(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体プロテインをコードする単離ＤＮＡであって、該変異体プロテインが、
（ｉ）下記配列のアミノ酸残基のうち、Ｍｅｔ５３Ｉｌｅ、Ｍｅｔ５３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２８ＡｌａおよびＡｒｇ１２８Ｇｌｕ、またはこれらのいずれかとの組み合わせからなるグループから選択された置換によって修飾されたＡＨＡＳプロテインを含むことを特徴とする、前記単離ＤＮＡ。
【表１】
0004469833.tif 000012
【請求項２】
修飾がプロテインの酵素活性を阻害するイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤の能力を変えることを特徴とする、請求項１において定義されるＤＮＡ。
【請求項３】
目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナ由来であることを特徴とする、請求項１において定義されるＤＮＡ。
【請求項４】
変異体ＡＨＡＳプロテインが、
（ａ）少なくとも一つのイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤の非存在下、
（１）それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；または
（２）該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該細胞中に発現されるあらゆる第二のイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて該細胞は生存のためＡＨＡＳ活性を必要とする、および
（ｂ）少なくとも一つのイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性；
を有することを特徴とする、請求項１において定義されるＤＮＡ。
【請求項５】
変異体ＡＨＡＳが野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％以上を有することを特徴とする、請求項１において定義されるＤＮＡ。
【請求項６】
変異体ＡＨＡＳがイミダゾリノンに基づく除草剤に対して、スルホニルウレアに基づく除草剤に対してよりも少なくとも２倍は耐性であることを特徴とする、請求項５において定義されるＤＮＡ。
【請求項７】
作動するように転写調節エレメントに結合している請求項１のＤＮＡを含むＤＮＡベクター。
【請求項８】
細胞が細菌、カビおよび植物の細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項７において定義されるＤＮＡベクターから誘導されるＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列を含む細胞。
【請求項９】
植物細胞からなる請求項８において定義される細胞。
【請求項１０】
請求項９において定義される細胞からなる種子。
【請求項１１】
請求項１において定義されるＤＮＡによってコードされるプロテインからなる変異体ＡＨＡＳプロテイン。
【請求項１２】
変異体ＡＨＡＳプロテインであって、
（ｉ）下記配列のアミノ酸残基のうち、Ｍｅｔ５３Ｉｌｅ、Ｍｅｔ５３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２８ＡｌａおよびＡｒｇ１２８Ｇｌｕ、またはこれらのいずれかとの組み合わせからなるグループから選択された置換によって修飾されたＡＨＡＳプロテインである、前記ＡＨＡＳ変異体プロテイン。
【表２】
0004469833.tif 000013
【請求項１３】
修飾がプロテインの酵素活性を阻害するイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤の能力を変えることを特徴とする、請求項１２において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。
【請求項１４】
目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナ由来であることを特徴とする、請求項１２において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。
【請求項１５】
変異体ＡＨＡＳプロテインが、
（ａ）少なくとも一つのイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤の非存在下、
（１）それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；または
（２）該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該細胞中に発現されるあらゆる第二のイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて該細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および
（ｂ）少なくとも一つのイミダゾリノン類またはスルホニルウレア類の除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性；を有することを特徴とする、請求項１２において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。
【請求項１６】
変異体ＡＨＡＳが野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％以上を有することを特徴とする、請求項１２において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。
【請求項１７】
細胞にイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性を付与するための方法であって、
（ａ）請求項１において定義されるＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすること
；および
（ｂ）遺伝子が該細胞にイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで発現されることからなる条件下該ＤＮＡを該細胞に形質転換すること；
を特徴とする、前記方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法に従って製造される細胞。
【請求項１９】
請求項１８において定義される細胞を含む植物。
【請求項２０】
ＡＨＡＳ遺伝子がシロイヌナズナＡＨＡＳ遺伝子であることを特徴とする、請求項１７において定義される方法。
【請求項２１】
細胞が細菌、カビおよび植物の細胞からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１７において定義される方法。
【請求項２２】
細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項２１において定義される方法。
【請求項２３】
細胞が種子中にあることを特徴とする、請求項２２において定義される方法。
【請求項２４】
イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性ＡＨＡＳプロテインの製造方法であって、該イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性ＡＨＡＳプロテインが、下記配列のアミノ酸残基のうち、Ｍｅｔ５３Ｉｌｅ、Ｍｅｔ５３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２８ＡｌａおよびＡｒｇ１２８Ｇｌｕ、またはこれらのいずれかとの組み合わせからなるグループから選択された置換によって修飾されたＡＨＡＳプロテインであって、
【表３】
0004469833.tif 000014
（ａ）変異の目標として、Ｍｅｔ５３Ｉｌｅ、Ｍｅｔ５３Ｈｉｓ、Ａｒｇ１２８ＡｌａおよびＡｒｇ１２８Ｇｌｕ、またはこれらのいずれかとの組み合わせからなるグループからＡＨＡＳプロテイン中のアミノ酸位置を選沢すること；
（ｂ）該位置で変異をコードする変異ＤＮＡを製造するため、ＡＨＡＳをコードするＤＮＡを変異すること；
（ｃ）該位置に該変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下に、第一の細胞中で該変異ＤＮＡを発現すること；
（ｄ）第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインを発現すること；
（ｅ）該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを該細胞から精製すること；
（ｆ）イミダゾリノン除草剤またはスルホニルウレア除草剤の非存在または存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換における触媒活性について該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；
（ｇ）イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、
（１）イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤の非存在下において、該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％よりも高い触媒活性；
（２）野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対してより耐性である触媒活性、そして
（３）イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対してより感受性である触媒活性；
を有するまで、該変異体がステップ（ｂ）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるようステップ（ａ）−（ｆ）を繰り返すこと；
からなる前記製造方法。
【請求項２５】
ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナ由来であることを特徴とする、請求項２４において定義される製造方法。
【請求項２６】
細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項２４において定義される製造方法。
【請求項２７】
作物における雑草を管理するための方法であって、請求項１９において定義されるイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性植物を栽培し、そして雑草を管理するのに有効な量の該イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤を用いて該作物を処理することを特徴とする、前記方法。
【請求項２８】
作物における雑草を管理するための方法であって、請求項１９において定義されるイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性植物を含む作物を栽培し、そして雑草を管理するのに有効な量の該イミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤を含む除草組成物を用いて該作物を処理すること、を特徴とする、前記方法。
【請求項２９】
請求項１において定義されるＤＮＡで形質転換された細胞であって、該ＤＮＡを該細胞にイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで該細胞中に発現することを特徴とする、前記細胞。
【請求項３０】
請求項１において定義されるＤＮＡで形質転換された植物であって、該ＤＮＡを該植物にイミダゾリノン類および／またはスルホニルウレア類の除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで該植物中に発現することを特徴とする、前記植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イミダゾリノンおよび他の除草剤に耐性であるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）の変異体の構造に基づくモデリングおよびデザイン、ＡＨＡＳ阻害除草剤、ＡＨＡＳの変異体、これら変異体をコードするＤＮＡ、これら変異体を発現する植物および雑草管理の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）は、細菌、酵母および植物のイソロイシン、ロイシンおよびバリンの生合成の第一段階を触媒する酵素である。例えば、トウモロコシ（Ｚｅａ  Ｍａｙｓ）の成熟ＡＨＡＳは葉緑体（図１を参照）に局在するほぼ５９９個のアミノ酸のプロテインである。該酵素は、アセト乳酸を生成するためコファクターとしてチアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を、基質としてピルビン酸を用いる。また、この酵素は、ピルビン酸とケト酪酸の縮合を触媒してアセトヒドロキシ酪酸を生成する。ＡＨＡＳは、アセト乳酸シンターゼまたはアセト乳酸ピルビン酸リアーゼ（炭酸化）としても知られ、ＥＣ  ４．１．３．１８と命名されている。活性酵素は多分少なくともホモダイマーである。Ｉｂｄａｈらは、抄録（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３：４７９−Ｓ，１９９４）で、ＡＨＡＳの活性部位に対する一つのモデルを開示している。
【０００３】
イマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ−Ｗａｙｎｅ，ＮＪ)等のイミダゾリノン化合物、スルホメツロンメチル(OUST（登録商標）−Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ−Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ)等スルホニルウレア系化合物、トリアゾロピリミジンスルホンアミド類(ＢｒｏａｄｓｔｒｉｋｅＴＭ−Ｄｏｗ Ｅｌａｎｃｏ；Ｇｅｒｗｉｃｋら、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２９：３５７−３６４，１９９０参照)、スルファモイルウレア類(Ｒｏｄａｗａｙら、水稲、麦および大麦におけるＡｃ３２２１４０の選択性のメカニズム、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ−Ｗｅｅｄｓ，１９９３の講演要旨集)、ピリミジルオキシ安息香酸類(ＳＴＡＢＬＥＲ（登録商標）−クミアイ化学工業、Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ;殺虫剤マニュアル １０版、ページ８８８−８８９、Ｃｌｉｖｅ Ｔｏｍｌｉｎ編、英国穀物保護委員会、４９ Ｄｏｗｎｉｎｇ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｆａｒｍｈａｍ，Ｓｕｒｒｅy Ｇ４９ ７ＰＨ，英国)およびスルホニルカルボキサミド類(Ａｌｖａｒａｄｏら、米国特許４，８３３，９１４)のようないろいろな除草剤がＡＨＡＳ酵素活性を阻害することにより作用する(Ｃｈａｌｅｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４：１４４３，１９８４；ＬａＲｏｓｓａら、J．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９， ８７５３，１９８４；Ｒａｙ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５：８２７，１９８４；Ｓｈａｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５，１９８４参照)。これらの除草剤は非常に効果的でかつ環境にやさしい。しかし、これらの除草剤の植物毒性効果に対して雑草のみならず作物も反応するので、農業にそれらを使用することは選択性の欠如のため限られる。
【０００４】
Ｂｅｄｂｒｏｏｋらは、米国特許５，０１３，６５９、５，１４１，８７０および５，３７８，８２４にいくつかのスルホニルウレア耐性ＡＨＡＳ変異体を開示している。しかし、これらの変異体は、植物、種子または細胞を変異させ、除草剤抵抗性変異体を選択することによって得られたか、そのような突然変異体から誘導された。このアプローチは、目標プロテインの構造モデルに基づく論理的なデザイン手法というよりはむしろ少なくとも初めは対応する突然変異体の偶然の機会による導入に頼る点で予測ができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、栽培される作物に選択的に広範囲および／または特異的な除草剤耐性を付与する方法および組成物には当該技術において、需要が依然としてある。本発明者らは、ＡＨＡＳの選択的除草剤耐性変異体およびそれを含む植物が、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）に対するＡＨＡＳの構造に基づくモデルリング、除草剤結合ポケットまたはＡＨＡＳモデル上のポケットを定め、結合ポケットに対する除草剤の結合性を変える特異的な突然変異体をデザインすることによって製造できることを発見した。これらの変異体および植物は、一種類以上の除草剤によって阻害されたり殺されたりされず、作物の成長を支えるべく充分なＡＨＡＳ酵素活性を維持する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づくモデリング方法を提供する。本方法は、
（ａ）目標ＡＨＡＳプロテインをピルビン酸オキシダーゼ鋳型またはそのＡＨＡＳモデリング同等物上に該目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために並べること；
（ｂ）目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ以上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること；
（ｃ）変異の目標として、変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除草剤の親和性を変えるために、目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのアミノ酸位置を選沢すること；
（ｄ）例えば、該位置で少なくとも一つの異なるアミノ酸の変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するため、目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること、そして
（ｅ）例えば、該位置で異なるアミノ酸のような変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下第一の細胞中で該変異ＤＮＡを発現すること、
を包含する。
更に、本方法は、
（ｆ）第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現すること；
（ｇ）野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること；
（ｈ）除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および
（ｉ）第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、
（１）：少なくとも一つの除草剤の非存在下、
（ａ）それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；または
（ｂ）第一のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および
（２）：少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性；
を有することが同定されるまで、ステップ（ｅ）のＡＨＡＳ変異体をコードするＤＮＡがステップ（ｃ）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるように、ステップ（ｃ）−（ｈ）を繰り返すこと
をさらに包含することができる。
【０００７】
除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づく別のモデリング方法も提供される。この方法は、
（ａ）目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、目標ＡＨＡＳプロテインを図１の配列を有するポリペプチドから得られる最初のＡＨＡＳ鋳型またはその機能的同等物上に並べること；
（ｂ）目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ以上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること；
（ｃ）変異の目標として、変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除草剤の親和性を変えることからなる目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのアミノ酸位置を選沢すること；
（ｄ）該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するため、目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること、および
（ｅ）該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下第一の細胞中で変異ＤＮＡを発現すること、
を包含する。
【０００８】
更に、この方法は、
（ｆ）第二の細胞で平行して目標野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを発現すること；
（ｇ）野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること；
（ｈ）除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および
（ｉ）第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、
（１）少なくとも一つの除草剤の非存在下、
（ａ）それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；または
（ｂ）第一のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および
（２）少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性；を有することが同定されるまで、ステップ（ｅ）のＡＨＡＳ変異体をコードするＤＮＡがステップ（ｃ）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるようステップ（ｃ）−（ｈ）を繰り返すこと、
をさらに包含することができる。
【０００９】
更に別の態様において、方法は、
（ａ）目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、同定された除草剤結合ポケットおよび図１の配列を有する最初のＡＨＡＳ鋳型またはその機能的同等物上に目標ＡＨＡＳプロテインを並べること；
（ｂ）変異の目標として、変異が該結合ポケットに対する少なくとも一つの除草剤の親和性を変えるために、目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのアミノ酸位置を選沢すること；
（ｃ）該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するため、目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること；
（ｄ）該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下で第一の細胞に変異ＤＮＡを発現すること；
を包含する。
【００１０】
この方法は、
（ｅ）第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現すること；
（ｆ）野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること；
（ｇ）除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および
（ｈ）最初の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、
（１）少なくとも一つの除草剤の非存在下、
（ａ）それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；
または
（ｂ）最初のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性、ここにおいて細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および
（２）少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりもな耐性である触媒活性；
を有することが同定されるまでステップ（ｄ）のＡＨＡＳ変異体をコードするＤＮＡがステップ（ｂ）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるようにステップ（ｂ）−（ｇ）を繰り返すこと、
をさらに包含することができる。
【００１１】
上記方法の好ましい態様において、除草剤非存在下の触媒活性は、野生型ＡＨＡＳの触媒活性の少なくとも５％そして最も好ましくは約２０％以上である。この除草剤がイミダゾリノン除草剤である場合、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインは、
（ｉ）除草剤非存在下において、野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％よりも高い触媒活性；
（ｉｉ）野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的より耐性である触媒活性、および
（ｉｉｉ）イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して比較的より感受性である触媒活性；
を有すると好ましい。
更に、本発明はアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体プロテインをコードする単離ＤＮＡを提供するものであって、該変異体プロテインは、
【表１】
0004469833.tif 000002
【００１２】
並びにこれらのいずれかと機能的に同等なもの、およびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基における少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換；
【表２】
0004469833.tif 000003
【００１３】
前者のいずれかと機能的に同等なものおよび前者のいずれかのすべての組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つのアミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削除；
（ｉｉｉ）図１の配列のＱ１２４とＨ１５０の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または機能的に同等なものの削除；
（ｉｖ）図１の配列のＱ１２４とＨ１５０の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または機能的に同等なものの付加；
（ｖ）図１の配列のＧ３００とＤ３２４の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または機能的に同等なものの削除；
（ｖｉ）図１の配列のＧ３００とＤ３２４の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または機能的に同等なものの付加；
（ｖｉｉ）以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ；
によって修飾されたＡＨＡＳプロテインからなる。
この番号システムにおいて、残基＃２は、即ち葉緑体ターゲッティングペプチドの除去後の成熟プロテインの推定アミノ末端に対応する。
【００１４】
上記修飾は、プロテインの酵素活性を阻害する除草剤、好ましくはイミダゾリノン系除草剤の能力を変えることに向けられている。好ましい態様において、該単離ＤＮＡはＡＨＡＳの除草剤耐性変異体をコードする。また、これらＡＨＡＳ変異体をコードするＤＮＡからなるＤＮＡベクター、変異体ＡＨＡＳプロテイン自体およびＡＨＡＳ変異体を発現するかまたはこれらのベクターを含むインビボまたは細胞培養中で増殖する細胞が提供される。
【００１５】
別の態様において、本発明は一つの細胞または複数の細胞、そして特に例えば種子のような一つの植物細胞または複数の植物細胞に除草剤耐性を付与するための方法を提供する。ＡＨＡＳ遺伝子、好ましくはシロイヌナズナＡＨＡＳ遺伝子をＡＨＡＳの酵素活性を阻害する除草剤の能力を変えるように変異する。変異遺伝子を適合する発現ベクターにクローン形成し、遺伝子を、それが細胞に除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで発現される条件下で除草剤感受性細胞に形質転換する。また、本発明に記載の除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子を含む作物が栽培され、雑草をコントロールするのに効果的量の除草剤で処理されるような雑草管理の方法が考えられる。
【００１６】
また、ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づくモデリング方法が開示される。この方法は、
（ａ）目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、ピルビン酸オキシダーゼ鋳型またはそのＡＨＡＳモデリング機能同等物上に目標ＡＨＡＳプロテインを、並べること；
（ｂ）目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれらの組み合わせを誘導するために第二の除草剤を該三次元構造にモデリングすること；および
（ｃ）第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊するのに充分にＡＨＡＳ活性を阻害するように、結合ポケットのＡＨＡＳ活性阻害有効部分と相互作用する、好ましくは結合する、非ペプチド性の第一の除草剤をデザインすること；
からなる。
【００１７】
また、ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づく別のモデリング方法が含まれる。この方法は、
（ａ）目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、図１の配列を有するポリペプチドから得られる第一のＡＨＡＳ鋳型またはその機能同等物上に目標ＡＨＡＳプロテインを並べること；
（ｂ）目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれらの組み合わせを誘導するために第二の除草剤を該三次元構造にモデリングすること；および
（ｃ）第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊するのに充分ＡＨＡＳ活性を阻害するように、結合ポケットのＡＨＡＳ活性阻害有効部分と相互反応する、好ましくは結合する、非ペプチド性の第一の除草剤をデザインすること；
からなる。
好ましくは、各方法において第一の除草剤は結合ポケットの官能性基と相互作用する少なくとも一つの官能性基を含有する。
【００１８】
本発明は、酵素ＡＨＡＳの修飾体およびＡＨＡＳ阻害除草剤の論理的なデザインまたは構造に基づく分子モデリングを含む。これら修飾酵素（ＡＨＡＳ変異体プロテイン）は除草剤の作用に対して耐性である。また、本発明は、これら変異体をコードするＤＮＡ、これらＤＮＡを含むベクター、ＡＨＡＳ変異体プロテインおよびこれら変異体を発現する細胞を含む。更に、これら変異体を発現することによって植物に除草剤耐性をつくる方法および雑草管理の方法が提供される。本発明のＤＮＡおよびＡＨＡＳ変異体は、ＡＨＡＳの構造の分子モデリングに基づく研究において発見された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ＡＨＡＳ変異体およびＡＨＡＳ阻害除草剤の論理的な構造に基づくデザイン
本発明に記載のＡＨＡＳの除草剤耐性変異体は、植物に除草剤耐性を付与するのに有用であり、ＰＯＸモデル、ＡＨＡＳモデルまたはそれらの機能的に同等なもの、例えばトランスケトラーゼ、カルボリガーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、コファクターとしてＦＡＤおよび／またはＴＰＰを結合するプロテインまたはＰＯＸおよび／またはＡＨＡＳに類似する構造的特徴を有する全てのプロテイン、また図１の配列を有するモデルのようなＡＨＡＳモデルまたは前のモデルからモデル化された変異体を含む図１の配列と機能的に同等なものを用いてデザインされる。用いることのできるプロテインは、上記に挙げた分子のいずれかに対して、それらのＣα炭素において３．５オングストロームよりも小さい平均二乗偏差を有するいかなるプロテインをも含む。ＡＨＡＳを対象とする除草剤を、これらの鋳型から同様に合わせることができる。ＡＨＡＳアミノ酸配列の機能的に同等なものは、特に例えば推定結合ポケットのような保存領域において実質的、即ち６０−７０％の相同性を有する配列である。相同性の程度は、例えばＧＣＧによるＧＡＰおよびＰＩＬＥＵＰのような当該技術において公知のプログラムに基づく簡単な整列によって決定される。相同性は、同一のアミノ酸または保存的置換を意味する。図１のＡＨＡＳプロテイン中の特定のアミノ酸残基の機能的に同等なものは、例えばＧＣＧによるＧＡＰおよびＰＩＬＥＵＰのような当該技術において公知のプログラムによって図１の配列と一緒に並べた時、図１のアミノ酸残基と同じ位置にある他のＡＨＡＳプロテインのアミノ酸残基である。
【００２０】
論理的デザインは、典型的には、（１）目標ＡＨＡＳプロテインをＰＯＸバックボーンまたは構造またはＡＨＡＳバックボーンまたは構造と並べること、（２）任意に、そしてＡＨＡＳバックボーンが同定された除草剤結合ポケットを有するならば、目標プロテインの除草剤結合ポケットを局限するために、一つ以上の除草剤を三次元構造中へモデリング、（３）このモデルに基づく変異の選択、（４）部位特異的変異誘発および（５）変異体の発現および精製を含む。追加のステップは、（６）酵素の性質の試験および（７）野生型ＡＨＡＳの性質と比べた適当な変異体の評価を含む。各ステップを以下別々に論述する。
【００２１】
１．分子モデリング
分子モデリング（ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）（および特にプロテイン相同モデリング）技術は、指定プロテインの構造および活性の知識を提供することができる。プロテインの構造モデルは、Ｘ−線結晶学などの実験データから直接に、相同モデリングなどにより間接的に、またはその組合わせにより決定することができる（Ｗｈｉｔｅ等によるＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２３：３４９，１９９４参照）。ＡＨＡＳの三次元構造の解明はポリペプチドに対して除草剤耐性を付与するＡＨＡＳ内の特定のアミノ酸残基の変異にかかわる理論的スキームの開発の基礎を提供する。
【００２２】
ラクトバシルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からの関連ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）の既知のＸ−線結晶構造を鋳型として使用するトウモロコシＡＨＡＳの構造の分子モデリングは、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体またはＡＨＡＳ阻害性除草剤のデザインに有用であるＡＨＡＳ構造の三次元モデルを提供する。この分子モデリング方法は、ＡＨＡＳおよびＰＯＸが多くの生化学的特徴を共有し、かつまた共通の先祖遺伝子から誘導することができるという利点を有する（Ｃｈａｎｇ等によるＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３９３７，１９８８）。
【００２３】
ＡＨＡＳ中の高度の交雑種（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）相同性から、本明細書に記載されているモデリングされたＡＨＡＳまたはその機能的に同等なものはまた、ＡＨＡＳ変異体プロテインをデザインするための鋳型として使用することができる。
【００２４】
相互作用性分子グラフィックおよび配列形成を用いるモデルの一つの誘導は以下で詳細に説明する。この方法から得られる三次元ＡＨＡＳ構造は酵素の活性部位およびこれに制限されないが、イミダゾリノン除草剤を包含する除草剤などの阻害剤の結合部位または結合ポケットのおおよその空間的構成を予想させる。このモデルを次いでリファインし、次いで以下でまた説明する生化学的検討に基づいて再解明する。
【００２５】
プロテイン相同モデリングには、検討するプロテインの一次配列をその結晶構造が既知である第二のプロテインとともに並べることが必要である。ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）はＡＨＡＳ相同モデルの作製に選択される。これはＰＯＸとＡＨＡＳとが多くの生化学的特徴を共有しているからである。例えば、ＡＨＡＳおよびＰＯＸは両方共に、酵素反応メカニズムの点で、かつまたコファクターおよび金属必須条件の点で共通している。これら両酵素では、その酵素活性にチアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および二価カチオンが必要である。ＦＡＤはＰＯＸにおける触媒作用期間中のレドックス反応を媒介する。これは多分、ＡＨＡＳの構造的機能のみを有し、ＰＯＸからＡＨＡＳに進化する際の痕跡残物である。これら酵素は両方ともに、基質としてピルビン酸を利用し、安定な反応中間体としてヒドロキシエチルチアミンピロホスフェートを生成する（Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｖ．等によるＩｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，Ｂａｒａｋ，Ｚ．Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｍ．，Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｖ．（編集）、ＶＣＨ出版社、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ国、１９９０）。
【００２６】
さらにまた、ＡＨＡＳ活性はＰＯＸのＮ−末端半分およびＡＨＡＳのＣ−末端半分からなるキメラＰＯＸ−ＡＨＡＳプロテインに存在し、これはＰＯＸそれ自体により示されるＡＨＡＳ活性は低度である。ＡＨＡＳおよびＰＯＸはまた、溶液中で類似の性質を示す（Ｒｉｓｓｅ，Ｂ．等によるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１：１６９９および１７１０，１９９２；Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．，＆  Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｇ．Ｋ．（１９８９），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５８：１１３；Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．等による（１９８９）、Ｉｎ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｌｏｐｐｉｎｇ，Ｌ．Ｇ．，等編集，ＢＣＰＣＭｏｎｏｇｒａｐｈ．８７頁）。プロテイン濃度を増加させながら、ＰＯＸおよびＡＨＡＳの両方は、モノマーからダイマーおよびテトラマーへの段階的転移を受ける。ＦＡＤ濃度を増加させると、より順位の高いサブユニット構築物が誘発される。両プロテインのテトラマー形態は熱による変質および化学的変質に対して最も安定である。
【００２７】
さらにまた、ラクトバシルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのＰＯＸの結晶構造は、Ｍｕｌｌｅｒ等により解明されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９６５，１９９３）。本発明者等は、ＡＨＡＳとＰＯＸとの間の物理的、生化学的および遺伝学的相同性の程度に部分的に基づいて、ＰＯＸのＸ−線結晶構造がＡＨＡＳ構造の相同モデリングのための構造上の出発点として使用できることを見出した。
【００２８】
しかしながら、ＡＨＡＳ配列とＬ．プランタラムＰＯＸ配列とは完全コンピューターによる配列形成に充分なほどには類似していない。総合的に、アミノ酸の約２０％のみが同一であり、一方残基の約５０％は類似の分類（すなわち、酸、塩基、芳香族など）に属する。しかしながら、これらの配列を親水性および疎水性残基の観点から比較すると、その６００個のアミノ酸のうちの５００個以上が一致する。ＡＨＡＳの二次構造予測（Ｈｏｌｌｅｙ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１５２，１９８９）はＰＯＸの実際の二次構造に相当に類似していることを示した。残基の７０％近くについて、予測ＡＨＡＳ二次構造はＰＯＸのものと一致する。
【００２９】
ＰＯＸモノマーは３つのドメインからなり、これらのドメインはいずれも、α−ヘリックスおよび長いループからなるクロスオーバーによる中央の平行β−シートを有する（Ｍｕｌｌｅｒ等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２５９，９６５，１９９３）。このシートの位相幾何学的形態はドメイン間で相違している、すなわち第一ドメインおよび第三ドメインでは、そのストランドが配列２−１−３−４−６−５でβ−シートに集合され、一方第二ドメインのβ−シートでは、その配列は３−２−１−４−５−６と読める。
【００３０】
コンピューター生成配列形成は、二次構造予測および配列相同性に基づいていた。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｃｈによりＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０に記載されている慣用の対式配列整列方法が使用された。２種の配列を並べて、配列形成スコア（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ）を最大にした。この配列形成スコア（相同性スコア）は、並べられた残基の全ての対にかかわるスコアおよびこの配列中に空間を導入するための任意のペナルティの合計である。この残基対を並べるためのスコアは、要約された整数値である。相同性スコアシステムは、一定の残基対の間の逸脱頻度を見出すことに基づいている。（ＭＯ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ＲＭ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＆  ＢＣ  Ｏｒｃｕｔｔ，“Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３，３４５〜３６２頁、１９７８）。
【００３１】
この配列形成をさらに、連続する規則的二次構造が保存されるように、空間再配置によりリファインする。同様の配列形成スキームを評価することによって見出されたアミノ酸置換を、相互作用性分子グラフィックにより比較した。一定の部位内のアミノ酸の特定の機能にかかわる大部分の保存性置換を備えた配列を選び出した。ＰＯＸおよびＡＨＡＳの最終配列は図２に示されている。残基の保存されたクラスターを、特にＴＰＰ結合部位およびＦＡＤ結合部位について同定した。この配列は第一ドメイン、第二ドメインの大部分および第三ドメインのほぼ半分に、ＡＨＡＳとＰＯＸとの間の高度の類似性を示した。不十分に並べられ、ＰＯＸとＡＨＡＳとでは相違して重畳されていることがある領域の大部分は当該プロテインの表面に存在するものと予想され、コファクターまたは阻害剤結合には包含されなかった。変異部位の予測は配列における小さな移動によっては実質的な影響を受けない。
【００３２】
ＴＰＰ結合残基の大部分はＰＯＸとＡＨＡＳとの間で高度に保存される（例えば、Ｐ４８−Ｇ４９−Ｇ５０）。若干の場合に、ＴＰＰに近い残基はＰＯＸとＡＨＡＳとの間で相違しているが、高度に保存されている領域内に残る（例えば、残基９０〜１１０）。他方、ＦＡＤ結合部位は、ほとんど保存されないものと見做される。若干のＦＡＤ結合性残基は強力に保存されるが（例えば、Ｄ３２５−Ｉ３２６−Ｄ３２７−Ｐ３２８）、その他はＰＯＸとＡＨＡＳとの間で明白に相違している（例えば、位置２７８〜２８５からのループに存在する残基は相同ではない）。詳細な分析によって、ほとんど保存されない接触部位の少なくとも一部では、その相互作用がこの側鎖によるよりも、そのペプチド幹鎖により媒介されることが解明された。すなわち、保存はポリペプチド重畳に必要なだけであって、アミノ酸配列には不必要である（例えば、残基２５８〜２６３の幹鎖はＦＡＤのリビトール鎖を結合する）。アデニンおよびイソアロキサジン結合部位の半分は明白に相違している。
【００３３】
一次構造配列を形成した後に、ＡＨＡＳアミノ酸配列をＰＯＸ鋳型構造体に転位させることによって相同モデルを構築した。欠落している配座（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）はアミノ酸残基の鋳型を用いて構築し、未確定側鎖を完成させた。この分子の小部分のデータバンク調査およびエネルギー最低化（ｅｎｅｒｇｙ−ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を採用して、未確定のループ領域の配座を完成した。補因子ＴＰＰおよびＦＡＤをそれらの結合ポケット中にモデル化した。このモデルを次いで、完全５００サイクルエネルギー最低化に付した。コンピュターモデリングは全部、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｃｏ．からのＩｎｄｉｇｏ  Ｅｌａｎ  Ｒ４０００  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで行った。相互作用性分子モデリングおよびエネルギー最低化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．からのＱｕａｎｔａ／ＣＨＡＲＭｍ  ４．０を用いて行った。このステップ中に、配座は安定する。これは、例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ接触に近似するような格別には好ましくない相互作用は生起しないことを示した。この結果を図３に模式図として示す。
【００３４】
予測ＡＨＡＳ構造の特徴
上記のモデリングしたＡＨＡＳ構造を検討することによって、プロテインの大部分が溶剤を許容する大部分の疎水性側鎖とともに、エネルギー的に妥当であるバックボーンと重畳していることが判った。β−シートの表面は滑らかであり、それらに付着しているクロスオーバー領域を収容している。
【００３５】
ダイマー形ＡＨＡＳのモデルは、配列形成スキームに関して定義されているＣα配座の対を用いて、エネルギー最低化モノマー形ＡＨＡＳの配座の重複および２つのＰＯＸサブユニットに２つのコピイをスーパーインポーズすることによって生成された。長い「ループ」およびα−ヘリックスにより取り囲まれている６−ストランドからなる平行β−シートコアからなる３つの同様に重畳されているドメイン中に、このＡＨＡＳのポリペプチド鎖を重畳する。一方のサブユニットの第一ドメインが他方のサブユニットのコファクター−結合ドメイン２および３のほぼ近くにあるように集合させる。溶剤で満たされた空間がこの部位でサブユニット間に残される。このポケットは３つのドメインの合流によって定められており、サブユニットのための準備された入口部位である。これはまた、除草剤用の結合部位であるように用意されている。
【００３６】
この結合ポケットの内面はコファクターにより縁どられている。ＴＰＰのチアゾールはこのポケットの底部に配置される。ドメイン３はその軸がＴＰＰのピロホスフェート向かっている地点である短いα−ヘリックスとともにポケットの内面に関連し、その双極子モーメントによるホスフェート電荷を補償する。この必須のヘリックスは、ＴＰＰと密に接触している「逆戻り」（ｔｕｒｎ）残基であるＧ４９８から出発し、Ｆ５０７で終わり、スルホニルウレア耐性のための３つの既知の変異部位、すなわちＶ５００、Ｗ５０３およびＦ５０７（米国特許第５，０１３，６５９号；同第５，１４１，８７０号および同第５，３７８，８２４号参照）を含んでいる。ドメイン１では、Ｐ４８−Ｓ５２として定められているループ（β−ストランドとα−ヘリックス２との間）がＷ５０３に対面し、この部位での変異はイミダゾリノンに対する耐性を付与する。残基Ｙ４７〜Ｇ５０はまた、ＴＰＰと接触している。このループはもう一つの逆戻り地点のＰ１８４〜Ｑ１８９に隣接しており、これはドメイン１のβ−シートの最後のストランドとβ−ストランドとを連結しており、このβ−ストランドはドメイン２と連結している。ポケット内では、その入口近くがドメイン２の相補ストレッチ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒｅｔｃｈ）と相互作用するドメイン１の長形領域である。Ｔ９６〜Ｇ１００からなる逆戻りはループ１２５〜１２９とＴＰＰとの間である。ドメイン３の追加のストレッチおよび結合ポケットを並べるドメイン２の２つの領域はこのポケットの裏側の角にある。ドメイン３の残基５７２、５７５、５８２および５８３は一側面でポケット表面を定めている。このポケット表面の内部の残りの部分はＦＡＤによりおよびまたＦＡＤのイソアロキサジン環と接触しているループ、Ｌ２７８〜Ｇ２８２により定められている。
ＡＨＡＳプロテインの構造モデルはまた、除草剤またはＡＨＡＳ阻害剤の理論的デザインに使用することができる。
【００３７】
２．結合部位中への除草剤のモデリング
イマゼタピル（ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒ）、すなわちＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標名）の活性イミダゾリノンを、相互作用性分子グラフィック（図４）および上記ソフトウエアー（図４）を用いて、その用意されている結合部位中に配置した。「アンカー」としてＫ１８５を選択し、カルボキシル基の電荷と相互反応させた。イミダゾリノンのＮＨ−ＣＯ単位を配置し、Ｇ５０およびＡ５１への水素結合を生成させた。これは、小さいα−ヘリックスのバックボーン上のＶ５００に近いイマゼタピルのメチル置換基を配置させた。イソプロピル基は、ポケット内面に関与する残基１２５〜１３５の領域でアミノ酸の疎水性残基により結合させることができる。ピリジン環はＡ１３４またはＦ１３５、Ｆ５０７およびＷ５０３間に最も多分、「サンドイッチ」されている。Ｗ５０３はまた、イミダゾリノン環系と相互作用する。
【００３８】
同様の方法で、スルホニルウレア除草剤のモデルを前記イミダゾリノン結合部位と部分的に重複している部位に作製した。スルホニルウレア結合部位とイミダゾリノン結合部位との重複は、競合結合試験および確立された変異データと一致し、トウモロコシにおける同一の変異、Ｗ５０３Ｌが両除草剤に対する耐性を付与することができることを示している。これらのモデルでは、スルホニルウレア除草剤耐性を付与する既知の変異部位、すなわちＧ５０、Ａ５１、Ｋ１８５、Ｖ５００、Ｗ５０３、Ｆ５０７は、結合した除草剤と密に接触している。Ｐ１２６およびＡ５１は疎水性孔を生成させることによってＫ１８５側鎖をその場所に保持するのに必要である。特異的イミダゾリノン耐性部位は、結合領域から離れており、その相同性が重畳における変化が予想されるほど不十分である領域に位置する。ＦＡＤ結合部位は明らかに、この領域でＡＨＡＳとＰＯＸとの間で低い相同性を有する。Ｓ５８２はトウモロコシにおける耐性を付与する残基であり、そしてＳ５８２およびその隣接残基はこの活性部位ポケットと密に接触している。ＦＡＤおよび残基２７８〜２８５を包含するループ領域は第三ドメインから僅かに離れて移動するものと予想され（図４の下流に向かって）、そしてＳ５８２を含むループは位置４９９〜５０７のヘリックスと位置２７８〜２８５のループとの間の空間で重畳されているものと予想される。もう一つの既知の耐性部位であるＤ３０５はＦＡＤに近接しており、ドメイン１とドメイン２との相互反応を媒介する。Ｍ２８０は位置４９８〜５０７でヘリックス配置に包含されるか、または阻害剤結合に直接に包含される。ドメイン１およびドメイン２が相互に僅かに近接して移動する場合には、Ｍ２０８およびＤ３０５はまた、阻害剤結合に直接に包含される。
【００３９】
３．変異の選択
ＡＨＡＳの一次配列中に変異を導入するための部位として、特定のアミノ酸残基を正確に定める。これらのアミノ酸はそれらの位置に基づいて選択される。すなわち、アミノ酸残基位置が修飾された場合には、結合ポケットに対する除草剤の親和性に関する変更が生じる（すなわち、減退する）。ポケットそれ自体の外側のアミノ酸残基として結合ポケットに存在する変異位置がポケットの電荷または形態を変更することができるか否かは必須ではない。変異のための目標部位の選択は、前記したとおりにして分子モデルを使用して達成される。例えば、上記モデルに従う場合に、位置１２８に存在するアルギニン（アミノ酸について１文字コードを用いて図１にＲ１２８として示されている）は、基質−および除草剤−結合ポケットへの入口近くに位置しており、高度の配座自由性を有し、従って結合ポケット中への帯電した除草剤の輸送に関与することができる。従って、この残基をアラニンにより置換して、その電荷およびその長い疎水性側鎖の両方を分離する。（生成する変異体をＲ１２８Ａと命名する）。
【００４０】
この変異は、単純な置換、すなわち野生型配列をいずれか別のアミノ酸で置き換えることによることができる。別法として、この変異は、１個または２個以上の、好ましくは５個までのアミノ酸を指定部位から削除するか、または指定部位に付加することからなることもできる。この付加配列は別種のプロテインに存在することが既知であるアミノ酸配列からなることができ、あるいは完全合成配列であることもできる。さらにまた、１つ以上の変異および（または）１形式以上の変異を単一のポリペプチド中に導入することもできる。
【００４１】
４．部位指向変異
ＡＨＡＳをコードするＤＮＡは、所望の変異が導入されるように操作することができる。変異は、例えばＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．によるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ，Ｉｎ  Ｍ．Ａ．ｉｎｎｉｓ等編集、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１７７〜１８３頁、１９９０に記載されているような当技術で標準的な方法を使用して行われる。
【００４２】
５．変異体の発現および精製
変異させたまたは変化させたＡＨＡＳ配列をＤＮＡ発現ベクターにクローン形成し（例えば、例３参照）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの適当な細胞で発現させる。好ましくは、ＡＨＡＳをコードするＤＮＡを転写調節エレメントに結合させ、変異体ＡＨＡＳを縮合プロテイン、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの一部として発現させ、精製を促進させる（下記例３参照）。この変異体ＡＨＡＳを次いで、アフィニテイクロマトグラフイまたは当技術で公知のいずれかその他の適当な方法を使用して精製する。ＡＨＡＳポリペプチドの「精製」は、当該ポリペプチドを発現させる細胞の別の成分により干渉されることなく、その酵素活性の測定を可能にする形態でＡＨＡＳポリペプチドを単離することを意味する。
【００４３】
６．酵素性の評価
この精製した変異体ＡＨＡＳは下記の３つの性質の１つまたは２つ以上について試験することができる：
（ａ）ピルビン酸をアセト乳酸に変換することにかかわる特異性または触媒活性（これは単位／ｍｇ純粋ＡＨＡＳとして表わされ、この活性の単位は生成されるアセト乳酸１μｍｏｌ／時間であると定義される）、あるいはピルビン酸と２−ケト酪酸とを縮合させてアセトヒドロキシ酪酸を生成することにかかわる特異性または触媒活性（これは単位／ｍｇ純粋ＡＨＡＳとして表わされ、この活性の単位は生成されるアセトヒドロキシ酪酸１μｍｏｌ／時間であると定義される）；
（ｂ）除草剤、例えばイミダゾリノンなどによる阻害レベル（これはＩＣ５０として表わされ、ＩＣ５０は酵素活性の５０％が阻害される濃度である);および
（ｃ）選択された除草剤に対する耐性対別種の除草剤に対する耐性の選択性（この選択性の指数は野生型酵素に比較したこの変異体のイミダゾリノンに対する集約耐性（ｆｏｌｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を野生型酵素と比較した同一変異体の別種の除草剤に対する集約耐性で割り算した数値であると定義される）。この野生型酵素と比較した除草剤に対する集約耐性は変異体のＩＣ５０値を野生型のＩＣ５０値により割り算した数値として表わされる。従って、この選択指数(Ｓ．Ｉ．)は下記式で表わされる:
【化１】
0004469833.tif 000004
これらの決定に適する試験方法は、これに制限されないものとして、下記例４に詳細に記載されている方法を包含する。
【００４４】
７．ａ．適当な変異体の評価
変異体ＡＨＡＳポリペプチドの酵素としての性質を野生型ＡＨＡＳと比較する。好ましくは、一定の変異は、インビトロでピルビン酸またはピルビン酸および２−ケト酪酸に向かう酵素活性を保有する、すなわちピルビン酸をアセト酪酸に変換するか、またはピルビン酸と２−ケト酪酸とを縮合させて、アセトヒドロキシ酪酸を生成させるＡＨＡＳ変異体ポリペプチドをもたらし（従って、インビボでの生物学的活性が予想される）、他方で野生型ＡＨＡＳに比較して選択された除草剤（１種または２種以上）に対して比較的大きい耐性を示す触媒活性を示す。好ましくは、この変異体ＡＨＡＳは：
（ｉ）少なくとも１種の除草剤の不存在下に、
（ａ）この変異体が発現された細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性を示し；あるいは
（ｂ）細胞中でまた発現された除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組合わされて触媒活性を示す；この組合わされるプロテインは第一のＡＨＡＳ変異プロテインと同一であっても、あるいは相違していてもよく、これが発現される細胞の生存を維持するのに充分なものである；この場合に、当該細胞は生存にＡＨＡＳ活性を要する、および
（ｉｉ）野生型ＡＨＡＳに比較して、少なくとも１種の除草剤に対してよりも大きい耐性を有し、かつまた野生型ＡＨＡＳに比較して除草剤（１種または２種以上）に対して比較的大きい耐性を有する触媒活性を示す。
【００４５】
従って、いずれか１種の特定のＡＨＡＳ変異体プロテインが細胞の生存の維持に要する全触媒活性を有する必要はないが、単独でまたは同一ＡＨＡＳ変異体の追加のコピイの触媒活性および（または）別種のＡＨＡＳ変異体プロテイン（１種または２種以上）の触媒活性と組合わされて、その生存にＡＨＡＳ活性を要する細胞の生存を維持するのに充分な量で若干の触媒活性を有していなければならない。例えば、細胞中に変異体をコードする遺伝子の複数のコピイを導入することによって、あるいは当該変異体の生成を増強させるために比較的強力なプロモーターをさらに含有する遺伝子を導入することによって、触媒活性を許容される最低レベルまで増加させることができる。
【００４６】
より大きい耐性の用語は、野生型ＡＨＡＳ触媒活性が除草剤（１種または２種以上）によって減少される程度に比較して、変異体の触媒活性が、生じたとしても、低度で除草剤（１種または２種以上）によって減少されることを意味する。好ましくは、このより大きい耐性を有する変異体ＡＨＡＳは細胞、植物または有機体の生存を維持するのに充分な触媒性を保有し、これに対して野生型ＡＨＡＳは細胞、植物または有機体の生存を維持するのに充分な触媒性を保有していない。
【００４７】
好ましくは、除草剤（１種または２種以上）の不存在下における触媒活性は少なくとも約５％であり、最も好ましくは除草剤（１種または２種以上）の不存在下における野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％よりも大である。最も好適なＡＨＡＳ変異体はスルホニルウレアを基剤とする除草剤に対する耐性よりも大きいイミダゾリノンに対する耐性を有する。しかしながら、いくつかの用途では、この選択性は必要ではなく、好ましくないこともある。
【００４８】
イミダゾリノン−耐性ＡＨＡＳ変異体の場合に、このＡＨＡＳ変異体は、好ましくは、
（ｉ）当該除草剤の不存在下に、野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約２０％よりも大きい触媒活性を有し、
（ｉｉ）野生型ＡＨＡＳに比較して、イミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的より耐性である触媒活性を有し、および
（ｉｉｉ）イミダゾリノン除草剤に比較して、スルホニルウレア除草剤の存在下に比較的大きい感受性を有する触媒活性を有する。
【００４９】
最も好ましい除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体は、約２０単位／ｍｇの最低特異活性を示し、イミダゾリノンによる阻害が最低であるか、または無く、かつまた別種の除草剤に対するのに比較して、約１．３〜約３０００の範囲にわたる選択指数を示す。
【００５０】
理論に拘束されることは望まないが、野生型またはその他の目標ＡＨＡＳプロテインに対するこの方法を全体的に繰り返し適用することによって、前記で説明した大きい酵素活性および１種または２種以上の除草剤に対する耐性という望ましい性質を有するＡＨＡＳ変異体の生成がもたらされるものと信じられる。例えば、特定の位置における野生型ＡＨＡＳ配列の指定アミノ酸への変異は、高度の除草剤耐性を示すが、ピルビン酸またはピルビン酸および２−ケト酪酸に対する酵素活性を格別には喪失していない変異体をもたらすことができる。上記方法の第二の用途では、この出発または目標ＡＨＡＳポリペプチドがこの変異体である（野生型ＡＨＡＳの代わりに）。理論的デザインには、元の変異位置における別のアミノ酸の置換および（または）除草剤耐性の保有が予想されるが、また高度の触媒活性の維持も予想される選択された地点または範囲におけるアミノ酸の付加または削除が包含される。
【００５１】
除草剤耐性ＡＨＡＳプロテインの構造に基づく理論的デザインはランダム変異および選択に頼る慣用の手段に優る多くの利点を提供する。例えば、特定のアミノ酸の別のアミノ酸による置換がコドン内の１個以上のヌクレオチドの置換を要する場合には、これがランダムに生じる可能性は実用することができないほど低い。これに対して、理論的デザイン手段により示唆されている場合には、コドン内のヌクレオチド配列の２つまたは３つの変更でさえも容易に実施することができる。例えば、選択的イミダゾリノン耐性を付与する理論的にデザインした変異の一つはアルギニンからグルタミンへの変更を要する。アルギニンはＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧによりコードされ、他方グルタミンはＧＡＡおよびＧＡＧによりコードされる。アルギニンコドンの中でＧＡから始まるものはないことから、この変更には隣接ヌクレオチドの二重の置換が必要であり、この二重置換は、成功を確信しては予想できず、反復できないようなランダム変異を使用することによっては非常に稀に生じるのみである。変異頻度はランダム変異中に増加させることができるが、ヌクレオチド配列における変更は、先行の部位指向変異の不存在下ではＡＨＡＳ遺伝子全体に等しく生じる可能性がある。これは酵素活性により干渉される無意味な変異が得られる可能性が増加させる。同様に、ランダム変異を使用して、触媒活性を維持しながら除草剤耐性を付与する複数のアミノ酸の置換、削除または置換／削除による変異が見出されることは稀である。除草剤耐性を付与する削除による変異はまた、ランダム変異手段を使用してはほとんど見込みがない。削除は小領域に制限する必要があり、かつまた酵素活性を保有するためにＡＨＡＳリーディングフレームが保有されるように、三重に生じさせなければならない。
【００５２】
しかしながら、構造に基づく理論的手段の場合には、二重のアミノ酸置換および（または）削除による変異が比較的容易に達成され、かつまた正確に目標を定めることができる。さらにまた、ランダム変異に使用される異なる変異原は特定の変異型を創造する。例えば、ナトリウムアジドは植物における一点置換変異を創造し、一方照射は削除を生じさせる傾向を有する。従って、複数の置換／削除組合わせを達成するためには、２種の変異プロトコールを使用しなければならない。
【００５３】
さらにまた、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体を理論的にデザインする本発明の構造に基づく方法は、除草剤耐性変異体の確実な改良を可能にする。このステップはランダム変異によっては促進されない。ランダム変異による除草剤耐性のための変異部位の同定は、あったとしても、変異特性の追加の改良を導く確実な利益をもたらすことはほとんどない。他方、本発明による構造に基づく手段は、構造モデルにおけるアミノ酸の位置、環境および機能に基づく手段として改良を可能にする。
【００５４】
この繰り返し式改良方法はまた、ＡＨＡＳの３つの重要な性質：耐性のレベル、耐性の選択性および触媒効力を独立して取り扱うことを可能にする。例えば、断定的方法で、補償変異をデザインすることができる。特定の変異が酵素活性に対して有害な作用を有する場合には、第二の補償変異を使用して、活性を保有させることができる。一例として、帯電した残基が変異によって導入されるか、または削除される場合に、ドメイン内の元の電荷の変化を第二の変異の導入によって補償することができる。酵素活性を保有させるための第二の部位における導入、削除または置換を行う位置および残基の種類の決定には、本明細書に記載されているようなモデルから誘導される構造−機能関係にかかわる知見が必要である。
【００５５】
７．ｂ．非ペプチド除草剤またはＡＨＡＳ阻害剤のデザイン
目標プロテインの活性部位を変更し、活性部位に適合させることができるか、またはいずれかの位置に結合する化学的実体は当業者に公知の方法によって、例えばレセプター部位と特異的に相互反応する化合物のデザインを助けるコンピューターデザインプログラムによって、デザインすることができる。
このようなプログラムの例には、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）がある（また、Ｌａｍ等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２６３：３８０，１９９４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等によるＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：３１００，１９９４を参照することができる）。
結合ポケットおよび特に阻害剤結合に包含されるものとして同定されているアミノ酸残基を、阻害剤デザイン用のアンカー地点として使用することができる。部位特異性除草剤のデザインは、農場で、特にＡＨＡＳ遺伝子の変異によって除草剤耐性を自発的に発現できる雑草の種のコントロールに有利である。
【００５６】
除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体：ＤＮＡ、ベクターおよびポリペプチド
本発明はまた、除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体ポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ分子を包含する。本発明によるＡＨＡＳポリペプチドをコードする遺伝子は、いずれかの種から、好ましくは植物種から誘導することができ、除草剤耐性を付与する変異は、これらのＡＨＡＳ遺伝子いずれかの中の相当する位置に導入することができる。相違するＡＨＡＳ遺伝子の指定のコドン位置の同等性は一次アミノ酸配列およびそのプロテインの保存および類似の三次元構造の保有の両方の関数である。例えば、図５は相違する植物種から誘導されたＡＨＡＳ間の高度の配列相同性を例示している。これらのＡＨＡＳポリペプチドは少なくとも約６０％〜約７０％の総合的相同性を示す。理論に拘束されることは望まないが、高度の保存配列を有するポリペプチドの領域では、ポリペプチド鎖形態がまた保存されているものと信じられる。従って、分子モデル形成用の種の一つからＡＨＡＳをコードする配列を使用して、初期試験および相互作用性改良用の第二の種からのＡＨＡＳ遺伝子中に予想どうりの変異を導入することができ、さらに遺伝子転換植物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔ）における発現用の追加の第三の植物種から誘導されるＡＨＡＳ中に最適化した変異を導入することができる。
【００５７】
一連の態様において、これらのＡＨＡＳ  ＤＮＡはＡＨＡＳポリペプチドの、好ましくは図１のトウモロコシＡＨＡＳポリペプチドの変異体をコードする。ここで、このポリペプチドは、図１のアミノ酸残基：
【表３】
0004469833.tif 000005
【００５８】
前者のいづれかと機能的に同等なものの先行または後続の１種または２種以上の置換または削除；図１のＱ１２４とＨ１５０、あるいはその機能的に同等なものとの間での挿入または削除；図１のＧ３００とＤ３２４、あるいはその機能的に同等なものとの間での挿入または削除；および前者のいずれかのすべての組合わせにより修飾することができる。
【００５９】
図１のポリペプチド中に導入するか、または別種のＡＨＡＳ遺伝子における同等の位置に導入するかにかかわらず、この変異は前記残基のいずれかの先行する５個までのアミノ酸または後続の５個までのアミノ酸の削除またはいずれか１個または２個以上の別のアミノ酸の単純置換をもたらすＤＮＡ配列の変更を包含することができる。適当なアミノ酸置換には、これらに制限されないものとして、天然産生アミノ酸が包含される。
【００６０】
別法として、この変異は、１種または２種以上のアミノ酸が上記位置でフレームとして付加または削除されるようなＤＮＡ配列の変更を包含することができる。好ましくは、この付加は約３〜約３０ヌクレオチドを包含し、そして削除は約３〜約３０ヌクレオチドを包含する。さらにまた、一回変異したポリペプチドが一つよりも多い類似のまたは相違する変異を含むことができる。
【００６１】
本発明はまた、ＤＮＡおよび対応するＲＮＡ配列、ならびにセンスおよびアンチセンス配列を包含する。ＡＨＡＳポリペプチドをコードする核酸配列は天然ＡＨＡＳ調節配列により側面に配列することができ、あるいはプロモーター、エンハサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５´−および３´−非コード領域などの異種配列と組合わせることができる。さらにまた、核酸を修飾して、安定性、溶解性、結合親和性および特異性を変えることができる。一例として、変異体ＡＨＡＳコード配列は選択的にメチル化することができる。本発明の核酸配列はまた、直接にまたは間接的に、検知可能なシグナルを提供できるラベルにより修飾することができる。ラベルの例には、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチンなどが包含される。
【００６２】
本発明はまた、ＡＨＡＳ変異体をコードする核酸を含有するベクターを提供する。プラスミドおよび真菌ベクターを包含する多数のベクターが種々の真核ホストおよび原核ホストにおける発現にかかわり開示されている。有利には、ベクターにはまた、作動するようにＡＨＡＳコードプロテインに結合されているプロモーターが包含される。コードされたＡＨＡＳはいずれか適当なベクターおよびホスト細胞を使用し、本明細書に記載されているか、または引用されている方法、あるいはまた別段では関連技術で当業者に公知の方法を用いて発現させることができる。適当なベクターの例には、これらに制限されないものとして、ｐＢＩＮに基づくベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターおよびｐＧＥＭベクターが包含される。
【００６３】
本発明はまた、変異体除草剤−耐性ＡＨＡＳポリペプチドまたはそのポリペプチド断片の両方を包含する。上記で説明したように、変異体ＡＨＡＳポリペプチドは図１に示されているトウモロコシポリペプチドから、あるいはいずれかの植物または微生物ＡＨＡＳポリペプチドから、好ましくは植物ＡＨＡＳポリペプチドから誘導することができる。これらのポリペプチドはまた、例えばホスホリル化、スルフェート化、アシル化、グリコシル化、またはその他のプロテイン修飾により修飾することができる。これらのポリペプチドは植物から分離することができ、あるいは異種有機体または細胞（これらに制限されないものとして、バクテリア、酵母、昆虫、植物および哺乳動物細胞を包含する）から分離することができる。これらの細胞中に変異体ＡＨＡＳポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、発現させる。さらにまた、ＡＨＡＳポリペプチドは検知可能なシグナルを生じることができるラベルにより、直接にまたは間接的に、修飾することができ、このようなラベルには放射性同位元素、蛍光化合物などが包含される。
【００６４】
化学物質−耐性植物および変異体ＡＨＡＳ遺伝子を含有する植物
本発明は、形質転換原性細胞（ｔｒｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）を包含し、この細胞には、これらに制限されないものとして、種子、有機体および植物が包含される。このような細胞に除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体をコードする遺伝子を導入する。非制限的例として、適当な受容植物を下記表１に挙げる
【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【００６８】
【表７】
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【００６９】
【表８】
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【００７０】
形質転換原性植物における変異体ＡＨＡＳポリペプチドの発現は、これらに制限されないものとして、イミダゾリノン除草剤、例えばイマゼタピル（ｉｍａｚｅｔｈａｐｙｒ）（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）)などの除草剤に対する高度の耐性を付与し、これらの除草剤を形質転換原性植物の栽培中に使用することを可能にする。 植物中への外来遺伝子の導入方法は当技術で公知である。このような方法の非制限的例には、アグロバクテリウム(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)感染、粒子衝撃、原形質体のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)処理、原形質体のエレクトロポレーション(ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ)、マイクロインジェクション(ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ)、マクロインジェクション(ｍａｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ)、チラーインジェクション(ｔｉｌｌｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ)、花粉管経路、乾燥種子膨潤、レーザー鑚孔、および電気泳動が包含される。これらの方法は、例えばB.Jenes等およびＳ．Ｗ．Ｒｉｔｃｈｉｅ等によるＩｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ編集、Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ １９９３；およびＭａｎｎｏｎｅｎ等によるＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：２８７〜３１０，１９９４に記載されている。
【００７１】
好適態様において、変異体ＡＨＡＳをコードするＤＮＡは、抗生物質耐性マーカー遺伝子を含有するＤＮＡベクターにクローン形成し、次いでこの組換えＡＨＡＳ  ＤＮＡ含有プラスミドをＴｉプラスミド含有アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中に導入する。この「二成分ベクター系」は、例えば米国特許第４，４９０，８３８号およびＡｎ等によるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕａｌ，Ａ３：１〜１９（１９８８）に記載されている。この形質転換したアグロバクテリウムを次いで、受容体植物からの葉ディスクとともに共培養し、植物細胞を感染させ、形質転換させる。この形質転換された植物細胞を次いで、新芽の発芽を促進する再生培地で、先ず形質転換細胞を選択するために適当な抗生物質の存在下に、次いで除草剤の存在下に、培養する。除草剤−耐性ＡＨＡＳをコードするＤＮＡにより充分に形質転換された植物細胞においては、形質転換されていない細胞からの新芽の発生を阻止するレベルの除草剤が存在しても、新芽の発芽が生じる。例えば、ポリアミラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を使用して変異体ＡＨＡＳ  ＤＮＡの存在を確認した後に、形質転換した植物を、それらの除草剤噴霧に対する耐性能力およびそれらの除草剤の存在下における種子発芽および発根抑制および増殖にかかわる能力について試験する。
【００７２】
その他の用途
本発明の方法および組成物は除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体の構造に基づく理論的デザインに使用することができ、この場合に、この変異体は植物中に組み込んで、植物に対して選択的除草剤耐性を付与することができる。ＡＨＡＳの中間変異体（例えば、最適に近い特異活性を示すが、高度の耐性および選択性を示すか、またはその逆である変異体）は、適度の特異的活性を保有し、かつまた高度の耐性および選択性を有する第二世代ＡＨＡＳ変異体をデザインするための鋳型として有用である。
【００７３】
除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子は、単一のまたは複数のコピーで作物種を形質転換させることができる。除草剤に対して減少された感受性を有する作物種の遺伝子エンジニアリングは：
（１）イミダゾリノン除草剤などの特異的有効な、環境に優しい除草剤の適用範囲および柔軟性を増大させることができ；
（２）これらの除草剤の市場価値を高めることができ；
（３）除草剤耐性作物種に対する除草剤の効果的な使用により作物栽培地における雑草による抑圧を減少させ、収穫量を対応して増加させることができ；
（４）除草剤耐性植物の種子の販売高を増加させることができ；
（５）以前の栽培で使用された除草剤の持ち込みからの作物の打撃に対する抵抗性を増大させることができ；
（６）有害な風土条件による除草剤特性の変化に対する感受性を減少させることができ；かつまた
（７）不均一に、または誤って施用された除草剤に対する寛容性を増大させることができる。
一例として、形質転換原性ＡＨＡＳ変異体プロテインを含有する植物を栽培することができる。この作物をＡＨＡＳ変異体形質転換原性植物が耐性である除草剤の雑草制御有効量で処理することによって、栽培される作物に有害に作用することなく、作物の雑草制御を生じさせることができる。
【００７４】
除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体をコードする前記ＤＮＡベクターを使用してまた、ＡＨＡＳ変異体の発現がベクターによる細胞の形質転換にかかわる選択性のマーカーを提供することができる。対象受容細胞は培養物であることができ、またはその元のものであることができ、またＡＨＡＳ変異体遺伝子は単独でまたは別種の選択可能なマーカーと組合わせて使用することができる。唯一の要件は、受容細胞が同種除草剤の細胞毒性作用に対して感受性であることである。この態様は、比較的安価であり、かつまた例えばイミダゾリノン基剤除草剤の毒性が欠落しているという利点をもたらし、ＤＮＡ媒介形質転換を必要とする全ての系に適用することができる。
【実施例】
【００７５】
好ましい態様の例示
以下の実施例により本発明を説明するが、これらに限定されるものではない。
実施例１：  除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体のデザイン
詳しく上述したモデルの提案された除草剤結合部位に近接する残基が変異誘発用に、除草剤結合能の減少した活性ＡＨＡＳポリペプチドをデザインするため選択された。ポケット表面の各部位は、コファクターおよび除草剤の他にポケットの他の残基との相互作用の可能性があるものと考えた。例えば、正に帯電した残基の付加は、結合部位内の電荷分布に影響し、負に帯電した除草剤の結合親和性の消失をもたらすものと期待される。
【００７６】
三つの残基が変異誘発に最も有用なターゲットとして決定された。
（１）Ｆ１３５はＦＡＤのイソアロキサチン環および除草剤の芳香環の両方と相互作用すると考えられた。結合ポケットにもっと帯電した残基を導入する戦略にしたがって、この残基をアルギニンに変えた。
（２）Ｍ５３はヘリックス４９８−５０７と接触している。このヘリックスは、公知の除草剤耐性変異部位を含み、ＴＰＰ結合とも関わっている。更に、５３位でグルタミン酸の置換は、Ｋ１８５との相互作用を有利にし、イマゼタピルのカルボキシル基に対するＫ１８５の親和性を減少させるものと考えられた。
（３）Ｒ１２８はポケットの入口の近かくに位置し、それが結合ポケットへの帯電した除草剤の最初の輸送に関与するものと考えられた。この残基は、その電荷と長い疎水性鎖とを除くためにアラニンに変換された。
【００７７】
実施例２：  除草剤耐性変異体を製造するための部位特異的変異誘発
アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子をｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子のコード領域の３′末端にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）挿入した。このようにしたベクターの構築は、発現されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ＡＨＡＳ融合プロテインの結合部に６個のアミノ酸のトロンビン認識配列を保持していた。発現された融合プロテインのトロンビン消化は、トロンビン認識部位から得られるＮ末端グリシン残基を有する推定トランジットペプチドプロセシング部位のトランジットペプチドの末端に、Ｎ末端出発位置を有するＡＨＡＳを与える。切り出されたＡＨＡＳプロテインの最終アミノ末端はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒからなる。部位特異的変異誘発はこのベクターのＡＨＡＳ遺伝子に導入された。
【００７８】
部位特異的変異誘発は、樋口のＰＣＲ法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ．  Ｉｎ  ＭＡ  Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ｐｐ．  １７７−１８３，  １９９０）にしたがってつくられた。二つのＰＣＲ産生物で、その各々が変異部位が重なっているものが増幅された。重なり領域のプライマーは変異を含んでいた。重複ＰＣＲ増幅断片を組み合わせ、変成させ、再連結させて、中断（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）３′末端を有するヘテロ二本鎖産生物を製造した。中断３′末端を所望の変異を含む二つの重複ＰＣＲ産生物の和である断片を製造するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって伸ばした。このフラグメントを二つの外側プライマーだけと引き続いて再増幅すると全長の産生物に富む結果となった。変異を含む産生物をｐＧＥＸ−２Ｔベクター中のアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子に再び導入した。
【００７９】
実施例３：  ＡＨＡＳ変異体の発現と精製
Ａ）方法
トウモロコシ野生型ＡＨＡＳ遺伝子（ベクター名ｐＡＣ７５１）、アラビドプシスＳｅｒ６５３Ａｓｎ変異体またはアラビドプシスＩｌｅ４０１Ｐｈｅ変異体を含むｐＧＥＸ−２Ｔベクターで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）細胞をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培養液中で一夜増殖させた。大腸菌の一夜培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍＬおよびアンチホーム  Ａ（０．１  ｖ／ｖ％）のＬＢ１リットルに１：１０で希釈した。培養物を３７℃でＯＤ６００が約０．８になるまで振りながら培養した。イソプロピルチオガラクトース(ＩＰＴＧ)を最終濃度が１ｍＭになるよう加え、培養物を３時間以上培養した。
【００８０】
細胞をＪＡ−１０ローターで１０分間８６７０ｘｇで遠心することより集め、ＭＴＰＢＳ（１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３)中に元の培養量の１／１００にして再懸濁した。トリトンＸ−１００およびリソザイムを各々最終濃度が１ｖ／ｖ％および１００μｇ／ｍＬになるよう加えた。細胞を３０℃で１５分間培養し、氷で４℃に冷やし、ミクロチッププローブの付いたＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ細胞破砕器を用いてレベル7で１０秒超音波をかけ破砕した。細胞を含まぬ抽出物を３５，０００ｘｇで４℃、１０分間遠心した。上清をデカンテーションし、遠心工程を繰り返した。
【００８１】
発現された融合プロテインの精製をＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎの方法（Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０，１９８８）を修飾しておこなった。その上清を室温に温め、ＭＴＰＢＳ中で平衡にされたグルタチオン−アガロースビーズ（硫黄結合、Ｓｉｇｍａ）の２ｍＬカラムに通した。次いで、カラムをＭＴＰＢＳを用いて流出液のＡ２８０がＭＴＰＢＳのそれと同じになるまで室温で洗浄した。次いで、融合プロテインをトリス(Ｔｒｉｓ)塩酸(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)中の還元グルタチオン(５ｍＭ)を含む溶液で溶出した。溶出融合プロテインを約３０ＮＩＨ単位のトロンビンを用いて処理し、クエン酸(５０ｍＭ、ｐＨ６．５)およびＮａＣｌ(１５０ｍＭ)に対して透析した。
【００８２】
融合プロテインを室温で一夜消化した。消化サンプルをＭＴＰＢＳに対して透析し、遊離したグルタチオントランスフェラーゼプロテインを除くためＭＴＰＢＳ中で平衡にされたグルタチオン−アガロースカラムに二度通した。カラムに吸着しないプロテインフラクションを集め、ＹＭ１０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）で限外ろ過して濃縮した。濃縮サンプルをゲルろ過緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で平衡にされたセファクリルＳ−１００ゲルろ過カラム（１．５×９５ｃｍ）にかける。２ｍＬフラクションを０．１４ｍＬ／分の流速で集めた。酵素の安定性は、０．０２％のナトリウムアジドを添加し、２ｍＭのチアミンピロフォスフェートおよび１００μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の存在または非存在下に、ゲルろ過緩衝液中で４℃で保存して試験された。
【００８３】
Ｂ）  結果
ＧＴＳ遺伝子でダウンストリーム且つイン−フレームに融合された野生型ＡＨＡＳ遺伝子を含むｐＡＣ７５１プラスミドによって形質転換された大腸菌がＩＰＴＧで形質転換されると９１ｋＤのプロテインが発現された。この９１ｋＤのプロテインは、ＧＳＴ／ＡＨＡＳ融合プロテインの予想された分子量（２６ｋＤと６５ｋＤの和）を示した。ＤＨ５α／ｐＡＣ７５１の細胞を含まぬ抽出物をグルタチオン−アガロース親和性ゲルに通し、洗い、そして遊離グルタチオンで溶出すると、９１ｋＤのプロテインに富んだ製造物が得られ（図６、レーンＣ）。ＧＳＴとＡＨＡＳの結合部に設計された６個のアミノ酸のトロンビン認識部位をトロンビンでうまく切断した（図６、レーンＤ）。切断された融合プロテインは、予想された２６ｋＤのＧＳＴプロテインおよび６５ｋＤのトウモロコシＡＨＡＳプロテインからなっていた。トウモロコシＡＨＡＳをＧＳＴを除くためグルタチオン−アガロース親和性カラムに二度通して精製し、トロンビンを除くため最後のセファクリルＳ−１００ゲルろ過工程に付した（図６、レーンＥ）。６５ｋＤのプロテインは、ウエスタンブロット上トウモロコシＡＨＡＳペプチドに対するモノクロナル抗体によって認識される。
【００８４】
精製された野生型トウモロコシＡＨＡＳをエレクトロスプレイ質量スペクトルによって分析し、６４，９９６ダルトンの分子量を有することを決定した（データは示されていない）。ｐＧＥＸ−２Ｔベクターに挿入された遺伝子の推定アミノ酸配列から計算される予想質量は６５，０５８である。実際に測定された質量と予想質量との間で０．０９６％の誤差は質量スペクトルの調節変動の範囲内であった。二つの質量決定が近似していることは、発現ベクターの構築の際間違って混入したヌクレオチドが無いこと、分子量に大きな変化をおこすようなプロテインに対する翻訳後の修飾も無いことを示唆する。更に、精製酵素の製造物にみかけのピークがないことは、サンプルに混ざりがないことを示した。
【００８５】
実施例４：  ＡＨＡＳ変異体の酵素特性
大腸菌で製造される野生型および変異体ＡＨＡＳの酵素特性をＳｉｎｇｈらの方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９，１９８８）を修飾して以下のように測定した。即ち、
１Ｘ  ＡＨＡＳ試験緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ＰＨ７．０、１００ｍＭのピルビン酸、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのチアミンピロフォスフェートおよび５０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ))を含む反応混合物を酵素の2X試験緩衝液に希釈するか、１Ｘ ＡＨＡＳ試験緩衝液に濃縮された酵素を加えるかして得た。イマゼタピルおよび関連対照を含む全ての試験は、５０％ＤＭＳＯ溶液として試験混合物にイマゼタピルを添加するため最終５％濃度のＤＭＳＯを含有した。試験をミクロタイタープレート中３７℃、最終容量２５０μＬで行った。反応を６０分間行わせた後、アセト酪酸の蓄積をＳｉｎｇｈらによって記載されているように比色測定した(Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９,１９８８)。
【００８６】
上記実施例３に記載されたｐＡＣ７５１から発現され精製されたトウモロコシＡＨＡＳはピルビン酸のアセト乳酸への変換に活性である。完全なＡＨＡＳ活性は、試験メジウム中のコファクターであるＦＡＤおよびＴＰＰの存在による。ＦＡＤのみを試験メジウムに加えたのでは活性は見られなかった。ＴＰＰだけと一緒にした精製酵素の活性は、共にＦＡＤおよびＴＰＰの存在下に検出される活性の１％にも達しなかった。通常、植物の粗抽出物に存在するＡＨＡＳは、特に基質およびコファクターの非存在下に非常に不安定である。これと対照的に細菌発現システムからの精製ＡＨＡＳは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＰＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３中、ＦＡＤおよびＴＰＰの存在または非存在にかかわらず４℃で一ヵ月貯蔵して触媒活性を失わなかった。更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに溶かした時に、これら貯蔵物から分解物は検出されなかった。 野生型ＡＨＡＳとＭ１２４Ｅ、Ｒ１９９ＡおよびＦ２０６Ｒ変異体の比活性を下記表２に示す。図５の配列から決定されるように、アラビドプシスＡＨＡＳのＭ１２４Ｅ変異はトウモロコシＭ５３Ｅ変異と同等であり、アラビドプシスのＲ１９９Ａ変異はトウモロコシＲ１２８Ａと同等であり、アラビドプシスのＦ２０６Ｒ変異はトウモロコシＦ１３５Ｒと同等である。トウモロコシＡＨＡＳ構造モデルにおいてデザインされた変異を双子葉植物のアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中の等価アミノ酸を同定するために使用し、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中に挿入および試験した。双子葉植物のアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中へ論理的にデザインされた除草剤変異のこの翻訳と挿入は、双子葉植物種の植物における除草剤耐性の評価を促進することができる。
【表９】
0004469833.tif 000011
【００８７】
Ｒ１９９Ａ変異は、イマゼタピルに対し有意なレベルの耐性を示す（図７）と同時に、高いレベルの触媒活性を保っている（表２）。特に、この変異体はスルホニルウレアに対し完全な感受性を保っている（図８）。したがって、この変異体は高い比活性と選択的な除草剤耐性の基準を満たしている。対照的に、Ｍ１２４Ｅ置換はイマゼタピルに対しほぼ完全な耐性をもたらすが、またひどく減少した触媒活性を示した（表２）。イミダゾリノン耐性に比較して、この変異体はスルホニルウレアに対し大きな感受性を示す（図８）ことから、この残基は選択的耐性を付与する変異を与えるよい候補であることを示唆している。グルタミン酸以外のアミノ酸の置換が触媒活性を維持するのに役立っている。Ｆ２０６Ｅ置換はＭ１２４Ｅ変異体について観察された結果と類似したものを与えたが、耐性の選択性に欠けた。
【００８８】
実施例５：  論理的デザインアプローチによるＡＨＡＳ除草剤耐性変異体の反復改良
上記実施例４に記載したようにＡＨＡＳの残基１２４をＭｅｔからＧｌｕに変えると、イミダゾリノン耐性が付与されたが、酵素活性は野生型の値の９．２％に減少された。上述のトウモロコシＡＨＡＳ構造のモデルは、Ｍｅｔ５３（アラビドプシスＭｅｔ１２４残基と同等）が別のサブユニットから得られるα−ヘリックスの表面上のＭｅｔ５３に近接している一連の疎水性残基と相互作用する。したがって、Ｍｅｔ５３とヘリックス上の残基との疎水性相互作用がサブユニット／サブユニット会合および活性部位のコンフォメーションを安定している。疎水性Ｍｅｔを帯電したグルタミン酸残基で置換することは多分サブユニット間の疎水性相互作用を不安定にし、触媒活性の喪失をもたらす。
【００８９】
この構造／機能解析に基づいて、元のアラビドプシスＭｅｔ１２４Ｇｌｕ（トウモロコシＭｅｔ５３Ｇｌｕと同等）変異酵素の活性を、次いでこの位置でより疎水性なアミノ酸（Ｉｌｅ）を置換することによって反復的に改善した。Ｉｌｅ側鎖の疎水性は、野生型のレベルまで活性を戻すことになった（比活性１０２、野生型活性の１０２％と同等）が、Ｉｌｅ側鎖のより大きなかさばりがイミダゾリノン耐性の有意なレベルを依然として維持できた（図９）。
比較すると、この位置でヒスチジン残基の置換は、野生型活性の４２．６％と同等の４２．５の比活性を示した。それにもかかわらず、この変異はＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）に高い耐性を示した(図１０)。
【００９０】
実施例６：  論理的デザインアプローチを用いＡＨＡＳ除草剤耐性変異体の反復改良
本発明の方法を用いる反復調整の別の例はＡｒｇ１２８Ａｌａ変異体を含む。トウモロコシＡＨＡＳの構造モデルは除草剤結合ポケットの縁にあるＡｒｇ１２８残基が帯電した基質と除草剤とを除草剤結合ポケットと活性部位に運ぶのに寄与する。Ａｒｇ１２８残基は、ＡＨＡＳの反応メカニズムにおける最初のピルビン酸分子を結合するＴＰＰ部分から離れており、アラビドプシスＡＨＡＳＡｒｇ１９９（トウモロコシＡｒｇ１２８と同等）のアラニンへの置換は酵素の触媒活性に余り影響しなかった理由を説明している。構造モデルは、もっとはげしい変化をこの位置で触媒活性の高いレベルを維持しながら耐性のレベルを上げるためすることができることを示した。これに基づいて、変異の反復改善は、正に帯電したアルギニン残基を負に帯電したグルタミン酸残基で置換してなされた。このようにして変異された酵素は、高い活性を維持しながら（比活性１１４、野生型活性の１１４％と同等）、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）に改善されたレベルの耐性を有していた(図11)。
【００９１】
実施例７：  除草剤耐性変異体の構造に基づく論理的デザインにおける各種の種から得られるＡＨＡＳ交換性
ＡＨＡＳの三次元構造の構造モデルを上述したようにトウモロコシから得られた単子葉植物ＡＨＡＳ配列で構築する。アラビドプシスのような双子葉植物種から得られるＡＨＡＳに変異を導入するため、単子葉植物種および双子葉植物種から得られるＡＨＡＳ配列をＧＡＰおよびＰＩＬＥＵＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１）を用いて並べる。同等の位置をコンピュター産出の並びから決定する。次いで、変異を上述のように双子葉植物ＡＨＡＳ遺伝子に導入する。大腸菌の変異ＡＨＡＳプロテインの発現および生化学的性質の評価（即ち、比活性および除草剤耐性）に続いて、変異遺伝子を上記の植物形質転換法によって双子葉植物に導入する。
【００９２】
実施例８：  論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子を用いる形質転換による除草剤耐性植物の製造
ＤＮＡ構築：
大腸菌発現ベクター内に含まれる論理的にデザインされたＡＨＡＳ変異体遺伝子を、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子に等価制限フラグメントを置き換えるためのＤＮＡ制限フラグメントの元として使用した。この遺伝子は、アラビドプシスＡＨＡＳプロモター、アラビドプシスＡＨＡＳ終結配列および５′−と３′−隣接ＤＮＡを含む５．５ｋｂの遺伝子ＤＮＡフラグメント中に存在する。適切な変異の存在を確認するために変異部位を通したＤＮＡ塩基配列の配列形成をした後、各プラスミドからの全５．５ｋｂフラグメントをｐＢＩＮに基づく植物形質転換ベクター（Ｍｏｇｅｎ，  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に挿入した。また、植物形質転換ベクターは、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモターによって駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）カナマイシン耐性遺伝子を含む。最終ベクター構築を図１２に示す。Ｍｅｔ１２４Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１２４ＨｉｓおよびＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異（図１に示されたトウモロコシＡＨＡＳ配列におけるＭｅｔ５３Ｉｌｅ、Ｍｅｔ５３ＨｉｓおよびＡｒｇ１２８Ｇｌｕ変異に対応）を有するアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子を含むベクターに各々ｐＪＫ００２、ｐＪＫ００３およびｐＪＫ００４のラベルを付けた。
【００９３】
これらのベクターの各々を、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕａｌ  ４３：１−１９（１９８８）に記載された形質転換方法を用いてアグロバクテリウム  ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４に形質転換した（Ｒ＆Ｄ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）。
【００９４】
植物形質転換：
タバコ属ｃｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ３８の葉の断片形質転換をＨｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１，１９８５）によって記載されているものを少し変えて行った。葉の断片を無菌状態で成長した植物から切り出し、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｓｋｏｏｇ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、プラスミドｐＪＫ００２、ｐＪＫ００３またはｐＪＫ００４を含むアグロバクテリウム  ツメファシエンスと共に２−３日間、２５℃暗所でひっくり返して培養した。この断片を乾式ブロットし、ベンジルアデニン（１ＭＧ／Ｌ）、１−ナフチル酢酸（０．１ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５００ｍｇ／Ｌ）およびセホタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）（全てＳｉｇｍａから入手）を含むＢ５ビタミンとともに再生Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｓｋｏｏｇ培地に移した。
初めに、形質転換体を形質転換ベクター中に存在するｎｐｔＩＩ遺伝子によって付与されるカナマイシン耐性によって選択した。葉の断片から得られる苗条を切り出し、セホタキシムおよびカナマイシンを含有する新鮮なＭｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｓｋｏｏｇ培地に置いた。
【００９５】
インビボ除草剤耐性
カナマイシン耐性タバコ苗条をイマゼタピル（０．２５μＭ）を含む培地に移した。この濃度のイミダゾリノン除草剤で、非形質転換タバコ苗条（内因性野生型ＡＨＡＳを含有）は、根形成を開始できなかった。対照的に、根形成および成長が各変異ＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ苗条から観察された。Ｍｅｔ１２４ＩｌｅおよびＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異遺伝子で形質転換された苗条から出た根を野生型と共に図１３に示す。更に、Ｍｅｔ１２４ＩｌｅおよびＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異遺伝子で形質転換された植物は、イマゼタピルの農場レート（１００ｇ／ヘクタール）の二倍散布に対して耐性であった（図１３）。除草剤の存在下の非形質転換植物に対する形質転換植物の根成長のパターンおよび除草剤散布後の様子は、論理的にデザインされた除草剤耐性遺伝子の発現がインビボ除草剤耐性を付与していることを示唆している。
【００９６】
除草剤耐性タバコ中の論理的にデザインされた遺伝子の検出
ゲノムＤＮＡをＡＨＡＳ形質転換タバコ植物から単離し、アラビドプシスＡＨＡＳ変異遺伝子の存在をＰＣＲ分析で証明した。アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列と二つのタバコＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列との間の差異を、タバコゲノムＤＮＡバックグラウンドのアラビドプシス遺伝子のみを増幅するＰＣＲプライマーのデザインに用いた。論理的にデザインされた除草剤耐性遺伝子を検出した。これは除草剤耐性植物の大多数において適当なサイズのＤＮＡフラグメントの増幅によって示されている。非形質転換タバコ植物からＰＣＲシグナルは見られなかった。
【００９７】
形質転換ＡＨＡＳ遺伝子の分離
形質転換植物中の論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子の分離を調べるため、発芽試験を行った。種子をＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）２．５μＭおよびカナマイシン１００μＭまで含むホルモンの入っていないＭｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ培地に置いた。得られた実生を除草剤に対する耐性または感受性に対して目で点数をつけた。
タバコ植物は二倍体であるから、自家授粉植物の子孫は耐性３に感受性１の比に分かれることが期待され、耐性ＡＨＡＳ遺伝子に対する一つの実生ホモ接合体、耐性ＡＨＡＳ遺伝子に対する二つの実生ヘテロ接合および耐性ＡＨＡＳ遺伝子を欠く一つの実生の存在を示す。
【００９８】
結果は、耐性ＡＨＡＳ遺伝子が予想された３：１の比に分かれることを示し、除草剤耐性が論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子の一つの支配的なコピーによって付与されるという結論を支持している。
これらの結果は、除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子の論理的にデザインをインビボで除草剤耐性の成長を示す植物の製造に使用できることを示している。
【００９９】
実施例９：  論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子による形質転換によって異なる除草剤に対する交差耐性植物の製造
上記実施例８の論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子を用いて形質転換されたタバコ植物を、また別の除草剤ＣＬ２９９，２６３（イマザモックスとしても公知）に対する交差耐性について試験した。発芽試験をＣＬ２９９，２６３（２．５μＭ）の存在または非存在下、Ｍｅｔ１２４Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１２４ＨｉｓおよびＡｒｇ１９９ＧｌｕのアラビドプシスＡＨＡＳ変異体遺伝子を含む一次形質転換体から収穫された種子について行った（図１５）。この濃度の除草剤は、野生型タバコ植物の激しい発育阻害と脱色を生じさせる。Ｍｅｔ１２４ＨｉｓＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物は、最大レベルの耐性を示した（図１５）。Ａｒｇ１９９Ｇｌｕ形質転換体は中間レベルの耐性を示したが、Ｍｅｔ１２４Ｉｌｅはほとんど耐性を示さなかった（図１５）。
【０１００】
上記のすべての特許、出願、論文、出版物および試験方法はここに引用して組み入れる。
本発明の多くの変更が上記の詳細な記述のもと当業者に示唆を与えるであろう。そのような明らかな変更は、添付されている特許請求項の全ての意図された範囲に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１ａ】図１ａは、植物ＡＨＡＳ酵素の一つの例として示されるトウモロコシ由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）の約５９９アミノ酸配列に対応する６００アミノ酸配列の例示である。この配列はトランジット配列を含まず、余分のグリシンはトロンビン分解部位から残っている。Ｍｅｔ５３、Ａｒｇ１２８およびＰｈｅ１３５残基は太字で示されている。
【図１ｂ】図１ｂは、植物ＡＨＡＳ酵素の一つの例として示されるトウモロコシ由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）の約５９９アミノ酸配列に対応する６００アミノ酸配列の例示である。この配列はトランジット配列を含まず、余分のグリシンはトロンビン分解部位から残っている。Ｍｅｔ５３、Ａｒｇ１２８およびＰｈｅ１３５残基は太字で示されている。
【０１０２】
【図２ａ】図２は、トウモロコシＡＨＡＳおよびラクトバチラスプラナルム由来ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）の配列を一列にならべたものである。
【図２ｂ】図２は、トウモロコシＡＨＡＳおよびラクトバチラスプラナルム由来ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）の配列を一列にならべたものである。
【０１０３】
【図３ａ】図３ａは、ＡＨＡＳサブユニットの二次構造の図式的な表示である。通常の二次構造部分のαヘリックスおよびβシートは、各々円と長円として描かれ、サブユニット中の三つのドメインの各々に対して別々に番号をつけている。ループやコイル領域を、その始まりと終りを表わす数字をつけて黒線で示す。コファクター結合部位および公知の変異部位は、各々八角形および星印で示される。
【図３ｂ】図３ｂは、ＡＨＡＳサブユニットの二次構造の図式的な表示である。通常の二次構造部分のαヘリックスおよびβシートは、各々円と長円として描かれ、サブユニット中の三つのドメインの各々に対して別々に番号をつけている。ループやコイル領域を、その始まりと終りを表わす数字をつけて黒線で示す。コファクター結合部位および公知の変異部位は、各々八角形および星印で示される。
【図３ｃ】図３ｃは、ＡＨＡＳサブユニットの二次構造の図式的な表示である。通常の二次構造部分のαヘリックスおよびβシートは、各々円と長円として描かれ、サブユニット中の三つのドメインの各々に対して別々に番号をつけている。ループやコイル領域を、その始まりと終りを表わす数字をつけて黒線で示す。コファクター結合部位および公知の変異部位は、各々八角形および星印で示される。
【０１０４】
【図４】図４は、結合ポケットに合ったイマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴＲ（登録商標）除草剤)を有するトウモロコシＡＨＡＳの活性部位のコンピュターによるモデルの例示である。
【０１０５】
【図５ａ】図５ａは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｂ】図５ｂは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｃ】図５ｃは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｄ】図５ｄは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｅ】図５ｅは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｆ】図５ｆは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｇ】図５ｇは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【図５ｈ】図５ｈは、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示である。ｐＡＣ７５１は、図１におけるようにｐＡＣ７５１大腸菌発現ベクターで発現されるトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシａｌｓ２はトウモロコシａｌｓ２ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシａｌｓ１はトウモロコシａｌｓ１ＡＨＡＳアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ１はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＡアイソザイムである。Ｔｏｂａｃ２はタバコＡＨＡＳ  ＳｕＲＢアイソザイムである。Ａｔｈｃｓｒ１２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｓｒ１．２ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂｎａａｌ３はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳＩＩＩアイソザイムであり、Ｂｎａａｌ２はセイヨウアブラナＡＨＡＳＩＩアイソザイムである。ｐＡＣ７５１およびトウモロコシａｌｓ２は、同一遺伝子であるが、トウモロコシａｌｓ２がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、ｐＡＣ７５１はｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミノ酸ではない。ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは，ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケージ−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｐａｒｋ−Ｍａｄｉｓｏｎ−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ  ＧＣＧパッケージによってつくられる。
【０１０６】
【図６】図６は、トウモロコシＡＨＡＳの精製を示すプロテインに対して染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルの写真例である。レーンは左から右へ、Ａ；分子量マーカー、Ｂ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）粗細胞抽出物、Ｃ；グルタチオン−アガロース  アフィニティ精製物、Ｄ；該アフィニティ精製物のトロンビン消化物、Ｅ；二度目のグルタチオン−アガロースカラムとセファクリルＳ−１００ゲルろ過を含む。
【図７】図７は、イマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）除草剤)の非存在下または増加する濃度での存在下における、野生型と変異ＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試験結果のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性(％)を示し、１００％値は阻害剤の非存在下で測定される。
【０１０７】
【図８】図８は、スルホメツロンメチル（ＯＵＳＴ（登録商標）除草剤)の非存在下および増加する濃度での存在下における、野生型と変異ＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試験結果のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性(％)を示し、１００％値は阻害剤の非存在下で測定される。
【図９】図９は、イマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）除草剤)およびスルホメツロンメチル(ＯＵＳＴ（登録商標）除草剤)の非存在下または増加する濃度での存在下における、野生型アラビドプシス(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ)ＡＨＡＳプロテインとＭｅｔ１２４Ｉｌｅ変異ＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性(％)を示し、１００％値は阻害剤の非存在下で測定される。
【０１０８】
【図１０】図１０は、イマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）除草剤)およびスルホメツロンメチル(ＯＵＳＴ（登録商標）除草剤)の非存在下または増加する濃度での存在下における、野生型アラビドプシスＡＨＡＳプロテインとＭｅｔ１２４Ｈｉｓ変異アラビドプシスＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性(％)を示し、１００％値は阻害剤の非存在下で測定される。
【図１１】図１１は、イマゼタピル（ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）除草剤)およびスルホメツロンメチル(ＯＵＳＴ（登録商標）除草剤)の非存在下または増加する濃度での存在下における、野生型アラビドプシスＡＨＡＳプロテインとＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異アラビドプシスＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性(％)を示し、１００％値は阻害剤の非存在下で測定される。
【０１０９】
【図１２】図１２は、３５Ｓプロモターのコントロール下にｎｐｔＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性をコードする）およびアラビドプシスＡＨＡＳプロモターのコントロール下にＡＨＡＳ遺伝子（野生型または変異体）含む植物形質転換のために使用されるＤＮＡベクターの模式図による説明である。
【図１３】図１３はＭｅｔ１２４Ｉｌｅ変異またはＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異のどちらかを含むアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物および非形質転換対照の発根を示す写真である。植物は０．２５μＭのイマゼタピルを含有する培地に移した後、１８日間生育させた。
【０１１０】
【図１４】図１４は、Ｍｅｔ１２４Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１２４ＨＩｓまたはＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異を含むアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物とイマゼタピルのフィールド率（１００ｇ／ヘクタール）の二倍で散布された非形質転換対照とを示す写真である。
【図１５】図１５は、除草剤ＣＬ２９９，２６３（ｉｍａｚａｍｏｘ）の存在下に行われた発芽試験の結果を示す写真であって、この試験は、Ｍｅｔ１２４Ｉｌｅ、Ｍｅｔ１２４ＨＩｓまたはＡｒｇ１９９Ｇｌｕ変異を含むアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子で形質転換された一次タバコ植物形質転換体から収穫された種子について行われた。
【図１ａ】
0004469833.tif 000015
【図１ｂ】
0004469833.tif 000016
【図２ａ】
0004469833.tif 000017
【図２ｂ】
0004469833.tif 000018
【図３ａ】
0004469833.tif 000019
【図３ｂ】
0004469833.tif 000020
【図３ｃ】
0004469833.tif 000021
【図４】
0004469833.tif 000022
【図５ａ】
0004469833.tif 000023
【図５ｂ】
0004469833.tif 000024
【図５ｃ】
0004469833.tif 000025
【図５ｄ】
0004469833.tif 000026
【図５ｅ】
0004469833.tif 000027
【図５ｆ】
0004469833.tif 000028
【図５ｇ】
0004469833.tif 000029
【図５ｈ】
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【図６】
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【図７】
0004469833.tif 000032
【図８】
0004469833.tif 000033
【図９】
0004469833.tif 000034
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0004469833.tif 000037
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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