(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有するジクロロメタンの溶液に成長ホルモンを分散させた後、ジクロロメタンを除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法。
【請求項２】
乳酸−グリコール酸共重合体の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が、８５／１５〜５０／５０である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量が、８，０００〜２０，０００である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
ジクロロメタン溶液中の乳酸−グリコール酸共重合体に対する亜鉛の含有量が０．００１〜２％（ｗ／ｗ）である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
徐放性製剤の平均粒子径が０．１〜３００μｍである請求項１記載の製造法。
【請求項６】
徐放性製剤が注射用である請求項１記載の製造法。
【請求項７】
乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有するジクロロメタン溶液に成長ホルモンを分散させた分散液を油相とするｏ／ｗ型乳化物を、水中乾燥することを特徴とする請求項１記載の製造法。
【請求項８】
徐放性製剤が徐放性マイクロカプセルである請求項１記載の製造法。
【請求項９】
乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有するジクロロメタンの溶液。
【請求項１０】
乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを、ジクロロメタン中に共存させることにより得られるジクロロメタン溶解性の乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛複合体。
【請求項１１】
乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有する、ジクロロメタンの溶液に成長ホルモンを分散させた分散液。
【請求項１２】
請求項１記載の製造法で製造される徐放性製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ポリペプチドを含有する徐放性製剤の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性ポリペプチドまたはその誘導体は、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞あるいはヤギ、ハムスターなどの生体を用いて大量に生産され、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。
例えば、成長ホルモン（以下、ＧＨと略記することがある）は、元来下垂体前葉で産生・分泌される代表的なホルモンで、身体の成長促進に働くほか、糖・脂質代謝、蛋白同化、細胞増殖や分化に関与するなど、幅広く多彩な生理作用を有する生理活性ポリペプチドであるが、現在では遺伝子組換え技術を用いて大腸菌により大量生産され、医薬品として全世界で広く臨床応用されている。しかしながら、ＧＨは生体内半減期が短く、有効血中濃度を維持するためには頻回投与が必要であり、特に下垂体性小人症の場合には、乳幼児あるいは若年患者に対して数カ月から１０年以上の長期に亘る連日皮下投与がなされているのが実情である。この問題を解決するため生理活性ポリペプチドを含有する徐放性製剤を開発する種々の試みがなされている。
【０００３】
特開平８−３０５５（ＥＰ−Ａ  ６３３０２０）には、水溶性ポリペプチドを生体内分解性ポリマーと脂肪酸金属塩とからなる生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる徐放性製剤の製造法および該製造法で調製された徐放性マイクロカプセル（以下、ＭＣと略記することがある）が開示されている。特開平８−２１７６９１（ＷＯ  ９６／０７３９９）には、水溶性ペプチド性生理活性物質を塩化亜鉛水溶液等を用い水不溶性ないし水難溶性多価金属塩とし、これと生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤の製造法が開示されている。ＷＯ ９４／１２１５８には、ヒトＧＨと生体分解性ポリマーとの徐放性製剤の製造法として、ポリマーに対して、０.１−３０％（ｗ／ｗ）水酸化亜鉛などのポリマー分解促進剤をポリマー溶液に加えることができるとの記載がある。また、ヒトＧＨとポリマーを含有する有機溶媒溶液を液体窒素中に噴霧し多孔性粒子として生物活性を保持した形でＭＣを調製する方法が開示されている。またＷＯ ９２／１７２００およびネイチャー  メディシン（Nature Medicine）, 第２巻, ７９５頁（１９９６）には、ヒトＧＨの亜鉛塩を用いる徐放性製剤の製造法が開示されている。
ＷＯ ９５／２９６６４には、炭酸亜鉛などの金属塩を固体状でポリマー溶液に分散させた後、生理活性物質（ホルモンなど）を添加し、生理活性物質と金属カチオンとを別々に生体分解性ポリマーに分散させてなるＭＣを製造する方法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する試みが種々成されているものの、生理活性ポリペプチドによっては、製剤内への生理活性ポリペプチドの取り込み率が低い、投与初期の過剰放出がある、長期にわたる安定した放出性が達成されない、十分な血中濃度が長期にわたって保持できないなどの点で、未だ臨床上満足すべき製剤は得られていない。また製造方法においても大量生産を前提とする工業化に合致しない方法が多いのが現状である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の問題点を解決するため鋭意研究を進め、ＭＣ基剤として用いる乳酸−グリコール酸共重合体（以下、ＰＬＧＡと略記することがある）と酸化亜鉛とを有機溶媒中で共存させると、意外にもそれ自体では有機溶媒に不溶の酸化亜鉛が有機溶媒に溶解し、効率良く含量の高いＰＬＧＡ・酸化亜鉛体が得られ、該ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液に直接生理活性ポリペプチドを粉末として分散させ成型すると、生理活性ポリペプチドの取り込み率が向上し、投与後の初期放出が抑制され、さらには持続性に優れた徐放性製剤が得られることを見いだした。また、該製造法は工程数が少なく、きわめて工業化に適した方法であることを見いだし、さらに検討を重ね、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを含有する有機溶媒溶液に生理活性ポリペプチドを分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の製造法、
（３）生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸共重合体である前記（１）記載の製造法、
（４）乳酸−グリコール酸共重合体の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が、約８５／１５〜約５０／５０である前記（３）記載の製造法、
【０００６】
（５）乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量が、約８,０００〜約２０,０００である前記（３）記載の製造法、
（６）有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーに対する亜鉛の含有量が約０.００１〜約２％（Ｗ/Ｗ）である前記（１）記載の製造法、
（７）徐放性製剤の平均粒子径が約０.１〜約３００μm である前記（１）記載の製造法、
（８）徐放性製剤が注射用である前記（１）記載の製造法、
（９）乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有する有機溶媒溶液に成長ホルモンを分散させた分散液を油相とするｏ／ｗ型乳化物を、水中乾燥することを特徴とする前記（１）記載の製造法、
（１０）徐放性製剤が徐放性マイクロカプセルである前記（１）記載の製造法、
（１１）乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有する有機溶媒溶液、
（１２）乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを有機溶媒に共存させることにより得られる有機溶媒溶解性の乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体、
（１３）乳酸−グリコール酸共重合体と酸化亜鉛とを含有する有機溶媒溶液に生理活性ポリペプチドを分散させた分散液、
（１４）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（１３）記載の分散液、および
（１５）前記（１）記載の製造法で製造される徐放性製剤に関する。
【０００７】
本発明に用いられる好ましい生体内分解性ポリマーの具体例としては、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水重縮合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ-γ-ベンジル-L-グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例、スチレン-マレイン酸重合体等）等が挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、上記α-ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−，Ｌ−，ＤＬ−体のいずれも用いることができる。これらの中で、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマー、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル等が好ましい。生体内分解性ポリマーは、さらに好ましくはα-ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体、特に好ましくは乳酸-グリコール酸共重合体である。
【０００８】
生体内分解性ポリマーとして乳酸-グリコール酸共重合体又は単重合体を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましく、約８５／１５ないし約５０／５０が更に好ましい。本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など単重合体のみならず乳酸-グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸-グリコール酸重合体と称することがある。
前記乳酸-グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００ないし約２５，０００が好ましく、さらに約５，０００から約２０，０００が特に好ましい。また、乳酸-グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２ないし約４．０が好ましく、約１．５ないし約３．５が更に好ましい。
【０００９】
なお、本明細書での重量平均分子量および分散度に関し、前者は重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の値、後者はこの値から算出した値である。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニター Ｌ-３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いて行った。
また、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、末端基定量による数平均分子量と上記のＧＰＣ測定による数平均分子量がほぼ一致するポリマーであり、末端基定量による数平均分子量は以下のようにして算出される。
【００１０】
約１ｇないし約３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン(２５ml)とメタノール(５ml)との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で、室温（２０℃）で撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量＝２００００Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液 (ml)
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対して、ＧＰＣ測定による数平均分子量は、各種分析・解析条件（例えば、移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、両測定による数平均分子量がほぼ一致するとは、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体において、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０．５倍から約２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０．７倍から約１．５倍の範囲内であることをいう。
例えば、１種類以上のα-ヒドロキシカルボン酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍以上に大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は、末端に遊離のカルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００１１】
末端に遊離のカルボキシル基を有する乳酸-グリコール酸重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法）に従って製造できる。
乳酸-グリコール酸重合体の分解・消失速度は、組成比あるいは重量平均分子量によって大きく変化するが、一般的にはグリコール酸分率が低いほど分解・消失が遅いため、グリコール酸分率を低くするかあるいは分子量を大きくすることによって放出期間を長くすることができる。逆に、グリコール酸分率を高くするあるいは分子量を小さくすることによって放出期間を短くすることもできる。長期間（例えば、１ないし４カ月）型徐放性製剤とするには、前記組成比および重量平均分子量の範囲の乳酸-グリコール酸重合体が好ましい。
【００１２】
従って、本発明において、用いる生体内分解性ポリマーの組成は、目的とする生理活性ポリペプチドの種類、所望の徐放期間などに応じて、選択されることが好ましい。その具体的な１例として、例えば、生理活性ポリペプチドとしてＧＨを用いる場合、乳酸−グリコール酸共重合体を用いることが好ましく、該乳酸−グリコール酸共重合体としては、その乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約８５／１５〜約５０／５０が好ましく、さらに好ましくは約７５／２５〜約５０／５０である。またその重量平均分子量は約８,０００〜約２０,０００が好ましく、さらに好ましくは約１０,０００〜約２０,０００である。また、乳酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２〜約４.０が好ましく、さらに好ましくは約１.５〜約３.５である。
用いる乳酸−グリコール酸共重合体は、前記公報記載の方法等、公知の方法に従い製造できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。前記ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とが、ほぼ一致する乳酸−グリコール酸共重合体(ＰＬＧＡ）を用いることが好ましい。
また、該共重合体は組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸共重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約１０,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約１２,０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物などが用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５〜約７５／２５である。
【００１３】
本発明において、ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体を作製するために用いられる酸化亜鉛は水難溶性亜鉛化合物であり、それ自体ではジクロロメタンなどの有機溶媒にも不溶ないし難溶性である。酸化亜鉛はＰＬＧＡと共にジクロロメタンなどの有機溶媒中に共存させると、全く予想外に効率良くＰＬＧＡ・酸化亜鉛体を形成して有機溶媒に溶解する。これらの操作は単にＰＬＧＡと酸化亜鉛とを有機溶媒に添加するだけで達成され、従ってＰＬＧＡ・酸化亜鉛体の分離操作が不要である。こうして得られたＰＬＧＡ・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液に直接生理活性ポリペプチドを添加して、簡便に生理活性ポリペプチド含有ＭＣを調製できる。また得られたＭＣは生理活性ポリペプチドを生物学的に安定に保ち、初期放出の小さい持続性に優れた徐放性製剤を提供する。
【００１４】
本発明において用いられる生理活性ポリペプチドとしては、好ましくは分子量約１,０００〜約５０,０００、さらに好ましくは分子量約５,０００〜約４０,０００の生理活性ポリペプチドが用いられる。
生理活性ポリペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。また該生理活性ポリペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、さらにそれらの誘導体ないし類縁体でもよい。該生理活性ポリペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明の生理活性ポリペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、ペプチド性神経伝達物質、造血因子、各種増殖因子、酵素、ポリペプチド系抗生物質、鎮痛性ペプチドなどが用いられる。
【００１５】
ペプチドホルモンとしては、例えばインスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（サンドスタチン，米国特許第４,０８７,３９０号，同第４,０９３,５７４号，同第４,１００,１１７号，同第４,２５３,９９８号参照）、成長ホルモン（ＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイドなど）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）その塩およびその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、サイモシン（チモシン）、モチリン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻  第５号  第６７６〜６９１頁（１９７８）〕参照｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲンなどが用いられる。ペプチドホルモンは、好ましくはインスリン及び成長ホルモンなどである。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカインなどが用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン類（アルファ型、ベータ型、ガンマ型等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２等）などが用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが用いられる。サイトカインは、好ましくはリンホカインなどであり、更に好ましくはインターフェロンなどである。サイトカインは、特に好ましくはインターフェロンアルファなどである。
ペプチド性神経伝達物質としては、例えばサブスタンスＰ、セロトニン、ＧＡＢＡなどが用いられる。
【００１６】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーターなどが用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ，酸性ＦＧＦ，塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−９など）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ等）、インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレインなどが用いられる。
ポリペプチド系抗生物質としては、例えばポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシンなどが用いられる。
鎮痛性ペプチドとしては、例えばエンケファリン、エンケファリン誘導体〔米国特許第４,２７７,３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフイン、キョウトルフインなどが用いられる。
その他、生理活性ポリペプチドとしては、サイモポエチン、ダイノルフィン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）およびその誘導体（米国特許第４,２２９,４３８号参照）、およびその他の胸腺因子〔医学のあゆみ、第１２５巻，第１０号，８３５−８４３頁（１９８３年）〕、ニューロテンシン、ブラジキニンおよびエンドセリン拮抗作用を有するペプチド類（ヨーロッパ特許公開第４３６１８９号，同第４５７１９５号，同第４９６４５２号，特開平３−９４６９２号，同３−１３０２９９号公報参照）などが挙げられる。
本発明に特に好ましく適用される生理活性ポリペプチドとしては、成長ホルモン、インスリンなどが挙げられる。
【００１７】
本発明において、生理活性ポリペプチドが金属を含有する場合、その金属含有量は０.１％以下が好ましく、さらに好ましくは０.０１％以下、特に好ましくは０.００１％以下であって実質的に金属を含まない生理活性ポリペプチドが最適である。例えば結晶性インスリンは、通常亜鉛、ニッケル、コバルト、カドミウムなどの少量の重金属を含んでいる。０.４％（ｗ／ｗ）亜鉛を含んでいるインスリンは６量体で存在し、それ自身で安定に存在し、生体内分解性高分子重合物の金属塩との相互作用が弱められると考えられる。
必要な場合には、生理活性ポリペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
成長ホルモンとしては、いずれの種由来のものでも良いが、好ましくはヒト由来である。また下垂体などから抽出される天然由来も本発明に用いられるが、好ましくは遺伝子組換え型ＧＨ（特公平６−１２９９６号公報、特公平６−４８９８７号公報）である。さらに好ましくはＮ末端にメチオニンを有さない天然型と同じ構造を有する組換え型ヒトＧＨである。かかるＧＨとしては金属塩であってもよいが、また実質的に金属を含有しないものも用いられる。
【００１８】
本発明に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素など）、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオールなど）、酢酸エチル、アセトニトリルなどが挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリルなどが好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルムなど）と、アルコール類（例、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオールなど）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。特に、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタンなど）を単独で用いることが望ましい。
【００１９】
本発明において、徐放性製剤の製造に用いる酸化亜鉛は、微粉状であることが好ましく、粒子径が小さい程、反応時間の短縮が期待できるが、同時に飛散性が上昇するため取り扱い上の問題が生じる。酸化亜鉛の粒子径は、通常、約０.００１μm 〜約１０μm 、好ましくは約０.００５μm 〜約１μm、さらに好ましくは約０.０１μm 〜約０.１μm である。
生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛との有機溶媒溶液において、生体内分解性ポリマーに対する亜鉛（Ｚｎ）の含量は、重量比で好ましくは約０.００１〜約２％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０.０１〜約２％（Ｗ／Ｗ）、特に好ましくは約０.１〜約２％（Ｗ／Ｗ）である。なお生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛との有機溶液溶液中の亜鉛含量は、例えば原子吸光法などの分析学上の一般公知方法により定量される。
本明細書において、徐放性製剤とは、生理活性ポリペプチドとマイクロカプセル基剤(生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体）とを含有する微粒子であればよく、その具体例としては、例えば１個の粒子中に１個の薬物コアーを含有するマイクロカプセル、１個の粒子中に多数の薬物コアーを含有する多核マイクロカプセル、または分子状で薬物がマイクロカプセル基剤に溶解あるいは分散しているようなマイクロスフェア等が挙げられる。
【００２０】
本発明の徐放性製剤は、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛との有機溶媒溶液に生理活性ポリペプチドを分散させ、有機溶媒を除去することにより製造される。本明細書においては、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とが有機溶媒に溶解した澄明な溶液中において形成されている生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とから生成される生成物を「生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体」と称する。該生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体は、通常の塩、錯塩、複塩、有機金属化合物など、分子間の結合によって生じた化合物ないし組成物であってもよい。該生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体は、有機溶媒に溶解するとともに、最終目的物である徐放性製剤に優れた徐放性を付与するという特性を有する。また、生体内分解性ポリマーがＰＬＧＡであるものを「ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体」と称する。
本明細書においては「分散」とは生理活性ポリペプチドが有機溶媒中に均質に分散していることを示しており、生理活性ポリペプチドの有機溶媒溶液および懸濁液のいずれも本発明の分散液に含まれる。
本発明の製造法において、有機溶媒の除去方法としては、例えば（a）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）、（b）相分離法（コアセルベーション法）、（c）噴霧乾燥法およびこれらに準じた方法などが用いられる。以下に徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
本発明製造法においては、まず生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中に共存させて、生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を製造する。この際、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は、分子量、有機溶媒などの種類によって異なるが、例えば約０.１〜約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１〜約７０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約２〜約６０％（Ｗ／Ｗ）である。また添加する酸化亜鉛量は、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば生体内分解性ポリマー量の約０.００１〜約５％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.０１〜約２.５％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜約２.５％（Ｗ／Ｗ）である。
有機溶媒への生体内分解性ポリマー及び酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。
【００２１】
ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体などの生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体の溶液を、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とから生成させる条件は、用いる生体内分解性ポリマーの種類、酸化亜鉛の粒子径、有機溶媒の種類、これらの組成等により適宜変更されるが、例えばポリマーとしてＰＬＧＡを用いる場合、通常、約０〜約３０℃好ましくは約２〜約２５℃で、約１時間〜約１６８時間、好ましくは約１２時間〜約９６時間、さらに好ましくは約２４時間〜約７２時間反応させることにより、ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体を得ることができる。しかしながら、本発明のＰＬＧＡ・酸化亜鉛体の生成は、添加時には懸濁状態である酸化亜鉛が有機溶媒に溶解し、澄明な溶液状態となることにより肉眼的に確認することが可能であり、前記範囲に限定される事なく、目視による液状の観察を指標として、反応時間を決定してもよい。
同反応は、ＰＬＧＡと酸化亜鉛とを単に有機溶媒中に共存させることによっても進行するが、適当な撹拌・振とう手段により、撹拌、振とう下で反応させることは、反応時間短縮において有利である。また、同様に超音波照射下で反応させることも好ましい。ここで、反応温度は高いほど反応時間が短縮されるが、同時にＰＬＧＡの分解速度も促進される弊害がある。
得られた生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体は、本発明において好ましくは有機溶媒溶液の状態で次工程に用いられるが、所望によっては有機溶媒を除去し、一旦固体状としてもよい。
【００２２】
次いで、前記のようにして得られた生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛体との有機溶媒溶液に、生理活性ポリペプチドを好ましくは粉末状で、例えば生体内分解性ポリマー量の約０.１〜約５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１〜約２０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約３〜約１５％（Ｗ／Ｗ）添加し、溶解または分散させ、生体内分解性ポリマー、酸化亜鉛および生理活性ポリペプチドとを含有する有機溶媒分散液（以下、単に生理活性ポリペプチド分散液と称することがある）を製造する。生理活性ポリペプチドが、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛との有機溶媒溶液に溶解せず、粉末で添加すると混濁し、分散させにくい性質を有するような場合、生理活性ポリペプチドはあらかじめ有機溶媒中に分散させておくのが好ましい。該有機溶媒中には、例えば生理活性ポリペプチド安定化剤（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、硫酸プロタミンなど）を添加してもよい。
生理活性ポリペプチドを有機溶媒中に均一に分散させるには、外部物理的エネルギーを加えることが好ましい。その方法として例えば、超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザーなどが挙げられる。この時の有機溶媒中での生理活性ポリペプチド粒子サイズとしては、約０.０１〜約２００μm、好ましくは約０.０５〜約１００μm、さらに好ましくは約０.１〜約５０μm であることが望まれる。また、この時の有機溶媒中での生理活性ポリペプチド濃度は、約１〜約５０％、好ましくは約２〜約２０％である。このような処理により有機溶媒中における生理活性ポリペプチドの粒子サイズを一定にして、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛との有機溶媒溶液中に均一に分散させることが可能となる。
また、生理活性ポリペプチドは、予め生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体とは独立して有機溶媒に分散させてもよい。この場合、用いる有機溶媒は、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛体とを溶解した有機溶媒と同一の組成でも、また異なっていてもよい。例えば、生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体をジクロロメタンに溶解し、生理活性ポリペプチドをアセトニトリルに分散させ、両者を混合してもよい。この際、生理活性ポリペプチドと生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体との比率（容量比）は、例えば約１：１０００〜約１：１、好ましくは約１：２００〜約１：５、特に好ましくは約１：１００〜約１：５である。
【００２３】
（ａ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
前記のようにして調製された生理活性ポリペプチド分散液をさらに水相中に加えて、ｏ／ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を揮散させ、マイクロカプセルを製造する。この際、該外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｏ／ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが用いられる。該乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールである。該乳化剤は、１種類または２種以上を組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、約０.００１〜約２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０.０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５％〜約５％（ｗ／ｗ）である。
【００２４】
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤などを蒸留水による洗浄で除去し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。その後必要であれば、加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒をさらに除去する。減圧下に加温してもよい。加温条件としては、用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥する。ここにおいて、ガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０ないし２０℃で昇温した際に得られる中間点をいう。
【００２５】
（b）相分離法（コアセルベーション法）
本法によりＭＣを製造する場合には、前記の生理活性ポリペプチド分散液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加え、ＭＣを析出、固化させる。該コアセルベーション剤の添加量は、上記分散液の約０.０１倍〜約１,０００倍の体積量、好ましくは約０.０５倍〜約５００倍の体積量、さらに好ましくは約０.１倍〜約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で使用した生体内分解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたＭＣを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄してコアセルベーション剤を除去する。さらに、前記（a）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。
水中乾燥法およびコアセルベーション法でのＭＣの製造では、ＭＣの洗浄の際に、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金属塩などの水溶性多糖類；グリシン、アラニンなどのアミノ酸類；フィブリン、コラーゲン等の蛋白質；塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが適宜用いられる。
【００２６】
（ｃ）噴霧乾燥法
本法によってＭＣを製造する場合には、生理活性ポリペプチド分散液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、ＭＣを製造する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型などがある。この際所望により、上記の分散液と同時に、ＭＣ粒子同志の凝集防止を目的として前記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られたＭＣは、前記（a）と同様にして洗浄し、必要であれば加温（要すれば減圧下）により、水分および有機溶媒をさらに除去する。
【００２７】
本発明において、ＰＬＧＡ・酸化亜鉛体をマイクロカプセル基剤とする場合、ＭＣへの生理活性ポリペプチド、例えばＧＨの取り込み率は約５０％以上であることが望ましい。
本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性ポリペプチドの含量は、例えば約０.１〜約３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約０.２〜約２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.５〜約１０％（ｗ／ｗ）である。
本発明の徐放性製剤は、例えば前記で得られたマイクロカプセルなどの微粒子をそのままで、あるいはこの微粒子を製剤原料として用いて、種々の剤型、例えば非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
これらの剤型の製剤は、製剤製造のために一般に用いられる公知の方法により製造される。
【００２８】
本発明の徐放性製剤は、特に注射剤であることが好ましい。前記方法で得られたマイクロカプセルなどの微粒子を注射剤とするには、該微粒子を分散剤（例、Tween ８０、ＨＣＯ−６０等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多糖類、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコール４００など）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン、クロロブタノールなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいはこれにレシチンなどのリン脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例、ミグリオール８１２等）と共に懸濁して油性懸濁剤として徐放性注射剤とする。
徐放性製剤は、微粒子であることが特に好ましい。徐放性製剤の粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１〜約３００μm、好ましくは約１〜約１５０μm、さらに好ましくは約２〜約１００μmである。
前記した微粒子を無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２９】
徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギなど）に対して安全に用いられる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより異なる。徐放性製剤は、該生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病など、インターフェロン−αである場合には、ウイルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎、ＨＢe 抗原陽性活動性肝炎など）、癌（例、腎癌、多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンの場合には貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例、制ガン剤治療時）、感染症など、ＩＬ−２の場合には癌（例、血管内皮腫など）など、ＦＧＦの場合には骨折、創傷(床ずれなど)、歯周病、消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症など、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合には血栓症など、腫瘍壊死因子の場合には癌などの治療または予防に有効である。また、ＧＨ含有徐放性製剤では、ＧＨの成長ホルモン作用に基づき、下垂体性小人症だけでなく、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、さらには成人性下垂体不全症に適応できる。また、ＧＨはダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、あるいは若年性慢性関節症などの疾患にも適応され、有効な治療効果を得たとの報告もある。
【００３０】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、該生理活性ポリペプチドの有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性ポリペプチドの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、該生理活性ポリペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０１〜約０.２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００３１】
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、ＧＨの場合には、投与量は、ＧＨの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、該ＧＨの有効濃度が体内で保持される量であればよい。上記した疾患の治療において、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、ＧＨの投与量は有効成分として、好ましくは、小児あるいは成人１人当たり約０.０１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選択して安全に投与することができる。さらに好ましくは約０.０５〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回あるいは１ケ月に１回等、ＧＨ含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することがさらに好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および実験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
実施例１
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００）１ｇと酸化亜鉛６.６ｍｇとをジクロロメタン１.７ｍｌに添加し、２５℃で３日間撹拌（６０ rpm）し澄明な乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.０ｍｇを添加し、ボルテックスミキサーおよび小型ホモジナイザーで混合し超音波処理して、ヒト成長ホルモンと乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体とを含む有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液を、あらかじめ１８℃に調節しておいた０.１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液４００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサーを使用してｏ／ｗ型エマルションとした。このｏ／ｗ型エマルションを室温で撹拌し、ジクロロメタンを揮散させ、マイクロカプセルを調製した。得られたマイクロカプセルを遠心分離操作（約１５００ rpm）により分取した。次いで蒸留水４００ｍｌを用いて２回洗浄後、凍結乾燥し粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５２１ｍｇを得た。
【００３３】
実施例２
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００）１ｇと酸化亜鉛１３.１ｍｇとをジクロロメタン２.３ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.３ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５３６ｍｇを得た。
実施例３
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００）１ｇと酸化亜鉛２１.９ｍｇとをジクロロメタン２.８ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.８ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５８９ｍｇを得た。
【００３４】
実施例４
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１２０００）１ｇと酸化亜鉛５.１ｍｇとをジクロロメタン１.９ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５２.９ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５０６ｍｇを得た。
実施例５
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１２０００）１ｇと酸化亜鉛１０.２ｍｇとをジクロロメタン２.５ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.２ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５６８ｍｇを得た。
【００３５】
実施例６
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝６５／３５（モル％）、重量平均分子量１２０００）１ｇと酸化亜鉛１７.０ｍｇとをジクロロメタン３.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.５ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５６１ｍｇを得た。
実施例７
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００）１ｇと酸化亜鉛４.５ｍｇとをジクロロメタン２.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５２.９ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５４０ｍｇを得た。
【００３６】
実施例８
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００）１ｇと酸化亜鉛８.９ｍｇとをジクロロメタン２.６ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.１ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５５９ｍｇを得た。
実施例９
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００）１ｇと酸化亜鉛１４.９ｍｇとをジクロロメタン３.１ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.４ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル４６４ｍｇを得た。
【００３７】
実施例１０
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量２００００）１ｇと酸化亜鉛４.０ｍｇとをジクロロメタン２.５ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５２.８ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５９５ｍｇを得た。
実施例１１
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量２００００）１ｇと酸化亜鉛７.９ｍｇとをジクロロメタン３.６ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.１ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル４７８ｍｇを得た。
【００３８】
実施例１２
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量２００００）１ｇと酸化亜鉛１３.２ｍｇとをジクロロメタン５.２ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.３ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５３４ｍｇを得た。
実施例１３
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５（モル％）、重量平均分子量１０５００）１ｇと酸化亜鉛６.６ｍｇとをジクロロメタン３.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５２１ｍｇを得た。
【００３９】
実施例１４
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝８５／１５（モル％）、重量平均分子量１２０００）１ｇと酸化亜鉛５.８ｍｇとをジクロロメタン２.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末５３.０ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル５０３ｍｇを得た。
【００４０】
実施例１５
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００）１.８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン３.４ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.４１ｇを得た。
実施例１６
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１２０００）１.８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン３.５ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.４１ｇを得た。
【００４１】
実施例１７
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１４０００）１.８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン４.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.４０ｇを得た。
実施例１８
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１６０００）１.８９ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン４.２ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.３４ｇを得た。
【００４２】
比較例１
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１５０００）をジクロロメタンに溶解し（９５０ｍｇ／ｍｌ）、乳酸−グリコール酸共重合体の有機溶媒溶液を得た。この溶液１ｍｌとヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末のジクロロメタン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌとを混合し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル４９０ｍｇを得た。
【００４３】
比較例２
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１００００）１.９０ｇをジクロロメタン２.６ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.２８ｇを得た。
比較例３
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１２０００）１.９０ｇをジクロロメタン２.８ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.１８ｇを得た。
【００４４】
比較例４
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１４０００）１.９０ｇをジクロロメタン３.０ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル０.８９ｇを得た。
比較例５
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０（モル％）、重量平均分子量１６０００）１.９０ｇをジクロロメタン３.２ｍｌに溶解し、乳酸−グリコール酸共重合体の有機溶媒溶液を得た。この溶液にヒト成長ホルモン凍結乾燥粉末１００ｍｇを添加し、実施例１と同様に処理して粉末状のヒト成長ホルモン含有マイクロカプセル１.２６ｇを得た。
【００４５】
〔実験例〕
実験例１
実施例７で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセル３０８ｍｇを分散媒（分散媒の組成：マンニトール（５％），カルボキシメチルセルロース（０.５％）, ツイーン２０（０.１％）を蒸留水に溶解し、酢酸で pＨ６.８に調整）（以下、同様）２.２５ｍｌに、実施例８で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセル３５１ｍｇを分散媒２.２５ｍｌに、実施例９で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセル３２７ｍｇを分散媒１.７５ｍｌに、さらに比較例１で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ含有マイクロカプセル２２９ｍｇを分散媒１.７５ｍｌに分散した。得られた分散液０.５ｍｌ（ヒトＧＨ３ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にラット背部に皮下投与した。尾静脈より経時的に採血し血清を分取した。得られた血清中のヒトＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学製）により測定した。得られた結果を〔表１〕に示す。
【表１】
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実施例７、８および９で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセル投与群におけるヒトＧＨ濃度は、比較例１で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ含有マイクロカプセル投与群に比べて有意に高値を示し、しかも長期の持続性を示した。本発明の製造法により、優れた放出性を示す徐放性製剤が製造できる。
【００４６】
実験例２
実施例１５，１６，１７および１８で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセルの、それぞれ５５０ｍｇ，５５６ｍｇ，５７６ｍｇおよび５７３ｍｇを実験例１に記載の分散媒３.３８ｍｌに；比較例２，３，４および５で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ含有マイクロカプセルの、それぞれ５４８ｍｇ，５４８ｍｇ，５６７ｍｇおよび５６０ｍｇを同様の分散媒３.３８ｍｌに分散した。得られた分散液０.７５ｍｌ（ヒトＧＨ６ｍｇを含有）をエーテル麻酔下にラット背部に皮下投与した。尾静脈より経時的に採血し、血清を分取した。得られた血清中のヒトＧＨ濃度を、実験例１記載のラジオイムノアッセイにより測定した。得られた結果を〔表２〕ないし〔表５〕に示す。
【表２】
0004459315.tif 000003
【００４７】
【表３】
0004459315.tif 000004
【表４】
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【００４８】
【表５】
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実施例１５、１６、１７および１８で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ・酸化亜鉛体含有マイクロカプセル投与群におけるヒトＧＨ濃度は、それぞれ比較例２，３，４，５で得られたヒト成長ホルモンおよびＰＬＧＡ含有マイクロカプセル投与群におけるヒトＧＨ濃度に比べて有意に高値を示した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、成長ホルモンなどの生理活性ペプチドの取り込み率を高め、長期に亘り一定した高い値の血中濃度を示す徐放性製剤を提供できる。