(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の膵島細胞を刺激してＳＴＦ−１転写を誘導する能力を決定する、次のステップを含む方法。
下記のＳＥＱ ＩＤ No.１の配列又はその断片のうち少なくともＳＥＱ ＩＤ No.１における主要な転写開始部位Ｓ１（０）から、それの−１０４塩基部位に位置するＥボックス要素（ＣＡＣＧＴＧ）までの配列を有する転写調節配列、及び該転写調節配列の転写制御を受け、宿主細胞に識別可能な標識を与えるレポーター遺伝子を含有するベクターを供給するステップと、
前記ベクターを前記宿主細胞へ移転するステップと、
前記宿主細胞を刺激し前記の標識を生産させる試験化合物の能力を決定するために該試験化合物の存在下で前記宿主細胞を培養するステップと、
標識の存在は試験化合物が膵島細胞を刺激しＳＴＦ−１転写を誘導したことを示し、標識の不存在は試験化合物が膵島細胞に対しＳＴＦ−１転写を誘導させる刺激を与えなかったことを示す、宿主細胞に前記識別可能な標識を生産させる刺激を与える試験化合物の能力を決定するための前記標識を分析するステップ
0004472025.tif 000006
【請求項２】
レポーター遺伝子が酵素である請求項１の方法。
【請求項３】
酵素がルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの群から選択される請求項２の方法。
【請求項４】
移転するステップがトランスフェクションによって行われる請求項１の方法。
【請求項５】
膵島細胞がＨＩＴ細胞である請求項４の方法。
【請求項６】
移転するステップがトランスジーンを動物（ヒトを除く）内へマイクロインジェクション誘導によって行う請求項１の方法。
【請求項７】
生体内インシュリン生産膵島細胞を標識化する次のステップを含む方法。
上記のＳＥＱ ＩＤ No.１の配列又はその断片のうち少なくともＳＥＱ ＩＤ No.１における主要な転写開始部位Ｓ１（０）から、それの−１０４塩基部位に位置するＥボックス要素（ＣＡＣＧＴＧ）までの配列を有する転写調節配列、及び該転写調節配列の転写制御を受け、膵島細胞に対し認知可能な標識を与えることができるレポーター遺伝子を含有するベクターを供給するステップと、
前記ベクターをトランスジーンとして動物（ヒトを除く）の胚に導入するステップと、
前記胚を膵島細胞を持つ個体に成長させるステップと、
前記動物の膵島細胞が、標識の存在がインシュリン生産膵島細胞の存在を示し、標識の不在がインシュリン生産膵島細胞の不在を意味する前記のレポーター遺伝子を発現させたかを決定するための前記の識別可能な標識分析のステップ。
【請求項８】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を作る請求項７の方法。
【請求項９】
前記方法がさらに蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、非インシュリン生産膵島細胞とインシュリン生産膵島細胞とを選別するステップを含む請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には生化学的内分泌学、分子生物学、及びタンパク質化学の分野に関するものである。より具体的には本発明は膵臓ランゲルハンス島（膵島）細胞におけるＳＴＦ−１発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法に関する。
関連技術の説明
グルコースホメオスタシスは多数の神経内分泌系の連携した作用を必要とする。膵島は哺乳類では１次“グルコースセンサー”の働きをすると考えられている。膵島細胞にはインシュリン生産細胞、グルカゴン生産細胞、ソマトスタンチン生産細胞、膵臓ポリペプチド生産細胞として特徴づけられる４群を含んでいる。これらのなかでは、インシュリン生産細胞であるβ−細胞の数が多い。血糖濃度の上昇によりインシュリンの生産と分泌が刺激され、その後、組織でのグルコースの取り込みが、必然的に行われる。したがって、β−細胞の機能障害あるいは破壊は血糖値の上昇をもたらし、最終的には悪化して糖尿病になる。
遺伝子連座分析の結果は、遺伝的要因が強く影響を及ぼし、糖尿病になりやすくしていることを示している。例えば、少なくとも18の遺伝子座がインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）に一定の関連性を有している。ＩＤＤＭ２と名付けられた病因遺伝子座はヒト・インシュリン遺伝子を含んでおり、インシュリンプロモーターの別の転写調節に関連している。したがって、インシュリン遺伝子の発現を調節する過程の停止は糖尿病発生の原因の１つであると考えられている。β−細胞機能障害が糖尿病において非常に多く見られる特徴となっていることは、この仮定と一致する。
インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は外部的要因と複合した遺伝的要因の２つが重なった結果として起こるものと考えられている。興味深いことに、インシュリン遺伝子座それ自身の対立遺伝子変異体がその疾患に関係している。これらの変異体は正常なインシュリン遺伝子を含んでいるように見えるが、転写調節に関して通常と異なる性質を示す。
約2,000万人のアメリカ人がインシュリン非依存性糖尿病（タイプII）にかかっていると推定されている。この疾病の進行には環境的要因といまだ大部分未解明の糖尿病発症性遺伝子の両方が必要と思われる。その糖尿病発症性遺伝子はタイプII糖尿病における、インシュリンシグナルに応答して正しくグルコースの利用ができない末端組織でのインシュリン抵抗性に関連寄与していると推定される。別の考え方として、遺伝的要因がこれらの患者のもつインシュリンを生産する膵臓β−細胞のグルコース感受性の減少の原因となっているとも考えられる。これらの生理学的状態の最終的な段階は両方とも糖尿病の最も主要な特徴である著しい過血糖症である。
インシュリン遺伝子の転写制御は細胞特異的でグルコース感受性のシグナリング分子と相互に作用するフランキング（flanking）ＤＮＡの短い領域を通じて達成される。この調節機構の正確な特質はほとんど未解明のままではあるが、ベーシック・ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）及びホメオドメイン含有因子はインシュリンのβ−細胞特異性発現を支配する転写機構の重要な構成要素であることが広く知られている。膵島特異性なベーシック・ヘリックス−ループ−ヘリックス複合体はＮir，ＩＥＢ１あるいはＩＣＥと様々な名前で呼ばれる基部Ｅボックスと相互に作用する。この因子はラット・インシュリンＩ遺伝子では２カ所出現するが、ラット・インシュリンIIとヒト・インシュリン遺伝子では１カ所しか出現しない。
インシュリン生産細胞系のトランジェット（Transiet）アッセイによりＥボックス結合因子はホメオドメイン認識配列の特徴を持つＦＬＡＴと呼ばれるＡＴリッチ配列に隣接して結合するβ−細胞特異性タンパク質と相助作用する事が示されてる。Ｉsl−１，lmx−１，cdx−３及びＳＴＦ−１を含む数種の特質を明らかにされたホメオドメインタンパク質がＦＬＡＴ因子と結合することが明らかにされている。さらに、ＳＴＦ−１はＰ要素と名付けられた進化上保存されたＡＴリッチ配列に対する主要な結合活性に相当する。Ｉsl−１はＦＬＡＴ要素との結合力は弱くインシュリン生産細胞の抽出物ではＦＬＡＴ結合複合物としての存在は見いだされない。最新の研究結果により神経系の発生においてＩsl−１がより重要な役割を果たすことが裏付けられている。ホメオドメイン因子であるlmx−１及びcdx−３は異種細胞でのインシュリンプロモーター機能に関して興味深いトランスアクチベーション特性をもっている。しかし、これらの細胞内分布及びβ−細胞内でのＦＬＡＴ結合能力については今だ解明にされていない。さらに、β−細胞系においてこれらの因子の機能について直接言及したデータはほとんどない。
インシュリン・プロモーター結合活性を持つ因子のグループの中では、ＳＴＦ−１は恐らくインシュリン・プロモーター機能の真正の調節物の最も有望な候補者である。マウスにおいては、ＳＴＦ−１は将来膵臓を生じさせる原始細胞の核に、その領域での最初に検出されるインシュリンの発現の寸前の胚発生日（embrionic day）8.5に最初に見いだされる。内分泌腺である膵臓の形成が続く期間中、ＳＴＦ−１とインシュリンは共に広く発現されている。加えて、ＳＴＦ−１はインシュリン生産細胞系からの抽出物において、インシュリンプロモーターの上のＦＬＡＴ及びＰ要素の両方と内因性ＤＮＡ結合活性の成分として現れる。また、ＳＴＦ−１はＥボックス因子Ｐan−１と強力な相助作用を行い、ＦＬＡＴ結合因子として期待される。しかしながら、ＤＮＡ結合アッセイではβ−細胞抽出物から得られる未知の別の因子もまた検出されたＦＬＡＴ結合活性に大いに関係していることが示されている。ＦＬＡＴ仲介したインシュリンプロモーター活性がこれらの検出された種の全体あるいは一部を必要とするのかどうかは未解明のままである。
ＳＴＦ−１は初期には発生中の膵臓の外分泌細胞と内分泌細胞の両方で発現するが、ＳＴＦ−１の生産は次第にインシュリン及びソマトスタンチン生産膵臓細胞に限定されるようになる。これらの細胞では、ソマトスタンチンとインシュリンンの両方の遺伝子の高レベルの発現の維持に重要な働きをＳＴＦ−１は示す。
ＳＴＦ−１はＦＬＡＴ及びＰと名付けられたインシュリンプロモーター上の２つのはっきりと定義された膵島特異性要素を認知する。これらの部位に結合するとき、ＳＴＦ−１はＦarとＮirと名付けられた２つのＥボックス要素を認知するヘッリクッス−ループ−ヘリックスタンパク質であるＥ47と協力しインシュリン遺伝子の転写を刺激する。同様にＳＴＦ−１は膵島細胞においてＴＳＥＩとＴＳＥIIと名付けられた２つの膵島特異性要素を通じてソマトスタンチン発現を調節する。
ＳＴＦ−１ようなホメオドメインタンパク質は細胞確立あるいは体節同一の段階における発生において重要な役割を果たすことが分かっている。それらの生体内での特異的ではっきりした作用に対し、インビトロにおいては、ほとんどのホメオドメインタンパク質は低くて特異性の少ないＤＮＡ結合特性しか示さない。しかしながら、最近の研究ではインビトロにおけるホメオドメインＤＮＡ結合特異性の決定要因としてあるタンパク質の補因子の関与が示されている。例えば、ショウジョウバエでは、エクストラデンティクル（exd）はホメオティックなタンパク質の活性をそれらの発現の様式を変化させる事なく調節していることが示されてきている。一方、エクストラデンティクルはあるホメオドメインタンパク質のＤＮＡ結合特異性を高めることにより、目的となる遺伝子選択を促進するらしい。実際にエクストラデンティクルは脊椎動物において高い割合で保存されており、ヒト・プロト腫瘍遺伝子Ｐbx１との間で高い配列相同性（71％）を有する。
発生の期間中の特異的な一群への細胞の参加については、識別された遺伝的プログラムの活動を仲介する多種のホメオドメイン（ＨＯＸ）選択タンパク質の発現の比較によって多くの部分が決定される。しかし、個々のＨＯＸ遺伝子それ自身が異なった細胞型での発現に対する目的物となるメカニズムは多くの部分が未解明のままである。
脊椎動物の膵臓は十二指腸原基の共通の幹細胞から生じる内分泌部と外分泌部とから構成される（１）。膵臓の内分泌部内では、初期に複数の膵臓ホルモンを発現する分化多能性先駆細胞は成熟したランゲルハンス島を構成する細胞の副集合体、すなわち、インシュリン、ソマトスタンチン、グルカゴン及び膵臓ポリペプチドをそれぞれ生産する細胞へと次第に制限的に分化する（２，３）。これらの発生経路が活性化するメカニズムについては明確になっていないが、最新の証明はホメオボックス因子ＳＴＦ−１（ＩＰＦ−１／ＩＤＸ−１）がこの過程の重要な決定要素であることを示す。実際、発生におけるＳＴＦ−１に対する必要性は膵臓の先天的欠損を導くＳＴＦ−１／ＩＰＦ−１遺伝子の破壊を目的とした相同組み換え研究により裏付けられる（４）。
ＳＴＦ−１（Ｐdx１ともよばれる）の発現は8.5胚発生日（embryoric day）に膵臓原基と分化多能性先駆細胞で検出される。発生途中の膵臓の内分泌及び外分泌部分で一時的に発現したのち、ＳＴＦ−１の生産は次第にインシュリン及びソマトスタンチンを生産する膵島細胞に限定される（５，６）。これらの細胞ではＳＴＦ−１はそれぞれのプロモーター内の機能的要素と結合することによりインシュリン及びソマトスタンチンの両方の遺伝子を調節するらしい（５，７−16）。
先の技術では膵臓細胞におけるホメオドメインタンパク質ＳＴＦ−１の発現調節の効果的な手法が欠如している。今回の発明はこの技術におけるこの長年の必要性と要望を実現するものである。
発明の概要
ＳＴＦ−１は膵臓遺伝子の重要な調節物質ではあるが、膵臓細胞を標的とするＳＴＦ−１それ自身の発現のメカニズムは特徴づけがなされていない。今回の発明ではＳＴＦ−１プロモーターの6.5kb断片は培養十二指腸細胞と同様にトランスジェニックマウスにおいてのβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の膵島特異的発現を効果的に導くことを示している。この6.5kb断片内で、主要となる転写開始部位より−104塩基部位に位置するＥボックス要素はＳＴＦ−１プロモーター活性に対し特に不可欠なものである。この要素はＳＴＦ−１の膵島発現の本質をなす上流の活性化因子により認知される。実際にこのＳＴＦ−１プロモーターは膵島細胞において目的とするＳＴＦ−１発現活性を20〜100倍に高める。−104部位の基部Ｅボックス配列の欠如はＨＩＴ細胞におけるＳＴＦ−１発現をまったく起こさせない。さらに、抗ＵＳＦ（upstream factor）抗血清がＣ１，Ｃ２及びＣ３の形成を阻害することはこれらのタンパク質はＵＳＦタンパク質により作り出されることを示している。
さらに、ＳＴＦ−１エンハンサー（enhancer）要素は転写開始部位の600bp上流に存在する530bp領域に見いだされる。この530bp断片を含むプロモーター構造物はデキサメタゾン処理により完全に抑制されるが、偏在するＵＳＦ−１認知部位を含む最小限のＳＴＦ−１プロモーターは抑制されない。その530bp領域はＣＯＳ−７細胞に比較してＨＩＴ−Ｔ15細胞では５〜10倍の高い活性をもち、この断片が膵島細胞特異性活性をもつことを示している。それゆえ、今回の発明においてＳＴＦ−１−lacＺ融合遺伝子が膵島細胞でのＳＴＦ−１発現を高める化合物の選別に使用された。ＳＴＦ−１生産を刺激する化合物は膵島β細胞機能、すなわちインシュリン生産機能を高める。したがって、今回の発明で記載された方法で識別された化合物はあいまいな膵島細胞の機能ためグルコースに対し不耐性のタイプII糖尿病にかかっている患者に対して特に有効である。
今回の発明の１つの具体化物は、ＳＴＦ−１転写を誘導する化合物の試験方法の供給である。
ＳＴＦ−１／lacＺ融合遺伝子を発現する膵島細胞系はリン酸カルシュウム共沈降を使用することにより分離される。ＳＴＦ−１発現に対する様々な化合物の効果を検査するために、検査対象化合物をＳＴＦ−１/lacＺを発現する細胞に加える。コントロールと検査する細胞のＬacＺ活性を比色法により定量分析する。この方法を使用すると、膨大な数の化合物がスクリーニングされＳＴＦ−１を誘導する化合物が迅速に同定できる。
今回の発明の１つの具体化物は、生体内のインシュリン生産膵島細胞に印をつけるためにＳＴＦ−１プロモーターを使用する方法がある。この方法に関しては、指標としてグリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）が使用される。グリーンフルオセントタンパク質の発現はOgawaらの方法より混乱なしに検出できる［Ogawa, et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., 92, 11899-11903（1995）］。動物の膵臓のβ細胞の回収を高めるためにＳＴＦ−１プロモーターはＧＦＰをコードする遺伝子に融合される。ＳＴＦ−１−グリーンフルオセントタンパクトランスジーンのブタへの導入は膵臓からのインシュリン生産細胞の効果的で迅速な回収を可能にする。端的に述べると、ブタから膵臓が回収され、細胞を離散させるためにコラーゲナーゼ処理される。インシュリン生産膵島細胞はＳＴＦ−１グリーンタンパク転換遺伝子の発現に基づく蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）により効果的に回収される。精製されたβ細胞群は糖尿病患者の細胞治療に使用することが可能である。
今回の発明の１つの側面としては、膵島細胞を刺激してＳＴＦ−１転写を誘導する複合物を検査する能力を決定する方法をもたらしたことである。この方法は以下の段階より構成される。ＳＥＱ  ＩＤ  No.１群あるいはＳＥＱ  ＩＤ  No.２群、あるいはそれらの断片から選別された配列、プロモーター及び前述のＳＴＦ−１エンハンサー及び前述のプロモーターの両方の転写制御を受けるレポーター遺伝子をもつベクターの供給の段階。ここで述べられているレポーター遺伝子は前述の宿主細胞に対して認知可能な標識を与えることができる。前述の宿主細胞への前述ベクターの導入の段階。前述の宿主細胞を刺激して前述の標識を生産させる物質の能力を決定するための検査複合物の存在下での前述宿主細胞の培養の段階。及び前述の検査複合物の前述の宿主細胞を刺激し前述の認知可能な標識を生産させる前述の能力を決定するための前述の指標分析の段階。ここにおいて、前述の標識の存在は前述の検査化合物が膵島細胞を刺激してＳＴＦ−１転写を誘導することを示している。また、前述の標識の不在は前述の検査化合物が膵島細胞に対してＳＴＦ−１転写誘導を刺激しないことを示している。
今回の発明のこの目的をさらに具体化すると、使用されたレポーター遺伝子は酵素である。さらに詳しく具体化すればその酵素はルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼのグループから選抜される。
今回の発明の別の具体化は、前述の転移段階が動物に対する転換遺伝子のトランスフェクションあるいはマイクロインジェクション注入により実行されることである。
今回の発明の別の目的としては、以下の段階により構成される、生体内におけるインシュリン生産膵島細胞を標識づけ方法を与えたことである。ＳＴＦ−１プロモーター及び前述のＳＴＦ−１プロモーターによる転写制御支配を受けるレポーター遺伝子を含むベクターの供給の段階。そこにおいて、前述のレポーター遺伝子は膵島細胞に対し認知可能な標識を与えることができる。前述のベクターの動物の胚へのトランスジーンとしての注入の段階。前述の胚の膵島細胞をもつ動物個体への成長の段階。前述の動物の膵島細胞のいずれかが前述のレポーター遺伝子を発現するか否かを決定するための前述の認知可能標識の分析。ここにおいて、標識の存在はインシュリン生産膵島細胞の存在を意味し、一方、標識の不在はインシュリン生産細胞の不在を意味している。
この発明のこの目的を具体化すると、そのレポーター遺伝子は蛍光タンパク質を生産し、この方法はさらに蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）による非インシュリン生産膵島細胞からのインシュリン生産膵島細胞の選抜の段階を含んでいる。
今回の発明の別のそしてより進んだ見地、特徴及び利点はこの発明の現在具体化されたものに関する以下の記載より今後明らかにされてくるであろう。
【図面の簡単な説明】
この発明の上記記述の特徴、利点及び目的に関する内容を達成し、及び詳細に理解できるようにするため、上で簡単に要約されたこの発明に関し、より詳細な記載を描き加えられた図面で示された具体例に対する参照として記載されている。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、描き加えられた図面はこの発明の選ばれた具体例を図示しており、したがってその範囲に限定して検討すべきでないことを注意しなければならない。
図１はＳＴＦ−１遺伝子の染色体上の所在を示す。図１ＡはＳＴＦ−１（Ｐdx１として引用されている）とマウス染色体５上のほかの遺伝標識との位置関係を示す模式図上で（マウス）染色体５の末梢領域に所在するオルファン（orphan）ホメオボックス遺伝子によりコードされている事を示している。センチモルガンの目盛りが右側に示されている。図１ＢはＳＴＦ−１と染色体５上の多種類の遺伝標識の間での組み換え頻度を示す表である。左の列は染色体位置決定の為に使用された遺伝標識を記載している。ＳＴＦ−１はここではＰdx１として引用されている。
図２は、ＳＴＦ−１プロモーターはＴＡＴＡ配列を欠如し、複数の転写開始部位を利用していることを示している。図２ＡはＳＴＦ−１の15キロベースのゲノムクローンを模式的に表しており、上にはキロベースの目盛りが付いている。6.5キロベースの５’フランク、４キロベースのイントロン、３キロベースの３’フランクが示されている。エキソンＩ（陰影をつけ、Ｉと示す）とエキソンII（陰影をつけ、IIと示す）を分断する４キロベースのイントロンはＩＶＳと呼ばれる。図２ＢはＳＴＦ−１遺伝子の５’フランク領域のヌクレオシド配列を示している。ＲＮアーゼ防護法により位置決定された転写開始部位（黒矢印）とプライマー・エクステンション法により決定された転写開始部位（白矢印）はＳ１（主要転写開始部位、太字）、Ｓ２及びＳ３と表されている。ｂＨＬＨ／ｂＨＬＨ−ＺＩＰタンパク質（Ｅボックス）、ＣＴＦ／ＮＦ−１（ＣＡＡＴ）及びＣ／ＥＢＰのそれぞれに対しての存在性上流因子結合部位はアンダーラインを引き主要開始部位に対する相対的な位置と共に記した。図２ＣはアンチセンスＳＴＦ−１  ＲＮＡプローブを使用したＴu６  ＲＮＡ（Ｔu６，２レーン）あるいはコントロールのイーストｔＲＮＡ（yeast，３レーン）のＲＮアーゼ防護試験の結果を示している。未消化のプローブを左側に示す（１レーン）。図２ＤはアンチセンスＳＴＦ−１プライマーを使用したイースト（４レーン）、Ｔu６  ｍＲＮＡ（５レーン）あるいはＲＩＮ  ｍＲＮＡ（６レーン）のプライマーエクステンション分析の結果を示している。連続するラダー（ladder）を一番右に示す（ＧＡＴＣ，７−10レーン）。ＲＮアーゼ防護生成物及びプリマーエクステンション生成物のとの間の一致したものが記録され、Ｓ１，Ｓ２及びＳ３と示される最初の３カ所の開始部位が示されている。（図２Ｂ、下部参照）。
図３はＳＴＦ−１プロモーターの6.5kb断片がトランスジェニックマウスの膵島細胞に対しβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現を標的としていることを示している。トランスジェニックから得られた成熟膵臓（上）及びコントロールの同腹児からの膵臓（下）の凍結切片を色素原としてＸgalを使用してlacＺ活性を評価したものを表している。矢印は膵島細胞を示している。
図４はＳＴＦ−１プロモーター内にある末端及び基部要素が膵島細胞に対してＳＴＦ−１を発現させることを示している。図４Ａは膵島細胞（βＴＣ３，ＨＩＴ）及び比較の意味で非膵島細胞系（ＰＣ12，ＣＯＳ，ＨeＬa）にトランスフェクションされた−6500  ＳＴＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド活性度を示している。記載されている分析結果はＲＳＶ−ＣＡＴコントロールプラスミドを同時トランスフェクションさせ正常化した後のＳＴＦ−１プロモーター活性をＨＩＴ細胞を基準（100％）として他の細胞の比較値を示している。試験は最低３回繰り返し行われた。図４ＢはＨＩＴ細胞にトランスフェクションされた後のＳＴＦ−１ルシフェラーゼ（ＳＴＦ  lus）プロモーター構造物の試験結果を表示している。構造物は主要転写開始部位に応じた５’プロモーター境界に従って命名された（Ｓ１、図２Ａ及び２Ｂ参照）。模式図は核因子に対する潜在的結合部位を示している。主要転写開始部位は黒矢印で示されている。星印は３キロベース末端における特質未確認の結合部位を示す。それぞれの構造物は、活性を内部調整物としてＲＳＶ−ＣＡＴ使用したトランスフェクション効率を正常化させた後の−6500  ＳＴＦ  Ｌucを100％としてその比較から計算された。試験は最低４回繰り返しおこなわれた。
図５はＳＴＦ−１プロモーターに存在する基部Ｅボックス要素が上流因子ＵＳＦに結合することを示している。図５Ａは−182〜−37に及ぶ（145塩基対）32Ｐ標識ＳＴＦ−１プロモーター断片を使用したＤＮアーゼＩ防護分析の結果を示す。オートラジオグラムは無抽出物（１及び４レーン）、ＨＩＴ及びＨela細胞からの核抽出物（それぞれ２及び３レーン）、あるいは組み換えＵＳＦ−１の存在下（５レーン）での消化パターンを示している。
図５ＢはＳＴＦ−１  Ｅボックス（−118/−95）を含む32Ｐ標識二重鎖オリゴヌクレオチドとともにインキュベートされたＨＩＴ核抽出物の電気泳動移動度分析を示す（１レーン）。未標識競合オリゴヌクレオチド（50倍モル過剰）を結合反応に加えたものを示した（２−５レーン）。ＳＴＦ  Ｅは野生型ＳＴＦ−１  Ｅボックスオリゴである。ＳＴＦ−Ｅ  ＭＵＴは−106塩基（Ｃ／Ａ）及び−102塩基（Ｔ／Ｇ）が置換されたＥボックスを含む突然変異ＳＴＦ−Ｅオリゴを表す。Ｉns−１（Ｐ）はインシュリンＩプロモーター由来のＰ要素である。また、Ｇal４はＧＡＬ４認識部位である。
左側の図５ＣはプローブとしてＳＴＦ−Ｅボックスを使用したＨＩＴ核抽出物のゲル移動分析の結果を示す（１レーン）。反応にＵＳＦあるいはＴＦＥ−３抗体を付加した結果は２及び３レーンに示した通りである。複合体Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３は図示された通りである。右側の図５ＤはＳＴＦ−Ｅプローブを使用したＨＩＴ（１−３レーン）抽出物のゲル移動分析の結果を示す。結合反応にＵＳＦ−１及びＵＳＦ−２の特異的抗血清を添加した結果が示されている。
図６は−104  Ｅボックスに対するＵＳＦの結合はＳＴＦ−１プロモーター活性に対して重要であることを図示している。図６ＡはＵＳＦ結合特性に対するＥボックス突然変異の効果を示している。野生型（Ｅ−ＷＴ）あるいは突然変異（Ｅ−ＭＵＴ）ＳＴＦ−１  Ｅボックスプローブを使用したＨＩＴ核抽出物のゲル移動分析の結果が下段に描かれた−106〜−102までの野生型及び突然変異プローブの配列とともに示されている。Ｃ１−３とは化合物Ｃ１，Ｃ２及びＣ３である。図６ＢはＨＩＴ細胞におけるＳＴＦ−１プロモーター活性に対するＥボックス突然変異の効果を示している。図にはＳＴＦ−１プロモーターの6500塩基対あるいは190塩基対に関係して野生型、突然変異あるいはＳＴＦ−１  Ｅボックス欠損体（−118/−95）をトランスフェクトされたＨＩＴ細胞の分析結果を表現している。レポーターの活性度はＲＳＶ−ＣＡＴ支配プラスミドを同時トランスフェクトさせトランスフェクション能力を正常化させた後の野生型−6500  ＳＴＦ−１  Ｌuc構造物を100％として、その比較で表されている。試験は最低３回繰り返し行われた。
図７はグルココルチコイドがＳＴＦ−１遺伝子５’フランキング領域に存在する膵島特異性促進物経由でＳＴＦ−１発現を抑制することを示している。
図７Ａは18〜24時間のデキサメタゾン（10-7Ｍ）あるいはコントロールのエタノール媒体によるＨＩＴ−Ｔ15細胞処理後のＳＴＦ−１プロモーター活性を示す。−6.2/−5.67  ＳＴＦ  Ｌucレポーターの活性を100％に合わせる。すべての構造物は５（基部フランキング領域の120塩基を含有するＳＴＦ−１ルシフェラーゼベクター（ＳＴＦ−１  Ｌuc）との関係で評価される。ＳＴＦ−１  Ｌucレポーターに挿入されたＳＴＦ−１配列はヌクレオチド番号で表示されている。例えば、−6.5/−6.2  ＳＴＦ  ＬucはＳＴＦ−１の５’フランキング領域の基部120塩基部位に融合した−6500〜−6200までのＳＴＦ−１配列を含有する。末梢領域は楕円及び正方形で図示された活性化要素を含んでおり、また、最小のＳＴＦ−１プロモーターは長方形で図示されている。標準偏差を表すバーが示されている。分析は最低３回繰り返された。ＳＴＦ−１レポーター活性はいかなるものも同時トランスフェクトされたＣＭＶ−βgal支配プラスミドを使用することによりトランスフェクション効率を正常化させた。
図７Ｂ（上段）はＨＩＴ  Ｔ15細胞におけるＳＴＦ−１レポーター構造物のトランジエントトランスフェクション分析の結果を示している。５’フランキング領域配列の6500塩基領域を含む−6500  ＳＴＦ  Ｌucの活性を100％に規定した。それぞれの試験は最低４回の倍数回繰り返して行われた。標準偏差は図示された通りである。下段ではＣＯＳ−７細胞にトランジエントトランスフェクションされた後のＳＴＦ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドの活性を示している。プロモーター活性はＣＭＶ−βgal制御活性に対し正常化され、ＨＩＴ細胞におけるＳＴＦ−レポーター活性との直接の比較が考慮されている。
図７Ｃは−6.2〜−5.67kbの範囲に展開するＳＴＦ−１遺伝子上の最小膵島特異性エンハンサーのヌクレオチド配列を表す。主体物と結合するＨＮＦ−３及びＥボックス主要素は太字表示され、またアンダーラインが引かれている。
図８はＳＦＴ−１遺伝子中の膵島特異性エンハンサーがＨＮＦ−３βとＢＥＴＡ−２に対する結合部位を含むことを示す。
図８ＡはラットＳＴＦ−１プロモーターの−5870〜−6100塩基の範囲の32Ｐ標識ＳＴＦ−１プローブを使用したＨＩＴ  Ｔ15膵島細胞、ＨelaあるいはＣＯＳ−７細胞由来の核粗抽出物のＤＮアーゼＩ保護試験の結果を示す。ＮＯＮＥとは抽出物を加えないコントロール反応であり、ＨＮＦ−３αとは組み替えタンパクを使用した反応である。
図８Ｂはそれぞれのレーンの上に記載されたＨele、ＨepＧ２、グルカゴン生産αＴＣ、あるいはインシュリン生産ＨＩＴ及びＲＩＮ細胞系由来の粗核抽出物のゲル移動度分析の結果を表す。分析はＨ要素を含有した32Ｐ標識のＳＴＦ−１オリゴヌクレオチドプローブを用いて行った。野生型（ＷＴ）と突然変異（ＭＴ）Ｈ要素の配列を下に示した。
図８ＣはＨＩＴインシュリノーマ（ＨＩＴ  ＮＥ）及び１次培養成体ラット膵島細胞（ＩＳＬＥＴ  ＮＥ）由来の粗核抽出物の、−5907〜−5927までに存在する32Ｐ標識ＳＴＦ−１  Ｈ要素を使用したゲル移動度分析の結果を表す。それぞれのレーンの上に記載されているとおりＨＮＦ３α，βあるいはγ抗血清が反応に添加された。−は抗血清は添加されていない。Ｉ及びIIはそれぞれタンパク質−ＤＮＡ及び抗体スーパーシフト複合体をそれぞれ表す。
図８ＤはＳＴＦ−１プロモーターの−5963〜−5981まで存在する32Ｐ標識Ｂ要素プローブを使用したＨＩＴ  Ｔ15細胞由来粗核抽出物のゲル移動分析の結果を示す。ＢＥＴＡ−２、Ｅ２ＡあるいはＳＴＦ−１抗血清の結合反応に対する添加が各レーンの上に示してある。100倍の過剰量の無標識野生型（ＷＴ：５’−ＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴ−３’）あるいは突然変異（ＭＴ：５’−ＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＴ−３’）の競合ＤＮＡが記載されているとおりに添加された。ＢＥＴＡ−２及びＥ−47  ｃＤＮＡでプログラムされた網状赤血球リゼイト由来の結合活性は７レーンで示した。７レーンの最上のバンドは網状赤血球に固有なものである。
図９はグルココルチコイドが膵島特異性エンハンサーのＨＮＦ−３活性を妨害することによりＳＴＦ−１発現を減少させることを示す。
図９ＡはＨＩＴ  Ｔ15インシュリノーマ細胞におけるＳＴＦ−１レポータープラスミドのトランジエットトランスフェクション分析の結果を表す。最小膵島特異的エンハンサー（−6200〜−5700）を含有する−6.2/−5.7  ＳＴＦ  Ｌuc構造物の活性を100％に合わせる。ＨＮＦ−３β及びＢＥＴＡ２／Ｅ２Ａの結合を阻害するＨ及びＢ要素上の点突然変異を含んだ構造物は楕円あるいは正方形にＸを記して表された。ＥボックスおよびＨ要素突然変異に相当する点突然変異はゲル移動分析に使用された（図８参照）。
図９Ｂはコントロール（−）及びデキサメタゾン処理（＋）ＨＩＴ−15細胞における野生型（有色縦棒）及びＨ要素変異（白色縦棒）のＳＴＦ−１レポーター活性に対するＨＮＦ−３β過剰発現に対する効果を表す。コントロール細胞において最小の膵島特異的エンハサー（−6200〜−5700）を含有する野生型−6.2/−5.7  ＳＴＦ  Ｌuc活性を100％にセットする。標準偏差を示すバーが示されている。実験は最低４回繰り返し行われた。
図９ＣはＨＩＴ−Ｔ15細胞におけるＳＴＦ−１（−6500  ＳＴＦ−１  ＬＵＣ）レポーター活性に対するＨＮＦ−３βエフェクタープラスミド量の増加の効果を示す。ＨＮＦ−３βエフェクタープラスミドの総量（μｇで）をそれぞれのグラフの下に示した。それぞれの分析においてのエフェクタープラスミドの総量はＣＭＶ無発現ベクターで調整し一定に保たれた。コントロール（ＥＴＯＨ）及びデキサメタゾン（ＤＥＸ）で記載のとおり細胞を処理した。
発明の詳細な説明
今回の発明では、膵臓の形態形成及びグルコースホメオスタシスの機能をもつホメオドメインタンパク質であるＳＴＦ−１がマウス染色体５上の“オルファン”ホメオボックス遺伝子によってコードされている事を示した。β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と融合させた場合、ＳＴＦ−１遺伝子由来の５’フランキング配列を含む6.5キロベースゲノム断片はトランジェニックマウスにおて膵島特異性活性を示す。膵島限定発現に対し、ＳＴＦ−１プロモーター内の２つの末梢要素が必要とされ、それは、−３と−6.5キロベースの間に所在する末梢エンハンサー及び−104に位置し、ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）／ロイシンジッパー（ＺＩＰ）核因子ＵＳＦにより最初に認識される基部Ｅボックス配列である。ＵＳＦ結合を中断させる−104  Ｅボックス内の点突然変異はそれ相当にＳＴＦ−１プロモーター活性を減少させていることから、今回の発明ではＵＳＦが膵島細胞に対してＳＴＦ−１発現を導く調節機構の重要な成分であることを示している。さらに、グルココルチコイドがＨＮＦ−３β及びＢＥＴＡ−２／Ｅ47という２つの内胚葉因子を認知する末梢膵島特異性エンハンサーの活性を妨害することによりＳＴＦ−１遺伝子の発現を強力に抑圧することを発見した。ＨＮＦ−３βあるいはＢＥＴＡ−２／Ｅ47のいずれかの結合を妨害するＳＴＦ−１エンハンサーの突然変異はそれ相当にＳＴＦ−１プロモーター活性を妨害する。グルココルチコイド処理した細胞におけるＳＴＦ−１エンハンサー活性を回復させるＨＮＦ−３β発現ベクターの能力はＨＮＦ−３βが実際にＳＴＦ−１発現の重要な調節要因であることを示す。
この発明の１つの目的はＳＴＦ−１転写を誘導する化合物の検査方法の供給である。ＳＴＦ−１／lacＺ融合遺伝子を発現する膵島細胞系リン酸カルシウム共沈降により分離される。ＳＴＦ−１発現に対する各種化合物の効果を調査するために、対象となる化合物をＳＴＦ−１／lacＺ発現細胞に添加する。比色定量分析によりコントロールと処理細胞のＬacＺ活性を定量する。この方法を使用して、非常に多種類の化合物が選抜できＳＴＦ−１誘導化合物が迅速に同定できる。
今回の発明の別の目的は、生体内においてインシュリン生産膵島細胞を標識する方法の供給。本件に関してグリーンフルオセントタンパク（ＧＦＰ）が不可欠の指示薬として使用される。ＧＦＰの発現はOgawaらの記載のとおり細胞を破壊する事なく検出できる［Ogawa et al.. ：Proc. Natl. Acad. Sci., 92：11899-11903（1995）］。動物の膵臓からβ細胞の回収を容易にするために、ＧＦＰをコードする遺伝子とＳＴＦ−１プロモーターを融合させた。ブタへのＳＴＦ−１−ＧＦＰ転換遺伝子の導入は膵臓からのインシュリン生産細胞の効果的で迅速な回収を可能にする。端的に述べると、ブタから膵臓を回収し細胞を離散させるためにコラーゲナーゼ処理される。インシュリン生産膵島細胞はＳＴＦ−１グリーンタンパク転換遺伝子の発現に基づく蛍光活性細胞選択（ＦＡＣＳ）により回収される。精製したβ細胞群は糖尿病患者に対する細胞治療に使用される。
今回の発明の１つの側面においては、膵島細胞を刺激してＳＴＦ−１転写を誘導する検査化合物の能力を決定する方法の供給である。この方法は以下の段階で構成される。すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  No.１あるいはＳＥＱ  ＩＤ  No.２あるいはそれらの断片群から選択された配列を持つＳＴＦ−エンハンサー、プロモーター、及び前述のＳＴＦ−１エンハンサー及び前述のプロモーターの転写制御をうけるレポーター遺伝子を持つベクターを供給する段階から構成される。ここで前述のレポーター遺伝子は前述の宿主細胞に対し認知可能な標識を与える能力がある。前述の宿主細胞に対して前述ベクターの導入の段階。前述の宿主細胞を刺激して前述の指標を生産させる前述の検査化合物の存在下での前述宿主細胞の培養の段階。および、前述の検査化合物の前述の宿主細胞を刺激し前述の認知可能な指標を生産させる前述の能力を決定するための前述の指標に対する分析の段階。ここにおいて、前述の指標の存在は前述の検査化合物が膵島細胞を刺激してＳＴＦ−１転写を誘導することを示唆する。また、前述の指標の不在は前述の検査化合物が膵島細胞にたいしてＳＴＦ−１転写誘導を刺激しないことを示している。
今回の発明のこの目的をさらに具体化すると、使用されたレポーター遺伝子は酵素である。さらにより具体化すれば、その酵素はルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼのグループから選抜される。
今回の発明の別の具体化は、前述の転移段階が動物に対する転換遺伝子のトランスフェクションあるいはマイクロインジェクション注入により実行されることである。
今回の発明のもう一方の目的は、以下の段階で構成される生体内でのインシュリン生産膵島細胞の標識づけ方法供給である。ＳＴＦ−１プロモーター及び前述のＳＴＦ−１プロモーターによる転写制御を受けるレポーター遺伝子を含有するベクターの供給の段階。ここにおいて、前述のレポーター遺伝子は膵島細胞に対し認知可能な標識を与える能力をもつ。前述のベクターの動物の胚への転換遺伝子の注入の段階。前述の胚の膵島細胞をもつ動物個体への育成の段階。及び前述の動物膵島細胞が前述のレポーター遺伝子を発現するか否かの決定のための前述の認知可能な標識の分析の段階。ここにおいて、標識の存在はインシュリン生産膵島細胞の存在を示し、一方、標識の不在はインシュリン生産膵島細胞の不在を示す。この方法は、これらの段階で構成される。
今回の発明のこの目的をさらに具体的にすると、このレポーター遺伝子は蛍光タンパク質を生産し、この方法は蛍光活性細胞選択（ＦＡＣＳ）による非インシュリン生産細胞からのインシュリン生産細胞の選抜の段階を含んでいる。
ヒトゲノムはＨoxあるいは相同異質形成選択遺伝子と命名され、胚形成期間中に軸体様式形成の不可欠の決定要因である４群の遺伝子を含有している［Krumlauf, Cell, 78：191−201（1994）］。その４群はそれぞれ13個までの遺伝子を含んでおり、一群から得られる遺伝子は通常他の３群の類似の遺伝子と特に高い相同性を有する。これらの関連遺伝子は、パラログス（palalogs）と命名されており、それゆえＨoxＡ１，ＨoxＢ１，ＨoxＣ１及びＨoxＤ１はすべて非常に関係性の強いパラログスであるが、それぞれは別の染色体上の異なったＨox群に存在する。ＨoxＢ複合体は染色体17の長腕部に存在し、例えばＨoxＢ１からＨoxＢ９までが確認されている。
インシュリン遺伝子のグルコース依存性調節はグルコース仲介のインシュリン分泌の増加と協力して起こるようである。このことは、ある程度細胞内カルシュウムの増加のためであると推定される。加えて、グルコース反応性インシュリンプロモーター機能は、少なくともその一部はＦＬＡＴ結合タンパク質の働きにより調節することにより起こることが推定される。ＨoxＢ13はインシュリンプロモーターの機能的に重要なＦＬＡＴ要素と高い親和性で結合している。付け加えると、ＨoxＢ13とインシュリンＩＣＥ／Ｎir要素結合因子Ｐan−１は共同して添加された場合インシュリンプロモーターを強力に活性化させる。このことはＦＬＡＴ及びＮir要素がインシュリン生産細胞において共同で作用するという観測結果と一致する。集約すると、これらのデータはカルシウム依存性信号経路がＨoxＢ13の機能を調節する可能性を示している。
今回の発明に関して、在来の生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術がその技術範囲内で使われている。これらの技術はすべて論文に記載されている。例えば、次を参照Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning：A Laboratory Manual（1982）；“DNA Cloning：A Practical Approach；Volume Ｉ and II（D. N. Glover ed. 1985）；“Oligonucleotide Synthesis”（M. J. Gait ed. 1984）；“Nucleic Acid Hybridization”［B. D. Hames & S. J. Higgins eds.（1985）］；“Transcription and Translation”［B. D. Hames & S. J. Higgins eds.（1984）］；“Animal Cell Culture”［R. I. Freshney, ed.（1986）］；“Immobilized Cell And Enzyme”［IRL Press,（1986）］；B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning”（1984）。
それゆえこの文書中での出現の場合、以下の用語は以下で説明される定義で使われている。
“ベクター”はプラスミド、ファージあるいはコスミドのようなレプリコンであり、付着ＤＮＡ分節の複製を生じさせるために別のＤＮＡに付着することができるものである。
“ＤＮＡ分子”は一本鎖、あるいは二本鎖らせん構造のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンあるいはシトシン）の多重合形態に対して述べられている。この用語は分子の１次及び２次構造に対してのみ使用されるが、特殊な３次構造に関する部分に対しては制限していない。したがって、この用語の意味には直線上なかんずくＤＡＮ分子（例として制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体で見られる２重らせんＤＮＡを含んでいる。本文で構造を考察する場合、無転換鎖のＤＮＡ（すなわちｍＲＮＡと相同的配列を持つ鎖である）の配列を５’から３’方向で示す通常の慣行に従う。
“複製の発端”とはＤＮＡ合成に参加するこれらのＤＮＡ配列のことを示す。
ＤＮＡ“コーディング配列”とは正確な調節配列の支配下のもとにおかれた場合、生体内において転写されポリペプチドに翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の終了コドンによって決定される。コーディング配列とはそれに限られたものではないが、原核配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核（例えばヒト）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列までも含むことができる。ポリアデニル化シグナル及び転写終末配列は通常コーディング配列の３’末端に位置するであろう。
転写及び翻訳制御配列とはプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、その他のような、宿主細胞においてコーディング配列を発現するＤＮＡ調節配列である。
“プロモーター配列”とは細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合できるＤＮＡ調節領域であり、下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。今回の発明を定義する目的では、プロモーター配列は転写開始部からその３’末端が境界となりバックグラウンド上で認識できる水準の転写開始に必要とされる最小限の塩基あるいは要素を含む上流（５’方向）に伸びている。プロモーター配列の内部には、ＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）だけではなく、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を使用したマッピングにより容易に定義された）が見いだされる。真核のプロモーターは頻繁に、だが常時ではなく、“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含有している。真核プロモーターは−10及び−35コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガノの配列を含有している。
“発現制御配列”とは別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、その後コーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される場合には、コーディング配列は細胞内で転写及び翻訳配列の“制御支配下”にある。
“シグナル配列”はコーディング配列の前方に含まれることができる。この配列はペプチドのＮ−末端にあり、宿主細胞に伝達しペプチドを細胞膜を通過あるいはペプチドを媒体内へ分泌させるシグナルペプチドをコードし、また、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞を通り過ぎる前に宿主細胞により切断される。シグナルペプチドは原核細胞及び真核細胞で生産される多様なタンパク質と結合した状態で見ることができる。
“オリゴヌクレオチド”の用語はここにおいては今回の発明のプローブに関して使用されており、２以上、多くは８以上のリボヌクレオチドから構成されている分子について定義されている。その正確な大きさは本質的な機能さらにオリゴヌクレオチドの使い方で決まる多くの要因により決まる。
ここで使用される“プライマー”の用語は制限消化物を精製させた天然物か合成されて生産されたかにかかわらず、オリゴヌクレオチドに対して使われており、そこは、プライマーエクステンション生成物が合成される状況下に置かれた場合の開始点としての機能する事ができ核酸鎖に対して相補的であり、例えば適切な温度とpHにおいてＤＮＡポリメラーゼのような誘導薬とヌクレオチドの存在下で誘導される。プライマーは一本鎖あるいは二本鎖のいずれの可能性があり誘導薬の存在下で求めるエクステンション生産物の主要な合成が十分に長いことが必要である。プライマー正確な長さは温度、プライマーの原料及び使用する方法を含む多くの要因により決定される。例えば、診断上の適用においては、目的とする配列の構成により決定し、オリゴヌクレオチドプラーマーはより少ないヌクレオチドの含有でも可能であるが、典型的に15〜25あるいはそれ以上のヌクレオチドを含有している。
ここにおけるプライマーは目的となる特定のＤＮＡ配列の別個の鎖と“実質上”相補的なものが選択される。このことはプライマーがそれぞれの鎖を有効なものとして相補的に交雑されることが必要であることを意味している。さらに、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片はその鎖に対し相補性をもつプライマー配列の残留物のある状態でプライマーの５’末端と接合することができる。別な言い方をすれば、非相補的塩基あるいはより長い配列をプライマー配列は配列に対し効果的相補性を所持あるいはそれをもって交雑し、及びエクステンション生成物の合成の鋳型を形成する条件でプラーマーの中に配置することができる。
ここで使用される“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”なる用語は、それぞれ特定のヌクレオチド配列のその地点あるいは近接点の二重鎖ＤＮＡを切断する細菌の酵素について使われる。
細胞はその内部に外因性のあるいは異型のＤＮＡを導入された場合それらＤＮＡにより“形質転換”される。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムの中に組み込まれる（共有的に結合する）可能性あるいは組み込まれない可能性の両方の可能性がある。たとえば原核生物、イースト及び哺乳類細胞では形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素の中で保持されている。真核細胞に関しては、安定した形質転換細胞は染色体複製を通じた娘細胞により遺伝するため形質転換ＤＮＡは染色体の中に組み込まれている。この安定性は真核細胞の形質転換ＤＮＡを持つ娘細胞の集合体で構成される細胞系統やコロニーを作り出す能力により示される。“クローン”とは単一の細胞あるいは共通の原種から分裂によって派生する細胞集合体の事である。“細胞系統”とは何代にもわたり試験管内で安定的に成長することができる１次細胞のコロニーである。
２つのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の配列が確定された長さに対してヌクレオチド最低約75％（一般的に言えばは少なくとも約80％、最も厳密に言えば少なくとも約90〜95％）適合する場合“実質的に相同”である。実質的に相同である配列は配列データバンクを利用できる標準ソフトウエアー配列比較あるいは例えば特殊システムに対して定義される厳格な条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定される。定義される正確なハイブリダイゼーション条件は既存技術である。たとえば、上記の「Maniatisらの著作」、「ＤＮＡ  Cloning, Vols. Ｉ＆II」「Nucleic Acid Hybridization」参照。
ＤＮＡ構造物の“異型”領域は自然界でより大きな分子と会合した形で見いだされない、より大きなＤＮＡ分子の内部で識別可能のＤＮＡ分節である。したがって、異型領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は元来の器官のゲノムにおいて哺乳類ゲノムＤＮＡに側面を接しないＤＮＡにより通常側面を接するであろう。別の例ではコーディング配列はコーディング配列それ自身が自然界では発見できない構造物に見られる。（例えば、ゲノムコーディング配列がイントロンを含むｃＤＮＡあるいは天然の遺伝子とは異なるコドンをもつ合成配列）。対立遺伝子の変異物あるいは自然発生の突然変異ではここで定義された様なＤＮＡの異型領域を発生させることはない。
今回の研究で最も一般的に使用されている標識は放射性元素、酵素、紫外線を照射した場合に蛍光を発する化学物質、その他である。多種類の蛍光物質が知られており標識として使用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー及びルシフェルイエローが含まれる。特殊な識別物質にはヤギで調製されイソチオシアネートによりフルオレセインと接合された抗ウサギ抗体である。
酵素標識も同様に有効あり、現在利用されている比色定量、分光分析、蛍光分光分析、アンペロメトリクあるいは気体定量の各技術のいずれかによって認識できる。その酵素はカルボジイミド、ジイソシアン酸、グルタラルデヒド、その他のような架橋分子と反応により選択された粒子と接合する。これらの手法に使用できる多種類の酵素が知られており、実際に効果がある。具体例を挙げるとペルオキシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ付加グルコースオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼである。U.S.Patent Nos. 3,654,090、3,850,752及び4,016,043には外の標識物質及び方法に関する明細書の実施例が言及されている。
以下の実施例はこの発明の様々な具体例を示す目的で記載されており、いかなる方法においても今回の発明に制限を持たせる意味ではない。
実施例１
染色体地図作製
ＳＴＦ−１遺伝子の染色体地図作製はJackson Laboratory Backcross DNA Panel Map Service社の（Ｂ６×ＳＰＲＥＴ）Ｆ１×ＳＰＲＥＴ戻し交雑パネル材料に32Ｐ標識ＳＴＦ−１  ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用して実施された。
実施例２
トランスジェニックマウスの発生及びβガラクトシダーゼ染色
β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の全面にＳＴＦ−１配列の上流部6500塩基対を含む融合遺伝子は通常のクローニング手法を使用して構築され受精卵の雄性前核に注入する。創始者マウスはサザンブロッティング及びＰＣＲ増幅技術を使用して決定される。ＳＴＦ−１／β−ガラクトシダーゼ遺伝子のトランスジェニック組織での発現は染色基質としてＸ−galしたパラホルムアルデヒド固定組織の20μM切片により評価された。
実施例３
抗体
スーパーシフト試験に使用する非識別ＵＳＦ−１，２抗体はSanta Cruz Biotechnologyより購入した。ＴＦＥ３抗体はK. Jonesより入手した。ＵＳＦ−１あるいはＵＳＦ−２を特異的に認識する抗体はM. Sawadogoにより供給された（17，18）。
実施例４
ＳＴＦ−１ゲノムクローンの分離
ＳＴＦ−１遺伝子はハイブリダイゼーションプローブとして32Ｐ標識  ＳＴＦ−１  ｃＤＮＡ断片を使用してＥＭＢＬ３ラットゲノムライブラリーから分離された。ＳＴＦ−１陽性ゲノム断片はＳＫIIプラスミド（Stratagene）のＥcoＲＩ部位にサブクローン化された。
実施例５
ＲＮアーゼ防護及びプライマーエクステンション
ポリＡ+ＲＮＡはオリゴテックス（ｄＴ）30システム（Quiagen）を使用して調製した。プライマーエクステンション分析のオリゴヌクレオチドプライマーはγ−32Ｐ  ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して５’末端が標識されてる。５μgのポリＡ+ＲＮＡは末端標識アンチセンスプライマーと最初に80℃で５分間、続いて42℃で16時間インキュベートした。プライマーエクステンション反応はＡＭＶ逆転写酵素37℃、１時間の条件で行われ生成物は５％変成ポリアクリルアミドにより分析された。ＲＮアーゼ防護反応はＴu６細胞から抽出された全ＲＮＡの25μg使用して行われた（19）。反感覚ＳＴＦ−１  ＲＮＡプローブは転写開始部位を起点として−185〜＋93まで広がるＳＴＦ−１ゲノム断片を使用して生成される。32Ｐ標識アンチセンスＳＴＦ−１  ＲＮＡは試験管内でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと32Ｐ−ＵＴＰ合成された。ＳＴＦ−１アンチセンスＲＮＡ及びｍＲＮＡは80℃で５分間アニーリングさせた後65℃で16時間インキュベートした。アニーリング反応物は続いて40μg/ml  ＲＮアーゼにより室温で１時間処理され、消化物は５％変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。
実施例６
レポータークローン及びトランジエットトランスフェクション
すべてのプロモーターはD. Helinski（20）が示した通常のクローニング手法を使用してｐ（Ａ）3ルシフェラーゼバックボーンの中でクローンとされた。ＳＴＦ−１プロモーター由来の５’フランキング配列は主要転写開始部位を起点として＋68部位（−6500  ＳＴＦ  Ｌuc，−3500  ＳＴＦ  Ｌuc，−540  ＳＴＦ  Ｌuc，−410  ＳＴＦ  Ｌuc，−225  ＳＴＦ  Ｌuc，−140  ＳＴＦ  Ｌuc）あるいは＋78部位（−190  ＳＴＦ  Ｌuc，−130  ＳＴＦ  Ｌuc，−120  ＳＴＦ  Ｌuc，−95  ＳＴＦ  Ｌuc，−35  ＳＴＦ  Ｌuc）にルシフェラーゼ遺伝子を融合された。プラスミドはリン酸カルシウム沈殿によりＨＩＴ−Ｔ15細胞（ＡＴＣＣ）、βＴＣ３（D. Hanahanの方法による（21））、ＰＣ12，ＣＯＳ及びＨeＬa細胞に対してトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ値はムーンライトルミノメーターにより計測され、並びに同時トランスフェクトされたＲＳＶ−ＣＡＴ内在制御プラスミドによりＣＡＴ活性を正常化させた。
実施例７
ゲル移動分析及びＤＮアーゼ防護分析
電気泳動分析ではオリゴヌクレオチドプローブはクレノールの断片を使用した補完反応によりα32Ｐ−ｄＣＴＰにより標識された。４μgの核抽出物は0.5ngの32Ｐで標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートされ、先に記載の通り（９）無変成ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を受ける。スーパーシフト分析ではタンパク質は抗体とプレインキュベートされ、続いて放射性二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートされ電気泳動される。ＤＮアーゼ防護は先に記載の通り行われた（22）。
ＤＮＡ結合の泳動像はＨＰ  ScanJet  ３Ｃにより実物の写真を走査されマッキントッシュを使ったCanvasソフトウエアーにより組み立てられる。走査映像はTektronix Phaser  II  ＳＤＸにより再現された。
実施例８
ＳＴＦ−１遺伝子の染色体上の所在及びゲノム構造
ＳＴＦ−１  ｃＤＮＡをJackson Laboratoriesから得られたＤＮＡのバックロッスパネル上でハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、ＳＴＦ−１遺伝子のシングルコピーはマウス染色体５の末梢領域に位置が定められた（図１Ａ）。末梢の遺伝標識であるＰmv12あるいはIapls３−９との組み換えは見られなかったが、一方、さらに末梢部に所在するActb遺伝子座６個の組み換えが観察された。（図１Ｂ）。これらの結果はＳＴＦ−１遺伝子はラットでは染色体14に、ヒトでは染色体７ｑで見いだされ、その遺伝子座は４つのホメオティクＨＯＸ群のいずれとも一致していないことを予言している。これらの結果はＳＴＦ−１は分類がされていない“オルファン”ホメオボックス遺伝子であることを示している。
ＳＴＦ−１をコードする遺伝子を分離するために32Ｐ標識ＳＴＦ−１  ｃＤＮＡを持つラットＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーから106個のバクテリオファージクローンがスクリーニングされ15キロベース（kilobases）が挿入されたゲノムをそれぞれ含有する陽性クローンが得られた。6.5kbの５’フランキング配列と3.5kbの３’フランキング配列が加わった、15キロベースＳＴＦ−１ゲノム断片はホメオボックスコーディング配列（アミノ酸140−215）の近接の上流（Ala135）に挿入されている１本の４キロベースイントロンによって中断されている完全なＳＴＦ−１コーディング領域を含んでいる（図２Ａ）。
ＳＴＦ−１ゲノムクローン（図２Ｂ）の５’フランキング領域には一般に広く存在しているＴＡＴＡボックス及びイニシエーターの配列が存在しない。次に、この遺伝子の転写開始部位を地図で示した。インシュリン生産細胞系ＲＩＮ及びＴu６由来のｍＲＮＡに対するＲＮアーゼ防護及びプライマーエクステンション分析により（図２Ｃ及び図２Ｄ）、Ｓ１，Ｓ２及びＳ３と命名され、それぞれ翻訳開始部位から91，107，120/125ヌクレオチド上流に所在する３つの主要な開始部位が決定された。翻訳開始部位から137ヌクレオチド上流のある４番目の比較的重要ではない転写開始部位も観測された。他のＴＡＴＡ欠如プロモーターと同様に、ＳＴＦ−１プロモーターもＳ１及びＳ２開始部位から30塩基対上流にＧ／Ａ及びＧ／Ｃ豊富な配列を含んでいる（23−25）。
実施例９
膵島細胞におけるＳＴＦ−１プロモーター活性
ＳＴＦ−１遺伝子の５’フランキング領域配列が膵島細胞に対してＳＴＦ−１発現させることに有効か否か決定するために、ＳＴＦ−１の５’フランキング配列の6500塩基対をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合させ、トランスジェニックマウスにおいてＳＴＦ−１−lac  ｚレポーターの発現を色素原基質としてＸ−galを使用してみると、β−ガラクトシダーゼ活性はトランジェニックの膵島で観測できるが３つの独立した創始者系統由来のコントロールの同腹子では観測できなかった（図３Ａ）。
内因性ＳＴＦ−１タンパク質に対して先に記載した発現様式と一致して、有効なβ−ガラクトシダーゼ活性はトランスジェニックマウスの外分泌腺房細胞（図３Ｂ）あるいは肝臓や脾臓のような膵臓以外の組織（未掲示）では観察されない。
十二指腸における内因性ＳＴＦ−１遺伝子の報告されている発現（８，13）と一致して、抗感覚β−ガラクトシダーゼＲＮＡプローブを使用した生体内でのハイブリダイゼーション研究ではまたトランスジェニック動物由来の十二指腸の上皮細胞において転換遺伝子発現を明らかにしている（未掲示）。これらの結果はＳＴＦ−１プロモーターの6500塩基対が膵島及び十二指腸細胞に対して目的とするＳＴＦ−１の発現に実際に十分効果があることを示している。
膵島細胞に対してＳＴＦ−１発現を導く機能的要素を定義するために、−6500  ＳＴＦ  Ｌucレポーターの活性を２つの別個の膵島細胞系（βＴＣ３，ＨＩＴ）で調査した。トランジェニックマウスでの結果から予測されるようにＳＴＦ−１レポーターはこれらの膵島細胞において、ＨeＬa，ＰＣ12及びＣＯＳのような非膵島系に比較して20〜100倍の高い活性を示す（図４Ａ）。対照的にＳＴＦ−１遺伝子の４キロベースのイントロン及び３キロベースの３’フランキング領域では最小のＳＶ40  ＣＡＴプロモータープラスミドに挿入された場合にはこのような活性は見られず（未掲示）、6.5キロベースＳＴＦ−１プロモーター断片は膵島細胞における目的とされるＳＴＦ−１発現を特異的に招くことを暗示する。
膵島細胞発現を与えるＳＴＦ−１プロモーター内部の配列を図示するために、一連の５’欠損変異構造物を生成させこれらのレポーターをＨＩＴ細胞にトランスフェクションすることにより分析された（図４Ｂ）。−6500レポーター構造物由来の−6500〜−3500塩基対までの配列の欠損変異はＳＴＦ−１レポーター活性を４分の１に減少させる。このことはその領域において末梢部賦活領域の存在を暗示する。さらに−3500塩基対から−190塩基対までのＳＴＦ−１プロモーターの先端切断ＨＩＴ細胞におけるレポーター活性に意味をもつような影響を与えない（図４Ｂ）。しかしながらＳＴＦ−１の−190〜−95塩基対までの欠損はＨＩＴ細胞のレポーター活性を激的に弱め、基部の要素もまたＳＴＦ−１プロモーター機能に必要であることを示している。ＳＴＦ−１プロモーターの−190〜−95の領域における配列の綿密な調査の結果は３つの一致したＥボックス主要素を示している（図２Ａ）。−177部位の２つ並んだＥボックスの除去はプロモーター活性を減少させないが、−104（−95  ＳＴＦ  luc）部位の基部Ｅボックス配列の欠損はＨＩＴ細胞におけるＳＴＦ−１発現を完全に消滅させる。
実施例10
ＵＳＦ含有複合体を認識するＳＴＦ−１プロモーター上の基部Ｅボックス
ＳＴＦ−１プロモーター中の機能的要素と結合する上流因子を特徴づけるために、ＤＮアーゼＩ防護分析はＨＩＴ及びＨeＬa細胞由来の核抽出物を使用することにより行われた（図５Ａ）。両方の抽出物において、優越したフットプリンティング活性はその境界機能的に重要な基部Ｅボックス主要素（−118/−95）と一致する。ＨeＬa抽出物に対照してＨＩＴ抽出物において重要な−104Ｅボックス結合タンパク質のさらなる特徴付けのためゲル移動度分析を行った。−118〜−95までに広がる二本鎖ＳＴＦ−１オリゴヌクレオチドを使用すると、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３と命名された３つの化合物が両方の核抽出物から確認された（右欄、図５Ｂ、１及び４レーン）。Ｃ１，Ｃ２及びＣ３化合物の形成は結合反応における50倍過多の無標識ＳＴＦ−１  Ｅボックス競合オリゴヌクレオチドにより抑制された。突然変異Ｅボックスヌクレオチドあるいは非特異的競合ＤＮＡはこれら結合活性に影響を持たないが、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３はＳＴＦ−１  Ｅビックス配列に対し実際に特異的であることを示している。ＨeＬaとＨＩＴ抽出物の間でこれら化合物がつくる型には質的差異は見られなく（未掲示）、−104Ｅボックス主要素は両方の細胞種において比較できる程度に発現する因子を認知するであろうことを暗示している。
以前の報告では−118/−95  ＳＴＦ−１主要因（ＣＡＣＧＴＧ）はmyc，max，ＴＦＥ−３，ＴＦＥ−Ｂ及びＵＳＦのようなｂＨＬＨ−ＺＩＰタンパク質に優先的に結合することが示されていた。これらの候補タンパク質のそれぞれがＣ１，Ｃ２あるいはＣ３複合物内部に含まれているのかどうかを決定された（26，27）。−118/−95Ｅボックス結合タンパク質の熱変成抵抗に対する能力（未掲示）により熱安定上流因子のＵＳＦのいずれがＣ１，Ｃ２あるいはＣ３の構成成分であるかの試験が行われた（未掲示）（28）。ゲル移動度反応における抗ＵＳＦ抗結成の添加は３つの複合物すべての形成を著しく抑制する（図５Ｃ）。しかし、抗ＴＦＥ−３抗血清はＣ１，Ｃ２あるいはＣ３複合体に対して影響を与えず、これらの複合体は高い可能性でＵＳＦタンパク質により形成されることを暗示している。ゲル移動分析において、組み換えＵＳＦ−１はＣ２複合体と同じ位置に移動するタンパク質ＤＮＡ複合体を生じさせた（未掲示）。加えてＤＮアーゼＩ防護研究においては、組み換えＵＳＦ−１のフットプリンティング活性はＨＩＴ抽出物で得られる結果と一致する（図５Ａ）。
ＵＳＦ−１及びＵＳＦ−２と命名されたＵＳＦのほとんどの細胞型において発現される（18）。これらＵＳＦタンパク質どちらがＣ１，Ｃ２及びＣ３複合体内部に含まれているか識別するために、ＨＩＴあるいはＨeＬa抽出物を抗ＵＳＦ−１特異性あるいは抗ＵＳＦ−１特異性抗血清のいずれかとインキュベートした（図５Ｄ）。ＵＳＦ−１抗血清は３種類の複合物のすべてを“スーパーシフト”することができたが、ＵＳＦ−２特異性抗血清Ｃ１及びＣ３複合体のみの形成を抑制する。これらの結果はＣ１及びＣ３複合体はＵＳＦ−１／ＵＳＦ−２ヘテロダイマーに相当し、一方Ｃ２はＵＳＦ−１ホモダイマーを含有している可能性を示している。
ＣＡＣＧＴＧ  Ｅボックス配列がＳＴＦ−１プロモーター活性に不可欠か否かを証明するためにＥボックス上２つの塩基対（−118/−95）の置換を含むＳＴＦ−１オリゴヌクレオチド突然変異が生成された。ＨＩＴ核抽出物をともなうゲル移動度分析においては、この突然変異Ｅボックス主要素（ＡＡＣＧＣＧ）はＣ１，Ｃ２及びＣ３を形成することはできなく、野生型Ｅボックスヌクレオチドに対するＵＳＦ−１の結合に対し競合することもできない（図６Ａ）。対応して、突然変異ＳＴＦ  Ｅ主要素を含有する完全な長さ（6.5キロベース）をもつＳＴＦ−１及び先端切断（−190  ＳＴＦ）レポータープラスミドは膵島細胞において野生型複製と比較して約10分の１の活性しか持たない（図６Ｂ）。これらの結果はＵＳＦと結合する基部ＥボックスがＳＴＦ−１プロモーター活性に対し実際に不可欠なものであることを表している。
したがって、ＳＴＦ−１  ５’配列の最初の6500塩基対内に存在する２つの要素は膵島発現に重要のようである。末梢要素は−6500〜−3500の間に所在し、基部要素は−104に所在する。基部−104要素は上流活性化因子ＵＳＦを認知する一致Ｅボックス主要素を構成する。複数の連続した証拠はＵＳＦがＳＴＦプロモーター活性に重要であることを示している。最初に、区別することのできないＵＳＦ−１，２抗体の両方はＵＳＦ−１及びＵＳＦ−２特異性抗体と同様にＳＴＦ−１  Ｅボックスに対して特異的な複合物を認知する。２番目に、ＨＩＴ核抽出物に対するＳＴＦ−１  Ｅボックス結合活性はＵＳＦを連想させる特性を持つ。この複合体は熱安定的で組み換えＵＳＦ−１と同様に半数の活動が持続することを示す。最後に、ＳＴＦ  Ｅボックス上のＵＳＦ形成を抑制する点突然変異はＳＴＦ−１レポーターそれ相当に弱める。これらの結果はＵＳＦ複合体はＳＴＦ−１プロモーター活性にとって実際に重要であり、その結果として膵臓形態形成に重要であることを暗示している。
ＵＳＦに添加されたほかの核因子、最も顕著なものはmyc及びmaxであるが、それもまたＳＴＦ−１  Ｅボックス（ＣＡＣＧＴＧ）主要素に対し高い親和性により結合することができる。mycは、Ｅボックス主要素へのmaxのヘテロダイマーのような結合によって標的遺伝子転写を刺激することが示されている。myc遺伝子発現は膵島注中のような有糸分裂後の典型的な細胞においては識別できないことから、myc−max複合体にはＳＴＦ−１プロモーター調節機能を持たないと推定される。しかしながら発生の期間中、ＳＴＦ−１発現は増殖中の管状細胞に濃縮され（６）、myc  mayはこれらの条件下で結果的にＳＴＦ−１発現を刺激すると思われる。この点については、膵臓発生期間中に観察されるＳＴＦ−１発現の激しい変化は、その一部は膵島細胞に対しＳＴＦ−１生産を最終的には限定するＥボックス結合活性の変化を反映していると思われる。
実施例11
ゲル移動分析及びＤＮアーゼＩ保護分析
電気泳動移動分析に関して、２本鎖オリゴヌクレオチドがクレノール断片を用いた32Ｐ  ｄＣＴＰ補完反応により標識された。５マイクログラムの核抽出物0.5ngの標識オリゴヌクレオチド及び１μg非特異的競合ＤＮＡともに氷上で30分インキュベートし、非変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。抗ＨＮＦ−３α，ＨＮＦ−３β及びＨＮＦ−３γ抗体はS. Duncan及びJ. Darnellの好意により供給された。抗ＢＥＴＡ−２抗体はM. J. Tsaiの好意により送られたものである。抗Ｅ２Ａ抗体はSanta Cruz Biochemicalsより購入した。ＤＮアーゼＩ保護分析は先に記載されている方法に従い行われた（37）。組み換えＨＮＦ−３αはK. Zaretより入手した。
実施例12
ノーザンブロッティング
ソマトスタチノーマ／インシュリノーマＴu６細胞はエタノールあるいは10-7デキサメタゾン中で時間を変えて培養された。すべてのＲＮＡはグアニジニウム−フェノール法を使うことにより抽出された。全ＲＮＡのうちの15マイクログラムをホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで分離されZetaプローブに転写される。ランダムプライムＳＴＦ−１とチューブリンｃＤＮＡはAmersham random priming kitにより濃縮された。
実施例13
膵島特異性エンハンサーを経由してＳＴＦ−１発現を調節する内胚葉分子ＨＮＦ−３β及びＢＥＴＡ−２
ＳＴＦ−１遺伝子の−6200〜−5670領域に広がって存在する530塩基対を含んだプロモター構造物はデキサメタゾン処理により完全に抑圧されるが、偏在するＵＳＦ−１認知部位を含有する最小ＳＴＦ−１プロモーター構造物は抑圧されない（図７ａ）。ＳＴＦ−１の同じ530bp領域はＨＩＴ−Ｔ15細胞においてはＣＯＳ−７細胞中と比較し５〜10倍の高い活性を示し、この断片は膵島細胞特異性活性があることを示している（図７ｂ）。細胞特異性ＳＴＦ−１エンハンサー内のヌクレオチド配列の厳密な調査からＥボックス結合タンパク質対するコンセンサス主要素（−5.98〜−5.963）及びＨＮＦ−３に対する主要素（−5.927〜−5.907）を表した（図７ｃ）。Ｂ要素とよばれるＥボックスの主要素の配列ははラットインシュリンＩ及びIIプロモータ内のＮＩＲ及びＦＡＲ要素の配列と同一である（34）。そして、Ｈ要素としして言及されるＨＮＦ−３部位はＨＮＦ−３調和結合部位の12カ所のうちの９カ所と一致する。
Ｂ及びＨ要素が膵島特異的核タンパク質により実際に認知されるのかを決定するために−5870〜−6100の範囲に存在する32Ｐ標識ＳＴＦ−１エンハンサー断片を使用したＤＮアーゼＩ保護分析を行った。ＨＩＴ  Ｔ15細胞から調整された核抽出物にはＢ（Ｅボックス主要素）及びＨ（ＨＮＦ−３主要素）の両方の部位に対するＤＮＡ結合活性を含むことが見いだされる。Ｂ要素はＨＩＴ，Ｈela，ＣＯＳ７細胞のいずれの核抽出物とのＤＮアーゼＩ保護分析比較において可能な程度まで防護されるが、一方Ｈ要素の防護はＨＩＴ細胞由来の核抽出物を伴う場合のみ観察される（図８ａ、２及び４レーンを比較）。Ｈ要素フットプリントを分断する主要な過敏性部位もまた、精製した組み換えＨＮＦ−３αタンパク質を含む反応で示され、ＨＩＴ−Ｔ15細胞において調節物の多種類のＨＮＦ−３族がＳＴＦ−１  Ｈ要素と結合する考察される（図８ａ、２及び５レーンを比較）。
ＳＴＦ−１エンハンサーのＨ要素を認識する核因子をさらに特徴づけるために32Ｐ標識ＳＴＦ−１  Ｈ要素プローブを使用したゲル移動度分析を行った。ＨＩＴあるいはＲＩＮ核抽出物を含む反応により１つの主要な低移動度の複合体が観測できこの複合体の形成が100倍の分子過剰の未標識野生型Ｈ要素競合ＤＮＡにより阻害されるが、突然変異のものでは見られない（図８ｂ，４−５，９−10，14−15レーンを比較）。Ｈela核抽出物を含む反応では特異的なタンパクＤＮＡ複合体は見られず、Ｈ要素は限られた発現様式のもとで核因子を認識すると推定される（図８ｂ，１，６レーンを比較）。しかし、ＨepＧ２肝腫瘍抽出物において存在するＨ要素特異的複合体はＲＩＮ／ＨＩＴ−Ｔ15複合体と同じ移動度の地点に移動することから、Ｈ要素結合タンパク質は一般に内胚葉起源の細胞内に表現される可能性が示された（図８ｂ，３−５レーンを比較）。
核活性因子のＨＮＦ−３族は高度に保存された翼状ヘリックスドメインを経由してＤＮＡと結合する３個の遺伝子、（α，β，γ）で構成される。ＨＩＴ抽出物中でのＨ要素結合活性がＨＮＦ−３族のどれに相当するのかを決定するために、ＨＮＦ−３族それぞれに対する特異的抗血清を使用したゲル移動度研究を行った。ウエスタンブロット分析において３種のＨＮＦ−３タンパク質のそれぞれが核抽出物中に見いだされたが（未掲載）、ＨＮＦ−３β抗血清のみはＨ要素プローブとともに同じ抽出物を使用すると主要タンパク−ＤＮＡ複合体の形成を阻止する（図８ｃ、１−４レーン）。生体ラット膵島細胞の１次培養細胞から調整された核抽出物のゲル移動分析からも同一結果が得られた（図８ｃ、５−８レーン）。
ＳＴＦ−１エンハンサー内のＢ要素インシュリンプロモーターのＥボックス要素と同一構造の一致Ｅボックス主要素を含有している。以前の研究で膵島特異性因子ＢＥＴＡ−２は偏在性因子Ｅ47を持つヘテロダイマーとしてこれらインシュリンプロモーター要素に結合することによりインシュリンプロモーター活性を高めることを示し、その結果に基づいて、ＳＴＦ−１  Ｂ要素に対するＢＥＴＡ−２／Ｅ47ヘテロダイマー形成試験を行った。ＨＩＴ核抽出物のゲル移動分析において32Ｐ標識Ｂ要素プローブは未標識野生型Ｂ要素オリゴヌクレオチドの添加により競合を受けることができるが、突然変異型では受けることができない４種の特異的ＤＮＡタンパク質の形成が観測される（図８ｄ、１，５，６レーンを比較）。最も移動速度の遅い複合体は組み換えＥ２Ａ／ＢＥＴＡ２ヘテロダイマー複合体が示す位置と同じ位置に移動する（図８ｄ、１及び７レーンを比較）。関連性の無い抗血清はＢ要素結合活性に何の効果をもたらさないが（図８ｄ、４レーン）、ＢＥＴＡ−２あるいはＥ２Ａ抗血清は最も移動速度の遅い複合物の形成を特異的に抑制し（図８ｄ、２及び３レーン）、このことは、ＢＥＴＡ−２／Ｅ47ヘテロダイマーはＨＩＴ核抽出物においてＢ要素を実際に認知することを明らかにしている。
ＳＴＦ−１エンハンサー活性仲介におけるＨＮＦ−３β及びＥ２Ａ／ＢＥＴＡ−２認識部位の重要さを評価するために、我々は試験管内でこれらの同族の因子との結合を妨害するＢ及びＨ要素に点突然変異を生じさせた。530bpのエンハンサーの前後関係を試験した時にはＢあるいはＨ要素のいずれかの突然変異を含有するＳＴＦ−１レポータープラスミドはＨＩＴ  Ｔ15細胞において野生型構造物に比較して低い活性を示す（図９ａ）。それに対して、ＣＯＳ−７細胞においては突然変異Ｂ及びＨ要素構造物は野生型−6500  ＳＴＦ−１レポーターと同等の活性を示す。しかしながら、これらの突然変異は膵島細胞と特異的に提携する転写活性を妨害することを示している。対応して、Ｂ及びＨ要素変異ＳＴＦ−１レポータープラスミドはまたＨＩＴ−Ｔ15細胞においてデキサメタゾン誘導に対して非応答性であり、このホルモンはＥ２Ａ／ＢＥＴＡ２あるいはＨＮＦ−３β活性のいずれれかに効果的に干渉することが推定される（図９ｂ）。
末梢エンハンサーにおけるＨＮＦ−３βあるいはＢＥＴＡ２／Ｅ47活性を妨害することによりデキサメタゾンがＳＴＦ−１発現を減少させるかどうかを評価するためにＨＮＦ−３βあるいはＢＥＴＡ−２及びＥ47エフェクタープラスミドを使用してトランジエントトランスフェクション試験が行われた。ＨＮＦ−３β（図９ｂ）あるいはＢＥＴＡ−２／Ｅ47（未掲載）の過大発現は刺激を受けていないＨＩＴ−Ｔ15細胞におけるＳＴＦ−１レポーターの発現に対し、ごくわずかな効果しか持たない（図９ｂ、１および５番目の縦棒を比較）。ＨＮＦ−３βは野生型ＳＴＦ−１レポーター活性に対するデキサメタゾンの減少を抑制するように見える（図９ｂ，１，３，７の縦棒を比較）、しかし、ＢＥＴＡ−２／Ｅ47，ＳＴＦ−１及びＨＮＦ−４のような活性化因子はデキサメタゾン処理した細胞においてＳＴＦ−１プロモーター活性を減少させない（未掲載）。増量したエフェクタープラスミドを使用した滴定実験によると、ＨＮＦ−３βは線量依存法により−6500  ＳＴＦ−１  ＬＵＣレポーター活性を減少させることが分かった（図９ｃ）。しかしながら、ＨＮＦ−３βはＨ要素の変異を含む変異ＳＴＦ−１レポータープラスミドの活性を強力にすることは無く、この活性化因子の抑制効果はＳＴＦ−１エンハンサーの認識部位を経由して起こることを暗示している。
参考文献
１．  Pictet, R. L., et al., Develop. Biol.；29, 436−467（1972）
2．  Gittes, G. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.；89, 1128−1132（1992）
3．  Alpert, S., et al., Cell；53, 295−308（1988）
4．  Jonsson, J., et al., Nature；371, 606−609（1994）
5．  Ohlsson, H., et al., EMBO J.；12, 4251−4259（1993）
6．  Guz, Y., et al., Development；121, 11−18（1995）
7．  Leonard, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.；89, 6247−6251（1992）
8．  Leonard, J., et al., Mol. Endocrinol.；７，1275−1283（1993）
9．  Peers, B., et al., Mol. Endocrinol.；８，1798−1806（1994）
10．  Walker, M. D., et al., Nature；306, 557−561（1983）
11．  Vallejo, M., et al., J. Biol. Chem., 267, 12868−12875,（1992）
12．  Karlsson, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 8819−8823（1987）
13．  Miller, C., et al., EMBO J.；13, 1145−1156（1994）
14．  Naya, F. J., et al., Genes and Dev.；９，1009−1019（1995）
15．  German, M., et al., Genes Dev.；６，2165−2176（1992）
16．  Peshavaria, M., et al.：Mol Endocrinol.；８，806−816（1994）
17．  VanDyke, M. W, et al., GenesIII；99−104（1992）
18．  Sirito, M., et al., Nucleic Acids Res.；22, 427−433（1994）
19．  Madsen, O. D., et al., J. Cell Biol.；103, 2025−2034（1986）
20．  Maxwell, I. H., et al., Biotechniques；７，276−280（1989）
21．  Hanahan, D., Nature；315, 115−122（1985）
22．  Montminy, M. R.et al., Nature；328, 175−178（1987）
23．  Weis, L., et al., FASEB J.；６，3300−3309（1992）
24．  Ishi, S., et al., Science；230, 1378−1381（1985）
25．  Geng, Y., et al., Mol. Cell. Biol.；13, 4894−4903（1993）
26．  Beckmann, H., et al., Genes and Dev.；４，167−179（1990）
27．  Gregor, P. D., et al., Genes and Dev.；４，1730−1740（1990）
28．  Sawadogo, M., et al., J. Biol. Chem.；263, 11985−11993（1988）
29．  Krumlauf, R., Cell；78, 191−201（1994）
30．  Boncinelli, E., et al., Hum. Reproduc.；３，880−886（1988）
31．  Lewis, E. B., Nature；276, 565−570（1978）
32．  Kretzner, L., et al., Nature；359, 426−429（1992）
33．  Blackwood, E., et al., Science；251, 1211−1217（1991）
34．  Edlund, T., et al., Science；230：912−916（1985）
35．  Clark, K., et al., Nature；364：412−420（1993）
36．  Lai, E., et al., PNAS；90：10421−10423（1993）
37．  Sharma, et al., JBC；271：2294−2299（1996）
配列のリスト
（1）一般情報
（i）出願人：モントミィとシャルマ
（ii）発明の名称：膵臓ランゲルハンス島細胞においてＳＴＦ−１発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法
（iii）配列の数：4
（iv）対応する住所
（Ａ）あて先：ジェイムス  エフ．ウエイラー，法代理人
（Ｂ）街路：スイート  1560，ワン  リバーウエイ
（Ｃ）都市：ヒューストン
（Ｄ）州：テキサス
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：77056
（ｖ）コンピュータ読取方式：
（Ａ）メディアタイプ：DS，HD1.44Mb/1.44Mo
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ互換型ＰＣ
（Ｃ）オペーレーティング  システム：PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト6.0
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：譲渡されない
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：実用
（viii）弁理士／代理人に関する情報：
（Ａ）氏名：ウエイラー，ジエイムス  エフ．
（Ｂ）登録番号：16,040
（Ｃ）参考／処理番号：D-5848
（ix）電信電話情報：
（Ａ）電話：713-626-8646
（Ｂ）テレファックス：713-963-5853
（２）ＳＥＱ ＩＤ NO：１の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：403bp
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）繊維状：２本
（Ｄ）トポロジー：ライナー
（ii）分子タイプ：
（Ａ）記事：他の核酸
（iii）ヒポセチカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）本来のソース：
（Ｂ）菌株：
（Ｃ）個体分離：
（Ｄ）開発段階：
（Ｆ）組織タイプ：
（Ｇ）細胞タイプ：
（Ｈ）細胞株：
（xi）配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：１：
0004472025.tif 000002
（3）ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２の情報
（i）配列特徴：
（Ａ）長さ：490bp
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）繊維状：２本
（Ｄ）トポロジー：ライナー
（ii）分子タイプ：
（Ａ）記事：他の核酸
（iii）ヒポセチカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）本来のソース：
（Ｂ）菌株：
（Ｃ）個体分離：
（Ｄ）開発段階：
（Ｆ）組織タイプ：
（Ｇ）細胞タイプ：
（Ｈ）細胞株：
（xi）配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：２：
0004472025.tif 000003
（4）ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３の情報
（i）配列特徴：
（Ａ）長さ：20bp
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）繊維状：単繊維
（Ｄ）トポロジー：ライナー
（ii）分子タイプ：
（Ａ）記事：他の核酸
（iii）ヒポセチカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）本来のソース：
（Ｂ）菌株：
（Ｃ）個体分離：
（Ｄ）開発段階：
（Ｆ）組織タイプ：
（Ｇ）細胞タイプ：
（Ｈ）細胞株：
（xi）配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：３：
0004472025.tif 000004
（5）ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４の情報
（i）配列特徴：
（Ａ）長さ：20bp
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）繊維状：単繊維
（Ｄ）トポロジー：ライナー
（ii）分子タイプ：
（Ａ）記事：他の核酸
（iii）ヒポセチカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）本来のソース：
（Ｂ）菌株：
（Ｃ）個体分離：
（Ｄ）開発段階：
（Ｆ）組織タイプ：
（Ｇ）細胞タイプ：
（Ｈ）細胞株：
（xi）配列図示：ＳＥＱ  ＩＤ  NO：４：
0004472025.tif 000005
【図１Ａ】
0004472025.tif 000007
【図１Ｂ】
0004472025.tif 000008
【図２Ａ】
0004472025.tif 000009
【図２Ｂ】
0004472025.tif 000010
【図２Ｃ】
0004472025.tif 000011
【図２Ｄ】
0004472025.tif 000012
【図３Ａ】
0004472025.tif 000013
【図３Ｂ】
0004472025.tif 000014
【図４Ａ】
0004472025.tif 000015
【図４Ｂ】
0004472025.tif 000016
【図５Ａ】
0004472025.tif 000017
【図５Ｂ】
0004472025.tif 000018
【図５Ｃ】
0004472025.tif 000019
【図５Ｄ】
0004472025.tif 000020
【図６Ａ】
0004472025.tif 000021
【図６Ｂ】
0004472025.tif 000022
【図７Ａ】
0004472025.tif 000023
【図７Ｂ】
0004472025.tif 000024
【図７Ｃ】
0004472025.tif 000025
【図８Ａ】
0004472025.tif 000026
【図８Ｂ】
0004472025.tif 000027
【図８Ｃ】
0004472025.tif 000028
【図８Ｄ】
0004472025.tif 000029
【図９Ａ】
0004472025.tif 000030
【図９Ｂ】
0004472025.tif 000031
【図９Ｃ】
0004472025.tif 000032