(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1) ペプチドのＮ末端α-アミノ基に、ｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、
ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(2) (1)の工程の前及び後におけるペプチドについて、衝突活性化解離法により生じるフラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3) (2)の工程で得られた２種の質量スペクトルを比較し、質量変化がないピークと質量増加をしたピークとを見出し、それぞれのピークをＣ末端由来のフラグメントイオン、Ｎ末端由来のフラグメントイオンに基づくピークとして特定し、該特定されたピークの質量及び当該ピーク間での質量差を読み取ることにより、前記ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするペプチドのアミノ酸配列の決定方法。
【請求項２】
ペプチドとして、(1)の工程に先立ちＳアルキル化処理されたものを用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドとして、タンパク質の切断により得られたものを用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カルボン酸無水物〔１〕のＲ1がＣ１−６アルキル基である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
イソシアネート化合物〔２〕のＲ2がフェニル基またはＣ１−６アルキル基である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドのアミノ酸配列の決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のアミノ酸配列の決定は、タンパク質の構造を確認、同定する手段として重要である。
タンパク質やペプチドのアミノ酸配列決定を行う方法として一般的にエドマン分解法が用いられているが、最近では質量分析法を用いるアミノ酸配列の決定も行われてきている。質量分析法を用いるアミノ酸配列決定法は、混合物試料や微量試料にも適用可能であるという特徴を有する。
【０００３】
質量分析法を用いたアミノ酸配列決定においては、衝突活性化解離法（以下、CID法と記す）により生じるフラグメントイオンの質量スペクトル（以下、MS/MSスペクトルと記す）を取得し、このスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定することが行われている。一般にこの方法によってMS/MSスペクトルが得られるのは分子量が約３０００程度以下であるため、それを越える高分子量物では通常、化学的または生化学的手段によって切断して分子量３０００以下程度以下のペプチドにした後、適用される。
【０００４】
CID法によってペプチドは主に主鎖部分で解離が起こり、該ペプチドのＮ末端を含むフラグメントイオンとＣ末端を含むフラグメントイオンが生成する（Methods in Enzymology, 193 (1990)）。得られるMS/MSスペクトルには、Ｎ末端を含むフラグメントイオンのピークとＣ末端を含むフラグメントイオンのピークが混在しており、解析に多大な労力を要するという問題があった。
Ｎ末端を含むフラグメントイオンとＣ末端を含むフラグメントイオンを区別する方法として、例えば、Ｈ218Ｏを含む溶液中で酵素により加水分解を行うことによって、断片化された各ペプチドのＣ末端を18Ｏで標識し、18Ｏ標識されたペプチドと18Ｏ標識していないペプチドのMS/MSスペクトルを比較する方法が報告されている（RAPIDCOMMUNICATION IN MASS SPECTROMETRY, Vol. 5, pp312-315 (1991)）。
【０００５】
一方、タンパク質あるいは切断ペプチドのＮ末端α−アミノ基の選択的修飾方法としては、グルカゴンにおいて無水酢酸を用いるアセチル化方法（Eur. J. Biochem. 60, 335-347, (1975)）や、切断ペプチドに無水ヨード酢酸をカップリング試薬として使用する方法（Anal. Chem., 65, 1703, (1993)； Bioconjugate Chem., 1, 114-122, (1990)）が知られているものの、これらの方法においてその選択性のためには、基質であるタンパク質あるいはペプチドと修飾試薬との使用比率を厳密に制御する必要があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ペプチドのアミノ酸配列を効率的に決定する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らはペプチドのアミノ酸配列の決定方法につき検討した結果、ペプチドに対する修飾剤の使用量を厳密に制御しなくとも比較的広い範囲で、ε−アミノ基共存下においてもＮ末端アミノ基を極めて選択性良く修飾できる方法を見出すと共に、該選択的修飾方法とCID法による質量分析法とを組み合わせることにより極めて効率的にペプチドのアミノ酸配列を決定できることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、
(1) ペプチドに、ｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、
ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(2) (1)の工程の前及び後におけるペプチドについて、衝突活性化解離法により生じるフラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3) (2)の工程で得られた２種の質量スペクトルを比較、解析することによりペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするペプチドのアミノ酸配列の決定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ペプチドとは、２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合により結合したものを言い、通常はアミノ酸数が約５０以下である。また、タンパク質とは、α−アミノ酸がペプチド結合により連結したポリペプチド鎖からなる高分子化合物を言い、通常は分子量約４０００以上である。
【０００９】
本発明において、通常は分子量３０００程度以下のペプチドが用いられ、高分子のペプチドやタンパク質を予め切断することにより分子量を３０００程度以下としたペプチドを用いることもできる。タンパク質の切断方法は特に限定されず、例えば、A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Second Edition, Academic Press, (1993)やMethods in Enzymology, 193, 389-412, (1990)等に記載の化学的切断方法、消化酵素を用いた生化学的切断方法等をあげることができる。具体的に化学的切断方法としては例えば、BrCNによる切断方法が挙げられ、消化酵素による生化学的切断方法としては、トリプシン、キモトリプシンなどを用いた消化を挙げることができる。
【００１０】
また、ペプチドを例えばヨードアセトアミドや4-ビニルピリジンなどにより予め還元Sアルキル化処理を行っておくことが実用上好ましい。この処理によりペプチドを構成するアミノ酸としてシステインを含む場合の副反応が抑えられる。この還元Ｓアルキル化処理自体は公知であり、例えば、A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Second Edition, Academic Press, (1993)等に記載の方法に準じて行うことができる。また、ペプチドを前記したタンパク質の切断により得る場合には、タンパク質の切断の前に還元Ｓアルキル化処理を行ってもよい。
【００１１】
(1) ペプチドへのカルボン酸無水物またはイソシアネート化合物処理工程
i) カルボン酸無水物〔１〕処理
ペプチドにｐＨ５以下でカルボン酸無水物〔１〕を作用させることによりＮ末端が選択的にアシル化されたペプチドが得られる。
カルボン酸無水物〔１〕におけるＲ1は直鎖または分岐アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１〜６の直鎖または分岐アルキル基を挙げることができ、具体的には、無水酢酸、プロピオン酸無水物、酪酸無水物、吉草酸無水物等を挙げることができる。
【００１２】
本工程の反応はｐＨ５以下、好ましくはｐＨ２〜５の範囲、さらに好ましくはｐＨ３〜５の範囲で行われる。
本工程において、通常は前記ｐＨを保持するための緩衝液を溶媒として使用する。該溶媒としては、酢酸水溶液、ぎ酸水溶液、ピリジン−酢酸緩衝液、トリフルオロ酢酸水溶液等の揮発性溶媒が、後処理の簡便さの点で好ましい。通常は、本工程の反応は、ペプチドおよび該溶媒からなる溶解または懸濁液に、カルボン酸無水物〔１〕またはそのテトラヒドロフラン等の溶液を添加することにより行われる。反応は、選択性の点から約１０℃以下で、使用する溶媒が凍らない範囲の温度で行うことが好ましい。反応時間は通常、１〜６０分程度である。
【００１３】
カルボン酸無水物〔１〕の反応系内の濃度は反応系内の初期濃度として通常、pH5で反応を行う場合には、約10〜30mM、pH3.3で反応を行う場合には、約60〜300mM程度である。
本工程において反応後、反応液からＮ−アシル化されたペプチドを回収する。例えば、反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、反応液を減圧下に留去すればよい。不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合には、脱塩処理を行った後溶媒を減圧留去すればよい。
本工程の処理を行うことにより、Ｎ末端のみが選択的に使用するカルボン酸無水物〔１〕に対応してアシル化されたペプチドを製造することができる。
【００１４】
ii) イソシアネート化合物〔２〕処理
ペプチドに、ｐＨ６以下でイソシアネート化合物〔２〕を作用させることにより、Ｎ末端アミノ基が選択的にカルバモイル化されたペプチドが得られる。
イソシアネート化合物〔２〕におけるＲ2は、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基である。置換されていてもよいアルキル基としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、よう素原子等のハロゲン原子で置換されていても良いアルキル基を挙げることができ、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１〜６アルキル基、クロロメチル基、ヨードメチル基、ジブロモメチル基、トリフルオロメチル基、ヨードエチル基等のＣ１〜６ハロアルキル基を挙げることができる。置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基としては、例えばフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｏ−ブロモフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等のハロゲン置換フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等のナフチル基、１−ヨードナフチル基、２−クロロナフチル基等のハロゲン置換ナフチル基等を挙げることができる。置換されていても良いピリジル基としては、例えば２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基等のピリジル基や、２−クロロ−４−ピリジル基、３，５−ジフルオロ−２−ピリジル基等のハロゲン置換ピリジル基を挙げることができる。
イソシアネート化合物〔２〕としては具体的には、フェニルイソシアネート、ｐ−クロロフェニルイソシアネート、１−ナフチルイソシアネート、２−ナフチルイソシアネート、ブチルイソシアネート、エチルイソシアネート、４−ピリジルイソシアネート、３−ピリジルイソシアネート等を挙げることができる。
本工程の反応はｐＨ６以下で行われ、好ましくはｐＨ約３〜６の範囲、さらに好ましくはｐＨ約５〜６で行われる。
【００１５】
本工程において、通常は前記ｐＨを保持するための緩衝液を溶媒として使用する。該溶媒としては、酢酸水溶液、ぎ酸水溶液、ピリジン−酢酸緩衝液、トリフルオロ酢酸水溶液等の揮発性溶媒が、後処理の簡便さの点で好ましい。通常は、本工程の反応は、ペプチドおよび該溶媒からなる溶解または懸濁液に、イソシアネート化合物〔２〕またはそのテトラヒドロフラン等の溶液を添加することにより行われる。反応は、例えば使用する溶媒が凍らない程度の低温から５０℃程度の範囲を挙げることができる。反応時間は通常、１〜６０分程度である。
イソシアネート化合物〔２〕の反応系内の濃度は反応系内の初期濃度として通常、pH６で反応を行う場合には、約2〜300mM程度である。
【００１６】
本工程の反応後、反応液からＮ−カルバモイル化されたペプチドを回収する。例えば、反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、反応液を減圧下に留去すればよい。不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合には、脱塩処理を行った後、溶媒を減圧留去すればよい。
本工程の処理を行うことにより、Ｎ末端のみが選択的に、使用するイソシアネート化合物〔２〕に対応してカルバモイル化されたペプチドを製造することができる。
【００１７】
(2) (1)の工程の前及び後におけるペプチドについて、衝突活性化解離法により生じるフラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程
(1)の工程の前及び後のそれぞれのペプチドのMS/MSスペクトルを取得する。
MS/MSスペクトルの取得の方法としては、ペプチドを主鎖部分で開裂させた質量スペクトルを分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、イオントラップ型の質量分析装置を用いてESIイオン化法にて分析することができる。
【００１８】
(3) (2)の工程で得られる２種のスペクトルを比較、解析することによりペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
(1)の工程の後のペプチドのMS/MSスペクトルと、(1)の工程の前のペプチドのMS/MSスペクトルとを比較し、質量変化していないフラグメントイオンのピークを特定することにより、これをＣ末端由来のフラグメントイオンと判定できる。同様にして、(1)の工程で使用したカルボン酸無水物〔１〕またはイソシアネート化合物〔２〕に対応するアシル基またはカルバモイル基に相当する質量変化があったフラグメントイオンのピークを特定することにより、これをＮ末端由来のフラグメントイオンと判定できる。例えば、ペプチドを無水酢酸により処理した場合には、MS/MSスペクトルにおいてＣ末端を含むフラグメントイオンは該処理により質量変化はしないので、(2)の工程の前後で同じ質量のフラグメントイオンが検出されるのに対し、Ｎ末端を含むフラグメントイオンにおいては、該ペプチドのＮ末端のα−アミノ基がアセチル化されることにより42の質量増加が検出される。また、例えば、イソシアン酸フェニルで処理した場合においては、Ｎ末端を含むフラグメントイオンは119の質量増加が検出される。
【００１９】
このようにして特定されたペプチドのＣ末端由来のフラグメントイオンとＮ末端由来のフラグメントイオンを、例えばMethods in Enzymology, 193 (1990)に記載の方法によりMS/MSスペクトル上で質量の順にたどり、その質量差からアミノ酸の特定及びその配列順序を解析することができ、アミノ酸配列を決定することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）ヒト成長ホルモンのトリプシン消化物の調製
組換えヒト成長ホルモン（hGH）200mgを1%炭酸水素アンモニウム緩衝液（pH 7.9）200mLに溶解し、トリプシンを4mg添加して、37℃、24時間反応させた。
【００２１】
（２）Ｎ末端選択的アセチル化
前記hGHトリプシン消化物1mg相当量を減圧濃縮し、残渣に0.1%酢酸水溶液（pH 3.3）を12mL加えて溶解し、氷上で1分間インキュベートした後、1M無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5mL添加して5分間インキュベートした。該反応液からの溶媒を減圧下に溜去し、残渣を質量分析用試料とした。また、アセチル化処理しないhGHトリプシン消化物1mg相当量も併せて調製した。
【００２２】
（３）MS/MSスペクトルの取得
MS/MSスペクトルの取得は、ThermoQuest社のイオントラップ型質量分析計LCQで行った。2種のhGHトリプシン消化物試料（アセチル化処理試料および未処理試料）それぞれを10mLの溶媒（酢酸／水／メタノール=0.1/50/50）に溶解し、1mLをNanospray用チップに入れ、Nanosprayイオン源（Protana社製）に装着した。エレクトロスプレー電圧を0.7kV、キャピラリー温度を120℃に設定してエレクトロスプレーマススペクトルおよびMS/MSスペクトルをそれぞれ取得した。
【００２３】
（４）アミノ酸配列解析
hGHトリプシン消化物のうちのペプチドTGQIFK（MW692.4）の解析を例にする。アセチル化未処理試料のマススペクトルにより、m/z693.4に[M+H]+が検出された。このm/z693.6のMS/MSスペクトルでは、Ｎ末端由来のフラグメントイオンとＣ末端由来のフラグメントイオンが混在している（図１）。アセチル化処理試料では42の質量増加があり、マススペクトルピークはm/z735.5に検出された。
このm/z735.5とm/z693.6のMS/MSスペクトルとを比較すると（図１, ２）、＊を付けた質量変化がないピークを見出すことができ、これらはＣ末端由来のフラグメントイオンであることがわかった。これらのフラグメントイオン（＊）の質量差を読み取ることにより、T→G→Q→I/Lという配列が確認できた（ここで、ＩとＬとは分子量が同じであるためいずれかを特定できないので、I/Lと記載する。以下同様。）。
一方、●を付けたピークは42の質量増加しており、これらはＮ末端由来のフラグメントイオンであることがわかり、質量差を読み取ることによりI/L→F→Kという配列を確認できた。
以上から、hGHトリプシン消化物に含まれるペプチドをアミノ酸配列TGQ(I/L)FKと決定できた。
【００２４】
実施例２
（１）Ｎ末端選択的イソシアン酸フェニル処理
実施例１と同様に調製したhGHトリプシン消化物1mg相当量を減圧濃縮し、残渣に0.1Mピリジン-酢酸（pH 6.0）を12mL加えて溶解し、0.1Mイソシアン酸フェニル／無水テトラヒドロフランを5mL添加して5分間インキュベートする。該反応液からの溶媒を減圧下に溜去し、残渣を質量分析用試料とする。また、カルバモイル化処理しないhGHトリプシン消化物1mg相当量も併せて調製する。
【００２５】
（２）MS/MSスペクトルの取得
hGHトリプシン消化物試料（カルバモイル化処理および未処理）を10mLの溶媒（酢酸／水／メタノール=0.1/50/50）に溶解し、実施例１と同様にMS/MSスペクトルを取得する。
【００２６】
（３）アミノ酸配列決定
hGHトリプシン消化物のうちのペプチドTGQIFK（MW692.4）の解析を例にする。
カルバモイル化処理をしていない試料のマススペクトルによりm/z693.4に[M+H]+が検出される。m/z693.6のMS/MSスペクトルでは、Ｎ末端由来のフラグメントイオンとＣ末端由来のフラグメントイオンが混在している。Ｎ末端選択的イソシアン酸フェニル処理をしたhGHトリプシン消化物試料では119の質量増加があり、マススペクトルピークはm/z812.6に検出される。実施例１と同様にm/z735.5とm/z812.6のMS/MSスペクトルとを比較すると、質量変化がないピークを見出すことができ、これらはＣ末端由来のフラグメントイオンであることがわかる。これらのフラグメントイオンの質量差を読み取ることにより、T→G→Q→I/Lという配列が確認できる。一方、119の質量増加したピークはＮ末端由来のフラグメントイオンであることがわかり、質量差を読み取ることによりI/L→F→Kという配列を読み取ることができる。以上から、hGHトリプシン消化物に含まれるペプチドをアミノ酸配列TGQ(I/L)FKと決定できる。
【００２７】
参考例１
ペプチドとしてダイノルフィンＡ（アミノ酸配列；YGGFLRRIRPKLKWDNQ、ペプチド研究所製）100pmolを0.1Mピリジン-酢酸（pH6.0）、0.1Mピリジン-酢酸（pH5.0）、0.1%酢酸水溶液（pH3.3）および1%酢酸水溶液（pH2.7）各12μLにそれぞれ溶解し、氷上で１分間インキュベートした後、0.005M〜5Mの無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。該反応液から溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用試料とした。
質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。上記試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、該試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して上記分析計に供し、FAB-MSおよびFAB-MS/MS測定を行った。
無水酢酸処理後に原料のダイノルフィンＡに比し質量が42増加したピークについてMS/MS分析を行ったところ、Ｎ末端α-アミノ基のみがアセチル化されたダイノルフィンＡであることが確認できた。
各ｐＨおよび無水酢酸量条件におけるＮ末端のみアセチル化されたダイノルフィンＡの選択率を表１に示す。
【００２８】
表１中の記号の説明
Ｎ末端のみアセチル化されたダイノルフィンＡの選択率
◎：７５％超
○：７０％超７５％以下
△：６０％超７０％以下
×：６０％以下
【００２９】
【表１】
0004505905.tif 000002
【００３０】
参考例２
参考例1において無水酢酸に代えて表２に記載のイソシアネート化合物〔２〕を用い、表２に記載した条件とした以外は参考例１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
0004505905.tif 000003
＊１：シアネート化合物の添加量を添加したシアネート化合物／ＴＨＦ５μＬ中のシアネート化合物のモル濃度（ｍＭ）として表示する。
＊２：Ｎ末端のみカルバモイル化されたダイノルフィンＡの選択率
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、ペプチドのアミノ酸配列を極めて効率的に決定することが可能な方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるhGHトリプシン消化物のアセチル化未処理試料のマススペクトルにより得られた[M+H]+（m/z693.6）のMS/MSスペクトルを示す。
●印は、アセチル化処理により質量が４２増加したフラグメントピークを示す。
＊印は、アセチル化処理により質量が変化しなかったフラグメントピークを示す。
Ｔ、Ｇ、Ｑ、I/L、Ｆ、Ｋはそれぞれフラグメントイオンピークの質量差から求められるアミノ酸残基を示し、Ｔはスレオニン残基を、Ｓはセリン残基を、Ｑはグルタミン残基を、I/Lはイソロイシン残基またはロイシン残基を、Ｆはフェニルアラニン残基を、Ｋはリシン残基を表わす。
【図２】実施例１におけるhGHトリプシン消化物のアセチル化処理試料のマススペクトルにより得られた[M+42+H]+（m/z735.5）のMS/MSスペクトルを示す。
●印は、アセチル化処理により質量が４２増加したフラグメントピークを示す。
＊印は、アセチル化処理により質量が変化しなかったフラグメントピークを示す。
Ac-Ｔ、I/L、Ｆ、Ｋはそれぞれフラグメントイオンピークの質量差から求められるアミノ酸残基を示し、Ac-Ｔはアセチル化スレオニン残基を、I/Lはイソロイシン残基またはロイシン残基を、Ｆはフェニルアラニン残基を、Ｋはリシン残基を表わす。
【図１】
0004505905.tif 000004
【図２】
0004505905.tif 000005