(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞においてペプチドを産生させるための方法であって、以下のステップ：
ａ．宿主細胞において核酸を発現させること、ここにおいて、前記核酸は、
ｉ．切断可能なリンカーによって下記（ｉｉ）に連結された少なくとも１つのキャリアポリペプチド、
ｉｉ．少なくとも２つの抗菌性ペプチドを含有する少なくとも１つのペプチドマルチマー（ただし、各ペプチドユニットは切断部位によって互いに直列に連結されている）
を含む融合ポリペプチドをコードする；および
ｂ．マルチマーを切断部位において切断すること；
を含み、
前記宿主細胞がシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、かつ、前記マルチマーと前記融合ポリペプチドが、電荷均衡を欠いている、
前記方法。
【請求項２】
キャリアポリペプチドが宿主細胞の総細胞タンパク質の少なくとも２％から２５％として発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キャリアポリペプチドが、トレドキシン、マルトース結合タンパク質およびヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒドロラーゼがグリコシダーゼまたはデハロゲナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
デハロゲナーゼがハロアルカンデハロゲナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
デハロゲナーゼがロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＴＤＴＭ−００３に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
キャリアポリペプチドがＮ末端短縮ペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
切断部位がＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
マルチマーが、有機酸によって切断されて、個々のペプチドユニットが産生されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有機酸が希酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
希酸が、０．０２５Ｎ  ＨＣＬおよび１０％酢酸からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
切断時の個々のペプチドユニットが、このペプチドユニットの最初のＮ末端アミノ酸としてＡｓｐアミノ酸を含有し、および、このペプチドユニットの最後のＣ末端アミノ酸としてＰｒｏアミノ酸を含有する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
切断部位がＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏトリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
マルチマーが、有機酸によって切断されて、個々のペプチドユニットが産生されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
有機酸が希酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
希酸が、０．０２５Ｎ  ＨＣＬおよび１０％酢酸からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
切断時の個々のペプチドユニットが、ペプチドユニットの最初のＮ末端アミノ酸としてＧｌｙ−Ａｓｐジペプチドを含有し、および、ペプチドユニットの最後のＣ末端アミノ酸としてＰｒｏアミノ酸を含有する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
マルチマーが少なくとも３つのペプチドユニットを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
直列に連結されたペプチドユニットが同じ配向を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
融合ポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして発現される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
融合ポリペプチドが少なくとも１ｇ／Ｌのレベルで発現される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸を含むシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）である微生物宿主細胞であって、前記核酸は、以下の：
ａ．ｉ．切断可能なリンカーによって下記（ｉｉ）に連結された少なくとも１つのキャリアポリペプチド、
ｉｉ．少なくとも２つの抗菌性ペプチドを含有する少なくとも１つのペプチドマルチマー（ただし、各ペプチドユニットは切断部位によって別のペプチドユニットに直列に連結されている）
を含む融合ポリペプチドをコードし、
ここで、前記マルチマーと前記融合ポリペプチドが、電荷均衡を欠いている、
前記細胞。
【請求項２３】
キャリアポリペプチドが宿主細胞の総細胞タンパク質の少なくとも２％から２５％として発現される、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
キャリアポリペプチドが、トレドキシン、マルトース結合タンパク質およびヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の細胞。
【請求項２５】
ヒドロラーゼがグリコシダーゼまたはデハロゲナーゼである、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
デハロゲナーゼがハロアルカンデハロゲナーゼである、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
デハロゲナーゼがロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＴＤＴＭ−００３に由来する、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２８】
キャリアポリペプチドがＮ末端短縮ペプチドである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２９】
切断部位がＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドである、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３０】
切断部位がＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏトリペプチドである、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３１】
マルチマーが少なくとも３つのペプチドユニットを含有する、請求項２２に記載の細胞。
【請求項３２】
直列に連結されたペプチドユニットが同じ配向を有する、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３３】
融合ポリペプチドが不溶性ポリペプチドとして発現される、２２〜３２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
融合ポリペプチドが少なくとも１ｇ／Ｌのレベルで発現される、２２〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
様々なタンパク質およびペプチドがヒトの健康（およびその他）のために有用かつ有益である。例えば、定義のとおりの、抗生物質特性を有する広範囲の種類の抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）が存在する。これらのペプチドは、経済的に製造することができるならば、治療剤、抗感染剤、消毒剤および保存剤として幅広く使用される可能性を有している。
【０００２】
他のタイプの小ペプチドには、広範囲の治療的用途を有するホルモンが含まれる。
【０００３】
抗菌性ペプチドは、哺乳動物、鳥類、爬虫類、昆虫および植物を含む多くのタイプの生物の天然の抗微生物防御の天然成分である。多くのタイプの抗菌性ペプチドが存在し、また、これらのペプチドの多くの天然の供給源が存在する。多くの種類の天然ＡＭＰが命名されている。例えば、カエルから得られるマガイニン類（例えば、Ｚａｓｌｏｆｆ他（１９８７）を参照のこと）；カイコガから得られるアタシン類およびセクロピン類（例えば、Ｂｏｗｍａｎ他（１９８３）を参照のこと）；ウサギ、ヒトおよび他の哺乳動物から得られるディフェンシン類（例えば、Ｐａｒｄｉ他（１９９２）を参照のこと）；雌牛から得られるインドリシジン類およびバクテレシン類（例えば、Ｓｅｌｓｔｅｄ他（１９９２）およびＮｉｉｄｏｍｅ他（１９９９）を参照のこと）；ならびに、ミツバチから得られるアピダエシン類（例えば、Ｃａｓｔｅｅｌｓ他（１９８９）を参照のこと）がある。国際特許出願公開ＷＯ００／３１７２９もまた参照のこと。
【０００４】
さらに、様々なＡＭＰが、節足動物（カニ、エビ、カブトガニ、クモ、サソリ）および下等無脊椎動物（ミミズ、軟体動物（ｍｏｌｕｓｃ）および海綿）によって産生されている。微生物もまたＡＭＰを産生しており、そのような微生物には、粘液細菌、放線菌、真性細菌、菌類（子嚢菌類および担子菌類の両方）、ならびに原生生物（アメーバなど）が含まれる。表１を参照のこと。
【０００５】
【表１】
0004472998.tif 000002
【０００６】
いくつかのＡＭＰおよび構造的に類似するペプチドが、ガン細胞に対する選択的な活性を有することが見出されている。例えば、国際特許出願公開ＷＯ９７／３３９０８（ＣＳＩＲＯ）および同ＷＯ９０／１２８６６（ルイジアナ州立大学）を参照のこと。人為的なＡＭＰ配列および抗腫瘍ペプチド配列を、天然アナログの改変によって合成すること（例えば、米国特許第５，９９４，３０６号（Ｉｎｔｒａｂｉｏｔｉｃｓ）を参照のこと）、または、ペプチド構造／活性の関係の一般的な原理からの設計によって合成すること（例えば、米国特許第５，８６１，４７８号（Ｈｅｌｉｘ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）を参照のこと）、または、ランダムな組合せ体のスクリーニング（例えば、米国特許第５，５０４，１９０号（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を参照のこと）によって行うことさえもまた可能である。
【０００７】
典型的なＡＭＰは長さが約１０アミノ酸から５０アミノ酸である。これらのペプチドは、塩基性アミノ酸（リシンおよびアルギニン）が比較的多い傾向を有しており、従って、（正味の正荷電を有して）カチオン性である傾向がある。ＡＭＰは自然界では両親媒性である（すなわち、分子の一部が親水性であり、その一方で、それ以外の部分は疎水性である）。広く研究されているが、ＡＭＰの作用モードは依然として科学的議論の対象である。多くの場合、データは、両親媒性ペプチドが、細孔または通路を膜に形成するように組織化することを示唆している。例えば、Ｄｕｒｅｌｌ他（１９９２）、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、６３：１６２３〜１６３１を参照のこと。別の場合には、ＡＭＰは、膜との「カーペット様」の会合を形成することによって膜を破壊するようである。例えば、Ｓｈａｉ他（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：１１４７９〜８８を参照のこと。これは、細胞膜の脱分極および必須細胞成分の喪失を引き起こすことによって微生物を破壊し、殺す。
【０００８】
ＡＭＰは、広い作用スペクトルの抗菌活性を有している。このことは、ＡＭＰを医薬用の抗生物質として使用することの注目される局面の１つである。様々な典型的な化学的抗生物質に対して耐性である病原性微生物の出現がますます拡大していることに照らして、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）を、経済的に製造することができるならば、典型的な化学的抗生物質の代替物として使用することが注目されている。
【０００９】
ＡＭＰは、治療剤（例えば、米国特許第６，１３２，７７５号（ニューヨーク大学）を参照のこと）、抗感染剤（例えば、米国特許第６，０７１，８７９号（オクラホマ大学）を参照のこと）、消毒薬（例えば、Ｊａｙｎｅｓ他［１９９６］、ＣＬＡＯ  Ｊ．、２２：１１４〜７を参照のこと）、保存剤（例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／０１４００（Ａｓｓｏｃ．Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．）を参照のこと）として、また、食品安全性（例えば、Ｐａｄｇｅｔｔ他［１９８８］、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、６１：１３３０〜１３３５を参照のこと）のために広範囲に使用できる可能性を有している。ＡＭＰおよびＡＭＰ様ペプチドはまた、レトロウイルス（例えば、Ｔａｍａｍｕｒａ他［１９９８］、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６：２３１〜２３８を参照のこと）を含めて、ガンおよびウイルスに対する治療的使用のために注目されている（例えば、Ｅｇａｌ他［１９９９］、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ、１３：５７〜６０を参照のこと）。同様に、主として遺伝子組換え植物法を使用することによって、植物病の蔓延防止のためにＡＭＰを使用することにもかなり注目されている。例えば、Ｎｏｒｅｌｌｉ他（１９９０）、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８９：Ｓ５６を参照のこと。
【００１０】
しかしながら、ＡＭＰまたは他の短いペプチド配列の大規模な治療的使用および関連する使用に対する実際の制限は、それらは、大量に製造するためには高価（および困難／非効率的）であるということである。例えば、ＡＭＰ（および他のペプチドまたはタンパク質）の化学的なペプチド合成は非常にコストがかかる。
【００１１】
治療的または機能的（例えば、触媒作用的）に重要な異種タンパク質の微生物における合成的な製造が達成されている。例えば、Ｓｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｒ．（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：１９５〜２０１を参照のこと。ポリペプチドを製造するそのような方法は、固相合成を上回る利点をいくつかもたらす可能性を有しており、そのような利点には、配列忠実性、利便性、低コスト、および、長いポリペプチド／タンパク質を製造することができることが含まれる。あるタイプのタンパク質およびポリペプチドの微生物による製造は好都合かつ費用効果的であり得るが、そのような技術は何にでも適用することができず、多くの場合、様々な制限が明らかである。これらの制限には、１）低い収率、２）誤って折り畳まれた不活性なタンパク質の蓄積、３）微生物成長の阻害、および４）ポリペプチド（特に、低分子量のポリペプチド）の検出または単離／精製が困難であることを挙げることができる。
【００１２】
全体的なタンパク質収率を改善するために、より大きい融合タンパク質の一部として小ペプチドを生物学的に製造する試みがなされている。例えば、米国特許第６，２４２，２１９号および同第６，２７４，３４４号（Ｘｏｍａ  Ｃｏｒｐ．）は、キャリアタンパク質に融合された（かつ、そのキャリアタンパク質から切断され得る）殺菌性の／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ）に由来するペプチドに関する。’２１９号特許は、キャリアからのペプチドの同時的な酸溶解および切断に関する。Ａｓｐ−Ｐｒｏ連結がペプチドとキャリアとの間で使用され得る。’３４４号特許は、ＢＰＩのように、キャリアはカチオン性であることが可能であることを示している。
【００１３】
小ペプチドは、細菌内の天然のプロテアーゼによる分解を極めて受けやすい。小ペプチドは、ＡＭＰを含めて、自然界では、マルチペプチド前駆体の一部として産生される場合がある。Ｃａｓｔｅｅｌｓ−Ｊｏｓｓｏｎ他（１９９３）、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１２（４）：１５６９〜１５７８。昆虫のニューロペプチド（短いペプチド）は、同様な様式で自然界では産生されるようである。例えば、Ｒａｏ他（１９９６）、Ｇｅｎｅ、１７：１〜５を参照のこと。しかしながら、天然の事象をインビトロで繰り返すことは極めて困難であり得る。例えば、多数コピーの所望するＤＮＡフラグメントを容易に切断可能な様式で組み立て、発現することは、手間および費用のかかるプロセスであり得る。多数コピーのクローン化されたＤＮＡセグメントを増幅することに関する背景については、より一般的には、例えば、Ｃｏｈｅｎ他（１９８６）、ＤＮＡ、５（４）：３３４〜３４５（これは、ＤＮＡフラグメントの直列反復を使用して逆向きにされた反復構造を有するマルチマーを製造することに関する）（ポリオーマウイルスＤＮＡがモノマーとして使用された）；および、Ｋｉｍ他（１９８８）、Ｇｅｎｅ、７１：１〜８（これは、クローン化されたＤＮＡを直列マルチマー（この場合、モノマーは非対称な付着末端を有する）として増幅することに関連する）を参照のこと。
【００１４】
従って、小ペプチドの合成的製造には様々な障害があり、ＡＭＰは、生物学的に合成することは特に困難である。短いこと、および、タンパク質分解的な分解を受けやすいことに加えて、ＡＭＰは、定義のとおり、細菌および他の微生物に対して毒性である。従って、天然の活性な物質としてＡＭＰをバイオリアクターで製造することは、実際上、不可能である。さらに、ＡＭＰは正荷電／カチオン性になりやすく、このことが、より詳細には下記で説明されるように、合成的な生物学的製造に対する別の障害をもたらしている。
【００１５】
例えば、組換えエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が、ＡＭＰを生合成的に製造するために様々な試みで使用されている。しかしながら、（これまでの）収率は、産生された場合、極めて低いものである。定義により、ＡＭＰは細菌および他の微生物に対して毒性である。従って、何らかの著量のＡＭＰが（例えば、エシェリヒア・コリの）培養によって産生されるとき、ＡＭＰは、培養物を殺す傾向がある。米国特許第５，２０６，１５４号（Ｘｏｍａ  Ｃｏｒｐ．）は、セクロピンの活性を抑制する目的でキャリア（ａｒａＢ）に融合されたセクロピンを特許請求している。この方法が成功した場合、キャリアに対するＡＭＰの相対的な収率は低いと考えられる。
【００１６】
また、活性なモノマーを生じさせるために後で切断されるマルチマー／コンカテマー前駆体としてＡＭＰを最初に合成することによってＡＭＰを合成的に製造することも試みられている。しかしながら、これにもまた、ＡＭＰをそのような様式で製造することに関して様々な問題が存在していた。
【００１７】
ＡＭＰをマルチペプチド前駆体として製造しようとする試みには、生物学的合成に関して、他にない、特に困難な様々な問題がある。より詳細には、１個のＡＭＰは非常にカチオン性／正荷電であるので、複数のＡＭＰモノマーを含むマルチマータンパク質を作製することは、本質的には、より大きい、非常にカチオン性のタンパク質を作製することである。（塩基性アミノ酸残基がＡＭＰに多数存在することによりカチオン性である）発生期のＡＭＰマルチマーの正荷電は、転写および翻訳に関与する（酸性である）ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの負荷電と相互作用し、それにより、天然の細胞プロセスを乱し、任意の実質的なレベルへの所望するＡＭＰの産生を妨げることが提案されている。例えば、Ｌｅｅ他（１９９６）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１３：１３９〜１４５を参照のこと（これは、９３塩基対のマガイニンモノマーの直列マルチマーを含む構築物の増幅に関する。ポリマーの正荷電アミノ酸は、ポリマーを負荷電のタンパク質に融合することによって中和されなければならないことがこれには提案されている）。生成物ペプチドのプロテアーゼ分解は別の観測された問題である。
【００１８】
ＡＭＰの正荷電をキャリアタンパク質によって均衡または中和させる融合タンパク質の形態でＡＭＰを製造する試みが行われている。国際特許出願公開ＷＯ９６／２８５５９（ブリティッシュ・コロンビア大学；Ｈａｎｃｏｃｋ他）は、アニオン性ＡＭＰ部分と、カチオン性部分の抗菌活性を抑制すると言われるカチオン性／ＬＰＳ結合部分とを有する融合タンパク質に関する。
【００１９】
米国特許第５，５９３，８６６号（ブリティッシュ・コロンビア大学）は、ＡＭＰを生合成的に製造するための試みにおけるカチオン性／アニオン性の融合体の使用を記載している。この特許には、セクロピンの最初の１８アミノ酸と、メリチンの最後の８アミノ酸とを含むセクロピン／メリチンの融合体が開示されている。その特許に記載されたキャリアペプチドの例には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来するＧＳＴタンパク質、および、緑濃菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外膜タンパク質（プロテインＦ）が含まれる。臭化シアンが、融合体を切断して、活性なペプチドを回収するために使用されていた。この特許では、融合タンパク質を製造するために、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑濃菌の使用が特許請求されている。この特許はまた、その発明のＡＭＰは、大腸菌、緑濃菌、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）および黄色ブドウ球菌を阻害するために使用することができると述べている。この特許はまた、２つのさらなるリシン残基をカルボキシ末端に有するＡＭＰに関連する。これは、驚くべきことに、ＡＭＰの抗菌活性を２倍にしたことが報告された。
【００２０】
Ｌｅｅ他（１９９８）（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８（１）：３４〜４１）は、十分な発現を達成するための試みにおいて、マイガイニン（ｍａｉｇａｉｎｉｎ）マルチマーに融合されたマルトース結合タンパク質を使用している。Ｌｅｅ他はＸａ因子切断部位をモノマー間に使用している。この参考文献は、Ｘａ因子による切断から生じたＡＭＰが、さらなるアミノ酸残基をコアＡＭＰに有するにもかかわらず、活性を驚くほど保持していたと述べた。
【００２１】
Ｌｅｅ他（１９９８年２月；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２巻、第１号、５３頁〜６０頁）は、塩基性／正荷電ＡＭＰ（ブホリンＩＩ）に融合された酸性ペプチドの直列反復を使用している。システイン残基が、酸性ペプチドの各末端に重要なエレメントとして付加された。臭化シアンが、そこにおいて使用された切断剤であった。
【００２２】
Ｌｅｅ他（１９９９年６月）（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９（３）：３０３〜３１０）は、システインが多い酸性ペプチドに融合されたブホリンＩＩ  ＡＭＰを使用している。Ｚｈａｎｇ他（１９９８）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２４７：６７４〜６８０）は、セクロピン／マガイニンと、アニオン性プレプロドメイン（ＲｅｐＡドメイン）およびセルロース結合ドメインを含むキャリアタンパク質とを含む融合タンパク質に関する。
【００２３】
国際特許出願公開ＷＯ９８／５４３３６（Ｋｉｍ、Ｌｅｅ他、Ｓａｍｙａｎｇ  ＧｅｎｅｘおよびＫｏｒｅａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；米国特許第６，１８３，９９２号もまた参照のこと）は、少なくとも２つのシステイン残基を有する、酸性ペプチド（グアメリン）とのＡＭＰ（ブホリンＩＩ）の融合体の使用に関する。この特許出願は、この酸性ペプチドが、ＡＭＰの翻訳時におけるＤＮＡおよびＲＮＡとの電気的な引き寄せおよび相互作用を防止するために塩基性／正荷電のＡＭＰを中和するために要求されることを教示している。システイン残基はまた、ポリペプチドの２つの部分の相互作用および適正な折り畳みを容易にするために必要であることが教示されている。国際特許出願公開ＷＯ９８／５４３３６は、一般的な酸性キャリアペプチド遺伝子は単独では塩基性の抗菌性ペプチドの効率的な発現を可能にしないと述べて、米国特許第５，５９３，８６６号と異なっている。すなわち、酸性ペプチドにおける少なくとも２つのシステイン残基の存在が、問題を効率的に解決するために必要であるとしている。国際特許出願公開ＷＯ９８／５４３３６も、同様に、国際特許出願公開ＷＯ９６／２８５５９を、効力がないとして記載しており、また、そのような問題に対する解決策としてアニオン性ペプチドにおけるシステイン残基の使用を同じように示唆している。
【００２４】
国際特許出願公開ＷＯ９９／６４６１１（Ｓａｍｙａｎｇ  Ｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）は、ｐｕｒＦ遺伝子およびＡＭＰを含む融合体の使用に関する。Ｓａｍｙａｎｇ  Ｇｅｎｅｘの別の特許出願（国際特許出願公開ＷＯ００／３４３１２）は、塩基性ペプチド／タンパク質を融合パートナーから切断するためのヒドロキシルアミンの使用に関する。米国特許第６，２５５，２７９号および国際特許出願公開ＷＯ９９／４８９１２（Ｋｏｒｅａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、口内洗浄薬および洗眼薬におけるＡＭＰの使用が可能であることを述べている。国際特許出願公開ＷＯ９７／２２６２４（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ  ＡＧ）は、抗菌性の化粧品調製物、デオドラント化粧品などにおいて使用されるランダムマルチマーの使用に関する。
【００２５】
国際特許出願公開ＷＯ００／３１２７９（Ｍｉｃｒｏｌｏｇｉｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）は、酸性ペプチド（セルロース結合ドメイン）に融合されたマルチマーＡＭＰであると考えられる「マルチドメイン融合タンパク質」に関し、この場合、必須エレメントとして、アニオン性スペーサーが、「電荷均衡」のために（すなわち、カチオン性ペプチド成分の電荷を除去するために）各ＡＭＰモノマーの間に存在する。この特許出願では、細胞によって産生される総タンパク質と比較してＡＭＰの相対的な産生を増大させるために、（集中した負荷電を提供する）小さいスペーサーが使用されている：このタイプのマルチマーは自身がキャリアタンパク質（セルロース結合ドメイン）に融合され得る。この特許出願は、７０％ギ酸が可能な切断剤であり得ると簡単には述べているが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）がこの出願を通して例示されていて、マルチドメインタンパク質を（メチオニン残基において）切断して、活性なモノマーを生じさせている。国際特許出願公開ＷＯ００／３１２７９は、融合タンパク質が不溶性のタンパク質で存在し得ると述べている。ここでは、「不溶性ペプチド」は、「細胞を破壊し、細胞破片が遠心分離（例えば、１０，０００Ｘｇから１５，０００Ｘｇ）によって沈殿させたとき、クーマシブルー染色を伴うＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって決定したとき、可溶性の成分を実質的にもたらさないポリペプチド」であると、定義されている。
【００２６】
シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）がＡＭＰを製造するために好都合であるかまたはＡＭＰを製造することができるということは、この分野ではこれまで示唆されていない。
【００２７】
シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびシュードモナス・フルオレセンスは、ビタミンＢ１２を製造するために商業的に使用されている。Ｓｃｈｅｎｅｃｔａｄｙ  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅのウエブサイトを参照のこと。ある種のシュードモナス・フルオレセンス菌株が抗真菌特性を有することが知られている。例えば、米国特許第６，０４８，７１３号を参照のこと。いくつかのシュードモナス・フルオレセンス菌株は、抗生物質を産生することが知られており、これら抗生物質を製造する際に使用することができる。例えば、米国特許第４，１０８，７２４号を参照のこと。米国特許第５，３４８，７４２号もまた参照のこと。殺昆虫性のタンパク質毒素を製造するためのシュードモナス・フルオレセンスの使用もまた知られている。例えば、米国特許第５，８４０，５５４号、同第５，５２７，８８３号、同第５，１２８，１３０号および同第５，０５５，２９４号（Ｍｙｃｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照のこと。シュードモナス・フルオレセンスはまた、環境汚染の生物浄化のためにも使用されている。例えば、米国特許第５，７１１，９４５号および同第４，８５３，３３４号を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
これらのペプチド発現システムのすべてにおいて、細胞培養において導入遺伝子から発現したポリペプチドの収率は、典型的には、数マイクログラム／リットルから約１００ｍｇ／Ｌまでの範囲で報告されている。結果として、著しくより大きい収量をもたらす遺伝子組換えポリペプチド発現システムがこの分野では依然として求められている。従って、ＡＭＰを含む様々な小ペプチドを、微生物発酵を使用して効率的かつ費用効果的な様式で製造する方法に対する要求は大きく、以前から意識されている。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
（要約）
小ペプチドの生合成的製造方法であって、少なくとも１個の微生物細胞；および、前記微生物細胞が、（ａ）切断可能なリンカーによって下記（ｂ）に連結された少なくとも１つの高発現キャリアポリペプチドと、（ｂ）少なくとも２つの小ペプチドユニットを直列配置で含有する少なくとも１つのペプチドマルチマー（ただし、それぞれの小ペプチドユニットは、少なくとも１つのＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドを含有する切断部位によって少なくとも１つの隣接する小ペプチドユニットに連結されている）とを含有するキャリア−ペプチド融合ポリペプチドを発現することができる少なくとも１つの核酸、を提供すること；前記核酸を前記微生物細胞にトランンスフェクションして、形質転換された微生物細胞を得ること；前記形質転換された微生物細胞を、細胞が核酸を発現することができ、前記核酸によりコードされたキャリア−ペプチド融合ポリペプチドを産生させることができる条件に置くこと；場合により、前記キャリア−ペプチド融合ポリペプチドを前記形質転換された微生物細胞から回収すること；場合により、切断反応を行って、前記キャリアポリペプチド（１つまたは複数）を前記ペプチドマルチマーから切断すること；切断反応を行って、マルチマーの小ペプチドユニットを互いに切断し、それにより小ペプチドを得ること；および、場合により、末端切断反応を行って、小ペプチドの末端に存在する切断部位アミノ酸残基または切断可能なリンカーアミノ酸残基またはそれらの両方を除くこと、を含む前記方法。
【００３０】
前記微生物細胞が細菌細胞である前記方法。前記細菌細胞がγプロテオバクテリア綱のメンバーである前記方法。前記細菌細胞がシュードモナス属のメンバーである前記方法。前記細菌細胞がシュードモナス・フルオレセンス群のメンバーである前記方法。前記細菌細胞がシュードモナス・フルオレセンスである前記方法。前記細菌細胞がシュードモナス・フルオレセンス細分類Ａである前記方法。
【００３１】
小ペプチドユニットを連結する切断部位のそれぞれが少なくとも１つのＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏトリペプチドを含有する前記方法。小ペプチドユニットを連結する切断部位のそれぞれがＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏトリペプチドである前記方法。ペプチドマルチマーが少なくとも３つのペプチドユニットを直列配置で含有する前記方法。ペプチドユニットのそれぞれが前記ペプチドマルチマー内で同じ配向で発現する前記方法。ペプチドマルチマーの小ペプチドユニットが同一のアミノ酸配列を有する前記方法。前記高発現キャリアポリペプチドが、微生物細胞において高度に発現するタンパク質のＮ末端フラグメントである前記方法。前記Ｎ末端フラグメントが長さ約１０アミノ酸残基以上である前記方法。前記タンパク質がロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＴＤＴＭ−００３ハロアルカンデハロゲナーゼ（配列番号３０）である前記方法。
【００３２】
（ａ）切断可能なリンカーによって下記（ｂ）に連結された少なくとも１つの高発現キャリアポリペプチドと、（ｂ）少なくとも２つの小ペプチドユニットを直列配置で含有する少なくとも１つのペプチドマルチマー（ただし、それぞれの小ペプチドユニットは、少なくとも１つのＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドを含有する切断部位によって少なくとも１つの隣接する小ペプチドユニットに連結されている）とを含有するキャリア−ペプチド融合ポリペプチドを発現させることができる核酸。ベクターである前記核酸。前記ベクターがプラスミドである前記核酸。シュードパリンドロームオリゴマーを含むオリゴマーのアニーリングおよび連結を行って、ペプチドユニットをコードするオリゴヌクレオチドを直列で含有し、および切断部位をコードするオリゴヌクレオチドによって連結されたマルチマーポリヌクレオチドのプール（前記プールは、ペプチドユニットをコードするオリゴヌクレオチド部分がすべて同じ配向で配置されているマルチマーポリヌクレオチドと、ペプチドユニットをコードするオリゴヌクレオチド部分が異なる配向で配置されているマルチマーポリヌクレオチドとの両方を含有する）を形成すること、次いで、適切な制限エンドヌクレアーゼで前記マルチマーポリヌクレオチドを処理して、ペプチドユニットをコードするオリゴヌクレオチド部分が異なる配向で配置されているようなマルチマーポリヌクレオチドのみを加水分解することを伴う方法によって調製される前記核酸。前記核酸を含有する微生物細胞。
【００３３】
前記方法によって製造される小ペプチド。小ペプチドが抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）である発明。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、コアＤ２Ａ２１抗菌性ペプチドに対するアミノ酸を示す。
【００３５】
配列番号２は、配列番号１のペプチドをコードするために使用されたＤＮＡ配列を示す。
【００３６】
配列番号３は、配列番号４のペプチドをコードするために使用されたＤＮＡ配列を示す。
【００３７】
配列番号４は、マルチマーに組み立てるためのペプチド連結／切断部位の３つのさらなるアミノ酸残基を有するコアＤ２Ａ２１抗菌性ペプチドモノマーについてのアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号５は、（大腸菌発現ベクターｐＥＴ２１ｂを使用する）配列番号６の４Ａダイマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００３９】
配列番号６は、（リーダーセグメント、トリペプチドリンカーにより隔てられた２つのＡＭＰ、およびトレーラーセグメントを含む）４Ａダイマーのアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号７は、Ｄ２Ａ２１’ＡＭＰモノマーのアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号８は、Ａｓｐ−Ｐｒｏの切断可能なジペプチドリンカーをコードする好ましいヘキサヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号９は、（リーダーセグメント、トリペプチドリンカーにより隔てられた３つのＡＭＰ、およびトレーラーセグメントを含む）ＡＢ４トリマーのアミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号１０は、（大腸菌発現ベクターｐＥＴ２１ｂにおける）配列番号９のＡＢ４トリマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１１は、ＴＦ３トリマーのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号１２は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号１１のＴＦ３トリマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号１３は、Ｄ４Ｅ１  ＡＭＰのアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１４は、Ｄ４Ｅ１トリマーのアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１５は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３およびエシェリヒア・コリ発現ベクターｐＥＴ２４ｂにおける）配列番号１４のＤ４Ｅ１トリマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号１６は、Ｄ４Ｅ１テトラマーのアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１７は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号１６のＤ４Ｅ１テトラマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号１８は、Ｄ４Ｅ１ペンタマーのアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号１９は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３および大腸菌発現ベクターｐＥＴ２４ｂにおける）配列番号１８のＤ４Ｅ１ペンタマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号２０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２１は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号２０のデハロゲナーゼタンパク質をコードするＤＨＦＲ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号２２は、ＤＨＦＲ／ＴＦ３トリマー融合体のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２３は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号２２の融合体をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号２４は、ＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１トリマー融合体のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号２５は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号２４の融合体をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号２６は、ＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１テトラマー融合体のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号２７は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号２６の融合体をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号２８は、ＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１ペンタマー融合体のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号２９は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号２８の融合体をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号３０は、全長デハロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３１は、配列番号３０のデハロゲナーゼタンパク質をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号３２は、「３Ｉ」融合体（デハロゲナーゼ／Ｄ２Ａ２１’トリマー）のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３３は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３およびエシェリヒア・コリ発現ベクターｐＥＴ２１ｂにおける）配列番号３２の「３Ｉ」融合体をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号３４は、「４Ｃ」構築物（１２３アミノ酸の短縮型デハロゲナーゼ／Ｄ２Ａ２１’トリマー）のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号３５は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３およびエシェリヒアメコリ発現ベクターｐＥＴ２１ｂにおける）「４Ｃ」構築物をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号３６は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）１６Ａ（Ｄ２Ａ２１）トリマーをコードするＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号３７は、１６Ａ（Ｄ２Ａ２１）トリマーのアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号３８は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）２１Ａ（Ｄ２Ａ２１）トリマーをコードするＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号３９は、２１Ａ（Ｄ２Ａ２１）トリマーのアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４０は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）２１Ｂ（Ｄ２Ａ２１）トリマーをコードするＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号４１は、２１Ｂ（Ｄ２Ａ２１）トリマーのアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号４２は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）ＪＰ２（Ｄ２Ａ２１）ダイマーをコードするＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号４３は、ＪＰ２（Ｄ２Ａ２１）ダイマーのアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号４４は、短縮化デハロゲナーゼ／Ｄ４Ｅ１ペンタマー融合体のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号４５は、（シュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３における）配列番号４４の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【００７９】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）を含む様々な小ペプチドの効率的かつ安価な製造方法を提供する。本発明によれば、細菌（および他の好適な微生物）、好ましくはシュードモナス・フルオレセンスが、大規模発酵において、ペプチド／ＡＭＰを製造するために使用される。ＡＭＰは、本発明による製造のための好ましいペプチドであるが、本発明の構成要素は、単独または組合せで、治療的有用性または触媒的有用性を有する他のタイプのペプチドを製造するために使用することができ、または、そのような用途のために適合させることができる。
【００８０】
本発明の要素は、単独および／または組合せで、ＡＭＰおよび目的とする他の小ペプチドを製造するためのシュードモナス・フルオレセンスの驚くほど有利な使用を可能にする。本発明は、広く、ＡＭＰを含む様々なペプチドを製造するためのシュードモナス・フルオレセンスの使用に関する。従って、本発明は、抗菌性ペプチドを製造するための方法を包含し、この方法は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを好ましくはシュードモナス・フルオレセンス細胞において発現させることを含む。ＡＭＰをシュードモナス・フルオレセンスにおいて産生させることが好ましいが、本発明の構成要素は、単独または組合せで、他の生物との使用のために、また、ＡＭＰ以外のペプチドを製造するために使用することができ、または適合させることができる。このことは、本開示の恩恵を受ける当業者には明らかである。
【００８１】
本発明によれば、高レベルのＡＭＰ（または他の小ペプチド）を、活性なモノマーを生じさせるために後で切断される非毒性のコンカテマー／マルチマー前駆体として細菌（好ましくはシュードモナス・フルオレセンス）において製造することができる。ＡＭＰをこの様式で製造することは、ＡＭＰの毒性（会合して細胞の膜に細孔を形成する能力に依存する）を除くことに役立つ。ペプチドを一般にこの様式で製造することはまた、小ペプチドが特に受けやすい望ましくないタンパク質分解的な分解を小ペプチドが回避することを助けることができる。
【００８２】
本発明の局面の１つはマルチマーである。本発明のマルチマーは、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のペプチド／ＡＭＰサブユニットを含むことができる。例示された構築物は、マルチマーにおいて所望される数のモノマーを製造するように改変し得る。
【００８３】
本発明は、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）を含む様々な小ペプチドを製造する効率的かつ安価な方法を提供する。本発明による発現システムは、約１ｇ／Ｌを超えて、多くの場合約５ｇ／Ｌで遺伝子組換えペプチドの生産をもたらすことが予想外にも見出された。これらの収量は、産業界での使用において既に報告されているシステムの収量を実質的に改善するものである。
【００８４】
特に好ましい実施態様において、細菌（および他の好適な微生物）、好ましくはシュードモナス・フルオレセンス（シュードモナス・フルオレセンス）が、大規模発酵において、ペプチドを製造するために使用される。ＡＭＰは本発明による製造のための好ましいペプチドであり、シュードモナス・フルオレセンスは好ましい微生物である。本発明の構成要素はまた、単独または組合せで、他のタイプの微生物を用いて他のタイプのペプチドを製造するために使用することができ、または適合させることができる。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を含有するオリゴペプチド分子またはポリペプチド分子を示し、この場合、そのような分子において、そのアミノ酸はペプチド結合だけによって互いに結合している。本発明によるペプチドは、機能的ペプチド；構造的ペプチド；それらのフラグメント；それらの前駆体；前記のいずれかの組合せ；および／または前記のいずれかのコンカテマーである任意のオリゴペプチド分子またはポリペプチド分子である。
【００８６】
上記で記されたように、本発明において有用なペプチドには、機能的ペプチド；構造的ペプチド；それらのフラグメント；それらの前駆体；前記のいずれかの組合せ；および／または前記のいずれかのコンカテマーであるペプチドが含まれる。
【００８７】
有用な機能的ペプチドには、例えば、生物活性なペプチド（すなわち、生物学的実体（例えば、生物、細胞、培養物、組織、器官またはオルガネラ）におけるか、またはそのような生物学的実体の生物学的な機能または活性の開始、増強、延長、弱化、終結または防止を発揮するか、または誘発するか、または、そうでなければ、生じさせるペプチド）；触媒作用ペプチド；微細構造活性ペプチドおよびナノ構造活性ペプチド（すなわち、何らかの活動（例えば、運動、エネルギー伝達）を行うか、または、一緒になってそのような活動を行う操作された微小構造またはナノ構造の一部を形成するペプチド）；および刺激性ペプチド（例えば、ペプチド矯味剤、着色剤、オドラント、フェロモン、誘因剤、抑止剤および忌避剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
有用な生物活性ペプチドには、例えば、免疫活性ペプチド（例えば、抗原性ペプチド、アレルゲンペプチド、ペプチド免疫制御因子、ペプチド免疫調節因子）；シグナル変換ペプチドおよびシグナル伝達ペプチド（例えば、ペプチドホルモン、サイトカインおよび神経伝達物質；受容体；アゴニストペプチドおよびアンタゴニストペプチド；ポリペプチド標的化ペプチドおよび分泌シグナルペプチド）；および生物阻害ペプチド（例えば、毒性ペプチド、殺生物ペプチド、バイオスタティック（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）ペプチド、例えば、ペプチド毒素および抗菌性ペプチドなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
有用な構造的ペプチドには、例えば、ペプチドアプタマー、フォールディングペプチド（例えば、別の分子における物理的な立体配座の形成または保持を促進または誘導するペプチド）；接着促進ペプチド（例えば、接着性ペプチド、細胞接着促進ペプチド）；界面ペプチド（例えば、ペプチド界面活性剤およびペプチド乳化剤）；微小構造構成ペプチドおよびナノ構造構成ペプチド（すなわち、操作された微小構造またはナノ構造の一部を形成する構造的ペプチド）；および活性化前のペプチド（例えば、プレタンパク質、プロタンパク質およびプレプロタンパク質ならびにプレペプチド、プロペプチドおよびプレプロペプチドのリーダーペプチド；インテイン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明は、広く、ＡＭＰおよび他の小ペプチドを製造するためのＰ．ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｓの使用に関する。本発明の要素は、単独および／または組合せで、ＡＭＰを含む様々な小ペプチドを製造するためのＰ．ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｓの驚くほど有用な使用を可能にする。本発明の様々な要素はまた、本開示の恩恵を受ける当業者には明らかであるように、単独または組合せで、他の生物とともに（および他の目的のために）使用することができる。
【００９１】
本発明によれば、高レベルのＡＭＰ（または他の小ペプチド）を、活性なモノマーを生じさせるために後で切断される非毒性のコンカテマー／マルチマー前駆体として細菌（好ましくはシュードモナス・フルオレセンス）において製造することができる。ＡＭＰをこの様式で製造することは、ＡＭＰの毒性（会合して細胞の膜に細孔を形成する能力に依存する）を除くことに役立つ。ペプチドを一般にこの様式で製造することはまた、小ペプチドが非常に受けやすい望ましくないタンパク質分解的な分解を小ペプチドが回避することを助けることができる。
【００９２】
本発明は、この分野で以前になされた教示または示唆のいずれとも異なる構造的特徴を有するマルチマー（好ましくはＡＭＰマルチマー）ならびにＡＭＰ（および他のペプチド）を提供する。本発明は、マルチマーを形成させるためにＡＭＰ／ペプチドモノマーを連結するための新規な手段を提供する。本発明はまた、モノマーをマルチマーから切断するための新規な手段を提供する。本発明の好ましいコンカテマー前駆体はＡｓｐ−Ｐｒｏペプチド連結／酸切断部位を個々のＡＭＰ／ペプチドサブユニット（モノマー）の間に含有する。Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ連結が特に好ましい。これにより、活性なモノマーを生じさせるための、マルチマーの安価かつ効率的な切断が可能になる。薄い無機酸または有機酸が好ましい切断剤である。そのような切断／切断部位をマルチマーにおける各コピーのペプチド／ＡＭＰモノマーの間に使用することはこの分野では教示されていなかった。
【００９３】
また、ペプチドをコードするポリペプチドの多数コピーをマルチマー構築物において好ましい配向で組み立て、一方、同時に、受け入れられ得る切断部位を導入するための方法も開示される。すなわち、受け入れられ得る切断部位をマルチマーに有することに加えて、本発明は、切断部位をコードするＤＮＡ配列を提供する。この場合、対応するＤＮＡ配列は、所望する配向での多数コピーのペプチド／ＡＭＰ「遺伝子」の効率的かつ安価な組立てを可能にする。他の知られている遺伝子構築方法とは異なり、本発明のこの局面は、最小限に改変された活性なＡＭＰ／ペプチド生成物を生じさせる特異的な化学的切断法を提供することとの適合性を有する。
【００９４】
本発明はまた、キャリアポリペプチド／タンパク質に融合された本発明のコンカテマー／マルチマーを好ましくは含む融合タンパク質を提供する。そのような融合体は、目的とするペプチド／ＡＭＰの回収レベルをさらに高めることができる。キャリアポリペプチドが使用される本出願の実施態様において、キャリアポリペプチドをマルチマーのＮ末端に融合することが好ましい。しかしながら、本発明のマルチマーは、末端融合に限定されない様々な発現システムでの使用のために適合させることができる。本発明のキャリアポリペプチドの種類もまた独特である。
【００９５】
本発明の他の非常に驚くべき局面は、本発明の好ましいカチオン性ＡＭＰマルチマーは電荷均衡を欠いているということである。さらに、本発明の好ましい融合タンパク質（これは、好ましくは、キャリアポリペプチドに融合されたＡＭＰモノマーを含む）もまた電荷均衡を欠いている。すなわち、ＡＭＰは典型的にはカチオン性／正荷電である。本発明は、マルチマー構築物における多数コピーのＡＭＰの正荷電を相殺することは必ずしも必要でないという驚くべき発見に関連している。先行技術は、これとは反対のこと、すなわち、十分な数の負荷電アミノ酸を、ＡＭＰの正味の正荷電を完全に相殺する（または、少なくとも著しく中和するために）、キャリアタンパク質において付加し、かつ／またはマルチマーに付加しなければならないことを教示していた。従って、本発明では、マルチマーＡＭＰ構築物の微生物による発現のために要求された、この分野でこれまで教示されていたこの要素が除かれる。本発明のこの局面はまた、ＡＭＰ以外のカチオン性ペプチドに関する使用のためにも同様に特に好都合である。
【００９６】
従って、本発明は、以前に考えられていたよりも広範囲の様々なキャリアポリペプチドの使用を可能にする。本発明は、驚くべきことに、キャリアタンパク質を、アニオン性（すなわち、ＡＭＰマルチマーはカチオン性であるので、ほぼアニオン性として）であるタンパク質に制限しなくとも、好ましいキャリアタンパク質またはポリペプチドが、それらは自身が目的の宿主において十分に発現する故に、選択されるはずであることを教示している。
【００９７】
本発明のマルチマーおよびマルチマー融合タンパク質は、好ましくは、不溶性のタンパク質封入体として製造される。本発明のシュードモナス・フルオレセンスは、好都合にも、マルチマーをこのような形態で産生させるために十分に適している。細菌で発現されたとき、本発明の好ましいコンカテマー前駆体は不溶性の不活性なタンパク質封入体に分配される。産生後、高密度の封入体を宿主細胞から機械的に分離することができる。所望する場合、溶媒またはカオトロピック剤で可溶化した後、コンカテマーは、活性なＡＭＰ／ペプチドモノマーを生じさせるために、希酸を使用して切断することができる。あるいは、また、好都合には、弱酸により、封入体を可溶化すること、およびコンカテマーを所望するペプチド生成物に切断することの両方を安価な１工程で行うことができる。本発明のプロセスは、固相合成と比較して費用を削減することができる。
【００９８】
従って、本発明は、ペプチドを微生物において経済的に製造するための簡便なシステムを提供する。本発明のペプチド発現システムは、抗菌性ペプチドを経済的に製造するために使用することさえできる。シュードモナス・フルオレセンス発現システムが好ましい。ＡＭＰが好ましいペプチドではあるが、本発明の発現システムは、他の種類のペプチドを経済的に製造するために使用することができる。細胞内プロテアーゼの望ましくない作用を避けること、および、ＡＭＰの毒性を低下させることができることに加えて、本発明の酸切断／キャリア−コンカテマーシステムはまた、組換えペプチドの発現をより「プロセスに適した」ものにする。すなわち、目的とするペプチドを、遠心分離またはろ過などの簡便かつ安価な操作によって多くの宿主混入物（他の細胞成分／残片）から分離することができる。その後、所望する画分を、酸処理によって活性な形態に容易に変換することができる。本明細書中で明らかにされる、シュードモナス・フルオレセンス発酵システムを安価なプロセス処理手順と効率的に結びつけることにより、天然由来ペプチドの製造および精製のために非常に競合し得るプロセスがもたらされる。
【００９９】
本発明は、この分野で以前になされた教示または示唆のいずれとも異なる構造的特徴を有するマルチマーおよびペプチド（ＡＭＰを含む）を提供する。本発明は、ペプチド／ＡＭＰモノマーを連結してマルチマーにするための新規な手段を提供する。本発明の好ましいコンカテマー前駆体はＡｓｐ−Ｐｒｏペプチド結合／切断部位を個々の（抗菌性）ペプチドサブユニット（モノマー）の間に含有する。Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ連結が特に好ましい。希酸が、有機酸または無機酸のいずれであっても、活性なモノマーを生じさせるための安価かつ効率的な切断を可能にする好ましい切断剤である。
【０１００】
このような切断／切断部位をモノマー（ＡＭＰ）各コピーの間で使用することはこの分野では教示されていなかった。通常、余分なアミノ酸残基はペプチド／ＡＭＰの活性を破壊するか、またはペプチド／ＡＭＰの活性に負の影響を及ぼすことが予想されると考えられていた。このように、酸に不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏ連結をモノマー間で使用することは、切断時に、その抗菌活性を驚くほど保持している誘導体化されたＡＭＰをもたらす。従って、本発明は、広く、そのような伸張部（Ｎ末端およびＣ末端におけるさらなるアミノ酸残基）を有するＡＭＰに関し、また、Ａｓｐ−Ｐｒｏ切断部位（ならびにＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ連結）をモノマー間に有するＡＭＰマルチマーに関し、また、これらの実施態様をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、全般に、ＡＭＰモノマーをＡＭＰマルチマーから切断するための希酸の使用にも関する。
【０１０１】
本発明の驚くべき局面の１つは、本発明の切断部位およびその好ましい希酸切断により、それぞれがコアペプチド／ＡＭＰをＮ末端およびＣ末端におけるさらなるアミノ酸残基と一緒に含む活性なモノマーが得られるということである。好ましくは、マルチマーの酸切断から生じるＡＭＰモノマーのそれぞれには、およそ３個のさらなるアミノ酸残基（Ｃ末端における２個の残基およびＮ末端における１個の残基）が存在する。例示されたモノマーは、コアＡＭＰと、コアＡＭＰのアミノ末端におけるプロリン残基と、Ｃ末端におけるグリシン残基およびアスパラギン酸残基とを含む。そのようなモノマーが優れた（抗菌）活性を保持することは驚くべきことである。この分野ではこれまで、ペプチド／ＡＭＰに残ったアミノ酸、特に、コアＡＭＰ／カチオン性ペプチドの両末端における酸性／アニオン性の残基は、通常、ペプチド（ＡＭＰ）の（抗菌）活性を破壊することが教示されていたからである。この「伸張された」ペプチドが活性であると推測するための根拠は全く存在せず、この「伸張された」ペプチドは所望された活性を失っていると通常予想されていた。従って、本発明のこの局面は、カチオン性ペプチド（好ましくはＡＭＰ）を製造するために特に好都合である。
【０１０２】
本発明の別の関連する局面は、モノマーをマルチマーから切断するための新規な手段である。本発明によれば、有機酸、好ましくは、０．０２５ＮのＨＣＬまたは１０％の酢酸などの希酸が、好ましくは、活性なペプチド／ＡＭＰモノマーをマルチマー（および、使用された場合にはキャリアポリペプチド）から分離するための切断剤として使用される。本発明による使用のために合わせることができる様々な切断剤が存在するが（上記の背景技術の節で議論された様々な参考文献では、様々な切断剤が使用されている）、本発明の希酸はいくつかの理由のために好ましい。１つの利点は、好ましい薄い有機酸による切断から生じるモノマーは天然の生成物であるということである；一部の切断剤は、自然界には存在しない望ましくない化学的誘導体を生じさせる。このことは、例えば、臭化シアンについては正しい。ギ酸もまた、望ましくないホルミル化を受けている残基を生じさせ得る。ギ酸はまた、除くことが困難である（ギ酸を使用してマルチマーの切断およびモノマーの取り出しを行った後では、ギ酸は、水性の生成物から分離することが困難になり得る。これは、ギ酸が水との極めて高い沸点の共沸混合物を形成するからである。この作用は水をギ酸よりも速く蒸発させ得るし、これはギ酸の除去工程を長くする）。従って、ギ酸以外の希酸が、驚くべきことに好ましい。このことは、先行技術の教示とは反対である。
【０１０３】
本発明の所望されるペプチド／抗菌性ペプチドは、好ましくは、最初、少なくとも２つのペプチド／ＡＭＰモノマーを含むマルチマー前駆体の一部として細胞によって発現される。好ましい製造方法はさらに、マルチマーＡＭＰ／ペプチドを希酸で切断して、ＡＭＰ／ペプチドモノマーを遊離させる工程を含む。具体的に例示された実施態様において、前記の切断から生じるＡＭＰモノマーは、配列番号７により表されるペプチドである。マルチマーの例示された実施態様において、マルチマーは配列番号６のアミノ酸配列を含む。様々な他のペプチドおよびマルチマーが本明細書中で例示される。具体的に例示されたＡＭＰモノマーのほかに、様々なさらなるペプチドモノマーを代わりに使用することができる。本明細書中で議論、例示および／または示唆されたペプチド／タンパク質のいずれかをコードする構築物およびポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
【０１０４】
受け入れられ得る切断部位をマルチマーに有することに加えて、切断部位をコードする対応するＤＮＡ配列もまた、多数コピーのペプチド／ＡＭＰ「遺伝子」の所望する配向での効率的かつ安価な組立てを可能にするに違いない。多数コピーのペプチド／ＡＭＰをコードするポリヌクレオチドを好ましい配向でマルチマー構築物において組み立て、一方、同時に、受け入れられ得る切断部位を導入するための方法もまた開示される。キャリア−ＡＭＰ融合ポリペプチドの高発現キャリアポリペプチドは、微生物宿主細胞において高度に発現する任意のタンパク質またはポリペプチドから選択される。その例には、トレドキシン（ｔｈｏｒｅｄｏｘｉｎｅ）、マルトース結合タンパク質、および、ニトリラーゼを除くヒドロラーゼが含まれる。ヒドロラーゼを使用する好ましい実施態様において、高発現のグリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１）または高発現のデハロゲナーゼ（ＥＣ３．８．１）が選択される。高発現グリコシダーゼの好ましい例には、ガラクトシダーゼ、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）がある。高発現デハロゲナーゼの好ましい例には、ハロアルカンデハロゲナーゼ（ＥＣ３．８．１．５）があり、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＴＤＴＭ−００３（これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１０８、米国；所在地、１０８１０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０、米国）からＡＴＣＣ５５３８８として入可能な生物である）から得られるハロアルカンデハロゲナーゼ（配列番号３０）がある。
【０１０５】
キャリアポリペプチドは、キャリア−ペプチド構築物の最初（すなわち、Ｎ末端）の部分として発現されるので、構築物のＮ末端部分は、完全な選択された高発現タンパク質もしくは高発現ポリペプチドまたはそれらのＮ末端フラグメントのいずれかを含有することができる。好ましくは、構築物のＮ末端部分は、選択された高発現タンパク質もしくは高発現ポリペプチドのＮ末端フラグメントであり、すなわち、そのようなＮ末端フラグメントを表す。好ましくは、Ｎ末端フラグメントは長さが少なくとも１０アミノ酸残基である。好ましい実施態様において、Ｎ末端フラグメントは長さが約１５アミノ酸残基以上である。好ましい実施態様において、Ｎ末端フラグメントは長さが約２０アミノ酸残基以上である。好ましい実施態様において、Ｎ末端フラグメントは長さが１５０アミノ酸残基未満であり、より好ましくは約１２０アミノ酸残基以下であり、さらにより好ましくは約１００アミノ酸残基以下であり、さらにより好ましくは約８０アミノ酸残基以下であり、なお一層より好ましくは約６０アミノ酸残基以下である。好ましい実施態様において、Ｎ末端フラグメントは長さが約１０アミノ酸残基から約１５０アミノ酸残基であり、より好ましくは約１０アミノ酸残基から約１２０アミノ酸残基であり、さらにより好ましくは約１５アミノ酸残基から約１００アミノ酸残基であり、さらにより好ましくは約１５アミノ酸残基から約８０アミノ酸残基であり、なお一層より好ましくは約２０アミノ酸残基から約６０アミノ酸残基である。好ましい実施態様において、Ｎ末端フラグメントは長さが約５０アミノ酸残基または約４０アミノ酸残基または約３０アミノ酸残基または約２０アミノ酸残基である。好ましい実施態様において、キャリアポリペプチドは、高度にアニオン性でないポリペプチドから選択される。この場合、高度にアニオン性は、ｐＫａまたはｐＩが５．５以下であるとして定義される。従って、好ましくは、キャリアポリペプチドは５．５よりも大きいｐＫａまたはｐＩを有する。
【０１０６】
キャリアポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された高発現ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列から得られるか、または選択された高発現ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列に由来する。電荷均衡についてのキャリアポリペプチドの最初の選択は、４つのクラスのアミノ酸を参照して考慮される。好ましい実施態様において、キャリアポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された高発現ポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸配列と同一である。好ましい実施態様において、キャリアポリペプチドのアミノ酸配列は上記Ｎ末端部分のアミノ酸配列の保存的変化体である。本明細書中で使用される表現「保存的変化体」は、アミノ酸配列（この場合、選択されたキャリアポリペプチドのアミノ酸配列）の保存的に変異した変化体を示す。アミノ酸配列の保存的変異は、下記の７群の１つまたは複数の内部でなされたアミノ酸置換として定義される：酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；非荷電の極性アミド：Ａｓｎ、Ｇｌｎ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；小さい非荷電または非極性：Ｇｌｙ、Ａｌａ；非極性アルキル：Ｖａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；極性アルコール：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。保存的変化体の好ましい実施態様において、７５％未満のアミノ酸残基、より好ましくは５０％未満のアミノ酸残基が変異させられる。好ましくは約３３％以下、より好ましくは約３０％以下、さらにより好ましくは約２５％以下、なお一層より好ましくは約２０％以下、なおさらにより好ましくは約１０％以下、なお一層より好ましくは約５％以下のアミノ酸残基が変異させられる。キャリアポリペプチドのアミノ酸配列が高発現ポリペプチドのアミノ酸配列と同一であるか、または高発現ポリペプチドのアミノ酸配列の保存的変化体であるかのいずれかである場合、そのポリヌクレオチドコード配列は、選択された宿主細胞に対してコドンが最適化され得る。
【０１０７】
下記の実施例は、長さが約１２０アミノ酸から約１６０アミノ酸の程度であるキャリアポリペプチドを参照して記載されるが、長さが約２０アミノ酸であるキャリアポリペプチドもまた、首尾良く使用されている。例えば、ロドコッカス・ロドクロウスのハロアルカンデハロゲナーゼのＮ末端の２０ｍｅｒフラグメントが、実施例において開示される、より大きいキャリアポリペプチド構築物について観測される発現レベルと比較して、キャリア−ペプチド融合タンパク質の発現の低下を全く伴うことなくＡＭＰコンカテマーを発現させるために使用されている。
【０１０８】
本発明によるペプチドは、微生物において、すなわち、微生物宿主細胞において生合成的に製造される。本明細書中で使用される用語「微生物」および用語「微生物（的）」は、真菌（糸状菌および酵母を含む）および細菌を示す。好ましい糸状菌には、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種が含まれる。好ましい酵母には、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種が含まれる。特に好ましい実施態様において、微生物は細菌である。
【０１０９】
細菌が微生物宿主細胞として選択される好ましい実施態様において、細菌は発酵菌門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバーであり、より好ましくはバチルス綱（Ｂａｃｉｌｌｉ）のメンバーである。バチルス綱の細菌が宿主細胞として選択されるとき、好ましくは、細菌はバチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）またはラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のメンバーである。バチルス目の細菌が選択されるとき、好ましくは、細菌はバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバーであり、より好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーであり、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。ラクトバチルス目の細菌が選択されるとき、好ましくは、細菌はラクトバチルス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバーであり、より好ましくはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。細菌が宿主細胞として使用される代わりの好ましい実施態様において、細菌は放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーであり、その好ましい例には、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の種が含まれる。
【０１１０】
細菌宿主細胞を使用する特に好ましい実施態様において、細菌は、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーであり、より好ましくはγプロテオバクテリア綱のメンバーである。γプロテオバクテリア綱の細菌が宿主細胞として選択されるとき、好ましくは、細胞は腸内細菌目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）またはシュードモナス目（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）のメンバーである。腸内細菌目の細菌が選択されるとき、好ましくは、細菌はエンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーであり、より好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属のメンバーである。エシェリヒアの種の好ましい例はエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、セラチア種の好ましい例はセラチアメマルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【０１１１】
シュードモナス目の細菌が選択されるとき、好ましくは、細菌はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）のメンバーであり、さらにより好ましくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のメンバーである。シュードモナス属の細菌が宿主細胞として選択されるとき、好ましくは、細菌は、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）群のメンバーであり、この群には、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）群、例えば、シュードモナス・オーランチカ（Ｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、シユードモナス・クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フラジ（Ｐ．ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・ルンデシス（Ｐ．ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）およびシュードモナス・タエトロレンス（Ｐ．ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）；および、シュードモナス・フルオレセンス群、例えば、シュードモナス・アゾトホルマンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス・ブレンネル（Ｐ．ｂｒｅｎｎｅｒｉ）、シュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）、シュードモナス・コングレランス（Ｐ．ｃｏｎｇｅｌａｎｓ）、シュードモナス・コルガタ（Ｐ．ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、シュードモナス・コンスタンチニー（Ｐ．ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉｉ）、シュードモナス・エキトレモリエンタリス（Ｐ．ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フルギダ（Ｐ．ｆｕｌｇｉｄａ）、シュードモナス・ガスサルディー（Ｐ．ｇａｓｓａｒｄｉｉ）、シュードモナス・リバネンシス（Ｐ．ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・マンデリー（Ｐ．ｍａｎｄｅｌｉｉ）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐ．ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス・メジテラネア（Ｐ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、シュードモナス・ミグラエ（Ｐ．ｍｉｇｕｌａｅ）、シュードモナス・ムシドレンス（Ｐ．ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・オリエンタリス（Ｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、シュードモナス・ポアエ（Ｐ．ｐｏａｅ）、シュードモナス・ロデシアエ（Ｐ．ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、シュードモナス・シンザンタ（Ｐ．ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・トラアジ（Ｐ．ｔｏｌａａｓｉｉ）、シュードモナス・トリビアリス（Ｐ．ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）およびシュードモナス・ベロンニー（Ｐ．ｖｅｒｏｎｉｉ）が含まれる。
【０１１２】
より好ましくは、細菌宿主細胞はシュードモナス・フルオレセンス群のメンバーであり、好ましくはシュードモナス・フルオレセンスである。シュードモナス・フルオレセンスが選択されるとき、好ましくは、それは、シュードモナス・フルオレセンス細分類Ａ、シュードモナス・フルオレセンス細分類Ｂ、シュードモナス・フルオレセンス細分類Ｃ、シュードモナス・フルオレセンス細分類Ｇ、シュードモナス・フルオレセンス  Ｐｆ−５、シュードモナス・フルオレセンス  Ｐｆ０−１またはシュードモナス・フルオレセンス  ＳＢＷ２５のいずれかである。シュードモナス・フルオレセンス細分類Ａが特に好ましい。
【０１１３】
本発明に従って製造される小ペプチドは、長さが少なくとも２アミノ酸である。好ましくは、小ペプチドは長さが約５アミノ酸以上であり、より好ましくは約１０アミノ酸以上であり、さらにより好ましくは約１５アミノ酸以上であり、さらにより好ましくは約２０アミノ酸以上であり、なお一層より好ましくは約２５アミノ酸以上である。好ましくは、小ペプチドは長さが約３００アミノ酸以下であり、より好ましくは約２５０アミノ酸以下であり、さらより好ましくは約２００アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約１８０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくはは約１５０アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約１２０アミノ酸以下である。小ペプチドが１２０アミノ酸未満の長さである場合、好ましくは、小ペプチドは長さが約１００アミノ酸以下であり、より好ましくは約８０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくは約６０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくは約５０アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約４０アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約３０アミノ酸以下である。
【０１１４】
好ましい実施態様において、小ペプチドは長さが２アミノ酸から約１００アミノ酸であり、より好ましくは約５アミノ酸から約８０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約５アミノ酸から約６０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約５アミノ酸から約５０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約１０アミノ酸から約４０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約１５アミノ酸から約４０アミノ酸であり、なお一層より好ましくは約２０アミノ酸から約３０アミノ酸である。
【０１１５】
代わりの好ましい実施態様において、小ペプチドは長さが約５アミノ酸から約３００アミノ酸であり、より好ましくは約１０アミノ酸から約２５０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約１５アミノ酸から約２００アミノ酸であり、なお一層より好ましくは約２０アミノ酸から約１８０アミノ酸であり、さらにより好ましくは約２５アミノ酸から約１５０アミノ酸であり、なお一層より好ましくは約３０アミノ酸から約１２０アミノ酸である。
【０１１６】
小ペプチドのアミノ酸配列は、生物学的生物に本来備わるペプチドのアミノ酸配列と同一であり得るし、また、そのようなペプチドのアミノ酸配列から得ることができる。あるいは、配列は合成され得る。すなわち、配列は、確率論的または推理的のいずれかであっても、遺伝子操作技術または遺伝子操作プロセスの適用によるような、人が介入した結果である。好ましい実施態様において、小ペプチドのアミノ酸配列が生物学的生物から得られる場合、好ましくは、生物は中温性生物である。
【０１１７】
好ましい実施態様において、本発明の方法に従って製造される小ペプチドは、切断部位ペプチドまたは切断可能なリンカーペプチドまたは両者によってもたらされる末端アミノ酸残基を除くためにさらに処理することができる。これは、この分野で知られているような酵素的または化学的な手段によって行うことができる。
【０１１８】
本明細書中に記載されているように、本発明において使用される導入遺伝子は、ペプチドマルチマー構築物（すなわち、ペプチドのコンカテマー）の上流（すなわち、ペプチドモノマー構築物に対してＮ末端部分）で発現するキャリアポリペプチドを含有する。ペプチドマルチマーに関して本明細書中で使用される用語「マルチマー」は、２個、３個またはそれ以上のペプチドユニットを含有するポリペプチドを示す。従って、ペプチドマルチマーは少なくともダイマーである。好ましい実施態様において、ペプチドマルチマーは少なくともトリマーである。ペプチドマルチマー構築物は、少なくとも２つの小ペプチド（ペプチドユニット）だけでなく、直列になったペプチドの間で、直列になったペプチドをつなぐ少なくとも１つのペプチド切断部位をも含む。好ましい実施態様において、ペプチドマルチマーは長さが約６００アミノ酸以下である。好ましくは、ペプチドマルチマーは長さが約５００アミノ酸以下であり、より好ましくは約４５０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくは約４００アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約３５０アミノ酸以下であり、なおさらにより好ましくは約３００アミノ酸以下であり、なお一層より好ましくは約２５０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくは約２００アミノ酸以下であり、一層さらにより好ましくは約１５０アミノ酸以下である。好ましくは、ペプチドマルチマーは長さが約１０アミノ酸以上であり、より好ましくは約１５アミノ酸以上であり、さらにより好ましくは約２０アミノ酸以上であり、さらにより好ましくは約２５アミノ酸以上であり、なお一層より好ましくは約３０アミノ酸以上であり、さらにより好ましくは約４０アミノ酸以上であり、なお一層より好ましくは約５０アミノ酸以上であり、さらに好ましくは約６０アミノ酸以上であり、さらに好ましくは約７０アミノ酸以上であり、なお一層より好ましくは約８０アミノ酸以上であり、なおさらに好ましくは約９０アミノ酸以上であり、なお一層より好ましくは約１００アミノ酸以上である。好ましい実施態様において、ペプチドマルチマーは長さが約１０アミノ酸から約６００アミノ酸であり、より好ましくは約１５アミノ酸から約５００アミノ酸であり、さらにより好ましくは約２０アミノ酸から約４５０アミノ酸であり、なお一層より好ましくは約２５アミノ酸から約４００アミノ酸であり、さらにより好ましくは約３０アミノ酸から約３００アミノ酸である。
【０１１９】
まとめると、ここに示される結果は、本発明の独特のコンカテマーペプチド／ＡＭＰ構築物が微生物（より好ましくは細菌、最も好ましくはシュードモナス・フルオレセンス）において効率的に製造され得ることを示している。ＡＭＰ遺伝子のコンカテマー化は、２つの特筆すべき作用を抗菌性ペプチドに対して有すると思われる。すなわち、ＡＭＰ遺伝子のコンカテマー化は、毒性を（細胞外および細胞内の両方で）低下させる。また、ＡＭＰ遺伝子のコンカテマー化は、細胞内分配および封入体形成を増大させ、それにより、プロテアーゼに対する感受性を低下させることができ、およびさらに、毒性作用を緩和することができる。
【０１２０】
ペプチド／ＡＭＰ遺伝子のコンカテマー化は、所望するペプチドの十分な発現を容易にするために十分であることが見出された一方で、キャリアポリペプチド（デハロゲナーゼが一例である）が、ペプチド／ＡＭＰのさらにより大きい発現レベルを生じさせるために使用された。マルチマー／コンカテマーをキャリアポリペプチドと一緒に使用することは、特に高度発現を促進させるために、特にシュードモナス・フルオレセンスでは好ましい。
【０１２１】
本発明はまた、キャリアポリペプチド／タンパク質に融合された本発明のコンカテマー／マルチマーを好ましくは含む融合タンパク質を提供する。そのような融合体はさらに、目的とするペプチドの回収レベルを高めることができる。全長タンパク質の短縮化形態（一例がデハロゲナーゼのＮ末端の１２３残基である）もまた、機能付与融合パートナーとして全長タンパク質と同様に（または全長タンパク質よりも良好に）機能し得る。そのような短縮化タンパク質は完全に折り畳まれないことがあり、全長のタンパク質よりも小さい溶解性を有し得る。これらの融合タンパク質はまた、不溶性の溶解物画分に分配され得る。従って、このタイプの無力化されたタンパク質フラグメントは容易に凝集し、沈殿し得る。これにより、結びつけられたペプチド／ＡＭＰコンカテマーが、そうでない場合にはコンカテマーがプロテアーゼに容易にさらされる溶液から、都合良く取り出される。
【０１２２】
遺伝子コンカテマー化およびある種の融合体の使用はともに、非毒性の高発現ペプチド／ＡＭＰ構築物を構築するために好都合である。封入体の形成は発現ペプチドの蓄積を容易にし得るが、このことが、高度発現レベルが現在達成された唯一の理由であるとは思われない。例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）−ＡＭＰ（モノマー）の融合体は、封入体を形成するために強く分配されることが観測された。しかしながら、この構築物はシュードモナス・フルオレセンス宿主に対して依然として毒性であった。これらのＤＨＦＲ−ＡＭＰ封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＡＭＰペプチドがＤＨＦＲ融合タンパク質から切断されたことを示唆した。このタンパク質分解により、細胞は、遊離した（毒性の）ＡＭＰにさらされたと考えられる。ＡＭＰ分子のコンカテマー化は、キャリアポリペプチド（例えば、ＤＨＦＲまたはデハロゲナーゼなど）に融合されたときには特に、そのようなタンパク質分解の事象における細胞に対するさらなるレベルの保護をもたらす。
【０１２３】
キャリアポリペプチドが使用される本出願の実施態様では、キャリアポリペプチドをマルチマーのＮ末端に融合することが好ましい。しかしながら、本発明のマルチマーは、末端融合に限定されない様々な発現システムにおける使用のために適合させることができる。本発明のキャリアポリペプチドはまた、（例えば、向き合ったマルチマーとしてのモノマーとともに）本明細書中に具体的に例示されていない様々な方法で使用することができる。
【０１２４】
本明細書中で特定された重要なパラメーターにより、広範囲の様々な「次世代」の発現構築物が、改善されたペプチド／ＡＭＰ発現のために可能になる。高発現構築物を、シュードモナス・フルオレセンス発酵の注目される低コストの属性と結びつけることにより、今や、新規な高容量適用のためのペプチド／ＡＭＰの経済的な製造が可能になる。本明細書中に例示されるプロセスは高密度発酵で実施することができる。好ましくは、シュードモナス・フルオレセンスが、これらの大規模発酵において使用される細菌である。本発明は、この分野でこれまでに知られている収量と比較して、ペプチド／ＡＭＰの非常に改善された収量を可能にする。
【０１２５】
本発明の別の非常に驚くべき局面は、カチオン性ＡＭＰマルチマーが電荷均衡を欠き得るということである。さらに、本発明の融合体（キャリアポリペプチド／タンパク質に融合されたマルチマーを含む）はまた、電荷均衡を欠き得る。すなわち、ＡＭＰは、しばしば、カチオン性／正荷電である。本発明は、マルチマー構築物における多数コピーのＡＭＰの正荷電を相殺することは必ずしも必要でないという驚くべき発見に関連している。本発明のマルチマーおよび融合体は、好都合に、しかし驚くべきことに、マルチマーまたは完全な融合体において電荷を均衡させることを必要としない。本発明では、マルチマーＡＭＰ構築物において要求された、この分野でこれまで教示されていたこの要素が除かれる。先行技術の試みのいくつかが、マルチマータンパク質および／または融合タンパク質の形態で不活性なＡＭＰを最初に製造することによって、ＡＭＰを生物学的に製造するためにこの分野では行われていた。しかしながら、十分な数の負荷電アミノ酸が、ＡＭＰの正荷電を完全に相殺するために、キャリアタンパク質として付加されなければならないか、またはマルチマーに付加されなければならないということがこれまで教示されていた。あるタイプの酸性タンパク質が、ＡＭＰの塩基性（ｐＨ）の性質を均衡させて打ち消すために（マルチマー内および／またはキャリア内に）要求された。この分野では、翻訳時に、発生期のＡＭＰまたはＡＭＰマルチマー（これはカチオン性／正荷電／塩基性である）が、翻訳に関与する核酸分子と相互作用すること、そしてまた、これにより、翻訳が効果的に停止させられることがこれまで教示されていた。従って、キャリアタンパク質は、ＡＭＰの電荷を均衡または無効にするために十分なアニオン性を有することに関してこれまで選択されていた。本開示に照らして明らかであるように、本発明はまた、ＡＭＰ以外のカチオン性ペプチドを製造するために特に好都合である。
【０１２６】
本発明は、驚くべきことに、また、好都合なことに、ＡＭＰ／ＡＭＰマルチマーの正電荷を著しく相殺するために、好ましくは、カチオン性であるか、または十分にアニオン性でないかのいずれかであるキャリアポリペプチドを提供する。すなわち、マルチマーＡＭＰおよびＡＭＰ融合体の正味の正荷電は酸性／負荷電のアミノ酸残基によって著しく相殺および／または均衡されない。本発明は、驚くべきことに、また、好都合なことに、この分野でこれまで教示されていたこととに反する。すなわち、相殺すること、すなわち、負荷電のアミノ酸セグメントは本発明のマルチマーおよび融合体には存在しない。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、コードされたＡＭＰの累積的な正荷電を著しく低下させることを最終的には担う成分を含まない。さらに、本発明のスペーサーおよびキャリアポリペプチド（ならびにＡＭＰサブユニット）は、先行技術の一部が示唆していたこととは反対に、付加されたシステイン残基を有していない。
【０１２７】
下記の表（表２）には、本発明の目的のために、４種類のアミノ酸が存在することが例示される。すなわち２種類（非極性および非荷電極性）が非荷電アミノ酸についてであり、残りの２種類（酸性および塩基性）が、それらがその一部であるタンパク質／ペプチドに電荷を与えるアミノ酸についてである。本明細書中で使用される場合、「酸性」アミノ酸は負荷電をタンパク質に加え、「塩基性」アミノ酸は正荷電をタンパク質に加える。
【０１２８】
【表２】
0004472998.tif 000003
【０１２９】
荷電均衡は必須ではないという本発明の発見により、本発明に従った使用のために利用することができるはるかにより大きな範囲のマルチマーおよびキャリアポリペプチドが提供される。従って、本発明は、この分野で以前に考えられていたよりも広範囲の様々なマルチマーおよびキャリアポリペプチドの使用を可能にする。本発明はカチオン性マルチマーを提供する。様々なクラスの本発明のキャリアポリペプチドはまた独特である。本発明は、驚くべきことに、キャリアタンパク質を、十分にアニオン性であるタンパク質に（ＡＭＰマルチマーはカチオン性であるので、ほぼアニオン性として）限定するのではなく、好ましいキャリアは目的とする宿主において自身が十分に発現するタンパク質またはポリペプチドフラグメントであることを本発明は教示していることを示している。発現レベルは優先的には総細胞タンパク質の２％から２５％である。本発明はまた、融合タンパク質を細胞質において溶液から取出して、不溶性の封入体／タンパク質凝集物にするように不溶性にしやすいキャリアポリペプチドを提供する。本発明のキャリアポリペプチドは、好都合なことに、結合したペプチド／ＡＭＰを沈澱させる。これは、ペプチド／ＡＭＰの回収レベルを、そうでない場合には可溶性のペプチド／ＡＭＰの細胞質プロテアーゼに対する感受性を低下させることによって、改善することを助けることができ、また、毒性ペプチド（例えば、ＡＭＰ）の細胞内活性を低下させることを助けることができる。
【０１３０】
本発明のマルチマー融合タンパク質は、好ましくは、不溶性のタンパク質封入体として製造される。本発明のシュードモナス・フルオレセンスは、好都合なことに、マルチマーＡＭＰをこの形態で製造するために十分に適する。
【０１３１】
上記で示されたように、本発明は、そのような構築物のそれぞれが、本明細書中で議論または示唆されるようなアミノ酸セグメントをコードするＤＮＡセグメントを含むポリヌクレオチド構築物を包含する。好ましくは、本発明のマルチマーおよび／または融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは「機能的に連結され」、すなわち、別のヌクレオチド配列との機能的な関係に置かれ、その結果、ＤＮＡセグメントを、目的とするタンパク質を産生させるために、目的の細胞において発現（転写および翻訳）させることができる。例えば、シュードモナス・フルオレセンスにおいて機能的であるプロモーターをコード配列に機能的に連結することができ、その結果、プロモーターはコード配列の転写を行わせる。一般に、「機能的に連結される」は、連結されている配列が連続していること、および、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合には、連続し、かつ読み枠が合っていることを意味する。しかしながら、エンハンサーなどのある種の遺伝子エレメントは、連続していない場合でさえ、機能的に連結され得ることが広く知られている。
【０１３２】
原核生物宿主または真核生物宿主への導入のために調製されたＤＮＡ構築物（すなわち、ベクタ−）は、通常は、所望されるポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡフラグメントを含む、宿主によって認識される複製システムを含み、そしてまた、好ましくは、ポリペプチドをコードするセグメントに機能的に連結された転写開始調節配列および翻訳開始調節配列を含む。発現システム（発現ベクター）は、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびＲＮＡ安定化配列）などを含むことができる。シグナルペプチドもまた、ペプチドの分泌を促進させるために、または、そうでなければ、タンパク質が細胞膜を横断するか、もしくはタンパク質が細胞膜と結合することを可能にするために含めることができる。
【０１３３】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、おそらくは、選択マーカー、すなわち、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または生育のために必要なタンパク質をコードする遺伝子を含有する。そのようなマーカー遺伝子は、宿主細胞に同時に導入される別のポリヌクレオチド配列で運搬されることがあるが、殆んどの場合にクローニングベクター上に含有される。マーカー遺伝子が導入されている宿主細胞のみが選択条件のもとで生存および／または生育する。通常、選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートなど）に対する抵抗性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を相補するタンパク質、または（ｃ）規定された増殖培地から利用することができない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適正な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存しており、種々の宿主に対する適切なマーカーがこの分野で知られている。
【０１３４】
形質転換体はまた、目的とする核酸配列を含むハイブリダイゼーションプローブを使用することによって検出することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．、Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ（１９８７）、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１６９頁〜１７０頁に記載されるような低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーおよび／または高いストリンジェンシーの条件のもとで行われる。本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチドはこの様式で検出することができる。
【０１３５】
本明細書中で使用される「組換え」ポリヌクレオチドは、核酸配列の２つの、そうでない場合には分離されているセグメントの組合せによって作製されるポリヌクレオチドを示す。この場合、これらの配列は、（遺伝子操作技術または化学合成による）人為的な操作によって結合される。そうする際には、それぞれが所望する機能を有する複数の異種のポリヌクレオチドセグメントを結合して、機能の所望する組合せを有するポリヌクレオチドを作製することができる。本明細書中で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドおよび／または「精製された」タンパク質に対する参照は、それらが、自然界で一緒に見出されるそれ以外の分子と会合していないときのこれらの分子を示す。従って、「単離された」および／または「精製された」に対する参照は、本明細書中で記載されるように、「人の手」の関与を意味する。
【０１３６】
本発明に従って前記微生物細胞によって製造されるマルチマー、融合タンパク質および／またはＡＭＰは、好ましくは、前記微生物細胞によって産生される総細胞タンパク質の約２％から２５％である量で産生される。これらの微生物細胞は、好ましくは、前記微生物細胞の大規模な回文式培養物を製造するために生育させられる（そのような培養物を繁殖させることができる）。マルチマー、融合タンパク質および／またはＡＭＰは、好ましくは、回文式培養物によって産生される総細胞タンパク質の約２％から２５％として産生される。
【０１３７】
同様に、本発明の１つの局面は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を含む微生物細胞である。遺伝子組換え宿主細胞は、本発明に関して、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含有するように遺伝子改変されている宿主細胞である。ＤＮＡは、特定のタイプの細胞について適切である、この分野で知られている任意の手段によって導入することができ、そのような手段には、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーションおよびボムバードメントが含まれるが、これらに限定されない。遺伝子組換え細胞にはまた、目的とする異種ＤＮＡを有する、そのような人為的に「形質転換された」細胞の「天然の」子孫も含まれる。異種ＤＮＡは、好ましくは、宿主細胞のゲノムに取り込まれる。これを達成するための様々な技術がこの分野では広く知られている。目的とするポリヌクレオチドはまた、非ゲノムのプラスミドとして子孫細胞において厳密に維持され、かつ発現され得る。これを達成するための様々な技術もまた、この分野では広く知られている。
【０１３８】
ＤＮＡ配列は、遺伝暗号の縮重性およびコドン使用頻度のために変化し得ることが当業者によって認められている。本明細書中で議論および例示されているペプチドおよびタンパク質をコードするＤＮＡ配列はすべてが本発明に包含される。
【０１３９】
さらに、対立遺伝子変化が、例示されたポリヌクレオチドおよびタンパク質／ペプチドに存在する場合があり、それらは、タンパク質／ペプチドの所望する活性を著しく変化させないことが当業者によって認識される。そのような均等物はすべて、本発明の範囲内に含まれる。保存的なアミノ酸置換を、上記の表１に示されたアミノ酸の種類に関して行うことができる。場合により、非保存的な変化を、本明細書中で議論されているタンパク質／ペプチドの所望する活性／機能を著しく変化させることなく行うことができる。
【０１４０】
本明細書中で参照または引用されている特許、特許出願、仮特許出願および刊行物はすべて、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度に、その全体が参照して組み込まれる。
【０１４１】
下記は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定として解釈してはならない。別途示されない限り、すべての百分率は重量比であり、すべての溶媒混合物の割合は体積比である。
【実施例１】
【０１４２】
マルチマーＡＭＰの設計および製造
Ｄ２Ａ２１抗菌性ペプチドが本発明の製造法による例示的なＡＭＰとして使用された。このコアＡＭＰは、α−らせんの立体配置にある、フェニルアラニン、アラニンおよびリシンからなる２３残基のペプチドである。
【０１４３】
【化１】
0004472998.tif 000004
【０１４４】
このＡＭＰをコードする遺伝子を合成し、その後、プラスミド構築物を、Ｄ２Ａ２１前駆体を細菌において発現させるために組み立てた。最初に、Ｄ２Ａ２１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を化学合成した。配列番号２は、配列番号１のＤ２Ａ２１ペプチドをコードするために使用されたＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ分子およびその非コード相補体を（正しい配向で）連結して、マルチマー／コンカテマーを形成させた。酸に不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏ切断部位が、活性なモノマーへのマルチマーの切断を可能にするために、（マルチマーを形成させるために連結される）各ＡＭＰモノマーの間に必要とされた。従って、「コアＡＭＰ」は、マルチマー生成物の（機能的モノマーへの）合成後の酸加水分解のためのリンカー／切断部位を規定するために改変された。一例において、９個のさらなるＤＮＡ残基（塩基）が、Ｄ２Ａ２１ペプチドのアミノ端における隣接するアスパラギン酸−プロリン配列と、Ｃ末端における１個のグリシンとを付加するために、コアＤ２Ａ２１ＤＮＡ配列の両端に付加された。下記の配列番号４を参照のこと。配列番号３は、配列番号４をコードするために使用されたＤＮＡ配列である。グリシン残基が、切断反応時の何らかの潜在的な「隣接基」作用を低下させるためにＡｓｐ−Ｐｒｏ配列のＮ末端に付加された。コアＡＭＰ＋３個のさらなるアミノ酸残基のアミノ酸配列は下記の通りである：
【０１４５】
【化２】
0004472998.tif 000005
その後、多数コピーのこれらのサブユニットは互いに結合させることができる。その後、弱酸を、アスパラギン酸残基とプロリン残基との間で、隣接配列内を切断するために使用することができる。
【０１４６】
下記（配列番号６）は、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ切断配列によって接続され、かつ関連性のないペプチドの短い配列が隣接する２つのＤ２Ａ２１抗菌性ペプチド（２コピーの配列番号３が結合されている）を有する例示的なダイマー（「４Ａダイマー」）である。（例えば、下記に示されるような６個のヒスチジン残基が、固定化Ｎｉでのマルチマーのアフィニティー精製を可能にするためにマルチマーのＣ末端に含まれた。例えば、下記の実施例５を参照のこと）。下記のマルチマーをコードするために使用されたＤＮＡ配列が配列番号５に示される。
【０１４７】
【化３】
0004472998.tif 000006
【０１４８】
Ａｓｐ−Ｐｒｏ切断部位が、残基１３＆１４、残基３９＆４０および残基６５＆６６の間で認めることができる。従って、上記マルチマーの酸処理により、それぞれがＤ２Ａ２１’と呼ばれる２つのＡＭＰモノマー（アミノ酸１４から３９およびアミノ酸４０から６５）が得られた。得られたＤ２Ａ２１’モノマーの配列は下記の通りである：
【０１４９】
【化４】
0004472998.tif 000007
【０１５０】
配列番号１のＤ２Ａ２１コアペプチドと比較した場合、Ｄ２Ａ２１’は１個のさらなるプロリンをＮ末端に含有し、グリシン−アスパラギン酸ジペプチドをそのＣ末端に含有する。Ｄ２Ａ２１’は、驚くべきことに、Ｄ２Ａ２１コア／元ペプチドと比較した場合、等価な抗菌活性を有することが見出された。
【０１５１】
アスパラギン酸およびグルタミン酸は酸性（負荷電）アミノ酸残基であり、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは塩基性（正荷電）アミノ酸残基であるので、配列番号６のマルチマーにおける荷電アミノ酸の下記の配置が明らかである：
・リーダー配列（配列番号６における最初の１３アミノ酸）における１個のアルギニン（正荷電；配列番号６における残基１２）および１個のアスパラギン酸（負荷電；配列番号における残基１３）、
・１個のアスパラギン酸（負荷電；残基３９）で終わる最初のＤ２Ａ２１サブユニット（配列番号６のアミノ酸１４から３９）における９個のリシン（正荷電）、
・１個のアスパラギン酸（残基６５）で終わる２番目のＤ２Ａ２１ペプチド（アミノ酸４０から６５）における９個のリシン、ならびに
・トレーラー配列（アミノ酸６５から８５）における１個のアスパラギン酸および１個のグルタミン酸（それぞれが負荷電）ならびに６個のヒスチジン（正荷電）。
【０１５２】
配列番号６の８５アミノ酸の電荷は下記のように例示することができ、この場合、「Ｏ」は中性のアミノ酸残基を表し、「＋」は正荷電／塩基性アミノ酸残基を表し、「−」は酸性／負荷電残基を表す；
【０１５３】
【化５】
0004472998.tif 000008
【０１５４】
従って、２５個の正荷電残基および５個だけの負荷電残基が配列番号６のマルチマーに存在することを明瞭に認めることができる。２つのＡＭＰにおける１８個のリシン残基（それぞれのＡＭＰにおける９個のリシン）から生じる正荷電は、リーダー配列およびリンカー配列の３個のアスパラギン酸と、トレーラー部の１個のグルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基とによって相殺されない。リーダー配列が正荷電残基（アルギニン）を含むこと、そして、トレーラー配列が６個のヒスチジン（これらは正に荷電している）を含むことは、さらに驚くべきことである。この分野ではこれまで、正荷電を有する重要でないさらなるアミノ酸を有するマルチマーの使用について反することが教示されていた。Ｄ２Ａ２１’の３つのさらなる残基（そのうちの１つは酸性である）が、コアＤ２Ａ２１ペプチドと比較した場合、Ｄ２Ａ２１’の活性に悪影響を及ぼさなかったことはなおさらに驚くべきことである。
【実施例２】
【０１５５】
多数コピーの正しく配向したＡＭＰユニットを有する構築物の合成
ペプチド生成物の製造費用は、ペプチド合成およびペプチド精製の両方の費用にある。ペプチドポリマーの大規模な化学合成は時間集約的かつ労働集約的である。固相ペプチド合成の場合、完了させるために合計で２時間から１９時間を要求する１３工程から１８工程が、各残基を合成時のポリマーに付加するために必要とされる（Ｍｅｒｇｌｅｒ＆Ｄｕｒｉｅｕｘ、２０００）。さらに、これらの工程の多くは完結しないことがあり、または副反応を受けやすく、そのため、（より長いペプチドの場合には特に）数多くの様々な副生成物が反応混合物中に蓄積する。その結果、合成費用は非常に大きくなり得る（ほぼ＄１，０００，０００／ｋｇ）。また、精製費用は、要求される純度レベルに依存して、この額またはそれ以上になり得る。明らかに、そのような費用は、多くの場合、大量適用のための受け入れられ得る費用限界を大きく超えている。
【０１５６】
ＡＭＰは、通常、周期的に配置された疎水性側鎖および正荷電（塩基性）側鎖から構成される（関連する総説については、ＨａｎｃｏｃｋおよびＬｅｈｒｅｒ（１９９８）、またはＢｌｏｎｄｅｌｌｅ他（１９９９）を参照のこと）。ＡＭＰは両親媒性分子である。残基の周期的な配置により、ペプチドが、構造化された（らせんまたはβ−シート）立体配置を取るとき、疎水性側鎖および荷電側鎖の空間的な隔離がもたらされる。電荷および疎水性のこの隔離により、ＡＭＰは微生物の外膜に結合することができる。結合すると、ペプチドは膜の脂質二重層の中に入り込み、溶解性の細孔に自己会合することができ（Ｈａｎｃｏｃｋ他、１９９５）、溶解性の細孔は細胞の内容物を流出させることができ、これにより、数分で微生物の死を生じさせる。ＡＭＰ分子は、微生物の膜に入り込み、その後、膜の構造的一体性を破壊する細孔に会合することによって微生物を殺すことが提案されている。詳細な作用機構は完全には理解されていないが、これらのペプチドの予測可能な構造的特徴により、活性なＡＭＰ分子を新たに設計することが可能になっている。
【０１５７】
オリゴマー化／会合プロセスを阻害する試みにおいて、また、生成物の溶解性を低下させる試みにおいて、本発明者らは、今、ＡＭＰ生成物が「頭−尾」連結ポリマー（コンカテマー）として発現される発現構築物を設計し、作製した。そのようなＡＭＰコンカテマーは、ＡＭＰコンカテマーが膜の中に入り込み、かつ、微生物宿主細胞を殺すために要求されるＡＭＰの溶解性および立体的／構造的柔軟性を低下させるために設計された。この不溶性コンカテマーポリペプチドは不溶性の封入体として細胞内に蓄積した。産生後、コンカテマーは、細胞を溶解し、可溶性の宿主関連の不純物を洗い流すことによって集めることができた。
【０１５８】
すべての遺伝子は、正しい（「センス」）発現を規定する５’から３’への極性を有する。同一ＤＮＡ分子をコンカテマー遺伝子に連結するためには、すべてのサブユニットが（ＤＮＡ分子の５’から３’への極性に関して）「頭−尾」配向で連結されることが必要である。正しく配向されていないそれぞれのサブユニットは、正しく産生されない（「アンチセンス発現」）だけでなく、隣接サブユニットの本来の発現をも破壊する。コンカテマーにおけるサブユニットの数が増大するに従い、正しい配向を有する、すべてがランダムに連結されたサブユニットの確率は、無視できるほど小さくなる。多くの場合、連結時における適正な配向は、２つの異なる制限エンドヌクレアーゼまたは任意のクラスＩＩＳエンドヌクレアーゼのいずれかを用いる「強制された」クローニング技術を使用して効率的に達成することができる（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．他、１９９６；Ｋｉｍ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９８８）。しかしながら、これらの従来の方法論は、最小限に改変された切断可能なペプチドコンカテマーを製造するためには有用でない。これは、そのようなコンカテマーでは、比較的多数のアミノ酸がペプチドの両端に付加されるからである（このことは、その活性を低下させるとこれまで予想されていた）。本発明の連結法では、短い切断可能なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ末端が可能になる。
【０１５９】
本発明はまた、ＡＭＰサブユニットを連結するために「シュードパリンドロームスペーサー」を使用するコンカテマー構築方法を開示しており、そのような構築方法を都合良く利用している。この選択的な方法により、正しく配向されたサブユニットを有するコンカテマーの製造、すなわち、（実用的でない配置を有するクローンを除くために）頭−尾配置でのコンカテマーの製造が可能になる。図１、図２、および図３Ａから図３Ｃを参照のこと。ＡＭＰモノマーをコードする合成ＤＮＡは、正しくない末端が連結されたときにだけ、パリンドローム状ヘキサヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ切断部位を形成するさらなる不連続な配列を含有する。ＤＮＡサブユニットの連結後（または連結時）において、正しく組み立てられていないコンカテマーは、ＤＮＡを適切なエンドヌクレアーゼで消化することによって都合良く分解することができる。図２および図３に示されるように、ＰｖｕＩにより、所望されないＢ−Ｂ極性が認識され、ＢａｍＨＩにより、所望されないＡ−Ａ極性が認識される。
【０１６０】
これらのコンカテマーは、「シュードパリンドローム」配列（５’ＧＡＴＣＣＧ３’）に基づく逆極性かつ自己相補性のＤＮＡ配列の重なりを使用するオリゴヌクレオチド融合によって作製された。この配列は、ＡＭＰモノマーユニットの接合部で使用される、酸に不安定な切断部位（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）を構成する可能なコード配列の１つのコアを形成する。これを達成するために具体的に使用された配列が図３（ＡからＣ）に示される。これらの配列末端は、自己相補性であるので、自身または相互に連結することができる。この場合、配列末端が自身に連結する場合、連結により、ＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼ部位またはＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位のいずれかが接合部で形成される。配列末端が相互に連結する場合、制限部位は形成されない。この後者の場合はまた、所望する極性のコンカテマー生成物をもたらす。実際、エンドヌクレアーゼ切断部位が、３つの可能な連結生成物のうちの２つに対する連結（第３に対してではない）によって形成されることを生じさせる２つの自己相補性オリゴヌクレオチドの間での何らかの連結は、所望する極性を含有する生成物を組み立てるために一般に有用である。優先的に連結を所望する生成物は、形成されたエンドヌクレアーゼ切断部位を連結点において含有しないということである。
【０１６１】
連結プロセスおよび消化プロセスが完了した後、残存しているコンカテマーは正しく組み立てられているはずである（均一なセンス配向）。次いで、所望するサイズのコンカテマーを精製し、発現プラスミドに挿入することができる。適切なヘキサヌクレオチド配列が選ばれた場合（ＧＡＴＣＣＧ（配列番号８））、ヘキサヌクレオチド配列は、ＡＭＰサブユニットを接続する切断可能なペプチドリンカー（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏの切断可能なジペプチドリンカー）をコードする。
【０１６２】
この方法を使用して、Ｄ２Ａ２１’コンカテマーが合成され、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２１ｂにマルチクローニング部位領域内のＢａｍＨＩ部位において挿入された。大腸菌への形質転換の後、２つのクローンが得られた（２つのＤ２Ａ２１’モノマーおよび３つのＤ２Ａ２１’モノマーをそれぞれ含有するクローン４Ａおよびクローン４Ｂ）。４Ａダイマーに対する配列は上記に示されている。ＡＢ４トリマー、およびＡＢ４トリマーをコードするために使用されたＤＮＡが、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示される。より大きいＤ２Ａ２１’コンカテマー（コンカテマーあたり６個、７個および８個のサブユニット）が精製され、発現プラスミドに連結されたが、本発明者らは、これらのダイマーおよびトリマーの使用についてさらなる例示的な研究を集中した。
【実施例３】
【０１６３】
大腸菌におけるＡＭＰコンカテマーポリペプチドの発現
４ＡダイマープラスミドおよびＡＢ４トリマープラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換体クローン（抗生物質耐性コロニー）が、液体増殖培地に接種するために使用された。得られた培養物は３７℃で振とうされた。培養密度が１のＡ６００に達したとき、遺伝子誘導を、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を培養物に１ｍＭの最終濃度に加えることによって行い、培養物を３７℃で３時間インキュベーションした。誘導後、細胞を集め、溶解し、遠心分離して、可溶性／細胞質成分および不溶性の細胞成分を分離した。これらの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。顕著な誘導されたタンパク質バンドが、ダイマーＤ２Ａ２１’構築物（４Ａ）またはトリマーＤ２Ａ２１’構築物（ＡＢ４）を発現する誘導された培養物から得られたサンプルにおいて観測された。予想されたように、これらのバンドは、ＡＭＰ遺伝子を含有しなかった培養物から得られたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では観測されていない。
【０１６４】
Ｄ２Ａ２１’ペプチドは、リシン、フェニルアラニンおよびアラニンのアミノ酸が非常に多い。Ｄ２Ａ２１’コンカテマーの産生レベルが、さらなるアミノ酸を増殖培地に加えることによって増大し得るかどうかを明らかにするために、本発明者らは、フェニルアラニンおよびリシンのそれぞれ０．５ｇ／ｌを誘導直後の培養物に加えた。この補充工程は、大腸菌におけるＤ２Ａ２１’ダイマーの産生レベルを著しく改善するようであった。
【実施例４】
【０１６５】
大腸菌からのＡＢ４の精製および分配
ＡＢ４遺伝子をコードするプラスミドを大腸菌発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、得られた抗生物質耐性コロニーを使用して、富化誘導培地を含有するフラスコに接種した。得られた培養物を３７℃で１のＡ６００にまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで３７℃で３時間誘導した。誘導後、培養物を遠心分離によって集め、溶解し、遠心分離して、可溶性の細胞成分（細胞質など）を不溶性の細胞成分（細胞膜またはタンパク質性封入体など）から分離した。ＡＢ４のＤ２Ａ２１’トリマーは大腸菌において良く発現され、不溶性の亜細胞画分に分配される。
【０１６６】
ＡＢ４タンパク質が封入体を形成するか、または細胞膜と会合しているかを明らかにするために、不溶性画分を緩衝液の界面活性剤溶液で洗浄した。ＡＢ４タンパク質は１％トリトンＸ−１００（非変性性の界面活性剤）で抽出することができなかった。この界面活性剤溶液は、膜の脂質およびタンパク質を可溶化することが予想される。ＳＤＳなどのアニオン性界面活性剤はＡＢ４タンパク質を非常に良く可溶化する。この結果は、強い好都合な相互作用がアニオン性界面活性剤とカチオン性ペプチドとの間で予想され得るので、驚くべきものではない。逆に、ＡＢ４トリマーはカチオン性界面活性剤によって可溶化されない。カチオン性界面活性剤は、宿主関連の不純物をＡＢ４タンパク質から選択的に可溶化するために有用であり得る。
【０１６７】
ＡＢ４タンパク質がトリトンＸ−１００などの非イオン性界面活性剤によって可溶化され得ないという観測結果は、このタンパク質が膜に結合していないことを示唆している。むしろ、本発明者らの総合したデータは、ＡＢ４タンパク質が細胞内で封入体を形成していることを示唆している。このことはまた、プロセス開発の観点から好都合である。封入体生成物は、遠心分離またはろ過などの安価な物理的技術を使用して多くの混入物から精製することができるからである。
【実施例５】
【０１６８】
可溶性ポリペプチドの精製
細菌により発現されたコンカテマーを特徴づけるために、４Ａ（Ｄ２Ａ２１）ダイマーを、固定化Ｎｉ＋＋クロマトグラフィーを使用して精製した。不溶性画分に分配される実施例４で議論されたトリマーとは異なり、ダイマーの大部分が可溶性の細胞質画分に分配される。４ＡダイマーＤ２Ａ２１’コンカテマーを発現する細胞から得られた大腸菌溶解物を調製し、固定化Ｎｉカラムに通した。カラムを緩衝液で洗浄して、非結合物を除いた後、コンカテマーを、０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ７．８）を使用して特異的に溶出した。Ｎｉ＋＋精製されたダイマーは、約１３ｋＤａの見かけＭＷを有する単一バンドとして現れる。精製されたダイマーのこの大きい分子量は、このポリペプチドの大きいカチオン性から生じていると考えられる。Ｎｉカラムからの生成物収量は、おそらくは、両親媒性ペプチドと固体支持体との間での強固な非特異的な相互作用により、または、支持体に対するマルチマーの結合が不良であるために、予想されたよりも低かった。精製されたタンパク質は、機能的分析および生化学的分析の前にイミダゾールを除くために透析された。
【０１６９】
精製されたダイマーのＭＡＬＤＩ質量分析による分析は、Ｎ末端メチオニンが除去されていることを示している（予想ＭＷ＝９，４９７．１；精製ダイマーの実測ＭＷ＝９，４９９．４）。この修飾はこのタンパク質発現システムについては一般に観測されている。下記の実施例７で議論されているプロトコルを使用した場合、透析されたＤ２Ａ２１ダイマーが検出可能な抗菌活性を全く有しないことが明らかにされた。このことは、ペプチドの抗菌活性がコンカテマー化によって弱められていることを示していた。
【実施例６】
【０１７０】
マルチマーからのペプチドモノマーの作製
Ｄ２Ａ２１’を例示されたコンカテマーから得ることができるかどうかを明らかにするために、精製された（不活性な）前駆体を５０％ギ酸（またはコントロールとして水）で処理して、混合物を７０℃に２４時間加熱した。切断期間後、サンプルを、スピードバッックを使用して真空乾燥し、サンプルをＴｒｉｓＣｌ／ＮａＯＨで中和し、その後、分析した。サンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって分析した。分析により、予想されたように、前駆体ポリペプチドがギ酸によって切断されたことが示された（水では切断されなかった）。これらの切断中間体および非切断物の不連続なラダーが、ギ酸処理サンプルについて、より初期の時点（６時間）で観測された。他の酸処理は本明細書中の他のところで議論されている。ペプチドを切断するための鍵は、ｐＨを低下させることである（このことは、本発明の開示に照らして、当業者によって認識される）。
【実施例７】
【０１７１】
マルチマーの切断から得られるモノマーの活性
切断されたペプチド（実施例５および実施例６から得られた同じサンプル）の抗菌活性を、大腸菌生育の用量依存的な阻害を測定することによって決定した。サンプルは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が接種された一晩培養物の生育を阻害するその能力について試験された。
【０１７２】
ＡＭＰサンプルを９６ウエルプレートにおいて水に連続希釈した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の一晩培養物をＬＢ培養液に１：５０希釈し、２５０μｌ量を９６ウエルプレートに移した。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、その後、５０μｌの希釈されたペプチド（または水）を各ウエルに加えた。プレートを３７℃で一晩インキュベーションして、培養密度を、Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーを使用して、６００ｎｍにおける見かけの吸光度を測定することによって決定した。
【０１７３】
ギ酸処理から得られたダイマーサンプルは、著しい抗菌活性を有することが見出されたが、水で処理されたダイマーは活性を有していなかった。
【０１７４】
これらの実験は、抗菌性ペプチドがＤ２Ａ２１’コンカテマー前駆体の酸切断によって製造されることを明瞭に示している。しかしながら、予想されるＤ２Ａ２１’ペプチドが、実際に、反応から得られた生成物であることをさらに明らかにするために、本発明者らは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ質量分析の各技術を使用して切断生成物を分析した。これらの実験は、まぎれなくＤ２Ａ２１’が細菌発現のダイマーおよびトリマーの切断から得られていることを示している。本発明者らはまた、Ｄ２Ａ２１’生成物が不溶性のＡＢ４トリマーの酸処理から得られることを明らかにするためにこれらの分析技術を使用した。
【実施例８】
【０１７５】
シュードモナス・フルオレセンスにおけるＡＭＰコンカテマーポリペプチドの発現
コンカテマーＤ２Ａ２１’遺伝子（ダイマーおよびトリマー）をシュードモナス・フルオレセンス発現プラスミドｐＭＹＣ１８０３にサブクローン化した。プラスミドｐＭＹＣ１８０３は、調節されたテトラサイクリン耐性マーカーと、ＲＳＦ１０１０プラスミドに由来する複製および転移性遺伝子座とを有するｐＴＪＳ２６０の誘導体である（米国特許第５，１６９，７６０号（Ｗｉｌｃｏｘ）を参照のこと）。「ＴＦ３」トリマーは本質的には「ＡＢ４」トリマーと同じであるが、異なる発現ベクターが産生のために使用された。配列番号１１および配列番号１２を参照のこと。さらに、本発明者らはまた、「ＪＰ２」ダイマー、「１６Ａ」トリマー、「２１Ａ」トリマーおよび「２１Ｂ」トリマーを使用した。１６Ａトリマーについては配列番号３６および配列番号３７を参照のこと。２１Ａトリマーについては配列番号３８および配列番号３９を参照のこと。２１Ｂトリマーについては配列番号４０および配列番号４１を参照のこと。ＪＰ２ダイマーについては配列番号４２および配列番号４３を参照のこと。ＡＭＰ発現プラスミドを保有するシュードモナス・フルオレセンス細胞を使用して、規定された培地に接種し、得られた培養物を生育させ、０．３ｍＭのＩＰＴＧを添加した後４８時間にわたって誘導した。培養物の一部を誘導前および誘導後の様々な時点で集めた。これらの培養物サンプルは、細胞生育、タンパク質産生、封入体形成およびプラスミド安定性を特徴づけるためにもっぱら分析された。
【０１７６】
実質的な量のトリマーＤ２Ａ２１’の発現が、誘導されたシュードモナス・フルオレセンス培養物において、特にＴＦ３トリマークローンから観測された。しかし、シュードモナス・フルオレセンスにおけるこれらの構築物の発現レベルは、一般に、エンシェリヒア・コリで観測されたレベルよりも低かった。ダイマーＤ２Ａ２１’構築物のより低い発現が、シュードモナス・フルオレセンスにおいてより明らかであった。
【０１７７】
誘導された培養物から得られた抽出物の免疫ブロット分析によれば、ダイマーのある程度の分解（およびトリマーＤ２Ａ２１’前駆体のいくらかの限定された分解）がシュードモナス・フルオレセンスサンプル中に生じていた。ダイマーのいくらかの分解（およびトリマーの限定された分解）はまた大腸菌抽出物においても観測された。コンカテマー前駆体の分解のあるものは、（分解がＡｓｐ−Ｐｒｏ連結点またはその付近で生じた場合）、いくらかの成熟型の殺生物性Ｄ２Ａ２１’の産生をもたらし得る。これにより、コンカテマーのさらなる発現が制限され得る。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現システムに対する誘導時間（３時間）が、シュードモナス・フルオレセンスに対する誘導間隔（４８時間）よりもはるかに短いことに留意すると、シュードモナス・フルオレセンスシステムに対するこのより長い誘導期間は、このシステムを、毒性Ｄ２Ａ２１’フラグメントのゆっくりした組立てに対しより感受性にし得る。
【実施例９】
【０１７８】
Ｄ２Ａ２１コンカテマー融合体
上記実施例は、Ｄ２Ａ２１’ＡＭＰのコンカテマー化がペプチドの毒性を低下させることを明瞭に示している。大腸菌およびシュードモナス・フルオレセンスにおいて、遺伝子中のＤ２Ａ２１’サブユニットの数が１個から２個に、２個から３個に増大するに従って、Ｄ２Ａ２１’前駆体の改善された発現が観測された。トリマーＤ２Ａ２１’ポリペプチドは、大腸菌およびシュードモナス・フルオレセンスの両方において非常に著しいレベルで発現される。産生レベルをなおさらに増大させるために、本発明者らは、様々なタンパク質配列のＤ２Ａ２１’トリマーへの融合の、コンカテマー発現に対する影響を調べた。
【０１７９】
特に、本発明者らは２つの融合パートナーに焦点を合せた（大腸菌に由来するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびロドコッカス・ロドクロウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ）に由来するハロアルカンデハロゲナーゼ）。例えば、デハロゲナーゼタンパク質は、シュードモナス・フルオレセンスにおいて極めて高いレベルに（シュードモナス・フルオレセンス自身により）発現されることから選択された。ＤＨＦＲキャリアポリペプチドは４．７７のｐＩおよび−１０．７７の（中性ｐＨ７での）電荷を有する。全長のデハロゲナーゼキャリアタンパク質は４．９５のｐＩおよび−１７．２５の（中性ｐＨ７での）電荷を有する。短縮化されたデハロゲナーゼキャリアペプチド（これは下記で議論される）は５．３１のｐＩおよび−７．５３の（中性ｐＨ７での）電荷を有する。これらの値は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉソフトウエアを使用して計算された。
【０１８０】
（ａ）ＤＨＦＲ
ＤＨＦＲ遺伝子（配列番号２０および配列番号２１を参照のこと）をＴＦ３（配列番号１１）のＮ末端に融合させた。配列番号２２および配列番号２３を参照のこと。これは図４に例示される。Ｎ末端融合体はまた、ＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１トリマー（配列番号２４および配列番号２５を参照のこと）、ＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１テトラマー（配列番号２６および配列番号２７参照のこと）およびＤＨＦＲ／Ｄ４Ｅ１ペンタマー（配列番号２８および配列番号２９参照のこと）について構築された。
【０１８１】
有意な量の誘導されたタンパク質バンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において観測されなかったが、誘導されたタンパク質バンドが、これらの融合体を発現するシュードモナス・フルオレセンス細胞から得られた誘導後の抽出物の免疫ブロットにおいて、特にＤＨＦＲ−トリマーＤ２Ａ２１’融合体（ＭＷ：ＤＨＦＲ−Ｄ２Ａ２１コンカテマー構築物について３４から３６ｋＤａ）について観測された。
【０１８２】
（ｂ）デハロゲナーゼ
下記で議論される３Ｉ融合体および４Ｃ融合体が図４に例示される。
【０１８３】
本発明者らは、「３Ｉ」融合体（配列番号３２および配列番号３３を参照のこと）を形成させるために、Ｄ２Ａ２１’トリマーコンカテマー（ＡＢ４）のＮ末端に翻訳可能に融合されたデハロゲナーゼ（Ｎｅｗｍａｎ他、１９９９）タンパク質（配列番号３０および配列番号３１を参照のこと）をコードする遺伝子融合体を作製した。ＡＭＰ対デハロゲナーゼ配列の比率を増大させるために、別の融合体が、このタンパク質の最初の１２３残基のみを含有する短縮化体のデハロゲナーゼタンパク質をＡＢ４トリマーのＮ末端に融合させることにより、構築された。ところで、ＤＨＦＲタンパク質およびデハロゲナーゼタンパク質はともに非常に弱いアニオン性であり、デハロゲナーゼの荷電残基はタンパク質全体に一様に分布している。従って、１２３ａａフラグメントもまたほんの少し弱いアニオン性であった。この構築物は「４Ｃ」と呼ばれた。配列番号３４および配列番号３５を参照のこと。両方の場合において、キャリアのＣ末端がマルチマーのＮ末端に融合された。
【０１８４】
デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’融合体を、ベクターｐＥＴ２４−ｂを使用して大腸菌において先ず発現させた。誘導後、誘導された細胞を溶解し、封入体を遠心分離によって（細胞膜などの他の不溶性成分と一緒に）集めた。デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’コンカテマー融合体は大腸菌において非常に良く発現した。これは、振とうフラスコにおいて培養液１リットルあたり３００ｍｇのレベルに蓄積した全長デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’融合体について、特にそのように言えた。デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’タンパク質は可溶性溶解物（細胞質）画分では全く検出されず、すべてが、不溶性画分に存在することが見出された。
【実施例１０】
【０１８５】
シュードモナス・フルオレセンスにおける融合体
本発明者らは、デハロゲナーゼ／トリマーＤ２Ａ２１’融合体両者（３Ｉおよび４Ｃ）を、シュードモナス・フルオレセンスにおける発現のために使用するｐＭＹＣ１８０３プラスミドにサブクローン化した。これらの発現プラスミドはシュードモナス・フルオレセンスにエレクトロポレーション導入され、得られた形質転換体クローンを使用して、規定された最少培地を含有する振とうフラスコ培養に接種された。培養物を３２℃で生育させ、ＩＰＴＧで誘導した。その後の４８時間の誘導期間の間に、一部を様々な時点でそれぞれの培養物から取り出し、細胞を遠心分離によって培地から集めた。細胞を再懸濁して、溶解緩衝液中で溶解し、可溶性（細胞質）画分および不溶性画分を遠心分離によって分離し、その後、別のチューブにデカントした。可溶性画分および不溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。
【０１８６】
ＡＢ４トリマークローンの十分な発現が達成された。他方、３Ｉ（全長デハロゲナーゼ／ＡＢ４トリマー）融合タンパク質が、ＡＢ４トリマー単独の場合よりもはるかに大きいレベルで、大腸菌およびＰ．ｆｌｕｏｔｒｅｓｃｅｎｓにおいて発現した。適切な分子量の強い、誘導されたタンパク質のバンドが、短縮型デハロゲナーゼ／Ｄ２Ａ２１’トリマー（４Ｃ）を発現するＰ．ｆｌｕｏｔｒｅｓｃｅｎｓ培養物の不溶性画分において観測された。極めて少量だけの誘導されたタンパク質が、これらの細胞から得られた対応する可溶性画分において観測された。このことは、これらのタンパク質がＰ．ｆｌｕｏｔｒｅｓｃｅｎｓにおいて封入体を効率よく形成していることを示唆している。相当量のタンパク質が誘導の最初の１５時間の間に蓄積し、さらなる蓄積はその後の３３時間の間に生じなかった。
【０１８７】
Ｐ．ｆｌｕｏｔｒｅｓｃｅｎｓにおいて、エシェリヒア・コリと比較して、より低いレベルの誘導されたタンパク質が、全長デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’トリマーを発現する培養物（クローン３Ｉ）から得られた不溶性画分において観測された。誘導されたバンドが、予想されたよりも幾分低い分子量（約３７ｋＤａ）ではあるが、これらの培養物から得られた可溶性サンプルにおいて観測された。極めて大きいレベルの４Ｃ（トリマー／短縮型の融合体）がＰ．ｆｌｕｏｔｒｅｓｃｅｎｓによって産生された。これらのレベルは２０リットルの発酵で１リットルあたり１グラムを超えていた。
【実施例１１】
【０１８８】
産生後のさらなる処理
溶解および当初の封入体洗浄の後、デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’トリマーの産生後の処理における次の工程は、誘導されたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から調製された封入体から融合タンパク質を可溶化することであった。本発明者らは、カオトロピック剤（８ＭグアニジンＨＣｌまたはウレアなど）および有機溶媒混合物（１０％ブタノール、４０％ＨＯＡｃ／４０％メタノール／２０％水、５０％ＨＯＡｃ、５０％ＨＯＡＣ／２％ピリジンなど）を含む広範囲の様々な化学剤を試験した。これらの溶液を封入体調製物に加えて、懸濁物を激しく混合した。液相および固相を遠心分離によって分離し、液相中の可溶性タンパク質濃度を測定した。表３を参照のこと。デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２’トリマー融合体は、グアニジンＨＣｌ、ウレア、酢酸、および酢酸／アセトニトリル混合物によって最も効率的に可溶化された。酢酸による融合タンパク質の可溶化は、少量のピリジンによって大きく妨げられた。全長デハロゲナーゼ融合体および短縮型デハロゲナーゼ融合体に対する抽出プロフィルは、２つの構築物の間には著しい分子量の差があるにもかかわらず、非常に類似していた。融合タンパク質を効果的に可溶化する溶液は、タンパク質を変性させる（ウレアおよびグアニジンＨＣｌ）ものか、またはペプチドの溶解性を促進させるもの（酢酸およびアセトニトリル／酢酸）か、いずれかであるようであった。
【０１８９】
【表３】
0004472998.tif 000009
【０１９０】
表３に報告された結果は、粗製の不溶性デハロゲナーゼ−Ｄ２Ａ２１’を含有するサンプルを各溶液で処理し、激しく混合して、遠心分離したものである。上清をデカンテーションして、タンパク質濃度を測定した。
【実施例１２】
【０１９１】
コンカテマーからのＡＭＰ生成物の製造および特徴づけ
グアニジンＨＣｌまたはウレアで可溶化されたタンパク質を、ＨＣｌ、ギ酸または酢酸でｐＨ１から１．５に酸性化した。サンプルを６０℃に２４時間から４８時間にわたって加熱した。２４時間毎に、一部を取り出し、ｐＨをＴｒｉｓＣｌ／ＮａＯＨで中和した。酸切断された生成物を、逆相ＨＰＬＣを使用して分析した。１０．２分の保持時間を有する大きいピークが、ＨＣｌ処理を６０℃で２４時間行った後に観測された。この保持時間は、合成されたＤ２Ａ２１’の保持時間と同一であった。１２．２分におけるペプチドピークは３，０４４．７の分子量を有しており、これは、Ｄ２Ａ２１’について予想される分子量と本質的に同一であった。１０．６分の保持時間でのより小さいピークもまた、９．１分における主要なピーク（このピークはＨＣｌ処理サンプルでは観測されなかった）と同様に、観測された。これらのピークは経時的に蓄積し続けた。このことは、これらが、関連した生成物であり得ることを示唆している。ウレアによる可溶化から得られたサンプルについてはピークが観測されなかった。これは、移動相に希釈されたときの、観測されたサンプルの沈殿によると考えられた。酸切断による生成物は相当のＡＭＰ活性を含有していた。まとめると、これらの結果は、マルチマーの加水分解により、生物学的に活性なＡＭＰモノマーの産生がもたらされたことを示している。
【０１９２】
類似する結果が、精製されたＡＭＰトリマーをギ酸で６０℃で消化したときに観測された。切断されたトリマーは強力な抗菌活性を有していた。ＨＰＬＣ分析により、（９．１分および１０．６分で溶出する化学種に加えて）多数の化学種が存在することが明らかにされた。本発明者らは、これらのピークの一部またはすべてがＤ２Ａ２１’生成物の誘導体であり得ることを仮定した。このことを調べるために、本発明者らは、Ｄ２Ａ２１’トリマーのギ酸消化の生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して分析した。強いピークが、３，０４５．１の質量を伴って質量スペクトルにおいて観測された。この質量は、所望するＤ２Ａ２１’生成物に対する３，０４４．７の予想される質量と非常に近かった。このピークに加えて、他の付加物ピークが観測された。小さいピークが、２，９２９．８の質量値で観測された。このピークは、おそらくは、Ｃ末端のアスパラギン酸残基が失われたＤ２Ａ２１’誘導体から生じたと考えられる（この化学種（Ｄ２Ａ２１”）の予想される分子量は２，９２９．６であった）。Ｄ２Ａ２１”化学種はこのサンプルでは比較的少量で存在し、より多量のＤ２Ａ２１”が、切断反応がより長時間にわたって行われたとき、または切断反応がより高い温度で行われたとき、生成物において観測された。
【０１９３】
規則的な間隔で現れるいくつかの他のピークもまた、質量スペクトルにおいて観測された。切断生成物のその後のＬＣ−ＭＳ分析により、Ｄ２Ａ２１”ピークは、親のＤ２Ａ２１’よりもわずかに大きい保持時間を有することが明らかにされた。これらのピークは、Ｄ２Ａ２１’ピークおよびＤ２Ａ２１”ピークの近くにクラスター化していた。これらの付加物ピークと親ピークとの質量差は２８ａｍｕであった。この質量はホルミル付加物の分子量に対応するので、本発明者らのデータは、ペプチドが切断反応時にギ酸によってホルミル化されたことを示唆していた。この結論は、Ｄ２Ａ２１’トリマーが、酢酸または希ＨＣｌを使用して切断されたときには、＋２８ａｍｕの付加物が観測されないという観測結果によって裏付けられた。
【実施例１３】
【０１９４】
活性に対する酸切断の副生成物の影響
Ｃ末端のアスパラギン酸残基の喪失、またはペプチド生成物のホルミル化がその抗菌活性に影響するかどうかを明らかにするために、高純度の合成Ｄ２Ａ２１’を、ギ酸、希ＨＣｌまたは水のいずれかで６０℃において２４時間にわたって処理した。サンプルを真空乾燥によって濃縮して、Ｔｒｉｓ／水酸化ナトリウムで中和し、その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。コンカテマーＤ２Ａ２１’前駆体の場合と同様に、ギ酸による処理はＤ２Ａ２１”およびホルミル化同時生成物の両方の形成を生じさせ、その一方で、後者の生成物の形成は、希ＨＣｌで処理されたサンプルでは観測されなかった。予想されたように、いかなる種類の副生成物も、水において２４時間加熱されたサンプルでは観測されなかった。興味深いことに、ＭＡＬＤＩ質量分析およびＨＰＬＣを使用した、ギ酸および塩酸による切断の比較により、Ｄ２Ａ２１’生成物対Ｄ２Ａ２１”副生成物の比率が、ＨＣｌによる切断反応生成物については、ギ酸による生成物よりも大きいことが示唆された。この改善された生成物対副生成物比はまた、１０％酢酸を使用する切断反応についても観測された。
【０１９５】
Ｃ末端切断反応およびホルミル化反応はともに、Ｄ２Ａ２１”またはホルミル化ペプチド生成物のいずれも、より低い温度（４℃）で酸とインキュベーションされたサンプルにおいては観測されなかったので、非常に温度依存的であった。
【０１９６】
ペプチド活性に対するこれらの処理の影響を測定するために、これらのサンプルのそれぞれの抗菌活性を、標準的な生育阻害アッセイを使用して二連で測定した。抗菌活性の著しい差は、酸処理サンプルまたは水処理サンプルのいずれについても観測されなかった。この結果は、Ｄ２Ａ２１”またはホルミル化生成物の形成はペプチドの抗菌活性に影響しないことを示唆していた。一方、薄いＨＣｌまたは酢酸で切断されたペプチド生成物は、望ましいことに、ペプチドのギ酸（および他の）加水分解から生じ得る天然に存在しない副生成物をもたらさない。
【実施例１４】
【０１９７】
Ｄ４Ｅ１コンカテマー／他のＡＭＰ：その融合体
Ｄ４Ｅ１として知られている別の抗菌性ペプチドが、本発明のマルチマー／コンカテマー化方法論をさらに評価するために選択された。Ｄ４Ｅ１は構造がβ−シートである。コアＤ４Ｅ１  ＡＭＰは下記の１７残基のアミノ酸配列を含む：
【０１９８】
【化６】
0004472998.tif 000010
【０１９９】
ＤＮＡ配列を化学合成して、細菌における発現のためにＤ４Ｅ１のマルチマーを構築した（配列番号１３を参照のこと）。Ｄ４Ｅ１’を、最初の取組みにおいて、Ｄ２Ａ２１’コンカテマーのために開発された方法を使用してｐＥＴ２４ｂにクローン化した。さらなる残基が、Ｄ２Ａ２１’と同様に、コアＤ４Ｅ１配列の両側に配置された。実際、この構築では、余分なＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドの付加がＤ４Ｅ１配列のＮ末端に含まれる。従って、ＤＮＡ配列は、コアＤ４Ｅ１  ＡＭＰを、コアＡＭＰのＮ末端およびＣ末端の両方におけるＡｓｐ−Ｐｒｏと一緒に含む２１アミノ酸のペプチドをコードする。しかしながら、Ｄ２Ａ２１’構築物がまさにそうであるように、コンカテマー化されたＤ４Ｅ１’ペプチドの酸加水分解は、１個のｎ末端ｐｒｏ残基およびｃ末端ｇｌｙ−ａｓｐ残基を含有することが予想される。
【０２００】
【化７】
0004472998.tif 000011
【０２０１】
２個、３個、４個および５個のマルチマーが達成されたが、過剰発現は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換されたとき、成功しなかった。トリマーおよびテトラマーの配列については配列番号１４から配列番号１７を参照のこと。前駆体の細菌生成物は、６ＸＨｉｓタグを有する２１アミノ酸の配列がＣ末端に配置され、Ｔ７タグを含有する１２アミノ酸のリーダー配列がＮ末端に配置された。Ｄ４Ｅ１ペンタマーのアミノ酸配列を下記に示す：
【０２０２】
【化８】
0004472998.tif 000012
このタンパク質をコードするＤＮＡ配列が配列番号１９に示される。
【０２０３】
電荷分布が下記に示される。この場合、Ｏは、非極性、極性、疎水性または非荷電であり、＋は正荷電残基を表し、−は負荷電残基を表す。
【０２０４】
【化９】
0004472998.tif 000013
【０２０５】
Ｄ４Ｅ１のコンカテマーが、Ｄ２Ａ２１コンカテマーを組み立てるための上記の方法を使用して作製された。
【０２０６】
コンカテマーの方向性分析が、エンドヌクレアーゼによる消化によって試験され、アガロースゲル電気泳動によって確認された。コンカテマーを表すバンドがゲル精製された。ＤＮＡは、続いて、Ｔ４リガーゼを使用して、ｐＥＴ２４ｂ（大腸菌）発現プラスミドのＢａｍＨＩ部位で連結された。連結混合物を大腸菌菌株のＤＨ５αライブラリーに適した細胞に形質転換して、カナマイシン耐性について選択した。カナマイシン耐性株を単一コロニー単離した。その後、個々のコロニーをＬＢ／Ｋａｎ培地に接種し、３７℃で一晩生育させた。ＤＮＡを細胞から抽出し、制限消化によって分析した。適正なプラスミドを含有するプラスミドはまた、ＤＮＡ配列決定によって分析された。
【０２０７】
Ｄ４Ｅ１のトリマー、テトラマーおよびペンタマーが、その後、一般的なＰＣＲ技術を使用してシュードモナス・フルオレセンス発現ベクターｐＭＹＣ１８０３に導入された。Ｄ４Ｅ１の配列確認されたコンカテマーを、コード配列のＮ末端およびＣ末端に対するプライマーを使用するＰＣＲによってｐＭＹＣ１８０３発現プラスミドにサブクローン化した。
【０２０８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認し、その後、ｐＭＹＣ１８０３発現プラスミドにそのＳｐｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位の間で連結するためにそれぞれの酵素で消化した。発現ベクターを細菌菌株ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢおよびテトラサイクリン含有（Ｔｅｔ）寒天平板に播いた。続いて、個々のコロニーをＬＢ／Ｔｅｔ培地に接種し、一晩生育させた。その後、細胞を集め、ＤＮＡを抽出し、配列決定した。発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。さらにより大きい発現レベルが所望された。ｐＭＹＣ１８０３におけるＤ４Ｅ１のトリマー、テトラマーおよびペンタマーが、その後、ＤＨＦＲをコードするＮ末端キャリア配列に融合された。
【０２０９】
（ａ）ｐｍｙｃ１８０３におけるＤ４Ｅ１−ＤＨＦＲ融合体
確認されたＤ４Ｅ１のｐＭＹＣ１８０３組換えプラスミドをＮｈｅＩおよびＫｐｎＩのエンドヌクレアーゼで消化して、Ｄ４Ｅ１コンカテマーを取り出した。トリマー融合体については配列番号２４および配列番号２５を参照のこと。テトラマー融合体については配列番号２７および配列番号２７を参照のこと。ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電形動によって確認し、定量した。ＤＮＡを、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする存在する上流配列をそのＳｐｅＩ部位およびＮｈｅＩ部位の間に含有する発現ベクターｐＭＹＣ１８０３のＮｈｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位に連結した。連結混合物をＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ／ｔｅｔ寒天平板に播いた。続いて、個々のコロニーをＬＢ／Ｔｅｔ培地において３７℃で一晩生育させた。細胞を、以前に記載された手順を使用して集めた。ＤＮＡを、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩの組合せによる制限消化、または、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩの組合せによる制限消化に供した。制限消化物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。しかしながら、ＤＨＦＲ−Ｄ４Ｅ１融合体のより大きい発現レベルがさらに所望された。
【０２１０】
（ｂ）ｐＭＹＣ１８０３デハロゲナーゼ融合キメラにおけるＤ４Ｅ１
Ｄ４Ｅ１ペンタマー（配列番号１８）を、一般的な増幅（ＰＣＲ）技術および連結技術を使用して、（配列番号３４の４Ｃ融合体におけるように）短縮型デハロゲナーゼに融合させた。
【０２１１】
ｐＭＹＣ１８０３  ＤＨＦＲ  Ｄ４Ｅ１ペンタマーを、デハロゲナーゼに融合されたｐＭＹＣ１８０３  Ｄ４Ｅ１ペンタマーを構築する際のＤ４Ｅ１に対するモデルテンプレートとして使用した。配列番号４４および配列番号４５を参照のこと。ｐＭＹＣ１８０３デハロゲナーゼ４Ｃプラスミドを、デハロゲナーゼに融合されたｐＭＹＣ１８０３  Ｄ４Ｅ１ペンタマーを構築する際の短縮型デハロゲナーゼ（最初の１２３アミノ酸）に対するＤＮＡテンプレートとして使用した。Ｃ末端デハロゲナーゼおよびＮ末端Ｔ７タグをコードするセンスＤＮＡ配列およびアンチセンスＤＮＡ配列を合成した。
【０２１２】
センス５’プライマーおよびＣ末端３’ＫｐｎＩプライマーが、Ｄ４Ｅ１：ＤＨＦＲ（配列番号２８および配列番号２９）からＤ４Ｅ１ペンタマーを増幅するために使用された。アンチセンス３’プライマーおよびＮ末端５’ＳｐｅＩプライマーが、短縮化体のデハロゲナーゼを４Ｃ（配列番号３４および配列番号３５）から増幅するために使用された。
【０２１３】
両方のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって確認した。ＰＣＲフラグメントを定量し、続いて等モル比で一緒にして、ＮｈｅＩエンドヌクレアーゼによる制限切断に供し、使用されたＰＣＲプライマーによってコード化し、続いて連結した。連結反応物を、完全なデハロゲナーゼおよびＤ４Ｅ１の融合配列を増幅するために、５’ＳｐｅＩプライマーおよび３’ＫｐｎＩプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。続いて、ＰＣＲをアガロースゲル電気泳動によって確認した。その後、ＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＫｐｎＩの両方の制限酵素で消化した。ＰＣＲ産物をシュードモナス・フルオレセンス株ＭＢ２１４発現ベクターｐＭＹＣ１８０３にそのＳｐｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位の間で連結した。連結混合物をＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ／Ｔｅｔ寒天に置床した。続いて、個々のコロニーをＬＢ／Ｔｅｔ培地において３７℃で一晩生育させた。細胞をそれに従って集めた。その後、抽出されたＤＮＡを、Ｄ４Ｅ１配列に融合されたデハロゲナーゼのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。融合配列を確認するプラスミドＤＮＡが、その後、ＤＮＡ配列決定に供された。配列番号４５を参照のこと。
【０２１４】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅにおける発現研究により、高レベルの誘導されたタンパク質およびＤ４Ｅ１モノマーペプチドが酸による処理／切断の後で明らかにされた。この発現プラスミドを含有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ株ＭＢ２１４は、２０リットルの発酵槽において生育させたとき、発酵液１リットルあたり少なくとも１グラムの産生をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】正しい配向でモノマーＡＭＰサブユニットをコードするＤＮＡセグメントのマルチマー構築物への組立て、次いでプラスミド内への組立てを例示する。
【図２】所望する配向でのマルチマーサブユニットの組立てを示す。
【図３Ａ】マルチマー／コンカテマーを形成させるために（Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドと連結されたＡＭＰをコードする）正しく配向した遺伝子を組み立てるために使用されたシュードパリンドロームスペーサー方法論を示す。所望する配向での遺伝子の付着末端の連結により、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドをコードする非パリンドローム配列が生じる。
【図３Ｂ】ＰｖｕＩによって切断され得る正しくない「頭−頭」連結または「尾−尾」連結から生じるパリンドローム配列を示す。
【図３Ｃ】ＢａｍＨＩによって切断され得る正しくない「頭−頭」連結または「尾−尾」連結から生じるパリンドローム配列を示す。
【図４】実施例９および実施例１０で議論される融合体／クローンを例示する。中央の黒色棒は、免疫ブロット検出のためのＴ７タグエピトープ（ＡＭＰマルチマーのリーダーセグメントの一部）を表す。白色棒はマルチマーにおけるトレーラー配列を表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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