(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むRNAからなるレプリコンRNA。
【請求項２】
さらにIRES配列を含む、請求項１記載のレプリコンRNA。
【請求項３】
さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、請求項２記載のレプリコンRNA。
【請求項４】
配列番号７に示される塩基配列を含むRNAからなるレプリコンRNA。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項記載のレプリコンRNAを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
【請求項６】
細胞が、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項５記載のレプリコン複製細胞。
【請求項７】
細胞が、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、及び293細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞である、請求項５又は６記載のレプリコン複製細胞。
【請求項８】
被験物質の存在下で、請求項５乃至７のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、劇症Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来の核酸、遺伝子、ならびに該遺伝子を利用したHCVレプリコン及びレプリコン複製細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス研究及び抗ウイルス薬の研究開発にはウイルスを効率よく増幅できる実験系が必要不可欠である。さらに、培養細胞によりウイルスを増幅させる系、あるいは培養細胞によりウイルスの増殖を評価する系があれば、ウイルス研究及び抗ウイルス薬の研究開発は飛躍的に進歩する。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus、HCV）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の(+)鎖センスRNAをゲノムとするウイルスで、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることがわかってきた。現在主流のHCV遺伝子型の分類法である、SimmondsらによるHCV株の塩基配列を用いた系統解析法によると、HCVは遺伝子型1a、遺伝子型1b、遺伝子型2a、遺伝子型2b、遺伝子型3a、及び遺伝子型3bの6タイプに分類され、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプに分類される（Simmonds, P. et al, Hepatorigy (1994) 10, p 1321-1324）。現在では、HCVの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている（Choo et al., Science, (1989) 244, p 359-362; Kato et al., J. Med. Virol.,(1992) p 334-339; Okamoto, H et al., J.Gen Virol., (1992) 73 p673-679; Yoshioka et al., Hepatorogy, (1992) 16, 293-299）。
【０００４】
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約60％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た患者も治療を中止すると半分以上が再燃する。インターフェロンの治療効果は、HCVの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型1bに対しては効果が低く、遺伝子型2aに対してはより効果が高いと言われている（Mori, S., et al., Biochem. Biophis. Res. Commun., (1992) 183, 334-342）。
【０００５】
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ、現在原因療法が存在しないＣ型肝炎に対して、効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な課題である。それゆえ、HCV特異的な化学療法やワクチン療法の発展、及び抗HCV薬の開発が切望されている。抗HCV薬開発のターゲットとしては、HCVの複製抑制やHCVの細胞感染の抑制が考えられる。
【０００６】
最近まで、HCVを細胞培養系で増やすこと、HCVを培養細胞に感染させることは困難であり、また、HCVに感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしかいなかったため、HCVの複製機構や感染機構の研究は困難であった。しかし、最近HCV由来の自律複製能を有するRNAとして、HCVサブゲノムRNAレプリコンが作製されたこと（特開２００１−１７１８７号公報; Lohmann et al., Science, (1999) 285, 110-113; Blight et al., Science, (2000) 290, 1972-1974; Friebe et al., J.Virol., (2001) 75, 12047-12057; Ikeda et al., J.Virol., (2002) 76, 2997-3006;）により、培養細胞を用いてHCVの複製機構を解析することが可能となった。これらのHCVサブゲノムRNAレプリコンは、遺伝子型1bに属するCon 1というクローンのHCVゲノムRNAの5'非翻訳領域中のHCV IRESの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子、及びその下流に連結したEMCV-IRESによって置換したものである。このRNAレプリコンは、ヒト肝癌細胞Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Huh7細胞内で自律複製することが証明されている。このRNAレプリコンシステムを用いたHCVの複製評価系は抗HCV薬の開発の強力なツールになると考えられる。
【０００７】
遺伝子型が異なるHCVではコードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型1bのHCV由来のサブゲノムRNAレプリコンの解析だけでは、HCVの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がHCVの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型1bのHCVのサブゲノムRNAレプリコンを含むHCV複製系のみを用いて様々なタイプのHCVに効果を及ぼす抗HCV薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のHCV RNAレプリコンを作製して、HCV複製機構、及び抗HCV薬の研究を行う必要があると考えられる。
【０００８】
現在培養細胞内でレプリコンとして複製ができたクローンは数株しかない。また、慢性肝炎からクローニングされチンパンジーに感染性が確認できたクローンが必ずしもレプリコンとして複製できるわけではない（Lomann et al., Science, (1999) 285, 110-113）。すなわち、複製効率がよく、かつ高確率でHCVレプリコンを作製できるHCV株を選択する方法は未だ見出されておらず、こうしたHCV株の選択方法を確立すれば、HCV治療薬の研究開発は飛躍的に前進すると考えられる。
【０００９】
HCVに関しては、現在ワクチンが開発されていない。その原因の一つは、安定して、大量にワクチンとなりうるHCV関連タンパク質を、生体内で存在する型で産生できないことにある。前述のHCVレプリコン細胞において、HCV関連タンパク質が発現していることから（特開２００１−１７１８７号公報）、このHCVレプリコン細胞を利用することが可能と考えられる。しかしながら、工業的にワクチンを製造するためには、大量培養が可能な細胞を用いる必要がある。この観点から、現在HCV RNAレプリコン複製細胞として唯一樹立されているHuh7はワクチン製造には適していないと考えられる。ワクチン製造に適した細胞としては、例えば、HeLa細胞のように浮遊培養系で超大量培養が可能な細胞が考えられる。また、前述のように、HCVは遺伝子型により配列が異なるため、ワクチンについても遺伝子型ごとに製造することが必要になる。つまり、ワクチン製造に適した細胞を用いて、各種遺伝子型のHCV RNAレプリコン細胞を作製することが必要となる。一方、Huh7細胞はHCVの感染に対する感受性が確認できていないという点でも、HCVが自律的に感染複製する細胞培養系の樹立には向いていないと考えられる。したがって、他の肝癌細胞を用いてHCVが自律的に感染複製する細胞培養系を樹立することが必要と考えられる。
【００１０】
さらに、様々な種類の細胞間でHCV RNAレプリコンの複製機構の差異を比較することにより、HCVの複製に必要な細胞性因子の同定が可能となり、新たな抗HCV治療薬のターゲットが発見できると考えられる。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、高確率で複製効率の良いHCVレプリコンRNA、及びHCVタンパク質を持続的に大量生産可能なHCVレプリコン細胞の提供を目的とする。
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、劇症Ｃ型肝炎患者のHCV株JFH2.1あるいはJFH2.2に由来するレプリコンを用いれば、高確率で複製効率の良いレプリコン複製細胞が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)のポリヌクレオチドからなる核酸を提供する。
(a)配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)前記(a)又は(b)記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクをコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がDNAの場合、配列表の塩基記号「u」は「t」に読み替えるものとする）
本発明はまた、前記核酸を構成する下記(1)〜(6)の核酸も提供する。
(1) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(2) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(3) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(4) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(5) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(6) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、上記(1)〜(6)のいずれについても、核酸がDNAの場合、配列表の塩基記号「u」は「t」に読み替えるものとする）
本発明はまた、前記各核酸からなる遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドも提供する。
【００１４】
本発明はまた、以下の(a)又は(b)のRNAからなるレプリコンRNAも提供する。
(a)配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むRNA
(b)配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むRNA
また、前記レプリコンRNAは、さらにIRES配列や、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明はまた、以下の(a)又は(b)のRNAからなるレプリコンRNAも提供する。
(a)配列番号７又は８に示される塩基配列を含むRNA
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ自律複製能を有するRNA
本発明はまた、前記レプリコンRNAを適当な細胞に導入することにより、レプリコン複製細胞を作製する方法と、該方法によって作製されたレプリコン複製細胞も提供する。該レプリコン複製細胞に用いられる細胞としては、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞が挙げられ、より具体的には、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、又は293細胞が挙げられる。
【００１６】
本発明はまた、被験物質の存在下で、前記レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法も提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記レプリコン複製細胞から複製レプリコンRNAを取得し、取得した複製レプリコンRNAを別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのレプリコンRNAの複製効率を増大させる方法も提供する。該方法において、複製効率は、レプリコン複製細胞に導入されたレプリコンRNAの複製効率と比較して、少なくとも2倍増大していることが好ましい。
【００１８】
本発明はまた、前記レプリコン複製細胞から複製レプリコンRNAを取得し、取得した複製レプリコンRNAを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンRNAを取得することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンRNAを製造する方法も提供する。
【００１９】
さらに、本発明は前記方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンRNAについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンRNAとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンRNAにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンRNAを製造する方法も提供する。
【００２０】
本発明の新規HCV RNA遺伝子を利用すれば、高確率で複製効率の良いレプリコンRNAとレプリコン複製細胞を得ることができる。このレプリコン複製細胞は、HCV由来のRNA及びHCVタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用することができる。さらに該レプリコン複製細胞は、HCVの複製又はHCVタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することもできる。
【００２１】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−３２９０８２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明に係るHCV由来の核酸、遺伝子及びレプリコンRNA
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTRとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTRとも表記する）からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
【００２３】
このようなHCVの構造タンパク質（Core、E1、及びE2）と非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、HCVのウイルスタンパク質）のうち、Coreはコアタンパク質であり、E1及びE2はエンベロープタンパク質であり、非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。また、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性(Ｎ末端側の３分の１)とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
【００２４】
本発明者らは、HCVの一般的な遺伝子型の分類ではなく、劇症肝炎患者から分離したHCVというクライテリアで選別したHCVゲノム用いて、高確率で複製効率が極めて良く、さらにはHuh7細胞などの細胞で自律的に複製することが可能なRNAを構築した。
【００２５】
本明細書では、自律複製能を有しており天然のHCVウイルスゲノムを改変して作製されたRNAを、「レプリコンRNA」又は「RNAレプリコン」と呼ぶ。
【００２６】
本明細書中において、「遺伝子」とは核酸のうち「生命活動に関わる特定の機能や情報を担う核酸」を意味し、RNAとDNAの両方を含むものとする。また、核酸及び遺伝子は１本鎖（cDNA、cRNA等）であっても２本鎖であってもよく、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。さらに部分的に修飾されていても、誘導体であってもよい。なお、便宜上、配列表の塩基配列はRNAで示すが、当該遺伝子がDNAである場合、塩基記号「U」は「T」に読み替えるものとする。
【００２７】
本発明において、「劇症肝炎」とは、肝炎のうち症状発現後8週間以内にII度以上の脳症とプロトロンビン時間40％以下を呈したものを意味し、10日以内に脳症の出現する急性型と、それ以後に脳症の出現する亜急性型に分けられる。「劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルス」とは、この「劇症肝炎」症状を呈した患者から分離したHCVのことを意味する。本発明において、「劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルス」あるいは「劇症株のHCV」には、天然由来のHCVゲノムRNAを有するウイルスだけでなく、天然由来のHCVゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムRNAを有するウイルスも包含する。劇症株のHCVの具体例としては、JFH-1株（特開２００２−１７１９７８号）、ならびにJFH-2.1株及びJFH-2.2株等のウイルスが挙げられる。
【００２８】
本願明細書において、「5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTR）」、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」、「Coreタンパク質をコードする配列（Core領域又はＣ領域）」、「E1タンパク質をコードする配列（E1領域）」、「E2タンパク質をコードする配列（E2領域）」、「NS2タンパク質をコードする配列（NS2領域）」、「NS3タンパク質をコードする配列（NS3領域）」、「NS4Aタンパク質をコードする配列（NS4A領域）」、「NS4Bタンパク質をコードする配列（NS4B領域）」、「NS5Aタンパク質をコードする配列（NS5A領域）」、「NS5Bタンパク質をコードする配列（NS5B領域）」、及び「3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTR）」、ならびにその他の特定の領域若しくは部位は、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスであるJFH-2.1及びJFH-2.2 株のゲノム全領域をコードする全長ゲノムRNAあるいはその部分ゲノムRNA（JFH-2.1及びJFH-2.2クローン）の塩基配列（それぞれ、配列番号１〜６）を含むポリヌクレオチドを基準として、定めるものとする。
【００２９】
具体的には、JFH-2.1クローンについては、配列番号１、３及び４で示される塩基配列に対して特定のHCVのRNA配列をアラインメントしたときに、配列番号３で示される塩基配列がそのRNAの「5'非翻訳領域」、配列番号１に示される塩基配列が「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」であり、同塩基番号1〜1893の配列が「NS3タンパク質をコードする配列」、塩基番号1894〜2055の配列が「NS4Aタンパク質をコードする配列」、同塩基番号2056〜2838の配列が「NS4Bタンパク質をコードする配列」、同塩基番号2839〜4236の配列が「NS5Aタンパク質をコードする配列」、塩基番号4237〜6012の配列が「NS5Bタンパク質をコードする配列」、配列番号４で示される塩基配列が「3'非翻訳領域」である。
【００３０】
JFH-2.2クローンについては、配列番号２、５及び６で示される塩基配列に対して特定のHCVのRNA配列をアラインメントしたときに、配列番号５で示される塩基配列がそのRNAの「5'非翻訳領域」、配列番号２に示される塩基配列が「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」であり、同塩基番号1〜1893の配列が「NS3タンパク質をコードする配列」、塩基番号1894〜2055の配列が「NS4Aタンパク質をコードする配列」、同塩基番号2056〜2838の配列が「NS4Bタンパク質をコードする配列」、同塩基番号2839〜4236の配列が「NS5Aタンパク質をコードする配列」、塩基番号4237〜6012の配列が「NS5Bタンパク質をコードする配列」、配列番号６で示される塩基配列が「3'非翻訳領域」である。
【００３１】
本発明にかかる遺伝子には、前記した配列番号１乃至６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに加えて、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレチドも、それが前記した所望のタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、6×ＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150mmol/l塩化ナトリウム、15mmol/lクエン酸ナトリウムによりなる）存在下、60℃でハイブリダイゼーション後、0.1%ＳＤＳを含む  １×ＳＳＣにて、68℃条件下で洗浄するような条件をである。ハイブリダイゼーション法としては、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることができ、これらの方法は、例えばMolecular Cloning, A laboratory manual, 20001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press の記載に準じて行うことができる。
【００３２】
本発明の核酸又は遺伝子は、それらが前記した所望のタンパク質をコードする限り、その配列内にギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。具体的には、配列番号１乃至６で示される塩基配列において、１又は複数個の塩基、つまり、1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜6個、最も好ましくは1〜数個（2〜5個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであっても、それらが所望のタンパク質をコードする限り：
すなわち、配列番号１又は２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするものであり、配列番号３又は５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするものであり、配列番号4又は6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするものである限り、本発明の核酸あるいは遺伝子に含まれる（「塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、「塩基配列を含む塩基配列」とも表示することがある）。
【００３３】
さらに上記の「特定のHCV」はJFH-2.1株、JFH-2.2株に限定されず、それらの誘導体であるウイルス株も包含される。
【００３４】
本発明に係るHCV レプリコンRNAの一つの実施形態は、劇症肝炎由来のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列と、3'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンRNAである。このレプリコンRNAは、さらに１つのIRES配列を含んでもよく、これにさらに１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでよい。またさらにこのレプリコンRNAは、JFH2.1 及びJFH2.2 以外のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNA上の、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、又はNS5Bタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードする配列を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明に係るHCV レプリコンRNAの別の好適な実施形態は、配列番号３で示される塩基配列からなる5'非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのIRES配列と、配列番号１で示されるHCVのゲノムRNA上のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号４で示される塩基配列からなる3'非翻訳領域とを含むポリヌクレオチド：あるいは、配列番号５で示される塩基配列からなる5'非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのIRES配列と、配列番号２で示されるHCVのゲノムRNA上のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号６で示される塩基配列からなる3'非翻訳領域とを含むポリヌクレオチドからなる、レプリコンRNAである。
【００３６】
本発明に係るレプリコンRNAは、好ましくは、最も5'側に配列番号３又は５のHCVのゲノムRNA上の5'非翻訳領域を、最も3'側に配列番号４又は６のHCVのゲノムRNA上の3'非翻訳領域を有する。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、IRES配列の上流に連結されてもよいし、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結されてもよいし、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」の中に挿入されてもよい。
【００３７】
本発明に係るレプリコンRNAは、より好ましくは、配列番号３又は５のHCVのゲノムRNA上の5'非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、IRES配列と、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」とをこの順番で有し、さらに最も3'側に劇症肝炎患者由来のHCVのゲノムRNA上の3'非翻訳領域を有する。
【００３８】
本発明に係るHCV レプリコンRNAのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号７又は８で示される塩基配列からなるRNAからなるレプリコンRNAである。さらに、配列番号７又は８で表される塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をも含む。さらに、この配列番号７又は８で示される塩基配列において、１乃至複数個の塩基、つまり1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜6個、最も好ましくは1〜数個（2〜5個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるレプリコンRNAであって、かつ、自律複製能を有するRNAも、好適な実施形態として本発明の範囲に含まれる。本発明において「自律複製能を有する」とは、レプリコンRNAを細胞中に導入したときに、そのレプリコンRNAが細胞内でそのレプリコンRNA自身の全長を複製することができることを意味する。限定するものではないが、この自律複製能は、例えば、レプリコンRNAをHuh7細胞中にトランスフェクションし、Huh7細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したRNAについて、導入したレプリコンRNAを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行ってレプリコンRNAの存在を検出することにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、HCVタンパク質の発現確認、レプリコンRNAの検出等の記載に従って行うことができる。
【００３９】
本発明に係るレプリコンRNAには、上記したような配列の他に、レプリコンRNAを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含むRNAを含んでもよい。外来遺伝子は、5'非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結してもよいし、「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする配列」の中に挿入してもよい。外来遺伝子を含むレプリコンRNAは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされたタンパク質を発現することができる。従って外来遺伝子を含むレプリコンRNAは、遺伝子治療などの、特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
【００４０】
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンTn9由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（SEAP）遺伝子等が挙げられる。但し、本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、レプリコンRNA中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
【００４３】
本発明における「IRES配列」とは、RNAの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるIRES配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、EMCV IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、FMDV IRES、HCV IRES、等が挙げられるが、EMCV IRES、及びHCV IRESがより好ましく、EMCV IRESが最も好ましい。
【００４４】
また本発明に係るレプリコンRNAには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、5'側のレプリコンRNA中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、又は外来遺伝子と、それより3'側のIRES配列、及び「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
【００４５】
本発明に係るレプリコンRNAにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNA上のウイルスタンパク質をコードする配列、及び外来遺伝子等が、レプリコンRNAから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうち、タンパク質をコードする配列は、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスの「NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質をコードする配列」から翻訳されるポリタンパク質とともに融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
【００４６】
２．本発明に係るレプリコンRNAの作製
本発明に係るHCV レプリコンRNAは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、HCV レプリコンRNAは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
【００４７】
まず、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質（配列番号１又は２）と3'非翻訳領域（配列番号４又は６）のRNAに対応するDNAとを、常法によりクローニングベクターに挿入して、DNAクローンを作製する。一方、5'非翻訳領域（配列番号３又は５）はRNA プロモーターの下流に挿入して、DNAクローンを作製する。ここで、「RNAに対応するDNA」とは、当該RNAの塩基配列のU（ウラシル）をT（チミン）に置き換えた塩基配列からなるDNAを意味する。前記RNAプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。好適なRNAプロモーターとしては、限定するものではないが、T7 RNAプロモーター、SP6 RNAプロモーター、SP3 RNAプロモーターが挙げられ、T7 RNAプロモーターが特に好ましい。
【００４８】
次に、作製した5'非翻訳領域DNAクローンについて、例えば、5'非翻訳領域の下流に、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を挿入し、その下流にIRES配列を挿入する。さらに、IRES配列の下流に配列番号１又は２で示される塩基配列からなるDNAと配列番号４又は６で示される塩基配列からなるDNAをこの順で連結する。
【００４９】
次いで、上記で作製したDNAクローンを鋳型として、RNAポリメラーゼによりRNAを合成する。RNA合成は、5'非翻訳領域及びIRES配列から、常法により開始させることができる。鋳型DNAがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、RNAプロモーターの下流に連結された上記DNA領域を制限酵素によって切り出し、そのDNA断片を鋳型として用いてRNAを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるRNAの3'末端がウイルスゲノムRNAの3'非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されたRNAが、本発明に係るレプリコンRNAである。
【００５０】
３．本発明に関わるHCVのレプリコンRNAを導入したレプリコン複製細胞の作製
上記のようにして作製されたレプリコンRNAを、レプリコンRNAを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンRNAが持続的に複製される細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンRNAが持続的に増幅される細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
【００５１】
レプリコンRNAを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、又は293細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば、癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
【００５２】
前記細胞は、ワクチン製造のようにHCVタンパクの大量製造を目的とする場合には、大量培養が可能な細胞を用いることが望ましい。そのような観点からは、Huh7細胞以外の細胞であることが好ましい。
【００５３】
レプリコンRNAの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、DEAEセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
【００５４】
レプリコンRNAは、目的のレプリコンRNAを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するRNA量を一定にしてレプリコンRNAの量を変化させたい場合には、目的のレプリコンRNAを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンRNAの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは1ピコグラム〜100マイクログラム、より好ましくは10ピコグラム〜10マイクログラムの量を使用する。
【００５５】
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンRNAを用いる場合には、そのレプリコンRNAが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのようなレプリコンRNAの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。
【００５６】
一例として、レプリコンRNAにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンRNAを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、16〜24時間培養した後に、培養ディッシュにG418（ネオマイシン）を0.05ミリグラム/ミリリットル〜3.0ミリグラム/ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に2回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは10日間〜40日間、より好ましくは14日間〜28日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、レプリコンRNAが導入され持続的に複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。
【００５７】
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。こうして得られる目的のレプリコンRNAが持続的に複製される細胞クローンを、本明細書では「レプリコン複製細胞クローン」と称する。
【００５８】
樹立した細胞クローンについては、導入されたレプリコンRNAから該細胞クローン中で複製されているレプリコンRNAの検出、導入されたレプリコンRNA中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムDNAへの組み込みの有無の確認、及びHCVタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的のレプリコンRNAが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
【００５９】
導入されたレプリコンRNAから該細胞クローン中で複製されたレプリコンRNA（本明細書中では、以下便宜的に、「複製レプリコンRNA」と称する）の検出は、当業者には公知の任意のRNA検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞クローンから抽出したトータルRNAについて、導入されたレプリコンRNAに対して特異的なDNA断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
【００６０】
また導入されたレプリコンRNA中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムDNAへの組み込みの確認は、限定するものではないが、例えば、細胞クローンから抽出した宿主ゲノムDNAについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するPCRを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞クローンでは、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、レプリコンRNA自体は該細胞内で持続的に複製されていない可能性がある。この場合、レプリコンRNAが持続的に複製されているか否かを、次に示すHCVタンパク質の発現の確認実験によって、確認することができる。
【００６１】
HCVタンパク質の発現の確認は、例えば、導入されたレプリコンRNAから発現されるべきHCVタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗HCVタンパク質抗体（例えば、抗NS3特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗HCVタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からHCVタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、HCV由来のレプリコンRNAが持続的に複製してHCVタンパク質を発現しているものと判断することができる。
【００６２】
以上のようにして、目的のレプリコンRNAを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばRNAを抽出しその中からレプリコンRNAを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンRNAを取得することができる。本発明はそのようなレプリコンRNAの製造方法をも提供する。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、HCVタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのHCVタンパク質の製造は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を取得することができる。
【００６３】
また本発明に係るレプリコン複製細胞が、外来遺伝子を含有するレプリコンRNAを持続的に複製している場合には、そのレプリコン複製細胞を用いて外来遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて取得することができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、目的のタンパク質に対する抗体を用いた検出等により外来遺伝子にコードされたタンパク質を選択的に取得することができる。
【００６４】
４．本発明に関わるHCVのレプリコンRNAへの複製効率を増大させる突然変異の導入
本発明に係るレプリコン複製細胞において複製され生成されたレプリコンRNA（複製レプリコンRNA）には、複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ずる。このような突然変異は適合変異であると思われる。
【００６５】
本発明では、このことを利用して、本発明に係るレプリコンRNAに複製効率を向上させる突然変異を高頻度で導入することができる。
【００６６】
具体的には、第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンRNAを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンRNAを抽出等により取得し、第１の複製レプリコンRNAをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製するという工程を、1回以上、好ましくは1〜10回、より好ましくは1〜5回、さらに好ましくは1〜2回反復的に行うことにより、レプリコン複製細胞中で、レプリコンRNAに複製効率を増大させる突然変異を高頻度に導入することができる。
【００６７】
複製レプリコンRNAを再導入する細胞としては、任意の細胞を用いることができるが、最初にレプリコンRNAを導入した細胞と同じ生物種由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンRNAを導入した細胞と同じ生物種由来の同じ組織由来の細胞であることがより好ましく、最初にレプリコンRNAを導入した細胞と同じ細胞株の細胞であることがさらにより好ましい。
【００６８】
従って、本発明では、上記の方法を用いて、複製効率を増大させる突然変異を導入したレプリコンRNAを製造することができる。すなわち、まず第１のレプリコン複製細胞（本発明に係るレプリコンRNAを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンRNAを抽出等により取得し、さらにこの第１の複製レプリコンRNAをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製する工程を、1回以上、好ましくは1〜10回、より好ましくは1〜5回、さらに好ましくは1〜2回反復的に行った後、この反復工程の最後に得られる最終的なレプリコン複製細胞から、複製レプリコンRNAを抽出等によって取得することにより、複製効率が増大したレプリコンRNAを製造することができる。
【００６９】
本発明では、以上のような方法により、レプリコンRNAの複製効率を少なくとも2倍、好ましくは10〜100倍、より好ましくは100〜10000倍に増大させることができる。
【００７０】
このような方法で製造された複製効率が増大したレプリコンRNAについては、逆転写PCRによってcDNAを得てそれを塩基配列決定に供するなどの公知の方法により、塩基配列を決定することが好ましい。さらに、決定された塩基配列又はそれにコードされるアミノ酸配列を、最初に細胞に導入されたレプリコンRNAの塩基配列と比較することにより、適合変異を同定することができる。複製効率を増大させる適合変異としては、特に、レプリコンRNAにコードされたウイルスタンパク質のアミノ酸を変異させる非同義置換が好ましい。
【００７１】
また本発明は、そのようにして同定した適合変異を、レプリコンRNAに常法により導入することで、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンRNAを製造する方法も提供する。
【００７２】
以上のようにして製造された複製効率が増大したレプリコンRNAはレプリコンRNAを大量に製造するために使用することができる。
【００７３】
本発明に係るレプリコンRNAの複製効率は、当業者に公知の方法、例えば次のような方法に従って決定することができる。
【００７４】
例えば、Huh7細胞に0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0マイクログラムの量のレプリコンRNAをトランスフェクションして、前述の実験手法と同様の方法でG418による選択培養を21日間行った後にコロニー形成数（コロニー数）を測定する。導入したRNA量とコロニー形成数とを比較して容量依存的にコロニー形成が増加するレプリコンRNA導入量の範囲を決定し、その範囲内でのコロニー形成数を、導入したRNA量で除算して得られる値を、１マイクログラムあたりのコロニー形成率とする。この計算式は、以下のとおりである。
コロニー形成率 [(Colony forming Unit; CFU)/マイクログラム] ＝ コロニー形成数 [個]／導入したRNA量 [マイクログラム]
こうして算出されたコロニー形成率を、導入したレプリコンRNAの複製効率を示す値とする。すなわち、コロニー形成率が高いほど、そのレプリコンRNAの複製効率は高い。
【００７５】
またレプリコンRNAの複製効率は、形成されたコロニー１個あたりの導入したレプリコンRNAのコピー数で示されるコロニー形成能で表すこともできる。すなわち、以下のような計算式に従って算出することができる。
コロニー形成能＝導入したレプリコンRNAのコピー数 [コピー]／コロニー形成数 [個]
【００７６】
５．本発明の他の実施形態
本発明に係るレプリコンRNA複製細胞は、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製を検出し、その被験物質がレプリコンRNAの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製の検出は、レプリコンRNA複製細胞から抽出したRNA中のレプリコンRNAの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中又は該培養物に含まれるレプリコンRNA複製細胞中のタンパク質に含まれるHCVタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
【００７７】
このような試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のために使用することができる。具体的には、以下のような例が挙げられる。
(1)HCVの増殖を抑制する物質の探索
HCVの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にHCVの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはHCVゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりHCVの増殖若しくはHCVタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば、単離精製された酵素）等が挙げられる。
(3)HCVに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばHCVウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るレプリコン複製細胞を使用することができる。
(4) HCVウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
(5) Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００７８】
レプリコンRNAの作製
１．発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスJFH-2.1株及びJFH-2.2株のウイルスゲノムの全領域に対応するDNAを、該ウイルス株のゲノム全長cDNAを含むJFH-2.1、及びJFH-2.2クローンから取得し、T7RNAプロモーター配列の合成DNAをそれぞれのクローンの5’端に付加し、プラスミドpUC19プラスミドに挿入した。このようにして構築されたプラスミドDNAを、以下、pJFH-2.1、及びpJFH-2.2と称する。なお、上記JFH-2.1、及びJFH-2.2クローンの作製については、既報（Lehmann et.al., Science, (1999)）に従った。
【００７９】
このようにして構築したプラスミドDNA pJFH-2.1、及びpJFH-2.2の構造を、図１の上段に示す。「T7」はT7 RNAプロモーター、「G」はJFH-2.1及びJFH-2.2の5’端の上流及びT7RNAプロモーター配列の3’端の下流に挿入したdGTPを示す。「5’NTR」から「3’NTR」までがＣ型肝炎ウイルスのゲノム全領域に対応するDNAである。
【００８０】
次に、プラスミドDNApJFH-2.1、及びpJFH-2.2の構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（neo；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）、及びEMCV-IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換して、プラスミドDNA pSGREP-JFH2.1、及びpSGREP-JFH2.2をそれぞれ構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（Lehmann et.al., Science, (1999)）に従った。具体的には、プラスミドpJFH-2.1、及びpJFH-2.2を制限酵素AgeI及びClaIで切断し、その切断部位に、pJFH-2.1、及びpJFH-2.2由来の5'NTRからCore領域におよぶ配列と発現ベクターpRSV5NEO由来のネオマイシン耐性遺伝子をPCR増幅により結合し制限酵素AglIとPmeIで切断した断片、及びEMCV IRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により結合し制限酵素PmeIとClaIで切断した断片を、挿入し連結した。
【００８１】
２．レプリコンRNAの作製
レプリコンRNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターpSGREP-JFH2.1及びpSGREP-JFH2.2を、それぞれ制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片のそれぞれ10から20μgを、Mung Bean Nuclease 20U（トータル反応液量 50μl）を用いて30℃で30分間インキュベートして、さらに処理した。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUGAの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean NuCleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCUGAの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean NuＣlease処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、CUGAの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製して、これを鋳型DNAとした。
【００８２】
次に、この鋳型DNAから、RNAをin vitro合成した。RNA合成にはAmbion社のMEGAscriptを用いた。鋳型DNAを0.5から1.0μg含む反応液20μlで、37℃で3時間から16時間反応させた。
【００８３】
RNA合成終了後、反応溶液にDNAse（2U）を添加して、37℃で15分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるRNA抽出を行って、鋳型DNAを除去した。このようにしてpSGREP-JFH2.1、及びpSGREP-JFH2.2に由来する上述の鋳型DNAから合成したRNA（レプリコンRNA）を、それぞれrSGREP-JFH2.1、及びrSGREP-JFH2.2と命名した。これらのレプリコンRNAの塩基配列を、rSGREP-JFH2.1については配列番号７及び図１、rSGREP-JFH2.2につては配列番号８及び図１に示す。
【実施例２】
【００８４】
レプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例１で作製した合成レプリコンRNA、rSGREP-JFH2.1、及びrSGREP-JFH2.2のそれぞれについて、レプリコンRNA 0.01ng〜10μgをHuh7細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、RNA総量が10μgとなるように調整した。次いで、その混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、16時間から24時間培養した後に、培養ディッシュにG418（ネオマイシン）を様々な濃度で添加した。その後、週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、図2に示すように、コロニー形成が確認できた。
【００８５】
コロニー形成が認められたrSGREP-JFH2.1又はrSGREP-JFH2.2トランスフェクション細胞については、上記の培養21日後の培養ディッシュからさらに生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。
【００８６】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明にかかる劇症Ｃ型肝炎患者のHCV株JFH2.1あるいはJFH2.2に由来する遺伝子を利用することにより、高確率で複製効率の良いHCVレプリコンRNAを作製することができる。該レプリコンRNAを導入したレプリコン複製細胞は、HCV由来のRNA及びHCVタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用できる。さらに前記レプリコン複製細胞は、HCVの複製及び／又はHCVタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】プラスミドDNA pJFH-2.1、及びpJFH-2.2の構造（上段）、ならびにプラスミドDNA pSGREP-JFH2.1、及びpSGREP-JFH2.2の構造（下段）を示す。
【図２】rSGREP-JFH2.1又はrSGREP-JFH2.2トランスフェクション細胞のコロニー形成を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号７−人工配列の説明：JFH2.1レプリコンRNA
配列番号８−人工配列の説明：JFH2.2レプリコンRNA
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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