(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を、小麦由来のセリンカルボキシペプチダーゼＷを用いて酵素処理してＮ末端のフルクトシルバリンを切り出し、ここに得られたフルクトシルバリンにケトアミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質の定量方法。
【請求項２】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１〜５のいずれかで表されるものである請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されている蛋白質が、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項１又は２記載の定量方法。
【請求項４】
酵素処理がｐＨ４．０〜７．０で行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フルクトシルバリンの生産方法及び該生産方法により得られたフルクトシルバリンの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
血中のヘモグロビン（Ｈｂ）Ａ１ｃは、そのβ鎖のＮ末端のバリン残基にグルコースが非酵素的に結合し、シッフ塩基を形成した後、アマドリ転移により、結果的にフルクトースが結合した構造を有するフルクトシル蛋白質である。かかるＨｂＡ１ｃは、臨床的に過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病管理の指標として重要であり、その迅速かつ正確な定量法が求められている。
【０００３】
ところで、ＨｂＡ１ｃ等のグリコシル化蛋白質を測定する方法として、試料をプロテアーゼで処理し、そのプロテアーゼ処理試料をケトアミンオキシダーゼで処理し、その反応生成物を測定する非酵素的グリコシル化蛋白質の測定法（特開平５−１９２１９３号公報）が知られている。
【０００４】
しかしながら、ＨｂＡ１ｃを測定するには、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端のフルクトシルバリン残基を特異的に切り出すことができるプロテアーゼが必要であるが、該公報に記載されたプロテアーゼは、フルクトサミンのフルクトシルリジン残基を切り出すものであり、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端のフルクトシルバリン残基を特異的に切り出すことはできない。したがって、該公報に記載の方法は、ＨｂＡ１ｃの測定法として利用することはできない。
【０００５】
また、ＨｂＡ１ｃを定量する他の方法として、例えばＩＦＣＣの実用基準法（Ｋｏｂｏｌｄ  Ｕ．，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎＡ１ｃ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ．  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４３：１９４４−１９５１）に、ヘモグロビンをエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃで水解（３７℃で１８時間処理）し、得られるβ鎖Ｎ末端の６ペプチドフラグメントをＨＰＬＣで分離した後、キャピラリー電気泳動法又は質量分析法で定量する方法が記載されている。しかしながら、該方法は、特別な装置を必要とするため、操作が煩雑で経済性が悪いという問題がある。
【０００６】
したがって、本発明は、かかるＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質から、フルクトシルバリンを生産する方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、かかる生産方法によって得られたフルクトシルバリンを定量する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、特定のセリンカルボキシペプチダーゼが、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質から、フルクトシルバリンを特異的に切り出すことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）を用いて酵素処理することを特徴とするフルクトシルバリンの生産方法を提供するものである。
本発明はまた、かかる生産方法により得られたフルクトシルバリンに、ケトアミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とするフルクトシルバリンの定量方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のフルクトシルバリンの生産方法に用いる酵素は、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）であり、これはペプチドや蛋白質のＬ−アミノ酸をＣ末端から順次遊離させるペプチダーゼである。ペプチドのＣ末端側から順次アミノ酸を切り出すペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＡ（牛膵臓由来）、カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）等が知られているが、これらを用いてＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を処理しても、フルクトシルバリンは得られなかった。かかる状況下、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）が、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質からフルクトシルバリンを切り出すことができることは、全く意外であり、これまで全く知られていなかったことである。該セリンカルボキシペプチダーゼは、植物、動物、カビ、酵母等に広く存在するが、本発明においては、このうち小麦由来のセリンカルボキシペプチダーゼを用いることが好ましい。
【００１０】
本発明においては、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質を、上記セリンカルボキシペプチダーゼを用いて酵素処理する。該ペプチド又は蛋白質は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されていれば、アミノ酸配列、アミノ酸残基の数等に特に制限はないが、このうち、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されている蛋白質としては、ＨｂＡ１ｃが好ましい。また、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドとしては、アミノ酸数には限定されないが、そのアミノ酸配列が配列番号１〜５で表されるものが好ましい。
【００１１】
上記Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチドは、かかる配列を有するペプチド又は蛋白質を、適当なエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼ等を用いて処理することにより、調製することができる。これらプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、アルカリプロテアーゼ、トリプシン、プロリン特異エンドプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ等が挙げられる。これらプロテアーゼの活性量としては、０．０５〜１００００Ｕ／ｍＬ、特に１０〜２０００Ｕ／ｍＬが好ましい。
【００１２】
Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されている蛋白質又はペプチドを処理するときの、上記セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）の活性量は、０．０５〜１００００Ｕ／ｍＬ、特に１〜１０００Ｕ／ｍＬが好ましい。また、処理温度は、１０〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましい。また、処理時間は、３分〜２００時間、特に５分〜１５０時間が好ましい。かかる処理により、フルクトシルバリンを得ることができる。
【００１３】
次に、本発明のフルクトシルバリンの定量方法について説明する。本発明の定量方法は、フルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理し、生成した過酸化水素を測定することにより、フルクトシルバリンを定量するものである。上記で得られたフルクトシルバリンは、そのまま、又は必要に応じて限外濾過等により精製して本発明の定量方法に供することができる。本発明において用いるケトアミンオキシダーゼとしては、フルクトシルバリンを基質とするものであれば特に制限はないが、フルクトシルバリンに対して高い特異性を有し、フルクトシルリジンに対して特異性の低いものが好ましい。かかるケトアミンオキシダーゼを用いれば、例えば本発明の定量方法を用いて血液中のＨｂＡ１ｃを定量する場合、被験試料中に混在する可能性のある、ヘモグロビンのα鎖及びβ鎖由来のフルクトシルリジンの影響を排除し、高い精度でＨｂＡ１ｃを定量することができる。かかるケトアミンオキシダーゼとしては、例えばコリネバクテリウム（Corynebacterium）属菌由来の酵素（キッコーマン社製）、コリネバクテリウム・スピシーズ（sp.）由来の遺伝子組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが挙げられる。ケトアミンオキシダーゼの活性量は、１〜１００００Ｕ／Ｌ、特に１０〜５０００Ｕ／Ｌが好ましい。また、ケトアミンオキシダーゼの処理温度は、１０〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましい。また、ケトアミンオキシダーゼの処理時間は、０．１分〜１時間、特に０．５分〜３０分間が好ましい。
【００１４】
フルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理することによって生成する過酸化水素の測定方法は、特に制限はないが、反応系に色原体及びパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加し、該色原体を酸化して発色物質を生成させ、これを測定する方法が好適である。この色原体としては、４−アミノアンチピリンと、フェノール系化合物、ナフトール化合物又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−ベゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組み合わせ、ロイコメチレンブルー等が用いられる。また、特許第２５１６３８１号に記載されているように、ＰＯＤ存在下にて過酸化水素と２価のコバルトイオンとの反応により生じた３価のコバルトイオンを、３価のコバルトイオンに特異的な指示薬、例えばＴＡＳＢＢ（トリゾリウム２−（２−チアゾリルアゾ）−５−ジスルフォブチルアミノベンゾエート）と組み合わせ、発色キレート化合物を生成させ、これを測定する方法も利用できる。これによれば、上記方法の５〜１０倍の測定感度を得ることができる。また、過酸化水素を検出する試薬として、高感度に測定可能なＴＰＭ−ＰＳ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン）（同仁化学社製）等も利用できる。
【００１５】
かかるフルクトシルバリンの定量方法を用いれば、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド、蛋白質、蛋白質のサブユニット等、例えばＨｂＡ１ｃを極めて高精度で定量することができる。ここでＨｂＡ１ｃの定量に使用される被験試料としては、例えば全血、赤血球等が挙げられる。
【００１６】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）又はＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５〜７）１６０μＬに、２５０μＭのｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ水溶液２００μＬ、及び２００Ｕ／ｍＬカルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬社製）４０μＬを加え（総反応液量４００μＬ）、混和後、３７℃で１４時間保持した。これを、以下のケトアミンオキシダーゼによる検出系の試料として、フルクトシルバリン濃度を測定した。
【００１８】
（ケトアミンオキシダーゼを用いた検出系）
試薬▲１▼
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）
ＥＤＴＡ−２Ｎａ  １０ｍＭ
ＴＰＭ−ＰＳ      １６ｍｇ／ｄＬ
試薬▲２▼
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）
パーオキシダーゼ        ５００Ｕ／ｄＬ
ケトアミンオキシダーゼ  １０００Ｕ／ｄＬ
【００１９】
測定には、日立自動分析装置７０７０形を用い、２ポイントエンド法にて行った。具体的には、上記試料１０μＬに試薬▲１▼２６０μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後、波長８００ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度の差を測定した。次いで試薬▲２▼１３０μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後、波長８００ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度の差を測定した。標準液としては４０μＭのフルクトシルバリン溶液を用い、試薬ブランクとしては生理食塩水を用いて同様の操作を行い、標準液と試薬ブランクとの吸光度差から、試料中のフルクトシルバリン濃度を求めた。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
表１から明らかなように、カルボキシペプチダーゼＷを用いることにより、フルクトシルペプチドからフルクトシルバリンを切り出すことができ、さらにケトアミンオキシダーゼを用いることにより、フルクトシルバリンを定量することができる。また、該カルボキシペプチダーゼＷの至適ｐＨは、一般に４であるが、実施例１においては、ｐＨ６のとき、ｐＨ４の場合の１０倍以上の活性が認められた。
【００２２】
実施例２
２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６）１２０μＬに、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド（ｆ−ＶＨＬ）の５００μＭ水溶液又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＮ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰ）の５００μＭ水溶液７５μＬ、１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬社製）３０μＬ及び精製水４５μＬを加えた（総反応液量２７０μＬ）。これを混和後、３７℃で１４時間又は６６時間保持した後のフルクトシルバリン濃度を実施例１と同様にして測定した。また、比較のため、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６）の代わりに２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）を、１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＷの代わりに１０００Ｕ／ｍＬのカルボキシペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１７．２、ブタ膵臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）を用い、他は上記と同様にしてフルクトシルバリン濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
表２から明らかなように、カルボキシペプチダーゼＢを用いた場合は、フルクトシルバリンはほとんど認められなかったが、カルボキシペプチダーゼＷを用いた場合は、ｆ−ＶＨＬ、ｆ−ＶＨＬＴＰのいずれからもフルクトシルバリンを得ることができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のフルクトシルバリンの生産方法により、簡単に、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド又は蛋白質からフルクトシルバリンを生産することができる。また、本発明のフルクトシルバリンの定量方法により、高精度でフルクトシルバリンを定量することができる。かかる定量方法は、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド、蛋白質、蛋白質のサブユニット等、例えばＨｂＡ１ｃ等の定量に特に有効である。
【００２６】
【配列表】
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【００２７】
0004427137.tif 000005
【００２８】
0004427137.tif 000006
【００２９】
0004427137.tif 000007
【００３０】
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