(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のファージ遺伝子の発現の結果その表面に特定のキメラコートタンパクのコピーを１つ又はそれ以上提示している提示ファージであって、
該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ候補、あるいはそのファージにとって外来である既知のタンパクドメインの変異体である結合ドメイン候補、及び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパクを提示することができるように機能する該ファージ本来の１種のコートタンパクの少なくとも一部分とからなり、
該キメラコートタンパクはさらに部位特異的プロテアーゼによって切断できるリンカーペプチドを含み、該リンカーペプチドは（ａ）該エピトープ候補あるいは結合ドメイン候補の配列と（ｂ）該本来のコートタンパクの配列との間に配置され、リンカーの切断により（ａ）が（ｂ）から遊離できることを特徴とするものである、提示ファージ。
【請求項２】
該キメラコートタンパクが該ファージの主要コートタンパクからなる、請求項１に記載の提示ファージ。
【請求項３】
該ファージが繊維状ファージである、請求項１または２に記載の提示ファージ。
【請求項４】
該繊維状ファージがＭ１３，ｆ１，ｆｄ，Ｉｆ１，Ｉｋｅ，Ｘｆ，Ｐｆ１またはＰｆ３である、請求項３に記載の提示ファージ。
【請求項５】
該繊維状ファージがＭ１３である、請求項３に記載の提示ファージ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載された提示ファージのライブラリー。
【請求項７】
Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１またはＰｆ３である繊維状ファージからなる提示ファージのライブラリーであって、各ファージが第１のファージ遺伝子の発現の結果その表面に特定のキメラコートタンパクのコピーを１つまたはそれ以上提示しており、
各キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ候補、あるいはそのファージにとって外来である既知のタンパクドメインの変異体である結合ドメイン候補、及び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパクを提示することができるように機能する該ファージ本来の１種の主要コートタンパクの少なくとも一部分とからなり、
該ライブラリーは集合的に複数のエピトープ候補又は結合ドメイン候補を提示し、
該キメラコートタンパクはさらに部位特異的プロテアーゼによって切断できるリンカーペプチドを含み、該リンカーペプチドは（ａ）該エピトープ候補あるいは結合ドメイン候補の配列と（ｂ）該本来のコートタンパクの配列との間に配置され、リンカーの切断により（ａ）が（ｂ）から遊離できることを特徴とするものである、提示ファージのライブラリー。
【請求項８】
該繊維状ファージがＭ１３である、請求項７記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
この発明は、変異させたエピトープ性ペプチド、又はポテンシャル結合タンパク質ドメインのライブラリー(集合体)のファージ表面上での発現及び提示と、親和性の高い種類を同定するためのこれら集合体のスクリーニングに係わるものである。
先行技術説明
アミノ酸配列はタンパク質の三次元構造を決定し、その三次元構造場がタンパク質の機能を決定するものである。ポリペプチド鎖上の残基のあるものは、タンパク質の三次元構造決定において他の残基より重要である。溶媒に露出しているアミノ酸の置換は、内部における置換ほど三次元構造に影響を及ぼさない。
「タンパク質エンジニアリング」はタンパク質の結合特性を変える目的でその配列を操作する技術である。タンパク質の結合に影響を与える要素は知られているが、新たな相補的な表面を作り出すことは困難とされている。
ＤＮＡ組換え技術の開発によって、天然のタンパク質をコードする遺伝子を突然変異させ、それを発現させる方法で、突然変異タンパク質を得ることが可能になった。突然変異誘発法の幾つかは既に知られている。一つは「タンパク質手術(surgery)」と呼ばれ、選ばれた遺伝子内に１つないし２つの予め決められた突然変異を導入する方法である。この方法では、予め完全に決定された単一のポリペプチドの配列が発現され、その結合上の特徴が評価される。
上記と極端に異なる方法は、ランダム突然変異法で、放射線や様々な化学物質といった比較的特異性のない突然変異原による方法である。
核酸合成法の適切なサイクル中で、塩基混合物を使って所定のヌクレオチドをランダムに変化させることができる。あるコドン中のそれぞれの位置に対する混合物中の塩基の割合により、縮重ＤＮＡの集合から発現されるポリペプチド中での各アミノ酸の出現頻度が決まる。オリファント等(OLIP86)及びオリファント及びストルール(OLIP87)は、非常に縮重したオリゴヌクレオチドの連結及びクローニングを行って、これらをプロモーターの突然変異に用いている。彼らは同じような方法がタンパク質コード領域の変化に使えるだろうと示唆している。ただし彼らは
ａ)どのように変化させるタンパク質残基を選択するべきか、又は
ｂ)どのように適切な特異性のある突然変異体を選択或はスクリーニングするべきかは述べていない。レイドハール−オルソン及びザウアー(REID88a)は合成縮重オリゴヌクレオチドを用いて２，３の残基を20種のアミノ酸全てに同時に変化させた。ヴァーション等(VERS86a、VERS86b)も参照のこと。レイドハール−オルソン及びザウアーは、一度に何個まで残基が変化させられるかについて、或いは異なったアミノ酸をコードするＤＮＡの量が同じではないという問題については触れていない。
【０００２】
多くの研究者が、変異させてない外来抗原性エピトープを天然のファージ表面タンパク質に融合させて、ファージ表面に導き、エピトープが抗体に認識されることを実証してきた。
ダルベッコ(DULB86)は、外来抗原エピトープをウイルス表面上のタンパク質に結合させ、外来エピトープが抗体に接近できるようなかたちで発現されたキメラ・タンパク質をウイルス表面上に提示する方法を提案している。1985年スミス(SMIT85)は、EcoRIエンドヌクレアーゼ遺伝子の機能しないセグメントをバクテリオ・ファージf1の「遺伝子III」(gene III)に「同期させて（in phase）」挿入したと報告した。「遺伝子III」のタンパク質は感染に必要なマイナーコートタンパク質である。スミスは、組換えファージがEcoRIエンドヌクレアーゼに対する固定抗体によって吸着させることを実証している。デ・ラ・クルツ等(DELA88)は、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)のサーカムスポロツォイト・タンパク質のリピート領域のフラグメントを「遺伝子III」タンパク質内の挿入体としてＭ13上に発現させた。彼らは、この組換えファージがウサギにおいて抗原性とともに免疫原性を示しこと、更にこのような組換えファージがＢエピトープ・マッピングに使用できることを示した。研究者たちは類似した組換えファージがＴエピトープ・マッピングやワクチンの開発に用いられ得ると提案している。
マッカファーテイ等(MCCA90)は、抗体のFvフラグメントをpＩＩＩタンパク質のＮ末端に融合させたものを発現させた。Fvフラグメントは突然変異させていない。
ラッドナー、グリック、及びバード（WO88/06630、公開1988年9月7日、米国出願07/021046に基づく優先権主張、ジーニックス・コーポレーションに譲渡)(LGB)は、ある抗原に結合できる多様な単鎖抗体ドメイン(SCAD)が次のような方法でスクリーニングできると考えている。その方法とは、単鎖抗体の結合決定領域をコードするDNAを変化させ、SCAD遺伝子をファージ・ラムダのgpＶ遺伝子内にサブクローニングしてSCAD/gpＶキメラがファージ・ラムダの外部表面に提示されるようにした上、親和性クロマトグラフィーで抗原に結合するファージを選択するものである。
【０００３】
パームリー及びスミス(PARM88)は、可能なヘキサペプチドを全て提示するエピトープライブラリーを構築し、抗体に結合するエピトープを分離するのに使用することが可能だと提案している。エピトープライブラリーを論じるにあたり著者たちは、異なるアミノ酸の出現(representation)のバランスをとることが望ましいことを示唆していない。また挿入体が外来タンパク質の完全なドメインをコードすべきであるとも教えていない。エピトープは、構造のあるタンパク質とは異なり、無構造のペプチドであると考えられている。スコット及びスミス(SCIT90)及びクワーラ等(CWIR90)は、エピトープをコードする縮重オリゴヌクレオチドをfdファージの「遺伝子ＩＩＩ」と融合させ、ファージ感染細胞に融合遺伝子を発現させることによって、目的の抗体のエピトープとなる可能性のあるヘキサペプチドをランダムに突然変異させた「エピトープライブラリー」を作成した。細胞はその表面にエピトープを提示している融合ファージを生産した。固定化抗体に結合したファージは酸で溶出され、研究された。デヴリン等(DEVL90)は同様に、M13ファージを使い、ストレプトアビジンによって認識されるランダムな15残基からなるエピトープをスクリーニングしている。
スコット及びスミス、クワーラ等、及びデヴリン等のライブラリーでは各位置ごとに可能なアミノ酸は非常に偏ったサンプリングをされている。可変部をコードする縮重オリゴヌクレオチドを設計するにあたって彼等が最も重視したのは、各位置において20種のアミノ酸全てを確実にコードできるようにすることだった。その次に考慮したのは停止のシグナルの頻度を最低限に抑えることである。その結果スコット及びスミス、及びクワーラ等はＮＮＫ(Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの同量の混合、Ｋ＝ＧとＴの同量の混合)を用い、デヴリン等はＮＮＳ(Ｓ＝ＧとＣの同量の混合)を使った。最も有利なアミノ酸に対する最も不利なアミノ酸の出現頻度比を最小にしようとする試みも、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸が生じる率を均等にしようとする試みもなかった。
【０００４】
デヴリン等は、親和性によって選択された数個のストレプトアビジン結合ペプチドの特徴を明らかにしたが、これらのペプチドの親和定数を測定しなかった。クワーラ等は彼の用いたペプチドの親和定数を測定したが、最良のヘキサペプチドでも親和性が350-300nMであり、標的抗体により認識される天然のMet−エンケファリンエピトープ(7nM)と「けた違いに」弱いことがわかり落胆した。クワーラ等は、恐らくファージ(pＩＩＩのコピーを約４個持つ)と二価ターゲットのIgＧとの間に多価の相互作用が起こるために、親和性の高いペプチドを持つファージが酸で溶出しても結合したままだったのではないかと推測している。スコット及びスミスはターゲット抗体(A2)に対する親和性が参考用のミオヘメリトリン(myohemerythrin)エピトープ(50nM)に匹敵するペプチドを発見することができた。しかし、 スコットとスミスも、ターゲットに対する融合ファージの不可逆的結合により、 親和性の高いペプチドが幾つか失われたのではないかという懸念を表している。
【０００５】
ラッドナー等（WO90/02809、ここに引用して組み込む）は、予め決められたターゲットと親和性のある新規結合タンパク質の生成及び確認のプロセスを説明している。このプロセスによると、ポテンシャル結合ドメイン(単なるエピトープ性ペプチドとは区別される)をコードする遺伝子を遺伝子エレメントと融合させるが、この遺伝子は限られた数の所定のコドンをランダムに変異させることによって得られるものであり、遺伝子エレメントは結果的にキメラ発現産物をウイルス(特に繊維状ファージ)又は細胞の外部表面に提示するものである。ついで、クロマトグラフィ選択を用いて、クロマトグラフィのターゲットに結合したタンパクをコードする融合遺伝子を含むゲノムを持っているウイルスや細胞を同定する。ラッドナー等はウイルス又は細胞がターゲットに非常にしっかりと結合しているために生存状態で溶出できない場合に、目的の遺伝子を回収する方法を幾つか検討した。それらの方法とは、細胞をその場(in situ)でクロマトグラフィのマトリックス上で生育させる、マトリックスをばらばらにして接種剤として培養器に入れる、マトリックスとターゲット物質の間の連結を分解する、 ウイルスや細胞を分解した上でそれらのＤＮＡを回収するといった方法である。しかしこれらの方法は、ターゲットに非特異的に結合しているウイルスや細胞も回収してしまう。
WO90/02809はまた変異誘発の方法を検討しており、それには20種のアミノ酸を全てほぼ同量の割合でもたらす方法も含まれているが、タンパク質ドメインの変異誘発の文脈で述べられており、エピトープ性ペプチドについてではない。
【０００６】
発明の要旨
本発明では、上述のような不備不足を克服することが意図されている。発明の実施形態の１つでは、「提示ファージ」のライブラリーが所定のターゲットに高い親和性で結合するドメインを同定するために使用されている。ポテンシャル結合ドメインはファージの表面に提示されるがこれは、ポテンシャル結合ドメインとファージが本来有するコートタンパク質のすくなくとも機能部分とからなるキメラ外部表面タンパク質をコードする融合遺伝子を発現することによって達成できる。好ましい方法は「多様化」(variegation)と呼ばれるセミランダムな変異発生のパターンを用いる。これは親結合ドメインの残基の中で、結合特性に最も影響を与えそうだがその基本構造を破壊する可能性が最も低そうな残基に変異を集中させる方法である。その結果、ある１つのファージは外来結合ドメインを１つだけ提示する(恐らく複数コピーとして）が、ファージライブラリーは全体として何千、何百万という異なる結合ドメインを提示することになる。ファージライブラリーは親和性分離技術によってスクリーニングされ、成功(高親和性の)結合ドメインのあるファージが同定され、これらのファージは回収され、特徴を調べられて、成功結合ドメインの配列を決定する。その上でこれらの成功結合ドメインは再び親結合ドメインとして、多様化及び親和性による分離に用いられるのである。
【０００７】
発明の別の実施形態では、提示ファージがその表面に、ある天然外部表面タンパク質の機能部分とポテンシャル・エピトープから成るキメラ外部表面タンパク質を提示する。これらの提示ファージから成り立っているエピトープライブラリー内では、外来エピトープに相当する領域は超可変になる(hypervariable)。このライブラリーは抗体又は他の関連結合タンパク質を用いてスクリーニングされ、親和性の高いエピトープが同定される。ポテンシャル結合ドメインの提示、変異誘発、及びスクリーニングに関する参考文献は、別途指示がない限り、ポテンシャル・エピトープの提示、変異誘発及びスクリーニングに、必要な変更を加えて(mutatis mutandis)適用される。
前述の通り、キメラコート・タンパク質のコピーが数個１つのファージ上に提示されている場合、特にターゲットが多価であれば(抗体の場合がそうである)不可逆的な結合が起こる危険がある。そのような場合、溶出勾配により最後に溶出されたファージは、最も高い親和性のあるエピトープ又は結合ドメインを有するものではなく、当初の溶出条件のもとではターゲットに結合していられるだけの親和性はあっても、不可逆的に結合するだけの親和性はない。結果として、この分野で知られている方法論では非常に親和性のある高いエピトープ又は結合ドメインを回収できない可能性がある。そういうエピトープや結合ドメインが、多くの目的にとって最も好ましい種類である。
【０００９】
これまでに知られているエピトープ提示ファージライブラリーでは、M13の野生型「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質をコードする遺伝子が、キメラ・コート・タンパク質をコードする遺伝子で置換することによってファージゲノムが変えられた。その結果、野生型「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質の正常なコピー５個がすべてキメラ・コート・タンパク質に置換された。この場合各ファージはターゲットに対し５個のポテンシャル結合個所を有しており、従って非常に高い結合性がある可能性がある。親和性の高いエピトープ(又は結合ドメイン)にあっては、これは不可逆的結合の原因となるかもしれない。
本発明における、提示ファージ、特にエピトープ提示ファージのターゲットに対する結合性を減らし、不可逆的結合の問題を緩和するための方法の１つは、ファージが二つの遺伝子、すなわちキメラコート・タンパク質をコードする遺伝子と、野生型タンパク質をコードする遺伝子をもつように操作することである。従って、同一のエピトープ又は結合ドメインを担っているファージであっても、野生型とキメラ・コート・タンパク質の分子比率が異なる場合もあり、因って異なった結合性を有する可能性がある。ライブラリーの平均比率はこれら二つの同起源遺伝子の発現レベルによって変わるだろう。
キメラ・コート・タンパク質とそれが由来する野生型・コート・タンパク質の比率を変えられた方が有利である。例えば、進化の初期段階において、ターゲットに対する結合ドメインの親和性はかなり低い。特にドメインがターゲットに対する親和性が全くない親結合ドメイン基づいていればなおさらである。
調節はキメラ遺伝子を制御可能なプロモーターのコントロール下に置くことにより達成できる。同族野生型遺伝子を、別の調節可能なプロモーターのコントロール下に置くことは可能かもしれないが、これはM13「遺伝子ＩＩＩ」の場合のように遺伝子がポリシストロン性オペロン(polycistronic operon)の一部であれば実現不可能となる。その場合、野生型遺伝子の発現は、メチオニン・イニシエーション・コドンをロイシン・イニシエーション・コドンと置換することによって削減できるだろう。
【００１０】
M13「遺伝子ＩＩＩ」は前述の通り、この繊維状ファージのマイナーなコート・タンパク質の一つをコードする(一つのファージにつき５個のコピー)。この遺伝子を変えて外来エピトープがファージ・コートに提示されるようにした人たちにより報告されている不可逆的結合の困難性を考慮すると、Ｍ13主要コート・タンパク質の使用を避けた方がよいことは明白である。しかし我々は、一つのファージにつきこの主要タンパク質のコピーが1000以上あるにもかかわらず(あるいはそうであるが故に)、主要コート・タンパク質のキメラは、実際スクリーニングの目的のためポテンシャル結合ドメインを提示させるのに役立つことを発見した。主要(ＶＩＩＩ)コート・タンパク質は同様にエピトープ・ファージのライブラリーを構築するのに役立つであろうことは間違いない。
我々はまた、ポテンシャル結合ドメイン(又はエピトープ性ペプチド)をこの主要コート・タンパク質に（恐らく他のタンパク質にも）連結するのに適したリンカーも開発した。
【００１１】
最後に、 エピトープライブラリーで経験した問題の幾つかは、アミノ酸の非常に偏った配置をもたらす変異誘発パターンを用いることから起こるということからすれば、現在の発明はまた、偏りがより少なく従ってより効率的なエピトープ・ファージライブラリーにとつながる、様々な改善されたパターンを志向すると言えよう。
【００１２】
好ましい実施形態の詳細な説明
Ｉ．提示方法
Ａ．一般的考察
本発明においては、ポテンシャル結合ドメイン(pbd)又はポテンシャル・エピトープはファージ表面においてファージのコート(外部表面)タンパク質(OSP)と融合した状態で提示される。このキメラの外部表面タンパク質はファージゲノムに挿入された提示遺伝子によって発現されたポリペプチドのプロセシング産物である。従って、１）提示遺伝子が導入できるためは、ファージのゲノムは、遺伝物質の追加に耐えうるか、又は置換してもよい遺伝物質を持っていなければならない。２)ビリオン(virion)は、遺伝物質の挿入又は置換後、ゲノムをパッケージする能力を持たなければならない。更に３)ファージ表面のOSP-IPBDタンパク質の提示は、ファージの増殖の障害となるほどのビリオン構造破壊をもたらしてはならない。
ウイルス粒子が組み立てられるとき、そのコートタンパク質は、ａ)細胞質から、ｂ)ペリプラスムから、またはｃ)脂質二重層内から、ファージに付着していく可能性がある。提示遺伝子からできたばかりの生成物は、コート・タンパク質がペリプラスム又は脂質二重層内からファージに付着していく場合には、例えば、phoＡシグナル(MKQSTIALALLPLLFTPVTKA)といった機能的分泌シグナルペプチドを、アミノ末端に持たなければならない。分泌シグナルがポテンシャル結合ドメインの提示に必要であれば、特に好ましい実施形態においては、雑種遺伝子が発現される細菌細胞は「分泌ができる」タイプの細菌である。
外来エピトープ又は結合ドメインをコードするDNA配列は、修飾後のコート・タンパク質の遊離末端が通常アミノ末端である場合は、コート・タンパク質をコードする配列の前に置くべきであり、遊離末端がカルボキシ末端である場合は後ろに置くべきである。
【００１３】
ファージの形態形成経路により、IPBDの折りたたみ(fold)が起こる環境が決まる。IPBDが必要不可欠なジスルフィド結合を有する場合、ペリプラスムで形成されるファージが好ましい。IPBDは細胞内では折りたたまれない可能性があるからである(これらのタンパク質はファージが細胞からリリースされた後に折りたたまれるだろう)。一方IPBDが大きな又は非水溶性の補欠分子団(Fe４S４クラスターなど)を必要とする場合は、細胞内で形成されるファージが好ましい。IPBDが分泌された場合、補欠分子団の欠如のために折りたたみができない可能性があるからである。
【００１４】
多様化(バリエゲーション)導入時、多重感染によって、ある一つのＰＢＤの遺伝子を持つにもかかわらず、その表面にすくなくとも幾つかの異なったＰＢＤのコピーを持つ雑種遺伝子パッケージ（GP）ができる可能性がある。結果的に低い多重感染度(MOI)となる条件下で細胞をファージに感染させることによって、この可能性を最低限に押さえることが望ましい。
あるバクテリア・ファージにとって望ましいOSPは、通常ファージ表面に最大数のコピーを持つものである。このことがOSP-IPBDの野生型に対する比率を変える際、最大の柔軟性を持たせられる上、親和性による分離を成功させる可能性が最も高いからである。更に、一つか二つのコピーの中にしか存在しないタンパク質は、通常、形態形成又は感染において必要不可欠な機能を持っている。このようなタンパク質を追加又は挿入によって変異させると、GPの生存度を低減する結果となる。しかしながら、M13gＩＩＩタンパク質のようなOSPは、PBDを提示させるOSPとして優れた選択であると言える。
野生型のosp遺伝子は保存されることが望ましい。ipbd遺伝子断片は受けいれ側のosp遺伝子の二番目のコピーに挿入するか又は新規につくられたosp遺伝子に挿入することができる。osp-ipbd遺伝子は調節プロモーターのコントロール下に置かれることが望ましい。我々のプロセスは、IPBDに由来するPBDのあるものが新しい機能、 つまり選択されたターゲットに結合するという機能を発展させるように進化を強制する。進化させる遺伝子を重複遺伝子上に置くことは、タンパク質の進化において広く認められたシナリオの模倣である。遺伝子の重複がタンパク質の先祖からあるタンパクファミリーが進化する上で第一の段階であったとすることは、現在一般的に認められている考え方である。ある遺伝子のコピーを２個持つことにより、影響を受ける生理学的過程はそのうち１個の遺伝子の突然変異を許容できる。この過程はグロブリンファミリーについてはよく理解されており、記録されている(DICK83、p65ff、及びCREI84、p117-125参照)。
【００１５】
ユーザーはipbd遺伝子断片を挿入するOSP遺伝子候補の部位を選ぶ必要がある。ほとんどのバクテリオファージのコートは非常に秩序整然としている。繊維状ファージは、螺旋形の格子といえる。等長ファージは二十面体の格子といえる。主要コート・タンパク質のモノマーは格子の交点にあり、付近のモノマーと決められた相互作用を起こす。通常の格子接触全部を形成はできないがいくらか形成することによって、格子にはまり込むタンパク質は、ａ)ビリオンの形成をだめにする。ｂ)ビリオンを不安定な状態にする。ｃ)ビリオンの間にギャップが残るので核酸が保護されないなどで、ビリオンを不安定にしやすい。従って、バクテリオファージにおいては、作られたOSP-IPBD融合タンパク質中にビリオンの他のタンパク質と相互作用をする親OSPの残基を保持することが重要なのである。Ｍ13gＶＩＩＩでは成熟タンパク質を全て保持することが望ましいが、Ｍ13gＩＩＩでは最後の100残基(又はそれ以下でもよい)を保持すれば充分である。このように短くしたgＩＩＩタンパク質は、完全なgＩＩＩタンパク質と並んで発現される。GＩＩＩタンパク質はファージの感染性に必要だからである。
提示遺伝子は既知のプロモーター、望ましくはlacUV5、 tac、 又はtrpといった調節プロモーターの下流に置く。
【００１６】
Ｂ．繊維状ファージ
繊維状ファージにはM13、f1、fd、If1、Ike、Xf、Pf1、及びPf3が含まれ、特に重要である。通常のクローニングと配列決定用ベクターである繊維状ファージM13のライフサイクル全体はよく理解されている。M13の遺伝子構造(SCHA78)はビリオンの物理的構造(BANN81、BOEK80、CHAN79、ITOK79、KAPL78、KUHN85b、KUHN87、MAKO80、MARV78、MESS78、OHKA81、RASC86、RUSS81、SHA78、SMIT85、WEBS78、及びZIMM82)とともに知られている。コート・タンパク質の構造及び機能に関する最近の検討は、RASC86を参照のこと。
マービン及び共同研究者(MARV78、MAKO80、BANN81)は、近縁のファージf1のおよその三次元ビリオン構造を、遺伝学、生化学、及びウイルスファイバーのＸ線回折を組み合わせて調べた。図２はバナー等(BANN81)のモデルに従って描かれたもので、タンパク質のCαｓのみしか示していない。円筒形のさやの中の穴のようなものは実際はタンパク質の側鎖によって満たされており、その中のDNAを保護している。タンパク質の各モノマーのアミノ末端はこの円筒の外側にあり、カルボキシ末端はDNAの近くの、より狭い範囲にある。他の繊維状ファージ(例えばPF1又はIke)はへリックスの対称性が異なるが、全て、多くの短いα−へリックスモノマーからなるコートをもっており、各モノマーのアミノ末端はビリオンの表面にある。
【００１７】
１．Ｍ13主要コート・タンパク質(gＶＩＩＩ)
Ｍ13の主要コート・タンパク質は「遺伝子ＶＩＩＩ」(gene VIII)によってコードされる。50個のアミノ酸からなる成熟した遺伝子ＶＩＩＩコート・タンパク質は、アミノ酸73個のプレコートとして合成される(SCHA78、ITOK79)。最初の23個のアミノ酸は、できたばかりのポリペプチドを細胞膜内に挿入する典型的なシグナル配列を構成する。プレコートが自然に膜内に入るのか、それともホストの分泌因子、例えばSecAやSecYなどの作用で入るのかは今なお議論の対象であるが、本発明の操作には何ら影響を及ぼさない。
E.coliシグナル・ペプチターゼ(SP-I)はアミノ酸18、21、 及び23を認識し、 残基22もある程度認識して、プレコート(KUHN85a、KUHN85b、OLIV87)の残基23及び24の間を切断する。シグナル配列が除去された後、成熟コートのアミノ末端は内膜のペリプラスム側に位置し、カルボキシ末端は細胞質側に位置する。アミノ酸50個からなる成熟コート・タンパク質のコピー約3000個が膜内で並んで集まっている。
我々は、以下の三部に分かれた遺伝子を構築した。
１)(２)及び(３)が内膜を通じて分泌されるよう導くシグナル配列をコードするＤＮＡ
２)成熟ＢＰＴＩ配列をコードするＤＮＡ
３)成熟Ｍ13gVIIIタンパク質をコードするＤＮＡ
この遺伝子は活性型のBPTIをＭ13ファージ表面上に出現させる。
【００１８】
２．Ｍ13マイナー・コート・タンパク質一般
導入された結合ドメイン又はエピトープは繊維状ファージ上にキメラマイナーコートタンパク質の一部として提示することもできる。これらは「遺伝子ＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩ、及びＩＸ」によってコードされ、それぞれはビリオンあたり約５個のコピーが存在し、形態形成又は感染に係わっている。対照的に、主要コート・タンパク質は一つのビリオンあたり2500個以上のコピーが存在する。「遺伝子ＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩ、及びＩＸ」タンパク質はビリオンの端に存在する。
３．Ｍ13gIIIマイナー・コート・タンパク質
一本鎖環状ファージＤＮＡは、「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質のコピー約５個と結合して、膜結合コート・タンパク質のパッチを通して、ＤＮＡがタンパク質の螺旋状のさやに閉じ込められるようなかたちで押し出される(WEBS78)。ＤＮＡは(ウイルスのゲノムを大きく制限するような)塩基対をつくらず、塩基は配列と無関係に相互に介入し合う。
スミス(SMIT85)及びデ・ラ・クルツ等(DELA88)は、「遺伝子ＩＩＩ」に挿入すると、新規タンパク質ドメインがビリオンの外部表面に現れることを示した。ミニ・タンパク質の遺伝子を「遺伝子ＩＩＩ」に融合させる部位は、スミス及びデ・ラ・クルツ等が使用した個所、別のドメイン領域に対応するコドン、タンパク質の表面ループ、或いは成熟タンパク質のアミノ末端がある。
【００１９】
出版された文献ではすべてfdの単一の「遺伝子ＩＩＩ」を変化させたものを含むベクターが用いられている。従って、gＩＩＩのコピー５個は全部同じ変化をしている。「遺伝子ＩＩＩ」はかなり大きいので(1272b.p,又はファージ・ゲノムの約20％)，遺伝子全体を重複させて安定した状態でファージに挿入できるかどうかは確かでない。更に、gＩＩＩタンパク質のコピー５個は全てビリオンの一端に集中している。二価ターゲットの分子(抗体など)が五価のファージと結合するとき、結果としてできた複合体は不可逆的となる。ファージのターゲットへの不可逆的結合は、ターゲットに対して最も高い親和性を持っている新規ポリペプチドをコードする遺伝子配列を有するＧＰを親和性により濃縮することの妨げとなる。
不可逆的な複合体の形成を抑制するためには、ＩＩＩのカルボキシ末端部分のみをコードする第２の合成遺伝子を用いることができる。例えば以下のエレメントから成る遺伝子を作り出すこともできる。(5′から3′の方向で)
１)プロモーター(調節されているものが望ましい)
２)リボゾーム結合部位
３)開始コドン
４)内膜を通り抜けて以下の５）と６）の部分が分泌されるように指示する機能的なシグナル・ペプチドをコードする配列
５)ポテンシャル結合ドメインをコードするＤＮＡ
６)Ｍ13gＩＩＩタンパク質の残基275から424までをコードするＤＮＡ
７)翻訳終了コドン
８)(オプション)転写終了シグナル
【００２０】
gＩＩＩタンパク質では、アミノ末端側部分が繊毛結合に関与しており(感染性)、カルボキシ末端側部分がパッケージングにかかわっている。従って、上述のキメラgＩＩＩタンパク質はウイルスのコートに組み上げられることはできるが、感染性には関与しない。
野生型の「遺伝子ＩＩＩ」は残しておくので、元のままの「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質が存在する。
このようにして雑種の遺伝子は、シグナル配列(例：細菌phoA又はbla遺伝子或いはＭ13ファージ「遺伝子ＩＩＩ」のシグナル配列)、少なくとも繊維状ファージ(例：Ｍ13)のコート・タンパク質(例：Ｍ13「遺伝子ＩＩＩ」又は「遺伝子ＶＩＩＩ」タンパク質)の機能的部分をコードするＤＮＡ、およびこれら２つに機能的に連結されたポテンシャル結合ドメインをコードするＤＮＡ、とからなっていてもよい。発現された物はホスト細胞の内膜(脂質二重層)に輸送され、そこでシグナル・ペプチドが切断されてプロセシングを受けた雑種タンパク質ができる。この雑種タンパク質のコート・タンパク質に似た部分のＣ末端は、脂質二重層に捕らえられて、この雑種タンパク質はペリプラスム空間に出られない(これは野生型コートタンパク質に特徴的に見られる)。新生ファージ粒子の一本鎖ＤＮＡは、ペリプラスム空間に入る際、脂質二重層から野生型・コート・タンパク質と雑種タンパク質の両方を集める。雑種タンパク質はこのように、ポテンシャル結合ドメインを繊維状ファージ表面に剥き出しにしたまま、ファージの表面外被に取り込まれる（phaged）。
【００２１】
４．Pf3のコート・タンパク質
他の繊維状ファージにおいても同様な構築物をつくることができる。  Pf3はIncP-1プラスミッド(plasmid)を持つ緑膿菌細胞に感染するよく知られた繊維状ファージである。ゲノムは全て配列が決められ(LUIT85)、複製と形成に係わる遺伝子シグナルは知られている(LUIT87)。Pf3の主要コート・タンパク質は、分泌を指示するシグナル・ペプチドを持たないという点が普通でない。 配列には荷電残基ASP7、ARG37、LYS40、及びPHE44-COO−１があり、これらは外に出たアミノ末端と一致する。従って、IPBDがPf3の表面に現れるようにするために、以下から成る三分割遺伝子を構築する。
１)緑膿菌に分泌を起こさせることが知られているシグナル配列(IPBDの分泌を生じさせるものとして知られていることが望ましい)
２)IPBD配列をコードする遺伝子断片
３)成熟したPf3コート・タンパク質をコードするＤＮＡ
（ここで１）は２）に、２）は３）に読み取り枠を合わせて融合されている）
更に、アミノ酸１個から10個からなるフレキシブル・リンカーをコードするＤＮＡをipbd遺伝子断片とPf3コート・タンパク質遺伝子との間に導入してもよい。また、特異的プロテアーゼ、例えば組織プラスミノーゲン(plasminogen)アクチベーター又は血液凝固因子Xaなどの認識部位をコードするＤＮＡをipbd遺伝子断片とPf3コート・タンパク質遺伝子との間に導入してもよい。特異的プロテアーゼの認識部位を形成するアミノ酸はまたフレキシブル・リンカーとしても機能する。この三分割遺伝子は、いかなるPf3遺伝子の発現も邪魔しないようにPf3に導入される。遺伝子組換えの可能性を減少させるため、(3)部は野生型の遺伝子からみて多くの沈黙突然変異を持つように設計されている。シグナル配列が切り落とされるとIPBDはペリプラスムに存在するようになり、成熟コート・タンパク質はアンカー及びファージ形成シグナルとして働く。この融合タンパク質が野生型・コート・タンパク質がたどるルートと異なるルートによって脂質二重層に入り、留まるようになってもかまわない。
【００２２】
遺伝子の構築
提示遺伝子の構造コード配列は、キメラ・コート・タンパク質と必要な分泌シグナルをコードする。「キメラ・コート・タンパク質」とは第一のアミノ酸配列(基本的には、少なくともファージ・コート・タンパク質の機能的部分に相当する)と第二のアミノ酸配列、例えば第一アミノ酸のいかなるドメインとも異なり、実質的に相同でないものとの融合体である。キメラ・タンパク質は外来ドメインを提示する場合があるが、この外来ドメインとは、第一のタンパク質を発現している生体内に（第１のタンパク質にではなく）見出されるドメインであるか、あるいは異なった種類の生物によって発現されるタンパク質構造の「種間」、「属間」の融合体であることができる。外来ドメインは第一のアミノ酸配列のアミノ又はカルボキシ末端に(スペーサーを介して又は介さずに)来てもいいし、第一のアミノ酸配列の途中に入ってもよい。第一のアミノ酸配列はファージの表面タンパク質の１つと完全に一致してもいいし、例えば結合ドメインを提示できるように変化させてもよい。
ipbd遺伝子をosp遺伝子に挿入するのに理想的な個所は、a)IPBDが元の形に折りたたまれるところ、b)OSPドメインが元の形に折りたたまれるところ、及びc)２つのドメイン間の抵触がないところである。
OSPのアミノ又はカルボキシ末端が溶媒にさらされていることを示す、ファージのモデルがある場合には、成熟OSPのその末端はipbd遺伝子を挿入するための第一候補となる。低解像度三次元モデルで十分である。
三次元構造モデルがない場合でも、成熟OSPのアミノ及びカルボキシ末端はipbd遺伝子の挿入用として最良の候補である。機能的融合をするには、ドメイン間の不要な相互作用を避けるため、IPBD及びOSPドメイン間に残基の追加が必要な場合もある。必要であれば、ランダム配列DNA、又はIPBD又はOSPに相同なタンパク質の特定配列をコードするDNAをosp断片とipbd断片の間に挿入することができる。
【００２３】
OSP内におけるドメイン境界での融合もまた機能的融合を得るための理想的なアプローチである。スミスは、異種DNAをf1の「遺伝子III」にサブクローニングする際にそのような境界を利用している(SMIT85)。
IPBDを提示させるのに適したOSPドメインを決める基準は、IPBDを同定する際に用いられる基準と多少異なっている。OSPを決める際に最小サイズはそれほど重要でない、というのもOSPドメインは最終的な結合分子中には存在しないし、多様化のラウンドごとに遺伝子を繰り返し合成する必要もないからである。設計上の重要事項は次のとおりである。ａ)OSP::IPBD融合でIPBDが提示されること。ｂ)最初の遺伝的構築体が適度に便利であること。及びｃ)osp::ipbd遺伝子が遺伝的に安定で操作が容易であること。ドメインを同定する方法はいくつかある。原子座標による方法はジャニン及びコーシア（JANI85）によって検討されている。これらの方法はαカーボン(Ｃα)の間の距離、分割平面(ROSE85参照)、又は埋没表面のマトリックスを用いる。コーシアとその共同研究者は、多くの天然タンパク質の挙動をドメイン構造と相互関連させた(彼らの定義に基づく)。ラッシンは、サーモライシンの残基206-316から成るドメインの安定性について正確に予測した(VITA84、RASY84)。
多くの研究者は、安定したドメインを単離し同定するため、部分的なタンパク質分解及びタンパク質配列分析を用いている。(例えば、VITA84、PATE83、SCOT87a、及びPABO79を参照のこと)  パボ等は、コリファージからのｃＩリプレッサが二つのドメインを含むことを示すインジケーターとして熱量測定を用い、更にドメイン境界を知るため、部分的なタンパク質分解を使った。
唯一利用できる構造上の情報が候補に上げられたOSPのアミノ酸配列のみであるならば、我々はターンやループを予測するためにその配列を使うことができる。ループやターンのいくつかは正確に予測される確率が非常に高い。(チュー及びファスマン(CHOU74)参照)  これらのロケーションはまたipbd遺伝子の一部を挿入する個所の候補である。
【００２４】
１個又はそれ以上の新しいドメインをタンパク質に融合させると、細胞から出される新しいタンパク質の機能が、親タンパク質の機能と違ってくるかもしれない。野生型・コート・タンパク質のシグナル・ペプチドは本来のポリペプチドのためには機能できても、融合体を外に出すよう指示することはできないこともある。Sec依存性経路を使うためは、異なるシグナル・ペプチドを要する場合がある。従ってキメラBPTI/M13「遺伝子III」タンパク質を発現し提示させるには、異種シグナル・ペプチド(この場合はphoA)を用いる必要性があることを我々は見出した。
ペプチドを提示するファージは、ターゲット、殊に多価ターゲットから溶出させることが困難である。ある特異的プロテアーゼ、例えば血液凝固因子Xaの切断部位を融合タンパク質に導入し、結合ドメインが遺伝子パッケージから分離され得るようにできる。このような分離には、結果として得られたファージ全てが同じコートタンパク質を有し、そのため同じ感染力を有するという利点がある。たとえポリペプチドを提示しているファージが親和性マトリックスから切断なしに溶出できる場合でもである。この工程は、別の方法では失われてしまうかもしれない、価値ある遺伝子の回収を可能にする。我々の知る限りにおいては、情報を含む遺伝子パッケージを回収したり、あるいは感染力が異なるファージの集団を類似した感染力を持つファージに転化させる方法として、特異的プロテアーゼを用いることを発表したり提案した者はだれもいない。
【００２５】
特異性の高いプロテアーゼが数多く存在する。本発明はある特定のプロテアーゼに関するものではないが、切断条件下ではリンカーは切断するが、ファージの生存に欠かせないポリペプチド、又は(非常に珍しいケースを除き)ポテンシャル・エピトープ／結合ドメインは切断しないようにするため、プロテアーゼは十分特異的であることが望ましい。例えば低温などといった特定の切断条件を選ぶと、条件外では不適切なプロテアーゼの使用を可能にすることもできる。
血液凝固及び補体システムには多くの非常に特異なプロテアーゼが含まれている。通常、カスケードの初期段階における酵素は、後の段階のものより特異性が高い。例えば因子Ｘa(FXa)はトロンビンより特異性が高い。(COLM87表10-2参照)ウシのF・XaはIle-Asp-Glu-Gly-Argの後ろを切断するが、ヒトのF・XaはIle-Asp-Gly-Argの後ろを切断する。どちらのプロテアーゼ-リンカーのペア組み合わせを使用してもよい。トロンビンが使われる場合、最も望ましいトロンビン感受性のリンカーはフィブリノーゲン、因子ＸＩＩＩ、及びプロトロンビン中に見出されるものである。リンカーの配列を、トロンビンを得た種から取ることが望ましい。例えば、もしウシのトロンビンを使用する場合、ウシのフィブリノーゲン又はウシのF.ＸＩＩＩからとられたリンカーを使うべきである。
ヒトの因子ＸＩaは、ヒトの因子ＩＸを二個所で切断する（COLM87、p.42)：
ＱＴＳＫＬＴＲ１４５／ＡＥＡＶＦ及び
ＳＦＮＤＦＴＲ１８０／ＶＶＧＧＥである。
従って、上記二つの配列（特に下線を引いた部分）のうちどちらでもPBD及びGP表面アンカー・ドメイン(GPSAD)のあいだのリンカーとして組み込んで、これらを切り出すのにヒトのF.ＸＩaを使うことができる。
ヒトのカリクレイン(kallikrein)はヒトのF.ＸＩＩをＲ353において切断する。(COLM87、p.258)
ＬＦＳＳＭＴＲ３５３／ＶＶＧＧＬＶ
この配列は上に示したhF.XIに非常に類似している。SSMTRVVGの配列をPBDとGPSADの間のリンカーとして組み入れ、ヒトのカリクレインでPBDをGPから切り出すことが可能である。
ヒトのF.XIIはヒトのF.XIをR369で切断する(COLM8、7p.256)：
ＫＩＫＰＲ369／ＩＶＧＧＴ。
KIKPRIVGをPBDとGPSADの間のリンカーとして組み込むことができる。ついでPBDはGPからhF.XIIで切り出される。
【００２６】
結合タンパク質を切り出すのに用いられてきた他のプロテアーゼには、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、キモシン、ウロキナーゼ、レニン、及びある種のシグナル・ペプチダーゼが含まれる。Rutter、US 4,769,326を参照のこと。
求めるものがプロテアーゼ阻害剤の場合は、ターゲットプロテアーゼや似たような基質特異性を持つ他のプロテアーゼは、PBDをGPから開裂するために用いるには適切ではない。ターゲットプロテアーゼの基質に似ているリンカーは提示ファージのどこにも組み込んではいけない。なぜなら優れた結合体を集団から分離するのが不必要に難しくなるからである。
リンカーの部位特異的開裂に立体障害がある場合、開裂部位が剥き出しになるようにそのリンカーを修飾することができる。例えば、複数のグリシン（柔軟性を増すため）やプロリン（最大限の伸張のため）を開裂部位とひとまとまりのタンパク質の間に介在させることによって行う。GUAN91ではグリシンの豊富なリンカー（PGISGGGGG）をトロンビン開裂部位(LVPRGS)の直ぐ後ろに導入することによって、ＧＳＴ融合タンパク質のトロンビンによる開裂を改善した。適切なリンカーはまた多様化−選択手法によって同定することもできる。
遺伝子の調節部の配列は、天然の調節エレメント（要素）：ａ）プロモーター、ｂ）シャイン／ダルガルノ配列、ｃ）転写ターミネーターなどの配列からとる。調節エレメントはまた、天然の調節領域のコンセンサス配列の知識に基づいて設計することもできる。これらの調節エレメントの配列はコード領域に連結される。制限部位もまた操作を容易にするために、調節領域の隣または中に挿入される。
【００２７】
親和性分離の基本的機能は、ターゲットとの親和性が高い、(IPBDから生じた)PBDを有するGPを、ターゲットとの親和性が低いGPから分離することである。ファージの溶出してくる液量がファージ表面にあるPBDの数に左右されるのであれば、親和性が低いPBDを多数有するファージ、すなわちGP(PBDw)は、より親和性の高いPBDを少数有するファージ、即ちGP(PBDs)と一緒に溶出してくる可能性がある。提示遺伝子の制御は、親和性に応じてきちんと分離されるように、ほとんどのファージがPBDを十分提示するようなものであることが望ましい。調節プロモーターを用いて提示遺伝子の発現レベルをコントロールすると、多様化された集団のクロマトグラフィ上での挙動を精密に調節できる。  操作した遺伝子の生菌細胞における合成誘導は、調節プロモーター、例えばlacUV5、trpP、又はtacなどを用いて実施されてきた(MANI82)。合成されるタンパク質の量を調整する要因は、かなり十分に理解されており、現在では広範囲に及ぶ異種タンパク質がE.coli,B.subtilis等のホスト細胞において、少なくともある程度の量で生産できるようになった（SKER88,  BETT88)。提示遺伝子のプロモーターは、少量の化学誘導剤によって調節される。例えば、lacプロモーターとハイブリッドtrp-lac(tac)プロモーターは、イソプロピル・チオガラクトシド(IPTG)によって調節される。構築された遺伝子のプロモーターは天然osp遺伝子から取る必要はない。バクテリアにおいて機能する調節可能なプロモーターであれば何でもよい。漏れのないプロモーターが望ましい。
合成される遺伝子のコード部分は、タンパク質レベルで設計され、DNAにコード化される。DNA配列を考案する上での主要な課題は、望ましい多様なポテンシャル結合ドメイン（又はエピトープ）の集団を得ることであるが、制限部位を供給してさらなる遺伝子操作を容易にすること、組換えと自然突然変異の可能性を最低限にすること、選択されたホスト細胞において効率的な翻訳ができるようにすること、なども考慮する。
【００２８】
本発明はDNA合成又は構築における方法に特に限定はない。従来のDNA合成機も、多様化DNA生産にあわせて試薬を適当に変えれば使用できる（現在、混合プローブの生産に用いられる方法と類似したもの）。
ファージは遺伝子操作され、例えばE.coli, B.subtilis, P.aeruginosaといった増幅に適したホスト細胞にトランスフェクト（移入）される。本発明ではDNAによる細胞の形質転換の方法や、ホスト細胞には限定はない。
【００２９】
イニシャル・ポテンシャル結合ドメイン（ＩＰＢＤ）
本発明のおかげで、抗体の抗原結合個所以外のターゲットに結合できるタンパク質が得られるようになった。付記する請求項の目的として、ある抗体の可変ドメインでないターゲットに関し、解離定数Kd(P,A)＜10−６モル／リットル(＜10−７モル／リットルの方が望ましい)であるならば、タンパク質Ｐは結合タンパク質である。「抗体の可変ドメイン」の除外は、この目的のためタンパク質が抗原性であるというだけでは「結合タンパク質」と考慮されないことをはっきりさせるためである。しかしある抗原は、酵素とその基質、又はホルモンとその細胞受容体といったように、抗体以外の物質と特異的に結合するため、結合タンパク質に値する可能性がある。更に、「結合タンパク質」には、スタフィロコッカスのプロテインＡのように抗体のFcに結合するタンパク質が含まれることも指摘されるべきであろう。
本発明は、抗体の可変ドメインにおける超可変(hypervariable)領域に相応するコドンの多様化を通して新規抗体の開発に使うことも可能であるが、主に抗体ではない、又は抗体の可変ドメインでもない結合タンパク質の開発に使用される。新規抗体は免疫学的技術によって得られるが、新規酵素やホルモンなどは得られない。
ほとんどの大型タンパク質は折りたたまれて、識別可能なドメインと呼ばれるいくつかの小球構造をとる。提示戦略は、まずそれに対する親和性分子(抗体でもよい）が利用できる、安定な、構造のあるドメイン(「イニシャル・ポテンシャル結合ドメイン」、ＩＰＢＤとよぶ)を提示するようにファ−ジを遺伝的に変化させることである。変更の成功度は、例えば変えられた遺伝子ファージが親和性分子に結合するかどうかを知ることによって測定できる。原子結合やタンパク質配列の相同性を完全に無視するわけにはいかないものの、ＩＰＢＤの同定という目的のためには、「ドメイン」の安定性、即ち温度の上昇やカオトロピック動因など混乱させる力に直面した時、全体構造を保持すること、を強調する定義付けが好まれる。タンパク質のあるドメインが、そのタンパク質がターゲットに結合する能力を主に左右する場合、本書では「結合ドメイン」(ＢＤ)と称する。
【００３０】
ＩＰＢＤは、広範囲な突然変異に対する受容度を考慮した上で選択される。一たびＩＰＢＤをファージ上に提示でき、親和性による選択にかけることができることがわかれば、ＩＰＢＤをコードする遺伝子について多重突然変異誘発の特別なパターン−本書で「多様化(バリエゲーション)」と呼ぶ−を行う。  適切なクローニングと増幅を行うと、それぞれ１つのポテンシャル結合ドメイン(ＩＰＢＤの変異体)を提示する多数のファージ集団ができる。この集団は全体として、構造的に関連しているが、多数の異なるポテンシャル結合ドメイン（ＰＢＤ）を提示するものである。それぞれの遺伝子ファージは、そのファージ上に提示されたＰＢＤをコードするpbd遺伝子を持っている。それから、親和性による選択を用いて望ましい結合特性のあるＰＢＤを持つ提示ファージを同定する。ついでこれらの提示ファージは増幅できる。親和性選択及び増幅による豊富化(enrichment)を１又は２サイクル行った後、成功結合ドメイン(SBD)をコードするＤＮＡを選択されたファージから回収することができる。必要があれば、多様化の最終ラウンドにおけるSBDを次世代のＰＢＤの「親ポテンシャル結合ドメイン」(ＰＰＢＤ)として用いることにより、SBDを持つファージのＤＮＡを更に「多様化」することができる。このプロセスは、実験者が結果に満足するまで繰り返し行うことができる。その時点では、ＳＢＤは化学合成を含む従来のどの方法でＳＢＤを作ってもよい。
イニシャル・ポテンシャル結合ドメインは：１）天然において生じるタンパク質のドメイン、２）天然に生じたものではないが、配列は実質的に天然のドメインに相応するが、配列中一つ又は二つの代替、置換、又は欠失があり、天然ドメインと異なるドメイン、３）実質的に２つ又はそれ以上の天然タンパク質のハイブリッドに配列が相当するドメイン、又は、４）アミノ酸ジオメトリー及びアミノ酸の二次構造の優先性に関する統計的証拠の知識に基づいた論理的基盤のみによって設計された人工的ドメインである。(しかし、論理に基づいた（a priori）タンパク質設計の限界が本発明のきっかけとなったのである。)  通常、ドメインは結合ドメイン、又は少なくともそれの同族であるが、既知の結合活性を持たないけれども、それに結合活性を与える裂溝や溝などの二次またはそれ以上の高次構造を持つタンパク質に由来するドメインであってもよい。ＩＰＢＤが由来するタンパク質はターゲット物質に特異的親和性を持つ必要はない。
【００３１】
複数の配列が「実質的に一致する」と見るべきかどうかを決める上で考慮すべきことは、次の点である。標準アルゴリズムにより最もよくあてはまるよう並べられた時の親和性の程度、架橋（ジスルフィド結合など）の接続パターンにおける類似性、タンパク質が例えばＸ線回折分析又はＮＭＲに示されるようにどの程度似た三次元構造をもっているか、及び配列が決められたタンパク質がどの程度類似した生物活性を持っているかという点である。この意味で、セリンプロテアーゼの阻害剤には、相同であると認められたタンパク質のファミリーであって、メンバーの中にたった３０％の配列相同性しか持たないペアがあるファミリーがいくつもあるということに留意すべきである。
ＩＰＢＤの候補は以下の基準を満たさなければならない。
１）意図された使用条件下で安定なドメインが存在すること（ドメインは挿入されるタンパク質全体からなっていてもよい。例：ＢＰＴＩ、αーコノトキシンＧＩ、又はＣＭＴＩ−ＩＩＩ）。
２）アミノ酸配列の知識が得られること。
３）ＩＰＢＤ、ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）に特異的で高い親和性がある分子が得られること。
多様化を推し進めるにあたり、ドメインの外部表面上にある残基がなんであるか及びその空間における関係についての情報があることが望ましい。しかし、この考察は結合ドメインが小さい場合、例えば40以下の残基であればそれ程重要でない。
【００３２】
ＩＰＢＤは必要以上に大きくないことが望ましい。なぜなら小さいＳＢＤ（例えばアミノ酸40個以下）は化学的に合成でき、小さいアミノ酸配列中には制限部位を設けるのが容易だからである。残基40個以下のＰＢＤにおけるさらなる利点は、多様化された遺伝子全体が１つとして合成されることである。その場合、osp遺伝子内に適切な制限部位を設けるだけでよい。より小さいタンパク質は、ファージ又はＧＰのホストにおける代謝疲労を最低限に抑える。ＩＰＢＤは残基200個以下であることが望ましい。ＩＰＢＤは更に、ほどほどの結合親和性と特異性を備えられるだけの大きさがあることが望ましい。ジスルフィド結合のような共有クロスリンクが欠如しているＩＰＢＤにとっては、ＩＰＢＤは残基が最低40個あることが望ましい。クロスリンクがあれば残基は６個でもよい。
ＩＰＢＤの候補物質は多くある。例えばウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ、残基58個)、CMTI-III(残基29個)、クランビン(残基46個)、オボムコイドの第三ドメイン(残基56個)、熱安定エンテロトキシン(E.coliのST-Ia)(残基18個)、α-コノトキシンGI(残基13個)、μコノトキシンGIII(残基22個)、コナス・キングコング・ミニ・タンパク質(残基27個)、T4リゾチーム(残基164個)、及びアズリン(残基128個)である。表５０には望ましいＩＰＢＤのリストがある。
場合によっては、他の基準が十分に満たされていなくてもターゲットに親和性のあるタンパク質が望ましいＩＰＢＤであることもある。例えばＣＤ４のＶ１ドメインは、HIVのgp120に結合するタンパク質のためのＩＰＢＤとして適切な選択である。Ｖ１の42から55までの領域における変異がgp120の結合に強い影響を与えること、その他の変異は影響がずっと少ないか、またはＶ１の構造を完全に破壊してしまうことが知られている。同様に、TNF受容体に対して高い親和性を持つTNF様の分子がほしい場合は、腫瘍壊死因子(TNF)が初期の選択として適切である。
【００３３】
表面における変異であってもPBDの安定性を低下させるかも知れないので、選択されたIPBDの融解温度は高くなければならず(50℃は許容できる最低限の温度であり、高ければ高いほどよい。BPTIは95℃で融解する)、また広いｐＨの範囲で安定でなければならない。そうすれば、選択されたIPBDから突然変異及び結合による選択によって生じたSBDが十分な安定性を保てるからである。多様なPBDを作り出しているIPBD中の置換がドメインの融解点をおよそ40℃以下には下げないことが望ましい。IPBDにくらべSBDの安定性を高める突然変異が起こることがあるが、本発明のプロセスではこのことに依存していない。多数のジスルフィドのような、共有クロスリンクを含むタンパク質は通常十分安定している。20個の残基ごとに少なくとも二つのジスルフィドを含むタンパク質と、少なくとも一つのジスルフィドを含むタンパク質は十分な安定性があると考えられている。
ターゲットがタンパク質又はその他の巨大分子である場合、ＩＰＢＤの具体的物質は、Cucuebuta maximaトリプシンインヒビターＩＩＩ(残基29個)、Bos TaurusのBPTI(残基58個)、菜種のクランビン(残基46個)、又はCoturnix coturnix Japonica(日本ウズラ)のオボムコイドの第三ドメインといった、小さいタンパク質であることが望ましい。このクラスのターゲットは、小さいタンパク質を非常に特異的なやりかたで受け入れる裂溝や溝があるからである。ターゲットがでんぷんのように巨大分子で緊密な構造を欠くものであれば、小さい分子のように扱わなければならない。コラーゲンのような明確な三次元構造を持つ伸張した巨大分子は、大きい分子として扱うべきである。
ターゲットがステロイドのように小さい分子であれば、IPBDの具体化物質は80から200個の残基からなるタンパク質であることが望ましい。Bos taurusのリボヌクレアーゼ(残基124個)、Aspergillus orizaeのリボヌクレアーゼ(残基104個)、Gallus gallusの鶏卵白リゾチーム(残基129個)、 Pseudomonas aerugenosaのアズリン(残基128個)、 又はT4リゾチーム(残基164個)などがその例である。なぜならこのようなタンパク質は小さいターゲット分子が入れる裂溝や溝があるからである。ブルックハーベン・タンパク質データバンクにはリストにあるタンパク質全ての三次元構造が含まれている。T4リゾチームほどの大きさのタンパク質をコードする遺伝子は、この発明の目的のため標準的技術によって操作することができる。
【００３４】
ターゲットがミネラルで、水に溶けない場合、そのミネラルの分子の表面の特性が考慮される。結晶シリコンのように表面がスムーズなミネラルは、ＩＰＢＤとしてリボヌクレアーゼのような中型から大型タンパク質を用いるのが最適である。十分な接触領域及び特異性を確保するためである。ゼオライトのように荒い、溝のある表面のミネラルはBPTIのような小型のタンパク質又はT4リゾチームのようなより大きいタンパク質のどちらとでも結合され得る。
BPTIは全ての基準を満たすか又はそれ以上の機能があり、特に望ましいIPBDである。これは小さく、大変安定したタンパク質で、よく知られた三次元構造を持っている。
小さいポリペプチドは、治療または診断用薬剤として使われた場合、大きいポリペプチドと比べて下記のような利点があると思われる（以下の利点のみに限られてはいない）。
ａ）細胞に対する浸透がより優れている。
ｂ）体循環からより速く除去される。（造影剤にとって重要である）
ｃ）抗原性がより低い。
ｄ）質量あたりの活性が高い。
従って、多様化と親和性選択の方法を組み合わせて、選択されたターゲットに結合する小さいポリペプチドを同定できることが望ましい。
しかし、このサイズのポリペプチドは結合分子としては不利な点がある。オリベラ等(OLIV90a)によると、「このサイズ範囲のポリペプチドは通常、多くのコンフォーメーション（立体配座）間で均衡状態を保っている(固定された構造を持つためには、タンパク質は一般的にもっとずっと大型でなければならない)」ということである。ペプチドがターゲット分子に特異的に結合するには、ペプチドは、結合個所に対して相補的なあるコンフォーメーションを取ることが必要である。
【００３５】
実施形態の１つでは、本発明は小さいポリペプチドの利点を保ちながら、望ましい結合特性を持つ新規ミニ・タンパク質の生合成を促進することにより、これらの問題を克服することができた。ミニ・タンパク質は小さいポリペプチド(通常残基が60個以下である。40個以下(「マイクロ・タンパク質」)であればより望ましい)である。これは非共有結合力だけで安定した構造を持つには小さすぎるが、共有結合的にクロスリンクされて(例：ジスルフィド結合により)安定した構造になっており、従って、同じぐらいの大きさの拘束されていないポリペプチドより、むしろもっと大きいタンパク質分子に見られる生物活性を持つ。
ミニ・タンパク質が多様化される時、親分子内に共有結合的にクロスリンクされた残基はそのまま残されるため、構造を安定化する。例えば、ジスルフィド結合をもつミニ・タンパク質の多様化において、一定のシステインは不変であるため、発現及び提示の状況下で、共有結合クロスリンク(例：１対またはそれ以上のシステイン間のジスルフィド結合)が形成され、超可変で、線状の中間（ジスルフィド結合に挟まれた）アミノ酸群がとるであろう構造を実質的に束縛する。換言すれば拘束的骨組みが、それ以外は徹底的にランダム化されるポリペプチド中に組み込まれるということである。
望ましい結合特性を持つミニ・タンパク質の性質が一たびわかれば、DNA組換え技術のみならず、非生物学的合成方法によって生産することが可能となる。
本願クレームの目的として、ミニ・タンパク質はおよそ8個から60個の残基を有する。たとえば残基16個のポリペプチドのアミノ酸3と8をつないでいる鎖内ジスルフィド架橋は、スパンが4あるという。アミノ酸4と12がジスルフィド結合されていれば、この架橋はスパンが７である。あわせると４つのシステインはポリペプチドを４つのシステイン間セグメントに分割する(1-2、5-7、9-11、及び13-16である)(Cys3とCys4との間にはセグメントがない)。
【００３６】
クロスリンクされたミニ・タンパク質の接続パターンは、クロスリンクの端点の相対位置を単純に述べるものである。例えば、２個のジスルフィドがあるミニ・タンパク質では、「1-3、2-4」という接続パターンは、（一次配列中）１番目のクロスリンクされたシステインは３番目のクロスリンクされたシステインにジスルフィド結合し、２番目は４番目と結合しているということを意味する。
本発明における多様化されたジスルフィド結合ミニ・タンパク質はいくつかの種類に分けられる。
クラスIミニ・タンパク質は、ジスルフィド結合を形成するよう相互作用できるシステインが１対あることを特徴とするもので、この結合のスパンは残基９個以下である。このジスルフィドブリッジは最低でも残基２個のスパンであることが望ましい。これはジスルフィド結合のジオメトリー的機能である。間隔が残基２個か３個であるとき、架橋された残基のねじれを減すため、残基のひとつはグリシンであることが望ましい。間隔の最大限度はそれほど厳密ではないが、一般的には、間隔が大きいほど、線状の中間アミノ酸残基のコンフォーメーションに対するジスルフィド結合による束縛は少ない。
スパンが４又は５のジスルフィドブリッジは特に望ましい。スパンが６に増えると、束縛力は減る。この場合、囲われた  残基のうち少なくとも１個は、主鎖にジオメトリー的制限を与えるアミノ酸であることが望ましいとされている。プロリンは最も大きな制限を与える。バリン及びイソロイシンは主鎖を制限するが、その程度はより低い。この拘束用非システイン残基の位置は不変システインの隣であることが望ましいが、他のブリッジされた残基の隣であってもよい。スパンが７である場合、主鎖のコンフォーメーションを制限するアミノ酸を２つ含むことが望ましい。これらのアミノ酸は７つの位置のうちどこにあってもよいが、システインの直ぐ隣にある架橋された残基２個であることが望ましい。スパンが８か９であれば、拘束用アミノ酸を追加することもできる。
【００３７】
追加アミノ酸は第一システインのアミノ側又はカルボキシ側にあることができる。「スパンされていない」直近のアミノ酸のみがスパンの構造に影響を与えると考えられる。
クラスIIミニ・タンパク質は、スパンがアミノ酸９個より大きい１個のジスルフィド結合を特徴とする。ブリッジされたアミノ酸は二次構造を形成するが、これはコンフォーメーションを安定させるのに役立つ。これらの中間アミノ酸がヘアピン・超二次(supersecondary）構造を形成することが望ましい。例えば以下に示した式のような構造である。
【化１】
0004451611.tif 000002
【００３８】
適切なヘアピン構造を設計する上で、三次元構造が知られているタンパク質から実際の構造を真似したり、個々のアミノ酸がとりやすい二次構造のデータを用いたり、又はこの二つの方法を組み合わせて、構造を設計することもできる。一つ以上の実際の構造をモデルとして用いることが望ましく、どの突然変異が構造を妨害することなく起こせるかを決める上で、頻度データを使うとよい。
システインとαヘリックス又はβストランドのはじめまたは終わりとの間には３個以上のアミノ酸がないほうがよい。
更に複雑な構造（ダブルヘアピンなど）も可能である。
クラスIIIミニ・タンパク質は複数のジスルフィド結合を特徴とする。クラスIIミニ・タンパク質に関して上に述べたような二次構造を持っていてもよい。可能なジスルフィド結合のトポロジーが結合数とともに急激に増えるため（結合２個、 トポロジー３；結合３個、トポロジー15）、ジスルフィド結合数は４つ以上にならないほうがよい。二つのジスルフィド結合は３個より好ましく、４個より３個のほうがよい。２個以上のジスルフィド結合では、ジスルフィドブリッジのスパンは30以上にならないほうがよく、最大のシステイン間鎖セグメントは20を越えないことが望ましい。
耐熱性エンテロトキシンＳＴ−Ｉａのような、天然のクラスＩＩＩミニ・タンパク質は、しばしば、アミノ酸配列中に密集したシステインの複数ペア(-C-C- 又は-C-X-C-)を有する。密集することにより、生じ得るトロポジーの数は減り、これは利点となる可能性がある。
【００３９】
メタルフィンガー・ミニ・タンパク質。本発明におけるミニ・タンパク質はジスルフィド結合によってクロスリンクされるものに限られてはいない。ミニ・タンパク質のもう一つの重要なクラスは、フィンガー・タンパク質の類似物である。フィンガー・タンパク質はフィンガー構造を特徴とする。これは金属のイオンが残基Cys２個とHis２個と配位結合し、その周りに四面体のアレンジメントを形成するものである。金属イオンはほとんどの場合亜鉛(ＩＩ)であるが、鉄、銅、コバルトなどのこともある。「フィンガー」は、(Phe又はTyr)-(1AA)-Cys-(2-4AAs)-Cys-(3AAs)-Phe-(5AAs)-Leu-(2AAs)-His-(3AAs)-His-(5AAs)(BERG88;GIBS88)というコンセンサス配列を有する。本発明では一つ又は二つのフィンガーを持つミニ・タンパク質を包含する。
タンパク質の側鎖のあるものを選択的に修飾できる酵素及び／又は化学試薬（できれば毒性のない）を用いてファージを処理することによって、ポテンシャル結合ドメインの提示ファージライブラリーに更なる多様性を導入し、そうすることにより提示されたＰＢＤの結合特性に影響を及ぼすことができる。親和性分離方法を使って、所定のターゲットに結合する修飾ＧＰを濃縮する。活性結合ドメインは遺伝学的に完全に特定されていないので、我々は、各濃縮段階において、形態形成後の修飾を繰り返さなければならない。このアプローチは、ミニ・タンパク質ＩＰＢＤにおいて特に適している。これらのＳＢＤの化学合成を構想しているからである。
【００４０】
エピトープ性ペプチド
本発明はまた、抗体、レクチン、酵素、又は他の結合タンパク質のエピトープ性結合部位であるターゲットに結合するエピトープ性・ペプチドの同定にも関する。抗体の場合、エピトープ性・ペプチドは少なくとも４個のアミノ酸でなければならず、最低６個又は８個のアミノ酸であることが望ましい。通常、20個未満のアミノ酸であるが、上限はない。ただし一般的にエピトープ性・ペプチドは、「線状」すなわち「連続した」エピトープである。通常、エピトープ性・ペプチドを提示するためのライブラリーを構築する際ポテンシャル・エピトープのアミノ酸部位の全部又はほとんどが変えることができる。しかし、タンパク質ドメインの突然変異誘発に関し下記に述べるように、ある特定の位置に存在することを許されたアミノ酸の間では出現頻度は比較的等しいことが望ましい。
【００４１】
多様化戦略−望ましい多様性を有するポテンシャル結合ドメイン（又はエピトープ）を得るための突然変異誘発
検知可能量で提示できる異なるドメインの数と比べて、あるドメインの突然変異によって得られる異なるアミノ酸配列の数の方が大きい場合、強制進化の効率は、どの残基を変化させるかを注意深く選択することによって大きく高めることができる。まず、既知のタンパク質の残基で、結合活性に影響を与えそう(例えば表面の残基)だが、タンパク質の安定度をはなはだしく低下させそうもないものを同定する。次にこれらの残基をコードする全ての、又はいくつかのコドンを同時に変化させ、ＤＮＡの多様化集団をつくる。多様化されたＤＮＡ集団は、さまざまなポテンシャル結合ドメインを発現させるのに用いられる。そしてポテンシャル結合ドメインは興味のあるターゲットに結合する能力に関して評価される。
本発明の方法はこのように、つくられるのが高度に多様化された集団であり、そこから新規結合タンパク質が選択されるという点において他の方法から更に区別される。我々は効率的で組織だった方法により、提示されたポテンシャル結合ドメインが、関連アミノ酸配列の近傍の「配列スペース」を手本とするようしむける。ここで用いられる様々な多様化計画を導くのは次の４つの目標である。
１）非常に多数の変異体が利用できる(例えば10７)  ２）可能性のある変異体のうち非常に高い割合が実際に検出可能量で出現する。３）望ましい変異体が現れる頻度が比較的一定している。４）変異が生じるのは、限定された数のアミノ酸残基においてのみであり、もっとも好ましくはポテンシャル結合ドメイン表面にあって共通の領域に向かっている側鎖基のある残基においてのみである。
これは、変異が起きる場所を全くコントロールできない（できてもおぼろげに）、放射線やヒドロキシル・アミンといった無差別変異誘発物質を単に遺伝子を変えるのに使うのと区別されるべきである。これらの無差別変異誘発では、突然変異の多くは結合ドメイン以外にある残基に影響を与えるであろう。更に、合理的な突然変異誘発レベルでは、変えられたコドンは塩基が１個だけ変化する傾向にあるため、限定された又は偏った範囲の可能性しか調べられない。同様に本方法とかけ離れているのは、突然変異を起こす、ランダムでない配列のオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発技術である。なぜならこれらの技術は多数の変異を起こしたりテストするのに使うことができないからである。集中無選別(fucused random )突然変異誘発技術は知られているが、変異の分布を制御することの重要性は見落とされている。
【００４２】
「多様化されたDNA(vgDNA)」とは同じか又は同様の長さのDNA分子の混合物で、それらを並べてみると、いくつかのコドンに違いがあり、それらのコドンは異なる複数のアミノ酸をコードするが、それ以外のコドンは１種のアミノ酸しかコードしないものを意味する。更に、多様化されたDNAにおいては、可変（変えることのできる）コドン、及び、ある可変コドンがコードする異なったアミノ酸の範囲と出現頻度は、前もってDNA合成機で決められるということがわかる。ただし合成手法では混合物の中にある、個々のDNA分子の配列はアプリオリに知ることはできない。多様化されたDNAにおける、指定された可変コドンの数は20個以下であることが望ましく、５から10個であれば更に望ましい。各可変コドンにおいてコードされるアミノ酸の配合比は、コドンによって異なる場合がある。多様化されたＤＮＡが導入された提示ファージの集団は、同様に「多様化された」と言うことができる。
タンパク質において知られているドメインの一部分をコードするＤＮＡが多様化される時、元のドメインは親ポテンシャル結合ドメイン(ＰＰＢＤ)と呼ばれる。そして多様化の結果としてコードされた多数の突然変異ドメインは集合的に「ポテンシャル結合ドメイン」(ＰＢＤ)と呼ばれる。予定されたターゲットに結合する能力が知られていないからである。
【００４３】
次に我々は、選択されたターゲットに必要な親和性をもって結合するＰＢＤを持つファージの選択を容易にするために、多様なポテンシャル結合ドメインの集合を作り出す方法について考察する。ポテンシャル結合ドメインは最初アミノ酸レベルで設計される。ＰＢＤにターゲットに対する親和性があるなら探知できる合理的な蓋然性を確実にするため、どの残基を変異させるか、どの変異をこれらの位置で起こすかがいったん決まれば、様々なＰＢＤをコードする多様化されたＤＮＡを設計できる。当然、得られる独立の形質転換体の数、及び親和性分離技術の感度によって、多様化のある１ラウンドにおいて可能な多様化の程度は制限される。
タンパク質内に多様性を持たせる方法は数多くある。極端な例では、タンパク質の残基数個をできる限り多様化する(集中突然変異誘発)方法であり、例えば５個から７個の残基を選び、それぞれを可能な13−20通りに変化させる。もう一つの極端な突然変異誘発法（拡散−突然変異誘発法)は、もっとずっと多くの残基を選択肢をより限定して多様化させるものである(VERS86a及びPAKU86参照)。使われる多様化パターンは以上の二つの極端な例の間にある。
同時に突然変異させ得るコドンの数に制限はない。しかし、ある１つの可能なＰＢＤ配列が実際に少なくとも１つのファージにより合理的な蓋然性をもって提示されうるような突然変異方法を使うことが望ましい。vgDNAによってコードされ、多様化の各位置に最も条件の悪いアミノ酸を有するある１つのミューテン（mutein）が、少なくとも一つの独立した形質転換体によってライブラリー内に提示されている確率が最低0.50であることが望ましい。最低0.90の確立あればより望ましい。(より好条件のアミノ酸から成り立っているミューテンは、当然、同一のライブラリー内でより生じやすい。)
多様化は、典型的な形質転換体のライブラリーに10６から10７個の異なるアミノ酸配列を、好ましくはその10倍以下の(より望ましくは３倍以下の)異なったＤＮＡ配列によって提示させるであろうことが望ましい。
【００４４】
αへリックス及びβストランドを欠くミニ・タンパク質に関しては、突然変異のどのラウンドにおいても、４−６個の非システイン・コドンを多様化し、それぞれが、20個のアミノ酸のうち少なくとも８個をコードするようにする。各コドンにおける多様化はその位置にふさわしいものでよい。システインは置換基候補には含まれないが、除外されるものではない。
ミニ・タンパク質がメタル・フィンガー・タンパク質であるとき、代表的な多様化方法では、二つのCysと二つのHisの残基と、更にオプションであるが上述のPhe／Tyr、Phe及びLeu残基は変えずに保ち、複数の他の残基(通常５−１０個)を変化させる。
ミニ・タンパク質にαへリックスとβストランドが１個またはそれ以上ある場合、どの位置においても、変更アミノ酸はその位置における二次的構造をなるべく妨害しないものを選ぶのが好ましい。各可変アミノ酸で可能なアミノ酸数がより限定されているため、可変アミノ酸の総数は、選択過程におけるサンプリング効率を変更することなくより多くできる。
最後に説明されたミニ・タンパク質のクラスにとって、ミニ・タンパク質以外のドメインの場合と同様、多様化されるコドンは20個以下、より好ましくは5-10個であることが望ましい。しかし、拡散突然変異誘発方法が使われるとき、多様化されるコドンの数はもっと多くできる。
どの残基を変えるかという決定は、どの残基がドメインの表面にあり、どれが内部にあるかということを知ることによって容易になる。
【００４５】
我々は数個の要因を検討した上でＰＰＢＤの残基を選択する。その要因にはａ)ＰＰＢＤの三次元構造、ｂ)ＰＰＢＤの相同配列、及びｃ)ＰＰＢＤとＰＰＢＤの突然変異体のモデリングが含まれる。ＰＰＢＤの正常なフォールディングを妨げることなく結合に強い影響を及ぼす残基の数が、同時に変化させられる残基の数より大きい場合、ユーザーは、一度に変化させる残基の部分集合を選ぶべきである。ユーザーは多様化の試行レベルを選び、様々な配列の豊富さを計算する。変化させた残基と変化させた各残基における多様化のレベルのリストは、混成多様化が、親和性分離方法の感度及び作ることのできる独立な形質転換体の数とつりあいがとれるまで調節される。
どの残基を変化させるか選んだ後は、各可変残基において許容できるアミノ酸の範囲を決定する。多様化の総合レベルは、変化した各残基ごとの変異体の数の積である。各変異残基は、異なる多様化計画を持つことができ、2から20の異なる可能性を生み出す。ある多様化されたコドンによってコードされ得るアミノ酸のグループは、その「置換セット」と呼ぶ。
ミリゲン7500などのＤＮＡ合成機を制御するコンピューターは、いくつかのヌクレオチド（nt）物質(例：ntフォスフォラミド)を二つ又はそれ以上の液だめから取ることによって、あるオリゴヌクレオチドのどの塩基も任意のntの分布で合成するようプログラムすることができる。あるいは、nt物質を任意の比率で混合して、一般に「汚れたボトル(dirty bottle）」と呼ばれる余分な液だめの一つに入れることができる。各コドンは別々にプログラムすることができる。そのコドンのそれぞれのヌクレオチドの位置における塩基の「ミックス」は、そのコドンによってコードされる異なったアミノ酸が生じる相対的頻度を決める。
単純に多様化されたコドンとは、縮重ヌクレオチドの位置で、二つ又はそれ以上の塩基が等モル比で混合されたものから得られるものである。これらの混合物は、この明細書では標準化された「不確定(ambiguous)ヌクレオチド」コードにより説明されている。このコードでは、例えば、縮重コドン「ＳＮＴ」においては、Ｓは塩基ＧとＣの等モル混合物を示し、Ｎは４つの塩基全ての等モル混合物、Ｔは単一不変塩基のチミジンを表す。
【００４６】
複雑に多様化されたコドンは、３つのうち少なくとも１つの位置に、二つ以上の塩基から成る等モル混合物以外の塩基が入るものである。
単純に多様化されたコドンも、複雑に多様化されたコドンも、どちらも望まれる置換セットを達成するために使われる。
あるアミノ酸又はアミノ酸のクラスが適切であることを示す情報が無い場合、我々は全てのアミノ酸を同等の確率で置き換えようと努力する。これは、ある１つのミニ・タンパク質を検出レベル以上に提示することは不経済だからである。コドン(ＮＮＮ)内のそれぞれの位置に４つ全部のヌクレオチドが同量存在すると、各アミノ酸がそれをコードするコドンの数に比例して存在するアミノ酸の分布ができる。この分布は一つの酸性残基あたり二つの塩基性残基を与えるという不利な点がある。更に、できるＷ又はＭの６倍ものＲ，Ｓ，及びＬが生じる。この分布で５個のコドンが合成される場合、Ｌ，Ｒ，及びＳからなるある組み合わせをコードする２４３種の配列のそれぞれは、Ｗ及びＭのある組み合わせ３２種をコードする配列に比べて、7776倍豊富であることになる。５個のＷが検知レベルに存在するということは、(Ｌ，Ｒ，Ｓ)配列のそれぞれを7776倍余分に持たなければ成らないということである。
タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸の配列が、分子の三次元的構造を決めるということは、定まった構造がないという可能性も含めて、一般的に認められている。決められた長さと配列のポリペプチドの中で、あるものは決まった三次構造を持つが、ほとんどのものは持たない。
特定のアミノ酸残基は、決められたポリペプチドの三次構造に、下記のようないくつかのやり方で影響を与え得る。
ａ)ポリペプチドの主鎖の柔軟性に影響を与える、
ｂ)疎水性基を加える、
ｃ)荷電基を加える、
ｄ)クロスリンク、例えばジスルフィドを形成する、金属イオンにキレートする、又は補欠分子族に結合する。
【００４７】
柔軟性：
ＧＬＹは最小のアミノ酸であり、二つの水素がＣαに付いている。ＧＬＹにはＣβがないため、主鎖に最大の柔軟性を与える。従ってＧＬＹは、逆ターンにおいて、特に、ＰＲＯ，ＡＳＰ，ＡＳＮ，ＳＥＲ，及びＴＨＲとともに非常に頻繁に生じる。
アミノ酸ＡＬＡ，ＳＥＲ，ＣＹＳ，ＡＳＰ，ＡＳＮ，ＬＥＵ，ＭＥＴ，ＰＨＥ，ＴＹＲ，ＴＲＰ，ＡＲＧ，ＨＩＳ，ＧＬＵ，ＧＬＮ，及びＬＹＳは、分岐していないβ炭素を持つ。これらのうち、ＳＥＲ、ＡＳＰ及びＡＳＮの側鎖基はしばしば主鎖に水素結合を行い、他にとってエネルギー的に条件の悪い主鎖の構造を持つことができる。ＶＡＬ，ＩＬＥ，及びＴＨＲは、延びた主鎖コンフォーメーションを有利にする、分岐したβ炭素を持っている。従って、ＶＡＬ及びＩＬＥは最もしばしばβシート内に見られる。ＴＨＲの側鎖基は主鎖に容易に水素結合するため、βシートに存在する傾向はより低い。
プロリンの主鎖は、環状の側鎖基によって特に制約されている。φ角度は常に−60°に近い。ほとんどのプロリンはタンパク質の表面に見られる。
【００４８】
荷電：
ＬＹＳ及びＡＲＧは、それぞれ10.4以下又は12.0以下のｐＨにおいて単一正荷電を持つ。しかし、これらのアミノ酸の、それぞれ４つ及び３つのメチレン基は、疎水性相互作用を起こすことができる。ＡＲＧのグアニジニウム基は同時に５個の水素を提供する能力があるが、ＬＹＳのアミノ・グループは３個しか提供できない。更に、これらのグループのジオメトリーはかなり違うので、これらのグループは相互交換出来ないことが多い。
ＡＳＰ及びＧＬＵは、それぞれ約4.5及び4.6以上のｐＨにおいて単一負荷電を持つ。ＡＳＰには一つしかメチレン基がないので、疎水性相互作用はほとんど不可能である。ＡＳＰのジオメトリーは主鎖の窒素に水素結合するのに役立ち、これはＡＳＰがしばしば逆ターンの中及びヘリックスの初めに見られることと一致する。ＧＬＵはもっと頻繁にαヘリックス及び殊にこれらのヘリックスのアミノ末端部分に見られる。側鎖基の負荷電はヘリックス双極子と安定相互作用があるからである(NICH88,SALI88)。
ＨＩＳには生理学的範囲に、つまり6.2にイオン化ｐＫがある。このｐＫは荷電基、又は水素ドナーあるいは受容体との近さによって変わる。ＨＩＳは亜鉛、銅、鉄などの金属イオンに結合することができる。
水素結合：
荷電されたアミノ酸以外に、ＳＥＲ，ＴＨＲ，ＡＳＮ，ＧＬＮ，ＴＹＲ，及びＴＲＰは水素結合に参加することができる。
クロスリンク：
クロスリンクの最も重要な形態は、二つのチオール、特にＣＹＳ残基のチオールの間に形成されるジスルフィド結合である。適切な酸化環境の中では、これらの結合は自発的に起こる。これらの結合は、タンパク質やミニ・タンパク質のある特定のコンフォーメーションを非常に安定させることができる。酸化されたおよび還元されたチオール試薬の混合物が存在する時、最も安定した構造が優位になる交換反応が起こる。タンパク質及びペプチドにおけるジスルフィドについては、KATZ90,  MATS89,  PERR84,  PERR86,  SAUE86,  WELL86,  JANA89,  HORV89,  KISH85,及びSCHN86を参照のこと。
【００４９】
形成に特定の酵素を必要としない他のクロスリンクに次のようなものがある。
１)(ＣＹＳ) ４:Ｆｅ  Rubredoxin (in CREI84,  p.376)
２)(ＣＹＳ) ４:Ｚｎ  Aspartate Transcarbamylase (in CREI84,  p376)及びZn-フィンガー(HARD90)
３)(ＨＩＳ)２(ＭＥＴ) (ＣＹＳ)：Ｃｕ
Azurin (in CREI84,p.376)及び塩基性「ブルー」きゅうりタンパク質(GUSS88)
４)(ＨＩＳ) ４:Ｃｕ  CuZn superoxide dismutase
５)(ＣＹＳ) ４:（Ｆｅ４ＳＯ４）  Ferredoxin(in CREI84,  p.376)
６)(ＣＹＳ) ２(ＨＩＳ)  ２:Ｚｎ   Zinc フィンガー(GIBS88)
７)(ＣＹＳ) ３(ＨＩＳ)２:Ｚｎ   Zincフィンガー(GAUS87,  GIBS88)
(ＨＩＳ)２(ＭＥＴ)(ＣＹＳ)：ＣｕのあるクロスリンクはＨＩＳ及びＭＥＴがＣｕなしには他のクロスリンクを形成できないという点において、潜在的利点がある。
【００５０】
単純に多様化されたコドン
単純に多様化された以下のコドンは、比較的バランスの取れたアミノ酸のセットをコードするので、役に立つ。
１)［Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］セットをコードするＳＮＴ：ここでａ)１つは酸性(Ｄ)で１つは塩基性(Ｒ)，ｂ)どちらも脂肪族(Ｌ，Ｖ)、および芳香族疎水性(Ｈ)，ｃ)大きい(Ｌ，Ｒ，Ｈ)及び小さい(Ｇ，Ａ)側鎖基，ｄ)固定された(Ｐ)及びフレキシブルな(Ｇ)アミノ酸，ｅ)個々のアミノ酸は一度しかコードされない。
２)［Ｍ，Ｔ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｅ，Ｇ］セットをコードするＲＭＧ：ここでａ)１つは酸性、２つが塩基性(最適ではないが、許容される)，ｂ)疎水性アミノ酸、及び親水性アミノ酸、ｃ)個々のアミノ酸は一度だけコードされる。
３)［Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｅ］セットをコードするＲＭＧ：ここでａ)１つは酸性で１つは塩基性、１つは中性で親水性，ｂ)３個の好条件のαヘリックス，ｃ)個々のアミノ酸は１度だけコードされる。
４)［Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］セットをコードするＶＮＴ：ａ)１つは酸性、１つは塩基性，ｂ)全てのクラス：荷電された、中性で親水性、疎水性、固定された、及びフレキシブルなアミノ酸、その他，ｃ)個々のアミノ酸は１度だけコードされる。
５)［Ｎ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｄ，Ｅ，Ｇ２］セットをコードするＲＲＳ：ａ)２つが酸性、２つが塩基性、ｂ)２個の中性親水性，ｃ)グリシンのみ２回コードされる。
６)［Ｆ，Ｓ，Ｙ，Ｃ，Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］セットをコードするＮＮＴ：ａ)１５個の異なったアミノ酸を与える１６個のＤＮＡ配列。繰り返されるのはセリンのみで、他の全ては同量で存在する。(このことにより、ライブラリーのサンプリングが大変効率的にできるようになる)，ｂ)酸性及び塩基性アミノ酸の数は同じである(ＤとＲが１個ずつ)，ｃ)全ての主要クラスのアミノ酸が存在している：酸性、塩基性、脂肪族性で親水性、芳香族性で疎水性、中性で親水性。
７)［Ｌ２，Ｒ２，Ｓ，Ｗ，Ｐ，Ｑ，Ｍ，Ｔ，Ｋ，Ｖ，Ａ，Ｅ，Ｇ，stop］セットをコードするＮＮＧ：ａ)αヘリックスの形成に好都合な残基がかなり優勢である［Ｌ，Ｍ，Ａ，Ｑ，Ｋ，Ｅ；及び、それより劣るが、Ｓ，Ｒ，Ｔ］，ｂ)１３個の異なったアミノ酸をコードする。(ＶＨＧはＮＮＧがコードするセットのサブセットをコードする。ＮＮＧは、９個の異なったＤＮＡ中に９個のアミノ酸をコードし、酸と塩基が同量で、5/9αヘリックスを好む。)
開始時の多様化においては、ほとんどの場合ＮＮＴが望ましい。しかし、コドンがαヘリックスに組み入れられるアミノ酸をコードするときはＮＮＧの方が望ましい。
以下においてライブラリーをサンプリングする上での効率に関し、いくつかの単純多様化方法を分析する。
【００５１】
(ＮＮＫ)６によってコードされる無作為ヘキサペプチドのライブラリーが報告されている(ＳＣＯＴ９０，ＣＷＩＰ９０)。表１３０はそのようなライブラリーの予測される挙動を示している。ＮＮＫは、ＰＨＥ，ＴＹＲ，ＣＹＳ，ＴＲＰ，ＨＩＳ，ＧＬＮ，ＩＬＥ，ＭＥＴ，ＡＳＮ，ＬＹＳ，ＡＳＰ，及びＧＬＵ(αセット)のためのコドンを１つづつ形成する。ＶＡＬ，ＡＬＡ，ＰＲＯ，ＴＨＲ，及びＧＬＹ(φセット)のためにコドンを２個ずつ生成する。そしてＬＥＵ，ＡＲＧ，及びＳＥＲ(Ωセット)のためにコドンを３個ずつ生成する。我々は６千４百万の可能性のある配列を２８のクラスに分けた。これは表１３０Ａに示されており、これらのセットのそれぞれにあるアミノ酸の数に基づいている。最大のクラスは、可能な配列の約14.6％を占めるφΩααααである。いかなる選択もしなければ同じクラスの配列は全て生成される確率が同じである。表１３０Ｂはある(ＮＮＫ)６ライブラリーから取られたＤＮＡ配列が、定められたクラスの一つに属するヘキサペプチドをコードする確率を示している。ＤＮＡ配列の約6.3％のみがφΩααααクラスに属していることに注目せよ。
表１３０Ｃは、あらゆる数の独立した形質転換体を含むライブラリーの各クラスにおいて予測される数を示す(10６,  3・10６,  10７,  3・10７,  10８,  3・10８,  10９及び3・10９)。  独立形質転換体(IT)が10６の時、我々はΩΩΩΩΩΩクラスの56％を見られるが、ααααααの0.1％しか見られないと予測している。配列のほとんどは、10％以下しかサンプルが取られていないクラスにおいて見られるものである。例えばクラスφφΩΩααのペプチドを、ターゲットに結合するライブラリーを分画することによって分離するとしよう。分離された配列に関係するペプチドについて我々がどれだけ知っているか考えてみてほしい。クラスφφΩΩααの４％しかサンプルとして取られていないため、Ωセットのアミノ酸群が実際にΩセットで最高のものであるという結論を出すことはできない。ＬＥＵが位置２にくることもできるが、ＡＲＧ又はＳＥＲの方がよい可能性もある。ΩΩΩΩΩΩクラスのペプチドを分離したとしても、クラス内のそれより優れたメンバーがライブラリーの中に存在しないと決めることはできない。
10７ITのライブラリーでは、完全にサンプルが取られたクラスがいくつかあるが、ααααααクラスは1.1％しかサンプルされていない。7.6・10７  ITでは、全てのアミノ酸配列の50％が提示されることを予測しているが、αセットのアミノ酸を３つ又はそれ以上含むクラスはやはりサンプル度が低い。(ＮＮＫ)６ライブラリーの完全サンプリングを達成するためには、3・10９のＩＴが必要である。これは、これまでに報告されている中で最大の(ＮＮＫ)６ライブラリーの10倍も大きいものである。
【００５２】
表１３１は(ＮＮＴ)４(ＮＮＧ)２によってコードされるライブラリーの期待値を示している。存在量の期待値はコドンの順序や、点在する不変コドンとは無関係である。このライブラリーはアミノ酸配列の0.133倍をコードするが、ＤＮＡ配列の0.0165倍しかコードしない。したがって5.0・10７のＩＴ(つまり(ＮＮＫ)６に必要な量より60倍少ない)が、ほぼ完全に近いライブラリーのサンプリングを達成できるのである。結果は(ＮＮＴ)６にとって多少よくなり、(ＮＮＧ)６にとって少しだけ悪くなる。制御要因はＤＮＡ配列とアミノ酸配列の比である。
表１３２は、ＮＮＫ，ＮＮＴ，及びＮＮＧのコドンに対する＃ＤＮＡ配列と＃ＡＡ配列の比を表す。ＮＮＫ及びＮＮＧについては、「停止コドンはなくなると仮定する」と書いてあるように、ＰＢＤが必須遺伝子、例えばFfファージの「遺伝子ＩＩＩ」、の一部として提示されているものと仮定した。このような必須遺伝子が使われることが要求される訳ではない。必須遺伝子でないものが使用されると、分析は多少異なる。ＮＮＫとＮＮＧのサンプリングは多少効率が下がる。(ＮＮＴ)６は(ＮＮＴ)５の3.6倍のアミノ酸配列を与えるが、ＤＮＡ配列は1.7倍少なくて済む。また、(ＮＮＴ)７は(ＮＮＴ)６の２倍のアミノ酸配列を与えるが、3.3倍少ないＤＮＡ配列を与えるのである。
したがって、単純な混合物(ＮＮＳ，ＮＮＫ，又はＮＮＮ)を用いて、ある位置における20個のアミノ酸を全て得ることは可能ではあるが、こういった単純な混合物からは、非常に偏ったコードされたアミノ酸のセットが得られる。この問題は複雑に多様化されたコドンを使うことによって解決される。
我々はまず、ntの分布が二つの制約を受ける場合に、最も有利なアミノ酸と最も不利なアミノ酸の比率を最小にするよう計算(WO90/02809を参照)された混合物について説明する。その二つの制約とは酸性と塩基性のアミノ酸が同量であることと、ありうる停止コドンの数が最小であることである。我々は、３番目の塩基をＴ又はＧに限定することによって(Ｃ又はＧも同等)、最適なnt分布の探索を単純化した。しかし、本発明は３番目の塩基がＴ又はＧ(あるいはＣ又はＧ)に限定されない複雑に多様化されたコドンを使用することも包含している。
【００５３】
最適な分布(「ｆｘＳ」コドン)は表１０Ａに示されており、ここに示された量比によって各タイプのアミノ酸をコードするＤＮＡ分子を作り出す。この化学反応により20個のアミノ酸が全てコードされることに注目せよ。その際酸性及び塩基性のアミノ酸がほぼ同量であり、最も有利なアミノ酸(セリン)がコードされる頻度は最も不利なアミノ酸(トリプトファン)のわずか2.454倍である。「fxS」vgコドンは、ＮＮＫ又はＮＮＳが１個のコドンしか与えない数個のアミノ酸［Ｆ，Ｙ，Ｃ，Ｗ，Ｈ，Ｑ，Ｉ，Ｍ，Ｎ，Ｋ，Ｄ，Ｅ］を含むペプチドのサンプリングを最も改善する。サンプリングの利点はライブラリーが比較的小さい時最も顕著である。
最も有利なアミノ酸と最も不利なアミノ酸の比率を最小にするだけでそれ以外の制約のない複雑に多様化されたコドンを検索した結果が表１０Ｂに示されている。変化は小さく、酸と塩基の均衡と最小の停止コドンを要求しても犠牲は少ないことを示している。また、最適化を制約しなくても酸性及び塩基性アミノ酸の頻度は非常に近くなるということにも注目しておきたい。一方、制約を緩めると、最も不利なアミノ酸がSERの0.412倍という分布が得られる。
【００５４】
ＮＮＴコドンの利点は本出願の別の個所で説明されている。最適化しないＮＮＴは、１６個のＤＮＡ配列のみによってコードされた１５個のアミノ酸を与える。表１０Ｃに示した複雑に多様化されたコドンによってＮＮＴを改良することは可能である。これによって５個のアミノ酸(ＳＥＲ，ＬＥＵ，ＨＩＳ，ＶＡＬ，ＡＳＰ)がほぼ同量ずつになる。更に８個のアミノ酸(ＰＨＥ，ＴＹＲ，ＩＬＥ，ＡＳＮ，ＰＲＯ，ＡＬＡ，ＡＲＧ，ＧＬＹ)はＳＥＲの７８％の量で存在する。ＴＨＲ及びＣＹＳはＳＥＲの半分ある。ジスルフィド結合のタンパク質用にＤＮＡを多様化するとき、ＣＹＳの量を減らすことが望ましいことが多い。この分布では１３個のアミノ酸が高レベルで存在することができ，停止コドンがないのに、最適化されたｆｘＳ分布は優勢度が高いアミノ酸を１１個しか許容しない。
【００５５】
ＮＮＧコドンもまた最適化することが可能である。等モルのＴ，Ｃ，Ａ，ＧがＮＮＧに用いられる時、ＬＥＵとＡＲＧは倍になる。表１０Ｄはほぼ最適化されたＮＮＧコドンを示す。この多様化においては、４個のほぼ等しい最も有利なアミノ酸がある。ＬＥＵ、ＡＲＧ、ＡＬＡ，及びＧＬＵである。このセットには酸性と塩基性のアミノ酸が１個ずつあることにも注意してほしい。等しく最も不利なのアミノ酸が２個ある。ＴＲＰ及びＭＥＴである。ｌｆａａ(最も不利なアミノ酸)／ｍｆａａ(最も有利なアミノ酸)の比率は0.5258である。このコドンが６回繰り返された時，ＴＲＰとＭＥＴのみで成り立つペプチドの一般性は、最も有利なアミノ酸のみで成り立っているペプチドの２％である。これを我々は「最適化されたＮＮＧ６    vgＤＮＡにおける(TRP/MET)６の優勢度」と呼んでいる。
「汚いボトル」方法でvgDNAを合成する時、ミックスの数を制限することが望ましいことがある。ある非常に有用な混合物は、「最適化されたＮＮＳ混合物」と呼ばれており、fxS混合物の最初の二つの位置を平均化する：(１番目は)T１=0.24，C１=0.17，A１=0.33，G１=0.26であり、２番目の位置は一番目と同じであり、(３番目は)C３=G３=0.5である。この分布はアミノ酸ＡＲＧ，ＳＥＲ，ＬＥＵ，ＧＬＹ，ＶＡＬ，ＴＨＲ，ＡＳＮ及びＬＹＳを５％超、ＡＬＡ，ＡＳＰ，ＧＬＵ，ＩＬＥ，ＭＥＴ及びＴＹＲを４％超与える。
それ以外の複雑に多様化されたコドンも大事である。このコドンは最初の２つの位置において最適化されたＮＮＴコドンとよく似ており、３番目の位置ではＴ：Ｇ：：９０：１０である。このコドンは１３個のアミノ酸(ＡＬＡ，ＩＬＥ，ＡＲＧ，ＳＥＲ，ＡＳＰ，ＬＥＵ，ＶＡＬ，ＰＨＥ，ＡＳＮ，ＧＬＹ，ＰＲＯ，ＴＹＲ，及びＨＩＥ)を５.超の比率で与える。４.３％のＴＨＲ及び３.９％のＣＹＳはＮＮＫのＬＦＡＡ(3.125％)より多い。残りの５個のアミノ酸は１％未満存在する。このコドンは全てのアミノ酸が存在するという特徴がある。低頻度アミノ酸が３個以上ある配列はまれである。このコドンを用いてＳＢＤを分離する時、我々は最初の１３個のアミノ酸は各位置でテストされていると確信できる。最適化したＮＮＧに基いて類似コドンを用いてもよい。
【００５６】
単純又は複雑に多様化された望ましいコドンの幾つかは、システインを含むアミノ酸をコードする。これはコードされた結合ドメインの幾つかは、不変ジスルフィド結合システインに加えてシステインを１個またはそれ以上有する、ということを意味する。例えばＮＮＴにコードされた各位置においては、１６に１つの割でシステインを得るチャンスがあるということである。６個のコドンが多様化された場合、追加システインを含むドメインの割合は０.３３となる。奇数個のシステインは問題を起こす。Perry及びWetzel(PERR84)を参照のこと。一方、ジスルフィドを含む多くのタンパク質、例えばトリプシン、はジスルフィドを形成しないシステインを含む。ペア化されないシステインの可能性は以下のような幾つかの方法で対応できる。
まず、多様化されたファージの集合を、遊離のチオールに強く結合する固定化試薬（サルフォリンク(イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル・カンパニー、カタログ番号44895H)など）の上を通過させる。ピアス社のもう一つの製品はＴＮＢ−チオール・アガロース(カタログ番号20409H)である。同じ目的のため、BioRad社がAffi-Gel4-1(カタログ番号153-4599)を販売している。
二番目としては、以下のようにシステインを除外する多様化方法を用いることもできる。
［Ｆ，Ｓ，Ｙ，Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｖ，Ａ，Ｄ］を与えるＮＨＴ
［Ｌ２，Ｐ２，Ｈ，Ｑ，Ｒ３，Ｉ，Ｍ，Ｔ２，Ｎ，Ｋ，Ｓ，Ｖ２，Ａ２，Ｅ，Ｄ，Ｇ２］を与えるＶＮＳ
［Ｌ２，Ｓ，Ｗ，Ｐ，Ｑ，Ｒ２，Ｍ．Ｔ．Ｋ．Ｒ．Ｖ．Ａ．Ｅ．Ｇ．ストップ］を与えるＮＮＧ
［Ｌ，Ｐ．Ｈ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］を与えるＳＮＴ
［Ｍ，Ｔ，Ｋ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｅ，Ｇ］を与えるＲＮＧ
［Ｔ，Ｋ，Ａ，Ｅ］を与えるＲＭＧ
［Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｉ，Ｔ，Ｎ，Ｓ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］を与えるＶＮＴ又は
［Ｎ，Ｓ，Ｋ，Ｒ，Ｄ，Ｅ，Ｇ２］を与えるＲＲＳ
しかし、これらのシステムはそれぞれにはＮＮＴに関して１つ又はそれ以上の不利な点がある。ａ)許容されるアミノ酸の数がより少ない。ｂ)アミノ酸は均等に与えられない、ｃ)酸性及び塩基性のアミノ酸が生じる確率は同等ではない、又は、ｄ)ストップコドンが生じる。けれどもＮＮＧ，ＮＨＴ，及びＶＮＴはＮＮＴとほぼ等しく役立つ。ＮＮＧは１３個の異なったアミノ酸とストップシグナル一つをコードする。１６倍ミックスに２回現れるアミノ酸は２個のみである。
【００５７】
３番目に、予め選ばれたターゲットに結合するものを集団内に増やしてから，選択された配列を余分なシステインについて評価することができる。コンフォーメーションを拘束するために置かれたシステイン以外にシステインを含むものも申し分なく使用できるかもしれない。予定外のジスルフィド結合が起こる可能性もあるが、これは単離されたＤＮＡ配列によって定められた結合ドメインが不適当であるということにはならない。単離されたドメインの適合性は、化学的に合成されたペプチドの化学的及び生化学的評価によって最もよく決めることができる。
最後に、遊離のチオールを、遊離チオールに特異的に結合するがジスルフィドには反応しない試薬、例えばエレマン試薬、ヨードアセテート、又は沃化メチルなどでブロックした上、変性ファージをその集団内に残しておくことができる。ブロック剤はミニ・タンパク質の結合能力を変える可能性があることを理解する必要がある。従って、異なった結合ドメインを発見できることを期待して様々なブロック剤を用いるのである。チオールがブロックされた提示ファージの多様化集団は、結合のために分画される。単離された結合ミニタンパク質のＤＮＡ配列が奇数個のシステインを含んでたならば、合成手段により可能なあらゆる架橋を持ち奇数個のチオールは適切にブロックされたミニタンパク質を作る。ニシウチ(NISH82,NISH86,及びその中に言及されている研究)は、複数のシステインを含んでいて、各チオールが異なるタイプのブロック基によって保護されるペプチドの合成方法を公開している。これらの基は選択的に除去できるので、ジスルフィド対をコントロールできる。我々はそのようなシステムを、１個のチオールがブロックされたままでいるか、又はブロックを解かれて異なる試薬で再ブロックされるような変更を加えて使用することを考えている。
【００５８】
ＮＮＴ又はＮＮＧ多様化コドンの使用により、多様化ライブラリーのサンプリングが非常に効率的になる。(異なったアミノ酸配列)／(異なったＤＮＡ配列)の比率が、ＮＮＫ、あるいは最適化されたｖｇコドン（ｆｘＳ)と比べても１に近いためである。にもかかわらず、数個のアミノ酸はどのケースでも落ちてしまう。ＮＮＴもＮＮＧも重要なクラスのアミノ酸は全て許容する。疎水性，親水性、酸性、塩基性、中性で親水性、小さいもの、大きいものである。結合ドメインを１つ選択した後、さらに配列の多様化及び選択をすることが望ましい。より高い親和性又は特異性を達成するためである。この２番目の多様化の間に前の多様化によって見逃されるアミノ酸の可能性を調べるとよい。
２回目の多様化において望ましい方法は、新しい残基セットによって各位置を変えることである。このセットは、成功結合ドメイン内のその位置に見出されるアミノ酸を含み、更に初回の多様化で除外された残基を出来る限り多く含む。
このように、後の多様化の回では、前に突然変異を生じなかったアミノ酸の位置、及び前に突然変異した位置における前の置換セットになかったアミノ酸の置換物がともにテストできる。  初回の多様化が完全な失敗に終わった場合、異なるパターンの多様化方法が用いられるべきである。例えば、１個のドメインの中に１つ以上の相互作用セットが特定できるならば，次の多様化の回で変える残基は、最初の多様化で調べたものとは異なるセットからのものでなければならない。失敗が続いた場合は、異なるＩＰＢＤに切り換えることもできる。
【００５９】
ターゲット結合突然変異体の親和性選択
親和性分離は本発明においては、まず提示システムが作動していることを確かめるために用いられる。つまり、キメラ外表面タンパク質が発現され、ファージ表面に移行して、挿入された結合ドメインがターゲット物質に接近できるよう、正しく位置付けられているかどうかを確認するためである。この目的で使われる場合、結合ドメインは、あるターゲットの既知の結合ドメインであり、ターゲットには親和性分離過程に使われる親和性分子である。例えば、ＢＰＴＩをコードするＤＮＡを使用するファージの外部表面タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、ＢＰＴＩがふつうなら結合するアンヒドロトリプシンと結合するかどうかをテストすることによって証明することができる。
ファージがターゲットに結合するならば、その結合ドメインは実際にファージによって提示されていることが確認できる。結合ドメインを提示する(そのことによってターゲットに結合する)ファージは、そうでないものから分離される。
提示システムが確保されれば、様々な異なるポテンシャル結合ドメインを提示する多様化ファージのライブラリーを用い、親和性分離手法により，それらのファージが一つ又はそれ以上のターゲットにどれほどよく結合するかを知ることができる。このターゲットは、提示された結合ドメインの親である既知の結合ドメインが結合するものである必要はない。つまり新しいターゲットに結合するように選択していけばよいということである。
例えばＢＰＴＩ結合ドメインを多様化し、トリプシンではなく、ヒトの好中球エラスターゼやカテプシンＧのような別のセリンプロテアーゼ、あるいはウマの心臓のミオグロビンのように全く無関係のターゲットに対する結合性をテストすることもできる。
「親和性分離手段」には次のものが含まれるがそれのみに限られてはいない。
ａ)親和性カラムクロマトグラフィー、ｂ)親和性マトリックス物質からのバッチ溶出、ｃ)プレートに固定された親和性マトリックス物質からバッチ溶出、ｄ)蛍光標識式細胞分取機（ＦＡＣＳ）、及びｅ)ターゲット物質存在下での電気泳動法。「親和性物質」は、精製されるべき物質（「アナライト」と呼ばれる）に親和性がある物質という意味で使われている。ほとんどの場合、不純物が洗い流された後にアナライトが親和性物質から離脱できるよう、親和性物質とアナライトの結合は可逆的である。
【００６０】
親和性クロマトグラフィーが使われる場合には、
１)ターゲット物質の分子は、親和性分離に適した固相担体に固定するのに十分な大きさと化学的反応性があること。
２)マトリックスに固定した後、ターゲット物質が水に反応しないことが望ましい。
３)マトリックスに固定した後、ターゲット物質が非特異的にタンパク質に結合したり分解したりしないことが望ましい。
４)ターゲット物質の分子は、同物質をマトリックスに付けても、タンパク質を結合するための変化しない表面が十分にある(通常少なくとも５００平方オングストローム、リンカーに接続される原子は除外)ように、十分大きいこと。
親和性クロマトグラフィーは望ましい分離方法であるが、ＦＡＣＳ、電気泳動法、又は他の方法を使用してもよい。
本発明では望ましい結合と性を持つタンパク質をコードする遺伝子を持つファージを集団中に増やすために、ファージの親和性分離を利用する。
本発明は、１つまたはそれ以上のターゲット物質に結合し、及び／又は１つ又はそれ以上のターゲット物質に結合できない結合ドメインを選択するのに使える。  特異性とは結合分子が限られたターゲット物質のセットには強く結合するが，最初のセットとは区別される別のターゲット物質にはより弱くあるいは全く結合しないことをいう。
【００６１】
親和性分離に適したほとんどの分子はターゲットとして用いることができる。ターゲットとなる可能性のあるものには次のものが含まれるが、それに限定されない。ペプチド、水溶性及び非水溶性タンパク質、核酸、脂質、炭水化物その他有機分子(単量体又は重合体)、無機化合物、有機金属化合物など。セリンプロテアーゼ類はポテンシャル・ターゲット物質の特に興味あるクラスである。
クロマトグラフィー、ＦＡＣＳ、又は電気泳動法においては、ターゲット物質をもう１つの化学物質とを共有結合させる必要がある場合がある。クロマトグラフィーにおけるもう１つの物質はマトリックス、ＦＡＣＳにおいては蛍光色素、電気泳動法においては強荷電分子である。多くの場合ターゲット物質が既に以下のような望ましい物質を有しているので、カップリングは不要である。ａ)固定性、ｂ)蛍光、ｃ)荷電。それ以外の場合には化学的又は物理的カップリングが必要である。
親和性分離に使われる固定化又は標識されたアナログを調製するのにの実際のターゲット物質を使う必要はない。むしろ、ターゲット物質の適切な反応性アナログのほうが便利かもしれない。反応官能基のないターゲット物質は、まずハロゲンのような強い試薬を使って反応官能性基を作ることによって固定され得る。場合によっては、実際のターゲット物質の反応基が、ターゲット分子の中でそのままにしておくべき部分を占めることがある。その場合には、追加の官能基を合成化学によって導入してもよい。
２つの一般的固定化方法が広く使われている。最初の方法は、対象化合物をビオチニル化し、さらにビオチニル化された誘導体を固定されたアビジンに結合させることである。二番目の方法はターゲット物質に対する抗体を生じさせ、数ある方法の一つを使ってその抗体を固定して、ターゲット物質をその固定された抗体に結合させるものである。抗体の使用は大きいターゲット物質により適している。小さいターゲット物質(例えば１０個又はそれ以下の水素でない原子から成るもの)は抗体に完全にのみこまれてしまい、ターゲット−抗体複合体の表面に出ているターゲットの部分がほとんどなくなってしまうかもしれないからである。
抗体を使用しない疎水性分子の非共有固定法も用いることができる。2,3,3トリメチルデカンのような化合物を、アルギン酸ナトリウムのようなマトリックス前駆体のなかに混ぜ、混合物を固化液の中に押し出す。結果としてできるビーズは全体に分散し表面に露出している2,3,3トリメチルデカンを有する。
他の固定方法は特殊な化学機能物質の存在に依存する。ポリペプチドは−ＮＨ２(Ｎ−末端、リジン)、−ＣＯＯＨ(Ｃ末端、アスパラギン酸、グルタミン酸)、−ＯＨ(セリン、スレオニン、チロシン)、及び−ＳＨ(システイン)を提示している。ポリサッカライドは糖の主鎖を持つＤＮＡと同じようにフリーなＯＨグループがある。
【００６２】
次の表は、反応官能基及びポテンシャル固定化試薬の非包括的な検討である。
グループ：反応物質
R-NH２ ： 2,4,6-トリニトロンベンゼンスルホネート(TNBS),(CREI84,p. 11)
R-NH２ ： カルボン酸無水物、例：コハク酸無水物、マレイン酸無水物、シトラコニック無水物の誘導体(CREI84,  p.11)
R-NH２ ：還元性シッフ塩基を形成するアルデヒド(CREI84,p.12)、グアニドシクロヘキサンジオン誘導体(CREI84, p.14)
R-CO２H ：ジアゾ化合物(CREI84,  p.10)
R-CO２-  ：エポキシド(CREI84,  p.10)
R-OH   ：カルボン酸無水物
アリール-OH：カルボン酸無水物
インドール環：ベンジルハロゲン化合物及びスルフェニルハロゲン化物（CREI84,p.19）
R-SH ：N-アルキルマレイミド(CREI84,  p.21)
R-SH ：エチレンイミン誘導体(CREI84,  p.21)
R-SH ：アリール水銀化合物(CREI84,  p.21)
R-SH ：ジスルフィド試薬（CREI84,  p.23)
チオールエーテル：沃化アルキル(CREI84,  p.29)  ケトン、シッフの塩基を作りNaBHとともに還元するREI84,  p.12-13)
アルデヒド：COOHを酸化する。vide supra
R-SO３H ：R-SO２Clに変換し、固定化アルコール又はアミンと反応する。
R-PO３H ：R-PO２Clに変換し、固定化アルコール又はアミンと反応する。
CC二重結合：HBrを加えてからアミン又はチオールを作る。
【００６３】
親和性クロマトグラフィーと関連技術に関する広範な文献は更に例を提供する。
担体物質としての使用に適したマトリックスには、ポリスチレン、ガラス、アガロース、その他のクロマトグラフィー用担体などがあり、ビーズ、シート、カラム、ウェル、その他必要な形態に製造できる。親和性クロマトグラフィー用担体物質のサプライヤーは、以下が含まれる。マサチューセッツ州ケンブリッジ、アプライド・プロテイン・テクノロジーズ。ニューヨーク、ロックビル・センター、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ。イリノイ州ロックフォード、ピアス、ケミカル・カンパニー。ターゲット物質は、各マトリックスを作成したメーカーの指示に従い、ターゲットがよく提示されることを考慮して、マトリックスに結合させる。
選択過程の初期においては、結合を行いやすくするためターゲット物質は比較的高い濃度でマトリックスに接触させてもよい。ターゲット濃度は、より高い親和性のあるＳＢＤを選ぶために次第に減らしていく。
提示ファージの集団は、結合タンパク質の意図された使用にみあう条件下で、親和性マトリックスに接触させ、その集団は、ある溶質の勾配をカラムにかけることによって分画される。この過程はターゲットに親和性を持つＰＢＤと、ターゲットに対するその親和性が使われる溶離剤の影響をほとんど受けないものが濃縮される。濃縮画分は、高濃度の溶離剤でカラムから溶出する、生存能力のある提示ファージを含む。
溶離剤は、提示されたＰＢＤと固定されたターゲット物質との間の非共有結合的相互作用を弱める能力があることが望ましい。溶離剤はファージを殺さないことが望ましい。成功ミニタンパク質に対応する遺伝的メッセージは、ＰＣＲのように試験管内で行うことによってよりも、ファージを再生することによって最も好都合に増大できる。ポテンシャル溶離剤のリストには塩(Ｎａ＋，ＨＧ４＋，Ｒｂ＋，ＳＯ４−−，Ｈ２ＰＯ４−，クエン酸塩、Ｋ＋，Ｌｉ＋，ＨＳＯ４−，ＣＯ３−−，Ｃａ＋＋＋，Ｓｒ＋＋，Ｃ１−，ＰＯ４−−−，ＨＣＯ３−，Ｍｇ＋＋，Ｂａ＋＋，Ｂｒ−，ＨＰＯ４−−及び酢酸塩)、酸、熱、ターゲットを結合することが知られている化合物、及び水溶性のターゲット物質(又はそのアナログ)などがある。
【００６４】
エタノール、アセトン、エーテル、又は尿素のような中性の溶質は、しばしばタンパク質の精製に用いられ、タンパク質と他の分子の間で起こる非共有結合相互作用を弱めることが知られている。これらの種類のうち多くはバクテリア及びバクテリオファージに有害である。尿素は８ＭまではＭ１３に有害とならない。ほとんどの場合塩は濃度勾配を作るのに望ましい溶質である。ｐＨを低下させることもまた非常に望ましい溶離剤である。場合によっては望ましいマトリックスが低いｐＨにおいて不安定なので、塩と尿素が最も望ましい試薬であることもある。一般的にタンパク質とターゲット物質間の非共有結合的相互作用を弱めるその他の溶質を使用してもよい。
溶出されない提示ファージは、溶出条件に抵抗するのに十分なターゲット物質に対する親和性のある結合ドメインをコードするＤＮＡを含む。このような成功結合ドメインをコードするＤＮＡは、いろいろな方法で回収できる。好ましくは結合提示ファージは単に溶出条件を変えて溶出させる。他の方法としては、ファージをその場で培養するか、あるいはターゲットを含む物質からフェノール(又は他の適切な溶剤でもよい)で抽出して、ＰＣＲ又はＤＮＡ組換え技術によってＤＮＡを増幅する。または、特異的プロテアーゼ用の部位が提示ベクターの中に作られている場合、そのプロテアーゼを用いて結合ドメインをＧＰから切り離す。
ＳＢＤを持つクローンの分析において、担体物質(ポリスチレン、ガラス、アガロース、セルロースその他)を変えるのは、ターゲットではなく担体物質に結合するファージを区別するためである。
収穫されたファージは、ターゲット結合表現型に関して濃縮されるがその際、親和性マトリックスに固定されたターゲット物質を使った親和性分離手法が用いられる。ターゲット物質に結合できないファージは洗い流される。バクテリアの増殖を防ぐため、アザイドのような殺菌剤をバッファーに入れておくことが望ましい事がある。クロマトグラフィーにおいて用いられるバッファーには次のようなものを含む。ａ）ターゲットを安定させるために必要なイオン又は他の溶質、及びｂ）ＩＰＢＤから派生するＰＢＤを安定させるのに必要なイオン又は他の溶質。
【００６５】
親和性カラムへの結合を示すファージを回収するには、上述のカオトロピック物質又は可溶形のターゲット物質の勾配でカラムから溶出してくる画分を集める。勾配において後から溶出する部分は高親和性ファージが濃縮されている。溶出したファージはそれから適切な細胞の中で増幅される。
高親和性ファージが生きた状態でターゲットから溶出できない場合、以下のように対処することができる。
１）マトリックスを栄養培地で満たし，その場で望ましいファージをその場で生育させる。
２）マトリックスの一部を除去し、それを生育培地に植菌する。
３）化学的または酵素的にターゲットのマトリックスに対する結合を弱め、ターゲットにまだ結合されているＧＰが溶出するようにする。
４）ファージを分解して、フェノール又は他の適切な溶剤でＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡを用いて細胞を形質転換し、GPを再生させる。
以上の手段を幾つか組み合わせて使うことも可能である。我々が親和性マトリックスから回収したいものはファージそれ自体ではなく、その中にある、成功エピトープ又は結合ドメインの配列に関する情報であるということを覚えておくべきである。
WO90/02809に説明されていたとおり、説明した親和性分離方法を変えて物質Ａには結合するが物質Bには結合しない分子、又はAとBの両方に拮抗的あるいは非拮抗的部位で結合する分子、又は選択されたターゲットに結合しない分子を選択してもよい。
【００６６】
その後の生産
本発明の手法を用いることにより、我々は、興味のあるターゲット物質に対し高親和性と特異性を持つ新規タンパク質ドメインを提示する複製可能ファージを得ることができる。このようなファージは、結合タンパク質ドメインのアミノ酸体現物と新規結合ドメインをコードする遺伝子のＤＮＡ体現物の両方を持つ。ＤＮＡが存在することによって、新規結合タンパク質ドメインから成るタンパク質の高レベルの発現システムでの発現が可能になる。このシステムは開発過程において使われたのと同じシステムである必要はない。
新規結合タンパク質の生産方法はいくつかあり、次の方法を含む。ａ）結合ドメインをコードする遺伝子を変えて、結合ドメインがファージに付かず水溶性のタンパク質として発現されるようにすること。（結合ドメインをコードするコドンの５’側のコドンを削除するか、結合ドメインをコードするコドンの３’側に複数のストップコドンを挿入することにより行う。)、ｂ）結合ドメインをコードするＤＮＡを、既知の発現システムに移す、及びｃ）ファージを精製システムとして利用する（ドメインが十分小さければ、従来のペプチド合成方法によって生産することもできるかもしれない。)
前述の通り、ミニタンパク質をＩＰＢＤとして使用することの利点は、生成されるＳＢＤもまたミニタンパク質のような挙動をし、化学合成によって得られるだろうからである。（ここで使われる「化学合成」という用語の意味には、無細胞系での酵素剤の使用を含む。)
ペプチドは、水溶液の中でも担体上でも化学的に合成することができる。段階合成や部分重合の様々な組み合わせが使用できる。
【００６７】
合成が行われている間、アミノ酸の側鎖は分岐を防ぐために保護されている。以下のようないくつかの異なった保護グループがシステインのチオール基を保護するのに役立つ。
１）４−メトキシベンジル(MBzl;  Mob)(NISH82;  BECK89c)、HFによって除去可能。
２）アセトアミドメチル(Acm)(NISH82;  NISH86,  BECK89c)、ヨウ素、水銀イオン（例．酢酸水銀）、硝酸銀によって除去可能。及び
３）Ｓ−パラーメトキシベンジル
その他のチオール保護基は標準的な参考文献を参考にしてほしい。例：グリーン著、「有機合成における保護基」(1981)
ポリペプチド鎖がいったん合成されると、ジスルフィド結合が形成されなければならない。酸化剤としての可能性があるものは、 空気(NISH86)、フェリシアニド(NISHI82）、ヨウ素(NISHI82)、及び過蟻酸である。温度、ｐＨ、溶媒、及びカオトロピック化学物質が酸化の過程で影響を及ぼすことがある。
複数のジスルフィド結合を持つ多くのミニタンパク質が、生物学的に活性のある形で化学的に合成されている。本発明における成功結合ドメインは、それ自体で又はより大きいタンパク質の一部として、結合タンパク質に適したあらゆる目的、たとえばターゲット物質の分離又は除去のために使うことができる。この目的のため、新規結合タンパク質は直接又は間接的に、共有結合的又は非共有結合的に標識、キャリアー、又は担体とカップリングすることができる。
薬品として使用される時、新規結合タンパク質は適切なキャリアー又はアジュバントを一緒に含んでもよい。
この明細書に記載された全ての出典は、関係のある範囲においてその内容が収録されている。
【実施例】
以下の例において使われる細胞は全てE.coli細胞である。
【００６８】
例  Ｉ
Ｍ13「遺伝子VIII」タンパク質との融合体としてのＢＰＩＴの提示
例Ｉは、Ｍ13上にある、成熟した「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質との融合体としての、ＢＰＴＩの提示に係わるものである。各ＤＮＡの構造は、制限分解及びＤＮＡ配列によって確認される。
１．viiiシグナル配列::bpti::成熟ＶＩＩＩコートタンパク質提示ベクターの構築
機能性クローニング・ベクターはＭ13及びＭ13から生成されたファジミドである。最初の構築はf1ベースのファジミドpGEM-3Zｆ(-)(TM)(ウイスコンシン州、マデイソンのプロメガ・コーポレーション)で行った。
我々は次の順でコードする遺伝子を構築した。i）変化させたlacUV5プロモーター、ii）シャイン−ダルガルノ配列、iii）Ｍ13「遺伝子ＶＩＩＩ」シグナル配列、iv)成熟BPTI、v）成熟Ｍ13「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質、vi）複数の停止コドン、及びvii）転写ターミネーター。この遺伝子は表１０２に図解されている。lacUV5のオペレーターは対称形のlacOでIPTGが無い場合はより強く抑制する。野生型「遺伝子ＶＩＩＩ」と同じ長さの最長セグメントは最小にしてあるため、共存する「遺伝子ＶＩＩＩ」と遺伝子組換えが起こる可能性は低い。
i）ｐＧＥＭ−３Ｚｆに基づくＯＣＶ
pGEM-3Zf(商標)(ウイスコンシン州、マデイソンのプロメガ・コーポレーション）は、amp遺伝子、バクテリアの複製開始点、バクテリオファージf1の複製開始点、マルチクローニングサイトの配列１個を含むlacZオペロン、及びT7とSP6のポリメラーゼ結合配列を含むベクターである。
BamHI及びSalIサイトは、lacZオペロンの両境界に導入された。(lacZオペロンを除いて合成遺伝子に置き換えるのを容易にするためである）このベクターはpGEM-MB3/4と名付けられている。
ii）Ｍ１３ｍｐ１８に基づくＯＣＶ
Ｍ13mp18(YANI85)は、ファージゲノム全体と、マルチクローニングサイトを１つ持つlacZオペロンから成るベクターである。(MESS77)(マサチューセッツ州ベバリーのニューイングランド・バイオラブス社）BamHI及びSalIサイトは、lacZオペロンの5′及び3′端でＭ13mp18に導入された。このベクターはM13-MB1/2と命名された。
【００６９】
Ｂ）合成遺伝子
合成遺伝子（ＶＩＩＩシグナル配列::成熟bpti::成熟ＶＩＩＩコートタンパク質）は合成オリゴヌクレオチド１６個から構築されたが、この合成オリゴヌクレオチドはテキサス州ヒューストンのジェネティック・デザインズ、Inc社により、KIMH89及びASHM89における手法と類似した方法によって合成された。表102にはこの配列を注釈付きで示す。オリゴヌクレオチドは、標準的方法を用いて一番5'側の分子を除きリン酸化されており、段階的にアニールされ、連結された。突出部分はT4ＤＮＡポリメラーゼによって埋められ、ＤＮＡはpGEM-3Zf(-)のHincＩＩサイトの中にクローニングされた。最初の構築体はpGEM-MB1である。pGEM-MB1の二本鎖DNAは、PstIで切断され、T4DNAポリメラーゼによって埋められ、SalIリンカーに連結された(ニューイングランド・バイオラブ社)。したがって合成遺伝子がBamHI及びSalIサイトによって挟まれている(表102)。合成遺伝子はBamHI−SalIカセットの上に得られ、導入されたBamHI及SalIサイトを使ってpGEM-MB3/4及びM13-MB1/2の中にクローンされ、pGEM-MB16及びM13-MB15がそれぞれできた。合成挿入体は配列決定された。もとのリボゾーム結合部位(RBS)は間違っていた(設計されたAGGAGGの代わりにAGAGGだった)ので、我々はインビトロでもインビボでも発現されたタンパク質を探知できなかった。
Ｃ）合成遺伝子の改変
Ｉ）リボゾーム結合サイト(ＲＢＳ)
pGEM-MB16において、SacI-NheIDNAフラグメント(RBSを含む)を、機能することがわかっているE.coli phoAのRBSとよく似た新規RBSをコードするオリゴヌクレオチドに置き換えた。
元の推定RBS(5'から3')
【化２】
0004451611.tif 000003
新規RBS(5'から3')
【化３】
0004451611.tif 000004
【００７０】
推定RBSは小文字で、開始メチオニンコドンは下線が引かれ太字で表されている。できあがった構築体がpGEM-MB20である。pGEM-MB20が持つ遺伝子の試験管内における発現により、約14.5Kdの予期されたサイズの新規タンパク質種が生成された。
ＩＩ）ｔａｃプロモーター
融合タンパク質の発現を高めるため，lacUV5プロモーターをtacプロモーターに替えた。pGEM-MB16において、BamHI-HpaIIフラグメント(lacUV5プロモーターを含む)を、trpプロモーターの−35配列(RUSS82参照）を含むオリゴヌクレオチドに置き換えた。ベクターはpGEM-MB22と命名した。
【化４】
0004451611.tif 000005
融合タンパク質遺伝子のプロモーター及びRBS変異体は以下のように構築された。
0004451611.tif 000006
pGEM-MB20及びpGEM-MB26の合成遺伝子は、ファージM13-MB27とM13-MB28をそれぞれ生成するため、変えられたファージベクターM13-MB1/2に再度クローニングされる。
【００７１】
ＩＩＩ．シグナルペプチド配列
tac及び「新」RBSにより調節された合成遺伝子の試験管内での発現により、未加工（未切断）タンパク質として予期されたサイズ(約16kd）の新規タンパク質が生成した。インビボの発現でもフルサイズの新規タンパク質が生成されたが、プロセシングをうけたタンパク質は、銀染色又は抗BPTI抗体を使うウエスタン分析によりファージ上にも細胞抽出物中にも見出されなかった。
そこで我々は融合体のシグナル配列を分析した。表106はいくつかの典型的なシグナル配列を示す。荷電残基は一般的に重要であると考えられており、太字で書かれ下線が引かれている。各シグナル配列には無荷電残基が長く続いており、ほとんどは疎水性である。これらは小文字で書かれている。右側の括弧の中にあるのは無荷電残基が続く長さである。「遺伝子ＶＩＩＩ」のシグナルとBPTI融合体、「遺伝子ＩＩＩ」のシグナルとBPTIの融合体は無荷電部分が比較的短いことに気づく。これらの短い無荷電の部分が融合ペプチドのプロセシングを減らすか阻止するのかもしれない。「遺伝子ＩＩＩ」シグナル配列は以下を指示する能力がある。ａ)(成熟BPTI)::(成熟「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質)から成るペプチドを脂質二重層に挿入する、及びｂ)BPTI及び成熟「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質のほとんどを脂質二重層を横切って移動させる(下記参照)。「遺伝子ＩＩＩ」タンパクが、ファージができるまで脂質二重層内から動かずにいるということは、成熟「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質のカルボキシ末端付近にある無荷電アンカー領域による指示であり(表116参照)、分泌シグナル配列によるものではない。phoAシグナル配列は成熟BPTIをE.coliのペリプラズムに分泌するよう指示できる(MARK86)。更に、成熟した本来の「遺伝子ＶＩＩＩ」タンパク質がファージ形成前に脂質二重層内に入るメカニズムについては議論がある。
【００７２】
従って我々は、「遺伝子ＩＩＩ」推定シグナル配列をコードするDNAを、次をコードする各DNAによって置換した。１）phoAシグナル配列、２）blaシグナル配列、及び３）Ｍ13「遺伝子ＩＩＩ」シグナル。これらの代替物はそれぞれ、順番に以下から成る融合タンパク質をコードする三分割遺伝子を生成する。(a)(b)及び(c)の部分をペリプラズムに分泌することを指示する第一の遺伝子に由来するシグナルペプチド、(b)第二の遺伝子(この場合、第二の遺伝子は動物の遺伝子)に由来する開始ポテンシャル結合ドメイン(この場合はＢＰＴＩ)。及び(c)第三の遺伝子に由来する構造的パッケージングシグナル(成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質)。
IPBD::パッケージング−シグナル融合がファージ表面に来る過程は図１に図示されている。図１ａでは、純正「遺伝子ＶＩＩＩ」タンパク質が脂質二重層に現れ(どのような過程を経るにせよ)、アミノ及びカルボキシ末端双方とも細胞質内にある。シグナルペプチダーゼＩは、「遺伝子ＶＩＩＩ」タンパク質を開裂させ、シグナルペプチド(これは細胞に吸収される)及び脂質二重層を横切る成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質を解放する。成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質の多くのコピーが脂質二重層に蓄積しファージ構築を待つ(図１ｃ)。幾つかのシグナル配列はかなり大きいタンパク質を脂質二重層を越えて移動させるよう指示できる。このような強力なシグナル配列のシグナルペプチダーゼＩによる切断部位をコードするコドンの後に複数の追加のコドンが挿入される場合、コードされたアミノ酸は、図１ｂに示されたとおり脂質二重層を越えて移動するであろう。シグナルペプチダーゼＩで切断された後、追加コドンによってコードされたアミノ酸は、ペリプラズムにあるが、成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質によって脂質二重層内につなぎとめられている。図１ｄ。環状一本鎖ファージＤＮＡは、高濃度の成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質を含んでいる脂質二重層のある場所を通って押し出される。各コートタンパク質分子のカルボキシ末端はDNA付近に集まり、アミノ末端は外側に集まる。融合タンパク質はその二重層貫通ドメインでは成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質と同一であるため、融合タンパク質は純正成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質と共集合する。図１ｅを参照のこと。
どの場合も、成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質部分は純正成熟「遺伝子ＶＩＩＩ」コートタンパク質と共集合して、表面に提示されたBPTIドメインを持つファージ粒子を作り出すことが意図されている。分泌シグナル配列の由来や特徴はそれほど重要ではない。シグナル配列は切り取られたり分解されたりするからである。しかし構造パッケージングシグナルは、機能するウイルスシース（鞘）を作るように純正遺伝子コートタンパク質と共集合しなければならないため、重要である。
【００７３】
ａ）細菌アルカリホスファターゼ(phoA)シグナル・ペプチド
構築体pGEM-MB26はSacI-AccＩＩＩフラグメントを有するが、このSacI-AccＩＩＩフラグメントは新ＲＢＳと、開始メチオニオン及びＭ13「遺伝子ＶＩＩＩ」プロタンパク質シグナルペプチドをコードする配列とを含む。このフラグメントを、RBS及び開始メチオニオンとPhoAのシグナルペプチドをコードするDNA(INOU82)を含む二重鎖(４つのオリゴヌクレオチドをアニールさせた)と置き替えた。このファージがpGEM-MB42である。M13MB48はGemMB42から生じたものである。GenMB42からのBamHI-SalIＤＮＡフラグメントはこの遺伝子構築体を含んでおり、同様に切断されたベクターM13MB1/2と結合されて、M13MB48を生じる。
PhoA RBS及びシグナルペプチド配列
【化５】
0004451611.tif 000007
【００７４】
ｂ）β-ラクタマーゼ・シグナルペプチド
β-ラクタマーゼ(amp)プロモーター、及びシグナルペプチドをコードするDNAを、(成熟BPTI)::(成熟ＶＩＩＩコートタンパク質)遺伝子内に移すため、我々はまずamp遺伝子のβラクタマーゼシグナルペプチド開裂部位のコドンの隣にAccＩＩＩサイトを導入した（Ｃ２５０４→Ｔ，およびＡ２５０１→Ｇ）。それからBamHIリンカーをAatＩＩサイトのnt2260、プロモーターの５’側、に連結した。できたベクターはpGEM-MB45である。BamHI-AccＩＩＩフラグメントはampプロモーター及びampRBS、開始メチオニン及びβラクタマーゼ・シグナルペプチドを持つ。このフラグメントを用いてpGEM-MB26の対応フラグメントを置き換えて、構築体pGEM-MB46を作った。
amp遺伝子プロモーターとシグナルペプチドの配列
【化６】
0004451611.tif 000008
ｃ）M13「遺伝子ＩＩＩ」シグナル::bpti::成熟ＶＩＩＩコートタンパク質我々は更に、KmＲ遺伝子と、前述のBPTI::成熟ＶＩＩＩコートタンパク質遺伝子フラグメントに融合しているM13「遺伝子ＩＩＩ」シグナルペプチドを持っているM13MB51を構築することもできる。これは。M13-MB51が「遺伝子ＩＩＩ」を持っていないため、ファージはプラークを形成できないが、細胞をKmＲにすることはことはできる。感染性ファージ粒子はヘルパーファージを介して得られる。「遺伝子ＩＩＩ」シグナル配列は(BPTI)::(成熟「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質)をファージの表面に向かわせることができる。（下記参照）
0004451611.tif 000009
【００７５】
２．合成(シグナルペプチド::成熟-bpti::ＶＩＩＩコートタンパク質)遺伝子にコードされたタンパク質産物の分析
ｉ）試験管内における分析
原核細胞の共役転写／翻訳システム(イリノイ州、アーリントンハイツのアマーシャム・コーポレーション)を用い、BPTI/ＶＩＩＩ合成遺伝子及びその誘導体によってコードされたタンパク質産物をインビトロで分析した。
表１０７は列挙されたベクターによりコードされるタンパク質を列挙するが、これらのタンパク産物は、３５Sメチオニンの存在下で試験管内合成されついでSDSポリアクルアミドゲル電気泳動で生成物を分離し、標準蛍光間接撮影によって可視化される。各サンプル中に、プレβラクタマーゼ産物(約31kd)が見られるが、これはベクターのありふれた選択遺伝子であるamp遺伝子によるものである。更に、合成遺伝子とその変種によってコードされる(pre-BPTI/ＶＩＩＩ)生成物は、示したとおりである。これらの分子種の泳動度(約14.5kd)は、コードされるタンパク質の予想サイズと一致している。
ＩＩ）試験管内における分析
(b)と(c)で詳細に説明したベクターは、E.coli  XL1-blue（ＴＭ）株（カリフォルニア州、ラホヤのストレータージーン社)及びSEF株に新たにトランスフェクトさせた。E.coli SE6004株(LISS85)はprlA4突然変異を持ち、野生型prlAを持つ株より分泌における許容度が高い。SE6004はＦ−であり、lacIは除去されている。したがって細胞には、Ｍ13が感染することができず、lacUV5およびtacプロモーターはIPTGで制御されない。SEF’株は、XL1-blueＴＭと掛け合わせてSE6004株(LISS85)から派生させたものである。XL1-blueＴＭのF’はTCＲ及びlacIｑを持つ。SE6004はストレプトマイシンＲ、TcＳであるのにたいし、XL1-blueＴＭはストレプトマイシンＳ、TcＲであり、両方の親株はTcとストレプトマイシンの組み合わせによって殺すことができる。SEF’は親株SE6004(prlA4)の分泌許容表現型を保持している。
新たなトランスフェクタントはNZYCM培地(SAMB89)中で１時間生育させる。1.0μMから0.5μMの範囲でIPTGを加え(lacUV5とtacを抑制解除するため)、更に1.5時間生育させる。
コードされた合成挿入タンパク質を発現している細胞と、コントロール細胞(ベクターなし、偽ベクター、IPTGなし)の部分標品を、SDSゲル用サンプルバッファーに溶解し、SDS及び尿素を含む20％ポリアクルアミドゲルの中で電気泳動する。二連のゲルは、銀染色(第一製薬、東京)するか、ナイロン膜(マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア社によるイモービロン)に電気的ブロッティングを行ってウサギの抗BPTIポリクローナル抗体を使ったウエスタン分析をした。
【００７６】
表１０８は、同一ゲルの銀染色及びウエスタン分析によって見られる興味深いタンパク質を示す。ウエスタン分析により、BPTIエピトープを持つIPTG誘導可能なタンパク質種がはっきりと見られる。これらのタンパク質は、試験株には存在するがコントロール株には見られない。タンパク質の一部は見たところ完全にプロセシングされたものと一致する大きさのところに移動するが、XL1-blueＴＭにおいてはこの種のタンパク質の易動度はは主にプロセシングされていない形態のプロタンパク質の易動度である。SEF'においては、プロセシングを受けた形態の方が優勢で、プロセシングされていないものに相当するかすかなバンドがあるだけである。
そこで我々は、SEF'株中で分泌シグナル配列の後で開裂される三分節融合タンパク質を生産させた。我々は成熟タンパク質はBPTIの後に「遺伝子ＩＩＩ」コートタンパク質が続いたものからなり、コートタンパク質部分は細胞膜を横断していると確信している。このタンパク質の一つ又はそれ以上のコピー、恐らく何百ものコピーが、Ｍ13から派生したファージ又はＭ13様ファジミドの中に組み込まれる。この構築体により、次のことが可能となる。ａ)BPTIドメインを突然変異させる。ｂ)各変異体を一つ又はそれ以上のファージのコートに提示する(一つのファージにつき一つのタイプ)。及びｃ)我々が選択したターゲット物質に関して新規な結合特性を示す変異体を提示しているファージを回収する。
ラシェッド及びオベラー(RASC86)の報告によると、成熟コートタンパク質の最初の11個の残基に違いがある「遺伝子ＶＩＩＩ」の２個の対立因子を発現している細胞で生成されたファージは、各タンパク質をいくらかずつ含む。したがって、我々はphoA(シグナル)::bpti::成熟ＶＩＩＩ融合遺伝子のインビボでのプロセシングを達成できたことから、この遺伝子と野生型ＩＩＩとの共集合により表面にBPTIドメインを持つファージが作られることは大いにありそうである。これらの遺伝子のbptiドメインを突然変異させるとファージのライブラリーができる。各ファージは、ファージ表面に提示されたBPTIの変異体をコードする遺伝子を持っている。
【００７７】
ＶＩＩＩ  提示ファージ：生産：調製及び分析
i．ファージ生産
OCVはIPTGのない状態でXL1-blueＴＭ中で生育できる。典型的には、プラークプラグをプレートから取り、新たに希釈された細胞を含む培地2mlの中で6から8時間の間培養する。この培養物は遠心器にかけられた後、上澄液の力価を測定する。これはファージのストック（保存原液）として更なる感染、ファージ生成及び興味のある遺伝子提示のために保存される。
１晩培養したSEF'細胞の培養液を500mlのNZCYM培地で100倍に薄めた液を直ちに、37℃においてシェーカー内で細胞密度が０．４（６００ｎｍにおける吸光度）になるまで培養する。この培養液にMOIが１０となるのに十分な量のファージストックを加え、同時にIPTGを最終濃度が0.5mMとなるように加えさらにもう2時間培養を続ける。
【００７８】
ii．ファージの準備及び精製
ファージを生産する細菌培養液は遠心して、上澄液にあるファージを細菌ペレットから分離する。この上澄液に、量にして１／４のファージ沈降液(20％PEG,  3.75M酢酸アンモニウム)を加え、PMSFを最終濃度1mMとなるよう加える。これを2時間氷上に放置し、その後沈降したファージを遠心により回収する。ファージペレットは、0.1％のサルコシルを含むTrisEDTAに再溶解し、4℃で1時間放置し、その後遠心して細菌及び細菌のかけらを除去する。上澄液のファージは4℃で一晩PEGにより再沈降させる。ファージペレットはLB培地中に懸濁させ、あと2回沈降させて界面活性剤を除去する。ファージは4℃でLB培地中に懸濁して、力価を測定し、分析及び結合の研究のために使われる。
より厳格なファージ精製計画は、CsC1勾配(NETバッファー(0.1M NaCl, 1mM EDTA, 0.1M Tris pH7.7)に3.86gのCsC1を溶かし10mlにする)の中で遠心分離にかける。TEサルコシル・バッファー中の10 １２から10 １３ファージを5mlのCsCl NETバッファーと混合し、34k rpmで一晩遠心する。例えばSorvall OTD-65B超遠心機などを用いる。400μlづつの分画を注意深く取り出す。各画分から5μlづつを取り、0.1％のSDSを含むゲル・ローディング・バッファーとともに15分間65℃で加熱した後、アガロースゲル電気泳動法によって分析する。ファージを含む画分はプールされる。ファージは再沈降させ、最終的にLB培地に1mlあたり10 １２から10 １３個の濃度になるよう再溶解させる。
ＩＩＩ．ファージの分析
提示ファージは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びゲルの銀染色又は、ナイロン膜に電気的に移してから抗BPTI抗血清(ウエスタン分析)を用いて分析するという標準手法を用いて分析する。異種タンパク質の提示は、電気泳動法及びウエスタン分析において元のタンパク質例えばBPTIの段階希釈と提示ファージサンプルを比較することによって定量する。別の方法では、ファージの倍々希釈液を電気泳動し、主要コートタンパク質と融合タンパク質を双方とも銀染色する。二つのタンパク質種の比率の比較により、ファージごとの融合タンパク質の数を予測すること可能になる。一つのファージ中にあるＶＩＩＩ遺伝子によりコードされたタンパク質の数が分かっているからである(約3000)。
【００７９】
融合タンパク質のバクテリオファージへの組み込み
ベクターGemMB42とM13MB48によってコードされるBPTI:ＶＩＩＩ融合タンパク質がプロセシングを受けたものがインビボで発現されると、プロセシングを受けた融合生成物は恐らく細胞膜内にあるということを示される。従って、この融合生成物はファージに組込まれている可能性があり、BPTI部分はファージ表面に提示されるであろうことが示唆される。
SEF'細胞に、コントロールとしてM13MB48又はＭ13mp18に感染させた。できたファージを、尿素を含む20％のポリアクリラミドゲル中で電気泳動し(１レーンごとに約10１１個のファージ)、ナイロンマトリックスに電気移動させて抗BPTIウサギ血清を使ってウエスタン分析を行った。単一種のタンパク質が、M13MB48保存ファージ感染細胞から得られたファージ中に観察されたが、これはコントロール感染細胞から得られたファージには観察されなかった。このタンパク質は約12kdのサイズのところへ移動したが、このサイズは完全にプロセシングされた融合タンパク質と一致する。
ファージ感染させた、あるいはさせていないSEF'細菌溶菌液のウエスタン分析により、約２０kdの別のタンパク質種があることが示された。この種は量は少ないが、ＰＥＧ沈殿させただけでさらなる精製（例えば非イオン性界面活性剤を用いたり、CsC1勾配遠心をするなど）を行わないファージ標品にも存在した。界面活性剤存在下又は非存在下で作られたM13MB48ファージ標品を比較すると、サルコシル処理及びCsCl勾配精製は菌体混入物を除去するが、BPTI:ＶＩＩＩ融合タンパク質の存在には全く影響を及ぼさないということを示した。これは融合タンパク質がファージのボディに組み込まれており、構成要素として存在することを示している。
感染後及びＩＰＴＧインダクション後のファージ生成及びBPTI:ＶＩＩＩの組み込みの時間経過を追跡した。ファージ生成及び融合タンパク質組み込みは２時間後に最高になるようであった。この時間経過はその後のファージ分析及び生成に用いられる。
ファージ標品のポリアクリルアミド電気泳動法、それに続く銀染色は、標品には基本的に混入タンパク質種がないこと、新しいタンパク質バンドが１つ、Ｍ13ＭＢ48に由来するファージに存在するがコントロールファージにはないことを示した。新タンパク質のサイズはウエスタン分析で見られたものと一致していた。
BPTI:ＶＩＩＩを組み込んだファージの段階希釈物を、同様に分析したところ、融合タンパク質と主要コートタンパク質の比率は通常約１：１５０であることが示された。ファージは「遺伝子ＶＩＩＩ」生成物のコピーを約3000個含むので、ファージ集合は平均、一つのファージにつき数十の融合タンパク質のコピーを含んでいるのである。
【００８０】
天然の「遺伝子ＶＩＩＩ」の開始メチオニンの変更
OCVM13MB48は、修飾Ｍ13mp18ファージベクターの遺伝子間領域にBPTI/ＶＩＩＩ融合タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。ベクターの残りはＭ13ゲノムである。ファージへの組み込みを増やすため、我々は、この遺伝子の最初のメチオニン・コドンをＣＴＧに変えることにより、天然「遺伝子ＶＩＩＩ」産物の生成を減らすことにした。このような場合、メチオニンは組み込まれるが、翻訳開始率は下がる。この変化は部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によって達成された。
0004451611.tif 000010
この変更ベクターから派生したファージを分析したところ、主要タンパク質に対する融合タンパク質の比率が非常に増加したことを示した。量的評価はファージ集団内で、一つのファージにつき１００個のBPTI:ＶＩＩＩ融合体のコピーが組み込まれたことを示した。
【００８１】
バクテリオファージによるBPTI：ＶＩＩＩ融合タンパク質の提示
BPTI：ＶＩＩＩ融合タンパク質がファージのボディ内に組み込まれることはすでに証明された。このファージを更に分析して、BPTI部分は特異的抗体にアクセスでき、したがってファージ表面に提示されていることを示した。
我々は精製ポリクローンウサギ抗BPTIIgGを、既知の力価のファージに加えた。インキュベート後、プロテインＡアガローズビーズを加えてIgGに結合させ、一晩インキュベートする。IgGタンパク質Ａビーズ及びそれに結合したファージを遠心分離により除き、上澄液を再度力価測定してファージの減少分を測定する。ビーズに結合したファージも酸によって溶出し力価測定することができる。このアッセイには、ＷＴファージストック(M13mp18)や正常ウサギの免疫前の血清から精製されたIgGなどをコントロールとして用いる。
表１４０は、ＷＴファージの力価測定が抗BPTIIgGによって変らないのにたいし、BPTI-IIIMK(ポジティブ・コントロール、下記参照)は、プロテインＡビーズの追加があってもなくても、力価測定においてかなりの低下が見られた。(BPTI部分はファージを細菌の繊毛に結合させるgIIIpの一部であるため、これは予測できた。)  M13MB48ファージ(BPTI:VIII融合タンパク質を含む)の２つのバッチは、pfuによって判断するところ、抗BPTI抗体及びプロテインＡが加えられた時、力価がかなりの低下を示した。抗体のみを加えたときに見られる力価の低下は、ファージの２バッチ間で多少異なる。免疫沈降ファージの回収は、定量性はないが、ＷＴファージ・コントロールと比べると著しい。
より多くのコントロールが表１４１と１４２に示されている。データは、BPTI:ＶＩＩＩを含むファージで観察された力価の喪失は、これらのファージによるBPTIエピトープの提示と、抗BPTI抗体との特異的相互作用の結果であることを示している。プロテインＡアガローズビーズも、通常のウサギの血清から精製されたIgGも、特に注目すべき相互作用はなかった。M13MB48バッチ５の力価低下が大きいことは、この標品では融合タンパク質の組み込みが高いことを示している。
【００８２】
BPTI-ＶＩＩＩ提示ファージにおけるBPTI部分の機能性
前述の２つのセクションでは、BPTI:ＶＩＩＩ融合タンパク質はファージボディに組み込まれたこと、及びBPTI部分はファージ表面に提示されたことを説明した。提示された分子が機能することを示すためには、前セクションで説明した方法とほぼ同じ方法で結合実験を行うが、抗体の代わりにプロテアーゼを使うところのみが異なる。提示ファージ及びコントロールは、固定されたプロテアーゼ又は固定され不活化されたプロテアーゼと相互作用させる。結合は提示ファージの力価の減少又はビーズに結合したファージを測定して評定できる。
表１４３は、BPTI-ＶＩＩＩ提示ファージ、M13MB48をアンヒドロトリプシン−アガローズビーズに結合させた実験の結果を示す。ＷＴファージ(BPTIの提示はなし)に比べて力価がかなり大きく低下した。それぞれがBPTI:主要コートタンパク質インターフェースにおいて多様化された5個のアミノ酸伸張部を含むファージのプール(5AAプール)は、同じような力価の低下を示した。コントロール実験では(表１４３)、無関係のタンパク質(ストレプトアビジン)を持つアガローズビーズにおいて提示ファージの非特異結合はほとんど観察されなかった。
提示ファージの実際の結合は、表１４４に示された二つの実験のデータに示されている。ネガティブコントロールはM13mp18で、ポジティブコントロールはBPTI-IIIMKであり、このファージにおいては「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質に付いたBPTI部分は提示され機能することが示されている。M13MB48とM13MB56はともにポジティブコントロールに匹敵するかたちで、アンヒドロトリプシン・ビーズに結合する。これはネガティブコントロール（非提示ファージ）の40から60倍も高い。従って、主要コートタンパク質におけるBPTI部分の機能性は確立されたといえよう。
【００８３】
更に、表１４５は、ファージによる活性及び不活性トリプシンへの結合を比較する。コントロールファージであるM13mp18及びBPTI-IIIMKは、本出願の別の個所で詳しく説明されている結合に似た結合を示した。ＷＴファージの活性プロテアーゼに対する非特異結合があきらかに顕著に低下したために、トリプシンへの相対的結合が増していることに留意したい。'EGGS'リンカー伸張部をドメイン・インターフェースに持つM13.3X7及びM13.3X11は、BPTI-IIIMKファージと同じようにアンヒドロトリプシン及びトリプシンに結合した。非提示ファージと比較して、アンヒドロトリプシン結合試験においては約100倍高く、トリプシン結合試験では少なくとも約1000倍高かった。'EGGGS'リンカー変異体であるM13.3Xdの結合はM13.3X7の結合と類似していた。
結合の特異性を示すため、ヒトの好中球エラスターゼ(HNE)ビーズを使って試験を繰り返し、表146に示したトリプシンビーズとの結合と比較した。BPTIはトリプシンに高い親和性を示し、HNEには低い親和性を示すため、BPTI提示ファージは、これらのビーズとの結合アッセイで、これらの親和性を反映するはずである。トリプシン結合におけるネガティブ及びポジティブコントロールは既に上に説明があるとおりであるが、HNEビーズのためにポジティブコントロールとしてBPTI(K15L，MGNG)-IIIMAを追加した。結果は、表146に示されており、この予測を確証した。M13MB48,  M13.3X7及びM13.3X11ファージは、BPTI-ＩＩＩMKファージに匹敵し、ＷＴファージ及びHNEコントロール(BPTI(K15L,MGNG)-ＩＩＩMA)と比べてトリプシンによく結合することを示した。逆に、HNEビーズを用いたときは、HNEポジティブコントロールファージを除き、結合は少なかった。
蓄積されたデータを総合すると、BTPIがM13の主要コートタンパク質との融合ンパク質の一部であるとき、分子はファージの表面に提示され、多くがプロテアーゼと特異的に結合する機能を持つ。
【００８４】
例ＩＩ
BPTI／「遺伝子ＩＩＩ」提示ベクターの構造
ＤＮＡの操作はマニアテス等(MANI82)又はサムブルック等(SAMB89)に解説されている標準的方法に基づいて行われた。まずM13MB1/2のlacZ遺伝子が除去された。M13MB1/2  RFがBamHI及びSalIによって切断され、大きいフラグメントが分離された。回収された6619bpフラグメントはKlenow酵素で補填され、HindＩＩＩ8merリンカーに結紮されて、XL1-blueTM(カリフォルニア州、ラホヤのストレータージーン社)細胞をトランスフェクトするのに用いられる。同細胞は次にプラーク形成のため培地で培養される。選択されたプラークからRF DNAが調製され、再生されたBamHI部位とSalI部位及び新たなHindＩＩＩ部位を、すべてBq1ＩＩ部位(6935)の500bp上流に含むクローンM13MB1/2デルタが選ばれた。
M13-MB1/2デルタにおける「遺伝子ＩＩＩ」のコドン17と18に唯一のNarIサイトが導入される(アミノ酸をH−SからG−Aに変える)。
野生型
【化７】
0004451611.tif 000011
突然変異オリゴ
【化８】
0004451611.tif 000012
ヌクレオチド1630にただ１つのNarI部位が存在することは、制限酵素分析によって確認された。新しいベクターはM13MB1/2デルタ-NarIである。ファージＭＫはプラスミドpUC4K(ニュージャーシー州ピスカットアウエイのファーマシア社)からの1.3kb BamHI KmＲフラグメントをM13MB1/2デルタNarIにクローニングすることによって作った。
【００８５】
合成ＢＰＴＩ遺伝子の挿入
BPTI-ＩＩＩ提示ベクターは標準的方法で構築された。合成bpit-ＶＩＩＩ融合体はNarI部位を１つ持つが、これはBPTIコード領域の最後の2個のコドンから成る。二番目のNarI部位はBPTIをコードする領域の上流にここに示すアダプターをAccＩＩＩで切断したM13-MB26に結紮することによって導入した。
【化９】
0004451611.tif 000013
連結標品はついでNarIによって制限切断され、BPTIをコードする180bpDNAのフラグメントが単離された。ファージMKのRF DNAはNarIで消化され、脱リン酸化され、更に180bpフラグメントに連結された。結紮のサンプルはXL1-blueTMをトランスフェクトするのに使われ、KmＲプラークのため固体培地で培養された。プラークから得られたファージから分離されたDNAは、BPTI遺伝子に相当する３２Pでリン酸化された二本鎖DNAプローブとハイブリダイズするかについてテストされる。強いハイブリダイゼーションシグナルを出しているクローンについて大規模RF標品が作られた。制限酵素消化分析により、ファージMK-BPTIを作るのに、合成BPTI遺伝子のコピーが1個MK「遺伝子ＩＩＩ」に挿入されていることが確認された。続くDNAの配列決定により、bpti-ＩＩＩ融合遺伝子の配列が正しく、正確なリーディングフレームが保持されていることが確認された。表１１６は全コーディング領域、タンパク質配列への翻訳、及びポリペプチド鎖の機能部分を示す。
【００８６】
ＢＰＴＩ−ＩＩＩ融合遺伝子の試験管内における発現
MK-BPTI RF DNAを共役原核細胞転写翻訳抽出物(Amarsham)に加えた。新しく合成された放射標識されたタンパク質がつくられ、次に電気泳動法により15％SDSポリアクリルアミド・ゲル上で分離された。MK-BPTI DNAは、プロセシングを受けていない「遺伝子ＩＩＩ」融合タンパク質の合成を指示する。このタンパク質はWT「遺伝子ＩＩＩ」より7kd大きく、BPTIの58個のアミノ酸を「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質に挿入したことと一致する。我々は無細胞原核細胞抽出物から得られた放射標識されたタンパク質の免疫的沈降を行った。ウサギの抗(M13「遺伝子ＶＩＩＩ」タンパク質)IgGも通常のウサギの細胞のIgGも、MK又はMK-BPTIによってコードされた「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質を免疫的沈降させることができなかった。しかしウサギの抗BPTI IgGは、MK-BPTIによってコードされた「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質を沈降でき、MKによるものはできなかった。これは、MK-BPTIによってコードされたＩＩＩタンパク質のサイズ増大は、BPTIタンパク質の挿入によるものであることを立証する。
ウエスタン分析
ファージは培養からPEG沈殿により回収された。残った細胞を取り除くため、回収されたファージは高い塩分のバッファー内に再懸濁され、遠心分離された。これは、MUTA-GENE(R)M13試験管内突然変異誘発キット(カリフォルニア州リッチモンド、バイオラッド社、カタログ番号170-3571)の説明に従って行われた。ファージの一部(最高40μgのタンパク質を含む)を、12.5％のSDS尿素ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動し、タンパク質をイモビロンのシート上に電気的に移動させる。ウエスタン・ブロットは、予めE.Coli抽出物とインキュベートしておいたウサギの抗BPTI血清、次いでアルカリ・ホスファターゼに結合させたヤギ抗ウサギ抗体を用いて現像された。67Kdの免疫反応するタンパク質がMK-BPTIの調製物中に見出されたが、MKファージには認められなかった。免疫反応性タンパク質のサイズは、プロセシングを受けたBPTI-ＩＩＩ融合タンパク質(6.4KD＋60KD)の予期されたサイズと一致している。これらのデータはBPTIに特有のエピトープが、MK-BPTIファージの表面に提示されているMKファージにはないこと示す。
【００８７】
アガロース固定アンヒドロトリプシンにより中和されるファージ力価
アンヒドロトリプシンは、活性部位のセリンがデヒドロアラニンに変換されたトリプシン誘導体である。アンヒドロトリプシンはトリプシンの特異的結合を維持しているが、プロテアーゼ活性はない。ポリクローナル抗体とは異なり、アンヒドロトリプシンは延びたBPTIにも不完全なフラグメントにも結合しないとされている。
ファージMK-BPTI及びMKは、1.0mg/mlのBSAを含むTBSバッファー(PARM88)で希釈して1mlあたり1.4・10１２粒子の濃度にする。希釈ファージ30μlを、2，5，又は10μlのアガロースに固定化したアンヒドロトリプシン(イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル社）のTBS/BSAバッファー中50％スラリーに加えた。25℃においてインキュベートした後、一部を取り出し、氷冷LB液で希釈し、XL1-blue（ＴＭ）細胞の菌叢（ローン）上でのプラーク形成ユニットについて力価測定される。表114はMK-BPTIファージが固定化アンヒドロトリプシンと４時間インキュベートすると、力価は顕著に減少したが、MK(コントロール)ファージではそのような効果はまったく見られないことを示す。ファージ力価減少はまた、MK-BPTIファージに加えた固定化アンヒドロトリプシンの量に比例する。アガロースに固定化したストレプトアビジン(モンタナ州セントルイスのシグマ社)のTBS/BSAバッファー中50％スラリー5μlとインキュベートすると、MK-BPTIのファージでもMKファージでも、力価は低くならない。これらのデータは、正しく折りたたまれた、機能的なBPTIタンパク質がMK-BPTIファージ表面上に提示されているが、MKファージ上には提示されていないことと合致する。折りたたまれていない、不完全なBPTIドメインはアンヒドロトリプシンと結合しないとされている。さらに、折りたたまれていないBPTIドメインは非特異的にくっつくと考えられている。
抗ＢＰＴＩ抗体によるファージ力価の中和
MK-BPTI及びMKファージは、LBブロスで1mlあたりに4・10８のプラーク形成ユニットの濃度になるよう希釈した。希釈されたファージ15μlを、等量のウサギの抗BPTI血清又はノーマル血清(双方ともLBブロスで10倍希釈)に加えた。３７℃でインキュベートした後、一部を取り出し氷冷LBブロスで希釈しXL1-blue（ＴＭ）細胞のローン上でのプラーク形成ユニットについて力価を測定した。MK-BPTIファージと抗BPTI血清をインキュベートすると、2時間にわたり力価が減少してゆくが、MKファージにおいてはこのような効果は見られない。予期通り、ノーマルなウサギの血清では、MK-BPTIもMKもファージ力価は下がらない。抗BPTI血清を前もって、等量の大腸菌タンパク質ではなく純正BPTIタンパク質とインキュベートしておくと、血清がMK-BPTIファージの力価を下げる機能がブロックされてしまう。これらのデータは、BPTI特有エピトープがMK-BPTIファージ表面に提示されているがMKファージでは提示されていないということと合致する。つまりデータはこれらのBPTIエピトープは「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質とが結合しており、この融合タンパク質と抗BPTI抗体が結合すると、細胞感染する能力がブロックされる。
【００８８】
トリプシンによるファージ力価の中和
MK-BPTI及びMKファージは、LBブロスで1mlあたり4・10８のプラーク形成ユニットの濃度になるよう希釈した。希釈ファージを等量のさまざまな濃度のトリプシンのLB溶液に加えた。３７℃でインキュベートした後、一部を取り出し氷冷LBブロスで希釈しXL1-blue（ＴＭ）細胞のローン上でのプラーク形成ユニットについて力価を測定した。0.15μgのトリプシンが入った溶液と２時間インキュベートすると、MK-BPTIファージでは力価に70％の低下が見られ、MKファージでは15％の低下しかなかった。ファージに加えられるトリプシンの量を減らすと、力価の低下が少なくなる。しかし、調べられた全てのトリプシン濃度で、MK-BPTIファージのほうがMKファージより、トリプシンとのインキュベーションにより敏感に反応する。従って、MK-BPTIファージ表面に提示されたBPTI-ＩＩＩ融合タンパク質にトリプシンが結合すると、細胞感染機能をブロックしてしまう。
トリプシンによるファージMKの力価の低減はおそらく一般的現象の一例である。プロテアーゼが十分な量存在すれば、ファージのタンパク質を分解し、感染力を低下させる。本出願では、この問題を解決することができる幾つかの方法がリストされている。
【００８９】
親和性選択システム
固定化アンヒドロトリプシンによる親和性選択
MK-BPTI及びMKファージはTBSバッファー(PARM88)で1mlあたり1.4・10１２個の粒子濃度になるよう希釈した。我々は4.0・10１０ファージを、TBS/BSA中のアガロース固定化アンヒドロトリプシン・ビーズ(ピアス・ケミカル社)か又はアガロース固定化ストレプトアビジン・ビーズ(シグマ社)の50％スラリー液5μ1に加えた。３時間室温でインキュベートした後、ビーズは5000rpmで30秒間、マイクロフュージで遠心分離してペレットにし、上清画分を集めた。ビーズはTBS/Tweenバッファー(PARM88)で5回洗浄するが、一度洗浄するたびにビーズは遠心分離によってペレットにし、上澄液を除いた。最後にビーズは再び溶出バッファー(1.0mg/mlのBSAを含む、グリシンでｐＨ2.2に調整された0.1N HCl)中に再懸濁され、室温で5分間インキュベートした後、ビーズは遠心分離によりペレットにする。上澄液を取り出し、ｐＨ8.0の1.0M Tris-HClバッファーを加えて中和した。
ファージサンプルの一部は、シュライヒャー及びシュエル(ニューハンプシャー州、キーン)のろ過マニホルドを用いてナイトラン膜に塗布された。ファージDNAは、80℃で2時間加熱することにより、ナイトラン上に固定された。加熱されたフィルターは、予備洗浄液(MANI82)と予備ハイブリダイゼーション溶液(ペンシルバニア州、ウエストチェスターの5プライム-3プライム社)で、42℃で1時間インキュベートされた。MKRFからの1.0Kb のDNAフラグメントNarI(塩基1630)／XmnI(塩基2646)は、オリゴラベリング・キット(ニュージャージー州、ピスキャットアウエイ、ファーマシア社)を用いて３２P-dCTPで放射標識された。放射性プローブをハイブリダイゼーション溶液(5プライム-3プライム社)中のナイトラン・フィルターに加え、一晩４２℃でインキュベートした後、フィルターを洗浄してオートラジオグラフィを行った。
【００９０】
この親和性選択システムの効率は、ドット・ブロット方法により半定量的に求めることができる。MK-BPTIファージ処理アンヒドロトリプシンビーズを溶出バッファーにさらすと、結合したMK-BPTIファージがリリースされる。ストレプトアビジン・ビーズはファージMK-BPTIを保持しない。アンヒドロトリプシン・ビーズはファージMKを保持しない。表115にある実験で、我々は全MK-BPTIファージの20％が5μlの固定アンヒドロトリプシンに結合し、ついでビーズを溶出バッファー(ｐＨ 2.2  HCl/グリシン)で洗浄することにより回収されたと評価している。同じ条件のもとで、検出量のMK-BPTIファージはストレプトアビジン・ビーズに結合せずまたそれから回収されなかった。溶出画分において回収されたMK-BPTIファージは、ファージに加えられた固定化アンヒドロトリプシンの量に比例する。固定化アンヒドロトリプシン又はストレプトアビジン・ビーズに結合したMKファージは検出されず、溶出バッファーによって回収されたファージもなかった。これらのデータは、上述の親和性選択システムが、特定の折りたたまれたタンパク質(この場合はBPTI)を提示するファージを選ぶのに用いられ得ることを示している。変性又は不完全なBPTIドメインはアンヒドロトリプシンに結合しないとされている。
【００９１】
抗ＢＰＴＩ抗体による親和性選択
MK-BPTI及びMKファージは、1.0mg／ml BSAを含むトリス・バッファー・生理食塩溶液(PARM88)で1mlあたり1・10１０粒子濃度まで希釈された。2・10８個のファージを、TBS/BSA中のビオチニル化ウサギ抗BPTI IgG又はTBS/BSA中のビオチニル化ウサギ抗マウス抗体IgG(シグマ)の2.5μgに加え、一晩４℃でインキュベートした。ストレプトアビジン・アガロース(シグマ)の50％スラリーは、TBSバッファーで３回洗浄してから30mg/mlのBSAを含むTBSバッファーと60分間室温でインキュベートし、TBS/Tweenバッファー(PARM88)で3回洗浄して、最終的にこのバッファー中50％の濃度になるよう再懸濁された。ファージとビオチニル化IgGを含むサンプルはTBS/Tweenバッファーで希釈してから、TBS/Tweenバッファー中のストレプトアビジン・アガロースを加えた。60分間の室温でのインキュベーションに続き、ストレプトアビジン・アガロース・ビーズは30秒間の遠心分離によってペレットにされ、上澄液のフラクションが集められた。ビーズはTBS/Tweenバッファーで5回洗浄したすが、一度洗浄するたびにビーズは遠心分離によってペレットにされ、上澄液が除去された。最後にストレプトアビジン-アガロース・ビーズは溶出バッファー(1.0mg/mlのBSAを含む、グリシンでｐＨ2.2に調整された0.1N HCl)中に再懸濁された。室温で5分間インキュベートした後、ビーズを遠心分離によりペレットにした。上澄液をとり、ｐＨ8.0の1.0M Tris-HClバッファーを加えて中和した。
【００９２】
ファージサンプルの一部を、シュライヒャー及びシュエル(ニューハンプシャー州のキーン社)のフィルタレーション・マニホルドを用いてナイトラン膜に塗布した。ファージDNAは、80℃で2時間加熱することにより、ナイトラン上で固定された。フィルターは、42℃の予備洗浄液(MANI82)で60分間洗浄し、42℃で60分間、サザン・プレハイブリダイゼーション溶液(5プライム-3プライム社)の中でインキュベートした。MK RFからのDNAフラグメント、1.0Kb NarI(1630bp)／XmnＩ(2646bp)は、オリゴラベリング・キット(ニュージャージー州、ピスキャットアウエイ、ファーマシア社)を用いて３２P-dCTPで放射標識した。ナイトラン膜は、42℃でプレ・ハイブリダイゼーション溶液からサザン・ハイブリダイゼーション溶液(5プライム-3プライム社)に移した。放射性プローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、一晩42℃でインキュベートしたあと、フィルターを、室温で2×SSC（0.1％SDS）中で３回洗浄し、65℃で2×SSC（0.1％SDS）中で１回洗浄した。 ナイトラン膜はオートラジオグラフィにかけた。 親和性選択システムの効率は、ドット・ブロット法により半定量的に求めることができる。ドットA1及びB1又はC1及びD1の比較は、 ファージの大半がストレプトアビジン−アガロース・ビーズに付着しなかったことを示している。TBS/Tweenバッファーによる洗浄により、 非特異的にストレプトアビジン・ビーズに結合していたファージの大半が取り除かれる。 ストレプトアビジン・ビーズを溶出バッファーにさらすと、前もってビオチニル化ウサギ抗BPTI IgGとインキュベートしておいたMK-BPTIファージの場合のみ結合ファージをリリースする。このデータは、上述の親和性選択システムが、特定の抗原を提示するファージ(この場合はBPTI)の選択に用いられ得ることを示している。我々は以下の計算に基づいて、少なくとも富化定数が４０倍高くなると評価している。
MK-BPTIファージが回収されたパーセンテージ
富化定数＝回収されたMK-BPTIファージパーセント／回収されたＭＫファージパーセント
【００９３】
例ＩＩＩ
BPTI：ＶＩＩＩ境界伸張
BPTIと成熟gＶＩＩＩpの間の柔軟性を増すため、我々は、これらのドメインの間にペプチドを伸ばすためのコドンを導入した。
融合タンパク質接点にブロック伸張を加える
バクテリオファージの電子顕微鏡観察で示されたようにＭ13「遺伝子ＩＩＩ」産物は「ストーク様」領域を含む(LOPE85)。このタンパク質の予測されたアミノ酸配列は、次のような繰り返しのモチーフを含む。
glu.gly.gly.gly.ser(EGGGS)が7回
gly.gly.gly.ser(GGGS)が3回
glu.gly.gly.gly.thr(EGGGT)が1回
本節の目的は、ドメインの接点において、ＩＩＩ遺伝子産物に見られる繰り返しモチーフを反映するマルチユニット伸張部を挿入することである。
二つの合成オリゴヌクレオチドが合成された。我々はこれらのコドンの３番目の塩基を選び、オリゴヌクレオチドが反対方向に翻訳されるとSERを生じるようにした。合成オリゴヌクレオチドをアニールさせると次のユニット二本鎖配列となる(EGGSリンカー)。
【化１０】
0004451611.tif 000014
この二本鎖分子では、共通する二つの塩基ペア（GC)がリンカーの両５’端に突出しており、マルチユニットの連結と、M13MB48及びGemMB42のOCV中に存在する単一のNarI認識配列中にクローン化する機能を持つ。 この部位は接点をコードするDNAの1個のコドン内に位置する。EGGSリンカー(またはマルチリンカー)をベクターのNarI部位にクローニングすると、 この認識配列が壊れる。EGGSリンカーを逆向きに挿入すると、ＧＳＳＳＬを融合タンパク質に挿入することになる。
【００９４】
表１１３に示す遺伝子のNarI部位へEGGSリンカーを1個加えると以下の遺伝子になる。
【化１１】
0004451611.tif 000015
OCVに挿入されるリンカーの方向は前もって選べず、どちらの向きの(予期されたEGGGS又はGSSSLアミノ酸配列の)マルチリンカーも、あるいは方向の混在（逆方向反復DNA)も起こる可能性がある。
異なる比率で５’末端がリン酸化されている及びリン酸化されていない２つの出発オリゴヌクレオチドをアニールし、連結することにより順々に大きくなるマルチリンカーのラダーが作られた。この背後にある論理は次のようなものである。あるオリゴヌクレオチドの３’非リン酸化末端が別のオリゴヌクレオチドの５’リン酸化末端に連結される。リン酸化及び非リン酸化オリゴヌクレオチドの混合物を用いると、マルチリンカー形成の程度を制御できる。15塩基対(1ユニットの二本鎖−5アミノ酸)から600塩基対以上(４０個の連結されたリンカー−２００アミノ酸)にわたる、挿入体の大きさの範囲を示すラダーがアガロースゲル電気泳動で容易に検出できた。
逆方向反復が大きいと、遺伝子的不安定性につながる。従って我々は、OCVへの連結前に、マルチリンカーを制限酵素AccＩＩＩ又はXhoIにより消化することによってそれらを除去することにした。リンカーが「頭同志」又は「尻尾同志」連結されるとこれらの認識配列を生じるからである。このような消化はマルチリンカーのサイズの範囲を、1〜8リンカー・ユニット(５工程で5個から40個のアミノ酸)の間へと顕著に減少させる。これはアガロース・ゲル電気泳動で査定された。
【００９５】
リンカーは、標準手法により、NarIで切断されたOCV又はGemMB42に連結される(異なるサイズの挿入体のプール又はゲルで精製した別々のフラグメントとして)。連結に続いて、制限酵素NarIを加えて、自動連結する出発OCVを除去する(リンカー挿入はNarI認識配列を壊すからである)。この混合物を用いてXL-1-blue細胞を形質転換し、プラーク(OCV M13MB48)又は抗アンピシリン・コロニー(OCV GemMB42)を作るように適切に平板培養した。
形質転換細胞は、二つの３２P標識オリゴヌクレオチドプローブのうちの一つを用いたドット・ブロットＤＮＡ分析により、スクリーニングされる。プローブの１つはBPTIのＰ１ループをコードするＤＮＡの相補配列から成り、もう一つのプローブはドメイン接点領域をコードするＤＮＡに相補的な配列から成る。適切なリンカー候補は最初のプローブには正に反応し、２番目のプローブには反応しないか、または反応が悪い。プラークから精製されたクローンは、結合分析及びBPTI提示のためファージストックをつくるのに使われ、ファージ感染細胞から得られたRfＤＮＡは制限酵素分析及び配列決定のために使われる。分析された選択クローンの代表的挿入配列は次のとおりである。
【化１２】
0004451611.tif 000016
これらの非常にフレキシブルなオリゴマーリンカーは、結合ドメインを繊維状ファージの主要コート・タンパク質(遺伝子ＶＩＩＩ)につないで結合ドメインをファージ表面に提示させるのに役立つに違いない。これらはさらに他の遺伝子パッケージ用のキメラOSPの構築にも役立つだろう。
【００９６】
ドメイン間伸張融合タンパク質のファージへの組み込み
BPTI：コートタンパク質接点において多様化されたペンタペプチド伸張部を含むファージプールをSEF細胞に感染させた。前節で述べた基準を用いて我々は、伸張融合タンパク質がファージに組み込まれと決めた。生成されたファージのゲル電気泳動とそれに続く銀染色又は抗BPTIウサギ血清を用いたウエスタン分析により、融合タンパク質が開始時の融合タンパク質に似ているが、多少遅い速度で移動することがわかった。
ドメイン接点のEGGGSリンカー伸張部に関しては、５個のアミノ酸からなるユニット伸張部を含むと予測される個々のファージストックを同様の方法で分析した。伸張融合タンパク質の移動は、ウエスタン分析と銀染色によって見ると、親融合タンパク質とは容易に区別できる。
より詳しく分析されたクローンには次が含まれる。M13.3X4(予測されたアミノ酸配列GSSSLのある単一逆方向EGGSリンカーを含む)、M13.3X7(予測されたアミノ酸配列EGGSのある正しい向きのリンカーを含む)、M13.3X11（逆方向を１つ含む４つのリンカーを含み、その伸張のための推定アミノ酸配列はEGGGSGSSSLGSSLである）、及びM13.3Xd（少なくとも5個のリンカーすなわち25個のアミノ酸から成る伸張部を含む）である。
伸張された融合タンパク質はすべて、高いレベルでファージに組み込まれ(ファージ1つにつき平均何十ものコピーが存在した)、ゲル電気泳動により分析すると、易動度は予測される伸張サイズと一致した。クローンM13.3X4とM13.3X7は、親融合タンパク質と類似しているが明らかに異なる位置に移動した。一方M13.3X11及びM13.3Xdは顕著に大きかった。
【００９７】
例ＩＶ  ペプチド・ファージ
以下の物質及び手法が以下の例で使われる。
１．ペプチド・ファージ
推定上のジスルフィド結合ミニタンパク質であるHPQ6はM13ファージ上に「遺伝子ＩＩＩ」タンパク質(gIIIp)の挿入物質として提示された。M13はビリオン1個につきgＩＩＩpのコピーを5個持つ。ファージは標準方法で構築された。HPQ6にはデブリンのストレプトアビジン結合Eペプチド特有の配列CHPQFPRC(DEVL90)及びF.Xa認識部位が含まれる(表820参照)。HPQ6ファージはストレプトアビジンに結合することが示されている。
ストレプトアビジンと全く親和性のない無関係の提示ファージをコントロールとして用いた。
２．ストレプトアビジン
アガロースビーズに固定されたものが市販されている(ピアス社)。６％アガロースのビーズに、1mlのゲルあたり1から2mgの濃度でストレプトアビジン(StrAv)が固定されたものが、50％スラリーとして入手できる。 遊離のタンパク質として市販されているもの(ピアス社)は1mgあたり14.6ユニットの比活性がある(1ユニットは1μgのビオチンを結合する)。0.01％アザイドを含むPBS中1mlあたり1mgのストック溶液を作る。
３．Ｄ−ビオチン
クリスタル状のものが市販されている(ベーリンガー・マンハイム社)。4mMのストック溶液を作る。
４．マイクロタイター・ウェルプレートのストレプトアビジン・コーテイングイミュロン(Immulon)(#2又は#4)ストリップ又はプレートが使われる。StrAv原液100μLを250μL容のウェルに加え、一晩4℃でインキュベートする。原液を除き、ml/mgのBSAを含む250μLのPBSと置換し、4℃で更に1時間インキュベートする。ファージ結合実験に用いる前に、0.1％Tweenを含むPBS250μLでウェルを急激に5回洗浄する。
【００９８】
５．結合実験
ビーズアッセイ
結合実験の直前に10から20μLのStrAvビーズスラリー(ビーズ体積5から10μL)を結合バッファー(1mlあたり1mgのBSAを含むTBS)によって3回洗浄する。コントロールエレメント又はペプチド提示ファージを含む50から100μLの結合バッファー(合計10８から10１１のプラーク形成ユニット(pfu))を各マイクロチューブに加える。結合は倒立回転器（エンドオーバー・エンドローテーター）を使って室温で１時間結合を行わせる。ビーズは短時間遠心分離して、上澄液を除く。ビーズは、0.1％Tweenを含むTBS 1mLで5回洗浄する。各洗浄は５分間のインキュベーションと短い遠心分離から成る。最後に結合したファージはStrAvビーズから、mg/mlのBSAを含むｐＨ2のクエン酸バッファーと１０分間インキュベートすることにより溶出される。その後ｐＨ8の1Mトリス260μLによって中和する。各段階に存在するファージの数は、適当に希釈したものをF'を持つE.Coli'のローンにプレーティングすることにより求められたプラーク形成ユニットとしてもとめられる。
プレートアッセイ
StrAvでコートされた各ウエルに対し既知量のファージ(10８から10１１のpfu)を含む100μLの結合バッファー(1mlにつき1mgのBSAを含むPBS)を加える。室温で１時間インキュベートし、その後非結合ファージの除去と0.1％Tween-PBSによる10回の急激な洗浄が続く。結合ファージは、ｐＨ2の250μLのクエン酸バッファー（1mLあたり1mgのBSAを含む）により溶出され、60μLの1MトリスｐＨ8により中和される。各段階に存在するファージの数は、適当に希釈したものをF'を持つE.Coli'のローンにプレーティングすることにより求められたプラーク形成ユニットとしてもとめられる。
【００９９】
例Ｖ
ストレプトアビジン・アガロースに結合する提示ファージに対するジチオトレイトール(ＤＴＴ)の効果
予備的対照実験
ａ．HRP結合ビオチン及びストレプトアビジン・ビーズの使用
HRP結合ビオチンに対するStrAvアガロース・ビーズの結合能力は、5μLのビーズにつき約1μｇ(約150pmolビオチンに相当)とされている。(これらの実験に使われた分量である)
ｂ．StrAvビーズに結合しているHRP結合ビオチンに対するDDTの効果
5μLのStrAvビーズを変化量のDTTの存在下(少なくとも99％は還元)10ngのHRPビオチンと結合バッファー(TBS-BSA)中でインキュベートした。室温で15分間インキュベートした後、ビーズは結合バッファーで２回洗浄した後、HRP基質を加えた。発色させた後、半定量的に検討された。表８２７は、ビオチニル化されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)が20mM未満の濃度のDDTではそれほど影響を受けないことを示している。20から50mMのDTT溶液はStrAvビーズがない時のHRPと基質との相互作用も阻害したので、全般的にこのシステムにおいてマイナスの効果を有することに注意。
【０１００】
HPQ6提示ファージの感染力に対するDTTの効果
HPQ6の108pfusがDTTの異なった濃度の溶液がある中で結合バッファー(TBS-BSA)に加えられた。室温で１時間インキュベートされた後、薄められプレートされてpfusとしての力価が求められた。表８２８はHPQ6提示ファージの感染力に対するDTTの効果を示す。従ってDTTは、この範囲の濃度においてはファージの感染力に効果を及ぼさないか、又はファージを薄める時に効果が逆になってしまったかのどちらかである。これらのコントロール要因の実験から、DTTはStrAvに結合するペプチド提示ファージにおける媒体を減らす効果に関する研究において10mM以下の濃度で用いることができることは明らかである。
表８２９は、ファージHPQ6とMKTNのStrAvビーズに対する結合へのDTTへのもっとも顕著な効果は、DTTが0.1及び1.0mMの間に生じた。この濃度では、前段階コントロール実験においてはマイナスの効果が観察されなかった。これらの結果は、HPQ6提示ファージの場合、DTTはStrAvに対する結合に大きな効果を持ち、提示ペプチド内のジスルフィドブリッジが優れた結合にとって必要になる、ということを強く示している。
【０１０１】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ファージを遺伝子ファージとしていかに使うかを示す。(ａ)は脂質二重層に位置する野生型プレコートタンパク質である。シグナルペプチドはペリプラスム空間にある。(ｂ)では、シグナル・ペプチドと成熟コートタンパク質配列の間に置かれたポテンシャル結合ドメインを有するキメラプレコートタンパク質が同じように捕らえられている。(ｃ)と(ｄ)では、シグナル・ペプチドはすでに野生型及びキメラ・タンパク質からそれぞれ切断されているが、コートタンパク質配列の残基のいくつかが脂質二重層と相互作用し、成熟タンパク質が完全にペリプラスムに移行するのを防いでいる。(ｅ)と(ｆ)では、成熟した野生型及びキメラ・タンパク質が、ペリプラスムに出て行くにつれて、一本鎖DNAファージのコートに形成されていく。ファージは外膜を通って培地の中にでていき、そこで回収されたりクロマトグラフィーによって評価されたりする。
【図２】ファージf1のコート・タンパク質のＣαｓを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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