(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な発現増進性を有するＤＮＡ断片を検出および任意に選択する方法であって、
１）ベクター中の、ｉ）遺伝子転写抑制性クロマチンの誘導に関係するリプレッサータンパク質複合体によって認識されるＤＮＡ配列と、ii）プロモーターを含有するレポーター遺伝子との間に、＜５０００塩基対のサイズを有するＤＮＡ断片をクローニングする工程であって、結果として、該リプレッサータンパク質複合体によって認識されるＤＮＡ配列と該レポーター遺伝子との間の距離が５０００塩基対より少ない、様々な断片を含有するベクターを生じる工程、
２）該ベクターを宿主細胞に導入する工程であって、該宿主細胞においては該リプレッサータンパク質複合体が発現されており、該ベクターにおけるプロモーターは宿主細胞において活性化され得るが、遺伝子転写抑制性クロマチンの誘導がレポーター遺伝子の抑制を生じさせる工程、および
３）レポーター遺伝子活性を示す宿主細胞を同定するために、宿主細胞を選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
４）安定な発現増進性を有するＤＮＡ断片を単離する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程３）における選択を、成長阻害剤に対する耐性を提供するレポーター遺伝子を使用することにより行い、宿主細胞を成長阻害剤の存在する中で培養することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
成長阻害剤が、成長阻害剤に対する耐性を提供する遺伝子が活性化していない宿主細胞を殺すために充分高い濃度で存在することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗生物質を成長阻害剤として使用し、レポーター遺伝子が抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子であることを特徴とする請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
抗生物質がゼオシンである請求項５記載の方法。
【請求項７】
レポーター遺伝子がグリーン蛍光タンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
蛍光活性化細胞分別装置（ＦＡＣＳ）を用いて、蛍光を発しない宿主細胞から蛍光を発する宿主細胞を分離することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
断片が２０００〜３０００塩基対の間のサイズを有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リプレッサータンパク質複合体が、ヘテロクロマチン結合タンパク質１（ＨＰ１）を含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
リプレッサータンパク質複合体が、ポリコウム群（Ｐｃ−Ｇ）タンパク質を含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リプレッサータンパク質複合体が、ヒストンデアセチラーゼ活性をもつことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
リプレッサータンパク質複合体が、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
リプレッサータンパク質複合体によって認識されるＤＮＡ配列が、少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質により選択的に認識されるＤＮＡ配列であり、また宿主細胞が、ｉ）選択的に認識されるＤＮＡ配列を選択的に結合する第１の部分、およびii）転写が抑制されるクロマチンの形成を誘導する第２の部分を含有するタンパク質複合体を発現することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
リプレッサータンパク質複合体が融合タンパク質よりなることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１の部分が、ＬｅｘＡ−ＤＮＡまたはＧＡＬ４−ＤＮＡのＤＮＡ結合部位に結合する部分であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程１におけるＤＮＡ断片が、植物または脊椎動物から単離されることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
脊椎動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ベクターがエピソーム的に複製するベクターであることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ベクターが、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）由来の複製起点、ＯｒｉＰおよび核抗原（ＥＢＮＡ１）を含有することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
安定に発現されるべき遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を作製する方法であり、請求項２記載の方法を含み、およびさらに５）安定な発現増進性を有する単離されたＤＮＡ断片を該遺伝子から２０００ｂｐ未満のところに挿入することを特徴とする方法。
【請求項２３】
安定な発現増進性を有する単離されたＤＮＡ断片が遺伝子の上流および下流に挿入されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列を検出および任意に選択する方法に関する。
【０００２】
ヌクレオチド配列が知られていない特異的なＤＮＡ配列を検出することは容易ではない。遺伝子操作が数十年間用いられている事実にもかかわらず、遺伝子的に改変された植物、動物または他の真核生物における遺伝子を、予測どおり発現に至らせることは難問である。多くの微生物学的産生方法は、単に、最も高度に可能な発現を目的とするけれども、植物または動物においては、多くの利用に対して正確なレベルの遺伝子発現が非常に重要である。非常に多い発現は、非常に少ない発現と同様に、達成されていない所望の結果を導くかもしれない。また経験によると、有性生殖ののち、次世代における発現能力は、再び失われることがよくある。生物における発現の時期および場所（組織特異性）を制御することも困難である。
【０００３】
本発明の目的は、ＤＮＡ配列を選択および、所望であれば、単離することを可能とする、前文に記載された種類の方法を提供することである。それにより、前記課題は回避され得る。
【０００４】
この目的のために、前文に記載の方法は、検出されるＤＮＡ配列が安定な発現増進性（expression-enhancing quality）をもつことを特徴とし、該方法は、
１）ベクターにおけるｉ）遺伝子転写抑制性クロマチンの誘導に関係するＤＮＡ配列と、ii）プロモーターを含有するレポーター遺伝子との間に、＜５０００塩基対のサイズを有するＤＮＡ断片をクローニングし、その結果、遺伝子抑制性クロマチン（gene-repressing chromatin）の転写の誘導に関係するＤＮＡ配列とレポーター遺伝子との間の距離が５０００塩基対より少ない、様々な断片を含有するベクターを生じ、
２）該ベクターを宿主細胞に導入し、該ベクターにおけるプロモーターは宿主細胞において活性化され得るが、遺伝子抑制性クロマチンの転写の誘導がレポーター遺伝子の転写の抑制を生じさせ；および
３）レポーター遺伝子活性を示す宿主細胞を同定するために、宿主細胞を選択する
工程よりなる。
【０００５】
本発明は、安定な発現増進性を有するＤＮＡ配列を検出する信頼できる方法を提供する。所望であれば、該配列を単離し、他の遺伝子の前方に挿入してもよい。たとえば、工程１）におけるＤＮＡとして、真核生物、とくに植物または脊椎動物由来で、制限酵素で切断されたＤＮＡが使用される。ここで、ＤＮＡ断片のサイズは５０００塩基対より少ない。
【０００６】
必要であれば、一方の、多くの場合においてクロマチンの転写抑制効果を相殺し得るであろう発現増進配列（expression-enhancing sequence）（「エンハンサー」）と、他方の、安定発現増進ＤＮＡ断片（stable expression-enhancing DNA fragment）とを容易に区別することは、明らかに可能である。
【０００７】
始めに、レポーター遺伝子とともにプロモーターを含有するが転写抑制性配列を有さないベクターで形質転換した生物中のレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子とともに安定発現増進ＤＮＡ断片を含有し、同様に、転写抑制性配列を有さないベクターで形質転換した生物中のレポーター遺伝子よりも高いレベルで発現される。
【０００８】
最初の好ましい実施態様によると、工程３）における選択は、成長阻害剤に対する耐性を提供するレポーター遺伝子を使用することにより行い、宿主細胞を成長阻害剤の存在する中で培養する。
【０００９】
これは、活性のある耐性遺伝子をもたないために成長阻害剤に対して耐性でない宿主細胞の成長を阻害し、そして安定発現増進ＤＮＡ配列をもつこれらの宿主細胞の選択を可能にする。
【００１０】
成長阻害剤は、成長阻害剤に対する耐性を提供する遺伝子が活性化していない宿主細胞を殺すために充分高い濃度で存在するのが好ましい。
【００１１】
これは、成長する生物が所望のＤＮＡ配列を有するベクターを含むであろうことを、大きく保証する。
【００１２】
非常に便宜的に、抗生物質を成長阻害剤として使用し、レポーター遺伝子は抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子である。
【００１３】
抗生物質に対する耐性を提供する多くの遺伝子はこの分野で利用でき、宿主細胞に適当な遺伝子を選ぶことを簡単にする。ついで、まだ宿主細胞が抵抗力をもっていない成長阻害剤に対して耐性を提供する遺伝子を選ぶ。
【００１４】
２つめの実施態様によると、レポーター遺伝子はグリーン蛍光タンパク質をコードする。
【００１５】
ついで、蛍光測定手段により、所望のＤＮＡ含有ベクターを有する宿主細胞を検出、および単離することは可能である。
【００１６】
好ましい実施態様によると、蛍光活性化細胞分別装置（Fluorescenece-Activated Cell Sorter）（ＦＡＣＳ）を用いて、蛍光を発しない宿主細胞から蛍光を発する宿主細胞を分離する。
【００１７】
３つめの実施態様によると、レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。ルシフェラーゼの助けをかりて、発現の（半）量的測定（（semi）-quantitative measurement）を実施することが可能である。
【００１８】
工程１）において、断片は実質的に２０００〜３０００塩基対の間のサイズを有するのが好ましい。
【００１９】
このようなサイズの断片は、工程３）にてスクリーニングされる数多くの宿主細胞を用いることなく、該配列のより正確な位置が検出されることを可能とする。工程３）にて宿主細胞が多くなるほど、不必要な作業負荷が生じる。
【００２０】
便宜的に、遺伝子抑制性クロマチンの転写誘導に関係するＤＮＡ配列は、ＨＰ１（ヘテロクロマチン結合タンパク質１）を含有するヘテロクロマチン結合タンパク質により認識されるＤＮＡ配列であり、該ＨＰ１含有複合体は宿主細胞にて発現される。代わりの方法によると、ＤＮＡ配列はポリコウム群（Polycomb-group）（Ｐｃ−Ｇ）タンパク質を含有する複合体により認識され、該ポリコウム群タンパク質含有複合体は宿主細胞にて発現される。さらに他の実施態様によると、ＤＮＡ配列は、ヒストンデアセチラーゼ活性をもつ複合体により認識され、該ヒストンデアセチラーゼ活性をもつ複合体は、宿主細胞にて発現される。最後に、さらなる実施態様によると、遺伝子抑制性クロマチンの転写誘導に関係するＤＮＡ配列は、ＭｅＣＰ２（メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２）を含有するタンパク質複合体により認識されるＤＮＡ配列であり、該ＭｅＣＰ２含有複合体は宿主細胞にて発現される。
【００２１】
このようにして、ＤＮＡ配列を認識する４つの適当な複合体が提供される。一方、これは、宿主細胞にて複合体が発現されていない場合に、偽陽性（false-positives）を生じず、求めるＤＮＡ配列を検出する効率を単に制限するであろうことを記しておくべきであろう。
【００２２】
便宜的に、該タンパク質複合体は、第１の部分がＬｅｘＡ−ＤＮＡまたはＧＡＬ４−ＤＮＡのＤＮＡ結合部位に結合する部分であるタンパク質複合体ような、融合タンパク質よりなる。
【００２３】
この種の適当なＤＮＡ結合部位は当業者に既知であり、バクテリアまたは酵母から得られる。
【００２４】
工程１）における生物は、植物およびとくに哺乳動物のような脊椎動物よりなる群から選ばれるのが好ましい。
【００２５】
これらの生物に対し、検出される塩基配列は実際のところ未知であるので、またいくぶんかは、大量の染色体ＤＮＡのために、本発明の方法を用いずに該ＤＮＡ配列を見出すことは事実上不可能である。
【００２６】
さらなる好ましい実施態様によると、ベクターは、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）由来の複製起点、ＯｒｉＰおよび核抗原（ＥＢＮＡ１）を含有するベクターのように、エピソーム的に（episomally）複製するベクターである。
【００２７】
このようなベクターは扱いが容易であり、遺伝子的に操作することができ、発現が抑制されるクロマチン構造を形成するベクターである。
【００２８】
さらに本発明は、ｉ）植物もしくは脊椎動物から単離されるＤＮＡ配列またはその誘導体、およびii）合成ＤＮＡ配列または遺伝子工学的手段により構築されたもの、から選択されるＤＮＡ配列に関する。該ＤＮＡ配列は、本発明に基づく方法により検出、選択および任意にクローン化され得る抑制阻害配列である。
【００２９】
さらにとりわけ、本発明は、ｉ）植物もしくは脊椎動物から単離されるＤＮＡ配列またはその誘導体、およびii）合成ＤＮＡ配列または遺伝子工学的手段により構築されたもの、から選択されるＤＮＡ配列に関する。該ＤＮＡ配列は、本発明に基づく方法により検出、選択および任意にクローン化される。
【００３０】
本発明に基づくＤＮＡ配列は、エンハンサーまたはサイレンサーでない点で、既知のＤＮＡ配列とは異なる。
【００３１】
合成ＤＮＡ配列は、一般に当業者に既知である技術により調製されてよい。とくに、多くの異なるＤＮＡ配列を調製することは可能であり、このような配列を商業的に（たとえば、ファルマシア  バイオテク社（Pharmacia Biotech）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン王国から）入手することができる。しかしながら、このような合成ＤＮＡ配列は、プラスミドにクローン化するために適当でなければならない。これは一般に当業者に既知であり、たとえば、制限酵素切断部位を含有するリンカーを用いてなされる。
【００３２】
明らかに、本発明はまた、安定に発現されるべき遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を作製する方法であり、本発明に基づく方法により選択される安定な発現促進ＤＮＡ配列を、該遺伝子から２０００ｂｐ未満のところに挿入する方法に関する。
【００３３】
これは、より安定で予測可能な遺伝子発現法である。
【００３４】
安定発現増進ＤＮＡ配列は、遺伝子の上流および下流に挿入されるのが好ましいであろう。
【００３５】
これは、安定な遺伝子発現の可能性をさらに増加させると信じられている。
【００３６】
最後に、本発明は、本発明に基づくＤＮＡ構築物の使用に関する。該ＤＮＡ構築物は、前に定義したような適当な生物の形質転換のためのベクターである。
【００３７】
ここで本発明を、以下の代表的実施態様に関してさらに説明する。
【００３８】
実施例Ｉ
本発明に基づく方法の操作の原理を説明するために、結合エレメント（boundary element）であることが既知のドロソフィラ  メラノガスタ（Drosophila melanogaster）由来のＤＮＡ断片であるｓｃｓが使用される。以下の実施例でみることができるように、ｓｃｓは以下のリプレッサーを妨害するために使用することができる：ＨＰ１、ポリコウム群タンパク質およびＭｅＣＰ２。同様にして、ラムダファージ由来のＤＮＡ断片がネガティブコントロールとして試験された。ｓｃｓ（特殊なクロマチン構造）は、ドロソフィラにおける熱ショック遺伝子座（ｈｓｐ７０）に接するＤＮＡ配列として初めて単離された（ケルム，Ｒ．（Kellum, R.）とＰ．シェドル（P. Schedl）、１９９１年、Ｃｅｌｌ、第６４巻、９４１〜９５０頁）。彼らは、ｓｃｓがレポーター遺伝子周辺に置かれてドロソフィラにて再誘導されると、レポーター遺伝子の発現は変動が少なくなることを見出した。彼らは、異なるリプレッサー、とくに前記リプレッサー、による抑制を妨げるためにｓｃｓを使用し得るという報告も示唆もしなかった。また、ケルムらは、導入遺伝子の発現の変動を少なくするために、ドロソフィラとは異なる系にてｓｃｓを使用し得るかもしれないという報告も示唆もしなかった。
【００３９】
ＤＮＡ配列の抑制排除性（repression−eliminating property）を試験するために、２つのタイプのベクターが構築される。
【００４０】
１つめのタイプのベクターは、５’〜３’配列において、４つのＬｅｘＡ結合部位、試験するｓｃｓ配列、ヒト熱ショック因子誘導性プロモーター、およびレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを含有する。コントロールとして、既知のｓｃｓ配列のかわりに同じような長さの（ラムダファージ由来の）任意の断片からなる類似のベクターを作製する（両者は、以下のポイント１にて記載される）。
【００４１】
形質転換細胞にてレポーター遺伝子の抑制を達成するために、２つめのタイプのベクターは、ＬｅｘＡと前記リプレッサーとの融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する。この２つめのタイプのベクターはＬｅｘＡのみをコードする遺伝子を含有する、またはＬｅｘＡ−ＨＰ１をコードする遺伝子を含有するベクターなどである（以下のポイント２にて記載する）。
【００４２】
１  ＥＢＮＡ−１（核抗原）をコードするベクターは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＲＥＰ４ベクター（インビトロゲン社（Invitrogen Corporation）、カールスバッド（Carlsbad）、アメリカ合衆国）である。該ベクターはゲノム中に（安定に）挿入しないが、エピソーム的に複製することを保証するために、ＤｅＥＢＮＡ−１配列が存在する。該ベクターのプロモーター（Ｐｒｓｖ）は、制限酵素ＳａｌＩでの消化により除かれており、大腸菌（E. coli）由来のＬｅｘＡのための４つの結合部位を有する合成配列で置換されている。該配列は、
【配列表１】
0004450995.tif 000002
【００４３】
である。該配列の５’側は、ＳａｌＩ部位、３’側はＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位を含有する（すべて太字体で示した）。ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩにおいて、ＬｅｘＡ結合部位から下流に、ヒト熱ショック因子誘導性プロモーター（０．２９ｋｂｐのＨｉｎｄIII／ＮｃｏＩ断片）およびＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルを含んだルシフェラーゼレポーター遺伝子（１．９ｋｂｐのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片）が、３段階のライゲーションにて（in three-way ligation）クローン化される。ヒト熱ショック因子誘導性プロモ−ター（ｈｓｐ７０；登録番号Ｍ５９８２８およびＭ３４２６７；ヌクレオチド５２から２４４まで）は、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０−１；クロンテック社（Clontech）、パロ  アルト（Palo Alto）、アメリカ合衆国）でのＰＣＲ増幅の方法により得ることができる。ＰＣＲプライマーとしては、
【配列表２】
0004450995.tif 000003
【００４４】
を検討してもよく、リバースプライマーとしては
【配列表３】
0004450995.tif 000004
【００４５】
を検討してもよい。フォワードプライマーはＨｉｎｄIII部位を含有し、リバースプライマーはＮｃｏＩ部位を含有する（太字プリントにて定めた）。ＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルを含んだルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ｐＧＬ３コントロールベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１７４１；プロメガ社（Promega）、マディソン（Madison）、アメリカ合衆国）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化により得られた。このように得られたベクターにおける、ＬｅｘＡ結合部位と熱ショックプロモーターとの間のＨｉｎｄIIIにおいて、ラムダファージ（ファルマシア  バイオテク社、ウプサラ、スウェーデン王国）の２．１ｋｂｐのＨｉｎｄIII断片、または１．７ｋｂｐのｓｃｓのＨｉｎｄIII断片がクローン化される。１．７ｋｂｐのｓｃｓのＤＮＡ断片は、ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー５’〜３’：ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＣＴＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧ；リバースプライマー５’〜３’：ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＡＡＴＣＧ）の助けをかりて、ドロソフィラゲノムＤＮＡ（Ｃａｔ．＃６９４０−１、クロンテク社、パロ  アルト、アメリカ合衆国）から単離される。これらのプライマーの末端には、ＨｉｎｄIII制限酵素部位が位置している。ラムダ断片を有するベクター（コントロール）はレポ−ター構築物ａとして、ｓｃｓ断片を有するベクターはレポーター構築物ｂとして指摘する。制限酵素消化、ＰＣＲ増幅およびクローニングは、サムブルック（Sambrook）ら、分子クローニング（Molecular Cloning）；実験マニュアル（laboratory manual）、第２版に記載の通常の手法により実施した。
【００４６】
２  ＬｅｘＡタンパク質（aa１〜２０２）（Ｃａｔ．＃６１８３−１、クロンテク社、パロ  アルト、アメリカ合衆国）のＤＮＡ結合ドメインは、ネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐＲＥＰ９（インビトロゲン社、カールスバッド、アメリカ合衆国）ベクターのＨｉｎｄIII部位にクローン化される。リプレッサーをコードする１つの遺伝子が、ＬｅｘＡ遺伝子の下流に読み枠を合わせて、ベクターごとにクローン化される。使用するリプレッサーは、ヒトポリコウム群遺伝子ＨＰＣ２（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＢ８０７１８）の１６７４ｂｐの長さのコーディング部分、ヒトポリコウム群遺伝子ＲＩＮＧ１（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｚ１４０００）の１１３１ｂｐの長さのコーディング部分、ドロソフィラポリコウム群遺伝子Ｓｕ（ｚ）２（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＡＡ４１９６５）の４０９８ｂｐの長さのコーディング部分、Ｍ３１（ｍＨＰ１）（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｐ２３１９７）の５５８ｂｐのコーディング部分、またはＭｅＣＰ２（登録番号Ｇｅｎｂａｎｋ：Ａ４１９０７）の１４７８ｂｐのコーディング部分である。これらの構築物は、ＬｅｘＡ−ＨＰＣ２、ＬｅｘＡ−ＲＩＮＧ１、ＬｅｘＡ−Ｓｕ（ｚ）２、ＬｅｘＡ−ｍＨＰ１およびＬｅｘＡ−ＭｅＣＰ２融合タンパク質、またはＬｅｘＡリプレッサーをコードする。これらはＬｅｘＡ結合部位に結合する（ポイント１参照）。
【００４７】
３  レポーターベクターａおよびｂならびにＬｅｘＡリプレッサーをコードするベクターを、ＡＴＴＣから得たＵ−２ＯＳ（骨肉種）細胞（登録番号ＨＴＢ−９６）にて発現する。該ＤＮＡ構築物を用いる細胞のトランスフェクションは、トランスフェクションキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３０６−０１９、ギブコＢＲＬ社（GibcoBRL）、ガイゼルスバーグ（Gaithersburg）、アメリカ合衆国）の製造業者の説明書に基づくリン酸カルシウム法を使用して実施する。骨肉種細胞は、１００μｇ／ｍｌネオマイシン（Ｇ４１８：Ｃａｔ．Ｎｏ．１４６４９８１；ベーリンガー／ロッシュ社（Boehringer/Roche）、スイス連邦）および５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．８４３５５５；ベーリンガー／ロッシュ社、スイス連邦）の存在する中で増殖する。トランスフェクションの３日後に、熱ショックが与えられる（４３℃１時間、続いて３７℃で６時間の回復時間）。該処理は、ルシフェラーゼ遺伝子を活性化し、ルシフェラーゼレポータータンパク質の産生を生じさせる。該ルシフェラーゼタンパク質の酵素活性は、誘導されている転写誘導の尺度である。標準のルシフェラーゼレポーター遺伝子検定キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８１４０３６；ベーリンガー／ロッシュ社、スイス連邦）に対する製造業者の説明書に全てしたがい、細胞を精製し、ルシフェラーゼ酵素活性を測定する。
【００４８】
結果
４  （ラムダ断片を有する）レポーター構築物ａを発現するがＬｅｘＡリプレッサーを発現しない細胞において、熱ショック後、ルシフェラーゼ遺伝子は発現される。これが１００％値である。
【００４９】
５  （ｓｃｓ断片を有する）レポーター構築物ｂを発現するがＬｅｘＡリプレッサーを発現しない細胞において、熱ショック後、ルシフェラーゼ遺伝子は１００％の値で発現される。該値は１００％を超えないので、前に説明したように、それが発現増進配列ではないことを示す。
【００５０】
６  （ラムダ断片を有する）レポーター構築物ａを発現し、またＬｅｘＡリプレッサーを発現する細胞において、熱ショック後、ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、平均２０％まで抑制される。
【００５１】
７  （ｓｃｓ断片を有する）レポーター構築物ｂを発現し、同時にＬｅｘＡリプレッサーを発現する細胞において、熱ショック後、ルシフェラーゼ遺伝子の発現は１００％の値に達する。これは、リプレッサー活性の誘導がｓｃｓで抑制され得ることを示す。
【００５２】
実施例II
本発明に基づいて、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼのかわりに別のレポーター遺伝子を使用することもまた可能である。他のプロモーターを使用することもまた可能である。
【００５３】
８  レポーター構築物ａおよびｂにおいて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子はゼオシン（Zeocin）耐性遺伝子により置換されている。熱ショックプロモーターは構成的ＳＶ４０プロモーターにより置換されている（ｐＳＶ４０／ＺＥＯ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５０２−２０；インビトロゲン社、カールスバッド、アメリカ合衆国）。トランスフェクションののち、Ｕ−２ＯＳ細胞は、２５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ２５０−０１：インビトロゲン社、カールスバッド、アメリカ合衆国）および１００μｇ／ｍｌネオマイシン（Ｇ４１８：Ｃａｔ．Ｎｏ．１４６４９８１；ベーリンガー／ロッシュ社、スイス連邦）中にて増殖する。
【００５４】
９  ２．１ｋｂｐラムダ断片を含有する選択構築物およびまたＬｅｘＡリプレッサーを発現する構築物でトランスフェクションされる細胞は、２０〜３０日後に死ぬ。これは、ラムダ断片が、抗生剤耐性を達成する遺伝子の抑制を克服することができないことを示す。
【００５５】
１０  ｓｃｓ断片を含有する選択構築物およびまたＬｅｘＡリプレッサーを発現する構築物でトランスフェクションされる細胞は、死なずに増殖しつづける。これはまた、結合エレメントｓｃｓがあれば抑制を克服し得ること、ならびに、本発明に基づく方法は様々なプロモーターおよびレポーター遺伝子を使用し得ることを示す。
【００５６】
実施例III
本発明に基づく方法により見出され選択される配列は、該配列が由来する組織とは異なる生物にて抑制と争うために使用され得る。
【００５７】
１１  いわゆる植物の形質転換に適当なＴ−ＤＮＡ構築物である、２つの新たな構築物ｃおよびｄを作製する。
【００５８】
１２  カナマイシンおよびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）レポーター遺伝子を用いる耐性選択のために、構築物ｃはＮＰＴII（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII）遺伝子を有するカセットを含有する。ＮＰＴII遺伝子は構成的ｎｏｓプロモーターに、およびＧＵＳレポーター遺伝子は構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより制御される（ムリナロバ，Ｌ．（Mlynarova, L.）ら、１９９５年、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第７巻、５９９〜６０９頁）。
【００５９】
１３  ｓｃｓ断片がＧＵＳ−ＣａＭＶ／ｎｏｓ−ＮＰＴIIカセットの直ぐ上流にクローン化され、そしてｓｃｓ断片が該カセットの直ぐ下流にクローン化される構築物ｃが、構築物ｄである。
【００６０】
１４  アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を構築物ｃまたはｄで形質転換する。シロイヌナズナの苗（Arabidopsis plants）を、構築物ｃを有するアグロバクテリウム  ツメファシエンスの懸濁液（培養液）および構築物ｄを有するアグロバクテリウム  ツメファシエンスの懸濁液に浸す（クロー（Clough）ら、１９９８年、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、第１６巻、７３５〜７４３頁）。
【００６１】
１５  構築物ｃまたはｄを有する４０個体のシロイヌナズナの苗を育成し、種子を回収する。該種子を、カナマイシン（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０６８０１；ベーリンガー／ロッシュ社、スイス連邦）を含有する培地上に播種し、成長した苗の葉におけるＧＵＳレポーター活性を測定する。
【００６２】
１６  構築物ｃを有する苗におけるＧＵＳ活性は非常に変動的であり（７高い；６中程度；１１低い；１６ゼロ）、構築物ｄを有する苗におけるＧＵＳ活性は全体的に高く、変動は減じられる（２６高い；４中程度；５低い；５ゼロ）。
【００６３】
１７  これは、結合エレメントが同じ生物に由来しないとしても、該結合エレメントにより、遺伝子はより安定に発現し得ることを示す。