(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に固相化された組織又は細胞の内容物を溶出させる工程と、該内容物を溶出した組織又は細胞に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを具備する組織又は細胞の乾燥固相化方法において、前記担体に固相化された組織又は細胞の内容物を溶出させる工程を、界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて行うことにより、組織または細胞の担体からの剥離が防止されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法であって、前記界面活性剤を含有する等張以上の液体が、
（１）脂肪酸の炭素数が１２〜１８であるポリオキシソルビタン脂肪酸モノエステル及びこれらの混合物、
（２）ポリオキシエチレン基の数が４〜４０であるポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル及びこれらの混合物、
（３）コール酸塩、
（４）N-アシルN-メチルグリシン及びそれらの塩、および
（５）オクチルグリコシド
からなる群から選択される界面活性剤を含有する生理食塩水であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法であって、前記界面活性剤を含有する生理食塩水が、
（１）0.1重量％以上0.8重量％以下のポリオキシソルビタンモノラウレート、
（２）0.25重量％超1重量％未満のオクチルグリコシド、
（３）0.125重量％超1重量％未満のコール酸ナトリウム、
（４）0.0063重量％超0.025重量％未満のポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（ポリオキシエチレン基の数＝9）、又は
（５）0.0063重量％超0.025重量％未満のポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（ポリオキシエチレン基の数＝9、10）
から選択される界面活性剤を含有する生理食塩水であることを特徴とする方法。
【請求項４】
前記乾燥用溶液が、タンパク質と糖を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法。
【請求項５】
前記乾燥溶液が実質的に塩を含まないことを特徴とする請求項４に記載の乾燥固相化方法。
【請求項６】
前記乾燥操作が、真空乾燥、自然乾燥、及び風乾であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法。
【請求項７】
前記担体が支持体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法。
【請求項８】
レクチン、抗体、及び陽性電荷ポリマーからなる群から選択される結合剤によって組織又は細胞が担体に固相化されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の組織又は細胞の乾燥固相化方法。
【請求項９】
前記レクチンが、コムギ麦芽レクチン、リシン、レンズマメレクチンであることを特徴とする請求項８に記載の固相組織又は細胞の乾燥固相化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固相化された組織又は細胞を乾燥固定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
固相化された組織又は細胞は、血液型検査等の多くの臨床検査用キットで多用されているが、細胞及び細胞上に存在する抗原等のマーカー物質は極めて変性しやすいため、これらが長期保存に耐え得るような処理を施すことが不可欠である。
【０００３】
例えば、支持体に赤血球をそのまま固相化する方法を開示する特開平２−１２４６４号では、赤血球を保存するためにアルセバー液やＭＡＰ液の中に赤血球を浮遊させている。しかし、赤血球は徐々に溶血するので、該方法により固定化された細胞は必ずしも長期間の保存には適していない。
【０００４】
これに対し、特開平２−１５１７６５号及び本願出願人による特開平５−１４２１２２号は、より長期間の保存を可能とする方法として、細胞を担体に固相した後に、該細胞を乾燥状態にする乾燥固相化方法を開示している。このように乾燥状態で固相化された細胞は、細胞をそのまま固相化する前記方法に比べて、少なくとも数倍長く保存することが可能である。
【０００５】
しかし、特開平２−１５１７６５号の方法では、正味正電荷を帯びた有機染料で染色した固相支持体上に細胞の単層を形成しているが、該支持体上への固相化はタンパク質の存在によって阻害されるので、乾燥操作時に添加する乾燥用溶液中に抗原性を安定化するためのタンパク質を添加できないという大きな欠点を有している。
【０００６】
一方、特開平５−１４２１２２号は、マイクロプレート等の支持体を担体として使用し、レクチン等の結合剤を介して組織又は細胞を該支持体に固相化している。このような固相化法では、タンパク質の存在によって組織又は細胞の結合能が低下することはなく、従って乾燥用溶液中に安定化作用を有するタンパク質を添加することができる。さらに、これら２つの方法では、いずれも乾燥工程に先立って組織又は細胞中の内容物を排出する操作を行っているので、組織又は細胞が、その中に存在する酵素等の悪影響を受けない。このため、細胞の内容物を排出する操作後に細胞等を乾燥することを特徴とする該方法によれば、他の従来技術に比べて、より長期間固相化された組織又は細胞を保存することが可能となる。
【０００７】
しかしながら、該方法では、生理学的に低張条件にして細胞等を破裂させるような低張液を用いて組織又は細胞中の内容物を排出しているので、細胞等が急激に破裂する際に細胞等が固相支持体から剥離してしまうという問題点もあった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術に存する問題点を解決するためになされたものであり、組織又は細胞及びこれらの上に存在する抗原等の物質に損傷を与えずに、長期間保存可能な乾燥組織又は細胞を調製するための乾燥固相化法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、固相化された組織又は細胞等に乾燥操作を施す前に、低濃度の界面活性剤で処理することにより組織又は細胞等の内容物を穏やかに排出せしめることを特徴とする組織又は細胞の乾燥固相化方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、担体に固相化された組織又は細胞の内容物を溶出させる工程と、該内容物を溶出された組織又は細胞に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを具備する。
【００１１】
本発明において、組織又は細胞を固相化するための担体は、タンパク質を含有する溶液の存在によって組織又は細胞の固相化能が実質的に低下しない任意の担体であり得る。本発明で使用するのに好ましい担体は、マイクロプレートウェル、ガラス・プラスチック試験管、スライドガラス、プラスチック等の支持体である。
【００１２】
本発明では、組織又は細胞は、レクチン、抗体、又は陽性電荷ポリマー等の結合剤を介して担体に固相することが好ましい。使用すべき結合剤の種類は、用いる組織又は細胞の特性に応じて、選択すればよく、例えば、赤血球を固相する場合には、赤血球上に存在する特異的な糖鎖を結合することができるレクチンを結合剤として用いることができる。レクチンには、コムギ胚芽レクチン（以下WGA）、リシン、レンズマメレクチン等を使用し得るが、これらに限定されない。結合剤として使用し得る物質には、ポリエチレンイミンやポリLリジンが含まれる。
【００１３】
担体に結合すべき組織又は細胞は、任意の組織又は細胞であり得る。
【００１４】
固相化された組織又は細胞には、その内容物を排出する操作を施す。該操作は、組織又は細胞中に含まれる分解酵素等を排出することにより、組織又は細胞の保存性を向上させるためのものである。
【００１５】
本発明において、該操作は、組織又は細胞に、低濃度の界面活性剤を含有する等張以上の液体、好ましくは等張液を作用させることによって行う。低濃度の界面活性剤を含有する等張液は、組織又は細胞の一部を極めて穏やかに破壊するので、従来の方法における低張液による破壊とは異なり、破壊のショック等で固相支持体から剥離したりすることもなく、また低濃度の界面活性剤を用いるので組織又は細胞に存在する抗原等が殆ど変性されない。なお、かかる内容物排出操作に用いる添加物の濃度等の条件は、後述する有効範囲内において、対象となる生物種、組織、細胞の種類に応じた最適な条件に設定するのが好ましい。
【００１６】
本発明に使用し得る界面活性剤には、１ポリオキシソルビタン脂肪酸モノエステル（Tween系界面活性剤）、２ポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（Triton系界面活性剤及びNP-40）、３コール酸塩、４N-アシルN-メチルグリシン及びそれらの塩（サルコシネート類）、５オクチルグリコシドが含まれる。組織又は細胞を破壊し、且つ組織又は細胞に存在する物質の反応性を維持するためには、使用する界面活性剤の種類とその濃度が極めて重要である。使用すべき界面活性剤の種類と濃度は、以下の実施例で詳述する。
【００１７】
このように、組織又は細胞の内容物を排出せしめる操作を行ったら、次に組織又は細胞を乾燥する操作を行う。該乾燥操作は、組織又は細胞に乾燥用溶液を添加した後、真空乾燥、自然乾燥、風乾することからなる。
【００１８】
前記乾燥用溶液には、タンパク質と糖を加えることが好ましく、塩を実質的に含まない方が好ましい。
【００１９】
乾燥用溶液中のタンパク質は、乾燥状態の細胞等の保存性を向上させる為だけではなく、アッセイ時の非特異的反応を低減する役割を果たす。本明細書において、「タンパク質」には、ペプチド、及び補因子、補酵素、糖鎖等が結合した複合タンパク質も含まれる。乾燥用溶液に添加すべき好ましいタンパク質は、動物の血清タンパク質、とりわけウシ血清アルブミン（以下BSA）、ゼラチン及びその加水分解物である。最も好ましいタンパク質は、0.05〜0.5重量%、特に0.2重量%程度のBSAである。
【００２０】
また、乾燥用溶液中に添加すべき糖には、グルコース、ラクトース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、及び多糖類が含まれる。特に好ましい糖は、グルコース、ラクトース、サッカロース、トレハロース、マルトース、フルクトースである。最も好ましいのは、3〜10重量%、特に5重量%のサッカロースである。
【００２１】
以上のような方法で作成した乾燥固相化組織又は細胞は、特開平2-124464に開示されているような磁性封入の感作粒子による凝集免疫アッセイに最適である他、従来のMPHA法、EIA法、RIA法、及び蛍光標識抗体法等の凝集免疫アッセイ以外の各種分析方法（生化学的分析、遺伝学的分析を含む）にも使用できる。なお、凝集分析アッセイ以外の方法に使用する場合には、後述する有効範囲内において、分析結果に基づき、各種添加物の種類を選択するとともに濃度等の条件を最適化すればよい。
【００２２】
以下実施例に従って、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
［実施例１］
本実施例では、本発明の方法による乾燥固相化赤血球の調製を記載する。
【００２４】
１．赤血球固相化用マイクロプレートの作成
Nvnc.社のＵ底プレート(Maxisorp)に、10μg/mLになるようにWGAを溶解せしめた0.01M PBS pH＝7.0に溶かしたものを50μL／ウェル分注し、室温で30分間インキュベートした後、PBSで５回洗浄した。
【００２５】
２．赤血球の固相化
血球濃度約0.7%になるように、抗原性既知のスクリーニング用O型赤血球（Ortho社セレクトジェン）をPBSで希釈し、該希釈した赤血球を25μL／ウェル分注する。10分間室温で静置し、後に生理食塩水で３回洗浄して、赤血球をマイクロプレートウェル底面に単層に固相した。
【００２６】
３．赤血球の溶血及び乾燥
ステップ２で得た固相された赤血球のウェルに、0.0125%のTriton X-100を含有する生理食塩水を100μL／ウェル分注して、10〜15分間静置し、溶血を行った。溶血後、生理食塩水で２回洗浄して、界面活性剤と溶血物を洗浄除去する。その後、乾燥用溶液として0.2% BSAを含有する5%サッカロース水溶液を100μL／ウェル分注して、30分間インキュベートする。その後水切りし、真空乾燥機を用いて、室温で減圧乾燥した。
【００２７】
４．抗体の検出
ステップ３で作成した乾燥赤血球プレートにLISS（低イオン強度メディウム）を75μL／ウェル分注した。陽性検体として、各抗赤血球抗体を含む抗血清（抗D、K、E、Fya、Jka、c、Jra血清）を陰性の血清で倍々希釈したもの、及び陰性検体として陰性の血清をそれぞれ25μL／ウェル分注し、37℃で10分間インキュベートして、生理食塩水で６回洗浄した。洗浄後、指定の粒子復元液（0.4%ゼラチン及び0.05%ウサギ血清を含有する0.02Mリン酸−0.01Mクエン酸等張緩衝溶液pH6.8）で復元した抗ヒトIgG抗体感作磁性体封入感作粒子（オリンパス光学工業（株）製）を分注し、磁石上で３分間パターン形成した（DRY-M-MPHA）。
【００２８】
対照として、同じ赤血球を用いて、Anti-RBC-オリビオ-MPHA法で赤血球抗体をアッセイした（M-MPHA）。
【００２９】
結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
0004505621.tif 000002
【００３１】
表１から明らかなように、検査した全ての抗体で、Anti-RBC-オリビオ-MPHA法と同等以上の反応性が達成された。
【００３２】
［実施例２］
本実施例では、トリトンX-100を用いて各種細胞を溶血したときの各抗原の変化を経時的に調べたものであり、溶血時間を変化せしめた以外は、実施例１の操作と同様に行った。
【００３３】
結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
0004505621.tif 000003
【００３５】
表から明らかなように、溶血時間が反応結果に影響することが分かった。種々の溶血時間による検討の結果、溶血した時点から20分以内、好ましくは10分以内に洗浄等を行って溶血処理を終了すれば、検出感度を高く維持できることが分かった。トリトンX-100についての好ましい溶血時間は、約9〜21分、特に約9〜15分であることが分かった。
【００３６】
［実施例３］
本実施例では、乾燥用溶液中の添加物の影響を調べた。
【００３７】
実施例１と同様に、赤血球をマイクロプレートに固相し、溶血を行った。その後、表３に示されている組み合わせで、乾燥用溶液に糖、BSA、塩(NaCL)を添加した。該乾燥用溶液を用いて赤血球を乾燥し、抗D抗体との反応性、陰性像、BLK像について実施例１と同様の方法で観察した。
【００３８】
【表３】
0004505621.tif 000004
【００３９】
表３に示されているように、5%サッカロース-BSAが、反応性、陰性像ともに最も良好な結果を与えた。ところが、BSA濃度は一定でもNaClを増やしていけば、反応性が低下した。糖が無い状態の0.9%NaCl-BSAでは、陰性像等は良好だが反応性が低下してしまった。
【００４０】
糖のみ（5%サッカロース）では、陰性像が削れたり、滲んだりしてしまう。
【００４１】
すなわち、BSA存在下でも乾燥用溶液に塩が入っていると反応性の低下が起こってしまい予定される反応力価が達成できなかった。BSAがないと陰性像の悪化が起こってしまうので、乾燥用溶液には、糖とBSAが必要であることが明らかとなった。
【００４２】
［実施例４］
本実施例では、種々の界面活性剤を添加した溶液で赤血球を溶血した。
【００４３】
実施例１と同様にマイクロプレートに赤血球を固相し、種々の濃度の食塩水及び以下の界面活性剤：Triton X-100(Sigma)、NP-40(Sigma)、Tween 20(ナカライテスク)、サルコシネートLN(日光ケミカルズ)、コール酸ナトリウム(ナカライテスク)、オクチルグリコシド(同人化学)を含有する生理食塩水を作成し、実施例１に記載したように、溶血、乾燥操作を行った。
【００４４】
乾燥赤血球プレートLISS（低イオン強度メディウム）を75μL／ウェル分注し、抗赤血球抗体陽性検体として、抗D血清を陰性血清で倍々希釈したもの及び陰性血清を25μL／ウェル分注し、37℃10分間インキュベートして、生理食塩水で6回洗浄した。洗浄後抗ヒトIgG抗体感作磁性体封入感作粒子（オリンパス光学工業（株）製）を指定の粒子復元液で復元したものを分注し、磁石上で３分間パターン形成した。
【００４５】
結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
0004505621.tif 000005
【００４７】
表４に示されているように、赤血球を溶血することができ（＊）、且つ陰性パターンを与え得る（○）界面活性剤及びその濃度は、0.25重量%超1重量%未満のオクチルグリコシド、0.125重量%超1重量%未満のコール酸ナトリウム、0.0063重量%超0.025重量%未満のNP-40、0.0063重量%超0.025重量%未満Triton X-100であった。NaCl溶液及びその他の界面活性剤は、溶血可能な濃度に達すると陰性パターンが得られなくなった。ただし、Tween20は、10〜15分間では溶血を呈さなかった。長時間（1時間）放置で、0.1重量%以上に溶血を認め、且つ陰性パターンを得た。
【００４８】
本実施例により、溶血処理を施した乾燥固相化赤血球において良好な陰性パターンを得るためには、適切な種類の界面活性剤を適切な濃度で含有する等張液を用いて溶血することが極めて重要であることが示された。
【００４９】
［実施例５］
本実施例では、室温における乾燥固相化赤血球の保存性を調べた。
【００５０】
実施例１と同様に、赤血球乾燥プレートを作成し、それを室温（25〜30℃）で保存して、1〜13ヶ月間の反応性の変化を調べた。
【００５１】
作製した赤血球乾燥プレートにLISSを75μL／ウェル分注し、抗赤血球抗体陽性検体として抗D、C、c、E、Fya、Jra血清を2%BSA/PBSで倍々希釈したもの及び陰性の血清を25μL／ウェル分注し、37℃10分間インキュベートして、生理食塩水で６回洗浄した。洗浄後抗ヒトIgG抗体感作磁性体封入感作粒子（オリンパス光学工業（株）製）を指定の粒子復元液で復元したものを分注し、磁石上で３分間パターンを形成した。結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
0004505621.tif 000006
【００５３】
表５から明らかなように、室温（25〜30℃）で13ヶ月保存しても各種抗体との反応性は、殆ど変化しなかった。
【００５４】
本実施例により、本発明の方法によって調製された乾燥固相赤血球は、室温での長期間の保存に耐え得ることが実証された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、固相化された組織又は細胞に乾燥操作を施す前に、界面活性剤を含有する等張液で組織又は細胞内の内容物を穏やかに排出することにより、室温でも長期間保存し得る乾燥固相化組織又は細胞を調製することが可能となる。
【００５６】
このように調製された組織又は細胞では、抗原等の物質の変性が生じないので、正確なアッセイを行うことができる。