(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素からの１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換された化学的に修飾された突然変異体酵素であり、
該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾され、
前記酵素がプロテアーゼであり、システインにより置換された前記アミノ酸がS1、S1’、およびS2からなる群より選択される酵素のサブサイトにあり、前記チオール側鎖が-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-COOH-C6H4)、および-SCH2C6F5からなる群より選択され、
前記化学的に修飾された突然変異体酵素が野生型酵素と比較して増加したエステラーゼ対アミダーゼの割合を有し、
前記酵素がバチルスレンタスサブチリシンであり、
前記システインにより置換された前記アミノ酸が、アスパラギン、ロイシン、およびセリンからなる群より選択される、
ことを特徴とする化学的に修飾された突然変異体酵素。
【請求項２】
前記チオール側鎖が-SCH2(p-OCH3-C6H4)であることを特徴とする請求項１記載の化学的に修飾された突然変異体酵素。
【請求項３】
前記チオール側鎖が-SCH2(p-COOH-C6H4)であることを特徴とする請求項１記載の化学的に修飾された突然変異体酵素。
【請求項４】
前記チオール側鎖が-SCH2C6F5であることを特徴とする請求項１記載の化学的に修飾された突然変異体酵素。
【請求項５】
前記システインにより置換された前記アミノ酸がアスパラギン62であることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の化学的に修飾された突然変異体酵素。
【請求項６】
化学的に修飾された突然変異体酵素を産生する方法であって、
１つ以上のアミノ酸がシステイン残基により置換された酵素を提供し、
少なくともいくつかの前記システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖により置換して化学的に修飾された突然変異体酵素を形成する、
各工程を含み、
前記酵素がプロテアーゼであり、システインにより置換された前記アミノ酸がS1、S1’、およびS2からなる群より選択される酵素のサブサイトにあり、前記チオール側鎖が-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-COOH-C6H4)、および-SCH2C6F5からなる群より選択され、
前記化学的に修飾された突然変異体酵素がバチルスレンタスサブチリシンであり、野生型酵素と比較して増加したエステラーゼ対アミダーゼの割合を有し、
前記システインにより置換された前記アミノ酸が、アスパラギン、ロイシン、およびセリンからなる群より選択される、
ことを特徴とする化学的に修飾された突然変異体酵素を産生する方法。
【請求項７】
前記チオール側鎖が-SCH2(p-OCH3-C6H4)であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記チオール側鎖が-SCH2(p-COOH-C6H4)であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記チオール側鎖が-SCH2C6F5であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記システインにより置換された前記アミノ酸がアスパラギン62であることを特徴とする請求項６から９いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は、1998年1月23日に出願され、ここに引用される、米国仮特許出願第60/072,266号の恩恵を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、化学的に修飾された突然変異体酵素およびその産生方法とアミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性についてのスクリーニング方法に関する。
【０００３】
発明の背景
部位定方向突然変異誘発による酵素特性の修飾は、制限を克服するための分子生物学的方法が最近得られた(Cornish et al.,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,34:621-633(1995))とはいえ、天然アミノ酸の置換に限られてきた。しかしながら、最近の方法はたいていの実験室では行うのが難しい。対照的に、酵素のコントロールされた化学的修飾は、酵素構造の容易で柔軟な修飾のために広い可能性を提供し、それにより酵素特異性のコントロールされた調整のために広い可能性を開く。
【０００４】
化学的修飾による酵素特性の変化は、サブチリシンBPNの活性部位セリン残基をシステインに化学的に形質転換(CH2OH→CH2SH)することによりチオールサブチリシンを産生したBender(Polgar et al.,J.Am.Chem.Soc.,88:3153-3514(1996))およびKoshland(Neet et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,56:1606-1611(1966))のグループにより1966年にされた最初の報告とともに、以前に広がった。Wu(Wu et al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4514-4515(1989);Bell  et  al.,Biochemistry,32:3754-3762(1993))およびPeterson(Peterson et al.,Biochemistry,34:6616-6620(1995))、およびより最近は、Suckling(Suckling et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:531-534(1993))により、合成の可能性を有するものを含む、化学的に産生された人工酵素への関心が復活した。
【０００５】
酵素は現在では、有機合成において有用な触媒として広く認識されている。しかしながら、天然の、野生型の酵素は、合成化学の観点から関心がもたれる全ての構造を取ると期待することはできず、また合成に必要な所望の鏡像異性的に純粋な物質に立体特異的に形質転換することは常にはできない。酵素の合成適用可能性におけるこの潜在的な制限がこれまで認識され、タンパク質工学の部位定方向およびランダム突然変異誘発技術を使用するコントロールされた方法で酵素の特異性を変化させることにおいて進歩がなされた。しかしながら、タンパク質工学による酵素特性の修飾は、天然アミノ酸の置換に制限され、この制限を克服するために案出された分子生物学的方法は、ごく普通の用途または大規模な合成に容易に従わない。酵素の化学的修飾により得られる新しい特異性または活性の産生は、長年化学者の興味をそそってきたしこれからもそうであろう。
【０００６】
Bech et al.の米国特許第5,208,158号(“Bech”)には、1つ以上のメチオニンがシステインに突然変異されている化学的に修飾された洗剤酵素が記載されている。その後システインを修飾して、酸化剤に対して改良された安定性を酵素に与える。請求された化学的修飾は、C1-6アルキルによるチオール水素の置換である。
【０００７】
Bechには、突然変異誘発および化学的修飾による酵素の酸化的安定性の変化が記載されているが、例えば洗剤または有機合成において使用するための、活性、球核特異性、基質特異性、立体選択性、熱安定性、pH活性特性、および表面結合特性のような特性が変化した1つ以上の酵素を同定することもまた所望である。特に、サブチリシンのようにペプチド合成のために作成された酵素が所望である。ペプチド合成に有用な酵素は、高エステラーゼおよび低アミダーゼ活性を有する。通常、サブチリシンはこれらの必要条件を満たさず、サブチリシンのエステラーゼ対アミダーゼの選択性の改良は、エステラーゼ対アミダーゼの選択性が改良されたサブチリシンのすばやい同定と同様に所望である。しかしながら、アミダーゼ活性を低下させることによりペプチド合成のための酵素を作成する以前の試みは、通常、エステラーゼおよびアミダーゼ活性の両方を劇的に減少させることとなった。アミダーゼ活性を低下させるための以前の方法には、水混和性の有機溶媒 (Barbas et al.J.Am.Chem.Soc.,110:5162-5166(1988);Wong et al.,J.Am.Chem.Soc.,112:945-953(1990);and Sears et al.,Biotechnol.Prog.,12:423-433(1996))および部位定方向突然変異誘発(Abrahamsen et al.,Biochemistry,30:4151-4159(1991);Bonneau et al.,J.Am.Chem.Soc.,113:1026-1030(1991); and Graycar et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,67:71-79(1992))の使用が含まれる。しかしながら、エステラーゼ対アミダーゼ活性の割合がこれらの方法により改良されると同時に、絶対的なエステラーゼ活性が低下した。Abrahamsen et al.,Biochemistry,30:4151-4159(1991)。非天然アミノ酸成分の取込みを可能にする化学的修飾技術(Neet et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,56:1606(1966);Polgar et al.,J.Am.Chem.Soc.,88:3153-3154(1966);Wu et al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4514-4515(1989); and West et al.,J.Am.Chem.Soc.,112:5313-5320(1990))もまた、サブチリシンのエステラーゼ対アミダーゼの選択性の改良に使用されてきた。例えば、サブチリシンの触媒三構造セリン(Ser221)のシステインへの化学的変換(Neet et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,56:1606(1996);Polgar et al.,J.Am.Chem.Soc.,88:3153-3154(1996);and Nakatsuka et al.,J.Am.Chem.Soc.,109:3808-3810(1987))またはセレノシステインへの化学的変換(Wu et al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4514-4515(1989))、およびキモトリプシンの触媒三構造ヒスチジン(His57)のメチル化(West et al.,J.Am.Chem.Soc.,112:5313-5320(1990))は、エステラーゼ対アミダーゼの選択性に実質的な改良をもたらした。しかしながらあいにく、これらの修飾もまた、絶対的なエステラーゼ活性の50倍から1000倍までの減少を伴った。
【０００８】
さらに、エステラーゼ対アミダーゼの選択性が改良された酵素を同定しようとする以前の試みは、化学的に修飾された突然変異体酵素を大量に必要とする時間のかかる工程となっていた。特に、完全に特徴付けられた化学的に修飾された突然変異体酵素の運動定数は、比色分析による初速度法により求められてきた。アミダーゼ活性は、テトラペプチド基質のスクシニルアラニルアラニルプロピルフェニルアラニル p-ニトロアニリド(sucAAPF-pNa)からのp-ニトロアニリドの放出を伴った。類似するチオベンジルエステル基質のスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−チオベンジルエステル(sucAAPF-SBn)は色素遊離基を有さず、従って加水分解の検出にはチオベンジル遊離基が5,5’-ジチオビス-2,2’-ニトロベンゾエート(DTNB,Ellman’s試薬)と反応することが必要とされる。しかしながら、この方法により新しく化学的に修飾された突然変異体酵素の完全な特徴付けおよび速度論評価は、非常に物質および時間を消費する。
【０００９】
本発明は、これらの欠点の克服を目的とするものである。
【００１０】
発明の概要
本発明は、アミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性について化学的に修飾された突然変異体酵素をスクリーニングする方法に関する。この方法は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されている、化学的に修飾された突然変異体酵素を提供し、前記化学的に修飾された突然変異体酵素を、アミダーゼについての基質および/またはエステラーゼについての基質と接触させ、前記化学的に修飾された突然変異体酵素がアミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性を示すか否かを測定する、各工程を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されている、化学的に修飾された突然変異体酵素に関する。チオール側鎖は、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-CF3-C6H4)、または-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)でもよい。
【００１２】
本発明はまた、化学的に修飾された突然変異体酵素を産生する方法に関する。この方法は、1つ以上のアミノ酸がシステイン残基により置換されている酵素を提供し、化学的に修飾された突然変異体酵素を形成するために該システイン残基の少なくともいくつかの中のチオール水素をチオール側鎖で置換する、各工程を含む。チオール側鎖は、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-CF3-C6H4)、または-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)でもよい。
【００１３】
本発明のアミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性について化学的に修飾された突然変異体酵素をスクリーニングする方法は、新しいCMMsを大量に調製する必要がなく新しいCMMsの完全な特徴付けおよび速度論評価が物質および時間を消費する性質を有しない、新しい化学的に修飾された突然変異体酵素(“CMMs”)を検出するための急速な酵素修飾スクリーニングを提供する。
【００１４】
本発明の化学的に修飾された突然変異体酵素は、野生型酵素と比較して増加したエステラーゼ対アミダーゼの割合を示し、従ってペプチド合成により有効に触媒作用を及ぼす。さらに、本発明の化学的に修飾された突然変異体酵素は、様々の洗剤組成物の調製および動物用飼料の調製において有用である。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は、化学的に修飾された突然変異体酵素を産生するためのサブチリシンバチルスレンタス(Bacillus lentus)(“SBL”)のシステイン突然変異体の化学的修飾を示す。
【００１６】
図２は、本発明による96穴比色定量分析を示す。
【００１７】
図３は、[kcat/KM エステラーゼ]/[kcat/KM アミダーゼ]v.a-gチオール側鎖v.化学的に修飾された突然変異体の三次元プロットであり、エステラーゼ/アミダーゼ活性についてのkcat/KMの割合について得られた結果を示す。試薬は図1に示されている。
【００１８】
図４は、本発明の急速な無作為配列分析および対応する完全に特徴付けられた酵素からのエステラーゼ/アミダーゼ特異性割合の比較を示す。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、アミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性について化学的に修飾された突然変異体酵素をスクリーニングする方法に関する。この方法は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されている、化学的に修飾された突然変異体酵素を提供し、前記化学的に修飾された突然変異体酵素を、アミダーゼについての基質および/またはエステラーゼについての基質と接触させ、前記化学的に修飾された突然変異体酵素がアミダーゼおよび/またはエステラーゼ活性を示すか否かを測定する、各工程を含む。
【００２０】
好ましくは、酵素はプロテアーゼである。より好ましくは、酵素はバチルスサブチリシンである。サブチリシンは、生体触媒作用、特にキラルの分解能、多機能化合物の部位選択性アシル化、ペプチド結合、およびグリコペプチド合成における使用が増加しているアルカリ性セリンプロテアーゼである。後者の２つの使用方法は、部位定方向突然変異誘発および非天然アミノ酸をタンパク質中へ導入する化学的修飾を提供するので、特に関心がもたれている。サブチリシンは、次いで第一アミンと反応してペプチド産物を形成するアシル酵素中間体を最初に形成することにより、エステル基質から始まるペプチド結合形態に触媒作用を及ぼすことができる。従って、この用途には、アシル酵素形態を促進するためには高エステラーゼ活性が、所望の産物のペプチド結合の加水分解を最小にするためには低アミダーゼ活性が必要である。通常、サブチリシンはこれらの必要条件を満たさず、エステラーゼ対アミダーゼの選択性が改良されたサブチリシンを同定する必要がある。
【００２１】
また、好ましくは、システインにより酵素中で置換されたアミノ酸は、アスパラギン、ロイシン、またはセリンからなる群より選択される。より好ましくは、置換されるアミノ酸は、酵素のサブサイト(subsite)、好ましくはS1、S1’、またはS2サブサイト中に位置する。最も好ましくは、置換されるアミノ酸は、N62、L217、およびS166であり、番号のついた位置は、バチルスアミロリクエファシエンス(amyloliquefaciens)からの天然発生サブチリシンまたはバチルスレンタスサブチリシンのような他のサブチリシン中の等価アミノ酸残基に対応する。
【００２２】
特に好ましい実施の形態において、酵素はバチルスレンタスサブチリシンである。別の特に好ましい実施の形態において、システインにより置換されるアミノ酸はN62、L217、またはS166であり、チオール側鎖基は、
-SCH2C6H5；
-SCH2(p-CH3-C6H4)；
-SCH2(p-OCH3-C6H4)；
-SCH2(p-COOH-C6H4)；
-SCH2C6F5；
-SCH2(p-CF3-C6H4)；および
-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)
からなる群より選択される。
【００２３】
好ましくは、エステラーゼ活性について、化学的に修飾された突然変異体酵素対基質の割合は、約1M:10Mから約1M:108Mまでである。最も好ましくは、化学的に修飾された突然変異体酵素対基質の割合は、約1M: 103Mである。
【００２４】
好ましくは、アミダーゼ活性について、化学的に修飾された突然変異体酵素対基質の割合は、約1M:10Mから約1M:1010Mまでである。最も好ましくは、化学的に修飾された突然変異体酵素対基質の割合は、約1M: 6×103Mである。
【００２５】
「化学的に修飾された突然変異体酵素」とは、アスパラギン、ロイシン、またはセリンのようなアミノ酸残基をシステイン残基により置換し、次いで該システインのチオール水素をチオール側鎖(例えば、-SCH2C6H5、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-COOH-C6H4)、-SCH2C6F5、-SCH2(p-CF3-C6H4)、および-SCH2(2,4-diNO2-C6H3))により置換することによって変化された酵素である。修飾の後、酵素の特性、すなわち活性または基質特異性が変化され得る。好ましくは、酵素の活性が増加される。
【００２６】
「酵素」という用語には、自分自身は変化されずに他の基質中の化学的変化に触媒作用を及ぼすことができるタンパク質が含まれる。酵素は、野生型酵素または突然変異酵素でもよい。本発明の範囲内の酵素には、プルラナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、およびレダクターゼが含まれる。酵素は、野生型または突然変異体プロテアーゼでもよい。野生型プロテアーゼは、例えばバチルスレンタスまたはバチルスアミロリクエファシエンスから単離されてもよい（BPN’とも称される）。突然変異体プロテアーゼは、例えば、ここに引用される国際特許出願公開第WO95/10615号および同第WO91/06637号により作成できる。
【００２７】
様々の種類の成分を、システイン残基のチオール水素を置換するために使用できる。これらには、-SCH2C6H5、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-COOH-C6H4)、-SCH2C6F5、-SCH2(p-CF3-C6H4)、-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)が含まれる。
【００２８】
「チオール側鎖基」、「チオール含有基」、および「チオール側鎖」という用語は、互いに交換して使用される用語であり、酵素中のアミノ酸の1つを置換するのに使用されるシステインのチオール水素を置換するために使用される基を含む。通常、チオール側鎖基には、上述で定義されたチオール側鎖基がシステインのチオール硫黄に付加される際の硫黄が含まれる。
【００２９】
酵素の結合部位は、酵素の表面を横切る一連のサブサイトからなる。サブサイトに対応する基質残基は標識されたPであり、サブサイトは標識されたSである。慣例より、サブサイトは標識されたS1、S2、S3、S4、S1’およびS2’である。サブサイトについては、ここに引用されるSiezen et al.,Protein Engineering,4:719-737(1991)およびFersht,Enzyme Structure and Mechanism,2 ed.,Freeman:New York,29-30(1985)に見ることができる。好ましいサブサイトは、S1、S1’およびS2である。
【００３０】
本発明の別の態様は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されて化学的に修飾された突然変異体酵素を形成する、化学的に修飾された突然変異体酵素に関する。チオール側鎖は、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-CF3-C6H4)、または-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)でもよい。
【００３１】
本発明はまた、化学的に修飾された突然変異体酵素を産生する方法に関する。この方法は、1つ以上のアミノ酸がシステイン残基により置換されている酵素を提供し、該システイン残基の少なくともいくつかの中のチオール水素をチオール側鎖で置換して化学的に修飾された突然変異体酵素を形成する、各工程を含む。チオール側鎖は、-SCH2(p-CH3-C6H4)、-SCH2(p-OCH3-C6H4)、-SCH2(p-CF3-C6H4)、または-SCH2(2,4-diNO2-C6H3)でもよい。
【００３２】
本発明のアミノ酸残基は、部位定方向突然変異誘発法または当該技術においてよく知られる他の方法を使用して、システイン残基により置換できる。例えば、ここに引用される国際特許出願公開第WO95/10615号参照。システイン残基のチオール水素を修飾する1つの方法は、実施例に示されている。
【００３３】
本発明の修飾された酵素は、重量で約0.01%から5%まで（好ましくは0.1%から0.5%まで）の濃度で6.5から12.0までの範囲のpHを有する既知の粉末状または液状洗剤に調製できる。これらの洗剤洗浄組成物または添加物にはまた、既知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、またはエンドグリコシダーゼのような他の酵素、並びにビルダーおよび安定剤が含まれてもよい。
【００３４】
本発明の修飾された酵素、特にサブチリシンは、様々の洗剤組成物の調製において有用である。多くの既知の化合物は、本発明の修飾された酵素を含む組成物において有用な、適切な界面活性剤である。これらには、ここに引用されるAndersonの米国特許第4,404,128号およびFlora et al.の同第4,261,868号に開示されているような、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン性の洗剤が含まれる。適切な洗剤製剤は、ここに引用されるCaldwell et al.の米国特許第5,204,015号の実施例７に記載されているものである。この技術は、洗浄組成物として使用できる異なる製剤でよく知られている。通常の洗浄組成物に加えて、本発明の修飾された酵素も、天然のまたは野生型の酵素が使用される任意の目的のために使用できることが容易に理解される。従って、これらの修飾された酵素は、例えば、バーソープまたは液体石鹸の用途において、食器洗浄用製剤において、コンタクトレンズ洗浄溶液または製品において、ペプチド合成において、食物添加物または食物添加物の調製のような食物の用途において、廃棄物処理において、織物の処理のような織物用途において、およびタンパク質産生における融合−開裂酵素として、使用できる。本発明の修飾された酵素は、洗剤組成物中において改良された洗浄能力を有し得る（先駆物質と比較して）。ここで用いたように、洗剤中の改良された洗浄能力とは、標準の洗浄サイクルの後、光反射評価により測定すると、草または血液のようなある酵素感受性の汚れの洗浄力の増加として定義される。
【００３５】
従来の洗浄組成物に本発明の修飾された酵素を加えても特別な使用上の制限は何ら生じない。言い換えれば、洗剤に適切な任意の温度およびpHは、pHが上述の範囲内で温度が記載される修飾された酵素の変成温度以下である限り、本発明の組成物にも適切である。さらに、本発明による修飾された酵素は、単独でまたはビルダーおよび安定剤と組み合わせて、洗剤を含有しない洗浄組成物中で使用できる。
【００３６】
本発明の別の態様において、修飾された酵素は、動物用飼料、例えば穀物をベースとした飼料の調製に使用される。穀物は、小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライ麦、エンバク、ライコムギ、および米の少なくとも1つでよい。穀物をベースとした飼料の穀物成分はタンパク質の供給源を構成するが、通常は飼料中に、魚粉、肉、または野菜に由来するような補助的なタンパク質の供給源が含まれる必要がある。野菜タンパク質の供給源には、脂肪の多い大豆、菜種、カノラ、大豆粉、菜種粉、およびカノラ粉の少なくとも1つが含まれる。
【００３７】
動物用飼料中に本発明の修飾された酵素を含むことにより、飼料の粗タンパク質値および/または消化性および/またはアミノ酸含有量および/または消化率を増加させることが可能になる。これにより、以前は動物用飼料の必須成分であった代替タンパク質供給源および/またはアミノ酸補助剤の量が減少する。
【００３８】
本発明により提供される飼料にはまた、1つ以上のβ−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、リパーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、およびペクチナーゼのような、他の補足酵素が含まれてもよい。バチルス属に由来するサブチリシンのようなさらなる補足酵素としてキシラーゼを含むことが特に好ましい。そのようなキシラーゼは、例えば、ここに引用される国際特許出願公開第WO97/20920号に詳細に記載されている。
【００３９】
本発明の別の態様は、織物を処理する方法である。この方法は、酵素からの1つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換されており、該システイン残基の少なくともいくつかが、システイン残基中のチオール水素をチオール側鎖で置換することにより修飾されている、化学的に修飾された突然変異体酵素を提供する工程を含む。ある酵素感受性の汚れに抵抗力のある織物の産生に有効な条件下で、化学的に修飾された突然変異体酵素を、織物と接触させる。そのような酵素感受性の汚れには、草または血液が含まれる。好ましくは、織物は修飾された酵素を含む。この方法は、ここに引用される研究開示書(Research Disclosure)第216,034番、欧州特許出願第134,267号、米国特許第4,533,359号、および欧州特許出願第344,259号のような刊行物に記載されているように、例えば、シルクまたはウールの処理に使用できる。
【００４０】
実施例
実施例１−アミダーゼおよびエステラーゼ活性についての化学的に修飾された突然変異体酵素の調製およびスクリーニングのための急速な無作為配列分析の実証  96穴酵素活性分析においては、kcat/KMは、近似として低い基質濃度におけるミカエリス−メンテンの式の制限ケースを使用して、産物の組成の割合(v)から得られる（式１、[S]および[E]はそれぞれ基質および酵素の濃度である）：
【数１】
0004475371.tif 000002
酵素の保存溶液を、アミダーゼ分析について約5×10-7Mおよびエステラーゼ分析について約5×10-8MにおいてpH6.5の2mM CaCl2で、5mMの4-モルホリンエタンスルホン酸(“MES”)中で調製した。基質溶液を、ジメチルスルホキシド(“DMSO”)中で調製した。アミダーゼ基質sucAAPF-pNaストックは1.6mMであり、これはウェル中で0.08mMを与えた。エステラーゼ基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−チオベンジルエステル(“sucAAPF-SBn”)保存溶液は1.0mMであり、これはウェル中で0.05mMを与えた。分析は、0.005%のTweenを有するpH8.6の0.1M トリスヒドロキシメチルアミノメタン(“Tris”)中で行った。エステラーゼ分析のためのTris緩衝剤は、0.375nMのDTNBを含有した。この緩衝剤は、緩衝剤の高pHにより数時間以内にDNTPが分解するので、すぐに使用しなければならなかった。ここに引用される、Berglund et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,6:2507-2512(1996)およびBerglund et al.,J.Am.Chem.Soc.,119:5265-5266(1977)。
【００４１】
それぞれの酵素溶液のサンプル(〜150μL)を、酵素填充プレートの1st、5th、または9 thカラム中のウェルの中に配置した。列Aから列Gまでは酵素を含有し、列HはMES緩衝剤を含有した。分離分析プレート（コーニング、平底、96穴）上で、基質溶液の10μLおよび緩衝剤の180μLを、ラン中に使用されるカラムに沿うウェル中に分配した。分析プレート上のカラム1からカラム4までは、填充プレートのカラム1中の酵素の4つの複製を含有する；カラム5からカラム8までは、填充プレートのカラム5中の酵素の4つの複製を含有する；およびカラム9からカラム12までは、填充プレートのカラム9中の酵素の4つの複製を含有する。酵素溶液の10μLを8チャンネルのピペットで填充プレートから分析プレートに移すことにより、反応を開始した。アミダーゼ分析について、4つのカラムを1度のランで開始した。エステラーゼ分析について、２つのカラムを1度のランで開始した。第1のカラムへの酵素の添加と読み取りの開始との間の時間の遅れは、22-30秒（アミダーゼ）および10-15秒（エステラーゼ）であった。開始直後に、プレートをTitertech Multiscan MCC340読み取り装置（運動モード、414nmのフィルタ、0.0分間の時間のずれ、5秒間のインターバルにプログラムされ、ブランク列Hの自動バックグラウンドサブトラクションを有する）(フィンランド国、Labsystems)上に配置し、1.0分間（アミダーゼ）または30秒間（エステラーゼ）読み取った。経過曲線のほとんど直線の部分を過ぎて（〜50%の転換まで）、読取りを延長すると、速度が過小評価される。読取り装置からの出力は、5秒間のインターバルで測定すると、プログラムされた全時間の414nm min-1における吸光度の変化の平均速度を示した。これらのデータは、p-ニトロアニリドについてe414=8581M-1cm-1、3-カルボキシレート-4-ニトロチオフェノレートについてe414−8708-Mcm-1を使用して、Ms-1における速度に変換した。両方の吸光率を、分析におけるのと同じ条件およびバックグラウンド減算を使用して読取り装置上で測定した。経路の長さは5mmであった。速度を活性酵素の濃度に対して補正し、それぞれの酵素についての4つの複製を平均した。
【００４２】
【表１】
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96穴分析を使用して得られたkcat/KM（アミダーゼ）の数値（表１）は、室温における1mLのキュベット中の初速度法により得られる数値と同じであった。25℃においてWTおよびCMMsについて得られたkcat/KM（アミダーゼ）の数値は、室温において得られた数値より2倍高かった。通常、キュベット分析は25℃で行う。徹底的な速度論評価を使用して20℃におけるキュベット中で得られたkcat/KM値と最低基質濃度における速度から計算された数値（式１）とは同じであり、これはWTについて低い基質近似値が保たれていることを示す（表１）。
【００４３】
この方法をさらに実証するために、徹底的な速度論実験を、列に沿った8つの異なる基質濃度および1酵素/カラムを実行することにより96穴プレート上で行った。これらの実験から得られたkcat/KMの数値は、WTおよび2つのL217C CMMsについての低い基質近似値で得られた数値と同じであり、これはCMMsについても低い基質近似値が保たれていることを示す。同様に、プレート上で得られたエステラーゼについてのkcat/KM値は、標準分析で得られた数値と大きくは異ならなかった（表２）。
【００４４】
【表２】
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エステラーゼ分析においては、温度は大きな影響を及ぼさなかった。
【００４５】
実施例２−96穴プレート上における新しいCMMsのアレイの産生および調製のための急速な無作為配列分析を使用するアミダーゼおよびエステラーゼ活性についての新しいCMMsのスクリーニングおよびアミダーゼおよびエステラーゼ活性についての化学的に修飾された突然変異体酵素のスクリーニング
新しいCMMsのスモールスケールの調製について、7つの異なる芳香族メタンチオスルホネート(“MTS”)試薬(1 a-g)（図１）と3つのシステイン突然変異体(N62C、L217CおよびS166C)との組合せ、並びにWTコントロールを、図２の上部に示されるように96穴プレート上に並べた。それぞれの突然変異体の2つの複製を、それぞれの試薬で調製した。1つの試薬であるベンジルMTS(1a)は、すでに大規模な修飾において数値が求められており、比較のために含まれた。それぞれのウェル中の反応混合物は、20μLの酵素溶液（5mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.5、ca、8×105M中）、40μLの2-[N-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸(“CHES”)緩衝剤（70mMのCHES、5mMのMES、2mMのCaCl2、pH9.5）およびアセトニトリル中10μLのMTS試薬（ca.1×102M）から成っていた。反応プレート上のブランクは、20μLのMES、40μLのCHESおよび10μLのアセトニトリルであった。
【００４６】
反応物質を室温に放置し、以下のようにして2時間後に遊離チオール基についてテストした。分離プレート上では、10μLの反応混合物を60μLのDTNB含有Tris緩衝剤(pH8.6)に加え、15分後にモニタープレートを414nmでスキャンした。WTと修飾されたシステイン突然変異体との間に違いは検出されず、これは反応が完全であったことを示す。反応を抑えるために、それぞれのウェルに6.5のpHにおいて10μLのMESを加え、それぞれのウェルからの20μLの混合物を980μLのMES緩衝剤で希釈した（エッペンドルフチューブ中）。アミダーゼ填充プレートを、希釈された混合物で調製した；エステラーゼ填充プレートを、適切なウェル中において10μLの希釈された混合物および90μLのMES緩衝剤で調製した。ここから、分析は実施例１に記載されているものと同じである。それぞれの反応物の複製を、二重に分析した。kcat/KM値を、[E]は親突然変異体中の活性酵素の濃度を基礎とし大きな変成はないと仮定して、式1により計算した。2つの反応物の複製の間に違いがほとんど観察されなかったので、それぞれの組合せについての4つの数値を、最終結果において平均した。
【００４７】
スクリーニングにおいて得られたN62C-aおよびS166C-aについてのアミダーゼkcat/KM値は、完全に特徴付けられた酵素について得られた数値より約2倍低く（表３）、これは実施例１における先の分析の実証の結果と矛盾しない。
【００４８】
【表３】
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N62C-aおよびS166C-aについてのアミダーゼのkcat/KM値がWTと異なる原因は、スクリーニングおよび特徴付けられたCMMsについてと同じであり、これはスクリーニングがアミダーゼ活性について正しい関連パターンを与えていたことを示す。エステラーゼに関しては、WTおよびN62C-aについてのkcat/KM値は、スクリーニングおよび特徴付けられた酵素において同じであり（表３）、これは実証の結果と矛盾しない。しかしながら、S166C-aについては、スクリーニングは、〜5倍エステラーゼkcat/KM値を過小評価した。S166C-aについてのアミダーゼの数値が過小評価されていないとすれば、相違の理由は大きな変成ではない。7つのWT対照処理は、同じエステラーゼおよびアミダーゼ活性（従って同じエステラーゼ/アミダーゼ比、図３）を有したが、これは試薬自身が異なる変成を起こしたのではないことを示す。
【００４９】
スクリーニングの結果（図４）は、N62c-dおよびeがWTと比較して大きく改善されたエステラーゼ活性を有したことを示す。166ファミリーにおいては、いくつかのCMMsは、非常に好ましいエステラーゼ/アミダーゼ比を有すると思われる。217ファミリーのメンバーは、エステラーゼおよびエステラーゼ/アミダーゼ比に関して中間である。これらの結果の信頼性を測定するために、N62C-およびS166C-c、d、およびeを調製し、特徴付けた。両方のCMMs中で大きな変成が生じたので、スクリーニングおよび特徴付けられた酵素からのkcat/KM値は、アミダーゼおよびエステラーゼがどちらもスクリーニングにおいて〜5倍過小評価された両方の4-カルボキシベンジル(d)CMMsを除いて（表３）、上述の誤差の範囲内で一致した。活性酵素の濃度は、親突然変異体から予想されるよりも4倍低かった。この問題はあるにしても、スクリーニングは、両方の4-カルボキシベンジル(d)CMMsがS-ベンジル(a)突然変異体と比較して改良されたエステラーゼ活性を有することをはっきりと示した（表３）。さらに、スクリーニングは、N62C-およびS166C-c、d、およびeについての大きく改善されたエステラーゼ/アミダーゼ特異性の割合を正しく予測した（図４）。
【００５０】
本発明は説明のために詳細に記載されてきたが、そのような詳細な記載は単に説明のためであり、請求の範囲に定義される本発明の意図および範囲から離れずに変更できることは当業者にとって自明であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  サブチリシンバチルスレンタス (“SBL”)のシステイン突然変異体の化学的修飾を示す図
【図２】  本発明による96穴比色定量分析を示す図
【図３】  エステラーゼ/アミダーゼ活性についてのkcat/KMの割合について得られた結果を示す三次元プロット
【図４】  本発明の急速な無作為配列分析および対応する完全に特徴付けられた酵素からのエステラーゼ/アミダーゼ特異性の割合の比較を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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