(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  バルナーゼをコードする雄性不稔性ＤＮＡ、および、
−  特定の雄しべ細胞において、雄性不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指示する、PTA29、PE1、PCA55、PT42、PT72およびPA9の中から選択される第１プロモーター、ここで該雄性不稔性ＤＮＡは、第１プロモーターと同じ転写単位にあり、該第１プロモーターの制御下にある、
−  を含む雄性不稔性遺伝子；ならびに
−  バルナーゼの活性を阻害することができるバルスターをコードする共調節ＤＮＡ、および、
−  該植物の非雄しべ細胞では該共調節ＤＮＡの発現を指示し、一方、特定の該雄しべ細胞では低レベル発現を指示するか、または発現を指示しないプロモーターであって、該プロモーターは、P35S，Pnosから選択される、
−  から成る群から選択される第２プロモーター、
ここで該共調節ＤＮＡは、該不稔性ＤＮＡの転写単位とは異なる転写単位にある、
−  を含む共調節遺伝子；
を含む、外来ＤＮＡをその細胞の核ゲノムに有する雄性不稔性植物。
【請求項２】
該雄性不稔性遺伝子および該共調節遺伝子が互いに隣接している、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
バルナーゼが、配列番号３のヌクレオチド４０４〜ヌクレオチド７３９のＤＮＡ配列によってコードされるたんぱく質のアミノ酸配列を含み、そしてバルスターが、配列番号２のヌクレオチド６９５〜ヌクレオチド９６７のＤＮＡ配列によってコードされるたんぱく質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
特定の雄しべ細胞が、葯細胞である、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
特定の雄しべ細胞が、絨毯組織細胞である、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
該第１プロモーターが、PTA29である、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項７】
該第２プロモーターが、Pnosである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
植物が、双子葉植物である、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】
アブラナ属植物である、請求項８に記載の植物。
【請求項１０】
該第１プロモーターが、PCA55、PE1、PT72またはPT42である、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１１】
該第２プロモーターが、CaMV35Sプロモーターである、請求項１０に記載の植物。
【請求項１２】
植物が、単子葉植物である、請求項１ないし５または１０のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１３】
トウモロコシまたはイネである、請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】
該第２プロモーターが、少なくとも非雄しべ細胞の大部分で該共調節ＤＮＡの発現を指示する、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１５】
該第２プロモーターが、CaMV35Sプロモーターである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の植物の細胞。
【請求項１７】
方法が、
−  バルナーゼをコードする雄性不稔性ＤＮＡ、および、
−  特定の雄しべ細胞において、雄性不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指示することができる、PTA29、PE1、PCA55、PT42、PT72およびPA9の中から選択される第１プロモーター、ここで該雄性不稔性ＤＮＡは、第１プロモーターと同じ転写単位にあり、該第１プロモーターの制御下にある、
−  を含む雄性不稔性遺伝子、および
−  該バルナーゼの活性を阻害することができるバルスターをコードする共調節ＤＮＡ、ここで該共調節ＤＮＡは、
−  非雄しべ細胞で該共調節ＤＮＡの発現を指示することができるプロモーターであって、該プロモーターは、P35S，Pnosから選択される、
−  から成る群から選択される第２プロモーターの制御下にあり、
それによって、該共調節ＤＮＡは、該不稔性ＤＮＡの転写単位とは異なる転写単位にある、
−  を含む共調節性遺伝子
−  を含む外来ＤＮＡで植物細胞の核ゲノムを形質転換すること；
−  該形質転換細胞から植物を再生すること；および
−  雄性不稔である再生植物を選択すること；
を含む、雄性不稔植物を得る方法。
【請求項１８】
バルナーゼが、配列番号３のヌクレオチド４０４〜ヌクレオチド７３９のＤＮＡ配列によってコードされるたんぱく質のアミノ酸配列を含み、そしてバルスターが、配列番号２のヌクレオチド６９５〜ヌクレオチド９６７のＤＮＡ配列によってコードされるたんぱく質のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
特定の雄しべ細胞が、葯細胞である、請求項１７に記載の植物。
【請求項２０】
特定の雄しべ細胞が、絨毯組織細胞である、請求項１７に記載の植物。
【請求項２１】
該第１プロモーターが、PTA29である、請求項１７ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
該第２プロモーターが、Pnosである、請求項１７ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
雄性不稔植物が、双子葉植物である、請求項１７ないし２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
双子葉植物が、アブラナ属植物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
該第１プロモーターが、PCA55、PE1、PT72またはPT42である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２６】
該第２プロモーターが、CaMV35Sプロモーターである、請求項１７または１８または２５に記載の方法。
【請求項２７】
雄性不稔植物が、単子葉植物である、請求項１７、１８または２５に記載の方法。
【請求項２８】
単子葉植物が、トウモロコシまたはイネである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該第２プロモーターが、少なくとも非雄しべ細胞の大部分で該共調節ＤＮＡの発現を指示する、請求項１７ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
該第２プロモーターが、CaMV35Sプロモーターである、請求項１７ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
該第２プロモーターが、Pnosプロモーターである、請求項１７ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１７ないし３１のいずれか一項に記載の方法によって得られる植物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、雄しべ細胞での雄性不稔ＤＮＡの発現を指示する植物プロモーターを含む外来雄性不稔遺伝子を使用して雄性不稔植物を得るための改善された方法および該方法によって得られる植物に関する。
発明の背景
ほとんどの植物種でなくても、多くは、個々の雑種の形質がその両親をしのぐ雑種強勢により生産性が一般的に増加するため、雑種栽培変種植物の開発がかなり好ましい（例えば、Fehr，1987, Principles of cultivar development, Volume 1: Theory and Technique, MacMillan Publishing Company, New York；Allard, 1960, Principles of Plant Breeding, John Wiley and Sons, Inc.）。
種々の植物種の雑種栽培変種植物の開発は、両親の間でほとんど完全な交差受粉を行うことができるかどうかに依存する。これは、葯を取り除くことにより手動で、または、葯および／または花粉の発達を防ぐ細胞質もしくは核遺伝子を一方の親に使用して遺伝的に一方の親系を雄性不稔にする（すなわち、花粉が存在しないか、機能しない状態にする。）ことにより非常に簡単に行われる（植物における雄性不稔の遺伝学の総説に関しては、Kaul, 1988,′Male Sterility in Higher Plants′, Springer Verlagを参照。）。
種子が収穫産物である雑種植物（例えば、トウモロコシ、アブラナ）に対しては、ほとんどの場合、雑種植物の受精能力が必ず完全に回復することも必要である。雄性不稔が遺伝子制御下にある系では、雄性不稔を回復することができる遺伝子の存在および使用を必要とする。雑種栽培変種植物の開発は、主に、適切で有効な不稔性および回復遺伝子の利用可能性に依存する。
内在性核遺伝子座は、雄性不稔性に影響を及ぼす遺伝子型を含むと考えられるほとんどの植物種に対して知られており、一般に、そのような遺伝子座は、雄性不稔の表現型を生じるためには、特定の劣性対立遺伝子に対してホモ接合であることが必要である。そのような遺伝子座に優性の「雄性稔性」対立遺伝子が存在すると、雄性稔性が得られる。
最近、雄性不稔性は、植物のゲノムに例えば細胞障害性産物（ＲＮアーゼなど）をコードするＤＮＡ配列（または雄性不稔性ＤＮＡ）を含むキメラ雄性不稔性遺伝子を付与し、雄性生殖器官の選択組織において優勢に活性であるプロモーターの制御下におくことによって、植物に誘導することができることが分かった。この点に関しては、Nicotiana tabacumのTA29遺伝子のプロモーターなどの雄しべ特異的プロモーターが、この目的に特に有用であることが分かっている（Marianiら、1990, Nature 347:737; 欧州特許公開（EP）0,344,029）。植物の核ゲノムにそのような雄性不稔性遺伝子を付与することにより、雄性不稔植物を生じる人工的雄性不稔性遺伝子型を含む人工的雄性不稔性遺伝子座が創出される。種々の雄しべ特異的プロモーターが記載されている（例えば、WO 92/13956、WO 92/13957）。
さらに、雄性稔性は、例えば、細胞障害性産物の活性を阻害するか、さもなくば植物細胞において活性な細胞障害性産物を防ぐタンパク質をコードする別のＤＮＡ配列（または稔性回復ＤＮＡ）を含むキメラ稔性回復遺伝子によって植物に復帰させることができることが分かっている（EP 0.412,911）。例えば、Bacillus amyloliquefaciensのbarnase遺伝子は、B. amyloliquefaciensのbarstar遺伝子によってコードされるタンパク質であるbarstarによって阻害され得るＲＮアーゼであるbarnaseをコードする。barnase遺伝子は、不稔性遺伝子の構成に使用することができ、一方、barstar遺伝子は、稔性回復遺伝子の構成に使用することができる。種々の植物種、例えばアブラナでの実験により、キメラbarstar遺伝子は、雄性不稔性がキメラbarnase遺伝子の存在による雄性不稔系の雄性稔性を完全に回復することができることが分かった（EP 0,412,911, Marianiら、1991, Prodeedings of the CCIRC Rapeseed Congress, July 9-11, 1991, Saskatoon, Saskatchewan, Canada; Marianiら、1992, Nature 357:384）。優性除草剤耐性遺伝子（例えば、除草剤ホスフィノトリシンを非毒性化合物に変換するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするbar遺伝子［De Blockら、1987, EMBO J. 6:2513］）などのマーカー遺伝子をキメラ雄性不稔性および／または稔性回復遺伝子と組合せることにより、育種系を満足させて、例えば雄性不稔植物の均一な集団を選択することができる（EP 0,344,029; EP 0,412,911）。
barnaseは、Bacillus amyloliquefaciensによって産生される細胞外リボヌクレアーゼである。barstarは、細胞内barnase活性の毒性効果から保護するために同じ細菌によって細胞内に産生される、barnaseの阻害剤である（Hartley, 1989, TIBS, 14:450-454）。barnase遺伝子をそれ自体の、または別の細菌のプロモーターの制御下で大腸菌（E. coli）およびB. subtilisにおいてクローン化するための最初の試みは、産生したbarnaseが宿主細胞に対して毒性を示したので、失敗に終わった。barnase遺伝子を、同じプラスミド上で予めクローン化した部分からbarstar遺伝子として再構成すると、barnase発現の致死効果は抑制された（Hartley, 1988, J. Mol. biol. 202:913-915）。
barnaseを大腸菌（E. coli）などの細菌宿主細胞でクローン化する場合はいつでも、barstar遺伝子を、その天然のまたは別の細菌のプロモーターの制御下で、宿主細胞に存在させることが、望ましくないbarnase発現の可能な悪影響から防ぐために有用であると考えられる。例えば、Paulら、1992, Plant Mol. Biol. 19:611-622は、ArabidopsisのＡ９遺伝子の絨毯組織（tapetum）特異的プロモーターの制御下でキメラbarnase遺伝子を構成した。プラスミドpWP127およびpWP128は、1437 bpのＡ９プロモーター断片とCaMVポリアデニル化配列との間にクローン化されたbarster及び成熟barnaseをコードするＤＮＡ断片を含む。プロモーターおよびbarstarをコードする配列をこれらのプラスミドに含有させたのは、成熟barnaseは、barsterの不在下では大腸菌でのクローン化ができなかったからである。
上記したように、barnase ＤＮＡは、植物に雄性不稔性を誘導するために使用されてきた。しかし、barnaseの他の使用も記載されている。WO 92/21757は、特に、作動可能に連結した下記ＤＮＡ配列、
−植物の特定の根細胞、好ましくは固定栄養補給部位の細胞での外来ＤＮＡの転写をかなり選択的に指示する、線虫によって誘導されるプロモーター；および
−barnaseをコードする第一外来ＤＮＡ
を含む、線虫によって誘導されるキメラ遺伝子により形質転換した植物を記載している。該植物はまた、作動可能に連結した下記ＤＮＡ配列、
−第一外来ＤＮＡが、植物の特定の根細胞以外の細胞、好ましくは固定栄養補給部位の細胞以外の細胞で、好ましくはかなり選択的に発現される植物の細胞で第二の外来ＤＮＡの転写を指示することができる、線虫によって抑制されるプロモーターなどの第二のプロモーター；および
−barstarをコードする第二外来ＤＮＡ
を含む回復キメラ遺伝子も、好ましくは線虫によって誘導されるキメラ遺伝子と同じ遺伝子座に含む。
WO 93/19188は、特に、作動可能に連結した下記ＤＮＡ配列、
−真菌類による植物の感染部位を取り囲む、好ましくは直接取り囲む植物の細胞での外来ＤＮＡの転写をかなり選択的に指示するのに適した、真菌類反応性プロモーター；および
−barnaseをコードする第一外来ＤＮＡ
を含む、真菌類反応性キメラ遺伝子で形質転換した植物を記載している。該植物はまた、作動可能に連結した下記ＤＮＡ配列、
−該真菌類感染部位を取り囲む細胞以外の植物の細胞、好ましくは少なくとも該真菌類感染部位を直接取り囲む細胞以外の植物の細胞での第二外来ＤＮＡの転写を指示することができる構成プロモーター（例えば、35S）などの第二プロモーター；および
−barstarをコードする第二外来ＤＮＡ
を含む回復キメラ遺伝子も、好ましくは真菌類反応性キメラ遺伝子と同じ遺伝子座に含む。
外来ＤＮＡは、植物ゲノムに導入すると、植物ゲノムにランダムに組み込まれると考えられる。独立して形質転換した植物の試験により、導入された遺伝子の発現レベルにかなりの変動（100倍まで）があることが分かった。いくつかの研究により、「形質転換体間の変動性」と所与の遺伝子座での導入ＤＮＡのコピー数との間に相関関係はないことが分かった。トランスジェニック植物での導入遺伝子の発現における変動性のいくつかは、隣接する植物ゲノムＤＮＡの影響によって引き起こされる「位置効果」の結果であることが示唆された。発現の変動性の原因と考えられる他の因子は、植物原料の生理学的変動性、種々の形質転換体における独立したＴ−ＤＮＡ遺伝子座の数の相違またはある種のＴ−ＤＮＡ構造の遺伝子発現に対する阻害効果である。発現における形質転換体間の変動性は、トランスジェニック植物における導入遺伝子の大部分に対して認められている。独立したトランスジェニック植物での多くの導入遺伝子の発現における変動性は、多数のトランスジェニック植物をアッセイして遺伝子の発現を正確に定量することを必要とする。形質転換体間の変動性の量を減少させることができるかどうかが大いに重要である（Deanら、1988, NAR 16:9267-9283）。
発明の要旨
本発明は、下記を含む、外来ＤＮＡをその細胞の核ゲノムに有する植物に関する。
−植物の雄しべ細胞で産生または過産生すると、雄しべ細胞の代謝、機能および／または発達をかなり乱す、不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする雄性不稔性ＤＮＡ；および植物の特定の雄しべ細胞、特に葯細胞、とりわけ絨毯組織細胞において雄性不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指示する不稔性プロモーター（雄性不稔性ＤＮＡは、不稔性プロモーターと同じ転写単位にあり、該不稔性プロモーターの制御下にある。）を含む雄性不稔性遺伝子；ならびに
−不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドが産生される植物細胞で産生されると、不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドの活性を十分妨げることができる共調節ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする共調節ＤＮＡ、および好ましくは、
−非雄しべ細胞、好ましくは少なくとも非雄しべ細胞の大部分で該共調節ＤＮＡの発現を指示し、一方、特定の該雄しべ細胞では低レベル発現を指示し、好ましくは発現を指示しないプロモーター、または
−最少プロモーター要素、好ましくは植物細胞で正常に発現したプロモーターから成るプロモーター（特にそれによって該共調節ＤＮＡは該植物の核ゲノムのエンハンサー要素の制御下にある）を含む共調節遺伝子；該共調節ＤＮＡは、不稔性ＤＮＡの転写単位とは異なる転写単位にある。
本発明はまた、雄性不稔植物を得る方法も提供し、該方法は、
−植物細胞の核ゲノムを、植物の雄しべ細胞で産生または過産生すると、雄しべ細胞の代謝、機能および／または発達をかなり乱す、不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチド、好ましくはbarnaseまたはその変種をコードする雄性不稔性ＤＮＡ；および該植物の特定の雄しべ細胞、特に葯細胞、とりわけ絨毯組織細胞において雄性不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指示することができる不稔性プロモーター（雄性不稔性ＤＮＡは、不稔性プロモーターと同じ転写単位にあり、該不稔性プロモーターの制御下にある。）を含む雄性不稔性遺伝子を含む外来ＤＮＡで形質転換し；
−該外来ＤＮＡで形質転換した植物を該形質転換細胞から再生する
ことを含み、該方法は、該外来ＤＮＡに、不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドが産生される植物細胞で産生されると、不稔性ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチド、好ましくはbarstarの活性を十分妨げることができる共調節ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチド、好ましくはbarstarをコードする共調節ＤＮＡを含む共調節遺伝子を含めることを特徴とし、該共調節ＤＮＡは、好ましくは、非雄しべ細胞、好ましくは少なくとも非雄しべ細胞の大部分で該共調節ＤＮＡの発現を指示することができ、一方、特定の該雄しべ細胞では低レベル発現を指示し、好ましくは発現を指示しないプロモーター；および最少プロモーター要素、好ましくは植物細胞で正常に発現されるプロモーターから成るプロモーター（特にそれによって該共調節ＤＮＡは、該植物ゲノムでの外来ＤＮＡの組み込み後に該植物の核ゲノムにおいてエンハンサー要素の制御下におくことができる）などのプロモーターの制御下にあり、それによって、該共調節ＤＮＡは、該不稔性ＤＮＡの植物転写単位とは異なる植物転写単位にあり、ただし、該共調節ＤＮＡが植物細胞での発現を指示することができるプロモーターの制御下にない場合は、該共調節遺伝子は、植物ゲノムへの挿入の後、共調節ＤＮＡが該植物ゲノムにおいて該外来ＤＮＡを取り囲むＤＮＡに存在する植物プロモーター配列の制御下におかれ得るように、該外来ＤＮＡに位置する。
本発明はさらに、その核ゲノムの好ましくは同じ遺伝子座に該雄性不稔性遺伝子および該共調節遺伝子を含む植物を提供する。
発明の説明
雄性不稔植物は、雄性不稔性遺伝子を含む外来雄性不稔性遺伝子型などの雄性不稔性遺伝子型の発現により雄性不稔である植物種の植物である。回復植物は、そのゲノム内に、雄性稔性を、雄性不稔性遺伝子型を含む雄性不稔植物系統に回復させることができる少なくとも１つの稔性−回復遺伝子を含む（すなわち、子孫が雄性不稔植物と回復植物との交雑から得られ、雄性稔性遺伝子型および稔性−回復遺伝子の両方を含む）、同じ植物種の植物である。回復植物は、雄性不稔であり、そのゲノム内に雄性不稔性遺伝子型および稔性−回復遺伝子を含む、同じ種の植物である。
系統は、所与の個々の植物の子孫である。
本明細書で使用する遺伝子は、一般に、タンパク質またはポリペプチドに翻訳可能であってもなくてもよく、ＤＮＡ領域の転写を制御する調節配列に作動可能に連結した、ＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡ領域を含むと理解される。該調節配列は、プロモーター領域、エンハンサー配列および３’調節配列を含む。構造遺伝子は、その産物が例えば酵素、構造タンパク質、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡである遺伝子である。調節遺伝子は、１個以上の構造または他の調節遺伝子の発現（例えば、転写）を調節するタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明の目的に対して、キメラ遺伝子などの遺伝子（または、ＲＮＡをコードする遺伝子のＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡをコードする遺伝子のＤＮＡ領域が、プロモーターおよびその遺伝子の他の調節配列の制御下で、生物学的に活性である、すなわち、別のＲＮＡと相互作用できるか、生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に翻訳可能であるＲＮＡに転写されることを意味する。
外来（例えば、キメラ）遺伝子を含むほとんどの真核遺伝子の発現は、最少プロモーター要素と調節タンパク質に結合する１個以上のエンハンサー要素との組み合わせによって調節される。プロモーターがＤＮＡの発現を指示する場合、それは活性である。所与の条件下、プロモーターによって産生するＲＮＡの量によって、発現が低レベルであるか高レベルであるか（あるいは、プロモーターの活性が低いか高いか）を言うことができる。本発明に関して、雄性不稔性遺伝子の発現が「高」レベルであることは、特定の雄しべ細胞での、稔性の雄性配偶子の産生が妨げられる発現レベルとして解釈される。
本明細書で使用する最少プロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を開始する能力を有するＤＮＡを意味する。所与の遺伝子に対して、最少プロモーターは、転写開始部位から上流に約30〜40塩基対、最大で100塩基対であり、一般に、TATAボックスを含む。エンハンサー要素は、一般に最少プロモーターのさらに上流にある調節要素であり、それに連結した最少プロモーターからの転写を活性化（または阻害）し、合成は、通常の開始部位で始まる。エンハンサーは、転写因子と結合することができ、通常は、両方の方向に作動可能であり、プロモーターから1000塩基対より多く移動しても、また上流からでも下流の位置からでも機能し得る。
本明細書で使用するプロモーターは、１個以上のエンハンサー要素と結合した最少プロモーターを含む。実際の目的に対しては、本明細書で使用するプロモーターおよび最少プロモーターは、転写されるＤＮＡの一部（例えば、ｍＲＮＡの未翻訳リーダー）を含むこともできる。
転写単位は、プロモーターから連続ＲＮＡに転写されるＤＮＡセグメントを意味する。本発明の目的に対して、転写単位は、プロモーターを含む。
植物の特定の細胞または組織（例えば、絨毯組織細胞などの雄しべ細胞）において選択的に発現を指示するプロモーターは、エンハンサー要素が、植物での特定の細胞もしくは組織および／またはこれらの特定の細胞もしくは組織の発達の特定の段階への転写を制限する、すなわち、特定の発達段階での特定の細胞もしくは組織における転写を高め、他の全ての細胞もしくは組織または他の発達段階での転写を阻害するように作用するプロモーターである。実際の全ての目的に対しては、そのような選択的プロモーターは、活性および効果において特異的である。通常、そのような選択的プロモーターは、種々の組織からｍＲＮＡライブラリーを分別スクリーニングすることにより同定される（Sambrookら、1989,″Molecular Cloning: a Laboratory Manual″, Cold Spring Harbor Laboratory, and Ausubelら、1994,″Current Protocols in Molecular Biology″, John Wiley & Sons）。一般に、植物の全ての組織および全ての細胞をスクリーニングすることは不可能であるが、こうして得られるプロモーターは、同じおよび／または異なる植物種のトランスジェニック植物の同じ組織において異種ＤＮＡの発現を選択的に指示するのに有用であることが分かった。
本明細書で使用する雄しべ細胞は、花の雄性生殖器官の少なくとも一部の細胞を意味し、発達の種々の段階では、花糸、葯、絨毯組織、葯細胞壁、花粉などである。雄しべ特異的プロモーターは、雄しべの１つ以上の発達段階で、雄しべ細胞（好ましくは、少なくとも絨毯組織細胞を含む）での（例えば、barnase ＤＮＡの）発現を選択的に指示して、稔性花粉の産生を妨げることができるプロモーターである。なお、花粉に特異的なプロモーター、すなわち小胞子および／または花粉（すなわち、減数分裂後）での発現を排他的に指示するプロモーターを含む雄性不稔性遺伝子は、barnase ＤＮＡに作動可能に連結すると、ある植物の核ゲノムにホモ接合形で存在する場合、その植物にのみ雄性不稔性を誘導することができる。
本明細書で使用する非雄しべ細胞は、雄しべ細胞（特に絨毯組織細胞）、特に、不稔性プロモーターがbarnase ＤＮＡの発現を指示することができる雄しべ細胞を除く植物の全細胞を意味する。
表現型は、ある遺伝子型、すなわちある遺伝子または遺伝子セットの発現（または発現の欠如）の外観（例えば、雄性不稔性、特定の植物組織におけるタンパク質またはＲＮＡの有無など）である。
本明細書で使用する遺伝子座は、植物の核ゲノム、すなわち特定の染色体におけるその位置に関して定義されるＤＮＡ（例えば、１個以上の遺伝子）である。２個の遺伝子座は、異なる染色体上にあってもよく、独立して分離する。２個の遺伝子座は、同じ染色体上にあってもよく、その場合は、一般に連結していると考えられる（それらの間で十分な組換えが生じ得ないならば）。内在遺伝子座は、植物種に天然に存在する遺伝子座である。外来遺伝子座は、例えば遺伝子形質転換による外来ＤＮＡの導入のために植物に形成される遺伝子座である。２個以上の遺伝子を含む外来ＤＮＡが植物ゲノムに導入されると、その植物ゲノムに、２個以上の遺伝子を含む１個の外来遺伝子座が創出されるとみなされる（２個以上の密接に連結した遺伝子座が創出されるとも言うことができる。）。
二倍体植物では、他の二倍体生物と同様に、遺伝子の２個のコピーが常染色体遺伝子座に存在する。遺伝子は、対立遺伝子と呼ばれるいくつかの異なる状態で核ゲノムに存在し得る。２個の同じ対立遺伝子が一つの遺伝子座に存在する場合、その遺伝子座はホモ接合であると呼ばれ、異なる対立遺伝子が存在する場合、その遺伝子座は、ヘテロ接合であると呼ばれる。ある遺伝子座または一組の遺伝子座の対立遺伝子組成物が、その遺伝子型である。一つの遺伝子座における対立遺伝子は、一般に、別々のシンボルで表される（例えば、Ｍとｍ、Ｓと−、−は遺伝子がないことを表す。）。外来遺伝子座は、一般に、外来ＤＮＡの存在および／または不在を特徴とする。優性対立遺伝子は、一般に、大文字で表され、通常は、生物学的に活性な遺伝子産物（例えば、タンパク質）および認め得る表現型の効果の存在と関連する。
植物は、遺伝学的には、少なくとも１つの遺伝子座の対立遺伝子状態を確認することによって解析することができる。
所与の遺伝子座の遺伝子型は、その遺伝子座に存在する２個の対立遺伝子に対するシンボル（例えば、Ｍ／ｍまたはｍ／ｍまたはＳ／−）によって指定することができる。連結していない２個の遺伝子座の遺伝子型は、各遺伝子座の遺伝子型の配列として表すことができる（例えば、Ｓ／Ｓ、Ｒ／−）。
外来雄性不稔性遺伝子座は、雄性不稔性に寄与する対立遺伝子が、植物の細胞で発現させたときに、植物の成長および発達に実質的に影響を及ぼすことなく、植物を雄性不稔にする雄性不稔性遺伝子を含む外来ＤＮＡ配列Ｓであるものである。
雄性不稔性遺伝子座はまた、好ましくは、同じ遺伝子座に少なくとも１つのマーカー遺伝子Ｔを含み、それは少なくとも、
ｔ１）少なくとも植物の特定の組織または特定の細胞に存在する場合、その植物を、少なくともその特定の組織または特定の細胞にあるマーカーＤＮＡによってコードされるマーカーＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドを含まない他の植物から容易に分離可能にするマーカーＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードするマーカーＤＮＡ；および
ｔ２）少なくともその特定の組織または特定の細胞にあるマーカーＤＮＡの発現を指示することかできるマーカープロモーター（マーカーＤＮＡは、そのマーカープロモーターと同じ転写単位において、そのマーカープロモーターの制御下にある。）を含む。
そのような雄性不稔性遺伝子は、そのような外来雄性不稔性遺伝子座ではいつも優性対立遺伝子である。劣性対立遺伝子は、植物の核ゲノムに雄性不稔性遺伝子が存在しないことに対応する。
本発明の雄性不稔性遺伝子において使用できる雄性不稔性ＤＮＡおよび不稔性プロモーターは、以前に記載されている（EP 0,344,029およびEP 0,412,911）。本発明の目的に対して、植物細胞における雄性不稔性遺伝子の発現は、例えば、同じ植物細胞での適切な稔性回復遺伝子の発現によって阻害され、または抑制され得るはずである。これに関して、有用な特定の雄性不稔性ＤＮＡは、barnaseをコードする（Hartley, J. Mol. Biol. 1988, 202:913）。不稔性プロモーターは、どんなプロモーターであってもよいが、少なくとも、雄しべ細胞、特に絨毯組織細胞では活性であるべきである。特に有用な不稔性プロモーターは、タバコ、アブラナおよび他のアブラナ種、チコリ、トウモロコシ、イネ、コムギおよび他の植物種で使用できる、Nicotiana tabacumのＴＡ２９遺伝子の絨毯組織−特異的なプロモーター（EP 0,344,029）；イネ、トウモロコシ、コムギおよび他の植物種で使用できるイネ由来のPT72、PT42およびPE1プロモーター（WO 92/13956）；トウモロコシ、イネ、コムギおよび他の植物種で使用できるトウモロコシ由来のPCA55プロモーター（WO 92/13957）；ならびにArabidopsis thalianaの絨毯組織−特異的遺伝子のA9プロモーター（Paulら、1992, Plant Mol. Biol. 19:611-922）などの雄しべ細胞で選択的に活性なプロモーターである。
barnase ＤＮＡなどの適切な不稔性ＤＮＡに作動可能に連結したPTA29などの雄しべ特異的プロモーターは、種々の植物種に使用して、雄性不稔性を誘導することができることが分かっている。実際、植物をそのような雄性不稔性遺伝子で形質転換すると、耕種学的に価値の高い雄性不稔系統が多くの植物種で得られている。実際の全ての目的に対して、雄しべ特異的プロモーターは、明らかに、その空間的・時間的特異性をかなり保持している。しかし、個々の全ての形質転換植物が、良好な耕種学的性能を有する系統に発達し得るわけではない。実際、いくつかの植物は、ソマクローナル変異および／または「位置効果」によると考えられる望ましくない表現型効果を示す。この変異の少なくとも一部は、トランスジェニック植物において組み込まれた雄性不稔性遺伝子を取り囲む植物ゲノムの天然（すなわち、内在性）エンハンサー要素の調節効果によると考えられる。そのようなエンハンサー配列および、その結果としての雄性不稔性遺伝子の発現に対するその効果は、雄性不稔性遺伝子の組み込みの位置に応じて異なる。この結果、いくつかの形質転換体では、雄しべ細胞以外の組織、例えば組織培養中の細胞または植物もしくは種子の体細胞での不稔性ＤＮＡ（例えば、barnase ＤＮＡ）の発現は低レベル（しばしば、検出すらできない）となり得る。
これに関して、本発明は、いくつかの環境下では、barnase ＤＮＡを含む遺伝子などの雄性不稔性遺伝子とともに導入したbarstar遺伝子などのキメラ遺伝子が、雄性不稔性遺伝子およびその結果としての表現型の発現における形質転換体間の変動性を低下させ、良好な耕種学的性能を有する形質転換体の頻度を増加させ得るという観察に基づいている。従って、本発明の目的に対しては、不稔性ＤＮＡがbarnase ＤＮＡであり、一方、共調節ＤＮＡがbarstarＤＮＡであるのが好ましい。
本発明の目的に対して、barnase ＤＮＡは、Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202:913-915に記載のアミノ酸配列を有するBacillus amyloliquefaciensのリボヌクレアーゼ（barnase s.s.）、またはリボヌクレアーゼ活性を有し、barstarによって不活性化され得るその変異体をコードするＤＮＡを意味する。これに関して、barnase s.s.の該変異体の一つは、barnase s.s.とアミノ酸レベルが84％同一であるリボヌクレアーゼ（binase）をコードするBacillus intermediusのＤＮＡによってコードされていることが分かった（Schulgaら、1992, NAR 20:2375; Guilletら、1993, Structure 1:165-177も参照）。好ましくは、そのbarnase変異体は、標準条件下での測定で、barnase s.s.の活性の少なくとも10％、特に少なくとも50％を保持する（FitzgeraldおよびHartley, 1993, Anal. Biochem. 214:544-547；Hartleyら、1993, Biochemistry 32:5978-5984）。
本発明の目的に対して、barstar ＤＮＡは、Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202:913-915に記載のBacillus amyloliquefaciensのbarnaseリボヌクレアーゼ（barnase s.s.）の阻害剤またはbarnase s.s.を阻害することができるその変異体をコードするＤＮＡを意味する。これに関しては、そのような変異体の一つが、binstarをコードするＤＮＡ Bacillus intermediusによってコードされることが分かっている（Guilletら、1993, Structure 1:165-177）。好ましくは、barstar変異体が、標準的条件でのbarstar変異体とbarnaseとの当モル混合物において、barnase活性の少なくとも90％、特に少なくとも50％を阻害することができる（Hartleyら、1993, Biochemistry 32:5978-5984）。
しかし、本発明では、いかなるリボヌクレアーゼをコードするＤＮＡも、そのリボヌクレアーゼのタンパク質阻害剤をコードするＤＮＡを得ることができるならば、不稔性ＤＮＡとして使用することができる。そのようなＲＮＡsesおよび対応する阻害剤の例は、例えばGuillerら、1993, Structure 1:165-177に挙げられている。そのようなリボヌクレアーゼの別の例は、Streptomyces aureofaciensのＲＮＡse  Ｓaまたはsarnaseである（Shlyapnikovら、1986, FEBS Letters 209:335-339; Homerovaら、1992, Gene 119:147-148）。ＲＮＡse  Ｓaの阻害剤は公知である（Muchaら、1983, Biologia 38:1177-1184）。
もちろん、ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする不稔性ＤＮＡおよび共調節ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードするその対応する共調節ＤＮＡで、その不稔性ＤＮＡと同じ植物細胞で発現した場合に、その不稔性ＤＮＡの発現または不稔性ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチドの活性を妨げることができるものは、使用することができる。これに関して、EP 0,412,911に稔性回復ＤＮＡとして記載されているＤＮＡは、やはりEP 0,412,911に記載されている対応の不稔性ＤＮＡと組み合わせて、本発明の共調節ＤＮＡとして使用することができる。
本発明の共調節遺伝子におけるプロモーター（「共調節プロモーター」）は、好ましくは、植物の種々の細胞および組織、好ましくは全ての細胞および組織において、共調節ＤＮＡ（例えば、barstar ＤＮＡ）の発現を推進して、雄性不稔性遺伝子（例えば、barnase ＤＮＡを含む）の可能な低レベル発現の望ましくない効果を消すことができる。これに関して、そのプロモーターはまた、不稔性プロモーターがbarnaseの発現を推進し、稔性雄性配偶子の産生を妨げるbarnaseの生物学的活性によって死滅させられる雄しべ細胞での発現も推進することができる。もちろん、そのような雄しべ細胞では、不稔性プロモーターおよび共調節プロモーターの活性は、例えば、該雄しべ細胞で産生するbarnaseの量が、少なくとも雄しべの発達期間中に産生するbarstarの量よりも高くなるようにすべきである。これに関して、共調節プロモーターは、不稔性プロモーターと同じ雄しべ細胞では活性でないのが好ましい。しかし、不稔性プロモーターがbarnaseＤＮＡの発現を推進する雄しべ細胞（例えば、絨毯組織）の外側では、共調節プロモーターは、どんなレベルで活性であってもよい。共調節プロモーターが不稔性プロモーターと同じ雄しべ細胞で活性であるならば（しかし、その結果、その雄しべ細胞では十分なbarnaseがなおも産生され、植物を雄性不稔にする）、稔性−回復遺伝子を含む（例えば、雄しべ特異的プロモーターの制御下にあるbarstarＤＮＡを含む）回復植物と交雑した後のこれらの雄性不稔性植物の子孫における雄性稔性の回復は、一般に、雄しべ細胞でのbarnaseの量が共調節遺伝子の発現によりすでに減少しているという事実により、より容易であるという利点をさらに有することができる。
好ましくは、共調節プロモーターは、植物細胞で作動可能なプロモーターであり、そのような多くのプロモーターを本発明で使用することができる（例えば、図１Ａ参照）。好ましい態様では、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（「P35S」）を使用する。これは、一般に構成プロモーターとして知られているが、葯細胞、特に絨毯組織細胞での活性は比較的小さいように見えるプロモーターファミリーである。驚いたことに、P35Sの活性は絨毯組織細胞では十分低く、絨毯組織特異的プロモーターを含む雄性−不稔性遺伝子とともに使用することができることが分かった。さらに驚いたことに、P35Sの共調節プロモーターとしての使用は、特にPT72およびpE1を不稔性プロモーターとして使用する場合はイネで、また特にPCA55またはPTA29を不稔性プロモーターとして使用する場合はトウモロコシで特に有効であることが分かった。
適するP35Sプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（「CaMV」）単離物CM1841（Gardnerら（1981）Nucl. Acids．Res. 9:2871）およびCabbB-S（Franckら（1980）Cell, 21:285）から得ることができ（「35S2プロモーター」または「P35S２」）、あるいはCaMV単離物CabbB-J1（HullおよびHowell（1978）Virology 86:482）から得ることができる（「35S3プロモーター」または「P35S3」）。P35S3は、P35S2と、その配列（P35S3の配列は、欧州特許公開（EP）359617に開示されている。）およびトランスジェニック植物での活性がより大きい（Harpsterら（1988）Mol. Gen. Genet. 212:182）点で異なる。
もちろん、他の公知の構成プロモーターを共調節プロモーターとして使用してもよい。例えば、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（「Pnos」）は、植物における低レベルの発現を構成的方法で推進することが知られている。Pnosは、Brassica種、例えばBrassica napusなどの双子葉植物での共調節プロモーターとして特に有効であると考えられる。
共調節プロモーターとして使用することができる他の適する構成プロモーターは、TR1′およびTR2′プロモーター（各々、「PTR1」および「PTR2」）であり、それらは、各々、AgrobacteriumのＴ−ＤＮＡの1′および2′遺伝子の発現を推進し（Veltenら（1984）EMBO J. 3:2723）、未誘導状態での活性がごく弱い創傷−誘導プロモーターである。
適する器官特異的、組織特異的および／または誘導外来プロモーター、例えば、光合成組織で主に活性である光誘導プロモーターであるArabidopsis thalianaの１，５−リプロース二リン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット遺伝子（１Ａ遺伝子など）のプロモーター（「ｓｓｕ」プロモーター）（Krebbersら（1988）Plant Mol. Biol. 11:745）；ならびに、例えばArabidopsis thalianaの種子特異的プロモーター（Krebbersら（1988）Plant Physiol. 87:859）およびクニッツ型トリプシンインヒビター遺伝子のプロモーター（JofukuおよびGoldberg, 1989, The Plant Cell 1:1079-1093）なども、共調節プロモーターとして使用することができる。
本発明の別の好ましい態様では（例えば、図１Ｂ参照）、共調節プロモーターが、構成プロモーター（P35S、Pnos）、組織特異的プロモーター（PTA29、PCA55、PT72、PE1、PT42）または誘導プロモーター（例えば、PTR1、PTR2、Pssu）などの、植物細胞で発現され得るプロモーターから誘導することができる最少プロモーター要素を含む。
そのような最少プロモーター要素は、転写開始部位の上流約30〜50塩基対、多くて約100塩基対を含む配列であり、TATAボックスを含む。そのような最少プロモーター要素は、本発明の共調節遺伝子において使用すると、非雄しべ細胞でのbarstarＤＮＡの低レベルの転写を指示することができる。さらに、導入遺伝子発現における位置効果は、ここでは、好ましい効果として使用できる。実際、外来ＤＮＡ（または導入遺伝子）に隣接する植物ゲノムＤＮＡは、種々の植物細胞でのbarstarＤＮＡの転写を高めるために最少プロモーターを調節することができる、エンハンサー配列などの別の配列を含むことができる。これに関しては、共調節遺伝子を、特に上流の配列が最少プロモーターに対して最適の位置になるように、形質転換ＤＮＡに付与するのが好ましい。これに関して、共調節遺伝子は、外来ＤＮＡ（例えば、Ｔ−ＤＮＡ）の最先端に存在するのが好ましい。
共調節遺伝子は、たとえ植物細胞で転写されるために必要な配列に欠けていてもよい。例えば、共調節遺伝子は、共調節ＤＮＡを含むだけでもよく、または、植物細胞での共調節ＤＮＡの発現を指示することができない上流配列とともに共調節ＤＮＡを含んでいてもよい。すなわち、共調節遺伝子は、適切なプロモーターに欠けていてもよく、または、細菌プロモーターを含んでいてもよい（例えば、B. amyloliquefaciensのbarstar遺伝子の天然のプロモーターまたはtacプロモーター）（例えば、図１Ｃ参照）。しかし、この場合、共調節遺伝子は、植物の形質転換に使用する外来ＤＮＡ（例えば、Ｔ−ＤＮＡ）の最先端に存在し、共調節ＤＮＡの翻訳開始コドンが外来ＤＮＡの両端の一方に最も近くなるような方向にするのが好ましい。実際、この方向は、共調節遺伝子が、植物ゲノムに挿入した場合、適切なプロモーター（例えば、最少プロモーター）および／または隣接する植物ゲノムＤＮＡのエンハンサー配列の制御下におかれて（すなわち、「捕獲されて」）、barstar ＤＮＡなどの共調節ＤＮＡの構成的発現を多かれ少なかれ可能にする確率を増加させると考えられる。植物プロモーターおよび／またはエンハンサー配列は、barstar ＤＮＡに関して適切な位置におかれそうにないので、barstar ＤＮＡの発現レベルは、多くのケースで所望されるように、非常に低いと予想される。
雄性不稔性遺伝子および共調節遺伝子は、好ましくは、１個の形質転換ＤＮＡとして植物ゲノムに挿入される。従って、どちらの遺伝子も、好ましくは、同じベクター上に存在し、または同じＴ−ＤＮＡの一部であるべきである。
しかし、両方の遺伝子が、どちらも形質転換に使用される別々のＤＮＡ上に存在してもよい。そのような「共形質転換」では、両方のＤＮＡが恐らく植物ゲノムの同じ遺伝子座に組み込まれるということが分かっているが、もちろん、両方の遺伝子が、植物ゲノムの異なる遺伝子座に組み込まれる可能性はある。これに関して、植物細胞の核ゲノムの形質転換に使用される外来ＤＮＡは、１個のＤＮＡ分子である必要はなく、多ＤＮＡ分子であってもよい。しかし、本発明の目的に対しては、雄性不稔性遺伝子および共調節遺伝子が植物核ゲノムの同じ遺伝子座に組み込まれるのが好ましい。
しかし、共調節遺伝子が、組織培養での雄性不稔性遺伝子の低レベル発現の妨害に有用である場合は、それは、成熟植物およびその子孫に存在する必要はない。植物を共形質転換によって形質転換する場合、ならびに、雄性不稔性遺伝子および共調節遺伝子が植物ゲノムの異なる位置に組み込まれる場合は、両方の遺伝子が子孫で分離し、その結果、共調節遺伝子は、形質転換植物系統から取り除かれる可能性がある。
本発明の雄性不稔植物は、雄性稔性親植物、特に、適切な稔性回復遺伝子を含む雄性稔性回復植物と交雑させることができる（例えば、EP 0,412,911参照）。
本発明で使用されるマーカー遺伝子に使用することができるマーカーＤＮＡおよびマーカープロモーターも周知である（EP 0,344,029；EP 0,412,911）。
また、雄性不稔性遺伝子、稔性回復遺伝子、共調節遺伝子またはマーカー遺伝子などの外来ＤＮＡは、好ましくは、適する３’転写調節配列およびポリアデニル化シグナルとともに、それらのコード配列、すなわち、各々、稔性回復ＤＮＡ、雄性不稔性ＤＮＡ、共調節ＤＮＡまたはマーカーＤＮＡの下流（すなわち、３’）に付与される。これに関しては、外来または内在性転写３’端生成およびキメラ遺伝子の発現を得るのに適したポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、Agrobacterium tumefaciens Ｔｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の遺伝子７（VeltenおよびSchell（1985）Nucl. Acids Res. 13:6998）、オクトピンシンターゼ遺伝子（De Greveら、1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:499; Gielenら（1983）EMBO J. 3:835；Ingelbrechtら、1989, The Plant Cell 1:671）およびノパリンシンターゼ遺伝子（De Pickerら、1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561）、またはカルコンシンターゼ遺伝子（SommerおよびSaedler, 1986, Mol. Gen. Genet. 202:429-434）、またはCaMV 19S/35S転写単位（Mogenら、1990, The Plant Cell 2:1261-1272）などの、遺伝子の外来３’非翻訳端を使用することができる。
本発明に係る稔性回復遺伝子、雄性不稔性遺伝子、共調節遺伝子またはマーカー遺伝子は、一般に外来ＤＮＡ、好ましくは外来キメラＤＮＡである。これに関して、該ＤＮＡに関する「外来」および「キメラ」は、EP 0,344,029およびEP 0,412,911に記載の意味と同じである。
植物、特に、ほとんどの双子葉植物（例えば、Brassica napus）およびいくつかの単子葉植物などのAgrobacteriumに感染し得る植物の細胞は、雄性不稔性遺伝子および／または共調節遺伝子（好ましくは、両方）を含み、Agrobacteriumによって運ばれる、ディスアームドＴｉ−プラスミドであるベクターを使用して形質転換することができる。この形質転換は、例えば、EP 0,116,718およびEP 0,270,822に記載の方法を使用して行うことができる。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、Ｔｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡのボーダー配列の間に外来ＤＮＡを含み、または、少なくとも右のボーダー配列の左に位置する。もちろん、他の型のベクターを使用し、直接遺伝子移動（例えばEP 0,233,247に記載）、花粉媒介形質転換（例えばEP 0,270,356、PCT特許公開WO 85/01856およびUSP 4,684,611に記載）、植物ＲＮＡウイルス−媒介形質転換（例えばEP 0,067,553およびUSP 4,407,956に記載）およびリポゾーム−媒介形質転換（例えばUSP 4,536,475に記載）などの方法を使用して、植物細胞を形質転換することもできる。トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギおよびライムギなどの主な穀物などの単子葉植物の細胞は、WO 92/09696に記載されているように、コンパクト胚形成カルス（トウモロコシにおける未熟な胚など）を形成することができる傷害または酵素−分解無傷組織、またはそれから得られる胚形成カルス（トウモロコシにおけるＩ型カルスなど）を使用して形質転換（例えば、電気穿孔法によって）することができる。形質転換される植物がトウモロコシである場合は、最近開発された他の方法、例えば、ある系統のトウモロコシに対してFrommら、1990, Bio/Technology 8:833; Gordon-Kammら、1990, Bio/Technology 2:603およびGouldら、1991, Plant Physiol. 95:426に記載された方法などを使用することもできる。形質転換される植物がイネである場合は、最近開発された方法、例えば、ある系統のイネに対してShimamotoら、1989, Nature 338:274; Dattaら、1990, Bio/Technology 8:736; およびHayashimotoら、1990, Plant Physiol. 93:857に記載された方法などを使用することもできる。
形質転換された細胞は、再生して成熟植物にすることができ、得られた形質転換植物は、通常の育種計画で使用して、同じ特徴を有するより多くの形質転換植物を作り、または他の種々の同じ関連植物種において、雄性不稔性遺伝子、共調節遺伝子（または両方）を導入することができる。形質転換植物から得られた種子は、安定したゲノム挿入物として本発明のキメラ遺伝子を含む。すなわち、本発明の雄性−不稔性遺伝子および／または共調節遺伝子は、特定の系統の植物種に導入した場合はいつも、戻し交雑によって他の系統に導入することができる。
すなわち、本発明は、雄性不稔植物を得る方法を提供し、その結果、耕種性能が良好な雄性稔植物を形質転換から得る頻度が増加する。これは、共調節遺伝子が非雄しべ細胞で発現されるからである。これに関して、共調節遺伝子の存在は、次のような多くの現象を妨げると考えられる。
−正常な植物の発達の前の再生を含む、組織培養におけるいくつかの形質転換植物細胞での雄性不稔性遺伝子の低レベル発現。実際、そのような組織培養細胞は、植物または種子において分化した細胞とは異なる生理機能、代謝および遺伝子調節パターンを有する。不稔性プロモーターは、一般に、植物または種子の天然の活性に基づいて選択されるので、組織培養細胞においてプロモーターを活性化するために、位置効果は恐らく、より著しいと予想される。遺伝子直接導入を使用する場合は、上記以外の現象が生じる可能性がある。実際、そのような形質転換法では、大量のＤＮＡが受容細胞に運ばれる。遺伝子の抑制が活性プロセスであり、例えばＤＮＡのメチル化またはリプレッサータンパク質の結合を必要とする場合は、抑制機構の時間的負担が大きくなり、運ばれたＤＮＡは、短時間で発現され得る。すなわち、共調節遺伝子は、全体的な形質転換効率を増加させ得ることが分かる；
−第一形質転換体および／または特にそれから得られる子孫植物の特定の非雄しべ細胞における不稔性ＤＮＡ（例えば、barnase ＤＮＡ）の低レベル発現。そのような低レベル発現は、その多くはあまり知られていないいくつかの因子によると考えられる；
−形質転換で使用されるベクターにおける要素による雄しべ特異的プロモーターの活性化；
−上記で概説した位置効果。そのような効果は、恐らく、イネなどの、ゲノムが小さく、反復ＤＮＡがほとんどない植物ではより顕著であると考えられる；
−導入遺伝子の別のコピーにおける再編成。これは、多分、形質転換ＤＮＡの多コピーが植物ゲノムの同じ遺伝子座にしばしば組み込まれる遺伝子直接導入による形質転換で生じ、それらのコピーのいくつかは続いて再編成される。そのような再編成中、barnase ＤＮＡを含むＤＮＡは、形質転換ＤＮＡに存在するプロモーター（例えば、P35Sプロモーター）の制御下に、または隣接する植物ゲノムＤＮＡ中にうっかりおかれる可能性がある。
理由が何であれ、本発明の共調節遺伝子を対応する雄性不稔性遺伝子と組み合わせて植物の形質転換で使用すると、一般に、農芸的性能が良好な雄性不稔トランスジェニック植物が高い頻度で生じる。
また、本発明の共調節遺伝子が、完全に雄しべ特異的というわけではなく、雄しべの外側の他のいくつかの組織（例えば、種子）での発現を指示することも知られているプロモーターの制御下にある雄性不稔性ＤＮＡを含む偽雄性不稔性遺伝子との組み合わせにおいても有用であることが理解される。これに関して、共調節プロモーターは、これらの他のいくつかの組織において、偽雄性不稔性遺伝子の発現を阻止するのに十分なレベルでは活性であるが、偽雄性不稔性遺伝子の雄しべ細胞（例えば、絨毯組織、葯−表皮細胞）での発現は妨げないプロモーターであるべきである。これに関して、偽雄性不稔性遺伝子および共調節遺伝子は共に、真の雄しべ特異的プロモーターを含む雄性稔性遺伝子と等価である。
すでに示したように、本発明は、耕種性能が良好な雄性不稔植物をより多く発生させることができる。そのような植物では、雄性不稔性遺伝子は一般に安定である。すなわち、遺伝子は継承され、その遺伝子を含む植物は全て、雄性不稔性であるはずである。にもかかわらず、その遺伝子を含む種子全てが必ずしも生きている（すなわち、成長して正常な成熟植物になる）必要はない。一般には、各雄性不稔植物から、雄性不稔性遺伝子を継承した生きた種子を得ることができれば十分である。
好ましくは、雄性不稔性遺伝子の性能（すなわち、表現型の発現）が、遺伝的背景に依存せず、遺伝子が戻し交雑により他の系統に容易に導入され得るべきである。
また、一般に、雄性不稔性の遺伝子型は、環境的に安定であり、表現型は、植物が成長する場所および期間に生じ得る種々の環境条件と無関係である必要がある。そのような環境的安定性は、通常は、雄性不稔植物による実地試験を異なる３〜４ヵ所で行うことにより示される。
また、一般に、雄性不稔性の遺伝子型は、耕種学的に重要な特徴および植物の発達に対してあまり悪影響を及ぼさないのが望ましい。にもかかわらず、これは、雄性不稔親植物の性能だけでなく、その親系統から得られた雑種の性能にも依存する。実際、これらの悪影響は、いくつかの環境では、雑種におけるかなりの利点によって補償することができる。
最後に、稔性の回復を必要とする植物種では、雄性不稔系統の保持または雑種種子生産のいずれかにおいて、雄性不稔性遺伝子型が、少なくとも１個の稔性回復遺伝子によって回復可能であるべきである。
特に断らない限り、組換えＤＮＡを操作する全ての実験手順は、Sambrookら、1989,″Molecular Cloning: a Laboratory Manual″, Cold Spring Harbor Laboratory,及びAusubelら、1994,″Current Protocols in Molecular Biology″, John Wiley & Sons, Vols 1 and 2に記載の標準的手順により行った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＤＮＡ断片のクローン化および／または増幅を行った。重複伸長によるＰＣＲを使用して、キメラ遺伝子を構成した（Hortonら、1989, Gene 77:61-68; Hoら、1989, Gene 77:51-59）。ＰＣＲ反応は全て、Thermococcus litoralis（Neunerら、1990, Arch. Microbiol. 153:205-207）から単離したVentTMポリメラーゼ（カタログNo. 254L−Biolabs New England, Beverley, MA 01915，USA）を使用して、通常の条件下で行った。オリゴヌクレオチドは、例えばKramerおよびFritz（1987, Methods in Enzymlogy 154:350）が概説している公知規則に従って設計し、Applied Biosystems 380A ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems B.V.，Maarssen, Netherlands）で、ホスホラミジト法（BeaucageおよびCaruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22:1859）により合成した。
説明および下記実験では、下記の図面および配列表を参照する。
図面
図１：本発明の外来ＤＮＡの３例を図式的に表したものである。
Pster:  不稔性プロモーター
barnase:  barnaseをコードする領域（不稔性ＤＮＡの例として）
3′end:  遺伝子の3′未翻訳領域（例えば、3′nos、3′g7）
Pcoreq: 共調節プロモーター（例えば、P35S、Pnos）
barstar:  barstarをコードする領域（共調節ＤＮＡの例として）
Pmin: 最少植物プロモーター
配列表
配列番号１：pTS174
配列番号２：pTS88 HindIII-EcoRI
配列番号３：pVE136-EcoRl-HindIII
配列番号４：pTCO113のＴ−ＤＮＡ
実施例
実施例１：イネにおける共調節遺伝子
イネの栽培変種植物Kochihibikiからコンパクト胚形成カルスを得て、カルス細胞の電気穿孔法による形質転換を、WO 92/096096の特に実施例９に記載の方法を使用して行ったが、形質転換ＤＮＡは、プラスミドpTS174または等量もしくはより好ましくは1:3のモル比のプラスミドpTS174およびpTS88で構成した。形質転換を行う前に、pTS174およびpTS88は、好ましくは、適切な制限酵素を使用した消化により線状化した。組織培養工程も全て、WO 92/096096、実施例９の記載に従って行った。
pTS174は、pUC19由来のプラスミドであり、そのポリリンカーに、PE1プロモーターの制御下にあるbarnaseＤＮＡ（PE1-barnase-3′nos）および35Sプロモーターの制御下にあるbar遺伝子（P35S-bar-3′g7）を含む。pTS174の配列を配列番号１に示す。pTS88は、pGEM2由来のプラスミドであり、そのポリリンカーのHindIIIおよびEcoRI部位の間に、35Sプロモーターの制御下にあるbarstarＤＮＡ（P35S-barstar-3′g7）を含む。pTS88のHindIII-EcoRI断片の配列を配列番号２に示す。barstar、barnaseまたはbarを含む全てのキメラ遺伝子は、適切な3′未翻訳領域（例えば、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子（3′nos）および遺伝子７（3′g7））も含んでいた。
イネの雄しべ特異的プロモーターの制御下にあるbarstarＤＮＡ（PE1-barstar）を含む稔性回復遺伝子および35Sプロモーター制御下にあるbar遺伝子（P35S-bar）を含む除草剤耐性遺伝子のキメラ遺伝子を含むプラスミドを対照として使用した。
形質転換の実験結果を表１に示す。pTS174のみによる形質転換の実験では、48個の電気穿孔キュベットから１個の正常な雄性不稔系統が回収できた。PTS174＋pTS88による形質転換の実験では、７個の正常な雄性不稔系統が40個のキュベットから回収できた。各キュベットは、約50個のカルス（約１〜２mmの直径）の組織断片を含んでいた。これに関して、正常な雄性不稔植物は、イネの雄性不稔植物（すなわち、花粉を含まない、小さくて白い葯を有する）であると理解される。すなわち、そうでなければ完全に正常であり（例えば、雌性稔性）、また、キメラbarnase遺伝子の正常なメンデルの分離の法則に従って、雄性不稔性の表現型がその子孫に伝えられる。
表１から、PTS174＋pTS88の使用がpTS174のみの使用に対して有利な点は、選択的再生培地上で回収できる再生した正常な新芽の数にあることも明らかである。すなわち、これは、P35S-barstar遺伝子が主に組織培養の細胞に影響を及ぼすという事実を証明するものである。また、これに関して、P35S-barstar-3′g7およびPE1-barnase-3′nosの両方のキメラ遺伝子を含む植物は雄性不稔であり、P35Sプロモーターが、イネ植物の特定の雄しべ細胞（特に絨毯組織細胞）では活性でない（または、PE1プロモーターよりも活性が小さい）ことを証明するものであることを記しておくのは重要である。
実施例２：トウモロコシにおける共調節遺伝子
H99、Pa91および（Pa91xH99）xH99（（PxH）xH）系統のトウモロコシを温室で育てた。Ｉ型カルスを、1〜1.5mmの大きさの未成熟接合胚から開始し、受粉の10〜14日後に穂から切り出した後、Mah1VIIカルス開始培地（D′Halluinら、1992, The Plant Cell 4:1495-1505）にプレーティングした。胚形成カルスを胚の胚盤から取り出し、２〜３週間毎にMah1VII基質上で継代培養した。胚形成組織片（直径約１〜1.5mm）を盛んに増殖している胚形成カルス培養から単離し、衝撃（bombardment）前の４時間の浸透前処理のために0.2Mのマンニトールおよび0.2Mのソルビトールを補充したMah1VII基質を有するプレート上においた（Vainら、1993, Plant Cell Reports 12:84-88）。１プレートにつき総量約250mgの組織を衝撃実験で使用した。ＤＮＡの組織への衝撃は、PDS-1000/He Biolistics(R)装置（Bio-Rad）を使用して行った。微粒子担体の調製およびＤＮＡの微粒子担体上への被覆は、実質的には、Sanfordら（1993, In Wu, R.（編）Meth. Enzymol. 217:483-509）の記載に従った。粒子衝撃パラメーターは、標的距離が６〜９cm、衝撃圧が1100〜1500psi、間隙の距離が1/4インチ、微粒子担体の飛程が11mmであった。ＤＮＡは、直鎖状または環状のどちらかであった。衝撃を受けた組織は、高浸透圧培地から取り出し（衝撃の０〜24時間後）、カゼイン加水分解物およびプロリンは含まないが、10〜20mg/lのＢＡＳＴＡを含む選択維持培地に移した。胚形成カルスを２〜３週間毎に６〜８週間、継代培養した後、３％のショ糖、10〜20mg/lのＢＡＳＴＡおよび５mg/lのＢＡＰ（H99系統の場合）または５mg/lのゼアチン（Pa91または（PxH）xH系統の場合）を含むＭＳ培地（MurashigeおよびSkoog, 1962, Physiol. Plant，15：473-497）に移した。胚形成組織は、適切なサイトカイニンを含む基質上で２回継代培養した。小さい再生植物を回収し、ホルモンは含まないが、６％のショ糖および10〜20mg/lのＢＡＳＴＡを含むＭＳ培地に移した。さらに成長する新芽を、さらに伸長させるために1.5％のショ糖を含む1/2強度のＭＳ培地に移した。次いで、得られた苗を温室の土壌に移した。形質転換工程の後は、培養培地中のＢＡＳＴＡの濃度を２mg/lまで減少できることが分かった。
次のＤＮＡを使用した。一組の実験では、カルスを、ポリリンカーのEcoRIおよびHindIII部位の間に、PCA55プロモーターの制御下にあるbarnaseＤＮＡ（PCA55-barnase-3′nos）およびキメラP35S-bar-3′nos遺伝子を含むpUC19由来のプラスミドであるプラスミドpVE136で形質転換した。pVE136のEcoRI-HindIII断片の配列を配列番号３に示す。他の実験では、pVE136およびpTS88の当モル混合物によりカルスへの衝撃を行った。pTS88は、実施例１に記載のプラスミドである。対照実験では、カルスを、P35S-bar-3′nosキメラ遺伝子のみを含むプラスミドであり、WO 92/29696に記載されているプラスミドpDE110で衝撃した。
形質転換実験の結果を表２に示す。pVE136＋pTS88による形質転換実験では、出発材料に対するＰＡＴ陽性植物の数が、pVE136のみを使用する実験で得られたもののほぼ２倍である。
P35S-barstar-3′g7およびPCA55-barnase-3′nosの両方のキメラ遺伝子を含むトウモロコシ植物が雄性不稔であり、P35Sプロモーターがトウモロコシ植物の雄しべ細胞では活性でない（またはPCA55プロモーターの活性より小さい）という事実を証明するものであることを記することは重要である。
実施例３：アブラナにおける共調節遺伝子
アブラナの植物（Brassica napus−春および冬の両変種）を、プラスミドpTCO113を用い、本質的にDe Blocら、1989, Plant Physiol. 91:694-701に記載のAgrobacterium媒介形質転換法を使用して形質転換した。
プラスミドpTCO113は、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡ両ボーダーの間に下記遺伝子：
−PSSUプロモーターの制御下にあるbar遺伝子；
−PTA29プロモーターの制御下にあるbarnase遺伝子；
−Pnosプロモーターの制御下にあるbarstar遺伝子
を含む中間クローニングベクター（Ｔ−ＤＮＡベクター）である。pTCO113のＴ−ＤＮＡの配列を配列番号４に示す。
pTCO113による形質転換効率は、pTCO113と同一であるがPnos-barstar遺伝子に欠けるＴ−ＤＮＡベクターであるpTHW107によって得られるものと同じであることが認められた（pTHW107のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド領域4917〜5834に欠けることを除いて、配列番号４と同一である。）。
pTCO113により形質転換したアブラナ植物は、雄性不稔であることが認められた。さらに正確には、pTCO113により形質転換した後に再生した31本の春のアブラナ植物のうち、27本（87％）の植物が、雄性不稔であることが示された。また、pTHW107により形質転換した後に再生した22本の春のアブラナ植物のうち、20本（91％）の植物が、雄性不稔であることが示された（表３）。
雄性不稔T0植物から採取した種子を形質転換していない雄性稔性植物によって受粉させると、温室でT1植物に成長した。各T1系統の植物の50％は、雄性不稔性遺伝子を有していると予想される。植物の分析を、各々、50％および100％が開花を開始したときに行った。pTCO113で形質転換した植物は、pTHW107で形質転換した植物と比較して、開花が少し遅いのが認められた。これは、植物の50％が開花を開始した瞬間の雄性稔性（Ｆ）／雄性不稔（Ｓ）植物の比によって測定した（表３）。全ての植物が開花したときのＦ／Ｓ比は、pTCO113およびpTHW107植物の両方に対して54/46であった。
種々の系統の雄性不稔T1植物から採取した種子を、形質転換していない雄性稔性植物によって受粉させて畑に蒔き、T2子孫の植物における雄性不稔性遺伝子の分離に関して分析した。試験した７個のpTHW107系統では２個のみであったが、試験した14個のpTCO113系統は12個以上がメンデルの正常な１：１の分離を示した（Ｘ2＝6.86、ｐ＜0.01）（表３）。従って、pTCO113による形質転換の実験では、良好な雄性不稔植物がより高い割合で得られたと結論づけることができる。
0004476359.tif 000002
0004476359.tif 000003
0004476359.tif 000004
配列表
配列番号：１
配列の長さ：6548
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
起源
生物名：プラスミドpTS174
配列の特徴：
特徴を表す記号：−
存在位置：1..2003
他の情報：標識＝ベクター
注＝「pUC19由来ベクター配列」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（2019..2283）
他の情報：標識＝3′nos
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（2284..2624）
他の情報：標識＝barnase
注＝「Bacillus amyloliquefaciensのbarnaseをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（2625..4313）
他の情報：標識＝PE1
注＝「イネの雄しべ特異的E1遺伝子のプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：4336..5710
他の情報：標識＝P35S
注＝「Cauliflower Mosaicウイルスの35Sプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：5711..6262
他の情報：標識＝bar
注＝「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：6263..6496
他の情報：標識＝3′g7
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子７のポリアデニル化信号を含む領域」
配列
0004476359.tif 000005
0004476359.tif 000006
0004476359.tif 000007
0004476359.tif 000008
0004476359.tif 000009
配列番号：２
配列の長さ：1303
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
起源
生物名：pTS88のHindIII-EcoRI断片
配列の特徴：
特徴を表す記号：−
存在位置：1..35
他の情報：標識＝pGEM2
注＝「pGEM2のポリリンカー」
特徴を表す記号：−
存在位置：36..694
他の情報：標識＝P35S
注＝「Cauliflower Mosaicウイルス株CM1841の35Sプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：695..967
他の情報：標識＝barstar
注＝「Bacillus amyloliquefaciensのbarstarをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：968..1287
他の情報：標識＝3′g7
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子７のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：1288..1303
他の情報：標識＝pGEM2
注＝「pGEM2のポリリンカー」
配列
0004476359.tif 000010
配列番号：３
配列の長さ：3658
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
起源
生物名：pVE136のEcoRI-HindIII断片
配列の特徴：
特徴を表す記号：−
存在位置：1..26
他の情報：標識＝pUC19
注＝「pUC19のポリリンカー」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（28..403）
他の情報：標識＝3′nos
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（404..739）
他の情報：標識＝barnase
注＝「Bacillus amyloliquefaciensのbarnaseをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（740..1918）
他の情報：標識＝PCA55
注＝「Zea maysのCA55遺伝子のプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：1956..2788
他の情報：標識＝P35S
注＝「Cauliflower Mosaicウイルスの35Sプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：2789..3340
他の情報：標識＝bar
注＝「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：3341..3623
他の情報：標識＝3′nos
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：3624..3658
他の情報：標識＝pUC19
注＝「pUC19のポリリンカー」
配列
0004476359.tif 000011
0004476359.tif 000012
0004476359.tif 000013
配列番号：４
配列の長さ：5864
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
起源
生物名：プラスミドpTCO113のＴ−ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（1..25）
他の情報：標識＝RB
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの右側ボーダー」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（98..330）
他の情報：標識＝3′g7
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子７のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（331..882）
他の情報：標識＝bar
注＝「ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（883..2608）
他の情報：標識＝Pssu
注＝「ArabidopsisのRubiscoの小さいサブユニット遺伝子のプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（2659..3031）
他の情報：標識＝3′nos
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（3032..3367）
他の情報：標識＝barnase
注＝「Bacillus amyloliquefaciensのbarnaseをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（3368..4877）
他の情報：標識＝PTA29
注＝「Nicotiana tabacumの雄しべ特異的TA29遺伝子のプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：4924..5216
他の情報：標識＝Pnos
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター」
特徴を表す記号：−
存在位置：5217..5489
他の情報：標識＝barstar
注＝「Bacillus amyloliquefaciensのbarstarをコードする領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：5490..5765
他の情報：標識＝3′g7
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子７のポリアデニル化シグナルを含む領域」
特徴を表す記号：−
存在位置：相補（5840..5864）
他の情報：標識＝LB
注＝「Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの左側ボーダー」
配列
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