(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質と、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ系列のブロック共重合体、ポリエチレングリコール、及び消泡性重合体から成る群から選択される有機重合体を含んで成る溶液成分が入っている出発水溶液から蛋白質を濃縮する方法であって、（１）前記出発水溶液に限外濾過を受けさせて前記蛋白質を濃縮することで１番目の保持液を生じさせ、（２）前記１番目の保持液の導電率を前記有機重合体によって誘発される前記溶液成分の沈澱が防止されるか或は逆転するように調整することで２番目の保持液を生じさせ、そして（３）前記２番目の保持液に限外濾過を受けさせて前記蛋白質を更に濃縮することで濃縮溶液を生じさせることを含んで成る方法。
【請求項２】
前記導電率を水、適切な希釈剤または緩衝液に対する透析濾過で調整する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１番目の保持液の導電率を２２℃で測定して６ｍＳ／ｃｍ未満に調整する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記１番目の保持液の導電率を２２℃で測定して０.５から５ｍＳ／ｃｍの範囲に調整
する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記１番目の保持液の導電率を２２℃で測定して１.０から１.５ｍＳ／ｃｍの範囲に調整する請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記有機重合体が非イオン性ブロック共重合体である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記有機重合体がＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ−６８ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記出発溶液が哺乳動物または昆虫細胞培養上澄み液を含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記濃縮溶液の前記蛋白質濃度の方が前記出発溶液のそれよりも少なくとも５０倍高くなるようにする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記濃縮溶液の前記蛋白質濃度の方が前記出発溶液のそれよりも少なくとも１００倍高くなるようにする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２００２年１１月１日付けで出願した米国出願連続番号６０／４２２，９９９（これは引用することによって全体が本明細書に組み入れられる）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は一般に巨大分子、例えば蛋白質などが入っている溶液に濃縮を受けさせることに関する。本発明の方法は、１つの態様において、巨大分子およびこれと一緒に濃縮を受ける有機重合体が入っている溶液に限外濾過を受けさせた後に透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を受けさせることで導電率を低くしそして次に２番目の限外濾過を受けさせることで巨大分子の濃縮を沈澱による有意な収率低下を起こさせることなくもたらすことを伴う。
【背景技術】
【０００３】
蛋白質の生産は、蛋白質の溶液を比較的希釈された状態で多量に作り出すことを伴う。さらなる段階、例えば凍結、バルク貯蔵および解凍そして下流の精製などを容易に行なおうとするには発酵後に蛋白質に濃縮を受けさせておくのが好適である。しかしながら、一緒に濃縮を受ける有機重合体、例えば哺乳動物細胞培養物の収穫で得られるいろいろな細胞培養上澄み液に存在する有機重合体などが入っている溶液から製品に最適な蛋白質濃度を達成しようとする時、今までは、限外濾過で濃度を高くしている時に生成物である分子が沈澱する度合が高い（従って失われる度合が高い）ことが原因で、それを行うことが制限されていることが分かった。例えば、最初の細胞培養上澄み液に入っている蛋白質の濃度を限外濾過で１０−２０倍高くしようとすると、沈澱が過度に起こることで濃縮が邪魔されていた。
【０００４】
単離、即ち一次回収工程が発酵と下流の精製の間の橋渡し役を構成しており、しばしば、生産能力および工程経済性の両方の点で重要である。そのような単離工程の主な目的は、さらなる処理および下流の精製を実施することができるように、生成物である蛋白質を粒子を含まない濃縮された溶液の状態で得ることにある。
【０００５】
限外濾過（ＵＦ）は蛋白質溶液に濃縮を受けさせるに適した効率良い技術であり、しばしば、細胞培養上澄み液から蛋白質を単離する時の重要な段階として用いられる。限外濾過は特にバッチ式および潅流両方の細胞発酵工程で用いられる。連続潅流工程でもたらされる蛋白質生成物は比較的希釈された状態で多量であることから、下流の処理を容易に行なおうとするには、濃縮係数を高くするのが望ましい。通常の細胞培養が基になった蛋白質製造工程の主な制限は、蛋白質の単離で達成可能な濃縮係数である。単離工程中に限外濾過を用いた時に達成される濃縮係数はたいてい１０−２０倍のみである。濃度を高くしようとする試みが成されたが、その結果として、濾過性の問題が大きくなりかつ沈澱が原因で起こる生成物損失がもたらされた。そのような沈澱の性質および原因は一般に未知である。ＵＦ段階における濃縮度合を有意に高くしようとすると典型的に沈澱が更に増加することからそれの達成は容易ではない。それによって、処理すべき体積が非常に大きくなることから、次に行う処理段階の速度が遅くなる可能性がある。このことは特に連続潅流工程に当てはまる、と言うのは、この工程ではバッチ式発酵に比べて生成物のタイターが相対的に低くかつ処理体積が相対的に高いからである。
【０００６】
細胞培養上澄み液は幅広い範囲の化合物で構成されている。それらには、細胞培養培地、例えば非イオン性ブロック共重合体、特にＢＡＳＦが販売しているＰｌｕｒｏｎｉｃ系列の非イオン性ブロック共重合体など、およびシリコンオイル、および細胞が分泌した化合物または細胞溶解で放出された化合物（例えば蛋白質、脂質）などが入っている上澄み液が含まれる。前記非イオン性ブロック共重合体であるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、一般に、哺乳動物の細胞を保護する補足物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として細胞培養培地に入れることが要求される。
【０００７】
本発明は、好適な態様において、生成物である巨大分子の収率の有意な損失も濾過の問題ももたらすことなく細胞培養上澄み液の濃度を非常に高くする方法に向けたものである。本出願者らは、驚くべきことに、生成物である巨大分子と有機重合体（限外濾過中に生成物である巨大分子と一緒に濃縮を受ける）、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ共重合体などが入っている細胞培養上澄み液に最初に１番目の限外濾過を受けさせた後に保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の導電率を例えば注射用蒸留水（ＷＦＩ）、希釈剤または緩衝液を用いた透析濾過などで調整しそして次にその溶液に２番目の限外濾過を受けさせることで前記上澄み液に濃縮を本出願者らが知っている報告された方法のいずれよりも高い収率で高度に受けさせることができることを見いだした。
【発明の開示】
【０００８】
（発明の簡単な要約）
本発明に関連して、溶液成分（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）が入っている出発水溶液から巨大分子を濃縮する方法を提供する。前記溶液成分には巨大分子および有機重合体が含まれる。前記出発溶液に最初に限外濾過を受けさせて前記巨大分子を濃縮することで１番目の保持液を生じさせた後、前記１番目の保持液の導電率を前記有機重合体によって誘発される前記溶液成分の沈澱が実質的に防止されるか或は実質的に逆転するように調整することで２番目の保持液を生じさせ、そして次に前記２番目の保持液に限外濾過を受けさせて前記巨大分子を更に濃縮することで濃縮溶液を生じさせることによって、前記巨大分子の濃縮を行う。好適な態様では、前記導電率を水、適切な希釈剤または緩衝液に対する透析濾過で調整する。
【０００９】
本発明は、好適には、未変性または組換え型蛋白質の水溶液に濃縮を受けさせることに関する。その出発溶液には、好適には、哺乳動物または昆虫細胞培養上澄み液が含まれる。更に、本発明は、好適には、生成物である蛋白質とＰｌｕｒｏｎｉｃ系列のブロック共重合体である有機重合体が入っている細胞培養上澄み液、より好適にはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８ブロック共重合体が入っている細胞培養上澄み液に濃縮を受けさせる方法に関する。本発明は、また、他の有機重合体、例えばポリエチレングリコールまたは消泡性化合物などが入っている細胞培養上澄み液を用いることでも実施可能である。本方法を用いると濃縮係数が高い（即ち２０倍から１００倍またはそれ以上、好適には７５倍から１００倍またはそれ以上の）蛋白質溶液がもたらされる。
【００１０】
本発明は更に生成物、組成物および中間体にも向けたものである。本出願者らは、限外濾過中に一緒に濃縮を受ける有機重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８などによって巨大分子の沈澱が誘発されることを見いだした。また、そのような沈澱は当該溶液のイオン濃度に依存することも見いだした。従って、本発明に従い、巨大分子と有機重合体が入っている溶液に濃縮を受けさせる方法を提供する。本方法は、最初に前記溶液に濃縮を受けさせて１番目の保持液を生じさせ、適切な希釈剤を用いて前記１番目の保持液のイオン濃度を前記有機重合体によって誘発されていくらか起こる溶液成分の沈澱が実質的に防止されるか或は実質的に軽減されるように調整することで２番目の保持液を生じさせそして次に前記２番目の保持液に濃縮を濃度が前記出発溶液の巨大分子濃度より少なくとも５０倍、好適には少なくとも１００倍、更により好適には１００倍以上高くなるまで受けさせることで前記巨大分子を７５−１００％、好適には少なくとも９５．０％、より好適には少なくとも９９．０％の収率、特に好適には前記巨大分子を９９．５パーセント以上の収率で得ることを含んで成る。好適な態様において、前記有機重合体はＰｌｕｒｏｎｉｃ系列の非イオン性ブロック共重合体の一員を含んで成り、より好適にはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含んで成る。任意のさらなる処理段階を実施することも可能である。例えば、そのようにして精製した生成物に凍結、解凍そして解凍後の濾過などを受けさせることで、本発明の方法の生成物である巨大分子の純度を向上させるか或は望ましい治療用投薬物を調製してもよい。
【００１１】
本発明は、特別な態様において、Ｐｌｕｒｏｎｉｃによって誘発されて蛋白質が沈澱を起こすと言った問題を解決することに向けたものである。１番目の段階で、細胞培養上澄み液に濃縮を好適には限外濾過で生成物の損失が最小限である濃縮係数（例えば、元々の濃度に比べて２０倍）まで受けさせる。次に、好適には同じ装置を用いて、前記１番目の段階で得た濃縮液の全部または一部に水（ＷＦＩ）または別の適切な緩衝液に対する透析濾過を受けさせることで、導電率をＰｌｕｒｏｎｉｃによって誘発される生成物沈澱が実質的に防止される点、即ち６ｍＳ／ｃｍ未満、より好適には０．５から５ｍＳ／ｃｍの導電率になるまで低下させる。本明細書で用いる如き導電率の測定は、特に明記しない限り、２２℃で実施した測定である。最後に、その材料にさらなる濃縮を高い最終的な濃度係数（例えば元々の濃度に比べて７５−１００Ｘ）に至るまで受けさせるが、この濃縮では生成物の損失がほとんどまたは全く起こらずかつかさ高い蛋白質の沈澱も最小限である。３段階全部を同じ装置内で実施することができる。そのようにすると一般に複雑さが増すことがほとんどまたは全くなくかつ新しい材料もハードウエア資格認定も全く必要でない。最初の濾過段階を設けることで透析濾過段階中に起こるＷＦＩの消費も緩衝液の消費も最小限になり得る。従って、透析濾過段階中に濾過すべき追加的体積が小さくなる（透析濾過中に追加的に要求される体積が通常は２０％未満、しばしば１５％未満になる）ことから、工程時間全体が有意に長くなることはない。
【００１２】
別の態様では最初の限外濾過段階を設けない。その代わりに、本方法に、最初に出発水溶液（この出発溶液には溶液成分が入っていて、前記溶液成分には巨大分子および有機重合体が含まれる）の導電率を前記有機重合体によって誘発される前記溶液成分の沈澱が実質的に防止されるか或は実質的に逆転するように調整した後に前記溶液に限外濾過を受けさせて濃度が最初の出発濃度より５０倍以上、好適には７５倍以上、より好適には１００倍以上高くなるようにすることを含める。
【００１３】
本発明に従う方法を用いると、濃縮係数を有意に高くする、即ち２０倍から１００倍およびそれ以上にすることが可能になると同時にまた生成物の収率を通常の方法に比べて向上させることが可能になる。本方法を用いた時に得られる工程収率は７５％から１００％、好適には９０％−１００％、多くの場合、９５％に及ぶか或は９９．５％にまで及ぶが、従来技術で達成可能な濃縮係数はずっと低く、１０−２０倍未満のみであり得る。本発明に従う方法を用いるとかさ高い蛋白質の沈澱が有意に減少する。例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造しているＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター２５ｍｌ（フィルター面積が２．８平方ｃｍ）を１０ポンドの圧力で用いて２０倍濃縮液を測定した時の濾過性は６から１０ｍｌの範囲である（１０ｍｌが理論的な最大値である）。これは、従来技術の方法を用いた時の１から５ｍｌに比べて有意な向上である。本発明に従う方法を用いて濃縮した７５倍濃縮液が達成した濾過性（平均で６ｍｌ）の方が、従来技術の通常方法を用いて濃縮した２０倍濃縮液を濾過した時の濾過性（平均で約３ｍｌ、即ち図１７に示した濾過性データを参照）よりも良好である。
【００１４】
本発明は、更に、連続または半連続潅流方法でもたらされた哺乳動物細胞培養物に濃縮を蛋白質濃度が初期上澄み液中の蛋白質濃度に比べて２０倍以上、好適には少なくとも５０倍、特に好適には少なくとも７５倍で有機重合体の濃度が少なくとも２０ｇ／ｌ、好適には少なくとも５０ｇ／ｌの蛋白質溶液が少なくとも７５％、より好適には少なくとも９０％、より好適には少なくとも９９％の収率（前記哺乳動物細胞培養物からもたらされる蛋白質の量を基準にして測定）が得られるように受けさせることにも向けたものである。加うるに、本発明は、哺乳動物細胞培養上澄み液から得た蛋白質溶液にも向けたものであり、この蛋白質溶液の蛋白質濃度は前記上澄み液中の濃度に比べて２０倍でありかつこの上で考察したＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター装置を用いてこれを測定した時の濾過性は少なくとも５ｍｌ、好適には少なくとも６ｍｌである。
【００１５】
本発明の追加的目的、特徴および利点を以下の説明の中に挙げるが、これらは、ある程度ではあるが、本説明から明らかになるか或は本発明の実施によって習得することができるであろう。本明細書に詳細に指摘する手段および組み合わせを用いて本発明の目的、特徴および利点を実現することができかつ得ることができる。
（好適な態様の詳細な説明）
本発明は、連続もしくは半連続潅流発酵およびバッチ式潅流発酵と一緒に用いるに有利である。より好適には、本発明は、連続もしくは半連続潅流発酵に向けたものである。本技術分野で良く知られているように、連続方法を用いた蛋白質の製造は特定の利点を有する。もたらされる蛋白質の品質は一般に生物反応器の中の保持時間が典型的に低いことが理由で良好である。また、連続方法でもたらされた蛋白質は劣化を起こす度合も低い。バッチ式方法では典型的に発酵上澄み液中の蛋白質濃度が高いが、連続方法でもたらされる蛋白質はより希釈された溶液の状態である。
【００１６】
従って、本方法は、連続もしくは半連続潅流工程で得られた蛋白質生成物に濃縮を受けさせるに特に有益である、と言うのは、処理を受けさせるべき蛋白質溶液が比較的希釈された状態であるからである。連続潅流における蛋白質濃度はしばしば１ｇ／ｌよりも有意に低く、時には０．１ｇ／ｌ未満である。下流のさらなる処理を容易に行なおうとするには濃縮係数を高くする、好ましくは１００倍以上にするのが非常に望ましい。加うるに、何らかの理由で望まれるならば、バッチ式にもたらされた蛋白質に関して本発明を用いることも可能である。
【００１７】
本発明は、溶液成分が入っている水溶液から巨大分子を濃縮することを伴う。そのような溶液成分には巨大分子および有機重合体が含まれる。そのような溶液成分には巨大分子および有機重合体が含まれる。そのような溶液成分には、また、他の化合物、例えば細胞培養上澄み液に通常存在する化合物なども含まれ得る。例えば、そのような成分には細胞培養培地の補足物、例えばシリコンオイルおよび消泡剤など、および細胞が分泌したか或は細胞溶解で放出された化合物（例えば蛋白質および脂質、例えば宿主細胞に存在するそれら）が含まれ得る。
【００１８】
本発明は、特に、有機重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ系列のブロック共重合体の一員が入っている、より好適にはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（これは蛋白質製造工程で用いられるいろいろな細胞培養培地の必須成分である）が入っている溶液に関して用いるに有用である。また、他の有機重合体も限外濾過中に所望巨大分子と一緒に濃縮を受けることで巨大分子または蛋白質の沈澱をもたらすと考えている。従って、本発明の方法を、一緒に濃縮を受ける他の有機重合体、例えばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、消泡性重合体および他の重合体などが入っている溶液の濃縮にも適用する。蛋白質の沈澱はたいてい限外濾過後の濃縮溶液が示す誘電率が低くなる結果として起こるばかりでなくその一緒に沈澱する有機重合体と巨大分子の溶媒和に要する水分子の競合が高まる結果として起こると考えている。
【００１９】
有機重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８などの濃度が高くなることで巨大分子の沈澱が誘発される基本的な機構は、本実施例に具体的に考察するそれを超えて、他の蛋白質と巨大分子が入っている溶液にも当てはまると考えている。従って、本発明の方法は多種多様な有機重合体および巨大分子に関しても使用可能である。本発明の方法で用いる巨大分子の溶液は、巨大分子、好適には大型の生物学的巨大分子、より好適には蛋白質のいずれかが入っている溶液であってもよい。１つの態様では、本発明に従う方法を組換え型蛋白質インターロイキン２選択的作動薬（「ＩＬ−２ＳＡ」）に関して用いることができる。本発明の技術を用いて処理を受けさせることができる他の組換え型蛋白質生成物には、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．がＫｏｇｅｎａｔｅ（商標）として販売している組換え型ヒトＩＩＩ因子、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．がＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）として販売している組換え型インフリキシマブ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  ＪｏｈｎｓｏｎがＲｅｏｐｒｏ（商標）として販売している組換え型アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．がＦａｂｒａｚｙｍｅ（商標）として販売しているアガルフィダフェベータ（ａｇａｌｆｉｄａｆｅ  ｂｅｔａ）、Ｗｙｅｔｈ  ＡｙｅｒｓｔがＲｅｆａｃｔｏ（商標）として販売している組換え型抗血友病因子、およびＢａｘｔｅｒ  Ｉｎｃ．がＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（商標）として販売している組換え型抗血友病因子、そしてそれらの第二および第三世代更新のいずれかおよび全部ばかりでなく他の数多くの蛋白質生成物が含まれる。
【００２０】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の主な機能は、細胞をスパージング（ｓｐａｒｇｉｎｇ）（これは生産規模の生物反応器の中に酸素が充分に送り込まれることを確保する目的で必要である）によって引き起こされる可能性のある損傷から保護する機能である［例えばＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９８８；ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９９０；Ｊｏｒｄａｎ他、１９９４（引用することによって本明細書に組み入れられる）を参照］。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８のような保護用物質を添加しないと、細胞が気体−液体界面に接着してしまう（ＣｈａｌｍｅｒｓおよびＢａｖａｒｉａｎ、１９９１）。その後、気泡が崩壊する時に細胞が非常に高いせん断応力を受ける。最大エネルギー逸散率は気泡の直径に応じて９．５２＊１０７Ｊ＊ｍ−３＊ｓ−１に及ぶと報告されており、気泡が小さければ小さいほど曝気を充分に行う必要があるが、それによってもたらされるせん断応力もまた高い（Ｂｏｕｌｔｏｎ−ＳｔｏｎｅおよびＢｌａｋｅ、１９９３；Ｇａｒｃｉａ−Ｂｒｉｏｎｅｓ他、１９９４）。比較として、境界明瞭な流れ場（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄｓ）の中で細胞死をもたらすエネルギー逸散率は１０４−１０７Ｊ＊ｍ−３＊ｓ−１の桁であることが知られている（例えばＳｃｈｕｒｃｈ他、１９８８、Ａｕｇｅｎｓｔｅｉｎ他、１９７１）。
【００２１】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、細胞が空気−液体界面に接着しないようにすることで細胞がそのような高いせん断応力を受けないように保護するが（Ｇａｒｃｉａ−ＢｒｉｏｎｅｓおよびＣｈａｌｍｅｒｓ、１９９２）、それはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が動的表面張力を下げる結果であると思われる（Ｍｉｃｈａｅｌｓ他、１９９５ｂ）。その上、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は細胞膜と直接相互作用する結果としてせん断感受性を有意に下げることも分かっている（Ｇｏｌｄｂｌｕｍ他、１９９０；Ｍｉｃｈａｅｌｓ他、１９９１）。
【００２２】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８による保護の度合は培地中のそれの濃度に依存する。文献では、多くの場合、１ｇ／ｌが最適であると見なされている（例えばＭｉｚｒａｈｉ、１９８４、Ｍａｉｏｒｅｌｌａ他、１９８８）。また、ＩＬ−２ＳＡの場合、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度を好適には１ｇ／ｌ（０．１％）にする。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃの構造および命名
Ｐｌｕｒｏｎｉｃは一般に親水性ポリオキシエチレン（ＰＥＯ）ブロック間に中心の疎水性ポリオキシプロピレン（ＰＰＯ）ブロックを含んで成り、従って、一般にＰＥＯｍ−ＰＰＯｎ−ＰＥＯｍトリブロック分子であると記述可能である（図１を参照）。ＰＥＯブロックの数はいろいろなＰｌｕｒｏｎｉｃで異なり、ｍ＝２−１３０である一方、ＰＰＯブロックの数はｎ＝１５−６７に及んで多様である。ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ  ＮＪ）が供給している如きＰｌｕｒｏｎｉｃの命名には、物理的形態を示す文字コード、即ち液状（Ｌ）、ペースト（Ｐ）またはフレーク（Ｆ）が含まれている。その文字の後に２桁また３桁の数字が続く。最初の数字、即ち３桁コードの場合の最初の２桁の数字に３００を掛けた値が、疎水性ＰＰＯ部分のおおよその分子量を示す。最後の桁の数字に１０を掛けた値が分子全体の中の親水性ＰＥＯのおおよその含有量を示す（例えば「８」はＰＥＯが８０％であることを表す）。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の物性
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８はＰＥＯ含有量が８０％の固体（フレーク）である。分子全体の平均分子量は約８．４ｋＤ（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．、ＮＪ）である。この分子は親水性ＰＥＯの含有量が高い（即ち８０％）であることから、他のいろいろなＰｌｕｒｏｎｉｃに比べて高い溶解性を示す（２５℃の水に＞１００ｇ／ｌ；製造業者であるＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．、ＮＪの情報）。
【００２３】
通常の界面活性剤とは対照的に、そのような両親媒性トリブロック共重合体が形成するミセルは本質的により複雑であり、一般に、明確なＣＭＣ（臨界ミセル濃度、即ち所定温度でミセルが生じる時の濃度）もＣＭＴ（臨界ミセル温度、即ち所定濃度でミセルが生じる時の温度）も観察されない。その代わりに、光散乱および／または分光技術、例えば蛍光プローブ（ＡｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓおよびＨａｔｔｏｎ、１９９５）などを用いた時に見られるＣＭＣおよび／またはＣＭＴの範囲は幅広い。この範囲は一般に＞１００ｇ／ｌである。ミセルの形成はエントロピーで推進されかつミセル形成の自由エネルギーは主に疎水性ＰＰＯブロックの関数であることから、主に親水性特徴を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は室温の水中では容易にはミセルを形成しない（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ他、１９９４）。その代わりに、水中の濃度を１０ｇ／ｌにした時のＣＭＴは約４５−５０℃である一方、濃度を１００ｇ／ｌにした時のＣＭＴは約３０−３５℃である。従って、室温の時のＣＭＣは＞１００ｇ／ｌである（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ他、１９９４）。
【００２４】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、最初の濃縮／単離でしばしば利用される限外濾過段階中にいくらか起こる追加的膜汚れの原因になることが知られている。この上で引用したＳｃｈｕｌｚ他（１９９７）が考察したように、限外濾過中に二次的な膜が生じ、それの特性によって有機重合体の保持が左右される。その結果として、高分子量のカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）膜を用いた時でさえＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が少なくともある程度ではあるが保持され、それが起こり得るのは特に大型の生成物（例えば１００ｋＤ）の場合のみである。従って、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を濾過工程で除去するのは非常に困難である（Ｓｃｈｕｌｚ他、１９９７）。
【００２５】
例えば、組換え型蛋白質（ＩＬ−２ＳＡ）単離方法で得られたデータが示されている。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が限外濾過工程中に一緒に濃縮を受けることで濃縮係数が２０−２５倍を超えると（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が培地中１ｇ／ｌの時に）有意な蛋白質沈澱が誘発されると言った詳細な調査が示された。
【００２６】
本発明の方法は限外濾過を伴うが、これは、本分野の技術者に公知の標準な装置および条件を用いて達成可能である。本発明は、また、溶液の導電率を調整する段階も伴う。これは、本分野の技術者に公知の如何なる方法で達成されてもよい。特に透析濾過、希釈またはゲル濾過が好適である。透析濾過が最も好適である。本明細書で用いる如き「溶液」は溶液または懸濁液を指す。
【００２７】
以下の実施例で本発明を更に詳細に記述するが、本実施例は詳述の目的で含めるものであり、記述する如き本発明を限定するものでない。
［実施例１］
【００２８】
沈澱物の性質の同定
細胞培養上澄み液に限外濾過濃縮を受けさせている間に生じた沈澱物を赤外分光法で分析することで蛋白質が沈澱物の主成分であることが明らかに分かっている。
【００２９】
ＩＬ−２ＳＡ発酵から２５倍濃度の収穫物を得た。その上澄み液に遠心分離を受けさせた後、その沈澱物をＰＢＳに再溶解させた。ＵＦ濃縮収穫物、２５倍濃縮物の上澄み液および沈澱物再溶解液をＳＤＳゲル電気泳動法に続く銀染色（図３ａを参照）および抗−ｈＩＬ−２ＳＡ−抗体による免疫染色（ＺＡＰ分析）で分析した（図３ｂを参照）。前記沈澱物を緩衝液に少なくともある程度再溶解させると実際にそれに蛋白質が有意な量で入っていることが図３ａの（４）から分かるであろう。図３ｂの（４）から分かるであろうように、ＩＬ−２ＳＡもまたいくらか沈澱する。しかしながら、沈澱したＩＬ−２ＳＡの量は相対的に少ないと思われ［３ｂの（４）と（３）を比較］、これは、通常の限外濾過方法におけるかなり妥当な収率である約９０％に一致している。従って、細胞培養上澄み液に限外濾過を受けさせている時に見られる沈澱物は大部分がかさ高い蛋白質（宿主細胞の蛋白質）が沈澱することで生じた沈澱物であると結論付けることができる。
［実施例２］
【００３０】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が一緒に濃縮
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の平均分子量は８．４ｋＤであり、これは比較的大きい。限外濾過工程中に二次的膜が生じかつ交差流通路に沿った条件は本質的に均一ではないことから、通常のＵＦ技術が示す選択率では、一般に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃの大きさの範囲の分子を有意に分離するのは不可能である。ｒＦＶＩＩＩまたはｇｐ２２０／３５０のように最も大型の蛋白質生成物で用いられる如き１００ｋＤのＵＦ膜を用いた時でも、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の如き重合体が有意に保持されて一緒に濃縮を受けることが一般に観察される（例えばＳｃｈｕｌｚ他、１９９７を参照）。整数分子量カットオフ（ｎｏｍｉｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）（ＮＭＷＣＯ）が例えば１０ｋＤの限外濾過過程中にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が示す保持係数は１（または１００％）に近いであろうと仮定することができる。発酵中に充分な細胞保護を得るに必要なＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度（培地中の）は１ｇ／ｌ（０．１％）であることから、従って、３０倍に濃縮すると結果としてＵＦ濃縮液中のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は３０ｇ／ｌ（または３％）になるであろう。
【００３１】
このような仮定を立証する目的で、濃縮係数がいろいろな保持液サンプル（１Ｘ＝培養上澄み液、２Ｘ、４Ｘ、８Ｘ、１６Ｘおよび約５０Ｘ）に薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析を受けさせた。結果として得た推定Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度は１Ｘおよび２Ｘの場合には１−２ｇ／ｌであり、４Ｘの場合には４ｇ／ｌであり、８Ｘの場合には４−１０ｇ／ｌであり、１６Ｘの場合には１０ｇ／ｌでありそして５０Ｘの場合には５０ｇ／ｌであった。ＴＬＣ方法は本質的に正確ではないことを考慮すると、そのような結果は明らかにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８のほとんど全部が一緒に濃縮を受けたことを立証している。
【００３２】
このようにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が一緒に濃縮を受けると、勿論、生成物の溶液の粘度が高くなると言った追加的影響が生じる。図４から分かるであろうように、いくつかのＵＦ実験で得た濃縮液が示した粘度特徴（推定Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度の関数として）は、実際、培養培地または希培養培地のいずれかを用いて生じさせた既知濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液のそれと同様である。
［実施例３］
【００３３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８添加実験
限外濾過保持液中の最終Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度は一般に非常に高いことが分かっていることから、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度をそのように高くした時に蛋白質の溶解性が受ける影響を特徴付ける目的で、培養上澄み液およびいろいろな濃度係数の濃縮液を用いた添加実験を実施した。図５から分かるであろうように、前以て濃縮を受けさせておいた培養上澄み液のサンプルにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を添加すると実際に強烈な沈澱が生じる。予測したように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８によって誘発される沈澱は濃度係数が高ければ高いほど激しく起こると思われる。図６に、溶液の中に残存する総蛋白質（遠心分離後）をブラッドフォード検定で測定した時の値を濃縮係数およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度の関数として示す。この結果はＡ５８０測定値と一致しており、添加したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度および全体としての濃縮係数の関数として蛋白質が析出することを立証している。図７から分かるであろうように、そのことは原則としてまたＩＬ−２ＳＡ生成物分子の例にも当てはまる。
【００３４】
このようにＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度を高くすると蛋白質の沈澱が誘発されるが、これは下記の２つの影響によって引き起こされると考えている。１番目として、水分子がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の親水性ＰＥＯブロックと結合すると水分子が蛋白質の水和外皮（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｈｕｌｌ）で利用される度合が低くなる。２番目として、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度が高くなると培地の誘電率が低くなることから蛋白質分子間のクーロン相互作用が高くなる。全体としてもたらされる結果は静電遮蔽の低下であり、従って、その系が蛋白質分子と完全に溶媒和する能力が低下する。
【００３５】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度が約２０−３０ｇ／ｌになると蛋白質が沈澱し始める（図８を参照）。これは、通常の方法では約２０−２５倍に濃縮した時にひどい沈澱が起こり始めることと一致している、と言うのは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の出発濃度が培地中１ｇ／ｌで保持が１００％の時の最終濃度は２０−２５ｇ／ｌであるからである。
【００３６】
ＩＬ−２ＳＡの例の場合、生成物分子の沈澱はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度がいくらか高い時に起こり（図９を参照）、このことは、そのような沈澱が起こると結果として次の段階で生じる損失が高くなりはするが通常方法を用いてＵＦ工程自身でかなり妥当な収率が得られることを説明している。
（比較実施例４）
【００３７】
蛋白質の沈澱を最低限にする流体力学的方策
蛋白質の沈澱を最低限にしようとする場合、その系の中の最大蛋白質濃度を最低限にすべきである。所定の交差流限外濾過装置では、保持されている溶質が対流によって膜表面の方向に移動することから、膜表面の所の層流境界層の中で最大蛋白質濃度に到達する、即ちそれはｃｗａｌｌに相当する。簡単な質量平衡による当然の結果として壁の所の濃度は指数関数的に透過流量（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｆｌｕｘ）Ｊと物質移動係数ｋＤに依存する（図１０を参照）：
【００３８】
【数１】
0004500683.tif 000002
【００３９】
完全な保持の場合の質量平衡（Ｒ＝１；図１０を参照）
空間が満たされている流路および膜表面の所の層流境界層の中で乱流が起こる場合（フィルムモデル）、下記の質量平衡が当てはまる：
（膜の所の蛋白質質量の蓄積）＝（対流輸送）−（拡散逆輸送）
【００４０】
【数２】
0004500683.tif 000003
【００４１】
ここで、ｄｍ／ｄｔ＝ｃ＊Ｆ（Ｆ＝膜を貫通する体積流量［例えばリットル／時］）
【００４２】
【数３】
0004500683.tif 000004
【００４３】
定常状態における表面の所の蛋白質蓄積は＝０であり、変数分離法によって下記がもたらされる：
【００４４】
【数４】
0004500683.tif 000005
【００４５】
ｙ＝０（ｃ＝ｃｗａｌｌ）からｙ＝境界層厚δ（ｃ＝ｃｂｕｌｋ）まで積分：
【００４６】
【数５】
0004500683.tif 000006
【００４７】
すると結果として下記がもたらされ：
【００４８】
【数６】
0004500683.tif 000007
【００４９】
従って、比流速（完全な保持）：
【００５０】
【数７】
0004500683.tif 000008
【００５１】
がもたらされる。従って、調整した任意の濾液流量Ｊに関して正規化した表面濃度は下記である：
【００５２】
【数８】
0004500683.tif 000009
【００５３】
記号表
Ａ      面積
Ｃ      濃度
ｃｅｑ    平衡状態の濃度
Ｄ      拡散係数
δ      層流境界層の厚み
Ｆ      体積流量
Ｊ      透過流量
ｋＤ      物質移動係数
Ｍ      質量
ｑｅｑ    平衡状態で樹脂１単位当たりに結合した質量
物質移動係数（これはシャーウッド数とレイノルズおよびシュミット数を経験的または半経験的に相互に関係付けることを基にして推定可能）は当該系における交差流速およびそれの幾何に依存する。しかしながら、せん断力と圧力発生の固有のカップリングが理由で通常の交差流装置の中の物質移動を最適にするのは困難である［即ち、Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．：「Ｋｏｎｔｒｏｌｌｉｅｒｔｅ  Ｓｃｈｅｒａｆｆｉｎｉｔａｔｓｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｅｉｎｅ  ｎｅｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ｚｕｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｅｒｔｅｎ  Ａｕｆａｒｂｅｉｔｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  ａｕｓ  ｔｉｅｒｉｓｃｈｅｒ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ」、Ｆｏｒｔｓｃｈｒ．−Ｂｅｒ．  ＶＤＩ  Ｒｅｉｈｅ  １７、Ｎｒ．１８５、ＶＤＩ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｄｕｅｅｓｅｌｄｏｒｆ、ＩＳＢＮ  ３−１８−３１８５１７−２．ＩＳＳＮ  ０１７８−９６００、１９９９、Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．、Ａｎｓｐａｃｈ，Ｂ．、Ｋｒｏｎｅｒ，Ｋ．−Ｈ、Ｐｉｒｅｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｈａｙｎｅｓ，Ｃ．Ａ．：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｈｅａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＣＳＡＦ）：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７８巻、７、８０６−８１４頁、２００（両方とも引用することによって本明細書に組み入れられる）を参照のこと］。より具体的には、ｋＤを大きくしようとして交差流速を高くするとまた流路内の圧力降下も大きくなってしまう。それによって今度は不均一な条件が作り出され、そのような条件ではｃｗａｌｌが流路に沿って変化し得る。
【００５４】
如何なる場合にも、Ｐｌｕｒｏｎｉｃによって誘発される全蛋白質沈澱をｃｗａｌｌを低くしようとする流体力学的アプローチで軽減することができるとしても若干のみであり、このように、より高い濃度係数を追加的収率損失無しに達成しようとしても僅かのみであることが分かっている。従って、基本的に新しい解決法が求められていたが、本発明に従う方法および生成物を用いることで、そのような問題を成功裏に解決した。
［実施例５］
【００５５】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃによって誘発される蛋白質沈澱に対して導電率が示す影響
蛋白質が細胞培養培地および収穫物の生理学的条件下で示す溶解度は一般に良好である。しかしながら、細胞培養上澄み液を濃縮するとＰｌｕｒｏｎｉｃの濃度が高くなることで蛋白質の水和外皮から水がより多い量で引き抜かれ、それによって、蛋白質間の疎水性相互作用が熱力学的に推進される可能性が非常に高くなり、その結果として、最終的に蛋白質の沈澱が起こると言った仮説を立てた。そのような状況は、実際、蛋白質の溶解性を維持するに要する水分子の「競合が高まる」ことを特徴とし得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃを有効に分離するのは不可能であることから、さらなる添加実験を用いて、ＷＦＩ（注射用蒸留水）に対する透析濾過によって塩含有量を低くするのが蛋白質溶解の維持に役立つか否かを試験した。導電率を１１−１２ｍＳ／ｃｍ（収穫物の場合の如き）から約１−１．５ｍＳ／ｃｍにまで低くした図１１から分かるであろうように、蛋白質が沈澱を起こすのはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度が高い時のみであると思われる。
【００５６】
導電率の影響を立証する目的で、導電率が低いサンプルに塩を添加して細胞培養上澄み液の元々の導電率を回復させた（図１２を参照）。透析濾過を受けさせた５０Ｘ濃縮液（約０．９ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．１４）にＮａＣｌ（１Ｍの原液）を混合下で段階的に添加することで導電率を上昇させた。Ａ５８０吸収が上昇し、可溶蛋白質が減少することから塩を添加すると低くなっていた導電率の効果が逆転することが分かる。この場合、Ａ５８０で測定されるように、強烈な蛋白質沈澱が誘発される（図１２を参照）。
【００５７】
このような結果は、塩の濃度を低くすると生成物の沈澱が有意に減少するか或は沈澱しなくなることさえあり得ることを示している。
［実施例６］
【００５８】
ｐＨが沈澱に対して示す影響
導電率を低くすると（即ち０．５から５、特に１．２ｍＳ／ｃｍ）沈澱が効率良く回避されることが図１３から分かるであろう。そのような条件は、例えば、ｐＨを６．７より高いｐＨに維持することなどで達成可能である。ｐＨが約６．７未満にまで低下すると、沈澱が起こったことを示すＡ５８０上昇が起こると同時に材料の濾過性が低下し始める。細胞培養発酵物のｐＨをほぼ中性条件（明らかに沈澱が最小限になる範囲内）に制御することを注目すべきである。貯蔵中にｐＨが低下する可能性はあるが、貯蔵収穫物の中にいくらか残存する生存細胞が示す代謝活性は４℃の貯蔵温度では低いことから無視することができる。それとは対照的に、細胞培養培地の緩衝系はしばしば重炭酸塩が基になっていることから、ＣＯ２の発生（例えばＵＦ中）によってｐＨが更に若干上昇する。如何なる場合にも、ｐＨ値が妥当に高い場合には沈澱が導電率に関して示す感受性の方がｐＨに関して示す感受性よりも高い（図１４を参照）。
［実施例７］
【００５９】
本発明の好適な単離計画：ＵＦ／ＤＦ／ＵＦ
本発明の好適な方法は限外濾過、透析濾過に続く限外濾過（「ＵＦ／ＤＦ／ＵＦ」）を含んで成る（図１５を参照）。１番目の段階で細胞培養上澄み液に限外濾過による濃縮を生成物の損失を引き起こさないと認識される濃度係数、例えば２０Ｘにまで受けさせる。次に、同じＵＦ装置内で、その濃縮液に水（ＷＦＩ）または緩衝液に対する透析濾過を受けさせることで、導電率をＰｌｕｒｏｎｉｃによって誘発される生成物沈澱が効率良く防止される点にまで低くする。最後に、その材料にさらなる濃縮を生成物の損失が起こらずかつかさ高い蛋白質の沈澱が最小限であるように受けさせることで非常に高い最終的濃度係数（例えば７５−１００Ｘ）を達成する。最初に行う濃縮は水／緩衝液の消費量および全工程時間を最小限にすることを意図したものである。このような段階を用いることで、次の透析濾過を受けさせるに必要な体積が細胞培養上澄み液の出発体積のほぼ１５％のみになる。透析濾過後に濃縮を再開して非常に高い最終的濃縮係数に到達させる（例えば＞７５−１００倍）。そのようにイオン濃度を低くしたことから、蛋白質は溶液の状態のままでありかつ濾過性も高いままである。
【００６０】
望まれるならば、３段階全部を同じ装置内で実施してもよい。そのようにすると複雑さが増すことはなくかつ新規な材料もハードウエア資格認定も全く必要でない。最初のＵＦ段階を設けるとＷＦＩの消費量が最小限になる。従って、ＤＦ段階中に濾過すべき追加的体積が低く（通常は１５％以上低く）なることから、全工程時間が有意に長くなることはない。
【００６１】
図１６に、ＩＬ−２ＳＡの例に関して２０Ｘから１００Ｘの最終的濃度係数に至るいろいろな段階で測定した本発明に従う方法の収率を示す。分かるであろうように、本新規方法を用いると通常方法に比べて濃度係数を有意に高くすることができると同時に生成物の収率を最大限にすることができる。濃度係数が５倍高くなりかつ収率が最大限になる。図１７に示した濾過性データから分かるであろうように、沈澱が有意に減少する。
［実施例８］
【００６２】
高いＰｌｕｒｏｎｉｃ濃度が下流の処理／カチオン交換クロマトグラフィーに対して示す影響
本ＵＦ−ＤＦ−ＵＦ方法を用いるとより高い濃度係数を達成することができることは、１番目の精製塔の中に入る当該材料のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度も同様に高くなる、例えば目標値である７５Ｘの場合には約７５ｇ／ｌ（または７．５％）にまで高くなることを意味する。従って、そのように高いＰｌｕｒｏｎｉｃ濃度が下流の最初の精製段階に対して否定的な影響を与える可能性があるか否かを評価するさらなる試験を実施した。最初の精製段階はしばしばカチオン交換クロマトグラフィーである。図１８に、２０℃の標準的なイオン交換樹脂がＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の追加的添加有り無しで示した吸着等温線を示す。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は必須培地成分であることから、Ｐｌｕｒｏｎｉｃを全く含有しない濃縮液は利用不可である。しかしながら、「対照」等温線を測定する目的、特に等温線の最初の傾きを測定する目的で、本ＵＦ−ＤＦ−ＵＦ−ＴＣＦ  ７５倍濃縮液を１６０倍希釈することで非常に低いＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度を得た。それとは対照的に、前以て希釈しておいた培地にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を７５ｇ／ｌ入れることで生じさせた溶液を用いた希釈で等温線のあらゆる点のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の最終濃度である７５ｇ／ｌを生じさせた。この図から分かるであろうように、両方の等温線とも非常に類似しており、このことは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃの濃度を高くしても吸着熱力学に否定的な影響が生じることはないことを示している。
【００６３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃは実際にあらゆる限外濾過工程中に一緒に濃縮を受ける。その結果として蛋白質の沈澱が誘発されるが、これは一般に濃度係数がほぼ２０−２５倍の時に始まる。このような「普遍的」蛋白質沈澱問題によって収量の損失がもたらされかつ単離／精製工程中に他の問題がもたらされることで、より高い濃度係数の達成が邪魔される。
【００６４】
ＩＬ−２ＳＡを模範例として用いて、培養上澄み液のイオン濃度を低くするとＰｌｕｒｏｎｉｃによって誘発される蛋白質沈澱がＰｌｕｒｏｎｉｃの濃度を非常に高くしても効率良く防止されるか或は最小限になり得ることが分かった。
【００６５】
結果として得た新規な単離計画（ＵＦ／ＤＦ／ＵＦ）は沈澱問題に対する効率良い健全な解決法を与えるものである。それによって１００倍に及ぶ濃度（即ち、古い方法に比べて５倍高い濃度）を達成することができることに加えて収率が最大限になりかつ濾過性が向上する。それによって今度は下流のさらなる操作が劇的に容易になる。
【００６６】
その上、結果として得た高いＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度（７５ｇ／ｌ以上に及ぶ）が下流のカチオン交換中のＩＬ−２ＳＡ結合に否定的な影響を与えることはないことも分かった。
【００６７】
従って、本ＵＦ／ＤＦ／ＵＦ工程計画は細胞培養発酵から蛋白質を単離するに非常に適した「プラットフォーム技術」であると主張する。これは性能が向上している以外に実施が健全かつ容易であり、通常のＵＦと同じ標準的限外濾過装置および洗浄手順を用いる。
【００６８】
追加的利点、特徴および修飾形が本分野の技術者に容易に思い浮かぶであろう。従って、本発明の幅広い面において、本発明を本明細書に示しかつ記述した特定の詳細および代表的装置に限定するものでない。従って、本明細書に定義する如き本発明の一般的な概念および相当物の精神からも範囲からも逸脱しない限りいろいろな修飾を成すことができる。
【００６９】
出版された下記の資料は、一般に、限外濾過を用いて哺乳動物および昆虫細胞培養物から産生蛋白質を回収することに関するばかりでなくそれに関連して用いられた特定の材料、例えば重合体などに関する資料である：
Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ，Ｐ．およびＨａｔｔｏｎ，Ｔ．Ａ．：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｉｄｅ）−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ：ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ９６、１−４６、１９９５。
【００７０】
Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓ，Ｐ．、Ｈｏｌｚｗａｒｔｈ，Ｊ．Ｆ．およびＨａｒｔｏｎ，Ｔ．Ａ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２７、２４１４、１９９４。
【００７１】
Ａｕｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．およびＷａｎｇ，Ｄ．Ｉ．Ｃ．：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｈｅａｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｅｌｌｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１３、４０９−４１８、１９７１。
【００７２】
Ｂａｖａｒｉａｎ，Ｆ．、Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｊ．Ｊ．：Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ−ｂｕｂｂｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、ＩＩ：Ｔｈｅ  ｂｕｂｂｌｅ  ｆｉｌｍ  ａｎｄ  ｂｕｂｂｌｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７、２、１５１−５８、１９９１。
【００７３】
Ｂｏｕｌｔｏｎ−Ｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｍ．およびＢｌａｋｅ，Ｊ．Ｒ．：Ｇａｓ−ｂｕｂｂｌｅｓ  ｂｕｒｓｔｉｎｇ  ａｔ  ａ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｆａｃｅ、Ｊ．Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈ．１５４、４３７−４６６、１９９３。
【００７４】
Ｇａｒｃｉａ−Ｂｒｉｏｎｅｓ，Ｍ．Ａ．およびＣｈａｌｍｅｒｓ，Ｊ．Ｊ．：Ｃｅｌｌ−ｂｕｂｂｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄａｍａｇｅ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６５５、２１９−２２９、１９９２。
【００７５】
Ｇａｒｃｉａ−Ｂｒｉｏｎｅｓ，Ｍ．Ａ．、Ｂｒｏｄｋｅｙ，Ｒ．Ｓ．およびＣｈａｌｍｅｒｓ，Ｊ．Ｊ．：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｇａｓ  ｂｕｂｂｌｅ  ａｔ  ａ  ｇａｓ−ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄａｍａｇｅ、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．４９、２３０１−２３２０、１９９４。
【００７６】
Ｇｏｄｂｌｕｍ，Ｓ．、Ｂａｅ，Ｙ．、Ｈｉｎｋ，Ｗ．Ｆ．およびＣｈａｌｍｅｒｓ，Ｊ．Ｊ．：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｌａｍｉｎａｒ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６、３８３−３９０、１９９１。
【００７７】
Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．、Ｓｕｃｋｅｒ，Ｈ．、Ｅｉｎｓｅｌｅ，Ａ．、Ｗｉｄｍｅｒ，Ｆ．、Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｍ．：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇａｓ  ｂｕｂｂｌｅｓ：ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｕｂｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４３巻、１９９４。
【００７８】
Ｍａｉｏｒｅｌｌａ，Ｂ．、Ｉｎｌｏｗ，Ｄ．、Ｓｈａｕｇｅｒ，Ａ．、Ｈａｒａｎｏ，Ｄ．：Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ−Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ．６、１４０６−１４１０、１９８８。
【００７９】
Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、ＭｃＩｎｔｉｒｅ，Ｌ．Ｖ．Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｅ．Ｔ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｆｒｅｅｌｙ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ（ＣＲＬ  ８０１８）ｆｒｏｍ  ｆｌｕｉｄ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｊｕｒｙ。Ｖｉｓｃｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ，Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ａｎｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８、１６９−１８０、１９９１。
【００８０】
Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｎｏｗａｋ，Ｊ．Ｅ．Ｍａｌｉｋ，Ａ．Ｋ．、Ｋｏｃｚｏ，Ｋ．、Ｗａｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．、Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｅ．Ｔ．：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｂｕｂｂｌｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｐａｒｇｅｄ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｄｄｔｉｖｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７、４２０−４３０、１９９５ａ。
【００８１】
Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｎｏｗａｋ，Ｊ．Ｅ．、Ｍａｌｉｋ，Ａ．Ｋ．、Ｋｏｃｚｏ，Ｋ．、Ｗａｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．、Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｅ．Ｔ：Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４７、４０７−４１９、１９９５ｂ。
【００８２】
Ｍｉｚｒａｈｉ，Ａ．：Ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ａｇｉｔａｔｅｄ  ａｎｄ  ａｅｒａｔｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ５５、９３−１０２、１９８４。
【００８３】
Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．、Ｇｏｏｃｈｅｅ，Ｃ．Ｆ．：Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、１９８８。
【００８４】
Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．、Ｇｏｏｃｈｅｅ，Ｃ．Ｆ．：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｓｐａｒｇｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、１９９０。
【００８５】
Ｓｃｈｕｒｃｈ，Ｕ．、Ｋｒａｍｅｒ，Ｈ．、Ｅｉｎｓｅｌｅ，Ａ．、Ｗｉｄｍｅｒ，Ｆ．およびＥｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｍ．：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎａｒ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｍａｓｓ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｊｉｎａｓｅ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７、１７９−１９１、１９８８。
【００８６】
Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃ．、Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ｉｎ：Ｃａｒｒｏｎｄｏ他（編集）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９７。
【００８７】
Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．：「Ｋｏｎｔｒｏｌｌｉｅｒｔｅ  Ｓｃｈｅｒａｆｆｉｎｉｔａｔｓｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｅｉｎｅ  ｎｅｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｋ  ｚｕｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｅｒｔｅｎ  Ａｕｆａｒｂｅｉｔｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  ａｕｓ  ｔｉｅｒｉｓｃｈｅｒ  Ａｅｌｌｋｕｌｔｕｒ」、Ｆｏｒｔｓｃｈｒ．−Ｂｅｒ．ＶＤＩ  Ｒｅｉｈｅ  １７、Ｎｒ．１８５、ＶＤＩ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、ＩＳＢＮ  ３−１８−３１８５１７−２、ＩＳＳＮ  ０１７８−９６００、１９９９。
【００８８】
Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．、Ａｎｓｐａｃｈ，Ｂ．Ｋｒｏｎｅｒ，Ｋ．−Ｈ．、Ｐｉｒｅｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｈａｙｎｅｓ，Ｃ．Ａ．：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｓｈｅａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＣＳＡＦ）：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７８巻、７、８０６−８１４頁、２００２。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
本明細に組み入れられかつ本明細の一部を構成する添付図に本発明の現在のところ好適な態様を示しかつ本図をこの上に与えた一般的な説明およびこの上に与えた好適な態様の詳細な説明と一緒に用いて本発明の原理を説明する。
【図１】図１に、典型的なＰｌｕｒｏｎｉｃブロック共重合体を示す。
【図２】図２：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８添加実験の実験組み立て。サンプルを典型的なＵＦ濃縮実験から採取した［１Ｘ−５０Ｘ；５０Ｘ（最終）サンプルを装置から排出して来る最終的ＵＦ濃縮液から採取した］。標準的な細胞培養培地を用いてＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の溶液を調製した（０−２００ｇ／ｌ）。その結果として２５種類の溶液の行列がもたらされ、上澄み液と比較した最終濃度係数は０．５−２５倍でありかつＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の濃度は０．５から１２５ｇ／ｌである（ＵＦ中にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８が完全に保持されかつ培地中のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度が１ｇ／ｌであると仮定）。
【図３】図３：（ａ）ＳＤＳゲル電気泳動に続く銀染色：（１）＝ＩＬ−２ＳＡ標準（５ｍｇ／ｌ）；（２）＝ＵＦ濃縮収穫物（２５Ｘ）；（３）＝２５Ｘに遠心分離を受けさせた後の上澄み液；（４）沈澱物を１ｍｌの緩衝液に再溶解させた液；（ｂ）ＺＡＰ（抗ｈＩＬ−２−抗体を用いた染色を受けさせたウエスタンブロット）；（１）＝濃縮を受けさせていない収穫物；（２）＝ＵＦ濃縮収穫物（２５Ｘ）；（３）＝２５Ｘに遠心分離を受けさせた後の上澄み液；（４）＝沈澱物を１０ｍｌに再溶解させた液。
【図４】図４：細胞培養培地を用いて調製したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液およびいろいろな限外濾過濃縮液の粘度。ＷＦＩを用いて培養培地の希釈を導電率が１−１．５ｍＳ／ｃｍに到達するように実施した。
【図５】図５：限外濾過を受けさせたいろいろな濃度の培養収穫物にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を添加している時に起こった沈澱（標準的分光光度計を用い、標準的なキュベットを用いて、５８０ｎｍの所の吸光度の上昇で測定）（また図２も参照）。２５Ｘ（最終）サンプルの材料は、最終的に排出された濃縮液から採取した材料であった。
【図６】図６：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８添加実験で遠心分離を行った後に残存する総蛋白質（また図２も参照）。２５Ｘ（最終）サンプルの材料は、最終的に排出された濃縮液から採取した材料であった。
【図７】図７：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８添加実験で遠心分離を行った後に残存する溶液の中のＩＬ−２ＳＡ（また図２も参照）。２５Ｘ（最終）サンプルの材料は、最終的に排出された濃縮液から採取した材料であった。
【図８】図８：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８で沈澱を誘発させた後のかさ高い蛋白質の収率。いろいろな蛋白質濃度の曲線を示す（図２を参照）。２５Ｘ（最終）サンプルの材料は、最終的に排出された濃縮液から採取した材料であった。
【図９】図９：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８で沈澱を誘発させた後のＩＬ−２ＳＡ収率。いろいろな蛋白質濃度の曲線を示す（図２を参照）。２５Ｘ（最終）サンプルの材料は、最終的に排出された濃縮液から採取した材料であった。
【図１０】図１０：（ａ）膜表面の所に保持されている溶質の濃度プロファイル（図式的）、（ｂ）交差流濾過中の圧力分布の不均一さそしてその結果として起こる透過流量不均一さ（Ｖｏｇｅｌ他、２００２による）、「ＴＭＰ」は膜貫通圧力。
【図１１】図１１：Ｐｌｕｒｏｎｉｃによって誘発されて沈澱した総蛋白質およびＩＬ−２ＳＡそして導電率の低下による沈澱減少（添加実験）。低導電率＝１−１．５ｍＳ／ｃｍ。
【図１２】図１２：透析濾過を受けさせた低導電率の濃縮液に塩を添加した時のかさ高い蛋白質の沈澱に対する影響。
【図１３】図１３：ｐＨが沈澱に対して示す影響。ＵＦ／ＤＦ／ＵＦの７５Ｘ濃縮液のｐＨを段階的に下げる目的で濃燐酸を用いた。
【図１４】図１４：異なる２種類のｐＨに関して導電率が沈澱に対して示す影響（濃燐酸を添加することでｐＨを６．０に調整）。両方の場合ともＵＦ／ＤＦ／ＵＦの７５Ｘ濃縮液を用いた。
【図１５】図１５：本発明の好適な態様に従うＵＦ／ＤＦ／ＵＦ単離工程計画。
【図１６】図１６：本発明のＵＦ／ＤＦ／ＵＦ単離工程計画を通常のＵＦ工程と比較した時の性能。
【図１７】図１７：本新規ＵＦ／ＤＦ／ＵＦ単離工程計画によって生じさせた濃ＩＬ−２ＳＡバルク（ｂｕｌｋ）が示した濾過性を通常のＵＦ／ＤＦ方法のそれと比較。
【図１８】図１８：高いＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８濃度（７５ｇ／ｌ）がＩＬ−２ＳＡとカチオン交換樹脂ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の結合に対して示す影響。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図３】
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