(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させるペントース−５−リン酸エステルの製造方法であって、
ペントースが（３Ｓ、４Ｒ）または（３Ｒ、４Ｓ）のペントースであり、ペントース−５−リン酸エステルが（３Ｓ、４Ｒ）または（３Ｒ、４Ｓ）のペントース−５−リン酸エステルであり、
ペントースがリボース、アラビノース、または２−デオキシリボースであり、ペントース−５−リン酸エステルがリボース−５−リン酸エステル、アラビノース−５−リン酸エステル、または２−デオキシリボース−５−リン酸エステルであり、
リン酸供与体がピロリン酸又はその塩であり、
ペントースとピロリン酸又はその塩とのモル濃度比を１：５〜７で反応させ、かつ、
酸性ホスファターゼがＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉに由来する酸性ホスファターゼである、ペントース−５−リン酸エステルの製造方法。
【請求項２】
酸性ホスファターゼが１Ｕ／ｍＬ以上存在する条件下で反応させる、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ペントース−５−リン酸エステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、医薬品および機能化学品の製造原料の一つであるヌクレオシド類を合成する出発物質として有用なペントース−５−リン酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ペントース−５−リン酸エステルは、ヌクレオシド類を合成する出発物質として有用な化合物である。例えば、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをホスホペントムターゼにより２−デオキシリボース−１−リン酸エステルに変換し、次いでヌクレオシドホスホリラーゼによって各種核酸塩基とグリコシル化することにより、各種デオキシリボヌクレオシド類を製造する方法が報告されている（特許文献１）。この製造方法で用いられている２−デオキシリボース−５−リン酸エステルは、ＤＮＡの酵素による加水分解により調製されているが、この調製方法は、原料となるＤＮＡが高価であり、分離・精製の工程の多い方法である。【０００３】  また、デオキシリボキナーゼを２−デオキシリボースならびにリン酸供与体であるアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）に作用させ、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを生成させる方法も報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法に用いられるＡＴＰは高価である。【０００４】  ＡＴＰに比べて安価なポリリン酸をリン酸供与体とし、仔ウシ腸に由来するアルカリホスファターゼを用いて有機ヒドロキシル化合物をリン酸化する方法も報告されている（特許文献２）。ここには、有機ヒドロキシル化合物として、アルコール類であるグリセロール、糖類であるＤ−グルコースおよびＤ−リボースを使用した実験が記載されている。Ｄ−グルコースおよびＤ−リボース等の糖類には分子内に複数個の水酸基が存在するが、該糖類の分子内に存在する水酸基のうちのどの水酸基にリン酸基が導入されるのかについては明らかにされていない。【０００５】  ホスファターゼは反応至適ｐＨの違いによって酸性ホスファターゼとアルカリホスファターゼに分類される。酸性ホスファターゼを用いたリン酸化反応としてヌクレオシドおよびグルコースのリン酸化反応が報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、これまで酸性ホスファターゼによるペントースのリン酸化反応を示した例はない。
【特許文献１】ＷＯ０１／１４５６６
【特許文献２】特開平０１−２７４８４
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６４，１９７４
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９２，２００１
【非特許文献３】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は、ペントース−５−リン酸エステルを簡便に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ペントースとポリリン酸との反応を酸性ホスファターゼの存在下で行うことにより、ペントース−５−リン酸エステルのみが選択的に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】  すなわち本発明は、ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させるペントース−５−リン酸エステルの製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】  本発明によれば、２−デオキシリボース等のペントースとピロリン酸等のリン酸供与体とから、選択的かつ簡便に２−デオキシリボース−５−リン酸エステル等のペントース−５−リン酸エステルを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】デオキシリボース（以下、「ｄＲ」と略記する。）に対してピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液の濃度を１００ｍＭ〜７００ｍＭに変えて反応させて得られた結果を示す図である。
【００１１】  ［１］ｄＲ／ピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液＝１００／１００
［２］ｄＲ／ピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液＝１００／３００
［３］ｄＲ／ピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液＝１００／５００
［４］ｄＲ／ピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液＝１００／７００
【図２】反応液中の活性値を０．７３Ｕ／ｍＬ〜７．３Ｕ／ｍＬ（０．５〜５．０ｍｇ湿菌体／ｍＬ）に変えて反応させて得られた結果を示す図である。
【００１２】  ［１］０．７３Ｕ／ｍＬ（０．５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）
［２］１．５Ｕ／ｍＬ（１．０ｍｇ湿菌体／ｍＬ）
［３］３．６Ｕ／ｍＬ（２．５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）
［４］７．３Ｕ／ｍＬ（５．０ｍｇ湿菌体／ｍＬ）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本明細書において、「ペントース」とは、「リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、１〜３位の水酸基が水素原子に置換されたリボース、１〜３位の水酸基が水素原子に置換されたキシロース、１〜３位の水酸基が水素原子に置換されたアラビノース、１〜３位の水酸基が水素原子に置換されたリキソース、１〜３位の水酸基が炭素数１〜５のアルコキシル基に置換されたリボース、１〜３位の水酸基が炭素数１〜５のアルコキシル基に置換されたキシロース、１〜３位の水酸基が炭素数１〜５のアルコキシル基に置換されたアラビノースまたは１〜３位の水酸基が炭素数１〜５のアルコキシル基に置換されたリキソース」を意味するものと定義する。【００１４】  ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させることによりペントース−５−リン酸エステルを製造することができる。【００１５】  本発明に使用されるペントースとしては、例えば、リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、２−デオキシリボース、２−デオキシキシロース、２−デオキシアラビノース、２−デオキシリキソース、１−メトキシリボース、１−メトキシキシロース、１−メトキシアラビノース、１−メトキシリキソース、１−メトキシ−２−デオキシリボース、１−メトキシ−２−デオキシキシロース、１−メトキシ−２−デオキシアラビノースおよび１−メトキシ−２−デオキシリキソース等が挙げられる。これらはＤ体であってもＬ体であっても構わない。【００１６】  ペントース中には不斉炭素原子が存在する。本発明に使用されるペントースとして、３位および４位の立体配置が（３Ｓ、４Ｒ）または（３Ｒ、４Ｓ）であるペントースは好ましい。【００１７】  本発明に使用されるペントースとして、リボース、アラビノース、２−デオキシリボースおよび１−メトキシ−２−デオキシリボースはより好ましい。【００１８】  本発明に使用されるリン酸供与体としては、酸性ホスファターゼの存在下でペントースにリン酸基を与えてペントース−５−リン酸エステルを製造しうるものであれば制限はなく、例えば、ポリリン酸またはその塩が挙げられる。【００１９】  ポリリン酸またはその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、およびこれらのナトリウム塩もしくはカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。【００２０】  これらのリン酸供与体は単独で使用してもよく、また二種類以上を併用することもできる。【００２１】  前記のリン酸供与体の中でも、ピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩は好ましい。【００２２】  本発明に使用される酸性ホスファターゼとしては、ペントースの５位の炭素原子にリン酸基を導入する反応を触媒するものであれば特に制限はなく、種々の生物由来の酸性ホスファターゼが使用できる。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ等のカビに由来するフィターゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等の酵母に由来するフィターゼ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇ��ｎｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ等の細菌に由来する酸性ホスファターゼ、ニワトリ等の動物に由来する酸性ホスファターゼ、ジャガイモ等の植物に由来する酸性ホスファターゼ等が挙げられ、これらは市販品として入手できるものもある。これらの中でも、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属）、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）由来の酸性ホスファターゼは好ましい。【００２３】  近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、目的遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により製造および取得することが容易になった。そのため、前記の微生物が産生する酸性ホスファターゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、酸性ホスファターゼを産生する遺伝子組換え体を作出することができる。【００２４】  ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボソーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボソームＲＮＡの３‘末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、酸性ホスファターゼの上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そのＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミテーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、��１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７等をベクターとして利用することができる。【００２５】  ここでいう任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌（Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。【００２６】  酵母を宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、ｅｎｏ−１プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター等が挙げられる。プラスミドの具体例としては、酵母内で自律複製可能なｐＥＳＣ、ｐＰＩＣ、ｐＡＯ、ｐＭＥＴ、ｐＹＥＳ、ｐＴＥＦ、ｐＮＭＴ等が挙げられるが、これらは大腸菌内でも自律複製可能である。宿主の具体例としては、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ等が挙げられる。【００２７】  本発明の製造方法には、酸性ホスファターゼ産生能を有する微生物および高等生物由来の細胞、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞そのものおよびこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物および該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した酸性ホスファターゼ活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。【００２８】  前記の反応に使用するペントースとリン酸供与体のモル比は特に制限されないが、通常、どちらか一方が他方に対して１倍モルより多く存在する条件下で反応は行われる。例えば、リン酸供与体がペントースに対して１倍モルより多く２０倍モル以下存在する条件下で行われる。しかしながら、リン酸供与体がペントースに対して多く存在する条件下で反応させることでペントース−５−リン酸エステルの生成量は増加するが、リン酸供与体がペントースに対して多く存在しすぎると、リン酸の産廃が多く発生してしまいプロセス上好ましくない。よって、好ましくはリン酸供与体がペントースに対して３倍モル以上７倍モル以下存在する条件下で行われる。【００２９】  反応液中のペントースの濃度は特に制限されないが、通常、０．０５〜２Ｍの範囲で行われ、好ましくは０．１〜１．０Ｍの範囲で行われる。【００３０】  反応液中のリン酸供与体の濃度は、酸性ホスファターゼの酵素活性が阻害されない範囲であれば特に制限されないが、通常、０．０５〜２Ｍの範囲で行われ、好ましくは０．１〜１．０Ｍの範囲で行われる。【００３１】  反応液中の酸性ホスファターゼの活性値は、ペントース−５−リン酸エステルが生成する量が存在すれば特に制限されないが、通常、１〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲で行われ、好ましくは１．５Ｕ／ｍＬ以上存在する範囲で行われる。しかしながら、反応液中の酸性ホスファターゼの活性値を４Ｕ／ｍＬまで下げてもペントース−５−リン酸エステルの生成量に変化はないが、４Ｕ／ｍＬより下げるとペントース−５−リン酸エステルの生成量も低下していく。よって、より好���しくは反応液中の酸性ホスファターゼの活性値が４Ｕ／ｍＬ以上存在する範囲で行われる。【００３２】  反応温度は、ペントース−５−リン酸エステルが生成する温度範囲であれば特に制限されないが、通常、２０〜４０℃の範囲で行われ、好ましくは３０〜３７℃の範囲で行われる。【００３３】  反応液のｐＨは、ペントース−５−リン酸エステルが生成する範囲であれば特に制限されないが、通常、ｐＨは３．０〜６．０の範囲で行われ、好ましくは３．５〜４．０の範囲で行われる。【００３４】  酸性ホスファターゼの中にはマグネシウムイオン等の二価の金属イオンでホスファターゼ活性の向上が見られるものもあるため、必要に応じて二価の金属イオンのような多価金属化合物等を反応液中に存在させることができる。【００３５】  前記の反応により、反応に使用するペントースに対応するペントース−５−リン酸エステルが得られる。Ｄ体のペントースからはＤ体のペントース−５−リン酸エステルが、Ｌ体のペントースからはＬ体のペントース−５−リン酸エステルが得られる。【００３６】  本発明者らは、３位および４位の立体配置が（３Ｓ、４Ｒ）または（３Ｒ、４Ｓ）であるペントースを使用することにより、対応する３位および４位の立体配置が（３Ｓ、４Ｒ）または（３Ｒ、４Ｓ）であるペントース−５−リン酸エステルがそれぞれ選択的に得られることを見出した。すなわち、本発明の製造方法は、選択的にペントース−５−リン酸エステルを製造する方法として有用である。【００３７】  例えば、リボース、アラビノース、２−デオキシリボースまたは１−メトキシ−２−デオキシリボースとピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩とを、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属）、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）由来の酸性ホスファターゼの存在下で反応させることにより、リボース−５−リン酸エステル、アラビノース−５−リン酸エステル、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルまたは１−メトキシ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステルがそれぞれ得られる。【００３８】  本発明の製造方法の一実施態様としては、例えば、所望のｐＨに調整したバッファー中にペントースとリン酸供与体を存在させ、そこに酸性ホスファターゼを加えて反応させる方法が挙げられる。【００３９】  前記の反応で得られるペントース−５−リン酸エステルは、反応液から金属塩として沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィー等の公知の分離方法を用いて分離することができる。【００４０】  以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実験において生成した目的化合物の分析は高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）に依った。ＨＰＬＣ分析の条件を次に示す。【００４１】  カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（昭和電工）
移動相：５０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム
検出器：示差屈折率計
また、培養して得られた菌体のホスファターゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルリン酸エステルからｐ−ニトロフェノール（ε＝１６６００Ｍ−１ｃｍ−１、ｐＨ６．０）への変化を４１０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより求めた。ホスファターゼ活性の測定条件は次のとおりである。【００４２】  １００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ６．０）、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸エステルを含む溶液に、実施例１で調製した培養菌体を添加して、３７℃で１５分間反応させた。１ＮのＮａＯＨを添加して反応を停止し、４１０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。１ユニット（Ｕ）の定義を１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニルを遊離することができる酵素量とした。
［参考例１］
公知のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＹＳＨ６０００に由来する酸性ホスファターゼ配列をもとに、配列番号１および配列番号２に示した２種のプライマーを作成し、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＹＳＨ６０００由来の酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭのＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭの硫酸マグネシウム、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、５０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、約０．７５ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ処理し、ｐＵＣ１９に連結した。作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスファターゼ活性の発現株を作成した。【００４３】  バッフル付フラスコにＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を調製し、１２０℃、２０分間殺菌後、作成したホスファターゼ活性の発現株を植菌して、３７℃、１２０ｒｐｍで振とう培養した。遠心分離によって菌体を回収したところ、１Ｌの培養液から湿重量で３．３７ｇの菌体が得られた。なお、この菌体の活性値は４９３０Ｕであった。
【実施例１】
【００４４】  １００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのＤ−２−デオキシリボースを含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が７．３Ｕ／ｍＬ（５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように調整した菌体液を添加して、３７℃で１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、１．５ｍＭのＤ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成していた。
【実施例２】
【００４５】  １００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのＤ−２−デオキシリボースを含む溶液に、１００ｍＭ〜７００ｍＭの濃度となるようにピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）を添加し、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が７．３Ｕ／ｍＬ（５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように菌体液を添加して、３７℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果を図１に示した。
【実施例３】
【００４６】  １００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、７００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭの各種ペントースを含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が７．３Ｕ／ｍＬ（５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように菌体液を添加して、３７℃で１時間反応させた。基質として用いた各種ペントースは、Ｌ−２−デオキシリボース、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノースである。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、Ｌ−２−デオキシリボースより９．６ｍＭのＬ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステル、Ｄ−リボースより１６．６ｍＭのＤ−リボース−５−リン酸エステルＤ−アラビノースより４．９ｍＭのＤ−アラビノース−５−リン酸エステル、Ｌ−アラビノースより２．８ｍＭのＬ−アラビノース−５−リン酸エステルが生成していた。
【実施例４】
【００４７】  １００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのＤ−２−デオキシリボースを含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が０．７３〜７．３Ｕ／ｍＬ（０．５〜５．０ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように菌体液を添加して、３７℃で１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果を図２に示した。
【実施例５】
【００４８】  ２Ｍのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ４．０）、２ＭのＤ−２−デオキシリボースを含む溶液２ｍＬに、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ＩＦＯ１８４０に由来するフィターゼの調製液を６０μＬ（１５０Ｕ）添加して、３７℃で４時間反応させた。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ＩＦＯ１８４０に由来するフィターゼの調製は、特開平１１−２０６３６８に記載の方法に依った。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、１５ｍＭのＤ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成していた。
【実施例６】
【００４９】  ０．３３ｇのピロリン酸カリウム、２．５ｇの２−デオキシリボースを含む溶液を塩酸にてｐＨ４．５に調整し、５ｍＬに希釈した。これにＡｓｐｅｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ  ＮＲＲＬ３１３５に由来するフィターゼ（ＳＩＧＭＡ）を２５ｍｇ（１００Ｕ）添加して、３７℃で１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、２２ｍＭのＤ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成していた。
【実施例７】
【００５０】  ２Ｍのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ４．０）、２Ｍの１−メトキシ−Ｄ−２−デオキシリボースを含む溶液１．５ｍＬに、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が３．９Ｕ／ｍＬ（４ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように菌体液を添加して、３７℃で２２時間反応させた。また、それとは別に、実施例６で用いたＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ＩＦＯ１８４０に由来するフィターゼの調製液３０μＬ（７５Ｕ）を添加した反応液、実施例７で用いたＡｓｐｅｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ  ＮＲＲＬ３１３５に由来するフィターゼ７．５ｍｇ（２０Ｕ）を添加した反応液も同様に調整して、５時間反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、調製した培養菌体を添加した場合で３００ｍＭ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ＩＦＯ１８４０に由来するフィターゼを添加した場合で２０ｍＭ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ  ＮＲＲＬ３１３５に由来するフィターゼを添加した場合で３０ｍＭの１−メトキシ−Ｄ−２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成していた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】  本発明は、ヌクレオシド類を合成する出発物質として有用なペントース−５−リン酸エステルを簡便に製造する方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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