(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡライブラリーを構築するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）単離されたワクシニアウイルスゲノムをチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内で切断して、第１の大きなウイルスフラグメントおよび第２の大きなウイルスフラグメントを生成する工程；
（ｂ）５’隣接領域および３’隣接領域に隣接するＤＮＡインサートを含む組換え移入プラスミドを提供する工程であって、ここで該５’隣接領域は該第１の大きなウイルスフラグメントに相同であり、該第３’隣接領域は該第２の大きなウイルスフラグメントに相同であり、該移入プラスミドは、該ウイルスフラグメントと相同組換えできる、工程；ならびに
（ｃ）該移入プラスミドならびに該第１および第２のウイルスフラグメントを、ヘルパーウイルスに感染した哺乳動物細胞に、該移入プラスミドならびに該第１および第２のウイルスフラグメントが相同組換えを受ける条件下で導入し、それにより、ＤＮＡインサートを含む、生存可能な改変ワクシニアウイルスゲノムのライブラリーを生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
（ｄ）前記ライブラリーを前記細胞から単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ワクシニアウイルスゲノムは、ＷＲゲノムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ワクシニアウイルスゲノムは、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａゲノムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）における前記ワクシニアウイルスゲノム  対  前記移入プラスミドのモル比は、１：１〜１：１０の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｃ）における前記ワクシニアウイルスゲノム  対  前記移入プラスミドのモル比は、１：１である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞はＢＳＣ−１細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）は、２つの独特の部位で前記ワクシニアウイルスゲノムを切断する工程を包含する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ワクシニアウイルスゲノムは、配列番号１を含むｖ７．５／ｔｋウイルスゲノムである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクシニアウイルスゲノムは、配列番号３を含むｖＥＬ／ｔｋウイルスゲノムである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記移入プラスミドは、以下：
（ａ）配列番号６に示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列、および
（ｄ）配列番号９に示されるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミドに連結されるＤＮＡインサートを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記移入プラスミドは、プロモーター、翻訳開始部位、翻訳終始シグナルおよび転写終始シグナルからなる群より選択される配列を含み、ここで前記ＤＮＡインサートは、該配列の制御下にある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記移入プラスミドは、プロモーターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーターは、構成性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターは、ワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロモーターは、合成初期／後期プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記移入プラスミドは、翻訳開始部位を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記移入プラスミドは、翻訳終始シグナルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記移入プラスミドは、転写終始シグナルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記移入プラスミドは、プロモーター、翻訳開始部位、翻訳終始シグナル、および転写終始シグナルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡインサートは、ｃＤＮＡである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｃＤＮＡは、腫瘍細胞および病原体に感染した細胞からなる群より選択される細胞から単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｃＤＮＡは、腫瘍細胞から単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｃＤＮＡは、病原体に感染した細胞から単離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記病原体は、ウイルス、真菌、およびミコバクテリアからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘルパーウイルスは、鶏痘ヘルパーウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（ａ）は、ＮｏｔＩ消化およびＡｐａＩ消化により達成される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願において反映される研究は、一部、国立衛生研究所からの助成金によって支持され、そして政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（１．導入）
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、そしてヒト腫瘍、癌および感染細胞に特異的な抗原を同定するための新規な方法、ならびに、哺乳動物（ヒトを含む）における腫瘍、癌または、感染の後退を誘導するための免疫学的組成物またはワクチンにおけるこのような抗原の使用に関する。本発明は、ヒト腫瘍、癌、または感染細胞に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の誘導または単離のための方法、およびこれらの特異的Ｔ細胞によって認識される標的抗原をコードする遺伝子の改善された選択のための方法を包含する。本発明はまた、正常組織に対して腫瘍性組織、癌性組織、または感染組織において示差的に発現されるＤＮＡフラグメントの分解能を改善する、およびその偽陽性の頻度を減少する、ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）方法に関する。本発明はさらに、腫瘍特異的抗原、癌特異的抗原、または感染細胞特異的抗原についての発現ベクターとしての組換えウイルスの操作に関する。
【０００３】
（２．発明の背景）
癌についての現在の治療としては、外科手術、化学療法および放射線が挙げられる。免疫治療的アプローチの開発および使用（例えば、抗体結合体を使用する腫瘍標的化、「癌ワクチン」など）は、魅力的な代替物であるが、現在まで、多くの理由のために成功が制限されている。例えば、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の開発は、困難であることが証明され、これは、一部、モノクローナル抗体によって認識される抗原ならびに腫瘍および癌細胞によって発現される抗原がまた、しばしば、正常な非癌性細胞によって発現されるからである。さらに、抗体によって標的される膜抗原の発現は、頻繁に、その細胞表面でそれらの抗原を発現しない腫瘍改変体の増殖を許容するように調節される。細胞媒介免疫応答は、このような応答に関与する、異なる一連のエフェクター機能のため、およびＴ細胞媒介応答が、膜抗原のみならず主要組織適合性分子と関連してプロセシングされ得そして存在し得る、任意の腫瘍特異的細胞内タンパク質もまた標的にするための両方のために、腫瘍の根絶により効果的であり得る。この理由のために、腫瘍が、膜発現を調節することによってＴ細胞サーベイランスを回避することが、非常により困難である。
【０００４】
細胞媒介免疫応答に基づく免疫治療アプローチは、より有効であるようであるが、腫瘍によって発現されそして細胞媒介免疫応答において認識される抗原は、同定および産生することが困難である。ワクチン接種および引き続く細胞媒介免疫の刺激を通じた癌のための有効な処置の開発は、困難な問題のままである；細胞媒介応答を刺激するために有効な抗原の同定は、特定の場合（例えば、黒色腫）においてのみ首尾よいものであった。黒色腫において、黒色腫に対する細胞性免疫応答を媒介する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その腫瘍自身を浸潤し、そしてこのようなＣＴＬは、この腫瘍から収集され得、そして他の黒色腫に対する反応性についてスクリーニングするために使用され得る。しかし、リンパ球を浸潤する腫瘍の単離はまだ、ほとんどの他の腫瘍（特にヒトの癌の８０％より多くを生じる上皮細胞癌腫）に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を回収するための首尾よいストラテジーではない。
【０００５】
ワクチン接種における使用のために有効な抗原を同定する問題に取り組むために、最も最近の研究は、潜在的な腫瘍抗原を同定するために腫瘍特異的ＣＴＬを有する発現ライブラリーをスクリーニングすることに焦点を置いていた。過度の労働および有効でないスクリーニングプロセスならびにほとんどの型の腫瘍についての腫瘍特異的ＣＴＬを単離することの相当な困難性を含む、有効な抗原を同定する既存の方法に有意な制限が存在する。
【０００６】
（２．１．癌ワクチン）
腫瘍細胞の変更された特徴が非自己としてその免疫系によって認識され、そして防御的免疫を誘導し得る可能性は、癌ワクチンを開発するための試みについての基礎である。これが実行可能なストラテジーであるか否かは、形質転換された細胞の特徴がどのように変更されるかに依存する。腫瘍形質転換における変異の中心的役割の評価により、腫瘍抗原が遺伝的に不安定な細胞においてランダムな変異の結果として生じるという仮説を生じた。ランダムな変異は、免疫原性を示し得るが、これらは、各々の腫瘍について固有の特定の免疫を誘導することが予測される。これは、広範に有効な腫瘍ワクチンの開発について都合が悪い。しかし、代替の仮説は、腫瘍抗原が、形質転換プロセスに関連する系統的および再生可能な組織特異的遺伝子の調節解除の結果として生じ得ることである。これは、免疫治療のための適切な標的であり得る、特定の型の腫瘍において共有される抗原の定性的または定量的な示差的発現を生じ得る。初期の結果は、いくつかの実験的腫瘍の免疫原性がランダムな変異に対して追跡され得ることを実証し（Ｄｅ  Ｐｌａｅｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２２７４−２２７８；ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＯｌｄ、１９８９、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：７８）、最初の仮説を支持した。しかし、ランダムな変異および系統的遺伝子調節解除の両方が、腫瘍において新たな免疫原性発現を生じ得る演繹的理由は存在しない。確かに、実験的腫瘍（Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６２０２−６３１０；Ｔｏｒｉｇｏｅら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３２５１）およびヒト黒色腫（ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７；Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５−３５１９；Ｂｏｅｌら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１６７−１７５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６８９−６９８）の両方における、より最近の研究は、調節解除された正常な遺伝子によってコードされる共有された腫瘍抗原の発現を明確に実証した。異なるヒト黒色腫に共通のＭＡＧＥ−１および他の抗原の同定は、複数の腫瘍ワクチンの将来の開発について大きな期待を抱かせる。
【０００７】
黒色腫における進歩にもかかわらず、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される共有された抗原は、他のヒト腫瘍について記載されていない。この主な問題は、技術的なものである。腫瘍細胞において固有に発現される免疫原性分子を同定するための、最も広く行き渡りかつ現在までに最も首尾よいアプローチは、腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。このストラテジーの適用は、ヒト黒色腫において優勢に発現されるいくつかの遺伝子ファミリーの同定を導いた。しかし、このアプローチの２つの主要な制限は、（１）スクリーニングが、いくつかのプールの少ない成分によってＴ細胞刺激をアッセイするために別々の標的集団に組換えＤＮＡの多くの小さなプールの労働集約的なトランスフェクションを必要とし、；および（２）腎細胞癌の可能な例外を除き、腫瘍特異的ＣＴＬを、他の型の腫瘍（特に、ヒト腫瘍の８０％より多くを含む上皮細胞癌腫）を有する患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＰＢＬのいずれかから単離することが非常に困難であったこと、である。黒色腫において、隔離されている腫瘍特異的ＣＴＬを生じる組織特異的な特性が存在し得るようである。
【０００８】
腫瘍特異的遺伝子産物を用いる直接免疫は、いくつかの共有された腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するために必須であり得る。腫瘍が強力な抗原を発現した場合、これが臨床的徴候の前に根絶されるべきであることが議論されてきた。おそらく、次いで、腫瘍は弱い抗原のみを発現する。免疫学者は、何が抗原を弱くまたは強くするかという問題において長い間興味を抱いている。２つの主要な仮説が存在している。弱い抗原は、不十分にプロセシングされ得、そしてＴ細胞に対して有効に提示されることができない。あるいは、適切な特異性を有する生物におけるＴ細胞の数は、活発な応答に非適切であり得る（いわゆる、「レパートリーにおける孔（ｈｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」）。抗原性ペプチドが細胞表面に対する輸送およびＴ細胞に対する提示のためにＭＨＣ分子と会合する複雑な細胞性プロセスの解明は、現代の免疫学の功績の１つである。これらの実験は、プロセシング欠損または他のペプチドからの競合に起因する提示の失敗が、特定のペプチドをほとんど免疫原性でないようにし得ることを、明確に確証した。対照的に、技術的理由について、Ｔ細胞レパートリーにおけるクローナル提示の頻度が低い応答性の重要な機構であることを確証することは、より困難であった。しかし、Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウスにおけるタンパク質抗原変化の、免疫優性と潜在のペプチドとの間の関係を実証する最近の研究は、ペプチド特異的Ｔ細胞の相対度数が、確かに、特定のペプチドがＴ細胞応答において潜在性または優性であるか否かにおける決定因子であり得ることを、示唆する。これは、ワクチンの開発についての意味を与えた。現在の方法に関して、腫瘍の抗原性ペプチドがＴ細胞に対してプロセシングされ、そして提示される方法の改変を行うことは、複雑かつ困難である。しかし、特異的Ｔ細胞集団の相対度数は、先のワクチン接種によって直接的かつ効果的に増加され得る。従って、これは、他の潜在性応答を免疫防御的にするために必要な、重要な操作であり得る。
【０００９】
広範に有効なヒトワクチンの開発についての別の主要な関心は、ＨＬＡクラスＩ分子の極度な多型である。クラスＩ  ＭＨＣ：細胞ペプチド複合体は、特異的なＣＤ８＋  ＣＴＬについての標的抗原である。内因性に合成されたタンパク質の分解に由来する細胞ペプチドは、プレゴルジ区画に移行し、ここでそれらは細胞表面への輸送のためにクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合する。ＣＤ８分子は、クラスＩ  重鎖のα３ドメインへの結合によって、Ｔ細胞と標的との間の相互作用のアビディティに寄与する。すべての内因性タンパク質が代謝回転するので、任意の細胞質タンパク質または核タンパク質由来のペプチドは、ＭＨＣ分子に結合し得、そして細胞表面への提示のために輸送され得る。このことは、Ｔ細胞が、分泌されるかまたは細胞膜に組み込まれるかのいずれかであるタンパク質のみの構造的決定基を認識することに限定されている抗体よりも、細胞タンパク質のより広い提示を概観することを可能にする。
【００１０】
Ｔ細胞レセプター抗原結合部位は、ペプチドおよび周辺のＭＨＣの両方の決定基と相互作用する。Ｔ細胞特異性は、従って、ＭＨＣ：ペプチド複合体によって規定されなければならない。ＭＨＣ分子に対するペプチド結合の特異性は、特異的抗体の抗原結合部位と比較して、非常に広範であり、そして相対的に低い親和性である。クラスＩ結合ペプチドは、一般的に８〜１０残基長であり、そしてＭＨＣペプチド結合部位におけるポケットに一致する特定の重要な位置での制限された多様性のアミノ酸側鎖に適応する。特定のＭＨＣ分子に結合するペプチドのこれらの重要な特徴は、ペプチド結合モチーフを構成する。
【００１１】
従って、ヒトの腫瘍、癌、および感染細胞に特異的なＴ細胞の誘導および単離を容易にする方法、ならびに適切なＭＨＣ含量でのこれらのＴ細胞によって認識される主要な標的抗原をコードする遺伝子を効率的に選択する方法についての必要性が存在する。
【００１２】
（２．２．ワクシニアベクター）
ポックスウイルスベクターは、タンパク質および抗原（例えば、ワクチン抗原）、真核生物細胞における発現についての発現ビヒクルとして広範に使用される。種々の宿主細胞におけるクローニングおよび増殖の容易さは、特に、外来性タンパク質の発現のためのポックスウイルスベクターの広範な使用、およびワクチン抗原のための送達ビヒクルとしての使用をもたらした（Ｍｏｓｓ，Ｂ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６６２−７）。
【００１３】
慣例的に、外来性ＤＮＡは、相同組換えによってポックスウイルスゲノムに導入される。標的タンパク質コード配列は、ポックスウイルス中の非必須領域に対して相同である配列と隣接するワクシニアプロモーターの後ろにクローニングされ、そしてプラスミド中間体は、相同組換えによってウイルスゲノムに組み換えられる。この方法論は、原核生物宿主によって許容される比較的小さなインサートについて効率的に働く。相同組換えの頻度は低く、そしてインサートサイズが増大するにつれて減少するので、大きなインサートが要求される場合；労力のかかるプラスミド中間体の構築を必要とする場合（例えば、発現ライブラリー産生において）；およびＤＮＡの増殖が細菌において許容されない場合、この方法は、より実行可能でなくなる。従って、このような労力のかかる遺伝子操作を必要としない、高い頻度で大きなインサートを導入する改善された方法についての必要性が存在する。
【００１４】
直接連結ベクターを使用する代替的な方法は、相同組換えが容易にはできない状況においてキメラゲノムを効率的に構築するために開発されてきた（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７−９９８１）。これらの直接連結プロトコールは、ポックスウイルスキメラゲノムを生成するための相同組換えの必要性を回避した。このようなプロトコールにおいて、このゲノム由来のＤＮＡは消化され、インビトロでインサートＤＮＡに連結され、そしてヘルパーウイルスで感染された細胞にトランスフェクトされた（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７−９９８１）。１つのプロトコールにおいて、ゲノムは、独特のＮｏｔＩ部位で消化され、そしてキメラゲノムの選択および検出のためのエレメントを含むＤＮＡインサートは、ゲノムアームに連結された（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７−９９８１）。この直接連結法は、ワクシニアウイルスゲノム中への外来性のＤＮＡの挿入について記載された（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２９５７−２９６２）。あるいは、ワクシニアＷＲゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｆフラグメント中のＮｏｔＩ部位を除去することによって改変され、そしてチミジンキナーゼ遺伝子の近位にＮｏｔＩ部位を再導入し、その結果この遺伝子座における配列の導入は、チミジンキナーゼ遺伝子を破壊し、このことは、薬物選択の使用を介してキメラゲノムの単離を可能にする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６）。
【００１５】
直接連結ベクターであるｖＮｏｔＩ／ｔｋは、少なくとも２６キロ塩基対長のＤＮＡインサートを効率的にクローニングおよび増殖させることを可能にした（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６）。大きなＤＮＡフラグメントはゲノムに効率的にクローニングされたが、ＤＮＡインサートによってコードされるタンパク質は、チミジンキナーゼ遺伝子（ワクシニアにおいて相対的に弱く発現される初期のクラスの遺伝子）に対応する低いレベルでのみ発現される。さらに、そのＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位に両方の方向で挿入される。従って、ＤＮＡインサートによってコ−ドされるタンパク質産物の高いレベルの発現を伴って、大きなＤＮＡフラグメントをウイルスゲノムにクローニングする、より効率的な方法についての必要性が存在する。改善された直接連結ベクターについての必要性もまた、存在する。このようなベクターは、癌ワクチンの開発のためにより普遍的に有用である。
【００１６】
（３．発明の要旨）
本発明は、ＣＴＬによって認識される標的抗原の同定のための方法、および標的抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する細胞媒介免疫を誘導するための免疫原性組成物またはワクチンにおけるこのような抗原の処方物および使用に関する。
【００１７】
２つの基本的なアプローチが標的抗原の同定について記載される。１つのアプローチでは、非標的（例えば、非腫瘍形成性の）細胞対応物に対して寛容化された動物におけるオーセンティックな標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対して生成されたＣＴＬが、標的細胞由来（例えば、腫瘍由来）のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡから作製された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されて、標的抗原を発現するクローンを同定する。本明細書中に記載される方法によって生成されるＣＴＬは、正常細胞とは交差反応性ではなく、従って、スクリーニングのためのより良好なツールである。改善された発現ライブラリーもまた、記載される。
【００１８】
標的抗原を同定するための第２のアプローチでは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）中で示差的に発現される遺伝子の産物は、動物を免疫して、オーセンティックな標的細胞に対する活性について評価されるＨＬＡ拘束ＣＴＬを生成するために使用される。第１のアプローチと同様に、この第２のストラテジーもまた、患者から腫瘍特異的なＣＴＬを直接的に生成することが不可能である多くのヒト腫瘍の型についてエピトープを同定するために特に有用であり得る。さらに、それは、腫瘍特異的なＣＴＬの提示が、腫瘍細胞産物を用いるワクチン接種によって最初に増大される場合、インタクトな腫瘍細胞の潜在性の抗原（すなわち、免疫原性になり得る腫瘍細胞産物）を同定し得る。分解能を改善し、そして擬陽性を減少するディファレンシャルディスプレイについての改変された方法が記載される。
【００１９】
本発明に従って、標的細胞は、細胞媒介免疫応答を誘導することが所望される細胞である。身体中での標的細胞の例には、腫瘍細胞、悪性細胞、形質転換された細胞、ウイルス、真菌、もしくは放線菌に感染した細胞、または標的抗原の産生をもたらす任意の他の疾患状態に供せられた細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明はまた、高収量の、候補標的抗原の発現、およびワクチン処方物のための組換えウイルスの産生を含む。
【００２１】
（３．１．略号）
ＣＴＬ−細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔ細胞）
ＰＢＬ−末梢血リンパ球
ＲＤＡ−提示差分析
ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、ＣＴＬによって認識される標的抗原の同定のための方法、および標的抗原を発現する細胞に対する細胞媒介免疫応答を誘導するための免疫原性組成物またはワクチンにおけるそのような抗原の使用に関する。
【００２２】
本発明の１つの実施形態において、動物において生成された腫瘍特異的ＣＴＬは、腫瘍細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡから生成された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され、反応性の標的抗原を同定する。この目的のために、非腫瘍原性ヒト細胞株を用いて寛容化された動物は、非腫瘍原性細胞株に由来する腫瘍細胞を用いて免疫される。得られるＣＴＬ（これは、腫瘍特異的であるが、正常細胞とは交差反応性ではない）は、腫瘍細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡから構築された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。ライブラリー中でこのように同定されたクローンは、本発明の免疫原性組成物およびワクチンについての候補である標的抗原をコードする。「３分子（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）組換え」アプローチを使用するこのようなＤＮＡライブラリーの効率的な構築のための改善または改変されたワクシニアウイルスベクターは、スクリーニング効率を改善するために記載される。
【００２３】
ヒト腫瘍細胞を用いて免疫する前に、動物（例えば、正常マウスまたはトランスジェニックマウス）を、正常ヒト細胞を用いて寛容化することは、本発明の好ましい実施形態である。寛容誘導は好ましい。なぜなら、動物の免疫応答は、他の場合では、腫瘍形質転換に特異的には関連しない、広範に発現される多数のヒトタンパク質についての特異性によって支配されるからである。特に好ましい実施形態において、そしてこのアプローチの効率を増強するために、インビトロ発癌または発癌遺伝子形質転換によって不死化された非腫瘍原性ヒト細胞株に由来するヒト腫瘍を用いて働くことが好都合である。これは、新生仔マウスおよび成体マウスの両方において、拡張された寛容化プロトコールのための正常コントロール細胞の容易な供給源を提供する。例えば、このアプローチによって生成されたＣＴＬ（以下の第７節を参照のこと）は、選択手順（例えば、以下の第８節において記載される手順）において利用されて、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー（例えば、３分子組換え（以下の第６節を参照のこと）によってワクシニアウイルスにおいて構築されたもの）由来の標的抗原をコードする組換えクローンを単離し得る。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、腫瘍細胞において示差的に発現される遺伝子産物は、オーセンティックな腫瘍細胞に対する活性について評価されるＨＬＡ拘束ＣＴＬを産生するために使用される。これは、提示差分析（ＲＤＡ）およびディファレンシャルディスプレイのような方法が、正常細胞に対して腫瘍細胞における示差的に発現される遺伝子フラグメントを同定するために利用される場合に、特に好ましい。簡便には、これらの遺伝子産物が他の関連する腫瘍（例えば、以下の第１０節および第１１節を参照のこと）において広範に発現することが決定される場合、それらは、ライブラリーからより長いクローンを選択するために使用され得る（例えば、第９．５節を参照のこと）。このライブラリーは、例えば、ヒトＣＤ８およびＨＬＡトランスジェニックマウスにおける腫瘍特異的免疫応答を誘導する能力について試験され得る（例えば、第１２節を参照のこと）。腫瘍特異的細胞媒介免疫を生成する遺伝子産物はまた、本発明の免疫原性組成物およびワクチンの候補である。擬陽性を減少させることによってスクリーニング効率を増強し、そして全長ｃＤＮＡを単離する効率を増強する、ディファレンシャルディスプレイのための改善された方法が記載される。
【００２５】
上記の任意の戦略を使用して同定された抗原は、組換えＤＮＡ方法によって大量に産生され、そして細胞性免疫応答を促進するアジュバント中に処方され得る。好ましくは、標的抗原をコードするＤＮＡは、ヒトを含む動物宿主にワクチン接種するために使用され得る組換えウイルス中へと、操作される。この点について、ワクチンを産生するために使用され得る、改善された直接的連結ワクシニアベクターが、記載される。
【００２６】
本発明の別の治療戦略は、人種集団を超えて上昇した頻度で発現するＨＬＡクラスＩ分子の小さなセットを標的とするワクチンを設計することである。異なるヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子のペプチド結合モチーフの広範な特徴づけによって、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の４つの主要なサブタイプが存在し、その結果多くのペプチドが１つの群の複数のメンバーに結合し得ることが示唆された（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：２６１〜２６６）。本発明はまた、患者があるクラスＩ  ＭＨＣ群中の一員であることに基づき、その患者にワクチンを標的化する方法を提供する。特定の実施形態において、クラスＩ  ＭＨＣサブタイプＡ２、Ａ３、Ｂ７およびＢ４４が標的とされる。各群は、人種集団を超えて、４０％と５０％との間の平均提示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。４つの全ての群の組み合わせ（全ての公知のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の５０％〜６０％を含む）が、ヒト集団の９５％を網羅することが、確立されている。特定の実施形態において、ヒト集団において最も頻繁に発現するＨＬＡ対立遺伝子（白人４３％、黒人２０％、中国人２５％）であり、そしてＡ２サブタイプの優性なメンバーであるＨＬＡ−Ａ２．１を、標的とした。
【００２７】
記載される本発明の方法は、腫瘍細胞中の反応性の標的抗原を同定するために使用されるが、この方法はまた、細胞性免疫を誘導することが所望される他の標的細胞中の標的抗原を同定するためにも、使用され得る。例えば、本発明の差示的な免疫学的方法を、マウスを非感染細胞で寛容化して、次に感染後の異なる時点で感染細胞によって免疫することによって、ウイルス、真菌またはミコバクテリアに感染した細胞の免疫原性分子を同定するために適用し得る。単離されたＣＴＬを使用して、プラスミドまたはウイルス発現ライブラリー中の標的抗原をコードする組換え体を選択し得る。発現ライブラリーは、３分子組換えを使用するワクシニアウイルスベクター中の、感染細胞から単離されたｃＤＮＡを用いて構築し得る。
【００２８】
このアプローチの特に有利な点は、病原体によって発現される潜在抗原を同定するのみではなく、感染の結果その遺伝子発現が変化した、宿主細胞によって発現される潜在的な抗原をも、同定することにある。多くの病原体は、頻繁な再生および変異によって免疫監視機構を巧みに避けるので、変異の対象ではないような宿主遺伝子産物を標的とするワクチンを開発することは、非常に価値があるかもしれない。
【００２９】
本発明の差示的遺伝子発現戦略はまた、ウイルス、真菌またはミコプラズマによって感染された細胞の免疫原性分子を同定するために、適用され得る。病原体または宿主のいずれかの遺伝子によってコードされる、より安定な抗原および／または以前に同定されていない抗原（それ以前の特定のワクチン接種がなければ、潜在性であり続け得る抗原を含む）を、同定し得る。
【００３０】
病原体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ウイルス病原体（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス）；真菌病原体（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ニューモシスティスカリニ）；およびミコバクテリア病原体（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ）。
【００３１】
以下の詳述および実施例は、腫瘍細胞における主要な標的抗原について言及する。上記から明らかなように、本発明の方法は、他の標的細胞（例えば、ウイルス感染細胞）中の標的抗原を同定するために適応され得、そしてワクチンの開発に有用であり得る。
【００３２】
（５．１．ワクチンにおける使用のための標的抗原の同定）
以下の小節は、免疫原性処方物またはワクチンにおける使用のための候補である、標的抗原または標的エピトープの同定のために使用され得る２つの戦略を記載する。本明細書において記載される２つの戦略は、腫瘍特異的エピトープ、ウイルス、真菌またはミコバクテリアによって感染された細胞に特異的なエピトープ、ならびに／または自己免疫疾患に特異的なエピトープを含むがこれらに限定されない標的エピトープを同定するために適応され得る。
【００３３】
（５．１．１．ヒト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導および標的エピトープをコードするＤＮＡ組換え体を選択するためのそれらの使用）
本発明のこの実施形態において、ヒト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、同時刺激物質（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）活性を発現しない非腫瘍形成性の不死化正常ヒト細胞株で寛容化した動物中で誘導する。その後、これらの動物は、同時刺激物質でトランスフェクトされた（例えば、Ｂ７でトランスフェクトされた）腫瘍細胞（インビトロの変異誘発によって誘導された腫瘍細胞、または同一の正常な不死化ヒト細胞株からのオンコジーン形質転換によって誘導された腫瘍細胞）で免疫される。この同一の様式において使用され得る、適合性の正常細胞および腫瘍細胞の対の代替的な供給源は、同一の患者の異なる組織サンプルから正常の細胞株および腫瘍細胞株を誘導することである。免疫の目的のために、同時刺激物質活性をまた、マウスＢ７でトランスフェクションすることによって、これらの腫瘍細胞中に導入し得る。この免疫レジメは、同種の正常細胞と交差反応しない腫瘍特異的ＣＴＬを生じる。腫瘍特異的ＣＴＬを誘導する主な目的は、以下に記載するように、腫瘍特異的ＣＴＬを使用して標的抗原をコードする組換え腫瘍ＤＮＡのクローンを選択し得ることである。そのような抗原は正常細胞と比較して腫瘍において差示的に免疫原性なので、その抗原は、免疫原性処方物またはワクチンのための候補である。異なる種の哺乳動物（最も一般的には、近交系マウスの多様な種）を、この目的のために使用し得る。任意の特定の個体において、特定の処方物またはワクチンが免疫原性であるか否かは、その抗原由来の特定のペプチドがプロセスされ得、そしてその個体によって発現される特定のＭＨＣ分子と共同して提示されるか否かに依存する。この選択プロセスの焦点を、特定のヒトＨＬＡ分子が会合するペプチドが由来し得る抗原に限定するために、第７節に記載のように、ＨＬＡ拘束されたＣＴＬを、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスから直接誘導することが可能である。あるいは、ヒト腫瘍の差示的に免疫原性である分子を、任意の動物ＭＨＣに対して拘束された腫瘍特異的ＣＴＬを使用して、最初に同定し得る。その後、そのように同定された抗原を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の一次インビトロ刺激によってか、または第１２節に記載のように、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスの免疫によって、プロセスされる能力および異なるヒトＨＬＡタイプと会合して提示される能力について特徴付けし得る。ＨＬＡトランスジーンは、マウス胸腺における、高親和性、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞レパートリーの選択を可能にする。さらに、ヒトＣＤ８トランスジーンは、最も好ましい。なぜなら、マウスＣＤ８は、ヒトクラスＩ  ＭＨＣと効率的に相互作用しないからである。
【００３４】
差示的免疫原性を決定するための方法は、マウスＭＨＣ分子をコードする遺伝子がトランスフェクションによってヒト細胞株中に導入される場合、正常のマウス中で行われ得る（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｍ．、１９９１、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）。あるいは、ヒト細胞株の抗原を、インビボ（Ｈｕａｎｇら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：９６１〜９６５）およびインビトロ（Ｉｎａｂａら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７０２；Ｉｎａｂａら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４７９〜４８８）におけるマウスの専門的（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞によって、再提示し得る。マウス樹状細胞によるヒト抗原の再提示の間にＴ細胞寛容を誘導するために、抗Ｂ７．１抗体および抗Ｂ７．２抗体を用いて同時刺激物質活性をブロックすることが必要であり得る。この方法において生成されたＣＴＬの特異性を、ヒト腫瘍細胞と、ＨＬＡクラスＩでトランスフェクトされた正常標的細胞またはＨＬＡクラスＩで感染された正常標的細胞またはＨＬＡクラスＩ組換えワクシニアウイルスで感染された正常標的細胞との溶解を比較することによって決定し得る。
【００３５】
任意の個体における抗原の免疫原性は、その抗原に由来するペプチドが、その特定の個人のＭＨＣ分子と会合してＴ細胞に対して提示され得るか否かに依存するので、ヒトボランティアの免疫、またはヒトＣＤ８およびＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫によって、どのヒトＨＬＡ分子が任意の同定された抗原のペプチドを提示し得るのかを、個別に決定し得る。正常のマウスよりもむしろＨＬＡトランスジェニックマウスを最初の免疫において使用する場合に、免疫原性およびＨＬＡ関連提示の２つの問題に同時に対処し得る。
【００３６】
トランスジェニックマウスの構築は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈｏｇａｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９４に記載される。ヒトＣＤ８トランスジェニックマウスは、ＬａＦａｃｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３１５−２５（１９９５）の方法によって構築され得る。ヒトＣＤ８αサブユニットおよびＣＤ８βサブユニットを発現するトランスジェニックマウスの新しい系統の構築は、対応するヒトｃＤＮＡをヒトＣＤ２ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）に基づくトランスジェニックマウス中のＴ細胞特異的発現のためのベクター中に挿入することによって作製され得る（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８５：１３３〜１４０（１９９５））。ＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスを、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７６９０〜７６９４（１９８８）またはＢｅｒｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１５７〜６２（１９８８）またはＶｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７〜１０１５（１９９１）またはＢａｒｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６８１〜９（１９９３）の方法によって構築し得る。
【００３７】
さらなるＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスの構築は、遺伝子調節において以前に関連付けられている最初の２つのイントロンとともに、２ｋｂの上流調節領域を含むＨ−２Ｋｂカセットの構築によって達成され得る（Ｋｒａｌｏｖａら、１９９２、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４５９１〜４６００）。内在性の翻訳開始部位がこの領域から除去され、そしてＨＬＡ  ｃＤＮＡの挿入のための制限部位が、第３エキソン中に導入され、その後にポリＡ付加部位が続く。この構築物の３’末端にゲノムＨ−２Ｋｂ配列のさらなる３ｋｂを含ませることによって、クラスＩ遺伝子が、胚性幹細胞中のＨ−２Ｋｂ遺伝子座において、相同組換えの標的となり得る。このことは、マウスクラスＩ発現と適合することが公知である規定された遺伝子座においてトランスジーンが発現される可能性があること、およびこれらのマウスが細胞膜におけるＨ−２Ｋｂ発現による可能性のある競合を欠失している可能性があることの、利点を有する。このことは、同一の構築物中に導入された多様なヒトクラスＩ  ｃＤＮＡの比較的再現性のある発現をもたらすと考えられる。
【００３８】
最も好ましくは、腫瘍細胞株は、全ての腫瘍細胞が単一の不死化、非腫瘍形成性の細胞株に由来する腫瘍細胞株のパネルである。非腫瘍形成性細胞は、腫瘍細胞においてもまた発現される、大量の正常ヒトタンパク質に対する耐性を誘導するために最も好ましい。
【００３９】
好ましくは、スクリーニングは、腫瘍細胞株（多様な発癌物質またはオンコジーン形質転換によって、独立して、同一の正常細胞に由来する）のそのようなパネルにおいて実行される。腫瘍細胞株のそのようなパネルのスクリーニングによって、発癌物質特異的な抗原の変化、または腫瘍細胞株のインビトロでの増殖の間のランダムな遺伝子変動により生じ得る抗原の変化を、フィルターを通して除去することが可能となる。
【００４０】
標的エピトープをコードするクローンを同定するために、上記のように生成された腫瘍特異的ＣＴＬを使用して、標的腫瘍細胞から調製された発現ライブラリーをスクリーニングし得る。本明細書において記載されるように、哺乳動物細胞に対して感染性のウイルスベクター中に構築されたＤＮＡライブラリーを、ＣＴＬによる、特異的組換え体の効率的な選択のために使用し得る。これら感染性ウイルスベクターの主要な利点は、１）組換え体が哺乳動物細胞中に導入され、そして発現し得ることの容易さ、および効率、ならびに２）感染された細胞のＭＨＣ分子と会合する組換え遺伝子産物の効率的なプロセシング、および効率的な提示、である。低い感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）において、多くの標的細胞が、感染の天然の経過の間の数時間以内に増幅される、単一の組換え体を発現する。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、代表的なＤＮＡライブラリーは、ワクシニアウイルス中に構築される。好ましくは、改変されたワクシニアウイルスベクターおよび関連するトランスファープラスミドを使用する３分子組換え方法を使用して、ワクシニアウイルス中に代表的なＤＮＡライブラリーを構築する。この方法は、ほぼ１００％の組換えワクシニアウイルスを生成する（第６節、第６．２節および第６．３節を参照のこと）。
【００４２】
好ましい実施形態において（第１４節、第１４．１１節も参照のこと）、ワクシニアウイルス移入プラスミドｐＪ／Ｋ（インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のＮｏｔＩ部位を含むワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を有するｐＵＣ１３由来のプラスミド）をさらに、２つの強力なワクシニアウイルスプロモーター（例えば、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーターまたは強力な合成初期／後期（Ｅ／Ｌ）プロモーター）の１つ、それに続くＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限部位を取り込むように改変する。ＡｐａＩ部位の前には、好ましくは、ＡＴＧコドンを含む強力な翻訳開始配列がある。この改変は、好ましくは、ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内に導入され、その結果ウイルスのｔｋ遺伝子の調節配列およびコード配列に隣接する。プラスミドベクターのｔｋ遺伝子内の２つの改変の各々は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来のｖＮｏｔＩ-ベクターのゲノム中の隣接するｔｋ配列中に、相同組換えによって移され、新たな２つのウイルスベクターを生成し得る。重要なことに、これら２つのウイルスベクターのＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ消化の後、各々がワクシニアｔｋ遺伝子の別々の非相同セグメントを含み、そしてともに感染性ウイルス粒子のアセンブリに必要な全ての遺伝子を含む２つの大きなウイルスＤＮＡフラグメントが、単離される。
【００４３】
１つの実施形態において、そのような改変は、哺乳動物細胞中で複製欠損である、ワクシニアのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株（Ｍｅｙｅｒら、１９９１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１〜１０３８）中に導入される。
【００４４】
好ましい実施形態において、以下の方法を使用して、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープを発現する組換えウイルスで感染させた細胞を、富化して、そして選択する。細胞の付着性単層に、組換えウイルスライブラリー（例えば、ワクシニア組換えウイルスライブラリー）を、１以下のｍ．ｏ．ｉ．で感染させる。これらの細胞は、それら自体では、特異的ＣＴＬによって認識される標的エピトープを発現しないが、これらのエピトープは、ウイルスライブラリーに表れることが重要である。さらに、ＣＴＬの選択のために、感染された細胞は、標的ペプチドと会合してＴ細胞に対して提示し得る適切なＭＨＣ分子を発現しなくてはならない。
【００４５】
組換えウイルスでの感染の１２時間後、その単層を洗浄して、任意の非付着性細胞を除去する。規定された特異性のＣＴＬを、３０分間添加する。この間、標的エピトープの発現をもたらす、組換え粒子で感染された付着細胞のいくつかは、特異的なＣＴＬと相互作用して、溶解事象を起こす。溶解事象を起こした細胞は、単層から放出され、そして浮遊する細胞集団中に収集され得る。上記のプロトコールを、好ましくは、５サイクル以上繰り返し、この手順によって得られる、富化のレベルを上昇させる。
【００４６】
（５．１．２．腫瘍細胞中で差示的に発現される遺伝子の産物に対して生成された細胞傷害性リンパ球の、真正の腫瘍細胞に対する活性についてのスクリーニング）
本発明のこの実施形態において、腫瘍において差示的に発現する遺伝子の産物を使用して、ＨＬＡ拘束ＣＴＬを生成する（例えば、トランスジェニック動物の免疫によるか、または適切なＭＨＣを発現する抗原提示細胞でのヒトＰＢＬのインビトロでの刺激による）。効果的な標的エピトープをコードする、差示的に発現される遺伝子を同定するために、そのように生成されたＣＴＬを、真正な腫瘍細胞に対する活性についてアッセイする。
【００４７】
本質的に、腫瘍特異的抗原を同定するこのアプローチは、前述の節に記載される戦略の逆である。真正な腫瘍細胞に対して生成されたＣＴＬを単離して、腫瘍特異的ｃＤＮＡの発現ライブラリーをスクリーニングするよりもむしろ、腫瘍特異的ｃＤＮＡまたは腫瘍特異的遺伝子産物（すなわち、腫瘍において差示的に発現している遺伝子の産物）を使用してＣＴＬを生成して、次に、ＣＴＬを真正な腫瘍を用いてスクリーニングする。この戦略は、患者から直接的に腫瘍特異的ＣＴＬを生成することが不可能であった場合に、多くのヒト腫瘍型についての標的エピトープを同定するために、非常に有利に使用される。この戦略は、潜在腫瘍抗原が同定され得るというさらなる利点を提供する。腫瘍細胞中で何が免疫原性であるのかについてのみをアッセイするよりもむしろ、本発明のこの実施形態は、腫瘍特異的Ｔ細胞の提示が、第１にワクチン接種によって増強される場合に免疫原性となり得る腫瘍細胞の産物の評価およびアセスメントを可能にする。
【００４８】
腫瘍に由来する差示的に発現される遺伝子を、当業者に周知の標準的な技術を使用して、同定し得る（例えば、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７〜９７１を参照のこと、その全体を本明細書において参考として援用する）。好ましくは、第９．２節および第９．３節（下記）に記載される改善された差示的ディスプレイ方法を使用して、疑陽性を減少して、同定されたＤＮＡフラグメントに対応する全長ｃＤＮＡの単離の効率を増強し得る。差示的に発現された遺伝子産物の各々は、潜在的に免疫原性であり、そして低アバンダンスまたは高アバンダンス転写物として示され得る。
【００４９】
腫瘍免疫療法についての候補であり得る、差示的に発現された遺伝子産物を同定するために、ヒトＨＬＡと会合したペプチドに対するＴ細胞応答が誘導され得る環境において、免疫のために産物を送達する手段を有する必要がある。この目的のために、差示的に発現されたｃＤＮＡを、発現ベクター（好ましくは、ウイルスベクター（例えば、本明細書に記載のワクシニアベクター））中に取り込み、その結果、免疫に適切な量の遺伝子産物を産生する。免疫は、サブユニットワクチン中に処方された、（例えば、細胞性免疫応答を増強し得る適切なアジュバントと混合した）組換え発現された遺伝子産物を使用して、達成され得る。好ましくは、組換えウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニア）を使用して、免疫し得る（ＢｅｎｎｏｃｋおよびＹｅｗｄｅｌｌ、１９９０、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３−１７８）。最も好ましくは、ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスを使用し、その結果、その遺伝子産物に特異的なＨＬＡ拘束マウス細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および単離し得る（Ｓｈｉｒａｉ，Ｍ．ら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２７３３〜４２；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７〜１０１）。あるいは、ヒトＰＢＬを、同種のＨＬＡを発現する抗原提示細胞を用いて、インビトロで刺激する。
【００５０】
ＨＬＡ適合性の重要性は、抗原提示細胞の表面に結合し、そして主要組織適合分子と会合して、抗原提示細胞の表面に輸送されるペプチドを、Ｔ細胞が、認識するということである。従って、ＨＬＡトランスジェニックマウスのＴ細胞は、プライムされて、発現されたヒトＨＬＡと会合する特異的なペプチドを認識し、そしてヒト腫瘍細胞の交差反応性は、同一のＨＬＡ分子と会合した同一の腫瘍ペプチドの発現に依存する。
【００５１】
免疫によって誘導されたＣＴＬは、対応するｍＲＮＡを発現するＨＬＡ適合腫瘍（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｔｕｍｏｒ）に関する交差反応性について試験され得る。ＣＴＬは、インビトロまたはインビボで真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）腫瘍細胞を殺傷するための能力についてアッセイされ得る。この終了までに第７章において記載されるアッセイが使用され得、または腫瘍細胞の特異性および死滅（ｋｉｌｌｉｎｇ）を決定するための当業者に周知である他の同様のアッセイが使用され得る。
【００５２】
このアプローチを使用して、ヒトの患者における腫瘍免疫治療のための特に良い候補である標的エピトープが、以下の判断基準に適合するエピトープとして同定される：（ａ）遺伝子は、多様なヒト腫瘍において示差的に発現される；（ｂ）遺伝子産物は、ＨＬＡに関連して免疫原性である；そして（ｃ）誘導される特定のＣＴＬはヒト腫瘍細胞に関して交差反応性である。
【００５３】
（５．２．  ワクチン処方物）
本発明は、真核生物組換え発現ベクターまたは原核生物組換え発現ベクターのいずれかにおいて同定された標的エピトープの発現；ならびに免疫原性および／または抗原組成物として同定されたエピトープの処方物を包含する。本発明と一致して、組換えによって発現した標的エピトープは、サブユニットワクチンとして発現され、精製されそして処方され得る。同定された標的エピトープはまた、ワクチンにおける使用のためにウイルスベクターに構築され得る。これに関して、生組換えウイルスワクチン、不活化された組換えウイルスワクチン、または殺傷された組換えウイルスワクチンのいずれかが、処方され得る。
【００５４】
（５．２．１．  原核生物発現系および真核生物発現系における標的エピトープの発現）
本発明は、発現系（真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクターの両方）を包含し、これらは同定された標的エピトープを発現するために使用され得る。この同定されたエピトープは、特にサブユニットのワクチンの形成のために、短縮型形態または全長形態のエピトープの両方において発現され得る。
【００５５】
本発明は、同定されたエピトープおよび免疫学的に等価なフラグメントをコードする、核酸配列の発現を包含する。このような免疫学的に等価なフラグメントは、同定されたエピトープ（配列の５’末端および／または３’末端で切断され、そして／または１つ以上の内部欠失を有する）をコードするヌクレオチド配列のアナログを作製すること、アナログヌクレオチド配列を発現すること、および生じるフラグメントが、免疫学的にエピトープ特異的ＣＴＬｓによって認識され、そして細胞媒介免疫応答を誘導するか否かを決定することによって、同定され得る。
【００５６】
本発明は、ＤＮＡ発現ベクター（コード配列の発現を指向する調節エレメントと作動可能に連結される任意の前述のコード配列を含む）および遺伝的に操作された宿主細胞（その宿主細胞において、コード配列の発現を指向する調節エレメントと作動可能に連結される任意の前述のコード配列を含む）を包含する。本明細書中において使用されるように、調節エレメントとしては、誘導性プロモーターおよび非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を駆動しかつ制御する当業者に公知の他のエレメントが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
標的エピトープ遺伝子産物またはそのペプチドフラグメントは、当該分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、エピトープ遺伝子配列を含む核酸を発現することによる、本発明のエピトープ遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製するための方法が、本明細書中に記載される。当業者に周知である方法が、発現ベクター（エピトープ遺伝子産物コード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび適切な翻訳制御シグナルを含む）を構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前出に記載される技術を参照のこと。あるいは、糖タンパク質エピトープ遺伝子産物の配列をコードすることが可能なＲＮＡが、例えば、シンセサイザーを使用して、化学的に合成され得る。例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、１９８４、Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（この全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を参照のこと。
【００５８】
本発明は、同定されたエピトープ遺伝子産物のペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列もまた包含する。例えば、選択されたエピトープの細胞外ドメインに対応するポリペプチドまたはペプチドは、分泌を容易にする「可溶性」タンパク質として有用であり得、特にサブユニットワクチンの産生において有用であり得る。市販されている抗体によって認識される異種エピトープに連結され得る選択されたエピトープ遺伝子産物またはそのペプチドフラグメントもまた、本発明に包含される。耐久性（ｄｕｒａｂｌｅ）融合タンパク質もまた、操作され得；（すなわち、選択されたエピトープ配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を有する融合タンパク質）、その結果、選択されたエピトープは、異種部分から離れて切断され得る。例えば、コラゲナーゼ切断認識コンセンサス配列は、選択されたエピトープタンパク質または選択されたエピトープペプチドと異種ペプチドまたは異種タンパク質との間で操作され得る。エピトープドメインは、コラゲナーゼを用いた処置により、この融合タンパク質から放出され得る。本発明の好ましい実施形態において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの融合タンパク質および選択されたエピトープタンパク質が、操作され得る。
【００５９】
ワクチン調製法（特に、サブユニットワクチン調製法）における使用のための本発明の選択されたエピトープタンパク質は、実質的に、純粋または相同である。サンプルの少なくとも６０〜７５％が、単一のポリペプチド配列を示した場合、このタンパク質は、実質的に、純粋または相同であると考えられる。実質的に純粋なタンパク質は、好ましくは、６０〜９０％のタンパク質サンプルを含み、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは９９％を含む。当業者に周知の方法が、タンパク質の純度または等質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を決定するために使用され得る（例えば、サンブルをポリアクリルアミドゲル電気泳動後、染色ゲル上で単一のポリペプチドバンドを視覚化する）。より高い分解能が、ＨＰＬＣまたは当該分野において周知の他の同様な方法を使用して、決定され得る。
【００６０】
本発明は、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現する宿主細胞から代表的に精製されるポリペプチドを包含する。このようなタンパク質精製は、当該分野において周知の種々の方法によって達成され得る。好ましい実施形態において、本発明のエピトープタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現される。アフィニティクロマトグラフィによって精製される、得られた組換え融合タンパク質およびエピトープタンパク質ドメインは、実質的に純粋なタンパク質サンプルにおいて得られる異種部分から離れて切断される。当業者に公知の他の方法が使用され得る；例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、１９８２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これらはその全体が本明細書中において参考として援用される）に記載される技術を参照のこと。
【００６１】
（５．２．１．１．  真核生物および原核生物の発現ベクター）
本発明は、発現系（真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクターの両方）を包含し、これらは、選択されたエピトープを発現するために使用され得る。種々の宿主発現ベクター系は、本発明の選択される標的エピトープ遺伝子を発現するために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され得、そして後に精製され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされる場合、インサイチュで本発明の選択されたエピトープ遺伝子産物を示し得る細胞もまた示す。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含むプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現発現ベクター；選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いてインフェクトされた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染された植物細胞系または選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉ  プラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
（５．２．１．２．  宿主細胞）
本発明は、動物細胞株および昆虫細胞株における選択されたエピトープの発現を包含する。本発明の好ましい実施形態において、選択されたエピトープは、非グリコシル化抗原（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）を産生するために昆虫細胞株中のバキュロウイルスベクターにおいて発現される。本発明の別の好ましい実施形態において、選択されたエピトープは、安定にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞（例えば、グリコシル化抗原を産生するＴリンパ球細胞株）において発現される。これらの細胞株によって組換えで発現される選択されたエピトープが、サブユニットワクチンとして処方され得る。
【００６３】
挿入された配列の発現を調節する、または所望される特定の様式における遺伝子産物を改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に対して重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび翻訳後修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または適切な宿主系が、発現される外来タンパク質の正確な改変を保証するために選択され得る。この終了までに、遺伝子産物の一次転写、遺伝子産物のグリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
長期間の、組換えタンパク質の高収率の産生、安定した発現が、好ましい。例えば、選択された標的エピトープを安定して発現する細胞株が、操作され得る。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネ−ター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞が、富化培地において１〜２日間の増殖が可能になり得、そして次いで、選択的培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、そして細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、そして増殖して、順にクローン化され得そして細胞株に拡大され得る増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、有利に細胞株を操作するために使用され得る。この方法は、選択されたエピトープ遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような細胞株は、特に、選択されたエピトープ遺伝子産物の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価に有用である。
【００６５】
多くの選択系が使用され得、疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）が挙げられこれらに限定されされず、それぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞において用いられ得る。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子についての選択のベースとして使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を付与る（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。
【００６６】
あるいは、任意の融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に対して特異的な抗体を利用することによって容易に精製され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の早い精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７６）。この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローン化され、その結果、遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと、翻訳的に融合される。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物が、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸アガロースカラムにロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて、選択的に溶出される。
【００６７】
（５．２．２．  組換えウイルスワクチンにおける標的エピトープの発現）
本発明の別の実施形態において、選択された標的エピトープを発現する生組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかが、操作され得る。生ワクチンが好まれ得、なぜなら、宿主における増殖が、天然の感染において起こるのと同様の性質および大きさの延長された刺激を導き、そして従って、実質的に長く永続的な免疫性を付与するからである。このような生組換えウイルスワクチン処方物の産生は、細胞培養におけるウイルスの増殖またはニワトリ胚の尿膜におけるウイルスの増殖、続く精製を含む従来の方法を使用して、達成され得る。
【００６８】
これに関して、種々のウイルスは、遺伝的に操作されて、選択されたエピトープを発現し得る。ワクチンの目的のために、組換えウイルスは、弱毒化特性を示すことが必要とされ得る。ヒトにおける使用のための現在の生ウイルスワクチン候補体は、寒冷受容性、温度感受性、または弱毒化のいずれかである。トランスフェクションに使用されるテンプレートへの適切な変異（例えば、欠失）の導入は、弱毒化特性を用いて新規のウイルスを提供し得る。例えば、温度感受性または寒冷受容性に関連する特異的で多様なミスセンス変異は、個々のウイルス遺伝子に導入され得る欠失変異および／または多様な変異へと作製され得る。これらの変異体は、単一の点変異を含む寒冷感受性変異体または温度感受性変異体より安定であるべきであり、そして復帰変異の頻度は顕著に低くあるべきである。あるいは、「自殺」特性を有する組換えウイルスが、構築され得る。このようなウイルスは、宿主において１または数回だけ複製を行う。
【００６９】
本発明の目的のために、任意のウイルスが、本発明に一致して使用され得、これは：（ａ）弱毒化された表現型を示すかまたは弱毒化特性を示すように操作され得る；（ｂ）哺乳動物（特にヒト）に対する向性を示すか、またはこのような向性を示すように操作され得る；そして（ｃ）本発明の選択された標的エピトープを発現するように操作され得る。
【００７０】
ワクシニアウイルスベクターは、本発明と一致して使用され得る。なぜなら、ＤＮＡの大きなフラグメントが、容易にそのゲノムにクローン化されるからであり、そして組換え弱毒化ワクシニア改変は、記載されている（Ｍｅｙｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｔｒｏｌ．７２：１０３１−１０３８）。オルトミクソウイルス（インフルエンザを含む）；パラミクソウイルス（ＲＳウイルスおよびセンダイウイルスを含む）；およびラブドウイルスが、弱毒化された表現型を生じる変異を発現するために操作され得る（米国特許出願第５，５７８，４７３号、１９９６年１１月２６日発行を参照のこと）。これらのウイルスゲノムもまた、本発明の選択されたエピトープのような外来ヌクレオチド配列を発現するために操作され得る（米国特許出願第５，１６６，０５７号、１９９２年１１月２４日発行、その全体が本明細書中に参考として援用される）。逆方向遺伝的技術（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）は、弱毒化された表現型を生じる変異を導入するように−鎖ＲＮＡウイルスゲノムおよび＋鎖ＲＮＡウイルスゲノムを操作するために適用され得る（インフルエンザウイルス、単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス、シンドビスウイルスおよびポリオウイルス（Ｐａｌｅｓｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３５４−１１３５８を参照のこと）において実証されるように）。これらの技術は、本発明と一致してワクチンとして使用される組換えウイルスベクターを作製するための、外来ＤＮＡ（すなわち、選択された標的エピトープ）を導入するためにもまた利用され得る。さらに、弱毒化されたアデノウイルスおよびレトロウイルスは、標的エピトープを発現するために操作され得る。従って、広範な種々のウイルスが、本発明のワクチンを設計するために操作され得る（しかし、例として、および制限ではなく、本明細書中において記載されるワクチンとして使用のための選択された標的エピトープを発現する組換え弱毒化ワクチンベクター）。
【００７１】
１つの実施形態において、組換え改変ワクシニア改変体である、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）が、ワクチン処方物において使用される。この改変ウイルスは、トリ細胞において５００サイクルの間継代されており、そして哺乳動物細胞において完全な感染性サイクルを起こすことができない（Ｍｅｙｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１−１０３８）。ワクチンとして使用される場合、この組換えウイルスは、単一の複製サイクルを終了し、そして十分なレベルの免疫応答を誘導するが、さらにヒト宿主中には入らず、そして疾患を引き起こさない。１つ以上の基本的なワクシニアウイルス遺伝子を欠く組換えウイルスは、複製の連続的な回を起こすことができない。このような欠陥ウイルスは、ウイルス複製に必要とされる特異的な遺伝子を欠くワクシニアベクターを半永久的に発現する細胞株に同時トランスフェクトすることによってこの遺伝子において産生され得る。基本的な遺伝子を欠くウイルスが、これらの細胞株において複製されるが、ヒト宿主に投与される場合、１回の複製を完遂することはできない。このような調製物が、この不全（ａｂｏｒｔｉｖｅ）サイクルにおいて、十分な数の遺伝子を転写および翻訳し得、免疫応答を誘導する。
【００７２】
あるいは、多量の株が投与され得、その結果これらの調製物が、不活化（死菌）ウイルス、ワクチンとして機能する。不活化ワクチンについて、異種遺伝子産物が、ウイルス成分として発現、その結果、この遺伝子産物は、ビリオンと関連することが好ましい。このような調製物の利点は、それらがネイティブタンパク質を含み、そして死菌ウイルスワクチンの製造において使用されるホルマリンまたは他の薬剤を用いての処理により、不活化を起こさないことである。
【００７３】
本発明の別の実施形態において、不活化ワクチン処方物が、組換えウイルスを殺傷するために従来の技術を使用して調製される。不活化ワクチンはそれらの感染性が破壊されている意味において「死」である。理想的には、このウイルスの感染性は、免疫原性に影響しないで破壊される。不活化ワクチンを調製するために、組換えウイルスが、細胞培養においてまたはニワトリ胚の尿膜において増殖され得、ゾーン超遠心分離によって精製され得、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンによって不活化され得、そしてプールされ得る。生じたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
【００７４】
不活化ウイルスは、免疫学的応答を増強するために適切なアジュバントとともに処方され得る。このようなアジュバントとして、ミネラルゲル（例えば、アルミニウム水酸化物）；表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン）；ペプチド；油性（ｏｉｌ）エマルジョン；および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００７５】
（５．２．３．処置および／またはワクチン接種の方法）
同定された本発明の標的エピトープは、大量に産生され得るので、このようにして産生および精製される抗原は、ワクチン調製物における使用を有する。この標的エピトープは、サブユニットワクチン調製物に処方され得るか、またはウイルスベクターに操作され、そしてワクチン調製物に処方され得る。あるいは、標的エピトープをコードするＤＮＡが直接ワクチン調製物として投与され得る。一旦、被験体に投与された「裸の（ｎａｋｅｄ）」プラスミドＤＮＡは、細胞に侵入し、Ｔリンパ球が選択されたエピトープを提示する細胞を攻撃するために、侵入された細胞の表面上に発現され、そして細胞性免疫応答を誘発する。この選択されたエピトープはまた、診断における用途を有する（例えば、被験体由来の体液のサンプルにおいて腫瘍の存在を検出または測定し、そしてこのようにして癌および腫瘍を診断し、そして／またはワクチン接種後の被験体の細胞性免疫応答をモニターする）。
【００７６】
本発明の組換えウイルスは、腫瘍細胞に対する免疫応答を発生させるために、腫瘍保有哺乳動物（ヒトを含む）を処置するために使用され得る。十分なそして適切な免疫応答の発生は、インビボで腫瘍の後退を導く。このような「ワクチン」は、単独または他の治療的な養生法（化学療法、放射線療法、手術、骨髄移植などを含むが、これらに限定されない）との組み合わせのいずれかで、腫瘍の処置のために使用され得る。例えば、外科技術または放射線技術は、腫瘍塊を減量するために使用され得、その後、身体中に残っている腫瘍塊または微小転移巣の後退を確実にし、そして進行を予防するために、本発明のワクチン処方物が投与され得る。あるいは、この「ワクチン」の投与は、このような外科的、放射線療法的または化学療法的処置に先行し得る。
【００７７】
あるいは、本発明の組換えウイルスは、腫瘍を含まない被験体を免疫化または「ワクチン接種」して腫瘍の形成を予防するために使用され得る。遺伝子検査の出現とともに、今や、被験体の癌に対する素因を予測することが可能である。従って、このような被験体は、適切な腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを用いて免疫化され得る。
【００７８】
エピトープワクチン処方物抗原の免疫効力は、試験動物における免疫化後の免疫応答をモニタリングすることにより、または当該分野において公知の任意の免疫アッセイの使用により決定され得る。細胞媒介免疫応答の発生は、免疫応答の指標として得られ得る。試験動物としては、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、チンパンジーなどが挙げられ得、そして最終的にヒト被験体が挙げられ得る。
【００７９】
このようなワクチンの適切な調製物としては、注射液（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）が挙げられ；注射前の、溶液中の溶液、溶液中の懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、乳化され得るか、またはリポソーム中にカプセル化されるポリペプチドであり得る。活性な免疫原生成分は、しばしば薬学的に受容可能かつ、この活性成分と適合性の賦形剤と混合される。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、所望であれば、このワクチン調製物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効力を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有する。
【００８０】
効果的であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＱＳ−２１（治験薬、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＤＥＴＯＸ（治験薬、Ｒｉｂｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢＣＧ。
【００８１】
アジュバントの効果は、標的エピトープに対して指向される細胞性免疫応答の誘発を測定することにより決定され得る。
【００８２】
本発明のワクチンは、多価または一価であり得る。多価ワクチンは、１を超える抗原の発現を指向する組換えウイルスから作製される。
【００８３】
所望であれば、この組成物はまた、少量の湿潤剤あるいは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物、または粉末であり得る。経口処方物は、標準的なキャリア（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸水素マグネシウムなど）を含有し得る。
【００８４】
一般的に、これらの成分は、別々に供給されるか、または単位投薬形態（例えば、凍結乾燥粉末または密封容器（例えば、アンプルまたは活性薬剤の量を示すサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ））に入った無水濃縮物）に一緒に混合されて供給されるかのいずれかである。この組成物が注射により投与される場合、これらの成分を投与前に混合するために、滅菌された希釈剤のアンプルが提供され得る。
【００８５】
特定の実施形態においては、本発明の凍結乾燥されたエピトープは、第一の容器で提供され；第二の容器は、５０％グリセリン、０．２５％フェノール、および防腐剤（例えば０．００５％ブリリアントグリーン）の水溶液からなる希釈剤を含有する。
【００８６】
精製抗原のワクチン調製物としての使用は、標準的な方法により行われ得る。例えば、精製タンパク質は適切な濃度に調整され、任意の適切なワクチンアジュバントと共に処方され、使用のために包装されるべきである。適切なアジュバントは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ゲル状鉱物（例えば、水酸化アルミニウム）；界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール）；ポリアニオン；ペプチド；油乳濁液；ミョウバン、およびＭＤＰ。免疫原はまた、リポソームに取り込まれるかまたは、ポリサッカライドおよび／またはワクチン処方物における使用のための他のポリマーに結合体化され得る。例えば、組換え抗原がハプテン（すなわち、同族の抗体と選択的に反応し得るという点で抗原性であるが、免疫応答を誘発し得ないという点で免疫原性でない分子）の場合においては、このハプテンは、キャリアまたは免疫原性の分子と共有結合され得る；例えば、血清アルブミンのような大きいタンパク質は、それに結合するハプテンに免疫原性を与える。ハプテンキャリアは、ワクチンとしての使用のために処方され得る。
【００８７】
多くの方法が、上述のワクチン処方物を患者に導入するために使用され得る。これらの方法としては、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、経皮、硬膜外、肺、胃、腸管、直腸、膣、または尿道の経路が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の生組換えワクシニアワクチン処方物を用いる処置の方法の場合、ワクシニアウイルス感染の天然の経路を経て（すなわち、口、鼻、胃、腸管、直腸、膣または尿管などの粘膜または表面の経路を通じて）、この処方物を導入することが好適であり得る。ＣＴＬ応答を誘導するために、投与の粘膜経路は、口または鼻の膜を通り得る。あるいは、投与の筋内または腹腔内経路が用いられ得る。好ましくは、１０6〜１０7ＰＦＵ（プラーク形成単位）の投与量の寒冷適応（ｃｏｌｄ  ａｄａｐｔｅｄ）組換えワクシニアウイルスがヒト患者に与えられる。
【００８８】
この処方物中に使用されるワクチン調製物の正確な用量はまた、投与の経路および患者の性質に依存し、そして熟練者の判断および標準的な臨床技術に従った各患者の状況に従って決定されるべきである。効果的な免疫化の量は、ワクチン調製物が投与される宿主における抗原に対する免疫応答を引き起こすために十分な量である。
【００８９】
引き続く用量または追加免疫の用量が必要とされる場合、ＭＶＡなどの改変ワクシニアウイルスが組換えを生じさせるために用いられる親ウイルスとして選択され得る。あるいは、他のウイルス（例えば、アデノウイルス、カナリア痘ウイルス）またはサブユニット調製物が追加投与に用いられ得る。免疫化および／または癌免疫療法は、組み合わされた免疫化養生法（例えば、本発明の組換えワクシニアウイルスワクチンを用いる免疫化および組換えワクシニアウイルスワクチンの追加免疫）を用いて達成され得る。このような実施形態においては、強い二次ＣＤ８+Ｔ細胞応答が、同じエピトープを発現する異なるウイルスを用いる初回刺激および追加免疫の後に誘導される（このような免疫化および追加免疫の方法については、例えば、Ｍｕｒａｔａら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：９６−１０７を参照のこと）。例えば、患者は、エピトープ（例えば、選択された腫瘍関連抗原またはそれらのフラグメント）を発現する組換えワクシニアウイルスを含有する本発明のワクチン処方物で、まず初回刺激される。次いで、この患者は、同様のエピトープを発現するワクシニア以外の組換えウイルスを含有するワクチン処方物で追加免疫（例えば、２１日後）される。このような初回刺激に続く追加免疫は、強い二次ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導する。このような初回刺激および追加免疫養生法は、選択された腫瘍関連抗原を発現する、腫瘍、転移または腫瘍性の増殖を有する患者を処置するために、好ましくは用いられる。
【００９０】
なお別の実施形態においては、この組換えワクシニアウイルスは、不活化された腫瘍細胞、腫瘍関連抗原あるいはそのエピトープを含有するサブユニットワクチン、または別の組換えウイルスワクチン（例えば、アデノウイルス、カナリア痘ウイルス、またはＭＶＡ）を用いる一次免疫化に続く追加免疫として使用され得る。
【００９１】
代替の実施形態においては、特定の腫瘍関連抗原、エピトープまたはそれらのフラグメントをコードする組換えワクシニアウイルスは、患者と組織適合性であり、かつ腫瘍関連抗原に対して特異的なＴリンパ球の活性化のための選択的免疫療法において使用され得る（選択的免疫療法の方法については、例えば、１９８７年９月１日に発行された、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，６９０，９１５号；１９９２年１月１４日に発行された、Ｚａｒｌｉｎｇら、米国特許第５，０８１，０２９号を参照のこと）。このようなＴリンパ球は、患者または組織適合性のドナーから単離され得る。このＴリンパ球は、インビトロで本発明の組換えワクシニアウイルスに曝すことにより活性化される。活性化されたＴリンパ球は、増殖され、そして腫瘍関連抗原エピトープに対して指向されるＴ細胞免疫を移すために、患者へと接種される。
【００９２】
本発明はまた、１以上の本発明のワクチン処方物の成分を含有する１以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器には、化学薬品または生物学商品の製造、使用または販売を規制する行政機関により定められた形式の通知が付随され得る。この通知は、その機関による、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売の承認を示す。
【００９３】
本発明は、以下の実施例において詳細に記載される例示的な実施形態を参考にすることにより、より良く理解される。
【００９４】
（６．実施例：発現ライブラリーを作製するための改変されたワクシニアウイルスベクターを使用する３分子組換え）
本実施例は、改変されたワクシニアウイルスベクターを使用する３分子組換え方法、および１００％近い組換えワクシニアウイルスを産生する関連するトランスファープラスミドを記載し、そして初めて、ワクシニアウイルスにおける代表的なＤＮＡライブラリーの効率的な構築を可能にする。
【００９５】
（６．１．  ベクターの構築）
先に記載されたワクシニアウイルストランスファープラスミドｐＪ／Ｋ（インフレームでＮｏｔ  Ｉサイトを含むワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を有するｐＵＣ１３誘導プラスミド（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６））は、さらに改変されて、強力なワクシニアウイルスプロモーターに続いてＮｏｔ  ＩおよびＡｐａ  Ｉ制限サイトを組み入れる。２つの異なるベクター、ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋは、それぞれ、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーターまたは強い合成の初期／後期（Ｅ／Ｌ）プロモーターのいずれかを含む（図１）。このＡｐａ  Ｉサイトを、ＡＴＧコドンを含む強い翻訳開始配列の前に配置した。この改変は、それをウイルスのワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の制御配列およびコード配列に隣接させるために、ｔｋ遺伝子内に導入された。これら２つの新しいプラスミドベクターのｔｋ遺伝子内の改変は、隣接するｔｋ配列における相同組換えにより、ワクシニアウイルスＷＲ株誘導ｖＮｏｔ  Ｉ-ベクターのゲノムに移され、新しいウイルスベクターｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋを生成した。重要なことには、これらのウイルスベクターのＮｏｔ  ＩおよびＡｐａ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消化に続き、２つの大きいウイルスＤＮＡフラグメントが単離され、各々、別々のワクシニアｔｋ遺伝子の非相同的なセグメントを含み、そして共に、感染性のウイルス粒子の構築に対して必要な全ての遺伝子を含む。これらのベクターの構築および特徴付け、ならびにワクシニアウイルスにおけるＤＮＡフラグメントの直接的な連結のためのそれらの代替の使用に関するさらなる詳細は、以下の第１４節に記載される。
【００９６】
（６．２．  増加した頻度のワクシニアウイルス組換え体の産生）
ワクシニアウイルスにおける組換え体の産生のための標準的な方法は、組換えワクシニアトランスファープラスミドとウイルスゲノムとの間の、相同組換えを利用する。表１は、ワクシニアウイルス感染細胞への組換えトランスファープラスミドのトランスフェクションの後の相同組換えの頻度を、標準的な条件下でアッセイしたモデル実験の結果を示す。機能的なアッセイを容易にするため、Ｈ−２Ｋbと会合するオボアルブミンの免疫優性の２５７〜２６４ペプチドエピトープをコードするミニ遺伝子を、トランスファープラスミドｔｋ遺伝子のＮｏｔ１部位に挿入した。相同組換えの結果、分裂されたｔｋ遺伝子は、任意の組換えウイルスの野生型ウイルスｔｋ＋遺伝子で置換される。これは、組換えのためのマーカーとして役立つ。なぜならば、ｔｋ−ウイルスに感染したｔｋ−ヒト１４３Ｂ細胞は、野生型ｔｋ＋ウイルスに感染した細胞と対照的に、ＢｒｄＵの毒性効果に対して耐性があるからである。組換えウイルスは、１２５ｍＭのＢｒｄＵの存在下で培養された１４３Ｂ細胞上のウイルスｐｆｕにより記録され得る。この様式において誘導される組換え体の頻度は、０．１％のオーダーの頻度である（表１）。
【００９７】
（表１：標準的な相同的組換えによる組換えワクシニアウイルスの産生）
【００９８】
【表１】
0004451987.tif 000002
*  ワクシニアウイルス株ｖＮｏｔ１
**  ％組換え＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００。
【００９９】
この組換え頻度は非常に低いため、ワクシニアベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーの効率的な構築が可能ではない。以下の２つの手順を、増加した頻度のワクシニアウイルス組換え体の産生のために用いた。
【０１００】
（ｉ）ワクシニアウイルス感染細胞へのプラスミドトランスファーベクターのトランスフェクションの後の相同的な組換えにより産生されるウイルス組換え体の頻度を制限する１つの要因は、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションが相対的に非効率的なのに対してウイルス感染が非常に効率的なことである。その結果、多くの感染細胞は組換えプラスミドを取り込まず、そしてそれ故、野生型ウイルスのみを産生し得る。この組換えの効率の希釈を減少させるため、裸のウイルスＤＮＡおよび組換えプラスミドＤＮＡの混合物を家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）感染哺乳動物細胞にトランスフェクトした。他書（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７−９９８１）により以前記載されたように、ＦＰＶは哺乳動物細胞において複製しないが、非感染性の裸のワクシニアＤＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞への成熟したワクシニアウイルス粒子のパッケージングのために必要とされる必要なヘルパー機能を提供する。この相同組換え技術の改変のみで、ウイルス組換え体の頻度を約３５倍の３．５％まで増加させた（表２）。
【０１０１】
（表２：改変された相同組換えによる組換えワクシニアウイルスの産生）
【０１０２】
【表２】
0004451987.tif 000003
表２：ＢＳＣ１細胞のコンフルエントな単層（５×１０5細胞／ウェル）をｍｏｉ＝１．０の家禽ポックスウイルス株ＨＰ１で感染させた。２時間後、上清を除去し、細胞をＯｐｔｉ−Ｍｅｍ  Ｉ培地で２回洗浄し、そしてリポフェクトアミンを用いて、６００ｎｇのワクシニア株ＷＲゲノムＤＮＡを単独、または１：１もしくは１：１０（ワクシニア：プラスミド）モル比のプラスミドｐＥ／Ｌｏｖａのいずれかでトランスフェクトした。このプラスミドは、ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープをコードするオボアルブミンｃＤＮＡのフラグメントを含み、マウスのクラスＩ  ＭＨＣ分子Ｋbと高い親和力で結合することが知られている。このミニ遺伝子の発現を、強い、合成の初期／後期ワクシニアプロモーターにより制御させる。この挿入物を、ワクシニアｔｋＤＮＡに隣接させる。３日後、細胞を収集し、そしてドライアイス  イソプロパノール／３７℃水浴における３サイクルの凍結／解凍によりウイルスを抽出した。粗ウイルスストックを、ヒトＴＫ−１４３Ｂ細胞において、ＢｒｄＵあり、およびＢｒｄＵなしでプラークアッセイにより力価を測定した（ｔｉｔｅｒ）。
*  ％組換え＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００。
【０１０３】
（ｉｉ）ウイルス性組換えの頻度におけるさらなる有意な増加は、ＦＰＶ感染細胞を、組換えプラスミド、ならびにＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより産生されたワクシニアウイルスＶ７．５／ｔｋ  ＤＮＡの２つの大きなおよそ８０キロベースのフラグメントおよび１００キロベースのフラグメントの混合物でトランスフェクトすることによって得られた。ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ部位がｔｋ遺伝子の中に導入されたので、これらの大きなワクシニアＤＮＡアームの各々は、ｔｋ遺伝子のフラグメントを含む。２つのｔｋ遺伝子フラグメントの間には、相同性がないので、２つのワクシニアアームが連結され得る唯一の方法は、組換え転移プラスミド中の挿入物に隣接する相同なｔｋ配列を通した架橋によるものである。表３の結果は、感染されたｔｋ細胞のＢｒｄＵ耐性により決定された場合に、３重にトランスフェクトされた細胞中に産生された感染性ワクシニアウイルスの９９％より多くが、ＤＮＡ挿入物に対して組換え体であることを示す。
【０１０４】
【表３】
0004451987.tif 000004
表３：ワクシニア株Ｖ７．５／ｔｋ（１．２μｇ）由来のゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。消化したＤＮＡを、半分に分けた。１つのプールを、ｐＥ／Ｌｏｖａの１：１（ワクシニア：プラスミド）モル比で混合した。このプラスミドは、オボアルブミンｃＤＮＡのフラグメントを含み、これは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１０）エピトープをコードし、マウスのクラスＩ  ＭＨＣ分子に対する高い親和性Ｋbで結合することが公知である。このミニ遺伝子の発現は、強力な合成的初期／後期ワクシニアプロモーターによって制御される。この挿入物は、ワクシニアｔｋ  ＤＮＡに隣接する。ＤＮＡを、リポフェクタミンを用いて、ｍｏｉ＝１．０  ＦＰＶで２時間前に感染されているＢＳＣ１細胞のコンフルエントな単層中（５×１０5細胞／ウェル）にトランスフェクトさせた。１つのサンプルは、６００ｎｇの未処理ゲノムＶ７．５／ｔｋＤＮＡを用いてトランスフェクトさせた。３日後、細胞を収集し、そしてウイルスを、ドライアイスイソプロパノール／３７℃水浴での３回の凍結融解によって抽出した。粗ウイルスストックを、ＢｒｄＵ選択ありおよびなしで、ＴＫ−１４３Ｂ細胞上にプラーク形成させた。
★  ％組換え体＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００
（６．３．ワクシニアウイルス中の提示的（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）ｃＤＮＡライブラリーの構築）
ｃＤＮＡライブラリーを、既知の細胞性ｍＲＮＡ配列の提示的な発現を示すために、ワクシニアベクター中に構築する。
【０１０５】
さらなる改変が、感染細胞における組換え発現の効率を増強するために、ｐ７．５／ｔｋ転移プラスミドおよびｖ７．５／ｔｋウイルスベクターの中に導入された。これらは、３つの異なる読み取り枠中の翻訳開始部位、ならびに翻訳終止シグナルおよび転写終止シグナルの両方、およびＤＮＡ挿入物のためのさらなる制限部位の導入を含む。
【０１０６】
第一に、ｐ７．５／ｔｋのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメント（ワクシニアｔｋ遺伝子）を、このプラスミドからｐＢＳファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位へサブクローン化し、ｐＢＳ．Ｖｔｋを作製した。
【０１０７】
第二に、ｐＢＳ．Ｖｔｋの本来の多重クローニング部位の一部分は、プラスミドをＳｍａＩおよびＰｓｔＩを用いて切断、大豆ヌクレアーゼを用いて処理し、そしてそれ自身に連結しなおし、ｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−を産生することによって除去された。この処理は、ｐＢＳ．Ｖｔｋから独特のＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、およびＰｓｔＩ部位を除去した。
【０１０８】
第三に、この時点における目的は、新しい多重クローニング部位をｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−の中の７．５ｋプロモーターの下流に導入することであった。新しい多重クローニング部位は、４つの異なる上流のプライマーおよび共通の下流のプライマーを使用したＰＣＲによって産生された。共に、これら４つのＰＣＲ産物は、ＡＴＧ開始コドンのいずれも、すなわち３つの可能性がある読み取り枠の各々におけるＡＴＧ開始コドンを含まない。さらに、各ＰＣＲ産物は、その３’最末端に、３つの読み取り枠全てにおける翻訳終止コドン、およびワクシニアウイルス転写二重終止シグナルを含む。これら４つのＰＣＲ産物は、別々にｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−のＮｏｔＩ／ＡｐａＩ部位の中に連結され、４つのベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋを産生した。これらのｐ７．５／ｔｋベクターと比較した配列改変は、図２に示される。各ベクターは、ＤＮＡ挿入物のクローニングのために独特なＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌＩ部位を含み、このＤＮＡ挿入物は、それら自身の内在性翻訳開始部位を使用するか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、または３つの可能な読み取り枠のいずれか１つにおけるベクターの翻訳開始部位を利用するか（ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ）のいずれかである。
【０１０９】
モデル実験において、ｃＤＮＡは、マウス腫瘍細胞株（ＢＣＡ３９）のポリ−Ａ＋ｍＲＮＡから合成され、そして４つの改変されたｐ７．５／ｔｋ転移プラスミドの各々の中に連結された。ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化されたｖ／ｔｋワクシニアウイルスＤＮＡアームの２０μｇ等量は、４つの組換えプラスミドｃＤＮＡライブラリーの等モル混合物と共に、ＦＰＶヘルパーウイルス感染ＢＳＣ−１細胞中に３分子組換え（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のためにトランスフェクトされた。回収されたウイルスは、９０％より多くがＢｒｄＵ耐性であった６×１０6ｐｆｕの合計力価を有した。
【０１１０】
組換えワクシニアライブラリー中のｃＤＮＡ挿入物の大きさの分配を特徴付けるために、個々の隔離されたプラークを、滅菌パスツールピペットを用いて拾い上げ、そして１００μｌリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む１．５ｍｌチューブに移した。ウイルスは、ドライアイス／イソプロパノールおよび３７℃水浴中での３回の凍結融解によって細胞から放出された。およそ３分の１の各ウイルスプラークを、最終容量２５０μｌのｔｋ−ヒト１４３Ｂ細胞を含む１２ウェル皿の１つのウェルへ感染させるために使用した。２時間の感染期間の最後に各ウェルを、２．５％ウシ胎仔血清（ＤＭＥＭ−２．５）および最終濃度を１２５μｇ／ｍｌとするに十分なＢＵｄＲを有する、１ｍｌ  ＤＭＥＭで覆った。細胞を３７℃でのＣＯ2インキュベーター内で３日間インキュベートした。３日目に、細胞を回収し、遠心分離によってペレット状にし、そして５００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した。ウイルスは、上記したような３回の凍結融解によって細胞から放出された。各ウイルスストックの２０％を、５０ｍｍ組織培養皿中で最終容量が３ｍｌ  ＤＭＥＭ−２．５において、コンフルエントな単層ＢＳＣ−１細胞を感染させるために使用した。２時間の感染期間の最後に、細胞を３ｍｌのＤＭＥＭ−２．５で覆った。細胞を３７℃でのＣＯ2インキュベーター内で３日間インキュベートした。３日目に、細胞を回収し、遠心分離によってペレット状にし、そして３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した。ウイルスは、上記したような３回の凍結融解によって細胞から放出された。粗ウイルスストックの１００μｌを１．５ｍｌチューブに移し、等量の融解した２％低融点アガロースを加え、そしてウイルス／アガロース混合物をパルスフィールドゲルサンプルブロック中に移した。アガーのウォーム（ｗｏｒｍ）が凝固したとき、これらをサンプルブロックから取り出し、そして３つの等しい切片に切断した。全ての３切片は、同じ１．５ｍｌチューブに移され、そして２５０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１％サルコシル、０．５ｍｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫを添加した。このウォームを、この溶液中で３７℃にて２４時間インキュベートした。ウォームを、５００μｌの０．５×ＴＢＥ緩衝液中で数回洗浄し、そして各ウォームの１つの切片を、１％の低融点アガロースゲルのウェルに移した。ウォームを添加した後、さらなる融解した１％の低融点アガロースを添加することによりウェルを密閉した。次にこのゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄパルスフィールドゲル電気泳動装置で、０．５×ＴＢＥ中１６時間、２００ボルト、８秒のパルス時間において電気泳動した。ゲルを、エチジウムブロマイド中で染色し、そしてワクシニアゲノムＤＮＡを含むアガロースの部分を、ゲルから摘出し、そして１．５ｍｌチューブに移した。ワクシニアＤＮＡを、β−Ａｇａｒａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて製造者の推奨に従ってアガロースから精製した。精製したワクシニアＤＮＡを、５０μｌのｄｄＨ2Ｏ中で再懸濁した。１μｌの各ＤＮＡストックを、製造者の推奨に従って最終容量２０μｌにおいて、ワクシニアＴＫ特異的プライマーＭＭ４２８およびＭＭ４３０（これは挿入の部位に隣接する）ならびにＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃ��）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用した。反応条件は、９５℃で５分間の最初の変性工程、引き続く以下の３０サイクル：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分を含んだ。２．５μｌの各ＰＣＲ反応物を、１％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロマイドを用いて染色した。多様なサイズの増幅フラグメントが、観察された。ＰＣＲで増幅された隣接するベクター配列について補正された場合、挿入物は、サイズが３００ｂｐと２５００ｂｐとの間の範囲である。
【０１１１】
ワクシニアウイルスｃＤＮＡライブラリーは、マウスαチューブリン配列に対して相同なクローンの提示という点でさらに特徴付けられた。ライブラリー由来の３００、９００または２，７００ウイルスｐｆｕのいずれかの平均を有する２０の別々のプールは、ＢｒｄＵが存在下で、１４３Ｂ  ｔｋ−細胞の単層を感染させることにより増幅された。ＤＮＡを、３日後に各感染された培養物から抽出し、そしてαチューブリン配列の存在について、チューブリン特異的プライマーを用いたＰＣＲによりアッセイした。陽性プールの頻度のポアソン分析は、あらゆる２０００〜３０００ウイルスｐｆｕに対して１つのαチューブリン組換え体の頻度を示す。これは、このマウス腫瘍細胞株におけるαチューブリン配列の推定された頻度とは有意に異ならず、そしてワクシニアｃＤＮＡライブラリーにおけるこの無作為に選択された配列の提示的な発現を示唆する。
【０１１２】
（６．４．議論）
上記された３分子組換えストラテジーは、１００％に近いウイルス組換え体を産生する。これは、プラスミド転移ベクターをワクシニアウイルス感染細胞中へトランスフェクトすることによるウイルス組換え体産生に対する近年の方法を超える、高度に顕著な改良である。この後者の手順は、わずか０．１％オーダーの頻度においてウイルス組換え体を産生する。３分子組換えにおけるウイルス組換え体の高い収率は、初めて、ワクシニアウイルス由来ベクター中で効果的にゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを構築することを可能にする。実験の初期の段階では、６×１０6組換えウイルスの力価は、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化したワクシニアベクターアームと等モル濃度の腫瘍細胞ｃＤＮＡとの２０μｇの混合物を用いたトランスフェクションに従って得られた。この技術的な進歩は、新しくそして効率的なスクリーニング、ならびに特異的なゲノムクローンおよびｃＤＮＡクローンの単離のための選択ストラテジーの可能性を創造する。
【０１１３】
本明細書中に開示されるような３分子組換え方法は、ワクシニアウイルスおよびヘルペスウイルスを含む哺乳動物ウイルスのような他のウイルスを用いて使用され得る。典型的に、相同性を有さない２つのウイルスアームが産生される。ウイルスアームが連結され得る唯一の方法は、プラスミドのような転移ベクター中の挿入物に隣接した相同性配列を通した架橋による。２つのウイルスアームおよび転移ベクターが同じ細胞に存在する場合、産生された感染性ウイルスのみが、転移ベクター中のＤＮＡ挿入物について組換え体である。
【０１１４】
ワクシニアウイルスおよび他の哺乳動物ウイルスにおいて本発明の３分子組換え方法によって構築されるライブラリーは、ワクシニアウイルスおよび本発明のＣＴＬスクリーニング系における標的抗原の同定の際におけるその使用について本明細書中に記載される利点に類似した利点を有し得る。より複雑なアッセイを真核細胞において行う場合、同様の利点が、ワクシニアウイルスまたは他の哺乳動物ウイルス中で構築されたＤＮＡライブラリーに対して期待される。このようなアッセイは、真核細胞のレセプターおよびリガンドをコードするＤＮＡのスクリーニングを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
（７．実施例：ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスにおけるヒト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の導入）
本実施例において、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスは、マウスＴ細胞に対する同時刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）活性を発現しない非腫瘍形成性の不死化された正常ヒト細胞株と寛容化され、そして引き続いてその同じ正常細胞株からインビトロ変異誘発または癌遺伝子形質転換によって誘導されたＢ７（同時刺激因子）トランスフェクトされた腫瘍細胞で免疫された。ＨＬＡ導入遺伝子は、マウス胸腺における高親和性のＨＬＡ−拘束Ｔ細胞のレパートリーの選択を可能にする。さらに、ヒトＣＤ８導入遺伝子は、マウスＣＤ８がヒトクラスＩ  ＭＨＣと効率的に相互作用しないので、必要とされる。Ｂ７トランスフェクトされた腫瘍細胞を用いた免疫の次に、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、そしてインビトロにおいて、非腫瘍形成性の不死化されたヒト細胞での同時刺激の非存在下で再度刺激する。腫瘍形成性細胞株および非腫瘍形成性細胞株によって共有される抗原に対する寛容誘導の２つの経路は、これらの操作を通して活性化され得る。当業者に公知のように、非常に若いマウスにおける抗原の暴露は、クローンの欠失およびＴ細胞アネルギーの誘導の両方を含み得る機構による寛容誘導に有利である。さらに、同時刺激因子活性の非存在下における、それらの抗原特異的レセプターを通した活性化Ｔ細胞の再刺激は、これらＴ細胞のアポトーシス性排除を誘導する。この免疫のレジメンは、相同な正常細胞と交差反応しない腫瘍特異的ＣＴＬを富化した。
【０１１６】
一連の腫瘍細胞株が使用された。これらは全て、一つの不死化された非腫瘍形成性細胞株から由来する。非腫瘍形成性細胞は、腫瘍細胞においてもまた発現される多数の正常ヒトタンパク質に対する寛容を誘導するために使用された。多様な発癌物質または癌遺伝子形質転換によって同じ正常細胞から別々に誘導された腫瘍のパネル（ｐａｎｅｌ）の利用可能性は、発癌物質特異的であるかまたは、腫瘍細胞株のインビトロ増殖の間の無作為な遺伝的浮動によって生じ得る抗原の変化を濾し出す（ｆｉｌｔｅｒ  ｏｕｔ）ことを可能にする。
【０１１７】
ヒト膀胱腫瘍細胞株に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍が由来する正常細胞株に対し寛容化された、（ＨＬＡ−Ａ２／Ｋb×ヒトＣＤ８）Ｆ1ハイブリッド二重トランスジェニックマウスから誘導および単離された。新生児マウスは、５×１０6非腫瘍形成性ＳＶ−ＨＵＣを用いて腹腔内に注射された。７週間後、これらは、５×１０6  Ｂ７．１でトランスフェクトされたｐｐＴ１１．Ｂ７腫瘍細胞を用いて免疫された。ｐｐＴ１１は、インビトロ発癌現象によってＳＶ−ＨＵＣから誘導されたいくつかの独立した腫瘍細胞株のうちの１つである（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：６０６６−６０７３；Ｐｒａｔｔら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６８８−６９５；Ｂｏｏｋｌａｎｄら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１６０６−１６１４）。免疫の１週間後、脾臓を取り出し、そして単一細胞懸濁液を調製した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞前駆体を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により推奨されるように、抗Ｌｙｔ−２でコーティングされたＭＡＣＳ（磁気細胞分類ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｂｅａｄｓ）上で富化した。次に、１．５×１０6のＣＤ８により富化されたＴ細胞を、３ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ウシ胎仔血清中の４×１０5  ＳＶ−ＨＵＣを用いて、インビトロで再刺激した。この理論的根拠は、新生児の寛容誘導を免れ、そしてｐｐＴ１１．Ｂ７の交差反応性決定基での刺激によってインビボで活性化される任意のＳＶ−ＨＵＣ特異的Ｔ細胞は、ここでインビトロにおける同時刺激因子活性がネガティブなＳＶ−ＨＵＣ細胞での再刺激によるアポトーシスを受けるように、誘導され得るということである。２４時間後、Ｔ細胞は、２０００ユニット／ｍｌの組換えマウスＩＬ−６の存在下で、ｐｐＴ１１．Ｂ７で再度刺激される。７日目、ｐｐＴ１１．Ｂ７を用いた再刺激により２４時間後に続けられるＳＶ−ＨＵＣ刺激のサイクルを、繰り返す。このｐｐＴ１１．Ｂ７を用いた２回の刺激は、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−７および５０ユニット／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２の存在下で実行される。ＣＴＬ活性は、５日後に、標識化した標的ＳＶ−ＨＵＣ、ｐｐＴ１１．Ｂ７、およびＹＡＣ−１、マウスＮＫ細胞による非特異的殺傷に感受性である細胞株からの標準的なクロムの放出アッセイによって決定される。表４の結果は、以前にＳＶ−ＨＵＣに対して寛容されなかったｐｐＴ１１．Ｂ７免疫マウス由来のＣＴＬが、ＳＶ−ＨＵＣおよびｐｐＴ１１標的細胞と同等に反応性であることを示す。対照的に、ＳＶ−ＨＵＣでの新生児寛容化後、エフェクター：標的の割合が５：１である細胞溶解性Ｔ細胞は、ＳＶ−ＨＵＣとよりもｐｐＴ１１．Ｂ７腫瘍細胞と有意により反応性である。Ｂ７同時刺激因子の活性は、同様の結果がＢ７トランスフェクトされた標的細胞またはトランスフェクトされていない標的細胞で観察されるように、エフェクター段階では必要とされないことに注意する。
【０１１８】
表４：ＳＶ−ＨＵＣ親細胞を用いて新生児期に寛容され、次にＢ７同時刺激因子でトランスフェクトされたｐｐＴ１１．Ｂ７ヒト膀胱腫瘍細胞を用いて免疫された（ＨＬＡ−Ａ２／Ｋb×ヒトＣＤ８）Ｆ1ハイブリッドトランスジェニックマウスにおける腫瘍特異的応答。
【０１１９】
【表４】
0004451987.tif 000005
本実施例手順の意義は、これが、ヒト上皮腫瘍細胞に対して特異的なマウスのＨＬＡ−拘束細胞溶解性Ｔ細胞を選択する手段を提供するということである。先に示したように、これは、そのようなＴ細胞を、患者ＰＢＬまたは黒色腫そしておそらく腎細胞癌腫以外の腫瘍の腫瘍浸潤性リンパ球のいずれかから直接的に単離することが、非常に困難であることが証明されている。さらに、５．１．１節に強調されるように、この同じストラテジーが、２つの段階において実行され得る。ヒト腫瘍の示差的に免疫原性な分子は、種々の異なる動物のＭＨＣに拘束された腫瘍特異的ＣＴＬを用いて初めに同定され得る。これらの抗原は、実施例１２に記載されるように、異なるヒトＨＬＡ型に関連してプロセスおよび提示される能力について、ヒトの被験体もしくはトランスジェニックマウスにおいて引き続き特徴付けられ得る。この２段階のアプローチの利点は、多くの異なるＭＨＣ分子が種々の近交系の株に利用可能であること、そしてこれらが、同等に広範な腫瘍特異的免疫原性ペプチドを、最初のスクリーニングにおいて獲得するために使用され得るということである。
【０１２０】
（８．実施例：特異的細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープをコードするライブラリーからＤＮＡ組換え体を選択するための高スループットストラテジー）
この実施例において、モデル系をアッセイして、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープをコードするＤＮＡ組換え体を選択する手順を通して得られ得る濃縮のレベルを決定した。
【０１２１】
（８．１．方法および結果）
十分に特徴付けられた卵白アルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号１０）をコードする特異的ワクシニア組換え体を、非組換えウイルスで希釈した。その結果、この組換え体は、０．２％、０．０１％、または０．００１％のいずれかのウイルスｐｆｕを構成した。この卵白アルブミンペプチドは、プロセシングされ、そしてマウスのクラスＩ  ＭＨＣ分子Ｈ−２Ｋbと結合して特異的ＣＴＬに提示されることが公知である。Ｈ−２Ｋbを発現するＭＣ５７Ｇ細胞の付着性単層を、このウイルス混合物にｍ．ｏ．ｉ．＝１（ウェル当たり約５×１０5細胞）にて感染させた。ＭＣ５７Ｇ細胞はそれ自身では卵白アルブミンペプチドを発現しないが、Ｈ−２Ｋbを発現し、それによって、この細胞が卵白アルブミンペプチドを結合し、そしてこれをＴ細胞へ提示することを可能とする。
【０１２２】
卵白アルブミンペプチドを発現する組換えワクシニアウイルスに１２時間感染した後、卵白アルブミンでプライムされた脾臓Ｔ細胞を、イムノドミナント卵白アルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでインビトロで刺激することを繰り返すことによって誘導された卵白アルブミンペプチド特異的ＣＴＬを、３０分間添加した。
【０１２３】
この間に、卵白アルブミンペプチドの発現を引き起こす組換え粒子に感染したいくつかの付着細胞が、特異的細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用し、溶解現象を起こした。溶解現象を起こした細胞を、単層から離した。３０分後、この単層を穏やかに洗浄し、浮遊する細胞および残っている付着細胞を別々に収集した。
【０１２４】
それぞれの細胞集団から抽出したウイルスを、卵白アルブミン組換えウイルスｐｆｕの頻度のために力価測定した。浮遊した細胞から抽出したウイルスを、次いで、新鮮な付着性ＭＣ５７Ｇ細胞および卵白アルブミンペプチド特異的ＣＴＬと共に、別の濃縮サイクルへのインプットとして使用した。総ウイルスの１０％より多くまでのＶＶｏｖａの濃縮後に、続くサイクルのｍ．ｏ．ｉ．が１から０．１に減少する場合に、組換えウイルスのさらなる濃縮が促進されることが観測された。表５に示されるこの結果は、５濃縮サイクルにおける初期濃度０．２％から４９％または０．０１％から３９％まで、および６濃縮サイクルにおける０．００１％から１８％までの、ＶＶｏｖａ組換えウイルスの顕著な濃縮を実証する。ウェルあたり５×１０5個の付着性ＭＣ５７Ｇ細胞およびｍ．ｏ．ｉ＝１の場合、平均して０．００１％のＶＶｏｖａ組換えウイルスの初期濃度は、１つの培養ウェルにおいて５×１０3個の野生型ワクシニアウイルスのうち５つの組換えｐｆｕのみを播種することと等価であることに注意のこと。非常に実質的な濃縮が、これらの条件の下でも達成される。
【０１２５】
【表５】
0004451987.tif 000006
（８．２．考察）
特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープをコードするＤＮＡクローンをウイルスライブラリーから単離するための上記の選択方法は、同じ目的を達成するための既存の方法よりもはるかに効率的である。本発明に先立って、最も広く使われている方法は、いくつかのプールの微量な成分によりＴ細胞刺激をアッセイするために、組換えプラスミドの多数の小さなプールの、別々の標的集合へのトランスフェクションが必要である。これは、多くのネガティブプラスミドのプールをスクリーニングする必要があるため、これは、本明細書に記載のポジティブ選択方法よりも遥かに骨の折れる集約的手順である。所定の資源の投資にとって、本明細書に記載の方法は、他の方法で可能な頻度よりかなり低い頻度で生じるポジティブＤＮＡクローンを検出し得る。このストラテジーの主要な原理は、特異的抗体ならびにＣＴＬを用いるＤＮＡクローンのスクリーニングおよび選択へと直接拡張され得る。
【０１２６】
（９．実施例：腫瘍中で示差的に発現する潜在的腫瘍特異的抗原の同定）
ヒトの腫瘍、癌、または感染した細胞中で示差的に発現した遺伝子の同定は、広く効果的なヒトワクチンの開発を促進し得る。示差的な遺伝子の発現を同定するほとんどの方法は、差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーションまたはより最近記載されたディファレンシャルディスプレイ技術のいずれかの改変形である。
【０１２７】
表示差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）は差し引きハイブリダイゼーションに基づいた、全細胞のＤＮＡの「表示」に適用される方法である（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，ＮおよびＮ．，Ｍ．Ｗｉｇｌｅｒ．１９９３．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９４６−９５１）。ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１）のディファレンシャルディスプレイ方法は、恣意的な１０ヌクレオチドプライマーおよび固定されたオリゴ−ｄＴを使用し、ＤＮＡ分子のより複雑なセットから恣意的なフラグメントのサブセットをＰＣＲ増幅する。以下に記載のように（９．２節）、本発明者らは、示差的に発現する遺伝子を同定し得るよう効率を増大するために、ディファレンシャルディスプレイを改変した。この実施例において本発明者らは、これらの方法を、腫瘍特異的な遺伝子生成物の同定を容易にする単一の非腫瘍形成性の不死化細胞株から独立的に誘導される腫瘍の関連するセットに適用する方法を例示する。
【０１２８】
Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら（１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６３０２−６３１０）によって記載された実験は、マウス腫瘍細胞株のセットに焦点を合わせており、その全ての細胞株は、単一のクローン化された非腫瘍形成性のＢＡＬＢ／ｃ胚性繊維芽細胞株から独立的に誘導された。これらの腫瘍は、それらが免疫保護抗原を共有することが公知であるために格別興味深かった。これらの実験の目的は、共有された腫瘍抗原の分子規定への到達であった。以下に記載の方法による示差的な遺伝子の発現および腫瘍免疫原性の効率的な分析のために、腫瘍細胞、ならびにその腫瘍細胞が誘導された正常細胞からすぐに入手可能であることを利用した。
【０１２９】
多様な発癌物質（または発癌遺伝子の形質転換）によって、同じ正常細胞から独立して誘導される複数の腫瘍が入手可能であることもまた、抗原性の変化を取り出すことを可能とし、その変化は、インビトロでの腫瘍細胞の増殖の間に発癌物質特異的であるか、またはランダムな遺伝的変動の結果として発生し得る。（実施例１０を参照のこと。ここで、一連のヒト腫瘍細胞株が記載され、それはこの分析の要求を満たす）。
【０１３０】
共有された腫瘍拒絶抗原の形質転換および発現のプロセスの間の関係を、Ｂ／Ｃ−Ｎ７．１Ｃ．１（ＢＡＬＢ／ｃ胎仔から誘導された連続した繊維芽細胞株の、接触阻害された非腫瘍形成性クローン（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：１６７；Ｌｉｎら、１９８５、ＪＮＣＩ  ７４：１０２５））から独立して誘導された一連のマウス腫瘍（ＢＣＡ  ３４、ＢＣＡ  ３９、ＢＣＡ  ２２、およびＢＣＢ  １３）間の免疫学的関係を特徴付けることによって研究した。腫瘍の形質転換の最も近い原因は、発癌物質により誘導された変異であったかもしれないが、このモデルは、形質転換のプロセスもまた限定数の共有された抗原の発現と関係あるか否かを決定する機会を提供した。
【０１３１】
Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら（１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６３０２−６３１０）によって報告されているように、免疫学的な分析は、４つのＢ／ｃ．Ｎ由来の腫瘍のうち３つが、お互いに対する交差保護性の免疫を付与することを示す。インビボでの交差保護のデータと一致して、１つの免疫学的に関係した腫瘍で免疫されたマウスからの細胞溶解性Ｔ細胞クローンは、３つ全ての免疫学的に関係した腫瘍を特異的に溶解するが、重要なことに、親のＢ／ｃ．Ｎ細胞または免疫学的に独立したＢＣＢ  １３腫瘍とは反応しない。クローン化された非腫瘍形成性の親細胞株から独立して誘導された腫瘍群間の免疫学的な交差反応性の観察は、非無作為の形質転換に関連するプロセスが同じ腫瘍抗原（単数または複数）の再発性の発現を生じることを、強く示唆する。示差的な遺伝子の発現を分析する２つの方法（表示差異分析（ＲＤＡ）および改変したディファレンシャルディスプレイ）を、関連した腫瘍抗原（単数または複数）をコードし得るｃＤＮＡの単離に使用した。
【０１３２】
（９．１．表示差異分析（ＲＤＡ））
ＲＤＡのＰＣＲ  ＳＥＬＥＣＴTMの改変型が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって市販されている。本文および図３に要約された以下の一般的プロトコールは、製造業者の推薦の概要である。ｃＤＮＡを、トレーサー（ＢＣＡ  ３９腫瘍ｍＲＮＡによって表示される）およびドライバー（親のＢ／ｃ．Ｎ  ｍＲＮＡによって表示される）の両方から合成する。トレーサーおよびドライバーのｃＤＮＡの両方の「表示物」は、４塩基認識配列ＧＴＡＣを切断して、平滑末端フラグメントを生じる、ＲｓａＩでの消化によって作製する。最終的にＰＣＲのプライマー部位として作用するアダプターを、トレーサーｃＤＮＡフラグメントのみの５’末端に結合する（図３）。トレーサー表示物の２つのアリコートを、２つの異なるアダプターを用いて別々に結合する。一連の２つのハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの第１のセットにおいて、アダプターに連結された各々のトレーサーサンプルを変性し、そしてドライバーｃＤＮＡの１０倍過剰の変性された表示物と８時間ハイブリダイズする。これらの条件下での全ての分子の再アニーリングは不完全であり、そして高コピーおよび低コピー両方の分子のいくつかは一本鎖のままである。再アニーリングの速度が、より大量の種についてより速いため、これは、低コピー数の一本鎖分子の相対的な濃縮を介した分布の規格化を導く。アダプターに連結された異なるトレーサーｃＤＮＡ表示物の各々との２つのハイブリダイゼーション反応を、次いで、細分化またはさらなる変性なしで、しかし、第２のハイブリダイゼーション反応でのより新しく変性されたドライバーの添加と組み合せ、この反応を約２０時間、さらに進行させて完了させる。
【０１３３】
第２のハイブリダイゼーションからの生成物のアリコートを、結合したアダプターの５’末端の既知の配列をプライマーとして用いて、高いストリンジェンシーのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用する。ここでの重要なポイントは、１）第１のハイブリダイゼーションを通じて一本鎖のままであり、そして２）第２のハイブリダイゼーションにいて代わりのアダプターに結合した相補的なトレーサー配列へハイブリダイズする、腫瘍トレーサー配列のみが、ＰＣＲの間に指数関数的に増幅され得ることである。これは、一本鎖を維持するか、または過剰のドライバーにハイブリダイズされたかのいずれかのトレーサーおよびドライバー種の両方（これらが、相補的なプライマーを分子の１つの末端にのみ有するか、またはどちらの末端にも有さないため）、ならびに、同じアダプターを有する分子にハイブリダイズするトレーサー配列（なぜなら、このアダプターはプライマーより長く、そしてそれら自身の相補体が変性した一本鎖分子の反対の末端に存在するとき、それら自身の相補体と高い親和性でハイブリダイズするため（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）ＰＣＲ」と呼ばれた反応））を除外する。最終的に、高いストリンジェンシーの第２のＰＣＲを、アダプターに組み込んだネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを使用して行って、バックグラウンドをさらに減少させ、そして示差的に発現した配列をさらに濃縮する。第２のＰＣＲの生成物を、アガロースゲル上で電気泳動し、そして可視化する。個々のバンドをさらなる分析のために切出し、そしてサブクローン化する。
【０１３４】
（９．２．潜在的な腫瘍免疫原をコードする遺伝子の表示差異分析）
この実施例は、ＰＣＲ  ＳＥＬＥＣＴTM  ｃＤＮＡの差し引き方法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、免疫学的に関連したマウス腫瘍のセットにおける共有された腫瘍抗原についての強力な候補を同定するために首尾良く使用した方法を記載する。
【０１３５】
図４に示されるように、フラグメント化された正常細胞ｃＤＮＡの表示物を、ＢＣＡ  ３９腫瘍ｃＤＮＡの同様の表示物から差し引くと、結果として、約３００から２２００塩基対のサイズの範囲の一連の７つの明らかに識別可能な差し引き生成物を同定した。これらのＤＮＡフラグメントが実際に示差的に発現されたことを確認するため、各バンドをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、それぞれのバンド由来の少なくとも５コロニーのＤＮＡインサートを、５つの異なる細胞株（親細胞、３つの免疫学的に交差反応性の腫瘍細胞株、および１つの非交差反応性の腫瘍細胞株）のＲＮＡに対するノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ＲＤＡバンド１に由来するクローン３ｆの代表的な結果を、図５Ａに示す。
【０１３６】
そのプローブは、ＢＣＡ  ２２、３４および３９の腫瘍ｍＲＮＡにおいて少なくとも３つの転写物にハイブリダイズした。３つの転写物の発現は、これらの３つの免疫学的に交差反応性の腫瘍に独特である。最少のハイブリダイゼーションは、親のＢ／ｃ．Ｎ細胞または非交差反応性のＢＣＢ  １３腫瘍の、ＲＮＡを用いて検出された。同様の結果が、独立したＲＮＡ調製物を用いた４つのノーザンブロットにおいて観察された。ＲＮＡサンプルの完全性および相対的ローディングを、マウスＧ３ＰＤＨ遺伝子のフラグメントに対するハイブリダイゼーションにより決定した（図５Ｂ）。
【０１３７】
クローン３ｆの配列を決定し、マウス槽内のＡ型粒子（ＩＡＰエレメント）の配列の一部に強く相同性であることを見出した（Ａｏｔａら、１９８７，Ｇｅｎｅ  ５６：１−１２）。ＩＡＰは、小胞体の槽に局在化する内在性のレトロウイルス様の粒子である。ＩＡＰは、機能的にパッケージングされたタンパク質をコードしないために非感染性であり、その配列の潜在的ｅｎｖ領域は、多くの保存された終止コドンを含む（ＫｕｆｆおよびＬｕｅｄｅｒｓ、１９８８，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：１８３−２７６）。大部分のＩＡＰは、７３ｋＤａの主要なｇａｇタンパク質、およびいくつかの逆転転写酵素の特性を有するｐｏｌポリペプチドをコードする（ＷｉｌｓｏｎおよびＫｕｆｆ、１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：１５３１−１５３６）。ＩＡＰ転写物の発現は、種々のマウスの原発性腫瘍（プラズマ細胞腫、乳頭腫、癌腫、乳癌、肉腫、肝細胞腫を含む）および樹立されたマウス腫瘍およびマウス細胞株（フレンド赤白血病、骨髄単球性白血病、Ｔリンパ腫、骨髄腫を含む）において記載された。正常な胸腺における発現は増大し得るが、大部分の正常なマウスの体細胞組織において、非常に低いレベルの発現のみが検出される（ＫｕｆｆおよびＬｕｅｄｅｒｓ、１９８８，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：１８３−２７６）。
【０１３８】
（９．３．ＲＤＡからの示差的に発現した遺伝子配列の特徴付け）
半定量的なＰＣＲは、示差的な発現にとってノーザンブロット分析よりもより敏感な試験である。クローン３ｆ配列に特異的なプライマーを、ＢＣＡ  ３９腫瘍およびその親細胞株の両方由来の全長オリゴ−ｄＴプライムされたｃＤＮＡの増幅のために使用した。マウスチューブリンプライマーを用いる増幅を、この２つの細胞株間のテンプレートの量の規格化のために使用した。それぞれのテンプレートの等しいアリコートを、可変数のＰＣＲサイクルを介して増幅した。それぞれの場合において、相対的テンプレートの濃度の推定は、サイクル数に応じて生成物が指数関数的に増加する増幅曲線の部分に直線を適合させる事によって誘導した。この仮定は、この領域において収量が、（初期のテンプレートの濃度）＊（ａn）の線形関数であることであり、ここでａは、そのＰＣＲ領域におけるサイクルあたりの増幅の平均であり、通常は１．５と１．８との間であり、そしてｎはサイクル数である。親Ｂ／ｃ．Ｎ．と比較して、ＢＣＡ３９腫瘍ｃＤＮＡにおいて、３ｆフラグメントの発現は少なくとも７倍多いことが決定された。
【０１３９】
腫瘍ＲＮＡにおける示差的な発現を、他の６つのＲＤＡバンドに由来するさらなる１２クローンのインサートについて確認した。ノーザン分析は、クローン３ｆについて観察したのと同一の、ＩＡＰ転写物のハイブリダイゼーションパターン特性を示した。それぞれのクローンの配列を決定し、そのＩＡＰのゲノムの他の領域と相同的であることを見出した。１０の独特なＲＤＡクローンの相対部位のマップを図６に示す。累積的に、これらのインサートが、このＩＡＰゲノムの大部分をカバーすることが理解され得る。
【０１４０】
これらのＩＡＰ配列の発現が、この３つの免疫学的に交差反応性の腫瘍（ＢＡＣ  ３９、ＢＣＡ  ３４、およびＢＣＡ  ２２）の間で共有されているが、Ｂ／ｃ．Ｎ親細胞および免疫学的に無関係のＢＣＢ  １３腫瘍の両方においては存在しないか、または非常に低いことが特に印象的である。従って、ＩＡＰエピトープは、この共有された腫瘍抗原についての強力な候補である。異なるＲＤＡクローンを抗原ネガティブＢ／ｃ．Ｎ細胞にトランスフェクトする実験が進行中であり、この細胞を、次いで、腫瘍特異的なＣＴＬによる溶解に対する感作について試験する。ＩＡＰを含む内在性のレトロウイルスエレメントの転写活性化は、新しいクラスの共有された腫瘍拒絶抗原を表し得る。マウスＬＥＣ自発性白血病の腫瘍抗原ＬＥＣ−Ａも、ＩＡＰエレメントのｇａｇ遺伝子によりコードされることが報告されている（ｄｅ  Ｂｅｒｇｅｙｃｋら、１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２２０３−２２１２）。最近、マウス結腸腫瘍の腫瘍拒絶抗原であるＣＴ２６が、別の型の内在性レトロウイルスであるＣ型粒子によってコードされることが見出された（Ｈｕａｎｇら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９７３０−９７３５）。レトロウイルス様エレメントもまた、ヒトゲノム中に存在し：ｐｏｌ遺伝子の発現がヒト乳房（Ｍｏｙｒｅｔら、１９８８，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１２７９−１２８３）、および結腸直腸癌（Ｍｏｓｈｉｅｒら、１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３９：１０７１−１０７７）において検出され、そしてｇａｇ遺伝子生成物に対する抗体が、ヒト精上皮腫の患者の血清（Ｓａｕｔｅｒら、１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：４１４−４２１）、および腎臓細胞癌の患者の血清（Ｗａｈｌｓｔｒｏｍら、１９８５，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５３：４６４−４６９）において報告された。
【０１４１】
（９．４．潜在的な腫瘍免疫原をコードする遺伝子の、改変されたディファレンシャルディスプレイ）
以下の実施例において、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅのディファレンシャルディスプレイ方法（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１）を、ＤＮＡフラグメントの分離の改良のため、および偽陽性の頻度の減少のために、改変した。
【０１４２】
ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅによって本来記載されたディファレンシャルディスプレイ方法（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１）は、恣意的な１０ヌクレオチドプライマーおよび固定されたオリゴ−ｄＴを使用し、ＤＮＡのより複雑なセットから恣意的なフラグメントのサブセットをＰＣＲ増幅する。原理的には、正常な細胞株および腫瘍の細胞株から産生したフラグメント間の相異は、その２つの細胞型における遺伝子発現の相異を反映するはずである。実際には、この方法は、時々良好に働くが、しばしば多数の偽陽性を生じる。すなわち、さらなる特徴付けの際に、示差的提示されたように見えるバンドが、示差的に発現されていないことが見出される。おそらくこれは、複合集団における個々の種の可変性のＰＣＲ増幅、および顕著でないバンドを不明瞭にし得る比較的高いバックグラウンドに起因する。示差的な発現の確立には相当の努力が要求されるため、これらの固有の偽陽性は、有効性および生産性の点では高価である。
【０１４３】
単一の恣意的なプライマーもまた、Ｗｅｌｃｈら（３、４）によって記載されるように、ディファレンシャルディスプレイに使用され得る。しかし、単一プライマーの使用は、複合ｃＤＮＡ集団の同じ範囲に達するために、独立したプライマーの非常に多くのセットの合成を必要とする。
【０１４４】
それ故に、ＤＮＡフラグメントの分離の改良および偽陽性の頻度の減少のために改良されたディファレンシャルディスプレイ方法が必要である。
【０１４５】
フラグメントの分離の改良および偽陽性の頻度の減少のために、ＰＣＲ増幅において使用される固定されたオリゴ−ｄＴを、第２の恣意的なプライマーに置換した。これは、結果として、各々のＰＣＲ反応において、より少ないＤＮＡ産物が産生し、その結果、個々のＤＮＡフラグメントを、配列決定ゲル上でより確実に分離し得る。
【０１４６】
この改変されたディファレンシャルディスプレイプロトコルにおいて産生するフラグメントの各々のサブセットが、全ｃＤＮＡのより小さな提示であるため、適切な試料採取のために、より多くのプライマー対が必要である。可能な６６個全てのプライマー対の組み合わせにおいて、１２の独立したプライマーを利用する場合、平均の大きさの真核生物のｃＤＮＡについて少なくとも１つのプライマー対が７０ｂｐ以上のサイズの代表的なＰＣＲフラグメントを増幅することに、８５％より大きい可能性が存在することが、負の２項分布を用いることで予想され得る。
【０１４７】
表６は、そのプライマー対が改変されたディファレンシャルディスプレイから選択された、１２の任意の十量体の配列を列挙する。この特異的なプライマーを、それらの配列の多様性、３'ハイブリダイゼーション親和性、および最小の対様式（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）ハイブリダイゼーションに基づいて選出した。
【０１４８】
【表６】
0004451987.tif 000007
各々のプライマーを用いて、０．１μｇのポリＡ−ＲＮＡおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いる分離ｃＤＮＡの合成反応行った。プライマー対の各々のメンバーを用いて作製されたｃＤＮＡ産物の５パーセントをＫｌｅｎ  Ｔａｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３０ＰＣＲサイクルにおける増幅のためにそのプライマー対と共に混合した。ＰＣＲプライマーをｃＤＮＡ合成のために使用し、オリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡ合成により加えられる３'の偏りを回避した。各々のプライマーを用いて分離合成を行うことにより、ｃＤＮＡ中の２つのプライマーの相対的配向性を無作為化した。これらのｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために選択されたプライマーとして同じ組み合せで混合し得る。ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡフラグメントをオートラジオグラフィーのために、６％アクリルアミドゲル上で分離し、そして乾燥した。少なくとも２つの腫瘍サンプルにおいて示差的提示されたこれらのバンドを、切断し、そして再水和しそして親細胞におけるバンドではそれらを行わなかった。この回収したＤＮＡのアリコート（１／５）を、同じプライマーセットおよび同位体の添加無しである以外は、同じＰＣＲ条件を用いて、再増幅した。この第二のＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離し、個々のバンドをβアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）とのインキュベーションにより回収した。回収した各々のＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ファージミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端連結によりクローンニングした。１つのバンドが１つより多い分子種を含み得ることが可能であるので、適切なサイズの挿入物を有する、少なくとも４つの異なる形質転換体を、さらなる特徴付けのために拾い上げる。ノーザン分析（ＲＮａｓｅ保護アッセイおよび半定量的ＰＣＲ）を、示差的発現を確認するために行った。
【０１４９】
マウス腫瘍細胞株において、多くのより示差的に発現した遺伝子フラグメントがＲＤＡによるよりもディファレンシャルディスプレイによって同定されるようであることを観察した。さらに、ＲＤＡフラグメントは、２、３時間だけ曝したノーザンブロット上で、陽性の結果を与える。対照的に、ディファレンシャルディスプレイにより同定されたフラグメントは、しばしば数日後でさえノーザンブロットにおいてシグナルを与えない。この場合、示差的発現を、ＲＮａｓｅ保護および配列特異的プライマーを用いる半定量的ＰＣＲにより確認した。これらの観察は、理論上の予想と一致する。この予想は、少量のｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを駆動して完結させる困難さのために、このような配列はＲＤＡに基づくハイブリダイゼーションによるよりも、ＰＣＲに基づくディファレンシャルディスプレイによって、より容易に同定されるということである。さらに、改変したディファレンシャルディスプレイのより高い感度についての別の理由が存在し得る。少量のｍＲＮＡ種は、より小さく、より安定で、そしてより大量のｍＲＮＡ種のサイズの平均して２倍のサイズであることが報告された（ＭｅｙｕｈａｓおよびＰｅｒｒｙ、１９７９、Ｃｅｌｌ  １６：１３９−１４８）。従って、任意のプライマー対の両方のメンバーは、より多量に発現されたより短い（平均２ｋｂ）ｍＲＮＡ種の２０％からよりも、細胞当たり非常に少数のコピーにより表されるより長い（平均４．９ｋｂ）非常に多様なｍＲＮＡ種の８０％から示差的に発現したｃＤＮＡにハイブリダイズし、そしてそのｃＤＮＡを検出するようである。
【０１５０】
予備実験において、示差的提示された３つのバンドの平均を、それぞれのプライマー対について同定した。１２の独立したプライマーのすべての可能な組み合わせから生じた総計６６のプライマー対を用いて、約２００の遺伝子フラグメントを同定し得た。いくつかの場合において、複数のフラグメントが、同じ遺伝子に由来し得る。図７は、任意の十量体（ＭＲ＿１（ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  Ｇ）（配列番号１１）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  Ｃ）（配列番号１３））の１つの対で観察されたディファレンシャルディスプレイフラグメントのパターンを示す。４つすべての腫瘍に関連するが、親細胞に関連しない多くのバンドを同定し得る。この分布は、腫瘍細胞の免疫原性に関連しない。なぜならば、４つの腫瘍の３つだけが免疫学的に交差反応的であるからである。２、３時間だけ曝されたノーザンブロットでポジティブな結果を与えたＲＤＡにより同定される、示差的に発現されたバンドと対照的に、ディファレンシャルディスプレイにより同定されたフラグメントは、数日後でさえ、ノーザンブロットにおいてシグナルを与えなかった。しかし、ディファレンシャルディスプレイフラグメントの示差的発現を、ＲＮａｓｅ保護アッセイにより、または配列特異的プライマーを用いた半定量的ＰＣＲにより確認し得る。図８に例を示し、これは、ディファレンシャルディスプレイバンド９からのクローン９０を用いたＲＮａｓｅ保護アッセイの結果である。Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋデータベースの登録と十分な相同性を有しないこの配列は、親Ｂ／ｃ．Ｎではなく、全ての４つの腫瘍株において発現された。
【０１５１】
上記で議論したように、本発明者らは、ＲＤＡおよびディファレンシャルディスプレイの結果におけるこの著しい相違を、ハイブリダイゼーションに基づくＲＤＡ方法と比較すると、ＰＣＲに基づく改変したディファレンシャルディスプレイのより優れた感度に起因するとする。異なる腫瘍および正常細胞株における発現のパターンに基づき、同系の腫瘍細胞を用いたマウスの直接的な免疫後に検出した共有された腫瘍抗原は、より大量に発現したＩＡＰ遺伝子によりコードされ得るようである。本実施例において記載される方法は、改変したディファレンシャルディスプレイにより同定した、より少量に発現された遺伝子の産物が、可能性のある潜在的な腫瘍抗原を表すか否かを決定するために用いられ得る。
【０１５２】
（９．５．潜在的な腫瘍免疫原をコードする全長ｃＤＮＡの選択）
このセクションは、提示の差分析により、または改変したディファレンシャルディスプレイにより同定された、示差的に発現した遺伝子のフラグメントからの、対応する全長ｃＤＮＡの選択を容易にするための方法を表す（図９）。一本鎖のビオチン化したプローブを、単離したｃＤＮＡフラグメントから合成し、そしてｃＤＮＡライブラリーからレスキューされた一本鎖サークルに対する溶液ハイブリダイゼーションにより、相補的配列を含む、より長いｃＤＮＡファージミド腫瘍を選択するために用いた。この方法は、特に、２つの任意のプライマーを利用する改変したディファレンシャルディスプレイ方法により単離したＤＮＡフラグメントの使用に最適である。ディファレンシャルディスプレイにおける所定のフラグメントのＰＣＲ増幅に用いた、この同じ任意のプライマーを修飾し、そのフラグメントから一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを産生し得る。これは、目的の各々の新しいフラグメントのためのフラグメント特異的プライマーの新しい対を配列決定、選択および合成することの必要性を回避する。
【０１５３】
ｉ）ディファレンシャルディスプレイにおいて利用するＰＣＲプライマーの対の２つのオリゴヌクレオチドは、修飾される：（ビオチン−ｄＴ）−ｄＴ−（ビオチン−ｄＴ）を、１つのプライマーの５’末端に組み込み、そしてリン酸を第二のプライマーの５’末端に組み込む。これらの改変したプライマーは、同じ非修飾の任意のプライマーで本来のＰＣＲ増幅後に選択したディファレンシャルディスプレイフラグメントの２つの鎖に、ＰＣＲによって組み込む。この二本鎖ＰＣＲ産物から、５’リン酸で標識した鎖を、λエキソヌクレアーゼで消化し、一本鎖ビオチン標識プローブを生じる。
【０１５４】
ｉｉ）一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡサークルを、ヘルパーウイルスとしてＭ１３Ｋ０７パッケージング欠損ファージを用いて、ファージミドｃＤＮＡライブラリーからレスキューする。このライブラリーを、Ａｐａ  Ｉ制限部位とＥｃｏ  ＲＶ制限部位との間で（ＡｐａＩ）オリゴ−ｄＴプライムされたｃＤＮＡのインサートを有する、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ファージミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に構築する。高力価のｃＤＮＡライブラリーの構築に必要な効率的な連結を達成するための重要な操作は、連結前にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理することにより、ｃＤＮＡインサートが５’リン酸化されることを確実にすることである。ディファレンシャルディスプレイフラグメントから生じたビオチン標識した一本鎖プローブを、ファージミドライブラリーのｓｓＤＮＡサークルに溶液中でハイブリダイズした。次いで、ビオチン標識したハイブリダイゼーション複合体を、さらなる分析のために、ストレプトアビジン磁気ビーズ上の無関係なｓｓＤＮＡから分離し得、そしてｓｓサークルを溶出し得る（図９）。
【０１５５】
この濃縮方法の試験として、モデルプラスミド混合物を調製し、それは、１％の特異的な任意に選択した組み換えクローンである３ｆ  ＩＡＰを含む。ビオチン化ｓｓプローブを、３ｆ  ＲＤＡフラグメントから調製し、そしてその１％プラスミド混合物から一本鎖ファージミドサークルを選択するために用いた。ストレプトアビジンビーズから溶出した後、一本鎖サークルを、細菌の形質転換前に第二のプラスミド鎖の合成をプライムするために配列特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。プラスミドＤＮＡを、形質転換した６３のコロニーから調製した。６３のこれらのプラスミド調製物のうち６３が、標的３Ｆ  ＩＡＰ挿入を発現した。従って、この方法は非常に効率的であるようである。
【０１５６】
この同じ方法は、以前には同定されていない、非免疫原性の親細胞におけるよりも約１０倍増の濃度で４つ全てのマウスの腫瘍において発現する、配列を表すディファレンシャルディスプレイフラグメント（Ｂ４）の、よりストリンジェントな場合において同様の効率で作用するようである。２００ｂｐのＢ４ＤＮＡフラグメントを有する一本鎖サークルの選択後、無作為に取り出された５つの形質転換体のうちの５つは、配列特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ポジティブなより長い挿入を有した。従って、この方法は、非常に効率的のようである。
【０１５７】
（１０．実施例：非腫瘍形成性の、不死化した細胞株由来の独立ヒト腫瘍細胞株）
以下の実施例は、異なる発癌物質または、同じクローン化した、非腫瘍形成性の親細胞株からの癌遺伝子形質転換により、独立的に由来するヒト腫瘍のセットを記載する。マウスの腫瘍において示差的に発現した遺伝子産物の同定のための、ＲＤＡおよび改変したディファレンシャルディスプレイの使用の、先の実施例におけるように、関連する正常および腫瘍細胞株の有効性は、潜在的な癌ワクチンの分子および免疫学的分析の重要な利点を有する。これは、容易に入手可能な正常なコントロール細胞源およびＲＮＡ源を供給するだけでなく、発癌物質に依存しない分子の特徴に集中することを可能にする。なぜならば、それらは複数の独立した腫瘍により共有され、インビトロでの増殖中の無作為な遺伝的ドリフト（ｄｒｉｆｔ）の産物ではないようであるからである。
【０１５８】
ヒト尿路上皮腫瘍のセットは、ヌードマウスにおいて、ＳＶ４０不死化ヒト尿路上皮細胞株であるＳＶ−ＨＵＣ（それ自体を接触阻止し、足場依存性であり、そして非腫瘍形成性）から、Ｄｒ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆの研究室（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学、Ｍａｄｉｓｏｎ）で誘導された（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：６０６６−６０７３）。一連の独立腫瘍細胞株を、ｒａｓ形質転換（Ｐｒａｔｔら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６８８−６９５）または膀胱特異的であるいくつかを含む異なる発癌物質を用いるＳＶ−ＨＵＳのインビトロ変異誘発（Ｂｏｏｋｌａｎｄら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１６０６−１６１４）のいずれかにより、誘導した。形質転換した細胞を、初めに、変更したインビトロ成長要求に基づいて選択し、そして各々の細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成性を示した。これらの腫瘍のサブセットの移行上皮癌の表現型を保持するものを選択する。表７は、インビトロでこれらの５つの腫瘍株を誘導するために利用した親細胞および発癌物質を列挙する。系統的なプログラムを、１）これらの腫瘍において示差的に発現された全長ｃＤＮＡを同定するため、および２）ワクシニアウイルス発現ベクター中にクローン化されたこれらのｃＤＮＡ産物のＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスにおける免疫原性を試験した。
【０１５９】
【表７】
0004451987.tif 000008
代表的な差分析および改変したディファレンシャルディスプレイ実験の両方を適用して、親ＳＶ−ＨＵＣと比較してＭＣ  ｐｐＴ１１−Ａ３腫瘍（ｐｐＴ１１Ａ３）において、示差的に発現した遺伝子フラグメントを同定する。全ての示差的発現したフラグメントを、他の腫瘍細胞株のｍＲＮＡにおける並行発現のために、ノーザン分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイにより試験した。腫瘍細胞株由来の５つのＳＶ−ＨＵＣのうちの少なくとも３つにおいて発現したＤＮＡクローンのみを、さらなる特徴付けのために選択する。
【０１６０】
腫瘍特異的遺伝子産物の同様の分析を、代表的な他のヒト組織のＳＶ４０ラージＴまたはＨＰＶ  Ｅ６もしくはＨＰＶ  Ｅ７不死化細胞株に由来する腫瘍を用いて行い得る。公開された実施例は、前立腺上皮（Ｐａｒｄａら、１９９３、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２３：９１−９８）、哺乳動物上皮（Ｂａｎｄら、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：７３５１−７３−５７）、および気管支上皮（Ｇｅｒｗｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７５９−２７６３；Ｋｌｅｉｎ−Ｓｚａｎｔｏら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６６９３−６６９７）を含む。
【０１６１】
（１１．実施例：新鮮な患者の膀胱腫瘍における遺伝子発現）
示差的に発現する遺伝子の同定のための上記の方法は、腫瘍および正常なコントロール細胞ｍＲＮＡの両方が容易に入手可能であることを要求する。前述のセクションは、不死化細胞株からインビトロで誘導された腫瘍に集中し、そこから、ｍＲＮＡを容易に大量に入手し得る。
【０１６２】
ｍＲＮＡを容易に入手し得る、インビトロで誘導された腫瘍を用いて働く利点にも関わらず、いくつかの形質転換が関連する遺伝子発現が失敗し得るか、または逆に、検出されるいくつかの示差的遺伝子発現が関連する形質転換でないかもしれない可能性に注意を向ける必要がある。正常なコントロールは接触阻止的、足場依存的および非腫瘍形成性であるにも関わらず、インビトロにおける連続した成長のための基礎であるいくつかの前腫瘍性の事象を経験したようである。恐らく、より大きな関心は、インビトロ増殖に関連する外来性遺伝子発現を同定し得ることである。そのような事象を除外するための２つの方法を利用する。第一に、５つの膀胱腫瘍株のうちの少なくとも３つにおいて発現するが、インビトロで順応した親細胞において発現されない遺伝子を分析した。このことは、ａ）それがこの正常な親細胞により共有されるので、インビトロの成長により選択される任意の系統的な遺伝子発現が徐々に知られ得、そしてｂ）それらは多様な発癌物質（または癌遺伝子形質転換）により誘導される複数の独立した腫瘍により共有されることが期待されないので、発癌物質特異的であるか、またはインビトロでの増殖中の無作為の遺伝的ドリフトの結果として生じ得る遺伝子発現における任意の変化を同定する。第二に、そして最も重要である、新鮮な患者の腫瘍物質の複数サンプルにおいて発現することもまた示し得る、これらの示差的発現した遺伝子のみを、さらなる特徴付けのために選択する。
【０１６３】
患者の腫瘍物質を、正常な膀胱上皮と一緒に手術後凍結保存する。ほかのいくつかの癌と比較して、正常な組織コントロールは膀胱癌患者から容易に入手可能である。全ＲＮＡを酸グアニジニウムイソシアネート方法（ＬｅｅおよびＣｏｓｔｌｏｗ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２：６３３−６４８）により冷凍サンプルから抽出する。ＤＮａｓｅ  Ｉ処理後、ポリＡ  ｍＲＮＡをオリゴｄＴビーズ上に分画し、そして遺伝子発現をノーザンブロット、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、および半定量的ＲＴ／ＰＣＲにより分析した。インビトロの腫瘍株において同定した各々の示差的発現した遺伝子フラグメントについて、遺伝子の発現を、２０患者の腫瘍および正常な組織コントロールのパネルにおいて特徴付ける。このサンプルサイズは、遺伝子を発現する患者の比率の０．１１％以下の標準誤差（ＳＥ＝ｓｑｒｔ［ｐ＊（１−ｐ）／ｎ］、ここで、ｐ＝真の比率、そしてｎ＝サンプルサイズである。ｐ＝０．５、集団（１０／２０患者）の比率において、ＳＥは最大であり、ＳＥ＝±０．１１であり；任意の他のｐの値については、ＳＥはより小さい）で遺伝子を発現することを可能にする。これらの遺伝子のいくつかの発現は、異なる腫瘍サンプル中に相関し得る。このことは、異なるヒトＭＨＣ分子と関連し得る複数のＴ細胞エピトープの可能性を引き起こすので、有用である。
【０１６４】
正常な他の成体および胎仔組織において、正常な膀胱上皮に対して、膀胱腫瘍において示差的発現される任意の遺伝子の発現パターンをもまた決定する。３０を超える異なる正常なヒト成体または胎仔組織から調製される、全ＲＮＡまたは第一鎖のｃＤＮＡ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＬｉｎｅTM  ＲＮＡおよびＧｅｎｅ  ＰｏｏｌTM  ｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用する。正常な成体組織ではなく、胎仔における発現は特に興味深く、そして免疫治療薬剤としての考慮を排除しない。中程度の量の種の発現を、ノーザン分析により決定する。少量の種を、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよび半定量的ＰＣＲにより定量する。複数の患者由来の腫瘍において周期的に発現し、そして正常な組織においては最も低く関連した発現を有する、これらの配列は、潜在的な腫瘍特異的抗原として、さらなる特徴付けのために選択した。
【０１６５】
（１２．実施例：示差的発現し、オーセンティックな腫瘍と交差反応的なＣＴＬを生じる発現した遺伝子産物の使用）
腫瘍免疫治療のための候補であり得る、示差的発現する遺伝子産物を同定するために、ヒトＨＬＡと関連するペプチドに対するＴ細胞応答が誘導され得る環境における免疫のための産物を送達する手段を有することが必要である。次いで、免疫原性産物により誘導されるＴ細胞を、対応するｍＲＮＡを発現するＨＬＡ適合腫瘍上での交差反応性について試験し得る。この実施例は、ヒトＨＬＡと関連するペプチドに対するＴ細胞応答の誘導のためのＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスの使用を記載する。全てのこれらの条件が、１）この遺伝子が複数のヒト腫瘍において示差的発現するが正常な組織対応物ではない、２）遺伝子産物がＨＬＡと関連して免疫原性である、および３）誘導された特異的Ｔ細胞が、ヒト腫瘍細胞で交差反応的である場合と一致する場合、これは、臨床的ワクチンの試験の開始の準備的である重要な予備的データを構成する。
【０１６６】
示差的発現した遺伝子産物が免疫原性であるか否かを決定するために、３つの（ＨＬＡ−Ａ２．１  ×  ｈｕＣＤ８）Ｆ1トランスジェニックマウスの群を、５×１０8ｐｆｕの各々特異的組み換えワクシニアウイルス（ＢｅｎｎｉｎｋおよびＹｅｗｄｅｌｌ、１９９０、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３−１７８）で、静脈内に免疫化した。少なくとも２週間後、マウスを屠殺し、ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を、抗ＣＤ８でコートした磁気ビーズ上で濃縮した。ＣＤ８＋細胞溶解性前駆体を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）プラスミド発現ベクター（セクション９・３）において以前に単離した示差的発現する組換え遺伝子を用いてトランスフェクトした親ＳＶ−ＨＵＣ細胞でインビトロで再刺激する。インビトロの再刺激のためのワクシニアベクターの代わりのプラスミド組換え体での置換は、ラージワクシニアベクター特異的応答を回避するために必要である。インビトロ培養５日後、細胞溶解活性を、特異的組換えプラスミドまたはコントロール卵白アルブミン遺伝子組換え体のいずれかでトランスフェクトしたＳＶ−ＨＵＣ標的細胞からの51Ｃｒの放出により定量する。
【０１６７】
この同じ細胞溶解性アッセイを、関連するＣＴＬエピトープもまた対応するｍＲＮＡを発現するＨＬＡ適合腫瘍細胞により提示されるか否かを決定するために容易に適用し得る。Ｔ細胞が（ＨＬＡ−Ａ２．１  ×  ｈｕＣＤ８）Ｆ1トランスジェニックマウスにおいて誘導される場合、ＨＬＡ適合標的は、天然のＨＬＡ−Ａ２．１を発現するか、またはＨＬＡ−Ａ２．１を用いてトランスフェクトしたいずれかの腫瘍細胞を含む。示差的発現する遺伝子産物の免疫原性を確立し、そしてヒト腫瘍細胞との交差反応が存在するか否かを決定する。この知見は、同じｍＲＮＡが正常な組織ではなく、新鮮な患者の腫瘍の複数のサンプルにおいて発現されることの実証（セクション１１）と共に、臨床的なワクチン試験の開始の前に必要とされる。
【０１６８】
ワクチン開発のための重要な考慮は、ヒトクラスＩ  ＨＬＡの広範な多型である。上記で議論したように、魅力的なストラテジーは、４つの主要なＨＬＡサブタイプ（民族的集団を超えた広範囲を提供する、Ａ２、Ａ３、Ｂ７およびＢ４４）を標的化することである。多くのペプチドが単一のサブタイプの複数のメンバーに結合する。いくつかのＣＴＬエピトープを各々のサブタイプについて同定する場合、これは、広く効果的なワクチンの処方を非常に容易にし得る。
【０１６９】
（１３．実施例：防御免疫の誘導）
特に、低い存在量のｍＲＮＡによってコードされる、潜在的腫瘍抗原の場合においては、示差的に発現された遺伝子産物に対するＴ細胞の応答が、防御腫瘍免疫を与えるか否かを決定することが望ましい。多くの示差的に発現された遺伝子が、上記のマウス腫瘍モデルにおいて同定されているため、このような実験を、マウスにおいて行う。
【０１７０】
４つのうち３つの独立的に誘導された腫瘍が、免疫学的に交差反応性であることが、このマウス腫瘍モデルについて、以前に報告されている（Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６３０２−６３１０）。これらの腫瘍において同定された、示差的に提示されたバンドの多くは、対照的に、すべての４つの腫瘍において存在する。従って、これらのフラグメントを誘導する遺伝子が、これらの腫瘍を接種された動物においては、免疫学的に優性ではなさそうである。
【０１７１】
示差的に遺伝子を発現した組み換え体を用いた直接的な免疫化が、それにもかかわらず、防御免疫を与えることを示す場合は、これは、潜在的腫瘍抗原を用いたワクチン接種の有効性の強制的な証拠を提供する。
【０１７２】
マウス腫瘍に対して同系のＢＡＬＢ／ｃ系統の５匹のマウスの群を、全長のｃＤＮＡ（すべての４つのマウス腫瘍株において示差的に発現されるが、親のＢ／ｃ．Ｎ細胞では発現されない）についての各々のワクシニアウイルス組み換え体を用いて免疫化する（図７）。マウスの各々の群を、１×１０6ＢＣＡ３９の腫瘍細胞の腫瘍形成性接種物を用いてチャレンジすることにより、防御免疫の誘導についてのアッセイを行う（Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６３０２−６３１０）。防御免疫が相対的な量的発現に相関するか否かを決定するために、独立した遺伝子産物を試験するが、これは半定量的なＰＣＲによって決定されるように、示差的な発現の異なるレベルを表す。
【０１７３】
（１４．実施例：ワクチンの使用のためのワクシニア発現ベクターの構築および特徴付け）
本実施例は、直接連結ベクターの新規のセット（キメラのワクシニアゲノムの産生について広く適用可能であるように設計された）の構築および特徴付けを記載する。この目的は、より広く有用である直接連結ベクターを獲得するために、ｖＮｏｔＩ／ｔｋのゲノムを改変することであった。第一に、挿入部位を、チミジンキナーゼ遺伝子の最初に、２つの固有の制限酵素のための部位を置くことによって変化させた。これにより、挿入ＤＮＡの配向を固定し、そしてウイルスアームの再連結後の、夾雑する野生型ゲノムの産物を排除することが可能になる。第二に、高レベルのタンパク質を発現する直接連結ベクターを産生するために、チミジンキナーゼ遺伝子の前に、強力な構成的ワクシニアウイルスプロモーターを配置した。
【０１７４】
これらの新規の連結ベクターは、ポックスウイルスアームの再連結を排除するため、および挿入ＤＮＡの配向を、強力に発現する構成的ワクシニアプロモーターの後で固定するために、一対の固有の制限部位（ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ）を含む。挿入カセットは、組み換え体の単離において薬物選択を利用するために、ワクシニアのチミジンキナーゼ遺伝子の最初に置かれている。
【０１７５】
（１４．１．  材料および方法）
（１４．１．１．  プラスミド構築）
アニーリングすると、オリゴヌクレオチドのペアが構築され、これは、７．５ｋ遺伝子プロモーター、
【０１７６】
【化１】
0004451987.tif 000009
ならびに、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩの制限部位を含んだ。二本鎖オリゴヌクレオチドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によってアニーリングし、そして、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結し、プラスミドｐ７．５／ｔｋおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋを得た。
【０１７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ｐＢＩ２２１（β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｇｕｓＡ遺伝子を含むプラスミド）に対して、以下のプライマー
【０１７８】
【化２】
0004451987.tif 000010
を用いて行い、そして得られたフラグメントを、ｐＣＲＩＩにクローニングした（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。このプラスミドを、ＮｏｔＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４２産物）を用いて切り出し、そしてＮｏｔＩを用いて消化されたｐＪＮｏｔ／ｔｋにクローニングして、ｐＪＮｏｔ／ｔｋ−ＧＵＳを生成するか、またはＮｏｔＩおよびＡｐａＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４１産物）を用いて切り出し、そしてＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて以前に消化されたｐＥＬ／ｔｋおよびｐ７．５／ｔｋに挿入して、ｐ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｐＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成した。
【０１７９】
アニーリングすると、オリゴヌクレオチドのペアが構築され、これは、７．５ｋ遺伝子プロモーター、およびオボアルブミン（１１）に対する細胞障害性Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含んだ：
【０１８０】
【化３】
0004451987.tif 000011
二本鎖オリゴヌクレオチドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によってアニーリングし、そして、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結し、プラスミドｐ７．５／ｔｋ−ｏｖａおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋ−ｏｖａを得た。
【０１８１】
（１４．１．２．  組み換えウイルスの産生）
細胞およびウイルスを、Ｅａｒｌら（１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ）によって記載される通り、維持および操作した。組み換えウイルスを、ＣＶ−１細胞を０．０５の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして２時間後に、ＤＮＡを、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて、製造業者によって提案される通りに、感染した細胞にトランスフェクトすることによる相同組み換えを用いて作製された。７２時間後、細胞を収集し、そして単離されたプラークを、ブロモデオキシウリジンの存在下で、Ｈｕｔｋ-細胞（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、またはＨＡＴを補充された培地（Ｗｅｉｒら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：１２１０−１２１４）に継代することによって選択した。
【０１８２】
ワクシニアウイルスを、鶏痘ウイルスを用いたレスキューによりウイルスＤＮＡから産生した（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７−９９８１）。ワクシニアウイルスを、ショ糖中でのバンド形成および沈降によって、感染されたＨｅＬａ細胞から単離した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。精製されたウイルス粒子を、プロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて処理し、そして０．３Ｍ酢酸ナトリウム中の２．５容エタノールを用いた沈殿の前に、飽和フェノール緩衝液、フェノール：クロロホルム（５０：５０）緩衝液、およびクロロホルム緩衝液を用いて徐々に抽出し、そしてＴＥ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。１２ウェル皿由来のＢＳＣ−１細胞のコンフルエントなウェルを、鶏痘ウイルスを用いて感染し、そして３７℃での２時間のインキュベーションの後、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて０．６μｇの全長のワクシニアＤＮＡでトランスフェクトした（製造業者によって提案される通りに）。２４、４８および７２時間後に、細胞を収集し、３回の凍結融解サイクルによって溶解し、そしてＢＳＣ−１細胞におけるプラークアッセイによって、スクリーニングした（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ。Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１８３】
（１４．１．３．  直接連結による組み換えウイルスの産生）
１．１ｋＢのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼフラグメント（ｐＨｂｅｔａ−Ｏｖａ−ｎｅｏ由来のオボアルブミンを含む）（Ｐｕｌａｓｋｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３６６９−３６７４）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＢＳ．ｏｖａを産生した。ｐＢＳ．ｏｖａにおいて、プライマー
【０１８４】
【化４】
0004451987.tif 000012
を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）由来のＤＮＡ産物を、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて消化し、製造業者の推奨に従って、β  Ａｇａｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて低融点のアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から、ゲル精製し、そしてＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いて消化されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋にクローニングし、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａを産生した。オボアルブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いたこのプラスミドの消化により、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａから切り出し、そしてβ  Ａｇａｒａｓｅを用いた低融点アガロースゲルに通した電気泳動の後に、精製した。１μｇの精製ｖＥＬ／ｔｋ  ＤＮＡを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１００濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）に通して遠心し、小さな介在フラグメントを取り除いた。ｖＥＬ／ｔｋ  ＤＮＡアームおよびオボアルブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含有する３０μｌ中において、４：１（挿入物：ウイルス）モル比で、室温で一晩連結した。連結産物を、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１２ウェルプレート由来のコンフルエントなＢＳＣ−１細胞のウェルへ、感染から２時間後に１細胞あたり１ｐｆｕで、鶏痘ウイルスを用いてトランスフェクトした。３日後、細胞を収集し、そして単離されたプラークを、ブロモデオキシウリジンの存在下で、Ｈｕｔｋ−細胞に継代することによって選択した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１８５】
（１４．１．４．  ウイルスＤＮＡゲノムの分析）
ＢＳＣ−１細胞を、高感染多重度（ｍｏｉ）で、ワクシニアＷＲ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＮｏｔＩ／ｔｋによって感染した。２４時間後、細胞を収集し、そしてＣｅｌｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｇ  Ｋｉｔ）に、１ｍｌあたり１×１０7個の細胞の割合で、再懸濁した。５０℃で予めインキュベートした等量の２％ＣｌｅａｎＣｕｔアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、そして細胞懸濁液を１００μｌのプラグへ形成した。４℃で硬化した後、タンパク質を消化するために、以前に記載した通りにプラグを処理した（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９８９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１５９５−１６０３）。電気泳動の前に、プラグを適切な制限酵素緩衝液および１ｍＭ  ＰＭＳＦ中で、室温で１６時間平衡化し、制限酵素緩衝液、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび５０ユニットのＮｏｔＩまたはＡｐａＩとともに、３７℃（ＮｏｔＩ）または室温（ＡｐａＩ）で２時間インキュベートした。
【０１８６】
ＢＳＣ−１の６ウェル皿の１つのウェルを、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔｋを用いて、高感染多重度（ｍｏｉ）で感染し、そして４８時間後に細胞を収集し、低速遠心によりペレット化し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてリンスし、そしてＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて単離した。最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そして２．５μｌを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ、または、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、１．０％アガロースゲルに通して電気泳動し、そしてＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いてＮｙｔｒａｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）へ転写した。サンプルを、ｐ７．５／ｔｋ（図１１ａ）またはｐＥＬ／ｔｋ（図１１ｂ）を用いてプローブし、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ＱｕｉｃｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で32Ｐで標識化し、そしてＫｏｄａｋ  ＸＡＲフィルム上で可視化した。
【０１８７】
ＢＳＣ−１細胞の６ウェル皿の１つのウェルを、ｖ７．５／ｔｋ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖｐＮｏｔＩ、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋまたは野生型ワクシニアＷＲを用いて、高感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時間後に細胞を収集し、低速遠心によりペレット化し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてリンスし、そしてＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて単離した。最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そしてプライマー
【０１８８】
【化５】
0004451987.tif 000013
を用いて、ＰＣＲ（３０サイクル、１分間９４℃、２分間５５℃、３分間７２℃、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−１００）に用いた。ヌクレオチド配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、35Ｓ配列決定により決定し、そして８％変性ポリアクリルアミドゲルに通した電気泳動後、Ｂｉｏ−Ｍａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ）への露光により、可視化した。
【０１８９】
（１４．１．５．  β−グルクロニダーゼ活性の測定）
１２ウェルプレート由来のＢＳＣ−１細胞のウェルを、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを用いて、１のｍｏｉで感染し、感染から２０時間後に細胞を収集し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして３サイクルの凍結融解により破砕した。抽出物を、ショートマイクロフュージスピン（ｓｈｏｒｔ  ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ｓｐｉｎ）（１分間、１４，０００ｒｐｍ）により清澄化し、そして上清を、Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載される通り、９６ウェルプレートに適合させるようにβ−ｇｌｕユニットについて分析した。Ａ405値をマイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ３０００）上で測定し、そしてβ−ｇｌｕ活性を、同じアッセイにおいて分析されたβ−ｇｌｕ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）標準との比較により測定した。
【０１９０】
（１４．１．６．  細胞障害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）Ｔ細胞応答の分析）
６ウェルプレートのウェル中におけるＭＣ５７Ｇ細胞のコンフルエントな単層を、１のｍｏｉで、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋ−ｏｖａ、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａ、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬクローン１およびｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬクローン２（ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬは、直接連結によって生成された全長オボアルブミンのウイルスクローンである）を用いて感染した。感染から１６時間後、細胞を収集し、１００μＣｉの51Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて、３７℃で１時間標識し、そして１０4個の細胞を４つ組の９６ウェルの丸底プレートのウェルに添加した。１μＭの精製ｏｖａ２５７−２６４ペプチドを用いてインキュベートした非感染ＭＣ５７Ｇ細胞のサンプルもまた、ポジティブコントロールとして51Ｃｒとともにインキュベートし、そしてネガティブコントロールとして非処理ＭＣ５７Ｇ細胞を用いた。ｏｖａ２５７−２６４に対して特異的なＴ細胞を、２：１および１０：１の割合で、標的細胞に添加した。細胞を、３７℃で４時間インキュベートし、上清を収集し、そして51Ｃｒ放出を測定した。自発的な放出は、培地のみとの標的細胞のインキュベートにより誘導され、そして最高の放出は、５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００との標的細胞のインキュベートにより測定した。特異的な溶解の割合は、式：％特異的溶解＝（（実験的放出−自発的放出）／（最高放出−自発的放出））×１００を用いて算出した。各々の場合において、４つ組ウェルの平均を、上記の式において用いた。
【０１９１】
（１４．２．  結果）
（１４．２．１．  直接連結ベクターの構築）
ワクシニアＷＲゲノムは、長さが約１９０キロベースであり、そしてＡ残基およびＴ残基に富む。ワクシニアＷＲゲノムの完全な配列は、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＰ．Ｅａｒｌによって提供された。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ）を用いたワクシニアＷＲゲノムの完全な配列の制限酵素検索は、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＦｓｅＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｆｉＩ、ＳｒｆＩおよびＳｇｆＩについての制限部位の欠如を明らかにした。酵素の高度に活性かつ純粋な調製ならびに消化における付着末端の産生の容易な有用性のおかげで、ｖＮｏｔ／ｔｋ中にすでに存在するＮｏｔＩ部位と組み合わせて、第２の部位としてＡｐａＩを用いることを選択した。
【０１９２】
ワクシニアウイルスを基にした発現ベクターは、外来タンパク質を構成的に発現する場合に、最も有用である。ウイルス複製の初期の間の外来タンパク質の発現は、細胞障害性Ｔ細胞応答に不可欠であり（Ｂｅｎｎｉｃｋら、１９９０、Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３−１８４）、そして高レベルの総タンパク質発現が、ウイルス複製の後期の間に活性なプロモーターを用いて観察されている。本発明者らは、構成的に発現された７．５ｋ遺伝子に対応するプロモーター（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４９：８５７−８６４）、および構成的に発現された合成プロモーターＥＬ（高レベルの発現で際立つ）を組み込むことを決定した。
【０１９３】
任意の新規なベクターにおいて保持されねばならないｖＮｏｔＩ／ｔｋの有用な特徴は、活性チミジンキナーゼ遺伝子に対する選択を用いた、組み換えウイルスゲノムについて識別する能力である。ｔｋ遺伝子についてのコード配列内へのＡｐａＩ部位の導入は、制限酵素部位を適応させるために、アミノ酸の総数における増加を必要とする。種々の動物およびウイルス種由来のチミジンキナーゼ遺伝子についてのアミノ酸配列の比較は、最大の不均質な領域が、タンパク質のＮ末端であったことを示し、タンパク質のこの領域が、アミノ酸の数におけるあまり多くない増加を許容し得たことを示唆した。
【０１９４】
組み換え非依存性クローニングベクターを、改変チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含むプラスミド中間体の作製、およびｖＮｏｔＩ／ｔｋゲノムにおけるｔｋ配列の相同組み換えによる置換によって、構築した。アニーリングすると、２つのセットのオリゴヌクレオチドペアが構築され、これは、７．５ｋ遺伝子についてのプロモーターまたは合成ＥＬ配列、ならびにＮｏｔＩおよびＡｐａＩについての制限部位を含んだ。改変チミジンキナーゼ遺伝子を、二本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリング、およびｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ（ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメントを含むプラスミド）におけるチミジンキナーゼ遺伝子の最初に存在するＮｏｔＩ部位への産物の連結によって構築した。オリゴヌクレオチドペアは、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋにおけるＮｏｔＩ部位へ連結され、そしてこの部位を排除して、新規のＮｏｔＩ部位、近接して続くプロモーターの後のＡｐａＩ部位を産生し、そしてチミジンキナーゼ遺伝子における最初のメチオニンをコードするヌクレオチドに隣接させ、プラスミドｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋとを得る（図１）。ＡｐａＩ部位の獲得を、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認し、そしてチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を決定し、そして図１に示される通りに見出した。
【０１９５】
ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋに由来する組み換えウイルスは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）の存在下におけるポジティブ薬物選択に頼る戦略を用いて、単離された（Ｗｅｉｒら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１２１０−１２１４）。ウイルスｖｐＮｏｔＩ、すなわちｖＮｏｔＩ／ｔｋのＮｏｔＩ部位で挿入されたｐＢＲ３２２のコピーを含むウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６）、およびｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋ、すなわちｖＮｏｔＩ-におけるチミジンキナーゼを遮断するｌａｃＺ遺伝子のコピーを有するウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２−５２６）は、ｔｋ遺伝子の最初の挿入ＤＮＡ以外はｖＮｏｔＩ／ｔｋと同一な、チミジンキナーゼネガティブ（ｔｋ-）ウイルスである。プラスミドｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋは、ＣＶ−１細胞におけるｖｐＮｏｔＩおよびｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋヘルパーウイルスと組み換わり、そして感染された単層を収集およびＨｕｔｋ-細胞に対してＨＡＴ培地の存在下で継代した。個々のプラークを、増大および分析の前に、Ｈｕｔｋ-細胞に対して、さらに３回継代および単離した。
【０１９６】
（１４．２．２．  ウイルスゲノムの構造の分析）
ＨＡＴを補充された培地におけるｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋウイルスの増殖は、ｖｐＮｏｔおよびｖＮｏｔ／ｌａｃＺ／ｔｋと対照的に、これらのウイルスが、活性チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含むことを暗示する。しかし、活性ｔｋ遺伝子は、７．５ｋまたはＥＬプロモーター配列を欠失する多種多様な交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）から生じ得、正常なｔｋプロモーターを有するウイルスを産生した。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメント内に、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩの両方についての固有の部位を含むはずである。単離されたウイルスストックのゲノム構造を、ＮｏｔＩまたはＡｐａＩを用いた、ウイルス感染細胞由来のアガロースプラグにおけるＤＮＡの制限酵素消化、および１％アガロースに通した産物の電気泳動によって分析した（図１０）。非切断ワクシニアＷＲ（レーン２）は、バクテリオファージλ（レーン１）のマルチマーと比較したときに、１９０キロ塩基対のサイズで移動する。ＮｏｔＩを用いた消化の後に、ワクシニアＷＲを、長さが約１５０および４０キロ塩基対の２つのフラグメントに切断し（左から７番目のレーン）、一方、ｖＮｏｔ／ｔｋ、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７．５／ｔｋを、約１１０および８０キロ塩基対のフラグメントに切断した。同じサンプルがＡｐａＩを用いて消化された場合、非切断ゲノムのサイズの、１つのフラグメントのみが、ワクシニアＷＲおよびｖＮｏｔ／ｔｋの両方において観察され、一方、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７．５／ｔｋは、ＮｏｔＩを用いた消化の後に観察された同じサイズのフラグメントを与えた。従って、ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋの両方は、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩの両方に固有の部位を含み、これらの部位はｖＮｏｔ／ｔｋにおけるＮｏｔＩ部位と同じ位置であり、そしてこれらの部位は、ワクシニアＷＲにおけるＮｏｔＩ部位を含むＨｉｎｄＩＩＩ  Ｆフラグメントよりもゲノムの中心的位置にある。細胞ＤＮＡフラグメントのバックグラウンドは、６塩基対認識部位を有するＡｐａＩ消化において、ＮｏｔＩ消化についてよりも顕著である。
【０１９７】
ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７．５／ｔｋについてのゲノムを、図１１に示すように、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＪフラグメントにおけるＡｐａＩおよびＮｏｔＩ部位の位置を確認するために、サザンブロッティングによって分析した。フィルターを、ｐ７．５／ｔｋまたはｐＥＬ／ｔｋ由来の32Ｐ標識されたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメントにハイブリダイズした。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについてのゲノムは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋにおいて現れないＡｐａＩ部位を有し（各々のブロットにおけるレーン７および８を、レーン５と比較のこと）、一方、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化は、等しいサイズのフラグメントのセットを生じる。ＮｏｔＩまたはＡｐａＩ消化から生じたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左手側由来の０．５キロベースのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩフラグメントは、アガロースゲルの下部から離れて電気泳動している。
【０１９８】
プロモーター配列の完全な特徴づけは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物を利用した。ｔｋ遺伝子の最初に隣接する一対のプライマーを、図１２に示すように、ウイルス（ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔｋ）およびそれらの同属プラスミド由来のＤＮＡフラグメントを産生するために用いた。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについてのＰＣＲ産物は、ウイルス（ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋ）を産生するために用いたプラスミドについて観察された産物と同じサイズであり、そしてワクシニアＷＲおよびｖＮｏｔＩ／ｔｋについて見られた産物より大きい。ＰＣＲフラグメントは、プラスミドｐＣＲＩＩにクローニングされ、ヌクレオチド配列が決定され、そして図１に示される配列に一致することが示された。
【０１９９】
（１４．２．３．プロモーター活性の定量）
ｖ７．５／ｔｋベクターおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋに比べて、上昇したレベルの挿入タンパク質を構成的に発現するように設計された。感染効率５でのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下および非存在下でのコンフルエントなＢＳＣ−１細胞への感染、この細胞の収集、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるＲＮＡの単離、およびプライマー伸張によるチミジンキナーゼＲＮＡ合成のレベルの分析により、ＲＮＡ合成のレベルを測定した（Ｗｅｉｒら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０２６７〜１０２８２）。ＡｒａＣを用いたインキュベーションは、ウイルスＤＮＡ複製をブロックし、ウイルスプロモーターのクラスを同定することを可能にする。
【０２００】
ウイルスプロモーターの初期のクラスは、ＤＮＡ複製の前に活性であり、そして感染においてＡｒａＣにより影響されない。後期プロモーターは、ＤＮＡ複製の発生後のみに発現されそしてそれらの活性はＡｒａＣの存在下で抑止される。変性ポリアクリルアミドゲル上での産物の精査により、ｖＮｏｔ／ｔｋに比較して、有意により多い（少なくとも１０倍と見積もられた）ｔｋＲＮＡプライマー伸展産物が、ｖＥＬ／ｔｋ感染により合成されたことが実証された。ｖＮｏｔ／ｔｋで感染した細胞において、ＡｒａＣインキュベーションに対して非感受性の単一のＲＮＡ開始部位が観察され、一方、ｖＥＬ／ｔｋ感染においては、２つの異なる開始部位（１つはＡｒａＣに対して耐性でかつ適切な初期開始部位に対応し（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７４９〜７６９）、そして１つの種はＡｒａＣに感受性でかつＲＮＡの適切な後期開始に対応する（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７７１〜７８４））が観察された（データ示さず）。ｖ７．５／ｔｋでの感染から誘導されたＲＮＡ種のパターンは、絶対的レベルのＲＮＡ発現を有するｖＥＬ／ｔｋについて観察されたパターンと類似であり、このｖＥＬ／ｔｋについて観察されたパターンは、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖＮｏｔ／ｔｋについて観察されたパターンに対して中間であった。
【０２０１】
ウイルスベクターに挿入された遺伝子の発現のレベルを確認するために、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｇｕｓＡ遺伝子をｖＮｏｔＩ／ｔｋウイルスベクター、ｖ７．５／ｔｋウイルスベクターおよびｖＥＬ／ｔｋウイルスベクター中にクローニングし、そして相対的なプロモーター強度を測定した。β−ｇｌｕ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＪＮｏｔ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｐ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｐＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成する各プロモーターを含むプラスミド中に挿入した。ｐＪＮｏｔ／ｔｋ中のインサートβ−ｇｌｕ遺伝子の正しい方向を、制限酵素分析により確認した。このプラスミドをｖＮｏｔＩ／ｔｋで組換え、そしてこの組換えウイルスをＸ−ｇｌｕでの染色により同定し（Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９５、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：３５２〜３５５）、Ｈｕｔｋ-細胞を通じて３回継代し、そしてウイルスストックであるｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成するために増殖させた。この組換えウイルスの構造をサザンブロット分析により確認した。
【０２０２】
ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳによるβ−ｇｌｕの発現のレベルを、ＡｒａＣの存在下または非存在下でＢＳＣ−１細胞の感染したコンフルエント単層から測定した（図１３）。ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋについてのβ−ｇｌｕ発現のレベルは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳについて観察されたレベルよりも非常に高く、そしてｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳでは、最高であった（約２０倍高い）。β−ｇｌｕの発現をシトシンアラビノシドの存在下で３つのウイルスすべてについて観察し、このことは各プロモーターがウイルスプロモーターの初期クラスのメンバーであることを示す。ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ中のβ−ｇｌｕのレベルは、ＡｒａＣの存在下または非存在下で変化せず、このことはこのプロモーターが感染の初期の間にのみ活性であることを示す。一方、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳにおけるβ−ｇｌｕレベルは、ＡｒａＣの存在下ではより低く、このことはこれらのプロモーターが感染の初期および後期の両方の時とも活性であることを示す。
【０２０３】
（１４．２．４．ウイルスベクターの生化学的特徴付け）
ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、ＨＡＴ補充培地の存在下での増殖により最初に単離され、そしてブロモデオキシウリジンの存在下でＨｕｔｋ-細胞における継代を介してインサートを有するウイルスの選択を可能にするために活性なｔｋ遺伝子を含むように設計される（Ｅａｒｌら、１９９１、Ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。両方のベクターを、薬物選択を用いてＨｕｔｋ−細胞中でのプラークアッセイにより試験し、そしてｖＥＬ／ｔｋについてのこの結果を図１４に示す。薬物なしでのインキュベーションまたはｖｐＮｏｔまたはｖＮｏｔ／ｌａｃＺ／ｔｋについてのプラーク形成を妨害するのに十分な濃度でのＨＡＴ補充物とのインキュベーションは、（データは示さないが）等しい数の同様のサイズのプラークを生じた。驚くべきことに、等しい数のプラーク（サイズが非常により小さいにもかかわらず）が、ワクシニアＷＲがＨｕｔｋ-細胞上でプラーク形成する能力を妨害するのに十分な濃度である２５ｍＭブロモデオキシウリジン中でのインキュベーションでｖＥＬ／ｔｋについて観察された（データ示さず）。１２５ｍＭブロモデオキシウリジンの添加は、ｖＥＬ／ｔｋ（図１４）およびｖ７．５／ｔｋ（データ示さず）についてのプラーク形成を阻害するのに十分だった。より高い濃度のブロモデオキシウリジンは、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋのようなｔｋ-ウイルスの増殖を妨害しないか（データ示さず）、またはＨｕｔｋ-細胞株の生存度に影響しなかった。
【０２０４】
（１４．２．５．直接連結による組換えウイルスの構築）
直接連結ベクターは、裸のＤＮＡ由来の感染ウイルスの生成が容易でかつ効率的である場合、複合体発現ライブラリーの生成にのみ有用である。以前に、条件致死温度感受性ウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９０：５２２〜５２６）または鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９９７７〜９９８１）での同時感染により、ＤＮＡ連結産物でトランスフェクトされた細胞中にヘルパーウイルス活性が供給された。高レベルの複製している野生型ウイルスは、ウイルスＤＮＡをパッケージする能力を妨害し、そしてワクシニアウイルスは、インプット（ｉｎｐｕｔ）ＤＮＡと組換えられ得るので、条件欠損ワクシニアウイルスのみがヘルパーとして用いられ得る（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９０：５２２〜５２６）。鶏痘は、３７℃で用いられる場合に、優れたヘルパーウイルスであり、非常に複製する株に復帰せず、そしてワクシニアＤＮＡと組換えしないかまたは初代細胞株に生産的に感染しないので、ワクシニアより高い感染効率で用いられ得る。鶏痘が効率的なヘルパーウイルスとして働くか否かを決定するため、ＢＳＣ−１細胞を含有する１２ウェルプレートからの一連のウェルを異なる感染効率の鶏痘に感染させ、そして全長ワクシニアＷＲ  ＤＮＡでトランスフェクトし、この細胞を２４時間、４８時間または７２時間後に収集し、そしてこのウイルス力価を表８に示すとおり決定した。鶏痘なしのＤＮＡのトランスフェクションまたは鶏痘単独での感染は、プラークを生じなかった。レスキューされたワクシニアのレベルは、後の収集物で増加し、そして鶏痘感染の感染効率に比例した。
【０２０５】
【表８】
0004451987.tif 000014
（表８．鶏痘ウイルスによるワクシニアＤＮＡのパッケージング）
第１４．１節（材料および方法）に記載のように、リポフェクタミンを用いて、鶏痘ウイルスに感染したＢＳＣ−１細胞にワクシニアＤＮＡをトランスフェクトした。この細胞をトランスフェクション後、１、２、または３日目に収集し、凍結融解サイクルにより溶解し、そしてＢＳＣ−１細胞上でのプラークアッセイにより感染ウイルスについてアッセイした。
【０２０６】
オボアルブミンｃＤＮＡの１．１キロベース対フラグメント（Ｐｕｌａｓｋｉら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３６６９〜３６７４）をモデルインサート（挿入物）として用いて、直接連結により機能的組換えウイルスの生成を研究した。このオボアルブミンインサートを「材料および方法」に記載のとおり、その５’末端にＮｏｔＩ部位を、その３’末端に翻訳終止コドン、ワクシニア転写終止シグナルおよびＡｐａＩ部位を含むように改変した。このインサートは、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化され、そしてＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化されていた精製されたｖＥＬ／ｔｋ  ＤＮＡアームと連結された。この連結混合物を、鶏痘が感染したＢＳＣ−１細胞にトランスフェクトし、細胞を収集し、そして３日後、この細胞抽出物を１２５ｍＭのブロモデオキシウリジンの存在下または非存在下でＨｕｔｋ-細胞に継代した。薬物選択なしで得た力価は、２．７×１０3ｐｆｕであり、そして薬物選択で得た力価は、２．８×１０4ｐｆｕであった。個々のプラークをブロモデオキシウリジンの存在下または非存在下でＨｕｔｋ-細胞から拾い上げ、そしてオボアルブミンｃＤＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションによりオボアルブミンインサートの存在について試験した。ブロモデオキシウリジンの存在下で拾い上げた１５の全てのプラーク、およびブロモデオキシウリジンの非存在下で拾い上げた１０の全てのプラークはオボアルブミンインサートを含んだ。これらのウイルスをｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬと名付けた。２つの個々のクローンをさらに増殖させ、そしてｏｖａ２５７〜２６４特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による溶解に対して宿主細胞を感作させる能力について試験した。この実験の結果を表９に示す。コントロールとして、ｏｖａ  ２５７〜２６４ミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、ｖ７．５／ｔｋ−ｏｖａおよびｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａについてのワクシニア組換え体を相同組換えにより生成した。これらのｏｖａペプチド組換えウイルスを、ｏｖａ特異的ＣＴＬによる溶解に対する宿主細胞を感作させる能力について、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬクローンと呼応して試験した。表９に示すとおり、全長またはミニ遺伝子のオボアルブミンワクシニア組換え体のいずれかでの感染は、ＯＶＡ−特異的ＣＴＬによる溶解に対する標的細胞の感作のための１μＭの精製されたＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドでのパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）と同じく効率的であった。
【０２０７】
【表９】
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（表９．組換えワクシニアウイルス感染細胞上でのＣＭＬアッセイ）ウイルス感染したＭＣ５７Ｇ細胞を第１４．１節（材料および方法）に記載のとおり生成した。ＭＣ５７Ｇ細胞の１つのサンプルをｏｖａ２５７〜２６４ペプチド（１μＭ）で処理し、細胞の別のサンプルを未処理のまま残した。２つの異なる比のｏｖａ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球とともに細胞を３７℃で４時間インキュベートし、そして特異的溶解パーセントを第１４．１節（材料および方法）に記載のとおり決定した。
【０２０８】
（１４．３．考察）
大きいＤＮＡウイルスは、細胞プロセスの研究のために、特に有用な発現ベクターである。なぜなら、それらは種々の細胞株においてそれらのネイティブな形態で多くの異なるタンパク質を発現し得るからである。さらに、組換えワクシニアウイルスにおいて発現される遺伝子産物は、効率的に処理され、そして細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するためＭＨＣクラスＩと結合して提示されることが示されている。目的の遺伝子は、通常、このウイルス中の非必須領域に相同である配列に隣接するプロモーターの制御下のプラスミドにクローニングされ、そしてこのカセットは相同組換えを介してゲノムに導入されている。発現、選択および検出のための一式のベクターが、種々のクローニングおよび発現ストラテジーを適応するために考案されている。しかし、相同組換えは、複合体ライブラリーの生成を必要とする状況で、またはインサートＤＮＡが大きい場合に組換えウイルスを作製する非効率的な手段である。インサートへのウイルスＤＮＡ「アーム（ａｒｍ）」の直接連結および引き続く感染ウイルスのレスキューに依る組換えゲノムの構築のための代替ストラテジーは、ポックスウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２〜５２６；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２９５７〜２９６２；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７〜９９８１）、ヘルペスウイルス（Ｒｉｘｏｎら、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：２９３１〜２９３９）およびバキュロウイルス（Ｅｒｎｓｔら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：２８５５〜２８５６）のゲノムについて研究されてきた。
【０２０９】
ポックスウイルスは、真核生物細胞における研究のための遍在性のベクターである。なぜならそれらは、容易に構築され、そして高レベルの外来性タンパク質を発現するように操作されるからである。このウイルスの広範な宿主範囲は、種々の細胞型においてタンパク質を忠実に発現することを可能にする。直接クローニングストラテジーは、ポックスウイルスのウイルスキメラについての適用の範囲を広げるために考案されてきた。ここでは、組換えゲノムがワクシニア「アーム」へのＤＮＡフラグメントの直接連結、およびヘルペスウイルスで感染された細胞へのＤＮＡ混合物のトランスフェクションによりインビトロで構築される（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２〜５２６；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９９７７〜９９８１）。このアプローチは、外来タンパク質の高レベル発現（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２９５７〜２９６２）のために、および２６キロベース長程度のの大きさのフラグメントを効率的にクローニングする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２〜５２６）ために用いられてきた。
【０２１０】
ワクシニアウイルスＤＮＡは、ウイルスとしては感染性ではない。なぜならこのウイルスは、細胞性転写機構を利用し得ず、そしてウイルスＲＮＡの合成のためにそれ自体のタンパク質に依存するからである。以前、温度感受性条件致死（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２〜５２６）または非相同ポックスウイルス鶏痘（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８９：９９７７〜９９８１）は、パッケージングのためのヘルパーウイルスとして利用されてきた。理想的なヘルパーウイルスは、効率的に感染性ウイルスを生成するが、宿主細胞中では複製しないか、またはワクシニアＤＮＡ産物を組換えない。鶏痘ウイルスは、３７℃で用いられる場合、理想的なヘルパーウイルスの特性を有し、高度に複製する株には復帰せず、そしてワクシニアＤＮＡと組換えしないかまたは初代細胞株に生産的に感染しないので、ワクシニアよりも相対的に高い感染効率で用いられ得る。
【０２１１】
ワクシニアに基づく直接連結ベクターｖＮｏｔＩ／ｔｋの有用性は、Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら（１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０：５２２〜５２６）により記載されている。このゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｆフラグメントにおいて通常に存在するＮｏｔＩ部位を欠失し、そしてこのコード配列とインフレームにおけるチミジンキナーゼ遺伝子の開始において特有のＮｏｔＩ部位を含む。これは、ＮｏｔＩ部位へのＤＮＡフラグメントの挿入および薬物選択による組換えゲノムの同定を可能にする。このｖＮｏｔＩ／ｔｋベクターを用いて、大きいＤＮＡフラグメントを効率的にクローニングし得るが、これはＤＮＡインサートの方向を固定しないか、または外来タンパク質の高い発現を導かない。本実施例は、直接連結に適切な１対のワクシニアＤＮＡベクターゲノムｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋの構築および特徴付けを記載する。このｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターを、チミジンキナーゼの開始部位にＮｏｔＩおよびＡｐａＩについて特有の制限部位を含むように設計した。これにより、ＤＮＡを方向付けてクローニングすること、およびワクシニアベクターアームの追放から生じるインタクトなゲノムを排除することが可能になる。
【０２１２】
ｖＮｏｔＩ／ｔｋベクターは、チミジンキナーゼ遺伝子（ウイルス感染の早期の間にのみ作られる弱く発現された遺伝子）のレベルで外来タンパク質のみを発現する。高いレベルのタンパク質発現を誘導するため、ウイルス７．５ｋプロモーターおよび合成ＥＬプロモーター（ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉおよびＭｏｓｓにより考案された）をコードする配列を用いて、内因性チミジンキナーゼプロモーターを置き換えた。いずれかのプロモーターにより誘導された発現のレベルは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋで観察されたレベルよりも非常に高く、そしてこのプロモーターは感染後、全ての時点で活性であった。これらの持続発現ベクターは、初期発現（例えば、Ｔ細胞エピトープ提示）に依存する場合に、およびタンパク質のバルク発現のために適用可能である。
【０２１３】
外来ＤＮＡのための挿入部位としてのチミジンキナーゼ遺伝子の使用により、ヘルパーまたは野生型のゲノムから組換え体を識別するための選択プロトコールの実行が可能になる。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ発現のレベルは、ワクシニアＷＲまたはｖＮｏｔ／ｔｋにおいてよりも非常に高いはずである。しかし、ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ遺伝子の開始におけるＡｐａＩ部位は、ＮｏｔＩ部位に余分なヌクレオチドを付加することによりｖＮｏｔ／ｔｋから形成された。さらなるヌクレオチドは、ｖ７．５／ｔｋ（配列番号２、アミノ酸１〜７）およびｖＥＬ／ｔｋ（配列番号４、アミノ酸１〜７）においてＭｅｔ−Ａｓｎ−ＧｌｙからＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙに、野生型ｔｋ遺伝子のＮ末端でアミノ酸配列を増加させる。チミジンキナーゼ遺伝子の発現レベルおよびＮ末端アミノ酸配列における改変は、ブロモデオキシウリジンに対するウイルスの感受性を増加し得る（タンパク質増）か、または低下させ得る（異なる配列）。プラークが、より小さいにもかかわらず、野生型ワクシニアＷＲについてのプラーク形成を完全に抑制するのに十分なブロモデオキシウリジンの濃度でのｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋ感染において、観察された。プラーク形成は、細胞の生存度を妨害しないか、またはｔｋ-ウイルスがプラークを形成する能力を妨げない薬物レベルである５倍高い濃度のブロモデオキシウリジンで抑制された。ブロモデオキシウリジンに対する変更された感受性についての説明には、タンパク質のさらなる特徴付けが待たれる。なぜなら、変更されたチミジンキナーゼ遺伝子は、ブロモデオキシウリジンのトリホスフェート形態の形成に対する異なる反応速度、またはブロモデオキシウリジンを結合する能力の低下を有し得る。
【０２１４】
直接連結ベクターの開発は、ポックスウイルス発現ベクターについての可能性のある適用を増加させた。このｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、方向付けされたクローニング、外来タンパク質の高レベルの発現、および組換えウイルスの選択の利点を、直接連結ベクターに組み込むように設計された。それらは、感染中、全ての時点で高レベルのタンパク質を発現することが示された。これらのベクターの有用性は、オボアルブミンのＣＴＬエピトープを含有する組換え体（プラスミドでの相同組換えにより構築された）またはオボアルブミンコード配列を含有する組換え体（直接連結プロトコールにより構築された）、を構築することにより実証され、そしてこれは両方の組換え体が、どのように強力なＣＴＬ応答を誘発し得たのかを示す。
【０２１５】
複合体発現ライブラリーの構築のためのプロトコールへのこれらのベクターの適用は、野生型および混入物を排除または最小化するために、組換え体の効率的な産生および強力な選択を必要とする。２つの制限部位の使用は、ＤＮＡフラグメント（例えば、ＰＣＲの産物）の方向づけられたクローニングのためのクローニングストラテジーを設計すること（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２９５７〜２９６２）、および所望の組換え体の頻度を増加させることを可能にする。なぜなら、野生型ゲノムは、ワクシニアのアームの連結によっては、もはや生成され得ないからである。予めＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化されたｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔｋのＤＮＡが、鶏痘に感染した細胞へトランスフェクトされた場合、このウイルス力価は、インタクトな非切断ＤＮＡについてよりも１００分の１未満であった。また、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬの単離の間、ブロモデオキシウリジンの存在および非存在下（１５は、ブロモデオキシウリジンを有し、そして１０はブロモデオキシウリジンなし）において単離された全てのプラークは、オボアルブミンインサートを含んだ。感染性ウイルス形成の効率はまた、相対的に高い感染効率で、ヘルパーウイルスである鶏痘の使用で上昇される。また、大きいＤＮＡフラグメントのトランスフェクションは、脂質の型および調製物で変動し（Ｍｉｌｅｓ  Ｃａｒｒｏｌｌ、私信）、そして本発明者らは、現在、直接連結プロトコールのための最適条件を見出すため、異なる脂質混合物および細胞型をアッセイし、そして他のパラメーターを研究している。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、ポックスウイルスについての、１セットの普遍的に適用可能な直接連結クローニングベクターを提供する。
【０２１６】
本発明は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図される、記載された特定の実施形態により、範囲内に限定されるとべきでなく、そして機能的に等価である、任意の構築物、ウイルスまたは酵素は、本発明の範囲内である。実際、本明細書において示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の記載および添付の図面から当業者に明白となる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内におさまることが意図される。
【０２１７】
本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度まで参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ７．５／ｔｋ（配列番号１）およびｐＥＬ／ｔｋ（配列番号３）のヌクレオチド配列。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについてのプロモーターおよびチミジンキナーゼ遺伝子の開始部のヌクレオチド配列。
【図２】ｐ７．５／ｔｋ（配列番号５）ワクシニア移入プラスミドのヌクレオチド配列における改変。４つの新規なベクター、ｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ（配列番号６）、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ（配列番号７）、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ（配列番号８）、およびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋ（配列番号９）は、本文中に記載されるように、ｐ７．５／ｔｋワクシニア移入プラスミドから誘導された。各ベクターは、ＤＮＡインサートをクローニングするための、独特なＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌＩ部位を含み、これは、それらの内因性の翻訳開始部位を利用するか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、または３つの可能なリーディングフレームのいずれか１つにおけるベクター翻訳開始部位を利用するか（ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ）のいずれかである。
【図３】  提示的示差分析のＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ  ＳＥＬＥＣＴTM法の概略図である。製造者によって提供される情報から改変した。
【図４】  Ｂ／ｃ．Ｎ親の配列のＲＤＡ差引き後にＰＣＲによって増幅したＢＣＡ３９腫瘍ＤＮＡフラグメント。ＢＣＡ３９腫瘍細胞ｃＤＮＡに連結されたＲＤＡアダプターに組み込まれたネステッドプライマーを、ＲＤＡから回収されたＤＮＡフラグメントの連続的なＰＣＲ増幅のため用いた。バンドを、２％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲルで分離した。１つのさらなる低分子量のバンドが、図示したゲルから流出し、そしてより短い電気泳動から回収された。
【図５】  （Ａ）ＩＡＰ  ｐｏｌ遺伝子のＲＤＡフラグメント、または（Ｂ）遍在的に発現されるマウスＧ３ＰＤＨ  ｃＤＮＡのフラグメントの、ＢＣＡ３９腫瘍ＲＮＡのノーザンブロットへのハイブリダイゼーションを示す。総ＲＮＡの１５マイクログラムを、１０×ＳＳＣ中でキャピラリーブロットによって、１％アルカリアガロースゲルからＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎナイロンメンブレンに転写した。ノーザンブロットは、最初に32Ｐ標識したＲＤＡクローン１ＤＮＡ（１０5ｃｐｍ／ｍｌ  Ｓｔａｒｋ’ｓハイブリダイゼーション緩衝液）にハイブリダイズさせ、次いでストリッピングし、そしてＧ３ＰＤＨ  ｃＤＮＡの３５０ｂｐフラグメントを用いてハイブリダイズを行った。
【図６】  全長ＩＡＰクローンＭＩＡ１４と比較した、ＩＡＰ遺伝子エレメントのフラグメントをコードするＲＤＡクローンを示す。各ＲＤＡクローンの末端領域（黒長方形の枠）のうちの一方または両方を配列決定し、ＩＡＰエレメントのサブ領域に対する相同性を同定した。重複の程度は、フラグメントサイズ、または、フラグメントの両方の末端の配列が決定された場所、そのフラグメントの２つの末端にわたる既知のＩＡＰ  ＭＩＡ１４配列のいずれかから推定された。１つの場合（クローン２．１９）において、２つの測定値は一致しなかった。このことは、ＢＣＡ３９腫瘍細胞中のこのＩＡＰフラグメントにおける欠失を示唆する。
【図７】
親の細胞Ｂ／ｃ．Ｎならびに腫瘍ＢＣＡ３９、ＢＣＡ３４、ＢＣＡ２２、およびＢＣＢ１３のｃＤＮＡの改変されたディファレンシャルディスプレイ。親の細胞および腫瘍細胞のｃＤＮＡのフラグメントを、一対の任意のデカマー、ＭＲ＿１（ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  Ｇ）（配列番号１１）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  Ｃ）（配列番号１３）を用いて増幅した。各細胞株について、第１の鎖のｃＤＮＡ合成を、ＭＲ−１またはＭＲ＿５を用いて別々にプライムした。次いで、２つのｃＤＮＡ調製物を、ＭＲ＿１とＭＲ＿５との両方を用いるＰＣＲ増幅についてプールした。４つすべての腫瘍と結合するが、不死化された、非腫瘍形成性の親の細胞株には結合しない、多くのバンドが同定され得る。
【図８】  ディファレンシャルディスプレイクローン９０の腫瘍株における示差的発現。ＲＮａｓｅ保護アッセイ：３００ピコグラムのクローン９０アンチセンスプローブを、ＲＮａｓｅ消化および５％変性ＰＡＧＥでの保護されたフラグメントの分析の前に、５マイクログラムの総ＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【図９】  溶液中での遺伝子の単離。ファージミドライブラリーからレスキューされた単鎖環からのより長いｃＤＮＡの選択のための方法の概略図。ＲＤＡまたは改変されたディファレンシャルディスプレイを通して同定されたＤＮＡフラグメントを用いて、より全長に近いｃＤＮＡを選択する。
【図１０】  ＣＨＥＦゲルを使用する、ウイルスゲノムの制限酵素分析を示す。ＢＳＣ−１細胞を、ワクシニアＷＲ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋ、またはｖＮｏｔＩ／ｔｋによって、高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。２４時間後、細胞を収集し、そしてアガロースプラグ（ｐｌｕｇ）を形成した。このプラグは、適切な制限酵素緩衝液および１ｍＭ  ＰＭＳＦ中で、室温で１６時間平衡化され、制限酵素緩衝液、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および５０単位のＮｏｔＩまたはＡｐａＩとともに３７℃（ＮｏｔＩ）または室温（ＡｐａＩ）で２時間インキュベートし、そして１．０％アガロースゲル中で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＨＥＦＩＩ装置上で、１５時間、６Ｖ／ｃｍで、切り換え時間１５秒間で電気泳動した。最も左のサンプルは、λＤＮＡを含み、第２のサンプルは、未消化のワクシニアＤＮＡを含み、そして残りのサンプルは、各ウェルに、ＡｐａＩまたはＮｏｔＩで消化した上記のＤＮＡサンプルを含み、ここで、ｖＥＬとは、ｖＥＬ／ｔｋのことをいい、そしてｖ７．５とは、ｖ７．５／ｔｋのことをいう。この図の下の部分は、各ウイルスでのＮｏｔＩ部位およびＡｐａＩ部位の位置を示す概略マップである。
【図１１】  ウイルスゲノムｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋのサザンブロット分析。ウイルスｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋを使用して、ＢＳＣ−１細胞の６ウェルディッシュのウェルに高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時間後、細胞を収集し、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＤＮＡを単離した。最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ  ８．０に再懸濁し、そして２．５μｌをＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、１．０％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）を使用して、Ｎｙｔｒａｎ（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に転写した。サンプルを、ＱｕｉｃｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でランダムプライマーＤＮＡ標識キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して32Ｐを用いて標識したｐ７．５／ｔｋ（図１１ａ）またはｐＥＬ／ｔｋ（図１１ｂ）を用いて探索した。この図の下の部分は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＡｐａＩ部位の位置を図示した、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊフラグメントのマップを示す。最も左の０．５キロベースフラグメントは、ゲルの底から電気泳動で流出した。
【図１２】  ＰＣＲによるｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋの分析を示す。ｖ７．５／ｔｋ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖｐＮｏｔＩ、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋ、または野生型ワクシニアＷＲを用いて、ＢＳＣ−１細胞の６ウェルディッシュの１つのウェルに高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時間後、細胞を収集し、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＤＮＡを単離した。最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そしてプライマーＭＭ４０７およびＭＭ４０８を用いるＰＣＲで使用した。これらのプライマーは、ワクシニアＷＲ中で５１８ヌクレオチド離れており、そしてチミジンキナーゼ遺伝子のＮ末端を含むフラグメントを産生する。生成物を、２％アガロースゲルを通して電気泳動した。最も左のサンプルは、ｐｈｉＸ  １７４  ＨａｅＩＩＩ消化産物を含む；他のすべては、ウェルの上に示すＤＮＡサンプルを用いて、プライマーＭＭ４０７およびＭＭ４０８を使用したＰＣＲ産物を含む。
【図１３】  組換えウイルスのプロモーター強度。β−ｇｌｕ活性の単位は、９６ウェルプレートについて適合されるように、Ｍｉｌｌｅｒ（１０）によって記載されるように決定された。Ａ405の値は、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ３０００）で決定され、そしてβ−ｇｌｕ活性は、同じアッセイにおいて分析されたβ−ｇｌｕ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）標準との比較によって決定された。
【図１４】  ｖＥＬ／ｔｋ上のプラークアッセイ。１０倍希釈のｖＥＬ／ｔｋを、Ｈｕｔｋ-細胞とともに、１０％ウシ胎仔血清を有するＥ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ中で、３７℃にて、１時間インキュベートした（上から下）。培地を、５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−０３８７）、５％ウシ胎仔血清、およびＨＡＴ補充物（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｍＭもしくは１２５ｍＭ  ブロモデオキシウリジン、または薬物なし、を有するＥ−ＭＥＭ  ３ｍｌで置き換え、３７℃で４８時間インキュベートし、そして０．５％  クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃ  ０７７５）、２０％  エタノール、７．５％  ホルムアルデヒドを用いて染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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