(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性のヒト前駆型カスパーゼ１遺伝子とケラチン１４プロモータとを含む組み換えＤＮＡを有し、持続的にアトピー性皮膚炎を生じるトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫。
【請求項２】
当該組み換えＤＮＡが、さらにβ−グロビンイントロンを有するものである請求項１記載の動物又はその子孫。
【請求項３】
当該組み換えＤＮＡが、さらにケラチンのポリＡを有するものである請求項１又は２記載の動物又はその子孫。
【請求項４】
当該組み換えＤＮＡが、ケラチン１４プロモータ、β−グロビンイントロン、外来性のヒト前駆型カスパーゼ１遺伝子、及びケラチンのポリＡを有する組み換えＤＮＡである請求項１〜３のいずれか１項記載の動物又はその子孫。
【請求項５】
血中に持続的に成熟型IL-18を分泌するものである請求項１〜４のいずれかに記載の動物又はその子孫。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の動物又はその子孫に被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防又は治療用物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物の受精卵に、外来性のヒト前駆型カスパーゼ１遺伝子とケラチン１４プロモータとを含む組み換えＤＮＡを導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の動物又はその子孫の作製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、アトピー性皮膚炎モデル動物として有用なトランスジェニック動物に関する。
背景技術
アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアトピー性疾患は正常人が反応しない環境抗原等に対して過敏に反応を示し、自己の免疫系による各臓器の破壊、障害を生ずる疾患である。これらの疾患の発生機序にはアレルギー反応を増強するＴｈ２型サイトカインの関与が想定されている。その誘導機序、調節機序の解明は生理学及び薬学上重要な意味を持つが、詳細なメカニズムは明らかにされていない。
現在、アトピー性疾患の治療には主として、抗原からの回避、ヒスタン等のメディエーターの受容体の結合に拮抗する抗ヒスタミン剤、抗炎症ステロイド剤等によるものが知られているが、より特異的な作用機序をターゲットとした治療方法の開発は、適切な実験動物がないことにより妨げられている。
従来、実験動物にアレルギー反応を誘発させるためには、予め抗原乃至アレルゲンを繰り返し免疫することにより動物を感作しておいてから当該抗原乃至アレルゲンを投与する必要があった。この場合、同時に多数の動物を感作するのは多大な労力を要するばかりでなく、個々の動物間に反応性のばらつきが生じることがあり、実験の再現性の上で問題となることがあった。
近年、ＮＣ／Ｎｇａマウスがアトピー性皮膚炎のモデル動物として注目されているが、このマウスに起こる皮膚炎はダニ存在下で初めて発症するもので、その発症率も不安定であり、症状も一定しない。
アトピー性疾患の治療薬の開発には動物実験が不可欠で、特にアトピー性皮膚炎のモデル動物が希求されているが、遺伝的背景が確立され、免疫学的にも明らかで、特異的病原微生物を排除した条件下で各種治療法及び薬剤の開発研究に利用可能なアトピー性皮膚炎モデル動物は現在のところ存在せず、実用に供されていない。
従って、本発明の目的は、アトピー性皮膚炎モデルとして有用な動物を作製することにある。
発明の開示
そこで本発明者らはインターロイキン１８（ＩＬ−１８）に着目した。ＩＬ−１８は、カスパーゼ１（ＩＬ−１β変換酵素）と呼ばれるプロテアーゼによってプロセシングを受けて前駆型から成熟型に変換される。成熟型のＩＬ−１８の機能としては、（１）ＩＦＮ−γ産生の誘導、（２）Ｆａｓリガンド発現の増強によるＦａｓ介在性アポトーシスの増強、（３）ＧＭ−ＣＳＦの誘導、（４）ＩＬ−１２との共存によるＩｇＥ産生抑制等が知られている。また、ＩＬ−１８は免疫組織以外の骨芽細胞様間質細胞、ケラチノサイト、小腸上皮細胞、副腎皮質細胞、下垂体細胞といったさまざまな組織でも発現されており、その生理学的な役割について活発な研究が行われている（免疫１９９７−９８，中山書店，６２−７２；臨床免疫，３０（２），１９１−１９８，１９９８等参照）。近年、発明者等はＩＬ−１８単独で過剰発現した場合は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の産生を増強し、ＩｇＥ産生を誘導する知見を得た。このことは、ＩＬ−１８がアトピー性疾患の発症に関係するＴｈ２型サイトカインに深く関与していることを意味する。従って、ＩＬ−１８を成熟型に変換するカスパーゼ１の分泌が促進されたモデル動物が作製されれば、アトピー性疾患の発症メカニズムの解明、治療法の開発に有用であると考えた。しかし、カスパーゼ１はアポトーシス誘導酵素であるため、単にこの遺伝子を導入して生体内で発現させると致死的になるという問題があった。また、成熟型ＩＬ−１８を分泌させるには、前駆型ＩＬ−１８を産生する細胞にカスパーゼ１が発現される必要があった。そこで、カスパーゼ１遺伝子を前駆型ＩＬ−１８を産生しうる皮膚特異的に発現するようなＤＮＡに組み換えて動物細胞に導入すれば、血中に持続的に成熟型ＩＬ−１８を分泌し、ダニ、カビ類等の特異的病原微生物を排除した条件下において飼育してもアトピー性皮膚炎の症状を呈するトランスジェニック動物が作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、本発明者らは先にカスパーゼ１遺伝子を受精卵ではなく、正常マウスに直接注射してカスパーゼ１による細胞死と炎症を検討した（Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．２１（１９９９）：４９−５８）。しかし、このマウスは炎症を自然発症するものでなく、本発明動物とは全く異なる。
すなわち、本発明は、外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込んだＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその子孫、及びその作製方法を提供するものである。
また本発明は、上記トランスジェニック動物に被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防又は治療用物質のスクリーニング方法、及び当該スクリーニングによりアトピー性皮膚炎の改善効果を有すると判定される物質を含有するアトピー性皮膚炎の予防又は治療用医薬を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のトランスジェニック動物は、体細胞及び生殖細胞に外来性のカスパーゼ１（ＣＡＳＰ１）遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込んだＤＮＡを有する。ここで外来性カスパーゼ１遺伝子としては、ヒト又はマウスのカスパーゼ１遺伝子が好ましく、例えばヒト前駆型カスパーゼ１（ｈｐｒｏＣＡＳＰ１）、マウス前駆型カスパーゼ１（ｍｐｒｏＣＡＳＰ１）、ヒトカスパーゼ１（ｈＣＡＳＰ１）、マウスカスパーゼ１（ｍＣＡＳＰ１）等の遺伝子が挙げられるが、ｈｐｒｏＣＡＳＰ１の完全なコード領域の１．４ｋｂ  ｃＤＮＡが特に好ましい。
外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込んだＤＮＡとしては、外来性カスパーゼ１遺伝子と皮膚特異的蛋白のプロモータとを含む組み換えＤＮＡが好ましい。ここで、皮膚特異的蛋白のプロモータとしては、皮膚に特異的に存在する蛋白のプロモータが挙げられ、例えばケラチン１４、ケラチン５、ケラチン１、ケラチン１０、インボルクリン等のプロモータが挙げられるが、ケラチンプロモータが特に好ましい。外来性カスパーゼ１遺伝子は、皮膚特異的蛋白のプロモータの下流に結合されるが、このとき、遺伝子の発現効率を上げるためβ−ｇｌｏｂｉｎイントロン等のイントロンも結合するのが好ましい。
上記ＤＮＡは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することができる。好ましくは、前記皮膚特異的蛋白のポリＡ、特に好ましくはケラチンのポリＡなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５′上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３′下流に連結することも目的により可能である。
かくして得られる組み換えＤＮＡを導入するための非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットであり、なかでも齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、とりわけマウスが好ましい。
本発明のトランスジェニック動物は、例えば非ヒト哺乳動物の受精卵に、前記外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚特異的に発現するように組み込んだＤＮＡを導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させることにより作製される。ここで、受精卵としては、雄精前核時期（受精後約１２時間位）のものが好ましい。また組み換えＤＮＡの導入方法としては、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが挙げられるが、マイクロインジェクション法が特に好ましい。
組み換えＤＮＡを導入した受精卵は、当該受精卵と同様の動物の雌に着床させる。着床の手段は、偽妊娠雌性動物の卵管に人工的に移植、着床させる手段が好ましい。かくして、受精卵を着床させた動物から生まれた仔の中から、目的とする遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体を継代すればよい。
得られたトランスジェニック動物に目的遺伝子が含まれているか否かの確認は、皮膚からＤＮＡを採取し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びサザンブロッティング法による導入遺伝子の解析によって行うことができる。
かくして得られる本発明のトランスジェニック動物は、皮膚において外来性カスパーゼ１遺伝子が発現されるため、特異的病原微生物の非存在下でもアトピー性皮膚炎の症状を呈し、かつ長期間生存するという特徴を有する。
すなわち、本発明のトランスジェニック動物は、外来性のカスパーゼ１遺伝子を皮膚のみに有し、他の組織、例えば肝臓、腎臓、肺、脳、脾臓では有さない。その結果、本発明のトランスジェニック動物の皮膚には、成熟型ＩＬ−１８及び成熟型ＩＬ−１βが含まれている。さらに本発明のトランスジェニック動物の血中には成熟型ＩＬ−１８及び成熟型ＩＬ−１βが正常動物に比べて大量含まれているが、その含有量は成熟型ＩＬ−１βに比べて成熟型ＩＬ−１８のほうが多い。
本発明のトランスジェニック動物は、８週齢ぐらいからアトピー性皮膚炎の症状を、例えば蚕食状皮膚炎、びらん性皮膚炎、皮膚潰瘍、びらんなどを呈する。また、皮膚組織の光学顕微鏡観察では、１０週齢ぐらいから、潰瘍の周辺の厚い表皮には、錯角化症を伴った乾癬様あるいは表皮肥厚といった変化が生じ、潰瘍の真皮には、単核細胞ならびに肥満細胞の浸潤が生じる。傷害部位の角質細胞は、核凝縮を伴った好酸性壊死を示し、これは角質細胞のアポトーシスの徴候である。また、本発明のトランスジェニック動物は、正常動物に比べて極めて多くの皮膚掻破行動をくり返し、アトピー性皮膚炎特有の強い掻痒を伴うことがわかる。さらに、本発明のトランスジェニック動物は、血中のヒスタミンレベル及びＩｇＥが極めて高いという、アトピー性皮膚炎特有の症状を示す。
このように本発明のトランスジェニック動物は、特異的病原微生物非存在下で、アトピー性皮膚炎の症状を呈するので、アトピー性皮膚炎の症状モデルとして有用である。すなわち、本発明のトランスジェニック動物又はその子孫に被験物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定すれば、アトピー性皮膚炎の予防又は治療用物質のスクリーニングが可能となる。ここで、アトピー性皮膚炎の改善効果は、前記血中成熟型ＩＬ−１８レベルの測定、皮膚中の成熟型ＩＬ−１８の検出、肉眼観察、皮膚組織の顕微鏡観察などを単独で又は適宜組み合せて検定すればよい。また当該スクリーニングによりアトピー性皮膚炎改善効果があると判定された被験物質はアトピー性皮膚炎の予防又は治療用の医薬として有用である。
実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
まず、実施例に用いた各種試験方法及び材料について説明する。
（１）ノーザンブロット法
マウスカスパーゼ１（ｍＣＡＳＰ１）のｃＤＮＡ（Ｃｅｌｌ，７５，６５３−６６０（１９９３）参照）は、大阪大学（三浦博士）より入手した。全ＲＮＡは、後記実施例１により得られたＣＡＳＰ１トランスジェニックマウス（ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ）及びコントロールマウスの組織からＩｓｏｇｅｎ試薬（ニッポンジーン社製）を使用して抽出した。ノーザンブロット解析では、１０μｇの全ＲＮＡを２％ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動により、サイズを分画した。ＲＮＡをナイロン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎ、ミリポア社製）に移し、ヒト及びマウスのＣＡＳＰ１にそれぞれ対応する３２ＰでラベルしたｃＤＮＡをプローブに使用した（ヒトＣＡＳＰ１のｃＤＮＡについてはＪ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，２１（１９９４），４９−５８参照のこと）。ハイブリダイゼーションの後、ブロットを４２℃、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。その後、ブロットを−７０℃でＸ線フィルムに露光した。
（２）サイトカイン、サイトカインアッセイ及び抗体
リコンビナントマウスＩＬ−１β（ｒｍＩＬ−１β）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社より購入した。ヒト前駆型ＩＬ−１β（ｈｐｒｏＩＬ−１β）は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：８２１（１９９１）に従い調製した。リコンビナントヒトＩＬ−１β（ｒｈＩＬ−１β）及び抗ヒトＩＬ−１β抗体は大塚製薬より入手した。ＩＬ−１αレベルはＥｎｄｏｇｅｎ社製のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＬ−１β及びＩＦＮ−γレベルは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社キットで測定した。ＩＬ−１８の生物学的活性は、ＩＬ−１８反応性マウスＮＫ細胞を使用してＩＦＮ−γ誘導活性で測定した。リコンビナントマウスＩＬ−１８（ｒｍＩＬ−１８）、ウサギ抗マウスＩＬ−１８中和抗体及びマウスＩＬ−１８ＥＬＩＳＡキットは林原研究所より入手した。マウスＩＬ−１８ＥＬＩＳＡキットでは１０〜１０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１８を検出可能であった。
（３）免疫組織化学
トランスジェニックとワイルドタイプマウスからのバイオプシー標本は、りん酸緩衝ホルマリンで２時間固定した。次いで、パラフィン切片にカットした。サンプルは、直ちに、冷凍組織用包埋剤であるＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ社製）中で、凍結し、−７０℃で保存した。クリオスタットの部分（５μｍ）は、アセトンで５分間、４℃で固定し、適度に希釈した一次抗体で１時間インキュベートした。洗浄後、結合した一次抗体を基質としてＡＥＣ（ダコジャパン社製）を使用してＶｅｃｔａｓｔｅｉｎ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で視覚化した。
（４）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したｄＵＴＰ−ビオチンニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）
パラフィン切片中の皮膚バイオプシー標本のＤＮＡフラグメンテーションは、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３３：８４５（１９９７）記載のＴＵＮＥＬ染色によって、調べた。
（５）イムノブロット
イムノブロットはＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１０６６（１９９１）に従って行った。Ｉｓｏｇｅｎキットを使用して、ＤＮＡとＲＮＡを除去した後、トランスジェニックとコントロールマウスからの表皮の細胞ライセートを還元条件下、ＳＤＳ−サンプルバッファーで懸濁した。電気泳動した蛋白質を、セミドライブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用してニトロセルロース膜（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。膜を一次抗体で１時間インキュベートした後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧあるいは抗ウサギＩｇＧ抗体で二次インキュベートし、最後に、ウエスタンブルー基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で発色させた。
（６）前駆型ＩＬ−１β（ｐｒｏＩＬ−１β）プロセッシング活性
リコンビナントヒト前駆型ＩＬ−１β（ｒｈｐｒｏＩＬ−１β）を新鮮な表皮ライセートとともに１０〜３０分インキュベートした。ＳＤＳ−サンプルバッファーを添加し直ちに煮沸した。サンプルを抗ヒトＩＬ−１β抗体及びウエスタンブルー検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用したイムノブロットにより分析した。
実施例１
（１）ＤＮＡ構成及びトランスジェニックマウスの作製
ｈｐｒｏＣＡＳＰ１の完全なコード領域の１．４ｋｂ  ｃＤＮＡを、ヒトケラチン１４プロモーター（シカゴ大学、Ｅ．Ｆｕｃｈｓ博士より入手（Ｎａｔｕｒｅ，３７４，１５９−１６２（１９９５）参照））及びウサギβ−ｇｌｏｂｉｎイントロン（京都大学、田中博士より入手（Ｎａｔｕｒｅ，３７４，１５９−１６２（１９９５）参照））に平滑末端ライゲーションによって結合させた（図１：図１中、Ｋ１４  ｐｒｏｍｏｔｅｒはヒトケラチン１４プロモーターを、β−ｇｌｏｂ．Ｉｎｔ．はウサギβ−ｇｌｏｂｉｎイントロンを、１．４ｋｂ  ｈｐｒｏＣＡＳＰ１はヒト前駆型カスパーゼ１の１．４ｋｂ  ｃＤＮＡを、Ｋ１４  ｐｏｌｙＡはヒトケラチン１４ポリＡを示す）。得られたＤＮＡフラグメントをＣ５７ＢＬ／Ｌ６マウス（日本チャールスリバー社）の受精卵へＤｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，３９：２５７（１９９７）記載の方法に準じてマイクロインジェクション法により注入した。
（２）トランスジェニックマウスにおける皮膚でのｈＣＡＳＰ１過剰発現の確認
尾部皮膚からのＤＮＡを使用したＰＣＲ及びサザンブロッティング法による導入遺伝子の取り込みによって仔をスクリーニングした。トータル９６匹の誕生したマウスのうち４匹（♂３、♀１）がｈＣＡＳＰ１のトランスジェニックであった（以下、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇと略す）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、誕生時には健康で、その後正常に成長したが、８週齢前においては同腹児のワイルドタイプより小さかった。この時点の後、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは慢性活動性皮膚炎の症状が明確に発現した。３匹の♂ＫＣＡＳＰ１Ｔｇのうちの１匹は、ワイルドタイプ♀と交配させた結果、♂：♀＝１：１でＫＣＡＳＰ１Ｔｇとワイルドタイプの仔が誕生した。すべての実験は、非トランスジェニックやワイルドタイプ同腹児と導入遺伝子のライン化されたヘテロ接合体との比較で行った。
（３）皮膚の症状
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、特別な病原体の検出されない条件のもとで８週から、目の周りの中程度の蚕食状皮膚炎が著明となり、急速に重度のびらん性皮膚炎に進展した。また、時折皮膚潰瘍が認められた。これらの症状は、その後１、２週内に顔、耳、首、胴体、足に広がった。その後再上皮化が起こり、一部のみに苔癬型皮膚炎（ｌｉｃｈｅｎｏｉｄ  ｄｅｒｍａｔｉｓ）が発症し、びらん及び潰瘍がぶり返した。１６週後、複数の皮膚病巣が形成され、耳とまぶたは変形した。顔及び四肢の毛は、多数の瘢痕を伴った外皮のみを残して消失した。
光学顕微鏡レベルでは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの表皮は、６週まで特に組織学的変化は認められなかった。１０週齢のＫＣＡＳＰ１Ｔｇの潰瘍の周辺の厚い表皮は、錯角化症を伴った乾癬様変化ならびに部分的に表皮肥厚を伴った皮膚炎が認められた。潰瘍の真皮には、多くの単核細胞が浸潤していた。傷害部位の角質細胞は、核凝縮を伴った好酸性の壊死を示し、これは角質細胞のアポトーシスの徴候である。実際、多くの角質細胞を含む皮膚傷害部位ではそれらの核がＤＮＡのフラグメンテーションの同定に用いられるＴＵＮＥＬ染色によってポジティブに染まった。一方、コントロールの同腹児の皮膚ではＴＵＮＥＬ陽性角質細胞は認められなかった。
高レベルのｈＣＡＳＰ１が、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの厚い表皮組織中で検出された。一方、コントロールのマウスではそれは検出されなかった。これらの潰瘍が、外因性ｈＣＡＳＰ１により内因性前駆型ＩＬ−１８からプロセッシングされた成熟型ＩＬ−１８により誘導された機能的Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）の作用によるものかどうかを確かめるために、皮膚変化開始前のＫＣＡＳＰ１ＴｇにＦａｓ−Ｌ中和抗体を投与した。具体的には、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２：１７７７（１９９５）記載の方法に準じて、１ｍｇのＦａｓ−Ｌ中和抗体（ＭＦＬ１、順天堂大学榧垣博士より入手）をＫＣＡＳＰ１Ｔｇに５週から９週の間の毎週、腹腔内に注入し、皮膚潰瘍の状態を観察した。しかしながら、このような抗Ｆａｓ−Ｌ中和抗体での集中的な処理によっても皮膚潰瘍は進展した。従って、角質細胞のアポトーシスはＦａｓ／Ｆａｓ−Ｌ経路の作用には非依存的に誘導されることが示唆された。ＩＬ−１βは、検討したどのセルラインや初代培養細胞においてもアポトーシスを誘導しなかった。さらに、角質細胞特異的なＩＬ−１αトランスジェニックマウスは、アポトーシス的な皮膚潰瘍を示さなかった。これはその機能がＩＬ−１αと同様であるＩＬ−１βがＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚アポトーシスに関与していないことを示唆している。
（４）皮膚における成熟型ｈＣＡＳＰ１の検出
ノーザンブロット解析により、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの耳表皮、背部表皮、肝臓、腎臓、結腸、肺、脳及び脾臓におけるｈｐｒｏＣＡＳＰ１のｍＲＮＡを測定した（図２参照）。結果、１．４ｋｂ  ｈｐｒｏＣＡＳＰ１のｍＲＮＡは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの耳及び背部表面にのみ認められたが、他の組織（肝臓、腎臓、結腸、肺、脳及び脾臓）では認められなかった。なお、図２中、レーン１は非トランスジェニックの同腹児からの試料、レーン２〜９はそれぞれＫＣＡＳＰ１Ｔｇの耳表皮組織、背部表皮組織、肝臓、腎臓、結腸、肺、脳、脾臓中のｈｐｒｏＣＡＳＰ１のｍＲＮＡの検出結果を示す。
一般的に、カスパーゼはそれらの生物学的活性を発揮するためには、適当なプロセッシングを必要とする。前駆型ＣＡＳＰ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、成熟型ＣＡＳＰ１を形成するために自己タンパク分解を起こすと報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１：３１９（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３２７３（１９９６）参照）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは、皮膚で自然に活性化されたｈＣＡＳＰ１含んでいることを示唆している。この可能性を確かめるために、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚ライセート中のｈＣＡＳＰ１蛋白質のサイズを抗ｈＣＡＳＰ１抗体を用いたイムノブロット解析により測定した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３２７３（１９９６）参照）。図３に示したように、皮膚ライセートは、ｈＣＡＳＰ１の両方の活性型成分（ｐ２０及びｐ１０）とｐ４５の前駆体を含み、一方、ワイルドタイプ同腹児からの皮膚ライセートはそれらの成分を含んでいなかった。この結果から、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚のｈＣＡＳＰ１は自然に成熟型に切断されていることが示された。なお、図３中、レーン１は陽性コントロールＴＨＰ−１細胞、レーン２は組み換えｐ２０／ｐ１０  ｈＣＡＳＰ１、レーン３はＫＣＡＳＰ１Ｔｇ皮膚ライセート、レーン４はワイルドタイプ皮膚ライセートである。
次に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ皮膚中のｈＣＡＳＰ１プロセッシング活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質として前駆型ＩＬ−１βを使用して試験した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ表皮ライセートは、３１ｋＤリコンビナントｈｐｒｏＩＬ−１βを成熟型１７ｋＤへ切断した。この切断は、合成ＣＡＳＰ１阻害剤及びヨードアセタミドにより阻害された。
さらに、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ皮膚中のｈＣＡＳＰ１が、ｉｎ  ｖｉｖｏでその生物学的活性を及ぼすかどうかを検討した。ケラチノサイトは、ｍＲＮＡレベルで定常的に、ＩＬ−１βとＩＬ−１８を発現しているので、皮膚中の蛋白質レベルでの両方のサイトカインのサイズを測定した。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ皮膚ライセートは、成熟型ＩＬ−１８と成熟型ＩＬ−１βの両方を含んでいたがワイルドタイプは発現していなかった。これはトランスフェクトしたｈＣＡＳＰ１が自発的な活性化を通じて自発的に内因性の前駆型ＩＬ−１βと前駆型ＩＬ−１８を切断したものと考えられる。
（５）血中におけるＩＬ−１８レベル
外因性ｈＣＡＳＰ１による局所でのＩＬ−１８とＩＬ−１βの活性化が、それぞれの成熟型のサイトカインの全身性の蓄積をもたらすのかどうかを検討した。図４に示すように、高レベルのＩＬ−１８が有意に誕生後４週でＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中で認められた。対照的に、ワイルドタイプの同腹児では、生存期間中を通じて、血清中でのＩＬ−１８のレベルは、低かった（０．１ｎｇ／ｍＬ以下）。ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清ＩＬ−１８濃度は、成長とともに徐々に上昇した。対照的に、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中ＩＬ−１βは、１２週からのみ少量検出され、ワイルドタイプでは検出されなかった。ケラチノサイトでのｈＣＡＳＰ１の過剰発現は、ＩＬ−１βよりＩＬ−１８の血清中濃度をより選択的に上昇させていた。
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中ＩＬ−１８が成熟型ＩＬ−１８であることを確かめるために、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中ＩＬ−１８の生物学的活性を検討した。その結果、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇからの血清は、ＩＬ−１８反応性のクローン化されたナチュラルキラー細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導する能力があることがわかった。さらに、このＩＦＮ−γ誘導能力は、抗ＩＬ−１８抗体（中和抗体）により完全に阻害された。これは、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中に活性型ＩＬ−１８を含んでいることを意味する。しかしながら、ＩＦＮ−γは定常状態では、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血清中には検出されなかった。このように、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇは循環血中に持続的に成熟型ＩＬ−１８を分泌していた。
（６）トランスジェニックマウスの皮膚掻破行動
目視法に従ってＫＣＡＳＰ１Ｔｇ及び正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｌ６マウス）における皮膚掻破回数を４０分間測定した。
その結果、図５に示すように、正常マウスの掻破回数は１０分間あたり５０回以下であるのに対し、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇのそれは１０分間あたり２００回以上であり、本発明のトランスジェニックマウスには痒みを伴う強い皮疹が生じていることがわかった。
（７）血中におけるＩｇＥ及びヒスタミンレベル
ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血中ＩｇＥ濃度（ＲＩＡ法）及びヒスタミン濃度（ＥＬＩＳＡ法）を経時的に測定した。その結果を図６に示す。また、１４週齢におけるＫＣＡＳＰ１Ｔｇ及び正常マウスの血中ＩｇＥ濃度を測定した。その結果を図７に示す。これらの結果より、本発明のトランスジェニックマウスは、血中ヒスタミンレベルが１３〜１４週で２０００ｎＭもの高値となり、また血中ＩｇＥレベルも１６週齢で５０μｇ／ｍｍ以上と極めて高値となることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、特異的病原微生物の非存在下で自然発症的にアトピー性皮膚炎を発症するので疾患モデル動物として有用である。本発明のトランスジェニック動物を用いれば、自然免疫によるアトピー性皮膚炎の予防治療用医薬の開発、さらにはアトピー性疾患の発症メカニズムの解明が可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、導入に用いた組み換えＤＮＡの結合状態を示す図である。
図２は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの各種組織中におけるｈｐｒｏＣＡＳＰ１のｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット解析した結果を示す図である。
図３は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの皮膚中のｈＣＡＳＰ１蛋白の発現を、抗ｈＣＡＳＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す図である。
図４は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇにおける血清中ＩＬ−１８、ＩＬ−１β及びＩＬ−１αの濃度の変化を示す図である。
図５は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ及び正常マウスにおける皮膚掻破回数の測定結果を示す図である。
図６は、ＫＣＡＳＰ１Ｔｇの血中のＩｇＥ及びヒスタミン濃度の経時変化を示す図である。
図７は、１４週齢ＫＣＡＳＰ１Ｔｇ及び正常マウスの血中ＩｇＥ濃度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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