(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ組織サンプルから遺伝物質を抽出し；その抽出された遺伝物質を試験してウイルスからのいずれかの遺伝物質を検出することを含む、ニワトリ組織サンプル中のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の検出方法であって、ニワトリ組織サンプルが腋窩域の１またはそれ以上のフェザーから誘導されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
サンプル中のウイルスの量についての量的情報が得られるところの、請求項１記載のウイルスの検出方法。
【請求項３】
ＭＤＶがＭＤＶ血清型１ であるところの、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＭＤＶ血清型１がＭＤＶ−１リスペンス株ＣＶＩ９８８ であるところの、請求項３記載のＭＤＶの検出方法。
【請求項５】
（ｉ）核酸ポリメラーゼ用のフォワードおよびリバースプライマーを準備し、ここで該プライマーはＭＤＶの１３２ｂｐ反復ヌクレオチド配列を側面に有するヌクレオチド配列より選択され；
（ｉｉ）そのプライマーの間の核酸配列を増幅させ；
（ｉｉｉ）その増幅された核酸配列中の１３２ｂｐ反復配列の数を検出し；および
（ｉｖ）１３２ｂｐ反復配列の数をウイルス核酸の独自性と関連付け、それにより組織サンプル中のＭＤＶの型を同定する
ことを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）ウイルス−特異的標的ポリヌクレオチドと特異的に結合する能力を有するポリヌクレオチド配列を得；
（ｂ）その抽出された遺伝物質をプローブと接触させ、それにより該プローブをその標的ウイルスポリヌクレオチドと特異的に結合させ；
（ｃ）該プローブがその標的ウイルスポリヌクレオチドと結合したかどうかを測定し；
（ｄ）該標的ポリヌクレオチドの存在がサンプル中での該ウイルスの存在を示すことを基礎として、そのサンプルが該ウイルスを含有するかどうかを決定する
ことを含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
プローブが標的ポリヌクレオチドと結合したかどうかを測定する工程（ｃ）が、プローブの結合部位を含む、標的ポリヌクレオチドの領域を増幅させることを含むところの、請求項６記載の方法。
【請求項８】
増幅が以下のプライマー：
フォワードプライマー（ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ）
リバースプライマー  （ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ）
によりプライムされるところの、請求項７記載の方法。
【請求項９】
プローブが、配列
５’  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＣＧＡ  ＣＴ  ３’
を有するところの、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
プローブを蛍光的に標識し、そのプローブが標的ポリヌクレオチドと結合するかどうかを測定する工程が該プローブの蛍光の発光を測定することを含むところの、請求項６ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＣＲ反応の使用を含むところの、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のウイルスの検出方法。
【請求項１２】
ＰＣＲ反応に付す前に、試験される抽出された遺伝物質を１またはそれ以上のウシ血清アルブミン；ブタアルブミン；およびヒツジアルブミンから選択される薬剤で処理し、存在する可能性のあるいずれかのフェザー組織因子の阻害作用を克服するところの、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はアッセイ法、特に、トリ組織サンプル中の、ウイルス、とりわけマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の存在を検出する方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
マレック病ウイルス（ＭＤＶ）は、ニワトリにてリンパ増殖性疾患を引き起こす、ヘルペスウイルスである。ＭＤＶに対するワクチンを導入した後であっても、その感染はなおも養鶏業にてかなりの損害をもたらす。ＭＤＶは３種の血清型に分類され、そのすべては致死感染を確立している。血清型１は発癌ウイルスを包含し、血清型２は非発癌ウイルスを包含し、血清型３はターキーヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を包含する（Bulowら（１９７６）Zentralblatt fur Veterinarmedizin、２３B、３９１−４０２）。
【０００３】
マレック病の従来の診断は臨床的徴候および病理的異変に基づくものである。しかしながら、ＭＤＶの有病率を観察するためのより具体的な方法が望ましいであろう。寒天ゲル沈降試験によるフェザー濾胞上皮中のウイルス抗原の検出方法がHaiderら（１９７０）Poultry Science、４９、１６５４−１６５７に記載されている。種々の血清型を寒天ゲル沈降試験により識別することができる（Leeら（１９８３）Journal of Immunology、１３０、１００３−１００６）が、その試験の感度は酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）およびＤＮＡハイブリダイゼーションの感度よりも低い（Davidsonら（１９８６）In: Current research on Marek's disease.  Proceedings of the 5th International Symposium on Marek's Disease（３１１−３１６頁）  Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.）。
【０００４】
ウイルスを単離するための好ましいサンプルは、感染しやすい一次細胞培養物と一緒に培養することができる、軟層細胞である。つづいて、免疫蛍光検定（Kitamotoら（１９７９）Biken Journal、４、１３７−１４２）またはＥＬＩＳＡ（Chengら（１９８４）Avian Disease、４、９００−９１１）をＮＤＶ血清型の同定に用いることができる。また、血清型は制限エンドヌクレアーゼ分析（Rossら（１９８３）Journal of General Virology、６４、２７８５−２７９０）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Wangら（１９９３）Molecular and Cellular Probes、７、１２７−１３１）により同定することもできる。インサイチュハイブリダイゼーションが感染組織中のＭＤＶゲノムの検出に用いられるが（Endohら（１９９６）Journal of Veterinary Medical Science、５８、９６９−９７６；Rossら（１９９７）Journal of General Virology、７８、２１９１−２１９８）、この技法はルーチンな診断にはおそらく面倒である。（Davidsonら（１９９５）Avian Pathology、２４、６９−９４；Davidsonら（１９９６）In: Current research on Marek's disease.  Proceedings of the 5th International Symposium on Marek's Disease（３１１−３１６頁）  Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.）ＭＤＶ血清型１−特異的ＰＣＲ技法を市販のニワトリおよびターキーの集団からの純血および腫瘍組織サンプルに適用すると、その大部分は腫瘍疾患を有した。Wangら（１９９３）Molecular and Cellular Probes、７、１２７−１３１；Young, P. & Gravel, J.（１９９６）In Current research on Marek's disease（３０８−３１０頁）、Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.；およびSilva, R.F. & Witter R.L.（１９９６）In: Current research on Marek's disease.  Proceedings of the 5th International Symposium on Marek's Disease（３０２−３０７頁）  Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.、ＭＤＶ血清型１−特異的ＰＣＲプロトコルを実験的にＪＭ／１０２菌を接種したニワトリの種々の組織に適用した。
【０００５】
Handbergら（２００１）Avian Pathology ３０：２４３−２４９は、ニワトリにてＭＤＶを検出するための血清型１−および３−特異的ＰＣＲの使用を記載する。血液から（軟膜細胞）、脾臓、肝臓、皮膚、フェザー先端および卵巣から組織サンプルを採取した。
【０００６】
（発明の記載）
本発明は、トリ組織サンプル中の、ウイルス、とりわけＭＤＶを検出するさらなる方法を提供する。
第一の態様において、本発明は、トリ組織サンプルから遺伝物質を抽出し；その抽出した遺伝物質を試験してウイルスから由来の遺伝物質を検出することを含む、トリ組織サンプル中のウイルスの検出方法であって、そのトリ組織サンプルが腋窩域の１またはそれ以上のフェザーから誘導されることを特徴とする、方法を提供する。
フェザーサンプルを用いることにより、生きている動物にて試験を行うことができる。フェザーのサンプリングは現場の条件下で、簡単で、迅速であり、かつ実践的である。フェザーのサンプルを適当な容器に入れ、所望により直ちに試験することも、あるいは将来の試験のために貯蔵しておくこともできる。反対に、血液のサンプリングは、血液の冷却下での輸送、条件の調節を含め、血餅形成を防止するために多大な注意を必要とする。血液凝固は負の試験結果をもたらす。脾臓および腫瘍サンプルなどの内臓サンプルは氷上で輸送されなければならず、現場の条件下では実践できない。
【０００７】
腋窩域のフェザーを選択し、それから組織サンプルを誘導することにより、本発明は、鳥の別の部分から組織サンプルを採取する既知の方法に比べて有意な利点を提供する。
意外にも、本発明者らは、ウイルスが他のフェザーよりも腋窩域のフェザーにて高レベルで検出され得ること、したがって、本発明によれば腋窩域のフェザーにて、他のフェザーを含め、他の組織サンプルでは検出され得ない、ウイルスを検出しうることを見出した。したがって、本発明の方法は、腋窩域のフェザー組織サンプルにおけるワクチン株の存在を検出することにより、鳥の集団がＭＤＶワクチンで効果的に免疫処理されている程度をモニター観察するのに特に適している。
「トリ」なる語は、いずれの鳥も含むが、好ましくは市販されている鳥であり、とりわけニワトリ、ターキー、アヒルなどの家禽類である。
【０００８】
「腋窩域のフェザー」なる語は、添付したフェザーの図面（図１）にて「腋窩」と付記される鳥の一の領域に位置するフェザーを意味する。好ましくは、選択される腋窩域のフェザーは、「ピンフェザー」、すなわち、未成熟なフェザーである。「ピンフェザー」なる語は当業者にはよく知られている。例えば、van Tyne & Berger AJは（１９５９）Fundamentals of Ornithology, John Wiley, New Yorkにて、「未だ完全に被鞘のない、新たに成長しているフェザー」としてのピンフェザーに言及している。Lucas AM & Stettenheim PRは（１９７２）Avian Anatomy, Integument Part 1, US Government Printing Office, Washington, １９９−２００頁にて、"The new feather is tightly furled inside a sheath while it forms.  As it appears above the skin, it has a long conical shape with a blunt tip and slightly moist surface.  A feather at this stage in any generation is often called a pin feather"との見解を示している。（さらに、図１（ａ）を参照のこと、これはLucas & Stettenheim （１９７２）から採用したものである）。
腋窩域のフェザーは有利には一月に満たないヒヨコから採取するのが好ましい。
【０００９】
好ましい具体例において、該方法は、免疫付与した後の１３日目またはそれ以前の、好ましくは免疫付与した後の８日と１２日の間の、より好ましくは免疫付与後の９日ないし１１日の間の、すなわち、免疫付与後の９日、１０日または１１日目のヒヨコから採取したサンプルで行われる。
好ましくは、該方法はサンプル中のウイルス、特にＭＤＶの量についての量的情報を提供する。
好ましくは、該方法はＭＤＶ血清型１に対して特異的であり、より好ましくは該方法はＭＤＶ−１リスペンス株ＣＶＩ９８８に特異的である。後者の株はFort Dodge, IA, USAで産生されている、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（ＡＴＣＣ）、Mannassas, VA, USAから入手可能な、市販のワクチン株である。
【００１０】
該方法はＰＣＲ反応の使用を含むことが有利である。好ましくは、該ＰＣＲ反応を行う前に、試験に付される抽出された遺伝物質を薬剤で処理し、存在する可能性のあるフェザー組織因子の阻害作用を克服する。この阻害作用はメラニンと関連しているようであり、したがって、褐色の鳥のフェザーをサンプルとする場合に特に問題とすることができる。好ましくは、該薬剤を１またはそれ以上のウシ血清アルブミン、ブタアルブミンおよびヒツジアルブミンから選択する。
【００１１】
当業者であれば、Handbergら（２００１）前掲の方法のような、本発明の方法にて用いることのできるウイルス、特にＭＤＶ、遺伝物質を検出するための一連の検出方法を認識するであろう。ＭＤＶ−１株ＣＶＩ９８８を検出するための特に好ましい方法は次のとおりである：
（ｉ）核酸ポリメラーゼ用のフォワードおよびリバースプライマーを準備し、ここで該プライマーはＭＤＶの１３２ｂｐ反復ヌクレオチド配列を側面に有するヌクレオチド配列から選択され；
（ｉｉ）そのプライマーの間の核酸配列を増幅させ；
（ｉｉｉ）増幅された核酸配列中の１３２ｂｐ反復配列の数を検出し；および
（ｉｖ）１３２ｂｐ反復配列の数をウイルス核酸の独自性と関連付け、それにより組織サンプル中のＭＤＶの型を同定する。その１３２ｂｐ反復配列の複本がＭＤＶ−１株ＣＶＩ９８８の指標である。
【００１２】
本発明に係るＭＤＶの検出にて用いるための好ましい定量方法は：
（ａ）ＭＤＶ−特異的標的ポリヌクレオチドと特異的に結合する能力を有するポリヌクレオチド配列を得；
（ｂ）その抽出された遺伝物質をプローブと接触させ、それにより該プローブをその標的ウイルスポリヌクレオチドと特異的に結合させ；
（ｃ）該プローブがその標的ＭＤＶポリヌクレオチドと結合したかどうかを決定し；
（ｄ）標的ポリヌクレオチドの存在がサンプル中でのＭＤＶの存在を示すことを基礎として、そのサンプルがＭＤＶを含有するかどうかを決定する
ことを含む。
【００１３】
工程（ｄ）は、好ましくは、サンプル中のウイルスの量の定量測定を提供する。
有利には、プローブが標的ポリヌクレオチドに結合したかどうかを決定する工程は、プローブの結合部位を含む、標的ポリヌクレオチドの領域を増幅させることを含む。
好ましくは、プローブは、配列５’  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＣＧＡ  ＣＴ３’（配列番号１）を有する。
【００１４】
好ましくは、増幅は以下のプライマーによりプライムされる：
ＧＡ株Ｍｅｑ遺伝子配列のＮＴ位置１３４１−１３６１にある、フォワードプライマー（ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ−配列番号２）；
ＧＡ（Georgia）株は、ジョージアより、卵巣腫瘍から由来の１９６４単離体である；参考文献：C.S.Schmittle（１９６８）Studies on acute Marek's disease. I. Characteristics of isolate GA in chickens. Avian Diseases １２；４６７−４７６。
リバースプライマー  （ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ−配列番号３）はＮＴ位置１４１３−１３９３にある。
【００１５】
有利には、該プローブは蛍光標識されており、該プローブが標的ポリヌクレオチドに結合するかどうかを決定する工程は該プローブの蛍光の発光を測定することを含む。
【００１６】
２種の蛍光色素を短鎖オリゴプローブの対向端に直接コンジュゲートさせることにより物理的に接近させる（５’レポーター蛍光色素、通常６−ＦＡＭおよび３’クエンチャー蛍光色素、通常ＴＡＭＲＡ）。４８８ｎｍで高エネルギーのフルオロフォア（ＦＡＭ）が励起されると、５２０ｎｍで放出されると考えられる蛍光の代わりに、捕獲されたエネルギーが低エネルギーのフルオロフォア（ＴＡＭＲＡ）に移され、５８０ｎｍで放出される（蛍光共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴが起こる）。フルオレセイン／ローダミンのレポーター／クエンチャーのコンビネーションを用いると、たとえ、それらの基が２５−３０個の塩基のＤＮＡで分けられているとしても、ＦＲＥＴは効果的に生じるであろう。ＴａｑＭａｎＴＭアッセイを行う間、２つのフルオロフォアをＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ作用により相互に物理的に分離させる。その後に４８８ｎｍで刺激することで５２０ｎｍで可視できるＦＡＭ放射がもたらされる。
【００１７】
通常、二元標識のプローブはＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥまたはＶＩＣなどの５’−レポーター色素を有し、ＴＡＭＲＡまたはＤａｂｃｙｌ（万能クエンチャー）などの３’−クエンチャー基を有する。
適当な蛍光標識は当業者の常識の範囲内にある。以下の試薬はSigma-Aldrich, UKから入手可能である：ＨＥＸはヘキサクロロ−フルオレセインを意味し；ＴＥＴはテトラクロロフルオレセインを意味し；Ｊｏｅは６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインであり；ＲＯＸは５−カルボキシローダミンであり；Ｄａｂｃｙｌは４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸である。
これらすべての構造およびさらなる情報は、モレキュラープローブのウェブサイトｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ．で利用可能である。ＶＩＣ色素はApplied Biosystemsから入手可能である。
【００１８】
６−ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン；（ホスホルアミダイト）；黄緑色色素；最大吸収＝４９４ｎｍ、最大放出＝５２５ｎｍ
ＨＥＸ：ホスホルアミダイト；桃色色素；最大吸収＝５３５、最大放出＝５５６
ＴＥＴ：ホスホルアミダイト；橙色色素；最大吸収＝５２１、最大放出＝５３６
ＶＩＣ：最大吸収＝５３８、最大放出＝５５４
ＪＯＥ：最大吸収＝５２１、最大放出＝５４７
ＴＡＭＲＡ：６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン；最大吸収＝５５５、最大放出＝５８０
Ｄａｂｃｙｌ：最大吸収＝４５３、最大放出なし（万能クエンチャー）
【００１９】
上述した記載より、本発明の方法の重要な態様が、ウイルス、特にＭＤＶ感染の検出に従来用いられたトリ組織サンプルよりも都合がよく、かつ有用であるトリ組織サンプルの使用にあることは明らかであろう。したがって、本発明のさらなる態様はトリ組織サンプルの提供に関する。
【００２０】
第二の態様において、本発明は、腋窩域からの１またはそれ以上のフェザーから単離されるトリ組織サンプルを提供する。
「単離」なる語は、組織サンプルが、通常、天然において結びついている、実質的な量の物質を含まないという意義を包含する。例えば、組織サンプルは容器中に貯蔵されていてもよく、あるいは種々の単離、抽出および／または精製方法により最初の腋窩域のフェザーから誘導されるものであってもよい。
好ましくは、単離された組織サンプルは近位部（皮膚に付着し、髄質を含有する羽枝以外の部分−添付図面を参照のこと）からなる。したがって、腋窩域のフェザーの近位部はフェザーの遠位（羽枝のある）部から離されていることが好ましい。これは、単にフェザーの近位部を鋏でカットし、その遠位部を除去することで容易になされる。
【００２１】
第三の態様において、本発明は、トリ組織サンプルからの遺伝物質含有のエキスであって、本発明の第二の態様に関連して記載されるような組織のサンプルから採取されるエキスを提供する。
本発明の第二および第三の態様に係るサンプルは当該分野にて収集および／または調製されるか、または調製および試験のための研究室などの別の場所に移されてもよいことがわかる。かくして、本発明のさらなる態様は、別の場所への輸送に適する形態にて貯蔵された本発明の第二および／または第三の態様によるサンプルに関する。
【００２２】
フェザーは完全な状態にて（例えば、２０ｍｌのステリリン製万能プラスチックチューブ中にて）、あるいはＤＮＡ調製に必要な近位部を切り離した後に（例えば、１ｍｌのエッペンドルフスナップ−キャップまたはスクリュー−キャップのチューブ中にて）貯蔵することができる。別法として、フェザーは熱密閉または熱閉鎖のプラスチックバッグにて貯蔵することもできる。短期の貯蔵の場合（例えば、１週間）、フェザーは４℃で貯蔵することもできるが、長期に及ぶ貯蔵の場合には、−２０℃で貯蔵しなければならない。
ＤＮＡは、スクリューキャップまたはスナップキャップの０．５ｍｌまたは１．５ｍｌのエッペンドリフチューブ中、トリス−ＥＤＴＡバッファーにて、もしＤＮＡをＴａｑｍａｎ分析に用いることを予定しているならば、ＥＤＴＡはＴａｑｍａｎ反応を阻害するから、水中にて、−２０℃で貯蔵しなければならない。
【００２３】
該方法の結果は明瞭なフォーマットで提供されるのが有利である。該結果は情報キャリアに記録または格納されるのが好ましい。しかしながら、該結果を提供する工程は、その結果を口頭で連絡することによってもできる。
「情報キャリア」なる語は、紙、コンピュータディスクなどの情報を格納する手段；ｅ−メイルまたはインターネットページなどのインターネットを基礎とする情報転送システム、あるいは電子ファイル等を包含する。もちろん、「明瞭なフォーマット」はまた、近似鍵を用いて解読することのできる暗号化された情報を包含する意図もある。
【００２４】
本発明の特定の態様を具現化する実施例を、次の図面を参考にして記載する。
図１（ａ）は、最初の４世代の、皮膚上でのフェザーの発達を示す。白丸はまだ成長しているフェザーを示す；黒丸は完全に成長しているフェザーを示す。
図１（ｂ）は腋窩域を示すニワトリのフェザーパターンの図である。
腋窩域はニワトリの下面にあり、各側面にて、頚部下部から腹部上部まで、翼の下にあって、胸骨に沿って伸長する。図１は「Bird Structure: An approach through evolution development and function in the fowl」D.A.Ede, Publisher: Huntchinson Educational, 1964の本を引用している。このフェザーパターンはすべての鳥で同じである。
【００２５】
図２（ａ）ないし２（ｄ）は腋窩域のフェザーの写真であり、個々のフェザーをクローズアップしており、その部分が本発明に係る組織サンプルを提供するように保持されていることを明らかにする。図２（ａ）および２（ｂ）は腋窩域のフェザーを示す。図２（ｃ）および２（ｄ）は分析のために採取したフェザーの部分を示す。
【００２６】
図３はＴａｑｍａｎ技法を用いてＭｅｑプライマー（７８ｂｐ産物）で検出されるような血清型ＣＶＩ９８８ワクチンの用量応答を示す。ＣＶＩ９８８ワクチンは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターから採取された。
Ｍｅｑ  Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブのセットの使用を試験／最適化するためにこの試験を行った。ＢＡＣ１０ＤＮＡを標的ＤＮＡとして用いた。というのも、該ＤＮＡはウイルスゲノムの多くのコピーを含むことが知られているからである。
Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて細菌人工染色体（ＢＡＣ１０）にクローンされたリスペンスウイルスゲノムから由来のＭｅｑ遺伝子をＤＮＡにて検出した。このＤＮＡを１０倍に希釈して用いた。リアルタイムＰＣＲの各サイクルの間に、レポーター蛍光色素ＦＡＭが放出され、蛍光を発生させることができる。したがって、各サイクルと共に蛍光強度は増加する。Ｃｔ値（蛍光が一定の閾値を越える際のサイクル数）は標的配列の初発コピー数を測定したものである。Ｃｔ値が低ければ低いほど、標的配列の初発コピー数は高くなる。４０というＣｔ値は、標的配列がないか、あるいは標的配列が検出不能な量で存在することを示す。この図面はこのＤＮＡ調製物を１：１０と１：１００００の間に希釈することで検出可能な量のＭｅｑ  ＰＣＲ産物が得られたことを示す。Ｃｔ値はＤＮＡの希釈と共にますます直線的に増加する。
【００２７】
図４は、ＣＶＩ９８８ワクチンのニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）および細菌人工染色体（ＢＡＣ）での用量応答を示す。リスペンス−ＭＤＶ感染細胞から由来のＤＮＡでＭｅｑ  Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブのセットの使用を試験／最適化するためにこの実験を行った。
Ｔａｑｍａｎ検定を用いて、ＢＡＣ１０から由来のＤＮＡにて、リスペンスＭＤＶ感染のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）から由来のＤＮＡにてＭｅｑ遺伝子を検出した。この図面は、ＢＡＣ１０ＤＮＡおよびリスペンス感染のＣＥＦＤＮＡの両方で、ＤＮＡの希釈と共にＣｔ値がますます直線的に増加することを示す。
【００２８】
図５はＣＶＩ９８８のニワトリ脾臓およびＣＥＦでの用量応答を示す。この実験を行ってリスペンス−ＭＤＶに感染したニワトリの組織サンプルから由来のＤＮＡに対するＭｅｑＴａｑｍａｎプライマー／プローブのセットの使用を試験／最適化した。
Ｔａｑｍａｎアッセイを用いてリスペンス−予防接種されたヒヨコ（１１ｄｐｉ）および一匹の年適合の予防接種されていないヒヨコの脾臓からのＤＮＡにてＭｅｑ遺伝子を検出した。リスペンス−感染のＣＥＦ細胞からのＤＮＡを陽性対照として用いた。ＤＮＡを１ｍｇ／ｍｌのストックにて１０倍に希釈して用い、反応につき１μｌを用いた。予防接種されていない脾臓ＤＮＡについてのＣｔ値は４０より低いが、そのＣｔ値はＤＮＡの濃度の上昇と共に上昇しないのは明らかであった。しかし、予防接種された脾臓ＤＮＡでのＭｅｑ検出は、ＤＮＡをニートにて、または１：１０の希釈度で用いた場合に、この基線よりも有意に上昇した。本発明者らは、このように、ＭＤＶ−予防接種されたヒヨコの組織サンプルより摂取したＤＮＡをＴａｑｍａｎ分析に付して、１ｍｇ／ｍｌのストックから１μｌのＤＮＡ、反応当たり１μｇのＤＮＡを使用することを確立した。
【００２９】
図６は感染後１５−２０日目にピークを示すニワトリのフェザーにおけるＣＶＩ９８８ワクチンの複製の経時変化を示す。この実験を行ってＴａｑｍａｎアッセイにより予防接種されたヒヨコの腋窩域のフェザー中のリスペンスＭＤＶ感染の経時変化を追跡した。
Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて、リスペンスで予防接種した後の０（予防接種の前）、１０、１５、２０および２８ｄｐｉでのヒヨコのフェザーチップから調製されたＤＮＡのＭｅｑ遺伝子を検出した。各時点で（０ｄｐｉでは４匹のヒヨコ）一群５匹のヒヨコをサンプルに付した。１μｇのＤＮＡをＴａｑｍａｎアッセイに用いた。各群の平均Ｃｔ値をプロットする。Ｃｔ値は０−１５ｄｐｉで減少し、ついで１５−２０ｄｐｉでピークを示して２０−２８ｄｐｉで再び上昇する。
【００３０】
図７：
この実験を行い、１３２ｂｐの反復ＰＣＲによる予防接種されたヒヨコのフェザー腋窩域におけるリスペンスＭＤＶ−感染の経時変化を追跡した。
リスペンスで予防接種されたヒヨコのフェザーチップから０（予防接種の前）、１０、１５、２０および２８ｄｐｉでのＤＮＡを調製した。各時点で（０ｄｐｉでは４匹のヒヨコ）一群５匹のヒヨコをサンプルに付した。１μｇのＤＮＡをＰＣＲ（反応当たり１０μｇのＢＳＡを含む）にて用い、サンプルを臭化エチジウム含有の１％アガロースゲル上で泳動させた。
（Ｍ）＝ラムダ分子サイズマーカー、（−）＝水（負の対照）、（＋）＝リスペンスＢＡＣ１０ＤＮＡ（正の対照）。感染後の日数をゲルの下に示す。
（ａ）各ＤＮＡサンプルのＰＣＲ−定性および定量を確認するために、ＰＣＲを行い、すべてのニワトリ細胞中に存在する内因性レトロウイルス配列を検出した。３６０ｂｐの内因性レトロウイルス産物をすべてのフェザーサンプルより検出し、各サンプルのＰＣＲ−定性を確認した。
（ｂ）１３２ｂｐの反復ＰＣＲを行った。（＋）と付記されたレーンはリスペンスＢＡＣ１０を用いて得られた１３２ｂｐの反復はしご型ＰＣＲ産物を示す−６個のコピーが明確に区別される。４匹の予防接種していないヒヨコのうち３匹がそうであるように、負の対照はＰＣＲ産物を示さない。４番目の予防接種していないヒヨコは反復の３コピーに相当するぼんやりとした産物バンドを示し、そのことはヒヨコが同じ部屋に収容されていた予防接種されたヒヨコによって接触感染されたことを示す。予防接種されたヒヨコはすべて１１、１５、２０および２８ｄｐｉで１３２ｂｐの反復に陽性であった。多くのケースにて優勢である特定の反復数を示すＰＣＲ産物およびこの優勢な産物により示されるコピーの数はサンプル間で変化した。このことは、一定の反復の数を有する、接種ウイルスのサブクローンが異なるヒヨコにて優勢となったことを意味する。
【００３１】
図８はリスペンスＢＡＣ１０ＤＮＡを用いるＭｅｑ遺伝子反応についての標準曲線を示すグラフである。
【００３２】
図９はワクチン接種後、（Ａ）８、（Ｂ）１３、（Ｃ）１９および（Ｄ）２６日で個々のヒヨコの種々のフェザー域にあるリスペンスウイルス負荷を比較して示すグラフである。
【００３３】
図１０は（Ａ）対数目盛および（Ｂ）均等目盛としてプロットしたＭｅｑ遺伝子についてのリアルタイムＰＣＲによって決定される種々のフェザー域でのリスペンスウイルス負荷を示すグラフである。４羽のワクチン接種したヒヨコについての平均値（＋ＳＥＭ）。
【００３４】
実施例１：ＭＤＶ−１についての定性ＰＣＲアッセイ
ＴａｑｍａｎＴＭ定性ＰＣＲは、蛍光閾値（Ｃｔ値により数学的に特定される）に到達するのに必要とされるＰＣＲサイクルの数を決定することにより初発のＰＣＲ標的の数を定量するのに用いられる確立された技法である。サンプル中の標的配列のコピー数が高ければ高いほど、Ｃｔ閾値に到達するのに必要なＰＣＲサイクルの数は小さくなる。
【００３５】
ＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブはＭＤＶ株ＧＡ（後記参照）のＭｅｑ遺伝子配列より設計された。この配列は、Johns D, Lee L, Liu JL, Kung HJ, Tillotson JK、Marek disease virus encodes a basic-leucine Zipper gene resembling the fos/jun oncogenes that is highly expressed in lymphoblastoid tumors、Proc Natl Acad Sci USA、1992 May 1; 89 (9): 4042-6にて公開されている。その受入番号はＭ８９４７１（配列番号９）である。Ｍｅｑ配列から最適なプライマー／プローブの配列を選択するのに、The Applied Biosystems 'Primer Express' ソフトウェアを用いた。
この分析に用いられる特定のプライマーはＭＤＶ血清型１ウイルスのｍｅｑ遺伝子における７３ｂｐ配列を増殖させる。この領域はワクチン株およびフィールド単離株の両方に共通である。
記載されている実験では、血清型１マレック病ウイルスの一例としてＣＶＩ９８８ワクチンを用いる。その結果はすべての血清型１マレックウイルスに適用することができる。というのも、プライマーが拮抗して方向付けられる配列の領域はＭＤＶ血清型１ウイルスに保存されているからである。
【００３６】
フェザーチップサンプルについてのＴａｑｍａｎ  ＴＭＭｅｑ遺伝子ＰＣＲ分析用プロトコル
１．必要な材料
試薬：
・ＴＮＥバッファー（室温で貯蔵）はトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有し、そのｐＨをＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整する。
・ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０％溶液（室温にて貯蔵）
・プロテイナーゼＫ（シグマ番号Ｐ−６５５６からの凍結乾燥された粉末；水中２０ｍｇ／ｍｌのストックを構成する；―２０℃で貯蔵）
・シグマ（カタログ番号Ｐ−４５５７）より得られるｐＨ７．９のフェノール（４℃で貯蔵）
・クロロホルム（−２０℃で貯蔵）
・ｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウム（室温で貯蔵）
・濾過されたニートなエタノール（室温で貯蔵）
・濾過された７０％冷却エタノール（４℃で貯蔵）
・ＰＣＲ用水
・８００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する、濾過されたＰＣＲ用水
・氷
【００３７】
・ＴａｑｍａｎＴＭＰＣＲコア試薬−ＴａｑｍａｎＴＭバッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑポリメラーゼ、ウラシル−グリコシラーゼ（パーキン・エルマー・バイオシステムズ）
Ｍｅｑフォワードプライマー  ５’  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ３’（配列番号２）（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）
Ｍｅｑリバースプライマー    ５’  ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ３’（配列番号３）（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）
Ｍｅｑプローブ  ５’ＦＡＭ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＧ  ＣＧＡ  ＣＴ  ３’（配列番号１）ＴＡＭＰＡ（Sigma-Genosys Ltd）（ＦＡＭ６ＴＡＭＲＡは蛍光タグである）
【００３８】
６−ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン；（ホスホルアミダイト）；黄緑色色素；最大吸収＝４９４ｎｍ、最大放出＝５２５ｎｍ
ＴＡＭＲＡ＝６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン；最大吸収＝５５５、最大放出＝５８０
５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ標識プローブは、Sigma-Genosys Ltd.（London Road, Pampisford, Cambridgeshire, CB2 4EF, UK. Tel. 01223 839200）から入手可能である。
５’ＶＩＣ−３’ＴＡＭＲＡ標識プローブは、Applied Biosystems Ltd.（Kelvin Close, Birchwood Science Park North, Washington, Cheshire, WA3 7PB）から入手可能である。
【００３９】
他の供給者は：
・Integrated DNA Technologies（IDT）1710 Commercial Park, Coralville, IA, 52241, USA
・Oswel Research Products Ltd.: Lab 5005, Medical and Biological Science Building, University of Southampton, Boldrewood, Bassett Crescent East, Southampton, SO16 7PX, Tel: 02380 592984
である。
【００４０】
装置
・ステリリン製２０ｍｌプラスチック万能チューブ
・清潔な鋏およびピンセット
・５０℃に設定した水浴
・マイクロ遠心分離機
・１．５ｍｌのスナップ−キャップエッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・１．５ｍｌのスクリュー−キャップエッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・０．５ｍｌのスナップ−エッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・真空／凍結乾燥器（不可欠ではない）
・分光光度計
・専用のＰＣＲキャビネット、ピペットおよびオートクレーブ処理したチップ
・熱−高速９６−ウェルＰＣＲプレートおよびキャップ（Perkin Elmer/Applied Biosystems）
・ＡＢＩプリズム７７００シーケンス検出器（Perkin Elmer/Applied Biosystems）
【００４１】
２．フェザーの収集
・各ニワトリの上腕羽域から８−１０本の「ピン」フェザー（多くの髄質のついた短く、新たに成長しているフェザー）を引き抜く（図面を参照のこと）。
・研究所に送り返すためにフェザーをプラスチック「万能」チューブに入れる。
【００４２】
３．フェザーチップからのＤＮＡ調製
・約１ｃｍのフェザー（すなわち、皮膚に付着し、髄質を含有する羽枝以外の部分−写真を参考）を切断して保存する。フェザーの遠位の羽枝の部分は処分する。
・各ニワトリについて、８−１０の保存したフェザー端を１．５ｍｌのスナップ−キャップエッペンドルフチューブに入れる。
・（使用直前にプロテイナーゼＫを加える）プロテイナーゼＫ（１００μｇ）含有の５００μｌのプロテイナーゼＫサンプルバッファー（０．５％ＳＤＳを含有するＴＮＥバッファー）を添加する。
・水浴中、５０℃で１．５−２時間インキュベートする。
・該チューブをマイクロ遠心分離に付し、フェザーチップおよび残骸を「ペレット」状にする。
・上澄みを新たなスナップ−キャップチューブに移す（フェザーが褐色の鳥から由来するのであれば、その上澄みはメラニンがあるため褐色であろう）。
・等容量（５００μｌ）のフェノールを再び該上澄みに添加する。
・渦流させる。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付す。
・上相（水相）を新たなスナップ−キャップチューブに移す。
・等容量（５００μｌ）のフェノールを再び該上澄みに添加する。
・渦流させる。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付す。
・上相（水相）を新たなスナップ−キャップチューブに移す。
・等容量（５００μｌ）の冷クロロホルムを添加する。
・渦流させる。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付す。
・上相を１．５ｍｌのスナップ−キャップチューブに移す。
・１ｍｌの濾過した１００％エタノールを添加する。
・５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加する。
・該チューブを反転させることで緩やかに混合し、室温にて２０分間放置する（ＤＮＡが沈降するため、可視できるようになるであろう）。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付し、そのＤＮＡをペレットにする（白色のニワトリを用いたならば、ペレットは白色であるし；褐色のニワトリを用いたならば、ペレットは褐色であろう）。
・上澄みを処分する。
・エタノールをチューブの側面をゆっくりとつたわせ、ついで捨てることによりペレットを５００μｌの７０％冷エタノールで２回すすぐ（ＤＮＡペレットを捨てないように注意する）。
・チューブのオープントップをパラフィンで覆い、針を用いて該パラフィンに数個の穿刺孔を設ける。
・チューブを約５分間真空乾燥器に入れてペレットを乾燥させる（別法として、風乾させる）。
【００４３】
該ペレットをゆっくりと渦流させながら５０μｌのＰＣＲ用水に再び懸濁させる。
分光光度計を用いてＤＮＡ調製物の濃度を測定する。
その濃度を水中１ｍｇ／ｍｌに調整する。
−２０℃で貯蔵する。
【００４４】
４．ＴａｑＭａｎＴＭ定量ＰＣＲアッセイ（パーキンエルマーバイオシステム）
・ＰＣＲ専用のピペットおよびオートクレーブに付したチップを用いて、ＰＣＲ専用キャビネットにて反応をセットアップする。
・氷上で操作する。
・適当数のサンプルについて以下の試薬を含有するマスター混合物を調製する−各サンプルについて重複した反応物をセットアップする。
【００４５】
（各反応について所定の容量）
【表１】
0004491411.tif 000002
【００４６】
・完全に混合するまで渦流させる。
・熱−高速ＰＣＲプレートを氷上のプレートホルダー中に入れ、使用されるべき各ウェルに２４μｌのマスター混合物を添加する。
・１μｌのオートクレーブ処理に付した水を非鋳型対照（no-template-control）（ＮＴＣ）ウェルに加え、ＤＮＡサンプルを開放する前にこれらのウェルに栓をする。
・１μｌの正の対照ＤＮＡ（＝１μｌの１ｍｇ／ｍｌの調製物）、例えば、リスペンス感染のＣＥＦからのＤＮＡを適当なウェルに加え、これらのウェルに栓をする。
・１μｇのサンプルＤＮＡ（＝１μｌの１ｍｇ／ｍｌの調製物）を適当なウェルに加えて栓をする。
・一時的にプレートを遠心分離機にてパルス処理に付す。
・プレートをＡＢＩプリズム７７００配列検出器（Applied Biosystems）に入れ、コンピューターをセットアップし、ＦＡＭ蛍光（Meqプローブ）を読み取り、サンプルを作動させる。
・サーモサイクルパラメータ
５０℃      ２分
９５℃      １０分
９４℃      １５秒）ｘ４０
６０℃      １分）
・マイクロソフトエクセルを用いて、Ｃｔ値であろう各サンプルについてデータを解析し（一定量の蛍光生成物がまず基線レベルより上で検出される際のＰＣＲサイクル数）；各ＤＮＡサンプルについて２通りの平均Ｃｔ値を算定する。
上記した実験の結果を図６に示す。
【００４７】
注釈
フォワードプライマー（ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ−配列番号２）をＧＡ株Ｍｅｑ遺伝子配列のＮＴ位置１３４１−１３６１に位置づける。リバースプライマー  （ＧＣＡ  ＴＡＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ−配列番号３）をＮＴ位置１４１３−１３９３に位置づける。Ｍｅｑ標的配列にて２つのプライマーの間で具体的にアニールするようにプローブを設計する（図８を参照のこと）。
【００４８】
ＰＣＲの間、蛍光性プローブは２つのプライマーの間を結びつけ、各伸長サイクルの間、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が該プローブを切断し、ついで蛍光を発することのできるレポーター蛍光色素ＦＡＭを放出する。したがって、各サイクルと共に、蛍光強度は増加する。Ｃｔ値（蛍光が一定の閾値を越える際のサイクル数）は標的配列の初発のコピー数の測定値である：初発コピー数が高ければ高いほど、Ｃｔ値は低くなる。
【００４９】
ＰＣＲの際のウシ血清アルブミンの使用：フェザー組織（特に、褐色のニワトリからの組織）はメラニンを含有し、それはＰＣＲに対して阻害的であることがわかっている。該反応にてＢＳＡを用いることでこのメラニン誘発の阻害を克服する。実験を褐色のニワトリで行った。Giambernardiら（１９９８）Biotechniques２５：５６４−６の方法に従ってＢＳＡを添加した。
【００５０】
実施例２：特異的ＭＤＶ−１（ＣＶＩ９８８ワクチン）株の検出方法
本発明のこの実施例は、ニワトリのフェザー中のＣＶＩ９８８マレックワクチンの存在を検出するための１３２塩基対（ｂｐ）反復ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験の特異的に修飾されたバージョンの使用に関する。
【００５１】
１３２塩基対の反復遺伝的配列をマレック病ウイルス（血清型１）ゲノムの内部反復長鎖（ＩＲ１）セグメントに位置づける。ＭＤＶ１の完全ゲノム配列がTulmanらにより（２０００年９月）J Virol. Vol.７４ No.１７、ｐ７９８０−７９８８に記載されており、受入番号ＡＦ２４３４３８でGenBankに寄託されている。血清型１のマレック病のＣＶＩ９８８単位体（ワクチン株）はこの反復セグメントのコピーを複数有し、それに対してフィールド株は単一のコピーを有する（Silvaら（１９９２）Avian Dis 36: 521-528；およびBeckerら（１９９３）Virus Genes 7: 277-287）。コピー数を測定することで、ワクチン株とフィールド株の差異の可能性が得られる。（Beakerら（１９９２）J Virol Methods 40: 307-322およびKopacekら（１９９３）Acta Virol 37: 191-195）。
【００５２】
添付した図面に従ってフェザーをサンプリングし、腋窩域のフェザーの近位チップを用いる。ＰＣＲ解析（後記参照）により、ワクチン接種後で１１日と２８日の間の動物における１３２ｂｐのセグメントの複数のコピーを説明する。ワクチン接種を１日齢の鳥に対して行った。
一連の許容できる試験は、新たなサンプルとして採取するか、または後日ＣＶＩ９８８ワクチンの存在を測定するために試験用に貯蔵しているか、いずれかの年齢の鳥のフェザーを用いることである。
【００５３】
フェザーチップサンプルの１３２ｂｐ反復ＰＣＲ用プロトコル
１．要求される材料
試薬：
・ＴＮＥバッファー（室温で貯蔵）はトリス（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有し、ＨＣｌを用いてｐＨを７．５に調製する。
・ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０％溶液（室温で貯蔵）
・プロテイナーゼＫ（Sigma番号Ｐ−６５５６からの凍結乾燥粉末、水中２０ｍｇ／ｍｌのストックを調製、−２０℃で貯蔵）
・Sigmaから得られるｐＨ７．９のフェノール（カタログ番号Ｐ−４５５７）（４℃で貯蔵）
・クロロホルム（−２０℃で貯蔵）
・３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）（室温で貯蔵）
・濾過されたニートなエタノール（室温で貯蔵）
・濾過された７０％冷エタノール（４℃で貯蔵）
・ＰＣＲ用水
・８００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する、濾過されたＰＣＲ用水
・ＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、Ｔａｑバッファー、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Bio／Gene Ltd、Kimbolton、Cambridgeshire、England）
・ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（１００ｍＭストック）（Promegaから入手）（ＵＳＡ）；これら４種をすべて、各々、１０ｍＭで含有する混合物を調製し、−２０℃で貯蔵する。
・ＤＮＡ分子サイズマーカー
・アガロースおよびＴＢＥバッファー
・プライマー配列：
ＭＤ−１３２  フォアード；５’ＴＡＣＴＴＣＣＴＡＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣＧＴ−３’（配列番号４）
ＭＤ−１３２  リバース；  ５’ＧＡＧＡＴＣＣＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＡ−３’（配列番号５）
【００５４】
装置：
・滅菌（sterilin）２０ｍｌプラスチック製万能チューブ
・清潔な鋏およびピンセット
・５０℃にセットされた水浴
・マイクロ遠心分離機
・１．５ｍｌのスナップ−キャップエッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・１．５ｍｌのスクリュ−キャップエッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・０．５ｍｌのスナップ−キャップエッペンドルフチューブ（オートクレーブ処理）
・真空／凍結乾燥機（必須ではない）
・分光光度計
・専用のＰＣＲキャビネット、ピペットおよびオートクレーブ処理したチップ
・熱サイクラー
・アガロースゲル装置
【００５５】
２．フェザーの収集
・各ニワトリの腋窩域（図面を参照）から８−１０本の「ピン」フェザー（多くの髄質のついた短い、新たに成長しているフェザー）をむしり取る。
・フェザーを研究室に輸送するためのプラスチック製「万能」チューブに入れる。
【００５６】
３．フェザーチップからのＤＮＡ調製
・約１ｃｍのフェザー（すなわち、皮膚に付着し、髄質を含有する羽の軸から生えていない部分−写真を参照）を切り取って保存する。
・各ニワトリについて、８−１０本の保存されているフェザーの端部を１．５ｍｌのスナップ−キャップエッペンドルフチューブに入れる。
・１００μｇのプロテイナーゼＫを含有する（使用直前にプロテイナーゼＫを添加する）５００μｌのプロテイナーゼＫサンプルバッファー（０．５％ＳＤＳ含有のＴＮＥバッファー）を添加する。
・水浴中５０℃で１．５−２時間インキュベートする。
・該チューブをマイクロ遠心分離に付し（６０００ｒｐｍ、１０分）、フェザーチップおよび残骸を「ペレット」とする。
・上澄みを新たなスナップ−キャップのチューブに移す（フェザーが褐色の鳥からのものであれば、上澄みはメラニンの存在のため褐色であろう）。
・等容量（５００μｌ）のフェノールを上澄みに加える。
・渦流させる。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付す。
・上相を新たなスナップ−キャップのチューブに移す。
・等容量（５００μｌ）の冷クロロホルムを添加する。
・渦流させる。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付す。
・上相を新たなスクリュ−キャップのチューブに移す。
・１ｍｌの濾過された１００％エタノールを添加する。
・５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加する。
・チューブを反転させることで緩やかに混合し、室温で２０分間放置する（ＤＮＡが沈降すると、それは可視できるようになるであろう）。
・１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離に付し、ＤＮＡをペレットにする（白色のニワトリを用いたならば、ペレットは白色であろうし；褐色のニワトリを用いたならば、ペレットは褐色であろう）。
・上澄みを捨てる。
・エタノールをチューブの側面をゆっくりとつたわせ、ついで捨てることによりペレットを５００μｌの７０％冷エタノールで２回すすぐ（ＤＮＡペレットを捨てないように注意する）。
・チューブの開口している頂部をパラフィンで覆い、針を用いて該パラフィンに数個の穿刺孔を設ける。
・チューブを約５分間真空乾燥器に入れてペレットを乾燥させる（別法として、風乾させる）。
・該ペレットをゆっくりと渦流させながら５０μｌのＰＣＲ用水に再び懸濁させる。
・分光光度計を用いてＤＮＡ調製物の濃度を測定する。
・その濃度を水中１ｍｇ／ｍｌに調整する。
・−２０℃で貯蔵する。
【００５７】
４．１３２ｂｐ反復ＰＣＲ：
・ＰＣＲ専用のキャビネット中の０．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおける氷上にＰＣＲ専用のピペットおよびオートクレーブ処理したチップを用いて反応物をセットアップする。
・適当な数のサンプル（反応当たり所定の容量）に対して以下の試薬を含有する「マスター混合物」を調製する：
【００５８】
【表２】
0004491411.tif 000003
・完全に混合するまで渦流させる。
・１９μｌの「マスター混合物」をオートクレーブ処理に付したスナップ−キャップエッペンドルフチューブに等分する。
・１μｇのＤＮＡ（＝１ｍｇ／ｍｌ調製物を１μｌ、またはＤＮＡ調製物の濃度が低い場合はそれ以上の容量）を添加する。
・完全に混合するまで渦流させる。
・（反応物を鉱油でオーバーレイさせる必要がないように、本発明者らの熱サイクラーは加熱蓋を有する。）
・以下のサイクルパラメーターを用いて熱サイクラーを行う：
９５℃        ２分                １サイクル
９５℃        １分）
５０℃        ３０秒）            ｘ４０サイクル
７２℃        １分）
７２℃        １０分              １サイクル
・反応生成物をアガロースゲル上で解析する。
上記した実験の結果を図７に示す。
【００５９】
注記
センスプライマーを反復単位の６５ｂｐ上流に位置付け、アンチセンスプライマーを反復単位の１０５ｂｐ下流に位置付ける。従って、考えられるバンドの大きさは単一の反復単位について３０２ｂｐ（すなわち、６５＋１３２＋１０５）であり、二重の反復単位では４３４ｂｐ（３０２＋１３２）であり、三重の反復単位では５６６ｂｐ（４３４＋１３２）などである。リスペンスワクチン株は多くのタンデム反復単位を生成する。
【００６０】
実施例３−フェザーチップ中のＰＣＲを用いるリスペンスウイルスゲノムＤＮＡの検出：異なるフェザー域から由来のサンプルとの比較
方法
リスペンス−ワクチン接種したヒヨコからのフェザーサンプリング
２週齢のロード・アイランド・レッド系のヒヨコに内腹膜経路を介して１０００ｐｆｕのフォート・ダッチ・リスペンス・ワクチンウイルスを予防接種した。週齢が適合するも、ワクチン処理を行っていないヒヨコを別の部屋に収容した。実験全体を通して個々のヒヨコを同定できるように、すべてのヒヨコの両方の羽に翼帯を付した。ワクチン接種から８、１３、１９および２６日後に、５羽のワクチン接種したヒヨコ（＃９２１、＃９２３、＃９２４、＃９２５）および１羽のワクチン接種していないヒヨコ（＃９４６）をサンプルに付した。頚部、上腕骨、脊髄、腋窩および大腿域の各々からおよそ６本のピンフェザーをむしり取った。残りの５カ所のフェザー域は、フェザーの数が少なすぎるため、４回の試験でサンプリングができない、あるいは生きているヒヨコの皮膚のデリケートな領域からむしり取るのは非道徳的であると考えられるとの理由から、使用しなかった。
フェザーチップからＤＮＡを調製してリアルタイムＰＣＲに付し、以下に要約するようにウイルスＭｅｑ遺伝子を検出した。
【００６１】
フェザーチップサンプルからのＤＮＡ調製
上記したように、フェザーチップからＤＮＡを調製した。簡単に言えば、１００μｇのプロテイナーゼＫ含有の５００μｌのＴＮＥ−ＳＤＳバッファー中、５０℃で２時間、フェザーチップをインキュベートした。上澄みをフェノールで、ついで氷冷されたクロロホルムで抽出した。エタノール／酢酸ナトリウムを用いてＤＮＡを沈降させて、ペレット状にし、真空乾燥させ、ついで水中に２００μｇ／ｍｌの濃度まで再び懸濁させた。
【００６２】
Ｍｅｑ遺伝子を検出するためのリアルタイム（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲアッセイ
２５μｌのデュプレックス反応を、ＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを用いて前記したようにセットアップし、２００ｎｇのフェザーチップＤＮＡからのウイルスＭｅｑ遺伝子および宿主オボトランスフェリン（Ovotransferrin）（Ovo）遺伝子（表１）を増幅させた。一反応当たり１０μｇの濃度でＢＳＡが存在した。反応速度をＦＡＭ−蛍光タグ化ＭｅｑプローブおよびＶＩＣ−蛍光タグ化Ｏｖｏプローブ（表１）を封入することで追跡した。各サンプルで二重に反応を行った。サーモサイクルパラメータは：５０℃（２分）で１サイクル、９５℃（１０分）で１サイクル、つづいて９４℃（１５秒）および６０℃（１分）で４０サイクルであった。試験下にあるフェザーサンプルに加えて、反応プレートはまた、計算された数のリスペンスゲノムのコピーを含む、１０倍希釈のリスペンスＢＡＣ１０ＤＮＡ（細菌人工染色体にクローンされたリスペンスウイルスゲノム）も含んだ。
【００６３】
データをマイクロソフトエクセルを用いて解析した。各反応について、Ｃｔ値（第一に所定量の蛍光生成物が基線レベルを越えて検出される際のＰＣＲサイクル数）を得、そうして４０−Ｃｔ値を得た。Ｃｔ値が４０であれば標的配列が存在しないことを示す。値が大きければ大きいほどウイルスゲノムのコピーが多いことを示すように、「４０−Ｃｔ」として数値を表す。
【００６４】
リスペンスＢＡＣ１０サンプルについて、４０−Ｃｔ値をウイルスゲノムのコピー数（対数目盛）に対してプロットし、標準曲線を作成した。該プロットの直線部分の式を測定した。試験下にあるフェザーサンプルについて、その４０−Ｃｔ値をＯｖｏ（すべてのニワトリ細胞に存在する「ハウスキーピング遺伝子」）に関する４０−Ｃｔ値に従って「標準化」し、各サンプルについて用いたＤＮＡの量のわずかな違いを修正した。ついで、二重反応にて平均化し、標準化した４０−Ｃｔ値を測定し、標準曲線を用いてリスペンスゲノムコピー数に変換した。
【００６５】
【表３】
0004491411.tif 000004
【００６６】
【表４】
0004491411.tif 000005
【００６７】
フェザーサンプリングおよびＤＮＡ調製
最初、１０カ所のフェザー域の各々をサンプリングする計画を立てたが、頚部、上腕骨、脊髄、腋窩および大腿域を用いて実施しただけであった。残りの５カ所のフェザー域は、フェザーの数が少なすぎるため、４回の試験でサンプリングができない、あるいは生きているヒヨコの皮膚のデリケートな領域からむしり取るのは非道徳的であると考えられるとの理由から、使用されなかった。ワクチン接種の８、１３および１９日後に各域から十分なピンフェザーを得た。２６日（ヒヨコがおよそ６週齢となった時）までに、ピンフェザーはより硬い、成熟したフェザーにより置き換えられ始めた。すべてのサンプルから十分なＤＮＡを得た。異なる域からで同じ数のフェザーから得られたＤＮＡの量に著しい違いはなかった。ＭｅｑおよびＯｖｏ値がリアルタイムＰＣＲの検出の直線範囲に入るように、ＤＮＡを２００ｎｇ／μｌの範囲に希釈し、リアルタイムＰＣＲ反応当たりこのストックを１μｇ用いる必要のあることが判明した。
【００６８】
種々の時点でウイルス負荷を正確に比較するために、異なるフェザー域にて、そして異なるヒヨコにてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
各反応では、４０−Ｃｔ値を計算した。リスペンスＢＡＣ１０サンプルの場合、４０−Ｃｔ値をウイルスゲノムのコピー数（対数目盛）に対してプロットし、標準曲線を作成した（図８）。検出の正確な下限が５０コピーであり、かくして４０−Ｃｔ値が０であるいずれのサンプルも２００ｎｇのフェザーチップＤＮＡ当たり５０よりも少ないコピーのリスペンスゲノムを含有する。
【００６９】
該プロットの直線部分の式は：ｙ＝１．８１０２Ｌｎ（Ｘ）−６．７９６であった。試験下にある各々のフェザーサンプルについて、その平均の標準化された４０−Ｃｔ値をこの式を用いてリスペンスゲノムコピー数に変換した（表２Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ；図９Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを参照）。予想どおり、所定の時点で個々のヒヨコの間にかなりのバラツキがあった。しかし、所定の個体の５カ所の異なるフェザー域にて検出されたウイルスのレベルは似たレベルであった。各ヒヨコにおいて、試験した４つの時点のうち、ウイルス負荷は１３日目が最大であり、１９および２６日目には減少している。
【００７０】
【表５】
0004491411.tif 000006
【００７１】
【表６】
0004491411.tif 000007
【００７２】
【表７】
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【００７３】
【表８】
0004491411.tif 000009
【００７４】
４羽のワクチン接種されたヒヨコにて、各フェザー域について、各々の時点で平均のゲノムコピー数（２００ｎｇのフェザーＤＮＡ当たりの数）を測定し、対数目盛（図５）または均等目盛（図１０Ｂ）のいずれかを用いてワクチン接種後の時点に対してプロットした。８日目で、平均コピー数は２００ｎｇのＤＮＡにつき１０４と１０５のコピーの間にあった。１３日目で、平均コピー数は５ｘ１０６と５ｘ１０７のコピーの間にあり；１９日目で、１０６と１０７の間、２６日目で１０５と１０６の間にあった。
【００７５】
対数プロット（図１０Ａ）は５カ所のフェザー域の各々においてウイルス複製速度が同様であることを示した。しかし、違いは均等プロットにて強調される（図１０Ｂ）。このプロットは、１３日目に、４羽のヒヨコの平均ウイルス負荷が腋窩域では他の４カ所の域の４倍までの大きさであることを示す。この時点で、上腕骨および頚部域のウイルス負荷は、各々の時点で極めて密接に関連しており、大腿部および脊髄域におけるウイルス負荷よりも大きかった。フェザー間のこれらの違いは８、１９または２６日目では明らかでなかった。
【００７６】
ワクチン接種していない対照のヒヨコ（＃９４６）では、サンプルの大部分は４０−Ｃｔ値が０であり、ＭＤＶ  ＤＮＡが存在していないと考えられる。
【００７７】
しかしながら、サンプルのいくつかは、その４０−Ｃｔ値が３までであった（図示せず）。リアルタイムＰＣＲでは、「負の」サンプルが０より大きい４０−Ｃｔ値を付与するケースも多く、４より小さな値は「当てにならない」と考えられる。かくして、３の４０−Ｃｔ値は約２００コピーのリスペンスゲノムと一致するが、この値はワクチン接種したヒヨコのサンプルにて得られる値よりも１００倍小さく、陰性であると考えることができる。図５Ｂに示されるように、ワクチン接種されていないヒヨコの５カ所のフェザー域の平均コピー数は基線より上にあることはない。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲ分析の要約
・各々のフェザー域のウイルス負荷はワクチン接種から８、１３、１９および２６日目でリアルタイムＰＣＲで検出できるぐらい十分であった。
・ウイルス負荷は、試験したフェザー域のすべてにおいて、ワクチン接種から８、１９および２６日目と比較して、ワクチン接種から１３日目にて最大であった。
・ワクチン接種から１３日目で、ウイルス負荷は腋窩域にて上腕骨および頚部よりも大きく（２倍以上）、あるいは脊髄および大腿域よりも大きかった（４倍以上）。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
（原文に記載なし）
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図２（ｄ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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