(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．温度応答性高分子が被覆されたＡ領域と、
（１）細胞と親和性の高い高分子が被覆されている領域、
（２）Ａ領域と異なる量の温度応答性高分子が被覆されている領域、
（３）Ａ領域と異なる温度に応答する高分子が被覆されている領域のいずれか、または（１）〜（３）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持ち、（２）の異なる量とは、Ａ領域とＢ領域との被覆量の差が少なくとも０．１μｇ／ｃｍ２以上であることを意味し、また、（３）の異なる温度とは、Ａ、Ｂそれぞれの高分子の応答する温度の差が少なくとも２℃以上であることを意味することを特徴とする細胞培養支持体材料。
【請求項２】
被覆領域の形態が、上部から観察して、（１）ラインとスペースからなるパターン、（２）水玉模様のパターン、及び（３）格子状のパターン、からなる群から選択される、請求項１記載の細胞培養支持体材料。
【請求項３】
少なくとも１つの温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１または２記載の細胞培養用支持体材料。
【請求項４】
（１）基材表面上全体にまずＢ領域を作成し、その後、最終的にＢ領域となる部分をマスクしてＡ領域を上乗せする方法、或いはそのＡ，Ｂを逆にした方法、（２）基材表面上全体にまずＢ領域を作成し、その後、最終的にＡ領域を構成するものを噴霧して上乗せする方法、或いはそのＡ，Ｂを逆にした方法、（３）被覆物質をあらかじめ溶媒中に分散、或いは乳化させ、これを塗布する方法、（４）あらかじめＡ，Ｂの２層を被覆しておき、超音波或は走査型機器によりどちらかの層を削り取る方法、（５）被覆物質をオフセット印刷する方法、を単独使用または併用することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項記載の細胞培養支持体材料の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項記載の細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞の共培養方法。
【請求項６】
Ｂ領域の全てが温度応答性高分子で被覆されていない請求項１ないし３のいずれか１項記載の支持体表面上において、まず細胞を所定期間培養させた後、温度応答性高分子上の細胞の全てもしくは一部を剥離、除去し、その後、異種の細胞を播種し培養させること、或いはさらにそれを繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。
【請求項７】
Ｂ領域のすべてが温度応答性高分子で被覆されている請求項１ないし３のいずれか１項記載の支持体表面上において、まず細胞を所定期間培養させた後、温度応答性高分子上の細胞の一部を剥離、除去し、その後、異種の細胞を播種し培養させること、或いはさらにそれを繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。
【請求項８】
Ｂ領域の全てもしくは一部に、Ａ領域と異なる温度応答性高分子が被覆されている請求項１ないし３のいずれか１項記載の支持体表面上において、まずＡ、Ｂいずれかの領域の高分子上に細胞を付着、増殖させ、その後、もう一方の高分子上に異なる細胞を付着、培養させることを特徴とする細胞の共培養方法。
【請求項９】
請求項１ないし３のいずれか１項記載の支持体上で、培養開始時から複数の種類の細胞を播種し、培養させ、その後、その全てもしくは一部を剥離させ、再びそのものを基材に付着させること、或いはさらにそれを繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。
【請求項１０】
共培養する細胞の組み合わせが、肝細胞と内皮細胞、肺胞上皮細胞と線維芽細胞、神経細胞とグリア細胞であることを特徴とする請求項５〜９記載の細胞の共培養方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０の共培養方法によって得られる支持体表面上の細胞を剥離させることで得られる共培養細胞シート。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生物学、医学および免疫学等の分野における細胞培養用支持体材料並びに該支持体材料を用いた細胞の共培養方法およびその方法より得られる細胞シートの作製方法に関する。
背景技術
近年、人工臓器の開発、再生医学、安全性評価並びに医薬品開発等を目的とする細胞培養が注目され、その技術も多種多様化し、ますます高度なものとなってきている。その一例として、２種以上の細胞を同一の培養基材上で培養するといった共培養法（共存培養とも称される）が挙げられる。
従来、細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を行った合成高分子の表面上にて行われていた。例えば、ポリスチレンを材料とする表面処理、例えばγ線照射、シリコーンコーティング等を行った種々の容器等が細胞培養用容器として普及しているが、多種多様なの培養方法に十分に対応できるものではなかった。
特公平０６−１０４０６１号公報には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。しかしながら、ここで示される支持体では温度応答性高分子が基材表面に均一に被覆されたもので、基材表面で培養した細胞をすべて剥離させてしまい、この基材においても多種多様な培養方法に十分に対応できるものではなかった。
ところで、上記のような細胞培養用容器を用いて複数の細胞を増殖させ共培養することは極めて難しい。例えば、肝実細胞の長期培養化には、（生体の肝臓の構造を考えて）共培養が有効であると考えられているが、ただ単に肝実細胞と線維芽細胞あるいは肝実質細胞と内皮細胞との混合等では安定に共培養することはできない。
肝臓中では肝実質細胞は決して単独で存在しているわけではない。肝臓は、肝実質細胞の他、内皮細胞、星細胞等が構築する肝小葉と呼ばれる微細構造の反復からなる。肝実質細胞の機能維持にこれら非実質細胞が重要であるとの考えから共培養の検討がなされてきた。また、人工肝モジュールに初代肝実質細胞を組み込む際、非実質細胞の混入がある方が肝分化機能を維持できるという観察からも、非実質細胞の必要性は強く示唆されている。しかし、通常の培養皿を用いる方法では超短期的な共培養しか実現できない上、また共培養する両細胞数の比率を変える以外には十分な検討ができず、詳細を明らかにすることはできなかった。
トナーらは、シリコーン表面上にラミニンをフォトレジスト技術を用い、光照射でパターン化して固定させた（Ｓ．Ｎ．Ｂｈａｔｉａ，  Ｍ．Ｌ．Ｙａｒｍｕｓｈ，  Ｍ．Ｔｏｎｅｒ，  Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，３４，１８９−１９９（１９９７））。この表面上に肝実質細胞を培養すると、肝実質細胞はラミニン固定ドメイン上にのみ接着し増殖する。この後に、線維芽細胞を播種すると、この細胞が極めて接着性が高いために、シリコーンドメイン上に接着し、肝実質細胞との共培養系が達成された。しかし、どのような組み合わせでもこれができるのではなく、肝実質細胞と、線維芽細胞ほどに接着性が高くない内皮細胞との共培養は達成することができない。
特開平４−９４６７９号公報では、上記特公平０６−１０４０６１号公報に示される技術を発展させ、基材表面の温度応答性高分子をパターン状に被覆させ、それを用いて細胞を培養する方法を記載している。しかしながら、ここで示される基材では、温度応答性高分子が付着していない基材表面の細胞親和性が弱く、複数の細胞の培養を目的とした基材としては不十分であった。また、この基材を用いる限り、共培養後に基材表面に広がった細胞シート全体を剥離させることはできなかった。
発明の開示
本発明は、多岐にわたる細胞培養法に対応できる細胞培養用支持体材料を提供することを目的とする。また、この支持体材料を用いることで上記のような問題点を解決するためになされたもので、例えば接着性が高くない内皮細胞のような細胞と肝実質細胞のような他の細胞との共培養を可能にする細胞の共培養方法およびそれより細胞シートを作製する方法を提供することを目的とする。
本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料に関する。
また、本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞の共培養方法に関する。
さらに、本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞シートの作製方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明で示される支持体材料とは、温度応答性高分子が被覆されたＡ領域と、
（１）細胞と親和性の高い高分子が被覆されている領域、
（２）Ａ領域と異なる量の温度応答性高分子が被覆されている領域、
（３）Ａ領域と異なる温度に応答する高分子が被覆されている領域
のいずれか、または（１）〜（３）の任意の２つもしくは３つの組み合わせからなるＢ領域の２領域を表面に持つことを特徴とするものである。
その製造法としては、最終的に上記の構造を有するものであれば何ら制約されるものではないが、例えば、▲１▼基材表面上全体にまずＢ領域を作成し、その後、最終的にＢ領域となる部分をマスクしてＡ領域を上乗せする方法、或いはそのＡ，Ｂを逆にした方法、▲２▼基材表面上全体にまずＢ領域を作成し、その後、最終的にＡ領域を構成するものを噴霧して上乗せする方法、或いはそのＡ，Ｂを逆にした方法、▲３▼被覆物質をあらかじめ溶媒中に分散、或いは乳化させ、これを塗布する方法、▲４▼あらかじめＡ，Ｂの２層を被覆しておき、超音波或は走査型機器によりどちらかの層を削り取る方法、▲５▼被覆物質をオフセット印刷する方法、等を単独または併用する方法が挙げられる。
被覆領域の形態は、上部から観察して、例えば、▲１▼ラインとスペースからなるパターン、▲２▼水玉模様のパターン、▲３▼格子状のパターン、その他特殊な形のパターン、或いはこれらが混ざっている状態のパターンが挙げられるが、何ら限定されるものではない。
被覆領域の大きさは何ら限定されるものではないが、後述する複数の細胞を共培養する際には、隣接するＡ、Ｂ領域に存在する細胞間で最も長い距離（中心間距離）が１ｃｍ以下、好ましくは０．０５ｍｍ〜８ｍｍ、さらに好ましくは０．１ｍｍ〜３ｍｍが良い。１ｃｍ以上の場合、共培養している異種の細胞間の影響が弱くなり、共培養の効率が悪くなり好ましくない。逆に、０．０５ｍｍ以下であるとＡ，Ｂ領域の何れか、若しくは両方の領域において細胞が増殖するための十分なスペースがなく共培養の効率が悪くなり好ましくない。
被覆を施される細胞培養支持体の材質は、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用いることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレート、ファイバー、（多孔質）粒子であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を有したものであっても差し支えない。
細胞培養支持体への温度応答性高分子の被覆方法は、支持体基材と被覆物質を、（１）化学的な反応によって結合させる方法、（２）物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な反応によって結合させる場合は、電子線照射（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ；ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、支持体と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。
細胞と親和性の高い高分子としては、例えば、イオン性基、親／疎水性基等を有するもの、また、それらを基材表面に被覆後、グロー放電、コロナ放電などで表面処理を施したもの、さらには、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白質のいずれかもしくは組み合わせた高分子或いはそれらの処理物で良く、特に限定されるものではない。
細胞培養用基材は、通常、基材表面に細胞が付着し易くさせるためグロー放電、コロナ放電などで表面処理を施されている。本発明の技術は、この表面をＢ領域として用い、温度応答性高分子からなるＡ領域を作成しても良いが、このものでは後述するＡ領域の細胞を剥離させる際、Ｂ領域に付着した細胞も若干引きずられて剥離してしまい、効率が悪く好ましくない。この場合、Ｂ領域の細胞付着性を強めることでそのような問題が解決できることが分かった。
温度応答性高分子の被覆量は、０．１〜５．０μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは０．３〜３．０μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．５〜２．５μｇ／ｃｍ２である。０．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、温度を変化させても当該高分子上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に５．０μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に培養することが困難となる。
Ａ，Ｂ両領域に温度応答性高分子が付着されている場合、Ａ，Ｂ間の被覆量の差は少なくとも０．１μｇ／ｃｍ２以上必要で、好ましくは０．２０μｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは０．５０μｇ／ｃｍ２以上必要である。０．１０μｇ／ｃｍ２以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうので好ましくない。
高分子の被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆領域の染色や蛍光物質の染色による分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独或いは併用して求めることができる。本発明のＡ，Ｂ領域の広さが分析可能な範囲より狭い場合は、あらかじめ分析可能な広さで被覆量を求めておく必要があり、その条件と同条件で被覆すれば良い。
本発明の温度応答性領域を作製するために用いる温度応答性高分子はホモポリマーであっても共重合体であってもよい。使用し得る温度応答性高分子の基本構成単位としては、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度７２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度５６℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、さらに１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン（同５６℃）、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン（同約６℃）、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下限臨界溶解温度３５℃）等のビニルエーテル誘導体、また増殖細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水、疎水性のバランスを調整する等の目的で、上記以外のモノマー類との共重合、重合体同士のグラフト重合または共重合、あるいは重合体、共重合体の混合物を用いてもよい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
Ａ，Ｂ両領域に異なる温度応答性高分子が付着されている場合、Ａ，Ｂそれぞれの高分子の応答する温度の差は少なくとも２℃以上必要で、好ましくは４℃以上、さらに好ましくは８℃以上必要である。２℃以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうので好ましくない。
本発明者らは、異種の細胞をパターン化した基材上に培養することで共培養を実現する新手法を開発した。
例えば、支持体表面にＢ領域として細胞と親和性の高い高分子を被覆させ、その中にＡ領域としてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＩＰＡＡｍとする）を固定化して温度応答性領域をデザインし、この領域上の細胞の接着／脱着を利用する手法である。すなわち、例えば、まず所定の細胞を３７℃で単層（シート）に培養した後に、温度応答ドメイン上の細胞のみを温度低下（例えば、２５℃以下）によって剥離させる。温度を再び３７℃に上昇させた後に違う細胞を播種し、既にドメイン化した安定な所定の細胞中に異種の細胞領域を作る新手法である。肝実質細胞の単一培養系では、一週間後から次第に死んでいくのに対し、本発明の細胞培養支持体を用いる方法によれば、肝実質細胞と内皮細胞系では２週間以上にわたり（１カ月レベル）共培養が可能であり、肝実質細胞の機能（アルブミン産生能）は長期にわたり（２週間以上）維持された。
ここでの共培養方法の一例を以下に説明する。
１．３７℃の温度下で上記支持体の表面に細胞を接着し、増殖させる。低温で細胞を脱着することのできるＰＩＰＡＡｍ領域は３７℃で疎水性、３２℃以下で親水性に変化する。
２．この表面上に単層の細胞シートを作製することができる。したがって、温度応答性高分子を用いて温度応答性領域を特定の形状にすることによって、特定の形をくり抜いた細胞シートを支持体表面上に自由に作製することができる。
３．温度応答性領域を海／島構造あるいはストライプ構造など自由にデザインでき、０．１〜０．５ｍｍ以上の孔径の球状ドメインや幅のストライプドメインで、温度低下（２５℃以下）により、ＰＩＰＡＡｍがグラフトされていない部分に一方の細胞（以下、Ａ細胞と称する）が残る。
４．３７℃に戻すとＰＩＰＡＡｍ領域には細胞が接着するので、他方の細胞（以下、Ｂ細胞と称する）を播種し、増殖させることができる。
５．Ａ細胞とＢ細胞のパターンをコントロールして、共培養できる新しいシステムとなる。
６．Ａ細胞として肝実質細胞、Ｂ細胞として内皮細胞を用いた場合、各々の細胞をパターン化することで長期培養（２週間以上）が可能となる。また、肝実質細胞の長期機能培養（例えば、アルブミン産生３００ｎｇ／ｈ／１０５ｃｅｌｌｓを２週間以上維持すること）を行うことができる。肝実質細胞の長期機能培養ができるために、薬物開発等、様々な領域において希求されている培養肝実質細胞による化学物質の試験システムを構築することも可能である。
本発明では、温度応答性高分子が被覆されたＡ領域とＢ領域の一部若しくは全部がＡ領域と異なる量の温度応答性高分子で被覆されている細胞培養用支持体材料も示される。この場合、同じ温度でも高分子の被覆量が多い領域ほど応答性が速くなる。従って、処理時間の差によって片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明ではＡ、Ｂどちらの領域の被覆量が多くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。
本発明では、また、温度応答性高分子が被覆されたＡ領域とＢ領域の一部若しくは全部がＡ領域と異なる温度に応答する高分子で被覆されている細胞培養用支持体材料も示される。この場合、それぞれの高分子の応答する温度によって、片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明ではＡ、Ｂどちらの高分子の応答する温度が高くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。
本発明では、さらに、支持体表面上のＡ領域とＢ領域の全てが温度応答性の高分子で被覆されている場合、すべての高分子が応答するような温度、処理時間などの条件を選べば、支持体材料表面上で共培養された細胞全てをそのまま剥離させることができる。
また、その支持体表面上のＡ領域とＢ領域の全てが温度応答性の高分子で被覆されているものであれば、初めから複数の細胞が混在しているような状態で培養を始めても、基材表面に存在するパターンが異なる細胞間で接着性の差を生じ、同種の細胞同士が若干集まる傾向にあり、その傾向は温度処理によりさらに進行することが分かった。この操作を繰り返すことで、今まで分割困難な細胞同士でも分割できる。
かくして得られた細胞培養用支持体材料であれば、
前記トナーらの方法と異なり、本発明の共培養方法は細胞の組み合わせの制約がないので、すべての細胞種の間で共培養が可能である。例えば、肺胞上皮細胞と線維芽細胞、脳内の神経細胞とグリア細胞との共培養を挙げることができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
実施例１、２
市販のポリスチレン製細胞培養皿（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）社製ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３００２ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを４０％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．３５ｍｌ塗布した。その塗布面上に直径１ｍｍ、中心間距離１．５ｍｍの孔をもつ金属製マスク（図１のａ）をのせ、そのままの状態で０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、培養皿表面にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）をドメイン状（島状の部分。マスク下の部分は電子線が当たらず何も被覆されない海部分となる。）に固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していないＰＩＰＡＡｍを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養基材を得た。ここで島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量は、マスクを使わずに上と全く同条件で作製した細胞培養支持体材料より求めた。その結果、この条件下であれば、基材表面に温度応答性高分子が１．６μｇ／ｃｍ２被覆されることが分かった。細胞培養前に、１．５μｇ／ｍｌの濃度のフィブロネクチン溶液２ｍｌ（実施例１）、或いはコラーゲン溶液２ｍｌ（実施例２）を上記培養皿に入れ、２０℃１時間インキュベートすることにより海部分のみに吸着させること（２０℃では、ＰＩＰＡＡｍ部分は親水性であり、接着性蛋白を付着させなかった。）で本発明である細胞培養支持体材料を得た。
得られた細胞培養支持体材料上にて、常法によりウシ大動脈血管内皮細胞を培養した（使用培地：ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。３７℃、５％ＣＯ２下）。培養した結果を表１に示す。
実施例３、４
金属製マスクを、直径０．５ｍｍ、中心間距離０．８ｍｍのもの（実施例３）、直径１．５ｍｍ、中心間距離５ｍｍのもの（実施例４）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞培養支持体材料を得た。
実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
実施例５、６
上記ファルコン３００２ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを３５％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．３５ｍｌ塗布した後、そのままの状態で０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、培養皿表面全体にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を被覆させた。さらにその上にＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの１０％イソプロピルアルコール溶液（実施例５）、或いは２０％イソプロピルアルコール溶液（実施例６）を０．３５ｍｌ塗布し、その塗布面上に直径１ｍｍ、中心間距離１．５ｍｍの孔をもつ金属製マスク（図１のａ）をのせ、０．２５ＭＧｙ強度の電子線を照射し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）をドメイン状（島状の部分。）に多く被覆させた。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。ここで海部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量は、実施例１、２と同様により求めた結果、１．６μｇ／ｃｍ２であった。同様に島部分の被覆量はそれぞれ１．８μｇ／ｃｍ２（実施例５）、２．０μｇ／ｃｍ２（実施例６）であった。  得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
比較例１
上記ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの３５％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布した後、そのままの状態で０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、培養皿表面全体にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を被覆させた。その後、さらにその上にＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの４０％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布し、その塗布面上に直径１ｍｍ、中心間距離１．５ｍｍの孔をもつ金属製マスク（図１のａ）をのせ、０．２５ＭＧｙ強度の電子線を照射し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）をドメイン状（島状の部分。）に多く被覆させた。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様に海部分と島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量を求めたところ、それぞれ１．６μｇ／ｃｍ２、５．５μｇ／ｃｍ２であった。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
比較例２
１回目の照射時に６０％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布した後、そのままの状態で０．４ＭＧｙの強度の電子線を照射したこと以外は比較例１と同様な手段により細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様に海部分と島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量を求めたところ、それぞれ５．３μｇ／ｃｍ２、８．９μｇ／ｃｍ２であった。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
実施例７
上記ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、幅１ｍｍ、間隔１ｍｍのライン状に孔をもつ金属製マスクをのせ（のせた場所に印をつける。）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドモノマーの３５％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布させた後、０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射した。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、まず格子状にポリマーが被覆した基材を製造した。その後、先のマスクのライン状の孔を１ｍｍずらして置き（先のマスク部分に孔がくるようにする。）、今度はＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの３５％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布し、０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドポリマーとＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーがライン状に交互に被覆した。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様にそれぞれのポリマーの被覆量を求めたところ、いずれも１．６μｇ／ｃｍ２であった。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
実施例８、９
上記ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドモノマー（実施例８）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（実施例９）の３０％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布させたこと以外は実施例５、６と同様に培養皿表面全体にそれぞれのポリマーを被覆させ、その後、さらに実施例５と同様にＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの１０％イソプロピルアルコール溶液を塗布し、それぞれのポリマーが被覆された中にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）をドメイン状に多く被覆させた。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様に海部分と島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量を求めたところ、それぞれ１．５μｇ／ｃｍ２、２．０μｇ／ｃｍ２であった（実施例８、９共に同じ結果であった。）。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１、２と同様な方法でウシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表１に示す。
0004567936.tif 000002
実施例１〜９の結果から、本願発明で示される温度応答性高分子が被覆された種々の形態の細胞培養支持体材料いずれにおいても通常の細胞培養が行え、細胞の付着性、増殖性等のようすも市販のペトリディッシュと同等であった。一方、比較例１、２で示されるように、細胞培養支持体材料表面の一部、もしくは全部において温度応答性高分子が多量に被覆されているとき、その部分への細胞の付着は認められず、細胞培養支持体材料として好ましいものではなかった。
実施例１０、１１
実施例１、２で得られた細胞培養支持体材料（それぞれ実施例１０、実施例１１）上で、この表面にラット肝実質細胞を１０７個を播種し、３７℃で１日（実施例１０、図１のｂ）、および２日（実施例１１）培養させた（使用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。図１のｂによれば、全面に肝実質細胞が接着・伸展していることがわかる。
培養後、２０℃で２時間インキュベートし、ピペッティングによりＰＩＰＡＡｍドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた（例えば実施例１０の場合、図１のｃ）。図１のｃは、ＰＩＰＡＡｍをグラフトした温度応答性ドメインからのみ細胞が脱着したことを示している。
再び、細胞培養支持体材料の温度を３７℃にし、ラット血管内皮細胞を１０７個播種した。内皮細胞は細胞のいないＰＩＰＡＡｍドメインにのみ接着した。その後３７℃で３日間共培養した（使用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地とウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を１：１で混合したカクテル培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。図１のｄは、実施例１０の３日後の各細胞の増殖状態を示す図である。図１のｄによれば、マスクパターン通りに肝実質細胞と内皮細胞が安定に共培養できていることがわかる。
常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表２に示す。
比較例３
市販のペトリディッシュ  ファルコン３００２（直径６ｃｍ）上で実施例１０と同様にラット肝実質細胞を培養させた。培養後、実施例１０と同様に２０℃で２時間インキュベートし、ピペッティングにより基材表面の細胞を剥離させようとしたが困難であった。一方で、同じ細胞培養基材上でラット肝実質細胞を培養し続けた。そのときの肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表２に示す。
実施例１２
実施例５で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肝実質細胞を１０７個を播種し、３７℃で２日培養させた（使用培地：５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。培養後、２０℃で３０分間インキュベートし、ピペッティングによりＰＩＰＡＡｍが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた。再び、細胞培養支持体材料の温度を３７℃にし、ラット血管内皮細胞を１０７個播種した。内皮細胞は肝実質細胞の剥がれた細胞のいない部分のみに接着した。その後３７℃で３日間共培養した（使用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地とウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を１：１で混合したカクテル培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表２に示す。
比較例４
実施例５と同様な方法で、まずファルコン３００２ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）表面全体にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を被覆させた。その後、さらにその上にＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーの５％イソプロピルアルコール溶液を０．２ｍｌ塗布する以外は実施例５と同様な方法で細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様に海部分と島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量を求めたところ、それぞれ１．６μｇ／ｃｍ２、１．６５μｇ／ｃｍ２であった。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１２と同様な方法で肝実質細胞を培養した。培養後、２０℃で３０分間インキュベートし、ピペッティングによりＰＩＰＡＡｍが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させようとしたが、島部分だけでなく、海部分に存在する肝実質細胞も剥離してしまい、本発明の細胞培養支持体材料として好ましいものではなかった。
実施例１３
実施例８で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肝実質細胞を１０７個播種し、３７℃で２日培養させた（使用培地：５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。培養後、２５℃で１時間インキュベートし、ピペッティングによりＰＩＰＡＡｍが被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた。再び、細胞培養支持体材料の温度を３７℃にし、ラット血管内皮細胞を１０７個播種した。内皮細胞は肝実質細胞の剥がれた細胞のいない部分のみに接着した。その後３７℃で３日間共培養した（使用培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０−８Ｍデキサメサゾン、１０−７Ｍインスリン、１０ｍＭニコチンアミド、さらに１０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地とウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を１：１で混合したカクテル培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表２に示す。
比較例５
上記市販ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミドモノマーの３０％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍｌ塗布させたこと以外は実施例５、６と同様に培養皿表面全体にそれぞれのポリマーを被覆させ、その後、さらに実施例５と同様にＮ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミドモノマーの２０％イソプロピルアルコール溶液を塗布し、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミドポリマーが被覆された中にＮ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミドポリマーをドメイン状に多く被覆させた。照射後、実施例１、２と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例１、２と同様に海部分と島部分のＰＩＰＡＡｍの被覆量を求めたところ、それぞれ１．５μｇ／ｃｍ２、２．１μｇ／ｃｍ２であった。
得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例１２と同様な方法で肝実質細胞を培養した。培養後、２０℃で３０分間インキュベートし、ピペッティングによりＰＩＰＡＡｍが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させようとしたが、島部分だけでなく、海部分に存在する肝実質細胞も剥離してしまい、本発明の細胞培養支持体材料として好ましいものではなかった。
0004567936.tif 000003
実施例１０〜１３の結果から、本願発明で示される共培養方法に従えば、従来技術では数日しか保持できなかった肝実質細胞の活性（比較例３）を４週間という極めて長期にわたって保持させられることが分かる。
実施例１４
実施例７で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット脳内神経細胞を１０７個播種し、常法にて３０℃で３日培養（使用培地：５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌブタインスリン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、１００μＭプトレシン、５０μ単位／ｍｌストレプトマイシン、５０μ単位／ｍｌペニシリンを含むＭＥＭ、Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２  １：１混合培地。３０℃、５％ＣＯ２下）し、まずＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドポリマー上にラット脳内神経細胞をライン状に増殖させた。培養後、細胞培養支持体材料の温度を３７℃とし、ラットグリア細胞を１０７個播種し、培養した（使用培地：上の神経細胞を培養した培地とウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％含むＤＭＥＭ、Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２  １：１混合培地を１：１で混合したカクテル培地。３７℃、５％ＣＯ２下）。グリア細胞は神経細胞のない部分に接着し、ライン状に増殖した。その後３７℃で３日間共培養した。
その結果、神経細胞とグリア細胞はどちらか一方が多量に増殖するようなことはなく、またそれぞれが混じり合うようなこともなく、それぞれライン状に増殖させることができた。
このことより、本発明の細胞支持体材料を用い、本発明に示すところの共培養方法に従えば、従来、困難であった神経細胞とグリア細胞をパターン状に培養することが可能となり、この共培養されたものはバイオチップとして有用である。
実施例１５、１６
実施例１２、１３で共培養された肝実質細胞および血管内皮細胞を、細胞培養支持体材料と共に２０℃で２時間インキュベートし、ピペッティングすることにより全て剥離させた（それぞれ実施例１５、実施例１６）。常法に従い、剥離された細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表３に示す。
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実施例１５、１６の結果から、本願発明で示される共培養方法に従えば、従来技術では数日しか保持できなかった肝実質細胞の活性（比較例３）を４週間という極めて長期にわたって保持させられ、しかも実施例１０〜１３に示される活性よりさらに高くさせられることが分かる。
実施例１７
実施例５で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肺胞上皮細胞（全細胞数の１５％は線維芽細胞が混在）を１０６個播種し、常法に従い３７℃で１３日間培養（使用培地：２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０μｇ／ｍｌインスリン、１００ｎｇ／ｍｌコレラトキシン、５μｇ／ｍｌコルチゾールを含むＤＭＥＭ、Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２を１：１で混合したカクテル培地。３７℃、５％ＣＯ２下）し、細胞培養支持体材料表面全体に増殖させた。培養後、２０℃で２時間インキュベートし、ピペッティングすることにより基材表面の細胞全体を剥離させた。その後、細胞培養支持体材料内に３７℃の上記培地入れ、先に剥離させた細胞シートを戻した。
得られた結果を図２〜４に示す。図２，３は肺胞上皮細胞から分泌されるサーファクタントプロテインを常法に従い蛍光染色した結果である。線維芽細胞が混在した肺胞上皮細胞を細胞培養支持体材料から剥離させる前（培養１３日後、図２ａ）、肺胞上皮細胞からサーファクタントプロテインが十分に分泌されていることが分かるが、それをそのまま２２日間培養すると分泌量は激減している。一方、培養１３日後に、上記方法にて剥離させ、再び細胞培養支持体材料上に付着させたものは、剥離後さらに３０日培養（図３ａ）、６０日培養（図３ｃ）させても分泌されていることが分かる。このことより、本発明の細胞支持体材料を用い、本発明に示すところの共培養方法に従えば、従来、困難であった肺胞上皮細胞を長期にわたり活性を維持させられるようになった。さらに、このことは肺胞上皮細胞表層の特異的な糖鎖の発現からも明らかであった。図４ａは培養１３日後の肺胞上皮細胞表層糖鎖を常法に従い蛍光染色した結果である。図４ｂは剥離させた後、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのものであり、上記方法により肺胞上皮細胞が明らかに活性化されていることが分かる。
産業上の利用の可能性
従来の細胞培養基材に比べ、本願発明の細胞支持体材料は、材料表面に被覆されている各高分子の種類、量、被覆面積などをコントロールすることでさまざまな培養方法に活用できるものである。その結果、従来技術では活性を高く維持し続けることが全く困難であった肝実質細胞、肺胞上皮細胞、神経細胞等細胞の培養においても十分な活性を長期にわたり保持させることが可能となった。このような結果は、全く初めての例であり、したがって、本発明の細胞培養用支持体材料並びに該材料を用いた細胞の共培養方法および細胞シートの作製方法は、細胞工学、遺伝子工学、医用工学、などの医学、安全評価、生物学等の分野において極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１０に記載した肝実質細胞と内皮細胞の共培養を説明する顕微鏡写真である。図１のａは使用した金属マスクのマスクパターンを示す。孔径は１ｍｍ、中心間距離は１．５ｍｍである。図１のｂは３７℃で肝実質細胞を播種したときの顕微鏡写真を示す。全面に肝実質細胞が接着・伸展している。図１のｃは２０℃でＰＩＰＡＡｍ上の肝実質細胞を脱着した後の顕微鏡写真を示す。ＰＩＰＡＡｍをグラフトした温度応答性領域からのみ細胞は脱着する。図１のｄは３７℃で内皮細胞を播種して３日後のマスクパターンの顕微鏡写真を示す。マスクパターン通りに肝実質細胞と内皮細胞が安定に共培養できている。
図２は、実施例１７に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するために、肺胞上皮細胞から分泌されるサーファクタントプロテインを常法により蛍光染色した顕微鏡写真である。図２のａは培養１３日後の分泌のようす、ｂはそのときの細胞核の位置（図ａとｂの中の細胞の位置は同じにしている。）を示している。図２のｃは細胞を細胞培養支持体材料から剥がさず、そのまま２２日間培養したときのようす、ｄはそのときの細胞核の位置（図ｃとｄの中の細胞の位置は同じにしている。）を示している。剥離せずに培養し続けると分泌量は激減することが分かる。
図３は、図２と同様、実施例１７に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するための写真である。培養１３日後に、本発明による方法にて剥離させ、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのようすで、図３ａは剥離後さらに３０日培養したときのようす、ｃは剥離後さらに６０日培養したときのようすを示している。本発明の方法に従えば、長期間、肺胞上皮細胞の活性を維持させられることが分かる。
図４は、図２と同様、実施例１７に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するために、肺胞上皮細胞表層の特異的な糖鎖を蛍光染色した顕微鏡写真である。図４ａは培養１３日後の肺胞上皮細胞表層糖鎖を常法に従い蛍光染色した結果である。図４ｂは剥離させた後、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのものであり、上記方法により肺胞上皮細胞が明らかに活性化されていることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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