(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸。
【請求項２】
核酸が、配列番号：３、５、７、９、３９、または４１に記載の核酸配列を含む、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
核酸がゲノムDNAまたはcDNAである、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項４】
核酸がポリペプチドの発現のための調節配列と機能的に結合しており、該調節配列がプロモーターを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
プロモーターが構成的プロモーターであるか、1つまたはそれ以上の外部因子によって誘導可能であるか、または細胞種特異的である、請求項4記載の核酸。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載の核酸を含み、該核酸にコードされるペプチドの発現をベクター含有細胞において指向する能力を有するベクター。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載の核酸を含む単離された細胞。
【請求項８】
線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、昆虫細胞、胚幹細胞およびリンパ球からなる群より選択される、請求項7記載の単離された細胞。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれかに記載の核酸を含むトランスジェニック細胞であって、該核酸が該トランスジェニック細胞内で発現する、トランスジェニック細胞。
【請求項１０】
実質的に純粋な配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項1〜5のいずれかに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１２】
生理学的に許容される担体中に処方されている活性成分として、請求項10または11記載のポリペプチドを含む治療的組成物。
【請求項１３】
動物細胞における配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードするIAP遺伝子を検出する方法であって、請求項1記載の核酸または長さが約18ヌクレオチドを超えるその一部を、該動物細胞からのゲノムDNA調製物と接触させる段階を含む、方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、IAPポリペプチドを得るための方法：
（a）細胞内で発現するための位置に置かれた、配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードする核酸を有する細胞を提供する段階、
（b）該核酸が発現するための条件下で該細胞を培養する段階、および
（c）該IAPポリペプチドを単離する段階。
【請求項１５】
核酸が、1つまたはそれ以上の外部因子によって誘導可能なプロモーターをさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、組換えDNAライブラリーから配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードするIAP遺伝子を単離する方法：
（a）組換えDNAライブラリーを提供する段階、
（b）配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードするIAP遺伝子を検出できるようなハイブリダイゼーション条件下において、該組換えDNAライブラリーと、検出可能な標識がなされた長さが約18ヌクレオチドを超える配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２をコードする核酸の断片とを接触させる段階、および
（c）該検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子のメンバーを単離する段階。
【請求項１７】
配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドと特異的に結合する精製抗体。
【請求項１８】
（a）配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドを発現している細胞を提供する段階と、
（b）配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドをコードするIAP遺伝子の発現レベルの変化からアポトーシスを調節する化合物の存在が示されるような、該細胞と候補化合物とを接触させ、IAP遺伝子の発現をモニターする段階とを含む、アポトーシスを調節する化合物を同定する方法。
【請求項１９】
IAP遺伝子が、配列番号：３、５、７、９、３９、または４１を含むDNAを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
細胞がリンパ球であって、IAPが、配列番号：６および８を含むポリペプチドからなる群より選択され、調節が、配列番号：６または８を含むポリペプチドの発現の増強である、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
IAP遺伝子の発現が蛋白質検出によってモニターされる、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
アポトーシス性疾患の存在またはアポトーシス性疾患を発症する可能性が高いか否かに関して哺乳動物を診断するためのキットであって、配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドと特異的に結合する実質的に純粋な抗体を含む、キット。
【請求項２３】
抗体の配列番号：４、６、８、１０、４０、または４２を含むポリペプチドとの結合を検出するための手段をさらに含む、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
アポトーシスの抑制に用いるための請求項1〜5のいずれかに記載の核酸。
【請求項２５】
アポトーシスの抑制に用いるための請求項10または11記載のポリペプチド。
【請求項２６】
アポトーシスを抑制するための医薬品の製造を目的とする請求項10または11記載のポリペプチドの使用。
【請求項２７】
アポトーシスを抑制するための医薬品の製造を目的とする請求項1〜5のいずれかに記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明はアポトーシスに関する。
細胞の死滅には2つの一般的な様式がある。最もよく認識されている様式は壊死によるものであり、これは通常は細胞のホメオスタシスを破壊するのに十分な重度の損傷によって引き起こされる。典型的には、細胞の浸透圧が乱され、その結果として細胞が膨張し、続いて破裂する。細胞内容物が周囲の組織空間に漏出した場合には、しばしば炎症反応が引き続いて起こる。
細胞が死滅する第2の一般的な様式は、アポトーシスまたはプログラム細胞死と呼ばれる。アポトーシスは非常に迅速に起こるため、検出が難しい場合が少なくない。これは、幅広いさまざまな生物的過程におけるアポトーシスの関与が、ごく最近になるまで認識されなかった理由の説明となると思われる。
アポトーシス経路は、進化の過程を通じて高度に保存されており、胚発生、ウイルスの病原性、癌、自己免疫疾患および神経変性疾患において重要な役割を果たしている。例えば、過剰なアポトーシスは、AIDS、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、色素性網膜炎および他の網膜疾患、骨髄異形成症候群（再生不良性貧血など）、アルコール中毒症などの中毒性肝障害、ならびに虚血性損傷（例えば、心筋梗塞、脳卒中および再潅流障害など）を引き起こしたり、その一因となる場合がある。逆に、アポトーシス性反応の不全は、特に濾胞性リンパ腫、p53を介した癌（p53-mediated carcinoma）およびホルモン依存性腫瘍などの癌、エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患、ならびにヘルペスウイルス、ボックスウイルスおよびアデノウイルスなどに起因するウイルス感染症の発生に関係するとされている。
HIV-1に感染した患者では、マイトジェンまたはスーパー抗原による刺激に成熟CD4+Tリンパ球が反応してアポトーシスを生じる。しかし、これらの細胞の大多数はウイルスには感染しない。したがって、HIV感染の初期に免疫系のこの極めて重要な部分が破壊される原因は不適切な抗原誘発性アポトーシスであると考えられる。
バキュロウイルスは、昆虫細胞がウイルスに感染した場合に通常ならば起こるはずのアポトーシスを抑制することからアポトーシス蛋白質抑制因子と呼ばれている蛋白質をコードする。これらの蛋白質は、他のウイルス蛋白質とは独立した様式で作用すると考えられている。バキュロウイルスのIAP遺伝子は、DNA結合に直接関与すると推定されているリングジンクフィンガー様モチーフ（RZF）、およびBIRドメインと呼ばれる70アミノ酸反復モチーフ（バキュロウイルスIAP反復部）からなる2つのN端ドメインを含む。
発明の概要
一般に、本発明は、哺乳類IAPポリペプチドをコードするゲノム、cDNAまたは合成DNA分子などの実質的に純粋なDNA分子を特徴とする。このDNAは、ベクター内に、哺乳類、酵母もしくは細菌などの細胞内に、またはトランスジェニック動物もしくはその胚内に組み込まれたものでもよい。好ましい態様において、このDNA分子はマウス遺伝子（例えば、m-xiap、m-hiap-1またはm-hiap-2）またはヒト遺伝子（例えば、xiap、hiap-1またはhiap-2）である。最も好ましい態様において、IAP遺伝子はヒトIAP遺伝子である。その他のさまざまな好ましい態様において、細胞は形質転換細胞である。関連した局面において、本発明は、アポトーシスを通常起こす能力を有する組織、すなわちアポトーシスの導入または抑制のいずれかによって損傷を受ける組織において発現する、またはそのような組織に送達されるIAPポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を特徴とする。さらにもう1つの態様において、本発明は、本明細書で提供されるBIRドメインおよびRZFドメインを含むIAPポリペプチドの断片をコードするDNAを特徴とする。
特殊な態様において、本発明は、図1〜6に示した配列またはその断片と実質的に同一なDNA配列を特徴とする。もう1つの局面において、本発明は、本明細書で説明するDNAによってコードされるRNAも特徴とする。好ましくは、このRNAはmRNAである。別の態様において、このRNAはアンチセンスRNAである。
もう1つの局面において、本発明は、図1〜6に示したIAPアミノ酸配列の1つと実質的に同一な配列を有する実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。
第2の局面において、本発明は、アポトーシスを起こす能力を有する細胞内でIAP遺伝子を発現する能力を有するプロモーターを含む実質的に純粋なDNAを特徴とする。好ましい態様において、このIAP遺伝子はxiap、hiap-1またはhiap-2である。最も好ましくは、この遺伝子はヒトまたはマウスの遺伝子である。hiap-2をコードする遺伝子は、図3に示したような完全長の遺伝子でも、または図3の枠で囲まれた配列が欠失した変異体などの切断型変異体でもよい。
好ましい態様において、プロモーターはIAP遺伝子に固有のプロモーターである。また、転写および翻訳に関する調節領域は、好ましくはIAP遺伝子に固有のものである。もう1つの態様において、本発明は、遺伝子組換え細胞系およびトランスジェニック動物を提供する。本発明の遺伝子組換え細胞は、好ましくはそのアポトーシス反応が改変された細胞である。好ましい態様において、この遺伝子組換え細胞は、線維芽細胞、神経細胞、リンパ球、グリア細胞、胚幹細胞または昆虫細胞である。最も好ましくは、ニューロンは運動ニューロンであり、リンパ球はCD4+T細胞である。
もう1つの局面において、本発明は、IAPポリペプチドをコードする導入遺伝子を有する遺伝子組換え細胞の作製を含む、アポトーシス抑制の方法を特徴とする。この導入遺伝子は、発現を可能とするような様式で細胞のゲノムに組み込まれる。さらに、細胞内での発現のレベルはアポトーシスを抑制するのに十分である。
関連した局面において、本発明は、少なくとも1つのIAP遺伝子のコピーが増えるような形でゲノム内に挿入された（変異型または野生型）、またはゲノム内の少なくとも1つのIAP遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類、最も好ましくはマウスを特徴とする。このトランスジェニック動物は、用いた構築物およびゲノム改変の性質に応じて、増加または減少した量のIAPポリペプチドを発現すると考えられる。例えば、IAPの全体または一部をコードする核酸分子を用いてIAP遺伝子中にノックアウト変異を生じるように操作することによって、対応するIAPポリペプチドの全体または一部の発現が低下した動物が作製される。これに対して、好ましくは活性のある調節性およびプロモーター性の要素の制御下において、IAP遺伝子の全体または一部の外因性コピーをゲノム中に挿入することは、対応するIAPポリペプチドの発現の増強をもたらすと考えられる。
もう1つの局面において、本発明は、細胞からのゲノムDNAの調製物を用いてのIAP遺伝子またはその一部（これは9ヌクレオチド長を超え、好ましくは18ヌクレオチド長を超える）との接触により、細胞内のIAP遺伝子を検出する方法を特徴とする。IAP遺伝子およびゲノムDNAは、HIAP-1、HIAP-2またはXIAPポリペプチドをコードするDNAとの同一性が少なくとも50％であるDNA配列のハイブリダイゼーション（およびその結果としての検出）を可能とする条件下において接触させられる。
もう1つの局面において、本発明はIAPポリペプチドを産生する方法を特徴とする。この方法には、IAPポリペプチドの全体または一部をコードするDNA（これは細胞内で発現するための位置に置かれている）を有する細胞の提供、DNAの発現を可能とする条件下における細胞の培養、およびIAPポリペプチドの単離が含まれる。好ましい態様において、IAPポリペプチドは、構成的または誘導可能なプロモーターの制御下にあるDNAによって発現される。本明細書で説明する通り、プロモーターは異種プロモーターであってもよい。
もう一つの局面において、本発明は実質的に純粋な哺乳類IAPポリペプチドを特徴とする。好ましくは、このポリペプチドは、図1〜4のいずれか1つに示されたアミノ酸配列の全体またはその断片と実質的に同一なアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、このポリペプチドは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、M-XIAP-1またはM-HIAPのポリペプチドである。また、BIRドメイン（RZFは含まない）、RZFドメイン（BIRドメインは含まない）、および本明細書で提供される少なくとも1つのBIRドメインを有するRZFドメイン、の1つまたはそれ以上を含む断片も本発明の一部である。
もう1つの局面において、本発明は、アポトーシスを調節する能力を有する組換え哺乳類ポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、本明細書で定義するように、少なくとも1つのリングジンクフィンガードメインおよびBIRドメインを含む。好ましい態様において、本発明は、（a）実質的に純粋な1つのポリペプチド、および（b）そのポリペプチドをコードする1つのオリゴヌクレオチドを特徴とする。このポリペプチドがリングジンクフィンガードメインを含む場合には、このリングジンクフィンガードメインは以下の配列と一致する配列を有すると考えられる：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGluまたはAsp、Xaa3はValまたはIleである（配列番号：1）；また、ポリペプチドは少なくとも1つのBIRドメインを含み、BIRドメインは以下の配列を有すると考えられる：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-Gly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2は任意のアミノ酸であっても欠失していてもよい（配列番号：2）。
さまざまな好ましい態様において、このポリペプチドは少なくとも2つ、またはより好ましくは少なくとも3つのBIRドメインを有し、RZFドメインは図6に示したIAP配列の1つを有し、BIRドメインは図5に示したBIRドメインから構成される。その他の好ましい態様において、BIRドメインは、RZFドメインと比較して蛋白質のアミノ末端に位置しており、RZFドメインはポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍に位置している。
もう1つの局面において、本発明は、（a）DNAの試料を提供する段階、（b）IAP性疾患抵抗性遺伝子の保存領域との配列相同性を有する1対のオリゴヌクレオチドを提供する段階、（c）ポリメラーゼ連鎖反応を介したDNA増幅に適した条件下において、1対の該オリゴヌクレオチドと細胞DNA試料とを混合する段階、および（d）増幅されたIAP遺伝子またはその断片を単離する段階、を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子を特徴とする。
好ましい態様において、増幅は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、例えばRACE法を用いて実施される。もう1つの局面において、本発明は、（a）DNAの調製物を提供する段階、（b）IAP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能な標識がなされたDNA配列を提供する段階、（c）ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子が検出できるようなハイブリダイゼーション条件下において、DNA調製物と検出可能な標識がなされたDNA配列とを接触させる段階、および（d）検出可能な標識とのその会合によりIAP遺伝子を同定する段階、を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子を特徴とする。
もう1つの局面において、本発明は、（a）細胞試料を提供する段階、（b）形質転換により細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、（c）細胞試料内において候補IAP遺伝子を発現させる段階、および（d）その反応によってIAP遺伝子が同定されるよう改変されたアポトーシス反応をその細胞試料が呈するか否かを判定する段階、を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子を特徴とする。
もう1つの局面において、本発明は、（a）細胞DNAの調製物（例えば、ヒトゲノムまたはcDNAライブラリー（アポトーシスを起こす細胞種から単離されたcDNAライブラリーなど）からのもの）を提供する段階、（b）IAP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能な標識がなされたDNA配列（例えば、本発明の方法によって調製されたもの）を提供する段階、（c）ヌクレオチドの配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子を検出できるようなハイブリダイゼーション条件下において、細胞DNAの調製物と検出可能な標識がなされたDNA配列とを接触させる段階、および（d）検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を同定する段階を含む、細胞内のIAP遺伝子を同定する方法を特徴とする。
もう1つの局面において、本発明は、（a）組換えライブラリーを提供する段階、（b）ヌクレオチドの配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子を検出できるようなハイブリダイゼーション条件下において、該ライブラリーと、本発明のPCR法に従って産生された検出可能な標識がなされた遺伝子断片とを接触させる段階、および（c）検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を単離する段階を含む、組換えライブラリーからIAP遺伝子を単離する方法を特徴とする。もう1つの局面において、本発明は、（a）細胞組織の試料を提供する段階、（b）形質転換により該細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、（c）細胞試料内において候補IAP遺伝子を発現させる段階、および（d）アポトーシスにおける変化（すなわち、調節など）によってIAP遺伝子が同定される、細胞試料がアポトーシスの抑制を示すか否かの決定を含む、IAP遺伝子を同定する方法を特徴とする。好ましくは、この細胞試料は、アポトーシスについてアッセイが可能と考えられる細胞種である（例えば、T細胞、B細胞、神経細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、グリア細胞、胚幹細胞、および線維芽細胞）。候補IAP遺伝子は例えばcDNA発現ライブラリーから入手したものであり、アッセイされる反応はアポトーシスの抑制である。
もう1つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるアポトーシスを抑制する方法であって、（a）アポトーシスを起こしやすい細胞へ少なくとも1つのIAPポリペプチドをコードするDNAを提供する段階であって、そのDNAが細胞のゲノムに組み込まれて細胞内で発現するための位置に置かれており、IAP遺伝子が遺伝子の制御された発現に適した調節配列の制御下にあり、そのIAP導入遺伝子がIAP導入遺伝子を欠く細胞と比較してアポトーシスを抑制するのに十分なレベルで発現するようなDNAを提供する段階、を含む方法を特徴とする。ゲノム内に組み込まれるDNAは、IAPポリペプチドの全体または一部をコードするものでもよい。それは、例えば、1つのリングジンクフィンガーおよび1つまたはそれ以上のBIRドメインをコードするものでもよい。これに対して、それは、リングジンクフィンガーのみ、または1つもしくはそれ以上のBIRドメインのみのいずれかをコードするものでもよい。当業者には、望ましくないアポトーシスを抑制するためにIAPポリペプチドが直接投与されてもよいことが認識されると思われる。
関連した局面において、本発明は、IAP遺伝子またはその断片を含む導入遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞を作製することによってアポトーシスを抑制する方法を特徴とする。このIAP遺伝子は、IAP遺伝子の構成的発現を提供するプロモーターの制御下にある位置に置かれてもよい。または、IAP導入遺伝子は、環境刺激によって調節されるような遺伝子の発現を可能とするプロモーターの制御下にある位置に置かれてもよい。例えば、IAP遺伝子は、組織特異的もしくは細胞種特異的なプロモーターを用いて、または化学的信号もしくは試薬などの外来性信号もしくは外来性因子の導入によって活性化されるプロモーターによって発現されてもよい。好ましい態様において、この細胞は、リンパ球、神経細胞、グリア細胞または線維芽細胞である。その他の態様において、それはHIVに感染したヒト、または神経変性疾患、虚血性損傷、中毒性肝障害もしくは骨髄異形成性症候群に罹患した哺乳動物の細胞である。
関連した局面において、本発明は、アポトーシス抑制量のIAPポリペプチドを提供することによって哺乳動物におけるアポトーシスを抑制する方法を提供する。IAPポリペプチドは完全長のポリペプチドであってもよく、本明細書に記載するその断片の1つであってもよい。
もう1つの局面において、本発明は、IAPファミリー蛋白質と特異的に結合する精製抗体を特徴とする。このような抗体は、IAPポリペプチドの同定のための任意の標準的な免疫検出法において用いることができる。好ましくは、この抗体はXIAP、HIAP-1またはHIAP-2と特異的に結合する。さまざまな態様において、この抗体は、他のIAPポリペプチドと反応してもよく、1つまたは少数のIAPポリペプチドに特異的であってもよい。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。好ましくは、抗体はIAPポリペプチドの1つのみと特異的に反応し、例えばマウスおよびヒトのxiapとは反応するが、他の哺乳動物種のhiap-1またはhiap-2とは反応しない。
本発明の抗体はさまざまな方法によって調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の産生を誘発させるために、動物にIAPポリペプチドまたはその抗原性断片を投与してもよい。または、本明細書で記載するように使用される抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製されるモノクローナル抗体であってもよい（例えば、Kohlerら、Nature 256:495、1975；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6：511、1976；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6:292、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma）、Elsevier、NY、1981）。本発明は、ヒトもしくはマウスのIAPポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体を特徴とする。特に本発明は「中和」抗体を特徴とする。「中和」抗体とは、IAPポリペプチドの任意の生物活性、特にIAPがアポトーシスを抑制する能力を阻害する抗体を意味する。中和抗体は、IAPポリペプチドがポリペプチドを阻害する能力を、好ましくは50％、より好ましくは70％、最も好ましくは90％またはそれ以上低下させると考えられる。中和抗体の評価には、本明細書で説明するものを含め、アポトーシスの任意の標準的なアッセイを用いることができる。
本来のモノクローナルおよびポリクローナルの抗IAP抗体のほかに、本発明は、さまざまな遺伝的に操作された抗体、ヒト化抗体ならびにF（ab’）2、Fab’、Fab、FvおよびsFv断片を含む抗体断片を特徴とする。抗体は、当技術分野で公知の方法によってヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化することができる（Scotgene、Scotland；Oxford Molecular、Palo Alto、CA）。また、トランスジェニック動物で発現されるような完全なヒト抗体も本発明の特徴である（Greenら、Nature Genetics 7:13〜21、1994）。
ラドナー（Ladner）（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、単一ポリペプチド鎖抗体を調製する方法を記載している。ワード（Ward）ら（Nature 341:544〜546, 1989）は、重鎖可変領域の調製物を記載しており、高い抗原結合親和性を有するそれらを「単一領域抗体」と命名している。マッカファーティー（MacCafferty）ら（Nature 348:552〜554, 1990）は、完全な抗体V領域がfdバクテリオファージの表面に提示され、このファージが抗原と特異的に結合し、ファージのごく一部（100万個のうち1個）をアフィニティクロマトグラフィーの後に単離することができることを示している。ボス（Boss）ら（米国特許第4,816,397号）は、免疫グロブリン、および単一宿主細胞において少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含んでおり免疫機能を有するその断片を産生するためのさまざまな方法を記載している。キャビリー（Cabilly）ら（米国特許第4,816,567号）はキメラ抗体を調製するための方法を記載している。
もう1つの局面において、本発明は、アポトーシスを調節する化合物を同定するための方法を特徴とする。この方法は、IAPポリペプチドを発現する細胞の提供、その細胞と候補化合物との接触、およびIAP遺伝子の発現の観測を含む。IAP遺伝子の発現レベルにおける変化により、アポトーシスを調節する化合物が存在することが示される。この化合物はアポトーシスの抑制因子でも増強因子でもよい。さまざまな好ましい態様において、この細胞は、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、リンパ球（T細胞またはB細胞）または昆虫細胞であり、その発現が観測されるポリペプチドは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、M-XIAP、M-HIAP-1またはM-HIAP-2（すなわち、ヒトまたはマウス）である。
関連した局面において、本発明は、相互作用トラップ（interaction trap）技術、およびおとり（bait）の要素としてIAPポリペプチドまたはその断片を用いてアポトーシスを調節する化合物を検出する方法を特徴とする。好ましい態様において、アポトーシスの調節因子として試験される化合物はポリペプチドでもある。
もう1つの局面において、本発明は、IAP核酸プローブまたは抗体を用いて、細胞増殖性疾患、またはそのような疾患の易発症性（increased likelihood）を診断するための方法を特徴とする。好ましくは、この疾患は癌である。最も好ましくは、この疾患は、前骨髄球性白血病、Hela型癌、慢性骨髄性白血病（好ましくはxiapまたはhiap-2に関連したプローブを用いる）、リンパ芽球性白血病（好ましくはxiapに関連したプローブを用いる）、バーキットリンパ腫（好ましくはhiap-1に関連したプローブを用いる）、結腸直腸腺癌、肺癌および悪性黒色腫（好ましくはxiapプローブを用いる）からなる群より選択される。好ましくは診断は、発現または活性が2倍に増強することによって示され、より好ましくは、発現または活性が少なくとも10倍に増強することによってなされる。
当業者には、哺乳類IAPまたはその断片（本明細書で説明するようなもの）が、治療的組成物における活性成分として機能すると考えられることが認識されると思われる。この組成物は、それに含まれるIAPまたは断片に応じて、アポトーシスを調節し、それによってアポトーシスの障害によって引き起こされる任意の状態を治療するために用いることができると考えられる。
このほか、IAP依存的な抗アポトーシス経路の負の調節因子を細胞に投与することによって、該細胞においてアポトーシスが誘導されるとも考えられる。この負の調節因子は無制限的に、リングジンクフィンガーを含むIAPポリペプチド、およびリングジンクフィンガーを含むが少なくとも1つのBIRドメインを欠失したIAPポリペプチドであってもよい。または、以上の2つのポリペプチドなどのIAPポリペプチドをコードする遺伝子を投与することによって、細胞にアポトーシスを誘導させることもできる。さらにもう1つの方法では、負の調節因子は、IAPポリペプチドと特異的に結合する精製抗体またはその断片であってもよい。例えば、この抗体は、少なくとも1つのBIRドメインを含むがリングジンクフィンガードメインは欠失したIAPポリペプチドの約26KDaの切断産物と結合するものでもよい。また、負の調節因子はIAPアンチセンスmRNA分子であってもよい。
以上に概要を示した通り、アポトーシスを調節するために、IAP核酸またはIAPポリペプチドを用いることができる。さらに、アポトーシスを調節するための医薬品の製造において、IAP核酸またはIAPポリペプチドを用いることもできる。
「IAP遺伝子」とは、その他の細胞内または細胞外送達法によって提供された場合に細胞または組織においてアポトーシスを調節する（抑制する、または増強する）ことのできる、少なくとも1つのBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。好ましい態様において、IAP遺伝子は、図1〜4に示した少なくとも一つのIAPアミノ酸コード配列またはその一部とのヌクレオチド配列との同一性が約50％またはそれ以上である遺伝子である。好ましくは、同一性を評価する配列の領域は、少なくとも1つのBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインをコードする領域である。哺乳類IAP遺伝子は、任意の哺乳動物の供給源から単離されたヌクレオチド配列を含む。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。
「IAP遺伝子」という用語は、アポトーシスを調節する能力によって特徴づけられるアポトーシス抑制性遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーを包含することを意味する。IAP遺伝子は、本明細書に記載するIAPのメンバー（すなわち、ヒトまたはマウスのxiap、hiap-1およびhiap-2からのBIRまたはリングジンクフィンガードメイン）の中の1つの保存領域の少なくとも1つとのアミノ酸配列の同一性が少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも50％であるポリペプチドをコードするものであってよい。IAP遺伝子ファミリーの代表的なメンバーには、無制限的にヒトおよびマウスのxiap、hiap-1およびhiap-2の遺伝子が含まれる。
「IAP蛋白質」または「IAPポリペプチド」とは、IAP遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはその断片を意味する。
「BIRドメイン」とは、以下の共通配列のアミノ酸配列を有するドメインを意味する：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-Gly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2は任意のアミノ酸であっても欠失していてもよい（配列番号：2）。好ましくは、この配列は、本明細書でxiap、hiap-1およびhiap-2に関して提供されるBIRドメインの1つと実質的に同一である。
「リングジンクフィンガー」または「RZF」とは、以下の共通配列のアミノ酸配列を有するドメインを意味する：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGluまたはAsp、Xaa3はValまたはIleである（配列番号：1）。
好ましくは、この配列は、本明細書中でヒトまたはマウスのxiap、hiap-1およびhiap-2に関して提供されるRZFドメインと実質的に同一である。
「アポトーシスを調節する」または「アポトーシスを変化させる」とは、特定の細胞集団において、当該行為を行わなかった場合と比べて、アポトーシスを起こす細胞数が増加または減少することを意味する。好ましくは、この細胞集団には、T細胞、神経細胞、線維芽細胞、または一定の実験条件においてアポトーシスを起こすことが知られているその他のあらゆる細胞系（例えば、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞）が含まれる。所与のアッセイにおいてIAPまたは調節性化合物によって提供される調節の程度がさまざまに異なりうることは認識されると思われるが、当業者には、IAPまたはIAPを調節する化合物が同定されるアポトーシスのレベルにおける統計学的に有意な変化を判定することが可能である。
「アポトーシスを抑制する」とは、処置を施していない対照と比べてアポトーシスを起こす細胞数がいくらか減少することを意味する。好ましくは、この減少は少なくとも25％、より好ましくはこの減少は50％であり、最も好ましくは、この減少は100％である。
「ポリペプチド」とは、グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後修飾の有無にかかわらず、2つ以上のアミノ酸からなるあらゆる鎖を意味する。
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列または核酸配列との相同性が少なくとも50％、好ましくは85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％であるポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較する配列の長さが一般に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも25アミノ酸であり、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸については、比較する配列の長さが一般に、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチドであり、最も好ましくは110ヌクレオチドである。
配列の同一性は、典型的には配列解析ソフトウェアを用い、デフォルト設定のパラメータにした条件で測定される（例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis Software Packageなど）。このソフトウェア・プログラムは、種々の置換、欠失、およびその他の修飾に関する相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列を比較するものである。保存的置換には、一般に以下の各群内における置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然の状態で付随している成分から分離されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、天然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が重量にして少なくとも60％であれば実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは、重量にして少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％純粋なIAPポリペプチドである。実質的に純粋なIAPポリペプチドは、例えば、天然の供給源（例えば、線維芽細胞、神経細胞、またはリンパ球）からの抽出、IAPポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または蛋白質の化学合成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC解析などの任意の適当な方法を用いて測定することができる。
蛋白質は、天然の状態で付随している汚染物質から分離されている場合に、天然の状態で伴う成分を実質的に含まない。このため、化学的に合成された蛋白質、または天然に由来する細胞と異なる無細胞系において産生された蛋白質は、天然の状態で伴う成分を実質的に含まないと考えられる。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するが大腸菌またはその他の原核生物において合成されたものも含まれる。「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する生物体の天然のゲノムにおいて、その遺伝子の近傍に位置する遺伝子を含まないDNAを意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製性プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、またはその他の配列から独立した分離分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAが含まれる。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもこれに含まれる。
「形質転換細胞」とは、その内部（またはその前駆細胞の内部）に、組換えDNA技術の手段によって、（本明細書で用いるように）IAPポリペプチドをコードするDNA分子が導入された細胞を意味する。
「導入遺伝子」とは、操作によって細胞内に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となる、DNAのあらゆる断片を意味する。このような導入遺伝子には、トランスジェニック生物体に対して、部分的にまたは完全に異種由来（すなわち、外来性）である遺伝子が含まれてもよく、または生物体の内因性遺伝子と相同な遺伝子を示していてもよい。
「トランスジェニック」とは、操作によって細胞に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となったDNA配列を含むあらゆる細胞を意味する。本明細書で用いるように、トランスジェニック生物体は一般にトランスジェニック哺乳動物（例えば、ラットまたはマウスなどの齧歯類）であり、DNA（導入遺伝子）は操作によって核ゲノム内に挿入される。
「形質転換」とは、外来分子を細胞に導入するためのあらゆる方法を意味する。リポフェクション、リン酸カルシウム沈澱法、レトロウイルス投与、電気穿孔、および遺伝子銃による形質転換は、用いることができる教示例のごく一部である。例えば、遺伝子銃による形質転換は、高速で射出されたタングステンまたは金の粒子などの微小弾丸を用いて、細胞に外来分子を導入する方法である。このような高速射出法は、本来はヘリウム、圧縮空気、および火薬を原動力とする技術を無制限的に含む圧力性射出に由来する。遺伝子銃による形質転換は、細胞内小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）、細菌、酵母、真菌、藻類、動物組織、および培養細胞を無制限的に含む非常にさまざまな種類の細胞および完全な組織に対する形質転換またはトランスフェクションに適用することができる。
「発現のための位置に置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写および翻訳を指向する（すなわち、例えばIAPポリペプチド、組換え蛋白質またはRNA分子の産生を促進するような）DNA配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。
「レポーター遺伝子」とは、その発現をアッセイすることができる遺伝子を意味する。このような遺伝子には、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）およびβ-ガラクトシダーゼが無制限的に含まれる。
「プロモーター」とは、転写を指向するのに十分な最小の配列を意味する。また、本発明では、細胞種特異的、組織特異的、または外来性の信号もしくは因子によって誘導可能である点で制御可能であるプロモーター依存的遺伝子発現を引き起こすために十分なそれらのプロモーター要素も含まれる。このような要素は、本来の遺伝子の5’もしくは3’領域に位置していてもよい。
「機能的に結合した」とは、ある遺伝子と1つまたはそれ以上の調節配列とが、適当な分子が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連結していることを意味する（例えば、転写活性化蛋白質は調節配列と結合している）。
「保存領域」とは、IAPファミリーのメンバーの2つまたはそれ以上の間（例えば、ヒトHIAP-1、HIAP-2およびXIAPの間）でアミノ酸配列の同一性が少なくとも30％、好ましくは50％、最も好ましくは70％であるような、6個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなるあらゆる連続部分を意味する。好ましい保存領域の例は（枠で囲まれた、または明示された配列として）図5〜7ならびに表1および2に示し、無制限的にBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインを含む。
「検出可能な標識がなされた」とは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、またはcDNA分子などの、ある分子の存在を示したり同定するためのあらゆる手段を意味する。分子に検出可能な標識をする方法は、当業者には周知であり、放射性標識（例えば、32Pまたは35Sなどの放射性同位元素を用いる）および非放射性標識（例えば、フルオレセイン標識などの化学発光標識）を無制限的に含む。
本明細書で核酸に関して用いる「アンチセンス」とは、その長さとは無関係に、遺伝子のコード鎖に対して相補的な核酸配列を意味する。
「精製抗体」とは、天然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が、重量にして少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは、この調製物は、重量にして少なくとも75％、より好ましくは90％、最も好ましくは少なくとも99％の抗体、例えばIAP特異的抗体である。精製抗体は、例えば、組換えによって産生された蛋白質または保存モチーフのペプチドおよび標準的手法を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって得ることができる。
「特異的に結合する」とは、ある蛋白質を認識して結合するが、蛋白質が通常含まれる試料、生物試料中のその他の分子は実質的に認識せず結合もしない抗体を意味する。
本発明のその他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の詳細な説明、および請求の範囲から明らかになると思われる。
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒトxiapのcDNA配列（配列番号：3）およびXIAPポリペプチド配列（配列番号：4）である。
図2は、ヒトhiap-1のcDNA配列（配列番号：5）およびHIAP-1ポリペプチド配列（配列番号：6）である。
図3は、ヒトhiap-2のcDNA配列（配列番号：7）およびHIAP-2ポリペプチド配列（配列番号：8）である。hiap-2-Δ変異体で欠失している部分は枠で囲んだ。
図4は、マウスxiapのcDNA配列（配列番号：9）およびコードされるマウスXIAPポリペプチド配列（配列番号：10）である。
図5は、マウスhiap-1のcDNA配列（配列番号：39）およびコードされるマウスHIAP-1ポリペプチド配列（配列番号：40）である。
図6は、マウスhiap-2のcDNA配列（配列番号：41）およびコードされるマウスHIAP-2ポリペプチド配列（配列番号：42）である。
図7は、IAP蛋白質のBIRドメインのアライメント（配列番号：11および14〜31）を図示したものである。
図8は、ヒトIAPポリペプチドのアライメントを、diap、cp-iapおよびIAP共通配列とともに図示したものである（配列番号：4、6、8、10、12および13）。
図9は、IAP蛋白質のリングジンクフィンガードメインのアライメントを図示したものである（配列番号：32〜38）。
図10は、ヒト組織におけるヒトhiap-1およびhiap-2のmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。
図11は、ヒト組織におけるヒトhiap-2のmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。
図12は、ヒト組織におけるヒトxiapのmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。
図13Aおよび13Bは、HIV感染T細胞におけるアポトーシス性DNAラダー（ladder）およびRT-PCR産物をhiap-1およびhiap-2に特異的なプローブを用いて示したアガロースゲルの写真である。
図14A〜14Dは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、bcl-2、smnおよび6-mycによるアポトーシスの抑制を描いたグラフである。
図15A〜Bは、表示したcDNA構築物による一時的遺伝子導入および引き続いて血清除去を行った後の生存CHO細胞の比率を描いた棒グラフである。
図16A〜16Bは、表示したcDNA構築物による一時的遺伝子導入および引き続いてメナジオン（図16A＝10μM メナジオン、図16B＝20μM メナジオン）曝露を行った後の生存CHO細胞の比率を描いた棒グラフである。
図17は、ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、B-3およびジヨーエ（Jiyoye）細胞ならびに正常胎盤から得たRNAからのhiap-1特異的プライマーを用いて増幅したcDNA断片を含むアガロースゲルの写真である。
図18は、ジャーカットおよび星状細胞腫細胞から抽出し、抗XIAP抗体を用いて染色した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。一連のマーカー蛋白質の位置およびサイズを示した。
図19は、実施例XIIに記載した処置に続いてジャーカット細胞から抽出した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2は抗Fas抗体、レーン3は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン4はTNF-α、レーン5はTNF-αおよびシクロヘキシミドを示す。
図20は、抗Fas抗体への曝露に続いてヒーラ（Hela）細胞から抽出した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2はシクロヘキシミド、レーン3は抗Fas抗体、レーン4は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン5はTNF-α、レーン6はTNF-αおよびシクロヘキシミドを示す。
図21A〜21Bは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色したウェスタンブロットの写真である。蛋白質は、抗Fas抗体への曝露の直後、1、2、3、5、10および22時間後にヒーラ細胞（図21A）およびジャーカット細胞（図21B）から抽出した。
図22Aおよび22Bは、抗CPP32抗体（図22A）またはウサギポリクローナル抗XIAP抗体（図22B）によって染色したウェスタンブロットの写真である。蛋白質は、抗Fas抗体への曝露の直後、3時間後または7時間後にジャーカット細胞から抽出した。総蛋白のほかに細胞質および核抽出物も示した。
図23は、インビトロXIAP切断アッセイの産物に対する電気泳動後のポリアクリルアミドゲルの写真である。
詳細な説明
I．IAP遺伝子およびポリペプチド
アポトーシスを調節する新たなクラスの哺乳類蛋白質（IAP）、およびこれらの蛋白質をコードする遺伝子が発見されている。IAP蛋白質は1つのリングジンクフィンガードメイン（RZF；図9）、ならびに図7および8に枠で囲んだ共通配列を示し、表1および2に配列ドメインの一覧を挙げることによって定義したBIRドメインが少なくとも1つ存在することによって特徴づけられる。新規なIAP遺伝子および蛋白質の例として、ヒトIAP（HIAP-1、HIAP-2およびXIAP）ならびに新規なマウスアポトーシス抑制因子であるXIAPのcDNA配列およびアミノ酸配列を提供した。哺乳類IAPファミリーのほかのメンバー（他の種からの相同体および変異型配列を含む）を、標準的なクローニング技法ならびに本明細書で提供し、当技術分野では公知である保存アミノ酸配列、プライマーおよびプローブを用いて単離してもよい。さらにIAPには、以下でさらに説明するような、リングジンクフィンガーを欠いた蛋白質も含まれる。
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哺乳類IAPファミリーが認識されたことにより、非常に新たなパターンの蛋白質構造がもたらされた。このパターンの認識に伴って、既知の相同配列を有するが機能は不明であった蛋白質を、推定上のアポトーシス抑制因子として分類することが可能になった。今日ではdiapと呼ばれている1つのショウジョウバエ遺伝子はこのような仕方で分類された（配列情報についてはジェンバンク寄託番号（Genbank Accession Number）M96581および図6を参照）。これらの蛋白質が種を超えて保存されていることは、アポトーシスのシグナル伝達経路が進化過程を通じて保存されてきたことを示す。
IAP蛋白質は、数多くの疾患過程または障害の一部として生じるアポトーシスを抑制するために用いることができると思われる。例えば、IAPポリペプチドまたはIAPポリペプチドをコードする核酸を、AIDS、神経変性疾患、虚血性損傷、中毒性肝障害および骨髄異形成症候群の一部として生じるアポトーシスの治療または予防のために投与することが可能と考えられる。また、IAPポリペプチドをコードする核酸はアポトーシスの抑制のためにも提供されうると考えられる。
II．IAP遺伝子のクローニング
A．xiap
アポトーシスに関与するヒト遺伝子を探索した結果、アポトーシスを抑制することが知られる2種のバキュロウイルス遺伝子であるCpIAPおよびOpIAP（Clemら、Mol. Cell Biol. 14:5212〜5222、1994；Birnbaumら、J. Virol. 68:2521〜8、1994）の保存RZFドメインと高い相同性を示す、X連鎖性配列タグ部位（X-linked sequence tag site）（STS）がジェンバンク（GenBank）データベースにあることが同定された。このSTSによるヒト胎児脳ZapII cDNAライブラリー（Stratagene, La Jolla, CA）のスクリーニングによって、xiap（X連鎖性アポトーシス抑制蛋白質遺伝子の略）の同定およびクローニングがなされた。このヒト遺伝子は1.5kbのコード配列を有し、そこに3つのBIRドメイン（Crookら、J. Virol. 67:2168〜74、1993；Clemら、Science 254:1388〜90、1991；Birnbaumら、J. Virol. 68:2521〜8、1994）および1つのジンクフィンガーを含む。xiapに関するノーザンブロット解析により、7kbを超える大きさのメッセージ（mRNA）が存在し、それがさまざまな組織、特に肝臓および腎臓で発現していることが明らかになった（図12）。転写物のサイズが大きいことは、5’および3’非翻訳領域が長いことを反映する。
B．ヒトhiap-1およびhiap-2
hiap-1およびhiap-2の遺伝子のクローニングは、全xiapコード領域を含むプローブによるヒト肝臓ライブラリー（Stratagene Inc., La Jolla, CA）の厳密性の低い条件（最終洗浄は40℃の2X SSC、10％SDSを用いて実施した；図2および3）でのスクリーニングによって実施した。また、BIRドメインの一部を含む発現配列タグ（expressed sequence tag）（EST；GenBank寄託番号（Accession No.）T96284）に由来するプローブを用いて、hiap-1およびhiap-2の遺伝子の独立した検出も行った。EST配列はポリメラーゼ連鎖反応によってまず単離した。その際にはテンプレートとしてcDNAライブラリーを用い、EST特異的プライマーを用いて増幅した。続いて、DNA増幅由来（ampliderive）プローブを用いて、完全長のhiapコード配列に関してヒト肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした。引き続いて、hiap-2配列は含むが、おそらくは選択的mRNAスプライシングのために1つのエクソンを欠失していると思われる第3のDNAを検出した（図3の枠で囲まれた領域を参照）。ノーザンブロット解析によってアッセイしたヒト組織におけるhiap-1およびhiap-2の発現を図8および9に示した。
C．m-xiap
xiapのcDNAプローブを用いて、マウス胚λgt11 cDNAライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA）およびマウスFIX IIゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより、14種のcDNAおよび2種のゲノムのクローンをそれぞれ同定した。一部が重複する12種のマウスクローンを用いて、8.0kbにわたるcDNAコンティグを構築した。塩基配列解析により、約1.5kbのコード配列の存在が明らかになった。このマウス遺伝子m-xiapは、ヒトXIAPとの間で開始メチオニン、終止コドン、3つのBIRドメインおよびRZFドメインの箇所およびその周囲において著しい相同性を有するポリペプチドをコードする。ヒト遺伝子の場合と同じく、このマウス相同体は長い5’および3’UTRを含んでおり、それによって7〜8kbの長さに及ぶ転写物が産生されると考えられる。
m-xiapの配列および制限地図に関する解析を行うことにより、m-xiapの構造およびゲノムの構成がさらに明らかに示された。エクソンのマッピングおよびエクソン-イントロン境界部の定義のためには、サザンブロット解析および逆PCR法（Grodenら、Cell 66:589〜600）を使用することができる。
例えば大腸菌などの細菌発現系を用いて、得られたm-xiap融合蛋白質に対する抗血清を産生させることができる。結果として得られた抗血清は、マウス体内におけるm-xiapの空間的および時間的発現の解析のためにノーザンブロット解析とともに用いることが可能である。
D．m-hiap-1およびm-hiap-2
ヒトhiap-1およびhiap-2の配列をプローブとして用いて、m-xiapの場合と同じ一般的な様式で、hiap-1およびhiap-2のマウスでの相同体のクローニングおよびシークエンシングを行った。m-hiap-1およびm-hiap-2のクローニングにより、本明細書で提供する技法および分子生物学の分野における当業者に公知である技法を用いて、異なる種からの相同体を単離することが可能と思われることがさらに示された。
III．ほかのIAP遺伝子の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーションなどの標準的な技法を用いて、ほかのヒトIAP遺伝子および他の種におけるそれらの相同体のクローニングを行うことが可能と思われる。厳密性の低い条件でxiap、hiap-1およびhiap-2に特異的なプローブとハイブリダイズさせたヒトゲノムDNAのサザンブロットから、その他の既知のヒトIAP配列に対応するバンドのほかに、既知のIAP配列とは対応しない付加的なバンドがあることが明らかになった。したがって、厳密性の低いハイブリダイゼーションを用いて、ほかのIAP配列を容易に同定することができると考えられる。付加的な遺伝子のクローニングに用いることができると思われる、マウスならびにヒトのxiap、hiap-1およびhiap-2に特異的なプライマーの例を表5に示した。
IV．IAP活性の特徴分析および細胞内局在に関する試験
推定上のIAPがアポトーシスを調節する能力は、その中でアポトーシスの変化を検出することができるインビトロ系において規定することができる。完全長または切断型のIAPのcDNAを載せた哺乳類の発現構築物を、CHO、NIH 3T3、HL60、Rat-1またはジャーカット細胞などの細胞系に導入することができる。さらに、SF21昆虫細胞を用いてもよく、この場合にはIAP遺伝子は好ましくは昆虫の熱ショックプロモーターを用いて発現させられる。遺伝子導入の後には、血清除去またはスタウロスポリン、メナジオン（これはフリーラジカルの形成を介してアポトーシスを誘導する）もしくは抗Fas抗体の適用を含む標準的な方法によってアポトーシスを誘導することができる。対照として、アポトーシスを起こすように誘導される細胞と同じ条件下において細胞を培養し、これには遺伝子導入を行わないか、IAP挿入物を含まないベクターによる遺伝子導入を行った。それぞれのIAP構築物が発現した際にアポトーシスを抑制する能力は、細胞の生存指標、すなわち生存している遺伝子導入細胞と生存している対照細胞との比を算出することによって定量化することができる。これらの実験は、アポトーシス抑制活性の存在に関する確認を可能とするほか、以下に説明するように、IAPの機能性領域の決定に用いることもできる。また、これらのアッセイは、IAPの発現を介してアポトーシスを調節する化合物を同定するために、ほかの化合物の適用と併用して実施することもできる。
A．完全長IAP構築物によるトランスフェクション後の細胞の生存、およびアポトーシスの誘導
さまざまなアポトーシス抑制アッセイを実施することによって得た結果の具体例を図14Aから14Dに示した。例えば、6種の構築物のうち1種による遺伝子導入を行い、引き続いて血清除去を行った後のCHO細胞の生存の様子を図14Aに示した。以下の組換えプラスミドのうち1つを2μg用いるとともにリポフェクターセ（Lipofectace（登録商標））を用いて細胞に遺伝子導入を施した：pCDNA36myc-xiap（xiap）、pCDNA3-6myc-hiap-1（hiap-1）、pCDNA3-6myc-hiap-2（hiap-2）、pCDNA3-bcl-2（bcl-2）、pCDNA3-HA-smn（smn）およびpCDNA3-6myc（6-myc）。xiap、hiap-1およびhiap-2のORFのPCR増幅およびpCDNA3（Invitrogen）へのクローニングを可能とするためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。それぞれの構築物に改変を施してペプチド配列MEQKLISEEDL［（配列番号：＿）］の6回反復物をコードする合成mycタグを組み込み、これによってモノクローナル抗myc抗血清（Eganら、Nature 363:45〜51、1993）を介したmyc-IAP融合蛋白質の検出が可能となるようにした。3シリーズ分の細胞系の試料を24穴皿に入れて無血清培地で5回洗い、実験の間は無血清条件を維持した。トリパンブルーを排出した細胞、すなわち生きている細胞を、血清除去の直後、24時間、48時間および72時間後に血球算定板を用いて算定した。生存率は最初の生存細胞数に対する比率として算出した。この実験ならびに図14Bおよび14Dに提示した実験に関して表示した生存細胞の比率は、3回に分けて実施した3つの別々の実験での平均±平均偏差を表す。
遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびメナジオンへの曝露の後のCHO細胞の生存率を図14Bに示した。細胞を24穴皿に播いた後、一晩増殖させ、続いて20μMメナジオン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）に1.5時間曝露させた。3シリーズ分の試料をメナジオンへの曝露時および24時間後に採取し、トリパンブルーの排出によって生存率を評価した。
遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびスタウロスポリンへの曝露の後のRat-1細胞の生存率を図14Cに示した。Rat-1細胞に遺伝子導入を施した後、800μg/mlのG418を含む培地中に2週間置いて選択した。この細胞系を、5時間にわたるスタウロスポリン誘発性アポトーシス（1μM）に対する抵抗性に関して評価した。スタウロスポリンへの曝露から24時間後にトリパンブルーの排出によって生存細胞を算定した。表示した生存細胞の比率は、2回の実験での平均±平均偏差を表す。
Rat-1細胞系は、これらの細胞に上記の6種の構築物のそれぞれによる遺伝子導入を施した後のメナジオンに対する抵抗性を試験する目的にも用いた（図14D）。細胞を10μMメナジオンに1.5時間曝露させ、18時間後に生存細胞数を算定した。
B．完全長および部分的IAP構築物による遺伝子導入後の細胞生存率の比較
XIAP、HIAP-1およびHIAP-2を含むヒトIAPが細胞死に対する防御をもたらす機序を調べるために、（1）完全長のIAP cDNA（上記のもの）、（2）BIRドメインをコードするがRZFはコードしないIAP遺伝子の一部、または（3）RZFをコードするがBIRドメインはコードしないIAP遺伝子の一部、のいずれかを含む発現ベクターを構築した。ヒーラ、ジャーカットおよびCHO細胞系における一時的または安定的発現により、ヒトおよびマウスのxiapまたはm-xiapを検討した。遺伝子導入後には、血清除去、メナジオンの適用、または抗Fas抗体の適用によってアポトーシスが誘導された。続いて上記のようにトリパンブルー排出によって細胞死を評価した。遺伝子導入の効率に関する対照として、細胞にβ-gal発現構築物による同時遺伝子導入を施した。典型的には、首尾よく遺伝子導入がなされたのは細胞の約20％であった。
CHO細胞に一時的遺伝子導入を施した場合には、完全長のxiapまたはm-xiapのcDNAを含む構築物によってもたらされた細胞死の防御はわずかであった（図15A）。これに対して、BIRドメインのみをコードした構築物（すなわち、RZFドメインを含まないもの）による遺伝子導入を受けたCHO細胞の生存率は、血清除去から72時間後では著明に高値であった。さらに、BIRドメインを発現している細胞の大部分は96時間後にも生存しており、この時点では対照、すなわち遺伝子導入を受けていない細胞培養物には生存細胞は残っておらず（図15Aの「CHO」参照）、ベクターのみ、すなわちcDNA挿入物を含まないものによる遺伝子導入を受けた細胞の中で生存していたものは5％未満であった（図15Aの「pcDNA3」参照）。いずれのBIRドメインの欠失によっても、血清除去から72時間以内の対照レベルに対しての生存CHO細胞の比率の低下に反映されるように、アポトーシス抑制の完全損失がもたらされた（図15B；72時間後における「xiapΔ1」（XIAP（配列番号：4）のアミノ酸89〜497をコードする）、「xiapΔ2」（XIAP（配列番号：4）のアミノ酸246〜497をコードする）および「xiapΔ3」（XIAP（配列番号：4）のアミノ酸342〜497をコードする）を参照）。
G418による選択下において数カ月維持された遺伝子導入CHO細胞の安定プール（stable pool）に対して10μMメナジオンを2時間曝露させることにより、アポトーシスを起こすように誘導した。検討したCHO細胞は、（1）完全長m-xiapのcDNA（miap）、（2）完全長xiapのcDNA（xiap）（3）完全長bcl-2のcDNA（Bcl-2）、（4）m-xiapの3つのBIRドメインをコードする（しかしRZFはコードしない）cDNA（BIR）、および（5）m-xiapのRZFをコードする（しかしBIRドメインはコードしない）cDNA（RZF）、による安定的な遺伝子導入を受けたものである。非遺伝子導入細胞（CHO）またはベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞（pcDNA3）を本実験における対照として用いた。10μMメナジオンへの曝露の後に、遺伝子導入細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗い、メナジオンを含まない培地中にてさらに24時間培養した。細胞死は、上記のようにトリパンブルー排出によって評価した。非遺伝子導入細胞およびベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞ともに24時間の生存試験期間の後に生存していたのは10％未満であった。RZFを発現している細胞に関して有意に優れた経過は認められなかった。しかし、完全長のm-xiap、xiapまたはbcl-2の発現、およびBIRドメインの発現によって細胞の生存率は高まった（図16A）。メナジオンの濃度を10μMから20μMに高めた場合（その他のすべての実験条件は10μMメナジオンを適用した際と同じにした）には、BIRドメインのcDNA構築物を発現した生存CHO細胞の比率は、完全長のm-xiapまたはbcl-2のいずれかを発現した生存細胞の比率よりも高かった（図16B）。
C．発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下局在の分析
上記の細胞死に関するアッセイから、RZFがIAPの抗アポトーシス機能の負の調節因子として作用する可能性が示された。RZF、およびおそらくはその他のIAPドメインが、その調節性作用を発揮する1つの仕方は、その産物がアポトーシス経路において機能する遺伝子の発現を変化させることによると考えられる。
発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下配置が核内調節因子としての役割と一致しているか否かを判定するために、COS細胞に以下の4種の構築物による一時的遺伝子導入を施し、発現されたポリペプチドの位置を免疫蛍光顕微鏡によって調べた：（1）配列番号：4の497個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6myc-xiap、（2）マウスxiap（配列番号：10）の497個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6myc-m-xiap、（3）m-xiap（配列番号：10）のアミノ酸1〜341をコードするpcDNA3-6myc-mxiap-BIR、（4）m-xiap（配列番号：10）のアミノ酸342〜497をコードするpcDNA3-6myc-mxiap-RZF。細胞をマルチウェル組織培養スライド上にて12時間増殖させた後に固定し、メタノールによる透過化処理を行った。用いた構築物（本試験および細胞死アッセイにおいて使用）には、N末端にヒトMycエピトープタグによるタグ付加を施した。このため、FITCを共役させた抗Mycモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス二次抗体を用いて、一時的遺伝子導入を受けたCHO細胞における発現産物の位置を調べることができると考えられた。完全長のXIAPおよびMIAPは細胞質に位置しており、核周辺領域で特に発現が顕著であった。RZFドメインをコードする（しかしBIRドメインはコードしない）構築物を発現する細胞の場合にも同じ配置パターンが認められた。しかし、BIRドメイン（RZFは含まない）を発現する細胞は主に核の染色を呈した。BIRドメインの構築物によって発現された蛋白質は、核への移行のさまざまな段階にあると考えられた。
以上の観察は、以下に説明するように、抗Fas抗体（これはアポトーシスの強力な誘導因子である）によって処理したT細胞内ではXIAPが切断され、そのN端領域が核に移動しているとの事実と一致する。
D．付加的なアポトーシスアッセイの例
アポトーシスアッセイの具体例は以下の参考文献でも提供されている。リンパ球におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：リ（Li）ら、「非感染リンパ球における、HIV-1 Tat蛋白質によるアポトーシスの誘導（Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein）」、Science 268:429〜431；ジベリーニ（Gibellini）ら、「Tatを発現するジャーカット細胞は、急性ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の感染を含むさまざまなアポトーシス刺激に対する抵抗性の増加を示す（Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptotic stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1）」、Br. J. Haematol. 89:24〜33、1995；マーチン（Martin）ら、「インビトロでのヒトCD4+T細胞のHIV-1への感染．これらの細胞における特異なアポトーシス誘導（HIV-1 infection of human CD4+ T cells in vitro. Differential induction of apoptosis in these cells）」、J. Immunol. 152:330〜42、1994；テライ（Terai）ら、「HIV-1に急性感染した培養Tリンパ芽球における細胞死の機序としてのアポトーシス（Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T Lymphoblasts acutely infected with HIV-1）」、J. Clin. Invest. 87:1710〜5、1991；デイン（Dhein）ら、「APO-1/（Fas/CD95）11を介した自己分泌T細胞の自殺（Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/（Fas/CD95）11）」、Nature 373:438〜441、1995；カチキス（Katsikis）ら、「Fas抗原刺激はヒト免疫不全ウイルス感染者におけるTリンパ球の著明なアポトーシスを誘発する（Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals）」、J. Exp. Med. 1815:2029〜2036、1995；ウェステンドープ（Westendorp）ら、「HIV-1 Tatおよびgp120による、CD95を介したアポトーシスに対するT細胞の感作（Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120）」、Nature 375:497、1995；デロッシ（DeRossi）ら、Virology 198:234〜44、1994。
線維芽細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：フォスペック（Vossbeck）ら、「ラット線維芽細胞に対するTGF-βの直接的な形質転換作用（Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblast）」、Int. J. Cancer 61:92〜97、1995；ゴルッピ（Goruppi）ら、「NIH3T3線維芽細胞のS期誘導に関与するc-mycドメインの精査（Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts）」、Oncogene 9:1537〜44；フェルナンデス（Fernandez）ら、「正常およびHa-ras形質転換C3Hマウス胚線維芽細胞の腫瘍壊死因子に対する感受性の差異：抵抗性細胞におけるbcl-2、c-mycおよびマンガンスーパーオキシドジスムターゼの誘導（Differential sensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells）」、Oncogene 9:2009〜17、1994；ハリントン（Harrington）ら、「線維芽細胞におけるc-Myc誘発性アポトーシスは特異的サイトカインによって阻害される（c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines）」、EMBO J. 13:3286〜3295、1994；イトウ（Itoh）ら、「アポトーシスに必要な新規な蛋白質ドメイン．ヒトFas抗原の変異分析（A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen）」、J. Biol. Chem. 268:10932〜7、1993。
神経細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：メリノ（Melino）ら、「組織トランスグルタミナーゼおよびアポトーシス：ヒト神経芽腫細胞を用いたセンスおよびアンチセンス遺伝子導入試験（Tissue transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells）」、Mol. Cell. Biol. 14:6584〜6596、1994；ローゼンバウム（Rosenbaum）ら、「低酸素誘発性の培養細胞のプログラム細胞死に関する証拠（Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons）」、Ann. Neurol. 36:864〜870、1994；サトウ（Sato）ら、「bcl-2による細胞死の防止の結果としてのPC12細胞の神経分化（Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2）」、J. Neurobiol. 25:1227〜1234、1994；フェラーリ（Ferrari）ら、「N-アセチルシステインのD-およびL-立体異性体は神経細胞のアポトーシス性細胞死を防止する（N-acetylcysteine D- and L-stereoisomers prevents apoptosis death of neuronal cells）」、J. Neurosci. 1516:2857〜2866、1995；タレー（Talley）ら、「ヒト神経細胞における腫瘍壊死因子α誘発性アポトーシス：抗酸化剤N-アセチルシステインならびに遺伝子bcl-2およびcrmaによる防御（Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crma）」、Mol. Cell. Biol. 1585:2359〜2366、1995；タレーら、「ヒト神経細胞における腫瘍壊死因子α誘発性アポトーシス：抗酸化剤N-アセチルシステインならびに遺伝子bcl-2およびcrmaによる防御（Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptosis in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant NAcetylcysteine and the Genes bcl-2 and crma）」、Mol. Cell. Biol. 1585:2359〜2366、1995；ウォルキンショー（Walkinshaw）ら、「L-DOPAによるカテコールアミン作働性PC12細胞におけるアポトーシスの誘導．パーキンソン病の治療との関連（Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implication for the treatment of Parkinson’s disease）」、J. Clin. Invest. 95:2458〜2464、1995。
昆虫細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：クレム（Clem）ら、「昆虫細胞の感染期間におけるバキュロウイルス遺伝子によるアポトーシスの防止（Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells）」、Science 254:1388〜90、1991；クルーク（Crook）ら、「ジンクフィンガー様モチーフを有するアポトーシス抑制性バキュロウイルス遺伝子」、J. Virol. 67:2168〜74、1993；ラビザデー（Rabizadeh）ら、「バキュロウイルスp35遺伝子の発現は哺乳類神経細胞死を抑制する（Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death）」、J. Neurochem. 61:2318〜21、1993、バーンバウム（Birnbaum）ら、「Cys/His配列モチーフを有するポリペプチドをコードする核多角体病ウイルスからのアポトーシス抑制性遺伝子（An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs）」、J. Virol. 68:2521〜8、1994；クレムら、「バキュロウイルス遺伝子p35およびIAPによるプログラム細胞死の制御（Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and IAP）」、Mol. Cell. Biol. 14:5212〜5222、1994。
V．トランスジェニック動物の作出
IAP遺伝子の特徴分析によって、相同組換えによってIAPノックアウト動物モデルを作り出すために必要な情報が提供される。好ましくは、このモデルは哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。同じく、標準的な組換え技法に従ってゲノム内に1つまたはそれ以上のIAP配列を組み込むことによってIAPを過剰産生する動物モデルを作製することができると考えられる。
ノックアウトモデルの作出に用いられる置換型のターゲティングベクター（targeting vector）は、例えば129/Sv（Stratagene Inc., LaJolla, CA）などのマウス系統からの同質遺伝子のゲノムクローンを用いて構築することができる。このターゲティングベクターを、電気穿孔法によって適切な由来を有する胚幹（ES）細胞の系列に導入することにより、著しく切断された形態のIAPを保持するES細胞系が作製されると考えられる。キメラ型ファウンダーマウスを作製するには、標的となる細胞系に対してマウス胞胚期胚を注入するとよい。ヘテロ接合性の子孫を交雑させることによってホモ接合が得られる。ノックアウトマウスによって、IAP依存的な経路を介してアポトーシスを調節する治療的化合物のスクリーニングを行うためのインビボでの手段が提供されると考えられる。
VI．IAP蛋白質の発現
IAP遺伝子は原核生物および真核生物の両方の細胞種において発現すると考えられる。IAPがアポトーシスを増悪させることによってそれを調節する場合には、その蛋白質は誘導可能なプロモーターの制御下において発現されることが望ましいと考えられる。
一般に、本発明によるIAPは、適切な発現ベクター内に配置されたIAPをコードするcDNA断片の全体または一部を有する適切な宿主細胞の形質転換によって産生することが可能である。
分子生物学の分野における当業者は、組換え蛋白質を産生させるためにさまざまに異なる種類の発現系を用いうることを理解すると考えられる。厳密にどの宿主細胞を用いるかは本発明にとって本質的ではない。IAP蛋白質の産生には、原核生物の宿主（大腸菌など）を用いてもよく、真核生物の宿主（例えば、ビール酵母菌、Sf21細胞などの昆虫細胞、もしくはCOS-1、NIH 3T3またはヒーラ（Hela）細胞などの哺乳類細胞）を用いてもよい。これらの細胞は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockville、MDなどから広く入手可能である。アウスユーベル（Ausubel）ら、分子生物学の最近のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）（John Wiley & Sons, New York, 1994）も参照されたい。形質導入の方法および発現用媒介物（expression vehicle）の選択は、選択される宿主系に依存すると考えられる。形質転換および遺伝子導入の方法は、例えばアウスユーベルら（前記）に記載されており、発現用媒介物は、例えばクローニングベクター：実験マニュアル（Cloning Vector: A Laboratory Manual）（P. H. Pouwelsら、1985, Supp. 1987）に提供されているものから選択してもよい。
好ましい発現系の一つは、例えばクローンテク（Clontech）社から入手可能なベクターであるpBacPAK9を用いるバキュロウイルス系である。必要に応じてこの系を、例えばエヴァン（Evan）ら（Mol. Cell. Biol. 5:3610〜3616, 1985）に記載されたmycタグ付加法などのその他の蛋白質発現法と併用して用いてもよい。
または、安定的な遺伝子導入がなされた哺乳類細胞系によってIAPを産生させることもできる。哺乳類細胞の安定的な遺伝子導入に適した数多くのベクターは広く入手することができ、例えばパウエル（Pouwel）ら（前記）に記載があり、このような細胞系を構築する方法も同様である（例えばAusubelら（前記）を参照）。1つの例においては、IAPをコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクター内にクローニングする。このプラスミドの組み込み、すなわちIAPをコードする遺伝子の宿主細胞の染色体への組み込みが起こったものは、細胞培養液に0.01〜300μMメソトレキセートを添加することによって選択される（Ausubelら、前記に記載された方法による）。この優性選択法は大部分の細胞種において可能である。組換え蛋白質の発現は、導入された遺伝子のDHFRを介した増幅によって増強させることができる。
遺伝子増幅を行う細胞系の選別の方法は、アウスユーベル（Ausubel）ら（前記）に記載されている。このような方法には一般に、培地中のメソトレキセートの量を徐々に増加させていく持続培養が含まれる。最も使用される頻度の高いDHFR含有性の発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV（A）（Ausubelら、前記に記載）である。上記の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞系（例えば、CHO DHFR-細胞、ATCC寄託番号CRL 9096など）は、安定的な形質移入がなされた細胞系またはDHFRを介した遺伝子増幅に関するDHFRによる選択を行うために最も好ましいものである。
いったん組換え蛋白質が発現されれば、例えばアフィニティクロマトグラフィーなどを用いてそれを単離する。1つの例においては、本明細書に説明した方法によって産生されたものなどの抗IAP抗体をカラムに結合させ、それを用いてIAPを単離することができる。アフィニティクロマトグラフィーの前に行うIAPを含有する細胞の溶解および分画化は、標準的方法に従って実施する（例えば、Ausubelら、前記を参照）。いったん単離されれば、必要に応じて、この組換え蛋白質を例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えば、フィッシャー（Fisher）、生化学および分子生物学における実験テクニック（Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology）、WorkおよびBurdon編、Elsevier, 1980を参照）などによってさらに精製することができる。
本発明のポリペプチド、特にIAPの短い断片は、化学合成によっても生成することができる（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）第2版、1984に記載されている方法による。The Pierce Chemical Co., Rockford, IL）。ポリペプチドの発現および精製に関するこれらの一般的な技法は、本明細書に記載したように、有用なIAP断片またはその類似体の産生および単離に用いることもできる。
VII．抗IAP抗体
IAP特異的抗体を作製するために、IAPコード配列（すなわち、アミノ酸180〜276）を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31〜40、1988）とのC端融合体として発現させることができる。この融合蛋白質は、グルタチオン-セファロースビーズ上にて精製し、グルタチオンによって溶出させ、トロンビンによって切断し（操作によって作成した切断部位において）、ウサギを首尾よく免疫化するために必要な程度まで精製することができる。一次免疫化はフロイント完全アジュバントによって実施することができ、その後の免疫化はフロイント不完全アジュバントを用いて実施することができる。抗体価の観測は、GST-IAP融合蛋白質のトロンビン切断IAP断片を用いるウェスタンブロットおよび免疫沈降分析によって行う。免疫血清には、CNBr-セファロースを連結したIAP蛋白質を用いてアフィニティ精製を行う。抗血清の特異性は、一連の非関連GST蛋白質（GSTp53、Rb、HPV-16 E6およびE6-APを含む）およびGST-トリプシン（既知の配列を用いるPCRによって作製されたもの）を用いて決定する。
GST融合蛋白質に対する代替的または付属的な免疫原として、例えばIAPの比較的ユニークな親水性領域に対応するペプチドを作製し、導入したC端リジンを介してキーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）と連結させることもできる。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清をBSAと共役させたペプチド上で同様にアフィニティ精製し、ペプチド共役体を用いるELISAおよびウェスタンブロット法、ならびに発現したIAPをGST融合蛋白質として用いるウェスタンブロット法および免疫沈降法によって特異性を検討する。
または、上記のIAPおよび標準的なハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる（例えば、Kohlerら、Nature 256: 495、1975；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6: 511、1976；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6: 292、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas）、Elsevier, New York, NY, 1981、Ausubelら、前記を参照）。いったん産生されたモノクローナル抗体を、ウェスタンブロット法または免疫沈降分析によって（Ausubelら、前記に記載された方法による）、IAPの特異的認識に関して検討することもできる。
1つまたはそれ以上のBIRドメインを含む（しかしリングジンクフィンガードメインは含まない）または1つのリングジンクフィンガードメインを含む（しかしBIRドメインは含まない）本明細書に記載されたものなどのIAPまたはIAPの断片を認識する抗体は、本発明において有用であると考えられる。それらは例えば、IAPの発現レベルを観測するためのイムノアッセイ、または哺乳動物によって産生されるIAPもしくはIAP断片の細胞下配置を決定するために用いることができる。本明細書で説明する26kDaのIAP切断産物（少なくとも1つのBIRドメインを含む）を抑制する抗体は、望ましくない増殖を起こしている細胞におけるアポトーシスの誘導に特に有用であると考えられる。
好ましくは、本発明の抗体は、高度に保存された領域内に位置しておらず、ジェームソン（Jameson）およびウルフ（Wolf）のアルゴリズム（CABIOS 4: 181, 1988）を用いてペプチド構造プログラム（Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Program Manual for the GCG Package, Version 7, 1991）によって示される基準などによる解析などで抗原性を有する可能性が高いと考えられるIAP配列を用いて産生される。具体的には、すべてのIAPのBIR1とBIR2との間に見いだされるこれらの領域は以下の通りである：hiap-1のアミノ酸99からアミノ酸170まで、hiap-2のアミノ酸123からアミノ酸184まで、およびxiapまたはm-xiapのアミノ酸116からアミノ酸133まで。これらの断片は、PCRなどの標準的手法によって作製し、pGEX発現ベクターにクローニングすることができる（Ausubelら、前記）。融合蛋白質は大腸菌で発現され、アウスユーベル（Ausubel）ら（前記）に記載されたように、グルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを用いて精製される。IAPに対して非特異的または低親和性の結合を示す抗血清が得られる可能性を極めて少なくするためには、それぞれの蛋白質について2種類または3種類の融合体を作製し、それぞれの融合体を少なくとも2匹のウサギに注入する。抗血清は、一連の連続注入、好ましくは少なくとも3回のブースター注入によって産生される。
VIII．IAP蛋白質の発現を調節する分子の同定
IAPのcDNAの単離により、IAPの発現を増強または低下させる分子の同定も容易となる。1つの手法においては、候補となる分子を、IAP mRNAを発現する細胞を含む培地に種々の濃度で添加する。続いてIAPの発現を、例えばハイブリダイゼーション用プローブとしてIAPのcDNAまたはcDNAの断片を用いる標準的なノーザンブロット分析（Ausubelら、前記）によって測定する（表5も参照のこと）。候補分子の存在下におけるIAPの発現レベルを、その他のすべての因子（例えば細胞種および培養条件など）を同一にした候補分子の非存在下におけるIAPの発現レベルと比較する。
その代わりに、IAPを介したアポトーシスに対する候補分子の影響を、IAP特異的抗体（例えば、本明細書で説明するIAP抗体）を用いるウェスタンブロット法または免疫沈降法などの標準的な蛋白質検出法とともに上記の一般的な手法を用いることによって、翻訳のレベルで測定してもよい。
IAPのレベルを調節する化合物は、精製されたもの、もしくは実質的に精製されたものでも、または細胞からの抽出物または上清などの化合物の混合体の1つの成分であってもよい（Ausubelら、前記）。化合物の混合体の1つのアッセイでは、化合物プール（例えば、HPLCまたはFPLCなどの標準的な精製法によって作成されたもの）のサブセットの大きさを段階的に小さくしていきながら、IAPの発現を調節する単一の化合物または効力のある最小数の化合物が示されるまで、IAPの発現の検討を続ける。
化合物を、それがIAPのアポトーシス抑制活性を調節する能力に基づいてスクリーニングすることもできる。この手法では、候補化合物の存在下におけるアポトーシスの程度と、その非存在下におけるアポトーシスの程度とを同一条件下で比較する。さらにまた、候補化合物のプールを用いてスクリーニングを開始し、そこから1つまたはそれ以上の有用な調節性化合物を段階的なやり方で単離してもよい。アポトーシス活性は、例えば、本明細書で説明するものなどの任意の標準的アッセイ法によって測定することができる。
IAPの活性を調節する化合物を検出するためのもう1つの方法は、ある任意のIAPポリペプチドと物理的に相互作用する化合物をスクリーニングすることである。これらの化合物は、当業者に周知の相互作用トラップ発原系を適合させることによって検出された。これらの系は、転写活性化アッセイを用いて蛋白質の相互作用を検出することができ、ギュリス（Gyuris）ら（Cell 75： 791-803, 1993）およびフィールド（Field）ら（Nature 340： 245-246, 1989）にその概ねが記載されており、Clontech社（Palo Alto, CA）から商業的に入手可能である。さらに、特許協力条約刊行物（PCT Publication）・国際公開公報第95/28497号には、相互作用トラップアッセイが記載されており、そこではアポトーシスに関与する蛋白質がBcl-2との相互作用を利用して検出される。IAPと相互作用する蛋白質およびその他の化合物を同定するために、同様の方法を用いることもできる。
IAPを介した細胞死の調節因子として機能する化合物または分子には、細胞抽出物、哺乳動物の血清、または哺乳類細胞を培養していた増殖培地に存在するようなペプチドおよび非ペプチド分子を含めてもよい。
IAPの発現またはIAPの活性の増強を促進する分子は、本発明において特に有用と考えられる。このような分子は、例えば、IAPの細胞レベルを高め、それによってアポトーシスを抑制するIAPポリペプチドの能力を引き出す治療薬として用いることができると思われる。
IAP活性を低下させる化合物（例えば、IAP遺伝子の発現またはポリペプチド活性の低下による）は、細胞増殖を低下させるために用いることもできる。これは、腫瘍（以下の表3参照）または他の細胞増殖性疾患の治療に有用と考えられる。
0004458551.tif 000004
上記の方法によって、IAP遺伝子の発現またはポリペプチド活性を効果的に調節することが見いだされた分子を、さらに動物モデルで検討してもよい。それらがインビボの状況でも引き続いてうまく機能する場合には、それらを、必要に応じてアポトーシスの抑制または増強のいずれかのための治療薬として用いることができると考えられる。
IX．IAPによる治療
IAP遺伝子の発現レベルはアポトーシスのレベルと相関関係にある。このため、IAP遺伝子には抗アポトーシス性の遺伝子治療における用途も見いだされる。特に、機能性IAP遺伝子は、神経変性疾患の経過においてアポトーシスを起こす神経細胞、リンパ球（すなわちT細胞およびB細胞）または虚血によって損傷を受けた細胞の維持のために用いることができると考えられる。
治療的なIAP遺伝子構築物のための遺伝子移入到達系としては、アポトーシスに関与すると考えられる細胞（例えば上皮細胞）に対する親和性を有する、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターを用いることができる。この目的に使用することができる多数のベクターは公知である（Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; EglitisおよびAnderson, BioTechniques 6:608-614, 1988; TolstoshevおよびAnderson, current opinion in Biotechnology 1;55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornettaら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 22-:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Millerら、Biotechniques 7:980-990, 1989; Le Gai La Salleら、Science 259:988-990, 1993; およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でも使用されている（Rosenbergら、N.Engl. J. Med 323:370, 1990; Andersonら、米国特許第5,399,346号）。そのままではアポトーシスを起こすと予想される細胞内に治療的DNAを導入するために、非ウイルス的手法を用いることもできる。例えば、リポフェクション（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Onoら、Neurosci. Lett. 117:259, 1990; Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubingerら、Meth. Enz. 101:512, 1983）、アシアロソヌコイド-ポリリジン抱合（Wuら、J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wuら、J. Biol. Chem. 264:16985, 1989）、または、好ましさは落ちるが、外科的状況下におけるマイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465, 1990）によって、神経細胞またはT細胞にIAPを導入することもできる。
上記の適用方法のいずれについても、治療的なIAP DNA構築物は、好ましくはアポトーシス現象が予想される部位に対して適用される（例えば注入による）。しかし、アポトーシス現象が予想される部位の近傍の組織、またはアポトーシスが起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。
上記の構築物において、IAP cDNAの発現は任意の適したプロモーターによって指向させることができ（例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）またはメタロチオネインのプロモーター）、任意の適切な哺乳類調節要素によって調節することができる。例えば、必要であれば、IAPを発現させるために、神経細胞、T細胞またはB細胞における遺伝子発現を優先的に指向することが知られているエンハンサーを用いてもよい。使用するエンハンサーは、その発現が組織または細胞に特異的であると特徴づけられたものを無制限に含む。または、IAPゲノムのクローンを治療的構築物として用いる場合（例えば、上記のIAP cDNAとのハイブリダイゼーションによって単離した後）には、コグネイト調節配列、または、必要であれば、上記の任意のプロモーターもしくは調節要素を含む異種供給源に由来する調節配列を介して調節することもできる。
あまり好ましくはないが、IAPの遺伝子治療は、アポトーシスを起こすと予想される細胞への、IAP mRNAまたはアンチセンスIAP mRNAの直接投与によって達成される。このmRNAは任意の標準的手法によって作製および単離されたものでよいが、高効率プロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるIAP cDNAを用いるin vivo転写によって最も容易に産生される。悪性腫瘍細胞へのIAP mRNAの投与は、上記の直接的な核酸投与の方法のいずれによっても実施することができる。
理想的には、任意の遺伝子治療の手法によるIAP蛋白質の産生は、少なくとも非罹患細胞における正常なIAPの細胞内レベルと等しいIAPの細胞内レベルをもたらすと考えられる。IAPを介した任意の遺伝子治療の手法による治療は、より伝統的な治療法と併用することができる。
本発明の範囲内にあるもう1つの治療的手法には、組換えIAP蛋白質の、アポトーシス現象が予想される部位への直接的（例えば注入による）または全身的（例えば、任意の従来の組換え蛋白質の投与法）のいずれかによる投与が含まれる。IAPの用量は、個々の患者のサイズおよび健康状態を含む多くの因子に依存するが、一般的には何らかの薬学的に許容しうる製剤の形で成人に対して1日当たり0.1mgから100mgの範囲で投与される。
X．IAPポリペプチド、IAP遺伝子またはIAPの合成もしくは機能の調節因子の投与
IAPの蛋白質、遺伝子または調節因子は、1回量を含む形で、薬学的に許容しうる希釈液、担体または賦形剤中に含めて投与することができる。過剰なアポトーシスによって引き起こされる疾患に罹患した患者に対するIAPポリペプチドの投与に適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的行為を用いてもよい。投与は患者に症候が現れる前に行ってもよい。投与経路には任意の適切なものを採用することができ、例えば投与は、非経口的、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼部、脳室内、関節包内、髄腔内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルまたは経口投与であってもよい。治療的製剤は液性溶液または懸濁液の形態をとることもでき、経口投与用であれば製剤は錠剤またはカプセル剤の形態をとることもでき、鼻腔内投与用であれば粉末剤、点鼻薬またはエアロゾル剤の形態をとることもできる。
製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば、「レミントン薬学」（Reminton’s Pharmaceutical Sciences）に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含むことができる。化合物の放出の制御のために、生体適合性で生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。その他の利用可能と考えられるIAP調節性化合物の非経口的送達系には、エチレン-酢酸ビニル共重合体の粒子、浸透圧性ポンプ、埋め込み可能な注入系およびリポソームが含まれる。吸入用の製剤は、例えばラクトースなどの賦形剤を含んでも、もしくは例えばポリエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩などを含む水性溶液であってもよく、または点鼻剤の剤形として投与するための油性溶液、またはゲルであってもよい。
必要に応じて、IAPの蛋白質、遺伝子または調節性化合物による処置を、自己免疫疾患に対する外科手術、ステロイド療法または化学療法、AIDSに対する抗ウイルス療法および虚血性損傷に対する組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）などのより伝統的な治療法と併用してもよい。
XI．アポトーシスの変調が関与する状態の検出
IAPのポリペプチドおよび核酸には、アポトーシスのレベルの異常が関与する状態の検出または観測における診断的用途も見いだされる。例えば、IAPポリペプチドの発現の低下は、ヒトにおけるアポトーシスの亢進と関連している可能性がある（以下のXIIを参照）。したがって、IAP産生レベルの低下または上昇は、有害な状態の徴候を提供する可能性がある。IAPの発現レベルは、任意の標準的な技法によってアッセイすることができる。例えば、生物試料（生検材料など）におけるIAPポリペプチドの発現は標準的なノーザンブロット分析によって観測してもよく、PCRによる補助も可能である（例えば、Ausubelら、前記およびPCR Technology：DNA増幅の原理および応用（Principles and Applications for DNA Amplification）、H.A. Ehrlich編, Stcokton Press, NY; Yapら、Nucl. Acids. Res. 19:4294、1991を参照）。
または、ミスマッチ検出法を用いて、患者から採取した生物試料を、IAP配列における1つまたはそれ以上の変異に関して分析することもできる。一般にこれらの技法には、患者の試料から得た核酸のPCR増幅、および引き続いて行われるハイブリダイゼーションの変化、電気泳動ゲル移動の異常、ミスマッチ結合蛋白質を介した結合もしくは切断、または直接的な核酸塩基配列の決定のいずれかによる変異（すなわちミスマッチ）の同定が含まれる。変異型IAPの検出を容易にするためにこれらの任意の技法を用いることができ、それぞれは本技術分野において周知である。特殊な技法の例は、オリタ（Orita）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766〜2770、1989；シェフィールド（Sheffield）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232〜236に無制限的に記載されている。
さらにもう1つの手法では、生物試料中のIAP蛋白質の検出または観測のためにイムノアッセイが用いられる。IAPポリペプチドのレベルの測定には、任意の標準的なイムノアッセイ形式（例えば、ELISA、ウェスタンブロット法またはRIA）において、IAP特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いることもできる。これらのレベルは野生型IAPのレベルと比較され、IAP産生に低下がみられれば、アポトーシスの亢進が関与する状態であることが示される。イムノアッセイの例は例えばアウスユーベル（Ausubel）ら、前記に記載されている。IAPの検出のために免疫組織化学的な技法を用いてもよい。例えば、患者から組織試料を採取し、切片化して、抗IAP抗体および任意の標準的な検出系（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させた二次抗体を含むもの）を用いてIAPの有無に関して染色することもできる。このような技法に関する一般的な指導は、例えばバンクロフト（Bancroft）およびスティーブンス（Stevens）（組織学的テクニックの理論および実践（Theory and Practice of Histological Techniques）、Churchill Livingstone、1982）およびアウスユーベルら（前記）に見いだすことができる。
1つの好ましい例では、IAP蛋白質の産生の評価（例えば、免疫学的技法または蛋白質切断試験（Hogerrorstら、Nature Genetics 10:208〜212、1995））に始まり、より微妙なIAPの変異（例えば点変異）を同定するように設計された核酸に基づく検出法も含む、複合的な診断法を使用することができる。上記の通り、当業者には多数のミスマッチ検出アッセイが利用可能であり、任意の好ましい技法を用いることが可能である。IAPにおける変異としては、IAPの発現の消失またはIAPの生物活性の消失のいずれかを引き起こすものを検出することができる。この複合的な診断法の変法では、任意の適切なプロテアーゼアッセイ系（例えば上記のもの）を用いて、IAPの生物活性がプロテアーゼ活性として測定される。
ミスマッチ検出アッセイによって、不適切なアポトーシスによってもたらされるIAPを介した疾患素因を診断する機会も提供される。例えば、IAPの変異に関してヘテロ接合性である患者は何ら臨床症状を示さないものの、1つまたはそれ以上の種類の神経変性性、脊髄形成異常性または虚血性の疾患を発症する可能性は正常例よりも高いと考えられる。この診断を受けた場合、患者は有害な環境因子（例えば、紫外線照射または化学的突然変異誘発物質）に対する曝露を最小限にし、自らの医学的状態を慎重に監視する（例えば、頻回の身体検査を通じて）ように予防策を講じると考えられる。この種のIAPの診断手法を、出生前スクリーニングにおいてIAPの変異を検出するために用いることもできる。上記のIAP診断アッセイは、その内部でIAPが通常発現される任意の生物試料（例えば、生検試料、または体液もしくは組織）を用いて実施することができる。被験試料に関するこれらの供給源を用いて、変異型IAP遺伝子の同定に関するアッセイを行うこともできる。
または、特にIAPに関連した変性疾患に対する素因を診断する一環として、IAPの変異を、任意の細胞からのDNA試料を用いて、例えばミスマッチ検出法によって検討することもできる。好ましくは、このDNA試料は分析に先立ってPCR増幅にかけられる。
癌の診断法および予後判定法としてのIAP遺伝子の有用性を示すために、ヒト癌細胞系複数組織ノーザンブロット（Clontech, Palo Alto, CA; #7757-1）をプローブ標識した。このノーザンブロットの各レーンには、以下の8種の異なるヒト細胞系からのポリA+RNAが約2μg含まれている：（1）前骨髄球性白血病 L-60、（2）ヒーラ（Hela）細胞 S-3、（3）慢性骨髄性白血病 K-562、（4）リンパ芽球性リンパ腫 MOLT-4、（5）バーキットリンパ腫 ラジ（Raji）、（6）結腸直腸腺癌 SW480、（7）肺癌 A549、および（8）悪性黒色腫 G361。対照として、ヒト複数組織ノーザンブロット（Clontech, Palo Alto, CA; #7759-1）のプローブ標識も行った。このノーザンブロットには、以下の8つの異なるヒト組織からのポリA+RNAが約2μg含まれている：（1）脾臓、（2）胸腺、（3）前立腺、（4）精巣、（5）卵巣、（6）小腸、（7）大腸、および（8）末梢血白血球。
ノーザンブロットには以下のものを連続的にハイブリダイズさせた：（1）xiapコード領域に対する1.6kbのプローブ、（2）3’非翻訳領域に対応する375bpのhiap-2特異的プローブ、（3）hiap-2と交差反応する、hiap-1のコード領域に対数RZFドメイン1.3kbのプローブ、（4）bcl-2のコード領域に由来する1.0kbのプローブ、（5）製造者によって提供されたβ-アクチンに対するプローブ。ハイブリダイゼーションは、製造者の意見に従って50℃で一晩実施した。ブロットには室温の2X SSC、0.1％SDSによる15分間の洗浄を2回行い、続いて50℃の2X SSC、0.1％SDSによる洗浄を行った。
検討した癌細胞系のすべてにおいて、非癌対照組織からの試料と比較してIAPの発現の増加が示された（表3）。xiapの発現は、ヒーラ（S-3）、慢性骨髄性白血病（K-562）、結腸直腸腺癌（SW480）および悪性黒色腫（G361）で特に高度であった。hiap-1の発現はバーキットリンパ腫で著しく高度であり、結腸直腸腺癌でも上昇が認められた。hiap-2の発現は、慢性骨髄性白血病（K-562）および結腸直腸腺癌（SW480）で特に高度であった。Bcl-2の発現にアップレギュレーションが認められたのはHL-60白血病細胞のみであった。
以上の観察から、抗アポトーシス性IAP遺伝子のアップレギュレーションは広範にみられる現象であって、おそらくBcl-2のアップレギュレーションよりも高い頻度で起こっていることが示唆された。さらに、アップレギュレーションは、癌性細胞の形質転換状態の確立または維持のために必要であると考えられる。
上記の観察を追究するために、すなわちラジ・バーキットリンパ腫細胞系においてhiap-1が過剰発現されるように、複数のバーキットリンパ腫細胞系においてRT-PCR分析を実施した。ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、EB-3およびジヨーエ（Jiyoye）細胞系の細胞、ならびに陽性対照として正常胎盤組織から全RNAを抽出した。RNAを逆転写させ、以下のオリゴヌクレオチドの組を用いるPCRによって増幅した：
5’-AGTGCGGGTTTTTATTATGTG-3’（配列番号：＿）および
5’-AGATGACCACAAGGAATAAACACTA-3’（配列番号：＿）、これらはhiap-1のcDNA断片を選択的に増幅する。RT-PCRはパーキンエルマー480サーモサイクラー（PerkinElmer 480 Thermocycler）を用いて行い、以下のプログラムを35サイクル実施した：94℃を1分間、50℃を1.5分間、および72℃を1分間。PCR反応産物をアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムによって染色した。適切なサイズの増幅されたcDNA断片は、バーキットリンパ腫の試料を含むすべてのレーンで明らかに可視化されたが、正常胎盤組織の試料を含むレーンでは認められず、テンプレートDNAを反応に加えなかった陰性対照を含むレーンでも認められなかった（図17）。
XII．星状細胞腫細胞における26kDa切断産物の蓄積
A．26kDa切断産物の同定
ジャーカット（Jurkat）細胞および星状細胞腫細胞に対して、50mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、1mM PMSF、1μg/ml アプロチニン、および5mMベンザミジン中にて超音波処理（×3回、4℃で15分間）を施すことにより、それらの細胞から全蛋白抽出物を調製した。超音波処理の後、試料に5分間の遠心処理を行った（遠心管中にて14,000RPM）。10％SDS-ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに蛋白質20μgを載せて電気泳動を行い、標準的な方法によってPVDF膜に対するエレクトロブロット法（electroblot）を行った。すでに記載した方法の通りにウェスタンブロット分析を実施した結果、星状細胞腫細胞系（CCF-STTG1）が、アポトーシスの誘因となるイベントがなかったにもかかわらず、抗xiap反応性の約26kDaのバンドを大量に発現したことが明らかになった（図18）。実際に、この細胞系が標準的なアポトーシス誘因に対して特に抵抗性を有するという特徴はすでに分析されている。
26kDaのxiap反応性バンドは以下の実験条件下でも認められた。ジャーカット細胞（形質転換ヒトT細胞系）は、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝露によって誘導されてアポトーシスを起こした。ジャーカット細胞の同一培養物に対して以下のいずれかを暴露させた：（1）抗Fas抗体およびシクロヘキシミド（20μg/ml）、（2）腫瘍壊死因子α（TNF-α、1000U/ml）または（3）TNF-αおよびシクロヘキシミド（20μg/ml）。投与開始から6時間後にすべての細胞を収集した。このほかに陰性対照として、細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加した。細胞はSDS試料緩衝液中に収集し、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準的な方法を用いてPVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。この膜に、1:1000としたウサギ抗XIAPポリクローナル抗体による免疫染色を1時間行った。15分間洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させたヤギ抗ウサギ抗体を室温で1時間適用した。非結合型の二次抗体を洗い流し、化学発光によるXIAP蛋白質の検出を実施した。このウェスタンブロットにより、非処置および処置細胞の両方に完全長の55kDaのXIAP蛋白質が存在することが明らかになった。さらに、アポトーシス性細胞の抽出物には約26kDaの新規なxiap反応性バンドも認められたが、対照の非処置細胞の抽出物ではこれは認められなかった（図19）。
XIAPの切断は、ヒーラ（Hela）などの他の癌細胞系を含むさまざまな細胞種で起こる。26kDaのXIAP切断産物の発現は、ヒーラ細胞では以下のようにして示されている。ヒーラ細胞に以下のいずれかの処置を行った：（1）シクロヘキシミド（20μg/ml）、（2）抗Fas抗体（1μg/ml）、（3）抗Fas抗体（1μg/ml）およびシクロヘキシミド（20μg/ml）、（4）TNFα（1,000U/ml）、または（5）TNFα（1,000U/ml）およびシクロヘキシミド（20μg/ml）。処置開始から18時間後にすべての細胞を収集した。上記の通りに細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加した。ヒーラ細胞を収集し、ジャーカット細胞の試料からのxiap反応性バンドの可視化に用いたものと同一の条件下でウェスタンブロットのプローブ標識を行った。アポトーシス性細胞調製物では同じく26kDaのXIAPのバンドが認められた（図20）。さらに、XIAPの切断の度合いとアポトーシスの程度との間には正の相関が認められた。ヒーラ細胞にシクロヘキシミドまたはTNFαのいずれかのみを投与した場合にはわずかなアポトーシスが引き起こされたのみであり、切断産物はほとんど認められなかった。細胞に抗Fas抗体を投与した場合には、より多量の切断産物が明らかに認められた。これらのデータは、XIAPが1種を超える細胞種において、1種を超えるアポトーシス誘因に反応して切断されることを示している。
B．発現の時間経過
ヒーラおよびジャーカット細胞に抗Fas抗体（1μg/ml）を投与して、投与の直後または1、2、3、5、10もしくは22時間後のいずれかに収集することにより、26kDa切断産物の蓄積に関する時間経過を検討した。上記の通りに、蛋白質抽出物を調製してウェスタンブロット分析を実施した。検討した時間経過の範囲にわたって、26kDa切断産物の蓄積量は両方の種類の細胞で増加した（図21Aおよび21B）。
C．26kDaのXIAP切断産物の細胞下局在
26kDa切断産物の細胞下配置を決定するために、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝露によってジャーカット細胞がアポトーシスを起こすように誘導し、続いてその直後、3時間後または6時間後に細胞を収集した。上記の通りに、それぞれの時点で収集した細胞から全蛋白質抽出物を調製した。核および細胞質の細胞抽出物を調製するために、アポトーシス性ジャーカット細胞を等張トリス（Tris）緩衝生理食塩水（pH7.0）で洗い、細胞抽出緩衝液（50mM PIPES、50mM KCl、5mM EGTA、2mM MgCl2、1mM DTTおよび20μMサイトカラシンB）中での凍結解凍を5回行うことによって溶解した。核は遠心処理によってペレット化し、等張トリス緩衝液（pH7.0）中に再懸濁させて-80℃で凍結した。抽出物の細胞質分画は、TA 100.3ローターに入れて60,000RPMでの遠心処理をさらに30分間施した。上清を除去し、-80℃で凍結した。核および細胞質の両方の分画の試料を12.5％SDS-ポリアクリルアミドゲル上に載せた後、PVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。続いて、抗CPP32抗体（Transduction Laboratories Lexington, KY；図22A）または上記のウサギ抗XIAP抗体（図22B）のいずれかを用いてウェスタンブロット分析を実施した。
CPP32プロテアーゼを認識する抗CPP32抗体（YAMAまたはアポパイン（Apopain）としても知られる）は、ほぼ独占的に細胞質分画中に分配された。55kDaのXIAP蛋白質は独占的にアポトーシス性細胞の細胞質中に位置しており、これは、正常で健全なCOS細胞でXIAPが細胞質に位置することが免疫蛍光顕微鏡法によって示した上記の研究の結果と一致する。これに対して、アポトーシス性ジャーカット細胞では、核分画に独占的に26kDa切断産物が位置していた。以上を総合すると、これらの観察から、XIAPの抗アポトーシス成分は26kDa切断産物であって、それは核内に作用を及ぼすと考えられることが示唆される。
D．XIAP蛋白質のインビトロでの切断、および切断産物の特徴分析
この一連の実験のために、プラスミドpcDNA3-6myc-XIAP、T7 RNAポリメラーゼ、および一対の転写／翻訳キット（Promega）を製造者の指示に従って用いて、XIAP蛋白質にS35による標識を施した。セファデックス（Sephadex）G-50を用いるカラムクロマトグラフィーにより、放射性標識が施されたXIAP蛋白質を、取り込まれなかったメチオニンから分離した。さらに、抗Fas抗体（1μg/ml）による処置を3時間行った後、アポトーシス性ジャーカット細胞の抽出物を調製した。抽出物を調製するために、細胞をTriton X-100緩衝液（1％ Triton X-100、25mM Tris HCl）中にて氷上に2時間置いて溶解し、続いて5分間のマイクロ遠心処理（microcentrifuge）を行った。可溶性抽出物を残した（これはTX100と表記した）。細胞抽出緩衝液中にて凍結／解凍を行って細胞を溶解した。可溶性の細胞質分画は別にまとめた（これはCEBと表記した）。CEB細胞質分画の調製物から得た核ペレットは、Triton X-100緩衝液によって可溶化し、マイクロ遠心処理を行って、主に核DNAを含む可溶性分画を残した（これはCEB-TX100と表記した）。可溶性細胞抽出物は細胞をNP-40緩衝液によって溶解することによって調製し、続いてマイクロ遠心処理を5分間実施した（これはNP-40と表記した）。インビトロでの切断は、それぞれの抽出物（CEB、TX-100、CEB-TX100およびNP-40）16μlを、インビトロで翻訳されたXIAP蛋白質とともに37℃で7時間インキュベートすることによって実施した。TX100緩衝液またはCEB緩衝液のみを含む陰性対照も含めた。蛋白質は10％SDS-ポリアクリルアミド上で分離し、乾燥させた後にX線フィルムに一晩露光させた。
XIAPのインビトロでの切断は、CEB抽出物では明らかであった。切断産物の分子量の観測値は約36kDaであった（図23）。切断産物のサイズに10kDaの差があったことは、観察された産物が、mycエピトープの6つのコピー（10kDa）を含む組換え蛋白質のアミノ末端に由来することを示している。このため、この切断産物は少なくとも2つのBIRドメインを有しており、核内に位置していると考えられる。
XIII．HIVに感染した個体の治療
hiap-1およびhiap-2の発現は、HIVに感染したヒト細胞では著明に低下する。さらに、この低下はアポトーシスに先行する。したがって、HIAP-1、HIAP-2、これらの蛋白質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子をアップレギュレートする化合物の投与を、HIVに感染した患者におけるT細胞の消耗を予防するために用いることができる。以下のアッセイを、hiap-1またはhiap-2の発現を変化させ、同時にアポトーシスを予防する化合物をスクリーニングするために用いることもできる。
培養成熟リンパ球CD-4+T細胞系（H9、「a」と表記；CEM/CM-3、「b」と表記；6T-CEM、「c」と表記；およびジャーカット、「d」と表記。いずれも図13Aおよび図13B）をマイトジェンまたはHIV感染に曝露させた後、アポトーシスの徴候（図13A）およびhiap遺伝子の発現（図13B）に関して検討した。アポトーシスの存在はゲル電気泳動上のDNAの「梯子状分布（laddering）」の出現によって示され、遺伝子の発現はPCRによって評価された。正常の（感染もマイトジェン刺激も受けていない）細胞から得た結果は、図13Aおよび13Bに「1」と表記した各レーンに示した。PHA/PMA（フィトヘマグルチニン／ホルボールエステル）刺激から24時間後に得た結果は、「2」と表記した各レーンに示した。HIV IIIB株の感染から24時間後に得た結果は、「3」と表記した各レーンに示した。「M」は標準的DNAマーカーを指す（図13Bにおける123bpのラダー、および図13AにおけるラムダHindIIIラダー（いずれもGibco-BRL））。アポトーシスの存在を示すDNAのラダー（Prigentら、J. Immunol. Methods、160:139〜140、1993）は、上記の試料から得たDNAをアガロースゲル上で電気泳動して臭化エチジウム染色を施した場合には明らかであった（図13A）。検討した4種のT細胞系のアポトーシスに対する感受性およびその程度は、マイトジェン刺激およびHIV感染の後に変化した。
hiap遺伝子の発現を検討するために、培養細胞から全RNAを調製し、オリゴdTプライミングを用いて逆転写を行った。hiap-2a、hiap-2bおよびhiap-1を検出するために、特異的プライマー（表5に示した）を用いるPCRによってRT cDNA産物を増幅した。PCRは、パーキンエルマー480サーモサイクラー（PerkinElmer 480 thermocycler）を用いて行い、以下のプログラムを35サイクル実施した：94℃を1分間、55℃を2分間および72℃を1.5分間。RT-PCR反応産物を1％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。HIVの感染から24時間後では4種の細胞系のすべてにおいてhiap-2の転写物は認められなかった。4種の細胞系のうち3種（すべてH9以外）では、HIV感染後にhiap-1遺伝子も劇的にダウンレギュレートされた。PHA/PMAマイトジェン刺激によってもhiap遺伝子の発現は低下するように思われ、これは特にhiap-2で強く、程度は落ちるがhiap-1でも認められた。これらの実験で得られたデータの概要を表5に示した。β-アクチンの発現は検討したすべての細胞系で一貫して認められ、このことから、hiap遺伝子の発現の低下はRT-PCRアッセイの欠陥によるものではないことが示された。
0004458551.tif 000005
0004458551.tif 000006
XIV．蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によるxiap、hiap-1およびhiap-2の染色体Xq25および11q22-23への割り当て
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を用いてxiap、hiap-1およびhiap-2の染色体上の位置を同定した。用いたプローブはプラスミドベクター中にクローニングしたcDNAである：2.4kbのxiapクローンは1493bpのコード配列、34bpの5’UTR（非翻訳領域）および913bpの3’UTRを含み、hiap-1のcDNAクローンは3.1kb長であって1812のコード配列および1300bpの3’UTRを含み、hiap-2クローンは1856bpのコード配列および1200bpの5’UTRからなる。合計1μgのプローブDNAをニックトランスレーション（BRL）によってビオチン標識した。正常末梢血培養物から調製した染色体展開物（chromosome spread）を70℃の50％ホルムアルデヒド／2X SSC中に2分間置いて変性させ、続いて、2X SSC／70％ホルムアルデヒド／10％硫酸デキストランからなる溶液中にて、ビオチン標識したDNAプローブと37℃で18時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に展開物を2X SSC／50％ホルムアルデヒドで洗い、続いて42℃の2X SSCで洗った。ビオチン標識したDNAを、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）共役アビジン抗体および抗アビジン抗体（ONCOR検出キット）により、製造者の指示に従って検出した。染色体はヨウ化プロピジウムによって対比染色し、オリンパス（Olympus）BX60間接蛍光顕微鏡を用いて検査した。染色体の同定のために、記録および標識された分裂中期展開物を載せたスライドに脱染、脱水、乾燥、トリプシンによる30秒間の消化、および4％ギムザ染色による2分間の染色を行った。染色体展開物の位置を再び捉えて、画像を比較した。
上記のようにして、合計101個の分裂中期展開物をxiapプローブを用いて検討した。分析した細胞の74％では、Xq25染色体の相同体の1つまたは両方のいずれかに対称的な蛍光信号が認められた。hiap-1およびhiap-2のプローブで染色した後に56個の細胞を分析したところ、検討した細胞の83％で11q22-23領域に対となる信号が認められた。xiap遺伝子はXq25にマッピングされ、hiap-1およびhiap-2遺伝子は11q22および11q23バンドの境界部にマッピングされた。
以上の実験により、xiap遺伝子の位置が染色体Xq25上にあることが裏づけられた。これまでのところ、いずれの悪性腫瘍についてもバンドXq25が関与する高度に一貫した染色体異常は報告されていない。しかし、この領域内の欠失は、伴性劣性リンパ増殖症候群を含む多数の免疫系欠損症と関連している（Wuら、Genomics 17:163〜170、1993）。
小児白血病の50％を超える割合で、表現型とは無関係にバンド11q23の細胞遺伝学的異常が同定されている（Martinez-Climetら、Leukemia 9:1299〜1304、1995）。MLL遺伝子（混合連鎖白血病（mixed lineage leukemia）または骨髄系リンパ球性白血病；Ziemin Van der Poelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10735〜10739）の再配列は、11q23の転座を有する症例の80％以上で検出されているが、MLL遺伝子以外の領域が明らかに再配列に関与している患者も報告されている（Kobayashiら、Blood 82:547〜551、1993）。このため、IAP遺伝子はBcl-2のパラダイムに従うと考えられ、したがって癌の形質転換において重要な役割を果たすと考えられる。
XV．予防的な抗アポトーシス療法
IAPの変異に関してヘテロ接合的である、またはIAPの変異を起こしやすい（その変異がIAPの生物活性の変調または消失をもたらさないものであっても）と診断された患者、またはHIV陽性であると診断された患者には、疾患の表現型が現れる前に上記の治療法のいずれかを投与することができると考えられる。例えばこの治療法は、HIV陽性であるが現時点ではT細胞数の減少またはその他の明白な徴候を有していない患者に対して提供されうる。特にIAPの発現またはIAPの生物活性を増強させることが示された化合物は、任意の標準的な用量および経路の投与（上記参照）によって投与することができると考えられる。または、IAP発現構築物を用いる遺伝子治療を行って変性疾患の発症の前に細胞欠損の回復または予防を行うこともできると考えられる。
本発明の方法は、例えばヒト、家庭内ペットまたは家畜などの任意の哺乳動物において本明細書で説明した疾患の低減または診断に用いることができると思われる。非ヒト哺乳動物に治療または診断を受けた場合、使用したIAPのポリペプチド、核酸または抗体は好ましくはその種に特異的である。
その他の態様
その他の態様において、本発明は、哺乳類IAPポリペプチド（図1〜6、配列番号：1〜42）と実質的に同一な任意の蛋白質を含む。このような相同体は、その他の実質的に純粋な天然の哺乳類IAP蛋白質のほか、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、蛋白質をコードしておりかつ高度に厳密な条件、または好ましさは落ちるが厳密性の低い条件（例えば、少なくとも40ヌクレオチド長のプローブとともに40℃で2X SSCにより洗浄）において図1〜6のIAPのDNA配列（配列番号：1〜42）とハイブリダイズするDNA配列、およびIAPを指向する抗血清と特異的に結合する蛋白質を含む。また、この用語は、IAPの一部を含むキメラ蛋白質を含む。
本発明はさらに、任意の天然のIAPの類似体を含む。類似体は天然のIAPとは、アミノ酸配列の違い、翻訳後修飾のいずれかまたはその両方の点で異なる。一般に本発明の類似体は、天然のIAPの配列の全体または一部と少なくとも85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％またはさらに99％の同一性を示す。比較する配列の長さは、少なくとも15アミノ酸残基であり、好ましくは25アミノ酸残基、より好ましくは35アミノ酸残基を上回る。修飾には、インビボおよびインビトロでのポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化などが含まれる。このような修飾は、ポリペプチドの合成もしくはプロセッシングの間、または単離された修飾酵素による処置後にも起こる。また、類似体は、天然のIAPとは一次配列に変化を生じている点でも異なる。これらには、天然型および誘導型の両方（例えば、Sambrook, FritschおよびManiatis、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）第2版、CSH Press、1989またはAusubelら、前記に記載された方法による、放射線照射もしくはエタンメチルスルホネート曝露によるランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって生じたもの）による遺伝的変異体が含まれる。また、環状化ペプチド分子、および例えばD-アミノ酸またはβもしくはγアミノ酸などの非天然型もしくは合成アミノ酸などの、L-アミノ酸以外の残基を含む類似体も含まれる。完全長のポリペプチドのほかに、本発明にはIAPの断片も含まれる。本明細書で用いる「断片」という用語は、少なくとも20個の隣接アミノ酸、好ましくは30個の隣接アミノ酸、より好ましくは50個の隣接アミノ酸、最も好ましくは60から80個またはそれ以上の隣接アミノ酸を意味する。IAPの断片は当業者に周知の方法によって作製することができるが、通常の蛋白質プロセッシング（例えば、新生ポリペプチドからの生物活性に必要でないアミノ酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的蛋白質プロセッシング過程によるアミノ酸の除去）によって得られたものでもよい。
本発明による好ましい断片または類似体は、診断対象となる試料におけるIAPの核酸またはアミノ酸配列の特異的な検出を容易にするものである。この目的に特に有用なIAP断片には、表2に示したアミノ酸断片が無制限的に含まれる。
請求内容は以下の通りである。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：University of Ottawa
Korneluk, Robert G.
Mackenzie, Alexander E.
Baird, Stephen
Liston, Peter
（ii）発明の名称：MAMMALIAN IAP GENE FAMILY, PRIMERS, PROBES, AND DETECTION METHODS
（iii）配列数：45
（iv）文書通信情報：
（A）宛名：Fish & Richardson P.C.
（B）街路名：225 Franklin Street
（C）市名：Boston
（D）州名：MA
（E）国名：USA
（F）郵便番号：02110-2804
（v）コンピューター読取りフォーム：
（A）メディア形式：Floppy disk
（B）コンピューター：IBM PC compatible
（C）運転システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vi）現出願データ：
（A）出願番号：PCT/IB96/----
（B）出願日：05-AUG-1996
（C）分類：
（vii）親出願データ：
（A）出願番号：US 08/511,485
（B）出願日：04-AUG-1995
（C）分類：
（vii）親出願データ：
（A）出願番号：US 08/576,956
（B）出願日：22-DEC-1995
（C）分類：
（viii）弁理士／代理人情報：
（A）氏名：Clark, Paul T.
（B）登録番号：30,162
（C）参照／明細書番号：07891/003WO1
（ix）電気通信情報：
（A）電話：617/542-5070
（B）ファックス：617/542-8906
（C）テレックス：200154
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（D）他の情報：Xaa at positons 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 30, 31, 32, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 42, and 45 may be any amino acid. Xaa at positon 8 is Glu or Asp. Xaa at positions 14 & 22 is Val or Ile.
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0004458551.tif 000007
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（D）他の情報：Xaa at positions 1, 2, 3, 6, 9, 10, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 24, 30, 32, 33, 35, 37, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 64 and 66 may be any amino acid. Xaa at positions 13, 16 and 17 may be any amino acid or may be absent.
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0004458551.tif 000008
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2540塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：３：
0004458551.tif 000009
0004458551.tif 000010
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：497アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４：
0004458551.tif 000011
0004458551.tif 000012
0004458551.tif 000013
（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2676塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：５：
0004458551.tif 000014
0004458551.tif 000015
0004458551.tif 000016
（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：604アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：６：
0004458551.tif 000017
0004458551.tif 000018
0004458551.tif 000019
0004458551.tif 000020
（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2580塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：７：
0004458551.tif 000021
0004458551.tif 000022
（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：618アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：８：
0004458551.tif 000023
0004458551.tif 000024
0004458551.tif 000025
（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2100塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：両形態
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：９：
0004458551.tif 000026
0004458551.tif 000027
（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：496アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１０：
0004458551.tif 000028
0004458551.tif 000029
（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：67アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１１：
0004458551.tif 000030
（2）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：275アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１２：
0004458551.tif 000031
0004458551.tif 000032
（2）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：498アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１３：
0004458551.tif 000033
0004458551.tif 000034
0004458551.tif 000035
（2）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：67アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
0004458551.tif 000036
（2）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：67アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１５：
0004458551.tif 000037
（2）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１６：
0004458551.tif 000038
（2）配列番号：１７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１７：
0004458551.tif 000039
（2）配列番号：１８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１８：
0004458551.tif 000040
（2）配列番号：１９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：１９：
0004458551.tif 000041
（2）配列番号：２０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２０：
0004458551.tif 000042
（2）配列番号：２１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２１：
0004458551.tif 000043
（2）配列番号：２２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：67アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２２：
0004458551.tif 000044
（2）配列番号：２３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：67アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２３：
0004458551.tif 000045
（2）配列番号：２４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：66アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２４：
0004458551.tif 000046
（2）配列番号：２５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：66アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２５：
0004458551.tif 000047
（2）配列番号：２６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２６：
0004458551.tif 000048
（2）配列番号：２７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２７：
0004458551.tif 000049
（2）配列番号：２８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２８：
0004458551.tif 000050
（2）配列番号：２９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：２９：
0004458551.tif 000051
（2）配列番号：３０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：68アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３０：
0004458551.tif 000052
（2）配列番号：３１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：66アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３１：
0004458551.tif 000053
（2）配列番号：３２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３２：
0004458551.tif 000054
（2）配列番号：３３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３３：
0004458551.tif 000055
（2）配列番号：３４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３４：
0004458551.tif 000056
（2）配列番号：３５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３５：
0004458551.tif 000057
（2）配列番号：３６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３６：
0004458551.tif 000058
（2）配列番号：３７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３７：
0004458551.tif 000059
（2）配列番号：３８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：46アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：両形態
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：３８：
0004458551.tif 000060
（2）配列番号：３９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2474塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：３９：
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（2）配列番号：４０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：602アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４０：
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0004458551.tif 000064
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（2）配列番号：４１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：2416塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：４１：
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（2）配列番号：４２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：591アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４２：
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（2）配列番号：４３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：11アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：不明
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号：４３：
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（2）配列番号：４４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：４４：
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（2）配列番号：４５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（genomic）
（xi）配列の記載：配列番号：４５：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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