびＲＴ−ＰＣＲによる発現解析のための、さらなる厳格な試験のために増幅する。これらの解析の後、ただ１つのクローンを、Ｇ４１８選別下、さらに増幅し、さらなる特性化および免疫原性試験のために、マスターストックを調製する。
【０１０９】
本発明で記述した挿入デングＮＳ１発現カセットを含む組換え体ＭＶＡを、ｍＢＮ０７と名付けた。図３ｂは、ｍＢＮ０７内の挿入外来配列の配置を示している。
４．ＭＶＡによる、真性ＮＳ１の発現
組換え体ＭＶＡ、ｍＢＮ０７からのＮＳ１タンパク質の発現を、非変性条件下での標準のウエスタンブロット解析によって確かめた。よりとりわけ、ＮＳ１発現を、精製ｍＢＮ０７を、哺乳動物組織培養細胞、たとえばＢＨＫ−２１細胞を、１．０感染ユニット／細胞のＭＯＩにて感染させるために使用した後に、解析した。未精製タンパク質抽出物を、感染２４〜３０時間後に、これらの感染細胞より調製し、その際、これらの抽出物の部分を、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）含有、または２−ＭＥを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディング緩衝液と混合した。これらの試料＋陽性対照として、デングＮＧＣ株に感染した細胞（蚊細胞）からのタンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて、電気泳動分離し、ついで、ニトロセルロース膜上にブロットした。膜を、抗デングＮＳ１モノクローナル抗体でプローブした。
【０１１０】
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が、抗デングＮＳ１モノクローナル抗体によって認識されること、およびデング感染細胞からのＮＳ１と同様な、正確な二量体形態を形成すること（２−ＭＥなし未煮沸ｍＢＮ０７レーンを、２−ＭＥなし未煮沸ＤＥＮ２レーンと比較する）が示された。さらに、二量体形態が、変性条件下で、単量体形態に分解されることが示された（２−ＭＥありの煮沸ｍＢＮ０７レーン）。
【０１１１】
ｍＢＮ０７に感染した細胞内で発現したＮＳ１はまた、回復患者の保存血清によって、および、ウエスタンブロット解析におけるすべての４つのデングのセロタイプのＮＳ１に交差反応するモノクローナル抗体で、認識される。このことは、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が免疫原性であることを示唆している。
【０１１２】
実施例項を通して、ｍＢＮ０７（しばしばＢＮ０７とも記述する）は、液体状態（任意に冷凍）、または凍結乾燥状態のいずれかで保存する。凍結乾燥ウイルスを得るために、ウイルスを含む溶液を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−緩衝液、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌ  デキストラン（ＭＷ  ３６０００〜４００００）、４５ｇ／ｌスクロース、０．１０８ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン酸一カリウム一水和物ｐＨ７．４を含んで調製する。ついで前記処方を凍結乾燥する。再構成のために、水を凍結乾燥調製品に加える。
【０１１３】
例２：
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１の、セロタイプ２以外のデングウイルスのＮＳ１、および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）および西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のＮＳ１に対する交差免疫原性
１．ｍＢＮ０７から発現したＮＳ１：患者回復期血清に対する応答性
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が、先のデングウイルス感染の証拠を持つ個体からの、回復期患者血清によって認識される可能性を試験した。（デングセロタイプ１〜４から調製した、真正抗体に対するイムノブロッティングによって）デングウイルスエンベロープタンパク質に対する抗体を持つ６８人の個体からの血清を、ｍＢＮ０７感染細胞抽出物から、および対照としてＭＶＡ−ＧＦＰ感染細胞抽出物から調製した免疫ブロットストリップに対する試験のために選別した。抗原含有細胞溶解物を、２メルカプトエタノール無しの試料緩衝液で処理し、熱しなかった。試験した６８人の個々の血清の内、６２（９１．２％）が、免疫ブロットにて、ｍＢＮ０７によって発現したＢＮ０７  ＮＳ１に反応した。これらの血清を、すべての４つのデングウイルスセロタイプ、ならびに日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のＮＳ１に対する反応性に関して解析した。結果は表１に示している。５４の血清が、すべてのデングウイルスセロタイプおよび日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のＮＳ１に反応し、これらの５４血清のうち５３（９８．２％）がまた、ｍＢＮ０７から発現したＮＳ１と反応した。７血清が、少なくとも１つのデングウイルスセロタイプのＮＳ１に関して特異的であり、ＪＥＶのＮＳ１とは反応しなかった。すべてのこれらの７血清がまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。他の７血清は、ＪＥＶのＮＳ１とのみ反応したが、任意のデングウイルスセルタイプのＮＳ１とは反応せず、これらのＪＥＶ−特異的血清のうち２つ（２８．６％）はまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。
【０１１４】
表１：真正ＮＳ１およびｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１に対する抗血清反応の比較。括弧内：試験した陽性試料の数／試験した試料の総数。ＤＥＮ＝デング、ＪＥＶ＝日本脳炎ウイルス。
【０１１５】
【表１】
0004500049.tif 000002
【０１１６】
同一の６８血清をまた、前膜（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質に対する反応性によって解析した。本発明者らの実験において、前膜に対する抗体は、ＮＳ１またはＥに対する抗体よりも、非常に特異的である。したがって、デングが感染した患者は、デングウイルス前膜を認識するが、ＪＥＶ前膜は認識しない、およびその逆の抗体を産生する可能性がある。これらの株にそった解析により、個体の感染の歴史のよりよい予測が提供されうる。表２は、２２人の患者からの血清が、真正デング前膜タンパク質のみと反応することを示しており、したがって、これらの２２人の患者が、デングウイルスに対してのみ暴露され、ＪＥＶに対しては暴露されていないことが示唆されている。すべてのこれらの２２の血清が、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。他の２２患者は、デングおよびＪＥＶ両方が先に感染した証拠を持ち、再びすべての２２の血清が、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。このシリーズにて、ＪＥＶのみの先の感染の証拠を持つ２１人の患者がまた存在する（これらの血清は、デングＥに対して交差反応する抗体を有するけれども）。興味深いことに、２１の内１７（８２％）のＪＥＶ反応者は、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。全セットのうち、デングまたはＪＥＶいずれかの前膜タンパク質と反応しなかったものが、ただ３血清、ただし、これらのうち１つがｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。このことに関してもっとも可能性のある理由は、抗体タイターが低すぎて、免疫ブロッティングによって検出できないことである。
【０１１７】
表２：真正前膜およびＢＮ０７  ＮＳ１に対する抗血清反応の比較。括弧内：試験した陽性試料の数／試験した試料の総数。ＤＥＮ＝デング、ＪＥＶ＝日本脳炎ウイルス。
【０１１８】
【表２】
0004500049.tif 000003
【０１１９】
表２でのデータはまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応しなかった６血清のうち、４つが、デングではなく、ＪＥＶに先に感染した個体からのものであったことを、明らかに示している。残りの２人は、デングまたはＪＥＶいずれかの前膜タンパク質に対する検出可能な抗体を持たず、低いタイターである可能性があった。
２．ウサギのｍＢＮ０７ワクチン化および、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルス免疫ブロットおよびエライザアッセイに対する、免疫後血清の試験
３匹の特異的病原体フリーウサギを、以下で示したような、ワクチン化スケジュールにしたがって、皮下経路によって免疫した。各ウサギを、第０日に無菌水にて１ｍｌまで再構成した、１バイアルの凍結乾燥ワクチン（１×１０ｅ８  ＴＣＩＤ５０  ＢＮ０７凍結乾燥ワクチン）によってワクチン化し、ついで第２８日目に再び行った。血液試料を、第一ワクチン化前（前採血）、および再び第二ワクチン化１０日後に採取した。
０日目＝前採血、つづいて第一ワクチン化
２８日目＝第二ワクチン化
３８日目＝血液採取
５６日目＝第三ワクチン化
６６日目＝血液採取
１１２日目＝各ウサギから５０ｍｌ血液採取
２．１  デングセロタイプ２免疫ブロットに対する前採血および免疫後血清の試験
デング２ウイルス抗体および未感染Ｃ６／３６細胞の抗体を、非変性条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した。免疫ブロット解析のために、３８日目の血清（１：２００に希釈）を使用した。結果は、ｍＢＮ０７によるワクチン化に際し、すべての３匹のウサギが、組織培養蚊細胞のデングセロタイプ２感染から産生された、真正ＮＳ１と交差反応する高タイターの高ＮＳ１抗体を産生したことを明らかに示唆した。ワクチン化の前に採取した血清は、免疫ブロットにおいて、どのデングタンパク質に対しても反応しなかった。
【０１２０】
３８日目の免疫後血清は、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：１０−４、１：１０−５、１：１０−６にて滴定し、デング２ウイルス抗体の免疫ブロットストリップおよび非変性条件下、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した未感染Ｃ６／３６細胞の対照ストリップ上で試験した。３８日目の３匹のウサギ血清に関するエンドポイントタイターは、１：１００００であると計算された。６６日目の血清に関するエンドポイントタイターは、それぞれ免疫ブロットアッセイおよびエライザ両方で、１×１０５であると計算された（データは示していない）。
【０１２１】
免疫前および後血清両方を、１：１０−２、１：１０−３、１：１０−４、１：１０−５、１：１０−６、１：１０−７にて滴定し、間接ＩｇＧ  エライザで試験した。ウェルをデング２および未感染Ｃ６／３６溶解物で、１：２５０希釈によってコートした。
表３：異なる希釈での、各ウサギからの免疫前および免疫後血清に関するエライザ吸収読み取り値（前＝免疫前血清、後＝免疫後血清）
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
各ウサギの免疫後血清に関する滴定結果を、図４で示したようにプロットした。各ウサギ免疫後血清に関する予想されたエンドポイントタイターは、１：１０００である。
２．２  デングウイルスセロタイプ１、３および４、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス免疫ブロットに対する、前採血および免疫後血清の試験
３８日目の各ウサギ血清を、デング１、２、３、４およびＪＥウイルスの免疫ブロットストリップ＋非変性条件下、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した未感染Ｃ６／３６細胞の対照ストリップ上で、１：１０００希釈にて試験した。各ウサギ免疫後血清は、デングセロタイプ１、３および４からのＮＳ１、ならびに日本脳炎ウイルス免疫ブロット上のＮＳ１と反応することが示された。  
【０１２４】
６６日目の各ウサギ血清を、デング１、３、４、ＷＮＶおよびＪＥウイルス抗原の免疫ブロットストリップ＋非変性条件下、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した未感染Ｃ６／３６細胞の対照ストリップ上で、１：１０００希釈にて試験した。各ウサギ免疫後血清は、デングセロタイプ１、３および４からのＮＳ１、ならびに日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルス免疫ブロット上のＮＳ１と反応することが示された。
【０１２５】
免疫ブロットアッセイを確認するために、エライザ交差反応アッセイを実施した。マイクロタイタープレートのウェルを、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ＪＥＶ、ＷＮＶおよび未感染細胞溶解物で、１：２５０希釈にてコートした。血清は、３８日目（図５Ａ）および６６日目（図５Ｂ）からの血清であった。
【０１２６】
免疫ブロットアッセイ、ならびにエライザ実験から、デングウイルスＮＳ１によって誘発された抗体が、すべてのデングセロタイプ、ＪＥＶおよびＷＮＶと交差反応すると結論づけることが可能である。
２．３  結論
−ｍＢＮ０７ワクチンによって免役したウサギは、真正デングウイルスセロタイプ２ＮＳ１を認識する抗体を誘発した。
−非常に高い免疫応答が、エンドポイントがそれぞれ免疫ブロットアッセイおよびエライザ両方で、１：１０−４および１：１０−３であった場合に観察された。
−ウサギにて誘発された抗体は、すべての他のデングセロタイプ（１、３および４）と交差反応した。
−抗体はまた、ＪＥＶおよびＷＮＶのような、異種ウイルスからのＮＳ１と交差反応した。
３．マウスにおける免疫原性試験
メスアウトブレッドマウスを、以下で示すような異なる量およびスケジュールにて、デングウイルスＮＳ１を発現しているｍＢＮ０７にて、腹膜内経路によって免疫した。ｍＢＮ０８、ｍＢＮ０７に相当するがＮＳ１を発現していないＭＶＡおよびＰＢＳを、対照として使用した。マウスの血清を使用して、マウスで産生された抗体が、それぞれ異なるフラビウイルスセロタイプから、および日本脳炎ウイルスからのＮＳ１タンパク質と、ウエスタンブロット上で反応可能であるかどうかを確認した。対照マウスからの血清は、すべての試験で陰性であった。
【０１２７】
次のグループを調べた。
【表１】
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前記免疫ブロット実験により、以下の結果が得られた。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
非常に似た実験を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで行った。マウスを、０日目および２１日目にて、１×１０８  ＴＣＩＤ５０  ＢＮ０７（凍結乾燥および水による再構成）の２ショットでワクチン化した。血清を４２日目に得た。１００％の血清が、デングウイルス２  ＮＳ１と反応し、１００％の血清が、すべての４つのデングウイルスセロタイプからのＮＳ１タンパク質と反応し、７５の血清が、ＪＥＶのＮＳ１タンパク質と反応した。１×１０８  ＴＣＩＤ５０非凍結乾燥ＢＮ０７によって得られた結果は以下のようであった。１００％の血清が、すべての４つのデングウイルスセロタイプ由来のＮＳ１と反応した。血清は、凍結乾燥ＢＮ０７によってワクチン化したマウスから得られた血清とは同じ程度ではないが、ＪＥＶからのＮＳ１を認識した。
【０１３０】
結論
−ＢＮ０７によって免疫したマウスの１００％が、非常に強い応答で、ＤＥＮＶ−２  ＮＳ１に対する抗体を持った。
−１×１０ｅ７  ＴＣＩＤ５０  ＮＢ０７で免疫したマウスの免疫応答は、１×１０ｅ８  ＴＣＩＤ５０  ＢＮ０７で免役したマウスの免疫応答と同程度強かった（データは示していない）。
−もっともよい交差反応割合は、４週間間隔および採血前４週間にて免疫したマウスで得られた。
−ＢＮ０７凍結乾燥ワクチンで免役したマウスは、非凍結乾燥ワクチンで免役したマウスと比較して、ＮＳ１に対して非常により高い応答を持つことが観察された。
参考文献
【外１】
【０１３１】
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【外２】
【０１３２】
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【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明において例として使用したコンストラクトの、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」ｃＤＮＡタンパク質コード配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」タンパク質コード配列を含むプラスミドｐＡＦ７ＮＳ１のダイアグラムを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｏＢＮ４５およびｏＢＮ３３８でのカセットのＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を示している、プラスミドｐＡＦ７内のＮＳ１カセットのヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄの上段：デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（デングＮＣＧポリタンパク質Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ０３８４０３号）のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロットを示し、下段はＥタンパク質のＣ−末端の最後の２８アミノ酸から由来するシグナル配列を含む、デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（アミノ酸７４８〜７７５）の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロットを示す。
【図２】図２は、「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ａ】図３ＡはクローンｐＢＮ４１を産生するための、ＮＳ１発現カセットの、ｐＢＮＸ０７の平滑末端化ＸｈｏＩ部位内へのクローニング（平滑末端クローニング）を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはＭＶＡの６つの欠失部位の局所を示す、ＭＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ９４８４８）のＨｉｎｄ  ＩＩＩマップ（−Ｊ−＝欠失部位の連結）を示す。
【図４】図４はすべての３匹のウサギに関する、免疫後血清滴定の、エライザ吸収読み取りのプロットを示す。
【図５】図５はエライザ交差反応研究を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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