(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記塩基配列は、植物の小穂非脱落性に関与する遺伝子またはＱＴＬと連鎖しており、
上記植物とは、イネ科植物であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
上記遺伝マーカーは、オオムギ由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝マーカー。
【請求項４】
上記遺伝マーカーは、オオムギ３ＨＳ染色体における遺伝マーカーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
上記遺伝マーカーは、ＡＦＬＰマーカーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを少なくとも含み、オオムギ染色体の連鎖地図の作成に用いられることを特徴とする遺伝マーカー群。
【請求項７】
さらに、制限酵素断片長多型マーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＴＳマーカーおよびマイクロサテライトマーカーから選択される少なくとも１つのマーカーを含むことを特徴とする請求項６に記載の遺伝マーカー群。
【請求項８】
請求項６または７に記載の遺伝マーカー群を用いて作成されることを特徴とするオオムギ染色体の連鎖地図。
【請求項９】
少なくとも、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を用いて、植物染色体から小穂非脱落性に関与する遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴とする小穂非脱落性遺伝子の単離方法。
【請求項１０】
上記遺伝マーカーをプライマーまたはプローブとして用いることを特徴とする請求項９に記載の小穂非脱落性遺伝子の単離方法。
【請求項１１】
上記遺伝子の座乗位置を特定する工程は、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子についてのＱＴＬ解析を行う工程を含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の小穂非脱落性遺伝子の単離方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を用いて、小穂非脱落性の植物個体を選別する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝マーカー、特に、オオムギ３ＨＳ染色体における新規遺伝マーカー、およびその利用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年代後半から、植物において遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）とそれらを利用した連鎖地図（染色体地図）作成が急速に行われてきた。このＤＮＡマーカーの検出技術の発展は、形態的形質に関与する標識遺伝子を遺伝マーカーとして用いてきた従来の連鎖解析を飛躍的に進展させた。例えば、イネでは、病虫害抵抗性等に代表される単一遺伝子が関与している形質の連鎖解析が効率化されたばかりでなく、従来の方法では解析が困難とされてきた複数の遺伝子が関与する形質（量的形質）についても、ＤＮＡマーカーによる関与遺伝子座の解析が可能となった。
【０００３】
ここで、「量的形質」について簡単に説明する。単一主働遺伝子支配の形質に対して、出穂期や稈長に代表される多くの農業上重要な形質は、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は一般に複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多く、総称して量的形質と呼ばれている。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質に含まれる。
【０００４】
係る量的形質に関与する個々の遺伝子座は量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Loci：ＱＴＬ）と呼ばれ、ＤＮＡマーカーの利用以前は、連鎖がみられる遺伝様式が明瞭な形態や生化学的な形質を司る遺伝子をマーカーとし、これらのマーカーとの連鎖分析によって試みられてきた。しかしながら、形態的なマーカーは多面発現といったそれ自体が目的の形質に影響する場合が多く、さらに染色体全体に分散する形態的なマーカーを用いることは事実上不可能であった。
【０００５】
そのため、新しい遺伝的なマーカーを利用した方法が開発された。核ＤＮＡを制限酵素により切断すると、個体または系統によりＤＮＡ断片の長さが異なることがある。これをＤＮＡ多型と呼ぶ。ＤＮＡ多型は、通常の形態形質を司る遺伝子と同じくメンデル遺伝をすることから、これらを遺伝的なマーカーとして利用し、相互の遺伝的連鎖の程度を推定して距離の指標とすれば、マーカー相互の染色体上の位置を示す連鎖地図が作成できる。このマーカーをRFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）マーカーと呼ぶ。１９８０年代になってRFLPマーカーに代表されるＤＮＡマーカーが開発され、量的形質遺伝子座のマッピングも現実的なものとなった。
【０００６】
上記RFLPマーカーのようなＤＮＡマーカーによる詳細な連鎖地図を利用することにより、量的形質を支配する遺伝子座（ＱＴＬ）の連鎖分析も可能となった。また、単に、連鎖群上のＤＮＡマーカーの数が増えても、該当するＤＮＡマーカーがないと連鎖地図上にギャップができる。しかし、ギャップはＤＮＡマーカーの種類を変えることにより埋まる可能性があり、ＲＦＬＰマーカーによって作成された連鎖地図上のギャップを、マイクロサテライトマーカーなどを使って補う試みも行われている。現在、図１に示すように、ＤＮＡマーカーとしては種々のマーカーが開発され利用されている。
【０００７】
さらに上記ＱＴＬ解析は、これまで解析が困難とされた環境による影響を受け易い耐病性や、培養特性などの遺伝性に関する研究にも利用されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００８】
ところで、オオムギ、コムギ、イネ等の植物では、野生種から栽培種への進化の過程において、諸形質が変化している。なかでも、野生種は成熟すると種子が自然に脱落する（小穂脱落性）が、栽培種は成熟しても人間が収穫して脱穀するまで種子が脱落しない性質（小穂非脱落性）を獲得している。
【０００９】
この小穂非脱落性は、オオムギ等の植物における野生種から栽培種への進化の過程において最も大きく、かつ重要な変化の一つである。このため、この遺伝的性質を調べ、遺伝情報の中に刻み込まれた進化の過程をひもとくべく、多くの研究者がその遺伝子分析を行っている。
【００１０】
その結果、オオムギの小穂脱落性は、２つの優性補足遺伝子：Btr1およびBtr2によって支配され、その１つが劣性遺伝子（btr1、btr2）である場合は、小穂非脱落性を獲得することがわかった。さらに、これらの遺伝子は、互いに密接に連鎖しているため、小穂非脱落性の栽培種は、btr1  Btr2か、またはBtr1  btr2の遺伝子型であり、両劣性の遺伝子型（btr1  btr2）を有する品種はきわめて稀であることがわかった。また、小穂非脱落性には、地理的分布が存在し、東洋にはBtr1  btr2の遺伝子型（Ｅ型）、西洋にはbtr1  Btr2の遺伝子型（Ｗ型）が多く見られることがわかっている（非特許文献３参照）。また、btr1、btr2の劣性遺伝子がオオムギの３ＨＳ染色体に位置することがわかっている（非特許文献４参照）。しかし、小穂非脱落性は量的形質であるため、その解析は困難を極め、小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2は、いまだ単離・同定されていない。その一方、ＱＴＬ解析等を利用した最近の研究成果によって、btr1の比較的近傍に位置するAFLP（amplified fragment length polymorphism）マーカーがいくつか開発されている（非特許文献５参照）。
【００１１】
【非特許文献１】
Mano, Y., Takahashi, H., Sato, K and Takeda, K.共著、「Mapping Genes for Callus Growth and Shoot Regeneration in Barley (Hordeum vulgare L.) 」、Breeding Science、46: 137〜142、1996
【００１２】
【非特許文献２】
Graner, A., Streng, S., Kellermann, A., Schiemann, A., Bauer, E., Waugh, R., pellio, B., Ordon, F共著、「Molecular mapping and genetic fine-structure of the rym5 locus encoding resistance To different strains of the Barley Yellow Mosaic Virus Complex.」、Theor Appl Genet 98:285-290、1999
【００１３】
【非特許文献３】
小西  猛朗著、「オオムギの遺伝的分化と地理的分布」、遺伝、1987年、5月号、（41巻、5号）、p6-10
【００１４】
【非特許文献４】
TAKAHASHI, R et al.、「Linkage study of two complementary genes for brittle rachis in barely.」、Ber. Ohara lnst. Landw. Biol., Okayama Univ. 12: 99-105.
【００１５】
【非特許文献５】
KOMATUDA, T., and Y. MANO, 共著、「Molecular mapping of the intermedium spike-c (int-c) and non-brittle rachis 1 (btr1) loci in barley (Hordeum vulgare L.).」、Theor Appl Genet 105: 85-90
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、ＱＴＬ解析が有効であるための前提条件には、順序の正確な遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）による連鎖地図が作成されていることである。一般に、マーカー間の密度が高いほど新しくマップされるＱＴＬの位置の精度が高くなり、また、インターバルマッピングによるＱＴＬマップの推定精度は、マーカー間の組換え価が小さいほど推定精度が高い傾向にある。さらに高密度な連鎖地図が利用されれば、ＱＴＬ、すなわち遺伝子の単離・同定も可能になる。
【００１７】
しかしながら、上述のような従来のオオムギ３ＨＳ染色体における、btr1近傍のAFLPマーカーのみでは、２つの劣性遺伝子btr1、btr2の正確な位置がわからず、また、btr1、btr2の位置の関連性も不明である。このため、これら２つの劣性遺伝子btr1、btr2を単離・同定するための、詳細な連鎖地図を作製できないという問題があった。
【００１８】
また、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2を単離・同定できれば、当該遺伝子を用いることにより、穀物の種子の脱落時期を制御できる可能性があり、学術面だけでなく、農業的にも非常に利用価値の高い、有用な遺伝子であると思われる。
【００１９】
そこで、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2を単離・同定するための有効な手段である信頼性の高い連鎖地図を作製するために、さらなるオオムギの３ＨＳ染色体における、btr1、btr2近傍に位置する遺伝マーカーが強く求められていた。
【００２０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規遺伝マーカー、特に、オオムギ３ＨＳ染色体における、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2近傍に位置する新規遺伝マーカー、およびその利用法を提供することにある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、オオムギの３ＨＳ染色体における、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に存在し、これらbtr1、btr2と密接に連鎖する８４の遺伝マーカーを開発し、当該遺伝マーカーについてマッピングを行い、連鎖地図を作製するとともに、さらに、８４の遺伝マーカーのうち、９つの遺伝マーカーの塩基配列を特定することにより、本発明を完成させるに至った。
【００２２】
すなわち、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギのゲノムＤＮＡをＡＦＬＰ処理することにより得られる遺伝マーカーであって、オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置と同じ位置、および上記btr1、btr2の染色体上の位置からそれぞれ０．５ｃＭ、１．０ｃＭ、２．０ｃＭテロメア側の位置、並びに上記btr1、btr2の染色体上の位置からそれぞれ２．７ｃＭ、３．２ｃＭ、３．７ｃＭ、４．２ｃＭ、４．７ｃＭ動原体側の位置から選択されるいずれかの位置に座乗することを特徴としている。
【００２３】
上記の遺伝マーカーは、オオムギ小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置の近傍に位置し、上記btr1、btr2と密接に連鎖する。このため、上記遺伝マーカーを利用することで、オオムギ小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2をクローニングすることができると考えられる。
【００２４】
なお、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置」とは、オオムギの３ＨＳ染色体において、テロメア側から５０ｃＭ、動原体側から２０ｃＭの位置であると考えられている。
【００２５】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。（ａ）配列番号１〜９のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜９のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の小穂非脱落性に関与する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００２６】
上記のような遺伝マーカーは、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2と連鎖するため、作物育種におけるマーカー選抜（marker assisted selection）を可能にするばかりでなく、連鎖地図作製にも利用可能であり、地図情報を利用した遺伝子単離（map-based cloning）の基盤となる。すなわち、上記遺伝マーカーによれば、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子を単離・同定するためのＱＴＬ解析等に有用な連鎖地図を作製することができる。さらに、上記遺伝マーカーを指標として、小穂非脱落性の植物を選択的に育種することが可能となる。
【００２７】
なお、上記植物は、イネ科植物であることが好ましい。特に、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましい。また、オオムギ３ＨＳ染色体における遺伝マーカーであることが好ましい。さらに、上記遺伝マーカーは、AFLPマーカーであることが好ましい。
【００２８】
また、本発明に係る遺伝マーカー群は、上記いずれかの遺伝マーカーを少なくとも含み、オオムギ染色体の連鎖地図の作成に用いられることを特徴としている。さらに、本発明に係る遺伝マーカー群は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＴＳマーカーおよびマイクロサテライトマーカーから選択される少なくとも１つのマーカーを含むことが好ましい。
【００２９】
上記の遺伝マーカー群を利用することにより、より正確な連鎖地図を作成することができる。
【００３０】
また、本発明に係る連鎖地図は、上記の遺伝マーカー群を用いて作成されることを特徴としている。上記連鎖地図によれば、小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖する多くの遺伝マーカーを用いているため、小穂非脱落性遺伝子の位置をより正確に特定することができる。
【００３１】
また、本発明に係る小穂非脱落性遺伝子の単離方法は、少なくとも、上記の遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を用いて、植物染色体から小穂非脱落性に関与する遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴としている。上記の小穂非脱落性遺伝子の単離方法によれば、効率的に小穂非脱落性遺伝子を単離することができる。
【００３２】
また、本発明に係る小穂非脱落性遺伝子の単離方法は、さらに、上記遺伝マーカーをプライマーまたはプローブとして用いることが好ましい。また、上記遺伝子の座乗位置を特定する工程は、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子についてのＱＴＬ解析を行う工程を含むことが好ましい。
【００３３】
また、本発明に係る植物個体を選別する方法は、上記の遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を用いて、小穂非脱落性の植物個体を選別することを特徴としている。
【００３４】
上記の構成によれば、上記の遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を指標として、簡便かつ効率的に小穂非脱落性の植物個体を選別することができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
オオムギは、野生種から栽培種に進化する過程で、成熟しても人間が刈り取るまで、種子を落とさない小穂非脱落性という性質を獲得した。かかるオオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2（non-brittle rachis 1 (btr1) and 2 (btr2)）は、オオムギ３ＨＳ染色体に位置することが知られている。しかし、小穂非脱落性は量的形質であり、単純なbtr1、btr2の単離・同定は困難であり、ＱＴＬ解析を通じての解析が最も効率的であると考えられる。しかし、これまで知られている、btr1、btr2近傍のＤＮＡマーカーだけでは、上記btr1、btr2の位置を正確に特定することができない。
【００３６】
そこで、本発明では、３ＨＳ染色体におけるbtr1、btr2の位置をより正確に特定すべく、新規遺伝マーカー、およびその利用法を提供する。なお、これらの発明を利用して、小穂非脱落性遺伝子であるbtr1、btr2を単離・同定することが最終的な目的である。以下に、本発明の遺伝マーカーおよびその利用法に関する実施の一形態について図１〜図１１に基づいて順に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。また、本発明では、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2のことを、小穂非脱落性に関与する遺伝子、小穂非脱落性遺伝子、または単にbtr1、btr2と称することもある。
【００３７】
（１）本発明に係る遺伝マーカー
本発明に係る遺伝マーカーは、上述のように、オオムギのゲノムＤＮＡをＡＦＬＰ処理することにより得られる遺伝マーカーであって、オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置と同じ位置、および上記btr1、btr2の染色体上の位置からそれぞれ０．５ｃＭ、１．０ｃＭ、２．０ｃＭテロメア側の位置、並びに上記btr1、btr2の染色体上の位置からそれぞれ２．７ｃＭ、３．２ｃＭ、３．７ｃＭ、４．２ｃＭ、４．７ｃＭ動原体側の位置から選択されるいずれかの位置に座乗する遺伝マーカーであればよい。
【００３８】
本発明でいう「ＡＦＬＰ処理」とは、後述する実施例に示すように、被検植物（オオムギ）から調製したＤＮＡ試料を２種類の制限酵素で処理した後、当該制限酵素により切断された粘着末端に選択的に結合する所定のAFLPアダプタを接続し、このアダプタに相補的なプライマーを用いたPCRを行い、当該制限酵素断片の第１次増幅産物を得て、この第１次増幅産物を鋳型とし、前述のAFLPアダプタに相補的なプライマーに、制限酵素断片の中に数塩基（本実施例の場合は３塩基）伸長した選択ヌクレオチドを加えたプライマーを用いて、選択的にPCRを行い、遺伝マーカーを得る従来公知のAFLP処理（方法）であればよい。
【００３９】
上記２種類の制限酵素としては、例えば、EcoRIおよびMseIを用いることができるが、特に限定されるものではない。また、「制限酵素断片の中に数塩基伸長した選択ヌクレオチドを加えたプライマー」としては、上記第１次増幅産物を鋳型として、PCRによって選択的に遺伝マーカーを増幅できるプライマーであればよく、「数塩基伸長した」とは、例えば、３塩基伸長したプライマーを挙げられるが、特に限定されるものではない１塩基〜十数塩基程度まで伸長したものでもかまわない。また、PCR等のその他のAFLP処理の条件は、従来公知のAFLP処理に基づいて適宜設定でき、特に限定されるものではない。
【００４０】
上記の遺伝マーカーとしては、例えば、図２に示される連鎖地図に位置付けられた８４の遺伝マーカーを挙げることができる（図２中、上方向がテロメア側、下方向が動原体側）。すなわち、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置と同じ位置」に座乗する（位置する）遺伝マーカーとしては、例えば、e09m-25-08、e24m42-08、e26m58-13、e30m07-09、e45m11-11、e50m21-01、e57m10-07、e58m61-09-1、e58m61-09-2、e59m33-13の１０個の遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から０．５ｃＭテロメア側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e01m12-09、e23m23-07、e40m19-08、e62m32-08の４つの遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から１．０ｃＭテロメア側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e05m15-09、e51m34-13が挙げられる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から２．０ｃＭテロメア側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e07m31-09、e22m24-13-1、e22m24-13-2等と図中同じ枠内に含まれる１１個の遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から２．７ｃＭ動原体側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e37-m44-13が挙げられる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から３．２ｃＭ動原体側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e23m12-13-1、e23m12-13-2、e23m44-13、e48m02-08の４つの遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から３．７ｃＭ動原体側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e04m55-09、e06m49-08等と図中同じ枠内に含まれる１４個の遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から４．２ｃＭ動原体側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e34m11-10、e39m08-08等と図中同じ枠内に含まれる６個の遺伝マーカーを挙げることができる。また、「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から４．７ｃＭ動原体側の位置」に座乗する遺伝マーカーとしては、例えば、e03m36-13-1、e03m36-13-2等と図中同じ枠内に含まれる３２個の遺伝マーカーを挙げることができる。
【００４１】
これらの遺伝マーカーのうちでも、特に、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2と同じ染色体上の位置に座乗する１０個の遺伝マーカー、および小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置の比較的近傍であって、btr1/btr2の染色体上の位置を挟む両側の位置である「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から０．５ｃＭテロメア側の位置」と「オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置から２．７ｃＭ動原体側の位置」とに座乗する遺伝マーカーは、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2のクローニング等のために非常に有用である。
【００４２】
また、本発明に係る遺伝マーカーは、上述のように、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列を有する遺伝マーカーであればよい。（ａ）配列番号１〜９のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜９のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の小穂非脱落性に関与する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００４３】
本発明でいう、「ＱＴＬ（Quantitative Trait Loci）」とは量的形質遺伝子座のことである。また、「連鎖」とは、同じ染色体上に位置する２つ以上の遺伝子あるいは遺伝形質が組になって遺伝する現象をいう。
【００４４】
また、上記植物は、イネ科植物であることが好ましい。ここでいう「イネ科植物」とは、オオムギ属（Hordeum）、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、上記遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましく、オオムギのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来であってもよい。オオムギ属は、二条、六条等の条性、裸性、皮性、並・渦性等の諸性質は特に限定されないことは、いうまでもない。さらに、上記遺伝マーカーは、オオムギの３ＨＳ染色体における遺伝マーカーであることが好ましい。
【００４５】
また、上記遺伝マーカーは、AFLPマーカーであることが好ましい。ここでいう、「AFLPマーカー」とは、サンプルＤＮＡを２種類の制限酵素で切断し、それらの粘着末端にアダプタを連結させ、当該アダプタに特異的で、かつ制限酵素断片の中にも数塩基伸長したプライマーを用いて、当該制限酵素断片を増幅させた遺伝マーカーをいう。
【００４６】
なお、本発明でいう「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。さらに、本発明の「遺伝マーカー」は、上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列以外に、その他の塩基配列、例えば、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列を含むものであってもよい。
【００４７】
本発明に係る遺伝マーカーは、配列番号１〜９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドそのものであってもよいが、その一部の塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。ここでいう「一部の塩基配列」とは、遺伝マーカーとして使用可能な程度の長さの塩基配列を示すものであり、その長さは特に限定されるものではない。
【００４８】
また、本発明でいう「１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、公知の人為的な手法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加される変異を意味する。また、上記変異は、人為的に導入された変異ではなくてもよい。例えば、天然に存在する植物のゲノムから同様の変異を有するポリヌクレオチドを単離して、本発明に係る遺伝マーカーとして用いてもよい。
【００４９】
上記の遺伝マーカーとして、本実施の形態では、例えば、▲１▼配列番号１に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e05m15-09）、▲２▼配列番号２に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e23m23-07）、▲３▼配列番号３に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e50m21-01）、▲４▼配列番号４に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e09m25-08）、▲５▼配列番号５に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e45m11-11）、▲６▼配列番号６に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e30m07-09）、▲７▼配列番号７に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e40m19-08）、▲８▼配列番号８に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e39m23-11）、▲９▼配列番号９に示される塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー名：e04m55-09）のほか、上記ゲノムＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ等が例示される。
【００５０】
以下、上記▲１▼〜▲９▼の遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）について詳細に説明する。なお、上記▲１▼〜▲９▼の遺伝マーカーは、いずれもSTS化されたマーカーである。また、図３〜図１１中下線部で示す配列は、プライマーの塩基配列を示す。これは、植物から抽出したＤＮＡを鋳型にして、直接下記に示すＤＮＡマーカーを増幅させる（AFLP処理ではなく）ためのプライマーとして利用することができ、非常に有用である。
【００５１】
▲１▼ＤＮＡマーカー：e05m15-09
e05m15-09は、配列番号１に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５２】
具体的には、e05m15-09は、図３に示すように、１６６塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Azumamugi」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」においては、増幅されない。
【００５３】
▲２▼ＤＮＡマーカー：e23m23-07
e23m23-07は、配列番号２に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５４】
具体的には、e23m23-07は、図４に示すように、２８０塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【００５５】
▲３▼ＤＮＡマーカー：e50m21-01
e50m21-01は、配列番号３に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５６】
具体的には、e50m21-01は、図５に示すように、１２０９塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ａ（アデニン）」の位置は、１塩基多型（ＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms）、スニップスとも称する）を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Ava IIによって検出することができる。
【００５７】
▲４▼ＤＮＡマーカー：e09m25-08
e09m25-08は、配列番号４に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５８】
具体的には、e09m25-08は、図６に示すように、２０７塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【００５９】
▲５▼ＤＮＡマーカー：e45m11-11
e45m11-11は、配列番号５に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００６０】
具体的には、e45m11-11は、図７に示すように、１０５塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【００６１】
▲６▼ＤＮＡマーカー：e30m07-09
e30m07-09は、配列番号６に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００６２】
具体的には、e30m07-09は、図８に示すように、１６６塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Azumamugi」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」においては、増幅されない。
【００６３】
▲７▼ＤＮＡマーカー：e40m19-08
e40m19-08は、配列番号７に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００６４】
具体的には、e40m19-08は、図９に示すように、２４７塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ａ（アデニン）」の位置は、１塩基多型を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Dra Iによって検出することができる。
【００６５】
▲８▼ＤＮＡマーカー：e39m23-11
e39m23-11は、配列番号８に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００６６】
具体的には、e39m23-11は、図１０に示すように、９５塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【００６７】
▲９▼ＤＮＡマーカー：e04m55-09
e04m55-09は、配列番号９に示される塩基配列のポリヌクレオチドを有するＤＮＡマーカーであって、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置し、当該小穂非脱落性遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００６８】
具体的には、e04m55-09は、図１１に示すように、１６４塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ｃ（シトシン）」の位置は、１塩基多型を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Msl Iによって検出することができる。
【００６９】
なお、上記▲１▼〜▲９▼の遺伝マーカーは、後述する実施例や図２に示す８４の遺伝マーカーのうち、染色体上の小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の位置に近い、断片が短すぎない（１００ｂｐ程度）、断片サイズが小さすぎない等の理由から塩基配列を特定したものである。
【００７０】
以上のように、上記▲１▼〜▲９▼の遺伝マーカーは、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2と密接に連鎖すると考えられるため、btr1、btr2対する遺伝マーカーとして利用できる。したがって、上記▲１▼〜▲９▼の遺伝マーカーは、作物育種におけるマーカー選抜を可能にするばかりでなく、オオムギ３ＨＳ染色体における連鎖地図作製にも利用可能であり、当該地図情報を利用したbtr1、btr2の単離にも利用可能である。
【００７１】
また、本発明に係る遺伝マーカーの一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝マーカーの一部配列をチップやシリコン等の担体上に固定した、いわゆるＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００７２】
また、上記プローブの配列を、本発明に係る遺伝マーカーの塩基配列の中から選択し、コムギ、イネ、その他の植物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各遺伝マーカーと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝マーカーを単離できる可能性が高い。
【００７３】
したがって、上記遺伝マーカーを利用すれば、オオムギだけでなく、他の植物、例えば、コムギ、イネ等の小穂非脱落性に関与する遺伝子をも、ＱＴＬ解析によって単離・同定することが可能となると考えられる。
【００７４】
なお、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、上記の方法や後述する実施例で詳細に説明するように、オオムギの葉から抽出されたＤＮＡをＡＦＬＰ処理することにより作製している。
【００７５】
具体的には、まず被検植物から調製したＤＮＡ試料を２種類の制限酵素（本実施例では、EcoRIおよびMseI）で処理した後、当該制限酵素により切断された粘着末端に所定のAFLPアダプタを接続し、このアダプタに相補的なプライマーを用いたPCRを行い、当該制限酵素断片の増幅産物を得る。この増幅産物を鋳型とし、前述のプライマーに、制限酵素断片の中に数塩基（本実施例の場合は３塩基）伸長した選択ヌクレオチドを加えたプライマーを用いてPCRを行い、遺伝マーカーを得ている。なお、得られた増幅産物を電気泳動によって解析し、バンドパターンを親品種と比較し、どちらの親の形質を有するのかを判定することができる。
【００７６】
もちろん、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、これに限定されるものではなく、公知の他の方法を用いて作製してもよい。すなわち、本発明では、前述した遺伝マーカー（ＳＮＰマーカー）やこれを含む遺伝マーカー群を作製できるような方法であれば、どのような方法を採用してもよい。
【００７７】
（２）本発明に係る遺伝マーカーの利用法（有用性）
本発明に係る遺伝マーカーの用途としては、遺伝子のクローニングや細胞融合、交配等の実験において目的とする遺伝子の所在を追跡するためのマーカーとして広く用いることができる。特に、本発明に係る遺伝マーカーのうち、塩基配列中に１塩基多型（ＳＮＰｓ）を含んでいるものは、検出が容易であるという利点がある。
【００７８】
また、本発明に係る遺伝マーカーを用いる対象となる生物は特に限定されるものではないが、これら遺伝マーカーがオオムギ由来のものであるので、特に好ましい対象としては、オオムギおよびオオムギの属するコムギ連、イネ科植物を挙げることができる。もちろん、用途によってはイネ科植物以外の植物や場合によっては動物も対象とすることができる。
【００７９】
本発明に係る遺伝マーカーは、それぞれ単独で上述した各種用途に用いることもできるが、特に、オオムギ染色体の連鎖地図の作成に用いるために、複数を組み合わせて遺伝マーカー群として用いることが好ましい。なお、本発明でいう「連鎖地図」とは、いわゆる遺伝子地図、遺伝地図、染色体地図とよばれるものをも含む広い意味の連鎖地図である。そのため、以下、連鎖地図のことを遺伝子地図、遺伝地図、染色体地図と称する場合もある。
【００８０】
本発明に係る遺伝マーカー群をマッピングして得られた連鎖地図は、染色体から目的とする遺伝子を特定する用途に好適に用いることができるが、本発明では、特に、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の座乗位置を特定する用途に好適に用いることができる。
【００８１】
上述したように、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2は、穀物の種子の脱落時期を制御することができる可能性があり、農業的に非常に利用価値の高い、有用な遺伝子であると思われる。このように小穂非脱落性遺伝子は、学術上でも産業上でも有用なものであり、本発明に係る遺伝マーカーまたは遺伝マーカー群を利用すれば、少なくともオオムギから小穂非脱落性遺伝子を有効に単離・同定することが可能となる。
【００８２】
本発明に係る遺伝マーカー群は、前述したオリゴヌクレオチドからなる遺伝マーカーを含んでいればよいが、さらに他の遺伝マーカーを含んでいてもよい。他の遺伝マーカーとしては、染色体上で遺伝的な標識として用いることができるものであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ、Restriction Fragment Length Polymorphism）マーカー、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ（Simple Sequenced Repeat）マーカー）、ＡＦＬＰマーカー、ＳＴＳ（Sequence Tagged Site、配列認識部位）マーカー等の従来公知の遺伝マーカーを挙げることができる。
【００８３】
後述する実施例で説明するように、本発明では、オオムギのゲノムからＡＦＬＰにより、ＳＴＳ化された遺伝マーカーを作製している。それゆえ、本発明に係る遺伝マーカーは、ゲノム上で唯一存在するような特異的な塩基配列を含んでいるため、ＲＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーよりも有用性が高い。しかしながら、本発明に係る遺伝マーカーと、他のＲＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＴＳマーカーとを組み合わせて遺伝マーカー群として用いれば、より詳細な連鎖地図を作成することができるので、その有用性はさらに一層向上する。
【００８４】
例えば、本発明では、図２に示すように、本発明に係る遺伝マーカーと、その他のＡＦＬＰマーカーとを組み合わせてオオムギの連鎖地図を作成することができる。この連鎖地図では、オオムギの３ＨＳ染色体について、次のように遺伝マーカーが位置付けられている。なお、図２において、上方向がテロメア側であって、下方向が動原体側である。
【００８５】
すなわち、図２に示すように、オオムギ３Ｈ染色体において、８６個の遺伝マーカーが位置付けられる。そのうち、上記▲１▼〜▲９▼に示す９つの本発明に係る遺伝マーカーは、いずれも小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置しているのがわかる（図中網かけされたマーカー）。具体的には、従来知られていた遺伝マーカー：e14m-27-04-01、e15m19-07（非特許文献５参照、図２中太字で示すマーカー）は、図２に示すように、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2が含まれる領域から、それぞれテロメア側に距離約2.0cM、動原体側に4.7cMはなれている。一方、上記▲３▼〜▲６▼の遺伝マーカーは、btr1、btr2が含まれる領域と同じ領域に含まれることがわかった。また、▲１▼の遺伝マーカーは、btr1、btr2が含まれる領域からテロメア側に距離約1.0cM離れており、▲２▼および▲７▼の遺伝マーカーは、btr1、btr2が含まれる領域からテロメア側に距離約0.5cM離れており、▲８▼および▲９▼の遺伝マーカーは、btr1、btr2が含まれる領域から動原体側に距離約3.7〜4.7cM離れている。なお、図２に示す３H染色体の全長は9.9cMである。
【００８６】
つまり、本発明に係る遺伝マーカーはいずれも、これまで公表されている遺伝マーカー：e14m-27-04-01、e15m19-07に比べて、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2のより近傍に座乗することがわかった。つまり、本発明に係る遺伝マーカーは小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2とより密接に連鎖するといえることから、この点からも本発明の有用性が明らかである。
【００８７】
以上のように、本発明に係る連鎖地図は、上記の遺伝マーカー群を用いて作製されているオオムギ染色体における連鎖地図であればよく、特に限定されるものではない。
【００８８】
連鎖地図では、マーカー間の密度が高いほど、遺伝子の位置の精度が高くなることは上述したが、本発明に係る連鎖地図はまさに、高密度な連鎖地図であり、これを利用すれば、小穂非脱落性遺伝子の単離・同定も可能になると考えられる。
【００８９】
なお、本発明にかかる連鎖地図の作製方法には、従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。例えば、計算ソフトを使った通常の方法が挙げられる（LANDER, E., P. GREEN, J. ABRAHAMSON, A. BARLOW, M. DALY et al., 1987 Mapmaker: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181.、またはLINCOLN, S., M. DALY and E. LANDER, 1993 Constructing genetic linkage maps with Mapmaker/Exp 3.0. Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report. 3rd ed, Cambridge, MA, USA.等）。
【００９０】
また、本発明に係る遺伝マーカー群は、小穂非脱落性遺伝子を特定する用途では、特に、オオムギの３ＨＳ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを含むことが好ましい。前述したようにオオムギにおける小穂非脱落性遺伝子は、３ＨＳ染色体に座乗すると報告されている。それゆえ、当該遺伝子を単離・同定するために利用する遺伝子地図を作成するには、３ＨＳ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを多く含むことが非常に好ましい。
【００９１】
上記のように、本発明に係る遺伝マーカーや遺伝マーカー群を用いれば、小穂非脱落性遺伝子を特定するための遺伝子地図を作成することができる。このため、本発明には、上記遺伝マーカーや遺伝マーカー群、または上記連鎖地図を用いて、植物染色体から小穂非脱落性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含む小穂非脱落性遺伝子の単離方法（クローニング方法）が含まれる。
【００９２】
小穂非脱落性遺伝子のクローニング方法としては、具体的には、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。例えば、本発明に係る上記遺伝マーカーや遺伝マーカー群をプライマーまたはプローブとして用いることにより、小穂非脱落性遺伝子を単離・同定すればよい。
【００９３】
また、上記遺伝マーカー、または遺伝マーカー群を位置付けた連鎖地図をもとに、小穂非脱落性遺伝子の染色体上の位置をより詳細に特定しクローニングを行う、いわゆるマップベースクローニングを行うことで、小穂非脱落性遺伝子を単離・同定することも可能である。そのための具体的な方法の１つとして、いわゆるＱＴＬ解析を利用した方法が挙げられる。
【００９４】
上記ＱＴＬ解析方法は、上記いずれかの遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図（以下、遺伝マーカー等と称する場合もある）を用いて、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2についてのＱＴＬ解析を行う方法であればよく、その他の条件、方法等は、従来公知のＱＴＬ解析方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００９５】
ＱＴＬ解析の原理は、雑種集団の各個体をマーカーの遺伝子型グループに分類し、それらの平均値を比較することから始まる。マーカーと解析対象形質に関与するＱＴＬの一つとが連鎖していれば、遺伝子型グループの平均値間に偏りが生じる。連鎖していなければ、それらの間に偏りはない。これを発展させ、マーカーの存在しないマーカー間に対応させた解析が、インターバルマッピング法によるＱＴＬ解析である。解析対象の生物種の染色体全体に分散するマーカーを用いてこの解析を繰り返すと、解析対象形質に関与する染色体領域が明らかになる。
【００９６】
また、ＱＴＬ解析で重要な項目の中に、交配親として解析対象の形質について大きな差異、すなわち遺伝的に異なる品種の選抜が重要となる。それにより、形質に関与するＱＴＬ中の主要なものが検出されると期待できる。
【００９７】
すなわち、「ＱＴＬ解析」とはＱＴＬのマッピングであればよい。さらに，マップされたＱＴＬを単離する具体的な方法として、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、２品種の親個体を交配させ、実験材料として多数の系統群の作出を行う。次に、目的とする形質を指標にこの系統群のゲノムを解析し、目的遺伝子の近傍に存在すると考えられる遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を統計的に解析し、見つけ出す。この遺伝マーカーを用いて連鎖地図を作製し、それぞれの遺伝マーカーを指標としながら片方の親で戻し交雑を繰り返して、目的遺伝子の周辺のみがもう片方の親由来である個体を作製する。ここで得られた個体は、準同質遺伝子系統と呼ばれ、この準同質遺伝子系統を利用して、目的遺伝子の染色体上の位置を絞り込んでいくことで、目的のＱＴＬ、すなわち遺伝子を単離する。
【００９８】
本発明に係るＱＴＬ解析方法によれば、上記遺伝マーカーまたは上記の連鎖地図を利用しているため、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子についてのＱＴＬ解析を行った結果、btr1、btr2の位置の正確性と信頼性とを高めることができる。したがって、本発明のＱＴＬ解析によって、オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2の位置をより正確に特定することができ、当該遺伝子を単離・同定することができると考えられる。
【００９９】
さらに、例えば、上記いずれかの遺伝マーカー、遺伝マーカー群、または連鎖地図を指標として、小穂非脱落性を有する植物（個体）を選抜することができる。上記植物（個体）選抜方法は、上記の遺伝マーカー等を指標として用いていればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【０１００】
上記植物選抜方法の具体的方法としては、植物育種における従来公知の手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーまたは遺伝マーカー群を有するか否かを指標として植物を選抜する方法が挙げられる。なお、上記遺伝マーカーまたは遺伝マーカー群を検出する手段としては、例えば、上記遺伝マーカー等の一部の配列を固定化させたＤＮＡチップを用いる方法、または上記遺伝マーカー等の一部の配列をプライマーとするＰＣＲにより上記遺伝マーカー等を増幅させる方法等の従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。
【０１０１】
また、その他にも、例えば、上記いずれかの遺伝マーカー等を指標として、小穂非脱落性を有する植物を生産することができる可能性がある。上記植物生産方法は、上記遺伝マーカーを指標としていればよく、その他の工程、条件、材料等は、特に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明に係る植物生産方法の具体的な方法としては、植物育種における従来公知の手法または遺伝子工学的な手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上記遺伝マーカーを有する植物を親個体として交配させて上記遺伝マーカーを有する植物個体を生産する方法、または上記遺伝マーカーを含むＤＮＡ領域をベクター等を利用した遺伝子導入等の遺伝子工学的な手法によって、上記遺伝マーカーを有する植物を生産する方法が挙げられる。なお、生産した植物個体が上記遺伝マーカーを有するか否かは、上述のＤＮＡチップやＰＣＲ法を利用して簡便に調べることができる。
【０１０３】
なお、ここでいう「植物」には、オオムギ、コムギ、イネ等のイネ科植物が好ましい。
【０１０４】
上記のように、上記植物選抜方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、小穂非脱落性を有する植物を選抜することができる。また、上記植物生産方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、小穂非脱落性を有する植物を生産することができる。
【０１０５】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０６】
【実施例】
オオムギの小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2について、染色体上の位置を詳細に特定し、かかる遺伝子btr1、btr2を単離・同定することを目的として、遺伝マーカーを作製した。具体的には、以下のように行った。
【０１０７】
〔１〕実験材料と実験方法
〔１−１〕使用した植物
本実施例では、以下に示すオオムギ品種を使用した。Hordeum vulgare ssp. vulgare cvs. Azumamugi, Kanto Nakate Gold （Barley Breeding Laboratory, National Institute of Crop Science, Tsukuba）。
【０１０８】
上記オオムギ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、以下のＡＦＬＰマーカーの作製に用いた。
【０１０９】
〔１−２〕ＡＦＬＰマーカーの作製
ＡＦＬＰマーカーの作製は、基本的には、MANOらの方法に従った（MANO,Y.,et al.、「Construction of a genetic map of barley (Hordeum vulgare L.) cross 'Azumamugi' x 'Kanto Nakate Gold' using a simple and efficient amplified fragment-length polymorphism system.」、Genome 44: 284-292）。具体的には、まず上記オオムギ品種の植物個体から調製したＤＮＡ試料を制限酵素EcoRIおよびMseIで処理した後、生じた制限酵素断片に対して、制限酵素の粘着末端に特異的に結合するAFLPアダプタを接続させた。上記AFLPアダプタとしては、制限酵素EcoRIによる粘着末端に結合するE-側AFLPアダプタと、制限酵素MseIによる粘着末端に結合するM-側AFLPアダプタとを用いた。これらAFLPアダプタは、２本鎖ＤＮＡであり、具体的には、E-側AFLPアダプタとして、配列番号１０に示される塩基配列を有するE-adapter1と配列番号１１に示される塩基配列を有するE-adapter2とを混ぜて使用し、M-側AFLPアダプタとして、配列番号１２に示される塩基配列を有するM-adapter1と配列番号１３に示される塩基配列を有するM-adapter2とを混ぜて使用した。
【０１１０】
次に、上記AFLPアダプタに相補的なプライマーを用いてPCRを行い、第１次増幅産物を得る。具体的には、E-側AFLPアダプタに相補的なプライマーとして、配列番号１４に示される塩基配列を有するE-000を使用し、M-側AFLPアダプタに相補的なプライマーとして、配列番号１５に示される塩基配列を有するM-000を使用した。
【０１１１】
続いて、この第１次増幅産物を鋳型とし、上記AFLPアダプタに相補的なプライマーである、E-000またはM-000に３個の選択ヌクレオチドを加えたプライマーを用いてPCRを行った。なお、上記E-000に３個の選択ヌクレオチドを加えたプライマーとしては、配列番号１６〜７９のいずれかに示される塩基配列を有する６４種類のプライマーe01〜e64を用い、また、上記M-000に３個の選択ヌクレオチドを加えたプライマーは、配列番号８０〜１４３のいずれかに示される塩基配列を有する６４種類のプライマーm01〜m64を用いた。そして、上記PCRの結果、得られた増幅産物をAFLPマーカーとし、その塩基配列を決定した。なお、PCR等の詳細な条件は、上記文献に従った。
【０１１２】
〔１−３〕ＱＴＬ解析
Composite interval mapping（CIM）のＱＴＬ解析は、コンピュータープログラムQTL Cartographer Version 1.14 (Basten et al.、「A reference manual and tutorial for QTL mapping.」、Department of Statictics, North Carolina State University, Raleigh, NC, USA)によって行い、データのbrittleness (%)は、arcsin√p変換を行った。
【０１１３】
ベースマップのために１００個のマーカーを用いた。CIMは、デフォルト用意されたモデル６（５つのバックグラウンドマーカーと10cMのwindowサイズ）にて実行した。バックグラウンドマーカーの包括は、正確に解析され、効率的なQTLｓマッピングが可能となる。Log-likelihood（LOD）スコアの３．０の閾値は、形質と関連する仮想の位置を含む領域が用いられている。
【０１１４】
〔１−４〕AFLPマーカーのマッピング
上記〔１−２〕で得たAFLPマーカーを位置付けた連鎖地図の作製方法は、基本的には、MANOらの方法に従った（MANO,Y.,et al.、「Construction of a genetic map of barley (Hordeum vulgare L.) cross 'Azumamugi' x 'Kanto Nakate Gold' using a simple and efficient amplified fragment-length polymorphism system.」、Genome 44: 284-292）。具体的には、計算ソフトを使った通常の方法で行った（LANDER, E., P. GREEN, J. ABRAHAMSON, A. BARLOW, M. DALY et al., 1987 Mapmaker: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181.、またはLINCOLN, S., M. DALY and E. LANDER, 1993 Constructing genetic linkage maps with Mapmaker/Exp 3.0. Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report. 3rd ed, Cambridge, MA, USA.）。
【０１１５】
〔２〕結果
オオムギの小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置を特定するために、まず上記〔１−３〕に示す方法により、ＱＴＬ解析を行った。その結果、図１に示すように、オオムギの３H染色体において従来から知られていたAFLPマーカー：e14m27-4-1とe15m19-7との間に大きなピークが検出された。このことから、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2は、AFLPマーカー：e14m27-4-1とe15m19-7との間に座乗すると考えられた。
【０１１６】
そして、AFLPマーカー：e14m27-4-1とe15m19-7との間に座乗し、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2のより近傍に位置する遺伝マーカーを作製するために、上記〔１−２〕に示す方法により、８４のAFLPマーカーを得た。次いで、これら８４のAFLPマーカーを〔１−４〕の方法にしたがって、位置付けた連鎖地図を作製した。図２にこの連鎖地図を示す。図中、太字で示したマーカーは、従来から知られているAFLPマーカー：e14m27-4-1とe15m19-7である。それ以外が今回作製したAFLPマーカーである。なお、図２において、上方向がテロメア側であって、下方向が動原体側である。
【０１１７】
同図に示すように、上記８４のAFLPマーカーはいずれも、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の染色体上の位置の近傍に座乗することがわかった。
【０１１８】
そして、上記８４のAFLPマーカーのうち、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2により近い、断片が短すぎない（１００ｂｐ程度）などの基準に従い、９つのAFLPマーカーの塩基配列を決定した。この９つのマーカーは、図２の連鎖地図における網かけされたマーカーである。
【０１１９】
これら９つのAFLPマーカーの塩基配列を、それぞれ配列番号１〜９に示す。具体的には、▲１▼配列番号１はe05m15-09の塩基配列を、▲２▼配列番号２はe23m23-07の塩基配列を、▲３▼配列番号３はe50m21-01の塩基配列を、▲４▼配列番号４はe09m25-08の塩基配列を、▲５▼配列番号５はe45m11-11の塩基配列を、▲６▼配列番号６はe30m07-09の塩基配列を、▲７▼配列番号７はe40m19-08の塩基配列を、▲８▼配列番号８はe39m23-11の塩基配列を、▲９▼配列番号９はe04m55-09の塩基配列をそれぞれ示している。
【０１２０】
▲１▼e05m15-09は、図３に示すように、１６６塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Azumamugi」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」においては、増幅されない。
【０１２１】
▲２▼e23m23-07は、図４に示すように、２８０塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【０１２２】
▲３▼e50m21-01は、図５に示すように、１２０９塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ａ（アデニン）」の位置は、１塩基多型（ＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms）、スニップスとも称する）を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Ava IIによって検出することができる。
【０１２３】
▲４▼e09m25-08は、図６に示すように、２０７塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【０１２４】
▲５▼e45m11-11は、図７に示すように、１０５塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【０１２５】
▲６▼e30m07-09は、図８に示すように、１６６塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Azumamugi」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」においては、増幅されない。
【０１２６】
▲７▼e40m19-08は、図９に示すように、２４７塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ａ（アデニン）」の位置は、１塩基多型を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Dra Iによって検出することができる。
【０１２７】
▲８▼e39m23-11は、図１０に示すように、９５塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーであるが、オオムギ品種「Azumamugi」においては、増幅されない。
【０１２８】
▲９▼e04m55-09は、図１１に示すように、１６４塩基対からなるＤＮＡマーカーであり、オオムギ品種「Kanto Nakate Gold」において増幅されるAFLPマーカーである。さらに、図中二重下線で示す塩基「Ｃ（シトシン）」の位置は、１塩基多型を有する位置であり、当該１塩基多型は制限酵素Msl Iによって検出することができる。
【０１２９】
これら９つのAFLPマーカーは、図２の連鎖地図に示すように、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の近傍に位置することから、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2と密接に連鎖していると考えられる。
【０１３０】
また、図２に示す連鎖地図は、高密度のAFLPマーカーを位置付けた連鎖地図であるため、正確に小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2の座乗位置を特定することができ、ひいては、小穂非脱落性遺伝子btr1、btr2を単離・同定できる。
【０１３１】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝マーカーによれば、信頼性の高い連鎖地図を作製することができるだけでなく、小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2について、より精度の高いＱＴＬ解析を行うことができるという効果を奏する。したがって、小穂非脱落性に関与する遺伝子btr1、btr2を単離・同定するための非常に有用な手段となるという効果を奏する。
【０１３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】オオムギの小穂非脱落性についてのＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図２】本実施の一形態における遺伝マーカーを位置付けたオオムギ３ＨＳ染色体における連鎖地図を示す図である。
【図３】本実施の一形態における遺伝マーカー▲１▼：e05m15-09の塩基配列を示す図である。
【図４】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲２▼：e23m23-07の塩基配列を示す図である。
【図５】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲３▼：e50m21-01の塩基配列を示す図である。
【図６】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲４▼：e09m25-08の塩基配列を示す図である。
【図７】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲５▼：e45m11-11の塩基配列を示す図である。
【図８】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲６▼：e30m07-09の塩基配列を示す図である。
【図９】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲７▼：e40m19-08の塩基配列を示す図である。
【図１０】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲８▼：e39m23-11の塩基配列を示す図である。
【図１１】本実施の一形態における他の遺伝マーカー▲９▼：e04m55-09の塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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