(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ＶＩＲ−１２１ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２；
ＶＩＲ−１６１ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３；
ＶＩＲ−１６２ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＶＧＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号４；
ＶＩＲ−１６３ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＶＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５；
ＶＩＲ−１６４ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＶＦＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号６；
ＶＩＲ−１６５ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＦＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７；
ＶＩＲ−１６６ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＶＡ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＮＫＰ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＶＦ 配列番号８；
ＶＩＲ−１７０ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号９；
ＶＩＲ−１７５ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号１０；
ＶＩＲ−１８２ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＬＡＦＡＫＰＦＶＦ 配列番号１１；
ＶＩＲ−１８４ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＩＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号１２；
ＶＩＲ−１９０ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＧＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号１３；
ＶＩＲ−１９１ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号１４；
ＶＩＲ−１９２ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号１５；
ＶＩＲ−１９３ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号１６；
ＶＩＲ−１９７ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＦＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号１７；
ＶＩＲ−１９９ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号１８；
ＶＩＲ−２２９ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号１９；
ＶＩＲ−２３４ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２０；
ＶＩＲ−２４３ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＦＡＦＮＫＤＦＶＦ 配列番号２１；
ＶＩＲ−２５２ ＬＥＤＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２２；
ＶＩＲ−２５５ ＬＥＫＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２３；
ＶＩＲ−２５７ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（シクロヘキシルアラニン）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２４；
ＶＩＲ−２５８ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥ（１−ナフチルアラニン）ＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２５；
ＶＩＲ−２５９ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥ（ｐ−フルオロフェニルアラニン）ＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２６；
ＶＩＲ−２６０ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（４−ピリジルアラニン）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２７；
ＶＩＲ−２６１ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥ（３，３−ジフェニルアラニン）ＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２８；
ＶＩＲ−２６２ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号２９；
ＶＩＲ−２６３ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３０；
ＶＩＲ−２６４ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（３−ベンゾチエニルアラニン）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３１；
ＶＩＲ−２６５ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（３−チエニルアラニン）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３２；
ＶＩＲ−２６６ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＷＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３３；
ＶＩＲ−２６８ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＶＦ 配列番号３４；
ＶＩＲ−２６９ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫ（Ｏｉｃ）ＦＶＦ 配列番号３５；
ＶＩＲ−２７２ ＬＥＡＩＰＭＣＩＰＰＥＣＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３６；
ＶＩＲ−２７３ ＬＥＡＩＰＭＣＩＰＰＥＣＦＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号３７；
ＶＩＲ−２７４ ＬＥＡＩＰＭＣＩＰＰＥＣＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号３８；
ＶＩＲ−２８０ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号３９；
ＶＩＲ−２８４ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰＰＥＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号４０；
ＶＩＲ−２８６ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰＰＥＬＡＦＡＫＰＦＶＦ 配列番号４１；
ＶＩＲ−２９０ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰｐＥＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号４２；
ＶＩＲ−２９８ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰｐＥＶＷＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号４３；
ＶＩＲ−３２０ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号４４；
ＶＩＲ−３２２ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶＦＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号４５；
ＶＩＲ−３２３ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号４６；
ＶＩＲ−３２６ ＬＥＤＩＰＭＧＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号４７；
ＶＩＲ−３２８ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶＷＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号４８；
ＶＩＲ−３４４ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号４９；
ＶＩＲ−３４５ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号５０；
ＶＩＲ−３４６ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＬＡＦＡＫＰＦＶＦ 配列番号５１；
ＶＩＲ−３４８ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＶＧＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号５２；
ＶＩＲ−３５０ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＶＦＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号５３；
ＶＩＲ−３５１ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＦＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５４；
ＶＩＲ−３５２ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＶＦＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５５；
ＶＩＲ−３５３ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＦＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５６；
ＶＩＲ−３５４ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰｐＣＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５７；
ＶＩＲ−３５５ ＬＥＡＩＰＣＧＩＰｐＣＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号５８；
ＶＩＲ−３５６ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＣＦＡＦＮＫＤＦＶＦ 配列番号５９；
ＶＩＲ−３５７ ＬＥＤＩＰＣＳＩＰｐＣＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号６０；
ＶＩＲ−３５８ ＬＥＫＩＰＣＳＩＰｐＣＶＡＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号６１；
ＶＩＲ−３７６ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＡＦＶＦ 配列番号６２；
ＶＩＲ−３７７ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＧＦＶＦ 配列番号６３；
ＶＩＲ−３８０ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＦＦＶＦ 配列番号６４；
ＶＩＲ−３８４ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＥＦＶＦ 配列番号６５；
ＶＩＲ−３９６ ＬＥＡＩＰＭＳＡＰｐＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号６６；
ＶＩＲ−４００ ＬＥＡＩＰＭＳＦＰｐＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号６７；
ＶＩＲ−４１６ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号６８；
ＶＩＲ−４１８ ＬＥＫＩＰＭＧＩＰｐＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号６９；
ＶＩＲ−４４５ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰｐＥＶ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７０；
ＶＩＲ−４４７ ＬＥＡＩＰＩＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＶＦ 配列番号７１；
ＶＩＲ−４４８ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７２；
ＶＩＲ−４４９ ＬＥＡＩＰＭＧＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７３；
ＶＩＲ−４５２ ＬＥＤＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７４；
ＶＩＲ−４５４ ＬＥＫＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７５；
ＶＩＲ−４５５ ＬＥＫＩＰＭＳＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７６；
ＶＩＲ−４７９ ＬＥＤＩＰＩＧＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７７；
ＶＩＲ−４８３ ＬＥＫＩＰＩＧＩＰｐＥＶ（Ｄ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７８；
ＶＩＲ−４８４ ＬＥＫＩＰＩＧＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号７９；
ＶＩＲ−４８５ ＬＥＫＩＰＩＧＩＰｐＥＶＡＦＮＫ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＶＦ 配列番号８０；
ＶＩＲ−４８７ ＬＥＤＩＰＩＧＩＰｐＥＶ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＮＫＰＦＶＦ 配列番号８１；
ＶＩＲ−４８８ ＬＥＤＩＰＩＧＩＰｐＥＶＡＦＮＫ（Ｌ−Ｔｉｃ）ＦＶＦ 配列番号８２；
ＶＩＲ−５１２ Ｎ−Ｍｅ−ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号８３；
ＶＩＲ−５６８ ＬＥＡＩＰＭＳＣＰＰＥＦＣＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号８４；
ＶＩＲ−５７０ ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＥＣＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号８５；
ＶＩＲ−５７６ （ＬＥＡＩＰＣＳＩＰＰＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ）2 配列番号８６；
ＶＩＲ−５８０ ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ−ミニＰＥＧ 配列番号８７；
ＶＩＲ−５９０ ＬＥＡＩＰＭＫＩＰＰＥＦＬＦＧＫＰＦＶＦ 配列番号８８；
のうちの１つを有する、ＨＩＶ感染に対する生物活性を有するペプチド。
【請求項２】
ＨＩＶの融合ペプチドであるＨＩＶ ｇｐ４１と相互作用する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＩＣ50３４８ｎＭのＶＩＲ−３４４（配列番号４９）、ＩＣ50２９８ｎＭのＶＩＲ−３４５（配列番号５０）、ＩＣ50２２５ｎＭのＶＩＲ−３５３（配列番号５６）、ＩＣ50４９７ｎＭのＶＩＲ−３５７（配列番号６０）、ＩＣ50７０６ｎＭのＶＩＲ−３５８（配列番号６１）、ＩＣ50２７４ｎＭのＶＩＲ−４４９（配列番号７３）、ＩＣ50１３４ｎＭのＶＩＲ−４５５（配列番号７６）、ＩＣ50１００ｎＭのＶＩＲ−４８４（配列番号７９）、ＩＣ50１３８ｎＭのＶＩＲ−５１２（配列番号８３）、ＩＣ50１０７ｎＭのＶＩＲ−５７６（配列番号８６）およびＩＣ50１５０ｎＭのＶＩＲ−５８０（配列番号８７）のうちの１つを有する、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドを含有する薬物。
【請求項５】
経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内投与用、およびエアロゾルとしての経肺投与用のガレヌス製剤の形をとる、請求項４に記載の薬物。
【請求項６】
少なくとも１種類の更なる治療薬を含む、請求項４または５に記載の薬物。
【請求項７】
前記の少なくとも１種類の更なる治療薬が、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルスｍＲＮＡ阻害剤である、請求項６に記載の薬物。
【請求項８】
ＨＩＶ感染を治療するための薬物の製造における、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、ＨＩＶの融合ペプチドと相互作用することができる分子を決定するアッセイ。
【請求項１０】
請求項９に記載のアッセイにおける、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドを含有する診断剤。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染について、単離血漿、組織、尿および脳脊髄液レベルを試験するアッセイシステムにおける、請求項１１に記載の診断剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト細胞の感染に対して阻害活性を示すペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去何年間の間に、ＨＩＶによる感染に対する活性を用いた療法についての集中的な研究が行われた。ＡＩＤＳの発症を遅らせ、抑制し、かつ血中のＨＩＶのレベルを低減するいくつかの薬物が開発され、試験された。米国において、ＡＩＤＳ発症後のＨＩＶ感染患者の寿命は、１９８４年での１１ヶ月から１９９７年での４６ヶ月と上昇した。療法の研究において、そのウイルスが複製に必要とするプロテアーゼを抑制するプロテアーゼ遮断薬、およびレトロウイルスの複製に必須であるウイルス逆転写酵素を抑制する薬物など、数種類の薬物を導く種々の方策を適用した。つい最近開発された活性作用物質のグループは、細胞内へのウイルスの侵入を防ぐとされている融合阻害剤である。他の活性作用物質と併用してインターロイキン−２を提供することによって、免疫応答の強さを増大することができることもまた知られていた。
【０００３】
侵入阻害剤は、ウイルスの進入中に生じる分子段階のうちの１つをブロックすることによって、ＨＩＶウイルス粒子の血球中への取り込みをブロックする。重要な段階は、主要なケモカイン補助受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４（ＣＣケモカイン受容体５およびＣＸＣＲケモカイン受容体４）のうちの１つにＨＩＶが結合する段階である。これらの補助受容体は、血球表面上に位置し、ウイルス侵入前にＨＩＶエンベロープタンパク質に結合する必要がある。融合に必要な、細胞とウイルスとが相互作用するもう１つの段階は、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０が細胞ＣＤ４受容体に結合する段階である。これらの段階は、細胞標的へのウイルス粒子の吸着と呼ばれることが多い。ケモカイン補助受容体へのＨＩＶの結合のブロッキングは、ウイルスの侵入を抑制することが示されている（Strizki J.M., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2001, 98, 12718-12723）。ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との相互作用をブロッキングすることによって、それが報告された（Linら, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2003, 100, 11013-11018)。ＨＩＶタンパク質ｇｐ４１は、抗ＨＩＶ薬の開発の潜在的な標的としても認められている（Gordonら, AIDS Research and Human Retroviruses 11, 677-686, 1995）。最初に認可された融合阻害剤はエンフュービルタイド（enfuvirtide）（Ｔ−２０，Ｆｕｚｅｏｎ，ＤＰ１７８）である（ＷＯ０１／５１６７３  Ａ２；ＷＯ９６／４０１９１；Cervia J.Sら, Clin. Infect. Dis, 2003, 37, 1102-1106; Kilby J.M., Nature Medicine, 1998, 4, 1302-1307）。この融合阻害剤は、ＨＲ−２と呼ばれるＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ４１の一部と同一であり、ｇｐ４１のＨＲ−１セグメント（ＨＲ＝７アミノ酸繰り返し）（図４）への結合によりＨＩＶ細胞融合を抑制し、このため、ｇｐ４１のＨＲ−１セグメントへのＨＲ−２の結合が阻止され、その結果、ウイルス粒子と血球の融合に必要な６本ヘリックスバンドルの形成が阻止される。Ｔ−２０は、ＨＩＶｇｐ４１のＨＲ−１以外のタンパク質セグメントまたはウイルスもしくは真核生物由来の他の分子に結合することが示されていない。ＨＩＶに対する生物活性を有する更なる作用物質が最近、ＷＯ０１／３４６４０に記載された。血液濾液から単離されたＶＩＲＩＰ（ウイルス抑制ペプチド）と呼ばれるアミノ酸２０個のペプチドが開示されており、ＨＩＶによるヒト細胞の感染を抑制することが見出された。
【０００４】
これらの努力および利用可能な様々な投薬法にもかかわらず、公知の療法は、体内のＨＩＶのレベルおよびＨＩＶ感染血球のレベルを有意に低減することができるが、ウイルスを完全に排除することができないため、ＡＩＤＳはまだ治癒しないという問題が未解決のままである。固有の欠点は、ＨＩＶは特に突然変異を起こしやすく、その結果、特定の療法に対する耐性を生じることが多いことである。一般に、公知の療法は、他の療法と併せて施されれば十分に有効であるにすぎない。現在のところかかる併用療法は、治癒を提供することなく、平均的患者の寿命を延ばし、一般に激しい副作用を伴い、患者は「通常の」生活を送ることができない場合が多い。治療を改善し、副作用が少なく、ＡＩＤＳ発症前または後に、ＨＩＶに感染した患者の余命を有意に延ばす、新規な療法および改善された療法を提供することが医学上非常に必要とされている。本発明は、上述の問題を克服し、効果的な治療を可能にする、または効果的な併用治療に寄与するであろう、新規な療法を提供するために、この問題に取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、この問題は、ＨＩＶｇｐ４１の融合ペプチドと少なくとも相互作用する、本発明によって提供されるペプチドによって解決される。その融合ペプチドは、約３０アミノ酸残基からなる、ｇｐ４１のまさにアミノ末端部分である。現在のモデルにおいて、ｇｐ４１の疎水性融合ペプチドは、ウイルス粒子を宿主細胞膜と結合させるアンカーとしての役割を果たし（Dimitrov A.S.ら, Biochemistry, 2003, 42, 14150-14158; Mobleyら, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1418, 1-18）、本発明のペプチドはＨＩＶ細胞融合プロセスを妨げ、したがって、ウイルスの侵入が阻止される。本発明のペプチドは、
（ａ）Ｘ12が、アラニン、グリシン、グルタミン酸、またはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸である場合には、Ｘ13、Ｘ14およびＸ15はそれぞれ、フェニルアラニン、バリンおよびフェニルアラニンであり；かつ／または
（ｂ）Ｘ12がフェニルアラニンである場合には、Ｘ13、Ｘ14およびＸ15はそれぞれ、バリン、フェニルアラニンおよび欠失であり；かつ
（ｃ）ペプチド中に最大で２個のシステイン残基が存在する；という条件で、
アミノ酸配列：
Ｚ1−ＬＥ−Ｘ1−ＩＰ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｐ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｋ−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｚ2
（Ｘ1は、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｘ2は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
Ｘ3は、セリン、システイン、リジンまたはグリシンであり；
Ｘ4は、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンまたはシステインであり；
Ｘ5は、プロリン、Ｄ−プロリンまたは置換Ｌ−もしくはＤ−プロリンであり；
Ｘ6は、システインまたはグルタミン酸であり；
Ｘ7は、疎水性もしくは芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；
Ｘ8は、疎水性もしくは芳香族側鎖を有するアミノ酸またはシステインであり；
Ｘ9は、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ10は、グリシン、アラニンまたはアスパラギンであり；
Ｘ11は、プロリン、アスパラギン酸、オクタヒドロインドリル（octahydroindolyl）−２−カルボン酸またはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり；
Ｘ12は、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸またはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり；
Ｘ13は疎水性もしくは芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ14は、疎水性もしくは芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ15は、フェニルアラニンまたは欠失であり；
Ｚ1は、ＮＨ2または１〜１０アミノ酸残基の配列であり；
Ｚ2は、ＣＯＯＨまたは１〜１０アミノ酸残基の配列である）
を有する、ＨＩＶ感染に対する生物活性を有するペプチド、ならびに断片および／または共有結合したオリゴマーおよび／または誘導体、特にアミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペグ化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体であるペプチド、およびその突然変異体である。
【０００６】
一般式：
Ｚ1−ＬＥ−Ｘ1−ＩＰ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｐ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｋ−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｚ2を有する上記のペプチドの好ましい実施形態において、
Ｘ7は、フェニルアラニン、システイン、バリン、イソロイシン、ロイシン、３、３−ジフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、またはｐ−フルオロフェニルアラニンであり；Ｘ8は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、トリプトファン、グリシン、システイン、Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸またはＬ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり；Ｘ9は、フェニルアラニンまたはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり；Ｚ1は好ましくは、ＮＨ2または１〜３アミノ酸残基の配列であり、Ｚ2は好ましくは、ＣＯＯＨまたは１〜３アミノ酸残基の配列である。ＩＣ50として測定される、上記のペプチドのＨＩＶ感染に対する生物活性は、６５００ｎＭ以下である。
【０００７】
更なる実施形態は、
（ａ）２つのシステイン残基が存在する場合に、前記残基が他の４つのアミノ酸残基によって分離され；かつ
（ｂ）Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸および／または３，３−ジフェニルアラニンが存在する場合には、システイン残基が存在しないという条件で、アミノ酸配列：
Ｚ1−ＬＥ−Ｘ1−ＩＰ−Ｘ1−Ｘ3−Ｘ4−Ｐ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｋ−Ｘ11−ＦＶＦ−Ｚ2
（Ｘ1は、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｘ2は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
Ｘ3は、セリン、システイン、リジンまたはグリシンであり；
Ｘ4は、イソロイシンまたはシステインであり；
Ｘ5は、プロリン、Ｄ−プロリンまたは置換Ｌ−もしくはＤ−プロリンであり；
Ｘ6は、システインまたはグルタミン酸であり；
Ｘ7は、フェニルアラニン、システイン、バリン、イソロイシンまたは３，３−ジフェニルアラニンであり；
Ｘ8は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、システイン、Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸またはＬ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸であり；
Ｘ9は、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；
Ｘ10は、グリシンまたはアスパラギンであり；
Ｘ11は、プロリンまたはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり；
Ｚ1は、ＮＨ2または１〜１０アミノ酸残基の配列であり；
Ｚ2は、ＣＯＯＨまたは１〜１０アミノ酸残基の配列である）を有する、ＨＩＶ感染に対する生物活性を有する本発明によるペプチド、ならびに断片および／または共有結合したオリゴマーおよび／または誘導体、特にアミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペグ化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体であるペプチド、およびその突然変異体である。
【０００８】
一般式：Ｚ1−ＬＥ−Ｘ1−ＩＰ−Ｘ1−Ｘ3−Ｘ4−Ｐ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｋ−Ｘ11−ＦＶＦ−Ｚ2を有する上記のペプチドにおいて、Ｘ9は、フェニルアラニンまたはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸であり、Ｚ1は好ましくは、ＮＨ2または１〜３アミノ酸残基の配列であり、Ｚ2は好ましくは、ＣＯＯＨまたは１〜３アミノ酸残基の配列である。ＩＣ50として測定される、上記のペプチドのＨＩＶ感染に対する生物活性は、２０００ｎＭ以下である。
【０００９】
さらに他の実施形態は、アミノ酸配列：
Ｚ1−ＬＥ−Ｘ2−ＩＰ−Ｘ2−Ｘ3−ＩＰ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｆ−Ｘ10−ＫＰＦＶＦ−Ｚ2
（Ｘ1は、リジン、アラニン、またはアスパラギン酸であり；
Ｘ2は、システイン、メチオニンまたはイソロイシンであり；
Ｘ3は、セリンまたはグリシンであり；
Ｘ5は、Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリンまたは置換Ｌ−もしくはＤ−プロリンであり；
Ｘ6は、システインまたはグルタミン酸であり；
Ｘ7は、フェニルアラニンまたはバリンであり；
Ｘ8は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、またはＬ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸であり；
Ｘ10は、グリシンまたはアスパラギンであり；
Ｚ1は、ＮＨ2または１〜１０アミノ酸残基の配列であり；
Ｚ2は、ＣＯＯＨまたは１〜１０アミノ酸残基の配列である）を有する、ＨＩＶ感染に対する生物活性を有する本発明によるペプチド、ならびに断片および／または共有結合したオリゴマーおよび／または誘導体、特にアミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペグ化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体であるペプチド、およびその突然変異体である。
【００１０】
一般式：Ｚ1−ＬＥ−Ｘ2−ＩＰ−Ｘ2−Ｘ3−ＩＰ−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｆ−Ｘ10−ＫＰＦＶＦ−Ｚ2を有するペプチドの好ましい実施形態において、Ｚ1は好ましくは、ＮＨ２または１〜３アミノ酸残基の配列であり、Ｚ2は好ましくは、ＣＯＯＨまたは１〜３アミノ酸残基の配列である。ＩＣ50として測定される、上記のペプチドのＨＩＶ感染に対する生物活性は、８００ｎＭ以下である。
【００１１】
さらに他の実施形態は、以下の：
Ｘ2は、プロリンである；または
Ｘ5は、ロイシンではない；または
Ｘ6およびＸ8は、システインである；
のうちの少なくとも１つが当てはまるという条件で、アミノ酸配列：
Ｚ1−ＬＥＡＩＰ−Ｘ2−ＳＩＰ−Ｘ5−Ｘ6−Ｖ−Ｘ8−ＦＮＫＰＦＶＦ−Ｚ2
（Ｘ2およびＸ6はシステインであるか、またはＸ2はメチオニンであり、Ｘ6はグルタミン酸であり；
Ｘ5は、Ｄ−プロリンまたはＬ−プロリンであり；
Ｘ8は、疎水性もしくは芳香族側鎖を有するアミノ酸またはリジンであり；
Ｚ1は、ＮＨ2または１〜１０アミノ酸残基の配列であり；
Ｚ2は、ＣＯＯＨまたは１〜１０アミノ酸残基の配列である）を有する、ＨＩＶ感染に対する生物活性を有する本発明のペプチド、ならびに断片および／または共有結合したオリゴマーおよび／または誘導体、特にアミド化、アルキル化、アシル化、硫酸化、ペグ化、リン酸化および／またはグリコシル化された誘導体であるペプチド、およびその突然変異体である。
【００１２】
一般式：Ｚ1−ＬＥＡＩＰ−Ｘ2−ＳＩＰ−Ｘ5−Ｘ6−Ｖ−Ｘ8−ＦＮＫＰＦＶＦ−Ｚ2を有するペプチドの好ましい実施形態において、Ｚ1は好ましくは、ＮＨ2または１〜３アミノ酸残基の配列であり、Ｚ2は好ましくは、ＣＯＯＨまたは１〜３アミノ酸残基の配列である。
【００１３】
本発明のペプチドの実施形態は、６位と１１位、６位と１２位、７位と１２位、または８位と１３位のシステイン残基が分子内ジスルフィド結合によって連結されているペプチドでもある。これらの位置にシステイン残基を有するペプチドは、これらの残基間の分子内架橋を有して、または直鎖状分子として還元的条件下にて生じる。更なる実施形態は、単一のシステイン残基を有するペプチドであり、前記システイン残基は、分子間ジスルフィド結合によって、単一のシステイン残基を有する他のペプチド分子に連結され、ホモダイマーが形成される。さらに実施形態は、アミノ酸位置１番目のロイシン残基およびアミノ酸位置２番目のグルタミン酸が、Ｎ−アルキル化アミド結合によって、またはエステル結合によって、または還元ペプチド結合によって、またはｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏペプチド結合によって、またはＮ−アルキル化ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏペプチド結合によって共有結合されているペプチドである。更なる実施形態は、ｇｐ４１のＨＩＶ融合ペプチドと相互作用するペプチドである。本発明のペプチドは、ＩＣ50３４８ｎＭのＶＩＲ−３４４（配列番号４９）、ＩＣ50２９８ｎＭのＶＩＲ−３４５（配列番号５０）、ＩＣ50２２５ｎＭのＶＩＲ−３５３（配列番号５６）、ＩＣ50４９７ｎＭのＶＩＲ−３５７（配列番号６０）、ＩＣ50７０６ｎＭのＶＩＲ−３５８（配列番号６１）、ＩＣ50２７４ｎＭのＶＩＲ−４４９（配列番号７３）、ＩＣ50１３４ｎＭのＶＩＲ−４５５（配列番号７６）、ＩＣ50１００ｎＭのＶＩＲ−４８４（配列番号７９）、ＩＣ50１３８ｎＭのＶＩＲ−５１２（配列番号８３）、ＩＣ50１０７ｎＭのＶＩＲ−５７６（配列番号８６）およびＩＣ50１５０ｎＭのＶＩＲ−５８０（配列番号８７）など、６５００ｎＭ以下、好ましくは２０００ｎＭ以下のＩＣ50、最も好ましくは８００ｎＭ以下のＩＣ50によって特徴付けられる。
【００１４】
これらのペプチドをコードする核酸も本発明の実施形態である。更なる実施形態は、これらのペプチドに特異的に結合する抗体である。更なる実施形態は、これらのペプチド、これらのペプチドをコードする核酸、これらのペプチドに対して作られる特異的な抗体のうちのいずれかを含有する薬物である。一実施形態において、この薬物は、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内投与用、およびエアロゾルとしての経肺投与用のガレヌス製剤の形をとる。更なる実施形態は、前記の少なくとも１種類の更なる治療薬が、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルスｍＲＮＡ阻害剤等である、薬物である。ＨＩＶ感染の治療用の薬物を製造するためのこれらのペプチドの使用は、更なる実施形態である。さらに、実施形態は、本発明の上記のペプチドのいずれかを含む、ＨＩＶの融合ペプチドと相互作用することができる分子を決定するためのアッセイである。前記アッセイにおけるこれらのペプチドの使用もまた実施形態である。更なる実施形態は、これらのペプチド、核酸または抗体を含有する診断剤である。もう一つの実施形態は、ＨＩＶ感染に関して単離血漿、組織、尿および脳脊髄液レベルを試験するためのアッセイシステムへの診断剤の使用である。本発明のさらに具体的な実施形態は、請求項８に記載のペプチドである。
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明のペプチドは、ＨＩＶ感染の防止に生物活性を有する、ＷＯ０１／３４６４０に開示かつ記載されている血液濾液由来ペプチドＶＩＲＩＰ（配列番号１）に関する。それらはすべて、少なくともアミノ酸位置１３番目がＶＩＲＩＰと異なり、ＶＩＲＩＰはリジン残基を含有するが、本発明のペプチドは、アミノ酸位置１３番目にリジン残基を含有しない。それに加えて、本発明のペプチドはさらに、ＶＩＲＩＰと比較して、それらの２１アミノ酸全体にわたりアミノ酸の変化を有する。本発明のペプチドはすべて、ＶＩＲＩＰよりも著しく高い抗ＨＩＶ活性（２つのＨＩＶ−１菌株に対してＩＣ50として測定される）を有する。抗ＨＩＶ活性の増加は、少なくとも４倍であり（ＶＩＲ−１８４、配列番号１２）、本発明の高度に活性なペプチドは、ＨＩＶに対してＶＩＲＩＰの１６１倍までの高い活性がある（例えば、ＶＩＲ−２８０、配列番号３９）。
【００１６】
本発明のペプチドは、２１アミノ酸のアミノ酸配列をベースとし、Ｚ1およびＺ2による末端両方に１〜１０アミノ酸の延長を有することが可能であり、３アミノ酸の延長が好ましい。本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、残基Ｚ1のために可能性のあるＮ末端延長に関係なく、基本配列のアミノ酸位置１〜２１番目に常に相当し、その結果、アミノ酸位置１番目はロイシンに相当し、アミノ酸位置２１番目はフェニルアラニンまたは欠失に相当する。一般的なアミノ酸の１文字および３文字表記が使用される。別段の指定がない限り、アミノのＬ−鏡像異性体が使用された。小文字の「ｐ」はＤ−プロリンを表す。他のＤ−鏡像異性体は「Ｄ」接頭語によって示される。「Ｔｉｃ」はテトラヒドロイソキノリンカルボン酸を表す。「Ｏｉｃ」はオクタヒドロインドールカルボン酸を表す。
【００１７】
本明細書において使用される「疎水性アミノ酸」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、および非内因性疎水性アミノ酸のうちのいずれかを意味する。本明細書において使用される「芳香族アミノ酸」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、および非内因性芳香族アミノ酸のうちのいずれか、例えば１−ナフチルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、またはＤ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸またはＬ−１，２，３，４−テトラヒドロイソ−キノリン−３−カルボン酸等を意味する。
【００１８】
「突然変異体（mutant）」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、開示されているアミノ酸の１つまたは複数が変化している、つまり１つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている、配列変異を意味する。本発明の突然変異体は好ましくは、請求項１のペプチドと１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸が異なる。好ましい実施形態において、突然変異は保存的であり、そのため、変更されたアミノ酸の側鎖の特性は、元のアミノ酸と実質的に変わらない。突然変異体は配列変異も含み、１つまたは複数のアミノ酸が配列から欠失しているか、または配列中に挿入されている。
【００１９】
「断片」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、その配列がＮ末端またはＣ末端で切断されている配列変異を意味する。好ましい実施形態において、そのペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端で２、４または６個までのアミノ酸を欠失している。
【００２０】
「共有結合されたオリゴマー」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、互いに共有結合した複数のペプチド鎖を意味する。ペプチド鎖は、同一または異なるアミノ酸配列を有し得る。共有結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、エーテル結合、アミド結合など、それぞれのペプチド鎖間の直接結合であり得る。ペプチド鎖は、いずれかの化学的性質のスペーサーによって共有結合することもできる（Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002）。
【００２１】
「誘導体」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、化学修飾されたペプチドを意味する。この修飾は、Ｎ末端およびＣ末端のペプチド、ペプチドの側鎖、ペプチド主鎖のＣａ原子およびＮａ原子、およびその主鎖のペプチド結合を形成する原子の単一のアミノ酸の置換、複数の置換または異なる化学修飾であり得る。
【００２２】
「アミド化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、そのＣ末端カルボキシル基がＣＯＮＲ2基（Ｒは、水素原子または水素原子のうちの少なくとも１つに取って代わる官能基である）によって置換されたペプチドの修飾を意味する。
【００２３】
「アシル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、Ｎ末端のアミノ基および／またはアミノ基の側鎖にあるアミノ基のアミノ酸以外に、共有結合したカルボン酸残基を含有するペプチドを意味する。
【００２４】
「アルキル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、Ｎ末端アミノ基、いずれかの主鎖原子および／または側鎖のいずれかの官能基にて種々の長さおよび構造のアルキル基で修飾されたペプチドを意味する。
【００２５】
「硫酸化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、チロシンおよびチロシン誘導体残基のヒドロキシル基にスルフェート部位を有するペプチドを意味する。
【００２６】
「ペグ化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、ポリエチレングリコールに特有の少なくとも２つの反復単位−ＣＨ2−ＣＨ２−Ｏ−からなる、共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位を含有するペプチドを意味する。いわゆるミニＰＥＧ基が好ましい。ペギル（Pegyl）基は２０ＫＤａまでの分子量を有し、ペプチド配列における異なる官能基に直接的に、あるいはＮ末端および／またはＣ末端および／または側鎖官能基におけるスペーサー基によって結合することができる。スペーサー基は、２、３、４、５、６、７、８または９個の炭素原子の主鎖によって特徴付けられる二官能性炭化水素鎖の基、および２つの官能基、例えば２つのアミノ基、２つのカルボキシル基、または１つのアミノ基と１つのカルボキシル基から選択される。１つまたは複数のペギル基は、ペプチドの異なる部位に含有される。
【００２７】
「リン酸化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、トレオニン、セリン、ヒドロプロリン、ヒドロキシリジン、チロシン、および／または他のいずれかの非天然ヒドロキシアミノ酸の側鎖のヒドロキシ基が、リン酸基でエステル化されたペプチドを意味する。
【００２８】
「グリコシル化」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、グリコシル性（glycosilic）もしくはアルコール性ヒドロキシ基を介してセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、および／または非天然アミノ酸の側鎖に結合されたモノマーおよび／またはオリゴマー炭水化物部位を含有するペプチドを意味する。
【００２９】
「環状」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、環状構造モチーフを含有するペプチドを意味する。環化は、主鎖を環化することによって、またはアミノ酸の側鎖を同じ分子に存在する異なるアミノ酸の側鎖に結合させることによって達成することができる。本発明の好ましい実施形態において、ペプチドの２つのシステイン残基または１つのカルボン酸側鎖および１つのアミノ基含有側鎖が、ジスルフィド結合またはアミド結合を介して環状モチーフを形成する。ペプチドＶＩＲ−１６１（配列番号３）、ＶＩＲ−１６２（配列番号４）、ＶＩＲ−１６３（配列番号５）、ＶＩＲ−１６４（配列番号６）、ＶＩＲ−１６５（配列番号７）、ＶＩＲ−１６６（配列番号８）、ＶＩＲ−２７２（配列番号３６）、ＶＩＲ−２７３（配列番号３７）、ＶＩＲ−２７４（配列番号３８）、ＶＩＲ−２８０（配列番号３９）、ＶＩＲ−３４４（配列番号４９）、ＶＩＲ−３４５（配列番号５０）、ＶＩＲ−３４６（配列番号５１）、ＶＩＲ−３４８（配列番号５２）、ＶＩＲ−３５０（配列番号５３）、ＶＩＲ−３５１（配列番号５４）、ＶＩＲ−３５２（配列番号５５）、ＶＩＲ−３５３（配列番号５６）、ＶＩＲ−３５４（配列番号５７）、ＶＩＲ−３５５（配列番号５８）、ＶＩＲ−３５６（配列番号５９）、ＶＩＲ−３５７（配列番号６０）、ＶＩＲ−３５８（配列番号６１）、ＶＩＲ−５６８（配列番号８４）、ＶＩＲ−５７０（配列番号８５）、ＶＩＲ−５７６（配列番号８６）すべてが、２つのシステイン残基を有し、環状の形を適応し得る。これらのペプチドは、直鎖状分子としても生じ得る。好ましい実施形態は、これらのペプチドの環状形は高い構造的安定性および生物学的安定性を特徴とすることから、これらのペプチドの環状形である。
【００３０】
驚くべきことに、ＶＩＲＩＰ（配列番号１）のアミノ酸配列を特異的に変化させることによって、ＨＩＶに対する活性が著しく増大したペプチドが得られることが見出された。１０位のＬ−プロリンがＤ−プロリンによって置換され、かつ／または２つのシステインがアミノ酸位置６番目および１１番目で導入され、かつ／または１３位の正に帯電したリジンが疎水性または芳香族側鎖を有するアミノ酸に対して交換された場合に、活性の最も有意な増加が認められる。野生型ＶＩＲＩＰ（配列番号１）と比較した場合の活性は、構造の変化のために増加すると考えられる。システイン架橋は著しく、ペプチドの構造を変化させ、ペプチドの柔軟性、ならびにペプチドの二次的構造要素の変化を生じさせ、このためペプチドの異なる部分の互いに変化した配向を生じさせるＤ−プロリンの導入を低減することが知られている。さらに、正に帯電したジン側鎖と、同じ分子の２位および１１位の負に帯電したアミノ酸との、または受容体分子の負に帯電した部分との可能性のある相互作用が変化することから、非荷電疎水性または芳香族アミノ酸に対するリジンの交換は、構造を変化させるだろう。
【００３１】
抗ＨＩＶ活性の有意な増加はさらに、３位のアラニン残基が、リジンまたはアスパラギン酸残基との置換によって正または負に帯電した残基に交換される場合に認められる。３位に荷電残基を導入することによって、増加した静電力または双極性力（dipolar force）によって受容体分子の相当する部分への結合強度を高めることができる。小さなアミノ酸残基、特にグリシンに対する、７位または／および１５位のアミノ酸残基の交換もまた、抗ＨＩＶ活性を増加することが見出されている。グリシン残基は最小の立体障害残基であり、受容体分子に結合する場合に、または受容体分子との結合に必要なそれら自体との凝集体を形成する場合に、ペプチドの最適な内部構造配置を可能にする。記載の置換は、本発明のペプチドにおいて組み合わせられる。さらに、本発明のペプチドはホモオリゴマー化、特にホモ二量体化された場合に、抗ウイルス活性が増加する。本発明のペプチドの二量体化は、２つの同一ペプチド鎖の共有結合によって化学的に達成することができる。その共有結合は、システイン残基のチオール基などの側鎖官能基間の直接結合、または本発明の２つの同一の鎖がリジン残基の２つのアミド基に結合した場合に存在するようなペプチド鎖間のスペーサーを含む結合であり得る。後者はしばしば、リジン−コアデンドリマーの最小形と呼ばれる（Sadler K., J. Biotechnology, 2002, 90, 195-229）。本発明のペプチドのオリゴマー、特にダイマーは、分子の構造的および／または生物学的により安定な形を誘導することができる。さらに、それらは、作用部位での抗ウイルス活性なペプチドの局所濃度を高めることができる。したがって、それらは、受容体分子とさらに有利に相互作用する本発明のペプチドの形を提供することができる。
【００３２】
本発明によるペプチドは容易に、化学的に合成するか、または組換え発現によって作製することができる。そのサイズが小さいため、つまり本発明のペプチドは少ない数のアミノ酸で構成されるため、かかる物質を化学的に合成するために、全ペプチド合成技術を用いることができる。３つの個々の断片を合成し、続いてその３つの断片を接合して最終産物Ｔ２０を生じさせる必要がある、ＨＩＶ融合阻害剤Ｔ−２０の合成と比較して、本発明のペプチドは、段階的な固相法によって、または液相合成化学によって大規模に合成することができる。このように、本発明のペプチドの製造プロセスは簡単明瞭であり、その結果、本発明のペプチドを含む製品のコストが低くなる。本発明のペプチドの更なる利点はそれらの溶解性と、広範囲のｐＨ（ｐＨ２〜８．５）にわたる様々なイオン強度の溶媒中での安定性である。
【００３３】
固相技術を用いた固体担体上で、または液相中で化学合成を行うことができ、どちらも当業者に公知の標準法である。本発明によるペプチドは、当業者に公知の標準法である、２つ以上の側鎖保護または側鎖非保護断片の連結によっても合成することができる（Tam J.P., Biopolymers, 2001, 60, 194-205）。本発明によるペプチドまたはその断片の固相合成は、アミノ酸のＦｍｏｃ／ｔＢｕまたはＢｏｃ／Ｂｚｌ保護パターンを用いて行うことができる。標準的なＦｍｏｃ保護法にはない他の保護基を使用することができる。合成ペプチドの精製は、逆相、イオン交換またはサイズ排除などのクロマトグラフ法によって達成される。上記の本発明のペプチドの化学合成の化学的方法は、いくつかの評論出版物に概説されている（例：Chan W.C.ら (編集者), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N.ら, peptide: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002; Goodman M., Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptide and peptidemimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002）。
【００３４】
本発明のペプチド中へのジスルフィド結合の導入は、当業者に公知のシステイン残基２個を含有するペプチドを用いた酸化的な化学的方法を適用することによって達成することができる（Penningtonら (編集者), peptide synthesis protocols, Humana Press, Totowa 1994; Chan W.C.ら (編集者), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000）。本発明のペプチドのジスルフィドは、酸化的処理によって、固相または液相合成から得られた１つまたは２つの非保護システイン残基を含有する、還元ペプチド前駆物質から形成される。酸化剤として、酸素、ジメチルスルホキシド、鉄（ＩＩＩ）塩、ヨウ素、または他のものを使用してもよい。代替方法として、本発明のペプチドのジスルフィドは、相当するシステイン残基に保護基を含有する前駆物質からペプチドに導入される。保護基として、アセトアミドメチル、ｔ−ブチル、Ｓ−ｔ−ブチルまたは他のものを使用してもよい。保護基の切断および鎖内ジスルフィド結合形成は、ヨウ素、ホスフィン、または他の物質など、作用物質を使用して行うことができる。
【００３５】
ジスルフィド結合を有するペプチド以外の環状ペプチドは、当業者に公知のように、ペプチドの主鎖の環化によって、またはアミノ、カルボキシ、ヒドロキシもしくはチオなどの少なくとも１つの反応性側鎖基と、同じ分子に存在する他のいずれかの反応性基との間の化学結合によって得ることができる（Liら, Curr. Top. Med. Chem., 2002, 2, 325-341; Tam J.P., Biopolymers, 2001, 60, 194-205; Goodman M., Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptide and peptidemimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002）。
【００３６】
ペプチドの共有結合オリゴマーは、様々な種類の化学結合により２つのペプチド鎖を連結することによって得られる。ジスルフィド連結オリゴマーは、活性化システインによって、またはシステインを予め活性化することなく、２つのペプチド鎖を結合させることによって合成される（Sacca B.ら, J. Pept. Sci., 2002, 8, 192-204; Seewald N.ら,Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002）。２つのペプチド鎖間のチオエーテル結合およびエーテル結合およびペプチド結合は、当業者に公知であり、文献（Seewald N.ら, Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002）に記載の様々な方法により導入することができる。リジン−コアデンドリマーは、固体担体にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを結合させることによって合成することができる。アミノ酸を脱保護した後、固相ペプチド合成によって、オリゴマーペプチドが得られる（Seewald N.ら, peptide: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002; Chan W.C. (編集者) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000）。アミノ基２個を含有する他のアミノ酸によって、リジンを置換することができる。アミド化ペプチドは、ペプチド鎖がその上に形成されるアミドリンカーを保持する樹脂を使用して、固相ペプチド合成によって得られる。それに応じて合成されるペプチドを酸切断（acid cleavage）することによって、ペプチドアミドが得られる。液相合成において、Ｃ末端に予め形成されたカルボキサミドを有する構成単位としてＣ末端アミノ酸を使用した場合に、アミド化ペプチドが得られる（Chan W.C. (編集者) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000）。
【００３７】
アシルハロゲン化物またはカルボン酸無水物または他の反応性化合物から誘導される活性化アシル化試薬を使用して、遊離アミノまたはヒドロキシ基を有するペプチドを相当するアシル化ペプチドに転化することにより、当業者によって、アシル化ペプチドが得られる。代替方法として、アシル化（acelytion）は、ホスホニウムまたはウロニウム型化合物によって、その場で活性化される遊離カルボン酸を使用して達成することができる（Greene T.W., Protective groups in organic chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1991; Kocienski P., Protecting groups, Thieme-Verlag, Stuttgart 1994）。
【００３８】
固体担体上で、または溶液中でペプチド合成を行う場合に、予めアルキル化されたアミノ酸構成単位を組み込むことによって、アルキル化ペプチドが得られる。かかるアミノ酸は、当業者に公知の標準的活性化プロトコルを使用してペプチド鎖状に結合される（Chan W.C. (編集者) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000）。当業者に公知の適切なアルキル化法を用いることによって、ペプチド鎖を形成した後に、アルキル化を達成することもできる（Greene T.W., Protective groups in organic chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1991; Kocienski P., Protecting groups, Thieme-Verlag, Stuttgart 1994）。かかる方法は、部分的に保護されたペプチドにおけるペプチド主鎖のアミノ、ヒドロキシ、チオおよびペプチド結合などの反応性基に適用される。硫酸化ペプチドは、固相または液相ペプチド合成においてチロシンまたはチロシン誘導体の予め硫酸化された構成単位を用いることによって得られる。２−クロロトリチル樹脂などの非常に酸不安定性の樹脂が合成に使用される場合には、樹脂からのペプチド切断中、Ｏ−硫酸基はヒドロキシル基に結合したままである（Seewald N.ら, peptide: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002）。
【００３９】
ペグ化ペプチドは、ペプチドの官能基に結合したペギル（pegyl）残基を含有する。ペギル残基は、反復単位−ＣＨ2−ＣＨ2Ｏ−を有する親水性直鎖状または分枝状ポリマー鎖として特徴付けられる。ペギル残基は、機能的に修飾され、かつ反応性の適切なペギル含有物質を使用して、ペプチド鎖の形成後にペプチド中に導入される。種々の活性化ペギル基は、異なる側鎖に、またはアミノ、カルボキシル、ヒドロキシおよびチオなどのペプチドの末端官能基に、様々な活性化法によって当業者によって結合することができる（Veronese F.M.ら, Bioconjug. Chem., 2001, 12, 62-70; Veronese F.M., Biomaterials, 2001, 22, 405-417）。
【００４０】
リン酸化ペプチドは、固相または液相ペプチド合成によって合成することができる。リン酸化ペプチドの合成は通常、リン酸化ヒドロキシアミノ酸構成単位を用いて、かつ／または１つまたは複数の遊離ヒドロキシ官能基を有する保護ペプチドの鎖形成後のリン酸化によって、当業者により達成される（Murray J.S., Biopolymers, 2001, 60, 3-31; Chan W.C.ら (編集者), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N.ら, Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002）。
【００４１】
グリコシル化ペプチドは、ペプチドの固相または液相合成中に組み込むことができるグリコシル化アミノ酸構成単位を使用して、または鎖形成後の全体的なグリコシル化アプローチによって、当業者により得ることができる（Davis B.G., Chem. Rev., 2002, 102, 579-602; Chan W.C.ら (編集者), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N.ら, Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002）。
【００４２】
本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸にも関する。好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、特にｃＤＮＡおよびｍＲＮＡである。
【００４３】
本発明の主題は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体でもある。「特異的に」という用語は、当業者には容易に理解される。特に、それは、その抗体が本発明のペプチドではないＶＩＲＩＰのような関連するペプチドに結合しない、または本質的に結合しないことを意味する。当業者は、通常の方法によって本発明のペプチドに対する抗体を得て、公知のスクリーニング法によって本発明の特異的な抗体を選択するだろう。
【００４４】
本発明は、ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ４１のＮ末端領域と特異的に相互作用し、かつその領域に特異的に結合するペプチドに関する。「と相互作用する」および「に結合する」という表現は、当業者には容易に理解される。かかる結合および相互作用によって、本発明のペプチドは、ＨＩＶ粒子による宿主細胞の感染をブロックする。本発明は、ＨＩＶのｇｐ４１の融合ペプチドに相当する合成ペプチドに結合するペプチドにも関する。当業者は、定量的構造／活性相関（ＱＳＡＲ）アッセイを適用することによって、ＨＩＶのｇｐ４１の合成融合ペプチドへの本発明のペプチドの結合および相互作用を検出する。これらのアッセイは、限定されないが、合成融合ペプチドの溶血作用の抑制の検出（Mobley P.W.ら, Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1139, 251-256; Gordon L., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1139, 257-274), microcalorimetry (Gohlke H.ら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2002, 41, 2644-2676）、または化学的なシフト（shift）滴定実験であり得るＮＭＲ−分光学技術、または飽和移動差分光法（Meyerら, Ernst Schering Res. Found. Workshop, 2004, 44, 149-167）を含む。
【００４５】
本発明は、本発明のペプチド、核酸または抗体を含有する薬物にも関する。この薬物は、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内投与用、およびエアロゾルとしての経肺投与用のガレヌス製剤の形で提供されることが好ましい。好ましい実施形態において、その薬物は、少なくとも１種類の更なる治療薬を含む。前記の少なくとも１種類の更なる治療薬は、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、融合阻害剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、グリコシル化阻害剤またはウイルスｍＲＮＡ阻害剤等である。かかる阻害剤はＨＩＶに対して作られることが好ましい。かかる併用療法は、ＡＩＤＳの治療において非常に関連性がある。本発明のペプチド、核酸および抗体は、ＨＩＶ感染の治療用の薬物の製造において使用されることが好ましい。これは、レトロウイルスＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の公知のすべての菌株、特にＨＩＶ−１の最も一般的な菌株を含む。ＨＩＶ−１は、ＡＩＤＳの大発生と関連している。
【００４６】
本発明は、本発明のペプチド、核酸または抗体を含有する診断剤にも関する。ＨＩＶ感染に関して単離血漿、血清、組織、尿および脳脊髄液レベルを試験するためのアッセイシステムにこの診断剤を使用することができる。
【００４７】
本発明は、ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ４１、特にｇｐ４１のＮ末端融合ペプチドに結合する物質を同定するツールとして本発明のペプチドを含むアッセイシステムにも関する。かかるアッセイは、単離されたウイルスもしくは他の形で、またはｇｐ４１の非常にＮ末端で開始する３５アミノ酸残基までの長さの合成形で、ｇｐ４１タンパク質全体に組み込まれた融合ペプチドへのいずれかの物質の結合を測定するのに適したシステムであり得る。分光学的、細胞アッセイ、または放射リガンドアッセイであり得る、かかるアッセイにおいて、本発明のペプチドに競合している物質の結合が測定される。本発明のペプチドをツールとして用いた、かかる競合アッセイの結果として、親和性が増大した物質およびＨＩＶｇｐ４１に対する結合部位特異性の同定が達成される。かかる物質は、ＨＩＶ粒子による細胞感染をブロックする向上した効力を有する。それらは、ＡＩＤＳを治癒させるための改善された治療薬として使用することができる。様々な本発明のペプチドを合成した後、収量を調べた。すべてのペプチドに関して、高い収量が達成され（表１参照）、合成プロセスの容易さが反映されている。本発明のペプチドを様々な試験にかけた。
【００４８】
最初に、それらの細胞障害性を試験するために、ヒト細胞を本発明のペプチドに暴露した。試験されたすべてのペプチド、つまりＶＩＲ−１６１（配列番号３）、ＶＩＲ−１６２（配列番号４）、ＶＩＲ−１６３（配列番号５）、ＶＩＲ−１６４（配列番号６）、ＶＩＲ−１６５（配列番号７）、ＶＩＲ−１６６（配列番号８）、ＶＩＲ−１７０（配列番号９）、ＶＩＲ−１７５（配列番号１０）、ＶＩＲ−１８２（配列番号１１）、ＶＩＲ−１８４（配列番号１２）、ＶＩＲ−１９０（配列番号１３）、ＶＩＲ−１９１（配列番号１４）、ＶＩＲ−１９２（配列番号１５）、ＶＩＲ−１９３（配列番号１６）、ＶＩＲ−１９７（配列番号１７）、ＶＩＲ−１９９（配列番号１８）、ＶＩＲ−２２９（配列番号１９）、ＶＩＲ−２３４（配列番号２０）、ＶＩＲ−２４３（配列番号２１）、ＶＩＲ−２５２（配列番号２２）、ＶＩＲ−２５５（配列番号２３）、ＶＩＲ−２５７（配列番号２４）、ＶＩＲ−２５８（配列番号２５）、ＶＩＲ−２５９（配列番号２６）、ＶＩＲ−２６０（配列番号２７）、ＶＩＲ−２６１（配列番号２８）、ＶＩＲ−２６２（配列番号２９）、ＶＩＲ−２６３（配列番号３０）、ＶＩＲ−２６４（配列番号３１）、ＶＩＲ−２６５（配列番号３２）、ＶＩＲ−２６６（配列番号３３）、ＶＩＲ−２６８（配列番号３４）、ＶＩＲ−２６９（配列番号３５）が、全く細胞障害効果がなかった。これらのデータから、まだ試験されていないペプチドもまた非細胞毒性であることが強く示唆されている。
【００４９】
第２組の実験は、ＨＩＶ感染を抑制する本発明のペプチドの有効性に関係する。２つのＨＩＶ−１株でペプチドを試験し、ＩＣ50値を計算した。最も活性なペプチドは、８００ｎＭ以下のＩＣ50を有し、例えばＶＩＲ−４８４（配列番号７９）は、１００ｎＭのＩＣ50を有した。さらにかなりの活性を有するペプチド、２０００ｎＭ以下のＩＣ50を有するペプチド、および６５００ｎＭ以下のＩＣ50を有するペプチドはさらに、天然ＶＩＲＩＰ（配列番号１）と比較して増加した活性を有し；天然ＶＩＲＩＰ（配列番号１）は、ＨＩＶ株ＮＬ４−３またはＤＴＶで試験した場合に、それぞれ１５，０００または２２，０００のＩＣ50を有することが見出された。表２を要約すると、本発明のペプチドは、天然ＶＩＲＩＰと比較して、４倍〜１６１倍の抗ＨＩＶ活性の増加を示した。
【００５０】
第３組の実験では、本発明のＶＩＲＩＰペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性を決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害性試験のポジティブな結果を考慮すれば、１種類の化合物のみの試験で十分であった。マウスにＶＩＲ−１２１（配列番号２）を注入し、マウスを屠殺する前に一定期間にわたって観察した。マウスが生存している間にわたって、運動性の低下または増加、呼吸困難、運動失調の徴候も、筋緊張の低下または増加の徴候も認めなかった。挙動の変化も認められず、挙動は対照動物の挙動と同様であった。病理学的試験では、異常は示されなかった。したがって、本発明のペプチドは、生体によって十分に許容されると結論づけられた。
【００５１】
第４組の実験は、哺乳動物の血漿における本発明のペプチドの安定性に関係する（表３参照）。様々な哺乳動物およびヒトから単離された血漿を規定量の本発明の様々なペプチドでスパイク（spike）した。そのペプチドは、ヒト血漿においてかなりの半減期を示し、３１５時間、３８．９時間および２３．３時間の半減期をそれぞれ有する、ＶＩＲ−５１２（配列番号８３）、ＶＩＲ−５８０（配列番号８７）およびＶＩＲ−３５７（配列番号６０）が最も顕著であった。これらのペプチドは、動物血漿中でかなりの安定性も示したが、実際の値は、ヒト血漿に対して見られた値と異なった。天然ＶＩＲＩＰ（配列番号１）は、ヒト血漿において５３．７時間の半減期を有する。その結果から、ラット血漿は。これらの種類の実験に適切なモデルシステムではないことも示された。
【００５２】
最終組の実験において、本発明のペプチドの増加用量を添加して、融合ペプチド誘導溶血の抑制を測定することによって、ｇｐ４１の融合ペプチドと相互作用する本発明のペプチドの能力を試験した。試験されたすべてのペプチドが、天然ＶＩＲＩＰよりも融合ペプチドの溶血作用の抑制に効果的であった。本発明のペプチドは、特異的な相互作用により融合ペプチドの構造的特性を変化させると結論づけられた。
【００５３】
本質的に、本発明のペプチドは、ＩＣ50として表されるその抗ＨＩＶ活性によって特徴付けられ、６５００ｎＭ以下であり、最も活性なペプチドは８００ｎＭ未満のＩＣ50を有する。本発明の個々のペプチドが、１００ｎＭ未満のＩＣ50を有すると見出された（表１参照）。
【実施例】
【００５４】
合計で６００種類を超えるペプチドを合成し、そのうち８４種類のみが本明細書により詳細に示されている（表１参照）。それぞれのペプチドですべての実験を行ったわけではない。本明細書に示されるこれらの８４種類のペプチドは、ＩＣ50により判断すると、残りのペプチドよりもＨＩＶに対して活性が高かった。しかしながら、８４種類のペプチドのグループのうちの２２種類の最も活性なペプチドをさらに選択し、異なるＨＩＶ株を使用して、更なる抗ウイルス活性試験にかけた。そのスクリーニングの最も有望な候補を血漿安定性試験にかけた。行った実験の詳細な説明を以下に示す。
【００５５】
実施例１：本発明のペプチドの化学的合成
固相ペプチド合成およびＦｍｏｃまたはＢｏｃ保護基法の原理を用いて（Atherton and Sheppard, 1989, solid phase peptide Synthesis, IRL Press; Merrifield, 1986, solid phase synthesis, Science 232, 341-347）、本発明によるペプチドを化学的に合成したが、液相合成で、または本発明によるペプチドの保護または非保護断片を結合させることによって、合成することもできる。一例として、ペプチドＶＩＲ−１９９（アミノ酸配列：ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ）（配列番号１８）の合成が、自動ペプチド合成機４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）においてフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護アミノ酸を使用して本明細書に記述されている。負荷容量１ｍｍｏｌ／ｇ樹脂で予め添加されたＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂を使用して、標準ＨＢＴＵ［（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート］／ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）により活性化して、０．２ｍｍｏｌのスケールでＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中の無水酢酸を使用したキャッピングサイクルで、合成を行った。使用したアミノ酸構成単位の側鎖は、以下のように保護された：Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）。ペプチド鎖形成のアシル化段階を１５〜６０分間行い、それぞれのアシル化後に、ＮＭＰ中のピペリジンでＦｍｏｃ基を脱保護した。１位にあるロイシン残基を脱保護した後、得られた保護ペプチジル樹脂をＮＭＰ、２−プロパノールおよびジクロロメタンで洗浄し、次いで乾燥させた。乾燥樹脂を室温にてトリフルオロ酢酸／エタンジチオール／水（９４：３：３（体積／体積／体積）、４０ｍｌ／ｇ樹脂）の新たな混合物で２〜４．５時間処理した。混合物を氷冷ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）中に濾過して、ペプチドの沈殿を促進した。得られた沈殿物を遠心分離によって分離し、ＴＢＭＥで洗浄し、真空下にて乾燥させた。未精製ペプチドを希酢酸に溶解し、分取Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（４７×３００ｍｍ、１５〜２０μｍ、流量４０ｍｌ／分；溶媒Ａ、ＴＦＡ０．０７体積％；溶媒Ｂ、アセトニトリル／Ｈ2Ｏ（８０：２０）（体積％）中ＴＦＡ０．０７体積％；２１５ｎｍでのＵＶ検出）上に以下の勾配：５０分でＢ４５〜７０体積％で添加した。質量分析法（ＡＰＩ  １００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）および分析用Ｃ１８  ＨＰＬＣ、または代替方法として、キャピラリー電気泳動によって検出される、目的の純粋なペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥により乾燥させた。凍結乾燥ペプチドは、分析用Ｃ１８  ＨＰＬＣ（図１）、キャピラリー電気泳動、および質量分析法（図２）による純度および分子量の分析に使用された。ペプチドＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ（配列番号１８）の収量は１３８ｍｇであった。
【００５６】
本発明によるペプチドを合成するプロセスは、０．５〜２０ｍｍｏｌの範囲の大きなスケールに適応され、精製された本発明のペプチドが１ｇ〜５ｇの量で得られた。合成プロセスは、小さなスケールの複数のペプチド合成にも適応された。分子内ジスルフィド結合を有する本発明によるペプチドを、ｐＨ７．５〜８．５の空気で、ジメチルスルホキシドを使用して、または使用することなく処理したか、あるいは代替方法として、アセトアミドメチル保護システイン残基２個を有する直鎖状前駆物質からの本発明によるペプチドを、ヨウ素による酸化によって処理して、システイン架橋形成を促進した。
【００５７】
これらの一般的な合成手法を用いて、特に以下のペプチドを合成し、クロマトグラフ法により９８％までの程度に精製して、分析した。
【００５８】
【表１】
0004505336.tif 000002
0004505336.tif 000003
0004505336.tif 000004
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＊ＶＩＲ−５７６はホモダイマーであり；分子間ジスルフィド架橋はアミノ酸位置６番目のシステインで生じる。
【００５９】
実施例２：ヒト細胞に対する本発明のペプチドの細胞障害性
本発明のペプチドの細胞障害性は、ヒト単球系ＴＨＰ−１細胞の生存度を評価することによって試験した。ペプチドの細胞障害効果は、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，ドイツ）を用いて、代謝活性へのそれらの影響によって試験した。２５ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびウシ胎仔血清１０体積％を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、９６穴プレート（１ウェル当たり２５，０００細胞）において、ＴＨＰ−１細胞を試験ペプチドと共に、ＣＯ2５体積％を含有する雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。ＷＳＴ−１溶液１０μｌをそれぞれのウェルに添加し、ＴＨＰ−１細胞のインキュベーションを相当する条件でさらに２時間行った。代謝的に活性なＴＨＰ−１細胞は、ＷＳＴ−１、薄赤色のテトラゾリウム塩を還元し、黄色の可溶性ホルマザン塩を形成する。還元されたＷＳＴ−１の量は、生細胞の数に直接的に相関し、マイクロタイタープレート読取り装置を使用して、λ＝４５０ｎｍの波長で測光的に測定される（参照波長は６３０ｎｍである）。ポジティブコントロールとして、公知の細胞毒性物質、シクロヘキシミドを濃度５０μｇ／ｍｌで使用し；シクロヘキシミドの細胞障害性を１００％に設定した。その他のポジティブコントロールとして、ペプチドＭＢＩ−２８、当業者に公知の高い細胞毒性のペプチドを最大濃度３００μｇ／ｍＬで使用した。ネガティブコントロールとして、本発明のペプチドまたはポジティブコントロールで処理されていない培養ＴＨＰ−１細胞を使用した。ＶＩＲＩＰペプチドの細胞障害性は、以下の式：
生存度［％］＝［Ａ450nm（ペプチド）−Ａ450nm（シクロヘキシミド）］／［Ａ450nm（ネガティブコントロール）−Ａ450nm（シクロヘキシミド）］*１００
を使用して計算され、未処理ＴＨＰ−１細胞の平均生存度と相関した。この実験は、本発明によるペプチドの濃度３０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬで行った。ペプチドＶＩＲ−１６１（配列番号３）、ＶＩＲ−１６２（配列番号４）、ＶＩＲ−１６３（配列番号５）、ＶＩＲ−１６４（配列番号６）、ＶＩＲ−１６５（配列番号７）、ＶＩＲ−１６６（配列番号８）、ＶＩＲ−１７０（配列番号９）、ＶＩＲ−１７５（配列番号１０）、ＶＩＲ−１８２（配列番号１１）、ＶＩＲ−１８４（配列番号１２）、ＶＩＲ−１９０（配列番号１３）、ＶＩＲ−１９１（配列番号１４）、ＶＩＲ−１９２（配列番号１５）、ＶＩＲ−１９３（配列番号１６）、ＶＩＲ−１９７（配列番号１７）、ＶＩＲ−１９９（配列番号１８）、ＶＩＲ−２２９（配列番号１９）、ＶＩＲ−２３４（配列番号２０）、ＶＩＲ−２４３（配列番号２１）、ＶＩＲ−２５２（配列番号２２）、ＶＩＲ−２５５（配列番号２３）、ＶＩＲ−２５７（配列番号２４）、ＶＩＲ−２５８（配列番号２５）、ＶＩＲ−２５９（配列番号２６）、ＶＩＲ−２６０（配列番号２７）、ＶＩＲ−２６１（配列番号２８）、ＶＩＲ−２６２（配列番号２９）、ＶＩＲ−２６３（配列番号３０）、ＶＩＲ−２６４（配列番号３１）、ＶＩＲ−２６５（配列番号３２）、ＶＩＲ−２６６（配列番号３３）、ＶＩＲ−２６８（配列番号３４）、ＶＩＲ−２６９（配列番号３５）を試験した。これらのペプチドは、ポジティブコントロールのシクロヘキシミドおよびＭＢＩ−２８と比較して、単球系ＴＨＰ−１細胞に対する細胞障害効果を示さなかった。
【００６０】
実施例３：本発明のペプチドによるＨＩＶ感染の抑制
一次ＣＤ４受容体および主要なＨＩＶ−１侵入補助因子ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の両方を発現するＰ４−ＣＣＲ５指標細胞（Charneauら, 1994; Journal of Molecular Biology 241, 651-662）を使用して、本発明によるペプチドがＨＩＶ−１感染の強力な阻害剤であるかどうかを評価した。これらの細胞は、ＨＩＶ−１プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含有する。したがって、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の活性化によって、ＨＩＶ−１感染の効率を測定することが可能であり、したがって、ＨＩＶ−１阻害剤の効力を定量することができる（Detheux M.ら, 2000; Journal of Experimental Medicine 192, 1501-1508; Munchら, 2002; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 982-990）。
【００６１】
通常の感染アッセイを実施するために、Ｐ４−ＣＣＲ５細胞（Charneauら, 1994; Journal of Molecular Biology 241, 651-662; Charneauら, Virology. 1994 205, 247-53）を、ＦＣＳ１０体積％を補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地中に維持した。この細胞系は、ＣＤ４と、ＨＩＶ−１補助受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の両方を共発現し、ＨＩＶ−１プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。記述されているカルシウム共沈法（Detheuxら, J Exp Med. 192:1501-8; 2000）によって、ウイルスストックを作製し、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍを通じて入手したＨＩＶ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキットで、ｐ２４抗原レベルを定量化した。平底の９６穴皿に細胞を播種し、一晩培養し、総体積５０ｍｌの培地中にｐ２４抗原１ｎｇを含有するウイルスに感染させる前に、様々な用量のペプチドと共に２時間インキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、抑制性のペプチドを含有しない新たな培地で培養した。感染させて３日後に、細胞を溶解し、製造元により推奨されるＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（商標）化学発光レポーターアッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ社，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、感染力を定量化した。すべての感染を５通り行った。
【００６２】
このアッセイの結果から、本発明によるペプチドは、ＶＩＲＩＰと比較して、大幅に向上した抗ＨＩＶ−１活性を有することが実証されている。本発明のペプチドは、Ｘ4−向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  ＤＴＶ（ここからＤＴＶと呼ぶ）による感染を抑制した。ＤＴＶはＮＬ４−３の変異体（variant）であり、元のＶＩＲＩＰの１０倍を超え、１００倍までの高い効率を有する分子クローン−ｒ４として、Ｒｉｍｓｋｙら（Journal of Virology 72, 986-993; 1998）により最初に記述された。本発明のペプチドは、Ｒ５−向性ＨＩＶ−１  ＹＵ−２分子クローンによる感染に対しても活性であった。これらのデータから、ＶＩＲＩＰの特異的な修飾は、本発明によるペプチドの抗ＨＩＶ−１効力を大幅に高めることが実証されている。記載の感染アッセイから得られた本発明のペプチドのＩＣ50を以下に示す。
【００６３】
【表２】
0004505336.tif 000006
0004505336.tif 000007
0004505336.tif 000008
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＊ＶＩＲ−５７６はホモダイマーであり；分子間ジスルフィド架橋はアミノ酸位置６番目のシステインで生じる。
【００６４】
実施例４：マウスにおける本発明のペプチドの毒性
ＳＣＩＤ−Ｃ．Ｂ１７−マウスの尾静脈に単回静脈内投与した後、急性毒性をＶＩＲ−１２１（ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＶＡＦＮＫＰＦＶＦ）で評価した。０．９体積％塩化ナトリウム溶液１３．６ｍｌ／体重（ｋｇ）に溶解したＶＩＲ−１２１（配列番号２）９２７ｍｇの投与量（マウス一匹当たり２０．４ｍｇまたは２７２μＬに等しい）を適用した。注入速度は１５秒以内の投与量であった。動物３匹を試験物質で処置し、試料を尾静脈に投与した後、５、１５、３０分、および１、３、６、および２４時間の時点で動物を観察した。対照として、マウス３匹をそれぞれ、相当する体積の賦形剤（ＮａＣｌ０．９体積％）で処置した。２４時間後、動物を屠殺し、解剖し、巨視的に調べた。適用する間および適用した後、２４時間の観察時間の終わりまで、ＶＩＲ−１２１（配列番号２）で処置されたすべての動物について、運動性の低下または増加、呼吸困難、運動失調の徴候も、筋緊張の低下または増加の徴候も認めなかった。挙動の変化も認められず、挙動は対照動物の挙動と同様であった。対照群と比較して巨視的な剖検から所見は得られなかった。
【００６５】
実施例５：哺乳動物血漿における本発明のペプチドの安定性
本発明のペプチドの半減期および暴露を評価するために、ヒト、イヌ、カニクイザルおよびラットから採取したＥＤＴＡ血漿において３７℃でインキュベートした後、ペプチドの安定性を哺乳動物血漿において調べた。血漿をスパイクした結果、濃度４０μｇ／ｍｌとなり、３７℃で保存した。０、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０および３００分の時点で、２０μｌの試料を採取した。沈殿させるために、０．１５％（ｗ／ｖ）ｎ−ノニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを含有する２倍体積のアセトニトリルと血漿をすぐに混合した。遠心分離した後、２倍体積の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸と上清を混合した。これらの溶液２０μｌをＬＣ−ＭＳにより分析した。以下の溶離剤：溶離剤Ａ：０．０６％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を含有する水、溶離剤Ｂ：アセトニトリル／水（８０：２０（ｖ／ｖ））（０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有する）での勾配を用いて、クロマトグラフィーを実施した。流量３０μｌ／分にて、Ｃ１８プレカラムをＣ１８分離カラム（３００Å、５μｍ、内径１５０×１ｍｍ）と組み合わせて使用した。ＨＰＬＣ溶出液を代表的なＬＣＱ質量分析計のエレクトロスプレー技術によってイオン化した。本発明のペプチドの検出ピークの領域を測定し、外部キャリブレーションによる定量化に使用した。較正曲線は、血漿０．５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌの範囲にわたって直線であった。初期濃度の５０％の濃度に低下するまでの時間として定義される半減期は、インキュベーション時間に対する所定の時点での相対的なペプチド濃度（対数スケール）をプロットする外挿曲線のスロープから算出された。これらの実験によって、血漿中のペプチド濃度を定量分析することが可能となった。得られた結果は、ヒト、カニクイザルおよびイヌにおいて本発明のペプチドのかなりの半減期を示しているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ラットにおける半減期は短いように思われる。ヒトおよびサルにおいてｔ１／２の得られた値から、本発明のペプチドは、ＨＩＶ粒子による細胞感染の抑制に必要とされる、したがって、ＡＩＤＳに対する治療用途に必要とされる十分な半減期を示すことが実証されている。以下の表には、ヒト、ラット、イヌおよびカニクイザルの相当する血漿における本発明のペプチドの算出された半減期を示す。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
実施例６：融合ペプチド誘導溶血の抑制
ＨＩＶ  ｇｐ４１の合成融合ペプチドは、濃度依存性溶血を生じさせ、それは赤血球により放出されるヘモグロビンによって測定することができる。ペプチドおよび融合ペプチに結合する他のいずれかの物質は、その構造的特性を変化させることによって赤血球を溶解するその効力を付与する。融合ペプチド誘導溶血の抑制を以下のとおり試験した：健康なドナーからの血液をシトレート・モノヴェット（citrate monovette）に回収し、当業者に公知の標準的な遠心分離および洗浄プロトコルによって赤血球を抽出した。最終的な赤血球含有ペレットをリン酸緩衝液で１：１００に希釈した。１０％ＤＭＳＯ中の１００μＭ融合ペプチド溶液２０μｌ（１０、１００、または１０００当量）をペプチドに添加し、その溶液をリン酸緩衝液で１００μｌに希釈した。３７℃で６０分間インキュベーションを行った。プレインキュベーション後、試料を９６穴プレートに移し、赤血球懸濁液１００μｌを添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。完全な溶血を１％Ｔｗｅｅｎ−２０で達成した。９６穴プレートを２８００ｒｐｍで５分間遠心し、上清液１５０μｌを平底マイクロタイタープレートに移し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。溶血のパーセンテージは：［（ペプチド処理した試料のＡ４５０−緩衝液処理した試料のＡ４５０）／（Ｔｗｅｅｎ−２０処理した試料のＡ４５０−緩衝液処理した試料のＡ４５０）］×１００％で計算した。
【００６８】
この結果から、融合ペプチド誘導溶血は、増加濃度の本発明のペプチドを添加すると抑制されることが示されている。特に、融合ペプチド誘導溶血は、ＶＩＲＩＰと比較して本発明のペプチドによって有効に抑制されている。これらの結果から、本発明のペプチドは、ウイルスｇｐ４１タンパク質と相互作用することによって、ＨＩＶ粒子による細胞感染をブロックすることが実証されている。
【００６９】
略語：
ＡＩＤＳ：  後天性免疫不全症候群
Ｂｏｃ：  ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＣＸＣＲ４：  ＣＸＣケモカイン受容体４
ＣＣＲ５：  ＣＣケモカイン受容体５
ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＰ：  融合ペプチド
ＨＩＶ：  ヒト免疫不全ウイルス
ＨＰＬＣ：  高性能液体クロマトグラフィー
ＨＲ−１、ＨＲ−２：  ７アミノ酸繰り返し１、２
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：  マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型
Ｍｉｎｉ−ＰＥＧ：  −ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ2
ＮＭＲ：  核磁気共鳴
Ｏｉｃ：  オクタヒドロインドリル−２−カルボン酸
ＰＥＧ：  ペギル、ポリオキシエチレングリコール
ＱＳＡＲ：定量的構造活性相関
ｔＢｕ：  ｔ−ブチル
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸
Ｔｉｃ：  １，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
Ｔｒｔ：  トリチル
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】精製ＶＩＲ−１９９（配列：ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ）（配列番号１８）のＣ１８  ＨＰＬＣの図。条件：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ、流量：０．８ｍｌ／分、勾配：３０分でＢ１０〜７０体積％、バッファーＡ：ＴＦＡ０．０７体積％、バッファーＢ：ＴＦＡ０．０５体積％、アセトニトリル８０体積％）。
【図２】精製ＶＩＲ−１９９（配列：ＬＥＡＩＰＭＳＩＰｐＥＦＬＦＮＫＰＦＶＦ）（配列番号１８）のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）。Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １００質量分析計を使用して、質量スペクトルを記録した。［Ｍ＋２Ｈ］2+（ｍ／Ｚ１１６９．０）および［Ｍ＋３Ｈ］3+（ｍ／ｚ  ７８０．０）に対する分子イオンが示されている。
【図３】種々のＶＩＲＩＰペプチドによる融合ペプチド溶血の用量依存的抑制。１０００μＭ、１００μＭおよび１０μＭにて、ペプチド（ＶＩＲＩＰ（配列番号１）、ＶＩＲ−１６４（配列番号６）、ＶＩＲ−１６５（配列番号７）、ＶＩＲ−１７５（配列番号１０）、ＶＩＲ−２６９（配列番号３５））を融合ペプチド１００μＭと共にプレインキュベートし、ヒト赤血球におけるヘモグロビンの放出を測定した。Ｙ軸は、ペプチドの濃度に依存する、融合ペプチド誘導溶血の抑制を表す。このように、溶血の抑制の程度は、融合ペプチドへのペプチドの結合の程度である。ＶＩＲＩＰよりも低いＩＣ50値を示すペプチドは、ＶＩＲＩＰと比較して、細胞の感染をより有効に抑制する。
【図４】ｇｐ４１の概略図である。融合ペプチド（ＦＰ）ドメイン、ＨＲ−１およびＨＲ−２ドメインの３つのドメインが示されている。融合ペプチドはｇｐ４１のＮ末端に位置する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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