(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエルシトリンを有効成分として含有する、脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
肥満を予防あるいは治療するのに有用な脂肪蓄積抑制剤、抗肥満剤、食品添加物及びそれらを配合した食品、ペットフードに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、わが国は食生活の欧米化が進み、糖質の摂取量が減り、脂肪、タンパク質の摂取量が増えてきている。それに伴い、肥満という問題が取り上げられるようになってきた。肥満は、高血圧、心臓病、糖尿病などの成人病の原因となるので、健康を維持するためには努力して防止する必要がある。
肥満の成因を考えていく上で、脂肪細胞への分化や脱分化のメカニズムが重要となっていた。１９７４年GREENらは、マウス胎児由来３Ｔ３線維芽細胞の中から脂肪細胞へと分化するものをクローニングし、細胞株を樹立することに成功し、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化の課程を生化学的に研究できるようになった（GREEN, H.等、CELL, VOL.1, １１３−１１６頁（１９７４）；CELL, VOL.3,１２７−１３３頁（１９７４））。また、Ne'grelらも遺伝性肥満マウス(C57BL/6J ob/ob)の副睾丸脂肪組織より脂肪細胞へと分化する細胞（ob 17)をクローン化した(Ne'grel,Ｒ.等、PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, VOL.75, 6054-6058頁(１９７８))。
【０００３】
これらの細胞を用いて生化学的研究が行われ、前駆細胞の時にはほとんど活性が検出されず、脂肪細胞に分化することにより増加する酵素が明らかになってきた。そのような酵素として、例えばグリセロリン酸脱水素酵素、リポプロテインリパーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼなどが報告されているが、特にグリセロリン酸脱水素酵素（グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、ＧＰＤＨ）は、1,０００倍も酵素活性が上昇するので、分化のマーカー酵素として利用されている。
脂肪細胞は生体にとって重要な役割を果たしているが、細胞内の大部分が中性脂肪であるといったその形態的特徴のため、それについての培養技術はなかなか進歩しなかった。しかしながら、前述の３Ｔ３線維芽細胞を培養することによって脂肪細胞へ変化する過程を研究することができる（Sekiya,K.,Okuda,H.,Hotta,Y.and Arichi,S.:Phytotherapy Res.,1,58-60(1987)；関谷敬三，奥田拓道：実験医学，4,482-488(1986)；関谷敬三，奥田拓道：代謝，29,83-93(1992)）。変化した細胞には線維芽細胞細胞には存在しない中性脂肪の油滴や脂肪酸合成・分解酵素の活性が著しく上昇しており、脂肪細胞となっていることがわかる。この変化の過程にいろいろな成分を加えることで肥満に対する影響を検討している。例えば、グリセロリン酸脱水素酵素の活性を阻害する物質が、脂肪の合成を抑制し脂肪細胞への分化を抑制することから、ひいては肥満の治療や予防につながるという点に着目して、種々のグリセロリン酸脱水素酵素阻害剤が提案されている（特開平１０−９５７３２号公報）。そしてそれらを肥満の治療や予防への利用するのみならず、食品に予め配合しておくことが提案されている。
しかしながら、酵素活性阻害以外の観点からの脂肪細胞の研究は十分になされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、脂肪蓄積に対して優れた抑制効果を示し、かつ安全性の高い脂肪蓄積抑制剤、抗肥満剤を提供することを目的とする。本発明の目的はまた、優れた脂肪蓄積抑制作用を発揮し且つ安全な食品添加物を提供し、さらにはそれを配合した食品及びペットフードを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、脂肪前駆細胞から脂肪細胞へ分化する過程で、脂肪細胞における脂肪蓄積に対して抑制を示す物質を探求したところ、クエルシトリンが強い脂肪蓄積抑制作用を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
従って本発明は、クエルシトリンを有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤に関する。本発明はまた、クエルシトリンを有効成分として含有する抗肥満剤に関する。本発明はさらに、上記脂肪蓄積抑制剤を含有する食品添加物に関する。本発明はまた、上記食品添加物あるいは脂肪蓄積抑制剤を配合した食品又はペットフードに関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明する。
クエルシトリン（Quercitrin）は正式名クエルセチン−３−ラムノシド（Quercetin-3-L-rhamnoside）であって、フラボノイドの一つである。自然界に広く分布していて、ドクダミ（茎葉）などの植物に含まれている。クエルシトリンは極めて毒性の低いものである。
クエルシトリンには、強心作用、利尿作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗炎症作用が既に知られている（原色牧野和漢薬草大図鑑、北隆館刊）。クエルシトリンが脂肪細胞の脂肪蓄積を抑制することは、今まで知られていなかった。
【０００７】
クエルシトリンは、主に植物など天然物より得ることができ、しかも数種の混合物として抽出・分離精製されることが多い。本発明では、天然物の抽出エキスに精製処理を加えて単一物質まで分離したクエルシトリンを使用するのが適当である。また、クエルシトリンは精製品として市販されており、本発明ではそのような市場品を使用することもできる。
【０００８】
【試験例１】
脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用の試験
被験物質として、クエルシトリン、ヘスペリジン及びルチンを使用した。
細胞株は脂肪前駆細胞株3T3-L1を用いた。この細胞は、マウス胎仔由来の３Ｔ３(Swiss albino)線維芽細胞株より分離されたもので、脂肪細胞に分化する能力を持っている。
培地は、10％FCS（牛胎仔血清）を含む、DMEM（ダルベッコ変法必須最少培地）を用いる。培養は、培養シャーレ（φ6cm、φ10cm）を用い、CO2インキュベーター内（5％CO2、95％air）で、37℃で行う。
［脂肪細胞への分化］
3T3-L1細胞を4×103cells/ml 培地となるようにφ６cmシャーレに播種した（培地量5ml）。１週間に３回培地交換すると、倍加時間約30時間で5〜6日目にはコンフレンスに達する。この細胞は休止期に入ると脂肪細胞へと分化する性質を持っている。
細胞がコンフレンスに達した後（培養開始から５日後）、0.25μMデキサメタゾン(DEX)、0.５mM3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む培地を加え、２日間培養処理した。デキサメタゾンなどを含む培地での２日間の処理後、細胞質に球形の微細な透明の脂肪滴がみられるようになる。一般的に１週間もするとほとんどの細胞に脂肪滴が認められるようになる。
その後、5μg/mlインスリンを含む培地を１週間に３回培地交換しながら７日間培養を続けた。各被験物質は、このインスリンを含む培地に各１００μｇ/ml加えておいた。また、被験物質を添加しないものをコントロールとした。一般的には、分化を促進させるインスリン（５μg/ml）を含む培地で２〜３週間培養すると脂肪細胞へと分化する。
【０００９】
［オイル-レッドＯ染色］
上記のように、インスリンを含む培地で７日間培養後、細胞質に蓄積した中性脂肪をオイル-レッドＯで染色し、中性脂肪蓄積量を判定した。
0.５gのオイル-レッドＯを100mlのイソプロパノールに溶解し、保存液とする。使用前にこの保存溶液６に対して水(SQ)４の割合で希釈する。10分間放置後、濾紙(No.2)で濾過する。各培養シャーレ（各検体を培地中に100μg/ml加えて培養したシャーレ及びコントロール）をPBS(-)で３回洗浄後、10％ホルマリンを含むリン酸緩衝生理食塩水を加え、細胞を１時間固定する。その後、オイル-レッドＯの希釈濾液を加え１時間染色し、水(SQ)で洗浄して観察した。
染色の程度を観察した結果、コントロール、ヘスペリジン、ルチンでは、クエルシトリンと比較して赤く染色された程度が明らかに高く、すなわち、コントロール、ヘスペリジン、ルチンでは中性脂肪蓄積量が多く、一方、クエルシトリンでは中性脂肪蓄積が強く抑制されていることが判る（図１参照）。目視にて染色の程度を観察し、コントロールを１０と判定した場合、各検体は以下のとおりである。
0004515556.tif 000002
【００１０】
【試験例２】
グリセロール-3-リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性の抑制試験
分化した脂肪細胞には、前駆細胞には存在しない中性脂肪の油滴がみられ、中性脂肪の合成・分解酵素の活性が著しく上昇している。前駆細胞のときはほとんど活性が検出されないもので分化とともに活性が上昇する酵素として、リポプロテインリパーゼ、ホルモン感性リパーゼ、脂肪酸合成酵素、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、ATPクエン酸リアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸脱水素酵素など多く報告されている。この中で、グリセロール-3-リン酸脱水素酵素は分化によって活性が1,000倍ほど上昇するので分化の指標として用いた。
ここでは、クエルシトリンを添加して培養した際の、細胞内のグリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性を測定した。
【００１１】
測定法を以下に述べる。
▲１▼細胞抽出液の調製
試験例１と同様に培養し、但し、インスリンを含む培地においてクエルシトリンを１００、２００又は３００μg/ml添加して培養した。培養したシャーレの培地を除去し、PBS(-)で洗浄後、２５mM Tris/HCl(pH7.５)、１mM EDTA １mlで細胞を回収した。次に、超音波処理３０W,５秒(Branson model 250 Sonifier)で細胞を破砕した。これを遠心(8,000g×20min、4℃）し、上清をＧＰＤＨ活性測定に用いた。
▲２▼活性測定
細胞抽出液（１〜100μg タンパク質）に基質溶液を加え、最終容量が1mlとなるようにして、２５℃で反応を行う。３４０nmの吸光度変化よりＧＰＤＨ活性を求める。１分間に１nmolのＮＡＤＨを酸化する酵素量を１Unitとする。また、粗酵素液のタンパク量をLowry法により測定し、タンパク当たりの活性を求めた。反応基質溶液の組成：
100mM トリエタノールアミン/HCl(pH7.5)
2.5mM EDTA
0.12mM NADH
0.2mM ジヒドロキシアセトン ホスフェート
0.1mM β-メルカプトエタノール
【００１２】
培地中にクエルシトリンを100、200、300μg/ml添加して培養した場合の、細胞内グリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性を以下の表１に示す。クエルシトリン無添加の場合の細胞内グリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性を１００％として記している。無添加と比較して、クエルシトリンを添加したものは明らかに抑制効果を示している。
【００１３】
【表１】
クエルシトリンの細胞内グリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性抑制効果
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【００１４】
上記試験例１のとおり、クエルシトリン、ヘスペリジン、ルチンの脂肪蓄積抑制効果を検討したところ、ヘスペリジン、ルチンに関しては脂肪蓄積抑制作用が弱かった。
一方ヘスペリジン、ルチンはグリセロール-3-リン酸脱水素酵素の活性を阻害するフラボノイドであり(特開平１０−９５７３２号参照）、クエルシトリンもまた、上記試験例２に示すようにグリセロール-3-リン酸脱水素酵素の活性を阻害する。これらの結果から、グリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性抑制効果と脂肪蓄積抑制効果が比例しないことが判る。この脂肪蓄積抑制作用は、フラボノイド全般に共通ではなく、クエルシトリンに特異的と考えられる。
【００１５】
本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤は、その有効成分であるクエルシトリンの他に添加剤を含んでもよい。また有効成分であるクエルシトリンは適当な助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口または非経口投与が可能な脂肪蓄積抑制剤とすることができる。
以下に、本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤の投与方法、投与量及び製剤化の方法を示す。
本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤は、経口及び非経口投与のいずれも使用可能であり、経口投与する場合は、軟・硬カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与される。非経口投与する場合は、注射剤、点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠液状として持続的な粘膜吸収が維持できるように坐薬のような剤型で投与され得るが、局所組織内投与、皮内、皮下、筋肉内及び静脈内注射、局所への塗布、噴霧、坐剤、膀胱内注射等の外用的投与法等も用いることができる。
【００１６】
投与量は、投与方法と、患者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、大人では通常、１日当たり有効成分として0.５〜5,０００mgが適当であり、小人では0.５〜3,０００mgが適当である。
本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤の有効成分の割合は、剤型によって変更され得るが、通常、経口投与されるとき、約0.３〜１5.０重量％が適当であり、非経口投与されるときは、ほぼ0.０１〜１０重量％が適当である。
また、本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤の製剤化に当たっては、常法に従い、水溶液、油性製剤などにして、皮下あるいは静脈注射用製剤とすることができる他、皮膚などに局所適用する製剤としたり、またカプセル剤、錠剤、細粒剤等の剤型に製剤化して経口用に供することができる。
【００１７】
また、有効成分に長時間の保存に耐える安定性及び耐酸性を付与して薬効を完全に持続させるために、更に医薬的に許容し得る皮膜を施して製剤化すれば、すぐれた安定性を有する脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤とすることができる。
本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤の製剤化に用いられる界面活性剤、賦形剤、滑沢剤、佐剤及び医薬的に許容し得る被膜形成物質等を挙げれば、次の通りである。
本発明の脂肪蓄積抑制剤又は抗肥満剤の崩壊、溶出を良好にするために、界面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチレングリコール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類、硫酸化脂肪アルコール類等の１種又は２種以上を添加することができる。
また、賦形剤として、例えば蔗糖、乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。
【００１８】
滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等を１種又は２種以上を添加することができ、また矯味剤及び矯臭剤として、食塩、サッカリン、糖、マンニット、オレンジ油、カンゾウエキス、クエン酸、ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味剤、香料、着色剤、保存料等を含有させてもよい。
懸濁剤、湿潤剤のような佐剤としては、例えばココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳酸カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含有させることができる。
また、被覆形成物質としては、セルロース、糖類等の炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、またアクリル酸系共重合体、二塩基酸モノエステル類等のポリビニル誘導体としてアクリル酸メチル・メタクリル酸共重合体、メタアクリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体が挙げられる。
また、上記被膜形成物質をコーティングするに際し、通常使用されるコーティング剤、例えば可塑剤の他、コーティング操作時の薬剤相互の付着防止のための各種添加剤を添加することによって被膜形成剤の性質を改良したり、コーティング操作をより容易にすることができる。
【００１９】
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、食品や健康食品に配合することができ、また、食品添加物の成分とすることもできる。本発明の脂肪蓄積抑制剤あるいは食品添加物を配合する食品は特に限定されるものではないが、例えばパン、麺類、ビスケット、ホットケーキ、錠菓などの穀粉や澱粉を主体とする食品、ドレッシング、ドリンク等を挙げることができる。本発明の食品は、各種食品の常法による製造過程で適宜、本発明の脂肪蓄積抑制剤あるいは食品添加物を配合して製造することができる。
食品中に配合する場合、有効成分として食品の全重量に基づいて0.００１〜１５重量％が適当であり、特に0.０１〜１０重量％配合することが好ましい。
【００２０】
本発明の脂肪蓄積抑制剤はまた、ペットフードに配合することができる。ペットフードとは、犬、猫、ハムスター、リス等の哺乳類の愛玩動物用の食餌をいう。本発明のペットフードの形態は特に限定されるものではなく、例えばドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末、顆粒、カプセルなどが挙げられる。本発明のペットフードは、各種形態に応じて常法に従って製造することができ、製造過程で適宜脂肪蓄積抑制剤を添加すればよい。本発明の脂肪蓄積抑制剤をペットフードに配合する場合、配合量はその有効成分として、０．００１から１５重量％が適当であり、特に０．０１〜１０重量％配合することが望ましい。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の脂肪蓄積抑制剤、抗肥満剤は優れた効果を発揮し且つ安全性が高く、肥満の治療や予防に有用である。また、その有効成分は食品添加物、食品、及びペットフードに簡便に配合することができ、安全性が高く、また、脂肪蓄積抑制効果に優れた食品添加物、食品、及びペットフードが得られる。
クエルシトリンはグリセロール−３−リン酸脱水素酵素の活性を阻害するのみならず、脂肪細胞における脂肪蓄積を抑制する効果を発揮し、これは該酵素の生成自体を抑制し、脂肪合成酵素系の生成を抑えていることに起因すると考えられる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
（錠菓及び錠剤の製造）
卵殻カルシウム108g、ピロリン酸第二鉄2g、アスコルビン酸40g、微結晶セルロース40g、還元麦芽糖285g、クエルシトリン25gをミキサーによって常法により混和した後、打錠し、錠菓及び錠剤を製造した。
【実施例２】
（ビスケットの製造）
小麦粉120g、クエルシトリン2.4g、砂糖35g、ショートニング15g、全卵粉1.5g、食塩1g、炭酸水素ナトリウム0.6g、炭酸アンモニア0.75g、水20gを用いて、常法によりドウを作成し、成形、焙焼してビスケットを製造した。
【００２３】
【実施例３】
（パンの製造）
小麦粉３kg、クエルシトリン３ｇ、イースト60ｇ、イーストフード３ｇ、砂糖150ｇ、食塩60ｇ、ショートニング150ｇ、脱脂粉乳60ｇ、水2070ｇを用いて、常法によりドウを作成し、成形、焙焼してパンを製造した。
【実施例４】
（麺の製造）
準強力小麦粉に対して、１重量％のクエルシトリン、34重量％の水、１重量％の食塩及び1重量％のかん粉を加えたものを、１２分間した混捏した後、麺機にて数回圧延、形成して、中華麺の生麺帯、生麺線を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１のオイル-レッドＯ染色後の、各シャーレ上の染色の状態を表す写真である。黒い部分がオイル-レッドＯで染色されている部分に相当する。
Ａ：コントロール、Ｂ：クエルシトリン、Ｃ：ヘスペリジン、Ｄ：ルチン。
【図１】
0004515556.tif 000004