(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のFcドメインと強い結合親和性を有するプロテインＡのIgG結合ドメインを含むキメラ・エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む、標的細胞に形質導入を起こさせるウイルスベクターであって、該エンベロープタンパク質がウイルスのエンベロープタンパク質であり、かつ該エンベロープタンパク質がウイルス粒子へのタンパク質の組立てを指令するように機能し、前記キメラ・エンベロープタンパク質が内因性のウイルス指向性の除去を引き起こす、上記ウイルスベクター。
【請求項２】
ウイルスのエンベロープタンパク質がレトロウイルスのエンベロープタンパク質を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
ウイルスのエンベロープタンパク質が同種指向性マウス白血病ウイルスまたはトリ白血病ウイルスのgp70タンパク質である、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
キメラ・エンベロープタンパク質がgp70タンパク質とプロテインＡのIgG結合ドメインとの融合タンパク質からなる、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
ウイルスベクターがATCC受託番号98378のp439-ZZである、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
ウイルスのエンベロープタンパク質がアルファウイルスのエンベロープタンパク質を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
アルファウイルスのエンベロープタンパク質がシンドビス(Sindbis)ウイルスのエンベロープタンパク質を含む、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
プロテインＡのIgG結合ドメインがシンドビスウイルスのエンベロープタンパク質のE2糖タンパク質に挿入されている、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
キメラ遺伝子がシンドビスウイルスエンベロープタンパク質のE2糖タンパク質とプロテインＡのIgG結合ドメインとの融合タンパク質からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
ウイルスベクターがATCC受託番号98377のDH-BB-ZZである、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
適切なウイルス配列の制御下にある対象の遺伝子、抗体のFcドメインと強い結合親和性を有するプロテインＡのIgG結合ドメインを含むキメラ・エンベロープタンパク質を含むキメラタンパク質、および対象の特定の細胞を標的にする抗体を含んでなるウイルス複合体であって、前記キメラタンパク質が内因性のウイルス指向性の除去を引き起こす、上記ウイルス複合体。
【請求項１２】
IgG結合ドメインが前記エンベロープタンパク質の表面に発現される、請求項11に記載のウイルス複合体。
【請求項１３】
前記抗体がサイトカインの受容体と結合し、該サイトカインが脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コロニー刺激増殖因子、内皮増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、グリア由来神経栄養因子、グリア増殖因子、gro-beta/mip 2、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターフェロン、インターロイキン、角質細胞増殖因子、白血病阻害因子、マクロファージ／単球化学走性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化タンパク質２、血小板由来増殖因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、および血管内皮増殖因子からなる群より選択される、請求項11に記載のウイルス複合体。
【請求項１４】
前記抗体がクラスI MHC抗原、クラスII MHC抗原、インターナライジング細胞表面受容体およびウイルス受容体からなる群から選択される抗原と結合する、請求項11に記載のウイルス複合体。
【請求項１５】
請求項１に記載のウイルスベクターを含有するパッケージング細胞。
【請求項１６】
ウイルスがアルファウイルスであり、パッケージング細胞がbcl-2をコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項15に記載のパッケージング細胞。
【請求項１７】
パッケージング細胞が同種指向性細胞である、請求項15に記載のパッケージング細胞。
【請求項１８】
パッケージング細胞が同種指向性細胞である、請求項16に記載のパッケージング細胞。
【請求項１９】
同種指向性パッケージング細胞がψ2パッケージング細胞である、請求項15に記載のパッケージング細胞。
【請求項２０】
標的細胞において対象の遺伝子を発現させる方法であって、
a．1)標的細胞内で活動性であるプロモーターに機能的に連結された対象の遺伝子、および
2)エンベロープタンパク質と、抗体のFcドメインと強い結合親和性を有するプロテインＡのIgG結合ドメインとを含むキメラタンパク質、および
3)適切な抗体
を含むウイルスベクター複合体を形成し、そして
b．該ウイルス複合体をイン・ビトロで標的細胞に接触させる、
各ステップを含んでなり、前記接触は、該ウイルス複合体が細胞の中にインターナライズされるような適切な条件下で起こり、該エンベロープタンパク質はウイルスのエンベロープタンパク質であり、該エンベロープタンパク質はウイルス粒子へのタンパク質の組立てを指令するように機能し、前記キメラタンパク質が内因性のウイルス指向性の除去を引き起こす、上記方法。
【請求項２１】
ウイルスのエンベロープタンパク質がレトロウイルスタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
キメラタンパク質がgp70タンパク質とプロテインＡのIgG結合ドメインとの融合タンパク質からなる、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
エンベロープタンパク質がアルファウイルスのエンベロープタンパク質を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
アルファウイルスのエンベロープタンパク質がシンドビスウイルスのエンベロープタンパク質である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
プロテインＡのIgG結合ドメインがシンドビスウイルスのエンベロープタンパク質のE2糖タンパク質に挿入される、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
キメラ遺伝子がシンドビスウイルスエンベロープタンパク質のE2糖タンパク質とプロテインＡのIgG結合ドメインとの融合タンパク質からなるタンパク質をコードする、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
ウイルス複合体が適切な抗体とプレインキュベートされる、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
1.  発明の分野
本発明は標的細胞の形質導入のための、すなわち、遺伝物質を標的細胞に導入するためのウイルスベクターに関する。目的とする標的は、真核細胞、特にヒト細胞である。形質導入はin vivo若しくはin vitroで行うことができる。さらに詳しくは、本発明は、キメラ・エンベロープタンパク質をもち、かつプロテインＡのIgG結合ドメインを含有するウイルスベクターに関する。これらのベクターは、特定の細胞を標的とする抗体と共に用いるとき、遺伝子治療には特に有用である。
2.  発明の背景
真核標的細胞に目的遺伝子を導入し発現させるために様々なウイルス由来のベクターが使われてきた。標的細胞において機能性のプロモーターに機能し得る形で連結された目的遺伝子で、1以上のウイルス遺伝子を置換するのに組換えDNA技術が使用されている。ウイルスベクターと呼ばれるその構築物は、ウイルスの生理学的感染「機構」を用いて標的細胞に感染し、ウイルス遺伝子の代わりに目的遺伝子を発現する。ウイルスの遺伝子すべてがそのベクターに存在する訳ではないので、ベクターによる標的の感染はウイルス粒子を産生しない。ヒトまたは哺乳動物の標的細胞を感染させるのに用いられてきたウイルスとしては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび白血病型レトロウイルス誘導体がある。中でも、ヒト由来細胞の形質導入において特に関心がもてるレトロウイルスは、両種指向性(amphotropic)レトロウイルスに基づく構築物である。
2.1  両種指向性および同種指向性(ecotropic)レトロウイルスベクターの使用
レトロウイルスは特に真核細胞の形質導入によく適合する。このタイプのウイルスに基づくベクターの利点としては、形質導入された細胞の子孫が目的の遺伝子を発現するように標的細胞のゲノムへ該ベクターを組み込める点がある。第二に、形質導入された標的細胞においてウイルス粒子を生成させない感染性ベクター粒子のストックを作る手法が十分に開発されている点である。最後に、106TCIU/mlの力価をもつベクター粒子ストックを生産・精製することができる点である。
レトロウイルスベクターを使用するうえでの1つの欠点は、現在のところ、対象とする特定の組織若しくは細胞型を特異的に形質導入できる実用的一般的な方法が皆無であることである。この点に関し従来なされた努力として、ウイルスベクター粒子の身体的分布を特定の器官に限定するという外科的な手法があった(Ferry,N.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.88:8377)。あるいは、当業者はC型のレトロウイルスベクターが分裂中の細胞にしか感染しないという事実を利用してきた。こうして、細胞、例えば、骨髄細胞の集団が被験者から取り出され、特定の標的細胞に特異的な増殖因子の存在下にex vivoで培養された。従って、培養液中には分裂細胞の大部分が含まれる。例えば、Wilson,J.M.et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:439-47;Ohashi,T.et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.89:11332-36参照。形質導入後に分裂細胞を回収して、多くの目的のために被験者に再び植え込まなければならない。あるタイプの細胞に特異的な増殖因子が利用できないことと合わせてex vivo培養法の技術的な困難性は、このアプローチの適用を制限してきた。
レトロウイルス由来のベクターを使用することによって生じる第二の困難は、ベクターの配列と内因性レトロウイルスとの間に組換えが起こる可能性があるという点にある。そのような組換えは、標的細胞による感染性粒子の生産を生じさせる複製能のあるウイルスをもたらすことがある。ヘルペスウイルスやアデノウイルス感染とは対照的に、レトロウイルス感染は必ずしも自己限定的ではない。
これらの難点にも拘わらず、ヒト細胞に感染する両種指向性マウス白血病レトロウイルスに基づくレトロウイルスベクターは、ある種の疾病、例えば、アデノシンデアミナーゼと低密度リポタンパク質受容体の欠損症およびゴーシェ病のヒト遺伝子治療に使用することが承認されている。例えば、Miller A.D.,1992,Nature 357:455;Anderson,W.F.,1992,Science 256:808;およびCrystal,R.G.,1995,Science 270:404-410参照。
ヒト細胞で両種指向性レトロウイルスベクターを使用することの制限を克服する1つのアプローチは、ウイルスの感染特異性を決めるウイルス表面のタンパク質、gp70タンパク質をコードする遺伝子を突然変異させることであった。組換えDNA技術を用いて、予め決めた配列でgp70配列の小領域を置換させた「変異型」ウイルスを構築する。このアプローチにも、目的とする標的の感染を可能にする配列についての知識がなければならないという制限がある。しかしながら、この知識が得られた場合は、ウイルス特異性の予想された変更が観察されている(Valsesia-Wittmann,S.,1994,J.Virol.68:4609-19)。
レトロウイルスベクターは、今日、脊椎動物細胞のゲノムへ安定に遺伝子を形質導入できる最も有効なツールである。遺伝子導入に常用されるマウス白血病レトロウイルス(MLV-)由来のベクターは、その宿主域に基づき、同種指向性かまたは両種指向性として分類される。マウスの同種指向性ビリオンはマウスまたはラット細胞に感染し得るだけであるが、マウス両種指向性ウイルスはヒト細胞を含む殆どの種の細胞に感染することができる。そのように広いスペクトルの細胞に感染するその能力のために、両種指向性ウイルスベクターを使用することの大きな欠点は、これらベクターが標的細胞に対する特異性を欠くという事実である。
これまで、レトロウイルスの宿主域を変更するいくつかの試みが報告されている。最近、マウス白血病レトロウイルス(MLV)のエンベロープタンパク質を直接改変すると、ウイルスの指向性が変わることが分かってきた。MLV env遺伝子のN末端領域で単一Fv抗体鎖をコードするフラグメントを含む組換えウイルスは、対応するエピトープを認識してヒト細胞に感染することが分かった(Russell,S.J.et al.,1993,Nucleic Acids Res.21:1081-1085;Somia,N.V.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7570-7574;Marin,M.et al.,1996,J.Virol.70:2957-2962)。Kasaharaらはエリトロポエチン-エンベロープ融合タンパク質を含むキメラな同種指向性ウイルスを作っている(Kasahara,N.et al.,1994,Science 266:1373-1376)。このキメラ・ウイルスはエリトロポエチン受容体をもつヒト細胞に感染することが分かってきた。しかしながら、こうしたアプローチには少なくとも2つの制限がある。まず第一に、それぞれの標的指向可能なベクターを新たに構築しなければならない。常に等しい成功をもって、また、得ることができるウイルス力価に比べその力価を減少させることなく、ウイルスのエンベロープ中に異なる標的指向性エレメントを組み込むことはできそうにない。第二に、野生型組換え体はそのようなベクターで治療した患者に潜在的な有害作用を与えることがあるため、ヒト細胞の特定の標的と直接結合するように構築されたビリオンは本質的に安全ではない。逆に、本明細書に記載されたごとく構築したビリオンは、mABのような付随的標的指向試薬が存在しない場合、ヒト細胞に対して感染性でない。mABは別個に作って、用時にウイルスと一緒に提供するだけでよい。
2.2  標的細胞を形質導入するための公知のウイルスベクター複合体
gp70タンパク質そのものの結合特異性を変更するもう1つの方法は、ウイルス粒子と標的細胞の両方に結合する、または結合される第2の新規な構造体を使用することである。このアプローチの1例として、ラクトース分子を非特異的反応により、同種指向性レトロウイルスのエンベロープタンパク質と共有結合させた。同種指向性レトロウイルスは、普通ヒト細胞には感染しない。形質導入された目的の遺伝子が標的細胞染色体に組み込まれたことは直接実証されていないが、ラクトース含有タンパク質の受容体をもつことが知られているヒト肝細胞癌はこのベクター複合体による形質導入を受けやすいことが分かった(Neda,H.et al.,1991,J.Biol.Chem.266:14143)。ラクトース特異的受容体のない肝細胞癌では発現の証拠は何も観察されなかった。Nedaの方法は、それぞれの誘導体化または結合されたエンベロープタンパク質に結合した、標的細胞上の露出アクセプターに対する可変数の結合部位をもたらすが、この方法はもちろん、標的細胞がラクトース受容体をもつ場合に限られている。
標的指向(ターゲッティング)に対するもう1つのアプローチは、ベクターに共有結合していないアダプターを含むアダプター分子を使用することである。このタイプのアダプターを使用することは、Rouxらにより試みられており、このストラテジーに関する報告が数件発表されている(1991年1月4日、Piecheczykの仏特許2,649,119;Roux P.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.86:9079-83;Etienne-Julan,M.et al.,1992,J.Gen.Virol.73:3251-55)。Rouxらは、2種のタンパク質(両方とも典型的には抗体)をビオチン化し、アビジンまたはストレプトアビジン4量体(すなわち、4個のビオチン分子と結合する)を用いてビオチン化タンパク質4個までの凝集体を生成することにより、これら2種のタンパク質からアダプターを構築している。
Merueloらの1994年12月23日付米国特許出願No.08/363,137にはさらに改良されたアプローチが記載されており、その内容は引用により本明細書に組み入れるものとする。Merueloらは、遺伝子治療に適した予備形成アダプターおよびリンカーを製造するためのウイルス複合体およびその使用法を記載している。それはレトロウイルス系には特によく適合する。
2.3  シンドビス(Sindbis)ウイルスベクターの使用
アルファウイルス属の1員であるシンドビスウイルスは、ウイルス由来の発現ベクターとして使用することについて相当の注目を集めてきた。発現構築物の迅速な遺伝子操作、高力価の感染性粒子ストックの生産、非分裂細胞への感染および高レベルの発現を含む、アルファウイルスベクターの多くの性質によって、アルファウイルスベクターは、開発されるその他のウイルス由来のベクター系の好ましい代替物となっている(Strauss,J.H.et al.,1994,Microbiol.Rev.58:491-562;Liljestrom,P.et al.,1991,Biotechnology 9:1356-1361;Bredenbeek,P.et al.,1992,Semin.Virol.3:297-310;Xiong,C.et al.,1993,Science 243:1188-1191)。しかしながら、シンドビスウイルスベクターを使用することの重大な欠点は、これらのベクターが標的細胞特異性をもたないという事実である。哺乳動物細胞の場合、少なくとも1つのシンドビスウイルス受容体は高親和性のラミニン受容体として以前に同定されたタンパク質であり、その広範な分布と高度に保存された性質は一部にはこのウイルスの広い宿主域に関係しているかもしれない(Strauss,J.H.et al.1994;Wang,K.-S.et al.,1992,J.Virol.66:4992-5001)。ある種の標的細胞型に対して特異的に遺伝子を送達するよう、シンドビスウイルスベクターの指向性を変更することが望ましい。これは、内因性ウイルス指向性を除くことと新しい指向性を導入することの両方を必要とする。成熟シンドビスウイルス粒子では、＋鎖ウイルスゲノムRNAとキャプシドタンパク質Cとが複合体を作って、2種の細胞膜内膜糖タンパク質であるE1およびE2が埋め込まれた脂質二重層によって取囲まれた二十面体ヌクレオキャプシドを形成している(Strauss,J.H.et al.,1994)。E1とE2は1単位として機能するヘテロ2量体を形成するが、E2ドメインは細胞への結合に特に重要なようである。ウイルス感染力を中和することができるモノクローナル抗体(mAb)は普通E2特異性であり、E1よりもむしろE2の突然変異のほうがより頻繁に宿主域と毒性の変更に関係している(Stanley,J.et al.,1985,J.Virol.56:110-119;Olmsted,R.A.et al.,1986,Virology 148:245-254;Polo,J.M.et al.,1988,J.Virol.62:2124-2133;Lustig,S.et al.,1988 J.Virol.62:2329-2336)。最近、E2に挿入を含み、哺乳動物細胞に対して欠陥結合を示すシンドビスウイルス突然変異体が確認された。この変異体は、標的指向性のシンドビスウイルスベクターの開発に有用であると期待されている(Dubuisson,J.et al.,1993,J.Virol.67:3363-3374)。
Grieveら(1994年8月18日国際公開WO 94/17813「Toxoplasma Gondii P30抗原を発現する欠陥シンドビスウイルスベクター」)は、欠陥シンドビスウイルスベクターを使用して、原生動物の寄生体、ぜん虫寄生体、外部寄生体、真菌、細菌およびウイルス類から哺乳動物を防御することを報告している(その内容を引用により本明細書に組み入れる)。Garoffら(1992年6月25日国際公開WO 92/10578「アルファウイルスに基づくDNA発現系」)は、アルファウイルスを使用して、免疫用またはタンパク質産生用のタンパク質配列を発現させることを述べている(その内容を参照により本明細書に組み入れる)。Davisら(1993年2月9日米国特許5,185,440「ベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルスおよびその弱毒化変異体をコードするcDNAクローン」)は、VEEをコードするcDNAおよび弱毒化トガウイルスの製造法を記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Huangら(1993年6月8日米国特許5,217,879「感染性シンドビスウイルスベクター」)は、ゲノムの構造領域に挿入された異種配列をもつ感染性シンドビスウイルスベクターを記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Schlessingerら(1992年2月25日米国特許5,091,309「シンドビスウイルスベクター」)は、挿入された異種配列をもつシンドビスウイルス欠陥干渉(DI)粒子に基づくRNAベクターを記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Dalemansら(1995年10月12日国際公開WO 95/27069「ワクチンキャリアとしてのアルファウイルスRNA」)は、抗原エピトープすなわち抗原決定基をコードする外因性RNAを送達するための、アルファウイルス、特にセムリキ森林熱ウイルスの医療的使用を記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Dubenskyら(1995年3月23日国際公開WO 95/07994「組換えアルファウイルスベクター」)は、異種遺伝子を標的細胞に送達する組換えレトロウイルスアルファウイルスベクターを記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Sjobergら(1995年11月23日国際公開WO 95/31565「アルファウイルス発現ベクター」)は、アルファウイルスの基本配列の下流にある異種配列の発現を増加させるベクターを記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。Liljestromら(1995年10月12日国際公開WO 95/27044「アルファウイルスcDNAベクター」)は、動物またはヒト細胞に導入されかつ転写されるcDNA構築物を記載している(その内容は引用により本明細書に組み入れる)。
3.  発明の概要
本発明は、ウイルスベクターおよびその使用に関する。特に、本発明はウイルスエンベロープタンパク質およびプロテインＡのIgG結合ドメインを含むキメラ・タンパク質である、ウイルス粒子表面上のタンパク質をもつウイルスに関する。プロテインＡは抗体のFc領域に結合するので、これらのキメラ・タンパク質により、抗体が結合しない細胞に対してではなく、抗体が結合する所望の細胞に対して、そのウイルス粒子を標的指向(ターゲッティング)させるために抗体を使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図1.  A：発現構築物の模式図。p439は、野生型Mo-MLVエンベロープ遺伝子を含むSV40由来の発現ベクターである。プラスミドp439-ZZは、適合性のリンカー-スペーサーの存在下、p439ベクターのユニークな制限部位Bst EIIおよびBam HI間のプロテインＡの合成IgG結合部(ZZ)でMo-MLV env遺伝子を置換することにより構築した。構築の詳細については「材料および方法」の項参照。
図中の略号：
LTR     ロングターミナルリピート
SV40P   SV40初期エンハンサー/プロモーター
L       リーダー配列
SU      表面タンパク質
TM      膜貫通タンパク質
ZZ      合成プロテインＡ
L/S     リンカー-スペーサー
p(A)    ポリアデニル化シグナル
B：p439およびp439-ZZで一過性にトランスフェクトされたCOS-7細胞から得られた溶解物のイムノブロット分析。レーン1および2は、SU抗血清、次いでHRP結合ウサギ抗ヤギIgGで染色した。レーン3および4は、プロテインＡの検出のためにHRP結合ウサギIgGで染色した。
図2.  A：ψ2およびψ2-ZZ10パッケージング細胞によって作られたビリオンのイムノブロット分析。レーン1および2は、SU抗血清、次いでHRP結合ウサギ抗ヤギIgGで染色した。レーン3および4は、プロテインＡの検出のためにHRP結合ウサギIgGで染色した。B：ψ2-ZZ10細胞によって生産されたキメラウイルスのIgG結合活性を検出するELISA。白丸：ψ2からのウイルス粒子；黒丸：ψ2-ZZ10からのウイルス粒子。結果は3回測定の平均値である。
図3.  (A)：シンドビスウイルスベクターを再標的指向させるための模式的戦略図。野生型シンドビスウイルス(左)は、哺乳動物細胞とその表面受容体を介して結合しており、該受容体は種を超えて高度に保存されていることが知られている。プロテインＡのIgG結合ドメインを示す組換えシンドビスウイルス(右)は、対応するモノクローナル抗体(mAb)と一緒に使用する場合には、細胞表面の新しい標的分子に結合するようになるだろう。(B)：組換えヘルパー構築物とSinRep/LacZ発現ベクターの模式図。DH-BBは、親のヘルパープラスミドであり、このプラスミドはシンドビスウイルスゲノムのパッケージングに必要とされる構造タンパク質(キャプシド、E3、E2、6KおよびE1)の遺伝子を含んでいる。DH-BB-Bstはアミノ酸71、74間のE2糖タンパク質にクローニング部位(BstEII)を導入することによって構築された。プロテインＡの合成IgG結合ドメイン(ZZ)はDH-BB-BstヘルパープラスミドのBstEIIに挿入され、DH-BB-ZZが得られた。SinRep/LacZは、RNA転写物を複製するためのパッケージングシグナル非構造タンパク質遺伝子およびlacZ遺伝子を含む、シンドビスウイルス由来の発現ベクターである。
図中の略号：
PSG     シンドビスウイルスのサブゲノムプロモーター
C       キャプシド
nsP1-4  非構造タンパク質遺伝子1-4
ZZ      プロテインＡの合成IgG結合ドメイン
p(A)    ポリアデニル化シグナル
図4.  シンドビスウイルス構造タンパク質成分および組換え体エンベロープの検出。ヘルパーRNAでトランスフェクトされたBHK細胞の細胞溶解物(A)およびその細胞からのウイルス粒子のペレット(B、C)をSDS-PAGE分析に付した。ニトロセルロースフィルターに移した後、ウイルスタンパク質を希釈した抗シンドビスウイルスマウス免疫腹水で染色して全構造成分を検出するか(AおよびB)、またはHRP-コンジュゲートヤギ抗マウスIgGで染色してプロテインＡ-エンベロープキメラタンパク質を検出した(C)。各パネル中、レーン1、レーン2およびレーン3はそれぞれ、DH-BB、DH-BB-Bst、DH-BB-ZZである。
図5.  細菌のlacZ遺伝子を形質導入するDH-BB-ZZヘルパーRNAから誘導された組換えシンドビスウイルスによるHeLaおよびHeLa-CD4+の感染。室温で1時間、抗CD4 mAb(0.5μg/ml)不在下または存在下、ウイルス上清(200μl)を予めインキュベートした後、6ウェルプレート中の各細胞(2 x 105個)に加えた。室温で1時間インキュベート後、細胞をPBSで洗い、増殖培地で24時間培養した。ウイルス感染はX-Gal染色により評価した。
図6.  A431およびU87MG細胞に対する組換えシンドビスウイルス粒子の抗体依存性感染力。室温で1時間、抗EGFR mAb(0.5μg/ml)不在下または存在下、ウイルス上清(DH-BBについては20μl、DH-BB-ZZについては500μl)を予めインキュベートした後、6ウェルプレート中の細胞(2 x 105個)に加えた。室温で1時間インキュベート後、細胞をPBSで洗い、増殖培地で24時間培養した。ウイルス感染はX-Gal染色により評価した。
図7.  浮遊細胞DaudiおよびHL-60に対する組換えシンドビスウイルス粒子の抗体依存性感染力。室温で1時間、0.5μg/mlのmAb(Daudiについては抗HLA-DR、HL-60については抗CD33)不在下または存在下、DH-BBおよびDH-BB-ZZでトランスフェクトしたBHK細胞から誘導されたウイルス上清(500μl)を予めインキュベートした後、6ウェルプレート中の細胞(1 x 106)に加えた。室温で1時間インキュベート後、細胞をPBSで洗い、成長培地で24時間培養した。対照は未感染細胞を示す。ウイルス感染は実験プロトコルに記載したFACS-Gal分析により評価した。各パネルに感染細胞の陽性パーセントを示した。
5.  発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物の細胞や鳥類細胞、さらに詳しくは、医療のため、ヒト細胞、さらにまた、獣医療のため、農業およびレクリエーションの目的に価値がある飼育動物の細胞等の真核細胞における遺伝子発現を変更する手段を提供する。本発明は、ウイルスベクター複合体による遺伝子物質の細胞への導入及び発現について提供する。ウイルスベクターにおいては、ウイルス遺伝子のいくつかまたは全部は、真核標的細胞で発現されるべき遺伝子によって置換されている。そのベクターから除かれた重要なウイルス遺伝子は、一般に、ウイルス粒子ストックを作るのに用いられる細胞系のゲノムに挿入される。プロデューサー細胞系はこうしてウイルスベクターに存在する欠陥を補完している。いくつかの態様においては、ベクターのゲノムに含まれる唯一のウイルス遺伝子は、ベクターゲノムをウイルス粒子にパッケージングするために必要とされる遺伝子である。
詳細に述べると、本発明は、エンベロープタンパク質およびプロテインAのIgG結合ドメインを含むキメラタンパク質をコードする標的細胞に形質導入するウイルスベクターに関する。1態様において、エンベロープタンパク質はレトロウイルスのエンベロープタンパク質である。1例としてマロニーMLVエンベロープタンパク質を挙げることができる。プロテインAのIgG結合ドメインはエンベロープタンパク質に挿入される。本明細書において、プロテインAはネイティブなプロテインAの1部であってもまたネイティブなプロテインAのFc結合性をもつ合成タンパク質であってもよい。1態様においては、それはgp70の超可変領域に挿入される。
他の態様において、エンベロープタンパク質はアルファウイルスエンベロープタンパク質である。アルファウイルスの1例としてはシンドビスウイルスがある。シンドビスウイルスについては、プロテインAをE2ドメインに挿入するのが好ましい。プロテインAはシンドビスウイルスの非特異的感染性を減少させるかまたは最小とするように挿入するのが好ましい。挿入部位の1例はE2グリコプロテインのアミノ酸71と74の間の位置である。
ウイルスによる感染を受けやすい細胞において一般的な遺伝子発現に適したウイルスに基づくベクターを構築については以下の特許文献に記載されている。Mulligan,R.C.らのWO 89/05345、レトロウイルスベクターに関するGuild,B.C.らのWO 92/07943、ヘルペスベクターに関するGeller,A.I.らのWO 90/09441およびWO 92/07945、Kahn,A.らのWO 94/08026、アデノウイルスベクターに関するHerz,J.らのWO 94/10322、アデノ随伴ウイルスに関するLebkowskiのUSP 5,354,678およびMuzcyzkaのUSP 5,139,941、そしてシンドビスウイルスベクターに関するHuangらのUSP 5,217,879およびSchlesingerのUSP 5,091,309。レトロウイルスベクターを作るパッケージングシステムはDanos,O.et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:6460-64およびLandau,N.R.et al.,1992,J.Virol.66:5110-13に記載されている。上記の内容は引用により本明細書に組み入れるものとする。
本明細書に記載の複合体には、多様な特異性を与えることができる。本出願は、標的細胞のアクセプターに特異的な抗体を含む複合体を構築する方法を開示するものであり、ベクター複合体は、ベクター複合体の結合後、標的細胞内に取り込まれる(インターナリゼーション)。アクセプターとして用いるのに適し、かつ、その抗体がすでに利用できる適当な細胞表面抗原は数多い。そのような構造としては、以下の例示に限定されるものではないが、クラスIおよびクラスIIの主要組織適合性抗原；以下の種々のサイトカイン類および細胞型特異的成長ホルモン類の受容体、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CTNF)、コロニー刺激因子、内皮増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、グリア細胞増殖因子、gro-beta/mip 2、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、インターフェロン類(α-IFN、β-IFN、γ-IFN、コンセンサスIFN)、インターロイキン類(IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14)、角質細胞増殖因子、白血病阻害因子、マクロファージ/単球走化性活性化因子、神経成長因子、好中球活性化プロテイン2、血小板由来成長因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子および血管内皮増殖因子；細胞接着分子；アミノ酸のような代謝物の輸送分子；B-およびT-リンパ球の抗原受容体；およびリポタンパク質の受容体がある。本発明は、ウイルスベクター複合体の標的として分化抗原を使用することにより、細胞型の特異的感染を可能にするものである。
本発明は、目的遺伝子を標的細胞へ形質導入するのに用いられる。本発明の好ましい態様を実施するには、標的細胞アクセプターと接触させる前に、予めウイルスベクターと抗体とをインキュベートしておく。
本発明の実施は、標的細胞をex vivoで培養することによって行うことができる。培養細胞を培養液に維持しておけば形質導入された遺伝子によってコードされた生成物を得ることができる。あるいは、ex vivoで形質導入された細胞を被験者に移植することができる。被験者はその培養細胞を得た宿主であってもよい。
さらに他の態様においては、ウイルスベクターと適当な抗体とを被験者に直接投与してもよい。そうすることによってex vivoで細胞培養する必要性を除くことができる。被験者に対する投与経路は、ベクター複合体と標的細胞が結果的に接触しさえすればいかなる経路であってもよい。従って例えば、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および循環系または造血系の標的細胞には静脈投与が適切である。ベクター複合体は、標的器官につながる動脈または静脈のカテーテル注入によって投与することもでき、それによって複合体を局所投与することができる。標的細胞が呼吸器系である場合には、複合体は吸気によって投与することもできる。
本発明の実施によって形質導入できる遺伝子は、真核細胞系で発現できるいずれの遺伝子をも含む。本発明を使用することによって発現できる遺伝子を例示すれば、グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、および第VIII因子や第IX因子のような血液凝固因子が含まれる。
ベクター複合体のウイルス成分は、その粒子が標的細胞と同じ種の細胞と結合できないか、または結合不能となるように改変されているウイルスであれば、いかなるウイルス由来のものであってもよい。そのようなウイルスを限定することなく例示すれば、マウス同種指向性白血球レトロウイルス、例えば、Moloney白血病ウイルスまたはAKVをあげることができる。あるいはまた、化学的に修飾したウイルス粒子を使用してもよい。同種指向性レトロウイルスの他に、本発明のこの態様に従ってベクターを構築するのに使用できるウイルスとしては、両種指向性レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスがある。さらに、本発明のウイルス成分はシンドビスウイルスのようなアルファウイルスであってもよい。
本発明のウイルスベクターとウイルスの複合体は、ヒトおよび動物の様々な疾患を治療するのに使用することができる。シンドビスウイルスに基づくベクターは、特に分子内ワクチン用として非常に適している。すなわち、ウイルス複合体は特定の抗原をコードする目的遺伝子をもっている。ウイルス複合体は細胞に取り込まれ、その抗原をコードする目的遺伝子を細胞の細胞質で発現する。ウイルス複合体を所望の細胞標的に目標を定めることにより、該抗原が目的とする細胞内で発現される。
本発明の複合体はまたアンチセンス配列の送達にも非常に適している。
本明細書に記載の方法によって予防または改善できる細菌性およびウイルス性疾患として多数の疾患を例示することができる。特に、本明細書に記載の方法は以下の疾病に用いることができる。アデノウイルス、AIDS、抗生物質関連下痢、細菌性肺炎、ウシヘルペスウイルス(BHV-1)、クラミジア、クループ、ジフテリア、Clostridium difficile、膀胱炎、サイトメガロウイルス(CMV)、胃炎、淋病、ヘリオバクターピロリ、A型肝炎、B型肝炎、ヘルペスウイルス、HSV-1、HSV-2、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、在郷軍人会病、Lyme病、マラリア、多発性硬化症、消化性潰瘍、百日咳、乾癬、狂犬病、呼吸器融合ウイルス(respiratory syncytial virus:RSV)、リウマチ様関節炎、ライノウイルス、ロトウイルス、サルモネラ、急性喉炎症、破傷風または旅行者下痢。
以下、本発明の態様をさらに詳述する。
6.  実施例
6.1.  実施例１：
本実施例においては、プロテインA-エンベロープキメラタンパク質を示す組換え同種指向性レトロウイルスの構築を記載する。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のタンパク質であるプロテインAは種々のほ乳動物IgG類のFc領域に強い親和性をもっている(Surolia,A.et al.,1982,Trends Biochem.Sci.7:74-76)。ネイティブなプロテインAは5個の相同IgG結合ドメイン(E、D、A、BおよびC)をもっており、本発明者らはプロテインAのBドメインに基づく合成Zドメインを利用した(Nilsson,B.et al.,1987,Protein Eng.1:107-113)。IgG(モノクローナル抗体)を結合できるレトロウイルスベクターの開発は特異的な遺伝子伝達にとって重要な応用であった。
物質および方法
6.1.1.  プラスミドおよび細胞株
マロニーMLV(Mo-MLV)エンベロープタンパク質を発現する、SV40由来のプラスミドp439(SV-E-MLV-env)(Landau,N.R.et al.,1992,J.Virol.66:5110-5113)はニューヨーク大学のDan R.Littman博士に提供いただいたものである。プロテインAのBドメインに基づく合成Zドメイン2個を含むpEZZ 18(Lowenadler,B.et al.,1987,Gene 58:87-97)は、スエーデン、ウップサラ(Uppsala)のPharmacia Biotechから購入した。ゼオシン耐性選択遺伝子をもつpZeoSVは、カリフォルニア州サンディエゴのInvitrogen Co.から購入した。同種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株ψ2(ATCC CRL9560)(Mann,R.et al.,1983,Cell 33:153-159)およびCOS-7細胞(ATCC CRL1651)は、10%胎児ウシ血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に維持した。
6.1.2.  キメラenv遺伝子の構築
テンプレートとしてpEZZ 18を用いポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、プロテインA(ZZ)の2つの合成IgG結合ドメインを増幅した。PCR増幅に使用したプライマーは、Bst EII部位をもつZZ-5(5’-CACGATGAGGTAACCGACAACAAATTCAAC-3’)(配列番号1)および、pEZZベクターのマルチクローニング部位下流に位置するM13(-40)シークエンシングプライマー(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)(配列番号2)である。得られたPCR産物はBst EIIおよびEco RIで消化し、リンカー/スペーサーとして機能する適合オリゴヌクレオチドEB1(5’-AATTCGGGAGGCGGTGGATCAGGTGGAGGCGGTTCAGG-3’)(配列番号3)およびEB2(5’-GATCCCTGAACCGCCTCCACCTGATCCACCGCCTCC-3’)(配列番号4)の存在下、p439ベクターのユニークな制限部位Best EII(5923位)およびBam HI(6537位)間にMo-MLV env遺伝子を置換した。適正なサイズの挿入物を含むクローンのシークエンシングを行って正しいリーディングフレームが維持されていることを確認した。
6.1.3.  細胞トランスフェクションおよびウイルス製造
最初にまず、野生型およびプロテインA-gp70キメラエンベロープ遺伝子をCOS-7細胞へ一過性にトランスフェクトした。直径3.5cmの皿に2 x 105個の細胞を植え、翌日LipofectAmine試薬(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)10μlとともにプラスミド2μgでトランスフェクトした。トランスフェクトして72時間後、細胞を集めてイムノブロット分析を行った。組換えエンベロープを発現するパッケージング細胞株を生産するため、CaPO法(Stratagene,La Jolla,CA)(Mann,R.et al.,1983)により、5 x 105個のψ2細胞をキメラエンベローププラスミド20μgおよびpZeoSV 1μgでトランスフェクトした。16時間後培地を交換し、トランスフェクトした細胞をゼオシン(Invitrogen Co.,San Diego,CA)250μg/mlで選択した。10日間の選択後、増殖させるためにゼオシン耐性細胞コロニーを選び取り、以下に述べるイムノブロット分析およびELISAによってスクリーニングした。
6.1.4.  イムノブロット分析
プロテインA-エンベロープキメラタンパク質の発現をモニターするため、トランスフェクトした細胞とウイルス試料のイムノブロット分析を行った。ウイルス試料は、SW41ベックマンローター(25,000rpm,2h,4℃)で上清(10ml)の超遠心を行うことによりペレット化した。イムノブロット分析は、Rausher白血病ウイルスSUタンパク質(Quality Biotech Inc.,Camden,NJ)に対するヤギ抗血清とホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギIgG抗体(Pierce,Rockford,IL)を用いて、既述の通りに行った(Marin,M.et al.,1996,J.Virol.70:2957-2962)。
6.1.5.  ELISA
培養上清中にプロテインA-エンベロープキメラタンパク質をもつキメラウイルスを検出するためELISAを行った。簡単に説明すると、10mlの培養上清からペレット化したウイルス粒子を400μlのリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁した。96ウェルマイクロタイタープレート(Dynatech Laboratories,INC.,Chantilly,VA)を2時間、室温で２連段階希釈したウイルス試料でコートした後1% BSAおよび0.05% Tween 20含有PBSでブロックした。次いで、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギIgG抗体(Pierce)0.1μg/mlを添加して室温で2時間インキュベートした。0.05% Tween 20含有PBSで洗浄後、基質としてo-フェニレンジアミン(Pierce)を用いて、各ウェルの結合活性を測定した。
6.1.6.  結果
COS-7細胞におけるプラスミド構築と一過性発現
プロテインAの2個の合成IgG結合ドメインを発現する、改変Mo-MLVエンベロープ発現ベクターp439-ZZを作った(図1)。gp70での置換位置は、エリトロポエチン(Kasahara,N.et al.,1994)およびヘレグリン(Han,X.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751)の機能を発揮させることが事前に分かっていた。プロテインA遺伝子のC末端は、プロテインAのIgG結合部と組換え融合タンパク質のエンベロープタンパク質セグメントとの相互作用を回避するため、EBリンカー/スペーサー(SGGGGSGGGGS)(配列番号5)でgp70のプロリン含量の多い超可変領域に結合されている。発現は、SV40初期エンハンサー/プロモーター配列と5’ロングターミナルリピート(LTR)によって駆動される。プラスミドp-439-ZZは1997年3月28日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託された。
組換えエンベロープの発現を調べるため、本発明者らはCOS-7細胞にp439-ZZ発現プラスミドをトランスフェクトした。まず、同種指向性(70kDa)のMo-MLV SUタンパク質に交差反応する抗Rauscher白血病ウイルスSU血清を用い、エンベロープ発現について、トランスフェクトした細胞とトランスフェクトされていない細胞の溶解物(lysate)を分析した。予測したとおり、野生型のp439プラスミドはgp70とその前駆体(80kDa)の主要タンパク質バンドを発現した(図1B、レーン2)。組換えp439-ZZプラスミドは、組換えエンベロープの前駆体タンパク質に対応する70kDaにおいて免疫反応性タンパク質を発現した。これは、プロテインA-gp70がトランスフェクトされたCOS細胞で発現し得ることを示唆している。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギIgGを用いてIgG結合活性を調べるため、同じ溶解物を使用した。図1Bのレーン6に示すとおり、p439-ZZプラスミドによって発現された70kDaのプロテインA-gp70キメラエンベロープ前駆体はIgG結合活性を示した。キメラプロテインA-gp70タンパク質の安定な発現は、プロテインAドメインが翻訳後適正に折り畳まれていることを示唆している。
プロテインA-エンベロープキメラウイルスを産生するパッケージング細胞株の生成
E-MLVのgag、polおよびenv遺伝子産物を発現するψ2パッケージング細胞株に、キメラエンベローププラスミドp439-ZZとゼオシン耐性遺伝子とを一緒にトランスフェクトした。ゼオシンで選択後、サブクローンを取り出し、ウサギIgGを使用する全細胞溶解物のイムノブロット分析により、プロテインA-gp70発現についてスクリーニングを行った。ψ2-ZZ10と呼ぶ1つのサブクローンは、細胞質のIgG結合活性を示した。これはさらに特性化するために選択された。キメラエンベロープタンパク質のビリオンへの取り込みを証明するため、ショ糖濃度勾配遠心法によりレトロウイルス粒子を精製した。次いで抗Rauscher白血病ウイルスSU血清またはウサギ抗ヤギIgGを用いて、ウイルスペレットのイムノブロット分析を行った。ψ2パッケージング細胞の野生型env遺伝子由来の70kDa主要バンドは、ψ2細胞、ψ2-ZZ10細胞両方のビリオンで検出することができた(図2A、レーン1、2)。プロテインA-gp70キメラタンパク質の推定分子量である60kDaのバンドも、ψ2-ZZ10によって産生したビリオンで検出することができた。しかしながら、ウイルスペレットでは野生型エンベロープに比べてより少ないキメラエンベロープが見つかった。ψ2-ZZ10により得られたビリオンは、60kDaのバンドにおいてIgG結合活性を示したのに対し、トランスフェクトされていないψ2細胞のそれにおいてはIgG結合活性がなかった(図2A、レーン3、4)。キメラウイルスのIgG結合活性はさらにELISAにより確認された。図2Bに示す通り、ψ2-ZZ10細胞によって得られたプロテインA-エンベロープキメラウイルスは、トランスフェクトされていないψ2細胞に比べて、濃度依存的にIgG結合活性を示した。総合すると、これらの結果により、p439-ZZがそのエンベロープにおいてIgG結合ドメインを示す組換えレトロウイルスを産生することを示された。
6.1.7.  検討
本研究において、本発明者らは、プロテインAがネイティブなエンベロープタンパク質に融合されたマウス同種指向性レトロウイルス粒子の表面に出現可能であることを示した。p439-ZZ由来のプロテインA-gp70キメラタンパク質は正しく発現されてビリオン中に組み込まれた。さらに、ψ2-ZZ10細胞によって得られたビリオン中にIgG結合活性が検出された。本研究において、キメラエンベロープは、ψ2-ZZ10によって得られたビリオン中では野生型エンベロープのそれと同じ程度に効率よく発現しなかった(図2A)。本発明者らは現在、発現プラスミドのエンハンサー/プロモーターを変更すること、ならびに他のパッケージング細胞株を利用することによって、プロテインA-gp70タンパク質の発現を増やす試みを行っているところである。多数のモノクローナル抗体が開発研究されているので、標的の原理として抗体-抗原相互作用を用いることは非常に有利である。キメラエンベロープのプロテインA部分は抗体のFcドメインと結合するので(Surolia,A.et al.,1982)、様々なmAbsのいずれも選択することができるから、標的となるエレメントに関してそれは柔軟性を付与するものである。細胞表面にレトロウイルスが随伴する抗体フラグメントの結合の後に、ウイルスと標的細胞間の膜融合が続くことが報告されている(Etienne-Julan,M.et al.,1992,Roux,P.et al.,1989)。細胞表面抗原に対するmAbsを示すプロテインA-エンベロープキメラレトロウイルスは、それらの抗原を発現する標的細胞へ優先的に結合しなければならない。そしてこのことがその感染を促進しているのかもしれない。
さらに、原則として、プロテインAの合成IgG結合ドメイン(ZZ)を挿入することにより、アデノウイルスやシンドビスウイルスベクターのごときその他のウイルスベクターで、同様のアプローチを用いることができる。本発明者らはまた、プロテインA-エンベロープで組換えシンドビスウイルスベクターも構築し、種々のヒト細胞に対するその高効率な細胞特異的感染を証明している。実施例2参照。本実施例に記載したプロテインA-エンベロープレトロウイルスベクターは、一旦ビリオンにおいてキメラエンベロープが成功裏に発現すれば、特異的細胞型に対する感染も可能となるはずである。結論として、ウイルス感染に関するプロテインA-mAb相互作用を利用する新規な細胞標的システムは、遺伝子発現研究ならびに遺伝子治療に広範な応用を提供するものである。
6.2.  実施例２：
この実施例で、本発明者らは、ウイルス向性(tropism)を再指令するプロテインA-エンベロープキメラタンパク質を提示する組換えシンドビス(Sindbis)ウイルスベクターの構築を記載する。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のタンパク質であるプロテインA(PA)は、様々な哺乳類IgGsのFc領域に対して強い親和性を有する(Surolia,A.ら，1982)。上に記載した標的レトロウイルスベクターとは対照的に、PA−エンベロープキメラウイルスベクターは、一度作製に成功すると、別の細胞を標的とするためのさらなる修正を必要としない。ターゲッティングは単に相補性mAbを変えることにより達成される(図３A)。さらに重要なことは、本発明者らは、このキメラウイルスをmAbと結合して使うと、ヒト細胞に感染して試験遺伝子である細菌性β-ガラクトシダーゼを高効率で伝達することができることを示す。ウイルス感染に対しPA-mAb相互作用を用いる新規の細胞ターゲッティングシステムは遺伝子発現研究および治療に重要な応用を有するであろう。
6.2.1.  結果
6.2.2.  プロテインA−エンベロープシンドビスウイルスヘルパープラスミドの構築
シンドビスウイルスのエンベロープタンパク質を修正するために、全長シンドビスウイルスcDNAクローン(Bredenbeek,P.J.ら，1993,J.Virol.67:6439-6446)のBspMIIとBamHI部位との間の領域の欠失により構築したDH-BBヘルパープラスミドを用いた(図３B)。DH-BB由来のRNAを、シンドビスウイルス発現ベクター由来の組換RNA(例えば、SinRep/Lacz、図３B)と同時トランスフェクトすると、DH-BB RNA転写物からトランスに発現される構造タンパク質は、組換えRNAのビリオンへのパッケージングを可能にする。DH-BBはパッケージングシグナルを含有しないので、防衛的妨害粒子を形成しないもしくは組換えRNAとパッケージされるであろう。２つの修正したシンドビスウイルスヘルパープラスミドを構築した：すなわち、BstEIIクローニング部位が挿入されたDH-BB-BstおよびPAの２つのIgG結合ドメインがE2領域に挿入されたDH-BB-ZZを作製した(図３B)。元来のプロテインAは５つの相同的IgG結合ドメイン(E、D、A、BおよびC)を有し、本発明者らは、プロテインAのBドメインに基づく合成Zドメインを用いた(Nilsson,B.ら，1987)。E2のコドン71と74アミノ酸との間の挿入位置を選んだのは、この領域の変異は、正常の粒子構築を可能とし、付着レベルの阻止ウイルス侵入(block virus entry)を解放することが、先に示されていたからである(Dubuisson,J.ら，1993)。
6.2.3.  キメラエンベロープのビリオンへの発現および組み込み
ヘルパーおよびSinRep/LacZプラスミドを線状化後、in vitro転写を実施し、RNAの品質をアガロースゲル上でチェックした(データは示されてない)。組換えエンベロープの発現を試験するため、組換えヘルパーRNAをSinRep/LacZプラスミド由来のRNAと共にBHK細胞中に、エレクトロポレーションにより同時トランスフェクトした。トランスフェクション効率は、以下の実験プロトコルに記載した方法によれば、通常ほぼ100%であった(データは示されてない)。トランスフェクトした細胞からの溶解物を、最初に、構造タンパク質の発現を抗シンドビスウイルス免疫腹水液を使って分析した。図４Aに示されたように、DH-BB-BstヘルパーRNAは、50〜55kDaバンドのエンベロープ(E1およびE2)およびDH-BBにより産生された親ウイルスと同じタンパク質プロフィールである33kDaのカプシドタンパク質を発現した。E2前駆体であるPE2に対応する60kDaのバンドも検出された。DH-BB-ZZ RNAにより発現されたタンパク質プロフィールにおいて、PA-E2およびPA-PE2キメラタンパク質の推定分子量である65〜70kDa間の主要バンドならびに33kDaカプシドタンパク質が観察された。これらの結果は、変異体が正しく発現されプロセッシングされたことを示す。DH-BB-ZZトランスフェクト細胞由来の溶解物中のエンベロープ(E1)のバンドは、E2糖タンパク質の消滅により、わずかに下にシフトされて見える。
キメラエンベロープタンパク質のビリオン中への組み込みを実証するために、ウイルスペレットを免疫ブロット分析に供試した。図４Bに示すように、DH-BBおよびDH-BB-Bst RNAにより産生されたビリオンはカプシドとエンベロープ(E1およびE2)タンパク質を含有し、DH-BB-Bstの変異はウイルスの組み立てに影響しないことを示す。PA-E2キメラタンパク質もビリオン中に取り込まれて、DH-BBおよびDH-BB-Bstには検出されないIgG結合活性を表した(図４BおよびCを参照)。これらの結果は、DH-BB-ZZは、エンベロープ中にIgG結合領域を提示する組換えシンドビス偽性ビリオンを産生することを実証する。トランスフェクトした細胞中に発現されたE1のタンパク質バンド(図４A、レーン３)はDH-BB-ZZ RNAにより産生されたビリオン中に検出することはできなかった。
6.2.4.  変異体エンベロープを運ぶウイルスによる感染
ハムスターおよびヒト細胞に対する組換えウイルスの感染力を、細菌性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を形質導入することができるシンドビスウイルスベクター(SinRep/LacZ)の伝達により測定した。表１に示すように、DH-BBおよびDH-BB-Bstヘルパー由来のウイルスは、BHK細胞に対して非常に高い感染力価(108LacZ CFU/ml)を示したが、DH-BB-ZZから産生したウイルスは非常に低い感染力(103LacZ CFU/ml)を示し、プロテインAのE2中への挿入は宿主細胞へのウイルス結合を阻止し、前の観察(Dubuisson,J.ら，1993)を支持することを示唆した。PAエンベロープウイルスも、ヒトHela-CD4+細胞に対して最小の力価(102LacZ CFU/ml)を示した。しかし、ビリオンが抗CD4 mAbと前培養されていると、プロテインA−エンベロープキメラウイルスは、抗体用量に依存して、Hela-CD4+細胞に感染することができた(表１)。ウイルス上清を0.5μg/ml mAbで前培養すると、感染力価はほぼ105LacZ CFU/mlであった。mAbによる感染力の向上は、DH-BBおよびDH-BB-Bstから誘導されたウイルスでは観察されなかった。図５に示すように、抗CD4 mAbをもつプロテインA−エンベロープキメラウイルスは、CD4をその表面に発現しないHela細胞に感染することはできず、感染は抗体および対応する抗原の両方に依存することを示した。これらのデータは、DH-BB-ZZヘルパー細胞RNA由来のPA-E2キメラエンベロープは、認識する抗体が存在すると、新しい受容体／抗原を介して、シンドビスウイルス感染を再指令できることを実証する。
次に、PA-E2を提示するウイルス粒子は、その表面に特異的抗原を発現する様々なヒト細胞系に対して感染能力があるかどうかを測定した。接着細胞として、類表皮癌細胞系A431およびグリア芽細胞腫細胞系U87MG(これらは、両方とも上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)を過剰発現する)を使った。予測したように、PAエンベロープをもつウイルスは、ビリオンを抗EGFR mAbで前培養したときにのみこれらの細胞に効率的に感染することができた(図６)。mAb(0.5μg/ml)を伴なう組換えウイルスのA431およびU87MG細胞に対する感染力価は、ほぼ104LacZ CFU/mlであった。mAbなしに感染させると、再び、これらの細胞についても最小の感染力(102LacZ CFU/ml)が見られた。本発明者らは、次に、２種のヒト懸濁細胞系、すなわち、Burkittリンパ腫細胞であるDaudi、および前骨髄球白血病細胞であるHL-60を使った。この実験では、感染細胞をFACS-Gal分析により検出した。感染力の典型的なFACS結果を図７に示した。粘着細胞(図６)のデータと対照的に、DH-BBヘルパーRNA由来の野生型ウイルス粒子は、DaudiおよびHL-60に対して非常に低い感染力をを有する。しかし、対応するmAb(Daudiに対する抗HLA-DR、およびHL-60に対する抗CD33)で前培養したPAエンベロープウイルスは、これらの細胞に非常に高い効率で感染することができ、感染細胞の陽性百分率は両細胞系ともに90%を越えた。mAb不在のときには、これらの細胞のプロテインA−エンベロープウイルスによる感染は観察されなかった。
6.2.5.  考察
本発明で、本発明者らは、プロテインA−エンベロープキメラタンパク質をウイルス表面に提示する組換えシンドビスウイルスベクターの構築を記載する。E2糖タンパク質の71アミノ酸と74アミノ酸との間の位置のプロテインA(zz)の合成IgG結合領域；この部位はシンドビスウイルスの宿主細胞への結合を阻止することが示されている(Dubuisson,J.ら，1993)。PA-E2キメラタンパク質は、シンドビスビリオン中に正しく発現されて取り込まれ、図４BおよびCに示すようにIgG結合活性を示した。しかし、この実験で、E1糖タンパク質のビリオン中への組み込みは検出できなかった(図４C、レーン３)が、トランスフェクトした細胞では発現された(図４A、レーン３)。IgG結合ドメインの挿入により、ヘテロ二量体を形成するE1との相互作用を阻害する組換えE2キメラタンパク質の構造的変化が生じる。E1とPA-E2との間の相互作用は十分には理解されてない。この結果はまた、シンドビスウイルスの組立てがE1糖タンパク質の組み込みなしに生じうることを示す。この観察は、シンドビスウイルス組立ての機構に対する洞察を与え得る。
PAエンベロープキメラシンドビスウイルスベクターは、BHKおよびその他のヒト細胞系に対して最小の感染力を示した。しかし、細胞表面抗原と反応するmAbを結合して使うと、PAエンベロープキメラウイルスはLacZ遺伝子をヒト細胞系に高効率で伝達することが可能であった。PAエンベロープウイルスはmAbおよび細胞表面の対応抗原なしに標識細胞に感染することができないので、組換えウイルスの新しい向性は抗原抗体相互作用に依存する(図５)。合わせて考えると、DH-BB-ZZヘルパーRNA由来のPA-E2キメラエンベロープは、シンドビスウイルス感染を高い効率で抗原抗体相互作用により再指令することができる。
いくつかのレトロウイルスおよびアデノウイルスの基づいた細胞ターゲッティングベクターが最近開発されている(Russel,S.J.ら，1993;Somia,N.V.ら，1995;Marin,M.ら，1996;Douglas,J.T.ら，1996,Nature,Biotechnology 14:1574-1578)。本発明の研究で開発された新規の細胞ターゲッティングシステムは、これらのレトロウイルスおよびアデノウイルス再ターゲッティングベクターと比較して、いくつかの利点を有する。本発明の手法では、各ターゲッティング可能ベクターをde novoに構築する必要がない。ウイルスのエンベロープ中の様々なターゲッティング要素の組み込みは、常に等しく成功し、得られるウイルス力価の低下なしに達成されることはあり得ないであろう。キメラエンベロープのプロテインA部分は、抗体のFcドメインと結合するので(Surolia,A.ら，1982)、ターゲッティング要素について、各種のmAbのどれかを選びうる柔軟性を可能とする。さらに、複製は、DNA中間体なしに、RNA分子のような感染細胞の細胞質中で全てに起こる(Strauss,J.H.ら，1994)。これは、ベクター活性の開始のために、核に入って宿主ゲノム中に統合しなければならないレトロウイルスとは対照的である。したがって、レトロウイルス由来ベクターは外来タンパク質の長期発現に対して応用はあるが、一過性の高レベル発現にはアルファウイルスベクターが主に有用である。さらに、アデノウイルスベクターは外来タンパク質を高レベルで発現することが可能であるが、これらのシステムは、アルファウイルスより遥かに複雑であり、構造タンパク質を含む多くの高度に抗原性のウイルス−特異的遺伝子産物を発現する(Rosenfeld,M.A.ら，1991,Science 252:431-434)。対照的に、最近のアルファウイルスベクターは、形質導入細胞のRNA増幅のために要求される４つのウイルスレプリカーゼタンパク質(非構造タンパク質nsP1〜nsP4)を発現するのみである。
シンドビスベクターを用いての研究において考慮しなければならないいくつかの問題がある。第１に、脊椎動物細胞のシンドビスウイルス感染は、持続感染が生じ得る神経細胞の注目すべき例外はあるが(Levine,B.ら，1992,J.Virol.66:6429-6435)、通常、アポトーシスによる細胞死をもたらす(Levine,B.ら，1993,Nature 361:739-742)。この細胞毒性は癌に対する遺伝子治療に適切であるうるが、長期または誘導性の発現ベクターは広範な応用を有するであろう。細胞性癌遺伝子bcl-2による細胞の形質変換は、シンドビスウイルスがもはやアポトーシスを誘起せず、代わりに持続感染を生じる細胞系に導くことが報告されている(Levine,B.ら，1993;Levine,B.ら，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:4810-4815、これらの内容は本発明出願書に参照により組み入れられる)。bcl-2は、アポトーシスの問題を克服する長期シンドビスウイルス発現ベクターを構築するために使うことができる。bcl-2ベクターは、キメラシンドビスエンベロープタンパク質およびコントロールシンドビスプロモーター下の目的の異種遺伝子の両方を発現する、マスターパッケージング細胞系を作製するために特に適切であろう。第２に、本発明において開発された組換えシンドビスウイルスベクターは、抗体が不在でも低い感染力を有しうる。したがって、受容体結合に関わるE1またはE2に他の部位が存在し得る(Strauss,J.H.ら，1994)。さらに、ニワトリ胚繊維芽細胞(Wang,K.S.ら，，Virology 181:694-702)およびマウス神経細胞(Ubol,S.ら，1991,J.Virol.65:6913-6921)上に様々な受容体が確認されており、シンドビスウイルスは複数の受容体を利用できることを示唆する。安全上の理由で、mAbと共に使わないときは、あらゆる哺乳類細胞に感染しない改善された組換えシンドビスウイルスベクターの開発が所望される。
本発明は、プロテインA抗体相互作用の新規な利用による、シンドビスウイルスベクターの再ターゲッティングの最初の実証を示す。同様な手法が、レトロウイルスおよびアデノウイルスベクターのような他のウイルスベクターで、プロテインＡの合成IgG結合ドメイン(ZZ)を挿入することにより、使うことができる。プロテインＡ−エンベロープを提示するウイルス系ベクターは、非常に有用であり、遺伝子伝達研究に対しおよび遺伝子治療分野に対し広範な応用を有し得る。
6.2.6  実験プロトコル
細胞系．  Invitrogen Co.,San Diego,CAから乳仔ハムスター腎臓(BHK)細胞を取得し、5％胎仔ウシ血清(FBS,Gemini Bio-Products,Inc.,Calabasas,CA)を補充したα改変最少必須培地(αMEM,JRH Biosciences,Lenexa,KS)中で維持した。10％FBSを補充したDulbecco改変Eagle培地(DMEM；GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)中で、ヒト類表皮癌細胞系A431(ATCC CRL1555)、ヒト類上皮癌細胞系HeLa(ATCC CRL2)およびヒトグリア芽細胞腫細胞系U87MG(ATCC HTB14)を単層として増殖させた。10％FBSを補充したRPMI 1640(JRH Bioscience)中で、CD4を表面上に発現するHeLa CD4+ Clone 1022(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)およびヒトBurkittリンパ腫細胞系Daudi(ATCC CCL213)，(ATCC CRL1582)を維持した。20％FBSを補充したRPMI1640中で、HL-60前骨髄球白血病細胞系(ATCC CCL240)を維持した。
モノクローナル抗体(mAbs)．  ヒト表皮成長因子受容体(EGFR)に対するIgG2a型のマウスmAbをUpstate Biotechnology(Lake Placid,NY)から入手した。抗HLA-DR(マウスIgG2a)、抗CD4(マウスIgG1)および抗CD33(マウスIgG1)をBecton Dickinson(San Jose,CA)から購入した。
プラスミド．  組換えエンベロープ遺伝子の構築のために、シンドビス ウイルスゲノムのパッケージングに必要な構造タンパク質(キャプシド、E3、E2、6KおよびE1)に関する遺伝子を含有するヘルパープラスミドDH-BB(Invitrogen Co.、図1B)(Bredenbeek,P.J.ら、1993)を使用した。シンドビス ウイルスに基づく発現ベクターSinRep/LacZ(Invitrogen Co.、図3B)(Bredenbeek,P.J.ら、1993)はパッケージングシグナル、RNA転写物の複製のための非構造タンパク質遺伝子1−4(nsP1−4)およびlacZ遺伝子を含有する。タンパク質ＡのＢドメインに基づく２つの合成Ｚドメインを含有するプラスミドpEZZ 18
0004548865.tif 000002
をPharmacia Biotech,Uppsala,Swedenから購入した。オリゴ指令部位特異的突然変異誘発によってDH-BBプラスミドのE2領域中にBstEII部位を導入するため、ファージミドpALTER-1ベクター(Promega Co.Madison,WI)を使用した。
組換えシンドビスウイルス構造遺伝子の構築．  シンドビス ウイルス構造遺伝子のE2領域中に特異的制限酵素部位を導入するために、Altered Sites in vitro Mutagenesis System(Promega Co.)を使用した。最初に、２つの適合性オリゴヌクレオチド5’-CTAGAGCGCGCAAA-3’および5’-AGCTTTTGCGCGCT-3’(配列番号６−７)を使用することによって、pALTER-1ベクターのXbaI部位とHindIII部位との間にBssHII部位を導入した。構造遺伝子のE2領域を含有するDH-BBプラスミドのSacIおよびBssHIIの間の断片をpALTER-1ベクター中にクローン化した。ヘルパーファージM13KO7の感染によって、この組換えpALTER-1ベクターの一本鎖鋳型を調製した。この一本鎖鋳型に、E2ポリペプチド中のコドン71と74アミノ酸との間にBstEIIクローニング部位を導入する突然変異性オリゴヌクレオチド(5’-ATGTCGCTTAAGCAGGTAACCACCGTTAAAGAAGGC-3’)(配列番号８)ならびにアンピシリン修復オリゴヌクレオチド(5’-GTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG-3’)(配列番号９)をアニールし、続いてT4 DNAポリメラーゼによって変異鎖を合成した。大腸菌中に形質転換した後、アンピリシンの存在下で変異体を選択し、そしてこのプラスミドDNAの直接の配列決定によってスクリーニングした。当初のDH-BBプラスミドのSacI-BssHII領域を変異断片と置換して、DH-BB-Bstプラスミドを取得した(図3B)。鋳型としてpEZZ 18を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、２つの合成IgG結合ドメインを含有するタンパク質Ａ(ZZ)の１領域を増幅した。PCR増幅のために使用したプライマーは両者とも独特のBstEII部位をコードするZZ-5(5’-CACGATGAGGTAACCGACAACAAATTCAAC-3’)およびZZ-3(5’-GGTCGAGGTTACCGGATCCCCGGGTACCGA-3’)(配列番号10−11)である。得られたPCR産物をBstEIIで消化し、あらかじめBstEII部位で消化したDH-BB-Bstプラスミド中に挿入した。適当なサイズおよび方向性の挿入物を含有するクローンを配列決定して、正しい読み枠が維持されていることを確認し、DH-BB-ZZプラスミドを取得した(図3B)。プラスミドp-DH-BB-ZZを1997年3月28日、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託した。
組換えウイルス製造のためのin vitro転写およびトランスフェクション．  Qiagen(Chatsworth,CA)カラムの使用によって、in vitro転写のためのプラスミドを調製した。すべてのヘルパープラスミド(DH-BB,DH-BB-BstおよびDH-BB-ZZ)ならびにSinRep/LacZプラスミドをXhoI制限酵素消化によって線状化し、フェノール／クロロホルム抽出に続くエタノール沈殿によって精製した。InvitroScript Cap Kit(Invitrogen Co.)を使用することによって転写反応を実施し、SP6プロモーターから大量のキャップmRNA転写物を産生させた。ヘルパーおよびSinRep/LacZ RNAのBHK細胞中への同時トランスフェクションのため、前記
0004548865.tif 000003
のようにエレクトロポレーションを実施した。5％FCSを含有するαMEM 10ml中にエレクトロポレーションした細胞を移し、12時間インキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、FCSを含まないOpti-MEM I培地(GIBCO-BRL)10ml中でインキュベートした。24時間後、培養上清を収穫し、そしてアリコートを-80℃で保存した。
イムノブロットアッセイ．  トランスフェクション後24時間目に、1％Triton X、0.15 M NaCl、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、1mM EDTAおよび10％グリセロールを含有する20mM Tris-HClバッファー(pH8.0)中で細胞を溶解した。次に細胞抽出物を超音波処理し、電気泳動ローディングバッファー(125mM Tris-HCl、pH6.8、10mM β-メルカプトエタノール、2％SDS、10％グリセロールおよび0.01％ブロモフェノールブルー)と混合した。SW41 Beckman Rotor中での上清(10ml)の超遠心分離(35,000rpm、2時間、4℃)によってウイルスサンプルをペレット化し、電気泳動ローディングバッファー中に再懸濁させた。抗シンドビス ウイルスマウス免疫腹水(ATCC VR-1248)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ウサギ抗ヤギIgG抗体(Pierce,Rockford,IL)を使用することによって、既述(Marin,M.ら、1996)のように、細胞抽出物およびウイルスサンプルをイムノブロット分析に供した。
感染アッセイ．  細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を形質導入することができるシンドビスウイルスベクター(SinRep/LacZ)(Bredenbeek,P.J.ら、1993)の転移によって、組換えキメラウイルスのBHKおよびヒト細胞系への感染力を判定した。ウイルス上清希釈物をモノクローナル抗体とともに、または抗体を含ませないで室温で１時間インキュベートし、その後6ウェルプレート中の付着(2×105)および懸濁(1×106)細胞に添加した。室温での１時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、増殖培地中で24時間インキュベートした。下記のようにしてX-Gal StainingおよびFACS-Galによってウイルス感染を評価し、LacZ CFU中、１ミリリッターあたりの力価を評価した。
X-Gal StainingおよびFACS-Galアッセイ．  X-Gal染色については市販品用のプロトコルにしたがった。簡単に述べると、0.5％グルタールアルデヒトを含有するPBS中で細胞を15分間固定し、その後PBSで３回洗浄した。次に、1mg/ml X-Gal,5mMフェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウムおよび1mM MgSO4を含有するPBSで37℃で２時間、細胞を染色した。既述(Fiering,S.N.ら、1991,Cytometry 12:291-301)のようにFACS-Galアッセイを実施した。
本発明は、本発明の個々の態様の単純な説明を意図して記載した特定の実施形態の範囲内に限定されるものではなく、機能的に等価な方法および内容は本発明の範囲内である。実際、これまでの記載および添付した図面から、本明細書中に示し、そして記載したものの他に、本発明の各種の改変が当業者にとって明らかになるであろう。こうした改変は添付する請求の範囲内に入るものと意図している。
７．微生物の寄託
以下の生物を1997年3月28日、American Type Culture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に寄託した。
0004548865.tif 000004
配列表
配列番号1:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:30塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000005
配列番号2:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:17塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000006
配列番号3:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:38塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000007
配列番号4:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:36塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000008
配列番号5:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:11アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:
0004548865.tif 000009
配列番号6:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000010
配列番号7:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:14塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000011
配列番号8:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:36塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000012
配列番号9:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:27塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000013
配列番号10:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:30塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000014
配列番号11:
(i)配列の特色:
(A)配列の長さ:30塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(xi)配列:
0004548865.tif 000015
国際出願番号：ＰＣＴ／
0004548865.tif 000016
ＰＣＴ／ＲＯ／１３４(１９８１年１)
国際出願番号：ＰＣＴ／
ＰＣＴ／ＲＯ／１３４(続き)
アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション
アメリカ合衆国  ２０８５２  メリーランド州
ロックビル，パークローン  ドライブ  １２３０１
受託番号 寄託日
９８３７７              １９９７年  ３月２８日
【図１Ａ】
0004548865.tif 000017
【図１Ｂ】
0004548865.tif 000018
【図２Ａ】
0004548865.tif 000019
【図２Ｂ】
0004548865.tif 000020
【図３Ａ】
0004548865.tif 000021
【図３Ｂ】
0004548865.tif 000022
【図４Ａ】
0004548865.tif 000023
【図４Ｂ】
0004548865.tif 000024
【図４Ｃ】
0004548865.tif 000025
【図５】
0004548865.tif 000026
【図６】
0004548865.tif 000027
【図７】
0004548865.tif 000028