(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース結合性タンパク質（GBP）および検出可能な信号を変換するレポーター基を具備するグルコースバイオセンサーであって、前記レポーター基は、前記GBPがグルコースに結合しているときに前記レポーター基によって変換された信号が、前記GBPがグルコースに結合していないときに前記レポーター基により変換された信号とは異なるように、前記GBPに結合されるバイオセンサー。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基は、前記GBPのグルコース結合部位から離れた部位において前記GBPに結合されるバイオセンサー。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基は、前記GBPのグルコース結合部位に結合されるバイオセンサー。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基が蛍光体であるバイオセンサー。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基が酸化還元共同因子であるバイオセンサー。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて0.8μM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項７】
請求項６に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて1mM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは突然変異体バクテリアタンパク質であるバイオセンサー。
【請求項９】
請求項８に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて0.8μM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項１０】
請求項９に記載のバイオセンサーであって、前記GBPは、グルコースについて1mM〜20mMの範囲の結合定数を有するバイオセンサー。
【請求項１１】
請求項９に記載のバイオセンサーであって、前記突然変異体タンパク質が突然変異体E. coliタンパク質であるバイオセンサー。
【請求項１２】
請求項１１に記載のバイオセンサーであって、前記突然変異体E. coliタンパク質であるGBPは、154および183の位置にアラニンを有するバイオセンサー。
【請求項１３】
請求項１２に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基が蛍光体であるバイオセンサー。
【請求項１４】
請求項１２に記載のバイオセンサーであって、前記レポーター基は255位置のシステイン残基に結合されるバイオセンサー
【請求項１５】
被検サンプル中におけるグルコースの存在を検出する方法であって：
グルコース結合性タンパク質（GBP）および検出可能な信号を変換するレポーター基を具備するグルコースバイオセンサーであって、前記レポーター基は、前記GBPがグルコースに結合しているときに前記レポーター基によって変換された信号が、前記GBPがグルコースに結合していないときに前記レポーター基により変換された信号とは異なるように、前記GBPに結合されるバイオセンサーを準備することと；
前記バイオセンサーを、該バイオセンサーが前記被検サンプル中に存在するグルコースと結合できる条件下で前記被検サンプルに接触させることと；
前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号を、前記バイオセンサーがグルコースを含まない対照サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号と比較することとを具備し、
前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号の、前記バイオセンサーが前記対照サンプルと接触しているときと比較した差によって、被検サンプルがグルコースを含有することが示される方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記被検サンプルが生理学的液体である方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記生理学的液体が血液、尿、間質液、または唾液である方法。
【請求項１８】
被検サンプル中のグルコース濃度を決定する方法であって：
グルコース結合性タンパク質（GBP）および検出可能な信号を変換するレポーター基を具備するグルコースバイオセンサーであって、前記レポーター基は、前記GBPがグルコースに結合しているときに前記レポーター基によって変換された信号が、前記GBPがグルコースに結合していないときに前記レポーター基により変換された信号とは異なるように、前記GBPに結合されるバイオセンサーを準備することと；
前記バイオセンサーを、該バイオセンサーが前記被検サンプル中に存在するグルコースと結合できる条件下で前記被検サンプルに接触させることと；
前記バイオセンサーが前記被検サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号を、前記バイオセンサーが既知量のグルコースを含有する対照サンプルと接触しているときに前記レポーター基により変換された信号を測定することにより作成された双曲線形状の標準のグルコース結合曲線と比較し、これにより前記決定を行うこととを具備した方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記被検サンプルが生理学的液体である方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記生理学的液体が血液、尿、間質液、または唾液である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は、1997年12月31日に出願された暫定出願60/070,293号の優先権を主張する。当該暫定出願の全体の内容を、本明細書の一部をなす参照として援用する。
【０００２】
【発明の技術分野】
本発明は一般的にバイオセンサーに関し、特に、遺伝子工学的に加工されたグルコース結合性タンパク質を含むグルコースバイオセンサーに関する。
【０００３】
【発明の背景】
バイオセンサーは、高度に特異的な生体分子リガンド結合事象とカップリングして生理的信号を変化させることにより、複雑な混合物中の一つの分子種の存在を測定できる分析ツールを提供する（Hall, Biosensors, Prentice-Hall: Englewood Cliffs (1991)）。殆どのバイオセンサーは、酵素または抗体のような天然に存在する巨大分子であり、これらは所望の分析特異性を提供するが、簡易な信号変換機構には十分に適さないことが多い。この問題に対する一つの解決策は、特定のタンパク質特性に対して特異的な装置を開発するのではなく、タンパク質工学技術を使用して信号変換機能を直接タンパク質に組込み、これをそのまま検出技術に適合させることである（Adams et al., Nature 39:694-697(1991)；Braha et al., Chem. Biol. 4:497-505(1997)；Brennan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:5783-5787 (1995)；Brune et al., Biochemistry 33:8262-8271(1994)；Cornell et al, Nature 387:580-583(1997)；Godwin et al., J. Am. Chem. Soc. 118:6514-6515(1996)；Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371(1997)；Post et al., J. Bio. Chem. 269:12880-12887(1994)；Romoser, J. Biol. Chem. 272:13270-13274(1997)；Stewart et al., J. Am. Chem. Soc. 116:415-416(1994)；Thompson et al., J. Biomed. Op. 1:131-137(1996)；Walkut et al., J. Am. Chem. Soc. 119:5445-5450(1997)）。このような一体化した信号伝達体を構築するための単純なアプローチは、リガンドの結合に応答する蛍光レポータ基の変化に基づいて光学的検出ストラテジーを開発することである（Guiliano et al., Annu. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 24:405-434 (1995)；Czarnik, Chem. Biol. 2:432-438(1995)）。全合成、半合成、または遺伝子融合を使用することにより、蛍光体をタンパク質の中に部位特異的に導入することができる。この方法では、蛍光エネルギー移動による結合の検出のために蛍光体の対を配置することができ、または付随する結合事象を伴うコンホメーション変化に応答するように、環境的に感受性の一つの蛍光体を配置することができる（上記の引用文献を参照のこと）。
【０００４】
理想的には、リガンド結合部位とレポーター基との間の構造的関係は、夫々が独立に操作できて、結合部位または蛍光体の特性の最適化へのモジュール的アプローチを可能にするものである（Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371(1997)；Walkup et al., J. Am. Chem. Soc. 119:3443-3450(1997)；Cheng et al., Am. Chem. Soc. 118:11349-11356(1996)；Ippolito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:5017-5021(1995)；Elbaum et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8381-8387(1996)）。このようなモジュール性を達成する一つの方法は、二つの部位を、それらの間の立体的干渉を最小限にするように空間的に離間させることである。レポーター基および結合部位の空間的分離には、蛍光体の挙動が、アロステリック結合機構を介してリガンド結合部位の占有度に密接に関連したまま残ることを必要とする。最近、構造に基づく合理的な設計アプローチを使用して、該タンパク質におけるリガンド結合の際に生じる大きなコンホメーション変化を利用することにより、E. coliのマルトース結合性タンパク質（MBP）におけるこのような一体化された蛍光アロステリック信号変換体（FAST）を加工することが可能であることが示された（Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371 (1997)）。
【０００５】
本発明は、一つの態様において、加工されたFAST機能をもったグルコース／ガラクトース結合性タンパク質に関し、また食品工業（Suleiman et al., In:Biosensor Desighn and Application, Matthewson and Finley, Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., Vol.511 (1992)）および臨床化学（Wilkins et al., Med. Eng. Phys. 18:273-278；Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1993)；Meyerhoff et al., Endricon 6:51-58(1996)）における応用性をもった新規クラスの蛍光グルコースセンサーに関する。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、遺伝子工学的に加工されたグルコース結合性タンパク質（GBP）を含むグルコースバイオセンサーに関する。特定の態様において、本発明は環境感受性レポーター基の部位特異的な導入を可能にする突然変異を含むように加工されたGBPに関する。これら補欠分子基の信号は、グルコース結合の程度に伴って線形に変化する。従って、本発明のグルコースセンサーは、例えば、血液中または工業的発酵プロセスにおけるグルコースの検出のために使用することができる。
【０００７】
【発明の詳細な記述】
本発明は、蛍光体のような環境感受性リポーター基の導入を可能にするアミノ酸残基を含むように、GBPから加工された新規なグルコース検知タンパク質に関する。本発明は、少なくとも部分的には、直接的にグルコース結合部位内に配置され、またはグルコース結合部位に対してアロステリックに密接に関連したGBP領域の同定に由来する。
【０００８】
本発明のグルコースセンサーの製造に先立って、マルトース結合性タンパク質（MBP）におけるアロステリック部位が同定された（Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371）。マルトース結合形（「閉鎖形」）およびマルトース遊離形（「開放形」）の両方の状態においてMBAの高解像度のＸ線構造が公知であったので、アロステリック部位の直接的な同定が可能であった。対照的に、GBPは「閉鎖形」（即ち、グルコースが結合した）のコンホメーションでしか結晶化せず、従って、可能なアロステリック部位（PAS）の位置を直接計算することは排除された。MBPおよびGBPには僅かの相同性しかなく、異なった分子量を有し、しかも二次構造トポロジーも幾分異なっているが、二つのタンパク質の間の粗い構造的類似性を利用して、GBPにおけるアロステリック部位の位置を予測することが可能であることが立証された（Vyas et al. Nature 327:635-638(1987)；Vyas et al., Science 242:1290 -1295(1988)；Vyas et al., Biochemistry 33:4762-4768(1994)）。
【０００９】
以下の例には本発明のグルコースセンサーが幾らか詳細に説明されているが、記載された特定の加工されたGBPは個別の具体例のみを表していることが理解されるであろう。更に、GBPは受容体タンパク質の副科のメンバーであるから、本発明は加工されたE.coli GBP以外の加工されたGBP、例えば加工された好熱性バクテリアGBP（Tam et al., Microbiol. Rev. 57:320(1993)参照）をも含むものであることが理解されるであろう。
【００１０】
本発明の加工されたタンパク質は、全合成、半合成、または遺伝子融合により、レポーター基を部位特異的に導入することによって製造することができる（全て上記に挙げたGodwin et al.(1996), Walkup et al.(1997), Adams et al.(1991), Brune et al.(1994), Gilardi et al.(1994), Marvin et al.(1997), Post et al.(1994), Thompson et al.(1996), Romoser et al.(1997)参照）。
【００１１】
信号伝達の物理的性質（例えば、蛍光、電気化学的、核磁気共鳴（NMR）および電子常磁性共鳴（EPR））およびレポーター基の化学的性質において異なる種々のレポーター基を使用することができる。例えば、異なった種々の蛍光体を使用することができる。分子センサーが経皮的バイオセンサーの中に組込まれるとき（皮膚は600nm未満では不透明である）は、長い励起および放出波長（例えば＞600nm）で動作する蛍光体が好ましい。現在のところ、スペクトルのこの領域で利用可能な環境的に感受性のプローブは僅かしか存在せず、またチオール反応性官能基をもったものは存在しない（Thompson, R.B., Red and near-infrared fluorometty, in Topics in Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Editor, 1994, Plenum Press: New York, p. 151-181）。しかし、オスミウム(II)ビスビピリジル錯体およびナイルブルー色素のチオール反応性誘導体は調製することができる（Green et al., Biochem. 30:9450(1991)）。例えば、GBPのヒンジ領域に構築された種々のシステイン変異体に結合したこれら蛍光体を含有する複合体を、グルコース結合の際に何れが大きな蛍光の変化を生じるかを決定するためにスクリーニングすることができる。Os(II)ビスビピリジル錯体は600 nmよりも長い波長に吸収を有し、700〜800 nmの領域に最大放出を有し（Demas et al., Anal. Chem. 63:829A(1991)）、寿命は長く（100nsの範囲）、蛍光の寿命測定機器の組み立てを簡単にする。これらの錯体の吸収および発光特性は、リガンド置換によって容易に変えることができる。これらの錯体において、Os(II)の状態は不活性に変化し（該錯体から金属が喪失する可能性を大きく低減する）、また酸化還元電位は〜1Vであるため生理学的条件下ではOs（III）に酸化され難いので、Osの毒性は低下する。酸化還元の共同因子は、レポーター基としても使用できる（例えばフェロセンおよびそのチオール反応性誘導体）。2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリンオキシジル（TEMPO）および
2,2,5,5-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ（PROXYL）のような有機遊離基のチオール反応性誘導もまた使用することができ、モニターされるリガンド結合に応答して、これらプローブのEPRスペクトルが変化する。
【００１２】
レポーター基はGBPの結合性ポケットに配置することができ（Vyas et al., Nature 327:635-638(1987), Vyas et al., Science 242:1290-1295(1988), Vyas et al., Biochemistry 33:4762-4768(1994)）、その結果、レポーター信号における変化は結合したグルコースとの直接的な相互作用の結果である。このアプローチは、レポーター基とグルコースとの間の望ましくない立体的な相互作用を伴う可能性があり、これがグルコース親和性または基質選択性を低下させる点において不利であるかもしれない。或いは、レポーター基は結合部位から遠くの位置に配置されることができ、そこでは、ドメイン移動の検出に基づくアロステリックカップリング機構を介して、レポーター基がグルコース結合を間接的に検知する。適切なアロステリック部位は、ドメイン間の曲げ移動と協働して局部的コンホメーション変化を受けるGBP領域に位置している。MBPの場合、このような部位の位置は、両タンパク質コンホメーション（即ち、「開放形」および「閉鎖形」）の実験的に決定された構造の比較によって推定される。上記に述べたように、MBPとGBPの二つのタンパク質間の粗い構造的ホモロジーに基づいて、この解析をGBPにまで拡大可能であることが証明された。アロステリック検知機構は、レポーター基とグルコースとの間の直接的な相互作用がなく、結合部位の元の性質が本質的に影響されないという利点を有する。このアロステリック設計ストラテジーは、自然界ではモジュール式(modular)である。即ち、リガンド結合部位は、結合したレポーターのレポート特性を破壊することなく変化され得る。
【００１３】
本発明の更なる側面においては、レポーター基とのアロステリック結合を破壊したり、過度に悪影響を及ぼすことなくグルコースに対するタンパク質の親和性を変更するために、アロステリック部位（レポーター基の連結のための）および結合部位の両方に突然変異が導入される。本発明のこの側面は、例えば、バイオセンサーが血中グルコース濃度測定のために使用されるときに応用できる。血中グルコースは典型的には約7 mMであり、糖尿病の症状では5〜15mMの間で変動する（Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed., (1986) Burtis and Ashwood (eds.) Saunders, London）。サンプルを希釈することを必要とせずにグルコースを正確に測定するために、生理学的（および病理学的）操作レンジに適合するように当該加工バイオセンサーの結合定数を調節する。野生型GBPは、Kd（グルコース）＝0.8μmを有している。有利なことに、本発明のバイオセンサーは弱い結合定数（約4乗小さい）を有するが、グルコースに対して特異的である。例えば、グルコースに対して0.8μM〜20 mMの結合定数を有するバイオセンサーを使用することができる。有利なことに、バイオセンサーが臨床目的で使用されるとき、結合定数は1mM〜20mMの範囲にある。結合定数は、例えば、既知量のグルコースに応答した、加工タンパク質の蛍光変化を測定することによって測定することができる（後述の例を参照のこと）。同様に、結合定数は、工業的プロセスにおける操作条件に適合するように「変更」することができる。
【００１４】
糖の特異性を変えることなくGBPの結合定数を変化させる突然変異は、GBPにおけるグルコース結合ポケットの三次元構造（図４）を調べることによって同定することができる。タンパク質と結合した糖との間の三つのカテゴリーの相互作用が変化され得る：（Ａ）直接の水素結合相互作用、（Ｂ）直接のフンデルワールス相互作用、（Ｃ）間接的なフンデルワールス接触または水素結合接触。クラス（Ａ）の接触は、特異性に最も寄与し易く、従って変更されずに残る。クラス（Ｂ）およびクラス（Ｃ）の接触は部位特異的突然変異によって変更することができ、第一の例では、特異的残基がアラニンに変異される。W183AおよびY10Aの単一変異体ならびにW183A Y10Aの二重変異体が、255Cと称するアロステリック信号伝達構築物中に構築された。これらの突然変異は、グルコースについての結合定数を0.2μMから夫々20μM、50μMおよび650μMに変化させ、アロステリック信号伝達機構を破壊することなく結合定数が「変化」され得ることを示す。実施例５に記載したD154A W183A二重突然変異（これも255Cバックグラウンドの中）は、7.2の結合定数を有する。例えば、Phe16、Lys92、Glu147、Lys9、Asp184、Asn14、Asn91、His152、Asp154、Arg158、Asn211、Asp236、Asn256；Tyr10、Met17、Asn66、Ser112、Ser115、Trp183、Asn210、Met214、Glu261および／またはTyr295を含む他の突然変異体を作製することができる。アラニンに特異的な位置を変えることに加えて、他のアミノ酸の効果を決定することができる。有利なことに、全ての突然変異体は非アロステリックな152Cバックグラウンドにおいても試験されるであろう。
【００１５】
本発明のバイオセンサーは、本質的には、グルコース検出が必要とされる如何なる環境においても使用することができる。例えば、本発明のバイオセンサーは、食品工業（Suleiman et al., In: Biosensor Desighn and Application, Mathewson and Finley, Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., Vol.511 (1992)）および臨床化学（Wilkins et al., Med. Eng. Phys. 18:273-278；Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1993)；Meyerhoff et al., Endricon 6:51-58(1996)；Riklin et al, Nature 376:672-675(1995)；Willner et al., J. Sm. Chem. Soc. 118:10321-10322(1996)）において使用することができる。本発明のバイオセンサーは、例えば、固定化されたGBP-FAST複合体を含む蛍光フローセルを構築するための基礎として使用することができる。（Wilkins et al, Med. Eng. Phys. 18:273-288(1966)；Pickup, Tr. Biotech. 11:285-291(1933)；Meyerhoff et al., Endricon. 6:51(1966)；Group, New Engl. J. Med. 329:977-986(1993)；Gough et al., Diabetes 44:1005-1009(1995)）。本発明のバイオセンサーは、人工膵臓としての使用に適した移植装置に用いることができる。
【００１６】
本発明の一定の側面を、以下の非制限的実施例において更に詳細に説明する（Marvin et al., J. Am. Chem. Soc. 120:7(1998)も参照されたい）。
【００１７】
【実施例】
以下の実験の詳細は、下記の特定の例に関する。
【００１８】
＜突然変異誘発＞
細胞質形態のGBPの遺伝子（Scholle et al., Mol. Gen. Genet. 208:247-253(1987)）（即ち、リーダー配列ペプチドを欠いているもの）を、開始コドンのN-末端にE.coliの制限部位5’を導入するように設計されたフランキングプライマー（5’ CCG GAA TTC GGA GAT ACC ATG GCT GAT ACT CGC ATT GGT GTA ACA ATC TAT 3’；制限部位および開始コドンに下線を付した）および停止コドンの直前にBamHI部位を導入するように設計されたフランキングプライマー（5’ AAG CTT TCA TTA GGA TCC TTT CTT GCT GAA CTC AGC CAG GTT GCT TTT 3’）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、大腸菌ゲノムDNAから増幅した。得られたフラグメントをpKK223-3発現ベクター（ファルマシア社）の中にクローニングした。続いて、His5をコードするオリゴヌクレオチドカセットをBamHI部位にクローニングして、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーによる一段階精製を可能にした（Hochuli et al., Bio/Technol. 6:1321-1325(1988)）（IMAC）。PCR断片突然変異誘発を重ね合わせることにより、個別的なシステイン突然変異体を作製した。
【００１９】
＜タンパク質の発現および精製＞
突然変異体GBPタンパク質を発現するプラスミドで新たに形質転換されたE. coli XL1-blue cells（ストラタジーン社）のコロニーを、100μg／mLのアンピシリンを含有する20 mLの2XYT培地中において37℃で一晩増殖させた。0.2％（w/v）のグルコースを懸濁させた2XYT培地（1L）に上記一晩培養物 10 mLを接種し、激しく震盪しながら、37℃においてOD600−0.5まで増殖させた。1 mM 1PTGでタンパク質の発現を誘導し、更に４時間増殖させた。3000gでの遠心分離により細胞を回収し、40 mLの高塩バッファー（1 mM NaCl, 50 mM燐酸, pH 7.0; HSB）の中に懸濁させ、-80℃で凍結保存した。細胞を融解し、1200 psiにおいて冷凍フレンチプレス中で溶解した。細胞の破片を6000 gで10分間の遠心分離により除去した。ポリエンイミン（pH8）を5％（w/v）まで添加することによりDNAを沈殿させ、6000gで30分の遠心分離により除去した。GBPを一段階IMAC（Hochuli et al., Biol/Technol. 6:1321-1325(1988)）で精製した。透明にした溶解液をHBSで100 mLにまで希釈して30 mLのイミノジアセテート／亜鉛カラム（ファルマシア社）に掛け、HSBで広範に洗浄して未結合のタンパク質（および結合したグルコース）を除去し、続いて200 mLのHBS中の0〜100 mMイミダゾール勾配溶液を使用して変異体GBPを溶出した。単一の遅延ピークの中にGBPが見つかり、これはオーバーロードしたSDS／ポリアクリルアミド上のクーマシー青で染色された唯一のタンパク質バンドであることが明らかになった。収率は、典型的には5 mg/Lであった。
【００２０】
＜蛍光体カップリング＞
蛍光体を、単一の遊離システインを介してGBPタンパク質に結合させた。アクリロダン(acrylodan)（Prendergast et al., J. Biol. Chem. 259:7541-7544(1983)）および（((2-(ヨードアセトキシ)エチル)メチル)アミノ）-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（Ghosh et al., Biochem. J. 108:155(1968)）（IANBD）をモレキュラープローブ社から購入し、更に精製せずに使用した。この蛍光体をアセトニトリル中に溶解し、1 M NaCl, 50 mMリン酸バッファー中において室温で3〜5時間、新たに精製したGBPnoシステイン変異体（〜1mg）と反応させた。未反応の蛍光体をゲル濾過によりタンパク質から分離した。エルマン試薬（Ellman, Arch. Biophy. 82:70-77(1959)）を使用して残留する遊離チオール濃度を測定することにより、また主タンパク質および蛍光体発色団の吸収率（ε280(GBP)＝37 mM-1cm-1（本研究）；ε469(IANBD)＝23 mM-1cm-1；ε392(アクリロダン)＝20 mM-1cm-1）を使用することにより、結合の程度を測定した。結合は常に95％より大きいことが分かった。グルコース結合試験により測定したところ、この複合体は4℃で数ヶ月に亘って安定であった。
【００２１】
＜グルコースおよびガラクトース結合の測定＞
SLM-Aminco-Bowmanシリーズ２蛍光計上で、25±1℃において、複合化された蛍光体の蛍光変化を測定することにより糖結合を決定した。グルコースまたはガラクトース（シグマ社）を、0.1MnaCl, 50 mMリン酸（pH7.0）中の50nM複合体タンパク質溶液の中に滴定し、これを磁気スターラーで連続的に混合した。滴定のために、励起および放出スリット幅を夫々4nmおよび16nmに設定した（IANBD：λex＝469 nm、λem＝540 nm；アクリロダン：λex＝392 nm、λem＝520 nm）。これらの条件の下で、装置ノイズはグルコースの飽和溶液中で観察された蛍光信号の＜1％であった。実験的に観察された結合曲線は、下記の結合等温曲線に適合した。
【００２２】
ΔＦ＝ΔＦmax（１＋Ｋd／Ｓ）-1        （１）
ここで、ΔＦは蛍光における変化であり、ΔＦmaxはリガンドの飽和濃度における蛍光変化であり、Ｋdは結合定数であり、Ｓはリガンドの濃度である。
【００２３】
【実施例】
実施例１：アロステリック的に連結されるレポーター部位の同定
開放型ＭＢＰ（Spurlino et al,J.Biol.Chem.266:5202-5219(1991)）および閉鎖型ＭＢＰ（Sharff et al,Biochemistry 31:10657-10663(1992)）の高分解Ｘ線構造の立体配座上の相違点が分析され、アロステリック的に結合部位に連結されると予想される領域が分析された（Marvin et al,Proc.Natl.Acd.Sci.USA 94:4366-4371(1977)）。これらの領域はアロステリック的にマルト−ス結合部位に連結されるということが、環境に敏感な蛍光体の部位特異的な結合により明らかとなった。ＧＢＰは閉鎖型立体配座においてのみ結晶化し、潜在的アロステリック部位（ＰＡＳ）の位置の直接的な予測（計算）を妨げてきた。その代わりに、ＭＢＰで得られた結果が用いられ、２つのタンパク質が配列相同性をほとんど共有せず、相違した分子量および多少相違した２次構造トポロジーであるにもかかわらず、ＭＢＰおよびＧＢＰとの大まかな構造的類似点を頼りに、後者における類似したＰＡＳの位置が予測された（Hsiao et al,J.Mol.Biol.262:225-242(1996)）。
【００２４】
ＭＢＰにおいて最も顕著なアロステリック信号を与えた部位は、現存するヒンジを覆っている可動性「フラップ」を形成する領域に位置する。このフラップは、それぞれがドメインの１つに閉じ込められる２つの結合されていない半片によって形成される。それらの相対的な移動は、ヒンジβシートにより結合ポケットから完全に分離して結合した蛍光体の環境を変化させる。ＧＢＰにおける相当するフラップ領域ははるかに小さく、１つの半片のみが適切に保持され、対するＧＢＰにおける結合位置をヒンジ自体に制限する（図１）。
【００２５】
ＧＢＰに役立つ限られた量の構造的情報を直視し、ＰＡＳの位置に関する研究がこの領域に限定された。フラップ領域における残基のどれが、リガンド結合に対して最も顕著なアロステリック応答を与えるかを予測することは不可能であるので、フラップのβシートの１部をこまかく調べ、レポーター基結合のための４つの部位（L255、D257、P294、V296）を同定した。これらの位置は全てヒンジβシートの片側に位置し、フラップαヘリックスが詰め込まれる表面を形成する。それゆえ、もしリガンド結合によってフラップ領域が再配列するならば、それらの微視的環境は変化すると予想される。
【００２６】
実施例２：非アロステリック（ペリステリック）レポーター部位
ＰＡＳ突然変異に加え、結合部位自体におけるレポーター基結合のための２つの部位（N15、H152）が同定された。これらの部位に配置される蛍光体は、リガンドの直接的な相互作用、リガンド周囲に接近した結合部位の「入り口」としてのタンパク質立体配座変化、または溶媒和における変化による微視的環境における変化に対し応答すると予測される。この戦略は、ＭＢＰ（Gilardi et al,Anal.Chem.66:3840-3847(1994)）および無機リン酸塩に結合するペリプラズム結合性タンパク質類の他のメンバーであるリン酸塩結合性タンパク質（Brune et al,Biochemistry 33:8262-8271(1994)）（ＰＢＰ）に蛍光性レポーター基を形質導入して、非アロステリック信号を首尾良く導入するために用いられてきた。どちらの場合においても、複合タンパク質のリガンド結合定数は、野生型に比較してかなり増加し、それはリガンドおよび蛍光体間の立体干渉の度合いが相当であり、そのことが発蛍光団の微視的環境における変化の原因であることを示す（Gilardi et al,Prot.Engin.5:479-486(1997)）。したがって、この戦略は、本来のアロステリックアプローチにおけるレポーター基および結合部位間の立体的独立を失っている。
【００２７】
実施例３：突然変異体の信号変換特性
蛍光体が部位特異的共有結合のために導入された１つのシステインを持つ６つのＧＢＰ変異体が、ＰＣＲ変異変異誘発戦略により構築された。表１はこれら突然変異タンパク質のアクリロダン（Prendergast et al,J.Biol.Chem.259:7541-7544(1983)）または(((2-(アイオドアセトキシ)エチル)メチル)アミノ)-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3,ジアゾール（Ghosh et al,Biochem.J.108:155(1968)）（ＩＡＮＢＤ）複合体の結果を示す。これら２つの蛍光体は、知られているように、微視的環境の極性に対して敏感であるとの理由から選択された。
【００２８】
【表１】
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Ｒ：アポタンパク質に対する完全に飽和したＧＢＰ（10ｍＭグルコース）の蛍光比（Ｒ＝1.0は、変化がないことを示す；Ｒ＜1.0は、グルコース結合の減少を示す；Ｒ＞1.0は、増加を示す）。Ｋd(Glc)、Ｋd(Gal)：それぞれグルコースおよびガラクトースにおける結合定数（μＭ）（nd：未実施；結合定数は、Ｒ≠1.0の全ての場合で決定した）。野生型は、Ｋd(Glc)=0.2μＭ、およびＫd(Gal)=0.4μＭを有する(Millerら、J.Biol.Chem.258:13665-13672(1983年))。Ｎ15ＣおよびＨ152Ｃは、非アロステリックレポーター基のための位置で、他の４つの突然変異体は、アロステリックフラップのヒンジ部に位置している。
【００２９】
ヒンジ部にある４つの全ての突然変異体は、リガンド結合におけるそれらのアクリロダンまたはＩＡＮＢＤ複合体の蛍光において変化を示した。位置255におけるアクリロダン複合体は、最も大きな変化を与える（２倍減少；図２Ａ）。全ての場合において、グルコースまたはガラクトース濃度の関数として蛍光の変化を測定することで、１つの部位の双曲線型結合曲線が構成され、そこから我々は予想通り、ヒンジ部に結合された蛍光体が、アロステリックに糖結合ポケットへ連結されると結論する。さらに、糖結合定数は、４つの因子だけによって影響され、ＦＡＳＴおよびリガンド結合部位は、意図通り、立体的に離されていることを示している。
【００３０】
また、２つのシステイン突然変異が、結合ポケット自体に組み立てられた（図１）。H152は、ガラクトースおよびグルコースの両方のＯ6酸素と水素結合を形成するhis152と置換されるため（Vyas et al,Biochemistry 33:4762-4768(1994)）、直接糖と相互作用する。本研究で研究される全ての変異体の蛍光における最も大きな変化（４倍増加）が、この位置に結合されたＩＡＮＢＤで観察された。しかしながら、Ｏ6酸素への水素結合の減少および結合した糖への直接的な立体干渉から予想されたように、この複合体はグルコース（〜100倍）およびガラクトース（〜500倍）の結合定数において大きな増加を示す。
【００３１】
糖結合ポケットからAsn15は離れて位置するので、Ｎ15Ｃに結合された蛍光体は、糖との直接的な相互作用によってというよりはむしろ、ドメイン間距離の変化に応答するはずである。アクリロダンおよびＩＡＮＢＤ複合体は、位置152におけるＩＡＮＢＤほど大きくはないが、糖結合における変化を示す。しかしながら、位置15における複合体は、糖結合定数を大きく乱さず、糖との直接的な相互作用が存在しないことを示す。
【００３２】
実施例４：蛍光体複合体の微視的環境
アクロリダンおよびＩＡＮＢＤのどちらも、それらの微視的環境における極性の変化に敏感であり（Ghosh et al,Biochem.J.108:155(1968)；Macgregor et al,Nature 319:70-73(1986)；Weber et al,Biochemistry 18:3075-3078(1979年)）、それは、溶媒アクセシビリティー、プローブの可動性における変化および周囲のタンパク質（または、H152C−NBD複合体の場合には、リガンド）との立体相互作用における変化に起因する。そのような微視的環境変化は、それらの極大波長のシフトだけでなく、放出強度の相違として明らかである。アクリロダンの放出極大は特に環境の極性に依存すると知られており、水成環境に関連した非極性における青シフトを示す（Macgregor et a,Nature 319:70-73(1986)；Weber et al,Biochemistry 18:3075-3078(1979)）。
【００３３】
相違する部位の応答は、広範囲にわたって様々である。幾つかの場合において、特定の部位に結合した２つの複合体のうち１つのみが、糖の結合に対して応答する（表１参照）。さらに、複合体のどれもリガンド結合における放出極大の感知しうるシフトを示さない。ヒンジ部における最もすぐれたアロステリック信号変換体の様子、Ｌ255Ｃ−アクリロダン（図３）、をより詳しく調査した。この複合体の放出スペクトルは、２つの極大（498および520ｎｍ；図２Ａ）を有し、結合されたアクリロダンが、水に関連したそれらの青シフトに基づき、水およびエタノールとの中間である極性が異なる２つの別の環境に存在することを示唆している（Prendergast et al,J.Biol.Chem.259:7541-7544(1983)）。両ピークは、それらの相対強度はリガンド結合において多少変化はするものの、アポおよび糖結合型で存在し、２つの状態間で再配置はわずかであること示唆する。リガンド結合によって起こる蛍光体の極性緩和の変化に対する結合部位における溶媒アクセビリティの相違の潜在的な寄与を調べるために、我々はグルコース存在下および非存在下において、蛍光における沃化物の効果を測定した。沃化物は溶媒にさらされた蛍光体を選択的に抑制する。抑制の度合いは、定常状態衝突抑制を表すシュテルン−フォルマーの式に従う：
Ｆ0／Ｆ＝１＋Ｋ[Ｉ-]（２）
そこで、Ｆ0／Ｆは蛍光の減少割合およびＫは溶媒アクセシビリティの度合いに関連するシュテルン−フォルマー抑制定数（溶媒にさらされた蛍光体において、Ｋ＞1.0）。アクリロダンの両放出極大において測定される抑制定数はほぼ同じであり、グルコース添加において変化せず、＞１である（図３）ことを見出し、両アクリロダン立体配座は部分的に溶媒にさらされ、微視的環境における変化は、溶媒アクセシビリティにおける変化を含みそうにないことを示す。同様に他の複合体でも観察された。
【００３４】
これらの結果は、立体配座変化が結合された蛍光体の双極子緩和に影響するメカニズムは、結合位置の局部的な溶媒アクセシビリティにおける変化を含まないが、ＭＢＰの結合部位に結合されたＩＡＮＢＤにおいても観察されたように（Gilardi et al,Prot.Engin.5:479-486(1997)）、その微視的環境との蛍光体の詳細な相互作用に依存することを示唆する。
【００３５】
実施例５：グルコース結合定数の改変
実験的に測定されるＧＢＰ３次元構造の試験（図４参照）は、グルコース結合部位（水素結合またはファンデルワールス相互作用を通してグルコースと直接接触する残基（第一結合表面）および第一結合表面における残基を配向させるために働く残基（第二結合表面））を形成する２つの型の残基が存在することを示す。（大腸菌ＧＢＰにおける第一結合表面：Asn14、Asn91、His152、Asp154、Arg158、Asn211、Asp236、Asn256；大腸菌ＧＢＰにおける第二結合表面：Tyr10、Phe16、Met17、Asn66、Ser112、Ser115、Trp183、Asn210、Met214、Gln261、Tyr295）。グルコースの結合定数を変化させるために、両表面の残基を、１つまたは１対のどちらかで体系的に突然変異させた。得られたデータを表２に示した。Asp154Ala、Trp183Ala(D154A＋W183A)の二重突然変異体は、7.2ｍＭの結合定数を有する。従って、変動範囲は生理的に関連したグルコース濃度範囲において作用するために調和している。
【００３６】
【表２】
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実施例６：光学装置
青ＬＥＤの放出波長（470ｎｍで極大、半パワー±30ｎｍ）は、ナイルブルー色素（ＮＢＤ）蛍光体の励起波長（469ｎｍで極大）に完全に匹敵するので、単純な原器の特別な目的のための蛍光器が、安価に、簡単に、素早く利用できる電子部分を基に構成された（図５参照）。１ｍｌキュベットを、ニチア化学(Nichia Chemical)ケイ素−混合窒化ガリウム青ＬＥＤ（20ｍＡで３ｃｄ）で照射する。サンプルの中に光を集めるため、二重の凸レンズが用いられる。放出光からの励起光を分離するために、ハイパスガラスフィルター（515ｎｍ遮断）が用いられる。放出された光を検出するために、広い（100ｍｍ2）平面拡散ＳｉＰＩＮフォトダイオード（光子検出器）が用いられる。フォトダイオードは、非バイアス（光起電力）モードで作動し、低ノイズおよび低周波数運転において最適化される。信号はローパスフィルターされ（5Ｈｚ遮断）、続いて所望の低−および高−末端キャリブレーションを達成するために可変サマーおよび可変ゲイン増幅器を通過する。すべてのアナログ信号処理のために、ＬＴ1028（超低ノイズ）演算増幅器が用いられる。アナログ入力からノイズを平均化するために、総変換時間〜150ｍｓの12ビットデュアルスロープ積分型アナログ・ディジタルコンバーターが用いられる。デジタル出力は、27Ｃ64ＥＰＲＯＭを通して供給される。表示は４つの７−セグメントグリーンＬＥＤディスプレー上に現れる。この計器は、双曲線型結合曲線を構成するのに十分精密にリガンド結合におけるＮＢＤ蛍光変化を検出できる。
【００３７】
全ての上記引用文書は、本文で参照文献欄に完全に記載している。
【００３８】
本技術分野の当業者は、形態および細部の様々な変化が本発明の真の領域からはずれることなく行われ得るということを、この開示を読むことで十分理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  夫々の基質と複合体を形成した閉鎖形態のMBP（Spurlino et al., J. Biol. Chem. 266:5202-5219(1991)）（top; Protein Data Bank ref 2MBP）およびGBP（Vyas et al, Nature, 327:635-638(1987)；Vyas et al., Science 242:1290-1295(1988)）（Vyas et al., Biochemistry 33:4762-4768(1944)）（bottom:PDB ref IGLG）の比較であり、位置を示している。結合した蛍光体の結合部位は球により示されている。MBPの「フラップ」領域に位置する球は、最良のアロステリック応答を与えることが分かった蛍光体の位置を示している（Marvin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371 (1977)）（Asp95Cysに結合される）。この結果に基づいて、GBPの類似領域における四つの部位（255，258，294，296）が、潜在的にグルコース結合性ポケットにアロステリックに結合することが予測される。グルコース結合性ポケット内に位置する部位15および152は、潜在的な非アロステリックレポーター基のための位置である。リボン図形はモルスクリプト(Molscript)で作製された（Krollis, J. Appl. Crystal. 24:946-950(1991)）。
【図２】  L255C-アクリロダン複合体（図２Ａ）およびH152C-IANBD複合体（図２Ｂ）へのグルコースの結合。結合曲線は３回の別々の滴定の平均である（誤差バーは示された円よりも小さい）。挿入図は、飽和グルコースの添加に際しての放出光スペクトルの変化を示している：グルコースなし（破線）、10mMグルコース（実線）。
【図３】  L255-アクリロダン複合体の沃化物による溶質クエンチング。沃化物を添加したときの498nmでの蛍光放出におけるＦ０／Ｆ画分変化。アポタンパク質（塩）について、および10mMグルコースの存在下（菱形）でクエンチングを測定し、498nm（塗り潰し）および520nm（白抜き）での最大放出についてプロットした。
【図４】  GBPにおけるグルコース結合性ポケット（タンパク質データバンクRef 2GBP）
【図５】  青LEDに基づく蛍光計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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