(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹細胞を外胚葉細胞に分化誘導する方法であって、前記工程はレチノイン酸の非存在下かつマウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞、Ｍ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来ＯＰ９細胞、又はマウス胎児由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞であるストローマ細胞の存在下に実施され、かつ外胚葉細胞は神経幹細胞、神経細胞、神経堤の細胞又は神経管の細胞に分化誘導する方法。
【請求項２】
神経幹細胞が、ネスチンを発現している神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる神経細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）ドーパミン作動性神経細胞；
（ｂ）アセチルコリン作動性神経細胞；
（ｃ）γアミノ酪酸作動性神経細胞；
（ｄ）セロトニン作動性神経細胞。
【請求項４】
アセチルコリン作動性神経細胞が、ｉｓｌｅｔ  １を発現している運動神経細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
神経管の細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）神経管の腹側化因子であるソニックヘッジホック（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）に反応し腹側に位置する細胞に分化し、かつ神経管の背側因子である骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）に反応し背側に位置する細胞に分化する能力を有する、背腹軸が決定される前の段階の神経管の細胞；
（ｂ）神経管の最も腹側の底板に位置するＨＮＦ−３β（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−３β）を発現している神経管腹側の細胞；
（ｃ）神経管の腹側からＨＮＦ−３β（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−３β）についで２番目に存在するマーカーＮｋｘ２．２を発現している神経管腹側の細胞；
（ｄ）Ｐａｘ−７を発現している神経管背側の細胞。
【請求項６】
神経堤の細胞が、ＡＰ−２（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）を発現している細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）存在下で培養することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ソニックヘッジホック（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）存在下で培養することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非凝集状態が、エンブリオイドボディを介さない状態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
無血清培養の条件下で培養する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ストローマ細胞が、物理化学的処理により増殖能力を失ったストローマ細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
物理化学的処理が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる処理である、請求項１１に記載の方法。
（ａ）抗癌剤による処理；
（ｂ）放射線の照射による処理；
（ｃ）病理診断で用いられる組織固定のための処理。
【請求項１３】
抗癌剤が、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびメトトレキセートからなる群から選ばれる抗癌剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
病理診断で用いられる組織固定のための処理が、マイクロウエーブ固定、急速凍結置換固定、グルタルアルデヒド固定、パラフォルムアルデヒド固定、ホルマリン固定、アセトン固定、ブアン固定、過ヨウ素酸固定、メタノール固定およびオスミウム酸固定からなる群から選ばれる処理である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ストローマ細胞が、ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体で認識される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
胚性幹細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞；
（ｂ）体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞。
【請求項１７】
胚性幹細胞を外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する効率が５％以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
実質的に中胚葉系細胞の分化誘導を伴わない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
被験物質存在下および該被験物質非存在下で、請求の範囲１〜１８のいずれか１項に記載の方法を行い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程を比較することを特徴とする、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程における調節に関連する物質の評価方法。
【請求項２０】
被験物質存在下および該被験物質非存在下で、請求の範囲１〜１８のいずれか１項に記載の方法を行い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程を比較することを特徴とする、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程における調節に関連する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、胚性幹細胞から機能性細胞を分化誘導する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、細胞医療として有用な外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を胚性幹細胞から分化誘導する方法、該分化誘導した細胞、並びにそれら用途に関する。本発明はまた、上記方法で用いる培地、上記方法で用いるストローマ細胞を特異的に認識する抗体、該抗体が認識する抗原、並びにそれら用途にも関する。
背景技術
通常、胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、他の個体の着床以前の胚、例えば、胚盤胞腔中に注入すると生殖細胞をも含むすべての細胞に分化できる細胞のことを意味しており、胚性幹細胞あるいはＥＳ細胞とも呼ばれている。
初期胚の発生と胚性幹細胞の関係をマウスを例として以下に説明する。
マウス受精卵は、卵管から子宮に向かって移動しながら２細胞、４細胞、８細胞と分裂を行い１６細胞期になった時点で細胞間の接着が強まるコンパクション（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）が起こり、細胞間の境界が不明瞭になった桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）と呼ばれる段階に至る。さらに、受精後３．５日には、胚内部に割腔（ｂｌａｓｔｃｏｅｌ）と呼ばれる空間ができ胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）になる。このとき胚盤胞は外側の栄養外胚葉（ｔｒｏｐｈｅｃｔｏｇｅｒｍ）層と内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ：ＩＣＭ）から構成されている。胚盤胞は受精後４．５〜５．５日にかけて子宮壁に着床する。着床の時期には、内部細胞塊の中で割腔に面した表面の細胞が原始内胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞に分化している。これらのうち、一部の細胞は胚本体から離れ栄養外胚葉層の中側へ遊走し遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞となり、細胞外マトリックスを分泌してライヘルト膜（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ’ｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）をつくる。
一方、胚体部分近くの原始内胚葉細胞は近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）と呼ばれる細胞層をつくる。これら遠位および近位内胚葉は、やがて胎児本体を保護して栄養物や老廃物を母体との間で交換するための支持組織となる。将来胎児本体をつくる内部細胞塊の細胞は増殖して原始外胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）と呼ばれる細胞層をつくる。原始外胚葉は、胚性外胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）あるいは上葉細胞層（ｅｐｉｂｌａｓｔ）とも呼ばれている。着床後の胚は全体として円筒形に成長するため、受精後５．５〜７．５日の胚は卵筒胚（ｅｇｇ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ）と呼ばれる。卵筒胚の子宮との付け根側半分には、将来胎盤をつくる胚体外組織（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）が栄養外胚葉から分化し形成されている。受精後６．５日には原始外胚葉層に原条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）と呼ばれる溝が現れ、この部分で原始外胚葉が間充織細胞様に変化して原始外胚葉層と近位内胚葉層との間に入り込み、原条から左右および前後方向に移動して胚性中胚葉細胞層（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）を形成する。この細胞層の申には、将来胎児本体の内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）になる細胞も含まれている。
このように、原始外胚葉からは外胚葉のみならず、胎児の中胚葉および内胚葉の３胚葉が作られることが明らかにされており、胎児のすべての組織は原始外胚葉由来であることが示されている。なお、神経系や表皮系の細胞は外胚葉から作られることが明らかにされており、神経系の細胞へ分化が運命づけられた外胚葉を神経性外胚葉（ｎｅｕｒａｌ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）、表皮系の細胞へ分化が運命づけられた外胚葉は非神経性外胚葉（ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）と呼ばれている。
以上述べた胚発生過程における細胞系譜の中で、受精卵からはじまり桑実胚までの個々の割球細胞、胚盤胞における内部細胞塊の細胞、および原始外胚葉層を構成している細胞は全能性を持ち未分化な胚性幹細胞としての性質を有している。原始外胚葉が各胚葉に分化をはじめるとそのほとんどの細胞は全能性を失うが、その一部が次の世代へ遺伝子を伝達する役目を担う始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）として残される。始原生殖細胞は、原始外胚葉が各胚葉に分化するときに原条から陥入する胚性中胚葉細胞層の中にまぎれて後方に移動し、尿膜（ａｌｌａｎｔｏｉｓ）基部の胚体外中胚葉（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）の中の特定の部位に出現する。始原生殖細胞は、やがて、生殖巣原基へ向かって移動し生殖巣の性分化にしたがって卵子や精子を形成する。
胚性幹細胞は、胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊を構成している細胞を培養に移し、頻繁に細胞塊の解離と継代を繰り返すことで樹立できる。この細胞は正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰り返すことが可能であり、内部細胞塊と同じようにあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を保つことが知られている。
胚性幹細胞を他個体の胚盤胞の中に注入すると、宿主胚の内部細胞塊の細胞と混ざり合って胚と胎児の形成に寄与しキメラ個体をつくる。極端な場合には、胎児本体がほぼ注入した胚性幹細胞だけからなる個体が生まれることもある。キメラ個体の中で、注入した胚性幹細胞が将来卵や精子をつくる始原生殖細胞の形成に寄与した個体を生殖系列キメラと呼び、この生殖系列キメラを交配させることによって注入した胚性幹細胞由来の個体を得ることができることから、胚性幹細胞はあらゆる細胞に分化することができる全能性を有していることが証明されている（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）（以下、「ジーン・ターゲッティング」と略す）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す））。
胚盤胞の内部細胞塊を通常の初代培養のように培養すると、ほとんどの場合、直に繊維芽細胞様の細胞に分化してしまう。未分化な状態を維持しながら培養するためには、通常、胎児から調製した初代繊維芽細胞やＳＩＨＭマウス由来のＳＴＯ細胞などをフィーダー細胞として用いる必要がある（ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）。フィーダー細胞の上で適切な細胞密度を保ち、頻繁に培養液を交換しながら細胞の解離と継代を繰り返すことで未分化幹細胞の性質を保持したまま維持することが可能となる（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）。
胚性幹細胞の未分化状態を維持する因子としてＬＩＦ（ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）が同定されており（Ａ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｈｏｏｐｅｒ；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２１，１（１９８７）；Ａ．Ｇ．Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６，６８８（１９８８）；Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，４，２３０８（１９９０））、培養液中にＬＩＦを添加することによって、フィーダー細胞を用いなくても全能性をもつ胚性幹細胞を単離し培養することが可能なことが報告されている（Ｊ．Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１０，１３４１（１９９０）；Ｓ．Ｐｅａｓｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１４１，３４４（１９９０））。また、ＬＩＦそのものを培養液に添加する代わりに、ＬＩＦの受容体のサブユニットの一つであるｇｐ１３０を受容体として共有しているインターロイキン６のファミリー分子の添加も有効であることが示されている（Ｄ．Ｐ．Ｇｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｕｃｅ、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．，４，６１（１９９２）；Ｊ．Ｉ．Ｃｏｎｏｖｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１９，５５９（１９９３）；Ｃ．Ｐｉｑｕｅｔ−Ｐｅｌｌｏｒｃｅら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１３，３４０（１９９４）；Ｄ．Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１０９１５（１９９５））。
さらに、ｇｐ１３０を直接活性化する作用を有するインターロイキン６と可溶性インターロイキン６受容体とを併用することで、胚性幹細胞の未分化状態を維持し生殖系列の細胞の形成に寄与する胚性幹細胞を樹立した報告がなされており（Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，４５，１６３（１９９４）；Ｊ，Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１５，２３７（１９９４）；特開平７−５１０６０号）、ｇｐ１３０からの細胞内情報伝達が胚性幹細胞の多分化能や未分化性の維持に重要な働きをしていることが明らかにされている。このことは、ＬＩＦ遺伝子やＬＩＦ受容体遺伝子を遺伝子ターゲッティングの手法を用いて破壊した欠損マウスにおいても初期胚の正常な発生が観察されるが（Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３５９，７６（１９９２）；Ｊ．Ｌ．Ｅｓｃａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３６３，３６１（１９９３）；Ｍ．Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３７８，７２４（１９９５）；Ｃ．Ｂ．Ｗａｒｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１，１２８３（１９９５））、ｇｐ１３０遺伝子を破壊したマウスにおいては、胎生１２．５日から出産に至る過程で胎生死することからも支持されている（Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，４０７（１９９６））。
マウスにおいて胚性幹細胞が初めて樹立されて以来（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１）；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１））、効率的な胚性幹細胞の樹立方法、例えば非マウスにおける胚性幹細胞の樹立法（米国特許５，４５３，３５７号；米国特許５，６７０，３７２号）などが研究され、これまでに、ラット（Ｐ．Ｍ．Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３，２８８（１９９４））、ニワトリ（Ｂ．Ｐａｉｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２，２３３９（１９９６）；米国特許５，３４０，７４０号；米国特許５，６５６，４７９号））、ブタ（Ｍ．Ｂ．Ｗｈｅｅｌｅｒ；Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６，５６３（１９９４）；Ｈ．Ｓｈｉｍら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５７，１０８９（１９９７））、サル（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４（１９９６））、ヒト（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１４５（１９９８）；Ｍ．Ｊ．Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１３７２６（１９９８））の胚性幹細胞が樹立されている。
胚性幹細胞を、胚性幹細胞と同系統の動物の皮下などに移植すると、様々な組織が混ざり合った奇形腫が形成されることが知られている（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）。
また、インビトロの培養においても、胚性幹細胞を凝集させ、いったん擬似胚状態にしたエンブリオイドボディと呼ばれる細胞塊（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ；以下、「ＥＢ」とも略す）を形成させることによって分化を誘導し、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイトの各種細胞を出現させることが可能であることが報告されている（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，１０，３１（１９９８））。しかしながら、この培養方法による分化の誘導では、細胞凝集塊の形成による自発的な分化が引き起こされ、結果として目的とした細胞の出現が観察されているのであって、ある特定の細胞集団を効率的に誘導するまでには至っておらず、同時に多種類の組織細胞の出現も観察されている。
胚性幹細胞から神経系細胞を効率的に分化誘導させる方法に関しては、様々な試みがなされている。
ＥＢを形成させた後、ポリＬ−リジンあるいはラミニンをコートした硝子デッシュ上でＮＧＦ（神経成長因子）を添加した培地を用いて培養を続けると、神経系細胞の分化に重要な転写因子Ｐａｘ３およびニューロフィラメントの発現が有為に上昇することが報告されている（Ｇ．Ｙａｍａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，５５２（１９９４））。後述するＥＣ細胞において、レチノイン酸処理により神経系への分化が促進されるという知見（Ｅ．Ｍ．Ｖ．Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９４，２５３（１９８２）；Ｇ．Ｂａｉｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１６，３２３（１９９４））からその効果が胚性幹細胞においても試され、レチノイン酸存在下で４日間ＥＢを培養した後、トリプシン処理し単層培養を行なうと、突起を進展させ活動電位を発生する神経細胞様の細胞が約４０％という高率で出現し、この細胞では蛋白レベルでクラスＩＩＩチューブリン、ニューロフィラメントＭサブユニット、神経特異的なカルモジュリン結合キナーゼＣの基質であるＧＡＰ−４３（ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４３）、ＭＡＰ−２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）、γアミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「ＧＡＢＡ」とも略す）受容体、ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体、シナプシンの発現が、ｍＲＮＡレベルでニューロフィラメントＬサブユニット、グルタミン酸受容体、チロシン水酸化酵素、転写因子Ｂｒｎ−３、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＡＢＡ合成酵素であるＧＡＤ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の発現が観察されることが報告されている（Ｇ．Ｂａｉｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８，３４２（１９９５）；Ｆ．Ａ．Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１０５６（１９９６））。
Ｂｒｎ−３は中枢神経で（Ｘ．Ｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３４０，３５（１９８９））、ＧＡＰ−４３は神経軸索で（Ｌ．Ｉ．Ｂｅｎｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ａ．Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，８４（１９９７））、ＭＡＰ−２は神経樹状突起で（Ｌ．Ｉ．Ｂｉｎｄｅｒら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６，１４５（１９８６））、ＧＦＡＰはグリア細胞で（Ａ．Ｂｉｇｎａｍｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，４３，４２９（１９７２））、ＧＡＢＡ受容体およびＧＡＤは抑制性神経で（Ｙ．Ｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｉ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８，２１２３（１９８８））、グルタミン酸受容体およびＮＭＤＡ受容体は興奮性神経で発現することが知られているため、レチノイン酸を用いて分化を誘導した場合には、様々な神経系細胞への分化のシグナルが同時に伝わることが示されている。
また、ＥＢ形成による細胞間相互作用を介さないで、胚性幹細胞に直接レチノイン酸を作用させただけでは、神経系細胞への分化誘導は観察されないことが報告されている（Ｈ．Ｇ．Ｓｌａｇｅｒら、Ｄｅｖ．Ｇｅｎ．，１４，２１２（１９９３））。単層培養した胚性幹細胞に１０−７ｍｏｌ／ｌ濃度のレチノイン酸を作用させると、３日後約５０％の細胞でＧＡＰ−４３の発現が、４〜５日後５％未満の細胞でニューロフィラメント−１６５（Ｓ．Ｈ．Ｙｅｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌ．Ｆｉｅｌｄｓ；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８８，１１５（１９８１））の発現が蛋白レベルで観察されているが、ＧＡＰ−４３陽性細胞のほとんどは内胚葉系細胞様の形態であることが報告されている（Ｗ．Ｇ．ｖａｎ  Ｉｎｚｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３１２，２１（１９９６））。ＧＡＰ−４３陽性細胞の中には一部グリア細胞様の形態を示し、そのうち約半分がニューロフィラメント−１６５陽性の細胞であるが、ＥＢを形成後のレチノイン酸処理で誘導される神経細胞様の細胞と比較してＧＡＰ−４３およびニューロフィラメント−１６５ともに抗体染色による染色強度が低いことが報告されている（Ｗ．Ｇ．ｖａｎ  Ｉｎｚｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３１２，２１（１９９６））。このように、ＥＢ形成による細胞間相互作用は効率的な神経系細胞の分化誘導に必要であることが確かめられている。
さらに、グリア細胞様の形態をとる細胞を対象としてパッチクランプの手法を用い活動電位を測定したところ、５−ＨＴ（５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎ）、ＧＡＢＡ、カイニン酸、グルタミン酸、ドーパミン、カルバコール刺激による電位の発生が調べた約半数の細胞で観察されるが、対照として用いたＥＢ形成後のレチノイン酸処理で誘導される神経細胞様の細胞では、カルバコール刺激による活動電位の発生が観察されず、代わりにノルアドレナリン刺激による活動電位の発生が観察されており、神経細胞の分化の方向性の決定にもＥＢ形成による細胞間相互作用が重要であることが示されている（Ｗ．Ｇ．ｖａｎ  Ｉｎｚｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３１２，２１（１９９６））。細胞凝集によるＥＢ形成では、ＥＢ表面の細胞層が原始内胚葉様に分化することが知られており、この細胞層と内部の未分化細胞との何らかの相互作用により分化が誘導されていることが想定されているが、その因子の具体的な同定には至っていない（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，１０，３１（１９９８））。
その後、さらに、胚性幹細胞に対するレチノイン酸の効果が詳細に解析された結果、レチノイン酸が添加された培地で形成されたＥＢを組織培養用のデッシュで培養すると、まず、ネスチン陽性で神経細胞およびグリア細胞の共通の前駆細胞である細胞が出現し、次に、ＧＡＢＡ作動性神経細胞、コリン作動性神経細胞、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイト、０４陽性（Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，８３，３２８（１９８１））のオリゴデンドロサイト様に分化した細胞が出現することが明らかにされている（Ａ．Ｆｒａｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０８，３１８１（１９９５））。
生体において、神経細胞とグリア細胞がネスチン陽性の共通の前駆細胞から分化することはレトロウイルスを用いたラベリング実験で示唆され（Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌら、Ｃｅｌｌ，６０，５８５（１９９０）；Ｊ．Ｐｒｉｃｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２，２３（１９９１）；Ｊ．Ｐｒｉｃｅら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，２，２３（１９９２））、その後、成体の脳に存在する前駆細胞が神経系幹細胞として単離されたことで証明されている（Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，８８，２８７（１９９７）；Ｒ．Ｄ．Ｇ．ＭｃＫａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））。
しかしながら、レチノイン酸を胚性幹細胞の分化誘導に用いる際には、生理的に存在している濃度より非常に高い濃度（１０倍〜１００倍）で用いられる。生理的に存在している濃度より高いレチノイン酸を用いることは、毒性の面から懸念されているため、得られた細胞を移植に用いるのは難しい。そこでレチノイン酸を用いずに、より生理的条件に近い状態で胚性幹細胞を神経系の細胞に分化誘導する試みもなされている。
４日間浮遊培養することによって形成させたＥＢを組織培養用のデッシュ上で１日培養し接着させ、インスリン、トランスフェリン、塩化セレン、フィブロネクチンを含むＩＴＳＦｎ培地（Ａ．Ｒｉｚｚｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇｒｏｗｌｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５７（１９８０））を用いて５〜７日間培養することで、ネスチン陽性でかつ脳で発現が観察される脂肪酸結合蛋白陽性（Ａ．Ｋｕｒｔｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，２６３７（１９９４））の神経上皮細胞様の前駆細胞（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）が誘導され、その前駆細胞をｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とラミニンを含むｍＮ３無血清培地で培養すると前駆細胞として増殖維持されるが、ｂＦＧＦを除いた培地では中枢系の神経細胞およびグリア細胞に分化し、さらに血清を添加した培地を用いて培養を続けると興奮性神経系および抑制性神経系のシナプス形成が観察されることが報告されている（Ｓ．Ｏｋａｂｅら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，５９，８９（１９９６））。
このようにしてインビトロで誘導された神経系細胞が、生体内において正常に機能しうるかについても検討されている。
上述のＩＴＳＦｎ培地を用いて誘導したマウスの神経上皮細胞様の前駆細胞を胎生１６日〜１８日のラットの脳室に移植すると、移植した前駆細胞が移動し脳組織に取り込まれ、神経、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化し、形態的には宿主の細胞と区別がつかないことが観察されている（Ｏ．Ｂｒｕｓｔｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４８０９（１９９７））。しかしながら、移植部位には、盛んに分裂を繰り返す神経管様の構造体やアルカリフォスファターゼ陽性の未分化細胞からなる小さなクラスターの形成など、本来の組織には観察されない奇形腫瘍組織の形成が観察されている。
このような奇形腫瘍組織の形成は、胚性幹細胞からレチノイン酸を用いて誘導した神経系の前駆細胞の移植においても観察されている（Ｊ．Ｄｉｎｓｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，５，１３１（１９９６）；Ｔ．Ｄｅａｃｏｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１４９，２８（１９９８））。
その後、胚性幹細胞からグリア細胞の前駆細胞を誘導し、その前駆細胞を先天的にミエリン髄鞘を欠損しているラットの脳や脊髄に移植することで、奇形腫の形成なしにミエリン髄鞘の修復が観察されることが報告されている（Ｏ．Ｂｒｕｓｔｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，７５４（１９９９））。この移植では、上述のＥＢ形成後、ＩＴＳＦｎ培地を用いて誘導した神経上皮細胞様の前駆細胞から、さらに分化が進んだグリア細胞の前駆細胞を誘導し移植に用いている。
すなわち、誘導した神経上皮細胞様の前駆細胞をポリオルニチンでコートしたデッシュ上でインスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレン、ＦＧＦ２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２）、ラミニンを含む培地で５日間培養し、カルシウムおよびマグネシウムを含有していないハンクスの緩衝液を用いて細胞を剥がし、５分の１の細胞密度でＦＧＦ２とＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含む培地で継代培養し、ほぼコンフルエント状態に達したらもう一度５分の１の細胞密度でＦＧＦ２とＰＤＧＦ−ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）を含む培地に継代し培養を続けることでグリア細胞の前駆細胞へと分化を誘導することが可能であることから、移植に用いることが可能であることが示されている。このようにして分化誘導した細胞は、Ａ２Ｂ５陽性であること（Ｍ．Ｃ．Ｒａｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ，３０３，３９０（１９８３））、ＦＧＦ２およびＥＧＦを含まない培地で培養するとアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトへの分化がインビトロで観察されることからグリア細胞の前駆細胞であることが明らかにされている。
上記胚性幹細胞と同様の機能を有する細胞について、胚性幹細胞との関係を以下に説明する。
悪性奇形腫（ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）より胚性幹細胞と同様多分化能を有する細胞株として、種々の胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）が樹立されている（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ；Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２８，１６３（１９７２））。
これらの細胞は、胚性幹細胞のマーカーとなる遺伝子を発現していること（Ｅ．Ｇ．Ｂｅｒｎｓｔｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０，３８９９（１９７３）；Ｓ．Ｂ．Ｄｉｗａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｃ．Ｓｔｅｖｅｎ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，５７，９３７（１９７６）；Ｄ．Ｓｏｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｂ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，５５６５（１９７８）；Ｂ．Ａ．Ｈｏｓｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，５６２３（１９８９）；Ｓ．Ｃ．Ｐｒｕｉｔｔ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，３７（１９９４））、インビトロにおいて様々な細胞に分化する能力を有していること（Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ、Ｃｅｌｌ，６，４６７（１９７５）；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，１４４１（１９７５）；Ｍ．Ｗ．ＭｃＢｕｒｎｅｙ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８９，４４１（１９７６））、同系個体への移植において様々な組織からなる奇形種が形成されること（Ｌ．Ｊ．Ｋｌｅｉｎｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂ．Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２４，７９７（１９６４））、胚盤胞の中に注入すると胎児形成に寄与しキメラ個体を形成すること（Ｂ．Ｍｉｎｔｚ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，３５３８（１９７５）；Ｖ．Ｅ．Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ，２５８，７０（１９７５）；Ｍ．Ｊ．Ｄｅｗｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５５６４（１９７７））、極めて稀ではあるが胚性癌腫細胞株の中には生殖系列キメラを作製する能力を持つ例も報告されていること（Ｔ．Ａ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ｍｉｎｔｚ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１））から、胚性幹細胞が有する未分化幹細胞としての性質を有した細胞と考えられている。
また、始原生殖細胞を培養する際にｂＦＧＦを加えると胚性幹細胞に類似した細胞の細胞株が出現することが示され、ＥＧ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）として樹立された（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ，７０，８４１（１９９２）；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ，３５９，５５０（１９９２））。このＥＧ細胞は、生殖系列キメラの形成に寄与できる能力を有しており（Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，６２６（１９９４）；Ｐ．Ａ．Ｌａｂｏｓｋｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，３１９７（１９９４））、上記胚性幹細胞が有する未分化幹細胞としての性質を有していることが明らかにされている。未分化幹細胞と生殖細胞にはかなり共通した性質があり、増殖や分化の制御状態変化によって比較的容易に相互変換できると考えられている。
一方、発生工学の進歩により、個々人の胚性幹細胞を作成する可能性について報告されている。１９９７年、Ｗｉｌｍｕｔらによって哺乳動物ではじめて、体細胞の核由来のクローン個体である羊ドリーが作出されて以来（Ｉ．Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、胎児細胞の核を用いたクローンウシ（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、皮膚、筋肉、耳殻、卵管、卵丘細胞の核を用いたクローンウシ（入谷明；蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、クローンヤギ（Ａ．Ｂａｇｕｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、卵丘細胞の核を用いたクローンマウス（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８））、雄の尾の細胞を用いたクローンマウス（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９））、胚性幹細胞の核を用いたクローンマウス（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９）；Ｗ．Ｍ．Ｒｉｄｅｏｕｔ  ＩＩＩら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））の作出が報告されており、体細胞の核を、脱核した受精卵に導入することで哺乳動物のクローン個体を作成することが可能であることが示されている。この核移植の技術と胚性幹細胞を樹立する技術を組み合わせることで個々人の胚性幹細胞の作成が可能であり、細胞医療としての臓器移植への応用の可能性が指摘されている（Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｚａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，９７５（１９９９））。また、胚性幹細胞に遺伝子操作を加えることでより効果的な遺伝子治療を行うことが可能であることや、組織適合性抗原の改変が可能なことも指摘されている（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，１０，３１（１９９８））。
次に、臓器移植における細胞医療の有効性について例をあげて説明する。
パーキンソン病は、黒質線条体ドーパミン神経細胞の変性を主体とする慢性進行性疾患である。従来より、Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）を中心とする内服療法が行われてきたが、長期にわたる内服が必要なため、多くの患者においてその効果が次第に減弱し、ｗｅａｒｉｎｇ  ｏｆｆ現象、ジスキネジアなどの副作用になやまされるようになる。このため、より有効な治療法の開発が模索され、パーキンソン病患者に対して中絶胎児脳を移植する治療が行われ始めた。全世界では、これまでに、数百例の中絶胎児脳を移植する治療が施行されている。最近、米国では、４０人のパーキンソン病患者を対象に、中絶胎児脳細胞の移植手術の二重盲検試験が行われ、その有用性が証明された。さらに、このような中絶胎児脳細胞移植を受けた患者の中には、１０年以上にもわたって移植した細胞が定着し移植した細胞が線条体とシナプスを形成している例が報告されている。このように、中絶胎児の脳を移植する細胞治療がパーキンソン病に対して高い有効性を示すことが分かってきているが、中絶胎児を利用することに倫理的な問題を指摘する声が強い。また、実際には、一人の患者を治療するのに１０体近い胎児が必要であるために、現実的な医療への応用に大きな障害となっている。したがって、ドーパミン作動性神経細胞を、社会通念上許容される方法で、かつ多量に調製する方法の開発が望まれている。
以上のような背景から、多分化能を保持したまま培養可能な未分化幹細胞から目的とする機能性細胞を選択的に、かつ効率的に分化誘導するための方法の開発が注目され、様々な試みがなされている。しかしながら、奇形腫瘍の形成をともなわない細胞集団を効率的に分化誘導する方法の開発は、未だ多くの機能細胞において成功していない。また、細胞医療の観点から、目的とする機能細胞を人為的にコントロールされた生理的環境下、例えば、血清やレチノイン酸を用いない培養条件で誘導することが望まれているが、そのような方法も知られていない。特に、外胚葉由来の細胞、具体的には正常な機能を有するドーパミン作動性神経細胞を、未分化幹細胞から効率的に分化誘導し取得する方法は、パーキンソン病をはじめとする脳疾患患者への医療の観点から重要であり切望されているが、未だ開発されていない。
発明の開示
本発明は、細胞および臓器移植医療に利用可能であり、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を選択的且つ効率的に分化誘導する方法、該分化誘導した細胞、並びにこれらの用途を提供することを目的とする。本発明はまた、分化誘導する方法に用いる培地、該分化誘導する方法に用いるストローマ細胞を特異的に認識する抗体および該抗体の製造方法、それにより取得される抗体、該抗体が認識する抗原の取得方法、それにより取得される抗原、並びにこれらの用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、胚性幹細胞の分化を引き起こす様々な培養条件を鋭意検討した結果、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する、選択的且つ効率的な方法を見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７１）に関する。
（１）胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹細胞を外胚葉細胞に分化誘導する方法。
（２）外胚葉細胞が、神経系細胞または表皮系細胞に分化しうる能力を有している細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３）胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹細胞を外胚葉由来の細胞に分化誘導する方法。
（４）外胚葉由来の細胞が、神経系細胞または表皮系細胞である、上記（３）に記載の方法。
（５）表皮系細胞が表皮細胞である、上記（４）に記載の方法。
（６）神経系細胞が以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる細胞である、上記（４）に記載の方法。
（ａ）神経幹細胞；
（ｂ）神経細胞；
（ｃ）神経管の細胞；
（ｄ）神経堤の細胞。
（７）神経幹細胞が、ネスチンを発現している神経幹細胞である、上記（６）に記載の方法。
（８）神経細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる神経細胞である、上記（６）に記載の方法。
（ａ）ドーパミン作動性神経細胞；
（ｂ）アセチルコリン作動性神経細胞；
（ｃ）γアミノ酪酸作動性神経細胞；
（ｄ）セロトニン作動性神経細胞。
（９）アセチルコリン作動性神経細胞が、ｉｓｌｅｔ  １を発現している運動神経細胞である、上記（８）に記載の方法。
（１０）神経管の細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる細胞である、上記（６）に記載の方法。
（ａ）神経管の腹側化因子であるソニックヘッジホック（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）に反応し腹側に位置する細胞に分化し、かつ神経管の背側因子である骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）に反応し背側に位置する細胞に分化する能力を有する、背腹軸が決定される前の段階の神経管の細胞；
（ｂ）神経管の最も腹側の底板に位置するＨＮＦ−３β（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−３β）を発現している神経管腹側の細胞；
（ｃ）神経管の腹側からＨＮＦ−３β（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−３β）についで２番目に存在するマーカーＮｋｘ２．２を発現している神経管腹側の細胞；
（ｄ）Ｐａｘ−７を発現している神経管背側の細胞。
（１１）神経堤の細胞が、ＡＰ−２（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）を発現している細胞である、上記（６）に記載の方法。
（１２）骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）存在下で培養することを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）ソニックヘッジホック（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）存在下で培養することを特徴とする、上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）非凝集状態が、エンブリオイドボディを介さない状態である、上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）無血清培養の条件下で培養する工程を含むことを特徴とする、上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）ストローマ細胞由来の因子の存在下で培養することを特徴とする、上記（１）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）ストローマ細胞存在下で培養することを特徴とする、上記（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）ストローマ細胞が、物理化学的処理により増殖能力を失ったストローマ細胞である、上記（１７）に記載の方法。
（１９）物理化学的処理が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる処理である、上記（１８）に記載の方法。
（ａ）抗癌剤による処理；
（ｂ）放射線の照射による処理；
（ｃ）病理診断で用いられる組織固定のための処理。
（２０）抗癌剤が、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびメトトレキセートからなる群から選ばれる抗癌剤である、上記（１９）に記載の方法。
（２１）病理診断で用いられる組織固定のための処理が、マイクロウエーブ固定、急速凍結置換固定、グルタルアルデヒド固定、パラフォルムアルデヒド固定、ホルマリン固定、アセトン固定、ブアン固定、過ヨウ素酸固定、メタノール固定およびオスミウム酸固定からなる群から選ばれる処理である、上記（１９）に記載の方法。
（２２）ストローマ細胞が、ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体で認識されるストローマ細胞である上記（１６）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法。
（２３）ストローマ細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）からなる群から選ばれるストローマ細胞である、上記（１６）〜（２２）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）胎児初代培養繊維芽細胞；
（ｂ）ＳＩＨＭマウス由来ＳＴＯ細胞；
（ｃ）マウス胎児由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞；
（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来ＯＰ９細胞；
（ｅ）マウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞；
（ｆ）胚性幹細胞由来のストローマ細胞；
（ｇ）骨髄間葉系幹細胞由来のストローマ細胞。
（２４）胚性幹細胞が、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選ばれる細胞である、上記（１）〜（２３）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞；
（ｂ）体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞。
（２５）培養工程にレチノイン酸を添加しないことを特徴とする、上記（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）胚性幹細胞を外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する効率が５％以上である、上記（１）〜（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２７）実質的に中胚葉系細胞の分化誘導を伴わない、上記（１）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法。
（２８）上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の方法で用いる、胚性幹細胞を外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導するための培地。
（２９）胚性幹細胞を外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する、ストローマ細胞由来の因子。
（３０）ムコ多糖吸着能を有する、上記（２９）に記載の因子。
（３１）ムコ多糖がヘパリンである、上記（３０）に記載の因子。
（３２）骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）を有効成分として含有する、外胚葉細胞から表皮系細胞への分化誘導剤。
（３３）胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有するストローマ細胞または該細胞由来の因子を有効成分として含む、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞への分化誘導剤。
（３４）ストローマ細胞が、上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載のストローマ細胞である、上記（３３）に記載の分化誘導剤。
（３５）ストローマ細胞由来の因子がムコ多糖吸着能を有する、上記（３３）または（３４）に記載の分化誘導剤。
（３６）ムコ多糖がヘパリンである、上記（３５）に記載の分化誘導剤。
（３７）胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有するストローマ細胞を、ムコ多糖を含む培地中で培養して得られる培養上清を含む培地。
（３８）ストローマ細胞が、上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載のストローマ細胞である、上記（３７）に記載の培養上清を含む培地。
（３９）ムコ多糖がヘパリンである、上記（３７）または（３８）に記載の培養上清を含む培地。
（４０）上記（３７）〜（３９）のいずれか１項に記載の培養上清を有効成分として含む、外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞の分化誘導剤。
（４１）ストローマ細胞を免疫原として用いることを特徴とする、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有するストローマ細胞を特異的に認識する抗体を取得する方法。
（４２）ストローマ細胞が、上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載のストローマ細胞である、上記（４１）に記載の方法。
（４３）上記（４１）または（４２）に記載の方法により取得される、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞を特異的に認識する抗体。
（４４）ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体。
（４５）上記（４３）または（４４）に記載の抗体を用いることを特徴とする、該抗体が認識する抗原を取得する方法。
（４６）上記（４５）に記載の方法により取得される、上記（４３）または（４４）に記載の抗体が認識する抗原。
（４７）上記（４６）に記載の抗原を含む細胞培養のための培地。
（４８）胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を指標に、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞へ分化誘導する活性を有するストローマ細胞由来の因子を取得する方法。
（４９）ムコ多糖とストローマ細胞由来の因子とを結合させる工程と、ムコ多糖に結合した該ストローマ細胞由来の因子から該因子を回収する工程を含む、上記（４８）に記載の方法。
（５０）ストローマ細胞が、上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載のストローマ細胞である、上記（４８）または（４９）に記載の方法。
（５１）ムコ多糖が、ヘパリンである、上記（４９）に記載の方法。
（５２）上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の方法を用いることによって誘導される、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞。
（５３）上記（５２）に記載の外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、胚性幹細胞から分化誘導された細胞の純度を高める方法。
（５４）抗癌剤が、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、メトトレキセートおよびアラＣからなる群から選ばれる抗癌剤である、上記（５３）に記載の方法。
（５５）上記（５３）または（５４）に記載の方法を用いて得られる細胞。
（５６）被験物質存在下および該被験物質非存在下で、上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の方法を行い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程を比較することを特徴とする、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程における調節に関連する物質の評価方法。
（５７）被験物質存在下および該被験物質非存在下で、上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の方法を行い、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程を比較することを特徴とする、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程における調節に関連する物質のスクリーニング方法。
（５８）被験物質存在下および該被験物質非存在下で、上記（５２）に記載の細胞を培養し、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞の機能を比較することを特徴とする、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞の機能の調節に関連する物質の評価方法。
（５９）被験物質存在下および該被験物質非存在下で、上記（５２）に記載の細胞を培養し、該被験物質存在下と該被験物質非存在下での外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞の機能を比較することを特徴とする、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞の機能の調節に関連する物質のスクリーニング方法。
（６０）胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞または該細胞由来の因子を含む医薬。
（６１）ストローマ細胞が、上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載のストローマ細胞である、上記（６０）に記載の医薬。
（６２）因子がムコ多糖吸着能を有する、上記（６０）に記載の医薬。
（６３）ムコ多糖がヘパリンである、上記（６２）に記載の医薬。
（６４）上記（４３）または（４４）に記載の抗体を含む医薬。
（６５）上記（４６）に記載の抗原を含む医薬。
（６６）上記（５２）または（５５）に記載の細胞を含む医薬。
（６７）外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の診断、予防および／または治療のための医薬である、上記（６０）〜（６６）のいずれか１項に記載の医薬。
（６８）外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患が、神経系細胞または表皮系細胞の障害に基づく疾患である、上記（６７）に記載の医薬。
（６９）神経系細胞の障害に基づく疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、背堆損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、または神経毒物の障害に起因する疾患であり、表皮系細胞の障害に基づく疾患が火傷、外傷、創傷治癒、床擦れ、または乾せんである、上記（６８）に記載の医薬。
（７０）上記（４３）または（４４）に記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（４６）に記載の抗原の免疫学的検出法。
（７１）上記（４３）または（４４）に記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（４６）に記載の抗原の免疫組織染色法。
以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明する。
１．本発明の分化誘導方法
（１）適用動物
本発明に係わる適用動物としては、脊椎動物、中でも温血動物、さらにはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物があげられる。
（２）胚性幹細胞
胚性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞を包含する。その例としては、（ａ）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞が挙げられ、具体的には、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立されたＥＳ細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞があげられる。悪性奇形腫より樹立されたＥＣ細胞もＥＳ細胞と同様の性質を示すことが知られていることから、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞に広義に含まれる。
本発明における胚性幹細胞としては、上記（ａ）の胚性幹細胞、（ｂ）体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞、および（ｃ）（ａ）あるいは（ｂ）の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞を包含する。
（３）外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞
本発明の分化誘導法によって、上述のような胚性幹細胞を非凝集状態で培養することにより、胚性幹細胞を外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞に分化誘導することができる。
本発明において、外胚葉細胞とは、神経系細胞や表皮系細胞に分化しうる能力を有した細胞から構成される胚葉細胞を包含する。その例としては、原始外胚葉から分化した胎児の外胚葉細胞があげられる。
本発明において、外胚葉由来の細胞とは、外胚葉細胞から分化した細胞で、かつ生体を構成する機能細胞を包含する。その具体例としては、神経系細胞や表皮系細胞があげられる。すなわち、本発明の方法によって、外胚葉細胞を神経系細胞または表皮系細胞へ誘導することができる。
（ａ）神経系細胞
神経系細胞としては、神経幹細胞、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などがあげられる。
（ｉ）神経細胞
神経細胞とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。
神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類されており、具体的には、神経伝達物質、神経伝達物質の合成酵素などの違いで分類されている。神経伝達物質としては、ペプチド性、非ペプチド性のいずれも包含される。非ペプチド性の神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、アセチルコリン、γアミノ酪酸、グルタミン酸があげられる。ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンの３種類をカテコールアミンと称す。
これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドーパミン作動性神経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、γアミノ酪酸作動性神経系細胞、セロトニン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞などがあげられる。ドーパミン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞を総称してカテコールアミン作動性神経細胞と呼ぶ。
カテコールアミン作動性神経細胞は共通してチロシン水酸化酵素を発現し、ノルアドレナリン作動性神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞では共通してドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを発現する。また、ノルアドレナリン作動性神経細胞ではフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼを発現し、セロトニン作動性神経細胞ではトリプトファンヒドロキシラーゼを発現し、アセチルコリン作動性神経細胞ではコリンアセチルトランスフェラーゼを発現し、γアミノ酪酸作動性神経細胞ではグルタミン酸デカルボキシラーゼをそれぞれ特異的に発現している。したがって、神経細胞を認識する方法としては、上記酵素を認識する抗体を用いた識別方法、上記酵素をコードするｍＲＮＡの発現を検出する方法などがあげられる。
ペプチド性の神経伝達物質としては、副腎皮質刺激ホルモン（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ（ＡＣＴＨ））、ααγ，β−リポトロピン（Ｌｉｐｏｔｒｏｐｉｎ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、α−エンドルフィン（Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）、β−エンドルフィン、γ−エンドルフィン、メチオニンエンケファリン（Ｍｅｔ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ロイシンエンケファリン（Ｌｅｕ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、α−ネオエンドルフィン（Ｎｅｏｅｎｄｏｒｐｈｉｎ）、β−ネオエンドルフィン、ダイノルフィンＡ（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ａ）、ダイノルフィンＢ（Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ｂ）、ロイモルフィン（Ｌｅｕｍｏｒｐｈｉｎ）、バソプレッシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ニューロフィシン（Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、ニューロフィシンＩ（Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ  Ｉ）、サブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）、ニューロキニンＡ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ａ）、神経ペプチドＫ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｋ）、神経ペプチド−γ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ−γ）、ニューロキニンＢ（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ｂ）、ボンベシン（Ｂｏｍｂｅｓｉｎ）、ガストリン放出ペプチド（Ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、セクレチン（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、バソアクチブインテスティナルペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、成長ホルモン放出因子（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、インスリン様増殖因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ）、ガストリン（Ｇａｓｔｒｉｎ）、コレシストキニン（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、神経ペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ）、膵臓ポリペプチド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ペプチドＹＹ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、アンギオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ニューロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ）、ガラニン（Ｇａｌａｎｉｎ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）があげられる。これらのペプチド性神経伝達物質を産生する神経細胞は、神経伝達物質あるいは神経伝達物質前駆ペプチドを認識する抗体、神経伝達物質あるいは神経伝達物質前駆ペプチドをコードするｍＲＮＡの発現を検出することで識別することができる。
また、運動神経は、その神経終末よりアセチルコリンを分泌することで骨格筋に情報を伝えており、アセチルコリン作動性神経細胞に分類される。運動神経のマーカー蛋白質としては、ｉｓｌｅｔ  １（Ｏ．Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３４４，８７９，１９９０）があげられる。
本発明の分化誘導法は、神経細胞、好ましくはドーパミン作動性神経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、γアミノ酪酸作動性神経系細胞、セロトニン作動性神経細胞への分化誘導に好適に用いられる。
特に、本発明の方法により胚性幹細胞から誘導されたドーパミン作動性神経細胞とは、前述したようにカテコールアミン作動性神経細胞に共通して発現が観察されるチロシン水酸化酵素を発現しているが、ノルアドレナリン作動性神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞に共通して発現が観察されるドーパミン−β−ヒドロキシラーゼを発現しない細胞として特徴づけられ、移植により神経変性疾患、例えばパーキンソン病の症状を改善する能力を有する。
（ｉｉ）神経幹細胞
神経幹細胞とは、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）およびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞として定義される。胚性幹細胞のようにすべての細胞に分化する多分化能は有していないが、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。
したがって、神経幹細胞であることを確認する方法としては、実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、インビトロで神経幹細胞が神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化誘導して確認する方法などがあげらえる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８，３８９（１９９７）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，５３４（１９９９））。
また、このような機能を有した神経幹細胞は、神経前駆細胞での発現が確認されている細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン抗体で染色可能である（Ｒ．Ｍｃｋａｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））。したがって抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
（ｉｉｉ）神経管および神経堤の細胞
脊索動物の初期発生においては、原始外胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）層に原条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）が現れ神経誘導（ｎｅｕｒａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）が開始される。神経誘導とは、初期胚の背側に位置する外胚葉が隣接あるいは内側部分に位置するオーガナイザー領域よりシグナルを受けて神経性外胚葉へと分化する過程を意味する。この神経誘導によって形成された神経性外胚葉は非神経性外胚葉、すなわち表皮外胚葉から独立して神経板（ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ）となり、これがやがて腹側に陥入して神経管（ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ）を形成する。神経板と表皮外胚葉との間の部分に位置する外胚葉部分は陥入の際、神経堤（ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ）を形成する。神経管を構成する一層の神経上皮組織から中枢神経系のすべての細胞群が発生する。すなわち、神経管の前方部は拡大して脳の原基となる脳胞（ｂｒａｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を形成し、後方部は管のままで脊髄に分化していく。神経堤は中枢神経そのものの分化には直接関与せず、神経堤を構成する細胞は移動して種々の組織、例えば脳・脊髄神経節、交感神経およびその神経節、副腎髄質、あるいはメラニン色素細胞などに分化する。
神経管の細胞とは、上述の発生過程における神経管を構成する細胞を意味する。
神経堤の細胞とは、上述の発生過程における神経堤を構成する細胞を意味する。
本発明の分化誘導法は、神経管の細胞、神経堤の細胞への分化誘導に好適に用いられる。
本発明の方法により胚性幹細胞から誘導された神経管の細胞は、神経管の腹側化因子であるソニックヘッジホック（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ、以下「ｓｈｈ」と略す）に反応し腹側に位置する細胞に分化し、かつ神経管の背側因子である骨形成因子４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、以下「ＢＭＰ４」と略す）に反応し背側に位置する細胞に分化する能力を有する、背腹軸が決定される前の段階の神経管の細胞として特徴づけられる細胞を包含する。また、該細胞が分化し、神経管の最も腹側の底板に位置するマーカーＨＮＦ−３β（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−３β、以下「ＨＮＦ−３β」と略す）を発現している神経管腹側の細胞、神経管の腹側からＨＮＦ−３βについで２番目に存在するマーカーＮｋｘ２．２を発現している神経管腹側の細胞、およびＰａｘ−７を発現している神経管背側の細胞も、本発明の方法により胚性幹細胞から誘導された神経管の細胞として含まれる。
本発明の方法により胚性幹細胞から誘導された神経堤の細胞は、ＡＰ−２（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、以下「ＡＰ−２」と略す）を発現している細胞として特徴づけられる細胞を包含する。
Ｓｈｈは、神経管の背腹軸の形成、肢芽の前後軸の形成など発生初期の形態形成に関わる分泌性の因子である（Ｃ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３８３，４０７（１９９６）；Ｍ．Ｂｉｔｇｏｏｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，６，２９８（１９９６））。
ＢＭＰ４は、神経管の背腹軸の形成、中胚葉背腹軸の形成など背側化因子として作用する、発生初期の形態形成に関与する分泌性の因子である（Ｊ．Ｍ．Ｇｒａｆｆら、Ｃｅｌｌ，７９，１６９（１９９４）；Ａ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０２５５（１９９４））。
ＨＮＦ−３βは、生後の肝、小腸、肺、膵ランゲルハンス島で発現していることが知られているが、発生過程では、前腸形成期以降の腸上皮や肝原基、または、原腸陥入期を通じて、原口背唇部、前脊索板、脊索、神経管腹側中央部などのオーガナイザー領域などで発現しており、発生時には神経管や体節の体軸パターン形成のためのシグナルをコントロールする重要な因子であることが知られている（Ｃ．Ｖａｉｓｓｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，１３６４（１９９７）；Ｍ．Ｌｅｖｉｎｓｏｎ−Ｄｕｓｈｎｉｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，３８１７（１９９７））。
Ｎｋｘ２．２は、発生過程において、神経管の腹側に発現している因子であるり、これら細胞の分化や機能に重要な役割を担う因子であることが知られている（Ｍ．Ｐｒｉｃｅら、Ｎｅｕｒｏｎ，８，２４１（１９９２））。
Ｐａｘ−７は、神経管において背側部に限局して発現し（Ｂ．Ｊｏｓｔｅｓら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，３３，２７（１９９０））、頭部の神経堤由来の組織、中枢神経系の分化形成において重要な役割を担う因子である（Ａ．Ｍａｎｓｏｕｒｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２，８３１（１９９６））。
ＡＰ−２は、胎生８．５日から１２．５日のマウス胚で、神経堤細胞とそれに由来する主要な組織である頭部の知覚神経節、脊髄神経節及び顔面の間葉に発現し、これら細胞の分化や機能に重要な役割を担う因子である（Ｈ．Ｓｃｈｏｒｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３８１，２３５（１９９６）、Ｊ．Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３８１，２３８（１９９６））。神経堤細胞に発現し頭蓋閉鎖に関与するＡＰ２以外の転写因子としてはＰａｘ−３とｔｗｉｓｔがあげられる。
これら神経管および神経堤の細胞は、そのマーカー遺伝子およびこれら細胞の発生の方向性に影響を与える因子が知られており、マーカー遺伝子のｍＲＮＡの検出、発現マーカー遺伝子産物そのものの検出、あるいは該因子に対する応答を調べることで細胞を特定することができる。
（ｂ）表皮系細胞
表皮系細胞としては、表皮細胞などがあげられる。
皮膚は、外胚葉に由来する上皮組織の表皮（ｅｐｉｄｅｍｉｓ）と、中胚葉に由来する結合組織の真皮（ｄｅｒｍｉｓ）から構成されており、表皮細胞とは、表皮を構成する上皮細胞として定義される。表皮は、基本的には角化した重層扁平上皮からなり、真皮から外表に向かって基底層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｂａｓａｌｅ）、有棘層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ）、顆粒層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、淡明層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）からなる。表皮細胞は、細胞の形態とケラチンフィラメントの発現様式を指標として分類される。ケラチン８と１８は発生の段階の初期に発現するので、胎児初期における上皮細胞のマーカーとして用いられる（Ｒ．Ｇ．Ｏｓｈｉｍａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．，９９，４４７（１９８３））。ケラチン１９は胎児における上皮細胞のマーカーとして用いられる（Ｐ．Ｃ．Ｓｔａｓｉａｋ  ＆  Ｅ．Ｂ．Ｌａｎｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，１００５８（１９８７））。ケラチン５と１４は表皮の基底層を構成する上皮細胞のマーカーとして用いられる（Ｅ．Ｆｕｃｈｓ  ＆  Ｈ．Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ，１９，１０３３（１９８０））。角化中の表皮細胞はケラチノサイトと呼ばれ、角化に伴いケラチン５や１４の発現が減少し代わりにケラチン１や１０の発現が上昇する（Ｅ．Ｆｕｃｈｓ  ＆  Ｈ．Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ，１９，１０３３（１９８０）；Ｃ．Ｂａｇｕｔｔｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１７９，１８４（１９９６））。
表皮系細胞、特に表皮細胞の識別は、上記各ケラチンに対する抗体や非神経外胚葉細胞のマーカーであるＥカドヘリンに対する抗体で検出したり、またはこれらケラチンのタンパク質のｍＲＮＡを検出することで行うことができる。
本発明の方法により、好適に、高い細胞分裂能を有する基底層部の表皮細胞へ分化誘導することができる。
（４）非凝集状態での胚性幹細胞の培養
本発明の分化誘導法としては、具体的には、単一細胞状態の胚性幹細胞を調製する工程、該胚性幹細胞をストローマ細胞あるいはストローマ細胞由来の因子を存在させて、非凝集状態で培養する工程を含む方法があげられる。
ここで、ストローマ細胞とは、後述の４に記載のストローマ細胞であり、ストローマ細胞由来の因子とは、後述の８に記載の抗原、後述の５の方法で得られる因子、ストローマ細胞の培養上清、ストローマ細胞の細胞断片等である。
胚性幹細胞を非凝集状態で培養するとは、細胞同士の接着を解除した単一細胞状態（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）で培養を開始し、継続して培養することである。単一細胞状態とは、酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞がバラバラになった状態をいう。
この培養では、播種した細胞が凝集せず、エンブリオイドボディを形成しない。このような単一細胞状態で胚性幹細胞の培養を開始し、それを継続して培養するには、胚性幹細胞の培養において通常の胚性幹細胞の継代に用いられる細胞密度よりも低い細胞密度で播種し培養することで行うことができる。即ち、酵素消化等の処理を胚性幹細胞に施し、培地を用いて単一細胞状態の細胞懸濁液を調製し、その細胞懸濁液を、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在できる程度に培養する。このような培養は、細胞を積極的に凝集させ擬似胚状態を再現することで分化誘導を引き起こそうとするエンブリオイドボディを用いた従来の培養方法とは根本的に考え方を異にするものである。ここで、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在できる程度の播種用胚性幹細胞の細胞密度としては、好ましくは数十〜数百細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは３０〜３００細胞／ｃｍ２である。
単一細胞状態の胚性幹細胞を取得する方法としては、組織細胞培養で用いられている、公知の酵素消化の方法があげられる。具体的には、前日培地交換を行い、数十％〜ほぼコンフルエント状態にまで増殖した胚性幹細胞を培養している培養皿から培地を除いた後、リン酸緩衝生理食塩水溶液（以下、「ＰＢＳ」と称す）を用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄する。洗浄後、胚性幹細胞の入った培養皿に適当な酵素消化液（例えば、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ）を加え、３７℃で数十分間、好ましくは５〜２０分間培養する。酵素反応後、後述の２で調製した培地に懸濁し、遠心操作（例えば、４℃、２００×ｇで５分間）を行ない、胚性幹細胞を再び培地に懸濁することにより、単一細胞状態の胚性幹細胞を回収することができる。
胚性幹細胞の培養方法としては、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、等に記載の胚性幹細胞を培養するための方法があげられる。また、無血清培養することも可能で、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１５〜２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ  ２−メルカプトエタノール、および１，０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦを加えた培地を用い、未分化な胚性幹細胞としての形質を保ったまま継代培養することができる（Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら、Ｆｏｃｕｓ，２０，８（１９９８））。
本発明の、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養方法としては、用いる胚性幹細胞の分化誘導に適した培養方法であればいずれも用いることができる。例えば、単層培養法、支持細胞との共培養法、高密度維持培養法、マイクロキャリア培養法、還流培養法、軟寒天培養法等をあげることができる。具体的には、単一細胞状態とした胚性幹細胞を後述の２で調製した培地中で培養する方法、後述の２で調製した培地中に懸濁した単一細胞状態の胚性幹細胞を、あらかじめ後述の４で調製したストローマ細胞と非凝集状態で数日間共培養する方法などがあげられる。
本発明の、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程は、無血清培養条件下で行われることが好ましいが、無血清培養条件下で行われた後に、血清を添加した培養条件で培養する工程（例えば、後述の２で記載した基礎培地に、好ましくは数十％、より好ましくは５〜２０％の哺乳類血清を添加した培地を用い、３７℃で数％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する工程）を行うこともできる。特に表皮系細胞に分化誘導させる場合には、この血清を添加した培養条件で培養する工程を含むことにより、分化誘導率をより高くすることができる。
上記方法により、本発明の外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞を得ることができる。本発明の方法により、胚性幹細胞は外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞へ分化誘導され、本発明の分化誘導法に供した胚性幹細胞の５％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは８０％以上を外胚葉系の細胞（外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞）へ分化誘導することができる。
外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞を神経系細胞に分化誘導するには、上述の工程を含む方法で適宜培地交換を行ないながら培養を継続することで行うことができる。
外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を表皮系細胞に分化誘導するには、ＢＭＰ４を上述の工程を含む培養系に添加することが好ましい。
外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞から神経管又は神経堤の細胞に分化誘導するには、ＢＭＰ４を含まない培地を用いて上述の工程を行い、胚性幹細胞が神経性外胚葉へ分化を開始した後（例えば、培養開始から１〜１４日、好ましくは２〜８日、より好ましくは４〜６日後）、ｓｈｈやＢＭＰ４を含む培地を用いて適宜培地交換を行いながら培養を継続することで行うことができる。
（５）ストローマ細胞存在下での培養
本発明の分化誘導方法は、ストローマ細胞あるいはストローマ細胞由来の因子の存在下で胚性幹細胞を培養することが好ましい。
ストローマ細胞は、後述の４に記載のとおりであり、ストローマ細胞由来の因子としては、後述の８に記載の抗原、後述の５の方法で得られる因子、ストローマ細胞の培養上清、ストローマ細胞の細胞断片等があげられる。
本発明の分化誘導法において、ストローマ細胞と胚性幹細胞の培養系での比率は、胚性幹細胞を外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞に分化誘導することが可能である比率であればいかなる比率でもよいが、１０４〜１対１（ストローマ細胞数対胚性幹細胞数）、好ましくは１０３〜１対１、より好ましくは１０２〜１０対１である。
ここで、胚性幹細胞とストローマ細胞との共培養としては、胚性幹細胞とストローマ細胞とが物理的に接触している場合や、両細胞が同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ細胞自体の物理的接触ができない場合も含まれる。
胚性幹細胞とストローマ細胞が同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ細胞自体の物理的接触ができない場合とは、例えば、通常の細胞培養に用いられるフィルターを用いて両細胞を隔てて培養する場合があげられる。フィルターの孔径としては、好ましくは０．０１〜数十μｍ、より好ましくは０．０２〜１２μｍが好ましい。このようなフィルターとしては、具体的には、メンブレンカルチャーインサート（岩城硝子社製）、ＮｕｎｃＴＣインサート（Ｎｕｎｃ社製）、ＣＯ−ＣＵＬＴＵＲＥシャーレ（グライナー社製）、セルカルチャーインサート（ファルコン社製）、ケモタキシスチャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．社製）等をあげることができる。胚性幹細胞とストローマ細胞のどちらをフィルター上に培養しても構わないが、ストローマ細胞をフィルター上で培養する方が好ましい。
胚性幹細胞とストローマ細胞とを共培養し、胚性幹細胞から外胚葉細胞および神経系細胞を分化誘導する方法としては、具体的には、回収した胚性幹細胞を後述の２で調製した培地（例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地に１０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、１ｍＭピルビン酸および１００μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加した培地）に懸濁し、後述の４で調製したストローマ細胞が培養されている培養器（例えば、細胞培養用フラスコ）に、数十〜数百細胞／ｃｍ２、好ましくは１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種し、５〜２０日間、好ましくは７〜１０日間３７℃で数％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法をあげることができる。
胚性幹細胞とストローマ細胞とを共培養し、胚性幹細胞から外胚葉細胞および表皮系細胞を分化誘導する方法としては、具体的には、回収した胚性幹細胞を２で調製した培地（例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地に１０％のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、１ｍＭピルビン酸、１００μＭ  ２−メルカプトエタノールおよび０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＭＰ４を添加した培地）に懸濁し、後述の４で調製したストローマ細胞が培養されている培養器（例えば、細胞培養用フラスコ）に、数十〜数百細胞／ｃｍ２、好ましくは１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種し、５〜２０日間、好ましくは７〜１０日間３７℃で数％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法をあげることができる。
また、胚性幹細胞とストローマ細胞とを共培養する代わりに、胚性幹細胞を培養する培地中にＯＰ９細胞（Ｔ．Ｎａｋａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，７２２（１９９６））、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｌ．Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６９））、またはＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞の培養上清を添加した培地を用いることで、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導することもできる。さらにまた、胚性幹細胞とストローマ細胞とを共培養する代わりに、培地中にＯＰ９細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞（Ｈ．Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，８９（１９８２））、ＳＴＯ細胞（Ｇ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１）；Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１））、または胎児初代培養繊維芽細胞（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）が産生している因子を添加した培地を用いることで、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導することもできる。
（６）レチノイン酸を用いない培養
本発明の分化誘導法では、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程において、レチノイン酸を用いずに培養することが好ましい。
ここで、「レチノイン酸を用いずに培養する」とは、非生理的な濃度のレチノイン酸を用いずに培養することである。非生理的な濃度とは、生体に生理的に存在する濃度の１０倍以上の濃度を意味する。具体的には、通常ヒトの血中には約１０−８ｍｏｌ／ｌの濃度のレチノイン酸が存在することが知られていることから（生化学辞典第２版，東京化学同人（１９９２））、１０−７〜１０−６ｍｏｌ／ｌの濃度範囲が非生理的な濃度である。レチノイン酸は発生分化の際に形態形成に影響を及ぼす形態形成物質（モルフォゲン）として作用を有しており、また細胞種によっては毒性なども強く、非生理的な濃度のレチノイン酸を用いた培養系を医療へ応用する際には二次的な副作用が懸念されている。従って、レチノイン酸を用いないで培養することは、上述のレチノイン酸使用にともなうリスクを回避することができるため有用である。
（７）中胚葉系細胞の分化が実質的に誘導されない培養
本発明の分化誘導法において、培養系に中胚葉系細胞の分化が実質的に誘導されないことが好ましい。
ここで、「中胚葉系細胞の分化が実質的に誘導されない」とは、培養系に分化してくる中胚葉系細胞の割合が、培養系全体の細胞数に対して５％以下であることを意味し、好ましくは２％以下である。
ここで、中胚葉系細胞とは、筋肉系、結合組織、骨格系、循環器系、泌尿器系、生殖系などの器官や組織を構成する細胞を意味する。
中胚葉系細胞を識別するには、中胚葉系細胞を特異的に認識する抗体で検出する方法、中胚葉系細胞で特異的に発現しているタンパク質のｍＲＮＡを検出する方法、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて検出する方法等を用いて行うことができる。
（８）培養器
本発明で使用できる培養器としては、胚性幹細胞を培養できるものであればいかなる培養器でも用いることができるが、好ましくは細胞培養用に用いられる培養器が望ましい。細胞培養用の培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、コンツアーデッシュ、パーマノックスデッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、セパレートストリップウエル、テラサキプレート、組織培養用チャンバースライド、シャーレ、細胞培養用シャーレ、組織培養用チューブ、トレイ、細胞培養用トレイ、セルファクトリー、培養バッグ、テクノポット、ローラーボトル、スピンナー、フォロファイバー等があげられる。培養器と細胞との接着性を制御するために、培養器の細胞と接触する側の表面を人工的に処理を施すこともできる。培養器の表面を人工的に処理する例としては、コラーゲンコート、ゼラチンコート、ポリ−Ｌ−リジンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコート、プロテオグリカンコート、グリコプロテインコート、マトリゲルコート、シリコンコート等があげられる。また、プライマリア（Ｆａｌｃｏｎ社製）などのように負の電荷を持つように処理することもできる。
２．培地の調製
本発明の、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する方法で用いる培地とは、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。
基礎培地としては、ＢＭＥ培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，８９，３６２（１９６５））、ＢＧＪｂ培地（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２５，４１（１９６１））、ＣＭＲＬ  １０６６培地（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５，３０３（１９５７））、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６，１４７（１９６２））、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，４９，１７０５（１９７２））、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，９，６（１９７０））、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０））、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））、Ａｌｐｈａ  ＭＥＭ培地（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３０，３１０（１９７１））、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、ハム培地（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９，５１５（１９６３）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５））、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．，１９９，５１９（１９６７））、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１０（１９６４））、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１００，１１５（１９５９））、ウイリアムスＥ培地（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，６９，１０６（１９７１）；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，８９，１３９（１９７４））、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
また、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の胚培養のための培地、例えば、Ｍ２培地、Ｍ１６培地、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、体外受精用培地など、胚の培養に用いることのできる培地であればいずれも基礎培地として用いることができる。
さらに、これら基礎培地に、血清代替物としての各種増殖因子を添加した培地、ストローマ細胞などが産生する因子を添加した培地、あるいは無蛋白培地であって、動物細胞や胚の培養が可能であるものであればいずれも本発明の培地として用いることができる。その具体的例として、市販のＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭ  ＳＲを添加した無血清培地（Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら、Ｆｏｃｕｓ，２０，８（１９９８））、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地（例えば、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ｅＲＤＦ  Ｄｒｙ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製））、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製））、ＩＴＰＳＧ培地（Ｓ．Ｈｏｓｏｉら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，Ｓ１７（１９９１））、ＩＴＳＦｎ培地（Ａ．Ｒｉｚｚｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇｒｏｗｌｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５７（１９８０））、ｍＮ３培地（Ｓ．Ｏｋａｂｅら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９，８９（１９９６）など）、細胞由来の因子を添加した培地（例えば、多能性奇形癌腫細胞ＰＳＡ１の培養上清を添加した培地（Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１））、後述の４に記載のストローマ細胞の培養上清を含む培地、後述の５に記載のストローマ細胞が産生する因子を含む培地、後述の８で得られた抗原成分を含む培地、ＢＭＰ４を含む培地、または無蛋白培地（例えば、ＣＤ−ＣＨＯ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）など）があげられる。
３．胚性幹細胞の作製法
上記１．（２）で述べた（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の胚性幹細胞の作製法を具体的に説明する。
（１）着床以前の初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞の作製
着床以前の初期胚を、文献（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）に記載された方法に従って培養することで、該初期胚より胚性幹細胞を調製することができる。
（２）体細胞の核を核移植した胚性幹細胞の作製
哺乳類動物細胞の体細胞の核を移植し正常な発生を開始した卵は、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａら（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、ＲｉｄｅｏｕｔＩＩＩら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００））等によって報告された方法を用いて、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、以下の方法が知られている。
核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合に好適である。
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒツジ、ヤギ、ウシなどの場合に好適である。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
（３）染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞の作製
相同組換え技術を用いることによって、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
例えば、改変する染色体上の遺伝子としては、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞または表皮系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、マニピュレイテイング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法を用い、行なうことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、「モレキュラー・クローニング第２版」と略す）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」と略す）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０））等があげられる。
４．ストローマ細胞の調製
本発明において、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する方法に用いるストローマ細胞としては、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞への分化を誘導する活性を有していればいずれも用いることができる。７に後述する方法で製造される本発明の抗体、好ましくは実施例１５（５）で得られるハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体で認識されるストローマ細胞が好ましく用いられる。具体的には、
（ａ）胎児初代培養繊維芽細胞（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）、
（ｂ）ＳＩＨＭマウス由来のＳＴＯ細胞（Ｇ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１）；Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１）、
（ｃ）マウス胎児由来のＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｌ．Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６９））、
（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来のＯＰ９細胞（Ｔ．Ｎａｋａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，７２２（１９９６））、
（ｅ）マウス頭蓋冠由来のＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞（Ｈ．Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，８９（１９８２））、
（ｆ）既に多分化能を有していることが証明されている胚性幹細胞（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル）から分化誘導し得られるストローマ細胞、あるいは
（ｇ）各種ストローマ細胞への分化能を有していることが示されている骨髄間葉系幹細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３（１９９９））から分化誘導し得られるストローマ細胞をあげることができる。
上記の中でも、好ましくは上記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）のストローマ細胞であり、より好ましくは（ｅ）のストローマ細胞である。
実施例１５（５）で得られるハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体で認識されるストローマ細胞は、文献（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５；酵素免疫測定法，第３版，医学書院，１９８７）等に記載の免疫学的な測定法、例えば該抗体を用いた酵素抗体法やフローサイトメーターを用いた細胞分離などの方法によって識別される。
ストローマ細胞の培養は、樹立された際に用いられた方法を用いて継代培養することが好ましい。また、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２２５，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の胚性幹細胞の培養に用いるフィーダー細胞を培養するための方法を用いることもでき、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを加えた培地を用いて培養することができる。
上述のストローマ細胞を、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる場合、培養皿等の適当な支持体上で増殖させたストローマ細胞を生きたまま用いても良いし、物理化学的処理を施すことにより増殖能力を失った細胞を用いても良い。物理化学的処理を施すことにより増殖能力を失った細胞とは、もはや遺伝子複製を伴う次世代子孫の形成能力が失われている細胞であり、具体的には、抗癌剤を含む培地を用いた培養、致死量の放射線照射、あるいは病理診断に用いられる組織固定のための処理を施すことにより得られた細胞である。
生きたままのストローマ細胞は、例えば、前日に培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した細胞を、ＰＢＳで数回洗浄後、上記２で得られる本発明の培地（例えば、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる無血清培地）を加えることで調製することができる。また、ほぼコンフルエントに達した細胞を適当な消化酵素（例えば、０．０２％ＥＤＴＡを含み、０．０５〜０．２５％のトリプシンあるいはアクチナーゼを含むＰＢＳ）で消化して回収し、上記２で得られる本発明の培地（例えば、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる無血清培地）に懸濁後、培養器（例えば、０〜１％、好ましくは０．１％ゼラチンでコートした組織培養皿）に播種し約１日間培養することによっても調製することができる。
抗癌剤を含む培地を用いた培養により、増殖能力を失ったストローマ細胞は、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；ジーン・ターゲッティング；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法を用い、調製することができる。例えば、前日に培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した細胞を、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌの濃度のマイトマイシンＣを含む培地で数時間、好ましくは２〜３時間培養し、ＰＢＳで数回洗浄し、適当な消化酵素（例えば、０．０２％ＥＤＴＡを含み、０．０５〜０．２５％のトリプシンあるいはアクチナーゼを含むＰＢＳ）で消化して回収し、上記２で得られる本発明の培地（例えば、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる無血清培地）に懸濁後、培養器（例えば、０〜１％、好ましくは０．１％ゼラチンでコートした組織培養皿）に播種し約１日間培養することによって調製することができる。また、マイトマイシンＣの代わりに他の抗癌剤、例えば５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどの抗癌剤を、生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１０分の１〜１０倍、好ましくは１倍の濃度で用いることでも、増殖能力を失ったストローマ細胞を調製することができる。
致死量の放射線照射によって増殖能力を失ったストローマ細胞は、組織培養の技術，朝倉書店（１９８２）、組織培養の技術（第二版），朝倉書店（１９８８）、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）等に記載の方法を用い、調製することができる。例えば、前日に培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した細胞を、２００〜５，０００ラド、好ましくは５００〜１，０００ラドのＸ線あるいはγ線を照射し、ＰＢＳで数回洗浄後、後述の６で得られる本発明の培地（例えば、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる無血清培地）を加えることで調製できる。また、放射線照射を施した細胞を適当な消化酵素（例えば、０．０２％ＥＤＴＡを含み、０．０５〜０．２５％のトリプシンあるいはアクチナーゼを含むＰＢＳ）で消化して回収し、後述の６で得られる本発明の培地（例えば、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を分化誘導する培養に用いる無血清培地）に懸濁後、培養器（例えば、０〜１％、好ましくは０．１％ゼラチンでコートした組織培養皿）に播種し約１日間培養することによっても調製できる。
病理診断に用いられる組織固定操作によって増殖能力を失ったストローマ細胞は、日本組織細胞化学会が編集し毎年発行している組織細胞化学，学際企画（１９８７−１９９９）、Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、電子顕微鏡チャートマニュアル，医学出版センター（１９９３）等に記載の方法を用い、調製することができる。具体的には、マイクロウエーブ固定、急速凍結置換固定、グルタルアルデヒド固定、パラフォルムアルデヒド固定、ホルマリン固定、アセトン固定、ブアン固定、過ヨウ素酸固定、メタノール固定、またはオスミウム酸固定を行なうことによって調製できる。例えば、前日に培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した細胞を、４℃で、０．１〜５０％、好ましくは１〜１０％、より好ましくは３〜５％のパラフォルムアルデヒドを含む溶液中に、例えば数分間〜数時間、好ましくは５分間〜１時間、より好ましくは３０分間浸潤し、ＰＢＳで数回洗浄することによって調製することができる。
５．胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞由来の因子を取得する方法
本発明におけるストローマ細胞より、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有する因子を取得することができる。具体的には、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）（以下、「モノクローナル・アンチボディズ」と略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（以下、「アンチボディ・エンジニアリング」と略す）等に記載された発現クローニングの方法を用いて、行なうことができる。
具体的には、例えば、本発明におけるストローマ細胞よりｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明におけるストローマ細胞が生産する遺伝子産物を産生する形質転換体を得、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択する。選択した該形質転換体に導入したｃＤＮＡにコードされている遺伝子配列を決定することにより、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有する因子を取得することができる。
以下に、詳細に説明する。
宿主細胞としては、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有していない細胞が好ましい。具体的には、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞（Ｔ．Ｔ．Ｐｕｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１０８，９４５（１９８５））、コッカスパニエル雌犬腎臓由来のＭＤＣＫ細胞（Ｃ．Ｒ．Ｇａｕｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２２，９３１（１９６６））；Ｄ．Ｓ，Ｍｉｓｆｅｌｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３，１２１２（１９７６））、ラット繊維芽細胞３Ｙ１（Ｓ．Ｓａｎｄｉｎｅｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１，８３０（１９８１））、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ細胞（Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ；Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１））があげられる。これら宿主細胞の中でも、ＳＶ４０系の発現ベクターを用いた発現クローニングに好適なＣＯＳ細胞がより好ましい。
ｃＤＮＡの作製に用いる細胞としては、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞が好ましい。具体的には、胎児初代培養繊維芽細胞（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）、ＳＩＨＭマウス由来のＳＴＯ細胞（Ｇ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７６３４（１９８１）；Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１））、より好ましくはマウス胎児由来のＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｊ．Ｌ．Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６９））、Ｍ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来のＯＰ９細胞（Ｔ．Ｎａｋａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，７２２（１９９６））、マウス頭蓋冠由来のＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞（Ｈ．Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，８９（１９８２））をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを調製する方法としては、後述の８に記載した方法があげられる。作製したｃＤＮＡライブラリーをそのまま用いてもよいが、目的とする遺伝子を濃縮するために、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有していない細胞のｍＲＮＡを用い、サブトラクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５７８３（１９８８））を行なって作製したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
組換えベクターの導入方法、形質転換体を得る方法、および得られた形質転換体を培地に培養する方法としては、後述の８に記載した方法があげられる。
本発明の分化誘導法において、胚性幹細胞と形質転換体との共培養を行なうことで、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択することができる。
選択した形質転換体に導入したｃＤＮＡを単離する方法、および単離したｃＤＮＡの遺伝子配列を決定する方法としては、後述の８に記載した方法があげられる。
発現クローニングの手法以外にも、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞由来の因子を取得することができる。具体的には、本発明におけるストローマ細胞を出発原料とし、培地中に添加した際の胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する促進効果を指標として精製することができる。精製方法としては、後述の８に記載した方法があげられる。
更に、ストローマ細胞由来の因子は、ムコ多糖（例えば、ヘパリン）に吸着する性質を有しているので、ストローマ細胞を培養した培養系中、あるいはストローマ細胞存在下で胚性幹細胞を非凝集状態で培養した培養系中の該因子をムコ多糖と結合させ、その後ムコ多糖に結合した前記ストローマ細胞由来の因子から該因子を取得することができる。例えば、ヘパリンを担体とするカラムクロマトグラフィーを用いてストローマ細胞由来の因子をヘパリンに結合させ、その後その結合した該因子を溶出させ、前記分化誘導促進効果を指標に該因子を取得することができる。
６．分化誘導剤とそれを含む医薬
（１）分化誘導剤
本発明の分化誘導剤としては、上述のストローマ細胞あるいはストローマ細胞由来の因子を有効成分として含有するものであれば、いずれの態様でもよい。具体的には、胚性幹細胞とストローマ細胞を培養できる培地と上述のストローマ細胞を含むものがあげられる。また、上述のストローマ細胞の細胞断片や培養上清も分化誘導剤の有効成分としてあげられる。
ここで、上述のストローマ細胞の培養上清としては、胚性幹細胞を外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有する上述のストローマ細胞を培地中で培養して得られた培養上清、あるいは該ストローマ細胞をムコ多糖を含む培地中で培養して得られた培養上清をあげることができる。
ここで、ムコ多糖としては、様々なストローマ細胞が産生する、胚性幹細胞を外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有する因子に結合する能力を有しているものであればいかなるものでも用いることができるが、例えばペパリンなどが好ましい。ヘパリンとしては市販されている公知のヘパリンを用いることができる。上記培養上清は、ヘパリンを数ｎｇ／ｍｌ〜数千ｎｇ／ｍｌ、好ましくは数百ｎｇ／ｍｌの範囲で含む培地を用い、上述のストローマ細胞を５分から数日間培養することで調製することができる。このようにして得られた培養上清は、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する分化誘導剤や、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性因子取得の際に有効に用いることができる。
また、ムコ多糖、例えばペパリンは、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性因子に特異的に相互作用する性質を有していると考えられるので、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞までの分化過程における調節に関連する物質の評価方法やスクリーニング方法、あるいは外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞の機能の調節に関連する物質の評価方法やスクリーニング方法に有効に用いることができる。
外胚葉細胞から表皮系細胞への分化誘導剤としては、ＢＭＰ４を含むことが好ましい。
（２）分化誘導剤を含む医薬
本発明の分化誘導剤は、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いることができる。
外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、神経系細胞の障害に基づく疾患あるいは表皮系細胞の障害に基づく疾患があげられる。
神経系細胞の障害に基づく疾患としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、背堆損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが、表皮系細胞の障害に基づく疾患としては、火傷、外傷、創傷治癒、床擦れ、乾せんなどがあげられる。
本発明の分化誘導剤を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該有効成分そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該有効成分および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
７．ストローマ細胞を認識する抗体の取得方法
本発明におけるストローマ細胞を免疫原として用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、本発明のストローマ細胞を認識する抗体を作製することができる。細胞を免疫原として用い、免疫原として用いた細胞の細胞表面特異的な抗体およびその抗体が認識する抗原分子を取得した報告はこれまでに数多くなされており（Ｎ．Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ，６６，２３３（１９９１））、多くの細胞表面抗原分子が同定されＣＤ抗原として知られている。
現在では、蛋白質やペプチドを免疫原として抗体を作製する場合と同様、細胞を免疫原として細胞表面分子を認識する抗体を作製する手法が確立されており、例えば以下の方法により本発明におけるストローマ細胞を認識する抗体を調製することができる。
（１）ポリクローナル抗体の作製
本発明に用いるストローマ細胞を免疫原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該免疫原の投与量は動物１匹当たり１０４〜１０８個の細胞あるいは該細胞から調製した細胞膜画分０．０１〜１０ｍｇが好ましい。
該免疫原は、適当なアジュバンド（例えば、フロインドの完全アジュバンド（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチンなど）とともに皮下、または腹腔内に投与する。
該免疫原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた免疫原と反応することを酵素免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（以下、「アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、あるいはフローサイトメーターを用いた方法（モノクローナル・アンチボディズ）等で確認する。
免疫原に用いた細胞の細胞膜成分は、既に多くの公知の方法を用いて調製できることが知られており、例えば、ショ糖濃度の違いによる密度差を利用したＪｏｎｅｓらの方法（Ｄ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｍａｔｕｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３５６，２７６（１９７４））を用いて調製することができ、この細胞膜成分をコートしたプレートを用いて酵素免疫測定を行なうことができる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿（アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明におけるストローマ細胞に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したマウスまたはラットに免疫原として用いた細胞を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、「Ｐ３−Ｕ１」と略す）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８））、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６））、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９））、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、「正常培地」という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地）で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地）１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル等に述べられている酵素免疫測定法、またはモノクローナル・アンチボディズ等に述べられているフローサイトメーターを用いた方法により、本発明におけるストローマ細胞に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、免疫原に用いた本発明におけるストローマ細胞から調製した細胞膜画分を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明におけるストローマ細胞に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
フローサイトメーターを用いた方法の具体例として、以下の方法をあげることができる。
免疫原に用いた細胞をハイブリドーマ上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチンあるいは蛍光物質等で標識した抗マウスまたは抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させ、ビオチン標識した第二抗体を用いた場合には、さらに蛍光標識したアビジンと反応させた後にＦＡＣＳ等のフローサイトメーターを用いて染色の有無を確認し、本発明におけるストローマ細胞に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し（１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する）、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する）した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０６〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
上記の方法で得られるモノクローナル抗体として、例えば実施例１５（５）で得られるハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３が産生するモノクローナル抗体があげられる。
８．本発明の抗体が認識する抗原の取得
上記４で取得した本発明に用いたストローマ細胞を免疫原として得られた抗体は、多くの細胞表面に存在する抗原分子を認識する。そこで、得られた抗体を用いて、該抗体が認識する抗原分子を取得することができる。具体的には、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、モノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング等に記載された発現クローニングの方法を用いて、行なうことができる。
具体的には、例えば、本発明におけるストローマ細胞よりｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製しｃＤＮＡライブラリーを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明におけるストローマ細胞が生産する遺伝子産物を産生する形質転換体を得、本発明の抗体と反応する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択する。選択した該形質転換体に導入したｃＤＮＡにコードされている遺伝子配列を決定することにより、本発明の抗体が認識する抗原分子を取得することができる。
以下に、詳細に説明する。
宿主細胞としては、ファージ、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の抗原分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
第１に本発明におけるストローマ細胞から全ＲＮＡを調製する。その方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７））、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）、実験医学、９（１９３７（１９９１））などがあげられる。また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製したストローマ細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株等の微生物中で自立複製でき、かつ宿主細胞において導入したｃＤＮＡを発現できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
ファージを宿主細胞として用いる場合には、例えば、市販のキットＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いることで、調製したｃＤＮＡを導入した形質転換体を得ることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、調製したｃＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ｃＤＮＡ遺伝子、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ、ｐＭＥＸ（ＭＯＢＩＴＥＣ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭  ５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製）、ｐＴｒｓ３２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製）、ｐＧＨＡ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１）、ｐＧＫＡ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０））、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（特開昭  ６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４（１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０））、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７））、ＥＢＶ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲｃ／ＣＭＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＺｅｏＳＶ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＤｉｓｐｌａｙｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＸＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＳＧ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＢＫ−ＲＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６号、日本特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養することにより、導入したｃＤＮＡがコードする遺伝子産物を発現させることができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明におけるストローマ細胞から調製したｃＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養することにより、該ｃＤＮＡがコードしている遺伝子産物を発現する形質転換体を得ることができる。
本発明の抗体と反応する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択する方法としては、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング、酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）等に述べられている酵素免疫測定法、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２５，９７２（１９９７）等に述べられているフローサイトメーターを用いた方法、またはモノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）等に述べられているパニング法をあげることができる。
選択した形質転換体に導入したｃＤＮＡを単離する方法としては、宿主細胞において自立複製可能な発現ベクターを用いた場合には、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，２８３７（１９８８）等に記載の通常のファージベクター、プラスミドベクターを回収する方法、あるいはＨｉｒｔ法をあげることができる。染色体中への組込れる発現ベクターの場合には、宿主細胞に導入するｃＤＮＡを複数種類（例えば、１００〜１０００種）からなる集団にプール分けし、目的とする形質転換体を与える集団を更に少ない種類（例えば、１０〜１００種）のｃＤＮＡからなる集団にプール分けすることを繰り返すことで、目的とするｃＤＮＡを単離することができる。
単離したｃＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
以上のように、発現クローニングの方法を用いて、本発明の抗体が認識する抗原分子を取得することができる。
本発明では、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有していない細胞（例えば、後述する実施例３において開示されている）を利用して発現クローニングを行なうことが好適である。
具体的には、胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞へ分化誘導する活性を有していない細胞を宿主細胞とし、本発明におけるストローマ細胞から調製したｃＤＮＡを導入して発現させ、本発明におけるストローマ細胞を認識する抗体を用いて選択する発現クローニングの手法があげられる。
胚性幹細胞から外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有していない細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞（Ｔ．Ｔ．Ｐｕｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１０８，９４５（１９８５））、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ細胞（Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１））、コッカスパニエル雌犬腎臓由来のＭＤＣＫ細胞（Ｃ．Ｒ．Ｇａｕｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２２，９３１（１９６６）；Ｄ．Ｓ．Ｍｉｓｆｅｌｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３，１２１２（１９７６））、ラット繊維芽細胞３Ｙ１（Ｓ．Ｓａｎｄｉｎｅｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１，８３０（１９８１））があげられる。したがって、宿主細胞として、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｙ１細胞、より好ましくはＳＶ４０系の発現ベクターを用いた発現クローニングに好適なＣＯＳ細胞を用いることが望ましい。
発現クローニングの手法以外にも、本発明のストローマ細胞を認識する抗体を用いて、該抗体が認識する抗原分子を取得することができる。具体的には、本発明におけるストローマ細胞を出発原料とし、該抗体との反応性を上述の酵素免疫測定法を用いて測定することを指標として精製することができる。
具体的には、本発明におけるストローマ細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル、界面活性剤処理等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗原精製標品を得ることができる。
９．本発明の分化誘導法、細胞、抗体、抗原および分化誘導剤の利用
（１）本発明の分化誘導方法を利用した物質の評価またはスクリーニング方法
本発明の、胚性幹細胞を外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞へ分化誘導する培養方法は、これら細胞の分化過程あるいは細胞の機能調節における生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価および活性評価に有用である。また、特定の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることにより、胚性幹細胞が外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞へ分化していく過程における、該遺伝子の機能評価にも有用である。
本発明の培養法の利用方法としては、例えば、以下のものがあげられる。
本発明の分化誘導方法を用いることにより、培地中に添加した被検物質の外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞への分化の過程、または外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞の機能調節に及ぼす影響を評価することができる。被検物質としては、培養系に加えることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝子、ウイルス、細胞などがあげられる。遺伝子を除く被検物質は、培養培地中に直接添加すればよい。
遺伝子を効率的に培養系に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培養系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的なベジクル構造に封入して培養系に添加する方法などがあげられる。その具体的例としては、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子解析に関する報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３（１９９５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，３５８７（１９９０）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，３８１６（１９９５））をあげることができる。
これらの被検物質は、上記分化誘導法における培養系にどのような時期でも添加することができ、例えば、幹細胞が外胚葉細胞へ分化する過程に対する作用を評価したい場合には比較的培養の初期に、外胚葉細胞から外胚葉由来の細胞に分化する過程に対する作用を評価したい場合には比較的培養の後期に被検物質を添加することで評価することができる。培養系において分化の程度を判断するには、胚性幹細胞から分化の結果生じる各種分化細胞のマーカー蛋白質の発現を調べることで把握することができる。被験物質の評価あるいはスクリーニングは、所定時間の培養後、例えば、外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞への分化効率の質的または量的な変化を測定することで行なうことができる。質的な変化の測定方法としては、具体的には、ｖａｎ  Ｉｎｚｅｎらが胚性幹細胞から分化誘導した神経細胞を用いて活動電位を測定した例があげられる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３１２，２１（１９９６））。
（２）細胞を含有する医薬
本発明で用いるストローマ細胞あるいは本発明のストローマ細胞由来の因子、またはそれらにより胚性幹細胞を分化誘導して得られた外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞は、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療、診断あるいは予防のための医薬として用いることができる。
外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、前述の６．（２）に記載された各種疾患があげられる。
外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療薬としては、移植医療に利用可能な、障害を受けた細胞の機能と同じ機能を有する細胞、障害を受けた細胞の前駆細胞、障害を受けた細胞の機能を代償する細胞、障害を受けた細胞の再生を促進する機能を有する細胞が用いられる。
本発明の治療薬は、本発明の、胚性幹細胞より分化誘導した外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を調製し、これを有効成分とすることにより製造できる。また、上記４の方法でストローマ細胞を、前述５の方法でストローマ細胞由来の因子を調製し、これを有効成分とすることにより製造することができる。本発明の治療薬は、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患において、障害を受けた細胞の再生を促進させる機能を有する。
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、その具体的例として、アンチボディズ・ア・ラボラトリー・マニュアル、モノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２７５（１９９８）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２５，９７２（１９９７）等に述べられているフローサイトメーターを用いた方法、モノクローナル・アンチボディズ、アンチボディ・エンジニアリング、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，２７９７（１９８８）等に述べられているパニング法、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）等に記載のショ糖濃度の密度差を利用した細胞分画法をあげることができる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、上述のような胚性幹細胞を分化誘導して得られた外胚葉細胞あるいは外胚葉由来の細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。このような未分化細胞は奇形腫瘍テラトーマの原因になることが危惧されるが、抗癌剤で処理することでその危険性を回避できる。
ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどがあげられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述の４に記載した方法にしたがい、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法をあげることできる。
ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の２に記載の培地等をあげることができる。また、これら抗癌剤は、分化誘導した細胞に上述の４に記載した方法にしたがって使用することができる。
本発明の治療薬は、上記の細胞（外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、ストローマ細胞を含む）に、薬理学的に許容される生理食塩水、添加剤および／または培地を含んでも構わないが、移植医療の目的に用いられるため、血清やウイルス等の不純物の混入が無いことが好ましい。上記因子を含む治療薬は、後述する９．（４）の方法により製造するが、細胞の治療薬と同様に血清やウイルス等の不純物の混入がないことが好ましい。本発明の方法によれば、無血清培養条件下で、また、非生理的な濃度のレチノイン酸等の分化誘導剤を用いる必要もなく、外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を分化誘導することができ、移植医療に有用である。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、前述の１．（２）に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞あるいは前述の１．（３）に記載の染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることで克服できる。
また、前述の１．（２）に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個人の外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を得ることができる。このような個人の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個人に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個人のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。
移植の方法としては、対象となる疾患に適した方法であればいずれの方法も用いることができ、疾患ごとにそれぞれの疾患に適した公知の方法が知られている。例えば、疾患患者より胚性幹細胞を取得し、ストローマ細胞およびストローマ細胞由来の因子を加えて、得られた胚性幹細胞を培養する。該胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を分化誘導させたのちに、患者の疾患部位に移植することにより疾患を治療することができる。または、ストローマ細胞およびストローマ細胞由来の因子を疾患患者の疾患部位に直接投与しても疾患を治療することができる。具体的に、パーキンソン病患者に対する中絶胎児の脳細胞を移植する方法としては、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）等に記載の方法があげられる。
（３）抗体を用いて抗原を免疫学的に検出する方法、および抗体を含有する医薬
本発明の、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞を特異的に認識する抗体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、本発明の抗原または該抗原を含む組織を免疫学的に検出することができる。該検出法および該抗体を含む医薬は、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患など、該ストローマ細胞の機能の低下あるいは消失に起因する疾患の診断に利用することができる。また、該検出方法は、抗原の定量にも用いられる。
外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、前述の６．（２）に記載の各種疾患があげられる。
免疫学的に検出する方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等があげられる。免疫学的に定量する方法としては、液相中で本発明の抗原と反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明の抗原と本発明の抗原を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
（４）抗原を含有する医薬
本発明の抗体が認識する、胚性幹細胞から外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞を分化誘導する活性を有するストローマ細胞で特異的に発現している抗原分子は、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いることができる。
外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、前述の６．（２）に記載の各種疾患があげられる。
本発明の抗原を有効成分として含有する医薬を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。これらの医薬製剤の形態、投与経路、投与量、使用形態等は、前述の６．（２）に記載の医薬製剤の形態、投与経路、投与量、使用形態等があげられる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
胚性幹細胞のドーパミン作動性神経細胞への分化：
胚性幹細胞であるＥＳ細胞ＥＢ５（Ｈ．Ｎｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４，３７２，（２０００）；大阪大学医学部分子制御医学講座  丹羽仁史博士より恵与された）とストローマ細胞であるＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞（Ｈ．Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，８９（１９８２）、以下、「ＰＡ６細胞」と略す）またはマウス胎児初代培養繊維芽細胞（以下、「ＭＥＦ細胞」と略す）との共培養を行なった。
ＥＳ細胞ＥＢ５は未分化特異的プロモーター（Ｏｃｔ３プロモーター；Ｅ．Ｐｉｋａｒｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，１０２６（１９９４））下に薬剤耐性遺伝子Ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎｅ−Ｒが発現するように遺伝子導入されており、Ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎｅ２０μｇ／ｍｌを添加して培養することで、未分化なＥＳ細胞のみを選択し、培養維持することができる。本発明で用いたＥＳ細胞ＥＢ５は、試験期間中、Ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎｅ２０μｇ／ｍｌを添加した培地中で生存し、未分化な状態を保っていることを確認して用いた。
ＥＳ細胞ＥＢ５は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＥＳ  Ｃｅｌｌ−Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ；ライテックオリエンタル株式会社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ  ２−メルカプトエタノール、および１，０００  Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＬＩＦ；ライテックオリエンタル株式会社製）を加えた培地を用い、ゼラチンコートしたプラスチック培養皿上でマニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアルに記載の方法に従って未分化な形質を保ちながら培養した。
ＰＡ６細胞は、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むα−ＭＥＭ培地を用い、児玉らの方法（Ｈ．Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２，８９（１９８２））に従って培養した。
ＭＥＦ細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地に１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＥＳ  Ｃｅｌｌ−Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ；ライテックオリエンタル株式会社製）、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを加えた培地を用い、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアルに記載の方法に従って調製し、培養した。
単一細胞状態としたＥＳ細胞と、ＰＡ６細胞またはＭＥＦ細胞とを共培養することで、ＥＳ細胞を分化誘導させた。
単一細胞状態としたＥＳ細胞ＥＢ５の調製は、以下のように行った。
培地交換を行い３０％コンフルエント状態にまでＥＳ細胞ＥＢ５を増殖させた。培地を除き、ＰＢＳ（−）を用いて２回洗浄した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ（−）を加え３７℃で２０分間培養した。該培養液を、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地に１０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  ＳＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、２ｍＭグルタミン、１００μＭ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、１ｍＭピルビン酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μＭ  ２−メルカプトエタノールを加えた培地（以下、「無血清培地」と略す）に懸濁した。該懸濁液を、４℃、２００×ｇで５分間遠心分離を行ない、沈殿した細胞を再び無血清培地に懸濁することで単一細胞状態としてＥＳ細胞ＥＢ５を調製した。
ＰＡ６細胞またはＭＥＦ細胞は、あらかじめ培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、上述の無血清培地を加えることでフィーダー細胞として調製した。
調製したＰＡ６細胞が培養されている培養器に、単一細胞状態に調製したＥＳ細胞ＥＢ５を１０〜１００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。コントロールとしてゼラチンコートしただけの培養器に上記のＥＳ細胞を同様に播種し同様に培養した。
８日間共培養後、培養器内の培地を除き、４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え３０分間固定した。固定した細胞を、代表的な神経マーカーであるＮＣＡＭに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、以下、「抗ＮＣＡＭ抗体」と略す）、神経特異的なマーカーであるクラスＩＩＩβチューブリンに対する抗体（Ｂａｂｃｏ社製、以下、「抗チューブリン抗体」と略す）、神経前駆細胞特異的なマーカーであるネスチンに対する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、以下、「抗ネスチン抗体」と略す）を用い、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に記載の方法に従って免疫染色を行なった。
上記と同様の方法で、ＰＡ６細胞とＥＳ細胞ＥＢ５とを１０日間共培養した。培養器内の細胞を固定後、ドーパミン作動性神経のマーカーであるチロシン水酸化酵素に対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、コリン作動性神経のマーカーであるＶＡｃｈＴに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｎｃｏ社製）、ＧＡＢＡ作動性神経のマーカーであるＧＡＤに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、セロトニン作動性神経のマーカーであるセロトニンに対する抗体（Ｄｉａ  Ｓｏｒｉｎ社製）あるいはノルアドレナリン神経マーカーであるドーパミンβ水酸化酵素に対する抗体（ＰＲＯＴＯＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて免疫染色を行った。
培養器として組織培養用３ｃｍデッシュ（プラスチック製、ＦＡＬＣＯＮ社製）を用い、１）ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として調製したデッシュ、２）ＭＥＦ細胞をフィーダー細胞として調製したデッシュ、３）ゼラチンコートしただけのデッシュのそれぞれに、２００個のＥＳ細胞ＥＢ５を播種し培養した結果を図に示した。
単一細胞状態で播種されたＥＳ細胞ＥＢ５は互いに凝集することなくフィーダー細胞あるいはデッシュ表面に付着し、細胞分裂を繰り返しコロニーを形成した（以下、「ＥＳ細胞由来のコロニー」あるいは単に「コロニー」という）。
第１図はＰＡ６細胞との共培養の結果、出現したコロニーを（Ａ）抗ＮＣＡＭ抗体、（Ｂ）抗チューブリン抗体、（Ｃ）抗ネスチン抗体で染色した結果を示した。第２図はＭＥＦ細胞との共培養の結果、出現したコロニーを抗ＮＣＡＭ抗体で染色した結果を示した。第３図はＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーをチロシン水酸化酵素に対する抗体（以下、「抗チロシン水酸化酵素抗体」と略す）で染色した結果を示した。第４図はＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの中で各種マーカー陽性のコロニーの割合を経時的に示した。コロニーの割合は、上述の１）、２）、３）のそれぞれの条件で共培養を行ったデッシュを１６０枚づつ用意し、出現した全てのコロニーの染色強度を顕微鏡で観察することによって算出した。
条件１）のＰＡ６細胞をフィーダー細胞として調製した共培養系ではＥＳ細胞ＥＢ５由来のコロニーの９０％（ｎ＝１６０）は第１図Ａに示すようにＮＣＡＭ強陽性であった。それらのコロニーでは抗チューブリン抗体（第１図Ｂ）、抗ネスチン抗体（第１図Ｃ）とも染色陽性であった。一方、条件２）のＭＥＦ細胞との共培養では有意な神経マーカーの出現は認められなかった（第２図）。ゼラチンコートした培養器上で培養したコロニーも、条件２）のＭＥＦ細胞との共培養で出現したコロニーと同様の染色結果であった。条件１）のＰＡ６細胞をフィーダー細胞として調製した共培養系では抗チロシン水酸化酵素抗体に陽性のＥＳ細胞由来のコロニーが高頻度に出現した（８９％）（第３図）。ＰＡ６細胞とＥＳ細胞ＥＢ５との共培養の結果、経時的には第４図に示すように、共培養開始３日後からネスチン陽性のコロニーが、４日後からチューブリン陽性のコロニーが出現している。また、チロシン水酸化酵素陽性のコロニーは５日後から出現し、１０日後でピークに達した。この間、ノルアドレナリン神経マーカーであるドーパミンβ水酸化酵素に対する抗体による免疫染色は陰性であった。１０日後におけるコリン作動性神経のマーカーであるＶＡｃｈＴ陽性のコロニーは５％，ＧＡＢＡ作動性神経のマーカーであるＧＡＤに陽性のコロニーは１５％，セロトニンに陽性のコロニーは４％であった。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例２
胚性幹細胞の非神経系外胚葉細胞への分化：
実施例１に記載の無血清培地に、０．５ｎｍｏｌ／ｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した培地を作製した。作製したＢＭＰ４添加無血清培地を実施例１で用いた無血清培地の代わりに用い、実施例１に記載した方法に従ってＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞の共培養を行なった。８日間の培養後、抗ＮＣＡＭ抗体、抗ネスチン抗体および非神経外胚葉細胞マーカーであるＥカドヘリンに対する抗体（宝酒造社製）を用いて細胞免疫染色を行なった。コントロールとして、ＢＭＰ４未添加無血清培地を用いて共培養を行った。結果を第５図Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆに示した。
また、ＢＭＰ４添加無血清培地を用いて８日間培養した後、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を含むＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地に交換し、さらに３日間培養した。培養細胞を４％パラフォルムアルデヒド溶液を加えて３０分間固定し、皮膚表皮細胞マーカーであるケラチン１４に対する抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉａ社製）を用いて、細胞の免疫染色を行なった結果を、牛血清未添加培地を用いてさらに３日間培養した場合と比較して第５図Ｇ、Ｈ、Ｉに示した。
実施例１に示したように、ＢＭＰ４未添加培地を用いた場合、ＥＳ細胞由来のコロニーは抗ＮＣＡＭ抗体強陽性（第５図Ａ）、抗ネスチン抗体強陽性（第５図Ｂ）であった。それに対し、Ｅカドヘリン陽性のコロニーは少数（１８％）であった（第５図Ｃ）。一方、ＢＭＰ４添加無血清培地を用いた培養ではＥＳ細胞由来のコロニーは抗ＮＣＡＭ抗体陰性（第５図Ｄ）、抗ネスチン抗体陰性（第５図Ｅ）であったが、Ｅカドヘリン陽性のコロニーが高頻度に（９８％）出現した（第５図Ｆ）。ケラチン１４陽性のコロニーは、ＢＭＰ４未添加培地を用いた場合全く出現しなかった（第５図Ｇ）が、ＢＭＰ４添加無血清培地を用いた培養では３４％の頻度で出現した（第５図Ｈ）。ＢＭＰ４添加無血清培地を用いて８日間培養した後、１０％牛胎児血清を含むＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地を用いてさらに３日間培養したものでは、ケラチン１４陽性のコロニーの頻度（４７％）もコロニーのサイズも共に有意に増加した（第５図Ｉ）。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例３
胚性幹細胞をドーパミン作動性神経細胞へ分化させる活性を有するストローマ細胞の選択：
ＰＡ６細胞、ＭＥＦ細胞、ＳＴＯ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＯＰ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｙ１細胞あるいはＣＯＳ細胞（以下、「各種細胞」と呼ぶ）とＥＳ細胞ＥＢ５との共培養を行なった。
ＳＴＯ細胞はＥｖａｎｓらが記載している方法（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４（１９８１））に従って培養した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞はＪａｉｎｃｈｉｌｌらが記載している方法（Ｊ．Ｌ．Ｊａｉｎｃｈｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４，５４９（１９６９））に従って培養した。ＯＰ９細胞は仲野らが記載している方法（Ｔ．Ｎａｋａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，７２２（１９９６））に従って培養した。ＣＨＯ細胞はＰｕｃｋらが記載している方法（Ｔ．Ｔ．Ｐｕｃｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１０８，９４５（１９８５））に従って培養した。ＭＤＣＫ細胞はＭｉｓｆｅｌｄｔらが記載している方法（Ｄ．Ｓ．Ｍｉｓｆｅｌｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３，１２１２（１９７６））に従って培養した。３Ｙ１細胞はＳａｎｄｉｎｅｙｅｒらが記載している方法（Ｓ．Ｓａｎｄｉｎｅｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１，８３０（１９８１））に従って培養した。ＣＯＳ細胞はＧｌｕｚｍａｎが記載している方法（Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１））に従って培養した。
実施例１に記載の方法に従って、上述の各種細胞とＥＳ細胞ＥＢ５とを８日間共培養し、抗ＮＣＡＭ抗体で免疫染色し、陽性のＥＳ細胞由来のコロニーの割合を調べた。その結果、ＰＡ６細胞、ＯＰ９細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、それぞれ９５％、４５％、１０％の陽性率を示し、これら細胞はＥＳ細胞に対して有為な神経分化誘導活性を有することが分かった。一方、他の細胞は有意な神経分化誘導活性を示さなかった。
次に、パラフォルムアルデヒドで固定した上述の各種細胞とＥＳ細胞との共培養を行なった。
あらかじめ培地交換を行ない細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達した各種細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え４℃で３０分間放置することで固定した。固定した細胞をＰＢＳ（−）溶液で数回洗浄することで各種細胞を調製した。
調製した各種細胞をフィーダー細胞として用い、実施例１に記載の方法に従ってＥＳ細胞ＥＢ５との共培養を行なった。パラホルムアルデヒドで固定した細胞を用いた場合、ＰＡ６細胞、ＯＰ９細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＥＦ細胞、ＳＴＯ細胞との共培養でＥＳ細胞の神経細胞への分化が高率に観察されたが、３Ｙ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞との共培養では観察されなかった。このことから、一群のストローマ細胞すなわち、ＰＡ６細胞、ＯＰ９細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＥＦ細胞、ＳＴＯ細胞が神経分化誘導活性を有すること、またその活性がパラホルムアルデヒドで固定しても残存することが分かった。また、ＭＥＦ細胞、ＳＴＯ細胞では、パラホルムアルデヒド処理により神経分化誘導活性を阻害する機構が解除されることが示唆された。
実施例４
ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を神経細胞へ分化させる活性の解析：
ストローマ細胞が有する胚性幹細胞を神経細胞へと分化させる活性を解析するために、多孔性フィルターを介してＥＳ細胞とストローマ細胞との共培養を行なった。
多孔性フィルターとして孔径０．４５μｍの６穴用セルカルチャーインサート（商品番号３０９０、ＦＡＬＣＯＮ社製）を用いた。ＰＡ６細胞をセルカルチャーインサートの中側に培養し、フィルター上に接着したＰＡ６細胞を実施例１に記載の方法に従ってフィーダー細胞として調製した。
ゼラチンコートした６穴カルチャーディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、実施例１に記載した無血清培地に懸濁したＥＳ細胞ＥＢ５を４００個／穴で播種し、上述のＰＡ６細胞をフィーダー細胞として調製したセルカルチャー・インサートを穴に挿入して培養した。即ち、６穴カルチャーデッシュ上に播種されたＥＳ細胞ＥＢ５と、フィーダー細胞としてセルカルチャー・インサート内に調製されたＰＡ６細胞とをフィルター膜を介して共培養した。培養開始後４日目、６日目、７日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。８日間共培養後、培地を除き、４％パラフォルムアルデヒド溶液を加え３０分間固定した。固定した細胞を、神経特異的なマーカーであるチューブリンに対する抗体（Ｂａｂｃｏ社製）を用い、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に記載の方法に従って免疫染色を行なった。チューブリン陽性のコロニーの出現割合をフィルターを介さないで培養した場合として比較して第６図に示した。
ＰＡ６細胞とＥＳ細胞ＥＢ５とをフィルターを介して共培養した場合（第６図，フィルター）は２５％のコロニーでチューブリン陽性となった。これはフィルターを介さないで培養した場合（第６図，ＰＡ６）に比して１／３程度の効率であるが、ＰＡ６細胞なしでゼラチン上で培養した場合（第６図、ゼラチン；陽性率３％以下）に比して有意に高い神経分化が認められた。
実施例５
ドーパミン作動性神経細胞に分化した胚性幹細胞の脳内移植の解析（その１）：
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で１０日間培養した。すなわち、６ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞ＥＢ５を２０００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、８日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて１０日間培養した。
培養の結果分化誘導された細胞を、細胞系譜トレーサーのＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用い、添付資料に従って蛍光標識した。標識後、Ｐａｐａｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）を用い、キット添付書類の方法に従ってパパイン酵素処理を室温で５分間行い、形成されたＥＳ細胞由来の各コロニーをほぼ一塊としてフィーダー細胞から分離した。なお、コロニー内の神経細胞にダメージを与えることを避けるため、分化誘導により形成された各コロニーをできるだけ一塊としてフィーダー細胞から分離し、移植に用いた。
キットに添付のパパイン阻害剤で酵素を失活させた後、１５ｍｌの遠心チューブを用いて３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分化誘導したＥＳ細胞塊を回収した。６ｃｍディッシュ１枚分より回収された分化誘導ＥＳ細胞塊を５μｌのＮ２添加Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社製）に浮遊させ、下記の移植に用いた。
移植および薬物注入はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（１９９９））３．１０に記載の方法に従って行った。定位脳固定装置（ナリシゲ社製）にネンブタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウスを固定し、Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社製（１９９７））に従って線条体を位置同定した。局所のドーパミン神経を破壊するために、６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（２，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（以下、「６−ＯＨＤＡ」という）をＰＢＳに８ｍｇ／ｍｌで溶解し、これを微小ガラス管を用いて、片側の線条体の吻側と尾側に１カ所４μｌずつ計２カ所注入した。一部のマウスでは３日後、注入側の錐体外路症状を確認した上で、針先平坦の２６Ｇハミルトンシリンジを用いて同側の線条体中央付近に上述の方法で神経細胞に分化誘導させたＥＳ細胞塊の浮遊液２μｌを４分間かけて注入した。６−ＯＨＤＡ処理より８日後、マウス脳を灌流固定して組織標本を作製し、それを、ドーパミン作動性神経のマーカーであるチロシン水酸化酵素に対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）とドーパミントランスポーターに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を用いて免疫染色を行った。
ドーパミン神経の破壊のため６−ＯＨＤＡで処理し細胞移植を行わなかった群では、同側の線条体内においてチロシン水酸化酵素およびドーパミントランスポーターを発現している神経組織は正常の４０％以下になっていた（ｎ＝６）。それに対し、分化誘導したＥＳ細胞の移植を行った群ではＤｉＩ標識された移植片を中心に、同側の線条体内におけるチロシン水酸化酵素およびドーパミントランスポーターの発現領域が有為に回復し、全体で７５％程度となり（ｎ＝６）、移植によるドーパミン作動性神経細胞の回復が観察された。
実施例６
ドーパミン作動性神経細胞に分化した胚性幹細胞の脳内移植の解析（その２）：
実施例１に記載した方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で８日間培養した。すなわち、６ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞ＥＢ５を２０００個／デッシュで播種し、４日目、６日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
その後さらに、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール、およびＮ２（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、１００倍原液を１００分の１添加）を添加したＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地（以下、「Ｎ２添加Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地」と表記する。）を用い４日間培養した。
培養後、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアルに記載の方法に従い１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を含む培地（上記Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地）で２時間培養を行った。
上記培養の結果分化誘導された細胞を、Ｐａｐａｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍキット（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）を用い、添付書類の方法に従ってパパイン酵素処理を室温で５分間キット行い、形成されたＥＳ細胞由来の各コロニーをほぼ一塊としてフィーダー細胞から分離した（なお、コロニー内の神経細胞に損傷を与えることを避けるため、分化誘導により形成された各コロニーをできるだけ一塊としてフィーダー細胞から分離した）。コロニーを分離後、コロニーを形成する細胞を細胞系譜トレーサーのＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用い添付資料に従い、５μｇ／ｍｌ  ＣＭ−ＤｉＩ、４ｍｇ／ｍｌグルコースを含むＰＢＳ溶液中で室温２０分間反応させることで蛍光標識した。標識後、Ｎ２添加Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地を用いて洗浄し、Ｎ２添加Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地１μｌに約４×１０５個の細胞が含まれるように調製し、下記の移植に用いた。
移植および薬物注入はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、１９９９）３．１０に記載の方法に従って行った。定位脳固定装置（ナリシゲ社製）にネンブタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウスを固定し、Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９７）に従って線条体を位置同定した。局所のドーパミン神経を破壊する６−ＯＨＤＡをＰＢＳに８μｇ／μｌで溶解し、これを微小ガラス管を用いてＴｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社製、１９９７）に従い片側の線条体に１カ所０．５μ１ずつ計３カ所（（Ａ＋０．５，Ｌ＋２．０，Ｖ＋３．０）（Ａ＋１．２，Ｌ＋２．０，Ｖ＋３．０）（Ａ＋０．９，Ｌ＋１．４，Ｖ＋３．０））に注入した。一部のマウスでは３日後、注入側の錐体外路症状を確認した上で、針先平坦の２６Ｇハミルトンシリンジを用いて同側の線条体中央付近（Ａ＋０．９，Ｌ＋２．０，Ｖ＋３．０）に上述の方法で神経細胞に分化誘導させたＥＳ細胞塊の浮遊液１μｌを３分間かけて注入した。対照群には１μｌのＮ２添加Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地を注入した。６−ＯＨＤＡ処理より１４日後マウス脳を灌流固定し、ドーパミン作動性神経のマーカーであるチロシン水酸化酵素に対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）とドーパミントランスポーターに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を用いて免疫染色を行った。
ドーパミン神経を破壊する６−ＯＨＤＡで処理し細胞移植を行わなかった群では、同側の線条体内においてチロシン水酸化酵素およびドーパミントランスポーターを発現している神経組織は正常の１５％以下になっていた（ｎ＝５）。それに対し、細胞移植を行った群ではＤｉＩ標識された移植片を中心に、同側の線条体内におけるチロシン水酸化酵素およびドーパミントランスポーターの発現領域が有意に回復し、全体で５０％程度となった（ｎ＝５）。また、移植２週間後においても奇形腫テラトーマの形成は観察されなかった。
実施例７
胚性幹細胞の神経性外胚葉細胞への分化過程の解析：
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で８日間培養した。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞ＥＢ５を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
８日間共培養後、実施例１に記載の方法に従って細胞を固定し、抗ＮＣＡＭ抗体、抗クラスＩＩＩβチューブリン抗体、抗ネスチン抗体、プレシナプス特異的なマーカーであるシナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）に対する抗体（Ｓｉｇｍａ社製）、神経上皮細胞（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）を認識するＲＣ２抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ社製）、中胚葉細胞を認識するＭＦ２０抗体（ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ社製）、同じく中胚葉細胞においてその発現が観察されているＰＤＧＦ受容体αおよびＦｌｋ１に対する抗体（Ｓ．ＩＮｉｓｈｉｋａｗａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２５，１７４７（１９９８））を用いてＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。
ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニーのほとんどは、実施例１で示した結果同様、抗ＮＣＡＭ抗体で染色された。また、抗体二重染色の結果、抗チューブリン抗体陽性のコロニーは抗シナプトフィジン抗体によって染色され、ネスチン陽性のコロニーは抗ＲＣ２抗体によって染色された。一方、中胚葉細胞のマーカーであるＰＤＧＦ受容体α、Ｆｌｋ１、およびＭＦ２０に対する各種抗体で染色されるコロニーは全コロニー２％以下とほとんど観察されなかった。従って、ＰＡ６細胞との共培養によるＥＳ細胞の神経細胞誘導の過程には中胚葉系細胞の誘導は実質的に伴わないことが示唆された。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例８
胚性幹細胞の非神経性外胚葉細胞への分化過程の解析：
実施例１に記載の無血清培地に０．５ｎｍｏｌ／ｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した培地を作製した。作製したＢＭＰ４添加無血清培地を実施例１で用いた無血清培地の代わりに用い、実施例１に記載した方法に従ってＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養を行った。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
８日間共培養後、実施例１に記載の方法に従って細胞を固定し、抗ＮＣＡＭ抗体、抗Ｅカドヘリン抗体、中胚葉細胞を認識するＭＦ２０抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ社製）、同じく中胚葉細胞においてその発現が観察されているＰＤＧＦ受容体αおよびＦｌｋ１に対する抗体（Ｓ．Ｉ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２５，１７４７（１９９８））を用いてＥＳ細胞とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。
ＥＳ細胞とＰＡ６細胞をＢＭＰ４添加無血清培地を用い共培養することで、実施例２で示した結果と同様、ＮＣＡＭ陰性Ｅカドヘリン陽性のコロニーが高頻度に出現した。一方、中胚葉細胞のマーカーであるＰＤＧＦ受容体α、Ｆｌｋ１、およびＭＦ２０に対する各種抗体で染色されるコロニーは全コロニーの５％以下とほとんど観察されなかった。従って、ＢＭＰ４存在下、ＰＡ６細胞との共培養によるＥＳ細胞の非神経系外胚葉細胞への誘導の過程には中胚葉系細胞の誘導は実質的に伴わないことが示唆された。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例９
胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞コロニーの解析：
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で１２日間培養した。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、８日目、１０日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて１２日間培養した。
１０日間共培養後、一部のデッシュの細胞を実施例１に記載の方法に従って固定し、チロシン水酸化酵素、ＶＡｃｈＴ、ＧＡＤ、セロトニンに対する抗体を用いてＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った（ｎ＝２００）。
ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーのうち、９２％がドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素陽性、４３％がＧＡＢＡ作動性神経細胞のマーカーであるＧＡＤ陽性、２８％がコリン作動性神経細胞のマーカーであるＶＡｃｈＴ陽性、７％がセロトニン陽性であった。
引き続き、残りのデッシュの培養を続け、１２日間培養後に実施例１に記載の方法に従って細胞を固定し、クラスＩＩＩβチューブリン、ネスチン、チロシン水酸化酵素に対する抗体を用いてＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。また、コロニーを形成する全細胞の数を測定する為に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社のキットＹＯＹＯ−１を用いた核染色を行った。核染色後、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニー（ｎ＝２０）をランダム選択し、共焦点顕微鏡で観察する事によって染色された細胞数をカウントした（ｎ＝５０５０）。
カウントした全細胞のうち、クラスＩＩＩβチューブリン陽性細胞、ネスチン陽性細胞、チロシン水酸化酵素陽性細胞の割合はそれぞれ、５２±９％、４７±１０％、３０±４％であった。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例１０
胚性幹細胞から分化誘導されたドーパミン作動性神経細胞の解析（その１）：
実施例１に記載の方法によって、胚性幹細胞から分化誘導される神経細胞の性質をより詳細に解析する為に、中脳のドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるＮｕｒｒｌ（Ｒ．Ｈ．Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，２４８（１９９７））およびＰｔｘ３（Ｍ．Ｐ．Ｓｍｉｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３３０５（１９９７））の該分化誘導に伴う発現変化をＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた。
細胞の調製は以下のように行った。
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で１２日間培養した。すなわち、９ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞ＥＢ５を５×１０４個／デッシュで播種し、４日目、６日目、８日目、１０日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて１２日間培養した。
また、実施例１で示したＥＳ細胞培養用培地を用い、９ｃｍの組織培養用デッシュにＥＳ細胞ＥＢ５を５×１０４個／デッシュで播種し、４日目、６日目、８日目、１０日目に新鮮な培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて１２日間培養した細胞を対照として調製した。
上記調製した分化誘導した細胞および対照ＥＳ細胞における、ＮｕｒｒｌおよびＰｔｘ３のｍＲＮＡレベルでの発現を検出する為に、マウス胎生１２日の胎児頭部をポジティブコントロールとして用い、笹井らによって報告されている方法（Ｙ．Ｓａｓａｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３３３（１９９５））に準じてＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、細胞を調製したデッシュおよび胎生１２日の胎児頭部から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用い添付マニュアルに従って全ＲＮＡを調製し、ＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを滅菌水を用いて５０倍に希釈した溶液を材料にして常法により反応液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰ，０．２μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー（配列表に記載），１ｕｎｉｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製））を調製後、９４℃で３分間反応させ、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル反復し、最後に７２℃で７分間反応させ、４℃で一晩保存する条件でＰＣＲを行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動し用いたプライマーに特異的なＤＮＡバンドの濃さを比較することで、各種因子の発現量の半定量的な比較を行った。
なお、配列番号１および２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＮｕｒｒｌ特異的プライマーとして、配列番号３および４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＰｔｘ３特異的プライマーとして、配列番号５および６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＧ３ＰＤＨ特異的プライマーとして各々用いた。Ｐｔｘ３特異的プライマーを用いてＰＣＲを行う場合にはＤＭＳＯを終濃度５％になるように反応液中に添加して行った。
ＥＳ細胞とＰＡ６細胞を１２日間共培養した結果、実施例１で示した結果と同様に神経細胞様のコロニーが出現した。また、この分化誘導されたコロニーを含む細胞集団では、ポジティブコントロールと同様に、有為なＮｕｒｒ１およびＰｔｘ３の発現が観察された（第７図：ＥＳ＋ＰＡ６）。一方、対照としたＥＳ細胞ではＮｕｒｒ１およびＰｔｘ３の発現が検出されなかった（第７図：ＥＳ）。なお、９ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞を対照に上述の条件でＲＴ−ＰＣＲを行っても、Ｎｕｒｒ１およびＰｔｘ３の発現は検出されなかった。従って、ＰＡ６細胞との共培養によって胚性幹細胞が神経細胞に分化誘導されるに伴い中脳のドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるＮｕｒｒ１およびＰｔｘ３の発現が上昇していることが分かった。
なお、ＥＳ細胞として代表的な１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた共培養の場合にも上記と同様の結果が得られた。
実施例１１
胚性幹細胞から分化誘導されたドーパミン作動性神経細胞の解析（その２）：
実施例１に記載の方法によって、胚性幹細胞から分化誘導される神経細胞の性質をより詳細に解析する為に、ドーパミンの生産量を常法（Ｋ．Ｉｎｏｕｅ  ＆  Ｊ．Ｇ．Ｋｅｎｉｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，８１５７（１９８８）；今泉美佳、熊倉鴻之助、実験医学別冊  神経生化学マニュアル、ｐ１９１−２００（１９９０））に従いＨＰＬＣを用いて定量した。
細胞からの測定試料の調製は以下のように行った。
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で８日間培養した。すなわち、９ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞を５×１０４個／デッシュで播種し、４日目、６日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。その後さらに、２ｍｍｏｌ／ｌグルタミン、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ溶液、０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍｍｏｌ／ｌアスコルビン酸、０．１ｍｍｏｌ／ｌテトラヒドロビオプテリン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ）、およびＮ２を添加したＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地を用い６日間培養した。培養後、緩衝液ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて２回洗浄し、洗浄した細胞を５６ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌを含むＨＢＳＳ溶液中で１５分間培養した。１５分後、培養液を回収し、終濃度が０．４ｍｏｌ／ｌ過塩素酸（Ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）および５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡとなるように調整し、測定試料として−８０℃で保存した。
上述のＥＳ細胞とＰＡ６細胞との共培養により約１００万細胞程度のＥＳ細胞由来分化細胞が出現した。また、出現した細胞を用いて調製した測定試料中のドーパミンの定量は、逆相−ＨＰＬＣを用いたＭｏｎｏａｍｉｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｉｃｏｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。結果を第８図に示した。
ＰＡ６細胞との共培養により胚性幹細胞から分化した神経細胞は、５６ｍｍｏｌ／ｌＫＣｌの脱分化刺激により有為な量のドーパミンを遊離していることが分かった（７．７ｐｍｏｌ／１０６細胞（ＥＳ細胞由来分化細胞））。また、ドーパミン派生物質であるＤＯＰＡＣ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびＨＶＡ（ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）も、有為な量が検出された（それぞれ、２．５ｐｍｏｌ／１０６細胞（ＥＳ細胞由来分化細胞）および４．０ｐｍｏｌ／１０６細胞（ＥＳ細胞由来分化細胞））。
従って、ＰＡ６細胞との共培養によって胚性幹細胞から分化誘導されたドーパミン作動性神経細胞は、ドーパミンを産生し機能的な神経として作用し得る能力を有していることがインビトロにおいても示唆された。
実施例１２
原始外胚葉を構成する細胞のドーパミン作動性神経細胞への分化：
ＥＳ細胞ＥＢ５の代わりにマウス胎生６日目の原始外胚葉（Ｐｒｅ−ｓｔｒｅａｋｅｐｉｂｌａｓｔ）から単離した細胞を用い、実施例１あるいは２に記載した方法に従ってＰＡ６細胞との共培養を行った。
マウス胎生６日目の原始外胚葉を構成する細胞の単離および培養は、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアルに記載の方法に従って行った。
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、単離した胚細胞をＢＭＰ４未添加無血清培地で８日間培養した。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上に単離した原始外胚葉細胞を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
また、実施例１で用いた無血清培地に０．５ｎｍｏｌ／ｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した培地を用い、実施例１に記載した方法に従って単離した胚細胞とＰＡ６細胞との共培養を行った。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
８日間共培養後、実施例１に記載の方法に従って細胞を固定し、抗ＮＣＡＭ抗体、抗チューブリン抗体、抗ネスチン抗体、抗Ｅカドヘリン抗体を用いて単離した胚細胞とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。
単離した原始外胚葉の胚細胞を用いた場合でも、ＥＳ細胞ＥＢ５を用いて行った実施例１および２の結果と同様の結果を得、神経系細胞および表皮系細胞の出現が観察された。
実施例１３
ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉系の細胞に分化誘導させる因子の回収：
実施例３に記載の方法に従い、パラフォルムアルデヒド固定したＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をＢＭＰ４未添加無血清培地で８日間培養した。この際、ＰＡ６細胞をヘパリン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含む培地で培養した場合（以下、「ヘパリン処理」という）と、ヘパリン無添加の培地で培養した場合との比較を行った。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞を２００ｎｇ／ｍｌヘパリンを含む培地で２日間培養したデッシュと、ヘパリン無添加の培地で２日間培養したデッシュを調製し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後パラフォルムアルデヒド固定を行い、これらパラフォルムアルデヒド固定したＰＡ６細胞上にＥＳ細胞ＥＢ５を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、７日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて８日間培養した。
８日間培養後、実施例１に記載の方法に従って細胞を固定し、抗ＮＣＡＭ抗体、抗チューブリン抗体、抗ネスチン抗体を用いてＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。
ヘパリン処理を施さなかったＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用いた場合には、実施例３で示した結果同様、９０％近くのＥＳ細胞由来のコロニーがＮＣＡＭ陽性であり、ＥＳ細胞の神経細胞への分化が高率で観察された。一方、ヘパリン処理を施したＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用いた場合にはＥＳ細胞の神経細胞への有為な分化は観察されなかった。このことより、ストローマ細胞が有する胚性幹細胞を外胚葉系の細胞に分化誘導する活性は、Ｗｎｔｓ分子で観察されている現象（Ｒ．Ｓ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ＆  Ａ．Ｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，１５６９（１９９０））と同様に、ストローマ細胞をヘパリンを含む培地で培養することで培養上清中に回収できる事が示唆された。
実施例１４
胚性幹細胞の、背腹軸に沿った多様な神経系の細胞への分化誘導：
中枢神経系の発生において背腹軸に沿った神経の多様性を決定する因子であるｓｈｈやＢＭＰ４の効果を調べるために、以下のようにしてストローマ細胞上で分化を開始したＥＳ細胞にこれら因子を作用させその影響を調べた。
実施例１に記載の方法に従い、ＰＡ６細胞をフィーダー細胞として用い、ＥＳ細胞ＥＢ５をｓｈｈおよびＢＭＰ４を添加していない無血清培地で１０日間培養した。すなわち、３ｃｍの組織培養用デッシュ上でほぼコンフルエントにまで増殖したＰＡ６細胞をフィーダーとして用い、このフィーダー細胞上にＥＳ細胞を２００個／デッシュで播種し、４日目、６日目、８日目に新鮮な無血清培地を用いて培地交換を行い、３７℃で５％ＣＯ２を通気したインキュベーターにて１０日間培養した。
ｓｈｈの効果は、上記と同様の培養方法で、４日目、６日目、８日目の培地交換の際、３００ｎｍｏｌ／ｌのｓｈｈ（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した無血清培地を用いることで評価した。
ＢＭＰ４の効果は、上記と同様の培養方法で、６日目、８日目の培地交換の際、０．５ｎｍｏｌ／ｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を添加した無血清培地を用いることで評価した。
１０日間共培養後、実施例１に記載の方法に従ってそれぞれの培養方法で培養した細胞を固定し、抗ＮＣＡＭ抗体、中枢神経系原基（神経管）の最も腹側に存在する底板のマーカーであるＨＮＦ−３βに対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋより購入）、ＨＮＦ−３βについで腹側から２番目に存在するマーカーであるＮｋｘ２．２に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋより購入）、神経管背側のマーカーであるＰａｘ−７に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋより購入）、神経堤細胞のマーカーであるＡＰ−２に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋより購入）、運動神経のマーカーであるｉｓｌｅｔ  １に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋより購入）、コリン作動性ニューロンのマーカーであるＶＡｃｈＴに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）をそれぞれ用いて、ＥＳ細胞とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニーの免疫染色を行った。
ｓｈｈあるいはＢＭＰ４添加に関わらず、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞の共培養の結果出現したコロニーのほとんどは、実施例１で示した結果同様、抗ＮＣＡＭ抗体で染色され、いずれの場合も、ＥＳ細胞由来のコロニーの９０％が陽性であった。
他のマーカーに対する抗体で染色されるＥＳ細胞由来のコロニーの割合と共に以下の表１に示す。
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以上の結果から、ＰＡ６細胞との共培養によるＥＳ細胞の神経細胞誘導では、神経マーカーであるＮＣＡＭのみならず、各種タイプのニューロン特異的なマーカーを発現する神経系の細胞が出現していることが示された。すなわち、ＰＡ６細胞との共培養によるＥＳ細胞の分化誘導では、中枢神経系原基（神経管）の最も腹側の底板に位置するＨＮＦ−３βを発現している神経系の細胞、中枢神経系原基（神経管）の腹側からＨＮＦ−３βについで２番目に存在するマーカーＮｋｘ２．２を発現している神経系の細胞、Ｐａｘ−７を発現している神経管背側の神経細胞、ＡＰ−２を発現している神経堤の細胞、ｉｓｌｅｔ  １を発現している運動神経細胞に分化誘導される。
また、胚の神経発生過程で背腹軸の決定に関与することが明らかにされているｓｈｈやＢＭＰ４に、胚の神経前駆細胞がインビボにおいて示す分化能と同様の分化能を示したことから、ＰＡ６細胞とのＥＳ細胞を共培養することで、背腹軸が決定される前の段階の神経管の細胞が誘導されていることが示された。すなわち、この神経管の細胞では、神経管の腹側化因子であるｓｈｈの作用により、腹側マーカーＨＮＦ−３βおよびＮｋｘ２．２の発現誘導が観察され、背側マーカーＰａｘ−７およびＡＰ−２の発現抑制が観察される。また、神経管の背側化因子であるＢＭＰ４を作用させた場合には、反対に、腹側マーカーＨＮＦ−３βおよびＮｋｘ２．２の発現抑制が観察され、背側マーカーＰａｘ−７およびＡＰ−２の発現誘導が観察される。
なお、ＥＳ細胞として代表的な、１２９系マウス由来のＣＣＥ細胞（Ｍ．Ｒ．Ｋｕｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）；ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製）を用いた場合にも同様の結果が得られた。
実施例１５
ストローマ細胞ＰＡ６を認識するモノクローナル抗体の作製：
（１）免疫原の調製
ＰＡ６細胞を免疫原として用いた。ＰＡ６細胞は、実施例１に記載した方法に従って培養した。細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達したＰＡ６細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１０μｇ／ｍｌアクチナーゼ（科研製薬社製）および０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）溶液を加え３７℃で３０分間培養し、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むα−ＭＥＭ培地を加えてアクチナーゼの作用を止め、４℃で１０００×ｇ、５分間遠心分離することで回収した。回収した細胞は、ＰＢＳ（−）に再度懸濁し再び４℃で１０００×ｇ、５分間遠心分離することで洗浄した。ＰＢＳ（−）で２度洗浄した細胞１０７個を１ｍｌＰＢＳ（−）に懸濁し免疫原として用いた。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（１）で調製した細胞１０７個を水酸化アルミニウムアジュバント（アンチボディ・ア・ラボラトリー・マニュアル，ｐ．９９）２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６〜８週令雌ＳＤラット各３匹に投与した。投与２週間後より、上記（１）で調製した細胞１０７個を１週間に１回、計４回投与した。該ラットの頚動脈より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
摘出した脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）酵素免疫測定法（バインディングＥＬＩＳＡ）
ＰＡ６細胞を９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社製）の各ウェルに播種し、コンフルエント状態にまで増殖させたプレートを抗原プレートとして用いた。該プレートに被免疫ラット抗血清あるいはモノクローナル抗体の培養上清を５０μｌ／ウェルで分注し、３７℃で１時間放置した。１時間後、添加した抗血清あるいは培養上清を除き、０．２５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（−）を添加し室温で３０分間放置した。該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ２０相当品：和光純薬社製）／ＰＢＳ（以下、「Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ」と表記）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ／ウェル加えて室温、１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液（２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム、１ｍｍｏｌ／ｌＡＢＴＳ／０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２））を添加し、４１５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（５）ハイブリドーマの作製
実施例１５（２）で得られたマウス脾細胞と実施例１５（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を１０８個のマウス脾細胞あたり０．５ｍｌ加え、該懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。
該懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにＨＡＴ培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ベーリンガーマンハイム社製）を加えた培地）１００ｍｌ中に懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
培養後、培養上清を実施例１５（３）に記載した酵素免疫測定法で調べ、ＰＡ６細胞に反応して１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）（以下、「１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）」溶液と略す）でコートしたコントロールプレートに反応しないウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ＰＡ６モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。その結果、ＰＡ６細胞を抗原に用いて、３種類の抗ヒトＰＡ６細胞抗体ＫＭ１３０６、ＫＭ１３０７、ＫＭ１３１０を取得した。
ＫＭ１３１０産生ハイブリドーマ細胞株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５７３として平成１３年４月２７日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に実施例１５（５）で得られたハイブリドーマ株を５×１０６〜２０×１０６匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＭモノクローナル抗体は、硫安沈殿法（アンチボディ・ア・ラボラトリー・マニュアル）により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により、ＫＭ１３０６、ＫＭ１３０７、ＫＭ１３１０すべてがＩｇＭと決定された。
（７）蛍光抗体法（セルソーター解析）によるＰＡ６細胞との反応性の解析
ＰＡ６細胞は、実施例１に記載した方法に従って培養した。細胞密度がほぼコンフルエント状態にまで達したＰＡ６細胞を、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１０μｇ／ｍｌアクチナーゼ（科研製薬社製）および０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）溶液を加え３７℃で３０分間培養し、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むα−ＭＥＭ培地を加えてアクチナーゼの作用を止め、４℃で１０００×ｇ、５分間遠心分離することで回収した。回収した細胞を１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むα−ＭＥＭ培地に懸濁し、１×１０６細胞ずつ１．５ｍｌチューブに分注した。分注した細胞を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液に懸濁し１０００×ｇ、５分間遠心分離することで２度洗浄した。洗浄した細胞を、１０μｇ／ｍｌの精製抗体（あるいは５０μｇ／ｍｌ硫安沈殿抗体画分）を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液に懸濁し３７℃で３０分間培養することで抗体と反応させた。抗体と反応させた細胞を常法に従い蛍光標識した二次抗体と反応させセルソーターを用いて解析した（アンチボディ・ア・ラボラトリー・マニュアル）。すなわち、抗体と反応させた細胞を１０００×ｇ、５分間遠心分離することで回収し、二次抗体を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液に懸濁し３７℃で３０分間培養し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液で２回洗浄後、２ｍｌの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液に懸濁しセルアナライザー（コールター社；ＥＰＩＣＳ  ＸＬｓｙｓｔｅｍＩＩ）にて解析した。二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラットイムノグロブリン（Ｈ＋Ｌ）；ＣＡＬＴＡＧ社製）を３０倍希釈した１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）溶液を用い、１００μｌ／チューブで使用した。コントロール抗体としてラットＩｇＭの老化抑制タンパク質を認識するモノクローナル抗体であるＫＭ２０７０を１０μｇ／ｍｌで反応させ、同様に検出した。ここで、ＫＭ２０７０は、ハイブリドーマＫＭ２０７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１９６；ＷＯ９８／２９５４４）により、産生される抗体である。尚、ＫＭ２０７０が認識する抗原分子の発現がＰＡ６細胞ではないことをあらかじめ確認の上、ＫＭ２０７０をコントロール抗体として用いた。
第９図、第１０図、第１１図にそれぞれ示したように、ＰＡ６細胞を免疫して得られたＫＭ１３０６、ＫＭ１３０７、ＫＭ１３１０はＰＡ６細胞を認識した。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。図中のｎｅｇａは、抗体を添加しなかった時の結果を示す。
産業上の利用可能性
本発明により、胚性幹細胞から外胚葉細胞および外胚葉由来の細胞を選択的且つ効率的に分化誘導する方法、該分化誘導した細胞並びにそれらの用途が提供される。
配列フリーテキスト
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーを、（Ａ）ＮＣＡＭ、（Ｂ）チューブリン、（Ｃ）ネスチンに対する抗体で染色した結果を示した顕微鏡写真である。
第２図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＭＥＦ細胞との共培養の結果出現したコロニーを抗ＮＣＡＭ抗体で染色した結果を示した顕微鏡写真である。
第３図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーをチロシン水酸化酵素に対する抗体で染色した結果を示した顕微鏡写真である。
第４図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの中で各種マーカー陽性のコロニーの割合を経時的に示したグラフである。
第５図は、ＢＭＰ４無添加でＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの中で、（Ａ）ＮＣＡＭに対する抗体、（Ｂ）ネスチンに対する抗体、（Ｃ）Ｅカドヘリンに対する抗体および（Ｇ）ケラチン１４に対する抗体を用いて染色した結果、およびＢＭＰ４添加でＥＳ細胞とＰＡ６細胞との共培養の結果出現したコロニーの中で、（Ｄ）ＮＣＡＭに対する抗体、（Ｅ）ネスチンに対する抗体、（Ｆ）Ｅカドヘリンに対する抗体および（Ｈ、Ｉ）ケラチン１４に対する抗体を用いて染色した結果を示した顕微鏡写真である。
第６図は、ＰＡ６細胞とＥＳ細胞ＥＢ５を、フィルターを介して共培養した場合（フィルター）、フィルターを介さないで共培養した場合（ＰＡ６）、およびＰＡ６細胞なしにＥＳ細胞ＥＢ５をゼラチン上で培養した場合（ゼラチン）とで、出現したコロニーをチューブリンに対する抗体を用いて染色した結果を示したグラフである。
第７図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現した分化細胞中のＮｕｒｒ１、Ｐｔｘ３およびＧ３ＰＤＨの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した結果を示した図である。胎生１２日のマウス頭部の細胞（図中、Ｅｍｂｒｙｏと表記）、ＰＡ６細胞と１２日間共培養したＥＳ細胞ＥＢ５（図中、ＥＳ＋ＰＡ６と表記）および対照として１２日間培養したＥＳ細胞ＥＢ５（図中、ＥＳと表記）を材料として、ＲＴ−ＰＣＲを行いアガロース電気泳動にて解析した結果を示した。
第８図は、ＥＳ細胞ＥＢ５とＰＡ６細胞との共培養の結果出現した分化細胞を脱分化刺激することで、培地中に分泌された成分をＨＰＬＣ法にて解析した結果を示したクロマトグラフである。対照として、フィーダー細胞として用いたＰＡ６細胞のみに対して同様の脱分化刺激を与えた際に分泌された成分の解析を行った結果を右上のクロマトグラフに示した。
第９図は、モノクローナル抗体ＫＭ１３０６とＰＡ６細胞との反応性を、セルソーターを用い蛍光抗体法により解析した結果を示すものである。対照として、抗体の種およびサブクラスが一致したラットＩｇＭモノクローナル抗体ＫＭ２０７０を用いて同様の解析を行った結果を示した。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
第１０図は、モノクローナル抗体ＫＭ１３０７とＰＡ６細胞との反応性を、セルソーターを用い蛍光抗体法により解析した結果を示すものである。対照として、抗体の種およびサブクラスが一致したラットＩｇＭモノクローナル抗体ＫＭ２０７０を用いて同様の解析を行った結果を示した。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
第１１図は、モノクローナル抗体ＫＭ１３１０とＰＡ６細胞との反応性を、セルソーターを用い蛍光抗体法により解析した結果を示すものである。対照として、抗体の種およびサブクラスが一致したラットＩｇＭモノクローナル抗体ＫＭ２０７０を用いて同様の解析を行った結果を示した。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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