(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、標的核酸分子の検出法：
2本の電気導線であって、第一の導線の末端は、第二の導線の末端近傍に位置するが、これらの導線は接触していないような導線と、
電気導線に付着した2個のオリゴヌクレオチドプローブの1種以上のセットであって、該プローブが互いに接触することができず、かつ第一の電気導線に付着した第一のプローブに相補的な第一の配列および第二の電気導線に付着した第二のプローブに相補的な第二の配列の2種の配列を有する標的核酸分子が、両方のプローブに同時に結合することができるように、該オリゴヌクレオチドプローブが位置しているセットと
を備える、標的核酸分子の存在を検出する装置を提供する段階；
これらのプローブを、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸分子を有することがある試料と接触する段階；
プローブに付着されている標的核酸分子を導体で被覆する段階；および
電流がこれらのプローブ間で流れ得るかどうかを測定し、該プローブ間の電流がプローブと相補的な配列を有する試料中の標的核酸分子の存在を示す段階。
【請求項２】
核酸分子がDNAである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸分子がRNAである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
導体が銀である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
導体が金である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
下記の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
標的核酸分子を、プローブとの結合後、ヌクレアーゼと接触する段階。
【請求項７】
下記の段階をさらに含む、請求項１記載の方法：
標的核酸分子を、プローブとの結合後、リガーゼと接触する段階；および
標的核酸分子を、プローブに連結していない標的核酸分子を変性するのに十分な高温で加熱する段階。
【請求項８】
プローブが、病原菌の遺伝物質由来の配列と相補的である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
病原菌が生物学的戦闘関連物質（biowarfare agent）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
病原菌が食品に生じる病原体（food borne pathogen）である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
プローブが、ウイルスの遺伝物質に由来する配列に相補的である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
プローブがヒトの遺伝物質由来の配列に相補的である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
プローブの一方または両方が、多型を有する配列に相補的である配列を有し、ここで多型に相補的である1個または複数個の塩基がプローブ末端に位置する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
2本の電気導線であって、第一の導線の末端は第二の導線の末端近傍に位置するが、導線は接触しないような導線と、
電気導線に付着された2個のオリゴヌクレオチドプローブの1種以上のセットであり、該プローブが互いに接触せず、かつ第一の電気導線に付着した第一のプローブに相補的な第一の配列および第二の電気導線に付着した第二のプローブに相補的な第二の配列の2種の配列を有する標的核酸分子が、両方のプローブに同時に結合することができるように、該オリゴヌクレオチドプローブが位置するセットとを備える、
標的核酸分子の存在を検出する装置。
【請求項１５】
試料から核酸分子を放出するように試料を処理するチャンバーをさらに備える、請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
装置が試料をプロセッシングするタンパク質を含む、請求項１４記載の装置。
【請求項１７】
タンパク質が、リガーゼ、プロテアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、または核酸結合タンパク質からなる群より選択される、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
タンパク質が熱安定性タンパク質である、請求項１６記載の装置。
【請求項１９】
核酸分子がDNAである、請求項１４記載の装置。
【請求項２０】
核酸分子がRNAである、請求項１４記載の装置。
【請求項２１】
プローブに付着されている標的核酸分子を導体で被覆する溶液の入ったチャンバーをさらに備える、請求項１４記載の装置。
【請求項２２】
導体が銀である、請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
導体が金である、請求項２１記載の装置。
【請求項２４】
プローブとの結合後、標的核酸と接触するためのヌクレアーゼを含むチャンバーをさらに備える、請求項１４記載の装置。
【請求項２５】
試料を加熱するための加熱要素をさらに備える、請求項１４記載の装置。
【請求項２６】
プローブが、病原菌の遺伝物質由来の配列に相補的である、請求項１４記載の装置。
【請求項２７】
病原菌が生物学的戦闘関連物質である、請求項２６記載の装置。
【請求項２８】
病原菌が食品に生じる病原体である、請求項２６記載の装置。
【請求項２９】
プローブが、ウイルスの遺伝物質に由来する配列に相補的である、請求項１４記載の装置。
【請求項３０】
プローブがヒトの遺伝物質由来の配列に相補的である、請求項１４記載の装置。
【請求項３１】
プローブの一方または両方が、多型を有する配列に相補的である配列を有し、多型に相補的である1個または複数個の塩基がプローブ末端に位置する、請求項３０記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
DNA同定技術は、病原体の同定、遺伝子試験、および法医学を含む多くの用途がある。同時に数千の配列を自動的にスクリーニングができるように進歩している。DNAプローブが、ガラスまたはシリコンのチップのような基板上に固定された遺伝子チップ技術が存在する。核酸分子を含有する試料を、チップに適用し、かつ試料内の核酸分子をチップ上のプローブDNAとハイブリダイズさせる。2本鎖核酸分子産物を同定するためには、典型的には、蛍光検出が使用される。このシステムの利点は、自動化されたシステムを用いて、数百または数千の配列のスクリーニングを行う能力がある点である。
【０００２】
蛍光検出によるハイブリダイゼーションスクリーニングは、核酸配列を検出する強力な技術である。しかし、標的DNA分子を検出するために、この標的は、信頼できるシグナルが得られるように最初にPCR増幅されなければならない。遺伝子チップ技術は、更に蛍光または放射性物質の検出を可能にするシステムも必要としている。このようなシステムは、使用に際し経費がかかり、かつ生体試料検出および同定のための携帯システムに適応し難い。更に、ハイブリダイゼーション反応は、最高2時間を要する。生物学的戦闘関連物質(biological warfare agent)の検出のような、多くの可能性のある用途に関して、遺伝子チップシステムは明らかに有効ではない。従って、PCR増幅に頼ることなく、少量の標的核酸分子を迅速に検出することができるシステムが必要とされている。
【０００３】
発明の概要
本発明は、標的核酸分子の検出法を提供する。標的核酸分子の存在を検出する装置は、導線の末端が互いに近傍に位置しているが接触していないような、2本の電気導線を有するように提供される。2個のオリゴヌクレオチドプローブの1種以上のセットが、この電気導線に付着されている。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、プローブが互いに接触することができず、かつ該プローブに相補的な2種の配列を有する標的核酸分子は両方のプローブに同時に結合することができるよう、配置されている。標的核酸分子を含有し得る試料は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でこれらのプローブに接触されている。標的が存在するならば、これらのプローブ間のギャップを架橋する。この標的核酸分子は、その後、これらのプローブ間に暖流を流すか、もしくは2個のプローブ間の導電性ワイヤを形成するための支持体として使用される。
【０００４】
更に本発明は、標的核酸分子の存在の検出装置を提供する。この装置は、導線の末端が互いに近傍に位置しているが接触していないような、2本の電気導線を有する。2個のオリゴヌクレオチドプローブの1種以上のセットが、これらの電気導線に付着されている。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、プローブが互いに接触することはできず、かつ該プローブに相補的な2個の配列を有する標的核酸分子は両方のプローブに同時に結合することができるよう、配置されている。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸分子の存在を迅速に検出する装置および方法を提供する。標的核酸分子はそれ自身、または支持体として、電気回路を完成するために使用される。標的核酸分子の存在は、回路を通じて電気シグナルを伝達する能力により示される。標的核酸分子が存在しない場合、この回路は完全ではない。従って、標的核酸分子はスイッチとして作用する。この核酸分子の存在は、電気回路にオン-シグナルを提供する一方で、標的ヌクレオチドの不在は、オフ-シグナルとして解釈される。この方法は、標的核酸分子を直接検出するので、2本のワイヤに結合した標的分子の非常に感度の高い検出をもたらす。
【０００６】
この検出装置は、支持体上に構築される。有用な基板材料の例は、例えばガラス、石英およびシリコンに加え、プラスチックのような高分子基板を含む。導電性または半導電性の基板の場合、一般に基板上に絶縁層を含むことが望ましい。しかし、非導電性表面を有するいずれかの固形支持体を用いて、該装置を構成することができる。この支持体表面は、平坦である必要はない。実際この支持体は、チップ内のチャンバーの壁面上に位置することができる。
【０００７】
2本の導線は、標的核酸分子にまたがる距離以内で、互いに近接しているが、互いに接触しないように位置した末端を有するように提供される。電流は、これら2本の導線に架橋する標的核酸分子が存在しない場合は、これらの導線間で効果的には流れることができない。標的核酸分子に特異的な2個のプローブが使用される。第一のものは1本の導線に、かつ第二のものは別の導線に付着されている。これらの2個のプローブは、標的分子上の配列に特異的であり、これは導線間の領域をまたぐのに十分な距離で隔てられている。典型的には、このギャップの長さは、ミクロンまたはミクロンの何分の一かである。しかしチップ製造が改善されたので、チップ上の要素間の距離を縮めることが可能となり、より短い長さの標的核酸分子が求められている。
【０００８】
この標的核酸分子は、2本の導線上にまたがっている。標的分子が該プローブの一方に相補的な配列を有するならば、これはそのプローブに結合するであろう。この核酸分子は、一旦そのプローブに結合したならば、その位置で繋ぎ止められる。次に第二のプローブに相補的な配列が、第二のプローブに結合される。このような反応を促進するために、2個の相補的配列は、その間の分子の長さが2本の導線の間の距離をまたぐことができ、かつ核酸分子に容易に移動するような柔軟性を提供するように、および第二の相補的配列が容易に第二のプローブに結合するように選択されなければならない。
【０００９】
好ましい態様において、これらのプローブは、ほぼ同じ融解温度を有するような標的に結合するように選択される。これは、ハイブリダイゼーション領域の長さを変動することにより実施することができる。A-T豊富な領域は、比較的長い標的配列を有することができるのに対して、G-C豊富な領域は比較的短い標的配列を有する。
【００１０】
基板に結合したオリゴヌクレオチドアレイ上のハイブリダイゼーションアッセイ法は、ハイブリダイゼーション工程および検出工程が関与している。ハイブリダイゼーション工程において、標的およびイソ安定化剤(isostabilizing agent)、変性剤または再生促進剤を含有するハイブリダイゼーション混合液が、アレイのプローブとの接触を生じ、かつ標的といずれかの相補的プローブの間のハイブリダイゼーションをもたらすのに適した温度および時間でインキュベーションされる。次に通常は、未結合の標的分子が、標的を含有しない洗浄混合液、例えばハイブリダイゼーション緩衝液などによる洗浄により、アレイから取り除かれる。これは、結合した標的分子のみを残留させる。検出工程において、標的がハイブリダイズしたプローブが同定される。本方法において、検出は、完全な電気回路の検出により行われる。各形状(feature)においてプローブのヌクレオチド配列は分かっているので、標的が結合した位置を同定することで、これらのプローブの特定の配列に関する情報が得られる。
【００１１】
ハイブリダイゼーション混合液中にハイブリダイゼーション最適化剤を含有すると、完全にマッチした標的と一塩基ミスマッチの間のシグナル識別を顕著に向上する。本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション最適化剤」とは、ミスマッチの核酸分子、すなわちその配列が完全に相補的でない核酸分子の間のハイブリダイゼーションを低下するような組成物を意味する。
【００１２】
イソ安定化剤は、DNA熱融解トランジッションに応じ塩基対組成物を減少するような組成物である。より詳細に述べると、この用語は、適当な濃度で、各々、ATまたはGCで構成された2本鎖DNAオリゴヌクレオチドについて、約1℃を越えない示差的融解温度を生じるような化合物を意味する。イソ安定化剤は、好ましくは濃度1M〜10Mの間、2M〜6Mの間、4M〜6Mの間、4M〜10Mの間、および最適には約5Mで使用される。例えば、2 x SSPE中の5Mのイソ安定化剤が適している。ベタインおよび低級テトラアルキルアンモニウム塩が、イソ安定化剤の例である。ある態様において、イソ安定化剤は、アルキルアンモニウムイオンではない。
【００１３】
ベタイン(N,N,N-トリメチルグリシン；(Reesら、Biochem、32:137-144(1993)、これは本明細書に参照として組入れられている)は、DNA熱安定性に応じて塩基対組成物を排除することができる。TMAClとは異なり、ベタインは、中性pHで双性イオンであり、かつ核酸の多価電解質的挙動を変更しないと同時に、これは核酸の組成物に依存した安定性を変更しない。ベタイン約5Mの含有は、平均的ハイブリダイゼーションシグナルを低下するが、マッチおよびミスマッチのプローブ間の識別は増強する。
【００１４】
変性剤は、2本鎖核酸の塩基間の水素結合または核酸分子の水和を妨げることにより、2本鎖核酸分子の融解温度を低下するような組成物である。変性剤は、ハイブリダイゼーション緩衝液に濃度約1M〜約6M、および好ましくは約3M〜約5.5Mで含有することができる。
【００１５】
変性剤は、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、DMSO(「ジメチルスルホキシド」)、酢酸テトラエチル、尿素、GuSCN、グリセロールおよびカオトロピック塩を含む。本明細書において使用される用語「カオトロピック塩」は、核酸分子の原子間のファンデルワールス力を妨害するように機能する塩を意味する。カオトロピック塩は、例えばトリフルオロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、グアニジンチオシアネート(「GuSCN」)、およびチオシアン酸カリウムがある。
【００１６】
再生促進剤は、核酸再生の速度を少なくとも100倍増大する化合物である。これらは、一般に核酸分子に弱く会合している相対的に構成されない高分子ドメインである。促進剤は、ヘテロ核リボ核タンパク質(「hnRP」)A1およびカチオン界面活性剤、例えば好ましくはCTAB(「セチルトリメチルアンモニウムブロミド」)およびDTAB(「ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド」)、および更にポリリシン、スペルミン、スペルミジン、1本鎖結合タンパク質(「SSB」)、ファージT4遺伝子32タンパク質ならびに酢酸アンモニウムおよびエタノールの混合物を含む。再生促進剤は、ハイブリダイゼーション混合液中、濃度約1muM〜約10mM、および好ましくは1muM〜約1mMで含まれ得る。CTAB緩衝液は、0.1mMと低い濃度で良好に作用する。
【００１７】
相同ヌクレオチド配列は、互いの選択的ハイブリダイゼーションにより検出することができる。本明細書において使用される選択的ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントまたは非ストリンジェントな条件下での、ひとつの配列由来のDNAまたはRNAプローブの、「相同」配列へのハイブリダイゼーションを意味する(Ausubelら編集、1989年、「分子生物学最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、第一巻、Greene Publishing Associates社およびJohn Wiley & Sons社、ニューヨーク、2.10.3頁、これは本明細書に参照として組入れられている)。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件も、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第二版、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989)に記されており、これも本明細書に参照として組入れられている。
【００１８】
様々なハイブリダイゼーション緩衝液が、本発明のハイブリダイゼーションアッセイ法において有用である。少量のイオン性界面活性剤(例えばN-ラウロイル-サルコシンなど)の添加が有用である。LiClがNaClに好ましい。ハイブリダイゼーションは、約14個のヌクレオチドのプローブについて、20〜65℃で、通常37℃〜45℃で実施することができる。ハイブリダイゼーション条件の追加例は、以下を含むいくつかの文献に記されている：Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル」、(1989)第二版、Cold Spring Harbor、N.Y.；ならびに、BergerおよびKimmel、「分子クローニング技術ガイド(Guide to Molecular Cloning Techniques)」、Methods in Enzymology、(1987)、第152巻、Academic Press社、サンディエゴ、カリフォルニア；YoungおよびDavis、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80:1194(1983)、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【００１９】
水性緩衝液に加え、非水性緩衝液も使用することができる。ハイブリダイゼーションを促進するが電気伝導性が低いような特定の非水性緩衝液が好ましい。
【００２０】
ハイブリダイゼーション混合液は、アレイと接触するように配置されかつインキュベーションされる。接触は、例えば皿、またはアレイと接触するためにプローブアレイを保持しかつ液体を導入しそれを細胞から除去することを可能にするように細胞特有に設計されたもののような、いずれか適当な容器において実施することができる。一般にインキュベーションは、通常核酸のハイブリダイゼーションに使用される温度、例えば約20℃〜約75℃ C、例えば約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃または約65℃で行われる。約14個のヌクレオチドよりも長いプローブについては、37℃〜45℃が好ましい。より短いプローブについては、55℃〜65℃が好ましい。より具体的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズされる領域の融解温度を決定するための式を用いて計算することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、融解温度でまたは融解温度よりも10℃低い温度と融解温度の間で実施される。より好ましくはハイブリダイゼーションは、融解温度でまたはそれよりも5℃低い温度と融解温度の間で実施される。標的といずれかのアレイの相補的プローブの間に望ましいレベルのハイブリダイゼーションが生じるのに十分な時間、標的は、プローブアレイと共にインキュベーションされる。ハイブリダイゼーション混合液とのインキュベーション後、アレイを通常、ハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄するが、これはハイブリダイゼーション最適化剤も含有することができる。これらの物質は、ハイブリダイゼーション工程の量と同じ範囲で含有するか、もしくはこれらは全て除くことができる。その後このアレイを試験し、標的がハイブリダイズされているプローブを同定することができる。
【００２１】
その配列が決定されるべき標的ポリヌクレオチドは通常、組織試料から単離される。標的がゲノムである場合は、試料はいずれかの組織(専ら赤血球を除く)に由来することができる。例えば全血、末梢血リンパ球またはPBMC、皮膚、毛髪または精液が通常の臨床検体の給源である。これらの給源は、標的がRNAである場合にも適している。血液および他の体液も、ウイルス核酸を単離するためには都合の良い給源である。標的がmRNAである場合は、試料はmRNAが発現されている組織から得られる。試料中のポリヌクレオチドがRNAである場合は、これはDNAに逆転写されるが、この方法ではDNAへの転換は必要ない。
【００２２】
プローブを電気回路に付着するには様々な方法がある。例えば本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,861,242号；第5,861,242号；第5,856,174号；第5,856,101号；および第5,837,832号に、固相支持体表面上の光を当てると外れる(photo-removable)保護基で保護された官能基(オリゴヌクレオチドについて、典型的には-OH) を活性化するために、マスクを通して光を照射する方法が開示されている。光で活性化した後、それ自身が光を当てると外れる保護基で保護された(5'-OHで)ヌクレオシド構造ブロックが、支持体の活性化された領域に結合される。この方法は、異なるマスクまたはマスク方向および構造ブロックを用いて繰り返され、支持体上にプローブを配置する。
【００２３】
あるいは、ペプチド、ポリカーボネートおよびオリゴヌクレオチドアレイのコンビナトリアルケミストリー合成の新規方法が、最近報告されている(Fodorら、Science、251:767-773(1991)；Choら、Science、261:1303-1305(1993)；および、Southernら、Genomics、13:1008-10017(1992)を参照のこと、これらは本明細書に参照として組入れられている)。これらのアレイ、または生物学的チップ(Fodorら、Nature、364:555-556(1993)を参照のこと、これも本明細書に参照として組入れられている)は、特異的化学的化合物を高密度の情報が豊富なフォーマットで正確な位置に繋ぎ止められ、かつ生体認識法の研究の強力な道具となっている。
【００２４】
好ましくは、これらのプローブは、空間的に方向づけられたオリゴヌクレオチド合成により、導線に付着される。空間的に方向づけられたオリゴヌクレオチド合成は、オリゴヌクレオチドの合成を基板上の特異的位置に方向づけるいずれかの方法により実施される。空間的に方向付けられたオリゴヌクレオチド合成の方法は、光で方向付けたオリゴヌクレオチド合成、マイクロリソグラフ、インクジェットによる塗布、特異的位置へのマイクロチャネル付着および物理的障壁による隔離(sequestration)を含むが、これらに限定されるものではない。一般にこれらの方法は、通常保護基の除去による、活性部位の形成；および、さらにヌクレオチド結合が望ましい場合には、それ自身任意に保護された活性部位を有するヌクレオチドの活性部位への結合に関係している。
【００２５】
ある態様において、導線に結合したオリゴヌクレオチドは、光で方向付けられたオリゴヌクレオチド合成により、特異的位置で合成され、これは米国特許第5,143,854号；PCT出願、国際公開公報第92/10092号；およびPCT出願国際公開公報第90/15070号に開示されている。この方法の基本的戦略において、リンカーおよび光不安定な保護基で修飾された固相支持体の表面は、フォトリソグラフのマスクを通じて照射され、照射領域に反応性ヒドロキシル基が得られる。次に3'-O-ホスホロアミダイトで活性化したデオキシヌクレオシド(5'-ヒドロキシル基が光不安定な基で保護されている)が表面に提示され、かつ露光された部位で結合が生じる。未反応の活性部位の任意のキャッピングおよび酸化の後、基板を洗浄し、かつ表面を第二のマスクを通して照射し、追加のヒドロキシル基を結合のためにリンカーに晒す。第二の5'-保護された3'-0-ホスホロアミダイトで活性化されたデオキシヌクレオシド(C-X)が表面に提示される。選択的光脱保護および結合のサイクルを、所望のプローブセットが得られるまで繰り返す。その後光不安定基は任意に除去され、かつその後この配列が任意にキャッピングされる。側鎖保護基が存在する場合は、これも除去される。フォトリソグラフを使用したので、この方法は、支持体上に高濃度で存在する標的導線に特異的に縮小化することができる。
【００２６】
この一般的方法は修飾することができる。例えば、ヌクレオチドは、これらが連結化学と共存性がある活性化されたヒドロキシル基を有する限りは、天然のヌクレオチド、化学的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであることができる。この保護基はそれ自身光不安定であることができる。あるいは、保護基は、例えば酸などの特定の化学条件下で不安定であることができる。この例において、固相支持体の表面は、露光時に酸を生成する組成物を含むことができる。従って基板領域の露光は、その領域に酸を生成し、これは露光領域の保護基を除去する。さらにこの合成法は、3'-保護された5'-O-ホスホロアミダイトで活性化されたデオキシヌクレオシドを使用することができる。この場合、オリゴヌクレオチドは、5'から3'方向に合成され、これは5'自由端を生じる。
【００２７】
露光により保護基を除去し、ヌクレオチド(任意に更なる結合と競合する)露出された活性部位に結合し、かつ任意に未反応の部位をキャピングする一般的方法は、本明細書に「光で方向付けられたヌクレオチド結合」と称される。
【００２８】
プローブ分子は、化学的および電気的方法により導線に標的化することができる。プローブは、好ましくはプローブまたはヌクレオチドが支持体材料よりもむしろ導線に結合するような、プローブまたはヌクレオチドを導線に付着する化学反応を用いて、導線に標的化することができる。あるいは、プローブまたはヌクレオチドは、プローブまたはヌクレオチドを静電気により引き付ける導線上の電荷の構築により導線に標的化することができる。
【００２９】
ヌクレアーゼを用いて、チップまたは導線の誤った位置に付着したプローブを除去することができる。より詳細には、標的核酸分子は、プローブに添加することができる。その両端がプローブに、一端が各導線に結合する標的は、自由端を有さず、かつエキソヌクレアーゼ消化に対し抵抗性がある。しかし、標的が両導線に接触できないように位置したプローブは、一端にのみ結合し、この分子は消化を受ける。従って不適切な位置にあるプローブは、適切に位置したプローブを保護している間に除去することができる。プロテアーゼが除去または不活性化された後、標的核酸分子は除去することができかつ装置はすぐに使用される。
【００３０】
興味深いのは、マイクロ流体(microfluidic)装置の組立て(fabrication)である。典型的には半導体製造技術分野の利点が、マイクロ機械構造の組立て、例えばマイクロポンプ、マイクロバルブなどに該当し、マイクロ流体装置は小型チャンバーおよび通路を有する。
【００３１】
多くの研究者が、特に遺伝子解析に関連した方法の一部の小型化において、これらのマイクロ組立て技術の活用を試みている。例えばNorthrupおよびWhiteの公開されたPCT出願国際公開公報第94/05414号は、標本からの核酸の収集および増幅のための一体化されたマイクロ-PCR装置を開示しており、その全体が全ての目的に関して本明細書に参照として組入れられている。Wildingらの米国特許第5,304,487号およびKrickaらの米国特許第5,296,375号は、細胞含有試料の収集および分析のための装置を開示している。同様の技術を用い、試料を受取り、核酸分子を放出し、その後標的配列を検出することができるチップを作成することができる。
【００３２】
マイクロ流体装置は米国特許第6,046,056号に開示されており、これは本明細書に参照として組入れられている。これらの装置は、基板表面に組立てられた一連のチャネルを備えている。これらのチャネルの少なくともひとつは典型的には、非常に小さい断面寸法、例えば約0.1μmから約500μmの範囲を有する。これらのチャネルの断面寸法は、好ましくは約0.1〜約200μmの範囲であり、かつより好ましくは約0.1〜約100μmの範囲である。特に好ましい局面において、各チャネルは少なくともひとつの約0.1μm〜約100μmの範囲の断面寸法を有するであろう。一般には直線のチャネルとして示されるが、基板上の空間の使用を最大とするためには、蛇行状、のこ歯またはその他のチャネルの幾何学的配置がより短い距離により長いチャネルを効果的に組込むことができることは正当に評価されると思われる。
【００３３】
基板表面へのこれらのマイクロスケールの構成要素の製造は、概して当技術分野において周知のマイクロ組立て技術のいくつかにより実行することができる。例えばリソグラフ技術は、フォトリソグラフエッチング、プラズマエッチングまたは湿式化学エッチングのような半導体製造業において周知の方法を使用する、例えばガラス、石英またはシリコン基板の組立てにおいて使用することができる。あるいは、レーザードリル加工、マイクロ磨砕法などのようなマイクロ機械加工法を使用することができる。
【００３４】
同様に、高分子基板について、周知の製造技術も使用することができる。これらの技術は、射出成形、または微小規模の基板の大きいシートを製造するために、例えば回転スタンプを用いて多くの基板が製造されるようなスタンプ成形法、またはマイクロ機械加工用型内で基板が重合されるポリマーマイクロ注型技術を含む。
【００３５】
これらの装置は、典型的には、導管を形成するために、様々なチャネルを封入しかつ液状封止するチャネルをつけた基板を覆う追加の平板状構成要素を備えるであろう。平板状カバー構成要素の付着は、例えば熱結合、接着を含む様々な手段で、もしくはガラスのような特定の基板、半硬質および非硬質高分子基板の場合は、2個の成分の間の天然の接着で行うことができる。この平板状カバー構成要素は、さらに特定のスクリーニングに必要な様々な流体要素を導入するためのアクセスポートおよび／または貯蔵器を備えることができる。
【００３６】
この装置はさらに、チャネルの末端に配置されかつ流体で連結された貯蔵器も備える。試料チャネルは、被験化合物を装置に導入するために使用される。多くの独立した個別の容量の化合物の試料への導入は、多くの方法により行うことができる。例えば、マイクロピペッターを用いて、被験化合物を装置に導入することができる。好ましい局面において、試料チャネルに流体で連結された電気ピペッターを用いることができる。一般に電気ピペッターは、電気浸透液の指示を利用し、多くの被験化合物または対象物質およびスペーサー化合物を交互に採取する。その後ピペッターは、個々の物理的に単離された試料を、試料チャネルへ送り、その後この装置内で操作する。
【００３７】
あるいは、試料チャネルは、複数の個別の貯蔵器に個別のチャネルを介して個々に流体により連結され得る。個別の貯蔵器は各々、タンパク質または界面活性剤のような反応体化合物を含み、適当なスペーサー化合物のためには追加の貯蔵器が備えられる。その後被験化合物、反応体化合物、および／またはスペーサー化合物が、様々な貯蔵器から、試料チャネルへと、適当な流体の方向づけスキームを用いて輸送される。
【００３８】
本発明の装置の試料収集部分は、マイクロスケールであるかどうかに拘らず、一般に試料の同定のために提供されるのと同時に、外部要素による試料の汚染か、もしくは試料による環境汚染を防ぐ。一般に、これは、分析のための試料、例えば予備増幅された試料、組織、血液、唾液などの、該装置の試料収集チャンバーへの直接導入により実施される。典型的には、試料の交差-汚染を防止することは、試料を試料収集チャンバーへ封止可能な開口部、例えば注入バルブまたはセプタムを通じての直接注入により実現することができる。一般に、封止可能なバルブが、試料注入中または注入後の漏出という脅威の可能性を低下するために好ましい。あるいは、この装置は、試料チャンバーへの試料の直接獲得のために、装置内に一体化されかつ試料収集チャンバーに連結された皮下注射針を備えることができる。これは実質的に試料の汚染の機会を減らす。
【００３９】
前述のことに加えて、該装置の試料収集部分は、更に感染性物質の中和、標本または試料の安定化、pH調節などのための試薬および／または処理を含むことができる。安定化およびpH調節処理は、例えば血液検体の凝固を防ぐためのヘパリン導入、緩衝剤の添加、プロテアーゼまたはヌクレアーゼインヒビターの添加、保存剤などを含むことができる。このような試薬は、一般に該装置の試料収集チャンバー内に貯蔵することができるか、または個別にアクセス可能なチャンバー内に貯蔵し、そこで試料を該装置に導入する際に、試料に試薬を添加または混合することができる。これらの試薬は、使用される具体的な試薬の特徴および安定性に応じて、液体または凍結乾燥された形のいずれかにおいて、装置内に混入することができる。
【００４０】
全細胞、ウイルスまたは他の組織試料が分析されるような態様において、典型的には、様々な試料の調製操作を続ける前に、細胞またはウイルスから核酸を抽出することが必要であろう。従って、試料収集に続けて、核酸を、収集した細胞、ウイルス外被などから粗抽出液へと遊離し、引き続き、その後の操作のための試料を調製するために追加処置、例えば汚染している(DNA結合)タンパク質の変性、精製、濾過、脱塩などが行われる。
【００４１】
試料の細胞またはウイルスから核酸を遊離すること、およびDNA結合タンパク質の変性は、一般に物理的または化学的方法で行うことができる。例えば、化学的方法は概して、細胞を破壊しかつ細胞から核酸を抽出するために溶解剤を使用し、引き続き抽出液をグアニジンイソチオシアネートまたは尿素のようなカオトロピック塩による抽出で処置し、あらゆる夾雑または干渉する可能性のあるタンパク質を変性する。一般に、化学的抽出および／または変性法が使用される場合には、適当な試薬は、抽出チャンバー、個別のアクセス可能なチャンバー内に混入するかまたは外部から導入することができる。
【００４２】
あるいは、物理的方法を用いて、核酸を抽出し、かつDNA結合タンパク質を変性する。本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,304,487号は、細胞膜に穴を空けかつそれらの内容物を抽出するためのマイクロチャネル内の物理的突起またはチャンバーもしくはチャネル内の鋭利に縁取った粒子の使用を開示している。より古典的な細胞抽出の方法、例えば試料が十分な流体圧でチャネルを通過する際に、細胞溶解を引き起こすような制限された断面寸法を伴うチャネルを使用するような方法も使用することができる。あるいは、細胞抽出および汚染タンパク質の変性は、交流を試料に流すことにより実施することができる。より詳細には、細胞試料が、微小管アレイを通して流されると同時に、交流が流体流動全体に流される。細胞溶解／抽出に作用するために様々な他の方法を、本発明の装置において利用することができ、これは、例えば細胞の超音波攪拌処理、または微小外形の孔を通る細胞の強制的通過、これにより細胞への高剪断応力を施し、破壊を生じることを含む。
【００４３】
抽出後、変性したタンパク質、細胞膜粒子などの粗抽出物の他の要素から核酸を分離することが望ましいことが多い。粒状物質の除去は一般に、濾過、凝集などにより達成される。様々なフィルターの種類を、該装置に容易に組込むことができる。更に、化学的変性方法が使用される場合には、次工程に進める前に、試料を脱塩することが望ましい。試料の脱塩、および核酸の単離は、通常1工程で、例えば核酸と固相との結合および混入している塩の洗浄除去または試料のゲル濾過クロマトグラフィーの実施により実現することができる。核酸結合に適した固相支持体は、例えばケイソウ土、シリカなどを含む。適当なゲル排除媒質も、当技術分野において周知であり、かつ例えばPharmacia社およびSigma Chemical社から市販されている。この単離および／またはゲル濾過／脱塩は、追加のチャンバーにおいて行うか、あるいは特定のクロマトグラフィー媒体を次の反応チャンバーに繋がっているチャネルまたは液体通路に組込むことができる。
【００４４】
あるいは、1個以上の液体通路またはチャンバーの内側表面は、例えば帯電した基、親和性結合基などのような望ましい精製に適した官能基を提供するようにそれ自身誘導することができる。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、連結法は、配列における一塩基の違いを特異的に同定するために使用することができる。これまでに、プローブ連結法により公知の標的配列を同定する方法が報告されている。N. M. Whiteleyらの米国特許第4,883,750号；D. Y. Wuら、Genomics、4:560(1989)；U. Landegrenら、Science、241:1077(1988)；および、E. Winn-Deenら、Clin. Chem.、37:1522(1991)であり、これらは本明細書に参照として組入れられている。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法(「OLA」)として公知のひとつの方法において、対象となる標的領域にまたがる2個のプローブまたはプローブエレメントは、該標的領域にハイブリダイズされる。プローブエレメントが隣接標的塩基と塩基対を形成するならば、プローブエレメントの対面端を、例えばリガーゼ処理によるような、連結により、結合することができる。連結されたプローブエレメントは、次にアッセイされ、標的配列の存在を証明する。
【００４６】
本発明において、一方または両方のプローブが、プローブの末端で配列の変異を特異的に認識するように設計することができる。標的がプローブへ結合した後、標的は、これらのプローブに結合しない分子の末端を除去するようにヌクレアーゼで処理される。その後この結合部は、リガーゼで処理される。相補的配列がプローブの末端に存在する場合は、このリガーゼは、標的をプローブに連結すると考えられる。次に試験チャンバーを、連結していない標的が変性するまで加熱することができる。その後、特異的標的の検出が行われる。
【００４７】
本発明のひとつの態様において、本明細書に参照として組入れられている米国特許出願第60/095,096号、同第60/099,506号、または同第09/315,750号において開示さているように、プローブセットは、標的核酸分子と接触されており、かつハイブリダイゼーション後、この核酸分子は、金属のような導体で被覆される。次に被覆された核酸分子は、プローブ対の間のギャップを越えて電気伝導し、その結果、標的核酸分子の存在の指標である検出可能なシグナルを生じる。
【００４８】
Braunは、銀をDNA分子に沿って付着することができることを明らかにした。3工程法が使用される。最初に銀が、Ag+/Na+イオン交換を通じてDNA分子に選択的に局在化され(Barton、Bioinorganic Chemistry (Bertiniら編集)第8章(University Science Books、Mill Valley, 1994、これは本明細書に参照として組入れられている)、かつ銀およびDNA塩基の間に複合体が形成される(Spiro(編集)、「核酸−金属イオン相互作用(Nucleic Acid-Metal Ion Interactions)」(Wiley Interscience, New York 1980; Marzeilliら、J. Am. Chem. Soc.、99:2797(1977)；Eichorn(編集)、Inorganic Biochemistry、第二巻、第33-34章(Elsevier, Amsterdam, 1973)、これは本明細書に参照として組入れられている)。イオン交換法は、標識したDNAの蛍光シグナルの消光を辿ってモニタリングすることができる。その後銀イオン-交換されたDNAは還元され、DNA主鎖への結合により凝集体を形成する。この銀凝集体は更に、写真化学において使用されているもののような常法を用いて現像される(Holgateら、J. Histochem. Cytochem.、31:938(1983)；Birellら、J. Histochem. Cytochem.、34:339(1986)、これらは本明細書に参照として組入れられている)。
【００４９】
核酸分子はそれだけで、それ自身の若干の導電性を有する。これらの特性は、電気回路の機能への有害な作用を減らすように修飾することができる(Meadeら、米国特許第5,770,369号、「核酸が媒介した電子移動(Nucleic Acid Mediated Electron Transfer)」(1998)、これは本明細書に参照として組入れられている)。核酸分子の電気特性の修飾は、これらの核酸分子の塩基間の化合物のインターカレーション、糖-リン酸主鎖の修飾、または回路エレメントが形成された後の核酸分子の切断により行うことができる。核酸分子の切断は、照射、化学的処理、または酵素的崩壊により実施することができる。γ線-照射を用いる照射は、この放射が核酸分子をコーティングしている物質を貫通するので好ましい。
【００５０】
本発明の別の局面において、核酸分子の電気伝導度は、電気シグナルの伝達によって決まる。Hans-Werner FinkおよびChristian Schoenenbergerが、本明細書に参照として組入れられているNature(1999)において、2本鎖DNAが半導体のように電気を伝導することを報告している。この電流の流れは、簡単なスイッチを構成するのに十分なものであることができる。本発明は、標的核酸分子が試料中に存在するかどうかを示す、このような核酸スイッチを基にした電気検出器を提供する。
【００５１】
標的核酸分子に対するプローブが、電気回路内に固定される。これらのプローブは、これらが互いに接触しないのに十分な距離に物理的に配置される。試験される試料は、これらのプローブと接触される。2種のプローブと配列相同性または相補性を有する核酸分子が、試料中に存在するならば、この核酸分子は、プローブ間のギャップに架橋することができる。次に検出ユニットは、この核酸分子を通って流れることができる電流を検出することができる。コンピュータユニットは、「オン」スイッチとして核酸分子の存在を検出する一方で、未架橋のプローブセットは「オフ」スイッチとなることができる。特定の標的の存在とスイッチの状態を関連付けるこの情報は、デジタルコンピュータで処理される。このコンピュータは、更に、同じ標的に対し特異的ないくつかのスイッチからの結果を解析し、結合の特異性および標的の濃度を決定することができる。この情報は、核酸分子上の生物学的物質、生物、変異体または他の対象となる標的の有無を示すことにより、ユーザーに素早く確定される。
【００５２】
検出装置は、多種多様な標的を検出することができる多くの異なるプローブセットを含むことができる。従って検出装置は、複数の標的DNA分子をスクリーニングすることができる。例えば検出装置は、複数の病原生物向けのプローブセットを備えることができる。この方法で、試料はいくつかの病原体について同時にスクリーニングされる。各プローブセットは、相補的核酸分子の有無を示す個別のスイッチであることができる。
【００５３】
細胞試料は、化学的(酵素的を含む)または物理的破壊のいずれかにより、もしくはそれらの組合せにより調製することができる。溶解後、この試料は更に処理することができる。例えば、試料は、RNaseで処理し、RNAを取り除き、DNAの検出を制限することができる。
【００５４】
これらのプローブとの接触前もしくは接触時に、試料中の核酸分子は変性される。この変性は優先的に、熱処理により生じる。変性は、担体溶液のイオン濃度を変更することによって、またはイオン処理および熱処理の組合せによっても実施することができる。
【００５５】
本発明は更に、複数の試料について使用することができるという利点も有する。このプローブセットは、プローブセットから標的DNAを剥離することにより再使用することができる。好ましい態様において、この剥離は、温度および／または塩濃度の増大により実施される。次にこのプローブセットは、別の試料の分析にそのまま使うことができる。
【００５６】
本発明の核酸分子は、優先的にDNAまたはRNA分子である。本発明において、好ましい核酸分子は、RNAおよびDNAを含む。RNA転写物はより高レベルであるので、RNA検出はより感度良くすることができる。更に、化学的に修飾された核酸分子または核酸アナログも本発明に含まれる。このようなRNAまたはDNAアナログは、2'-O-アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、3'-チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、およびニトロキシド主鎖修飾、アミド、ならびに塩基部分が修飾されたアナログを含むが、これらに限定されるものではない。加えて、オリゴマーアナログは、糖部分が修飾または他の適当な部分により置換されているようなポリマーであることができ、これは、ポリビニル主鎖(Pithaら、「ポリ(1-ビニルシトシン)の調製および特性(Preparation and Properties of Poly(1-vinylcytosine))」、Biochim. Biophys. Acta.、204:381-8(1970)；Pithaら、「ポリ(1-ビニルウラシル)：調製およびアデノシン誘導体との相互作用(Poly(1-vinyluracil): The Preparation and interactions with Adenosine Derivatives)」、Biochim. Biophys. Acta、204:39-48(1970)、これは本明細書に参照として組入れられている)、モルホリノ主鎖(Summertonら、「モルホリノアンチセンスオリゴマー：デザイン、調製、および特性(Morpholino Antisense Oligomers: Design, Preparation, and Properties)」、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187-9(1997)、これは本明細書に参照として組入れられている)、およびペプチド核酸(PNA)アナログ(Steinら、「4種のアンチセンス型の特異性の比較：モルホリノ、2'-O-メチルRNA、DNA、およびホスホロチオエートDNA(A Specificity Comparison of Four Antisense Types: Morpholino, 2'-O-methyl RNA, DNA, and Phosphorothioate DNA)」、J. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:151-7(1997)；Egholmら、「アキラルペプチド主鎖を有するペプチド核酸(PNA)-オリゴヌクレオチドアナログ(Peptide Nucleic Acids (PNA)-Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone)」、J. Am. Chem. Soc.、114:1895-1897(1992)；Faruqiら、「ペプチド核酸−マウス細胞における染色体遺伝子の標的突然変異(Peptide Nucleic Acid-Targeted Mutagenesis of a Chromosomal Gene in Mouse Cells)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95:1398-403(1998)；Christensenら、「ペプチド核酸の固相合成(Solid-Phase Synthesis of Peptide Nucleic Acids)」、J. Pept. Sci.、1:175-83(1995)；Nielsenら、「ペプチド核酸(PNA)、ペプチド主鎖偽DNA(Peptide Nucleic Acid (PNA). A DNA Mimic with a Peptide Backbone)」、Bioconjug. Chem.、5:3-7(1994)、これらは本明細書に参照として組入れられている)を含むが、これらに限定されるものではないようなポリマーを生じる。加えて連結は、下記の例証的修飾を含むことができる：ペンダント部分、例えばタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチドおよびポリ-L-リシンを含む)；インターカレート剤(例えばアクリジンおよびソラレン)、キレート剤(例えば、金属、放射活性金属、ホウ素および酸化的金属)、アルキル化剤、および他の修飾された連結(例えば、αアノマー核酸)。このようなアナログは、標的化されたRNA、結合親和力、ヌクレアーゼ抵抗性および／または標的特異性のRNAseH-媒介型破壊を改善する目的で、連結基が関与する前述の修飾および／または糖もしくは塩基の構造修飾の様々な組合せを含む。
【００５７】
ある態様において、架橋している核酸分子は、プローブに相補的な配列の間に位置した標的核酸分子の領域に相補的である核酸分子のセグメントを添加することにより、2本鎖とすることができる。リガーゼを使用して、断片を1個の分子へと連結することができる。この装置は、架橋している核酸分子を放出するために、制限エンドヌクレアーゼを通過することにより、再使用することができる。あるいは、ポリメラーゼを用いて、相補的配列を埋める(fill)ことができる。この場合、溶液は、相補鎖の合成のためのヌクレオチドを含有しなければならない。
【００５８】
各プローブセットは、2個のプローブからなる。各プローブは、オリゴヌクレオチドの1個またはそれ以上のコピーからなり、ここではそのプローブの全てのコピーが回路に付着しており、その結果、電流がプローブを通じ、回路へと流れることができる。1個のプローブ中のいずれかのオリゴヌクレオチドとそのセットで別のプローブのいずれかのオリゴヌクレオチドとの接続は回路を完成し、「オン」シグナルを生じるであろう。これらのプローブが複数のオリゴヌクレオチドコピーからなるか、および／または複数のプローブが使用されるならば、この装置を用いて、シグナル強度または活性化されたスイッチ数により、試料中の標的核酸分子のレベルを定量化することができる。
【００５９】
プローブの数は、標的核酸分子の濃度を測定するために増大することができる。例えば、数千の反復プローブを、検出ユニットにおいて作成することができる。この回路は、占有された部位の数を数えることができる。標的分子の濃度を決定するために、このユニットを使って計算を行うことができる。
【００６０】
本発明は、例えば病原体の検出のような、多くの用途に使用することができる。例えば試料は、飲料水または食品から単離され、かつ迅速に感染性生物についてスクリーニングされる。本発明は更に、ハイブリダイゼーション技術を用いたDNA配列決定にも使用される。このような方法は、米国特許第5,837,832号に開示されており、これは本明細書に参照として組入れられている。本発明は、患者から単離された試料中の突然変異または多型のスクリーニングにも使用することができる。
【００６１】
本発明は更に食品および水の検査にも使用することができる。最近、腐った肉製品の大規模リコールが数件あった。この電気的DNA検出システムは、食品中の病原体の工程中における検出と、それに続く汚染された食品の破棄のために使用することができる。これは、食品の安全性を著しく改善し、食品に起因した疾患および死亡を防止し、かつ経費のかかるリコールを避けることができる。一般的な食品に発生する病原体、例えばサルモネラ菌や大腸菌を同定することができるようなプローブを伴うチップを、食品産業において使用するために設計することができる。
【００６２】
更に別の態様において、本発明は、生物学的戦闘関連物質のリアルタイム検出のために使用することができる：最近の戦場、およびテロリストの攻撃における生物兵器使用の懸念から、本装置は、生物学的脅威の高性能な警告のために兵士の個人用センサーまたは遠隔操作センサーを構成することができる。物質を特異的に同定するために使用することができるこの装置は、モデムと組合わせ、情報を別の地域に送信することができる。可搬式装置は更に、位置と病原体の両方の情報を提供するための、グローバルポジショニングシステム(GPS)を備えることもできる。
【００６３】
更に別の態様において、本発明は、個人を確定するために使用することができる。高い信頼性で個人を識別するのに十分な数の、一連のプローブが、この装置内に配置される。様々な多型部位が使用される。優先的に、この装置は、100万分の1より高い特異性で同一性を決定することができ、より好ましくは10億分の1よりも高い特異性、さらにより好ましくは100億分の1よりも高い特異性であることができる。
【００６４】
例として、標的核酸分子の存在について、いかにして細胞試料を試験するかを示す、フローチャートを提供する：
1. 試料の注入
2. 細胞溶解
3. 溶解液の処理
4. 核酸分子の変性
4. 試料とプローブセットの接触−ストリンジェントな条件下
5. 電流がプローブセット間を移動し得るかどうかの測定
6. 電流シグナルと標的DNAの陽性確認との相関
用途に応じて、全ての工程が必要とはならないことに注意。例えば溶解は、DNAが依然細胞内に存在する場合にのみ必要である。
【００６５】
対照プローブセットは、本システムが適切に作動していることを証明するために使用することができる。このプローブセットは、試料中に生じることがわかっている配列または試料に添加された核酸分子に存在する既知の配列を認識することができる。
【００６６】
対照は、多型を有する配列の存在を決定するために特に有用である。多型を欠いている対照核酸分子を、個別の試験で比較することができる。好ましい態様において、対照配列は、該装置の個別のチャンバーにおいて同時に試験される。正確な対照配列は、わずかに高い温度でプローブとハイブリダイズするであろう。この差異は、正確な配列からの一塩基突然変異体の識別に使用することができる。この装置は、突然変異配列は結合することができないような温度での、正確な配列による結合を示すであろう。しかし、より低い温度では、両方の配列が結合するであろう。
【００６７】
更に別の態様において、基板上のヌクレオチドプローブは、無作為に選択され得る。基板と相補的な配列を含むリンカー核酸分子は、プローブおよび標的核酸分子に相補的な配列に結合した(図2参照)。従ってこのリンカーは、装置それ自身を改変することなく、任意の標的核酸配列を検出することが可能なプローブ配列を作成するために使用することができる。むしろこのリンカー分子は、試験される試料の前にでも、または試料と同時にでも、基板に結合した核酸分子に結合することができる。望ましいならば、このリンカーは、基板に結合したプローブに連結することができる。これは複数の試料でのリンカーの再使用を可能にする。
【００６８】
本発明は、細胞における遺伝子発現をモニタリングするために使用することができる。RNAレベルは、標的RNA分子と相補的なプローブを伴う複数のスイッチを用いて決定される。試料は、刺激後様々な時点で、または発生の様々な段階で採取することができる。
【００６９】
別の態様において、本発明は、核酸分子の配列決定に使用することができる。ハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)は、各部位のプローブの同一性が分かっているようなアレイを形成するための多くのプローブを表面へ付着することにより、最も効率的に実施される。次に標識された標的DNAまたはRNAは、このアレイにハイブリダイズされ、かつハイブリダイゼーションパターンが、アレイの全ての相補的プローブの同一性を決定するために試験される。ミスマッチのプローブ／標的複合体は重要ではないことを示す先行技術の内容とは矛盾するが、本発明は、ミスマッチしたプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーションシグナルが、アレイ上の完全にマッチしたプローブ／標的複合体の同一性を同定または確認するような分析法を提供する。
【００７０】
プローブアレイを使用する 核酸の配列決定技術は、PCT出願第92/10588号に開示されており、これは本明細書に参照として組入れられている。各プローブは基板上の位置的に識別できる位置に配置されている。標識された標的がこの基板に晒された場合は、これは相補的ヌクレオチド配列を含む位置で結合する。結合位置でのこれらのプローブの配列の知識により、標的核酸のヌクレオチド配列を決定することができる。この技術は、核酸プローブの非常に大きいアレイが利用される場合に、特に有効である。
【００７１】
好ましい態様において、マイクロ流体構造を有する検出チップからなる装置は、試料から核酸分子を放出することが必要であった。核酸分子は、プローブを有する検出システムを備えるチャンバーに導入される。検出スイッチは、ハイブリダイゼーション反応が得られた結果を解析することができる情報処理装置に連結されている。スクリーンのようなユーザーインターフェースが、ユーザーが結果を判読するために備えられている。加えて本装置は、標的核酸分子が由来した生物または個体に関する追加情報を、記憶装置またはアクセス可能なモデムにおいて有することができる。
【００７２】
実施例
実施例１ - 病原体を検出するための試料の調製
試験される試料を単離する。一般的試料は、患者の血液試料である。この試料を、装置に注入する。試料を、チャンバーに移動し、そこで界面活性剤により化学的に、またはプロテアーゼにより酵素的に処理し、核酸分子を試料中の細胞から遊離する。熱処理も、核酸分子の放出を促進するために使用する。その理由は、本発明において使用したタンパク質は、好ましくは熱安定性であるからである。次にこの混合物を、チップ上のフィルターに通過させ、核酸分子を部分的に精製する。
【００７３】
実施例２- オリゴヌクレオチドプローブセットの調製
各オリゴヌクレオチドプローブセットを、2個のプローブが標的核酸分子の一部と相補的であり、かつ核酸分子は、装置上の2個のプローブが結合した場合にこれらの間のギャップを架橋することができるよう、標的核酸分子のその2個の部分が十分離れて位置するように選択する。この相補的配列は、標的核酸分子が1個のプローブと結合した場合に自在に移動することができ、その結果これは第二のプローブに接近することができるように、若干長めであるように選択する。好ましくは、この分子は、ギャップに容易に架橋するのに必要な長さよりもはるかに長いようなことはない。分子の長さが増すにつれ、そこに第二のプローブが位置する機会は減少し、その理由は標的分子上の結合部位の有効濃度が、それが移動することができる容積が増大するにつれ、低下するからである。
【００７４】
各プローブセットは、前述のような位置で基板に付着しているであろう。
【００７５】
実施例３-標的核酸分子の存在の試験
前記プローブセットを、核酸分子と接触させる。試験チャンバーは、標的のプローブへの結合を促進するために小さい容量である。結合の機会を増大するために、試料は試験チャンバー中を複数回循環させる。試料は、プローブセットを含む試験チャンバー内を、標的核酸分子がプローブに結合するのに十分な低い流量で、流れるであろう。条件は、プローブの長さおよび配列によって決まる。
【００７６】
これらの条件は、プローブとの非特異的結合を排除するのに十分であるようなストリンジェンシーを持ったレベルに設定する。標的核酸分子は、ストリンジェントな条件下でプローブに接触させる。ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件は、核酸、塩、および温度による。これらの条件は、当技術分野において周知であり、かつ同一または関連したポリヌクレオチド配列を同定するため、もしくは検出するために変更することができる。低または高ストリンジェンシーのいずれかを含む多くの同等の条件は、配列(DNA、RNA、塩基組成)の長さおよび性質、標的の性質(DNA、RNA、塩基組成)、環境(溶液中、または固相基板上の固定)、塩および他の成分の濃度(例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリコール)、ならびに反応温度のような要因によって左右される。1種またはそれ以上の要因は、前記条件とは異なるが同等の低または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を作成するために変動させることができる。
【００７７】
次に試験チャンバーを、溶液で洗浄し、未結合の核酸分子を除去する。非導電性の溶液は、緩衝液により媒介された導電性を遮断することにより、偽陽性レベルを下げる。
【００７８】
次に1本の導線に電流を流すと同時に、検出器は他方の導線のシグナルを調べる。2本の導線間の電流は、標的核酸分子の存在の指標となる。
【００７９】
本明細書において、好ましい態様が詳細に描写されかつ説明されているが、当業者には、本発明の精神から逸脱しない限りは、様々な修飾、追加、置換えなどを行うことができ、従ってこれらは前記の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲内であると考えられることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の方法を図示している。2本の導線は、各々が標的核酸分子上の配列に相補的であるプローブを有するように提供される(図1A)。標的核酸分子は、2個のプローブに、相補的配列で結合する(図1B)。この相補鎖は埋められる(filled in)(図1C)。ヌクレアーゼを使用し、標的核酸分子の自由端を除去する(図1D)。電流を、この2本鎖分子を通して流すことができるか、または標的核酸分子およびプローブを導体で被覆し、その後電流の流れについて試験することができる。
【図２】  一塩基変異を識別するためにリガーゼ法を用いる、図1に示した方法の変法である。この変異は、アスタリスクで示される。工程Dの後、リガーゼを用いる。該プローブの末端に完全なマッチを有するこれらの標的のみが、連結される。連結後、試料を加熱し、連結していない標的分子を除去する(図2E)。図2Eの構造は、高温で安定しているのに対し、図2Dの連結していない構造は、熱処理下で変性される。
【図１】
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【図２】
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