(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンα蛋白質をコードする遺伝子、インターフェロンγ蛋白質をコードする遺伝子またはIRF-2 蛋白質をコードする遺伝子を有効成分とする、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（HM1.24抗原）の白血病またはリンパ腫からなる造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項２】
前記遺伝子がベクターに組み込まれた遺伝子である請求項１に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項３】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項１又は２に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項４】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞性非ホジキンリンパ腫である請求項１又は３に記載の発現増強剤または発現誘導剤。
【請求項５】
有効成分として、（１）インターフェロンα蛋白質をコードする遺伝子、インターフェロンγ蛋白質をコードする遺伝子またはIRF-2 蛋白質をコードする遺伝子、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、を含んでなる白血病またはリンパ腫からなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項６】
インターフェロンα蛋白質をコードする遺伝子、インターフェロンγ蛋白質をコードする遺伝子またはIRF-2 蛋白質をコードする遺伝子と併用することを特徴とし、有効成分として配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでなる白血病またはリンパ腫からなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項７】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体と併用することを特徴とし、有効成分として、インターフェロンα蛋白質をコードする遺伝子、インターフェロンγ蛋白質をコードする遺伝子またはIRF-2 蛋白質をコードする遺伝子を含む白血病またはリンパ腫からなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項８】
前記白血病が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病である請求項７に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項９】
前記リンパ腫がホジキン病、Ｔ細胞系非ホジキンリンパ腫またはＢ細胞系ホジキンリンパ腫である請求項７に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項５から７のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１１】
前記細胞傷害活性がADCC活性である請求項10に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５から11のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体またはヒト抗体である請求項10に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体が寄託番号FERM BP-5233であるハイブリドーマによって産生される抗HM1.24抗体である請求項12に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【請求項１５】
前記キメラ抗体またはヒト型化抗体が、寄託番号FERM BP-5233であるハイブリドーマによって産生される抗HM1.24抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である請求項13に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄腫におけるHM1.24抗原の発現増強剤としてのインターフェロンα及びインターフェロンγ並びに IRF-2蛋白質の使用に関する。
また、本発明は、リンパ球系腫瘍におけるHM1.24抗原の発現増強剤としてのインターフェロンαおよびインターフェロンγ並びにIRF-2 蛋白質の使用に関する。さらに、本発明は、抗HM1.24抗体とインターフェロンαまたはインターフェロンγとを用いて白血病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常ヒト末梢血中に存在する白血球（leukocyte）には、顆粒球（granulocyte）、単球（monocyte）およびリンパ球（lymphocyte）があり、顆粒球はさらに細胞質内の特殊顆粒の染色性によって、好中球（neutrophil）、好酸球（eosinophil）、好塩基球（basophil）に分けられる。これらの血球の産生は、共通の未分化な造血幹細胞から骨髄球系幹細胞およびリンパ球系幹細胞が分化し、さらにこれらの幹細胞から最終的に各系統の白血球が分化する。これら造血幹細胞を含めた血球系細胞は造血器細胞ともよばれている。造血器細胞の腫瘍（造血器腫瘍）には白血病、リンパ腫、骨髄腫等がある。
【０００３】
白血病は造血器細胞が腫瘍化した疾患であり、骨髄が白血病細胞により占拠され、正常造血機能が抑制されるために、正常血液細胞の産生が低下し、貧血、白血球減少症と血小板減少症が現れる。また、白血病細胞の発生源から骨髄性白血病（myelocytic leukemia ）とリンパ球性白血病（lymphocytic leukemia）に二大別され、さらにそれぞれ急性と慢性に分けられる。尚、亜型として、骨髄系とリンパ球系の二系統の細胞形質を有する系統混合白血病（mixed lineage leukemia）も知られている。
【０００４】
腫瘍化は造血幹細胞レベルでおこり、分化、成熟のある一定の段階で分化が停止し、それより上流の細胞のみで腫瘍を構成している場合と、生体の調節能を逸脱し自律性増殖を示すものの、分化・成熟能を保持している場合がある。前者には急性白血病（acute leukemia）が、後者には慢性白血病（chronic leukemia）や骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome）が含まれる。急性白血病は、増殖細胞の帰属から、急性骨髄性白血病（acute myelocytic leukemia；AML）、急性単球性白血病（acute monocytic leukemia；AMoL）、急性赤白血病（acute erythroleukemia)、巨核芽球性白血病（megakaryoblastic leukemia）、急性リンパ性白血病（acute lymphocyteic leukemia；ALL）、に大別される。
【０００５】
また、亜型として急性前骨髄性白血病（acute promyelocytic leukemia；APL）が知られている。尚、急性白血病と骨髄異形成症候群は、FAB分類（French-American-British classification)により分類することができる。FAB分類では、急性リンパ性白血病はL1、L2、L3に分類され、例えば、パーキットリンパ腫はL3に分類される。また、急性骨髄性白血病は、M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7に分類され、例えば、赤白血病はM6に、巨核芽球性白血病はM7に分類される。これらの分類方法、検査方法は周知であり、多くの成書に記載されている（例えば、新臨床内科学、高久史麿、尾形悦郎、医学書院、1999）。
【０００６】
慢性白血病も増殖細胞も帰属から、慢性骨髄性白血病（chronic myelocytic leukemia；CML）と慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia；CLL）に分類される。また、慢性骨髄性白血病の亜型として、慢性骨髄単球性白血病（chronic myelomonocytic leukemia）が知られ、慢性リンパ性白血病の亜型として前リンパ球性白血病（prolymphocytic leukemia）が知られている。
【０００７】
リンパ腫は、リンパ節などのリンパ組織を構成する細胞に由来する腫瘍の総称であり、主にリンパ球の腫瘍化によって引き起こされる造血器細胞腫瘍である。悪性リンパ腫（Malignant lymphoma）は、ホジキン病（Hodgkin's disease）と非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma；NHL）に分けることができるが、いずれもリンパ球系細胞が腫瘍化したもので、Ｔ細胞系またはＢ細胞系に分けることができる。
【０００８】
非ホジキンリンパ腫には、Ｂ細胞系腫瘍である濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、Burkitt リンパ腫、pre-Ｂリンパ腫等がある。また、Ｔ細胞系腫瘍では、成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；ATL）や非ATL 末梢性Ｔリンパ腫(PNTL）が知られている。また、Ｔ細胞とＢ細胞の２型のあるびまん性リンパ腫も非ホジキンリンパ腫に含まれる。さらに、亜型として、Ｂ細胞系腫瘍であるヘイリー細胞（有毛細胞）白血病（hairy cell leukemia)が知られている。
【０００９】
リンパ球性白血病やリンパ腫は、リンパ球の主要構成細胞が腫瘍化したものであり、リンパ球系腫瘍とも呼ばれ、Ｂ細胞腫瘍とＴ細胞腫瘍に大別される。例えば、Ｂ細胞腫瘍には急性Ｂリンパ性白血病（B-ALL）、慢性Ｂリンパ性白血病（B-CLL）、pre-Bリンパ腫、Burkittリンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞外套リンパ腫、びまん性リンパ腫等が含まれる。Ｔ細胞腫瘍には、急性Ｔリンパ性白血病（T-ALL）、慢性Ｔリンパ性白血病（T-CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、非ATL末梢性Ｔリンパ腫（PNTL）等が含まれる（図解臨床癌シリーズ、NO.17   白血病・リンパ腫、杉村隆ら、MEDICAL VIEW社、1987；Ｂ細胞腫瘍、高月清、西村書店  1991；新臨床内科学、高久史麿、尾形悦郎、医学書院、1999）。尚、骨髄腫もリンパ系腫瘍のひとつであるが、特徴的な臨床所見を呈する。
【００１０】
骨髄腫（myeloma）は、形質細胞種（plasmacytoma）、多発性骨髄腫（multiple myeloma）とも呼ばれ、モノクローナルな形質細胞の骨髄内集積を特徴とする腫瘍性疾患である。骨髄腫は、免疫グロブリンを産生し分泌する終末分化Ｂ細胞、すなわち形質細胞がモノクローナルに主として骨髄において増加する疾患で、この疾患の患者の血清中にはモノクローナルな免疫グロブリンもしくはその構成成分であるＬ鎖、Ｈ鎖などが検出される。
【００１１】
骨髄腫の治療としては、これまで化学療法剤等が使用されているが、完全寛解に導き、患者の生存期間を延長するような有効な治療剤は見いだされておらず、新たな作用メカニズムによる治療効果を有する薬剤の登場が待たれていた。また、リンパ腫や白血病では、ある程度有効な化学療法が開発されているが、副作用の点から新たな薬剤が望まれていた。
【００１２】
一方、Goto, T.らは、ヒト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（マウス抗HM1.24抗体）を報告している（Blood (1994) 84, 1922-1930）。ヒト骨髄腫細胞を移植したマウスに抗HM1.24抗体を投与すると、この抗体が腫瘍組織に特異的に集積したこと（小阪昌明ら、日本臨床（1995) 53, 627-635 ）から、抗HM1.24抗体はラジオアイソトープ標識による腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能であることが示唆されている。
【００１３】
また、上記Blood (1994) 84, 1922-1930には、抗HM1.24抗体が、in vitroにおいて、ヒト骨髄腫細胞株RPMI8226に対して細胞傷害活性を有することが述べられている。また、マウス抗HM1.24抗体をキメラ化したキメラ抗HM1.24抗体、およびヒト型化した再構成抗HM1.24抗体が、骨髄腫細胞に特異的に結合すること、さらには細胞傷害活性を有することが示されている（Blood (1999) 93, 3922-3930）。
【００１４】
一方、リンパ球系腫瘍に関しても、抗HM1.24抗体が認識する抗原タンパク質がリンパ球系腫瘍に発現していること、および抗HM1.24抗体がリンパ球系腫瘍に対し、CDC 活性やADCC活性による細胞傷害活性を有し、抗腫瘍効果を発現することが示されている（WO98/35698）。このように、HM1.24抗原は、終末分化Ｂ細胞である骨髄腫細胞のみならず、リンパ球系腫瘍においても高発現しており、HM1.24抗原を認識する抗HM1.24抗体は、リンパ球系腫瘍の治療剤として有用であることが示されている。
【００１５】
このように、HM1.24抗原は、終末分化Ｂ細胞である骨髄腫細胞やリンパ球系腫瘍細胞に特異的に高発現しており、この抗原を認識する抗HM1.24抗体は、細胞表面のHM1.24抗原分子数に比例して殺細胞活性を発揮することから、抗HM1.24抗体を用いた免疫療法は多発性骨髄腫やリンパ球系腫瘍に有効な治療法と考えられる。従って、抗HM1.24抗体の抗原であるHM1.24抗原の細胞表面上の発現量を増強することができれば、より少量の抗体投与により同等の細胞傷害活性が期待でき、副作用をより低下させることが可能となる。
【００１６】
さらに、HM1.24抗原を発現していない造血器腫瘍細胞に対して、細胞表面上のHM1.24抗原の発現量を増強することができれば、通常は抗HM1.24抗体単独では効果を示さない造血器腫瘍細胞に対しても、抗HM1.24抗体によるADCC活性やCDC 活性を介した細胞傷害活性、殺細胞活性を期待することができる。
【００１７】
一方、ウイルス増殖抑制活性を示す物質として発見されたインターフェロンは、現在、ほ乳類においては、α，β，γ及びωの４種類に分類され、多彩な生理活性を有することが知られている（Pestka, S., et.al., Ann.Rev.Biochem. (1987) 56, 727-777; Langer, J.A., et.al., Immunology Today (1988) 9, 393-400 ）。しかしながら、インターフェロンαおよびインターフェロンγが、骨髄腫細胞やリンパ球系腫瘍等の造血器腫瘍細胞において、HM1.24抗原の発現量を増加させる作用を有することについては報告がなかった。
【００１８】
他方、インターフェロン調節因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1 および２は、IFN-β遺伝子の転写調節因子として同定された。IRF-1 および２は一般に同じ遺伝子制御配列に結合し、IRF-1 は転写活性化因子、IRF-2 は転写抑制因子として拮抗的に作用することが知られている。IRF-2 を高発現させたNIH3T3細胞は細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲルでのコロニー形成、ヌードマウスでの造腫瘍性が認められ、IRF-2 は癌遺伝子として機能することが明らかになっている。
【００１９】
一方、最近の研究の進展により、IRF-2 が細胞周期の調節に働くヒストンＨ４の発現に必要であることが示されている。また、IRF-2 は筋肉細胞においてvascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)の発現を上昇させることが示され、VCAM-1の活性化にはIRF-2 の酸性領域（182 から218 ）が作用していることも明らかになっている。このことからIRF-2 は転写抑制因子として働くばかりでなく、転写活性化因子として作用を示す場合も知られている。
しかしながら、 IRF-2蛋白質がHM1.24抗原遺伝子のプロモーター（HM1.24プロモーター）に結合し、該プロモーターを活性化することは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
現在行われている骨髄腫の治療は、上記のごとく、未だ完全ではなく、骨髄腫を完全寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。抗HM1.24抗体による骨髄腫の治療は、特異性及び有効性の点で画期的な治療剤となる可能性があり、抗HM1.24抗体の作用をより効果的に発揮させる方法が望まれている。
【００２１】
また、現在行われているリンパ球系腫瘍の治療には、種々の化学療法、Ｘ線療法、骨髄移植等が挙げられるが、いずれの治療方法も未だ完全ではなく、リンパ球系腫瘍を寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。さらには、リンパ性白血病以外の白血病、すなわち、急性骨髄性白血病や慢性骨髄性白血病等の骨髄性白血病に効果のある治療法が待たれている。これら骨髄腫、リンパ球系腫瘍、骨髄性白血病を、寛解に導き、患者の生存期間を延長させることができる薬剤や治療方法は、造血器腫瘍全般の治療薬、治療方法となりうる。
【００２２】
従って、本発明の目的のひとつは、骨髄腫細胞において、HM1.24抗原の発現量を増加させることで、抗HM1.24抗体の骨髄腫抑制作用を増強させる手段を提供することである。
また、本発明のもうひとつの目的は、リンパ球系腫瘍において、HM1.24抗原の発現量を増加させることで、抗HM1.24抗体のリンパ球系腫瘍抑制作用を増強させる手段を提供することである。
【００２３】
さらに、本発明のさらなる目的は、骨髄性白血病において、HM1.24抗原の発現を新たに誘導する手段を提供し、抗HM1.24抗体による骨髄性白血病抑制作用を誘導する手段を提供することである。
これらは、HM1.24抗原の発現量を増強するか、もしくは、新たにHM1.24抗原を誘導する手段を用いて、抗HM1.24抗体により造血器腫瘍を治療する手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、かかる方法を提供すべく、HM1.24抗原の発現量を増加させるまたは新たにHM1.24抗原を細胞表面上に発現させる薬剤を探索した結果、インターフェロンα、インターフェロンγおよびIRF-2蛋白質が所望の活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、インターフェロンα、インターフェロンγ、またはIRF-2蛋白質を有効成分とする、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（HM1.24抗原）の造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤を提供する。
【００２５】
前記造血器腫瘍は、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫などであり、この白血病としては急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられ、前記リンパ腫としては、ホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫などが挙げられ、前記骨髄腫としては多発性骨髄腫が挙げられる。
本発明者はまた、上記のHM1.24抗原発現増強剤または発現誘導剤によりHM1.24抗原が発現した造血器腫瘍細胞に、該HM1.24抗原に特異的に結合する抗原を結合させることにより、該造血器腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を増強することができることを見出した。
【００２６】
従って本発明はまた、インターフェロンα、インターフェロンγまたはIRF-2蛋白質と併用することを特徴とし、有効成分として配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
本発明はまた、有効成分として（１）インターフェロンα、インターフェロンγまたはIRF-2蛋白質、および（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体と併用することを特徴とし、有効成分として、インターフェロンα、インターフェロンγ、またはIRF-2蛋白質を含む造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。
前記の造血器腫瘍は、例えば、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。上記白血病としては急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられ、上記リンパ腫としてはホジキン病、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫などが挙げられ、そして上記骨髄腫としては多発性骨髄腫等が挙げられる。
【００２８】
前記抗体は、好ましくは細胞傷害活性を有する抗体であり、この細胞傷害活性は例えばADCC活性である。抗体は好ましくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、またはヒト抗体である。モノクローナル抗体は、好ましくは寄託番号FERM BP-5233であるハイブリドーマによって産生される抗HM1.24抗体であり、前記キメラ抗体またはヒト型化抗体は、好ましくは寄託番号FERM BP-5233であるハイブリドーマによって産生される抗HM1.24抗体のキメラ抗体またはヒト型化抗体である。
【００２９】
本発明はさらに、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（２）上記抗体を、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
【００３０】
本発明はまた、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；および
（２）上記薬剤を、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
【００３１】
本発明はまた、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を増強する薬剤；
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体；および
（３）上記薬剤および抗体を組み合わせて患者に投与することを指示する指示書；
を含むキットを提供する。
【００３２】
本発明はまた、HM1.24抗原の発現増強剤をスクリーニングする方法であって、
（１）HM1.24遺伝子プロモーター領域を有するレポーター遺伝子を有する細胞を調製する工程；
（２）前記細胞に被験物質を接触させる工程；
（３）レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、上記の方法によって選択されるHM1.24抗原の発現増強剤を提供する。
本発明はまた、上記の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明はまた、発現を増強する薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）細胞と被験物質を接触させる工程；
（２）前記細胞のIRF-2蛋白の発現量を測定する工程、
を含む方法を提供する。
本発明はまた、上記の方法によって選択されるIRF-2タンパク質の発現増強剤を提供する。
本発明はまた、上記の発現増強剤を含み、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
インターフェロンα及びインターフェロンγ
インターフェロンは、ウイルス増殖抑制活性を示す物質として発見されたものであり、現在、哺乳類においてはα、β、γ、ωの４種類が知られている。これらは、ウイルス増殖抑制活性に加え、細胞増殖抑制活性や多彩な免疫調節作用を示すことが知られ、既に医薬品として使用されている（インターフェロン“サイトカイン”、大沢利昭編、（1990）115〜133、東京化学同人； Pestka, S. et al., Ann.Rev.Biochem. (1987) 56, 727〜777； Langer J.A. et al., Immunology Today (1988) 9, 393〜400）。
【００３６】
本発明で使用されるインターフェロンα及びインターフェロンγは、HM1.24抗原の発現量を増加させる活性を有する限り変異体を用いることも可能である。HM1.24抗原の発現量を測定するには、実施例に記載されたように、骨髄腫細胞株あるいは骨髄腫患者から採取した骨髄腫細胞を用いて、フローサイトメトリーにより検出することができる。変異体としては、例えば、１もしくは数個、あるいは複数個のアミノ酸残基が、欠失または置換または挿入または付加等により変異されたインターフェロンα及びインターフェロンγであってもよい。
【００３７】
欠失または置換または挿入を蛋白に導入する方法としては、対応する遺伝子を改変する部位特異的変異誘発法を用いることができる（Hashimoto-Gotoh, Gene (1995) 152, 271-275, Zoller, Methods Enzymol. (1983) 100, 468-500, Kramer, Nucleic Acids Res. (1984) 12, 9441-8456, Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1985) 82, 488-492、「新細胞工学実験プロトコール  東京大学医科学研究所  制癌研究部編 (1993) p241-248」）。
【００３８】
また、市販のPCRを利用した「部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL ）や「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 」（ストラタジーン社製）を利用することも可能である。また、蛋白質中のアミノ酸の変異は自然界においても生じることもある。また、この様に変異を導入された蛋白がもとの蛋白と同様の活性を有することは、Mark, Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1984) 81, 5662-5666に示されている。
【００３９】
アミノ酸残基の置換においては、性質の保存されたアミノ酸どうしで置換することが好ましい。例えば、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）どうしの置換が好ましい。
【００４０】
さらに、変異体としては、インターフェロンα又はインターフェロンγのペプチド断片を用いることも可能である。特に、インターフェロンα又はインターフェロンγ受容体との結合部位を有するペプチド断片が好ましい。好ましくは100個以上、さらに好ましくは130個以上、さらに好ましくは150個、最も好ましくは160個以上の連続するアミノ酸残基から構成されるペプチド断片である。
【００４１】
IRF-2 蛋白質
インターフェロン調節因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1 および２はIFN-β遺伝子の転写調節因子として同定された（Taniguchi, T. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 8372 Taniguchi, T. et al., Cell (1989) 58, 729）。IRF-1 および２は一般に同じ遺伝子制御配列に結合し、IRF-1 は転写活性化因子、IRF-2 は転写抑制因子として拮抗的に作用することが知られている。IRF-2 を高発現させたNIH3T3細胞は細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲルでのコロニー形成、ヌードマウスでの造腫瘍性が認められ、IRF-2 は癌遺伝子として機能することが明らかになっている。
【００４２】
一方、最近の研究の進展により、IRF-2 が細胞周期の調節に働くヒストンＨ４の発現に必要であることが示されている。また、IRF-2 は筋肉細胞においてvascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)の発現を上昇させることが示され、VCAM-1の活性化にはIRF-2 の酸性領域 (182 から218 ）が作用していることも明らかになっている。このことからIRF-2 は転写抑制因子として働くばかりでなく、転写活性化因子として作用を示す場合も知られている。
【００４３】
ハイブリドーマ
本発明で使用される抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、HM1.24抗原蛋白質やHM1.24抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００４４】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原であるHM1.24抗原発現細胞としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるKPMM2 （特開平7-236475）やKPC-32（Goto, T. et al., Jpn.J.Clin.Hematol. (1991) 32, 1400）を用いることができる。また、感作抗原として配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗HM1.24抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。
【００４５】
なお、感作抗原として使用される、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のcDNAはpUC19 ベクターのXbaI切断部位の間に挿入されて、プラスミドpRS38-pUC19 として調製されている。このプラスミドpRS38-pUC19 を含む大腸菌(E. coli）は、平成５年（1993年）10月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19）として、受託番号FERM BP-4434としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特開平7-196694参照）。このプラスミドpRS38-pUC19 に含まれるcDNA断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗HM1.24抗体が認識するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを作製することができる。
【００４６】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。
【００４７】
具体的には、感作抗原をPBS (Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００４８】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（J.Immnol. (1979) 123: 1548-1550 ），P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7），NS-1（Kohler.G. and Milstein, C.Eur.J.Immunol. (1976) 6: 511-519），MPC-11（Margulies.D.H.et al., Cell (1976) 8: 405-415），SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270），FO（de St.Groth, S.F. et al., J.Immunol.Methods (1980) 35: 1-21 ），S194（Trowbridge, I.S.J.Exp.Med. (1978) 148: 313-323），R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133 ）等が適宜使用される。
【００４９】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler.G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG)、センダイウィルス(HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００５０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM 培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清(FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【００５１】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG 溶液、例えば、平均分子量1000−6000程度のPEG 溶液を通常、30〜60％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００５２】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT 培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT 培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。
【００５３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでHM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、HM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるHM1.24抗原またはHM1.24抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735参照）。
【００５４】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにより所望のヒト抗体を単離することもできる。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体として（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、HM1.24抗原を固定化したプレートを用いて、HM1.24抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、HM1.24抗原に結合する抗体の可変領域をコードする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、抗HM1.24ヒト抗体を作製することができる。これらの方法は既に周知の方法であり、WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388を参考にすることができる。
【００５５】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００５６】
モノクローナル抗体
具体的には、抗HM1.24抗体産生ハイブリドーマの作製は、Goto, T.らの方法（Blood (1994) 84. 1922-1930）により行うことができる。独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成７年４月27日にFERM BP-5233としてブダペスト条約に基づき国際寄託された抗HM1.24抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗HM1.24抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、５％ BM-CondimedH1（Boehringer Mannheim 製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM 培地（GIBCO-BRL 製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清から抗HM1.24抗体を精製する方法で行うことができる。
【００５７】
組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A.K.Borrebaeck, James, W.Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
【００５８】
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J.M.ら、Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chmczynski, P.ら、 (1987) 162, 156-159）等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
【００５９】
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには５′-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCR を用いた5 ′-RACE 法（Frohman, M.A. ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. ら、Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ）を使用することができる。得られたPCR 産物から目的とするDNA 断片を精製し、ベクターDNA と連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNA の塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシ法により確認する。
【００６０】
目的とする抗体のＶ領域をコードするDNA が得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするDNA を、抗体Ｃ領域のDNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００６１】
改変抗体
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanized ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００６２】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするDNA をヒト抗体Ｃ領域をコードするDNA と連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023 、国際特許出願公開番号WO96/02576参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００６３】
例えば、キメラ抗HM1.24抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ）およびEscherichia coliDH5α(pUC19-1.24H-gγ1)として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成８年８月２９日に、各々FERM BP-5646およびFERM BP-5644としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平8-264756参照）。
【００６４】
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR；complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023 、国際特許出願公開番号WO96/02576参照）。
【００６５】
具体的には、マウス抗体のCDR とヒト抗体のフレームワーク領域（framework-region；FR）を連結するように設計したDNA 配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR 法により合成する。得られたDNA をヒト抗体Ｃ領域をコードするDNA と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO96/02576参照）。
【００６６】
CDR を介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856 ）。
【００６７】
例えば、ヒト型化抗HM1.24抗体のＬ鎖およびＨ鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia coli DH5α（pUC19-RVLa-AHM-gk)およびEscherichia coli DH5α（pUC19-RVHr-AHM-gγ1)として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成８年８月29日に、各々FERM BP-5645およびFERM BP-5643としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（特願平8-264756参照）。
【００６８】
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用され、細胞傷害活性を呈するヒト抗体Ｃ領域として、ヒト Cγ例えば、 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4 を使用することができる。これらのうち、特に Cγ1, Cγ3 を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、ADCC活性、CDC 活性を有し、本発明に好適に使用される。
【００６９】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（framework region；FR）およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例としては、ヒト型化抗HM1.24抗体が挙げられる（WO98/14580 参照）。
【００７０】
発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたDNA あるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter／enhancer）を挙げることができる。
【００７１】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Nature (1979) 277, 108）、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushima らの方法（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば容易に実施することができる。
【００７２】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Nature (1098) 341,544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
【００７３】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S.P. et al J.Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００７４】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００７５】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、CHO, COS、ミエローマ、ＢＨＫ（baby hamster kidney ）、HeLa, Vero、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）などが知られている。
【００７６】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM を使用することができ、牛胎児血清(FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivo にて抗体を産生してもよい。
【００７７】
一方、in vivo の産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993）。また、昆虫としては、カイコなどを用いることができる。
【００７８】
植物を使用する場合、タバコなどを用いることができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA 断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。
【００７９】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594 ）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530 に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチニア・タバカム（Nicotiana tabacum ）に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C.Ma et al., Eur.J.Immunol. (1994) 24, 131-138 ）。
【００８０】
上述のようにin vitroまたはin vivo の産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするDNA を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするDNA を単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO94-11523参照）。
【００８１】
上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール(PEG）等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００８２】
抗体の分離、精製
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Hyper D, POROS, Sepharose F.F.等が挙げられる。
【００８３】
その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。
【００８４】
抗体の濃度測定
上記方法で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルをPBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、１mg／mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1Ｍ重炭酸緩衝液（pH9.6）で１μｇ／mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG (BIO SOURCE 製）100μｌを96穴プレート（Nunc製) に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固層化する。
【００８５】
ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG (CAPPEL 製）100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG (BIO SOURCE 製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
【００８６】
ＦＣＭ解析
骨髄腫細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、FCM(フローサイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。樹立細胞株としては、骨髄腫由来RPMI8226 (ATCC CCL 155) 、同U266(ATCC TIB 196)、同KPMM2 、同KPC-32、形質細胞腫由来ARH-77 (ATCC CRL 1621)などを用いることができる。
【００８７】
上記細胞をPBS(-)で洗浄した後、FACS緩衝液（２％ウシ胎児血清、0.05％アジ化ナトリウム含有PBS(-)）で25μｇ／mlに希釈した抗体あるいはコントロール抗体100μｌを加え、氷温化30分インキュベートする。FACS緩衝液で洗浄した後、25μｇ／mlのFITC標識ヤギ抗マウス抗体（GAM, Becton Dickinson 製）100μｌを加え、氷温化30分間インキュベートする。FACS緩衝液で洗浄した後、600μｌあるいは１mlのFACS緩衝液に懸濁し、FACScan (Becton Dickinson 製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。
【００８８】
スクリーニング方法
HM1.24抗原の発現増強剤をスクリーニングするには、例えば、無刺激の状態でHM1.24抗原を発現していないか、あるいは少なく発現している細胞を用いてFCM 解析にて測定することができる。例えば、実施例に記載の細胞を被検物質と１〜２日インキュベートし、ついで一次抗体としてマウス抗ヒトHM1.24抗体にて染色する。細胞を洗浄し、さらに二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG 抗体により染色する。最後に、細胞を洗浄したのち、フローサイトメータにより細胞のFITC蛍光強度を測定すればよい。
【００８９】
また、前記の間接法による染色ではなく、細胞を高濃度の免疫グロブリンで処理し、Fcレセプターをブロックした後にFITC標識した抗ヒトHM1.24抗体を用いた直接法による染色によりFCM 分析することもできる。
また、HM1.24プロモーター配列を用いたレポーター遺伝子アッセイによりHM1.24抗原の発現増強剤をスクリーニングすることができる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼを用いることができる。HM1.24プロモーター配列をレポーター遺伝子の上流に含むプラスミドを構築し、ついで、細胞に形質転換した後、得られた細胞を被検物質と１〜２日培養し、回収された細胞をルシフェラーゼアッセイすることで、HM1.24抗原の発現を増強する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００９０】
細胞傷害活性
ADCC活性の測定
本発明に使用される抗体は、細胞傷害活性として、例えば、ADCC活性を有する抗体である。
本発明において造血器腫瘍細胞に対するADCC活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、エフェクター細胞（Effector cell ：Ｅ）として調製する。
【００９１】
また、標的細胞（Target cell ：Ｔ）としては、RPMI8226 (ATCC CCL 155), U266 (ATCC TIB 196), KPMM2, KPC-32, ARH-77 (ATCC CRL 1621)、HEL、患者由来の細胞などを51Crにより標識して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞にADCC活性を測定する抗体を加えインキュベートし、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベートする。
【００９２】
インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、１％のNP-40 を用いることができる。細胞傷害活性（％）は、(A-C)/(B-C) ×100 で計算することができる。なお、Ａは抗体存在下において遊離された放射活性（cpm ）、ＢはNP-40 により遊離された放射活性（cpm ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（cpm ）である。
【００９３】
細胞傷害活性の増強
ADCC活性のような細胞傷害活性を発揮するには、ヒトにおいては抗体定常領域（Ｃ領域）として Cγ、特に Cγ1, Cγ3 を使用することが好ましい。さらに、抗体Ｃ領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力なADCC活性、あるいはCDC 活性を誘導することができる。
【００９４】
例えば、アミノ酸置換によるIgG のIgM 様ポリマー化（Smith, R.I.F. & Morrison, S.L.BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688 ）、アミノ酸付加によるIgGのIgM様ポリマー化（Smith, R.I.F. et al., J.Immunology (1995) 154, 2226-2236）、Ｌ鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Shuford, W. et al., Science (1991) 252, 724-727 ）、アミノ酸置換によるIgG の二量体化（Caron, P.C. et al., J.Exp.Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J.Immunology (1992) 148, 2918-2922）、化学修飾によるＩｇＧの二量体化（Wolff, E.A. et al., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565）、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（Norderhaug, L. et al., Eur.J.Immunol. (1991)21, 2379-2384）が挙げられる。
【００９５】
これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。
【００９６】
患者の治療
本発明の態様のひとつは、HM1.24抗原の発現量を増強する薬剤、または、通常の状態では細胞表面上にHM1.24抗原を発現していない細胞に対してHM1.24抗原の発現を誘導する薬剤と、抗HM1.24抗体を患者に投与することにより、造血器腫瘍を治療する方法に関する。造血器腫瘍としては、例えば、骨髄腫、好ましくは多発性骨髄腫、リンパ球系腫瘍、例えばリンパ腫、好ましくはホジキン病または非ホジキンリンパ腫、リンパ球性白血病、好ましくは、急性Ｔリンパ性白血病、慢性Ｔリンパ球性白血病、急性Ｂリンパ性白血病、慢性Ｂリンパ性白血病、および骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病である。さらに、FAB分類でL1〜L3、M0〜M7の急性白血病も含まれる。
【００９７】
HM1.24抗原の発現量を増強する薬剤、または、通常の状態では細胞表面上にHM1.24抗原を発現していない細胞に対してHM1.24抗原の発現を誘導する薬剤としては、インターフェロンα、インターフェロンγ、IRF-2蛋白質あるいはIRF-2蛋白質をコードするDNA を含むベクターであり、好ましくは、インターフェロンαまたはインターフェロンγである。インターフェロンαまたはインターフェロンγの投与量としては、人体に投与した際に、血中濃度最高値として１〜10000 I.U./ml（国際単位）、より好ましくは５〜1000 I.U./ml、さらに好ましくは５〜500I.U./ml、最も好ましくは５〜50 I.U./mlになる投与量である。
【００９８】
静脈内投与の場合、好ましくは１万〜1000万I.U.、より好ましくは10万〜1000万I.U.、さらに好ましくは50万〜500万I.U.、最も好ましくは、100万〜500万I.U.を１回あたり投与することである。インターフェロンと抗HM1.24抗体は、一緒に投与してもよいし、別個に投与してもよい。後者の場合には、まず、インターフェロンを投与し、96時間以内に抗HM1.24抗体を投与することが好ましい。インターフェロン投与と抗HM1.24抗体投与の間隔は、インターフェロン投与によってHM1.24抗原の発現量が増強されている限り制限はないが、好ましくは96時間以内であり、より好ましくは72時間、さらに好ましくは48時間以内である。
【００９９】
患者の臨床応答に応じてインターフェロンと抗HM1.24抗体を複数回、交互に投与することも本発明の範囲内である。投与経路は、血流中に直接投与されることが望ましく、静脈内投与あるいは動脈内投与が好ましい。持続的に投与することも可能であり、点滴静脈内投与でもよい。また、皮下投与や筋肉投与でもよい。
【０１００】
本発明の他の態様は、インターフェロンαまたはインターフェロンγと抗HM1.24抗体を含有する造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物に関わる。本発明の治療剤または医薬組成物は、従来、インターフェロンや抗体製剤に用いられてきた薬学的に許容しうるビヒクル、例えば、生理食塩水または５％デキストランを通常の安定化剤や賦形剤と一緒に含有することができる。
本発明の他の態様では、造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキットであって、抗HM1.24抗体を有効成分として含有する医薬組成物と、インターフェロンαまたはインターフェロンγとの併用療法に関する記載を含む指示書とからなるキットを提供する。
【０１０１】
本発明の他の態様では、抗HM1.24抗体を有効成分として含有する、造血器腫瘍を有する患者を治療するための医薬組成物であって、インターフェロンαまたはインターフェロンγと併用するための医薬組成物を提供する。
本発明の他の態様は、HM1.24抗原の発現は増強する、または誘導する物質をコードする遺伝子を投与することに関わる。例えば、インターフェロンα、インターフェロンγ、IRF-2のDNA 配列は公知であり、所望のベクターに組み込んで患者に投与することができる。ベクターとしては、遺伝子治療に用いられるアデノウイルスベクター（例えばpAdexLew）やレトロウイルスベクター（例えばpZIPneo ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ex vivo であってもよいし、in vivo であってもよい。また、naked DNA を投与することも可能である。
【実施例】
【０１０２】
実施例１.（参考例）インターフェロンαによる骨髄腫細胞におけるHM1.24抗原発現量の増強
ヒト骨髄腫細胞株U266 (ATCC TIB 196) および多発性骨髄腫患者の骨髄由来の骨髄腫細胞を10％ウシ胎児血清（Whittaker Bioproducts, Inc, Walkersville, MD, USA ）を含むRPMI1640培地（Sigma, St Louis, MO, USA）を用い、５％炭酸ガス培養器中、37℃で培養した。マウス抗HM1.24抗体を生産するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託番号FERM BP-5233（寄託日1995年４月27日）として寄託されている。
【０１０３】
骨髄腫細胞（１×105／ml）を1000Ｕ／mlの天然型インターフェロン−α（大塚製薬、東京）存在下又は非存在下に48時間培養し、HM1.24抗原（それをコードする塩基配列を配列番号：１に示す）の変化をフローサイトメトリーで測定した。細胞を0.1％ウシ血清アルブミン（Sigma, St Louis, MO, USA）と0.02％アジ化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液（Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）で洗浄後、ヒト免疫グロブリン（３mg／ml、ミドリ十字、大阪）を加えたPBS（100μｌ）に浮遊させ、４℃で15分間、反応させた。
【０１０４】
その後、２μｌのFITC- ヒト IgG1 （１mg／ml）又はFITC−抗HM1.24抗体（１mg／ml）を加え、４℃で60分間、染色した。患者骨髄腫細胞を用いた場合、骨髄腫細胞の同定には20μｌのPE-anti-CD38 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ）を加え、二重染色を行った。染色後、細胞をPBCで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（和光純薬、大阪）を含むPBS中で保存した。その後、フローサイトメーター（EPICS XL, Coulter, Hialeah, FL, USA ）を用い、HM1.24抗原の発現を解析した。
【０１０５】
その結果、骨髄腫細胞株U266（図１）および患者骨髄腫細胞（図２）は無刺激の状態でHM1.24抗原を発現しており、インターフェロン−αの刺激により、HM1.24抗原の発現量はさらに増加した。
インターフェロン−αは骨髄腫細胞のHM1.24抗原の発現をさらに増強させ、骨髄腫細胞へ結合する抗HM1.24抗体の数を増加させた。抗HM1.24抗体による治療の抗腫瘍効果は、結合する抗体数に比例することから、骨髄腫患者において、インターフェロン−αを投与した後に抗HM1.24抗体治療を行うことは、抗体による治療効果を増強し、より有効性を高める治療になると期待される。
【０１０６】
実施例２．レポーター遺伝子解析によるHM1.24抗原の発現機能の解析
抗原の発現誘導がHM1.24プロモーター領域により調節されているかどうか調べるために、プロモーター領域でのレポーター遺伝子解析を行った。
HM1.24プロモーター領域の遺伝子（配列番号：３）はPCR クローニングにより得た。ヒト末梢血単核細胞よりDNAzol reagent（GIBCO ）を用い、ゲノムDNA を調製した。得られたゲノムDNA を鋳型として、プライマーHM2k（aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc ）（配列番号：４）、及びBST2B (atagtcatacgaagtagatgccatccag ）（配列番号：５）を用い、TaKaRa Taq（宝酒造、大津）を用いThermal Cycler 480（Perkin Elmer, CA, USA ）にてPCR （94℃  １min 、55℃  １min 、72℃  １min 、30cycles）を行った。
【０１０７】
得られた約２kbの断片を制限酵素KpnI及びBgIII(宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドpGL3-basic（Promega, WI, USA）のKpnI-BglIIサイトにDNA ligation kit ver. II（宝酒造）を用いてクローニングし、コンピテントE. coli JM109 （ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌を100μｇ／mlのアンピシリンを含むLB培地にて37℃培養し、QIAGEN plasmid maxi kit （QIAGEN, Hilden, Germany ）にてプラスミドを調製した。
【０１０８】
得られたプラスミドHM-2k/GL3 を制限酵素KpnI及びXhoIにて処理し、kilo-sequence 用deletion kit（宝酒造）にてdeletion cloneを作製し、転写開始点上流−493bpまでを含むプラスミドHM-493/GL3を得た。またHM-2k/GL3 を制限酵素KpnI及びAflII にて処理し、上記方法にてdeletion cloneを作製し、転写開始点上流−151bp又は−77bpまでを含む、それぞれHM-151/GL3及びHM-77/GL3 を得た。
【０１０９】
細胞へのプラスミド導入はPolyethylenimine-Transferrinfection Kit （Tf PEI-Kit）（Bender MedSystems, Vienna, Austria）、ルシフェラーゼアッセイはDual-Luciferase Reporter Assay System （Promega ）を用いた。細胞株を50μＭ Defferrioxamine、10％  FBS を含むRPMI-1640 にて一晩培養した。導入するプラスミドをTf-PEIとの複合体にするため、終濃度20μｇ／mlのレポータージーンプラスミド、0.4μｇ／mlのpRL-SV40、1 μｇ／ml Tf-PEI 試薬の混合液を作製し、室温で20分間インキュベートした。５×105 細胞／mlの細胞をTf-PEI・プラスミド混合液の３倍容加え、４時間37℃にてインキュベートし、培地にて洗浄後、２×105 細胞／mlの濃度で１wellあたり100μｌを96ウイル平底プレートで培養した。
【０１１０】
IFN−αを終濃度０，10，100、又は1000Ｕ／mlとなるよう添加し、37℃２日間培養した。細胞をPBS(-)にて洗浄後、20μｌのPassive Lysis Bufferにて溶解し、６μｌをC96 White Polysorp Fluoronunc plate （Nunc）にアプライした。Luminoskan（Labsystems）にて基質液30μｌ、測定時間10秒にてFirefly 及びRenilaそれぞれの発光強度を測定した。測定値は、Firefly/Renilaにて補正後、コントロール（medium）を１として相対活性を求めた。
【０１１１】
その結果、上流２kbp 及び493bpともにIFN α濃度依存的にレポーターのルシフェラーゼ活性が上昇しており、プロモーター領域の転写活性上昇が抗原の発現誘導を引き起こすことを確認した（図３）。
さらに、転写開始点上流151bp又は77bpのレポータープラスミドを用いた結果では、上流151bpのレポータープラスミドではIFN α刺激によりルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。一方上流77bpのレポータープラスミドではIFN α刺激による活性の変化は認められなかった（図４）。77〜151bpの領域にはGAS element, ISRE に相同性の高い配列が存在し、IFN α刺激に応答して活性化する転写調節因子であることから、IRF ファミリーの転写調節因子が活性に関与していることが示された。
【０１１２】
実施例３.（参考例）インターフェロンγによる骨髄腫細胞におけるHM1.24抗原発現量の増強
実施例１に記載の方法により、1000Ｕ／mlの天然型インターフェロンγ（R & D System社）を用いて解析した。その結果、骨髄腫細胞株U266（図５）および患者骨髄腫細胞（図６）において、インターフェロンαと同様に、HM1.24抗原の発現量の増大が観察された。
【０１１３】
実施例４.（参考例）IRF-2のHM1.24プロモーター領域への結合
HM1.24プロモーター領域に結合する転写因子を同定するために、HM1.24プロモーター領域をプローブとしたElectrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA）を次のように行い、結合因子として IRF-2を同定した。
（１）核抽出物の調製
骨髄腫細胞U266-B1 (ATCC-TIB196) を10％FBS (HyClone）を含むRPMI-1640 培地(GIBCO-BRL）にて37℃、５％CO2 インキュベーター中で培養した。インターフェロンα (IFN-α)(Pepro Tech EC)による細胞への刺激を行うため、培地中に IFN−αを終濃度1000Ｕ／mlとなるように添加し、添加後30分、２時間、４時間及び８時間の細胞を回収した。細胞を冷PBS(-)に懸濁、1,000rpmにて遠心して上清を捨て、10mM Tris, 10mM NaCl, 6mM MgCl2 溶液に懸濁した。
【０１１４】
氷中に５分間静置後に再度遠心し、上清を捨てた。10mM Tris, 10mM NaCl, 6mM MgCl2, 1mM DTT, 0.4mM PMSF, 1mM Na3VO4に細胞を懸濁した。ガラス製ホモジェナイザーを用いて細胞を氷上でホモジェナイズし、6000ｇ３分間遠心し、上清を捨てた。抽出緩衝液（20％グリセロール、20mM HEPES, 420mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1mM DTT, 0.1mM Na3VO4, ２mg／mlアプロチニン、 5mg／mlロイペプチン）に細胞を懸濁し、氷中に20分間静置した。 12000ｇ10分間遠心し、上清を回収した。
【０１１５】
（２）標識プローブの調製
プローブとして、HM1.24プロモーター領域においてGAS (IFN−γ活性化部位：GAS コンセンサス配列はttncnnnaa(配列番号：８))、ISRE (IFN-α刺激応答因子：ISREコンセンサス配列はngaaanngaaact(配列番号：９))とホモロジーのある配列（ttcccagaa(配列番号：10）およびggaaactgaaact(配列番号：11）を含むISRE2 を作製した。すなわち、オリゴDNA ISRE-F2 (aatttctgggaaactgaaactgaaaacct（配列番号：12))及びISRE-R2 (aattaggttttcagtttcagtttcccaga（配列番号：13))を混合し、アニールさせ２本鎖DNA プローブISRE2 とした。
【０１１６】
また、オリゴDNA adp-1 (catggcatctacttcgtatgactattgcagagtgcc(配列番号：14))及びadp-2 (catgggcactctgcaatagtcatacgaagtagatgc(配列番号：15))を混合し、アニールさせunrelated プローブadp とした。プローブの標識はBand Shift Kit (Amersham Pharmacia Biotech）を用い、その標準プロトコールに準じて行った。すなわち、上記にて作製した２本鎖DNA50ng を [α−32P]dATP (20μCi)(Amersham Pharmacia Biotech）を含む反応液中でKlenow断片のポリメラーゼ反応を37℃、１時間行った。反応終了した溶液を２倍に希釈後Nick Spin Column (Amersham Pharmacia Biotech）にかけ、1600rpm 、４分間遠心して回収した溶液を標識プローブとした。
【０１１７】
（３）IFN-αによる刺激により産生された結合因子の経時変化
Band Shift Kit (amersham pharmacia biotech, NJ, USA)の標準プロトコールに従って以下の操作を行った。前記（１）において経時的に調製した抽出物５μｇにキット添付の10x 結合緩衝液 (100mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl, 5mMDTT) 2 μｌ, 50％グリセロール４μｌ，１％NP-40 １μｌ、及び１μｌのpoly(dI-dC) ・poly(dI-dC) を加え、前記（２）で調製した32P 標識ISRE-2プローブ２μｌを添加し、水を加えて全量を20ulとした後、この反応混合物を室温にて20分間インキュベートし、前記抽出物中に存在する可能性のある結合因子と前記32P 標識ISRE-2プローブとの結合を許容した。
【０１１８】
反応液18μｌに10×染色液（Kit に添付）２μｌを加え、１×Tris−グリシン緩衝液（25mM Tris, 190mMグリシン、１mM EDTA, pH8.1) 中、7.5 ％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、電気泳動後、ゲルを濾紙にはりつけて蛋白質を濾紙に移行させた。ゲルドライヤーにて乾燥した濾紙をＸ線フィルムに感光させ、シグナルを検出した。
【０１１９】
比較のため、抽出物を添加しない反応液[(NEC-)]、インターフェロンαにより刺激しないで培養した細胞培養物からの抽出物を添加した反応液 [0h] 、８時間の培養液の抽出物に標識プローブの代りに未標識ISRE2 プローブ50ngを添加した反応液 [8h (+cold)] 、及び８時間の培養後の抽出液にunrelated プローブadp を50ng添加した反応液 [８ｈ(+cold unrelated)]を用意し、上記を同様に処理してシグナルの検出を行った。
結果を図７に示す。この図７から明らかな通り、HM1.24プロモーターの一部に相当する２本鎖DNA と結合する物質が、インターフェロン刺激下で培養したU266-B1 細胞中に経時的に増加した。
【０１２０】
（４）各種抗体との反応による転写因子の同定
前記（１）に記載したようにして、骨髄腫細胞U266-B1 (ATCC-TIB196) を1000Ｕ／mlのインターフェロン−αの存在下で８時間培養し、抽出物を調製した。Band Shift Kit (Amercham Pharmacia Biotech）の標準プロトコールに従って次の操作を行った。すなわち、５μｇの抽出物に抗体２μｇを添加し、室温にて15分間インキュベートし、抽出液／抗体反応液を得た。前記キット添付の10×結合緩衝液２μｌ、50％グリセロール４μｌ、１％ NP-40  １μｌ及び１μｌのPoly (dI-dC)・ Poly (dI-dC) に、前記抽出液／抗体反応液２μｌ及び前記（２）で調製した標識プローブ２μｌを添加し、水を加えて全量を20μｌとした後、この反応混合物を室温にて20分間インキュベートした。
【０１２１】
この反応混合物を、前記（３）に記載したようにして電気泳動にかけ、シグナルの検出を行った。
上記の抗体として、次の抗体（いずれも、Santa Cruz Biotechnologyより）を使用した。
抗−ヒトSTAT1 p84/p91 (E-23) : (説明）ウサギポリクローナル抗体（SC-346X)
抗−ヒトSTAT2 (C-20) :ウサギポリクローナル抗体（SC-476X)
抗−マウスSTAT3 (K-15) :ウサギポリクローナル抗体（SC-483X)
抗−ヒトISGF-3γp48 (C-20) :ウサギポリクローナル抗体（SC-496X)
抗−ヒトIRF-1 (C-20) :ウサギポリクローナル抗体（SC-497X)
抗−ヒトIRF-2 (C-19) :ウサギポリクローナル抗体（SC-498X)
抗−マウスICSAT (M-17) :ヤギポリクローナル抗体（SC-6059X)
【０１２２】
また、対照として、インターフェロンの刺激なしに培養した細胞の抽出物を用いた反応液 [0h] ; 1000Ｕ／mlのインターフェロン−α刺激下で８時間培養した細胞の抽出物を添加し、抗体を添加しない反応液 [8h] ; 標識ISRE2 プローブの代りに未標識ISRE2 プローブ50ngを添加した反応液 [8h(+cold)] ;及び標識ISRE2 プローブの代りに未標識のdpプローブ50ngを添加した反応液 [8h(+unrelated cold) を用意し、上記の同様に処理した。
【０１２３】
結果を図８に示す。図８から明らかな通り、インターフェロン−αの刺激下で培養した細胞のからの抽出物中の標識ISRE2 プローブと結合する成分は抗−IRF-2 抗体とのみ結合し、HM1.24プロモーターに結合してそれを活性化する因子は、転写因子IRF-2 であることが示された。
【０１２４】
実施例５.（参考例）IRF-2によるHM1.24プロモーター活性化の確認
IRF-2 共発現によるHM1.24プロモーター活性への影響をU266細胞を用いたレポータージーンアッセイにより測定し、実際にIRF-2 がHM1.24プロモーターの転写活性化作用を持つことを明らかにした。以下の実験では、骨髄種細胞株U266-B1(ATCC TIB196)を用いた。細胞は、10％FBS(GIBCO BRL)を含むRPMI-1640 培地(GIBCO)(以下medium) により、５％CO2 incubator にて培養した。
【０１２５】
（１）HM1.24プロモーター領域を含むプラスミドの構築
HM1.24プロモーター領域の遺伝子はPCR cloning により得た。ヒト末梢血単核細胞よりDNAzol reagent(GIBCO) を用い、ゲノムDNA を調製した。得られたゲノムDNA を鋳型として、プライマーHM2k（aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc)（配列番号：16）、BST2B （atagtcatacgaagtagatgccatccag)(配列番号：17）を用い、TaKaRa Taq（宝酒造、大津）を用いThermal Cycler 480（Perkin Elmer, CA, USA)にてPCR （94℃  １分間、55℃  １分間、72℃  １分間、30サイクル）を行った。
【０１２６】
得られた約２kbの断片を制限酵素KpnI, BglII （宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドpGL3-basic (Promega, WI, USA) のKpnI, BglII サイトにDNA ligation kit ver. II（宝酒造）を用いてクローニングし、コンピテントE.coli JM109（ニッポンジーン）を形質転換した。形質転換した大腸菌を100 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地にて37℃培養し、QIAGEN plasmid maxi kit (QLAGEN, Hilden, Germany) にてプラスミドを調製した。
【０１２７】
得られたプラスミドHM-2k/GL3 を制限酵素KpnI, XhoIにて処理し、kilo-sequence 用deletion kit（宝酒造）にて欠失クローンを作製し、転写開始点上流-491bpまでを含むプラスミドHM-491/GL3を得た。またHM-2k/GL3 を制限酵素Kpn I, AflIIにて処理し、上記方法にて欠失クローンを作製し、転写開始点上流-151bpまでを含むHM-151/GL3、を得た。
【０１２８】
さらにHM-2k/GL3 を鋳型としてプライマー10Ｓ（tttcggtacctaattaatcctctgcctg)(配列番号：18）およびGLプライマー２（ctttatgtttttggcgtcttcca)（配列番号：19) を用い、TaKaRa Taq（宝酒造、大津）を用いThermal Cycler 480（Perkin Elmer, CA, USA)にてPCR （94℃  １分間、55℃  １分間、72℃  １分間、30サイクル）を行った。得られた断片を制限酵素KpnI, BglII （宝酒造）にて処理し、レポータージーンプラスミドpGL3-basic (Promega, WI, USA) のKpnI, BglII サイトにligation high （東洋紡）を用いてクローニングし、コンピテントE.coli JM109（ニッポンジーン）をtransform した。
【０１２９】
形質転換した大腸菌を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地にて37℃培養し、QIAGEN plasmid maxi kit (QIAGEN, Hilden, Germany) にてプラスミドを調製した。こうして転写開始点上流125bp までを含むHM-125/GL3を得た。またHM-2k/GL3 を鋳型としてプライマーHMP700（aaaggtaccagagtttacctggtatcctgg)(配列番号：20）およびGLプライマー２を用い、同様の手順にてPCR を行い、pGL3-basicのKpnI, BglII サイトに断片を導入することにより、転写開始点上流約700bp までを含むHM-700/GL3を得た。
【０１３０】
さらにHM-2k/GL3 を鋳型としてプライマーHMP700および11A'（cagaggattaattaggtaccgaaagagaggtgggctttt)（配列番号：21）を用い、KOD ポリメラーゼ（東洋紡）を用いThermal Cycler 480(Perkin Elmer, CA, USA) にてPCR （98℃  15秒、65℃  ２秒、74℃  30秒、25サイクル）を行った。得られた断片をZero BluntTOPO PCR cloning kit for sequencing ver.B (Invitrogen）を用いて、pCR4 Blunt-TOPO vectorに挿入した。得られたプラスミドを制限酵素KpnIにて処理し、およそ550bp の断片を回収し、HM-125/GL3のKpnIサイトにligation high を用いて導入した。こうして転写開始点上流-125〜-145付近を欠失したdISRE/GL3 を得た。
【０１３１】
（２）IRF-2 発現プラスミドの構築
IRF-2 発現プラスミドは以下のように作製した。interferon- α（1000U/ml) にて刺激後８時間経過したU266細胞より、TRIzol試薬（GIBCO-BRL)を用いて全RNA を抽出した。First-strand cDNA Synthesis kit (Pharmacia) を用い、得られたRNA を鋳型、NotI-d(T)18 をプライマーとして逆転写反応を37℃１時間行った。得られたcDNAを鋳型、IRF2-F2 （ttgtattggtagcgtgaaaaaagc)(配列番号：22）、IRF2-R2 （cagctagttcacattatctcgtcc)(配列番号：23）をプライマーとしてLA-Taq（宝酒造）を用いてPCR （94℃  45秒、60℃  45秒、72℃  60秒、40サイクル）を行った。
【０１３２】
得られたPCR 反応液を鋳型、IRF2-F1 （agagggtaccatgccggtggaaaggatgcg)(配列番号：24）、IRF2-R1 （agtcggtaccttaactgctcttgacgcggg)(配列番号：25）をプライマーとしてKOD ポリメラーゼ（東洋紡）を用いて再度PCR （94℃  45秒、60℃  45秒、72℃  60秒、30サイクル）を行った。得られた断片を制限酵素KpnIにて処理し、発現プラスミドpTracer-CMV (Invitrogen)のKpnIサイトにligationhigh （東洋紡）を用いて導入し、IRF-2 発現プラスミドpIRF-2/Tracer を得た。
【０１３３】
（３）レポーター遺伝子活性の測定
細胞へのプラスミド導入はPolyethylenimine-Transferrinfection Kit (Tf PEI-Kit)(Bender MedSystems, Vienna, Austria)を、ルシフェラーゼアッセイはDual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) を用いた。細胞株を50μM Defferrioxamine, 10 ％ FBSを含むRPMI-1640 にて一晩培養した。導入するプラスミドをTf-PEIとの複合体にするため、終濃度20μg/mlのレポータージーンプラスミド、20μg/mlのpIRF-2/Tracer またはpTracer-CMV, 0.4μg/mlのpRL-SV40, １μg/ml Tf-PEI reagent の混合液を作製し、室温で20分間インキュベートした。
【０１３４】
５×105 細胞／mlの細胞をTf-PEI plasmid混合液の３倍容加え、４時間37℃にてインキュベートし、培地にて洗浄後、２×105 細胞／mlの濃度で１ウェルあたり100 μｌを96ウェル平底プレートで培養した。IFN-αを終濃度0,1000U/mlとなるよう添加し、37℃２日間培養した。細胞をPBS(-)にて洗浄後、20μｌのPassive Lysis Bufferにて溶解し、６μｌをC96 White Polysorp Fluoronunc plate (Nunc)にアプライした。Luminoskan (Labsystems) にて基質液30μｌ、測定時間10秒にてFirefly, Renila それぞれの発光強度を測定した。測定値はFirefly/Renilaにてトランスフェクション効率の補正を行い相対活性を求めた。
【０１３５】
（４）結果
HM1.24プロモーターレポータープラスミドとIRF-2 発現プラスミドをU266細胞に導入し、レポーター活性を測定した（図９）。その結果、IRF-2 結合サイトであるISREモチーフ配列を含む-700および-151で、IRF-2 共発現によりルシフェラーゼ活性が上昇した。一方ISRE配列を欠失したdISRE/GL3 ではIRF-2 共発現によるルシフェラーゼ活性に変化は認められなかった。以上の結果よりIRF-2 はHM1.24プロモーターのISRE領域に結合し、その転写活性を増強することが示された。
【０１３６】
（５）IRF-2 の強制発現によるHM1.24抗原の発現増強の確認
IRF-2 によるHM1.24抗原の発現量の変化は、IRF-2 発現プラスミド（pIRF-2/Tracer)またはコントロールプラスミド（pTracer/CMV)をU266細胞に上記方法にて導入し、１〜２日間培養した後、細胞を回収し、一次抗体としてマウス抗ヒトHM1.24抗体にて染色する。細胞を洗浄し、さらに二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG 抗体により染色する。細胞を洗浄したのち、フローサイトメータにより細胞のFITC蛍光強度を測定する。IRF-2 発現プラスミド導入細胞では、コントロールプラスミド導入細胞に比較してFITC強度の高い細胞が多く存在することを確認する。
【０１３７】
実施例６．インターフェロンαによるリンパ系腫瘍細胞におけるHM1.24抗原発現量の増強、および骨髄性白血病細胞におけるHM1.24抗原の発現誘導
ヒト骨髄性白血病細胞株HEL（Japanese Cancer Research Resources, Tokyo, Japan）および造血器腫瘍患者の骨髄やリンパ節由来の腫瘍細胞は、実施例１に記載の方法で培養した。また、インターフェロンαは実施例１と同一のものを用い、インターフェロンαによる刺激方法およびフローサイトメトリーの測定方法も実施例１と同様におこなった。尚、FITC−抗HM1.24抗体として、FITC−ヒト型化抗HM1.24抗体（１mg/ml）を使用した（国際特許公開番号WO98/14580参照、軽鎖および重鎖可変領域のバージョンはRVLaおよびRVHｓ）。また、骨髄性白血病細胞の同定にはPE−抗CD33抗体、Ｂ細胞性リンパ腫の同定にはPE−抗CD19抗体、Ｔ細胞性リンパ腫の同定にはPE−抗CD４抗体（全てPharmingen, San Diego, CA,USA）を20μｌ加え、二重染色を行った。
【０１３８】
その結果、IFN-α非刺激下では、HEL および急性骨髄性白血病患者由来の腫瘍細胞では、HM1.24抗原の細胞表面上への発現は、殆ど認められないか、非常にわずかしか認められず、これらの腫瘍細胞では、IFN-α非刺激下ではHM1.24抗原の発現は実質的に認められなかった。一方、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫患者由来の腫瘍細胞では、IFN-α非刺激下においてもHM1.24抗原の細胞表面上での発現が認められた。これに対し、IFN-αで刺激した場合、HEL および急性骨髄性白血病患者由来の腫瘍細胞ではHM1.24抗原の発現が誘導された。
【０１３９】
実質的にHM1.24抗原を発現していないこれらの細胞においても、IFN-αはHM1.24抗原を発現させることができた。また、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫患者由来の腫瘍細胞においても、HM1.24抗原の発現量が増大した。これら５種の腫瘍細胞において、IFN-α刺激によって発現したHM1.24抗原の量はほぼ同程度であった。これらの結果は、IFN-αが造血器腫瘍細胞全般に対して、HM1.24抗原の発現誘導作用または発現増強作用を有することを示す。
【０１４０】
実施例７．インターフェロンαによる抗HM1.24抗体のADCC活性の増強
ヒト骨髄性白血病細胞株HEL を標的細胞として用いた。HEL（１x106cells）に0.1mCiの51Cr-sodium chromate（New England Nuclear, Boston, MA, USA）を加え、37℃で１時間放置した。その後、RPMI1640で３回洗浄し、1x104 個を円底96ウエルプレート（Corning ）に分注した。
【０１４１】
種々の濃度のヒト型化抗HM1.24抗体（国際特許公開番号WO98/14580参照、軽鎖および重鎖可変領域のバージョンはRVLaおよびRVHs）を加えた後、エフェクター細胞として、健常人の末梢血単核球（5x105個）を加え、37℃で４時間放置した。培養上清中の放射活性をガンマカウンターで測定し、ADCCによる細胞傷害活性を以下の計算式により求めた。尚、最大値は、標的細胞に１％NP40を加えることで細胞を破壊して測定した。また、最小値は、培養液であるRPMI1640のみを添加して測定した。
ADCC活性（％）＝（測定値−最小値）／（最大値−最小値）
【０１４２】
その結果、IFN-αによる刺激を行わない場合には、いずれのヒト型化抗HM1.24抗体濃度においても顕著なADCC活性は認められなかったが、IFN-αで刺激した場合には、ヒト型化抗HM1.24抗体による顕著なADCC活性が認められた。また、ADCC活性は抗体濃度依存性であり、細胞表面上のHM1.24抗原の発現によってADCC活性が誘導されたことが示された。
【０１４３】
この結果は、IFN-α等の刺激により腫瘍細胞表面上のHM1.24抗原の発現量が上昇すれば、抗HM1.24抗体による細胞傷害活性、すなわち抗腫瘍効果が増強されることを示しており、IFN-α等のHM1.24抗原発現増強剤と抗HM1.24抗体を併用することで、より少量の抗HM1.24抗体使用量で同等の効果を期待できることを示す。また、抗HM1.24抗体単独では顕著な効果が期待できない造血器腫瘍細胞においても、IFN-α等の発現誘導剤と抗HM1.24抗体との併用により、抗腫瘍効果が期待できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、インターフェロンαの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した骨髄腫細胞株U266を、標識としてヒトIgG(対照）又は抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
【図２】図２は、インターフェロンαの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した患者骨髄腫細胞を、標識としてヒトIgG(対照）又は抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
【図３】図３は、HM1.24抗原をコードする遺伝子のプロモーター領域を挿入したレポータープラスミドにより形質転換したU266細胞をインターフェロンαの非存在下又は種々の濃度での存在下で培養した後ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
【０１４５】
【図４】図４は、HM1.24抗原をコードする遺伝子のプロモーター領域の内、転写開始点から151bp上流まで、又は77bp上流までを挿入したレポータープラスミドにより形質転換されたU266細胞又はHEL 細胞を、インターフェロンα (1000Ｕ／ml）の存在下で培養した後にルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、インターフェロンγの非存在下（上）は存在下（下）で培養した骨髄腫細胞株U266を、標識としてヒトIgG(対照）又は抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
【図６】図６は、インターフェロンγの非存在下（上）又は存在下（下）で培養した患者骨髄腫細胞を、標識としてヒトIgG(対照）又は抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。
【０１４６】
【図７】図７は、U266培養細胞にIFN-αを添加することにより産生されHM1.24プロモーター領域に結合する転写因子の量の経時的変化を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。NE(-) は核抽出物添加せず。0hはIFN-α刺激なしの核抽出物を添加。0.5 〜8hはIFN-α (1000Ｕ／ml) 刺激後それぞれの時間経過した核抽出物を添加。+cold は未標識ISRE2 プローブ50ng添加、+cold unrelated は未標識adp 配列50ng添加。
【図８】図８は、HM1.24プロモーターに結合する転写因子を、各種の抗体を用いて同定した結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。NE(-) は核抽出物添加せず。0hはIFN-α刺激なしの核抽出物を添加。8hはIFN-α (1000Ｕ／ml) 刺激後8hの核抽出物を添加。+cold は未標識ISRE2 プローブ50ng添加。+cold unrelated は未標識adp 配列50ng添加。抗体はそれぞれ2 μｇ添加。
【図９】図９は、HM1.24プロモーターレポータープラスミドとIRF-2 発現プラスミドとをU266細胞に導入し、レポーター活性を測定した場合の結果を示すグラフである。
【０１４７】
【図１０】図10は、ヒト白血病細胞株HEL および急性骨髄性白血病患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトIgG （対照）または抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗HM1.24抗体による染色を示す。
【図１１】図11は、急性リンパ性白血病患者およびＢ細胞性非ホジキンリンパ腫患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトIgG （対照）または抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗HM1.24抗体による染色を示す。
【図１２】図12は、Ｔ細胞性非ホジキンリンパ腫患者から採取した細胞を、インターフェロンαの非存在下（左）または、存在下（右）で培養し、標識としてヒトIgG （対照）または抗HM1.24抗体を用いてフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。黒塗りが対照であり、白抜きが抗HM1.24抗体による染色を示す。
【図１３】図13は、ヒト白血病細胞株HEL を標準細胞とし、健常人の末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた際の、種々のヒト型化抗HM1.24抗体によるADCC活性を測定した結果を示す。
【図１】
0004522431.tif 000002
【図２】
0004522431.tif 000003
【図３】
0004522431.tif 000004
【図４】
0004522431.tif 000005
【図５】
0004522431.tif 000006
【図６】
0004522431.tif 000007
【図９】
0004522431.tif 000008
【図１０】
0004522431.tif 000009
【図１１】
0004522431.tif 000010
【図１２】
0004522431.tif 000011
【図１３】
0004522431.tif 000012
【図７】
0004522431.tif 000013
【図８】
0004522431.tif 000014
【配列表】
0004522431000001.app