(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM BP-7418、FERM BP-7821又はFERM BP-7822のハイブリドーマにより産生される、細胞表面に存在するヒトBST2抗原に結合し、該細胞へのインターナリゼーションにより該細胞内部へ局在化しうることを特徴とするモノクローナル抗体又はその機能的断片。
【請求項２】
受託番号FERM BP-7418、FERM BP-7821又はFERM BP-7822のハイブリドーマよりヒト抗体遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現可能な状態で宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することにより取得される、細胞表面に存在するヒトBST2抗原に結合し、該細胞へのインターナリゼーションにより該細胞内部へ局在化しうることを特徴とするモノクローナル抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片と、治療用薬剤とを結合したものである、リンパ球性腫瘍治療用の複合体。
【請求項４】
治療用薬剤が、放射性核種、細菌毒素、化学療法剤及びプロドラッグから選ばれる少なくともひとつである、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
メイタンシン結合抗体である、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
請求項３又は請求項４記載の複合体を有効成分として含む、ヒトBST2を発現する細胞を標的とする医薬組成物。
【請求項７】
多発性骨髄腫に適用するものである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１又は請求項２記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞表面に存在するヒトＢＳＴ２抗原を認識する抗体に関する。具体的には、本発明は該ヒトＢＳＴ２抗原に結合し該細胞へのインターナリゼーションにより該細胞内部へ局在化しうるモノクローナル抗体又はその機能的断片に関する。
本発明はまた、該モノクローナル抗体又はその機能的断片と、治療用試薬とを結合したものである複合体に関する。
背景技術
癌（腫瘍）は、わが国における死亡原因の第一位を占め、さらに患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。造血器腫瘍の一つである多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）は、Ｂ細胞の分化の最終段階に異常を来す不治のＢ細胞腫瘍である。臨床的には、多発性骨髄腫の経過は、末期の形質細胞性白血病（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）と類似しており、形質細胞のクローンの蓄積を特徴とする新生物で免疫グロブリン鎖の分泌を伴うことが多い。腫瘍による骨髄浸潤には貧血、低グロブリン血症及びバクテリア感染等の多数の合併症を伴った制御不能な骨髄腫細胞の増殖がみられる。また、多発性骨髄腫ではインターロイキン６（ＩＬ６）レベルが増大するが、骨の痛み、骨折及び低カルシウム血症を導く破骨細胞の増大をもたらす。高濃度の骨髄腫免疫グロブリン及び高カルシウム血症に関して、腎不全もともなうことも多い。
これまで多発性骨髄腫患者に対し種々の治療法が試みられてきたが、いまだ患者全体の臨床的効果は低い。化学療法はメルファラン及びプレドニゾロンを用いた多剤併用治療が標準的な治療であるが、約２年の中間的な持続とともに寛解の導入後再発して死亡する（Ａｌｅｘａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．，１９９４  Ｖｏｌ  ３３０：４８４）。また、これら薬剤は、腫瘍細胞だけに特異的に作用するのではなく、正常細胞に対しても毒性を示すため重篤な副作用が発現し、治療効果にも限界がある。１９８０年代より造血幹細胞移植を併用した超大量化学療法が未だ活発に検討されているが臨床的な効果は低いままである。
正常細胞への毒性を低減するため、放射性核種や他の細胞毒性物質を結合したターゲッティング抗体の使用が試みられている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．，１９８９  Ｖｏｌ  １９：３３２）。しかしながら、腫瘍細胞内部へターゲッティング抗体が取り込まれる割合は一般に低く、総注入量の０．０１％から０．００１％にすぎない（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．，１９８７  Ｖｏｌ  ６０：５６７）。標的細胞内への迅速な局在化（インターナリゼーション）特性を併せもつ抗体を開発することにより、化学合成毒素、抗がん剤及び放射性核種などの治療用試薬との結合によりそれら細胞毒性物質の迅速な細胞内放出を達成でき、有効性の向上及び副作用が低減する可能性がある。
これまで多発性骨髄腫を対象とした抗体療法の試みが行われてきている。ＩＬ−６は多発性骨髄腫細胞の主要な増殖因子であると考えられ（Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，１９８８  Ｖｏｌ  ３３２：８３；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９１  Ｖｏｌ  ７３：５１７）、ＩＬ−６シグナル伝達系を阻止することを目的とし、ＩＬ−６あるいはＩＬ−６レセプターに対する中和抗体を用いた多発性骨髄腫患者の治療が試みられている。しかし、疾患の白血病変異を伴う患者において骨髄腫細胞の増殖抑制が観察されたものの、腫瘍が再発し臨床的な有効性は得られていない（Ｂａｔａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９５  Ｖｏｌ  ８６：６８；Ｖａｎ  Ｚａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９８  Ｖｏｌ１０２：７８３；日本臨床免疫学会会誌  １９９７  ｖｏｌ２０：８７）。さらにＣＤ１９（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９８  Ｖｏｌ１０２：５０９），ＣＤ２０（Ｈｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９９  Ｖｏｌ９４［Ｓｕｐｐｌ．１］：３１３），ＣＤ３８（Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９９  Ｖｏｌ３６［Ｓｕｐｐｌ．３］：３０），ＣＤ５４（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９５  Ｖｏｌ５５：６１０），ＣＤ１３８（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９６  Ｖｏｌ９４：３１８），Ｍｕｃ−１（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９９  Ｖｏｌ９３：１２８７）等の骨髄腫細胞発現抗原が、抗体療法の標的抗原の候補として報告されているがいまだ実用化には至っていない。
近年、骨髄腫細胞に高発現している抗原の一つとして、Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＢＳＴ２、あるいはＨＭ１．２４抗原とも称される）が報告されている（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９４  Ｖｏｌ８４：１９２２；Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９  Ｖｏｌ２５８：５８３）。ＢＳＴ２は１８０アミノ酸残基からなる分子量約３０ｋＤａのｔｙｐｅ  ＩＩ膜貫通糖タンパク質である。Ｓ−Ｓ結合によりホモダイマーを形成し細胞膜上に発現している。ＢＳＴ２タンパク質は、正常な末梢血細胞、骨髄細胞、反応性リンパ球、肝臓、腎臓、心臓等には発現しておらず、形質細胞と骨髄腫細胞に特異性高く発現している。詳細な生物学的活性は未だ不明であるが、ＢＳＴ２はＢ細胞の終末分化に関与するものと考えられている（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，１９９５  Ｖｏｌ２６：５２７）。ヒトＢＳＴ２に対する抗体については、ヒトＢＳＴ２発現細胞株をマウス等の非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製されたマウスモノクローナル抗体（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９４  Ｖｏｌ８４：１９２２）が報告されている。また、このマウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域からなるキメラ抗体も報告されている（Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９９  Ｖｏｌ９３：３９２２）。この抗体をヒト骨髄腫細胞を移植されたＳＣＩＤマウスに対して骨髄腫細胞の注入１０日後に投与した場合、腫瘍増殖は抑制された（Ｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９７  Ｖｏｌ９０：３１７９）。このようにＢＳＴ２をターゲット抗原とした多発性骨髄腫の抗体療法は有望であることが予想される。また、ＢＳＴ２は、骨髄腫のみならず他のリンパ球系腫瘍にも発現していることが報告されているため、抗ＢＳＴ２抗体療法はこれら腫瘍にも効果を発揮することが予想される。しかしながら、これら抗体は、抗体結合によるＢＳＴ２  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎを起こす活性はなく（尾崎ら  血液・腫瘍科、２０００  Ｖｏｌ４１：１２８）、化学療法剤や放射性核種などの治療用試薬の有効性増加・副作用の低減が大いに期待できる迅速なインターナリゼーションを誘導する抗ＢＳＴ２抗体は未だ全く報告されていない。また、一般に細胞表面に発現する抗原蛋白質に結合し、当該細胞内部へのインターナリゼーションを誘導する抗体が取得されうることは知られているが、すべての細胞表面抗原についてそのような抗体が取得されるものであるかは必ずしも明らかではない。
発明の開示
本発明の目的は、ヒトＢＳＴ２に結合でき、かつ、ヒトＢＳＴ２を発現する腫瘍細胞等の細胞の内部への局在化（インターナリゼーション）誘導活性を併せ持つ抗体を開発することにより、現在治療困難な多発性骨髄腫等の疾患の治療のために新しい作用機序に基づく治療剤を提供することである。
本発明者らは、ヒトＢＳＴ２に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、標的細胞内への迅速なインターナリゼーション特性をもつ抗ＢＳＴ２抗体を取得することに成功し本発明を完成させた。本発明は下記の発明を包含する。
（１）細胞表面に存在するヒトＢＳＴ２抗原に結合し、該細胞へのインターナリゼーションにより該細胞内部へ局在化しうることを特徴とするモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（２）前記細胞がＲＰＭＩ８２２６株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）であり、氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合した後、３７℃にて培養開始後１２０分以内にインターナリゼーションが進行し、前記細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（３）前記細胞がＲＰＭＩ８２２６株であり、氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合した後、３７℃にて培養開始後９０分以内にインターナリゼーションが進行し、前記細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（４）前記細胞がＲＰＭＩ８２２６株であり、氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合した後、３７℃にて培養開始後６０分以内にインターナリゼーションが進行し、前記細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（５）前記細胞がＲＰＭＩ８２２６株であり、氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合した後、３７℃にて培養開始後３０分以内にインターナリゼーションが進行し、前記細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（６）前記細胞がＲＰＭＩ８２２６株であり、氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合した後、３７℃にて培養開始後１５分以内にインターナリゼーションが進行し、前記細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（７）配列番号２のアミノ酸番号５０〜１８０のアミノ酸配列中のエピトープを認識する、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（８）ＩｇＧ１（κ）又はＩｇＧ４（κ）である、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（９）ヒト抗体である、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（１０）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２１又はＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２２のハイブリドーマ（それぞれ５−７Ｉ、７−９０Ｇ、９−１６−１又はｂ−７６−８）により産生される、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（１１）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２１又はＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２２のハイブリドーマ（それぞれ５−７Ｉ、７−９０Ｇ、９−１６−１又はｂ−７６−８）よりヒト抗体遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現可能な状態で宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することにより取得される、（１）のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（１２）（１）から（１１）のいずれかのモノクローナル抗体又はその機能的断片と、治療用薬剤とを結合したものである複合体。
（１３）治療用薬剤が、放射性核種、細菌毒素、化学療法剤及びプロドラッグから選ばれる少なくともひとつである（１２）の複合体。
（１４）（１２）又は（１３）の複合体を有効成分として含む、ヒトＢＳＴ２を発現する細胞を標的とする医薬組成物。
（１５）リンパ球性腫瘍、リウマチ、又は原発性局所癌に適用するものである（１４）の医薬組成物。
（１６）多発性骨髄腫に適用するものである（１４）の医薬組成物。
（１７）ヒトＢＳＴ２抗原の少なくとも部分アミノ酸配列を含むポリペプチドを免疫した非ヒト動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合によりハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマよりヒトＢＳＴ２抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、前記選抜されたハイブリドーマより産生されたヒトＢＳＴ２抗原に結合する抗体を、ヒトＢＳＴ２抗原を発現する細胞と反応させ、前記細胞を培養する過程で該細胞表面のヒトＢＳＴ２／前記抗体複合体の存在量の低下を指標とした選抜を行うことを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片の作製方法。
また、本発明は前記（１）から（１１）のいずれかのモノクローナル抗体又はその機能的断片に、生物学的に活性な物質を化学的又は遺伝子工学的手法により結合させることにより、ヒトＢＳＴ２を発現する細胞の内部へ前記生物学的に活性な物質を導入する方法をも提供する。「生物学的に活性な物質」とは、該物質が導入された細胞に対して何らかの生物学的変化、例えば▲１▼該細胞の増殖の促進又は抑制、▲２▼分化の促進若しくは抑制又は脱分化、▲３▼該細胞から他の細胞への信号伝達等の作用の変化、▲４▼細胞の死、などをもたらしうる物質のことを言う。具体的には、化学療法剤、放射性核種、細菌毒素、各種のサイトカイン類若しくはホルモン類、転写因子、糖鎖の合成若しくは分解に関連する酵素、又は細胞に対して前記機能を有するＤＮＡ若しくはＲＮＡなどが挙げられる。
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
「ヒトＢＳＴ２」とは、ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２の略称であり、１８０アミノ酸残基からなる分子量約３０ｋＤａのタイプＩＩ膜貫通糖タンパク質で、ジスルフィド結合によりホモダイマーを形成し形質細胞、骨髄腫細胞等の細胞の細胞膜上に特異的に発現しているタンパク質をいう（例えばＧｏｔｏら，上記；Ｏｈｔｏｍｏら，上記）。
「インターナリゼーション」又は「迅速なインターナリゼーション」とは、一般に食作用（エンドサイトーシス：ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）と称される機構のうち、細胞の非特異的なとりこみの飲作用などを示すのではなく、抗体が細胞表面抗原と免疫複合体を形成し、短時間で細胞内に取りこまれる現象を示す。例えば、反応条件や抗体・抗原の性質等により異なるが、一般に抗体がこの機序でとり込まれる場合、抗体と受容体の免疫複合体は、結合後エネルギー依存的に細胞表面を移動し、やがて一極に集中（キャッピング）したあと、１〜数分、遅くとも１２時間以内に細胞内に取り込まれる。細胞表面の抗原に結合し、インターナリゼーションにより細胞内に取り込まれる抗体を、本明細書では「インターナリゼーション誘導活性を有する抗体」と称することがある。
「細胞表面上のヒトＢＳＴ２／前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示す」とは、ヒトＢＳＴ２抗原を細胞表面に有する細胞を抗ＢＳＴ２抗体の存在下で培養する際に、培養開始時に細胞表面上のヒトＢＳＴ２との免疫学的反応によって形成されたヒトＢＳＴ２／モノクローナル抗体複合体の存在量１００に対する一定時間経過後の該複合体の残存量の割合が５０％以下であること、言い換えれば免疫学的複合体を形成する抗ＢＳＴ２抗体の５０％以上がインターナリゼーションによって細胞内部にとり込まれたこと、を意味する。
「プロドラッグ」とは、生体内に投与されると内因性酵素等の作用によって活性型の薬剤に変換される前駆体薬剤をいう。
「化学療法剤」とは、腫瘍等に基因する疾患を患者に対し著しい障害を与えることなく病原に選択的に作用して治療する薬剤をいう。
本明細書又は図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。
（Ｇ）グリシン、（Ａ）アラニン、（Ｖ）バリン、（Ｌ）ロイシン、（Ｉ）イソロイシン、（Ｓ）セリン、（Ｔ）スレオニン、（Ｄ）アスパラギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｎ）アスパラギン、（Ｑ）グルタミン、（Ｋ）リジン、（Ｒ）アルギニン、（Ｃ）システイン、（Ｍ）メチオニン、（Ｆ）フェニルアラニン、（Ｙ）チロシン、（Ｗ）トリプトファン、（Ｈ）ヒスチジン、（Ｐ）プロリン。またＤＮＡを表記するために用いられるアルファベットの一文字の意味は、各々次に示す。（Ａ）アデニン、（Ｃ）シトシン、（Ｇ）グアニン、（Ｔ）チミン。
以下、本発明を詳細に説明する。
ヒトＢＳＴ２は、公知の塩基配列又はアミノ酸配列（各々、配列番号１又は２）に基づいて、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる方法を適宜用いることにより製造することができる。またヒトＢＳＴ２の部分配列は、後述する技術的分野において知られる方法に従って、遺伝子組換え技術又は化学的合成法により製造することもできるし、またヒトＢＳＴ２をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
本発明の抗体には、インターナリゼーション誘導特性を有することを特徴とする各種の抗ヒトＢＳＴ２モノクローナル抗体が包含される。該抗体の例には、後述の実施例７から実施例１５に記載されるような抗ヒトＢＳＴ２モノクローナル抗体、あるいは、該抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体であって、インターナリゼーション誘導特性を有する抗体も包含される。本発明の抗体のアミノ酸配列中への、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｓｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８４  Ｖｏｌ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。本発明の抗体には、いずれのイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体も包含するが、好ましくはヒトイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体であり、好ましいクラス、サブクラスはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ４であり、好ましい軽鎖はκである。
本発明の抗体又はその断片の好ましい例は、該抗体又はその断片を氷冷下で骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）に結合した後、３７℃にて培養開始後約１２０分以内、好ましくは約９０分以内、さらに好ましくは約６０分以内、特に好ましくは約３０分以内、さらに特に好ましくは約１５分以内にインターナリゼーションが進行し、該細胞表面上のヒトＢＳＴ２／抗ＢＳＴ２抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、培養開始時の５０％以下を示すものである。
本発明の抗体又はその断片の好ましい別の例は、ヒトＢＳＴ２のアミノ酸配列（配列番号２）中の連続又は不連続の少なくとも８個のアミノ酸残基によって構成されるエピトープを認識し、かつ、インターナリゼーション誘導特性を有するモノクローナル抗体又はその断片からなる配列である。例えば配列番号２のアミノ酸番号１０〜１８０、２０〜１８０、３０〜１８０、４０〜１８０、５０〜１８０、５０〜１７０、５０〜１６０、５０〜１５０、５０〜１４０、５０〜１３０、５０〜１２０、５０〜１１０、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０のアミノ酸配列中のエピトープを認識し、かつ、インターナリゼーション誘導特性を有するモノクローナル抗体又はその断片である。
本発明の抗体又はその断片の好ましいさらに別の例は、ヒトＢＳＴ２及びサルＢＳＴ２に対して交差反応を示す性質を有する抗体である。このような抗体は、ヒトＢＳＴ２とサルＢＳＴ２において、同一又は極めて類似したエピトープ構造を認識するものと想定され、ヒトに対する臨床試験に先立ちサルを実験動物とした種々の試験が可能であるという利点を有する。このような抗体の具体例は、ハイブリドーマ９−１６−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２１）又はハイブリドーマｂ−７６−８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２２）の産生する抗体である。
本発明における抗体の断片とは、前記で定義した抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ＦＶ、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  ＦＶ（ｓｃＦＶ）及びこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。「機能的断片」とは、抗体が特異的に結合する抗原に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味する。
本発明の抗体は、例えば、下記のような方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したようなヒトＢＳＴ２若しくはその一部、又は抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ等）との結合物、又はヒトＢＳＴ２を細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、ＢＳＴ２を組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択し、さらに後述する方法によりインターナリゼーション誘導特性を有するクローンを選抜することによって製造される。また好ましくは、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト抗体を産生する非ヒト動物を用いることにより、本発明の抗体はヒト抗体であってもよい。ここで、ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、又はその機能的な断片を意味する。
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ．，１９７５  Ｖｏｌ．２５６：４９５−４９７）及びそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくはリンパ節又は脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを、細胞融合させることにより調製される。細胞融合は例えば、ポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）等の高濃度ポリマー溶液中、通常約３０〜４０℃、約１〜１０分間、抗体産生細胞とミエローマ細胞を混合することによって行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
上記の方法で作製された本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、治療用薬剤とコンジュゲートすることによって、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体を形成できる。抗体へ結合させる治療用薬剤の例としては、以下のものに限定されないが、ヨード（１３１Ｉｏｄｉｎｅ：１３１Ｉ，１２５Ｉｏｄｉｎｅ  １２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙｔｔｒｉｕｍ：９０Ｙ）、インジウム（１１１Ｉｎｄｉｕｍ：１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｅｃｈｎｅｔｉｕｍ：９９ｍＴｃ）等の放射核種（Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）、緑膿菌毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、リシン（Ｒｉｃｉｎ）のような細菌毒素、及びメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、カリキアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）などの化学療法剤（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ、Ｍ．Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．，１９９８  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ）等が挙げられ、より好ましくは、抗体との結合によりプロドラッグ化できるメイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）等がよい（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ５２：１２７，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９９６  Ｖｏｌ９３：８６８１）。抗体と治療用薬剤の結合は共有又は非共有結合（例えばイオン結合）のいずれでもよい。例えば、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）又は配位性基を利用し、必要に応じてより反応性の基を結合するか又は反応性の基に変換した後、該反応性基と反応して結合を形成しうる官能基（細菌毒素、化学療法剤の場合）又は該配位性基との間で錯体を形成しうるイオン性基（放射性核種の場合）をもつ治療用薬剤と抗体とを接触させることによって、本発明の複合体を得ることができる。あるいは複合体の形成に際してビオチン−アビジン系の利用も可能であろう。また、治療用薬剤がタンパク質又はペプチドである場合は、遺伝子工学的手法により抗体と前記タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として生産することも可能である。
さらに具体的には、下記のようにしてメイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）化合物結合抗体を作製できる（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ５２：１２７，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，２０８，０２０）。メイタンシン又はａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ  Ｐ−３を、水素化リチウムアルミニウムにて還元し、メイタンシノールを調製する。調製されたメイタンシノールを、ジシクロヘキシルカルボジイミド、塩化亜鉛存在下にて、Ｎ−メチル−Ｎ−（メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニンとエステル化後、シリカゲルカラム等で精製し、メイタンシン誘導体（Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅ）を調製する。抗体をＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸等又はスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等と反応させ、抗体にそれぞれジチオピリジル基又はマレイミド基を導入する。Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅをジチオトレイトール等で還元し調製したＭａｙ−ＳＨを、ジチオピリジル基又はマレイミド基を導入した抗体と反応させ、メイタンシノイド化合物結合抗体を作製できる。
また、本発明の抗ヒトＢＳＴ２抗体、あるいは上記治療用薬剤と結合した抗ヒトＢＳＴ２抗体を含有する医薬組成物もまた本発明の範囲内に含まれる。該組成物には治療上有効量の治療用薬剤が含まれているべきであり、経口、非経口投与用の種々の形態に製剤化される。ここで、治療上有効量とは、所与の症状や投与計画について治療効果を与える量をいう。本発明の組成物は、抗体に加えて、生理学的に許容され得る製剤上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、付形剤及び担体のうち１種又は複数を含むことができる。また、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。適切な担体には、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに当該分野において周知であるアミノ酸、糖類、界面活性剤等の安定化剤、表面への吸着防止剤を含んでいてもよい。製剤の形態としては、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は配薬を含む非経腸的経路が考えられるが、動物を用いた試験により最適の経路が選択される。あるいは、患者の患部に直接本発明の組成物を接触させる方法も可能であろう。投与量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により適宜決定されるが、一般に患者の状態若しくは重篤度、年齢、体重、性別などが考慮されるべきである。
本発明の抗体又は医薬組成物は、ＢＳＴ２を発現している細胞に起因する可能性を有する種々の疾患又は症状の治療又は予防への適用が可能である。その疾患又は症状としては、多発性骨髄腫等のリンパ球性腫瘍、リウマチなどが挙げられる。リウマチの場合、自己抗体産生細胞、すなわちＢＳＴ２を発現している形質細胞（プラズマＢ細胞）に対して本発明の医薬組成物を選択的に作用させることができる。また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、原発性の局所癌に罹患している患者の延命にも適用可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
（実施例１）ヒトＢＳＴ２発現ベクターの調製
完全長ヒトＢＳＴ２  ＤＮＡ（配列番号１）を、その５’末端にＮｏｔ  Ｉ配列を、その３’末端にＸｂａ  Ｉと終結コドンを付加するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により修飾した。プライマー５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号４）を使用し、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）ＤＮＡポリメラーゼ及びヒト骨髄由来ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）で合成したｃＤＮＡ（約２０ｎｇ）を鋳型として、９４℃、１５秒；５０℃、３０秒；及び６８℃、１分間、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。修飾されたＢＳＴ２配列を、Ｎｏｔ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉ断片として単離し、そして同一酵素で開裂されていたｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターにライゲートした。得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ／ｈＢＳＴ２と命名した。
（実施例２）可溶型ヒトＢＳＴ２発現ベクターの調製
可溶型ＢＳＴ２タンパク質をバキュロウイルスを用いた発現系にて以下の方法にて調製した。５４−１８０のアミノ酸配列を持つＢＳＴ２部分ペプチド（配列番号２のアミノ酸番号５４〜１８０）のＮ末端にＦＬＡＧ（Ｎ末端−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−Ｃ末端、Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４）１６：７３０）（ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２）、Ｎ末端にＦＬＡＧ及びＣ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１）（ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴ）を付けた２種類の可溶型ＢＳＴ２発現プラスミドを作製した。ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２ベクターは、５’末端に分泌シグナル配列、ＦＬＡＧコドンを付加するために５’末端ＢｇｌＩＩ配列、３’末端ＢａｍＨＩ配列からなる下記のＤＮＡ配列  ５’−ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５）のｃＤＮＡを合成した（Ｓｉｇｎａｌ−Ｆｌａｇ断片）。５’末端ＢａｍＨＩ配列、ｓＢＳＴ２領域、終結コドン、３’末端にＮｏｔＩ配列を付加するため、プライマー５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号７）を使用してＰＣＲにより修飾した。ＰＣＲを、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）及び約２０ｎｇのヒト脾臓由来１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用して、３５サイクルの、９４℃、３０秒；５６℃、３０秒；及び７２℃、１分間をもって反応させた。修飾されたＢＳＴ２配列を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。そしてＳｉｇｎａｌ−Ｆｌａｇ断片とＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片をＢｇｌＩＩとＮｏｔＩ酵素で開裂したｐＦａｓｔＢａｃ１（ＧＩＢＣＯ社製）ベクターにライゲートした。得られたプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ１／ＦＢＳＴ２と命名した。
同様にＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴは、５’末端にＢａｍＨＩ配列を、３’末端にＮｏｔＩ配列を付加するため、プライマー５’−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号７）を使用してＰＣＲにより修飾した。ＰＣＲは、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）及び２０ｎｇのｐＦａｓｔＢａｃ１／ＦＢＳＴ２を使用して、３０サイクルの、９４℃、３０秒；５６℃、３０秒；及び７２℃、１分間をもって反応させた。修飾されたＢＳＴ２配列を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片として単離した。また、ＧＳＴと終結コドン配列を付加するため、５’末端にＮｏｔＩ配列を、３’末端にＫｐｎＩ配列を付加するため、プライマー５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号８）及び５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣ−３’（配列番号９）を使用してＰＣＲにより修飾した。ＰＣＲは、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）及び２０ｎｇのｐＧＥＸプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用して、３０サイクルの、９４℃、３０秒；５６℃、３０秒；及び７２℃、１分間をもって反応させた。修飾されたＧＳＴ配列をＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片として単離し、前述のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片とＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩで開裂したｐＦａｓｔＢａｃ１／ＦＢＳＴ２ベクターにライゲートした。得られたプラスミドをｐＦａｓｔＢａｃ１／ＦＢＳＴ２／ＧＳＴと命名した。
（実施例３）組換体発現ウイルスの調製
組換体ウイルスの作製は実施例２で作製された発現ベクターとＧＩＢＣＯＢＲＬ社製ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてマニュアルの方法にて行った。得られた組換体バキュロウイルスは、３ｘ１０６個のＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５ｍｌに組換体バキュロウイルス含有上清を０．３ｍｌ添加し、フラスコ（Ｔ−Ｆｌａｓｋ  ２５ｃｍ２，ＣＯＲＮＩＮＧ社製）で４日間、２７℃で培養後、培養上清を回収し、組換体バキュロウイルスの増幅を行った。目的のウイルス量が得られるまで同様な操作を行った。
（実施例４）可溶型ヒトＢＳＴ２の発現
可溶型ＢＳＴ２の大量発現は、８００ｍｌのＨｉＦｉｖｅＴＭ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に実施例３で作製された８０ｍｌのウイルスを加え、２７℃で６０時間培養し、培養上清を回収した。回収した上清は、遠心後、０．２μｍのＰＥＳフィルター（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に供し、細胞等の雑排物を除去した。
（実施例５）可溶型ヒトＢＳＴ２の精製
実施例４で作製された培養上清からの可溶型ＢＳＴ２（ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２，ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴ）の精製は以下の方法で行った。可溶型ＢＳＴ２を含む培養上清をＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティ  カラム（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動で単一バンドの精製ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２，ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴを得た。
（実施例６）ヒト抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖破壊及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０））及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスは、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統（系統Ａ）のマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統（系統Ｂ）のマウスとの交配により作製した。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏｌ９７：７２２）に記載されている。また、系統Ｂは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６  Ｖｏｌ１４：８４５）に記載されている。系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される固体（Ｉｓｈｉｄａ  ＆  Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ  １１ｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０００）を以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、麒麟麦酒株式会社より入手可能である。
（実施例７）ヒトＢＳＴ２に対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行  １９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのヒトＢＳＴ２は、実施例１で調製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ／ｈＢＳＴ２ベクターと実施例５で調製したＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２を用いた。被免疫動物は、実施例６で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒト抗体産生マウスに、実施例１で作製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ／ｈＢＳＴ２ベクター（１０μｇ／匹）をＴｒａｎｓ  ＩＴＴＭ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ試薬（宝酒造株式会社製）を用いて導入・発現することにより初回免疫した。初回免疫から同ベクターを１週間毎に３回導入・発現し追加免疫した。さらに、実施例５で作製したＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２（１０μｇ）を尾静脈内注射により追加免疫し、さらに以下に述べる脾臓細胞の取得３日前にＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２（１０μｇ）を同様にして免疫した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、回収した脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＣＲＬ１５８１）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６−ｗｅｌｌ  マイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗ヒトｈＢＳＴ２ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により測定することにより行った。
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、以下に述べる３種類のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつヒトｈＢＳＴ２に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表又は図中においては、各々の本発明のヒト抗ヒトｈＢＳＴ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表わす：２−１Ｌ，２−２０Ｊ，５−７Ｉ，５−８５Ｈ，７−９０Ｇ、８−１９０、ｂ−７６−８又は９−１６−１。
それらの内４つのハイブリドーマクローン５−７Ｉ、７−９０Ｇ、９−１６−１及びｂ−７６−８を、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブダペスト条約の規定下で国際寄託した。ハイブリドーマクローン５−７Ｉ及び７−９０Ｇは各々受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４１８であり（平成１２年１２月２６日付）、ハイブリドーマクローン９−１６−１及びｂ−７６−８は各々受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２１及びＦＥＲＭ  ＢＰ−７８２２である（平成１３年１２月７日付）。
（実施例８）ヒト免疫グロブリンγ鎖を有するモノクローナル抗体の検出
実施例５で作製したＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴ（１μｇ／ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３，５０μｌ／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、室温で３０分インキュベートし、ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートし、ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴが結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴでコーティングしたマイクロプレートを作製した。
各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、室温下で３０分反応させた後、各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。次いで、過酸化酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈した溶液（５０μｌ／ウェル）を、各ウェルに加え、室温下３０分インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（ＴＭＢ）、１００μｌ／ウェル、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに、２Ｍ硫酸（５０μｌ／ウェル）を加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果、３００クローン以上の抗ヒトＢＳＴ２抗体が取得できた。その一部を表１に示す。
（実施例９）ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（ＩｇＬκ）を有するモノクローナル抗体の検出
実施例５で作製したＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴ（１μｇ／ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３，５０μｌ／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、室温で３０分インキュベートし、ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、３０分反応させた後、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、各ウェルに、過酸化酵素で標識したヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（２，０００倍希釈、５０μｌ／ウェル、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、１００μｌ／ウェル、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、２Ｍ硫酸（５０μｌ）を各ウェルに加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果を表１に示す。
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（実施例１０）各モノクローナル抗体のサブクラス同定
実施例５で作製したＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴ（１μｇ／ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３，５０μｌ／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、室温で３０分インキュベートし、ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ＦＬＡＧ−ｓＢＳＴ２−ＧＳＴをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、３０分反応させた後、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、各ウェルに、それぞれ過酸化酵素で標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（各２，０００倍希釈、５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、１００μｌ／ウェル、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、２Ｍ硫酸（５０μｌ）を各ウェルに加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果を表１に示した。
（実施例１１）ｈＢＳＴ２発現細胞に対する各モノクローナル抗体の反応試験
ＢＳＴ２が発現していると報告されている骨髄腫由来細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５，Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９４  Ｖｏｌ８４：１９２２；Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９  Ｖｏｌ２５８：５８３）に対する各モノクローナル抗体の反応性の検討をＦＡＣＳ解析で行った。２ｘ１０６／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ８２２６細胞株を１％ウサギ血清入り、０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。各々のハイブリドーマの培養上清（５０μｌ）を加え、氷温下３０分間インキュベートした。陰性コントロールは各サブクラスに応じ、ヒトＩｇＧ１抗体（シグマ社製）又はヒトＩｇＧ４抗体（シグマ社製）を用い、ハイブリドーマ培養培地で２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ添加後氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、０．０１２５ｍｇ／ｍｌのＲＰＥ蛍光標識ウサギ抗ヒトＩｇＬκＦ（ａｂ’）２抗体（ＤＡＫＯ社製）３０μｌを加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の平均蛍光強度を測定した。その結果、何れの抗体もＲＰＭＩ８２２６細胞株に強い結合活性を有する抗体であることがわかった（図１）。
（実施例１２）各抗体の調製
抗ＢＳＴ２抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。抗ＢＳＴ２抗体産生ハイブリドーマをウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０−５ｍＭ、シグマ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。スピナ−フラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が９０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。
上記培養上清からの抗ＢＳＴ２抗体の精製は以下の方法で行った。抗ＢＳＴ２抗体を含む培養上清をＨｙｐｅｒ  Ｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（日本ガイシ製）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１  ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌し、精製抗ＢＳＴ２抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４５ＯＤとして算出した。
（実施例１３）抗ＢＳＴ２抗体の蛍光標識
抗ＢＳＴ２抗体の蛍光標識化は以下の方法で行った。Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を付属の説明書に従い、実施例１２で調製した抗ＢＳＴ２抗体に結合させた。２ｍｇ／ｍｌの抗ＢＳＴ２抗体０．５ｍｌに５０μｌの１Ｍ炭酸緩衝液を添加後、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８と混合し、撹拌しながら室温１時間反応させた。ヒドロキシルアミンを添加し反応を止め、ゲルろ過カラム（ＮＡＰ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に混合液を供し、抗体に未結合のＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８を除去した。この条件で抗体１分子に６つの蛍光物質が結合した。蛍光標識された抗体はＲＰＭＩ８２２６に結合し、その結合活性は標識されていない抗体と同等であった。
（実施例１４）各抗ＢＳＴ２抗体の交叉反応性
各モノクローナル抗体のマウス及びアカゲザルの血液細胞への交叉反応性をＦＡＣＳ解析で調べた。１ｍＬヘパリン（Ｎｏｖｏ社製）入りヒト末梢血１０ｍＬ、あるいはアカゲザル末梢血１０ｍＬを１０ｍＬのＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に重層した。１５００  ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心後、単核球画分を回収しＰＢＳ（−）で２回洗浄した。マウスの血液細胞は、以下のように調製した。ＥＤＴＡコートした試験管に、眼窩採血により末梢血５０μＬを採取した。さらに滅菌水を３００μＬ添加後すぐに２ｘのＰＢＳ（−）を３００μＬ添加し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。調製された各細胞は１％ヒト血清入り、０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に２ｘ１０６／ｍｌの濃度で浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。実施例１３で作製された各々のＡｌｅｘａ標識抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各抗体の反応性を調べた。その結果、いずれの抗体もヒト末梢血細胞に結合したが、マウス末梢血細胞に反応しなかった。一方、ｂ−７６−８及び９−１６−１は、ヒト末梢血細胞だけでなくアカゲザルの末梢血細胞にも同様に結合できた。
（実施例１５）ＢＳＴ２インターナリゼーション誘導活性評価
抗体による抗原インターナリゼーション誘導活性は、Ａｎｄｒｚｅｊら（Ｊ．ｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｖｏｌ  １６５：６０３７）の方法に従い以下の方法にて行った。２ｘ１０６／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ８２２６株を氷冷１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、１％ウサギ血清含有ＲＰＭＩ培地に浮遊させ、細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。実施例１３で作製されたＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８標識抗ＢＳＴ２抗体を氷冷１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）で７００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製し、各ウェルに１００μｌ分注後、氷上で３０分間反応させた。氷冷１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で４回洗浄することにより、結合されていないＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８標識抗ＢＳＴ２抗体を細胞から除去した。３７℃に温めた１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に再懸濁後３７℃で培養し、培養０，１５，３０，６０，１２０分間後にインターナリゼーションを停止させるために氷冷ＳＢで２回洗浄した。細胞表面上のｈＢＳＴ２と結合している抗体を検出するため、０．０１２５ｍｇ／ｍｌのＲＰＥ蛍光標識ウサギ抗ヒトＩｇＬκＦ（ａｂ’）２抗体（ＤＡＫＯ社製）３０μｌを加え、氷温化３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で各細胞の平均蛍光強度を測定した。バックグラウンドレベルの設定は、コントロールとしてＡｌｅｘａ  ＦｌｏｕｒＴＭ４８８標識ＩｇＧ１κ抗体とＲＰＭＩ８２２６株を用いて前述の処理を行った試料の３７℃培養開始時の平均蛍光強度を、Ａｌｅｘａでは３〜５、ＲＰＥでは６〜８を示すように感度を設定することにより行った。その結果を図２に示す。Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８の平均蛍光強度は３７℃で培養しても低下することは無かったが、細胞表面上のＢＳＴ２／抗ＢＳＴ２抗体免疫複合体の存在量を示すＲＰＥ蛍光物質の平均蛍光強度は、３７℃の培養時間の経過と共に低下し、培養１５分でＲＰＥ蛍光物質の平均蛍光強度は、５０％以下に低下し、抗ＢＳＴ２抗体（７−９０Ｇ）は、効率良くＢＳＴ２のインターナリゼーションを誘導する抗体であった。また、蛍光検鏡法によりインターナリゼーションの様子を観察した（図３）。インターナリゼーション開始１５分後には、キャッピング形成が観察され、ＲＰＥ蛍光物質は細胞表面染色のみ観察されたが、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８蛍光物質は、細胞表面上だけでなく、膜に隣接した領域内にインターナライズされた状態でも見られ、また、膜内周囲に散在した細かい点が、ゴルジ装置であると考えられる位置の顆粒群にも存在した。さらに以上の特徴は、抗体が治療用薬剤等で標識されてもＢＳＴ２を細胞内にインターナライズする能力を損なうことなく、治療用薬剤を細胞内に効率良く暴露できる可能性が高いことを強く示唆する。他の抗ＢＳＴ２抗体も同様な活性が観察された。
（実施例１６）チオール基導入メイタンシンの作製
本実施例におけるメイタンシンへのチオール基導入は、Ｃｈａｒｉらの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ５２：１２７）やＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，２０８，０２０に記載されるような方法を参考にし行った。
すなわち２０ｍｇのａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ  Ｐ−３（和光純薬工業社製）を４ｍｌのＴＨＦに溶解し、−２３℃に冷却しつつ３３ｍｇ水素化リチウムアルミニウム（１０当量）にて５時間還元した。反応液を２０ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解後、当量の酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を濃縮乾固後、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製し、１１．８ｍｇのメイタンシノールを調製した。
参考文献に従い別法にて調製された２６ｍｇのＮ−メチル−Ｎ−（メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニンを３ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ここに３０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（２当量）、１Ｍ塩化亜鉛  ２０μｌ（１当量）を添加して室温で３０分撹拌した。しかし、この条件では反応が進まなかったため、１Ｍ塩化亜鉛の添加量を１００μｌ（５当量）に変え室温で３０分撹拌した。ここに１１．８ｍｇのメイタンシノールを１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解して添加し、エステル化反応を行った。３時間後反応液を濃縮乾固し、主生成物を分取ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）、続いて分取ＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒６０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いて精製した。結果、２．５ｍｇのメイタンシン誘導体（Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅ体）を得た。得られたＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅ体の５００ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲを図６に示す。実施例１９に記載されているヒト骨髄腫細胞株ＩＭ９の細胞障害活性試験で、得られたＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅ体のＩＣ５０は１０ｎＭであり、ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ  Ｐ−３の１０００分の１以下の活性であった。
得られたＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅ体２．５ｍｇを０．４６ｍｌエタノール＋０．３２ｍｌ  ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）溶液に溶解後、ここに１００ｍＭのジチオスレイトール８０ｕｌ（１．５当量）を加え、窒素ガス存在下４℃で４時間還元した。この結果得られた還元化合物（Ｍａｙ−ＳＨ）は、６０％アセトニトリルで平衡化したＯＤＳカラムで精製した（最終収量２．０ｍｇ）。
（実施例１７）抗ＢＳＴ２抗体（ｂ−７６−８）のＰＤＰ化
本実施例における抗体へのチオール基の導入は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、Ｃｈａｒｉらの方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ５２：１２７）と新生化学実験講座・分子免疫学ＩＩＩ（日本生化学会編、東京化学同人発行  １９９２）に記載されるような方法を参考にし調製した。精製抗体ｂ−７６−８を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて２．６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。２．６ｍｇ／ｍＬの抗体溶液５ｍＬに１１．５ｍＭのＳＰＤＰ−エタノール液を４２．３μＬ滴下し、２３℃で４０分間反応させた。反応液を２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−２５カラム（ＮＡＰ２５ＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にかけ、未反応のＳＰＤＰを除去した。得られたサンプルの一部へ１ｍＭになるようにジチオトレイトールを加え、室温５分間反応させた。反応後、遊離したピリジン−２−チオンの３４３ｎｍの吸光度を測定し、反応系に存在していたＰＤＰ基のモル濃度を定量した（ピリジン−２−チオンのε＝８．０８ｘ１０３）。その結果、導入されたＰＤＰ基は３．４分子／抗体であった。
（実施例１８）メイタンシン結合ｂ−７６−８抗体の調製
実施例１６で作製されたＭａｙ−ＳＨ（１７０μｇ／８００μＬ）と実施例１７で作製されたＰＤＰ化ｂ−７６−８（１０ｍｇ／９ｍＬ）を４℃で４０時間反応させた。反応液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−２５カラムにかけ、未反応のＭａｙ−ＳＨを除去した。得られたサンプルの一部へ１ｍＭになるようにジチオトレイトールを加え、室温５分間反応させた。反応後、遊離したピリジン−２−チオンの３４３ｎｍの吸光度を測定し、反応系に存在していたＰＤＰ基のモル濃度を定量した。その結果、導入されたメイタンシン化合物は１．８分子／抗体であった。０．１Ｍになるようにシステインを添加し、反応液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにかけメイタンシン結合ｂ−７６−８抗体（Ｍａｙ−ｂ−７６−８）を精製した。
（実施例１９）メイタンシン結合ｂ−７６−８抗体の抗腫瘍活性
実施例１１と同法にてヒト骨髄腫細胞株ＩＭ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５９）に対する反応性を調べた。その結果、Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体は、ｂ−７６−８抗体と同等の反応性を示した。Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体の抗腫瘍活性は、次のように行った。９６ウエル平底プレート（ベクトンディッキンソン社製）の各ウエルに２ｘ１０５個／ｍｌのＩＭ９細胞を１００μｌと、ｂ−７６−８抗体、Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体、あるいはコントロールヒトＩｇＧ１を加え、炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。その後、ＭＴＳ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｐｈｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，プロメガ社製）溶液を２０μｌ各ウエルに添加し、さらに２時間培養した。次いで、生存している細胞を波長４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果、ＩＭ９細胞に対しコントロールヒトＩｇＧ１とｂ−７６−８抗体を添加した場合、有意な細胞障害活性は観察されなかったが、Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体は濃度依存的な細胞障害活性が観察され、ＩＣ５０は１０ｎＭ（メイタンシン濃度）／５．５ｎＭ（抗体濃度）であった。
（実施例２０）メイタンシン結合ｂ−７６−８抗体のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果
投与抗体は、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて８００μｇ／ｍｌに調製し、投与抗体とした。
ヒト骨髄腫移植マウスは、ＳＣＩＤマウス（日本クレア）を用いてヒト骨髄腫細胞株ＩＭ９細胞を、ＰＢＳ（−）で２．５ｘ１０７個／ｍｌになるように調製した。前日に抗アシアロＧＭ１（和光純薬社製）１００μｌを尾静脈内投与したＳＣＩＤマウス（メス、６週令）（日本クレア）に上記ＩＭ９細胞液２００μｌを尾静脈より注入した。これらマウスに対し、ＩＭ９細胞移植後６日目から１０日目の間に調製した抗体をそれぞれ２００μｌ静脈内連日投与した。
Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体の抗腫瘍効果については、マウスの生存期間で評価した。その結果、図７に示すようにＰＢＳ（−）コントロール投与群とアイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１投与群では、ＩＭ９細胞移植後２０日目あたりから死亡が観察され、ＰＢＳ（−）投与群では移植後２２日目に前例死亡し、アイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１投与群でも同様な生存期間が観察された。ｂ−７６−８抗体投与群ではコントロール群と比較して、生存期間の延長が認められた（ｐ〈０．０１，Ｌｏｇｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）。さらに、ｂ−７６−９−８抗体投与群と比較してＭａｙ−ｂ−７６−８抗体投与群では、有意な生存期間の延長が観察された（ｐ〈０．０５）。一方、ｂ−７６−８抗体とＭａｙ−ＳＨ（１．９ｎｍｏｌ／ｓｈｏｔ）を同時に投与してもｂ−７６−８投与群と比較して有意な生存期間の延長は観察されなかった（ｐ〉０．１）。以上の結果より、Ｍａｙ−ｂ−７６−８抗体がヒト骨髄腫移植マウスに対して抗腫瘍効果を有すること、さらに本抗体の抗腫瘍効果はｂ−７６−９−８抗体単独投与よりも強いことが示された。この事実はインターナリゼーションを有する抗ＢＳＴ２抗体にメイタンシンノイド化合物等の抗腫瘍活性のある物質を結合させることによりさらに強い抗腫瘍効果が期待できることを示し、画期的な骨髄腫治療薬になることができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０００−４０３２４５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
配列番号６−人工配列の説明：プライマー
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
産業上の利用可能性
本発明のモノクローナル抗体は、細胞表面のヒトＢＳＴ２抗原に結合し、インターナリゼーションによって該細胞内部へ局在化しうる特徴を有しているため、この抗体に結合させた治療上有用な薬剤を、ＢＳＴ２を細胞表面に発現する多発性骨髄腫細胞、リンパ球系腫瘍細胞、原発性局所癌細胞などの細胞内に効率よく送達することが可能になり、治療困難な疾患の治療に対し、新しい作用機序に基づく治療剤を提供する利点を有する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、抗ヒトＢＳＴ２抗体のＲＰＭＩ８２２６細胞株に対する反応性を示す図である。
図２は、抗ヒトＢＳＴ２抗体（７−９０Ｇ）のインターナリゼーション誘導活性を示す図である。
図３は、３７℃培養１５分後のＲＰＭＩ８２２６細胞内に内在化する抗ＢＳＴ２抗体を示す顕微鏡写真である。
図４は、完全長ヒトＢＳＴ２ＤＮＡの塩基配列を示す図である。
図５は、完全長ヒトＢＳＴ２のアミノ酸配列を示す図である。
図６は、合成したメイタンシン化合物の５００ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲを示す図である。
図７は、メイタンシン結合ｂ−７６−８抗体のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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