(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MIF1の活性をモジュレーションする分子に関するスクリーニング方法であって、該活性はMEKK1への結合によって定義され、
ａ）配列番号8に示すアミノ酸配列からなるMIF1タンパク質を、完全長MEKK1タンパク質またはMEKK1タンパク質のアミノ酸配列の287〜353の領域を含むキメラタンパク質と候補分子に接触させ、
ｂ）標識されたMIF1または標識された二次試薬によって該MIF1タンパク質への該分子の結合を検出し、標識化は同位体標識、蛍光または化学発光タグによって提供され、該結合がMIF1活性のモジュレーションと関連することを含んでなる方法。
【請求項２】
MIF1の活性をモジュレーションする分子に関するスクリーニング方法であって、該活性はMEKK1への結合によって定義され、
ａ）配列番号8に示すアミノ酸配列からなるMIF1タンパク質を、完全長MEKK1タンパク質またはMEKK1タンパク質のアミノ酸配列の287〜353の領域を含むキメラタンパク質と候補分子に接触させ、
ｂ）該MIF1タンパク質への該分子の結合を検出し、該結合はMIF1とMEKK1との相互作用のモジュレーションと関連することを含む方法。
【請求項３】
MEKK1タンパク質のアミノ酸配列の287〜353の領域を含むMEKK1のMIF1結合ドメインと転写アクチベーターのDNA結合ドメインとよりなるキメラタンパク質の制御下で発現されるレポーター遺伝子の発現レベルの変化を、MIF1および該MEKK1キメラタンパク質でトランスフェクトされた細胞系内で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発現の検出が、一過性にトランスフェクトされた哺乳類細胞におけるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該分子がMIF1のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該分子がMIF1のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞内のMIF1タンパク質のレベルを増加させることを含んでなる、インビトロにおける該細胞内のMEKK1活性を減少させる方法であって、該MIF1タンパク質が配列番号8に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする方法。
【請求項８】
該細胞が、該MIF1タンパク質の発現を可能にする条件下、MIF1をコードするベクターでトランスフェクトされている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞内のMIF1タンパク質のレベルを減少させることを含んでなる、インビトロにおける該細胞内のMEKK1活性を増加させる方法であって、該MIF1タンパク質が配列番号8に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
細胞内条件下でMIF1 mRNAにハイブリダイズするMIF1アンチセンス核酸を該細胞内に導入することによりMIF1タンパク質のレベルを減少させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
MIF1に特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を、MIF1に結合しそれを不活性化するのに十分なレベルで該細胞内に導入することによりMIF1タンパク質のレベルを減少させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号8のMIF1アミノ酸16〜28を特異的に認識する抗体。
【請求項１３】
ポリクローナルである、請求項１２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、MEKKシグナル伝達経路の新規タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さらに、本発明は、該タンパク質または該遺伝子の診断および治療用途、ならびに該タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト（特にMEKK活性に関するもの）のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
最近、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAP）が精力的な研究の主要対象となっている。相同キナーゼのこのファミリーは細胞外刺激に対する種々の細胞応答に関与し、それらのそれぞれの活性化状態が細胞の運命を決定するらしい。すべての真核生物間で良く保存された少なくとも3つのキナーゼモジュールよりなる種々のMAPKカスケードの同定が、各キナーゼシグナリング経路に関与する応答のそれぞれの枠組みを部分的に明らかにした。ERKモジュールは、マイトジェンまたは分化シグナルにより活性化されて、その基質（p90リボソームS6キナーゼ、cPLA2、PHAS-1、c-myc、MAPKAPK2およびElk1を含む）を活性化する。一方、ストレス、いくつかの増殖因子、プロ炎症性サイトカイン、UVまたはγ線照射、セラミド、バソアクティブペプチド、タンパク質合成阻害剤または熱ショックに対する細胞応答は、Jun N末端キナーゼ（JNK）およびp38/HOGの活性化を伴う。このストレスキナーゼカスケードの終着点は、c-Jun、Elk lまたはATF-2（CRE-BP1）転写因子のリン酸化である。JNKの持続的活性化は、増殖停止、アポトーシスの発生または造血幹細胞の活性化に関連している。
【０００３】
JNKは、JNKキナーゼ（MKK4/SEK1）による二重のリン酸化により活性化される。それらのJNKキナーゼは、MEKキナーゼ（MEKK）と称される上流のセリントレオニンキナーゼにより活性化される。MEKKは、キナーゼの拡張ファミリーを代表するものである。哺乳類MEKK1 cDNAは78kDaのタンパク質をコードしているが、種々の細胞系においてMEKK1のいくつかの形態（50、78または98kDa）が報告された。その後、195kDaのタンパク質をコードするラットMEKK1完全長cDNAがクローニングされた。これはカスパーゼにより切断されて、より短く且つより活性なキナーゼの発現をアノイキス（anoikis）（細胞剥離によるアポトーシス）中に引き起こすと報告されている。その98kDaの切断産物は完全長MEKK1のC末端部分の625アミノ酸に対応する。最近のデータは、MEKK1がiκB-αキナーゼのリン酸化によりnFκB転写因子をも調節することを示している。
【０００４】
MAPKの活性化を招く広範な細胞外または細胞内刺激においては、それらの活性化メカニズムの特異性が問題となる。マイトジェンキナーゼカスケード（ERK）の活性化段階は既に記載されている。これに対して、ストレスキナーゼカスケードを調節する第1活性化段階は現時点では不明である。このMAPK/JNKカスケードの共通の調節体（例えば、ホスファターゼ）が同定されており、それは、細胞増殖とアポトーシスとの間の平衡（すなわち、すべての組織の恒常性を調節する平衡）の決定因子として作用する。
【０００５】
Raf（マイトジェンRas依存性シグナルにより活性化されるMAPKKK）およびMEKK1は共に、GTP結合Rasとそのエフェクタードメインを介して相互作用するが、Ras-GTPがMEKK1タンパク質を直接活性化するという証拠はない。それでも、腫瘍原性Rasはまた、JNKカスケードを活性化し、この活性化はRasトランスフォーメーションに必要であるらしい。
【０００６】
これらの例は、MEKK1が、細胞分裂、細胞活性化または細胞死のいずれかにつながる広範な細胞事象の調節に関与することを示している。したがって、その活性の顕著な制御が細胞内で生じているはずである。MEKK1活性の増加は、過剰のアポトーシスまたはT細胞活性化を招く可能性があり、炎症および喘息、免疫抑制、心臓虚血または肥大、骨髄形成異常症候群、神経変性などの広範な病理の原因となりうる。一方、MEKK1活性のダウンレギュレーションは、過剰な細胞増殖および／または生存を誘導して、腫瘍増殖、過剰な血管新生、慢性関節リウマチ、乾癬および持続的ウイルス感染症を招きうる。
【０００７】
本明細書に開示するMIF1 cDNAと100％相同なcDNAは、Ren Yら, Eur. J. Biochem., 253, pp734-742, 1988に公開されており（受託番号Genbank AF015308）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）微小球（microspherule）タンパク質（MSP58）と称される。しかし、このタンパク質には何れの機能も帰属されていない。
【０００８】
しかしながら、MEKKに媒介される細胞過程の分子メカニズムを更に理解することが、当技術分野において必要とされている。特に、MEKK調節タンパク質を同定することが、当技術分野において必要とされている。
【０００９】
以下に説明するとおり、本発明はこの要求について対処するものである。
【００１０】
本明細書におけるいずれの参照文献の引用も、そのような参照文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１１】
（発明の概要）
前記のとおり、本発明は、MEKK調節因子の同定に関する。この因子は、本発明ではMEKK相互作用性FAHタンパク質（MIF1）と称され、MEKK活性のモジュレーション、したがって多数の生理的過程（例えば、アポトーシス、ならびに炎症および他の刺激に対する細胞応答）のモジュレーションのための手段を提供する。
【００１２】
したがって、第1の態様において、本発明は、MEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）をコードする単離された核酸であって、それが、配列番号1または配列番号7に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅されうること；それが、ストリンジェントな条件下、配列番号1に示すヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズすること；それが、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそれらの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすること；およびそれが、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対して産生した抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードすること；から選ばれる特性を有することを特徴とする単離された核酸を提供する。以下に例示する特定の実施形態においては、MIF1は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。例えば、その単離された核酸は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含む。以下に例示するもう1つの実施形態において、MIF1は、配列番号8に示すアミノ酸配列を有する。例えば、その単離された核酸は、配列番号7に示すヌクレオチド配列を含む。もう1つの実施形態においては、MIF1は約483アミノ酸を有する。特定の実施形態においては、「約」または「およそ」なる語は、与えられた値または範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内を意味する。
【００１３】
当業者には容易に理解されるとおり、本発明の核酸（特に、cDNA）を製造するための1つの有効な方法は、MIF1のコード配列を含むcDNAライブラリーから該核酸をPCRにより増幅することである。配列番号1または配列番号7からの任意の所望のセグメントに対応する種々のPCRプライマーを、本発明に従い使用することができる。以下の特定の実施形態においては、配列番号10、11および14に示す配列を有するPCRプライマーを使用して、本発明の核酸を増幅し単離した。あるいは、本発明の核酸は、配列番号7に示す配列または相補的配列を有するヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、少なくとも10塩基のもの）で単離し同定することができる。特定の態様においては、該オリゴヌクレオチドは、ゲノムDNA（サザン分析）の検出、または細胞内でのMIF1コード化mRNA（ノーザン分析）の発現のための方法において使用することができる。いずれの場合も、該方法は、該細胞由来のサンプルと、検出可能（例えば、放射性同位体または発色団もしくは発蛍光団での標識によるもの）なオリゴヌクレオチドとを接触させ、該サンプル中のゲノムDNAまたはmRNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み、この場合、ゲノムDNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの検出は、ゲノム内のMIF1コード化遺伝子の存在を示し、mRNAに対するハイブリダイゼーションの検出は、MIF1をコードするmRNAの発現を示す。また、定量的方法、例えばゲノム内のMIF1遺伝子の数を検出するための方法またはmRNAの発現レベルの増加もしくは減少を検出するための方法を用いることも可能である。
【００１４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、MIF1をコードするmRNAに結合し細胞内でのその翻訳を妨げるオリゴヌクレオチドであってもよい。そのようなアンチセンス分子は、細胞内で発現されるベクターによりコードされうる。あるいは、そのようなアンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチド、好ましくは、非ホスホエステル結合を含み細胞内ヌクレアーゼに抵抗性のものであってもよい。
【００１５】
もう1つの実施形態においては、前記の単離された核酸は、ポリペプチドタグをコードする配列を更に含んでいてキメラタグ付きMIF1タンパク質をコードするものであってもよい。適当なタグには、Mycタンパク質の一部、ポリヒスチジン配列またはグルタチオントランスフェラーゼタンパク質が含まれるが、決してこれらに限定されるものではない。
【００１６】
もちろん、本発明の核酸、特にcDNA分子は、クローニングベクター中または発現ベクター中で提供されうる。発現ベクターにおいては、MIF1をコードする配列は、発現コンピテント宿主細胞内でのMIF1ポリペプチドの発現を可能にする発現制御配列に作動的に結合している。本発明のベクターには、RNA分子、プラスミドDNA分子およびウイルスベクターが含まれる。該ベクターがプラスミドDNA分子である場合、該プラスミドDNAは、DNA凝縮（condensing）タンパク質、正電荷脂質、リポソーム、重合体およびDNA沈殿剤よりなる群から選ばれる組成物を更に含んでいてもよい。該ベクターがウイルスベクターである場合、該ウイルスベクターとしては、少数ながら挙げると、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスなどのベクターを挙げることができる。好ましいレトロウイルスベクターには、HIVなどのレンチウイルス科のベクターが含まれる。また、本発明は、クローニングベクター（その場合の宿主は、通常、後記に例示する原核細胞となろう）または発現ベクターのいずれかでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。該発現ベクターを含有する宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞および哺乳類細胞が含まれる。特定の実施形態においては、酵母細胞および宿主細胞の両方を用いる。
【００１７】
本発明の宿主細胞は、MIF1を組換え的に製造するために使用することができる。この方法は、該宿主細胞を、MIF1の発現を可能にする条件下、培地内で培養し、該培養からMIF1を単離することを含む。
【００１８】
もう1つの態様において、本発明は、単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）を提供する。該タンパク質は、本発明の核酸にコードされうる。あるいは、MIF1タンパク質は、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそれらの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。さらにもう1つの実施形態においては、該タンパク質は、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対して産生した抗体に特異的に結合することにより特徴づけられる。本発明は、マウスおよびヒトの両方のMIF1を提供する。さらにもう1つの実施形態においては、該タンパク質は、例えば前記のとおりのポリペプチドタグを含むキメラMIF1である。
【００１９】
また、単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）の断片である抗原性ペプチドを提供する。特定の実施形態においては、該抗原性ペプチドは、配列番号8のアミノ酸16〜28に対応するアミノ酸配列を有する。
【００２０】
もちろん、本発明は更に、MIF1タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、細胞内のMIF1の存在および所望によりその量を検出するために診断的に使用することができる。また、本発明の抗体、特に、一本鎖Fv抗体（scFv）は、MIF1活性を抑制するために治療的に使用することができる。後記に例示する特定の実施形態においては、該抗体は、配列番号8のMIF1アミノ酸16〜28を特異的に認識する。後記に例示するもう1つの特定に実施形態においては、該抗体はポリクローナルである。モノクローナル抗体および（scFv抗体のほかの）抗体フラグメントも本発明に含まれる。本発明の抗体を使用して、MIF1タンパク質への該抗体の結合を可能にする条件下で該細胞由来のサンプルと該抗体とを接触させ、該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を検出することにより、細胞内でのMIF1タンパク質の発現を検出することができ、この場合、該タンパク質への該抗体の結合の検出は、該細胞内でのMIF1の発現を示す。定量的イムノアッセイまたはウエスタンブロット法を用いて、MIF1を定量し、特に、より早期の細胞または正常細胞と比較した場合のMIF1の量の増加または減少を検出することが可能である。
【００２１】
前記のとおり、MIF1はMEKKの活性を調節する。MEKKは、多数の系における重要なシグナル伝達分子である。本発明は、有利にも、MIF1の活性、したがってMEKKの活性をモジュレーションする分子に関するスクリーニング方法を提供する。当技術分野における任意のスクリーニング方法（特に、ハイスループットスクリーニング）を用いることができる。特定の実施形態においては、該方法は、MIF1タンパク質と候補分子とを接触させ、該MIF1タンパク質への該分子の結合を検出することを含む。特定の実施形態においては、MIF1への該分子の結合の検出は、MIF1とMEKKとの相互作用のモジュレーションを検出することを含む。特定の実施形態においては、MEKKのMIF1結合ドメインと転写アクチベーターのDNA結合ドメインとよりなるキメラタンパク質の制御下で発現されたレポーター遺伝子の発現レベルの変化を、MIF1および該MEKKキメラタンパク質でトランスフェクトされた細胞系内で検出することを、MIF1とMEKKとの相互作用のモジュレーションが含む。より詳しくは、発現の検出は、一過性にトランスフェクトされた哺乳類細胞におけるものである。MEKK活性の一過性モジュレーションを、後記実施例において例示する。本発明のスクリーニング方法は、MIF1のアゴニストまたはアンタゴニストの同定を可能にする。
【００２２】
さらにもう1つの実施形態において、本発明は、細胞内のMIF1タンパク質のレベルを増加させることを含んでなる、該細胞内のMEKK活性を減少させる方法を提供する。該MIF1タンパク質はマウスMIF1であってもよい。より好ましくは、それはヒトMIF1である。好ましい実施形態においては、該細胞は、該MIF1タンパク質の発現を可能にする条件下、MIF1をコードするベクターでトランスフェクトされている。
【００２３】
あるいは、所望により、本発明は、細胞内のMIF1タンパク質のレベルを減少させることを含んでなる、該細胞内のMEKK活性を増加させる方法を提供する。細胞内条件下でMIF1 mRNAにハイブリダイズするMIF1アンチセンス核酸を細胞内に導入することにより、MIF1タンパク質のレベルを減少させることができる。あるいは、MIF1に特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を、MIF1に結合しそれを不活性化するのに十分なレベルで細胞内に導入することにより、MIF1タンパク質のレベルを減少させることができる。
【００２４】
したがって、本発明の第1の目的は、MEKK（特にMEKK1）の活性を調節する因子を提供することにある。
【００２５】
それに関連した目的は、そのようなポリペプチドをコードする核酸を提供することにある。
【００２６】
さらにもう1つの目的は、MEKK調節因子をコードする核酸を増幅するためのPCRプライマーとしての又はそのような核酸を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドを提供することにある。
【００２７】
本発明の更にもう1つの目的は、精製タンパク質の回収のためのトランスフェクト化またはトランスデュース化細胞の発酵による、あるいは細胞内のインビボでの、MEKK調節タンパク質の高レベルの発現（インビトロでの更なる試験またはインビボでのMEKK活性の調節、例えば遺伝子治療を目的としたもの）を提供することにある。
【００２８】
特に、本発明の目的は、MIF1活性（特に、MEKKに対するMIF1の相互作用）の小分子モジュレーター（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）のスクリーニングを提供することにある。
【００２９】
これらの及び他の目的について本発明で検討する。本発明は、添付図面および以下の「発明の詳細な記載」および「実施例」で更に詳しく説明する。
【００３０】
（発明の詳細な記載）
MEKK1の上流調節に関してはほとんど知られていないため、その活性の推定調節体を見出すためにMEKK1のパートナーを同定するように努めた。本発明は、1つには、そのような調節タンパク質（本発明ではMIF1と称される）の同定に基づく。MEKK1の活性化および調節経路の更なる知見はMIF1タンパク質によりもたらされうるであろう。ツーハイブリッド法および餌（bait）としてのMEKK1を使用して、MIF1（MEKK1相互作用性FHAタンパク質1、483アミノ酸）をクローニングした。
【００３１】
MIF1タンパク質は、Prositeデータバンク中で同定されたタンパク質モチーフを含有する。このドメイン（フォークヘッド関連（Forkhead Associated）（FHA）ドメイン）は、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると記載されており、リン酸化セリンおよびトレオニンに対する結合モチーフでありうる。既に記載されており恐らく細胞質内に位置する唯一のフォークヘッド相同タンパク質はKAPP（リン酸化依存的にセリン／トレオニンキナーゼと相互作用するホスファターゼ）である。
【００３２】
MIF1とMEKK1との間の相互作用ドメインのマッピングは、MIF1とMEKK1との相互作用がMEKK1のリン酸化に依存することを示した。MEKK1が非修飾キナーゼ活性を有し相互作用部位を自己リン酸化する場合にのみ、酵母におけるMIF1とMEKK1との相互作用が認められうる。MEKK1 cDNA（ツーハイブリッド）の種々の断片を使用することにより、MIF1と相互作用するMEKK1ドメインが該キナーゼの調節ドメイン（アミノ酸284〜369）内にマッピングされた（図1を参照されたい）。
【００３３】
したがって、本発明は、小分子または天然物に関するスクリーニングにおける使用のための（例えば、MEKK/MIF1相互作用の阻害のための）、MIF1タンパク質、ホモログ、スプライシング変異体、単点または欠失突然変異体をコードするヒトcDNAおよびこれらの配列にコードされるタンパク質の使用に関する。実施例に記載のツーハイブリッド株、リン酸化によるMEKKの活性化、記載されているMIF1活性の修飾を、本方法において用いることができる。
【００３４】
また、細胞内でのJNKの活性化を修飾するために、遺伝子治療用途においてMIF1を使用することができる（コードおよびアンチセンスの両方の分子を使用することができる）。MIF1の過剰発現またはダウンレギュレーションに基づくこれらの遺伝子治療に関連した病理学については、前記の「発明の背景」で検討されている。
【００３５】
また、診断および精製用途において抗MIF抗体を使用することができる。
【００３６】
MAP3K活性の調節体としての新規MAP4Kをクローニングするために、MIF1 cDNAおよび誘導体を酵母スリーハイブリッドスクリーニングにおいて有効に使用することができる。また、MAP4Kの阻害剤に関してスクリーニングするために、MIF1 cDNAおよび誘導体を使用することができる。
【００３７】
本発明のこれらの及び他の態様、特に、MIF1遺伝子の単離、MIF1タンパク質の発現、抗MIF1抗体の産生、MIF1のモジュレーションに関するスクリーニングアッセイ、MIF1/MEKK相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ、および特に遺伝子治療用のMIF1コード化ベクターの運搬について、以下の節で詳しく説明する。節の見出しは、読者の便宜のために与えられているにすぎず、いかなる点においても限定的なものとみなされるべきではない。
【００３８】
MIF1タンパク質をコードする遺伝子
本発明は、任意の動物（特に哺乳類または鳥類、さらに詳しくはヒト）由来のMIF1の完全長または天然に存在する形態およびそれらの任意の抗原性断片を含む本発明のMIF1をコードする遺伝子の単離に関する。本発明で用いる「遺伝子」なる語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を意味し、cDNAおよびゲノムDNA核酸を含む。本発明で用いる「MIF1」はMIF1ポリペプチドを意味し、「MIF1」は、MIF1ポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。
【００３９】
本発明では、当技術分野の通常の知識に含まれる通常の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術を用いることができる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（本明細書中では「Sambrookら, 1989」と称される）; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol.IおよびII（D.N. Glover編, 1985）; Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait編, 1984）; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames ＆ S.J. Higgins編, (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames ＆ S.J. Higgins編, (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney編, (1986)]; Immobilized Cell And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubelら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００４０】
したがって、本明細書で用いる以下の用語は以下に記載の意義を有するものとする。
【００４１】
「クローニングベクター」は、別のDNAセグメントが結合していて該結合セグメントの複製を引き起こしうるレプリコン（例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド）である。「レプリコン」は、インビボにおいてDNA複製の自律的単位として機能する（すなわち、それ自身の制御下で複製されうる）任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。クローニングベクターは、1つの細胞型における複製と別の細胞型における発現とをもたらしうる（「シャトルベクター」）。
【００４２】
「カセット」は、ベクターの特定の制限部位に挿入されうるDNAセグメントを意味する。該DNAセグメントは、関心のあるポリペプチドをコードする。該カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適したリーディングフレームでの該カセットの挿入が保証されるように設計される。
【００４３】
外因性または異種DNAにより細胞が「トランスフェクト」されているのは、そのようなDNAが該細胞の内部に導入されている場合である。外因性または異種DNAにより細胞が「形質転換」されているのは、該トランスフェクト化DNAが表現型の変化をもたらす場合である。その形質転換するDNAは、該細胞のゲノムを構成する染色体DNA内に組込まれ（共有結合し）うる。
【００４４】
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「DNA分子」）のリン酸エステル重合体、あるいはそれらの任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルの一本鎖形態または二本鎖ヘリックスを意味する。二本鎖DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAヘリックスが可能である。核酸分子、特に、DNAまたはRNA分子なる語は該分子の一次および二次構造を指すにすぎず、それをいずれかの特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この語は、とりわけ、直鎖状または環状DNA分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖DNAを含む。特定の二本鎖DNA分子の構造を論ずる場合、配列は、DNAの非転写鎖に沿った5'から3'への方向の配列（すなわち、mRNAと相同な配列を有する鎖）のみを示す標準的な慣例に従い表されうる。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【００４５】
核酸分子が別の核酸分子（例えば、cDNA、ゲノムDNAまたはRNA）に「ハイブリダイズ」するのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で該核酸分子の一本鎖形態が、その別の核酸分子にアニーリングする場合である（Sambrookら, 前掲を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸に関する予備的スクリーニングのためには、55℃のTmに対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、ホルムアミドの不存在下の5 x SSC、0.1％ SDS、0.25％ミルク；または30％ホルムアミド、5 x SDS、0.5％ SDS）を用いることができる。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応し、例えば、40％ホルムアミドの存在下の5xまたは6x SCCである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応し、例えば、50％ホルムアミド、5xまたは6x SSCである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じた塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションのためには、2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の度合などの当技術分野においてよく知られた変数に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの配列を有する核酸ハイブリッドのTmの値は大きくなる。核酸のハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いTmに対応する）は以下の順序で減少する：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関するTmの計算のための式が誘導されている（Sambrookら, 前掲, 9.50-0.51を参照されたい）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrookら, 前掲, 11.7-11.8を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは少なくとも約10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、より好ましくは、その長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００４６】
特定の実施形態においては、「標準的なハイブリダイゼーション条件」なる語は55℃のTmを意味し、前記の条件を用いるものである。好ましい実施形態においては、Tmは60℃である。より好ましい実施形態においては、Tmは65℃である。
【００４７】
本発明で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、MIF1をコードするゲノムDNA分子、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしうる、一般には少なくとも18ヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、ビオチンなどの標識に共有的に共役している例えば32P-ヌクレオチドで標識することができる（MIF1ポリペプチドの標識に関しては前記考察を参照されたい）。1つの実施形態においては、MIF1をコードする核酸の存在を検出するためのプローブとして、標識オリゴヌクレオチドを使用することができる。もう1つの実施形態においては、完全長または断片形態のMIF1をクローニングするために、あるいはMIF1をコードする核酸の存在を検出するために、PCRプライマーとしてオリゴヌクレオチド（それらの一方または両方が標識されていてもよい）を使用することができる。もう1つの実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドはMIF1 DNA分子と三重鎖を形成していてもよい。一般には、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザー上で合成的に調製する。したがって、オリゴヌクレオチドは、天然には存在しないホスホエステル類似体結合（例えば、チオエステル結合など）で調製することができる。
【００４８】
DNA「をコードする配列（コード配列）」は、適当な調節配列の制御下に配置された場合にインビトロまたはインビボで細胞内で転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンと、3'（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンとにより定められる。コード配列には、原核性配列、真核性mRNA由来のcDNA、真核性（例えば、哺乳類）DNA由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。コード配列を真核細胞内で発現させようとする場合には、通常、該コード配列に対して3'側にポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が位置するであろう。
【００４９】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらすDNA調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）である。ポリアデニル化シグナルは真核細胞における制御配列である。
【００５０】
「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼに結合し下流（3'方向）のコード配列の転写を開始させうるDNA調節領域である。本発明を定義する目的においては、プロモーター配列は、その3'末端で転写開始部位と境界をなし、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルでの転写の開始に必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（5'方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1でのマッピングにより簡便に定められる）と、RNAポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）とが見出されるであろう。
【００５１】
RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、ついでそれがトランスRNAスプライシングされ（該コード配列がイントロンを含有する場合）、該コード配列にコードされるタンパク質に翻訳される場合、該コード配列は、細胞内での転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００５２】
本発明で用いる「相同」なる語は、そのすべての文法形態および文字変形において、「共通の進化起源」を有するタンパク質 [スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）に由来するタンパク質を含む]間、および異なる種に由来する相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）間の関係を意味する（Reeckら, 1987, Cell 50:667）。そのようなタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、それらの高い配列類似性により表されるとおりの配列相同性を有する。
【００５３】
したがって、「配列類似性」なる語は、そのすべての文法形態において、共通の進化起源を有していても有していなくてもよい核酸またはタンパク質アミノ酸配列間の同一性または対応の度合を意味する（Reeckら, 前掲を参照されたい）。しかしながら、一般的な用法および本出願においては、「高度（に）」などの副詞で修飾された場合の「相同」なる語は配列類似性を指すことがあり、一般的な進化起源を指すものではない。
【００５４】
特定の実施形態においては、2つのDNA配列は、それらのDNA配列の一定の長さにわたり該ヌクレオチドの少なくとも約50％（好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％または95％）がマッチする場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して、または例えばその特定の系に関して定められたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比較することにより、実質的に相同な配列を同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当業者の技量の範囲内に含まれる。例えば、Maniatisら, 前掲; DNA Cloning, Vol.I＆II, 前掲; Nucleic Acid Hybridization, 前掲を参照されたい。
【００５５】
同様に、特定の実施形態においては、2つのアミノ酸配列は、該アミノ酸の30％以上が同一である又は約60％以上が類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、例えばGCG（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラムを使用するアライメントにより、類似または相同な配列を同定する。
【００５６】
本発明では、「対応」なる語は、類似性または相同性の比較対象分子と厳密な位置が同一であるか異なるかには無関係に、類似または相同配列を表すために用いられる。核酸またはアミノ酸配列のアライメントはスペースを含みうる。したがって、「対応」なる語は配列類似性を指すものであり、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の数を指すものではない。
【００５７】
MIF1をコードする遺伝子は、ゲノムDNAであるかcDNAであるかにかかわらず、任意の起源（特に、ヒトcDNAまたはゲノムライブラリー）から単離することができる。MIF1遺伝子を得るための方法は、前記のとおり、当技術分野でよく知られている（例えば、Sambrookら, 1989, 前掲を参照されたい）。
【００５８】
したがって、任意の動物細胞が、MIF1遺伝子の分子クローニングのための核酸源として潜在的に有用である。該DNAは、当技術分野で公知の標準的な方法によりクローン化DNA（例えば、DNA「ライブラリー」）から得ることができる。好ましくは、該タンパク質を高レベルで発現する組織（例えば、心臓、膵臓および胎盤cDNAが挙げられる。ならなら、これらは、MIF1の最高レベルの発現を示す細胞だからである）から調製したcDNAライブラリーから、化学合成により、cDNAクローニングにより、または所望の細胞から精製したゲノムDNAもしくはその断片のクローニングにより、該DNAを得る（例えば、Sambrookら, 1989, 前掲; Glover, D.M. (編), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K Vol. I, IIを参照されたい）。ゲノムDNA由来のクローンは、コード領域に加えて調節性およびイントロンDNA領域を含有しうる。cDNA由来のクローンはイントロン配列を含有しないであろう。特定の実施形態においては、Hela細胞ライブラリーからMIF1を単離した。該遺伝子は、その起源には無関係に、該遺伝子の増殖に適したベクター内に分子的にクローニングされるべきである。
【００５９】
該DNA断片が得られたら、所望のMIF1遺伝子を含有する特定のDNA断片の同定を多数の方法で行うことができる。例えば、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションにより、DNA断片をスクリーニングすることができる（BentonおよびDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。該プローブに対する相当な相同性を有するDNA断片がハイブリダイズするであろう。前記のとおり、相同性が大きいほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることができる。特定の実施形態においては、MIF1遺伝子のmRNAスプライシング変異体を同定するためにノーザンハイブリダイゼーション条件を用いる。
【００６０】
該遺伝子の特性に基づき、さらなる選択を行うことができる（例えば、該遺伝子が、本明細書に開示するMIFタンパク質の等電点電気泳動性アミノ酸組成または部分アミノ酸配列を有するタンパク質産物をコードする場合）。したがって、該遺伝子の発現産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイにより、該遺伝子の存在を検出することができる。例えば、cDNAクローン、または適当なmRNAをハイブリッド選択するDNAクローン（例えば、MIF1について知られているものと類似または同一の電気泳動度、等電点電気泳動または非平衡pHゲル電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図または抗原特性を有するタンパク質を産生するもの）を選択することができる。特定の実施形態においては、発現されたタンパク質は、MIF1のアミノ酸16〜28に対して産生したポリクローナル抗体により認識される。
【００６１】
本発明はまた、MIF1および他の種に由来するそのホモログと同じまたは相同な機能的活性を有する、本発明のMIF1の対立遺伝子変異体、スプライシング変異体、類似性および誘導体をコードする遺伝子（例えば、cDNA）に関する。MIF1に関連した誘導体および類似体の製造および使用は、本発明の範囲内である。特定の実施形態においては、該誘導体または類似体は機能的に活性である（すなわち、本発明の完全長の野生型MIF1に関連した1以上の機能的活性を示しうる）。特に、そのような類似体または誘導体はMEKK活性を調節しうる。あるいは、対立遺伝子変異体は、MEKK活性をMIF1が調節するのを不能にする突然変異を含みうる。
【００６２】
機能的に等価な分子を与える置換、付加または欠失により、コードする核酸配列を変化させることにより、MIF1誘導体を製造することができる。好ましくは、天然MIF1と比較して増強または増加した機能活性を有する誘導体を製造する。
【００６３】
ヌクレオチドコード配列の縮重によりMIF1遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列（単一のアミノ酸変異体を含有するアミノ酸配列を含む）をコードする他のDNA配列を、本発明の実施において使用することができる。これらには、対立遺伝子、他の種に由来する相同遺伝子、およびMIF1遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列（サイレントな変化をもたらすように該配列内の同一アミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により改変されたもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない。同様に、本発明のMIF1誘導体には、同類アミノ酸置換を与えるように機能的に等価なアミノ酸残基により該配列内の残基が置換されている改変した配列を含むMIF1タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を一次アミノ酸配列として含有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、該配列内の1以上のアミノ酸残基を、サイレントな変化をもたらす機能的等価体として作用する同様の極性の別のアミノ酸により置換することができる。該配列内のアミノ酸に代わるアミノ酸は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選ばれうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される見掛け分子量にも等電点にも影響を及ぼさないと予想される。
【００６４】
特に好ましい置換には以下のものが挙げられる：
・ArgからLys、およびその逆（これらの場合には、正電荷が維持されうる）、
・AspからGlu、およびその逆（これらの場合には、負電荷が維持されうる）、
・ThrからSer（この場合には、遊離-OHが維持されうる）、および
・AsnからGln（この場合には、遊離CONH2が維持されうる）。
【００６５】
また、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換するために、アミノ酸の置換を導入することができる。例えば、別のCysとのジスルフィド架橋の潜在的部位に、Cysを導入することができる。Hisを、特に「触媒性」である部位として導入することができる（すなわち、Hisは酸または塩基として作用することが可能であり、生化学的触媒作用における最も一般的なアミノ酸である）。Proは、タンパク質構造内でβターンを誘導する特に平面的な構造を有するため、Proを導入することができる。
【００６６】
本発明のMIF1誘導体および類似体をコードする遺伝子は、当技術分野において公知の種々の方法により製造することができる。それらの製造をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、当技術分野において公知の多数の方法（Sambrookら, 1989, 前掲）のいずれかにより、該クローン化MIF1遺伝子配列を修飾することができる。該配列を、インビトロで、適当な部位において制限エンドヌクレアーゼで切断し、ついで、必要に応じて更に酵素による修飾に付し、単離し、連結することができる。MIF1の誘導体または類似体をコードする遺伝子の製造においては、修飾された遺伝子が、所望の活性をコードする遺伝子領域内において、翻訳終結シグナルにより遮断されることなくMIF1遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内に依然として存在することが保証されるように注意すべきである。
【００６７】
また、MIF1をコードする核酸配列をインビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開始および／または終結配列を生成させ及び／又は破壊し、またはコード領域内に変異を生成させ、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成させ、または既存の該部位を破壊して、さらなるインビトロ修飾を促進させることができる。好ましくは、そのような突然変異が、突然変異したMIF1遺伝子産物の機能的活性を増強する。インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson, C.ら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; ZollerおよびSmith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphantら, 1986, Gene 44:177; Hutchinsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用などを含む（これらに限定されるものではない）当技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術を用いることができる。部位特異的突然変異誘発には、PCR技術が好ましい（Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA”, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich編, Stockton Press, 第6章, pp.61-70を参照されたい）。
【００６８】
ついで、同定され単離された遺伝子を適当なクローニングベクター内に挿入することができる。当技術分野で公知の多数のベクター-宿主系を使用することができる。考えられうるベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。ただし、該ベクター系は、用いる宿主細胞に対して和合性でなければならない。ベクターの具体例には、大腸菌（E. coli）、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、またはプラスミド、例えばpBR322誘導体もしくはpUCプラスミド誘導体、例えばpGEXベクター、pmal-c、pFLAGなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。クローニングベクター内への挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクター内に該DNA断片を連結させることにより達成されうる。しかしながら、該DNAを断片化するために使用した相補的制限部位が該クローニングベクター内に存在しない場合には、該DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、該DNA末端上にヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることにより、所望の任意の部位を得ることができる。これらの連結リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。該遺伝子配列の多数のコピーが産生されるよう、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどにより、組換え分子を宿主細胞内に導入することができる。好ましくは、クローニング細胞（例えば、大腸菌（E. coli））の増殖と、所望により適当な発現細胞系内への後続の挿入のための簡便な精製とをもたらすシャトルベクタープラスミド上に、該クローン化遺伝子を含有させる。例えば、大腸菌（E. coli）プラスミド由来の配列を酵母2mプラスミド由来の配列と連結させることによりシャトルベクター（これは、2以上の生物型内で複製されうるベクターである）を調製して、大腸菌（E. coli）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の両方における複製をもたらすことが可能である。
【００６９】
MIF1ポリペプチドの発現
MIF1またはその抗原断片、誘導体もしくは類似体、または機能的に活性なその誘導体（キメラタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター）内に挿入することができる。本発明においては、そのような要素を「プロモーター」と称することにする。したがって、本発明のMIF1をコードする核酸は、本発明の発現ベクター内でプロモーターに作動的に結合している。cDNA配列およびゲノム配列は共に、そのような調節配列の制御下でクローニングされ発現されうる。また、発現ベクターは、好ましくは、複製起点を含む。
【００７０】
必要な転写および翻訳シグナルを、組換え発現ベクター上に設けることができる。あるいは、それらは、MIF1をコードする天然遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給されうる。
【００７１】
潜在的な宿主-ベクター系には、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳類細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNAで形質転換された細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性の点で様々である。使用する宿主-ベクター系に応じて、多数の適当な転写および翻訳要素のいずれかを使用することができる。
【００７２】
本発明の組換えMIF1タンパク質またはその機能的断片、誘導体、キメラ構築物もしくは類似体は、組換えによる該コード配列の組込みの後、染色体上で発現されうる。この場合、高レベルの安定な遺伝子発現を達成するために、多数の増幅系のいずれかを用いることができる（Sambrookら, 1989, 前掲を参照されたい）。
【００７３】
MIF1をコードする核酸を含む組換えベクターが導入された細胞を、該細胞によるMIF1の発現がもたらされる条件下、適当な細胞培養培地内で培養する。
【００７４】
クローニングベクター内へのDNA断片の挿入のための既に記載されている方法のいずれかを用いて、該タンパク質コード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルよりなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNAおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝的組換え）が含まれうる。
【００７５】
MIF1タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー要素により制御されうるが、これらの調節要素は、発現用に選択した宿主内で機能的でなければならない。MIF1遺伝子発現を制御するために使用しうるプロモーターには、SV40初期プロモーター領域（BenoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-410）、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列内に含まれるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）；βラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）またはtacプロモーター（DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）などの原核性発現ベクター（“Useful proteins from recombinant bacteria”, Scientific American, 1980, 242:74-94も参照されたい）；酵母または他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal4プロモーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および組織特異性を示しトランスジェニック動物において用いられている動物転写制御領域；膵臓腺房細胞内で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら, 1984, Cell 38:639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ球様細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、乳、リンパ様およびマスト細胞内で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Lederら, 1986, Cell 45:485-495）、肝臓内で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓内で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235:53-58）、肝臓内で活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞内で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Mogramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94）、脳内の希突起神経膠細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら, 1987, Cell 48:703-712）、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）および視床下部内で活性な性腺刺激ホルモン遺伝子制御領域（Masonら, 1986, Science 234:1372-1378）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明のMIF1をコードする核酸を含有する発現ベクターは、以下の5つの一般的アプローチにより同定することができる：（a）所望のプラスミドDNAまたは特異的mRNAのPCR増幅、（b）核酸ハイブリダイゼーション、（c）選択マーカー遺伝子機能の存在または不存在、（d）適当な制限エンドヌクレアーゼでの分析、および（e）挿入された配列の発現。第1のアプローチにおいては、増幅産物の検出がもたらされるよう、PCRにより該核酸を増幅することができる。第2のアプローチにおいては、発現ベクター内に挿入された外来遺伝子の存在を、挿入されたマーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第3のアプローチにおいては、ベクター内への外来遺伝子の挿入により生じる或る「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、βガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス内の封入体形成など）の存在または不存在に基づき、組換えベクター／宿主系を同定し選択することができる。もう1つの例では、MIF1をコードする核酸を該ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入する場合には、該MIF1インサートを含有する組換え体を、MIF1遺伝子機能の不存在により同定することができる。第4のアプローチにおいては、適当な制限酵素での消化により、組換え発現ベクターを同定する。第5のアプローチにおいては、発現されたタンパク質が、機能的に活性なコンホメーションを取る場合には、該組換え体により発現された遺伝子産物の活性、生化学的または免疫学的特性に関してアッセイすることにより、組換え発現ベクターを同定することができる。
【００７７】
本発明のDNA配列を発現させる場合には、多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成DNA配列のセグメントよりなるものでありうる。適当なベクターには、SV40の誘導体および公知細菌プラスミド、例えば大腸菌（E. coli）プラスミドcol E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX（Smithら, 1988, Gene 67:31-40）、pMB9およびそれらの誘導体、RP4などのプラスミド；ファージDNAS、例えばファージ1の多数の誘導体、例えばNM989および他のファージDNA、例えばM13および繊維状一本鎖ファージDNA；酵母プラスミド、例えば2mプラスミドまたはその誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞において有用なベクター；プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、例えばファージDNAまたは他の発現制御配列を利用するように修飾されたプラスミドなどが含まれる。
【００７８】
例えば、バキュロウイルス発現系においては、非融合トランスファーベクター [例えば、pVL941（BamH1クローニング部位; Summers）、pVL1393（BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglIIおよびPsIクローニング部位; Invitrogen）、pVL1392（BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaIおよびBamH1クローニング部位; SummersおよびInvitrogen）およびpBlueBacIII（BamH1、BglII、PstI、NcoIおよびHindIIIクローニング部位; ブルー／ホワイト組換え体スクリーニングが可能; Invitrogen）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない] および融合トランスファーベクター [例えば、pAc700（BamH1およびKpnIクローニング部位; 該BamH1認識部位は開始コドンで始まる; Summers）、pAc701およびpAc702（異なるリーディングフレームを有する以外はpAc700と同じ）、pAc360（ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流にBamH1クローニング部位; Invitrogen (195)）およびpBlueBacHisA、B、C（異なる3つのリーディングフレーム; BamH1、BglII、PstI、NcoIおよびHindIIIクローニング部位、ProBond精製用のN末端ペプチドを有し、プラークのブルー／ホワイト組換え体スクリーニングが可能; Invitrogen(220)] の両方を使用することができる。
【００７９】
本発明での使用が意図される哺乳類発現ベクターには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）プロモーターなどの誘導プロモーターを有するベクター、例えば、DHFR発現ベクターまたはDHFR/メトトレキセート共発現ベクター、例えばpED（PstU、SalI、SbaI、SmaIおよびEcoRIクローニング部位; 該ベクターは、クローン化遺伝子とDHFRとの両方を発現する）を有する任意の発現ベクターが含まれる（Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)を参照されたい）。あるいは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共発現ベクター、例えば、pEE14（HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRIおよびBclIクローニング部位; 該ベクターは、グルタミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を発現する; Celltech）を使用することができる。もう1つの実施形態においては、エプスタイン・バーウイルス（EBV）の制御下でエピソーム発現を指令するベクター、例えばpREP4 [BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuIIおよびKpnIクローニング部位、構成的ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（RSV-LTR）プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen]、pCEP4 [BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuIIおよびKpnIクローニング部位、構成的ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen]、pMEP4（KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamH1クローニング部位、誘導性メタロチオネインIIa遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen）、pREP8（BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheIおよびKpnIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー; Invitrogen）、pREP9（KpnI、NheI、HindII、NotI、XhoI、SfiIおよびBamHIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、G418選択マーカー; Invitrogen）およびpEBVHis（RSV-LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ProBond樹脂により精製可能でありエンテロキナーゼにより切断されるN末端ペプチド; Invitrogen）を使用することができる。本発明で使用する選択可能な哺乳類発現ベクターには、pRc/CMV（HindIII、BstXI、NotI、SbaIおよびApaIクローニング部位; G418選択; Invitrogen）、pRc/RSV（HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaIクローニング部位、G418選択; Invitrogen）などが含まれる。本発明で使用するワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（Kaufman, 1991, 前掲を参照されたい）には、pSC11（SmaIクローニング部位、TK-およびb-gal選択）、pMJ601（SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnIおよびHindIIIクローニング部位; TK-およびb-gal選択）およびpTKgptF1S（EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHIおよびHpaクローニング部位、TKまたはXPRT選択）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
また、本発明においては、MIF1を発現させるために酵母発現系を使用することができる。例えば、2例だけを挙げると、非融合pYES2ベクター（XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1およびHindIIIクローニング部位; Invitrogen）または融合pYESHisA、B、C（XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnIおよびHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂で精製されエンテロキナーゼで切断されるN末端ペプチド; Invitrogen）を、本発明に従い使用することができる。
【００８１】
特定の組換えDNA分子を同定し単離したら、当技術分野で公知のいくつかの方法を用いてそれを増殖させることができる。適当な宿主系および増殖条件を確立したら、組換え発現ベクターを増殖させ、大量生産することができる。既に説明したとおり、使用しうる発現ベクターには、少数ながら挙げると以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない：ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。
【００８２】
また、挿入された配列の発現を、所望の特異的様態でモジュレーションし又は該遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞系を選択することができる。異なる宿主細胞は、それらに特徴的かつ特異的な、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングならびに修飾のメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングが保証されるよう、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。酵母内での発現は、生物学的に活性な産物を産生しうる。真核細胞内での発現は、「天然」のフォールディングの可能性を増大させうる。また、哺乳類細胞内での発現は、MIF1活性を再生または構成するための手段を提供しうる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度で、タンパク質分解切断などのプロセシング反応に影響を及ぼしうる。
【００８３】
ベクターは、当技術分野で公知の方法 [例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用またはDNAベクター輸送体（例えば、Wuら, 1992, J Biol. Chem. 267:963-967; WuおよびWu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; 1990年3月15日付け出願のHartmutら, カナダ国特許出願第2,012,311号を参照されたい）] により、所望の宿主細胞内に導入される。
【００８４】
培養流体を集め、例えば界面活性剤での処理、および所望により超音波処理または他の機械的処理（前記のとおり）により封入体を可溶化することにより、該タンパク質の可溶性形態を得ることができる。可溶化された又は可溶性のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、等電点電気泳動、2次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、イムノアフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差、免疫沈降などの種々の技術を用いて、あるいはタンパク質の精製のための他の任意の標準的技術により、単離することができる。
【００８５】
MIF1に対する抗体
本発明では、組換え的に又は化学合成により製造したMIF1ポリペプチドおよびその断片または他の誘導体または類似体（融合タンパク質を含む）を抗原または免疫原として使用して、該MIF1ポリペプチドを認識する抗体を産生させることができる。ある分子が、免疫グロブリン（抗体）またはT細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用しうる場合、該分子は「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは、少なくとも約10個のアミノ酸を含有する。分子の抗原性部分は、抗体またはT細胞受容体の認識に関して免疫優性な部分でありうる。あるいは、それは、抗原性部分を免疫化用担体分子と共役させることにより該分子に対する抗体の産生に使用された部分でありうる。抗原性分子は、それ自体が免疫原性である（すなわち、担体無しで免疫応答を惹起しうる）必要はない。
【００８６】
そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗MIF1抗体は交差反応性でありうる。例えば、それらは、異なる種に由来するMIF1を認識しうる。ポリクローナル抗体では、交差反応性となる可能性が、より高い。あるいは、本発明の抗体は、単一のMIF1形態（例えば、マウスMIF1）に特異的でありうる。好ましくは、そのような抗体はヒトMIF1に特異的である。
【００８７】
当技術分野で公知の種々の方法を、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体の製造に用いることができる。抗体の製造のためには、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体（例えば、断片または融合タンパク質）の注射により、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるが、これらに限定されるものではない）を免疫することができる。1つの実施形態においては、MIF1ポリペプチドまたはその断片を免疫原性担体（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH））にコンジュゲートさせることができる。免疫応答を増強するために、宿主種に応じて種々のアジュバント[フロイント（完全および不完全）、無機質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が含まれるが、これらに限定されるものではない]を使用することができる。
【００８８】
MIF1ポリペプチドまたはその断片、類似体もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の製造のためには、培養内の連続的継代細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いることができる。これらには、KohlerおよびMilstein [Nature 256:495-497 (1975)]により最初に開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術 [Kozborら, Immunology Today 4:72 (1983); Coteら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)]、およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBV-ハイブリドーマ技術 [Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985)]が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の追加的な実施形態においては、モノクローナル抗体を無菌動物において製造することができる [1989年12月28日付け公開の国際特許公開WO 89/12690]。実際、本発明では、MIF1ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子に由来する遺伝子と適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とをスプライシングさせることによる「キメラ抗体」の製造用に開発された技術 [Morrisonら, J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neubergerら, Nature 312:604-608 (1984); Takedaら, Nature 314:452-454 (1985)]を用いることができる。そのような抗体は本発明の範囲内である。そのようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害（後記）の治療での使用に好ましい。なぜなら、該ヒトまたはヒト化抗体は、異種抗体に比べて、免疫応答（特に、アレルギー応答）自体を誘導する可能性がはるかに低いからである。
【００８９】
本発明では、一本鎖Fv（scFv）抗体の製造に関して記載されている技術 [Hustonの米国特許第5,476,786号および第5,132,405号; 米国特許第4,946,778号]を、MIF1ポリペプチド特異的一本鎖抗体の製造に応用することができる。本発明の追加的な実施形態は、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体または類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメント（断片）の迅速かつ簡便な同定を可能にするFab発現ライブラリーの構築に関して記載されている技術 [Huseら, Science 246:1275-1281 (1989)]を用いる。
【００９０】
該抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、公知技術により産生させることができる。例えば、そのようなフラグメントには、該抗体分子のペプシン消化により産生されうるF(ab')2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されうるFab'フラグメント；および該抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより産生されうるFabフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
抗体の製造においては、当技術分野で公知の技術、例えばラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を使用するもの）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどにより、所望の抗体に関するスクリーニングを行うことができる。1つの実施形態においては、一次抗体上の標識を検出することにより、抗体結合を検出する。もう1つの実施形態においては、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより、一次抗体を検出する。さらにもう1つの実施形態においては、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおける結合を検出するための多数の手段が当技術分野で公知であり、本発明の範囲内に含まれる。例えば、MIF1ポリペプチドの特異的エピトープを認識する抗体を選択するために、そのようなエピトープを含有するMIF1ポリペプチド断片に結合する産物に関して、産生したハイブリドーマをアッセイすることができる。特定の動物種由来のMIF1ポリペプチドに特異的な抗体を選択する場合には、その動物種の細胞により発現された又は該細胞から単離されたMIF1ポリペプチドとの陽性結合に基づいて、選択を行うことができる。
【００９２】
前記の抗体は、MIF1ポリペプチドの局在位置決定および活性に関する当技術分野で公知の方法（例えば、前記の又は当技術分野で公知の検出技術のいずれかを用いるウエスタンブロット法、MIF1ポリペプチドのin situでのイメージング、適当な生理的サンプル中のそのレベルの測定などのための方法）において使用することができる。
【００９３】
特定の実施形態においては、MIF1ポリペプチドの活性を作動または拮抗する抗体を産生させることができる。そのような抗体は、リガンドを同定するための後記アッセイを用いて試験することができる。特に、そのような抗体は、細胞内で発現されるscFv抗体であってもよい。
【００９４】
スクリーニングアッセイ
本発明のMIF1をコードする遺伝子の同定および単離は、天然源から単離可能なものより大量のMIF1の発現をもたらし、あるいは、細胞のトランスフェクションまたは形質転換後に発現されるMIF1の活性を示すように特別に操作された指示細胞内でのMIF1の発現をもたらす。したがって、MIF1ポリペプチドの構造に基づくアゴニストおよびアンタゴニストの論理的設計に加えて、本発明は、当技術分野において公知の種々のスクリーニングアッセイを用いてMIF1の特異的リガンドを同定するためのもう1つの方法を意図する。
【００９５】
MIF1のアゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングするために、あるいはMIF1/MEKK1結合のアンタゴニストに関してスクリーニングするために、当技術分野で公知の任意のスクリーニング技術を用いることができる。
【００９６】
本発明は、小分子リガンドまたはリガンド類似体および模擬体に関するスクリーニング、ならびにインビボにおいてMIF1に結合しMIF1の活性を作動または拮抗する天然リガンドに関するスクリーニングを意図する。例えば、本発明のアッセイを用いて、MIF1活性を作動または拮抗する分子に関して天然物ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００９７】
MIF1活性を作動または拮抗する及び／又はMIF1/MEKK相互作用をモジュレーションする分子または化合物は、細胞アポトーシスの調節解除を伴う病理または他の病理（例えば、炎症および喘息、免疫抑制、心臓虚血または肥大、骨髄形成異常症候群、神経変性、肝臓変性障害、自己免疫疾患、ウイルス感染症、エイズ、血管新生障害に関連した病理、慢性関節リウマチ、創傷治癒不全、アテローム動脈硬化症、糖尿病性網膜症、カポジ肉腫、乾癬など）の予防および／または治療のための新たな立脚点となりうる。
【００９８】
この点に関して、本発明はまた、MIF1活性を作動または拮抗する及び／又はMIF1/MEKK相互作用をモジュレーションする分子または化合物の治療的に有効な量を投与することを含んでなる、MIF1活性を抑制または活性化することを要する又はMEKK活性を調節することを要する個体の治療方法を提供する。本発明は、医薬の製造のための、そのような分子または化合物の使用を提供する。
【００９９】
MIF1の一次配列、および公知機能を有するタンパク質とその配列との類似性の知見は、該タンパク質のインヒビターまたはアンタゴニストとしての最初の手がかりを与えうる。該タンパク質の構造的特徴を、例えばX線結晶学、中性子回折、核磁気共鳴分光法、および構造決定のための他の技術を用いて決定することにより、アンタゴニストの同定およびスクリーニングが更に促進される。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの論理的設計または同定をもたらす。
【０１００】
もう1つのアプローチは、大きなライブラリーを得るために組換えバクテリオファージを用いるものである。「ファージ法」[ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlinら, Science, 249:404-406 (1990)]を用いて、非常に大きなライブラリー（106〜108個の化合物）を構築することができる。第2のアプローチは、主として化学的方法を用いるものである。そのような化学的方法としては、例えば、Geysen法 [Geysenら, Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysenら, J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)]およびFodorらの方法 [Science 251:767-773 (1991)]が挙げられる。Furkaら[14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)]、Houghton [1986年12月発行の米国特許第4,631,211号]およびRutterら [1991年4月23日付け発行の米国特許第5,010,175号]は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験されうるペプチドの混合物の製造方法を記載している。
【０１０１】
もう1つの態様においては、本発明に従いMIF1リガンドに関してスクリーニングするために、合成ライブラリー [Needelsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993); Ohlmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lamら, 国際特許公開WO92/00252; Kocisら, 国際特許公開WO9428028; それらの各々の全体を参照により本明細書に組み入れることとする]などを使用することができる。
【０１０２】
MIF1を発現する組換え細胞を用いて、あるいは前記の精製されたタンパク質（例えば、組換え的に産生されたもの）を使用して、該スクリーニングを行うことができる。例えば、前記の参照文献に記載のとおり、ライブラリーをスクリーニングするために、該分子のMEKK結合性部分を含む標識された可溶性MIF1の能力を利用することができる。
【０１０３】
1つの実施形態においては、MIF1を直接的に標識することができる。もう1つの実施形態においては、関心のある分子（例えば、固相支持体に結合した分子）に対するMIF1の結合を検出するために、標識された二次試薬を使用することができる。酵素標識による発色団のin situでの形成により、結合を検出することができる。適当な酵素には、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。もう1つの実施形態においては、関心のある異なる受容分子上に2つの酵素標識を有する2つの発色性基質を使用する2つの発色アッセイを用いることができる。交差反応性および単一反応性リガンドを、二色アッセイで同定することができる。
【０１０４】
本発明で使用する他の標識には、着色ラテックスビーズ、磁気ビーズ、蛍光標識 [例えば、発蛍光団を少数ながら挙げると、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン（PE）、テキサスレッド（TR）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド系列塩、特にEu3+などである]、化学発光分子、放射性同位体または磁気共鳴イメージング標識が含まれる。二色アッセイは、2以上の着色ラテックスビーズ、または異なる波長で発蛍光する発蛍光団を用いて行うことができる。標識は、視覚的に又は機械的／光学的手段により検出することができる。機械的／光学的手段には、蛍光活性化ソーティング（すなわち、FACSと類似した方法）、およびマイクロマニピュレーター除去（removal）手段が含まれる。
【０１０５】
本明細書に例示されているとおり、MIF1タンパク質のレベルは、該タンパク質の代謝標識により評価することができる。[35S]-メチオニンで補足された培地の存在下での生検組織のインビトロでのインキュベーション中に代謝標識が生じるため、検出される各マーカーのレベルは該インビトロ条件により影響されうる。[35S]-メチオニンでの代謝（または生合成）標識に加えて更に、[14C]-アミノ酸および[3H]-アミノ酸（該トリチウムは、反応活性でない位置で置換される）での標識が、本発明において意図される。したがって、化合物のサンプルまたはライブラリーを、その中のタンパク質の標識後に、直接的に分析することができる。これは、例えば、銀、金、クーマシーブルーまたはアミド-シュワルツ（amido-schwartz）（少数の例が挙げられているにすぎない）を使用する比色染色；例えば[32P]-オルトホスフェート、[125I]、[131I]での同位体標識；蛍光または化学発光タグ；および標識抗体による又はマーカーの特異的結合パートナーによる免疫学的検出により行うことができる。
【０１０６】
また、MIF1に対するリガンド、MIF1/MEKK1結合のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、およびMEKK1をリン酸化しうるMAP4Kを同定するために、酵母におけるツーハイブリッド系でのスクリーニングにおいて、MIF1 cDNAおよび誘導体を使用することができる。
【０１０７】
遺伝子治療およびトランスジェニックベクター
前記のとおり、「ベクター」は、本発明の核酸を宿主細胞内に導入するための任意の手段である。好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。例えば、抗血管新生性タンパク質またはそのポリペプチドドメイン断片をコードする遺伝子を、ウイルスベクターを使用して又はDNAの直接導入によりインビボ、エクス・ビボ（ex vivo）またはインビトロで導入する。標的組織内での発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化することにより行うことができる。そのような標的化は、例えば、ウイルスベクターまたは受容体リガンドを使用して又は組織特異的プロモーターを使用して又はその両方を使用することにより行うことができる。
【０１０８】
前記のとおり、本発明の発現ベクターを使用して、細胞をトランスフェクトしてMIF1活性のモジュレーターのスクリーニングまたは生物学的試験を行ったり、あるいは遺伝子治療用にインビボまたはエクスビボ（ex vivo）でMIF1遺伝子またはMIF1アンチセンス遺伝子を運搬して例えばMIF1活性のレベルを増加または減少させることができる。また、抗MIF scFvを発現するベクターを、後記の技術を用いて導入することができる。
【０１０９】
インビボまたはエクスビボ（ex vivo）ターゲッティングおよび治療操作において一般に使用されるウイルスベクターとしては、DNA系ベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターを構築し使用するための方法は、当技術分野において公知である [例えば、MillerおよびRosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)を参照されたい]。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損型である。すなわち、それらは標的細胞内で自律的には複製されない。一般に、本発明の範囲内で使用される複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞内での該ウイルスの複製に必要な少なくとも1つの領域を欠く。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術により除去（全部または一部）または非機能化されうる。これらの技術には、全摘出、置換（他の配列、特に、挿入された核酸による置換）、（複製に）必須な領域に対する1以上の塩基の付加または部分的欠失が含まれる。そのような技術は、遺伝子操作の技術を用いて又は突然変異誘発剤での処理によりインビトロ（単離されたDNA上）またはin situで行うことができる。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子を被包するのに必要なそのゲノムの配列を保有する。
【０１１０】
DNAウイルスベクターには、弱毒化または欠損DNAウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルスなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞内に導入された後、複製可能ではなく、したがって生産的ウイルス感染を引き起こさない。欠損ウイルスベクターの使用により、特定の限局領域内の細胞への投与が可能となり、この場合、該ベクターが他の細胞に感染するのではないかと心配する必要がない。このようにして、特定の組織が特異的に標的化されうる。個々のベクターの具体例には、欠損ヘルペスウイルス1（HSV1）ベクター [Kaplittら, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)]、糖タンパク質L遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター [特許公開RD 371005 A]または他の欠損ヘルペスウイルスベクター [1994年9月24日付け公開の国際特許公開WO94/21807; 1994年4月2日付け公開の国際特許公開WO92/05263]；弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetら [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); また、La Salleら, Science 259:988-990 (1993)も参照されたい]；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター [Samulskiら, J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulskiら, J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowskiら, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)]が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
インビボ投与の場合には、好ましくは、ウイルスベクターおよびトランスフェクト化細胞の免疫不活性化を回避するために、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）での処理と共に適当な免疫抑制処理を行う。例えば、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を阻止するために、免疫抑制性サイトカイン、例えばインターロイキン12（IL-12）、インターフェロンγ（IFN-γ）または抗CD4抗体を投与することができる [例えば、Wilson, Nature Medicine (1995)を参照されたい]。また、最小数の抗原を発現するように操作されたウイルスベクターを使用するのが好都合である。
【０１１２】
もちろん、本発明は、遺伝子治療用途のための、治療的に有効な量のMIF1を発現するベクターの運搬を意図する。本発明で用いる「治療的に有効な量」なる表現は、宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％減少させ、最も好ましくはそれを予防するのに十分な量を意味する。あるいは、治療的に有効な量は、宿主における臨床的に有意な状態の改善をもたらすのに十分な量である。
【０１１３】
本発明の任意のウイルス性または非ウイルス性ベクターが、医薬上許容されるビヒクルまたは担体中でインビボにおいて好ましく導入されるであろう。「医薬上許容される」なる表現は、ヒトに投与された場合にアレルギー性または同様の不都合な反応（例えば、胃の不調、眩暈など）を典型的には引き起こさない生理的に許容されうる分子または組成物に関して用いられる。好ましくは、本発明で用いる「医薬上許容される」なる語は、連邦政府または州政府の統制機関により承認されていること、または米国薬局方もしくは一般に認められた他の薬局方（動物、特にヒトでの使用に関するもの）に掲載されていることを意味する。「担体」なる語は、該化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌液、例えば水および油（石油、動物、植物または合成技術に由来するものを含み、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる）であってもよい。水または水溶液、例えば、食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、担体、特に注射液用担体として好ましく使用される。適当な医薬担体は、E.W. Martin（Remington's Pharmaceutical Sciences）により記載されている。
【０１１４】
アデノウイルスベクター
好ましい実施形態においては、該ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に運搬するよう修飾されうる真核性DNAウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。本発明の範囲内においては、これらの血清型のうち、2型または5型ヒトアデノウイルス（Ad2またはAd5）または動物由来のアデノウイルス（WO94/26914を参照されたい）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用されうる動物由来のアデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Mav 1, Beardら, Virology 75 (1990） 81）、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル（例えば、SAV）由来のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくは、CAV2アデノウイルス（例えば、ManhattanまたはA26/61株 (ATCC VR-800)）である。
【０１１５】
好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、ITR、カプシド化配列、および関心のある核酸を含む。より好ましくは、該アデノウイルスベクターの少なくともE1領域が非機能的である。E1領域における欠失は、好ましくは、Ad5アデノウイルスの配列のヌクレオチド455〜3329（PvuII-BglII断片）またはヌクレオチド382〜3446（HinfII-Sau3A断片）に伸長する。また、他の領域、特にE3領域（WO95/02697）、E2領域（WO94/28938）、E4領域（WO94/28152、WO94/12649およびWO95/02697）または後期遺伝子L1-L5のいずれかが修飾されていてもよい。
【０１１６】
好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1領域に欠失を有する（Ad 1.0）。E1欠失アデノウイルスの具体例はEP 185,573（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。もう1つの好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1およびE4領域における欠失を有する（Ad 3.0）。E1/E4欠失アデノウイルスの具体例はWO95/02697およびWO96/22378（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。さらにもう1つの好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E4領域および該核酸配列が挿入されたE1領域における欠失を有する [FR94 13355（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい]。
【０１１７】
本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術（Levreroら, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917）により製造することができる。特に、とりわけ対象DNA配列を保持するプラスミドとアデノウイルスとの間の相同組換えにより、それらを製造することができる。該アデノウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系内にコトランスフェクトした後、相同組換えが生じる。使用する細胞系は、好ましくは、（i）前記要素により形質転換されうるべきである；そして（ii）好ましくは組換えの危険性をなくすために組込み形態として、該複製欠損アデノウイルスのゲノム部分を相補しうる配列を含有すべきである。使用されうる細胞系の具体例としては、ヒト胎児腎細胞系293（これは、そのゲノム内に組込まれたAd5アデノウイルスのゲノムの左側部分（12％）を含有する）（Grahamら, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59）、およびE1およびE4の機能を相補しうる細胞系（出願WO94/26914およびWO95/02697に記載されている）が挙げられる。当業者によく知られた標準的な分子生物学的技術を用いて、組換えアデノウイルスを回収し精製する。
【０１１８】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、感染細胞のゲノム内に安定かつ部位特異的に組込まれうる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。それは、細胞の増殖、形態学または分化に何ら影響を及ぼすことなく広域スペクトルの細胞に感染することが可能であり、ヒトの病理には関与しないらしい。AAVゲノムは既にクローニングされ配列決定され特徴づけられている。それは、約4700塩基を含み、両端に約145塩基の逆方向末端反復配列（ITR）領域を含有し、これは該ウイルスの複製起点として働く。該ゲノムの残りの部分は、被包化機能を保持する2つの必須領域；ウイルスの複製および該ウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含有する該ゲノムの左側部分；および該ウイルスのカプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含有する該ゲノムの右側部分に分けられる。
【０１１９】
インビトロおよびインビボで遺伝子を導入するためのAAV由来のベクターの使用は既に記載されている（WO91/18088; WO93/09239; 米国特許第4,797,368号, 米国特許第5,139,941号, EP 488 528を参照されたい）。これらの刊行物は、repおよび／またはcap遺伝子が欠失し対象遺伝子で置換された種々のAAV由来構築物を記載しており、該対象遺伝子をインビトロで（培養細胞内）またはインビボで（生物内に直接的に）導入するための、これらの構築物の使用を記載している。2つのAAV逆方向末端反復配列（ITR）領域に隣接した対象核酸配列を含有するプラスミドと、AAV被包化遺伝子（repおよびcap遺伝子）を保持するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞系内にコトランスフェクトすることにより、本発明の複製欠損組換えAAVを増殖させることができる。ついで、産生されたAAV組換え体を標準的技術により精製する。
【０１２０】
したがって、本発明はまた、AAV ITRに隣接した抗血管新生性因子をコードする核酸をコードする配列を含むゲノムを有するAAV由来組換えウイルスに関する。本発明はまた、AAV由来の2つのITRに隣接した抗血管新生性因子をコードする核酸をコードする配列を含むプラスミドに関する。そのようなプラスミドを、そのまま該核酸配列の導入に使用することが可能であり、適宜、該プラスミドをリポソームベクター（偽ウイルス）内に取込ませることができる。
【０１２１】
レトロウイルスベクター
もう1つの実施形態においては、該遺伝子をレトロウイルスベクター内に導入する（例えば、Andersonら, 米国特許第5,399,346号; Mannら, 1983, Cell 33:153; Teminら, 米国特許第4,650,764号; Teminら, 米国特許第4,980,289号; Markowitzら, 1988, J. Virol. 62:1120; Teminら, 米国特許第5,124,263号; EP 453242, EP 178220; Bernsteinら, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; 1995年3月16日付け公開のDoughertyら, 国際特許公開WO 95/07358; およびKuoら, 1993, Blood 82:845に記載されている）。レトロウイルスは、分裂中の細胞に感染する組込み性ウイルスである。レトロウイルスゲノムは、2つのLTR、被包化配列および3つのコード領域（gag、polおよびenv）を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいては、一般には、gag、polおよびenv遺伝子を完全に又は部分的に欠失させ、関心のある異種核酸配列で置換する。これらのベクターは、HIV、MoMuLV（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、MSV（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハーベイ肉腫ウイルス」）、SNV（「脾臓壊死ウイルス」）、RSV（「ラウス肉腫ウイルス」、フレンドウイルスなどの種々の型のレトロウイルスから構築することができる。欠損レトロウイルスベクターはWO95/02697に開示されている。
【０１２２】
一般には、核酸配列を含有する組換えレトロウイルスを構築するために、LTR、被包化配列およびコード配列を含有するプラスミドを構築する。この構築物を、パッケージング細胞系（この細胞系は、該プラスミドに欠損しているレトロウイルス機能をトランスで供給しうる）にトランスフェクトするために使用する。したがって、一般には、該パッケージング細胞系はgag、polおよびenv遺伝子を発現しうる。そのようなパッケージング細胞系は先行技術において既に記載されており、特に、細胞系PA317（米国特許第4,861,719号）、PsiCRIP細胞系（WO90/02806）およびGP+envAm-12細胞系（WO89/07150）が挙げられる。また、該組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTR内の修飾、と、gag遺伝子の一部を含みうる長い被包化配列とを含有していてもよい（Benderら, J. Virol. 61 (1987) 1639）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的技術により精製する。
【０１２３】
レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するように又は一連のトランスフェクションに付されるように構築されうる。前者の場合には、腫瘍原性トランスフォーメーション特性を与える遺伝子以外のその遺伝子の全部を保有するように及び異種遺伝子を発現するように、該ウイルスを修飾する。非感染性ウイルスベクターの調製は、該ウイルスパッケージングシグナルが破壊されるように、かつ該異種遺伝子と該パッケージングシグナルとを含有するよう操作された共導入ウイルスのパッケージングに必要な構造遺伝子が保有されるように行う。したがって、産生されるウイルス粒子は、さらなるウイルスを産生する能力を有さない。
【０１２４】
標的化遺伝子運搬は、1995年10月に公開された国際特許公開WO95/28494に記載されている。
【０１２５】
非ウイルスベクター
別法として、リポフェクションにより該ベクターをインビボで導入することができる。過去10年の間に、インビトロで核酸をカプセル化しトランスフェクトするためのリポソームの使用が益々増加してきている。リポソーム媒介トランスフェクションの際に遭遇する問題点や危険性を制限するように設計された合成正電荷脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる [Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackeyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988)を参照されたい; Ulmerら, Science 259:1745-1748 (1993)]。正電荷脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進することが可能であり、また、負に荷電した細胞膜との融合を促進することが可能である [FelgnerおよびRingold, Science 337:387-388 (1989)]。核酸の導入に特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863およびWO96/17823ならびに米国特許第5,459,127号に記載されている。外因性遺伝子を特定の器官内にインビボで導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実用的利点を有する。特定の細胞に対するリポソームの分子ターゲッティングは、有益な1つの領域を代表するものである。特定の細胞型にトランスフェクションを導くことが、細胞不均質性を有する組織（例えば、膵臓、肝臓、腎臓および脳）においては特に有利であることが明らかである。ターゲッティングの目的のために、脂質を他の分子と化学的にカップリングさせることができる [Mackeyら, 前掲を参照されたい]。ターゲッティングされるペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質（例えば、抗体）、または非ペプチド性分子を、リポソームに化学的にカップリングさせることができる。
【０１２６】
また、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するためには、他の分子、例えば正電荷オリゴペプチド（例えば、国際特許公開WO95/21931）、DNA結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公開WO96/25508）または正電荷重合体（例えば、国際特許公開WO95/21931）も有用である。
【０１２７】
また、該ベクターを裸のDNAプラスミドとしてインビボで導入することも可能である。当技術分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体の使用）[例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); WuおよびWu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); 1990年3月15日付け出願のHartmutら, カナダ国特許出願第2,012,311号; Williamsら, Proc. Natl. Acad. USA 88:2726-2730 (1991)を参照されたい]により、遺伝子治療用の裸のDNAベクターを所望の宿主細胞内に導入することができる。受容体介在DNA運搬アプローチを用いることも可能である [Curielら, Hum. Gene Ther: 3:147-154 (1992); WuおよびWu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]。
【０１２８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より深く理解されるであろう。これらの実施例は本発明の典型例として記載されている。
【０１２９】
（実施例）
材料および方法
酵母株
Hela細胞融合バンクをツーハイブリッド系によりスクリーニングするための手段として、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）属（MATa、ura3-52、his3-200、ade2-101、lys2-801、trp1-901、leu2-3、112、can1、gal4-542、gal80-538、met16::URA3-pGAL1/10-LacZ）のYCM17株を使用した。それを以下の培地上で培養した。
【０１３０】
YPD完全培地：
・酵母エキス（10g/L）（Difco）
・バクト-ペプトン（20g/L）（Difco）
・グルコース（20g/L）（Merck）
寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。
【０１３１】
YNB最少培地：
・酵母窒素塩基（アミノ酸を含まない）（6.7g/L）（Difco）
・グルコース（20g/L）（Merck）
寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。この培地上での栄養要求性酵母の増殖を可能にするためには、該酵母が依存するアミノ酸または窒素塩基50mg/Lをそれに加えることが必要である。
【０１３２】
細菌株
使用する組換えプラスミドを増幅し単離するための手段として、遺伝子型supE、hsdD5、thi、D(lac-proAB)、F'[tra D36 pro A+B+ lacIqlacZDM15]の大腸菌（Escherichia coli）のTG1株を使用することができる。それを以下の培地上で培養した：
LB培地：
・NaCl（5g/L）（Difco）
・バクト-トリプトン（10g/L）（Difco）
・酵母エキス（5g/L）（Difco）
寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。アンピシリン（100μg/ml）は、この抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子をマーカーとして保持するプラスミドを受容した細菌の選択を可能にする。
【０１３３】
プラスミド
一連のpGBT（Clontech、または以下に記載されている：Roder KH, Wolf SSおよびSchweizer M (1996) Anal. Biochem 241:260-2）のベクターを使用した。これらは、細菌および酵母の2つの微生物内で高コピー数で複製されるのを可能にする細菌および酵母の複製起点を有するシャトルプラスミドである。これらのプラスミドは、GAL4のDNA結合ドメインのコード配列の下流かつ終結コドンの上流に位置するマルチクローニング部位を含有していて、融合タンパク質の形成をもたらす。それらはまた、エス・セレビシエ（S. cerevisiae）の遺伝子TRP1を含有し、これは、遺伝子型trp1の酵母が相補されてトリプトファン非含有最少培地上でそれらが選択されるのを可能にする。このベクターは、アンピシリン耐性を付与する遺伝子を保持し、該遺伝子は、それを有する細菌のアンピシリン含有培地上での選択を可能にする。
【０１３４】
一連のpGAD（Clontech）のベクターも使用した。これらは、GAL4のトランスアクチベータードメインと、関心のあるタンパク質またはHela細胞バンク由来のcDNA（EcoRI XhoI部位のレベルで挿入されているもの）にコードされるタンパク質との融合タンパク質が酵母内で発現されるのを可能にするベクターである。
【０１３５】
タンパク質p53とT抗原との間のタンパク質-タンパク質相互作用を示すための陽性対照として、ベクターpAV3およびpTD1（Clontech）を使用した。
【０１３６】
一連のBluescriptベクター（Stratagene）を使用した。これらのベクターは、一連のpMTL（Chambersら, Gene 1988, 68, pp 139-149）と同様にクローニングを行うことを可能にする。
【０１３７】
また、ベクターpCDNA3（Invitrogen）および誘導体ベクター（pSG42およびpCNW8）を使用した。これらは、哺乳類細胞内でのCMVプロモーターの制御下のタンパク質発現を可能にする。
【０１３８】
また、PCR断片のクローニングを可能にするベクターpCRII（Invitrogen）を使用した。
【０１３９】
これらのプラスミド内にcDNAをクローニングし挿入するために用いた遺伝子工学技術は、通常のプロトコールによるものであった（Maniatis Tら, “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprinng Harbor, N.Y., 1982; Ausbel F.M.ら (編), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley＆Sons, New York, 1987）。
【０１４０】
プラスミドDNAの調製
Promegaの高速DNA調製キットを該製造業者の説明書に従い使用して、大量のDNAを調製した。以下の方法により少量のDNAを調製した。該プラスミドを含有する細菌を、シェーカー内のLB培地2ml中、攪拌しながら少なくとも4時間培養した。ついでそれらを、エッペンドルフチューブ中、14,000rpmで2分間遠心分離し、ついで該濃縮物を、100μlの溶液I（50mMグルコース, 25mM Tris-HCl pH8バッファー, 10mM EDTA pH8）中の懸濁液に戻し、200μlの溶液II（0.2M NaOH, 1％ SDS）で溶菌した。ついで該溶菌溶液を150μlの溶液III（3M酢酸カリウム, 11.5％(v/v)氷酢酸）で中和した。綿状沈殿物が得られるまで該チューブを攪拌した後、フェノール/クロロホルム（水中に飽和した50％フェノールおよび50％クロロホルム）の混合物150μlを加え、全混合物を30秒間攪拌した。14,000rpmで2分間の遠心分離の後、該DNAを含有する水相を回収した。ついで該DNAを、0.5容積のイソプロパノールの添加により沈殿させ、ついで14,000rpmで5分間遠心分離し、最終的に20μlのTE-RNアーゼ（50μg/ml RNアーゼと共に10mM Tris-HClおよび1mM EDTAを含む溶液）に溶解するために風乾した。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAの酵素増幅
二本鎖DNA、dNTP(0.2mM)、PCRバッファー（10mM Tris-HCl pH8.5、1mM MgCl2、5mM KCl、ゼラチン0.01％）、該オリゴヌクレオチドのそれぞれの0.5μgおよび2.5 IUのAmpli Taq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）の存在下でホルムアミド（5％）の存在下または不存在下、100μlの最終容積中でPCR反応を行った。該サンプルの蒸発を抑えるために、該混合物を2滴のパラフィン油で覆った。使用した装置はAppligeneの「Crocodile II」であった。ヘリックスを変性させるために、90℃の温度で変性を行った。該変性（一本鎖）DNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための温度は、該オリゴヌクレオチドの分離のための温度より5〜10℃低かった。該酵素による伸長には、72℃の温度を用いた。PCRにより得た断片をクローニングに使用し、それらがクローニングされたら、該断片を系統的に再配列決定して、増幅中に生じたかもしれない突然変異が存在しないことを確認した。
【０１４２】
β-シアノエチル保護基を使用するホスホロアミダイト法（Sinha, 1984）により、該オリゴデオキシヌクレオチドを化学合成した。合成後、アンモニアでの処理により該保護基を除去し、ブタノールでの2回の沈殿により、該オリゴデオキシヌクレオチドの精製および濃縮が達成された（Sawadogo, 1991）。光学濃度を260nmで測定することにより、該DNA濃度を測定した。
【０１４３】
連結反応
すべての連結反応は、100〜200ngのベクター、0.5〜2μgのインサート、40 IUの酵素T4 DNAリガーゼ（Biolabs）および連結バッファー（50mM Tris-HCl pH7.8; 10mM MgCl2; 10mM DTT、1mM ATP）の存在下、10μlの最終容積中、+14℃で一晩行った。該インサートの不存在下での該ベクターの連結により、陰性対照を得た。
【０１４４】
供給業者の説明書に従い、大腸菌（E. coli）のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント（Biolabs）により連結する前に、必要に応じて、突出5'末端を埋めた。突出3'末端の破壊を、製造業者の推奨に従い使用したT4ファージのDNAポリメラーゼ（Biolabs）の存在下で行った。
【０１４５】
細菌の形質転換
Chungら（1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2172-2175）の方法によりコンピテント化されたTG1細菌を形質転換するために、全連結容積（10μl）を使用した。600nmで0.6のODが得られるまで、該TG1細菌を、インキュベーター中、液体LB培地内の培養内に37℃で攪拌しながら数時間配置した。ついで該培地を6,000rpmで10分間遠心分離した。最初の培養の培地容積の1/10に相当する容積のTSB（LB培地 + 100g/LのPEG 4000、5％ DMSO、10mM MgCl2、10mM MgSO4）に該細菌濃縮物を溶解することにより、該細菌をコンピテント化した。4℃で30〜60分間インキュベートした後、200μlの細菌を、氷上で15分間該連結産物と接触させて配置した。200μlのLB（培地）を加えた後、該細菌を37℃で30分間インキュベートし、ついでLB+アンピシリン培地上に広げた。
【０１４６】
DNAの分離および抽出
DNAの分離を、そのサイズに相関する電気泳動により行った。これを行うためには、分離する断片のサイズに応じて種々のゲルを使用した：
・大きなDNA断片（500bpを超えるもの）を分離するためには、TBEバッファー（90mM Tris塩基、90mMホウ酸塩; 2mM EDTA）中の1％アガロースゲル（Gibco BRL）；
・小さな断片（500bp未満のもの）を分離するためには、TBEバッファー中の2％ NuSieveアガロースゲル（FMC Bioproducts）。
【０１４７】
アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上での泳動を、TBEバッファー中および分子量マーカー（1Kbラダー, Gibco BRL）の存在下で行った。該DNAを、該ゲル上で析出させる前に、青色の析出物容積（200g/LのFicoll、0.5g/Lのブロモフェノールブルー、50mM EDTA）の1/10と混合した。100ボルトで泳動させ臭化エチジウム（0.5μg/mlゲル）で染色した後、該バンドをUVランプ下で可視化した。
【０１４８】
アガロースゲルのバンドからの該DNAの抽出は、電気溶出により以下のとおりに行った。該DNA断片を含有するゲル片を小刀で切り出し、2個のクランプで密封され100〜500μlのTBEを含有する透析チューブ内に配置した。該全混合物を電気泳動タンク内に配置し、該タンク内でそれを100ボルトの電場にさらした。ついで、該DNAを該ゲルから取り出した後、該DNAをフェノール/クロロホルムでの2回の抽出およびそれに続くクロロホルムでの2回の抽出により精製し、ついで0.3M酢酸ナトリウムおよび2.5容積の無水アルコールの存在下で沈殿させた。遠心分離（14,000rpmで5分間）の後、該DNA濃縮物を乾燥させ、ついで20μlの水に溶解した。
【０１４９】
プラスミドDNAの蛍光配列決定
異なる蛍光マーカーを有する4種のジデオキシリボヌクレオチドを使用しSangerの方法に従い、配列決定を行った。これらのジデオキシリボヌクレオチドのうちの1種の取込みは、配列決定するDNAのTaqポリメラーゼによる複製の停止を引き起こした。この反応は種々のサイズのDNA断片を与え、それらはすべて、それらの4種のジデオキシリボヌクレオチドのうちの1種により3'で終結するものであった。1μgのプラスミドおよび4ピコモルのプライマーを、Applied Biosystemsから商標PRISM（著作権）で供給されている9.5μlの「プレミックス（premix）」に加えた。96℃で30秒間の変性工程、50℃で15秒間のハイブリダイゼーション工程および60℃で4分間の伸長工程に分けられる25サイクルのPCRを行うためには、最終容積を20μlにしなければならなかった。増幅後に得られたDNA断片を排除カラム（ClontechからのChromaspin-30）上で精製し、ついでSpeed Vac中で乾燥した。該乾燥物質のすべてを、24μlのEDTA（50mM）と120μlの脱イオン化ホルミアミドとからなる5μlの混合物に溶解した。96℃で3分間の変性後、3〜5μlを電気泳動ゲル上で析出させた。種々のDNA断片を、それらのサイズに応じて分離し、ついで、種々の発蛍光団が検出されるABI 370 DNAシークエンサー（Applied Biosystems）のレーザーリーダーの前方に連続的に通過させた。
【０１５０】
Hela細胞バンク（Clontech（登録商標））からのプラスミドの調製
Hela細胞cDNAバンクを細菌の形態で入手した。該バンクの力価を確認した後、8mlのLB（培地）内に予め配置されているHela細胞融合バンクからの2μlの細菌を固体培地上にまばらに広げて、このバンクの典型的性質を維持するようにした。したがって、本発明者らは、LB+アンピシリン培地を含有する16 770cm2のディッシュ上に該細菌を広げた。該ディッシュのそれぞれについて、出現したコロニーを30mlの液体LB+アンピシリン培地中に溶解した。ついで、得られた懸濁液をエルレンマイヤーフラスコ中に配置し、シェーカー中、37℃で3時間でインキュベートした。ついで、Maxiprep技術により、これらの株から該DNAを抽出した。DNA濃度を260nmで測定した。
【０１５１】
プラスミドによる酵母の形質転換
100mlの液体培地内で培養した酵母細胞を、3,000rpmで3分間の遠心分離後に集め、1mlの無菌水中の懸濁液中に配置した。3,000rpmで3分間の遠心分離後、該細胞濃縮物を再び、1mlの無菌水中の懸濁液中に配置し、ついで再び遠心分離した。該培地の痕跡を除去するために、この操作をもう1度繰返した。ついで該酵母細胞を1mlの形質転換溶液I（0.1M LiAc、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA）中に溶解し、3,000rpmで3分間遠心分離した。該細胞濃縮物を再び、1mlの形質転換溶液Iに溶解した。50μlのこの懸濁液を50μgのサケ精子DNAおよび1〜5μgのプラスミドDNAと混合した。つぎに300μlの形質転換溶液II（0.1M LiAc、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA; 40％ PEG4000中）を加え、ついで該全混合物を28℃で30分間インキュベートした。ついで該形質転換混合物に、水浴中、40℃で15分間の熱ショックを与え、ついで該全混合物を15,000rpmで1分間遠心分離して該細胞濃縮物を集めた。この濃縮物を200μlの水に溶解し、ついで、該形質転換プラスミドにより提供されたマーカーに対応するアミノ酸を含有していない寒天最少培地上に広げた。ついで該酵母を28℃で72時間培養した。
【０１５２】
Hela細胞cDNAバンクによる酵母の形質転換は、異なる方法で行った。使用した酵母は、GAL4のDNA結合ドメインに融合したMEKKの発現を許容するプラスミドpCM433を含有していた。それを、107細胞/mlの濃度になるまで、250mlのYPG最少培地中、攪拌しながら28℃で培養した。該細胞を3,000rpmで10分間の遠心分離により集め、250mlの水に溶解した。もう1度遠心分離した後、該細胞濃縮物を100mlの水に溶解し、再び遠心分離した。ついで該濃縮物を10mlの形質転換溶液Iに溶解し、攪拌しながら28℃で1時間インキュベートした。遠心分離後、該細胞をもう1度、2.5mlの形質転換溶液I、100μlのHela細胞cDNAバンクおよび20mlの形質転換溶液IIに溶解し、ついで攪拌しながら28℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物に42℃で20分間、熱ショックを与えた。遠心分離（3,000rpmで5分間）を連続的に3回繰返した。各遠心分離において、該濃縮物を10mlの無菌水に溶解した。3回目の遠心分離では、該濃縮物を2.5mlの無菌水に溶解した。このようにして、細胞に毒性のPEGが除去された。2.4mlのこの懸濁液を使用して、アミノ酸His、LysおよびMetならびに塩基UraおよびAdeを含有する250mlの最少培地に播き、シェーカー中、28℃で一晩培養した。該一晩培養物を遠心分離（3,000rpmで5分間）し、連続して2回、無菌水で洗浄した。ついで該濃縮物を2.5mlの水に溶解した。2.4ml（この容積を無菌水中で10mlまで増加させた）を使用して、YNB+Lys+Met+His+Ade培地を含有する10 435cm2ディッシュに播き、それを3日間インキュベートした。
【０１５３】
酵母ゲノムおよびプラスミドDNAの調製
平均的な酵母クローンアリコートを、直径450μmの3gのガラスビーズおよび200μlのフェノール/クロロホルムの存在下、200μlのTELT溶液（2％ Triton X100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris pH8、1mM EDTA）中に配置した。この混合物を15分間ボルテックスし、ついで14,000rpmで2分間遠心分離した。該タンパク質ケークを取込むことなく、該上清を集め、この相中に含まれるDNAを2.5容積の無水アルコールで沈殿させた。14,000rpmで2分間の遠心分離後、該DNA濃縮物を乾燥させ、20μlのTE-RNアーゼに溶解した。ゲノムとプラスミドDNAとの混合物に相当するこのDNA溶液を、細菌の形質転換に直接使用した。該プラスミドDNAだけが該細菌中で複製可能であり、ミニプレップ技術により分析可能であった。
【０１５４】
β-ガラクトシダーゼ活性試験
ニトロセルロースのシートを、個々の酵母クローンを含有するペトリディッシュ上に予め配置した。吸着現象のため、該クローンの配置と一致した像が得られた。ついで、このシートを液体窒素中に30秒間浸して酵母を破裂させ、それによりβガラクトシダーゼ活性を放出させた。融解後、1.5mlのPBS溶液（60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4、pH7）および10〜30μlのX-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシダーゼ）と50mg/mlのN,N-ジメチルホルムアミドとで予め飽和されたワットマン紙を含有する別のペトリディッシュ中に、ニトロセルロースのシートを、コロニーが上向きになるように配置した。ついで該ディッシュを、乾燥を防ぐためにカバーで密閉して、オーブン中に37℃で配置した。青染色が出現するまでの時間は、数分から数時間までの大きなばらつきを示した。この試験は、既知相互作用を有し迅速に青変する陽性対照の存在下で行った。
【０１５５】
CHO-K1細胞のトランスフェクション
CHO-K1細胞を完全培地（HAM's F12、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、1％ペニシリン、1％グルタミン）中で増殖させた。細胞（1.105細胞/ウェル）を6ウェルプレート中に播き、完全培地中で24時間増殖させた。ついで、GIBCO-BRLからのリポソーム製剤（Lipofectamine試薬）を使用し該製造業者の推奨に従い、細胞を1μg/ウェルの合計量のプラスミド（pCDNA3またはpCM562）でトランスフェクトした。トランスフェクションの4日後、細胞を10cmペトリディッシュ中に播き、500μg/mlのG418と共に2週間インキュベートした。ついで耐性細胞をプールし、分析および／または凍結するまで、G418の存在下で増殖させた。
【０１５６】
細胞抽出物およびPAGE-SDSによるタンパク質発現分析
細胞をPBS（1,06mM KH2PO4、154mM NaCl、5,6mM Na2HPO4）で洗浄し、HNTG溶解バッファー [Hepes pH7.4 50mM、NaCl 150mM、TritonX100 1％、グリセロール10％]中で集めた。30分間の細胞溶解の後、細胞抽出物を遠心（2000rpmで10分間、室温）し、比色アッセイ（Pierce）により上清中のタンパク質を定量した。熱変性後、10μgの細胞抽出物を10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離し、PVDFメンブレン上にエレクトロブロットした。ブロットをTBS [Tris pH7.5mM 20mM、NaCl 150mM]-Tween 0.1％中の2％乾燥乳で4℃で16時間飽和させた。二次抗体としてのHRP酵素と共役した抗マウス抗体を使用するECL表現系（Amersham）およびマウス抗myc抗体を使用して、Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質を検出した。
【０１５７】
Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質を発現する安定クローンの生成
MIF1/MSP58タンパク質を発現する安定クローンを、個々の細胞のクローニングにより得た。200μl当たり約0.1個の細胞を含有する細胞懸濁液を96ウェルプレートに分注（200μl/ウェル）し、37℃で数日間インキュベートした（3個のプレートを調製した）。4週間増殖させた後、36個のクローンを得、細胞抽出物を、抗myc抗体を使用する免疫ブロット法により分析して、MIF1/MSP58タンパク質を検出した。
【０１５８】
外部刺激で処理した細胞におけるJNKキナーゼ活性の分析
細胞（2.105個/ウェル）を6ウェルプレートに播き、完全培地中で24時間インキュベートした。ついで200μMのソルビトール（PBS中に新たに希釈したもの）を加え、細胞を5、15または30分間インキュベートした。対照細胞を200μlのPBSで処理した。インキュベーション後、細胞をPBSで素早く洗浄し、プロテアーゼPICのインヒビター（0.1mMペファブロック、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン、1μg/mlアンチパイン、10μg/mlベンズアミジン、1μg/mlダイズトリプシンインヒビター、1μg/mlキモスタチン、1μg/mlペプスタチンA）で補足された200μlのb-グリセロリン酸バッファー（80mM b-グリセロリン酸 pH7.4、20mM EGTA pH8、15mM MgCl2）中で集めた。ついで細胞を超音波処理（6×30秒）し、細胞抽出物を100,000rpm、4℃で30分間の超遠心分離により清澄化した。上清（細胞質ゾル抽出物）を-80℃で保存した。タンパク質濃度をPierce試薬で測定した。500ngの細胞抽出物を、20mM HEPES pH7.4、5mM MgCL2、2mM DTT、2mM EGTA中、基質（2.5μg）としてのGST-cJun(1/223)組換えタンパク質のインビトロリン酸化に使用した。反応混合物をPKI（20μg/ml）、Na3VO4（1mM）、ATP（25μM）および33PgATP 3μCiで補足した。サンプルを30℃で10分間インキュベートし、Laemmliローディングバッファー（5X）の添加により反応を停止させた。タンパク質を、10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離する前に熱不活性化（95℃で10分間）した。ホスホルイメージャー（phosphorimager）（Packard）を使用して、リン酸化GST-Jun (1-223)タンパク質を定量した。
【０１５９】
アポトーシスアッセイ
細胞（2.105個/ウェル）を6ウェルプレートに播き、完全培地中で24時間インキュベートした。200mMのソルビトールを加え、細胞を24時間インキュベートした。ついで上清を遠心（3500rpm、室温で10分間）して、アポトーシス性細胞をペレット化した。プレートからの細胞をトリプシン処理により集め、PBSで洗浄し、遠心した。ついでペレットを冷エタノールに穏やかに再懸濁させ、RNアーゼ（1mg/ml）の存在下でのヨウ化プロピジウム染色（10μg/ml）後のFACS分析により10000個の細胞上でアポトーシスを調べた。
【０１６０】
GST-MEKK1プラスミドの構築
全MEKK1（Russelら, 1995, J. Biol. Chem. vol 270 p11757）コード配列を含有するpCM556由来のHindIII[平滑]-XhoI断片を、HpaIおよびXhoI酵素で切断したpBCGSTプラスミド（Biotechniques, 1995, vol 18, p142）中にクローニングした。MEKK1配列（C-Term）に融合したGST（N-Term）のオープンリーディングフレームを、DNA配列決定により確認した。このプラスミドをpBCGST-MEKK1と命名した。
【０１６１】
GSTプルダウンによるMIF1/MSP58-MEKK1相互作用の分析
CHOMIF1/MSP58#34（6.105細胞）を10cmペトリディッシュに播き、完全培地中で3日間増殖させた。ついでリポフェクタミン試薬（Gibco）を使用して、GST-MEKK1タンパク質をコードするプラスミド（pBCGST-MEKK1）または対照としてのpBCGSTの10μgで細胞をトランスフェクトした。ついで細胞を完全培地で24時間増殖させた。ついで、細胞溶解の前に、細胞を200mMソルビトールの存在下または不存在下で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、1mM Na3O4、4mM NaF、10μM AlC13と共にプロテアーゼインヒビターPICを含有する500μlのHNTGバッファー中、4℃で細胞溶解した。ついで細胞を超音波処理（6×30秒）し、細胞抽出物を遠心分離（4℃、3000rpmで10分間）により清澄化した。上清（500μl）を、HNTGで平衡化されたGSHセファロース4B（Pharmacia）100μlと共に4℃で1時間、回転させながらインキュベートした。遠心分離後、GSH-セファロースを200μlのHNTGで3回洗浄した。GST/GSH複合体を、100μlのTris.HCl（pH7.7）50mM、GSH 10mM中、4℃で16時間溶出した。ついでGSH-セファロースを4000rpm（4℃）で30分間遠心し、溶出液のアリコート30μlを10％ Tris-グリシン PAGE-SDS上にローディングし、抗GST抗体（Tebu）および抗myc抗体（MIF1/MSP58の検出用）を使用するウエスタンブロットにより分析した。
【０１６２】
実施例1：MEKK1とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の発現を可能にするベクターの構築
二重（double）ハイブリッド系を用いるバンクのスクリーニングは、タンパク質MEKK1がトランスアクチベータータンパク質GAL4のDNA結合ドメインと融合していることを要する。GAL4のDNA結合ドメイン（GAL4DB）に対応する配列と同じリーディングフレームにてpCM411（MEKK1をコードする遺伝子を保持するベクターpMTL21）由来の断片EcoR1-Xho1が導入されているベクターpGBT9（前記「材料および方法」）を用いて、この融合タンパク質の発現を行った。MEKK1遺伝子をプラスミドpGBT9のEcoR1-Sal1部位のレベルで挿入して、プラスミドpCM433を得た。
【０１６３】
該構築物を配列決定した。これは、該MEKK1遺伝子が実際に、GAL4DBに対応する断片と同じオープンリーディングフレームにて存在することを証明した。
【０１６４】
実施例2：Hela細胞融合バンクのスクリーニング
本発明者らにとって関心のあるタンパク質と相互作用しうるGAL4のトランスアクチベータードメインに融合したタンパク質を産生するクローンの同定が、融合バンクのスクリーニングにより達成されうる。この相互作用は、YCM17株におけるレポーター遺伝子URA3およびLacZの発現を誘導しうるトランスアクチベーターの再構成を可能にする。
【０１６５】
このスクリーニングを行うために、ヒトHela細胞cDNAを使用して作製した融合バンクを選択した。このバンクは細菌の形態で供給されたため、該バンクのプラスミドDNAをまず精製した。
【０１６６】
融合バンクからのプラスミドDNAの調製
Hela細胞cDNAバンクからのプラスミドDNAを、Clontech（登録商標）のプロトコール（「材料および方法」）に従い抽出した。この調製中に、該バンクの典型的性質を維持すること、すなわち、それを含む独立したプラスミドの数（合計6×106個のプラスミド）を維持することが重要であった。この調製中にバンクからプラスミドが喪失するのを防ぐために、該プラスミドDNAロットを、該バンクの典型的性質の3倍を少し超える数（すなわち、1.8×107個のコロニー）に対応する単離された細菌コロニーから得た。
【０１６７】
Hela細胞バンクによる形質転換およびβガラクトシダーゼ活性試験による選択
該融合バンクからの各独立プラスミドが、少なくとも1つの酵母中に、プラスミドGAL4DB-MEKK1と同時に存在する高い可能性が、該スクリーニング中に確保される必要があった。これは、該酵母の形質転換に関する優れた効率を必要とした。この目的のために、形質転換細胞105個/1μg DNAの効率を与える酵母形質転換プロトコールを選択した。また、2つの異なるプラスミドによる該酵母の同時形質転換はこの効率を減少させるため、プラスミドpCM433により予め形質転換された酵母を使用した。この酵母株を該融合バンク由来の100μgのプラスミドDNAにより形質転換した。DNAのこの量は、本発明者らが1.5×106個の形質転換細胞を得ることを可能にした。機能的GAL4トランスアクチベーターを再構成しうる形質転換細胞の選択を、YNB+Lys+Met+His+Ade培地上で行った。得られたクローンのlacZ活性を確認した。
【０１６８】
この第2選択の終了までに、表現型Ura+およびbGal+を有する46個のクローンを得た。
【０１６９】
実施例3：選択されたプラスミドインサートの同定
該酵母から抽出したプラスミドを該細菌内に導入し、ついで「材料および方法」に記載のとおりに調製した。該EcoRI部位から52bpの位置に存在するHela細胞cDNAバンクの挿入部位付近のGAL4TA領域の相補的オリゴヌクレオチドCTATTCGATGATGAAGATACCCC（配列番号9）を使用して、配列決定を行った。オープンリーディングフレーム（配列番号1）を表すがGenBank寄託配列に対する有意な相同性を示さない同一cDNAが、該陽性クローンにおいて数回見出された。この遺伝子をMIF1と命名し、該cDNAバンク由来の対応プラスミドをpCM480と命名した。このスクリーニング中、他の4つの配列がオープンリーディングフレームを示した。2つはGenBank寄託配列と同一であった（すなわち、プラスミドpCM479およびpCM481に対応するそれぞれセントリン（またはカルトラクチン）およびUBC9）。プラスミドpCM524由来の、オープンリーディングフレームを示す1つの配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子に対する若干の相同性をタンパク質レベルで示した。オープンリーディングフレームを示す最後の配列は、GenBank寄託配列に対する相同性を全く示さなかった。
【０１７０】
実施例4：MEKK1の種々の欠失断片とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の酵母内発現を可能にするベクターの構築
プラスミドpCM433のNco1-Nco1断片の欠失は、プラスミドpCM484の入手を可能にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸353〜672の発現を可能にした。
【０１７１】
プラスミドpCM433のPst1-Pst1断片の欠失は、プラスミドpCM485の入手を可能にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸1〜369の発現を可能にした。
【０１７２】
プラスミドpCM433のSac1-Sac1断片の欠失は、プラスミドpCM486の入手を可能にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸287〜672の発現を可能にした。
【０１７３】
実施例5：タンパク質MEKK1とMIF1との相互作用領域の位置決定
酵母yCM17株を、実施例1および4に記載の種々のプラスミドおよびpCM480で同時形質転換した。「材料および方法」に記載のとおりに、β-gal活性を測定した。これは、MIF1との相互作用に必須のMEKK1の領域の検出を可能にした。実際、287〜353の領域がMIF1との相互作用に重要であるらしい（図1を参照されたい）。
【０１７４】
実施例6：MEKK1のキナーゼDEAD突然変異体とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の酵母内発現を可能にするベクターの構築
プラスミドpCM411上で、オリゴヌクレオチド9471および7841でPCR断片を増幅した。この断片をStu1およびPshA1で消化し、ついで、制限酵素Stu1およびPshA1で切断されたプラスミドpCM433中に連結した。得られたプラスミドをpCM518と命名した。
【０１７５】
プラスミドpCM518のSac1-Sac1断片の欠失は、プラスミドpCM519の入手を可能にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したキナーゼ-dead MEEK1pのアミノ酸287〜672の発現を可能にした。
【０１７６】
プラスミドpCM518のNco1-Nco1断片の欠失は、プラスミドpCM520の入手を可能にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したキナーゼ-dead MEEK1pのアミノ酸353〜672の発現を可能にした。
【０１７７】
実施例7：タンパク質MEKK1とGal4のトランス活性化ドメインとの融合タンパク質およびタンパク質MIF1とGal4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の酵母内発現を可能にするベクターの構築
Gal4のトランス活性化ドメイン（GAL4TA）に対応する配列と同じリーディングフレームにてpCM411由来の断片EcoR1-Xho1が導入されたベクターpGAD424（「材料および方法」）により、タンパク質MEKK1とGal4のトランス活性化ドメインとの融合タンパク質の発現が達成された。このプラスミドの配列を確認した。このプラスミドをpCM490と命名した。
【０１７８】
GAL4のDNA結合ドメイン（GAL4DB）に対応する配列と同じリーディングフレームにてpCM480由来の断片EcoR1-Xho1が導入されたベクターpGBT9+2（「材料および方法」）により、タンパク質Mif1とGal4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の発現が達成された。このプラスミドの配列を確認した。このプラスミドをpCM491と命名した。
【０１７９】
実施例8：タンパク質Mekk1pとMifp1との相互作用領域の位置決定
酵母yCM17株を、プラスミドpCM479、pCM480、pCM481、pCM482およびpCM524と同時に実施例1、4、5、6および7に記載の種々のプラスミドで形質転換した。「材料および方法」に記載のとおりに、β-gal活性を検出した。タンパク質MEKK1pのキナーゼ活性が、タンパク質MIF1p（pCM480）、セントリン（pCM479）、およびプラスミドpCM482およびpCM524のタンパク質との相互作用に重要であるらしい。これに対して、タンパク質UBC9p（pCM481）とのその相互作用はキナーゼ活性の不存在に影響されないらしい（図1を参照されたい）。
【０１８０】
実施例9：タンパク質MIF1pをコードする遺伝子の5'部分の同定
プラスミドpCM480のインサートの配列に対して又は相互間で高い割合の相同性を示すGenBankの種々のESTのコレクション（すなわち、EST番号W26888, 受託番号g1306116; EST番号AA134651, 受託番号g1695513; EST番号F12127, 受託番号g706460; EST番号W00383, 受託番号g1271822; EST番号T66207, 受託番号g675252; EST番号R28239, 受託番号g784374）から、コンセンサス配列を確立することができた。タンパク質MIF1をコードする配列の5'末端を増幅するためのオリゴヌクレオチド：5' CGC GGA GAA ATT GTT GGA 3'（配列番号10）/5' CCG ATA TCG CAC TTG GTC CCC TTT GG 3'（配列番号11）を、このコンセンサス配列から選択した。Hela細胞cDNAバンク上でPCRを行った後、得られた断片を、該供給業者が提供している説明書に従いプラスミドpCR2中にクローニングして、プラスミドpCM577を得た。プラスミドpCM577のインサートの配列を確認した。該断片の980個中603個のヌクレオチドが、プラスミドpCM480のインサートの5'末端と同一であることを確認した。残りの377ヌクレオチドは、タンパク質MIF1をコードするcDNAの5'末端部分に対応した。これらの2つの配列を結合させることにより、タンパク質MIF1の全コード配列（配列番号7）を再構成させることができた。
【０１８１】
実施例10：mycタグを有するタンパク質MIF1の哺乳類細胞内発現を可能にするベクターの構築
オリゴヌクレオチド：5' agcttccaccatggagcagaagctgatctccgaggaggac ctggaattctctcgag3'（配列番号12）および5' gatcctcgagagaattccaggtcctcctcgg agatcagcttctgctccatggtgga 3'（配列番号3）をペアにし、ついでBamH1およびHind3で消化されたベクターpCDNA3内に連結してプラスミドpSG47を得た。ベクターpCM480由来のSma1-Apa1断片をpSG47のEcoR1およびApa1部位のレベルで挿入して、pCM500を得た。ついで該Apa1-Apa1断片を適切な配向でpCM500のApa1部位のレベルで連結して、プラスミドpCM501を得た。オリゴヌクレオチド：5' CGG GAT CCA TGG ACA AAG ATT CTC AG 3'（配列番号4）および5' CCG ATA TCG CAC TTG GTC CCC TTT GG 3'（配列番号11）を使用するPCRにより、タンパク質Miflpをコードする配列の5'末端をプラスミドpCM577から増幅し、それをBamH1およびEcoRVで消化し、同様にBamH1およびEcoRVで消化されたベクターｐBluescriptII内に連結した。得られたプラスミドをpCM525と命名した。このプラスミドの配列を確認した。プラスミドpCM525のBamH1-PshA1断片をプラスミドpCM501のBamH1-PshA1部位のレベルで挿入した。得られたプラスミドpCM562は、CMVプロモーターの制御下、mycタグを有するタンパク質Miflpの哺乳類細胞内発現を可能にした。
【０１８２】
実施例11：HAタグを有するタンパク質MEKK1pの哺乳類細胞内発現を可能にするベクターの構築
オリゴヌクレオチド：5' agcttccaccatgtatccgtatgatgtgcctgactacgcagaattctc tcgag 3'（配列番号5）および5' gatcctcgagagaattctgcgtagtcaggcacatcatacggata cagggtgga 3'（配列番号6）をペアにし、ついでBamH1およびHind3で切断されたベクターpCDNA3内に連結してプラスミドpSG52を得た。プラスミドpCM411のEcoR1-Xho1断片をpSG52のEcoR1-Xho1部位のレベルで挿入した。得られたpCM556は、CMVプロモーターの制御下、HAタグを有するMEKK1pの哺乳類細胞内発現を可能にした。
【０１８３】
実施例12：インビボおよびインビトロでのMIF1の真核性発現
ESTライブラリーのスクリーニングによる試験では、MIF1は多種多様な組織において発現される。ヒト腫瘍サンプルのノーザンブロット分析は、すべての被検腫瘍において発現される2.4kbの唯一のメッセンジャーRNAを検出する（図2）。正常化（normalized）ヒト多組織ブロットのノーザンブロット分析により示されるとおり、MIF1は、正常組織においても発現される。より強い発現が心臓、膵臓および胎盤において見出された。この最後の組織においては、異なるメッセンジャーを検出することができた。これらの異なるサイズのメッセンジャーの観察は、天然スプライシング変異体が存在することを示している。
【０１８４】
NIH3T3細胞における一過性トランスフェクション実験においては、MIF1タンパク質は、Gal4Junレポーターに融合したMEKK1タンパク質でのコトランスフェクションにより得られるJNK活性化のレベルを減少させた（図4）。安定なトランスフェクト体をCHOおよびPC12細胞において得た。MIF1タンパク質の過剰発現による毒性は何ら認められなかった。これは、細胞内で過剰発現された場合に細胞アポトーシスを誘導すると報告されているMEKK1の触媒ドメインとは対照的である。
【０１８５】
MIF1のアミノ酸16〜28（S14Y）に対応するペプチドに対するポリクローナル抗体を産生させた。この抗体は、ヒトおよびマウスの両方のMIF1タンパク質を認識し、ウエスタンブロットにおけるMIF1タンパク質の検出を可能にした（図5）。
【０１８６】
実施例13：MIF1タンパク質を発現する安定クローンの作製
CMVプロモーターの制御下でMIF1 cDNAをコードするプラスミド（pCM562）または対照としての空ベクター（pCDNA3）で、細胞をトランスフェクトした。G418耐性細胞のプールの細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。結果は、pCM562で安定にトランフェクトされた細胞が、タグ付きMIF1/MSP58タンパク質を発現することを示した（図6）。抗myc抗体を使用する免疫蛍光による分析は、G418耐性細胞のプールにおける種々のレベルのMIF1タンパク質発現から生じた核の不均一標識を示した。ついで、高レベルのMIF1タンパク質を発現する細胞の個々のクローニングを行い、36個のクローンをMIF1タンパク質発現に関して試験した。高レベルの組換えタンパク質の産生に関して、2つのクローンを選択した（#14および#34）（図7）。これらのクローンは、pCDNA3ベクターでトランスフェクトされた対照細胞と比較して増殖速度における有意な相違を示さなかった（図8）。
【０１８７】
実施例14：MIF1はソルビトール誘導性JNK活性を阻害する
本発明者らは、MEKK1刺激を介したJNK活性化に対するMIF1発現の効果を分析するためにCHOMIF1 #34を使用した。
【０１８８】
Yurijiら（Science (1988), vol 282, p1911）は、MEKK1が、200mMソルビトールに応答してJNKを活性化することを示した。ソルビトールによるMEKK1の活性化に対するMIF1発現の効果を分析するために、本発明者らは、200mMソルビトールの存在下でCHOMIF1細胞および対照細胞（CHOpCDNA3）を種々の時間（5、15および30分間）インキュベートした。ついで細胞抽出物を調製し、MEKK1活性化（およびそれに続くJNK活性化）を、インビトロGST-Jun（1-223）リン酸化試験（「材料および方法」を参照されたい）を用いて分析した。MIF1発現細胞は、ソルビトールのインキュベーションに応答したJNK活性化の阻害（弱いGST-JUNリン酸化により示される）を示した（図9）。これらの結果は、ソルビトール（200mM）での刺激の後に、MIF1が、見掛け上はMEKK1活性の阻害により、JNK活性化を阻害することを示した。
【０１８９】
実施例15：ストレス条件においてMIF1はMEKK1と相互作用する
細胞内でのMEKK1タンパク質とMIF1タンパク質との相互作用を分析するために、本発明者らは、GST-MEKK1タンパク質（約120Kda）をコードする組換えプラスミドを構築した（「材料および方法」を参照されたい）。CHOMIF1 #34細胞内へのトランスフェクションの後、ソルビトール（200mM）を30分間加えるか又は加えず、ついで細胞を細胞溶解し、GST-タンパク質をGSH-セファロース上に固定した。過剰のGSH溶液で溶出した後、タンパク質複合体をTris-グリシン PAGE-SDS上に分離し、抗GST抗体（図11）または抗myc抗体（図12）を使用するウエスタンブロットにより分析した。図11に示されている結果は、細胞抽出物のインキュベーション後にGSTおよびGST-MEKK1がGSHセファロースと相互作用したことを示している。図12は、MIF1-mycタグ付き細胞タンパク質がMEKK1タンパク質と相互作用したことを示している。この相互作用は、ストレス条件（+ソルビトール）において、より重要であり（レーン4をレーン3と比較されたい）、このことは、酵母ツーハイブリッド実験において既に示されているとおり、MIF1-MEKK1相互作用がMEKK1リン酸化により促進されることを示している。これらの結果は、ツーハイブリッド酵母系において得られたデータを証明するものであり、MIF1タンパク質が細胞内でリン酸化MEKK1タンパク質と相互作用することを示している。
【０１９０】
総合すると、これらの結果は、MEKK1タンパク質によるストレスキナーゼカスケードの活性をMIF1が阻害しうること、およびそれがMEKK1タンパク質との直接的相互作用により生じることを証明している。
【０１９１】
実施例16：MIF1はMEKK1活性の阻害によりアポトーシスに対する細胞の感受性を増強する
MEKK1の活性化はソルビトールに対する長期暴露による細胞アポトーシスを防ぎうることが示されている（Yurijinら, (1988), Science vol 282, p1911; Yurijinら, (1999), J. Biol. Chem., vol 274, p12605）。
【０１９２】
CHOpCDNA3およびCHOMIF1 #34のアポトーシスに対する感受性を、細胞を200mMソルビトール中で24時間インキュベトした後に分析した。結果は、MIF1を発現する細胞が、ソルビトール誘導性アポトーシスに対して、対照細胞より感受性であることを示した（図10）。
【０１９３】
実施例17：MEKK1-MIF1タンパク質相互作用を破壊する化合物を同定するための試験
本明細書に記載の方法は、MEKK1-MIF1相互作用およびMEKK1のキナーゼ活性を阻害する薬物の同定を可能にする。この方法は、ツーハイブリッド技術に基づく（Fields S, Sternglanz R Trends Genet 1994 Aug;10(8):286-92 The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions/Mendelsohn AR, Brent R Curr Opin Biotechnol 1994 Oct;5(5):482-6 Applications of interaction traps/two-hybrid system to biotechnology research/Bemis LT, Geske FJ, Strange R. Methods Cell Biol 1995;46:139-51 Use of the yeast two-hybrid system for identifying the cascade of protein interactions resulting in apoptotic cell death/White MA. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Sep 17;93(19):10001-3 The yeast two-hybrid system: forward and reverse/Luban J, Goff SP Curr Opin Biotechnol 1995 Feb;6(1):59-64 The yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions./Bai C, Elledge SJ Methods Enzymol 1996;273:331-47 Gene identifications using the yeast two-hybrid system/Frederickson RM Curr Opin Biotechnol 1998 Feb;9(1):90-6 Macromolecular matchmaking: advances in two-hybrid and related technologies./T Colas P, Brent R rends Biotechnol 1998 Aug;16(8):355-63 The impact of one-hybrid and related methods on biotechnology./Vidal M, Legrain P Nucleic Acids Res 1999 Feb 15;27(4):919-29 Yeast forward and reverse‘n'-hybrid systemに概説されている)。
【０１９４】
DNA結合ドメインに融合した欠失MEKK1または完全長MEKK1を使用する（対応するコード配列を、例えば酵母プラスミドpCM433およびpCM486内にクローニングする（実施例1および4に記載されてる））。トランスアクチベータードメインに融合した欠失MIF1または完全長MIF1を使用する（例えば、対応するコード配列をプラスミドpCM480内にクローニングする（実施例3に記載されている））。使用する酵母ツーハイブリッド株は、少なくとも1つのレポーター遺伝子（URA3、HIS3、LEU2、CYH2、CAN1、lacZ、GFPまたは他のレポーター遺伝子が挙げられる）と、レポーター遺伝子の発現の検出を可能にする関連突然変異（すなわち、レポーター遺伝子としてURA3遺伝子を使用する場合にはura3突然変異）とを、各試験化合物の内部濃度を増加させる追加的な遺伝子突然変異または不活性化の存在下または不存在下に有する（WO96/10082を参照されたい）。一例として、「材料および方法」に記載の酵母yCM17株を用いる。MEKK1/MIF1相互作用の減少を引き起こす薬物は、レポーター遺伝子の発現の減少を誘導する。レポーター遺伝子の発現をモニターするためには、種々の方法（例えば、レポーター遺伝子にコードされる酵素タンパク質の比色／蛍光／発光酵素アッセイ）を用いることができる。酵母染色体突然変異を相補するレポーター遺伝子に選択的な培地上で、増殖阻害性ハロ体（halo）を測定することができ、一方、非選択培地上で増殖性ハロ体を測定することができる（対抗選択が利用可能な場合）（例えば、レポーター遺伝子がURA3の場合にはフルオロ体含有培地；レポーター遺伝子がCAN1で酵母がcan1突然変異または不活性化を有する場合にはカナバニン含有培地などである）。酵母生物学において用いられるこれらのすべての方法は、文献に詳細に記載されている（Methods Enzymol 1991;194:1-863 Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods Enzymol 1983,101:167-346 Recombinant DNA, Biotechnology 1989;13:1-354 Yeast genetic engineering; Methods in molecular biology 1996,53,1-433 Yeast protocols; Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach, John R. Johnston編集 1994 1-300; The Yeast Two-Htbrid System 1997 1-356 Paul L. BartelおよびStanley Fields; Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual 1997; Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, 1990）。
【０１９５】
MIF1/MSP58-MEKK1結合のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するための二次スクリーニングの原理を、図13に記載する。MIF1/MSP58を過剰発現する細胞安定クローン（例えば、クローンCHOMIF #34）を、MEKK1/JNK経路の活性化を表現するレポーター系でトランスフェクトする（Yujiriら, 1999, J. Biol. Chem. Vol 274, p12605; Yujiriら, 1998, Science, vol 282, p1911）。プラスミド1は、MIF1/MSP58をコードし（例えば、pCM562）、ネオマイシン耐性遺伝子を保持する。プラスミド2および3は、レポーター遺伝子系Gal4-Jun/Gal 4 Lucを与え（Lassignal Johnsonら, 1996 J. Biol. Chem. Vol 271, p3229; Guptaら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216; Hibiら1993, Genes and Dev., Vol 7, p2135）、異なる他の2つの選択マーカーを保持する（例えば、プラスミド2はハイグロマイシン耐性遺伝子を保持し、プラスミド3はゼオシン耐性遺伝子を保持する）。プラスミド2は融合タンパク質Gal4(1-147)-Jun(1-233)をコードしている（Hibiら, 1993, Genes and Dev., vol 7, p2135, Sadowskiら, 1989, Nucleic Acids Res, Vol 17, p7539）。このタンパク質は、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流のプロモーター内に位置するGal4-DBD配列に結合することが可能であり（Guptaら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216）、Jun部分がリン酸化されるとルシフェラーゼ遺伝子の転写を活性化する。MEKK1/JNK経路を活性化する外部刺激は、低濃度（200mM）のソルビトールまたは低温ショックまたはノコダゾール（0.5μg/ml）などでありうる（Yujiriら, 1999, J. Biol. Chem. Vol 274, p12605; Yujiriら, 1998, Science, vol 282, p1911）。被検分子を、外部刺激の存在下（または前もしくは後）、完全培地内に加える。ルシフェラーゼ活性を、製造業者の説明書（Promega）に従う細胞溶解の後に分析し、ルミノメーターで測定する。
【０１９６】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の記載および添付図面から当業者に理解されるであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１９７】
さらに、核酸またはポリペプチドに関して与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は概数であり、説明用に記載されていると理解されるべきである。
【０１９８】
本明細書中に引用した種々の刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  トランケート化MEKK1および部分的または完全長MIF1をコードする種々のプラスミドの組で形質転換された酵母yCM17株におけるβ-ガラクトシダーゼの活性の検出。
【図２】  ヒト腫瘍サンプルのノーザン分析。該プローブは、完全長MIF1をコードするpCM562プラスミドから得た1069bpのKpnI-BamHI断片よりなる。該プローブを標準的方法REDIPRIME（Amersham）で標識し、製造業者の説明書に従いハイブリダイズさせた。
【図３】  ヒト組織のノーザン分析。該プローブは、図2に記載のものと同じであった。
【図４】  MIFの存在下および不存在下にMEKKでトランスフェクトされたNIH3T3細胞上のルシフェラーゼ活性。
【図５】  CHO K1細胞抽出物のウエスタンブロット。pcDNA3 MIF1/MSP58プラスミドで細胞をトランスフェクトするか又はトランスフェクトしなかった。ペプチドS14Y（アミノ酸残基16〜28）へのポリクローナル抗体の結合により、MIF1の発現を判定した。
【図６】  CHOトランスフェクト化細胞（プールNeoR）内でのMIF1の発現。CHOK1をpCDNA3（レーン1）およびpCM562（Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質をコードする）（レーン2）でトランスフェクトし、G418で選択した。耐性細胞を集め、細胞溶解した。細胞抽出物を10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離し、エレクトロブロットし、MIF1/MPS58の発現を、抗myc抗体を使用して検出した。ペルオキシダーゼと共役した2次抗体を使用するECL系（Amersham）を用いて表現させた。
【図７】  安定なクローンにおけるMIF1の発現。96ウェルプレートの細胞懸濁液の限界希釈により、pCM562でトランスフェクションした後、個々の安定なクローンをNeoR耐性細胞のプールから誘導した。増幅後、抗myc抗体を使用して各クローン（示されているクローンは#13、#14および#34である）をMIF/MSP58タンパク質の発現に関して試験した。クローニング前のトランスフェクト化細胞の細胞抽出物をレーンT+pCM562にローディングした。
【図８】  24ウェルプレート中、完全培地（HAM's F12、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、1％ペニシリン、1％グルタミン、500μG/mkl G418）内に密度1（5.103細胞/ウェル）で細胞を播いた。各時点で、ウェルを計数し、結果を4個の独立した計数値の平均で表した。
【図９】  MIF1/MSP58は、ソルビトールで誘導されたJNK活性を阻害する。CHOpcDNA3（空ベクターを使用して得られたCHO安定クローン）およびCHO-MIF34（MIF1/MSP58を過剰発現するCHO安定クローン#34）安定細胞を、示されている時間にわたりソルビトール（200mM）によるストレスに付し、JNKの活性化に対するMIF1/MSP58の過剰発現の効果を、サイトゾル抽出物によるGST-Jun（1〜223）基質のリン酸化（インビトロリン酸化）により直接調べた。
【図１０】  MIF1/MSP58の発現は、緩和な浸透圧ショック（200mMソルビトール）に応答したアポトーシスを増強する。細胞を6ウェルプレート内に播き、200mMソルビトールの存在下または不存在下で24時間インキュベートした。ついで、ヨウ化プロピジウム染色後、FACSによりアポトーシスを検出した。
【図１１】  GSH-セファロース上のGST-MEKK1の保持。CHOMIF1/MSP58#34細胞をpBCGST（対照ベクター、レーン1および2）またはpBCGST-MEKK1（レーン3および4）でトランスフェクトし、200mMソルビトールで処理するか（レーン1および3）または処理しなかった（レーン2および4）。細胞抽出物をGSHセファロース上で固定し、タンパク質複合体を過剰のGSHで溶出した。PAGE-SDS上へのローディング後、結合タンパク質を抗GST抗体で分析し、ECL系で表現した。結果は、両方のタンパク質がGSH-セファロースに結合することを示した。
【図１２】  GSTプルダウンは、MIF1/MSP58がMEKK1タンパク質と相互作用することを示している。CHOMIF1/MSP58#34細胞をpBCGST（対照ベクター、レーン1および2）またはpBCGST-MEKK1（レーン3および4）でトランスフェクトし、200mMソルビトールで処理するか（レーン1および3）または処理しなかった（レーン2および4）。細胞抽出物をGSHセファロース上で固定し、結合タンパク質をGSHで溶出した。PAGE-SDS上へのローディング後、MIF-MSP58の存在を、抗myc抗体を使用して検出し、ECL系で表現した。結果は、MIF1/MSP58がGST-MEKK1に結合すること、および該結合がストレスにより調節されることを示している。
【図１３】  MIF1/MSP58-MEKK1結合のアンタゴニストまたはアゴニストの同定のための2次スクリーニングの原理。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0004548938.tif 000025
【図１２】
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【図１３】
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