(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖疾患の予防又は治療薬の調製におけるピラゾリン誘導体又はその生理的許容塩の使用であって、
前記ピラゾリン誘導体は次の一般構造式（Ｉ）で示され、
【化１】
0004451599.tif 000029
式中、
Ｒ１は、水素原子、メチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、炭素数１〜４の低級アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、又はシアノ基を示し、
Ｒ２は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８はそれぞれ、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示し、
Ｒ５は、メチルスルホニル基を示し、
Ｒ６は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、又はトリフルオロメトキシ基を示すものであって、
また、Ｒ１がメチル基を示す場合、
Ｒ２は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ３及びＲ８はそれぞれ、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、又はトリフルオロメチル基を示し、
Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示し、
Ｒ５は、メチルスルホニル基を示し、
Ｒ６は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、又はトリフルオロメトキシ基を示すものであって、
Ｒ７は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示すものであり、
前記ピラゾリン誘導体又はその生理的許容塩を、ヒトを含む哺乳動物における細胞増殖疾患の予防又は治療薬の調製に使用することを特徴とする使用。
【請求項２】
請求項１に記載の一般構造式（Ｉ）で示される化合物又はその生理的許容塩の使用であって、
前記化合物は、
［４］４，５−ジヒドロ−１−（４−メチルフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［１０］４，５−ジヒドロ−１−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［５９］１−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［６５］１−（４−クロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［６６］４，５−ジヒドロ−１−フェニル−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［６７］４，５−ジヒドロ−１−（２−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［６８］１−（４−クロロ−２−メチルフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［６９］４，５−ジヒドロ−１−（３−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７０］４，５−ジヒドロ−１−（３−メチルフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７１］４，５−ジヒドロ−１−（２，４−ジメチルフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７２］１−（２−クロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７３］４，５−ジヒドロ−１−（２−メチルフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７４］１−（２，４−ジクロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［７５］４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１−（２−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール、
［７７］４，５−ジヒドロ−１−フェニル−３−メチル−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール、
［７８］４，５−ジヒドロ−１−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール、
［８１］（＋）−４，５−ジヒドロ−１−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［８２］（−）−４，５−ジヒドロ−１−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［８３］（＋）−１−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
［８４］（−）−１−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール、
から成る群より選ばれ、
前記化合物又はその生理的許容塩を、ヒトを含む哺乳動物における細胞増殖疾患の予防又は治療薬の調製に使用することを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項１に記載の一般構造式（Ｉ）で示される化合物又はその生理的許容塩の使用であって、
相乗効果を生じさせるため、新形成の治療に一般的に用いられる他の生成物と共に、前記化合物又はその生理的許容塩を、ヒトを含む哺乳動物における細胞増殖疾患の予防又は治療薬の調製に使用することを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用であって、
前記細胞増殖疾患が、新生物形成前又は新生物形成過程、腫瘍血管新生、悪液質、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に関わる病的状態、または、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成の原因となる遺伝子の発現抑制により利益を受ける病的状態であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び／又は動物の治療に有用な薬物の調製における、一般構造式（Ｉ）で示されるピラゾリン誘導体、またその生理学的に許容できる塩（physiologically acceptable salt）の使用に関する。この化合物は、細胞増殖疾患の予防又は治療薬、より詳細には、新生物形成前（preneoplasic）又は新生物形成過程、腫瘍血管新生、悪液質、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に関わる病的状態、また一般に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成の原因となる遺伝子の発現を抑制することにより利益を受ける全ての病的状態の予防又は治療薬の調製に、単独で、又は他の生成物と組み合わせて用いられ、後者の場合は相乗効果を生じる。
【背景技術】
【０００２】
同一出願人による国際特許出願第９９／６２８８４号では、酵素シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の抑制剤であって抗炎症薬としての用途を持つ、一般構造式（Ｉ）で示される化合物とその生理的許容塩について述べている。
【化１】
0004451599.tif 000002
【０００３】
関連文献が増えていることからも明らかなように、ＣＯＸ−２合成の原因となる遺伝子の調節は、その抗炎症応答だけでなく、細胞増殖及び癌、免疫応答の調節、脳の変性疾患など、重要な病理学的状態にも応用できることから関心が高まっている。一連の研究より、ＣＯＸ−２抑制剤は結腸・直腸癌（ＣＲＣ）の潜在的な化学予防剤であると考えられるようになった。ＣＯＸ−２を標的として選んだのはその過剰発現がしばしば見られるためで、結腸癌の９０％、結腸腺腫の４０％までに大量のＣＯＸ−２のｍＲＮＡとタンパク質が見られる（エバーハートら，Gastroenterology,1994,107,1183-1188;デュボアら，Gastroenterology,1996,110,1259-1262；プレスコットら，Cell,1996,87,783-786）。更に、ａ）ＣＯＸ−２の過剰発現とアポトーシスの抑制とは関連がある（ツジイら，Cell,1995,83,493-501）；ｂ）Ａｐｃ（−）マウスのＣＯＸ−２を不活性化すると、腫瘍成長が抑制される；ｃ）結腸・直腸癌で最も一般的な遺伝子変異の２つ、Ａｐｃ腫瘍抑制遺伝子の変異とｒａｓオンコジーンの変異が、ＣＯＸ−２の過剰発現に関係している（ブールボルら，Cancer Res.,1996,56,2556-2560；Ｈ．シェンら，J. Biol. Chem.,1998,273(34),2120-2127）ことから、ＣＯＸ−２の過剰発現がＣＲＣの腫瘍表現型に関与していることは明らかである。
【０００４】
同一出願人によるＰＣＴ特許出願第ＥＳ００／００２４５号では、ＣＯＸ−２遺伝子のプロモータシーケンスの全部又は一部とトークン遺伝子とから成るＤＮＡ構成物を含む細胞系であって、前記ＣＯＸ−２遺伝子のプロモータシーケンスが適当な刺激に応じて前記トークン遺伝子の発現を制御するよう互いに効果的に結合している細胞系を述べている。この試験方法は、前述の細胞系を供試化合物と接触させておき、トークン遺伝子による活性の発現を示すシグナルの存在を測定するものである。この方法は、ＣＯＸ−２の転写レベルにおける適当な刺激による誘導の選択的阻害剤の調査に適しているとされている。
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願第９９／６２８８４号
【特許文献２】ＰＣＴ特許出願第ＥＳ００／００２４５号
【非特許文献１】エバーハートら，Gastroenterology,1994,107,1183-1188
【非特許文献２】デュボアら，Gastroenterology,1996,110,1259-1262
【非特許文献３】プレスコットら，Cell,1996,87,783-786
【非特許文献４】ツジイら，Cell,1995,83,493-501
【非特許文献５】ブールボルら，Cancer Res.,1996,56,2556-2560
【非特許文献６】Ｈ．シェンら，J. Biol. Chem.,1998,273(34),2120-2127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
我々は、一般構造式（Ｉ）で示される化合物とその生理的許容塩が、ヒト及び／又は動物の治療に使用される、細胞増殖疾患の予防又は治療薬、より詳細には、新生物形成前又は新生物形成過程、腫瘍血管新生、悪液質、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に関わる病的状態、また一般に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成の原因となる遺伝子の発現抑制により利益を受ける病的状態の治療薬の調製に特に有用であり、この化合物は単独で、又は他の生成物と組み合わせて用いられ、後者の場合は相乗効果を生じることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト及び／又は動物の治療に使用される薬物の調製における、一般構造式（Ｉ）で示される、Δ２−ピラゾリン、別名４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾールから誘導されたピラゾリン誘導体の使用に関する。
【化２】
0004451599.tif 000003
この化合物は、細胞増殖疾患の予防又は治療薬、より詳細には、新生物形成前又は新生物形成過程、腫瘍血管新生、悪液質、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に関わる病的状態、また一般に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成の原因となる遺伝子の発現抑制により利益を受ける病的状態の治療薬の調製に、単独で、又は他の生成物と組み合わせて用いられ、後者の場合は相乗効果を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
構造式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子、メチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、炭素数１〜４以下のアルコキシカルボニル基、カルバモイル基、又はシアノ基を示し、Ｒ２は、水素原子又はメチル基を示し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、及びＲ８はそれぞれ、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示し、Ｒ５は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、トリフルオロメトキシ基、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基を示し、Ｒ６は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、トリフルオロメトキシ基、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基を示すものであって、置換基Ｒ５又はＲ６の一方は、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基であり、また、Ｒ１がメチル基を示す場合、Ｒ２は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ３及びＲ８はそれぞれ、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、又はトリフルオロメチル基を示し、Ｒ４は、水素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示し、Ｒ５は、フッ素原子、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基を示し、Ｒ６は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、トリフルオロメトキシ基、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基を示すものであって、置換基Ｒ５又はＲ６の一方は、メチルスルホニル基、アミノスルホニル基、又はアセチルアミノスルホニル基であり、Ｒ７は、水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、トリフルオロメチル基、又はメトキシ基を示す。
【０００９】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物は不斉中心を持つため、鏡像異性体として純粋なもの又はラセミ化合物として調製可能である。化合物（Ｉ）のラセミ化合物は、一般的な方法、例えば、そのジアステレオ異性体塩のキラル分離クロマトグラフィ又は分別晶出などによりその光学異性体に分離できる。ジアステレオ異性体塩は、化合物（Ｉ）を鏡像異性体として純粋な酸又は塩基と反応させることにより得られる。同様に、鏡像異性体として純粋なキラル前駆体を用いたエナンチオ選択性合成によっても得ることができる。
【００１０】
本発明はまた、一般構造式（Ｉ）で示される化合物の生理的許容塩、無機及び有機酸付加塩、またアルカリ金属とによって生成される塩に関する。
【００１１】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物とその生理的許容塩は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成の原因となる遺伝子の発現を阻害する。この阻害性は、同一出願人によるＰＣＴ特許出願第ＥＳ００／００２４５号に述べた方法に従って、ルシフェラーゼ遺伝子に結合したＣＯＸ−２プロモータ遺伝子を移入した、安定なトランスフェクタント（transfectant）ＪＵＲＫＡＴ細胞である細胞系を用いて示すことができる。
【００１２】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物は、ヒトを含む哺乳動物に治療的有効量を投与し、新形成の成長、増殖、又は転移を部分的又は完全に抑制し、また新形成細胞を部分的又は完全に破壊する、新生物形成前又は新生物形成過程の予防又は治療薬として用いることができる。例えば、一般構造式（Ｉ）で示される化合物は、胃・腸癌、肝臓癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌などの新形成、あるいは家族性ポリポーシスなどの腺腫性ポリープの予防又は治療に用いることができる。
【００１３】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物は、ヒトを含む哺乳動物に治療的有効量を投与し、血管新生過程に依存する腫瘍の成長や転移など血管新生が関与する疾病、また網膜症や子宮内膜症などの疾患の予防又は治療薬として用いることができる。
【００１４】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物は、ヒトを含む哺乳動物に治療的有効量を投与し、悪液質及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の関わる疾患の予防又は治療薬として用いることができる。
【００１５】
一般構造式（Ｉ）で示される誘導体は、同一出願人による特許出願第ＷＯ９９／６２８８４号に述べた方法により調製できる。以下に例として、１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール（実施例３）とその鏡像異性体（実施例７９及び実施例８０）の調製について述べる。表１及び表２に、一般構造式（Ｉ）で示される化合物の特に重要な一群と、その特徴的な物理化学的性質を示す。
【実施例１】
【００１６】
[１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール（実施例３）の調製]
【化３】
0004451599.tif 000004
【００１７】
[アセチミドイルを用いる（Ｅ）−１，１，１−トリフルオロ−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−３−ブテン−２−オンの調製]
乾燥不活性雰囲気としたフラスコに２６０ｍｌの無水ＴＨＦを入れて−７８℃に冷却し、温度を−６５℃以下に保つような速度でＬＤＡの２ＭのＴＨＦ／ｎ−ヘプタン溶液２２５ｍｌを加えた。次に、３０ｍｌのＴＨＦに溶解したジエチルメチルホスホン酸（３４．２５ｇ、０．２２５ｍｏｌ）を手早く滴下して加え、−７８℃で３０分間振とうした。次に、４０ｍｌのＴＨＦに溶解したＮ−フェニルトリフルオロアセチミドイル＝クロリド（４６．７ｇ、０．２２５ｍｏｌ）を滴下して加え、同じ状態で１時間振とうを続けた。４０ｍｌのＴＨＦに溶解した２，４−ジフルオロベンズアルデヒド（３３．６ｇ、０．２３６ｍｏｌ）を加え、冷浴を外して温度を周囲温度まで上げた。この状態で一晩振とうを続けた。翌朝、２ＮのＨＣｌを４５０ｍｌ加え、２４時間振とうを続けた。ロータリーエバポレータでＴＨＦを留去し、得られた水溶液を酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出し、５％のＮａＨＣＯ３溶液と、飽和ＮａＣｌ溶液とで洗い、硫酸ナトリウムで乾燥濾過し、ロータリーエバポレータで溶媒を留去した。こうして５４．６ｇの赤みを帯びた液状の粗生成物が得られ、これを固化した。粗生成物を３５ミリバールの圧力で蒸留し、１０７〜１１４℃において（Ｅ）−１，１，１−トリフルオロ−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−３−ブテン−２−オンの留分を集めた（４３ｇ、８１％）。この物質の性状は以下のとおりであった。
融点：５０〜５１℃
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：１７１７，１６０２，１５８３，１２７７，１１４６，１０５９，７０６
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：６．９（ｍ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），７．６（ｍ，１Ｈ），８．０（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１０５．１（ｔ，Ｊ＝２６Ｈｚ），１１２．６（ｄｄ，Ｊ＝４，２２Ｈｚ），１１６．４（ｑ，Ｊ＝２９１Ｈｚ），１１８．２，１１８．５，１３１．５（ｄｄ，Ｊ＝４，１１Ｈｚ），１４１．５，１６２．５（ｄｄ，Ｊ＝１３，１９３Ｈｚ），１６５．７（ｄｄ，Ｊ＝１３，１９０Ｈｚ），１８０（ｑ，Ｊ＝３６Ｈｚ）
【００１８】
[アルドール縮合による（Ｅ）−１，１，１−トリフルオロ−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−３−ブテン−２−オンの調製]
フラスコ内で、２，４−ジフルオロベンズアルデヒド（２５０ｇ、１．７６ｍｏｌ）と、氷酢酸（１５２．５ｇ、２．５４ｍｏｌ）と、ピペリジン（１５２．５ｇ、１．７９ｍｏｌ）とを３リットルのＴＨＦに溶解した。溶液を５〜１０℃に冷却し、これにＣＦ３ＣＯＣＨ３（約１４０ｇ、１．２ｍｏｌ）をバブリングした。冷浴を外して温度を周囲温度まで上昇させ、この温度で２時間振とうを続けた。ＣＦ３ＣＯＣＨ３ （約４０ｇ、０．３６ｍｏｌ）をもう一度加えて２時間振とうした。更に約４０ｇを加えて更に２時間振とうした。これで合計約４１５ｇ（３．７ｍｏｌ）のＣＦ３ＣＯＣＨ３を加えたことになる。２０％の塩化アンモニウム溶液（６００ｍｌ）を加え、減圧下（５０℃、８０ミリバール）で溶媒を留去した。３００ｍｌの水を加え、酢酸エチルを用いて抽出した。有機相を、水、５％Ｈ２ＳＯ４、水で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を蒸留し、３０ミリバールで、（Ｅ）−１，１，１−トリフルオロ−４−（２,４−ジフルオロフェニル）−３−ブテン−２−オンの留分を集めた（２８１．４ｇ、６８％）。この生成物の融点は５０〜５１℃であり、ＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、及び１３Ｃ−ＮＭＲはアセチミドイルを用いて得た生成物と同一であった。
【００１９】
[１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾールの調製]
４−（アミノスルホニル）フェニルヒドラジン塩酸塩（２４３．８ｇ、１．０９ｍｏｌ）と、（Ｅ）−１，１，１−トリフルオロ−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−３−ブテン−２−オン（２８１．４ｇ）とを１６００ｍｌの酢酸に溶解し、窒素雰囲気中で２４時間還流した。これを冷却し、激しくかき混ぜた氷水（１０〜１２リットル）上にゆっくりと注ぎ、濾過した。これをトルエン（５００ｍｌ）で洗い、乾燥した。３２８ｇの粗生成物が得られた（純度９５．６％）。これをジオキサンから晶出させ、２１６．７ｇの１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール（純度９８．１％）を得た。晶出に用いた液体を濃縮後、更に６９．３ｇ（純度９７．５％）を得た。この２つの画分を合わせ、イソプロパノールから再結晶させて、粒径１００μｍ以下、純度９９．５％、融点１６１〜１６２℃の微粉砕生成物２６７．８ｇ（収率６１％）を得た。
元素分析値：
％  Ｃ          ％  Ｈ          ％  Ｎ          ％  Ｆ
計算値      ４７．４１        ２．９８      １０．３７      ２３．４３
実測値      ４７．４２        ２．７７      １０．３５      ２３．５７
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３１５，３２３２，１６１７，１５９３，１５０６，１３２６，１１７９，１０９９，１０６７
１Ｈ−ＮＭＲ［３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃，δ（ｐｐｍ）］：３．０（ｄｄ，ｊ＝６．３，１１．４Ｈｚ，１Ｈ）；３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，１２．６Ｈｚ，１Ｈ）；４．７９（ｓ  ｗｉｄｅ，２Ｈ）；５．７０（ｄｄ，Ｊ＝６．３，１２．６Ｈｚ，１Ｈ）；６．８−６．９５（ｍ，２Ｈ）；７．０１−７．０９（ｍ，３Ｈ）；７．７４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲ［３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２５℃，δ（ｐｐｍ）］：３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１８，５Ｈｚ，１Ｈ）；３．８９（ｔ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ）；５．９６（ｄｄ，Ｊ＝１３，６Ｈｚ，１Ｈ）；７．０３−７．１６（ｍ，５Ｈ）；７．３３（ｍ，２Ｈ）；７．６４（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ［７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃，δ（ｐｐｍ）］：４０．２，５７．９，１０４．９（ｔ，Ｊ＝２５Ｈｚ），１１２．４（ｄｄ，Ｊ＝４，２２Ｈｚ），１１３．５，１２０．４（ｑ，Ｊ＝２６９Ｈｚ），１２２．１（ｄ，Ｊ＝１７Ｈｚ），１２８，１２８．２，１３３．５，１３９．５（ｑ，Ｊ＝３８Ｈｚ），１４５．８，１５９．６（ｄｄ，Ｊ＝１２，２４５Ｈｚ），１６３（ｄｄ，Ｊ＝１２，２４８Ｈｚ）
１３Ｃ−ＮＭＲ［７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，２５℃，δ（ｐｐｍ）］：３９．７，５８．８，１０５．１（ｔ，ＪＣ−Ｆ＝２６Ｈｚ），１１２．１（ｄｄ，ＪＣ−Ｆ＝２２，３Ｈｚ），１１３．３，１２０．９（ｑ，ＪＣ−Ｆ＝２６８Ｈｚ），１２３．１（ｄｄ，ＪＣ−Ｆ＝１４，４Ｈｚ），１２７．４，１３０．０（ｄｄ，ＪＣ−Ｆ＝１０，５Ｈｚ），１３５．９，１３９．０（ｑ，ＪＣ−Ｆ＝３７Ｈｚ），１４４．６，１６０．０（ｄｄ，ＪＣ−Ｆ＝２４７，１３Ｈｚ），１６２．３（ｄｄ，ＪＣ−Ｆ＝２４６，１３Ｈｚ）
ＭＳ［ＥＩ，−７０ｅＶ，ｍ／ｚ（％）］：４０５（Ｍ＋，１００），３８６（４），３４１（７），２９２（１４），１５６（２６），１３９（１６）
【００２０】
[（＋）−１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール（実施例７９）、及び（−）−１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾール（実施例８０）の調製]
ラセミ体混合物である（±）−１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾールを、大きさ２５×２ｃｍ、粒径１０μｍのキラルパック（CHIRALPAK）ＡＳカラム（ダイセル（Daicel）製）を用い、移動相０．１％ジエチルアミン／メタノール、流速８ｍｌ／分とした高分解能液体クロマトグラフィにより、その鏡像異性体に分離した。保持時間７．４分において（＋）−１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾールが白色固体として得られた（融点１７３〜４℃；鏡像異性体純度９９．９％；［α］D＝＋１８３．９（ｃ＝１，ＣＨ３ＯＨ））。保持時間９．２分において（−）−１−（４−アミノスルホニルフェニル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４，５−ジヒドロ−３−トリフルオロメチル−１Ｈ−ピラゾールが白色固体として得られた（融点１７３〜１７４℃；鏡像異性体純度９９．９％以上；［α］D＝−１８９.４（ｃ＝１，ＣＨ３ＯＨ））。
【００２１】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の具体例を次の表１に示した。表中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、一般構造式（Ｉ）中の各置換基を示す。
【化４】
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【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
ヒトの治療における本発明の化合物の投与量は、治療すべき状態の重症度に応じて変わるが、通常１０〜５００ｍｇ／日の範囲である。本発明の化合物は、単一の活性素因として、あるいは相乗効果を生じさせるため他の生成物と共に投与できる。本発明の化合物は適当な薬理学的処方を行って、経口、経皮、腸管外、皮下、鼻腔内、筋肉内、又は静脈内に投与する。一般構造式（Ｉ）の化合物を含む薬剤混合物は、同一出願人による特許出願第ＷＯ９９／６２８８４号に述べられている。
【００２５】
（生物学的評価）
一般構造式（Ｉ）で示される化合物は、新生物形成前又は新生物形成過程、血管新生、悪液質、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に関わる病的状態、また一般に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）合成に関わる遺伝子の発現抑制により利益を受ける病的状態の治療に有用である。その活性を示すため、例として以下のようにいくつかの薬理学的試験を行った。
【００２６】
[ＣＯＸ−２誘導阻害]
シクロオキシゲナーゼ−２の転写誘導に対する阻害性を求めるため、ルシフェラーゼ遺伝子に結合したＣＯＸ−２プロモータ遺伝子を移入した、安定なトランスフェクタントＪＵＲＫＡＴ細胞である細胞系を使用した。基礎ルシフェラーゼ活性が４，５００〜１８万ＲＬＵ／１０５細胞の範囲内でそれぞれ異なる３種のクローン、Ｃ３、Ｃ７、及びＦ９を用いた。ルシフェラーゼ活性は、ホルボール（forbol）エステル（ＴＰＡ）やイオノフォア（イオノマイシン）といった、細胞シグナル伝達経路の前炎症型活性化因子などの刺激剤に反応して増加する。
【００２７】
試験として、細胞を供試化合物で１時間前処理した後、ＴＰＡ＋イオノマイシンで６時間刺激した。次に細胞抽出物を取り出してそのルシフェラーゼ活性を測定し、蛋白質濃度を求めた。ルシフェラーゼ活性の阻害はＣＯＸ−２誘導の阻害を示すものである。
【００２８】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の活性を示す例として、実施例１０の化合物を用いて得られた結果を以下に示す。これよりＣＯＸ−２の誘導阻害が明らかである。
【表３】
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【００２９】
[ヒト結腸癌における抗腫瘍活性]
一般構造式（Ｉ）で示される化合物のヒト結腸癌細胞系（ＴＤ２０及びＮＣ５９）に対する効果を求め、その抗腫瘍活性を調べた。この２つの細胞系は、野生型蛋白Ｋ−Ｒａｓを持つ。ＴＤ２０はｐ５３抑制遺伝子の変異を含み、ＮＣ５９はｐ５３野生型蛋白を持つものである。
【００３０】
ふたつの細胞系を、胎児ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）製）を１０％加えたＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ製）中、３７℃、ＣＯ２５％で培養した。
【００３１】
テトラゾリウム塩をホルマザンへ代謝する細胞の能力を測定するＸＴＴキット（べーリンガー・マンハイム（Boehringer−Manheim）製）を用いて、細胞障害性試験を行った。
【表４】
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【００３２】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の活性を示す例として、ふたつのヒト結腸癌細胞系に対する実施例３及び実施例１０の化合物の細胞障害活性を示した。そのＩＣ５０はそれぞれ、細胞系ＮＣ５９に対しては実施例３が３０μＭ、実施例１０が２７μＭであり、細胞系ＴＤ２０に対しては実施例３が３４μＭ、実施例１０が３８μＭであった。
【００３３】
これらの化合物の作用機序をより深く理解するため、実施例３の化合物の腫瘍細胞系ＴＤ２０におけるアポトーシス誘導性を調べた（投与量１００μＭ）。この条件で、２４時間後に２０％、４８時間後に８０％のアポトーシス細胞が見られ、一方、キャリヤで処理した細胞ではアポトーシス細胞は１％以下であった。ＸＴＴで求めた細胞障害濃度（cytotoxicity level）とアポトーシス濃度（apoptosis level）とが同程度であることから、実施例３の細胞障害活性はそのアポトーシス誘導性によるものと考えられる。
【００３４】
次に、アポトーシス過程に関わるシグナル伝達経路を調べた。ＮＣ５９細胞を１００μＭ濃度の実施例３の化合物に曝露し、曝露５時間後及び２０時間後の、ｐ５３、ＦＡＫ、及びβ−アクチンの発現レベルと、ＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、及びＰＫＢ／Ａｋｔの活性化レベルを求めた。この結果、従来の遺伝子毒性薬（例えば、５−ＦＵ）によって活性化される経路である、ｐ５３、ＪＮＫ、又はｐ３８以外のシグナル伝達経路の活性化が示された。
【００３５】
結論として、実施例３及び実施例１０の化合物はヒト結腸癌に対する有効な抗腫瘍剤であると言え、これより、一般構造式（Ｉ）で示される化合物は化学予防剤としてだけでなく既に発生した結腸癌に対しても使用可能と考えられる。更に、その抗腫瘍効果はアポトーシスによって行われ、形質導入経路の活性化は、ｐ５３、ＪＮＫ、又はｐ３８以外のシグナルによって行われることから、これらの化合物は、異なる細胞障害作用機序を持つものとして現在の化学治療に新たなプロトコルを加えるものとなろう。
【００３６】
[乳癌における抗腫瘍活性]
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の乳癌細胞系（ＭＤＡＭＢ４５３）に対する効果を求め、その抗腫瘍活性を調べた。この細胞系を、胎児ウシ血清（ライフ・テクノロジーズ製）を１０％加えたＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ製）中、３７℃、ＣＯ２５％で培養した。
【００３７】
テトラゾリウム塩をホルマザンへ代謝する細胞の能力を測定するＸＴＴキット（べーリンガー・マンハイム製）を用いて、細胞障害性試験を行った。
【表５】
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【００３８】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の活性を示す例として、乳癌細胞系に対する実施例３及び実施例１０の化合物の細胞障害活性を示した。ＩＣ５０は、実施例３が１３μＭ、実施例１０が１８μＭであった。
【００３９】
結論として、実施例３及び実施例１０の化合物は乳癌に対する有効な抗腫瘍剤であると言うことができ、これより、一般構造式（Ｉ）で示される化合物は化学予防剤としてだけでなく既に発生した乳癌に対しても使用可能であると考えられる。
【００４０】
[抗血管新生活性]
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現の誘導阻害性を求め、抗血管新生活性を調べた。ＶＥＧＦ発現の増大と腫瘍の進行及び血管新生とは相関がある。ＶＥＧＦは前血管新生因子であり、有糸分裂誘発、遊走、及びインビトロでの内皮細胞の血管透過性の増大を促進する。近年、ＣＯＸ−２は、結腸癌細胞によって誘発される血管新生過程を制御し、前記細胞による前血管新生因子の発現を増大させることができることが示された。ＣＯＸ−２の抑制はこの過程を妨げ、ＶＥＧＦなどこれらの因子のあるものの発現を抑制すると考えられる。
【００４１】
更に、ＶＥＧＦは、単核細胞膜、上皮細胞、及び内皮における組織因子（ＴＦ）の発現も誘導する。ＴＦの主な機能は凝固カスケードの開始であるが、転移及び腫瘍に伴う血管新生に関わる細胞間シグナルを導入することもできる。ＴＦは腫瘍の生体内での成長を促し、血管新生を生じ易くする。ＴＦを形質導入した腫瘍細胞はより著しい血管新生を生じることが示されている。
【００４２】
一般構造式（Ｉ）で示される生成物の抗血管新生活性を調べるため、Ｃａｃｏ−２ヒト結腸癌細胞系を用い、これにヒトＶＥＧＦ遺伝子のプロモータを含むベクターを一時的に形質導入して、基礎及び刺激状態におけるＶＥＧＦプロモータの発現を調べた。試験条件を確立後、そのプロモータのルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＶＥＧＦ及びＴＦ遺伝子の発現に対する供試物質の阻害性を調べた。
【００４３】
２４穴プレート、５００マイクロリットルのＤＥＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地中で、対応するＤＮＡを一時的に導入した、１．２５×１０５Ｃａｃｏ−２細胞を用いて試験を行った。細胞を供試化合物で１時間前処理した後、ＴＰＡで１６時間刺激した。次に細胞抽出物を取り出してそのルシフェラーゼ活性を測定し、蛋白質濃度を求めた。
【００４４】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の活性を示す例として、実施例３及び実施例１０の化合物を用いて得られた結果を以下に示す。ＶＥＧＦ及びＴＦの両者が阻害されていることから、その抗血管新生効果は明らかである。
【表６】
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【００４５】
[腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の阻害]
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）はサイトカインであり、慢性関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、癌に伴う悪液質など様々な炎症状態、更にウィルス感染によるヒトの免疫不全に関わる、強力な前炎症性物質及び免疫調節物質である。ＴＮＦ−αは最初、リポ多糖類（ＬＰＳ）で処置した動物においてある種の腫瘍の出血性壊死を誘発するものとして報告された。これはある種の寄生虫病に伴う摩耗症候群の循環性伝達物質であることから、カケクチンとも呼ばれる。悪液質、あるいはＴＮＦより生じる摩耗は、リポ蛋白のリパーゼを増加させるＴＮＦの性質によって脂肪細胞が消耗するためである。ＴＮＦ−αは、例えば、細菌又はミコバクテリウム蛋白、真菌類抗原、ウィルス、Ｃ５ａ補体、又はγインターフェロンの存在など、様々な刺激によって活性化されると、主にマクロファージによって生産される。
【００４６】
ＴＮＦ−αは、グラム細菌内毒素性ショックの伝達物質の一つであり、発熱、代謝性アシドーシス、下痢、高血圧、播種性血管内凝固症候群、また場合によっては死亡の原因と考えられる。更に、ＴＮＦ−αは好中球を活性化し、ＩＬ−１の遺伝子発現を誘発し、内皮細胞内のＭＨＣ抗原（クラスＩ主要組織適合性を持つ）の発現を増加させることができ、また骨髄の再吸収や滑膜細胞及びヒト線維芽細胞のＰＧＥ２及びコラーゲナーゼの生産にも関与している。これらのことから、この伝達物質の活性を弱めることのできる生成物は、その致死的影響に対抗する臨床的価値を持つことができる（Ｃ．Ａ．マッキンタイアら，Drugs News and Perspectives,1992,5(4),207-213；Ａ．Ｊ．Ｈ．ギヤリングら，Nature,1994,370,555-557；Ｍ．Ａ．パーラバニ，Drugs of Today,1993,29(8),525-533)。
【００４７】
Ｐ．クレムらによって述べられた方法（Europ. J. Pharmacol.,1995,281,69-74）に従って、ＴＮＦ−αの阻害活性を調べた。この方法は、急性の炎症の起きた局部でのＴＮＦ−αの生産を求めるもので、詳細には、マウス体内のザイモサン（zymosan）で膨らませた空気袋モデルを用いるものである。ザイモサンの刺激により前述の袋の中に生産された炎症性滲出物中に存在するＴＮＦ−αを求めた。ＴＮＦ−αの分析定量はＥＬＩＳＡ法で行った。
【００４８】
一般構造式（Ｉ）で示される化合物の活性を示す例として、実施例１０の化合物を用いて得られた結果を以下に示す。投与量に非常に良く相関して、有意のＴＮＦ−α阻害活性が認められた。
【表７】
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