(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンの炭素数が１４〜２０、二重結合の数が０〜５の脂肪酸混合物のモノエステルを有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアポトーシス誘導剤に関するもので、アスタキサンチンモノエステルを有効成分とするものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、細胞に本来備わっている死の機構を発動させて起きる自殺型の細胞死であって、細胞の小体化やその核の断片化を伴うものである。そして、アポトーシスは多細胞生物の生命を維持する上で不可欠の機構であるから、その制御が狂い、アポトーシスが起きすぎたり、逆に少なすぎたりすると、さまざまな病気になることも知られている。
【０００３】
癌は、細胞が死ぬ機構をなくしたために起きるものであることから、アポトーシスの減少もその発生原因の一つであると言われている。また、その他にアポトーシスの減少に起因する疾患として自己免疫性疾患、あるいはウイルス感染などが挙げられている（Thompson,C.B.,Science,267,1456,1995）。したがって、アポトーシスを増加させる物質、すなわちアポトーシス誘導活性を有する物質を提供することは、癌のみでなくその他の疾患の治療あるいは予防にも役立つものである。
【０００４】
癌細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する物質として、いくつかの化合物が研究されているが、アポトーシス誘導活性があり、かつ副作用が少ない有効成分の提供は未だに困難な状況にある。
【０００５】
一方、本発明者らは、エビ、カニなどの甲殻類に含まれるカロテノイドとして知られるアスタキサンチン類について、種々の研究を行ってきたが、この度、アスタキサンチンのエステルがアポトーシス誘導活性を有することを見出した。
アスタキサンチンは、エビ、カニなどの甲殻類のみでなく、赤色酵母やヘマトコッカスなどの藻類にも含有されていることが知られている。天然物から抽出することができるので、その利用は安全性の点から好ましいものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アポトーシス誘導活性を有する、安全性の高い新規な医薬を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アスタキサンチンモノエステルを有効成分として含有させることによって上記の課題を解決した。すなわち、本発明は、アスタキサンチンモノエステルを有効成分とするアポトーシス誘導剤に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、アスタキサンチンは、遊離の化合物としてではなく、エステルとして用いる。実施例で示すように、本発明者らは、アスタキサンチンは、遊離の化合物ではアポトーシス誘導活性を有さないが、エステルにすると特異的にアポトーシス誘導活性を有することを発見した。
【０００９】
本発明において、エステルを構成する酸成分としては、パルミチン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸などの不飽和脂肪酸のいずれもが用いられる。
【００１０】
アスタキサンチンは、合成であっても、また、アスタキサンチン及び／又はそのエステルを含有する赤色酵母、エビ、カニ、オキアミ等の甲殻類の殻、緑藻類、微細藻類等よりの抽出物であっても、いずれでも使用できる。
例えば、本発明者らによる特開平１１−５６３４６号公報には、ヘマトコッカス藻体からアスタキサンチンを抽出する方法が記載されているが、該方法は好ましい抽出方法の一つである。
【００１１】
以下に、特開平１１−５６３４６号公報に記載される抽出法の概略を説明する。
緑藻類としては、ヘマトコッカス属に属し、アスタキサンチンを生産する藻体であれば、いかなる緑藻類でも使用しうる。例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュウストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（Haematococcus capensis）などが挙げられるが、ヘマトコッカス・プルビアリスが好適である。ヘマトコッカス・プルビアリス藻体の栄養細胞は、暗所で酢酸などの有機物を炭素源として従属栄養的に、または、明所で酢酸などの有機物と炭酸ガスの両方を炭素源として混合栄養的に培養することによって得られる。培養したヘマトコッカス藻体の栄養細胞はアスタキサンチン合成能が低いため、アスタキサンチン合成能を高めるために、様々なストレスによりアスタキサンチン合成の誘導・活性化を行う必要がある。すなわち、栄養源枯渇、強光、活性酸素、高温、乾燥等の環境ストレスを単独又は組み合わせて付加することにより、栄養細胞を休眠状態であるシスト細胞に速やかに形態変化させることができる。この形態変化に伴いアスタキサンチン合成系が誘導され、アスタキサンチンが多量蓄積される。このように培養したヘマトコッカス藻体のシスト細胞は、遠心分離等により容易に回収され、アスタキサンチンの抽出工程が行われる。
【００１２】
本発明のアスタキサンチンモノエステルを有効成分とする製剤の投与形態は、経口投与または非経口投与のいずれでも良く、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤などを挙げることができる。
【００１３】
本発明のアスタキサンチンモノエステルがアポトーシス誘導活性を有することは、制癌剤のスクリーニング法として通常使われている実施例で示す方法によって確認した（平成１０年版「制がん剤の分子標的スクリーニング−その概要と利用法−」文部省がん特定  総合がん・制がん剤スクリーニング委員会）。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
アスタキサンチンモノエステルの製造例
表１に示す培養基100mlを200ml容のフラスコに入れ、121℃で15分間滅菌した。同じ組成を有する維持用の培養基に別に培養したヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）NIES  144のシードを接種し、1500ルクスの光照射下、生育温度20℃で４日間、液体培養した。上記液体培養で得られた栄養細胞に、炭素源として酢酸濃度が45mM、鉄イオン濃度（FeSO4・7H2O）が450μMとなるように添加し、9000ルクスの光照射下、20℃でさらに４日間培養した。栄養細胞は速やかにシスト細胞へ形態変化し、細胞内に著量のアスタキサンチンを蓄積した。
【表１】
0004491090.tif 000002
【００１５】
このようにして得られたシスト細胞100ｇ（総アスタキサンチン５％、クロロフィル２％含有）を、80℃に加温した40％アセトン溶液１Ｌに浸漬し、80℃で２分間保持した後、急冷し、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去し、熱アセトン処理したシスト細胞を回収し、定法どおり凍結乾燥して乾燥細胞を得た。この乾燥細胞にアセトン−メタノール（７：３）溶液１Ｌを加え、室温で24時間浸漬した後、遠心分離によって細胞を除去して抽出液を得た。この抽出液を窒素雰囲気下、エバポレーターにより濃縮し、アスタキサンチン粗抽出乾固物を得た。この乾固物を少量のアセトンに溶解し、ＴＬＣ（Kieselgel 60、0.2mm、メルク社製）によりアスタキサンチンエステルの分画を暗所で行った。展開溶媒はアセトン−ヘキサン（３：７）を使用した。アスタキサンチンジエステルのRf値は約0.6、モノエステルのRf値は約0.75〜0.85であった。スパチュラによりエステル画分を回収し、アセトンに溶解して、各アスタキサンチンエステル標品を得た。アスタキサンチンエステルは、エバポレーターによりアセトンを除去し、適当な溶媒に溶解して試験に使用した。
【００１６】
アポトーシス誘導試験に供したアスタキサンチンエステルのエステル成分を次の方法で分析した。
上記製造例で製造したアスタキサンチンエステル混合物を、石油エーテル100mlに溶解してから、10％KOH含有メタノール100mlと混合し、50℃で攪拌しながら24時間けん化処理を行った。遊離アスタキサンチンを石油エーテル層に分配し、除去した後、水溶性画分のpHを３に下げて石油エーテルにより遊離脂肪酸を抽出した。遊離脂肪酸を定法どおりメチル化し、ガスクトマトグラフィにより組成分析を行った。
組成分析の結果は、次のとおりであった。
Ｃ14:0、0.62%;  Ｃ16:0、22.37%; Ｃ17:0、1.10%;  Ｃ18:0、4.11%;  Ｃ18:1、19.73%; Ｃ18:2、24.68%; Ｃ18:3、10.74%; Ｃ18:4、2.07%;  Ｃ20:1、0.11%;Ｃ20:4、0.15%;  Ｃ20:5、0.37%;  その他13.95%
なお、ここで、例えば、Ｃ14:0は、炭素数１４、二重結合数０の脂肪酸を表す。
【００１７】
アポトーシス誘導試験例
上記製造例で得られたアスタキサンチンモノエステルのアポトーシス誘導活性は、ヒト単球系白血病Ｕ937細胞を用いて次のような形態変化観察により測定した。
Ｕ937細胞の培養は、10％FBSを含むRPMI中、37℃、5％CO2濃度下で行う。サンプルは溶媒による10倍希釈系列を４段階用意した。
前培養を行い、対数増殖期に入った細胞を３×105cells/mlになるように培地で調整し、24穴培養プレートに１mlずつ分注し、サンプル溶液を10μl（最終濃度が10、1、0.1、0.01にμg/mlなるよう）添加し、混和する。0、4、8、24時間培養した後、各ウェルの細胞について顕微鏡像の写真撮影を行った。
【００１８】
顕微鏡写真による形態変化観察の評価は、形態変化の無いもの（−）、多くの細胞に形態変化が認められるもの（＋）、及び細胞が死滅していると思われるもの（＋＋）として表２に示した。
また、対照例として遊離型アスタキサンチンについて同様のアポトーシス誘導活性試験を行い、その結果得られた評価を表３に示した。
いずれかの段階で＋が認められたものは、総合的にアポトーシス誘導活性を有するものであると評価される。
【００１９】
【表２】
0004491090.tif 000003
【００２０】
【表３】
0004491090.tif 000004
【００２１】
以上の結果から、アスタキサンチンモノエステルが、ヒト単球系白血病細胞に対してアポトーシス誘導活性を示すのに対して、遊離型アスタキサンチンではアポトーシス誘導活性を示さないということが分かる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のアスタキサンチンモノエステルは、アポトーシス誘導活性を示し、制癌剤などアポトーシスが関連する疾病の予防及び治療剤としての効果を有する。