(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光化合物を定量するための発光化合物のルミネセンスの発生方法であって、
（i）一対の供電用電極と、（ii）前記電極の間に、前記電極と電気的に接触せずに配置されている導電物質と、（iii）前記導電物質と電気的に接触している前記発光化合物と、を内部に有している電解液を設け、
前記電極間に電流を流し、それによって前記導電物質と電気的に接触している前記発光化合物からルミネセンスを誘起させるルミネセンス発生方法。
【請求項２】
前記発光化合物の濃度を定量するために、さらに前記ルミネセンスの測定を含む請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項３】
前記導電物質が、電気化学的不活性物質である請求項１記載のルミネセンス発生方法。
【請求項４】
前記電気化学的不活性物質が、ガラス状炭素、金、白金、又はそれらの混合物である請求項３に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項５】
前記導電物質が、絶縁された金属又は半金属である請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項６】
前記絶縁された金属又は半金属が、酸化物被覆又はポリマー被覆により絶縁されている請求項５に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項７】
前記金属又は半金属が、アルミニウム、ハフニウム、マグネシウム、ケイ素、タンタル、チタン、ジルコニウム、又はそれらの混合物である請求項５に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項８】
前記導電物質が、電気化学的不活性物質の薄膜、又は絶縁された金属若しくは半金属の薄層によって被覆された多孔膜である請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項９】
前記導電物質が、電気化学的不活性物質と、絶縁された金属又は半金属との結合体である請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１０】
前記導電物質が、さらに磁性材料を含む請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１１】
前記電解液が、少なくとも２つの導電物質を含有している請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１２】
前記電解液が、少なくとも２つの異なるタイプの導電物質を含有している請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１３】
前記電解液が水系電解液である請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１４】
前記電解液が非水系電解液である請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１５】
前記発光化合物が、前記導電物質の表面に付着している請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１６】
前記発光化合物が、分析対象物と結合している請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１７】
前記ルミネセンスが、前記供電用電極間に流される前記電流の終点よりも遅れて測定される請求項１に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１８】
前記ルミネセンスが、少なくとも２つの異なる発光化合物に起因する請求項１６に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項１９】
前記ルミネセンスが、少なくとも２つの異なるタイプの導電物質の表面で形成される請求項１６に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項２０】
前記異なる導電物質の表面上での前記ルミネセンスが、供電用電極を介して通電される種々の電流値により発光して測定される請求項１９に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項２１】
異なる導電体上の２以上の化学発光化合物の測定値が、内部の基準化に用いられる請求項１８に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項２２】
異なる導電体上の２以上の発光化合物の測定値が、２以上の分析物の濃度決定に用いられる請求項１９に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項２３】
前記分析対象物が核酸配列である請求項１６に記載のルミネセンス発生方法。
【請求項２４】
前記分析対象物がアミノ酸配列である請求項１６に記載のルミネセンス発生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ルミネセンスによる発光化合物の濃度分析法に関し、さらに詳しくは、電気発生の化学ルミネセンスによる発光化合物の濃度分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学、生物学、および生化学上の物質、例えば、抗体、ホルモン、ウィルス、酵素、代謝物、麻酔薬、毒物、薬品、微生物、核酸などの物質を検出し定量するための、正確で感度がよく、迅速かつ費用効果のある方法への必要性が高まっている。必要な感度と精度は、抗原−抗体反応などの結合反応を用いて、診断評価用の錯体（complex）すなわち分析物の存在が、１以上の錯体物質（complexing material）に付着した検出可能な標識によって指示されることにより得られる。商業的な標識化合物の一例には、光化学的、化学的、電気化学的な励起方法に基づいて、ルミネセンスを発生させることができる化合物がある。
【０００３】
種々に改良されたルミネセンスに基づく分析方法は、その感度について広く知られているが、発光種が非常に低濃度である場合には、各方法に特有の短所を有する。蛍光の感度は、蛍光不純物と同様にレイリー散乱およびラマン散乱現象によっても制限され、これらは非特異性バックグラウンド発光を増加させる。燐光は主として固体に限定され、溶液中で常温で燐光を発するそれらごく少数の化合物からの発光は、たいてい酸素に非常に敏感であり、これが実用化を阻害している。従来の蛍光や燐光に基づく方法は、光励起を用いるので、適切な光源や光学系を必要とする。化学ルミネセンスに基づいた方法は、励起用光学系を必要としないので、一般的に装置が非常に単純である。しかし、化学ルミネセンス法には、多くの場合、深刻な化学的妨害を受ける。装置的に単純な電気化学的励起に基づく方法（電気発生化学ルミネセンス、すなわちＥＣＬ）は、電極に印加された電気パルスを励起に利用しており、低い検出限界を提供する。
【０００４】
電解液中の無機化合物および有機化合物のＥＬＣは、この分野ではよく知られている。例えば水系電解液中における白金電極でのルミノールのアノードＥＬＣは、１９２９年以来研究されている（例えば、N. Harvey の J. Phys. Chem.33(1929)1456や、K. Haapakka とJ.Kankare の Anal. Chem. Acta 138(1982)263）。水系電解液中におけるシュウ酸塩の存在下でのＲｕ(ｂｐｙ)３２＋のアノードＥＬＣ、およびアセトニトリル／水の混合液中においけるペルオキシ二硫酸塩の存在下でのＲｕ(ｂｐｙ)３２＋のカソードＥＣＬが、Bardらによって報告されている（D. Ege, W. Becker と A. Bard, Anal. Chem. 56(1984)2413）。適した酸化剤を含んでいる水系電解液中において、酸化物被覆アルミニウム電極での多数の無機イオンのカソードＥＣＬ（K. Haapakka, J. Kankare と S. Kulmala Anal. Chem. Acta 171(1985)259）、および多数の有機イオンのカソードＥＣＬ（K. Haapakka, J. Kankare と O. Puhakka の Anal. Chem. Acta 207(1988)195）が報告されており、短寿命ＥＣＬは、電極に電気パルスを印加している間に測定される。種々のテルビウム（III）錯体は、ペルオキシ二硫酸塩を含む電解水溶液中において、酸化物被膜アルミニウム電極で、長寿命なテルビウム（III）特有のカソードＥＣＬを発させることが可能である。このカソードＥＣＬは、時分割ＥＬＣ検出を用いることにより、短寿命のバックグラウンドＥＣＬを除去することが可能であり、極微量分析のための基礎を成している（J. Kankare, K.Falden, S. Kulmala と K. Haapakka の Anal. Chem. Acta 256(1992)17、および J. Kankare, A. Karppi と H. Takalo の Anal. Chem. Acta 295(1994)27）。電極表面でのＥＣＬ測定に基づく、分析対象物の結合分析（binding assay）が提案された。例えば、A. Bardら（D. Ege, W. Becker と A. Bard, Anal.Chem. 56(1984)2413、および国際公開ＷＯ８６／０２７３４）は、ルテニウム（III）、およびオスミウム（III）を含有するＥＣＬ標識を提案している。J. Kankare とK. Haapakka（英国特許ＧＢ２２１７００７Ｂ、米国特許ＵＳ５３０８７５４、J. Kankare, K. Haapakka, S. Kulmala, V. Nanto, J. Eskola とH. Takalo Anal. Chem. Acta 266(1992)205）、さらにM. Billadeauら（国際公開ＷＯ９６／４１１７７）は、時分割ＥＣＬに基づく結合分析におけるＬｎ（III）含有ＥＣＬ標識（Ｌｎ（III）＝Ｄｙ（III）、Ｅｕ（III）、Ｓｍ（III）、Ｔｂ（III））の使用を提案している。ＥＣＬを検出するための数多くの試料セル構成と測定方法が提案された。ＥＣＬは、電極表面（例えば、ヨーロッパ特許ＥＰ６５８７６０Ａ１および国際公開ＷＯ９６／２８５３８）か、又は電極表面上に集められた磁性ビーズ表面（例えば、国際公開ＷＯ９２／１４１３９、ＷＯ９２／１４１３８、日本特許公開８−１９０８０１Ａ２および国際公開ＷＯ９６／１５４４０）のいずれかで発生している。ＥＣＬ検出器は、高圧液体クロマトグラフィ（例えば、D. Skotty, W. Lee と T. Nieman の Anal. Chem. 68(1996)1530）や、キャピラリー電気泳動（G. Forber, T. Nieman と J. Sweedler の Anal. Chem. Acta. 347(1997)289）に適用されている。
【０００５】
Jones（ヨーロッパ特許ＥＰ９６２７７３）は、双極電極上での公知のＥＣＬ反応を研究した。その公報では、非常に小さい導電性炭素粒子上で電気化学反応が起こており、導電性炭素粒子に亘って十分な電圧降下を得るには、大きい電圧勾配が、それは実際問題としては非現実的であるが、要求される。Jonesは、電気化学的不活性物質と、絶縁した金属、半金属、又はその混合物とが結合した導電体については開示しておらず、そのような導電体が本発明の特徴的な形態の１つを提供し、以下に記載するように、多重成分分析および内部基準を可能にするのに寄与している。多重成分分析においては、本発明の好ましい実施形態であるが、以下に記載するように、各標識ごとに、また各導電体ごとに特定の緩衝剤も必要である。
【０００６】
発明が解決しようとする課題
通常は、ＥＣＬでは、ルミネセンス化合物は電極表面のごく近傍に位置しなければならない。特に、ＥＣＬイムノアッセイ（immunoassay）に関しては、ＥＣＬ標識は、抗体又は抗原と結合している発光化合物を含んでいるが、この標識が電極表面に結合される。この結合は、たとえば、電極表面で免疫試薬の１つが固定される場合には直接免疫反応によって（J. Kankare and K. Haapakka の英国特許ＧＢ２２１７００７、米国特許ＵＳ５３０８７５４）、あるいは免疫試薬で被覆した非導電性磁性ビーズを用い、免疫反応が起こされた後に、磁性ビーズを磁場によって電極表面上に集めて間接的になされる。磁性ビーズを使う利点は、例えば、抗体被覆した平面電極表面に起こる結合反応と比べて、かなり効率的な結合反応にある。しかしながら、ＥＣＬアッセイ（ECL assay）で磁性ビーズを用いることは、以下の不利益がないわけではない。即ち、（i）電極表面からおよそ２５Å以下の励起距離が要求されるので、励起効率がたいてい低く（国際公開ＷＯ９２／１４１３９を参照）、（ii）電極表面近傍からの発光の検出効率が、光を遮断するビーズ層によって妨げられ、（iii）短い励起パルスの間に磁性ビーズが電極表面から離れるので励起効率が抑制される。
【０００７】
磁性ビーズは従来のＥＣＬ法の改良を提供するが、ＥＣＬアッセイの当業者の間では、さらに高い感度を示し、多重成分分析および／又は内部基準を可能にする、という要望が未だにある。よって、本発明は、高感度を有し、そして多重分析対象物の濃度分析能という利点を有するＥＣＬ法を提供することを目的とする。
【０００８】
発明の概要
本発明は、発光化合物の濃度を高感度で測定する方法を提供するものである。その方法は、電極と電気的接触をせずに電極間に配置された導電物質を備えた１対の電流供給用の電極と、発光化合物とを、電解液に浸漬して備えることを含む。そして、電流を電極に印加して、導電物質と電気的接触している発光化合物を発光させる。発光を測定して、発光化合物の濃度を確立する。
【０００９】
導電物質の例には、電気化学的不活性物質、絶縁した金属、合金、および半金属、及びそれらの複合物が含まれるが、これらに限定されるものではなない。代表的な電気化学的不活性物質には、不定形炭素、金、白金、及びそれらの混合物がある。絶縁する金属又は半金属の代表的なものは、アルミニウム、ハフニウム、マグネシウム、ケイ素、タンタル、チタン、ジルコニウム、およびそれらの混合物である。好ましくは、絶縁用材料は、酸化物膜又はポリマー膜がよい。ある実施形態では、導電物質は、電気化学的不活性物質、絶縁した金属又は半金属からなる薄膜で被覆された多孔質膜である。
【００１０】
電解液は、非水系又は水系の電解液である。発光化合物は、導電物質の表面に付着されているか、又は分析対象物（例えば、核酸又はアミノ酸配列など）と結合されている。ある実施形態では、ルミネセンスは、供電用電極に印加される電気パルスの終点から遅延して測定される。他の実施形態では、ルミネセンスは、少なくとも２つの異なった電気化学発光化合物、少なくとも２つの異なるタイプの導電物質、又は少なくとも２つの異なった分析対象物を用いて発光される。
【００１１】
本発明の方法の利点は、感度のよいＥＣＬアッセイを提供できることである。他の利点は、多重分析対象物の濃度の分析能、および内部基準能を含むことである。これらの利点、及び他の利点は、以下に記載した説明により明らかになるであろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、発光化合物の濃度を感度よく測定する独特な方法を提供する。以下に説明する測定方法は、これからは非接触型電気発生ルミネセンス法、即ちＣＯＥＬと称することにする。
【００１３】
本発明では、発光化合物を含む電解液に一組の供電用電極が浸漬される。導電物質は、供電用電極と電気的接触をせずに電極の間に配置される。ここでいう電気的接触とは、物理的に接触していること、及び発光化合物のルミネセンスを発光するのに要求される励起距離、好ましくは２５Å以下の距離以内に存在していること、の両方を意味する。電流は、導電物質と電気的接触してルミネセンスを発する発光化合物を含んでいる電極間で発生する。したがって、従来のＥＣＬ法と比べると、発光化合物が通電用電極に電気的接触する範囲内に存在しなくても、発光することができる。ルミネセンス（発光）は、発光化合物の濃度を突きとめるための以下の従来技術で測定される。
【００１４】
導電物質（以後は「導電体」と称する）は、電解液と有害な反応をしなければ、どのような導電物質であってもよい。導電体は、電解液と等しい電導度、好ましくは電解液より大きい電気伝導度を有している。理論にたよるべきではないが、電流供給用電極間に電流が発生するとき、電解液内に電圧降下を与えることによって、導電体を通してファラデー電流が発生していると考えられている。ファラデー電流を発生させるこの方法は、双極電解（bipolar electrolysis）としても知られており、Eardley, D. Handley と S. Andrew の Eletrochim. Acta 18(1973)839、F. Goodridge, C. King と A. Wright の Eletrochim. Acta 22(1977)347、M. Fleischmann, J. Ghoroghchian と S. Pons の J. Phys. Chem. 89(1985)5530 に述べられている。
【００１５】
導電体は、ＥＣＬアッセイの電極に用いられる電気伝導性材料からなると好ましい。例えば、導電体は、不定形炭素、金、白金、ステンレス鋼、又はそれらの組合わせなどの電気化学的に不活性な物質で形成することができる。導電体はまた、絶縁した金属、合金、半金属、およびそれらの組合わせであってもよい。金属及び半金属の特別な例には、アルミニウム、ハフニウム、マグネシウム、シリコン、タンタル、チタン、ジルコニウム、又はそれらの組合わせなどが含まれているが、これらに限定されるものではない。ここで、絶縁した（insulated）というのは、金属、合金、又は半金属が、酸化物膜又はポリマー膜のような保護膜によって絶縁されている（即ち被覆されている）ことを意味する。保護膜は、１〜１００ｎｍの範囲ですることができ、これは公知のＥＣＬアッセイに用いられる酸化物被膜電極と同様である。
【００１６】
当業者にとっては自明なことであるが、導電体用の材料の選択は、ルミネセンスの発光に利用されるＥＣＬ反応のタイプに依存する。例えば、もしアノードＥＣＬ反応がルミネセンスを発するのに用いられるなら、電気化学的不活性物質が選択される。他方、カソードＥＣＬ反応がルミネセンスを発するのに用いられるなら、絶縁した金属、合金、半金属が選択される。
【００１７】
本発明の導電体は、導電体の物理的性質を修正するために、余分の非導電性部分を含んでいてもよい。例えば、導電体の密度を小さくして電解液中に浮かせることができるように、導電体がポリマーの芯（core）を有していてもよい。さらに、導電体の収集を助けるために、導電体が磁性金属又は磁性合金から成る芯を有してもよい。the Handbook of Chemistry and Physics 第７０版ＣＲＣプレスに列挙されている磁性金属又は磁性合金などの、公知の磁性金属又は磁性合金が利用可能である。これは引用して組み込む。
【００１８】
本発明においては、導電体は、どのような形状・寸法であってもよい。たとえば、導電体は球形や楕円形でもよい。球状の導電物質は、たとえば米国コネチカットにあるAbbotBall社などの商業的な供給会社から容易に入手可能である。球状導電体はサイズが１０μｍから１０ｍｍの範囲にあることができる。さらに、導電体は、表面に電気化学的不活性物質、絶縁した金属又は半金属を備えた多孔性マトリクスであってもよい。
【００１９】
任意であるが、電解液は、形状、サイズ、電気伝導性材料の異なる導電体を含むことで、交互に切り替わる（alternating）ルミネセンス発生の閾値電位を提供することもできる。例えば、本発明の教示するところに従えば、当業者には明らかになるであろうが、金とアルミニウムのように異なる材料で形成された導電体は、導電体と電気的接触している発光化合物（即ちＥＣＬモイエティ（moiety））からルミネセンスを開始するための異なる閾値電位を有するであろう。さらに、異なるサイズの導電体も、ＥＣＬモイエティでルミネセンスを発するための異なる閾値電圧を示すであろう。本発明におけるこの独特な形態は、同じ電解液内で接触されることによる多重ＥＣＬ反応を可能とし、これは、内部基準および多重分析対象物の分析を促進する。
【００２０】
電解液は、ＥＣＬ反応に用いられるどんな電解液でもよい。本発明においては、電解液には、水系電解液又は非水系電解液を用いることができる。電解液の選択は、検出されるべき分析物と用いられるべきＥＬＣモイエティなどの要素によって、部分的に決定される。例えば、もし生体分子（核酸やタンパク質）の濃度を確立するには、緩衝剤で処理された水系電解液が選択できる。そのような要因は、当業者には容易に決定できるであろう。
【００２１】
本発明においては、ＥＣＬＣモイエティは、ＥＣＬアッセイに用いられるどんな発光モイエティでもよい。従って、ＥＣＬモイエティは、好ましくは金属キレートである。利用できる金属キレートの例には、ルテニウム、テルビウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロム、タングステン、又はそれらの組合わせなどの遷移金属又は希土類金属のキレートが含まれるが、これに限定されるものではない。特に好ましい２つは、ルテニウムの、およびテルビウムのキレートである。
【００２２】
供電用電極は、ＥＣＬ反応の電極に用いられるどんな電気伝導性材料で形成されていてもよい。従って、電極は、上記の導電体を形成するのに用いたのと同じ電気伝導性材料で形成することができる。本発明のある実施形態では、電極と導電体とは同じ材料で形成される。別の実施形態では、供電用電極は、バックグラウンド発光を最小にするために、表面でのＥＣＬ無発光が可能な電気伝導性材料で形成される。電極は、末端で互いに間隔をあけて配置されていると好ましい。
【００２３】
電流は、適切な電圧を供電用電極に所定の時間枠に印加して発生させ、その結果、電導体を通る部分電流が、導電体と電気的接触しているＥＣＬモイエティを発光させる。ルミネセンスを発生させるために必要な電圧（すなわち、閾値電位）は、導電体−電解液界面の界面ポテンシャルと、界面を通じて流れるファラデー電流の一部分とに依存する。双極電解の分野の当業者にとっては自明になるであろうが、導電体を通じて流れる電流は、以下の要因に依存する。即ち（１）電解液の電導度、（２）導電体に用いられる電気伝導性材料、（３）電流線に配向した導電体の最長寸法、（４）導電体周囲の電解液中における電流経路の自由空間、（５）境界で起きている電極プロセスの特徴、および（６）導電体と電解液の間の境界抵抗である。従って、導電体の寸法、形状、方向、位置、または材料などの要因の変更は、ルミネセンスを誘起するために供電用電極に印加されるべき必要電圧に影響するであろう。これらの要因は、以下の本発明の教示に従えば、当業者によって容易に明確にすることができるであろう。
【００２４】
得られた光の強度が、要求される信号対雑音比を得るために必要な時間についての波長及び／又は時間分割ベースで測定され、そして発光化合物の定量のために用いられる。光検出器は、たとえば光学フィルタ又はモノクロメータと組合わせた光電子倍増管又はフォトダイオードなど、どのような光検出装置でもよい。任意に、光検出装置には、光検出器からの電気信号を増幅する増幅器と接続されてもよい。ＥＣＬモイエティの濃度は、その分野で知られている標準的な分析技術により決定される。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象分析物の測定に用いられる。他の公知のＥＣＬアッセイでは、ＥＣＬモイエティは、対象分析物の濃度定量のための標識剤として用いられる。ＥＣＬモイエティは、標識剤として、分析対象物と、又は分析物の存在を突きとめるために用いる試薬（例えば、イムノアッセイでの抗原又は抗体）と、結合される。それゆえ、本発明の方法は、特に低い検出限界の要求のある分析法に用いるのに適している。そのような分析法の例には、イムノアッセイのような結合アッセイ、核酸交雑（hybridization）アッセイ、解離アッセイ、逆滴定アッセイ、およびクロマトグラフィ、キャピラリ電気泳動およびフローインジェクション分析で用いられる検出システムを含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
例えば、本発明の方法は、１以上の抗原の濃度を決定するためのイムノアッセイとして用いられる。抗原は、その表面に一次抗体を固定されている導電体又は多導電体を、まず抗原含有試料と、次いでＥＣＬモイエティが結合されている二次抗体とインキュベートすることにより、定量化される。十分に時間をかけてインキュベーションした後、その導電体又は多導電体導電体は洗浄され、結合していない標識抗体は洗い流される。続いて、その導電体又は多導電体導電体は、セル内の供電用電極間に配置され、それによってルミネセンスは、本発明に従って発光され、測定される。
【００２７】
上記のイムノアッセイの様々な変形が用いられる。例えば、時分割又はスペクトル識別を用いて、２以上の標識化合物は同時検出が可能である。上記の２重標識は、非競合アッセイに拡張され、第２の抗体は、アッセイの内部基準をなしとげるために、異なるＥＣＬモイエティで標識される。２以上の異なる標識化合物を代わりに用いることができるが、ルミネセンスを発するために異なる電解液が要求される。電解液を変えることにより、同じ又は異なる導電体の上の異なる標識化合物および分析物とが、順次定量化される。
【００２８】
さらに、導電体の寸法又は材質を変えると、異なる発光化合物の同時測定および試料中の異なる分析物の濃度検出が可能になる。例えば、寸法の異なる２つの導電体を異なる第一抗体で被覆してもよい。そこでは、導電体は、定量されるべき２つの異なる抗原と、同じＥＣＬモイエティで標識された２つの第二抗体とを含む混合物でインキュベートされる。十分な時間経過の後、導電体は、未結合の第二抗体を除去するために洗浄される。その後、導電体はセル内に配置され、供電用電極に印加される電圧を徐々に増加させることによって、ルミネセンスが発せられる。大きい方の導電体は、小さい方に比べて低い閾値電位を有するので、電圧が徐々に増加すると、光は、はじめに大きい方の導電体で発光する。電解液中の電圧降下が十分に高くなれば、小さい方の導電体で発光しはじめる。本発明の他の変形は、当業者には容易に明らかになるであろう。
【００２９】
実施例
以下の非限定的な例では、非接触型電気発生ルミネセンス（ＣＯＥＬ）の利用を説明している。図１は、本発明に従った使用をするための装置の概略図である。図１には、電解液（１４）を収容するセル壁（１２）を有する、セル（１０）が備えられている。電解液（１４）は、一対の供電用電極（１６,１８）と導電体（２０）とを浸しており、導電体（２０）は、電極と電気的接触せずに、電極間に配置されている。電流源（２２）は、電極（１６,１８）と接続され、記録装置（２４）とも接続されている。記録装置（２４）の次には、導電体で発光された光（ｈν）を検出するために、光検出器（２６）が接続されている。
【００３０】
以下の実施例に用いたセルは、寸法が長さ１６ｍｍ、幅７ｍｍ、深さ９ｍｍのポリテトラフルオロエチレンのセルであった。供電用電極は、直径２ｍｍのステンレス鋼線であった。２本の電極は、１１ｍｍの間隔をあけて設けた。電源は自作の静電型（coulostatic）パルス発生器で、６０ボルト（Ｖ）、０．４ミリ秒（ｍｓ）の矩形パルスが発生可能であった。光検出器は、浜松ホトニクス社製の光電子倍増管Ｒ３５５０型であった。検出信号は、スタンフォード・リサーチ社製のプリアンプＳＲ４５５型で増幅した。増幅された信号は、スタンフォード・リサーチ社製のフォトンカウンタＳＲ４００型で計測した。光子計数器は、測定システムを制御しデータを蓄積するために、ＰＣコンピュータに接続した。
【００３１】
電流は、導電体の電圧降下と、ルミネセンス発生の主要な要素であるが、装置的な理由により、実施例１ないし６では供電用電極に印加された電圧だけを述べている。
【００３２】
実施例１
ルミノールの非接触型電気発生ルミネセンス
試料溶液は、次の成分、ｐＨ７．８に調整された５．０×１０−２Ｍのホウ酸塩緩衝液、７．１×１０−２Ｍのアジ化ナトリウム、及びさまざまな量のルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）で調製した。非接触型電気発生ルミネセンス（ＣＯＥＬ）は、直径６．３ｍｍの球状アルミニウム導電体（Ａｌ導電体）（AbbotBall社製）の表面で、次のように発光した。振幅６０Ｖ、継続時間０．４ｍｓと、その間に０レベル、１０ｍｓとがある励起パルスを供電用電極に印加し、その結果、試料溶液中に約５０ｍＡのピーク電流を生じた。得られたＡｌ導電体からの発光（ＣＯＥＬ応答）は、光電子倍増管で検出した。５００回の励起パルスからの総ＣＯＥＬ応答を、試料溶液中のルミノール濃度の関数として、表１および図２に示した。バックグラウンドＣＯＥＬ応答（サンプルセル内でＡｌ導電体のないＣＯＥＬ応答）は、表１の類似バックグラウンドＣＯＥＬ応答の約５０倍ほど低かった。
【００３３】
【表１】
0004573486.tif 000002
【００３４】
実施例２
Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋の非接触型電気発生ルミネセンス
試料溶液は、次の成分、ｐＨ７．２に調整した、１．１２×１０−１Ｍのリン酸二水素カリウムと８．８０×１０−２Ｍのリン酸水素二カリウムとからなる緩衝液、１．０×１０−１Ｍのトリプロピルアミン、７．１×１０−２Ｍのアジ化ナトリウム、及びさまざまな量のトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（II）（Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋）で調製した。非接触型電気発生ルミネセンス（ＣＯＥＬ）は、直径５．０ｍｍの球状の金導電体（Ａｕ導電体）（金の真空蒸着薄膜で被覆したガラス球）の表面で、次のように生じた。振幅６０Ｖ、継続時間０．４ｍｓと、その間に０レベル、１０ｍｓとがある励起パルスを供電用電極に印加し、その結果、試料溶液中に約５０ｍＡのピーク電流を生じた。Ａｕ導電体から得られる発光（ＣＯＥＬ応答）は、光電子倍増管で検出した。５００回の励起パルスからの総ＣＯＥＬ応答を、試料溶液中のＲｕ(ｂｐｙ)３２＋濃度の関数として、表２および図３に示した。バックグラウンドＣＯＥＬ応答（サンプルセル内のＡｕ導電体なしでのＣＯＥＬ応答）は、表２の類似バックグラウンドＣＯＥＬ応答の約５０倍ほど低かった。
【００３５】
【表２】
0004573486.tif 000003
【００３６】
実施例３
テルビウム（III）-ｌの非接触型電気発生ルミネセンス
試料溶液は、次の成分、ｐＨ７．８に調整された５．０×１０−１Ｍのホウ酸塩緩衝液、７．１×１０−２Ｍのアジ化ナトリウム、及びさまざまな量のテルビウム（III）-ｌキレートで調製された。ここでｌとは、２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−４−ベンゾイルフェノールのことである。ＣＯＥＬは、直径６．３ｍｍの球状アルミニウム導電体（Ａｌ導電体）（AbbotBall社製）の表面で、次のように発光した。振幅６０Ｖ、継続時間０．４ｍｓと、その間に０レベル、１００ｍｓとがある励起パルスが、供電用電極に印加され、その結果、試料溶液中に約５０ｍＡのピーク電流を生じた。Ａｌ導電体から得られる発光（ＣＯＥＬ応答）は、０．４ｍｓ励起パルスの終わりから０．０８〜８．０ｍｓの間に光電子倍増管で検出した（遅延ＣＯＥＬ応答、略してＤＣＯＥＬ応答）。５００回の励起パルスからの総ＤＣＯＥＬ応答を、試料溶液中のテルビウム（III）濃度の関数として、表３および図４に示した。バックグラウンドＤＣＯＥＬ応答（サンプルセル内のＡｌ導電体なしでのＤＣＯＥＬ応答）は、表３に示した類似バックグラウンドＣＯＥＬ応答の約５０００倍ほど低かった。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
実施例４
非接触型電気発生ルミネセンスによる、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）のイムノアッセイ
Ａ．標識化合物の調製
４−（３−イソチオシアナトベンゾイル）−２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フェノールが配位しているテルビウム（III）錯体を標識化合物として用いた。この化合物は、J. Kankareらの、Anal. Chem. Acta, 266,205(1992)に公開されているように合成した。この論文は、参照してここにに組み込まれる。
【００３９】
Ｂ．抗ｈＴＳＨのＩｇＧへの標識
６０倍過剰の４−（３−イソチオシアナトベンゾイル）−２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フェノールテルビウム（III）錯体は、ｐＨ９．５で、抗ｈＴＳＨ ＩｇＧ（フィンランド KauniainenのOy Medix Biochemica Ab社製）と一晩反応させた。標識抗体は、セファデックスＧ−５０（１．０×５．５ｃｍ）、セファロース６Ｂ（１．０×５．２ｃｍ）を充填したカラムで、過剰な遊離したテルビウム（III）錯体と分離した。そのとき、ｐＨ９．３の１．０×１０−１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に、抽出剤として塩化ナトリウム９ｇｌ−１と０．０５％のアゾ化ナトリウムを含有するものを用いて分離された。
【００４０】
Ｃ．アルミニウム導電体の被覆
直径６．３ｍｍのＡｌ導電体（AbbotBall社製）は、塩化ナトリウム９ｇｌ−１と０．０５％のアゾ化ナトリウムを含んでいるｐＨ７．５に調整した５．０×１０−２Ｍのトリス塩酸緩衝液を用いて、物理吸着により抗ｈＴＳＨのＩｇＧで被覆した。反応混合物は、常温で一晩放置する。被覆後、Ａｌ導電体は塩化ナトリウム９ｇｌ−１、０．０１％のアゾ化ナトリウム、０．２ｇｌ−１のツイン(Tween)を含む溶液で洗浄し、０．１％のＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）で一晩浸し、４℃、液中で保存した。
【００４１】
Ｄ．ｈＴＳＨのイムノアッセイ
ｈＴＳＨの適当な標準含有量が０，１，１０，１００，１０００μＵｍｌ−１である１００μｌのアリコート（aliquot）（フィンランド、EspooのOrion Diagnostica社製）を、３００ｍｌ試験管に加え、その後テルビウム（III）で標識された抗ｈＴＳＨ溶液１４．５ｍｌを加えた。ここでは、そのテルビウム（III）で標識された抗ｈＴＳＨの２３．４ｍｌ−１が、ｐＨ７．８に調整された５．０×１０−２Ｍのトリス硫酸緩衝液５．０６４ｍｌへ、さらに塩化ナトリウム９ｇｌ−１、ＢＳＡ５ｇｌ−１、アゾ化ナトリウム０．５ｇｌ−１、ウシγ−グロブリン０．５ｇｌ−１、ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．１ｇｌ−１、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）７．９ｍｇｌ−１を含ませている液に溶解されていた。被膜され、洗浄されたＡｌ導電体は前述の試験管内に入れられた。連続攪拌しながら１時間インキュベーションした後、Ａｌ導電体は、ｐＨ７．４に調整された５．０×１０−２Ｍのトリス塩酸緩衝液４００ｍｌへ、さらにアゾ化ナトリウム０．０５％、ＢＳＡ０．２％、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）０．１％を含ませている液で、２分間２回洗浄した。Ａｌ導電体は、ｐＨ７．８に調整した５．０×１０−２Ｍのホウ酸−硫酸緩衝液と、５．０×１０−２Ｍのアゾ化ナトリウムとを含んでいるＣＯＥＬセルに移した。ＤＣＯＥＬ応答は、実施例３の手順に従って測定され、その結果を表４および図５に示す。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
実施例５
非接触型電気発生ルミネセンスによる多重成分分析
試料溶液は、次の成分、ｐＨ７．８に調整された５．０×１０−１Ｍのホウ酸塩緩衝液、３．０×１０−３Ｍのペルオキシ二硫酸、１．０×１０−３Ｍのツイン(Tween)（ポリオキシエチレン（２０） ソルビタン 一ラウリン酸塩）、及びさまざまな量のＲｕ(ｂｐｙ)３２＋およびＴｂ（III）-ｌキレートで調製した。ＣＯＥＬは、直径６．３ｍｍの球状アルミニウム導電体（Ａｌ導電体）（AbbotBall社製）の表面で、次のように発光させた。継続時間０．４ｍｓで電圧６０Ｖと、その間に０レベル、１００ｍｓとがある励起パルスを、供電用電極に印加し、その結果、試料溶液中に約５０ｍＡの電流を生じた。Ａｌ導電体から得られる発光は、励起パルスの間（すなわちＣＯＥＬ応答）と、励起パルスの終わりから０．０８〜８．０ｍｓの間（すなわち遅延ＣＯＥＬ応答、即ちＤＣＯＥＬ応答）とで光電子倍増管で検出した。５００回の励起パルスからの総ＣＯＥＬ応答および総ＤＣＯＥＬ応答を表５および図６に示した。ＤＯＣＬ応答は、試料中のＴｂ（III）-ｌの定量に用いることができる。それは、Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋のＣＯＥＬは、あまりに短寿命なので、０．０８〜８．０ｍｓの検出窓に到達しないからである。表に記載したＣＯＥＬ応答（観測されたＣＯＥＬ応答からＤＣＯＥＬ応答より見積もられたＴｂ（III）-ｌのＣＯＥＬ応答を減じたもの）はＲｕ(ｂｐｙ)３２＋を定量するのに用いることができる。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
実施例６
寸法選択的な非接触型電気発生ルミネセンス
試料溶液は、次の成分、ｐＨ７．２に調整された、１．１２×１０−１Ｍのリン酸二水素カリウムと８．８０×１０−２Ｍのリン酸水素二カリウムとからなる緩衝液、１．０×１０−１Ｍのトリプロピルアミン、７．１×１０−２Ｍのアジ化ナトリウム、および１．０×１０−８Ｍのトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（II）（Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋）で調製した。試料溶液中で０Ｖから２０Ｖまでの直流励起電圧を、掃引速度０．２５Ｖｓ−１で供電用電極に印加すると、ＣＯＥＬは、表６に記載されている直径の球状の金導電体（Ａｕ導電体）（すなわち金の真空蒸着薄膜で被覆したガラス球）の表面で別々に発光した。異なるＡｕ導電体からのＲｕ(ｂｐｙ)３２＋のＣＯＥＬ応答の結果は、光電子倍増管によって検出され、その結果を図７に図示する（２ｍｍ（-・-）、２．５ｍｍ（.....）、３．５ｍｍ（- - - -）、６．０ｍｍ（----）である）。異なるＡｕ導電体を用いた場合の、ピーク電圧とＲｕ(ｂｐｙ)３２＋のＣＯＥＬ強度とを表６に示す。
【００４６】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  １つの導電物質を備えた、非接触型電気発生ルミネセンス測定装置のブロック図である。
【図２】  非接触型電気発生ルミネセンス法で測定して、ルミノール濃度の関数としてルミネセンスをプロットしたグラフである。
【図３】  非接触型電気発生ルミネセンス法で測定して、Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋濃度の関数としてルミネセンスをプロットしたグラフである。
【図４】  遅延非接触型電気発生ルミネセンス法で測定して、テルビウム（III）濃度の関数としてルミネセンスをプロットしたグラフである。
【図５】  遅延非接触型電気発生ルミネセンス法で測定して、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）濃度の関数としてルミネセンスをプロットしたグラフである。
【図６】  サンプル混合物中のテルビウム（III）（●）、及びＲｕ(ｂｐｙ)３２＋（○）の濃度を、おのおの非接触型、および遅延非接触型電気発生ルミネセンス法で測定してプロットしたグラフである。
【図７】  Ｒｕ(ｂｐｙ)３２＋の複数の電気ルミノグラムであり、金の球状導電体の直径を変えることによりルミネセンスに与える影響を示している。直径は、２ｍｍ（-・-）、２．５ｍｍ（.....）、３．５ｍｍ（- - - -）、６．０ｍｍ（----）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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