(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ分子を特異的結合させるＤＮＡ鎖を用いて、前記ＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める遺伝子解析装置において、
前記ＤＮＡ鎖を収容可能な試料セルと、
励起用の光を発生する光源と、
前記試料セル中に配置される光プローブと、
前記試料セルを保持し、３次元方向に変位可能な移動機構と、
前記光プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を検出する変位検出手段と、
前記移動機構を制御することによって、前記光プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を制御する移動機構用コントローラと、
前記試料セル中に挿入されるとともに、電場の印加によって伸張される前記ＤＮＡ鎖を巻き取ることができる回転可能なローターを有するマイクロ巻き取り機構と、
前記ローターの回転を制御するローター用コントローラと、
前記光源からの光を前記光プローブの先端に導入し、前記光プローブの先端から前記ＤＮＡ鎖に光を照射し、前記ＤＮＡ鎖からの蛍光を、対物レンズ、ダイクロイックミラー、及び蛍光検出用フィルターを介して検出する光検出器と、
を備えることを特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項２】
プローブ分子を特異的結合させるＤＮＡ鎖を用いて、前記ＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める遺伝子解析装置において、
前記ＤＮＡ鎖を収容可能な試料セルと、
前記試料セル中に配置される原子間力顕微鏡用プローブと、
前記試料セルを保持し、３次元方向に変位可能な移動機構と、
前記原子間力顕微鏡用プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を検出する変位検出手段と、
前記移動機構を制御することによって、前記原子間力顕微鏡用プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を制御する移動機構用コントローラと、
前記試料セル中に挿入されるとともに、電場の印加によって伸張される前記ＤＮＡ鎖を巻き取ることができる回転可能なローターを有するマイクロ巻き取り機構と、
前記ローターの回転を制御するローター用コントローラと、
を備えることを特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項３】
プローブ分子を特異的結合させるＤＮＡ鎖を用いて、前記ＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める遺伝子解析装置において、
前記ＤＮＡ鎖を収容可能な試料セルと、
前記試料セル中に配置されるトンネル顕微鏡用プローブと、
前記試料セルを保持し、３次元方向に変位可能な移動機構と、
前記トンネル顕微鏡用プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を検出するとともに、前記移動機構の２次元走査により前記ＤＮＡ鎖表面の形状像等を検出する変位検出手段と、
前記移動機構を制御することによって、前記トンネル顕微鏡用プローブの先端と前記ＤＮＡ鎖表面との距離を制御する移動機構用コントローラと、
前記試料セル中に挿入されるとともに、電場の印加によって伸張される前記ＤＮＡ鎖を巻き取ることができる回転可能なローターを有するマイクロ巻き取り機構と、
前記ローターの回転を制御するローター用コントローラと、
を備えることを特徴とする遺伝子解析装置。
【請求項４】
ＤＮＡ鎖にプローブ分子を特異的結合する特異結合操作と、前記プローブ分子を特異的結合した前記ＤＮＡ鎖を固定する固定操作と、前記固定操作により固定した前記ＤＮＡ鎖を延伸する伸張操作と、前記伸張操作により伸張した前記ＤＮＡ鎖を走査型プローブ顕微鏡の探針の走査によって検出する検出操作と、によってＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める遺伝子解析方法において、
前記固定操作は、前記プローブ分子を特異的結合した前記ＤＮＡ鎖を回転可能なローターを有するマイクロ巻き取り機構の前記ローター上に固定し、
前記伸張操作は、前記ローター上に固定した前記ＤＮＡ鎖を電場の印加により伸張し、前記ローターを回転させ、伸張した前記ＤＮＡ鎖を前記ローター上に巻き取ることを特徴とする遺伝子解析方法。
【請求項５】
前記検出操作は、前記伸張操作において伸張した前記ＤＮＡ鎖を前記ローター上に巻き取り、巻き取りによる前記ＤＮＡ鎖の移動によって、前記探針が相対的に前記ＤＮＡ鎖を走査することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子解析方法。
【請求項６】
前記固定操作は、前記プローブ分子を特異的結合した前記ＤＮＡ鎖末端にチオール基を修飾するとともに、前記ローター上に金薄膜あるいは金微粒子を固定し、前記チオール基と前記金薄膜あるいは前記金微粒子とを結合することにより固定することを特徴とする請求項４または５に記載の遺伝子解析方法。
【請求項７】
前記固定操作は、前記プローブ分子を特異的結合した前記ＤＮＡ鎖末端にビオチンを修飾するとともに、前記ローター上にアビチンを固定し、前記ビオチンと前記アビチンとを結合することにより固定することを特徴とする請求項４または５に記載の遺伝子解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の配列情報を解析する方法、および、そのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子配列を解析する方法としては、クローニングしたＤＮＡ鎖を制限酵素によって切断し、数１００ｂｐ程度にしたうえで、さらに酵素によって切断し、電気泳動によって、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃそれぞれの塩基についての電気泳動パターンを求め塩基配列を解析する方法が広く用いられている。
【０００３】
また、最近では、数多くの既知の配列のオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどを基板上に固定し、クローニングした試料ＤＮＡを反応させ、特異吸着の起きたことを検知することで、試料ＤＮＡ中に存在する塩基配列を推測するＤＮＡチップと呼ばれる方法も開発されている。
この他、ＤＮＡを解析する技術としては、Fluorescence in situ Hybridization 法によって、試料ＤＮＡに対してプローブＤＮＡが、ハイブリダイズした状態を蛍光顕微鏡で観察することが、Holmes-Davisら［Trends in Plant Science 3(1999)91］によって試みられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
電気泳動法による遺伝子解析およびＤＮＡチップによる遺伝子解析法における問題点としては、解析操作の複雑さが挙げられる。すなわち、この方法によると
、制限酵素で細かく断片化されたＤＮＡの配列をいくつもの工程をへて解析し、さらに、それらの情報をつなぎ合わせる、という作業を行う必要がある。
【０００５】
これは、試料ＤＮＡの準備に手間がかかり、損傷ＤＮＡなどのクローニングのできないＤＮＡ試料の解析には適用できないという問題がある。また、解析が複雑になる点も問題としてあげられる。
これに対して、Fluorescence in situ Hybridization 法は、断片化していないＤＮＡ試料の配列情報を解析する方法として、工程も少なく、情報をつなぎ合わせる操作も不要で、きわめて有効な方法である。しかし、これまでの蛍光顕微鏡による観察法では、分解能がせいぜい５００ｎｍ程度であり、１．５ｋｂｐ程度の分解能でしか解析ができないという課題を有している。
【０００６】
遺伝子地図の解析は、遺伝子操作技術において、その対象となる遺伝子部位を特定するという点できわめて重要な部分を占める。したがって、迅速かつ、効率よく、高精度に遺伝子地図を解析する手法の開発が、強く望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記Fluorescence in situ Hybridization 法の課題を解決する方法として、測定対象のＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める方法において、測定対象ＤＮＡ鎖およびプローブ分子を用い、すくなくとも、ＤＮＡ特異結合操作、固定・伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法 、および、すくなくとも、ＤＮＡ固定操作、特異結合操作、伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法、および、すくなくとも、ＤＮＡ固定・伸張操作、特異結合操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法を考案し、ここで用いる探針として、近接場光学顕微鏡用プローブまたは原子間力顕微鏡用プローブまたはトンネル顕微鏡用プローブを用い、また、伸張操作として、光ピンセット法等を用いることで、分解能と精度の高い遺伝子配列の解析を実現可能にした。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照し説明する。
図１から３は、本発明の遺伝子解析方法の基本的な手順を示すものである。それぞれ、測定対象ＤＮＡ鎖１、プローブ分子２、基板３、探針４に対して、図１においては、測定対象ＤＮＡ鎖１とプローブ分子２とのＤＮＡ特異結合操作（図１ｂ）、測定対象ＤＮＡ鎖１の基板３への固定操作（図１ｃ）、測定対象ＤＮＡ鎖１の伸張操作（図１ｄ）、探針４による検出操作（図１ｅ）による解析手順を示している。図２においては、ＤＮＡ固定操作（図２ｂ）、特異結合操作（図２ｃ）、伸張操作（図２ｄ）、探針による検出操作（図２ｅ）による解析手順を示している。図３においては、ＤＮＡ固定・伸張操作操作（図３ｂ）、特異結合操作（図３ｃ）、探針による検出操作（図３ｄ）による解析手順を示している。これらの解析手順は、各操作において使用する手法に応じて選択することができる。
【０００９】
本手法の探針による検出操作によって、高い分解能で、遺伝子配列情報の解析を行うことが可能になる。この探針としては、近接場光学顕微鏡の探針、原子間力顕微鏡の探針、トンネル顕微鏡の探針を用いることができる。この探針によって、２次元的な形状情報の他、近接場光学顕微鏡による２次元的な蛍光情報、電気化学・原子間力顕微鏡による電解電流、表面電位・原子間力顕微鏡による表面電位、トンネル顕微鏡による電子励起発光を検出することができ、多元的な情報によって、測定対象ＤＮＡ鎖上のブローブ分子の位置を同定することができる。
【００１０】
測定対象ＤＮＡ鎖としては、本手法を用いることで、１ｋｂｐ以上のＤＮＡ鎖を対象とすることができる。また、染色体中のＤＮＡ鎖を測定対象とすることもできる。さらに、損傷ＤＮＡをそのまま解析することも可能である。この他にも、プラスミド、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣなど）、ガン細胞中の遺伝子などにも適用可能である。特に、特定の限られた１つのＤＮＡを対象にできること、個々の細胞内のＤＮＡを対象にできることは、大きな特徴といえる。
【００１１】
プローブ分子としては、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなど、ＤＮＡの対応する配列に特異的に結合する分子を用いることができる。
このプローブ分子を標識しておくことで、形状情報以外の相補的な配列情報を獲得できる。この標識には、蛍光物質、酵素などを用いることができる。ここで、蛍光物質としては、ＧＦＰ(Green Fluorescence Protein)、cameleon（カルシウム指示タンパク質試薬）などの蛍光タンパク質を用いることもできる。これらの標識物質は、複数種類のプローブ分子を用いる場合には、それに応じて、複数種類用いることで、それぞれのプローブ分子の識別ができる。これによって、一つのＤＮＡ鎖上に複数のプローブ分子が結合した場合でも、それぞれを識別することができる。また、酵素としては、酸化還元酵素を用いることで、酵素反応生成物を検出し、位置検出を行うこともできる。この他、抗体を用いることも可能である。遺伝子導入のチェックを行おうとする場合には、プロモータ領域に特異的に結合する転写因子、制限酵素などのタンパク質をプローブ分子として用いることもできる。さらに、標識物質として金コロイドを用いることもでき、この場合は、形状像から、位置の検出を行うことができる。一方、ＤＮＡ鎖中にインターカレートとする蛍光物質によって、２本鎖部分を特異的に染色することもできる。
【００１２】
次に、ＤＮＡ鎖の固定操作としては、図４に示すように、基板表面に対して、ＤＮＡ鎖全体を吸着させたり、図５に示すように、ＤＮＡ鎖の末端（固定端５）を結合させたりすることができる。あるいは、ＤＮＡ鎖の片端あるいは両端にビーズを結合させ、このビーズの位置を固定することによって、固定を行うこともできる。図６ａは、両端にビーズ６を固定した例、図６ｂは、片端にビーズを固定し、もう一つの端は、基板上に固定した例である。
【００１３】
固定操作において、ＤＮＡ鎖全体を吸着させる場合には、基板として、疎水性表面を有する基板を用いることができる。また、親水性基板の場合には、マグネシウムイオンなどの２価カチオンを吸着させることで、ＤＮＡ鎖を固定させることもできる。この他、基板表面を化学修飾することで、種々の官能基を結合させ、ＤＮＡの吸着能を高めることもできる。
【００１４】
ＤＮＡ鎖の末端を結合させる場合には、ＤＮＡ末端にチオール基を修飾することによって、金薄膜または粒子を有する基板上に固定することもできる。また、基板上の薄膜または粒子にアビチンが固定された基板を用い、ビオチンを末端に修飾したＤＮＡ鎖を固定して使用することもできる。なお、このようなＤＮＡの末端修飾は、ターミナルトランスフェラーゼを用いることで、処理することができる。
【００１５】
ＤＮＡ鎖の固定後には、必要に応じて非特異吸着のブロック操作として、基板に親和性を持ち、測定対象ＤＮＡ鎖とプローブ分子には、特異結合性を示さない分子を反応させることによって、プローブ分子が、基板上に非特異的に結合するのを防ぐことができる。
ＤＮＡ鎖の伸延には、特表平９−５０９０５７に開示されているような、メニスカスの移動を用いることもできる。この場合、ＤＮＡ水溶液の蒸発に伴う水流や、傾斜あるいは吸引に伴って起こるＤＮＡ水溶液の水流、あるいは、ブロアーによる気体の吹きつけによって生じる水流を用いることができる。また、ＤＮＡが、電場の印加によって、まっすぐにのびることを利用して、電場印加によって、伸延することもできる。ＤＮＡ鎖の片端あるいは両端にビーズを結合させた場合には、光ピンセットによって、ビーズを移動させることで、ＤＮＡ鎖を伸延させることができる。
【００１６】
マイクロマニピュレータを用いることで、伸延させることもできる。図７は、この例を示したもので、マイクロマニピュレータ先端部７にＤＮＡ鎖を結合し（図７ｃ）、続いて、マイクロマニピュレータ先端部を移動することによって（図７ｄ）、ＤＮＡ鎖を伸延させることができる。
解析対象となるＤＮＡとしては、染色体、人工染色体、精子、あるいは、花粉の一部を構成しているＤＮＡ、および、ベクターも解析対象となる。染色体などを測定対象とする場合には、特定の酵素（トリプシンなど）を用いることで、染色体の一部の構造を弛緩させ、ＤＮＡ鎖を伸延させることができる。この他、染色体に関しては、界面活性剤、超音波、遠心力、酸（酢酸など）、温度上昇などを構造弛緩および伸延操作に利用することができる。
【００１７】
検出操作において、一定領域の走査による測定対象ＤＮＡ鎖の位置検出、ＤＮＡ鎖に沿った検出用走査の手順によって検出を行うことも可能であり、これによって、効率の良い測定が可能になる。
また、検出操作において、マイクロ巻き取り機構を使うことで、試料ＤＮＡの巻き取りを行い、巻き取りによるＤＮＡ鎖の移動によって、探針を相対的にＤＮＡ上を走査させることができる。図８において、巻き取り機構の先端部８にＤＮＡ鎖が固定されており（図８ａ）、ローター部８が回転することによって（図８ｂ）ＤＮＡ鎖を移動させることができる。この場合、ＤＮＡ鎖は、電場の印加等によって、方向を常に一定に保つことができる。
【００１８】
図８ａ−ｂの場合、プローブ先端の向きに対して巻き取り機構の回転軸が、平行方向になる構成であるが、図８ｃ−ｄのように、プローブ先端の向きに対して巻き取り機構の回転軸が直交するような構成にすることもできる。この場合は、巻き取り機構先端部の軸上で検出操作が行われることになる。この場合は、一度巻き取られたＤＮＡ鎖は、ローター部上に伸延された形で固定されるため、ローターを回転させることで、繰り返し検出操作を行うことができる。
【００１９】
次に、本発明の遺伝子解析装置について説明する。
図９は、近接場光学顕微鏡と光ピンセット操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図９において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。光ピンセット用レーザー３３からの光は、ガルバノミラー３４、ダイクロイックミラー３５を介して、対物レンズ３２を通り、試料セル中のビーズに集光される。ガルバノミラーは、コントローラ３６を介して、任意にコントロール可能である。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。光プローブ顕微鏡用プローブ４０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。蛍光励起用の光は、光源４３から、プローブ４０に導入され、プローブ先端から、試料に照射され、試料からの蛍光は、対物レンズ３２、ダイクロイックミラー３５、蛍光検出用フィルター４４を介して、光検出器４５において検出される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像と蛍光像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。光検出器４５の部分に分光器と高感度ＣＣＤカメラを接続することによって、蛍光波長の解析を行い、蛍光標識分子の違いを識別することができる。
【００２０】
本実施の形態においては、ＡＦＭ方式の光プローブについて示したが、ストレートタイプの光プローブを用いるシアフォース方式も適用可能である。
図１０は、原子間力顕微鏡と光ピンセット操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１０において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。光ピンセット用レーザー３３からの光は、ガルバノミラー３４、ダイクロイックミラー３５を介して、対物レンズ３２を通り、試料セル中のビーズに集光される。ガルバノミラーは、コントローラ３６を介して、任意にコントロール可能である。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。原子間力顕微鏡用プローブ５０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。形状像の他に、表面電位像などを取得することで、標識分子の検出を行うことができる。
【００２１】
図１１は、トンネル顕微鏡と光ピンセット操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１１において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。光ピンセット用レーザー３３からの光は、ガルバノミラー３４、ダイクロイックミラー３５を介して、対物レンズ３２を通り、試料セル中のビーズに集光される。ガルバノミラーは、コントローラ３６を介して、任意にコントロールできる。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。トンネル顕微鏡用プローブ６０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段６１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。また、電子エネルギー損失分光を利用することで、標識分子の識別を行うこともできる。
【００２２】
以上の装置構成において、さらに、ストロークの大きなＸＹステージを設け、これによって、試料面内を移動させることによって、数十ミクロン以上の長いＤＮＡ鎖の測定に対応させることができ、さらに、複数のＤＮＡ鎖の測定を同一試料基板上で行うことも可能である。
続いて、図１２は、近接場光学顕微鏡とマイクロマニピュレータ操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１２において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。伸延操作を行うためのマイクロマニピュレータ操作装置７１は、先端７を試料セル３０中に挿入した状態で設置されている。光プローブ顕微鏡用プローブ４０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。蛍光励起用の光は、光源４３から、プローブ４０に導入され、プローブ先端から、試料に照射され、試料からの蛍光は、対物レンズ３２、ダイクロイックミラー３５、蛍光検出用フィルター４４を介して、光検出器４５において検出される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像と蛍光像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。光検出器４５の部分に分光器と高感度ＣＣＤカメラを接続することによって、蛍光波長の解析を行い、蛍光標識分子の違いを識別することができる。
【００２３】
本実施の形態においては、ＡＦＭ方式の光プローブについて示したが、ストレートタイプの光プローブを用いるシアフォース方式も適用可能である。
図１３は、原子間力顕微鏡と光ピンセット操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１３において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。伸延操作を行うためのマイクロマニピュレータ操作装置７１は、先端７を試料セル３０中に挿入した状態で設置されている。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。原子間力顕微鏡用プローブ５０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。形状像の他に、表面電位像などを取得することで、標識分子の検出を行うことができる。
【００２４】
図１４は、トンネル顕微鏡と光ピンセット操作装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１４において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。伸延操作を行うためのマイクロマニピュレータ操作装置７１は、先端７を試料セル３０中に挿入した状態で設置されている。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。トンネル顕微鏡用プローブ６０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段６１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。
【００２５】
本実施の形態で示した一般的なマイクロマニピュレータ操作装置とは別に、マイクロマシン技術によって、ミリメートルレベルのマイクロマニピュレータを作製することが可能であり、この場合は、駆動部分全体を試料セル中に挿入して使用することもできる。
一方、図１５は、近接場光学顕微鏡とマイクロ巻き取り装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１５において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。マイクロマシン技術で製作したマイクロ巻き取り機構の駆動部８１とローターは、試料セル３０中に挿入されており、コントローラ８２によってコントロールされる。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。伸延操作を行うためのマイクロマニピュレータ操作装置７１は、先端７を試料セル３０中に挿入した状態で設置されている。光プローブ顕微鏡用プローブ４０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。蛍光励起用の光は、光源４３から、プローブ４０に導入され、プローブ先端から、試料に照射され、試料からの蛍光は、対物レンズ３２、ダイクロイックミラー３５、蛍光検出用フィルター４４を介して、光検出器４５において検出される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像と蛍光像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。光検出器４５の部分に分光器と高感度ＣＣＤカメラを接続することによって、蛍光波長の解析を行い、蛍光標識分子の違いを識別することができる。
【００２６】
本実施の形態においては、ＡＦＭ方式の光プローブについて示したが、ストレートタイプの光プローブを用いるシアフォース方式も適用可能である。
図１６は、原子間力顕微鏡とマイクロ巻き取り装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１６において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。マイクロマシン技術で製作したマイクロ巻き取り機構の駆動部８１とローターは、試料セル３０中に挿入されており、コントローラ８２によってコントロールされる。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。原子間力顕微鏡用プローブ５０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段４１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。形状像の他に、表面電位像などを取得することで、標識分子の検出を行うことができる。
【００２７】
図１７は、トンネル顕微鏡とマイクロ巻き取り装置を複合した遺伝子解析装置の例を示したものである。図１７において、試料セル３０は、ＸＹＺ方向に変位可能な移動機構３１によって保持されており、その下には、対物レンズ３２が配置されている。マイクロマシン技術で製作したマイクロ巻き取り機構の駆動部８１とローターは、試料セル３０中に挿入されており、コントローラ８２によってコントロールされる。試料の状態は、切り替え式のミラー３７を介して、例えば、接眼レンズ３８を通して観察するか、ＣＣＤカメラによって観察することができる。トンネル顕微鏡用プローブ６０は、試料セル３０中に配置され、試料表面との距離を変位検出手段６１とコントローラ４２および移動機構３１によって、制御される。移動機構３１をＸＹ方向に２次元的な走査を行うことによって、試料表面の形状像を取得し、遺伝子配列情報の解析を行うことができる。
【００２８】
なお、本装置で使用するローターは、顕微鏡下で観察しやすくするために、ガラスなどの透明な材料で製作することができる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の遺伝子解析方法及び装置によって、遺伝子地図の解析をシーケンス法に比べ、大幅に速く、実用的な分解能で行うことが可能になり、シーケンス法で、１度に解析できる限界の１ｋｂｐをはるかに越えるサイズのＤＮＡ鎖の解析を行うこともできる。本発明の手法によれば、従来のＦＩＳＨ法に対しても、分解能の向上に加えて、形状測定を行うことによって、測定精度を向上させることが可能になった。さらに、従来のシーケンス法では、適用できなかったＤＮＡの損傷の解析を行うことができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子解析方法を示す説明図である。
【図２】本発明の遺伝子解析方法を示す説明図である。
【図３】本発明の遺伝子解析方法を示す説明図である。
【図４】本発明における固定操作を示す説明図である。
【図５】本発明における固定操作を示す説明図である。
【図６】本発明における固定操作を示す説明図である。
【図７】本発明における伸延操作を示す説明図である。
【図８】本発明における伸延操作を示す説明図である。
【図９】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１０】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１１】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１２】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１３】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１４】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１５】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１６】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【図１７】本発明の遺伝子解析装置を示す模式図である。
【符号の説明】
１  ＤＮＡ鎖
２  プローブ分子
３  基板
４  探針
５  ＤＮＡ固定端
６  ビーズ
７  マイクロマニピュレータ先端部
８  巻き取り機構先端部
３０  試料セル
３１  移動機構
３２  対物レンズ
３３  光ピンセット用レーザー
３４  ガルバノミラー
３５  ダイクロイックミラー
３６  コントローラー
３７  ミラー
３８  接眼レンズ
４０  光プローブ顕微鏡用プローブ
４１  変位検出手段
４２  コントローラ
４３  光源
４４  蛍光検出用フィルタ
４５  光検出器
５０  原子間力顕微鏡用プローブ
６０  トンネル顕微鏡用プローブ
６１  変位検出手段
７１  マイクロマニピュレータ操作装置
８１  マイクロ巻き取り機構駆動部
８２  コントローラ
【図１】
0004475478.tif 000002
【図２】
0004475478.tif 000003
【図３】
0004475478.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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