(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における疾患の検出方法であって、
被験者からの体液の試料中のリゾホスファチジン酸を第１酵素で消化して、基質を得て；
該基質を酵素サイクリング反応において第２酵素と反応させて、検出可能な産物を得て；
該検出可能な産物を測定することによって、該リゾホスファチジン酸の濃度を測定し；そして、
該リゾホスファチジン酸の正常な濃度と比較することによって、該リゾホスファチジン酸の濃度を疾患と相関させる、
ことを含む、該方法。
【請求項２】
第１酵素は、ホスホリパーゼＢ、リゾホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＡ１、およびホスホリパーゼＡ２からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２酵素は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロキナーゼ、およびグリセロールデヒドロゲナーゼからなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
基質はグリセロール−３−リン酸である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出可能な産物は過酸化水素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
検出可能な産物の測定は、比色定量による過酸化水素の増加の測定を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
検出可能な産物はＮＡＤＨである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出可能な産物の測定は、ＮＡＤＨの酸化の測定を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
酵素サイクリング反応は、Ｇ-３-Ｐを、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−リン酸オキシダーゼと反応させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
体液の試料は、血漿、血清、尿、唾液、腹水、脳脊髄液、および胸膜液からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
更に、体液の試料から脂質を抽出する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
更に、リゾホスファチジン酸の濃度を同じ被験者からのリゾホスファチジン酸の初期濃度と比較する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
リゾホスファチジン酸の正常な濃度と比べたリゾホスファチジン酸の濃度の増減は疾患の存在を示す、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
疾患は、婦人科の癌または卵巣癌である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
疾患は、リゾホスファチジン酸のレベルの変化に関係する血液障害である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
リゾホスファチジン酸を測定することによる、疾患の検出方法であって、
体液の試料中のリゾホスファチジン酸を第１酵素で消化して、グリセロール−３−リン酸を得て；
該グリセロール−３−リン酸を酵素サイクリング反応において反応させ；
ＮＡＤＨの酸化または過酸化水素の蓄積を測定することによって、リゾホスファチジン酸の濃度を測定し；そして、
ＮＡＤＨの酸化または過酸化水素の蓄積の測定と疾患の存在とを相関させる、
ことを含む、該方法。
【請求項１７】
第１酵素は、ホスホリパーゼＢおよびリゾホスホリパーゼからなる群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
酵素サイクリング反応は、Ｇ-３-Ｐを、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−リン酸オキシダーゼと反応させることを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
疾患は婦人科の癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
婦人科の癌は卵巣癌である、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、生物学的液体中のリゾホスホリピド（例えば、リゾホスファチジン酸（ＬｙｓｏＰＡ）およびリゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ））を検出するための方法、並びにリゾホスホリピドの変化した濃度に関係する病状と相関させ、且つそれを検出するための酵素的な方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチンとも呼ばれる）は、多不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸およびリノレン酸）の主要な供給源の１つである。前者は、多数の生物学的活性を有するエイコサノイドの前駆体である。ＰＣの加水分解により、リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）および構成（constituent）脂肪酸が産生し、このものはシグナル伝達に関与する（Asaokaらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4917-4921 (1993); Yoshidaらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6443-6446 (1992)）。証拠の多くは、ＬｙｓｏＰＣ（このものは、酸化された低密度リポタンパク質中に高濃度で存在する）がじゅく腫形成および他の炎症障害において有意な役割を果たし得ることを示す（Steinbergらによる, New. Eng. J. Med. 320: 915-924 (1989)）。ＬｙｓｏＰＣは、培養した内皮細胞中での血小板由来増殖因子のＡ鎖およびＢ鎖、およびヘパリン結合性表皮細胞増殖因子様タンパク質（ＨＢ−ＥＧＦ）をコードする遺伝子の転写を増大させること（KumeおよびGimbroneによる, J. Clin. Invest. 93: 907-911 (1994)）、およびヒト単球中のＨでのＢ−ＥＧＦをコードするｍＲＮＡを増加させること（Nakanoらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1069-1073 (1994)）が報告されている。これら遺伝子産物は、平滑筋細胞および繊維芽細胞の分裂促進因子である（Higashiyamaらによる, Science 251: 936-939 (1991); Rossによる, Nature(Lond.) 362: 801-809 (1993)）。ＬｙｓｏＰＣはまた、インビトロでタンパク質キナーゼＣを活性化すること（Sakakiらによる, FEBS Letter 320: 47-51 (1993)）、ヒトＴリンパ球の活性化を増強すること（AsaokaらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6447-6451 (1992)）および膜浸透性ジアシルグリセロールまたはホルボールエステルによって誘発される、ＨＬ−６０細胞からマクロファージへの分化を増強すること（Asaokaらによる, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4917-4921 (1993））も示されている。
【０００３】
ＬｙｓｏＰＣは、リゾホスホリパーゼＤによる加水分解によって生物活性なリゾホスファチジン酸（１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩、ＬｙｓｏＰＡ）（Moolenaarらによる, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 119: 47-65 (1992)）の供給源をも提供し得る（Tokumaraらによる, Biochim. Biophys. Acta 875: 31-38 (1986)）。ＬｙｓｏＰＡは、広範囲な増殖因子様生物学的活性を有する天然に存在するホスホリピドである。ＬｙｓｏＰＡが真核生物および原核細胞生物細胞の両方におけるホスホリピド生合成の前駆体として作用し得ることは十分に確立されている（Van den Boschによる, Ann. Rev. Biochem. 43: 243-277 (1974); Racenisらによる, J. Bacteriol. 174; 5702-5710 (1992)）。ＬｙｓｏＰＡの細胞間脂質媒介因子として作用する能力については記載されている（Vogtによる, Arch. Pathol. Pharmakol. 240: 124-139 (1960); Xuらによる, J. Cell. Physiol. 163: 441-450 (1995); Xuらによる, Biochemistry 309 933-940 (1995); Tigyiらによる, Cell Biol. 91: 1908-1912 (1994); Panettiらによる, J. Lab. Clin. Med. 120(2): 208-216 (1997)）。ＬｙｓｏＰＡは活性化された血小板によってすぐに生成し、血小板の凝集を刺激し得、創傷は回復する。
【０００４】
卵巣癌活性化因子（ＯＣＡＦ）は卵巣癌の腹水から単離されており（Millsらによる, Cancer Res. 48: 1066 (1988); Millsらによる, J. Clin. Invest. 86: 851 (1990)、並びに米国特許第5,326,690号および5,277,917号）、多くの形態のＬｙｓｏＰＡからなることが同定されている（Xuらによる, Clin. Cancer Res. 1: 1223-1232 (1995)）。ＬｙｓｏＰＡは、卵巣癌の患者の腹水中での強力な腫瘍増殖因子であることが同定されている（同上）。
【０００５】
多数の病気に関係する他のリゾホスホリピドとしては、リゾホスファチジルセリン（ＬｙｓｏＰＳ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬｙｓｏＰＥ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬｙｓｏＰＧ）およびリゾホスファチジルイノシトール（ＬｙｓｏＰＩ）を含む。活性化された血小板は、２種類のホスホリパーゼ：ｓＰＬＡ２およびＰＳ−ＰＬＡ１を分泌する。ｓＰＬＡ２は、炎症反応において増加し、この酵素を阻害することにより炎症が軽減されることが報告されている（Schrierらによる, Arthritis Rheum. 39(8): 1292-1299 (1996); Tramposchらによる, Pharmacol. and Experimental Therapeutics 271(2): 851-859 (1994)）。ＰＳ−ＰＬＡ１は、ホスファチジルセリンまたはリゾホスファチジルセリン（ＬｙｓｏＰＳ）を特異的に加水分解して、ＬｙｓｏＰＳまたはグリセロール−３−Ｐセリンを与える。ＬｙｓｏＰＳは、コンカナバリンＡによって誘発されるラットのマスト細胞の脱顆粒化を強く増大し、ヒスタミンの放出を強化し（Tamori-Natoriらによる, J. Biochem (Tokyo) 100(3): 581-590 (1986)）、そしてラット漿膜マスト細胞からのｓＰＬＡ２によって誘起されるヒスタミンの放出を刺激し得る（Haraらによる, Biol. Pharm. Bull. 19(3): 474-476 (1996)）。ＬｙｓｏＰＳは炎症性脂質の媒介因子であり（Lloretらによる, J. Cell Physiol. 165(1): 89-95 (1995)）、ｓＰＬＡ２は炎症プロセスに関与する（Lloretらによる, Toxicon 32(11): 1327-1336 (1994)）。ＬｙｓｏＰＩは、酵母アデニリルシクラーゼ活性を刺激し、下流のエフェクター分子の活性およびそれらとラス（ＲＡＳ）タンパク質との相互作用を変化させることに関係することが示されている（ResnickおよびThomaskaによる, J. Biol. Chem. 269(51): 32336-32341(1994)）。
【０００６】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、続いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および／またはマス分光学（ＭＳ）などによる技術を用いて、ホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＡ）を分離し、半定量する方法が知られている。例えば、脂質を、抽出法（例えば、BlighおよびDyerによるCan. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959)に記載）を用いて、体液の試験試料から抽出することができる。薄層クロマトグラフィーは、多数のホスホリピドを分離するのに使用することができ、これについては例えばThomasおよびHolubによるBiochem. Biophys. Acta. 108: 92-98 (1991)に記載されている。次いで、ホスホリピドおよびリゾホスホリピドを、例えば紫外線を用いて（GaudetteらによるJ. Biol. Chem. 268: 13773-13776 (1993)）プレート上で見えるようにする。別法として、ホスホリピドから単離後であるかまたはホスホリピドの一部としてのリゾホスホリピド濃度を、ＮＭＲまたはＨＰＬＣによって測定することができる（CreerおよびGrossによるLipids 20(12): 922-928 (1985)およびBowesらによるJ. Biol. Chem. 268(19) 13885-13892 (1993)）。培養中の真核生物細胞に及ぼすＬｙｓｏＰＡの特異的な影響にたよるアッセイを用いて、卵巣癌の患者からの腹液中のＬｙｓｏＰＡ濃度も測定されている（MillsらによるCancer Res. 48: 1066-1071 (1988)）。しかしながら、これらの以前の方法は時間を費やし、高価であり、変わりやすく、典型的に単に半定量である。
【０００７】
リゾホスホリピド類についての速く且つ感度のよいアッセイの開発により、細胞活性（例えば、血小板の活性化）のマーカー、およびリゾホスホリピド類の変化した濃度に関係する病気のマーカーとしてこれらリゾホスホリピドを使用することが容易になるであろう。その上、それらアッセイは、リゾホスホリピドの変化した濃度と、それら変化した濃度に関係する病気との相関関係を測定する方法を提供するであろう。
【０００８】
（本発明の概要）
本発明は、生物学的液体（例えば、血清または血漿）試料中のリゾホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＡ）濃度を測定する酵素的方法を含む。該方法は少なくとも１タイプのリゾホスホリピドの２工程の酵素による消化を含み、続く酵素反応のための基質を得て、該酵素反応により検出可能な最終産物を得て、次いでリゾホスホリピド濃度の検出が可能となる。
【０００９】
該方法は、被験者から採取した体液試料中のリゾホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＡ）濃度を検出することによって行う。試料中のリゾホスホリピドはまず、脂質を抽出することによって濃縮することが好ましい。例えば、極性の脂質を水溶液に再溶解し、リゾホスホリピド濃度を２工程の酵素反応を用いて測定する。該リゾホスホリピドを酵素を用いて消化して産物を得て、次いでこのものについて第２の酵素反応を行う。特定の態様において、第２の反応はシグナルを増幅する酵素的循環反応（enzymatic cycling reaction）である。この方法により、試験試料中に少量存在するリゾホスホリピドの測定が可能となる。
【００１０】
１態様において、リゾホスホリパーゼまたはホスホリパーゼＢなどの酵素を用いてＬｙｓｏＰＡからＧ３Ｐを遊離させる。ＮＡＤＨの存在下で、Ｇ３Ｐオキシダーゼおよびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素的循環反応を用いて、Ｇ３Ｐ濃度を測定する。検出するＬｙｓｏＰＡ量は、ＮＡＤＨの酸化を測定することによって分光学的に定量する。別法として、循環反応によって生成する過酸化水素を検出することによって、ＬｙｓｏＰＡ量を比色定量的に測定する。
【００１１】
ＬｙｓｏＰＡに加えて、他のリゾホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬｙｓｏＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬｙｓｏＰＩ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬｙｓｏＰＥ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬｙｓｏＰＧ）を、本発明の方法を用いて検出することができる。これらリゾホスホリピドに対して、それらの方法で使用するための別の酵素としては、例えばホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、レシチナーゼＢおよびリゾレシチナーゼ、グリセロホスホコリンホスホジエステラーゼおよびグリセロールキナーゼを含むが、これに限定しない。
【００１２】
本発明の酵素反応は、正常者中のリゾホスホリピドの通常濃度と比べて被験者中のリゾホスホリピド濃度の変化を検出し、それらリゾホスホリピド濃度の変化に関係する病状を検出するのに使用することができる。本発明の方法を用いた病気の診断は、被験者から採取した試料中のリゾホスホリピド濃度の時間にわたる変化の速度を測定することによって行うこともできる。
【００１３】
本発明の別の態様は、リゾホスホリピド濃度と病気の存在との間に相関関係が存在するかどうかを測定する方法における該アッセイの使用である。この態様において、特定の病状（例えば、炎症）を有することが知られている被験者からの試料中のリゾホスホリピド濃度を測定し、それらの病気を有しない被験者からの試料中のリゾホスホリピド濃度と比較する。正常な被験者からの試料の場合と比較した、病気を有する被験者からの試料中のリゾホスホリピドの変化した濃度は、リゾホスホリピド濃度と病気の存在との相関関係を示唆する。
【００１４】
本発明の方法の更に別の態様は、被験者から採取した体液試料中のリゾホスホリピド濃度を測定するために、本発明の酵素的アッセイを行うための酵素および他の試薬を含む診断用キットである。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
本発明はリゾホスホリピドの変化した濃度を検出し、そして定量する酵素的方法を提供するものであって、該リゾホスホリピドは、例えば被験者からの体液試料中のリゾホスファチジル酸（ＬｙｓｏＰＡ）、リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬｙｓｏＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬｙｓｏＰＩ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬｙｓｏＰＥ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬｙｓｏＰＧ）を含むが、これらに限定しない。
【００１６】
被験者は真核生物であって、脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、魚類、両生類または爬虫類を含むが、これらに限定しない）が好ましい。被験者は哺乳類が好ましく、ヒトが最も好ましい。体液としては、血漿、血清、尿、唾液、腹水、髄液または胸膜液を含むが、これらに限定しない。
【００１７】
これらリゾホスホリピド濃度の変化に関連する病気は、炎症性の病気（すなわち血小板の活性化に関係する病気）を含むが、これに限定しない。ホスホリピドの代謝の変化については、多数の疾患で報告されており（総説として、Gregor Cevc（編）による, Phospholipids Handbook, 28章; GuptaによるPhospholipids in Disease. pp. 895-908 (1993)を参照）、これら疾患により、生物学的液体中のリゾホスホリピド濃度およびホスホリピド濃度の変化を生じ得る。これらの疾患としては、鎌状赤血球貧血、糖尿病、筋ジストロフィー、虚血、肝臓疾患、肺疾患、心臓疾患、マラリア、アルツハイマー病、パーキンソン病、婦人科の癌（例えば、卵巣癌、乳癌を含む）、および多数の他の癌を含むが、これらに限定しない。これらの病気の場合では、細胞機能の欠損により、直接的にまたは間接的にホスホリピドの定常濃度の変化を生じる。他の疾患としては、出血障害または血液障害（これは結果的に凝固障害となる、異常な血小板機能に関係する障害を含む）を含む。
【００１８】
従って、本発明の方法は、リゾホスホリピドの変化した濃度に関係する病気がない被験者（すなわち、「正常な被験者」）からの体液中で見られる濃度に対する被験者からの体液中のリゾホスホリピドの変化した濃度と相関することが知られている病気の検出、またはそれらの変化と相関する病気の同定に関する。
【００１９】
本発明の用途
本発明の方法は、被験者からの体液の試料中に存在する少量のリゾホスホリピドを検出するための、感度を増大させた速く且つ正確なアッセイを提供する。酵素的アッセイは、正常な試料と比べて被験者からの試料中のリゾホスホリピドの変化した濃度に関係する病状を検出するのに使用することができる。加えて、該アッセイにより、多数の病状とリゾホスホリピドの変化した濃度との相関関係を測定することが可能となる。従って、本発明の方法および試験キットは、あるリゾホスホリピドの変化した濃度に関係する病状を検出する実際の手法を提供する。
【００２０】
リゾホスホリピドの検出、および定量のための酵素的方法
本発明の方法は以下の通り行う。生物学的試料（例えば、血液すべて）を被験者から集める。例えば、選択したリゾホスホリピド類（例えば、ＬｙｓｏＰＡ）またはリゾホスホリピド全部についてクロロホルム：メタノールを用いた有機抽出、遠心分離および濃縮を行うことによって、試料由来の血清または血漿から脂質を抽出する。濃縮の必要性は、測定するリゾホスホリピドを消化するのに使用する酵素の特異性にある程度依存する。リゾホスホリピドを加水分解する酵素を、抽出した脂質試料と一緒にインキュベートし、少量の代謝産物を得る。次に、別の酵素による消化を行って、検出可能な産物を得る。１態様においては、検出可能な産物を蓄積する２つの酵素反応からなる酵素的循環反応を行う。本明細書の実施例においてＬｙｓｏＰＡ濃度を検出するのに、ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）またはリゾホスホリパーゼ（ＬＹＰＬ、EC 3.1.1.5, アサヒ社）を使用して、グリセロール−３−リン酸塩（Ｇ−３−Ｐ）を得る。次いで、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびＮＡＤＨを用いた酵素的循環反応を行って、Ｈ２Ｏ２およびＮＡＤを蓄積させる（Uedaらによる、米国特許第5,122,454号）。
【００２１】
ＮＡＤＨの酸化を３４０ｎｍで分光学的に追跡（すなわち、ＯＤ３４０の消失）したり、そしてペルオキシダーゼを用いて比色定量的にＨ２Ｏ２の蓄積を追跡することによって、ＬｙｓｏＰＡ濃度を検出する。公知のｃ１８：１  ＬｙｓｏＰＡからなる標準曲線から数値を得る。典型的な標準曲線としては、０〜３μＭのＬｙｓｏＰＡの公知の量を含む。アッセイは、正のコントロールと負のコントロールの両方を用いて２回行うことが好ましい。酵素的循環反応の前後のＯＤ３４０の差異は、存在するＬｙｓｏＰＡの量に直接に比例する。ホスホリパーゼＢを有しない血漿のバックグラウンドのシグナルを全ての試料の値から引く。ＬｙｓｏＰＡの標準曲線値をプロットし、フィッティングさせて、直線または二次の多項式のカーブフィットを得る。各試料中のＬｙｓｏＰＡ濃度は、測定した各シグナルを標準曲線と比較することよって測定する。
【００２２】
別法として、リゾホスホリピドを、更なるおよび／または異なる酵素の組み合わせを用いて検出することができる。例えば、ホスホリパーゼＣ（EC 3.1.4.3,シグマ社）は、ＬｙｓｏＰＡから無機リン酸塩（Ｐｉ）を切断するのに使用する。次いで、確立された方法（例えば、商業的に入手可能なキット（Procedure 670、シグマ社）を使用）を用いて遊離したＰｉ量を測定することによって、ＬｙｓｏＰＡ濃度を決定する。感度の増大のために、以前に記載（KawasakiらによるAnalytiscal Biochem. 182: 366-370 (1989)）の通り、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）および尿酸オキシダーゼ（ＵＯＤ）を用いてＰｉを測定する。後者の方法により、各Ｐｉについて３Ｈ２Ｏ２が生成する。Ｈ２Ｏ２の蓄積は、ペルオキシダーゼを用いた比色定量分析によって検出する。
【００２３】
別の態様の場合では、リゾホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＡ）をホスホリパーゼＢまたはリゾホスホリパーゼを用いてインキュベートして、Ｇ−３−Ｐを得る。酸素および水の存在下でＧ−３−Ｐオキシダーゼを用いて、Ｇ−３−Ｐをジヒドロキシアセトンリン酸塩および過酸化水素に変換する。ＮＡＤＨの存在下で、Ｇ−３−Ｐデヒドロゲナーゼは、ジヒドロキシアセトンリン酸塩をＧ−３−Ｐに変換し、且つＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する。ＮＡＤＨの消失は、ＯＤ３４０で分光学的に追跡する。別法として、過酸化水素の産生を、例えば蛍光分析または化学ルミネセンスによる比色定量分析的に測定することができる。比色定量アッセイについては多数の発色基質のいずれかを使用することができ、例えば４−アミノアンチピリン（ＡＡＰ）、ピロガロール、２−(２'−アゾビス(３−エチルベンゾチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）および３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む。
【００２４】
更に別の態様において、ホスホリパーゼＢまたはリゾホスホリパーゼを用いてＬｙｓｏＰＣからグリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）および脂肪酸を遊離させることによって、ＬｙｓｏＰＣを測定することができる。ＧＰＣホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＰＤＥ）を用いてＧＰＣからコリンおよびグリセロ−３−リン酸塩（Ｇ−３−Ｐ）を遊離させ、続いてコリンオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン（ＡＡＰ）、３,５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＨＤＣＢＳ）およびペルオキシダーゼを用いてコリンの比色定量分析の酵素による測定を行うことによって、ＬｙｓｏＰＣ濃度を測定する。Ｈ２Ｏ２およびベタインに酸化し、次いでペルオキシダーゼを用いてキノンイミン染料を得ることによって、コリンを検出する。別法として、本発明のアッセイの循環反応においてＧ−３−Ｐデヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼを用いて、Ｇ−３−Ｐを測定する。
【００２５】
ＬｙｓｏＰＡおよびＬｙｓｏＰＣに加えて、他のリゾホスホリピド（例えば、リゾホスファチジルセリン（ＬｙｓｏＰＳ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬｙｓｏＰＩ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬｙｓｏＰＥ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬｙｓｏＰＧ））を、本発明の２工程の酵素的アッセイを用いて検出することができる。
【００２６】
リゾホスホリピドを消化する方法の第１の工程で使用する酵素としては、例えばリゾホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＤを含むが、これらに限定しない。
【００２７】
１の工程においてリゾホスホリピドの酵素による消化の産物を検出するのに使用する酵素としては、グリセロール−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸塩オキシダーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＰＤＥ）、コリンオキシダーゼ、セリンデヒドロゲナーゼ、セリンデアミナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、エタノールアミンデアミナーゼ、グリセロキナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼを含む。
【００２８】
例えば、ＬｙｓｏＰＡを測定するために、ＬｙｓｏＰＳをホスホリパーゼＤによって消化して、セリンおよびＬｙｓｏＰＡを得る。産生したセリンの量は、セリンデヒドロゲナーゼを用いたＮＡＤＨの産生（Ａ３４０での吸収）を検出することによって測定する。別法として、セリンをデアミナーゼを用いて脱アミノ化して、アンモニア（ＮＨ３）およびＨＯＣＨ２−ＣＯ−ＣＯＯＨを得る。別法として、ＬｙｓｏＰＡをリゾホスホリパーゼにより消化してグリセロール−３−Ｐセリンを得て、次いでこのものをグリセロール−３−Ｐコリンホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＰＤＥ）を用いて消化して、グリセロール−３−Ｐおよびセリンを得る。セリンデヒドロゲナーゼによるか、またはＬｙｓｏＰＡに固有のリゾホスホリパーゼ酵素を用いることによって、ＮＨ３の産生またはＮＡＤＰＨの産生を検出することによって、ＬｙｓｏＰＳを測定する。
【００２９】
ホスホリパーゼＤによりＬｙｓｏＰＥをＬｙｓｏＰＡおよびエタノールアミンに加水分解することによる本発明の酵素的アッセイを用いて、ＬｙｓｏＰＥを測定することができる。次いで、ＮＡＤＨを得るために、エタノールアミンをデアミナーゼによって脱アミノ化し、脱水素化することによってＨＯＣＨ２−ＣＨＯおよびＮＨ３を得る。次いで、ＨＯＣＨ２−ＣＨＯをアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて消化してＮＡＤＨを得て、次いでこのものを分光計（例えば、Ａ３４０）によって検出する。別法として、ＬｙｓｏＰＥに固有のリゾホスホリパーゼ酵素を用いてＬｙｓｏＰＥを加水分解してグリセロール−３−Ｐエタノールアミンとしたり、逆にグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＰＤＥ）によって加水分解してグリセロール−３−Ｐとする。次いで、グルセロール−３−Ｐを、本発明の循環反応を用いて測定する。
【００３０】
本発明の方法において、濃縮のための有機液抽出の別法は、固相抽出の使用を含み、例えば、シリカまたはフルオロシルよりなるBond-Elutカラム（登録商標）カラム（Varian, Harbor City, CA）を用いて、リゾホスホリピドを濃縮し、タンパク質および他の脂質を除去することができる。
【００３１】
目的のリゾホスホリピドの回収を最適化する目的で、試料中に存在し得る内因性酵素の阻害物質を使用して、リゾホスホリピドのバックグラウンドの濃度の増大および試料中のリゾホスホリピド濃度の低下を防止することができる。それら阻害物質としては、特異的ＰＬＡ２阻害物質（例えば、アリストル酸（Aristolic Acid）（９−メトキシ−６−ニトロフェナントロ−(３,４−ｄ)−ジオキソール−５−カルボン酸、ビオモール社（Biomol Research Laboratories）, Plymouth Meeting, PA）；ＯＮＯ−Ｒ−０８２（２−(ｐ−アミルシンナモイル)アミノ−４−クロロ安息香酸、ビオモール社）；ＯＢＡＡ（３−(４−オクタデシル)ベンゾイルアクリル酸、ビオモール社）、４−ブロモフェナシルブロミド（シグマ社）；キンクリン（Quincrine）（６−クロロ−９−(４−ジエチルアミノ)−１−メチルブチル)アミノ−２−メトキシクリジン、メパクリン（Mepacrine）、シグマ社）；マノアリド（Manoalide）（ビオモール（Biomol）社）およびＨＥＬＳＳ（ハロエノールラクトン（suicide）基質、ビオモール社）；ホスホジエステラーゼ阻害物質（例えば、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン、カルバイオケム社（CalBiochem、La Jolla、ＣＡ））；Ｒｏ−２０−１７２４（カルバイオケム社）；ザプリナスト（Zaprinast）（カルバイオケム社）およびペントキシフィリン（カルバイオケム社）；通常のプロテアーゼ阻害物質（例えば、E-64（トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミノ−(４−グアニジノ)ブタン、シグマ社）；ロイペプチン（Leupeptin）（シグマ社）；ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、シグマ社）；ペプスタチンＡ（シグマ社）；ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド、シグマ社）；ベンズアミジン（シグマ社）および１,１０−フェナントロリン（シグマ社）；有機溶媒（例えば、クロロホルムおよびメタノールを含む）；洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）；ホスホリパーゼを分解するプロテアーゼ（例えば、トリプシン（シグマ社）および熱安定プロテアーゼ（ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN））および金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、シグマ社）およびＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−(β−アミノエチルエーテル）、シグマ社）を含む。
【００３２】
該アッセイをミクロタイタープレート基板（format）上で行うことにより、使用すべき試料および試薬を少量とし、例えばＥＬＩＳＡ記録計を用いて追跡することができるようになる。これらの基板により、アッセイの実施の自動化が容易となる。それら基板を用いて、アッセイの処理時間を減少させることにより、結果間の変動を減少させることができる。
【００３３】
リゾホスホリピド濃度と疾患との相関関係
最初に、リゾホスホリピドおよび／または特定のリゾホスホリピド類の生理学的な（「正常な」）濃度を、病気を有しない被験者について測定する。続けて、疾患についてスクリーニングするべき、試験被験者からの体液試料中のリゾホスホリピド濃度を測定し、このものを正常な被験者について確立された濃度と比較する。正常なコントロールと比べてリゾホスホリピド濃度（例えば、正常な場合に対する１つ以上の標準偏差）が有意に増加したり、または減少することは、リゾホスホリピド濃度の変化に関係する病気の存在を示し得る。
【００３４】
加えて、被験者から採取した試料中のリゾホスホリピド濃度を時間にわたって測定することによって、処置に対する病気の反応を追跡することができる。リゾホスホリピド濃度を測定し、その患者から初期に採取した濃度と比較する。時間にわたってリゾホスホリピド濃度の増加が見られる場合、そのことは被験者の病気の重度の増大を示す。逆に言えば、リゾホスホリピド濃度の低下が見られる場合、そのことは被験者の病気の改善を示す。
【００３５】
診断用キット
被験者からの体液試料中のリゾホスホリピド濃度を測定するための本明細書に記載の方法は、例えば予めパッケージングした診断用キットを用いることによっても行うことができる。それらのキットは、１つ以上のリゾホスホリピド（例えば、ホスホリパーゼＢ）を診断する酵素試薬を含む。それら試薬としては、酵素的循環反応を実施するための試薬（例えば、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ））、助剤（例えば、緩衝化剤）および続く試料の運搬および保存中でのリゾホスホピリドの産生または加水分解を阻害するための試薬（例えば、ＥＤＴＡ）を含む。該キットはまた、本発明の方法を実施したり、および／またはプロセシングのために試料を診断ラボに移すための装置または容器、並びに本発明の方法を実施するための適当な指示を含む。
【００３６】
以下の実施例は、本発明の方法を示し、且つ当業者がその方法を使用する助けとなるように提供するものである。それら実施例は、本明細書中の特許による開示またはその付与された保護の範囲に限定されることを意図するものではない。
【００３７】
実施例Ｉ
ヒト血漿中のＬｙｓｏＰＡ濃度の検出および定量
試薬
ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）、グルセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、ヒト血漿、ヒト血清、４−アミノアンチピリジン（ＡＡＰ）および塩化カルシウムをシグマ社（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.）から購入した。リゾホスホリパーゼ（ＬＹＰＬ）を、アサヒ社（Asahi Chemical Industry, Tokyo, Japan）から購入した。ペルオキシダーゼおよびＮＡＤＨを、ベーリンガー・マンハイム社から購入した。全ての脂質標準品、脂肪酸およびメチルエステルを、アバンチ・ポーラー・リピッド社（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）またはシグマ社から購入した。３,５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＨＤＣＢＳ）を、バイオシンスＡＧ社（Biosynth AG., Naperville, IL）から購入した。
【００３８】
試料の収集およびプロセシング
血液をＢＤヴァキュテーナー試験管6415番または7714番中に、３.２％のクエン酸緩衝液（酸性クエン酸）を用いて収集し、処理するまで氷上で封をして維持した。抜き取りの１時間以内に、血液を３０００×ｇで１５分間遠心分離（できるだけ、冷却遠心分離器で）した。血漿をとりだし、プラスチック性試験管に移し、−２０℃〜−８０℃で凍結した。別法として、血液をＥＤＴＡを入れたヴァキュテーナー試験管中に抜き出し、８０００×ｇで５分間遠心分離した。上清液をシリコン試験管に移し、再び８０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を別のシリコン試験管に集め、−７０℃で凍結した。
【００３９】
試料の調製および薄層クロマトグラフィー
別法として、血漿（０.５ｍＬ）をクロロホルム：メタノール（１：２）（３.７５ｍＬ）に加えて、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新しい試験管にデカントし、このものにクロロホルム（１.２５ｍＬ）および水（１.７５ｍＬ）を加えた。この混合物を渦巻き混合し、再び遠心分離を行って二相の溶液を得た。下相を貯蔵し、上相を別の試験管に集めた。この上相に、クロロホルム（２.５ｍＬ）および濃塩酸（６３μＬ）を加えた。その混合物を渦巻き混合し、次いで再び遠心分離を行った。この酸性のクロロホルム抽出液から得た下相を集めて、先に貯蔵している下相と一緒にプールした。そのプールした抽出液の容量を窒素気流下で５０μＬよりも少なくなるまで減少させ、シリカゲルＴＬＣプレート（Fisher Scientific, Santa Clara, CA）の原点にスポットした。クロマトグラフィーを、クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム（６５：３５：５.５）を含有する溶媒系を用いて行った。
【００４０】
展開したプレートにローダミン６Ｇ（シグマ社）の水溶液を噴霧することによって、脂質および標準品を見えるようにし、ＬｙｓｏＰＡに相当するスポットをそのプレートから取り出した。各試料について、内部標準としてヘプタデカン酸を加えた。１Ｎ  ＮａＯＨのメタノール液（１ｍＬ）を加えることによって、脂肪酸を加水分解し、１００℃で１５分間インキュベートした。冷却後、三フッ化ホウ素（１ｍＬ、１４％メタノール液、Alltech Associates, Deerfield, IL）を加え、その試料を室温で３０分間インキュベートして、メチルエステルを得た。ヘキサン（２ｍＬ）および水（１ｍＬ）を加えて、混合物を十分に渦巻き混合し、３０００ｒｐｍで３〜５分間遠心分離して、容易に相分離した。有機相（上相）を集めて、窒素下で乾燥し、ヘキサン（２５μＬ）に再び懸濁して、オートサンプラー瓶中に封した。
【００４１】
ガスクロマトグラフィー
オートサンプラーおよび水素炎イオン化検出器を備えたHewlett Packard 5890 Series II GC を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）を定量した。試料のヘキサン液（２μＬ）をSupelco SPB-5キャピラリーカラム（Supelco, Bellefonte, PA）中に注入した。ＧＣプログラムを、１７０〜２３５℃（１０℃／分）および次いで２３５℃で１３.５分間保ち、総実験時間は２０分となるようにセットした。メチルエステルの保持時間を公知の標準品を用いて測定し、未知の試料のピークと比較した。ピークの定量は、ヘプタデカン酸内部標準について計算したヘプタデカン酸標準曲線と比較することによって行った。
【００４２】
酵素的アッセイのための試料の調製
血漿（約０.５ｍＬ）をクロロホルム：メタノール（１：２）（３.７５ｍＬ）に加えて、渦巻き混合し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新しい試験管にデカントし、このものにクロロホルム（１.２５ｍＬ）および水（１.７５ｍＬ）を加えた。この混合物を渦巻き混合し、上記の通り遠心分離を行って二相の溶液を得た。上相を別の試験管に集めて、クロロホルム（２.５ｍＬ）および濃塩酸（６３μＬ）を加え、その混合物を渦巻き混合し、先の通り遠心分離を行った。下相を集めて、清潔な試験管に移した。その試料を窒素下で完全に蒸発させて、乾燥した脂質抽出物を試料緩衝液（２.５％のTriton X-100、５ｍＭのＣａＣｌ２および１００ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０）を含有）（２５０μＬ）中で再生させた。アッセイするまで、その試料を−７０℃で保存した。
【００４３】
別法として抽出の改良法を開発し、その方法は試料を１００μＬしか使用せず、且つ混入している脂質（例えば、ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリン）の濃度を有意に低下させた。この抽出では、血漿（０.１ｍＬ）にクロロホルム：メタノール（１：２）（０.７５ｍＬ）を加え、渦巻き混合し、１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を新しい試験管にデカントし、このものにクロロホルム（０.２５ｍＬ）およびメタノール（０.３５ｍＬ）を加えた。この混合物を上記の通り、渦巻いて、遠心分離を行って二相の溶液を得た。下相を廃棄して、残りの上相にクロロホルム（０.５ｍＬ）を加えた。試料を渦巻き混合し、１４,０００ｒｐｍで５分間再び遠心分離を行った。更にもう１回下相を廃棄した。上相にクロロホルム（０.５ｍＬ）および濃塩酸（１２.６μＬ）を加えて、上記の通り渦巻いて、遠心分離を行った。その酸性の下相を集めて、清潔な試験管に移した。試料を窒素下で完全に蒸発させて、試料緩衝液（２.５％のTriton-X-100、５ｍＭのＣａＣｌ２および１００ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０）を含有）中で再生した。アッセイするまで、その試料を−７０℃で保存した。
【００４４】
酵素的アッセイ
９６ウェルミクロタイタープレートウェル中で、抽出した脂質試料（５〜１００μＬ）を０.２５単位のホスホリパーゼＢまたはＬＹＰＬを用いて、１００ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０）中、３７℃で３０〜６０分間インキュベートして、Ｇ−３−Ｐを得た。循環反応酵素の混合物（５０ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０）中に、１.７単位のＧ−３−Ｐデヒドロゲナーゼ、４単位のＧ−３−Ｐオキシダーゼ、０.２５ｍＭのＮＡＤＨおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有）の１００μＬを加えて、その混合物を３７℃で更に６０分間インキュベートした。Ｇ−３−Ｐオキシダーゼは、Ｇ−３−Ｐをジヒドロキシアセトンリン酸塩およびＨ２Ｏ２に変換する。逆に、ジヒドロキシアセトンリン酸塩は、Ｇ−３−ＰデヒドロゲナーゼによってＧ−３−Ｐに変換される。この反応はＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する。従って、循環を続けるにつれて、Ｈ２Ｏ２およびＮＡＤの両方が蓄積される。
【００４５】
ＬｙｓｏＰＡ濃度は、ＮＡＤＨの酸化（すなわち、循環前のＡ３４０と比較して循環作用後の３４０ｎｍでの吸収の低下）を追跡することによって測定した。加えて、５０μＬの溶液（１００ｍＭのトリス８.０中、０.５単位のペルオキシダーゼ、０.５％のＨＤＣＢＳおよび０.１５％のＡＡＰを含有）を各ウェルに加え、５０５ｎｍでの吸収を記録することによって、Ｈ２Ｏ２の蓄積を比色定量測定した。
【００４６】
既知のＬｙｓｏＰＡ量から構築した標準曲線から、ＬｙｓｏＰＡ濃度の数値を得た。抽出した血漿の内部標準は各アッセイ（すなわち、各プレート）内に含まれ、このものを異なる希釈度で測定した。場合により、この内部標準を用いて異なる実験の間の変動を補正した。ＰＬＢ酵素またはＬＹＰＬ酵素がない場合の内部標準をも測定した。この「酵素がない」試料はバックグラウンド値を与えるものであり、この値をＮＡＤＨ測定を用いてＬｙｓｏＰＡ濃度を算出する際に、各未知の試料の値から引いた。比色定量分析を用いる場合に、発色を行う前の５０５ｎｍでは、プレートをブランクにした。
【００４７】
結果
本発明の２工程の酵素的アッセイの結果を表１、および図１と２に示す。
【表１】
表Ｉ
ＬｙｓｏＰＡを検出するための酵素的アッセイ
0004472872.tif 000002
【００４８】
これらの結果は、ＴＬＣ／ＧＣアッセイと比較して本酵素的アッセイが有利であることを実証する。該アッセイはＬｙｓｏＰＡ濃度が０.２μｍ〜１μＭの間で直線である。加えて、本発明の酵素的アッセイは高収率、感度の増大および速い処理時間を与える。
【００４９】
実施例ＩＩ
ヒト血漿および血清中でのＬｙｓｏＰＣ濃度の検出および定量
試薬
リゾホスホリパーゼ（ＬＹＰＬ）を、アサヒ社から購入した。グリセロホスファチジルコリンホスホジエステラーゼ（ＧＰＣ−ＰＤＥ）、コリンオキシダーゼおよび４−アミノアンチピリジン（ＡＰＰ）を、シグマ社から購入した。ペルオキシダーゼは、ベーリンガー・マンハイム社から購入した。３,５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＨＤＣＢＳ）を、バイオシンスＡＧ社から購入した。全ての脂質標準品および脂肪酸を、アバンチ・ポーラー・リピッド社またはシグマ社から購入した。
【００５０】
試料の収集およびプロセシング
血液を集めて、血漿を実施例Ｉに記載の通り処理した。血清については、血液をシリコンでコーティングしたヴァキュテーナー試験管（Red Top）中で集め、通常の条件下で遠心分離を行った。血清および血漿をプラスチック性の試験管に移し、−２０℃〜−８０℃で凍結保存した。
【００５１】
酵素的アッセイのための試料の調製
約３５μＬの血漿または血清を試料緩衝液（１％のトリトン（Triton）、１０ｍＭの塩化カルシウム、５０ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０））中で１０倍に希釈して、総量を３５０μＬとした。
【００５２】
酵素的アッセイ
９６ウェルミクロタイタープレートのウェル中に、希釈した脂質（１００μＬ）を繰り返しアリコートした。各ウェルに、５０μＬのＬＹＰＬ（０.１２５単位）／ＧＰＣ−ＰＤＥ（０.０１２５単位）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応は、ＬＹＰＬによるＬｙｓｏＰＣの消化からの中間体としてグリセロホスホリルコリンを産生する。次いで、そのプレートはＥＬＩＳＡ記録計のＡ５０５でブランクにした。次に、５０μＬのコリン検出混合物（０.１５単位のコリンオキシダーゼ、０.５単位のペルオキシダーゼ、０.０３％のＡＡＰ、０.１２５％のＨＤＣＢＳ、１００ｍＭのトリス（ｐＨ  ８.０））を加えて、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、そのプレートについてＡ５０５を記録した。
【００５３】
表ＩＩおよび図３は、ＬｙｓｏＰＣについてのアッセイの結果を例示する。該アッセイは５〜２００μＭのＬｙｓｏＰＣでは直線であり、５μＭのＬｙｓｏＰＣまで感度が良く、アッセイ間の低い変動およびアッセイ内の低い変動を示す。
【００５４】
【表２】
表ＩＩ
血漿中でのＬｙｓｏＰＣを検出するための酵素的アッセイ
0004472872.tif 000003
【００５５】
これらの結果は、本発明の２工程の酵素的アッセイを用いて、ＬｙｓｏＰＣが血漿中または血清中で容易に検出されることを示す。同様な結果が同一の被験者からの血漿または血清から得られ、このことは該方法が血漿または血清のどちらかに利用可能であることを実証している。血漿中または血清中での典型的なＬｙｓｏＰＣ濃度は、５０μＭ〜５００μＭの範囲にわたる。結果として、このアッセイを用いて１０倍に希釈した試料で、ＬｙｓｏＰＣを測定することができる。
【００５６】
実施例ＩＩＩ
癌を有する患者からの試料中でのＬｙｓｏＰＡの検出および定量
癌を有しない被験者および卵巣癌を有する患者の両方の血漿中のＬｙｓｏＰＡ濃度を測定した。血液を女性患者から集め、上記の実施例Ｉに記載の通り、処理した。上記実施例Ｉに記載の通り、本発明の酵素的アッセイのためにその試料からの血漿を調製した。その酵素的アッセイを上記実施例１に記載の通り行った。
【００５７】
その酵素的アッセイを用いて測定した、癌でない患者および癌の患者についての平均ＬｙｓｏＰＡ濃度を、図４に示す。
【００５８】
本発明の方法を用いて測定した通り、このデータは卵巣癌を有する患者の血漿中で、平均ＬｙｓｏＰＡ濃度が有意に増加したことを示す。
【００５９】
加えて、上記の実施例ＩＩおよびＩＩＩに記載する酵素的アッセイを用いて、卵巣癌を有する、および有しない患者の血漿からのＬｙｓｏＰＣ濃度およびＰＣ濃度を測定した。これらの結果を組み合わせて、且つかけて多数の脂質の診断測定値を得た。卵巣癌患者について独立に測定したＬｙｓｏＰＣ濃度およびＰＣ濃度は、正常な患者の場合に対して１０〜１００％だけ高かった。各試料について、ＬｙｓｏＰＡ×ＬｙｓｏＰＣ×ＰＣ濃度を組み合わせて、かけることによって、図５に示す通り、正常な患者に対して卵巣癌の患者の場合では４００％〜５００％高い測定値を得た。これらの結果は、コンビナトリアル法により、虚偽の正の結果および虚偽の負の結果の数を減少させることによって、病気（例えば、リゾホスホリピド濃度およびホスホリピドの変化した濃度に関係する癌）を検出するためのより精密なアッセイを提供し得ることを示唆している。
【００６０】
実施例ＩＶ
出血障害を有する患者におけるＬｙｓｏＰＡの検出および定量
年齢が１〜８０歳にわたる男性および女性患者からの９３血漿試料中のＬｙｓｏＰＡ濃度を、上記実施例Ｉに記載する通り測定した。その９３試料中の１７試料は、予め出血障害（すなわち、凝固障害）と診断された患者からのものである。図６に示す通り、出血障害を有する患者は癌または出血障害を有しない患者よりも有意に高い平均ＬｙｓｏＰＡ濃度を示した。
【００６１】
本明細書中の実施例からの結果は、本発明の方法が、リゾホスホリピド濃度およびホスホリピド（例えば、ＰＣ）濃度の変化に関係する多数の病状を有する患者におけるそれらの濃度の変化を検出するのに使用することができる。その上、これらの結果は、リゾホスホリピド濃度の変化に関係する病状を診断する新しい方法を提供するものであって、該方法では血漿中および血清中の異なるホスホリピド（例えば、ＬｙｓｏＰＡおよびＬｙｓｏＰＣ）濃度をかけてそれら病気を検出する。
【００６２】
多数の刊行物を本明細書に引用するが、それらは本明細書の一部を構成する。
【００６３】
本発明に関わる分野の当業者にとって明らかな通り、本発明の精神または潜在的な特徴を逸脱せずに、上に具体的に開示する以外の態様を使用することができる。従って、あらゆる点で上に記載する本発明の具体的な態様は、例示するものであって、制限するものではないと考えるべきである。本発明の範囲は、上の記載に含まれる実施例に限定するのではなく、特許請求の範囲に記載する発明およびその均等物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例Ｉに詳細に記載する、ＮＡＤＨの酸化によって定量した、ＬｙｓｏＰＡ標準液および血漿についての希釈曲線を示す図である。
【図２】  実施例Ｉに詳細に記載する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の産生によって定量した、ＬｙｓｏＰＡ標準液および血漿についての希釈曲線を示す図である。
【図３】  実施例Ｉに詳細に記載にする、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の産生によって定量した、ＬｙｓｏＰＣ標準液および血漿についての希釈曲線を示す図である。
【図４】  実施例ＩＩＩで示す本発明の酵素的アッセイ法を用いた、癌でない被験者中の場合と比べた卵巣癌を有する被験者中の平均血漿中ＬｙｓｏＰＡ濃度の増大を示す。
【図５】  実施例ＩＩＩに詳細に記載する、本発明の酵素的アッセイ法を用いた、癌でない被験者のかけ合わせた濃度と比べて卵巣癌を有する患者の血漿中の組み合わせた場合のＬｙｓｏＰＡ、ＬｙｓｏＰＣおよびＰＣの平均濃度は増大していることを示す棒グラフである。
【図６】  実施例ＩＶに詳細に記載する、癌または出血障害を有しない被験者に対する出血障害（凝固障害によって示される）を有する患者中の平均血中ＬｙｓｏＰＡ濃度の増大を示す棒グラフである。
【図１】
0004472872.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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