(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチニルエステル、レチノール、レチナール及びそれらの混合物から選択された０．０１％−１％のレチノイドから成り第一効果を提供する第一組成物と、
ゲニステイン、ダイジェイン、グリシチン、ビオチャニンＡ、ホルモノネチン、エクオール及びそれらの混合物から選択された０．００１％−１０％の少なくとも１つのフィトエストロゲンから成り第一効果を増強する第二組成物と、
第一組成物を収容する第一区画と、
第二組成物を収容する第二区画と、
から成り、第一区画と第二区画とが互いに接合されており、第一組成物と第二組成物が相乗効果を奏する量であることを特徴とする安定なスキンケア製品。
【請求項２】
第二組成物が少なくとも２種類のフィトエストロゲンを０．００１％−１０％の量で含有することを特徴とする請求項１に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項３】
フィトエストロゲンが、ゲニステイン、ダイジェイン及びそれらの混合物から選択される請求項１又は２に記載の安定なスキンケア製品。
【請求項４】
乾燥肌、ニキビ、光損傷肌、しわ及び老人斑の出現及び／または老化肌を治療するため、角質層の柔軟性を増加するため、皮膚の色を明るくするため、皮脂分泌を調節するため、皮膚の剥落を改善するため、及び／または、表皮の分化を改善するための請求項１ないし３のいずれか１項に記載の安定なスキンケア製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２区画パッケージの第一区画にレチノイド、第二区画にフィトエストロゲンを含有した安定なスキンケア組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイド（例えば、レチノール及びレチニルエステル）は化粧品に常用の成分である。レチノール（ビタミンＡ）は、ヒトの体内で天然に産生する内因性化合物であり正常な上皮細胞の分化に必須である。天然及び合成のビタミンＡ誘導体は様々な皮膚障害の治療において皮膚の修復剤または再生剤として広く使用されてきた。レチノイン酸は様々な皮膚状態、例えば、ニキビ、しわ、乾癬、老人斑、変色を治療するために使用されてきた。例えば、Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｗ．Ｊ．（１９９０），ｐｐ．４９６−４９８；Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ，”Ｖａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｖｏｌ．３，（１９８９），ｐｐ．２４９−２５２；ＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ９３／１９７４３を参照のこと。
【０００３】
しかしながら、レチノイドの代謝によってレチノイドが効果のない副生物に変換され、その結果として皮膚状態の治療に有効なレチノイン酸の量が減ることもある。従って、従来技術の幾つかの文献は、ニキビ、しわ、乾癬、老人斑及び変色のような皮膚状態の治療を支援するために様々な天然活性物質を使用することを教示している。例えば、フィトエストロゲン（即ち、エストロゲン類似活性を有しており植物に見出される天然化合物）は美容目的及び治療目的で益々使用されるようになった。エストロゲン及びエストロゲンと同様に作用する合成化合物は、皮膚層の厚みを増し、加齢皮膚のしわの形成を抑制することが知られている。閉経後に生じる皮膚の乾燥、皮膚の弾力性の喪失及び肥満などはエストロゲン産生低下が原因であると考えられている。エストロゲン治療は、加齢皮膚に付随する変化の多くを予防または減速させる（Ｃｒｅｉｄｉら，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｃｒｅａｍ（Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標））  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉａｌ  Ｓｋｉｎ，”Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，１９，ｐ．２１１−２１３，１９９４）。
【０００４】
美容効果を目的とした数種類のフィトエストロゲンが従来技術に開示されている。例えば、米国特許第５，７２８，７２６号は、チロシンキナーゼ阻害活性をもつゲニステインの使用を教示している。Ａｖｏｎに譲渡された米国特許第５，８４７，００３号及び第５，８３４，５１３号は、レチノイドに組合せたオキシ酸及びオキシ二酸の使用を開示している。これらの２つのＡｖｏｎ特許は、ゲニステイン及びダイジェイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）のような抗酸化性バイオフラボノイドを任意成分として使用することを開示している。
【０００５】
しかしながら、フィトエストロゲンはレチノールの酸化を誘発し、従って、レチノール分解の一因となることが判明した。複数の組成物をデリバリーする多区画システムは従来技術に記載されているが、フィトエストロゲンをレチノイドから隔離する必要が開示されたことはない。例えば、本発明の所有者に付与された米国特許第５，９１４，１１６号。該特許は特に、皮膚に２つの効果を与える異なる２種類の皮膚活性物質を隔離する２つの独立容器を記載しており、１つの区画にレチノイドが含有され、第二の区画に異なる第二の効果を与える第二の活性物質が含有されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、フィトエストロゲンによるレチノイド増強効果を伴って皮膚にレチノイド効果を与える組成物が依然として要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
約０．００１％−約１０％のレチノイドから成る第一組成物と、
約０．００１％−約１０％のフィトエストロゲンから成る第二組成物と、
第一組成物を収容する第一区画と、
第二組成物を収容する第二区画と、
から成り、第一区画と第二区画とが互いに接合されていることを特徴とする安定なスキンケア製品を提供する。
【０００８】
本文中で使用された“から成る”という用語は、から形成される、から組成される、から構成される、及び／または、本質的にから構成される、ことを含意する。処理実施例及び比較実施例以外、または明白に異なる指定がある場合を除いて、材料の量もしくは比または反応条件、材料の物理的特性及び／または使用量を指定する本明細書中のすべての数値は、“約”という用語で修飾されると理解されたい。
【０００９】
本文中で使用された“コンディショニング”という用語は、美容目的またはその他の目的で乾燥肌、ニキビ、光損傷肌、しわ及び老人斑の出現、老化肌を予防及び治療すること、角質層の柔軟性を増加すること、皮膚の色を明るくすること、皮脂分泌を調節すること、及び、全般的に皮膚の質を向上させることを意味する。組成物はまた、皮膚の剥落及び表皮の分化を改善するために使用し得る。
【００１０】
本発明の組成物は好ましい成分としてレチノイドを含有している。レチノイドは、レチニルエステル、レチノール、レチナール及びレチノイン酸から選択され、好ましくはレチノールまたはレチニルエステルである。“レチノール”という用語は、以下のレチノールの異性体を包含する：全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール；３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノール。好ましい異性体は、全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。商品として入手することが極めて容易であるという理由で全−トランス−レチノールが最も好ましい。
【００１１】
レチニルエステルはレチノールのエステルである。“レチノール”という用語については上記に定義した。本発明に使用するための適当なレチニルエステルは、レチノールのＣ１−Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２−Ｃ２０エステルであり、入手がいっそう容易であるという理由でＣ２、Ｃ３及びＣ１６のエステルが最も好ましい。レチニルエステルの非限定例は、パルミチン酸レチニル、ギ酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、酪酸レチニル、吉草酸レチニル、イソ吉草酸レチニル、ヘキサン酸レチニル、ヘプタン酸レチニル、オクタン酸レチニル、ノナン酸レチニル、デカン酸レチニル、ウンデカン酸レチニル、ラウリン酸レチニル、トリデカン酸レチニル、ミリスチン酸レチニル、ペンタデカン酸レチニル、ヘプタデコン酸レチニル、ステアリン酸レチニル、イソステアリン酸レチニル、ノナデカン酸レチニル、アラキドン酸レチニル、ベヘン酸レチニル、リノレイン酸レチニル、オレイン酸レチニルである。
【００１２】
本発明に使用するための好ましいエステルは、商品として最も入手し易く従って最も廉価であるという理由でパルミチン酸レチニル、酢酸レチニル及びプロピオン酸レチニルから選択される。効能の面からはリノール酸レチニル及びオレイン酸レチニルも好ましい。
【００１３】
レチノールまたはレチニルエステルは本発明組成物中に約０．００１％−約１０％の量、好ましくは０．０１％−約１％の量、最も好ましくは約０．０１％−約０．５％の量で使用される。
【００１４】
フィトエストロゲン
フィトエストロゲンが皮膚に対するレチノイドの効果を相乗的に改善することが意外にも知見され、本発明の一部はこの知見に基づく。本質的に、フィトエストロゲンはレチノイドに対する皮膚の感受性を高める。
【００１５】
従って、本発明は約０．００１％−約１０％の少なくとも１種類のフィトエストロゲンを第二組成物中に含有する。
【００１６】
フィトエストロゲンは、エストロゲン性フラボノイド類、ゲニステイン、ダイジェイン、グリシチン、ビオチャニンＡ、ホルモノネチン及びエクオール及びそれらの混合物、ゲニステイン及びダイジェインのアセチル及びマロニルエステル、ゲニステイン及びダイジェインのグルコシドのようなフラボノイド類を包含する。しかしながらこれらはフィトエストロゲンの非限定例であり、平均的な当業者に公知の別のフィトエストロゲンが包含されることに注目されたい。
【００１７】
２区画パッケージ
レチノイドを含有する組成物は一般に不安定であり、化学分解が生じ易い。フィトエストロゲンは極めて強力なレチノイド増強効果をもつ本発明の必須成分である。ゲニステイン及びダイジェインのようなフィトエストロゲンは皮膚に有益な効果を与えるようにレチノイドと相乗的に相互作用する。しかしながら、フィトエストロゲンは酸化にも関与し、従ってレチノイドの分解に関与する。双方の成分が単一処方に含まれているときには、増強されたレチノイド組成物の総合的効力が、フィトエストロゲンに誘発されるレチノールの不安定化によって劇的に減少する。従って、フィトエストロゲンの有益な相乗効果を維持しながらレチノイドの分解を防御するために、本発明は、レチノイドを含有する第一組成物を第一区画に含有し、少なくとも１種類のフィトエストロゲンを含有する第二組成物を第二区画に含有する２区画パッケージを提供する。第一組成物は皮膚に第一効果を与え、第二組成物は第一効果を増強または増進すべく作用する。
【００１８】
２区画パッケージは、個別の２つの容器で第一及び第二の組成物を供給するという目的が果たされる限り平均的な当業者に公知の様々な方法で設計できる。１つの実施態様では、２区画パッケージは隣り合って接合された２つのジャーまたはびんの形態である。第二の実施態様では、２区画パッケージが１つのびん／ジャーの内部を第一及び第二の区画に分割する仕切りをもつ単一のびん／ジャーの形態である。組成物が独立に保持される限り、本発明の範囲に包含される別の実施態様も考察できる。
【００１９】
化粧品に許容されるビヒクル
本発明の組成物はまた、第一組成物及び第二組成物の一方または双方の有効成分の希釈剤、分散剤または担体として作用し、組成物を皮膚に塗布したときにこれらの有効成分の分布を促進するような、化粧品に許容されるビヒクルを含有している。
【００２０】
水に代替または追加されるビヒクルとしては、液体または固体の皮膚緩和剤、溶媒、保湿剤、増粘剤及び粉末がある。特に好ましい非水性担体としてはポリジメチルシロキサン及び／またはポリジメチルフェニルシロキサンがある。本発明のシリコーンは、２５℃で約１０−１０，０００，０００センチストークスの範囲内の任意の粘度をもつシリコーンであればよい。低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物が特に望ましい。これらのシリコーンはＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙから商標Ｖｉｃａｓｉｌ，ＳＥ及びＳＦとして、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙから２００及び５５０シリーズとして入手できる。本発明の組成物中に使用し得るシリコーンの量は、組成物の５−９５重量％、好ましくは２５−９０重量％の範囲内の任意の値である。
【００２１】
任意の皮膚有益物質及び化粧品添加剤
本発明の第一及び第二組成物の一方または双方では、使用する乳化剤の平均親水疎水バランス（ＨＬＢ）に主として依存して油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンを形成するために油または油性物質を乳化剤と共に存在させてもよい。
【００２２】
本発明の第一及び第二の化粧組成物の一方または双方に様々な種類の有効成分を存在させ得る。有効成分は、皮膚緩和剤以外、及び、組成物の物理的特性を改善するだけの成分以外の皮膚または髪に有益な物質であると定義される。一般的な例は日光遮断剤、皮膚美白剤、日焼け剤、などであるがこれらの種類に限定はされない。
【００２３】
日光遮断剤は紫外光を遮断するために常用の物質から成る。代表的な化合物はＰＡＢＡ、シンナメート及びサリチレートの誘導体である。例えば、オクチルメトキシシンナメート及び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）を使用し得る。オクチルメトキシシンナメート及び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンはそれぞれＰａｒｓｏｌ  ＭＣＸ及びベンゾフェノン−３という商標で市販されている。
【００２４】
エマルジョン中に使用される日光遮断剤の正確な量は、日光紫外線の所望の防御度に従って変更し得る。
【００２５】
別の好ましい任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、即ち、すべての細胞の形質膜形成に必須の脂肪酸から選択される。ケラチノサイト中でＥＦＡ欠乏は細胞を超増殖性にする。これはＥＦＡの補給によって是正される。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成を増進し、表皮のバリアー形成用脂質を供給する。好ましい必須脂肪酸は、リノール酸、Ｙ−リノレン酸、ホモ−Ｙ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、Ｙ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸及びそれらの混合物から選択される。
【００２６】
皮膚緩和剤がしばしば本発明の化粧組成物に添合される。このような皮膚緩和剤のレベルは、全組成物の約０．５重量％−約５０重量％、好ましくは約５重量％−３０重量％の範囲である。皮膚緩和剤はエステル、脂肪酸及びアルコール、ポリオール及び炭化水素のような一般化学物質の種類に分類される。
【００２７】
エステルはモノエステルでもジエステルでもよい。適格な脂肪ジエステルの例は、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート及びジオクチルスクシネートである。適格な分枝鎖状脂肪エステルとしては２−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート及びイソステアリルパルミテートがある。適格な三塩基性酸エステルとしてはトリイソプロピルトリリノレエート及びトリラウリルシトレートがある。適格な直鎖状脂肪エステルとしてはラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、オレイルユールケート及びステアリルオレエートがある。好ましいエステルとしてはココ−カプリレート／カプレート（ココ−カプリレートとココ−カプレートとのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート及びセチルオクタノエートがある。
【００２８】
適当な脂肪アルコール及び脂肪酸としては１０−２０個の炭素原子をもつ化合物がある。特に好ましい化合物は、セチル、ミリスチル、パルミチル及びステアリルのアルコール及び酸のような化合物である。
【００２９】
皮膚緩和剤として役立つポリオールとしては直鎖状及び分枝鎖状のアルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えば、プロピレングリコール、ソルビトール及びグリセリンが好ましい。また、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールのような重合ポリオールも有用である。ブチレン及びプロピレングリコールはまた浸透増進剤として特に好ましい。
【００３０】
皮膚緩和剤として役立つ代表的な炭化水素は、１２−３０個の範囲内の任意の数の炭素原子を含む炭化水素鎖を有している炭化水素である。特定例は鉱油、石油ゼリー、スクアレン及びイソパラフィンである。
【００３１】
本発明の化粧組成物中の別の種類の機能成分は増粘剤である。増粘剤は通常は、組成物の０．１重量％−２０重量％、好ましくは約０．５重量％−１０重量％の範囲内の任意の量で存在するであろう。代表的な増粘剤は、Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから商標Ｃａｒｂｏｐｏｌで入手し得る架橋したポリアクリレート材料である。キサンタン、カラゲナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン及びイナゴマメガムのようなガムを使用してもよい。ある種の状況下では、シリコーンまたは皮膚緩和剤として作用する材料が増粘機能も果たし得る。例えば、１０センチストークス以上のシリコーンゴム及びグリセロールステアレートのようなエステルは二重機能を有している。
【００３２】
本発明の化粧品の第一及び第二の化粧組成物の一方または双方に粉末を添合し得る。これらの粉末としては、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイトクレー、化学的に変性したケイ酸アルミニウムマグネシウム、有機的に変性したモンモリロナイトクレー、水和ケイ酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、デンプンオクテニルコハク酸アルミニウム及びそれらの混合物がある。
【００３３】
また、その他の補助的な少量成分を本発明の化粧品の第一及び第二の組成物の一方または双方に添合し得る。これらの成分としては着色料、乳白剤及び香料がある。これらの材料の量は組成物の０．００１重量％−２０重量％までの範囲内の任意の量でよい。
【００３４】
本発明の化粧品の第一及び第二の組成物は主としてヒトの皮膚に局所的に塗布する製品、特に皮膚の状態を調整し皮膚を滑らかにする製品、並びに、しわまたは老化肌の出現を予防または抑制する製品として提供される。
【００３５】
使用の際には、適当な容器またはアプリケーターから少量、例えば１−５ｍｌの第一組成物を皮膚の露出領域に塗布し、必要ならば手または指または適当なデバイスを使用して皮膚に展着させるか及び／または擦り込む。同時に、適当な容器またはアプリケーターから少量、例えば１−５ｍｌの第二組成物を皮膚の露出領域に塗布し、必要ならばこれも手または指または適当なデバイスを使用して皮膚に展着させるか及び／または擦り込む。従って、所望の治療効果の程度に応じて、第一組成物と第二組成物とを単独で使用してもよく、同時に使用してもよく、または順次に使用してもよい。
【００３６】
製品の形態及び包装
本発明の外用皮膚トリートメント組成物はローション、流体クリーム、クリームまたはジェルの形態に配合できる。
【実施例１】
【００３７】
レチノイドとフィトエストロゲンとの相乗作用
（ａ）細胞培養方法
この試験では、２５−３０歳の有志の女性被験者の日光防御した腕の内側から採取したヒトの成熟線維芽細胞を使用した。１０％ＦＢＳを含有する１：１のＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地中の細胞を標準周囲酸素圧力下、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃に維持することによって増殖させた。第三継代の成熟線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地中、１２ウェルのプレートで２５００細胞／ｍｌ／ウェルの播種密度で増殖させた。８０％単層集密度の細胞を無血清及びフェノールレッド非含有（ＰＲＦ）ＤＭＥＭ培地中で２回洗浄した。植物性化合物による前処理を４時間実施し、次いで所定用量のレチノイドを加えて４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、細胞単層を１００μｌの細胞溶解バッファ（１×ＰＢＳ、１％トリトンＸ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビター（１０ｍｇ／ｍｌのイソプロパノール中のＰＭＳＦ、１０μｌ／ｍｌ）含有の０．１％のＳＤＳを含有する）に採取した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を収集し、この上清のアリコートをタンパク質定量に使用した。タンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅタンパク質キットを使用して測定した。１００μｌの上清（細胞溶解液）の残りは、４０μｌのサンプルバッファ（ＮＯＶＥＸ）及び０．５％のベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）の混合物中でサンプルを５分間煮沸することによって変性した。次に、ＳＤＳ  ｐａｇｅによるタンパク質解析を行うために等しい量のタンパク質を１６％のトリス−グリシンゲルに充填し、ＣＲＡＢＰ−２タンパク質発現を測定するためにウェスタンイムノブロッティングで処理した。
【００３８】
（ｂ）細胞性レチノイン酸結合タンパク質２（ＣＲＡＢＰ−２）の検出
細胞の内部でレチノールおよびレチノイン酸は特異的細胞性結合タンパク質に結合する。主要タンパク質の２つはＣＲＡＢＰ−１及び２である（Ｒｏｏｓら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ：５０，３１５−３３３，１９９８）。これらのタンパク質はレチノイド代謝における貯蔵タンパク質またはシャトルタンパク質の双方として作用することによってレチノイドの細胞内濃度を調節すべく作用する。高レベルまたは低レベルのレチノイドは細胞死を含む細胞損傷を惹起する。従って、レチノイド及びその結合タンパク質を一定レベルに調節することは細胞生存に極めて重要である。このタンパク質のレベルは細胞内部のレチノイン酸の量によって調節される。レチノイドの細胞内レベルが高いほど、ＣＲＡＢＰ−２の発現が増加する。従って、細胞内のこのタンパク質の量は細胞のレチノイド活性を表す規準となる。皮膚細胞は表皮及び真皮の双方にＣＲＡＢＰ−２を高レベルで含有している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ線維芽細胞中のレチノイド投与に対するＣＲＡＢＰ−２応答は、ヒトの皮膚応答を予測するために生体内レチノイド活性の再現可能な規準として使用されている（Ｅｌｄｅｒら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：５１７−５２１，１９９６）。ＣＲＡＢＰ−２の増加はまた、表皮分化及び真皮レチノイド作用の増進に関連する。従って、これらの試験では、線維芽細胞のＣＲＡＢＰ−２発現を表皮分化の増進（皮膚コンディショニング効果及び乾燥肌に対する効果）並びに真皮コラーゲン及び細胞外マトリックスの合成の増進（老化防止、しわ防止効果）の規準として使用した。
【００３９】
線維芽細胞中のＣＲＡＢＰ−２のレベルを測定するために、細胞上清の等しい量のタンパク質を製造業者の指示通りにドットブロット装置のニトロセルロースブロットにロードし、ＣＲＡＢＰ−２に対するモノクローナル抗体を使用して標準手順に従って免疫染色を行った。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）から得られた化学発光システムを使用してドットブロット中のＣＲＡＢＰ−２タンパク質バンドを可視化した。フィルム中のバンドを密度測定走査によって定量し、３重複サンプルから得られたデータを対照に対する％として計算し、３重複サンプルの対照に対する増加％（対照を１００％とする）＋／−ＳＤとして以下の表に表した。
【実施例２】
【００４０】
フィトエストロゲン性フラボノイドの存在下のレチノールの安定度
レチノールを水性エタノール（１：１の水：エタノール）中に１０％溶液として溶解した。この溶液を０．００１％（約３０μＭ）に希釈した。この溶液は９６ウェルプレート分光光度計中、３６０ｎｍで約０．３５吸光単位のＯＤを与えた。
【００４１】
ゲニステイン、ダイジェインの水エタノール系予製液を０．１％、０．０１％または０．００１％で調製した。９６ウェルプレート中の０．００１％のレチノール溶液２００μｌに、最終フラボノイド濃度０．０１、０．００１及び０．０００１％を与える２０μｌのフラボノイド（即ち、１−１０に希釈）を添加した。プレートを混合し、３６０ｎｍの初期ＯＤを読み取った。プレートを暗中、室温で２日間までインキュベートし、次いで８、２４及び４８時間目に読み取りを行った。これらの時点のＯＤ読み取り値を０時点の読み取り値に標準化した。レチノールの安定度を０時点のレチノールに対する％として表した（ＯＤ読み取り値）。データを以下の表に示す。
【００４２】
以下の２つの表では、ゲニステイン及びダイジェインとレチノイドとの間の相乗作用を試験した。双方の試験で、ゲニステインはＤＭＳＯ：エタノール中の可溶性形態で細胞に供給された。１μＭのゲニステインは単独でＣＲＡＢＰ−２を有意に刺激した。ゲニステインとダイジェインとの双方はレチノイド活性を相乗的に刺激する。酢酸レチニルを除く試験した全部のレチノイドがゲニステイン及びダイジェインとの相乗作用を示した。これらのデータは、フィトエストロゲン性フラボノイド、ゲニステイン及びダイジェインは可溶性形態で細胞に供給されたときにレチノイドの活性を相乗的に増進したという我々の主張を支持する。
【００４３】
【表１】
0004451062.tif 000002
【００４４】
【表２】
0004451062.tif 000003
【００４５】
以下の表は、レチノールの不安定化に対するゲニステイン及びダイジェインの影響を示す。方法の項に記載の手順で実験した。重複測定によるＯＤ測定値の平均を以下に示す。
【００４６】
【表３】
0004451062.tif 000004
【００４７】
【表４】
0004451062.tif 000005
【００４８】
レチノールは他の薬剤が存在しない単独状態ではゆっくりと分解した（８時間で８％、２４時間で１４％、４８時間で１９％）。しかしながら、ゲニステイン及びダイジェインの存在下ではレチノールの分解が促進された。これらのフラボノイドの存在下では８時間という早い時期に１６−１８％のレチノールが分解した。これは、ゲニステイン及びダイジェインの双方がレチノールの不安定度を著しく増加させたことを示唆する。このため、レチノイドとフラボノイドとを含有する製品ではレチノール用の１つの区画とフラボノイド用の別の区画とから成る特別なパッケージングを使用することが必要になるであろう。