(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍で特異的に発現するポリペプチド、抗腫瘍および／または抗腫瘍形成活性を有する活性薬物、および幹細胞分化、特に、例えば、骨形成での骨芽細胞形成に依存する状態を改善するのに有効な薬物、該薬物の医薬組成物、および該薬物および組成物の医薬上の使用に関する。本発明は、試験管内での、抗腫瘍および／または抗腫瘍形成活性について、ならびに、幹細胞分化を促進するのに有効な薬物についてスクリーニングする方法にも関する。
【０００２】
細胞の互いとの、および細胞外基質（ＥＣＭ）との接着、ならびに該結合の結果として伝達される細胞シグナルは、体の形態および機能の発生および維持に基本的に重要である。ＥＣＭは、組織のホメオスタシスでの重要な制御機能を有し、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子と共に、腫瘍形成に決定的に関与する（Boudreau, N. & Bissell, M. J. (1998) Curr Opin Cell Biol 10: 640-646 and Ruoslahti, E. (1999) Adv Cancer Res 76: 1-20に概説）。
【０００３】
世界の豊かな国では、癌は、５人中約１人の死亡の原因となり、最も一般的な５種類の癌は肺、胃、乳房、大腸／直腸、および子宮頚部である。この種の腫瘍は、たいてい、リンパ管および血管により、転移する。癌は、全ての場合で致命的であるわけではないが、癌を発症する約半数のヒトがそれにより死亡する。癌患者および彼らの医師に直面する問題は、癌を治癒させようとすることは雑草を駆除しようとすることに似ているということである。
【０００４】
癌を効果的に処置するための１つの方法は、初期での診断を受けることである。ほとんどの癌は、発症の初期では、広範には血管新生しない（それゆえ、浸潤性でない）。高血管新生、浸潤性、および体中に広がった最終的な転移性癌への移行は、通常、１０年以上かかる。浸潤する前に癌が検出されると、癌にかかった組織の外科的除去が効果的な治療となる。しかしながら、癌は、しばしば、臨床的症状が現れた際にのみ検出される。一般的に、該症状は、疾病が十分に確立した場合（しばしば、転移が生じた後）にのみ現れ、患者の予後は、癌にかかった組織の外科的切除後でさえ、悪い。従って、癌の初期での検出は、検出が罹患率を有意に減少させるという点で重要である。初期で癌を診断する、信頼でき、非侵襲性、かつ正確な技術が、多くの命を助けるだろう。
【０００５】
癌細胞は、外科的に除去されるか、または毒性化合物または照射で破壊され得るが、癌にかかった細胞全てを排除することは大変困難である。従って、一般的な目標は、癌細胞を選択的に殺す一方で、影響を受けていない正常体細胞を残す、よりよい方法を見出すことである。該努力の一部は、新規抗癌薬物を同定することを含む。
【０００６】
腫瘍形成とは別に、ＥＣＭは、組織のホメオスタシス、および体の形態および機能の発生および維持、例えば、骨格の発生またはリモデリング、または骨形態形成での重要な制御機能を有する。骨髄は、骨形成の可能性のある幹細胞を有し、かつ骨形成に関係する決定された骨形成前駆体細胞、および誘導可能な骨形成前駆細胞からなる。決定された骨形成前駆細胞は、外因性シグナルなしで、骨に分化できる。誘導可能な骨形成前駆細胞は、分化プログラムを開始するための分子シグナル、例えば、細胞外基質との結合による誘導を必要とする。
【０００７】
細胞接着を仲介する多くの分子が、脊椎動物および無脊椎動物共に分子レベルで同定され、特徴付けられた。テネイシンは、巨大な多重結合細胞外基質タンパク質のファミリーであり、それぞれが、変動可能な数の繰り返しドメインで構成される相同なサブユニットを有する。これらは、７個の繰り返し、上皮成長因子（ＥＧＦ）様繰り返し、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、およびフィブリノーゲンでも見出される、Ｃ末端球状ドメインを含む。テネイシンＣは、ある例では、筋腱間抗原として（Chiquet, M. & Fambrough, DM. (1984) J Cell Biol 98(6):1937-1946）、そして別の例では、神経膠腫の間質で富化されたタンパク質（すなわち、腱および靱帯、および腫瘍間質の細胞外基質での主な部分のテネイシンＣ発現を反映する）として（Bourdon, MA. et al (1983) Cancer Res 43(6):2796-2805）発見された、ファミリーの最初のメンバーであった。テネイシンＣ（ヘキサブレイキオン（hexabrachion)とも呼ばれる）に関する発見のさらなる例は、そのフィブロネクチンとの相互作用を反映する（Erickson, HP. et al. (1984) Nature 311(5983):267-9）。腫瘍細胞のフィブロネクチンとの強制的相互作用は、細胞培養での増殖を遮断し、かつヌードマウスでの腫瘍成長を減少させ得る（Akamatsu H. et al (1996) Cancer Res 56: 4541-4546およびGiancotti, F. G & Ruoslahti, E. (1990) Cell 60: 849-859）。テネイシンＣは、細胞のフィブロネクチンとの相互作用を分断させ、そしてこの方法で、腫瘍細胞の増殖を増大させることが分かった。Chiquet-Ehrismann, R. et al (1988) Cell 53: 383-390は、テネイシンＣのフィブロネクチンとの結合が、細胞のフィブロネクチンとの接着を遮断し、ラットの乳腺癌腫細胞の増殖を増加させることを最初に示した（Chiquet-Ehrismann, R. et al (1986) Cell 47: 131-139）。
【０００８】
テネイシンＣは、神経系を含む多数の発生中の組織に存在する。成熟靱帯および腱での富化にも関わらず、筋が損傷された骨格および心筋には存在しない。テネイシンＣ発現は、本質的には、全癌腫、ならびに多くの他の種類の腫瘍で上昇される（概説として、Chiquet-Ehrismann, R. (1993) Semin Cancer Biol 4(5):301-10を参照されたい）。さらに、テネイシンＣは、創傷治癒（Latijnhouwers, MA. et al. (1996) J Pathol 178(1):30-5）、骨格形成（Koyama, E. et al (1996) J Orthop Res. 14(3):403-412およびHall, BK. & Miyake, T. (1995) Int J Dev Biol. 39(6):881-893）、ならびに、感染および炎症を含む多くの疾病（Schenk, S. et al. (1995) Int J Cancer 61(4):443-9）でアップレギュレートされる。
【０００９】
それぞれのテネイシンフェミリーのメンバーは、胚形成中、および成体での特異的遺伝子発現パターンを示し（概説として、Chiquet-Ehrismann, R. (1995) Experientia 51(9-10):853-62を参照されたい）、これは、それぞれのメンバーの特異的な役割を示唆する。テネイシンＲは、主に脳組織で見出される神経系の細胞外基質成分である（Pasheva, P. et al. (2001) Prog Brain Res. 132:103-14. Review）が、テネイシンＸは、筋肉と皮膚の結合組織で顕著に発現する。ある患者では、テネイシンＸの不測が、エーラーダンロスフェノタイプとなると報告された（Burch, GH. et al. (1997) Nat Genet 17(1):104-8）。
【００１０】
現時点で、文献（Weber, P. et al. (1998) J Neurobiol 35(1):1-16）での利用可能なテネイシンＷについての報告は１つだけである。この研究では、テネイシンＷをコード化するｃＤＮＡが、全テネイシン分子で見出される保存上皮成長因子様ドメインに基づき、受精後２０〜２８時間のゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリーから単離された。テネイシンＷ転写物の発現パターンは、インサイツハイブリダイゼーションにより、発生中のゼブラフィッシュで研究された。それは、神経堤および硬節細胞、および発生中の骨格で存在することが見出された。Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列ＡＪ００１４２３は、ゼブラフィッシュのテネイシンＷを提供し、そしてＡＬ０４９６８９は、「テネイシンＲ様、１番染色体由来新規ヒトｍＲＮＡ」（機能は未知）を提供する。
【００１１】
本発明は、
（ａ）配列番号：１で説明されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の配列のうち５０個より多くの連続するヌクレオチドの部分配列（subsequence）；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の任意のヌクレオチド配列または部分配列と相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明の１つの態様において、ヌクレオチド配列を有する単離核酸分子は、好ましくは、（ａ）の配列と少なくとも８５％の同一性を示し、より好ましくは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸欠損、付加（例えば、融合タンパク質）、または置換を含む変異体の様な、配列番号：２で示されるアミノ酸配列の変異体をコード化する。好ましくは、変異体は、配列番号：２の該アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換を含み、より好ましくは、該変異体は、幹細胞分化誘導活性、特に、幹細胞からの骨芽細胞発生を誘導する活性を有する。最も好ましいのは、単離核酸分子が、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する場合である。
【００１３】
核酸分子はアンチセンス分子であり得る。この場合、それは、リボまたはデオキシリボヌクレオチドの一部または全部を置換するヌクレアーゼ分解に対して抵抗性のヌクレオチド残基を有することが望まれる。
【００１４】
本発明の核酸分子を含む核酸ベクター、ならびに、ベクターまたは核酸を含む宿主細胞、および本発明の操作された核酸を含むか、または内在性配列のないトランスジェニック、ノックアウト、または遺伝子改変動物（ヒト以外、特に、マウス）も提供される。
【００１５】
本発明は、
（ａ）配列番号：２で説明されるアミノ酸配列；および
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸の部分配列（ただし、該部分配列は、配列番号：２のアミノ酸番号１１０２から１１５２の範囲ではない）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む組成物も提供する。
【００１６】
好ましくは、（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸の保存的置換を含む。より好ましくは、ポリペプチドまたはフラグメントは、上記の幹細胞分化誘導活性を有する。有用なフラグメントは、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して生じた、ポリクローナル抗体により認識されるエピトープを示す。特に好ましいポリペプチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列によりコード化されるものである。
また、本発明のポリペプチドに対して特異的に反応する抗体も提供される。
【００１７】
本発明の別の態様において、組成物は、
（ａ）配列番号：１または配列番号：３で説明されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）、好ましくは（ａ）の配列の任意の１つと少なくとも３５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの部分配列；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子、
および、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む。
【００１８】
１つの実施態様において、核酸分子は、好ましくは、幹細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコード化する。別の実施態様において、核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３に対するアンチセンスである部分配列を有し、該核酸分子は、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性のヌクレオチド残基を含む。別の実施態様において、単離核酸分子は、配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列をコード化する。なお別の実施態様において、核酸分子は、配列番号：１のヌクレオチド２３８０〜３１７１、配列番号：３のヌクレオチド２３７１〜３１６２、配列番号：１のヌクレオチド２３８０〜３１７１の相補体、および配列番号：３のヌクレオチド２３７１〜３１６２の相補体からなる群から選択される部分配列、またはそのＲＮＡ相当物を有する。
【００１９】
従って、上記の薬剤としての使用のための核酸組成物、ならびに癌または骨病変の予防または処置のための医薬の製造のための該組成物の使用も提供される。
【００２０】
テネイシンＷ、好ましくは、組換えテネイシンＷ、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む組成物も提供される。好ましい実施態様において、テネイシンＷは、
（ａ）配列番号：２または４で説明されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも３５％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸配列の部分配列、
からなる群から選択さられるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２１】
好ましくは、ポリペプチドは、上記の幹細胞分化誘導活性を有する。より好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号：４で示されるアミノ酸配列によりコード化される。
【００２２】
従って、テネイシンＷレベルの増加を必要とする任意の疾病または状態、例えば、血栓症、創傷治癒、またはアテローム性動脈硬化症、ならびに骨形成の促進により改善される状態、例えば、骨折治癒、骨粗鬆症の処置または予防的処置のためのテネイシンＷの使用、ならびに、テネイシンＷの幹細胞マーカーとしての使用も提供される。
【００２３】
転移性癌を含む癌（例えば、膠芽細胞腫、前立腺癌腫、肺癌腫、結腸直腸癌腫、骨癌腫、または乳癌種）の予防または処置、またはテネイシンＷを含む任意の疾病または状態、例えば、過剰骨成長の予防または処置のための薬剤として使用するための、ならびに医薬の製造のための、テネイシンＷを特異的に認識する抗体も提供される。
【００２４】
本発明は、腫瘍形成の予防または予防的処置、または腫瘍または癌の処置または予防的処置のための、またはテネイシンＷを含む任意の疾病または状態、例えば、骨形成の促進または阻害により改善される状態の処置または予防的処置のための薬物を同定する方法も提供し、これは、試験化合物をテネイシンＷ発現細胞試料と接触させること、次に、該試験化合物が非存在である場合と比較して、
（ａ）細胞増殖、例えば、細胞周期のＳ期に入る細胞のプログレッション；
（ｂ）ＤＮＡ合成；
（ｃ）細胞接着；
（ｄ）細胞伝播；
（ｅ）フィブロネクチンでの病巣接着（focal adhesion）およびアクチンストレスファイバー形成；および
（ｆ）細胞の細胞外基質（ＥＣＭ）との結合、
のうちの１以上の変化を測定することを含む。
【００２５】
必要に応じて、該方法は、試験化合物が非存在である場合と比較して、テネイシンＷ発現の変化を測定することをさらに含む。テネイシンＷは、上記の特徴のうち１以上を有する。特に好ましいアッセイは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の形で行われる。
【００２６】
テネイシンＷの機能のモジュレーターを同定する方法も提供され、これは、
（ａ）試験化合物をテネイシンＷおよび／またはα８β１インテグリンと接触させること、および、該試験化合物が非存在である場合と比較して、
（ｂ）該試験化合物のテネイシンＷおよび／またはα８β１インテグリンとの結合を測定すること、または
（ｃ）テネイシンＷのα８β１インテグリンとの結合の開裂を測定すること、
を含む。
【００２７】
必要に応じて、方法は、対照化合物のテネイシンＷとの結合を測定することをさらに含む。１つの実施態様において、テネイシンＷは、固体表面に、例えば、テネイシンＷに対する抗体反応を用いて結合される。該結合は、蛍光標識、蛍光クエンチャー、放射性標識、シンチレーション標識、または酵素で標識された抗体を用いて、有利に検出され得る。または、結合は、α８β１の固定化テネイシンＷとの接着（実施例８に記載）、またはその逆を測定することにより、検出される。テネイシンＷのα８β１インテグリンとの結合の減少は、テネイシンＷのα８β１インテグリンとの相互作用のインヒビター（そしてそれ故、テネイシンＷの機能のインヒビター）の指標である。試験化合物の存在下でのテネイシンＷのα８β１インテグリンとの結合の増加は、α８β１インテグリンを活性化し、これにより、テネイシンＷの機能のアゴニストとして作用する、可能性のある薬物の指標である。
【００２８】
従って、本発明のスクリーニング方法により同定される、腫瘍形成の予防または予防的処置、または腫瘍の診断、または処置または予防的処置、またはテネイシンＷを含む任意の疾病または状態、例えば、骨形成の促進により改善される状態の処置または予防的処置のための薬物も提供される。
【００２９】
癌を診断または予後診断する方法も提供され、これは、
（ａ）個体から採取された試料をテネイシンＷの存在について分析すること；および
（ｂ）テネイシンＷの存在を、好ましくない予後診断または診断と関連づけること、
を含む。
【００３０】
必要に応じて、方法は、健常組織と比較して、試料中のテネイシンＷの増加（レベルの上昇）を、好ましくない予後診断または診断と関連づけることをさらに含む。テネイシンＷは、テネイシンＷに特異的な抗体を用いて有利に検出され得るか、またはテネイシンＷは、ポリメラーゼ連鎖反応法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）の様な当該技術分野でよく知られた技術を用いて、転写物レベルで検出され得る。方法は、対照のさらなる使用を含んでもよい。
【００３１】
試料は、例えば、個体由来の血清であり得る。方法は、試料中の細胞を細胞培養で増殖させることもさらに含む。１つの実施態様において、方法は、試料をα８インテグリンの存在（α８インテグリンの存在は、好ましくない予後診断または診断と関連する）について分析することをさらに含む。
【００３２】
本発明者は、細胞外基質分子、発生中のその発現、細胞接着、および腫瘍細胞の増殖を調べ、そして、哺乳類テネイシンファミリーの新規メンバーを特徴付けた。本発明より前に、テネイシンＷは哺乳類供給源から同定されておらず、その機能は以前は分かっていなかった。本発明者は、マウスおよびヒトテネイシンＷをコード化する完全ｃＤＮＡ配列を同定し、特徴付けた。抗血清は、テネイシンＷのフラグメントに対して調製され、そして、腫瘍間質、骨膜、および肝臓組織でのテネイシンＷを検出し、かついくつかの哺乳類種由来のテネイシンＷと交差反応する。具体的に、本発明者は、テネイシンＷが、転移性腫瘍細胞、ならびに骨膜、骨形成のための幹細胞成分で特異的に発現されることを発見した。
【００３３】
従って、１つの態様において、本発明は、
（ａ）配列番号：１で説明されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の配列の５０、７５、１００、２００個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の任意のヌクレオチド配列または部分配列と相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を含む組成物を提供する。
【００３４】
組成物は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡを含む、様々な種類の核酸を含む。本発明の１つの態様において、ヌクレオチド配列を有する単離核酸分子は、好ましくは、（ａ）の配列（配列番号：１）と少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、９０％の同一性、最も好ましくは、９５、９８、または１００％の同一性を示す。配列番号：２で示されるアミノ酸を有するポリペプチド、または配列番号：２で示されるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸欠損、付加（例えば、融合タンパク質）、または置換を含む変異体の様なその変異体をコード化する核酸も包含される。従って、たいていのアミノ酸は１以上の３塩基コドンによりコード化されるから、遺伝子コードの縮重により、該ポリペプチドをコード化できる様々な核酸は異なり得る。該コドンの同一性は、当該技術分野でよく知られており、該情報は、本発明の範囲の核酸の構築のために用いられ得る。変異体は、野生型タンパク質の生物学的活性を増強、付加または減少させる１以上のアミノ酸置換を有する点で、野生型タンパク質と異なる。アミノ酸の変異が選択されると、該変異体をコード化する核酸は、当該技術分野でよく知られた方法に従い、構築される。
【００３５】
好ましくは、変異体は、配列番号：２の該アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸での保存的置換を含む。変異体は、典型的には、配列番号：２で説明されるポリペプチドの生物学的機能、すなわち、幹細胞分化誘導活性、特に、幹細胞から骨芽細胞発生を誘導する活性、またはテネイシンＷを特異的に認識する抗体との結合を示す。生物学的活性を維持するために、従って、１個の保存的置換が好ましく、これは、当該技術分野でよく知られている。最も好ましいのは、単離核酸分子が、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する場合である。
【００３６】
核酸分子は、アンチセンス分子であり得る。この場合、それは、リボまたはデオキシリボヌクレオチドの一部または全部を置換するヌクレアーゼ分解に対して抵抗性である、ヌクレオチド残基を有することが望ましい。ヌクレアーゼに対して抵抗性の該ヌクレオチド残基は、当該技術分野でよく知られており、かつ化学的方法により容易に合成され得る。
【００３７】
本発明の核酸分子を含む核酸ベクター、ならびに、ベクターまたは核酸を含む宿主細胞、および本発明の操作された核酸を含むか、または内在性配列のない、トランスジェニック、ノックアウト、遺伝的に改変された動物（ヒト以外、特にマウス）も提供される。
【００３８】
本発明は、
（ａ）配列番号：２で説明されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％の同一性、好ましくは、９０、９５、９８、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列の少なくとも３０、４０、５０、７５、１００個、またはそれ以上の連続するアミノ酸の部分配列（ただし、該部分配列は、配列番号：２のアミノ酸番号１１０２から１１５２は含まない）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを含む組成物も提供する。
【００３９】
好ましくは、（ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸の保存的置換を含む。より好ましくは、ポリペプチドまたはフラグメントは、上記の幹細胞分化誘導活性を有する。有用なフラグメントは、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して生じた、ポリクローナル抗体により認識されるエピトープを示す。特に好ましいポリペプチドは、マウス組織由来の配列番号：２で示されるアミノ酸配列によりコード化されるものである。
【００４０】
従って、組換え方法、または合成方法により生成されるか、または天然に存在する供給源から単離されるかに関わらず、配列番号：２により記載されるポリペプチドの変異体および誘導体、またはそのフラグメントも本発明の範囲に含まれる。例えば、修飾アミノ酸／ペプチド結合、および安定性または活性の様な改善された特性を有する、非天然に存在するアミノ酸および／または環状ペプチドが含まれる。さらに、本発明のペプチドは、別のタンパク質、例えば、ポリペプチド（そのフラグメントを含む）の標的とされる送達または検出、または精製のためのタグを有する形、または融合したものであってもよい。
【００４１】
アミノ酸配列の意味での「変異体」は、別のもの、普通は関係アミノ酸配列と１個以上のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を定義する。変異体は、「保存的」変化を有し、ここで、置換されたアミノ酸は、類似の構造または化学特性を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換え）。変異体はあまり「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンでの置き換え）を有さない。類似の小数変異体はまた、アミノ酸欠損または挿入（すなわち、付加）、または両方を含む。いくつのアミノ酸残基が、活性（例えば、抗癌活性、骨芽細胞促進活性、抗原活性）を破壊することなく、置換、挿入、または欠損されるかを決定する際のガイダンスは、当該技術分野でよく知られたコンピュータープログラムを用いて見出される。本発明のポリペプチドの変異体は、ミュータント変異体の全ての形（例えば、少なくとも１個のアミノ酸が欠損されるか、または置換されている）を含む。アミノ酸の置換を含む任意の変化は、好ましくは、天然または保存的置換である。他の変異体は、配列中に少なくとも１個の付加アミノ酸を含み、および／または当該技術分野でよく知られた、融合タンパク質の様な付加アミノ酸配列またはドメインをさらに含むタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００４２】
さらに、本発明のポリペプチドの変異体は、配列中の少なくとも１個のアミノ酸が天然または非天然の類似体であるものを含む。また、配列中の１個以上のアミノ酸は、例えば、物理的安定性を増加させるために、または酵素、特に、プロテアーゼまたはキナーゼ活性に対する感受性を減少させるために、化学的に修飾されてもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドに対して特異的に反応する抗体も提供される。抗体産生方法は、当該技術分野でよく知られている。本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、動物を免疫原性のある量のポリペプチドで免疫することにより、容易に得られ得る。従って、本発明のポリペプチドを認識する抗体は、動物を免疫することにより得られ、かつ本発明のポリペプチドを特異的に認識することが、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、または当該技術分野で既知の他の日常的方法により確かめられ得る、ポリクローナル抗体および抗血清を包含する。
【００４４】
ポリクローナル抗体が感作により得られ得ると、ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体は、感作動物のリンパ球から得られることはよく知られている（Chapter 6, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988）。従って、本発明のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体も提供される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野の技術者に既知であり、科学文献および特許文献に記載されている（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Green, NY (1991)； Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, and references cited therein (Stites)； Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986)；およびKohler (1975) Nature 256: 495.を参照されたい）。該技術は、ファージまたは類似の細胞で表された組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択を含む。Huse (1989) Science 246: 1275 and Ward (1989) Nature 341: 544を参照されたい。組換え抗体は、哺乳類細胞での一過性または安定的発現ベクターにより発現され得る（例えば、Norderhaug (1997) J. Immunol. Methods 204: 77-87）。
【００４５】
本発明において、抗体は、その活性フラグメントも包含する。活性フラグメントは、抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味する。特別に名付けられたものは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、およびＦｖの様な活性フラグメントである。例えば、Ｆ（ａｂ’）２は、本発明の抗体がペプシンで切断されると生じ、そしてＦａｂは、パパインで切断されると生じる。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２が、２−メルカプトエタノールの様な試薬で還元され、そしてモノヨード酢酸でアルキル化されると生じる。Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域がリンカーで結合されている、単一活性フラグメントである。キメラ抗体は、該活性フラグメントを保存すること、および該活性フラグメント以外のフラグメントを別の動物のフラグメントとに置換することにより得られる。特に、ヒト化抗体が、想定される。
【００４６】
本明細書で調べられた核酸およびポリペプチド配列は、転移性癌細胞株から採取された試料で差次的に発現することが見出され、転移性癌組織、ならびに他の種類の癌および疾病でのテネイシンＷ発現を予測する。
【００４７】
従って、本発明のある種の態様は、腫瘍組織、特に、転移性癌細胞株で差次的に発現される核酸、該核酸によりコード化されるポリペプチド、該ポリペプチドと免疫反応する抗体、および該組成物の製造に関する。さらに、本発明は、診断および治療アッセイ、および例えば、対象核酸の異常発現を含む疾患を検出および処置するための試薬を提供する。
【００４８】
従って、本発明のさらなる態様において、テネイシンＷまたはそのフラグメントをコード化する単離核酸分子、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む、組成物が提供される。テネイシンＷをコード化する核酸の医薬上の使用は、これまで示されておらず、従って、該実施態様において、医薬組成物の核酸は、本発明の核酸に限られない。具体的には、組成物は、
（ａ）配列番号：１または配列番号：３で説明されるヌクレオチド配列（ヒトテネイシンＷをコード化する）；
（ｂ）配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）、好ましくは（ａ）の配列の任意の１つと少なくとも３５％の同一性、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の配列ののうち少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列；および
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する単離核酸、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む。
【００４９】
１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列、または配列番号：２または４に対応する配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸を有するテネイシンＷをコード化する。核酸分子は、配列番号：１または配列番号：２、またはそれに対する相補鎖の少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、２０、３０、５０、７５、１００個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドである。
【００５０】
１つの実施態様において、本発明は、抗体パラトープと結合するエピトープをコード化する、配列番号：１のヌクレオチド２３８０〜３１７１または配列番号：３のヌクレオチド２３７１〜３１６２、配列番号：１のヌクレオチド２３８０〜３１７１または配列番号：３のヌクレオチド２３７１〜３１６２の相補鎖、およびそのＲＮＡ相当物からなる群から選択されるヌクレオチド配列フラグメントを含む組成物を提供する。
【００５１】
別の実施態様において、核酸分子は、好ましくは、幹細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコード化する。日常的方法論を用いて、適当な活性を有するポリペプチドを同定することは当該技術分野の技術者の十分に範囲内であるが、単離核酸分子は、好ましくは、配列番号：２または配列番号：４で示されるアミノ酸配列、最もこのましくは、配列番号：４のものをコード化する。
【００５２】
なお別の実施態様において、核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３に対するアンチセンスである部分配列を有し、ここで、該核酸分子は、ヌクレアーゼ分解に抵抗性のヌクレオチド残基を含む。
【００５３】
核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の全部または一部に対するアンチセンス、または配列番号：１または配列番号：３（テネイシンＷをコード化する）と低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる、配列番号：１または配列番号：３と少なくとも７０％の同一性を有する配列に対するアンチセンスであってもよい。低ストリンジェントな条件は、約１０倍の高濃度を利用する高ストリンジェントと比較して、約０．０１×ＳＳＣバッファーを利用する。または、アンチセンスＲＮＡは、テネイシンＷ遺伝子の制御配列、特に、該遺伝子の５’上流配列（プロモーター領域）に対するアンチセンスであってもよい。同様に、低分子ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、特定の方法で、テネイシンＷの発現を阻害するように設計され得る。
【００５４】
核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、センスまたはアンチセンスであり得、そしてある実施態様においては、２本鎖（ｓｉＲＮＡを含む）または１本鎖であり得る。ある種の実施態様において、核酸（センスまたはアンチセンス）のヌクレオチド残基の少なくともいくつかは、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性とされ、そしてこれは、ホスホロチオエートおよび／またはメチルホスホン酸の様な残基から選択され得る。
【００５５】
上記のアンチセンス核酸は、薬剤、好ましくは、癌の様なテネイシンＷレベルの上昇に依存する状態の予防または処置のための医薬の製造のためである医薬上の適用として、有利に用いられ得る。
【００５６】
従って、本発明は、テネイシンＷに依存する状態を予防または処置する方法も提供し、これは、個体に本明細書に記載の核酸を有効量投与することを含む。従って、本発明は、薬剤、ならびに特に、癌または骨病変の予防または処置のための医薬の製造のための該核酸分子の使用を包含する。
【００５７】
なお別の態様において、本発明は、１以上のベクター配列、およびテネイシン（teneurin）Ｗをコード化する核酸配列を含む、宿主細胞で複製可能な発現ベクターを提供する。薬剤として使用するための構造物、ならびに、癌の予防または処置、または骨病変の予防または処置のための医薬の製造のためのその使用も提供される。
【００５８】
本発明の他の実施態様は、（ａ）本発明のテネイシンＷタンパク質またはポリペプチドをコード化する少なくとも１個の核酸配列、（ｂ）上記のアンチセンス核酸（または例えば、細胞でのアンチセンスＲＮＡの発現が予測される場合、その相補体）、または（ｃ）上記の核酸、およびテネイシンＷ（またはその相同体）以外のタンパク質をコード化する少なくとも１個の核酸配列、例えば、ベクター配列を含む、宿主細胞で複製可能な核酸構造物を含む。該構造物は、天然に存在する配列ではない。該構造物は、それらがベクターとして機能することを可能とするＤＮＡの必須配列を欠いているが、「ハイブリッド」核酸として天然に存在するものではない。それらは、該核酸構造物の宿主細胞での複製を可能とするために、本発明のヌクレオチド配列と作動可能に結合した転写制御領域を非限定的に含む、リンカーまたは制限酵素部位として機能する核酸配列を含む。好ましい構造物は、当該技術分野の技術者によく知られたオリゴヌクレオチド合成方法を用いて、合成される。
【００５９】
上記の構造物を含むベクターも提供される。好ましいベクターは、発現ベクター、好ましくは、プラスミドまたはウイルスベクターであるが、クローニングベクターも、必要に応じて、プラスミドの形で提供される。
本発明は、ベクターを含有する宿主細胞を提供する。好ましい宿主細胞は、真核生物の細胞、より好ましくは昆虫細胞、または哺乳類細胞である。
【００６０】
本発明の構造物、ベクター、および形質転換された宿主細胞は、薬剤として、ならびに、癌または骨疾病の様なテネイシンＷに依存する状態の予防または処置のための医薬の製造のための使用である。
【００６１】
同様に、本発明のさらなる態様において、テネイシンＷ、好ましくは、組換えテネイシンＷ、またはそのフラグメント、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む組成物が提供される。好ましい実施態様において、テネイシンＷは、
（ａ）配列番号：２または４で説明されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも３５％の同一性、好ましくは、少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列のうち少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、７５、１００個、またはそれ以上の連続するアミノ酸の部分配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００６２】
好ましくは、ポリペプチドは、上記の幹細胞分化誘導活性を有する。さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：４で示されるアミノ酸配列によりコード化される。
【００６３】
従って、テネイシンＷレベルの増加を必要とする任意の疾病または状態、例えば、血栓症、創傷治癒、またはアテローム性動脈硬化症、ならびに、骨形成の促進により改善される状態、例えば、骨折治癒、骨粗鬆症の処置または予防的処置のためのテネイシンＷの使用、ならびに、幹細胞マーカーとしてのテネイシンＷの使用も提供される。なおさらなる態様において、テネイシンＷタンパク質は、薬剤として用いられる。
【００６４】
本発明は、例えば、腫瘍形成の予防または予防的処置、または腫瘍または癌の処置または予防的処置のための医薬の製造のための、テネイシンＷの使用をさらに提供する。本発明は、骨疾病、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植の拒絶反応の予防、およびテネイシンを含む任意の他の疾病（例えば、血栓症、癌、創傷治癒、およびアテローム性動脈硬化症）のうち任意の１以上の処置または予防的処置のための医薬の製造のための、テネイシンＷの使用も含む。
【００６５】
従って、本発明は、テネイシンＷの上記の活性フラグメントのうち１つ以上を含む、ヒトのための医薬組成物、または動物で使用するための獣医薬組成物を提供する。該組成物は、他の活性または非活性薬物も含んでいてもよい。非活性薬物は、食塩水、緩衝食塩水、デキストラン、および水に限らず、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含んでもよい。
【００６６】
従って、本発明の組成物および医薬は、腫瘍が形成されるのを予防するために、予防的に用いられるか、またはそれらは、既に存在する腫瘍状態を処置または抑制するために、治療方法または部分的治療方法で用いられる。腫瘍同様、癌にかかった状態、または悪性状態は、本発明の組成物または医薬で予防または処置される。
【００６７】
特定の態様において、本発明は、放射免疫療法のための、上記の核酸、またはタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。放射標識抗体の使用は、腫瘍への直接的な放射療法を目標とするための有望な方法である。抗テネイシンＣ抗体は、フェーズＩおよびＩＩの臨床試験で現在試験されている。悪性神経膠腫の患者は、腫瘍に直接注射される１３１Ｉ標識抗テネイシン抗体を用いた局所領域放射免疫療法（ＬＲ−ＲＩＴ）を受けた（Riva et al., 1999a）。第１の結果は、ＬＲ−ＲＩＴが、特に、微小異常の患者での良好な結果を伴い、安全に行われ得ることを示す。類似の方法は、９０Ｙ（純β線エミッター）標識抗体（Riva et al., 1999b）で行われ、有望な結果となった。より有効な可能性のある放射免疫療法は、患者に過度の毒性のない、２１１Ａｔ標識抗テネイシン抗体（Zalutsky et al., 2001）の場合の様な、他の同位元素を用いて可能であることが示された。腫瘍への特異的標的化同位元素の存在は、腫瘍の連続的シンチグラフィーを可能とし（Riva et al., 1999a）、治療の成功の直接的判断を可能とするので、それはさらに、腫瘍の正確な画像化に有用なツールである。類似の方法論は、テネイシンＷに特異的な抗体を用いて適用され得る。
【００６８】
本発明の腫瘍または腫瘍細胞は、好ましくは、間質でテネイシンＷを発現するものである。特に好ましい実施態様において、腫瘍は、固形腫瘍、例えば、骨肉腫、膠芽細胞腫の様な間葉系腫瘍、または乳癌腫、前立腺癌腫、肺癌腫、および結腸直腸癌腫の様な上皮癌である。
【００６９】
本発明は、さらに、骨形成の促進により改善される状態、例えば、骨粗鬆症、骨関節炎の処置または予防的処置、軟骨および骨病変の処置のための、テネイシンＷの使用を提供する。上記のタンパク質またはポリペプチドは、骨形成を促進するための股関節、膝関節、または骨折（これらに限定されない）を含むインプラントに取り込まれるために用いられる。
【００７０】
本発明は、腫瘍形成の予防または予防的処置、または腫瘍または癌、またはリウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の任意の１以上の処置または予防的処置、テネイシンＷを含む任意の疾病、例えば、個体の血栓症、創傷治癒、およびアテローム性動脈硬化症の処置または予防的処置の方法も提供し、これは、テネイシンＷ、またはそのフラグメントを有効量投与することを含む。
【００７１】
本発明は、骨形成の促進により改善される状態、例えば、骨粗鬆症、骨関節炎の処置または予防的処置、個体の軟骨および骨病変の処置の方法も提供し、これは、テネイシンＷ、またはそのフラグメントを有効量投与することを含む。
【００７２】
有効用量の決定は、当該技術分野の技術者の能力の十分範囲内である。任意の化合物について、治療上有効な用量は、まず、細胞培養アッセイ、または適当な動物モデルで評価され得る。動物モデルを用いて、好ましい濃度範囲および投与経路ももたらされる。次に、該情報を用いて、ヒトでの投与のための有効用量および経路が決定され得る。
【００７３】
治療上有効な用量とは、症状または状態を改善する活性薬物の量を意味する。該化合物の治療上の効果および毒性は、細胞培養または実験動物での標準的医薬的手順により決定され得る（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％で治療上有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％で致死用量）。治療と毒性作用との用量比は治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比としても表され得る。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒト使用のための投与量の範囲を明確にするのに用いられる。該化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度範囲にある。投与量は、利用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存して、該範囲内で変化する。
【００７４】
正確な投与量は、処置されるべき患者を考慮して、個々の医師により選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するために、または所望の効果を維持するために、調整され得る。考慮される、さらなる因子は、疾病状態の重症度（例えば、腫瘍の大きさ、および位置）；患者の年齢、体重、および性別；食事：投与時間および頻度；薬物の組合せ；反応感受性；および治療に対する耐容性／応答性を含む。長期間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に依存して、毎日、３から４日毎、週毎、または２週間に１回投与される。
【００７５】
本発明者は、テネイシンＷを発現する幹細胞、特に、骨膜、骨形成のための幹細胞成分を観察した。従って、テネイシンＷが、骨髄での骨形成前駆細胞（これに限定されない）を含む細胞の幹細胞マーカーとして用いられる、本発明の方法も本発明に包含される。従って、骨芽細胞へ分化する能力のある幹細胞または前駆細胞を、該能力を有さない他の細胞から選択する方法も提供される。テネイシンＷを発現する幹細胞は、抗体により検出され得る。テネイシンＷを認識する抗体は、必要に応じて、例えば、放射標識、酵素、アビジンまたはビオチン、または蛍光原料（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはローダミン）で標識される、テネイシンＷ抗体に特異的な２次抗体を用いて検出され得る。細胞は、ベースレベル以上のテネイシンＷ発現を有することを特徴とし、好ましくは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞の混合集団から選択される（例えば、Abe et al., Dev Biol. 1996； 180(2):468-72を参照）。従って、選択された細胞は、蛍光で検出可能なタンパク質を有する。ソートされた細胞は、体の生物学的部分、例えば、骨組織の産生に有用である。
【００７６】
薬剤としての使用、ならびに、転移性癌を含む癌（例えば、膠芽細胞腫、前立腺癌腫、肺癌腫、結腸直腸癌腫、骨癌腫、または乳癌腫）の予防または処置、またはテネイシンＷを含む任意の疾病または状態、例えば、過剰骨成長の予防または処置のための医薬の製造のための、テネイシンＷを特異的に認識する抗体も提供される。本発明の別の態様において、抗体は、テネイシンＷまたはそのフラグメントと特異的に反応し、そして癌の予防または処置のための医薬の製造のための抗体の使用、および薬剤としての使用のための抗体が提供される。
テネイシンＷまたはそのフラグメントを特異的に認識する抗体、特に、上記のエピトープを認識する抗体も提供される。
【００７７】
テネイシンＷを検出する方法は、例えば、上記の抗体の使用を、必要に応じて、酵素反応の使用と共に包含する。テネイシンＷを認識する抗体は、必要に応じて、例えば、放射標識、酵素、アビジンまたはビオチン、または蛍光原料（ＦＩＴＣ、またはローダミン）で標識される、テネイシンＷ抗体に特異的な２次抗体を用いて検出され得る。
【００７８】
医薬、特に、癌の予防または処置、骨疾病の予防または処置のための医薬の製造のための、または薬剤としての、テネイシンＷを特異的に認識する抗体の使用も、本発明により包含される。特に、腫瘍、特に、転移性腫瘍の診断のための、テネイシンＷを特異的に認識する抗体の使用も、本発明により包含される。
【００７９】
さらなる実施態様において、本発明は、腫瘍形成の予防または予防的処置、または腫瘍または癌の処置または予防的処置、またはテネイシンＷを含む任意の疾病または状態、例えば、骨形成の促進（または阻害）により改善される状態の処置または予防的処置のための薬物を同定する方法を提供し、これは、試験化合物をテネイシンＷ発現試料と接触させること、そして次に、該試験化合物が非存在である場合と比較して、（ａ）細胞増殖、例えば、細胞周期のＳ期に入る細胞のプログレッション；（ｂ）ＤＮＡ合成；（ｃ）細胞接着；（ｄ）細胞伝播；（ｅ）フィブロネクチンでの病巣接着およびアクチンストレスファイバー形成；（ｆ）細胞の細胞外基質（ＥＣＭ）との結合、のうちの１以上での変化を測定すること、を含む。
【００８０】
細胞は、細胞培養へのテネイシンＷの添加により、好ましくは、それで固体基質をコートすることにより、増殖を促進される。基質は、細胞接着を促進する任意の表面であり得る。固体基質はまた、フィブロネクチン、コラーゲンなど（これらに限定されない）を含む他のＥＣＭによりコートされてもよい。細胞培養は、好ましくは、固体基質上または液体培地中で行われる。（ａ）から（ｆ）のうちの１つ以上の最初の測定は、細胞を試験物質と接触させる前に行われる。２回目の測定は、その後行われる。多数回のさらなる測定は、細胞の試験化合物との接触後、数時間または数日に渡り行われる。この方法では、細胞応答の時間的経過が得られ、そして分析される。
【００８１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、液体培地中のテネイシンＷの存在が、試験化合物が非存在である場合と比較して、測定される。該試験薬物が非存在である場合と比較して、培地中に存在するテネイシンＷレベルの増加は、例えば、骨形成の促進に有効な薬物と関連する。該試験薬物が非存在である場合と比較して、培地中に存在するテネイシンＷレベルの減少は、抗増殖性または抗腫瘍性薬物、または骨形成または骨芽細胞形成の阻害に有効な薬物と関連する。
【００８２】
好ましい態様において、細胞を試験化合物と接触させた後に生じる次の状態：
（ａ）細胞増殖の減少；または細胞周期のＳ期に入る細胞の割合の減少
（ｂ）ＤＮＡ合成の減少；
（ｃ）細胞接着の増加；
（ｄ）細胞伝播の増加；
（ｅ）フィブロネクチンでの病巣接着およびアクチンストレスファイバー形成の増加；および
（ｆ）細胞のＥＣＭ、好ましくは、フィブロネクチンとの結合の増加、
の１つ以上が、抗増殖性または抗腫瘍性薬物、または骨芽細胞形成のインヒビターの指標である。
【００８３】
他の好ましい態様において、細胞を試験化合物と接触させた後に生じる次の状態：
（ａ）細胞増殖での増加；または細胞周期のＳ期に入る細胞の割合の増加；
（ｂ）ＤＮＡ合成の増加；
（ｃ）および（ｄ）アルカリホスファターゼ活性の様な骨特異的マーカーの発現、石灰化、または当該技術分野で既知の他のもの（例えば、Raouf and Seth, 2002, Bone 30: 463-71）の増加、
のうち１つ以上が、骨形成促進薬物を示す。
【００８４】
アクチンストレスファイバー形成は、Bloom, L et al (1999) Mol Biol Cell 10: 1521-1536に記載のアクチンアセンブリアッセイに従いアッセイされる。接着アッセイは、Bloom, L et al (1999)に記載の方法に従い、行われる。
【００８５】
他の実施態様において、本発明の方法は、試験物質の非存在下で成長させられる対照細胞をさらに含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および／または（ｆ）は、対照および試験培養物中で測定される。試験測定値は、これにより、該対照についてさらに標準化され得る。
【００８６】
スクリーニング方法はさらに、可能性のある抗腫瘍性薬物または腫瘍予防薬物の同定、または骨形成阻害薬物のための本質的な無細胞システムを提供する。該方法は、ＥＣＭとテネイシンＷ間の結合を予防、阻害、または開裂するための、可能性のある抗腫瘍性薬物の能力による。ＥＣＭとテネイシンＷ結合の任意の開裂の性質は、結合アッセイをＥＣＭおよびテネイシン（例えば、実施例１０参照）について行うことにより、決定される。例えば、熱量測定法、または標識試薬の測定が用いられる。
【００８７】
または、テネイシンＷの機能のモジュレーターを同定する方法も提供され、これは、（ａ）試験化合物をテネイシンＷおよび／またはα８β１インテグリンと接触させること、および（ｂ）該試験化合物のテネイシンＷおよび／またはα８β１インテグリンとの結合を測定すること、または（ｃ）該試験化合物が非存在である場合と比較して、テネイシンＷのα８β１インテグリンとの結合の開裂を測定すること、を含む。テネイシンＷのα８β１インテグリンとの結合の減少は、該相互作用のインヒビターの指標であり、そして結合の増加は、該試験化合物がα８β１インテグリンを活性化し、これにより、テネイシンＷとα８β１インテグリン間の相互作用を増加させることを示し得る。
【００８８】
試薬および試験物質の相対量または濃度が変えられ、これにより、阻害定数、および他のパラメーター、例えば、結合親和性の計算が可能となる。アッセイ条件の最適化は、当該技術分野の通常の技術者の十分範囲内であろう。システムは、さらに、試験物質を含まない対照を含み、結合が対照で測定され、これにより、試験システムでの対応する測定値が、対照と比較して標準化されることが可能となる。
【００８９】
本発明のアッセイ（スクリーニング）システムの１つの成分が、固体粒子または基質と結合される場合、次に、結合されない他の成分の１つ以上が、標識される。標識の例は、例えば、１４Ｃまたは３Ｈ、ダイ、金属ゾル、酵素、またはビオチン／アビジンを含む。該システムでの該標識の「遊離」成分との接着により、任意の結合アッセイが、当該技術分野でよく知られた方法に従い、溶液中で行われる。成分が反応できた後、固相粒子が、溶液から、例えば、濾過または沈降（遠心分離を含む）により、分離され得る。ある実施態様において、免疫沈降を用いて、結合と遊離の標識成分とが分離される。普通、抗体を利用して、溶液外に非標識成分（該成分が、別の標識成分と結合しているかまたはしていないかにかかわらず）を排除する。分離後、溶液中に存在する標識（遊離）、および固相中または固相上に存在する標識（結合）が測定される。該結合および遊離データの標準的分析、例えば、スキャッチャード・プロット、および結合の親和性および阻害定数の決定は、当該技術分野の通常の技術者によく知られている。
【００９０】
固相が粒子でなく、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの様な表面形態である場合、結合および遊離標識を決定する結合アッセイが行われるが、これは、結合反応が生じた後、ウェルからの液相の除去を含む。便宜上、該アッセイ態様は、特異的に標識された反応成分の必要性を省く。その代わり、標識抗体を用いて、既に遊離した反応成分の固相成分との結合が測定される。
【００９１】
ある実施態様において、テネイシンＷ分子、変異体、またはそのフラグメントは、固相に直接接着される。この種の好ましい免疫アッセイ実施態様において、テネイシンＷのＥＣＭとの結合は、テネイシンＷに対して反応性の抗体を用いて測定される。
【００９２】
免疫結合アッセイは、当該技術分野で既知である。概論として、Methods in Cell Biology Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, (Ed.) Academic Press, Inc. New York (1993)を参照されたい。
【００９３】
標識は、任意の検出可能な組成物であり、これにより、検出は、分光的、光学的、生化学的、免疫化学的、物理的、または化学的なものであり得る。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、蛍光ダイ（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびランタニドリン光体）、高電子密度試薬、例えば、通常ＥＬＩＳＡで用いられる酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼ）、ビオチン、ジオキシゲニン、または抗血清またはモノクローナル抗体を利用可能とするためのハプテンおよびタンパク質を含む。該標識は、検出されるべき標的化合物に直接的に取り込まれるか、またはそれは、標的と結合するプローブまたは抗体と接着される。
【００９４】
本発明のアッセイを通じて、インキュベーションおよび／または洗浄段階は、試薬のそれぞれの適用、または試薬の組合せのインキュベーションを必要とする。インキュベーション段階は、約５分から数時間、おそらく、約３０分から約６時間で変動する。しかしながら、インキュベーション時間は、普通、アッセイ形態、アナライト、溶液の容量、濃度などに依存する。普通、該アッセイは、環境温度で行われるべきであり、それは、例えば、１０℃から４０℃の範囲の温度で実施される。
特に好ましいアッセイ形態は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００９５】
上記の本発明のスクリーニング方法全てが、生物学的活性についての物質のスクリーニング、およびテネイシンＷを含む任意の他の疾病または状態、例えば、創傷治癒、またはアテローム性動脈硬化症の処置のための、可能性のある薬物のスクリーニングに同様に適用できる。
【００９６】
抗腫瘍形成、抗腫瘍、抗転移、（抗）骨形成、創傷治癒、または抗アテローム性物質、または本発明の任意のスクリーニング方法により同定される、テネイシンＷを含む任意の疾病または状態の処置または予防的処置のための物質も、本発明の範囲である。該物質は、タンパク質、ポリペプチド、または低有機分子（薬剤）であってもよい。従って、本発明は、腫瘍、転移、または骨病変を予防または処置するための医薬組成物を含み、これは、本発明の方法により同定される物質の１つ以上を含む。例えば、テネイシンＷ発現または活性のインヒビターが、可能性のある抗癌性薬物とみなされ、一方、テネイシンＷまたはそのアゴニストは、生体内、またはエキソビボで用いられ得る、骨形成を促進するのに有効な薬物とみなされる。
【００９７】
従って、本発明は、テネイシンファミリーの新規哺乳類メンバー、およびその使用を提供する。それは、本明細書に記載の任意のスクリーニング方法の実施による、テネイシンＷに依存する状態に対して有効な薬物、特に、抗癌性薬物、または骨形成を促進する薬物の同定を可能とする。好ましい抗癌性薬物は、癌細胞の増殖を阻害し、かつ一般的な抗増殖性薬物であるものである。
【００９８】
本発明は、上記の全核酸、およびタンパク質およびポリペプチド、ならびに本方法の実施により同定される薬物、および該薬物の薬剤、特に、癌およびテネイシンＷに依存する他の状態の予防または処置のための医薬としての使用を提供する。
【００９９】
従って、さらなる態様において、本発明は、テネイシンＷ、および本発明のスクリーニング方法で同定される薬物の薬剤としての使用を提供する。
【０１００】
本発明は、テネイシンＷに依存する状態の予防または処置、癌または骨疾病、または免疫的欠陥を処置するために使用するための医薬の製造のための、テネイシンＷ、または本発明のスクリーニング方法により同定される薬物をさらに提供する。
【０１０１】
本発明は、テネイシンＷに依存する状態を予防または処置する方法を提供し、これは、個体に上記の構造物、ベクター、宿主細胞、または抗体を有効量投与することを含む。
【０１０２】
本発明は、テネイシンＷに依存する状態を阻害する方法も提供し、これは、癌または骨疾病、または免疫的欠陥の処置のため、上記の本発明のスクリーニング方法により同定されるモジュレーターを有効量投与することを含む。
【０１０３】
医薬組成物中、可能なら、当該技術分野の通常の技術者に既知の適当な賦形剤の存在下の、上記の核酸分子、タンパク質、および薬物も本発明により提供される。組成物は、当該技術分野の技術者の知識の範囲内である任意の適当な投与方法により、下記の任意の適当な組成物の形で投与される。好ましい投与経路は、非経腸投与である。非経腸投与において、本発明の組成物は、溶剤、懸濁剤、または乳化剤の様な注射可能な単位投与量剤形で、医薬的に許容される賦形剤と共に製剤される。該賦形剤は、本質的に非毒性および非治療性である。該賦形剤の例は、食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液である。固定油およびオレイン酸エチルの様な非水溶性賦形剤が用いられてもよい。好ましい賦形剤は、食塩水中の５％  ブドウ糖である。賦形剤は、バッファーおよび保存剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質の様な添加剤を少量含有してもよい。
【０１０４】
任意のタンパク質は、同種移植拒絶反応、ＧＶＨＤ、アレルギー疾患、および自己免疫疾患を予防するために、治療上有効な濃度で投与される。投与量および投与方法は、個体に依存するであろう。一般に、組成物は、機能的タンパク質が、１ｐｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように、投与される。好ましくは、それは、巨丸剤として与えられる。連続する短時間の点滴（３０分間）も用いられてもよい。本発明による組成物は、５から２０μｇ／ｋｇ／分、より好ましくは、７から１５μｇ／ｋｇ／分の用量で点滴されてもよい。
【０１０５】
特定の場合に従い、必要とされる、組成物の「治療上有効な用量」が、処置が必要な患者を治療するために、または少なくとも部分的に、疾病およびその合併症を抑制するために十分な用量で投与されるべきである。該使用のための有効量は、疾病の重症度、および患者の一般的な健康状態に依存するだろう。１回または多数回投与は、患者により必要とされ、かつ耐容される投与量および頻度に依存して、要求される。
【０１０６】
本発明は、癌、またはテネイシンＷレベルの上昇に依存する任意の他の状態を診断または予後診断する方法も提供し、これは、（ａ）個体から採取された試料をテネイシンＷの存在について分析すること；および（ｂ）テネイシンＷの存在を好ましくない予後または診断と関連付けること、を含む。
【０１０７】
本発明の方法は、典型的には、細胞または組織試料中のテネイシンＷの存在、レベル、または活性の決定を含む。そして試料は、たいていヒトから採取されるであろうが、本発明の方法により試験される試料は、ウシ、ウマ、ヒツジなどの様な農業上重要な動物、またはネコおよびイヌの様な獣医の対象の他の動物から採取され得ることも、容易に理解され得る。アッセイは、体細胞、生殖系組織、または癌にかかった組織の様な任意の細胞または組織試料、ならびに胸膜液、血液、血清、血漿、および尿の様な体液由来の試料で行われる。方法は、さらに、試料中の細胞を細胞培養で増殖させることを含む。
【０１０８】
「試料」は、必ずではないが一般的に、アッセイ可能な形のテネイシンＷを提供するために事前処置の対象とされ、分析される材料である。これは、例えば、細胞抽出物を形成する、当該技術分野で既知の方法を必要とするだろう（例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y., 1987)を参照）。
【０１０９】
本発明の広範な態様において、一貫性が維持される限り、試料の収集および取り扱いに対する制限は存在しない。試料は、生検、外科的切除、スメアなどの様な、当該技術分野で既知の方法により採取される。必要に応じて、試料中の採取された細胞は、細胞培地中で増殖させられてもよい。
【０１１０】
臨床試料でのテネイシンＷまたはテネイシンＷ活性の測定の一貫性は、様々な技術を用いて確かめられ得る。例えば、それぞれの組織抽出物の品質についての対照として、アルカリホスファターゼの様な別の酵素活性が、内部対照として役立ち得る。さらに、内部標準は、アッセイ条件の対照として、試料中のテネイシンＷで同時に測定され得る。従って、アッセイ段階は、試料中の対照タンパク質を検出すること、必要に応じて、テネイシンＷについて得られた値を、対照タンパク質で得られたシグナルで標準化することを含む。
【０１１１】
試料中のテネイシンＷの存在は、当該技術分野で既知の方法を用いて、テネイシンＷタンパク質を検出することにより、決定され得る。本発明において、テネイシンＷまたはテネイシンＷ活性を測定するために用いられるアッセイの種類に対する制限は存在しない。例えば、テネイシンＷは、テネイシンＷに特異的な抗体を用いる免疫アッセイにより、検出され得る。抗体は、例えば、タンパク質が、酵素結合免疫測定法により、または全細胞タンパク質、または部分的に精製されたタンパク質のドットブロット（抗体サンドイッチ）アッセイで同定される、２次元ゲルのウエスタンブロットで用いられ得る。
【０１１２】
試料の濃縮およびタンパク質の精製方法は、文献（Scopes, 1987を参照）に記載されている。例えば、必要に応じて、細胞抽出物に存在するテネイシンＷが、硫酸アンモニウムでの沈殿により、または市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMilliporeの限外濾過ユニットに抽出物を通すことにより、濃縮され得る。抽出物は、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂の様な適当な濾過マトリックス、またはゲル濾過マトリックスに適用され得るか、または分取ゲル電気泳動法の対象とされ得る。かかる場合、それぞれの精製段階後に生じたテネイシンＷおよびタンパク質は、試料中のテネイシンＷの量を決定する際に考慮される必要がある。
【０１１３】
テネイシンＷは、テネイシンＷに特異的な抗体を用いて検出され、対照アッセイは、別のテネイシン分子に特異的な抗体を用いて行われる。必要に応じて、方法は、健常組織と比較して、試料中のテネイシンＷの増加を関連づけることをさらに含む。例えば、テネイシンＷは、腫瘍組織で発現したテネイシンＷに特異的な抗体を用いて検出され、そして健常組織で発現した任意のテネイシンＷとの抗体結合（または、非特異的反応）と比較され得る。
【０１１４】
試料は、好ましくは、組織化学分析のため、固体表面に乗せた組織試料である。到達可能で、検出可能な、テネイシンＷの存在は、テネイシンＷが結合するために細胞に到達可能であることを示す。このことは、好ましくない診断または予後診断を導く。一方、抗体が組織切片中のテネイシンＷと反応しないと、テネイシンＷが存在しないと予測される。このことは、好ましい診断または予後診断を導く。
【０１１５】
本発明者は、テネイシンＷが、固形腫瘍、特に、転移性腫瘍またはその間質で特異的に発現することを見出した。従って、テネイシンＷの存在は、癌にかかった状態、特に、転移性組織の存在を示すが、テネイシンＷの非存在は、健常組織、または非転移性腫瘍組織を示す。テネイシンＷは、ウエスタンブロッティングにより、発生中のマウス組織において同定された。テネイシンＷの高発現は、ｒａｓトランスジェニックマウスの転移性腫瘍で見出されたが、ｍｙｃまたはｎｅｕＴで形質転換された非転移性腫瘍では見出されなかった。テネイシンＷ（１７０ｋＤ）の存在は、好ましくない診断の指標である。
【０１１６】
さらなる実施態様において、本発明の診断および予後診断方法は、試料をα８インテグリンの存在について分析すること（該α８インテグリンの存在は、好ましくない予後診断または診断と関連する）を、さらに含む。これは、例えば、以下の実施例８に詳細に記載する抗体を用いて、容易に達成され得る。
【０１１７】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の診断または予後診断方法での使用に適したキットを提供する。該キットは、該方法を行うのに有用な試薬、例えば、テネイシンＷおよびα８β１インテグリンに特異的な１以上の種由来の抗体を含む。該１次抗フィブロネクチン抗体のいずれか、または両方を認識する２次抗体も、試料と結合している１次抗体の認識および検出の目的上、含まれ得る。該２次抗体は、検出のため、例えば、フルオロフォア、酵素、放射標識、または他のもので標識され得る。他の検出標識は、当該技術分野の技術者に思いつかれるだろう。または、１次抗テネイシンＷ抗体は、直接検出のために標識され得る。
【０１１８】
本発明は、説明のみの目的上、以下の実施例でさらに説明される。
実施例１：マウステネイシンＷのクローニング
マウステネイシンＷを、胚発生期１９日全マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（DupLEX-A DLM-110； OriGene Inc.）からクローン化した。第１の段階において、テネイシンＲ（受託番号ＡＬ０４９６８９）に類似の１番染色体由来の配列からもたらされる次のＰＣＲプライマーを、マウスｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるExpand High FidelityＰＣＲシステム（Roche）でのネステッドＰＣＲに用いた。第１の反応を、プライマーセット５’−ＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：５）／５’−ＡＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡ−３’（配列番号：６）により、そして第２の反応を５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧ−３’（配列番号：７）／５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣ−３’（配列番号：８）により行った。第２のプライマーセットは、組換えタンパク質の複製のためのＣ末端Ｈｉｓタグを生じる細菌発現ベクターｐＱＥ３０（Qiagen）への指揮したクローニングを可能とするために、それぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含んでいた。
【０１１９】
マウスタンパク質（上記の方法の結果として得た、テネイシンＷポリペプチドフラグメント）を、E. coliで発現させ、マトリックス供給源のマニュアルに従い、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス（Qiagen）のアフィニティークロマトグラフィーにより、精製した。該タンパク質を天然条件下で精製し、２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。
【０１２０】
全長テネイシンＷを、マウステネイシンＷに特異的な、上記のマウステネイシンＷ  ｃＤＮＡ由来のプライマー、および上で用いられた同一の胚発生期１９日全マウス胚ｃＤＮＡライブラリーのベクターと一致するプライマーの使用により、クローン化した。完全５’配列を得るために、上記のｃＤＮＡを鋳型として用いた次のＰＣＲ反応を行った：第１のＰＣＲ反応を、プライマーペア５’−ＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＧＧ−３’（配列番号：９）／５’−ＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：１０）を用いて行い、続いて第２のＰＣＲ反応を、プライマーセット５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＣＣＴＧＡＴＴＧＧＴＣＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号：１１）／５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２）により行った。テネイシンＷ  ｃＤＮＡの３’部分を完成させるため、次のＰＣＲ反応を行った：第１の反応では、プライマーペア５’−ＣＴＣＡＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号：１３）／５’−ＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号：１４）を用い、続いてプライマーペア５’−ＴＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＧ−３’（配列番号：１５）／５’−ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号：１６）を用いた。それぞれの場合で、最長産物をクローン化した。該オーバーラップテネイシンＷ  ｃＤＮＡクローンを、１つの全長マウステネイシンＷ  ｃＤＮＡに集め、発現ベクターｐＣＥＰ／Ｐｕ（Kohfeldt et al. (1997). FEBS Lett. 414:557-61を参照）にクローン化した。テネイシンＷ  ｃＤＮＡの３’末端において、哺乳類細胞培養で発現した全長マウステネイシンＷタンパク質の精製を可能とするために、６×Ｈｉｓタグを停止コドンの前に挿入した。
【０１２１】
組換えマウステネイシンＷタンパク質は、テネイシンＷヌクレオチド配列のヌクレオチド２３８０〜３１７１によりコード化される、マウステネイシンＷの全アミノ酸配列のアミノ酸７９４〜１０５７により同定される領域に、３つのＣ末端フィブロネクチンタイプＩＩＩ繰り返しを含む。
【０１２２】
実施例２：マウステネイシンＷの特徴化
マウステネイシンＷの全長ｃＤＮＡを、実施例１に記載の様にクローン化した。該ｃＤＮＡ配列は、テネイシンタンパク質ファミリーの典型的なメンバーをコード化し、タンパク質のＮ末端からＣ末端に、次の構造ドメイン：分泌のためのシグナルペプチド、７個の繰り返しにより集められる２つのテネイシンＷ３量体の２量体化のためのＮ末端ドメインを有する。これは、それぞれのサブユニットが、３．５回のＥＧＦ様繰り返し、９回のフィブロネクチンタイプＩＩＩ繰り返し、およびフィブリノーゲン様Ｃ末端球状ドメインを含有する、ジスルフィド結合６量体タンパク質複合体となる。
【０１２３】
全長テネイシンＷ  ｃＤＮＡを、トランスフェクション試薬ｆｕｇｅｎｅ（Roche）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をピューロマイシンで選択し、分泌テネイシンＷタンパク質を含有する培地を集め、そして該タンパク質を、調製物中の任意のコンタミフィブロネクチンを除去するためのゼラチンアガロースカラム（Sigma）での連続的クロマトグラフィーにより、およびＮｉ−ＮＴＡマトリックス（Qiagen）への吸着により、精製した。テネイシンＷを、２５０ｍＭ  イミダゾールにより、ニッケルカラムから溶出した。
【０１２４】
組換えタンパク質を、還元および非還元条件下での６％  ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により、ならびに、テネイシンＣについての記載（Chiquet Ehrismann, R. et al. (1988) Cell 53, 383  390）と同一の方法を用いて、ロータリシャドーイング後の電子顕微鏡観察によっても分析した。テネイシンＷは、６量体テネイシンＣタンパク質として、類似のゆっくりとした遊走を示した。ロータリシャドーイング後のテネイシンＷの電子顕微鏡観察は、実際、中心の球状ドメインから四方に広がる約５０ｎｍの長さの６つのサブユニットを有する６量体分子を示した。
【０１２５】
実施例３：ヒトテネイシンＷのクローニング
ヒトテネイシンＷを、本質的に実施例１に記載した、同一のＰＣＲプライマーを用いて、骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ  ８５）から単離したｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡからクローン化した。ヒトタンパク質を発現させ、マトリックス供給源のマニュアルに従い、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス（Qiagen）のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。該タンパク質を天然の条件下で精製し、２５０ｍＭ  イミダゾールで溶出した。
【０１２６】
組換えタンパク質は、それぞれ、データベースエントリーＡＬ０４９６８９のテネイシンＷヌクレオチド配列のヌクレオチド２３７１〜３１６３によりコード化される、ヒトテネイシンＷの完全アミノ酸配列のアミノ酸７９１〜１０５４により定義される領域に、３つのＣ末端フィブロネクチンタイプＩＩＩ繰り返しを含む。
【０１２７】
全長テネイシンＷを、骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ  ８５）から単離したｍＲＮＡからなるｃＤＮＡを鋳型として用いて、ヒトテネイシンＷに特異的な、上記のヒトテネイシンＷ  ｃＤＮＡ、およびｃＤＮＡ配列エントリーＡＬ０４９６８９のヒトゲノム配列５’からＡＴＧ開始コドン由来のプライマーの使用により、クローン化する。次のプライマーをネステッドＰＣＲの３つのセットのために用いる。
ｈＴＮＷ１：５’ＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣ３’（配列番号：１７）
ｈＴＮＷ２：５’ＧＧＧＣＡＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号：１８）
ｈＴＮＷ３：５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣ３’（配列番号：１９）
ｈＴＮＷ４：５’ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＣＴＴＴＣＡＧ３’（配列番号：２０）
ｈＴＮＷ５：５’ＧＣＧＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧ３’（配列番号：２１）
ｈＴＮＷ６：５’ＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧ３’（配列番号：２２）
ｈＴＮＷ７：５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧ３’（配列番号：２３）
ｈＴＮＷ８：５’ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧ３’（配列番号：２４）
ｈＴＮＷ８：５’ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧ３’（配列番号：２４）
ｈＴＮＷ９：５’ＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＡＴＴＧ３’（配列番号：２５）
ｈＴＮＷ１０：５’ＣＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣ３’（配列番号：２６）
ｈＴＮＷ１１：５’ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＡＣＣ３’（配列番号：２７）
ｈＴＮＷ１２：５’ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’（配列番号：２８）
【０１２８】
次のＰＣＲ反応を、フラグメントＡプライマーの組合せｈＴＮＷ１／ｈＴＮＷ２、次にｈＴＮＷ３／ｈＴＮＷ４、フラグメントＢ  ｈＴＮＷ５／ｈＴＮＷ６、次にｈＴＮＷ７／ｈＴＮＷ８、そしてフラグメントＣ  ｈＴＮＷ９／ｈＴＮＷ１０、次にｈＴＮＷ１１／ｈＴＮＷ１２を用いて行う。該３つのフラグメントを、フラグメントＡをＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで、フラグメントＢをＡｃｃＩ／ＮａｒＩで、フラグメントＣをＮａｒＩ／ＢａｍＨＩで切断し、そして発現ベクターｐＣＥＰ／Ｐｕ（Kohfeldt et al. (1997) FEBS Lett. 414:557-61を参照）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位へライゲーションした集合体をクローニングすることにより、全長ヒトテネイシンＷを作り出すために、共に結合させ得る。ヒトテネイシンＷ  ｃＤＮＡの３’末端にて、哺乳類細胞培養での発現の際の精製を容易にするため、６×Ｈｉｓタグを停止コドンの前に挿入した。ヒトテネイシンＷを、マウステネイシンＷについて記載（実施例２）の様に、精製する。
【０１２９】
実施例４：抗体産生、免疫組織化学、および免疫ブロット：発生中のテネイシンＷの発現
上の実施例１に記載のマウステネイシンＷの細菌で発現した組換えフラグメントを、標準的免疫方法を用いて、ウサギでポリクローナル抗血清を生じさせるために用いた。該抗血清を用いて、テネイシンＹについて記載（Hagios, C. et al. (1996) J. Cell Biol. 134, 1499-1512）された方法を用いて、組織抽出物および発生中のマウス胚の凍結切片においてテネイシンＷを検出した。抗血清は、ウエスタンブロットにより示される様に、精製全長組換えテネイシンＷ、ならびにマウス器官の組織抽出物の内在性テネイシンＷと特異的に反応した。両方の場合で、テネイシンＷを１７０ｋＤａ分子量種として同定した。
【０１３０】
抗テネイシンＷ抗血清を用いて、免疫組織化学により、正常マウス発生中のテネイシンＷの発現を調べた。免疫組織化学のため、組織を、氷冷、リン酸緩衝食塩水中（ＰＢＳ）の４％  パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２５％  スクロースで４℃にて一晩凍結保護した。該組織を、ＯＣＴ（最適切削温度）マウンティング培地（mounting medium）（Ted Pella Inc., CAにより合成された、カタログ番号２７０５０  ＯＣＴ）に包埋し、１２〜１６μｍの切片を切削し、ガラススライド上に集めた。該切片を２時間、風乾し、抗テネイシンＷ抗血清、次に蛍光標識２次抗体で染色した。
【０１３１】
テネイシンＷは、上顎プロセス中の胚発生期１１．５日（Ｅ１１．５）で最初に出現する。Ｅ１４．５とＥ１６．５の間で、テネイシンＷおよびテネイシンＣの発現は、顔および顎の発生中の連結組織（口蓋および下顎）でオーバーラップする。さらに、テネイシンＷは、平滑筋、中胚葉、および骨の細胞外基質（ＥＣＭ）で見出される。成体マウスでは、テネイシンＷは、大動脈弁および角膜縁のテネイシンＣ陽性ＥＣＭのサブセットで見出される。該位置でのその発現は、それぞれの組織の幹細胞コンパートメントで同時に起こる。テネイシンＷは、骨形成のための幹細胞コンパートメントである骨膜でも発現する。テネイシンＷは、腎臓、およびテネイシンＣ陽性領域のサブセットの消化管でも発現するが、脳では発現しない。
【０１３２】
実施例５：ヒトテネイシンＷに対するモノクローナル抗体
上の実施例３に記載のヒトテネイシンＷの細菌で発現させた組換えフラグメントを用い、標準的方法を用いてヒトテネイシンＷに対するモノクローナル抗体を生じさせた。該モノクローナル抗体は、ヒトテネイシンＷに対する抗マウステネイシンＷの交差反応活性によるものより、良好な結合を有するヒトテネイシンＷと特異的に反応した。該モノクローナル抗体は、ヒト組織を染色するのに特に有用である。
【０１３３】
実施例６：腫瘍細胞でのテネイシンＷ発現
腫瘍細胞でのテネイシンＷ発現を試験し、腫瘍組織で高発現することが見出されたテネイシンＣについての既知の結果（Chiquet-Ehrismann, R. (1993) Sem. Cancer Biol. 4, 301-310）と比較した。マウス乳房腫瘍は、乳腺特異的プロモーターの制御下で癌遺伝子を発現するトランスジェニックマウスで、容易に発生する。ｃ−ｍｙｃの過剰発現は、非転移性腫瘍の成長となるが、Ｈａ−ｒａｓの過剰発現は、転移性腫瘍の発生を導く（Li, F. et al. (1994) Int. J. Cancer 59, 560-568）。
【０１３４】
この実施例において、Hagios, C. et al. (1996)によりテネイシンＹについて記載された様に、実施例４に記載の抗血清を用いて、マウス乳房腫瘍でテネイシンＷを検出した。テネイシンＷ（約１７０ｋＤａ）の高発現は、ｒａｓトランスジェニックマウスの腫瘍（転移性）で見出されたが、ｍｙｃまたはｎｅｕＴで形質転換した非転移性腫瘍では見出されれなかった。一方、テネイシンＣは、両種類の腫瘍で過剰発現した。
【０１３５】
対照として、テネイシンＷの発現を、例えば、血清を用いて健常組織で調べた。血清でのテネイシンＷ含有量を、ウェスタンブロッティングにより分析する。感度の改善のため、テネイシンＣについて既に記載（Schenk et al. 1995. Int. J. Cancer 61:443-449）された、サンドイッチＥＬＩＳＡ試験を用い得る。概略、９６ウェルプレートを、ポリクローナルまたはモノクローナル抗テネイシンＷ抗体でコートした。血清試料をアプライし、ウェルを洗浄し、結合テネイシンＷを、ポリクローナルまたはモノクローナル抗テネイシンＷ抗体、次に適当なペルオキシダーゼ標識２次抗体で検出した。テネイシンＷの発現を、野生型マウス由来の血清で見出さなかった。対照的に、健常の腎臓、心臓弁、および角膜は、テネイシンＷを発現すると分かった。
【０１３６】
ｎｅｕＴを過剰発現するトランスジェニックマウスは、非転移性乳房腫瘍を発生するが、ｎｅｕＴをＥｐｈＢ４受容体チロシンキナーゼと共に過剰発現するトランスジェニックマウスでは、腫瘍は転移性である（Munarini, N. et al. (2002) Cell Sci. 115, 25-37）。該モデルシステムを用いて、我々は、非転移性ではなく、転移性腫瘍でのテネイシンＷの高発現を再び見出した。該発現パターンを、腫瘍抽出物の分画化、二フッ化重合ビニリデン膜でのブロッティング、および抗テネイシンＷ抗血清を用いた抽出物の分析によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により、確認した。
【０１３７】
実施例７：接着アッセイ
精製テネイシンＷを、ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌腫細胞株（ＡＴＴＣ；ＨＴＢ−１２９）、Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋芽細胞（ＡＴＴＣ；ＣＲＬ−１７７２）、Ｔ９８Ｇ膠芽細胞腫細胞（ＡＴＴＣ；ＣＲＬ−１６９０）、およびＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＴＣ；ＣＲＬ−１６５８）の細胞接着研究に用いた。概略、６０ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）を、２〜１００μｇ／ｍｌ  テネイシンＷで３７℃、１時間、コートした。非コートのプラスチック表面を、ＰＢＳ中の１％  加熱不活性化ＢＳＡでブロックした。細胞をトリプシン処理し、トリプシンをＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌ  大豆トリプシン阻害剤で壊し、細胞を無血清培地に再懸濁し、カウントした。１ウェル当たり２００〜５００個の細胞を指示した時間点でまき、グルタールアルデヒド（最終濃度２％）の添加により１５分間固定し、２０％  メタノール中の０．１％  クリスタルバイオレットで３０分間染色した。細胞を顕微鏡（Nikon diaphot）下で観察した。
ほとんどの細胞が、２〜１００μｇでコートされたテネイシンＷと接着するが、テネイシンＣとの細胞接着は最小であった。
【０１３８】
我々は、テネイシンＷ上のＣ２Ｃ１２マウス骨格筋芽細胞、およびＴ９８Ｇ膠芽細胞腫の形態、およびアクチン細胞骨格を、フィブロネクチンまたはテネイシンＣ上の細胞と比較した。テネイシンＷ上の細胞の形態は、フィブロネクチン上の細胞と非常に異なり、そしてこれは、ファロイジンでのＦアクチンの染色後、特に明白となる。フィブロネクチン上の細胞は、ストレスファイバーを含有して十分に広がる。しかし、テネイシンＷ上の細胞は、多くのアクチンリッチのプロセスを有するが、ストレスファイバーを有さず、そして細胞体は比較的円形のままであった。
【０１３９】
実施例８：細胞のテネイシンＷ受容体の同定
テネイシンＷとの細胞接着に関与する細胞受容体を決定するために、我々は、テネイシンＷ上のＴ９８Ｇ膠芽細胞腫の接着に対する、インテグリン機能遮断抗体の作用を試験した。α１、α２、α３、α４、α５、α６、およびαＶに対する抗体は、Ｔ９８Ｇ細胞のテネイシンＷとの接着を阻害できた。しかしながら、１０μｇ／ｍｌ  抗β１インテグリン遮断抗体Ｐ４Ｃ１０（Sigma）が、テネイシンＷとの接着を完全に阻害できなかったため、該接着はβ１インテグリン依存性であった。
【０１４０】
ＩＤＧトリペプチドモティーフは、α９β１インテグリンの認識配列であると報告された（Yokosaki et al., 1998）。マウステネイシンＷは、３つのＩＤＧモティーフを含有するので、我々は、α９インテグリンが、テネイシンＷの受容体であり得るか否かを調べた。我々は、空ベクター、またはα９インテグリンのｃＤＮＡ（Yokosaki et al. J Biol Chem. 1996 Sep 27；271(39):24144-50）含有ベクターでトランスフェクションしたＳＷ４８０大腸癌腫細胞を、テネイシンＷでコートしたウェルにまいた。しかしながら、α９およびニセのトランスフェクションＳＷ４８０細胞は、テネイシンＷと接着できなかったが、それらは、フィブロネクチンおよびコラーゲンと十分に接着した。
【０１４１】
インテグリンα８は、発生中の肋骨、腎臓、および胃・腸管由来の平滑筋で発現する（Denda et al. Biochemistry. 1998 Apr 21；37(16):5464-74）。該発現パターンは、テネイシンＷの存在と共に起こるので、インテグリンα８は依然、テネイシンＷの良好な受容体候補であった。我々は、α８インテグリンでトランスフェクションした白血病細胞株Ｋ５６２（Denda et al. Biochemistry. 1998 Apr 21；37(16):5464-74）を用いることにより、該仮説を研究した。トランスフェクションしたＫ５６２細胞は、実際、テネイシンＷと接着でき、ニセのトランスフェクションした対照細胞は接着しなかた。従って、α８β１インテグリンはテネイシンＷの受容体である。
【０１４２】
実施例９：ＤＮＡ複製および増殖アッセイ
９６ウェルプレート（Falcon）を上記の様にコートする。細胞を一晩血清枯渇させ、トリプシン処理した。１０４細胞を、１％  血清、または４０ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢ（血小板由来成長因子ＢＢ）の存在下で、コートしたプレートに移す。１４時間後、細胞を放射性３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）で、３７℃、４時間標識し、取り込んだ３Ｈ−チミジンを１０％  ＴＣＡで沈殿させ、０．３Ｎ  ＮａＯＨ、２％  ＳＤＳでの細胞溶解後、Beckmanのシンチレーションカウンターで測定した。または、ＢｒｄＵの取り込みを測定するか、細胞数を、異なる基質上にまいた細胞の数日間の一定成長期間でカウントする。テネイシンＷ上で成長した癌細胞は、細胞をカウントすることにより確立した、フィブロネクチン上にまいた細胞の成長速度の増加、または細胞ＲＮＡへの放射性３Ｈ−チミジンまたはＢｒｄＵ取り込みの増加を示す。
【０１４３】
実施例１０：試験管内結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、適当なＥＣＭタンパク質（例えば、フィブロネクチン、またはテネイシンＷ）で、３７℃、１時間コートし、ＰＢＳ中の１％  粉ミルク、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックした。ＥＣＭタンパク質（テネイシンＷ、またはフィブロネクチン）を、ブロッキング溶液に添加し、１時間おき、ブロッキング溶液で洗浄し、そして適当な抗体を添加する。この方法では、例えば、テネイシンＷとフィブロネクチン間の相互作用を試験できる。結合タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合２次抗体との免疫反応させ、次いで２１ｍｇ／ｍｌ  クエン酸一水和物、３４ｍｇ／ｍｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／ｍｌ  フェニレンジアミン、１μｌ  Ｈ２Ｏ２と呈色反応させ、これを４Ｍ  硫酸で終結させることにより検出し得る。吸光度は５９０ｎｍで読み取った。
【０１４４】
実施例１１：免疫蛍光顕微鏡観察
１０４細胞を、本質的に上記の様に、ＥＣＭタンパク質でコートした４ウェルCellstarプラスチックプレート（Greiner）に移す。細胞を、ＰＢＳ中の４％  パラホルムアルデヒド、５０ｍＭ  リン酸バッファー、５ｍＭ  ＥＤＴＡで、１５分間固定し、ＰＢＳ中の３％  ＢＳＡ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックし、ブロッキング溶液中の１次抗体および２次抗体と共にインキュベートする。退色防止剤（antifade agent）として２．５％  ＤＡＢＣＯを含有した１０．５％  Ｍｏｗｉｏｌに、スライドを埋め込む。細胞を顕微鏡で分析する。該方法は、テネイシンＷまたは抗体が入手可能な培地中の細胞によって生産される任意の他のタンパク質の検出に特に有用であり、それぞれの抗原の合成または蓄積に影響する物質を分析するために用い得る。
【０１４５】
当該技術分野の通常の技術者に明らかであるが、上記の方法のバリエーションは、同一の目的を達成するために容易に導入され得る。様々なインキュベーション条件、標識、装置、および原料が、個々の優先事項に従い、選択され得る。本明細書で言及された全刊行物は、それぞれが個々に言及されたかのように、全体として引用により取り込まれる。
【配列表】
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