(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの安定性を向上させることによる該タンパク質の生産方法であって、以下の工程：mRNA分解酵素であるRNaseGの欠損株に、該欠損株が過剰発現するポリペプチドであるAdhEをコードする遺伝子の5’-非翻訳領域に上記目的タンパク質をコードする遺伝子を作用可能な状態で連結した発現ベクターを、導入し、これにより転写されたｍRNAの安定性を向上させ；得られた株を培養し；そして上記目的タンパク質を回収する；を含む、前記生産方法。
【請求項２】
前記欠損株が大腸菌(Escherichia coli) K-12株由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記欠損株がGM11（rng::cat）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的のタンパク質がβ−ガラクトシダーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現ベクターが作用可能な状態でプロモーター配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ベクターがpALF1である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
目的タンパク質の発現系であって：mRNA分解酵素であるRNaseGの欠損株；並びに発現ベクターであって：上記欠損株が過剰発現するポリペプチドであるAdhEをコードする遺伝子の5’-非翻訳領域；及び上記目的タンパク質をコードする遺伝子；を作用可能な状態で含むもの；を含み、ここで、上記発現ベクターが上記欠損株内に導入されており、これにより上記目的タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの安定性が高められる、前記発現系。
【請求項８】
前記欠損株が大腸菌(Escherichia coli) K-12株由来である、請求項７に記載の発現系。
【請求項９】
前記欠損株がGM11（rng::cat）である、請求項８に記載の発現系。
【請求項１０】
前記目的のタンパク質がβ−ガラクトシダーゼである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１１】
前記発現ベクターが作用可能な状態でプロモーター配列をさらに含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項１２】
前記発現ベクターがpALF1である、請求項１１に記載の発現系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、mRNA分解酵素の欠損株を用いて目的遺伝子のmRNAの安定性を向上させることによるタンパク質の大量生産方法並びに該方法に用いる発現系に関する。より特に、本発明は、RNaseG欠損株に、adhEの5’-非翻訳領域の下流に目的遺伝子の構造遺伝子部分を接続したものを担持するプラスミドを、導入することによるタンパク質の大量発現方法並びに該方法に用いる発現系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
RNaseGは、大腸菌 (Escherichia coli)の遺伝子マップ上７１分にあるrng遺伝子によりコードされる、16S rRNAの5’-末端プロセッシングを担当するエンドリボヌクレアーゼであるが（１３，２５，２７）、cafA遺伝子（大腸菌 (Escherichia coli)のRNaseGをコードするrng遺伝子の旧名称）は、元々、メシリナム(mecillinam)-耐性型決定突然変異体の分析の間に、未知の機能をもつ推定オープン・リーディング・フレーム (orfF)として発見された（２５）。CafAタンパク質の過剰生産は、大腸菌 (Escherichia coli)において連鎖細胞及びミニセル(minicells)の形成を引き起こした。本願発明者は、電子顕微鏡観察により細胞の長軸方向に沿った繊維状の構造体を観察し、caf (cytoplasmic axial filament)と名づけた（１８）。McDowall らは、CafAタンパク質とRNaseEのＮ−末端半分の間にかなりの配列類似性があることを報告した（１４）。RNaseEは、大腸菌 (Escherichia coli)の遺伝子地図上２４分にあるrne遺伝子によりコードされている。RNaseEは、5S rRNAの成熟及び多くのmRNAの分解に関わる必須の大腸菌 (Escherichia coli)エンドリボヌクレアーゼである（３）。rne-1（ams-1とも言われる）温度感受性突然変異は、全RNAの化学的半減期を増加させるものとして最初に記載された（１２，１９）。同一遺伝子としてマップされた他の独立に単離された突然変異、rne-3071は、5S rRNAの前駆体である9S rRNAの蓄積を導く（６，１７）。これらの２つの突然変異は、RNaseEとRNaseGの間の高相同領域内のアミノ酸置換により引き起こされた（１４）。
【０００３】
本発明者は、細胞内RNA代謝に対するcafA突然変異の効果を調べ、そして16S rRNAの前駆体分子がcafA::cat突然変異体において蓄積することを発見した。本発明者は、その5’-末端に６６の余分のヌクレオチドをもつ16.3S rRNAといわれる16S rRNAの前駆体を蓄積するBUMMERといわれる大腸菌 (Escherichia coli)突然変異体（４）がcafA遺伝子内に１１ｂｐの欠失をもつということも発見した（２７）。これら結果は、cafA遺伝子がBUMMER突然変異体において欠陥のある16S rRNAの5’-末端成熟に関わるRNase活性をコードするということを示した。本発明者は、この活性がRNaseGと命名する新規酵素により提供されるということを発見した。この遺伝子をrngに名称変更した。以下、CafAとcafAの代わりに、それぞれ、RNaseGとrngを用いる。
【０００４】
RNaseGのエンドリボヌクレアーゼ活性は、Tockらにより、インビトロにおいて高純度タンパク質と合成オリゴリボヌクレオチド基質を使用して確認された（２２）。RNaseGの働きは、上記の基質の5’-末端の性質に依存した。RNaseGは、5’-モノホスホリル化された基質を効率よく解裂するが、5’-ヒドロキシル化された基質は全く解裂しない。また、RNaseGの働きは、5’-トリホスフェート基によりブロックされる。面白いことに、5’-モノホスフェート基は、同一RNA分子上に存在する部位における解裂だけを刺激することができる。これらの特徴を考慮して、Tockらは、RNaseGは、無傷の5’-トリホスホリル化されたRNAの分解を開始するよりもむしろ5’-モノホスホリル化された分解又はプロセッシング中間体を完全に切断することを好むと推定した。これに反し、3’-ホスホリル化状態は、RNaseGによる解裂速度に影響を及ぼさなかった。これらのインビトロ実験の結果から、Tockらは、RNaseGが大腸菌 (Escherichia coli)におけるRNAの分解になんらかの貢献をしているということを示唆した。RNaseEとRNaseGの作用が部分的にではあるが重複していることを示す本発明者の遺伝学的証拠（２６）も、Tockらの推定を支持するものである。
【０００５】
ところで、細菌のタンパク質生産の制御機構については、好気、嫌気に拘らず、プロモーター、オペレーター、リプレッサーといった転写レベルでの調節と、SD配列（リボソーム結合配列）の強さと翻訳開始点からの距離などが重要な要素であるというのが一般的な考えである。しかしながら、さまざまな環境の変化に素早く適切に対応するためにはｍRNAの安定性の変化による制御が重要であることが、最近になって提唱され（３０，３１）、現在、ｍRNAの安定性を決定する機構についての研究が精力的に行われている。その中で、特に重要な役割を果たしていると考えられているのが部位特異的なendo型のRNaseであるRNaseE、RNaseIIIと、exo型のRNaseであるPNPaseである（１７，３２，３３）。
【０００６】
従来のタンパク質発現系においては、目的遺伝子を強力なプロモーターの制御下に置き、ｍRNAを合成を増大させることにより目的タンパク質の大量発現を行ってきた。転写されたｍRNAは速やかに分解されてしまうので、タンパク質を大量発現させる（ｍRNAの細胞内濃度を高める）ためには分解を上回る速度で合成を行わなければならない。ｍRNAの合成はヌクレオチド３リン酸（生体エネルギー分子）を大量に消費する過程であるので、このような従来の発現系を用いた目的タンパク質の発現方法においては、エネルギーのロスが大きい。
【０００７】
特に、大腸菌 (Escherichia coli)のような細菌においては、嫌気条件下では、好気呼吸によるエネルギー（ATP）生産が行えないために、好気条件下に比較してエネルギーがきわめて制限された状態にある。そのため従来の嫌気性菌を用いた発現系においては、ひじょうに長い時間をかけて代謝を行わせる必要があった。有用な嫌気条件反応が発見された場合、その反応に関わるポリペプチド（例えば、酵素）の大量発現系を構築する必要があるであろう。しかしながら、好気条件下で用いられている強力なプロモーターに目的遺伝子を繋ぐというような従来技術の方法では、エネルギー供給が十分ではないために効率的な発現ができない。特に、上述のように、転写はヌクレオチド３リン酸（生体エネルギー分子）を大量に消費する（大腸菌 (Escherichia coli)の場合、菌体重量の約２０％がRNA分子である）。従って、嫌気条件下でも効率的なエネルギー節約型の発現系の構築が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明が解決しようとする課題は、mRNAを安定化させることによりエネルギーのロスを最小限に抑えて目的タンパク質の大量生産を達成せしめる発現方法及び発現系を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、RNaseGが16S rRNA以外のRNA分子に対する作用を有するか否かを調べ、その結果、今般、初めてRNaseGがmRNAをインビボにおいて分解することを発見した。そしてかかる発見に基づき、上記課題を解決するための新規発現方法及び発現系を構築した。
【００１０】
本発明の１の態様においては、目的タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの安定性を向上させることによる該タンパク質の生産方法であって、以下の工程：
mRNA分解酵素の欠損株に、該欠損株が過剰発現するポリペプチドをコードする遺伝子の5’-非翻訳領域に上記目的タンパク質をコードする遺伝子を作用可能な状態で連結した発現ベクターを導入し、これにより転写されたｍRNAの安定性を向上させ；
得られた株を培養し；そして
上記目的タンパク質を回収する；
を含む、前記生産方法を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様においては、目的タンパク質の発現系であって：
mRNA分解酵素の欠損株；並びに
発現ベクターであって：
上記欠損株が過剰発現するポリペプチドをコードする遺伝子の5’-非翻訳領域；及び
上記目的タンパク質をコードする遺伝子；
を作用可能な状態で含むもの；
を含み、ここで、上記発現ベクターが上記欠損株内に導入されており、これにより上記目的タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの安定性が高められる、前記発現系を提供する。
【００１２】
前記ｍRNA分解酵素はRNaseGであることができ、前記欠損株が過剰発現するポリペプチドはAdhEであることができ、前記欠損株は大腸菌 (Escherichia coli)  K-12株由来、例えば、GM11（rng::cat）であることができ、前記目的のタンパク質は、例えばβ−ガラクトシダーゼであることができ、そして前記発現ベクターは作用可能な状態でプロモーター配列をさらに含み、例えばpALF1であることができる。
RNaseGとRNaseEのN-末端エンドリボヌクレオチド分解ドメインの同族体は、ほとんどのグラム陰性細菌及びいくつかのグラム陽性細菌に存在するので、前記mRNA分解酵素欠損株は、大腸菌以外のこれらの菌であることもできる。
【００１３】
前記ｍRNA分解酵素欠損株GM11（rng::cat）と、前記欠損株が過剰発現するポリペプチドAdhEとの組み合わせが好ましい。
【００１４】
定義
本明細書中に使用するとき、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、酵素をも包含する。
本明細書中に使用するとき、用語「5’-非翻訳領域」とは、ｍRNA分解の半減期を高めるという機能を発揮する限り、その全体ではなく一部をも意味する。
本明細書中に使用するとき、用語「ｍRNAの安定性」とは、ｍRNA分解酵素の作用機構がいかなるものであるかを問わず、結果としてそのｍRNA分解の半減期が増加することをいう。
【００１５】
本発明者は、RNaseGが16S rRNA以外のRNA分子に対する作用をもつか否かについて検討した。まず、本発明者は、RNaseG欠損株においては、１００ｋDaのタンパク質が顕著に過剰発現していることを発見した。そのタンパク質のN-末端アミノ酸配列決定により、上記タンパク質はadhEがコードしているアルコール・デヒドロゲナーゼであることが判明した（実施例１参照）。AdhEの過剰発現がどのレベルの制御によるものであるか（転写又は転写後）を明らかにするために、ノーザン・ハイブリダイゼーションを行ったところ、RNaseG欠損株においては、adhE mRNA量が約６倍に増加していた。さらにリファンピシン追跡実験により、RNaseG欠損株においては、adhE mRNAの半減期が約２．５倍に増加していた（実施例４参照）。このとき、対照として調べたgapA mRNAやmreB mRNAではこのような変化は見られなかったので、RNaseGの作用は何らかの認識配列を介したものであると思われる。RNaseGによるadhE mRNA分解の生理学的意義は未だ明らかではないが、RNaseG欠損株内では、転写されたadhE mRNAが安定に存在するため、生体エネルギー分子を大量に消費する無駄な転写を最小限に抑えてアルコール・デヒドロゲナーゼを生産させることができるといえる。
【００１６】
次に、RNaseG/adhEの発現系が他の遺伝子にも応用できるかどうかを確かめるために、adhEとlacZの融合遺伝子を構築した。adhEのプロモーターと5’-非翻訳領域をlacZ遺伝子に融合させたものでは、RNaseG欠損により、アルコール・デヒドロゲナーゼとほぼ同レベルのβ−ガラクトシダーゼの大量発現が引き起こされた（実施例５参照）。RNaseGがadhE mRNAの5’-非翻訳領域を切断することにより、転写されたｍRNAの分解が引き起こされるが、RNaseG欠損株においてはこのような切断が起こらずに転写されたｍRNAが細胞内に安定に蓄積するために、アルコール・デヒドロゲナーゼの過剰発現が引き起こされると考えられる。これにより、adhEの5’-非翻訳領域を他の遺伝子の翻訳領域と連結させることによりRNaseG欠損株による発現制御が可能になることが証明された。
【００１７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、以下の実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実験手順
バクテリア株及び培地
使用した大腸菌 (Escherichia coli) K-12株を、以下の表１に列記する：
【表１】
0004555920.tif 000002
細胞を、１％Bactopeptone、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、及び０．１％グルコースを含有するＬブロス（ｐＨ７．０）中３０℃で培養した。適当な抗生物質を、プラスミド担持細胞を培養するために添加した。
cafA::cat突然変異株を、以下のように構築した。(T. Ogura, Kumamoto University School of Medicine, Kumamoto, Japanから得た)  pUC9のHincII部位に挿入されたpACYC184の１．３ｋｂのHaeII断片を担持する、pXX557からの１．３ｋｂのBamHI-HindIII上のcat遺伝子カセットを、T4 DNAポリメラーゼの処理によりその付着末端を平滑末端にした後、pMEL1（２８）上のcafA遺伝子内のユニークBglII部位に挿入した。得られたプラスミドpMEL1-cafA::catから、cafA::catとその隣接領域を含む７．８ｋｂのSalI断片をアガロース・ゲル電気泳動後に単離した。大腸菌 (Escherichia coli) K-12 recD 突然変異体株FS1576（２９）を、上記の単離された線状DNAで形質転換させ、そして上記のcafA::catを含有線状DNAと染色体cafA領域の間の相同的組換えにより形成されたクロラムフェニコール耐性コロニーを単離した。このcafA::cat構築物を、P1ファージ仲介形質導入により使用された他の株に移した。この染色体のcafA::cat挿入をサザン・ハイブリダイゼーションにより確認した（データを示さず）。
【００１９】
細胞タンパク質の分析
リン酸ナトリウム・バッファー(50mM, pH 7.0)中に懸濁させた細胞を音波処理により破壊した。未破壊細胞を除去した後、細胞溶解物を、超遠心分離(100,000 x g, 30分、4℃)により分画した。上澄を可容性画分として集めた。沈殿を同一バッファー中に懸濁させ、そして膜画分として集めた。タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離し、そしてゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーにより染色した。
【００２０】
全細胞RNAの単離とmRNNAの分析
全細胞ＲＮＡを、以下のように、先に（２７）に記載されたように単離し、そして分析した。全細胞RNAを以下に記載する迅速法により単離した。１００μｌの大腸菌 (Escherichia coli)培養物を遠心分離し、そして氷冷TE (10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA)で洗浄した。細胞を、１００μｌのTE中に懸濁させ、そして等容量の平衡化フェノール／クロロホルム及び１／１０容量のローディング染料溶液（０．３６％のブロモフェノール・ブルー、０．３６％のキシレン・シアノール、５０％のグリセロール）とともに激しくボルテックスすることにより直接抽出した。遠心分離（10,000 x g, 10分）後、上層の一部を修飾アガロース・ゲル電気泳動上に直接適用した。抽出されたRNAを、ホルムアルデヒド−アガロース・ゲル電気泳動(6.5%ホルムアルデヒド、1xMOPSバッファー[20mM 3-(N-モルフォロノ)−プロパン・スルホン酸pH7.0、5mM 酢酸ナトリウム、1mM EDTA]、１％アガロース)により分離した。ゲルを１μg/mlの臭化エチジウム溶液で染色し、そしてその後、UV照射（２５４ｎｍ）下で写真撮影した。
【００２１】
ノーザン・ハイブリダイゼーションのために、RNAを、キャピラリー法により、正電荷をもつナイロン膜 (Hybond-N+, Amersham International plc., Buckinghamshire, England)上に移した。ハイブリダイゼーション・プローブとして、adhE遺伝子の一部を含有する2.1kbのHindIII断片とmreB遺伝子の一部を含有する0.6kbのpstI断片を使用した。gapA遺伝子のためには、DNA断片を、以下のプライマー・セット：
5’-GACTATCAAAGTAGGTATCAACGGT-3’      （配列番号２）及び
5’-GATGTGAGCGATCAGGTCCAGAACT-3’      （配列番号３）
を用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）により増幅した。ノーザン・ハイブリダイゼーションをGene Image キット (Amersham)を使用して行った。
【００２２】
リファンピシン−追跡実験
対数増殖細胞を、１５０μg/mlのリファンピシンで処理して、RNAの新規合成を阻害し、そして所定の時間が経過した後に、全RNAを先に記載したように抽出し、そして分析する。mRNAの半減期を、NIH Imageソフトウェアを使用してそのバンド強度を計測することにより決定する。
【００２３】
adhE-lacZ融合遺伝子の構築
プロモーター配列、5’-非翻訳領域、及びコーディング領域の最初の２７ｂｐを含むadhE遺伝子の１．３ｋｂ上流領域を、以下のプライマー・セット：
5’-GATGTGGCGAAGTTAACATGATGG-3’      （配列番号４）及び
5’-GCTCTACGAGTGCGTTAACTTACGCGAC-3’  （配列番号５）
｛プライマー中、HpaI部位（下線）がクローニングのために導入されている。｝を使用してPCRにより増幅した。増幅されたDNAを、HpaIで消化し、そしてアンピシリン耐性遺伝子を担持するミニ−Fプラスミド上でadhEの第9コドンとlacZの第6コドンにおいてlacZ遺伝子とフレームをあわせて連結した。得られたpALF1と名づけたプラスミドを、rng::cat突然変異体株及びそれらの親株内に導入した。AdhE-LacZ融合物の発現を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により又はβ−ガラクトシダーゼ活性の計測により調べた。β−ガラクトシダーゼ活性を、Millarの方法により測定した（１６）。
【００２４】
実施例１：  rng::cat突然変異体におけるAdhEタンパク質の過剰生産
大腸菌 (Escherichia coli)のrng::cat突然変異体株を分析して、本発明者は、rng::cat突然変異体GM11が、rng+親株MC1061と比較したとき、約１００ｋDaの分子量をもつ多量のタンパク質を産生することを発見した（図１参照）。rng::cat株GM11は、その野生型株MC1061よりも約5倍以上の量の１００ｋDaタンパク質を産生した。この１００ｋDaタンパク質のほとんどは、その膜画分中に回収された。但し、上記タンパク質のかなりの量がその可容性画分中に回収された。上記１００ｋDタンパク質の過剰生産は、無傷の遺伝子としてrng遺伝子だけを担持するプラスミドpMEL2（２４）が上記突然変異体株に導入されたときに、野生型に復帰した（図１参照）。これは、上記１００ｋDaタンパク質の過剰生産がrng遺伝子の機能の欠陥によるということを示している。
【００２５】
上記の現象は、rng::cat突然変異が上記MC1061株に導入されたとき、顕著であった。W3110株又はCSH26株においては、上記１００ｋDaタンパク質の過剰生産はMC1061株の場合におけるものよりもかなり低かった（図６参照）。それゆえ、この現象のさらなる分析を、MC1061株とそのrng::cat誘導体GM11株を主に用いて行った。
【００２６】
上記１００ｋDaタンパク質を同定するために、このタンパク質のN−末端アミノ酸配列決定を行った。上記１００ｋDaタンパク質のN-末端部分の１８のアミノ酸残基の配列は、AKGQSLQDPFLNALRRER（配列番号１）であることが判明し、そしてそれはAdhEタンパク質、すなわち、大腸菌 (Escherichia coli)マップ上の２８分にあるadhE遺伝子によりコードされる発酵的アルコール・デヒドロゲナーゼ (alcohol dehydrogenase)の配列と同一であった（７）。但し、そのN-末端メチオニン残基は除去されていた。AdhEタンパク質の計算分子量、99,995は、SDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動上の、上記過剰生産されたタンパク質の推定値に合致した。このAdhEタンパク質はスピロソーム (spirosome)といわれる大きな複合体を形成し、そして超遠心分離により沈殿物中に主に回収されるということが報告されている（１１, ８）。さらに、AdhE破壊株は、上記rng::cat突然変異が導入されたときにさえ、もはや上記１００ｋDaタンパク質を産生しなかった（データを示さず）。これらの結果から、本願発明者は、上記１００ｋDaタンパク質はAdhEであると結論した。
【００２７】
実施例２：  AdhEタンパク質の発現に対するrne-1突然変異の効果
rng遺伝子産物、RNaseGは、ｍRNAの分解及びｒRNAプロセッシングに関わる（１４）RNaseEと、高い配列ホモロジー（１４）及び遺伝的相互作用（２６）を示すので、AdhEの発現に対するRNaseEの突然変異の効果を調べた。図2に示すように、MC1061のrne-1 (RnaseEts) 誘導体であるCH1828は、制限温度（４３℃）及び許容温度（３０℃）においてAdhEタンパク質を過剰生産せず、上記現象はRNaseG−特異的であることを示した。
【００２８】
実施例３：  rng::cat突然変異におけるadhE ｍRNAの安定性向上
rng遺伝子はRNaseGをコードするので、adhE ｍRNAに対するrng::cat突然変異の効果を、ノーザン・ハイブリダイゼーションにより調べた。図３（A）に示すように、rng::cat突然変異株GM11におけるadhE ｍRNAのレベルは、rng+株MC1061におけるレベルより約６倍高かった。他方、上記遺伝子マップ上３９分にあり、かつ、解糖系内のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼをコードするgapA遺伝子（１）のmRNAレベル、及び上記遺伝子マップ上rng遺伝子の直上流にあり、かつ、形態決定性タンパク質MreBをコードするmreB遺伝子（５）のmRNAレベルは、両株においてほぼ同じであった（図３（Ｂ）と３（Ｃ）参照）。
【００２９】
rng::cat突然変異がadhE遺伝子の転写又はadhE mRNAの安定性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、リファンピシン (rifampicin)−追跡実験を行った。MRNAの新規合成は、１５０μg/mlのリファンピシンにより対数増殖細胞を処理することにより阻害され、そしてリファンピシン添加前に合成されたadhE mRNAの分解を、rng+株とrng::cat株において調べた。図４（A）と４（C）に示すように、adhE mRNA は、rng+細胞内において4.0分の半減期をもって分解された。一方、adhE mRNA は、rng::cat突然変異細胞内において9.7分の半減期をもって分解された。これは、rng::cat突然変異体株におけるAdhEタンパク質の過剰生産がadhE mRNAの安定性向上に因ることを意味する。adhE mRNA以外のmRNAの安定性に対するrng::cat突然変異の効果についても調べた。図４（B）と４（D）に示すように、gapA mRNAはrng+株とrng::cat株において調べた。図４（A）と４（C）に示すように、adhE mRNA は両株においてほぼ同様の半減期をもって分解された；  rng+細胞内において7.9分、及びrng::cat突然変異細胞内において8.6分。これらは、rng遺伝子によりコードされるRNaseGがadhE mRNAを特異的に分解することを示唆している。但し、これは、RNaseGがadhE mRNA以外のmRNAを分解する可能性を排除するものではない。
【００３０】
実施例４：  RNaseG−依存性の安定性制御におけるadhE mRNAの5’-非翻訳領域の関わり
どんな因子がRNaseGによる安定性制御に関わっているかを調べるために、adhE-lacZ融合遺伝子を以下の実験手順に記載するように構築した。フレーム内にlacZ遺伝子と連結された、プロモーター配列、5’-非翻訳領域、及びコーディング領域の最初の２７ｂｐを含むadhE遺伝子の１．３ｋｂ上流領域を担持するプラスミドpALF1を、MC1061 (rng+)及びGM11 (rng::cat)内に導入した。図５（A）に示すように、AdhE-LacZ融合タンパク質は、染色体adhE遺伝子によりコードされる無傷のAdhEタンパク質とほぼ同じレベルまで、rng::cat突然変異体株GM11内において過剰生産された。GM11 (rng::cat)内のadhE-lacZ融合遺伝子から発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性は、その親株MC1061 (rng+)における活性よりも約３．６倍高かった（図５（B）参照）。これは、adhE遺伝子のコーディング領域の大部分がRNaseGによる安定性制御のために必要でないということを意味している。
【００３１】
プラスミドALF1をCSH26 (rng+)及びそのrng::cat誘導体GC11内に導入した。面白いことに、AdhE-LacZ融合タンパク質の発現レベルは、MC1061におけるレベルよりも、rng+バックグラウンドにおいてさえ、CSH26においてかなり低かった（約１／５）。しかしながら、rng::cat突然変異の導入によるβ−ガラクトシダーゼ活性の上昇率は、CSH26とMC1061においてほぼ同じであった（図５（B）参照）。これは、adhE遺伝子の基礎的な転写レベルに影響を及ぼすであろういくつかの未知のトランス作用因子がMC1061とCSH26（及びたぶんW3110）の間で変わっているということ、及びこれがrng::cat突然変異の効果とは無関係であるということを、示唆する。
【００３２】
【発明の効果】
本願発明は、従来の転写制御による遺伝子発現調節に代わる、転写されたｍRNAの安定性制御による新規過剰発現系を提供する。本願発明に係る発現系においては、エネルギー分子（ヌクレオチド３リン酸）を消費する無駄な転写を最小限に抑えて目的のタンパク質を大量に生産することができる。
【００３３】
0004555920.tif 000003
0004555920.tif 000004
0004555920.tif 000005
0004555920.tif 000006
【００３４】
【配列表】
0004555920.tif 000007
0004555920.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】rng::cat突然変異株GM11におけるAdhEタンパク質の過剰発現を表す電気泳動ゲルの写真。MC1061 (rng+)、GM11 (rng::cat)、及びGM11/pMEL2 (rng::cat/rng+)の細胞タンパク質を可容性画分と膜画分に分画し、そして実験手順中に先に記載したように７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動上で分析した。クマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルを示す。ゲルの左に示す数字は、分子量（x kDa）である。
【図２】  AdhEタンパク質の発現に対するrne-1突然変異の効果を表す電気泳動ゲルの写真。３０℃で培養したMC1061 (rng+)、GM11 (rng::cat)、及びCH1828 (rne-1)、並びに対数増殖期（ＯＤ６６０＝０．３）まで３０℃で培養し、そしさらに3時間４３℃にシフトさせたCH1828を、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動上で分析した。クマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルを示す。ゲルの左に示す数字は、分子量（x kDa）である。
【図３】adhE、gapA、及びmreB mRNAに対するrng::cat突然変異の効果を表すノーザン・ハイブリダイゼーション結果。MC1061 (rng+)及びGM11 (rng::cat)から抽出した全RNAを、実験手順中に記載したように、adhE（A）、gapA（B）、及びmreB（C）遺伝子のためのDNAプローブとのノーザン・ハイブリダイゼーションにより分析した。
【図４】リファンピシン−追跡実験の結果。MC1061 (rng+)及びGM11 (rng::cat)の培養物を、RNAのde novo合成を阻害するために１５０μg/mlのリファンピシンで処理した。RNAを所定の時刻に抽出し、そして、図３におけるようにadhE（A）及びgapA（B）遺伝子のためのDNAプローブを用いたノーザン・ハイブリダイゼーションにより分析した。MRNAの半減期 (T 1/2)を、NIH Imageフトウェアを用いたバンド強度の計測により決定した。
【図５】adhE-lacZ融合遺伝子の発現に対するrng::cat突然変異の効果を表す電気泳動ゲルの写真である。adhE-lacZ融合遺伝子を担持するプラスミドALF1を、MC1061 (rng+)、そのrng::cat誘導体GM11、又はCSH26 (rng+)及びそのrng::cat誘導体GC11内に導入した。AdhE-LacZ融合タンパク質の発現を、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（A）により又はβ−ガラクトシダーゼ活性の計測（B）により調べた。平均±SD(n=3)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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