(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、インビトロでＫｕｚの活性を特異的に検出する工程を含んでなる、病原性血管形成を確認するためのＫｕｚ活性の検出方法。
【請求項２】
検出工程が、Ｋｕｚ特異的プロテアーゼアッセイ又はＫｕｚ特異的免疫結合アッセイを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｋｕｚ活性を有する脊椎動物において、インビトロでＫｕｚの活性を特異的に検出する工程を含んでなる、血管形成の検出方法。
【請求項４】
検出工程が腫瘍を検出することを含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（緒言）
（発明の分野）
本発明の分野は、Ｋｕｚとして知られているタンパク質を標的とすることによって血管形成を変調することである。
【０００２】
（発明の背景）
ＡＤＡＭファミリーの遺伝子はメタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインの両方を含む膜貫通タンパク質をコードしており（BlackとWhite, 1998 Curr. Opin. Cell Biol. 10,654-659; WolfsbergとWhite, 1996 Dev. Biol. 180, 389-401）、哺乳動物における多様な生物プロセス、例えば受精（Cho等, 1998 Science 281, 1857-1859）、筋芽細胞融合（Yagami-Hiromasa等, 1995 Nature 377, 652-656）及び外部ドメイン分断（Moss等, 1997 Nature 385, 733-736; Black等, 1997 Nature 385, 729-733; Peschon等, 1998 Science 282, 1281-1284）に関与している。ショウジョウバエのクズバニアン（kuzbanian(ｋｕｚ)）遺伝子は無脊椎動物で同定された最初のＡＤＡＭファミリーのメンバーである（Rooke等, 1996 Science 273, 1227-1231）。過去の遺伝子研究では、ｋｕｚはショウジョウバエの神経発生中において側方抑制と軸索成長に必要とされることが示された（Rooke等, 1996；Fambrough等, 1996 PNAS.USA 93, 13233-13238; PanとRubin, 1997 Cell 90, 271-280；Sotillos等, 1997 Development 124, 4769-4779）。特に、側方抑制プロセスの間、ｋｕｚはＮｏｔｃｈの上流で作用し（PanとRubin, 1997；Sotillos等, 1997）、それがＤｅｌｔａ遺伝子によってコードされた側方抑制シグナルのための膜貫通レセプターをコードする。より最近では、Ｎｏｔｃｈの線虫ホモログの活性を同様な形で調節するｋｕｚのホモログが線虫（ＳＵＰ-１７）において同定された（Wen等, 1997 Development 124, 4759-4767）。
【０００３】
ｋｕｚの脊椎動物ホモログは、アフリカツメガエル、ウシ、マウス、ラット及びヒトにおいて単離されている。ＫＵＺのウシホモログ（ＭＡＤＭ又はＡＤＡＭ１０とも呼ばれる）は最初はウシＫＵＺプロテアーゼに対する生理学的基質ではありそうにない細胞質タンパク質であるミエリン塩基性タンパク質に対するそのインビトロでのタンパク分解活性に基づいて思いがけなく単離された（Howard等, 1996 Biochem. J. 317, 45-50）。最近の研究で、我々は、アフリカツメガエル中でのマウスｋｕｚホモログ（ｍｋｕｚ）のドミナントネガティブ型の発現が余分なニューロン生成を生じ、脊椎動物の神経発生におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節に対してｍｋｕｚの進化的に保存された役割を示唆している（PanとRubin, 1997）。しかして我々は胚性幹(ＥＳ)細胞中での遺伝子ターゲティングを利用してｍｋｕｚ欠損マウスを産生した。我々は、ｍｋｕｚが胚発生のために必須であり、ｍｋｕｚ変異体マウスはおよそ胎齢（Ｅ）９．５日で、神経系、沿軸中胚葉及び卵黄嚢脈管構造に重症の欠陥が生じて死亡することを示す。神経系において、ｍｋｕｚ変異体胎仔は、異所性ニューロン分化を示す。沿軸中胚葉において、ｍｋｕｚ変異体胎仔は体節の遅発性でまとまりのない分節化を示す。これらの表現型はＮｏｔｃｈ-１又はＮｏｔｃｈ経路の成分、例えばＲＢＰ-Ｊｋを欠くマウスのもの（Conlon等, 1995, Development 121, 1533-1545; Oka等, 1995）と同様であり、マウスの発育中のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節におけるｍｋｕｚの保存された役割を示している。更に、我々は我々のノックアウト動物ではＮｏｔｃｈプロセシングに可視できる欠陥は検出していない。神経発生と体節発生の欠陥に加えて、ｍｋｕｚ変異体マウスはまた卵黄嚢脈管構造に重大な欠陥を示しており、毛管網が拡大して乱れ、大きな卵黄血管がない。そのような表現型はＮｏｔｃｈ-１又はＲＢＰ-Ｊｋを欠くマウス（Swiatek等, 1994 Genes Dev 15, 707-719; Conlon等, 1995; Oka等, 1995 Developement 121, 3291-3301）では観察されていないので、我々は、この表現型はＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節におけるその役割とは別のｍｋｕｚの新規な機能を明らかにするものであると決定した。まとめると、我々の研究は哺乳動物の神経発生、体節発生及び血管形成におけるＡＤＡＭファミリーのディスインテグリンメタロプロテアーゼの必須の役割を明らかにする。
【０００４】
(発明の概要)
我々は、Ｋｕｚが体節発生、神経発生及び血管形成に関与しており、関連した病状における介入のための有用な治療上のターゲットを提供することを開示した。従って、本発明は体節発生、神経発生及び特に血管形成におけるＫｕｚの関与に関する方法と組成物を提供する。一実施態様では、本発明は、病原性血管形成であるとされた脊椎動物においてＫｕｚの活性を特異的に調節する工程を含んでなる、血管形成の調節方法を提供する。Ｋｕｚに特異的に結合するか、基質又は必要とされるコファクターについてＫｕｚと競合する薬剤に動物を接触させることを含む、Ｋｕｚ活性を特異的に調節する非常に様々な方法が開示される。
【０００５】
他の実施態様では、本発明は、病原性血管形成であると必ずしもされていない脊椎動物においてＫｕｚの活性を特異的に調節し、むしろ動物において結果として生じた血管形成の調節を続いて検出する工程を含んでなる血管形成の調節方法を提供する。
本発明はまた病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、例えばＫＵＺ特異的プロテアーゼアッセイ又はＫＵＺ特異的免疫結合アッセイを使用して、Ｋｕｚの活性を特異的に検出する方法を提供する。本発明はまた所定のＫｕｚ活性を持つ脊椎動物において、例えば病原性血管形成に伴う腫瘍を検出することによって、病原性血管形成を特異的に検出する方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた血管形成の修飾因子を同定する方法において、（ａ）予め定まった量のＫｕｚを含む血管形成アッセイ系を候補薬剤に、候補薬剤が存在しない場合に系が基準血管形成を付与する条件下で、接触させ、（ｂ）系の薬剤バイアス血管形成を検出する工程を含み、薬剤バイアス血管形成と基準血管形成の差異により、薬剤による系の血管形成の調節が示される方法を提供する。このような方法は、インビトロの細胞ベースアッセイ又はインビボの動物ベースアッセイで実施されうる。
本発明はまた主題の方法に適合化されたキットと試薬を提供する。
【０００７】
（発明の特定の実施態様の説明）
特定の実施態様と実施例の次の説明は例示のために提供されるもので限定のためではない。矛盾せず又はそれ以外の定義が示されない限り、これらの説明及び本明細書全体を通じて、「ａ」及び「ａｎ」という用語は一又は複数を意味し、「又は」という用語は及び／又はを意味する。Ｋｕｚは広く記載されている当該分野で認められた天然タンパク質ファミリーを意味し、当該分野でまたよく知られているオーソロガス(orthologs)及び変異体を包含する。例えば、ＷＯ９８／３７０９２及びＷＯ９７／３１９３１；Mayer等(米国特許第５９２２５４６号；及びRubin等(米国特許第５９３５７９２号)を含む、ヒトＫＵＺの幾つかの型が記載されている。しばしば血管形成について検討され実証されるが、開示された方法と試薬は一般に病原性体節発生及び神経発生にも同様に適用可能であるものと理解されなければならない。
【０００８】
幾つかの開示された用途は脊椎動物におけるＫｕｚの活性を特異的に調節することを含む。Ｋｕｚに特異的に結合するか、あるいは基質又は必要とされるコファクターに対してＫｕｚと競合する薬剤に動物を接触させることを含む、Ｋｕｚ活性を特異的に調節する非常に様々な方法が開示される。
【０００９】
ｋｕｚに特異的に結合する薬剤には、メタロプロテアーゼインヒビター、例えばヒドロキサマートメタロプロテアーゼインヒビター及びＴＡＣＥ（ＴＮＦ-α転換酵素）インヒビター（レビューには、Amour A等, Ann N Y Acad Sci 1999 June 30;878:728-31を参照）が含まれる。例示的なインヒビターには、ＩＣ-３(Ｎ-{Ｄ,Ｌ-[２-(ヒドロキシアミノカルボニル)メチル]-４-メチル-ペンタノイル}-Ｌ-アラニン，２-アミノエチルアミド、Black等, Nature, 1997, Vol 385, 729-73; GalkoとTessier-Lavigne, Science, 2000, Vol 289, 1365-1367）、ＧＭ６００１（ＮＨＯＨＣＯＣＨ２ＣＨ(Ｉ-Ｂｕ)ＣＯ-Ｔｒｐ-ＮＨＭｅ）；ＧＷ９４７１（Moss等, Nature, 1997, Vol 385, 733-736に示されたＴＡＣＥの精製中に使用されたＧＷ９４７１のビオチン化誘導体であるＧＷ９２７７の構造を参照）；及び合成ヒドロキサマートペプチド模倣マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターであるＢＢ-９４（batimastat）（Hernandez-Pando R等 Int J Exp Pathol 2000 Jun; 81(3):199-209を参照）が含まれる。有用な天然のＭＭＰインヒビターには、ＭＭＰｓの組織インヒビター（ＴＩＭＰｓ）、例えばＴＩＭＰ-１及びＴＩＭＰ-３が含まれる（例えばAmour等, FEBS Lett. 2000 May 19;473(3):275-9を参照のこと）。
【００１０】
Ｋｕｚに特異的に結合するインヒビターの他のクラスは、Ｋｕｚに特異的に結合する免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、特にＣＤＲ３領域を含むポリペプチドである。これらは抗体と抗体断片、例えばＦ(ａｂ)断片を包含する。治療用の抗体及び抗体断片を製造し使用する方法はよく知られている。例えば米国特許第５９３５７９２号を参照。
【００１１】
細胞内抗体、つまりイントラボディは遺伝子療法における用途を持つ中和分子のクラスを表す（vonMehren M, Weiner LM. (1996) Current Opinion in Oncology. 8: 493-498, Marasco WA. (1997) Gene Therapy. 4: 11-15, Rondon IJ, Marasco WA. (1997) Annual Review of Microbiology. 51:257-283）。抗Ｋｕｚイントラボディは重鎖の可変ドメインがペプチドリンカーを介して軽鎖の可変ドメインに結合され、親Ｋｕｚ抗体の親和性を維持している遺伝子操作された一本鎖抗体である（Rondon等）。抗ＫｕｚイントラボディはＫｕｚの酵素活性形態を認識し、結合時にＫｕｚのリン酸転移能を阻害する抗体をコードするポリクローナルか又はモノクローナルの抗Ｋｕｚ抗体ｃＤＮＡから設計される。また、抗ＫｕｚイントラボディはＫｕｚ酵素活性を刺激する抗体をコードするポリクローナルか又はモノクローナル抗体ｃＤＮＡから産生することができる。抗Ｋｕｚ一本鎖イントラボディはまた細胞質の安定性を増大させるためにＣ末端ヒトＣκドメインで、及び／又は発生期にあるイントラボディを核コンパートメントに向けるためにＣ末端ＳＶ４０核移行シグナルで、それぞれ修飾してもよい（Mhashilkar AM等 (1995) Embo Journal. 14: 1542-1551）。この点について、安定に発現された一本鎖抗Ｋｕｚイントラボディとその修飾形態は、真核生物細胞の細胞質又は核コンパートメントの何れかにＫｕｚ分子を効率的にターゲッティングするために使用することができる。
【００１２】
Ｋｕｚ特異的イントラボディは標準的なＤＮＡトランスフェクション法（リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、リポフェクタミン等々）を含む幾つかの確立された方法の任意のものによって培養された細胞中に導入することができる。抗Ｋｕｚイントラボディは、ｔｅｔ抑制の（Gossen M, Bujard H. (1992) Proc. Natil. Acad. Sci. USA. 89: 5547-5551）又はＩＰＴＧ誘発性の（Liu HS等, (1998) Biotechniques. 24: 624-632, Hannan GN等(1993) Gene. 130: 233-239）又はグルココルチコイド誘発性（ＧＲＥを使用）の誘発性発現ベクター、構成発現ベクター（例えばＣＭＶ又はＲＳＶプロモータ駆動ベクター）又は組織特異的発現遺伝子のプロモータ（例えばＴ細胞レセプタープロモータ）を使用する組織特異的発現ベクターの、種々のものの任意のものに構築される。抗Ｋｕｚイントラボディ組織（並びに株化細胞）を発現するための重要な変更点は、標準的なプロトコール（Vile RG等(1995) British Medical Bulletin. 51:12-30, Shoji I等 (1997) J. General Virology. 78: 2657-2664, Paulus W等 (1996) J. Virology. 70: 62-67）を使用して適切なウイルス発現ベクターを構築することである。抗Ｋｕｚイントラボディ遺伝子はキーとなるウイルス遺伝子に置き換えられ、宿主細胞によってウイルス粒子中に収容される。改変されたウイルスゲノムが標的の組織ゲノム中に組み込まれるが、新しいウイルス粒子の形成を防ぐように崩壊される。そして標的組織の個々の細胞が抗Ｋｕｚイントラボディ転写物とタンパク質を生産する。
【００１３】
基質又はコファクターに対してＫｕｚと特異的に競合する非常に多種の薬剤を使用することができる。競合的インヒビターには、高親和性の亜鉛結合によってＺｎ-メタロプロテアーゼを阻害することが知られている、置換ヒドロキサマート、カルボキシラート、チオール、ホスホナート、アミノジアチアゾール、及びカテコール、並びにＥＤＴＡ及び１,１０-フェナントロリンのような二価カチオンのキレーターを含む、数多くのクラスが包含される。競合的インヒビターにはまたプロテアーゼドメインが欠失又は点変異誘発によって破壊されているドミナントネガティブ型Ｋｕｚ変異体が含まれる。そのようなＫｕｚ変異体は当該分野で公知であり、新規なドミナントネガティブ型変異体はプロテアーゼドメイン内での残基の標的変異誘発の後に常套的な活性スクリーニングを行うことによって直ぐに作製される。米国特許第５９３５７９２号参照。例示的なドミナントネガティブ型ヒトｋｕｚ変異体を表１に示す。
【００１４】
0004522047.tif 000002
”番号付けは米国特許第５９３５７９２号のヒトＫｕｚ（配列番号：４）に記載されたアミノ酸残基を示す。対応する変異は、配列アラインメントによって米国特許第５９２２５４６号及びＰＣＴ公報ＷＯ９７／３１９３１に開示されているように、他のヒトＫｕｚタンパク質において同定できる。
【００１５】
好適な実施態様では、ドミナントネガティブ型Ｋｕｚ変異体は可溶性であり、つまり膜貫通ドメインを欠いているが一又は複数の細胞外ドメインを含んでいる。好ましくは、可溶性ドミナントネガティブ型変異体はまたシグナルペプチドとプロドメインを欠き、システインリッチドメイン、ディスインテグリンドメイン及び／又はメタロプロテアーゼドメインを含む。他の好適な実施態様では、可溶性ドミナントネガティブ型変異体は精製、欠失又は可溶化を容易にするか、あるいはある種の他の機能を付与するように選択される非関連ポリペプチドに融合される。融合タンパク質は一般に可溶性Ｋｕｚ変異体をコードするヌクレオチド配列が、選択された非関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に読み枠を一致させて結合したハイブリッド遺伝子を発現することによって産生される。好適な非関連タンパク質は免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域（例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域）であり、これは、得られた融合タンパク質を、生物療法に使用する場合により安定でより長い半減期を持つものとできる。
【００１６】
幾つかの開示された用途は、病原性体節発生、神経発生又は特に血管形成であることがきまった脊椎動物、特にマウス、ラット又はヒトを含む。他の実施態様では、本方法は動物の病原性血管形成、体節発生又は神経発生を特異的に検出することに関する。病原性血管形成は例えば望ましくない過剰又は欠乏した血管形成を全身的又は局部的に呈するあらゆる症状を包含し；例示的な元となる状態には、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、黄斑変性症、乾癬、及び過剰又は不十分又は調節を誤った血管形成が役割を担っているその他の病理状態が含まれる。例えば、我々のＫｕｚ欠損マウスは、Ｍａｓｈ-１とニューロゲニン(neurogenin)を含む幾つかの神経の特定遺伝子のアップレギュレーションを呈し、神経前駆体が過剰であることを示している。これらのマウスはまた体節におけるＤｌｌ１発現の喪失と体節の深刻な表現型破壊によって明らかにされる体節発生不良を呈している。また、マウスは病原性血管形成を呈しており、胚性卵黄嚢中の卵黄の血管が発生していない。病原性体節発生、神経発生又は血管形成は、組織検査、関連しているマーカー遺伝子の発現等々のような常套的な方法によって直ぐに検出される。また、以下において実証するように、内皮細胞ベースの血管形成アッセイのような数多くのインビトロモデル系が知られている。多くの場合、検出は、病原性血管形成に関連する腫瘍のような状態を検出することにより推論して実施される。血管形成は、特に、インビトロ細胞ベースアッセイ、例えばｈｕｖｅｃアッセイ及びインビトロ指標、例えば血流パラメータ、微小血管密度、血管内皮成長因子レベル（例えばLee等 Obstet Gyneco 2000 Oct;96(4):615-21を参照）、成長因子レセプター（例えばShin等 2000 J Cancer Rec Clin Oncol 126, 519-28）等々を含む、任意の常套的な手段によって検出される。これらのアッセイは、異種移植系、例えばRofstad等 2000 Cancer Res 60, 4932-8のようなモデル系で実施できる。
【００１７】
Ｋｕｚが病原性体節発生、神経発生又は血管形成に関連する症状に対する有用な治療上のターゲットを提供するという本開示は、当業者に明らかな数多くの応用例−病原性体節発生、神経発生又は血管形成に関連する症状の治療ターゲットとしてＫｕｚの使用を前提とした任意の応用例、を提供する。例えば、一実施態様では、本発明は、病原性血管形成であると必ずしもされていない脊椎動物においてＫｕｚの活性を特異的に調節し、むしろ動物中に結果として生じた血管形成の調節を続いて検出する工程を含んでなる血管形成の調節方法を提供する。他の実施態様では、本発明はまた病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、例えばＫＵＺ特異的プロテアーゼアッセイ又はＫＵＺ特異的免疫結合アッセイを使用して、Ｋｕｚの活性を特異的に検出する方法を提供する。他の実施態様では、本発明は所定のＫｕｚ活性を持つ脊椎動物において、例えば病原性血管形成に伴う腫瘍を検出することによって、病原性血管形成を特異的に検出する方法を提供する。
【００１８】
本発明はまたＫｕｚ活性に関連していることが推測的に知られている血管形成の修飾因子を同定する方法を提供する。例示できるそのような方法は、（ａ）予め定まった量のＫｕｚを含む血管形成アッセイ系を候補薬剤に、候補薬剤が存在しない場合に系が基準血管形成を付与する条件下で、接触させ、（ｂ）系の薬剤バイアス血管形成を検出する工程を含み、薬剤バイアス血管形成と基準血管形成の差異により、薬剤による系の血管形成の調節が示される。このようなスクリーニング方法は、以下に記載するように、インビトロの細胞ベースアッセイ又はインビボの動物ベースアッセイで実施されうる。
【００１９】
更なる説明を行わなくとも、当業者であれば、これまでの説明と次の例証のための実施例を用いて、本発明の化合物を製造し使用し、本発明の方法を実施することができるであろう。従って、次の実施例は本発明の好適な実施態様を特に指摘するもので、残りの開示を如何なる形であっても限定するものとみなしてはならない。上記の発明は理解を容易にするための実施例と例証によりある程度の詳細さで説明したが、特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りそれに所定の変形と変更を加えても良いことは本発明の教唆から当業者には明らかであろう。この明細書中に引用した全ての刊行物及び特許出願を、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が出典明示によりここに取り込まれる旨が示されているかのように、出典明示によりここに取り込む。
【００２０】
（実施例）
１．血管内皮成長因子、インターロイキン８、血小板由来内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子及びＫｕｚはヒトのメラノーマ異種移植片における血管形成と転移を促進する。
この実験は、メラノーマの血管形成と転移が、Ｋｕｚを含む幾つかの既知の血管形成因子のインヒビターによって阻害されることを実証する。実験の詳細はRofstad等 2000 Cancer Res 60, 4932-8のものを適応させた。簡単に述べると、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに移植したヒトメラノーマ株（Ａ-０７、Ｄ-１２、Ｒ-１８及びＵ-２５）からの細胞が腫瘍モデルとして用いられる。血管形成因子の発現はエライザ、ウェスタンブロット法及び免疫組織化学法により検査される。血管形成は皮内血管形成アッセイを使用して評価される。肺のコロニー形成及び突発性肺転移は、腫瘍細胞の静脈内及び皮内注射後にそれぞれ判定される。腫瘍血管形成、肺コロニー形成、及び突発性転移におけるＶＥＧＦ、ＩＬ-８、ＰＤ-ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ及びＫｕｚの特異的な役割は、中和抗体又はドミナントネガティブ型変異体で処置したマウスで評価される。メラノーマ株は複数の血管形成因子を発現し、各々の株が独特の発現パターンを示す。複数の血管形成因子は殆どの血管形成メラノーマ株において血管形成を促進する。腫瘍増殖、肺コロニー形成及び突発性転移は血管形成の速度によって制御され、よって血管形成を促進する血管形成因子によって制御される。肺コロニー形成と突発性転移は中和抗体又はドミナントネガティブ型変異体での処置によって阻害される。結果は、主題の血管形成因子のそれぞれがヒトメラノーマ異種移植片において血管形成と転移を促進することができ、それぞれが治療介入のための有効なターゲットであることを実証する。
【００２１】
方法：成体（８−１０週齢）の雌のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを用いて腫瘍血管形成、肺コロニー形成及び突発性転移を評価する。
４種のヒトメラノーマ細胞株（Ａ-０７、Ｄ-１２、Ｒ-１８及びＵ-２５、Rofstad, Br. J. Cancer, 70: 804-812, 1994）を、１３％の仔ウシ血清、２５０ｍｇ／ｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを補填したＲＰＭＩ１６４０（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ-グルタミン）中で単層培養物として維持する。培養物を空気中５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃にてインキュベーションし、一週間に２回、継代培養する。細胞株にマイコプラズマ汚染がないことが証明された。
【００２２】
腫瘍血管形成は内皮血管形成アッセイ（Danielsen, T等, Int. J. Cancer, 76:836-841, 1998）を使用して評価される。１００-μｌのハミルトンシリンジを用いてマウスの脇腹に１０μｌの細胞懸濁液の一定分量を接種する。接種点は真皮の深層部分のＳ.Ｃ.筋肉組織上である。接種当たりの細胞数は１．０ｘ１０６である。接種後７日でマウスを殺し−小さい血管が新生した腫瘍がそのときまでに接種部位に発生する。接種部位の回りの皮膚を取り除き、腫瘍を解剖顕微鏡に配する。腫瘍の方を向いた真皮中の毛細血管をカウントし、目盛付きの接眼レンズを使用して腫瘍の直径を測定する。毛細血管の数を、１０μｌのＨＢＳＳの注射の後に決定したバックグラウンドに対して補正する。血管形成を、腫瘍当たりの毛細血管の数又は腫瘍の外周１ｍｍ当たりの毛細血管の数として定量する。
【００２３】
インビボでの中和抗体での処置。
腫瘍血管形成、肺コロニー形成、及び突発性転移におけるＶＥＧＦ、ＩＬ-８、ＰＣ-ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ及びＫｕｚの特異的な役割は、これらの血管形成因子に対する中和抗体で宿主マウスを処置することによって調べられる。処置に使用される抗体は抗ヒトＶＥＧＦマウスモノクローナル抗体、抗ヒトＩＬ-８マウスモノクローナル抗体、抗ヒトＰＤ-ＥＣＧＦヤギポリクローナル抗体、抗ヒトｂＦＧＦヤギポリクローナル抗体及び抗ヒトＫｕｚ抗体である。抗体溶液をＰＢＳで希釈し、腹腔内注射によって０．２５ｍｌの容量をマウスに投与する。血管形成と肺コロニー形成実験では、処置は、２４時間の間隔で与えられる抗体２５μｇ（ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ）又は１００μｇ（ＩＬ-８及びＰＤ-ＥＣＧＦ）の４回の投与からなる。最初の投与量は腫瘍細胞の接種の１時間前に与えられる。
【００２４】
インビトロでの中和抗体での処置。
上述の中和抗体の可能な細胞障害性又は抗増殖性効果がインビトロで調べられる。Ａ-０７、Ｄ-１２、Ｒ-１８又はＵ-２５細胞を、５μｇ／ｍｌの抗体の存在下又は非存在下で８日間、１３％の仔ウシ血清、２５０ｍｇ／ｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを補填したＲＰＭＩ１６４０（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ-グルタミン）中で培養する。培養物中の細胞の数を、培養開始から２、４、６又は８日後に、血球計数器で細胞をカウントすることによって決定する。
【００２５】
２．Ｋｕｚインヒビターによる血管形成の阻害
この実施例では、ＩＣ-３、ＧＭ６００１、ＧＷ９４７１、ＢＢ-９４、ＴＩＭＰ-１及び２を含むＫｕｚインヒビターが幾つかのモデル系で血管形成を阻害することが示される。Ｋｕｚとその活性の存在はエライザとＫｕｚ特異的プロテアーゼ活性によって血管形成の測定前又は後にアッセイされる。我々の結果は、Ｋｕｚインヒビターがマトリゲル上に蒔いたラット微小血管内皮細胞によって形成される管形成を減少させ、３０−７０％でフィブリン上に蒔いたヒト微小血管内皮細胞によるｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＮＦα（２．５ｎｇ／ｍｌ）刺激微小血管形成を有意に低減させることを実証している。更に、インヒビター濃度は従属的にラット大動脈-リングアッセイでの突発的な微小血管形成とニワトリ絨毛尿膜アッセイでの血管発生を阻害した。
【００２６】
Manolopoulos VG等 Gen Pharmacol 2000 Feb; 34(2):107-16の方法を適応させた。ラット副腎髄質からの微小血管内皮細胞（ＲＡＭＥＣｓ）を単離し、増殖させ、特徴付けた（Manolopoulos等, 1997 Biochim Biophys Acta 1356, 321-332; Manolopoulos等, 1997 Am J. Physiol. 273, C214-C222）。細胞を空気中１０％のＣＯ２を補填したＤＭＥＭ中で培養し、１７−１９継代で使用する。ヒト包皮微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣｓ）を、過去に記載されたようにして（Koolwijk等 1996. J. Cell Biol. 132, 1177-1188.）、単離し増殖させる。細胞を、５％のＣＯ２の空気中３７℃で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１０％のヒト血清、１０％の新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、１５０μｇ／ｍｌのＥＣＧＦ、５ＩＵ／ｍｌのヘパリン、２ｍＭのＬ-グルタミン及び抗生物質を補填したＭ１９９中でゼラチン被覆皿にて培養し、１０又は１１継代で使用する。両方の細胞型はＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない溶液中の０．５ｇ／ｌトリプシン-ＥＤＴＡに簡単に暴露することによって継代される。
【００２７】
マトリゲルアッセイはKubota Y等, 1988. J. Cell Biol. 107, 1589-1598に従って実施される。１５．８ｍｇ／ｍｌで基底膜成分を含む腫瘍抽出物であるマトリゲルを１ｃｍ２ウェル（１２０μｌ／ウェル）に塗布し、３７℃で１時間、固化させる。続いて、各ウェルに５００００ＲＡＭＥＣｓを蒔き、実験の薬物を含む完全ＤＭＥＭと共に３７℃で８時間インキュベートする。選んだインキュベーション時間（８時間）は予備実験では我々の実験条件下で最適な管形成のために最低限必要であることが見出されている。各ウェルに形成された管構造の全長を、ＯＰＴＩＭＡＳ画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータに接続したビデオカメラが装備された顕微鏡（東京、日本）を用いて、ウェル表面全体をカバーする６倍の顕微鏡視野（２．５ｘ倍率）で測定する。
【００２８】
フィブリンゲルアッセイは上掲のKoolwijk等によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、ヒトフィブリンマトリックスを、指示薬なしのＭ１９９培地１ミリリットル当たり２．５Ｕの第ＸＩＩＩ因子、２ｍｇのヒトフィブリノーゲン、２ｍｇのクエン酸ナトリウム、０．８ｍｇのＮａＣｌ、及び３μｇのプラスミノーゲンの混合物に０．１Ｕ／ｍｌのトロンビンを加えることによって調製する。全体で３００ｍｌのこの混合物を１ｃｍ２ウェルに加える。室温での凝固後、フィブリンマトリックスに、１０％ヒト血清、１０％ＮＢＣＳ及び抗生物質を補填した０．５ｍｌのＭ１９９を含ませる。内皮細胞を高密度で蒔いてコンフルエントな単層を取得し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１０％ヒト血清、１０％ＮＢＣＳ、２ｍＭのＬ-グルタミン、抗生物質、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを補填した指示薬なしのＭ１９９培地で培養する。新鮮培地と試験化合物を２から３日毎に加えて、インキュベーションを１０日の間続ける。三次元フィブリンマトリックス中の内皮細胞によって形成された管構造を、位相差顕微鏡によって観察し、各ウェル中のその全長を、ＯＰＴＩＭＡＳ画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータに接続したモノクロＣＣＤカメラ（ＭＸ５）が装備されたオリンパス顕微鏡を用いて、ウェル表面全体をカバーする６倍の顕微鏡視野で測定する。
【００２９】
血管形成のラット大動脈-リングアッセイは、Liekens等, 1997 Oncol. Res. 9, 173-181によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、滅菌した１．５％のアガロース溶液を培養皿に注ぎゲル化させる。アガロースゲルにそれぞれ１０及び１７ｍｍの直径の２つの同心円を打ち抜くことによってアガロースリングが得られる。そのリングを６ウェルのプレートに移し、各ウェルに３つのリングを配する。胸大動脈を、成体の雄ウィスターラットから取得して、脂肪及び結合組織を除去し、０．５ｍｍのリングに切断する。各大動脈リングを、底部が既に１５０μｌの凝固フィブリノーゲンで被覆されたアガロースウェルの中心に位置させた後、アガロースウェルに凝固フィブリノーゲンを完全に満たす。使用されるフィブリノーゲン溶液は、３ｍｇ／ｍｌの濃度になるように無血清培地中に部分的に精製したウシフィブリノーゲンを溶解することにより得られる。フィブリンゲルは室温で３０秒で形成される。フィブリンのゲル化後に、各ウェルに、２０％ＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのグルタミン、及び抗生物質を補填したＭ１９９培地を満たし、試験化合物を添加する。培養物を毎日調べて倒立顕微鏡で記録する。微小血管網目構造の三次元の複雑さのため、２００を越える微小血管の形成がよくあり；よって形成される微小血管は二人の独立した観察者によって０（血管なし）から１０（最大の血管数）までのスケールで記録される。
【００３０】
絨毛尿膜血管発生アッセイは上掲のLiekens等によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、新鮮な受精卵が、ＣＡＭにさらす開口が卵殻に開けられる前に３７℃（湿度５５−６０％）で４日間、インキュベートされる。セロファンテープで開口を塞ぎ、卵をインキュベータに戻す。９日目に、試験化合物が滅菌状態で乾燥させられて上に配されているプラスチック円板（直径１０ｍｍ）をＣＡＭの選択領域に適用し、各ＣＡＭに一つの円板とされる。また、（ＰＢＳ又はＤＭＳＯを含む）コントロール円板を、試験化合物を含む円板から１ｃｍ離して各ＣＡＭに配する。酢酸コルチゾンの滅菌溶液（１００μｇ／円板）を全ての円板に含めて炎症反応を防止する。その後、開口を覆い、卵を３７℃で４８時間インキュベートする。卵に多量の１０％緩衝ホルマリンをかけることによりインキュベーションを終了させ、プラスチック円板を取り除く。
【００３１】
卵を少なくとも４時間室温で維持した後、円板の回りの大きな領域を切断し、ガラススライドに配する。円板の下の血管密度指数（血管数として表される）を測定する（Harris-Hooker等, 1983. J. Cell Physiol. 114, 302-310）。簡単に述べると、膜を１０％緩衝ホルマリンに固定し、切り取り、ガラススライド上に平坦にして載せる。血管密度を、円板があったスポットをグリッドで覆うことによって決定する。グリッドは対象領域を覆う３つの同心円（１ｍｍ離間）を含む。円に交差する血管をカウントする。この方法により、最近形成された小さい微小血管を考慮に入れながら、微小血管の形成を客観的に評価することが可能になる。円板打ち込みまでの全体のニワトリ胎仔の生存は９０％を越える。コントロール円板には化合物を含む円板と同じ容量のＤＭＳＯが含められる。
【００３２】
３．Ｋｕｚはインビトロでの血管構造の形成を促進する。
Kureishi Y等 Nat Med 2000 Sep;6(9):1004-10に記載されたようにして、ＨＵＶＥＣによる血管様構造の形成が、基底膜マトリックス調製物である成長因子を低減したマトリゲル（Becton Dickinson, Bedford, MA）で評価される。２ウェルチャンバーのスライドをＥＢＭ中４−５ｘ１０４細胞／ウェルで被覆プレートに蒔き、３７℃で６０分間、インキュベートする。培地に薬剤（ヒトＫｕｚのメタロプロテアーゼドメイン、Ｋｕｚインヒビター、Ｋｕｚ抗体、ＶＥＧＦ等々）を補填し、３７℃で８−１２時間、インキュベートする。管形成画像を倒立位相差顕微鏡（Nikon Diaphot）を使用して観察する。像をビデオグラフィックシステム（ＤＥＩ-７５０ＣＥデジタルアウトプットカメラ, Optronics, Goleta, CA）にとる。管形成の度合いを、国立保健研究所（ＮＩＨ）イメージプログラムを使用して各ウェルからランダムな視野で管の長さを測定することにより定量する。ＶＥＧＦ同様、Ｋｕｚ処置は毛細血管様管の形成を促進し、それはＫｕｚインヒビター及び抗体によって阻害される。
【００３３】
４．Ｋｕｚは正常コレステロール動物の血管形成：肢血管再生を促進する。
ここでは、我々は、虚血性組織の生理的血管再生をＫｕｚが促進しＫｕｚインヒビターが低減することができることを示す。Kureishi Y等 Nat Med 2000 Sep;6(9):1004-10のものを適応させたプロトコールにおいて、正常コレステロールのウサギからその大腿動脈とその主な枝を一方向から切除し、後肢血流に顕著な減少を生じさせる（Pu等 J. Surg. Res. 54,575-583, 1993）。最初は、我々は虚血性後肢の内皮細胞へのアデノウイルス媒介遺伝子導入を使用して、Ｋｕｚがこのモデルで血管再生を促進することを初めて証明する。Ｂ-ガラクトシダーゼ（Ｂｇａｌ）を発現するアデノウイルスコンストラクトをこれらの肢に注入すると、導入遺伝子の発現が血管内皮に限定されることが明らかになった。このモデルにおけるアデノ-Ｋｕｚコンストラクトの注入は側副血管形成を亢進し、腓腹血圧比の増加によって示されるように組織血流を改善する。これに対して、アデノ-Ｂｇａｌの注入は未処置の虚血性後肢（コントロール）又は生理食塩水を注入した血管に対して、血管形成又は組織血流を促進しなかった。
【００３４】
肢血管再生に対するＫｕｚ及びＫｕｚインヒビターの効果を試験するために、Ｋｕｚとインヒビターの投薬を、大腿動脈切除後に毎日（例えば腹腔内注射により０．１ｍｇ／ｋｇＩＣ-３）行う。Ｋｕｚ処置を受ける動物は、大腿動脈切除後４０日で未処置のコントロール群よりも、より検出可能な、特徴的な螺旋状の形態を持つ側副血管を示す。これに対して、Ｋｕｚインヒビター処置を受けた動物は、大腿動脈切除後４０日で未処置のコントロール群ほど、検出しにくい特徴的な螺旋状の形態を持つ側副血管を示す。
【００３５】
同様に、Ｋｕｚ処置された動物の肢は虚血性肢の収縮期圧の正常な肢のものに対する比によって決まる減少した血行力学的欠陥を示す。Ｋｕｚの投与はまた虚血性肢において毛細血管形成を促進する（Ｋｕｚ＞２５０毛細血管／ｍｍ２；コントロール＜１７０毛細血管／ｍｍ２内転筋；Ｐ＜０．０１）。比較のために、幾らかの動物は虚血性肢の大腿中へＶＥＧＦをコードするアデノウイルス（アデノ-ＶＥＧＦ）の筋肉内注射を受ける。Ｋｕｚ同様、ＶＥＧＦでの処置は側副血管及び毛細血管の形成を亢進し腓腹血圧を増加させた。Ｋｕｚインヒビターの同時投与はこれらの効果を逆にすることが示されている。
【００３６】
方法：３．０−３．５ｋｇの体重で正常な食餌が与えられた雄のニュージーランドホワイトラビットを用いて、血管成長のＫｕｚ及びＫｕｚインヒビター媒介調節の効果を調べる。注入モデルに対しては、左大腿動脈と主要な側枝をその基点から伏在及び膝窩動脈への二股分岐部の２ｃｍ以内のところまで切除する。１０日後に、術後の回復を可能にするために、末梢の大腿動脈を再暴露し、大腿静脈を一時的にクランプした後、５０ｍｌの生理食塩水、Ａｄ-Ｂｇａｌの３．５ｘ１０１０ウイルス粒子を有する生理食塩水、又はＡｄ-Ｋｕｚ（ヒトＫｕｚのメタロプロテアーゼドメインを発現）の３．５ｘ１０１０ウイルス粒子を有する生理食塩水を末梢の大腿動脈に注入し、１５分インキュベートする。クランプの除去後、末梢の大腿動脈を連結する。Ａｄ-Ｂｇａｌを注入した２匹の動物を、手術の３日後に殺し、腓腹筋中でのＢ-ガラクトシダーゼの発現を判定する。残りの動物（ｎ＝６）について大腿動脈切除後３１日目に肢血管再生を分析する。Ａｄ-ＶＥＧＦの筋肉内注射又はＫｕｚインヒビターの腹腔内注射には、左大腿動脈と側枝をその基部から二股分岐が生じる遠くの点まで完全に切除する。１０日後に、術後の回復を可能にするために、２．５ｍｌの生理食塩水中全体で３．５ｘ１０１０のＡｄ-ＶＥＧＦのウイルス粒子を、内転筋（２部位）、内側大（２部位）及び半膜性（１部位）筋（注射部位当たり５００ｕｌ）に３から５ｍｍの深さで２７ゲージ針によって注射する。あるいは、インヒビター（ＩＣ-３、０．１ｍｇ／ｋｇ／日）又は生理食塩水を手術の後の日から犠牲にする１日前まで腹腔内投与（１ｍｌ）する。これらの群（ｎ＝６）の動物について手術から４０日後に肢血管再生を分析する。如何なる処置計画の場合にも、死亡、浮腫又は血管腫の形成を含む如何なる有害事象もなかった。腓腹血圧をドップラー流量計（モデル１０５９, Parks Medical Electronics, Aloha, OR）によって両方の肢について測定する。腓腹血圧は右腓腹収縮期圧に対する左腓腹の比として定義される。側副動脈は内腸骨血管造影によって評価される。３-Ｆ注入カテーテル（Tracker-18, Target Therapeutic, San Jose, CA）を総頚動脈内に導入し、蛍光透視鏡の下で０．０１４インチのワイヤーを使用して虚血性肢の内腸骨動脈まで進める。ノニオン性の対照培地（Isovue-３７０, Squibb Diagnostics, New Brunswick, NJ）を１ｍｌ／秒の速度で注入し、虚血性肢の連続的画像を１フィルム／秒の速度で１０秒間記録する。側副血管の定量血管造影分析は、４コマ血管造影図上に配した５ｍｍ離れて列に配置された２．５ｍｍ直径の円からなるグリッドオーバーレイを用いて結果を知らない研究者によって実施される。血管造影スコアは、可視できる動脈が交差する円の数を内側大腿における円の全数によって割ったものとして算定される。毛細血管密度は安楽死の時点で虚血性肢の内転筋から取り出された切片について光学顕微鏡を用いて結果を知らない研究者によって評価される。筋肉試料はＯＣＴ化合物（Miles, Elkhart, IN）に包埋され、液体窒素でスナップ凍結される。横断した形で配向した筋繊維を持つ凍結された切片（５ｕｍ厚）を、インドキシル-テトラゾリウムを使用してアルカリホスファターゼに対して染色した後、０．５％エオシンで対比染色する���毛細血管密度は１０のランダムに選択された視野から平均された毛細血管／ｍｍ２として算定される。
【００３７】
５．Ｋｕｚはニワトリ絨毛尿膜アッセイにおいて血管形成を促進する。
Bellahcene A等 Circ Res 2000 Apr 28;86(8):885-91のものを適応させたプロトコールで、受精したローマン選択白色レグホーン卵を加湿インキュベータにて３７℃でインキュベートする。発生の３日目に、矩形の開口を卵殻に開けた。８日目に、３．５ｍｍの内径（高さ５００ｍｍ、重さ７ｍｇ）の２つのシラスティックリングを、ニワトリ胎仔絨毛尿膜（ＣＡＭ）表面に配する。Ｋｕｚ（ヒト、メタロプロテアーゼドメイン、１５ｍＭ）を滅菌ＰＢＳに溶解し５ｍｌの一定分量でリング内に適用する。ビヒクル単独（ＰＢＳ）及び血管形成の刺激剤である塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、０．５ｍＭ）をそれぞれ負のコントロール及び正のコントロールとして使用する。他の実験では、抗ａｖｂ３抗体ＬＭ６０９（１５ｍｇ）をリングに加えてＫｕｚの存在下での血管発生に対するその効果を評価する。ＣＡＭを１０日目まで毎日調べ、ライカＤＭＬＭ顕微鏡（Van Hopplynus, Brussels, Belgium）でin ovoで写真にとった。各条件に対して最少８個の卵を処置し、実験を少なくとも２回行った。血管指数を、記載されたようにして（Barnhill等 J Invest Dermatol. 1983;81:485-488）リングを横断する全ての識別可能な血管をカウントすることにより決定し、コントロールＰＢＳリングと比較した場合の異なった実験条件での血管数の相対的増加として表す。我々の結果は、Ｋｕｚがニワトリ絨毛尿膜アッセイで進行中の血管形成を刺激することを証明する。Ｋｕｚの血管形成活性はＫｕｚインヒビター、ドミナントネガティブ型変異体及びＫｕｚ特異的抗体によって阻害された。