(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚炎抑制剤。
【請求項３】
ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする浴用剤。
【請求項４】
ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする花粉症軽減剤。
【請求項５】
前記へキサンによる抽出物中に、スチグマスト−４−エン−３，６−ジオン、スチグマスタ−４，２２−ジエン−３オン、及びスチグマスト−４−エン−３−オンの少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする請求項２記載の皮膚炎抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベニカミキリフラスを有効成分とする皮膚外用薬などの薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
人が生命体を維持して、活動を行っていく上で、体表面の皮膚に感ずる痒みとは、皮膚や粘膜の痛点が弱い刺激によって生じる感覚、掻痒感のことである。
近年、生活環境の変化に伴いアトピー性皮膚炎の発症が激増している。アトピー性皮膚炎の発症には環境要因が大きく作用するといわれている。環境要因には、非アレルギー的要因とアレルギ−的要因に分けられる。非アレルギー的要因には、皮膚の乾燥、発汗、皮膚の加圧・加重、皮膚の掻破等によるものである。アレルギー的要因では、食物アレルゲンの吸引によるもの、だに、ハウスペット、花粉、金属等との接触などによるものである。
非アレルギー要因による場合には、要因と接触することで、痒みが生じ、粗の痒みに対して皮膚を掻くことにより皮膚組織が破壊され、皮膚が有する防御機能が損なわれ、皮膚過敏や病原菌による感染症状が引き起こされる。
アレルギ−症状は、体内で起こる抗原抗体反応による免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生により、結果的に肥満細胞の細胞膜を刺激し、ヒスタミン、ロイコトリエン、セロトニンなどの活性物質を放出することにより起こる。放出されたこれらの物質は、血管透過性を促進させる作用や、平滑筋を収縮させる作用があるため、白血球や蛋白質を血管から漏出させたり、炎症により気管支を収縮させ、喘息を引き起こす原因となる。また、体内にアレルゲンが侵入するとＴ細胞が感作され、再度アレルゲンに接触するとリンホカインと呼ばれる炎症性因子を放出し、反応を起こす。このような症状に対して、予防・改善に有効な因子を探し出す研究が行われている。
そして、抗アレルギー成分に関し、ボルネオールの肥満細胞膜安定可能を利用するもの（特許文献１）、放線菌培養液による炎症抑制作用を利用するもの（特許文献２）などが知られている。また、ごま油を摂取することによって、アレルギ−反応の原因となるロイコトリエンの産生を抑制する効果が知られている（非特許文献１）。また、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、或いはリノレン酸を含む油脂の抗アレルギ−性を利用するもの（特許文献３）が知られている。これらの天然に存在する坑アレルギー剤は副作用が少ないが、抗アレルギ−症状の予防及び治療には、その効果は、十分ではない。
ヒスタミンを代表とする多数の活性物質が肥満細胞や好塩基球から遊離されることが影響を与えていることから、前記の抗アレルギ−症状を軽減させるために、ヒスタミン受容体阻害剤が有効と考えられ、クロラルフェニルアミン、ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン剤や副腎皮質ホルモンが用いられるが、これらの薬剤を用いる場合には、副作用を伴うことが問題とされている。
このようなことから、副作用が少ない薬剤の開発が進められており、天然物由来の物質の開発が進められている。
この種の天然物としてはキク科ヒマワリ属の花弁抽出物を用いるもの（特許文献４）、アカナノキなどの抽出物（特許文献５）、テイートリーの抽出物（特許文献６）、トコフェロール抽出物（特許文献７）、キトサンを用いるもの（特許文献８）などが開発されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平６−２１１７１３号公報
【特許文献２】
特開平５−２５０５３号公報
【特許文献３】
特開平２−２９０８１号公報
【特許文献４】
特開２０００−３５１７２３号公報
【特許文献５】
特開２０００−２６３０７号公報
【特許文献６】
特開平１１−２５５６６１号公報
【特許文献７】
特開２００１−１６３７６４号公報
【特許文献８】
特開２００１−５５３３５号公報
【非特許文献】
Prostaglandin、第３６巻、第３号、１９８８年
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、皮膚に感ずる種々の痒み防止及び改善に対して有効な、天然物由来のかゆみどめ、アトピー性皮膚炎やアレルギー性症状の予防、改善及び治療となる、抗アレルギー剤、皮膚外用剤、皮膚炎抑制剤及び浴用剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究し、竹類に寄生するベニカミキリの幼虫の排泄物であるベニカミキリフラスの成分を含む組成物、ベニカミキリフラスを水或いは有機溶媒で処理して得られる抽出物を用いて、ヒスタミン遊離抑制試験及びロイコトリエン分泌抑制試験を行ったところ、高活性を示し、アレルギー性の皮膚炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性症状に有効に作用することを見出し、さらに、実際にヒスタミンが関与するアレルギー性の皮膚炎、アトピー性皮膚炎やアレルギー性症状、花粉症状軽減薬、虫さされ、環境要因による皮膚そう痒症等に用いて試したところ、広範囲にわたる痒み症状に対して短時間で顕著な効果が見られ、各種の痒みの内服薬及び外用薬として予防及び改善に有効であること、更に機能性食品として用いると、痒みの予防・改善に有効であること、更にこれらを浴用剤として用いると、痒みの予防・改善にも有効にあることを見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。
（２）  ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚炎抑制剤。
（３）  ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする浴用剤。
（４）  ベニカミキリフラス、その乾燥物、又はその水／又はヘキサンによる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする花粉症軽減剤。
（５）  前記へキサンによる抽出物中に、スチグマスト−４−エン−３，６−ジオン、スチグマスタ−４，２２−ジエン−３オン、及びスチグマスト−４−エン−３−オンの少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする（２）記載の皮膚炎抑制剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の対象であるベニカミキリフラス成分を取得するために用いられる原料の竹としては、モウソウチク属、シホウチク属、マダケ属、シュドササ属、ササモルフア属、ナリヒラタケ属、トウチク属などの竹類が用いられる。なかでも、マダケ属の孟宗竹及びハチクが好適に用いられる。これらの竹が切り取られ、放置されると、ベニカミキリ（Purpuricenus temminckii Guerin-Meneville1844）が卵をうみつけ、その幼虫が竹類を食べて成長する。その成長過程で、排泄物を竹の中に残す。これをベニカミキリフラスと呼ぶ。このベニカミキリフラスを集めて、本発明の抗アレルギー剤などの対象物質とする。
なお、ベニカミキリは、主に我が国では、本州（ヤブツバキ帯−ブナ帯下部）、佐渡、四国、九州、壱岐、対馬などに分布し、春から夏にかけて出現する。
【０００８】
竹から得られるベニカミキリフラスは、しっとりとした粒状の薄黄色を帯びた組成物として得られる。
このベニカミキリフラスは、水分を含有するので、これを乾燥させることにより水分を取り除いて粉状体とすることができる。乾燥させるには、３０〜８０℃の条件下に行う。８０℃を越える高温で処理すると、分解などを伴うので、好ましくない。
この粉状のものを、ガーゼなどを用いて患部に直接接触させることにより、薬剤として使用することができる。また、このベニカミキリフラスは、格別水分などを取り除くことなく、そのまま薬剤として使用することもできる。後述する実施例で直接用いた結果を示すが、薬剤として良好な結果を示すものである。
また、水又は有機溶媒により抽出された抽出液の状態のものを、アレルギー症状を緩和させるために、患部に前記と同様に接触させて用いることができるし、水に溶解させたものを、花粉症点鼻薬として粘膜にほどこすことができる。
【０００９】
ベニカミキリフラスより水抽出物を取り出す場合には、過剰量の水（熱水）と容器内で接触させる。水には熱湯を用いることが効果的である。通常、０．００１〜０．００７重量％程度の濃度になるように水量を調節する。抽出には、環流条件下に加熱する。加熱時間は、適宜設定する。加熱処理は、通常少なくとも１５分以上、１時間程度は必要である。
その結果、ベニカミキリフラスの抽出成分は熱水層に移行させることができる。この熱水処理は２回以上、通常３回程度まで繰り返すことが有効である。
この一回目の操作により、一般には、ベニカミキリフラス重量に対して０．３〜１．０％程度、通常０．７重量％程度の割合で液状物が得られる。このようにして得られる液状物を環流条件下に濃縮する。最終的に、ベニカミキリフラスの抽出物は、茶褐色の粉末状のものとして得られる。収量は、ベニカミキリフラスの重量に対して１．０〜２．０重量％程度のものが得られる。
温水の利用も可能である。圧力をかけた条件下にも行うことができる。このようにして得られる粉末状の水抽出物を、使用に際しては、適宜水に溶かして薬剤として利用する。
後の実施例に示すように竹フラス１０ｇを用いて水抽出を行った結果、１７６．２ｍｇのフラス抽出物を得ている。
【００１０】
ベニカミキリフラスを有機溶媒に接触させて処理することにより有機溶媒による抽出物としたものを薬剤として利用することができる。
有機溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール又はその誘導体、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸イソプロピルなどのエステル類、エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類を挙げることができる。また、石油エーテル、ｎ−へキサン、ｎ−ペンタンなどの脂肪族炭化水素なども用いることができる。
これらの中では、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコールなどが用いられる。これらには、水を含めて混合溶媒として用いることもできる。
いずれも溶媒抽出した後、更に他の溶剤に接触させて、さらに特定の成分を取り出すことができるが、そのような操作を施すことなく、エタノール或いは１，３−ブチレングリコール溶媒のものを適当な濃度のものとして、患部に直接、塗りつける、或いはガーゼなどにしみこませた状態であてがうことによって、用いることができる。
【００１１】
ベニカミキリフラス成分の有機溶媒抽出に当たっては、へキサンなどで抽出を行って、へキサン抽出物と残さに分け、この残さをメタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸エチル溶解成分とブタノール溶解成分に分けることができ、残さを水抽出を行うなどして、各種溶解成分を取り出すこともできる。
【００１２】
ベニカミキリフラスの成分を含有する組成物は、抗アレルギー剤として用いることができる。抗アレルギ−剤としては、経口内服薬、静脈注射、外用薬として利用できる。また、花粉症軽減薬、又、機能性食品や菓子などの食品及び各種飲料中に添加して痒み防止或いは改善をはかることもできる。又、皮膚外用剤、皮膚保護剤、皮膚炎抑制剤、ローション及びクリーム及び石鹸などに添加して、痒み防止・改善をはかる化粧品として利用することもできるし、痒み防止・改善作用も有する頭髪剤にも用いることもできる。また、浴用剤に添加して浴用剤に痒み防止・改善をはかるようにすることもできる。場合によっては、下着や靴下などの衣料に含有させて、衣料に痒み防止・改善の作用をもたせることもできる。
【００１３】
ベニカミキリフラスを、水抽出物、有機溶剤抽出物、或いは乾燥物として０．００１〜２０重量％程度の濃度のものとして用いることが一般的である。
この中に、抗炎症剤、抗アレルギー性疾患剤である、アズレン、塩酸ジフェンヒドラミン、ｄｌ−αトコフェロール及びその誘導体と共に用いることもできる。
また、多糖類などの天然高分子、でんぷん、水溶性高分子、アニオン、カチオン、ノニオンなどの界面活性剤を用いることもできる。
【００１４】
入浴剤として用いる場合には、粉状のベニカミキリフラス、炭酸水素ナトリウム、無水硫酸ナトリウム、硼砂、香料、安定剤などともに混合したものを、水などに溶解抽出物を適宜水に溶かして薬剤として利用する。また、液状のベニカミキリフラスをホホバ油、香油、色素、保湿剤、界面活性剤と混合した液状のもとしても利用することができる。
【００１５】
以下に、本発明の内容を実施例により説明する。
本発明のベニカミキリフラスの抽出液の製造方法として、有機溶媒による抽出液の製造方法及び水による抽出液の製造方法について示す。
本発明のベニカミキリフラスの薬剤として用いた効果については、ヒスタミン遊離抑制及びロイコトリエン分泌抑制試験、β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制試験を行うことによって、痒みなどに対する効果を確認することができる。
本発明のベニカミキリフラスの各種皮膚疾患に使用する場合の毒性試験として、線維芽細胞を用いる「２４穴マルチウェル・スクリーニング法」により行い、その結果から、その毒性の有無を確認することができる。以下に、その内容及び実験結果について詳細に説明する。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明の内容を説明する。
【００１７】
実施例１
（ベニカミキリフラスの有機溶媒による抽出液の製造）
竹から得られたベニカミキリフラス５９１ｇを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物３３２ｍｇと残さに分け、この残さを、メタノール抽出し、メタノール抽出物１４．６ｇと残さに分け、メタノール抽出物が酢酸エチルに溶解した区分３．６８５ｇと水により溶解した区分に分けることができ、水により溶解した区分について、ｎ−ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分１．９３１ｇと水区分に分けることができ、メタノール抽出残さを水（熱水）抽出を行って、水抽出物１２．１３２ｇを得た。
【００１８】
実施例１−２
（ベニカミキリフラスの有機溶媒による抽出液の製造）
竹から得られたベニカミキリフラス１０３７ｇを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物５０９．９ｍｇと残さに分け、この残さを、メタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸エチル溶解区分５．４１ｇ及び水溶解区分にわけることができ、水により溶解した区分について、ｎ−ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分２．５３ｇと水区分３．６５ｇに分けることができ、メタノール抽出残さを水（熱水）抽出を行って、水抽出物２７．１３２ｇを得た。（図６）
【００１９】
実施例１−３
（ｎ−ヘキサン抽出物からの成分の分離）
ベニカミキリフラス（１０３７ｇ）を、ｎ−ヘキサン（３Ｌ）で３回、３時間加熱環流抽出し、得られた抽出物（４６１ｍｇ）をシリカゲルのカラムクロマトで分画した。得られた３−オキソステロイド画分の薄層クロマトグラフィ及び逆相分取ＨＰＬＣを行い、３種の化合物を単離した。
３種の化合物は、スチグマスト−４−エン−３，６−ジオン（２．９ｍｇ）、スチグマスタ−４，２２−ジエン−３オン（１．０ｍｇ）、及びスチグマスト−４−エン−３−オン（５．９ｍｇ）と同定した。これらの３種の３−オキソステロイドについて、β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法の試料とした。
【化１】
0004450406.tif 000002
【化２】
0004450406.tif 000003
【化３】
0004450406.tif 000004
【００２０】
実施例２−１
（ベニカミキリフラスの水抽出液の製造）
竹から採取したベニカミキリフラス１０ｇを、水５００ｍｌに溶解させ、加熱し、環流条件下に加熱した。加熱処理は、５時間行った。
得られたベニカミキリフラスの抽出成分を含有する成分に関し、同様に２回操作を繰り返した。その結果、ベニカミキリフラス水抽出物１７６．２ｍｇを得た。以後の実施例ではこれを必要量の水に溶解して用いる。
【００２１】
実施例２−２
（β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法に用いたベニカミキリフラスの水抽出液の製造）
竹から採取したベニカミキリフラス１０３７ｇに、水３Ｌを加え、３時間加熱環流を行い、抽出を行った。得られた抽出物（４１．２ｍｇ）の一部を、Ｓhodexカラム（ＧＳ−３２０ＨＱ）にて７区画分に分画した。これら７区画分［Ｆｒ．１（３．２ｍｇ）、Ｆｒ２（３．２ｍｇ）、Ｆｒ３（８．２ｍｇ）、Ｆｒ４（６．８ｍｇ）、Ｆｒ５（６．２ｍｇ）、Ｆｒ６（５．０ｍｇ）、Ｆｒ．７（５．０ｍｇ）について、β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法に用いるベニカミキリフラスの水抽出液とした。
【００２２】
実施例３
（ヒスタミン遊離抑制試験）
実施例２−１で得られたベニカミキリフラス水抽出液のヒスタミン遊離抑制効果を、ラット由来好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）から遊離されるヒスタミンを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価した。
ＲＢＬ−２Ｈ３を２４穴プレートに２．５×１０5細胞／穴となるように細胞を播種し、２４時間培養（二酸化炭素５％、３７度）後、Phosphate buffer saline（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、各濃度の竹チップ抽出液／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＤＭＥＭ  １８０μＬを加えて二酸化炭素５％、３７度で３０分培養し、次に、刺激剤Ａ２３１８７（カルシウムイオノフア），を２０μＬ加えて３０分培養した後、上清２００μＬを取り出した。また、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉｕｍ）及び界面活性剤０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（細胞壁を溶解することで細胞中の全ヒスタミン含量を測定する）を用いて上述と同様に刺激して得られた上清を各々Negative  Control、Positive  Controlとした。
このようにして取り出した上清中のヒスタミン含量はHistamine enzyme-linked immunoadsorbent assay（ＥＬＩＳＡ）Ｋｉｔ（ＩＣＮ  Pharmaceuticals社製）を用いて定量した。なお、ヒスタミン遊離率およびコントロールに対するヒスタミン遊離率は式１及び式２を用いて算出した。コントロールに対する各濃度のヒスタミン遊離率を図１に示す。
ヒスタミン遊離率（％）
＝（（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００    ・・・（式１）
Ａはベニカミキリフラス水抽出液処理した細胞にＡ２３１８７で刺激した上清中のヒスタミン含量
ＢはＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌによる上清中のヒスタミン含量
ＣはＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌによる上清中のヒスタミン含量
コントロールに対するヒスタミン遊離率（％）
＝（Ｄ／Ｅ）×１００      ・・・（式２）
Ｄは各濃度のベニカミキリフラス水抽出液のヒスタミン遊離率（％）
ＥはＡ２３８１７刺激のみ（ベニカミキリフラス水抽出液で未処理）のヒスタミン遊離率（％）
コントロールはＡ２３１８７で刺激のみ（ベニカミキリフラス水抽出液で未処理）の上清中のヒスタミン遊離率（％）
（結果）
Ａ２３１８７はブランクの結果である。
０．６２５ｍｇ／ｍｌの場合には、顕著に減少しており、その後、１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ以降徐々に値が減少している。ヒスタミン遊離抑制効果は十分にあることが理解できる。
【００２３】
実施例４
（ロイコトリエン分泌抑制試験）
実施例２−１で得たベニカリキリフラス水抽出液のロイコトリエン分泌抑制効果をラット由来好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）から分泌されるロイコトリエンを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価した。
ＲＢＬ−２Ｈ３を２４穴プレートに２．５×１０5細胞／穴となるように細胞を播種し、２４時間培養（二酸化炭素５％、３７度）後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、各濃度のベニカミキリフラス水抽出液／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＤＭＥＭ  １８０μＬを加えて二酸化炭素５％、３７度で３０分培養し、次に、抗原２０μＬ加えて刺激し３０分培養した後、上清２００μＬを取り出した。
このようにして取り出した上清中のロイコトリエン分泌量はLeukotriene C4 Enzyme immunoassay(EIA) Kit(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI）を用いて定量した。なお、ロイコトリエンの分泌量はロイコトリエン標準溶液（０〜１０００ｐｇ／ｍＬ）による検量線を用いて算出した。各濃度によるロイコトリエン分泌抑制効果を図２に示す。
（結果）
ＤＮＰ−ＢＳＡは、ブランクの結果である。０．６２５ｍｇ／ｍｌ以降、徐々に減少し、５．０ｍｇでは、４５ｐｇ／ｍＬという小さな結果の値を得た。このことから、ベニカミキリフラス水抽出物のロイコトリエン分泌抑制効果は、十分に確認することができた。
【００２４】
（β−ヘキソサミニダーゼ測定法）
β−ヘキソサミニダーゼ測定法の測定原理は、以下の通りである。
β−ヘキソサミニダーゼは、糖分解酵素であり、マスト細胞の顆粒中に豊富に存在するリソソーム酵素の一つである。
β−ヘキソサミニダーゼ測定法は、本酵素の存在により、ｐ−ニトロフェノールが分離する。この分離されたｐ-ニトロフェノールを比色法により測定し（４０５ｎｍ）、この結果をβ−ヘキソサミニダーゼ酵素活性とする。
（結果）
ＮＡＤＰＨ oxidase の阻害剤であるＤＰＩを用いて、β−ヘキソサミニダーゼ抑制効果を検討したところ、ＤＰＩは抗原刺激により生じたβ−ヘキソサミニダーゼを濃度依存的に抑制した。
β−ヘキソサミニダーゼ抑制効果は、ヒスタミン抑制効果と同等の評価が可能であった。
【００２５】
（β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制試験）
β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定効果は、ラット由来好塩基球菌（ＲＢＬ−２Ｈ３)から遊離されるβ−ヘキソサミニダーゼを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価することとした。
ＲＢＬ−２Ｈ３を、１０％ウシ子牛血清（ＦＣＳ)１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Minimum Ｅssential Ｍedium Ｅagleで培養（５％二酸化炭素、３７℃）した。次に、細胞培養用２４ウェル平底マイクロプレートに、２×１０５セル数（５００μＬ medium／well）づつ播種し、２４時間培養（５％二酸化炭素、３７℃）することによって、細胞を感作させた。その後、感作した細胞を５００μＬのＰＢＦで１回洗浄し、１６０μＬの５．６ｍＭグルコース、１ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ＢＳＡ含有siraganian緩衝液を加えた。各濃度のサンプル液、２０μＬの被験物質溶液（ＤＭＳＯ：０．１％）を加え、１０分後に抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ：１０μｇ／ｍＬ）を加えて１０分間インキュベートして細胞を刺激した。１０分間氷冷して反応を止めた後、上清５０μＬを、９６ウェル平底マイクロプレートに移し、酵素反応液１００μＬを加えて、混和し、マイクロプレートリ−ダ−にて吸光度を測定し、以下の式により遊離率を求めた（測定波長：４０５ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。
β−ヘキソサミニダーゼ遊離率（％）
＝［刺激により遊離したβ−ヘキソサミニダーゼ量／
細胞内全β−ヘキソサミニダーゼ量］×１００
細胞内全β−ヘキソサミニダーゼの測定には、超音波破砕機で破砕した細胞を遠心分離した上清を用いた。
【００２６】
（ヘキサン抽出物によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法）
実施例１−２のへキサン抽出物から得られた３種のオキソステロイド（スチグマスト−４−エン−３，６−ジオン、スチグマスタ−４，２２−ジエン−３オン、及びスチグマスト−４−エン−３−オン）について、β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定効果を測定した。これらについては、一応のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離測定効果を確認した。結果は、図７の通り。
【００２７】
実施例５
（水抽出物によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法）
実施例２−２で得られたベニカミキリフラスの水抽出液（竹から採取したベニカミキリフラス１０３７３ｇに、水３Ｌを加え、３時間加熱環流を行い、抽出を行った。得られた抽出物（２７．１ｇ）の一部を、Ｓhodexカラム（ＧＳ−３２０ＨＱ）により、７区画分に分画した。これら７区画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．７））について、β−ヘキソサミニダーゼ遊離測定試験を行った。
結果を、（図８）に示した。
全体に一応の活性を見ることができた。Ｆｒ．１及び２については、活性が強いことがわかった。
【００２８】
実施例６
（２４穴マルチウェル・スクリーニング法（毒性試験））
２４穴マルチウェル・スクリーニング法（高岡聡子著「組織培養入門」学会出版センタ−発行６８頁）により、本発明のベニカリキリフラスの薬剤の毒性試験を行った。
（この方法は、ＡＢＣＤ各ライン（行）及び１から６列のウェル（合計２４穴）を用意し、Ａラインについて薬剤原液０．１ｍｌを含む（Ａ１）、及び濃度が倍々に希釈され、濃度が相違する（（Ａ２〜Ａ５）、薬剤を含まない（Ａ６）を用意する。次に、細胞の浮遊液を調製する。細胞数は、５×１０４／ｍｌ程度である。各ウェルに細胞浮遊液を０．９ｍｌずつ分注する。これを水平にしたまま、左右に軽く揺すって、炭酸ガスふらん器で培養。３〜７日培養し、培地をすて、メタノールを静かに注入し、１０分以上固定。流水で洗った後、ギムザ染色を行い、染色異常が見られるかどうかで毒性を判定するものである。）
毒性試験の内容は、以下の通りであった。
（１）薬剤抽出液の作成
ベニカミキリフラス水抽出物（ベニカミキリフラス３．９ｇに、２０ｃｃの純水を添加して撹拌し、室温から１００℃直前（沸騰直前）まで加熱し、この温度において煮出した状態として、１時間保ち、室温まで冷却し、遠心分離器により（１２００ｒｐｍ．１０分間）、遠心分離を行った。上澄の清浄液を濾過滅菌し、薬剤原液を作成した。
（２）毒性試験として、前記２４穴マルチウェル・スクリーニング法を行った。
（３）使用細胞は、以下の細胞を使用した。
ＮＨＤＦ−ＮＥＯ  ＣＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＥＤ（ヒト皮膚線芽細胞  新生児）である。ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ（ＡＣＡＭＢＲＥＸ  ＣＯＭＰＡＮＹ製製造年月日:１９９９年５月１０日  Ｌｏｔ番号：９Ｆ０８８９  保証書添付のもの）
（４）培養培地は、以下の培地を使用した。
ＦＢＭ（改変  ＭＣＤＢ２０２血清添加）
（５）添加条件は以下の通りであった。
原液のマルチウェルへの添加は、１ウェルあたり、０．１ｍｌであった。
希釈は、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）により、最終濃度を、０％、１２．５％、２５％、５０％の４段階とした。
（６）培養条件
培地ＦＢＭに浮遊した細胞液０．９ｍｌを、各２４ウェルに添加した。３６℃で４日間、加温した。
（７）鑑定法
（イ）ウェル内の培地を捨て（細胞は、ウェルに接地）、直ちに、メタノールで固定後、ギムザ染色を行った。顕微鏡により観察し、写真記録を行った（図９）。
（ロ）２５ｃｍ２のプラスチック培養瓶で原液５０％を添加し、８日間観察した。また、培養後、ギムザ染色を行った。
（８）鑑定結果
（イ）以上の操作により得られた、２４穴マルチウェル・スクリーニング法による対照結果（図９）によれば、対照結果（０％）と前記最終濃度０％、１２．５％、２５％、５０％の結果と比較して、最終濃度０％、１２．５％、２５％、５０％のいずれも、増殖及び形態に変化はなく、毒性がないことがわかった。
（ロ）２５ｃｍ２のプラスチック培養瓶で原液５０％を添加し、８日間観察した結果では、増殖及び形態共に影響は見られなかった。
培養後、ギムザ染色を行った結果によれば、異常はなかった。
（９）結論
ベニカミキリフラスの水抽出液は、ヒト由来線維芽細胞に影響を与えず、薬剤として使用した場合に安全であると言うことができる。
【００２９】
実施例７
ベニカミキリフラスの水抽出物を精製水に溶解し、０．００５％濃度として、かゆみを呈する際に随時患部に塗布させ、かゆみ症状の改善状況について表１に示す結果を得た。なお、本剤使用期間中は抗ヒスタミン剤など別の抗アレルギー剤の使用は中止させた。
本発明による皮膚外用剤を塗布した症例１〜１１皮膚掻痒症、アトピー性皮膚炎、水虫、あせも、蕁麻疹、虫刺され、血液人工透析、かぶれ、刺青、しもやけ、とびひ）結果は、これら全ての症状によるかゆみに本剤が極めて有効であることを示しており、止痒効果の無い例及び塗布により症状（かゆみ及び皮膚炎など）の悪化した例は一件も認められなかった。
その結果を整理して表に整理したものが、表１である。
【００３０】
【表１】
0004450406.tif 000005
【００３１】
（結果）
以上の表の記載から明らかなように、顕著に効いたものが多く、そして、有効が若干有り、全体として顕著に効いたということができる。無効及び悪化というものは皆無であった。そして、各種の原因による痒みに有効であることが理解できる。
本調査結果について、集計方法の整理して見ると以下のことがわかる。
男女の割合は、各々５０％であり、同じである。年齢及び性別による患者の分布の状態は、図３に示すとおりである。ベニカミキリフラスの使用に関しては、水抽出物（９０％）、粉末（３％）及びその両方を併用したもの（７％）であった。
効果が現れる迄の時間は、殆ど１分から５分の間にあり、痒みに対して即効性があることがわかる（図４）。痒い症状の原因の分布は、図５に示すとおりである。この結果から、広範囲の症状に有効であることが理解できる。
【００３２】
実施例８
ベニカミキリフラス１００ｇを水１Ｌにより添加し、加熱し、煮沸した状態で３時間保持した。得られた抽出液を冷却して、水抽出液を得た。これを点鼻注入器により、１０日間にわたり、１日３回、花粉症の患者２０人に注入した。
花粉症の軽減が１４人に見られ、そのうち５人には著効があった。
【００３３】
以下に、処方例の一例を示す。本発明はこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
ローション状痒み防止・軽減剤
エタノール                                      １５．０（重量％）
ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
ベニカミキリフラス水抽出物                        ０．２
精製水                                          ８４．６
【００３４】
乳状痒み防止・軽減剤
0004450406.tif 000006
【００３５】
ゲル状痒み防止・軽減剤
ジプロピレングリコール                          １０．０（重量％）
カルボキシビニルポリマー                          ０．５
水酸化カリウム                                    ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
ベニカミキリ水抽出物                              ０．５
精製水                                          ８８．８
【００３６】
クリーム状痒み・軽減防止剤
0004450406.tif 000007
【００３７】
散剤状痒み軽減防止剤
ケイ酸アルミン酸マグネシウム                    ９５．３（重量％）
カルボキシメチルセルロースカルシウム              ４．５
ベニカミキリフラス乾燥粉末                        ０．２
【００３８】
浴用剤
炭酸水素ナトリウム                              ６３．０（重量％）
無水硫酸ナトリウム                              ３０．０
硼砂                                              ２．０
ベニカミキリフラス乾燥粉末                        ５．０
【００３９】
浴用剤
精製ホホバ油                                      ５．０（重量％）
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート      ２０．０
グリセリンモノラウレート                          ５．０
流動パラフイン                                    ２．０
ラウリン酸ジエタノールアミド                      ２．０
ベニカミキリフラス水抽出物                        ３．０
精製水                                          ６７．０
【００４０】
【発明の効果】
本発明によるベニカミキリフラスを成分として含有する皮膚外用剤、皮膚炎抑制剤、及び入浴剤は、皮膚に感ずる各種の痒み、アレルギー性の皮膚炎、アトピー性皮膚炎やアレルギー性症状、虫さされ、皮膚そう痒症の予防及び治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベニカミキリフラス水抽出物のヒスタミン遊離抑制試験の結果を示す図である。
【図２】ベニカミキリフラス水抽出物のロイコトリエン分泌抑制試験の結果を示す図である。
【図３】年齢及び性別による患者の分布の状態を示す図である。
【図４】痒みに対する改善の効果が現れるまでの時間を示す図である。
【図５】痒みの原因となる症状の分布を示す図である。
【図６】ベニカミキリフラスの抽出物分画スキーム
【図７】ベニカミキリフラスのｎ-ヘキサン抽出物によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法の結果
【図８】ベニカミキリフラスの水抽出物によるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離測定法の結果
【図９】ベニカミキリフラス水抽出物の２４穴マルチウェル・スクリーニング法によるギムザ染色の結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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