(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不動態化用生体材料表面の製造において使用される試薬であって、該試薬は、光反応性基及び２官能性脂肪族系酸を含み、両方の基は共に、表面に共有結合されており、かつ、該試薬は、一般式（Ｘ）m−Ｙ−（Ｚ）nをもち、式中Ｘは光反応性基であり、Ｙはスペーサ基であり、Ｚが２官能性脂肪族系酸であり、かつ、ｍ及びｎは独立して１以上である、前記試薬。
【請求項２】
活性化の間、前記光反応性基は、前記試薬を前記表面に共有結合させ、一方、結合された試薬の脂肪族系酸は、前記表面を不動態化させるために、疎水性又はイオン性相互作用により、タンパク様の成分を引きつけ、そしてそれに結合することができるように未だ利用可能なままにある、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記２官能性脂肪族系酸が、カルボン酸の形態のアニオン領域を含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記２官能性脂肪族系酸が、脂肪酸を含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項５】
前記タンパク様成分がアルブミンを含む、請求項２に記載の試薬。
【請求項６】
前記スペーサが、ヘテロ２官能性試薬を提供するべく２価のスペーサを含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項７】
前記スペーサが、重合体試薬を提供するべく重合体主鎖を含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項８】
前記重合体主鎖が、付加又は縮合重合の結果得られたオリゴマー、ホモポリマー及びコポリマーから成る群から選択された合成重合体主鎖、及び天然の重合体から成る群から選ばれる、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
前記試薬が、各々多数の脂肪酸側基及び多数の光活性化可能な側基を含有する、光活性化可能なポリアクリルアミド共重合体、光活性化可能なポリビニルピロリドン及び光活性化可能なポリシロキサンから成る群から選択される、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記スペーサが、脂肪族スペーサ、重合体スペーサ及びＯ，Ｎ及びＳから成る群から選択されたヘテロ原子から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬。
【請求項１１】
不動態化用表面の製造における使用のための試薬であって、
モノ−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジル・エーテル、モノ−３−カルボキシヘプタデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジル・エーテル、モノ−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミドテトラ（エチレン・グリコール）モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル、モノ−３−カルボキシヘプタ−デカンアミドテトラ（エチレン・グリコール）モノ−４−ベンゾイルベンジル・エーテル、Ｎ−［２−（４−ベンゾイルベンジルオキシ）エチル］−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、Ｎ−［２−（４−ベンゾイルベンジルオキシ）エチル］−３−カルボキシヘプタデカンアミド、Ｎ−［１２−（ベンゾイルベンジルオキシ）ドデシル］−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、Ｎ−［１２−（ベンゾイルベンジルオキシ）ドデシル］−３−カルボキシ−ヘプタデカンアミド、Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］−３−カルボキシヘプタデカンアミド、Ｎ−（３−ベンゾイルフェニル）−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、Ｎ−（３−ベンゾイルフェニル）−３−カルボキシヘプタデカンアミド、Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、ポリ（エチレン・グリコール）200モノ−１５−カルボキシペンタデシル・モノ−４−ベンゾイルベンジル・エーテル、及びモノ−１５−カルボキシペンタ−デカンアミドポリ（エチレン・グリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジル・エーテル、から成る群から選択される、前記試薬。
【請求項１２】
以下の式：
【化１】
0004472869.tif 000027
のアクリルアミドと脂肪酸単量体との光反応性終点共重合体、
以下の式：
【化２】
0004472869.tif 000028
のＮ−ビニルピロリドンと脂肪酸単量体との光反応性終点共重合体、
以下の式：
【化３】
0004472869.tif 000029
のＮ−ビニルピロリドンと脂肪酸単量体との光反応性ランダム共重合体、及び
以下の式：
【化４】
0004472869.tif 000030
脂肪酸リガンドを含有する光反応性シロキサン共重合体、
から成る群から選択される、不動態化用表面の製造における使用のための試薬であって、各重合体中に示す単量体がランダムな配列及び相対的濃度で存在する、前記試薬。
【請求項１３】
Ｎ−［３−メタクリルアミド）プロピル］−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド、Ｎ−［３−メタクリルアミド）プロピル］−３−カルボキシヘプタデカンアミド、Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド、及びＮ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミド、から成る群から選択される、請求項１に記載の試薬の製造における使用のための中間体。
【請求項１４】
不動態化用生体材料表面の製造方法であって、請求項１に記載の試薬で生体材料表面をコーティングする段階、及び上記試薬を上記表面に共有結合させるのに適した条件下で上記光反応性基を活性化させる段階を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記試薬がヘテロ２官能性試薬を提供するべく２価のスペーサを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記スペーサが、重合体試薬を提供するべく、重合体主鎖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノエポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチック、から成るグループの中から前記生体材料が選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の試薬を共有結合により付着された状態で有する生体材料表面を含む不動態化用生体材料。
【請求項１９】
前記生体材料が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）といった塩素含有重合体、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチック、から成る群から選択される、請求項１８に記載の不動態化用生体材料。
【請求項２０】
前記表面を不動態化するためアルブミン分子を引きつけそれに結合させることを可能にするのに適した条件下、in vivoにおいて配置される、請求項１８に記載の不動態化用生体材料。
【請求項２１】
請求項１８に記載の不動態化用生体材料から製造された医療用物品。
【請求項２２】
in vivo で利用するための血液と接触する医療用デバイスを含む、請求項２１に記載の医療用物品。
【請求項２３】
それに結合されたタンパク様の材料を有する表面を含む、請求項２０に記載の不動態化用生体材料から製造された不動態化された生体材料表面。
【請求項２４】
請求項１１に記載の試薬を共有結合で付着した状態で有する生体材料表面を含む不動態化用生体材料。
【請求項２５】
前記生体材料が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）といった塩素含有重合体、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチック、から成る群から選択される、請求項２４に記載の不動態化用生体材料。
【請求項２６】
前記表面を不動態化するためアルブミン分子を引きつけそれに結合させることを可能にするのに適した条件下、in vivoにおいて配置される、請求項２４に記載の不動態化用生体材料。
【請求項２７】
請求項２４に記載の不動態化用生体材料から製造された医療用物品。
【請求項２８】
in vivo で利用するための血液と接触する医療用デバイスを含む、請求項２７に記載の医療用物品。
【請求項２９】
それに結合されたタンパク様の材料を有する表面を含む、請求項２６に記載の不動態化用生体材料から製造された不動態化された生体材料表面。
【請求項３０】
請求項１２に記載の試薬を共有結合で付着した状態で有する生体材料表面を含む不動態化用生体材料。
【請求項３１】
前記生体材料が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）といった塩素含有重合体、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチック、から成る群から選択される、請求項３０に記載の不動態化用生体材料。
【請求項３２】
前記表面を不動態化するためアルブミン分子を引きつけそれに結合させることを可能にするのに適した条件下、in vivoにおいて配置される、請求項３０に記載の不動態化用生体材料。
【請求項３３】
請求項３０に記載の不動態化用生体材料から製造された医療用物品。
【請求項３４】
in vivo で利用するための血液と接触する医療用デバイスを含む、請求項３３に記載の医療用物品。
【請求項３５】
それに結合されたタンパク様の材料を有する表面を含む、請求項３２に記載の不動態化用生体材料から製造された不動態化された生体材料表面。
【請求項３６】
請求項１８に記載の方法に従って製造された表面を含む不動態化用生体材料。
【請求項３７】
前記生体材料が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）といった塩素含有重合体、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチック、から成る群から選択される、請求項３６に記載の不動態化用生体材料。
【請求項３８】
前記表面を不動態化するためアルプミン分子を引きつけそれに結合させることを可能にするのに適した条件下、in vivoにおいて配置された、請求項３６に記載の不動態化用生体材料を共有結合で付着された状態で有する生体材料表面を含む、不動態化された生体材料表面。
【請求項３９】
請求項３６に記載の不動態化用生体材料から製造された医療用物品。
【請求項４０】
in vivo で利用するための血液と接触する医療用デバイスを含む、請求項３９に記載の医療用物品。
【請求項４１】
それに結合されたタンパク様の材料を有する表面を含む、請求項３８に記載の不動態化された生体材料表面。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
潜在的反応性血液適合性作用物質
本出願は、本書にその開示全体が参考として内含されている１９９８年３月１８日付けで提出され通し番号６０/０７８,３８３号が割当てられた暫定的米国特許出願の継続出願である、１９９８年１０月２２日付で提出され通し番号０９/１７７,３１８号が割当てられた米国特許出願の継続出願である。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は、表面を生体適合性のあるものにするための試薬及び方法、特に移植可能な医療装置の表面を「不動態化して（passivating）」それを血液適合性のあるものにするための試薬及び方法に関する。もう１つの態様においては、本発明は、生体医用デバイス自体、特に血液適合性を含め生体適合性のある組織−接触表面に関する。
【０００３】
発明の背景
移植可能な医学装置のメーカーはかなり前から、血液と接触する利用分野において使用される材料の性能を理解し、次にそれを改善することを試みてきた。（Leconard, E.F., et al. Ann. N.Y. Acad. Sci.５１６, New York, Acad, Sci, New York,１９８７）人体の生物学的応答ならびに感染に関する問題は、移植可能で使い捨ての体外装置の応用を妨げてきた。ヘパリンやクーマジン（coumadin）といったような抗凝血薬はかかる装置の使用を改善することができるが、抗凝血剤にはそれ自体に対応するリスク及び欠点がある。これらの理由から、血液に対して高い適合性をもつ材料の開発が精力的に行なわれてきた（Sevastianov, V.I. CRC Crit. Rev. Biocomp. ４：１０９，１９８８）。
【０００４】
改善された血液接触材料を開発するために使用されてきた２つの一般的戦略としては、バルク材料自体の化学を改質すること及び／又は材料の界面特性を改質することがある。後者のアプローチの場合には、複数の材料クラスが、血液適合性を改善するという最終目的で、血液接触表面上に共有結合されてきた。これらの材料には、ヘパリン及びヒルジンといったような抗凝血剤；ヒドロゲル；酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）；アルブミン結合剤；細胞膜成分；プロスタグランジン及びスルホン化重合体が含まれる。これらのアプローチは、タンパク質吸着、血小板付着及び活性化及び血栓形成を低減させるという点に関して様々なレベルの成功をおさめてきた。残念ながら、これまでのところ、どのアプローチもまだ、血液と生体材料の相互作用を改善させるために普遍的に適用可能であることが実証されていない。
【０００５】
上述のように、生体材料上で使用するために、アルブミン結合剤が考慮されてきた。高い表面濃度のアルブミンを有する生体材料は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン又は免疫グロブリンといったようなその他の血清タンパク質を高い濃度で有するものと比べて、フィブリンカスケード及び血小板付着を開始させる確率が低いことが示されてきた。しかしながら、数多くの重合体材料上で、フィブリノーゲンは往々にしてタンパク質混合物又は血漿から吸着された卓越したタンパク質である。これらの理由から、研究者らは、アルプミンを材料上に固定化させるか又は血液から内因性アルブミンの結合を増強させることになる生体材料表面を設計し、かくしてフィブリノーゲンの吸着及びそれに続く血栓形成現象を軽減するよう試みてきた。
【０００６】
この点に関し、これまでに一定数の異なるアプローチが用いられてきた。これらのアプローチには、表面に対するアルブミンの受動的吸着又は共有結合による固定化及び循環血からの内因性アルブミンと選択的に結合するように設計された表面の開発が含まれ、後者ではアルキル鎖修飾された材料及びその他の手段が使用される。
【０００７】
Munro, et al., の米国特許第４，５３０，９７４号は、血清アルブミンが選択的に結合することになる非イオン疎水性脂肪族鎖を表面に共有結合させることによりポリウレタンといったような非水溶性重合体にアルブミンを吸着させる方法を開示している。
Frautschi et al., の米国特許第５，０１７，６７０号及び米国特許第５，０９８，９７７号は、アルブミンの結合を増大させるため、芳香族環及び隣接する二次ヒドロキシルを伴う環状構造を含有する、非水溶性重合体に対して１２〜２２個の炭素原子の脂肪族拡張を共有結合により付着させるための方法を教示している。
【０００８】
Eaton の米国特許第５,０７３,１７１号は、装置が、アルブミンを含有する生理的流体と接触した時点で装置上に内因性アルブミンのコーティングを形成するのに有効な量のアルブミン結合用染料を組込む生体適合性ある補てつ装置について記述している。
これらのさまざまな戦略の一部又は全ては、血液と接触する材料表面に対する内因性アルブミンの結合を増大させ、その代りにフィブリノーゲンの結合を減少させるために使用することができるものの、これらのアプローチは各々単数又は複数の点で制限を受けている。アルキル鎖改質された表面は、アルブミンの結合を増大させフィブリノーゲンの結合を減少させることが示されてきた。これらの効果は、例えば短時間の時間的枠組（一般には１時間未満）までかなり制限されていた。さらに、上述のその他のさまざまな表面改質方法が、狭い範囲の基質材料のみについて有用である。
【０００９】
もう１つの主題について、この出願の譲受人は、生物活性基を直接的又は間接的に表面に共有結合させることによって表面に生物活性基を付着させる能力を開発した。例えば、米国特許第４，７２２，９０６号、４，９７９，９５９号、４，９７３，４９３号及び５，２６３，９９２号は、光反応性基及び化学的リンキング成分を介して生体材料表面に共有結合された生体適合性作用物質を有する装置に関する。米国特許第５，２５８，０４１号及び５，２１７，４９２号は、長鎖化学スペーサの使用を通した表面に対する生体分子の付着に関する。米国特許第５，００２，５８２号及び５，５１２，３２９号は、所望の特性を提供する重合体作用物質が、光反応性半分を介して表面に共有結合されている、重合体表面の前処理及び使用に関する。特に、重合体自体は、所望の特徴を示し、好ましい実施形態では、実質的にその他の（例えば生物活性）基を含まない。
【００１０】
長時間使用するために適切に安定した要領で、特にアルブミンが経時的に又は使用中に補給され得るような要領で生体材料表面に対しアルブミンを付着させることができることがきわめて望ましいと思われる。
発明の要約
本発明は、生体材料表面を不動態化するのに使用するための新しい試薬において、各基の望ましい機能を保つような形で脂肪族系酸に対して潜在的反応性基をリンクするスペーサ基と組合わせた形で、潜在的反応性基と２官能性脂肪族系酸を含む試薬を提供している。この試薬は、表面に対し試薬を共有結合させるために表面の存在下で潜在的反応性基を活性化させることによって表面を不動態化させるのに使用することができる。ひとたび表面に結合された時点で、試薬は、アルブミンを保持し配向するのに充分な要領で（例えば濃度及び配向） in vivoで生理学的環境に対し脂肪族系酸を提示する。好ましくは、経時的に、試薬表面は、結合解除又は劣化した状態となったアルブミン分子を新しいアルブミン分子と置換させることによって、自ら補給することができる。アルブミン（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））は、脂肪酸結合部位を含有する天然に発生するあらゆるタンパク様の半分として定義される。
【００１１】
好ましい実施形態においては、試薬は、（Ｘ）m−Ｙ−（Ｚ）nといった一般化学式を有し、この式中各々本書に記述されているようにＸは潜在的反応性（例えば光反応性）基であり、Ｙはスペーサラジカルであり、Ｚは２官能性脂肪族系酸である。ｍ及びｎの値は１以上であり、ｍはｎと等しいものであってもよいが、それが必ず必要というわけではない。脂肪族系酸は、それが脂肪族領域とアニオン（例えばカルボン酸）領域の両方を提供するという点で「２官能性」である。ひとたび表面に付着させられた時点で、これらの部分は、表面を不動態化するためアルブミンのひきつけ及び結合プロセスにおいて共働する。
【００１２】
ｍはｎの両方が１に等しい好ましい実施形態においては、試薬は、ヘテロ２官能性試薬と呼ばれる。脂肪族系酸は好ましくは、脂肪族又はアニオン部分のいずれの機能にも不利な影響を及ぼさない形で、２価のスペーサ基を用いて潜在的反応性基に付着される。ここでも又それぞれの基の機能に不利な影響を及ぼさないような形で、多数の脂肪族系酸及び潜在的反応性基の付着を可能にするさらに高い価のスペーサ基を選択することもできる。この場合、ｍは必ずしもｎに等しくなく、両方共１以上である。
【００１３】
さらなる実施形態においては、スペーサ基は、脂肪族系酸及び潜在的反応性基の共有結合形付着を可能にする主鎖に沿った多数の部位を有する多価の重合体でありうる。これらの基は、従来の化学的カップリング技術を用いて予め形成された反応性重合体に付着され得、そうでなければ適切な置換された単量体を用いることにより重合プロセス中に取込まれてもよい。この実施形態においては、ｍはｎと必ずしも等しくなく、標準的には両方共１より大きい。
【００１４】
本発明はさらに、不動態化用試薬を調製するための方法ならびに、合成又は天然の生体材料の表面を不動態化するためにこの試薬を使用する方法をも提供する。さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、その不動態化用試薬でコーティングされた表面、そして次にかかる試薬でコーティングされた又はコーティング可能な表面を提供する材料から製造される製品をも提供する。さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、それに付着された状態の試薬及び結合された試薬に対しひきつけられ付着されたアルブミンを有する不動態化された生体材料表面を提供する。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、表面改質試薬を使用することにより、増強すべき表面に対するアルブミンの結合を可能にする。試薬は、表面のアルブミンをひきつけ結合する能力を改善するような量及び配向で、表面に対し付着させられる能力をもつ。理論により束縛されるつもりはいが、本発明の試薬を支持する表面は、アルブミンとの（アルキル鎖の）疎水性相互作用及び（アニオン成分の）イオン相互作用の両方のため、改善されたアルブミン結合を示す。疎水性相互作用は、遊離アルブミン分子を保持し配向するのに役立ち、一方イオン相互作用は、イオン引力の付加によりアルブミン分子を所定の位置に維持するのに役立つ。特に好ましい実施形態においては、２官能性脂肪族系酸は、２官能性酸類似体の脂肪族及びイオンの両方の領域を、生体材料表面から空間的に離れるように配向させかくして、未変性アルブミンとのより優れた結合を誘発することができるようにするため、アルカン、オキシアルカン又は疎水性重合体主鎖のいずれかに付着させられる。一方試薬は、さまざまな医療品材料を用いてそして特に血液と接触する医療装置内で使用するためにアルブミン結合表面を作り上げることを可能にする。
【００１６】
２官能性脂肪族系酸
本発明の２官能性脂肪族系酸（「Ｚ」基）は、脂肪族部分とアニオン部分の両方を内含する。本書で使用されているとおりの「脂肪族（aliphatic）」という語は、アルブミンと疎水性相互作用を形成する能力をもつ、例えば炭化水素主鎖といった実質的に線状の部分のことを意味する。一方、「アニオンの」という語は、アルブミン分子とのさらなるイオン相互作用を形成する能力をもつ帯電した部分を意味する。本発明の試薬を使用することより、これらの部分は、血液及びその他の体液から未変性アルブミンをひきつけ結合するため、その所望の機能を保持するような形で、表面に対し共有結合により付着され得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明は、多数の光活性化可能脂肪酸官能基をもつ重合体を含めた脂肪酸官能基をもつ光活性化可能分子ならびにヘテロ２官能性分子を内含する。多数の側基脂肪酸類似体及び多数の光側基を含有する光活性化可能ポリアクリルアミド共重合体が脂肪酸類似体を含むアクリルアミド、ベンゾフェノン置換アクリルアミド及びＮ置換アクリルアミド分子から合成された。光活性化可能ポリビニルピロリドンも同様に、類似の要領で調製された。単一の終点光基及び多数の側基脂肪酸類似体を伴うポリアクリルアミド又はポリビニルピロリドンの共重合体も同じく合成された。最後に、スペーサにより作動的に分類された一方の端部のベンゾフェノンと他方の端部の脂肪酸基をもつ光活性化可能ヘテロ２官能性分子が作られ、ここで、このスペーサは、疎水性アルキル鎖又はより親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖でありうる。
【００１８】
スペーサ基
本発明のヘテロ２官能性試薬を調製する上で使用するための適切なスペーサ（「Ｙ」基）には、その両方を意図された目的のために使用することを可能にするような要領で脂肪族系酸に対して潜在的反応性基を共有結合することのできる何らかの２又はそれ以上の官能性のスペーサが含まれる。スペーサはそれ自体望ましい化学的及び／又は物理的機能を提供することができるものの、好ましくはスペーサは、その意図された目的のために脂肪族及びイオン部分を使用することに不利な影響を及ぼさないという点において、非妨害性のものである。本発明の重合体試薬の場合、スペーサ基は、重合体の主鎖に対し脂肪酸を付着するのに役立つ。
【００１９】
スペーサは脂肪族又は重合体のいずれであってもよく、炭素に代ってＯ，Ｎ及びＳといったさまざまなヘテロ原子を含むことができる。スペーサを構成する原子は、線形に整列される必要はない。例えば、水素原子の引抜きを介して共有結合の形成を開始させることによって潜在的反応性基が機能するような試薬におけるスペーサ設計の一部分として、（以下で定義するような）、引抜き可能な水素原子が欠如した芳香族環を内含させることもできる。その前駆体形態（すなわち光反応性基及び脂肪族系酸の付着の前の形態）において、スペーサは、例えば従来のカップリング化学といった適切な化学反応により光反応性基及び脂肪族系酸を付着させる上で使用するのに適しているヒドロキシル、アミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基といった任意の適切な官能性で終結され得る。
【００２０】
代替的には、光反応性基を含有する（又は付着する能力をもつ）前駆体を脂肪族系酸を含有する（又は付着する能力をもつ）もう１つの前駆体と組合わせる間に、スペーサを形成することもできる。例えば、光基を含有するカルボン酸とカップリングされうる、２官能性の脂肪族系酸の脂肪族アミン誘導体を提供するべく、脂肪族系酸を脂肪族ジアミンと反応させることができる。当業者にとっては、Ｏ，Ｎ，又はＳを含有する任意の適切な求核基と反応することになる任意の熱化学基に対して光基を付着させることができるということは明白であろう。
【００２１】
適切なスペーサ基の例としては、２官能性の脂肪族脂肪酸、及び光活性化可能基に対するリンキング官能基としてのアミド、エーテル及び炭酸エステルをもち、置換された又は未置換のアルキレン、オキシアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、オキシアリーレン又はアラルキレン基から成る基が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００２２】
本発明のスペーサは同様に、主鎖として役立つ重合体を含むこともできる。重合体主鎖は、合成であっても天然に発生するものであってもよく、好ましくは、付加又は縮合重合の結果得られる、低重合体、単独重合体及び共重合体から成るグループの中から選択される合成重合体である。多糖といった天然に発生する重合体も同様に使用可能である。好ましい主鎖は、記述された要領でのその使用と一貫性のない又はその使用に不利である生物学的機能を提供しないという点において、生物学的に不活性である。
【００２３】
かかる重合体主鎖は、ヒドロキシエチル・アクリレート、ヒドロキシエチル・メタクリレート、グリセリル・アクリレート、グリセリル・メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド及びメタクリルアミドから重合されたものといったアクリル系誘導体；ポリビニルピロリドン及びポリビニル・アルコールといったようなビニル系誘導体；ポリカプロラクタムといったナイロン系誘導体；ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレン・アジパミド及びポリヘキサメチレン・ドデカンジアミド及びポリウレタンの誘導体；酸化ポリエチレン、酸化ポリプロピレン及び酸化ポリブチレンといったようなポリエーテル及びポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリ無水物、及びポリオルトエステルといったような生分解性重合体を内含することができる。
【００２４】
重合体主鎖は、単数又は複数の光反応性基及び単数又は複数の脂肪酸官能基を支持する能力をもつ主鎖を提供するように選択される。重合体主鎖は同様に、表面とさまざまな光反応性基及び脂肪酸官能基の間のスペーサを提供するように選択される。この要領で、試薬は、最適な活性を示すのに充分な運動自由度をもつ脂肪酸官能基を提供するべく、表面又は隣接する試薬分子に結合され得る。重合体主鎖は好ましくは、水溶性があり、ポリアクリルアミド及びポリビニルピロリドンが特に好ましい重合体である。
【００２５】
光反応性基
好ましい一実施形態においては、中央のＹスペーサラジカルに付着されたＸ基により、単数又は複数の光反応性基が提供されている。適当な光源に露呈された時点で、光反応性基の各々は、活性化を受ける。ここで使用される「光反応性基（photoreactive group）」という語は、隣接する化学構造（例えば脂肪族炭素−水素結合）に対する共有結合を結果としてもたらす活性種の生成を受けるべく適用された外部エネルギー源に応答する化学基のことを意味する。
【００２６】
好ましいＸ基は、それがかかる特性を保持する条件下で保管されるのに充分安定なものである。例えば、参考として本書にその開示が内含されている米国特許第５，００２，５８２号を参照のこと。電磁スペクトルのさまざまな部分に対する応答性をもつ潜在的反応性基を選択することができ、スペクトルの紫外線及び可視部分に応答するもの（ここでは「光反応性」と呼ぶ）が特に好ましい。
【００２７】
アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン及びアントロン様の複素環（すなわち１０の位置にＮ，Ｏ又はＳをもつものといったアントロンの複素環類似体）又はそれらの置換された（例えば環置換された）誘導体といったような、光反応性アリルケトンが好ましい。かかるケトンの官能基は、それらが本書に記述されている活性化／不活性化／再活性化サイクルを受ける能力を容易に有することから好まれている。ベンゾフェノンは、三重項状態への系内交差を受ける励起された一重項状態の初期形成を伴った光化学励起の能力をもつことから、特に好ましい光反応性基である。励起された三重項状態は、（例えば、作用物質の結合近位内及び溶液内の標的分子又は支持体表面からの）水素原子の引抜きにより炭素−水素結合内に挿入することができ、かくしてラジカル対を作り上げる。その後のラジカル対の崩壊は、新しい炭素−炭素結合の形成を導く。結合のため反応性結合（例えば炭素−水素）が利用可能でない場合には、ベンゾフェノン基の紫外線誘発された励起は可逆的であり、分子はエネルギー源の除去の時点で基底状態エネルギーレベルまで戻る。従って、光反応性アリール・ケトンが特に好ましい。
【００２８】
アジ化物は、好ましいクラスの潜在的反応性基を構成し、アジ化フェニル特に４−フルオロ−３−ニトロフェニル・アジドといったようなアジ化アリール（Ｃ6Ｒ5Ｎ3）、アジド蟻酸エチル、アジド蟻酸フェニルといったようなアジ化アシル（−ＣＯ−Ｎ3）、アジ化ベンゼンスルフォニルといったアジ化スルフォニル（−ＳＯ2−Ｎ3）、及びアジ化ジフェニルスルフォリル及びアジ化ジエチルホスホリルといったようなアジ化ホスホリル（ＲＯ）2ＰＯＮ3を含む。ジアゾ化合物は、もう１つのクラスの光反応性基を構成し、ジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタンといったようなジアゾアルカン（−ＣＨＮ2），ジアゾアセトフェノン及び１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノンといったようなジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2）、ｔ−ブチルアルファジアゾアセトアセテートといったようなジアゾアセテート（−ＣＯ−ＣＮ2−ＣＯ−Ｏ−）を含む。その他の光反応性基には、アゾビスイソブチロニトリルといったような脂肪族アゾ化合物、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリンといったようなジアジリン（−ＣＨＮ2）及びケテン及びジフェニルケテンといったようなケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）が含まれる。
【００２９】
光反応性基の活性化時点で、コーティング接着性分子は、互いに及び／又は材料表面に対して、光反応性基の残基を通しての共有結合によって共有結合される。光反応性基及び活性化時点でのそれらの残基の例は、以下のとおりである。
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試薬の調製
本発明の試薬は、ヘテロ２官能性試薬又は重合体試薬のいずれかの選択に基づき適切なあらゆる手段により調製可能である。ヘテロ２官能性試薬の場合、脂肪酸残基は、カルボン酸官能性を保存しながら脂肪酸に対するヘテロ２官能性分子の残余分の共有結合カップリングを可能にするアルキル鎖上の化学的反応性基を有する脂肪酸によって提供される。好ましくは、反応性基の部位は、疎水性アルキル鎖の結合活性に対する効果を最小限におさえるべくカルボン酸基のすぐ近くにある。最も好ましくは、脂肪酸残基は、ｎ−テトラデシルコハク酸無水物（ＴＤＳＡ）といった化合物により提供され得る。第１アミンといったような求核性種を有する第２の分子とかかる分子の反応は、無水物環の開放を結果としてもたらし、分子の残余に対するアミドリンケージを伴う脂肪酸を提供する。この反応は、無水物環開放の方向に応じて一対の領域異性体を生成する。この反応における第２の分子は、脂肪酸化合物との反応能力をもつ基を有する光活性化可能基を伴うか又は伴なわないスペーサ基により提供されうる。最も好ましくは、このスペーサ基は、無水物種との高度の反応性をもつアミンを有する。スペーサ基は、標準的に、脂肪酸誘導体との反応に先立ち付着された光活性化可能基をもち得る２官能性分子であり、そうでなければ、逆の反応順序を使用することができる。２官能性スペーサは、ヘテロ２官能性又はホモ２官能性のいずれであってもよく、前者は、第１及び第２の反応段階において異なる反応性を必要とし、後者は第１の反応の後に、１官能性にされたスペーサを分離する効率の良い方法を必要とする。任意には、いかなるスペーサも必要とされず脂肪酸誘導体と反応する能力をもつ官能性を有する光活性化可能基を使用することが可能である。以上の例は制限的意味をもつものではなく、これらのカップリング反応を達成する方法は、当業者にとって明らかである。
【００３０】
本発明の重合体試薬は、脂肪酸誘導体及び光活性化可能基との反応能力をもつ重合体の主鎖に沿って反応性基を有する予備成形された重合体の誘導体化によって調製可能である。例えば、スペーサ基を伴う又は伴わない主鎖に沿ったアミノ基で官能化されたポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン又はシロキサンを４−ベンゾイルベンゾイル塩化物（ＢＢＡ−Ｃｌ）及びＴＤＳＡと反応させて、光活性化可能リガンド及び脂肪酸リガンドをそれぞれ提供することができる。代替的には、光活性化可能基及び脂肪酸基を、その後自ら及びその他の単量体と共重合されて本発明の重合体を提供することのできる重合化可能な単量体の形で調製することが可能である。本発明のさらなる実施形態においては、重合体鎖の終りで光活性化可能基をもつ重合体を提供するべく脂肪酸単量体及びその他のコモノマーと共に連鎖移動剤の形で光活性化可能基を導入することができる。例えば、光活性化可能基としての２つの誘導体化されたベンゾフェノン及び連鎖移動剤としてのメルカプタンを有する連鎖移動剤を用いて、脂肪酸単量体及びアクリルアミド又はＮ−ビニルピロリドン単量体を共重合させ本発明の重合体を得ることが可能である。代替的には、この重合体を主鎖に沿った反応性基を用いて調製でき、後には脂肪酸誘導体との反応が続く。
【００３１】
付着の表面と方法
本発明の試薬は、任意の適切な表面を改質するために使用することができる。潜在的反応性基が好ましいタイプの光反応性基である場合、表面が活性化された基との共有結合に適した引抜き可能な水素原子を提供することが特に好まれる。
ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ塩化（ビニル）といった塩素含有重合体、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノエポキシ樹脂、ポリエステル、シリコーン樹脂、セルロース系プラスチック、及びゴム状プラスチックといったようなプラスチックが全て支持体として使用可能であり、本書で記述されているように改質可能な表面を提供する。一般に、本書に参考としてその開示が内含されている Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, ed., John Wiley and Sons, １９９０中、ｐ４６２−４６４の「プラスチック」を参照されたい。さらにガラス、セラミクス又は金属のシリル化された表面及び熱分解炭素で形成されたものといったような支持体が、表面改質に適している。
【００３２】
表面に対する試薬結合のためには任意の適切な技術を使用することができ、かかる技術は、各々の材料、プロセス又は装置について選択し最適化することができる。脂肪酸結合試薬の溶液の噴霧、浸漬被覆又はブラシコーティングにより上述のとおりの材料表面を清浄するために、試薬をうまく応用することができる。表面は照明に先立ち空気乾燥させることができ、又コーティング溶液内に浸しながら照明することもできる。光反応性基は遊離活性種の生成を介して、もう１つのポリ２官能性試薬分子又は生体材料表面のいずれかと試薬の間に共有結合を形成するべく、外部刺激（例えば適切な光源に対する露呈）を介して付勢される。このコーティング方法は、ここでは「１段階コーティング方法」と呼ぶが、これは、光反応性カップリング化学が、本発明の重合体を生体表面に付着させ、生物活性基を付加するのにその後の段階が全く必要とされないからである。利用される外部刺激は望ましくは、電磁放射線であり、好ましくは電磁スペクトルの紫外、可視又は赤外領域内の放射線である。
【００３３】
「２段階」方法には、表面に対し炭化水素主鎖を光カップリングする第１段階とそれに続く、固定化された主鎖に対して単数又は複数の脂肪酸を付着（例えば熱化学的）させる第２の段階が関与する。例えば、この２段階アプローチには、熱化学的に脂肪酸誘導体を表面にカップリングするのに使用できる求核基を含む光反応性炭化水素主鎖を共有結合で付着させること又は、表面に対し熱化学基（例えばアミン）を直接付着させることとそれに続いて、単数又は複数の脂肪酸誘導体を熱化学的に付着させることが関与している。
【００３４】
代替的には、光化学によるものでないさまざまな方法により、化学的に反応性ある基を表面上に導入し、その後、改質された表面に対する脂肪酸基の化学的カップリングを行なうことができる。例えば、メタン及びアンモニアの混合物でのプラズマ処理により表面上にアミン基を導入することができ、その後、アミドリンケージを通して表面に脂肪酸誘導体を化学的にカップリングするためＴＤＳＡを用いて結果としてのアミンに到達することができる。望まれる場合には、本発明の試薬を用いた表面改質のためにその他のアプローチを使用することもできる。このアプローチは、本発明の試薬を用いて表面改質のために使用可能である。このアプローチは、従来の化学を用いて支持体を改質することが困難であるような状況下で、又は表面上の標的分子のひときわ優れた持続性及び安定性を必要とする状態のために特に有用である。
【００３５】
例
本発明について次に、以下の化学式の表を内含する以下の制限的意味のない例を基準にしてさらに記述する。当業者にとっては、本発明の範囲から逸脱することなく記述された実施形態において数多くの変更を行なうことができるということは明白である。かくして、本発明の範囲は、本出願に記述された実施形態に制限されるべきではなく、クレームの文言で記述されている実施形態及びこれらの実施形態の等価物によってのみ制限されるべきである。相反する指示のないかぎり、全ての百分率は重量百分率である。
【００３６】
【化５】
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【００３７】
【化６】
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【００３８】
【化７】
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【００３９】
【化８】
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【００４０】
【化９】
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【００４１】
【化１０】
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【００４２】
【化１１】
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【００４３】
【化１２】
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【００４４】
【化１３】
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【００４５】
【化１４】
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【００４６】
【化１５】
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【００４７】
実施例１
４−ベンゾイルベンゾイル塩化物（ＢＢＡ−Ｃｌ）（化合物１）の調製
４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）、１.０kg（４.４２モル）を、還流凝縮器及び架空撹拌器が備わった乾燥した５リットル入りモートンフラスコに付加し、その後塩化チオニル６４５ml（８.８４モル）及びトルエン７２５mlを添加した。その後ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３.５mlを添加し、混合物を４時間還流にて加熱した。冷却後、減圧下で溶剤を除去し３×５００mlのトルエンを用いて３回の蒸発により残留塩化チオニルを除去した。生成物をトルエン／ヘキサン（１/４）から再結晶化し真空オーブン内での乾燥後、９８８ｇ（９１％の収量）を得た。生成物の融点は、９２〜９４℃であった。８０ＭHzでの核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。最終化合物は、例えば例１０及び２０に記述されているように、光活性化可能化合物の調製において使用するために保管した。
【００４８】
実施例２
４−ブロモメチルベンゾフェノン（ＢＭＢＰ）（化合物２）の調製
４−メチルベンゾフェノン、７５０ｇ（３.８２モル）を、架空撹拌器が備わった５リットル入りのモートンフラスコに添加し、２８５０mlのベンゼン中に溶解させた。次に溶液を還流まで加熱し、その後３３０mlのベンゼン中に臭素６１０ｇ（３.８２モル）を滴下により添加した。添加速度は、約１.５ml／分であり、反応を開始させるため９０ワット（９０ジュール／秒）のハロゲンスポットライトでフラスコを照明した。ランプと共にタイマーを用いて、１０％のデューティサイクル（５秒間オン、４０秒間オフ）とその後１時間以内に続く２０％のデューティサイクル（１０秒間オン、４０秒間オフ）を施した。添加が終了した時点で、ガスクロマトグラフィにより生成物を分析し、７１％の所望の４−ブロモメチルベンゾフェノン、８％のジブロモ生成物及び２０％の未反応４−メチルベンゾフェノンを含有することがわかった。冷却後、反応混合物を、水１００ml中の亜硫酸水素ナトリウム１０ｇで洗浄し、その後３×２００mlの水で洗浄した。生成物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、トルエン／ヘキサン（体積比（ｖ/ｖ）１/３）から２回再結晶化させた。真空下での乾燥の後、６３５ｇのＢＭＢＰを分離し、１１２〜１１４℃の融点をもつ６０％の収量を得た。
【００４９】
ＮＭＲ分光計上の分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。最終化合物は、例えば例３，７，８，９，１５及び２１内で記述されているように、光活性化可能化合物の調製において使用するために保管した。
実施例３
ポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物３）の調製
ポリ（エチレングリコール）200（ＰＥＧ）７２.７２ｇ（０.３６３モル）を２時間２００mlのトルエンと共沸させて、水分を除去し、その後真空下で過剰のトルエンを除去した。次に、４℃でアルゴン下で撹拌しながら無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４００mlの中にＰＥＧ残基を溶解させた。鉱油（７２.５mmol）中の６０％混合物の水素ナトリウム２.９０ｇを、複数の分量に分けて添加し、室温で１時間、混合物を撹拌した。例２に記述された一般的方法に従って調製したＢＭＢＰ，２０.０ｇ（７２.７mmol）を、２時間にわたりＴＨＦ１００ml中の溶液として添加し、混合物を１６時間アルゴン下の室温で撹拌した。反応を塩化アンモニウム水（水２００ml中３６ｇ）で急冷し、真空下で有機溶剤を除去した。残渣を塩水中に溶解させ、クロロホルムで抽出し、結果として得た有機抽出物を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルム溶液をジエチルエーテルに添加することによって粘性油として生成物を分離し、所望の生成物２７.６４ｇの沈殿を結果として得た。生成物は、付加的な精製なく使用された。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００５０】
実施例４
ポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテルモノメタンスルフォネート（化合物４）の調製
例３に記述されている一般的方法に従って調製された化合物３、３.０ｇ（７.６１mmol）を、２５mlの塩化メチレン中に溶解させ、その後トリエチルアミン（ＴＥＡ）１.５ｇ（１４.８mmol）を添加した。混合物をアルゴン下の氷浴上で冷却し、塩化メタンスルフォニル（ＭｓＣｌ）１.３ｇ（１１.３mmol）を１０分間にわたり滴下により添加した。反応温度を一晩大気温まで上昇させた。沈殿した塩をろ過によって除去し、溶剤を真空下で除去した。残渣をトルエン中で溶解させ、固体を除去するべくろ過し、その後真空下で蒸発を行ない生成物３.０１ｇを得た。この時点で生成物のさらなる精製は全く行なわなかった。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００５１】
実施例５
モノアミノポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物５）の調製
例４に記述した一般的方法に従って調製された化合物４、１７.９７ｇ（３８.０７mmol）を、壁厚の試験管内の無水ＴＨＦ１００ml中で溶解させ、その後、１００mlの濃縮水酸化アンモニウムを添加した。管を密閉し、２相混合物を１６時間６５℃で勢いよく撹拌した。溶剤を真空下で除去し、結果として得た残渣をクロロホルム中に溶解させた。シリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上に投入し、極性の比較的低い不純物が除去されるまでクロロホルム／アセトン／酢酸（６０／４０／１  ｖ/ｖ）で溶離させた。次に生成物をクロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）で溶離させた。ＵＶ，ニンヒドリン及びドラーゲンドルフ陽性であった分画をプールし、溶剤を真空下で除去して８.６３ｇの生成物を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００５２】
実施例６
モノ−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物）及びモノ−３−カルボキシヘプタデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物７）の調製
例５に記述した一般的方法に従って調製された化合物５、３.０３ｇ（７.７１mmol）を、塩化メチレン３０ml中で溶解させ、その後、固体としてＴＤＳＡ２.４０ｇ（８.１０mmol）を添加した。反応混合物をアルゴン下で室温にて１８時間撹拌した。溶剤を真空下で除去し、結果として得た油を、溶剤勾配すなわちエーテル／ヘキサン５００ml（７５／２５ ｖ/ｖ）；エーテル／ヘキサン／酢酸５００ml（７５／２５／１  ｖ/ｖ）；クロロホルム／アセトン／酢酸（６０／４０／１  ｖ/ｖ）及びクロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）を用いたシリカゲル閃光クロマトグラフィにより精製した。分画をプールし無水物環の環開放の結果得た領域異性体を表わす２つの別々のＵＶ及びドラーゲンドルフ陽性材料を得た。溶剤を蒸発させることによって、１つの分画中には１.３５ｇの生成物が、又第２の分画中は０.８９３ｇの生成物が得られた。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００５３】
実施例７
モノ−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミドテトラ（エチレングリコール）モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物８）及びモノ−３−カルボキシヘプタデカンアミドテトラ（エチレングリコール）モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物９）の調製
テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、７.０６３ｇ（３６.４mmol）を２００mlのトルエンと２時間共沸させて水分を除去し、その後真空下で余剰のトルエンを除去した。その後、ＴＥＧ残渣を、氷浴上でアルゴン下で撹拌しながら無水ＴＨＦ７０ml内で溶解させた。鉱油（３６.３mmol）中の６０％混合物の水素化ナトリウム１.４５ｇを添加し、室温で１時間、混合物を撹拌した。例２に記述された一般的方法に従って調製したＢＭＢＰ，５.０ｇ（１８.２mmol）を添加し混合物を１６時間アルゴン下の室温で撹拌した。反応を塩化アンモニウム水（水４０ml中９ｇ）で急冷し、真空下で有機溶剤を除去した。残渣を飽和塩水中に溶解させ、クロロホルムで抽出し、結果として得た有機抽出物を、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルム溶液をジエチルエーテルに添加することによって粘性油として生成物を分離した。粗製生成物７.６ｇは、付加的な精製無しで使用された。
【００５４】
以上からの生成物全体を、塩化メチレン２００mlに溶解させ、その後ＴＥＡ３.９６ｇ（３９.１mmol）を添加した。混合物をアルゴン下で４℃まで冷却し、ＭｓＣｌ  ３.３５ｇ（２９.２mmol）を添加した。６時間後に、ＴＥＡ及びＭｓＣｌを各々さらに１mlずつ添加し、完全な反応を保証するべく反応を１６時間撹拌させた。沈殿した塩をろ過により除去し、溶剤を真空下で除去した。トルエン中で残渣を溶解させ、ろ過して固体を除去し、その後、真空下での蒸発に付した。この時点で、生成物のさらなる精製は全く行なわなかった。
【００５５】
以上からのメシレート生成物全体を、壁厚の試験管内のＴＨＦ５０ml中で溶解させ、その後、５０mlの濃縮水酸化アンモニウムを添加した。管を密閉し、２相混合物を１６時間６５℃で勢いよく撹拌した。溶剤を真空下で除去し、結果として得た残渣をクロロホルム２０ml中に溶解させた。硫酸ナトリウム上での乾燥後、ジエルエーテルにクロロホルム溶液を添加することによって生成物を沈殿させ、褐色の粘性油約４.５ｇを結果として得た。生成物の一部分つまり約１ｇを、エーテル／ヘキサン／酢酸（７５／２５／１ ｖ/ｖ）とそれに続くクロロホルム／アセトン／酢酸（６０／４０／１  ｖ/ｖ）及びクロロホルム／エタノール／水／酢酸（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）という溶剤勾配を用いたシリカゲル閃光クロマトグラフィにより精製した。合計２２０mgの精製された生成物を分離した。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００５６】
以上からのアミン生成物；０．２２０ｇ（０．５６８mmol）、及びＴＥＡ、６３mg（０．６２３mmol）を、２０mlの塩化メチレン中に溶解させ、その後、０．１８５ｇ（０．６２５mmol）のＴＤＳＡを添加した。この反応混合物をアルゴン下、室温で４８時間撹拌した。この溶媒を、真空中で除去し、そして得られた油を、クロロホルム／メタノール／酢酸（８５／１５／１／１  ｖ／ｖ）を使用したシリカ・ゲル・フラッシュ・クロマトグラフィーにより精製した。適当な画分をプールし、蒸発させ、クロロホルム中に再溶解させ、そして硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒の蒸発は、上記無水物環の開環から生じた幾何異性体の混合物として２３４mgのワックス状固体を与えた。ＮＭＲスペクトルメーター上の分析は、所望の生成物に一致した。
【００５７】
実施例８
Ｎ〔２−（４−ベンゾイルベンジルオキシ）エチル〕−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物１０）及びＮ−〔２−（４−ベンゾイルベンジルオキシ）エチル〕−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物１１）の調製
無水エタノールアミン、１.００ｇ（１６.４mmol）をアルゴン下での撹拌に伴って５mlの無水ＴＨＦ中で溶解させた。６０％の鉱油分散の水素化ナトリウム０.６５５ｇ（１６.４mmol）を、固体として添加しさらに５mlの無水ＴＨＦを添加した。結果として得た混合物を４５分間室温で撹拌し、この時点でもはや水素の発生は見られなかった。例２に記述された一般的方法に従って調製したＢＭＢＰ，４５.０ｇ（１６.４mmol）を、３０分間にわたりＴＨＦ２５ml中の溶液として添加した。反応を一晩室温で撹拌した。反応を水で急冷させ、クロロホルムで生成物を抽出した。有機抽出物を０.１ＮのＨＣｌで洗浄し、水溶液をクロロホルムで一回洗浄した。次に水溶液を真空下で蒸発させ、クロロホルム中１０％のメタノール（ｖ/ｖ）中で溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤を蒸発させることにより、２.６２ｇの薄黄色の固体が得られ、これは、付加的な精製無しで使用された。
【００５８】
上述のアミン０.６２５ｇ（２.１４mmol）とＴＤＳＡ，０.４６７ｇ（１.５７mmol）を１０mlの塩化メチレンの中で溶解させ、その後、ＴＥＡ６６０μｌ（４.７４mmol）を添加した。反応を完了させるため１６時間、結果として得た溶液を室温で撹拌した。生成物を水で希釈し、５％のＨＣｌで処理し、その後有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤を真空下で除去し、生成物を、クロロホルムとその後につづくクロロホルム中の２.５％及び５％（ｖ/ｖ）のメタノールという溶剤勾配で、シリカゲル閃光クロマトグラフィを用いて精製した。該当する分画をプールし、無水物環の開放の結果得られた１対の領域異性体として３５７mgの生成物を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００５９】
実施例９
Ｎ〔１２−（ベンゾイルベンジルオキシ）ドデシル〕−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物１２）及びＮ−〔１２−（ベンゾイルベンジルオキシ）ドデシル〕−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物１３）の調製
１.１２−ドデカンジオール、５.０ｇ（２４.７mmol）を窒素下の乾燥フラスコ内で５０mlの無水ＴＨＦ中に溶解させた。鉱油（１２.４mmol）中の６０％分散の水素化ナトリウム０.４９４ｇを５分間にわたり複数の分量に分けて添加した。結果として得た混合物を１時間室温で撹拌した。例２に記述された一般的方法に従って調製したＢＭＢＰ，３.４０ｇ（１２.４mmol）を、ヨウ化ナトリウム（０.１８５ｇ，１.２３mmol）及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム臭化物（０.３９８ｇ，１.２３mmol）と共に固体として添加した。混合物を２４時間穏やかな還流にて撹拌した。その後反応を冷却し、水で急冷し、５％のＨＣｌで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶剤を真空下で除去した。生成物を、非極性不純物を溶離するためクロロホルムを用いてシリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上で精製し、その後ひきつづき生成物をクロロホルム／酢酸エチル（８０／２０  ｖ/ｖ）で溶離させた。該当する分画をプールし溶剤を蒸発させることによって３.４２ｇの生成物つまり７０％の収率が得られた。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６０】
上述のアルコール１.３０ｇ（３.２８mmol）を１３mlの無水塩化メチレン中で溶解させ、その後０.８２９ｇ（８.１９mol）のＴＦＡ及びアルゴン下での氷浴上での冷却が続いた。ＭｓＣｌ ０.５６３ｇ（４.９１mmol）を５分間にわたり滴下により添加し、その後１６時間室温で撹拌を行なった。反応を水で希釈し、５％のＨＣｌで酸性化させ、クロロホルムで抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて黄色油を１.５６ｇ得た。この生成物は、さらなる精製なく使用された。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６１】
上述のメシレート、１.５６ｇ（３.２８mmol）を、壁厚の試験管内でＴＨＦ２５ml中で溶解させ、その後、２５mlの水酸化アンモニウムを添加した。管を密閉し、混合物を７２時間８０℃で勢いよく撹拌した。混合物を２００mlの水で処理し、生成物クロロホルムで抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、生成物をシリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上で精製した。比較的低い極性の不純物が除去されるまでカラムをクロロホルム及びクロロホルム／メタノール（９５／５  ｖ/ｖ）で溶離し、その後クロロホルム／メタノール／水酸化アンモニウム（７０／２５／５ ｖ/ｖ）を用いて所望の生成物を溶離した。ニンヒドリンをＵＶ活性分画をプールし溶剤を蒸発させることにより、０.５２６ｇの生成物つまり４０％の収率を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６２】
上述のアミン、０.４４０ｇ（１.１１mmol）を塩化メチレン７ml中で溶解させ、その後０.３２９ｇ（１.１１mmol）のＴＤＳＡ及び０.３３７ｇ（３.３３mmol）のＴＥＡが続いた。結果として得た混合物を３６時間室温で撹拌した。次に反応を水で希釈させ、５％のＨＣｌで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発後の残渣をシリカゲル閃光クロマトグラフィ上で精製した。クロロホルム、クロロホルム中の２.５％のメタノール（ｖ/ｖ）及びクロロホルム中の５％のメタノール（ｖ/ｖ）という溶剤の勾配を用いて生成物を溶離した。合計で３７８mgの生成物を、無水物環の開放の結果得た領域異性体の部分的に分解した対として分離した。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６３】
実施例１０
Ｎ−〔３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル〕−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物１４）及びＮ−〔３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル〕−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物１５）の調製
１，３−ジアミノプロパン、１.９１０kg（２５.７７mmol）を、１２リットル入りモートンフラスコ２中に入れ、１０００mlの塩化メチレンで希釈した。氷浴上で１０℃未満まで冷却した後、塩化メチレン２５０ml中のｔ−ブチルフェニルカーボネート１.００５kg（５.１７５mol）溶液を、つねに温度を１５℃未満に保ちながらジアミンに対しゆっくりと添加した。添加がひとたび完了した時点で、混合物を、２時間室温まで暖め、反応完了させた。反応をさらに９００mlの塩化メチレンで希釈し、続いて５００ｇの氷を添加し、２.２ＮのＮａＯＨ、２５００mlをゆっくりと添加した。有機層を分離し、塩基性水溶液を３×１２５０mlの塩化メチレンで抽出し、各抽出物を別々に保った。これらの別々の抽出物を、最初の抽出物から始め最後のものまで続行して、０.６ＮのＮａＯＨ １２５０mlを用いて連続的に洗浄した。この洗浄手順を反復し、有機抽出物を組合せ、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤を蒸発させることにより、９２％の収率として８２５ｇの生成物が得られた。この生成物は、さらなる精製無しで使用された。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６４】
上述のアミン０.７７４ｇ（４.４４mmol）を２０mlの無水塩化メチレンで希釈させ、その後ＴＥＡを１.２４ｇ（１２.３mmol）加え、例１に記述されている一般的方法に従って調製されたＢＢＡ−Ｃｌ １.０ｇ（４.０９mmol）を含有する無水塩化メチレン１０mlを滴下により添加した。室温で１.５時間撹拌した後、反応を水で希釈し、１ＮのＨＣｌで酸性化した。生成物をクロロホルムで抽出し、有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルム／メタノール（９０／１０ ｖ/ｖ）を使用したシリカゲル閃光クロマトグラフィにより、溶剤残渣に起因して理論上よりもわずかに多い１.６８ｇの生成物が得られた。
【００６５】
上述の生成物１.５ｇ（３.９５mmol）を、窒素雰囲気下で１０mlのトリフルオロ酢酸中に溶解させた。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）保護基を除去するべく室温で３時間撹拌した後、減圧下で溶剤を除去し、生成物をシリカゲル閃光クロマトグラフィを用いて精製した。クロロホルム／メタノール（９０／１０ ｖ/ｖ）で極性の比較的低い不純物を除去した後、所望の生成物を分離するため、溶離用溶剤をクロロホルム／メタノール／水酸化アンモニウム（７０／２５／５  ｖ/ｖ）に切換えた。該当する分画をプールし、溶剤を蒸発させることにより、１.７７ｇの生成物が得られた。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６６】
上述のアミン生成物の一部分つまり０.５００ｇ（１.７７mmol）を、アルゴン雰囲気下で無水塩化メチレン１０ml中に溶解させた。ＴＥＡ０.１９７ｇ（１.９５mmol）を添加し、ひきつづき０.５７７ｇ（１.９５mmol）のＴＤＳＡを添加した。反応を室温で４時間撹拌した。混合物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出し、有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤を真空除去した後、生成物を、クロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）系を用いてシリカゲル閃光クロマトグラフィによって精製した。クロロホルム（ｖ/ｖ）系中の０→５％のメタノールを用いた反復クロマトグラフィにより、さらに純粋な生成物が得られた。無水物環の開放の結果として得た領域異性体対として、合計０.２５９ｇの生成物（２５％の収率）を分離した。ＮＭＲ分光計上での分析は、所望の生成物と一貫性あるものであった。
【００６７】
実施例１１
Ｎ−（３−ベンゾイルフェニル）−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物１６）及びＮ−（３−ベンゾイルベフェニル）−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物１７）の調製
３−アミノベンゾフェニン、０.５００ｇ（２.５３mmol）を、ＴＥＡ０.５１２ｇ（５.０６mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン０.０３０ｇ（０.２５mmol）と共に乾燥ＤＭＦ５.０ml中に溶解させた。アルゴン下で撹拌しながら、ＴＤＳＡ０.８２６ｇ（２.７９mmol）を添加し、結果として得た溶液を一晩４５℃で撹拌した。反応を水で希釈し、所望の生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上での乾燥後、溶剤を除去し、生成物をシリカゲル閃光クロマトグラフィ上で精製した。極性が比較的低い不純物をクロロホルムで溶離させ、生成物をクロロホルム（ｖ/ｖ）中の２.５→５.０％のメタノールの勾配で溶離した。無水物環系の関数の結果得られた２つの領域異性体の部分的分解を用いて、合計１.０４８ｇの生成物を分離した。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００６８】
実施例１２
Ｎ−（４−ベンゾイルフェニル）−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物１８）及びＮ−（４−ベンゾイルフェニル）−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物１９）の調製
４−アミノベンゾフェノン、０.５００ｇ（２.５３mmol）を、ＴＥＡ０.５１２ｇ（５.０６mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン０.０３０ｇ（０.２５mmol）と共に乾燥ＤＭＦ７.０ml中に溶解させた。アルゴン下で撹拌しながら、ＴＤＳＡ０.８２６ｇ（２.７９mmol）を添加し、結果として得た溶液を８０時間５５℃で撹拌した。この時点で、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、極性が比較的低いＵＶ活性生成物への部分的変換を明らかにした。反応を水で希釈し、所望の生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上での乾燥後、溶剤を除去し、生成物をシリカゲル閃光クロマトグラフィ上で精製した。極性が比較的低い不純物をクロロホルムで溶離させ、生成物をクロロホルム（ｖ/ｖ）中の２.５→５.０％のメタノールの勾配で溶離した。無水物環系の開放の結果得られた２つの領域異性体の部分的分解を用いて、合計０.７５３ｇの生成物を分離した。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００６９】
実施例１３
モノヘキサデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２０）の調製
例５に記述された一般的方法に従って調製された化合物５、０.９１４ｇ（２.３２mmol）を、アルゴン下で撹拌しながら無水クロロホルム１０ml中で溶解させた。ＴＥＡ０.５１６ｇ（５.１０mmol）を添加し、その後０.７０１ｇ（２.５５mmol）の塩化パルミトイルをゆっくりと滴下して加えた。結果として得た混合物を一晩室温で撹拌した。反応を水で希釈し、生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上での乾燥の後、溶剤を真空下で除去し、生成物をシリカゲルクロマトグラフィにより精製した。生成物を溶離するのにクロロホルム／メタノール（９５/５）溶剤を使用し、３８２mgの粘性油を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７０】
実施例１４
モノ−３−カルボキシプロパンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２１）の調製
例５に記述された一般的方法に従って調製された化合物５、０.５００ｇ（１.２７mmol）を０.１４ｇ（１.４０mmol）の無水コハク酸と共に無水クロロホルム５ml中に溶解させた。溶解が完了した後、アルゴン下で撹拌しながらＴＥＡ０.１４１ｇ（１.３９mmol）を添加した。結果として得た混合物を２４時間室温で撹拌した。その後、溶剤を真空下で除去し、クロロホルム溶剤とそれに続くクロロホルム／メタノール（９５/５〜９０/１０ ｖ/ｖ）溶剤勾配を用いて、シリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上で生成物を精製した。該当する分画をプールし、溶剤を蒸発させることで、粘性油４４７mgが得られた。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７１】
実施例１５
ヘキサデシル４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２２）の調製
１−ヘキサデカノール５.０ｇ（２０.６mmol）を暖めながら無水ＴＨＦ１０ml中で溶解させ、その後鉱油中のＮａＨの６０％の分散を０.８４０ｇ（２１.０mmol）ゆっくりと加えた。水素の発生がひとたび完了した時点で、例２に記述された一般的方法に従って調製された６.３５ｇ（２３.１mmol）のＢＭＢＰを添加した。反応混合物を１時間アルゴン下で５０℃にて撹拌し、その後１６時間室温で撹拌した。この後、反応を水で急冷し、生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、溶剤を真空下で除去し、ヘキサン／エーテル（９０/１０）溶剤を用いてシリカゲル閃光クロマトグラフィにより残渣を精製した。該当する分画をプールし蒸発させて、８.０１ｇのろう質の固体つまり８８.９％の収率が得られた。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７２】
実施例１６
ポリ（エチレングリコール）200モノヘキサデシルモノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２３）の調製
例３に記述された一般的方法に従って調製された化合物３、１．００ｇ（２.５４mmol）をアルゴン雰囲気下で無水ＴＨＦ１０ml中に溶解させた鉱油中６０％の分散の水素化ナトリウム０.１１２ｇ（２.８０mmol）を、氷浴上で撹拌しながら、複数の分量に分けて添加した。混合物を室温で２０分撹拌し、その後０.７７６ｇ（２.５４mmol）の１−ブロモヘキサデカンを添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応を水で急冷し、生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上での乾燥及び溶剤の除去後、溶離剤としてクロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）を用いてシリカゲル閃光クロマトグラフィにより生成物を精製した。該当する分画をプールし、生成物１.３５７ｇ、つまり８６％の収率を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７３】
実施例１７
ポリ（エチレングリコール）200モノ−１５−カルボキシペンタデシルモノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２４）の調製
１０−ヒドロキシヘキサデカン酸、０.７８５ｇ（２.８８mmol）を、アルゴン下で乾燥フラスコ中の無水ＤＭＦ２０ml中に溶解させた。鉱油中の６０％分散の水素化ナトリウム、０.２６０ｇ（６.５mmol）を次に添加し、結果として得たスラリーを４時間６０℃で撹拌した。この後、例４で記述された一般的方法に従って調製された化合物４，１.２４ｇ（２.６２mmol）を、ＤＭＦ７ml中の溶液として添加した。結果として得たスラリーを７２時間室温で撹拌した。この後、反応を水で急冷し、生成物をクロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上での乾燥の後、生成物をシリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上で精製した。比較的極性の低い不純物が除去されるまでクロロホルム／メタノール（９５／５  ｖ/ｖ）でカラムを溶離し、その後クロロホルム／メタノール／酢酸／水（９０／１０／１／１  ｖ/ｖ）で生成物を溶離した。該当する分画をプールし、蒸発させて１.２４ｇの生成物、すなわち７４％の収率を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７４】
実施例１８
モノ−１５−カルボキシペンタデカンアミドポリ（エチレングリコール）200モノ−４−ベンゾイルベンジルエーテル（化合物２５）の調製
アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、無水ＤＭＦ５ml中にヘキサデカン二酸０.５００ｇ（１.７５mmol）を溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０.４４２ｇ（３.８４mmol）及びジシクロヘキシルカルボジイミド、１.４４ｇ（６.９８mmol）を添加し、室温で６時間混合物を撹拌した。結果として得た固体をろ過により除去し、ろ塊を１mlのＤＭＦで洗浄した。次に溶液を、例５に記述された一般的方法に従って調製され５mlのＤＭＦ及び０.３８９ｇ（３.８４mmol）のＴＥＡ中に溶解された化合物５、０.７４７ｇ（１.９０mmol）と反応させた。室温で２時間撹拌した後、ＴＬＣは、出発アミンの完全な消化を示した。生成物はクロロホルムを用いて極性の比較的低い不純物を溶離させること及び、クロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）溶剤を用いた所望の生成物の溶離によってシリカゲル閃光クロマトグラフィカラム上で精製した。適切な分画をプールし、蒸発させて１.３５６ｇの生成物を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７５】
実施例１９
Ｎ−〔３−メタクリルアミド）プロピル〕−２−（カルボキシメチル）ヘキサデカンアミド（化合物２６）及びＮ−〔３−メタクリルアミド）プロピル〕−３−カルボキシヘプタデカンアミド（化合物２７）の調製
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ−ＨＣｌ），６.０６４（３３.９mmol）を、ＴＥＡ１０.２４ｇ（１０１mmol）と共に無水塩化メチレン中に溶解した。ＴＤＳＡ，１０.０ｇ（３３.７mmol）を直ちに添加し、乾燥用管からの水分保護を伴って室温で４８時間撹拌した。この後、反応をＩＮのＨＣｌで酸性化し、クロロホルムで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルム／メタノール／酢酸／水（８５／１５／１／１  ｖ/ｖ）溶剤を用いてシリカゲルクロマトグラフィ上で生成物を精製した。該当する分画をプールし、１００ppm のフェノチアジンを添加し、減圧下で溶剤を除去して、無水物環の開放の結果得られる領域異性体対として１６.０ｇの生成物を得た。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７６】
実施例２０
Ｎ−〔３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル〕メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）（化合物２８）の調製
ＡＰＭＡ−ＨＣｌ、１２０.０ｇ（０.６７２mol）を、フェノチアジン２５mgと共に８００mlのクロロホルム中に懸濁させた。溶液を１０℃未満まで冷却し、次に例１に記述されている一般的方法に従って調製されたＢＢＡ−Ｃｌ １７２.５ｇ（０.７０５mol）を添加した。クロロホルム５０ml中のＴＥＡ１５０.３ｇ（１.４９moles)溶液を調製し、氷浴上で撹拌しながら１〜１.５時間にわたり上述の懸濁液に対し滴下により溶液を添加した。添加が完了した後、氷浴を除去し、反応を完了させるため２.５時間溶液を撹拌した。次に、０.３ＮのＨＣｌ ６００mlとそれに続いて０.０７ＮのＨＣｌ、２×３００mlで混合物を洗浄した。次にクロロホルム溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、トルエン／クロロホルム（４／１ ｖ/ｖ）混合物を用いて生成物を２回再結晶化させた。早すぎる重合を防ぐため、第２の再結晶化に先立ち、フェノチアジン２５mgを添加した。収率は、１４７〜１５１℃の融点で２１２ｇ（９０％の収率）であった。ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７７】
実施例２１
Ｎ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミド（化合物２９）の調製
光活性化可能な連鎖移動試薬を以下の要領で調製し、例２２及び２４に記述されている要領で使用した。３，５−ジヒドロキシ安息香酸４６.２ｇ（０.３０モル）を、ソックスレー抽出器及び凝縮器の備わった２５０ml入りフラスコ内に計量した。メタノール４８.６ml及び濃硫酸０.８mlをフラスコに添加し、３Ａの分子ふるいを ソックスレー抽出器内に置いた。抽出物をメタノールで希釈させ、混合物を一晩還流下で加熱した。結果として得た生成物についてのガスクロマトグラフィ分析は、所望のメチルエステルへの９８％の変換を示した。溶剤を減圧下で除去して約５９ｇの粗製生成物を得た。この生成物は、これ以上精製せずに次の段階で使用された。ＮＭＲ分析のために少量の標本を精製し、結果として所望の生成物と一貫性あるスペクトルが得られた。
【００７８】
以上からのメチルエステル生成物全体を、架空撹拌器及び凝縮器を伴う２リットル入りフラスコ中に入れ、その後、例２で記述された一般的方法に従って調製されたＢＭＢＰ  １７３.２５ｇ（０.６３モル）、炭酸カリウム２０７ｇ（１.５０モル）及びアセトン１２００mlを加えた。次に、結果として得られた混合物を一晩還流させ、ＴＬＣによって示されるように完全な反応を得た。ろ過により固体を除去し、減圧下でアセトンを蒸発させて４９ｇの粗製生成物を得た。１リットルの水で固体を希釈させ、クロロホルム１リットル×３で抽出させた。抽出物をアセトン可溶分画と組合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗製生成物１７７ｇを生成した。生成物をアセトニトリルから再結晶化させて白色固体１５０.２ｇ，つまり最初の２回の段階について９０％の収率を得た。生成物の融点は１３１.５℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００７９】
メチル３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾエート、６０.０５ｇ（０.１０８モル）を、２リットル入りフラスコ中に入れ、その後水１２０ml，メタノール４８０ml，水酸化ナトリウム６.４８ｇ（０.１６２モル）を添加した。混合物を３時間還流下で加熱し、エステルの加水分解を完了させた。冷却後、メタノールを減圧下で除去し、酸のナトリウム塩を２４００mlの温水中に溶解させる。濃塩酸を用いて酸を沈殿させ、ろ過し、水で洗浄し、真空オーブン内で乾燥させて５８.２ｇの白色固体を得た（収率９９％）。生成物上の融点は１８８.３℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００８０】
３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）安息香酸２０.０ｇ（３６.８６mmol）を２５０ml入りフラスコに添加し、続いてトルエン３６ml，塩化チオニル５.４ml（７４.０mmol）及びＤＭＦ２８μｌを加えた。混合物を４時間還流させ、酸塩化物を形成させた。冷却後、溶剤及び余剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。各々２０mlのクロロホルムを用いて、４回の付加的蒸発により残留塩化チオニルを除去した。粗製生成物をトルエンから再結晶化させ１８.４５ｇの生成物、すなわち８９％の収率を得た。生成物の融点は１２６.９℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００８１】
２−アミノエタンチオール塩酸塩４.１９ｇ（３６.７mmol）を、架空撹拌器の備わった２５０ml入りフラスコに加え、続いてクロロホルム１５ml及びＴＥＡ１０.６４ml（７６.５mmol）を加えた。氷浴上でアミン溶液を冷却した後、５０分間にわたり、５０mlのクロロホルム中の１８.４ｇ（３２.８mmol）の３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾイル塩化物溶液を滴下により加えた。氷上の冷却を３０分間続行し、続いて２時間室温まで暖めた。生成物をクロロホルム１５０mlで希釈し、０.１Ｎの塩酸２５０ml×５で洗浄した。生成物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、トルエン／ヘキサン（１５／１  ｖ/ｖ）から２回再結晶化させて１３.３ｇの生成物つまり６７％の収率を得た。生成物での融点は１１５.９℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計上での分析は所望の生成物と一貫性のあるものであった。
【００８２】
実施例２２
アクリルアミドと脂肪酸単量体の光反応性終点共重合体（化合物３０）の調製
ＴＨＦ９ml中にアクリルアミド０.６４０ｇ（９.００mmol）を溶解させ、その後例１９に記述された一般的方法に従って調製された化合物２６及び２７、０.２９９ｇ（０.６８mmol），例２１中に記述された一般的方法に従って調製された化合物２９、０.０６０ｇ（０.１０mmol），Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）９μｌ（０.０６０mmol），及び２，２'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０.０４９ｇ（０.３０mmol）を加えた。溶液に、ヘリウムを２分間アルゴンを２分間散布し、次に密閉して一晩５５℃で加熱した。結果として得た懸濁液を付加的ＴＨＦ５mlで希釈し、ジエチルエーテルに添加し、その後ろ過して固体を分離した。真空オーブン内での乾燥後、白色固体０.９６６ｇを分離した。重合体の分析は、重合体１グラムあたり０.０７３mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８３】
実施例２３
アクリルアミドと脂肪酸単量体の光反応性ランダム共重合体（化合物３１）の調製
ＴＨＦ９ml中にアクリルアミド０.６５７ｇ（９.２４mmol）を溶解させ、その後例１９に記述された一般的方法に従って調製された化合物２６及び２７、０.３０７ｇ（０.７０mmol），例２０中に記述された一般的方法に従って調製された化合物２８、０.０３６ｇ（０.１０mmol），ＴＥＭＥＤ９μｌ（０.０６０mmol），及びＡＩＢＮ０.０２６ｇ（０.１６mmol）を加えた。溶液に、ヘリウムを２分間アルゴンを２分間散布し、次に密閉して一晩５５℃で加熱した。結果として得た懸濁液を付加的ＴＨＦ５mlで希釈し、ジエチルエーテルに添加し、その後ろ過して固体を分離した。真空オーブン内での乾燥後、白色固体０.９９７ｇを分離した。重合体の分析は、重合体１グラムあたり０.０８６mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８４】
実施例２４
Ｎ−ビニルピロリドンと脂肪酸単量体の光反応性終点共重合体（化合物３２Ａ−Ｃ）の調製
ＴＨＦ３ml中にＮ−ビニルピロリドン０.９１５ｇ（８.２３mmol）を溶解させ、その後例１９に記述された一般的方法に従って調製された化合物２６及び２７、０.２７１ｇ（０.６１８mmol），例２１中に記述された一般的方法に従って調製された化合物２９、０.０７０ｇ（０.１１６mmol），ＴＥＭＥＤ１μｌ（０.０１mmol），及びＡＩＢＮ０.０５７ｇ（０.３４７mmol）を加えた。この組成物は、反応混合物中単量体７モル％のＴＤＳＡを作るように設計されたものである。溶液に、ヘリウムを２分間アルゴン２分間を散布し、次に密閉して一晩５５℃で加熱した。重合体とジエチルエーテルの添加により沈殿させ、続いてろ過で分離した。真空オーブン内での乾燥後、白色固体１.１０ｇを分離した。化合物３２Ａの分析は、重合体１グラムあたり０.１０９mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８５】
ＴＨＦ４ml中、Ｎ−ビニルピロリドン０.４３３ｇ（３.９０mmol）；化合物２６及び２７，０.５０７ｇ（１.１６mmol）、化合物２９，０.０６０ｇ（０.１０mmol）；ＴＥＭＥＤ，３μｌ（０.０２mmol）及びＡＩＢＮ，０.０４９ｇ（０.２９８mmol）という量の試薬を用いて、上述の手順に従った。この組成物は、反応混合物中の単量体の２３モル％のＴＤＳＡを作るように設計された。上述の手順に続く分離の後、白色固体０.８０８ｇを分離した。化合物３２Ｂの分析は、重合体１グラムあたり０.０８３mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８６】
ＴＨＦ３ml中、Ｎ−ビニルピロリドン０.１８１ｇ（１.６３mmol）；化合物２６及び２７，０.７５９ｇ（１.７３mmol）、化合物２９，０.０６０ｇ（０.１０mmol）；ＴＥＭＥＤ，１μｌ（０.０１mmol）及びＡＩＢＮ，０.０４９ｇ（０.２９８mmol）という量の試薬を用いて、上述の手順に従った。この組成物は、反応混合物中の単量体の５０モル％のＴＤＳＡを作るように設計された。上述の手順に続く分離の後、白色固体０.７０５ｇを分離した。化合物３２Ｃの分析は、重合体１グラムあたり０.１０２mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８７】
実施例２５
Ｎ−ビニルピロリドンと脂肪酸単量体の光反応性ランダム共重合体（化合物３３Ａ−Ｄ）の調製
ＴＨＦ８．８ml中にＮ−ビニルピロリドン０.７４９ｇ（６.７４mmol）を溶解させ、その後例１９で記述された一般的方法に従って調製された化合物２６及び２７、０.２２４ｇ（０.５１１mmol）、例２０中に記述された一般的方法に従って調製された化合物２８、０.０２７ｇ（０.０７７mmol），ＴＥＭＥＤ１μｌ（０.０１mmol）、及びＡＩＢＮ０.０１９ｇ（０.１１６mmol）を加えた。この組成物は、反応混合物中単量体７モル％のＴＤＳＡを作るように設計されたものである。溶液に、ヘリウムを２分間アルゴンを２分間散布し、次に密閉して一晩５５℃で加熱した。重合体をジエチルエーテルの添加により沈殿させ、続いてろ過で分離した。真空オーブン内での乾燥後、白色固体０.３５３ｇを分離した。化合物３３Ａの分析は、重合体１グラムあたり０.１１２mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８８】
ＴＨＦ３ml中、Ｎ−ビニルピロリドン０.３６２ｇ（３.２６mmol）；化合物２６及び２７、０.６２１ｇ（１.４２mmol）；化合物２８、０.０１７ｇ（０.０４９mmol）；ＴＥＭＥＤ、１μｌ（０.０１mmol）及びＡＩＢＮ、０.０１２ｇ（０.０７３mmol）という量の試薬を用いて、上述の手順に従った。この組成物は、反応混合物中の単量体の３０モル％のＴＤＳＡを作るように設計された。上述の手順に続く分離の後、白色固体０.７７０ｇを分離した。化合物３３Ｂの分析は、重合体１グラムあたり０.０５２mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００８９】
ＴＨＦ３ml中、Ｎ−ビニルピロリドン０.１９６ｇ（１.７６mmol）；化合物２６及び２７、０.７９１ｇ（１.８０mmol）；化合物２８、０.０１３ｇ（０.０３７mmol）；ＴＥＭＥＤ、１μｌ（０.０１mmol）及びＡＩＢＮ、０.００９ｇ（０.０５５mmol）という量の試薬を用いて、上述の手順に従った。この組成物は、反応混合物中の単量体の５０モル％のＴＤＳＡを作るように設計された。上述の手順に続く分離の後、白色固体０.７０８ｇを分離した。化合物３３Ｃの分析は、重合体１グラムあたり０.０４８mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００９０】
ＴＨＦ７ml中、Ｎ−ビニルピロリドン０.１８８ｇ（１.６９mmol）；化合物２６及び２７、１.７９２ｇ（４.０９mmol）；化合物２８、０.０２０ｇ（０.０５７mmol）；ＴＥＭＥＤ，１μｌ（０.０１mmol）及びＡＩＢＮ，０.０１４ｇ（０.０８５mmol）という量の試薬を用いて、上述の手順に従った。この組成物は、反応混合物中の単量体の７０モル％のＴＤＳＡを作るように設計された。上述の手順に続く分離の後、白色固体０.８７９ｇを分離した。化合物３３Ｄの分析は、重合体１グラムあたり０.０５８mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００９１】
実施例２６
脂肪酸リガンドを含有する光反応性シロキサン共重合体（化合物３４）の調製
６〜７モル％のアミン単量体含有量のアミノプロピルメチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体５.００ｇを乾燥塩化メチレン５０ml中に溶解させ、続いてＴＥＡ０.７９ｇ（７.８１mmol）を添加した。例１に記述された一般的方法に従って調製されたＢＢＡ−Ｃｌ、０.１９ｇ（０.７８mmol）を次に添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。その後、ＴＤＳＡ、０.９２４ｇ（３.１２mmol）を添加し、室温で２４時間溶液を撹拌した。その後反応を水で希釈し、０.１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを約６に調整した。有機層を除去し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤を減圧下で除去し、結果として得た油をヘキサンで希釈した。沈殿物をろ過により除去し、溶剤を蒸発させて粘性油４.７５ｇを得た。重合体の分析は、重合体１グラムあたり０.０１３mmolのＢＢＡを明らかにした。
【００９２】
実施例２７
アミン誘導体化した表面上の脂肪酸固定化
メタンとアンモニアガスの３／１混合物（ｖ/ｖ）を用いたプラズマ処理により、重合体表面を誘導体化する（例えば、米国特許第５,６４３,５８０号に記述された一般的方法を参照のこと）。メタン（４９０ＳＣＣＭ）及びアンモニア（１６１ＳＣＣＭ）の混合物を、コーティングすべき重合体と共にプラズマチャンバ内に導入する。ガスを０.２〜０.３トールの圧力に維持し、チャンバ内で３００〜５００ワットのグロー放電を起こさせる。標本をこれらの条件下で合計３〜５分間処理する。化学分析のための電子分光法（ＥＳＣＡ）及び飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を用いた表面分析により、アミノ誘導体化された表面の形成を確認する。
【００９３】
ＴＤＳＡを、３０mg／mlの濃度で重合体基体及び無水物の両方と適合性ある溶剤中溶解させる。無水物との関係において１.５当量のＴＥＡを溶液に加え、表面に対する脂肪酸の最大のカップリングを可能にするべく室温で２４時間、最終混合物をアミン誘導体化された表面と共にインキュベートさせる。次に、最終的表面を新鮮な溶剤で洗浄して未反応材料全てを除去し、残留するＴＥＡをすべて除去するための希酸洗浄により最終的洗浄を行なう。
【００９４】
実施例２８
選択された基体表面の試薬による改質
生体材料として一般に用いられる３つの重合体を、上述の新規化合物で表面改質した。重合体基体は、ポリエチレン（ＰＥ），ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）及びポリウレタン（ＰＵ）を内含していた。これらの重合体は、平坦なシートとして得られ１×１cmの正方形、１cmの円形ディスクとして使用されたか又は、円筒形（管又はロッド）の形で得られ短かいセグメントとして使用された。部品の形状及びサイズは、コーティングされた基体を用いて行うべき特定の検査に基づいて選択された。
【００９５】
精製イソプロパノール（ＩＰＡ）又は脱イオン水／ＩＰＡ溶液中に１〜１５mg／mlの範囲の濃度で試薬を溶解させることによりコーティング溶液を調製した。浸漬被覆法を用いて重合体基体に対し試薬を塗布した。部品を垂直に懸吊し、２cm／秒で溶液中に浸漬させ、５秒間とどまらせ、次に０.１cm／秒の速度で引き出した。コーティング溶液から基体を除去した後、溶剤がもはや見えなくなるまで、往々にして約１分以内で空気乾燥させた。コーティングを伴う基体を次に、各々 Heraeus Ｑ４０２Ｚ４電球が備わった２つの相対する DymaxＵＶ硬化用ランプの中央に懸吊させた。ランプの設置距離において、断片は、３３０〜３４０ｎｍの波長範囲内で約１.５ｍ Ｗ／cm2の照射を受けた。表面が確実に均等な光を受けるようにするため２分間の照射中３rpm で基体を回転させた。照射の後、部品をランプチャンバからとり出し、新鮮な溶剤中で３０分間洗浄を連続して２回行なう方法により、ＩＰＡ中で洗浄した。次に、使用までの間、コーティングを受けた標本を暗所に保管した。
【００９６】
実施例２９
化合物８，９，１８，１９，３２及び３３で改質された重合体基体の表面分析
化合物の存在及び均等性を確認するため、改質された基体の表面を評価するべく３つの異なる技術（染色、ＥＳＣＡ及びＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を使用した。
ＰＥ及びＰＶＣの平坦な材料を、ヘテロ２官能性試薬（化合物８，９，１８，１９）及び重合体試薬（変動する単量体組成をもつ化合物３２及び３３）で改質した。試薬をＩＰＡ内で１.０mg／mlで調製し、例２８で記述された方法を用いて塗布した。
【００９７】
第１に、正に帯電した可視波長染料であるトルイジンブル−Ｏで、コーティング済み材料を染色した。標本を、３０秒間染料の溶液（水中０.０２％  ｗ/ｖ）中に浸漬させ、溶液から取り出し、ＤＩ水で洗い流した。この染色プロトコルは、材料表面上の試薬の各々の存在を定性的に同定するために有用である。染料結合の結果は、表面改質手順が、基体表面上に試薬を固定化する上で成功を収めたことを示唆していた。同じ材料上の異なる試薬からと同時に異なる材料上の同じ試薬についても、染料の暗さに幾分かの変動が存在していた。染色は、材料の表面全体にわたり裸眼でほぼ均質であり、このことはすなわち、試薬が表面に塗布されたとき、滞留したり分離したりしていないこと又表面の被覆率が比較的均等であることを示唆している。
【００９８】
改質された基体の表面化学組成を定量的に分析するため、ＥＳＣＡを用いた。ヘテロ２官能性試薬（化合物８，９，１８，１９）及び重合体試薬（可変的モル組成をもつ化合物３２及び３３）で改質したＰＥ及びＰＶＣを、６５度のテイクオフ角度での分析と共に単色Ａ１Ｘ線を用いる Perkin Elmer ５４００ＥＳＣＡ型で分析した。表面中の原子濃度を計算するためサーベイスペクトルを収集した。
【００９９】
表面改質された材料上のＥＳＣＡ測定の結果（表１及び２）は、コーティングの存在及び化学組成を示すのに有用であった。ＰＶＣ基体については、コーティングが基体材料をマスキングしたか否かを見極めるために、塩素原子（Ｃｌ）の原子濃度を用いた。改質後ＰＶＣの表面上に検出されたＣｌの量を比較することによって、Ｃｌが表面改質された基体の上で大幅に低減されていることは明らかであった。上述の染料結合の結果と合わせて、このことは試薬が表面を完全にカバーしているものの、下にある基体を検出するのに充分なほど薄いものであることを示唆していた。コーティングを受けていない状態で炭素１００％の原子濃度を有するはずである（ＥＳＣＡはＨ原子を検出できないため）ＰＥ基体については、改質済みの又は未改質の標本を炭素濃度を用いて単純に比較することができる。改質された標本の全てについて、炭素濃度は約２０％減少していた。改質されたＰＥ及びＰＶＣの表面上には窒素が存在したものの、未コーティング表面上では存在しないことも明らかであった。これは、各々の試薬の中の窒素を表わすものであった。最後に、各化合物で改質されたＰＥ及びＰＶＣ標本の表面上のＣ，Ｏ及びＮの原子濃度の類似性が、コーティングの存在及び完全性を裏づけている。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
コーティングが基体の最も外側の表面上にあることを確実にするためＴＯＦ−ＳＩＭＳを行なった。ＴＯＦ−ＳＩＭＳは、表面の外側１０Å以内の化学構造に対し敏感である。ＴＯＦ−ＳＩＭＳは、Physical Electronics (Eden Prairie, ＭＮ）により、Physical Electronics 型式番号７２００の計器を用いて実施された。各々の表面について正及び負のイオンスペクトルが記録された。さらに、（基体の化学とは無関係に）コーティングを表わす化学的フラグメントの均質性を見極めるために、表面の走査を用いた。ＴＯＦ−ＳＩＭＳによって分析した表面（基体とコーティング）は、上述のＥＳＣＡにより分析した表面と同じであった。コーティングされた基体については、ＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルは、未コーティングのＰＥ又はＰＶＣ材料についてのスペクトルとは実質的に異なっていた。例えば、ベース材料のいずれにも存在しない窒素を含有する数多くの化学的フラグメントが存在していた。ヘテロ２官能性試薬（化合物８，９及び１８，１９）と結びつけられた正のイオンスペクトル（２００〜６００質量／電荷単位の間）内には、数多くの高分子量のフラグメントが存在していた。重合体ベースの試薬（化合物３２，３３）は、重合体主鎖を表わす規則的な反復するＦＲＧ指紋を有していた。同様に、材料の表面上に試薬が存在していることを確認しているのは、各化合物についてのＦＲＧパターンが２つの異なる基体上で類似しているという点であった。さらに、コーティング試薬と一意的に結びつけられたピークの存在を検出するための表面の走査は、基体の表面上に試薬が比較的均等に分布していることを示しており、前述のトルイジンブルーＯ染色試験の結果をさらに確認していた。
【０１０３】
実施例３０
緩衝液及び貧血小板血漿からのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の吸着
単一タンパク質緩衝溶液及び希釈したヒト貧血小板血漿（ＰＰＰ）から重合体材料上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の吸着を、放射線標識づけされたタンパク質を用いて定量化した。脂肪酸を含まないＨＳＡ（Sigma Chemical, St. Louis ＭＯ）を、水素化ホウ素ナトリウム技術（Means and Feeney, Biochemistry ７，２１９２（１９６８））を用いて 3Ｈで放射線標識づけした。トリス−塩水（ＴＮ）緩衝溶液（５０ｍＭ Tris, １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）中で０.１mg／mlの濃度になるまで標識づけされていないＨＳＡを溶解させることによって、ＨＳＡの緩衝溶液を調製した。次に、結果として得た溶液を、溶液全体について比活性が約１０００ｄpm/μｇＨＳＡとなるような形で、3Ｈ−ＨＳＡのアリコートでスパイクした。クエン酸ナトリウム（３.８％）擬血防止された血液から調製した市販のＰＰＰ（George King Biochemical ； Overland Park, KS）を用いて、血漿溶液を調製した。吸着実験の直前に、リン酸緩衝溶液（１０ｍＭの燐酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７.４；ＰＢＳ）でＰＰＰを４：１に希釈し、次に、比活性が希釈血漿中のＨＳＡ約６０００dpm/μｇとなるような形で、放射線標識づけされたＨＳＡでスパイクした。
【０１０４】
3Ｈ−ＨＳＡを含有するＰＰＰ溶液と緩衝液の両方について同じように、吸着実験を行なった。表面改質したＰＥ及びＰＶＣの円形ディスク（１cm）を２０mlのシンチレーションバイアル中に置き、同じ材料の未コーティンクディスクを対照として用いた。これらの断片を室温で一晩ＴＮ２ml中で水和した。実験当日に、上述のとおりに、3Ｈ−ＨＳＡ溶液（緩衝液又はＰＰＰ）を調製した。重合体標本から水和緩衝液を吸引し、バイアルに放射線標識づけされたＨＳＡ溶液を添加した。バイアルを室温で２時間軌道振とう機上で穏やかに撹拌した。ＨＳＡ溶液を吸引し、各バイアルに対し４mlのＴＮＴ溶液（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ，０.０５％の Tween２０，ｐＨ７.５）を添加し、バイアルを室温で１５分間振とうした。ＴＮＴ洗浄段階を２回反復し、ディスクを清潔で乾燥したシンチレーションバイアルに移した。２mlのＴＨＦを各バイアルに添加し、標本を軌道振とう機上で一晩強く撹拌した。各バイアルに対して、１０mlの Hionic Fluor を添加し、渦流により徹底的に混合した。液体シンチレーションカウンタ（Packard １９００ＣＡ）を用いてバイアルを計数した。ＨＳＡ吸着溶液の比活性及びディスクの表面積を用いてこれらのデータからＨＳＡの表面濃度を計算した。
【０１０５】
例２８に記述したものと同じ手順を用いて、ＰＥ及びＰＶＣをヘテロ２官能性及び重合体化合物で改質した。ＴＮ緩衝溶液から改質された未コーティングＰＥ及びＰＶＣ材料上への3Ｈ−ＨＳＡの結合の結果は、表３に示されている。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
緩衝溶液からのＨＳＡ結合の結果は、数多くの重合体試薬がＨＳＡを未コーティング表面と同様のレベルで結合させ、一方、ヘテロ２官能性化合物は未コーティングのものに比べ２〜３倍結合を増強させることを示した。
実施例３１
血漿から化合物８，９，１８，１９，３０，３２及び３３で改質したＰＥへのＨＳＡ結合
ＰＥの平坦な基体を化合物８，９，１８，１９，３０，３２及び３３で改質した。化合物８，９，１８，１９，３２及び３３を１mg／１mlの濃度でＩＰＡ中で調製し、化合物３０はＩＰＡ／水（８０／２０  ｖ/ｖ）中で調製し、例２８で記述したとおりの手順に従って、基体をコーティングした。ＰＰＰからのＨＳＡ結合を例３０で記述したとおりに測定し、比活性は２,００３dpm/μｇであった。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
実施例３２
血漿から化合物８，９，３２及び３３で改質したＰＶＣへのＨＳＡ結合
ＰＶＣの平坦な基体を化合物８，９，３２及び３３で改質した。化合物を１mg／mlの濃度でＩＰＡ中で調製し、例２８に記述したとおりの手順に従って基体に塗布した。ＰＰＰからのＨＳＡ結合を例３０で記述されている通りに測定した。この実験では、比活性は３１５０dpm/μｇＨＳＡであった。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
実施例３３
血漿から化合物１４，１５で改質したＰＥへのＨＳＡ結合
ＰＶＣの平坦な基体を化合物１４，１５で改質した。化合物を１〜１０mg／mlの範囲内の濃度でＩＰＡ中で調製し、１層又は３層塗りでかつその他の点では例２８に記述したとおりの手順に従って塗布した。ＰＰＰからのＨＳＡ結合を例３０で記述されている通りに測定し、実験＃１及び＃２でＨＳＡの比活性は５,６３６dpm/μｇであった。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
この実験の結果は、塗布される試薬の濃度を高めると、ＰＰＰからのＨＳＡの結合の増加を示す表面が生み出されるということを示している。さらに、表面に塗布された試薬の層の数を増大させると、ＰＰＰからのＨＳＡの結合が増加する。
実施例３４
血漿から化合物１０，１１で改質したＰＥへのＨＳＡ結合
ＰＥの平坦な基体を化合物１０，１１で改質した。化合物を１〜１５mg／mlの範囲の濃度でＩＰＡ中で調製し、３層塗りでかつその他の点では例２８に記述したとおりの手順に従って塗布した。ＰＰＰからのＨＳＡ結合を例３０で記述されている通りに測定した。実験＃１ではＨＳＡの比活性は５,９７７dpm/μｇであり、実験＃２では、６，６３６dpm/μｇであった。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
この実験の結果は、塗布される試薬の濃度を高めると、あたかもＨＳＡ結合が、それ以上表面に塗布する試薬を増加させてもいかなる付加的な利益を提供しなくなる安定水準状態に達したかに見えるものの、ＨＳＡ結合の増加を生みさない、ということを示している。このことは、表面が試薬で飽和した状態となったことを示している可能性がある。
【０１１６】
実施例３５
化合物８，９で改質したＰＥへのＨＳＡ結合
ＰＥの平坦な基体を化合物８，９で改質した。化合物を１〜１０mg／mlの範囲の濃度でＩＰＡ中で調製し、１層塗り又は３層塗りでかつその他の点では例２８に記述したとおりの手順に従って塗布した。ＰＰＰからのＨＳＡ結合を例３０で記述されている通りに測定し、血漿中の比活性は６，０４５dpm/μｇ ＨＳＡであった。
【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
ＰＥ及びＰＶＣ上のこれらのコーテングは、緩衝液及び血漿からのＨＳＡ結合を１０倍も増強した。一部の試薬（１０，１１，１４，１５及び８，９）では、コーティング溶液の濃度を高めることで、ＨＳＡ結合能力の増大した表面が生成された。この安定水準状態は、試薬１４，１５については、７.５mg／ml近くで起こり、化合物８，９，１０，１１については、１０mg／mg近くで起こった。
【０１１９】
実施例３６
ＰＰＰから改質された基体上へのフィブリノーゲン（Ｆgn）吸着
ＰＥ及びＰＶＣ基体を化合物８，９，１８，１９，３２及び３３で修行した。化合物を１.０mg／mlの濃度でＩＰＡ中で調製し、単一の層として、かつその他の点では例２８に記述した通りの手順従って塗布した。
【０１２０】
3Ｈ−Ｆgnを使用することにより、対照及び表面改質された材料上へのヒト血漿（ＰＰＰ）からのＦgnの吸着を定量化した。水素化ホウ素ナトリウム技術（Means 及び Freeney, Biochemistry  ７，２１９２（１９６８））を用いて3ＨでＦgnを放射線標識づけし、使用するまで−８０℃で凍結させた状態で保管した。吸着実験のためのＦgnの血漿溶液をＰＰＰ（George King Biochemical ；Overland Park, KS）を用いて調製した。吸着実験当日に、ＰＰＰをＴＮ緩衝液で４：１に希釈した。その後、希釈したＰＰＰを、原料の3Ｈ−Ｆgn溶液のアリコートでスパイクし、比活性１，８１６dpm/μｇＦgnをもつ作業溶液を得た。
【０１２１】
重合体標本（１cmの円形ディスク）を２０mlのシンチレーションバイアル中に入れ、タンパク質吸着に先立ち室温でＴＮ２.０ml中で一晩水和した。実験当日に、緩衝溶液を吸引し、重合体標本を完全にカバーするため3Ｈ−Ｆgnを含有する希釈ＰＰＰ１.０mlを添加した。基体を２３℃で２時間3Ｈ−Ｆgn溶液中でインキュベートした。ＰＰＰ溶液を吸引し、ＴＮＴで３回（毎日１５分）基体を洗浄した。ディスクを清浄なシンチレーションバイアル内に入れ、ＴＨＦで溶解させ、ＨＳＡ吸着実験のため例３０に記述した通りに放射能について計数した。Ｆgnの表面濃度を、溶液中のＦgnの比活性及び重合体標本の表面積を用いて計算した。フィブリノーゲン吸収実験の結果は表１０に示されている。
【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
これらの試薬の場合、改質された表面に対するＦgn結合は、未コーティング表面に対する吸着以下であった。ＨＳＡの増強された結合が、Ｆgnの結合の減少の原因であったことも考えられる。Ｆgnの結合を減少させる表面は一般に、フィブリン形成及び血小板接着といったような血液からのその後の不利な応答を誘発する可能性が比較的少ない。
【０１２４】
実施例３７
ＨＳＡに対し露呈された改質済みＰＥに対する抗ＨＳＡ抗体の結合
化合物８，９，１８，１９，３０，３１，３２及び３３でＰＥ基体を改質した。化合物をＩＰＡ中において１.０mg／mlの濃度で調製し、単一層として、かつその他の点では例２８に記述されているとおりの手順に従って、塗布した。
【０１２５】
ポリクローナル抗ＨＳＡ抗体の結合は、吸収された状態での未変性の構造を結合済みアルブミンが維持しているか否かを見極めるため、ＥＬＩＳＡ技術を用いて行なわれた。ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）に接合されたヒツジ抗（ＨＳＡ）抗体を Biodesign (Kennebunk, ME）から得た。重合体標本を２時間ＴＮで水和させ、タンパク質溶液をＴＮ中１.０mg／mlのＨＳＡ濃度で調製した。１mlのタンパク質溶液を標本に添加し、室温で２時間インキュベートした。吸着の後、溶液を吸引し、標本をＴＮＴ緩衝液で洗い流した。遮断段階として１mlの１％ＢＳＡを添加し、１時間インキュベートした。標本を各々３０分ずつ２回ＴＮＴで洗浄した。洗浄の後、標本をＴＮで簡単に洗い流し、穏やかに撹拌しながら１時間室温で、ＴＮ中のヒツジ−Ａb−ＨＲＰ（１：２０００希釈）と共にインキュベートした。標本を、渦流によりバイアル１本あたり３mls のＴＮＴで４回洗浄した。断片を試験管に移し、１mlのＴＭＢ／ペルオキシド溶液を添加した。１５分間発色させた。溶液の吸光度を、分光光度計を用いて６５５nmで読取った。吸光度は、ＨＲＰの表面濃度と正比例し、従って同様に、基体表面に結合した抗ＨＳＡ抗体の表面濃度にも正比例する。
【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
未コーティングで表面改質された材料まで以前に緩衝液から吸収されたＨＳＡに対する抗ＨＳＡ抗体の結合の結果は、テスト対象の試薬間にはほとんど差異がつかなかったことを示した。全ての表面は、未コーティングの表面よりも約３〜４倍高い濃度の抗体を結合した。
実施例３８
改質されたＰＥ及びＰＶＣ上の富血小板血漿（ＰＲＰ）からの血小板の付着及び活性化
表面改質された材料を富血小板血漿（ＰＲＰ）と共にインキュベートしその後、血小板の付着及び活性化に対する表面化学の影響を見極めるため、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で検査した。ボランティアから直接、９：１という血液対抗擬血剤の比率を用いて３.８％のクエン酸ナトリウム内に血液を採取した。血液を１５分間１２００rpm で遠心分離して、血液からＰＲＰを分離した。ＰＲＰを収集し、使用まで（１時間未満）室温に保った。テスト用標本を６ウェル平板内に、ウエルあたり１標本の割合で入れた。血漿中の血小板を定量化するため、ＰＲＰの標本を取り上げ、１％のしゅう酸アンモニウムで１：１００に希釈した。血球計算盤に少量の溶液を移すためにも毛細管を使用し、血小板が沈降するよう３０分間、カバーしたいペトリ皿の中で標本をインキュベートした。位相差顕微鏡下で血小板を計数し、血小板は１mlあたり１.４〜４.４×１０14個の間にあることを確認した。表面全体がカバーされるまで標本の上面にＰＲＰ溶液を添加し、標本を撹拌せずに室温で、１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＰＲＰを吸引により入念に除去し、３mlのＴyrode 緩衝液（１３８ｍＭのＮａＣｌ，２.９ｍＭのＫＣｌ，１２ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ７.４）を各ウェルに穏やかに添加した。平板を１５分間軌道振とう機上でわずかに撹拌した：溶液を交換し、洗浄をくり返し行なった。洗浄溶液を吸引し、各ウェルに Karnovskyの固定液（ホルムアルデヒド２５ml＋２５％のグルタルアルデヒド５ml＋２３％のＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ＋７７％の無水ＮａＨＰＯ4の溶液２０ml）２.０mlを加えた。平板をパラフィルムで包み、わずかに撹拌しながら一晩インキュベートした。固定液を吸引し、標本を各々１５分ずつ３回各々純水で洗浄した。その後標本を、各々１５分ずつ、２５，５０，７５のエタノール系列で脱水した。標本を、取り付けるまで（最高４日），１００％のエタノール内で４℃に保った。標本を取りつけＰｄ/Ａｕでコーティングし、ＪＥＯＬ８４０走査型電子顕微鏡を用いて観察した。各標本のそれぞれの代表的概要を提供するため、複数の倍率で標本表面上の異なる部域の写真を撮影した。血小板を計数し、Goodman et al の Scanning Electron Microscopy／１９８４／Ｉ．２７９−２９０（１９８４）に基づき形態学的記述を用いて活性化の度合について判断した。
【０１２８】
２つの代表的血小板付着実験についてのＳＥＭの結果は、表１２及び１３に示されている。ＳＥＭ写真から、結合した血小板の表面密度を推定した。両方の基体上で一貫して、化合物３３Ｃ重合体上に最低の血小板密度が見られた。化合物３２Ｃの重合体も同様に、一貫して低い血小板密度を有していた。優勢な血小板形態は表１３にまとめられている。丸味のある又は樹状の血小板は、活性化度が比較的低いものと解釈され、一方広がりつつある又は完全に広がり実質的な凝集を示した血小板は、より広範に活性化されているものと解釈された。ＰＥについては、未コーティング基体は、最高の血小板密度ならびに最も完全に広がった血小板形態を有していた。ＰＶＣについては、未コーティング表面では少なかったものの最悪の表面ではなかった。
【０１２９】
【表１２】
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【０１３０】
【表１３】
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【０１３１】
重合体試薬は、両方の基板上で血小板付着及び活性化を低減させる上で最高の性能を示した。ヘテロ２官能性試薬８及び９は、重合体試薬３２Ｃと同様の性能を示した。ヘテロ２官能性試薬１８及び１９は、基体に応じて未コーティング表面と同様か又はそれより不良であった。
実施例３９
化合物６，７で改質されたカテーテルを伴う急性イヌ頸静脈移植
化合物６，７で改質した表面を、急性イヌ頸静脈移植モデルを用いてテストした。表面改質された標本及び対照標本を体重１５〜２５kgの混合品種のイヌの外頸静脈内に１時間移植した。ガンマカメラ画像化を用いて実時間で、111Ｉnで標識付けした自己由来の血小板の付着を、空間的及び定量的に監視した。
【０１３２】
各々の実験において、イヌをペントバルビタールで麻酔し、背臥位置に固定した。実験に先立って又実験中に動物に抗凝血剤を与えることはしなかった。９０mlの血液をクエン酸塩／デキストロース（９：１ ｖ/ｖ）内に引き込み、血小板を分離し、111Ｉn−オキシンで標識付けした。標識付けした血小板をイヌの体内に再度注入し２０分間循環させた。迅速に連続して、脂肪酸誘導体で改質した１本のロット及び未コーティングの１本の対照ロットを左右の外頸静脈内に左右相称に移植した。各実験において未コーティングの対照ロッドを使用することによって、移植された材料に対する個々の動物の応答のあらゆる変動性を説明した。ロッドの挿入直後に、イヌの首の領域を１時間連続して、Picker４／１５デジタルガンマカメラで監視し、ロッド上への血小板の付着を実時間で追跡した。ガンマカメラは放射線計数の数値的定量化及び空間的解像の両方を可能にした。カメラで収集したデータを専用マイクロコンピュータに移して、コーティングされた材料及び対照材料上の相対的血小板接着を計算した。１時間の走査後、動物を全身的にヘパリン化して、さらなる血栓形成をことごとく停止させ、ＫＣｌの静脈内注射で安楽死させた。各々の頸静脈を露呈し長手方向に開放して静脈中の所定の場所でロッドを見せた。ロッドを写真撮影した後、これらを除去し、血栓を剥がし、凍結乾燥させ、計量した。
【０１３３】
【表１４】
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【０１３４】
コーティングされたＰＵ表面は、未コーティンク表面よりもはるかに良好な性能を示し、この血液適合性の急性テストにおいて血小板接着を低減させた。
実施例４０
改質されたシリコーンゴム心臓弁を用いた生後５カ月のヒツジの僧帽弁移植片
シリコーンゴム（ＳＲ）の心臓弁を試薬１４，１５で改質する。試薬はＩＰＡ中５mg／mlで調製し、例２８で記述されている通りの手順を用いて、重合体三葉弁のＳＲ部分の表面に３層塗りで塗布した。弁は酸化エチレンを用いて滅菌し、以前に Irwin E.D., et al., J. Invest Surg, ６，１３３−１４１（１９９３）が記述した手順を用いて若齢のヒツジの体内の僧帽弁位置に移植した。試薬で処理した３つの弁を移植する。弁は約１５０日間所定の位置に残す。移植期間の終りで、ヒツジを屠殺し、心臓を外植する。周囲の心臓組織を含めた弁をとり出し、緩衝させたホルマリンの中に入れる。弁を目視で検査し、写真撮影する。
【０１３５】
外植した弁葉の外観は、コーティングによって改善されるはずである。コーティングされたバルブでは葉の表面上に最小限の血栓しかもたず、一方、未コーティングのＳＲ弁は、葉の表面の大部分をカバーする実質的な血栓を有するはずである。さらに、表面上に存在する血栓は、著しく鉱化されている可能性があり、これは、潜在的に弁の耐用寿命を短縮することになるもう１つの不利な結果である。