(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流動性第一試料物質の分析操作を行う方法であり：
内部に配置された少なくとも第一チャネルを有するボディを有し、該第一チャネルは第一及び第二チャネルセグメントを有し、該第一チャネルセグメントは界面活性剤について臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）又はそれ以上の界面活性剤濃度を含む第一流体環境条件を含むミクロ流動装置を提供し；
第一試料物質を第一チャネルセグメントに流通させて、分離操作を実行し；
第一試料物質を第一チャネルセグメントから第二チャネルセグメントに流し；そして、
第一希釈剤を第二チャネルセグメント内に導入し、該希釈剤は界面活性剤について臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の界面活性剤濃度を含む第二流体環境条件を生成する、
ことを含む該方法。
【請求項２】
さらに検出操作を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該分離操作が電気泳動ポリペプチド分離を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該第一流体環境条件が０．１％より大きい濃度で界面活性剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該検出操作が分離操作で分離されたポリペプチドと結合する親油性染料の検出を含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該第二流体環境条件が０．１％未満の濃度で界面活性剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該第二流体環境条件が０．０５％の濃度で界面活性剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該提供段階が少なくとも第一チャネルセグメント内で分離緩衝液を提供することをさらに含み、該分離緩衝液がポリマーマトリックス、緩衝剤、第一界面活性剤及び親油性染料を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該ポリマーマトリックスが非架橋ポリマー溶液を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該非架橋ポリマー溶液が線状ジメチルアクリルアミドポリマー溶液を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該線状ジメチルアクリルアミドポリマーが分離緩衝液中に０．１と２０％（ｗ／ｖ）との間の濃度にて存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該第一界面活性剤がアルキルスルホネート界面活性剤を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
該第一界面活性剤がナトリウムオクタデシルサルフェート、ナトリウムデシルサルフェート及びナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）からなる群より選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
該第一界面活性剤がナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
該第一界面活性剤が第一チャネルセグメント内の分離緩衝液中に、０．０３％より大きい濃度で存在する請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
該希釈剤が、界面活性剤を用いない緩衝剤を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
該緩衝剤がトリス−トリシンを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
該緩衝剤が第一チャネルセグメント内の分離緩衝液中に、１０ｍＭと１００ｍＭとの間の濃度にて存在する請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
該親油性染料が、蛍光性親油性染料である請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
該親油性染料が、第一チャネルセグメント内の分離緩衝液中に、０．１μＭと２０μＭとの間の濃度にて存在する請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
ボディ構造；
ボディの内部に配置される第一チャネルセグメントであり、界面活性剤について臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）又はそれ以上の界面活性剤濃度を含む第一流体環境条件を含む該第一チャネルセグメント；
第一チャネルセグメントと流体的に接続した第二チャネルセグメント；
第二チャネルセグメントと流体的に連結した少なくとも第一希釈剤ソース；及び、
第一希釈剤を第二チャネルセグメントに運び、第二チャネルセグメント内に、界面活性剤について臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の界面活性剤濃度を含む第二環境条件を生成するための、第一希釈剤ソースと操作可能に連結した流れコントローラ、
を含むミクロ流動装置。
【請求項２２】
該第一環境条件が、ポリマーマトリックスと緩衝剤とを含む分離緩衝液をさらに含む請求項２１に記載のミクロ流動装置。
【請求項２３】
該界面活性剤がアルキルサルフェート界面活性剤である請求項２２に記載のミクロ流動装置。
【請求項２４】
該界面活性剤が、ナトリウムデシルサルフェート、ナトリウムドデシルサルフェート及びナトリウムオクタデシルサルフェートから選択される請求項２２に記載のミクロ流動装置。
【請求項２５】
該希釈剤が、緩衝剤を含み界面活性剤を含まない希釈緩衝液を含む請求項２２に記載のミクロ流動装置。
【請求項２６】
少なくとも第二チャネルセグメントに流体的に接続した第二希釈剤ソースをさらに含む請求項２１に記載のミクロ流動装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９９９年２月２日に出願された米国特許出願第０９／２４３，１４９号の部分継続出願であり、全ての目的上、その全体について、本明細書中に参考として全ての開示が援用されている。
【０００２】
生物学的化合物の特性決定は、生命、生命維持プロセス、これらのプロセスに影響を与える事象及び要素を理解しようとする努力において、本来、必要なものである。典型的には、生命のプロセスを理解すること、及びこれらの調節における努力は、生命の基本的構築用ブロック、すなわち生命有機体と単なる生命のない原始的な泥（ｏｏｚｅ）とを区別する高分子化合物及び複合体に最初に注目する。生命プロセスの理解及び調節において特に興味深いのは、それらが符号化する核酸及びタンパク質である。
【０００３】
タンパク質の場合には、多くの特性決定法が１０年間大きな変化のないままである。例えば、現在のタンパク質特性決定法は、少なくとも部分的に、それらの相対分子量によってタンパク質を特性決定するナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥに依る。これらの方法は架橋ポリアクリルアミドのスラブ又はシートを使用する。分離及び特性決定されるタンパク質は、洗浄剤（界面活性剤を意味する。以下同じ）緩衝液（ＳＤＳ）と混合され、そしてスラブの一端に、典型的にはウェル（ｗｅｌｌ）内に静置される。スラブを横切って電場がかけられ、ゲルを通してタンパク質を含む高度に帯電した洗浄剤ミセルを引き寄せる。より大きなタンパク質は、より小さいタンパク質よりもより遅くスラブゲルを通って移動し、それにより、より大きなミセルから分離される。分離後、ゲルを染料、典型的には「クーマシーブルー」又は銀錯剤と接触され、それらはゲル中で異なるタンパク質と結合する。クーマシーブルー着色ゲルの場合は、スラブゲルは汚れを取り除かれ、過剰の染料を除去しなければならない。この工程はサイズにより分けられたスラブゲル中の異なるタンパク質のラダ−（ｌａｄｄｅｒ）を生じる。銀染色法は非量的に染色されたゲルであるにもかかわらず、類似した消費時間、そして質的に一般的な収率である。これらの方法の改良は、より早く移動するより小さいゲルを製造し、そのゲルは購入された「使用できる」ゲルであり、染色工程を代替する。しかし、基本的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法はタンパク質特性決定方法として大きく変化しないままである。
【０００４】
多くの試みが行われ、タンパク質特性決定の他の領域において行われる進歩が試みられた。例えばキャピラリ電気泳動法であり、これはタンパク質の特性決定において試みられる核酸の分析においての成功が証明されている。これらの方法はタンパク質の分離において可能であることが証明されているが、タンパク質と核酸間の基礎構造及び化学的な相違同様、化学的物質のラベリング利用における相違は、タンパク質の特性決定におけるＣＥ法の広い使用に対する実質的な障壁を生成する。特に、キャピラリを通って移動する分離されたタンパク質の検出は、比較的複雑な化学物質を使用して、全てのタンパク質に対するラベリング基の共有付着が典型的には必要である。さらに、タンパク質分離におけるＳＤＳの存在は、それらはサイズに基づく分離を保証するが、キャピラリシステム内のラベリングと分離においてさらなる困難を生成する。
タンパク質とポリペプチドを特性決定するための方法、装置、システム及び道具が所望であり、それは処理量、反応性を高め、空間、時間及び試薬必要量を提言する。本発明は、これら及び種々の必要性に見合うものである。
【０００５】
ある態様においては、本発明は流体第一試料物質の分析操作を行う方法を提供する。この方法は、典型的には、内部に配置された少なくとも第一チャネルを有するボディを有するミクロ流体装置を提供することを含む。第一チャネルは第一及び第二チャネルセグメントを含み、第一チャネルセグメントは第一操作の実行に適合する第一流体環境を有する。第一試料物質は第一チャネルセグメントに流通させて、第一操作を行う。それから、この物質は第一チャネルセグメントから第二チャネルセグメントへ流れる。第一希釈剤は第二チャネルセグメントへ流れ、これにより希釈液は第二チャネルセグメント内に第二流体環境を提供し、第二環境は第一環境よりもより第二操作に適合する。
【０００６】
関連する態様において、本発明は試料物質の分析操作を行う装置を提供する。該装置は通常はボディの内部部分に配置された第一チャネルセグメントを有するボディ構造を含み、第一チャネルセグメントは第一環境を含む。該装置はボディの内部に配置され、かつ第一チャネルセグメントと流体的に接続した第二チャネルセグメントをも含む。第二チャネルセグメントと流体的に連結した少なくとも第一の希釈剤ソース（ｓｏｕｒｓｅ）をも提供する。該装置は、第一希釈剤を第二チャネルセグメント内に運んで、第二チャネルセグメント内に第二環境を提供するための第一希釈剤ソースと操作可能に連結した流れコントローラをも典型的に含む。
【０００７】
別の態様においては、本発明はポリペプチドの特性決定方法を提供し、内部に配置された分離緩衝液を有する第一キャピラリチャネルを提供することを含む。分離緩衝液はポリマーマトリックス、緩衝剤、洗浄剤及び親油性の染料を含む。ポリペプチドはキャピラリチャネルの一端に導入される。キャピラリチャネルの長さを横切って電場がかけられ、異なったサイズのポリペプチドを、ポリマーマトリックスを通して異なった速度で移動させる。それからポリペプチドはキャピラリチャネルの長さに沿った点を通過するごとに検出される。
本発明の別の態様は、ポリペプチド分離装置である。該装置は内部に分離緩衝剤を含む少なくとも第一キャピラリチャネルを有するボディ構造を含む。分離緩衝液はポリマーマトリックス、緩衝剤、洗浄剤、及びポリペプチドと結合することができる親油性の染料で構成される。ボディ構造内に配置されたポートは、ポリペプチドを第一キャピラリチャネル内に導入するために、第一キャピラリチャネルと流体的に接続されている。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドの特性決定に使用されるキット（ｋｉｔ）である。該キットは上記装置の要素を含むミクロ流動装置で構成される。分離緩衝剤はポリマーマトリックス、緩衝剤及び親油性の染料で構成される。それぞれのパッケージはボディ構造、分離緩衝液及び親油性の染料を含む。
本発明の別の態様は、ポリペプチドの特性決定用のシステムである。該システムは内部に配置された分離緩衝液を含む少なくとも第一キャピラリチャネルを有するボディ構造を含む。分離緩衝液はポリマーマトリックス、緩衝剤、洗浄剤及び親油性の染料をで構成される。キャピラリチャネルの長さを横切って電場がかけられるために、電力ソースは、第一キャピラリチャネルの反対側の端と操作可能に連結される。センサーは、第一点においてキャピラリチャネルに検出的に接続して配置され、ポリペプチドが第一点を通過するごとにポリペプチドを検出する。
【０００９】
図１は、本発明の関連において使用するミクロ流動装置を表す。
図２は、本発明に従ってポリペプチドの特性決定において使用する全体のシステムを表す。
図３は、与えられた緩衝剤中の洗浄剤の臨界的ミセル濃度を測定するための、洗浄剤濃度に対する蛍光強度のプロットを表す。
図４は、本発明の方法を使用するミクロ流動装置において行われるタンパク質分離のクロマトグラムを表す。クロマトグラムは、１２の別々の分離を見ると、それぞれエミュレートされたゲルの別々のレーンとして、エミュレートされたゲルとして表示される。
図５は、図４に示されたように分離された、移動時間に対する標準タンパク質の分子量の対数のプロットである。
図６は、洗浄剤−染料フロントピークを示す分子量標準物のクロマトグラムである。
図７は、ここで記載された方法の後分離処理を行うためのミクロ流動装置の概略例である。
図８（Ａ−Ｄ）は、後分離希釈の影響を説明する分離データのプロットを示す。
【００１０】
Ｉ．  方法、装置及び試薬
Ａ．    通例
本発明はポリペプチド、タンパク質及びそれらの残存部分（ここではまとめて「ポリペプチド」と呼ぶ）の特性決定に使用する方法、装置、システム及びキットを提供する。本発明の方法、装置、システム及びキットは、通常「キャピラリ電気泳動」という用語でも呼ばれるキャピラリチャネル内に含まれるポリマー分離マトリックスを通過して、ポリペプチドの電気泳動移動を通じてそれらの分子量によりポリペプチドを特性決定するのに有用である。
前に示したとおり、キャピラリ電気泳動法を使用してタンパク質とポリペプチドを分離する試みが行われた。キャピラリ電気泳動は閉じたシステム、例えばキャピラリを使用するため、タンパク質のラベリングは典型的には分離前に行われる。これは通常、分離される混合物中の全てのタンパク質に対し、ラベリング基の共有付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の形態を取る。一度分離されると、各タンパク質上のラベルはそれから検出されることができる。共有ラベリング技術はしばしば錯化学を含み、そして非常に稀にタンパク質の分離に先立ち、さらなる段階を必要とする。さらに、ラベルは通常、タンパク質の分子量の測定に反対に作用し得る比較的大きな構造である。非共有、結合染料を使用する幾つかの試みが行われたが、そのような試みは、許容できる結果未満で提供される。
【００１１】
しかし、本発明の少なくとも第一の態様に関しては、キャピラリ電気泳動法によりタンパク質を特性決定及び／又は分離する方法を提供し、その方法は迅速で、再現可能であり、そして分離を行う前に錯試料製造段階を含まない。特に本発明の方法は、内部に分離緩衝液を含む第一キャピラリチャネルを提供し、分離緩衝液はポリマーマトリックス、緩衝剤、洗浄剤及び親油性染料を含む。本発明の好適な態様に関して、洗浄剤及び緩衝剤は臨界ミセル濃度（「ＣＭＣ」）又はそれ未満の濃度で分離緩衝剤内に存在する。洗浄剤及び緩衝剤濃度をＣＭＣ以下に維持することにより、染料が洗浄剤ミセルと結合するような逆の効果を最小化することができる。操作の特別な理論との結びつきがなければ、上記システムにおけるキャピラリシステム内で洗浄剤ミセルに結合する染料は、結果として実質的なバックグラウンド信号を生じ、分離操作中の不規則な信号、例えば信号ベースラインの上昇（ｂｕｍｐｓ）及び下降（ｄｉｐｓ）を生じる。他方、本発明の方法は、本システムの種々の成分を注意深く調節し、これらの逆の効果を避けるか少なくとも最小化する。特に好ましい態様においては、少なくとも操作の分離成分が検出される点において、緩衝液及び洗浄剤はＣＭＣ又はそれ未満のレベルで提供され、それによりより高いバックグラウンド信号を与えるミセルと結合する染料を避けることができる。これは（例えば緩衝液及び洗浄剤濃度が）ＣＭＣ未満のレベルにおいて維持及び／又は実行される全体システムの結果であることができ、又は試料、緩衝剤及び洗浄剤流体のもとの場所の処理（例えば希釈、試薬追加又は他の溶液改質）の結果であることができ、ＣＭＣ未満のレベルに対するシステムの検出部分における分離緩衝液を減じる。
【００１２】
実際には、分析又は特性決定されるタンパク質又はポリペプチド試料は、典型的に前処理され、試料中の被覆されたタンパク質の十分なラベリングを提供するのと同様に、洗浄剤によるタンパク質の十分な被覆を提供する。
特性決定されるタンパク質又はポリペプチド（又は分離されるポリペプチドの混合物）は、キャピラリチャネル中に、典型的にはチャネルセグメントの１つの末端において導入される。キャピラリチャネルの長さを横切って電場をかけることによって、異なったサイズのポリペプチドが、ポリマー溶液中を通って異なった速度で移動する。ポリペプチドに結合して実質的な供給を有する洗浄剤中で被覆されたポリペプチドは、キャピラリチャネルを通って１つの方向に移動する。しかし異なる分子量のポリペプチドは、ポリマー溶液を異なった速度で通って移動して、分離される。ポリペプチドは、チャネル内の分離緩衝液中を移動する間に、試料、例えば試料前処理中に、希釈液等とともに随意に含まれる任意の結合する染料を運ぶとともに、分離緩衝液中に存在する親油性染料を集める。
分離については、互いに一度分離されると、この点でこれらに結合する結合性の親油性染料のレベルを有するポリペプチドは、これらが導入される点の下流におけるキャピラリチャネル中の点で、その染料の効力により検出される。
【００１３】
試料前処理
上記のように、特性決定の前に、試料を含むタンパク質又はポリペプチドは、緩衝液を含む適切な洗浄剤を使用して前処理される。特に好ましい態様においては、ポリペプチド試料混合物は、分離前のタンパク質の変性を保証するために、分離緩衝液と同じ緩衝剤と分離緩衝剤中で使用されるものと同じ洗浄剤とを含む緩衝液中で前処理される。タンパク質の変性は、分離中の線状分子を保証するので、タンパク質分離の輪郭は、本来のタンパク質が球状、線状、繊維状又はいくつかの他の形態であるかに関わらず、その分子量とより密接に関連する。前処理は、典型的には試料のタンパク質の濃度（ｗ／ｖ）よりも大きい濃度で、より好ましくは試料中のタンパク質の濃度（ｗ／ｖ）の約１．４倍よりも大きい濃度での洗浄剤の存在下で実行される。
洗浄剤結合染料の干渉効果を妨げるために、しばしば、運転緩衝液中の洗浄剤濃度未満か又はほとんど等しい洗浄剤濃度、運転中の緩衝液中の洗浄剤濃度の約０．０５倍〜約３倍にて試料前処理を行うことが所望である。
【００１４】
好ましい態様において、前処理緩衝液中のＳＤＳの濃度は、運転緩衝液中で使用されるものよりも小さい。それゆえ、試料前処理は、典型的には約０．０５％〜２％、好ましくは約０．０５％〜約１％、より好ましくは約０．５％未満の洗浄剤濃度の存在下で実行される。充填された試料中で希釈、例えば約１：２〜約１：２０に希釈された場合は、約０．００２５％〜約１％、好ましくは約０．００２５％〜約０．５％、より好ましくは約０．５％未満の充填された試料における洗浄剤レベルを生じる。
このレベルは、試料が分離緩衝液の濃度の５〜２０倍も大きくなり得る洗浄剤濃度で前処理される慣用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離とは対照的である。特に典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に関する試料前処理は、運転緩衝液は０．１％の洗浄剤しか含まないが、５０ｍＭ緩衝液中で２％又はそれ以上（例えばＵ．Ｓ．特許第５，６１６，５０２号参照）の洗浄剤、例えばＳＤＳ濃度を有する充填緩衝液中で通常実行される。しかしここで記載されるキャピラリシステムが使用された場合、運転緩衝液と比較して充填緩衝液において比較的高い洗浄剤レベルを使用することは、所望の範囲の分子量を有するポリペプチドとともに溶出する傾向のある干渉する洗浄剤フロント（ｆｒｏｎｔ）を非常に多く生じさせる。例えば、図６は分子量標準物のセットのクロマトグラムを示す（以下の実施例のセクションを参照）。示された実施例において、洗浄剤フロントに関連したピークは約４３秒において溶出し、それはタンパク質の分析においては重要な分子量範囲である６０〜７０ｋＤの範囲における分子量を有するタンパク質又はポリペプチドについての溶出時間に相当する。
【００１５】
試料前処理段階における洗浄剤の濃度を減少させることにより、干渉したピークも減少する。これは従来当業界において抱かれていた試料の前処理には洗浄剤の高いレベル、例えば２％又はそれ以上が必要であるという信念を効果的な破棄することを証明した。さらに、イオン強度及び試料前処理の洗浄剤並びにここで述べたパラメータに関連した分離緩衝液濃度を調節することで、洗浄剤フロントの溶出の概略を１つから幾つかコントロールすることを許容し、例えば特性決定されるポリペプチドの前又は後の溶出の原因となる。
好ましい態様においても、前処理で使用される洗浄剤は分離緩衝液で使用される物と同じ洗浄剤、例えばＳＤＳである。通常は、前処理条件は、例えば分離されるタンパク質の性質、試料が配置される媒体、例えば緩衝液、及び塩濃度等、以下分離緩衝液について記載されたような、全体の分離の条件により変化することができる。特に、ＳＤＳ及び塩濃度は、例えば与えられた分離の最適化するようなここで記載されたパラメータ内で変化させることができる。
【００１６】
Ｂ．    分離緩衝液
本発明に関連して、分離緩衝液はここで記載した方法を実行するのに使用され、緩衝液はポリマーマトリックス、緩衝剤、洗浄剤及び親油性染料を含む。架橋及び／又はゲル化可能なポリマーを含む種々のポリマーマトリックスが、本発明に使用することができる。しかし、好ましい態様においては、非架橋ポリマー溶液がポリマーマトリックスとして使用される。ここで述べられた方法において好適に使用される非架橋ポリマー溶液は、キャピラリ電気泳動による核酸の分離における使用のために前に記載した、本発明において参考としてそれぞれ援用されているＵＳ特許５，２６４，１０１号、５，５５２，０２８号、５，５６７，２９２号及び５，９４８，２２７号を参照されたい。このような非架橋又は「線状」ポリマーは、架橋又はゲル化ポリマーにわたる使用の容易の有利さを提供する。特に、ゲル化ポリマーは典型的にはポリマーがキャピラリ内にある間に架橋反応が起こる必要があるにも係わらず、これらの液体性状のために、このようなポリマー溶液はキャピラリチャネル内により容易に導入され、使用する準備ができる。
【００１７】
一般的には、最も共通に利用されている非架橋ポリマー溶液はポリアクリルアミドポリマーを含み、好ましくは中性、正に帯電又は負に帯電したポリジメチルアクリルアミドポリマー溶液であることができる。特に好ましい態様において、負に帯電したポリジメチルアクリルアミドポリマー、例えばポリジメチルアクリルアミドポリマー−コ−アクリル酸（ＵＳ特許５，９４８，２２７参照）が使用される。驚くべきことに、ポリジメチルアクリルアミドポリマー溶液の使用は、キャピラリシステム内において分離されるタンパク質／ポリペプチドのいかなる汚れをも生じさせない。操作の特別な理論的な結びつきはないが、ポリマー溶液はここに記載されたシステム内において２つの機能を有すると信じられる。第一の機能はマトリックスの提供であり、より小さな種に対し、それを通って移動するより大きな種の移動性を遅らせる。ポリマー溶液の第二の機能は、キャピラリチャネル内での物質の電気浸透流を減じ又は除去することである。ポリマー溶液はこれをキャピラリ表面に対し吸収し、それにより電気浸透流を特性決定するシース（ｓｈｅａｔｈ）流を妨げると信じられる。
【００１８】
典型的には、非架橋ポリマーは、分離緩衝液中に約０．０１％と約３０％（ｗ／ｖ）との間の濃度において存在する。もちろん、実行される分離の型、例えば特性決定されるポリペプチドの性質及び／又はサイズ、分離が行われるキャピラリチャネルのサイズ等により、異なるポリマー濃度が使用できる。好ましい態様においては、ほとんどのポリペプチドの分離について、ポリマーは、分離緩衝液中に約０．０１％〜約２０％、より好ましくは約０．０１％〜約１０％にて存在する。
ポリマー溶液中のポリマーの平均分子量は、ポリマー溶液が所望される適用に幾分か依存して変化させることができる。例えば、高度の分解を必要とする適用は、高分子量ポリマー溶液を利用でき、より厳しくない適用では低分子量ポリマー溶液を利用できる。典型的には、本発明に関するポリマー溶液は、約１ｋＤ〜約６，０００ｋＤ、好ましくは約１ｋＤ〜約１０００ｋＤ、そしてより好ましくは約１００ｋＤ〜約１０００ｋＤの範囲の平均分子量を有する。
【００１９】
上記投入割合及び分子量に加えて、本発明で使用されるポリマーは、それらの粘度によっても特性決定される。特に、ここで記載されるシステムのポリマー成分は、典型的にはキャピラリチャネル内で使用されるように約２〜約１０００センチポイズ、好ましくは約２〜約２００センチポイズ、より好ましくは約５〜約１００センチポイズの範囲の溶液粘度を有する。
非架橋ポリマー溶液の導入に加えて、本発明の実行に使用される分離緩衝液も、緩衝剤、洗浄剤及び親油性染料を含む。
前述のように、ポリペプチドは典型的にはそれらの物理化学的特性、特に重量比に対する供給量において、アミノ酸組成に依存して大きく変化する。このように、異なるポリペプチドは、適用される電場において通常は異なる電気泳動移動性を有する。このように、タンパク質及び他のポリペプチドの電気泳動分離は、全てのタンパク質／ポリペプチドが電場下で同じ方向に移動が保証されるため、運転緩衝液中の洗浄剤を典型的に利用する。例えば典型的なタンパク質分離、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、洗浄剤（ナトリウムドデシルサルフェート又はＳＤＳ）は試料緩衝液中に含まれる。試料中のタンパク質／ポリペプチドは、実質的な負の帯電を伴う種々のタンパク質／ポリペプチドを提供する洗浄剤により覆われる。負に帯電したタンパク質／ポリペプチドは、それから電流下でカソードに向かって移動する。しかしシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）マトリックスの存在下で、より大きなタンパク質は、より小さいタンパク質より遅く動き、それによりそれらの分離が許容される。
【００２０】
本発明の一定の態様においては、分離緩衝液の洗浄剤、緩衝剤及び染料成分のそれぞれが選択され、そしてそれらの間のあらゆる逆に作用する相互作用を最小化するように提供される、ここで相互作用は、例えば分離効率、信号感度の低下、異常信号の生成等のように、タンパク質又はポリペプチドの分離及び特性決定を妨げ得る。特に、緩衝剤と洗浄剤とは典型的に、ポリペプチドの分離効率を最適化し、しかしバックグラウンド信号及びベースライン信号の不規則性を最小化するような濃度で提供される。前に示したとおり、洗浄剤ミセルと結合する染料は、例えば上昇や下降のような種々のベースラインの不規則性を増加させるとともに、キャピラリ分離中に実質的なレベルのバックグラウンド信号を生成する。
従って、第一の態様において、ポリペプチドの分離及び／又は特性決定は、緩衝剤及び洗浄剤を、洗浄剤が緩衝溶液中で染料が結合し、過剰の独立したミセルを形成し始める濃度未満にて提供することにより、成し遂げられる。典型的には、ミセルが形成し始める濃度は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と呼ばれる。言い換えると、ＣＭＣは得られる得る最も高いモノマー洗浄剤濃度、そしてそれゆえ得られうる最も高い洗浄剤ポテンシャルである。Ｈｅｌｅｎｉｕｓ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５６（６３）：７３４−７４９（１９７９）。
【００２１】
洗浄剤溶液のＣＭＣは、アポラー（ａｐｏｌａｒ）部位（又は炭化水素末端）のサイズの増加とともに、そしてより小さい程度でサイズ及び極性基の極性の減少とともに減少する。上記Ｈｅｌｅｎｉｕｓ等。それゆえ洗浄剤溶液がＣＭＣより大か小かは洗浄剤の濃度のみでなく、ＣＭＣにおいて影響を有しうる他の成分、すなわち緩衝剤及び全溶液のイオン強度によっても測定される。従って、本発明の方法、システム及び装置において、分離緩衝液は、緩衝液がＣＭＣ又はそれ未満であるような洗浄剤濃度及び緩衝剤濃度で提供される。
緩衝液がＣＭＣ未満であるかどうかを測定するのには、多数の方法を使用することができる。例えばＲｕｉ等．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３：２５０−２５５（１９８６）には、蛍光Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン染料を使用して洗浄剤溶液のＣＭＣを測定することが記載されている。ここで記載される分離緩衝液の文脈において、洗浄剤は、典型的には、分離緩衝液に関するＣＭＣ又はそれ未満の濃度にて提供される。特に好適な態様において、洗浄剤濃度は緩衝液についてＣＭＣか、それより少し低い。洗浄剤の最適濃度の測定は、実験的に測定される。特にここに記載される親油性染料を使用して、溶液の蛍光を測定することにより、洗浄剤濃度の関数として、洗浄剤溶液の相対ミセル濃度を測定することができる。例えば、図３は、１０μＭの蛍光性親油性染料（Ｓｙｔｏ６１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ）を含むＳＤＳ溶液の蛍光強度のプロットをＳＤＳ濃度の関数として表す。臨界ミセル濃度は蛍光強度におけるスティープ増加により示され、Ａ点として示される。それゆえ本発明に関連して、洗浄剤の濃度はＣＭＣかそれ未満であることが示されるが、洗浄剤の濃度は、示されるようなプロットのスティープ上又は未満にそれぞれに落ちる濃度であり、そして特にＢ点として示された曲線上の点未満、そして好ましくはＡ点でマークされた領域内かそれ未満である。
【００２２】
示されたように、洗浄剤のＣＭＣはある洗浄剤から他のものまで変化する、そして洗浄剤が配置された緩衝液のイオン強度とともにまた変化する。典型的な分離操作及び緩衝液において、緩衝液がＣＭＣ又はそれ未満に維持される場合は、緩衝剤は典型的には約１０ｍＭ〜約５００ｍＭで提供されるが、分離緩衝液中の洗浄剤濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）より大きく、しかし約０．５％未満で提供される。
分離緩衝液中に導入される洗浄剤は、電気泳動分離における使用について記載された任意の多数の洗浄剤から選択される。典型的にはアニオン性洗浄剤が使用される。一般的には、ナトリウムオクタデシルサルフェート、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）及びナトリウムデシルサルフェートのようなアルキルサルフェート及びアルキルスルホネート洗浄剤が好ましい。特に好ましい態様においては、洗浄剤はＳＤＳを含む。ＳＤＳの具体例においては、洗浄剤濃度は一般的には上記濃度に維持される。好ましい態様においては、分離緩衝液中のＳＤＳ濃度はそれゆえ典型的には０．０１％より大きく、試料中で適切なタンパク質の被覆を保証する、しかし過剰ミセル形成を妨げるため約０．５％未満である。好ましい態様において、洗浄剤濃度は約０．０２％と約０．１５％との間の濃度であり、好ましくは約０．０３％と０．１％の間である。
【００２３】
好適な洗浄剤濃度を利用する緩衝液中において、緩衝剤は任意の多数の異なる緩衝剤から典型的に選択される。例えば、トリス、トリス−グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ、ＭＥＳ、トリシン、それらの組み合わせ等のような、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの適用に関連して一般的に使用される緩衝液も、本発明に特に有用である。しかし特に好適な態様において、緩衝剤は非常に低いイオン強度を有するものを選択する。このような緩衝液の使用は、ＣＭＣを超過することなしに洗浄剤の濃度を増加させることを許容する。この型の好適な緩衝液は、ヒスチジンやトリシンのようなアミノ酸のような両性イオン性緩衝液を含み、適切なｐＨにおいて比較的高い緩衝能力を有するが、それらの両性イオン性のために非常に低いイオン強度を有する。システム内で比較的低い移動性を有する比較的大きなイオンを含む緩衝剤も、例えばカウンターイオン（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｉｏｎ）の様なトリスを使用して、ベースラインを平滑にする明確な能力のために好ましい。
上記濃度における、例えばＳＤＳ、ナトリウムオクタデシルサルフェート、ナトリウムデシルサルフェート等の好ましい洗浄剤溶液の場合、緩衝剤は典型的には約１０ｍＭと約２００ｍＭとの間の範囲の濃度、好ましくは約１０ｍＭと約１００ｍＭとの間の範囲の濃度において提供される。特に好ましい態様においては、トリス−トリシンが約２０ｍＭと約１００ｍＭとの間の範囲の濃度において、緩衝剤として使用される。
【００２４】
前の議論に関連して、最も好ましい分離緩衝液は約０．０３％〜約０．１％の間の範囲の濃度でＳＤＳを含み、約２０ｍＭと約１００ｍＭとの間の範囲の濃度で緩衝剤としてトリス−トリシンを含み、全てのシステム／方法の通常の操作条件において操作される場合、それぞれが緩衝液がＣＭＣ又はそれ未満になるように提供される。
前述の成分に加え、分離緩衝液は典型的には結合性染料又は他の検出可能なラベリング基をも含み、それは特性決定／分離されるタンパク質及びポリペプチドと結合する。これは分離緩衝液を通って移動するタンパク質及び／又はポリペプチドの検出を可能にする。ここで使用されるように「結合性染料」とは、検出可能なラベリング化合物又は部位を意味し、興味深い分子クラス、例えばタンパク質又はポリペプチドと結合し、与えられた混合物中の他の分子について優先的に結合する。タンパク質又はポリペプチドの特性決定の場合、親油性染料がタンパク質又はポリペプチド結合性として特に有用である。
【００２５】
本発明において使用される特に好ましい親油性染料の例としては、蛍光染料、例えば本明細書で参考文献として導入するＵ．Ｓ．特許第５，６１６，５０２号において記載されたようなメロシアニン染料が含まれる。特に好ましい染料としては、Ｓｙｐｒｏ  ＲｅｄTM、Ｓｙｐｒｏ  ＯｒａｎｇｅTM及びＳｙｔｏ  ６１TM染料のようなＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）から一般的に市販入手できるものが含まれる。このような染料は、通常、着色スラブゲル中で使用することを意図しているので、過剰な染料を洗浄除去でき、そして例えば洗浄を通じてゲル中のＳＤＳの任意の逆の効果を取り除くことができる。しかし驚くべきことに、本発明者により、ここで記載されたように緩衝液が形成された場合、これらの染料はＳＤＳキャピラリゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）中で特に有用であり、驚くべき反応性を与え、そしてほとんど又は全く「塗布」若しくは洗浄剤の妨害を伴わないことを見い出した。
【００２６】
さらに、そして染料の分離緩衝液との適応性よりも予想外であることは、キャピラリチャネル中の分離緩衝液中に親油性染料を導入することは、分析感度を減少させるような過剰のバックグラウンド信号を生成しない。特に、分離緩衝液中に染料を提供することにより、緩衝液中の染料から比較的高いバックグラウンド信号を観察することが予想できる。従って、チャネル中の分離緩衝液中ではなく、試料溶液中の染料を含む事を必要とすることが予想できる。しかし、後者の技術は、結果として分離中に特に低い信号レベルを生じる。キャピラーチャネル中の分離緩衝液中に染料を含むことにより、バックグラウンドは驚くほど低いが信号は高く維持される。本発明で使用される親油性染料は、通常は約０．１μＭと１ｍＭとの間、より好ましくは約１μＭと約２０μＭとの間の濃度で、分離緩衝液中に存在する。
【００２７】
Ｃ．    後−分離処理
上記方法とは対照的に、ここで試料は前処理され、そして利用される染料システムについて最適化する緩衝剤及び洗浄剤濃度下で、例えば特定の洗浄剤のＣＭＣ未満を維持して分離され、一定の態様においては、試料成分が存在する緩衝液／洗浄剤条件は、これら成分の分離後及びこれら成分の検出の最中又は直前に変えられ、その上、洗浄剤ミセルの逆の効果は減じられ又は除去される。とりわけ、試料成分、例えばポリペプチドは、最適化された分離緩衝液及び洗浄剤条件又はＣＭＣ若しくはそれ未満であることができる濃度下で分離される。試料成分が一度分離されると、これらの条件は、検出点における緩衝液及び／又は洗浄剤濃度が検出段階について最適化されるように、例えばこれらのレベルをＣＭＣ未満のレベルに減じるように、変化させる。特に、しばしば、一度洗浄剤レベル及び／又は緩衝液濃度がＣＭＣ未満に調節されると、ミセルが分散され、そしてミセルに結合する染料の逆の効果は減じられ又は除去される。
典型的には、ポリペプチドの分離の場合は、それらをセンサに通す前に、１種又はそれ以上の希釈剤を分離された成分中に、試料含有分離緩衝液がＣＭＣ又はＣＭＣ未満になるように加えることにより、環境を変化させる。これは洗浄剤と緩衝剤の比を変化させることにより行われ、ＣＭＣを洗浄剤の操作濃度又はそれ以上に上げ、及び／又はＣＭＣ未満に落とすように洗浄剤のレベルを希釈する。それゆえ、希釈剤を加え、典型的には洗浄剤のレベルを減じるが緩衝剤の濃度を維持し又は減じることができ、又は緩衝剤の濃度を減じるが洗浄剤濃度を維持することができる。
いずれの例においても、所望の目的は検出のポイント及び時間において洗浄剤ミセルを除去することである。類似の態様において、効果的に洗浄剤ミセルを破壊する物質、例えば共洗浄剤を加えることができる。
【００２８】
後分離処理が使用される場所において、分離緩衝液組成物は緩衝液と洗浄剤濃度のより広い範囲に及ぶ。例えば、分離緩衝液は、典型的には緩衝剤を、例えば上述のように約１０〜約２００ｍＭの濃度で含み、約０．０１〜約１．０％及びＣＭＣ以上の、例えば約０．０５％以上及び好ましくは約０．１％以上で、洗浄剤濃度を含む。他方、親油性染料の検出は、染料と結合し過剰のバックグラウンド信号に寄与する過剰の洗浄剤ミセルの不存在下で行われることが好ましい。それゆえ、分離緩衝液の希釈は、洗浄剤のＣＭＣ未満のレベルに、例えば約０．１％未満に洗浄剤濃度を減じる事を典型的に実行する。従って、希釈段階は、好ましくは検出前に分離緩衝液を約１：２〜約１：３０に減少させる。これは検出される試料成分をも希釈するが、希釈の結果、バックグラウンドが実質的に現象するので、試料物質の非常に低いレベルにおける容易な検出を可能にする。
本発明のこの態様に関しては、この方法を実行するのにミクロ流動装置が特に適している。特に、統合された流体チャネルネットワークを含むことで、物質流体流中に希釈剤及び他の洗浄剤を加えることができるようになる。特に、希釈チャネルは、分離試料成分を伴い検出領域内に希釈剤を運ぶために検出領域のすぐ上流に提供される。試料成分は洗浄剤ミセルの妨げなしに、それから検出される。後分離装置を達成するためのミクロ流動装置に関する特に好適なチャネルレイアウトの例を図７に示す、そして以下により詳細に示す。ここで使用されるように、「上流」及び「下流」とは、興味深い物質例えば、流体、試料成分の流動方向を考慮した際の、記載されたシステムの通常操作間における、記載された装置の相対的な位置を示す。典型的には、この上流という語は特定のチャネルと接続する試料又は緩衝液リザーバに向かう方向を言い、下流とは特定のチャネルと接続する廃液リザーバに向かう方向を言う。
【００２９】
Ｄ．    キャピラリチャネル及び装置
１．通常
本発明は、上記タンパク質特性決定方法の実行に使用する装置及びシステムも提供する。本発明の装置は、内部に分離緩衝液が配置される分離領域を含む支持基質を典型的に含む。分離／特性決定される試料は、分離領域の端に置かれ、そして分離領域を横切って電場がかけられ、試料内のタンパク質／ポリペプチドの電気泳動分離を引き起こす。分離されたタンパク質／ポリペプチドは、隣接配置され及び検出的に分離領域と結合する検出システムにより、それから別々に検出される。
【００３０】
２．慣用のキャピラリシステム
少なくとも第一の態様において、本発明の方法は慣用のキャピラリベースの分離システムに適用できる。従って、これらの態様において、支持基質は典型的にキャピラリチューブ、例えば溶融シリカ、ガラス又はポリマーのキャピラリチューブを含み、それを通して配置されるキャピラリチャネルを含む。チューブ内のキャピラリチャネルの少なくとも一部は、キャピラリの分離領域を含む。分離緩衝液は、圧力ポンピング、キャピラリ作用等によりキャピラリチャネル内に配置され、そして分離／特性決定される試料は、キャピラリチャネルの一端に注入される。それから流体内に配置されたキャピラリチューブの一端は、（リザーバと接触するカソードを有する）カソードリザーバと一端でと接続し、及び他端において（リザーバと接触するアノードを有する）アノードリザーバと接続し、そしてキャピラリチューブを通して電場がかけられ、キャピラリチューブ及び含まれる分離緩衝液を通して試料物質を電気泳動させる。分離緩衝液を通したタンパク質及びポリペプチドの移動は、検出システムによりキャピラリチャネルのカソード端に向かって検出される親油性染料と結合する。
例えば上述のような後分離処理段階において、追加の流路及びキャピラリを主分離キャピラリに接触させることにより、追加の緩衝液を典型的に試料成分の後分離の流路内に導入し、分離キャピラリ内に存在する分離成分は追加の緩衝液又は希釈剤が混合される。検出チャンバ又はキャピラリもこの分岐に接続され、全ての物質が、検出される検出領域内に流れる。
【００３１】
３．ミクロ流動装置
特に好ましい態様において、本発明の方法は、単一に統合された固体支持体内に配置されたミクロ寸法のキャピラリチャネルのネットワークを提供するミクロ流動装置内で実行される。特に支持体基質は、内部に配置された１又はそれ以上のミクロ寸法のチャネルのネットワークを含み、それらのうち少なくとも１つは分離チャネルである統合されたボディ構造を典型的に含む。分離緩衝液は、少なくとも分離チャネル内に配置される。好ましい態様において、ミクロ流動チャネルネットワークは、少なくとも第一試料注入チャネルにより交差する少なくとも第一分離チャネルを含む。これら２つのチャネルの交差は、「インジェクションクロス」と呼ばれる。操作において、試料物質は注入チャネルを通して、かつ分離チャネルと交差して注入される。交差内の物質の一部は、分離緩衝液を通って分離された分離チャネル内に注入される。検出器は分離チャネルと隣接して配置され、分離されたタンパク質を検出する。
【００３２】
特に好適な態様において、本発明において使用されるミクロ流動装置は、順番に分離チャネルと流体的に接続する試料注入チャネルと流体的に接続する複数の試料ウェルを含む。これは、単一に統合されたミクロ流動装置内で、複数の異なる資料を分析することを許容する。本発明において使用される複数の好適なミクロ流動装置の例は、本明細書において全ての問題について完全に引用される、一般的に所有される、１９９８年１０月２日に出願のＵ．Ｓ．特許出願第０９／１６５，７０４に示されかつ記載される。このようなミクロ流動装置の例としては、図１に表されている。示されているように、装置１００は平面ボディ構造１０２を含み、内部に配置された複数の内部接続チャネル、例えばチャネル１０４−１３８を含む。多数のリザーバ１４０−１７０もボディ構造２０２内に配置され、そして様々なチャネル１０４−１３８と流体的に接続している。分析すべき試料及び緩衝液は、装置のチャネル内に誘導されるためにこれらのリザーバ内に配置される。
【００３３】
操作において、分離／特性決定に使用される分離緩衝液は、始めにリザーバ、例えばリザーバ１６６内に配置され、そして装置の全てのチャネル内に運ばれ、それによってこれらのチャネルが分離緩衝液により満たされる。分離／特性決定される試料は、リザーバ１４０−１６２内に別々に配置される。それから分離緩衝液はリザーバ１６４、１６８及び１７０内に配置され、そして既に１６６内に存在する。適切な電流の適用を通して、第一の試料物質はリザーバ、例えばリザーバ１４０から、チャネル１０４について、チャネル１２０及び１１６を介し、主注入交差１７２を通して移動又は電気泳動される。これはリザーバ１４０及び１６８間に流れ（ｃｕｒｒｅｎｔ）を適用することにより達成される。低レベルピンチング流は、交差における試料物質の拡散を防ぐため、例えば、リザーバ１６６及び１７０からリザーバ１６８に向かって低いレベルの流れを提供することにより（ＷＯ９６／０４５４７参照）交差において典型的に適用される。短時間後、流体は、交差内の物質が主分析チャネル１０４の下に電気泳動されるように、例えばリザーバ１７０と１６６の間に流体を適用することにより切り換えられる。典型的には、注入後わずかな流体が適用され、チャネル１１６及び１３４間の物質を交差の背後に押し、分離チャネル内の漏れを妨げる。第一のサンプルが主チャネル１０４の下に電気泳動されるが、次の分析される試料は、リザーバ、例えばリザーバ１４２から前充填交差１７４を通って前充填リザーバ１６４に向かって、試料物質を電気泳動する事により、前もって充填される。これは非常に短い時間のみを許容し、試料物質を前装填部分から注入交差１７２へ移動させる。第一の試料分析が完了すると、第２の試料物質が注入交差１７２を横切って電気泳動され、そして前のように主分析チャネルの下に注入される。このプロセスは、装置内に充填される試料ごとに繰り返される。
【００３４】
検出領域１７６は、チャネルから信号を検出できる点を提供するために、典型的には主分析チャネル１０４とともに提供される。典型的には、本明細書に記載される装置は透明な材料から製作される。このように、光学的な分析のための検出窓は、分析チャネル１０４の長さに沿った任意の点に実質的に設置される。分離された試料が検出窓を通過するごとに、ポリペプチドフラグメントに結合した親油性染料が検出される。分離チャネルを通って移動させるために、各ポリペプチドフラグメントに必要とされる時間の量は、例えば分子量の測定と同じく、それから特定のポリペプチドの特性決定を許容する。特に、非公知のポリペプチドの保持時間は、公知の分子量標準物の保持時間と比較され、それにより非公知のおおよその分子量が測定、例えば標準物質から内挿又は外挿される。
【００３５】
前術のとおり、ここで記載された前分離処理はミクロ流動チャネルシステムの使用により、特に有利になる。特に主分離チャネルに対する希釈剤のソースのカップリングは、好適な方向にて、例えば分離が起こった後であるが検出領域及び窓の前の点にて、そのチャネルと接続するチャネルを供給する単純なことである。これを達成するためのミクロ流動チャネルネットワークの例を図７に示す。示されたように、ミクロ流動装置７００は、内部に配置されたチャネルネットワークを含むボディ７０２を含む。典型的には、図７に示された装置は、図１について上述したものと同じ様式にて製作される。チャネルネットワークは、複数の異なる試料物質リザーバ７０６−７２２と７２８と、試料チャネル７０６ａ−７２２ａ及び７２８ａそれぞれとを介し、流体的に接続する主チャネル７０４を有する。前充填／廃液リザーバチャネル／リザーバ７２４／７２４ａ及び７２６／７２６ａも示す。主チャネル７０４は緩衝液リザーバ７３６及び廃液リザーバ７３２と接続し、そして検出領域７３８を含む。示されたように、２つの希釈剤チャネル７３０ａ及び７３４ａが主チャネルと接続して、主チャネル７０４の逆側に、検出領域のすぐ上流（物質の操作上の流れの方向）、しかしチャネルの機能、例えば分離が起こる主チャネル７０４の主要部の下流の点に提供される。希釈剤チャネル７３０ａ及び７３４ａも希釈剤ソース、例えばリザーバ７３０及び７３４と、それぞれ、希釈剤をこれらのソースから主チャネル７０４へ運ぶことができるように、希釈剤ソースと接続する。
【００３６】
ポリペプチドの分離における操作において、例えばポリペプチド混合物を含む試料の特性決定を所望の場合は、装置７００のチャネルを分離緩衝液で満たす。前分離処理の場合は、この緩衝液は上記定義された構造に固執する必要ない、なぜなら過剰ミセルの形成に関する懸念は大きく欠如しているからである。典型的には、これらの場合、洗浄剤の濃度は前処理法と同程度に重要ではない。特に、分離緩衝液はより高い洗浄剤濃度、例えば約０．１％〜約２．０％を有することができる。典型的には、洗浄剤濃度は０．１％を超過する。チャネルネットワークを満たすことは、典型的には分離緩衝液を１つのウェル、例えば廃液リザーバ７３２内に配置することにより実行される。それから分離緩衝液は、チャネルネットワークを通って、それが他のリザーバ７０６−７３０及び７３４−７３６のそれぞれへ着くまで運ぶ。随意にわずかな圧力が廃液リザーバ７３２にかけられ、チャネルネットワークを満たすことを促進する。追加の量の緩衝液、例えば分離緩衝液は、緩衝液リザーバ７３６及び充填／廃液リザーバ７２４及び７２６内に配置される。希釈剤物質は希釈剤リザーバ７３０及び７３４内に配置される。
【００３７】
試料物質は１又はそれ以上の試料リザーバ７０６−７２２及び７２８内に配置される。随意に、多数の異なる試料物質を異なるリザーバ内に配置してもよい。該装置はそれからコントローラ／センサ装置、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製ａ２１００バイオアナライザー内に配置され、それは装置のチャネルを通る試料の移動を、すべての目的について本明細書において完全に参考文献として導入されているＵ．Ｓ．特許第５，９７６，３３６に記載されたように、動電学的方法をコントロールすることにより指示する。例えばリザーバ７０６内に配置された試料は、試料チャネル７０６ａに沿って、チャネル７０４を横切るまで移動し、チャネル７２６ａを介し充填廃液リザーバ７２６に向かって流れる。試料充填チャネル７０６ａと主チャネル７０４との交差における試料物質の一部は、分離チャネル７０４内に注入され、それを通って移動する。適用された電場の元では、分離緩衝液を通り移動する試料の一部は、チャネル７０４に沿って移動するような構成成分に分離する。それが移動するごとに、試料成分、及びある場合において洗浄剤ミセルは、分離緩衝液中に存在する親油性染料を受け取る。洗浄剤を低い濃度で含むか又は全く含まない希釈剤緩衝剤は、チャネル７３０ａ及び７３４ａを介しチャネル７０４へ連続様式で導入される。この希釈剤は、分離緩衝液を洗浄剤についてＣＭＣ未満の点まで希釈し、結果として過剰の洗浄剤ミセルが除去される。親油性染料を運ぶ希釈試料成分は、それから検出窓７３８にて検出される。いくつかの場合、流体希釈はサイドチャネルを通って実際の流体の導入を通じて達成される。しかし、好ましい態様において、サイドチャネル７３０ａ及び７３４ａは典型的にチャネルネットワークを通して存在する同じ分離マトリックスを含む。このように、希釈は分離チャネル内に電気泳動的に導入される緩衝溶液からイオン種を電気泳動的に導入することにより実行され、分離チャネル内の種を効率的に希釈する。代替の態様において、サイドチャネル７３０ａ及び７３４ａには何らマトリックスは提供されず、例えばそれらはベースとされる圧力又は電気浸透流を支持し、そしてバルク流は主チャネル７０４内に導入され、分離された試料成分を希釈する。示されたように、希釈剤がチャネルに加えられる速度が選択され、検出ポイントにおけるチャネル内の洗浄剤濃度を、特定の条件下の洗浄剤について約ＣＭＣ未満のレベルにまで減じる。典型的には、これは洗浄剤の約１：２から１：３０希釈を含む。それゆえ分離緩衝液が例えば３０ｍＭのトリストリシン緩衝液中に２％のＳＤＳを含む場合は、洗浄剤のレベルを約０．１％未満、及び好ましくは約０．０５％ＳＤＳ未満に希釈することが、通常は好ましい。それゆえ希釈は約２〜３倍から約４倍である。もちろん前述のように、特定の洗浄剤のＣＭＣは緩衝液の性質及び濃度に依存して変化することができる。
【００３８】
前に、ポリペプチド分離緩衝液を、緩衝液中の洗浄剤のＣＭＣ未満である点に希釈することについて記載したが、ここで記載されている後分離処理方法は、より広く適用されると認められる。特にこのような方法は、その後の一連の分析方法段階における操作が、すぐ後の段階又は操作と異なる環境を必要とする種々の分析操作において使用することができ、その環境はその後の操作について、試薬、緩衝液又は希釈剤を加えることにより十分に変化させることができる。上記方法は、最適化された検出環境と最適に適合することができないポリペプチドの分離について、環境を最適化した例を表している。それゆえ、本発明の態様の最も広い理解において、「希釈剤」という用語は加えられる要素、例えば流体、緩衝剤等を意味し、それが導入される環境を変化させる。この意味において環境の変化は、環境の物理的特性の変化、例えば洗浄剤ミセルの存在、溶液粘度の減少を含む、しかし化学環境の変化、例えば溶液のｐＨの変化を生じる緩衝液の滴下、例えばｐＨ感受性染料又は他のラベリング種について操作できる環境を生じさせ、溶液の塩濃度を変化させて疎水性／親水性における変化に影響を与え、又は溶液内のイオン相互作用に影響与えることをも含む。
同様に、初期操作後にラベリング種を加えることができ、このようなラベリング種は前の操作に影響を与える。このようなラベリングの一例としては、例えば特定のタンパク質にラベルされた抗体を加えることを含み、それによってシステムにチップベース（ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ）のウエスタン吸い取りシステム（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）としての機能を許容する。特に、タンパク質分離の後に、ラベルされた抗体が検出直前の分離されたタンパク質に加えられ、優先的に認識されたエピトープを運ぶタンパク質と結合する。それから、タンパク質は、そのサイズの効力と選択された抗体により認識される能力により検出される。
【００３９】
Ｄ．  全体のシステム
本発明の装置と洗浄剤は、ミクロ流動装置内で実行される操作と分析をコントロール及びモニタする全体の分析システムとここで記載される試薬の利用とを結合させて典型的に使用される。特に全体のシステムは、典型的にはミクロ流動装置及びキャピラリシステムに加え、ミクロ流動装置又はキャピラリ要素と操作可能に連結する電気コントローラ、及び分離領域又は装置のチャネルの検出的な結合中に配置されたセンサを含む。
本発明のシステムの例を図２に示す。示されたとおり、システム２００はミクロ流動装置１００を含み、内部部分に配置されたチャネルネットワークを有し、チャネルネットワークは複数のリザーバ又は試料／洗浄剤ウェルと接続する。電気コントローラ２０２は、ミクロ流動装置１００のリザーバ中の流体と接触して配置される複数の電極２０４〜２３４を介して、操作可能にミクロ流動装置と連結する。電気コントローラ２０２は、装置の分離チャネルの長さを横切って適当な電場をかけ、試料物質の適当な電気泳動を運転する、そして結果として本発明のタンパク質とポリペプチドの分離を生ずる。例えば示したような交差するチャネルネットワークを含むミクロ流動装置の場合、電気コントローラも電流を適用し、異なるチャネルを通して異なる物質を移動させ、そしてこれらの物質を他のチャネル内に注入する。物質の移動をコントロールする装置のチャネルを通して、選択できる流れレベルを提供する電気コントローラは、本発明で使用するには特に好ましい。このような「流れコントローラ」の例は、参考文献として導入されているＵ．Ｓ．特許第５，８００，６９０号に詳細に記載されている。
【００４０】
全体システム２００は、ミクロ流動装置１００内のチャネルネットワークの分離チャネル部分と検出的に接続して配置されるセンサ２０４をも含む。ここで使用されるように、「検出的に接続する」という句は、ミクロ流動装置内のチャネルからの特定の信号を受け取るために位置する検出器を意味する。例えば、光学信号、例えば発色、蛍光又は化学発光信号を生成する操作を行うのに使用されるミクロ流動装置の場合、ミクロ流動装置の適当な位置からこれら光学的信号を、検出器内の光学要素が受け取るように、これらの検出器は装置の半透明部分に隣接して位置する。他方、電気化学的センサは、検出的な接続のために、典型的には、例えば生成され、さもなければチャネル内に存在する電気化学的信号を検出できるように、装置の適当なチャネル内に配置された電気化学センサ、例えば電極を含む。同様に、温度を感知するためのセンサは、温度又はその中の相対的変化を感知するように、装置のチャネルと温度的に接続される。好適な態様において、光学検出器が本発明において使用され、そしてより好ましくは、光学検出器が蛍光信号を検出するために形成される。このように、これらの検出器は分離チャネルから放射された蛍光の量を集め、伝達しそして量を図るために光学縦列及び光センサと同様に、典型的には分離チャネルにおける活性化光を導くための光源及び光学縦列を含む。活性化光及び蛍光放射を区別するエネルギーの２タイプの波長における差異に依存して、通常は、これらの双方を伝達するために、単一の光学縦列が使用される。通常は、本発明の光学検出器内に導入される光学センサは、光電子増倍管（ＰＭＴ）フォトダイオード等のような公知のものから選択される。特に好ましい態様においては、アジレント２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）がコントローラ／検出器システムとして使用される。
【００４１】
ここで記載されるシステムは、ユーザ指示又は予めプログラムされた操作パラメータに関する電気コントローラの操作を指示するために、電気コントローラと操作可能に連結するプロセッサ又はコンピュータ２０６を含む。コンピュータも、センサがミクロ流動装置から受け取ったデータを受け取り、そして分析するために、検出器と典型的には操作可能に接続される。従って、コンピュータは典型的には電気コントローラの操作を指示するための適切なプログラムを含み、分離チャネル内の可能性のある複数の試料のそれぞれを注入する電場をかける。典型的には、コンピュータは典型的には検出器からデータを受け取り、検出器から受け取ったデータを保存するために、検出器とも操作可能に接続する。プロセッサ又はコンピュータ２０６は任意の種々の異なる型のプロセッサであることができる。典型的にはコンピュータ／プロセッサはＩＢＭ  ＰＣ又はＰＣ互換性コンピュータであり、例えばＩｎｔｅｌ又はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ製の例えばＰｅｎｔｉｕｍTM、Ｋ６TM又はＭａｃＩｎｔｏｓｈTM、ＩｍａｃTM又は互換性コンピュータが導入される。
【００４２】
本発明のポリペプチド特性決定法の場合は、典型的には、コンピュータ又はプロセッサは検出器からの信号データを受け取り、そして検出器を通過する分離されたタンパク質に相当する信号ピークを同定することをプログラムされている。典型的には、１種又はそれ以上の内部標準タンパク質は、試料物質とともに移動することができる。このような場合において、コンピュータは典型的には標準物質を、例えば全体の分離におけるその位置、初めか終わりかにより同定することし、そして試料中の未知のポリペプチドの分子量を、標準物質の外挿又は内挿により測定することをプログラムされている。本発明において使用される特に有用なコンピュータソフトウェアプログラムは、本明細書において参考文献として導入される、１９９７年１２月３０日に出願された仮特許出願第Ｎｏ．６０／０６８，９８０号において、分離方法の使用について記載される。アジレント２１００バイオアナライザにより行われるこれらの具体例の場合は、コンピュータは、典型的にはこれらの核酸分析用システムの動作に使用される提供されたものに類似するソフトウェアプログラムを含む。
【００４３】
Ｅ．  道具
本発明は記載された方法の実行において、使用するための道具も提供する。通常はそのような道具は、ここで記載されたようなキャピラリ又はミクロ流動装置を含む。この道具は、典型的には分離緩衝液の種々の成分、例えば非架橋ポリマー封止マトリックス、洗浄剤、緩衝剤及び親油性染料をも含む。これらの成分は、前もって形成された分離緩衝液成分の分離された体積として、この道具内に存在し、これらは前もって測定されてもされなくてもよく、又は全ての洗浄剤の単一の組み合わせに匹敵しそしてそれを含む前もって形成した試薬を組み合わせた体積として提供されてもよく、それによりユーザは、ミクロ流動装置内に直接分離緩衝液を配置することができる。緩衝液成分に加え、本発明の道具も、分子量標準物質のような他の有用な緩衝液を、例えば緩衝液、試料、又は他の洗浄剤をミクロ流動装置のチャネル内に導入することを意図する装置及びシステムを用いて使用するためのツールと同様に、随意に含むことができる。
道具の形態、洗浄剤、装置及びそれらの使用を詳説する指示は、典型的には単一のパッケージングユニット、例えば箱又はポーチにて提供され、一緒に売られる。道具として試薬及び装置の供給は、試薬がより便利な体積で提供される高価なシステムを除いて、すぐに使用できる状態でユーザに提供される、そして全てが所望の適用、例えば高分子量対低分子量タンパク質の分離について最適に形成される。
【００４４】
【実施例】
本発明を、本発明の範囲を限定することなく、本発明の一定の態様を証明する以下の実施例を参照して、さらに例証する。
全ての実施例は単一分離チャネルを有する１２の試料ミクロ流動装置内で行い、そしてチャネルの幾何構造を図１に示す。コントロール及び検出は単一分離チャネルに沿って位置する単一点レーザー蛍光検知器を有するマルチチャネル、１２電極電気コントローラ／検知器を使用した。
【００４５】
実施例１：準ＣＭＣ分離緩衝液を使用したポリペプチドの分離
分離チャネルから受け取った蛍光データをコンピュータ（Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ■マイクロプロセッサを使用するＰＣ）により記録した。データはＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐの適切なソフトウェアにより生ずるエミュレートゲル形式同様、蛍光対時間の両方の線状プロットにおいて表示した。
脱イオン水中にトリシンを０．５Ｍ濃度に溶解させることにより、０．５Ｍトリス−トリシン緩衝液を調製し、そして１Ｍトリシンを使用してｐＨを７．５に調節した。得られた緩衝液を０．２２μｍシリンジフィルターを通して濾過した。封止又は分離緩衝液は、０．９％（ｗ／ｖ）ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）を伴う１２．５ｍＭトリス−トリシン緩衝液中、３％のポリジメチルアクリルアミド−コアクリル酸、そして１０μＭのＳｙｔｏ６０染料（分子プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）で調製した。それから分離緩衝液を、Ｃｏａｓｔｅｒ  Ｓｐｉｎ−ＸTM０．２２μｍセルロースアセテート遠心機フィルターを通して濾過した。
【００４６】
試料は装置のリザーバ内に置かれる前に変性緩衝液中で前処理した。変性緩衝液は２５０ｍＭトリス−トリシン緩衝液中の、０．７５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び１％２−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）（ＢＭＥ）であった。試料は０．５ｍｌマイクロフュージ管内で変性緩衝液と１：１に（例えば２０μｌの試料と２０μｌの緩衝液）混合し、そして１００℃に１０分間加熱した。それから加熱した試料を遠心分離にかけ、そして渦を巻かせた（ｖｏｌｔｅｘｅｄ）。ミクロ流動装置のウェル内に試料を充填する前に、それらを脱イオン水を用いて１：１０で（例えば１μｌの試料／緩衝液と９μｌの水）希釈した。それゆえ調製された試料は０．０３７５％のＳＤＳの洗浄剤濃度を有する。
ミクロ流動装置を準備するために、７．５μｌの分離緩衝液を、清潔で乾燥した装置のウェル１６６内に移し、そしてシリンジを用いて加圧し、装置の全てのチャネル内の分離緩衝液に力をかけた。それから７．５μｌの分離緩衝液をウェル１６４、１６８及び１７０のそれぞれに移した。それからの０．５μｌの希釈された試料をウェル１４０−１６２のそれぞれの中に別々に移した。図４に示した例において、公知分子量の標準物質が使用された。標準物質はオバルブミン（４５ｋＤ）、ウシ炭酸脱水酵素（２９ｋＤ）、大豆トリプシン抑制剤（２１．５ｋＤ）及びα−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤ）を含む。
【００４７】
図１に関して、ウェル１４２及び１４６は緩衝液のみ含み、そしてブランクとして使用される。４つのタンパク質標準物質のそれぞれを１００μｇ／ｍｌ含む標準タンパク質溶液は、ウェル１５０及び１５４のそれぞれの中に配置し、５００μｇ／ｍｌの同じ４つのタンパク質の溶液はウェル１５８及び１６２に配置した。ちょうど１０００μｇ／ｍｌの炭酸脱水酵素を含む溶液を、ウェル１４０及び１４４に配置した。炭酸脱水酵素及びトリプシン抑制剤の両方を１００μｇ／ｍｌで含む溶液は、ウェル１４８及び１５２中に配置し、同じタンパク質を５００μｇ／ｍｌ含む溶液はウェル１５６及び１６０中に配置した。
それぞれの試料を、別々に主分離チャネル１０４に注入し、そして分離成分は、注入からの保持時間の関数として検出した。それぞれの実行（ｒｕｎ）についてのクロマトグラムは、標準のクマシー着色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをエミュレートすることを示す暗色バンドの形態で表示した。エミュレートされたゲルのそれぞれのレーンは、分離された試料についてのクロマトグラムを、バックグラウンド上の蛍光の増加を示す暗色バンドを用いて表した。特に、オバルブミン（４５ｋＤ）、ウシ炭酸脱水酵素（２９ｋＤ）、大豆トリプシン抑制剤（２１．５ｋＤ）及びα−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤ）の混合物を調製した。４つのタンパク質の混合の２つの異なる濃度が、１００μｇ／ｍｌ（レーンＡ２、ウェル１５４）及び５００μｇ／ｍｌ（レーンＡ３、ウェル１６２）において実行した。これら標準物質のそれぞれの分離した混合物もまた調製し、以下のように実行した。：
レーンＢ１（ウェル１４４）：炭酸脱水酵素（１ｍｇ／ｍｌ）
レーンＢ２（ウェル１５２）：トリプシン抑制剤及び炭酸脱水酵素（両方１００                            ｍｇ／ｍｌ）
レーンＢ３（ウェル１６０）：Ｂ２と同じ（両方５００ｍｇ／ｍｌ）
レーンＣ２（ウェル１４２）：Ａ２と同じ
レーンＣ３（ウェル１５０）：Ａ３と同じ
レーンＤ１−Ｄ３（ウェル１４０−１５６）：Ｂ１−Ｂ３と同じ
【００４８】
図５は、上記と同じ様式における、一組の標準的な実行についての移動時間に対する分子量の対数のプロットを示す。示されているように、分離方法は収率を正確に、例えば直線データで記載しており、それは示されたプロットに関して、一組の標準物質を用いて未知のタンパク質についての移動時間と関連させることにより、未知の分子量のタンパク質の特性決定することを許容する。図４及び５に示されるように、タンパク質及び他のポリペプチドの特性決定について、高度に再現でき、性格でかつ迅速な方法を提供した。
Ｃｙ−５染料マーカをも含む同じ標準物質の組も実行し、洗浄剤染料フロントの共溶出を示した。この実行からのクロマトグラムを図６に示す。認められるように、洗浄剤−染料のピーク（アステリスクを用いて示す）は、６５ｋＤの範囲の分子量を有するタンパク質と実質的に同じ時間に溶出する。試料の前処理緩衝液における洗浄剤濃度が先行技術に記載されたレベル、例えば２％であるこれらの例において、示されたピークは非常に大きく、そのピークはこの分子量範囲におけるタンパク質の同定及び定量の実質的な妨げとなる。
【００４９】
実施例２：後分離／前検出溶出を使用したポリペプチドの分離及び検出
図７に示したミクロ流動装置を、上記分離緩衝液で満した。分離チャネル７０４は、注入点から１．２ｃｍ下流で検出点７３２の０．１ｃｍ上流の点において、希釈チャネル７２０ａ及び７２２ａにより交差する。分離緩衝液は、３０ｍＭトリス−トリシン緩衝液中の４．２％の非架橋ポリジメチルアクリルアミド／コ−アクリル酸及び０．１３％のＳＤＳを含んだ。ポリマーとＳＤＳを使用しない３０ｍＭのトリス−トリシンを含む希釈緩衝液は、リザーバ７２０と７２２内に配置される。緩衝液は動電学的に、例えば電気泳動的に分離チャネル内に流れた。
ポリペプチド標準溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．製１０−２０５ｋＤタンパク質標準物）を試料リザーバ、例えばリザーバ７０６内に配置し、そして前に本明細書中で引用したＵ．Ｓ．特許５，９７６，３３６に記載されたものと同じ方法にて、充填及び分離チャネル内に注入した。
【００５０】
図８Ａ−８Ｄは、後分離処理なしでかつ後分離希釈を用いて行われる標準的な分離について、２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において検出点７３２で検出するごとの時間に対する蛍光のプロットを表す。特に、図８Ａ及びＢはブランク実行（試料中にポリペプチドを含まない）及び後分離希釈機能を持たないミクロ流動装置におけるタンパク質試料の実行を示す。この装置は、図１に示した装置チャネルレイアウトに、機能的に類似する。示されたように、ブランク及びポリペプチドの実行からのデータは、実質的にバックグラウンド及び大きな洗浄剤染料のフロント、後に続くベースラインの谷（ｄｉｖｏｔ）及び後に続く染料の山（ｈｕｍｐ）を含む他のベースラインの問題を含む。これらの同じベースラインのずれは、サンプル分離の実行においても見られ、これは分離データの訂正及び定量が実質的に困難である原因となる。図８Ｃ及び８Ｄは、多くの分離の下流であるが、検出点の上流である分離チャネル内にトリストリシン緩衝液を導入した場所での、後分離希釈段階を使用する同じブランク実行とポリペプチド試料分析を例証する。示されるように、後分離希釈段階は、非希釈試料に関して検出される試料成分に比べ、全体のバックグラウンド蛍光を減少させ、ミセル染料結合、例えば図８Ａ及び８Ｂ参照、に関するベースラインの山及び下降をも減じる。
【００５１】
他に特別に示さない限りは、本明細書中で提供された全ての濃度の値は、任意の転化、分離、成分を変えるための反応、成分の一度その混合物又は溶液に加えられた１又はそれ以上の異なる種への変換から独立した混合物又は溶液に加えられた成分として、与えられた成分の濃度を意味する。
全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物及び特許出願が特別にかつ個々に、参考により援用することを示したものと同じ程度まで援用される。本発明は明確化及び理解の問題のために、図示や例示の方法によりいくつかの詳細を記載しているが、添付した特許請求の範囲の範囲内で一定の変更及び改変を実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の関連において使用するミクロ流動装置を表す。
【図２】  本発明に従ってポリペプチドの特性決定において使用する全体のシステムを表す。
【図３】  与えられた緩衝剤中の洗浄剤の臨界的ミセル濃度を測定するための、洗浄剤濃度に対する蛍光強度のプロットを表す。
【図４】  本発明の方法を使用するミクロ流動装置において行われるタンパク質分離のクロマトグラムを表す。クロマトグラムは、１２の別々の分離を見ると、それぞれエミュレートされたゲルの別々のレーンとして、エミュレートされたゲルとして表示される。
【図５】  図４に示されたように分離された、移動時間に対する標準タンパク質の分子量の対数のプロットである。
【図６】  洗浄剤−染料フロントピークを示す分子量標準物のクロマトグラムである。
【図７】  ここで記載された方法の後分離処理を行うためのミクロ流動装置の概略例である。
【図８Ａ】  後分離希釈の影響を説明する分離データのプロットを示す。
【図８Ｂ】  後分離希釈の影響を説明する分離データのプロットを示す。
【図８Ｃ】  後分離希釈の影響を説明する分離データのプロットを示す。
【図８Ｄ】  後分離希釈の影響を説明する分離データのプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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