(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの翻訳を有する組換え発現系における蛋白質産
生に関する方法であって、
ａ）野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造を予測する工程と、
ｂ）前記野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造と比較して、修飾型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造が増大した自由エネルギーを有するように、前記野生型異種ＤＮＡ配列を修飾して修飾型異種ＤＮＡ配列を産生するものである、前記修飾する工程であって、前記修飾型異種ＤＮＡ配列はＩｇＥシグナルリーダー配列を有するものである、前記修飾する工程と、
ｃ）蛋白質産生の組換え発現系において、前記修飾型異種ＤＮＡ配列を用いる工程（ただし、インビボにおける人体の使用を除く）と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ＩｇＥシグナルリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳをコードする核酸配列を有するものである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記組換え発現系は、無細胞試験管内転写および翻訳系、試験管内細胞発現系、及びＤＮＡ直接注入に用いられるＤＮＡ構築物、から成る群より選択されるものである。
【請求項４】
組換え発現系において蛋白質を産生する方法であって、
ａ）野生型異種ＤＮＡ配列を修飾する工程であって、前記修飾はＩｇＥシグナルリーダー配列を有するものである、前記修飾する工程と、
ｂ）蛋白質産生の組換え発現系において、前記修飾型異種ＤＮＡ配列を用いる工程（ただし、インビボにおける人体の使用を除く）と
を有する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記ＩｇＥシグナルリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳをコードする核酸配列を有するものである。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記組換え発現系は、無細胞試験管内転写並びに翻訳系、試験管内細胞発現系、及び直接的なＤＮＡ注入において使用されるＤＮＡ構築物、から成る群から選択されるものである。
【請求項７】
発現系において異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの翻訳を含む組換え発現系において、蛋白質を産生するための単離ＤＮＡ分子であって、
前記ＤＮＡ分子は、ＩｇＥシグナルリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む修飾型異種ＤＮＡ配列を有しており、前記修飾型異種ＤＮＡ配列は、野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造のものと比較して増強された自由エネルギーを有する二次構造を有するものである、単離ＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項７記載の単離ＤＮＡ分子において、前記ＩｇＥシグナルリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳをコードする核酸配列を有するものである。
【請求項９】
組換えウイルスベクターであって、調節エレメントに制御可能な形で結合した蛋白質をコードする修飾型コード配列を含み、前記修飾型コード配列は、ＩｇＥシグナルリーダー配列を有するものである。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えウイルスベクターにおいて、前記ＩｇＥシグナルリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳをコードする核酸配列を有するものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、引用により本明細書の一部に組み込まれている２０００年１０月４日付け出願の米国仮出願番号６０／２３７，８８５号の利益を主張するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
この発明は、一般的に遺伝子発現、遺伝子治療、遺伝免疫の分野に関するものである。
【０００３】
【発明の背景】
遺伝子産物としての蛋白質の発現は、遺伝子コピー数、ゲノム中の遺伝子組み込み部位もしくは遺伝子の位置、転写因子、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率を含む多くの要因の影響を受ける。例えば、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１)の構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの発現は、転写後のレベルにおいてＲｅｖ／Ｒｅｖ反応エレメント（ＲＲＥ)に依存している。このＲｅｖへの依存性は遺伝子発現に対する制限因子となる。加えて、ＨＩＶのＲＮＡ転写産物の様々な領域において形成される、非常に安定なＲＮＡの二次構造は、リボゾームの動きを阻害、あるいは干渉し、効果的に翻訳を制限する。遺伝子転写産物の安定なＲＮＡ二次構造の形成は一般的な現象であり、それによって、広範な種類の遺伝子について、遺伝子産物すなわち蛋白質への翻訳量が制限される。
【０００４】
ここに参考文献として含められる、Ｇｅｎｅ，１９９；２９３−３０１（１９９７年）において、キムらは哺乳類の細胞におけるヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現を至適化する為に、成熟ＥＰＯ蛋白質のリーダー配列と最初の６アミノ酸をコードするコドンを酵母細胞で最も汎用されているコドンに変更し、成熟ＥＰＯ蛋白質のそれ以外の部分をコードするコドンをヒトで最も汎用されているコドンに変更した。
【０００５】
ここに参考文献として含められる、米国特許番号５，９７２，５９６と５，９６５，７２６（パブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ）ら）は、ｍＲＮＡのコード領域内にみられる阻害性あるいは不安定性の配列（ＩＮＳ：ｍＲＮＡを不安定、あるいは十分に利用できなくする、または翻訳できなくする配列）の局在を決定する方法と、ヌクレオチドの群置換により、ＩＮＳを取り除く目的で、ｍＲＮＡをコードしている遺伝子を修飾する方法を述べている。
【０００６】
蛋白質を発現する為の新しい方法が必要であり、治療目的ならびに免疫原性導入遺伝子の蛋白質発現レベルを増加する為の新しい方法が必要である。任意の蛋白質性遺伝子産物の翻訳収量を増加する為の方法が必要である。ＲＮＡ転写産物における、ＲＮＡの二次構造によってもたらされる、任意の遺伝子の蛋白質発現レベルの限界を克服する方法が必要である。本発明は、これらならびに他の必要性に応えようとするものである。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は組換え発現系において蛋白質を産生する方法に関するものであり、発現系において、異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡを翻訳する過程から成り立つ。本方法は野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造を予測する工程と、野生型異種ＤＮＡ配列を修飾することにより、修飾型異種ＤＮＡ配列を産生するものである、前記修飾する工程であって、前記修飾型異種ＤＮＡ配列はＩｇＥシグナルリーダー配列を有するものである、前記修飾する工程とを含む。この修飾型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造は、野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造に比べて、増大した自由エネルギーを有する。さらに、本方法は前記修飾型異種ＤＮＡ配列を用いて、組換え発現系において蛋白質を産生する工程（ただし、インビボにおける人体の使用を除く）を含む。前記組換え発現系は無細胞試験管内転写および翻訳系、試験管内細胞発現系、及び直接的ＤＮＡ注入に用いられるＤＮＡ構築物、のいずれでもあり得る。野生型異種ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの二次構造は、コンピューターとコンピュータープログラムとを用いて予測される。野生型異種ＤＮＡ配列はコード配列のアデニンとチミンの含有量を増加することによって修飾されるが、特にコード配列の５'末端、もしくはコード配列の５'末端で、開始コドンから２００ヌクレオチドまたは１５０ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチド以内において修飾される。
【０００８】
本発明はまた注射可能な医薬成分に関するものである。本医薬成分は核酸分子を含み、蛋白質をコードする修飾型コード配列が制御可能な形で制御エレメントに結合されている。この修飾型コード配列は野生型核酸配列に比較して、高いアデニンとチミンもしくはアデニンとウラシルの含有量を有している。本医薬成分はさらに医薬的に許容される担体を含む。コードされる蛋白質は免疫原でも非免疫原性治療蛋白質でもよい。コード配列の修飾は最初の１００ないし２００塩基以内、またはコード配列の全体にわたって分散された配列の範囲内、または最後の１００ないし２００塩基以内にされ得る。
【０００９】
本発明はまた、組換えウイルスベクターに関するものである。本ウイルスベクターは核酸分子を含み、蛋白質をコードする修飾型コード配列が制御可能な形で制御エレメントに結合されているものであり、前記修飾型コード配列は、ＩｇＥリーダー配列を有するものである。この修飾型コード配列は野生型核酸配列に比較して、高いアデニンとチミンもしくはアデニンとウラシルの含有量を有している。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ヌクレオチドレベルでの変化に起因する、ＲＮＡの二次構造の自由エネルギーの増加と、二次構造の不安定化によって、蛋白質発現が増強されるという、発見に基づいている。ＲＮＡ転写産物の自由エネルギー（Ｘ  ｋｃａｌ）の増加によって、それがコードする蛋白質発現の増加をもたらすということが知られている。
【００１１】
好ましい実施例において、ＲＮＡ転写産物の２００塩基セグメント範囲内の自由エネルギー（Ｘ  ｋｃａｌ）の増加は、それがコードしている蛋白質発現の増加に帰結するであろう。そのセグメントは、５’末端にあることが好ましく、通常開始コドンを含む。いくつかの実施例においては、そのセグメントの長さが２００塩基、１５０塩基、もしくは１００塩基が好ましい。ＲＮＡ分子の二次構造は、その三次元構造において生じる塩基対の集合体である。任意のＲＮＡ分子の二次構造は予測可能であり、そのように予測された二次構造に対して、総体自由エネルギー価が与えられる。予測されるＲＮＡの二次構造に対して予測される最小限の総体自由エネルギーまで総体自由エネルギーの増加をもたらすような、あるいはまた、そのＲＮＡの部分領域に対して予測される二次構造に対して予測される最小自由エネルギーを増加するような、ＲＮＡ転写産物の一次配列の変更が、そのＲＮＡ転写産物によってコードされる蛋白質の発現の増加を促進することが知られている。
【００１２】
本戦略は蛋白質発現を至適化する為のものであり、発現が望まれるどのような場合にも応用される。すなわち、生体内におけるＤＮＡワクチン、生ワクチン、遺伝子治療、あるいは遺伝子導入が含まれるが、これらに限定するものではない。また、試験管内においては原核生物や真核生物（哺乳類、昆虫、酵母）の培養細胞の系を用いての組換え製造法を含むが、これらに限定するものではない。また、生体外においては、細胞が発現構築物を受容し、レシピエントの生体に移植される系を含むがこれに限定するものではない。また、目的の遺伝子の発現、もしくは遺伝子発現を増強することが望まれる、他のいかなる発現系も含まれる。
【００１３】
この発明のひとつの側面は、蛋白質の効率的な発現を促進、もしくは蛋白質の発現レベルの増加を導く蛋白質をコードするＲＮＡを産生することである。ＲＮＡの予測二次構造に対する最小総体自由エネルギーの増加を導く、あるいは、ＲＮＡのひとつかそれ以上の領域の予測二次構造に対する最小自由エネルギーを増加するように、ＲＮＡをコードするＤＮＡの配列を変更することによって、コードされた蛋白質の能率の良い、もしくは、より増強した発現を促進する。
【００１４】
ＲＮＡの二次構造の自由エネルギーの増加は、エネルギー最小化に基づいて入力配列に対して最も安定な構造を計算し予測する、ＭＦＯＬＤのようなプログラムを用いて、さまざまに変更されたバージョンの配列を分析することによってモニターすることができる。ＭＦＯＬＤは、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）、ジャガー（Ｊａｅｇｅｒ）、その同僚らによってデザインされたコンピューターソフトウェアであり(ズーカー、１９７８、ＲＮＡ分子の全ての準至適折り畳みについての知見、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４８−５２．ジャガーら、１９８９、ＲＡＮの二次構造の改善された予測、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：７７０６−７７１０これらはそれぞれ、ここに参考文献として含まれる)、Ｔｕｒｎｅｒとその同僚らによって開発されたエネルギー法則を用いた自由エネルギー最小化によるＲＮＡ二次構造の予測に用いられる(参考文献としてここに含まれる、Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：９３７３−９３７７を参照のこと)。ＭｕｌＦｏｌｄはＭＦＯＬＤのマッキントッシュ版である。ＬｏｏｐＤｌｏｏｐは二次構造描写プログラムである。最も安定な構造は最小限の総体自由エネルギーを持つものである。構造に対する自由エネルギー値が負になればなるほど、より安定である。より高い総体自由エネルギー価を持つ二次構造になることが予測されるＲＮＡ配列の変更は、より安定でないＲＮＡの二次構造に帰結し、ＲＮＡの効率的な翻訳と蛋白質発現の増加を促進する不安定な変化である。
【００１５】
この発明の実践は、もし他の方法で指示されなければ、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術で通常の知識に属する在来法を使用する。このような技術は文献の中で十分に説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ(３ｒｄ  ｅｄ．)Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ(２００１)；  アースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ(２００１)；Ｇｌｏｖｅｒ  &  Ｈａｍｅｓ、ｅｄｓ、．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｓ．Ｉ、II  &  III、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｌｄ(１９９５)；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  &  Ｋａｐｌａｎ、ｅｄｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ウェイアー（Ｗｅｉｒ）ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５th  ｅｄ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｔｄ．、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、(１９９７)；  Ｆｉｅｌｄｓ、Ｋｎｉｐｅ、&Ｈｏｗｌｅｙ、ｅｄｓ．、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ(３ｒｄ  ｅｄ．)Ｖｏｌｓ．Ｉ  &  II、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｓ．(１９９６)；フリント（Ｆｌｉｎｔ）ら、ｅｄｓ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、ａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、(１９９９)；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ(２００１)を参照すること。これらの文献はこの明細書に含まれる。
【００１６】
本明細書の全体にわたり、様々な定義がされている。ほとんどの表現は、通常の知識を有する人には通じる言葉である。本明細書内で下記もしくは他のどこかで特に定義される表現は、この発明の文脈の中で通常の知識を有する者によって一般的に理解される。
【００１７】
ここで使われるように、"組換え発現系"という用語は、対象の遺伝子産物（単数または複数）の発現を目的とする、核酸に基づく任意の方法や実験系のことであり、対象の遺伝子産物（単数または複数）はそれらの発現を目的とする成分から人工的に作られてきた（ヒトが作った）ものである。その成分とは、自然に生じた遺伝資源、合成的もしくは人工的、もしくは天然と人工の遺伝的要素の組み合わせである。一般的に遺伝子産物とは蛋白質、ポリペプチド、ペプチドである。組換え発現系の例としては、無細胞試験管内転写翻訳系、試験管内細胞発現系、ＤＮＡ直接注入に用いられるＤＮＡ構築物、そして、個体にＤＮＡを導入する組換えベクターが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００１８】
ここで使われるように、"異種ＤＮＡ配列"とは自然に存在しない状況におかれた、デオキシリボ核酸に基づく配列のことであり、これらは例えば、組換え構築物、またはプラスミド、またはウイルスの中にあるか、染色体上の自然に存在しない位置に挿入されているか、もしくは、自然に存在しないかまたは異種の細胞に導入されているものである。"異種ＤＮＡ配列"とは任意のＤＮＡ配列のことであって、それは異種のＤＮＡ配列であるか、またはそれが（制御可能であろうとなかろうと）関連もしくは結合する他のＤＮＡ配列と自然には関連しないＤＮＡ配列であるか、またはそれが導入される細胞や生体と自然には関連しないＤＮＡｎｏ配列のことである。異種ＤＮＡ配列の例としては、宿主細胞または生体において、外来性もしくは異種蛋白質性遺伝子産物の発現に用いられた配列が挙げられる。異種ＤＮＡ配列は、宿主細胞の生体内または試験管内、または無細胞試験管内発現系において、蛋白質、ポリペプチド、またはペプチド等の遺伝子産物を発現するように設計された、遺伝物質を有する、ベクターもしくは発現構築物の一部で有り得る。
【００１９】
ここで使われるように、"野生型異種ＤＮＡ配列"という用語は、非自然環境に位置づけられているが、自然な環境におけるその配列から修飾または変更されていないヌクレオチド配列を持つ異種ＤＮＡ配列のことである。例えば、ウイルス遺伝子は、組換え発現構築物に挿入されて、その構築物内での他の配列との関係において異種ＤＮＡ配列であるが、ウイルス遺伝子の核酸配列にはどんな変化も導入されていない。この例において、野生型異種ＤＮＡ配列として、ウイルス遺伝子はウイルスゲノムの中に自然の状態で存在する通りの野生型核酸配列をもつが、組換え発現構築物（新しい環境）との関係においては異種である。野生型異種ＤＮＡ配列はまた、任意のＤＮＡ配列であって、それは核酸配列の変化を含む修飾型（非自然）ＤＮＡ配列を調整するための、参考配列もしくは出発材料（開始バージョン）となり得る。野生型異種ＤＮＡ配列はまた、自然に存在する配列から変更されていないが、自然界には一緒に存在することがない、野生型ＤＮＡ配列の多数の組み合わせにより成り立つこともあり得る。このように、多数の野生型ＤＮＡ配列から成り立つ野生型異種ＤＮＡ配列の例としては、二つの異なる遺伝子由来の野生型遺伝子配列で構成される融合遺伝子がある。
【００２０】
ここで使われるように、"修飾型異種ＤＮＡ配列"とは、非自然環境に位置付けられるだけでなく、自然環境での配列を修飾もしくは変更されたヌクレオチド配列を持つ異種ＤＮＡ配列のことである。例えば、修飾型異種ＤＮＡ配列であるウイルス遺伝子は、組換え発現構築物に挿入されることによって、構築物の中の他の配列との関係において異種であるが、さらに、ウイルスゲノム中の自然な環境に見つけられる野生型ヌクレオチド配列ではなく、修飾または変更されたヌクレオチド配列を持つ。
【００２１】
ここで使われるように、ＲＮＡ二次構造に関する"自由エネルギーの増加"という用語は、ＲＮＡ二次構造に対する自由エネルギー価の増加のことを示す。より多く負である自由エネルギー価は、より少なく負であるところの自由エネルギー価よりも低い。
【００２２】
ここで使われるように、"修飾型コード配列"とは、核酸配列（ＤＮＡ−またはＲＮＡ−に基づく）のことであり、それは遺伝子産物、蛋白質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードし、しかも、野生型または自然に生じるその遺伝子産物、蛋白質、ポリペプチド、もしくはペプチドに対するコード配列から修飾、変更されたものである。そのコード配列はひとつ以上の遺伝資源由来の配列で構成され得る。例えば、そのコード配列は、ある蛋白質の遺伝子由来のリーダー配列と、それ以外の部分は別の蛋白質の遺伝子由来の配列とから成り立つ融合蛋白質をコードする融合遺伝子で有り得る。この融合遺伝子は、一つの融合コード配列として一緒に運ばれ、自然には存在しないものである。この例ように、ひとつ以上の遺伝資源由来の複数の配列から成り立つコード配列の場合、"修飾型コード配列"とは、いかなる修飾も、それぞれ別個のコード配列について、野生型もしくは自然に生じるコード配列に関連して行われたものであることを示す。
【００２３】
ここで使われるように、"野生型コード配列"という用語は、核酸配列（ＤＮＡ−またはＲＮＡ−に基づく）のことであり、それは遺伝子産物、蛋白質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードし、しかも、野生型または自然に生じるその遺伝子産物、蛋白質、ポリペプチド、もしくはペプチドに対するコード配列から修飾、変更されていないものである。コード配列が融合蛋白質をコードする場合、成分部分は、それら構成部分に対する野生型または自然に生じるコード配列から修飾もしくは変更されていない。
【００２４】
ここで使われるように、"より高いアデニンとチミンもしくはアデニンとウラシル含有量"という用語は、コード配列に対する修飾のことであり、その修飾はコード配列を、もしそれがＤＮＡに基づいたものであれば、対応する野生型コード配列より高い濃度のアデニンとチミジン残基を持ち、もしＲＮＡに基づいたものであれば、対応する野生型コード配列より高い濃度のアデニンとウリジン残基を持つ、というような、"修飾コード配列"にすることを指す。
【００２５】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最初の２００塩基"という用語は、それぞれのコード配列の５’末端からの最初の隣接２００ヌクレオチド基を示す。
【００２６】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最初の１５０塩基"という用語は、それぞれのコード配列の５’末端からの最初の隣接１５０ヌクレオチド基を示す。
【００２７】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最初の１００塩基"という用語は、それぞれのコード配列の５’末端からの最初の隣接１００ヌクレオチド基を示す。
【００２８】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最後の２００塩基"という用語は、それぞれのコード配列の３’末端からの最後の隣接２００ヌクレオチド基を示す。
【００２９】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最後の１５０塩基"という用語は、それぞれのコード配列の３’末端からの最後の隣接１５０ヌクレオチド基を示す。
【００３０】
ここで使われるように、野生型コード配列と比較して、修飾型コード配列に関しての"最後の１００塩基"という用語は、それぞれのコード配列の３’末端からの最後の隣接１００ヌクレオチド基を示す。
【００３１】
ここで使われるように、コード配列に関しての"２００塩基の長さまでの領域"という用語は、コード配列の隣接２００ヌクレオチド基までの領域を示す。
【００３２】
ここで使われるように、コード配列に関しての"１５０塩基の長さまでの領域"という用語は、コード配列の隣接１５０ヌクレオチド基までの領域を示す。
【００３３】
ここで使われるように、コード配列に関しての"１００塩基の長さまでの領域"という用語は、コード配列の隣接１００ヌクレオチド基までの領域を示す。
【００３４】
ここで使われるように、"分散修飾"という用語は、修飾を受ける個々の領域が野生型コード配列に比べて、より高いアデニンとチミンもしくはアデニンとウラシル含有量を有するように修飾される、隣接したヌクレオチド基群の少なくとも二つの領域の任意の組み合わせのことを示し、しかも、修飾型コード配列の領域が野生型コード配列と交互に配置されるように、配列の全般に分散されることを示す。これに限るものではないが、例として、修飾型コード配列は修飾された配列領域を交互に含み得る。そして、コード配列の最初の隣接した２００塩基は野生型コード配列と比較してより高いアデニンとチミンもしくはアデニンとウラシルの含有量を持っており、コード配列の次の２００塩基は野生型コード配列に比較して非修飾配列であり、後の隣接した２００塩基領域は野生型コード配列と比較してより高いＡＴまたはＡＵ含有量を持つように修飾される、という具合である。修飾領域の長さは任意であるが、２００、１５０、１００塩基の長さが好ましい。非修飾領域の長さは、修飾領域の位置に依存するので、さまざまな長さになる。好ましい実施例として、分散修飾は、コード配列の全長にわたり、修飾型コード配列と野生型コード配列の交互の領域を有しており、その交互の領域のサイズはそれぞれ、２００塩基または１５０塩基または１００塩基の長さが好ましい。
【００３５】
ここで使われている、"注射可能な医薬品成分"という用語は、患者における使用に対して、医薬品として容認可能な成分であるということ示す。したがって、無菌であり、発熱物質を含まず、本質的に微粒子や微粒物質を含まないものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈＥｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０とＵ．Ｓ．Ｐ．、Ｕ．Ｓ．薬局方の基礎、をここに参照として記載する。
【００３６】
ここで使われている"医薬品として容認可能な担体"は、成分を受取った個人に有害な影響を誘発しない、さまざまな担体のことを含んでいる。例えば、"医薬品的に容認可能な担体"はレシピエントに対して有害な抗体の産生を誘発すべきでない。適切な"医薬品的に容認可能な担体"は、通常の知識を有している者には知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｓｕｐｒａ。に記載されている。
【００３７】
ここで使われている、"標的蛋白質"という用語は、免疫反応に対する標的蛋白質として働き、この発明における遺伝子構築物によってコードされているペプチドと蛋白質を示す。"標的蛋白質"や"免疫原"という用語は交換可能で、それに対して免疫反応を誘発させることができる蛋白質を言及する。標的蛋白質とは免疫原性の蛋白質であり、それは病原体または癌細胞や自己免疫疾患に関係する細胞のような望ましくないタイプの細胞由来の蛋白質と少なくともひとつの抗原決定基を共有しており、それに対する免疫反応が望まれるもののことである。標的蛋白質に対して惹起される免疫反応は、標的蛋白質が関係する、特定の感染症や疾患から個体を保護し、または治療に有用であろう。
【００３８】
ここで使われている、"望まれる蛋白質"は、本発明における遺伝子構築物によってコードされるペプチドと蛋白質のことであり、その遺伝子構築物は免疫反応に対する標的蛋白質として、もしくは遺伝子療法における治療的、補償的蛋白質としても働く。
【００３９】
ここで使われている、免疫原に関する"その免疫原性断片"という句は、それに対して免疫反応が惹起される、免疫原の全長より短い断片のことである。
【００４０】
ここで使われている、"癌抗原"という用語は、癌、腫瘍、もしくは癌細胞に関係し、またはそのマーカーとして働く、任意の蛋白質、ポリペプチドもしくはペプチド、あるいは類似の物質を示す。
【００４１】
ここで使われている、"自己免疫疾患関連蛋白質"とは任意の蛋白質、ポリペプチド、またはペプチド、ならびに類似の物質であって、自己免疫疾患に関与もしくはその原因となる細胞に関連するか、またはその細胞のマーカーとなるものである。
【００４２】
ここで使われている、"非免疫原性治療蛋白質"という用語は、さまざまな病気や異常の治療法において有用な蛋白質、ポリペプチド、ペプチドを示し、そのような治療や処置が必要であるレシピエントの生体、患者もしくは個人の身体への導入で、免疫反応は望まれず、またはもしくは予測されないものを指す。"非免疫原性治療蛋白質"の例として、その蛋白質をコードしている内因性遺伝子の遺伝的欠陥を持つ個人において、欠損もしくは低濃度である蛋白質が挙げられる。"非免疫原性治療蛋白質"の例として、限定するものではないが、サイトカイン、成長因子、血液産物、酵素が含まれる。
【００４３】
ここで使われている、"組換えウイルスベクター"という用語は、ウイルスゲノムに基づいた構築物を示し、それは、対象の蛋白質、ポリペプチド、ペプチドをコードする核酸を運ぶための担体として使われる。組換えウイルスベクターは通常の知識を有するところにおいてはよく知られており、広く報告されている。組換えウイルスベクターは、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターを含み、それらは普通の方法と出発材料を用いて準備される。
【００４４】
ここで使われている、"遺伝的構築物"という用語は、標的蛋白質または免疫修飾蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子のことである。そのコード配列は、核酸分子を投与された個々の細胞において直接発現できるように、プロモーターとポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと連結可能な開始、終結シグナルを含む。
【００４５】
ここで使われている、"発現可能な形体"という用語は、遺伝子構築物のことである。これは必須調節エレメントを持ち、標的蛋白質または免疫修飾蛋白質をコードするコード配列に制御可能な形で連結されており、個々の細胞内に存在する時、そのコード配列が発現される。
【００４６】
ここで使われている、"抗原決定基の共有"という用語は、他の蛋白質の抗原決定基と同一もしくはほぼ同じである、少なくともひとつの抗原決定基を有する蛋白質を示す。
【００４７】
ここで使われている、"実質的に同様の抗原決定基"という用語は、蛋白質の抗原決定基と同一ではないが、それにも関わらず、その蛋白質と交差反応する細胞性もしくは体液性免疫反応を惹起する構造を持つ抗原決定基のことを意味する。
【００４８】
ここで使われている、"細胞内病原体"という用語は、複製または生活環の少なくとも一区間で宿主細胞の中に存在し、その中で病原体蛋白質を生産もしくは生産を引き起こす、ウイルスもしくは病原生物体のことを意味する。
【００４９】
ここで使われている、"過剰増殖病"という用語は、細胞の過剰増殖を特徴とする病気や異常のことを意味している。
【００５０】
ここで使われている、"過剰増殖関連蛋白質"という用語は、過剰増殖病、およびもしくは過剰増殖細胞に関連した蛋白質のことを意味している。
【００５１】
いくつかの好ましい実施例において、ＲＮＡの変化は蛋白質の配列を変化しないことが好まれる。いくつかの好ましい実施例において、変化が導入された２００塩基は、ＲＮＡ転写産物の５’末端にあることが好まれる。いくつかの好ましい実施例において、ＲＮＡ転写産物のひとつ以上のセグメントにおいて自由エネルギーが増加することが好まれる。ＲＮＡ二次構造の自由エネルギー増加のために、任意にリーダー配列を加える。
【００５２】
オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）配列の５’末端にある安定性ＲＮＡ二次構造は、リボゾーム機能を阻害することによって転写を効果的にブロックする。多くのＲＮＡ分子は高度に安定な二次構造の整合性を持っており、これらの相互作用は、遺伝子発現を阻害できる。アデニンとチミンが豊富な配列で至適化したように修飾型、リーダー配列をコードする配列の添加は、予測ＲＮＡ構造のより高い自由エネルギーに帰結し、細胞性リボゾームによる効果的な開始を認めた。安定性ＲＮＡ二次構造は自由エネルギーの増加によって除かれる。
【００５３】
従って、この発明によれば、ＲＮＡ二次構造の整合性の減少と、ＲＮＡ転写産物における阻害二次構造（ステムループ）の解離による蛋白質の発現/翻訳の増加という結果によって、コード配列内のアデニンとウラシルの含有量の増加は配列を至適化する。二次構造の整合性の分解は、ＲＮＡやコード配列、特にそのＲＮＡの最初の１００から２００ヌクレオチド、の５’部分において特に大事である。いくつかの実施例において、転写開始点から最初の１００から２００ヌクレオチドにおいてアデニンとウラシルのもしくはアデニンとチミンの含有量が増加し、いくつかの具体化の中においては、コード配列または翻訳開始点の最初の１００から２００ヌクレオチドにおいてアデニンとウラシルもしくはアデニンとチミンの含有量が増加する。いくつかの実施例において、ＲＮＡ二次構造完全体の破損は、全遺伝子変化もしくは１００から２００ヌクレオチド基伸張における変化パターンによって成立する。３’末端の修飾も大事である。
【００５４】
リーダーコード配列の添加や、酵母至適化（滅多にヒトのコドンは用いられない）されたその配列のコドン変化の戦略は、どんな蛋白質をコードしたどんな遺伝子にも適応できる。限定するものではないが、例えば、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子を含むウイルス蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。アデニンとウラシルの含有量が豊富であることがより好ましく；ヒト優性コドン／グアニンとシトシンの含有量が高いものはあまり好ましくない。蛋白質発現や構造に関する前もった知識なしでｍＲＮＡでの二次構造の領域の安定性を低下可能である、ということが発見されていた。
【００５５】
結果として生じる変化した転写産物から予測された二次構造の最小自由エネルギーは、元の転写産物よりも増強した蛋白質発現が可能である変化した転写産物を与える。標準的な技術と容易に入手可能な出発材料を用いて、修飾核酸分子を準備する。その核酸分子は、宿主細胞に取り込まれる発現ベクターに組み込まれる。蛋白質産生に対してよく知られた組換え発現系に用いる宿主細胞は、よく知られており容易に入手可能である。宿主細胞の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のような細菌細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ)細胞などの非ヒト哺乳類組織培養細胞、ＨｅＬａ細胞のようなヒト組織培養細胞が含まれる。
【００５６】
いくつかの実施例において、例えば、通常の知識を有してる人は、よく知られた技術を用い、よく知られた発現系として用いるための市販の発現ベクターに、ＤＮＡ分子を挿入できる。例えば、市販のプラスミドであるｐＳＥ４２０(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける免疫修飾蛋白質の産生に用いられる。また、例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)は、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける産生に用いられる。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣＴＭコンプリートバキュロウイルス発現系(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)は、昆虫細胞における産生に用いられる。市販のプラスミドｐｃＤＮＡＩもしくはｐｃＤＮＡ３(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ)は、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞における産生に用いられる。通常の知識を有する人は、これらの市販の発現ベクターや発現系、もしくは、普通の技術や容易に利用可能な出発材料による免疫修飾蛋白質を産生するための他の技術を用いることができる。（サムブルックら、ｅｄｓ．、２００１、ｓｕｐｒａ参照）従って、要求蛋白質は、原核生物、真核生物の両方の系において準備でき、その結果、さまざまな形の処理された蛋白質が生じる。
【００５７】
通常の知識を有する人は、市販の他の発現ベクターや系を用いることもあるし、もしくはよく知られた方法や容易に利用可能な出発材料を用いてベクターを作製する。プロモーターやポリアデニル化シグナルのような必須調節配列やエンハンサーを含む発現系は、容易に利用可能で、宿主の多様性に対する技術として知られている。（サムブルックら、ｅｄｓ．、２００１、ｓｕｐｒａ参照）。
【００５８】
修飾ＤＮＡを含む発現ベクターは、互換性のある宿主を形質転換するために用いられ、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養され、維持される。この発明において産生される蛋白質は、通常の知識を有する者に適切でよく知られているように、培養によって、細胞の溶解によって、または培養液中に回収される。通常の知識を有した人は、よく知られている技術を使い、その発現系を用いて産生された蛋白質を分離することができる。抗体を用いて自然源から蛋白質を精製する方法は、組換えＤＮＡ方法論によって生産された精製蛋白質に同様に当てはめられる。
【００５９】
この発明の医薬品成分は、哺乳類の身体の中において活性を持った薬剤がその作用場所へ到達することを可能にする、任意の手段によって投与される。この発明の医薬品成分は、局所または全身の治療が必要とされているかということと、治療する場所に依存した多数の方法によって投与される。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口、もしくは非経口投与である。非経口投与は、静脈点滴、皮下・腹腔内・筋肉内注射、例えば吸引やガス注射による肺投与、くも膜下腔内または脳室内投与が含まれる。
【００６０】
この発明は核酸分子を有する注射可能な医薬品成分と関係している。
【００６１】
調節エレメントと連結可能な修飾ヌクレオチド配列を有する注射可能な医薬品成分は、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種としても言及される）、組換えアデノウイルス、ウイルス関連組換えアデノウイルス、そして組換えワクシニアウイルスのような組換えベクターを含めて、いくつかのよく知られた技術のどれかを用いて運ばれる。
【００６２】
ＤＮＡワクチンは米国特許番号．５，５９３，９７２、５，７３９，１１８、５，８１７，６３７、５，８３０，８７６、５，９６２，４２８、５，９８１，５０５、５，５８０，８５９、５，７０３，０５５、５，６７６，５９４、とここで引用されている前明細書に記載されている。それらの明細書に記載されている添付実験方法に付け加えて、導入ＤＮＡの選択方法は、ここの参照に含まれている、米国特許番号４，９４５，０５０と５，０３６，００６、に記載されている。投与方法は、限定するものではないが、吸引、坐薬によって、もしくは粘膜組織、例えば膣、直腸、尿道、頬側、舌下組織における洗浄によって、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、経口、また、局所的、経皮的投与を含む。より好ましい投与方法は、粘膜組織、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下注射を含む。遺伝子構築物は、限定するものではないが、従来の注射針のない注射装置、もしくは"マイクロプロジェクティルボンバードメントジーンガン"を含む手段によって投与される。
【００６３】
細胞を取り扱う時、遺伝子構築物は、機能する染色体外分子として細胞内に残り、あるいは細胞の染色体ＤＮＡの中に結合する。ＤＮＡはプラスミドもしくはプラスミドらの形で分離遺伝子物質として維持し細胞に導入される。代わりに、染色体内に結合できるリニアＤＮＡが細胞に導入される。細胞内にＤＮＡを導入する時、ＤＮＡが染色体に結合することを促進する試薬が加えられる。結合を促進するのに有効なＤＮＡ配列もＤＮＡ分子に含まれる。代わりに、ＲＮＡが細胞に投与される。セントロメア、テロメア、複製基点を含むリニアミニ染色体としての遺伝子構築物を供給することも予測される。遺伝子構築物は、減弱した生微生物もしくは細胞内で生存している組換え微生物ベクター内に、遺伝子物質の一部を残している。遺伝子構築物は組換えウイルスワクチンのゲノムの一部分で有り得、その中の遺伝物質は細胞の染色体に組み込まれるか、もしくは染色体外に残ることになる。
【００６４】
遺伝子構築物は核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。そのエレメントには、プロモーター、開始コドン、ストップコドン、ポリアデニル化シグナルを含まれる。付け加えると、エンハンサーはしばしば、標的蛋白質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの因子は要求蛋白質をコードする配列と連結可能であり、調節エレメントは投与された個体において作用可能である、ということが必要である。開始コドンとストップコドンは一般的に要求蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられている。しかしながら、これらの因子は、その遺伝子構築物を投与された個々において機能的であるということが必要である。その開始と終結コドンはコード配列の枠内でなくてはならない。プロモーターとポリアデニル化シグナルは個々の細胞内において機能的でなくてはならない。この発明の実施に対して有効なプロモーターの例として、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生においては、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモーター、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）プロモーター、Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）のＨＩＶ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｖｉｒｕｓプロモーター、ＡＬＶのプロモーター、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）のＣＭＶ前初期プロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）のプロモーター、Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）のプロモーターを含むが、これらに限定するものではない。この発明の実施に有効であるポリアデニル化シグナルの例は、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において、限定するものではないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして言及されているｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の中のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが使われている。ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに付け加えて、他の因子はＤＮＡ分子の中に含まれる。そのような追加因子はエンハンサーを含む。そのエンハンサーは、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶなどのウイルス由来のエンハンサー、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサーを含むグループから選ばれるものである。構築物を染色体外性に維持し、細胞内に多数の複製物を産生するために、遺伝子構築物には哺乳類複製基点を加えることが可能である。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製プラスミドｐＣＥＰ４とｐＲＥＰ４は、Ｅｐｉｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓの複製基点ならびに核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでおり、染色体に組み込まれることなしに、染色体外で高コピー数の複製が行われる。
【００６５】
この発明のひとつの方法は、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、もしくは局所、の核酸分子の投与ステップ、もしくは吸引、膣、直腸、尿道、頬側、舌下から成るグループから選択された粘膜組織の洗浄によるステップを有する。
【００６６】
いくつかの実施例において、核酸分子はポリヌクレオチド機能エンハンサー、または遺伝子ワクチン促進因子の投与と協力して働く細胞に運ばれる。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは１９９３年１月２６日に提出された米国特許出願番号０８／００８，３４２、１９９３年３月１１日に提出された米国特許出願番号０８／０２９，３３６、１９９３年９月２１日に提出された米国特許出願番号０８／１２５，０１２、１９９４年１月２６日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９に記載されており、それぞれはここの参照として記載してある。遺伝子ワクチン促進（ＧＶＦ）因子は、ここの参照として含まれている、１９９４年４月１日に提出された米国特許出願番号０８／２２１，５７９に記載されている。核酸分子と協力して働く投与される共因子は、核酸分子の投与の前か後に核酸分子との混合として投与され、もしくは別々の形で同時に投与される。さらに、因子ＧＶＦと共に共投与されるであろう他の因子で、形質移入因子、または複製因子、または、炎症性因子として働くものの中には、成長因子、サイトカイン、リンホカインを含み、それにはα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、線維芽細胞成長因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フレウンズ不完全アジュバンド、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、ムラミルペプチド、キノン類縁体、スクアレインとスクアレンのような空胞とヒアルロン酸含むＬＰＳ類縁体のようなものがあり、これらはは遺伝子構築物と共に働いて投与される。いくつかの実施例において、免疫調節蛋白質はＧＶＦとして使われる。
【００６７】
この発明によれば、医薬品成分は約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤＮＡを有する。いくつかの好ましい実施例において、この発明によれば、医薬品成分は約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを有する。いくつかの好ましい実施例においてその医薬品成分は約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施例においてその医薬品成分は約０。１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施例においてその医薬成分は約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施例においてその医薬品成分は約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施例においてその医薬品成分は約１００から約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００６８】
この発明によれば、医薬品成分は使われる投与方法に従って処方される。医薬品成分は注射用薬剤構築物である場合、無菌であり、発熱物質や粒子を含まない。等張処方の使用がより好ましい。一般的に等張性に対する添加物は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを含むことができる。いくつかの場合において、リン酸緩衝食塩水のような等張性水溶液が用意された。安定剤は、ゼラチン、アルブミンを含む。いくつかの実施例において、血管収縮因子が処方に加えられる。
【００６９】
この発明は、病原体、アレルゲン、もしくは個人の所有する"異常"細胞に特に関連した標的蛋白質に対する広範囲の免疫反応を誘発するために有用である。病原体蛋白質に対する免疫反応はその病原体に対する防衛免疫を供給するように、この発明は病原体因子と有機体に対して個人を免疫化するために有用である。過剰増殖細胞に特に関連する標的蛋白質に対する免疫反応の誘発による癌のような過剰増殖病や障害と戦うのに、この発明は有用である。自己免疫状態に関わる細胞に特に関連する標的細胞に対する免疫反応の誘発による自己免疫疾患や障害に、この発明は有用である。
【００７０】
核酸分子はプラスミドＤＮＡ、組換えベクターの核酸分子として、もしくは弱毒ワクチンまたは細胞ワクチン内に提供される遺伝子物質の一部として供給される。一方いくつかの実施例において、標的蛋白質、およびもしくは免疫調節蛋白質は、それらをコードする核酸分子を添加する蛋白質、もしくはそれらをコードする核酸分子の代わりの蛋白質として運ばれる。
【００７１】
この発明は、単細胞病原組織と多細胞寄生虫のような、ウイルス、原核生物、病原体真核生物組織などの全ての病原体に対して個人を免疫するのに有用である。この発明は、細胞を感染させ、淋病、リステリア、赤痢菌のようなウイルス、原核生物などの被包性ではないそれら病原体に対して個人を免疫するのに特に有用である。付け加えるとこの発明は、細胞内病原体となる生活環段階を含む原生動物病原体に対する個人を免疫するのに有用である。
【００７２】
病原体の感染を防ぐための遺伝子ワクチンを産生するために、免疫防御反応の攻撃に対抗する免疫原性蛋白質をコードする遺伝子物質は、標的蛋白質に対するコード配列として遺伝子構築物に含まれなくてはならない。この発明において特に有用である、細胞内に感染する病原体に対してであろうと、細胞外に感染する病原体に対してであろうと、全ての病原抗原は防御反応を誘発する可能性は低い。なぜならＤＮＡとＲＮＡは両方とも比較的小さく、比較的簡単に産生され得るので、この発明は、多数の病原抗原のワクチン接種を念頭に入れた付加的な利点を供給する。遺伝子ワクチンで用いられた遺伝子構築物は、たくさんの病原抗原をコードする遺伝子物質を含むことができる。例えば、いくつかのウイルス遺伝子は、そこからの複数標的を供給するひとつの構築物に含まれる。
【００７３】
この発明の他の側面は、過剰増殖病に特徴的な過剰増殖細胞に対する広範囲の免疫防御反応を与える方法および過剰増殖病に苦しむ個人の治療法を供給する。過剰増殖病の例として、全ての形態の癌と乾癬を含む。
【００７４】
免疫原性"過剰増殖細胞"関連蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の個々の細胞への導入は、個々のワクチン接種された細胞内のそれらの蛋白質産生に帰結する。過剰増殖病に対して免疫化するために、過剰増殖病に関連する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が、個々に投与される。
【００７５】
過剰増殖関連蛋白質が効果的な免疫原性標的となるために、過剰増殖細胞において正常細胞に比べて独占的にもしくはより高いレベルで産生される蛋白質であるべきである。標的抗原は、そのような蛋白質から見つけられる少なくともひとつのエピトープを有する蛋白質、フラグメント、ペプチドを含んでいる。いくつかの場合において、過剰増殖関連蛋白質は蛋白質をコードする遺伝子の変異産物である。結果として正常蛋白質には見つけられない異なるエピトープを生じる、わずかに異なったアミノ酸配列を持つこと以外は、その変異遺伝子は正常蛋白質とほぼ同一である蛋白質をコードする。そのような標的蛋白質は癌遺伝子によってコードされている、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、転位遺伝子であるｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、ＥＧＲＦを含む。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗ガン治療と防御療法に対する標的蛋白質は、Ｂ細胞リンパ腫によって作られた抗体の可変領域と、自己免疫疾患に対する標的抗原として使われるＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含んでいる。他の癌関連蛋白質は、モノクローナル抗体１７−１Ａ、葉酸結合蛋白質によって認識される蛋白質を含む、癌細胞に高いレベルで見られる蛋白質のような標的蛋白質として使われる。
【００７６】
癌のいくつかの形態のひとつもしくはそれ以上に対して免疫するために使われている一方、この発明は、特に癌が発症しやすい、もしくは癌患者で再発しやすい個人に、予防的に免疫する時に特に有用である。免疫学と同様に遺伝子学と科学技術における発展によって、個人における癌の発症に対する確率とリスク評価の決定を考慮できる。遺伝子スクリーニングおよびまたは家族健康歴用いることで、特定の個人が癌のいくつかのタイプのどのひとつが発症するかという確率を予測することが可能である。
【００７７】
同様に、すでに発症した癌患者と癌を除去する治療を受けた、もしくは別に緩解にあるそれらの個人は、特に再発と再発現しやすい。治療法の一部として、そのような個人は、診断されたその癌に対して免疫され得る。従って、癌タイプを持っており再発の危険性がある個人は、癌になる将来と戦う彼ら個人の免疫系を準備するために免疫化され得る。
【００７８】
この発明は過剰増殖疾患を患った個人を治療する方法を供給する。この方法において、遺伝子構築物の導入は、標的蛋白質を産生する過剰増殖細胞と戦うように個人の免疫系を仕向けるまたは促進する免疫療法として貢献する。
【００７９】
この発明は、"自己"攻撃抗体を産生する細胞受容体と細胞を含む、自己免疫に関連した標的に対する広い保護免疫反応を与えることによって、自己免疫疾患または障害を患った個人を治療する方法を供給する。
【００８０】
Ｔ細胞は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス（類肉腫症）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェグナー肉芽腫症、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫病を媒介した。これらの疾患は、内因性抗原と結合し、自己免疫疾患に関連する炎症性のカスケードを開始するＴ細胞受容体によって特徴付けられる。Ｔ細胞の様々な領域に対するワクチン接種は、それらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬｓを含む免疫反応を誘発する。
【００８１】
ＲＡ（関節リュウマチ）において、その病気に関わるＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）のいくつかの特定可変領域は特徴付けられていた。これらのＴＣＲｓはＶβ−３、Ｖβ―１４、Ｖβ―１７、Ｖα―１７を含んでいる。従って、これらの蛋白質の少なくともひとつをコードしているＤＮＡ構築物のワクチン接種は、ＲＡに関わるＴ細胞を標的とする免疫反応を誘発する。ここの参照に取り込まれている、ホウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０９２１−１０９２５；パリアード（Ｐａｌｉａｒｄ）ら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：３２５−３２９；ウィリアムスら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：３２６−３３３；を見ること。
【００８２】
ＭＳ（多発性硬化症）において、その病気に関わるＴＡＲｓのいくつかの特定可変領域は特徴付けられていた。これらのＴＣＲｓはＶβ―７、Ｖα―１０を含む。従って、これらの蛋白質の少なくともひとつをコードしているＤＮＡ構築物のワクチン接種は、ＭＳに関わるＴ細胞を標的とする免疫反応を誘発する。ここの参照に含まれている、ウチェルプフェニグ（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ）ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：１０１６−１０１９；オクセンバーグ（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ）ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：３４４−３４６；を見ること。
【００８３】
強皮症において、その病気に関わるＴＡＲｓのいくつかの特定可変領域は特徴付けられていた。これらのＴＣＲｓはＶβ―６、Ｖβ―８、Ｖβ―１４、とＶα―１６、Ｖα―３Ｃ、Ｖα―７、Ｖα―１４、Ｖα―１５、Ｖα―１６、Ｖα―２８、Ｖα―１２を含む。従って、これらの蛋白質の少なくともひとつをコードしているＤＮＡ構築物のワクチン接種は、強皮症に関わるＴ細胞を標的とする免疫反応を誘発する。
【００８４】
Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を患った患者、特にそのＴＣＲの可変領域がまだ特徴付けられていない患者を治療するために、滑膜組織診を行うことができる。Ｔ細胞のサンプルが使われ、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患のＴＣＲｓのその可変領域は標準技術を用いて特定化された。遺伝子ウイルスはこの情報を用いて準備される。
【００８５】
Ｂ細胞は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、バゼドウ病、重症筋無力病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、悪性貧血を含む自己免疫疾患を媒介した。これらの疾患は、内因性抗原と結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性のカスケードを開始する抗体によって特徴付けられた。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、その抗体を産生するＢ細胞を排除するためのＣＴＬｓを含む免疫反応を誘発する。
【００８６】
Ｂ細胞媒介自己免疫疾患を患った患者を治療するために、自己免疫活性化に関わるその抗体の可変領域は、特定化されるべきである。組織診が行われ、炎症部位での抗体のサンプルが利用され得る。Ｂ細胞媒介自己免疫疾患の抗体の可変領域は、標準技術を用いて特定化され得る。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて準備され得る。
【００８７】
ＳＬＥの場合において、ひとつの抗原はＤＮＡであると信じられている。従って、ＳＬＥに対して免疫化された患者において、彼らの血清は抗ＤＮＡ抗体として選別され、血清内で見つけられたそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンが準備され得る。
【００８８】
ＴＣＲｓと抗体の両方の可変領域における共通の構造特徴はよく知られている。特にＴＣＲもしくは抗体をコードしたそのＤＮＡ配列は、一般的に下記のよく知られた方法においてよく見られる。ここの参照に取り込まれている、カバット（Ｋａｂａｔ）ら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢａｔｈｅｓｄａＭＤ、に記載されている。付け加えると、ここの参照に取り込まれている、抗体からの機能的可変領域のクローニングの一般的な方法は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１０６６、内に見られる。
【００８９】
遺伝子療法に関連した発明のいくつかの実施例において、遺伝子構築物は代償遺伝子だけでなく、治療性蛋白質をコードする遺伝子を含んでいる。代償遺伝子の例としては、ジストロフィンまたは機能的断片をコードした遺伝子、嚢胞性線維症を患った患者における欠損遺伝子を代償するための遺伝子、インスリン遺伝子、ＡＤＡを患った患者における欠損遺伝子を代償するための遺伝子、ＦａｃｔｏｒVIIIをコードした遺伝子を含む。治療性蛋白質をコードした遺伝子の例として、エリスロポエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦをコードした遺伝子を含む。その上、毒性物質に特に結合する一本鎖抗体成分をコードする遺伝的構築物は投与され得る。いくつかの好ましい実施例において、ジストロフィン遺伝子はミニ遺伝子の一部分として供給され、筋ジストロフィーを患った個人の治療に用いられる。いくつかの好ましい実施例において、部分的ジストロフィン蛋白質に対するコード配列を含むミニ遺伝子が供給される。ジストロフィン異常は軽症ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）と重症デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の両方の原因である。ＢＭＤにおいてジストロフィンは作られるが、サイズ及びもしくは量ともに異常である。その患者は軽症ないし中程度に筋力が弱っている。ＤＭＤにおいてはジストロフィン蛋白質は作られず、患者は１３歳までにｃｈａｉｒ−ｂｏｕｎｄ（寝たきり、ベットで体を起こせる状態）になり、通常２０歳までに死んでしまう。何人かの患者において、特にＢＭＢを患っている人はにおいて、この発明によってもたらされたミニ遺伝子の発現によって産生される部分的ジストロフィン蛋白質は、改良された筋機能を供給できる。
【００９０】
いくつかの好ましい実施例において、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロン、ＴＮＦをコードする遺伝子は、存在するだけでなく除去された腫瘍細胞に運ばれ、個人に再導入される。いくつかの好ましい実施例において、ガンマインターフェロンをコードする遺伝子は多発性硬化症を患った個人に投与される。
【００９１】
遺伝的ワクチンを改善するための修飾型核酸配列の使い方に加えて、この発明は弱毒生ワクチンの改善と、抗原をコードする外来性遺伝子を運ぶための組換えベクターを用いたワクチンの改善に関連している。弱毒生ワクチンと、外来性抗原を運ぶための組換えベクターの例としては、ここの参照に取り込まれている、米国特許番号：４，７２２，８４８；５，０１７，４８７；５，０７７，０４４；５，１１０，５８７；５，１１２，７４９；５，１７４，９９３；５，２２３，４２４；５，２２５，３３６；５，２４０，７０３；５，２４２，８２９；５，２９４，４４１；５，２９４，５４８；５，３１０，６６８；５，３１０，６６８；５，３８７，７４４；５，３８９，３６８；５，４２４，０６５；５，４５１，４９９；５，４５３，３６４；５，４６２，７３４；４，４７０，７３４；５，４８２，７１３に記載されている。提供される遺伝子構築物は、ワクチン内で発現を起こすために機能し得る調節配列と連結可能な修飾型ヌクレオチド配列を含む。その遺伝子構築物は弱毒生ワクチンと、この発明による改良されたワクチンを産生するための組換えワクチンへ取り込まれる。同様に修飾型核酸配列は要求された蛋白質をコードする遺伝子治療学を行うのに有用な組換えベクターにおいて使われ得る。
【００９２】
この発明は、ＤＮＡワクチン、弱毒生ワクチン、組換えワクチンを含むワクチン成分の一部として、遺伝子構築物を個人の細胞へ運ぶ過程を有する個人を免疫化する改良された方法を供給する。この遺伝子構築物は免疫修飾蛋白質をコードするヌクレオチド配列と、ワクチン内において発現を起こすために機能し得る調節配列と連結可能なヌクレオチド配列を有する。この改善されたワクチンは細胞性免疫反応の増強に帰結する。
【００９３】
この発明は下記の例の方法によって説明され、発明のいくつかの実施例で詳しく述べるつもりである。これらの例は、その発明の範囲を制限するものとしての意図もなく、解釈されるものでもない。ここで特に記載された方法以外で本発明を実施することが可能であるということは明らかである。たくさんの修飾とこの発明の多様性は、ここでの指導の見解を可能にし、その結果、この発明の範囲内である。
【００９４】
【実施例】
例１：材料と方法
ｍＲＮＡ二次構造の予測
導入遺伝子の翻訳効率を上げるために、ＲＮＡ二次構造をＭｕｌＦｏｌｄを用いて予測し、マッキントッシュコンピューター用のＬｏｏｐＤｌｏｏｐソフトウェアを用いて見た。
【００９５】
放射線ラベル試験管内翻訳蛋白質の免疫沈降
３５Ｓラベル蛋白質産物はＴＮＴ−Ｔ７関連転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて準備された。１０μｌの放射線ラベル蛋白質サンプルと１μｌ抗Ｈｉｓ（Ｃ−ｔｅｒｍ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を３００μｌのＲＩＰＡバッファーに加え、静かに混ぜた。４℃、９０分インキュベーションした後、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃアデニンとチミンａｗａｙ、ＮＪ）を蛋白質−抗体複合体にチューブ当たり最終濃度の５ｍｇ加え、そのサンプルは回転性シェーカーにおいて４℃、９０分で反応させた。
【００９６】
そのビーズはＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、２ＸＳＤＳサンプルバッファーに混ぜた。免疫沈降された蛋白質複合体は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１５％）ゲルにおける短時間の煮沸と分離によってセファロースビーズから溶離された。蛋白質サンプルの移動度は市販の１４Ｃ−メチル化分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の移動度と比較された。そのゲルは固定され、１Ｍサリチル酸ナトリウム溶液で簡単に処理され、ゲルドライアー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で乾燥された。その乾燥したゲルはＸ−線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に一晩露光された。試験管内翻訳蛋白質の分子サイズは２１．５ｋＤであった。
【００９７】
試験管内翻訳蛋白質
非放射性試験管内翻訳Ｃｐ蛋白質は非放射性構築物を持つＴＮＴ−Ｔ７関連転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて上記のように作成された。試験管内翻訳の対照には発現可能な挿入断片を欠いているｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の入った試験管内翻訳キットを用いて作成された。
【００９８】
マウスのＤＮＡ接種
６−から８−週目の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｃ、．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の四頭筋にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に混ぜた１００μｇのｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ、もしくはｐｃＤＮＡ３．１を注射した。マウスは２つのＤＮＡ免疫化（それぞれ１００μｇ）を２週間に分けて注射された。追加免疫後１３日目に、マウスは屠殺され、脾臓を回収され、そのリンパ球は分離、細胞免疫反応によって検定された。
【００９９】
フローサイトメトリーによる細胞内ＩＮＦ−γ検出
９６穴プレートのそれぞれのウェルに５０Ｕ／ｍｌ  ｒＨｕＩＬ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）、１０μｇ／ｍｌ  Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（フォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１μｇ／ｍｌ  イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１００μｌＲＰＭＩ−１６４０（５％ＦＢＳ添加）を入れた。試験管内翻訳蛋白質だけでなく試験管内翻訳対照（発現可能挿入断片を欠いたベクターを持つ試験管内翻訳キットを用いて作成された）４μｇ／ｍｌは５０μｌ  Ｒ５培地に加えられた。抗原（Ａｇｓ）を添加後、分離された脾細胞はそれぞれのウェルに１Ｘ１０６個、５０μｌ  Ｒ５培地と共に添加された。フローサイトメトリーの補償のために、未処理マウスからの脾細胞はＩＬ−２とＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａのみでセットアップされた。そのプレートは３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて５から６時間反応させた。対照として、細胞を抗原なしで反応させた。反応後、プレートは１２００ｒｐｍ、５分遠心され、上清は捨てた。細胞は２００μｌ  ＰＢＳで懸濁、１％  ＢＳＡを添加、１５分氷上に放置、その後スピンダウンし、サンプル当たり０．１μｇの抗ＣＤ４−ＰＥｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の溶けた５０μ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡで懸濁した。４℃、３０分で反応後、細胞はＰＢＳ／１％で２回洗浄した。２回の洗浄後、細胞プレートは１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に懸濁され、４℃、２０分で反応した。細胞は１ＸＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２回洗浄し、サンプル濃度当たり０。１μｇの抗ＩＮＦ−γ−ＡＰＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む５０μｌ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で懸濁した。４℃、３０分の反応後、細胞は１ＸＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定、フローサイトメトリーで分析するまで４℃で保存した。
【０１００】
例２：ウエストナイルウイルスキャプシドｍＲＮＡへのリーダー配列の付加
ウエストナイルキャプシドｍＲＮＡにおいて自由エネルギーを最小化するためのリーダー配列の付加は、蛋白質発現と免疫反応の増強に帰結する。
【０１０１】
導入遺伝子の転写と翻訳効率を増強するために、ヒトＩｇＥリーダー配列はオープンリーディング枠（ｏｒｆ）配列の５’上流に付加された（Ｆｉｇ．１）。
【０１０２】
ヒト（ＷＮＶｙ−ＤＪＹ構築物（酵母コドン））においてそれほど優勢でなく使われているコドンを含むヒトＩｇＥリーダー配列をコードした配列の付加は、リーダー配列のないｍＲＮＡに対する二次構造（ＷＮＶｗｔ構築物（野生型））、もしくはヒトコドンで至適化されたリーダー配列をコードするｍＲＮＡに対する二次構造（ＷＮＶｈ−ＤＪＹ構築物（ヒトコドン））と比較して、自由エネルギー価の増加したｍＲＮＡに対する予測された二次構造に帰結する（Ｆｉｇ．２）。
【０１０３】
その上、放射線標識された試験管内翻訳蛋白質の免疫沈降によって決定された際、ヒト（酵母至適化）においてそれほど優勢でなく使われているコドンを含むリーダー配列をコードするその構築物は、ヒト至適化コドンを含むリーダー配列をコードする構築物よりもより高い蛋白質レベルをもたらす（Ｆｉｇ．３；Ｔａｂｌｅ１、酵母コドン利用）。酵母によってより優勢に用いられたコドンは一般的にアデニンとウラシルが豊富で、ヒトによってより優勢に用いられたコドンは一般的にグアニンとシトシンが豊富である（キムら、１９９７、Ｇｅｎｅ、ｓｕｐｒａ参照）。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
細胞内ＩＦＮ−γフローサイトメトリー分析によって決定される際、マウス筋肉へのＤＮＡプラスミド挿入は抗原特異性、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞依存性免疫反応を誘導する。ＣＤ４＋Ｔｈ細胞依存性、細胞内ＩＦＮ−γ産生はフローサイトメトリーによって定量化された。ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ（ｐＷＮＶＣｙ）免疫マウスから単離された脾細胞は、ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ９ｐＷＮＶＣｈ）免疫マウスから単離された脾細胞と比較して、試験管内翻訳Ｃｐ蛋白質での刺激におけるＩＦＮ−γが高いレベルで発現していた（Ｆｉｇ．４参照）。
【０１０６】
例３：最少予測自由エネルギーの増加によるＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ＲＮＡにおけるＲＮＡ二次構造の除去
リーダーコード配列の付加と酵母至適化（ヒトにおいてそれほど優勢ではなく使われている）するためのコドンの変換の戦略は、ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子に適応された。ヒトにおいてそれほど優勢でなく使われたコドンを持つＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列がＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子の５’末端に付加された時、最小化された転写エネルギーの予測自由エネルギーは増加した（Ｆｉｇ．５）。
【０１０７】
ＨＩＶ−１  ｐｏｌ構造において、ヌクレオチド（ｎｔ）１７３８とｎｔ１９３８の間に位置された安定二次構造のいくつかの領域はＭｕｌＦｏｌｄ分析によって予測された（Ｆｉｇ．６）。ｎｔ１７３８からｎｔ１９３８までの領域におけるコドンの、ヒトにおけるそれほど優勢ではなく使われているコドン（酵母至適化コドン）への変化は、その領域における二次構造の弱小化に帰結する。修飾型コドンを持つ領域に対する予測された二次構造は、オリジナル配列に対する予測された二次構造より高い自由エネルギーを持った（Ｆｉｇ．７）。付け加えて、ｐｏｌ遺伝子の最初の２００ヌクレオチドにおけるｍＲＮＡ二次構造の形成は、ヒトにおいて最も優勢に使われているコドン（ヒト至適化コドン）（ＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ｈｕ）を含む転写産物と比較して、ヒトにおいてそれほど優勢ではなく使われているコドン（酵母至適化コドン）（ＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ｙｔ）を用いて最小化された（Ｆｉｇ．８）。最小自由エネルギーは−５３．０ｋｃａｌから−２６．４ｋｃａｌへと劇的に増加した。
【０１０８】
例４：最小予測自由エネルギーの増加によるＨＩＶ−１  ｇａｇＲＮＡにおけるＲＮＡ二次構造の除去
安定二次構造のいくつかの領域はＨＩＶ−１  ｇａｇ構造遺伝子の転写産物に対するＭｕｌＦｏｌｄ分析によって予測され（Ｆｉｇ．９）、最小自由エネルギーはヒトにおいてそれほど優勢でなく使われたコドン（酵母至適化）を用いて増加した（−３５１．０７ｋｃａｌから−２８３．１１ｋｃａｌへ）（Ｆｉｇ．１０）。
【０１０９】
例５：最小予測自由エネルギーの増加によるＷＮＶ  ｅｎｖ  ＲＮＡにおけるＲＮＡ二次構造の除去
ウエストナイルウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子において、ヒトにおいてそれほど優勢でなく使われているコドン（酵母至適化、ＷＮＶｙｔ２００）を持つ遺伝子の最初の２００塩基対（ｂｐ）でのＲＮＡエネルギー最小化の戦略適応は、野生型ＷＮＶ  ｅｎｖ遺伝子（ＷＮＶｗｔ２００）の転写産物もしくは、ヒトにおいて最も優勢に使われているコドン（ＷＮＶｈｕ２００）で至適化された転写産物と比較して、同族転写産物の最小自由エネルギーが増加した（Ｆｉｇ．１１）。
【０１１０】
前述の例はこの発明を説明するつもりであり、この発明をどんな風にも限定するものではない。この技術におけるそれらのスキルはこの発明の精神と範囲内での修飾であると認識する。
【０１１１】
ここで引用されたすべての参照は、そのまま参照としてこれによって含まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＲＮＡ二次構造に基づいて修飾型構造（ＷＮＶＣｈｕとＷＮＶＣｙ)を持つ、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ)  野生型キャプシド（Ｃｐ)蛋白質（ＷＮＶＣ)のヌクレオチドとアミノ酸配列を示している。分泌型ＩｇＥシグナルリーダー配列はＷＮＶＣ蛋白質と融合された。ＷＮＶＣのプロモーターと５’−近接領域の間のリニア配列で当然である様々な発現レベルを回避するために、ＷＮＣＶのアミノ酸２−６に対するリーダー配列とコドンは、酵母至適化コドン（ＭＮＶＣｙ）またはヒト至適化コドン（ＷＮＶＣｈｕ)によって修飾型。しかしながら、両方の構築物におけるＷＮＶキャプシド蛋白質に対するコード配列の残った部分は、ヒト至適化コドンによって修飾型。１）ｓＩｇＥリーダー配列をエンコードしている野生型ヌクレオチド配列（4．ｓＩｇＥｏｒｉ)(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１)、２）ｓＩｇＥリーダー配列のアミノ酸配列（ヌクレオチド配列は上に記載）(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２)、３）ＷＮＶキャプシド蛋白質に対するアミノ酸配列（最初のメチオニンを除く）(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３)、４）ＷＮＶＣｈｕ構造の配列をエンコードしているｓＩｇＥｈ−ＷＮＶキャプシド蛋白質のヌクレオチド配列（１．ｓＩｇＥｈ−ＷＮＶＣｈｕ）(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４)、が示されている。ＷＮＶＣｙ構造の中のｓＩｇＥｈ−ＷＮＶキャプシド蛋白質に対するコード配列（２．ｓＩｇＥｙ−ＷＮＶＣｙ）と野生型ＷＮＶキャプシドエンコード配列（３．ＷＮＶＣｗｔ）の違いは、ＷＮＶＣｈｕ構造のヌクレオチド配列の下に示される。
【図２】  １）ＷＶＮキャプシド蛋白質をエンコードする野生型ｍＲＮＡ（ＷＮＶｗｔ)、２）ヒト至適化コドン（ＷＮＶｙ−ＤＪＹ)を含むｓＩｇＥリーダー／ＷＮＶキャプシド蛋白質をエンコードするｍＲＮＡ、３）酵母至適化コドン（ＷＮＶｈ−ＤＪＹ)を含むｓＩｇＥリーダー／ＷＮＶキャプシド蛋白質をエンコードするｍＲＮＡ、の最初の７３ヌクレオチドに対する自由エネルギー価と共に、予測されるＲＮＡ二次構造をＭｕｌＦｏｌｄで示している。ＷＮＶｙ−ＤＪＹ配列によって明らかにされた最後のコドン（グリシンに対するＧＧＣ）は、ヒト至適化である。示されるように、"Ｔ"はＲＮＡ鎖において"Ｕ"に書き換えられる。ＷＮＶｈ−ＤＪＹとＷＮＶｙ−ＤＪＹにおける融合のｓＩｇＥリーダー部分をエンコードしたｍＲＮＡ鎖のヌクレオチドは、はっきりと示されている。
【図３】  異なるＷＮＶキァプシド蛋白質構造：ｐＷＮＶＣｈｕ(ＷＮＶＣｈｕとｐＷＮＶｈ−ＤＪＹとも呼ばれる)とｐＷＮＶＣｙｔ(ＷＮＶＣｙとｐＷＮＶｙ−ＤＪＹとも呼ばれる)、からの試験管内転写/翻訳産物を電気泳動で分離し、免疫沈降し、放射線標識したオートラジオグラフを示している。左側の最初のレーンは、分子量マーカーを含む。矢印はメインキャプシド蛋白質産物の位置を指し示している。Ｃ−末端ポリヒスチジンタグとの融合蛋白質は抗−Ｈｉｓ抗体を用いて免疫沈降された。
【図４】  ＤＮＡ免疫されたマウスからの試験管内刺激脾細胞における細胞内ＩＮＦ−γ発現のフローサイトメトリー解析を示している。示された値は、二重ポジティブ細胞のパーセンテージである。上のパネルにおいて、細胞はＩＮＦ−γとＣＤ４４で染色され；下のパネルにおいて、細胞はＣＤ４とＩＮＦ−γで染色された。トップのラベルは、以前マウスに免疫したベクター、プラス、脾細胞の試験管内再刺激に用いた刺激ベクターを示している。免疫するベクターは、ｐｃＤＮＡIII(ｐｃＤＮＡ３．１)、ｐＷＮＶｈ−ＤＪＹ(ｐＷＮＶＣｈ)、ｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ(ｐＷＮＶＣｙ)であった。"Ｎｏ  Ａｇ"は、脾細胞は試験管内翻訳対照（例２に描写している）と反応させた、ということを指し示し、"ｐｒｏｔｅｉｎ"は、脾細胞はｐＷＮＶｙ−ＤＪＹ発現構築物からの翻訳された試験管内Ｃｐ蛋白質産物と反応させた、ということを指し示している。
【図５】  ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子(ｐｏｌｗｔ２００ｒｎ)に対する野生型ｍＲＮＡの最初の２００ヌクレオチドと、ヒトにおいてそれほど優勢でなく使われた（酵母至適化）(ｓＩｇｙ＋ｐｏｌｗｔ)コドンを持つＩｇＥリーダー配列をエンコードする５’配列を含むＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子に対するｍＲＮＡの最初の２００ヌクレオチド、に対するエネルギー最小限化に基づいた自由エネルギー価を持つ予測される二次構造をＭｕｌＦｏｌｄで示している。示されるように、"Ｔ"はＲＮＡ鎖において"Ｕ"に書き換えられる。
【図６】  ＨＩＶ−１  ｐｏｌ構造遺伝子に対するｍＲＮＡの予測される二次構造をＭｕｌＦｏｌｄで示してある。
【図７】  ヌクレオチド１７３８からヌクレオチド１９３８までの２００ヌクレオチド領域配列はヒトにおいてそれほど優勢でなく利用されたコドン（酵母至適化コドン）を持つために変えられた後のＨＩＶ−１  ｐｏｌ構造遺伝子に対するｍＲＮＡの予測される二次構造をＭｕｌＦｏｌｄで示している。
【図８】  予測される二次構造、ならびに、ヒト至適化コドン（ＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ｈｕ)を含むＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子に対するｍＲＮＡの最初の２００ヌクレオチドと、ヒトにおいて利用されたコドン（酵母至適化コドン）（ＨＩＶ  Ｐｏｌ  ｙｔ)を含むＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子に対するｍＲＮＡにおける全体の自由エネルギー価のＭｕｌＦｏｌｄで示している。示されるように、"Ｔ"はＲＮＡ鎖において"Ｕ"に書き換えられる。
【図９】  予測される二次構造と、ＨＩＶ−１  ｇａｇ構造遺伝子に対するｍＲＮＡ転写における全体の自由エネルギー価をＭｕｌＦｏｌｄで示してある
【図１０】  予測される二次構造と、ヒト（酵母至適化）においてそれほど優勢ではなく利用されたコドンに変えられたＨＩＶ−１  ｇａｇ構造遺伝子に対するｍＲＮＡ転写における全体の自由エネルギー価をＭｕｌＦｏｌｄで示してある。
【図１１】  予測される二次構造と、１）野生型ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ)エンベロープ（ｅｎｖ)遺伝子(ＷＮＶｗｔ２００)、２）最も優勢に使われたヒトにおけるコドン(ＷＮＶｈｕ２００)に至適化されたＷＮＶ  ｅｎｖ遺伝子、３）ヒトにおいてそれほど優勢でなく利用されたコドン(酵母至適化、ＷＮＶｙｔ２００)を持つＷＮＶ  ｅｎｖ遺伝子、に対するｍＲＮＡ転写の最初の２００ヌクレオチドにおける全体の自由エネルギー価をＭｕｌＦｏｌｄで示してある。示されるように、"Ｔ"はＲＮＡ鎖において"Ｕ"に書き換えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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