(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（a）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（c）工程（a）および工程（b）で得られたタンパク質を混合する工程と、
（d）工程（c）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（e）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（f）各タンパク質について、工程（a）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（c）工程（a）および工程（b）で得られたタンパク質を混合する工程と、
（d）工程（c）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（e）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（f）各タンパク質について、工程（a）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項３】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（c）工程（a）で得られたタンパク質または工程（b）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
（d）工程（c）で得られた標識されたタンパク質と、工程（a）および工程（b）で得られたタンパク質のうち工程（c）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
（e）工程（d）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（f）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（g）各タンパク質について、工程（a）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項４】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（b）工程（a）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（c）工程（b）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（d）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（e）工程（d）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（f）工程（e）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（g）工程（c）および工程（f）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（h）各タンパク質について、工程（a）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程（d）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項５】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（a1）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（a2）工程（a1）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（a3）工程（a2）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（a4）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（b1）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（b2）工程（b1）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（b3）工程（b2）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（b4）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（c）各タンパク質について、工程（a1）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程（b1）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項６】
化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（b）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（d）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
工程（b1）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、請求項１〜４、６〜８および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
同位体が、13Cである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（a）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（c）手段（a）および手段（b）で得られたタンパク質を混合する手段と、
（d）手段（c）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（e）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（f）各タンパク質について、手段（a）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
【請求項１４】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（c）手段（a）および手段（b）で得られたタンパク質を混合する手段と、
（d）手段（c）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（e）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（f）各タンパク質について、手段（a）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
【請求項１５】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（b）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（c）手段（a）で得られたタンパク質または手段（b）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
（d）手段（c）で得られた標識されたタンパク質と、手段（a）および手段（b）で得られたタンパク質のうち手段（c）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
（e）手段（d）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（f）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（g）各タンパク質について、手段（a）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（b）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
【請求項１６】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（a）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（b）手段（a）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（c）手段（b）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（d）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（e）手段（d）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（f）手段（e）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（g）手段（c）および手段（f）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（h）各タンパク質について、手段（a）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段（d）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
【請求項１７】
複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（a1）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（a2）手段（a1）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（a3）手段（a2）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（a4）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（b1）担体に固定化された化合物と同じ又は異なる化合物を添加することにより予め当該化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、前記担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（b2）手段（b1）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（b3）手段（b2）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（b4）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（c）各タンパク質について、手段（a1）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段（b1）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
【請求項１８】
化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
手段（b）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
手段（d）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
手段（b1）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行い、当該化合物の種類の数だけタンパク質群を調製することを特徴とする、請求項１７記載のシステム。
【請求項２２】
担体に固定化された化合物が、ATP、GTP、NADおよびNADPからなる群から選択されるいずれかの化合物である、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33Pおよび34Sからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、請求項１３〜１６、１８〜２０および２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
同位体が、13Cである、請求項２３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法に関する。
【背景技術】  ヒトをはじめ多くの生物のゲノム配列が解析され、得られたゲノム情報をもとに効率よく、かつ必然性の高い薬剤を作るゲノム創薬が注目されている。薬剤の標的の多くは、タンパク質であるが、総数約３２，０００と推定されているヒト遺伝子から合成されるタンパク質の数は、翻訳後修飾等を考えると遺伝子の数から単純に計算される数の数倍になる。また、抗生物質などヒトに直接作用しない薬剤もあることを考慮すると、創薬上相当な数のタンパク質を解析することになるが、実際に薬剤のターゲットになりうるものはごく限られている。
近年、創薬上の特定の標的タンパク質を定めた場合には、ＨＴＳ（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）等の手法により、数多くの化合物群の中からその標的に対して最適な化合物をスクリーニングすることが可能になり、このスタイルが創薬研究の主流になっている。しかしながら、選び出された化合物のタンパク質に対する特異性（結合、相互作用など）については、数種類程度のタンパク質について確認する程度であって、より網羅的な特異性の検討は行われていない。
そして、薬剤候補品の真の標的分子やその標的分子が関わる情報伝達経路を同定することは、薬効、副作用の機序を明らかにすることにつながり、臨床試験で他薬剤との薬効、副作用等の差別化を図る上で大きな役割を果たす。薬剤の標的分子探索にはいくつかの手法があるが、薬剤と標的タンパク質の相互作用の直接的な証明は、最終的には生化学的な実験で立証しなければならない。
一方、プロテオミクスでは薬剤の結合タンパク質を直接、質量分析計（ＭＳ）で解析することができ、タンパク質試料は、培養細胞由来でも臓器由来でも良いといった、ジェネティクスにはない魅力がある。
ある特定のタンパク質を単離する手法として、アフィニティークロマトグラフィーが広く用いられている。化合物の結合タンパク質を単離する目的でアフィニティークロマトグラフィーを用いた代表例として、免疫抑制剤ＦＫ５０６のターゲットタンパク質であるｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＦＫＢＰ）を同定した例があげられる１、２）。Ｈａｒｄｉｎｇらは，活性を保持した状態でＦＫ５０６をアフィニティーマトリックスに固定化し，脾臓から調製したライセートをカラムに流した。そして、リガンドに結合したタンパク質を、固定化していないＦＫ５０６溶液で競合的に溶出することにより、特異的に結合するタンパク質としてＦＫＢＰを得た。また、天然物由来生理活性物質の中には、ターゲットと共有結合することによってその活性をより強固にするものがある３−５）。このような物質に、ビオチンなどのタグを導入し、それを細胞などに加えて一定時間インキュベートした後にライセートを調製する。そして得られたライセートから、アビジンを固定化したカラムによってビオチンタグで標識された化合物を回収して化合物に結合したタンパク質を同定することが可能になる。Ｓｉｎらは，血管新生抑制作用のあるｆｕｍａｇｉｌｌｉｎのビオチン化誘導体を合成し，ウシ脳の抽出液と反応させた。そして数段階のクロマトグラフィーの後，アビジンカラムを用いてビオチン化誘導体を回収し，特異的な結合タンパク質としてＩＩ型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ−２）を同定した。この系は，化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーとは異なり，細胞抽出液のみならず生理的条件下での培養細胞とプローブとの反応が可能であり、細胞の分画やライセートの調製段階で容易に変性してしまうような結合タンパク質の単離には有効な方法である５）。
アフィニティークロマトグラフィーによって，当初予想した以外のタンパク質も同定されることがある６−９）。Ｋｎｏｃｋａｅｒｔら７）は、種々のｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）阻害剤を、まずｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｎｅｌの測定系で評価した。ただし、ここで用いた酵素は、数種のＣＤＫとｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３α／β（ＧＳＫ−３α／β）を主とするごく限られたものであった。本アッセイにより、ｐａｕｌｌｏｎｅがＣＤＫおよびＧＳＫ−３α／βの阻害剤であることが示されたが、ｐａｕｌｌｏｎｅをアフィニティーマトリクスに固定化し、それをプローブとして結合タンパク質を精製した際には予想外の結果が得られた。すなわち、これらのｋｉｎａｓｅ以外にｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ｍＭＤＨ）が特異的にこのプローブに結合することが見出された。そして、その後のｉｎ  ｖｉｔｒｏの酵素活性測定系において，ｐａｕｌｌｏｎｅが確かにｍＭＤＨ活性を阻害することが確認されたことから，アフィニティークロマトグラフィーを用いる手法によって初めて，ｐａｕｌｌｏｎｅについて想定外の新規細胞内ターゲット（ｍＭＤＨ）が明らかにされたといえる。本実験結果は，化合物のターゲットおよび作用機序探索研究に幾つかの示唆を与えるものと考えられる。上記示唆のひとつは，その化合物の作用が、想定しているターゲットタンパク質を介した機序のみならず、複数の作用機序の総合として発現されている可能性である。
アフィニティークロマトグラフィーでは，一部の天然物由来生理活性物質を除き，化合物とタンパク質の相互作用は非共有結合であることを基本としている。しかしながら、親和性が弱い場合には、真のターゲットが操作の過程で化合物から解離してしまう場合がある。たとえば、化合物がより親和性の高いタンパク質や、親和性は同等でも量的により多く含まれるタンパク質によって飽和されてしまうような場合がある。つまり、アフィニティークロマトグラフィーで得られたタンパク質の中には、非特異的相互作用による結合タンパク質が少なからず存在する。特にタンパク結合率が高い薬剤は、血清中などで非常に多くのタンパク質と結合しうるため、例えばアフィニティーカラムにおいて１Ｍ塩化ナトリウムで入念に洗浄した後でも、２００−３００種類のタンパク質が結合していることが多々ある。従って、プロテオーム技術が発達し、多くのタンパク質を同定することが比較的容易になったとはいえ、如何にしてこれらの中から特異的なタンパク質を見つけるかが重要になる。Ｓｈｉｍｉｚｕらは、マトリックスの表面を親水性の高い高分子重合体でコーティングし，汎用されているマトリックスに比べてこの非特異的な吸着を低減している２）。
非特異的相互作用を軽減する別の試みの一つとして、アフィニティークロマトグラフィーを行う前に、化合物に特異的に結合するであろうタンパク質群をあらかじめ絞り込んでおく方法がある１０）。キノリン系骨格を有する抗マラリア薬であるクロロキンの結合タンパク質を調べるために、まずＡＴＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を固定化したカラムでＡＴＰ結合タンパク質群を精製し、結合タンパク質候補群を得る。キノリンは、プリン体に似た構造を持つため、ＡＴＰやＤＮＡなどプリンヌクレオチドと結合しうるタンパク質と親和性を持つことが考えられる。そこで、ＡＴＰカラムであらかじめ標的候補タンパク質を絞り込むことによって、非特異的相互作用を軽減でき、クロロキンの標的タンパク質を同定することができた。これによりクロロキンはマラリアではなくヒトに作用していることが明らかとなり、作用メカニズムと副作用メカニズムも推察できた。
特異性を高める別の試みとしては、化合物固定化カラムから結合タンパク質を溶出する際に、固定化していない化合物や結合部位を競合すると思われる分子、例えばＡＴＰやＮＡＤＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）などを用いて競合的に溶出する方法がある。ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０の結合タンパク質解析では、化合物とＡＴＰを組み合わせて溶出することで、ｐ３８の回収率を上げることに成功している１１）。この方法により、ｐ３８特異的と考えられていたＳＢ２０３５８０に結合する新たなキナーゼを多数同定するに至った。同様に化合物で競合的に溶出させるためには、化合物が水溶液に充分量溶けることが必要であるため、難溶性薬剤には適用が難しい。しかしアフィニティーカラムにアプライする前のタンパク質混合液中に固定化していないフリー化合物を混ぜておくことでターゲットをマスクすることができる。このマスクしたタンパク質を含むサンプルをアフィニティーカラムにアプライして、カラム結合タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。マスクの有無でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のバンドの比較を行い、マスクすることによって消えたバンドがターゲットであると考えられる２）。この場合、化合物の水に対する溶解性が悪くてもタンパク質混合液中であれば、ある程度の溶解性を期待できる。
しかし、低分子化合物は、そのほとんどが少なからず血清タンパク質と結合する。したがって、結合タンパク質群の中から低分子化合物に特異的な標的タンパク質を見つけなければいけない。
そのためには、目的の化合物と構造が似ているが活性の異なる化合物を用意して、結合タンパク質のディファレンシャル・ディスプレイを行えばよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで違いのあるバンドを見つけても良いが、結合タンパク質が多い場合は全てのバンドを分離するのは容易ではない。そこで、本発明者らは、２次元電気泳動又は安定同位体標識法を用いたＭＳ解析１２）により、薬剤のターゲットタンパク質の同定手法を、新規抗癌剤Ｅ７０７０を用いて検討し報告した１３）。Ｅ７０７０は，マウス由来癌細胞Ｐ３８８の細胞周期をＧ１期で阻害することを指標にしてスクリーニングされた化合物１４）で、その結合タンパク質はこれまで不明であった。そこで、Ｅ７０７０をアフィニティー・プローブとして、その結合タンパク質を同定することにした。プローブを用いた手法では、いかに良質なプローブを用いるかが鍵となる。そのプローブが元の化合物と同程度の活性を有していることが理想である。化合物にはその活性発現に必須な構造があるが，必須構造はケミストが化合物の構造変換を行い，その活性を高めていく過程で構造活性相関として明らかになる。そしてこの必須構造部分とは異なる部分にリンカーを伸ばしてマトリックスに導入することになるのであるが，Ｅ７０７０ではその構造活性相関から，ｓｕｌｆａｍｏｙｌ基を変換することによってプローブを合成した。そして、Ｅ７０７０を固定化したアフィニティークロマトグラフィーで結合タンパク質の同定を行った。しかしながら，このプローブには非常に多くのタンパク質が結合し，ターゲットタンパク質の絞込みが困難であった。一般に，低分子の合成化合物は特異性が低く様々なタンパク質に結合する傾向がある。また，Ｅ７０７０など合成低分子化合物は水溶液に難溶であることが多いため、固定化していない薬剤をアフィニティーカラムへ大量に流すことで特異的に溶出させる方法が困難であることが多い。Ｅ７０７０も溶解度が低く，界面活性剤や変性剤のような溶出力を高めた溶液を段階的に用いることによって溶出せざるを得なかった。そして精製条件について種々検討したが、Ｅ７０７０の場合，溶出されたタンパク質のほとんどは化合物に結合したもので，ビーズやリンカーなどに対する非特異吸着によるものではなかった。そこで，構造が類似していながら抗腫瘍活性の異なる化合物を用いたプローブを新たに調製し，それぞれのプローブから溶出されたタンパク質をＩＣＡＴ１５、１６）および２Ｄ−ＤＩＧＥ１７）の定量的プロテオームの手法を用いて解析することによって、Ｅ７０７０により強く吸着するタンパク質を同定する戦略を構築した１３）。その結果、非常に多くのタンパク質が２つのマトリックスに吸着していた中で、Ｅ７０７０タイプのプローブに特異性が高く吸着するタンパク質の同定に成功した。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥでのバンドの有無による定性的判断とは違い、このような定量的な判定により信頼性の高い結果を得ることが出来る。
しかし、前述の方法には、依然幾つかの課題が残っている。例えば、（１）化合物を担体（カラムに充填された担体を含む、以下、単に「カラム」と称する場合がある）に固定化する必要があるにもかかわらず、スクリーニングのために合成された化合物のほとんどは担体（カラム）に固定化できない場合がある。そのため別途合成する必要があるが、多くの時間も労力も要する。さらに担体（カラム）に固定化する化合物の部位によって結合するタンパク質の種類が変わることも多い。（２）化合物を担体（カラム）に固定化できるように構造を変える際には、活性が変わらないようにすべきであるが、構造を変えることにより、特異性や親和性が変わってしまうことがある。（３）アフィニティーカラムとして固定化する化合物を変えることでディファレンシャル・ディスプレイを行う際に、ポジティブ化合物（活性の比較的強い化合物）の選択よりもネガティブ化合物（活性の比較的弱い化合物）の選択に迷うことが多い。理想的にはネガティブ化合物全てをアフィニティーカラムにすればよいが、現実的には（１）の理由から容易ではない。（４）一般的にアフィニティーカラムとして固体化されている化合物量は多くの場合ゲル１ｍｌあたり０．１ｍｇから数ｍｇ程度であり、これは１ｍＭ前後に相当する。ところが細胞に対して何らかの表現型を誘導する（活性がある）薬剤は、数μＭから数ｎＭ、ときにはｐＭオーダーで活性を示す。したがって、活性を示す濃度は、カラム内に固定化された薬剤濃度と大きな乖離がある。一般に薬剤を薬効用量よりもはるかに高い濃度で使用すると非特異的な毒性作用が現れることが多い。つまりカラム内に高い濃度の薬剤が固定化されているということは、このような毒性領域の作用が含まれていることがあると思われる。そこで担体（カラム）に対する化合物の固定化量を数μＭから数ｎＭに減らすことも可能であるが、そのような微量の固定化量をコントロールすることは必ずしも容易ではなく、また結合するタンパク質の量、つまりアフィニティーカラムの負荷量も大きく減るため目的のタンパク質をＭＳで検出できなくなる可能性もある。その際にはカラムサイズを大きく、例えば１００〜１０００倍にすることになるが実用的には扱いづらくなる。
参照文献
１）Ｍ．Ｗ．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａ．Ｇａｌａｔ，Ｄ．Ｅ．Ｕｅｈｌｉｎｇ，ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８（１９８９）．
２）Ｎ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｊ．Ｔａｎｇ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉ，Ｉ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｈｉｒａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａｉｚａｗａ，Ｍ．Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｒ．Ｏｈｂａ，Ｈ．Ｈａｔｏｒｉ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｆ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．Ｏｏｍｏｒｉ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｈ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈａｎｄａ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８，８７７（２０００）．
３）Ｎ．Ｓｉｎ，Ｌ．Ｍｅｎｇ，Ｍ．Ｑ．Ｗ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｗｅｎ，Ｗ．Ｇ．Ｂｏｒｎｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｃｒｅｗｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９４，６０９９（１９９７）．
４）Ｅ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｚ．Ｓｕ，Ｂ．Ｅ．Ｔｕｒｋ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｗｕ，Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｏ．Ｌｉｕ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，４６１（１９９７）．
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１１）Ｋ．Ｇｏｄｌ，Ｊ．Ｗｉｓｓｉｎｇ，Ａ．Ｋｕｒｔｅｎｂａｃｈ，Ｐ．Ｈａｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｂｌｅｎｃｋｅ，Ｈ．Ｇｕｔｂｒｏｄ，Ｋ．Ｓａｌａｓｓｉｄｉｓ，Ｍ．Ｓｔｅｉｎ−Ｇｅｒｌａｃｈ，Ａ．Ｍｉｓｓｉｏ，Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｈ．Ｄａｕｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１５４３４−１５４３９（２００３）．
１２）Ｓ．Ｓｅｃｈｉ，Ｙ．Ｏｄａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７，７０−７７（２００３）．
１３）Ｙ．Ｏｄａ，Ｔ．Ｏｗａ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｂ．Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｓ．Ｄａｎｉｃｌｓ，Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ａ．Ｙｏｋｏｉ，Ｊ．Ｋｕｒｏｍｉｔｓｕ，ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｇａｓｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５，２１５９（２００３）．
１４）Ｔ．Ｏｗａ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｔ．Ｏｋａｕｃｈｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｍａｔｓｕ，Ｙ．Ｏｚａｗａ，Ｎ．Ｈ．Ｓｕｇｉ，Ｔ．Ｎａｇａｓｕ，Ｎ，Ｋｏｙａｎａｇｉ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｉｔｏｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，３７８９（１９９９）．
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【発明の開示】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにて、当該カラムに結合する複数種のタンパク質を精製（本明細書において、「精製」とは、分離および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することを含むものとする）した。一方で、同位体標識されたタンパク質群と化合物とを接触させたものの中から、前記の化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにて、当該カラムに結合する複数種のタンパク質を精製した。これらの精製タンパク質を混合し、当該混合したタンパク質を質量分析計により分析し、質量分析の情報から各タンパク質を同定し、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、化合物の有無による結合率の差から、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することによって、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
（２）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
（３）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で得られたタンパク質または工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質のうち工程（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｇ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
（４）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｇ）工程（ｃ）および工程（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｈ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
（５）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ａ２）工程（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（ａ３）工程（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ２）工程（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（ｂ３）工程（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（ｃ）各タンパク質について、工程（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法。
（６）化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）工程（ｂ）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（８）工程（ｄ）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（４）に記載の方法。
（９）工程（ｂ１）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（５）記載の方法。
（１０）担体に固定化された化合物が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群から選択されるいずれかの化合物である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｐおよび３４Ｓからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、（１）〜（４）、（６）〜（８）および（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）同位体が、１３Ｃである、（１１）に記載の方法。
（１３）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｃ）手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質を混合する手段と、
（ｄ）手段（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｆ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
（１４）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいた同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｃ）手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質を混合する手段と、
（ｄ）手段（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｆ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
（１５）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｃ）手段（ａ）で得られたタンパク質または手段（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
（ｄ）手段（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質のうち手段（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
（ｅ）手段（ｄ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｇ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
（１６）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）手段（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（ｃ）手段（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｅ）手段（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（ｆ）手段（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｇ）手段（ｃ）および手段（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｈ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
（１７）複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ａ２）手段（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（ａ３）手段（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ２）手段（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（ｂ３）手段（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（ｃ）各タンパク質について、手段（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システム。
（１８）化合物が固定化された担体が、アフィニティークロマトグラフィー用の担体である、（１３）〜（１７）のいずれか１項に記載のシステム。
（１９）手段（ｂ）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載のシステム。
（２０）手段（ｄ）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（１６）に記載のシステム。
（２１）手段（ｂ１）におけるタンパク質群と化合物との接触を複数種の化合物について行うことを特徴とする、（１７）記載のシステム。
（２２）担体に固定化された化合物が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰからなる群から選択されるいずれかの化合物である、（１３）〜（２１）のいずれか１項に記載のシステム。
（２３）同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｐおよび３４Ｓからなる群から選択されるいずれかの同位体又はこれらの組み合わせである、（１３）〜（１６）、（１８）〜（２０）および（２２）のいずれか１項に記載のシステム。
（２４）同位体が、１３Ｃである、（２３）に記載のシステム。
本発明により、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となった。
また、本発明により、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムを複数種用意する必要がなくなり、簡便かつ効率的に複数種の化合物に基づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。また、本発明で用いる化合物中の一種類の化合物を固定化するだけで、他の化合物は固定化せずに使用するため、各化合物本来の構造でタンパク質に対する親和性を評価することができるようになり、より正確な構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
さらに、本発明により、本発明で用いる化合物の構造を変えることによって、種々の構造を有する化合物を使用することにより、化合物の構造がいかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、網羅的に化合物とタンパク質との構造親和性相関を解析することができる。これによって、化合物、特に薬剤を合成、開発する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることが可能となった。
また、本発明により、担体に固定化する化合物として、ＡＴＰ、ＧＴＰ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎｅａｍｉｄｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いることにより、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰに結合する複数種のタンパク質に対する化合物の構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
具体的には、本発明によりＡＴＰを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるｋｉｎａｓｅとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、ｋｉｎａｓｅ阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
また、本発明によりＧＴＰを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるＧＴＰ結合タンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、ＧＴＰ結合タンパク質阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、本発明によりＮＡＤまたはＮＡＤＰを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）に結合した化合物の濃度は、一般的に担体１ｍｌあたり０．１ｍｇから数ｍｇ程度であり、これは１ｍＭ前後に相当する。しかし、細胞に対して何らかの活性を有する化合物は、数μＭから数ｎＭ、ときには数ｐＭ程度で活性を示すことが知られている。したがって、細胞に対して何らかの活性を示す濃度と、化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）に固定化された化合物濃度との間には大きな乖離がある。本発明においては、担体に固定化していない化合物を用いるため、化合物濃度を数μＭから数ｎＭに減らすことも可能となった。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の第一の態様を概略的に示す図である。
図２は、本発明の第一の態様を概略的に示す図である。
図３は、本発明の第二の態様を概略的に示す図である。
図４は、本発明の第三の態様を概略的に示す図である。
図５は、複数種のタンパク質と式２−式６（化２−化６）で表される化合物との構造親和性相関を表す。数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いことを意味している。
図６は、本発明のシステムの構成を示すブロック図である。
図７は、本発明のシステムの各ユニットを示す模式図である。
図８は、制御ユニットの詳細構成図である。
図９は、制御ユニットの動作のフローチャートである。
図１０は、一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図である。
【符号の説明】
１ａ：チューブ
１ｂ：チューブ
２ａ：攪拌羽根
２ｂ：攪拌羽根
１１ａ：培養装置
１１ｂ：培養装置
１１ｃ：培養装置
１２ａ：培養液ボトル
１２ｂ：培養液ボトル
１３ａ：細胞破砕器
１３ｂ：細胞破砕器
１３ｃ：細胞破砕器
１４：化合物との接触器
１４ｃ−１：化合物との接触器
１４ｃ−２：化合物との接触器
１４ｃ−３：化合物との接触器
１５ａ：化合物が固定化された担体
１５ｂ：化合物が固定化された担体
１６ａ：タンパク質精製用制御装置
１６ｂ：タンパク質精製用制御装置
１７ａ：精製タンパク質分取器
１７ｂ：精製タンパク質分取器
１８：チューブ
１９：プレート
２０：質量分析処理装置
２１：コンピュータ
３０：中央コンピュータ
３１：サンプル分注装置
１００：ＬＡＮ
６０１：制御ユニット
６０２：タンパク質精製ユニット
６０３：タンパク質混合ユニット
６０４：質量分析ユニット
８０１：ＣＰＵ
８０２：送信／受信部
８０３：入力部
８０４：出力部
８０５：ＲＯＭ
８０６：ＲＡＭ
８０７：ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）
８０８：ＣＤ−ＲＯＭドライブ
８０９：タンパク質データベース（ＤＢ）
８１０：ＣＤ−ＲＯＭ
８１１：インターネット
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、複数種のタンパク質と１種以上の化合物との構造親和性相関を解析する方法に関するものである。本発明の方法は、（ｉ）ある化合物が固定化された担体を用いてタンパク質を精製し、他方、（ｉｉ）タンパク質の群と化合物とを接触させてその接触したタンパク質を前記担体を用いて精製し、（ｉｉｉ）上記（ｉ）と（ｉｉ）により精製された各タンパク質の量比を、同位体標識または指標ＥＭＰＡＩを利用し、質量分析により測定することを基本とする。
上記方法の例としては、まず、ある化合物が固定された担体（カラム）を用いて、同位体標識されたタンパク質群から、当該カラム上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。一方で、化合物が固定された前記の担体（カラム）を用いて、予め１種以上の化合物と接触させておいた同位体非標識のタンパク質群または異なる同位体で標識されたタンパク質群から、当該カラム上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。
上記の担体（カラム）に添加するタンパク質群（例えば、細胞から抽出したタンパク質群）の中には、多種多様のタンパク質が存在する。本発明の方法は、担体（カラム）を用いることにより、担体（カラム）上の化合物に結合する複数種のタンパク質を選別して、続く解析の対象とするものである。つまり、本発明の方法は、母集団である多種のタンパク質を含むタンパク質群から、当該化合物に結合するという類似した性質を有する複数種のタンパク質を選択し、当該複数種のタンパク質と１種以上の化合物との構造親和性相関を解析するものである。
また、本発明では、母集団であるタンパク質群を予め化合物と接触させておき、そこから担体（カラム）を用いて担体（カラム）上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する。当該タンパク質群の中には、予め化合物と結合していることにより、結合部位が競合し、担体（カラム）上の化合物に結合しにくくなるタンパク質も存在する。その結果、カラムから精製した当該タンパク質の量（（ｃｃ）とする）は、予め化合物と接触する操作をしないでカラムから精製した当該タンパク質の量（（ｃ）とする）よりも少なくなる。そして、どちらかのタンパク質を同位体標識することで、（ｃ）と（ｃｃ）を同時に質量分析処理で比較することができ、親和性の比を算出することができる。本発明は、以上の原理を利用して、複数種のタンパク質と１種以上の化合物との構造親和性相関の解析を行うものである。
本発明において「構造親和性相関」とは、一群の共通骨格を有する化学物質の構造変化と、その化学物質とタンパク質との親和性（結合の強さ）との相関関係をいう。
本発明において「タンパク質」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。
＜化合物が固定化された担体＞
本発明において、「化合物が固定化された担体」とは、担体に官能基を介して、化合物を共有または非共有結合させたものをいう。
化合物が固定化された担体は、例えば、まず、担体側に官能基として、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅやＨｙｄｒａｚｉｄｅを共有結合させたり、単にアミノ基にしたり、またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＨｅｐａｒｉｎもしくはＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３ＧＡなどを固定化し、このような担体の官能基に対して、化合物を直接または化合物の構造の一部を変えたものを共有または非共有結合させたものがある。
担体に固定化する化合物は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、生体内核酸物質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨなど）、脂質などが挙げられる。これら化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。担体に固定化する化合物は、所定の活性を有するものである。本明細書において「所定の活性」とは、担体に固定化される化合物または後述の非固定化化合物が有する活性を意味し、特に限定されず、例えば、生理活性、生物活性、薬理活性、結合活性等を挙げることができる。
担体としては、アガロースゲル、アクリルアミド、磁気ビーズ、セルロース、シリカゲルなどがあげられ、好ましくはアガロースゲルである。担体は、例えば、バイオラド社等から購入することができる（アフィゲル１０、バイオラド社製、カタログ番号１５３−６０９９）。
化合物が固定化された担体は、担体に所望の化合物を結合させることにより、作製することができる。化合物が固定化された担体の作製は、例えば、アミノ基を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、アミノ基を有する化合物溶液をＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅが結合している担体（例えばアフィゲル１０）に加える。次に、トリエチルアミンを加え、インキュベーションした後、２−アミノエタノールを加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが好ましい。
また、化合物が固定化された担体の作製は、カルボン酸を有する化合物であれば、以下の手順で行うことができる。まず、カルボン酸を有する化合物溶液にカルボジイミドを加え、インキュベーションした後、アミノ基が結合している担体に加える。次に、酢酸（もしくは乳酸）を加え、さらにインキュベーションすることによって作製することができる。また、適宜洗浄操作を加えることが望ましい。さらに、ＮＡＤＰアナログを固定化した担体などは、例えば、アマシャムバイオサイエンス社から購入することができる（２’５’ＡＤＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（コード番号１７−０７００−０１））。
担体に固定化する化合物の量は、特に限定されないが、担体１ｍｌあたり０．１ｍｇから数ｍｇ程度とすることが好ましい。
化合物が固定化された担体は、アフィニティークロマトグラフィー用の担体として用いることができ、適当なカラム（例えば、ポリプレップエンプティカラム（バイオラド社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．７３１−１５５０）等）に充填することによって、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムとして使用できる。また、化合物が固定化された担体は、適当なチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ社製）等）に加えることによって、使用することもできる。
１．本発明の第一の態様
本発明の第一の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
本発明の第一の態様を概略的に説明する（図１を参照）。
本発明においては、まず、所定の活性を有する化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム等）を用意する。活性を有する化合物の固定化量は、担体１ｍｌあたり０．１ｍｇから数ｍｇ程度とすることが好ましい。この化合物が固定化された担体に同位体で標識した（図１中「＊」印で表示）タンパク質群（図１（ａ）中、三角形並びに円およびだ円で表示）をアプライし、前記化合物に結合した結合タンパク質（図１（ａ）中、円およびだ円で表示）を精製する。得られた複数種のタンパク質をタンパク質Ａとする（図１（ａ））。ここで、「タンパク質群」とは、担体にのせる（プライする）母集団となるサンプルのことを意味する。
一方、担体に固定化されていない化合物（所定の活性を有する１種又は複数種の化合物。それぞれの化合物の活性の強度は、異なっていることが好ましい。）（図１（ｂ）中、化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を、適当な濃度（例えば数μＭ）になるように同位体非標識のタンパク質群（図１（ｂ）中、三角形並びに円およびだ円で表示）に添加して、一定時間インキュベートして当該タンパク質群と化合物とを接触させる（サンプル液）。本明細書において、タンパク質群に接触させるために添加する化合物であって、固定化されていない化合物を、「非固定化化合物」ということもある。このサンプル液には大量のタンパク質が含まれているため、水に対して難容性の化合物であっても、ある程度溶解させることができる。ここで、同位体非標識のタンパク質群に代えて、前記の「同位体標識されたタンパク質群」とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
この各サンプル液を、前記の所定の活性を有する化合物が固定化された担体にのせ、当該化合物に結合した結合タンパク質を精製する。得られた複数種のタンパク質の集合をタンパク質Ｂとする。ただし、非固定化化合物毎にサンプル液を調製するため、タンパク質Ｂは添加した非固定化化合物の種類だけ数がある（図１（ｂ））。図１（ｂ）では、４種類の非固定化化合物（化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を予めタンパク質群に接触させているため、Ｂは４種類存在することを示している。
このタンパク質Ａとタンパク質Ｂとを一定の割合で混合し（図１（ｃ））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどでタンパク質を分離後、トリプシンなどで消化して質量分析処理し（図１（ｄ））、タンパク質の同定を行う（図１（ｅ））。ここで、質量分析処理の結果として得られる質量分析スペクトル（図１（ｄ））では、同一タンパク質についての、同位体標識したサンプル由来であるタンパク質Ａのピーク（破線ピーク）と同位体非標識のサンプル由来又は異なる同位体で標識したサンプル由来であるタンパク質Ｂのピーク（黒色実線ピーク）の２本のペアで観測される。そして、各タンパク質について、Ａ由来のピークとＢ由来のピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する（図１（ｆ））。
以下に、タンパク質Ａとタンパク質Ｂとを１対１で混合した場合における解析例を示す。
非固定化化合物（図１の化合物ｂを例とする）と結合したタンパク質は、担体上に固定化した化合物ａに結合しにくくなるので、質量分析スペクトル上でタンパク質Ｂ由来のピークは、タンパク質Ａ由来のものと比べて小さくなる。例えば、Ｂ由来のタンパク質（図１のタンパク質Ｐ２を例に用いる）上の化合物ａとの結合部位と化合物ｂとの結合部位が同じまたは重なるときであって、タンパク質Ｐ２に対する親和性が化合物ｂの方が化合物ａよりも大きいとき、または化合物ｂの濃度が化合物ａより高いときには、当該結合部位が化合物ｂとの結合で使用されているために、タンパク質Ｐ２は担体上に固定した化合物ａに結合しにくくなる。その結果、担体から精製されるＢ由来のタンパク質Ｐ２の量は、Ａ由来のタンパク質Ｐ２の量に比べて少なくなる。したがって、Ｂ由来の質量分析スペクトルピークはＡ由来のものよりも小さくなる（図１のｂ−Ｐ２）。また例えば、タンパク質Ｐ２と化合物ｂとの結合によって、タンパク質Ｐ２上の化合物ａとの結合部位がマスクされしまう場合も、同様に考えることができる。
逆に、添加した非固定化化合物（例えば図１の化合物ｂ）と結合しないタンパク質（例えば図１のタンパク質Ｐ１）は、担体上に固定化された化合物への結合に影響を受けないので、担体上の化合物に結合するタンパク質Ｐ１の実質的な量は、非固定化化合物の添加の有無に関わらず同じになる。この場合、「実質的な」とは、非固定化化合物の添加によって生じる担体固定化化合物へのタンパク質の非特異的な結合量の変化は含めないで考えた場合を意味する。したがって、Ｂ由来のタンパク質Ｐ１のピークはＡ由来のタンパク質Ｐ１のピークと実質的に同じであり（図１のｂ−Ｐ１）、ピーク強度比に変化は生じない。
添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同一である場合（例えば、図１の化合物ａ）、担体上に固定化された化合物ａは、タンパク質（例えばＰ１）との結合を非固定化化合物ａによって競合的に拮抗されるため、担体上に固定化された化合物ａに結合するタンパク質の量が少なくなる。その結果、精製して得られたタンパク質Ａとタンパク質Ｂを１対１で混合したとき、質量分析スペクトル上で非標識タンパク質Ｂ由来のピークは、標識タンパク質Ａ由来のものと比べて小さくなる（図１のａ−Ｐ１）。
一方、添加した非固定化化合物と担体に固定化された化合物とが同じであって、精製タンパク質Ａ及びＢを１対１で混合した場合において、Ｂ由来のピークがＡ由来のピークよりも小さくならないピークパターンを示すタンパク質（図１のａ−Ｐ３）は、当該化合物以外の部分（例えば担体部分等）に結合した非特異的結合タンパク質であることがわかる。
また、活性の異なる非固定化化合物同士（例えば図１のａ、ｂ、ｃ、ｄ同士）の比較において、質量分析スペクトル上でＢ由来のピークがＡ由来のピークと比べて同程度小さくなる場合には（図１（ｄ）、質量分析スペクトル中の各Ｐ３のスペクトル）、当該タンパク質（例えば図１のタンパク質Ｐ３）は、活性を有する化合物、つまり添加された化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄの活性に重要な特異的結合タンパク質ではないと考えられる。
一方、添加する所定の活性を有する非固定化化合物（例えば図１の化合物ｄ）が低濃度であっても質量分析スペクトル上でＢ由来のピークが小さくなる場合（図１のｄ−Ｐ４）には、当該タンパク質（例えば図１のタンパク質Ｐ４）は、その化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。同様に、構造は近いが活性が異なる別の非固定化化合物（例えば図１の化合物ｃ）によって質量分析スペクトル上でＢ由来のピークが影響を受けないのであれば（図１のｃ−Ｐ４）、当該タンパク質Ｐ４が前記の活性を有する非固定化化合物ｄの当該活性に重要な特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合（どの程度弱いかは不明）であって、当該化合物濃度が低い場合には、カラムを通過する際に、タンパク質と結合している化合物がカラム内に高濃度に固定化された化合物と置き換わるという影響を受ける可能性もあるが、このことは、非固定化化合物濃度を高めることでそのような影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
また、化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラムなど）としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨなどを固定化した担体またはカラムを使うこともできる。このような担体またはカラムを用いて、同様に様々な化合物で親和性の程度を調べれば、特定のタンパク質のＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ結合部位に結合する化合物とタンパク質との構造親和性相関を見出すことも可能になる。
さらに、この方法では同位体を使っているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのバンドの有無だけではなく、質量分析スペクトル上でピーク強度比を計算することで定量的な情報を得ることができる。このような情報は、化合物を合成する研究者に大きな情報を与えることが出来る。これまで構造活性相関では１つの標的分子あるいは１つのアッセイ系に対して、化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて次の合成展開をはかってきた。一方、本発明の方法を使えば、１種又は複数種の化合物と複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。つまり、１つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対する特異性の違いを定量的に評価でき、また、あるタンパク質に注目すれば化合物間での結合の違いを定量的に知ることができる。
以下、本発明の第一の態様について、詳細に記載する。
＜同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群＞
本発明において、「同位体標識されたタンパク質群」とは、タンパク質を構成する分子の一部が同位体で標識されたタンパク質の集合をいう。
同位体標識されたタンパク質群は、タンパク質を構成する分子（アミノ酸）の一部が同位体で標識されていればよく、その調製方法や標識部位については、特に限定されない。
以下、具体的な調製方法について記載する。
同位体標識されたタンパク質群は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を破砕することで、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社のＭ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５０１，Ｔ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５１０など）を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されたタンパク質群を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｐ若しくは３４Ｓ又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは１３Ｃである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、１３Ｃ標識（１３Ｃｘ６個）ロイシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（ＣＩＬ）社製、Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｕ−１３Ｃ６，ＣＬＭ−２２６２）を挙げることができる。
また、同位体標識されたタンパク質群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる（「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」第１６巻、第１５号、２００２年、ｐｐ．１４１６−１４２４参照）。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である（「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第１７巻、第１０号、１９９９年１０月、ｐｐ．９９４−９９９）。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」とは、同位体標識する行為を施していないタンパク質の集合をいう。
同位体標識されていないタンパク質群は、タンパク質を含む生体試料、好ましくは細胞、特に好ましくは培養細胞を破砕し、タンパク質を抽出することで調製することができる。
破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社のＭ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５０１，Ｔ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５１０など）を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、同位体標識されていないタンパク質群を調製することができる。
また、同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群は、化学合成により製造してもよい。
なお、同位体標識されたタンパク質群および同位体標識されていないタンパク質群は、適当な条件、好ましくは−２０℃以下、特に好ましくは−８０℃以下で保存することができる。
本発明において、「同位体標識されていない（同位体非標識）タンパク質群」については、天然型試薬（同位体でない試薬）を用いて、「同位体標識されたタンパク質群」と同一の方法で調製することが好ましい。
本発明において、「同位体標識されていないタンパク質群」の代わりに「同位体標識されたタンパク質群」の同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群（以下、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」ともいう。）を用いることもできる。当該「異なる同位体で標識されたタンパク質群」中の同位体は、両タンパク質群由来の対応する各タンパク質の質量が異なるようにタンパク質を標識できる限り、「同位体標識されたタンパク質群」中の同位体とは別の同位体であってもよいし、同一の同位体を含んでいてもよい。
（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
同位体標識されたタンパク質群を、化合物が固定化された担体を用いて精製する。これにより、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。本明細書において「担体を用いて」とは、母集団のタンパク質群を精製する際に、化合物が固定化された担体を利用することを意味する。
以下、詳細に説明する。
初めに、適当な溶液で化合物が固定化された担体を平衡化する。平衡化する溶液は、特に限定されないが、タンパク質群を溶解することができ、かつ、変性させない溶液が望ましい。例えば、生理的ｐＨに調製したリン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液またはトリス緩衝液などが挙げられ、必要に応じて、これらに塩化ナトリウムおよび／または界面活性剤（ｎ−オクチルグルコシドなど）を適当量加えることができる。
平衡化する工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
次に、同位体標識されたタンパク質群を、適当な溶液に溶解する。続いて、同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる。同位体標識されたタンパク質群と化合物が固定化された担体とを接触させる工程は、化合物が固定化された担体が適当なカラムに充填されている場合には、同位体標識されたタンパク質群をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、同位体標識されたタンパク質群をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
その後、化合物が固定化された担体を適当な溶液で洗浄することが望ましい。洗浄操作は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶液をカラムに添加することによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
そして、適当な溶出溶液で同位体標識されたタンパク質群を溶出する。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、６Ｍ塩酸グアニディン、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、あるいは１０ｍＭ程度のＡＴＰやＧＴＰ等を用いることができる。同位体標識されたタンパク質群を溶出させる工程は、化合物が固定化された担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶出溶液をカラムにアプライすることによって、化合物が固定化された担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶出溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
これらの方法により、担体に固定化した化合物に結合するタンパク質群を精製することができる。
以上の操作温度は、特に限定されないが、４℃から３７℃、さらには４℃から２０℃で行うことが好ましい。
（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
工程（ｂ）で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程（ａ）の「同位体標識されたタンパク質群」の同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。以下の説明では、同位体標識されていないタンパク質群を用いた場合について説明するが、「異なる同位体で標識されたタンパク質群」の場合も同様に実施することができる。
同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させ、その後、非固定化化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、化合物が固定化された担体で精製する。これにより、非固定化化合物と接触させた同位体標識されていないタンパク質群について、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
以下、詳細に説明する。
初めに、同位体標識されていないタンパク質群を、適当な溶液に溶解する。続いて、同位体標識されていないタンパク質群と非固定化化合物とを接触させる。
同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物（非固定化化合物）は、特に限定されず、例えば、合成低分子化合物、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、生体内核酸物質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨなど）、脂質などが挙げられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これら化合物は所定の活性を有している。
同位体標識されていないタンパク質群と接触させる化合物（非固定化化合物）は、一種であってもよいが、複数種、例えば、５種以上であることが好ましい。また、これらの化合物および担体に固定化された化合物は、特に限定されないが、互いに構造において類似することが好ましい。非固定化化合物は、担体に固定化された化合物を含んでいてもよい。さらに、生理活性または薬理活性等の所定の活性の強度が異なることが好ましい。
接触に際しての化合物の溶媒、濃度、インキュベーション等の諸条件は、特に限定されず、自由に設定できる。同位体標識されていないタンパク質群を溶解した溶液は、大量のタンパク質が含まれているため、水に対して難容性の化合物でも溶解させることができる。
次に、化合物と接触させた当該同位体標識されていないタンパク質群を、上記１．（１）（ａ）で作製した化合物が固定化された担体で精製する。タンパク質の精製方法は、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法によって行うことができる。
これらの方法により、化合物と接触させた同位体標識されていないタンパク質群について、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
（３）（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程
工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。後述する強度比のダイナミックレンジを向上させるため、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」で得られた複数種のタンパク質に対して、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」で得られた複数種のタンパク質を過剰量（例えば、２倍から１０倍）加えることが好ましい。
（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程
工程（ｃ）得られた混合物を質量分析処理する。混合物は、そのまま質量分析計により分析してもよいが、濃縮（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０，０００ＭＷＣＯなどによる）や以下の分離または消化を行うことが好ましい。後述の分離または消化操作を施した混合物を、「分離したタンパク質」または「消化したタンパク質」とする。分離方法は、二次元電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等が考えられるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化があげられるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ，Ａｓｐ−Ｎ，Ｇｌｕ−Ｃなどがあげられ、好ましくはトリプシンがあげられる。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（アメリカ特許公報ＵＳ５６７４９８７およびＵＳ５７６３５８６、アナトレース社（Ａｎａｔｒａｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ））を加えることが望ましい。
こうして得られた濃縮したタンパク質、分離したタンパク質又は消化したタンパク質は、ＨＰＬＣにより分離することができ、得られたタンパク質を、「ＨＰＬＣにより分離されたタンパク質」とする。ＨＰＬＣに用いるカラムは、当業者における技術常識により、適当なものを選択すればよく、好ましくはアニオン交換カラム又はカチオン交換カラムである。ＨＰＬＣの諸条件（流速、検出器、移動相など）は、当業者における技術常識により、適宜選択できる。
次に、上記の操作により得られた複数種のタンパク質を質量分析計で質量分析処理する。質量分析計は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）や液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計におけるイオン化方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＥＩ（電子イオン化法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＬＤ、ＦＤ、ＳＩＭＳ、ＴＳＰ等があげられ、好ましくはＭＡＬＤＩ又はＥＳＩがあげられる。アナライザーは、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＴＯＦ（飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計の装置及び方法は、ここにあげたものに限定されるものではなく、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、複数種のタンパク質中のタンパク質を同定することができる。すなわち、得られたデータをソフトフェア（例えば、ＳｏｎａｒＭＳＭＳ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社製））およびデータベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＩＰＩ、Ｓｐｏｒｔ等のデータベース）を使用することにより解析し、サンプル中のタンパク質を同定することが可能である。質量分析計による測定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８：２０，４６−５０；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８：１４１，９６７−９７７；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００：１４８，６３５−６５１；Ｎａｔｕｒｅ．２００２：４１５，１４１−１４７；Ｎａｔｕｒｅ．２００２：４１５，１８０−１８３；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３：１５，１９９−２０５；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３：７，２１−２７）。同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることは、当業者にとって容易である。
（６）（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
本発明において、「工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる質量分析スペクトルにおいて、同位体標識されたタンパク質群に由来するシグナル強度又はその総和（通常面積で表されることは当業者であれば理解できる）をいう（以下、単に「標識ピーク」と称する場合がある）。
本発明において、「工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピーク」とは、質量分析の測定結果から得られる質量分析スペクトルにおいて、同位体標識されていないタンパク質群または異なる同位体で標識されたタンパク質群に由来するシグナル強度又はその総和をいう（以下、説明の便宜上単に「非標識ピーク」と称する場合がある）。
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各タンパク質について、非標識ピークと標識ピークとの強度比（＝「非標識ピークの強度」／「標識ピークの強度」）（以下、単に「ピーク強度比」と称する場合がある）を求めることにより、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量することができる。
同位体標識されたタンパク質は、同位体標識されていないタンパク質に比べ、同位体標識されている分子の分、分子量が大きくなり質量分析スペクトル上でペアのピークとして観測される。同位体標識されたタンパク質の分子量は、同定されたタンパク質およびそのアミノ酸配列から計算によって求めることができる。
工程（ｂ）のタンパク質群のうち、非固定化化合物と結合したタンパク質は、非固定化化合物との結合により、担体上の化合物に結合しにくくなるので、質量分析スペクトル上で非標識ピークが小さくなり、ピーク強度比は、工程（ｂ）で得られたタンパク質と工程（ａ）で得られたタンパク質とを工程（ｃ）において混合したときの比（＝工程（ｂ）で得られたタンパク質量の混合量／工程（ａ）で得られたタンパク質量の混合量）（以下、「タンパク質混合比」と称する場合がある）に比べて小さくなる。一方、添加した非固定化化合物と結合しないタンパク質は、化合物が固定化された担体への結合に影響を受けないので、非標識ピークが小さくならず、ピーク強度比とタンパク質混合比との間で変化は生じない。また、生理活性、生物活性、薬理活性または結合活性等の所定の活性が異なる非固定化化合物同士の比較において、質量分析スペクトル上で、あるタンパク質における非標識ピークが同程度小さくなる場合、すなわち、ピーク強度比が同程度小さくなる場合には、当該タンパク質は、活性を有する化合物、すなわち比較に用いた非固定化化合物の当該活性に重要な特異的結合タンパク質ではないと考えられる。
一方、所定の活性を有する非固定化化合物（説明上、化合物Ｃとする）が低濃度であっても質量分析スペクトル上で非標識ピークが小さくなる場合、すなわち、ピーク強度比がタンパク質混合比に比べて小さくなる場合には、当該タンパク質は、その非固定化化合物の活性に重要なタンパク質である可能性がある。同時に、化合物Ｃと構造は類似するが、生理活性、生物活性、薬理活性または結合活性等の所定の活性が異なる他の非固定化化合物によって、質量分析スペクトル上で非標識ピークが影響を受けずに小さくならない場合、すなわち、ピーク強度比が影響を受けない場合には、当該タンパク質が、所定の活性を有する非固定化化合物Ｃの当該活性に重要な特異的結合タンパク質である可能性が高い。
また、非固定化化合物とタンパク質との親和性が極めて弱い場合（どの程度弱いかは不明）であって、当該非固定化化合物の濃度が低い場合には、カラムを通過する際に、タンパク質と結合している前記非固定化化合物が、カラム内に高濃度に固定化された化合物と置き換わる可能性もあるが、このことは、非固定化化合物の濃度を高めることで影響を低下させることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と一種以上の化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
なお、前記解析方法は、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させた場合（図１参照）について説明したが、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させた場合（図２参照）でも本発明に係る解析方法が実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。なお、この場合はピーク強度比の値は、「標識ピークの強度」／「非標識ピークの強度」の式により求める。また、同位体標識されていないタンパク質群に代えて、異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いても本発明の解析方法を実施することができる。
また、化合物が固定化された担体として、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨなどを固定化した担体またはカラムを使って、同様に様々な化合物で親和性の程度を調べれば、特定のタンパク質のＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ結合部位に結合する化合物とタンパク質との構造親和性相関を見出すことも可能になる。
さらに、この方法では安定同位体を使っているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのバンドの有無だけではなく、質量分析スペクトル上でピーク強度比を計算することで定量的な情報を得ることができる。このような情報は、化合物を合成する研究者に大きな情報を与えることが出来る。これまで構造活性相関では１つの標的分子あるいは１つのアッセイ系に対して、化合物の種類を変えて活性値の変化を調べて次の合成展開をはかってきた。一方、本発明の方法を使えば、複数種の化合物と複数種のタンパク質との構造親和性相関を網羅的に解析することができる。つまり、１つの化合物に着目すれば結合する複数種のタンパク質それぞれに対する特異性の違いを定量的に評価でき、また、あるタンパク質に注目すれば化合物間での結合の違いを定量的に知ることができる。
本発明は、さらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｃ）手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質を混合する手段と、
（ｄ）手段（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｆ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段と同一のものである。手段（ｂ）において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段（ａ）の同位体標識されたタンパク質群とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｃ）手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質を混合する手段は、上記の「１．（３）（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｄ）手段（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記の「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記の「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｆ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記の「１．（６）（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
なお、前記システムは、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させてから精製工程を実行する態様（第一の態様、図１）について説明したが、同位体標識されていないタンパク質群を化合物と接触させず、同位体標識されたタンパク質群を化合物と接触させてから精製工程を実行する態様（図２）でも、システム内の各構成要素となる装置を適宜入れかえて本発明に係るシステムが実施可能であることは、当業者には容易に理解できる。なお、この場合はピーク強度比の値は、「標識ピークの強度」／「非標識ピークの強度」の式により求める。また、同位体標識されていないタンパク質群に代えて、異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いても、本発明のシステムを実施可能である。
以下に、本発明の第一態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて詳しく述べる。なお、手段（ｂ）のタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質を例として以下に説明する。
図６は、本発明のシステムの構成を示すブロック図である。図６において、本発明のシステムは、制御ユニット６０１、タンパク質精製ユニット６０２、タンパク質混合ユニット６０３及び質量分析ユニット６０４からなる。
制御ユニット６０１は、本発明の方法を実行するために必要な各ユニットの動作全体を制御する。タンパク質精製ユニット６０２、タンパク質混合ユニット６０３及び質量分析ユニット６０４は、制御ユニット６０１にそれぞれ接続され、互いに独立して、又は各ユニットと連携して実行するように制御ユニット６０１により制御される。例えば、本発明の方法を主としてバッチ式で実行するときは、各ユニット（タンパク質精製ユニット６０２、タンパク質混合ユニット６０３及び質量分析ユニット６０４）は制御ユニット６０１から独立して制御され、制御ユニット６０１はそれぞれのユニットが実行する内容を指示する。また、本発明の方法を主として連続的に流れ作業として実行するときは、制御ユニット６０１は、それぞれのユニットの実行内容、例えば各ユニットの進行状況を監視し、各ユニットは連携して制御される。
タンパク質精製ユニット６０２は、タンパク質を精製するためのユニットであり、細胞培養器、細胞破砕器、化合物との接触処理器、クロマトグラフィー等を行うための担体、精製タンパク質の回収器などを備える。精製ユニットに含まれる各構成要素は、制御ユニット６０１の指令に従って、独立して、又は各構成要素と互いに連携して制御される。
タンパク質混合ユニット６０３は、タンパク質精製ユニット６０２により精製されたタンパク質を混合するユニットである。タンパク質混合ユニット６０３は制御ユニット６０１に接続されており、混合量、混合比などの指令を制御ユニット６０１から受けて混合処理する。
質量分析ユニット６０４は、上記混合されたタンパク質を質量分析にかけるユニットであり、混合タンパク質を測定用プレートにスポットするためのスポッター、当該測定プレートを質量分析器にかけるためのトレー等を備える。質量分析ユニット６０４におけるこれらの構成要素は制御ユニット６０１に接続されており、制御ユニット６０１の指令に従って質量分析処理を実行する。
図７は、上記各ユニットの一態様を示す模式図である。
図７において、タンパク質精製ユニット６０２は、培養装置１１ａ及び１１ｂ、培養液ボトル１２ａ及び１２ｂ、細胞破砕器１３ａ及び１３ｂ、化合物との接触器１４、化合物が固定された担体１５ａ及び１５ｂ、タンパク質精製用制御装置１６ａ及び１６ｂ、精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂを備える。
培養装置１１ａ及び１１ｂは、細胞培養を行うための装置であり、温度、ＣＯ２濃度などを調節して細胞を所定時間培養する。培養装置１１ａ及び１１ｂには、それぞれ培養液ボトル１２ａ及び１２ｂが接続されており、それぞれチューブ１ａ、１ｂを介して各培養装置に培養液を供給してもよい。培養装置１１ａ及び１１ｂには、それぞれ攪拌羽根２ａ、２ｂを供えてもよい。培養装置１１ａ及び１１ｂは、浮遊細胞を培養するための容器として例示してあるが、これは本発明のシステムを説明するための一態様であり、限定されるものではない。従って、培養プレートに付着する細胞を培養する場合は、当業者は目的に応じた培養容器を選択することができる。培養装置１１ａ及び１１ｂは、ＬＡＮ１００を経由して制御ユニット６０１に接続される。
培養液ボトル１２ａ及び１２ｂは、細胞を培養するための培養液を貯蔵する容器である。本発明の第一の態様では、培養液ボトル１２ａには、タンパク質群を同位体標識するためのアミノ酸などが混合される。培養液ボトル１２ａ及び１２ｂは、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に接続されていてもよい。
細胞破砕器１３ａ及び１３ｂは、培養された細胞を破砕してタンパク質群を得るための装置であり、培養装置１１ａ、１１ｂから細胞を回収して細胞を破砕し、タンパク質群の懸濁液を得る工程を実行する。細胞破砕器１３ａ及び１３ｂは、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に接続されていてもよい。
化合物との接触器１４は、タンパク質群と化合物とを接触させるための装置である。図７は、同位体標識していないタンパク質群と化合物とを、担体に適用する前に予め接触させるため、細胞破砕器１３ｂの次に配置されている態様（本発明の第一の態様）を示す。第一の態様の別の側面として、化合物との接触器１４は、同位体標識したタンパク質群と化合物とを、担体に適用する前に予め接触させるため、細胞破砕器１３ａの次に配置し得ることは、当業者であれば容易に理解できる。化合物との接触器１４は、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に接続されていてもよい。
化合物が固定化された担体１５ａ及び１５ｂは、タンパク質を精製するためのカラムであり、内部に化合物が固定されている。
複数種のタンパク質と複数種の化合物との構造親和性相関を解析する場合には、タンパク質群とそれぞれの化合物とを、化合物との接触器１４において接触させればよい。この場合、化合物との接触器１４による接触処理前までは、培養装置１１ｂ由来のサンプルは同じ処理が施された同一のものである。そのため、化合物との接触器１４に導入するタンパク質群としては、化合物毎に異なる培養装置１１ｂおよび細胞破砕器１３ｂを用いて採取されるタンパク質群であってよい。あるいは、一つの培養装置１１ｂおよび細胞破砕器１３ｂを用い、そこから採取されるタンパク質群を、複数個（例えば、非固定化化合物の数）に分け、化合物との接触器１４に導入していてもよい。
タンパク質精製用制御装置１６ａ及び１６ｂは、制御ユニット６０１からの指令に従って、タンパク質をそれぞれ化合物が固定化された担体１５ａ、１５ｂに導入するとともに、担体を通過させて精製タンパク質分取器１７ａ、１７ｂに送る工程を実行する。タンパク質精製用制御装置１６ａ及び１６ｂは、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に接続されていてもよい。
精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂは、一方の精製工程で得られた精製タンパク質と、他方の精製工程で得られた精製タンパク質とを一時貯蔵する。タンパク質の分量が多いときは、同一種類のタンパク質（同一細胞から精製されたタンパク質）を複数のボトルに分注しておくこともできる。
図７では１種類の培養精製工程を示しているが、システムを複数並列させて複数種類の培養精製工程を実行することができるようにし、その結果、複数種類の異なる細胞由来のタンパク質を精製することもできる。その場合は、各精製タンパク質を区別して分取器に貯蔵する必要があるが、本発明においては、精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂは、分取器ごとに別々のタンパク質を貯蔵する態様であってもよく、分取器内のボトルごとに、それぞれ種類の異なるタンパク質を貯蔵する態様であってもよい。
図７では、精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂが、タンパク質精製用制御装置１６ａ及び１６ｂにより制御される態様を示しているが、これに限定されるものではなく、独立して、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に接続されていてもよい。
図７において、タンパク質混合ユニット６０３は、タンパク質精製ユニット６０２において精製された一方のタンパク質と他方のタンパク質とを混合するユニットである。タンパク質混合ユニット６０３は、制御ユニット６０１からの指令に従って、精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂに配列されたサンプルを選択して一定の割合で混合する。図７は、チューブ１８に１番のサンプル同士、２番のサンプル同士のように同じ番号のサンプルを混合する態様を示している。
質量分析ユニット６０４は、質量分析の対象となる１つ又は複数種のタンパク質試料を解析するユニットである。質量分析ユニット６０４は、制御ユニット６０１の指令に従って、タンパク質混合ユニット６０３により混合された試料を質量分析用のプレート１９にスポットし、質量分析処理装置２０により質量分析処理を実行する。プレート１９を質量分析処理装置２０に移送するには、コンピュータ制御のロボット型試料取扱装置を用いることもできる。
質量分析は、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１の指令に従って実行される。質量分析処理は、質量分析処理装置２０に付属のコンピュータ２１を設置して実行させることも可能である。
質量分析処理の情報は、ＬＡＮ１００を介して制御ユニット６０１に送信され、タンパク質の同定プロファイル、強度比プロファイル、親和性の比プロファイルを得るための処理に付される。
制御ユニット６０１は、本発明のシステムを実行させるための中央制御ユニットであり、中央コンピュータ３０、インターネット通信回線等を備える。
制御ユニット６０１は、タンパク質の同定を実行するとともに、同位体標識ピークと非標識ピークとの強度比及び親和性の比を決定し、制御ユニット６０１内の表示装置に表示する。各データは、制御ユニット６０１により自動整理される。
図８は、制御ユニット６０１の詳細構成図である。図８において、中央コンピュータ３０は、ＣＰＵ８０１、送信／受信部８０２、入力部８０３、出力部８０４、ＲＯＭ８０５、ＲＡＭ８０６、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）８０７、ＣＤ−ＲＯＭドライブ８０８及びタンパク質データベース（以下「ＤＢ」という）８０９を備える。
ＣＰＵ８０１は、本発明のシステム全体の動作を制御するとともに、質量分析結果のデータ、同定されたタンパク質データ、強度比データ、親和性データ等をＤＢ８０９に記録する。ＣＰＵ８０１は、送信／受信部８０２の通信制御、ＤＢ８０９に記憶されているデータを利用して、インターネット８１１を介して他のタンパク質のデータと照合することもできる。
送信／受信部８０２は、ＣＰＵ８０１の指令に従って、タンパク質精製ユニット６０２、タンパク質混合ユニット６０３、質量分析ユニット６０３との間でデータの送信及び受信処理を行う。
入力部８０３は、キーボード、マウス、タッチパネル等であり、ユーザからの情報入力時、データベースの内容更新時等に操作される。出力部８０４はＬＣＤ（液晶ディスプレイ）等であり、各種データベースの更新時等にＣＰＵ８０１からのコードデータをその都度表示用データに変換して表示処理を行う。ＲＯＭ８０５は、本発明のシステムの処理プログラムを格納する。ＲＡＭ８０６は、本発明のシステムの処理に必要なデータを一時的に格納する。ＨＤＤ８０７は、質量分析データ等を格納するためのドライブである。ＣＤ−ＲＯＭドライブ８０８は、ＣＰＵ８０１からの指令に従って、ＣＤ−ＲＯＭ８１０に格納されている、本発明のシステムの実行（各種態様の実行）に必要なプログラム等を読み出してＲＡＭ８０６等に書き込む。ＣＤ−ＲＯＭの代わりに記録媒体として書き換え可能なＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ等を用いることもできる。その場合には、ＣＤ−ＲＯＭドライブ８０８の代わりにＣＤ−Ｒ又はＣＤ−ＲＷ用ドライブを設ける。また、上記媒体の他に、ＤＶＤ、ＭＯ、フラッシュメモリースティック等の媒体を用い、それに対応するドライブを備える構成としても良い。
中央コンピュータ３０は、タンパク質群の精製ユニット６０２、混合ユニット６０３、質量分析ユニット６０４と通信し、これらのユニットが機能するように、制御情報を送信するとともに、タンパク質の同定結果およびタンパク質の質量分析結果を受信して同定結果、強度比、親和性比の同定結果を表示する。
以下、制御ユニットの動作（第一の態様）を、図面（図９）を用いて説明する。
制御ユニット６０１の中央コンピュータ３０は、本発明の実施に必要な培養液、試料（細胞）、その他の試薬を一方の培養装置１１ａに充填するよう充填装置（図示せず）に命令するとともに、タンパク質の標識に必要な同位体標識物質（同位体標識されたアミノ酸等）を添加するよう試薬充填装置（図示せず）に命令し、充填装置は充填を実行する（Ｓ９０１ａ）。これと並行して、中央コンピュータ３０は、本発明の実施に必要な培養液、試料（細胞）その他の試薬を他方の培養装置１１ｂに充填するよう、試薬充填装置（図示せず）に命令し、充填装置（図示せず）は充填を実行する（Ｓ９０１ｂ）。各培養装置１１ａ、１１ｂへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ３０は次に、所定条件で培養するよう各培養装置１１ａ、１１ｂに命令し、各培養装置１１ａ、１１ｂは培養を実行する（Ｓ９０２ａ、Ｓ９０２ｂ）。「所定条件」としては、培養時間、培養温度、ＣＯ２濃度、攪拌の有無などが挙げられる。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ３０は、細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕装置１３ａ、１３ｂに命令し、各細胞破砕装置１３ａ、１３ｂは細胞破砕を実行する（Ｓ９０３ａ、Ｓ９０３ｂ）。Ｓ９０３ａにより同位体標識物質含有培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ３０は所定の化合物が固定化された担体１５ａにタンパク質精製工程を実施するよう命令し、当該担体はタンパク質の精製を実行する（Ｓ９０５ａ）。他方、Ｓ９０３ｂにより同位体を含有しない培地から採取された細胞を破砕した後は、次に、中央コンピュータ３０は破砕物（タンパク質群）と化合物との接触処理を行うよう、化合物との接触器１４に命令し、当該接触器１４は接触を実行する（Ｓ９０４）。化合物との接触処理後、Ｓ９０５ａと同様に、タンパク質の精製を実行する（Ｓ９０５ｂ）。タンパク質の精製が完了すると、中央コンピュータ３０は、後に実施する混合（Ｓ９０７）に備えて、タンパク質精製用制御装置１６ａ及び１６ｂに、タンパク質試料を精製タンパク質分取器１７ａ、１７ｂにて分取後、一時保存するよう命令し、当該制御装置は分取及び一時保存を実行する（Ｓ９０６ａ、Ｓ９０６ｂ）。その後、中央コンピュータ３０は、精製タンパク質混合ユニット６０３に、分取された精製タンパク質を混合するよう命令し、精製タンパク質混合ユニット６０３は精製タンパク質を混合する（Ｓ９０７）。
混合が完了すると、中央コンピュータ３０は、質量分析のための試料を調製するよう命令する（Ｓ９０８）。この質量分析用試料調製工程は、培養用のウェルトレイで行っても、別のウェルトレイで行ってもよい（Ｓ９０８）。次に中央コンピュータ３０は、スポッター（図示せず）が調製後の資料を質量分析用プレート（例えば図７のプレート１９）にスポットし、続いて質量分析装置が試料の質量分析を開始するよう命令し、スポッターはスポットを実行し、質量分析装置はその分析を実行する（Ｓ９０９）。
中央コンピュータ３０は、タンパク質を同定するとともに（Ｓ９１０）、各タンパク質の標識ピークと非標識ピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する（Ｓ９１１）。タンパク質の同定結果、強度比のデータは中央コンピュータ３０に報告され、出力装置又はコンピュータのディスプレイは、当該同定結果及び強度比を表示する（Ｓ９１２）。
中央コンピュータ３０は、強度比および同定結果のデータを既存の情報と照会するとともに、ハードディスクに蓄積してデータベース化を実行する（Ｓ９１３）。
２．本発明の第二の態様
本発明の第二の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｃ）工程（ａ）で得られたタンパク質または工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質のうち工程（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｇ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第二の態様について、詳細に記載する（図３を参照）。
（１）（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程（ａ）で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程（ｃ）で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」に準じる方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程（ｂ）で用いられるタンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群の他、工程（ｃ）で用いる同位体と異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（３）（ｃ）工程（ａ）で得られたタンパク質または工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程
工程（ａ）で得られたタンパク質または工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する。いずれを同位体標識するかは、特に限定されない。工程（ｃ）で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｐ）若しくは３４Ｓ又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは１３Ｃである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。
以下、具体的な同位体標識方法について記載する。
工程（ａ）または工程（ｂ）で得られたタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同位体標識することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる（「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」第１６巻、第１５号、２００２年、ｐｐ．１４１６−１４２４参照）。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である（「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第１７巻、第１０号、１９９９年１０月、ｐｐ．９９４−９９９）。
さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のＣ末、Ｎ末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に１８Ｏで標識された水を加える。消化酵素としては、キモトリプシン、トリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃを用いることができる。キモトリプシン、Ａｓｐ−Ｎを用いたときには、加水分解後のペプチドのＣ末側に１８Ｏが一つ、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃを用いたときには、加水分解後のペプチドのＣ末のカルボン酸の酸素原子が二つとも１８Ｏになることが知られている。
くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のＣ末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており（Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ＤＲ，Ｋｅｌｌｅｒ  Ａ，Ｗａｔｔｓ  ＪＤ，Ｎｅｗｉｔｔ  Ｒ，Ｙｉ  ＥＣ，Ｐｕｒｖｉｎｅ  Ｓ，Ｅｎｇ  ＪＫ，ｖｏｎ  Ｈａｌｌｅｒ  Ｐ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｋｏｌｌｅｒ  Ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅ  ｎｏｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１：１５，ｐｐ．１２１４−１２２１参照）、同位体標識されたメタノールを用いてメチル化することにより、同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片のＮ末をニコチン酸誘導体化する方法（Ｍｕｎｃｈｂａｃｈ  Ｍ，Ｑｕａｄｒｏｎｉ  Ｍ，Ｍｉｏｔｔｏ  Ｇ，Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００：７２，ｐｐ．４０４７−４０５７参照）や、アセチル化する方法（Ｊｉ．Ｊ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  Ａ，Ｇｅｎｇ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ａｍｉｎｉ  Ａ，Ｂｉｎａ  Ｍ，Ｒｅｇｎｉｅｒ  Ｆ．Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．２０００：７４５，ｐｐ．１９７−２１０参照）が知られている。そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することもできる。
（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質のうち工程（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する工程
当該工程は、上記「１（３）（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程」に準じる方法により、行うことができる。
（５）（ｅ）工程（ｄ）得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（６）（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（７）（ｇ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、上記「１．（６）（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。ここで、工程（ａ）で得られたタンパク質および工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方は、工程（ｃ）で同位体標識されており、他方は同位体標識されていない。なお、この場合、ピーク強度比の値は、「工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークの強度」／「工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークの強度」の式により求められる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｃ）手段（ａ）で得られたタンパク質または手段（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段と、
（ｄ）手段（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質のうち手段（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段と、
（ｅ）手段（ｄ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｇ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ａ）において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段（ｃ）で用いる同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ｂ）において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、手段（ｃ）で用いる同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｃ）手段（ａ）で得られたタンパク質または手段（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する手段は、上記「２．（３）（ｃ）工程（ａ）で得られたタンパク質または工程（ｂ）で得られたタンパク質の一方を同位体標識する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｄ）手段（ｃ）で得られた標識されたタンパク質と、手段（ａ）および手段（ｂ）で得られたタンパク質のうち手段（ｃ）で標識されていない他方のタンパク質とを混合する手段は、上記「１．（３）（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で得られたタンパク質を混合する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｅ）手段（ｄ）で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｆ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｇ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「１．（６）（ｆ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段に準じるものである。なお、この場合、ピーク強度比の値は、「手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークの強度」／「手段（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークの強度」の式により求められる。
本発明の第二の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムは、第一の態様の当該システムについての説明（図６、７，８および９）に準じるが、タンパク質精製ユニット６０２における処理の順序、構成が一部異なる。タンパク質精製ユニット６０２は、第一の態様で説明した装置の他、タンパク質分注装置や同位体標識制御装置などをさらに備えていても良い。
本発明の第二の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル１２ａには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置１１ａ由来のサンプルは、化合物との接触器１４による接触処理前までは、培養装置１１ｂ由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器１４に導入するタンパク質群としては、異なる培養装置１１ａおよび１１ｂを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置（１１ａまたは１１ｂあるいは１１ｃ（図１０））のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個（例えば、非固定化化合物の数＋１個）に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図１０に示す。一つの培養装置１１ｃから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器１３ｃにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ３０は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体１５ａに導入し、別の部分は化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３（図１０では化合物との接触器は３つ表示した）に導入するよう、サンプル分注装置３１に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体１５ａまたは化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３に導入する。
同位体標識の工程は、化合物が固定化された担体１５ａ及び１５ｂによりタンパク質が精製された後に実行する。中央コンピュータ３０は、Ｓ９０５ａおよびＳ９０５ｂによりタンパク質の精製を実行した後は、Ｓ９０５ａにより精製されたタンパク質またはＳ９０５ｂにより精製されたタンパク質のどちらかが同位体標識されるように同位体標識制御装置（図示せず）に命令し、当該制御装置はタンパク質への同位体標識を実行する。中央コンピュータ３０は、標識後の精製を同位体標識制御装置にさらに命令することもできる。標識後のタンパク質は、精製タンパク質分取器１７ａおよび１７ｂにより分取され、一時保存（Ｓ９０６ａ、Ｓ９０６ｂ）される。
あるいは、同位体標識の工程は、精製タンパク質分取器１７ａおよび１７ｂにより分取した後、行うこともできる。中央コンピュータ３０は、Ｓ９０６ａ、Ｓ９０６ｂにより精製タンパク質の分取、一時保存をした後、Ｓ９０６ａ、Ｓ９０６ｂにより保存されたタンパク質のどちらかが同位体標識されるように同位体標識制御装置（図示せず）に命令し、当該制御装置はタンパク質への同位体標識を実行する。
第二の態様では、タンパク質混合ユニット６０３および質量分析ユニット６０４は、第一の態様と同様である。
３．本発明の第三の態様
本発明の第三の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物を固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する工程と、
（ｇ）工程（ｃ）および工程（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｈ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第三の態様について、詳細に記載する（図４参照）。
（１）（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程（ａ）において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（２）（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程
工程（ａ）で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。内部標準物質とは、測定系において基準となる物質を意味し、ここでいう同位体標識されたタンパク質群が内部標準物質として機能する。内部標準物質は、好ましくは、工程（ａ）で得られた複数種のタンパク質と同質の生体試料に由来するものであるが、異なる生体試料に由来するものであってもよい。
以下に、内部標準物質として機能しうる同位体標識されたタンパク質群（以下、「本発明の内部標準物質」と称する場合がある）の調製方法の一例について記載する。
本発明の内部標準物質は、代謝的に同位体標識することによって、調製することができる。例えば、培養可能な細胞を、同位体標識されたアミノ酸を含む培地で培養することによって、細胞中のタンパク質を代謝的に同位体標識することができる。培養条件はどのようなものであってもよく、液体培地あるいは固体培地に該細胞を培養するのに好適な条件を選択すればよい。例えば、動物細胞を選択した場合には、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清、アミノ酸、グルコース、ペニシリン又はストレプトマイシンなどを添加することができ、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
このようにして得られた代謝的に同位体標識されたタンパク質群を含む細胞を、破砕することで、本発明の内部標準物質を調製することができる。破砕する方法は、例えば、ダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社のＭ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５０１，Ｔ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５１０など）を用いる方法又は凍結融解法などがあげられ、好ましくは細胞溶解液を用いる方法があげられる。破砕した細胞は、遠心分離操作により、不溶性物質を除去することが好ましい。このようにして、本発明の内部標準物質を調製することができる。
本発明で用いる同位体は、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから、特に好ましい。安定同位体には、以下に限定されるものではないが、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｐ若しくは３４Ｓ又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、より好ましくは１３Ｃ、１５Ｎ若しくは１８Ｏ又はこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは１３Ｃである。本発明に利用される同位体は、タンパク質を標識し得るものであれば、その種類は特に限定されない。具体的には、同位体標識タンパク質の前駆体として、１３Ｃ標識（１３Ｃｘ６個）ロイシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（ＣＩＬ）社製、Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｕ−１３Ｃ６，ＣＬＭ−２２６２）を挙げることができる。
また、本発明の内部標準物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても調製することができる。たとえば、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたアルキル化試薬を用いてアルキル化することにより、同位体標識することができる（「ラピッド・コミュケーションズ・イン・マス・スペクトルメトリー（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」第１６巻、第１５号、２００２年、ｐｐ．１４１６−１４２４参照）。さらに、タンパク質中のシステイン残基を同位体標識されたビオチン化試薬を用いてビオチン化することにより、同位体標識することもできる。これを、さらに、アビジンカラムを用いて、標識されたタンパク質のみを精製することが可能である（「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第１７巻、第１０号、１９９９年１０月、ｐｐ．９９４−９９９）。
さらにまた、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のＣ末、Ｎ末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基などを同位体標識した分子で標識することができる。具体的には、タンパク質を酵素で消化する際に、緩衝液中に１８Ｏで標識された水を加える。消化酵素としては、キモトリプシン、トリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃを用いることができる。キモトリプシン、Ａｓｐ−Ｎを用いたときには、加水分解後のペプチドのＣ末側に１８Ｏが一つ、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃを用いたときには、加水分解後のペプチドのＣ末のカルボン酸の酸素原子が二つとも１８Ｏになることが知られている。
くわえて、タンパク質を消化して得られたペプチド断片のＣ末、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基のカルボン酸をメチルエステルにする方法が知られており（Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ＤＲ，Ｋｅｌｌｅｒ  Ａ，Ｗａｔｔｓ  ＪＤ，Ｎｅｗｉｔｔ  Ｒ，Ｙｉ  ＥＣ，Ｐｕｒｖｉｎｅ  Ｓ，Ｅｎｇ  ＪＫ，ｖｏｎ  Ｈａｌｌｅｒ  Ｐ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｋｏｌｌｅｒ  Ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅ  ｎｏｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１：１５，ｐｐ．１２１４−１２２１参照）、同位体標識されたメタノールを用いてメチル化することにより、同位体標識することも可能である。
また、タンパク質を消化して得られるペプチド断片のＮ末をニコチン酸誘導体化する方法（Ｍｕｎｃｈｂａｃｈ  Ｍ，Ｑｕａｄｒｏｎｉ  Ｍ，Ｍｉｏｔｔｏ  Ｇ，Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００：７２，ｐｐ．４０４７−４０５７参照）や、アセチル化する方法（Ｊｉ．Ｊ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  Ａ，Ｇｅｎｇ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ａｍｉｎｉ  Ａ，Ｂｉｎａ  Ｍ，Ｒｅｇｎｉｅｒ  Ｆ．Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．２０００：７４５，ｐｐ．１９７−２１０参照）が知られている。そのため、これらの同位体標識された試薬を用いることにより、同位体標識することもできる。
（３）（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（４）（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程（ｄ）においては、当該タンパク質群は、工程（ａ）と同様に同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（５）（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程
工程（ｄ）で得られたタンパク質および内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を、一定の割合で混合する。一定の割合は、等量でもよく、比率を変えてもよい。ここでいう同位体標識されたタンパク質群は、内部標準物質として機能するため、好ましくは、工程（ｄ）で得られた複数種のタンパク質と同質の生体試料に由来するものであるが、異なる生体試料に由来するものであってもよい。また、内部標準物質として機能するため、上記「３．（２）（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」と同一の本発明の内部標準物質を使用する。
（６）（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（７）（ｇ）工程（ｃ）および工程（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（８）（ｈ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
質量分析による測定の結果得られたデータを用いて、各タンパク質について、工程（ａ）または工程（ｄ）で得られたタンパク質由来のピークと本発明の内部標準物質由来の標識ピークのピーク強度比を求めて、該ピーク強度比の値を比較することにより、各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
より具体的には、例えば、担体に固定化された化合物Ａおよび担体に固定化されていない非固定化化合物Ｂと各タンパク質との親和性を解析する場合、化合物Ｂと接触させていないタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内部標準物質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、該タンパク質におけるピーク／標識ピーク（＝ピーク強度比Ａ）を求める。一方、化合物Ｂと接触させたタンパク質群における各タンパク質のピークを本発明の内部標準物質における該タンパク質の標識ピークで除することによって、該タンパク質におけるピーク／標識ピーク（＝ピーク強度比Ｂ）を求める。次に、ピーク強度比Ｂとピーク強度比Ａとを比較することで、化合物Ａおよび化合物Ｂと各タンパク質との親和性の比を定量することができる。比較は、例えば、ピーク強度比Ｂとピーク強度比Ａとの比を算出して行うことができる。そして、求めた値を各タンパク質に対する化合物Ｂの親和性と化合物Ａの親和性との比として用いることができる。
なお、工程（ａ）または工程（ｄ）で得られたタンパク質中では存在していて、本発明の内部標準物質中では存在していないタンパク質が存在することがある。この場合には、質量分析計で測定した際に、近傍の本発明の内部標準物質由来のピーク、好ましくはＬＣ／ＭＳならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、ＭＡＬＤＩ−ＭＳなら分子量が近いピークを対象としてピーク強度比を求めて、該ピーク強度比を比較することによって定量することができる。したがって、工程（ａ）または工程（ｄ）で得られたタンパク質中のすべてのタンパク質について、タンパク質と化合物との親和性の比を測定することが可能である。
より具体的には、担体に固定化された化合物Ａとタンパク質Ｘとの親和性および担体に固定化されていない化合物Ｂとタンパク質Ｘとの親和性とを比較する場合、本発明の内部標準物質にタンパク質Ｘが存在せず、近傍にタンパク質Ｙ由来のピークが存在することがある。ここで、近傍のピークとは、本発明の内部標準物質由来のピークで、かつ、ＬＣ／ＭＳならクロマトグラフィーでの溶出時間が近いピーク、ＭＡＬＤＩ−ＭＳなら分子量が近いピークである。この場合には、非固定化化合物Ｂと接触させていないタンパク質群におけるタンパク質Ｘのピークをタンパク質Ｙに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除することによって、タンパク質Ｘにおけるピーク／タンパク質Ｙにおける標識ピーク（＝ピーク強度比Ｃ）を求める。一方、化合物Ｂと接触させたタンパク質群におけるタンパク質Ｘのピークをタンパク質Ｙに対応する本発明の内部標準物質の標識ピークで除することによって、タンパク質Ｘにおけるピーク／タンパク質Ｙにおける標識ピーク（＝ピーク強度比Ｄ）を求める。次に、ピーク強度比Ｃとピーク強度比Ｄとを比較することで、化合物Ａとタンパク質Ｘとの親和性および化合物Ｂとタンパク質Ｘとの親和性の比を定量することができる。また、近傍のタンパク質を複数選択することによって、測定の精度を上げることができる。
このような方法を用いることによって、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となる。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ）手段（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（ｃ）手段（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｅ）手段（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段と、
（ｆ）手段（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する手段と、
（ｇ）手段（ｃ）および手段（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｈ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
（ａ）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ａ）において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｂ）手段（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段は、上記「３．（２）（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｃ）手段（ｂ）で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｄ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ａ）において、タンパク質群は、同位体標識されていないものを用いることもできるし、本発明の内部標準物質で用いられた同位体とは異なる同位体で標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｅ）手段（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する手段は、上記「３．（５）（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｆ）手段（ｅ）で得られた混合物を質量分析処理する手段は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｇ）手段（ｃ）および手段（ｆ）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｈ）各タンパク質について、手段（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および手段（ｄ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「３．（８）（ｈ）各タンパク質について、工程（ａ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比および工程（ｂ）で得られたタンパク質に由来するピークと内部標準物質であるタンパク質に由来するピークとの強度比を求めて、当該強度比を比較することにより各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
以下に、本発明の第三の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて述べる。本システムは、第一の態様の当該システムについての説明（図６、７，８および９）に準じるが、タンパク質精製ユニット６０２及びタンパク質混合ユニット６０３における処理の順序、構成が一部異なる。タンパク質精製ユニット６０２は、第一の態様で説明した装置の他、タンパク質分注装置をさらに備えていても良い。
本発明の第三の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル１２ａには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置１１ａ由来のサンプルは、化合物との接触器１４による接触処理前までは、培養装置１１ｂ由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器１４に導入するタンパク質としては、異なる培養装置１１ａおよび１１ｂを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置（１１ａまたは１１ｂあるいは１１ｃ（図１０））のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個（例えば、非固定化化合物の数＋１個）に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図１０に示す。一つの培養装置１１ｃから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器１３ｃにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ３０は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体１５ａに導入し、別の部分は化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３（図１０では化合物との接触器は３つ表示した）に導入するよう、サンプル分注装置３１に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体１５ａまたは化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３に導入する。
また、上記分取器１７ａ、１７ｂに分取されるタンパク質とは別に、培養装置１１ａ、培養液ボトル、１２ａ、細胞破砕器１３ａにより、細胞を所定の条件で培養し、タンパク質群を得ておく。ここで培養液ボトル１２ａには、タンパク質群を同位体標識するためのアミノ酸が混合され、内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を得る。
制御ユニット６０１の中央コンピュータ３０は、内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群を得るのに必要な培養液、試料（細胞）、その他の試薬を培養装置１１ａに充填するよう充填装置（図示せず）に命令し、充填装置（図示せず）は充填を実行する。培養装置１１ａへの培養液等の充填が完了すると、中央コンピュータ３０は次に所定条件で培養するよう培養装置１１ａに命令し、培養装置１１ａは培養を実行する。所定条件での培養が終了した後、中央コンピュータ３０は細胞破砕工程を実施するよう、細胞破砕装置１３ａに命令し、細胞破砕装置１３ａは細胞破砕を実行する。
第三の態様では、タンパク質混合ユニット６０３は、タンパク質精製ユニット６０２により精製されたタンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するユニットである。
中央コンピュータ３０は、Ｓ９０６ａ、Ｓ９０６ｂによる分取および一時保存の後、タンパク質混合ユニット６０３に、分取された精製タンパク質と内部標準物質である同位体標識されたタンパク質群とを混合するよう命令し、精製タンパク質混合ユニット６０３は精製タンパク質を混合する（Ｓ９０７）。
４．本発明の第四の態様
本発明の第四の態様は、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析する方法であって、
（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ａ２）工程（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（ａ３）工程（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程と、
（ｂ２）工程（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程と、
（ｂ３）工程（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程と、
（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程と、
（ｃ）各タンパク質について、工程（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程と、
を含む、前記方法を提供する。
以下、本発明の第四の態様について、詳細に記載する。
（１）（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。
工程（ａ１）において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（２）（ａ２）工程（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（３）（ａ３）工程（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（４）（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程において、各タンパク質を定量する方法は、特に限定されないが、例えば、以下の方法により行うことができる。
工程（ａ３）において、同定された各タンパク質について、検出されたペプチド数（Ｎｏｂｓｄ）および検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）を算出する。
「検出されたペプチド数（Ｎｏｂｓｄ）」は、「４．（２）（ａ２）工程（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程」において、実際に検出されたペプチド数を意味する。検出されたペプチド数（Ｎｏｂｓｄ）は、質量分析のデータおよび同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。検出されたペプチド数（Ｎｏｂｓｄ）は、質量分析のデータをもとに算出する場合、各タンパク質について質量分析で検出されたピークの数と一致する。
また、「検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）」は、「４．（２）（ａ２）工程（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程」において、理論上検出され得るペプチド数を意味する。検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）は、同定されたタンパク質の配列情報をもとに算出することができる。各タンパク質について、上記工程における分離、消化又はＨＰＬＣによる分離操作によって理論的に生じるペプチド数を配列情報をもとに算出し、質量分析で検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）を求めることができる。例えば、トリプシンによる消化操作を行った精製物を質量分析する場合は、トリプシンによりリシン、アルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖が切断されるため、各タンパク質の配列情報から切断により生じるペプチド数が予測できる。場合によっては、質量分析器の測定範囲も考慮して、検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）を求めることができる。
次に、上記の検出され得るペプチド数（Ｎｏｂｓｂｌ）と検出されたペプチド数（Ｎｏｂｓｄ）とを用いて各タンパク質を定量するために、以下の式（Ｉ）にしたがって、ＥＭＰＡＩ（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ）を設定し、算出する。
式（Ｉ）：
ＥＭＰＡＩ＝１０Ｎｏｂｓｄ／Ｎｏｂｓｂｌ−１
ＥＭＰＡＩは、タンパク質混合物中のタンパク質含有量に比例する指数である。
さらに、以下の式（ＩＩ）にしたがって、タンパク質含有率（ｍｏｌ％）を算出することができる。
式（ＩＩ）：
0004469853.tif 000002
ここで、Σ（ＥＭＰＡＩ）は、すべての同定されたタンパク質のＥＭＰＡＩの和を表す。
また、以下の式（ＩＩＩ）にしたがって、タンパク質含有率（重量％）を算出することができる。
式（ＩＩＩ）：
0004469853.tif 000003
ここで、ＭＷは、同定された各タンパク質の分子量を表す。Σ（ＥＭＰＡＩ×ＭＷ）は、すべての同定されたタンパク質のＥＭＰＡＩ×ＭＷの和を表す。
各タンパク質の分子量は、アミノ酸配列から算出することができる。また、工程（ａ１）で得られたタンパク質の総重量は、既存の方法、例えば、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、２８０ｎｍの吸光度測定などの方法によって容易に測定することができる。そうすると、工程（ａ１）で得られたタンパク質の総重量および上記で求めたタンパク質含有率から、各タンパク質を定量することができる。
よって、上記方法により、各タンパク質を定量することができる。
各タンパク質を定量する工程は、コンピュータを用いてもよい。
（５）（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程
当該工程は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」と同様の方法により、担体に固定化した化合物に結合する複数種のタンパク質を精製することができる。工程（ｂ１）において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（６）（ｂ２）工程（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する工程
当該工程は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（７）（ｂ３）工程（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程
当該工程は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（８）（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程
当該工程は、上記「４．（４）（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」と同様の方法により、行うことができる。
（９）（ｃ）各タンパク質について、工程（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程
当該工程は、工程（ａ４）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量および工程（ｂ４）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量の比を求めることにより、各タンパク質と化合物との親和性を定量することができる。
本発明の第四の態様における方法は、各タンパク質について同位体標識する必要がないことに特徴を有する。
本発明はさらに、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムであって、
（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ａ２）手段（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（ａ３）手段（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段と、
（ｂ２）手段（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段と、
（ｂ３）手段（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段と、
（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段と、
（ｃ）各タンパク質について、手段（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段と、
を含む、前記システムを提供する。
（ａ１）タンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記の「１．（１）（ａ）同位体標識されたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて、当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ａ１）において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ａ２）手段（ａ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ａ３）手段（ａ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「４．（４）（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｂ１）予め化合物と接触させておいたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する手段は、上記「１．（２）（ｂ）予め化合物と接触させたタンパク質群の中から、化合物が固定化された担体を用いて当該担体上の化合物に結合する複数種のタンパク質を精製する工程」において用いられる手段に準じるものである。手段（ｂ１）において、当該タンパク質群は、同位体標識されていないタンパク質群を用いることができる。また、同位体標識されていないタンパク質群の代わりに、同位体標識されたタンパク質群を用いることもできる。
（ｂ２）手段（ｂ１）で得られた精製物を質量分析処理する手段は、上記「１．（４）（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物を質量分析処理する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｂ３）手段（ｂ２）で得られた質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する手段は、上記「１．（５）（ｅ）質量分析の情報から複数種のタンパク質中の各タンパク質を同定する工程」において用いられる手段に準じるものである。
（ｂ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する手段は、上記「４．（４）（ａ４）複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する工程」において用いられる手段と同一のものである。
（ｃ）各タンパク質について、手段（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と手段（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する手段は、上記「４．（９）（ｃ）各タンパク質について、工程（ａ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量と工程（ｂ１）で得られたタンパク質に由来するタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する工程」で用いられる手段と同一のものである。
以下に、本発明の第四の態様における複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を解析するシステムについて述べる。本システムは、第一の態様の当該システムについての説明（図６、７，８および９）に準じるが、タンパク質混合ユニット６０３は省略され、タンパク質精製ユニット６０２における処理の順序、構成が一部異なる。
本発明の第四の態様では、タンパク質への同位体標識処理手段の配置が第一の態様と異なり、培養液ボトル１２ａには同位体標識物質は原則として混合されない。したがって、培養装置１１ａ由来のサンプルは、化合物との接触器１４による接触処理前までは、培養装置１１ｂ由来のサンプルと同一のものである。そのため、化合物との接触器１４に導入するタンパク質としては、異なる培養装置１１ａおよび１１ｂを用い、その一方から採取されるタンパク質群であってもよい。あるいは一つの培養装置（１１ａまたは１１ｂあるいは１１ｃ（図１０））のみを用い、そこから採取されるタンパク質群を複数個（例えば、非固定化化合物の数＋１個）に分け、その一部分を化合物に接触させても良い。
一つの培養装置から採取されるタンパク質群を複数個に分ける際の装置の模式図を図１０に示す。一つの培養装置１１ｃから採取されるタンパク質群は、細胞破砕器１３ｃにより細胞破砕される。その後に、中央コンピュータ３０は、破砕後のサンプルを複数個に分け、一部は化合物が固定化された担体１５ａに導入し、別の部分は化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３（図１０では化合物との接触器は３つ表示した）に導入するよう、サンプル分注装置３１に命令し、サンプル分注装置はサンプルを複数個に分け、各々を化合物が固定化された担体１５ａまたは化合物との接触器１４ｃ−１，１４ｃ−２，１４ｃ−３に導入する。
第四の態様では、タンパク質混合ユニット６０３は存在せず、質量分析ユニットは、制御ユニット６０１からの指示に従って、精製タンパク質分取器１７ａ及び１７ｂに配列されたそれぞれのサンプルについて、質量分析用の試料を調製し（Ｓ９０８）、質量分析（Ｓ９０９）する。中央コンピュータ３０は、１７ａ由来のタンパク質および１７ｂ由来のタンパク質をそれぞれ同定するとともに（Ｓ９１０）、質量分析時のデータ、タンパク質同定によるアミノ酸配列情報などに基づいて、複数種のタンパク質中の各タンパク質を定量する。そして、各タンパク質について、１７ａ由来のタンパク質量と１７ｂ由来のタンパク質量との比を求めて、各タンパク質に対する化合物の親和性の比を定量する。
【実施例】  以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
（１）化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムの作製
次式１：
0004469853.tif 000004
で表される化合物（１）を特開平７−１６５７０８に記載の方法で製造した。次に、式１で表される化合物（１）約５２ｍｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４ｍＬ、メタノール（ＭｅＯＨ）４ｍＬに溶かし、さらに水（Ｗａｔｅｒ）４ｍＬを加えた。
この液６ｍＬをＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｗａｔｅｒ＝１／１／１（ｖ／ｖ／ｖ）１８ｍＬで希釈し、あらかじめＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｗａｔｅｒ＝１／１／１（ｖ／ｖ／ｖ）で洗浄しておいたアフィゲル１０（バイオラド社製、カタログ番号１５３−６０９９）２５ｍＬに加えた。
そこに、１００μＬのトリエチルアミン（東京化成工業社製、カタログ番号Ｔ０４２４）を加え、室温にて一晩インキュベーションした。翌朝、１００μＬの２−アミノエタノール（東京化成工業社製、カタログ番号Ａ０２９７）を加え、室温にて３時間インキュベーションした。そして、このゲルをＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｗａｔｅｒ＝１／１／１（ｖ／ｖ／ｖ）で十分洗浄し、メタノール液に置換後４℃にて保存し、これをアフィニティーゲルとした。なお、この反応で式１からなる化合物（１）が、ゲル１ｍＬあたり約１ｍｇ結合した。作製したアフィニティーゲルをカラムに充填して、アフィニティークロマトグラフィーカラムとした。
（２）細胞の調製
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ）を培養した。培地には、１０％牛胎児血清（ＭＯＲＥＧＡＴＥ社、ＢＡＴＣＨ  ３２３００１０２）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社、１５１４０−１２２）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社、Ｒ−７１３０）を用いた。ＲＰＭＩ−１６４０としては、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、炭酸水素ナトリウムを含まない粉末培地を選択し、当該培地に欠損した成分を加えて調製（Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ−８５４０）、Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｌ−９０３７）、Ｌ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｍ−５３０８）、炭酸水素ナトリウム（和光純薬、１９１−０１３０５）をそれぞれ０．３ｇ／Ｌ、０．０４ｇ／Ｌ、０．０１５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌを加え、さらに、天然型のＬ−ロイシンまたは安定同位体１３Ｃ（６個）で標識されたＬ−ロイシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＣＬＭ−２２６２）を０．０５ｇ／Ｌ加えた）した。このようにして調製した培地を用いて、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。この培養によって得られた細胞を、それぞれ天然型培地で培養した細胞、または安定同位体培地で培養した細胞として以下の実験に用いた。
（３）タンパク質の抽出
安定同位体培地で培養した細胞を１５センチ皿５０枚分、天然型培地で培養した細胞を１５センチ皿２０枚分、それぞれ用意し、細胞を集めた。１５センチ皿１枚あたり約１．２ｍｌのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社、７８５０１）で可溶化し、遠心分離により不溶性画分を除去して可溶性画分を調製した。こうして得られた可溶性画分を、それぞれ代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液、代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液とした。
（４）化合物の調製
式２から式６で表された化合物（２）から化合物（６）を特開平７−１６５７０８に記載の方法で製造した。次に、式２から式６で表された化合物について、式２からなる化合物（２）を約２０ｍｇ、式３からなる化合物（３）を約１３ｍｇ、式４からなる化合物（４）を約１２ｍｇ、式５からなる化合物（５）を約９ｍｇ、式６からなる化合物（６）を約１４ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯを加えて溶かし、それぞれの化合物について濃度２ｍｇ／３００μＬにした。これらの化合物は、細胞増殖阻害活性が、化合物（２）＞化合物（４）＞化合物５＞化合物３＞化合物６であることが知られている（Ｙ．Ｏｄａ，Ｔ．Ｏｗａ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｂ．Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｓ．Ｄａｎｉｃｌｓ，Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ａ．Ｙｏｋｏｉ，Ｊ．Ｋｕｒｏｍｉｔｓｕ，ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｇａｓｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５，２１５９（２００３）．）。
式２：
0004469853.tif 000005
式３：
0004469853.tif 000006
式４：
0004469853.tif 000007
式５：
0004469853.tif 000008
式６：
0004469853.tif 000009
（５）化合物を固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムにおける結合タンパク質群の精製
まず、代謝的に安定同位体で標識されたタンパク質抽出液１０ｍｌにＰＢＳ２０ｍｌを加えた。これに、調製した式２から式６で表された化合物（２）〜（６）溶液（実施例（４））３００μＬを加えて、４℃にて３時間インキュベーションを行い、これを化合物と混合したタンパク質抽出液とした。
次に、アフィニティーゲル約１ｍｌをオープンカラムとし、上から化合物と混合したタンパク質抽出液を加えて自然落下させた。続いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ１５ｍｌをこのカラムに流した。そして、５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ６ｍｌを流した。次に、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを６ｍｌ流した。この後に、６Ｍ塩酸グアニディンおよび２％ＣＨＡＰＳを含む液６ｍｌを流して溶出画分を集めて、化合物と混合したタンパク質精製液とした。
この操作と並行して、代謝的に安定同位体で標識されていないタンパク質抽出液２０ｍｌにＰＢＳ４０ｍｌを加え、３０ｍｌずつ２つに分けた。アフィニティーゲル約１ｍｌをオープンカラムとして２本用意し、２つに分けた抽出液をそれぞれ上から加えて自然落下させた。続いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ１５ｍｌをこのカラムに流した。そして、５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ６ｍｌを流した。次に、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．０１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳを６ｍｌ流した。この後に、６Ｍ塩酸グアニディンおよび２％ＣＨＡＰＳを含む液６ｍｌを流して溶出画分を集めて、化合物と混合していないタンパク質精製液とした。
そして、化合物と混合したタンパク質精製液３に対して、化合物と混合していないタンパク質精製液を１の割合で混合した。この混合液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０，０００ＭＷＣＯ（ミリポア、カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）で濃縮し、５０ｍＭの炭酸水素アンモニア水で洗浄を繰り返した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ディー・アール・シー株式会社、５−２０％Ｔゲル、１ｍｍ、７ｗｅｌｌ、４ｃｍ、２００Ｖ）で分離し、泳動レーンを１２等分してゲル内トリプシン消化を行い、消化されたタンパク質溶液とした（Ｈ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｋ．Ｓａｔｏｈ，Ｍ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．Ｄｅｇｕｃｈｉ−Ｔａｗａｒａｄａ，Ｙ．Ｏｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｇａｓｕ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７，１０７１−１０７８（２００３）．）。
（６）ＬＣ／ＭＳによる測定
消化されたタンパク質溶液を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリルに溶かし、測定対象のタンパク質溶液とした。ＭＳとしてはＬＣＱ−Ｄｕｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）で測定を行った。ＬＣ／ＭＳのＬＣとしては自家製のＯＤＳカラム（Ｙ．Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｊ．Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｍａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．９７９，２３３−２３９（２００２）．）内径０．２ｍｍ、長さ約１５センチに移動相として０．５％酢酸を含み、最初の１分間でアセトニトリル濃度４％として、その後３５分間でアセトニトリル濃度を２０％まで直線的に増加させて、その後０．１分間でアセトニトリル濃度を８０％にして５分間維持し、その後アセトニトリル濃度を０％として１２分後に次のサンプルを注入した。
ポンプには島津製作所のＬＣ−１０ＡシリーズのＲＯＭをミクロ対応として、また、ミキシングチャンバーとしては付属の島津製作所製を外してバルコ社のＴコネクターを採用した。
流速としてはＦｌｏｗ−ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ方式を採用し、カラムには約毎分１−２μＬの流速となるように調製した。測定対象のタンパク質溶液をＣＴＣ社のオートサンプラーＰＡＬによって１０μＬ注入した。カラムの出口から溶出物を直接スプレーして得られたイオンをＬＣＱ内に送り込むことで測定を行った。スプレー電圧としては２．５ｋＶを印加した。測定は、Ｄａｔａ  ＤｅｐｅｎｄｅｎｔモードでＤｙｎａｍｉｃ  ＥｘｃｌｕｓｉｏｎのＲｅｐｅａｔを１とした。なお、スキャン回数を稼ぐためにＺｏｏｍ  Ｓｃａｎモードを外したいわゆるダブルプレーモードで測定した。
（７）データ解析
得られたデータについては、ＳｏｎａｒＭＳＭＳ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社）およびＮＣＢＩｎｒデータベース用いてタンパク質の自動同定を行った。このとき、安定同位体で標識したロイシン（ロイシン１つにつき分子量６の増加）でもＮＣＢＩｎｒに対して検索できるように、プログラムの一部を改変した。
定量は、ロイシンを含むペプチドのピークで行うため、ＳｏｎａｒＭＳＭＳにより同定されたペプチドのうち、ロイシンを含むペプチドのみを選び出し、かつ、そのペプチドピークの溶出位置（ＨＰＬＣでの保持時間＝ＭＳでのスキャン番号）を特定するためにＬＣＱ  Ｄｕｏの付属ソフトであるＬＣＱ＿ｄｔａ．ｅｘｅファイルからスキャン情報を自動で選び出すソフトウエアを構築した。そして、そのスキャン番号の情報から、そのスキャン番号のＭＳスペクトルを抜き出し、天然型ロイシンペプチドのピークと同位体ペプチドのピークについて、ＭＳ／ＭＳを測定した際の親イオンの情報（ｍ（質量数）／ｚ（電荷）値）とそのペプチド内に何個のロイシンがあるか、そして、電荷は何個かをＳｏｎａｒＭＳＭＳでの検索結果から求めて、ペアとなるピークを探し、そのピーク強度比を自動計算した。このように構築した解析ソフトウエアを用いてタンパク質の同定およびピーク強度比の算出を行った。
得られた結果の一例について図５に示した。図５は、複数種のタンパク質と化合物２（化２）〜化合物６（化６）で表される化合物との構造親和性相関を表す。数字が小さいほど化合物に対して親和性が強いことを意味している。
この図５から、例えば、以下のような情報を得ることができる。
（１）図を縦方向に見て、例えば、化合物（３）（化３）に最も親和性の強いタンパク質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｏｍｅｇａ  １で、次に親和性の強いタンパク質は、ｈｅｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １であるというように親和性の強さについての序列がわかるので、化合物（３）が、標的タンパク質以外にどのようなタンパク質に対して親和性が高いのかについての情報を得ることができる（図５）。
（２）図を横方向に見て、あるタンパク質、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｏｍｅｇａ  １に着目して、そのタンパク質を標的にした化合物合成展開をしようとしたときに、化合物（４）（化４）なら化合物（３）に比べて親和性が強くなり、化合物（６）（化６）なら弱くなるという情報を得ることができる（図５）。
したがって、本発明の方法は、化合物の構造を変えることによって、いかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することができるため、化合物、特に薬剤を合成する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることができる。
（３）さらに、図全体を見て、縦方向に見ても、横方向に見ても、１点だけ親和性が強いところがあれば、その化合物とタンパク質の組み合わせは特異性が高いという情報を得ることができる。そして、その化合物の標的タンパク質であるともいえるであろう。
【産業上の利用可能性】  本発明により、簡便かつ効率的に、複数種のタンパク質と化合物との構造親和性相関を同時に解析することが可能となった。
また、本発明により、化合物を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムを複数種用意する必要がなくなり、簡便かつ効率的に複数種の化合物に基づく構造親和性相関の情報を得ることができるようになった。また、一種類の化合物を固定化するだけで、他の化合物は固定化せずに使用するため、各化合物本来の構造でタンパク質に対する親和性を評価することで、より正確な構造親和性相関の情報を得ることが可能となった。
また、本発明により、化合物の構造を変えることによって、いかなるタンパク質との親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、化合物、特に薬剤を合成する上で、主作用を増強しつつ、副作用を軽減するような有益な情報を得ることが可能となった。例えば、本発明によりＮＡＤまたはＮＡＤＰを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。また、例えば、本発明によりＡＴＰまたはＧＴＰを固定化した担体を用いて構造親和性相関の情報を得ることにより、化合物の構造を変えることによって、いかなるｋｉｎａｓｅ、ＡＴＰ−ａｓｅ、ＧＴＰ−ａｓｅなどとの親和性に影響を与えるのかを網羅的に解析することが可能となり、これらの阻害剤のスクリーニングをする上で、特異性、選択性などに関する有益な情報を得ることが可能となった。
さらに、化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）に結合した化合物の濃度は、一般的にゲル１ｍｌあたり０．１ｍｇから数ｍｇ程度であり、これは１ｍＭ前後に相当する。しかし、細胞に対して何らかの活性を有する化合物は、数μＭから数ｎＭ、ときには数ｐＭ程度で活性を示すことが知られている。したがって、化合物が固定化された担体（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）に固定化された化合物濃度と大きな乖離がある。本発明においては、担体に固定化していない化合物を用いるため、化合物濃度を数μＭから数ｎＭに減らし、より生体における化合物に近い状態にすることも可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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