(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルボサイクリンまたはアルボサイクリンＭ−３を含有することを特徴とするヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）α鎖発現阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）α鎖発現阻害活性を有し、抗原特異的ＩｇＥ−受容体間の結合を介した細胞の活性化を阻害することにより一連のアレルギー反応を抑えるのに有効な抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食住環境の変化からアレルギー疾患が急増している。中でも花粉症にかかる率は、この２０年間に１０倍近く増加している。I型アレルギーは、肥満細胞や好塩基球表面のＦｃεＲＩにＩｇＥが固着し、固着したＩｇＥ２分子に特異抗原が結合することにより、細胞内顆粒から化学伝達物質、そして細胞膜リン脂質の生化学反応からアラキドン酸代謝産物が合成・放出され、これらの化学伝達物質、さらに肥満細胞の産生するサイトカインが標的組織、標的細胞に作用して、種々の臨床症状を呈するものをいう。また、肥満細胞上のＦｃεＲＩ凝集によるシグナルは核を経由し、サイトカイン合成や細胞増殖が誘導される。抹消の組織において肥満細胞は血管周囲に多数存在し、肥満細胞から放出されるこれらサイトカインは近接する血管内皮細胞に種々の接着分子の発現を誘導する。これらの接着分子のリガンドを発現している血流中の好酸球、リンパ球は炎症局所の血管内皮細胞に接着した後、肥満細胞から放出された走化性因子の濃度勾配に応じて局所に遊走、集積し、遅発型喘息反応が惹起される。すなわち、喘息においては、炎症を主体とする遅発型喘息反応もその起源をたどればＦｃεＲＩ凝集による肥満細胞の活性化にある。これらのことからＦｃεＲＩはアレルギー反応を引き起こす鍵となる受容体であり、抗原−ＩｇＥ− ＦｃεＲＩの結合を何らかの方法で阻害することはアレルギー性疾患の治療を行う上で有効な手段となりうる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これまでのアレルギー治療剤には、マレイン酸クロルフェニラミン製剤に代表される抗ヒスタミン剤とザジテン（ノバルティス）に代表される抗アレルギー剤が挙げられる。前者は、アレルギーを誘発する体内物質ヒスタミンに対抗することで効果を発揮し、湿疹などのかゆみ、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎などに有効である。一方、抗コリン作用という副次的作用により痰が出ずらくなったり、鼻がつまったりすることがあり、喘息や鼻閉にはあまり効果はない。また、後者は、ヒスタミン以外の化学伝達物質の働きも抑えることで抗ヒスタミン剤（第２世代）に分類されることがあり、抗コリン作用がほとんどないので喘息にも適用するものがある。しかし、一般に、遅効性であり、症状によっては投与後、十分効果が現れるまでに時間がかかることがある。いずれにせよ、アレルギー反応の根元を断つ治療剤は未だ開発されていない。ＦｃεＲＩの発現そのものを抑制し、既存の抗アレルギー治療剤とは異なる作用点、すなわち、 ＩｇＥ− ＦｃεＲＩによるアレルギー反応の悪循環サイクルを断つ新たな物質が開発された場合、産業上の有用性には計り知れないものがある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、土壌中より単離した１種類の放線菌より抗アレルギー活性を有する、次式：
【０００５】
【化１】
0004573933.tif 000002
で表されるアルボサイクリン（以下、ＡＬＢと略記する）（１）およびアルボサイクリンＭ３（以下、ＡＬＢ−Ｍ３と略記する）（２）を見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
このＡＬＢおよびＡＬＢ−Ｍ３はグラム陽性菌に有効な抗生物質であることと農園芸用殺菌剤であることが既に知られているが、抗アレルギー作用を持つことは、今回発明者等によって新規に見い出された。
【０００７】
従って、本発明の第一は、アルボサイクリン化合物を含有することを特徴とする抗アレルギー剤を提供することである。さらに、本発明の第二はアルボサイクリン化合物を含有することを特徴とするヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）α鎖発現阻害剤を提供することである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の抗アレルギー剤及びヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）α鎖発現阻害剤に用いることができるアルボサイクリン化合物には、アルボサイクリン、アルボサイクリンＭ１、アルボサイクリンＭ２、アルボサイクリンＭ３、アルボサイクリンＭ４、アルボサイクリンＭ５、アルボサイクリンＭ６、アルボサイクリンＭ７などがあげられるが、アルボサイクリンおよびアルボサイクリンＭ３が好ましい。
【０００９】
今回抗アレルギー活性が新規に見出されたＡＬＢおよびＡＬＢ−Ｍ３は、以下の実施例に記載の方法によって放線菌ＫＳ１２９１１株から単離することができる。また、既知放線菌株STREPTOMYCES BRUNEOGRISEUS NOV. SPから単離（J. Antibiot., Ser. A., Vol. XX, No.5, 261-266, 1967）、あるいは公知の方法（Tetrahedron, Vol. 43, No.19, 4395-4406, 1987）により合成することもできる。
【００１０】
このＡＬＢおよびＡＬＢ−Ｍ３は高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）α鎖を発現する細胞に作用し、ＦｃεＲＩα鎖発現量を低下させ、抗原特異的ＩｇＥ−受容体間の結合を介した細胞の活性化を阻害することにより一連のアレルギー反応を抑えることができる。
【００１１】
本発明の化合物を抗アレルギー剤として使用する場合は、例えば錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、注射剤、貼付剤などの適宜な剤型を持って投与できる。これらの剤型による各所製剤に当たっては、賦形剤、溶解補助剤、結合剤、安定剤、香味剤などを使用することができる。
【００１２】
錠剤、カプセル剤などに混和することのできる補助薬の具体例は次のものである。トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤、微晶性セルロースのような賦形剤、コンスターチ、全ゲル化スターチ、アルギン酸などのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、スクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤、単位使用形態がカプセル剤の場合、上記のタイプの材料のほかに脂肪油のような液状担体を含有することができる。種々の他の材料は被覆剤としてまたは用量単位の物理的形態を別の方法で変化するために存在させることができる。例えば、錠剤はシェラック、シュガーまたは両方を被覆することができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてスクロース、防腐剤ととしてメチル及びプロピルパラベン、染料、及びチェリーまたはオレンジ香味のような香味剤を含有することができる。
【００１３】
注射用の滅菌組成物は注射用水、ゴマ油、ヤシ油、ピーナッツ油、綿実油などの天然由来植物油などの賦形剤中に活性物質を溶解または懸濁させることによって、通例の医薬実施に従って処方することができる。緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤などを必要に応じて混和することができる。
【００１４】
本発明の薬剤は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射などの各種注射あるいは経口投与、経皮投与などの種々の方法によって行うことができるが、液状にして注射剤、点滴剤として投与することが望ましい。特に好ましい投与の形態は静脈内投与であり、その投与量は、一般には１日１〜１０００μｇ／kgが好ましく、一日数回に分けて投与されてもよい。 アレルギー性疾患の種類や症状あるいは投与方法などにより、その投与量は変化することが一般的であり、上記範囲外で投与することもできる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明はヒト高親和性ＩｇＥレセプター（ ＦｃεＲＩ ）を発現する肥満細胞や好塩基球に作用し、特にＦｃεＲＩα鎖の発現を抑制することにより抗原−ＩｇＥ− ＦｃεＲＩ間の結合による細胞の活性化を阻害し、アレルギー性疾患の治療や予防に有効な薬剤として利用できる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
実施例１（放線菌培養液からのＡＬＢおよびＡＬＢ−Ｍ３の調製）
茨城県北相馬郡守谷町で採取した土壌を乾燥させて、乳鉢ですりつぶし、生理食塩水で懸濁後、AV寒天培地プレート（栄研化学株式会社）に塗布し、放線菌株ＫＳ１２９１１株を得た。30℃で１週間培養後、生育した放線菌コロニーを選択してコットンシードミール液体培地（２％コーンスターチ（和光純薬工業社）、0.5%ファルマメディアコットンシードミール（TRADERS PROTEIN ,SOUTHERN COTTON OIL COMPANY社）、0.05%イーストエキストラクト（DIFCO LABORATORIES社）、0.1%NaCl、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4）500mlに植菌し、30℃で１週間振とう培養後、培養上清４．２ｇを得た。
ＫＳ１２９１１株培養抽出物凍結乾燥品１０．０ｇを５００ｍｌの水に溶解し、５００ｍｌの酢酸エチルで二回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムにて乾燥し、溶媒を減圧下にて留去し、シロップ状の液体（茶色）647mgを得た。
得られた液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサンと酢酸エチルからなる混合溶媒より分画、精製し、化合物A（２４ｍｇ）およびB（１０ｍｇ）を得た。化合物AおよびBはそれぞれアルボサイクリン（ＡＬＢ）およびアルボサイクリンＭ３（ＡＬＢ−Ｍ３）で、物性値は文献（Harada, K., et al., J. Antibiotics, 37, 1187-1197 (1984) と一致した。
【００１８】
実施例２（錠剤、カプセル剤）
ＡＬＢ                              ０．１
乳糖                                ０．７５
ステアリン酸マグネシウム            ０．１５
合計                                １．０
上記の各重量部（ｇ）を均一に混合し、常法に従って錠剤、カプセル剤とした。また、ＡＬＢ−Ｍ３についても同様に錠剤、カプセル剤とした。
【００１９】
実施例３（散剤、顆粒剤）
ＡＬＢ                              ０．２
澱粉                                ０．３
乳糖                                ０．５
合計                                １．０
上記の各重量部（ｇ）を均一に混合し、常法に従って散剤、顆粒剤とした。また、ＡＬＢ−Ｍ３についても同様に散剤、顆粒剤とした。
【００２０】
実施例４（注射剤）
ＡＬＢ                              ０．１
界面活性剤                          ０．９
生理食塩水                          ９．０
合計                              １０．０
上記の各容量部（ｍｌ）を加熱混合、滅菌して注射剤とした。また、ＡＬＢ−Ｍ３についても同様に注射剤とした。
【００２１】
実施例５（ ＦｃεＲＩα鎖遺伝子プロモーター活性阻害効果）
ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子プロモーター約６００塩基対（国際公開第９９／４６３９９参照）をレポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐGV-ｐ２（東洋インキ：商品名ピッカジーンプロモーターベクター）のマルチクローニングサイトに連結したプラスミドpGVP2α3N N0.6  ５μｇおよびヒトサイトメガロウイルスプロモーターを含むプラスミドpRL-CMV（Promega）2５ｎｇを１×１０７個のラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３及びマウスマストサイトーマＰＴ−１８へジーンパルサーII（バイオ・ラッド社製）を用いてエレクトロポレーション法（950μF, 300mV）で取り込ませた。この細胞を１０％ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）を含むα−ＭＥＭ（α-Minimum Essential Medium, Life Technologies., Inc.）１０ｍｌに懸濁し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター内で６時間培養を行った。続いて、ＡＬＢまたはＡＬＢ−Ｍ３を最終濃度25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57μg/ mlとなるよう添加、さらに２０〜２４時間培養を行い、細胞を回収して細胞中に発現しているルシフェラーゼの活性をルミノメーターMicroLumat Plus（ベルトールド社製）にて測定した。活性測定の際、基質としてDual luciferase assay kit（東洋インキ）を用い、方法は添付のプロトコールに従った。
【００２２】
その結果、図１に示すように、ＡＬＢ及びＡＬＢ−Ｍ３はヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子プロモーターの活性を濃度依存的に明確に阻害した。
【００２３】
実施例６（ ＦｃεＲＩα鎖mRNA発現量阻害効果）
ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３ 及びマウスマストサイトーマＰＴ−１８へＡＬＢ（濃度3, 1.5μg/ ml）またはＡＬＢ−Ｍ３（濃度 25, 12.5μg/ ml）を添加し、２０〜２４時間培養した後、細胞を回収し、PBS(−)にて洗浄後、TRIZOL試薬（Life technologies Inc.）を用いてトータルRNAを調製した。このトータルRNAを用いてノーザンブロッティングを行った。すなわち、各トータルRNAを1.5 %アガロース・ホルマリン変性ゲルで100Vで泳動した。１レーンあたりのトータルRNA量は10μgとした。ゲル中のmRNAを毛細管作用を利用してニトロセルロースフィルター（アマシャム・ファルマシア社製、商品名ハイボンド−Ｎ＋）に転写し、UV照射してRNAを膜に固定した。プローブとして、DIG-DNAラベリングキット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて、ラットＦｃεＲＩα鎖cDNAおよびマウスＦｃεＲＩα鎖cDNAをそれぞれDIG標識したものを用いた。また、インターナルマーカーとして同じくDIG標識したβ−アクチンｃDNAを用いた。ノーザンブロッティングはベーリンガー・マンハイム社のDIGシステムを用いてハイブリダイゼーションを行うためのユーザーガイドに基づいて行った。検出は化学発光により行い、基質としてCDP-Star（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いた。化学発光により得られたシグナルはＸ線フィルム（アマシャム・ファルマシア社製、商品名Hyper film）に露光し、現像液（富士フィルム社製、商品名レンドール、レンフィクス）を用いて現像した。
【００２４】
その結果、図２に示すようにＡＬＢ及びＡＬＢ−Ｍ３はＦｃεＲＩα鎖の発現を抑制したが、対照であるβ−アクチンの発現は抑制しなかった。すなわち、 ＦｃεＲＩα鎖の発現を選択的かつ無毒的に抑制した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット好塩基球細胞ＲＢＬ−２Ｈ３およびマウスマストサイトーマＰＴ−１８に対するＡＬＢおよびＡＬＢ−Ｍ３のα鎖遺伝子プロモーター活性阻害効果を観察した結果を示すグラフ。
縦軸に示したプロモーター活性の値が低いほどα鎖の発現を抑制していると考えられる。横軸はＡＬＢ，ＡＬＢ−Ｍ３の添加濃度を示す。
【図２】ノーザンブロッティングの結果を示す図。
レーン１はコントロール。
レーン２、３はＡＬＢの添加濃度がそれぞれ３、１．５μｇ／ｍｌ。
レーン４、５はＡＬＢ−Ｍ３の添加濃度がそれぞれ２５、１２．５μｇ／ｍｌ。
上部がα鎖ｍＲＮＡ、下部がβ−アクチンｍＲＮＡ量を観察したもの。
【図１】
0004573933.tif 000003
【図２】
0004573933.tif 000004