(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000009
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、ＭＢＰ（Maltose-Binding Protein)であり、Ｌ１はＧｌｎ−ＩｌｅまたはＬｅｕ−Ｈｉｓであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項２】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項３】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000010
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、ＡＬＢＰであり、Ｌ１はＧｌｎ−Ｖａｌであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項４】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３６のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項５】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000011
ここで、ＢＰ（Binding Proteins）は、ＡＲＢＰであり、Ｌ１はＰｒｏ−Ａｒｇであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項６】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３７のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項７】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000012
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、ＲＢＰであり、Ｌ１はＡｓｎ−Ａｓｐであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項８】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３８のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項９】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000013
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、配列番号３０のアミノ酸配列のうち６２番目のアミノ酸が変異されたＭＢＰ（Maltose-Binding  Protein)の変異体であり、Ｌ１はＧｌｎ−ＩｌｅまたはＬｅｕ−Ｈｉｓであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項１０】
前記変異はＴｒｐ６２Ａｌａ、Ｔｒｐ６２Ｈｉｓ及びＴｒｐ６２Ｌｅｕから構成された群から選択された何れか一つであることを特徴とする請求項９に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項１１】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３３ないし配列番号３５から構成された群から選択された、何れか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項１２】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000014
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＭＢＰの変異体であり、Ｌ１はＧｌｎ−ＩｌｅまたはＬｅｕ−Ｈｉｓであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項１３】
下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度が向上された蛍光標識蛋白質:
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000015
ここで、ＢＰ（Binding Proteins)は、配列番号３０のアミノ酸配列のうち、Ａｓｐ１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１５Ｐｈｅ、Ｔｒｐ６２Ｔｙｒ及びＧｌｕ１１１Ｔｙｒの変異を含むＭＢＰの変異体であり、Ｌ１はＧｌｎ−ＩｌｅまたはＬｅｕ−Ｈｉｓであり、Ｌ２はＧｌy−Ｓｅｒであり、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescence Protein)及びＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)から構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【請求項１４】
前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３に記載の蛍光標識蛋白質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の蛍光標識蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む組み換えベクターを、バクテリア、酵母、カビ及び動植物の細胞から構成された群から選択される宿主細胞に導入させて得られた組み換え微生物または細胞。
【請求項１７】
下記の工程を含む構造式Ｉの蛍光標識蛋白質の製造方法：
（ａ）請求項１６に記載の組み換え微生物または細胞を培養して蛍光標識蛋白質を発現する工程；及び（ｂ）前記培養微生物または細胞から前記蛍光標識蛋白質を得る工程。
【請求項１８】
下記の工程を含む構造式Ｉの蛍光標識蛋白質を利用した微生物及び細胞内の糖濃度変化の検出方法：
（ａ）請求項１６に記載の組み換え微生物または細胞を培養して、構造式Ｉの蛍光標識蛋白質を発現する工程；及び（ｂ）蛍光分析装備を利用して、前記培養された微生物または細胞内の糖濃度変化を分析する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖濃度に対する向上したシグナルの強度を有する蛋白質バイオセンサー及びその用途に係り、さらに詳細には、糖の結合によって構造的な変化を起こす結合蛋白質の両末端に、相異なる発光波長帯を有する蛍光蛋白質を融合させて、細胞内代謝に関与する多様な糖濃度の変化を、蛍光共鳴エネルギー転移(Fluorescence Resonance Energy Transfer：FRET)による発光量の変化を利用して比較できる蛍光標識蛋白質、及び該蛍光標識蛋白質を利用した糖濃度変化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲから由来したｗｔＧＦＰ（wild type Green Fluorescent Protein)の多様な遺伝子変異であるＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescent Protein)、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescence Protein)、あるいはＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescence Protein)とＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescence Protein)との間のＦＲＥＴ現象を利用した蛍光標識蛋白質センサーの始まりは、サンディエゴ大学のＴｓｉｅｎグループで、１９９７年に‘カルモジュリン(calmodulin)’、及びそれと相互作用する‘Ｍ１３ペプチド’にＥＢＦＰ及びＥＧＦＰを融合させた、‘カメレオン（cameleon）’と名づけた蛍光標識蛋白質であって、細胞内Ｃａ２＋の濃度を測定することによって本格的に始まった(Miyawaki, A.et al., Nature, 388:882, 1997;WO98/40477)。また、１９９７年、Ｈｅｌｌｉｎｇａグループでは、リガンドの結合により構造が変わる微生物のＰＢＰｓ（Periplasmic Binding Proteins)の一種であるＭＢＰ（Maltose-Binding Protein)に蛍光染料を結合させて、生体外部(in vitro)で高い感度を有するセンサーを構築し、つい最近まで多様な種類のＰＢＰｓに適用した事例が報告されている(Marvin, J. S. et al., PNAS, 94:4366, 1997;Robert, M. et al., Protein Science, 11:2655, 2002)。
【０００３】
このような研究に基づいて、２００２年、Ｆｒｏｍｍｅｒグループでは、ＭＢＰの両末端にＥＣＦＰ及びＥＹＦＰを融合させて、生きている酵母で安定的に発現して、ＦＲＥＴにより変わるＥＹＦＰ及びＥＣＦＰの発光量の比率変化を比較する方法で、生きている酵母内でマルトースの濃度を定量的に測定した結果を発表した(Fehr, M.et al., PNAS, 99:9846, 2002;WO03/025220)。同グループでは、同種のＰＢＰｓであるＲＢＰ（Ribose-Binding Protein)、ＧＧＢＰ（Glucose/Galactose-Binding Protein)及びＧｌｎＢＰ（Glutamin-Binding Protein)を利用して、生きている細胞内でそれぞれの物質を定量的に分析する研究結果を発表した(Lager, I.et al., FEBS Lett., 553:85, 2003;Fehr, M.et al., JBC., 278:19127, 2003;Okumoto, S. et al., PNAS, 102:8740, 2004)。その他にも、細胞内の信号伝達に重要な役割を行うＧＴＰ／ＧＤＰの濃度変化を、生きている細胞でリアルタイムで観察した研究 (Mochizuki, N.et al., Nature, 411:1065, 2001)、ボツリヌス(C．botulinum)の神経毒素の活性を測定した研究(Dong, M.et al., PNAS, 101:14701, 2004)、及び細胞内のイノシトール１，４，５−トリリン酸を定量的に測定した研究(Tanimura, A.et al., JBC., 279:38095, 2004)などに、‘カメレオン’と類似した形態の蛍光標識蛋白質を利用して、さらに多様な物質を検出する目的への技術発展が行われてきた。
【０００４】
環境モニタリングなどのバイオセンサーと関連して、さらに他の方向への研究としては、ＲＢＰを、インシリコ蛋白質の設計に基づいた遺伝子の操作により、ＴＮＴ（trinitrotoluene）のような環境有害物質と結合できる蛋白質から再構成した形態の新たな機能を行うバイオセンサーの開発が行われ(Looger, L.L.et al., Nature, 423:185, 2003)、マルトース(Maltose)の結合によって構造の変化を伴う、ＭＢＰの特定部位にラクタマーゼ(β-lactamase)を挿入した蛍光標識蛋白質の構造的な連動に基づいて、マルトースの結合部位にショ糖（sucrose）が結合できる新たな結合蛋白質の再設計に成功した例がある(Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005)。これは、前記‘カメレオン’形態の結合蛋白質に新たな結合蛋白質を導入する方式の、“オーダーメードＦＲＥＴセンサー”の開発が可能であり、したがって、多様な細胞機能の分析に有効に適用できる基盤技術であると言える。
【０００５】
しかし、初期に開発された前記蛍光標識蛋白質は、非常に低いシグナルの強度を表すという短所があり、さらに正確かつ定量的な測定手段として活用するためには、シグナルの強度に優れた蛍光標識蛋白質の開発が要求されている(Fehr, M.et al., Current Opinion in Plant Biology, 7:345, 2004)。また、最近は、このような短所を補完しようとする試みがあり、その一例として、Ｍｉｙａｗａｋｉグループでは、‘カメレオン’のＥＹＦＰ遺伝子を改良するか、または順次置換(circular permutation)する方法で蛍光標識蛋白質の低いシグナルの強度を向上させうるという研究結果を、２００１年から最近まで持続的に発表してきた(Nagai, T.et al., PNAS, 98:3197, 2001;Nagai, T.et al., PNAS, 101:10554, 2004;WO05/036178)。また、Ｆｒｏｍｍｅｒグループでは、ＧＧＢＰまたはＧｌｎＢＰなどの遺伝子に蛍光蛋白質を挿入するイン−フレーム・フュージョン（in-frame fusion）で各蛍光標識蛋白質のＦＲＥＴシグナルの変化を大きく向上させうるという研究結果を発表した(Deuschle, K.et al., Protein Science, 14:2304, 2005)。しかし、蛍光標識蛋白質のシグナルの強度を向上させる目的で前記方法を適用するには、遺伝子の操作に高度な技術が必要であり、さらに、構造及び動的特性の異なる結合蛋白質及び蛍光蛋白質から構成された新たな蛍光標識蛋白質を製作するには、全ての開発過程が初めから改めて設計されねばならないという問題点がある。
【０００６】
従って、本発明者らは、前記問題点を解決するために鋭意努力した結果、結合蛋白質と蛍光蛋白質との間に任意の短い無作為なペプチドを挿入するか、または結合蛋白質に物質が結合する特定部位を遺伝子変異させて高速探索する方法で、多様な糖濃度範囲が感知できるシグナルの強度の向上した蛍光標識蛋白質の製作が可能であるという事実を確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、糖濃度に対する高いシグナルの強度を有する蛍光標識蛋白質及び該蛍光標識蛋白質を利用した微生物内の糖濃度変化の検出方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記蛍光標識蛋白質をコードする核酸及び前記核酸を含む組み換え発現ベクターで形質転換された組み換え微生物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記組み換え微生物を培養することを特徴とする糖濃度に対するシグナルの強度の向上した蛍光標識蛋白質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記構造式Ｉで表示される糖濃度に対するシグナルの強度の向上した蛍光標識蛋白質を提供する。
【００１１】
〔構造式Ｉ〕
0004505439.tif 000002
【００１２】
ここで、ＢＰは、ＭＢＰ、ＡＬＢＰ(Allose Binding Protein)、ＡＲＢＰ(Arabinose Binding Protein)、ＲＢＰ及びＳＢＰ(Sucrose Binding Protein)から構成された群から選択され、Ｌ１及びＬ２は、２つのアミノ酸または短いペプチドから構成され、ＦＰ１は、ＥＣＦＰ、ＥＢＦＰ及びＥＧＦＰから構成された群から選択され、ＦＰ２は、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ及びＲＦＰ(Red Fluorescent Protein)から構成された群から選択される。
【００１３】
本発明において、前記ＢＰは、ＭＢＰであり、前記Ｌ１は、Ｇｌｎ−ＩｌｅまたはＬｅｕ−Ｈｉｓであることを特徴とし、前記蛍光標識蛋白質（ＭＢＰ融合蛋白質）は、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を有しうる。
【００１４】
本発明において、前記ＢＰは、ＡＬＢＰであり、前記Ｌ１は、Ｇｌｎ−Ｖａｌであることを特徴とし、前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３６のアミノ酸配列を有しうる。
【００１５】
本発明において、前記ＢＰは、ＡＲＢＰであり、前記Ｌ１は、Ｐｒｏ−Ａｒｇであることを特徴とし、前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３７のアミノ酸配列を有しうる。
【００１６】
本発明において、前記ＢＰは、ＲＢＰであり、前記Ｌ１は、Ａｓｎ−Ａｓｐであることを特徴とし、前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３８のアミノ酸配列を有しうる。
【００１７】
本発明において、前記ＢＰは、ＭＢＰ変異体であり、前記変異体は配列番号３０のアミノ酸配列のうち６２番目のアミノ酸が変異されたことを特徴とし、前記変異はＴｒｐ６２Ａｌａ、Ｔｒｐ６２Ｈｉｓ及びＴｒｐ６２Ｌｅｕから構成された群から選択された何れか一つであることを特徴とすることができる。
【００１８】
本発明において、前記蛍光標識蛋白質は、配列番号３３ないし配列番号３５からなる群のうち、何れか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とすることができる。
【００１９】
本発明において、前記ＢＰはＳＢＰであることを特徴とし、前記ＳＢＰは配列番号３０のアミノ酸配列を有するＭＢＰの変異体であることを特徴とすることができる。
【００２０】
本発明において、前記変異体は配列番号３０のアミノ酸配列のうち、Ａｓｐ１４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１５Ｐｈｅ、Ｔｒｐ６２Ｔｙｒ及びＧｌｕ１１１Ｔｙｒの変異を含むことを特徴とすることができる、また、前記蛍光標識蛋白質（ＳＢＰ融合蛋白質）は、配列番号３９のアミノ酸配列を有することを特徴とすることができる。
【００２１】
本発明は、前記蛍光標識蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸を提供する。さらに、本発明は、前記核酸を含む組み換えベクターを提供する。
【００２２】
本発明において、前記組み換えベクターは、ｐＥＣＭＹ−ＱＩ、ｐＥＣＭＹ−ＬＨ、ｐＥＣＳＹ−ＬＨ、ｐＥＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ、ｐＥＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ及びｐＥＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌから構成された群から選択されうる。
【００２３】
本発明において、前記組み換えベクターは、標的信号配列（targeting signal sequence）をさらに含むことを特徴とし、標的信号配列及び付着配列をさらに含みうる。
【００２４】
本発明は、また、前記蛍光標識蛋白質をコードする塩基配列を含む組み換えベクターを、バクテリア、酵母、カビ及び動植物の細胞から構成された群から選択される宿主細胞に導入させて得た組み換え微生物または細胞を提供する。
【００２５】
また、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物または細胞を培養して蛍光標識蛋白質を発現する工程と、（ｂ）前記培養微生物または細胞から前記蛍光標識蛋白質を得る工程と、を含む構造式Ｉの蛍光標識蛋白質の製造方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、（ａ）前記組み換え微生物または細胞を培養して、構造式Ｉの蛍光標識蛋白質を発現する工程と、（ｂ）蛍光分析装備を利用して、前記培養された微生物または細胞内の糖濃度変化を分析する工程と、を含む構造式Ｉの蛍光標識蛋白質を利用した微生物及び細胞内の糖濃度変化の検出方法を提供する。
【００２７】
本発明において、前記（ｂ）工程は、蛍光分析装備で蛍光供与体及び受容体の発光量の変化を比較して、微生物または細胞内の糖濃度が分析できる。
【００２８】
本発明において、前記蛍光分析装備は、共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡でありうる。
【００２９】
前記ＢＰのうちＳＢＰは、ＭＢＰで再設計されたプロテインであり(Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005)、前記プロテインに制限されず、検出しようとする物質との特異的な結合が可能であり、かつ検出物質の結合によって構造が変わる蛋白質であればいかなるものでもよい。
【００３０】
前記ＦＰ１及びＦＰ２は、信号発生部として使用した蛍光供与体及び受容体であり、供与体の発光スペクトルと受容体の吸光スペクトルとが互いに重なり合って、ＦＲＥＴを誘発できるものであればいかなるものでもよく、このうち、単量体への発現が可能であり、かつ発現された蛍光蛋白質の吸光係数、量子効率及び光安定性などを考慮すれば、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰが望ましい。前記蛍光標識蛋白質センサーの作動原理は、図１に示す通りである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明はＦＲＥＴの原理に基づいて、既存の蛍光標識蛋白質よりシグナルの強度に優れており、かつ細胞内のマルトースなどの多様な種類の糖濃度をより正確に測定できる糖濃度に対するシグナルの強度の向上した蛍光標識蛋白質を提供する。また、既存のマルトース以外にも、他の多様な種類の糖を検出する蛍光標識蛋白質の製造が可能になり、既存のバイオセンサーとして利用される蛋白質から、信号強度の向上した蛍光標識蛋白質の製造に容易に活用されうるので、さらに普遍的に適用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００３３】
本発明は、生体外部で、または生きている細胞内部(in vivo)に流入されるか、または代謝される物質の濃度を定量的に測定できる蛋白質センサーに関する。また、本発明は、ＦＲＥＴの可能な相異なる二種の蛍光蛋白質の間に、検出しようとする物質の結合により蛋白質の３次元構造が変わる結合蛋白質を融合させた形態のバイオセンサーであって、前記の蛍光標識蛋白質は、検出しようとする物質の結合による結合蛋白質の構造変化が、ＦＲＥＴに変化を誘発して発光の波長を変化させ、このような発光波長の変化は、結合物質の濃度に比例するので、検出しようとする物質の定量的な測定が可能である。
【００３４】
本発明において、蛍光の光学的な特性である‘ＦＲＥＴ’とは、相異なる二種の蛍光物質の間で発生する非放射性エネルギー転移現象であって、励起された状態の供与体の励起準位エネルギーが受容体に伝達される現象である。ＦＲＥＴは、一般的に供与体から放出される短波長が受容体の吸光スペクトルと重なり合い、光子の出現することなく発生するため、共鳴エネルギー転移と言い、これは、供与体と受容体間の長距離双極子の相互作用による結果である。ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、供与体の発光（emission）スペクトルと受容体の吸収（absorption）スペクトルとがスペクトルオーバーラップ（spectral overlap）される範囲、供与体の量子効率（quantum yield）、供与体及び受容体の転移双極子(transition dipoles)の相対的配向(relative orientation)、及び供与体分子と受容体分子間の距離によって変わる。したがって、ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、供与体分子と受容体分子間の距離及び相対的配向から影響を受けるが、Ｆｏｒｓｔｅｒの数式によれば、下記数式１で表される。
【００３５】
【数１】
0004505439.tif 000003
【００３６】
前記数式１で、Ｅは、ＦＲＥＴ効率を表し、Ｒは、供与体と受容体間の距離であって、蛍光物質によって差はあるが、ＦＲＥＴの発生可能な距離は、通常、２〜９ｎｍ以内と定義される。また、Ｒ０は、ＦＲＥＴ効率が５０％になる供与体と受容体間の距離を言い、一般的に、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離またはＦｏｒｓｔｅｒ半径と呼ばれる。Ｒ０は、下記数式２で表される。
【００３７】
【数２】
0004505439.tif 000004
【００３８】
前記数式２で、ｋ２は、配向係数であり、通常、２／３で計算し、供与体の発光及び受容体の吸収の相対的な配向によって０〜４の範囲の値を有する。ｎは、媒質の屈折率であり、通常、２５℃の水は、〜１.３３４であり、ＱＤは、供与体の量子効率である。Ｊ（λ）は、供与体の発光及び受容体の吸収のスペクトル上の重複程度であり、Ｍ−１ｃｍ−１ｎｍ４の単位値を有する(Lakowicz, J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999;Patterson, G.H.et al.,Anal.Biochem.、284:438, 2000;Patterson, G.H.et al.J.Cell Sci.、114:837, 2001)。
【００３９】
これにより、前述したＦＲＥＴの原理を利用して、ＦＲＥＴの供与体及び受容体として作用する蛍光蛋白質であるＥＣＦＰ及びＥＹＦＰをＭＢＰの両末端に融合させた蛍光標識蛋白質を構成した。このような蛍光標識蛋白質（ＭＢＰ融合蛋白質）を、生きている細胞内部で発現させて、内部に流入されるマルトースの濃度を定量的に測定した。さらに詳細には、本発明は、ＦＲＥＴのエネルギー転移効率に影響を及ぼす供与体と受容体間の距離及び相対的な配向に変化を加える目的として、ＥＣＦＰとＭＢＰとの融合部位に任意の短い無作為なペプチドを挿入して、高いシグナルの強度を有するＭＢＰ融合蛋白質を探索する方法で蛍光標識蛋白質を構成し、マルトースが結合するＭＢＰの特定部位に遺伝子操作を加えて、多様な濃度で存在するマルトースが検出できるように構成した。
【００４０】
また、本発明は、次の工程を含む蛍光標識蛋白質（ＭＢＰ融合蛋白質）を改良・製作する方法を提供する。
（１）ＥＣＦＰ−ＭＢＰ−ＥＹＦＰから構成された蛍光標識蛋白質で、ＭＢＰ遺伝子とＥＣＦＰ遺伝子との融合部位の塩基配列を多様化したライブラリーを構築するか、またはマルトースが結合するＭＢＰの特定部位に遺伝子操作を加えた後、ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを構築する工程；（２）前記ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを形質転換させた大腸菌から、シグナルの強度が増加し、かつ定量的な特性を異ならせるＭＢＰ融合蛋白質を高速探索及び分析する工程；（３）前記工程で獲得したシグナルの強度の増加したＭＢＰ融合蛋白質を利用して、単一細胞の内部に流入されるマルトースの濃度を定量的に測定する工程；及び（４）ＭＢＰと類似した構造及び機能を有する他種の結合蛋白質に前記開発方法を適用して、新たな物質を検出する蛍光標識蛋白質を構成する工程。
【００４１】
本発明によるＭＢＰ融合蛋白質は、図１に示すように、ＥＣＦＰ−ＭＢＰ−ＥＹＦＰが、一つのポリペプチドから構成されて巨大な融合蛋白質として発現されるが、ＭＢＰの大きさが３×４×６.５ｎｍ(Spurlino, J.C.et al.、J.Biol.Chem., 266:5202, 1991)であることを考慮すれば、ＥＣＦＰとＥＹＦＰ間の距離(distance)が約５〜６ｎｍであるので、ＦＲＥＴが発生可能な距離である。したがって、４３６ｎｍでＥＣＦＰを励起させれば、ＥＣＦＰの励起準位エネルギーがＥＹＦＰに伝達されて、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰの発光を同時に観察することができる。このように、ＭＢＰ融合蛋白質にマルトースが結合すれば、ＭＢＰの両末端に融合されたＥＣＦＰとＥＹＦＰ間の距離及び相対的な配向が変わり、ＥＣＦＰからＥＹＦＰへのＦＲＥＴ効率の差によって発生する二つの蛍光蛋白質の発光量の比率変化を測定する原理でマルトースの検出が可能であるが、発光量の比率変化は、マルトースの濃度に比例するので、定量的な測定が可能である。
【００４２】
さらに、前記数式２の計算によれば、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰのＦＲＥＴ対は、約５ｎｍのＲ０値を有するので (Patterson, G.H.et al.Anal.Biochem., 284;438, 2000)、ＥＣＦＰとＥＹＦＰ間の距離が約５〜６ｎｍであると仮定すれば、距離または相対的な配向の小さな変化が、ＦＲＥＴ効率には大きな差をもたらしうる。したがって、マルトースとの結合以前のＦＲＥＴ効率を最小化し、マルトースの結合によるＦＲＥＴ効率を極大化することが可能であれば、蛍光標識蛋白質のシグナルの強度が大きく向上することになり、これは、ＭＢＰと二つの蛍光蛋白質との融合部位の構造を変化させることになって、ＥＣＦＰとＥＹＦＰ間の距離及び相対的な配向に変化を与えて、ＦＲＥＴ効率の調節が可能になると予想できる。
【００４３】
これにより、本発明者らは、図２Ａに示すように、ＭＢＰの両末端に多様な組成及び長さを有する連結ペプチドが挿入されるように図案した１１種の遺伝子を、発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（＋）（Novagen、Germany）のＴ７プロモーターとＨｉｓ―６タグの塩基配列との間に存在する制限酵素部位に挿入して、図２Ｂに示すＭＢＰ融合蛋白質発現ベクターを構成した。前記の蛍光標識蛋白質発現ベクターは、生体外部の実験のための発現及び精製の目的で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体内に有している大腸菌である、ＪＭ１０９（ＤＥ３）(Promega、ＵＳＡ)をホストとして形質転換させ、形質転換させた大腸菌をＬＢメディアに培養しつつ、発現誘導物質であるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することによって、ＭＢＰ融合蛋白質の発現を誘導した。それぞれのＭＢＰ融合蛋白質は、ＭＢＰ融合蛋白質の末端に発現されたＨｉｓ―６タグを利用して、Ｎｉ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭが充填されたＨｉｓＴｒａｐＴＭ ＨＰ１(Amersham Biosciences、Sweden)カラムに結合させた後、イミダゾールを利用した勾配溶離（gradient elution）によって精製した。
【００４４】
前記精製された１１種のＭＢＰ融合蛋白質は、次のような方法で、ＭＢＰ融合蛋白質としての蛍光特性を検証した。ＭＢＰ融合蛋白質として使用するための重要な要件の一つは、ＭＢＰの両末端に融合させた蛍光蛋白質によるＭＢＰのマルトース結合に障害があってはならないことである。したがって、ＭＢＰの末端にＥＹＦＰを融合させた蛋白質及び１１種類のＭＢＰ融合蛋白質を対象として、アミロース樹脂（NEB、米国）を利用したプルダウン分析（pull-down assay）によって、マルトースとの結合の程度を次のような方法で確認した。
【００４５】
ＭＢＰ−ＥＹＦＰ及び１１種のＭＢＰ融合蛋白質をそれぞれアミロース樹脂と混合した後、遠心分離して沈殿させ、上澄み液に残っているＥＹＦＰの発光強度を５１０ｎｍの波長で測定して、アミロース樹脂との結合以前のＥＹＦＰの発光強度と比較することによって結合の程度を分析した。図３に示すように、ＭＢＰ−ＥＹＦＰ及び１１種類のＭＢＰ融合蛋白質の残存ＥＹＦＰの発光強度は約７０％であり、ほぼ同じ数値を表した。したがって、ＭＢＰの両末端に融合されたＥＣＦＰ及びＥＹＦＰは、マルトースとの結合に影響を及ぼさないと判断された。
【００４６】
次に、実施例３に詳細に説明された方法により、前記で構成した１１種の蛍光標識蛋白質のＦＲＥＴ効率を分析した。ＦＲＥＴ効率は、４３６ｎｍの波長でＥＣＦＰを励起させて観察されるスペクトルにおいて、ＥＹＦＰ及びＥＣＦＰの最大発光比率である５３０／４８０ｎｍで分析し、図４に示すように、蛍光蛋白質とＭＢＰとを連結するペプチドの長さ及び組成によって異なる結果を表した。
【００４７】
その結果、ＭＢＰ融合蛋白質のＦＲＥＴ効率は、蛍光蛋白質とＭＢＰとを連結するペプチドの長さ及び組成によって変わり、これは、マルトースの結合によるＭＢＰ融合蛋白質のシグナルの強度（Δ比率）にも大きな影響を及ぼすということが確認された。
【００４８】
本発明では、ＣＭＹ−ＢＩＩの発現ベクターであるｐＥＣＭＹ−ＢＩＩのＥＣＦＰとＭＢＰとを連結する６個の塩基配列が、多様な組合わせに置換されるように、突然変異の誘発のためのプライマーとして飽和突然変異（saturation mutagenesis）を加えたＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを構成した。本発明では、ＥＣＦＰ遺伝子の増幅時に使用した逆方向プライマーに６個の任意の塩基配列を置換させて、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間に、２個のアミノ酸からなる多様な組合わせの連結ペプチドを生成させ、同様に、ＭＢＰのＣ−末端にも多様な組合わせの連結ペプチドを生成させることによってライブラリーが構成できた。
【００４９】
前記方法で構成したＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを、大腸菌であるＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換させた後、マイクロチター速蛍光分析装備を使用して、個別のＭＢＰ融合蛋白質のマルトースに対するΔ比率変化を分析する方式で、約４,０００個の融合蛋白質を探索し、シグナルの強度の大きく向上した配列番号３１のＭＢＰ融合蛋白質ＣＭＹ−ＱＩ及び配列番号３２のＣＭＹ−ＬＨを選別した。
【００５０】
一方、既に発表された資料によれば、ＭＢＰのＴｒｐ６２をＡｌａに置換させたとき、ＭＢＰのＫｄ及びマルトースに対する定量範囲を変えうることが確認されたため(Martineau, P.et al., J.Mol.Biol.、214:337, 1990)、ＭＢＰのＴｒｐ６２を多様な種類のアミノ酸に置換させるための遺伝子の操作を行って、マルトースとの結合能力の変わったＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを製造した。本発明では、ＭＢＰのＴｒｐ６２を置換することにしたが、同様に、マルトースと水素結合またはファン・デル・ワールス相互作用(Van Der Waals interaction)を行うと報告された結合部位（binding site）のアミノ酸にも同じ方式で適用可能である。
【００５１】
本発明では、前記方法で構築したＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを、大腸菌であるＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換させた後、探索した結果、シグナルの強度が向上し、かつ定量的な特性の変わった配列番号３３のＭＢＰ融合蛋白質ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ、配列番号３４のＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ及び配列番号３５のＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌを得た。
【００５２】
本発明において、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌの発現ベクターで形質転換させた大腸菌は、２００５年７月１４日に菌株国際寄託機関である生命工学研究所遺伝子銀行(KCTC)（韓国デジョンシユスングオウンドン５２ＫＲＩＢＢ内、３０５−３３３）に寄託番号ＫＣＴＣ  １０８３０ＢＰとして寄託した。しかし、本発明で使用または製作したベクターは、実施例に詳細に説明された方法によって、商業的に購入可能なベクターから通常の操作方法で製作できるので、必ずしも寄託を要するものではない。
【００５３】
本発明に係る物質結合蛍光標識蛋白質の効率的な利用分野は、生きている細胞内部に流入または代謝される物質の濃度を定量的に測定及び分析する分野であって、シグナルの強度の向上したＭＢＰ融合蛋白質を酵母内部で発現して、イメージングで分析した。その例として、ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５(Sohn et al., Process Biochemistry, 30:653、1995)のＧＡＬプロモーターの後位に、ＭＢＰ融合蛋白質の発現可能な遺伝子を挿入させた組み換え発現ベクターであるＹＥＧ−ＣＭＹ−Ｂ、ＹＥＧ−ＣＭＹ−ＢＩＩ、ＹＥＧ−ＣＭＹ−ＬＨ及びＹＥＧ−ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌを構成した。前記で構成したＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターは、栄養要求性(auxotrophic)菌株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２８０５(Sohn et al., Process Biochemistry、30:653, 1995)に形質転換させて、蛍光顕微鏡を利用してＭＢＰ融合蛋白質の発現及びイメージングを分析した。
【００５４】
本発明は、特定物質の結合蛍光標識蛋白質のシグナルの強度を向上させる目的のみに制限されるものではなく、さらに多様な種類のシグナルの強度の向上した蛍光標識蛋白質の開発に幅広く適用可能である。例えば、ＭＢＰの代りに、ＭＢＰと類似した構造及び機能を有するＢＰｓの結合蛋白質のうち、ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰ、ＳＢＰなどを適用することも可能である。
【００５５】
本発明では、前記構成によるＭＢＰ融合蛋白質を利用した新たな結合能力を有する蛍光標識蛋白質を製作するために、既に発表されたＭＢＰの遺伝子を部分的に変異させて製作したＳＢＰ(Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005)の遺伝子を、ＭＢＰ融合蛋白質発現ベクターのＭＢＰ遺伝子の部位に置換して構成しようとした。それにより、ＭＢＰの遺伝子を部分的に変異させて製作したＳＢＰの遺伝子を製作し、既存のＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターであるｐＥＣＭＹ−Ｂ、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ及びｐＥＣＭＹ−ＬＨのＭＢＰ遺伝子の部位に置換・挿入する方法で、ＳＢＰ融合蛋白質の発現ベクターを構成した。
【００５６】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。それらの実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
【００５７】
＜実施例１：ＭＢＰ融合蛋白質の発現用組み換えベクターの構築＞
図２Ａに示すように、三つの蛋白質ドメイン（ＥＣＦＰ、ＭＢＰ、ＥＹＦＰ）及び二つの合成リンカーが連結ペプチド（ｃｃ、ｙｃ）とフランキング（flanking）蛋白質の非構造化された末端領域で組み立てれたマルトースの検出用の蛍光標識蛋白質：ＥＣＦＰ―ｃｃ−ＭＢＰ―ｙｃ−ＥＹＦＰが構築された。本発明のＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターを構築するために、プライマー１〜１１で遺伝子を増幅して発現ベクターを構成した。
【００５８】
まず、ＥＹＦＰの遺伝子を得るために、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター(Clontech、米国)を鋳型とし、５’の末端には、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ制限酵素の認知部位が、３’の末端には、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の部位が導入された配列番号１〜４のプライマーを使用してＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を行った。増幅されたＥＹＦＰ遺伝子は、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した後、ＭＢＰ発現ベクターであるｐＭＡＬｃ２ｘベクター(NEB、米国)の各制限酵素の部位に挿入してｐＭＥＹＦＰ−Ｉ、ｐＭＥＹＦＰ−ＩＩ、ｐＭＥＹＦＰ−ＩＩＩを構成し、前記三種のベクターから、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断したＭＢＰ−ｙｃ−ＥＹＦＰ遺伝子を、ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター(Novagen、ドイツ)の相応する部位に挿入して、ｐＥＴ―ＭＹ−Ｉ、ｐＥＴ―ＭＹ−ＩＩ及びｐＥＴ―ＭＹ−ＩＩＩの発現ベクターを構築した。
【００５９】
次に、ｐＥＣＦＰベクター(Clontech、米国)のＥＣＦＰ遺伝子とｐＭＡＬｃ２ｘベクター(NEB、米国)のＭＢＰ遺伝子を違うＥＣＦＰ側のコネクター（ｃｃ）と共に結合させてＥＣＦＰ―ｃｃ−ＭＢＰ遺伝子を取得した。ＥＣＦＰ遺伝子はＥＣＦＰ遺伝子の３‘末端、ｃｃ及びＭＢＰ遺伝子の５’末端から構成された配列番号５の一個の正方向のプライマーと配列番号６〜９の四個の逆方向のプライマーを用いて増幅した。同様に、ＭＢＰ遺伝子は、ｐＭＡＬｃ２ｘベクターを鋳型として、配列番号１０及び、３’の末端に、ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素の認知部位が同時に導入された配列番号１１のプライマーを使用したＰＣＲを行うことによって得た。
【００６０】
このように増幅されたそれぞれのＥＣＦＰ及びＭＢＰ遺伝子は、互いに重なり合うように製作されたプライマーにより重複伸長重合酵素連鎖反応(overlap-extension PCR)が可能であるので、配列番号５及び配列番号１１のプライマーを利用して、反応液に同量のＥＣＦＰ及びＭＢＰ遺伝子を添加した後にＰＣＲを行って、ＥＣＦＰ及びＭＢＰが合成・増幅された多様な種類の遺伝子を得ることができた。前記増幅されたＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子は、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ＭＢＰ―ｙｃ−ＥＹＦＰの発現ベクターであるｐＥＴ―ＭＹ−Ｉ、ｐＥＴ―ＭＹ−ＩＩ及びｐＥＴ―ＭＹ−ＩＩＩの制限酵素の認知部位に挿入する方法で、ＭＢＰの両末端に、多様な組合わせ及び長さを有する連結ペプチドが生成されうる１１種の融合蛋白質発現ベクターを構築して、ｐＥＣＭＹ系列と名づけ、前記ベクターから発現されたＭＢＰ融合蛋白質をＣＭＹ系列と名づけた（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００６１】
発現ベクターの構成、及び突然変異に利用したプライマーの塩基配列は配列番号１から配列番号２９として配列目録に表した。
【００６２】
＜実施例２：ＭＢＰ融合蛋白質（蛍光標識蛋白質）の発現及び精製＞
実施例１で構築したＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターは、大腸菌であるＪＭ１０９（ＤＥ３）（Promega、米国)に形質転換させ、形質転換された組み換え菌株は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ampicillin）及び０.５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−ｄ−チオガラクトピラノシド）が添加されたＬＢ培地（１％のバクトトリプトン（bacto-trypton）、０.５％の酵母抽出物、１％のＮａＣｌ）に接種して、２８℃で２４時間振盪培養する方法で発現を誘導した。発現が終わった大腸菌を遠心分離によって回収して、５０Ｍｍのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７.５）に分散させ、超音波により細胞膜を破壊し、遠心分離した後、以後の精製工程に使用した。
【００６３】
前記ＭＢＰ融合蛋白質の精製は、ＥＹＦＰのＣ−末端に発現させたＨｉｓ−６タグを利用して、ＦＰＬＣ（Fast Performance Liquid Chromatography、Amersham Biosciences、スウェーデン）に連結させたＨｉｓｔｒａｐＴＭ  ＨＰ１カラム(Amersham Biosciences、スウェーデン)で精製した。精製に使用したバッファは、０.５ｍＭのＰＭＳＦ（Phenylmethylsulphonylfluoride：フッ化フェニルメチルスルホニル）、１ｍＭのＤＴＴ（dithiothreitol：ジチオスレイトール）及び２０ｍＭのイミダゾールが添加された５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ(ｐＨ７.５）であり、カラムに結合させた蛋白質は、０.５Ｍのイミダゾールが添加された５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファで勾配溶離した。精製されたＭＢＰ融合蛋白質は、ＦＰＬＣに連結されたＨｉｔｒａｐＴＭ脱塩カラム(Amersham Biosciences、スウェーデン)に２０％のグリセロールが含まれた、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７.４）で溶出してバッファを交換し、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０ｍｌ(10,000MWCO、Vivascience、ドイツ)で濃縮して、−８０℃の冷凍室に保管した。
【００６４】
＜実施例３：ＭＢＰ融合蛋白質の蛍光分析＞
前記実施例で発現及び精製されたＭＢＰ融合蛋白質の蛍光分析は、蛍光分析装備であるＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｖａｒｉａｎ、オーストラリア）を使用して２５℃で行い、ＭＢＰ融合蛋白質は、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７.４）に０.２μＭの濃度に同じく調節して測定した。蛍光分析は、ＥＣＦＰの励起を４３６ｎｍにしたときに測定される４８０ｎｍでの発光強度、及びＦＲＥＴにより発生する５３０ｎｍでのＥＹＦＰの発光強度の比率を、便宜上、下記数式３に代入する方法でＦＲＥＴ効率を定義した。
【００６５】
【数３】
0004505439.tif 000005
【００６６】
また、蛍光標識のシグナルの強度を表す指標は、１０ｍＭのマルトースが存在する条件でのＦＲＥＴ効率(ratio10mM)と、マルトースが存在していない条件でのＦＲＥＴ効率（ratioapo）との差（Δ比率）で定義した。
【００６７】
前記で発現及び精製されたＭＢＰ融合蛋白質のＦＲＥＴ効率は、図４に示すように、蛍光蛋白質とＭＢＰとを連結するペプチドの長さ及び組成によって異なる結果を表した。例えば、ＭＢＰとＥＹＦＰとの間にＧＳの短いペプチドで連結させたＣＭＹ−Ｂ系列の蛍光標識蛋白質の初期ＦＲＥＴ効率(ratioapo)は、ＣＭＹ−Ｂ（〜１.３）を除いては、相対的に高い数値である〜１.８を表した。これに対し、ＣＭＹ−Ｅ及びＣＭＹ−Ｓ系列のＭＢＰとＥＹＦＰとの間に、約２０個以上のアミノ酸のペプチドで連結された融合蛋白質は、相対的に低いｒａｔｉｏａｐｏである１.２〜１.５の数値を表した。
【００６８】
また、前記で構成した１１種のＭＢＰ融合蛋白質のＦＲＥＴ効率に基づいて、マルトースに対するシグナルの強度を測定した。マルトースのシグナルの強度を表す指標は、既に報告された資料(Fehr, M.et al., PNAS, 99:9846, 2002)から引用して、Δ比率で確認した。対照区としては、ＭＢＰと蛍光蛋白質との間に連結ペプチドのないＣＭＹ−０（Δ比率＝０.０５）を使用し、図４に示すように、ＣＭＹ−ＢＩＩ及びＣＭＹ−ＢＩＩＩＭＢＰ融合蛋白質は、ＥＣＦＰ側のコネクター（図２Ａ）を除いては、最も類似しているものと見られるが、Δ比率値は、ＣＭＹ−ＢＩＩがＣＭＹ−ＢＩＩＩに比べて約６倍以上高かった。また、１１種のＭＢＰ融合蛋白質のうち、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間にＳＲペプチドで連結されたＣＭＹ−ＢＩＩ融合蛋白質が、最も高いΔ比率である０.１７を表した。これに対し、ＣＭＹ−Ｅ及びＣＭＹ−Ｓ系列のＭＢＰ融合蛋白質は、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間の連結ペプチドの種類に関係なく、非常に低いΔ比率値を表すところ、これは、マルトースの結合以前のＦＲＥＴ効率及びマルトースの結合によるＦＲＥＴ効率にほとんど差が無いことを表す。前記結果は、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間の連結ペプチドが、マルトースの結合によるΔ比率に非常に重要な役割を行うと判断された。したがって、ＥＣＦＰとＭＢＰとの連結ペプチドを最適化させて、マルトースの結合によるΔ比率を極大化しようとした。
【００６９】
広範囲の結合物質濃度での比率変化はＳｉｇｍａｐｌｏｔ（SPSS、米国）のＨｉｌｌの方程式及び４―パラメータ（four-parameter）方式を適用した。また、ｒａｔｉｏ１０ｍＭとｒａｔｉｏａｐｏとの中間に該当する結合物質の濃度を、融合蛋白質の解離定数（Ｋｄ）と定めた。
【００７０】
一方、表１に示すように、ＣＭＹ−ＢＩＩのΔ比率、定量的に測定可能なマルトースの濃度範囲及び解離定数（Ｋｄ）は、既に報告されたＦＲＥＴ―基盤ナノセンサーであるＦＬＩＰｍａｌ−２μ（ＦＬＩＰｍａｌ−５ＡＡ）と類似していると確認された(Fehr, M.et al., PNAS, 99:9846, 2002;WO03/025220)。
【００７１】
＜実施例４：ＭＢＰ融合蛋白質ライブラリーの構築及び蛍光標識蛋白質の探索＞
ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーの構築は、ＣＭＹ−ＢＩＩの発現ベクターであるｐＥＣＭＹ−ＢＩＩに基づいて、ＭＢＰとＥＹＦＰとの間には、ＧＳのペプチドが挿入されるように固定させ、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間には、多様な組合わせの２個のアミノ酸から構成された連結ペプチドが挿入されうる変異プライマーを使用して、ＭＢＰ融合蛋白質の組み換え発現ベクターライブラリーを構築した。
【００７２】
具体的に、ＥＣＦＰ遺伝子は、配列番号５及び配列番号１２のプライマーを使用して増幅し、ＭＢＰの遺伝子は、配列番号１０及び配列番号１１のプライマーで増幅した。ＥＣＦＰ及びＭＢＰの遺伝子は、配列番号５及び配列番号１１のプライマーを使用して重複伸長ＰＣＲで合成・増幅し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断して、既に構築されたｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターからＥＣＦＰ−ｃｃ−ＭＢＰの遺伝子を除去した後、増幅された遺伝子を挿入する方法で発現ベクターライブラリーを構築した。したがって、ＥＣＦＰ遺伝子とＭＢＰ遺伝子との間に挿入した６個のＮ塩基（Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す）によって、２個のアミノ酸の組合わせで連結された多様なペプチドが生成されうるが、６個の塩基を考慮した計算的な数値は、４６＝４,０９６である。
【００７３】
前記構築されたＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーは、大腸菌であるＪＭ１０９（ＤＥ３）(Promega、米国)に形質転換させ、得られたそれぞれのクローンを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０.５ｍＭのＩＰＴＧが添加されたＬＢ培地が分株されている９６ディープウェルプレート(deep well plate)（Bioneer、韓国)に接種して、２８℃で２４時間振盪培養して発現させた。発現が終わった大腸菌を、３，０００×ｇで２０分間遠心分離して回収した後、１ユニットのＤＮａｓｅ、２０μｇ／ｍｌのリゾチーム、及び微生物細胞溶解液であるＣｅｌｌｙｔｉｃ  Ｂ(Sigma、米国)を５０％になるように添加した２５０μｌのＰＢＳバッファ（ｐＨ７.４）に１時間分散させて細胞膜を破壊し、さらに３，０００×ｇで２０分間遠心分離して、上澄み液２００μｌを新たな９６ウェルプレートに移して分析した。
【００７４】
発現させたＭＢＰ融合蛋白質ライブラリーの分析は、フィルタ方式の高速蛍光分析装備であるＶｉｃｔｏｒ２(Perkin-elmer、米国)を使用し、４５０／８ｎｍの励起フィルタと、４８０／１０ｎｍ及び５３５／２５ｎｍの発光フィルタとを使用して、ＥＣＦＰ及びＥＹＦＰの発光強度を測定した。シグナルの強度を表す指標は、１０ｍＭのマルトースが存在する条件でのｒａｔｉｏ１０ｍＭと、マルトースが存在していない条件でのｒａｔｉｏａｐｏとのｒａｔｉｏの変化（Δ比率）で定義した。
【００７５】
ＥＣＦＰとＭＢＰとの連結ペプチドを多変化させて製作した約４,０００個のＭＢＰ融合蛋白質ライブラリーの分析結果は、次の通りである。図５に示すように、ＣＭＹ−ＢＩＩに比べてΔ比率の向上したＭＢＰ融合蛋白質は、約５％以内で存在し、結果的に、Δ比率が大きく向上した配列番号３１の融合蛋白質ＣＭＹ−ＱＩ及び配列番号３２のＣＭＹ−ＬＨの選別が可能であったが、ＣＭＹ−ＱＩは、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間にＧｌｎ−Ｉｌｕを介して融合され、ＣＭＹ−ＬＨは、Ｌｅｕ−Ｈｉｓを介して融合されたことが確認された。前記のＣＭＹ−ＱＩ及びＣＭＹ−ＬＨのｒａｔｉｏａｐｏは、それぞれ１.９６及び３.０２であることが確認され、Δ比率は、図６で確認できるように、それぞれ０.３４及び０.５であり、ＣＭＹ−０を基準に、シグナルの強度が約７〜１０倍向上して、マルトースの濃度をより正確かつ定量的に測定できるＭＢＰ融合蛋白質を得ることが可能になった。それらを利用した定量範囲及びＫｄは、表１に示すように、核ＭＢＰ融合蛋白質が 前記実施例３で構築したＣＭＹ−ＢＩＩと類似していると確認された。
【００７６】
＜実施例５：マルトース結合部位の変異された融合蛋白質の構成及び分析＞
既に発表された資料によれば、ＭＢＰのＴｒｐ６２をＡｌａに置換したとき、ＭＢＰのＫｄ及びマルトースに対する定量範囲を変えうることが確認されたため(Martineau, P.et al., J.Mol.Biol.214:337, 1990）、ＭＢＰのＴｒｐ６２を多様な種類のアミノ酸に置換するための遺伝子操作を行って、マルトースとの結合能力の変わったＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを製造した。
【００７７】
マルトースとの結合に重要な役割を行うＭＢＰのＴｒｐ６２を他の種類のアミノ酸に置換するために、ＭＢＰのＴｒｐ６２をコードする塩基配列をＮＮＮ（Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す）に置換した、配列番号１３のプライマー及び配列番号１０のプライマーを使用して、ＭＢＰのＮ−末端部位の遺伝子を増幅させたメガ−プライマーを増幅した。次いで、メガ−プライマー及び配列番号１１のプライマーを使用して、完全な長さの変異ＭＢＰ遺伝子を増幅し、配列番号５のプライマー及び、ＥＣＦＰとＭＢＰとの間にＬｅｕ−Ｈｉｓが生成されるように製作した配列番号１４のプライマーを使用して、ＥＣＦＰの遺伝子を増幅した。ＥＣＦＰ及び変異ＭＢＰ遺伝子は、重複伸長ＰＣＲで連結し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰの部位に置換・挿入して、変異ＭＢＰ遺伝子に置換された発現ベクターライブラリーを構築した。
【００７８】
前記各ＭＢＰ融合蛋白質のＥＣＦＰ遺伝子とＭＢＰ遺伝子との連結部位、及びＭＢＰのＴｒｐ６２部位の遺伝子変異は、配列番号１５プライマーを使用して塩基配列を確認した。
【００７９】
前記方法で構築したＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターライブラリーを、大腸菌であるＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換させた後、マイクロチター速蛍光分析装置Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用して探索した結果、配列番号３３のＭＢＰ融合蛋白質ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ、配列番号３４のＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ、及び配列番号３５のＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌを得ることができた。ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａは、ＭＢＰのＴｒｐ６２部位がＡｌａに置換されたものであって、対照群として使用するために確保し、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈは、ＭＢＰのＴｒｐ６２部位がＨｉｓに置換されたものであり、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌは、ＭＢＰのＴｒｐ６２部位がＬｅｕに置換されたものであると確認された。
【００８０】
前記のＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ、及びＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌのｒａｔｉｏａｐｏは、２.６６〜２.８１の範囲であり、ＣＭＹ−ＬＨに比べて少し低かった。しかし、Δ比率は、非常に大きな差を表したが、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ及びＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌは、それぞれ０.３０、０.６９、１.００のΔ比率を表した（図７）。これは、ＣＭＹ−０を基準に、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈは、１４倍、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌは、２０倍程度向上した数値を有し、 前記ＭＢＰ融合蛋白質などを利用して定量的に測定可能なマルトースの濃度範囲及びＫｄは、下記表１に表されている。したがって、前記ＭＢＰ融合蛋白質を得たことによって、さらに幅広い濃度のマルトースの定量が可能になった。
【００８１】
【表１】
0004505439.tif 000006
【００８２】
一方、ＭＢＰ融合蛋白質のうち、マルトースとの結合能力の異なる３種（ＣＭＹ−ＬＨ、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌ）の基質特異性を調べるために、多様な種類の単糖類、二糖類、三炭糖、糖アルコールなどの結合の程度を、実施例３の方法で分析した。図８Ａ〜Ｃは結合物質に対するＭＢＰ融合蛋白質の結合力を比較した結果を表す。図８Ａは、マルトースを除いたほとんどの糖類は、ＭＢＰ融合蛋白質との結合が確認されていないが、ｄ−グルコース及びメレジトース（melezitose）は、濃度を１０ｍＭに上げると、低い親和力を表した。これは、ｄ−グルコースの場合には、マルトース単位で結合されている炭水化物を加水分解して生産するので、微量のマルトースの汚染によって、比率の変化（Δ比率 ）が発生したことである(Guntas, G.et al., J.Mol.Biol., 336:263-273, 2004)。図８Ｂ及び図８Ｃは、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ及びＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌの基質に対する親和力を比較した結果であり、マルトース以外のあらゆる糖類及び濃度に関係なく親和力を表していない。
【００８３】
前記結果から、前記ＭＢＰ融合蛋白質は、マルトースに対してのみ特異的な結合力を表し、その他の糖による干渉なしに、生きている細胞の顕微鏡分析による細胞内のマルトース濃度の定量的な測定に有効に使用されうることが立証された。
【００８４】
＜実施例６：酵母でのＭＢＰ融合蛋白質を利用したイメージング分析＞
ＭＢＰ融合蛋白質を利用した生きている酵母のマルトース吸収及び細胞内の濃度変化などを分析するために、次のように発現ベクターを構築した。発現ベクターとしては、ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５(Sohn et al., Process Biochemistry, 30:653、1995）を使用し、酵母発現ベクターを構成するために、ＳａｃＩ及びＮｄｅＩ制限酵素の部位がＧＡＬプロモーターの５’の末端及び３’の末端に挿入されるように、プライマー１６及びプライマー１７を製作して、ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５からＧＡＬプロモーター遺伝子を増幅させた。
【００８５】
前記ＧＡＬプロモーター遺伝子をＳａｃＩ及びＮｄｅＩ制限酵素で切断し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ制限酵素で、ｐＥＣＭＹ−Ｂ、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ、ｐＥＣＭＹ−ＬＨ及びｐＥＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２ＬのＭＢＰ融合蛋白質をコードする遺伝子をそれぞれ切断した後、ＳａｃＩ及びＳａｌＩの制限酵素で切断したＹＥＧα−ＨＩＲ５２５に同時に挿入させる方法で、ＹＥＧ−ＣＭＹ系列と名づけた酵母発現ベクターを構築した（図９）。
【００８６】
イメージングによる酵母内部に流入されるマルトース濃度の定量的な測定のために、ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターの宿主としてＨａｐｌｏｉｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２８０５(Mat a prep4::HIS3 prb1 can1 his3 ura3)(Sohn et al., Process Biochemistry, 30:653, 1995)を使用して形質転換させた。前記で構成したＹＥＧ−ＣＭＹ系列のベクターでそれぞれ形質転換させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ２８０５は、アミノ酸を含んでいない０.６７％の酵母窒素塩基(BD Bioscience、米国)、及び０.０７７％の−Ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ(BD Bioscience、米国)から構成されたＳＤ培地に１％のグルコースと１％のガラクトースとを炭素源及び誘導物質として使用して、約３０〜４０時間培養した。
【００８７】
イメージングに先立って、培地に残っている炭素源を除去するために、糖のなしＳＤ培養液（ｐＨ７.４）に、取得した酵母を分散させて約２時間培養した。次に、２５μｌの培養培地を糖フリーのＳＤ培養液の入っているガラス底皿（３５×１０ｍｍ、ＳＰＬ、韓国）に添加して１時間定置した。顕微鏡で観察する間に細胞の沈殿が浮遊することを防ぐために、酵母を含んでいる皿を両面テープを利用して顕微鏡の試料台に固定させた。
【００８８】
イメージングは、スプリット・プライマリー・イメージ・カメラ・ポート（split primary image camera port）(U-SIP)に連結させたＤＰ３０ＢＷ(Olympus、日本)の高感度ＣＣＤ(Charge Coupled Device)カメラ及びＩＸ７１倒立顕微鏡(Olympus、日本)から構成されたＦＲＥＴスプリットイメージングシステム(Olympus、日本)を使用し、ＰｌａｎＡｐｏ  Ｎ  ６０ｘ、１.４２ｎａ、油浸対物レンズ(Olympus、日本)で観察した。顕微鏡で観察された映像の保存及び分析には、ＣｅｌｌＰソフトウェア(Olympus、日本)を使用し、生きている酵母のＦＲＥＴによる比率イメージングを観察するためのＦＲＥＴフィルタセットは、４４０ＡＦ２１励起、４５５ＤＲＬＰダイクロイックミラー（dichroic mirror）、そして、４８０ＡＦ３０及び５３５ＡＦ２６の発光フィルタで組合わせられたＸＦ８８−２(Omega Optical、米国)を使用した。
【００８９】
酵母内部に流入されるマルトース濃度の定量的な測定は、蛍光顕微鏡に装着されたＣＣＤカメラを通じて蛍光イメージを観察し、３０秒の間隔で１０分間蛍光イメージを取って、ＣｅｌｌＰソフトウェア(Olympus)で保存して定量分析した。マルトースの観察は、最初の時間から２分経過後、全体的な濃度が１０ｍＭになるように添加し、経時による細胞内のマルトース濃度の変化は、ＥＹＦＰ及びＥＣＦＰの発光強度を比較して分析した。
【００９０】
図１０Ａは、マルトースのシグナルの強度の喪失されたＣＭＹ−Ｂを発現した酵母のイメージング分析結果であり、マルトースを添加していない酵母のｒａｔｉｏａｐｏと、２分経過後に飽和濃度である１０ｍＭのマルトースを添加したｒａｔｉｏ１０ｍＭとは同じであった。したがって、図１０Ａの分析結果を対照区として、他種のＭＢＰ融合蛋白質が発現された酵母のマルトース濃度によるＦＲＥＴの変化を分析した。
【００９１】
図１０Ｂは、ＣＭＹ−ＢＩＩを発現した酵母のイメージング結果であり、マルトースを添加していない条件と、２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した条件とでその比率に差があることと、マルトース添加後に２分程度経過すれば、細胞内のマルトース濃度が飽和状態に到達することが確認された。
【００９２】
図１０Ｃは、ＣＭＹ−ＬＨを発現した分析結果であり、２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した比率の変化幅が、ＣＭＹ−ＢＩＩを発現した酵母より２倍以上大きかった。これは、ＥＣＦＰとＭＢＰとの連結ペプチドを最適化してシグナルの強度を向上させたＭＢＰ融合蛋白質が、生体外部だけでなく、細胞内部でもそのまま適用されることを立証する結果である。
【００９３】
図１０Ｄは、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌを発現した酵母のイメージング結果であり、比率の変化幅は、生体外部で測定した結果と同様に、ＣＭＹ−ＬＨより大きくなることが確認された。しかし、図１０Ｂまたは図１０Ｃの結果とは異なり、１０分経過後にも細胞内のマルトース濃度が飽和状態に到達していないことが確認されたが、これは、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２ＬのＫｄが８０μＭに向上したためである。したがって、細胞内部に流入または代謝されるマルトースの定量的な測定範囲が大きく拡張して、生理的なレベルでのリガンドの濃度変化を上限値の制約なしに測定可能であろう。
【００９４】
＜実施例７：多様なＰＢＰｓを利用した蛍光標識蛋白質の製作＞
マルトース検出用の蛍光標識蛋白質のＭＢＰの位置に、構造的・機能的に類似した大腸菌由来のＰＢＰｓを導入して、多様な物質の検出のための蛍光標識蛋白質を開発するために、遺伝子の操作を行った。
【００９５】
ＭＢＰの位置に導入するＢＰｓの選抜は、ＳＣＯＰ(Structural Classification of Proteins；http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop／）から資料を収集した後、ＰＤＢ（Protein Data Bank、http://www.rcsb.org/pdb／）で、基質結合に伴われる三次構造の動力学的な変化を確認して選抜した。その例として、ＡＬＢＰ、ＲＢＰ及びＡＲＢＰの３種の大腸菌由来のＰＢＰｓを、本発明に係るＭＢＰ融合蛋白質のＭＢＰの位置に導入させようとした。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（http://kr.expasy.org／）で前記のＰＢＰｓの遺伝子配列情報を得、これに基づいて、各ＰＢＰｓをコードする遺伝子を増幅させうるプライマーを製作して、大腸菌ＭＧ１６５５の染色体からＰＣＲを行って遺伝子を増幅した。
【００９６】
ＡＬＢＰ融合蛋白質の発現ベクターを構築するためのＥＣＦＰ遺伝子の増幅は、塩基配列５及び配列番号１８のプライマーを使用し、ＡＬＢＰ遺伝子は、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを使用して増幅した。増幅されたＥＣＦＰ及びＡＬＢＰ遺伝子は、配列番号５及び配列番号２０のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲで、ＥＣＦＰ−ＡＬＢＰの遺伝子を増幅した。したがって、ＭＢＰ融合蛋白質と同様に、ＥＣＦＰとＡＬＢＰとの間には、６個のＮ塩基（Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す）によって、２個のアミノ酸の組合わせで連結された多様なペプチドが生成され、前記ＥＣＦＰ−ＡＬＢＰ遺伝子は、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素の認知部位を利用して、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターからＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子を除去して挿入する方法でライブラリーを構築した。同様に、ＡＲＢＰ融合蛋白質の発現ベクターを構築するためのＥＣＦＰ遺伝子の増幅は、塩基配列５及び配列番号２１のプライマーを使用し、ＡＲＢＰ遺伝子は、配列番号２２及び配列番号２３のプライマーを使用して増幅した。増幅されたＥＣＦＰ及びＡＲＢＰ遺伝子は、配列番号５及び配列番号２３のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲで、ＥＣＦＰ−ＡＲＢＰ遺伝子として連結し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子の位置に挿入する方法でライブラリーを構築した。また、ＲＢＰ融合蛋白質の発現ベクターを構築するためのＥＣＦＰ遺伝子の増幅は、塩基配列５及び配列番号２４のプライマーを使用し、ＲＢＰは、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーを使用して増幅した。増幅されたＥＣＦＰ及びＲＢＰ遺伝子は、配列番号５及び配列番号２６のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲで、ＥＣＦＰ−ＲＢＰの遺伝子として連結し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子の位置に挿入してライブラリーを構築した。
【００９７】
前記のように、ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターは、ライブラリーの形態に製作して、大腸菌であるＪＭ１０９（DE3）に形質転換させ、実施例４の過程による探索過程を経ず、任意に３〜５個ずつ選別して、実施例２の方法によって発現及び精製を行った。次に、多様なＰＢＰ融合蛋白質でそれぞれの結合物質に対す蛍光性質を分析した。結果的に、図１１Ａ〜Ｃ及び下記表２に示すように、シグナルの強度の最も良い糖センサー（糖検出用の蛍光標識蛋白質）を選定し、配列番号３６のＣａｌｓＢＹ−ＱＶ、配列番号３７のＣａｒａＦＹ−ＰＲ、及び配列番号３８のＣｒｂｓＢＹ−ＮＤなどを得ることができた。
【００９８】
【表２】
0004505439.tif 000007
【００９９】
前記融合蛋白質のＤＮＡ配列を分析した結果、ＣａｌｓＢＹ−ＱＶは、ＥＣＦＰとＡＬＢＰとの間にＧｌｎ−Ｖａｌを介して融合され、ＣａｒａＦＹ−ＰＲは、ＥＣＦＰとＡＲＢＰとの間にＰｒｏ−Ａｒｇを介して融合され、ＣｒｂｓＢＹ−ＮＤは、ＥＣＦＰとＲＢＰとの間にＡｓｎ−Ａｓｐを介して融合されたことが確認された。ＣａｌｓＢＹ−ＱＶ及びＣｒｂｓＢＹ−ＮＤは、アロースやリボースの結合によりΔ比率が低下するが、これは、ＭＢＰやＡＲＢＰとは異なり、結合物質の結合により結合蛋白質の両末端が離れる構造を有するためである（Chaudhuri, B.N.et al.J.Mol.Biol., 286:1519, 1999;Magnusson, U.et al., J.Bio.Chem., 277:14077, 2002）。
【０１００】
前記三種の蛍光標識蛋白質に対する基質親和力を調べるために、多様な種類の糖類を対象として基質特異性を分析した。図１２Ａは、ＣａｌｓＢＹ−ＱＶの基質に対する結合力を比較した結果であり、アロースを除いたほとんどの糖類ではＡＬＢＰ融合蛋白質との結合が確認されていないが、リボースが、ｍＭ水準の濃度に上昇すると、ＡＬＢＰ融合蛋白質とは低い親和力を表した（Chaudhuri, B.N.et al., J.Mol.Biol., 286:1519, 1999）。逆に、図１２Ｃは、ＣｒｂｓＢＹ−ＮＤの基質に対する結合力を比較した結果であり、ほとんどの糖類は、ＲＢＰ融合蛋白質との親和力は表していないが、アロースとは非常に高い親和力を表し、キシロースも、アロースよりは低いが、高い親和力を表すことを確認した（Kim, C.H.et al., J.Bacteriol., 179:7631, 1997）。図１２Ｂは、ＣａｒａＦＹ−ＰＲの基質に対する結合力を比較した結果である。ＡＲＢＰ融合蛋白質は他種の融合蛋白質に比べては相対的に基質特異性が低下することが確認されたが、特に、ガラクトースとは非常に高い親和力を表し（Fukada, H.et al., J.Biol.Chem., 258:13193, 1983）、そして、その他のキシロース、ラムノース、乳糖及びメリビオースなどともある程度の親和力を表すことが確認された。
【０１０１】
＜実施例８：ＳＢＰを利用した蛍光標識蛋白質の製作＞
既に発表されたＭＢＰの遺伝子を部分的に変異させて製作したＳＢＰ（Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005）の遺伝子を、ＭＢＰ融合蛋白質の発現ベクターのＭＢＰ遺伝子の部位に置換して構成しようとした。
【０１０２】
鋳型として使用するＭＢＰをコードする遺伝子は、ｐＭＡＬｃ２ｘベクター（NEB、米国）を使用し、ＳＢＰの遺伝子を製作するために、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号１１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。前記で増幅された遺伝子は、ＭＢＰのＡｓｐ１４をＬｅｕに、Ｌｙｓ１５をＰｈｅに、Ｔｒｐ６２をＴｙｒに、そしてＧｌｕ１１１をＴｙｒに置換させる部分突然変異を含むため、既存の報告によれば、ショ糖と結合可能なＳＢＰの遺伝子をコードしている（Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005）。
【０１０３】
ＣＳＹ−Ｂの発現ベクターを構成するために、塩基配列５及び塩基配列６のプライマーを使用して増幅したＥＣＦＰ遺伝子及び前記ＳＢＰ遺伝子を、配列番号５及び塩基配列１１のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲでＥＣＦＰ−ＳＢＰ遺伝子に連結し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子の位置に挿入してｐＥＣＳＹ−Ｂベクターを構成した。同様に、ＣＳＹ−ＢＩＩの発現ベクターは、塩基配列５及び塩基配列８のプライマーを使用して増幅したＥＣＦＰの遺伝子及び前記ＳＢＰの遺伝子を、配列番号５及び塩基配列１１のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲでＥＣＦＰ−ＳＢＰ遺伝子に連結し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子の位置に挿入してｐＥＣＳＹ−ＢＩＩベクターを構成した。また、ＣＳＹ−ＬＨの発現ベクターを構成するために、塩基配列５及び塩基配列１４のプライマーを使用して増幅したＥＣＦＰ遺伝子及び前記のＳＢＰの遺伝子を、配列番号５及び配列番号１１のプライマーを利用した重複伸長ＰＣＲでＥＣＦＰ−ＳＢＰ遺伝子に連結し、ｐＥＣＭＹ−ＢＩＩ発現ベクターのＥＣＦＰ−ＭＢＰ遺伝子の位置に挿入してｐＥＣＳＹ−ＬＨベクターを構成した。
【０１０４】
前記ＳＢＰ融合蛋白質の発現ベクターは、大腸菌であるＪＭ１０９（DE3）に形質転換させ、実施例３の方法で発現及び精製を行った。次に、多様なＳＢＰ融合蛋白質を用いて蛍光分析でショ糖及びマルトースに対するシグナルの強度を分析し、それそれのＳＢＰ融合蛋白質の性質を分析した。結果的には、図１３Ａ、図１３Ｂ及び表３に示すように、多様なＳＢＰ融合蛋白質の中で、ショ糖に対するシグナルの強度の最も高い配列番号３９の蛍光標識蛋白質ＣＳＹ−ＬＨを得た。
【０１０５】
【表３】
0004505439.tif 000008
【０１０６】
前記表３から分かるように、シグナルの強度の最も向上したＳＢＰ融合蛋白質であるＣＭＹ−ＬＨのＭＢＰの両末端の連結ペプチドをそのまま適用させた、ショ糖結合蛍光標識蛋白質であるＣＳＹ−ＬＨが最も高いΔ比率を表すことが確認された。したがって、ＭＢＰを鋳型として新たな結合能力を有する蛍光標識蛋白質の構成は、ＣＭＹ−ＬＨの最適化された連結ペプチドをそのまま使用して、シグナルの強度に優れた新たな機能を有する結合蛋白質の構成が可能であるということが確認された。しかし、ＣＳＹ−ＬＨを基準に、ショ糖及びマルトースに対するＫｄは、既に報告された結果とは異なり、約２５倍以上向上した結果が表れた（Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005）。
【０１０７】
前記ＣＳＹ−ＬＨを利用した多様な種類の糖類との結合親和力を分析した。図１４の結果から、ＣＳＹ−ＬＨは、既に報告された結果と同様に、ショ糖及びマルトースを除いたほとんどの糖類では結合しないことが確認された（Guntas, G.et al., PNAS, 102:11224, 2005）。
【０１０８】
以上、本発明の内容の特定な部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施の態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明による蛍光標識蛋白質の一例として、ＭＢＰ融合蛋白質の基本的な構成及び作動原理を示す図面である。
【図２Ａ】本発明に係る蛍光蛋白質と連結されるＭＢＰの両末端部を異ならせたＭＢＰ融合蛋白質の模式図である。
【図２Ｂ】前記ＭＢＰ融合蛋白質の発現のための発現ベクターの構成を示すフローチャートである。
【図３】実施例１で製作したベクターから発現された ＭＢＰ融合蛋白質の、アミロース樹脂(amylose resin)に対する結合の程度（融合蛋白質の結合能）を示すグラフである（黒色のバー：アミロース樹脂を利用したプルダウン(pull-down)以前のＥＹＦＰの発光量；斜線のバー：アミロース樹脂を加えてプルダウンした後の上澄み液中のＥＹＦＰの発光量）。
【図４】実施例１で製作したベクターから発現されたＭＢＰ融合蛋白質のマルトース結合によるＦＲＥＴ効率の変化を比較したグラフである（黒色のバー：マルトースとの結合以前のＦＲＥＴ効率；斜線のバー：マルトースとの結合以後のＦＲＥＴ効率；バーの上に表記された数字：シグナルの強度の指標であるΔ比率（Δratio））。
【図５】ＥＣＦＰとＭＢＰとの連結ペプチドを無作為的に多変化させて製作したＭＢＰ融合蛋白質ライブラリーから探索した結果であるΔ比率の分布グラフである（白抜きの四角で囲まれた部分：ＣＭＹ−ＢＩＩよりシグナルの強度の向上した融合蛋白質の分布；横線の四角で囲まれた部分：ＣＭＹ−ＢＩＩよりシグナルの強度の低下した融合蛋白質の分布；○で囲まれた部分：ＣＭＹ−ＢＩＩのグループ）。
【図６】本発明に係るＭＢＰ融合蛋白質のマルトースの濃度変化によるΔ比率変化を、シグモイド曲線（sigmoidal curve）で示すグラフである（●：ＣＭＹ−０；○：ＣＭＹ−ＢＩＩ；▼：ＣＭＹ−ＱＩ；▽：ＣＭＹ−ＬＨ）。
【図７】本発明によってＭＢＰのＴｒｐ６２に突然変異を加えて得られたマルトースに対する定量範囲が多様なＭＢＰ融合蛋白質のマルトースの濃度変化によるΔ比率変化をシグモイド曲線で示すグラフである（●：ＣＭＹ−０；○：ＣＭＹ−ＬＨ；▼：ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ａ；▽：ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈ；■：ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌ）。
【図８Ａ】本発明に係る定量的な特性の相異なるＭＢＰ融合蛋白質を、多様な種類の糖類を対象として結合親和力を比較したグラフであり、ＣＭＹ−ＬＨの場合を示すグラフである。
【図８Ｂ】本発明に係る定量的な特性の相異なるＭＢＰ融合蛋白質を、多様な種類の糖類を対象として結合親和力を比較したグラフであり、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｈの場合を示すグラフである。
【図８Ｃ】本発明に係る定量的な特性の相異なるＭＢＰ融合蛋白質を、多様な種類の糖類を対象として結合親和力を比較したグラフであり、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌの場合を示すグラフである。
【図９】生きている酵母の細胞内部に流入されるマルトースの濃度変化を観察する目的で酵母発現用ベクターの製作する工程を示すフローチャートである。
【図１０Ａ】蛍光顕微鏡を利用したＦＲＥＴイメージングで、生きている酵母細胞内のマルトースの濃度変化を観察した結果であって、ＣＭＹ−Ｂを発現させた酵母で分析した結果である（●：マルトースを非存在下の時の酵母の発光量の比率；○：最初の観察時間から２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した酵母の発光量比率）。
【図１０Ｂ】蛍光顕微鏡を利用したＦＲＥＴイメージングで、生きている酵母細胞内のマルトースの濃度変化を観察した結果であって、ＣＭＹ−ＢＩＩを発現させた酵母で分析した結果である（●：マルトースを添加していない酵母の発光量の比率；○：最初の観察時間から２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した酵母の発光量比率）。
【図１０Ｃ】蛍光顕微鏡を利用したＦＲＥＴイメージングで、生きている酵母細胞内のマルトースの濃度変化を観察した結果であって、ＣＭＹ−ＬＨを発現させた酵母で分析した結果である（●：マルトースを添加していない酵母の発光量の比率；○：最初の観察時間から２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した酵母の発光量比率）。
【図１０Ｄ】蛍光顕微鏡を利用したＦＲＥＴイメージングで、生きている酵母細胞内のマルトースの濃度変化を観察した結果であって、ＣＭＹ−ＬＨ／Ｗ６２Ｌを発現させた酵母で分析した結果である（●：マルトースを添加していない酵母の発光量の比率；○：最初の観察時間から２分経過後に１０ｍＭのマルトースを添加した酵母の発光量の比率）。
【図１１Ａ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部として導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質を、アロース(allose)、アラビノース(arabinose)、リボース(ribose)の濃度変化によるＦＲＥＴ効率変化をシグモイド曲線で示すグラフであり、ＣａｌｓＢＹ−ＱＶの場合を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部として導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質を、アロース、アラビノース、リボースの濃度変化によるＦＲＥＴ効率変化をシグモイド曲線で示したグラフであり、ＣａｒａＦＹ−ＰＲの場合を示すグラフである。
【図１１Ｃ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部として導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質を、アロース、アラビノース、リボースの濃度変化によるＦＲＥＴ効率変化をシグモイド曲線で示したグラフであり、ＣｒｂｓＢＹ−ＮＤの場合を示すグラフである。
【図１２Ａ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部に導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質の、多様な種類の糖類に対する結合親和力を比較したグラフであり、ＣａｌｓＢＹ−ＱＶの場合を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部に導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質の、多様な種類の糖類に対する結合親和力を比較したグラフであり、ＣａｒａＦＹ−ＰＲの場合を示すグラフである。
【図１２Ｃ】ＡＬＢＰ、ＡＲＢＰ、ＲＢＰを感知部に導入して構成したそれぞれの蛍光標識蛋白質の、多様な種類の糖類に対する結合親和力を比較したグラフであり、ＣｒｂｓＢＹ−ＮＤの場合を示すグラフである。
【図１３Ａ】ＭＢＰに遺伝子変異を起こして再構成したＳＢＰ（Sucrose-binding Protein）を結合部位として導入して構成したＳＢＰ融合蛋白質を、ショ糖の濃度変化によるΔ比率変化をシグモイド曲線で示したグラフである（●：ＣＳＹ−Ｂ；○：ＣＳＹ−ＢＩＩ；▼：ＣＳＹ−ＬＨ）。
【図１３Ｂ】ＭＢＰに遺伝子変異を起こして再構成したＳＢＰ（Sucrose-binding Protein）を結合部位として導入して構成したＳＢＰ融合蛋白質を、マルトースの濃度変化によるΔ比率変化をシグモイド曲線で示したグラフである（●：ＣＳＹ−Ｂ；○：ＣＳＹ−ＢＩＩ；▼：ＣＳＹ−ＬＨ）。
【図１４】ショ糖結合蛍光標識蛋白質のうち、高いシグナルの強度を有するＣＳＹ−ＬＨの多様な種類の糖類に対する結合親和力を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0004505439.tif 000028
【図１０Ｂ】
0004505439.tif 000029
【図１０Ｃ】
0004505439.tif 000030
【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
0004505439.tif 000032
【図１１Ｂ】
0004505439.tif 000033
【図１１Ｃ】
0004505439.tif 000034
【図１２Ａ】
0004505439.tif 000035
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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