(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングする方法であって：
ａ）ある量の選択された硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）またはデキストラン硫酸、ペントサン・ポリ硫酸およびポリビニルスルホン酸からなる群から選択されるＧＡＧ関連巨大分子を、選択された媒体上に固定し；そして、以下のいずれか：
ｂ１）ある量の溶解された低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）に、選択された量の選択されたアミロイド療法剤候補を添加して、試験溶液を生成し；そして、
ｃ１）媒体上に固定されたＳＧＡＧに、選択された量の試験溶液を添加してＡβ：ＳＧＡＧ重量／重量（ｗ／ｗ）比を調整する；
工程を含み、
これによって、選択されたアミロイド療法剤候補を含まずに上述のように調製された試験基準試料に比較した際の、アミロイド斑形成における阻害パーセントが、選択されたアミロイド療法剤候補の有効性パーセントの指標となる、前記方法；または
ｂ２）媒体上に固定されたＳＧＡＧに、選択された量の溶解された低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）を添加してＡβ：ＳＧＡＧ  ｗ／ｗ比を調整し、媒体上にアミロイド斑を形成させ；そして、
ｃ２）媒体上に固定されたアミロイド斑に、選択された量の選択されたアミロイド療法剤候補の試験溶液を添加する；
工程を含み、
これによって、選択されたアミロイド療法剤候補を含まずに上述のように調製された試験基準試料に比較した際の、媒体上のアミロイド斑の破壊パーセントが、選択されたアミロイド療法剤候補の有効性パーセントの指標となる、前記方法。
【請求項２】
Ａβ：ＳＧＡＧ重量／重量（ｗ／ｗ）比が、１：０．０１〜１：２０、１：０．１〜１：１０、または１：０．５〜１：２である、請求項１の方法。
【請求項３】
Ａβ：ＳＧＡＧ  ｗ／ｗ比が１：１である、請求項２の方法。
【請求項４】
選択された媒体が、スライド、フィルム、またはタイターウェルプレートのいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
タイターウェルプレートが、１８〜９６ウェルのテフロン（登録商標）分割スライドである、請求項４の方法。
【請求項６】
固定されたＳＧＡＧに、バブリング技術によって、請求項１の工程ｂ２におけるＬＦＡβを添加する、請求項５の方法。
【請求項７】
固定されたＳＧＡＧに、バブリング技術によって、請求項１の工程ｃ１における試験溶液を添加する、請求項５の方法。
【請求項８】
ＳＧＡＧが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸およびコンドロイチン−６−硫酸からなるＳＧＡＧの群から選択され、そしてＧＡＧ関連巨大分子がデキストラン硫酸である、請求項１〜７のいずれか１項の方法。
【請求項９】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングするキットであって：媒体上に固定された、ある量の硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）；ある量の低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）；および請求項１の工程ａ〜ｃ１ごとのスクリーニング使用説明書を含む、前記キット。
【請求項１０】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングするキットであって：請求項１、工程ａ〜ｂ２にしたがって媒体上で形成された、ある量のアミロイド斑；および請求項１の工程ｃ２のスクリーニング使用説明書を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、特定のアミロイド斑の形成法、並びにアルツハイマー病およびパーキンソン病の治療における、こうした斑のスクリーニング適用に関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病は、ベータ−アミロイド・タンパク質またはＡβと称される、原線維型で、細胞外アミロイド斑として、そして脳血管壁内にアミロイドとして存在する、３９〜４３アミノ酸ペプチドの集積によって特徴付けられる。アルツハイマー病における原線維Ａβアミロイド沈着は、患者に有害であり、そして最終的に、アルツハイマー病に顕著な特徴である毒性および神経細胞死を導く。アルツハイマー病患者の脳においては、多様な形態学的に別個の種類のＡβ含有斑が記載されてきており、これらには、びまん性斑（Ａβ免疫反応性を示すが、コンゴレッドおよびチオフラビンＳなどのアミロイド染色剤を用いた際、原線維アミロイドに関して染色されない）、神経突起斑（コンゴレッドおよびチオフラビンＳで染色される中央アミロイド・コアを含有し、そしてジストロフィー神経突起に囲まれている）および緻密な（ｃｏｍｐａｃｔ）燃え尽きた（ｂｕｒｎｅｄ−ｏｕｔ）斑または「アミロイド・スター」斑（コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、通常、マルタ十字架パターンを示す）が含まれる。コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターンを示す緻密な斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成は、以前には達成されていない。
【０００３】
ヒト・アルツハイマー病の脳におけるアミロイド・スター斑の発展は、一般的に、当該技術分野において、形成し、そして集積するのに数年かかると見なされている。しかし、ひとたび現れると、これらの斑は、次いで、脳由来の天然のプロテアーゼまたは他のクリアランス機構に耐性である。したがって、これらのアミロイド・スター斑を溶解するか、またはこれらを修飾してプロテアーゼ消化およびクリアランスに、より感受性にするのを補助する剤はいずれも、アルツハイマー病を治療する際の優れた候補であろう。
【０００４】
当該技術分野において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアミロイド・スター斑に対する、こうした候補剤のスクリーニングはいずれも、死後、アルツハイマー病の脳からアミロイド斑を物理的に抽出し、そして単離することによってのみ、達成される。このプロセスは、技術的に面倒であるだけでなく、非常に時間がかかり、そして得られるアミロイド・スター斑の量は非常に少なく、そしてそれ自体、非常に変わりやすい。さらに、米国において、精選されたいくつかのセンターだけが、アルツハイマー病の脳バンクにアクセス可能であり、またそれ自体のバンクを有する。
【０００５】
びまん性斑、神経突起斑および緻密（「アミロイド・スター」）斑
神経突起斑は、より成熟していると見なされ、そして球状のアミロイド斑コアを取り巻くジストロフィー神経突起を含有する（Ｂａｒｃｉｋｏｗｓｋａら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：２２５−２３１，  １９８９；Ｉｋｅｄａら，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６０：１１３−１２２，  １９８９；Ｍａｓｌｉａｈら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５２：６１９−６３２，  １９９３）。これらの斑内のアミロイド・コアは、Ａβ免疫陽性であり、そしてコンゴレッドおよびチオフラビンＳで染色される。さらに、神経突起斑内のアミロイド斑コアは、通常、球状であり、そしてコンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターンに似ている（Ｉｋｅｄａら，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６０：１１３−１２２，  １９８９；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：３３７−３４７，  １９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １４７：５０３−５１５，  １９９５）。神経突起斑内のアミロイド・コアは、電子顕微鏡で観察した際、アミロイド・スターに似ている（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：３３７−３４７，  １９８９）。緻密アミロイド・コア（燃え尽き斑またはコア斑とも呼ばれる）もまた、電子顕微鏡で観察した際、アミロイド・スターに似ており（Ｓｅｌｋｏｅら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ４６：１８２０−１８３４，  １９８６；Ｓｎｏｗら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １３３：４５６−４６３，  １９８８）、そして一般的に、斑形成のより成熟した形に相当すると考えられる（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：３３７−３４７，  １９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １４７：５０３−５１５，  １９９５；Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５６：３２１−３３９，  １９９７）。これらの球状斑は、Ａβ免疫陽性であり、そしてコンゴレッド（偏光下で観察した際、やはりマルタ十字架に似ている）およびチオフラビンＳで染色される。
【０００６】
以前には、当業者の誰も、アルツハイマー病患者の脳で見られるこれらの斑と類似のこうした斑沈着の形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き起こしたことがなかった。こうしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成を用いて、ユニークな抗斑療法潜在能力を有し、そしてアルツハイマー病治療の新規アプローチとして働きうる剤を評価し、そして同定することも可能である。アミロイド斑の発展を阻害するかまたは乱す可能性がある剤をスクリーニングし、そして同定するのに使用可能な化合物およびアッセイ技術が必要である。こうした化合物および方法は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の開始および進行に関連するアミロイド斑形成を評価する際に有用であろう。
【０００７】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアミロイド・スター斑を生成する必要性があり、そしてその必要性は、親出願に先に開示されるように、多くの技術的問題に直面してきた。アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療として働くであろうありうる候補をｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに試験するため、アミロイド・スター斑をより高収率で形成する方法に対する必要性も依然としてある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミロイド斑は、それ自体、理想的には、ｉｎ  ｖｉｖｏのアミロイド斑に知られる特性、例えば安定性、プロテアーゼ耐性、およびコンゴレッドで染色した際、偏光下で観察すると、マルタ十字架パターンを示す特性を維持する。最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミロイド斑形成は、ヒト脳でかかる時間よりも迅速に、そして多量に生じなければならない。
【０００８】
発明の開示
本出願は、出願第１０／００７，７７９号、２００１年１１月３０日出願の一部継続出願であり、そして仮出願第６０／４２３，１８５号、２００２年１１月１日出願に優先権を請求し、これら文献はどちらも本明細書に完全に示されるかのように本明細書に援用される。
【０００９】
ヒト・アルツハイマー病の脳に存在するコンゴ親和性（ｃｏｎｇｏｐｈｉｌｉｃ）マルタ十字架緻密斑と実質的に同一のコンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑（すなわち「緻密斑」または「アミロイド・スター」）を多量にｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に形成する方法を開示する。アルツハイマー病およびパーキンソン病の抗斑療法剤を同定する、いくつかの異なるアッセイ技術および動物モデルで使用するため、こうしたアルツハイマー斑を一貫して形成する方法もまた開示する。ベータ−アミロイド・タンパク質（Ａβ）（残基１〜４０であるが、残基１〜４２でない）および非常に硫酸化されたグリコサミノグリカン類（ＧＡＧ）または関連する硫酸化巨大分子を、本明細書にさらに開示するように、そしてＡβ：硫酸化プロテオグリカン／ＧＡＧの適切なモル比／重量比のもとで、インキュベーションした際、これらの同時インキュベーション後に形成される緻密アミロイド斑の迅速でそして大量の形成を開示する。
【００１０】
こうした緻密コンゴ親和性マルタ十字架アミロイド斑は、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２単独のインキュベーション後（３７℃で１週間まで）には形成されない場合もあった。アミロイド斑形成を誘導するのに好ましいｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件は、Ａβ４２でなく、Ａβ４０を硫酸化ＧＡＧ（ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸など）またはＧＡＧ関連巨大分子（デキストラン硫酸）と同時インキュベーションすることを必要とする。
【００１１】
Ａβ１−４０と非常に硫酸化されたＧＡＧまたは関連する硫酸化巨大分子の同時インキュベーションによって形成される４〜６５μｍのアミロイド斑（平均直径＝２５〜２６μｍ）は、ヒト・アルツハイマー病の脳に存在する緻密アミロイド斑の特性をすべて有し、こうした特性には：１）コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターンを示すアミロイド斑、２）透過型電子顕微鏡で観察した際、斑の中心から放射されるように見えるアミロイド原線維の放射束状構造（各々７〜１０ｎｍの原線維直径を持つ）を持つ、球状「アミロイド・スター」形態が含まれる。これらの斑の他の特性には、ａ）球状の形状または緻密な形状、ｂ）コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際のコンゴ親和性のマルタ十字架パターン（すなわち斑の緑色に対して９０度である斑の赤色）、ｃ）蛍光顕微鏡で観察した際のチオフラビンＳでの陽性染色、ｄ）透過型電子顕微鏡で観察した際の球状の外見および／または「アミロイド・スター」の外見、ｅ）走査型電子顕微鏡で観察した際の球状の形状または緻密な形状（直径１０〜４０μｍの斑）および／またはｆ）プロテアーゼ分解に対する耐性が含まれる。アルツハイマー病およびパーキンソン病の抗斑療法剤を同定するスクリーニング・ツールとしての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたこうしたアミロイド斑の使用もまた開示する。
【００１２】
本明細書に開示されるものなどの、非常に硫酸化されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、およびデキストラン硫酸などの関連する硫酸化ＧＡＧ巨大分子はすべて、ベータ−アミロイド・タンパク質（Ａβ）（残基１〜４０）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導して、ヒト・アルツハイマー病の脳に存在するコンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑と実質的に同一のアミロイド斑沈着に変換することが見出された。
【００１３】
変化する温度（−８０℃〜４５℃）、Ａβ４０の最適な初期濃度（２５、３７．５、５０、６２．５、７５、８７．５、１００、１１２．５、１２５、２５０、および５００μＭ）、同時インキュベーション用の多様な硫酸化ＧＡＧ（ヘパリン、ヘパラン硫酸（多数の供給源由来）、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸）または硫酸化ＧＡＧ関連巨大分子（デキストラン硫酸）、異なる比のＡβ４０：硫酸化ＧＡＧまたは巨大分子（１：０．０１、１：０．０５、１：０．１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１４、１：１６、１：１８、１：２０  ｗｔ／ｗｔ）、超音波処理ありまたは超音波処理なし、異なる範囲のｐＨ（３．０〜９．５）および最適インキュベーション時間（０、１、２、３、５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２４、２６、２８、３０日間）を含む、異なる条件を検討して、一貫したｉｎ  ｖｉｔｒｏアミロイド斑形成法を確立した。超音波処理は、細胞研究業の当業者に知られる用語である。アルツハイマー病の脳で観察されるような、緻密コンゴ親和性マルタ十字架「アミロイド・スター」斑の形成を誘導する、これらの開示される範囲内の最適条件を、本明細書に開示する。
【００１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一貫したアミロイド斑形成は、非常に硫酸化されたＧＡＧまたはＧＡＧ関連巨大分子とＡβ１−４０の同時インキュベーションによってのみでなく、用いるＡβ１−４０の品質によっても最適化される。好ましいＡβ１−４０のいくつかの特性は、最初の可溶化時のチオフラビンＴ蛍光定量読み取り値が４００〜４０００ＦＵ（励起４４４ｎｍ／発光４８５ｎｍ）の間、好ましくはＦＵ〜２０００であるように、Ａβ１−４０が低原線維であること；１ｘＴＢＳ中のＡβ１−４０が比較的中性ｐＨ（ｐＨ〜６．５〜７．５）であることであり；そしてＡβ１−４０の最大濃度が１ｍｇ／ｍｌまたは２５０μＭを超えないこともまた好ましい。
【００１５】
光学顕微鏡観察（本明細書にさらに論じるとおり）は、Ａβ（１−４０）に加えた非常に硫酸化されたＧＡＧまたは非常に硫酸化されたＧＡＧ関連巨大分子の同時インキュベーションによって形成されたアミロイド斑が、ヒト・アルツハイマー病の脳から単離されたアミロイド斑コアのものと実質的に同一の特性および形態を有することを示す。これらの発見によって、アルツハイマー病の脳で観察されるコンゴ親和性マルタ十字架および緻密アミロイド斑は、非常に硫酸化されたＧＡＧとＡβ１−４０の同時沈着および同時集積によって、長期に渡って形成される可能性があることが示される。
【００１６】
ＡβおよびＧＡＧおよび／またはＧＡＧ関連巨大分子、あるいはその部分を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する方法を開示する。こうしたＧＡＧには、ヘパラン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、およびデキストラン硫酸が含まれる。好ましい態様において、こうした緻密アミロイド斑形成は、Ａβ１−４０と硫酸ＧＡＧを、２５℃〜４０℃、および好ましくは約３７℃で、そして本明細書に記載するような適切なＡβ：ＧＡＧ重量比および／またはモル比のもとで、同時インキュベーションすることによって達成される。
【００１７】
開示するのは、アミロイド斑を誘導する方法であって
ａ）ある量の選択された硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）またはＧＡＧ関連巨大分子を、選択された媒体上に固定し；
ｂ）媒体上に固定されたＳＧＡＧに、ある量の溶解された低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）を添加する
工程を含む、前記方法である。
【００１８】
この方法において、ＬＦＡβは、１：０．０１〜１：２０の間の範囲のＡβ：ＳＧＡＧ重量／重量（ｗ／ｗ）比で、または１：０．１〜１：１０の間の範囲のＡβ：ＳＧＡＧ  ｗ／ｗ比で、好適には１：０．５〜１：２の間の範囲のＡβ：ＳＧＡＧ  ｗ／ｗ比で、そして好ましくは約１：１のＡβ：ＳＧＡＧ  ｗ／ｗ比で添加される。選択される媒体は、スライド、フィルム、またはタイターウェルプレートのいずれかであり、そして好ましいタイターウェルプレートは、１８〜９６ウェルのテフロン分割スライドである。ＳＧＡＧは、好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸およびコンドロイチン−６−硫酸から選択され、そしてＧＡＧ関連巨大分子は、好ましくはデキストラン硫酸である。ＬＦＡβは、好適には、テフロンが部分的に液体をはじき、そして支持体、この場合は固定されたＳＧＡＧ上に、バブル中の液体を保持するように、テフロンで境界を定めたウェルに、少量の液体をピペッティングすることを伴う、バブリング技術によって、固定されたＳＧＡＧに添加される。
【００１９】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングする方法であって：
ａ）ある量の選択された硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）またはＧＡＧ関連巨大分子を、選択された媒体上に固定し；
ｂ）ある量の溶解された低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）に、選択された量の選択されたアミロイド療法剤候補を添加して、試験溶液を生成し；
ｃ）媒体上に固定されたＳＧＡＧに、選択された量の試験溶液を添加する
工程を含み；
これによって、選択されたアミロイド療法剤候補を含まずに上述のように調製された試験基準試料に比較した際の、アミロイド斑形成における阻害パーセントが、選択されたアミロイド療法剤候補の有効性パーセントの指標となる、前記方法もまた開示する。
【００２０】
このスクリーニング法では、Ａβ：ＳＧＡＧ重量／重量（ｗ／ｗ）比範囲の詳細は、斑形成法に関して上に開示するとおりであり、選択される媒体の選択の範囲および好ましいＳＧＡＧもまた、上に開示するとおりである。
【００２１】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングする別の方法は：
ａ）ある量の選択された硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）またはＧＡＧ関連巨大分子を、選択された媒体上に固定し；
ｂ）媒体上に固定されたＳＧＡＧに、選択された量の溶解された低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）を添加して、媒体上にアミロイド斑を形成し；
ｃ）媒体上のアミロイド斑に、選択されたアミロイド療法剤候補の選択された量の試験溶液を添加する
工程を含み；
これによって、選択されたアミロイド療法剤候補を含まずに上述のように調製された試験基準試料に比較した際の、媒体上のアミロイド斑の破壊パーセントが、選択されたアミロイド療法剤候補の有効性パーセントの指標となる。
【００２２】
選択されたアミロイド療法剤候補をスクリーニングするキットであって、上述のような、媒体上に固定されたある量の硫酸化グリコサミノグリカン（ＳＧＡＧ）およびある量の低原線維Ａβ１−４０（ＬＦＡβ）とともにスクリーニング使用説明書を有する、阻害試験用の１つのキット、および上に開示するような、媒体上であらかじめ形成された、ある量のアミロイド斑および上述のようなスクリーニング使用説明書を有する、破壊用の別のキットを開示する。
【００２３】
斑の形態、斑の数、または当業者に知られる他の測定値を比較することによって、当業者に認識されるであろうように、本明細書に論じるようなアミロイド斑形成の阻害および破壊に好適に注目し、そしてこれら阻害および破壊を定量化することも可能であり、そしてこれには、プロテアーゼ分解またはミクログリア分解を用いた試験の後、影響を受けた斑が、ここで、天然クリアランスの対象であり、そしてもはや、こうした分解に耐性である、アルツハイマー病の脳におけるものおよび合成したもの両方の、本明細書に論じる特定のアミロイド・スター斑に相当しないことを確認する測定値が含まれることも可能である。
【００２４】
１つの態様において、Ａβ１−４０をヘパリン（低分子量または高分子量いずれか）とともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この態様において、１０μＭ〜２５０μＭの範囲のＡβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、ヘパリンと、１：０．０２〜１：１００のＡβ：ヘパリン・モル比の範囲内で、そして好ましくは約１：０．５μＭで、３７℃でインキュベーションする。
【００２５】
別の態様において、Ａβ１−４０を非抗凝血ヘパリンとともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この好ましい態様において、１０μＭ〜２５０μＭのＡβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、非抗凝血ヘパリン、ヘパリン様分子、またはその断片と、１：０．０２〜１：１００のＡβ：非抗凝血ヘパリン・モル比の範囲内で、そして好ましくは約１：０．５μＭで、３７℃でインキュベーションする。
【００２６】
別の態様において、Ａβ１−４０をヘパラン硫酸とともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この態様において、Ａβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、ヘパラン硫酸と、１：０．１〜１：１００のＡβ：ヘパラン硫酸重量比の範囲内で、そして好ましくは約１：１で、３７℃でインキュベーションする。この同じ範囲および選択は、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、およびコンドロイチン−６−硫酸などの他の硫酸化ＧＡＧにも適用される。
【００２７】
別の態様において、Ａβ１−４０をデキストラン硫酸とともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この好ましい態様において、１０μＭ〜２５０μＭのＡβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、デキストラン硫酸と、１：０．０２〜１：１００のＡβ：デキストラン硫酸モル比の範囲内で、そして好ましくは約１：０．５μＭで、３７℃でインキュベーションする。
【００２８】
別の態様において、Ａβ１−４０をペントサン・ポリ硫酸とともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この好ましい態様において、１０μＭ〜２５０μＭのＡβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、ペントサン・ポリ硫酸と、１：０．０２〜１：１００のＡβ：ペントサン・ポリ硫酸モル比の範囲内で、そして好ましくは約１：０．５μＭで、３７℃でインキュベーションする。
【００２９】
別の態様において、Ａβ１−４０をポリビニルスルホン酸とともに利用して、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。この好ましい態様において、Ａβ１−４０を、蒸留水、ＰＢＳまたはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、ポリビニルスルホン酸と、１：０．１〜１：１００のＡβ：ポリビニルスルホン酸重量比の範囲内で、そして好ましくは約１：１で、３７℃でインキュベーションする。
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑を阻害するか、破壊するか、または除去する抗斑療法剤であって、偏光顕微鏡観察を利用して同定可能な該剤を同定するスクリーニング法のための、本明細書で産生されるアミロイド斑の使用を開示する。こうした好ましい態様において、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、典型的なマルタ十字架パターンを示すアミロイド斑コアをまずｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成する。試験化合物と（実験的に決定される適切な投薬量およびインキュベーション時間で）インキュベーションした後、偏光顕微鏡下でアミロイド斑コアを観察して、コンゴ親和性および／またはマルタ十字架形成の損失があるように、既定の化合物または剤が、アミロイド斑構造を阻害するか、破壊するか、または除去することが可能であるかどうかを決定する。まず、こうした偏光顕微鏡観察技術によって同定されたこうした化合物を、透過型および／または走査型電子顕微鏡観察法、並びに／あるいはプロテアーゼ消化法を利用した二次アッセイまたは三次アッセイでさらに解析して、斑阻害、破壊または除去を確認することも可能である。
【００３１】
さらに別の好ましい態様において、スクリーニング法のため本明細書で産生される緻密アミロイド斑を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、球状アミロイド斑の構造（すなわちサイズおよび／または直径）を阻害し、破壊する抗斑療法剤であって、細胞選別機を伴う方法論を用いて同定可能な該剤を同定する。こうしたアッセイにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密球状アミロイド斑を、細胞選別機に通して、こうした斑の平均直径（および直径範囲）を決定することも可能である。次いで、これらの斑を多様な化合物または剤と（実験的に決定される既定の投薬量およびインキュベーション時間で）インキュベーションし、そして次いで、再び細胞選別機を通して、既定の化合物が、こうした斑を粉々にして、サイズ（およびしたがって直径）を乱すのに有効であったかどうかを決定することも可能である。
【００３２】
発明を実施するための最良の形態
定義
本明細書において、多様な異なる抗Ａβ抗体と免疫反応性であるが、一般的に原線維アミロイドに関しては染色されない（すなわちコンゴレッド、チオフラビンＳ）、ヒト・アルツハイマー病の脳におけるアミロイド斑を指すのに、用語「びまん性斑」を用いる（Ｉｋｅｄａら，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６０：１１３−１２２，  １９８９；Ｖｅｒｇａら，  Ｎｅｕｒｏｓｃ．  Ｌｅｔｔ．  １０５：２９４−２９９，  １９８９）。
【００３３】
本明細書において、球状アミロイド斑コアを取り巻くジストロフィー神経突起を含有する、ヒト・アルツハイマー病の脳における斑を指すのに、用語「神経突起斑」を用いる（Ｂａｒｃｉｋｏｗｓｋａら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：２２５−２３１，  １９８９；Ｉｋｅｄａら，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６０：１１３−１２２，  １９８９；Ｍａｓｌｉａｈら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５２：６１９−６３２，  １９９３）。これらの斑内のアミロイド・コアは、Ａβ免疫陽性であり、そしてコンゴレッドおよびチオフラビンＳで染色される。さらに、神経突起斑内のアミロイド斑コアは、通常、球状であり、そしてコンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架に似ている（Ｉｋｅｄａら，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６０：１１３−１２２，  １９８９；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：３３７−３４７，  １９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １４７：５０３−５１５，  １９９５）。
【００３４】
本明細書において、一般的に、斑形成のより成熟した型に相当すると考えられている、ヒト・アルツハイマー病またはプリオン病の脳における斑を指すのに、用語「緻密」斑または「燃え尽き」斑を用いる（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  ７８：３３７−３４７，  １９８９；Ｓｃｈｍｉｄｔら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １４７：５０３−５１５，  １９９５；Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５６：３２１−３３９，  １９９７）。これらの球状斑は、Ａβまたはプリオン・タンパク質免疫陽性であり、そしてコンゴレッド（偏光下で観察した際、やはりマルタ十字架に似ている）およびチオフラビンＳで染色される。「緻密」斑または「燃え尽き」斑もまた、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターンを示す。
【００３５】
本明細書において、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、赤色／青リンゴ色の複屈折を示す原線維アミロイド沈着を記載するのに、用語「コンゴ親和性」を用いる。コンゴ親和性沈着は、必ずしもマルタ十字架パターン（定義に関しては以下を参照されたい）を示さなくてもよい。
【００３６】
用語「マルタ十字架」は、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターン（すなわち赤色が、青リンゴ色に対して９０度である）を示す、球状で、そして緻密なアミロイド斑を指す。偏光装置の回転に際して、赤色が青リンゴ色に変わり、そして青リンゴ色が赤色に変わるように（すなわち赤色／緑色複屈折）、斑の色のシフトが起こる。本発明に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるアミロイド斑、ヒト・アルツハイマー病の脳における神経突起斑のアミロイド・コア、ヒト・アルツハイマー病の脳における「緻密」斑または「燃え尽き」斑、並びにヒト・クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー症候群およびクールーの小脳におけるアミロイド斑はすべて、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、「マルタ十字架」パターンを示す。
【００３７】
本明細書において、電子顕微鏡で観察した際に、アミロイドの星形沈着に似ている「緻密」アミロイド斑または「燃え尽き」アミロイド斑を指すのに、用語「アミロイド・スター」を用いる（Ｓｅｌｋｏｅら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ４６：１８２０−１８３４，  １９８６；Ｓｎｏｗら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １３３：４５６−４６３，  １９８８）。斑の「アミロイド・スター」の外見は、斑の中心から放射されるように見えるアミロイド原線維の放射束状構造によるものである。
【００３８】
本明細書において、適切な条件下でインキュベーションした際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される緻密アミロイド斑を指すのに、用語「誘導」または「形成」を用いる。誘導または形成に関して論じる際、開示する方法の範囲内に、場合によって、インキュベーション構成要素の穏やかな混合が含まれる。
【００３９】
本明細書において、ａ）緻密斑の構築、染色特性、または構造を、直接、溶解するか、阻害するか、または破壊する際に、そして／またはｂ）緻密斑が他の細胞（すなわちニューロン）、組織または臓器に有しうる有害な影響（すなわち神経毒性）を阻害する際に有効である、化合物または薬剤を指すのに、用語「抗斑療法剤」を用いる。
【００４０】
用語「ベータ−アミロイド・タンパク質（Ａβ１−４０、本明細書においてＡβ４０とも称される）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を指し、そしてヒト疾患（例えばＡβ１−４０における単一のアミノ酸置換が知られるアルツハイマー病）、または種変異（ヒトＡβ１−４０に比較して３アミノ酸相違を有することが知られる、げっ歯類Ａβ１−４０）で生じるすべての単一アミノ酸置換または多数のアミノ酸置換を含むことも可能である。
【００４１】
以下の実施例、図および考察は、本発明の態様の例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意味しない。
図１は、パールカンによって、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑がｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成されるが、ヒト・アルツハイマー病の脳に存在することが知られる他のアミロイド斑関連巨大分子によってはアミロイド斑がｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されないことを示す。これらの研究において、２５μＭのＡβ（１−４０）を、単独で（図１Ｃ）、あるいは１００ｎＭのＰ構成要素（図１Ｄ）、アルファ１−アンチキモトリプシン（図１Ｅ）、アポＥ（図１Ｆ）、Ｃ１ｑ（図１Ｇ）、ラミニン（図１Ｈ）、フィブロネクチン（図１Ｉ）、ＩＶ型コラーゲン（図１Ｊ）またはパールカン（図１Ｋおよび１Ｌ）の存在下のいずれかで、再蒸留水またはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中、３７℃でインキュベーションした。ゼラチンでコーティングしたスライド上、インキュベーション混合物の５ｆｌアリコットを風乾し、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した。２５０：１の好ましいＡβ：パールカン・モル比（すなわち１：０．８の重量比）で、Ａβ１−４０とパールカンを３７℃でプレインキュベーションすると、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑様沈着の形成が誘導された（図１Ｋおよび１Ｌ）。１２５μＭ  Ａβ（１−４０）と０．６２５μＭパールカン（すなわち２００：１のＡβ：パールカン・モル比；１：１のＡβ：パールカン重量比）を用いると、同様のアミロイド斑形成が観察されたが、１２５μＭ  Ａβ（１−４０）と０．６２５μＭの上に列挙する他のアミロイド斑共構成要素を用いると、アミロイド斑形成は観察されなかった（未提示）。パールカンに誘導されるアミロイド斑は、形態および染色特性（すなわちコンゴレッド染色後のマルタ十字架）が、ヒト・アルツハイマー病の脳の緻密アミロイド斑に実質的に同一であった（図１Ｋおよび１Ｌを図１Ａに比較されたい）。図Ａ、ＢおよびＫ中のバー＝２５μｍ。図Ａ、ＣおよびＨは同じ倍率で撮影されており、図Ｂ、Ｄ〜ＧおよびＩ〜Ｊも同倍率である。
【００４２】
図２は、非常に硫酸化されたグリコサミノグリカン（すなわちヘパリンおよびヘパラン硫酸）および関連する硫酸化巨大分子（すなわちデキストラン硫酸、ペントサン・ポリ硫酸）による、コンゴ親和性でそしてマルタ十字架球状であるアミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成を示す。これらの研究において、２５μＭのＡβ１−４０を、単独で（図２Ｂ）、あるいは多様な量のヘパリン（図２Ｃ）、ヘパラン硫酸（図２Ｄ）、デルマタン硫酸（図２Ｅ）、コンゴレッド（図２Ｆ）、ペントサン・ポリ硫酸（図２Ｇ）、またはデキストラン硫酸（図２Ｉ）の存在下のいずれかで、再蒸留水またはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベーションした。ゼラチンでコーティングしたスライド上、インキュベーション混合物の５ｆｌアリコットを風乾し、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した。予備的実験によって、緻密アミロイド斑形成に最適なＡβ：ＧＡＧ／硫酸化巨大分子比は、Ａβ１−４０を２５μＭに維持すると、ヘパリン、デキストラン硫酸およびペントサン・ポリ硫酸に関しては１：５のモル比、そしてヘパラン硫酸に関しては１：８の重量比であることが決定された。再蒸留水中、１２５μＭのＡβ１−４０を用いた場合、上述のものと類似の結果が得られた。これらと同じモル比／重量比で、Ａβ１−４０とヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサン硫酸またはデキストラン硫酸を３７℃でプレインキュベーションすると、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑様沈着の形成が誘導された（図２Ｃ、２Ｄ、２Ｇ〜２Ｉ）。これらの非常に硫酸化されたＧＡＧおよび関連する硫酸化巨大分子に誘導されるアミロイド斑は、ヒト・アルツハイマー病の脳の緻密アミロイド斑と実質的に同一であった（図２Ａと比較されたい）。図Ａ、ＢおよびＩ中のバー＝２５μｍ。図Ａ、Ｃ、ＤおよびＨは同じ倍率で撮影されており、図ＢおよびＥも同倍率である。
【００４３】
図３は、ポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）によるコンゴ親和性でそしてマルタ十字架球状であるアミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成を示し、そしてＡβ：ＰＶＳの重量比の変化が、緻密アミロイド斑形成の潜在能力にどのように影響を及ぼすかを示す。これらの研究において、再蒸留水中の５０ｆｇのＡβ１−４０を、総体積１００ｆｌ中、２５ｆｇ  ＰＶＳ（２：１のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ａ）、５０ｆｇ  ＰＶＳ（１：１のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｂ）、２００ｆｇ  ＰＶＳ（１：４のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｃ）、２５０ｆｇ  ＰＶＳ（１：５のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｄ）、４００ｆｇ  ＰＶＳ（１：８のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｅ）、５００ｆｇ  ＰＶＳ（１：１０のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｆ）、８００ｆｇ  ＰＶＳ（１：１６のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｇ）、２０００ｆｇ  ＰＶＳ（１：４０のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｈ）、および４０００ｆｇ  ＰＶＳ（１：８０のＡβ：ＰＶＳ重量比）（図３Ｉ）を含む、増加する量のＰＶＳの存在下で、３７℃でインキュベーションした。ゼラチンでコーティングしたスライド上、インキュベーション混合物の５ｆｌまたは１０ｆｌアリコットを風乾し、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した。ＰＶＳによってコンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑形成が誘導されたが、Ａβ：ＰＶＳ重量比が１：５以上のときのみであった。最適なアミロイド斑コア形成は、１：４０のＡβ：ＰＶＳ重量比で観察された（図３Ｈ）。図ＡおよびＣ中のバー＝２５μｍ。図Ａ、Ｂ、ＨおよびＩは同じ倍率で撮影されており、図Ｃ〜Ｇも同倍率である。
【００４４】
図４は、エンゲルブレス−ホルム−スワーム腫瘍から単離された、〜２２０ｋＤａヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）によって誘導されるコンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑形成を示す。１００ｆｌ  Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中の５０ｆｇのＡβ（１−４０）を、単独で、または１０ｆｇの〜２２０ｋＤａ  ＨＳＰＢ（５：１のＡβ：ＨＳＰＢ重量比）の存在下のいずれかで、３７℃でインキュベーションした。図４Ａは、Ａβ単独の１週間インキュベーション後に形成される、不規則なコンゴ親和性アミロイド沈着（矢印）を示し、この場合、明らかなコンゴ親和性マルタ十字架アミロイド斑は形成されない。図４Ｂは、〜２２０ｋＤａ  ＨＳＰＧを加えたＡβ１−４０の１週間のインキュベーション後に形成されるコンゴ親和性マルタ十字架アミロイド斑（矢じり）を示す。形成されるアミロイド斑は、ヒト・アルツハイマー病の脳に存在する緻密斑と同一であった（図１Ａおよび２Ａを参照されたい）。図ＡおよびＢは同じ倍率で撮影されている。バー＝２５μｍ。
【００４５】
図５は、プラスチック中に固定されて見えるものとして、パールカンに誘導された球状アミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成を示す。この研究において、１２５μＭのＡβ１−４０を、０．６２５μＭのパールカン（２００：１のＡβ：パールカン・モル比；１：１のＡβ：パールカン重量比）の存在下、再蒸留水中、３７℃でインキュベーションした。次いで、インキュベーション混合物の１０ｆｌアリコットをプラスチック・ペトリ皿上で１時間風乾し、そして次いで、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．３）中、３％グルタルアルデヒドで１０分間、ｉｎ  ｓｉｔｕで固定した。ろ過した蒸留水で３回リンスした後、蒸留水中の１％四酸化オスミウムで１０分間、後固定し、前と同様にリンスし、そして一晩風乾した。この図は、プラスチック中に見えるものとして、パールカンに誘導され、そして位相差光学顕微鏡で観察したアミロイド斑様沈着を示す。パールカンは、Ａβを誘導して球状アミロイド斑沈着を形成させ（図５Ａおよび５Ｂ、矢じり）、これは、中心源から放射されるように見えるアミロイド原線維の放射束状構造に相当した。形成されたこれらの斑は、ヒト・アルツハイマー病の脳から単離されたアミロイド斑コアに似ている。バー＝２５μｍ。
【００４６】
図６は、透過型電子顕微鏡によって観察した際の、ヒト・アルツハイマー病の脳由来の単離されたアミロイド斑コアに実質的に同一である、パールカンに誘導された球状「アミロイド・スター」形成を示す。この研究において、１２５μＭのＡβ１−４０を、０．６２５μＭのパールカン（２００：１のＡβ：パールカン・モル比；１：１のＡβ：パールカン重量比）の存在下、再蒸留水中、３７℃でインキュベーションした。パールカンに誘導されたアミロイド斑コア（図６Ｃおよび６Ｄ）は、中心源から放射されるように見えるアミロイド原線維の放射束状構造を伴う、アミロイド・スターを形成した。個々のアミロイド原線維の直径は、７〜１０ｎｍであると決定された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたこれらのアミロイド斑は、ヒト・アルツハイマー病の脳から単離されたアミロイド斑コアと実質的に同一であった（図６Ａおよび６Ｃ）。バー＝２μｍ。図ＡおよびＢは同じ倍率であり、図ＣおよびＤも同倍率である。
【００４７】
図７は、パールカンまたはデキストラン硫酸に誘導され、そして走査型電子顕微鏡によって観察した、アミロイド斑コア形成を示す。この研究において、１２５μＭのＡβ１−４０を、単独で（図７Ｂ）、あるいは０．６２５μＭのパールカン（２００：１のＡβ：パールカン・モル比）（図７Ｄおよび７Ｅ）またはデキストラン硫酸（１：５のＡβ：デキストラン硫酸モル比）の存在下のいずれかで、再蒸留水中、３７℃でインキュベーションした。さらに、０．６２５μＭのパールカンのみを３７℃でインキュベーションした（図７Ｃ）。Ａβ（図７Ｂ）またはパールカン（図７Ｃ）単独で１週間インキュベーションした後、アミロイド斑コア形成は観察されなかった。しかし、パールカン（図７Ｄおよび７Ｅ）またはデキストラン硫酸（図７Ｆ）の存在下で、Ａβによって緻密アミロイド斑形成が誘導された。パールカンまたはデキストラン硫酸に誘導されたアミロイド斑の形状および一般的な形態は、走査型電子顕微鏡によって観察すると、ヒト・アルツハイマー病の脳から単離されたアミロイド斑コアの形状および一般的な形態に似ていた。各図の下に倍率を示す。
【００４８】
実施例
非常に硫酸化されたＧＡＧおよび関連する硫酸化巨大分子によって誘導されるアミロイド斑コアのｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の好ましい態様を詳細に開示するため、以下の実施例を提供する。しかし、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によって、タイミング、体積測定値および濃度の変動が達成可能であるため、本発明がこれらの特定の実施例に限定されると見なしてはならない。一般的に、これらの量の５０％もの変動、そして特に１０〜２０％もの変動は、最適ではないにしても、なお、好適な結果を生じるであろう。
【００４９】
斑の迅速誘導法
方法１：超音波処理を伴う、溶液中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成：
１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（カタログ番号Ａ−１０５２−２、２４５  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ａｔｈｅｎｓ，  ＧＡ  ３０６０５，  ＵＳＡ  ｗｗｗ．ｒｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏｍ）の凍結乾燥Ａβ４０の１ｍｇビンを解凍する
２）１ｘＴＢＳ中、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、硫酸化ＧＡＧの２ｍｌ溶液を作成する
３）５秒間ボルテックスして混合する
４）Ａβ４０の１ｍｇ凍結乾燥ビンに２ｍｌのストックＧＡＧ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を添加する
５）５秒間ボルテックスして混合する
６）５００μｌ／試験管を１．５ｍｌポリプロピレン微量遠心管に移す
７）５秒間ボルテックスして混合する
８）レベル７、２５℃で５分間、超音波処理する
９）試験管をパラフィルムで覆って蒸発を防ぐ
１０）振動させずに暗所で１〜１４日間、好ましくは５日間、３７℃でインキュベーションする。
【００５０】
方法２：固定された硫酸化ＧＡＧ上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成：
１）１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１ｍｇ／ｍｌで、水中の硫酸化ＧＡＧストック溶液を作成する
２）青いテフロンでコーティングしたガラススライド上に、三つ組で、５０μｌ  ＧＡＧ／ウェルをピペッティングする
３）２５℃でスポットを風乾して薄層フィルムにする
４）最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように、１ｍｇ凍結乾燥Ａβ４０に１ｍｌの１ｘＴＢＳを直接添加することによって、Ａβ４０溶液を作成する
５）５秒間ボルテックスして混合し、そして最初のチオＴ読み取り値をチェックする。最初のチオＴ読み取り値が４０００ＦＵ（励起４４４ｎｍ、発行４８５ｎｍ）以下であれば続行する
６）固定されたＧＡＧ上に５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  Ａβ４０／ウェルのバブルまたはスポットをピペッティングする
７）密封加湿チャンバー（これは、単に、ふたを閉めると密封されるタッパーウェア容器中の水を飽和させたキムワイプからなることも可能である）中にスライドを入れる
８）振動させずに３７℃で８〜７２時間、好ましくは約２４時間インキュベーションする
９）記載する染色プロトコルにしたがってコンゴレッド染色する
１０）偏光下で観察する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミロイド斑のコンゴレッド染色法：
１）１８ウェルを含有する青いテフロンをコーティングしたガラススライドに、１０μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑溶液／ウェルをアリコットする
２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑溶液に、５μｌのコンゴレッド／ウェル（１２５μＭストック）を添加し、そして２５℃で１０分間染色する
３）５μｌの５０％グリセロール／ウェルを添加する
４）スライドを風乾して、およそ５〜１０μｌ／ウェルの総体積にする
５）各染色ウェルを５ｍｍのカバーガラス（Ｂｅｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ）で覆う
６）偏光下で観察する
（実施例１）
異なる硫酸化ＧＡＧまたはＧＡＧ関連巨大分子を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成
図８は、１：０．１、１：１、および１：１０を含む、試験した多様な重量比のいくつかの異なる硫酸化ＧＡＧに誘導されたコンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成を示す。これらの研究において、ウェルあたり５０マイクロリットルのＧＡＧ（１：１０  ｗ／ｗには１０ｍｇ／ｍｌストック、１：１  ｗ／ｗには１ｍｇ／ｍｌストック、１：０．１  ｗ／ｗには０．１ｍｇ／ｍｌストック）を、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライド上にスポッティングし、そして風乾してフィルム状にした。ガラス表面上にＧＡＧが固定されたら、ストック濃度１ｍｇ／ｍｌで１ｘＴＢＳ（ｐＨ７．４）に可溶化された５０マイクロリットルのＡβ１−４０を各ウェル上にスポッティングした。アッセイスライドを、振動させずに３７℃で１８時間、加湿チャンバーに入れた。次いで、ウェルを１２５μＭコンゴレッド溶液５μｌで１５分間染色し、その後、５０％グリセロール溶液をウェルあたり１０マイクロリットル加えた。次いで、ガラススライドのウェルを風乾して、ウェルあたりおよそ５マイクロリットルの体積にして、そして次いで５ｍｍカバーガラスを乗せた。偏光顕微鏡下で、コンゴ親和性マルタ十字架アミロイド斑を観察した。調べた硫酸化ＧＡＧには、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ブタ粘膜腸管；ＨＳ（ｐｉｍ））、デルマタン硫酸（ＤｅｒｍＳ）、コンドロイチン−４−硫酸（Ｃ−４−Ｓ）、コンドロイチン−６−硫酸（Ｃ−６−Ｓ）、およびケラタン硫酸（ケラタンＳ）が含まれる。試験した硫酸化ＧＡＧ関連巨大分子には、デキストラン硫酸（ＤｅｘＳ）およびポリビニルスルホン酸（未提示）が含まれる。
【００５１】
（実施例２）
マルタ十字架ｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑に比較した、ヒト・アルツハイマー病の脳におけるアミロイド・スター斑および対応する電子顕微鏡写真（ＥＭ）
図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイド斑と、アルツハイマー病の脳におけるアミロイド・スター斑の間の物理的特性の類似性を示す。Ａ）死後のヒト・アルツハイマー病の脳組織に埋まって見られるコンゴレッドで染色されたコンゴ親和性マルタ十字架斑。Ｂ）偏光下で観察した、同じマルタ十字架特性を示す、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたコンゴ親和性マルタ十字架斑。Ｃ）ヒト・アルツハイマー病の脳から単離された単一アミロイド・スター斑の走査型電子顕微鏡観察。Ｄ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された単一アミロイド・スター斑の走査型電子顕微鏡観察。球状の形状が類似であり、そしてサイズが近いことに注目されたい。
【００５２】
（実施例３）
超音波処理を伴うおよび伴わない、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマルタ十字架斑形成
図１０は、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）溶液中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成のための超音波処理迅速法を示す。これらの研究において、２００マイクロリットルの２５０μＭ  Ａβ４０を１ｘＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に可溶化し、そして１：５の最終モル比または１：１０の重量対重量比にするため、２００マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸を含み、または含まずに混合した。次いで、この混合物を簡単な５分間の超音波処理に供するか、またはまったく超音波処理せず、そして次いで、３７℃で３〜７日間、好ましくは５日間、インキュベーションした。Ａ）超音波処理を行わない、ＴＢＳ中のＡβ４０単独の場合、コンゴ親和性物質が示されたが、赤色／緑色複屈折またはマルタ十字架形成は示されない。Ｂ）５分間の超音波処理を行った、ＴＢＳ中のＡβ４０単独の場合、それでもマルタ十字架斑形成は生じず、コンゴ親和性染色された物質が見られるのみである。Ｃ）超音波処理を行わない、デキストラン硫酸の存在下のＡβ４０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に少量のマルタ十字架斑を生じる。その代わり、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際の赤色／緑色複屈折の証拠によって、非常に凝集したアミロイド形成が見られる。Ｄ）簡単な５分間の超音波処理を行った、デキストラン硫酸の存在下のＡβ４０は、多量のコンゴ親和性マルタ十字架斑を生じた。
【００５３】
（実施例４）
固定化ＧＡＧ法におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマルタ十字架斑形成
図１１は、固定されたＧＡＧまたはＧＡＧ関連巨大分子上の、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成の迅速法を示す。この研究のため、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライドを、ＴＢＳ、蒸留脱イオン水、またはウェルあたり５０マイクロリットルのデキストラン硫酸（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック）いずれかでコーティングし、そして風乾して薄い透明フィルムにした。次いで、１ｘＴＢＳ中の２５０μＭ  Ａβ４０をウェルあたり５０マイクロリットル添加し、そしてスライドを加湿チャンバーに入れ、そして３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションスライドをウェルあたり５マイクロリットルの１２５μＭコンゴレッド溶液で染色し、そして偏光下、２ｘ対物レンズで観察して、多量のマルタ十字架斑形成が見られることを示した。Ａ）ＴＢＳ単独；Ｂ）ＴＢＳ中のＡβ４０単独；Ｃ）ＴＢＳ中の固定化デキストラン硫酸上のＡβ４０。この方法を用いると、２４時間未満で、１，０００より多い斑／ｍｌが形成可能である。
【００５４】
図１２は、固定されたＧＡＧまたはＧＡＧ関連巨大分子、例えばヘパリン（低分子量型）、ヘパリン（高分子量型）、デキストラン硫酸（低分子量型）、およびデキストラン硫酸（高分子量型）上の、Ａβ４０を用いた、コンゴ親和性マルタ十字架斑ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成を示す。この実験において、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライドを、ＴＢＳ、あるいはウェルあたり５０マイクロリットルのデキストラン硫酸（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック；示すとおりに高分子量型または低分子量型）、またはヘパリン（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック；高分子量型または低分子量型）いずれかでコーティングし、そして風乾して薄い透明フィルムにした。次いで、１ｘＴＢＳ中の２５０μＭ  Ａβ４０をウェルあたり５０マイクロリットル添加し、そしてスライドを加湿チャンバーに入れ、そして３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションスライドをウェルあたり５マイクロリットルの１２５μＭコンゴレッド溶液で染色し、そして偏光下、２ｘ対物レンズで観察して、多量のマルタ十字架斑形成が見られることを示した。Ａ）ＴＢＳ中のＡβ４０単独；Ｂ）ＴＢＳ中の固定化デキストラン硫酸（低分子量型）上のＡβ４０；Ｃ）ＴＢＳ中の固定化デキストラン硫酸（高分子量型）上のＡβ４０；Ｄ）ＴＢＳ中の固定化ヘパリン（低分子量型）上のＡβ４０；Ｅ）ＴＢＳ中の固定化ヘパリン（高分子量型）上のＡβ４０；Ｆ）蒸留脱イオン水中の、（Ｃ）由来の試料の１／１０希釈を、１２５μＭのコンゴレッド溶液５μｌ／ウェルで染色した。この方法を用いると、２４時間未満で、１０，０００より多い斑／ｍｌが形成可能である。
【００５５】
（実施例５）
斑サイズを決定するための、コンゴレッドで染色したマルタ十字架斑の画像解析
図１３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したコンゴ親和性マルタ十字架斑であって、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたマルタ十字架斑の量を計算するだけでなく、斑をサイズにしたがって並べる能力を有するＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ４．１を用いた画像解析に供した、前記斑を示す。本実施例において、図１２Ｆは、１：１０の重量比または１：５のモル比の、固定されたデキストラン硫酸（高分子量型）上、Ａβ４０を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたマルタ十字架斑を示すが、これをさらなる画像解析に用いた。この５マイクロリットルのアリコット中の斑の量は６３個であり、用いた１ｍｌあたり、総数１２，６００個の斑が形成されたと概算された。斑の直径は１〜４ミクロンから６０〜１００ミクロンの範囲であり、これによると、平均の斑直径は、１０〜４５ミクロンの間の範囲である。
【００５６】
（実施例６）
固定されたＧＡＧ上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたチオＳ染色斑
図１４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成し、そして蛍光下で観察したチオＳ染色斑を示す。この研究のため、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライドを、ＴＢＳ、あるいはウェルあたり５０マイクロリットルのデキストラン硫酸（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック；示すとおりに高分子量型）、ポリビニルスルホン酸（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック）またはデルマタン硫酸（脱イオン水中の１０ｍｇ／ｍｌストック）いずれかでコーティングし、そして風乾して薄い透明フィルムにした。次いで、１ｘＴＢＳ中の２５０μＭ  Ａβ４０をウェルあたり５０マイクロリットル添加し、そしてスライドを加湿チャンバーに入れ、そして３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。次いで、インキュベーションスライドのウェルあたり３０マイクロリットル、２０マイクロリットル、または８マイクロリットルのアリコットをウェルあたり５マイクロリットルの１２５μＭチオフラビンＳ溶液で染色し、そして蛍光ＦＩＴＣ光のもとで、２ｘ対物レンズで観察して、球状体として、多量のチオＳ陽性斑が見られることを示した。
【００５７】
（実施例７）
固定されたＧＡＧ上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたチオＳ染色斑の画像解析
図１５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したチオフラビンＳ陽性斑であって、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された球状チオＳ陽性斑の量を計算するだけでなく、斑をサイズにしたがって並べる能力を有するＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ４．１を用いた画像解析に供した、前記斑を示す。本実施例において、１：１０の重量比または１：５のモル比の、固定されたデキストラン硫酸（高分子量型）上のＡβ４０を、画像解析に用いた。画像解析のためのカウント範囲を、３０〜３５００平方ミクロンの間の範囲の面積および４〜１００ミクロンの間の範囲の直径として設定した。このセット閾値より下または上に属するものはすべて、データ解析には含まなかった。また、このセット範囲外に属する物体を視覚的に検証し、そしてこれらが、ガラス上の粒子状物質またはくず（ｊｕｎｋ）／繊維の塊いずれかであり、そしてコンゴレッド染色によって見られるような、典型的なコンゴ親和性マルタ十字架パターンを示さない（未提示）ことを確認した。この８マイクロリットルのアリコット中の斑の量は３２３個であり、用いた１ｍｌあたり、総数４０，３７５個の斑が形成されたと概算された。斑の直径は１〜４ミクロンから６０〜１００ミクロンの範囲であり、これによると、平均の斑直径は、１０〜２５ミクロンの間の範囲である。
【００５８】
（実施例８）
多様なリード化合物の適用に際する斑の破壊
図１６は、コンゴレッド染色後、偏光顕微鏡観察を利用して同定される斑のコンゴ親和性マルタ十字架パターンを阻害するか、減少させるか、または除去する能力に関してスクリーニングするため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであらかじめ形成されたアミロイド斑とインキュベーションした化合物または剤を示す。これらの研究のため、ウェルあたり３０マイクロリットルのデキストラン硫酸（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストックのＤｅｘＳ）、デルマタン硫酸（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストックのＤｅｒｍＳ）、ヘパリン（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストック）、またはＴＢＳのみを、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライド上にスポッティングし、そして風乾して薄い透明フィルムにした。次いで、１ｘＴＢＳ中の２５０μＭ  Ａβ４０をウェルあたり３０マイクロリットル添加し、そしてスライドを加湿チャンバーに入れ、そして３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。次いで、ウェルあたり５マイクロリットルをコンゴレッド染色に供して、マルタ十字架斑形成を確認した。次いで、残った未染色インキュベーションスライドを、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＤＣ−０００４、ＤＣ−００２１、およびＤＣ−００５１を含む、選択した抗アミロイド化合物での３日間の処理にさらに供した。化合物で３日間処理した後、次いで、ウェルを通常のコンゴレッド染色法に供して、そして偏光下で観察した。本実施例でわかるように、すべての条件で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマルタ十字架斑が形成される。特定の化合物での処理は、多様な度合いで、マルタ十字架斑パターンの破壊を示す。例えば、ＤＣ−０００４は、すべての条件で、マルタ十字架斑を破壊可能であり、一方、ＤＣ−００２１は、これらのあらかじめ形成されたマルタ十字架斑に対して、穏やかな破壊しか示さなかった。ＤＣ−００５１は、ＤＣ−０００４ほど頑強でないが、Ａβ４０単独、Ａβ４０＋デキストラン硫酸およびＡβ４０＋デルマタン硫酸のマルタ十字架斑に影響を及ぼすことが可能であった。Ａβ４０＋ヘパリン斑は、他のＧＡＧまたはＧＡＧ関連分子によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成された他の斑よりも、ＤＣ−００５１に、より影響を受けなかった。この種のスクリーニングは、また、よりハイスループットなスクリーニングのため、アミロイド斑量に関するマーカーとしてチオフラビンＴを用いて、９６ウェルアッセイプレート上でも実行可能である。
【００５９】
（実施例９）
リード化合物を用いたプロテアーゼ消化後の斑の破壊
図１７は、化合物または剤であって、これらの化合物が斑をプロテアーゼ消化に感受性にする能力に関してスクリーニングするため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであらかじめ形成されたアミロイド斑とインキュベーションし、そしてその後、２４時間プロテイナーゼＫ処理した、前記化合物または剤を示す。これらの研究のため、ウェルあたり３０マイクロリットルのデキストラン硫酸（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストックのＤｅｘＳ）、デルマタン硫酸（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストックのＤｅｒｍＳ）、ヘパリン（脱イオン水中の１ｍｇ／ｍｌストック）、またはＴＢＳのみを、テフロンでコーティングした１８ウェルのガラススライド上にスポッティングし、そして風乾して薄い透明フィルムにした。次いで、１ｘＴＢＳ中の２５０μＭ  Ａβ４０をウェルあたり３０マイクロリットル添加し、そしてスライドを加湿チャンバーに入れ、そして３７℃で１２〜２４時間インキュベーションした。次いで、ウェルあたり５マイクロリットルをコンゴレッド染色に供して、マルタ十字架斑形成を確認した。次いで、残った未染色インキュベーションスライドを、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＤＣ−０００４、ＤＣ−００２１、およびＤＣ−００５１を含む、選択した抗アミロイド化合物での３日間の処理にさらに供した。化合物で３日間処理した後、次いで、ウェルを３７℃で２４時間、プロテイナーゼＫ処理（１Ｕ／ｍｌ）に供する。次いで、インキュベーションスライドを５マイクロリットル／ウェルの１２５μＭコンゴレッドで染色して、そして偏光下で観察した。本実施例でわかるように、すべての条件で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマルタ十字架斑が形成される。特定の化合物で処理した後、プロテイナーゼＫで処理すると、多様な度合いで、マルタ十字架斑パターンの消失が示される。例えば、ＤＣ−０００４は、Ａβ４０＋デキストラン硫酸斑を除くすべての条件で、プロテアーゼ処理による斑除去を可能にした。ＤＣ−００２１処理は、Ａβ４０＋デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の組み合わせでｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された斑にプロテアーゼ感受性を与えたが、Ａβ４０＋デキストラン硫酸またはＡβ４０＋ヘパリンの斑には感受性を与えなかった。ＤＣ−００５１での処理は、Ａβ４０＋デルマタン硫酸およびＡβ４０＋ヘパラン硫酸であらかじめ形成された斑をプロテアーゼ処理に感受性にするのに穏やかにしか成功せず、一方、Ａβ４０＋デキストラン硫酸およびＡβ４０＋ヘパリンであらかじめ形成された斑では無効であった。
【００６０】
抗斑療法剤を同定するための適用
本明細書に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたコンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑をスクリーニング法に利用して、アルツハイマー病治療のリード化合物としての抗斑療法剤を同定することも可能である。好ましい態様において、こうしたスクリーニング法は、放射標識された、アミロイド・タンパク質（Ａβ）、硫酸化ＧＡＧ、硫酸化または陰イオン性巨大分子あるいはその断片を利用するであろう。好ましい態様において、Ａβ１−４０を、放射性ヨード（すなわち１２５Ｉ）などの放射性標識に結合させる。しかし他の適切な標識剤および技術が使用可能であり、そしてこれらには、限定されるわけではないが、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、または抗原標識が含まれる。同位体の中では、Ａβタンパク質またはその断片に取り込まれうるいかなる放射性物質も使用可能である。好ましい同位体には、限定されるわけではないが、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１３１Ｉが含まれる。１３１Ｉは、より短い半減期およびより高いエネルギーレベルを有する。酸化的ヨウ素化によって、タンパク質またはタンパク質断片にヨウ素放射性同位体を取り込ませることも可能である。また、ボルトン−ハンター試薬を使用して、ペプチドの求核基に、３−ヨード−４−ヒドロキシフェニルプロプリオニル基または３，５−ジヨード−４−ヒドロキシプロプリオニル基を付加することによって、放射性ヨードを取り込ませることも可能である。
【００６１】
他の同位体もまた、求核基またはペプチドと反応させることによって、取り込ませることも可能である。例えばプロピオニル−Ｎ−ヒロドキシスクシンイミドと反応させることによってトリチウム（３Ｈ）を取り込ませることも可能であり、また同様の試薬によって放射性イオウ（３５Ｓ）を取り込ませることも可能である。当業者に知られる方法による、３５Ｓを用いたＧＡＧまたは硫酸化巨大分子の標識もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイド斑コアが標識され、そして以下に記載するように監視されることを可能にするであろう。酵素法によって放射性リン（３２Ｐ）を取り込むことも可能である。さらに、適切なキレート基をまず添加するならば、９９ｍテクネチウムなどの多様な放射性金属イオンをＡβまたはその断片に取り込むことも可能である。
【００６２】
本発明にしたがったｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いた検出のため、酵素標識もまた有用である。好ましい酵素標識の中には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼなどのホスファターゼがある。
【００６３】
抗体に結合する抗原基を付加することによってペプチドまたはペプチド断片を修飾すると、ペプチドまたはペプチド断片自体の直接検出が可能になる。例えば、抗原・ジゴキシゲニンをペプチドに連結して、そして次いで、標識したジゴキシゲニン特異的抗体、または標識した抗−抗体で視覚化することも可能である。
【００６４】
放射性同位体より高感度ではないが、蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）もまたＡβペプチドに取り込んで、そして既知の蛍光検出技術にしたがって検出することも可能である。適切な蛍光体の例には、フルオレセイン、テキサスレッド等が含まれる。
【００６５】
ジオキセタンなどの直接または間接的化学発光標識もまた、本発明にしたがって使用可能である。例えば、Ａβペプチドを、分解するに連れて光を放出することが可能な基で修飾する。
【００６６】
さらに、アビジン−ビオチン系を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、Ａβペプチドまたはペプチド断片を検出することも可能である。例えば、ペプチドまたは断片をビオチンで官能化して、そしてアビジンまたはストレプトアビジンを添加し、タンパク質または断片を検出することも可能である。
【００６７】
Ａβが上述のように適切に標識されたら、本明細書に記載するような特定のＧＡＧ、硫酸化または陰イオン性巨大分子と組み合わせて、そして３７℃でインキュベーションして、コンゴ親和性マルタ十字架緻密アミロイド斑を形成する。標識斑をまず試験して、形成されたアミロイド斑の染色特徴および構造特徴が、標識の非存在下で形成されたものと同一であることを裏付ける。適切な標識技術後、斑の安定性を裏付けるパラメーターには：
ａ）形成された斑の球状の形状または緻密な形状、ｂ）コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際のコンゴ親和性のマルタ十字架パターン（すなわち斑の緑色に対して９０度の斑の赤色）、ｃ）チオフラビンＳでの陽性染色、ｄ）電子顕微鏡で観察した際の球状の外見および／または「アミロイド・スター」の外見、およびｅ）光学顕微鏡で観察した際の球状または緻密な形状（直径１０〜４０μｍの斑を伴う）が含まれる。標識アミロイド斑が、１以上の上述のような染色特徴および構造特徴を示す場合、抗斑療法剤を同定する多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に、これらを利用することも可能である。
【００６８】
１つのこうした好ましい方法において、標識斑コアを９６ウェルプレートに植え付け、そして一晩結合させる。当該技術分野に知られる異なる方法を利用して、ウェルに対するこうした標識斑結合の最適条件を決定する。こうした結合が達成されたら、多様な溶液／緩衝液（実験的に決定される）中のいくつかの化合物または剤を、多様なインキュベーション時間（実験的に決定される）で、標識斑を含有するウェルに添加する。化合物または剤を含有しないウェル、あるいは斑構築を改変するのに有効でないと考えられる化合物または剤を含有するウェルと、染色特性および構造特性を比較することによって、染色特性または緻密アミロイド斑の構造（以下に記載するとおり）を粉々にするか、破壊するか、または除去することが可能な剤または化合物を同定する。緻密アミロイド斑の染色または構造組成を粉々にするか、破壊するか、または除去することが可能な剤または化合物は、以下を含む、多様な手段によって同定可能である：
１）化合物または剤で処理していない斑のウェルに比較した、化合物または剤で処理した斑のウェルにおける上清（すなわち液体相）の放射標識の増加。放射性同位体などの標識を検出する方法は、同位体およびその対応するエネルギーレベルによって多様である。例えば、ガンマ・カウンターは、１２５Ｉを検出することが可能であるが、３Ｈ（トリチウム）または３５Ｓ−硫酸は検出不能であり、この場合、シンチレーションカウンターが必要であろう。上清中の標識の増加は、斑が破壊されるかまたは粉々にされたことを示し、既定の化合物または剤が、斑構築を粉々にするか、または破壊するのに有効であり、そしてしたがって、潜在的な抗斑療法剤と同定されることを示す。同定されたこうした剤または化合物を、限定されるわけではないが、以下を含む、二次スクリーニングまたは三次スクリーニングによってさらに同定することも可能である：１）コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際のコンゴ親和性のマルタ十字架パターンの減少または除去、これは、既定の化合物または剤が、アミロイド原線維構造を減少させるかまたは改変するのに有効であり、そしてしたがって潜在的な抗斑療法剤と同定されることを示す、２）チオフラビンＳでの陽性染色の減少または除去、これは、既定の化合物または剤が、アミロイド原線維構造を減少させるかまたは改変するのに有効であり、そしてしたがって潜在的な抗斑療法剤と同定されることを示す、３）電子顕微鏡で観察した際の球状の外見および／または「アミロイド・スター」の外見の減少、改変または除去、これは、既定の化合物または剤が、アミロイド斑の構築を改変するのに有効であり、そしてしたがって潜在的な抗斑療法剤と同定されることを示す、そして／または４）走査型電子顕微鏡で観察した際の、アミロイド斑の球状の形状または緻密な形状（直径１０〜４０μｍの斑を伴う）の減少、改変または除去、これは、既定の化合物または剤が、アミロイド斑の構築を改変するのに有効であり、そしてしたがって潜在的な抗斑療法剤と同定されることを示す。
【００６９】
その開示が本明細書に援用される、ＷＭ  ＨｕｎｔｅｒおよびＦＣ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５，  １９６２；ＡＥ  ＢｏｌｔｏｎおよびＷＭ  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １３３：５２９，  １９７３；並びにＨＰ  ＴｏｏおよびＪＥ  Ｍａｇｇｉｏ，  Ｍｅｔｈ．  Ｎｅｕｒｏｓｃ．  ６；２３２，  １９９１の方法を用いて、Ｎａ  １２５Ｉおよびクロラミン−Ｔを用いた酸化的放射性ヨウ素化によって、芳香族アミノ酸を含有するペプチドを放射標識し、そして逆相吸収によって遊離ヨウ素から分離することも可能である。
【００７０】
抗斑療法剤を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの別の方法は、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、マルタ十字架パターンを示す、本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された非標識緻密アミロイド斑を利用するであろう。適切な時間（実験的に決定される）、緻密アミロイド斑とインキュベーションした後、斑のコンゴ親和性マルタ十字架パターンを阻害するか、減少させるかまたは除去することが可能な化合物または剤は、偏光顕微鏡観察を利用して、潜在的な抗斑療法剤と同定される。こうした方法において、コンゴレッドで染色し、そして偏光下で観察した際、典型的なマルタ十字架パターンを示す緻密アミロイド斑をまず形成する（本明細書に記載するとおり）。試験化合物と（実験的に決定される適切な投薬量およびインキュベーション時間で）インキュベーションした後、ゼラチンでコーティングしたスライド上で緻密アミロイド斑を風乾し（本明細書に記載するとおり）、コンゴレッドで染色し、そして偏光顕微鏡下で観察して、コンゴ親和性および／またはマルタ十字架形成の損失があるように、既定の化合物または剤が、アミロイド斑構造を阻害するか、破壊するか、または除去することが可能であるかどうかを決定する。二次スクリーニングまたは三次スクリーニングには、既定の剤または化合物とのインキュベーション後の、透過型および走査型電子顕微鏡観察法による、こうした斑の解析が含まれるであろう。
【００７１】
抗斑療法剤を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの別の方法は、チオフラビンＳで染色し、そして蛍光顕微鏡で観察した際、陽性染色を示す、本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑を利用するであろう。適切な時間（実験的に決定される）、緻密アミロイド斑とインキュベーションした後、斑の陽性チオフラビンＳ蛍光を減少させるかまたは除去することが可能な化合物または剤は、潜在的な抗斑療法剤と同定される。二次スクリーニングおよび三次スクリーニングには、既定の剤または化合物とのインキュベーション後の、透過型および走査型電子顕微鏡観察法による、こうした斑の解析が含まれるであろう。
【００７２】
抗斑療法剤を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのさらに別の方法は、透過型電子顕微鏡で観察した際、球状の外見または「アミロイド・スター」の外見を示す、本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑を利用するであろう。適切な時間（実験的に決定される）、緻密アミロイド斑とインキュベーションした後、球状斑形状または「アミロイド・スター」の外見を破壊するかまたは改変することが可能な化合物または剤は、潜在的な抗斑療法剤と同定される。
【００７３】
抗斑療法剤を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのさらに別の方法は、走査型電子顕微鏡で観察した際、１０〜４０μｍのアミロイド斑直径（２５μｍの平均斑直径）を持つ球状の形状を示す、本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑を利用するであろう。適切な時間（実験的に決定される）、緻密アミロイド斑とインキュベーションした後、球状斑形状を破壊するかまたは改変し、あるいはアミロイド斑の直径を実質的に減少させることが可能な化合物または剤は、潜在的な抗斑療法剤と同定される。
【００７４】
抗斑療法剤を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのさらに別の方法は、本明細書に記載するように形成された緻密アミロイド斑のサイズおよび形状を利用するであろう。球状アミロイド斑の構造（すなわちサイズおよび／または直径）を阻害するか、破壊するか、または除去する剤または化合物は、細胞選別機を伴う方法論を用いて同定可能である。こうしたアッセイにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される緻密球状アミロイド斑を、細胞選別機に通して、こうした斑の平均直径（および直径範囲）を決定することも可能である。１つの好ましい態様において、形成されるアミロイド斑コアを、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰ細胞選別機（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、フロリダ州ハイアリーア）に装填し、そして１００Ｍｍ  ３ｘチップを通して、１４２８粒子／秒の流速で流動させる。側方散乱光に基づく選別のため、４８８ｎｍで励起が最大となるアルゴンレーザーを用いる。選択される斑コアは、サイズ（１０〜５０Ｍｍ）に基づくであろう。電子顕微鏡による観察に基づいて、本明細書に記載する方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるアミロイド斑は、通常、１０〜４０μｍの直径範囲、平均２５μｍの直径を有する。適切な条件およびインキュベーション時間（実験的に決定される）のもとで、既定の化合物または剤とインキュベーションした後、細胞選別機を用いて平均斑直径（すなわちサイズ）を決定する評価によって、剤または化合物の非存在下で形成された斑を、剤または化合物とインキュベーションされて形成された斑と比較する。別の方法において、本明細書に記載するような方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された斑を、特定の時間（実験的に決定される）、化合物または剤で処理し、そして次いで、細胞選別機を用いて、こうして処理した斑の平均直径を決定し、そして未処理斑の平均直径と比較する。既定の化合物または剤が、緻密斑のサイズ（およびしたがって直径）を粉々にするか、または破壊するのに有効であれば、より小さい直径（すなわち、より小さい斑またはその粉々になった構成要素）の比率の増加が観察されるであろう。適切な時間（実験的に決定される）、緻密アミロイド斑とインキュベーションした後、アミロイド斑の直径を乱すか、または実質的に減少させることが可能な化合物または剤は、潜在的な抗斑療法剤と同定される。
【００７５】
本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたアミロイド斑の別の潜在的な有用性は、Ａβの神経毒性効果を減少させるかまたは除去するのに有効な剤または化合物を同定することである。最初の組の実験では、本明細書に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑が、培養中のおよび／または動物モデル中のニューロンに対して毒性を引き起こすかどうか決定することが重要であろう（以下に記載する）。こうした細胞培養実験には、まず、緻密アミロイド斑を本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成し、そして初代ニューロン（標準的であり、そして当業者に知られる技術を用いて単離する）またはニューロン細胞株を含有するペトリ皿に入れる。ニューロン培養物とアミロイド斑を長期インキュベーション（すなわち４８時間または７２時間）した後、神経毒性レベル（当該技術分野に知られる標準的アッセイを用いる）を測定し、そしてアミロイド斑を含有しない培養物に比較する。緻密アミロイド斑が、細胞培養物において、神経毒性効果を示すことが可能であれば、潜在的な抗神経毒性療法剤である剤または化合物をスクリーニングし、そして同定するのに、これらのアミロイド斑をさらに利用することも可能である。こうした方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑を、初代ニューロン培養物中で、またはニューロン細胞株中で、長期間（すなわち４８時間または７２時間）、そして既定の試験化合物または剤の存在下または非存在下でインキュベーションする。次いで、アミロイド斑のインキュベーションによって引き起こされる神経毒性を阻害するかまたは減少させることが可能な剤または化合物を、抗神経毒性剤と同定する。
【００７６】
研究適用
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された緻密アミロイド斑は、多様な異なる研究適用に有用であろうと期待される。１つの例において、あらかじめ形成された緻密アミロイド斑を、他の細胞（例えばニューロン、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）を含有する培養物に入れ、そして培養中のこうしたアミロイド斑に対する細胞の反応（すなわち食作用、分解）を測定することも可能である。別の例において、当業者に知られる標準的技術を用いて、培養中のこうした緻密アミロイド斑に対する個々の巨大分子（すなわちアミロイド症に関連付けられる他の構成要素、例えばアポリポタンパク質Ｅ、アミロイドＰ構成要素、補体因子、サイトカイン、炎症性因子）の反応を評価することもまた可能である。
【００７７】
さらに、細胞構築および／または多様な巨大分子（すなわちベータ−アミロイド前駆体タンパク質、特定のプロテオグリカン）の代謝に対する緻密アミロイド斑沈着、集積および残留性の影響もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで研究することも可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの緻密アミロイド斑のこうした使用は、将来、実用的で、そして未開拓の適用を伴う、研究の新たな手段を生じるであろう。
【００７８】
本発明の別の潜在的な適用は、キットの形で、あらかじめ形成された緻密アミロイド斑、またはこうした緻密アミロイド斑を産生する能力を提供することである。こうしたキットは、抗斑療法剤として潜在能力を有する化合物または剤のスクリーニングおよび同定に有用である可能性もある。こうしたキットは、ａ）緻密アミロイド斑形成に適した量または必要な濃度（本明細書に記載される）で、低原線維Ａβ１−４０（好ましくは溶液中のまたは凍結乾燥されたＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（カタログ番号Ａ−１０５２−２）のＡβ４０）を有する第一の容器、ｂ）緻密アミロイド斑形成に適した量または必要な濃度（本明細書に記載される）で、溶液中のまたは凍結乾燥された、特定のＧＡＧ（例えばヘパリンまたはヘパラン硫酸）、または特定の硫酸化巨大分子（例えばデキストラン硫酸、ペントサン・ポリ硫酸またはポリビニルスルホン酸）を含有する第二の容器で構成されることも可能である。こうしたコンゴ親和性マルタ十字架アミロイド斑形成は、２つの容器各々から適切な量を混合した後に生じるであろう。
【００７９】
別のキットにおいて、緻密アミロイド斑があらかじめ形成され、そして次いで、流通のため、凍結されるかまたは凍結乾燥されることも可能である。研究者または個人が受け取ったら、蒸留水またはＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適切な溶液中、そして適切な体積の溶液に入れることによって、緻密アミロイド斑を再形成することも可能である。こうしたキットを、研究および／または商業的適用に使用することも可能である。
【００８０】
法律にしたがって、本発明は、構造特徴に関して、多かれ少なかれ特異的に記載されている。しかし、示した手段および構築は、本発明を達成する好ましい型を含むため、本発明は示した特定の特徴に限定されないことが理解されるものとする。したがって、本発明は、均等論にしたがって適切に解釈される、付随する請求項の正当でそして有効な範囲内の型または修飾のいずれにおいても請求される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａ〜１Ｌは、１つの態様における、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の顕微鏡写真である。
【図２】図２Ａ〜２Ｉは、別の態様による、コンゴ親和性でそしてマルタ十字架球状であるアミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の顕微鏡写真である。
【図３】図３Ａ〜３Ｉは、別の態様による、コンゴ親和性でそしてマルタ十字架球状であるアミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の顕微鏡写真である。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、別の態様による、コンゴ親和性マルタ十字架球状アミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の顕微鏡写真である。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の方法の別の態様における、球状アミロイド斑のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成の顕微鏡写真である。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、透過型電子顕微鏡で観察した際、ヒト・アルツハイマー病の脳由来の単離アミロイド斑コアに実質的に同一である、パールカンによって誘導された、球状「アミロイド・スター」形成の顕微鏡写真である。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、パールカンまたはデキストラン硫酸によって誘導され、そして走査型電子顕微鏡で観察した、アミロイド斑コア形成の顕微鏡写真である。
【図８】図８は、異なる硫酸化ＧＡＧまたはＧＡＧ関連巨大分子を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑形成を示す。
【図９】図９は、マルタ十字架ｉｎ  ｖｉｔｒｏ斑および対応する電子顕微鏡写真（ＥＭ）に比較した、ヒト・アルツハイマー病の脳におけるアミロイド・スター斑の例を示す。
【図１０】図１０は、超音波処理を伴う、および伴わない、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマルタ十字架斑形成を示す。
【図１１】図１１は、固定化ＧＡＧ法におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏのマルタ十字架斑形成を示す（２Ｘ対物レンズ）。
【図１２】図１２は、図４のマルタ十字架斑形成を示すが、１０Ｘ対物レンズを用いている。
【図１３】図１３は、斑サイズを決定するためのコンゴレッドで染色したマルタ十字架斑の画像解析を示す（直径ミクロン−μｍ）。
【図１４】図１４は、固定されたＧＡＧ（および／またはＧＡＧ関連巨大分子）上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され、チオＳで染色された斑を示す。
【図１５】図１５は、固定されたＧＡＧ（および／またはＧＡＧ関連巨大分子）上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され、チオＳで染色された斑の画像解析を示す。
【図１６】図１６は、多様なリード化合物の適用に際する斑の破壊を示す。
【図１７】図１７は、プロテアーゼ消化後、リード化合物での斑の破壊を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
0004469281.tif 000003
【図１ｃ】
0004469281.tif 000004
【図１ｄ】
0004469281.tif 000005
【図１ｅ】
0004469281.tif 000006
【図１ｆ】
0004469281.tif 000007
【図１ｇ】
0004469281.tif 000008
【図１ｈ】
0004469281.tif 000009
【図１ｉ】
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【図１ｊ】
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【図１ｋ】
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【図１ｌ】
0004469281.tif 000013
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
0004469281.tif 000020
【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図３ａ】
0004469281.tif 000023
【図３ｂ】
0004469281.tif 000024
【図３ｃ】
0004469281.tif 000025
【図３ｄ】
0004469281.tif 000026
【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図４ａ】
0004469281.tif 000032
【図４ｂ】
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【図５ａ】
0004469281.tif 000034
【図５ｂ】
0004469281.tif 000035
【図６ａ】
0004469281.tif 000036
【図６ｂ】
0004469281.tif 000037
【図６ｃ】
0004469281.tif 000038
【図６ｄ】
0004469281.tif 000039
【図７ａ】
0004469281.tif 000040
【図７ｂ】
0004469281.tif 000041
【図７ｃ】
0004469281.tif 000042
【図７ｄ】
0004469281.tif 000043
【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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