(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿試料中のメグシンタンパク質を測定することからなる、腎機能評価方法。
【請求項２】
尿試料中のメグシンタンパク質を測定し、正常な試料のメグシンタンパク質の測定値と比較することからなる、請求項１に記載の腎機能評価方法。
【請求項３】
尿試料中のメグシンタンパク質を、抗メグシンタンパク質抗体を用いた抗原抗体反応によって測定することを特徴とする請求項１に記載の腎機能評価方法。
【請求項４】
抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の腎機能評価方法。
【請求項５】
抗メグシンタンパク質抗体を含む、腎機能の尿診断用試薬。
【請求項６】
抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
固体顆粒の表面に、抗メグシンタンパク質抗体を結合した顆粒を含む、メグシンタンパク質尿検出用試薬。
【請求項８】
固体顆粒が磁性を有するものである、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
固体顆粒の比重が１以上である、請求項７に記載の試薬。
【請求項１０】
抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の試薬。
【請求項１１】
下記工程を含むことを特徴とする、尿試料中に含まれるメグシンタンパク質の検出方法。
i) 固体顆粒の表面に第１の抗メグシンタンパク質抗体を結合したメグシンタンパク質検出用顆粒を尿試料と接触させる工程
ii) 尿試料を接触させた前記メグシンタンパク質検出用顆粒に、標識分子を結合した第２の抗メグシンタンパク質抗体を接触させる工程、および
iii) 前記第２の抗メグシンタンパク質抗体を介してメグシンタンパク質と結合している前記標識分子を検出する工程
【請求項１２】
第１の抗メグシンタンパク質抗体、および第２の抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
第１の抗メグシンタンパク質抗体および第２の抗メグシンタンパク質抗体が異なる認識部位を有する抗メグシンタンパク質抗体である請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
以下の要素を含むメグシンタンパク質尿検出用キット。
ａ）抗メグシンタンパク質抗体を結合するための磁性固体顆粒、
ｂ）前記磁性個体粒子に予め固定されるか、または間接的に固定することができる抗メグシンタンパク質抗体、および
ｃ）磁石
【請求項１５】
さらに標識分子を結合した抗メグシンタンパク質抗体を含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は尿や血液などの生体試料中に含まれるメグシンタンパク質を測定することからなる腎機能評価方法に関する。さらに本発明は、抗メグシンタンパク質抗体を含む腎機能診断用試薬に関する。
背景技術
腎臓の血液濾過作用や解毒作用が全く機能しない末期腎不全においては、腎移植が唯一の治療手段であるが、我が国においては、移植腎の供給体制が十分に整備されているとは言い難い。また、移植療法自体に対する社会的認知も進んでいないことなどから、腎代用療法としては透析療法に頼らざるを得ないのが現状である。
現在、日本の透析患者は推定約１７万人を数える。一人当たりの平均的な治療費は年間約６００万円を必要とし、医療保険制度を圧迫する大きな原因の一つとされている。また、毎週２〜３日、１日４〜６時間を透析治療のために拘束されることから、患者本人の社会活動も大きく妨げられることになる。
腎不全は、腎疾患患者が最終的に至る病態である。その原因や経歴は一様ではなく、薬物中毒、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの本来腎臓以外の病変により、腎障害が発症し、腎不全に至る場合も数多くみられる。
腎障害においては、末期即ち腎不全近くになるまで顕著な自覚症状が現れないことから、その発生が見過ごされ易く、発症した時点では既に腎臓は回復不可能なダメージを受けている場合が多い。従って、自覚症状の発現をみる前に、できる限り初期の段階で腎障害を発見することが、腎不全への移行を防ぐために、また、透析治療による保険財政圧迫を避けるためにも大切である。
従来、腎障害を診断する手がかりとして、いわゆる検尿による尿タンパクや尿沈渣の検査が広く行われている。しかし、尿タンパクは健常人でも過激な運動、精神的ストレス、多量の肉食、月経前などで一過性に増加する。また、若年者に多くみられる（健常人の０．５％程度）起立性タンパク尿など、腎疾患に由来しない尿タンパクもある。さらに尿路疾患、膀胱疾患、女性性器疾患などでも尿タンパクが認められる。従って、尿タンパクの検査のみで腎障害を確定診断することは困難である。
尿沈渣は、尿を遠心分離し、その沈渣を顕微鏡で観察するものであるが、赤血球沈渣は健常人でもみられ、腎障害以外の尿路系関連臓器に由来する場合もあるので、これもまた腎障害の確定診断には不十分である。
また、糖尿病性腎症の診断の指標として尿中に漏洩したアルブミンを定量し、健常人の正常値と比較して早期の糖尿病性腎症を特定する方法が知られている。しかし、尿中のアルブミン量は健常人においても変動することから、糖尿病性腎症の正確な病態を把握することはできない。
さらに、尿成分の血中停滞を検査する目的で血清クレアチニン（Ｃｒ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の測定なども行われるが、これらの検査も食事の影響を受けやすい。このように、尿タンパクや血清Ｃｒ、ＢＵＮの検査において異常値が顕れても、それが必ずしも腎障害に由来するものとは限らず、健常人や他の疾患でもしばしば異常値が発現する。
他に、尿中β２−ミクログロブリン、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＩｇＧ、トランスフェリン、あるいはインターロイキン−６など様々な物質の測定による腎障害の診断が試みられているが、腎障害の重症度と一致しない場合も多く、いずれも有効でない。
また、これら血液成分を尿中で測定する方法については、腎全体の障害または免疫反応の関与を推測することは可能であるが、腎組織内の障害部位を特定することは困難である。そして、上記に列記した手段以外には、腎障害の診断および重症度の判定に充分な感度および特異性を有する検査方法はまだ知られていない。現在のところ、腎障害の診断や重症度の最終的判定には、腎生検による組織学的診断が不可欠とされている。
しかしながら、腎生検は侵襲的検査であり、出血、感染などの合併症の危険性が常に伴う。また、検査を実施するためには、専門医と設備の整った施設に入院しなければならず、患者への肉体的、社会的負担は無視できない。
以上のように、検尿による検査は簡便で、且つ、多量の検体を処理できる優れた検査方法ではあるが、腎障害の確定診断という観点からは満足できるものではない。一方、腎生検は、腎障害の診断、重症度の判定は確実であるものの、その利用は極く限られたものとならざるを得ない。このような背景から検尿の簡便さと、腎生検の正確さを兼ね備えた腎障害の診断方法が望まれていた。
さて、腎に限らず特定の組織に特異的に発現しているタンパク質は、しばしばその臓器の機能障害の指標として用いられる。たとえば、ＬＤＨやγＧＴＰといった酵素タンパク質は、肝機能マーカーとして広く利用されている。しかし腎においては、その機能の指標となるような腎に特異的なタンパク質の存在は知られていない。
ところで、本発明者は、大規模ＤＮＡ配列決定およびデータベース解析により、メサンギウム細胞で特に強く発現する遺伝子として、メグシンと命名した遺伝子を単離している。そして、メグシンの全長ｃＤＮＡクローンがコードする３８０個のアミノ酸からなる新規タンパク質であるメグシンタンパク質を取得することに成功した。更に、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースを用いてＦＡＳＴＡプログラムによるアミノ酸ホモロジー検索を行ったところ、ヒトメグシンタンパク質が、ＳＥＲＰＩＮ（セリンプロテアーゼインヒビター）スーパーファミリー（Ｒ．Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，第１０巻，２０頁，１９８５年；Ｒ．Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，第５２巻，５２７頁，１９８７年；Ｅ．Ｋ．Ｏ．Ｋｒｕｉｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，第８６巻，４００７頁，１９９５年；Ｊ．Ｐｏｔｅｍｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６９巻，１５９５７頁，１９９４年；Ｅ．Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．，第３１５巻，１０５頁，１９９３年）に属するタンパク質であることを見出した（Ｔ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，第１２０巻，８２８−８３６頁，１９９８年）。そしてこの知見を特許出願した（ＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＪＰ９８／０４２６９）。
ヒトメグシンタンパク質は、ヒト繊維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞およびケラチノサイトでは発現が弱く、メサンギウム細胞において特に強く発現している。また、ＩｇＡ腎症患者と健常人とで腎臓組織中のメグシンタンパク質の発現量を比較したところ、ＩｇＡ腎症腎症患者においてメグシンタンパク質の発現量が有意に高いことを見出した。従って、尿中あるいは血中に存在するメグシンタンパク質を測定することは、たとえばＩｇＡ腎症などのメサンギウム細胞増殖性腎症のマーカーとして有用であると考えられる。このように、メグシンタンパク質遺伝子の発現は腎疾患の発症およびその亢進に深く関与している可能性が窺われるが、腎疾患の病態の進行との相関関係については明らかにされていなかった。
発明の開示
本発明は、上記のような課題を解決し、腎疾患の診断や重症度の判定を可能とする方法と、そのための試薬、あるいは試薬キットの提供を課題としている。
まず本発明者は、腎障害の確定診断および重症度を判定するためには、病態と密接に関連した特異的なタンパク質を測定する必要があると考えた。そこで、糸球体に存在するメサンギウム細胞（ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ）に注目した。メサンギウム（ｍｅｓａｎｇｉｕｍ）は、腎糸球体の毛細管係蹄の小葉中心部に位置し、各小葉を結びつける芯となる組織である。メサンギウムは糸球体基底膜に覆われており、毛細管腔とは内皮細胞によって隔てられている細胞（メサンギウム細胞）と３層からなる糸球体基底膜の中の内透明層と連続している無形物質（メサンギウム基質：ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ）から構成されている。
メサンギウム細胞は、腎糸球体の構造および機能の維持に中心的な役割を果たしていることが知られている。またその増殖は、糸球体腎炎や糸球体硬化症などの糸球体疾患の発症における主要な要因であると考えられている。そして、メサンギウム細胞は、各種腎炎において障害の標的となっている。例えば、メサンギウム細胞の増殖や細胞外メサンギウム基質の蓄積は、末期腎不全の２大原因である慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症のような種々の糸球体障害を有する患者に糸球体硬化症をもたらす最初の過程とされている（Ｄ．Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，第４９巻，１５８３−１５８５頁，１９９６年；Ｒ．Ｂ．Ｓｔｅｒｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５９５−６２６頁，１９９７年）。従って、メサンギウム細胞で特異的に発現している遺伝子を見いだし、その発現の調節機構や腎疾患における病態との関連性を明らかにすることは、メサンギウム細胞の生物学的性質の解明、メサンギウム細胞に関連する疾患の原因の究明、更にはメサンギウム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効であると考えられる。
また、メサンギウム細胞の増殖の激しいＩｇＡ腎症に対しては、近年、ステロイド剤の有効性が報告されている（Ｊ．Ｖ．Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，第８巻，１３２４−１３３２，１９９７）。しかしステロイド剤は、一方で重篤な副作用の発現も見られることから、ステロイド剤が無効のＩｇＡ腎症に漫然とステロイド剤を投与することは避けなければならない。したがって、ステロイド療法においては、メサンギウム細胞の増殖の程度等の組織重傷度とのマッチングが必須であり、そのためにもメサンギウム細胞の増殖の程度を簡便に評価できる腎機能検査法が望まれていた。
本発明者は、腎疾患の発症およびその亢進に関連してメグシンタンパク質遺伝子の発現が増加し、それに伴ってメグシンタンパク質の産生が増大すれば、尿中あるいは血中へメグシンタンパク質が漏出し、しかもその漏出量は病態の進行に伴って増加するのではないかと考えた。そしてこのメカニズムを確かめるために、様々な生体試料中のメグシンタンパク質濃度、あるいはその量の測定と比較を試み、その測定値に基づいてメグシンタンパク質が関与した腎疾患の状態を評価し得ることを見出し本発明に到達した。すなわち本発明は、以下の腎機能評価方法と、そのための試薬、あるいは試薬キットに関する。
〔１〕生体試料中のメグシンタンパク質を測定することからなる、腎機能評価方法。
〔２〕生体試料中のメグシンタンパク質を測定し、正常な試料のメグシンタンパク質の測定値と比較することからなる、〔１〕に記載の腎機能評価方法。
〔３〕生体試料が尿である〔１〕に記載の腎機能評価方法。
〔４〕生体試料中のメグシンタンパク質を、抗メグシンタンパク質抗体を用いた抗原抗体反応によって測定することを特徴とする〔１〕に記載の腎機能評価方法。
〔５〕抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、〔４〕に記載の腎機能評価方法。
〔６〕抗メグシンタンパク質抗体を含む腎機能診断用試薬。
〔７〕抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、〔６〕に記載の腎機能診断用試薬。
〔８〕固体顆粒の表面に、抗メグシンタンパク質抗体を結合した、生体試料中に含まれるメグシンタンパク質検出用顆粒。
〔９〕固体顆粒が磁性を有するものである、〔８〕に記載のメグシンタンパク質検出用顆粒。
〔１０〕固体顆粒の比重が１以上である、〔８〕に記載のメグシンタンパク質検出用顆粒。
〔１１〕抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である、〔８〕に記載のメグシンタンパク質検出用顆粒。
〔１２〕下記工程を含むことを特徴とする、生体試料中に含まれるメグシンタンパク質の検出方法。
ｉ）固体顆粒の表面に第１の抗メグシンタンパク質抗体を結合したメグシンタンパク質検出用顆粒を生体試料と接触させる工程
ｉｉ）生体試料を接触させた前記メグシンタンパク質検出用顆粒に、標識分子を結合した第２の抗メグシンタンパク質抗体を接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記第２の抗メグシンタンパク質抗体を介してメグシンタンパク質と結合している前記標識分子を検出する工程
〔１３〕第１の抗メグシンタンパク質抗体、および第２の抗メグシンタンパク質抗体がモノクローナル抗体である〔１２〕に記載の検出方法。
〔１４〕第１の抗メグシンタンパク質抗体および第２の抗メグシンタンパク質抗体が異なる認識部位を有する抗メグシンタンパク質抗体である〔１３〕に記載の検出方法。
〔１５〕生体試料が尿である〔１２〕に記載の検出方法。
〔１６〕生体試料が血液である〔１２〕に記載の検出方法。
〔１７〕以下の要素を含むメグシンタンパク質検出用キット。
ａ）抗メグシンタンパク質抗体を結合するための磁性固体顆粒、
ｂ）前記磁性個体粒子に予め固定されるか、または間接的に固定することができる抗メグシンタンパク質抗体、および
ｃ）磁石
〔１８〕さらに標識分子を結合した抗メグシンタンパク質抗体を含む、〔１７〕に記載のメグシンタンパク質検出用キット。
メグシンタンパク質は、先に述べたようにヒト腎メサンギウム細胞で高度に発現している遺伝子によってコードされるタンパク質として単離された。本発明におけるメグシンタンパク質には、配列番号：２に示すアミノ酸配列を持つタンパク質（ヒト・メグシンタンパク質）のみならず、その機能的に同等なタンパク質をも含まれる。機能的に同等なタンパク質としては、たとえばヒト以外の種におけるメグシンタンパク質のホモログを示すことができる。あるいは、生体試料中に見出すことができ腎機能の指標とすることが可能であれば、それらの前駆体や断片のほか、メグシンタンパク質とプロテアーゼの複合体を指標とすることも可能である。ヒト以外の種におけるメグシンタンパク質のホモログは、その種における腎機能の評価の指標とすることができる。したがって、腎機能障害のモデルにおける病態の把握に有用である。
ヒト以外の種に由来するメグシンタンパク質のホモログは、たとえば次のようにして得ることができる。配列番号：１に示すヒトのメグシンタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を元に、ＯＲＦの前後にディジェネレーティブプライマーを設定し、これを利用したＰＣＲによってホモログのｃＤＮＡを増幅する。増幅されたｃＤＮＡが完全長でない場合には、５’ＲＡＣＥ法などによって更に上流の塩基配列を明らかにすることができる。たとえばラットにおいては、培養メサンギウム細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行う。このときに用いるディジェネレーティブプライマーとしては、たとえば次の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。このＰＣＲによって得られるクローンを配列決定すれば、ラットにおけるメグシンタンパク質のホモログの構造の一部を明らかにすることができる。
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅプライマーＦＹ：ＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＮＴＧＮ／配列番号：３（１７２ＶＮＡＶＹＦＫＧＫ１８０に相当）、
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅプライマーＲ２１：ＡＡＮＡＧＲＡＡＮＧＧＲＴＣＮＧＣ／配列番号：４（Ｒは、ＡまたはＧ：３５７ＡＤＨＰＦＬＦ３６３に相当）  しかしこのプライマーの組み合わせではｃＤＮＡの一部しか増幅することはできないので、更に５’側の領域を得るためには、ラットメグシンタンパク質のクローン断片から遺伝子特異的プライマーを調製し、再度ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲを行う。このときに利用するメグシンタンパク質のＮ末端付近のアミノ酸配列に相当するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅプライマーＲＭ−ＣｔｅｒｍＣ１：ＡＴＧＧＣＮＴＣＮＧＣＮＧＣＮＧＣＮＧＣＮＡＡＹＧＣ／配列番号：５（ＹはＴまたはＣ、メグシンタンパク質をコードする配列のＮ−末端に対応する）
ＲＭ−ＭＲ−Ａ２：ＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧ／配列番号：６
ＲＭ−ＭＲ−Ａ１：ＧＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣ／配列番号：７
（いずれもラットメグシンタンパク質特異的ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである）  得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ製）に組み込み、その塩基配列を明らかにすればラットのホモログをコードするｃＤＮＡの３’領域を得ることができる。こうして得られた塩基配列を基にデザインされたプライマーを使って、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ法を行えば、最終的にはホモログをコードするｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定することができる。なおラットの場合、５’−ＲＡＣＥには、２種の遺伝子特異的アンチセンスプライマーＲＭ−ＰＲＯ１：ＧＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡ／配列番号：８およびＲＭ−ＰＲＯ２：ＣＴＧＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣ／配列番号：９を用いることができる。一方、３’−ＲＡＣＥには、遺伝子特異的センスプライマーＲＭ−ＭＲ−Ｓ３：ＧＡＧＧＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣ／配列番号：１０を使用することができる。マウスにおいても、同様の手法によってホモログの単離が可能である。配列番号：１８（ラット）および配列番号：２０（マウス）に示したラットとマウスにおけるメグシンｃＤＮＡの塩基配列は、このような手法に基づいて明らかにされたものである。
本発明において用いられるメグシンタンパク質の測定法は制限されない。たとえば、メグシンタンパク質に対する抗体と、メグシンタンパク質との免疫学的反応を応用した免疫学的測定方法は特異性と感度の点で優れている。このような例としては、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光分析、エンザイムイムノアッセイ、化学発光分析、イムノヒストケミスト（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔ）分析が包含される。またメグシンタンパク質に対する抗体を利用して、ウエスタンブロット法によりメグシンタンパク質を測定することもできる。また、これらのイムノアッセイは、例えば免疫沈降とその後のウェスタンブロット法のように組み合わせて用いることもできる。これらの分析手段は、当該技術分野において公知である。
イムノヒストケミスト（免疫組織染色）とは、分離したヒトの細胞あるいはその破砕液、組織あるいはその破砕液、血清、胸水、腹水、眼液などに本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。各標識物質は、ビオチン化した抗体にストレプトアビジン結合標識物質を結合させることによって間接的に標識することもできる。その他メグシンタンパク質がプロテアーゼインヒビターであることから、プロテアーゼの阻害活性を指標として検出することが可能である。あるいは、プロテアーゼに対する親和性を利用してメグシンタンパク質の測定を実施することができる。
メグシンタンパク質の免疫学的な測定方法に必要な抗体は、検出対象であるメグシンタンパク質を認識することができるものであれば、その由来や調製方法は限定されない。したがって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、あるいはそれらの混合物等を利用することができる。また、抗体分子の可変領域を含む断片を利用することもできる。メグシンタンパク質の抗体は、たとえば以下のようにして得ることができる。本発明に用いる抗体には、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体が含まれる。メグシンタンパク質またはその部分アミノ酸配列に対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）、あるいは抗血清は、メグシンタンパク質、その部分アミノ酸配列を含むオリゴペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６−Ｔａｇ−メグシンタンパク質やＭＢＰ−メグシンタンパク質のような融合タンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。なお部分アミノ酸配列を有する合成ペプチドを免疫原とする場合には、できるだけメグシンタンパク質に特異的に存在し、かつ親水性の高い部分のアミノ酸配列を利用するのが一般に有利である。このようなアミノ酸配列としては、実施例で利用した配列番号：１１〜配列番号：１７に示すようなアミノ酸配列を挙げることができる。これらのアミノ酸配列の中でも、特に配列番号：１２（ヒト）、配列番号：１４（ヒト）、あるいは配列番号：１７（ラット）に示したアミノ酸配列は、糸球体組織に対する良好な反応性を持った抗体を与えた。
本発明のメグシンタンパク質、または本発明のメグシンタンパク質の部分アミノ酸配列を有する合成ペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または担体、希釈剤と共に投与される。合成ペプチドは、ウシチログロブリンやキーホールリンペットヘモシアニンのような担体タンパク質と結合させたものを免疫原として使用する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントとともに投与することができる。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後述の標識化メグシンタンパク質と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。
本発明によるモノクローナル抗体は、メグシンタンパク質に特異的なエピトープを認識するものを選択することによって他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的に、そのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも７以上のアミノ酸残基、望ましくは１０〜２０アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるエピトープは、そのタンパク質に固有のエピトープを示すといわれている。したがって、たとえば配列番号：２（ヒト）、配列番号：１９（ラット）、および配列番号：２１（マウス）のいずれかに記載されたアミノ酸配列から選択され、かつ連続する少なくとも７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、メグシンタンパク質特異的なモノクローナル抗体といえる。配列番号：２、配列番号：１９（ラット）、および配列番号：２１（マウス）に記載されたアミノ酸配列の間で保存されたアミノ酸配列を選べば、メグシンタンパク質ファミリーに共通のエピトープを選択することができる。あるいは各配列に特異的なアミノ酸配列を含む領域であれば、種間の識別が可能なモノクローナル抗体を選択することができる。
抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えばＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテインＡまたはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を示すことができる。
このようにして得られたメグシンタンパク質を認識するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体は、メサンギウム細胞に関連する疾病の診断等に利用することが可能である。これらの抗体を用いてメグシンタンパク質を測定する方法としては、不溶性担体に結合させた抗体と、標識分子を結合した標識化抗体とによりメグシンタンパク質を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識ヒト尿由来メグシンタンパク質と検体中のヒト尿由来メグシンタンパク質を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のヒト尿由来メグシンタンパク質を測定する競合法を利用して検体中のヒト尿由来メグシンタンパク質を測定することができる。
サンドイッチ法によるヒト尿由来メグシンタンパク質の測定においては、まず、固定化抗体とヒト尿由来メグシンタンパク質とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体−ヒト尿由来メグシンタンパク質標識化抗体を形成させる２ステップ法若しくは固定化抗体、標識化抗体及びヒト尿由来メグシンタンパク質を同時に混合する１ステップ法などを用いることができる。
測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属などが挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えば粒子状、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。
一方、ヒト精子の受精能を評価するための試薬として、固体顆粒の表面に、先体反応後のヒト精子と特異的に反応するモノクローナル抗体を結合してなる、精子受精能検出用顆粒が知られている（特許第２６５１２４９号）。この検出用顆粒は、先体反応後のヒト精子と特異的に反応するモノクローナル抗体を固体顆粒に結合させてものである。これに精子を結合させて、結合した精子を計数することにより、ヒト精子の受精能を評価することができる。放射能、蛍光などの煩雑な測定手段を必要とせず、短時間で容易・確実に受精能の試験が可能である。また、磁性を有する固体顆粒を用いる場合は、磁石により容易に固体顆粒を集束させることができ、微量サンプルの測定も可能となる。本発明者は、この技術をメグシンタンパク質の検出に適用することにより、より簡便かつ正確なメグシンタンパク質の検出が可能になることを見出した。
抗体の固相化は、公知の化学結合法又は物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ−スクシニイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート及びＮ−スクシニイミジル−２−マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸などを用いるカルボジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固相化させておいて捕捉することも可能である。
標識物質は、免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。具体的には、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、金属キレート等を使用することができる。好ましい標識酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。好ましい蛍光物質としては、例えはフルオレセインイソチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびオルトフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましい発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリン等が挙げられる。そして好ましい放射性物質としては、１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、あるいは３５Ｓ等が挙げられる。
前記標識物質を抗体に結合する手法は公知である。具体的には、直接標識と間接標識が利用できる。直接標識としては、架橋剤によって抗体、あるいは抗体断片と標識とを化学的に共有結合する方法が一般的である。架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−オルトフェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，４’−ジチオピリジン、その他公知の架橋剤を利用することができる。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。この他、抗体にビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサール又はフルオレサミンのような低分子ハプテンを結合させておき、これを認識する結合成分によって間接的に標識する方法を採用することもできる。ビオチンに対してはアビジンやストレプトアビジンが認識リガンドとして利用される。一方、ジニトロフェニル、ピリドキサール又はフルオレサミンについては、これらのハプテンを認識する抗体が標識される。
抗体を標識する場合、西洋わさびペルオキシダーゼを標識化酵素として用いることができる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができるので有利である。また、抗体としては場合によっては、そのフラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体はアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、防腐剤としてチメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）等を、そして安定剤としてグリセリン等を加えて保存する。標識化抗体は、凍結乾燥して冷暗所に保存することにより、より長期にわたって保存することができる。
標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質溶液としてＨ２Ｏ２を用い、発色剤として２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を使用することができる。酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質としてオルトニトロフェニルフォスフェート、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができる。酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明は、また、前述のモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体を標識して、あるいは固相化してメグシンタンパク質の免疫学的測定用試薬としたもの、更にはこの試薬に標識検出用の指示薬や対照試料等をキット化したのものをも含むものである。
本発明におけるメグシンタンパク質の測定対象は、血漿、血清、血液、尿、組織液、あるいは脳脊髄液等の体液等、メグシンタンパク質、あるいはメグシンタンパク質の前駆体や断片を含む生体試料であれば限定されない。これらの生体試料の中でも特に尿においては、メサンギウム細胞の増殖や活性化に伴って高い頻度でメグシンタンパク質が検出されるようになる。したがって、尿中メグシンタンパク質の測定は、ＩｇＡ腎症などのメサンギウム増殖性腎症のマーカーとして有用である。
本発明において腎機能の評価とは、腎臓組織を構成する重要な細胞であるメサンギウム細胞の状態を把握し、メサンギウム細胞に異常を生じる腎疾患の有無、あるいはその程度を知ることを意味する。本発明における腎疾患とは、メサンギウム細胞に異常を伴う全ての疾患を包む。具体的には、ＩｇＡ腎症、急性糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、およびループス腎炎などが挙げられ、かかる腎疾患により変化した腎機能の状態が本発明の方法によって評価することができる。本発明による腎機能の評価方法は、これらの疾患の中でもＩｇＡ腎症のようなメサンギウム細胞増殖性腎症のマーカーとして特に有用である。また、本発明の腎機能評価方法は、腎疾患の有無や程度の判定の他、治療効果の評価や予後の判定に適用することができる。更に、本発明による腎機能の評価方法によれば、尿タンパクの検査で陽性を示す検体についてメグシンタンパク質の量を測定することにより、メサンギウム細胞の増殖に起因しない急性腎孟腎炎、慢性腎孟腎炎、微小変化型ネフローゼ症候群、慢性糸球体腎炎、および腎アミロイドーシスなどの疾患を除外することができる。
本発明に基づいて、腎機能の評価を行うには、腎機能を評価すべき個体の生体試料を採取し、これに含まれるメグシンタンパク質の濃度を先に述べたような方法に基づいて測定する。そして望ましくは、濃度と体液の体積とからメグシンタンパク質の量を明らかにし、正常者の値と比較する。メグシンタンパク質の量を求めるには、尿を試料として用いる場合には、たとえば１日分の尿をプールして尿量を測定すれば、尿における１日あたりのメグシンタンパク質の量を明らかにすることができる。あるいは、随時尿を試料とした場合であっても、クレアチニン補正によって量に相当する値を推定することもできる。クレアチニン補正とは、クレアチニンの濃度に基づいて尿量の変動による測定対象成分の希釈（または濃縮）の影響を補正する手法である。１日当たりの尿へのクレアチニン排泄量が一定であることに基づいて、クレアチニンの濃度から随時尿が１日における尿の総排泄量に占める割合を算出し、同じ尿から得られた測定対象成分の濃度を１日当たりの総排泄量に換算することができる。また血液においては、体重補正などの腎機能診断の際に一般的に使用される数値補正を適用して量の推定が可能である。体重補正とは、血液を採取した個体の体重から推測される血液の体積に基づいて、血液中成分の量を算出する手法である。
この他に、ある個体に由来する生体試料のメグシンタンパク質濃度の変動を観察すれば、量への換算を行わなくても腎機能の変化を経時的に追跡することができる。あるいは、特定の種、あるいは人種などの集団における体液試料のメグシンタンパク質濃度の正常値を予め設定しておき、特定の個体のメグシンタンパク質濃度（または量）と比較することにより、腎機能の異常の有無を知ることもできる。
本発明において、生体試料としては、尿や血液を用いることができる。中でも尿は、非侵襲的に採取することができ、腎機能の状態を直接的に反映する好ましい試料である。血液の採取は若干の侵襲を伴うものの、メグシンタンパク質が腎臓に特異的なタンパク質であることから、その測定値の異常は、腎機能の異常と密接に関連している。したがって、腎機能の指標として高い特異性を期待することができる。たとえば、現在広く行われている尿タンパク質を指標とする腎機能障害のスクリーニングに比べ、メグシンタンパク質を指標とすることで、より特異的で感度に優れるスクリーニングが期待できる。以下に、モノクローナル抗体を利用したメグシンタンパク質の免疫学的な測定方法に基づいて尿中のメグシンタンパク質を測定し腎機能を評価するための具体的な操作について詳細に説明する。
（Ａ）抗体の製造
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
動物の免疫は、例えば次のように行う。公知の方法（例えば、Ｔ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，第１２０巻，８２８−８３６頁，１９９８年）に従って精製したヒトメグシンタンパク質をラット、マウスなどの哺乳類動物に免疫する。哺乳類動物は細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞と同系統の動物を用いるのが好ましい。動物の週令は、例えばマウスでは８〜１０週令が好適である。性は雌雄何れでも構わない。免疫の方法は、精製したヒトメグシンタンパク質を適当なアジュバント（例えばフロイント完全アジュバントまたは水酸化アルミニウムゲル−百日咳菌ワクチンなど）と混合しエマルジョンとした後、動物の皮下、腹腔内、静脈内などに投与する。以後、この免疫操作を１〜２週間間隔で２〜５回行う。最終免疫は、０．５〜２μｇのヒトメグシンタンパク質を動物の腹腔内に投与することにより行う。このようにして免疫した動物の体液からは、ポリクローナル抗体が得られる。各免疫操作後３〜７日後に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を以下に示すプロテインＡロゼットアッセイ法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第４巻，５００−５０７頁，１９７４年）により測定し、抗体価が充分上昇したとき、抗体または抗体産生細胞を採取する。
プロテインＡロゼットアッセイ法は、例えば、７２穴のテラサキプレート（ファルコン製）にヒト赤芽球性細胞株Ｋ５６２（ジャパニーズ・キャンサー・リサーチ・リソーシズ・バンク（ＪＣＲＳ）製）をコートし、ＰＢＳ（リン酸二ナトリウム２．９０ｇ、リン酸一カリウム０．２０ｇ、塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、蒸留水１Ｌ）で希釈した試料を加え、ＣＯ２インキュベーター内に３７℃で３０分間放置する。そして、ＰＢＳで洗浄後、プロテインＡ（アマジャム・ファルマシア・バイオテク製）をコートしたヒツジ赤血球を加えてロゼットの形成を顕微鏡で観察することによって実施される。
上記のようにヒトメグシンタンパク質で免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血などから得ることができるが、特に脾臓が好ましい。例えば、最終免疫の３〜４日後に脾臓を無菌的に摘出し、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（日水製薬製）中で細断し、ピンセットで解し、１２００ｒｐｍ×５分間の条件で遠心分離させた後、上清を除き、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を除去し、さらにＭＥＭ培地で３回洗浄して細胞融合用脾臓細胞を得る。
（２）永久増殖性細胞の調製
融合される相手方の永久増殖性細胞には、永久増殖性を有する任意の細胞を用いることができるが、一般的には骨髄腫細胞が用いられる。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と同種の動物由来のものを用いるのがよい。例えばマウスの場合、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）由来骨腫瘍細胞株として次のような細胞株が知られている。
Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第８１巻，１−７頁，１９７８年）、
Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第６巻，５１１−５１９頁，１９７６年）、
ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，第２７６巻，２６９−２７０頁，１９７８年）、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１２３巻，１５４８−１５５０頁，１９７９年）、および
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５−４９７頁，１６７５年）
これらの永久増殖性細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＣＬＳ製）（１０％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地）で継代培養し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（３）細胞融合
細胞融合は例えば次のように行う。（１）で得られた抗体産生細胞と（２）で用意した永久増殖性細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が５〜１０：１の比になるように混合する。１２００ｒｐｍ×５分間遠心分離した後、上清を除き、沈殿した細胞群をよく解した後、攪拌しながら３７℃に保ちつつ、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．５〜１．０ｍＬの混液０．１〜１．０ｍＬ／１０８個細胞を加えて細胞融合を起こさせる。その後、１０分毎にＭＥＭ培地３ｍＬを数回添加し、ＭＥＭ培地を全量が５０ｍＬになるように加えて希釈し、細胞融合を停止させる。次に、遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分間）して上清を除去し、緩やかに細胞を解した後、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＣＳ）１００ｍＬを加え、メスピペットによるピペッティングで緩やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を９６ウエルの培養用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３〜５日間培養する。培養プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌのＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を添加した培地）を加え、さらに３日間培養する。以後３日間毎に培養上清の半容量を除去し、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で約２週間培養する。
（４）ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
融合細胞がコロニー状に生育しているのが認められるウエルについて、上清の半容量を除去し、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）を同量加え、４日間培養する。培養上清の一部を採取し、前述のプロテインＡロゼットアッセイ法によりメグシンタンパク質に対する抗体価を測定する。抗体価は、例えばメグシンタンパク質抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したメグシンタンパク質を加え、固相に結合した抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体を検出する方法等によって確認することもできる。
メグシンタンパク質に反応する抗体の産生が観察されたウエルにつき、限界希釈法によりクローニングを４回繰り返し、安定したメグシンタンパク質の抗体価を示すものを抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製
上記のようにして得られたハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで培養することによりモノクローナル抗体を産生させる。ｉｎ  ｖｉｖｏで培養する場合、任意の動物にハイブリドーマを移植するが、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物と同種の動物を使用するのが好ましい。例えば、プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン−プリスタン−０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する。）をした８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに（４）で得られた抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の２〜４×１０６個／匹腹腔内投与する。２〜３週間でマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してくる。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×５分間）して固形分を除去し、ＩｇＧを精製する。一方ハイブリドーマのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養は、好ましくは無血清培地中で行われ、至適量の抗体をその上清に与える。腹水や培養上清を５０％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、ＰＢＳで１〜２週間透析する。この透析画分をプロテインＡセファロースカラムに通し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得る。
抗体のイソタイプは、オクタロニィ（二重免疫拡散）法（免疫学実験入門，生物化学実験法１５，学会出版センター刊，７４頁，１９８１年）により決定した。タンパク質量は、フォーリン法および２８０ｎｍにおける吸光度（１．４（ＯＤ２８０）≒イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ）により算出する。
（６）モノクローナル抗体の特性
上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性は、例えば、（１）細胞表面をヨウ素ラベルしたＨＳＢ−２、Ｋ５６２などのヒトリンパ球由来の細胞株を用いる免疫沈降反応（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１３８巻，２８５０−３８５５頁，１９８７年）および（２）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１４２巻，２７４３−２７５０頁，１９８９年）等により明らかにすることができる。
（７）標識結合モノクローナル抗体の調製
得られた精製モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒド法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．，第６巻，４３頁，１９６９年）、過ヨウ素酸法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，第２２巻，１０８４頁，１９７４年）、マレイミド法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第７９巻，２３３頁，１９７６年）、ピリジル・ジスルフィド法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第１７３巻，７２３頁，１９７８年）などの方法により、酵素標識することができる。
例えば、過ヨウ素酸法を用いた場合、ペルオキシダーゼ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）に５０μＬの過ヨウ素酸（３８．５ｍｇ／ｍＬ）を攪拌しながら加え、室温で２０分間反応させた後、１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に置換したＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いて緩衝液交換を行う。次に０．２Ｍの水酸化ナトリウム４０μＬを加える。これに１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析したモノクローナル抗体１０ｍｇを加え、室温で２時間反応する。反応終了後、氷冷し、１００μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を加え２時間反応させる。反応液をＰＤ−１０を用いてＰＢＳに交換した後、３０００ｒｐｍ×３０分間遠心分離し、上清をセファクリルＳ２００ＨＲ２６×３０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク製）を用いてゲル濾過して、４０３および２８０ｎｍの吸光度を測定し標識モノクローナル抗体の画分を分取する。得られた分画にウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、−２０℃で保存し、使用直前にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で希釈する。
（Ｂ）検出用顆粒の製造
この発明で使用する検出用顆粒は、適当な顆粒、例えばクロマト用ゲルに、物理的または化学的に抗メグシンタンパク質抗体を結合させることによって製造することができる。化学的に活性化した顆粒に、本発明で用いる抗体を結合させる方法は、結合安定性を期待できることから望ましい結合方法である。具体的には、ｐ−トルエンスルフォニルクロライドによってトシル化活性された顆粒に、本発明で用いる抗体を結合させる方法を示すことができる。
顆粒としては、ガラス、アガロース、セファロース、アガロース充填多孔性珪藻上、親水性共重合アクリルゲル、ポリスチレン等からなる顆粒が用いられる。磁性を有する顆粒を使用すれば、磁石等を用いて顆粒を集束することができるので、微量サンプルの測定が可能となる。たとえば可磁性物質（例えばＦｅ２Ｏ３）をコア内に含ませることにより超常磁性を持たせた顆粒とすることができる。このような顆粒は、免疫学的分析用の固相として市販されている。顆粒の形状は球形、不定破砕形等任意であるが、球形が好ましい。粒径は特に制限されず、例えば平均粒径５〜１０００μｍを示すことができる。また、反応液の比重（約１）よりも比重の大きな顆粒を用いた場合も顆粒の集束が容易となり、磁性を有する顆粒を用いたときと同様の効果が得られる。さらにこの場合、顆粒を集束するための遠心分離の条件を緩やかにできるため、結合が外れ易い抗体を使用する際にも有利である。
顆粒への抗メグシンタンパク質抗体の結合は、直接的な結合のみならず間接的な結合を利用することもできる。たとえば、マウスのモノクローナル抗体を用いる場合であればマウスのＩｇＧを認識する抗体を顆粒に結合し、間接的に顆粒上にマウスの抗体を結合することができる。このような抗体は二次抗体と呼ばれている。間接的な結合には、二次抗体の他、イムノグロブリンの定常領域を結合するプロテインＡやプロテインＧの利用、あるいはビオチン化した抗体をアビヂンを固定した顆粒で捕捉する方法等を応用することもできる。上記のような顆粒に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧを化学的に結合させるには、顆粒を活性化させてから結合させるのが好ましい。顆粒の活性化は、この種の顆粒にタンパク質を結合させる際の任意の活性化法を選択することができる。このような活性化法には、トシルクロライド法、ブロムシアン法、ブロムアセチル法、グルタールアルデヒド法等がある。活性化顆粒の中には市販されているものもある。このような活性化、および活性化顆粒と二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ等のタンパク質との結合は、常法によって行うことができる。
また、既に二次抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ等を結合した顆粒も市販されている。市販の顆粒としては、たとえば次のようなものが知られている。日本ダイナル株式会社輸入、株式会社ベリタス販売のダイナビーズ（登録商標）  Ｍ−４５０、Ｍ−２８０
ヒツジ抗マウスＩｇＧコートタイプ
ヤギ抗マウスＩｇＧコートタイプ
ヒツジ抗ラットＩｇＧコートタイプ
ヒツジ抗家兎ＩｇＧコートタイプ
ポリサイエンス・インコーポレイティッド製
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ
ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ
プロテインＡカルボキシレートビーズ
ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル
ヤギ抗家兎ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル
プロテインＡミクロマグネットパーティクル
ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）ミクロマグネットパーティクル
上記のような顆粒に本発明で用いる抗体を結合させるには、適当な媒質中で懸濁した顆粒をタンパク質溶液で処理して非特異的吸着を防止した後、抗体を含む腹水または精製した抗体の溶液を混合する。
（Ｃ）検出法
本発明の検出法を実施するには、被験者から血液または尿を採取し、遠心分離後の上清を検体とする。尿の遠心分離は沈殿を分離するために行うもので、静置後の上清やろ過によって沈殿を除いた尿試料を利用することもできる。前記のようにして製造した検出用顆粒に希釈した検体および（７）で得られた標識結合抗体を加え、室温で２時間インキュベーションする。反応終了後、洗浄し、基質液を加えて発色後、遠心分離して顆粒を除去し、上清をマイクロプレートに移し、吸光度を測定する。同様に正常者の検体も測定し、値を比較する。値の比較にあたっては、単にメグシンタンパク質の濃度としての比較の他に、その個体の体液の体積を乗じて得ることができるメグシンタンパク質の体液中の絶対量、あるいはそれに類する補正値に基づく比較を行うこともできる。
（Ｄ）キット
上記の試験を実施するために必要な材料は、キットとして供給することができる。このようなキットは、前述した抗体を固定化した検出用顆粒および磁石を含むことができる。さらに標識分子を結合した抗体を含むこともできる。そのほか、本発明によるキットには、試験管、遠心管、その他類似の容器、ピペットまたは類似の吸引器具、あるいは顕微鏡を含ませることができる。あるいはまた、標識を検出すために必要な酵素基質、陽性や陰性の標準試料などを組み合わせることもできる。なお上記検出用顆粒の代わりに、その製造原料となる固体顆粒と抗体の組合せとすることもできる。以下、この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］メサンギウム細胞
タカラ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入したヒトのメサンギウム細胞、およびＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。ヒトのメサンギウム細胞は７−１０代継代して以下の実験に用いた。
［実施例２］メグシンタンパク質の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体の製造
他のセルピンファミリーとの相同性が低く、かつ親水性を有する領域を免疫原として利用し、メグシンタンパク質に対するポリクローナル抗体を製造した。具体的には、ヒト（配列番号：２）およびラット（配列番号：１９）のメグシンを構成するアミノ酸配列から、次のアミノ酸配列を免疫原として選択した。
0004567890.tif 000002
上記アミノ酸配列のＮ末端（ペプチド３のみＣ末端）にＣを付加したペプチドを、自動合成装置モデル４３２Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。合成ペプチドは逆相ＨＰＬＣで精製後、凍結乾燥して、免疫および、免疫学的特異性の確認のための競合実験に用いた。
各合成ペプチドとウシチログロブリン（シグマ社製）をＮ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（同仁化学研究所製）を用いて結合させ、０．８５％ＮａＣｌ溶液にて透析後、アジュバント（Ｄｉｆｃｏ製）と充分混和し乳化させ、ウサギ皮下に投与した。初回免疫（２０μｇ／羽）後３週間後に２回目（５０μｇ／羽）の免疫を行い、以後２週間毎に４回免疫（５０、１００、２００μｇ／羽）を行った。アジュバントは初回のみフロインド完全アジュバントで、２回目以降はフロインド不完全アジュバントを用いた。４１日後、５５日後、採血で得た血清が合成ペプチドと反応することを確認するため、血清の抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。抗原５０ｎｇ／ｗｅｌｌを固相化した９６穴プレートに連続的に希釈した抗血清を各ウェルに１００μＬ加えて一次反応を行い、洗浄後、二次反応としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カッペルプロダクト製）を反応させた。洗浄後、基質としてオルトフェニレンジアミン（和光純薬製）を用い発色させ吸光度４９２ｎｍで測定し、抗体価が上昇していることを確認した。
［実施例３］メグシンタンパク質の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体の精製法
メグシンタンパク質の各合成ペプチドに対するポリクローナル抗体は、公知の方法（細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ  抗ペプチド実験プロトコール、秀潤社）に従ってイムノアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。操作は、次のとおりである。各合成ペプチドをＦＭＰ（２−ｆｌｕｏｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｏｌｕｅｎｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）活性化セルロファイン（生化学工業製）に固定化し、アフィニティーカラムを作製した。抗体は、メグシンタンパク質を免疫し抗体価の上昇したウサギ血清をＰＢＳ（−）で希釈したのち、ペプチドカラムを用いてアフィニティー精製した。得られた精製抗体はウエスタンブロットによりメグシンタンパク質融合タンパク質と反応することを確認し、メグシンタンパク質に特異的であることを証明した。（図１−図４）
［実施例４］ラットメグシン合成ペプチドに対する抗体の調製
各ラットメグシン合成ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ−Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）と結合させた。すなわち、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁したＫＬＨを、ジメチルホルムアミドに溶解したｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）と室温で３０分間撹拌することにより反応させた。反応物を０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、ＫＬＨ−ＭＢとした。更に得られたＫＬＨ−ＭＢを蒸留水に懸濁した前記ペプチドとインキュベートした。半量の０．２Ｍのリン酸水素２ナトリウムをＫＬＨ−ＭＢに加え、３時間室温で撹拌した。反応後、リン酸ナトリウム緩衝液に対して透析し、最後に凍結乾燥した。
得られたＫＬＨ結合合成ペプチドを、アジュバントとともにウサギに免疫した。アジュバントは初回のみフロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）で、２回目以降はフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて２−３週おきに５回免疫した。プロテインＡアフィニティカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で抗血清からＩｇＧを精製した。免疫したウサギからは免疫前の血清も採取して同様にＩｇＧを精製した。
［実施例５］ウサギポリクローナル抗メグシンペプチドＩｇＧの反応性の検討
以下のような各種タンパク質を抗原として用い、メグシンペプチドを免疫原とするウサギＩｇＧの反応性を確認した。まずＭＢＰ−メグシンタンパク質とＨｉｓ−メグシンタンパク質は次のように調製した。すなわち、まず配列番号：１に示すメグシン遺伝子の塩基配列に基づいてそのコード領域をＰＣＲによって増幅した。この増幅産物を、マルトース結合タンパク質融合タンパク質発現用ベクター、ｐＭＡＬ−ｃ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）に組み込むことによってＭＢＰとメグシンタンパク質との融合タンパク質を発現するベクターを得た。このベクターで大腸菌を形質転換し、その細胞破壊液からアミロース樹脂等を利用したアフィニティクロマトグラフィーによって発現産物を精製しＭＢＰ−メグシンタンパク質とした。他方Ｈｉｓ−メグシンタンパク質を得るために、ヒスチジンタグとの融合タンパク質としてインサートを発現するベクターｐｔｒｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に前記メグシン遺伝子の増幅産物を組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ＩＰＴＧで発現を誘導後に細胞破砕液からニッケルカラム等によって精製した融合タンパク質としてＨｉｓ−メグシンタンパクを得た。
次に以下のようにして、ＣＨＯ細胞で組み換えメグシンを発現させた。ＰＣＲを使った変異導入によって、メグシンｃＤＮＡの全長コード領域のＮ末端側にｃ−ｍｙｃタグ、およびヒスチジンタグを連結した。タグ結合メグシンｃＤＮＡを、哺乳動物細胞発現ベクターｐＲＥＰ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。６ウエルプレートに捲いて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養したＣＨＯ細胞（１０５細胞）に、ヒト・メグシンｃＤＮＡを含むｐＲＥＰ９をＬｉｐｏｆｒｃｔＡＭＩＮＥ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使って形質転換した。安定な形質転換体を０．５ｍｇ／ｍｌのｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  ｄｉｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬製）で選択した。そして（Ｈｉｓ）６アフィニティカラムで培養上清から、ｃ−ｍｙｃ−ヒスチジンタグ結合メグシン組み換え体（ＣＨＯメグシン）を精製した。
またメグシンタンパク質（＋）ウイルス感染カイコ体液とは、公知の方法（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第７８巻、３０７３−３０８０頁、１９７９）に従ってメグシン遺伝子導入ウイルスを感染させたカイコの体液である。一方、メグシンタンパク質（−）ウイルスとは、メグシン遺伝子を導入していないウイルスベクターのみを感染させたカイコの体液である。これらの各種メグシン組み換え体の構築に必要なメグシンをコードする遺伝子は、ＰＣＲによってメサンギウム細胞のｍＲＮＡを鋳型として合成することもできるし、あるいは本発明者が構築したメグシン遺伝子クローニングベクター（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５１８）から得ることもできる。
その他、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ  Ｉ）、ＭＢＰ−プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−２融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＡＩ  ＩＩ）等に対する反応性も観察した。これらのタンパク質は、メグシンタンパク質とある程度の相同性を持つタンパク質で、抗体の交差反応性の確認を目的として選択した。
ＭＢＰ−メグシンタンパク質、
Ｈｉｓ−メグシンタンパク質、
ＭＢＰ−ＰＡＩ  ＩＩ、
ＰＡＩ  Ｉ、
ＣＨＯ細胞で発現させたメグシンタンパク質、
メグシンタンパク質（＋）ウイルス感染カイコ体液、
メグシンタンパク質（−）ウイルス感染カイコ体液、
非ウイルス感染カイコ体液、および
ヒト血清アルブミン
それぞれのタンパク質溶液を等量のサンプルバッファー（０．２５％トリス−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、３０％グリセリン、１０％β−メルカプトエタノール、０．０２５％ブロモフェノールブルー）（第一化学薬品製）で処理し、５分間１００℃で加熱し、ゲル濃度４〜２０％のグラジエントゲル（第一化学薬品製）を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，第２２７巻，６８０−６８５頁，１９７０年）により分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を、ブロッティング溶液（２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭ  グリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）を用いて１００Ｖの定電圧で１時間、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（バイオ・ラッド製）にブロッティングを行った。ブロッティングしたＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄後、５％ブロックエースのＴＴＢＳ溶液中で３時間ブロッキングした。次に、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ（２０ｍＭ  トリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で洗浄した後、ＴＴＢＳで希釈した１次抗体であるウサギポリクロール抗メグシンペプチドＩｇＧの溶液と４℃で一夜反応させた。次に、アンプリファイドアルカリフォスファターゼイミュンブロットキット（バイオ・ラッド製）を用いて検出した。すなわち、ＴＴＢＳで希釈したビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと室温で１時間インキュベートした後、あらかじめ室温でストレプトアビジンとビオチン標識アルカリフォスファタアーゼを１時間インキュベートして調製したストレプトアビジン−ビオチン標識アルカリフォスファタアーゼのコンプレックスを反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで洗浄し、基質（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍと５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ塩の溶液）と室温で約３０分間インキュベートすることにより、１次抗体に結合された抗体を可視化した。蒸留水で十分反応させることにより、反応を停止させた。
結果は図１〜図４に示した。なお各図において反応させた抗体は、それぞれ以下に示す免疫原によって得られた抗体である。
図１  免疫原：メグシンペプチド２
図２  免疫原：メグシンペプチド３
図３  免疫原：メグシンペプチド３４２、および
図４  免疫原：ＭＢＰ−メグシンタンパク質
［実施例６］アフィニティー精製抗メグシンペプチドＩｇＧの酵素標識
実施例３で得たアフィニティー精製抗メグシンペプチドＩｇＧを市販の標識キット（ＡＰラベリングキット：ベーリンガーマンハイム製）を用い、キットの指示に従ってアルカリフォスファターゼで標識した。また、ビオチン標識は標識キット（ＥＣＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ：アマシャム  ファルマシア  バイオテク製）を用いてキットの指示に従い行った。
［実施例７］ＥＬＩＳＡによる尿中メグシンタンパク質の測定
正常者１６人、ＩｇＡ腎症患者２４人、および微小変化型ネフローゼ症候群患者２４人の尿を遠心し、不溶物を除いた後、分画分子量５０００の限外濾過膜（ミリポア製ウルトラフリー）を用いて濃縮した。ウサギポリクローナル抗メグシンペプチド２のＩｇＧをコートした９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに、ＰＢＳ（−）を１２０μＬずつ分注後、濃縮した尿を１２０μＬ分注し、４℃で一夜放置した。ＰＢＳ（−）で洗浄し、ブロックエース（大日本製薬製）を加えて室温で２時間ブロッキングをした後、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬製）含有ＰＢＳ（−）（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識ウサギポリクローナル抗メグシンペプチド１抗体を加え、室温で１時間放置した。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、発色基質溶液（１ｍｇ／ｍＬ  オルトフェニレンジアミン（和光純薬製）−１Ｍ  ジエタノールアミン（和光純薬製）緩衝液（ｐＨ９．８））を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。室温で反応させた後、１Ｎ水酸化ナトリウムを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製  Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  ２５０）で吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、検量線から尿中メグシンタンパク質濃度を求めた。同じ尿試料について市販のクレアチニン測定用試薬（ダイヤ試薬製、自動分析機用測定試薬「ダイヤ」−Ｃｒｅａ）によってクレアチニン濃度を求め、メグシンタンパク質の量をクレアチニン比として補正した。結果を図５に示す。正常者とＩｇＡ腎症患者との間にはｐ＜０．００１で、またＩｇＡ腎症患者と微小変化型ネフローゼ症候群患者との間でもｐ＜０．００１で有意差が認められた。
正常者とＩｇＡ腎症患者との間に有意差が見られたことから、尿中メグシンタンパク質を測定することにより腎障害の発生を確認することができた。また、ＩｇＡ腎症患者と微小変化型ネフローゼ症候群患者との間でも有意差が認められたことから、本発明に基づいて尿中メグシンタンパク質を測定することにより両者の識別が可能なことが明らかとなった。これらの疾患は、公知のスクリーニング方法である尿タンパク質を指標とする方法では、いずれも同様に陽性となるため、識別することができない。
またクレアチニン補正を行わない尿中メグシンタンパク質濃度の比較では、腎疾患患者で高値となる傾向は見られるものの、今回のような少ない例数によって統計学上の有意な差を証明することは困難と思われた。したがって、随時尿中のメグシンタンパク質の測定に基づいて本発明を実施する場合には、クレアチニン補正等の手法によって量の比較を行うことが望ましいと考えられる。
［実施例８］尿中メグシンタンパク質のウエスタンブロッティングによる検出と定量
正常者８名、ＩｇＡ腎症患者９名の随時尿を遠心し、不溶物を除いた後、分画分子量５０００の限外濾過膜（ミリポア製ウルトラフリー）を用いて濃縮した。濃縮尿と等量のサンプルバッファー（０．２５％トリス−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、３０％グリセリン、１０％β−メルカプトエタノール、０．０２５％ブロモフェノールブルー）（第一化学薬品製）で処理し、５分間１００℃で加熱し、ゲル濃度４〜２０％のグラジエントゲル（第一化学薬品製）を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５）により分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を、ブロッティング溶液（２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭ  グリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）を用いて１００Ｖの定電圧で１時間、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（バイオ・ラッド製）にブロッティングを行った。ブロッティングしたＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄後、５％ブロックエースのＴＴＢＳ溶液中で３時間ブロッッキングした。次に、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ（２０ｍＭ  トリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で洗浄した後、ＴＴＢＳで希釈した１次抗体であるウサギポリクローナル抗メグシンペプチドＩｇＧの溶液と４℃で一夜反応させた。
次に、アンプリファイドアルカリフォスファターゼイミュンブロットキット（バイオ・ラッド製）を用いて検出を行った。すなわち、ＴＴＢＳで希釈したビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと室温で１時間インキュベートした後、あらかじめ室温でストレプトアビジンとビオチン標識アルカリフォスファタアーゼを１時間インキュベートして調製したストレプトアビジン−ビオチン標識アルカリフォスファタアーゼのコンプレックスを反応させた。ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで洗浄し、基質（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍと５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ塩の溶液）と室温で約３０分間インキュベートすることにより、１次抗体に結合された抗体を可視化した。蒸留水で十分反応させることにより、反応を停止させた。可視化したバンドについては、電気泳動画像処理装置（アトー製  ＡＥ−６９２０Ｍ−０５型）と泳動・スポット画像解析ソフトウエア（アトー製  ＡＥ−６９２０ＷＳＥ／ＭＳＥ）を用いて定量を行った。結果（電気泳動像）は図６に示した。また、画像解析装置による測定結果は以下に示すとおりである。正常者の濃縮尿に比べてＩｇＡ腎症患者の濃縮尿で濃いバンドが確認された。そしてこのバンドの濃さを定量することにより、メグシンタンパク質の定量が可能なことが確認された。
画像解析装置による測定結果
レーン    測定結果
１        分子量マーカー
２        ８．５
３        ５．２
４      １３．８
５        ４．８
６      ３２．８
７      １５．１
［実施例９］検出用顆粒の製造
市販の磁性顆粒に、抗メグシンペプチドＩｇＧを、抗マウスＩｇＧ抗体を介して結合させることにより、本発明による検出用顆粒を製造した。操作は次のとおりである。顆粒としてダイナビーズ（登録商標）Ｍ−４５０トシルアクティベイティッド（トシル活性化された均一な常磁化ポリスチレン顆粒：日本ダイナル製）を用い、その１ｍＭ  塩酸懸濁液を無菌蒸留水で１回洗浄し、更に０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）で洗浄した。次に抗メグシンペプチドＩｇＧ抗体を０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に１５０μｇ／ｍＬの濃度に溶解した液を、等容量の活性化顆粒懸濁液に加えた（抗体／顆粒＝７５μｇ／１５ｍｇ）。ゆっくり攪拌しながら２２℃で２４時間インキュベートした。磁石を用いて抗体結合顆粒を集め、磁石に顆粒を付けたまま上清を除き、
（１）５ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０分間、
（２）５ｍＬの１Ｍ  エタノールアミン−塩酸（ｐＨ９．５）で２時間、
（３）０．１Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．０５Ｍ  トリス（ｐＨ７．５）の５ｍＬで１２時間、および
（４）Ｔｗｅｅｎ２０を含まない（３）の緩衝液５ｍＬで２時間、の順に洗浄した。洗浄後、磁石で顆粒を集め、上清を捨て、１０％ブロックエース含有ＰＢＳ（−）／ＢＳＡに約４×１０８顆粒／ｍＬ（３０ｍｇ／ｍＬ）の濃度に懸濁した。得られたＩｇＧ結合顆粒は、４℃で少なくとも６カ月間は安定である。
［実施例１０］磁気顆粒法による尿中メグシンタンパク質の測定
正常者１２例、および各種腎疾患患者２４例の随時尿試料について、メグシンタンパク質の濃度を実施例９で用意した抗体結合顆粒を利用する磁気顆粒法によって測定した。腎疾患患者２４例の内訳は、ＩｇＡ腎症１２例、微小変化型ネフローゼ症候群１２例である。尿試料は−８０℃に保存し、測定時に解凍して３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後の上清を試料として用いた。測定操作は次のとおりである。
一次抗体（ウサギポリクローナル抗メグシンペプチド２抗体を結合した磁気顆粒５０万個をあらかじめブロックエース（大日本製薬製）でブロッキングしたチューブ（１．５ｍＬ）に入れた。このチューブに各尿試料５００μＬとＰＢＳ（−）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識ウサギポリクローナル抗メグシンペプチド１抗体を等量加え、回転させながら室温で２時間反応させた。次に、３０００ｒｐｍで５分遠心後、磁石で顆粒を固定しながら上清をすて、洗浄液である０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬製）含有ＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４）（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を１ｍＬ加え撹拌し洗浄した。この洗浄操作を合計４回行った後、基質液１００μＬを加えて撹拌しながら２０〜３０分反応させた。基質液には、１ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン（和光純薬製）の１Ｍジエタノールアミン（和光純薬製）緩衝液（ｐＨ９．８）を用いた。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止し、吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、検量線から尿中メグシンタンパク質の濃度を算出した。同じ尿試料について実施例７と同様にクレアチニン濃度を求め、メグシンタンパク質の濃度をクレアチニン比として補正した。
測定の結果、尿中メグシンタンパク質の測定値（クレアチニン補正値：ＡＵ）は、正常者に比べＩｇＡ腎症患者において高値に分布する。また、ＩｇＡ腎症患者と微小変化型ネフローゼ症候群では、ＩｇＡ腎症患者において高値となった。従って、本発明の方法によれば、腎障害の判定のみならず、腎疾患の病態の確定が可能となることが明らかとなった。
［実施例１１］メグシンペプチド抗体を利用した腎臓組織に対する免疫組織染色（イムノヒストケミスト）
同意を得た３名のＩｇＡ腎症患者（男性２例、女性１例：年齢２１〜４８歳）から腎臓組織を採取した。また腎臓がん患者から外科的に切除した腎組織から、がんにおかされていない組織を採取し正常腎組織標本とした。正常な腎組織を提供した患者は、尿に異常が無いものとし、組織学的には糸球体の異常を伴うものを除いた。腎臓以外の臓器についても、同意を得た患者によって提供されたものを対照として用意した。ラットについては、正常なウイスター系ラット（雄８週齢）から腎臓をはじめとする各臓器を採取した。
腎臓組織は、常法に従い、凍結組織包埋剤（Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を用いて包埋した。この凍結包埋組織からフリオスタットを用いて４μｍの凍結切片を作製した。この凍結切片を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマ製）でコートしたスライド上にマウントした（４％パラホルムアルデヒド固定、１５分）。
凍結切片を０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、４％のスキムミルクでブロッキング後、４℃の加湿チャンバー内で抗メグシンペプチド−２抗体、および抗メグシンペプチド−４抗体と１晩インキュベートした。組織切片を洗浄し、１：１００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ製）を用いて室温で２時間インキュベートした。ペルオキシダーゼの検出には、０．００３％の過酸化水素水を含有する３，３’−ジアミノベンジジン溶液を用いた。細胞核は、ヘマトキシリンで染色した。ヘマトキシリン／エオシン染色は、公知の方法により実施した。
ＩｇＡ腎症患者の腎臓組織に対して組織免疫染色した顕微鏡写真（ニコン製ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ４００：倍率８０倍）を図７に示す。図から明らかなように、ヒト腎臓糸球体組織に本発明のペプチド抗体で染色される部位が存在し、特に、メサンギウム細胞胞体内およびメサンギウム基質に顕著な陽性染色が認められたが、尿細管には認められなかった。
ヒトメグシンペプチド−２抗体（図８−Ｉおよび図８−ＩＩ）、あるいはヒトメグシンペプチド−４抗体（図９−Ｖおよび図９−ＶＩ）によってヒト腎組織の糸球体が染色された。特に、メサンギウム領域に顕著な陽性染色が認められた。一方、ヒトメグシンペプチド−４抗体によって腎組織の間隙部（図８−Ｉ）、ヒトメグシンペプチド−２抗体によって肝（図９−ＶＩＩ）、脾（図９−ＶＩＩＩ）、膵、心、あるいは大動脈組織は染まらなかった（データは示さない）。過剰量のメグシンペプチド−２の存在によって完全に染色が阻止されたことから、免疫染色の特異性が確認できた（図８−ＩＶ）。免疫前のウサギＩｇＧでは免疫反応は確認できなかった（図８−ＩＩＩ）。また、メグシンペプチド−２抗体、およびメグシンペプチド−４抗体に対して、メグシンペプチド−１やメグシンペプチド−３に対する抗体では、ヒト腎組織の糸球体に特異的な免疫染色は行えなかった（データは示さない）。
メグシンタンパク質の免疫染色は、ラットの腎組織の糸球体でも陽性を認めた（ラットメグシンペプチド−２；図１０−Ｉ）。腎間質、肝（図１０−ＩＩＩ）、あるいは脾（図１０−ＩＶ）組織では反応が見られなかった。ラット腎組織に対する免疫学的な反応は、抗体を予めラットメグシンペプチド−２とインキュベーションすることによって阻止された（図１０−ＩＩ）。免疫前のウサギＩｇＧ、あるいはラットメグシンペプチド−１に対する抗体では、免疫反応は確認できなかった（データは示さない）。
［実施例１２］免疫沈降
ヒトメサンギウム細胞中のメグシンタンパク質の存在を確認するために、［３５Ｓ］メチオニンを用いた免疫沈降（Ｔ．Ｍｉｎｏｒｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２５９巻，５６０頁，１９８４年）を行い、得られた免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析し、メグシンタンパク質の検出を試みた。
先ず、メサンギウム細胞を標識培地中（ＤＭＥＭ：１０％非働化ウシ胎仔血清および［３５Ｓ］メチオニン（３．７Ｍｂｑ／ｍＬ）を添加したもの）、５％ＣＯ２培養器で３７℃、１６時間インキュベーションし、全タンパク質成分を標識した。
次に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ウシヘモグロビン、１ｍＭヨードアセトアミド、０．２Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）を含有するＴＳＡ（トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５％アジ化ナトリウム）２００μＬで懸濁した。４℃で１時間放置後、４℃、１０００００×ｇで１時間遠心し、ライセートを得た。
この放射性標識された抗原（１０５−１０６ｃｐｍ）と実施例２および３で得られた抗メグシンペプチド−２ポリクローナル抗体１μＬ（０．７ｍｇ／ｍＬ）を４℃で９０分間インキュベートした。
プロテインＧ−セファロース（ファルマシア・バイオテク製）を用い、さらに４℃で９０分間インキュベーションし、免疫複合体を沈澱させた。そして、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１％ウシヘモグロビンを含有するＴＳＡで３回洗浄後、０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。
洗浄免疫沈降物を３０μＬのサンプルバッファー（０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、グリセロール、１％ＢＰＢ）に再懸濁した後、５分間煮沸した。ボルテックスミキサーを用いて懸濁後、２００×ｇで１分間遠心する。上清について、常法によりＳＤＳ電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。分子量マーカーには、１４Ｃ−メチル化タンパク質混合物を用いた（アマシャム・インターナショナル製：分子量２２０、９７．４、６６、４６、３０ｋＤａ）。結果を図１１に示す。分子量５０ｋＤａ付近（レーン２のｍｅｇで示したバンド）に、抗メグシンペプチド−２抗体により特異的に認識されるポリペプチドが確認できた。
［実施例１３］ＥＬＩＳＡによるメグシンの測定
ＣＨＯ細胞で発現させたメグシンタンパク質（ＣＨＯ−メグシンタンパク質：Ｔ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，第１２０巻，８２８−８３６頁，１９９８年、ＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＪＰ９８／０４２６９）および実施例５に記載のＭＢＰ−メグシンタンパク質についてＥＬＩＳＡ分析を試みた。
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で段階希釈した精製ＣＨＯ−メグシンタンパク質溶液（５０μＬ／ウェル）を加え、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（大日本製薬製）を加えて（３５０μＬ／ウェル）室温で２時間ブロッキングした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄した。次に実施例２および３で得られた抗メグシンペプチド−２ポリクローナル抗体、および抗メグシンペプチド−４ポリクローナル抗体をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで希釈した液を５０μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間放置した。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ（カッペル製）を添加し、４℃で一晩放置後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。
各ウェルにペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（アマシャム製）を加え、室温で１時間放置した。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１００μＬ／ウェルのオルトフェニレンジアミン発色基質溶液（０．００９％過酸化水素水含有クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にオルトフェニレンジアミンを０．０４％の濃度になるように溶解した液）を添加した。室温、暗所で１０〜３０分間反応させた後、２Ｍ硫酸５０μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス製：ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ２５０）で４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
ＭＢＰ−メグシンタンパク質についても同様に操作した。結果を図１２（メグシンペプチド−２抗体）および図１３（メグシンペプチド−４抗体）に示す。その結果、ペプチド−２抗体およびペプチド−４抗体が濃度依存的にメグシンタンパク質と特異的に反応することが明らかとなった。対照として測定したＣＨＯの培養上清やＭＢＰでは、反応性は見られなかった。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、腎生検のような侵襲性の高い検査ではなく、尿や血液のような非侵襲性材料によって腎機能の評価を可能とする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの簡便な腎機能の評価が実現したことにより、より多くの被験者について、迅速に、しかも安価に検査サービスを提供することができる。腎疾患には、早期に発見し人工透析治療の開始を少しでも遅らせることが望まれるものも多い。したがって、本発明は単に被験者の負担を軽減するのみならず、簡便な検査手法による腎機能評価方法の提供を通じて、より多くの透析治療予備軍の発見と監視を可能とするものである。しかも尿中や血中のような生体試料中に見出されるメグシンタンパク質は、腎機能を反映する優れた指標であり、その評価においては高い信頼性を期待できる。
特に、本発明によって提供されるメグシンタンパク質の免疫学的検出方法とそのためのキットは、磁性顆粒担体の採用した操作性に優れた手法である。このような検出方法によって、より迅速で、正確なメグシンタンパク質の測定が可能となる。またメサンギウム細胞の増殖程度を把握できることから、ＩｇＡ腎症の治療に用いられるステロイド療法の導入時期や継続の可否の判断も容易となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、メグシンタンパク質の部分アミノ酸配列（配列番号：１２）を有する合成ペプチド２を免疫原として得られたポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法によって確認した結果を示す写真。各レーンは、次のタンパク質に対応する。
１：ＭＢＰ
２：ＭＢＰ−メグシンタンパク質
３：Ｈｉｓ−メグシンタンパク質
４：ＭＢＰ−ＰＡＩ  ＩＩ
５：ＣＨＯ細胞で発現させたメグシンタンパク質
６：メグシンタンパク質遺伝子導入組み換えウイルス感染カイコ体液
７：メグシンタンパク質遺伝子導入前のウイルスベクター感染カイコ体液
８：非ウイルス感染カイコ体液
９：正常ヒト血清
図２は、メグシンタンパク質の部分アミノ酸配列（配列番号：１３）を有する合成ペプチド３を免疫原として得られたポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法によって確認した結果を示す写真。各レーンは、図１と同じタンパク質に対応する。
図３は、メグシンタンパク質の部分アミノ酸配列（配列番号：１５）を有する合成ペプチド３４２を免疫原として得られたポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法によって確認した結果を示す写真。各レーンは、図１と同じタンパク質に対応する。
図４は、ＭＢＰ−メグシンタンパク質を免疫原として得られたポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法によって確認した結果を示す写真。各レーンは、図１と同じタンパク質に対応する。
図５は、ＥＬＩＳＡによる尿中メグシンタンパク質の測定結果を示すグラフ。縦軸はメグシンタンパク質の測定値（クレアチニン比：ＡＵ）を示す。試料とした尿は、正常者（１６例）、ＩｇＡ腎症患者（２４例）、および微小変化型ネフローゼ症候群患者（２４例）のものである。
図６は、ウエスタンブロット法による尿中メグシンタンパク質の測定結果を示す写真。各レーンは、次のタンパク質に対応する。
１：ＭＢＰ−メグシンタンパク質
２−５：正常者濃縮尿
６−７：ＩｇＡ腎症患者濃縮尿
図７は、ＩｇＡ腎症患者の腎臓組織に対して組織免疫染色した顕微鏡写真を示す。
図８は、正常なヒト腎臓組織に対して組織免疫染色した顕微鏡写真を示す。倍率は、Ｉが３３倍、ＩＩ〜ＩＶが８０倍である。
図９は、正常なヒト腎、肝および脾臓組職に対して組織免疫染色した顕微鏡写真を示す。倍率は、Ｖが３３倍、ＶＩが８０倍、ＶＩＩおよびＶＩＩＩが４０倍である。
図１０は、正常なラット腎、肝および脾臓組織にラットメグシンペプチド−２抗体を用いて組織免疫染色した顕微鏡写真を示す。倍率は、ＩおよびＩＩが１００倍、ＩＩＩおよびＩＶが４０倍である。
図１１は、免疫沈降によるメグシンタンパク質の検出結果を示す写真。
レーン１：抗メグシンペプチド２抗体（−）
レーン２：抗メグシンペプチド２抗体（＋）
レーン３：分子量マーカー
図１２は、抗メグシンペプチド２抗体を使ったＥＬＩＳＡにより、ＣＨＯ−メグシン、またはＭＢＰ−メグシンを抗原として測定した結果を示すグラフ。縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度を、横軸は抗原濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
図１３は、抗メグシンペプチド４（２５７−２７２）抗体を使ったＥＬＩＳＡにより、ＣＨＯ−メグシン、またはＭＢＰ−メグシンを抗原として測定した結果を示すグラフ。縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度を、横軸は抗原濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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