(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ8−ベンジルノルシムセリン。
【請求項２】
Ｎ8−ノルシムセリン。
【請求項３】
Ｎ1，Ｎ8−ビスノルシムセリン。
【請求項４】
Ｎ1，Ｎ8−ビスベンジルノルフィソスチグミン。
【請求項５】
Ｎ1，Ｎ8−ビスベンジルノルフェンセリン。
【請求項６】
Ｎ1，Ｎ8−ビスベンジルノルシムセリン。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
コリン作動系における欠損は、正常老齢化及びアルツハイマー病に関連した認識障害の基礎をなすことが示唆されている（Bartus et al., Science 217:408-417（1982）; Fisher et al., Neurobiol. Aging 13:9-23（1992））。多くの研究が、これらの障害について考え得る治療法としてのコリン様作動性置換（replacement）療法の開発に集中している。それらの中で、コリンエステラーゼ阻害薬、例えばフィソスチグミン（physostiymine）（Ｐｈｙ）及びテトラヒドロアミノアクリジン（ＴｈＡ）が、動物（Rupniak et al., Neurobiol. Aging 11:09-613:1990; Murray et al., Psychopharmacology 105:134-136（1991））及びヒト患者（Mohs et al., J. Am. Geriarr. Soc. 3:749-757（1985）;Summers et al., N. Engl. J. Med. 315:1241-1245（1986））の両方で記憶増強作用に関して研究されてきた。
その他の薬剤は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の選択的阻害薬として提案されている。したがって、ヘプチル−フィソスチグミン（Ｈｅｐｔｙｌ−Ｐｈｙ）は、親化合物より脂質親和性が大きく、コリンエステラーゼに及ぼす阻害作用が長く、そして脳中のアセチルコリンの増大がより持続的で、その上毒性が低いと記載されている（Brufani et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 26:625-629（1987））。しかしながら、ヘプチル−Ｐｈｙの治療窓口が臨床的使用のために十分に広いか否かに関しては懸念がある。フェンセリン（（−）−Ｎ−フェニルカルバモイルエセロリン）は優れた選択的ＡＣｈＥ阻害薬であると同定され、したがって老齢化及びアルツハイマー病に関連した認識障害に対する治療のための薬剤として適している（米国特許第５４０９９４８号、１９９５年４月２５日発行）。
米国特許第５１７１７５０号（１９９２年１２月１５日発行）には、ＡＣｈＥ又はブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）のいずれかの選択的阻害薬であることが示された一連の置換フェンセリンが開示されている。（−）−フィソベノール（physovenol）のクミルカルバメート（４‘−イソプロピルフェニルカルバメート）誘導体は、逆酵素特異性を有することが注目された。即ちそれはＡＣｈＥを上回って、ＢＣｈＥを選択的に阻害した。本特許は、発明の化合物が「コリン作動性疾患、例えば緑内障、重症筋無力症、アルツハイマー病を治療するために、並びに有機リン酸塩による中毒に対する解毒薬として」有用であることを示す。特定の疾患を治療するためにどの種類の阻害薬を用い得るかに関する指標はないが、しかしながら、赤血球、脳及び神経組織中に認められるＡＣｈＥは、血清、膵臓及び肝臓に見出されるＢＣｈＥの場合よりもin vivoでアセチルコリン（ＡＣｈ）を加水分解することが知られているより特異的な酵素であると思われる旨の開示が存在する。ＡＤの顕著なコリン作動性損失は、コリン作動性神経伝達物質アセチルコリン、Ａｃｈ、及びＡｃｈの作用を終えるＡＣｈＥの合成に関連する酵素コリンアセチルトランスフェラーゼの劇的低減を伴う（Perry, et al.,Brit. Med. J., 2 6150:1457-1459, 1978; Whitehouse, et al., Science 215;1237-1239,1982）。
米国特許第５３７８７２３号（１９９５年１月３日発行）は、ＡＣｈＥ又はＢＣｈＥの抑制に高い効力を表すことが示された一連のチアフィソベノールカルバミン酸誘導体を記載する。その発明の化合物は、前記の米国特許第５，１７１，７５０号の場合と同様に、緑内障、重症筋無力症、アルツハイマー病及び有機リン酸塩中毒といった疾患を治療するのに有用であることが示された。前記のように、どの種類の阻害薬がどの特定の疾患に用い得るかに関しては、特別な指標は何も示されていない。
GeulaとMesulamは、論文（Cholinesterases and the Pathology of Alzheimers Disease, Alzheimers Disease and Associated Disorders, Vol. 9, Suppl. 2, pp 23-28（1995））中で、以下のような観察をおこなっている。要約すると：「アルツハイマー病（ＡＤ）は、皮質コリン作動性軸索及びコリン受容性ニューロンに関連したアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の顕著な損失を伴う。この損失と同時に、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）活性が、プラーク、もつれ及びアミロイド血管症に関連したＡＣｈＥ及びＢＣｈＥ活性の形態でＡＤ皮質中に出現する。我々の観察は、ＡＤの病変に関連したＣｈＥ（ＡＤＣｈＥ）は、正常ニューロン及び軸索に伴うＣｈＥと比較して、異なる酵素特性を有し、そして事実上おそらくは異なる供給源を有するということを示した。ＡＤＣｈＥがＡＤの病因に関与する非コリン作動性機能を有するということは、最も考えられることである」。さらに別の項（２６ページ）で、著者は、次のように述べている：「これらの観察は、グリアが、ＡＤの病変に関連したＣｈＥ、特にＢＣｈＥの供給源であると思われるということを示す。それらはさらに、高比率のＢＣｈＥ対ＡＣｈＥ陽性グリアがこの疾患の神経病理学において許された又は原因となる役割を演じ得るということを示唆する。ＣｈＥのその他のプールが、ＡＤ  ＣｈＥの場合と同様の又は同一の酵素特性を有して存在する、ということも考えられる。この可能性は、未だ探求されていない」。
ＢＣｈＥが、年齢適合性非痴呆化脳からのプラークにおけるよりもＡＤプラークにおいて有意に高い量で見出される、ということを当業者は示している。さらに、ＢＣｈＥは、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の凝集を変えることが判明した。ＡＣｈＥが高濃度のアセチルコリン（ＡＣｈ）により阻害される一方、ＢＣｈＥは影響を受けないままであるために、ＢＣｈＥはＡＤ患者の脳中のＡＣｈのシナプス濃度のin vivo調節において重要な役割を演じることは十分あり得る、と仮定されている。脳中に浸透したＢＣｈＥ阻害薬は、細胞外ＡＣｈのレベルの有意の増大を生じた（Giacobini, et al., Proc. Soc. Neurosci. 22:203,1996）。
３つのＡＤ検体において、密集型又は神経炎型のものであるプラークは、ほとんど常に、強ＢＣｈＥ活性と関連した、ということも判明している。ＢＣｈＥ活性はプラーク形成の中間段階で現れ、したがってそれは神経変性及び痴呆に関連した密集神経炎形態への初期良性Ａβ沈着物の変換に関与する因子の１つを構成し得る、と結論づけられる。
発明の要約
高選択的ＢＣｈＥ阻害薬は全身投与により用いられて、宿主の老齢化又はアルツハイマー病に関連した認識障害を防止し又は治療し得るということは、予期せず発見され、したがって本発明の基礎を形成する。ＢＣｈＥ活性は従来、主に末梢器官、例えば膵臓、肝臓及び血清に、又は循環系に存在することが確認されており、その抑制は第一世代アルツハイマー病療法で観察された副作用に関連していたため（Liston et al., Proc. Soc. Neurosci., 20:608, 1994（Soreq & Zachnt, Human Cholinestrase and ?, Academic Press, New York, pp.21-29,1993）参照）、老齢化又はアルツハイマー病に関連した認識障害の治療又は予防における高選択的ＢＣｈＥ阻害薬の使用は、当業者により示唆されなかった。脳及び中枢神経系ＣＮＳの認識性疾患を治療する場合の高選択的ＢＣｈＥ阻害薬の考え得る使用とは離れて示されたさらに別の因子は、このような薬剤の予測される分布パターンであった。当業界で利用可能なデータは、このような化合物が、それらの基質活性の大部分が存在する末梢器官に優先的に結合される、ということを示唆する。したがって、（ｉ）このような化合物は脳に達する前に全身酵素と結合して、そのアクセスを制限し、そして（ｉｉ）当業界で公知の大半のＢＣｈＥ阻害薬が容易に脳に進入しないので、患者に全身投与された臨床的有用濃度の高選択的ＢＣｈＥ阻害薬が血液脳関門を通過して脳中で利用される、ということは予測されなかった。実際、今日まで、ＢＣｈＥの阻害薬は農業における殺虫剤として大いに利用されてきた（Soreq and Zachut, Human Cholinesterases and Anticholinesterases, Academic Press, N.Y., pp.21-29, 1993）。
「高選択的」という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒト血漿ＢＣｈＥに対するＩＣ（５０）値の、ヒト赤血球ＡＣｈＥに対するそれらのＩＣ（５０）値に比する割合が約１５対１以上であるＢＣｈＥ阻害薬を包含することを意味する。
ＩＣ（５０）値は、当業界で十分公知の方法を用いてこのような阻害薬に関して確定される。このような検定では、各化合物の薬理学的活性は、ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥの酵素活性の５０％を抑制するのに要する濃度（ナノモル）と定義されたＩＣ（５０）として、別々に確定される。ＩＣ（５０）値の確定に関しては、各濃度の酵素活性は、各化合物の非存在下で確定された濃度のパーセントとして表される。これは次にロジットフォーマットに変換され（ここで、ロジット＝Ｉｎ（活性％／［１００−活性％］））、化合物の対数濃度の一関数としてプロットされた。ＩＣ（５０）値（即ち、ロジット＝Ｉｎ（５０／［１００−５０］＝０））は、−０．９８５未満の相関係数（ｒ2）からのみ、そして２回の試料検定からの阻害が５０％以上になった場合に、確定された。次に、ＡＣｈＥを用いて各化合物に関して得られたＩＣ（５０）値をＢＣｈＥに関する値と比較することにより、選択性比を確定した。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、活性に関して試験した化合物の化学構造の表を示し、本発明によるＢＣｈＥに対する望ましい選択性を有する化合物の例を挙げる。
図２は、βＡＰＰのin vitro分泌に及ぼす指示化合物の作用を確定するための検定のイムノブロットである。
図３は、シムセリン（symserine）がラットにおけるＣＳＦ  βＡＰＰγレベルを低減することを示すグラフである。
図４は、１ｍｇ／ｋｇ静注シムセリンの投与後の経時的なラットにおける血液／脳関門分布を示す図表である。
図５は、シムセリンがラットにおける認識成績を改良することを示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明の方法に有用な高選択的ＢＣｈＥ阻害薬は表１の化合物であって、この表には１５以上のＢＣｈＥに関する選択性を有することが示されている。一方それらの構造は、本発明の化合物に関して１５以上のＢＣｈＥに対する選択性を示す図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに（それらの選択性比とともに）提示されている。構造を比較するために、その他の関連する化合物も図１Ａ、１Ｂ、１Ｃに示したが、これらはＢＣｈＥに対する所望の選択性を示さない。
表１及び図１に列挙した化合物の中には、ブチリルコリンエステラーゼを阻害するある種の新規の化合物が存在する。本発明の新規の化合物を以下に示す（括弧内の数字は表１の化合物の番号に対応する）：Ｎ8−ベンジルノルシムセリン（３３）；Ｎ8−ノルシムセリン（３７）；Ｎ1，Ｎ8−ビスノルシムセリン（４１）；Ｎ1，Ｎ8−ビスベンジルノルフィソスチグミン（４２）；Ｎ1，Ｎ8−ビスベンジルノルフェンセリン（４３）；及びＮ1，Ｎ8−ビスベンジルノルシムセリン（４５）。これらの新規の化合物を、以下のように合成した：
（−）−（３ａＳ）−８−ベンジル−１，３ａ−ジメチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−４’−イソプロピルフェニルカルバメート（Ｎ8−ベンジルノルシムセリン；化合物３３）：  （−）−（３ａＳ）−８−ベンジル−１，３ａ−ジメチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール−５−オール1（３３ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）をエーテル（２ｍＬ）に溶解し、Ｎａ（１ｍｇ）を付加した。混合物を室温で１分間攪拌後、４−イソプロピルフェニルイソシアネート（１８．１ｍｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）を付加した。混合物を室温で５分間攪拌した。溶媒を除去後、残渣をクロマトグラフィー処理（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝２０／１）して、３３（４０ｍｇ、８０．０％）を発泡体として得た：［α］20D−６０．０°（ｃ＝０．２、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ７．４０−７．０８（ｍ，９Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４−Ｈ），６．７０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），６．１５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ），４．４５及び４．３５（ＡＢ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2），４．２５（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），２．８０（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ＜），２．６８（ｍ，２Ｈ，Ｃ１−Ｈ2），２．３２（ｓ，３Ｈ，Ｎ１−ＣＨ3），１．９０（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），１．３５（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3），１．１５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ，＞ＣＭｅ2）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：２９４（ＭＨ+−ＡｒＮＨＣＯ，６５），２８０（２．２），２６５（３．６），２３７（７５），２０７（５８），１６０（３４），９１（１００）．ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ29Ｈ33Ｎ3Ｏ2  理論値：４５５．２５７３；実測値：４５５．２５６９。
（−）−（３ａＳ）−１，３ａ−ジメチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−４‘−イソプロピルフェニルカルバメート（Ｎ8−ノルシメルセリン；化合物３７）：  化合物３３（２２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１ｍＬ）及びＴＦＡ（０．５ｍＬ）の混合物中に溶解した。水酸化パラジウムオンカーボン（５ｍｇ）を付加した。反応混合物を大気圧での水素中で、室温で１時間攪拌後、触媒を濾過した。濾液を真空蒸発して残渣を生じ、これをＨ2Ｏに溶解して、Ｎａ2ＣＯ3で塩基性にし、エーテルで抽出後、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。溶媒を除去後、残渣を分配ＴＬＣ（シリカゲル）上でクロマトグラフィー処理（ＣＨ2Ｃｌ2＝１０／１）して、生成物３７（１２ｍｇ、６５．７％）をゴムとして得た：［α］20D−７３．８°（ｃ＝０．２、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ６７．３０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’−Ｈ及びＣ６’−Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’−Ｈ及びＣ５’−Ｈ），６．８０−６．７０（ｍ，２Ｈ，Ｃ４−Ｈ及びＣ６−Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ７−Ｈ），４．６５（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），２．６４（ｍ，１Ｈ，−ＨＣ＜），２．４８（ｓ，３Ｈ，Ｎ１−ＣＨ3），２．００−１．９０（ｍ，２Ｈ，Ｃ３−Ｈ2），１．４２（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3），１．２０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ，＞ＣＭｅ2）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：２０４（ＭＨ+−ＡｒＮＨＣＯ，９９），１８９（２５），１７４（８．３），１１７（１０）．ＨＲ−ＭＺ  ｍ／ｚ  Ｃ22Ｈ27Ｎ3Ｏ2  理論値：３６５．２１０５；実測値：３６５．２１００。
（−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロール［２，３−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−４’−イソプロピルフェニルカルバメート（化合物４５）：  （−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール−５−オール2（６８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を無水エーテル（２ｍＬ）に溶解し、Ｎａ片（約１ｍｇ）を付加した。混合物を室温で１分間攪拌後、４−イソプロピルフェニルイソシアネート（３０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を付加し、５分間攪拌した。溶媒を蒸発させて粗製生成物を得て、これを直接クロマトグラフィー処理して、４５（８９ｍｇ、９９１．３％）をゴムとして得た：［α］20D−４４．７°（ｃ＝０．５、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’−Ｈ及びＣ６‘−Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’−Ｈ及びＣ５’−Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４−Ｈ），６．７０（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），６．１５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ），４．４８（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），４．３０−４．１５（ＡＢ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ８），３．７３（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ１），２．８０（ｍ，１Ｈ，−ＨＣ＜），２．７０（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），１．９０（ｍ，２Ｈ，Ｃ３−Ｈ2），１．４０（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3），１．１５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：３７０（ＭＨ+−ＡｒＮＨＣＯ−，１．０），２９４（９０），２７９（１０），２３７（８．０），１７４（９５），１６０（９２），１３２（６０），１０４（５５），９１（１００）．ＨＲ−ＭＺ  ｍ／ｚ  Ｃ35Ｈ37Ｎ3Ｏ2  理論値：５３１．２８８８；実測値：５３１．２９０７。
（−）−（３ａＳ）−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロール［２，３−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−４‘−イソプロピルフェニルカルバメート（化合物４１）：  化合物４５（４２ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（１ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃ（５ｍｇ）を付加した。反応混合物を大気圧での水素中で、室温で６０分間攪拌後、触媒を濾過した。溶媒を蒸発させて残渣を生じ、これをクロマトグラフィー処理（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝１０／１）して、最高極性成分である化合物４１（１４ｍｇ、５１．０％）をゴムとして得た：［α］20D−７１．１°（ｃ＝０．３、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’−Ｈ及びＣ６‘−Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’−Ｈ及びＣ５‘−Ｈ），６．８０（ｍ，２Ｈ，Ｃ４−Ｈ及びＣ６−Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ７−Ｈ），５．２０（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），２．９０（ｍ，１Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ＜），２．８０（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），２．１３（ｍ，２Ｈ，Ｃ３−Ｈ2），１．４５（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3），１．１８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，＞ＣＭｅ2）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：１９０（ＭＨ+−ＡｒＮＨＣＯ，９８），１７４（１０），１６０（７０），１４６（１００），１３３（１１），１１７（１５），１０３（５．０），９１（１４）．ＨＲ−ＭＳ（ＮＨ3）  ｍ／ｚ：  Ｃ21Ｈ25Ｎ3Ｏ2  理論値：３５１．１９４８；実測値：３５１．１９４１。
（−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロール［２，３−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−メチルカルバメート（化合物４２）：  （−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−５−メトキシピロロ［２，３−ｂ］インドール（４７．５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を無水エーテル（２ｍＬ）に溶解し、Ｎａ金属片（約１ｍｇ）を付加した。混合物を室温で１分間攪拌後、メチルイソシアネート（１４．６ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を付加し、混合物を１０分間攪拌した。溶媒を蒸発させて粗製生成物を得て、これを直接クロマトグラフィー処理して、４２（５０．０ｍｇ、９０．０％）をゴムとして得た：［α］20D−５８．２°（ｃ＝０．７、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．４０−７．２０（ｍ，１０Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４−Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），６．２４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ），４．６５（ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），４．４０（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），４．３５−４．２０（ＡＢ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ８），３．７０（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ１），２．８０（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，３Ｈ，ＮＨ−ＣＨ3），２．７０（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），１．９０（ｍ，２Ｈ，Ｃ３−Ｈ2），１．３５（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：３７０（ＭＨ+−ＣＨ3ＮＨＣＯ−，３３），３５４（１．５），２７９（８．５），２６４（３．０），９１（１００）．  分析（Ｃ27Ｈ39Ｎ3Ｏ3）  Ｃ，Ｈ，Ｎ。
（−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロール［２，２−ｂ］インドール−５−イル−Ｎ−フェニルカルバメート（化合物４３）：  （−）−（３ａＳ）−１，８−ジベンジル−３ａ−メチル−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロ−５−メトキシピロロ［２，３−ｂ］インドール−５−オール（４０．７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を無水エーテル（２ｍＬ）に溶解し、Ｎａ金属片（約１ｍｇ）を付加した。混合物を室温で１分間攪拌後、フェニルイソシアネート（１３．１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を付加し、５分間攪拌した。溶媒を蒸発させて粗製生成物を得て、これを直接クロマトグラフィー処理して、４３（４８ｍｇ、８９．１％）をゴムとして得た：［α］20D−５９．１°（ｃ＝０．７、ＣＨＣｌ3）；1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．４０−６．９０（ｍ，１５Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４−Ｈ），６．７３−（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ７−Ｈ），４．４５（ｓ，１Ｈ，Ｃ８ａ−Ｈ），４．３０−４．２０（ＡＢ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ８），３．７２（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ2−Ｎ１），２．７０（ｍ，２Ｈ，Ｃ２−Ｈ2），１．９０（ｍ，２Ｈ，Ｃ３−Ｈ2），１．３８（ｓ，３Ｈ，Ｃ３ａ−ＣＨ3）；ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：３７０（ＭＨ+−ＰｈＮＨＣＯ−，３１），３５４（１．０），２７９（８．０），２６４（２．０），９１（１００）．  分析（Ｃ27Ｈ29Ｎ3Ｏ3）  Ｃ，Ｈ，Ｎ。
表１に列挙した残りの化合物の合成は公知であり、図１に列挙した各化合物に関して引用した参考文献中に見出される（それらの各々は、参照により本明細書中に含まれる）。
表１を要約すると、古典的抗コリンエステラーゼ  フィソスチグミン（１）は２つの亜型酵素、アセチル−（ＡＣｈＥ）及びブチリル−コリンエステラーゼ間に阻害作用の選択性を保有しないが、一方フィソスチグミン（２）の（−）−フェニルカルバメートの４’（パラ）位置、（４，５）における特異的置換は、ＢＣｈＥ阻害に対する選択性を有する化合物を提供する、ということを広範な試験は実証した。これは、その他の４’置換、（６）、又は他の位置、例えば２’（オルト）位置（３，７）での同様の置換がＢＣｈＥに対する選択性を提供しないので、予期せぬことである。最近の研究は、３’置換が同様にＢＣｈＥ選択性を提供しないことを示した。例えば、３’−メチル−カルバモイルエセロリンは、ＡＣｈＥ  ２７ｎＭ及びＢＣｈＥ  １６５ｎＭのＩＣ50値を有する。実際、２’−；２’，４’−；３’−；２’，３’；３’，５’−；又は２’，４’，６’−位置での置換はＢＣｈＥ選択性を提供しない。
さらに別の研究は、別々に以下の置換を実証した；フィソスチグミン（１）のＮ1−位置、例えばＮ１−ノルフィソスチグミン（８）、Ｎ1−ベンジルノルフィソスチグミン（１２）、Ｎ1−フェネチルノルフィソスチグミン（１６）及びＮ1−アリルノルフィソスチグミン（２０）は、フィソスチグミン（１）に比して、ＢＣｈＥ選択性を提供する。これは、アミン（２１）がそうでないように、他の置換と同様に予想外である。チアフィソベニン（２２）及びフィソベニン（２６）を提供するためのフィソスチグミン（１）のＮ1基の置換も、予想外に、ＢＣｈＥに対する阻害作用の選択性を提供する。
さらなる研究は、別々に、Ｎ8−ベンジルノルフィソスチグミン（３０）及びＮ8−ノルフィソスチグミン（３４）を提供するための、フィソスチグミン（１）のＮ8−位置の置換がＢＣｈＥの有効な且つ選択的阻害薬を生成することを実証した。
記載された修飾の組合せは、ＢＣｈＥ対ＡＣｈＥ阻害作用に対する劇的選択性を示すか又は示すことが予測される化合物［１１、１５、１６、１９、２５、２９、３３、３７］を提供する。本発明の目的のためのその他の有用な化合物としては、化合物［１２、２０及び２２］が挙げられる。
本発明の方法に用いるのに特に好ましい化合物は、シムセリン（化合物４、表１、図１Ａ）である。シムセリンに関する選択は、その合成の容易さ、安定塩の利用可能性、及び血液脳関門を通過するその能力に基づいている。
本発明の方法に用いるための組成物としては、活性成分がその意図された目的を達成するために有効な量で含入される組成物が挙げられる。化合物は、あらゆる製薬上許容可能な量で、例えば体重１ｋｇ当たり０．００１ｇ〜１ｇの範囲の量で投与され得る。本明細書中に示される情報を基礎にして、有効量の確定は、十分当業者の技能内である。化合物は一般に、約０．１〜９９重量％、好ましくは約２５〜８５重量％の量で組成物中に担体又はビヒクルとともに活性成分を含有する（重量％）製剤組成物に用いられる。
液体又は固体単位投与形態は、経口投与のために容易に調製される。例えば、高選択的ＢＣｈＥ阻害薬は、慣用的成分、例えばリン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、タルク、ラクトース、アラビアゴム、メチルセルロース及び製剤賦形剤又は担体と機能的に類似した物質と混ぜ合わせ得る。持続性放出処方物は、任意に用い得る。老齢又は支離滅裂な患者では、持続性放出処方物は好ましくさえある。カプセルは、化合物を不活性な製剤希釈剤と混合し、この今後物を適切なサイズの硬質ゼラチンカプセル中に挿入することにより処方される。軟質カプセルが望ましい場合には、化合物と植物油、軽油又はその他の不活性油とのスラリーをゼラチンカプセル中に形成して封入される。
懸濁液、シロップ及びエリキシルは、経口投与又は流体単位投与形態のために用いられる。油を含む流体製剤は、油溶性形態に用いられる。植物油、例えばコーン油、ピーナツ油又はフラワー油は、例えば風味剤、甘味剤及び任意の防腐剤とともに、許容可能な流体製剤を生成する。界面活性剤を水に付加して、流体単位投与要のシロップを生成し得る。許容可能な甘味剤、例えば糖、サッカリン又は生物学的甘味剤及び風味剤をエリキシルの形態で含有する水−アルコール製剤が用いられる。
非経口的及び坐剤投与のための製剤組成物は、当業界の技術標準を用いても得られる。
本発明の化合物の好ましい使用は、経口投与に適した製剤としてである。化合物の別の好ましい使用は、アルツハイマー病のようなコリン作動性疾患を防止又は治療するのに特に有用である経皮性非経口処方物中である。したがって、これらの領域に投与するのに適した組成物は、本発明内に含まれる。前記の非経口溶液又は懸濁液は、経皮的に投与され、皮膚パッチを用いて供給される。所望により、それらはゴマ油のような適切なビヒクル中で注射により投与され得る。
したがって、活性化合物及び徐放性マトリックスの混入は、経皮的投与のために実行される。化合物は、組成物の約０．０１〜９９％の量で、好ましくはビヒクル又は担体中に約２５〜８５重量％の活性成分の量で経皮投与される。
経皮的治療系は、無傷皮膚に適用される場合、全身循環に制御速度で薬剤（単数又は複数）を供給する自己含入投与形態である。経皮投与経路を用いる利点としては、以下のことが挙げられる：治療効能の増強、投与頻度の低減、血中濃度対時間プロフィールの最適化による副作用の低減、多数回投与スケジュールによる患者のコンプライアンスの増大、肝臓「一次通過」代謝のバイパス処理、胃腸不適合性の回避、並びに活性の予測可能及び延長可能持続期間の提供。しかしながら、皮膚の主な機能は、化合物の進入に対する関門として作用することである。結果的に、経皮療法は、皮膚関門を通り抜ける拡散に対して望ましい物理化学的特性を有する限定数の薬剤にとって好ましい。皮膚の関門機能を克服する有効な一方法は、経皮療法系の処方物中に浸透増強剤を含むことである。
浸透増強剤は、処方物中に含まれると皮膚の透過性を薬剤ラインまで一時的に増大して、より短時間でより多くの薬剤を吸収させる化学化合物である。例えば、ジメチルスルホキシド、ｎ−デシルメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（アゾンAzone）、プロピレングリコール、エタノール、ピロリドン、例えばＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）及び界面活性剤のような、いくつかの異なる種類の浸透増強剤が報告されている。
前記の化合物は、単独で、又は製剤担体と組合せて、貯蔵所中に存在し得る。本発明の目的に対して許容可能な製剤担体は、薬剤、宿主又は薬剤供給用具を構成する物質に悪影響を及ぼさない公知技術の担体である。適切な製剤担体としては、滅菌水、食塩水、デキストロース、水又は食塩水中のデキストロース、ヒマシ油１モル当たり約３０〜３５モルの酸化エチレンから成るヒマシ油及び酸化エチレンの縮合生成物、液体酸、低級アルカノール、乳化剤、例えば脂肪酸のモノ−又はジ−グリセリドを伴う油、例えばコーン油、ピーナツ油、ゴマ油等；又はホスファチド、例えばレシチン等；沈殿防止剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリ（ビニルピロリドン）等の存在下で、単独で又は適切なっ分配剤、例えばレシチン、ポリオキシエチレンステアレート等を伴うグリコール、ポリアルキレングリコール、水性媒質が挙げられる。担体はさらに、補助剤、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤等を浸透増強剤及び本発明の化合物と一緒に含有し得る。
哺乳類に関する有効量は、治療される被験者の年齢、体重活動レベル又は症状といった因子によって変わり得る。典型的には、本発明の化合物の有効投与量は、１日１〜３回経口又は直腸投与により投与する場合、約１〜８００ｍｇである。これは、１日当たり、投与される被験者の体重１ｋｇ当たり約０．００２〜約５０ｍｇである。好ましくは、約１０〜約３００ｍｇが、成人に対して１日１〜３回、経口的に又は経直腸的に投与される。非経口的に投与される場合には、必要用量はかなり少ない。好ましくは約０．０１〜約１５０ｍｇが成人に対して１日１又は２回、筋肉内に又は経皮的に投与される。
本発明に用いるための化合物は、組成物の約０．０１〜約９９重量％、好ましくは約２５〜８５重量％の量で、局所的に投与される。本発明の方法は、有効量の本発明の化合物又は有効量の本発明の製剤組成物をこのような治療が必要な哺乳類に投与することから成る。
本発明の試験では、ストーン迷路と呼ばれる１４単位のＴ迷路における老齢Fischer-344（Ｆ３４４）ラット（月齢２１〜２２歳）の成績に及ぼす長期シムセリン治療（５日）の影響を、我々は査定した。この試験のためのストーン迷路paragigmの使用は、２つの従来の観察：（１）薬理学的及び試験した病変により実証されるような成績におけるコリン作動系の公知の関与、及び（２）Fischer-344（Ｆ３４４）系統を含めた数種の齧歯類系統で実証された成績における顕著な年齢関連減衰により支持される。この試験にＦ３４４ラットを用いることは、特定脳領域におけるコリン作動性マーカーの老齢化関連減衰、及び種々のコリン作動性処置後のこの系統からの老齢ラットの記憶成績の改良がそれぞれ実証されているために、正当であると容認される。
雄Ｆ３４４ラット２１〜２２ヶ月齢は、National Institute on Agingから契約下でHarian-Sprague-Dawleyから入手した。予め特性化したような特定病原体を含有しない条件下でGerontology Research Centerの動物飼育所で、２匹／ケージでラットを保持した。
前記のように、ストーン迷路は半透明プラスチックで構築され、スクランブルフットショック用に床を金網格子にして、迷路外の手がかりの利用可能性を低減するために灰色の壁で周囲を囲った。予備訓練のために用いられる他の装置だけが真っ直ぐな走路（２ｍ）であった。迷路と同様に、走路も半透明プラスチック製で、スクランブルフットショック用に床を金網格子にして、灰色壁で取り囲んだ。
開始１日目に、ラットに、食塩水対照群として０．９％ＮａＣｌを、又は食塩水に溶解した酒石酸シムセリンを１日１回腹腔内注射で、０．５及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、２〜５日目に継続投与した。３〜５日目には、行動試験の３０分前に注射した。２日目に訓練を開始して、直線走路で一方向能動回避で訓練を施した。各試験では、ラットは、フットショック（０．８ｍＡ）の開始を避けるためには、出発箱からゴール箱に１０秒以内で移動しなければならなかった。２日目に１０回、３日目に１０回の試験をラットに施した。最大３０試験内の連続１０試験内に８回避の成績判定基準をラットが満たした場合に、試験を終結した。この試験を満たしたラットだけが翌日、ストーン迷路で試験を受けた。
４日目と５日目の午前中及び午後に４回の試験期間を計画されたストーン迷路で、ラットに訓練を施した。各試験中、ラットは、ギロチンドアで各々仕切られた５つの迷路を通って、スタート箱からゴール箱まで移動しなければならなかった。強化偶然性により、動物がドアを通って次のセグメントに移動すると終了される軽度のフットショック（０．８ｍＡ）の開始を避けるためには、ラットは１０秒以内に各セグメントを通り抜ける必要があった。先のセグメントに進入後、前のセグメントからのドアは、引き返せないように閉じられた。正しい経路からの逸脱と記録される場合、エラーは一次従属変数であり、マイクロプロセッサーに接続された一連の赤外線センサーにより自動的にカウントされた。スタート箱からゴール箱までの走行時間も、自動的に記録された。フットショックの頻度及び持続時間は、機械的操作クロックで記録された。
薬剤処置の影響は、予備訓練中は観察されなかった。全ラットに関する平均（ｓ．ｅ．ｍ．）回避率は、対照、並びに１、２及び３ｍｇシムセリン群に関して、それぞれ、６７％（１．７）、６５％（２．８）、６３％（３．８）及び６１％（３．９）であった。偏すの一方向分析（ＡＮＯＶＡ）は、このパラメーターにおける有意の群差を示さなかった（Ｆ（３，４０）＜１．０）。
シムセリン処置は、対照条件と比較して、ストーン迷路でなされたエラー数を有意に低減した（図５）。この作用は、訓練の最終ブロック中に最も顕著であって、３ｋｇ用量に関して最小作用が現れた。最終係数に関する反復測定により、４つの（試験ブロックの）ＡＮＯＶＡによる４つの（薬剤群）の結果において、統計的確証が提供された。群の有意の主要作用  Ｆ（３．４２）＝３．４１，ｐ＝０．０３、試験ブロックの有意の主要作用  Ｆ（３，１２６）＝１５１．６，ｐ＜０．０００１を生じたが、しかしブロック相互作用による群は、統計的有意  Ｆ（８，１２６）＝１．５５，ｐ＝０．１３に達しなかった。したがって、エラーの個々の比較は、全市県を通しておこなわれた。１及び２ｍｇ／ｋｇ群だけが、対照に比して、成績の有意の改善を示した。
他の成績変数（走行時間、ショック頻度及び持続時間）も、エラーに関して観察されたよりも低い一致度に、シムセリン処置ラットでは低減された。各変数に関するデータは、最終係数に関する反復測定により、４つの（試験ブロックの）ＡＮＯＶＡによる４つの（薬剤群）で最初に分析された。薬剤の有意の主作用は、これらの分析からは出現しなかった；しかしながら薬剤ｘブロック相互作用は、各々で有意であった（ｐ＜０．００５）。したがって、さらに各ブロックでの対照群に対するｔ−検定比較を用いて、データを分析した。１．０ｍｇ／ｋｇシムセリンで処理したラットは、対照に比して、ブロック３及び４で走行時間、ショック頻度及び持続時間の有意の低減を示した。２．０ｍｇ／ｋｇ群では、これらの成績パラメーターはブロック４で有意に低減された。３．０ｍｇ／ｋｇ群は、ブロック４でのショック持続時間に関してのみ対照と有意に異なった。ショック持続時間は、１．０ｍｇ／ｋｇ群のブロック２でも有意に低減された。要するに、これらの成績変数は、後期試験中にのみ、そして１．０ｍｇ／ｋｇ群で最も顕著に、有意に作用を受けた。いくつかの運動副作用、例えば微小振せんが、３ｍｇ／ｋｇ用量で処置したラットの２〜３匹に検出された；それ以外は、副作用はシムセリン処置ラットには認められなかった。
シムセリンの長期処置は、ストーン迷路における老齢化ラットの学習成績を顕著に改善した。１〜２ｍｇ／ｋｇの用量のシムセリンを摂取したラットは、エラーの有意の低減、並びに最後の２〜３回の試験中のその他の成績変数の改善を示した。この反応は、この有効な長期作用コリンエステラーゼ阻害薬の作用によるコリン作動性神経伝達の増強によるものと思われた。
本発明のさらに別の局面は、高選択的ＢＣｈＥ阻害薬がβ−アミロイド前駆体タンパク質合成及び分泌の低減に用い得る、という発見に関する。アルツハイマー病は、脳血管アミロイド及び細胞外老斑の形態でのアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の沈着を特徴とする。老斑の原発性コア構成成分は、アミノ酸６９５〜７７０の一群の大型グリコシル化膜貫通タンパク質に由来する残基３９〜４３の自己凝集タンパク質であるＡβペプチド、β−ＡＰＰである。β−ＡＰＰは、ＡＤ患者の脳中で沈着することが公知の毒性Ａβペプチドの供給源である。ＡＰＰ遺伝子の突然変異は、β−ＡＰＰ６９５〜β−ＡＰＰ７７０に関連し、そのいくつかが疾病過程における中心として、活性Kunitz族のセリンプロテアーゼ阻害薬（ＫＰＩ）ドメイン並びにβ−ＡＰＰのＡβ及びその他のアミロイド原性断片を含有するある種の族においてＡＤと同時分離する（Selkoe, J. Neuroparhol, EXP. Neurol. 53:438-447, 1994）。β−ＡＰＰは代替的タンパク質分解経路によりプロセッシング／代謝されて、異なる分解生成物を生じる。これらの例としては、分泌及びリソソーム／エンドソーム経路が挙げられる。分泌経路では、３つの異なるセクレターゼが関連していた。ヒトでは（ラットではそうではない）、大多数のβ−ＡＰＰがα−セクレターゼによりＡβ領域内で切断された非アミロイド原性可溶性β−ＡＰＰであるｓＡＰＰを生じるが、これは多数の有益な生理学的役割を有することが公知である。仮定上の代替的セクレターゼ切断物、γ−セクレターゼは、アミロイド原性の可能性がある配列を含有する切頭ｓＡＰＰγを生じる。これは、ラットで産生される選択的形態であり、仮定上のβ−セクレターゼによるヒトにおけるさらなる切断は、神経毒Ａβを産生する（Checler, J. Neurochem., 65:1431-1444,1995）。
β−ＡＰＰ及びその誘導体の合成、プロセッシング及び分泌は、脳でin vivoに起こり、生成物は、ヒト及び動物モデルの両方で脳及びＣＳＦにおいて検出可能であり、さらに組織培養でin vitroに起きて、その生成物は細胞培養の条件調節培地中及び細胞溶解物中で検出可能である。Ａβの沈着を調節する因子は、ＡＤにおける脳血管変化を理解する中心となる（Roberson & Harrell, Brain Res. Rev., 25:50-69, 1997）。この疾患は、皮質に突き出すコリン作動性ニューロンの劇的損失により、そして神経化学的には、特に記憶及び学習に関連した脳の領域におけるコリン作動系のシナプス前部（コリンアセチルトランスフェラーゼ  ＣｈＡＴ）マーカーの低減によっても特色づけられる（Perry, et al.,1978, 同上）。皮質及び海馬へのコリン作動性投射の損失とβ−ＡＰＰの合成及びプロセッシングとの間には明らかな関係が認められる（Wallace, et al., PNAS, 98:8712-8716,1993）。ＡＤのコリン作動性欠損は、前脳基底の神経毒病変によりラットでモデル化されており、最も一般的なものはマイネルト基底核（ｎｂＭ）を有する（Olton and Wenk, In, Psychopharmacology: The Third Generation of Progress（ed. Meltzer）Raven Press, NY, pp 941-954,1987）。ラットにおけるこのような病変は、ヒトのＡＤと同様、動物の皮質におけるコリン作動系の枯渇及びＡＤと共通の特徴を有する認識障害を引き起こす（Kesner et al.,Behav. Neursci., 101:451-456,1987）。さらに、コリン作動性前脳病変は、ラットの皮質中のβ−ＡＰＰ  ｍＲＮＡ及びＣＳＦ中の全長Ａβを含有する分泌β−ＡＰＰのレベルを有意に増大する（Wallace et al., Mol. Brain Res. 10:173-178,1991）。
Lahiri等（ANN, NY. Acad. Science, 828:416-421,1997）による報告では、βＡＰＰのプロセッシングが異なるコリンエステラーゼ阻害薬により調節され得るという可能性が調べられた。多数の細胞株、即ちグリア芽細胞腫、ＨｅＬａ、神経芽細胞腫及びＰＣ１２からの分泌形態のβＡＰＰの分泌に及ぼすコリンエステラーゼ阻害薬の影響を確定するために試験された薬剤としては、３，４−ジアミノピリジン、メトリフォネート、フィソスチグミン（化合物１，表１）及びタクリンが挙げられる。観察された結果は、タクリンによるニューロン細胞の治療はβＡＰＰの分泌を調節せず、それを低減するが、一方他の薬剤、即ちすべての古典的抗コリンエステラーゼはどれも、このような分泌の変化を生じなかった。これらのその他の薬剤により示されるあらゆる活性がそれらの抗コリンエステラーゼ活性とは無関係である、ということが示唆された。これらの試験に用いた化合物はいずれも、高選択的ＢＣｈＥ阻害薬でなかった。
さらなる研究で、選択的ＡＣｈＥ（化合物２、３（フェンセリン及びトルセリン）表１）及びＢＣｈＥ（化合物４（シムセリン）、表１）阻害薬の作用を、ヒト神経芽細胞株に対して査定した。状態調節培地中で測定した分泌レベル、及び細胞溶解物中で測定したβＡＰＰの細胞レベルが査定され、未処置細胞中で達成されたレベルと比較された。すむセリンはβＡＰＰの細胞レベルを劇的に低減したが、これは合成の低減、そして同様に分泌βＡＰＰレベルの低減を示す（図２）。
選択化合物が細胞中及び分泌βＡＰＰレベルを調節する能力を確定するために用いうる方法を以下に示す：
１〜１．５ｘ１０7個の各種類の細胞（ニューロン及び非ニューロン）をそれぞれの培地で培養した。薬剤を付加する前に、細胞に０．５％のＦＢエス（低血清）のみを含有する培地を供給した。次に被験化合物の非存在下で、又は存在下で細胞をインキュベートした。１２〜４８時間インキュベート後、核プレートからの状態調節培地を収集し、それと細胞の両方を８００ｇで１０分間遠心分離した。状態調節培地を収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５％ナトリウムデオキシクロレート、各々１μｇ／ｍｌのアプロトニン、ロイペプチン及びＴＬＣＫ、並びに０．１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡを含有する緩衝液中で細胞を溶解させた。細胞を４℃で１１，０００ｇで１０分間、遠心分離した。Bradford染料結合法（Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254,1976）により、上清溶液（細胞溶解物）のタンパク質を測定した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティングに関しては、対照実験では、等濃度のエタノールをビヒクルとして用いたが、これは培地中に１％未満である。約０．１５〜０．５ｍＭの化合物用量が用いられる。１００μｌの状態調節培地又は総細胞溶解物からの３０μｇのタンパク質を、ＳＤＳを含有する１２％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離した。アビジンビオチニル化複合体検出キット（Vector Laboratories）（Lahiri et al., J. Neurosci; Res. 12:777-787（1994））を用いて、イムノブロット分析を実施した。使用した抗血清は、細胞膜中に見出されるβＡＰＰのすべての成熟形態、並びに状態調節培地中に分泌されるカルボキシル切頭型可溶性形態、及びＡＰＰ様タンパク質を認識するｍＡｂ２２Ｃ１１クローン（Boehringer Mannheim）からであった。さらに、Ａβの残基１〜２８を認識するｍＡｂ６Ｅ１０が用いられた。薬剤作用がβＡＰＰに対して選択的であり、そしてすべてのタンパク質に非選択的に作用しないことを確証するために、ヒトプロテアーゼネキシンＩＩ（ＰＮ−ＩＩ）に対して生じる生じる抗体及び抗ＨＳＰ−７０（熱ショックタンパク質−７０  ＨＳＰ−７０に対して生じる抗体）を用いた。ビオチニル化二次抗体、ウマ抗マウス及びヤギ抗ウサギ（Boehringer Mannheim及びVector Labs）も用いた。前記の検定法を用いて、本発明のどの高選択的ＢＣｈＥ阻害薬が分泌及び細胞形態のβＡＰＰの合成及び分泌を調製する能力を示すかを確認した。図２に示したように、シムセリンはβＡＰＰレベルを劇的に低減し、βＡＰＰに対してｍＡｂ２２Ｃ１１及び６Ｅ１０により査定した場合にはその他の分泌タンパク質、例えばＨＳＰ−７０に影響を及ぼすことなく、そうした。
選択的ＢＣｈＥ阻害薬の代表であるシムセリンはさらに、in vivoでのβＡＰＰ合成／プロセッシングを変えた。コリン作動性前脳（マイネルトの基底核）の病変を有するラットでは、βＡＰＰのレベルは、前記のようなシナプス前部コリン作動系の枯渇、モデルＡＤ、並びに皮質及び海馬における高度脳中心へのコリン作動性投射の低減の結果として、ＣＳＦ中で直ちに且つ劇的に増大した（図３、病変を有する対照群対見せかけの対照）。試験は、ヒトの場合とは異なり、分泌βＡＰＰはＡβの善緒を含有するが、しかしそれはラットにおいてはセクレターゼ作用により切断されて毒性Ａβペプチドを生じることはなく（Wallace et al., J. Neurosci., 15:4896-4905,1995）、それゆえＡＤはヒトに独特である。したがって、ラットにおいては、全長Ａβペプチドを含有するβＡＰＰの上昇は、ヒトにおけるＡβの産生増大を模している。
前脳コリン作動性病変を有するラットへのシムセリンの投与は、分泌βＡＰＰの上昇を遮断する（図３）。これはβＡＰＰに及ぼすシムセリンのin vitro作用と一致し、さらに腹腔内経路で１日２回、７日間投与された全身投与すむセリンは血液脳関門を容易に通り抜けて、脳に進入する、ということを実証する。実際、図４に示すように、その全身投与（静脈内経路で１ｍｇ／ｋｇ）後、シムセリンは容易に進入して、血漿中のレベルの約４０倍高いレベルで嚢中に保持される。さらに、図３に示すように、シムセリンはコリン作動性病変を示さない動物で、即ちシムセリン単独ラット対純対照ラットにおいて、βＡＰＰのレベルを低減した。
選択化合物がin vivoで分泌βＡＰＰレベルを調節する能力を確定するために用い得る方法を以下に示す：
前脳コリン作動系病変に関しては、興奮毒としてＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）を用いて、マイネルトの基底核（ｎｂＭ）の一側性皮質下病変をラットに起こさせた。これに着手するに際して、ラットを麻酔して、上切歯のレベルと耳内を通る線で固定する定位脳手術装置に入れた。３３ゲージ注入カニューレを、脳の一側のｎｂＭ内の２つの部位に挿入した（それぞれ、ＡＰブレグマ、ＭＬ  −２．８ｍｍ、ＤＶ  −８．０ｍｍ  ｒｅ：頭蓋及びＡＰブレグマ  −０．８ｍｍ、ＭＬ  −３．０ｍｍ、ＤＶ  −７．８ｍｍ）。ＰＢＳ緩衝液（生理学的ｐＨ）中の５０ｍＭ  ＮＭＤＡの溶液  １μｌを、各部位に徐々に注入した。病変に関する対照は、ビヒクル単独及びＮＭＤＡ処置動物の対側であった。
βＡＰＰレベルの分析のためのＣＳＦの収集は、死亡直後のラットの大槽からアリコートを取り出すことにより着手した。βＡＰＰの定量は、ｍＡｂ２２Ｃ１１を用いたイムノブロット分析により実行した。
ラットにおけるシムセリンの脳及び血漿時間依存性動態は、麻酔動物の伏在静脈中に化合物を投与することにより調べた。特定時間に過剰麻酔して動物を屠殺糸、血液及び脳標本を直ちに採取した。血液を遠心分離（１０，０００ｇ、２分間）し、血漿を脳の標本と一緒に採取し、−８０℃で保存した。高速液体クロマトグラフィーにより、シムセリンの濃度の定量をおこなった。
本発明のさらに別の実施態様では、高選択的ＢＣｈＥ阻害薬は、蛍光標識を導入することにより修飾し得る。その結果得られた標識試薬は、脳組織切片のアルツハイマー病及びその他の痴呆に関連した病変又は病理学的状態の組織化学的検出に用い得る。当業界で公知のあらゆる適切な蛍光標識、例えばフルオレセインが用いられる。高選択的ＢＣｈＥ阻害薬の標識誘導体は、それ自体公知の方法で、例えばこのような阻害薬を５−［４，６−ジクロロトリアゼン−２−イル−アミノ］フルオレセインと反応させ、反応生成物を当業界で公知の方法、例えば薄層クロマトグラフィーにより精製することにより、調製し得る。
脳スキャン、特に陽電子射出断層撮影法及びシングルフォトンエミッション断層撮影法を実施する場合に用い得る高選択的ＢＣｈＥ阻害薬の誘導体としては、以下のものが挙げられる：表１の化合物及びその類似体で、in vitro又はin vivo画像法／定量のための蛍光又は検出をそれらに提供するための適切な部分を有するもの。
したがって、適切な修飾を有する以下の放射性薬剤を、必要な場合には、当業界で十分公知の方法を用いて、あらゆる高選択的ＢＣｈＥ阻害薬に結合させ得る：ヨウ素131又はヨウ素123、キセノン133、クリプトン481、ガリウム67、インジウム111、炭素11、窒素13及びフッ素18。これらの同位元素は、例えば冷キットとして導入し得るし、そして適切な化学物質を用いて再構成される。再構成化合物は、患者に投与後、特定の薬剤、並びに放射能標識が取り付けられる部分の物理的及び化学的特性により身体内に分布される。
これらの薬剤は、脳並びに全身辺縁領域における診断：例えばアルツハイマー病における脾臓での並びに脳での辺縁性アミロイドの沈着に用いられる。当業界で十分公知の方法を用いて、これらの放射性薬剤を血液脳関門を通り抜ける担体分子、例えばシムセリンに結合すると、特異的神経病理学診断薬が作られる。
一例は、脳画像法に用いられる過テクネチウム酸テクネチウムの使用である。本発明の高選択的ブチリルコリンエステラーゼ阻害薬と組合せたこの薬剤は、脳のある区域、例えば脈絡叢に局在する。
最適の種類の放射性薬剤は、そのエネルギーのほとんどをγ線の形態で有する。核医学に用いられる診断装置は、一定の最適検出エネルギーレベルを有する。核医学に用いられる放射性物質のほとんどが、安定元素を放射性形態に転換することにより作られる。転換は、陽子又は中性子で安定元素を衝撃する原子炉又はサイクロトロンにより実行される。
フィルムレス検出器中を前進させると、感光性元素に衝突する光子の数についての情報が得られる。このデータは、データ処理算法の使用と組合せ留と、医学的画像法の力を増大した。診断画像形成装置としては、コンピューター連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）、シングルフォトンエミッションコンピューター連動断層撮影（ＳＰＣ）、デジタルサブトラクションアンギオグラフィー（ＤＳＡ）、シンクロトロン放射線による血管造影画像法、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が挙げられる。
画像法に用いられる主な同位元素は、炭素１１、酸素１５、窒素１３である。これらの作用物質は、中性子プアな、陽電子射出同位元素である。それらはサイクロトロンにより産生され、本発明の化合物中に容易に取り込まれる。
したがって、本発明のこの局面の実施態様は、高選択的ブチリルコリンエステラーゼ阻害活性を示す化合物であり、これらは放射性薬剤を混入し、したがってアルツハイマー病に関連した病変又は病状の存在を検出するための患者の画像化に適した薬剤を提供することにより調製される。このような薬剤は、当業界で公知の交換神経性経路により導入される。したがって、例えば高選択的ブチリルコリンエステラーゼ阻害薬のカルボミル部分は、Bonnot（J. Label Comp. Radiopharm. 33［4］,277-284（1993））が用いた一般的手法を用いることによりα炭素11部分として提供される。その結果生じる化合物は患者に非経口的に投与され、脳に進入して、そこでそれらはあらゆる病変又は病状と選択的に結合し、ＰＥＴスキャンのような適切な画像化装置により検出される。
参考文献
0004522499.tif 000002
0004522499.tif 000003
【図１Ａ】
0004522499.tif 000004
【図１Ｂ】
0004522499.tif 000005
【図１Ｃ】
0004522499.tif 000006
【図２】
0004522499.tif 000007
【図３】
0004522499.tif 000008
【図４】
0004522499.tif 000009
【図５】
0004522499.tif 000010