(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
休眠、仮死または潜伏している細菌細胞を蘇生させることができる単離されたポリペプチドであって、
ｉ）配列番号４のアミノ酸残基４４〜１１４位、配列番号６のアミノ酸残基７３〜１４０位、または配列番号２のアミノ酸残基１１７〜１８４位のいずれかと少なくとも９５％同一性の配列であって、配列番号４３の配列で示されるM.luteusの蘇生因子（ＲＰ因子）であることを含む配列を含んでなる、ポリペプチド、
ii）配列番号４、配列番号６、または配列番号２のいずれかと少なくとも９０％同一性の配列であって、配列番号４３の配列で示されるM.luteusの蘇生因子（ＲＰ因子）であることを含む配列を含んでなる、ポリペプチド、または
ｉ）配列番号４のアミノ酸残基４４〜１１４位、配列番号６のアミノ酸残基７３〜１４０位、または配列番号２のアミノ酸残基１１７〜１８４位のいずれかを少なくとも含んでなる、ポリペプチド
であって、かつ、感染症の治療、診断または予防において使用される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
組換え体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでなる、薬学的組成物。
【請求項４】
ワクチンである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
（ａ）治療法、診断または予防において使用される；および／または
（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であるか、あるいは局所投与または全身投与に適する形態である、
請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
治療法が免疫療法である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１または２に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項８】
（ａ）治療法、診断または予防において使用される；および／または
（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であるか、あるいは局所投与または全身投与に適する形態である、
請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
治療法が免疫療法である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】
発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１４】
薬学的賦形剤中に存在する、請求項１０に記載の核酸、または請求項１１または１２に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでなる、感染症診断用キット。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでなる、培養培地。
【請求項１７】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでなる、輸送培地。
【請求項１８】
生物学的サンプルを請求項１または２に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、感染症のインビトロ（in vitro）検出方法。
【請求項１９】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする遺伝子において変異を有する弱毒化微生物を含んでなる、生ワクチン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＲＰ因子（RP-factor）、その同系レセプター、その変換酵素、その個々の遺伝子、およびその阻害剤または模倣物に関する。特に、本発明は、ＲＰ因子およびそのレセプター／変換酵素に基づく抗体、薬学的組成物および（治療的、診断的）方法に関する。
背景技術
細菌フェロモン
いくつかの化学物質は、細菌の培養において細胞間の情報交換を媒介し得ることが知られている。そのような情報交換は、胞子形成、接合、ビルレンスおよび生物発光における変化において重要であることが明らかにされている。二次代謝産物として産生される様々な異なるオートクリン性および／またはオパラクリン性の化学化合物（「フェロモン」）が原核生物におけるそのような協同的行動をもたらすことは、現在、明らかである（例えば、Kell他、1995、Trends Ecol.Evolution、10、126〜129）。
フェロモンは、特に下記の点で栄養物と区別することができる。（ｉ）フェロモンは、生物自身によって産生される。（ii）フェロモンは、非常に低い濃度（例えば、ピコモルまたはナノモルの濃度）で活性である。（iii）プロホルモンのプロセシングを除いて、その代謝は、活性のためには必ずしも必要でない（しかし、当然、フェロモンは最終的には分解され得る）。
このようなフェロモン化合物の化学的性質は広範囲にわたっている：グラム陰性生物に関連するフェロモンは低分子量である傾向を有し（例えば、Ｎ−アセチルホモセリンラクトン誘導体）、一方、多数のグラム陽性生物はタンパク質およびポリペプチドを使用する（Ｋｅｌｌ他、１９９５、上記参照）。
フェロモンはまた、細菌培養物の生育において重要な役割を果たしていることが知られている。ストレス負荷のない（損傷していない）細菌および最適な増殖培地に関して、培養増殖の「自己促進」モードは、通常、増殖因子の大きな産生速度およびこのようなフェロモンに対する細胞の感受性のために隠されている。好ましくない条件（例えば、不十分な増殖培地、少ない初期接種および／または飢餓状態の細胞）でのみ、この自己促進行動を「見ることができる」。
例えば、Nitorosomonas europeaの培養における遅滞期の長さの劇的な減少が、Ｎ−（３−オキソ−ヘキサノイル）ホモセリンラクトンにより媒介され、そして絨毛性性腺刺激ホルモン様のリガンド（48kDaタンパク質）は、Xanthomonas maltophilaに対して類似した増殖刺激活性を有した。多数の哺乳動物ホルモン（ペプチドホルモンおよびステロイドホルモンならびにサイトカインを含む）もまた、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に対して強力な増殖促進活性を示すことが明らかにされている。
潜伏および蘇生
微生物細胞が栄養寒天平板上で増殖して分裂する能力により、目的のサンプルにおける生細胞の数を測定するための標準的方法が組み立てられる。しかし、特に自然において、生存および非生存の区別は絶対的ではないこともまた広く認識されている；多くの細胞は、「休眠」または「瀕死」の形態または状態で存在することができ、従って栄養培地でコロニーを形成しない（すなわち、「非培養性」である」）。しかし、このような休眠細胞または潜伏細胞は死んではいない：そのような細胞は、蘇生として知られている方法によって、生存可能／培養可能な状態に戻すことができる。
例えば、（Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性）細菌のMicrococcus luteusの細胞は、「初期の生存」細胞が存在しないときにでさえ、培養上清液によって蘇生させることができる真の休眠状態に入ることができる。
潜伏状態は、医療的には深刻な意味合いを有する：多くの病原性細菌（結核菌（M.tuberculosis）などの病原性マイコバクテリアを含む）は、宿主生物に潜伏した状態で長期間存続していることが知られている。実際、結核は、再発生している非常に重大な感染症であり、原因生物（Mycobacterium tuberculosis）は、患者体内で休眠状態のままであり（潜伏したままであり）、何年もの間保有される。
潜伏状態はまた、（例えば、食品産業および健康産業において）細菌の検出、培養および計数を行うための多くの実験室方法を複雑にするので、商業上の重要な関連を有する。
従って、潜伏および蘇生の生理学的基礎を早急に理解しなければならない。
発明の概要
本発明は、少なくとも一部は、真の休眠の後に細菌の蘇生を刺激する新しいクラスのフェロモンの発見に基づく。このような「蘇生因子」（本明細書中においては「ＲＰ因子」の用語によって包含される）は、ピコモル濃度で活性を発揮することができる（これは、非栄養的な役割を意味する）。フェロモンの構造をアミノ酸配列レベルで解明することによって、本発明らはまた、より大きなファミリーのタンパク質を記載することが可能になった。そのいくつかのメンバーもまた、細胞増殖または複製の調節因子として、より広く作用するが、蘇生促進因子としては必ずしも作用していない。さらに配列比較を行うことによって、その同系レセプターもまた同定され、少なくともそのいくつかは、その同系ＲＰ因子とある程度の配列類似性を有する。
従って、本発明の最初の態様において、単離されたＲＰ因子が提供される。
ＲＰ因子
用語「ＲＰ因子」は、そのメンバーが休眠細胞、仮死細胞または潜伏細胞（すなわち、休眠細菌細胞）を蘇生させ得るファミリーの物質の任意のものを包含するために本明細書中において使用される。さらに、本発明のＲＰ因子はまた、増殖中の細胞（例えば、増殖中の細菌細胞）に関して増殖促進活性を示すことができ、かつ／または細胞（例えば、細菌細胞）培養の遅滞期を減少させる能力を有し得る。ＲＰ因子の蘇生活性（および必要に応じて、さらに、増殖刺激活性または遅滞期減少活性）は、特定の（細菌）細胞に特異的であり得る（例えば、１つまたは複数の病原性マイコバクテリウムに特異的であり得る）か、あるいは、非特異的である。特異性は、例えば、ＲＰ因子の特異性決定ドメインを（例えば、本明細書中に記載されている変異誘発またはキメラ化によって）操作することによって、あるいはシグナル伝達ドメインを置換することによって操作することができる。
用語「ＲＰ因子」はまた、少し広い意味で、細菌が発現するポリペプチドであって、同系の細胞レセプターと共同して（例えば、同系の細胞レセプターに結合することにより）シグナル伝達分子として作用することによって細胞（「標的細胞」）の増殖または繁殖の調節（例えば、促進、開始、防止または低下）を行うポリペプチドを包含するために本明細書中で使用されている。そのようなポリペプチドは、本明細書中では、細菌サイトカインとして言及されることがある。
従って、本発明のＲＰ因子には、休眠細胞、仮死細胞または潜伏細胞（すなわち、休眠細菌細胞）を蘇生させる能力を有していてもよく、あるいはそのような能力を有していなくてもよい細菌サイトカインが含まれ、かつ／あるいは増殖中の細胞（例えば、増殖中の細菌細胞）に関して増殖促進活性を示す。本発明のＲＰ因子はまた、細胞（例えば、細菌細胞）培養の増殖に関連する遅滞時間を減少させる能力を有していてもよく、あるいは有さなくてもよい。さらに、本明細書中において定義されている用語「ＲＰ因子」の範囲に含まれる細菌サイトカインのいくつかは、（特に、標的細胞が真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞である場合）標的細胞の増殖を防止するか、または低下させることさえし得る。
本発明のＲＰ因子は、オートシグナル伝達因子およびアロシグナル伝達因子の少なくとも２つのクラスに分けることができる。オートシグナル伝達因子は、それが発現した細菌細胞の増殖を調節するように作用する（すなわち、オートシグナル伝達因子は、細菌のオートクリン因子として作用する）。一方、アロシグナル伝達因子は、他の細胞の増殖を調節するように作用する（すなわち、アロシグナル伝達因子は、細菌のパラクリン因子として作用する）。従って、オートシグナル伝達因子は、細菌の細胞増殖の自己調節因子として作用し、生存および／または増殖に必須であり得る。いくつかのＲＰ因子は、オートシグナル伝達サイトカインおよびパラシグナル伝達サイトカインの両方として機能し得る。
アロシグナル伝達因子は様々な異なる特異性を示し得る。アロシグナル伝達因子には、その発現細胞と同じ種の他の細菌細胞に単独で作用し得る因子（「ホモ活性因子」）が存在し、１つまたは複数の他の種の細胞に対して作用し得る因子（「ヘテロ活性因子」）も存在する。ヘテロ活性因子は広範囲の特異性を示し得る：ヘテロ活性因子は、いくつかの異なる種に対して（例えば、属に特異的な様式で）作用し得るか、または種に特異的であり得る。いくつかのヘテロ活性細菌因子は、真核生物細胞に対して作用することができ、そして特定の細胞タイプに特異的であり得る。例えば、いくつかのヘテロ活性細菌サイトカイン（特に、ある種の病原体によって産生されるヘテロ活性細菌サイトカイン）は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物の上皮細胞、内皮細胞または免疫細胞）に対して作用することができ、組織特異的または細胞タイプ特異的であり得る。
上記の説明にもかかわらず、少なくともいくつかのＲＰ因子の特異性は濃度依存的であり得ると考えられている。このような場合、任意のそのようなＲＰ因子の特異性は連続的に変化し、その結果、オートシグナル伝達性ＲＰ因子は混信を媒介することができ、従ってその濃度が十分に高い場合、アロシグナル伝達活性を示し得る。同様に、アロシグナル伝達性ＲＰ因子は、濃度に依存して、ホモ活性またはヘテロ活性を示し得る。
ＲＰ因子は細胞膜を介して転位することができ、その後、ＲＰ因子は、周囲の環境に分泌され得るか、あるいは細胞の表面に結合したままであり得る。従って、ＲＰ因子には、分泌型および非分泌型の少なくとも２つのクラスが存在し得る。分泌型ＲＰ因子は、分泌シグナル配列の存在を特徴とする（その存在は、ＤＮＡおよび／またはアミノ酸の配列モチーフの存在に基づいて当業者によって容易に認識される）。非分泌型ＲＰ因子は、細胞結合型因子または細胞質因子であり得る。両方のクラスのＲＰ因子は、１つの細胞源（例えば、１つの細菌源）に存在し得る。両方のクラスのＲＰ因子は本発明において応用される。
非分泌型ＲＰ因子は、下記のように少なくとも４通りの異なる方法で作用し得る：（ａ）物理的に近接または接触している２つの異なる細胞間の増殖調節シグナルを媒介する膜固定型ジャクスタクリン因子として；および／または（ｂ）可溶性のシグナル伝達分子を細胞外環境に放出する酵素（例えば、本明細書中において定義されている変換酵素）によって切断されるときの細胞間シグナル伝達分子として；および／または（ｃ）非分泌型因子を発現する細胞の表面に位置する同系レセプターへの結合または完全な細胞内作用によるオートクリン因子として；および／または（ｄ）別の非分泌型ＲＰ因子または分泌型ＲＰ因子の同系レセプターとして作用する。
従って、本発明のＲＰ因子は、図１Ａに示される配列によって同定される９個の因子および図１Ｂに示される配列によって同定される５個の因子を、その種変異体、対立遺伝子型形態、ホモログ、誘導体、ムテイン、および対応する分泌型形態／非分泌型形態とともに含み得る（下記参照）。
好ましくは、本発明のＲＰ因子は、図１Ａに示される配列によって同定される９個の因子および図１Ｂに示される配列によって同定される５個の因子のいずれか１つの種変異体、対立遺伝子型形態、ホモログ、誘導体、ムテイン、および対応する分泌型形態／非分泌型形態である。
ＲＰ因子は、成熟型形態を得るためにプロセシングされる前駆体形態で合成することができる。そのようなプロセシングは、様々な中間体の（プロ）形態を介して進行し得る。そのような前駆体、中間体および成熟タンパク質はすべて、別途指示されている場合を除き、本明細書中で使用されている用語「ＲＰ因子」により包含されるものとする。本明細書中で使用されている用語「プロＲＰ因子」は、成熟ＲＰ因子の任意の様々な前駆体を特異的に規定する（そのような前駆体は活性であってもよく、あるいは不活性であってもよい）。
プロセシングには、タンパク質分解的切断および／または分泌が含まれ得る。前駆体は不活性であり得るが、成熟型形態としてプロセシングされたときに活性型になる。前駆体には、分泌途中で除去される分泌リーダー配列を有するタンパク質（プレ形態）が含まれ得る。そのような形態は、本明細書中では、「プレＲＰ因子またはプレプロＲＰ因子」として示される。上記で説明したように、そのようなプレ形態またはプレプロ形態もまた、別途指示されている場合を除き、本明細書中で使用されている用語「ＲＰ因子」により包含されるものとする。
プロセシングは、ＲＰ因子前駆体が同系レセプターに結合するときに付随し得る。そのようなレセプターは、次いで、前駆体を直接（または間接的に）切断して、より成熟型形態に近いＲＰ因子を産生させることができる。そのようなプロセシングは、いくつかのレセプター−プロセシング複合体を含む一連のカスケードとして生じ得る。従って、そのようなプロセシングにより、末端の（シグナル伝達）レセプターに結合することによってシグナル伝達分子としてその後作用する成熟型ＲＰ因子が最終的に得られる。
そのようなプロセシングにおいて、近位の（または中間的な）レセプターは変換酵素として機能することができ、末端のレセプターはシグナル伝達装置として機能することができる。しかし、レセプターは、変換酵素およびシグナル伝達装置の両方として機能することができる。本明細書中で使用されている用語「変換酵素」は、ＲＰ因子前駆体と結合し、そしてＲＰ因子前駆体を（直接的または間接的に）プロセシングして、より成熟型に近い形態を産生する分子を規定するものとする。変換酵素は、例えば、プロテアーゼ活性を有し得る。
上記のレセプター／変換酵素は、細胞表面（例えば、膜結合型）に配置され得るか、あるいは細胞質または細胞外に配置され得る。
好ましくは、ＲＰ因子は、細菌（例えば、病原性細菌）から得られる。特に好ましいものは、Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性細菌から得られるＲＰ因子である。しかし、本発明者らは、Bacillus subtilisおよびクロストリジウム属を含むＧ＋Ｃ含有量が低いグラム陽性細菌のＲＰ因子ファミリーのメンバーもまた発見した。従って、Ｇ＋Ｃ含有量が低いグラム陽性細菌（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量が低い病原性グラム陽性細菌）から得られるＲＰ因子もまた本発明により好ましい。後者の例には、Streptococcus spp.、Staphylococcus spp．、Listeria spp.、Bacillus spp.、Clostridium spp.およびLactobacillus spp.が含まれる。
本発明はまた、本発明のＲＰ因子およびＲＰ因子レセプター／変換酵素のホモログ、対立遺伝子型形態、種変異体、誘導体、ムテインまたは等価物を包含する。
好ましくは、本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体は、図１Ａおよび図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性を有する。
特に好ましいものは、図１Ａおよび図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも３０％の同一性、例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体である。
本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体は、図１Ａおよび図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２５％の相同性を有し得る。
特に好ましいものは、図１Ａおよび図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも３０％の相同性、例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の相同性を有する発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体である。
本発明はまた、キメラＲＰ因子を包含する。キメラＲＰ因子は、１つまたは複数の異種ドメインを含む因子である。この文脈において、異種ドメインは、それが会合する他のドメインが得られるそれとは異なるＲＰ因子から得られるＲＰ因子の部分である。そのようなキメラＲＰ因子は、ＲＰ因子の特異性および／または活性が操作されるか、または変更される適用において特に利用される。
本発明はまた、分離した部分および従属的な部分として本発明のＲＰ因子の個々のすべての機能的なドメインを包含する。
本発明はまた、組換えＲＰ因子を包含する。本明細書中で使用されている用語「組換え」は、「組換えＤＮＡ技術」として総称的に知られている技術の主要部によって（例えば、下記の核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を使用して）産生される物質を規定するものとする。
同系レセプター
いくつかの場合において、同系の細胞レセプターは細胞表面レセプターであり；他の場合においては、標的細胞によって取り込まれた後でサイトカインが相互作用する細胞質レセプターである。本発明のＲＰ因子および／または細菌サイトカインが相互作用するレセプターは、ＲＰ因子／サイトカイン自身とのいくつかの構造的モチーフを有し得る。特に、レセプターは、同系のＲＰ因子／サイトカインのシグナル伝達ドメインと構造的に類似するリガンド結合ドメインを含有し得る。
レセプターはまた、膜アンカードメインおよび壁展開ドメインを含み得る。
好ましくは、同系レセプターは、本明細書中下記において定義されているレセプタードメインおよび／または本明細書中下記において定義されている壁展開ドメインおよび／または膜アンカーを含む。
特に好ましいものは、図１Ａに示されるＭｔｕｂＺ９４７５２のアミノ酸配列または図１Ｂに示されるB.subtilis由来のＹａｂＥのアミノ酸配列を含む同系レセプターである。
同系レセプターはまた、上記に定義されているアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失または置換（例えば、保存的な置換）を有する。
同系レセプターはまた、図１Ａに示されるＭｔｕｂＺ９４７５２のアミノ酸配列または図１Ｂに示されるB.subtilis由来のＹａｂＥのアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
ＲＰ因子／同系レセプターのドメイン構造
本発明のＲＰ因子（本明細書中で同様に定義されている細菌サイトカインを含む）およびその同系レセプターは、複数の別個のドメインを含み得る。このようなドメインは、機能的および／または構造的に異なっていてもよい。
本発明のＲＰ因子は、分泌シグナル配列（これは因子の活性形態において完全にあるいは部分的に存在しなくてもよい）およびシグナル伝達ドメインの少なくとも２つの機能的なドメインの存在を特徴とし得る。シグナル伝達ドメインは、下記においてより詳細に説明するように少なくとも２つの別個のクラスの一方に含まれ得る。
多くのＲＰ因子はまた、標的細胞の表面との物理的な会合を媒介する第３の機能的なドメインを含む（これ以降、「局在化ドメイン」として示され、下記においてより詳細に説明される）。
本発明のＲＰ因子は、シグナル伝達ドメインと連携して機能し得る特異性決定ドメインをさらに含み得る。
非分泌型ＲＰ因子は、壁展開ドメイン（詳細については下記を参照のこと）および／または膜アンカーをさらに含み得る。
上記ドメインの全体的な構造および／またはアミノ酸配列はかなり変化し得る。特に、表面局在化ドメインの構造は、標的細胞の細胞壁の構造に従って異なり得る。例えば、表面局在化ドメインは、クラスＩ（これはペプチドグリカンに対して作用し得る）およびクラスＩＩ（これはマイコバクテリアにおいて見出される脂質外膜に対して作用し得る）の少なくとも２つの異なるクラスに分けることができる。
本発明の同系レセプターは、レセプタードメインおよび膜展開ドメインの少なくとも２つの機能的なドメインの存在を特徴とし得る。本発明の同系レセプターはまた、膜アンカーを含み得る。レセプタードメインは、同系のＲＰ因子のシグナル伝達ドメインと構造的に類似し得る（詳細については下記を参照のこと）。
レセプター／シグナル伝達ドメイン、クラスＩ
このドメインは、Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性細菌（マイコバクテリアおよびMicrococcus spp.など）に由来するＲＰ因子および／またはその同系レセプターと会合し得る。このドメインがＲＰ因子に存在する場合、このドメインは、レセプター結合に関与し得るし、そして例えば、同系レセプターにおいて構造的に類似するドメインと結合し得る。従って、本発明のＲＰ因子の一部として存在する場合、このドメインは「シグナル伝達ドメイン」と呼ばれ、同系レセプターに存在する場合には、このドメインは「レセプタードメイン」と呼ばれる。
このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ａに示される９個の配列のいずれか１つにおいて星印（asterisk）によって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ａに示される９個の配列のいずれか１つにおいて星印およびドットによって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ａに示される９個の配列のいずれか１つにおいて太大文字で強調されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
より特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ａに示される９個の配列のいずれか１つにおいて大文字で表されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
このドメインはまた、上記に定義されているアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失または置換（例えば、保存的な置換）を有する。
このドメインはまた、上記に定義されている個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
レセプター／シグナル伝達ドメイン、クラスＩＩ
このドメインは、Ｇ＋Ｃ含有量が低いグラム陽性細菌（バチルスおよびクロストリジウムなど）に由来するＲＰ因子および／またはその同系レセプターと会合し得る。このドメインがＲＰ因子に存在する場合、このドメインは、レセプター結合に関与し得るし、そして例えば、同系レセプターにおいて構造的に類似するドメインと結合し得る。従って、本発明のＲＰ因子の一部として存在する場合、このドメインは「シグナル伝達ドメイン」と呼ばれ、同系レセプターに存在する場合には、このドメインは「レセプタードメイン」と呼ばれる。
このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ｂ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて星印によって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ｂ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて星印およびドットによって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ｂ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて太大文字で強調されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
より特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ｂ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて太大文字で表されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
このドメインはまた、上記に定義されているアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失、または置換（例えば、保存的な置換）を有する。
このドメインはまた、上記に定義されている個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
壁展開ドメイン
このドメインは、非分泌型ＲＰ因子（例えば、細胞会合型ＲＰ因子、またはジュクスタクリン因子として作用するＲＰ因子）および本発明のＲＰ因子の同系レセプターと会合し得る。このドメインがＲＰ因子に存在する場合、このドメインは、ＲＰ因子／レセプターが全体としてその中に広がり得るような細胞壁との相互作用を媒介することに関与する。従って、壁展開ドメイン（wall spanning domain）は、インビボ（in vivo）では細胞質領域および細胞外領域と接し得る。このドメインは、膜アンカーと会合することが多い。この２つの構造的エレメントは、細胞表面でのＲＰ因子／レセプターを維持するために協調して作用する。
このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ａ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて大文字で表され、そしてハッシュ（＃）で示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ａ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて大文字で表され、そしてハッシュおよびドットによって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ａ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて太大文字で強調されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
より特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｂ（Ａ）に示される５個の配列のいずれか１つにおいて大文字で表されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
このドメインはまた、上記に定義されているようなアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失または置換（例えば、保存的な置換）を有する。
このドメインはまた、上記に定義されている個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
局在化ドメイン、クラスＩ
このドメインは、分泌型ＲＰ因子に存在し得るし、そしてペプチドグリカンまたはいくつかの他の表面成分と結合するように作用することによって標的細胞の表面との物理的な会合を媒介し得る。従って、このドメインは、標的細胞表面でのサイトカインの局所的濃度を増大させるように作用することができ、その結果、同系レセプターのすぐ近傍でのＲＰ因子の局所的濃度を増大させることによって活性を促進させることができる。従って、局在化ドメインは、アロシグナル伝達性細菌サイトカインの特徴的な特徴であり得るし、そしてオートシグナル伝達因子には存在しなくてもよく、あるいはその逆である。例えば、局在化ドメインがオートシグナル伝達性因子に存在する場合、局在化ドメインは、細胞膜を通って分泌された後、細胞表面またはその近くに因子を保持するように作用し得る。
局在化ドメインが存在する場合、局在化ドメインは、ＲＰ因子に重要な結合特性をもたらすことができ、それによって、同系レセプターへの結合は、二相的になり、そして同系レセプターとの二次的な（特異性が比較的高い）会合を伴う細胞表面との最初の（特異性が比較的ない）会合によって特徴付けられる。
このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｃに示される１０個の配列のいずれか１つにおいて星印によって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｃに示される１０個の配列のいずれか１つにおいて星印およびドットによって示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｃに示される１０個の配列のいずれか１つにおいて太大文字で強調されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
より特に好ましい実施形態おいて、このドメインは、その同一性および相対的な位置が、図１Ｃに示される１０個の配列のいずれか１つにおいて示されるそのような残基に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
このドメインはまた、上記に定義されているアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失または置換（例えば、保存的な置換）を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
このドメインはまた、上記に定義されている個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
局在化ドメイン、クラスＩＩ
このドメインは、分泌型ＲＰ因子に存在し得るし、そしてマイコバクテリアに存在する脂質外膜と結合するように作用することによって標的細胞の表面との物理的な会合を媒介し得る。従って、このドメインは、標的細胞表面でのサイトカインの局所的濃度を増大させるように作用することができ、その結果、同系レセプターのすぐ近傍におけるＲＰ因子の局所的濃度を増大させることによって活性を促進させることができる。従って、局在化ドメインは、アロシグナル伝達性細菌サイトカインの特徴的な特徴であり得るし、そしてオートシグナル伝達因子には存在しなくてもよい。
局在化ドメインが存在する場合、局在化ドメインは、ＲＰ因子に対する重要な結合特性をもたらすことができ、それによって、同系レセプターへの結合は、二相的になり、そして同系レセプターとの二次的な（特異性が比較的高い）会合を伴う細胞表面との最初の（特異性が比較的ない）会合によって特徴付けられる。
このドメインは、図１Ｄに示される１つまたは複数のアミノ酸モチーフ‘Ａ’、Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、‘Ｃ、Ｄ、Ｄ*およびＤ’（このいずれか１つは連続して反復し得る）などのアラニンおよびプロリンが多いセグメントを含むことができる。
好ましい実施形態において、このドメインは、図１Ｄに示されるＭｔｕｂＭＴＶ０４３の残基１５８〜３２２または図１Ａに示されるＭｔｕｂＭＴＶ００８の残基４５〜１１２に対応するアミノ酸残基の配列を含むことができる。
このドメインはまた、上記に定義されているアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得るが、生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性またはリガンド結合活性）が実質的に保持されている場合には、そのような配列においてアミノ酸の付加、欠失または置換（例えば、保存的な置換）を有する。
このドメインはまた、上記に定義されている個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３０％の同一性または相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性または相同性を有するアミノ酸残基の誘導体または等価体の配列を含み得る。
用語「単離された」は、因子が自然の状態で存在する環境と異なる物理的環境において存在することを示すために本明細書中で使用されている。例えば、単離された因子は、因子が自然状態で存在する複雑な細胞環境に関して実質的に単離され得る。純度の絶対的なレベルは重要ではなく、当業者は、因子が用いられ得る使用に従って、適する純度レベルを容易に決定することができる。
多くの状況において、単離された因子は、組成物（例えば、多くの他のタンパク質および物質を含有する高い精製度の粗抽出物あるいは低い精製度の粗抽出物）、緩衝液系、または例えば、（アルブミンなどの他のタンパク質を含む）他の成分を含有し得る薬学的賦形剤の一部を形成する。
別の状況において、単離されたタンパク質は、例えば、ＰＡＧＥまたはカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣまたは質量スペクトル）によって決定されるように本質的に均一になるまで精製され得る。好ましい実施形態において、本発明の単離されたＲＰ因子は、所与の組成物において、本質的には唯一の活性なＲＰ因子である。特に好ましいものは、ＲＰ因子（あるいは、その特定の種、ホモログ、ムテイン、誘導体または等価体）が、薬学的組成物における唯一の活性成分として存在する組成物である、
本発明における使用に必要なＲＰ因子は、上記に定義されている意味において単離される必要はない。しかし、例えば、高い精製度の粗上清または低い精製度の粗上清（例えば、「使用後の」培地）は、いくつかの適用における使用に十分な濃度のＲＰ因子を含有し得る。好ましくは、そのような上清は、分画および／または抽出が行われる（下記参照）。しかし、多くの状況において、そのような上清は、前処理を行うことなく使用することができる。それらは、好ましくは、ＲＰ因子を産生する微生物（例えば、下記の細菌源）を培養するために使用された使用後の培地から得られる。上清は、好ましくは無菌である、上清は、様々な方法で、例えば、濃縮、ろ過、遠心分離、噴霧乾燥、透析および／または凍結乾燥によって処理することができる。好都合には、培養上清は、細胞／細胞残渣を除くために単に遠心分離が行われ、そしてろ過される。
そのような上清は、診断キットおよび方法において、例えば、下記の診断キットおよび方法において利用される。上清はまた、培養可能な微生物を様々なサンプル（例えば、土壌、食物、海水、淡水または組織サンプル）から、あるいは生物（例えば、ヒトまたは動物）から採取されたサンプルから回収するときに利用される。
培養上清はまた、様々な培養基質における補充物として、例えば、培養培地または輸送培地における補充物として使用することができる。培養培地は、例えば、寒天平板、ブロス、斜面培地、コーティングされた採取用スティック、コーティングされたプローブ、メンブレン、コーティングまたは充填されたウエルまたはフィルムなどの任意の便利な形態を取り得る。培地は、規定された培地または複雑な培地であり得るが、培養される微生物の同定を容易にするための指示色素を含有し得る。好ましくは、培地は、例えば、Mycobacterium spp.の細菌の培養または輸送に適する。
用語「単離された」は、本発明の他の物質（例えば、ＲＰ因子およびその同系レセプター／変換酵素をコードする遺伝子および他の核酸）に適用される場合、必要に応じて変更して解釈することができる。従って、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡまたは（構造）遺伝子）に適用される場合、単離された核酸は、任意の広範囲のベクターにおいて、そして任意の広範囲の宿主細胞（あるいは、緩衝液、ウイルス、または細胞抽出液などの他の環境）において存在し得る。
用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質に適用される場合、タンパク質自身の一次配列のレベルあるいはタンパク質をコードするＤＮＡのレベルのいずれかにおいて実質的な配列類似性を有する一群のタンパク質を示すために本明細書中で使用されている。配列類似性は、タンパク質／遺伝子の全体に広がり得るか、あるいは特定の領域またはドメインに限定され得る。類似性は、ヌクレオチド配列／アミノ酸配列の同一性ならびに類似性に基づき得る（例えば、当業者は、類似するような特定のアミノ酸を認識し、そして保存的な変化に対して類似するアミノ酸の変更に基づく変化を同定する）。タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、それらが、共通する進化的祖先を有するという意味で関連し得るし、そのような関連タンパク質は、本明細書中では、ホモログとして示されることがある。タンパク質ファミリーのメンバーは、同じ生化学的特性または生物学的機能を必ずしも有する必要はないが、それらの類似性は、通常、共通した機能的特徴（エフェクター結合部位および基質など）に反映される。
タンパク質ファミリーが認識される基準は、この分野では周知であり、ＤＮＡおよびタンパク質のレベルでの配列の多数のコレクションのコンピューター分析ならびにハイブリダイゼーション分析および酵素アッセイなどの生化学的技術を含む（例えば、PearsonおよびLipman（1988）、PNAS USA、85:2444を参照のこと）。
従って、本発明のＲＰ因子には、図１Ａおよび図１Ｂに示される因子が、その種変異体、対立遺伝子型形態、ホモログ、誘導体、ムテイン、および対応する分泌型形態／非分泌型形態とともに含まれる（下記参照）。好ましくは、本発明のＲＰ因子は、図１Ａおよび図１Ｂに示されるタンパク質のいずれか１つの種変異体、対立遺伝子型形態、ホモログ、誘導体、ムテイン、および対応する分泌型形態／非分泌型形態である。
本発明のＲＰ因子は、成熟形態を得るためにプロセシングされる前駆体の形態で合成することができる。そのようなプロセシングは、様々な中間体の（プロ）形態を介して進行し得る。そのような前駆体、中間体および成熟タンパク質はすべて、別途指示されている場合を除き、本明細書中で使用されている用語「ＲＰ因子」により包含されるものとする。本明細書中で使用されている用語「プロＲＰ因子」は、成熟ＲＰ因子の任意の様々な前駆体を特異的に規定する（そのような前駆体は活性であってもよく、あるいは不活性であってもよい）。
プロセシングには、タンパク質分解的切断および／または分泌が含まれ得る。前駆体は不活性であり得るが、成熟型形態としてプロセシングされたときに活性型になる。前駆体には、分泌途中で除去される分泌リーダー配列を有するタンパク質（プレ形態）が含まれ得る。そのような形態は、本明細書中では、「プレＲＰ因子またはプレプロＲＰ因子」として示される。上記で説明したように、そのようなプレ形態またはプレプロ形態もまた、別途指示されている場合を除き、本明細書中で使用されている用語「ＲＰ因子」により包含されるものとする。
プロセシングは、ＲＰ因子前駆体が同系レセプターに結合するときに付随し得る。次いで、そのようなレセプターは、前駆体を直接（または間接的に）切断して、より成熟型形態に近いＲＰ因子を産生させることができる。そのようなプロセシングは、いくつかのレセプター−プロセシング複合体を含む一連のカスケードとして生じ得る。従って、そのようなプロセシングにより、末端の（シグナル変換）レセプターに結合することによってシグナル伝達分子としてその後作用する成熟ＲＰ因子が最終的に得られる。
そのようなプロセシングにおいて、近位の（または中間的な）レセプターは変換酵素として機能することができ、末端のレセプターはシグナル伝達装置として機能することができる。しかし、レセプターは、変換酵素およびシグナル伝達装置の両方として機能することができる。本明細書中で使用されている用語「変換酵素」は、ＲＰ因子前駆体と結合し、そしてＲＰ因子前駆体を（直接的または間接的に）プロセシングして、より成熟型に近い形態を産生する分子を規定するものとする。変換酵素は、例えば、プロテアーゼ活性を有し得る。
上記のレセプター／変換酵素は、細胞表面（例えば、膜結合型）に配置され得るか、あるいは細胞質または細胞外に配置され得る。
好ましくは、ＲＰ因子は、細菌（例えば、病原性細菌）から得られる。特に好ましいものは、Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性細菌から得られるＲＰ因子である。
用語「から得られる」は、規定された供給源に適用される場合、その意味において、物質の物理的な起源である供給源だけでなく、参照供給源から生じる物質の特徴に対応する構造的および／または機能的な特徴を有する物質をも規定するものとする。従って、所与の供給源「から得られた」タンパク質は、そのような供給源から必ずしも精製されていない。
用語「Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性細菌」は、進化的に関連する細菌の特定のクラスを規定するこの分野の用語である。このクラスには、Micrococcus spp.（例えば、M.luteus）、Mycobacterium spp.（例えば、増殖が早いマイコバクテリアまたは増殖が遅いマイコバクテリア、例えば、M.tuberculosis、M.leprae、M.smegmatisまたはM.bovis）、Streptomyces spp.（例えば、S.rimosusおよびS.coelicolor）、およびCorynebacterium spp.（例えば、C.glutamicum）が含まれる。本発明によって好ましいものは、マイコバクテリアから得られるＲＰ因子／同系レセプター／変換酵素（「マイコバクテリアＲＰ因子／ＲＰ因子レセプター／変換酵素」）である。
本発明はまた、本発明のＲＰ因子およびＲＰ因子レセプター／変換酵素のホモログ、対立遺伝子型形態、種変異体、誘導体、ムテインまたは等価体を包含する。
用語「ホモログ」は、本明細書中では２つの異なる意味で使用される。この用語は、狭義には、異なる生物に由来する対応したタンパク質（すなわち、種変異体）を規定するために使用されている。この場合、タンパク質およびそのホモログの間には直接的な進化的関係が存在する。これは、構造的および機能的な等価性に反映され得る。そのようなタンパク質およびそのホモログは、それぞれの生物において同じ役割を果たす。
上記の用語は、広義には、所与の（参照）ＲＰ因子に対して構造的に類似している（すなわち、必ずしも、関連的および／または構造的および機能的な等価体でない）タンパク質を規定するために本明細書中で使用されている。この意味において、相同性が、純粋に構造的基準に基づき、（Dayhoff他、Atlas of protein structure第５巻、National BioMed Fd′n、Washington D.C.、1979によって示されているような）アミノ酸配列同一性および／または保存的アミノ酸変化の存在によって認識される。
本発明のために、ホモログは、その対応するＤＮＡが特異的または選択的に交差ハイブリダイゼーションし得るか、あるいは選択的で適切なハイブリダイゼーション条件および／または適切なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで交差ハイブリダイゼーションし得るそのようなタンパク質として認識することができる。
用語「選択的または特異的に（交差）ハイブリダイゼーションし得る」は、この文脈において、相同的な配列の特徴部（または小さなクラス）への対応するｓｓＤＮＡ配列の結合が高ストリンジェントまたは低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで得ることができるような配列であることを示す。本発明のこの方法は、（例えば、日常的な試行錯誤によるか、または熱力学的考慮に基づいて）当業者によって容易に決定され得る任意の特定のハイブリダイゼーション条件に依存しない。
好ましくは、本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体は、図１Ａまたは図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２０％の同一性を有する。
特に好ましいものは、図１Ａまたは図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも３０％の同一性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体である。
本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体は、図１Ａまたは図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも２５％の相同性を有する。
特に好ましいものは、図１Ａまたは図１Ｂに示される個々のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも３０％の相同性、例えば、それとの少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の相同性を有する本発明のＲＰ因子のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体である。
用語「誘導体」は、本発明のタンパク質（例えば、ＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素）に対して本明細書中で適用される場合、本発明のタンパク質の改変体であるタンパク質を規定するために使用されている。そのような誘導体には、本発明のタンパク質が１つまたは複数の異なるタンパク質またはペプチド（例えば、標識として作用するか、または精製を容易にするための抗体または生化学的活性を付与するタンパク質ドメイン）に融合した融合タンパク質が含まれ得る。
誘導体はまた、本発明のタンパク質を出発物質または反応物として使用する合成プロセスの産物であり得る。
用語「ムテイン」は、本発明のタンパク質の変異型形態であるタンパク質、すなわち、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を有するタンパク質を規定するために本明細書中で使用されている。従って、本発明のムテインには、フラグメント、短縮体および融合タンパク質（例えば、融合した免疫グロブリン、レセプター、変換酵素または酵素部分を含む）が含まれる。
本発明のムテインには、タンパク質の１つまたは複数の活性を効果的に促進させるか、または損なう変異、例えば、レセプター、認識配列またはエフェクター結合部位の機能を促進させるか、または損なう変異が導入されたタンパク質もまた含まれる。
ムテインは、任意の好都合な方法によって調製することができる。好都合には、変異原性オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法を、二本鎖テンプレート（ＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換構想の遺伝子を含有するpBluescript KSII構築物）（例えば、ChameleonTMまたはQuikChangeTM、StratageneTM）を使用して用いることができる。配列決定によって各変異誘導体を確認した後、変異遺伝子を切り出し、適切なベクターに挿入し、その結果、改変されたタンパク質を過剰発現させて、精製することができる。
好ましい変異型形態は、ＲＰ因子シグナル伝達ドメインまたはＲＰ因子特異性決定因子、あるいはＲＰ因子レセプターリガンド結合ドメイン、あるいはそれらの２つ以上の組合せからなる（あるいは、本質的にはそれらからなる）短縮体である。
本発明はまた、キメラＲＰ因子を包含する。キメラＲＰ因子は、１つまたは複数の異種ドメインを含む因子である。この文脈のおいて、異種ドメインは、それが会合する他のドメインが得られるそれとは異なるＲＰ因子から得られるＲＰ因子の一部である。そのようなキメラＲＰ因子は、ＲＰ因子の特異性および／または活性が操作されるか、または変更される適用において特に利用される。
そのようなキメラＲＰ因子の構築において有用なものは、選択されたドメイン（例えば、シグナル伝達ドメインまたは特異性決定ドメイン）をコードするＤＮＡから本質的になるＤＮＡフラグメントまたはカセットである。そのようなフラグメントまたはカセットは、必要に応じて、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはクローニング部位と接する。本発明はまた、連鎖状のドメインカセットならびにクローニング部位（例えば、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位）を１つまたは複数のドメイン内領域に有する変異型ＲＰ因子の構造遺伝子を包含する。
本明細書中で使用され、そして本発明の物質に対して適用される用語の等価体は、構造（例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）において異なるが、本発明の物質の機能と実質的に同じ機能を示す物質（例えば、タンパク質、ＤＮＡなど）を規定する。そのような等価体は、例えば、機能的に重要な配列を（例えば、保存配列または特徴的な配列を同定することによって、あるいは機能的アッセイを伴う変異誘発法によって）同定して、それに基づくアミノ酸配列を選択し、次いで選択したアミノ酸配列に基づくペプチドを合成することによって作製することができる。そのような合成は、固相ペプチド合成（合成ペプチドの作製）およびオリゴヌクレオチドのアセンブリー化（およびその後のクローニング）を含むこの分野で知られている多くの異なる方法のいずれかによって行うことができる。
本発明のタンパク質のホモログ、フラグメント、ムテイン、等価体または誘導体はまた、特に、本発明のタンパク質に対する抗体と交差反応するそのようなタンパク質として、特に図１Ａまたは図１Ｂに示される特定のタンパク質のいずれかに対する抗体と交差反応するそのようなタンパク質として定義することができる。
本発明はまた、分離した部分および従属的な部分として本発明のＲＰ因子のすべての個々の機能的なドメインを包含する。
本発明はまた、組換えＲＰ因子を包含する。本明細書中で使用されている用語「組換え（体）」は、「組換えＤＮＡ技術」として総称的に知られている技術の主要部によって、（例えば、下記の核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を使用して）産生される物質を規定するものとする。
本発明はまた、本発明のＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素（あるいはそのホモログ、種変異体、対立遺伝子型形態、誘導体、ムテインまたは等価体）を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン）を包含する。
薬学的組成物は、患者（例えば、ヒトまたは動物）への投与に適する形態、濃度および純度レベルの固体組成物または液体組成物であり、それを投与したときに、所望する生理学的変化を高めることができる。本発明のワクチンは、適切なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、ＢＣＧまたはＢＣＧ抽出物）を含むことができる。
別の態様において、本発明は、本発明の物質を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、（ａ）治療（例えば、免疫療法）、診断または予防において使用され；および／または（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であり、あるいは局所投与または全身投与に適する形態である。
別の態様において、本発明は、本発明のＲＰ因子（あるいはそのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）に特異的な抗体（または抗体誘導体）に関する。
抗体は、好ましくは、治療（例えば、免疫療法）、診断または予防における使用に適切な形態であり；および／または薬学的賦形剤、ユニット投薬形態で処方されるか、あるいは局所投与または全身投与に適する形態で処方される。抗体は、標識および／または固定化および／または他の分子とのコンジュゲート化を行うことができ、そのような実施形態は診断適用において特に利用される。
本発明の別の態様により、単離されたＲＰ因子レセプターまたは組換えＲＰ因子レセプターが提供される。
レセプター／変換酵素は、本明細書中前記のいずれかの供給源から、例えば、細菌供給源（例えば、病原性細菌供給源）から得ることができる。そのような供給源には、Ｇ＋Ｃ含有量が高いグラム陽性のMicrococcus spp.（例えば、M.luteus）；またはMycobacterium spp.（例えば、増殖が早いマイコバクテリアまたは増殖が遅いマイコバクテリア、例えば、M.tuberculosis、M.leprae、M.smegmatisまたはM.bovis）；またはStreptomyces spp.（例えば、S.rimosusおよびS.coelicolor）；またはCorynebacterium spp.（例えば、C.glutamicum）が含まれる。
本発明はまた、本発明のレセプター／変換酵素のホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体、ならびに（本明細書中前記において定義されている）組換えＲＰ因子レセプター／変換酵素を包含する。
本発明はまた、本発明のレセプター／変換酵素（あるいはそのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン）を包含する。
好ましくは、レセプター／変換酵素（あるいはそのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）または薬学的組成物は、（ａ）治療（例えば、免疫療法）、診断、または予防において使用され；および／または（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であり、あるいは局所投与または全身投与に適する形態である。
本発明のレセプター／変換酵素（あるいはそのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）に特異的な抗体（または抗体誘導体）もまた包含される。抗体は、（ａ）治療（例えば、免疫療法）、診断または予防において使用することができ；および／または（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であり得るし、あるいは局所投与または全身投与に適する形態であり得る。
ＲＰ因子のアンタゴニストまたは阻害剤もまた包含される。
好ましくは、アンタゴニストまたは阻害剤は、（ａ）本発明の抗体；および／または（ｂ）本発明のレセプター／変換酵素；（ｃ）ＲＰ因子特性決定ドメインを含み、例えば、機能的なシグナル伝達ドメインを有さないＲＰ因子ムテインを含む。レセプターは、それが可溶性ＲＰ因子のシンク（sink）として作用し得る可溶性形態で投与された場合、アンタゴニストまたは阻害剤として機能し得る。好ましくは、レセプタードメインからなり（そして、膜アンカーおよび壁展開ドメインを有さない）改変されたレセプターが阻害剤またはアンタゴニストとして使用される。そのような誘導体は、より大きな溶解性を示し得る。
本発明のアンタゴニストまたは阻害剤は、好ましくは、（ａ）治療（例えば、免疫療法）、診断または予防において使用され；および／または（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態であり、あるいは局所投与または全身投与に適する形態である。
本発明はまた、ＲＰ因子のアゴニスト、活性化因子または模倣物を包含する。好ましくは、アゴニスト、活性化因子または模倣物は下記を含む：（ａ）本明細書中に記載されているＲＰ因子レセプター／変換酵素の抗体；および／または（ｂ）ＲＰ因子特異性決定ドメインを含む（あるいは、ＲＰ因子特異性決定ドメインからなる）ＲＰ因子ムテイン；および／または（ｃ）ＲＰ因子シグナル伝達ドメインを含む（あるいは、ＲＰ因子シグナル伝達ドメインからなる）ＲＰ因子ムテイン；および／または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかが機能的に連結した組合せ。
アゴニスト、活性化因子または模倣物は、（ａ）治療（例えば、免疫療法）、診断または予防において使用することができ；および／または（ｂ）薬学的賦形剤、ユニット投薬形態で処方され得るか、あるいは局所投与または全身投与に適する形態で処方され得る。
好ましくは、アゴニスト、活性化因子または模倣物は、補助的治療において使用することができる（例えば、抗菌剤、例えば、抗生物質と組み合わせて処方され得るか、あるいはそれとの組合せで存在し得る）。
本発明はまた、本発明のＲＰ因子（あるいは、そのホモログ、誘導体、対立遺伝子型家形態、種変異体、ムテインまたは等価体）またはＲＰ因子レセプター／変換酵素（あるいは、そのホモログ、誘導体、対立遺伝子型家形態、種変異体、ムテインまたは等価体）をコードする単離された核酸を包含する。従って、本発明の核酸は、本発明のタンパク質をコードする限り、任意の配列を有するＤＮＡを包含する。遺伝コードの縮重の結果として、本発明の任意の特定のアミノ酸配列は、多くの異なる配列によってコードされ得ることは当業者によって理解されている。従って、核酸配列は、例えば、任意の特定の宿主細胞におけるコドン使用に関して、選択または最適化を行うことができる。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）を包含する。ベクターの性質は、本発明にとって重要ではない。プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、トランスポゾン、ミニ染色体、リポソームまたは力学的なキャリアを含む任意の適切なベクターを使用することができる。
本発明の発現ベクターは、所望するタンパク質産物（例えば、ＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター）をコードするＤＮＡの発現に適するＤＮＡ構築物である。このようなベクターは、（ａ）調節エレメント（例えば、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、リプレッサーおよび／またはエンハンサー）、（ｂ）ｍＲＮＡに転写される構造配列またはコード配列、および（ｃ）適する転写配列、翻訳配列、開始配列および終結配列を含み得る。ベクターはまた、（例えば、発現したタンパク質のその後の精製を容易にするために、アフィニティー（例えば、Ｈｉｓ）標識などの）任意の様々な標識をコードする配列を含有することができる。
特に好ましいものは、本発明のＤＮＡに作動可能に連結した１つまたは複数の発現エレメントを含み、適切なレベルでその発現をもたらすベクターである。任意の広範囲の発現エレメントを使用することができ、そのような発現エレメントは、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、オペレーターおよび活性化配列から選択することができる。そのような発現エレメントは、エンハンサーを含むことができ、そして例えば、調節可能であり得るし、例えば、（誘導因子の添加によって）誘導可能であり得る。
本明細書中で使用されている用語「作動可能に連結した」は、線状ＤＮＡ配列の一部が、同じ線状ＤＮＡ配列の他の部分の活性に影響を及ぼすことができる状態をいう。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に加わる前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結している。リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。
ベクターは、ポジティブ選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーをさらに含むことができる。ポジティブ選択マーカーの使用は、ベクターを含有する細胞の選択および／または同定を容易にする。
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を包含する。任意の適切な宿主細胞を使用することができ、これには、原核生物の宿主細胞（Escherichia coli、Streptomyces spp.およびBacillus subtilisなど）および真核生物の宿主細胞が含まれる。
別の態様において、本発明は、本発明のＲＰ因子（あるいは、そのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）を含む培養培地または輸送培地を提供する。培養培地は、例えば、寒天平板、ブロス、斜面培地、コーティングされた採取用スティック、コーティングされたプローブ、メンブレン、コーティングまたは充填されたウエルまたはフィルムなどの任意の任意な形態を取り得る。培地は、規定された培地または複雑な培地であり得るが、培養される微生物の同定を容易にするために指示色素を含有し得る。好ましくは、培地は、例えば、Mycobacterium spp.、Streptomyces spp.およびCorynebacterium spp.の細菌の培養または輸送に適する。
本発明はまた、本発明の核酸に対して相補的な核酸を含む核酸プローブを包含する。そのようなプローブは、好ましくは、本発明のタンパク質（例えば、ＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素）をコードする核酸と選択的にハイブリダイゼーションする。プローブは、好都合には、単鎖ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブである。
本発明はまた、本発明の因子（あるいはそのホモログ、誘導体、ムテインまたは等価体）、レセプター、抗体、プローブまたは培養培地を含む診断キットを包含する。
別の態様において、本発明は、本発明のＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素をコードする核酸に対応するアンチセンスＤＮＡを包含する。
本発明はまた、抗菌性薬物を製造するための方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）ＲＰ因子レセプターを提供する工程；（ｂ）候補薬物を提供する工程；（ｃ）抗菌活性の指標である親和性を、ＲＰ因子レセプターを候補薬物の１つと接触させ、そしてＲＰ因子レセプターに関する候補薬物の親和性を測定して、この親和性を抗菌活性の指標とすることによって、候補薬物をスクリーニングする工程；および、必要に応じて、（ｄ）工程（ｃ）でスクリーニングされた候補薬物の同定に基づいて、抗菌活性を有する薬物の合成または精製を行う工程。
好ましくは、抗菌性薬物を製造するための方法は下記の工程を含む：（ａ）ＲＰ因子レセプター／変換酵素を提供する工程；（ｂ）候補薬物を提供する工程；（ｃ）ＲＰ因子を提供する工程；（ｄ）ＲＰ因子レセプターをＲＰ因子の存在下で候補薬物の１つと接触させ、次いでＲＰ因子レセプターに対する結合についてＲＰ因子と非生産的に競合する候補薬物の能力を測定して、この競合的結合能を抗菌活性の指標とすることによって候補薬物をスクリーニングする工程；および、必要に応じて、（ｅ）工程（ｄ）でスクリーニングされた候補薬物の同定に基づいて、抗菌活性を有する薬物の合成または精製を行う工程。
本発明はまた、本発明の方法によって製造される（あるいは、それによって得ることができる）抗菌性薬剤またはその誘導体を包含する。
本発明はまた、製品（例えば、食品、薬学的調製物または医療製品）の微生物学的品質を測定するための方法を包含する。この方法は、製品サンプルをＲＰ因子（例えば、本明細書中前記において規定されているＲＰ因子）と接触させる工程を含む。そのような方法において、ＲＰ因子は、好ましくは、栄養物組成物（例えば、平板、ブロス、フィルムまたは採取用スティック）の一部を形成する。
別の態様において、本発明は、細菌（例えば、マイコバクテリア）細胞を培養する方法に関する。この方法は、ＲＰ因子（例えば、本明細書中前記において定義されているＲＰ因子）を含有する培養培地で細胞をインキュベーションする工程を含む。
本発明はまた、エクスビボ（ex vivo）診断方法を包含する。この診断方法は、生物学的サンプルをＲＰ因子（例えば、本明細書中前記において定義されているＲＰ因子）と接触させる工程を含む。
本発明の診断方法は、好ましくは、本発明の培養培地または輸送培地をインキュベーションして、生物学的サンプル内の細胞（例えば、細菌細胞）の増殖を可能にする工程を含む。
本発明はまた、（ａ）微生物の増殖を刺激し；かつ／または（ｂ）休眠、仮死または潜伏している微生物を蘇生させる方法を包含する。この方法は、微生物をＲＰ因子（例えば、本明細書中前記において定義されているＲＰ因子）と接触させる工程を含む。
本発明はまた、本発明の組換えＲＰ因子または組換えＲＰ因子レセプター／変換酵素を製造するための方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）本発明の宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）培養された宿主細胞から因子またはレセプターを（例えば、培養上清または細胞の画分から）精製する工程。
本発明はまた、本発明の組換えＲＰ因子または組換えレセプター／変換酵素を製造するための方法を包含する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）核酸プローブに対して選択的にハイブリダイゼーションする遺伝子を同定するシグナルを得るために、同系の構造遺伝子と選択的にハイブリダイゼーションし得る核酸プローブを用いて遺伝子ライブラリーを探索する工程；（ｂ）工程（ａ）で同定された遺伝子を（例えば、宿主細胞へのクローニングを、例えば本明細書中前記に定義されている方法に従って行うことによって）発現させて、因子またはレセプターを製造する工程。
本発明はまた、上記の方法によって得ることができる組換えＲＰ因子または組換えレセプター／変換酵素を包含する。
医療適用
本発明は、治療、予防および診断における使用に必要な広範囲の新規な医薬品および調合薬の単離、合成および合理的な設計を可能にする。
本発明の物質が適用される治療、予防および診断の様々な形態には、１つまたは複数の感染性病原体の蘇生（ＲＰ因子）シグナル伝達経路を変化させること、破壊することまたは乱すことが含まれ得る。
従って、本発明の物質は、抗菌性薬剤、例えば、抗菌剤として一般に適用される。従って、本発明の物質は、微生物（例えば、細菌）感染症、特に、潜伏に関連したそのような感染症（例えば、マイコバクテリア感染症）の処置、予防または診断において使用することができる。
従って、本発明を使用して、例えば、（ａ）潜伏（または休眠）している病原体の蘇生；および／または（ｂ）病原体の増殖、および／または（ｃ）病原体の繁殖および伝搬；および／または（ｄ）潜伏感染の活性化（例えば、潜伏している細菌（例えば、マイコバクテリア）の感染）の防止、軽減または妨害を行うことができる。
一般に、本発明の物質を使用して、蘇生（ＲＰ因子）シグナル伝達経路の変化、破壊または乱れ、あるいは感染性病原体に関連するＲＰ因子レセプター／変換酵素の阻止を示す状態を処置することができる。
そのような治療方法／予防方法における使用に必要な特に好ましい物質には、ＲＰ因子のアンタゴニストまたは阻害剤が含まれる。そのようなアンタゴニストまたは阻害剤は、本明細書中において定義されているＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素に対する抗体；本発明のＲＰ因子レセプター／変換酵素；ＲＰ因子ムテイン、例えば、変更されたＲＰ因子特異性決定ドメインを含むか、および／または機能的なシグナル伝達ドメインを有さないＲＰ因子ムテインを含むことができる。
ＲＰ因子抗体は、潜伏性細菌感染を有する患者において、内因性ＲＰ因子を封鎖して、最終的には排除するように作用する。
ＲＰ因子抗体は、感染性病原体と会合するレセプターに非生産的に結合する。変換酵素に対する抗体は、変換酵素の活性を（例えば、立体的阻害によって）不活性化し、その結果、ＲＰ因子の成熟化を妨げる。従って、抗体は、感染性病原体と会合するレセプター／変換酵素に対する内因性ＲＰ因子の結合を競合的に阻害することができる。あるいは、抗体は、大きな親和性で（および／または本質的には不可逆的に）、ＲＰ因子レセプター／変換酵素に結合することができ、その結果、ＲＰ因子−リガンドの結合またはＲＰ因子の成熟化を阻止することができる。類似した活性が、特異性および／またはシグナル伝達活性を変更したＲＰ因子ムテインによって示される。
いずれの場合においても、潜伏している病原体の蘇生、病原体の増殖および／または疾患状態の進行に必要なＲＰ因子−ＲＰ因子レセプター／変換酵素の結合が乱され、低下させられ、あるいは破壊される。
そのような方法における治療剤としての使用に必要なＲＰ因子レセプターは、それらが通常会合するシグナル伝達経路とは連携していない。従って、そのようなＲＰ因子は、好ましくは、遊離（すなわち、可溶性または分散可能な）形態であり、かつ／または膜に結合していない。このように、遊離ＲＰ因子レセプターの効果的な循環濃度または全身濃度を患者において確立することができ、そして維持することができる。このような形態において、ＲＰ因子レセプターは、ＲＰ因子シンク（ｓｉｎｋ）として作用し、そして潜伏性細菌感染を有する患者において内因性ＲＰ因子を中和する（そして最終的には排除する）。従って、レセプターは、（潜伏している）病原体の活性化および／または病原体増殖の刺激を低下または防止し、その結果、感染の進行を遅らせるか、または停止させる。
別の態様において、本発明を使用して、インビボで、潜伏（休眠）している病原性微生物を蘇生させることができるか、あるいはそのような蘇生を助けることができ（あるいは、そのような病原性微生物を活性化させることができるか、またはそのような活性化を助けることができ）、それによって、補助的な抗菌的治療の効果を高めることができる。そのような適用における使用に必要な補助的な抗菌的治療は、十分な効力に関して、潜伏していない標的病原体の集団、すなわち活動している（例えば、増殖中または複製中の）標的病原体集団に依存する治療である（例えば、特定のタイプの抗生物質に基づく補助的治療）。従って、本発明の物質は、抗微生物治療における様々な抗菌性化合物により相乗的に作用し得る。
好ましい実施形態において、本発明は、例えば、１つまたは複数のイソニアジド、リファンピシン、ピルジンアミドおよび／またはエタンブトール（またはストレプトマイシン）の同時投与を含む結核の抗菌性治療の効果を高めるために使用することができる。
そのような治療における使用に特に有用な物質には、例えば、本発明のＲＰ因子、ＲＰ因子アゴニスト、活性化因子および模倣物が含まれる。そのようなアゴニスト、活性化因子および模倣物は下記を含むことができる：本明細書中前記のＲＰ因子レセプター抗体；本明細書中前記において定義されているＲＰ因子変換酵素；ＲＰ因子特異性決定ドメインを含む（あるいは、ＲＰ因子特異性決定ドメインからなる）ＲＰ因子ムテイン；ＲＰ因子シグナル伝達ドメインを含む（あるいは、ＲＰ因子シグナル伝達ドメインからなる）ＲＰ因子ムテイン；および／またはその機能的に連携した組合せ。
そのような方法における使用に必要なＲＰ因子レセプター抗体は、ＲＰ因子レセプターでの遠心性のシグナル伝達経路を開始させるのに役立つ抗体である。従って、抗体は、ＲＰ因子模倣物として作用することができ、潜伏／休眠を破り、そして病原体を蘇生させるように作用することができる。
そのような方法において特に有用なものは、特異性が変更された変異型ＲＰ因子（例えば、特異性決定ドメインが変異しているか、または改変されているＲＰ因子）である。そのような変異型ＲＰ因子は、広範囲の病原体に対して（例えば、実質的にすべての病原性または感染性のマイコバクテリアに対して）活性であり得るか、または特定の病原体（例えば、M.tuberculosisおよびM.leprae）に対して標的化され得る。
上記の抗体、ＲＰ因子、レセプターおよび変換酵素は、直接的に、あるいは生ワクチン媒体によって投与することができる。そのような生ワクチン媒体は、本発明の治療的に活性な抗体、ＲＰ因子、レセプターおよび変換酵素がインビボで発現するように（そして好ましくは、それらを分泌するように）遺伝子操作された微生物を含む。
従って、本発明は、広範囲の様々な微生物感染症の処置において適用され、そして潜伏している微生物（例えば、細菌）の感染症の処置において特に適用される。
好ましい実施形態において、本発明は、放線菌またはマイコバクテリアによる感染症、例えば、M.tuberculosis、M.leprae、M.bovis、M.kansasiiおよびM.aviumが関与する感染症の処置において適用される。
本発明により処置され得る他の感染症には、Corynebacterium spp.（Corynebacterium diphtheriaeを含む）、Tropheryma whippelii、Nocardia spp.（Nocardia asteroidesおよびNocardia brasiliensisを含む）、Streptomyces spp.（Streptomyces griseus、Streptomyces paraguayensisおよびStreptomyces somaliensisを含む）、Actinomadura spp.、Nocardiopsis spp.、Rhodococcus spp.、Gordona spp.、Tsukamurella spp.およびOerskovia spp.、ならびにＧ＋Ｃ含有量が高い病原性グラム陽性細菌として示される属に由来する他の病原性生物が関与する感染症が含まれる。処置され得る他の感染症には、Ｇ＋Ｃ含有量が低い病原性グラム陽性細菌（例えば、Streptococcus spp.、Staphylococcus spp.、Listeria spp.、Bacillus spp.、Clostridium spp.およびLactobacillus spp.）が関与する感染症が含まれる。
本発明はまた、様々なワクチンまたは免疫療法薬剤において包含される。そのようなワクチンまたは薬剤は、本明細書中に記載されるＲＰ因子によって媒介されるシグナル伝達経路の１つまたは複数のエレメント（特に、ＲＰ因子またはＲＰ因子レセプター／変換酵素自身）を標的化する。従って、ＲＰ因子は、ワクチンまたは免疫療法組成物の一部として投与することができ、患者の内因性ＲＰ因子に対する免疫応答を誘発することができ、その結果、病原体の活性化を低下させ、その活性化を妨げ、その結果、感染症の進行を遅らせるか、または停止させることができる。
その代わりに（あるいは、さらに）、ＲＰ因子レセプター／変換酵素は、ＲＰ因子は、ワクチンまたは免疫療法組成物の一部として投与することができ、患者での病原体産生ＲＰ因子に対する免疫応答を誘発することができる。このように、細胞性および／または体液性の免疫応答を病原体に対して刺激することができ、かつ／または潜伏している病原体の活性化（またはその継続した増殖もしくは繁殖）を、ＲＰ因子のシグナル伝達経路を介して低下または妨げることができ、その結果、感染症の進行を遅らせるか、または停止させることができる。
本発明はまた、生ワクチンの調製において適用される：１つまたは複数のＲＰ因子をコードする（あるいは、１つまたは複数のＲＰ因子の発現または活性を調節する）遺伝子が変異している弱毒化微生物株を構築することができる。そのような弱毒化ワクチンは、下記の微生物の変異株に基づくことができる：放線菌、マイコバクテリア（例えば、M.tuberculosis、M.leprae、M.bovis（M.bovis BCGなど）、M.kanasiiおよびM.avium）、Corynebacterium spp.（Corynebacterium diphtheriaeを含む）、Tropheryma whippelii、Nocardia spp.（Nocardia asteroidesおよびNocardia brasiliensisを含む）、Streptomyces spp.（Streptomyces griseus、Streptomyces paraguayensisおよびStreptomyces somaliensisを含む）、Actinomadura spp.、Nocardiopsis spp.、Rhodococcus spp.、Gordona spp.、Tsukamurella spp.およびOerskovia spp.、ならびにＧ＋Ｃ含有量が高い病原性グラム陽性細菌として示される属に由来する他の病原性生物。
そのような弱毒化ワクチンにおいて特に有用な微生物株は、変異したＲＰ因子をコードする遺伝子を有する微生物株である。そのような変異は、フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異および／または置換変異であり得る。好ましい実施形態において、変異は、ヌル変異（例えば、非復帰性ヌル変異）であり、微生物の増殖を妨げる（すなわち、微生物を「弱毒化」する）ことができる。他の実施形態において、変異は、特異性が変更された変異型ＲＰ因子（例えば、特異性決定ドメインが変異しているか、または改変されているＲＰ因子）、および／または機能的なシグナル伝達ドメインを有さない変異型ＲＰ因子を発現させることができる。そのような変異型ＲＰ因子は、大きな親和性で（および／または本質的には不可逆的に）、そして非生産的にＲＰ因子レセプター／変換酵素に結合することができ、その結果、ＲＰ因子−リガンドの結合またはＲＰ因子の成熟化を阻止することができる。本発明の弱毒化微生物株は、他の遺伝子（例えば、増殖するのに必須な他の遺伝子）においても変異を有し得るし、１つまたは複数の遺伝子マーカーエレメントもまた有し得る。
生物工学的適用
大多数の（おそらくは、９９％を十分に超える）土壌生物はまだ培養されていないと広く認識されている。これまで培養されていない生物はまた、他の供給源にも存在することが考えられる。本発明は、任意の供給源から、培養することによってそのような生物を回収するために使用することができる。従って、本発明は、存在することが知られているが、現在培養することができない生物多様性の膨大な供給源を明らかにする方法を提供する。
従って、本発明は、有用であることが考えられる微生物ライブラリーおよび生体分子を産生し得る新しい供給源を提供する。そのようなライブラリーは、次いで、医学的または産業的に有用な生成物について検索するためのスクリーニング方法において使用することができる。
従って、別の態様において、本発明は、生体分子ライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）サンプル（例えば、土壌、海水、食品、淡水、組織または生物由来）を提供する工程；（ｂ）ＲＰ因子（例えば、前記請求において規定されるＲＰ因子、またはＲＰ因子を含む培養上清）を含む培養培地でサンプルをインキュベーションして、微生物の培養物を得る工程；および（ｃ）工程（ｂ）の培養物から微生物を単離する工程。
この方法は下記の工程をさらに含むことができる：単離された微生物を、１つまたは複数の目的の生体分子（例えば、代謝物、酵素、抗生物質（例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤または抗真菌剤）あるいはトキシン）を産生する微生物についてスクリーニングする工程。
上記の方法によって製造される（あるいは、それによって得ることができる）生体分子またはその誘導体もまた包含される。
別の態様において、本発明は、微生物（例えば、細菌）のライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）サンプル（例えば、土壌、海水、食品、淡水、組織または生物由来サンプル）を提供する工程；（ｂ）ＲＰ因子（例えば、前記請求において規定されるＲＰ因子、またはＲＰ因子を含む培養上清）を含む培養培地でサンプルをインキュベーションして、微生物培養物を得る工程；（ｃ）工程（ｂ）の培養物から微生物を単離する工程。
上記の方法によって製造される（あるいは、それによって得ることができる）微生物またはその誘導体（例えば、変異体）もまた包含される。
実施例
次に、いくつかの実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。実施例は、例示を目的とするのみであって、本発明をいかなる点においても限定することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
図１：
パートＡ．  M.luteus、M.tuberculosis、M.lepraeおよびStreptomyces coelicolorから得られたＲＰ因子様遺伝子産物の推定アミノ酸配列の配列比較。ＲＰ因子に類似するタンパク質は下記の生物から得られる：M.tuberculosis（アクセス番号：Ｕ３８９３９、ヌクレオチド２４０６〜２７６５、およびＺ８１３６８、ヌクレオチド３３９３２〜３４３９６）およびM.leprae（アクセス番号：Ｌ０１０９５、ヌクレオチド１２２９２〜１２７５９、およびＬ０４６６６、ヌクレオチド２５４４６〜２４９２１）。アクセス番号Ｚ８１３６８における目的のＤＮＡ配列はまた、アクセス番号ＡＤ００００１０にも含まれる。推定されるグラム陽性菌シグナル配列に対応するＮ末端残基に下線を付す。M.lepraeのＬ０４６６６配列はまた、３２アミノ酸の短いシグナルペプチドを含有し得る。
パートＢ．    Bacillus subtilisのＹａｂＥに関連する遺伝子産物の配列比較。配列比較を２つ（ＡおよびＢ）に分けて示す。比較される配列残基を大文字で示す。２つ以上の配列において保存されている（あるいは保存的に置換されている）そのような残基を太字で示す。パートＡにおいて、完全に保存されている残基にはハッシュ（＃）で印を付け、保存的な置換にはドット（．）を付ける。Cperfringは、Clostridium perfringensの不完全なＯＲＦ１である（アクセス番号：Ｕ０４９６６）。Caceto５０６は、Clostridium acetobutylicumゲノム配列決定プロジェクトのコンティグ（contig）５０６に由来する不完全なＯＲＦである。B.subtilisから得られたＹｏｃＨおよびB.subtilisから得られたＹａｂＥは、B.subtilisゲノム配列決定プロジェクトから得られたＹｏｃＨおよびＹａｂＥの推定される遺伝子産物である（アクセス番号：ＢＧ１３５２１およびアクセス番号：Ｐ３７４５６）。
パートＣ．    他の生物から得られた既知の壁会合タンパク質および仮想的な壁会合タンパク質とのＲＰ因子Ｃ末端ドメインの配列比較。完全に保存されている残基には星印を付け、少なくとも７つの配列において保存されている残基にはドット（．）を付ける。
パートＤ．    ＭｔｕｂＭＴＶ０４３のＣ末端（残基１５８〜３２２）でのモチーフ。
パートＥ．    M.luteusのＲＰ因子の推定アミノ酸配列とListeria spp.から得られたｐ６０タンパク質との間の配列比較。M.luteusのＲＰ因子のＣ末端部（残基１２５〜２２０）と、L.monocytogenes EGDのｐ６０タンパク質（残基１５８〜２４５）との間の配列比較において保存されている残基の多くはまた、６つの他のListeria spp.から得られたｐ６０タンパク質においても保存されている。
図２：
パートＡ．    ＲＰ因子のコード遺伝子およびその推定される産物の配列。ヌクレオチド配列を小文字で示し、ＰＣＲプライマーを太字で示す。推定されるタンパク質配列を太大文字（１文字表記）で示す。オリゴヌクレオチドを設計するために使用したタンパク質およびペプチドの部分配列結果を斜体大文字で示す。
パートＢ．    Streptomyces coelicolorから得られたＲＰ因子の一部分をコードする２９９塩基対のＤＮＡフラグメントの配列。推定されるアミノ酸配列を、１文字のアミノ酸表記を使用してＤＮＡ配列の下に示す。
図３：
蘇生活性の溶出図。ＤＥＡＥ−セファロースカラム（材料および方法を参照のこと）から０．２５Ｍ  ＫＣｌで溶出される画分をＭｏｎｏＱカラムに負荷し、１０％グリセロールを添加した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）での０．０８Ｍ〜０．２８Ｍ  ＫＣｌの２０ｍｌの直線勾配で溶出した。飢餓細胞（ＣＦＵ３．１０6細胞．ｍｌ-1、総数１．２．１０9細胞．ｍｌ-1）の稀釈した懸濁液の１０μｌを、Bioscreen装置において５〜１０個のレプリカで、０．５％ｗ／ｖの乳酸塩および０．０５％酵母抽出物が補充され、２μｌの各画分を含有するＬＭＭ上清の２００ｍｌに加えた。詳細については、材料および方法を参照のこと。  Ａ：２８０ｎｍでの吸光度およびＫＣｌ濃度の強度。  Ｂ：蘇生活性。  Ｃ：ＤＥＡＥ−セルロースおよびＭｏｎｏＱでのクロマトグラフィーを行った後の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図。  レーン：１  マーカー（94,000、67,000、43,000、30,000、20,100、14,400）；  レーン：２  ＤＥＡＥ−セルロースカラムからの画分；レーン：３  精製された調製物（ＭｏｎｏＱカラムの第８画分）。  Ｄ：生細胞の見かけ上の遅滞期の減少。定常期の生細胞を稀釈した懸濁物の１０μｌ（生細胞数：２０細胞）を、Bioscreen装置において５〜１０個のレプリカで、０．５％ｗ／ｖの乳酸塩が補充され、２μｌの各画分（パートＡおよびパートＢに示される実験とは異なる実験の画分）を含有する２００μｌのＬＭＭ上清に加えた。見かけ上の遅滞期を、指数増殖線を横軸に外挿することによって推定した。
図４：  M.luteusに対する精製ＲＰ因子の効果。
Ａ．  蘇生に関するＲＰ因子活性の濃度依存性：異なる濃度のＲＰ因子による休眠細胞の蘇生。飢餓細胞を稀釈した懸濁液の１０μｌ（ＣＦＵ３．１０6細胞．ｍｌ-1、総数５．１０9細胞．ｍｌ-1）を、Bioscreen装置において５〜１０個のレプリカで、０．５％ｗ／ｖのＬ−乳酸塩、０．０５％酵母抽出物、および示された濃度のＲＰ因子が補充された２００μｌのＬＭＭ上清に加えた。詳細については、材料および方法を参照のこと。
Ｂ．  洗浄細胞の増殖。ＬＭＭで増殖させたM.luteusの定常期細胞を、乳酸塩を除いたＬＭＭでの懸濁および遠心分離を行うことにより５回洗浄した。最後に、細菌をシリンジに繰り返し通すことによって同じ培地に細菌を懸濁し、稀釈し、そしてＬＭＭまたはＬＭＭ＋３１ｐＭのＲＰ因子を含有する２０ｍｌフラスコに接種した。初期細胞密度は２５０生細胞／ｍｌであり、インキュベーションを３０℃で激しく振盪しながら行った。増殖を、寒天で固化させたブロスＥを含有する平板に０．１ｍｌのサンプルを置床することによってモニターした。
図５：  Micrococcus luteus、Mycobacterium smegmatisおよびStreptomyces rimosusにおけるＲＰ因子様遺伝子の検出。
0004459308.tif 000002
図６：濁度として測定される回分培養でのMycobacterium smegmatis（A）およびMycobacterium bovis（B）の増殖に対するM.luteusのＲＰ因子の効果。M.smegmatisを、３１ｐＭｏｌ／ＬのＲＰ因子を加えたブロスＥで増殖させた。細胞を約２００／ウエルのレベルで接種し、増殖をBioscreen装置でモニターした。M.bovisは、材料および方法に記載されるように、ＲＰ因子（６２０ｐＭｏｌ／Ｌ）を加えたソートン（Sauton）培地およびＲＰ因子無添加のソートン培地で増殖させた。接種は約１．１０5細胞．ｍｌ-1であり、示すＯＤは、１０本の試験管の異なる測定値の１０回の平均である。
図７：
Ａ：  Ｈｉｓ標識ＲＰ因子の精製。ＲＰ因子をＥ．ｃｏｌｉ  ＨＳＭ１７４（ＤＥ３）で発現させ、下記のように精製した。Ｎｉ2+キレート形成クロマトグラフィーを行った後の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示す。分子量（ｋＤａ）マーカー（ＳＩＧＭＡ）は、ウシ血清アルブミン（６７）、オボアルブミン（４３）、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（３６）、カーボニックアンヒドラーゼ（３０）、ダイズトリプシン阻害剤（２０．１）およびラクトアルブミン（１４．４）である。  レーン：１  マーカー；  レーン：２  ｐＥＴ１９ｂベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉから得られた粗抽出物；  レーン：３  ｐＲＰＦ１を含有するＥ．ｃｏｌｉから得られた粗抽出物；  レーン：４  精製した組換えＲＰ因子。
Ｂ：  精製した組換えＲＰ因子によるM.luteus生細胞の見かけ上の遅滞期の減少。実験の詳細については、図３Ｃの説明文を参照のこと。１０0の希釈度は３３μｇＲＰ因子／ｍｌに対応する。
Ｃ：  精製した組換えＲＰ因子によるM.luteus洗浄細胞の増殖刺激。ＬＭＭで増殖させたM.luteusの定常期細胞を、乳酸塩を除いたＬＭＭでの懸濁および遠心分離を行うことにより５回洗浄した。最後に、細菌をシリンジに繰り返し通すことによって細菌を同じ培地に懸濁し、稀釈し、そしてＬＭＭまたはＲＰ因子（２３０ｐＭｏｌ／Ｌ）存在のＬＭＭを含む２０ｍｌフラスコに接種した。初期細胞密度は１０2生細胞／ｍｌであり、インキュベーションを３０℃で激しく振盪しながら行った。増殖を、寒天で固化させたブロスＥを含有する平板に０．１ｍｌのサンプルを置床することによってモニターした。
図８：
Ａ：  抗ＲＰ因子血清はMicrococcus luteus増殖を阻害する。細菌を５×１０5／ｍｌの初期密度で乳酸最少培地（ＬＭＭ）に接種し、ＯＤ600nmを一定間隔でモニターした。培養物の増殖を１４０時簡にわたり一定間隔でモニターした。ＬＭＭ＋抗体およびＬＭＭ＋コントロール抗体と表示したサンプルは、それぞれ、等量の免疫血清および免疫前血清を含有する。免疫血清（抗体）および免疫前血清（コントロール抗体）を１：１０００の希釈度で用いた。
Ｂ：  ＲＰ因子はMicrococcus luteus増殖に対する抗ＲＰ因子血清の阻害作用を抑える。細菌を１０7細胞／ｍｌの初期密度で接種し、ＯＤ600nmを一定間隔で測定することによって増殖をモニターした。免疫血清（抗体）および免疫前血清（コントロール抗体）を１：1000の希釈度で用い、ＲＰ因子を５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。
図９：
パートＡ：    ９個のＲＰ因子のブロック化配列の配列比較（下記に説明するように、ＭｔｕｂＺ９４７５２は同系レセプターであり得る）。同一性／類似性を有する配列領域を陰影領域により示す。示されているS.coelicolorの遺伝子産物はフラグメントである。
パートＢ：    ＲＰ因子ファミリーにおけるいくつかの遺伝子産物のドメイン構造を示す図。
図１０：
ソートン培地におけるM.tuberculosis増殖に対する組換えＲＰ因子の効果。０．０５％ツィーン８０および１００μＭｏｌ／Ｌオレイン酸ナトリウム＋１０％（ｖ／ｖ）補充物（１リットルにつき、５０ｇのウシ血清アルブミン、２０ｇのグルコース、８．５ｇのＮａＣｌを含有する）を含有するソートン培地に、同じ培地で増殖させたM.tuberculosis H37Ra株の２．５ヶ月前の培養物を、３１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ（１０％v/v補充物（上記の組成）を含有する寒天固化ミドルブルック（Middlebrook）７Ｈ９培地に置床することにより測定される総数）の初期密度に接種した［顕微鏡による総数＝１０6細胞／ｍｌ］。３７℃でのチューブ培養物の増殖を、２８日間にわたり一定間隔でＯＤ600nmを測定することによりモニターした。この実験のために用いたＲＰ因子、Ｒｐｆ（M.luteus）およびＲｐｆ２（M.tuberculosis）の未稀釈物の濃度は約１０μｇ／ｍｌであった。
例
材料および方法
生物および培地
Micrococcus luteus NCIMB13267（以前には、「フレミング株２６６５」と記載されていた）を、前記のように、Ｌ−乳酸塩を含有する乳酸最少培地（ＬＭＭ）において好気的に３０℃で振盪フラスコで増殖させた。培養物が定常期に達した場合、攪拌を、２ヶ月までの間、３０℃で続けた。次いで、培養物を、さらに２〜３ヶ月までの間、攪拌することなく好気的に室温で維持した。この時点でのこれらの培養物の見かけ上の初期生存率（平板での計測数を顕微鏡での計測数と比較することによって測定）は１０-3未満であった。
Mycobacterium smegmatis（「早い」株、All-Russia State Institute for Control of Veterinary Preparations、モスクワ）を、ソートン培地または栄養ブロスＥ（ＬａｂＭ）のいずれかで増殖させた。一晩の前培養物を使用して、１０3細胞／ｍｌの初期密度に培養物を接種した。Mycobacterium bovis（BCG）、Mycobacterium tuberculosis H37RVおよびMycobacterium aviumをソートン培地で増殖させた。
Ｍ．ｌｕｔｅｕｓのスペント（使用後）培地の調製
乳酸最少培地、または乳酸塩をコハク酸塩＋０．０１％酵母抽出物（高分子物質を透析によって除く）と置き換えた同じ培地で増殖させたＭ．ｌｕｔｅｕｓの後期対数期培養物（２００〜１０００ｍｌ）を遠心分離した後に上清を得た。接種は、富化培地（ブロスＥ、ＬａｂＭ）で増殖させ、次いで乳酸塩を含まないＬＭＭで洗浄した細胞の２％からなった。上清を０．２２μｍフィルター（Ｗｈａｍａｎ）に通した後に使用した。
平板によるＭ．ｌｕｔｅｕｓ細胞の生存性
１．３％Nutrient Broth E（ＬａｂＥ）または乳酸最少培地からなる平板を使用した。飢餓培養物から採取し、遠心分離してオートクレーブ処理したスペント培地を用いて、細胞稀釈物を四連で作製した。平板を３０℃で３日〜５日の間インキュベーションした。
ＭＰＮによるＭ．ｌｕｔｅｕｓ細胞の生存性
ＭＰＮアッセイを、Bioscreen Ｃ光学増殖分析機（Labsystem、フィンランド）において、０．５％乳酸塩および０．０５％酵母抽出物が補充された乳酸最少培地を蘇生培地として使用して行った。飢餓細胞の稀釈物を、記載されているように作製した。１０μｌの各稀釈物（５〜１０個のレプリカ）を、０．５％乳酸塩および０．０５％酵母抽出物が補充された２００μｌの乳酸最少培地または同じ培地を含有するウエルに加えて、一部（２〜２０μｌ）を試験した。増殖（光学密度）を、６００ｎｍフィルターを使用してモニターした。激しく連続的な振盪を行いながら、平板を３０℃でインキュベーションした。全測定期間は１２０時間であった。各ウエルを１時間毎に測定した。クロマトグラフィー処理後に得られた画分を溶出緩衝液２（下記参照）に対して透析し、様々な割合（１：10、１：100、１：500、１：1000、１：5,000、１：10,000）で蘇生培地で稀釈して、０．２２μｍのGelmanフィルターでろ過した後に試験を行った。発表されている表に基づいてＭＰＮを計算した。
総細胞数
染色されない細胞を、位相差顕微鏡および改善されたNeubauer計数チャンバーを用いて計数した。マイコバクテリアを用いた長期間の実験において、微生物をZiel-Neelsen試薬で染色した後に計数した。
クロマトグラフィー
予め湿潤化したＤＥＡＥセルロースを培養上清に加え（１：１０ｖ／ｖ）、ゆっくり攪拌しながら４℃で１時間インキュベーションした。このＤＥＡＥセルロースをカラムに詰め、１０ｍＭ  ＫＣｌとともに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる緩衝液１（ｐＨ７．４）の５容量で洗浄した。カラムを０．３Ｍ  ＫＣｌ／緩衝液１の２〜３ベッド容量で段階的に溶出した。得られた画分を氷上で緩衝液１でゆっくり稀釈して、ＫＣｌの最終濃度を０．０８Ｍにした。次いで、４０カラム容量のこの画分をＤＥＡＥ−セファロース−ファースト−フローカラム（０．０８Ｍ  ＫＣｌを含有する緩衝液１で予め平衡化した１部のセファロース）に負荷した。カラムを、０．０８Ｍ  ＫＣｌを含有する緩衝液１の５ベッド容量で洗浄し、０．２５Ｍ  ＫＣｌ／緩衝液１の３容量で段階的に溶出した。得られた画分を氷上で緩衝液１で再びゆっくり稀釈してＫＣｌの最終濃度を０．０８Ｍにし、０．２２μｍのＧｅｌｍａｎフィルターでろ過して、０．０８Ｍ  ＫＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０％グリセロールからなる緩衝液２（ｐＨ７．４）で平衡化したＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５型、充填済み、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。ＭｏｎｏＱカラムを、緩衝液２において、０．０８Ｍ〜０．２８ＭのＫＣｌの直線勾配により溶出した（溶出総量は２０ｍｌであった）。流速および分画サイズは、それぞれ、１ｍｌ／ｍｌおよび１ｍｌ／チューブであった。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー工程以外のすべての操作を４℃で行った。得られた画分を、１０％グリセロールを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌに対して透析して（透析は活性の保持には重要である）、活性が喪失することなく、５日までの間、４℃で保存した。冷凍庫で長期間保存するために、画分を同じように透析して、グリセロールを２０〜３０％ｗ／ｖの最終濃度に加えた。精製した調製物におけるタンパク質含有量を、基準品としてリゾチームを使用してトリプトファンの蛍光によって推定した。
トリプシン処理
トリプシンを、透析したＭｏｎｏＱカラムの活性画分に加え、０．５％ｗ／ｖ乳酸塩および０．０５％酵母抽出物が補充されたＬＭＭで稀釈した（１：１００）（トリプシンの最終濃度は５０μｇ／ｍｌであった）。混合物を、３０分間、３７℃でインキュベーションした。反応を、トリプシン阻害剤（１００μｇ／ｍｌ）を加えることによって停止させた。コントロール実験では、トリプシン阻害剤を混合物に添加（１００μｇ／ｍｌ）した後にインキュベーションした。
ＰＡＧＥ電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をLaemmliに従って行った。クロマトグラフィー画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して４〜５時間透析し、回転真空装置で乾燥し（１．５時間）、サンプル緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−３４０１）に溶解し、１５％アクリルアミドゲルに負荷し、２００Ｖの定電圧で泳動した。ゲルをコロイド状クーマシーＧ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
化学薬品
Nutrient Broth E、酵母抽出物および寒天をＬａｂ  Ｍから入手したが、Ｌ−乳酸塩（リチウム塩）、コハク酸塩、トリプシン、ダイズトリプシン阻害剤およびＤＥＡＥ−セファロース−ファースト−フローをＳｉｇｍａから入手した。ＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２をＷｈａｔｍａｎから入手した。ＭｏｎｏＳおよびＭｏｎｏＱはＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。他の化学薬品は分析グレードであり、ＳｉｇｍａまたはＢＤＨから入手した。
ＤＮＡ操作
精製したＲＰ因子から得られたＮ末端に由来するタンパク質の部分配列決定結果（ＡＴＶＤＴＷＤＲＬＡＥｅｘＳＮＧＴｘＤ）および内部ペプチドの配列（ＶＧＧＥＧＹＰＨＱＡＳＫ）を使用して、２つのオリゴヌクレオチド（Ａ１、Ａ２）を設計した：Ａ１［ＧＣＳＡＣＳＧＴＳＧＡＣＡＣＳＴＧＧＧＡＣＣＧＳＣＴＳＧＣＳＧＡＧ］およびＡ２［ＧＣＹＴＧＲＴＧＩＧＧＲＴＡＩＣＣＹＴＣＩＣＣ］。Ｔａｑポリメラーゼを標準的な条件下で用いて、M.luteusのＤＮＡからこれらのプライマーにより１４７ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。この２つのプライマーを用いてM.luteusのＤＮＡから得られたＰＣＲ産物をジゴキシゲニンで標識して、サザンハイブリダイゼーション実験用のプローブとして使用した。ＳｍａＩで消化したゲノムＤＮＡをアガロース電気泳動によるサイズ分画を行って、約１．４ｋｂｐのフラグメントをｐＭＴＬ２０にクローニングし、E.coli DH５α株で組み立てた。所望の挿入物を有する２つの組換えプラスミドをハイブリダイゼーションによって検出し、オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２を使用するＰＣＲにより確認した。その内の１つを、ジデオキシ鎖停止法を使用して両方の鎖について手作業で配列決定を行った。
標準的な手順を用いて、ＤＮＡをM.luteusおよびM.smegmatisから単離した。Streptomyces rimosusのＤＮＡは、D.Hranueli博士から寄贈された。S.smegmatisおよびS.rimosusのＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションを、最初に、非ストリンジェントな条件（０．５ＳＳＣ、３７℃）のもとで行った。続いて、ストリンジェントな条件（０．１ＳＳＣ、６５℃）を用いて、Streptomyces coelicolor A3（2）のＤＮＡの整列化コスミドライブラリーをスクリーニングした。
ＲＰ因子の精製
材料および方法に記載されているプロトコルに従って、乳酸最少培地で増殖させた細胞の培養上清から精製されたＲＰ因子は、M.luteusの休眠細胞の蘇生および生細胞の増殖の両方を阻害する著量のポリマー状物質が、使用したすべてのタイプのカラムから溶出されることを明らかにした。さらに、高濃度のこの物質は、細胞の溶解さえ引き起こし得る（示さず）。この阻害物質は、乳酸由来のポリマーであるようである。なぜなら、細胞の非存在下で室温で１０時間保存された乳酸含有ＬＭＭを同じ精製手順に供すると、このスペント培地の阻害特性に類似する阻害特性が明らかにされたからである。この問題を回避するために、本発明者らは、増殖培地中の乳酸塩をコハク酸塩に置き換えたが、良好な増殖を得るためには、透析して高分子物質を除いた酵母抽出物の少量（０．０１％ｗ／ｖ）を加えることが必要であることを見出した。
コハク酸塩の増殖培地を使用して、活性画分を、アニオン交換媒体（材料および方法を参照のこと）の組合せによって精製した。最終活性は、ＭｏｎｏＱカラムにおいて、直線的なＫＣｌ勾配の約１８０ｍＭ  ＫＣｌ（０．０８Ｍ〜０．２８Ｍ  ＫＣｌ）で、３つの隣接する画分に溶出された（図３）。いくつかの画分は、透析前では不活性であるので、画分の活性を調べる前に画分を透析することは重要であることが明らかになったことに言及することは価値のあることである。活性な画分は、４００倍（v/v）までの稀釈を行った後においてその蘇生活性は変化しなかった。
興味深いことに、蘇生を引き起こすことにおいて活性である画分はまた、生細胞の増殖速度を増大させることができる。
最終精製工程から得られる蘇生促進物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。最終産物（図３Ｃ）は、約１６ｋＤと推定される分子量を有する単一のタンパク質からなることが明らかになった。すべての活性な画分は、画分Ｎ９において含有量が最大のタンパク質の単一バンドからなる。
ＲＰ因子遺伝子のクローニング
２つのプライマーを、精製したＲＰ因子のＮ末端および内部ペプチドについて得られたタンパク質部分配列決定の結果から設計した。このプライマーを使用して、M.luteusのＤＮＡから１４７ｂｐのフラグメントを増幅した。このフラグメントをクローニングして、配列決定を行った。次いで、完全な遺伝子を、オリゴヌクレオチドＧ１およびＧ２を使用するインバースＰＣＲと１．４ｋｂｐのＳｍａＩゲノム制限フラグメントの単離との組合せにより得た。配列決定により、最初のＰＣＲ産物は、シグナル配列（図２Ａ）を有するタンパク質をコードし得る遺伝子の一部であることが明らかにされた。分泌型の遺伝子産物の推定されるサイズは１９，１４８Ｄａであり、その推定されるＮ末端アミノ酸配列は、プライマー設計において使用されなかった残基（図２Ａ）を含むタンパク質の部分配列の結果と一致する。推定される遺伝子産物が、培養上清から精製されたＲＰ因子よりも大きいという事実は、この遺伝子産物は、例えば、同系のレセプター／変換酵素と接触したときにその生物学的に活性な形態に変換される前駆体として分泌され得るということを示唆する。
ＲＰ因子ホモログの同定
ＢＬＡＳＴ検索を、参照配列としてM.luteusのＯＲＦの推定アミノ酸配列を使用して行った。実質的な類似性を有する７つの遺伝子は、以前に配列決定されていた。５つの配列がM.tuberculosisで見出され、２つの配列がMycobacterium lepraeで見出された（図１Ａ）。それぞれの生物において１つまたは複数の遺伝子産物が、分泌シグナル配列（図１Ａにおいて下線を付す）を有するようである。これらのマイコバクテリア属の推定される産物の機能は不明である；それらはゲノム配列決定プロジェクトにより見出されていた。ＢＬＡＳＴ検索はまた、ＲＰ因子の残基１２６〜２２０と、Listeria spp.の３Ｔ６マウス繊維芽細胞への接着に関与している（主要な細胞外）ｐ６０タンパク質の保存セグメントとの間の類似性を明らかにした（図１Ｅ）。このことは、おそらく、M.luteusの接着におけるＲＰ因子またはそのタンパク質分解産物の役割が考えられることを示唆する。
M.tuberculosisおよびM.lepraeと同様に、M.luteusは、ＲＰ因子をコードする遺伝子に類似する別の遺伝子を含有する。様々な異なる制限酵素で切断したＤＮＡサンプルと、プローブとして、クローニングされた１４７ｂｐフラグメントとを使用するサザンハイブリダイゼーション実験により、２つのハイブリダイゼーションバンドが明らかにされる。強い方のハイブリダイゼーションシグナルは、分泌型ＲＰ因子をコードする遺伝子から生じている。もう一方の遺伝子は、上記で同定された別のマイコバクテリア遺伝子の１つに対応し得る。
プローブとして１４７ｂｐフラグメンを使用するサザンハイブリダイゼーション実験、ならびにプライマーとして高度に保存されたアミノ酸モチーフに基づく２つのオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ実験により、ＲＰ因子に類似するタンパク質をコードする遺伝子は、少なくとも、Ｇ＋Ｃ含有量が高いＤＮＡを有するグラム陽性細菌の全体に広く存在していることが示される。類似した遺伝子が、Streptomyces rimosus（図５Ｃ）を含む本発明者らが調べたStreptomycesの６つの種のすべて、ならびにMycobacterium smegmatis（４つの類似する遺伝子、図５Ｃ）、Mycobacterium bovis（BCG）およびCorynebacterium glutamicum（２つの類似する遺伝子）を含む他のマイコバクテリアにおいて、これらの方法の一方または両方によって検出されている。
ドメイン構造
配列情報により、ＲＰ因子遺伝子およびマイコバクテリアのそのすべてのホモログは、分泌シグナル配列および特に高度に保存された約７０アミノ酸のセグメントを有することが明らかにされる。その１つ（ＭＴｕｂＺ９４７５２）はまた、膜アンカーモチーフを有する。保存された７０残基のセグメントは、シグナル伝達ドメインの候補である。このセグメントの大部分は、弱い親水性（Kyte-Doolittle）であり、両親媒性のα−ヘリカル領域（Garnier-Robson;Chou-Fasman）またはβ−シート領域（Eisenberg）を形成することが予想される。全体的に、このセグメントは低い表面確率を有する（Emini）。対照的に、Ｃ末端部は、あまり大きく保存されておらず、局在性または特異性を決定するためのより良好な候補と見なすことができる（すなわち、細胞区画標的化ドメインまたは特異性決定ドメインであり得る）。他のタンパク質のシグナル伝達系（例えば、動物における多くのプロホルモンおよび植物におけるシステミン）との類推により、最も近いシグナル伝達分子はタンパク質分解的に切断された産物であると考えることができる。
このセグメント内における２つの酸性残基のＤ７およびＥ１３（M.luteusの分泌型タンパク質に従った番号付けによる）は、絶対的に保存されている。ＫＡＥＱＩＫＲＡＥセグメント（残基５１〜５９）は、表面確率が特に高い孤立した部分を表す。これらのエレメントは、ＲＰ因子タンパク質における機能的ドメインの一部を形成し得る。
保存されたドメインは、４個の保存されたトリプトファン残基（その１個は表面確率が高い領域ＤＴＷＤＲ（残基４〜８）の内部に存在する）を含有する。ヒト成長ホルモンとその最初に結合するレセプターとの複合体において、レセプターの表面に位置する２つのトリプトファン残基が関与する相互作用は、複合体結合自由エネルギーの７５％以上を占める（ClacksonおよびWelle、Science 267、383〜386、1995）。２個の保存されたシステイン残基は、ジスルフィド架橋を形成し得る。
様々なタンパク質のドメイン構造を示す配列比較を、図９Ａおよび図９Ｂに示す。
ＲＰ因子活性
休眠細胞を蘇生させるのと同様に、M.luteusから精製されたＲＰ因子をM.luteusおよびいくつかの他の生物に対する増殖刺激活性について試験した。このＲＰ因子は、M.luteusおよびM.smegmatisの増殖を強く刺激し、M.tuberculosis、M.bovis（BCG）およびM.aviumに対して、より弱い活性を有するようである（図６を参照のこと）。すべての場合において、回分培養における見かけ上の遅滞期は短くなった（図３Ｄ、図４Ｂ、図６Ｂおよび表１を参照のこと）。この因子は、不十分な培地および酵母抽出物を補充した不十分な培地で活性であり、煮沸またはトリプシン処理の後で活性を喪失する。
約４０ｐＭｏｌ／ＬのＲＰ因子をMycobacterium smegmatis洗浄細胞に加えた場合、増殖は２０〜２４時間の後に始まったが、ＲＰ因子を有さないコントロールは６日後でも増殖しなかった。増殖が遅いバクテリアを用いた実験において、類似した結果が得られた。M.bovis（BCG）もまた、４０ｐＭｏｌ／ＬのＲＰ因子によって強く刺激された；増殖は１４日後に始まったが、ＲＰ因子を有さないコントロールは９０日後でも増殖しなかった。最後に、ＲＰ因子はまた、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium aviumおよびMycobacterium kansasiiの増殖を刺激した（表１を参照のこと）。
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Ｍ．ｌｕｔｅｕｓの第２のホモログをコードする遺伝子の単離および特徴づけ
プライマーとしてオリゴＧ１およびＧ２（図２Ａを参照のこと）を使用するインバースＰＣＲと、適切なサイズ分画を行ったゲノム制限フラグメントのクロニーニングとを組み合わせて用いることによって、M.luteusから第２のホモログをコードする遺伝子を単離することができる。次いで、この遺伝子の配列を決定し、ゲノムクローンの分析、および複数の独立したＰＣＲ反応の生成物を組み合わせることによって得られたＰＣＲフラグメントの直接的な配列決定によって何らかの考えられるＰＣＲの誤りを注意して除く。次いで、M.luteus、M.lepraeおよびM.tuberculosisのタンパク質を比較する配列分析を行って、生物学的機能に重要であり得る残基、配列モチーフおよび構造モチーフに関する推定の精度を高めることができる。
M.luteusおよびM.tuberculosisの遺伝子産物のE.coliにおける過剰発現および精製
M.luteusおよびM.tuberculosisの分泌型ＲＰ因子をコードする配列を増幅して、正しい読み枠で市販のプラスミド（ｐＥＴベクターまたはｐＣＡＬベクター）に挿入することができるように適切な制限部位を取り込むＰＣＲプライマーを設計することができる。最初に、ＰＣＲ増幅したフラグメントをpBluescriptKSIIベクター（Stratagene）にクローニングすることができ、その結果、考えられるＰＣＲの誤りを除くために、その全体の配列を確認することができる。（この物質はまた、部位特異的変異誘発のために用いることができる−下記参照。）次いで、ｐＥＴまたはｐＣＡＬでの構築物を用いて、本質的に均一にまで一段階で精製することができるヒスチジン標識タンパク質またはカルモジュリン結合ペプチド標識タンパク質の制御された大量発現を得ることができる。最後に、タンパク質精製で使用した標識を（エンテロキナーゼまたはトロンビンを適するように使用して）除くことができる。
Micrococcus luteusのＲＰ因子のE.coliにおける発現
２つのプライマー［５′−ＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧ−３′］および［５′−ＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧ−３′］を用いて、ゲノムＤＮＡのクローニングした１．４ｋｂｐのＳｍａＩフラグメントからＲＰ因子のコード配列（すなわち、シグナル配列を有さない配列）を増幅した（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の５サイクル、その後、９４℃で３０秒、７２℃で６０秒の１５サイクル）。それを、最初に、E.coli DH５αにおいて、５６７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＭＴＬ２０内で組み立て、次いで、５６２ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、ｐＥＴ１９ｂ（Novagen）に挿入して、E.coli DH５αにおいて再び組み立てた。ｐＲＰＦ１と名付けたこのプラスミドにおけるＰＣＲ産物およびベクター−挿入物接合部の配列を確認した。このベクターをE.coli HSM174（DE3）に形質転換した後、ＲＰ因子をＲＰＦ１から発現させた。Ｎ末端にＨｉｓ10標識を含有するタンパク質を、細菌をＯＤ600nm＝０．６まで増殖させて、０．４ｍＭのＩＰＴＧで４時間の誘導を行った後、５ｍＭのＤＴＴおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有する改変結合緩衝液（ＭＢＢ、５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．９）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／８Ｍ尿素）中で超音波処理することによって単離した。低速度の遠心分離の後、ＥＤＴＡおよびＤＴＴを含む低分子量化合物を、ＭＢＢで予め平衡化したセファデックスＧ１０カラムに通して除いた。Ｎｉ2+キレートカラム（セファロース６Ｂに固定化されたＮｉ2+配位のイミノ二酢酸）にＧ１０溶出液を負荷し、２０容量のＭＢＢで洗浄し、次いで０．０１Ｍイミダゾール、０．０５Ｍイミダゾール、０．２Ｍイミダゾールおよび１Ｍイミダゾールをそれぞれ含有する４つのＭＢＢの１０容量で順次溶出した。最後に、カラムを脱離緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）／１００ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。モノクローナル抗（ポリＨｉｓ）抗体（Ｓｉｇｍａ、クローンＨｉｓ−１）を用いて、標準的な方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供され、電気ブロッッティングされる画分の免疫ブロット分析を行った。画分を緩衝液２に対して透析して、上記のように生物学的活性についてアッセイした。
組換えＲＰ因子の分析
残基Ａ39で始まる分泌型のＲＰ因子に対応するコード配列をｐＥＴ１９ｂに挿入して、プラスミドｐＲＰＦ１を作製した（下記参照）。ｐＲＰＦ１を含有するＩＰＴＧ誘導したE.coli HSM174（DE3）株の抽出物を、ポリＨｉｓ抗体と反応させた。強いシグナルが、１Ｍイミダゾールによりアフィニティーカラムから溶出されたタンパク質（見かけ上の大きさは２９ｋＤａであったが、推定される大きさは２２ｋＤａである）に結合していた（図７Ａ）。HSM174（DE3）から得られたＨｉｓ標識タンパク質は、M.luteus生細胞の見かけ上の遅滞期を減少させたが、コントロール（プラスミドベクターのみを含有する細胞から得られた抽出物を負荷したときに同じ条件で同じカラムから溶出された物質）は活性を示さなかった（図７Ｂ）。ｐＲＰＦを含有するE.coliで産生された組換えタンパク質に生物学的活性が伴うこと、およびｐＥＴ１９ｂを含有する遺伝子的に同じコントロールにおいて活性がないことは、活性な分子は確かにｒｐｆ遺伝子の産物であることを明確に実証する。
抗体調製
組換えＲＰ因子（上記のようにして調製された組換えタンパク質）を使用して、ウサギを１週間の間隔で３回免疫化した。タンパク質を、不完全フロイントアジュバントにおいて１回の注射あたり３００μｇのタンパク質で投与した（０．５ｍｌタンパク質および０．５ｍｌアジュバント）。血液を、投与を開始する前と、最後の注射を行った１１日後に採取した。免疫グロブリン画分を、ＰＥＧを使用する標準的な手順によって得た。抗体を、標準的な（Pharmacia）プロトコルに従ってプロテインＧ−セファロースカラムでさらに精製した。最終的なタンパク質濃度を分光光度計的に１ｍｇ／ｍｌに調節した。
あるいは、モノクローナル抗体を、確立された技術を使用して作製することができる。
細菌増殖を阻害するための抗ＲＰ因子抗体の使用
Micrococcus luteusを５×１０5／ｍｌの初期密度で乳酸最少培地（ＬＭＭ）に接種し、ＯＤ600nmを一定間隔でモニターした。培養物の増殖を１４０時間にわたりモニターした。抗ＲＰ因子血清（上記の「抗体調製」で記載されているようにして調製）の存在により、細菌増殖は完全に阻害された（図８を参照のこと）。
E.coliにおけるM.tuberculosisのＲＰ因子の発現
２つのプライマー［５′−ＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＣ−３′］および［５′−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＡＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＣ−３′］を用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲｖのゲノムＤＮＡからＲＰ因子のコード配列（すなわち、シグナル配列を有さない配列）を増幅した（９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の５サイクル、その後、９４℃で３０秒、７２℃で６０秒の１５サイクル）。ＰＣＲ産物を、最初に、E.coli DH５αにおいて、３３６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＭＴＬ２０で組み立て、次いで、３３１ｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、ｐＥＴ１９ｂ（Novagen）に挿入して、E.coli DH５αにおいて再び組み立てた。ｐＲＰＦ２と名付けたこのプラスミドにおけるＰＣＲ産物およびベクター−挿入物接合部の配列を確認した。このベクターをE.coli HSM174（DE3）に形質転換した後、M.tuberculosisのＲＰ因子をＲＰＦ２から発現させた。Ｎ末端にＨｉｓ10標識を含有するタンパク質を、細菌をＯＤ600nm＝０．９まで増殖させて、０．４ｍＭのＩＰＴＧで４時間の誘導を行った後、結合緩衝液（ＢＢ、５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．９）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／８Ｍ尿素）中で超音波処理することによって単離した。低速度の遠心分離の後、Ｎｉ2+キレートカラム（セファロース６Ｂに固定化されたＮｉ2+配位のイミノ二酢酸）に上清を負荷し、２０容量のＢＢおよび１００ｍＭイミダゾールを含有する２０容量のＢＢで洗浄し、次いで０．５Ｍイミダゾールを含有する１０容量のＢＢで溶出した。さらなる精製をＭｏｎｏＱカラムによるクロマトグラフィーによって行った（下記参照、ただし、塩による勾配溶出を０．１Ｍ〜１Ｍ  ＮａＣｌで行った）。モノクローナル抗（ポリＨｉｓ）抗体（Ｓｉｇｍａ、クローンＨｉｓ−１）を用いて、標準的な方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供され、電気ブロッッティングされる画分の免疫ブロット分析を行った。画分を緩衝液２に対して透析し、そして上記のように生物学的活性についてアッセイした。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの組換えＲＰ因子の分析
残基Ｄ50で始まるM.tuberculosisの分泌型ＲＰ因子（ｇ１６５５６７１；アクセス番号Ｚ８１３６８）に対応するコード配列ををｐＥＴ１９ｂに挿入して、プラスミドｐＲＰＦ２を作製した（下記参照）。ｐＲＰＦ２を含有するＩＰＴＧ誘導したE.coli HSM174（DE3）株の抽出物を、ポリＨｉｓ抗体と反応させた。強いシグナルが、０．５Ｍイミダゾールによりアフィニティーカラムから溶出されたタンパク質に結合していた。HSM174（DE3）から得られたＨｉｓ標識タンパク質は、図１０に示すように、M.tuberculosis H37Rvの増殖をわずかではあるが、有意に増強した。このタンパク質はまた、ＬＭＭにおいてM.luteus増殖を刺激した。コントロール培養物は、最終的には１．０のＯＤ600nmに達したが、ＲＰ因子（１：10,000の稀釈物）を含有する培養物は、最終的には２．０〜６．０の間のＯＤ600nmに達した。
マクロファージから単離されたMycobacterium tuberculosisの増殖に対するM.luteusのＲＰ因子の効果
３つの独立した実験において、ネズミの腹腔マクロファージ培養物から単離された休眠／潜伏しているM.tuberculosis細胞を、M.luteusのＲＰ因子による蘇生を行った。ネズミのマクロファージから得られた不均一な懸濁物におけるM.tuberculosis細胞の総数を顕微鏡により測定した。生細胞数を、１０％（v/v）の補充物（１リットルについて、５０ｇのウシ血清アルブミン、２０ｇのグルコース、８．５ｇのＮａＣｌを含有する）を含有する寒天固化ソートン培地に置床することによって、あるいは１０％（v/v）の補充物（上記参照）を含有する液体ソートン培地を使用するＭＰＮ法によって測定した。
これらの細胞懸濁物の生細胞数（ＭＰＮ）は、（１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた）（表２参照）M.luteusのＲＰ因子の存在により２５倍〜２，５００倍高まった。表に示すすべての値は、１ｍｌあたりの細菌数である。
腹腔マクロファージを、白色マウス（野生株）から標準的なプロトコルによって得た。M.tuberculosis「Academiya」（実験室株）によるマクロファージの感染を１０6細胞（総数）／マウスの腹腔内注射によってインビボで行い、その後、６日間のインキュベーション（第１継代）を行った。第２および第３の継代を得るために、単層状態のマクロファージ細胞を、それ以前の継代物から得られるマクロファージから単離したM.tuberculosis細胞を使用して感染させた。
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マクロファージを、プラスチック製ペトリ皿での単層（１０6細胞／５ｃｍ2）として、ゲンタマイシンおよびペニシリン（それぞれ、１０μｇ／ｍｌ）を含有する標準的なＲＰＭＩ培地で、標準的な条件（３７℃のインキュベーターでのＣＯ2／Ｏ2混合）のもとで増殖させた。M.tuberculosis細胞を、細いシリンジ針に繰り返し通すことによってマクロファージから回収した。マクロファージの細胞破片を低速度の遠心分離により除き、次いで、より高速度の遠心分離によってM.tuberculosis細胞を回収した。
Bacillus subtilis増殖に対するｙａｂＥおよびｙｏｃＨのノックアウト変異の効果
ｙａｂＥの全コード配列を、隣接する領域とともに、B.subtilisのゲノムＤＮＡから、プライマーＤ１１［５′−ＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡ−３′］およびＤ１２［５′−ＣＣＡＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＡＴＣＡＣ−３′］を使用して、１８０３ｂｐの産物として増幅した。コード配列の３末端部を含む１１８６ｂｐのＨｉｎｄIII−ＢｃｌＩフラグメントをＰＣＲ産物から切り出し、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＴＬ２０と連結し、これを使用してE.coli DH５α株の形質転換を行い、アンピシリン耐性について選択した。プラスミドｐＹＡＢＥを形質転換体の１つから単離した。ｙａｂＥのコード配列内からの完全な７６３ｂｐのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＹＡＢＥから切り出し、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＵＴＩＮ４（B.subtilisでのノックアウト変異を作製するために用いることができる組み込み型プラスミド：Edwards&Errington、1997、Molecular Microbiology、24、905〜915）と連結し、これを使用してE.coli XL1-Blue株の形質転換を行い、アンピシリン耐性について選択を行した。ｙａｂＥのコード配列の内部セグメントを含有するプラスミドｐＹＡＢ２を、形質転換体の１つから単離した。ｙａｂＥのコード配列の３末端部を含む１２０７ｂｐのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＭＵＴＩＮ４と連結し、これを使用してE.coli XL1-Blue株の形質転換を行い、アンピシリン耐性について選択した。ｙａｂＥのコード配列の３末端部を含有するプラスミドｐＹＡＢ３を、形質転換体の１つから単離した。
ｙｏｃＨの全コード配列を、隣接する領域とともに、B.subtilisのゲノムＤＮＡから、プライマーＤ１０［５′−ＧＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧ−３′］およびＤ９［５′−ＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＡ−３′］を使用して、１１４５ｂｐの産物として増幅した。ｙｏｃＨのコード配列内からの完全な３５８ｂｐのＨｐａＩフラグメントをＰＣＲ産物から切り出し、ＳｍａＩで消化したｐＭＴＬ２０と連結し、これを使用してE.coli XL1-Blue株の形質転換を行い、アンピシリン耐性について選択した。ｙｏｃＨのコード配列の内部セグメントを含有するプラスミドｐＹＯＣ２ａを、形質転換体の１つから単離した。次いでこのプラスミドの挿入物をｐＹＯＣ２ａから３８５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして切り出し、ｐＭＵＴＩＮ４に挿入してｐＹＯＣ２を作製した。ｙｏｃＨのコード配列の３末端部を含む３０７ｂｐのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントを１１４５ｂｐのＰＣＲ産物から切り出し、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＵＴＩＮ４と連結し、これを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株の形質転換を行い、アンピシリン耐性について選択した。ｙｏｃＨのコード配列の３末端部を含むＤＮＡセグメントを含有するプラスミドｐＹＯＣ３を、形質転換体の１つから単離した。
ｐＹＡＢ２、ｐＹＡＢ３、ｐＹＯＣ２およびｐＹＯＣ３のプラスミドを、ｐＭＵＴＩＮ４ベクター配列を１カ所で切断するＡｐａＩで線状化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、これを用いてBacillus subtilis SA253 nonA nonB leuA8 arg-15株の形質転換を行い、富化栄養培地（ＬＢ＋１μｇ  Ｅｍ／ｍｌ）でのエリスロマイシン耐性について選択した。次いで、ＥｍR形質転換体を拾いサザンハイブリダイゼーションによって確認した。プローブとして組み込み型プラスミドを使用し、そして染色体ＤＮＡをＡｐａＩで消化することによって、１コピーの組み込み型プラスミドを有する形質転換株は２つのハイブリダイゼーションバンドを与えたが、野生株（および存在する何らかの自発的なＥｍR変異体）は１つのハイブリダイゼーションバンドを与えた。
４つのプラスミドのそれぞれを用いた形質転換産物の分析により、ｙａｂＥおよびｙｏｃＨの遺伝子産物は、B.subtilisにおける（少なくとも特定の条件下での）増殖に必要であることが示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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