(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性蛋白質あるいはペプチド、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および水溶性リン酸塩水溶液を混合し、沈澱を形成させることにより得られることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項２】
前記水溶性亜鉛塩が、酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛であることを特徴とする請求項１に記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項３】
生理活性蛋白質あるいはペプチドと、水溶性亜鉛塩における亜鉛のモル比が、１：１００以上であることを特徴とする請求項１に記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項４】
前記水溶性炭酸塩が、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項５】
前記水溶性リン酸塩が、リン酸ナトリウムまたはリン酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項６】
前記生理活性蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ、抗体、成長ホルモン、ＩＦＮ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＴＮＦ抗体、インターロイキンまたはＦＧＦであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項７】
前記亜鉛含有徐放性組成物が、凍結乾燥されたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項８】
前記亜鉛含有徐放性組成物が、皮下注射及び筋肉内注射に適した形態であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性組成物。
【請求項９】
前記亜鉛含有徐放性組成物に、必要に応じて製剤学的に受容可能な添加物を加えたことからなることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性製剤。
【請求項１０】
前記の製剤学的に受容可能な添加物が、分散剤、界面活性剤、防腐剤又は安定化剤であることを特徴とする請求項９に記載の亜鉛含有徐放性製剤。
【請求項１１】
前記の製剤学的に受容可能な添加物が、糖類であることを特徴とする請求項９または１０に記載の亜鉛含有徐放性製剤。
【請求項１２】
前記の亜鉛含有徐放性製剤が、凍結乾燥されたものであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性製剤。
【請求項１３】
前記の亜鉛含有徐放性製剤が、皮下注射及び筋肉内注射に適した形態であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性製剤。
【請求項１４】
前記生理活性蛋白質がＧ−ＣＳＦであり、請求項９〜１２のいずれかに記載の亜鉛含有徐放性製剤からなる白血球増加剤。
【請求項１５】
生理活性蛋白質あるいはペプチド、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および水溶性リン酸塩水溶液を混合し沈澱を形成させることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有する蛋白質あるいはペプチドと、水溶性亜鉛塩と、水溶性炭酸塩および／または水溶性リン酸塩の水溶液を混合し、沈澱を形成させることからなる亜鉛含有徐放性組成物、その製剤およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、好中球の減少を伴う疾患や病態に対して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）製剤が用いられている。その投与方法は静脈注射、皮下注射、点滴などであるが、投与が１日１回あるいは２回による連日投与となっている。
これは、Ｇ−ＣＳＦの血中安定性が悪く半減期が短いうえに、薬効を維持するためにはある濃度以上のＧ−ＣＳＦが血中に存在する必要があるからである。そのために患者は連日投与という負担を強いられ、Ｇ−ＣＳＦの大量使用にもつながっている。したがって、Ｇ−ＣＳＦの血中濃度を維持するための製剤化が必要とされている。
【０００３】
そこで、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が金属イオン、たとえばカルシウムイオンや亜鉛イオンで沈澱を形成することに注目し、その水不溶性沈澱による徐放製剤の開発を試みた先行技術がある。例えば、蛋白質と多価金属イオンのみの沈澱は溶解し易く、そのままでは期待する徐放効果は得られない。したがって、Ｇ−ＣＳＦと金属イオンからなる沈澱の溶解を抑える方法として、Ｇ−ＣＳＦと金属イオンからなる沈澱組成物中にさらに別の沈澱性の物質を加える方法が提案されている（特開２００３−８１８６５号公報）。この場合に添加される別の沈澱性の物質としては、金属イオンと結合するそれ自体で薬効がほとんど無い蛋白質、例えばヒト血清アルブミンなどであり、さらにコンドロイチン硫酸のような酸性ムコ多糖体を添加することにより、上記混合蛋白質をさらに効率よく沈澱でき、得られた沈澱物についてＧ−ＣＳＦの徐放性もさらに向上するとされている。
【０００４】
しかしながら、かかる方法では、Ｇ−ＣＳＦは、数１００μｇ／ｍｌ程度の濃度の場合には、これら蛋白質との共沈によりその９５％以上が沈澱するものの、濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上であると、沈澱効率が９０％以下に落ちてしまう問題点がある。また、共沈物として使用するヒト血清アルブミンやコンドロイチン硫酸は生体由来物質であることから、安全性に問題点がある。さらに、この方法において、必須として添加する生体由来物質は高価なものであることから、その使用は製造コストに少なからず影響を与え、また使用を控えられているという問題点がある。またさらに、組成物の種類による製造工程数などを考えると、いまだ改良の余地があるという問題点があった。
【０００５】
また、国際公開公報ＷＯ０３／０００２８２公報には、成長ホルモンの固形化を目的として、成長ホルモンと、炭酸水素ナトリウムおよび酢酸亜鉛を組合せることが記載されている（実施例１、２）が、生成した固形成長ホルモンの徐放効果については言及されていない。また、本発明者らが見出した徐放性性能を得るための組成とは異なるものである。
そこで、本発明は前記の方法よりも簡単で、しかもＧ−ＣＳＦ等の生理活性蛋白質あるいはペプチドを高収率で沈澱化させ、安定化させるとともに、得られた沈澱物が徐放効果により、生体内で数日間に亘り生理活性蛋白質あるいはペプチドの薬効を保持し得る、水不溶性の製剤を提供することを目的とする。
【０００６】
前記の目的を達成するため、本発明者らは前記したヒト血清アルブミンやコンドロイチン硫酸のような生体由来物質を使用することなく、亜鉛イオンと相互作用を持つ生理活性蛋白質を、亜鉛イオン共存下で効率よく沈澱形成させ得る物質を見出すべく、亜鉛の水不溶性塩との共沈を利用する方法を検討した。
【０００７】
その結果、亜鉛イオンと相互作用を持つ生理活性蛋白質は、塩化亜鉛や酢酸亜鉛のような水溶性亜鉛塩と、水溶性の炭酸水素ナトリウムや炭酸ナトリウムなどの炭酸塩および／またはリン酸ナトリウムのようなリン酸塩とを混合することにより形成される沈澱中に、効率よく含有されることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明者らは、水溶性の亜鉛塩と、水溶性の炭酸塩および／またはリン酸塩水溶液との混合による沈澱形成時に、Ｇ−ＣＳＦのような亜鉛結合性生理活性蛋白質を共存させると、効率よくこのような生理活性蛋白質を含有する沈澱が形成されることを見出した。その上、得られた沈澱組成物は、含有している生理活性蛋白質を徐放的に放出することが確認された。
【０００９】
さらに、水溶性の炭酸塩とリン酸塩の両者を用い、その混合比を変化させることにより、Ｇ−ＣＳＦのような生理活性蛋白質の徐放速度を調節できることも見出した。
【００１０】
ところで、同様な水不溶性無機塩を用いた粒子徐放製剤として、特開２００２−３４８２３４号に記載の炭酸カルシウム製剤がある。この場合、１００μｇ／ｍｌ程度のＧ−ＣＳＦを沈澱に含有させるには、１Ｍ以上の濃度で炭酸カルシウム粒子を形成させることが必要とされている。また、得られた沈澱からのＧ−ＣＳＦの放出は微量であり、本発明の沈澱組成物との沈澱の性質は非常に異なるものである。
例えば、本発明においては２０ｍＭ程度の酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛（亜鉛濃度：約１．３ｍｇ／ｍｌ）および２０ｍＭ程度の炭酸水素ナトリウムおよび／またはリン酸塩を用いて同時に混合することにより、約１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ−ＣＳＦのほとんどを沈澱物中に含有することができる。
【００１１】
すなわち、水溶性の亜鉛塩、ならびに水溶性の炭酸塩および／またはリン酸塩を用いることにより、Ｇ−ＣＳＦとほぼ同等の重量の亜鉛量で、例えばＧ−ＣＳＦをほぼ１００％沈澱させることができることを見出し、本発明に至った。
得られた沈澱は、注射針を通るのに十分な細かさであり、注射剤として使用可能である。
さらに本発明は、生理活性蛋白質の沈澱形成の収率を高めるだけでなく、生体内での徐放効果も非常に高まることがマウスを使った実験において確認され、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の基本的態様は、生理活性蛋白質あるいはペプチド、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および／または水溶性リン酸塩の水溶液とを混合することにより得られた、生理活性蛋白質あるいはペプチドを含有する沈澱物からなることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
【００１３】
より具体的な本発明は、前記の水溶性亜鉛塩が、酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛であることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
また、本発明は、具体的には、前記の水溶性炭酸塩が、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムであり、水溶性リン酸塩が、リン酸ナトリウムまたはリン酸水素ナトリウムであることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
この場合において、水溶性炭酸塩は沈澱物の形成および初期の徐放性を良好にし、また水溶性リン酸塩は、沈澱物から生理活性蛋白質あるいはペプチドの徐放的放出持続性を良好にするものである。
【００１４】
さらに具体的には、前記の生理活性蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ、抗体、成長ホルモン、ＩＦＮ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、インターロイキンまたはＦＧＦであることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
より好ましい具体的な本発明は、前記の亜鉛含有徐放性組成物が、凍結乾燥されたものであり、また、皮下注射および筋肉内注射に適した形態であることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
【００１５】
また本発明は、別の態様として、これらの亜鉛含有徐放性組成物を含有する亜鉛含有徐放性製剤を提供するものであり、具体的には、上記した亜鉛含有徐放性組成物に、必要に応じて製剤学的に受容可能な添加物を加えたことからなることを特徴とする亜鉛含有徐放性製剤である。
具体的には、前記の製剤学的に受容可能な添加物が、分散剤、界面活性剤、防腐剤または安定化剤であることを特徴とする亜鉛含有徐放性製剤であり、より具体的には、前記の製剤学的に受容可能な添加物が、糖類であることを特徴とする亜鉛含有徐放性製剤である。
また本発明は好ましくは、凍結乾燥されたものであることを特徴とする亜鉛含有徐放性製剤であり、皮下注射および筋肉内注射に適した形態であることを特徴とする亜鉛含有徐放性製剤である。
【００１６】
そのなかでも本発明は、特に、前記生理活性蛋白質がＧ−ＣＳＦである亜鉛含有徐放性製剤からなる白血球増加剤である。
さらに本発明は、また別の態様として、生理活性蛋白質あるいはペプチド、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および／または水溶性リン酸塩の水溶液とを混合し、生理活性蛋白質あるいはペプチドを含有する沈澱物を形成することを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物の製造方法でもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、上記したように、その基本的態様は、Ｇ−ＣＳＦをはじめとする生理活性蛋白質あるいはペプチドと、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および／または水溶性リン酸塩の水溶液とを混合することにより得られた、生理活性蛋白質あるいはペプチドを含有する沈澱物からなることを特徴とする亜鉛含有徐放性組成物である。
【００１８】
この沈澱を形成させる場合においては、特にｐＨが４．５〜９．０の間で沈澱を形成させることを特徴とする。すなわち、中性に近いｐＨであるためＧ−ＣＳＦのように、極端なｐＨ値で活性を失うような蛋白質においても、その活性を損なわずに製造することが可能である。さらに、沈澱にＧ−ＣＳＦを高い割合で含有させることを特徴とする。この場合の最適な条件では９９％以上の含有率が得られるのである。
【００１９】
本発明が提供する沈澱物である水不溶性徐放性組成物は、基本的には１０〜２０００μｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを、２０ｍＭ以上の最終濃度の炭酸水素ナトリウム溶液と最初に混合し、次いで最終濃度２０ｍＭ以上の酢酸亜鉛溶液あるいは塩化亜鉛溶液を加え、沈澱を形成させて沈澱徐放組成物を作ることが望ましい。この場合、水溶性亜鉛塩の添加量は、生理活性蛋白質あるいはペプチドと、水溶性亜鉛塩における亜鉛のモル比が、１：１００以上であることが好ましい。
同様に、抗体、インターフェロン、成長ホルモンについても、本発明の沈澱の作製方法により、Ｇ−ＣＳＦとほぼ同等の性質を有するものと思われる沈澱組成物を作製することができた。
【００２０】
また、Ｇ−ＣＳＦの沈澱物中への含有率は少々落ちるものの、炭酸塩の替わりに中性付近のリン酸塩を用いても本発明が目的とする徐放組成物を作ることができる。さらに、水溶性炭酸塩とリン酸塩の両者を用い、その混合比を変化させることにより、Ｇ−ＣＳＦの徐放速度を調節できることも見出した。
また、コンドロイチン硫酸のような酸性ムコ多糖や乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を加えることにより、徐放効果を調節することも可能である。
さらに、本発明の沈澱組成物にあっては、沈澱形成後の懸濁液中に、マンニトールやトレハロースなどの糖類を加え凍結乾燥したものを、注射用蒸留水で再懸濁し、用いることができる。
【００２１】
凍結乾燥前後の沈澱物をＥＤＴＡで溶解し、ＨＰＬＣにより分析したところ、その溶出パターンは作製に使用したＧ−ＣＳＦのそれと違いはなく、Ｇ−ＣＳＦが沈澱作成中、あるいは凍結乾燥中に凝集や分解をおこしていないことが確認され、極めて安定性に優れたものであることが確認された。なお、本沈澱を含有する製剤は、その貯蔵安定性試験において、３７℃で１ヶ月以上Ｇ−ＣＳＦが変性していないことが確認されている。
本発明が提供する別の態様である沈澱組成物を含有する製剤、例えばＧ−ＣＳＦ含有製剤は、上記した沈澱の形成により得られた沈澱物と、製剤学的に受容可能な添加物である分散剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、または糖類を加えたものからなり、かかる製剤は、皮下注射あるいは筋肉注射等の手段による投与が可能な製剤である。
【００２２】
かくして提供される本発明の製剤である、例えばＧ−ＣＳＦ製剤は、マウスにおいては一回の投与で１週間以上その薬効を維持するだけでなく、その投与量はその薬効を維持するために連日投与で使用されるＧ−ＣＳＦ量に比べ、少なくすることができる。
【００２３】
したがって、本発明が提供する亜鉛含有徐放性組成物は、具体的には、生理活性蛋白質あるいはペプチドと、水溶性亜鉛塩、水溶性炭酸塩および／または水溶性リン酸塩の水溶液とを混合し、生理活性蛋白質あるいはペプチドを含有する沈澱物を形成することにより製造される。
【００２４】
かかる方法により製造される亜鉛含有徐放製剤にあっては、含有させる生理活性蛋白質あるいはペプチドとして、Ｇ−ＣＳＦのみならず、亜鉛イオンと沈澱を形成することができる生理活性蛋白質あるいはペプチドをあげることできる。そのような生理活性蛋白質あるいはペプチドとしては、例えば、ヒルジン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エタナセプト、抗体、ＴＮＦ抗体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＦＧＦ、γ−カルボキシグルタミン酸を持つ蛋白質、Ｈｉｓ−タグをつけた組み換え体蛋白質製剤などを挙げることができる。そのなかでも、特に微量で薬効を示す生体由来因子は望ましいものである。
例えば、抗体やインターフェロンや成長ホルモンを、本発明の方法により沈澱化したものは、Ｇ−ＣＳＦと同様の高率で沈澱物中に含有されたことから、同様の徐放効果を期待できる。
【００２５】
本発明が提供する徐放性製剤は、その特性を生かした非経口投与用製剤として製剤化することができる。
非経口用製剤としては、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、静脈注射等）、点滴靜注等の液剤、噴霧剤等の経鼻剤、粘膜経由投与剤等を挙げることができる。これらの製剤は、いずれも日本薬局方の「製剤総則」に記載の方法に順じ、調製することができ、製剤化に用いられる担体、流動化剤、等張化剤、安定化剤等としては、製剤学的に汎用されている各種のものを適宜選択して、使用することができる。
【００２６】
本発明が提供する徐放性剤における有効成分である沈澱組成物の含有量は、一概に限定できない。一般には、投与されるべき患者の年齢、性別、体重、その症状等により異なるが、沈澱組成物中に含有される生理活性蛋白質またはペプチドの薬理活性を発揮し、その効果が発現できる用量を含有させればよい。
【実施例】
【００２７】
以下に、本発明を実施例により、詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：Ｇ−ＣＳＦの酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛（２０ｍＭ）と、炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＭ）混合による沈澱徐放性組成物の作成と、Ｇ−ＣＳＦの沈澱率、および金属塩をカルシウムとした場合の比較
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８μｌおよびミリＱ水１３４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）あるいは塩化亜鉛（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置した。同様に、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８μｌおよびミリＱ水１３４μｌを最初に混合し、次いで攪拌しながら塩化カルシウム（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置した。これら懸濁液を約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、さらに沈澱物は０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）で溶解し、上清と沈澱物中に含有されるＧ−ＣＳＦの含有量を、ＥＬＩＳＡ法により求めた。
その結果を第１表に示す。
【００２９】
第１表：Ｇ−ＣＳＦの酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛溶液と炭酸水素ナトリウム溶液混合による沈澱形成におけるＧ−ＣＳＦの沈澱率および塩化カルシウム溶液と炭酸水素ナトリウム溶液混合におけるＧ−ＣＳＦの沈澱率
【００３０】
【表１】
0004567668.tif 000002
【００３１】
第１表に示したように、１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ濃度において、塩化カルシウムを用いた沈澱形成では１０％以下しかＧ−ＣＳＦは沈澱に含まれていない。しかしながら、２０ｍＭの酢酸亜鉛あるいは塩化亜鉛を用いた沈澱形成では９９％以上の高効率でＧ−ＣＳＦが沈澱物中に含有されていることが判明した。
なお、前記した先行技術としての特開２００２−３４８２３４号では、Ｇ−ＣＳＦを高い効率で沈澱物中に含有させるためには、塩化カルシウム（５Ｍ）６５０μｌとＧ−ＣＳＦ（０．５ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌに、さらに炭酸ナトリウム（１Ｍ）２．５ｍｌを加えることにより作製している。
【００３２】
実施例２：１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを９９％以上沈澱させるのに必要な亜鉛の濃度の検討
（１）最終濃度が２０ｍＭ亜鉛の製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）４０μｌおよびミリＱ水７０μｌを最初に混合し、次いで、この溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．１Ｍ）４０μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（２）最終濃度が１０ｍＭ亜鉛の製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）２０μｌおよびミリＱ水１１０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．１Ｍ）２０μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（３）最終濃度が５ｍＭ亜鉛の製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）１０μｌおよびミリＱ水１３０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．１Ｍ）１０μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（４）最終濃度が２ｍＭ亜鉛の製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）４μｌおよびミリＱ水１４２μｌを最初に混合し、次いで攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．１Ｍ）４μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
これらの（１）〜（４）の懸濁溶液を、約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、さらに沈澱物を０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）で溶解し、上清と沈澱物中に含有されるＧ−ＣＳＦの量をＥＬＩＳＡ法にて求めた。
【００３３】
その結果を第２表に示した。
【００３４】
第２表：１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ濃度で酢酸亜鉛と炭酸水素ナトリウムを用いた沈澱形成における亜鉛濃度とＧ−ＣＳＦの沈澱率
【００３５】
【表２】
0004567668.tif 000003
【００３６】
第２表に示すように、最終濃度が２０ｍＭの酢酸亜鉛溶液を用いた場合（重量比、Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎ＝１：１．３）には、９９％以上のＧ−ＣＳＦが沈澱物中に含有されているが、最終濃度が１０ｍＭ以下の場合には、Ｇ−ＣＳＦの沈澱率が急激に低下することが判明した。
【００３７】
実施例３：リン酸を含まない溶液で１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを９９％以上沈澱させるのに必要な亜鉛の濃度の検討
（１）最終濃度が２０ｍＭ亜鉛の製剤は、注射用水に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８μｌおよびミリＱ水１０４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（２）最終濃度が１５ｍＭ亜鉛の製剤は、注射用水に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）６μｌおよびミリＱ水１０８μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）６μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（３）最終濃度が１０ｍＭ亜鉛の製剤は、注射用水に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４μｌおよびミリＱ水１１２μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
（４）最終濃度が５ｍＭ亜鉛の製剤は、注射用水に溶解したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）２μｌおよびミリＱ水１１６μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）２μｌを加え、室温に１０分間静置することにより調製した。
これら（１）〜（４）の懸濁溶液を、約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、さらに沈澱物は０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）で溶解し、上清と沈澱物中に含まれるＧ−ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡ法にて求めた。
【００３８】
その結果を第３表に示した。
【００３９】
第３表：１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ濃度で、酢酸亜鉛と炭酸水素ナトリウムを用いた沈澱形成における亜鉛濃度とＧ−ＣＳＦの沈澱率
【００４０】
【表３】
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【００４１】
第３表に示した結果からも判明するように、沈澱作成時にリン酸塩が含まれない場合には、最終濃度が５ｍＭの酢酸亜鉛溶液（重量比、Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎ＝１：０．３３）でもＧ−ＣＳＦを約９９％沈澱させることが判った。
【００４２】
実施例４：１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを２０ｍＭ酢酸亜鉛と２０ｍＭ炭酸水素ナトリウムで沈澱させるときにリン酸塩がＧ−ＣＳＦの沈澱形成に与える影響
脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ（終濃度１ｍｇ／ｍｌ）および炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８μｌ（終濃度２０ｍＭ）混合液に、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液（０．２Ｍ）／ミリＱ水を、各々（１）４０μｌ／６４μｌ（リン酸終濃度４０ｍＭ）、（２）２０μｌ／８４μｌ（リン酸終濃度２０ｍＭ）、（３）１０μｌ／９４μｌ（リン酸終濃度１０ｍＭ）、（４）５μｌ／９９μｌ（リン酸終濃度５ｍＭ）、（５）０μｌ／１０４μｌ（リン酸終濃度０ｍＭ）と最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置して、それぞれのリン酸最終濃度を有する懸濁液を調製した。これらの懸濁溶液を約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、さらに沈澱物は０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）で溶解させ、上清と沈澱中に含有されるＧ−ＣＳＦ量をＥＬＩＳＡ法にて求めた。
【００４３】
その結果を、第４表に示した。第４表に示した結果からも判明するように、２０ｍＭ酢酸亜鉛／２０ｍＭ炭酸水素ナトリウムでの組合せで、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦの沈澱を作成する場合には、リン酸塩は１０ｍＭ以下であればＧ−ＣＳＦの沈澱形成を阻害しないことが判明した。
【００４４】
第４表：１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ濃度で２０ｍＭ酢酸亜鉛と２０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを用いた沈澱形成において、リン酸塩が含まれるときのＧ−ＣＳＦ沈澱率
【００４５】
【表４】
0004567668.tif 000005
【００４６】
実施例５：リン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦを用いて製造したＧ−ＣＳＦ徐放製剤の血中動態
（１）Ｇ−ＣＳＦの２ｍｇ／ｍｌ含有徐放製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）１６０μｌおよびミリＱ水６８０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ） １６０μｌを加え作製した。
（２）Ｇ−ＣＳＦの０．２ｍｇ／ｍｌ含有徐放製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）１６０μｌおよびミリＱ水１５８０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６０μｌを加え作製した。
（３）Ｇ−ＣＳＦの０．０２ｍｇ／ｍｌ含有徐放性剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）１６０μｌおよびミリＱ水１６７０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６０μｌを加え作製した。
（４）Ｇ−ＣＳＦの０．２ｍｇ／ｍｌ含有溶液製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌおよびミリＱ水１９００μｌを混合し、作製した。
これら（１）〜（４）の溶液に０．１ｇのマンニトールを加え、８週令ｄｄＹマウス（各群２匹）の皮下に、それぞれ５ｍｌ／ｋｇずつ投与した。投与後４時間後、１、２、３、４日後に採血（６５μｌ）を行い、ＥＬＩＳＡ法でＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。
【００４７】
第５表に示した結果から判明するように、Ｇ−ＣＳＦ含有徐放製剤は、皮下投与により、徐放的に数日間Ｇ−ＣＳＦが血中に存在していることが確認された。これに対し溶液製剤は、Ｇ−ＣＳＦは血中に１日間しか検出できなかった。
【００４８】
第５表：Ｇ−ＣＳＦ製剤投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００４９】
【表５】
0004567668.tif 000006
ＮＤ： 検出されなかった。
【００５０】
実施例６：リン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦを用いて製造した場合と、脱塩によりリン酸を除いたＧ−ＣＳＦを用いて製造したＧ−ＣＳＦ徐放製剤の血中動態の比較
リン酸を含む徐放製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４０μｌおよびミリＱ水１７０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４０μｌを加え作製した。リン酸を含まない徐放製剤は、注射用水に、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）４００μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４０μｌおよびミリＱ水２０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液を攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４０μｌを加え作成した。これらに０．０２５ｇのマンニトールを加え、８週令ｄｄＹマウス（各群２匹）に、上記製剤を皮下に５ｍｌ／ｋｇずつ投与した。投与後４時間後、１、２、３、４日後に採血（６５μｌ）を行い、ＥＬＩＳＡ法でＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。
【００５１】
第６表に示した結果から判明するように、リン酸を含むＧ−ＣＳＦ製剤の方が、血中Ｇ−ＣＳＦ濃度が１０倍程度維持されることが示された。
【００５２】
第６表：Ｇ−ＣＳＦ製剤投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００５３】
【表６】
0004567668.tif 000007
【００５４】
実施例７：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤におけるＧ−ＣＳＦと亜鉛量比が徐放性に与える影響
（１）Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎのモル比が１：４００の製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．４ｍｇ／ｍｌ）８３４μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８０μｌおよびミリＱ水６μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８０μｌを加え作製した。
（２）Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎのモル比が１：２００の製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．４ｍｇ／ｍｌ）８３４μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４０μｌおよびミリＱ水８６μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４０μｌを加え作製した。
（３）Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎのモル比が１：１００の製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．４ｍｇ／ｍｌ）８３４μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）２０μｌおよびミリＱ水１２６μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）２０μｌを加え作製した。
（４）Ｇ−ＣＳＦ：Ｚｎのモル比が１：４００の製剤（炭酸塩不含）は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．４ｍｇ／ｍｌ）８３４μｌおよびミリＱ水８６μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８０μｌを加え作製した。
これらの製剤に０．０５ｇのマンニトールを加え、８週令ｄｄＹマウス（各群２匹）に、上記製剤を皮下に５ｍｌ／ｋｇずつ投与した。投与後４時間後、１、２、３、４日後に採血（６５μｌ）を行い、ＥＬＩＳＡ法でＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。
【００５５】
その結果を第７表に示した。表中に示した結果からも判明するように、Ｇ−ＣＳＦに対する亜鉛の比が小さくなるに従い、製剤の徐放性能が落ちていくことが判った。また、Ｇ−ＣＳＦに対する亜鉛の比が同じであっても、炭酸塩を含まない製剤における徐放性は非常に低下した。
【００５６】
第７表：Ｇ−ＣＳＦと亜鉛の比を変えたＧ−ＣＳＦ製剤投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００５７】
【表７】
0004567668.tif 000008
ＮＤ： 検出されなかった。
【００５８】
実施例８：亜鉛含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の炭酸塩とリン酸塩による徐放性の調節
（１）炭酸塩を使用した製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．３ｍｇ／ｍｌ）６４０μｌおよび炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）６４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）６４μｌを加え作製した。
（２）炭酸塩とリン酸塩の両方を使用した製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．３ｍｇ／ｍｌ）６４０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）６４μｌおよびｐＨ７．２のリン酸緩衝液（０．２Ｍ）４０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）６４μｌを加え作製した。
（３）リン酸塩を使用した製剤は、脱塩したＧ−ＣＳＦ溶液（２．３ｍｇ／ｍｌ）６４０μｌおよびｐＨ７．２のリン酸緩衝液（０．２Ｍ）２０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）６４μｌを加え作製した。
これらの製剤に０．０４ｇのマンニトールを加え、８週令ｄｄＹマウス（各群２匹）に、上記製剤を皮下に５ｍｌ／ｋｇずつ投与した。投与後４時間後、１、２、３、４日後に採血（６５μｌ）を行い、ＥＬＩＳＡ法でＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。
【００５９】
その結果を第８表に示した。表中に示した結果からも判明するように、亜鉛含有Ｇ−ＣＳＦ製剤の作製において、炭酸塩あるいはリン酸塩を加えることより徐放性能に違いがあり、両者を同時に使用することにより徐放効果が優れることが判明した。また、これらの混合比により徐放速度が調節可能であることが示された。
【００６０】
第８表：亜鉛含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の炭酸塩とリン酸塩によるＧ−ＣＳＦ製剤投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００６１】
【表８】
0004567668.tif 000009
【００６２】
実施例９：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の凍結乾燥による影響および血中動態
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌ、炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）４．０ｍｌおよびミリＱ水４．７ｍｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）０．８ｍｌを加え沈澱形成後、０．５ｇのマンニトールあるいはトレハロースを加え１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥前の試料４５０μｌに０．５Ｍ  ＥＤＴＡ５０μｌを加え沈澱を溶かし、このうちの１００μｌを逆相ＨＰＬＣで分析した。凍結乾燥後の試料は１ｍｌの注射用水で再懸濁し、４５０μｌ抜き取り０．５Ｍ  ＥＤＴＡ５０μｌを加え沈澱を溶かし、このうちの１００μｌを逆相ＨＰＬＣで同様に分析した。Ｇ−ＣＳＦの溶出ピークの面積でＧ−ＣＳＦの回収量を比較した。
【００６３】
その結果を第９表に示した。表中の結果からも判明するように、凍結乾燥後もほぼ１００％Ｇ−ＣＳＦは回収され、凝集や分解は見られなかった。
【００６４】
第９表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の凍結乾燥後のＧ−ＣＳＦ回収率
【００６５】
【表９】
0004567668.tif 000010
【００６６】
凍結乾燥が可能であることが確認できたので、実施例５の実験を凍結乾燥製剤で行なった。凍結乾燥製剤の再懸濁は０．５％カルメロースを用い行い、得られた溶液５ｍｌ／ｋｇを８週令のｄｄＹマウスの皮下に単回投与した。第１０表に示すように凍結乾燥製剤においても徐放効果が確認された。
【００６７】
第１０表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤凍結乾燥品投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００６８】
【表１０】
0004567668.tif 000011
ＮＤ：検出されなかった。
【００６９】
実施例１０：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤におけるマンニトール添加の徐放性に対する効果
マンニトールを含む徐放製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）４７６μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８０μｌおよびミリＱ水３６４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８０μｌを加えた後、さらに０．０５ｇのマンニトールを加え作成した。
マンニトールを含まない徐放製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）４７６μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８０μｌおよび生理食塩水３６４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８０μｌを加え作成した。
８週齢のｄｄＹマウス（各群２匹）に、上記製剤を皮下に５ｍｌ／ｋｇずつ投与した。投与後４時間、１、２、３および４日後に６５μｌ採血を行ない、ＥＬＩＳＡ法でＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。
【００７０】
その結果を、第１１表に示した。表中に示すように、マンニトールの添加による徐放効果を高める効果は、全く認められなかった。
【００７１】
第１１表：Ｇ−ＣＳＦ製剤投与マウスのＧ−ＣＳＦ血中動態
【００７２】
【表１１】
0004567668.tif 000012
【００７３】
実施例１１：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の白血球増加効果
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）１６０μｌおよびミリＱ水１５８０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６０μｌを加え作製した０．２ｍｇ／ｍｌ含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤、および約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）１６０μｌおよびミリＱ水１６７０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６０μｌを加え作製した０．０２ｍｇ／ｍｌ含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤のそれぞれに、０．１ｇのマンニトールを加え凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤に０．５％カルメロースを加え再懸濁し、７週令のｄｄＹマウス（各群３匹）に、それぞれの製剤を５ｍｌ／ｋｇずつ単回皮下投与し、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００７４】
その結果を第１２表に示した。表中に示すように、投与量により白血球増加数に違いはあるが、両投与量において１週間以上の薬効の持続が確認された。
【００７５】
第１２表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤投与マウスの白血球数の変化
【００７６】
【表１２】
0004567668.tif 000013
【００７７】
実施例１２：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤とＧ−ＣＳＦ溶液製剤の白血球増加効果の比較
（１）約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）２８．６μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４８μｌおよびミリＱ水１０７５．４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４８μｌを加え沈澱形成後、０．０６ｇのマンニトールを加え、０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有徐放製剤を調製した。
（２）約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）４８μｌおよびミリＱ水１９５２μｌを混合し、次いで０．１ｇのマンニトールを加え、０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有溶液製剤を調製した。
上記で調製したそれぞれの製剤を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤に０．５％カルメロースを加え再懸濁し、７週令のｄｄＹマウス（各群３匹）にそれぞれの製剤を１０ｍｌ／ｋｇずつ単回投与した。
なお、連日投与のためのＧ−ＣＳＦ含有溶液製剤は、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）３８．４μｌおよびミリＱ水７９６１．６μｌを混合後、０．４ｇのマンニトールを加え０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液製剤とし、１．５ｍｌずつ分注し凍結保存したものを用い、７週齢のｄｄＹマウス（３匹）に、１０ｍｌ／ｋｇを初めの５日間にわたり連日投与した。
各試験において、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００７８】
その結果を第１３表に示した。表中に示すように、徐放製剤と同量単回投与した溶液製剤の薬効は、２日程度しかない。徐放製剤は、単回投与で溶液製剤を５回に分けて連投した薬効と同等以上の薬効を示し、また、溶液製剤の投与終了後では薬効がすぐになくなるのに比較して、徐放製剤は薬効の持続を示した。
【００７９】
第１３表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤（単回）と溶液製剤（単回および連日５回）投与マウスの白血球数増加効果の比較
【００８０】
【表１３】
0004567668.tif 000014
【００８１】
実施例１３：酢酸亜鉛または塩化亜鉛を用いて作製したＧ−ＣＳＦ徐放製剤の白血球増加効果の比較
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）８０μｌおよびミリＱ水１７９０μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８０μｌあるいは塩化亜鉛（０．５Ｍ）８０μｌを加え作製した０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有徐放製剤に、０．１ｇのマンニトールを加え凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤に０．５％カルメロースを加え再懸濁し、７週齢のｄｄＹマウス（各群３匹）にそれぞれの製剤を１０ｍｌ／ｋｇずつ単回投与し、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００８２】
その結果を第１４表に示した。表中に示すように、徐放製剤作製において、亜鉛塩として酢酸亜鉛または塩化亜鉛のいずれを用いて作製した徐放製剤の薬効は、同等であることが判明した。
【００８３】
第１４表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤投与マウスの白血球数の変化
【００８４】
【表１４】
0004567668.tif 000015
【００８５】
実施例１４：コンドロイチン硫酸含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の白血球増加維持効果
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍｌ）２８．６μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４８μｌおよびミリＱ水１０７５．４μｌを最初に混合し、この溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４８μｌを加え作製した０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有徐放製剤、ならびに、約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．２ｍｇ／ｍＬ）２８．６μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）４８μｌおよびミリＱ水１０１５．４μｌを最初に混合し、この溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）４８μｌを加え、さらにコンドロイチン硫酸（２０ｍｇ／ｍＬ）６０μｌを加え作製した０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ製剤を調製した。
これらの製剤に０．０６ｇのマンニトールを加え凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤に０．５％カルメロースを加え再懸濁し、７週令のｄｄＹマウス（各群３匹）にそれぞれの製剤を１０ｍｌ／ｋｇずつ単回投与し、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００８６】
その結果を第１５表に示した。表中に示すようにコンドロイチン硫酸を加えた製剤は白血球数の最高値は低くなるが、白血球数増加の持続がより観察された。
【００８７】
第１５表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤投与マウスの白血球数の変化
【００８８】
【表１５】
0004567668.tif 000016
【００８９】
実施例１５：リン酸塩を用いたＧ−ＣＳＦ徐放製剤の白血球増加効果
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ、ｐＨ７．２のリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）４００μｌおよびミリＱ水３３４０μｌを最初に混合し、次いで攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６０μｌを加え、０．１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有徐放製剤を調製した。この製剤に、０．１ｇのマンニトールを加え凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤に注射用水を加え再懸濁し、７週令のｄｄＹマウス（１群３匹）に１０ｍｌ／ｋｇずつ単回投与し、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００９０】
その結果を第１６表に示した。表中に示すように、炭酸塩の代わりにリン酸塩を用いた亜鉛含有徐放製剤においても１週間以上の薬効の持続が確認された。
【００９１】
第１６表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤投与マウスの白血球数の変化
【００９２】
【表１６】
0004567668.tif 000017
【００９３】
実施例１６：Ｇ−ＣＳＦを最後に加え作製した沈澱へのＧ−ＣＳＦ含有率とその沈澱製剤の薬効
炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）１６μｌおよびミリＱ水１５８μｌを最初に混合し、この溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６μｌを加え、さらに攪拌しながら約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを加え、室温に１０分間静置した。懸濁液を約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、また得られた沈澱を０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解し、上清と沈澱に含まれるＧ−ＣＳＦ量を、ＥＬＩＳＡ法にて求めた。その結果、沈澱には、ほぼ１００％のＧ−ＣＳＦが含まれていることが判明した。
薬効を確認するために、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．５Ｍ）１７６μｌおよびミリＱ水１７３８μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１７６μｌを加え、さらに攪拌しながら約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）溶液１１０μｌを加え、０．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有徐放製剤を調製した。得られた製剤に０．１１ｇのマンニトールを加え凍結乾燥した。凍結乾燥製剤に注射用水を加え再懸濁し、７週令のｄｄＹマウス（１群３匹）に懸濁液を５ｍｌ／ｋｇずつ単回投与し、１２日間にわたり採血（３５μｌ）し、自動血球測定装置で白血球数を測定した。
【００９４】
その結果を第１７表に示した。表中に示すように、最初に酢酸亜鉛と炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、さらにＧ−ＣＳＦを加えて得た沈澱製剤においても、充分な薬効の持続が確認された。
【００９５】
第１７表：Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤投与マウスの白血球数の変化
【００９６】
【表１７】
0004567668.tif 000018
【００９７】
実施例１７：抗ＴＮＦ抗体（モノクローナル）とインターフェロンαおよび成長ホルモンについて、酢酸亜鉛溶液（２０ｍＭ）と炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＭ）混合による沈澱形成における沈澱率
抗ＴＮＦ抗体溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μｌ、炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）８μｌおよびミリＱ水１７４μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置して、懸濁液を得た。
同様に、インターフェロンα（１．３ｍｇ／ｍＬ）７７μｌ、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．５Ｍ）８μｌおよびミリＱ水１０７μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）８μｌを加え、室温に１０分間静置して、懸濁液を得た。
さらに、成長ホルモン（０．５ｍｇ／ｍＬ）２００μｌ、炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）１６μｌおよびミリＱ水１６８μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）１６μｌを加え、室温に１０分間静置して懸濁液を得た。
これら懸濁液を約１０，０００×ｇで遠心分離し、上清を採取し、沈澱は０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）に溶解し、上清と沈澱に含まれる抗ＴＮＦ抗体とインターフェロンα量をＥＬＩＳＡ法にて、また、成長ホルモン量は逆相ＨＰＬＣで定量した。
【００９８】
その結果を第１８表に示した。表中に示すように亜鉛との結合が知られている抗ＴＮＦ抗体、インターフェロンαおよび成長ホルモン等の蛋白質は、抗ＴＮＦ抗体あるいはインターフェロンαの０．５ｍｇ／ｍＬ、成長ホルモンの０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で、炭酸水素ナトリウム溶液と酢酸亜鉛溶液との混合による沈澱形成で、沈澱中への含有率は、Ｇ−ＣＳＦ同様に非常に高いことが確認された。
【００９９】
第１８表：抗ＴＮＦ抗体、インターフェロンαおよび成長ホルモンの沈殿率
【０１００】
【表１８】
0004567668.tif 000019
【０１０１】
実施例１８：亜鉛含有ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）徐放製剤の炭酸塩とリン酸塩による徐放性の調節
（１）炭酸塩を使用した製剤は、脱塩したｈＧＨ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）７２０μｌ、炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）２４μｌおよびミリＱ水４３２μｌを最初に混合し、この溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）２４μｌを加え、作成した。
（２）炭酸塩とリン酸塩の両方を使用した製剤は、脱塩したｈＧＨ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）７２０μｌ、炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）２４μｌ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液（０．２Ｍ）３０μｌおよびミリＱ水４０２μｌを最初に混合し、次いでこの溶液に攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）２４μｌを加え、作成した。
（３）溶液製剤は、脱塩したｈＧＨ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）７２０μｌ、炭酸水素ナトリウム溶液（０．５Ｍ）２４μｌおよびミリＱ水４３２μｌを混合し、作成した。
これらの製剤に、０．０３ｇのマンニトールを加え、凍結乾燥した。投与前に、（１）と（２）の製剤は２０ｍＭ酢酸亜鉛／２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム混合液６００μｌで、また（３）の製剤はミリＱ水６００μｌで溶解した。７週齢ｄｄＹマウス（各群２匹）に、上記の製剤を５ｍｌ／ｋｇずつ皮下投与した。投与４時間後、１、２、３、４日後に採血（６５μｌ）を行い、自動ＥＩＡ装置によりｈＧＨ濃度を測定した。
【０１０２】
その結果を第１９表に示した。表中の結果から判明するように、亜鉛／炭酸塩の両者を含有するｈＧＨ製剤では、薬物の溶出に徐放性が認められた。これにさらにリン酸塩を加えることにより、徐放性の性能が向上し、数時間後の溶出が抑えられ、さらに数日間、より高いｈＧＨの血中濃度が観察された。
【０１０３】
第１９表：亜鉛含有ｈＧＨ徐放製剤投与マウスにおけるｈＧＨの血中動態
【０１０４】
【表１９】
0004567668.tif 000020
ＮＤ：検出されない
【０１０５】
実施例１９：凍結乾燥Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の安定性
約３０ｍＭのリン酸緩衝液に溶解させたＧ−ＣＳＦ（４．０ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌ、炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ）０．８ｍｌ、ミリＱ水７．９ｍｌを最初に混合し、攪拌しながら酢酸亜鉛溶液（０．５Ｍ）０．８ｍｌを加え沈澱形成後、０．５ｇのトレハロースを加え、１ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、３７℃の恒温器に入れた。凍結乾燥前の試料４５０μｌに０．５Ｍ  ＥＤＴＡ５０μｌを加え沈澱を溶解させ、その１００μｌを逆相ＨＰＬＣでＧ−ＣＳＦ含有量を測定した。一方、凍結乾燥直後、恒温器保存１週間後、４週間後の各試料１ｍｌを注射用水で再懸濁し、その４５０μｌを抜き取り、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ５０μｌを加え沈澱を溶解させ、その１００μｌを逆相ＨＰＬＣで同様にＧ−ＣＳＦ含有量を測定した。
Ｇ−ＣＳＦの溶出ピークの面積により、Ｇ−ＣＳＦの回収量を比較した。
【０１０６】
第２０表に示すように、凍結乾燥Ｇ−ＣＳＦ製剤を３７℃にて４週間保存した場合であっても、ほぼ１００％のＧ−ＣＳＦが回収され、凝集や分解は認められなかった。
【０１０７】
第２０表：凍結乾燥Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤の３７℃での４週間の安定性
【０１０８】
【表２０】
0004567668.tif 000021
【０１０９】
実施例２０：製剤例（懸濁注射剤）
実施例１０に準じて作製した０．２ｍｇ／ｍｌ含有Ｇ−ＣＳＦ徐放製剤に、マンニトールを加えて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤を、バイアルに充填し懸濁注射製剤を、別にバイアル充填した０．５％カルメロースあるいは注射用水を加え再懸濁することにより、懸濁注射製剤が調整される。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
以上記載したように、本発明によりＧ−ＣＳＦ等の生理活性蛋白質あるいはペプチドを高収率で沈澱化させ、安定化させるとともに、得られた沈澱物が徐放効果により、生体内で数日間に亘り生理活性蛋白質あるいはペプチドの薬効を保持し得る水不溶性の製剤が提供され、その医療上の価値は多大なものである。