(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ部分およびカルボキシ部分からなるターゲットタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）カルボキシ末端に介在タンパク質配列を特徴とするポリペプチドのアミノ末端部分が結合した、前記ターゲットタンパク質のアミノ部分を製造するステップ、
（ｂ）アミノ末端に介在タンパク質配列を特徴とする前記ポリペプチドの残りのフラグメントが結合した、前記ターゲットタンパク質のカルボキシ部分を製造するステップ、および
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）のターゲットタンパク質のアミノ部分およびカルボキシ部分を制御可能な前記介在タンパク質配列のトランス切断に適する予め決定した条件下に置き、前記ターゲットタンパク質を得るステップ
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
介在タンパク質配列がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予め決定される条件が、温度の変化、スプライシングもしくは切断を促進もしくは抑制する化学試薬の添加もしくは除去、ｐＨの変化、光への露出もしくは除光、アミノ酸残基の脱リン酸化もしくは脱グリコシル化及びスプライシングもしくは切断を促進もしくは阻害することができるペプチドもしくはペプチド模倣体の接触もしくは除去から成る群より選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
介在タンパク質配列およびターゲットタンパク質がスプライス部位を形成し、切断のために、当該スプライス部位が当該スプライス部位のＣ末端側に−ＯＨ又は−ＳＨ側鎖を有さないアミノ酸残基をＣ末端切断のために含み、−ＯＨ又は−ＳＨ側鎖を有するアミノ酸残基のみを上流のスプライス部位にＮ末端切断のために有する請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記条件が化学的制御を含む請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
化学的制御がヒドロキシルアミンによる活性化を含む請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、改質タンパク質及びその製造法に関する。より具体的には、本発明の改質タンパク質は、ターゲットタンパク質及び、予め決定した条件下で切除または切断し得る制御可能な介在タンパク質配列（ＣＩＶＰＳ）を含む。
成熟タンパク質の産生には、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質への情報の流れが含まれる。その情報を妨げるＤＮＡ及びＲＮＡ要素を正確に切除することは、既に報告されている（Ｍ．Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４，ｐ．３６３，１９９０；Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，ｐ．５４３，１９９０；Ｈｕｎｔｅｒ等，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，ｐ．２１０１，１９８９）。近年、介在タンパク質配列の正確な切除についての証拠が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＦＰＩ対立遺伝子（Ｈｉｒａｔａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，ｐ．６７２６，１９９０；Ｋａｎｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，ｐ．６５１，１９９０）及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｒｅｃＡ遺伝子（Ｄａｖｉｓ等，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３，ｐ．５６５３，１９９１；Ｄａｖｉｓ等，Ｃｅｌｌ  ７１，ｐ．１，１９９２）に関しても報告された。これらは、各々成熟タンパク質を産生するために除去しなければならない内部フレーム内ペプチドセグメントを含んでいる。各Ｔｆｐ１及びＲｅｃＡの発現により、２種類のペプチド、即ち、一方は介在タンパク質配列（ＩＶＰＳ）を表し、他方は外部タンパク質配列（ＥＰＳ）の連結産生物を表すペプチドが生じる。この翻訳後プロセシング事象（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｖｅｎｔ）は、「タンパク質スプライシング」と呼称されてきた。同様に、好高熱性の原始細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、２個のフレーム内ＩＶＰＳを含んでいる（Ｐｅｒｌｅｒ等，ＰＮＡＳ  ８９，ｐ．５５７７，１９９２）。
研究への応用とは別にＩＶＰＳまたはタンパク質スプライシングを使用する方法の開発に於ける大きな障害は、ＩＶＰＳの活性及びスプライシング事象を制御することが不可能である点にある。
従って、ＩＶＰＳを用いるターゲットタンパク質を改質するための、特にＩＶＰＳの活性が制御可能な、便利な手段を提供する方法が望ましい。その活性が実質的に不活化されるようにターゲットタンパク質を特異的に改質し得る方法を得るのも望ましい。不活化改質タンパク質の活性を回復させるために使用し得る方法を得るのが望ましい。
発明の概要
本発明は、予め決定した条件下でシスまたはトランスに、スプライシングなしに切断またはタンパク質スプライシングにより切除し得るＩＶＰＳとターゲットタンパク質とを含む改質タンパク質に関する。このような予め決定した条件（ｐｒｅｄｉｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、使用したＩＶＰＳに依存し、例えば、温度上昇、ｐＨ条件の変化、光への暴露、脱リン酸化、またはアミノ酸残基の脱グリコシル化、または切断／スプライシングを誘導する化学試薬への曝露を包含し得る。ＩＶＰＳは、ターゲットタンパク質にＩＶＰＳを挿入することによってまたは、ターゲットタンパク質のアミノ若しくはカルボキシ末端でターゲットタンパク質とＩＶＰＳを融合することによってターゲットタンパク質と結合し得る。従って、制御可能な介在タンパク質配列（ＣＩＶＰＳ）と称されるこれらのＩＶＰＳは、スプライシングまたは切断反応を制御するのに有用である。本発明はさらに、ＣＩＶＰＳの産生、選択及び試験方法にも関する。
好ましい実施態様の一つでは、ＣＩＶＰＳをコードするＤＮＡ配列は、両方のコード配列が連続する読み取り枠を形成するように、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ配列に挿入するか、またはこれと結合させる。その後、この融合ＤＮＡの発現を利用して改質ターゲットタンパク質を産生する。もう一つの実施態様では、このようにして産生された改質タンパク質を、ＣＩＶＰＳを切除するか切断する予め決定した条件にかける。特定の実施態様に於いては、ターゲットタンパク質を実質的に不活化させるターゲットタンパク質領域にＣＩＶＰＳを挿入し、そしてＣＩＶＰＳの切除によりターゲットタンパク質の活性を回復させる。
好ましいＣＩＶＰＳとしては、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られるＣＩＶＰＳ１及び２（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１及び２または、ＩＶＳ１及び２とも称される）並びに、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得られるＣＩＶＰＳ３（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１またはＩＶＳ１とも称される）が挙げられる。これらのＣＩＶＰＳは、温度上昇時に改質タンパク質から除去、即ち、タンパク質スプライシングを介して除去し得る。他の好ましいＣＩＶＰＳに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母から取得可能なものが含まれる。
本発明により、特定のＣＩＶＰＳアミノ酸残基及び少なくとも最初の下流アミノ酸残基はスプライシング反応を調節し、且つこれらの残基の改質によりスプライシング反応が減少するかまたは停止することも知見された。これらの残基は、他のＩＶＰＳに保存されることが知見された。このような残基の改質を使用して、ＩＶＰＳをＣＩＶＰＳに転換させ得る。
本発明により、特定の状況下では、完全スプライシング反応は必要でないか、または望ましくないことが知見された。このような状況下では、ＣＩＶＰＳを改質してスプライシングなしに切断し、ターゲットタンパク質からＣＩＶＰＳの分離または切断を制御し得る。
本発明のＣＩＶＰＳ及び改質タンパク質の潜在的な用途は多様である。これらの例としては、例えば、ターゲットタンパク質の酵素活性の制御、アフィニティークロマトグラフィーによるＣＩＶＰＳに特異的な抗体を使用する改質タンパク質の精製、及び宿主細胞に有毒であるタンパク質の産生が挙げられる。
本発明のＣＩＶＰＳは、さらに、ＣＩＶＰＳに融合したターゲットタンパク質を含む改質タンパク質を産生するタンパク質精製方法で使用し得る。所望により、３部分融合は、ＣＩＶＰＳがターゲットタンパク質と基質（結合タンパク質）、例えばＭＢＰに対する親和性を有するタンパク質との間にある場合に産生し得る。次いで改質タンパク質は、ＣＩＶＰＳまたは結合タンパク質が特異的親和性を有する基質と、例えばアフィニティークロマトグラフィーを使用して接触させる。高度に精製したターゲットタンパク質は、例えばＣＩＶＰＳとターゲットタンパク質の間の切断を開始する予め決定した条件にＣＩＶＰＳをかけることによって、カラムから遊離し得る。あるいは、融合タンパク質は上記の如く精製し得、次いでターゲットタンパク質は、ＣＩＶＰＳを予め決定した条件にかけることによって融合物から放出してもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は目的のタンパク質スプライス部位のアミノ酸配列（配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８及び配列番号：３９）を示す図である。アミノ末端（上）及びカルボキシ末端（下）スプライス部位は矢印で示されたスプライス部位で示され、保存された類似のアミノ酸はボックスで示されている。
図２はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位へのＩＶＰＳの挿入を示す図である。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）またはＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）のいずれかのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＨＯ５に、β−ガラクトシダーゼのＡｓｐ残基とＩｌｅ残基との間に位置するように連結して改質β−ガラクトシダーゼ産物を産生した。
図３Ａ及び図３Ｂは改質β−ガラクトシダーゼのスプライシングにより活性β−ガラクトシダーゼが産生することを示すグラフである。４２℃に於ける表示ＩＶＰＳ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現する宿主由来の粗な抽出物のインキュベーションにより、経時的に酵素活性が増加するが、宿主（ＲＲ１）のみまたは未改質β−ガラクトシダーゼ構築物（ｐＡＨＯ５）との４２℃に於けるインキュベーションでは、酵素活性は増加しないことを示す。
図４は温度制御したタンパク質スプライシング実験結果を示すウェスタンブロットを示す。ＣＩＶＰＳ２及びＣＩＶＰＳ３をβ−ガラクトシダーゼのＥｃｏＲＶにクローン化した。ＣＩＶＰＳタンパク質（各々、Ｉ−ＴｌｉＩ及びＩ−ＰｓｐＩ）またはβ−ガラクトシダーゼに対する血清を用いる細胞抽出物のウェスタンブロット実験から、改質β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（レーン１、４、７、１０）を検出する。４２℃（レーン２、５、８、１１）または５０℃（レーン１２）に於ける抽出物の処理（６時間）によって、遊離ＣＩＶＰＳタンパク質及び未改質β−ガラクトシダーゼのスプライシング及び産生が生起する（残留セリンまたはトレオニン残基を除く。実施例２＆３参照）。ｐＡＨＯ５由来の未改質β−ガラクトシダーゼはレーン６である。レーン３＆９は、サイズマーカーを含む。
図５はβ−アガラーゼに対する血清を用いる細胞抽出物のウェスタンブロット実験により、改質β−アガラーゼ融合タンパク質の検出を示す図である。
レーン１＆４：サイズマーカー
レーン２＆５：β−アガラーゼ標準
レーン３：ＣＩＶＰＳ２−β−アガラーゼ融合物
レーン６：ＣＩＶＰＳ３−β−アガラーゼ融合物
図６はサイレント突然変異によるＩＶＰＳ内での新しい制限部位（ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ）の作製によるＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子への挿入を示す図である。
図７はターゲット遺伝子内のサイレント突然変異による新しい制限部位（ＸｂａＩ及びＳａｌＩ）の作製によるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子へのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）またはＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）のいずれかの挿入を示す図である。
図８はｐＡＮＧ５のプラスミドマップを示す図である。
図９はＣＩＶＰＳ２の上流スプライシング部位に於ける化学的ブロック化セリンのサプレッサーｔＲＮＡ−媒介取り込みを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラムを示す図である。
図１０は化学的ブロック化前駆体タンパク質の可視光照射により開始したＣＩＶＰＳ２のスプライシング反応を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラムを示す図である。
図１１は温度制御したタンパク質スプライシング及び切断を示すゲルを示す図である。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）カセットをβ−ガラクトシダーゼのＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ウェスタンブロット分析を使用して、ｐＤＶ７（ＣＩＶＰＳ３カセット、レーン１〜３）、ｐＤＶＣ３０２（ＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセット、レーン４〜６）、ｐＤＶＴ３２１（ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセット、レーン７〜９）及びｐＤＶＳ７１２（ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒカセット、レーン１０〜１２）の細胞抽出物を試験した。ＣＩＶＰＳ３タンパク質（Ｉ−ＰｓｐＩ）（ＮＥＢ）に対する抗体で、融合タンパク質並びに、遊離ＣＩＶＰＳ３、Ｎ−ＥＰＳ−ＣＩＶＰＳ３及びＣＩＶＰＳ３−Ｃ−ＥＰＳ（スプライス部位の一つでの切断由来）の切断産生物を検出する。未処理抽出物は、レーン１、４、７及び１０である。４２℃（レーン２、５、８及び１１）または６５℃（レーン３、６、９及び１２）に於ける抽出物の処理（２時間）により、種々の効率でスプライシング及び／または切断活性が増加した。
図１２は温度制御したタンパク質スプライシング及び切断を示すウェスタンブロットを示す図である。Ｉ−ＰｓｐＩ及びβ−ガラクトシダーゼ（Ｃ−ＥＰＳドメイン）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析を使用して、ｐＤＶＣ３０２（レーン１〜３）、ｐＤＶＴ３２１（レーン４〜６）及びｐＤＶＳ７１２（レーン７〜９）の融合構築物を試験した。４２℃（レーン２、５及び８）または６５℃（レーン３、６及び９）での抽出物の処理（２時間）により、スプライシング（ｐＤＶＳ７１２）または切断した。ｐＤＶＳ７１２抽出物に於けるタンパク質スプライシングにより、遊離ＣＩＶＰＳ３タンパク質、Ｉ−ＰｓｐＩ及び未改質β−ガラクトシダーゼ（残留セリンを除く）が産生した。レーン１は、サイズマーカーを含む。
図１３Ａ及び図１３Ｂはクーマシーブルー染色及びイムノブロットにより調べたアミロース及びＭｏｎｏＱカラム上のＭＩＰ前駆体の精製を示す図である。部分ＡとＢとの間の図は、分枝状分子ＭＩＰ*を含む各バンドの提案構造を示す。黒塗りボックスはＭＢＰドメインを示し、白抜きボックスはＩＶＰＳドメインを、灰色ボックスはパラミオシン△Ｓａｌドメインを示す。プラス（＋）は、サンプルを３７℃で１２０分熱処理したことを、マイナス（−）はサンプルを熱処理しなかったことを示す。
部分Ａ：  クーマシーブルー染色ゲル。全体：ＭＩＰ培養物由来の粗な上清。Ｆ．Ｔ．：アミロース樹脂を素通り。アミロース溶離液（−）：アミロース樹脂で精製したＭＩＰ調製物。アミロース溶離液（＋）：レーン４のアミロース溶離液を３７℃で１２０分処理して、スプライシングを誘導した。ＭｏｎｏＱ：ＭｏｎｏＱ精製サンプル。ＭｏｎｏＱ上でのクロマトグラフィー後、ＭＢＰ−ＣＩＶＰＳ３（ＭＩ）の回収率は多様であるが、通常低い。略号は以下の通りである。ＭＩＰ*：見かけの分子量１８０ｋＤａの分枝状分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）；ＭＩＰ：１３２ｋＤａ前駆体；単一スプライス部位切断産生物（ＭＩ：ＭＢＰ−ＣＩＶＰＳ３；ＩＰ：ＣＩＶＰＳ３−パラミオシン△Ｓａｌ；Ｍ：ＭＢＰ）；及びスプライス化産生物（ＭＰ：ＭＢＰ−パラミオシン△Ｓａｌ；Ｉ：ＣＩＶＰＳ３＝ＰＩ−ＰｓｐＩ）。
部分Ｂ：  イムノブロット。部分Ａ由来のＭｏｎｏＱサンプルを上記の如く熱処理し、三重に電気泳動させた。ＭＩＰ関連タンパク質は、抗ＭＢＰ血清、抗パラミオシン血清及び抗ＰＩ−ＰｓｐＩ（抗ＣＩＶＰＳ３）血清との免疫反応により同定した。
図１４はＭＩＰ２１融合物中の置換可能なスプライス部位カセットを示す図である。ｐＭＩＰ２１は、各スプライス部位とフランキングする２個のユニークな制限部位を含む。スプライス部位は矢印で示されている。スプライス部位の周囲のアミノ酸残基が示されている。スプライス部位は、アミノ末端ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩカセットまたはカルボキシ末端ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットのいずれかを別のＤＮＡカセットと置き換えることにより変更し得る。
図１５Ａ及び図１５Ｂは改質ＭＩＰ融合物由来の単一スプライス部位での熱誘導可能な切断を示すゲルを示す。融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより精製した。
図１５ＡはＭＩＰ２３融合物由来のＣ末端スプライス部位での切断を示す図である。精製融合タンパク質サンプルは、４℃、３７℃、５０℃または６５℃で１時間インキュベートした。産生物を４／２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシーブルー染色で分析した。ＭＩＰ２３融合タンパク質（ＭＩＰ）由来のＣ末端スプライス部位の切断から、ＭＢＰ−ＣＩＶＰＳ（ＭＩ）及びパラミオシン△Ｓａｌ（Ｐ）が産生した。
図１５ＢはＭＩＰ２８融合物由来のＮ末端スプライス部位での切断を示す図である。精製タンパク質サンプルは、４℃、４２℃、５０℃または６５℃で１時間インキュベートした。産生物を４／２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシーブルー染色で分析した。ＭＩＰ２８融合タンパク質（ＭＩＰ）由来のＮ末端スプライス部位の切断から、ＭＢＰ（Ｍ）及びＣＩＶＰＳ−パラミオシン△Ｓａｌ（ＩＰ）が産生した。サイズ標準（キロダルトン）を左側に示した。
図１６はＭＩＣ融合物の熱誘導可能な切断を示すゲルを示す。精製融合タンパク質サンプルは、４℃、３７℃、５０℃または６５℃で１時間インキュベートした。産生物を４／２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシーブルー染色で分析した。ＭＩＣ融合タンパク質（ＭＩＣ）のインキュベーションから、連結産物、ＭＢＰ−ＣＢＤ（ＭＣ）及び切除産生物、Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（Ｉ＝Ｉ−ＰｓｐＩ）が産生した。切断産物、ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＭＩ）及びＤｅｅｐ−Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ（ＩＣ）は、すべてのサンプル中に存在し、この熱処理では変化しない。
図１７Ａ及び図１７ＢはＭＩ′及びＩ′Ｐによるトランススプライシング反応のウェスタンブロットを示す。Ｉ′Ｐ及びＭＩ′を本明細書に述べたように処理して、ＭＰ及びＩ′生成物の蓄積により観察されるトランススプライシングを誘導する。抗ＣＩＶＰＳ３（抗Ｐｉ−ＰｓｐＩ）血清または抗パラミオシン血清を用いるウェスタンブロッティングを本明細書に述べたように行なった。記号「４°」を付したレーンは、４℃でインキュベートした対照Ｉ′Ｐ及びＭＩ′サンプルを含む。レーン３〜７は、４２℃で０、５、１０、２０及び３０分間インキュベーション後の切断反応サンプルをそれぞれ含む。レーンＳはサイズマーカー（ＮＥＢの染色済み広域タンパク質マーカー）を含む。
図１８はトランススプライシングがＩ−ＰｓｐＩエンドヌクレアーゼ活性を再樹立することを示す。ＸｍｎＩで直鎖状にしたｐＡＫＲ７  ＤＮＡを０．０１、０．１または１μｇのＭＩ′、Ｉ′Ｐ、トランススプライシング反応生成物（図中Ｉ′Ｐ及びＭＩ′両方の行に記号「＋」を記入することで示す）もしくはシススプライスしたＭＩＰ５２で消化した。Ｉ−ＰｓｐＩ活性はＭＩＰ５２及びトランススプライシング混合物にのみ存在した。レーンＳはサイズマーカー（ＨｉｎｄIIIで消化したλ  ＤＮＡとＨａｅIIIで消化したＰｈｉＸ１７４  ＤＮＡとの混合物）を含む。
図１９はＭＩ′２２によるＩ′Ｐのトランス切断を示す。Ｉ′Ｐ及びＭＩ′２２を本明細書に述べたように処理してトランス切断を誘導した。レーン１及び２は出発サンプルのＭＩ′２２及びＩ′Ｐをそれぞれ含む。レーン３はサイズマーカー（ＮＥＢの広域タンパク質マーカー）を含む。レーン４〜９は、４２℃で０、５、１０、２０、４０及び９０分間インキュベートして得られた切断反応サンプルをそれぞれ含む。
図２０はＳｅｒｌＣｙｓ置換を有するＭＩ９４融合物のＮ末端スプライス部位における切断の化学的活性化を示す。精製タンパク質サンプルを、０．２５Ｍヒドロキシルアミンを加えて（＋）かまたは加えず（−）に３７℃でインキュベートした。生成物を４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルー染色によって分析した。ＭＩ９４融合タンパク質（ＭＩ）のＮ末端スプライス部位における切断によってＭＢＰ（Ｍ）及びＣＩＶＰＳ３（Ｉ）が得られた。図中左方にサイズ標準（単位ｋＤａ）を示す。
図２１はＮ４５４Ａ置換を有するｐＭＹＢ１２９融合構築物を示す。
図２２Ａ及び図２２Ｂはキチンによるターゲットタンパク質（ＭＢＰ）の一段階精製を示す。ｐＨ７．６の３０ｍＭ  ＤＴＴにより切断を４℃で１６時間誘導する。図２２Ａ中左方にサイズマーカー（ＮＥＢ）を示す。レーン１は細胞溶解物、レーン２は素通り溶解物、レーン３はＤＴＴ誘導切断生成物のＭＢＰ（Ｍ）、レーン４は６Ｍグアニジン洗液を含む。
図２３Ａ及び図２３Ｂはβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）（図２３Ａ）及びＤＴＴ（図２３Ｂ）によるＭＹＢ融合タンパク質の切断の活性化を示す。
図２４はキチンビーズの製造に用いられる反応容器の外形寸法及び構造を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、改質タンパク質及びその製造方法に関する。改質タンパク質は、制御可能な介在タンパク質配列（ＣＩＶＰＳ）及びターゲットタンパク質を含み、ＣＩＶＰＳは、例えば温度上昇、ｐＨ条件の変化、光分解によるアミノ酸残基不ブロック化、脱リン酸化、脱グリコシル化、化学試薬での処理または他の手段などの予め決定した条件下で、タンパク質スプライシングなしに切断またはタンパク質スプライシングにより切除し得る。所望により、改質タンパク質をこれらの条件にかけ得る。ＣＩＶＰＳは実質的にターゲットタンパク質活性を不活化する領域にも挿入し得る。
介在タンパク質配列（ＩＶＰＳ）は、前駆体タンパク質内に見出される内部フレーム内ペプチドセグメントであり、ネイティブタンパク質を形成するためにタンパク質スプライシングを介して除去または切り出される。ＩＶＰＳは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＦＰＩ対立遺伝子（Ｈｉｒａｔａ等，上掲；Ｋａｎｅ等，上掲）及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｒｅｃＡ遺伝子（Ｄａｖｉｓ等，上掲（１９９１）；Ｄａｖｉｓ等，上掲（１９９２））中に存在することが報告されている。これらの文献は、本明細書中参照として含まれる。
本発明のＣＩＶＰＳは、ネイティブのＩＶＰＳの固有の特性（例えば、温度の上昇）によりまたは、ＩＶＰＳを制御すべき反応にかける改質により切除または切断が制御され得る任意の介在タンパク質配列を含む。
好高熱性原始細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、発現したポリメラーゼの動力学的及び生化学的特性に影響することなく、ＤＮＡレベルで欠失し得る２つのフレーム内ＩＶＰＳ、即ちＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ１）及びＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）（Ｐｅｒｌｅｒ等，上掲）を含む。両方のＩＶＰＳを含むＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の正しいプロセシングは、ネイティブの原始細菌Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓで起こる。さらに、ＩＶＰＳ１を欠失する発現構築物の正しいプロセシングは、真正細菌の大腸菌（Ｐｅｒｌｅｒ等，上掲）、真核生物のバキュロウイルスに感染した昆虫細胞、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（Ｈｏｄｇｅｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｅｓｅａｒｃｈ  ２０，ｐ．６１５３，１９９２）内で観察されている。さらに、ウサギ網状赤血球及び大腸菌ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系は、ＩＶＰＳ２配列を正しく除去して、成熟ポリメラーゼを産生する。理論に拘泥するつもりは無いが、Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳは自己スプライシングすると考えられる。
Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列表中配列番号：１として記載した。ＣＩＶＰＳ１のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１７７３〜３３８６である。ＣＩＶＰＳ２のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド３５３４〜４７０３である。ＣＩＶＰＳ１及びＣＩＶＰＳ２は、１９９０年４月２４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号４０７９５号を受けたファージＮＥＢ６１９から得ることができる。
第３のＩＶＰＳ（ＣＩＶＰＳ３、即ち、ＤＶ  ＩＶＰＳ１）は、好熱性の原始細菌、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（単離物ＧＢ−Ｄ）のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中に本発明者によって発見された。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、時折Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼと称される。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列は、配列表中配列番号：２として記載した。ＣＩＶＰＳ３のヌクレオチド配列は、１８３９〜３４４９である。ＣＩＶＰＳ３は、１９９１年１０月１日にＡＴＣＣに寄託し、受託番号６８７２３を受けたプラスミドｐＮＥＢ＃７２０から得ることができる。
本発明により、上記ＣＩＶＰＳ１、ＣＩＶＰＳ２及びＣＩＶＰＳ３は、温度上昇時に改質タンパク質から切除し得る。例えば、ＣＩＶＰＳは３７℃以下の温度では低減した速度で切除されるが、約４２℃〜８０℃の温度ではより効率的に切除し得る。好ましい切除温度は、約４２℃〜６０℃である。予め決定した切除条件は、ターゲットタンパク質が変性しないか、熱不活化を受けない温度を実験的に考慮すると最も好ましい。改質タンパク質を予め決定した温度に、１分未満〜数時間かけ得る。特定の状態では、ターゲットタンパク質の熱感受性に依存して、温度を下げながらインキュベーション時間を長くするのが好ましい。
さらに、異なる改質タンパク質は、種々の温度でスプライシング効率に違いを示し得る。必要により、各改質タンパク質の単離及びスプライシングの最適温度は、実験的に決定し得る。ＣＩＶＰＳが目的温度よりも低すぎる温度でスプライスする場合、ＣＩＶＰＳを改質し得るか、ターゲットタンパク質中のその位置を最適スプライシング温度が上昇するように変化させ得る。改質タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでスプライスせず、無傷の改質タンパク質の収量を確実に増加させるために、宿主細胞を増殖して、改質タンパク質をより低い温度（例えば、１２℃〜３０℃）で精製し得る。これは、スプライシング要素を突然変異させて、スプライシング温度を最適温度例えば３０℃〜３７℃から４２℃〜５０℃にシフトさせ、その結果、生理学温度でのスプライシングのレベルを減少させることによっても達成し得る。
他のＩＶＰＳは、例えば、コード容量（ｃｏｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が知見されたタンパク質よりもかなり大きく、成熟タンパク質に存在しないタンパク質配列をコードする遺伝子類を識別することにより単離し得る。ＩＶＰＳを含むタンパク質は、成熟タンパク質がＩＶＰＳを含む前駆体のＮ末端及びＣ末端配列を依然として有するという点で「プレ−プロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）」前駆体を有するタンパク質と区別し得る。さらに、ＩＶＰＳは、特定のタンパク質ファミリー（例えばＤＮＡポリメラーゼ）中に保存されるという特質（ｍｏｔｉｆｓ）が存在しないことにより検出され得る。このような特質が存在しないということは、ＩＶＰＳが特質を妨害することを示している（Ｐｅｒｌｅｒ等，上掲）。挿入がマーカータンパク質活性を減少させるように、疑わしいタンパク質配列をマーカータンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ中に挿入することにより、目的のＩＶＰＳをスクリーニングし得る。得られた改質タンパク質は、マーカータンパク質活性の増加に関して特定の時間間隔で評価し得る。実施例１〜３参照。一度識別できたら、ＩＶＰＳをコードするＤＮＡを単離し、通常のＤＮＡ増幅方法を使用して増幅し得る。
スプライシングまたは切断の化学的活性化は、所期のＣＩＶＰＳを、スプライシングまたは切断を促進または誘導する化学試薬と反応させることによって行ない得る。好ましい一具体例では、最初にＣＩＶＰＳの突然変異または他の任意の手段によって切断またはスプライシングを不活性化し、その後例えばヒドロキシルアミン、β−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールといった化学試薬の添加によって切断またはスプライシングを活性化する二段階法において１種以上の化学試薬を用いることによりスプライシングまたは切断を制御する。化学試薬による切断またはスプライシングの制御は、シス及びトランスＣＩＶＰＳ反応の両方に適用することができる。
用いる化学試薬は、切断をＮ末端とＣ末端とのいずれにおいて生起させるかということに一部左右される。理論に拘泥するつもりは無いが、Ｎ末端切断はＮ末端ドメインとＩＶＰＳとの間のエステルまたはチオエステル形成を含むと考えられる。従って、Ｎ末端切断の誘導にはヒドロキシルアミン（Ｂｒｕｉｃｅ及びＢｅｎｋｏｖｉｃ，“Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，”Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；その開示は本明細書に参考として含まれる）、β−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールといった、エステルまたはチオエステルの切断を促進する任意の化学試薬を用い得る。Ｃ末端切断はＩＶＰＳ  Ｃ末端保存アスパラギンの環化を含むと考えられる。従って、Ｃ末端切断の促進にはアスパラギンの環化率を高める任意の試薬を用い得る。非共有結合性の化学的救済（ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｃｕｅ）と呼称される一方法では、酵素を突然変異させ、それによって該酵素を不活性形態とし得る。その後、反応混合物に化学試薬を添加すれば活性は回復できる。例えば、Ｔｏｎｅｙ及びＫｉｒｓｃｈ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，ｐｐ．１４８５−１４８８，１９８９；その開示は本明細書に参考として含まれる）を参照されたい。ＣＩＶＰＳ３の切断活性を上記非共有結合性の化学的救済法で救済する方法を実施例１４に説明する。化学試薬によって酵素活性に非共有結合性の化学的救済を施すことは潜在的に、各種の突然変異に適した化学試薬の使用により、ＣＩＶＰＳ切断またはスプライシング突然変異体の一次突然変異部位かまたは二次突然変異導入後の多くの異なる可能なＣＩＶＰＳアミノ酸残基に適用可能である（Ｔｏｎｅｙ及びＫｉｒｓｃｈ，上掲）。
理論に拘泥するつもりは無いが、Ｃ末端切断はＩＶＰＳ  Ｃ末端保存アスパラギンの環化を含むと考えられる。従って、Ｃ末端切断の促進にはアスパラギンの環化率を高める任意の試薬を用い得る。
ＩＶＰＳは、以下の特性：
（１）ＨＯエンドヌクレアーゼまたは他のホーミングエンドヌクレアーゼとの類似性、
（２）アミノ酸配列（Ａｌａ／Ｖａｌ）ＨｉｓＡｓｎ（Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ）（配列番号：４５）
をいくらか有する領域の存在及び、成熟タンパク質で観察されるよりも大きな読み取り枠によっても識別し得る。
本発明のＣＩＶＰＳは、スプライシング反応が制御され得るように改質されたＩＶＰＳも含む。図１（配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８及び配列番号：３９）に示されているように、ＩＶＰＳをスプライシングする公知のタンパク質の並んだスプライス部位から幾つかの類似点が明らかになる。特に、−ＯＨ及び−ＳＨ側鎖は、下流スプライス部位でジペプチドＨｉｓ−Ａｓｎにより先行された両方のスプライス部位のＣ末端側の残基上に見出される。
理論に拘泥するつもりは無いが、ヒドロキシ／スルフヒドリル基は、スプライシング反応に関係し、これらの残基の改質はスプライシング反応を調節すると考えられる。このような改質は、挿入がマーカータンパク質活性を減少させるように、マーカータンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼに改質ＣＩＶＰＳを挿入することにより評価し得る。得られた改質タンパク質は、次いで、マーカータンパク質活性が増加する制御条件下で特定の時間間隔で評価し得る。実施例１〜３参照。さらに、ウェスタンブロット分析を使用して、スプライシング及び切断産生物を評価し得る。実施例８を参照。同定後、ＣＩＶＰＳをコードするＤＮＡを単離し、標準ＤＮＡ増幅方法を使用して増幅し得る。
本発明により、ＣＩＶＰＳ２のセリン１０８２の単一アミノ酸の変化は、タンパク質スプライシング反応を遅延させるかまたは遮断（ｂｌｏｃｋ）することが知見された。特に、トレオニン置換変異体は、野生型酵素のポリメラーゼ活性の１０％を示したが、システイン及びアラニン置換変異体は検出可能な活性を与えなかった。しかしながら、他のスプライス部位での切断に対応する反応生成物が観察された。この種は、スプライス部位でセリンとシステインを置き換えた変異体中に蓄積したが、セリンがトレオニンまたはアラニンと置き換えた時には変化がなかった。野生型ＣＩＶＰＳ２は、スプライシング反応時にカルボキシ末端スプライス部位での切断で予想される大きさの種の蓄積を示したが、セリン１０８２がトレオニン、システインまたはアラニンに変えられた時もこの産生物の蓄積は減少したけれども依然として観察された。Ｓ１０８２Ａ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）はタンパク質スプライシングの証拠を示さなかったが、この産生物を産生した。
カルボキシ末端スプライス部位に於ける突然変異の誘発、即ちトレオニン１４７２（Ｔ１４７２）残基とセリンとのアミノ酸置換により、野生型と同一のスプライシングパターンが生じた。Ｔ１４７２とアラニン、グリシンまたはイソロイシンとの置換は検出可能なスプライシングを与えなかった。アスパラギン１４７１をアラニンと置換すると、スプライシングは観察されなかったが、アミノスプライス部位での切断の証拠が観察された。以下の表１は、ＣＩＶＰＳ２に於ける切断及びスプライシングでのアミノ酸置換の効果をまとめたものである。
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タンパク質スプライシング上の単一アミノ酸置換の効果は、大腸菌発現系中にＩＶＰＳ２を含むＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのパルス−チェイス分析を使用して評価した（Ｈｏｄｇｅｓ等，上掲（１９９２））。矢印は、スプライス部位の位置を示している。小文字は、他のサンプルに関しては２時間以内に知見されたのと対照的に、一晩インキュベーション後にのみ見られた効果を示している。スプライシングが観察される場合、Ｃ末端及びＮ末端切断由来の切断産生物も知見された。
従って、ＣＩＶＰＳスプライス部位での切断は、タンパク質スプライシングなしに達成され、ターゲットタンパク質からＣＩＶＰＳの分離を制御できた。特定の状況では、このような活性が望ましい。これらの状況では、本発明のＣＩＶＰＳは、自己タンパク質分解性タンパク質、例えば、自己タンパク質分解性プロテアーゼなど、例えばレトロウイルスプロテアーゼ（例えば、ＨＩＶ−１プロテアーゼ：Ｌｏｕｉｓ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９，ｐ．３６１，１９９１；及びＤｅｂｏｕｃｋ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐｐ．８９０３−８９０６，１９８７）も包含し得る。当業者には他のこのようなタンパク質も公知である。Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．７０１−７５４，１９８８参照。このようなタンパク質は、開示の方法に従って、タンパク質分解活性が予め決定した条件下で誘導し得るように改質し得る。
スプライス部位アミノ酸を含むＣＩＶＰＳアミノ酸の改質は、種々の方法で実施し得る。例えば、改質すべきアミノ酸残基を取り囲む配列を変更して、生物学的リン酸化部位を作り出し、特異的なキナーゼ及びホスファターゼに対する基質とする。プロテインキナーゼの例としては、例えばカゼインキナーゼII、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ｃｄｃ２及びｐｐ６０c-src（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＫｅｍｐ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２００，ｐ．６２，１９９１）が挙げられる。ホスファターゼの例としては、例えばタンパク質ホスファターゼ２Ａ、λホスファターゼ及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）由来のｙｏｐホスファターゼ（Ｔｏｎｋｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，ｐ．１１１４，１９９０）が挙げられる。
実施例６Ｃに記載の如くＣＩＶＰＳ２を例として使用すると、アルギニン残基を位置１０７９で置換して、コンセンサスカルモジュリン依存性プロテインキナーゼII部位を作り出す（ＸＲＸＸＳ*；Ｐｅａｒｓｏｎ等，上掲）。タンパク質スプライシング反応は、リン酸化度によって調節され得、ホスホセリンを作り出し、スプライシングをブロックするためにキナーゼを、リン酸を除去するためにホスファターゼを使用し、野生型セリンを回復し、タンパク質スプライシングする。
さらに、重要なスプライス部位残基は、改質が逆転するまでスプライシング反応がブロックされるように、化学的に改質され得る。これは、例えば、異常なアミノ酸突然変異誘発（Ｎｏｒｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，ｐ．１８２，１９８９；Ｅｌｌｍａｎ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０２，ｐ．３０１，１９９１）を使用することにより実施し得る。この方法を使用して、スプライシング反応に含まれるアミノ酸１個を翻訳時に、側鎖の側鎖官能基が化学的または光分解的に除去し得る基によって「マスク」される合成誘導体と置換し得る。例えば、実施例７に記載の如く、ＣＩＶＰＳ２のセリン１０８２を以下の如く本方法により改質した。アンバー停止コドンをセリン１０８２に対応する位置でＶｅｎｔポリメラーゼ遺伝子に導入した（実施例６Ｄ参照）。この遺伝子を、野生型遺伝子のタンパク質スプライシングを指示することが既に示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（Ｅｌｌｍａｎ等，上掲）に添加した。このコドンを介して読み取るｔＲＮＡの非存在下では、切頭産物だけが予想された。化学的にＯ−（ｏ−ニトロベンジル）セリンでアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡをこの系に添加したときには、このコドンの先では連続的な翻訳が可能であり、その結果、改質セリンの部位特異性組み込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が得られた。予想通り、完全長前駆体だけが観察され、これは、スプライシング反応がブロックされたことを示している（図９）。ｏ−ニトロベンジル基は３５０ｎｍでの短時間の照射により除去可能なので（Ｐｉｌｌａｉ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １，１９９０）、ブロックされた前駆体は、照射後には通常スプライスすると考えられる。ブロックされた前駆体は、可視光に暴露されるとセリンを放出し、インキュベートするとスプライシング反応が起きるので、スプライスされた産生物がはっきりと知見される（図１０）。
この戦略は、ＣＩＶＰＳ２の下流スプライス部位に見られるトレオニン１４７２並びに、側鎖の化学官能基がスプライシングに必要であるか、その位置に嵩高い基を導入することによりスプライシングを立体的に妨害する他の任意の残基に適用し得る。ブロック基は、保護すべき側鎖の化学的性質だけでなく、（化学的または光分解的）脱ブロックの望ましい方法に基づいて選択し得る。例えば、タンパク質スプライシングの他の例（図１）に存在するシステイン基は、例えば、ジスルフィド交換（例えば、ジチオジピリジンを用いる）または遷移金属イオン（例えば、Ｈｇ2+）との錯体形成を使用してブロックし得るチオール側鎖を有する。Ｃｏｒｅｙ及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４，ｐ．３６６６，１９８９参照。得られたブロック化前駆体は、次に、各々金属キレート化剤の添加または温和な還元によりスプライシングするために活性化し得た。
ＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２は各々、エンドヌクレアーゼ、即ち、Ｉ−ＴｌｉII及びＩ−ＴｌｉＩをコードする。さらにＤＶ  ＩＶＰＳ１は、ＩＶＰＳ１がＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に挿入したのと同位置でＤＶ  ＤＮＡポリメラーゼに挿入し、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１遺伝子と６２％の相同であるエンドヌクレアーゼＩ−ＰｓｐＩもコードする。Ｔｆｐ１、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｅｃＡ、Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＩＶＰＳ読み取り枠は、ホーミングエンドヌクレアーゼ、イントロンを欠失する対立遺伝子を切断し得るイントロン−コード化タンパク質の種類と似たタンパク質配列を有する（Ｈｉｒａｔａ等，上掲；Ｋａｎｅ等，上掲；Ｄａｖｉｓ等，上掲；Ｐｅｒｌｅｒ等，上掲）。
特定の宿主細胞は、ＣＩＶＰＳの遺伝子産物に対して耐性がないので、場合により、エンドヌクレアーゼ機能を不活化するのが好ましい。本発明により、タンパク質スプライシングは、ＣＩＶＰＳエンドヌクレアーゼ機能が不活化された時に起きることが明らかになった。このような不活化は、例えば、ランダム突然変異誘発、欠失または挿入不活化または特定部位の突然変異誘発を含む種々の方法で達成し得る。エンドヌクレアーゼ機能は、部位特異的突然変異誘発により不活化されるのが好ましい。Ｉ−ＴｌｉＩは、特徴的なドデカペプチドモチーフ対中の他の「ホーミングエンドヌクレアーゼ」と似た配列を共有する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ等，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｔ．１６，ｐ．３８１，１９８９）。実施例６Ｂに見られるように、エンドヌクレアーゼ活性は、これらのモチーフの一種内の単一残基のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発により不活化された（アスパラギン酸１２３６からアラニンへ）。別の残基の置換は、タンパク質スプライシングに影響を及ぼすことなくエンドヌクレアーゼ活性を減少または除去し得た。エンドヌクレアーゼ機能の不活化により、改質タンパク質を保持する構築物の安定性を増加させることが明らかになった。
本発明で使用し得るターゲットタンパク質としては、例えば、酵素、毒素、細胞毒素、糖タンパク質及び成長因子が挙げられる。このような多くのタンパク質は当業者には公知である。このようなタンパク質のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、多くのコンピューターデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔにより容易に得られる。あるいは、ターゲットタンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、当業界で日常的な方法を使用して決定し得る。
実質的にターゲットタンパク質活性を不活化するのが望ましい場合、このような活性を不活化する領域にＣＩＶＰＳを挿入する。このような領域は当業者には公知であり、例えば、結合部位、酵素活性部位、タンパク質の保存モチーフ、例えばＤＮＡポリメラーゼ及び二量化または多量化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）が挙げられる。あるいは、ＣＩＶＰＳをランダムに挿入し、所望の活性レベルが得られるまで各改質タンパク質の活性を測定し得る。このような改質タンパク質は、ネイティブのタンパク質と比較して活性が約５０％減少しているのが好ましい。約７５％減少しているのがより好ましく、９９％以上減少しているのが最も好ましい。
ＣＩＶＰＳは、任意の多くの方法によりターゲット遺伝子に挿入し得る。好ましくは、適正なタンパク質スプライシングを確実にするためにＣＩＶＰＳが切除される場合、ＣＩＶＰＳの切除によりそのアミノ酸がスプライス部位に残るので、適正なスプライス部位残基の直前にＣＩＶＰＳを挿入することが重要である。これは、好適なスプライス部位アミノ酸の直前にＣＩＶＰＳを挿入するか、またはＣＩＶＰＳが好適なアミノ酸を一緒に「持ってくる（ｂｒｉｎｇ）」ようにＣＩＶＰＳを改質することによって達成し得る。
例えばＣＩＶＰＳ１、２または３は、好適なスプライス部位アミノ酸、例えばセリン、トレオニンまたはシステイン残基の直前、最も好ましくはセリンまたはトレオニンの直前に挿入し得る。図１を参照。このような部位は、殆どのターゲットタンパク質で便利に利用し得る。
ターゲットタンパク質が毒素であるような特定の状態では、第２の制御を加えることによりタンパク質スプライシングをさらに制御することが望ましい。これは、例えばＣＩＶＰＳが通常先行せず、スプライシング反応を遅延させ得るようなそれほど最適でないアミノ酸の前にＣＩＶＰＳを挿入することにより達成し得る。
上記の如く、ＣＩＶＰＳが好適な下流アミノ酸を一緒に「持ってくる」場合、ターゲットタンパク質内の任意の部位に挿入し得る。これは、所望の下流のアミノ酸のコドンを有するＣＩＶＰＳ  ＤＮＡの作製により達成し得る。このようなＤＮＡの産生方法を以下に詳述する。このＤＮＡは次いで、ターゲットＤＮＡ内の任意の部位に挿入し得る。得られた改質タンパク質のタンパク質スプライシング時には、ＣＩＶＰＳによりもたらされた過剰の残基は後方に残存する。従って、最終産生物の活性が重要である場合、当業者は、過剰の残基が、活性に悪影響を及ぼすようなターゲットタンパク質領域内に絶対残存しないように製造段階を取らねばならない。
ＣＩＶＰＳは、標準法（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０，ｐ．１０５，１９８４参照）及び市販のタンパク質合成機を使用して、任意の所望の部位に挿入した、ＣＩＶＰＳを含む、ターゲットタンパク質の第１のアミノ酸配列を化学的に合成することにより、ターゲットタンパク質に挿入またはターゲットタンパク質に融合し得る。
あるいは、ＣＩＶＰＳをコードするＤＮＡ配列は、両方のコード配列が連続読み取り枠を形成するようにターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ配列に挿入または融合される。これは、当業者には公知の種々の方法を利用して実施し得、その幾つかを以下に記載する。
例えば、ＣＩＶＰＳ  ＤＮＡを、ターゲット遺伝子内でブラント切断し且つ枠内にある任意の制限酵素部位に挿入する。これは、第１に、その３’末端にトレオニンコドン（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２）またはセリンコドン（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１若しくはＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ１）をもつＣＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントを合成することにより実施し得る。次いで、このフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによりブラント末端に切断した線状プラスミドにフレーム内で結合する。ｌａｃＺ  ＤＮＡ配列、例えば、ＥｃｏＲＶ部位を使用して、残基３７５（アスパラギン酸）と３７６（イソロイシン）との間にＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２またはＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１を挿入し得る。図２参照。しかしながら上記の如く、この方法を使用してＣＩＶＰＳを切除する場合、過剰の残基がスプライス部位に残存し、従って、ＣＩＶＰＳが挿入される場所に応じて、得られたタンパク質はネイティブのタンパク質と同一機能または構造を持たなくてもよい。
ＣＩＶＰＳ  ＤＮＡは、ターゲット遺伝子と適合性の制限部位を作り出すためにＣＩＶＰＳの両方の末端または一方の末端の近くにサイレント突然変異（アミノ酸残基を維持する）を起こすことによっても挿入し得た。例としてＣＩＶＰＳ２を使用すると、サイレント突然変異により、ＢｓｐＥＩ制限部位は５’末端の近くに作り出され得、ＳｐｅＩ制限部位はその３’末端の近くに作り出され得る。新しい制限部位と重複し、且つａｓｐ  ５９４またはｔｈｒ５９５のいずれかに於けるｌａｃＺターゲット遺伝子の開始により連続するＰＣＲプライマーを使用して、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ制限部位と適合性のｌａｃＺフラグメントを作製し得る。次いで、ＣＩＶＰＳをｌａｃＺコード領域内のアスパラギン酸コドン（残基５９４）とトレオニンコドン（残基５９５）の間に挿入する。ＤＮＡフラグメントは、ＣＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子の両方から、ＣＩＶＰＳの末端と重複する挿入部位のその末端とのＰＣＲにより合成され得、従って同一制限部位を含む。好適な制限エンドヌクレアーゼ処理後、適合性末端を有するＤＮＡフラグメントを連結して融合遺伝子を作製し得る。ＣＩＶＰＳの切除後には過剰残基は全く残らないので、スプライシング発生時にネイティブのポリペプチドが形成するだろう。作り出された制限部位がＣＩＶＰＳ内に１個及びターゲット遺伝子内に１個であると、多重フラグメントの連結及び複雑なスクリーニング方法を回避し得るので好ましい。
ターゲット遺伝子配列を保持するプラスミドベクターが比較的小さい場合、例えば、約５ｋｂ未満である場合、線状型プラスミドをＰＣＲを使用して作製し、次いで線状プラスミドをＣＩＶＰＳ遺伝子に連結する。この方法を使用して、ＣＩＶＰＳ遺伝子を以下の如くターゲット遺伝子の任意の位置に挿入し得る。第１に、ターゲット遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、挿入部位（例えば、ＣＩＶＰＳ１、２及び３に関してはセリン若しくはトレオニンコドン）で開始するプライマー対または、ＣＩＶＰＳが好適な下流アミノ酸を持ってくる場合には任意のコドンを使用するＰＣＲにより合成し得る。次に、（任意にセリンまたはトレオニンを含む）ＣＩＶＰＳ遺伝子を（セリンまたはトレオニンコドンを含まない）線状プラスミドＤＮＡに連結し得る。必要なスプライス部位アミノ酸（セリンまたはトレオニン）を、ＣＩＶＰＳフラグメントまたはターゲット遺伝子のいずれかの上に配置し得る。内在性セリンまたはトレオニンの上流に配置する際に必要なアミノ酸をＣＩＶＰＳフラグメント上に有する利点は、コード領域にセリンまたはトレオニンが欠失しているので、（ＣＩＶＰＳ挿入物を含まない）自己連結ベクターＤＮＡがターゲット遺伝子の欠陥産物だけを発現し得るということである。これは、融合タンパク質がスプライスして機能性産物を産生する場合に、融合構築物に関する表現型の選択を助長し得る。
改質タンパク質をコードする融合ＤＮＡは、好適な発現ベクター、即ち、挿入したタンパク質−コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入し得る。種々の宿主−ベクター系を使用してタンパク質−コード配列を発現し得る。これらの例としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物または、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換したバクテリアが挙げられる。使用した宿主−ベクター系に依存して、多数の好適な転写及び翻訳要素のうちの任意のものを使用し得る。例えば、改質真核生物タンパク質を発現する際、好適な真核生物ベクター及び宿主細胞を使用すると都合がよい。融合ＤＮＡの発現により、本発明の改質タンパク質が産生する。
一度得られたら、公知方法を好適に組み合わせて、改質タンパク質を分離し且つ精製し得る。これらの方法としては、例えば、塩析及び溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の違いを利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的な親和性を利用する方法、逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの疎水性の違いを利用する方法及び等電点電気泳動などの等電点の違いを利用する方法が挙げられる。
所望により、改質タンパク質を、ＣＩＶＰＳが除去される予め決定した条件にかけ得る。このような条件は、使用するＣＩＶＰＳに依存する。例えば、ＣＩＶＰＳ１、２及び３は、改質タンパク質を高温、４２℃〜８０℃、最も好ましくは４２℃〜６０℃にかけることにより除去し得る。これは、公知方法、例えば、水浴または熱発生レーザーを使用して実施し得る。インキュベーション時間は１分未満から数時間以上を変動し得る。上記の如く、特定の状態では、ターゲットタンパク質の熱感受性に依存して、温度を下げながらインキュベーション時間を延長するのが望ましい。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏスプライシングが望ましい場合、宿主生物の増殖と適合する温度が好ましい。
本発明により、改質タンパク質が無毒性であるように毒性ターゲットタンパク質を改質するためにＣＩＶＰＳを使用することにより宿主細胞に対して非常に毒性のタンパク質を産生し得る。これは、例えば、ＣＩＶＰＳを毒性に関与する領域に挿入することにより実施し得る。単離後、無毒性改質タンパク質を、ＣＩＶＰＳを除去し、得られた毒性を単離し得るような予め決定した条件にかけ得る。
タンパク質が宿主細胞に対して非常に毒性が高い場合、「トランススプライシング（ｔｒａｎｓｐｌｉｃｉｎｇ）」と称される方法を使用してそのタンパク質を産生するのが望ましい。この方法を使用すると、毒性タンパク質は、別個の宿主細胞中にＣＩＶＰＳを挿入することにより改質されている２つ以上の部分（ｐｉｅｃｅｓ）内で産生する。例えば、ターゲットタンパク質のカルボキシ末端にＣＩＶＰＳのアミノ末端フラグメントが挿入されるターゲットタンパク質のアミノ部分を含む第１の改質タンパク質を産生し、その後、ターゲットタンパク質のアミノ末端にＣＩＶＰＳの残りのフラグメントが挿入されるターゲットタンパク質の残りの部分を含む第２の改質タンパク質を産生し得る。あるいは、重複ＣＩＶＰＳフラグメントを使用し得る。次いで、各改質タンパク質を宿主細胞から単離し、ＣＩＶＰＳのスプライシングに好適な条件下、一緒にインキュベートする。これにより連結したターゲットタンパク質が得られる。ターゲットタンパク質を２個の異なる宿主に分割することにより、微小画分でさえも宿主に悪影響を与えるｉｎ  ｖｉｖｏスプライスする可能性はない。さらに、ＣＩＶＰＳ全体を第１の改質タンパク質のスプライス部位の一方の側に挿入し、残りのターゲットタンパク質フラグメントをスプライシング混合物に添加することも可能である。
従って、トランススプライシングはきわめて有毒な遺伝子の大腸菌における発現を、２個の異なる宿主のそれぞれにおいてターゲットタンパク質の不活性部分のみを発現させることにより可能にし得る。発現された二つの相補的フラグメントは、大量に精製し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏトランススプライシングによって互いに連結することができる。ＣＩＶＰＳを二つの部分に分割することによって、そのスプライシング活性を前記二つの部分が一体化されるまで有効に制御する。従っていずれのＩＶＰＳも、異なる宿主から精製してスプライシングが必要となるまで分離しておく二つの部分に分割すればＣＩＶＰＳとなる。
トランス切断は、トランススプライシング、ＣＩＶＰＳ切断、及び三部分アフィニティー切断ベクター系の特性を併せ持つ。トランス切断ではＣＩＶＰＳを二つのフラグメントに分け、これらのフラグメントは組み合わせて活性化すると、所期のタンパク質とＣＩＶＰＳとの間に切断を実現する。実施例９においてシス切断に関して述べたのと同様の、考えられる一用途では、トランス切断を所期のタンパク質のアフィニティー精製に用い得る。この用途では、ＣＩＶＰＳの前記フラグメントの一方または両方が精製のためのアフィニティータグ（ｔａｇ）と、所期のタンパク質とのフレーム内融合物を形成するクローニング部位とを有する。二つの構築物をそれぞれ、トランススプライシングに関して述べたようにして増殖させ、かつ別個に誘導する。次に、二つの構築物のそれぞれに由来するタンパク質を標準的なクロマトグラフィー技術またはアフィニティー技術によって精製する。得られた二つのタンパク質フラグメントを、ＣＩＶＰＳの二つの部分が一体となって活性なＣＩＶＰＳを構成することを可能にする条件下に組み合わせる。その後、温度、ｐＨ、化学試薬または他の手段によって切断を誘導し、精製された所期のタンパク質の放出を実現する。
一具体例において、ＣＩＶＰＳの二つの部分の組み合わせは一方の部分を固体支持体に結合させた状態で可能である。この場合は切断活性化後、所期のタンパク質が固体支持体から放出され、一方ＣＩＶＰＳ及びアフィニティータグは固体支持体上に残留する。条件次第では二つのＣＩＶＰＳフラグメントは切断反応後も会合したままであり、その結果、一方のフラグメントしかアフィニティータグを有しなくとも両フラグメントが固体支持体との結合状態を維持することが可能となる。ＣＩＶＰＳの二つのフラグメントの両方にアフィニティータグを付け、それによって切断後に所期のタンパク質をＣＩＶＰＳフラグメントから分離することも可能である。実施例９に述べた三部分融合の場合同様、結合ドメイン、ＣＩＶＰＳ及び所期のタンパク質を結合させる順序は様々となり得る。ＣＩＶＰＳ精製及び切断案に関して述べた変形は総てトランス切断系にも適用可能である。
ＣＩＶＰＳ融合物におけるシス切断に関して得られたのと同じ情報を用いるか、または新規な突然変異を用いることによって、切断をＣＩＶＰＳのＮ末端またはＣ末端で生起するようにプログラムし得る。この例では、ＣＩＶＰＳフラグメントの開始点は実施例１２に述べた開始点とする。得られたＣＩＶＰＳ３フラグメントを、実施例１０に述べたカセット置換によってトランス切断試薬に変換した。ＣＩＶＰＳ３のＣ末端におけるトランス切断をもたらすことを本発明者が示した多くの可能な突然変異の中に、ＣＩＶＰＳ３のＡｌａ５３５のＬｙｓへの変異、ＣＩＶＰＳ３のＳｅｒ１のＡｌａへの変異、及びＣＩＶＰＳ３のＩｌｅ２のＬｙｓへの変異が有る。ＣＩＶＰＳのＡｓｎ５３７のＡｌａへの変異はＣＩＶＰＳ３のＮ末端におけるトランス切断をもたらした。
本発明のＩＶＰＳは、「タンパク質連結」で使用し、非天然アミノ酸残基、構造プローブ、識別エピトープ若しくはタグまたは、他の決定子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）をターゲットタンパク質に添加し得る。例えば、ターゲットタンパク質をＩＶＰＳのアミノ末端に融合し得る。停止コドンを、ＩＶＰＳのカルボキシ末端の直後に配置し得る。次いで融合すべきペプチドを混合物に添加し得る。天然のスプライシング機構を非常に厳密に模倣するためには、このペプチドのアミノ末端はセリン、トレオニンまたはシステインであってもよい。次いで、産生物のスプライシングへ質量作用により増大されたスプライシング反応を進行し得る。
上記反応は、ターゲットタンパク質のアミノ末端にカルボキシ末端で融合したＩＶＰＳから構成される出発物質を用いて起きるようにもし得る。特定のＣＩＶＰＳ内で開始するセリン残基に先行するように工学的に作製されたメチオニンでの開始が、大腸菌内でアミノ末端セリン残基を残すように翻訳を起こさせる。次いで、このターゲットタンパク質のアミノ末端に融合すべきペプチドを添加し、スプライシングを進行させた。添加されるペプチド上のカルボキシ末端残基に関しては公知の要件がないので、このような試みは好ましい。さらに、今回の実験的証拠から、上流スプライス部位の切断は連結反応に先行して起こることが示唆されており、この試みが天然の反応機構に非常に近いことを示している。ターゲットペプチドをペプチドに添加し、融合タンパク質を翻訳し易くすることが可能であった。
本発明は、他のタンパク質の誘導または分化などの特定の条件下、または細胞周期の特定の部分の間にターゲットタンパク質の効果を研究するためにも使用し得る。例えば、特定のタンパク質をコードする遺伝子の染色体コピーをＣＩＶＰＳを含むバージョンと置き換え得る。細胞周期の特定点、分化または他の所望の点で、細胞を加熱すると前駆体がスプライスし、活性ターゲットタンパク質はこの時点でのみ存在する。
本発明のＣＩＶＰＳを使用して、ＣＩＶＰＳに対して特異的な抗体を持つアフィニティクロマトグラフィーを使用することにより改質タンパク質を単離することもできる。例えば、標準法を使用してＣＩＶＰＳに対して結合親和性を持つモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生し得る。これらの抗体は、アフィニティクロマトグラフィー精製法で使用し、改質タンパク質を単離し得る。精製後、所望により、改質タンパク質をＣＩＶＰＳを切除する予め決定した条件にかけ得る。
上記の如く、ＣＩＶＰＳスプライス部位での切断は、タンパク質スプライシングなしに実施でき、ターゲットタンパク質からＣＩＶＰＳの分離を制御し得る。従って、このようなＣＩＶＰＳは融合タンパク質精製系で使用し得る。
融合タンパク質精製系は当業者には公知である。ヨーロッパ特許出願第０  ２８６  ２３９号及びＮ．Ｍ．Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，ＴＩＢＴＥＣＨ  ８，ｐｐ．８８−９３，１９９０参照。通常、このような系では、結合タンパク質とターゲットタンパク質はプロテアーゼ認識部位を持つリンカーで結合されている。次いで、融合物は、結合タンパク質に対して親和性を持つ基質上のアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。結合タンパク質とターゲットタンパク質を、次に、プロテアーゼ、例えば第Ｘａ因子と接触させることにより分離する。これらの系では、非常に精製されたターゲットタンパク質を得るために、プロテアーゼはターゲットタンパク質並びに汚染の可能性から分離せねばならず、従って、追加の精製段階にかける。プロテアーゼの代わりにＣＩＶＰＳを使用することにより、本発明の方法は、現在使用されているタンパク質融合精製系に含まれるこれら及び他の問題を避けることができる。
本発明の方法により、基質（結合タンパク質）に対して親和性を持つタンパク質とターゲットタンパク質の間にＣＩＶＰＳがある融合タンパク質を含む改質タンパク質が形成する。このような融合タンパク質を形成する方法は、当業者には公知である。ヨーロッパ特許出願第０  ２８６  ２３９号及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１７．２９−１７．３３，１９８９参照。
本発明の方法で使用し得る結合タンパク質としては、例えば、糖結合タンパク質、例えばマルトースまたはアラビノース結合タンパク質、レセプター結合タンパク質、アミノ酸結合タンパク質及び金属結合タンパク質が挙げられる。他の結合タンパク質は当業界で公知である。ヨーロッパ特許出願第０  ２８６  ２３９号及びＮ．Ｍ．Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，ＴＩＢＴＥＣＨ，上掲参照。
次いで改質タンパク質を、結合タンパク質が特異的親和性を有する基質と、例えばアフィニティクロマトグラフィーを用いて接触させる。
非常に精製されたターゲットタンパク質を、例えば、ＣＩＶＰＳとターゲットタンパク質の間で切断が開始するような予め決定した条件にＣＩＶＰＳをかけることにより、カラムから遊離し得る。あるいは、精製融合タンパク質を、上記の如くカラムから溶離且つ遊離し得る。
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明を理解しやすくするためのものであり、限定するものではない。
上記及び下記引用の参照文献は、すべて本明細書中参照として含まれる。
実施例１
ターゲット遺伝子コドンの間の平滑部位に挿入するためのＩＶＰＳカセットの合成
ｌａｃＺコード領域（ｌａｃＺ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）又は他の任意のターゲット遺伝子にＩＶＰＳをフレーム内挿入（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）するためのＤＮＡフラグメント又はカセットは、最初の下流外部タンパク質配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ＥＰＳ）コドンを用いて又は用いずにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造し得る。天然の（ｎａｔｉｖｅ）下流残基は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合のセリン、又はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合のトレオニンである。ＩＶＰＳ２は、トレオニン又はシステインに先行していれば、程度は低いが、スプライスできることが判明した。理論に拘泥するつもりは無いが、全てのＩＶＰＳは、セリン、トレオニン又はシステインのいずれかに先行していれば、ある程度までスプライスできると考えられる。下流のセリン又はトレオニンを含むカセットは、セリン又はトレオニンに先行する位置を含めて、ターゲット遺伝子内の任意の所望位置に挿入することができる。この構築では、セリン又はトレオニンをターゲット遺伝子から欠失させ、これをカセット上の入来残基で置換し得る。下流のセリン、トレオニン又はシステインを有していないカセットは、ターゲット遺伝子内のセリン、トレオニン又はシステインより前に挿入し得る。
下記のプロトコルは、最初の下流ＥＰＳコドンを含む、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰ３）及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰ２）（エンド＋及びエンド−バージョン）用カセットの製造を説明するものである。
ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭの硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、０．９μＭの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたものからなる。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を用いて、９４℃で３０秒、４８℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに３０回かけることにより実施した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む４．８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントを有するｐＮＥＢ＃７２０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７２３）から合成した。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２は、ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列の１．９ｋｂ  ＥｃｏＲ１フラグメント（２８５１−４７６６）を有するｐＶ１５３−２から合成した。ＩＶＰＳ２にはｐＮＥＢ６７１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８４４７）を使用することもできる。ｐＡＭＱ２９は、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２コード領域内にアミノ酸置換（アスパラギン酸１２３６をアラニンに）を有する、ｐＶ１５３−２のエンドヌクレアーゼ欠失誘導体である。プライマー５’−ＡＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴ−３’（配列番号：３）（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）、３５３４−３５５６、Ａ３５４２のＣへの置換）及び５’−ＡＧＴＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：４）（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２／Ｔｈｒ逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）、４６８５−４７０６）を用いて、３’末端にトレオニンコドンを有するエンド＋又はエンド−Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２フラグメント（１１７３ｂｐ）を合成した。プライマー５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号：５）（ＤＶ  ＩＶＰＳ正方向、１８３９−１８６２）及び５’−ＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６）（ＤＶ  ＩＶＰＳ１／Ｓｅｒ逆方向、３４２８−３４５２）を用いて、３’末端にセリンコドンを有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）ＩＶＰＳ１フラグメント（１６１４ｂｐ）を合成した。Ｃ末端セリン又はトレオニンを欠失したＩＶＰＳフラグメントの形成には、最後の３つのヌクレオチドを欠失した逆方向プライマーを使用し得る。
ＰＣＲ試料はフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３Ｍ  ＮａＡｃ及び７０％エタノール中で−２０℃で一晩沈殿させ、ミクロ遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１０分間、１０Ｋで遠心分離して回収し、乾燥し、各々を３０μｌの蒸留水に再懸濁し、１％アガロースゲル上に配置して６０ボルトで１５時間電気泳動にかけた。ＰＣＲ増幅フラグメントを含むゲル切片を１％低融点（ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ）アガロースゲル中に配置して８０ボルトで２時間電気泳動にかけた。０．５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中６５℃で３０分間インキュベートし、フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホルムで抽出し、０．６Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）及び５０％イソプロパノール中で−２０℃で一晩沈殿させることにより、低融点アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを回収した。ＤＮＡを遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１５．５μｌの蒸留水に再懸濁した。
ＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントのリン酸化を、２μｌの１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、１５．５μｌの精製ＤＮＡと、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、２０μｌ中５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを用いて３７℃で６０分間実施した。試料を６５℃の水浴中で１０分間加熱した。８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えた後、試料をフェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホルムで逐次抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で−７０℃で３．５時間沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋで遠心分離してペレット化し、冷７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、蒸留水（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１  ＤＮＡの場合は２０μｌ、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳエンド-ＤＮＡの場合は１０μｌ）に再懸濁した。
実施例２
β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドのような制限酵素直線化プラスミド（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ）へのＩＶＰＳのフレーム内挿入
この実施例では、２つのコドンの間でターゲット遺伝子内に平滑切断（ｂｌｕｎｔ  ｃｕｔ）を形成する制限酵素部位にカセットを挿入することによって、ＩＶＰＳカセットをターゲット遺伝子にクローニングする方法を説明する。カセットは、必要であれば、Ｃ末端セリン、システイン又はトレオニンを有し得る。このプロトコルは、制限酵素がターゲット遺伝子ベクターを１回又は２回切断する場合に最も効果的である。具体例として、ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位への挿入を説明する（図２）。
ＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５の調製
ｐＡＨＯ５は、ｔａｃプロモーターの下流のｐＡＧＲ３のポリリンカー内でＢａｍＨＩ部位とＳｍａＩ部位との間に挿入されたｐＲＳ４１５（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ  ５３：８５−９６（１９８７））からの３．１ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＤｒａＩフラグメント上に完全なｌａｃＺ遺伝子配列を有する。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃＩq遺伝子の産物によって抑制され得且つイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導され得る転写制御エレメントである。５．９ＫｂベクターｐＡＨＯ５（ＮＥＢ）は更に、ｔａｃプロモーター及びポリリンカーの上流の転写終結配列と、大腸菌ｌａｃＩq遺伝子とを有する。ｐＡＨＯ５は２つのＥｃｏＲＶ認識配列を含んでいる。ＥｃｏＲＶは開裂部位に平滑末端を残す。ＥｃｏＲＶ開裂部位の１つは、３７５番目のコドン（アスパラギン酸）と３７６番目のコドン（イソロイシン）との間のｌａｃＺコード領域内で切断を行い、ＩＶＰＳフラグメントのフレーム内挿入用部位として予定される。もう１つの部位は大腸菌ｌａｃＩq遺伝子内で３．２ｋｂ下流に位置する。該プラスミドを部分的に切断して、ＥｃｏＲＶ部位のうちの１つだけが開裂されている分子を幾つか産生する。これらの直線プラスミドを精製する。ＩＶＰＳカセットはいずれかのＥｃｏＲＶ部位にランダムにクローニングする。従って、得られた組換え体は、配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と固有のＥｃｏＲＶ部位への挿入とについてスクリーニングする必要がある。ＤＮＡは、１５μｇのｐＡＨＯ５  ＤＮＡを１００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中４０単位のＥｃｏＲＶ（ＮＥＢ）と共に３７℃で６０分間インキュベートすることにより部分的に消化した。ＥｃｏＲＶを失活するために試料を６５℃で１０分間加熱した後、２０μｌの染料添加アガロースゲルを試料に加えた。１％低融点アガロースゲルでの電気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離した。直線化ｐＡＨＯ５プラスミドＤＮＡを実施例１と同様に低融点アガロースゲルから回収し、４４．６μｌの蒸留水に再懸濁した。
ＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５の脱リン酸化を、２μｇのＤＮＡと４単位の子牛腸アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）との存在下で、５０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中５０℃で６０分間実施した。０．５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えた後、試料を６５℃の水浴中で３０分間加熱し、フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホムで抽出した。ＤＮＡを０．７５Ｍ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で２時間沈殿させ、実施例１と同様に回収し、２０μｌの蒸留水に再懸濁した。
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の構築
脱リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡとリン酸化ＩＶＰＳフラグメントとの連結を、２０μｌ容量で、８．６μｌの蒸留水と、２μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、４μｌの０．１μｇ／μｌ脱リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡと、前述のように調製した５μｌのＩＶＰＳ  ＤＮＡ（０．２５μｇのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２、０．４μｇのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１又は０．２５μｇのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２エンド−）と、１６０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて１６℃で１５時間実施した。
１００μｌのコンピテントＲＲ１細胞と１０μｌの連結反応試料とを氷上で３０分間混合し、４２℃で２分間加熱し、氷上で５分間冷却し、０．８ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットル  トリプトン、５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルＮａＣｌ、１ｇ／リットル  デキストロース、１ｇ／リットルＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で４５分間インキュベートして、大腸菌株ＲＲ１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢプレートに試料をプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、プレート当たり約１５０〜３００のコロニーが観察された。
コロニーのハイブリダイゼーションを使用して、組換えプラスミドを有するクローンをスクリーニングした。実施例１で説明したＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向プライマー及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１正方向プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［  −32Ｐ］で放射性標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。コロニーを採取してニトロセルロース上に配置し、下記の各溶液中で５分間処理した：１０％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（２回）及び２×ＳＳＣ（２回）。ニトロセルロースフィルターを室温で１時間乾燥し、真空下８０℃で２時間焼成し、６×ＳＳＣに５分間浸漬し、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で４２℃で２時間洗浄した。６×ＮＥＴ、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、０．５％ＳＤＳ及び２５μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で４時間処理した後、フィルターを放射性標識オリゴマープローブと共に同一条件で１６時間インキュベートし、次いで６×ＳＳＣ中で、室温で１５分間の洗浄３回と、４２℃で２分間の洗浄２回と、５０℃で２分間の洗浄２回とにかけ、その後オートラジオグラムを撮った。３６個のクローンが、対応するオリゴマープローブにハイブリダイズしていた。
実施例１で説明したＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向プライマー（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１正方向プライマー）と、挿入部位から３９２ｎｔ下流のｌａｃＺコード配列（１４１７−１４４０、１４３７にＧ：Ｔ不適合を有する）に対して相補的なｌａｃＺ逆方向プライマー（５’−ＡＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：７））とを用いて、ポジティブクローンから抽出したプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅により挿入位置の決定を行うために、ポジティブクローンを更に分析した。１４個のクローンからのＰＣＲ反応で、対応するＤＮＡフラグメントが産生された。クローンｐＶＴ１３３、１３８、１３９、１４１、１４２及び１４４は１．４ＫｂのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２挿入物を含んでおり、ｐＶＴＥ  ８３４、８３６、８３９及び８４１はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（エンド-）挿入物を含んでおり、いずれも約１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを産生する。クローンｐＤＶＳ７１２、７４２、７４５及び７４６は１．６ＫｂのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物を有し、約２．０ＫｂのＤＮＡフラグメントを産生する。
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の発現
前記クローンを、誘導物質ＩＰＴＧを用いて融合（改質）タンパク質を発現する能力について更に調べた。
クローンは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃で培養した。非誘導細胞（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ）から溶解物を調製するために、１．５ｍｌの培養液をペレット化し、１００μｌの尿素溶解緩衝液（ｕｒｅａ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、１０分間沸騰させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に４時間増殖させた。１．５ｍｌの培養液の細胞をペレット化し、２時間及び４時間の誘導後に２５０μｌの尿素溶解緩衝液で溶解した。クーマシーブルー染色ゲルでタンパク質生成物を分析した。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２−ｌａｃＺ融合構築物のうちの３つ（ｐＶＴ１３９、１４２及び１４４）並びに４つのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（エンド-）−ｌａｃＺ融合構築物の全ては、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質について予想された大きさである約１６２〜１６５ＫＤａの主産物を発現した。４つのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ｌａｃＺ融合クローンはいずれも、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質について予想された大きさである１７３〜１７８ＫＤａのより大きい産物を発現した。
Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ（ＮＥＢ）又はβ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する抗体を用いるウェスタンブロットにより、ｐＶＴ１４２及び１４４並びにｐＶＴＥ８３６及び８３９に由来するＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２融合タンパク質のアイデンティティを更に分析した。試料を、予備染色したマーカー（ＢＲＬ）を用いて４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。試験した４つのクローン全部から得られた約１６０ＫＤａのバンドは両方の血清と反応し、クーマシーブルー染色バンドと同じ位置に移動する。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１融合も調べた。β−ガラクトシダーゼ及びＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１のタンパク質生成物）に対する血清を用いてｐＤＶＳ７１２及び７４２のウェスタンブロット分析を行ったところ、クーマシーブルー染色バンドと同じ約１６８〜１７５ＫＤａに予想された主バンドが得られた。
実施例３
β−ガラクトシダーゼ−ＩＶＰＳ融合におけるタンパク質スプライシングの熱制御
前述の構築物（ｌａｃＺ  ＥｃｏＲＶ部位に挿入したＩＶＰＳ）は誘導後に融合（改質）タンパク質を産生した。ＩＶＰＳタンパク質は、高温でのインキュベーションによって、連結ターゲットタンパク質（活性β−ガラクトシダーゼ）と遊離ＩＶＰＳエンドヌクレアーゼとを形成するために、融合タンパク質から切り出すことができる。
スプライシングは温度誘導によって制御できる：粗抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性は温度シフトに応答して増加する。
ＲＲ１（大腸菌宿主）及びｐＡＨＯ５含有ＲＲ１（実施例２で説明した非融合β−ガラクトシダーゼ親プラスミド）又は融合構築物ｐＶＴ１４２（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２もしくはＣＩＶＰＳ２）、ｐＶＴＥ８３６（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１エンド−）もしくはｐＤＶＳ７１２（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１もしくはＣＩＶＰＳ３）の培養物から下記のステップに従って粗抽出物を調製した。単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートし、１リットルのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン）中３０℃でＯＤ600nmが約０．５になるまで継代培養し、０．３ｍＭのＩＰＴＧで３０℃で２時間誘導した。細胞を遠心分離し、１００ｍｌのＬＢに再懸濁し、４℃で３分間超音波処理し、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、−２０℃で貯蔵した。
粗抽出物の７．５ｍｌアリコートを４２℃又は５０℃の水浴中でインキュベートした。１ｍｌアリコートを、ｐＶＴ１４２及びｐＶＴＥ８３６抽出物の場合は１時間後、２時間後及び１２時間後に採取し、ｐＤＶＳ７１２、ｐＡＨＯ５又はＲＲ１抽出物の場合は０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後及び１６時間後に採取した。
Ｍｉｌｌｅｒらの方法［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２），Ｃｏｌｄ  Ｓｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。アッセイ緩衝液は、Ｚ緩衝液を２．７μｌ／ｍｌの２−メルカプトエタノールと混合することによって調製した。基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を４ｍｇ／ｍｌでアッセイ緩衝液に溶解した。処理した抽出物又は非処理抽出物０．１ｍｌを、０．９ｍｌのアッセイ緩衝液と１滴の０．１％ＳＤＳとが入っている試験管に移し、２８℃で５分間インキュベートした。ブランクには０．１ｍｌのＬＢ培地を使用した。４ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧを０．２ｍｌ加えてアッセイ反応を開始させた。適当な黄色が発色した時点で、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3を加えて反応を停止させた。インキュベーション時間を記録し、活性をスペクトロホトメーターでＯＤ420nm及びＯＤ550nmで測定した。熱処理した抽出物からの酵素活性は次のように計算した。インキュベーション後の活性をゼロ時点の活性で除算し、比に１００を掛けてパーセンテージを出した。酵素活性の比較の結果、熱処理は最初の２時間のインキュベーションではＲＲ１又はＲＲ１／ｐＡＨＯ５抽出物からの活性に影響しないことが判明し、３つのＩＶＰＳ−ＬａｃＺ融合構築物ｐＶＴ１４２、ｐＶＴＥ８３６及びｐＤＶＳ７１２は全て４２℃への温度シフトに応答して非処理試料の１４３％から２２１％への酵素活性の増加を示した（図３Ａ及び図３Ｂ）。β−ガラクトシダーゼ活性の増加は、ＩＶＰＳの切り出しと２つのβ−ガラクトシダーゼ半体の連結とに起因するものであり、活性な酵素をより多く形成した。スプライシングはウェスタンブロット分析によって確認した。ＲＲ１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、染色体遺伝子の発現に由来する。一晩のインキュベーションは、すべての試料からの酵素活性を低下させた。これはおそらく、β−ガラクトシダーゼの熱失活に起因する（図３Ａ及び図３Ｂ）。
スプライシングは温度誘導によって制御できる：クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットによるタンパク質の分析
ＲＲ１細胞におけるＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合タンパク質合成の分析は、β−ガラクトシダーゼの染色体発現によって複雑になる。そこで、分析を容易にするために、すべての構築物を、β−ガラクトシダーゼを合成しない大腸菌宿主に移した。
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合クローンからの粗細胞抽出物の調製、及び熱処理した試料のウェスタンブロット分析は下記のように実施した。
融合構築物とｌａｃＺ発現ベクターｐＡＨＯ５とを、既述の標準的形質転換手法によってｌａｃＺ欠失大腸菌株ＥＲ２２６７（ＮＥＢ）に導入した。
プラスミド含有細胞の場合はアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ加えたＬＢ培地中で３０℃で、ＥＲ２２６７（５０ｍｌ）、ＥＲ２２６７／ｐＡＨＯ５（５０ｍｌ）、ｐＶＴ１４２又はｐＤＶＳ７１２プラスミドの培養物（各々１リットル中）を増殖させた。ＯＤ600nmが０．４８〜０．５５に到達した時点で、誘導物質ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで培養物に加え、該培養物を２３℃で更に３時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＬＢ培地５０ｍｌ（ＥＲ２２６７又はｐＡＨＯ５担持ＥＲ２２６７の場合）又は１００ｍｌ（ｐＶＴ１４２又はｐＤＶＳ７１２担持ＥＲ２２６７）に再懸濁し、４℃で３分間超音波処理し、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を−２０℃で貯蔵した。各抽出物の５ｍｌアリコート３つを２３℃、４２℃又は５０℃で１６時間インキュベートしサンプリングした。０．９ｍｌのアリコートを１、２、３、４、６時間インキュベートした後１．５ｍｌミクロ遠心管に移した。非処理抽出物又は処理した抽出物５μｌを１０μｌの水及び５μｌの５×試料緩衝液（０．３１Ｍ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８／１０％ＳＤＳ／２５％２−メルカプトエタノール／５０％グリセロール／０．００５％ブロモフェノールブルー）と混合し、１０分間沸騰させた。
各試料５μｌを４／２０％ＳＤＳポリアクリルアミド上に配置し、１００ボルトで３〜４時間電気泳動させた。β−ガラクトシダーゼに対する抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）とエンドヌクレアーゼＩ−Ｔｌｉ−ＩもしくはＩ−ＰｓｐＩに対する抗体（ＮＥＢ）とを用いて、Ｐｒｏｍｅｇａの手順でウェスタンブロットを行った。その結果、構築物ｐＶＴ１４２及びｐＤＶＳ７１２の両方から２３℃でＩＰＴＧ誘導した後の細胞中には、辛うじて痕跡量のエンドヌクレアーゼしか存在しないことが判明した。これは、切り出し活性があったとしても不十分なものであることを意味する。しかしながら、ＥＲ２２６７／ｐＶＴ１４２抽出物をより高い温度４２℃又は５０℃にシフトした後では、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ前駆体からの切り出しエンドヌクレアーゼと同じ大量のＩＶＰＳ２生成物（Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ、約４２ＫＤａ）が蓄積された（図４）。４２℃又は５０℃で処理したｐＤＶＳ７１２／ＥＲ２２６７抽出物についても類似のパターンが観察され（図４）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１生成物Ｉ−ＰｓｐＩについて予想された約６０ＫＤａの生成物が蓄積された。
β−ガラクトシダーゼに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析では、ＩＶＰＳドメインの切り出しが、中断されたβ−ガラクトシダーゼのＮドメインとＣドメインとの連結又は再結合に結びついていることが判明した。どちらの融合構築物の熱処理試料も、完全長のβ−ガラクトシダーゼと同じ大きさの１１４ＫＤａの生成物を含んでいた（図４）。しかしながら、この生成物はｐＶＴ１４２試料中には少量しか蓄積されなかった。これは、該融合タンパク質からのスプライシングが前述の条件下では効果がないことを意味する。
融合タンパク質を、８０℃までの高温でスプライスする能力についてさらに調べた。種々の温度での初期反応速度を比較した。抽出物を１．５ｍｌミクロ遠心管内の３００μｌアリコート中で４２℃、５０℃、６５℃又は８０℃でインキュベートした。１５分、３０分、１時間、２時間及び４時間後に各加熱抽出物試料から２０μｌを採取し、４０μｌの水及び２０μｌの５×試料緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。ウェスタンブロット分析の結果、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は６５℃及び８０℃でスプライスできることが判明したが、１１４ＫＤ生成物の蓄積によって測定したところではスプライシング効率は６５℃での方が大きかった。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の切り出しは６５℃では有効であったが、８０℃では抑止されると思われる。蓄積が見られなかった理由は、８０℃では経時的にβ−ガラクトシダーゼが熱変性し沈殿することにあり得る。
実施例４
β−アガラーゼＩをコードするプラスミドのようなＰＣＲ産生線状プラスミドへのＩＶＰＳのフレーム内挿入
実施例２では、実施例１で形成したＩＶＰＳカセットを制限酵素直線化プラスミドに挿入する方法を説明した。この方法は、ターゲット遺伝子内の適当な制限酵素部位の使用可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。環状プラスミド上の互いに反対向きのプライマーを使用するＰＣＲ増幅は、任意の位置で任意のプラスミドを直線化させ、ＰＣＲ反応の能力によってのみ制限される。ターゲットプラスミドが直線状になれば、該プロセスは本質的に、制限酵素によって形成された線状プラスミドについて実施例２で述べたものと同じである。
実施例２で述べたように、ターゲット遺伝子へのＩＶＰＳカセットの挿入は、ＩＶＰＳフラグメントと線状プラスミドとの連結によって達成できる。この実施例では、ＰＣＲプラマーを用いて、セリン又はトレオニンコドンの直前で直線化したプラスミドを形成する。このようにすると、ＩＶＰＳを切り出し２つのターゲットタンパク質半体を連結した時に、ターゲットタンパク質中に余計なアミノ酸が残らない。挿入部位のセリン又はトレオニンは、ＩＶＰＳフラグメント上又はターゲット遺伝子上に配置し得る。セリン又はトレオニンがＩＶＰＳカセット上に存在する場合は、下流ＥＰＳの最初の残基をコードする３つのヌクレオチドを欠失させて、ターゲット遺伝子ＰＣＲプライマーを構築し得る。ＩＶＰＳカセットがセリン又はトレオニンコドンを欠く場合は、互いに反対向きの接し合うＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲを用いて、セリン又はトレオニンコドンの部位で直線化されたターゲットプラスミドを合成する。
この実施例では、実施例２に記載の手順で、２つのＩＶＰＳエレメント、即ちＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１をβ−アガラーゼＩコード遺伝子内にクローニングする方法を説明する（Ｙａｐｈｅ，Ｗ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９８７−９９３（１９５７））。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１は２９０アミノ酸β−アガラーゼＩ遺伝子の１０８番目のコドンであるセリンの前に挿入し、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２はβ−アガラーゼＩ遺伝子の１３３番目のコドンであるトレオニンの前に挿入する。
３’末端にセリンコドン（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合）又はトレオニンコドン（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合）を含むＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントを実施例１と同様に調製した。ｌａｃプロモーターの配向でベクターｐＵＣ１８内にβ−アガラーゼＩ遺伝子配列を含む３．８Ｋｂの組換えプラスミドであるｐＡＧ６ａ１（ＮＥＢ）をＰＣＲ鋳型として用いて、線状プラスミドＤＮＡフラグメントを合成した。プライマーａｇａＳ１０８．ｒｖ（５’−ＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：８））及びａｇａＳ１０８．ｆｗ（５’−ＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号：９））はそれぞれ１０８番目のコドンのＤＮＡ配列５’及び３’に対して相補的である。プライマーａｇａＴ１３３．ｒｖ（５’−ＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：１０））及びａｇａＴ１３３．ｆｗ（５’−ＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴ−３’（配列番号：１１））はそれぞれ１３３番目のコドンの配列５’及び３’に対して相補的である。各プライマー対を用いて、セリン又はトレオニンコドンを欠失した線状プラスミドＤＮＡフラグメントを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭ硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、０．５μＭの各プライマーと、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたもので構成した。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを用いて、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒及び７２℃で５分のサイクルに３０回かけて実施した。ＰＣＲ試料はフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３Ｍ  酢酸Ｎａ及び５０％イソプロパノール中で沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離して回収し、乾燥し、１００μｌの蒸留水に再懸濁した。次いでＤＮＡ試料を１％低融点アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ＰＣＲ合成フラグメントを実施例１と同様に回収した。
ＰＣＲ合成フラグメントとリン酸化ＩＶＰＳフラグメント（実施例１）との連結を、２０μｌ容量中で、９．５μｌの蒸留水と、２μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、４μｌの０．０１μｇ／μｌ  ＰＣＲ合成プラスミドＤＮＡと、４μｌのＩＶＰＳ  ＤＮＡ（０．２０μｇのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２もしくは０．３２μｇのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１）と、０．５μｌの４００，０００Ｍ／ｍｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて、１６℃で１２時間実施した。連結試料での大腸菌株ＲＲ１の形質転換を実施例２と同様に実施した。アルカリ溶解法（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出するために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で形質転換体を培養した。０．８％アガロースゲル上での電気泳動と、その後の臭化エチジウムでの染色とによって、プラスミドＤＮＡをｐＡＧ６ａ１と比較した。組換えプラスミドｐＡＧ１０８Ｓ１８はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物を含み、ｐＡＧ１３３Ｔ２２、２６、３１及び３５はいずれもＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２挿入物を含んでいる。
ＩＶＰＳ−β−アガラーゼＩ融合遺伝子の発現
クローンを、融合タンパク質を発現する能力について更に調べた。ｐＡＧ１０８Ｓ１８又はｐＡＧ１３３ｔ３５を有するＲＲ１細胞を、デキストロースを含まず１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１リットルの改良ＬＢ培地で、ＯＤ600nmが約０．５になるまで３０℃で培養した。誘導物質ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を冷却し、２５℃で更に４時間増殖させた。細胞を遠心分離し、５０ｍｌのＬＢ培地に再懸濁した。粗抽出物を実施例３と同様に調製した。これらのクローンから発現された融合（改質）タンパク質を検出するために、Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ（ＮＥＢ）、Ｉ−ＰｓｐＩ（ＮＥＢ）及びβ−アガラーゼＩ（ＮＥＢ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。試料を、４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で、予備染色したマーカー（ＢＲＬ）を用いて電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスファターゼ結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。抗Ｉ−ＰｓｐＩ血清及び抗β−アガラーゼＩ血清はどちらも、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（約６０ＫＤａ）−β−アガラーゼＩ（約３０ＫＤａ）融合タンパク質（図５）について予想された大きさの、ｐＡＧ１０８Ｓ１８／ＲＲ１から発現された９０〜９５ＫＤａ産物と反応した。抗Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ血清及び抗β−アガラーゼＩ血清はどちらも、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（４２ＫＤａ）−β−アガラーゼＩ融合タンパク質（図５）について予想された大きさにほぼ等しい、ｐＡＧ１０８Ｓ１８／ＲＲ１からの７０〜７５ＫＤａ産物と反応した（図５）。
実施例５
サイレント置換を介する新しい制限酵素部位の形成によるターゲト遺伝子内へのＩＶＰＳの挿入
以上の実施例では、最初の下流ＥＰＳコドンを有する又は有していない、完全なＩＶＰＳ配列を含むＩＶＰＳカセットを、平滑な直線化プラスミドに挿入した。ＩＶＰＳ又はターゲット遺伝子の末端の近傍でサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（アミノ酸残基を保持する）によって制限部位を形成することもできる。
ＩＶＰＳの末端の近傍での制限部位の形成
ターゲット遺伝子内の任意の位置へのＩＶＰＳの挿入を容易にするために、サイレント突然変異（アミノ酸残基を保持する）によってＩＶＰＳの両端に制限部位を形成することができる。新しい制限部位の形成後に、これらの酵素でＩＶＰＳを切断する。ターゲット遺伝子プラスミドはＰＣＲで形成する。制限部位はＩＶＰＳ内にあるため、ＩＶＰＳを完全にし且つターゲット遺伝子内に適合性クローニング部位を形成するためには、欠失しているＩＶＰＳ配列をそれぞれのターゲット遺伝子ＰＣＲプライマーの５’末端に含ませなければならない（図６）。
例えば、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２におけるサイレント突然変異は、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２正方向ＢｓｐＥＩ（５’−ＡＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴ−３’（配列番号：１２））を用いて５’末端にＢｓｐＥＩ部位を形成することができ、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２逆方向ＳｐｅＩ（５’−ＡＴＴＧＴＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡ−３’（配列番号：１３））を用いて３’末端にＳｐｅＩを形成することができる。次に、これは例えば、ｌａｃＺコード領域内のアスパラギン酸コドン（残基５９４）とトレオニンコドン（残基５９５）との間に挿入し得る。線状ターゲット遺伝子プラスミドは、実施例４で説明したように、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ部位、ＩＶＰＳの残部、並びにｌａｃＺと一致する領域を含むプライマーで、プライマーｌａｃＺ１／ＢｓｐＥＩ逆方向（５’−ＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＡＡ−３’（配列番号：１４））及びプライマーｌａｃＺ２／ＳｐｅＩ正方向（５’−ＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＣＡＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１５））を用いて、ＰＣＲにより形成できる。ＤＮＡフラグメントはＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子の両方からＰＣＲによって合成する。ＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子プライマーは両方とも新しい制限部位を含んでいる。適当な制限エンドヌクレアーゼで切断した後で、融合遺伝子を形成すべく、適合性末端を有するＤＮＡフラグメントを連結することができる。ＩＶＰＳの切り出し後に余分の残基が残ることはないため、スプライシングが起これば生来のβ−ガラクトシダーゼポリペプチドが形成されると予想される。
挿入部位の近傍の制限部位でのＩＶＰＳの挿入
別の一般的な方法では（図７）、ターゲット遺伝子内の挿入部位（例えばトレオニン又はセリンコドン）の近傍の制限部位を使用して、ターゲット遺伝子に適合した末端を有するＩＶＰＳを挿入することができる。挿入部位又はその近傍のサイレントヌクレオチド置換によって制限部位を形成するか、又は生来の制限部位を使用し得る。線状ターゲット遺伝子プラスミドは、挿入部位の近傍の制限部位で開始しながら実施例４と同様にＰＣＲで形成する。ＩＶＰＳは、適合性制限部位とターゲット遺伝子配列の残り（制限部位と挿入部位との間の配列）を含むプライマーを用いて合成する。両端が挿入部位で該配列と重なり合うＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントを合成し、適当な酵素で切断し、次いで同じ酵素で切断したベクターに連結し得る。
例えば、サイレント突然変異によりＳａｌＩ部位（残基４７８〜４７９）及びＸｂａＩ部位（残基４８１〜４８２セリン−アルギニン）を形成することによって、ｌａｃＺ遺伝子内の残基４７９（アスパラギン酸）と４８１（セリン）との間にＩＶＰＳエレメントを挿入することができる。これは、プライマーｌａｃＺ３  Ｓａｌ逆方向（５’−ＡＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：７））及びｌａｃＺ４  Ｘｂａ正方向（５’−ＣＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：１６））を用いて、実施例２に記載のターゲットプラスミドｐＡＨＯ５のＰＣＲにより達成し得る。次に、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２正方向ＳａｌＩ（５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：１７））及びＶｅｎｔ  ＩＶＳ２逆方向ＸｂａＩ（５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号：１８））を用いて、ＰＣＲによりＩＶＰＳ２フラグメントを形成する。ＤＮＡフラグメントはＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子の両方からＰＣＲによって合成する。ＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子プライマーは両方とも新しい制限部位を含む。都合の悪いことに、このベクターは単一ＸｂａＩ及びＳａｌＩ部位も含む（図７）。従って、ターゲット遺伝子ベクターＰＣＲ生成物は、部分的消化を生起する条件下で切断しなければならない。次いで、必要な線状プラスミドをアガロースゲルから単離する。適当な制限エンドヌクレアーゼで切断した後、融合遺伝子を形成するために、適合性末端を有するＤＮＡフラグメントを連結することができる。ＩＶＰＳの切り出し後に余分な残基が残ることはないため、スプライシングが起これば、生来のβ−ガラクトシダーゼポリペプチドが形成されると予想される。通常は、前述のようなクローニングプロセスを容易にするために、ターゲット遺伝子及びベクター内に唯一の制限部位を選択又は形成することが重要である。
実施例６
Ａ．  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼでのＩＶＰＳ２のスプライシングに関する実験を容易にするために、Ｔ７プロモーター構築物ｐＶ１７４−１Ｂ１を改質したものを形成した。この改質構築物ｐＡＮＧ５（図８）は、ｐＶ１７４−１Ｂ１と同じＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ前駆体をコードする。本明細書で検討しているような突然変異体の形成を簡単にするために、多数のサイレント突然変異を、特に上流及び下流スプライス部位に導入した。変化は下記の通りである。
１．ベクタ−主鎖内のＸｍａＩ及びＰｐｕＭＩ部位の破壊。ＸｍａＩ部位はまずＴ７発現ベクタ−ｐＡＩＩ１７をＸｍａＩで切断し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで修復し、次いで平滑末端を再連結することによって除去した。プラスミドをＸｍａＩによる開裂に対する耐性についてスクリーニングした。得られたベクタ−からＰｐｕＭＩ部位を同様に除去し、今度はＰｐｕＭＩ開裂に対する耐性についてスクリーニングした。最終ベクタ−をｐＡＭＬ１と命名した。このベクタ−は、ポリメラーゼ遺伝子内の単一のＸｍａＩ及びＰｐｕＭＩ部位の使用を可能にした。
２．制限部位を形成するためのサイレント塩基変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｂａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ）の導入。この変化は、Ｋｕｎｋｅｌの方法に従い（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，Ｊ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＲ．Ａ．Ｚａｋｏｕｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７−３８２（１９８７））、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて導入した。ｆ１ヘルパーファージＩＲ１での重感染により２つのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）誘導体内に一本鎖鋳型を形成した（Ｅｎｅａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２２：２２−２２６（１９８２））。第１のフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結したｐＶ１７４−１Ｂ１からのＢｓａＡＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ配列のヌクレオチド３７１４〜５８３７を表す）を含んでいた。第２のフラグメントは、ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結したＣｌａＩ〜ＳｓｐＩフラグメント（ヌクレオチド８１６〜４４０８）を含んでいた。
ＢｓａＡＩ／ＢａｍＨＩ構築物に、下記の３つのオリゴヌクレオチドで同時に突然変異を与えた：
５’−ＧＣＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：１９）（ＡｇｅＩ  ｎｔ４６６９〜４６７４）、
５’−ＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：２０）（アンバー１７０３オーカー）、
５’−ＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号：２１）（Ｄ１２３６Ａ）。
改質塩基には下線を引き、変化は括弧内に示した。Ｄ１２３６Ａを形成するためのオリゴヌクレオチドは、スクリーニングに使用するためのＢｓａＩ部位を形成するためのサイレント塩基変化も含んでいた。得られた単離体をｐＡＭＮ２と命名した。
ＣｌａＩ／ＳｓｐＩ構築物に、下記の４つのオリゴヌクレオチドで同時に突然変異を与えた：
５’−ＧＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧＧ−３’（配列番号：２２）（ＳａｌＩ  ｎｔ３８６３〜３４６８）、
５’−ＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣ−３’（配列番号：２３）（ＢｓａＢＩ  ｎｔ３５５４〜３５６３）、
５’−ＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：２４）（ＢｓｔＢＩ  ｎｔ３６０８〜３６１３）、
５’−ＣＣＧＣＡＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：２５）（ＰｐｕＭＩ  ｎｔ３５１７〜３５２３）。
マークは前述の通りである。スクリーニングも前述のように行い、得られた構築物をｐＡＭＯ２２と命名した。
ＢｓａＡＩ／ＢａｍＨＩ構築物にも下記のオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号：２６）（ＢｓａＢＩブロッキングｎｔ５６４１）
で突然変異を与え、ｄａｍメチル化部位の付加に起因するＢｓａＢＩ開裂に対する耐性についてスクリーニングした。得られた構築物をｐＡＭＷ３と命名した。
最後に、ｐＶ１７４−１Ｂ１の開始コドンにおけるＮｄｅＩ部位を、部分的ＮｄｅＩ開裂と、クレノウでの末端修復と、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる再環化とによって失活させた。プラスミドを適当なＮｄｅＩ部位の消失についてスクリーニングした。この種の構築物の１つをｐＡＫＣ４と命名した。
ｐＡＮＧ５構築物は前記部分から組み立てた。
１．ｐＡＫＣ４からのＸｂａＩ／ＣｌａＩ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼの翻訳開始及びアミノ末端）
２．ｐＡＭＯ２２からのＣｌａＩ／ＮｄｅＩ（よりアミノ末端ポリメラーゼ＋ＩＶＰＳ２のアミノ末端領域）
３．ｐＡＭＮ２からのＮｄｅＩ／ＮｓｉＩ（ＩＶＰＳ２のカルボキシル末端領域、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端領域）
４．ｐＡＭＷ３からのＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩ（ポリメラーゼの最後の５つのアミノ酸＋下流領域）
５．ｐＡＭＬ１からのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ（Ｔ７プロモーター、複製起点、アンピシリン耐性）
ｐＡＮＧ５と親ｐＶ１７４−１Ｂ１とを比較すると、後述のようにｐＡＮＧ５含有株の生存率の方が高いという点を除いて、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＩ−ＴｌｉＩ産生のパターンは同じである。これは、ＲＮＡ又はＤＮＡレベルでのスプライシングと対照的に、タンパク質レベルでスプライシングが生じた場合に予想されることである。
Ｂ．  大腸菌におけるＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現の研究過程で、ＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２の欠失後に発現及び細胞生存率が大幅に増加することが判明した。この増加は、それぞれＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２の遺伝子産物であるＩ−ＴｌｉＩＩ及びＩ−ＴｌｉＩの毒性作用を表すか、又はスプライシング反応自体の毒性作用を表す。エンドヌクレアーゼ及びスプライシング活性は非依存的であり得、スプライシングに影響を与えずにエンドヌクレアーゼを失活させると推論された。ｐＡＮＧ５の構築で述べたＡへの単一アミノ酸置換を、Ｉ−ＴｌｉＩのアミノ近位ドデカペプチドモチーフ内の保存残基内で行った（変更残基Ｄ１２３６）。これらの構築物はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを発現したが、Ｉ−ＴｌｉＩ活性は検出されなかった。ｐＶ１７４−１Ｂ１と異なり、ＢＬ２１（ＤＥ３）のようなＴ７発現株は３７℃でもｐＡＮＧ５に良く耐えた。ウェスタンブロットによるタンパク質スプライシングの分析及びパルス−チェイス分析では、ｐＡＮＧ５とｐＶ１７４−１Ｂ１との間にタンパク質スプライシングの差は認められなかった。即ち、完全長の前駆体の産生、並びにその後の成熟ポリメラーゼと大きさがＩ−ＴｌｉＩに対応するタンパク質の形成に差は見られなかった。
Ｃ．  カセット置換突然変異誘発を用いてチロシン１０７９をアルギニンで置換することにより、共通のカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ部位（ＸＲＸＸＳ*；Ｐｅｒｓｏｎら、前出の文献）を構築した。要約すれば、ｐＡＮＧ５を唯一の制限部位ＢｓａＢＩ及びＰｐｕＭＩで切断し、下記の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）（配列番号：２７）を挿入して、所望の変化を導入した。
５’−ＧＴＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡ−３’
３’−ＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴ−５’
正しい構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
Ｄ．  ブロックされたアミノ酸を付加するためのアンバー終止コドンの導入を、ｐＡＮＧ５におけるカセット置換突然変異誘発によって実施した。例えば、ＰｐｕＭＩ及びＢｓａＢＩで切断したｐＡＮＧ５に挿入した次の二本鎖（配列番号：２８）を用いて、セリン１０８２をアンバーコドンによって置換した。
５’−ＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡ−３’
３’−ＧＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴ−５’
同様にして、ＡｇｅＩ及びＳｍａＩで切断したｐＡＮＧ５中に下記の二本鎖（配列番号：２９）を配置することにより、チロシン１４７２をアンバー終止コドンで置換した。
５’−ＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＡＣＣＣ−３’
３’−ＡＡＧＡＡＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡＴＧＧＧ−５’
最後に、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がアンバーコドン（ＴＡＧ）内で終わるため、ｐＡＭＮ２（既述）からの適当な制限フラグメントをｐＡＮＧ５内の対応する部位に挿入して、前記終結コドンをオーカーコドン（ＴＡＡ）に変える。
実施例７
ＣＩＶＰＳ２のスプライス部位へのＯ−（ｏ−ニトロベンジル）セリンの導入によるタンパク質スプライシングの制御
光活性化可能な（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）タンパク質スプライシングを明らかにするために、ｐＶ１７４．１Ｂ１を用いて２つのベクターを構築した。第１の構築物ｐＡＮＹ５（「野生型」とも称する）は下記のようにアミノ酸レベルで記述できる：ｐＶ１７４．１Ｂ１  Δ１−１０６３、Δ１５４４−１７０２、Ｖ１５４２Ｍ、Ｖ１５４１Ｍ、１５４３オパール（ＴＧＡ）。この構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で翻訳された時に、４５．３ｋＤａのエンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＴｌｉＩ）をスプライスして１０．５ｋＤａの連結反応生成物を形成する５５．８ｋＤａの前駆体タンパク質を産生するように設計されている。第２の構築物ｐＡＯＤ１（「アンバー変異体」とも称する）は、下記のようにアミノ酸レベルで記述できる：ｐＶ１７４．１Ｂ１  Δ１−１０６３、Δ１５４４−１７０２、Ｖ１５４２Ｍ、Ｖ１５４１Ｍ、１５４３オパール（ＴＧＡ）、Ｓ１０８２アンバー（ＴＡＧ）。この構築物は、標準的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳条件で２．２ｋＤａのアンバーフラグメントを生成するように設計されているが、ｏ−ニトロベンジルセリンで化学的にアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応を補充すると、光活性化可能セリンを取り込むだろう。位置１０８２のセリンが「ブロック」されていると、前駆体はスプライスすることができない。強い３５０ｎｍ光で照射すると、ｏ−ニトロベンジル基が放出され（Ｐｉｌｌａｉ、前出の文献）、セリンの求核性ヒドロキシル側鎖が遊離し、タンパク質がスプライスできるようになる。
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（３’末端ＣＡ残基を欠く）は、文献（Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献、Ｎｏｒｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：８３（１９９０））に記載のように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでＦｏｋＩ直線化ｐＹＰｈｅ２プラスミド鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）転写を行うことによりミリグラムスケールで合成した。αアミンをＢＰＯＣ、ＣＢＺ又はＢＯＣのような官能基で保護したセリン誘導体は市販されている（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｎ−ブロックされたセリンは、ｏ−ニトロベンジルブロミドのような試薬を用いて標準的アルキルハロゲン化物置換反応を行うことにより、Ｎ−ブロックされたＯ−（ｏ−ニトロベンジル）セリンに変換できる。次いで、完全にブロックされたセリンを、文献（Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献）に記載のように５’−ホスホデオキシリボシチジリル−（３’−５’）−リボアデノシン（ｐｄＣｐＡ）に結合した。次いで、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いてアミノアシル化ダイマーを切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）サプレッサーｔＲＮＡに連結して、完全長のアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡを得た。
３μｇの塩化セシウム精製プラスミドＤＮＡと、３μｌの１００ｍＭ酢酸マグネシウムと、１μｌの１００ｍＭ酢酸カルシウムと、７．５μｌの低分子量混合物（Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献）（カルシウム又はメチオニン無含有）と、１μｌの［35Ｓ］−メチオニン（１０μＣｉ／μｌ、１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、１μｌの３ｍｇ／ｍｌリファムピシンと、総量を３０μｌにするのに必要な量の水とを氷上で混合することにより、「野生型」構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を実施した。前記反応物質を３７℃で３分間インキュベートし、その間に、大腸菌Ｄ１０から調製したＳ−３０抽出物（Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献）のアリコートを解凍した。８．５μｌのＳ−３０抽出物を加えた後、１．５μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（３００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を加え、これらの反応物質を３７℃で６０分間インキュベートした。試料を１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上で電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーよってタンパク質を可視化した（図９）。
「アンバー変異体」のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を、「野生型」で説明したように、但し反応物質に３．５μｌの化学的にアミノアシル化したｏ−ニトロベンジルセリン−ｔＲＮＡamberを約３μｇ／μｌの濃度で補充して実施した。サプレッサーｔＲＮＡをＳ−３０抽出物の添加の直前に反応に加えた。
図９は、「野生型」（ｐＡＮＹ５）又は「アンバー変異体」（ｐＡＯＤ１）構築体でプライムしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応の１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。レーン１は、５５．８ｋＤａ前駆体と、「野生型」構築体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現された、切り出された４５．３ｋＤａのＩ−ＴｌｉＩエンドヌクレアーゼとを示している。レーン２は、添加ｔＲＮＡに起因する翻訳の阻害が存在しないことを示すために、１３．５μｇの完全長の無変化アンバーサプレッサーｔＲＮＡを加えた「野生型」反応を示している。レーン３及び４は、完全長の非アシル化サプレッサーｔＲＮＡ（１０．５μｇ）を加えた又は加えていない「アンバー変異体」のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の結果を示している。これらの反応はいずれも、予想通りに、完全長の前駆体分子又はスプライス生成物を産生しない。これは、サプレッサーｔＲＮＡが細胞抽出物中でいずれの内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによってもアミノアシル化されないことを意味する。分子量約５２ｋＤａのバンドは明らかに、アンバー変異体のすぐ下流の二次的翻訳開始部位によるものである。レーン５は、「アンバー変異体」に化学的にアミノアシル化したｏ−ニトロベンジルセリン−ｔＲＮＡamberを加えた場合の結果を示している。前駆体タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されるが、スプライス生成物（即ちＩ−ＴｌｉＩ）は見えない。
前駆体タンパク質の位置１０８２に部位特異的に挿入したセリンからｏ−ニトロベンジル基を光化学的に除去して、調節スプライシングを行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応の６μｌアリコートを０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１０μｇ／μｌ）で処理して翻訳を停止させ、ＧＥモデル＃ＲＳＫ６Ｂタニングランプ（ｔａｎｎｉｎｇ  ｌａｍｐ）からの強力（２７５Ｗ）可視光により１０ｃｍの距離で１０分間照射し、４μｌの水で希釈し、その後３７℃で６０分間インキュベートしてスプライシングを生起させた。得られたスプライス生成物を１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動によって可視化し、次いでオートラジオグラフィーを行った（図１０）。
図１０は、化学的にブロックした前駆体（レーン５、図９）を３５０ｎｍの光に露光した結果を示している。レーン１〜４は、「野生型」反応（レーン１、図９）を下記のように処理した対照である。レーン１は３７℃で６０分インキュベートしたもの、レーン２は０．５μｌのＲＮａｓｅ（１０μｇ／μｌ）を加えて３７℃で６０分間インキュベートしたもの、レーン３は３５０ｎｍの光で１０分間照射し３７℃で６０分間インキュベートしたもの、レーン４はＲＮａｓｅで前述のように処理し、３５０ｎｍの光で１０分間処理し、３７℃で６０分間インキュベートしたものである。レーン５〜８は、「ブロックした」前駆体（レーン５、図９）をレーン１〜４と同様に処理した結果をそれぞれ示している。「ブロックした」前駆体を照射すると、ＩＶＰＳ２でコードされるＩ−ＴｌｉＩ（４５．３ｋＤａ）エンドヌクレアーゼが切り出される（レーン７、８をレーン５、６と比較されたい）。
実施例８
ターゲット遺伝子への改質ＩＶＰＳのフレーム内挿入及びペプチド結合開裂の熱制御
この実施例では、ＩＶＰＳ（ＣＩＶＰＳ）カセットの改質方法及びターゲット遺伝子への挿入方法を説明する。具体例として、最初の天然下流残基（セリン）の置換又は欠失によるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）の改質と、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位への改質カセットのフレーム内挿入とを取り上げる。
ＩＶＰＳカセットの改質
一般的に、ＩＶＰＳカセットは残基の置換及び欠失、又はＩＶＰＳの一端もしくは両端への残基の付加によって改質できる。このような改質ＩＶＰＳカセットを用いた改質又は融合タンパク質は、特定のペプチド結合部位におけるスプライシング（ペプチド連結）又は開裂といった種々の触媒活性を示し得る。
既述のように、カルボキシルスプライス部位の最初の下流残基は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合のセリン、又はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合のトレオニンである。ＣＩＶＰＳ１、ＣＩＶＰＳ２及びＣＩＶＰＳ３のアミノスプライス部位における最初のＩＶＰＳ残基はセリンである。システイン残基は、酵母ＴＦＰ１及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＲｅｃＡのスプライス部位に発見された（Ｈｉｒａｔａら、前出の文献；Ｋａｎｅら、前出の文献；Ｄａｖｉｓら、前出の文献）。スプライス部位のセリン、トレオニン又はシステイン残基は、タンパク質のスプライシング及び開裂に不可欠と考えられている。既述の実施例は、最初の下流残基を有するＩＶＰＳがタンパク質のスプライシングに関する情報を含むのに十分であることを明らかにした。しかしながら、これらの残基は種々のＩＶＰＳコンテクストで異なる機能を果たし得る。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）内で、天然残基、例えばセリンをトレオニン又はシステインで置換すると、スプライシングが低下し、開裂活性が変化した（Ｈｏｄｇｅｓら、前出の文献参照）。
ターゲット遺伝子コドンの間の平滑部位にフレーム内挿入するための改質ＩＶＰＳカセットの合成
ｌａｃＺコード領域又は他の任意のターゲット遺伝子にフレーム内挿入するためのＩＶＰＳカセットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製できる。下記のプロトコルは、それぞれＣＩＶＰＳ３、ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ、ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓと称する、カルボキシル末端コドン、セリン、トレオニン又はシステインを有する又は有していない４つのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１カセットの製造を説明するものである。
プライマー５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号：５）（ＤＶ  ＩＶＰＳ正方向、１８３９〜１８６２）と、下記の４つの逆方向プライマーのうちの１つとを用いて、ｐＮＥＢ＃７２０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７２３）からカセットを合成した。鋳型として使用したｐＮＥＢ＃７２０は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入したＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む４．８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントを有する。逆方向プライマー５’−ＧＣＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：４０）及び５’−ＧＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：４１）（３４２８〜３４５２）を用いて、それぞれＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓフラグメント（１６１４ｂｐ）を形成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭの硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと、０．９μＭの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたものを含む。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを用いて９４℃で３０秒、４８℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに２０回かけて実施した。プライマー５’−ＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＧ−３’（配列番号：４２）（３４２５〜３４４９）を使用して、前述のＰＣＲで、但し増幅を３０サイクル実施して、ＣＩＶＰＳ３フラグメント（１６１１ｂｐ）を合成した。プライマー５’−ＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６）（３４２８〜３４５２）を用いて実施例１と同様にＩＶＰＳ１／Ｓｅｒフラグメント（１６１４ｂｐ）を合成した。
ＰＣＲ試料をフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３μＭ  ＮａＡｃ及び５０％イソプロパノール中−２０℃で６時間沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離し、乾燥し、各々を２０μｌの蒸留水に再懸濁し、１％低融点アガロースゲル上に配置して８０ボルトで６時間電気泳動にかけた。０．４ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、６５℃で３０分間インキュベートし、フェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３μＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）及び５０％イソプロパノール中−２０℃で一晩沈殿させることにより、低融点アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを回収した。ＤＮＡを遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１０μｌの蒸留水に再懸濁した。
ＩＶＰＳ１  ＤＮＡフラグメントのリン酸化を、４μｌの１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、３１μｌの精製ＤＮＡと、４μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを用いて４０μｌ中３７℃で６０分間実施した。試料を６５℃の水浴中で１０分間加熱した。８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えた後、試料をフェノール及びクロロホルムで逐次抽出した。ＤＮＡを２．４μＭ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で−７０℃で一晩沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離してペレット化し、冷７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、２０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒフラグメントのリン酸化を前述のように実施した。
ベクターＡＨＯ５中の大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位へのＣＩＶＰＳ３カセットのフレーム内挿入
ＰＣＲ合成ＣＩＶＰＳカセットは、ターゲット遺伝子を有する直線化ベクターとの連結によってターゲットコード領域に挿入できる。線状プラスミドベクターは、前述のような制限酵素またはＰＣＲ合成によって調製し得る。ｐＡＨＯ５は、ｔａｃプロモーターの下流のｐＡＧＲ３（ＮＥＢ）のポリリンカー内でＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ部位の間に挿入されたｐＲＳ４１５（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ，５３：８５−９６（１９８７））からの３．１ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＤｒａＩフラグメント上に完全なｌａｃＺ遺伝子配列を有する。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃＩq遺伝子の産物によって抑制され得且つイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導され得る転写制御エレメントである。ｐＡＨＯ５は２つのＥｃｏＲＶ認識配列を含む。ＥｃｏＲＶは開裂部位に平滑末端を残す。ＥｃｏＲＶ開裂部位の１つはｌａｃＺコード領域内で３７５番目のコドン（アスパラギン酸）と３７６番目のコドン（イソロイシン）との間を切断する。
１５μｇのｐＡＨＯ５  ＤＮＡを、１００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中で４０単位のＥｃｏＲＶ（ＮＥＢ）と共に３７℃で６０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡを部分的に消化した。ＥｃｏＲＶを失活させるべく試料を６５℃で１０分間加熱した後、２０μｌの染料添加アガロースゲルを試料に加えた。１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によってＤＮＡフラグメントを分離した。実施例８の方法で低融点アガロースゲルから直線化ｐＡＨＯ５プラスミドＤＮＡを回収し、蒸留水に再懸濁した。
ＣＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の構築
ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ−ｌａｃＺ融合の構築は実施例２で説明した。ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合は、リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡをリン酸化ＩＶＰＳ１フラグメントに連結することによって行った。該反応は、２０μｌ容量中で、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、０．１μｇのｐＡＨＯ５  ＤＮＡと、０．５μｇのＩＶＰＳ１  ＤＮＡと、１６０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて１６℃で５時間実施した。１００μｌのコンピテントＲＲ１細胞と１０μｌの連結試料とを氷上で３０分間混合し、４２℃で２分間加熱し、氷上で５分冷却し、０．８ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットル  トリプトン、５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルＮａＣｌ、１ｇ／リットル  デキストロース、１ｇ／リットルＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で４５分間インキュベートして、大腸菌株ＲＲ１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢプレートに試料をプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、プレート当たり約１５０〜３００のコロニーが観察された。
ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ−ｌａｃＺ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ−ｌａｃＺ融合を、０．１μｇのＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡと０．７ｇのＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ又はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓフラグメントとの連結によって行った。大腸菌株ＥＲ２２５２（ＮＥＢ）の形質転換を前述のプロトコルで実施した。
コロニーハイブリダイゼーションを用いて、組換えプラスミドを有するクローンをスクリーニングした。前述のＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３正方向プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで放射性標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。コロニーを採取してニトロセルロースに移し、下記の各溶液中で５分間処理した：１０％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（２回）及び２×ＳＳＣ（２回）。ニトロセルロースフィルターを室温で１時間乾燥し、真空下８０℃で２時間焼成し、６×ＳＳＣに５分間浸漬し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳの溶液中で４２℃で２時間洗浄した。６×ＮＥＴ、５×デンハート及び０．５％ＳＤＳ中で４２℃で４時間処理した後、フィルターを放射性標識オリゴマープローブと共に同一条件下で一晩インキュベートし、次いで２×ＳＳＣ中で、４２℃で１５分間の洗浄４回と、５０℃で２分間の洗浄２回とにかけ、その後オートラジオグラフィーを行った。
オリゴマープローブにハイブリダイズしたポジティブクローンを、誘導物質ＩＰＴＧで融合タンパク質を発現する能力について更に調べた。クローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５に達するまで３０℃で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に４時間増殖させた。０．１ｍｌの細胞を０．１ｍｌの尿素溶解緩衝液と共に１０分間沸騰させることにより粗溶解物を調製した。前述のポジティブクローンからの融合タンパク質のアイデンティティを、β−ガラクトシターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３のタンパク質生成物、ＮＥＢ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で試料を電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合クローンは、両抗体と反応する１７３〜１７８ＫＤａの産物を発現した。この大きさは、ＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ融合タンパク質（図１１）について予想された大きさである。クローンｐＤＶ７及びｐＤＶ１５はＣＩＶＰＳ３挿入物を含む。ｐＤＶ３０２、３０６及び３０７はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを有し、ｐＤＶＴ３１９、３２１及び３２３はＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを含む。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ挿入物を含むｐＤＶＳ７１２及び７４２は既に実施例２で説明した。
改質ＣＩＶＰＳ３カセットを用いるＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ融合物中での特定ペプチド結合開裂の熱制御
カルボキシル末端でセリンを置換するためのトレオニン又はシステインを有するカセットを含むＤＶＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）−β−ガラクトシターゼ融合物は、融合タンパク質中の特定ペプチド結合点で熱制御可能な開裂を示す。前述の構築物（ｌａｃＺ  ＥｃｏＲＶ部位に挿入したＣＩＶＰＳ３カセット）は、ＩＰＴＧでの誘導後に融合タンパク質を産生する。２５℃で増殖した細胞から調製した細胞抽出物をより高い温度（４２℃又は６５℃）で処理し、β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３の産物）に対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析した（図１１及び図１２）。ＩＶＰＳ１／Ｓｅｒ融合タンパク質は、高温でインキュベートすると、タンパク質スプライシングを起こして連結タンパク質と遊離ＩＶＰＳエンドヌクレアーゼとを生成し得る。連結反応活性は観察されなかったが、４２℃ではＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ又はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを有する融合タンパク質が主にアミノスプライス部位で開裂し、６５℃では両方の融合タンパク質がカルボキシルスプライス部位でより大きい開裂活性を示した。
ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合クローンからの細胞抽出物の調製を下記の方法で実施した。種々の大腸菌宿主内で最初に構築した融合構築物の全てを、実施例８で述べた標準的形質転換手順で、β−ガラクトシターゼを合成しないｌａｃＺ欠失大腸菌株ＥＲ１９９１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）中に導入した。ｐＤＶ７、ｐＤＶＣ３０２、ｐＤＶＴ３３２又はｐＤＶＳ７１２クローンからの単コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１．５ｍｌのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが約０．５になるまで３０℃でインキュベートし、１．５ｍｌの０．６ｍＭ  ＩＰＴＧ、１００μｇアンピシリン／ｍｌ  ＬＢを加えることにより０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで２５℃で５時間誘導した。３ｍｌの細胞を遠心分離し、０．５ｍｌのＬＢに再懸濁し、４℃で１分間超音波処理し、４℃で５分間６，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を回収し、−２０℃で貯蔵した。
細胞抽出物を室温で急速解凍した後、４２℃又は６５℃で熱処理した。４８μｌの抽出物を１２μｌの５×試料緩衝液（０．３１  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８／１０％ＳＤＳ／２５％２−メルカプトエタノール／５０％グリセロール／０．００５％ブロモフェノールブルー）と混合し、１０分間沸騰させて、非処理対照試料を調製した。４８μｌアリコートを１．５ｍｌミクロ遠心管に移し、４２℃の水浴中で３０、６０、１２０もしくは２４０分間、又は６５℃の水浴中で１５、３０、６０もしくは１２０分間インキュベートした。各々を１２μｌの５×試料緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。
処理した試料を、Ｉ−ＰｓｐＩ（ＮＥＢ）（図１１及び図１２）又はβ−ガラクトシターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（図１２）に対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析し、各試料５μｌを４／２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上に配置して１００ボルトで４時間電気泳動にかけた。ウェスタンブロットはＰｒｏｍｅｇａの手順に従って実施した。
結果は、融合タンパク質前駆体が主要物質（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅ）であり、４つの融合構築物全部から２５℃でＩＰＴＧ誘導した後の細胞中には極めて微量のＩ−ＰｓｐＩエンドヌクレアーゼしか存在していないことを示した。これは、低温ではスプライシング及び切り出し活性が不十分であることを意味する。しかしながら、ｐＤＶＳ７１２（ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ−β−ガラクトシターゼ融合）抽出物をより高い温度４２℃又は６５℃にシフトすると、ＣＩＶＰＳ３生成物Ｉ−ＰｓｐＩ（約６０ＫＤａ）が多量に蓄積された（図１１及び図１２）。ＩＶＰＳドメインの切り出しは、中断されたβ−ガラクトシターゼのＮドメイン及びＣドメインの連結に結びついており、完全長のβ−ガラクトシターゼと同じ大きさである１１６ＫＤａの生成物を産生した（図１２）。約１３０ＫＤａ（アミノスプライス部位での開裂に対応する）の別の主産物（ＩＶＰＳ１−Ｃ−ＥＰＳ）も観察された。
他の３つの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）の融合タンパク質（ＣＩＶＰＳ３、ＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ及びＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを有する）は低温での安定性がより大きかった。非処理抽出物からは、スプライス部位での開裂に対応するＩ−ＰｓｐＩ又は他の産物が極めて少量しか検出されなかった（図１１）。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ融合と対照的に、これら３つの融合構築物の熱処理した試料では連結タンパク質は観察されなかった（図１２）。ｐＤＶ７（ＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ融合物）試料は、６５℃では、Ｉ−ＰｓｐＩと単一スプライス部位での開裂に対応する生成物とを微量しか産生しなかった。これは、いずれのスプライス部位でも切り出しが十分でないことを意味する（図１１、レーン１〜３）。ＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを含むｐＤＶＣ３０２は、４２℃で中庸量のＩ−ＰｓｐＩ及びＣＩＶＰＳ３−Ｃ−ＥＰＳ種の蓄積を示した（図１１、レーン５）。Ｉ−ＰｓｐＩ、Ｃ−ＥＰＳ及びカルボキシルスプライス部位での開裂に対応する約１１０ＫＤａの生成物（Ｎ−ＥＰＳ−ＣＩＶＰＳ３）の収率は６５℃で増加したが、ＣＩＶＰＳ−Ｃ−ＥＰＳ種は減少した（図１１、レーン４〜６；図１２）。この結果は、融合タンパク質及び／又はＣＩＶＰＳ−Ｃ−ＥＰＳ生成物からのカルボキシルスプライス部位でのペプチド結合開裂が促進されたことを意味する。ｐＤＶＴ３２１（ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを有する）は、４２℃で処理すると、主要生成物ＣＩＶＰＳ３−Ｃ−ＥＰＳ以外のＩ−ＰｓｐＩ又はＣ−ＥＰＳを極めて少量しか示さなかった（図１１、レーン８；図１２）。このデータは、４２℃では、アミノスプライス部位でペプチド結合の効果的な開裂が得られるが、カルボキシルスプライス部位では該開裂が得られないことを意味する。６５℃で見られた少量のＩ−ＰｓｐＩの蓄積は、カルボキシルスプライス部位での開裂が促進されたことを意味する（図１１、レーン９）。
要約すれば、前記データは、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）のカルボキシルスプライス部位で単一の天然残基セリンを置換すると、融合タンパク質のプロセシングが変化し、温度によってより良く制御できるようになることを立証している。ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ−β−ガラクトシターゼ融合タンパク質は（そして程度はより低いがＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ融合タンパク質も）高温の時にだけ、アミノスプライス部位で特定ペプチド結合を開裂した。
実施例９
ＭＩＰの構築及び精製
アフィニティクロマトグラフィーによるＣＩＶＰＳ融合体の精製、ＭＢＰ融合タンパク質へのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１のクローニング
本発明の実施態様の１つでは、ＣＩＶＰＳと、容易に精製できるセグメント、例えば結合タンパク質と、対象となっているタンパク質又はペプチド、即ちターゲットタンパク質とを含む三部分融合体（ｔｈｒｅｅ−ｐａｒｔ  ｆｕｓｉｏｎ）を形成することができる。これらの部分の順序は変えることができる。この種の融合体の利点は精製が容易なことにある。前駆体タンパク質を精製すれば、対象となっているペプチドを、改質ＣＩＶＰＳで誘導した単方向タンパク質開裂によって融合体から分離することができる。上述の実施例では、ＣＩＶＰＳ部位の１つを改変してその部位のスプライシング又は開裂を低下又は防止すると、別の部位の開裂がスプライシングより促進されることを明らかにした（詳細な説明、並びに実施例８参照）。これは、融合体から対象ペプチドの分離を可能にするものである。
この実施例は、結合タンパク質であるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、ＣＩＶＰＳ３と、パラミオシンペプチドとを含む前述のような三部分融合体が、非スプライス前駆体としてアミロース樹脂で簡単に精製できることを明かにする。この実施例では、連結なしで開裂生成物のみを生成するためにスプライシングを妨害すべく開裂をＣＩＶＰＳの片側に制限する試みは行わなかった。
Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物（ＣＩＶＰＳ３）の合成
上述の実施例と同様に、但し下記の点を変えて、ＰＣＲによりＣＩＶＰＳ３カセットを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００Ｍの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００リットル中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｅｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて、９４℃で３０秒、５０℃で３秒及び７２℃で２分のサイクルに２０回かけて実施した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１はｐＮＥＢ＃７２０から合成した。
正方向プライマーは、２つのフランキングＫｐｎＩ部位を含む、ＤＶ  ＩＶＰＳ１の５′末端と同じ３′末端の２６／２７塩基からなるプライマー９６−６、５′−ＧＧＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡ−３′（配列番号：４３）であった。３′ＫｐｎＩ部位は、アミノ酸残基を変えずに制限部位を形成するサイレント置換を含む。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１逆方向プライマーであるプライマー９６−７、５′−ＣＣＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣ−３′（配列番号：４４）は、３′末端にＢａｍＨＩ部位を有する。３′末端の２３／２４塩基はＤＶ  ＩＶＰＳ１の３′末端と相同であり、ＢａｍＨＩ部位を形成するための単一塩基置換を有する。プライマー９６−６及び９６−７を使用してＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１カセット（１．６ｋｂ）を合成した。
ＰＣＲ試料を１：１でクロロホルムと混合し、上方水性層を１％低融点アガロースゲル上に負荷して電気泳動にかけた。ゲルから１．６ｋｂバンドを切り取り、６５℃でインキュベートした。ゲルの融解後、０．２５ｍｌのＴＥ緩衝液（（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を６５℃で加え、試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出した。ＤＮＡを０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び２倍容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、乾燥し、６０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ｐＰＲ１００２、即ちｐＭＡＬ−ｃ２−パラミオシンΔＳａｌプラスミドの調製
ｐＭＡＬ−ｃ２−パラミオシンΔＳａｌ融合プラスミドであるｐＰＲ１００２は、パラミオシンΔＳａｌ欠失と称する、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓパラミオシン遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントに結合した、ｔａｃプロモーター制御下のｍａｌＥ遺伝子を含む７．２ｋｂのベクターである（Ｓｔｅｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５：３９１７−３９２３（１９９０））。４μｇずつの２つのｐＰＲ１００２試料を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液＃２中で６単位のＸｍｎＩ（ＮＥＢ）により３７℃で２時間直線化した。該反応物質を１％低融点アガロースゲルにかけた。７．２ｋｂバンドを切り取り、前述のようにゲルから精製し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ｐＭＩＰ１７の構築
ｐＰＲ１００２とＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１との連結を、１４．５μｌの蒸留水と、２．５μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、１μｇ／μｇの開裂ｐＰＲ１００２  ＤＮＡと、前述のように調製した５μｌの０．２μｇ／μｌ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１と、８００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えた２５μｌ容量中で１６℃で１６時間実施した。
１００μｌのコンピテントＥＲ２２５２細胞と５μｌの連結試料とを、０．１Ｍ  ＣａＣｌ2と１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸Ｎａ）との１：２混合物１００μｌ中で混合し、４２℃で３分間加熱し、氷中で５分間冷却し、０．１ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母抽出物、１０ｇ／リットルのＮａＣｌ、１ｇ／リットルのデキストロース、１ｇ／リットルのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で３０分間インキュベートすることにより、大腸菌株ＥＲ２２５２を氷上で５分間形質転換した。形質転換細胞３００μｌをペレット化し、１００μｌの上清に再懸濁し、ＬＢａｍｐプレートにプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、約１６０のコロニーが観察された。
ＰＣＲ増幅を用いて、組換えプラスミドを有するコロニーのスクリーニングを行った。個々のコロニーを採取してウェル数９６のマイクロタイター皿内の１００μｌの蒸留水に入れ、５分間沸騰させて細胞を溶解した。ＰＣＲ混合物は、５０μｌの反応混合物中Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラセーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー（同上）と、２．５μｌの細胞溶解物と、２単位のＶｅｎｔ  Ｅｘｏ-  ＤＮＡポリメラセーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに３０回かけることにより実施した。１０μｌの各反応混合物を１％アガロースゲル上で電気泳動させた。ポジティブクローンはＩＶＰＳ１（１．６ｋｂ）に対応するバンドを有していた。１つのポジティブプラスミドをｐＭＩＰ１７と命名した。
ＭＩＰの発現：ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−パラミオシンΔＳａｌ融合
ｐＭＩＰ１７を含むポジティブクローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃で培養した。非誘導細胞から溶解物を調製するために、１．０ｍｌの培養液をペレット化し、５０μｌのタンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）に再懸濁した。誘導培養物からの試料は下記のように調製した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に２０時間増殖させた。誘導後５時間目及び２０時間目の０．５ｍｌ培養物からの細胞をペレット化し、１００μｌの５×タンパク質試料緩衝液に再懸濁した。予備誘導した５時間目の試料を−２０℃で１６時間凍結し、２０時間目の試料を−７０℃で１５分凍結した。前駆体の収率を増加させるために、培養物を１２℃〜２０℃で誘導し、前駆体の量をクーマシーブルー染色ゲルで決定した。全ての試料を５分間沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と、クーマシーブルー染色か、又はＩ−ＰｓｐＩに対する抗体（ＮＥＢ）を用いるウェスタンブロットとを順次行ってタンパク質生成物を分析した。試料は４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｐｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス抗−Ｉ−ＰｓｐＩ）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。クーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットの両方で、予想した主要バンドが約１３２ｋＤａに観察された（データ示さず）。
アミロース及びＭｏｎｏＱカラムでのＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１パラミオシンΔＳａｌ融合体の大規模精製
単コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４×１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃でインキュベートした。これらの培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４×１リットルのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃でインキュベートした。次いで培養物を１２℃にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞をペレット化し、カラム緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離し、透明な培養溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけた。融合タンパク質を（製造業者の指示に従って）マルトースで溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調べた（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。アミロース樹脂溶離物を、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱアニオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーにより更に精製した。カラムを０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中０．２〜１．０ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶離した。タンパク質は０．４〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。
６つのタンパク質バンドを、ＭＢＰ、Ｉ−ＰｓｐＩ及びパラミオシンに対する抗体を用いてウェスタンブロットで同定した。見掛け分子量１８０ｋＤａ及び１３２ｋＤａの２つのバンドは前記３種類の抗体の全てと反応した。完全長の前駆体は１３２ｋＤａの筈である。分子量がより大きいバンドはスプライシング中間体と考えられ、類似の高分子量物質が全てのＣＩＶＰＳ構築物について見られた。切り出されたＩ−ＰｓｐＩは６０ｋＤａのところに泳動し、Ｉ−ＰｓｐＩ抗体に認識されただけであった。また、スプライスされた生成物（ＭＢＰ−パラミオシンΔＳａｌ、７２ｋＤａ）は、ＭＢＰ及びパラミオシン抗体と反応する血清に認識されただけであった。約１０３ｋＤａのバンドはＭＢＰ及びＩ−ＰｓｐＩ抗体とだけ反応した。このバンドは、ＩＶＰＳのＣ末端での単一開裂の産物を表す。約８９ｋＤａのバンドはＩ−ＰｓｐＩ及びパラミオシン抗血清とだけ反応した。該バンドはＩＶＰＳのＮ末端での単一開裂の産物を表す（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−パラミオシンΔＳａｌ融合体の切り出し及び連結
前駆体（１３２ｋＤａ）を含む幾つかのＭＩＰ関連ポリペプチドと、移動速度の遅い物質（見掛け分子量１８０ｋＤａ）と、単一スプライス部位での開裂生成物（１３０ｋＤａ及び８９ｋＤａ）と、少量のスプライスされた生成物及び切り出された生成物（７２ｋＤａ及び６０ｋＤａ）とを含むアミロース樹脂及びＭｏｎｏＱ調製物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で３７℃で２時間熱処理した。１３２ｋＤａの前駆体及び１８０ｋＤａの移動速度の遅い物質は経時的に減少し、７２ｋＤａのスプライスされた生成物及び６０ｋＤａの切り出されたＩ−ＰｓｐＩは増加した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
これらの結果は、三部分ＣＩＶＰＳ融合体を精製できるだけでなく、単一開裂生成物を得ることもできることを意味する。ＣＩＶＰＳ部位を更に操作すると、連結を伴わないいずれかのスプライス部位の開裂が促進され得る。
実施例１０
ＭＩＰ融合体におけるＣＩＶＰＳの改変
置換可能なスプライス部位カセットを有するＭＩＰの構築
この実施例では、両方のスプライス部位に置換可能カセットを有し、ＣＩＶＰＳがカセット置換によって改変された、ＭＩＰ融合体（実施例９参照）を構築した。また、２つの事例で、改質ＣＩＶＰＳが主に単一スプライス部位で熱誘導的に開裂できるという事実も明らかにする。
実施例９では、３つの部分、即ちＣＩＶＰＳ、精製の容易な結合ドメイン（ＭＢＰ）、及び対象となっている遺伝子（パラミオシンΔＳａｌ）を用いて形成できる三部分融合体ＭＩＰを説明した。精製融合タンパク質のスプライシングでは２種類の主要産物、連結タンパク質ドメイン、ＭＢＰ−パラミオシンΔＳａｌ及び切り出されたＣＩＶＰＳ（又はＩ−ＰｓｐＩ）が得られた。ＣＩＶＰＳにおける改変のなかには、連結反応の抑制と１つのスプライス部位での開裂の増加とを誘起し得るものがあり、その結果、改質ＣＩＶＰＳにより触媒された特定ペプチド結合部位での開裂によって、融合タンパク質から対象ペプチドが分離されるのであろうと推論された。実施例８では、１つのスプライス部位の開裂がＣＩＶＰＳ３の改変（Ｔｈｒ又はＣｙｓによるＣ末端Ｓｅｒの置換）によって促進され得、これらの変化がもう１つの部位のスプライシング又は開裂を低下又は防止することを明らかにした。制御可能なスプライシング又は開裂活性の好ましい特性での改変に関してスクリーニングを行うためには、スプライス部位に種々の変異を導入し分析しなければならない。これは、各改変を有する完全ＣＩＶＰＳカセットの合成によって達成し得る。しかしながらこの操作は、ＰＣＲ時に余分の変異を導入する可能性がある。
本発明者は、スプライス部位の周りで短い長さのＤＮＡだけを置換することによって前記操作を容易にする手法を開発した。該実施例では、実施例９で形成した元のＭＩＰ融合体を、各スプライス部位を挟む２つのユニーク制限部位を有するように改変する方法を説明する。制限消化後のカセット置換では、スプライス部位の１つにおける２つのユニーク制限部位の間の短い長さのＤＮＡを別の短いＤＮＡカセットで置換することができる。この実施例では、実施例９で説明したｐＭＩＰ１７融合体を、各接合部位に２つのユニーク制限部位を有するように、即ちアミノスプライス部位にフランキング配置するＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位と、カルボキシルスプライス部位にフランキング配置するＢａｍＨＩ部位及びＳｔｕＩ部位とを有するように改変した（図１４参照）。
スプライス部位カセットを有するＭＩＰ融合体は２つのステップで構築した。まず、ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩ部位を次のように導入した。４μｇのｐＭＩＰ１７（実施例９）を１×ＥｃｏＲＩ緩衝液（ＮＥＢ）中で５０μｌ中０．５単位のＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）により３７℃で１０分間消化した。１％アガロースゲルで電気泳動により分離した後、ＧｅｎｅｃｌｅａｎIIキット（ＢＩＯ  １０１）を用いて直線化ｐＭＩＰ１７プラスミドＤＮＡ（８．８Ｋｂ）を精製した。精製ｐＭＩＰ１７  ＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと、４０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）とを加えた１ｘＢａｍＨＩ緩衝液（ＮＥＢ）中３７℃で３時間消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを０．３Ｍ  酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中で−２０℃で２時間沈殿させた。ＤＮＡをミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収し、乾燥し、２０μｌの無菌水に再懸濁した。
ベクターとの連結の前に、２つの相補オリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣ−３′（配列番号：４６））及びＭＩＰ３０２Ｒ（５′−ＡＡＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧ−３′（配列番号：４７））をアニールさせて二本鎖リンカーＭＩＰ３０１Ｆ／ＭＩＰ３０２Ｒを形成した。５０ｐｍｏｌのオリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ及びＭＩＰ３０２Ｒを１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で６８℃で１５分間インキュベートし、２０℃〜３０℃にゆっくりと冷却した。１μｇのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＭＩＰ１７  ＤＮＡを、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）及び２５ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ３０１Ｆ／ＭＩＰ３０２Ｒを加えた３５μｌの１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で１６℃で１４時間にわたり連結反応させた。
得られた構築物をｐＭＩＰ１８と命名した。上流ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位を次の方法でｐＭＩＰ１８に導入した。２μｇのｐＭＩＰ１８を、１００μｌの１×緩衝液２（ＮＥＢ）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ及び２０単位のＫｐｎＩ（ＮＥＢ）中で３７℃で４時間消化した。電気泳動で分離した後、線状ｐＭＩＰ１８ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１）で精製した。ベクターと連結する前に、２つの相補オリゴマーＭＩＰ５２１Ｆ（５′−ＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣ−３′（配列番号：４８））及びＭＩＰ５２２Ｒ（５′−ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＴＡＣ−３′（配列番号：４９））をアニールさせて二本鎖リンカーＭＩＰ５２１Ｆ／ＭＩＰ５２２Ｒを形成した。５０ｐｍｏｌのオリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ及びＭＩＰ３０２Ｒを１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で７５℃で１５分間インキュベートし、２０℃〜３０℃にゆっくりと冷却した。０．２μｇの消化ｐＭＩＰ１８を、３５μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）及び２５ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ５２１Ｆ／ＭＩＰ５２２Ｒ中で室温で３時間連結反応させた。いずれの場合も、連結ＤＮＡ試料を用いて大腸菌株ＥＲ２２５２（ＮＥＢ）を形質転換した。最終構築物ｐＭＩＰ２１は、各スプライス部位に２つのユニーク制限部位を含む。Ｎ末端スプライス部位を包囲するＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位と、Ｃ末端スプライス部位を包囲するＢａｍＨＩ部位及びＳｔｕＩ部位とが存在する（図１４）。
改質ＭＩＰ２１融合タンパク質の発現とスプライシング活性とを調べるためにウェスタンブロット分析を行った。ｐＭＩＰ２１含有ＥＲ２２５２を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中３０℃でＯＤ600nmが０．５になるまで培養した。次いで培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで３０℃で３時間誘導した。４．５ｍｌの培養物をペレット化し、０．５ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、氷上で超音波処理した。透明上清を４／２０％のポリアクリルアミドゲル上で１００ボルトで４時間電気泳動させた。ウェスタンブロットを抗ＭＢＰ血清でプローブした。結果は、改質ＭＩＰ２１融合体からのスプライシング活性がＭＩＰ１７のそれと区別できないものであることを示している。
スプライス部位カセット置換によるＭＩＰ２１の改変
改変ＭＩＰ融合構築物ｐＭＩＰ２１では、アミノスプライス部位カセットがＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位の間に８つのアミノ酸残基を含んでおり、カルボキシルスプライス部位カセットがＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩ部位の間の６つのアミノ酸残基をコードする配列を含んでいる。スプライス部位は、Ｎ末端ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩカセット又はＣ末端ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを置換することによって変えることができる。Ｃ末端カセット置換の場合は、ｐＭＩＰ２１をまずＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩで消化する。元のＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを、所望の変異を含む相補プライマーで置換する。この実施例では、２つの異なる部位カセットでＭＩＰ２１  ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを置換した。
下記のカセット置換実施例では、Ａｌａ535をＬｙｓで置換するか、又はＨｉｓ536をＬｅｕで置換した。
残基Ａｌａ535をＬｙｓで置換するためには、相補オリゴマーＭＩＰ３０３Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧ−３′（配列番号：５０））及びＭＩＰ３０４Ｒ（５′−ＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＡＧＧ−３′（配列番号：５１））を使用した。Ｈｉｓ536をＬｅｕで置換するためには、相補オリゴマーＭＩＰ３１１Ｆ（５′−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３′（配列番号：５２））及びＭＩＰ３１２Ｒ（５′−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧ−３′（配列番号：５３））を使用した。これら２対の相補オリゴマーを前述のように処理して二本鎖リンカーを形成した。どちらのリンカーも、ｐＭＩＰ２１のＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ開裂後にカルボキシルスプライス部位を置換するための適合性末端を含む。２μｇのｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを加えた１×ＢａｍＨＩ緩衝液（ＮＥＢ）中４０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で３７℃で４時間消化し、クロロホルムで抽出し、０．３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中で−２０℃で２時間沈殿させた。ミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを回収し、乾燥し、８８μｌの無菌水に再懸濁した。次いで、ＢａｍＨＩ消化ｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを１００μｌの１×緩衝液２（ＮＥＢ）中４０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）で３７℃で３時間消化し、クロロホルムで抽出し、０．３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中−２０℃で一晩沈殿させた。ミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを回収し、乾燥し、３０μｌの無菌水に再懸濁した。０．１μｇのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ消化ＤＮＡを、４０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）の存在下で、１０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中６ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ３０３Ｆ／ＭＩＰ３０４Ｒ又はＭＩＰ３１１Ｆ／ＭＩＰ３１２Ｒと２３℃で６時間連結させた。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＲＲ１を形質転換した。ｐＭＩＰ２３はＡｌａ535からＬｙｓへの置換を含み、ｐＭＩＰ２８はＨｉｓ536からＬｅｕへの置換を含む。改質ＭＩＰ融合体ＭＩＰ２３及びＭＩＰ２８の発現を、前述のように抗ＭＢＰ抗体を用いるウェスタンブロット分析で調べた。その結果、どちらの融合構築物でもスプライシング活性がブロックされていることが判明した。しかしながら各改変は、一方のスプライス部位のみの開裂活性を増加させた。ＭＩＰ２３におけるＡｌａ535からＬｙｓへの置換はカルボキシルスプライス部位の開裂活性を急増させ、ＭＩＰ２８におけるＨｉｓ536からＬｅｕへの置換は強度のアミノスプライス部位開裂を示した。
改質ＭＩＰ融合タンパク質の精製及び熱誘導可能な開裂活性
融合タンパク質の発現を低温で誘発し、ＭＩＰ融合タンパク質をアミロース樹脂カラムで精製した。ｐＭＩＰ２３又はｐＭＩＰ２８を含有するＲＲ１を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１リットルのＬＢ培地中３０℃でＯＤ600nmが０．５になるまで培養した。培養物を氷上で約１５℃に冷却した後、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加え、培養物を１２℃〜１４℃で更に１２時間増殖させた。細胞をペレット化し、−７０℃で即座に冷凍し、−２０℃で貯蔵した。ペレットをカラム緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で別個に超音波処理し、遠心分離した。各ＭＩＰ融合体からの透明溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけ、洗浄し、マルトースで溶離した（実施例９と同様）。
ＭＩＰ２３の精製試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．０）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で４℃で透析した。次いで試料を４℃、３７℃、５０℃及び６５℃で１時間インキュベートし、４／２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、その後クーマシーブルーで染色した（図１５Ａ）。ゲルは、温度を上げると、ＭＩＰ２３が元の構築物のように連結生成物（ＭＩＰ）又は切り出し生成物（Ｉ）を形成せずに、Ｃ末端開裂生成物（ＭＩ、１０３ｋＤ及びＰ、２９ｋＤ）を蓄積することを示している。
精製ＭＩＰ２８試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．０）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で４℃で１．５時間透析した。次いで試料を４℃、４２℃、５０℃及び６５℃で１時間インキュベートし、１／５容の５×タンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）と混合した。タンパク質生成物を４／２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、次いでクーマシーブルーで染色した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。データは、これらの条件下ではスプライシング活性が完全にブロックされることを示した。アミノスプライス部位の開裂活性は温度の増加に対応して増加し、６５℃でより多くのＭＢＰ（Ｍ、４３ｋＤ）及びＣＩＶＰＳ３−パラミオシンΔＳａｌ（ＩＰ、８９ｋＤ）が得られた。
これらの結果は、スプライス部位カセット置換法を使用して融合構築物のスプライス部位を改変することができ、このような改変がスプライシング及び開裂活性に著しい効果を与え得ることを示している。このデータは更に、ＣＩＶＰＳの連結及び完全切り出しの不在下で１つのスプライス部位のみにおける開裂が観察される構築物の一例を示している。
実施例１１
ＭＩＣの構築及び精製
ＣＩＶＰＳ融合体における外来遺伝子の置換
精製を容易にするための結合ドメインと、スプライシングドメイン（ＣＩＶＰＳ３）と、ターゲットタンパク質（パラミオシン）とを含む三部分融合タンパク質（ＭＩＰ）を、実施例９と同様に構築した。この構築物を精製し、熱活性化によってスプライスできることを明らかにした。この系が種々のターゲットタンパク質を受容する能力を調べるために、ＭＩＰ構築物中のパラミオシンをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキチナーゼ遺伝子由来のキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）で置換した［Ｋｕｒａｎｄａ及びＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６（２９）：１９７５８−１９７６７（１９９１）］。この第２のタンパク質融合体がスプライスして連結生成物及び切り出し生成物の両方を形成する能力は、該融合方法を別の外来タンパク質に使用できることを立証するものである。更に、キチン結合ドメインはタンパク質精製用の別の結合タンパク質として使用できる。
キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）の合成
上述の実施例と同様の手順で、但し下記の点を変えて、ＰＣＲによりキチン結合ドメインを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中１単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で３０秒のサイクルに２０回かけて実施した。キチン結合ドメインは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキチナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＴ３０から合成した［Ｋｕｒａｎｄａ及びＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６（２９）：１９７５８−１９７６７（１９９１）］。
正方向プライマーであるプライマー９９−０２、５′−ＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＣＡＴ−３′（配列番号：５４）は５′末端にＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ（配列番号：５５））を有する。該プライマーの３′末端の２２塩基は、キチナーゼ遺伝子のキチン結合ドメインの５′末端と同じである。逆方向プライマーであるプライマー９９−０３、５′−ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧ−３′（配列番号：５６）は５′末端にＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ（配列番号：５７））を有する。該プライマーの３′末端の２６塩基は、キチナーゼ遺伝子のキチン結合ドメインの３′末端のアンチセンス鎖と同じである。プライマー９９−０２及び９９−０３を用いてキチン結合ドメインカセット（２７０ｂｐ）を合成した。
ＰＣＲ試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出し、ＤＮＡを０．５ＭのＮａＣｌ及び２容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、乾燥し、４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に最懸濁した。２０μｌの再懸濁ＤＮＡと、２１μｌの蒸留水と、５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液＃２と、４０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）と、２０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）とでの消化を５０μｌ容で３７℃で２時間実施した。該反応物質を１．８％の低融点アガロースゲル上に負荷して電気泳動にかけた。ゲルから０．２５ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＳｔｕＩ消化生成物を切除し、ゲルが融解するまで６５℃でインキュベートした。０．２５ｍｌのＴＥ緩衝液を６５℃で加え、試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出した。ＤＮＡを０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び２容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させ、遠心分離し、乾燥し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ｐＭＩＰ２１の調製
ＰｓｔＩ／ＳｔｕＩ二重消化により、実施例１０に記載のｐＭＩＰ２１の残りからパラミオシンコード領域を分離する。５μｇずつのｐＭＩＰ２１試料を６０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）及び３０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）と、５μｌのＮＥＢ緩衝液＃２と、３４μｌの蒸留水とで、５０μｌ容中３７℃で２時間消化した。該反応物質を１％低融点アガロースゲルにかけた。８．１ｋｂバンドを切除して前述のようにゲルから精製し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ融合体（ＭＩＣ）の構築
ＭＩＰ２１中のパラミオシンを下記のようにキチン結合ドメインで置換して、ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ構築体（ＭＩＣ）を形成した。１μｌの８．１ｋｂ  ｐＭＩＰ２１フラグメントと１０μｌのキチン結合ドメイン（どちらも前述のように調製）とを、９．５μｌの蒸留水、２．５μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）及び８００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と混合し、２５μｌ容中１６℃で４時間インキュベートした。
大腸菌株ＲＲ１  ｔｏｎＡ（ＮＥＢ）を、（１）１００μｌのコンピテントＲＲ１  ｔｏｎＡ細胞と、５μｌの連結試料と、０．１Ｍ  ＣａＣｌ2及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  酢酸Ｎａ）の１：２混合物１００μｌとを氷上で５分間混合し、（２）４２℃で３分間加熱し、（３）氷中で５分間冷却し、（４）ＬＢａｍｐプレートにプレーティングすることによって形質転換した。３０℃で一晩のインキュベーション後に、約２００のコロニーが観察された。
アルカリ溶解物ミニプレパレーション（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出の文献）を用いて、キチン結合ドメインを含む組換えプラスミドを有するクローンのスクリーニングを行った。ＰｓｔＩ及びＳｔｕＩで消化すると、ポジティブクローンはキチン結合ドメインに対応するバンドとベクターに対応するバンドとを有していた。１０μｌのミニプレパレーション  ＤＮＡと、２．５μｌのＮＥＢ緩衝液＃２と、８．５μｌの蒸留水と、４０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）と、２０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）とを２５μｌ容中で３７℃で２時間混合することにより制限酵素消化を実施した。
ＭＩＣ融合体の発現
ＭＩＣ構築を確認するために、小規模タンパク質調製物をクーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットで分析した。ポジティブクローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中３０℃でＯＤ600が約０．５になるまで培養した。非誘導細胞から溶解物を調製するために、１．５ｍｌの培養液をペレット化し、２５μｌの５×タンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）に再懸濁した。誘導細胞からのタンパク質試料は下記のように調製した。培養物を１２℃に冷却した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加え、培養物を１２℃で更に５時間増殖させた。２時間の誘導後に１．５ｍｌの試料を採取し、５時間の誘導後に３ｍｌの試料を採取した。試料をペレット化し、５０μｌの５×タンパク質試料緩衝液に再懸濁し、−２０℃で１６時間冷凍し、次いで解凍し、５分間沸騰させた。タンパク質生成物をクーマシーブルー染色ゲルと、抗ＭＢＰ抗体（ＮＥＢ）を用いるウェスタンブロットとによって分析した。予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて試料を４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗ＭＢＰ抗体でプローブし、アルカリホスフェート結合抗ウサギ第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。クーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットの両方で、ＭＩＣ融合タンパク質について予想された主バンドが約１１０ｋＤａに観察された。
アミロース及びＭｏｎｏＱカラムでのＭＩＣの大規模精製
単コロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた３×１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートした。該培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた３×１リットルのＬＢ培地に接種し、３０℃でＯＤ600が０．５になるまでインキュベートした。次いで培養物を１２℃にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞をペレット化し、カラム緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離し、透明培養溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけた。融合タンパク質を（製造業者の指示通りに）マルトースで溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。アミロース樹脂溶解物を、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱアニオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーで更に精製した。カラムを０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中０．２〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの直線ＮａＣｌ勾配で溶離した。タンパク質は０．４〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。ＭＩＣ及びＭＩＰタンパク質融合生成物はアミロース樹脂及びＭｏｎｏＱ樹脂の両方で同様に精製された。
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ融合体の切り出し及び連結
ＭＩＣのアミロース精製試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。次いで試料を４℃、３７℃、５０℃及び６５℃で１時間熱処理し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調べた（図１６）。ゲルは、４℃試料中に約１１０ｋＤａのＭＩＣ前駆体が多量に存在することを示しているが、該前駆体は熱誘導後に減少する。前駆体の減少に伴い、約５３ｋＤａの大きさの連結生成物ＭＢＰ−ＣＢＤ（ＭＣ）、及び約６０ｋＤａの大きさの切り出し生成物Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（Ｉ＝Ｉ−ＰｓｐＩ）の蓄積が温度上昇に伴って観察された。ゲルは更に、約１０３ｋＤａの開裂生成物ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＭＩ）及び約７０ｋＤａのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ（ＩＣ）と同じ大きさのバンドが存在していることを示している。
実施例１２
トランススプライシング
この実施例は、前駆体タンパク質の半体（ｈａｌｖｅｓ）の間でｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングがトランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）生起し得ることを明らかにする。ＭＩＰを分割する位置（実施例９及びＸｕら，Ｃｅｌｌ，７５：１３７１−１３７７（１９９３）。この文献の開示は参考として本明細書に包含される）は、天然型ＣＩＶＰＳ３中のメチオニン残基のすぐ上流に選択したが、ギャップ又はオーバーラップＣＩＶＰＳ配列に帰着する部位を含む別の部位も有効であり得る。この実施例では、ＭＩＰ半タンパク質の一つが不溶性であったため、トランススプライシングを尿素中で実施した。部分又は完全変性は一般に要件と解釈すべきではない。なぜなら、別の分離点が二つの半体の溶解性に帰着し得、且つ不溶性半体は非変性条件下でトランススプライシング実験のために可溶性にし得るからである。
ＭＩ’の構築
正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴ−３’（配列番号５８）（下線部はＮｄｅＩ部位）及び逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＣＣＣＧ−３’（配列番号５９）（下線部はＢａｍＨＩ部位）を用いて、ｍａｌＥ、ＣＩＶＰＳ３及びＤ．ｉｍｍｉｔｉｓパラミオシンΔＳａｌ遺伝子の間の融合体を有するｐＭＩＰ２１（実施例１０及びＸｕら，前出文献（１９９３））からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｍａｌＥ遺伝子（ＭＢＰをコードする）とＣＩＶＰＳ３遺伝子の最初の２４９個のアミノ酸との融合体を合成した。ＰＣＲ反応混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と、各４００ｍＭのｄＮＴＰと、０．８４ｍＭのプライマーと、５ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡと、２０Ｕ／ｍｌのＶｅｎｔ  Ｅｘｏ+ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）とを５０μｌ中に含んでいた。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを使用して、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で１３５秒間で１５サイクルにわたり増幅を実施した。制限酵素消化を製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の指示通りに実施した。ゲル精製したＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ生成物を、ゲル精製したＢａｍＨＩ／Ｎｄｅｌ消化ｐＡＩＩ−１７Ｔ７ベクター（Ｐｅｒｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５７７−５５８１（１９９２）、この文献の開示は参考として本明細書に包含される）に直接連結して、ｐＭＩ／Ｌ２４９を形成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ。この文献の開示は参考として本明細書に包含される）。大腸菌ＥＲ２１６９ｐＬｙｓＳ（ＢＬ２１（ＤＥ３）ＸＰ１ｖｉｒ（ＥＲ１４８９）−→ＴｅｔR）ＭｃｒＢ−））をｐＭＩ／Ｌ２４９で形質転換してＮＥＢ９４１を形成した。ＮＥＢ９４１によって産生されたタンパク質を、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）−ＣＩＶＰＳ３  Ｎ末端ドメイン（ＩＶＰＳ）融合にちなんでＭＩ’と名付けた。
Ｉ’Ｐの構築
制限酵素消化を製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の指示通りに実施した。ポリリンカー部位と６ヒスチジンタグ配列とを有するゲル精製ＸｂａＩ／Ｂｐｕ  １１０２Ｉ消化ｐＥＴ−２１ｂフラグメント（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、ゲル精製Ｂｐｕ  １１０２Ｉ／ＸｂａＩ消化ｐＡＩＩ−１７  Ｔ７ベクターＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出文献（１９８９））に直接連結して、Ｉ’Ｐの発現に使用するｐＰＨＴ（Ｐｏｌｉｌｙｎｋｅｒ−ＨｉｓＴａｇ）−Ｔ７ベクターを形成した。
正方向プライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧ−３’（配列番号６０）（下線部はＮｄｅＩ部位）及び逆方向プライマー５’−ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ−３’（配列番号６１（下線部はＮｏｔＩ部位）を用いて、ＣＩＶＰＳ３遺伝子の最後の２８８個のアミノ酸とＤ．ｉｍｍｉｔｉｓパラミオシンΔＳａｌ遺伝子との融合体をｐＭＩＰ２１からＰＣＲにより合成した（Ｘｕら，前出文献（１９９３））。ＰＣＲ混合物は、１００μｌ中とした以外は上述と同じであった。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを使用して、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒及び７２℃で１０５秒で１０サイクル実施した。ゲル精製ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ産物をゲル精製ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ消化ｐＰＨＴ−Ｔ７ベクターに直接連結して、ｐＩ／Ｍ２５０−ＰＨを形成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出文献（１９８９））。大腸菌ＥＲ２１６９  ｐＬｙｓＳをｐＩ／Ｍ２５０−ＰＨで形質転換してＮＥＢ９４２株を形成した。ＮＥＢ９４２によって産生されたタンパク質は、ＣＩＶＰＳ３  Ｃ末端ドメイン（ＩＶＰＳ）−Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ  Ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ  ΔＳａｌ−ＨｉｓＴａｇ融合にちなんでＩ’Ｐと名付けた。Ｃ末端ドメインはＣＩＶＰＳ中に存在するメチオニンから始まるため、追加のアミノ酸を含まない。
ＭＩ’の発現及び精製
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で、ＮＥＢ９４１をＯＤ６００が約０．５になるまで３０℃で増殖させた。培養物を３０℃で０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、即座に２２℃空気振盪機に移し、冷たい室内に一晩おいた。細胞を４℃で回収し、−２０℃で貯蔵した。１ｌ培養から得た凍結細胞を５０ｍｌのアミロースカラム緩衝液（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５，０．２Ｍ  ＮａＣｌ，１．０ｍＭ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ）に再懸濁し、音波処理で破砕した。９，０００ｇで３０分間遠心分離した後、粗上清をアミロースカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，樹脂５ｍｌ）に通し、カラムを５０ｍｌの前記緩衝液で洗浄した。マルトースを最終濃度１０ｍＭでカラム緩衝液に加え、ＭＢＰ融合体が溶離されるまで溶離を続けた。
Ｉ’Ｐの発現及び精製
精製を容易にするためにＨｉｓＴａｇをＩ’Ｐ構築物に含ませた。大腸菌内でＩ’Ｐタンパク質を発現させると、約９０％が不溶性であった。これは、多くのＨｉｓＴａｇ（６−１０ヒスチジン）融合タンパク質に見られることである。そこで、Ｉ’Ｐ試料を精製のために６Ｍ尿素中で可溶化し、Ｎｉ2+アフィニティ樹脂でクロマトグラフィーにかけた。
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で、ＮＥＢ９４２をＯＤ600が約０．５になるまで３０℃で増殖させた。培養物を３０℃で０．４ｍＭ  ＩＰＴＧでで一晩誘導した。細胞を４℃で回収し、−２０℃で貯蔵した。１ｌ培養物から得た凍結細胞を１３０ｍｌのアミロースカラム緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１．０ｍＭ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ）中で解凍し、音波処理で破砕した。２０，０００ｇで３０分間遠心分離した後、Ｉ’Ｐタンパク質を含む不溶性物質を含んでいるペレットを１３０ｍｌのカラム緩衝液に再懸濁し、前述のように遠心分離した。洗浄ペレットを再度１３０ｍｌのカラム緩衝液に再懸濁し、前述のように遠心分離した。このようにして２回洗浄したペレットを最終的に、６Ｍ尿素を補足した１３０ｍｌのＮｉ2+結合緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。可溶化ペレットを４℃で一晩撹拌し、次いで３１，０００ｇで１時間の最終的遠心分離にかけた。上清を０．４５ｍＭメンブラン（Ｍｉｌｌｅｘ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で濾過し、Ｎｉ2+添加カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，樹脂２．５ｍｌ）に通し、カラムを１０倍容の結合緩衝液で洗浄した。結合緩衝液にイミダゾールを最終濃度６０ｍＭで加え、混入タンパク質の溶離をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で検出できなくなるまで続けた。Ｉ’Ｐ融合タンパク質を結合緩衝液中１８０ｍＭのイミダゾールで溶離し、前述のアッセイで融合体の完全な溶離が明らかになるまで溶離を続けた。
トランススプライシングの実験
ＭＩＰの二つの相補的半体を上述のように構築した。総てのＭＢＰとＣＩＶＰＳ３のＮ末端ドメイン（アミノ酸１−２４９）とを含むＭＩＰ  Ｎ末端半体構築物をＭＩ’と名付け、ＣＩＶＰＳ３のＣ末端ドメイン（アミノ酸２５０−５３７）と総てのパラミオシンΔＳａｌとを含むＭＩＰ  Ｃ末端半体構築物をＩ’Ｐと名付けた。不都合なことに、Ｉ’Ｐは不溶性であり、６Ｍ尿素中で可溶化し精製する必要があった。酵素活性の回復を伴う酵素の変性及び再生は文献に記述されている（特にＢｕｒｂａｕｍ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１９−３２４（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２２４１４−２２４１９（１９９３）；Ｓａｎｃｈｏ及びＦｅｒｓｈｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：７４１−７４７（１９９２）。これらの文献の開示は参考として本明細書に包含される）。しかしながら、プロトコルはそれぞれ異なる。この研究のために最初に選択されたプロトコルは、二つのＭＩＰ半体を尿素中で混合し、４℃でインキュベートし、タンパク質を迅速に希釈し、次いで希釈タンパク質を再生させるものであった。次に選択されたのは、希釈タンパク質を濃縮した後でスプライシングを行う標準的ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングプロトコル（Ｘｕら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：５５１７−５５２２（１９９４）；Ｘｕら，前出文献（１９９３）。これらの文献の開示は参考として本明細書に包含される）であるが、前記濃縮ステップは不要である。初期濃度、尿素濃度（もしくは他の変性剤）、希釈度、インキュベーションの長さ及びタンパク質の比率を含む種々のパラメーターを変化させれば、再生及びトランススプライシング効率を最適化することができる。
精製ＭＩ’及びＩ’Ｐ融合タンパク質を、７．２Ｍ尿素を加えた緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５％酢酸、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ及び１４０ｍＭβ−メルカプト−エタノール）と交換し、使用前にｐＨ７．５で平衡化した。緩衝液交換又はタンパク質濃縮が必要な各ステップで、Ｍａｃｒｏｓｅｐ（１５ｍｌ）及びＭｉｃｒｏｓｅｐ（３．５ｍｌ）濃縮装置（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．；Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｓ）を製造業者の指示通りに使用した。次いで、二つの融合体を最終濃度２．３ｍｇ／ｍｌで混合し、４℃で一晩インキュベートした。該混合物を緩衝液Ｂ（トリス−ＨＣｌ  ｐＨ６、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で５０倍に希釈し、４℃で２時間の０．５〜２ｍｇ／ｍｌの濃縮ステップの間に再生を生起させた。混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーで４２℃で１時間加熱してスプライシングを誘発した。スプライシング反応を観察するために、試料を複数の時点で採取し、ウエスタンブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出文献（１９８９））を、ＣＩＶＰＳ３に対するマウス血清（抗ＰＩ−Ｐｓｐｌ）又はパラミオシンΔＳａｌを使用して重複して実施した（Ｓｔｅｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５：３９１７−３９２３（１９９０）、この文献の開示は参考として本明細書に含まれる）。その後の実験で、混合後の濃縮ステップは不要であることが判明した。残念ながら、スプライシングを観察するためにはウエスタンブロットが必要である。なぜなら、基質ＭＩ’及び産生物ＭＰの両方が類似の分子量（約７２ｋＤａ）を有するからである。抗パラミオシン抗体はＩ’Ｐ基質（約６０ｋＤａ）の崩壊及びＭＰ産生物（〜７２ｋＤａ）の形成を示すため、診断に役立つ。これに対し、類似の大きさのＭＩ’及びＭＰと反応する抗ＭＢＰ血清（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）は診断に役立たない。なぜなら、ＭＩ’が減少するに伴ってＭＰがゲル中の同一位置で増加するからである。その結果、抗ＭＢＰ血清は比較的一定のバンドを７２ｋＤａに検出する。マウス抗ＣＩＶＰＳ３血清を使用するウエスタンブロットは、基質（ＭＩ’及びＩ’Ｐ）の崩壊並びにＩ’産生物（分子量が類似しているために電気泳動時に分離できないことが多い）の形成を明らかにする。抗パラミオシン抗体を使用するウエスタンブロットでは、抗パラミオシン血清がＭＩ’と反応しないため、公差反応性がないことが判明した（図１７Ｂ）。抗ＣＩＶＰＳ３（抗ＰＩ−ＰｓｐＩ）抗体は、ＭＩ’及びＩ’Ｐの両方と反応することが明らかになった（図１７Ａ）。
シスでの（ｉｎ  ｃｉｓ）ＭＩＰのタンパク質スプライシングは、高温（６５℃以下）及び低ｐＨ（６．０）の方が効果が大きい（Ｘｕら，前出文献（１９９４）；Ｘｕら，前出文献（１９９３）及び実施例１１）。数回のアッセイの後、トランスススプライシングのスプライシング反応を４２℃、ｐＨ６．０に設定したが、別の温度及びｐＨも有効である。トランススプライシングの時間的経過を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。トランススプライシング反応は、抗パラミオシン血清を用いたウエスタンブロットで示されるような７２ｋＤａ  ＭＰの蓄積と、抗ＣＩＶＰＳ３血清（抗ＰＩ−Ｐｓｐｌ、図１７Ａ）を使用した場合のＭＩ’及びＩ’Ｐの減少並びにＩ’の形成とによって最も良く観察される。この実験では、ＭＩ’及びＩ’Ｐの両方をＭｉｃｒｏｓｅｐ濃縮器（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．；Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して緩衝液Ａ中７．２Ｍ尿素に交換し、各タンパク質の最終濃度１ｍｇ／ｍｌで混合した。該混合物を４℃で一晩インキュベートし、次いで緩衝液Ｂ中で５０倍に希釈した。希釈試料は即座に４２℃又は４℃に配置した。５分、１０分、２０分及び３０分のインキュベーション後に試料を採取し、氷上に配置した。管を４２℃に配置する前にゼロ時点を採取した。各時点の試料５μｌを二つ組５〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｄａｉｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で電気泳動にかけ、抗ＣＩＶＰＳ３（抗ＰＩ−Ｐｓｐｌ）又は抗パラミオシン血清を用いてウエスタンブロットを実施した（Ｐｅｒｌｅｒら，前出文献（１９９２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出文献（１９８９））。４℃でインキュベートした試料ではトランススプライシングは観察されなかった。４２℃では５分以内に枝分れ中間体（ＭＩ’Ｐ*）が観察され、１０分後までにはスプライシング産生物（ＭＰ及び両Ｉ’）が観察された（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。
Ｉ−ＰＳＰ  Ｉ活性の再生
トランススプライシング後に、タンパク質混合物をＩ−ＰｓｐＩ活性試験にかけた（この実施例ではＩ−ＰｓｐＩ又はＰＩ−ＰｓｐＩはＣＩＶＰＳ３又はＩと同じである）。Ｉ−ＰｓｐＩ消化に使用した基質ＤＮＡは、ｐＡＫＫ４由来の７１４ｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｐｅｒｌｅｒら，前出文献（１９９２））をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングすることによって形成したｐＡＫＲ７である。前記７１４ｂｐフラグメントは、野生型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼクローン内でＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２が存在していた部位を包囲するコーディング領域を含む。ＸｍｎＩ及びＩ−ＰｓｐＩで開裂すれば、約２３２７及び１３５１ｂｐのフラグメントが得られる筈である。試験基質ＤＮＡであるｐＡＫＲ７を、ＭＩ’、Ｉ’Ｐ、トランススプライシング反応生成物又はシススプライシングしたＭＩＰ５２のいずれかと反応させた（図１８）。Ｉ−ＰｓｐＩ制限部位の近傍の地点でプラスミドを直線化するためにｐＡＫＲ７をＸｍｎＩで切断した。５μｇのｐＡＫＲ７  ＤＮＡを、ＮＥＢ緩衝液２中で３７℃で１００分間にわたり、６単位のＸｍｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で消化した。１μｇの直鎖状ｐＡＫＲ７  ＤＮＡを０．０１、０．１又は１μｇのＭＩ’、Ｉ’Ｐ又はトランススプライシング反応生成物のいずれかと、最終容量５５μｌのＩ−ＰｓｐＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で混合し、５０℃で１時間インキュベートした。同様の反応で、ＭＩＰ５２タンパク質を対照として使用した。ＭＩＰ５２は、ＣＩＶＰＳ３のＳｅｒ１の前にＭＩＬＶＡ挿入体を含むＭＩＰの突然変異体形態であり、前記挿入体はスプライシング又はエンドヌクレアーゼ活性に影響しない。Ｉ−ＰｓｐＩではなくＭＩＰ５２を使用したのは、シススプライシングした混合物の方がトランススプライシングした混合物に類似していたからである。ＭＩＰ５２対照試料は、前駆体ＭＩＰと、シススプライシングしたＭＰ及びＩ産生物とを含んでいた。エンドヌクレアーゼ活性はＭＩＰ５２酵素及びトランススプライシングした混合物中にのみ存在していた。これは、前述のトランススプライシングプロトコルがスプライシング能力を再生するだけでなく、ＣＩＶＰＳ３中のエンドヌクレアーゼ活性も再生することを意味する。別の対照として、ＭＩ’及びＩ’Ｐを前述のような消化混合物に別個に加えた。消化は観察されなかった（図１８）。これは、エンドヌクレアーゼ活性の回復に前記タンパク質フラグメントが両方とも必要であることを意味する。
実施例１３
トランス開裂
この実施例では、実施例１２に記載のＭＩＰフラグメントを出発点として使用して、ＣＩＶＰＳ３のＣ末端でのトランス開裂を説明する。
ＣＩＶＰＳ３中にＩｌｅ２Ｌｙｓ突然変異体を含むＭＩ’２２の構築
実施例１２では、トランススプライシングに使用するＭＩ’及びＩ’Ｐの構築を説明した。この実施例では、（ＭＩ’をコードする）ｐＭＩ／Ｌ２４９内のスプライス部位カセットを、ＣＩＶＰＳ３のＩｌｅ２をＬｙｓで置換する二本鎖オリゴマー（ｄｕｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）で置換した。使用した方法は実施例１０及び１２に記載の通りである。要約すれば、ベクターｐＭＩ／Ｌ２４９と連結する前に、二つの相補的オリゴマーＤＶＭＩＰ５２５ＦＷ（５’−ＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号６２）及びＤＶＭＩＰ５２６ＲＶ（５’−ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡ
0004476360.tif 000003
ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣ−３’（配列番号６３）をアニーリングさせて、二本鎖リンカーＤＶＭＩＰ５２５ＦＷ／ＤＶＭＩＰ５２６ＲＶを形成した。各オリゴマー１００ｐｍｏｌを５０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中６８℃で１５分間インキュベートし、２０〜３０℃までゆっくり冷却した。ｐＭＩ／Ｌ２４９  ＤＮＡをＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で製造業者の指示通りに消化し、直鎖状プラスミドを電気泳動分離後にＧｅｎｅｃｌｅａｎＩキット（ＢＩＯ１０１；Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製した。０．１μｇのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＭＩ／Ｌ２４９  ＤＮＡを、１０μｌの１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で１６℃で一晩、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｂａｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１５．５ｐｍｏｌのリンカーＤＶＭＩＰ５２５ＦＷ／ＤＶＭＩＰ５２６ＲＶと連結させた。得られた構築物をｐＭＩ’２２と名付け、このクローンによって産生されたタンパク質をＭＩ’２２と命名した。
ＭＩ’２２及びＩ’Ｐの精製
Ｉ’Ｐは実施例１２と同様に精製した。ＭＩ’２２は、実施例１２でＭＩ’について説明したように精製した。大腸菌株ＥＲ２４９７（ＮＥＢ９７５）をｐＭＩ’２２で形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で３０℃でＯＤ６００約０．５まで増殖させた。培養物を０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で、３０℃で一晩誘導した。細胞を４℃で回収し、−２０℃で貯蔵した。１ｌ培養物から得た凍結細胞を６０ｍｌのアミロースカラム緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１．０ｍＭ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ）に再懸濁し、音波処理で破砕した。９，０００ｇで２０分間遠心分離した後、粗上清をカラム緩衝液で２倍に希釈し、アミロースカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，樹脂１２．５ｍｌ）に通し、カラムを６０ｍｌの前記緩衝液で洗浄し、次いでｐＨ６に調整したアミロースカラム緩衝液６０ｍｌで洗浄した。マルトースを最終濃度１０ｍＭでｐＨ６カラム緩衝液に加え、ＭＢＰ融合体が溶離されるまで溶離を続けた。
トランス開裂
二つの相補的ＭＩＰ半体を上述のように構築した。総てのＭＢＰとＩｌｅ２Ｌｙｓ置換を含むＣＩＶＰＳ３のＮ末端ドメイン（アミノ酸１−２４９）とを含んでいるＭＩＰ  Ｎ末端半体構築物をＭＩ’２２と名付け、ＣＩＶＰＳ３のＣ末端ドメイン（アミノ酸２５０−５３７）と総てのパラミオシンΔＳａｌとを含むＭＩＰ  Ｃ末端半体構築物をＩ’Ｐと名付けた。トランススプライシング反応の生成物は不変ＭＩ’２２、並びにＩ’フラグメント及びＰフラグメントを形成する開裂Ｉ’Ｐである。前記フラグメントは両方とも約３０ｋＤａである。不都合なことにＩ’Ｐは不溶性であり、６Ｍ尿素中で可溶化し精製する必要があった。この研究のために選択した最初のプロトコルは実施例１２に記載の通りであり、二つのＭＩＰ半体を尿素中で混合し、４℃でインキュベートし、タンパク質を迅速に希釈し、次いで希釈タンパク質を再生させるものであった。これに、標準的ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングプロトコルが続いた（Ｘｕ，Ｍ．ら，前出文献（１９９４）；Ｘｕ，Ｍ．ら，前出文献（１９９３））。初期濃度、尿素濃度（もしくは他の変性剤）、希釈度、インキュベーションの長さ及びタンパク質の比率を含む種々のパラメーターを変化させれば、再生及びトランス開裂の効率を最適化することができる。
各１０μｇの精製ＭＩ’２２及びＩ’Ｐ融合タンパク質を、６Ｍ尿素に調整した総容量２４μｌのＮｏｖａｇｅｎ  Ｈｉｓ  Ｔａｇカラム結合緩衝液（２０ｍＭトリス、ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）中で混合し、氷上で９０分間インキュベートした。試料を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２５倍に希釈し、４２℃でインキュベートした。０、５、１０、２０、４０及び９０分の時点で試料を採取し、氷上に配置した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出文献（１９８９））中で煮沸し、４−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｄａｉｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で電気泳動にかけ、クーマシーブルーで染色した。図１９に示すように、Ｉ’Ｐ（〜６０ｋＤａ）は時間とともに消失し、Ｉ’及びＰがゲル中のほぼ同じ位置に出現する（〜３０ｋＤａ）。図示しないが、対照試料は、ＭＩ’２２＋Ｉ’Ｐ混合物を４℃でインキュベートするか、又は各タンパク質フラグメントを別個に４２℃でインキュベートする操作にかけた。これらの対照実験では開裂活性は観察されなかった。
実施例１４
ＩＶＰＳ活性の化学的制御
上述の実施例では、ＩＶＰＳのスプライシング及び開裂活性をアミノ酸置換、温度及びｐＨで制御できることを明らかにした。この実施例では、ＩＶＰＳ活性の活性化又は阻害にも化学的処理を使用し得ることを立証する。例えば、ＩＶＰＳはその活性を化学的処理によって制御できればＣＩＶＰＳになり得る。実施例１０で、スプライシングではなく、スプライス部位の一つを開裂させることになるカセット置換によるＭＩＰ融合でのＣＩＶＰＳ３の改変を説明した。ｐＭＩＰ２１は各スプライス部位に二つのユニーク制限部位を含む。即ち、Ｎ末端スプライス部位の両側のＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位、並びにＣ末端スプライス部位の両側のＢａｍＨＩ部位及びＳｔｕＩ部位である（図１４、実施例１０）。Ｎ末端スプライス部位残基はＸｈｏＩ−ＫｐｎＩカセットの置換によって変えることができ、Ｃ末端スプライス部位残基はＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットの置換によって変えることができる。Ｎ末端カセットの置換の場合は、まずｐＭＩＰ２１をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化する。二つの相補的プライマーをアニーリングすることによって形成した所望の突然変異体を有するカセットで、元々存在していたＸｈｏＩ−ＫｐｎＩカセットを置換する。ＣＩＶＰＳの何らかの改変は、化学的処理による開裂又はスプライシング活性の活性化を可能にし得る。この特定実施例では、ＣＩＶＰＳ３内でＳｅｒ１をＣｙｓで置換すると、ＭＩ（ＭＩＰの切頭形態）コンテクストで化学的に誘導し得るＣＩＶＰＳが得られ、これをヒドロキシルアミンで活性化すると、改変ＣＩＶＰＳ３内でＭＢＰとシステインとの間の結合が開裂されることを明らかにする。
ＣｙｓでのＳｅｒ１の置換によるＣＩＶＰＳ３の改変
この実施例ではまず、カセット置換によりＣＩＶＰＳ３（Ｓｅｒ１Ｃｙｓ）のＮ末端スプライス部位でセリンをシステインで置換することによりｐＭＩＰ２１（実施例１０）を改変してｐＭＩＰ４７を得る。２μｇのｐＭＩＰ２１を，１００μｌの１×緩衝液１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ並びに２０単位のＸｈｏＩ及び２０単位のＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で４時間消化した。１％アガロースゲル上での電気泳動分離後、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１；Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを精製した。二つの相補的オリゴマーＭＩＰ５３５ＦＷ（５’−ＴＣＧＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号６４））及びＭＩＰ５３６ＲＶ（５’−ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号６５））をアニーリングさせて二本鎖リンカーＭＩＰ５３５ＦＷ／ＭＩＰ５３６ＲＶを形成した。１００ｐｍｏｌの各オリゴマーＭＩＰ５３５ＦＷ及びＭＩＰ５３６ＲＶを５０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中６５℃で１５分間インキュベートし、ゆっくりと２０〜３０℃に冷却した。約０．１μｇのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを１６℃で一晩、１０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、８単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１５．６ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ５３５ＦＷ／ＭＩＰ５３６ＲＶ中で連結させてｐＭＩＰ４７を得た。連結ＤＮＡ試料を大腸菌株ＥＲ２４２６（ＮＥＢ９７４）の形質転換に使用した。
ＭＩをコードするｐＭＩ８４の構築
下記のカセット置換実験に従ってｐＭＩ８４を２ステップで構築した。まず、Ｃ末端スプライス部位カセットをリンカーＭＩＰ３５３ＦＷ／ＭＩＰ３５４ＲＶで置換することによりｐＭＩＰ２１を改変してｐＭＩＰ６６を得た。ＳｐｈＩ認識配列を含むリンカーＭＩＰ３５３ＦＷ／ＭＩＰ３５４ＲＶは、前述のように二つの相補的オリゴマーＭＩＰ３５３ＦＷ（５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡ−３’（配列番号６６））及びＭＩＰ３５４ＲＶ（５’−ＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＡＧＧ−３’（配列番号６７））をアニーリングさせることによって形成した。ｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを実施例１０に記載のようにＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及びＳｔｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で消化した。０．１μｇのＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ消化ｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを、４０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の存在下に、１０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で１６℃で一晩、１６．６ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ３５３ＦＷ／ＭＩＰ３５４ＲＶと連結させた。１μｌの１０×緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び０．５μｌ（１０単位）のＳｔｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた後、連結ＤＮＡ試料を３７℃で３時間インキュベートし、その後大腸菌ＥＲ２４２６（ＮＥＢ９７４）を形質転換した。
ｐＭＩＰ６６は、Ｃ末端スプライス部位の両側の唯一のＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ部位を含んでおり、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ消化後にリンカーの置換を可能にする。次いで、終止コドンをＣＩＶＰＳ  Ｃ末端の後に挿入してＭＩ切頭融合体を形成する。ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩカセットをリンカーＭＩＰ３８５ＦＷ／ＭＩＰ３８６ＲＶで置換することにより、Ｓｅｒ５３８を翻訳終止コドン（ＴＡＡ）に突然変異させた。リンカーは前述のように二つの相補的オリゴマー、ＭＩＰ３８５ＦＷ（５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＡＴＧ−３’（配列番号６８））及びＭＩＰ３８６ＲＶ（５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧ−３’（配列番号６９））をアニーリングさせることによって形成した。この突然変異誘発カセットは、ｐＭＩＰ６６のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ開裂後にＣ末端スプライス部位カセットを置換するための相容性末端を含む。約１μｇのｐＭＩＰ６６を、３０μｌの１×ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、２０単位のＢａｍＨＩ及び２０単位のＳｐｈＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で４時間消化した。１％アガロースゲル上での電気泳動分離後、ｐＭＩＰ６６  ＤＮＡを２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１；Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により精製した。約０．０５μｇのＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ消化ｐＭＩＰ６６  ＤＮＡを、１０ｍｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１６．６ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ５３５ＦＷ／ＭＩＰ５３６ＲＶ中で１６℃で一晩連結させてｐＭＩ８４を得た。連結ＤＮＡ試料を大腸菌株ＥＲ２４２６（ＮＥＢ９７４）の形質転換に使用した。
ｐＭＩ９４（Ｓｅｒ１Ｃｙｓ突然変異を有するＭＩ）の構築
ｐＭＩＰ４７の６．６Ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメントとｐＭＩ８４の２．３Ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメントとを連結することにより、ｐＭＩ８４のＣ末端スプライス部位に導入した翻訳終止コドン（ＴＡＡ）をｐＭＩＰ４７内にトランスファーしてｐＭＩ９４を得た。ｐＭＩＰ４７及びｐＭＩ８４  ＤＮＡ各１μｇを、３０μｌの１×緩衝液１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１０単位のＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１０単位のＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で４時間インキュベートした。１％アガロースゲル上での電気泳動分離後に、ｐＭＩＰ４７試料由来の６．６Ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメント及びｐＭＩ８４試料由来の２．３Ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、それぞれ２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１）により精製した。１μｌの精製６．６Ｋｂ  ｐＭＩＰ４７  ＤＮＡ及び７．８μｌの精製２．３Ｋｂ  ｐＭＩ８４  ＤＮＡを、１μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．２μｌの４００，０００単位／ｍｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で１６℃で一晩インキュベートすることによりｐＭＩ９４を形成した。連結ＤＮＡ試料を大腸菌株ＥＲ２４２６（ＮＥＢ９７４）の形質転換に使用した。ｐＭＩ９４は、完全ＭＩＰ融合コンテクストでｐＭＩ４７中に存在するＳｅｒ１Ｃｙｓ置換を有するＭＩ融合タンパク質をコードする。
ＭＩ９４の精製及び化学的に誘発し得る開裂活性
ｐＭＩ９４構築物は、ＣＩＶＰＳ３のＮ末端に生来のセリン残基に代えてシステイン残基を含むＭＩ９４と称するＭＢＰ−ＣＩＶＰＳ３融合タンパク質を発現する。開裂活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査を実施するために、ＭＩ９４融合タンパク質の発現を低温（１２℃）で誘発し、アミロース樹脂カラムで精製した。ｐＭＩ９４を含んでいるＥＲ２４２６（ＮＥＢ９７４）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた２ｌのＬＢ培地で培養し、実施例１０に記載のように誘導した。細胞をペレット化し、１００ｍｌのｐＨ８．５カラム緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で音波処理し、遠心分離した。清澄化溶解液を１５ｍｌアミロース樹脂カラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に充填した。カラムを１００ｍｌのｐＨ８．５カラム緩衝液及び１００ｍｌのｐＨ６カラム緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で順次洗浄した。ＭＩ９４をｐＨ６カラム緩衝液中１０ｍＭのマルトースで溶離した（実施例９に記載の手順に従う）。
ヒドロキシルアミン（ＮＨ2ＯＨ）を使用して、Ｎ末端スプライス部位での開裂活性を活性化した。ＭＩ９４タンパク質試料（０．６ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ６及びｐＨ７の０．２５Ｍ  ＮＨ2ＯＨで処理した。７５μｌの精製ＭＩ９４試料を、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ６に調整した２５μｌの０．４Ｍビス−トリス−プロパン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  ＮＨ2ＯＨ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、又は６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整した２５μｌの０．４Ｍビス−トリス−プロパン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１Ｍ  ＮＨ2ＯＨ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）と混合した。対照実験では、１００μｌのＭＩ９４試料を、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ６に調整した３３μｌの０．４Ｍビス−トリス−プロパン、０．５Ｍ  ＮａＣｌと混合した。対照試料４０μｌを、２０μｌの３×Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と混合し、氷上で貯蔵した。各混合物の二つの４０μｌアリコートを３７℃でそれぞれ０．５時間及び２時間インキュベートした。各試料を２０μｌの３×Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｍｐｌｅ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と混合し、５分間煮沸した。各試料５μｌを４−１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動にかけ、次いでクーマシーブルーで染色した（図２０）。データは、対照実験（ＮＨ2ＯＨを使用しない）と比べて、ヒドロキシルアミン処理がＮ末端スプライス部位の開裂活性を急増させることを示している。ＭＩ融合タンパク質はｐＨ６及びｐＨ７の両方でヒドロキシルアミンによって活性化され、効果的に開裂されて、より多くのＭＢＰ（Ｍ、４３ｋＤａ）及びＣＩＶＰＳ３（Ｉ、６０ｋＤａ）を与えた。
この実験では、ＩＶＰＳの改変が化学的処理後にスプライシング及び開裂活性に著しく影響し得ることを明らかにする。このデータはまた、Ｎ末端スプライス部位における開裂がＣＩＶＰＳの連結及びカルボキシル部位開裂活性の不在下で観察される別の構築物の具体例も与えている。
実施例１５
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＩＶＰＳの開裂活性の化学的制御
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＩＶＰＳ（酵母インテイン（ｉｎｔｅｉｎ））のタンパク質スプライシング活性は、Ｈｉｒａｔａらの前出の文献及びＫａｎｅらの前出の文献に記述されている。この実施例では、実施例９のＭＩＰ融合体と類似の酵母インテイン融合システムの構築を説明した。酵母インテイン融合システムは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、遺伝子工学的に形成した酵母インテイン（Ｙ）と、キチン結合ドメイン（Ｂ）とからなる３部分融合体である。この酵母インテイン融合システムはＭＹＢ融合体と称し、マルトース結合タンパク質と酵母インテインとの間のＮ末端スプライシング部位（Ｃｙｓ１）で開裂するように誘導できる。ＭＢＰはＭＹＢタンパク質精製システムで標的タンパク質に置換することができる。
野生型ＭＹＰの構築
酵母ＩＶＰＳのスプライス部位アミノ酸残基は図１に示す。酵母ＩＶＰＳ（Ｇｉｍｂｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（２９）２１８４４−２１８５３（１９９３）、該文献の開示は参考として本明細書に包含される）をｐＴ７ＶＤＥのプラスミドからＰＣＲによって増幅し、ＸｈｏＩ部位とＳｔｕＩ部位との間でＭＩＰ２１に挿入して（実施例１０に記載）ＣＩＶＰＳ３（又はＰｙｒｏｃｃｏｃｕｓ  ＩＶＰＳ）を置換した。プライマー対５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＴ−３’（配列番号７０）及び５’−ＣＣＴＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴ−３’（配列番号７１）を使用してＰＣＲによりＩＶＰＳフラグメントを合成した。Ｔ７プロモーターの方向に酵母ＩＶＰＳ遺伝子配列を含むｐＴ７ＶＤＥプラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ混合物は、５０ｕｌ中４ｍＭの硫酸マグネシウムと４００ｕＭの各ｄＮＴＰと１ｕＭの各プライマーと５０ｎｇのＴ７ＶＤＥ  ＤＮＡと０．５単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で５分で２０サイクル実施した。試料を１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、約２ｕｇのＰＣＲ合成１．３ＫｂフラグメントをＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１；Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により２０ｕｌの蒸留水中に回収した。精製ＤＮＡを、４０単位のＸｈｏＩを加えた１００ｕｌの１×ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で消化にかけた。消化ＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２及び７０％エタノール中に−２０℃で一晩沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、乾燥し、４０ｕｌの蒸留水に再懸濁した。０．５ｕｇのＭＩＰ２１  ＤＮＡをＸｈｏＩ及びＳｔｕＩで消化し、７．２ＫｂベクターＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ１０１；Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により０．５ｕｇ／２０ｕｌで１％アガロースゲルから精製した。ＸｈｏＩ消化ＩＶＰＳフラグメントを７．２Ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ  ＭＩＰ２１フラグメントに連結してＭＹＰ１を形成した。この反応は、２ｕｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．４ｕｇ  ＩＶＰＳ  ＤＮＡ、０．０２５ｕｇ  ＭＩＰ２１フラグメント及び２００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えて１０ｕｌの容量で２２℃で５時間実施した。実施例２の手順で、大腸菌株ＲＲ１を連結試料で形質転換した。Ｑｉａｇｅｎスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｓｔｕｄｙ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出��るために、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で形質転換体を培養した。ＭＰ種（７１ＫＤａ）を形成すべくスプライシングする能力についてクローンを更に調べた。ＭＹＰ１〜９を有する９個のクローンを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍが約０．５になるまで３０℃で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えることにより、ＭＹＰ融合遺伝子の発現を３０℃で更に３時間誘発した。細胞を遠心分離し、０．５ｍｌのＬＢ培地に再懸濁した。粗抽出物を実施例３に記載のように調製した。これらのクローンから発現された融合タンパク質及びスプライシング産生物を検出するために、ＭＢＰに対する抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いてウエスタンブロットを実施した。試料を、予備染色マーカー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）と共に４−１２％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ；Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、抗ＭＢＰ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ウサギ由来）でプローブし、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギ二次抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の指示通りに使用して検出した。ウエスタンブロット分析の結果、ＭＹＰ２クローンを除いて、他の８個の分離体が総て７１ｋＤａの主産生物を与えることが判明した。これは、野生型ＭＹＰ融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで効果的なスプライシングを実施できることを意味する。
野生型酵母インテインの改変
酵母インテインの最初の改変は、Ｃ末端スプライシング部位の両側に二つのユニーク制限部位（ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）を形成することであった。これは、カセットの突然変異誘発を容易にすると考えられた。
１μｇのｐＭＹＰ１及び１μｇのＬＩＴＭＵＳ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、１×緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．５単位のＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び０．５単位のＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１５μｌの反応混合物中で３７℃で２時間にわたり別個に消化した。１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．；Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上での電気泳動分離後、酵母インテインを含むＸｈｏ−Ｐｓｔフラグメント及び消化ＬＩＴＭＵＳ２９をゲルから切除した。ゲルの切片を混合し、６５℃で１０分間融解した。次いで、該混合物を４２℃で１０分間インキュベートし、その後１単位のβ−アガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた。更に１時間インキュベートすると、混合物はＤＮＡ連結反応に使用できる状態になった。連結は、０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で１５℃で一晩実施した。連結混合物１５μｌを使用して、大腸菌株ＥＲ２２６７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を形質転換した。得られた構築物をｐＬｉｔ−ＹＰと名付けた。これは、酵母インテインを含むＬＩＴＭＵＳベクターである。
ｐＬｉｔ−ＹＰを使用して一本鎖ＤＮＡを合成し、次いでＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発を行った（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ＰＮＡＳ（１９８５），８２：４８８、該文献の開示は参考として本明細書に包含される）。まずｐＬｉｔ−ＹＰをコンピテント大腸菌株ＣＪ２３６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中に形質転換した。単一コロニーを採取して５０ｍｌの富裕（ｒｉｃｈ）ＬＢ培地に接種した。細胞を強力通気下で３７℃で２〜３時間増殖させた。次いで、５０μｌのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を培養物に加えた。更に１時間培養した後、カナマイシンを培養物１ｍｌ当たり７０μｇの最終濃度で加えた。一晩培養した後、細胞を遠心分離した。１０ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０％ＰＥＧを上清に加えた。一本鎖Ｌｉｔ−ＹＰ  ＤＮＡ（ｓｓｐＬｉｔ−ＹＰ）を含んでいるファージを氷上で１時間沈殿させた。次いで、上清を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ファージペレットを１．６ｍｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで４００μｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０％ＰＥＧを加えて、ファージを２５℃で５分間再沈殿させた。ファージペレットを再度遠心分離し、６００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。３回のフェノール抽出及び１回のクロロホルム抽出後に、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ含有６０％エタノール中で一本鎖ＤＮＡを沈殿させた。次いでＤＮＡペレットを乾燥し、３０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
二つの突然変異誘発プライマー、ＭＹＰ（ＥｃｏＲ）（５’−ＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡ−３’）（配列番号７２））及びＭＹＰ（Ｂａｍ）（５’−ＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号７３））を最初に５’ホスホリル化した。これらの突然変異誘発プライマー（各２０ｐｍｏｌ）を、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１ｍＭ  ＡＴＰ及び１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む２０μｌの反応混合物に加えた。反応を３７℃で３０分間実施し、次いでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを６５℃で１０分間加熱失活させた。１０ｐｍｏｌのホスホリル化突然変異誘発プライマーを、０．１μｇの一本鎖ｐＬｉｔ−ＹＰ鋳型、１×アニーリング緩衝液を含む１０μｌの反応混合物に加えた。該反応混合物を４分間９４℃に加熱し、ゆっくりと２５℃に冷却してプライマーを鋳型にアニーリングさせた。次の伸長反応は、１×Ｔ７ポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．５μｇのＢＳＡ、３００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＡＴＰ、アニーリングした鋳型、１単位のＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む５０μｌの混合物中で３７℃で２時間実施した。伸長混合物を１５μｌ使用して大腸菌株ＥＲ２２６７の形質転換を行った。得られたプラスミドｐＬｉｔ−ＹＰ’は、酵母インテインＣ末端スプライシング部位の両側に二つのユニーク制限部位ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１を含んでいた。インテインのＧｌｙ４４７及びＳ４４８をそれぞれＡｌａ及びＡｓｎに突然変異させた。
１μｇのｐＭＹＰ及び１μｇのｐＬｉｔ−ＹＰ’を、１×緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．５単位のＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び０．５単位のＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１５μｌの反応混合物中で３７℃で２時間別個に消化した。１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．；Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上での電気泳動分離後、ｐＬｉｔ−ＹＰ’由来Ｘｈｏ−Ｐｓｔフラグメント及び消化ｐＭＹＰをゲルから切除した。ゲルの切片を混合し、６５℃で１０分間融解した。次いで該混合物を４２℃で１０分間インキュベートし、その後１単位のβ−アガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた。更に１時間インキュベートすると、混合物はＤＮＡ連結反応に使用できる状態になった。連結は、０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中１５℃で一晩実施した。連結混合物を１５μｌ使用して大腸菌株ＥＲ２２６７（ＮＥＢ＃７４６；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の形質転換を行った。得られた構築物をｐＭＹＰ’と名付けた。
第二の改変は、Ａｓｎ４５４をＡｌａで置換することであった。これはカセット突然変異誘発によって達成した。
１μｇのｐＭＹＰ’を、１５μｌの１×緩衝液１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ並びに１単位のＸｈｏＩ及び１単位のＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で２時間消化した。１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．；Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上での電気泳動分離後、消化ｐＭＹＰ’プラスミドＤＮＡをゲルから切除した。ゲル切片を６５℃で１０分間融解し、次いで４２℃で１０分間インキュベートし、その後１単位のβアガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた。更に１時間インキュベートすると、精製ｐＭＹＰ’消化物はＤＮＡ連結反応に使用できる状態になった。二つの相補的オリゴマー、ＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＦＷ（５’ＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号７４））及びＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＲＶ（５’ＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号７５））をアニーリングさせて二本鎖リンカーＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＦＷ／ＲＶを形成した。１００ｐｍｏｌの各オリゴマーＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＦＷ及びＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＲＶを２０μｌの１×アニーリング緩衝液中で９０℃で４分間インキュベートし、ゆっくりと３７℃に冷却した。約０．１μｇのＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＭＹＰ’ＤＮＡを、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む２０μｌの反応混合物中で、２０ｐｍｏｌのアニーリングしたリンカーＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）ＦＷ／ＲＶに１６℃で一晩連結した。連結ＤＮＡ試料を使用して大腸菌株ＥＲ２２６７の形質転換を行った。得られたプラスミドをｐＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）と名付けた。
酵母インテイン精製ベクターｐＭＹＢ１２９の構築
酵母インテイン精製ベクターは、キチン結合ドメインをアフィニティ精製のアフィニティタグとして使用した。ｐＭＩＣ（実施例１１）はキチン結合ドメインと直接的クローニングに適合した制限部位とを含んでいるため、ｐＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）由来ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをまずｐＭＩＣ内にトランスファーし、元々存在していたＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ配列を置換した。次のステップで、ＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩリンカーの挿入を実施して、酵母インテインＣ末端スプライシング部位配列を再生した。
１μｇのｐＭＹＰ’（Ｎ４５４Ａ）及び１μｇのｐＭＩＣを１×ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、０．５単位のＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び０．５単位のＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１５μｌの反応混合物中で３７℃で２時間別個に消化した。１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．；Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上での電気泳動分離後、ｐＭＹＰ（Ｎ４５４Ａ）由来ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び消化ｐＭＩＣをゲルから切除した。ゲルの切片を混合し、６５℃で１０分間融解した。次いで該混合物を４２℃で１０分間インキュベートし、その後１単位のβアガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた。更に１時間インキュベートすると、混合物はＤＮＡ連結反応に使用できる状態になった。連結は、０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む１×リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で１５℃で一晩実施した。連結混合物を１５μｌ使用して大腸菌株ＥＲ２２６７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の形質転換を行った。得られた構築物をｐＭＹ−ＩＣと名付けた。
１μｇのｐＭＹ−ＩＣを、１５μｌの１×ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１単位のＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１単位のＡｇｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で３７℃で２時間消化した。１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．；Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上での電気泳動分離後、消化ｐＭＹ−ＩＣプラスミドＤＮＡをゲルから切除した。ゲル切片を６５℃で１０分間融解し、次いで４２℃で１０分間インキュベートし、その後１単位のβアガラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた。更に１時間インキュベートすると、精製ｐＭＹ−ＩＣ消化物はＤＮＡ連結反応に使用できる状態になった。二つの相補的オリゴマー、ＭＹＢ（Ｂａｍ−Ａｇｅ）ＦＷ（５’ＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡ−３’（配列番号７６））及びＭＹＢ（Ｂａｍ−Ａｇｅ）ＲＶ（５’−ＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号７７））をアニーリングさせて二本鎖リンカーＭＹＢ（Ｂａｍ−Ａｇｅ）ＦＷ／ＲＶを形成した。１００ｐｍｏｌの各オリゴマーＭＹＢ（Ｂａｍ−Ａｇｅ）ＦＷ及びＭＹＢ（Ｂａｍ−Ａｇｅ）ＲＶを２０μｌの１×アニーリング緩衝液中で９０℃で４分間インキュベートし、ゆっくりと３７℃に冷却した。約０．１μｇのＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ消化ｐＭＹ−ＩＣ  ＤＮＡを、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む２０μｌの反応混合物中で、２０ｐｍｏｌのアニーリングしたリンカーに１６℃で一晩連結させた。連結ＤＮＡ試料を使用して大腸菌株ＥＲ２２６７の形質転換を行った。得られたプラスミドをｐＭＹＢ１２９（図２１）と名付け、その試料を１９９５年１２月２８日にブダペスト協約の条件下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９７３９８で受理された。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の改変ＩＶＰＳの化学的に誘発し得る開裂活性による標的タンパク質の１ステップ精製
標的タンパク質の１ステップ精製を説明するためにｐＭＹＢ１２９構築物を使用した。ここでは、マルトース結合タンパク質が標的タンパク質である。ｐＭＹＢ１２９を含んでいる大腸菌株ＥＲ２２６７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１ｌのＬＢ培地で３７℃で培養した。６００ｎｍのＯＤが０．７に到達するまで培養物を増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭで加えることにより誘導を行った。誘導培養物を３０℃で３時間増殖させ、その後細胞を４０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを５０ｍｌのカラム緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中に再懸濁した。該細胞懸濁液を６分間音波処理し、次いで１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、透明溶解液を得た（約５０ｍｌ）。
溶解液をキチン（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）上に直接添加し、４℃で３０分間結合させた。（使用し得る別の好ましいキチン樹脂は後で述べる。）次いでキチンを１０倍容のカラム緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。３０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むカラム緩衝液を使用してＭＢＰタンパク質を溶離した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。溶離は４℃で１６時間実施した。これらの条件では、マルトース結合タンパク質のみがキチンから溶離された（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。
実施例９に記載のように、ＭＹＴ融合タンパク質をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）で精製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂実験で、３０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）及び３０ｍＭ  ＤＴＴがＭＹＢをそれぞれ約７０％及び９０％開裂することが判明した（図２３Ａ、図２３Ｂ）。
セファロース４Ｂに結合したキチンの製造
１リットルベッド容量のセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）（５倍容の水で予備洗浄したもの）を１ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ、１ｌの１，４−ブタンジオールジグリシドキシエーテル及び２ｇのホウ水素化ナトリウムに懸濁する。該懸濁液を密閉容器内で室温で４時間静かに揺動する。エポキシ活性化セファロース４Ｂビーズを、ブフナー漏斗（真空又は吸引器を備えたサイドアームフラスコ上に配置）内で、３ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨ水溶液及び６倍容の脱イオン水で順次洗浄して、流出液ｐＨを中性にする。洗浄後、エポキシ活性化セファロース４Ｂビーズを、メタ過ヨウ素酸ナトリウム４０ｇを含む１ｌの水溶液に懸濁する。該懸濁液を密閉容器内で室温で９０分間振盪する。得られたスペーサー結合アルデヒドセファロース４Ｂビーズをブフナー漏斗（真空又は吸引器付き）内で３ｌの水で洗浄する。ビーズペーストを、４５ｇのキトサン（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗａｕｋｅｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）と４ｇのシアノホウ水素化ナトリウムとを含む１．２ｌの４％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液に加える。（キトサン溶液はオートクレーブ内で炭水化物ポリマーを４％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液中で１時間オートクレーブ処理することにより調製する。）キトサン溶液中のアルデヒドセファロース４Ｂビーズ懸濁液を密閉容器内で室温で１８時間静かに揺動する。得られたキトサン結合セファロース４Ｂをブフナー漏斗（真空補助又は吸引器付き）内で１０ｌの水で洗浄する。次いでビーズを１ｌのメタノールで洗浄する。メタノールビーズペーストを７５０ｍｌの無水酢酸に懸濁し、密閉ポリエチレン容器内で室温で１８時間静かに揺動する。得られたキチン結合ビーズ懸濁液をブフナー漏斗に移す。濾過（真空補助又は吸引器）によって無水酢酸を除去した後、ビーズを３ｌのメタノール及び６ｌの脱イオン水で順次洗浄する。グルコサミン標準及びＴＮＢＳ：過塩素酸アッセイ（Ｗｉｌｋｉｅ，Ｓ．Ｌａｎｄｒｙ，Ｄ．ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３（５）：２０５−２１４（１９８８）、該文献の開示は参考として本明細書に包含される）を使用して、アセチル化が完了したかどうかを調べる。アミンが検出されれば、ビーズを前述のように再アセチル化する。最後に、ビーズをブフナー漏斗内で１ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨで洗浄する。キチンビーズを０．５ｇのホウ水素化ナトリウムを含む１ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨに懸濁し、密閉容器内で室温で１８時間静かに揺動する。流出液のｐＨが中性になるまで、ビーズをブフナー漏斗内で６ｌの脱イオン水で洗浄する。キチン結合セファロースビーズを３０％メタノール／Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）に懸濁して貯蔵する。
キチンビーズの製造
水溶液をビーズ状小滴に成形する間に水溶液中のキトサンを凝固（沈殿）させることによって、ビーズ形態のキチンを製造する。水溶液のビーズ状小滴は、水溶液を水不溶性有機層（ペンタノール）と一緒に撹拌し、これを界面活性剤又は安定剤（Ｔｗｅｅｎ８０）の添加により安定させてエマルションを形成することによって形成する。キトサンビーズはｐＨの増加に伴って形成され、１，４ブタンジオールジグリシジルエーテルの添加で反応して架橋する。ビーズの質、例えば大きさ及び形状は、キトサンの濃度及び長さ、水及び油層の容量及び密度、撹拌機及び反応容器の形状及び相対的寸法、安定剤の量及び化学的種類、並びに温度に直接左右される。
図２４に示す大きさの装置を用意する。反応容器に１ｌのペンタノール、５０ｍｌのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０；Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）及び５０ｍｌの１，４ブタンジオールジグリシジルエーテルを加える。撹拌溶液を７０℃に平衡化する。撹拌シャフトを３００ｒｐｍに維持する。５％酢酸水溶液（ｖ：ｖ；７０℃に予加熱）１ｌ中の７．５キトサン（ＭＷ＝７０，０００；Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の濾過溶液をペンタノール、洗剤及び架橋剤の撹拌溶液に加える。エマルションを７０℃に維持し、１００ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを１２分間で滴下する。エマルションを７０℃で１時間、３００ｒｐｍで撹拌する。１時間後に撹拌及び加熱を停止し、ペンタノール層（上層）をビーズ懸濁水から分離させる。上方アルコール層を吸引器で吸い上げて下方水層から除去する。
キトサンビーズ懸濁水を吸引ポンプを備えたブフナー漏斗に移し、５ｌの水及び１．５ｌのメタノールで順次洗浄する。メタノールビーズペーストをポリエチレン容器に移し、２００ｍｌの無水酢酸に懸濁する。ビーズを密閉容器内で室温で静かに揺動しながら１８時間アセチル化する。得られたキチンビーズをブフナー漏斗に移し、２ｌのメタノール及び４ｌの水で順次洗浄する。ビーズを最後に１ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨで洗浄する。
アルカリ性ビーズペーストをポリエチレン容器に移し、０．５ｇのホウ水素化ナトリウムを含む１ｌの０．３Ｍ  ＮａＯＨに懸濁する。キチンビーズ懸濁液を密閉ポリエチレン容器内で室温で１８時間静かに揺動する。キチンビーズ懸濁液をブフナー漏斗に移し、４ｌの脱イオン水で、又は流出液のｐＨが中性になるまで洗浄する。ビーズを５００ｍｌの３０％メタノール水（ｖ／ｖ）中で貯蔵する。
以上、本発明を好ましい実施態様を含めて詳細に説明してきたが、これらの実施態様は当業者により、本明細書の開示に基づいて、「請求の範囲」に記載の本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々に変形され得るであろう。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：５８３７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：
配列
0004476360.tif 000004
0004476360.tif 000005
0004476360.tif 000006
0004476360.tif 000007
配列番号：２
配列の長さ：４７０７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：
ハイポセティカル：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：Ｎ末端
配列の特徴：
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：３６３．．４２９
配列
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配列番号：３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：６
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：７
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：９
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１２
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１４
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１５
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１６
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１８
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：１９
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２１
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：３１
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３１
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３２
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３３
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３４
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３５
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３６
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３７
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３８
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：３９
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
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配列番号：４０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４１
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４３
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４４
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４５
配列の長さ：４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の特徴
特徴を表す記号：ペプチド
存在位置：１
他の情報：/ノート＝”位置1のＸaa＝（Ala/Val）”
配列の特徴
特徴を表す記号：ペプチド
存在位置：４
他の情報：/ノート＝”位置4のＸaa＝（Ser/Cys/Thr）”
配列
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配列番号：４６
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４７
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４８
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：４９
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５０
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５３
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５４
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５５
配列の長さ：６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５６
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
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配列番号：５７
配列の長さ：６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：５８
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：５９
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６０
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６１
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６２
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６３
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６４
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000076
配列番号：６５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000077
配列番号：６６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６７
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６８
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
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配列番号：６９
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000081
配列番号：７０
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000082
配列番号：７１
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000083
配列番号：７２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000084
配列番号：７３
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000085
配列番号：７４
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000086
配列番号：７５
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000087
配列番号：７６
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000088
配列番号：７７
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：他の核酸
配列
0004476360.tif 000089
【図１】
0004476360.tif 000090
【図２】
0004476360.tif 000091
【図３Ａ】
0004476360.tif 000092
【図３Ｂ】
0004476360.tif 000093
【図４】
0004476360.tif 000094
【図５】
0004476360.tif 000095
【図６】
0004476360.tif 000096
【図７】
0004476360.tif 000097
【図８】
0004476360.tif 000098
【図２４】
0004476360.tif 000099
【図９】
0004476360.tif 000100
【図１０】
0004476360.tif 000101
【図１１】
0004476360.tif 000102
【図１２】
0004476360.tif 000103
【図１３Ａ】
0004476360.tif 000104
【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
0004476360.tif 000107
【図１５Ｂ】
0004476360.tif 000108
【図１６】
0004476360.tif 000109
【図１７Ａ】
0004476360.tif 000110
【図１７Ｂ】
0004476360.tif 000111
【図１８】
0004476360.tif 000112
【図１９】
0004476360.tif 000113
【図２０】
0004476360.tif 000114
【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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