(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物であって、不ケン化性のアルコール可溶性成分を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項２】
不ケン化性のアルコール可溶性成分が、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：１（V/V/V））のＲｆ値が、０．４〜０．９である請求項１記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項３】
不ケン化性のアルコール可溶性成分が、大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物のケン化処理物からアルコール抽出物を分取したものである請求項１又は２記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項４】
ケン化処理物が、酵素処理に基づくものである請求項３記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項５】
酵素処理が、リパーゼ分解である請求項４記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項６】
大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物が、食用油製造時に発生する油滓である請求項１、２、３、４又は５記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項７】
皮膚老化防止性及び／又は抗炎症性を有する請求項１、２、３、４、５又は６記載のエラスターゼ阻害剤。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６又は７記載のエラスターゼ阻害剤を含有するエラスターゼ阻害用化粧品。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６又は７記載のエラスターゼ阻害剤を含有するエラスターゼ阻害用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エラスターゼ阻害剤及び該剤を含有する化粧品、又は医薬品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
エラスターゼには、膵、白血球エラスターゼの２種類がある。特に白血球エラスターゼは、生理的に肺気腫、リュウマチ様関節炎等の原因とされている。また、皮膚のエラスチンを分解して、弾力の低下やしわの発生に関係している。
従って、エラスターゼを阻害することにより、上記の疾患、老化を抑えることが期待できる。
【０００３】
エラスターゼ阻害剤に関する従来例としては、例えば、（１）大豆タンパクからなるもの（特開平５−２３０１００）、（２）小麦由来セラミドからなるもの（Int.．J． Cosmc．, 17, 255(1995））、（３）ジガラクトシルジグリセリド、スフインゴ脂質、リン脂質の混合物からなるもの（欧州特許公開第１０４３０１６号 ）等がある。
しかし、上記の従来例のものは、活性が余り高くない（（１）：IC50=68μg / m l、（２）：IC50=約40μg / m l、（３）：IC50=30μg / m l）。
よって、阻害活性が高いエラスターゼ阻害剤の開発が待たれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、阻害活性の高いエラスターゼ阻害剤を、入手し易い安価な植物原料から効率的に得ることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、穀類由来の有機溶剤抽出物の特定成分には、高いエラスターゼ阻害活性があることを知り、更に研究を重ねた結果、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の構成からなるものである。
１．大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物であって、不ケン化性のアルコール可溶性成分を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
２．不ケン化性のアルコール可溶性成分が、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：１（V/V/V））のＲｆ値が、０．４〜０．９である上記１記載のエラスターゼ阻害剤。
３．不ケン化性のアルコール可溶性成分が、大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物のケン化処理物からアルコール抽出物を分取したものである上記１又は２記載のエラスターゼ阻害剤。
４．ケン化処理物が、酵素処理に基づくものである上記３記載のエラスターゼ阻害剤。
５．酵素処理が、リパーゼ分解である上記４記載のエラスターゼ阻害剤。
６．大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物が、食用油製造時に発生する油滓である上記１、２、３、４又は５記載のエラスターゼ阻害剤。
７．皮膚老化防止性及び／又は抗炎症性を有する上記１、２、３、４、５又は６記載のエラスターゼ阻害剤。
８．上記１、２、３、４、５、６又は７記載のエラスターゼ阻害剤を含有するエラスターゼ阻害用化粧品。
９．上記１、２、３、４、５、６又は７記載のエラスターゼ阻害剤を含有するエラスターゼ阻害用医薬品。
【０００７】
本発明は、「大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物の不ケン化性のアルコール可溶性成分にはエラスターゼ阻害活性がある。」という新知見に基づいてなされたものである。
本発明の活性成分は、従来のものより、エラスターゼ阻害活性は高い点で非常に優れている。
本発明の活性成分で、活性の高いものは、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：１（V/V/V））のＲｆ値が、０．４〜０．９となる成分である。Ｒｆ値が、０．４〜０．９の間には、活性の特異点が三つほどあることからみて、本発明の活性成分は複数の成分からなっているものと推察される。
【０００８】
そして、エラスターゼ阻害活性を有するものは、通常、皮膚老化防止作用や抗炎症作用等の特性を有するので、本エラスターゼ阻害剤は、皮膚老化防止剤や抗炎症剤としての利用が期待できる。
また、本発明の有効成分である、大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物で、不ケン化性のアルコール可溶性成分を含むものとしては、例えば、食用油の製造工程中の脱ガム工程で得られる油滓が用いられるが、このものは、食用油製造の副産物等から安価に効率的に得られる点において、価値が高い。
更に、本発明の有効成分は、大豆又は菜種から得られるので、本発明は、安全性の面においても問題がなく、外用剤としても、経口剤としても、使用可能である点においても、優れている。
【０００９】
以上、大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物の中で、不ケン化性のアルコール可溶性成分に高いエラスターゼ阻害活性があることは、本発明により初めて見い出された知見であるので、この点からみても、本発明の構成の選択に格別の意義があることが分かる。
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のエラスターゼ阻害剤は、大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物の不ケン化性のアルコール可溶性成分を有効成分とするものである。
従って、本阻害剤の有効成分は、原則的には、大豆又は菜種の有機溶剤抽出物であって、活性成分の不ケン化性のアルコール可溶性成分を含むものであれば、その種類は問わない。
【００１１】
（１）大豆又は菜種の有機溶剤抽出物
原料の大豆又は菜種は、そのままのものでもよいが、豆腐滓、大豆粕等の加工処理物等も使用することができる。
大豆又は菜種からの有機溶剤抽出は、大豆又は菜種を、そのままで、又は蒸煮、乾燥、粉砕、圧片などの予備処理を施した後、有機溶剤により抽出を行えばよい。
有機溶剤としては、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ベンゼン等の炭化水素；メタノール、エタノール等のアルコール；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；メチルエーテル、エチルエーテル等のエーテル；アセトニトリル等のアクリル等が挙げられる。また、これら溶剤の含水物、或いはこれらの溶剤を一定の比率で混合した混合溶剤が用いられる。
抽出操作は、必要に応じ、加温することにより行うこともできる。
また、有機溶媒抽出物として、食用油脂製造の副産物である油滓を用いることも好適である。
【００１２】
（２）活性成分
本活性成分は、上記の有機溶剤抽出物の不ケン化性のアルコール可溶性成分である。ここで、不ケン化性とは、ケン化されない性質、すなわちアルカリ等による加水分解を受けない不ケン化物の性質を示す。
活性成分は、上記の有機溶剤抽出物を、加水分解、いわゆるケン化処理した後、このケン化処理物をアルコール抽出すること等により好適に得ることができる。
大豆又は菜種の有機溶剤抽出物中には、通常、活性成分の外に、不活性成分、例えば、グリセリド類や脂肪酸エステル等が含まれているが、このような不活性成分は、上記の加水分解処理により、ケン化され、水溶性成分として分離除去される。
加水分解手段としては、アルカリ処理や酵素処理等の方法を用いることができる。
酵素処理に用いられる酵素としては、脂質を加水分解できる酵素であれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ等が挙げられる。ホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ等が挙げられる。リゾホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ等を併用してもよい。
その他、抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー等による分画等の手段を用いることもできる。
更に、高濃度の活性成分の目的物を得るためには、抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー等の精製手段を行えばよい。例えば、目的物をクロロホルムに溶解した後、シリカゲルカラムを用いて、クロロホルムとアセトンの混合液で溶出を行えば、高い活性の目的物を得ることができる。
【００１３】
（３）本阻害剤の利用
本阻害剤は、外用剤として、また経口剤として、いずれの形態でも使用可能であり、例えば、（イ）化粧品、（ロ）医薬品などに添加することにより、皮膚機能強化等に資することができる。
【００１４】
（イ）化粧品
化粧品としては、化粧用クリーム、乳液、化粧水、美容エッセンス、パック剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメイクアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディローション、石けん、クレンジングフォーム、軟膏、ゼリー剤、エアゾール剤等の製品形態で用いることができる。
化粧品には、本阻害剤の他に、油分、界面活性剤、アルコール、保湿剤、抗酸化剤、美白剤、紫外線吸収剤、防菌防かび剤、顔料、色素、香料などを適宜添加することができる。
【００１５】
（ロ）医薬品
本阻害剤は、常用の医薬用担体を用いて医薬品とすることができる。例えば、経口用固形剤を得る場合は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、増沢剤、矯味剤等を加え、常法によって錠剤、顆粒剤、カプセル剤とする。また、適宜の安定剤、その他常用の助剤を加え、常法により注射剤などの非経口用製剤とすることもできる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、特に断らない限り、「％」は重量％を意味する。
【００１７】
＜エラスターゼ阻害活性の測定＞
実施例及び比較例のエラスターゼ阻害活性の測定は、以下の方法で測定した。
エッペンチューブに、リン酸緩衝液４００μｌ、１０μg／ m lエラスターゼ液（ヒト白血球由来、和光純薬工業社製）２５μｌ、実施例１、２、３又は比較例１の抽出物を、適宜ＤＭＳＯで希釈して濃度調整したＤＭＳＯ溶液５０μｌを混合し、３０℃で１０分間プレインキュベートした後、１０ｍＭBoc−L−アラニン−ｐ−ニトロフェニルエステル（シグマ社製）ＤＭＳＯ溶液２５μｌを添加して、反応を開始した。３０℃で２０分間反応させた後、３４７．５nmにおける吸光度を測定した。
【００１８】
【実施例１】
大豆からｎ−ヘキサンで抽出した粗原油の脱ガム工程で得られる油滓を、ロータリーエバポレーターを用いて水分を０．２％まで乾燥した。乾燥油滓２００g、及び水（抽出物に対して、トリアシルグリセロールリパーゼ（名糖産業（株）製）５０００U／gを含む）２００gを混合乳化した後、３５℃にて７２時間、加水分解（ケン化）した。次いで、９５％エタノール４００gを混合した後、遠心分離して、得られた油層と水層からなる層から、油層の油分を分離し、不溶物を除去し、エタノール抽出物を回収した。
次に、回収したエタノール抽出物は、減圧加熱して、エタノールと水を除去した後、遠心分離して、不溶物を除去し、油分を回収した。回収した油分を、分子蒸留（１８０〜２００℃、０．２mmＨｇ以下）に供して、蒸留残渣１０gを得た。
次いで、得られた蒸留残渣に、９５％エタノール５０gを加えて攪拌分散させ、遠心分離によってエタノール抽出物を回収した。抽出物はロータリーエバポレーターで乾燥して、目的の大豆抽出物４gを得た。
【００１９】
【実施例２】
原料をナタネ油滓に代えて、実施例１と同様の処理を行い、目的物を５ｇ得た。
【００２０】
【実施例３】
実施例１の方法で得られた大豆抽出物を以下の方法で精製した。
大豆抽出物５０ｇをクロロホルム０．５Ｌに溶解し、これを予めクロロホルムを用いて充填したシリカゲルカラム（Wako−gel  C−200：和光純薬工業社製）１５０ｇに通過させた。カラムに供した溶液の全量がカラムに接触した後、クロロホルム０．８Ｌを流下させ、次いで、クロロホルムとアセトンの混合液（クロロホルム／アセトン＝８／５）１Ｌを流下させた。得られた溶出液を回収し、ロータリーエバポレーターで乾燥させて、目的の成分を含有する画分３ｇを得た。
【００２１】
【比較例１】
大豆油製造工程で得られた大豆油滓からなる大豆抽出物を用いた。
上記の実施例及び比較例の抽出物の活性を、上記のエラスターゼ阻害活性の測定法により測定した。
【００２２】
（１）活性成分の確認
実施例及び比較例の抽出物の活性成分の存在を確認するために、以下の方法により、各例の特定画分の発色値を測定した。
各例の抽出物を、１０ｍｇ／ｍｌになるように、クロロホルムとメタノールの混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１（v/v））に溶解した。得られた溶液を、ＴＬＣプレート（Merck社製のSilica Gel ６０、サイズ：２０ｃｍ×２０ｃｍ、層厚：０．２５ｍｍ）に５μｌスポットした。次いで、クロロホルム、メタノール及び水の混合液２００ｍｌ（クロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：１（v/v/v））を用いて展開した（展開槽：ＹＡＺＡＷＡ １００−７Ｄ  外形１２×２５×２４（高さ）ｃｍ）。展開したＴＬＣプレートを風乾させた後、５０％硫酸溶液を噴霧し、１５０〜１８０℃で加熱して発色させた。発色させたＴＬＣプレートのスポットを画像解析ソフト  レーンアナライザー（ATTO(株）製）にて定量し、Ｒｆ値が０．４と０．９ の間に存在する成分の発色値を加算した。
以上の実施例及び比較例のエラスターゼ阻害活性及び発色値の測定結果を、表１に示す。
阻害活性は、阻害剤を添加しない時の酵素活性を５０％阻害するのに必要な酵素反応液中の阻害剤濃度（ＩＣ５０）で表した。即ち、その数値が低い方が阻害活性は強いといえる。
【００２３】
【表１】
0004459503.tif 000002
【００２４】
（２）実施例１の活性成分の分取と、その活性測定
以下の方法により、実施例１の抽出物について、活性成分を分取し、その収量とその阻害活性を測定した。
実施例１の抽出物を、２００ｍｇ／ｍｌになるように、クロロホルムとメタノールの混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１（v/v））に溶解した。得られた溶液を、ＴＬＣプレート（Merck社製のSilica Gel ６０、サイズ：２０ｃｍ×２０ｃｍ、層厚：０．５ｍｍ）に１００μｌスポットした。次いで、クロロホルム、メタノール及び水の混合液２００ｍｌ（クロロホルム：メタノール：水＝４０：１０：１（v/v/v））を用いて展開した（展開槽：ＹＡＺＡＷＡ １００−７Ｄ  外形１２×２５×２４（高さ）ｃｍ）。展開したＴＬＣプレートを風乾させた後、５０％硫酸溶液を噴霧し、１５０〜１８０℃で加熱して発色させた。その展開パターンから、成分を６画分に分け、残りのＴＬＣプレートから、それぞれの画分を掻き取った。掻き取ったシリカゲル層は、クロロホルムとメタノールの混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１（v/v））に懸濁して、吸着している成分を抽出した。遠心分離によって抽出液を分離して、エバポレーターで濃縮後、減圧乾燥して乾固させた。得られた画分の収量を測定した。
【００２５】
そして、阻害剤の濃度が５μｇ／ｍｌになるように、得られた画分をメタノールへ溶解して、各画分のエラスターゼ阻害活性を測定して、阻害率を求めた。
この場合の阻害率は、阻害剤を添加しない場合を０％として測定したものであり、その値が高いほど阻害活性は強いことを表す。
また、表２中のＲｆ値とは、ＴＬＣ分析における（試料着点からの各成分の移動距離）／（試料着点から展開溶媒の移動距離）を表す。
なお、参考のために、上記の測定法における、セラミド、トリグリセリドのＲｆ値を示すと、セラミド０．３７、トリグリセリド０．８５である。
得られた画分の収量及び阻害率を、表２に示す。
【００２６】
【表２】
0004459503.tif 000003
【００２７】
上記の表１及び表２の結果から、以下のことが分かる。
（１）大豆又は菜種由来の有機溶剤抽出物の内、不ケン化性のアルコール可溶性成分には、高いエラスターゼ阻害活性があること（実施例１、２）。
（２）上記の活性成分は、ＴＬＣ分析法におけるＲｆ値が、０．４〜０．９のものであること（表２）。
（３）セラミド、トリグリセリドなどが含まれるＲｆ値が０．４未満又は０．９を上回る範囲の成分は、本阻害剤の活性有効成分ではないこと。
【００２８】
【実施例４】
化粧品の製造
実施例１の大豆抽出物を用い、以下の配合（単位：重量％）で、常法によりクリームを製造した。
セトステアリルアルコール                ４．０
スクワラン                            ４０．０
流動パラフィン                          ５．０
ミツロウ                                ３．０
還元ラノリン                            ５．０
大豆抽出物                              ０．２
エチルパラベン                          ０．３
モノステアリン酸グリセリド              ２．０
グリセリン                              ５．０
精製水                                ３５．５
【００２９】
得られたクリームを乾燥肌、張りがないなど肌トラブルに悩む２０〜４０歳代の女性２０名をパネラーとし、顔、腕、足に朝夕二回、三ヶ月間塗布させた。
その結果、潤い、肌の張り、かゆみの改善など、良好な結果が見られた。
【００３０】
【実施例５】
ソフトカプセルの製造
実施例１の大豆抽出物を用い、以下の配合（単位：重量％）で、常法によりソフトカプセルを製造した。
植物油                                ９９．０
大豆抽出物                              １．０
【００３１】
【実施例６】
ドリンクの製造
実施例１の大豆抽出物を用い、以下の配合（単位：重量％）で、ドリンクを製造した。
オレンジ果汁                            ５．０
果糖ぶどう糖液糖                      １１．０
クエン酸                                ０．２
L−アスコルビン酸                      ０．０２
香料                                    ０．２
大豆抽出物                              ０．１
水                                    ８３．４８
【００３２】
【発明の効果】
（１）本発明の大豆又は菜種由来の抽出物を有効成分とするエラスターゼ阻害剤は、従来にない高い阻害活性を持っており、皮膚機能強化成分である、皮膚組織中のエラスターゼの活性低下を特異的に防止する特性を有している点で、非常に優れている。
【００３３】
（２）エラスターゼ阻害活性を有するものは、通常、抗炎症作用を有しているので、本エラスターゼ阻害剤は、抗炎症剤としての利用が期待できる。
【００３４】
（３）本発明は、有効成分の抽出物が、食用油製造の副産物から安価に効率的に得られる点においても、優れている。
【００３５】
（４）本発明の有効成分の抽出物は、食用原料由来のものであるので、安全性の面においても問題がなく、本発明のものは、外用剤としても、経口剤としても、使用可能である点において有利である。