(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類の抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体を用いることを特徴とする乳アレルゲンの検出方法。
【請求項２】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、さらに、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の乳アレルゲンの検出方法。
【請求項３】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１又は２記載の乳アレルゲンの検出方法。
【請求項４】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。
【請求項５】
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中のαｓ１カゼインを、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の乳アレルゲンの検出方法。
【請求項６】
未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類の抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体を備えたことを特徴とする乳アレルゲン検出用キット。
【請求項７】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、さらに、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６記載の乳アレルゲン検出用キット。
【請求項８】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６又は７記載の乳アレルゲン検出用キット。
【請求項９】
抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１及びハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の乳アレルゲン検出用キット。
【請求項１０】
異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つが、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の乳アレルゲン検出用キット。
【請求項１１】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１。
【請求項１２】
ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性及び変性の乳アレルゲンを指標とした乳アレルゲンの検出方法や、それに用いられる乳アレルゲンの検出用キットに関する。
【０００２】
また、本発明は、食品等の試料中に含まれる未変性又は変性の乳アレルゲンを定性的かつ定量的に高感度で分析することができる、カゼインの主要タンパク質であるαｓ１カゼインを指標とした乳アレルゲンの検出方法や、それに用いられる乳アレルゲンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母若しくはゼラチンなどが知られており、特に乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼインや、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリンや、卵白アレルゲン成分としてはオボアルブミンとオボムコイドや、小麦アレルゲンの主要成分としてグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１が知られている。
【０００４】
従来、アレルゲンの検出する方法としては、例えば、アレルゲンに特異的に反応するイムノグロブリンを定量する方法（特開平０５−２４９１１１号公報参照）や、抗原抗体複合体を含有する検体中の該抗原抗体複合体を酸処理等により解離させ、必要に応じてアルカリを用いて中和処理を行った後、該検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を測定する方法（特開平０７−１４０１４４号公報参照）等が知られている。
【０００５】
また、現在、乳、卵、小麦、そば、落花生の特定原材料を検出するための公定法として、加熱・非加熱複合抗原より得られるポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（特開２００３−１５５２９７号公報参照；以下「市販公定法Ａ」という）、あるいは精製抗原より得られたポリクローナル抗体を用いた免疫学的な検出方法（以下「市販公定法Ｂ」という）が用いられている。これらは、特異的にアレルゲンを検出するために有効な方法であるが問題も多い。例えば、市販公定法Ａでは複合抗原を用いているため、何に対する抗体なのかが不明で、交差性が高く、例えば、イムノブロット法などによる抗原の同定ができず、また非特異反応が増える可能性がある。また、市販公定法Ｂでは、抗原が精製されているため抗体の特異性は明確であるものの、未変性の抗原を用いて作製された抗体を使用しているため、変性／未変性により抗体が結合する程度に違いがあるため、同じ添加量であっても、加熱前、加熱後での定量値が異なるという問題があった。特に、小麦は他の特定原材料（卵、乳、そば、落花生）の中でも過酷な加熱処理が施される場合が多い（例えばパン、唐揚げ等）ため、小麦アレルゲンは未変性から加熱変性まで、広範囲な状態で存在する。そこで、小麦アレルゲンを検出するためには、どの様な状態のアレルゲンに対して結合するかを明らかにしたモノクローナル抗体を作製し、その特性に応じて利用する必要がある。
【０００６】
さらに、卵の同定、定量に関しては、オボムコイドを指標として、すでにポリクローナル抗体を用いた方法（例えば、Int. Archs. Allergy appl. Immun., 75, 8-15, 1984参照）あるいはモノクローナル抗体を用いた方法（例えば、Nutr. Sci. Vitaminol. 45, 491-500, 1999参照）が知られている。また、オボムコイドを認識するモノクローナル抗体で、未変性オボムコイドと反応するが熱変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、熱変性オボムコイドと反応するが未変性オボムコイドとは反応しないモノクローナル抗体、及び未変性オボムコイドと熱変性オボムコイドに反応するモノクローナル抗体を用いて、加熱変性状態をも識別してオボムコイドを定量し、卵アレルゲンの同定と正確な定量を可能とする免疫学的定量方法が報告されている（例えば、特開２００２−２５３２３０号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、乳アレルゲンを含む食品において、乳アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても検出できる高感度な免疫学的な検出方法及びそれに用いられる検出キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定原材料である乳アレルゲンを検出する方法について鋭意検討し、未変性及び変性の乳アレルゲンを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いると、これら特定原材料の乳アレルゲンを検出することができることを見い出した。
【０００９】
特定原材料の一つである乳の検出方法の検討を行うに当たっては、カゼインの主要たんぱく質であるαｓ１カゼインを指標として、これに対するモノクローナル抗体（以下ＭＡｂと記す場合がある）を作出し、その中から未変性αｓ１カゼイン、尿素処理αｓ１カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識することができるＭＡｂを複数選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、未変性αｓ１カゼイン、尿素処理αｓ１カゼイン、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを、１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうるＭＡｂの組合わせを見い出した。また、これらのＭＡｂを用いると、食品中の乳アレルゲンがいかなる加工工程を経た場合にでも、本発明による検出方法や検出キットを利用する者がより簡便に検査対象製品からの乳アレルゲンを検出しうることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明（乳アレルゲン）の２種類の抗αｓ１カゼインＭＡｂを用いた、各種状態のαｓ１カゼインに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】本発明（乳アレルゲン）のＰａｓ１ＣＮ１およびＰａｓ１ＣＮ２の認識するαｓ１カゼインの構成たんぱく質の相違を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の乳アレルゲンの検出方法としては、未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類の抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体を用いる乳アレルゲンの検出方法であれば特に制限されず、また、本発明の乳アレルゲン検出用キットとしては、未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを認識し、かつ、それぞれ異なるエピトープを認識する２種類の抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体を備えた乳アレルゲン検出用キットであれば特に制限されない。かかる未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを認識するモノクローナル抗体として、抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体を具体的に例示することができる。ここで「乳アレルゲン」とは、乳カゼインの主要タンパク質であるαｓ１カゼインを含むものをいう。
【００１２】
上記抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体としては、未変性αｓ１カゼインと尿素処理αｓ１カゼインに加えて、未変性カゼインナトリウム、及び変性カゼインナトリウムを認識する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体が好ましく、例えば、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識するモノクローナル抗体を挙げることができ、具体的には、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２等を好適に例示することができる。また、Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２を組み合わせることで、特に有利にサンドイッチＥＬＩＳＡやイムノクロマトを行うことができる。例えば、これらの抗体を用いることで、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、食品中の未変性αｓ１カゼイン及び尿素処理αｓ１カゼインを、１０〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析することができる。
【００１３】
以上の本発明の免疫学的なアレルゲンの検出方法は、未変性／変性の乳アレルゲンを含む試料を、標識化した抗αｓ１カゼインＭＡｂと接触させ、あるいは標識化した抗体の存在下にαｓ１カゼインＭＡｂと接触させ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識物質を用いて分離・測定する検出段階とからなり、かかる免疫反応段階における抗原抗体反応の方法も特に制限されず、例えば、以下の方法を例示することができる。
【００１４】
不溶性担体に結合した本発明の抗αｓ１カゼインＭＡｂに試料中の乳アレルゲンを捕捉させた後に標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させるサンドイッチ法や、不溶性担体に結合した抗αｓ１カゼインＭＡｂと異なるエピトープを認識する標識抗αｓ１カゼインＭＡｂ（第二抗体）を用いるサンドイッチ二抗体法や、不溶性担体に結合した抗αｓ１カゼインＭＡｂに試料中の乳アレルゲンを標識化抗原の存在下で反応させる競合法や、乳アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する磁気ビーズ結合標識抗αｓ１カゼインＭＡｂを作用させさせた後、磁力により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する磁気ビーズ法や、乳アレルゲンを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識抗αｓ１カゼインＭＡｂを作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法や、金コロイド等で標識された抗αｓ１カゼインＭＡｂと食物アレルゲンであるαｓ１カゼインが結合した抗原抗体複合体が試験ストリップ上を毛管現象等により移動する途中に、αｓ１カゼインと結合する抗αｓ１カゼインＭＡｂをあらかじめ固定しておき、抗原抗体複合体を補足させることで現れる着色ラインの有無によって定性分析するイムノクロマト法の他、二重免疫拡散法、放射免疫拡散法など公知の免疫測定法を利用することができるが、抗αｓ１カゼインＭＡｂとして、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上のモノクローナル抗体を用いる方法、例えば、食品中の未変性アレルゲン及び／又は変性アレルゲンが１００〜１０００ｐｐｂの濃度範囲においても定性的かつ定量的に分析しうる高感度の点でサンドイッチ二抗体法が、定性的には簡便性からイムノクロマト法が好ましい。また、食肉製品等の食品試料中からアレルゲンを抽出する場合、尿素と２−メルカプトエタノールを用いることが望ましい。
【００１５】
上記抗原抗体反応において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等を挙げることができ、また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管、ラテックスビーズ状等の種々の形状で用いることができる。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は特に限定されるものでなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１６】
本発明の乳アレルゲンの検出方法や乳アレルゲン検出用キットに用いられる抗αｓ１カゼインＭＡｂの免疫グロブリンのクラス及びタイプは特に制限されないが、抗αｓ１カゼインＭＡｂとして、ＩｇＧクラス、タイプκの抗体が好適に用いられる。また、モノクローナル抗体の形態としては、全抗体又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ等の断片を用いることもできる。抗体の由来は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができるが、作製の簡便性からマウスに由来するモノクローナル抗体が好適に用いられる。また、抗αｓ１カゼインＭＡｂは、未変性又は変性のαｓ１カゼインで免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養するか、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。
【００１７】
抗αｓ１カゼインＭＡｂ産生ハイブリドーマは、例えば、未変性及び／又は変性のαｓ１カゼインを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗αｓ１カゼインＭＡｂ産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えば未変性及び／若しくは変性のαｓ１カゼイン又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えば未変性及び／又は変性のαｓ１カゼインをそのまま又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜２回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
【００１８】
細胞融合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で混合することにより行なうことができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁して培養することによりハイブリドーマを選択し、次いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニングを行ない、抗αｓ１カゼインＭＡｂを産生するハイブリドーマを得ることができる。また、αｓ１カゼイン等の未変性の食物アレルゲンのみを用いて免疫した抗免疫動物から、有利に抗変性αｓ１カゼインＭＡｂを得ることができる場合もある。この場合、抗変性αｓ１カゼインＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングしてもよいし、あるいは、固相状態でのＥＬＩＳＡで未変性のαｓ１カゼインに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択し、この抗体産生ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体から液相状態で未変性のαｓ１カゼインに対してのみ特異的に反応する抗αｓ１カゼインＭＡｂを得ることができる。前記のように、抗体産生ハイブリドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体を培養物から採取することができるが、培養物又は腹水からのモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、例えば、ＩｇＧ精製に通常使用される硫安分画法、陰イオン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロマトグラフィーによって行なうことができる。
【００１９】
また、標識化抗体作製に用いられる標識物質としては、単独でまたは他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識物質であればよく、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金コロイド等を使用するのができ、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を、発光物質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジニウム塩類等を、放射性物質としては３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等を例示することができる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤、蛍光剤、発光剤等が用いることができる。
【００２０】
本発明の食物アレルゲン検出用キットには、それぞれ異なるエピトープを認識する２以上の抗αｓ１カゼインＭＡｂを含むが、これらは保存安定性の点から、溶液状態よりも凍結乾燥物として収容されていることが好ましく、検出用キットにはかかる抗αｓ１カゼインＭＡｂ溶解する緩衝液や培養液の他、試料を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。また、より好ましい別の態様の本発明の抗食物アレルゲン検出用キットとしては、前記イムノクロマト法における試験ストリップを挙げることができる。この場合、異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体の少なくとも一つを、イムノクロマト用に用いられる金コロイドで標識されたモノクローナル抗体とすることが好ましい。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ１や、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）が産生する抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体Ｐａｓ１ＣＮ２を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成１７（２００５）年２月２４日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
１．抗αｓ１カゼインモノクローナル抗体の確立
１−１ 材料及び方法
１）αｓ１カゼイン（以下「αＣＮ」という）の調製
新鮮な牛乳よりZittle（1959）に従い、αＣＮの粗画分を得た。この粗画分をさらにＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｓ（TOSOH）を用いて、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．４）、４Ｍの尿素を含むＮａＣｌのリニアグラジエント（０から０．３Ｍ）により精製を行った。精製したαＣＮ画分を蒸留水による透析後、凍結乾燥を行った。生理食塩水でこの凍結乾燥物の０．１％溶液を調製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注し、免疫に供するまで−２０℃で凍結保管し、抗原溶液とした。
【００２４】
２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％のαＣＮが５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００２５】
３）血中抗体価の測定
初回あるいは追加免疫でαＣＮを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温に２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗αＣＮ抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserchLaboratories Inc.製）を用いた。
【００２６】
４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％αＣＮ溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Cell Strainer, 70 mm, Becton Dickinson）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8.653）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１，０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３，３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００mｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６cells/wellとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００２７】
５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗αＣＮ抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりαＣＮに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９ cell/wellとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６cells/wellとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。
クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００２８】
６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、未変性αＣＮ（以下「Ｎ−αＣＮ」という）、尿素処理αＣＮ（以下「Ｄ−αＣＮ」という）、市販のカゼインナトリウムの未変性物（以下「Ｎ−ＣＮ」という）又は市販のカゼインナトリウムの尿素処理物（以下「Ｄ−ＣＮ」という）の４種類のたんぱく質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−αＣＮは、精製αＣＮを１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。培養上清のＮ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮあるいはＤ−ＣＮに対する反応性を非競合法ＥＬＩＳＡにて調べた。
【００２９】
７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Jonesら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６cellsのクローニングされたハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をProtein Ｇカラム（アマシャム ファルマシア）により精製した。
【００３０】
８）ＭＡｂのクラス、サブクラス及びタイプ
ＭＡｂのクラス及びサブクラスについては、Monoclonal mouse immunoαＣＮobulin isotyping kit（Pharmingen）により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＬ（κ）及びＩｇＬ（γ）を決定した。
【００３１】
９）ＭＡｂのビオチン化
精製したＭＡｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれビオチン化処理を行った。５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、ＤＭＳＯに３ｍｇ／１００μｌで溶解したＮＨＳ−ビオチン溶液を１０μｌ加え、撹拌後、氷冷しながら２時間静置した。その後、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで置換した。
【００３２】
１−２ 結果
１）ＭＡｂの選択
乳の主要アレルゲンであるαｓ１カゼイン（αＣＮ）を特異的に認識する６種類のＭＡｂが得られた。これら６種類のＭＡｂにおける、それぞれ固相とした各抗原Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、又はＤ−ＣＮに対する特異性をダイレクトＥＬＩＳＡにより調べた。また、これらＭＡｂのクラス、サブクラスについても調べた。結果を表1に示す。表１中、＋は各固相抗原に対し陽性であることを、−は陰性であることを示す。表１に示されるように、全ての状態の抗原に結合するＭＡｂであるＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を選択した。
【００３３】
【表１】
0004427541.tif 000002
【００３４】
２）サンドイッチＥＬＩＳＡにおける組合せ条件
ダイレクトＥＬＩＳＡで選択したＰａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３を用いて、全てのＭＡｂの組合わせについてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。Ｐａｓ１ＣＮ１、Ｐａｓ１ＣＮ２、Ｐａｓ１ＣＮ３をそれぞれ固相あるいはビオチン化抗体として、αＣＮあるいはＣＮを検出するためのＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより選出した。その結果、Ｎ−αＣＮ、Ｄ−αＣＮ、Ｎ−ＣＮ、Ｄ−ＣＮを検出できる組合せとしてＰａｓ１ＣＮ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６３）とＰａｓ１ＣＮ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２６４）を選択した。結果を図１に示す。
【００３４】
２．Ｐａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の認識するエピトープ
αｓ１カゼイン溶液を、リシルエンドプロテアーゼで分解し、分解物をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（分離ゲル１６．５％、濃縮ゲル５％）により分離した。分離したゲルを用いて、エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜にＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の培養上清（１／１０００）を反応させたのち、発色させて、認識するエピトープを確認した。結果を図２に示す。その結果、認識部位はＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２ともに、分子量約７０００、配列番号１で示されるαｓ１カゼインのアミノ酸配列の１３２番目から１９３番目までの領域を認識した。
【００３５】
３．サンドイッチＥＬＩＳＡによる食品中の変性および未変性カゼインの検出
上記１．で選択されたＰａｓ１ＣＮ１とＰａｓ１ＣＮ２の組合せにより、実際の食品中のカゼインを検出できるかを試みた。
【００３６】
３−１ 材料及び方法
１）モデル食肉製品の作製
定量試験のためのモデル食品として食肉製品を選択し、表２に示す配合にて各濃度のカゼインナトリウムを含むモデル食肉製品を作製した。豚赤肉は、豚ロース肉より脂、スジを除去し、５ｍｍで挽肉にしたものを使用した。
【００３７】
【表２】
0004427541.tif 000003
【００３８】
各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行い、７５℃で３０分の加熱を行った。
２）サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量分析
各モデル食肉製品を、フードプロセッサーにて均一になるまで磨砕し、分析用サンプルとした。サンプルを２ｇを量り取り、１Ｍ尿素および０．１％ ２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳＴを３８ｇ加え１００℃、一時間加熱処理を行った。冷却後、３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離を行い、上清０．５ｍｌにＰＢＳＴを９．５ｍｌ加え、ＥＬＩＳＡ用サンプルとした。検量線には同様に尿素・２−メルカプトエタノール処理を行ったカゼインナトリウムの段階希釈を用いた。また、分析用サンプルからＰＢＳＴを用いて抽出し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを０．５％加えたもの）に溶解したカゼインナトリウムを検量線とした尿素および２−メルカプトエタノールを用いない場合との比較を行った。
【００３９】
３−２ 結果
サンドイッチＥＬＩＳＡによるモデル食肉製品中のカゼインナトリウムの分析について、尿素および２−メルカプトエタノールを用いた結果を表３に、また、ＰＢＳＴのみで抽出した結果を表４に示す。
【００４０】
【表３】
0004427541.tif 000004
【００４１】
【表４】
0004427541.tif 000005
【００４２】
以上の結果から、尿素および２−メルカプトエタノールを抽出液に加えた場合に、高い回収率でモデル食肉製品中のカゼインナトリウムを検出可能であり、ＰＢＳＴ抽出では非常に低い回収率となった。これらのことから、食品中からのカゼインナトリウムの抽出には尿素および２−メルカプトエタノールを用いることが有効であり、その場合に利用するＭＡｂの特性には、尿素可溶化カゼインに結合可能であることが必要であることが明らかとなった。
【００４３】
４．イムノクロマトによる変性および未変性カゼインナトリウムの検出
４−１材料および方法
１）金コロイド標識およびコンジュゲートパッドの作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰａｓ１ＣＮ１のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６２５μｌを加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。ガラスウール製コンジュゲートパッドに６８μｌ／ｃｍ２となるよう塗布し、乾燥させた。
【００４４】
２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようＰａｓ１ＣＮ２のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００４５】
３）イムノクロマトストリップの組立と評価
上記で作製したサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドをそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。被検液としては、上記調製したモデル食肉製品を適宜希釈して用いた。
【００４６】
４−２ 結果
Ｐａｓ１ＣＮ２および金コロイド標識Ｐａｓ１ＣＮ１の組合せによりカゼインナトリウムは加熱、非加熱に係わらず５０ｐｐｂ（食品中２ｐｐｍ）まで検出することができた。この結果から、製造工程中に混入した未変性カゼインナトリウムが対象となっても、加熱後の製品が対象となっても、いかなる場合にでも対応できるイムノクロマトストリップの設計が可能となった。
【００４７】
市販のアレルゲン検出用イムノクロマトストリップでは、ブランクとして０．０１Ｍの尿素のみを含むＰＢＳを滴下したところ、非特異的なバンドが生じてしまい、擬陽性となってしまった。これでは、加熱などにより変性した食品たんぱく中から効率よくアレルゲンを抽出するためのたんぱく質変性剤を使用できず、アレルゲンとして検出できる対象が極めて狭い範囲に限られてしまう危険性が考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によると、食品等に含まれる乳アレルゲンについての免疫学的な検出方法において、乳アレルゲンが、変性／未変性のいかなる状態にあっても正確に定性かつ定量的に検出することができる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>  Prima Meat Packers, Ltd.
<120>  Method for detecting allergen
<130>  2006P3340
<150>  2004-63071
<151>  2004-03-05
<150>  2004-285542
<151>  2004-09-29
<150>  2004-285543
<151>  2004-09-29
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  199
<212>  PRT
<213>  cow
<400>  1
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu
1               5                   10                  15
Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Gln Val Phe
20                  25                  30
Gly Lys Glu Leu Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser
35                  40                  45
Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser
50                  55                  60
Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Gln Gln Lys His
65                  70                  75                  80
Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu
85                  90                  95
Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val
100                 105                 110
Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His
115                 120                 125
Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Thr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala
165                 170                 175
Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu
180                 185                 190
Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp
195
【図１】
0004427541.tif 000006
【図２】
0004427541.tif 000007