(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均１〜３０個のＨＳ基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも１個のＨＳもしくはＨ2Ｎ基を有し、５０００及び２０００００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールと結合するように、カップリングすることにより、
又は、細胞増殖抑制性化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均１〜３０個のＨＳ基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも１個のＨＯもしくはＨ2Ｎ基を有し、５０００及び２０００００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの１つの分子と結合するように、カップリングすることにより得ることができるか、
或いは、チオール化アルブミンを、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる２〜３０当量の誘導体化された細胞増殖抑制性化合物と付加し、ビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合化させることにより得ることができる、トランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。
【請求項２】
アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金（II）−錯体の各々の群からの細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制牲化合物を、平均１〜３０個のＨＳ基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも１個のＨＳもしくはＨ2Ｎ基を有し、５，０００及び２００，０００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの１つの分子と結合するように、カップリングすることにより、
又は、アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金（II）−錯体の群からの細胞増殖抑制性化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するスペーサ分子とからなる誘導体化された細胞増殖抑制性化合物を、平均１〜３０個のＨＳ基を有するチオール化トランスフェリンもしくはアルブミン又は少なくとも１個のＨＯもしくはＨ2Ｎ基を有し、５，０００及び２００，０００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールと、誘導体化された細胞増殖抑制性化合物の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールと結合するように、カップリングすることにより、
或いは、チオール化アルブミンを、アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタードガス誘導体、プリンもしくはピリミジンアンタゴニスト、葉酸アンタゴニスト、タキソイド類、カンプトテシン類、ポドフィロトキシン誘導体、ビンカアルカロイド又はシス−配位白金（II）−錯体の各々の群からの細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド基を有するスペーサ分子とからなる２〜３０当量の誘導体化された細胞増殖抑制性化合物に付加し、ビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合化させることにより得ることができる、請求項１に記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。
【請求項３】
a）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサンドロン、クロラムブシル、メルファラン、５−フルオロウラシル、５’−デスオキシ−５−フルオロウリジン、チオグアニン、メトトレキセート、パクリタクセル（paclitaxel）、ドセタクセル（docetaxel）、トポテカン（topotecane）、９−アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド（teniposide）、ミトポドシド（mitopodoside）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンオレルビン（vinorelbine）又は一般式Ｉ，II，IIIもしくはIVの化合物
0004573916.tif 000009
［式中、ｎは０〜６、Ｘは−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯＲ*、−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−ＣＯＲ*を示す。Ｒは１〜６の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖又は置換もしくは非置換のフェニレン基を示す。Ｒ*はＨ、フェニル、１〜６の炭素原子を有するアルキルを示す。アミン官能基は、tert−ブチルオキシカルボニル保護基等の保護基を有している。］で表される化合物を、
一般式V，VIもしくはVII
0004573916.tif 000010
［式中、Ｒが１〜６の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖を示す場合、Ｙは−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣｌ、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＯＨ、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨＮＨ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ3Ｃｌ、−ＳＯ2−ＮＨＮＨ2、−Ｏ−ＣＯＣｌ、−ＣＨＯ、ＣＯＲ*を示す。ｎは１〜６、Ｒ*はＨ、フェニル、１〜６の炭素原子を有するアルキルである。Ｒが置換もしくは非置換のベンジル基又は置換もしくは非置換のフェニレン基を示す場合、Ｙは−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣｌ、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＯＨ、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨＮＨ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ3Ｃｌ、−ＳＯ2−ＮＨＮＨ2、−Ｏ−ＣＯＣｌ、−ＣＨＯ、ＣＯＲ*、−ＣＯ−ＮＨＮＨ2を示す。ｎは１〜６、Ｒ*はＨ、フェニル、１〜６の炭素原予を有するアルキルである。］で表されるマレインイミド化合物と反応させることにより、
又は一般式VIII，IXもしくはX
0004573916.tif 000011
［式中、Ｒは置換もしくは非置換のフェニレン基を示す。Ｙは−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣｌ、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＯＨ、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−ＣＯＯ−（ＣＨ2）n−ＮＨＮＨ2、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ3Ｃｌ、−ＳＯ2−ＮＨＮＨ2、−Ｏ−ＣＯＣｌ、−ＣＨＯ、ＣＯＲ*、−ＣＯ−ＮＨＮＨ2を示す。ｎは１〜６、Ｒ*はＨ、フェニル、１〜６の炭素原子を有するアルキルである。］
で表されるＮ−ヒドロキシスクインイミド化合物と反応させることにより得ることができ、
上記一般式I，II又はIIIの化合物から得られる誘導体においては、保護基を除去し、斯くして得られるアミンをテトラクロロプラチネート塩と反応させて対応するシス−配位白金（II）−錯体を得、上記一般式IVの化合物から得られる誘導体を、シス−［ＰｔＡ2Ｂ］（Ａ＝ハロゲン、Ｂ＝（ＮＨ3）2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、１，２−ジアミノシクロヘキサン）と反応させて対応する白金（II）−錯体を得、その結果、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド化合物もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物との間の化学結合は、それぞれアミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシルヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタール又はケタール結合を通じて生ずる細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が供給され、及びb）斯くして得られるマレインイミド誘導体は、平均１〜３０個のＨＳ基を有するチオール化されたトランスフェリンもしくはアルブミンに、又は少なくとも１個のＨＳもしくはＨ2Ｎ基を有し、５，０００及び２００，０００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールに、工程a）で得られるマレインイミド誘導体の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの１分子に結合するようにカップリングされ、又は、斯くして得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体は、トランスフェリン又はアルブミンに、又は少なくとも１個のＨＯもしくはＨ2Ｎ基を有し、５，０００及び２００，０００Ｄａの間の質量を有するポリエチレングリコールに、工程a）で得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の１〜３０分子がトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコールの１分子に結合するようにカップリングされ、又は、チオール化アルブミンを、工程a）で得られるマレインイミド誘導体の２〜３０当量に付加し、一般式XI
0004573916.tif 000012
［Ｚは−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｏ−ＣＯ−、−Ｃ＝ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−を示す。ｎは２〜１２を示す。］
で表されるビスマレインイミド化合物を介して、トランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と複合体化させることにより得ることができる請求項１又は２に記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体。
【請求項４】
a）ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサンドロン、クロラムブシル、メルファラン、５−フルオロウラシル、５’−デスオキシ−５−フルオロウリジン、チオグアニン、メトトレキセート、パクリタクセル、ドセタクセル、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、エトポシド、テニポシド、ミトポドシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンまたは一般式I、II、III若しくはIV
0004573916.tif 000013
［式中、n=0-6、X=-NH2，-OH，-COOH，-O-CO-R-COR*，-NH-CO-R-COR*、Rは1-6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖または置換或いは非置換のフェニレン基であり、R*はH、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルであり、アミン基はtert-ブトキシカルボニル保護基のような保護基を有している。］の化合物を、一般式V、VIまたはVII
0004573916.tif 000014
［式中、Rが1-6の炭素原子を有する脂肪族炭素鎖の場合には、Ｙ=-OH，-COOH，-COCl，-CONH-（CH2）n-OH，-COO-（CH2）n-NH2，-COO-（CH2）n-NHNH2，-SO3H，-SO3Cl，-SO2-NHNH2，-O-COCl，-CHO，-COR*である場合n=1-6、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。また、Rが置換若しくは非置換のベンジル基または置換若しくは非置換のフェニレン基の場合には、Y=-OH，-C00H，-COCl，-CONH-（CH2）n-OH，-COO-（CH2）n-NH2，-COO-（CH2）n-NHNH2，-SO3H，-SO3Cl，-SO2-NHNH2，-O-COCl，-CHO，-COR*においてn=1-6であって、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。］のマレインイミド化合物と反応させるか、または、一般式VIII，IX若しくはX
0004573916.tif 000015
［式中、Rは置換されたまたは非置換のフェニレン基、Y=-OH，-NH2，-NHNH2，-COOH，-COCl，-COO-（CH2）n-OH,-CONH-（CH2）n-NH2,-COO-（CH2）n-NHNH2，-SO3H,-SO3Cl,-SO2-NHNH2,-O-COCl,-CHO,-COR*,-CO-NHNH2においてn=1-6であって、R*=H、フェニル、1-6の炭素原子を有するアルキルである。］
で表されるN-ヒドロキシスクシンイミド化合物とを反応させ、
上記一般式I、IIまたはIIIの化合物から得られる誘導体においては、保護基を除去し、さらに、この様にして得られるアミンを、テトラクロロ白金塩と反応させて、対応するcis-配位の白金（II）錯体を得、また
上記一般式IVの化合物から得られる誘導体を、cis-［PtA2B］（A=ハロゲン、B=（NH3）2，エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2-ジアミノシクロヘキサン）と反応させて、対応する白金（II）錯体を得、その結果、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体またはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が供給され、化学的結合が、アミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシルヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタールまたはケタール結合を通じて、細胞増殖抑制性化合物とマレインイミド化合物またはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物との間に生じ、さらに
ｂ）この様にして得られるマレインイミド誘導体を、平均１〜３０個のHS基を有するチオール化されたトランスフェリン若しくはアルブミン、または少なくとも１個のHS若しくはH2N基を有し、且つ5,000〜200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、工程a）において得られるマレインイミド誘導体の1〜30分子が、トランスフェリン、アルブミンまたはポリエチレングリコールの１分子に結合されるようにカップリングされ、または、この様にして得られるN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体を、トランスフェリンもしくはアルブミンまたは少なくとも１個のHOまたはH2N基を有し、且つ5,000と200,000Daの間の質量を有するポリエチレングリコールと、工程a）において得られるN-ヒドロキシスクシンイミド誘導体の1〜30分子が、トランスフェリン、アルブミンまたはポリエチレングリコールの１分子と結合されるように、カップリングされ、または、チオール化されたアルブミンを、工程a）において得られるマレインイミド誘導体の2〜30当量に付加し、トランスフェリンまたは一般式XI
0004573916.tif 000016
［式中、Z=-CO-NH-（CH2）n-NH-CO-，-CO-O-（CH2）n-O-CO-,-C=NH-（CH2）n-NH=C-，-C=N-NH-（CH2）n-NH-N=C-，-C=N-NH-CO-（CH2）n-CO-NH-N=C-，n=2-12］のビスマレインイミド化合物を介して、腫瘍関連抗原に対しするモノクロナール抗体と複合体化されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体の製造方法。
【請求項５】
必要に応じて通常の担体および補助剤と一緒に、請求項１から３のいずれかに記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項６】
ガン疾患の処置のための請求項１から３のいずれかに記載のトランスフェリン、アルブミン又はポリエチレングリコール複合体を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、適当なキャリアーシステムと細胞増殖抑制性の化合物とからなる、タンパク質とポリマーとの腫瘍抑制性複合体に関する。さらに、本発明は、この様な複合体の製造方法とその使用に関する。
免疫−複合体あるいはタンパク複合体あるいはポリマー複合体は、例えば、抗体、成長因子、ホルモンあるいはペプチド類似構造体、タンパクまたはポリマーの様な適当なキャリア物質と、細胞増殖抑制剤、トキシン類あるいは放射性同位元素などの細胞毒性活性物質の１種または２種以上とからなるコンパウンドである。キャリアー物質は、一般に、好ましくは腫瘍組織中に蓄積するという性質を有しているので、この様にして、キャリアー物質に結合された活性物質も腫瘍組織に蓄積し、選択的な抗腫瘍治療が行われる。化学免疫−複合体は、キャリアー物質と細胞増殖抑制性化合物との複合体であり、そのキャリアーは、一般に、抗体である。
従来技術
現在ガンに対して使用されている細胞増殖抑制剤は、一連の強い全身的な副作用を有しており、腫瘍組織に蓄積しないので、選択的な抗腫瘍治療を可能とする新しい誘導体および配合物が探索されている。この目的で、化学免疫−複合体、すなわち１種の適当なキャリアー物質あるいは細胞増殖抑制剤からなるタンパク類あるいはポリマー類の複合体が開発されつつある。
キャリアー物質として、特に、抗体、成長因子、血清タンパク、ホルモン様構造体あるいはペプチド、あるいはポリマーが考慮されている。これらは、一般に、腫瘍組織中に蓄積することが知られている
0004573916.tif 000002
本発明は、ヒト血清トランスフェリンと血清アルブミンとをキャリアータンパクとして含む。これらについては、腫瘍組織への蓄積は報告されている（Ward,S.G．Taylor,R.C.:1-54,in Metal-Based Drugs（Gielen,M.F.（Ed.））,Freund Publishing House Ltd，1988;Sinn,H.,Schrenk,H.H.,Friedrich,A.,Schilling,U．and Maier-Borst,W.（1990）,Nucl.Med.Biol.,Vol.17（8）,819-827）。また、細胞増殖抑制剤のキャリアーとしてのポリエチレングリコール類（PEGs）も報告されている（Topchieva,I.N.（1990）,Polym.Sci．USSR 32,833-851;Poly（ethylene glycol）Chemistory:Biotechnical and Biomedical Applications（1992）,Ed.J.M.Harris，Plenum Press，New York）。
PEGsは、その生物−適合性、良好な水溶性および合成上の多様性の故に、治療用のポリマー複合体の開発に極めて適している。近年、PEGsは、主に医学上有用なタンパク類および酵素類と複合化されている（Overview in Topchieva,I.N.（1990）,Polym.Sci.USSR,32,833-851）。
化学免疫−複合体およびタンパク複合体あるいはポリマーの複合体は、通常キャリアー物質と活性物質との直接カップリングにより、あるいはスペーサーグループ、いわゆるホモ−あるいはヘテロバイファンクショナル試薬の介在により、生成する。現在までのところ、直接カップリング法が主に使用されているが、この方法は、しばしばポリマー性の生成物と必ずしも明確に同定できない複合体とを形成する。最近、特定のバイファンクショナル試薬を用いて得られた数種の化学免疫−複合体が、細胞増殖抑制的に効果的なメディアとして提案されている（欧州特許出願EP 91-117535 911615,欧州特許出願EP 90-109268 900516,PCT国際特許出願WO 90-CA251 900809,英国特許出願GB 83-5104 830224および欧州特許出願EP 89-102370 890210）。さらに、DE 41 22 210 A1からは、トランスフェリンあるいはアルブミンと腫瘍活性化合物との複合体が知られている。この複合体においては、腫瘍活性化合物は、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドにより活性化され、この様にして得られた混合物は、直接キャリアータンパク質とカップリングされる。
発明の説明
トランスフェリン、アルブミンおよび5000〜200000Daの範囲の質量を有するポリエチレングリコールと、さらにマレインイミドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドの化合物により修飾された少なくとも１種の細胞増殖抑制性化合物とからなるトランスフェリン、アルブミンおよびポリエチレングリコール複合体が、細胞抑制性化合物と同等あるいはそれ以上の腫瘍抑制効果を有していることが見出された。
これらのタンパクのあるいはポリマーの複合体を製造するに適した細胞増殖抑制性化合物としては、下記の化合物をマレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミドの化合物により修飾したものが例示される；ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびミトサンドロンなどのアンスラサイクリン類；クロロアムブシルおよびメルファランなどのアルキレート類；メトトレキセート、5-フルオロウラシル、5′-デスオキシ-5-フルオロウリジンおよびチオグアニンなどの代謝拮抗物質；パクリタクセルおよびドセタクセルなどのタクソイド類；トポテカンおよび9-アミノカンプトテシンなどのカンプトテシン類；エトポシド、テニポシドおよびミトポドシドなどのポドフィロトキシン誘導体；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド類ならびに一般式Ｉ、II、IIIまたはIVの化合物；
0004573916.tif 000003
式中、n=0-6、X=-NH2、-OH、-COOH、-O-CO-R-COR*、-NH-CO-R-COR*（Rは、炭素数1-6の脂肪族炭素鎖あるいは置換もしくは非置換のフェニレン基およびR*H、フェニル、炭素数1-6のアルキルの１種であり、アミン官能基はtert-ブチロキシカルボニル保護基の様な保護基を有している）。製造に際し、細胞増殖抑制性化合物を通常マレインイミド化合物あるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物と反応させる。これらの化合物は、細胞増殖抑制性化合物と結合するに適した少なくとも１つの基、例えば、アミノ-、ヒドロキシ-、カルボン酸-、カルボン酸クロライド-、スルホン酸-、スルホン酸クロライド-、酸ヒドラジド-あるいはヒドラジノ-、オキシカルボニルクロライド-、アルデヒド-あるいはケト-基を有しているので、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体あるいはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が得られる。これらの誘導体においては、マレインイミド化合物と細胞増殖抑制性化合物との化学的結合は、アミド、エステル、イミン、ヒドラゾン、カルボキシヒドラゾン、オキシカルボニル、アセタールまたはケタール結合により生ずる。一般式Ｉ-IVの化合物から得られるマレインイミドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドには、次いで、細胞増殖抑制性シス−配位のプラチナユニットが導入される。すなわち、保護基の除去後、テトラクロロプラチネート塩とのあるいはcis-［PtA2B］（A=ハロゲン、B=（NH3）2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、1,2-ジアミノシクロヘキサン）との反応を経て、対応するPt（II）-錯体が得られる。
下記概要１に示す通り、修飾された細胞増殖抑制性化合物と天然のあるいはチオール化されたトランスフェリンまたはアルブミンとの反応により、あるいは質量5000〜200000のヘテロ-またはホモバイファンクショナルPEGsとの反応により、
概要図１：
0004573916.tif 000004
タンパクあるいはポリマーの複合体が容易にかつ効率よく製造される。この複合体は、高純度で、オリジナルの細胞増殖抑制性化合物の幾つかと比較して、優れた水溶性を有し、生理的緩衝液中で安定した配合物を形成し、ヒト腫瘍細胞に対して、非結合の細胞増殖抑制性化合物と同等あるいはそれ以上のインビトロ抗増殖効果を発揮する。さらに、複合体は、インビボで同等あるいは改善された抗腫瘍効果を発揮し、改善された耐性を示す。ガン疾患の選択的治療に極めて適したこの様なカップリングにより得られたタンパクまたはポリエチレングリコールの複合体が、本発明の目的物であり、以下に詳述する。
タンパクあるいはポリエチレングリコールの複合体の合成方法は、４段階（工程１から４）でのマレインイミド誘導体との複合体あるいは３段階（工程１、２および４）でのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体との複合化により、行われる。
工程１：マレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
工程２：細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体あるいはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の合成
工程３：キャリアータンパクのチオール化
工程４：工程２で得られた細胞増殖抑制性化合物の天然あるいはチオール化キャリアータンパクに対するあるいは前記概要１に示すPEGsに対するカップリング
工程１：マレインイミドあるいはN-ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
マレインイミド化合物は、通常下記の２つの方法にいずれかにより製造される。
第一の方法においては、無水マレイン酸を脂肪族アミノ化合物H2N-R-Y（Rは、炭素数1〜6の脂肪族Ｃ鎖あるいは置換もしくは非置換のベンジル基である；Yは、-OH、-COOH、-SO3H、-CH（OC2H5）2、R*-C=O、R*=フェニルまたは炭素数1〜6のアルキル基である）と反応させて、対応するマレアミノ酸を生成させ、次いで、2当量までのトリエチルアミン（Et3N）と無水トルエン中で水を共沸除去しつつ反応させて、対応するマレインイミド化合物を得る。Y基のそれ以外の修飾は、-COOHあるいは-SO3H基をシュウ酸クロライドまたはチオニルクロライドと反応させて対応する酸塩化物を生成させることにより、ヒドロキシ基をビス（トリクロロメチル）-カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロライドを生成させることにより、アセタール基-CH（OC2H5）2を、例えば、p-トルエンスルホン酸、硫酸あるいは酸性シリカゲルなどを使用する酸触媒開裂で対応するアルデヒドを生成させることにより、および酸塩化物をN-（tert-ブトキシカルボニル）-アルコールアミンあるいはN-（tert-ブトキシカルボニル）-アルコールヒドラジンと反応させ、次いでエーテル、テトラヒドロフラン（THF）あるいはジオキサン中でのトリフルオロ酢酸あるいは塩化水素による開裂によりそれぞれ対応するアミノ化合物あるいはヒドラジノ化合物を得る。
第二の方法において、マレイン酸無水物を芳香族アミノ化合物Ｈ2Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中、Ｒは置換又は非置換のフェニレン基であり、Ｙ＝−ＯＨ，−ＣＯＯＨ，−ＳＯ3Ｈ，Ｒ*−Ｃ＝Ｏ（Ｒ*＝フェニル又は炭素原子数１〜６のアルキル基）］と反応させて、対応するマレアミノ酸を得、続いて酢酸無水物及び無水酢酸ナトリウムと反応させてマレインイミド化合物を得る。基Ｙのさらなる誘導体化を、−ＣＯＯＨ又は−ＳＯ3Ｈ基を塩化オキサリル又は塩化チオニルと反応させて、対応する酸クロリドを得ることにより、水酸基をビス（トリクロロメチル）−カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得ることにより、LiAl［OC（CH3）3］Hと酸クロリドをＴＨＦ中で反応させて対応するアルデヒドを得ることにより、酸クロリドをＴＨＦ又は酢酸エチル中でｔ−ブチルカルバゼート（t-Butylcarbazate）と反応させ、続いてエーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中でトリフルオロ酢酸又はＨＣｌで開裂させて対応する酸ヒドラジドを得ることにより、及び酸クロリドをＮ−（tert−ブトキシカルボニル）アルコールアミン又はＮ−（tert−ブトキシカルボニル）アルコールヒドラジンと反応させ、次いでエーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中でトリフルオロ酢酸又はＨＣＬで開裂させ、対応するアミノ又はヒドラジノ化合物を得ることにより行う。
一般式VI及びVIIのマレインイミド化合物は、上記方法にて得られたマレインイミド化合物［式中、Ｙは−ＣＯ−ＮＨＮＨ2又はＣＯＲ*であり、ｎ＝１〜６、Ｒ*＝Ｈ，フェニル，炭素原子数１〜６のアルキルである。］を、一般式Ｏ＝ＣＲ*−Ｒ−Ｙで表されるカルボニル化合物と、又は一般式Ｙ−Ｒ−Ｒ*ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2で表される酸ヒドラジドと、無水ＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、必要に応じてトルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、反応させて得られる。基Ｙのさらなる誘導体化を、ＣＯＯＨ−又はＳＯ3Ｈ基を、塩化オキサリルと又は塩化チオニルと反応させて、対応する酸クロリドを得ることにより、或いは、ヒドロキシ基をビス−（トリクロロメチル）−カーボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得ることにより行う。
一般式XI［式中、２つのマレインイミド化合物はジアミノアルカン、ジヒドロキシアルカン、ジヒドラジノアルカン又はカルボン酸ジヒドラジド化合物を示す基Ｚにより結合しており、その結果２つのマレインイミド化合物は２つのアミド、エステル、イミン、ヒドラゾン又はカルボキシルヒドラゾン結合を介して互いに結合している。］のビスマレインイミド化合物は上記マレインイミド化合物より得られ、アミン結合により結合している化合物の合成は、ＴＨＦ又は酢酸エチル中で、必要に応じてEt3Nを添加して、マレインイミド化合物の酸クロリドをジアミノアルカン化合物NH2-（CH2）n-NH2［ｎ＝２〜１２］と反応させることにより行い、エステル結合により結合している化合物の合成は、ＴＨＦ又は酢酸エチル中で、必要に応じてEt3Nを添加して、マレインイミド化合物の酸クロリドをジヒドロキシ化合物HO-（CH2）n-OH［ｎ＝２〜１２］と反応させることにより行い、イミン結合により結合している化合物の合成は、無水ＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、マレインイミド化合物のアルデヒド又はケトンをジアミノアルカン化合物NH2-（CH2）n-NH2［ｎ＝２〜１２］と反応させることにより行い、ヒドラゾン又はカルボキシルヒドラゾン結合により結合している化合物の合成は、無水ＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、マレインイミド化合物のアルデヒド又はケトンをジヒドラジノアルカン化合物NH2-NH-（CH2）n-NH-NH2又はカルボン酸ジヒドラジン類H2N-NH-CO-（CH2）n-CO-NH-NH2［ｎ＝２〜１２］と反応させることにより行う。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化合物は、通常、対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物得るために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをY-R-COOH又はY-R-COCl［式中、Ｒは置換又は非置換のフェニレン基であり、Ｙ＝-OH，-NH2，-COO-（CH2）n-OH，-CONH-（CH2）nNHBOC，-NHNHBOC，-COO-（CH2）nNHNHBOC，-SO3H，-SO2-NHNHBOC，-CHO，-COR*，-CO-NHNHBOC、ｎ＝１〜６であり、Ｒ*＝Ｈ，フェニル，炭素原子数１〜６のアルキルであり、BOCはtert-ブチルオキシカルボニル保護基である。］と反応させることにより得られる。この場合、Y-R-COOHから開始する反応は、無水溶媒、好ましくはジクロロメタン，アセトニトリル又はＴＨＦ中で、ジメチルアミノピリジン（DMAP）及び縮合剤、通常、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド  メト−ｐ−トルエンスルホネート（CMC）を添加して行い、対応するスクシンイミドエステル誘導体を得る。例えば塩化オキサリル又は塩化チオニルのような酸ハロゲン化剤による塩素化により得られる酸クロリド  Y-R-COClを用いる場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応は、好ましくは無水ＴＨＦ，アセトニトリル又は酢酸エチル中で行う。
次いで、ＢＯＣ保護基をエーテル又はジオキサン中トリフルオロ酢酸又はＨＣｌで除去し、対応するアミノ又はヒドラジノ化合物並びに酸ヒドラジドをトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩として得る。基Ｙのさらなる誘導体化は、水酸基をビス−（トリクロロメチル）カーボネートと反応させて行い、対応するオキシカルボニルクロリドを得る。
一般式IX及びＸのＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物は、上記方法にて得られるヒドロキシスクシンイミド化合物［式中、Ｙは-CONHNH2又は-COR*であり、ｎは１〜６であり、Ｒ*＝Ｈ，フェニル，炭素原子数１〜６のアルキルである。］を、一般式O=CR*-R-Yで表されるカルボニル化合物と、又は一般式Y-R-R*CO-NH-NH2で表される酸ヒドラジドと、無水ＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、必要に応じてトルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して反応させることにより得られる。基Ｙのさらなる誘導体化は、ＣＯＯＨ若しくはＳＯ3Ｈ基を塩化オキサリルと、又は塩化チオニルと反応させて行い、対応する酸クロリドを得、水酸基をビス（トリクロロメチル）カルボネートと反応させて対応するオキシカルボニルクロリドを得る。
上記マレインイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物の単離は、下記の実施例に詳述されるように、結晶化、シリカゲルカラムクロマトグラフィー又はジオールカラム上での分取ＨＰＬＣ若しくはＬＰＬＣのいずれかにより行われる。
工程２：細胞増殖抑制化合物のマレインイミド誘導体又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体
工程１にて得られたマレインイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物との反応に適しているのは、請求項１〜３に記載された細胞増殖抑制性化合物である。これら細胞増殖抑制性化合物は、工程１に記載されたマレインイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物と反応し、細胞増殖抑制性化合物のマレインイミド誘導体及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体が得られ、マレインイミド化合物又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物と細胞増殖抑制性物質との間の化学結合は、アミド，エステル，イミン，ヒドラゾン，カルボキシルヒドラゾン，アセタール又はケタール結合を介して起こる。
アンスラサイクリン類，ドキソルビシン，ダウノルビシン，エピルビシン又はイダルビシンの場合、合成の詳細は、対応するアンスラサイクリン−マレインイミド誘導体又は対応するアンスラサイクリン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＴＨＦ中にて、必要に応じて第三級塩基、通常Et3Nを添加し、又は必要に応じてＤＭＡＰ及び縮合剤、通常ＤＣＣ若しくはＣＭＣを添加する、工程１に挙げられた式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドの酸又は酸クロリドとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのアミノ糖の３’−ＮＨ2基を介してアミド結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはＤＭＦ，メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する、工程１に挙げられたマレインイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのアミノ糖の３’−ＮＨ2基を介してイミン結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、通常トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する、工程１に挙げられたマレインイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミンとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのＣ13−ケト位を介してイミン結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはＤＭＦ，メタノール又はエタノール中で、酸、通常、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加する工程１に挙げられたマレインイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸ヒドラジドとの反応によるものであり、カップリングは、アンスラサイクリンのＣ13−ケト位を介してカルボキシル又はスルホニルヒドラゾン結合として生じる。
ミトザンドロン（Mitoxandron）の場合、合成は、詳細には、対応するミトザンドロン−マレインイミド誘導体又はミトザンドロン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、溶媒、好ましくはＤＭＦ又はＴＨＦ中で、必要に応じて第３級塩基、通常、Et3Nを添加し、或いは必要に応じてＤＭＡＰ及び縮合剤、通常、ＤＣＣ又はＣＭＣを添加する、工程１に挙げられた式Ｖ〜ＸのマレインイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸クロリドとの反応により行われ、カップリングはミトザンドロンの脂肪族ＨＯ−基の少なくとも１つを介してエステル結合として生じ、
或いは、溶媒、好ましくはＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常トリフルオロ酢酸又はトルエン−ｐ−スルホン酸を添加する、工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンとの反応により行われ、カップリングは、ミトザンドロンの脂肪族ＨＯ−基の少なくとも１つを介してアセタール又はケタール結合として生じる。
クロラムブシル（Chlorambucil）及びメルファランのようなアルキル化剤の場合、合成は、詳細には、クロラムブシル又はメルファランと工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のヒドロキシ化合物を、溶媒、好ましくはＤＭＦ，ジクロロメタン又はＴＨＦ中で、ＤＭＡＰ及び縮合剤、通常ＤＣＣ又はＣＭＣを添加して反応させ、対応するクロラムブシル又はメルファラン−マレインイミド誘導体或いはクロラムブシル又はメルファラン−ヒドロキシスクシンイミド誘導体をそれぞれ得、カップリングはクロラムブシル又はメルファランのＣＯＯＨ基を介してエステル結合として生じ、
或いは、クロラムブシル又はメルファランを、それぞれ塩化オキサリル又は塩化チオニルのような酸ハロゲン化試薬と反応させ、対応する酸クロリドを得、次いで酸クロリドとＴＨＦ又は酢酸エチル中で、必要に応じて第三級塩基、通常Et3Nを添加し、ｔ−アルキルカルバゼート、通常tert−ブチルカルバゼートと反応させ、
或いは、クロラムブシル又はメルファランを、ＤＭＦ，ＴＨＦ又は酢酸エチル中でｔ−アルキルカルバゼートと、通常、ＤＣＣ又はＣＭＣと反応させ、次いで得られた生成物を、エーテル，ＴＨＦ又はジオキサン中、酸、通常、トリフルオロ酢酸又はＨＣｌで開裂させ、対応するクロラムブシル又はメルファランの酸ヒドラジドをそれぞれ得、次いで工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンの１種と、溶媒、好ましくはＤＭＦ，メタノール又はエタノール中で、酸、通常、トリフルオロ酢酸又はトルエン−ｐ−スルホン酸と反応させ、クロラムブシル又はメルファランの対応するマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシルヒドラゾン誘導体をそれぞれ得る。
５−フルオロウラシルの場合、合成は、詳細には、対応する５−フルオロウラシルのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸クロリドと、溶媒、好ましくはＴＨＦ中で、必要に応じて第３級塩基、通常Et3Nを添加した反応により行われ、カップリングは、５−フルオロウラシルの1Ｎ−又は3Ｎ−位を介して酸アミド結合として生じ、
或いは、対応する５−フルオロウラシルのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のオキシカルボニルクロリドと、溶媒、好ましくはＴＨＦ中で、必要に応じて第３級塩基、通常Et3Nを添加しての反応により行われ、カップリングは、５−フルオロウラシルの1Ｎ−又は3Ｎ−位を介してオキシカルボニル結合として生じ、
或いは、対応する５−フルオロウラシルのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、５−フルオロウラシルを、工程１に挙げられたホルムアルデヒド、カルボン酸及びスルホン酸と、溶媒、好ましくはジクロロメタン又はＴＨＦ中で、必要に応じてＤＭＡＰ及び縮合剤、通常、ＤＣＣ又はＣＭＣを添加した反応により行われ、カップリングは５−フルオロウラシルの1Ｎ−又は3Ｎ−位でカルバモイルオキシメチル結合として生じる。
５’−デスオキシ−５−フルオロウリジンの場合、合成は、詳細には、５’−デスオキシ−５−フルオロウリジンの対応するマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を得るために、工程１に挙げられた式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸クロリドと、溶媒、好ましくはＴＨＦ中で、必要に応じて第３級塩基、通常、Et3Nを添加して反応を行い、カップリングは５’−デスオキシ−５−フルオロウリジンの２’−ＨＯ又は３’−ＨＯ基を介してエステル結合として生じ、
或いは、工程１に挙げられたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンと、溶媒、好ましくはＴＨＦ，メタノール又はエタノール中で、必要に応じて酸、通常、トリフルオロ酢酸又はトルエン−ｐ−スルホン酸を添加して反応を行い、カップリングは、５’−デスオキシ−５−フルオロウリジンの２’−ＨＯ及び／又は３’−ＨＯ基を介してアセタール又はケタール結合として生じる。
チオグアニン（thioguanine）の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加して、工程１に記載された式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸塩化物と反応させ、アミド結合としてチオグアニンのＨ2Ｎ基を介してカップリングが生じ、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ中で、対応するチオグアニンのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体が生じることによって合成が行われるか、
或いは、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はトルエン−ｐ−スルホン酸を添加して、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンと反応させ、イミン結合としてチオグアニンのＨ2Ｎ基を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
メトトレキセート（methotrexate）の場合には、詳細には、溶媒、好ましくはＤＭＦ又はジメチルスルホキシド中で、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のヒドロキシ又はアミノ化合物をメトトレキセートと反応させ、エステル又はアミド結合としてα−ＣＯＯＨ基若しくはγ−ＣＯＯＨ基を介するか、又は両方のＣＯＯＨ基を介してカップリングが生じ、それぞれ、対応するメトトレキセート−マレインイミド誘導体又はメトトレキセート−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることにより合成が行われるか、
或いは、溶媒、好ましくはＤＭＦ又はジメチルスルホキシド中で、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、アルキルカルバゼート、一般にｔ−ブチルカルバゼートをメトトレキセートと反応させ、続いて、エーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はＨＣｌで開裂させて、メトトレキセートのα−ＣＯＯＨ基若しくはγ−ＣＯＯＨ基、又は両方のＣＯＯＨ基に酸ヒドラジド基を導入して、対応するメトトレキセートの酸ヒドラジドとし、得られたメトトレキセートの酸ヒドラジド誘導体を、溶媒、好ましくはＤＭＦ、メタノール、ＴＨＦ又はエタノール中で、酸、一般に、トリフルオロ酢酸又はトルエン−ｐ−スルホン酸を添加して、工程１に記載されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンの一種と反応させて、対応するメトトレキセートのＮ−ヒドロキシスクシンイミド  カルボキシルヒドラゾン誘導体とすることによって、合成が行われる。
タキソイド（taxoides）、パクリタクセル（paclitaxel）及びドセタクセル（docetaxel）の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加し、工程１に記載された一般式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させ、エステル結合としてタキソイドのＣ7−又はＣ10−ＯＨ基を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはＤＭＦ又はＴＨＦ中で対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって、合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくはＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加し、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン又はヒドラジンと反応させ、イミン又はヒドラゾン結合としてタキソイドのＣ9−ケト位を介してカップリングが生じて、合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくはＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸ヒドラジドと反応させ、カルボキシル又はスルホニルヒドラゾン結合として、タキソイドのＣ9−ケト位を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
カンプトテシン（camptothecines）、トポテカン（topotecan）又は９−アミノカンプトテシン（９−aminocamptothecine）の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加し、工程１に記載された式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合としてトポテカンのＣ10−ＯＨ基を介してカップリングが生じるか、又はアミド結合として９−アミノカンプトテシンのＣ9−ＮＨ2基を介してカップリングが生じ、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ又はＴＨＦ中で、対応するトキソイド−マレインイミド誘導体又はトキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体が生じることによって合成が行われるか、
又は、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、必要に応じて、酸、一般に、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加し、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアルデヒド又はケトンを９−アミノカンプトテシンと反応させ、イミン結合としてＣ9−ＮＨ2基を介してカップリングが生じて、合成が行われる。
ポドフィロトキシン（podophyllotoxin）誘導体、エトポシド（etoposide）、テニポシド（teniposide）及びミトポドジド（mitopodozide）の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、工程１に記載された式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合としてポドフィロトキシン誘導体の脂肪族ＨＯ−基の一個を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはＤＭＦ、ジクロロメタン又はＴＨＦ中で、対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって合成が行われる。
ビンカアルカロイド（vinca alkaloids）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンデシン（vindesine）及びビンオレルビン（vinorelbine）の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、工程１に記載された一般式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させて、エステル結合として、ビンカアルカロイドの脂肪族ＨＯ−基の一個を介して、カップリングが生じ、溶媒、好ましくはＤＭＦ、ジクロロメタン又はＴＨＦ中で、対応するタキソイド−マレインイミド誘導体又はタキソイド−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を生じることによって合成が行われる。
シス−配位の白金（II）−錯体のマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の場合には、詳細には、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、対応するアミノ化合物Ｈ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ、（Ｈ2Ｎ−ＣＨ2）2ＣＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ又はＨ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ（一般式Ｉ、II及びIII）（式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、ＢＯＣ基で保護されており（ビス−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル無水物との反応）、Ｘは−ＮＨ2又は−ＯＨである）を、溶媒、好ましくはＴＨＦ又は酢酸エチル中で、工程１に記載された一般式Ｖ〜Ｘのマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の酸又は酸塩化物と反応させ、対応するＢＯＣ−保護マレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、エーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はＨＣｌにより、ＢＯＣ基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、ＤＭＦ、ＤＭＦ／水混合物、ＴＨＦ／水混合物又はＤＭＦ／メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸（II）塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸（II）カリウムと反応させて、エステル結合として末端ＨＯ基を介すか、又は酸アミド結合として末端Ｈ2Ｎ基を介してカップリングが生じて、対応する白金（II）−錯体とすることによって合成が行われるか、
又は、対応するアミノ化合物Ｈ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ、（Ｈ2Ｎ−ＣＨ2）2ＣＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ又はＨ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ（一般式Ｉ、II及びIII）（式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、ＢＯＣ基で保護されており（ビス−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル無水物との反応）、Ｘは−ＮＨ2又は−ＯＨである）を、溶媒、好ましくはＴＨＦ又は酢酸エチル中で、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＣＲ*又はＣｌＯＣ−Ｒ−ＣＯＣＲ*（Ｒは炭素数１〜６の脂肪族炭素鎖又は飽和若しくは不飽和のフェニレン基であり、Ｒ*は、Ｈ、フェニル、炭素数１〜６のアルキルである）型化合物と反応させ、更にカルボニル基を有する対応するＢＯＣ−保護マレインイミド又はヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、これを、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン、酸ヒドラジド又はヒドラジンと反応させ、対応するイミン、カルボキシルヒドラゾン又はヒドラゾン誘導体とし、次いで、再度、エーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はＨＣｌにより、ＢＯＣ基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、ＤＭＦ、ＤＭＦ／水混合物、ＴＨＦ／水混合物又はＤＭＦ／メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸（II）塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸（II）カリウムと反応させて、対応する白金（II）−錯体とすることによって合成が行われるか、
又は、対応するアミノ化合物Ｈ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ、（Ｈ2Ｎ−ＣＨ2）2ＣＨ−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ又はＨ2Ｎ−ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）−（ＣＨ2）ｎ−Ｘ（一般式Ｉ、II及びIII）（式中、第一級又は第二級アミノ基の一個又は二個は、ＢＯＣ基で保護されており（ビス−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル無水物との反応）、ＸはＣＯＯＨであるか又はこのカルボニル基は、塩化チオニル又は塩化オキサリル等の酸ハロゲン化剤を用いて酸塩化物に変換されている）を、溶媒、好ましくはＴＨＦ又は酢酸エチル中で、必要に応じて、三級塩基、一般に、Ｅｔ3Ｎを添加するか、又は必要に応じて、ＤＭＡＰ及び縮合剤、一般にＤＣＣ又はＣＭＣを添加して、ＨＯＲ−ＣＯＣＲ*又はＨ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＣＲ*（Ｒは炭素数１〜６の脂肪族炭素鎖又は飽和若しくは不飽和のフェニレン基であり、Ｒ*は、Ｈ、フェニル、炭素数１〜６のアルキルである）と反応させ、更にカルボニル基を有する対応するＢＯＣ−保護マレインイミド又はヒドロキシスクシンイミド誘導体とし、次いで、これを、溶媒、好ましくは、ＤＭＦ、メタノール又はエタノール中で、酸、一般に、トルエン−ｐ−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸を添加して、工程１に記載されたマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のアミン、酸ヒドラジド又はヒドラジンと反応させて、対応するイミン、カルボキシルヒドラゾン又はヒドラゾン誘導体とし、次いで、再度、エーテル、ＴＨＦ又はジオキサン中で、トリフルオロ酢酸又はＨＣｌにより、ＢＯＣ基を開裂させて、対応するトリフルオロ酢酸塩又は塩酸塩とし、最終的に、水、塩緩衝液、ＤＭＦ、ＤＭＦ／水混合物、ＴＨＦ／水混合物又はＤＭＦ／メタノール混合物中で、テトラクロロ−白金酸（II）塩、好ましくは、テトラクロロ白金酸（II）カリウムと反応させて、対応する白金（II）−錯体とすることによって合成が行われる。
一般式IV（ＨＯＯＣ）2−ＣＨ−（ＣＨ2）ｎＸのマロン酸誘導体を有するマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体をシス−配位の白金（II）錯体とする場合には、上記錯体の場合と同様にして合成が行われ、マロン酸誘導体を有するマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を、水酸化物溶液、好ましくはＫＯＨ水溶液を添加して、シス−［ＰｔＡ2Ｂ］（Ａ＝ハロゲン、好ましくはＣｌ又はＩ、Ｂ＝（ＮＨ3）2、エチレンジアミン、プロパンジアミン、１，２−ジアミノシクロヘキサン）と反応させて、水、塩緩衝液、ＤＭＦ、ＤＭＦ／水混合物、ＴＨＦ／水混合物又はＤＭＦ／メタノール混合物等の溶媒中で、対応する白金（II）錯体とすることによって、白金（II）錯体が得られる。この反応は、必要に応じて、硝酸銀（ＡｇＮＯ3）又は硫酸銀（Ａｇ2ＳＯ4）の存在下に行うことができる。白金錯体は、結晶化、又は溶媒、好ましくは、ジエチルエーテル又はＴＨＦの添加により得られる。
上記したマレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド細胞増殖抑制化合物の分離は、下記実施例に記載するように、それぞれ、結晶化、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、又は逆相（Ｃ８又はＣ１８）若しくはジオールカラムによる分離用ＨＰＬＣ又はＬＰＬＣにより行われる。
工程３：担体タンパク質のチオール化
スルホヒドリル基（ＨＳ基）は、担体タンパク質とチオール化剤、好ましくはイミノチオラン（iminothiolan）の反応により、ヒト血清トランスフェリン及び血清アルブミンに導入される。チオール化は、過剰のチオール化剤（２〜１００倍過剰）を含む塩緩衝液、一般に、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ−ｐＨ＝８．０中で生じ、引き続き、０．０２５Ｍホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ＝６．０〜７．５又は０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５等の塩緩衝液を用いてゲル濾過（例えば、登録商標：Sephadex G10又はG25）を行う。ゲル濾過終了後のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光係数により決定され、一般に、１．０×１０-4〜５．０×１０-3Ｍの範囲である。導入されたＨＳ基の数は、４１２ｎｍでエルマン試薬（Ellmann’s reagent）で決定される。反応条件を変化させることにより、平均して１〜３０個のＨＳ基を導入できる。チオール化されたトランスフェリン又はアルブミン溶液は、複合体の合成に直接使用される。
工程４：概要１に示された、細胞増殖抑制性マレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の、天然若しくはチオール化担体蛋白への又はポリエチレングリコールへのカップリング
細胞増殖抑制性マレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物のＰＥＧ類へのカップリングのために、ＨＯ−、ＨＳ−又はＨ2Ｎ基の１又は２個及び５，０００〜２００，０００Ｄａの間の好ましくは２０，０００〜７０，０００Ｄａの間の質量を有するＰＥＧ類が用いられる。相当する化合物は市販されていない。以下において、１又は２個のＳＨ基を有するポリエチレングリコールはＨＳ−ＰＥＧ又はＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨと略称し、１又は２個のＨ2Ｎ基を有するＰＥＧ類はＨ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2と略称する。
細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体のチオール化担体蛋白への又はＨＳ−ＰＥＧ、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2へのカップリング；細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体（工程２参照）は、チオール化トランスフェリン、アルブミン（工程３参照）、ＨＳ−ＰＥＧ、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2と室温で反応される。反応の間に、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５又は０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５の様な脱気した塩緩衝液中に存在している、チオール化蛋白、ＨＳ−ＰＥＧ、ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2に、（蛋白又はＰＥＧ中の利用できるＨＳ基の数に関して）約１．１〜１０倍過剰の細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体を加え、通常ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はＴＨＦ（チオール化試料の容量の約１〜１０％）のような溶剤の最小量に溶解した。約５〜１２０分後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体又はＰＥＧ複合体を、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５、０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５若しくは０．１〜０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3の様な脱気した塩緩衝液中、又はメタノール若しくはＴＨＦ中での、引き続くゲル濾過（例えば、セファデックス（登録商標）Ｇ１０、Ｇ２５又はＬＨ２０）により、過剰の細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体から分離した。マレインイミド誘導体の添加に先立って、チオール化蛋白溶液を塩緩衝液で希釈し、最小量の溶剤に溶解されたマレインイミド誘導体を加え、次いで５〜２０分後通常の市販濃縮器で溶液を濃縮し、そして上記の如く蛋白複合体を分離することが、有利であり得る。更に、かくして得られた蛋白複合体又はＰＥＧ複合体の溶液は、通常の市販濃縮器で濃縮でき、又は溶剤は高真空下で除去できる。
細胞増殖抑制性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の天然担体蛋白への又はＨＯ−ＰＥＧ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2へのカップリング；細胞増殖抑制性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体（工程２参照）は、トランスフェリン、アルブミン、ＨＯ−ＰＥＧ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2と室温で反応させる。反応の間に、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜８．０又は０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜８．０の様な脱気した塩緩衝液中に存在している、蛋白、ＨＯ−ＰＥＧ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ又はＨ2Ｎ−ＰＥＧ−ＮＨ2に、約１．１〜５０倍過剰の細胞増殖抑制性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を加え、通常ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、水、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はＴＨＦ（チオール化試料の容量の約１〜１０％）である溶剤の最小量に溶解する。約５分〜４８時間後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体又はＰＥＧ複合体を、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５、０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５若しくは０．１〜０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3の様な脱気した塩緩衝液中、又はメタノール若しくはＴＨＦ中での、引き続くゲル濾過（例えば、セファデックス（登録商標）Ｇ１０、Ｇ２５又はＬＨ２０）により、過剰の細胞増殖抑制性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体から分離した。かくして得られた蛋白複合体又はＰＥＧ複合体の溶液は、通常の市販濃縮器で濃縮でき、又は溶剤は高真空下で除去できる。
担体蛋白に又はポリエチレングリコールに結合している細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の数は、細胞増殖抑制性マレインイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の吸収波長（典型的には２２０と６６０ｎｍの間）での光学的濃度測定法により及び／又は比色測定法により特定され、クロラムブシルとメルファランの複合体の場合はＮＢＰテストにより特定され（Epstein，J.，Rosenthal，R.W.，Ess．R．J．Anal．Chem．（1955），27，1435-1439）、５−フロオロウラシルと５’−デスオキシ−５−フルオロウリジンの複合体の場合はHabibによるアッセイにより特定され（Habib，S．T.，Talanta（1981），28，685-87）、そしてｃｉｓ−配位白金（ＩＩ）アナログの複合体の場合はゴニアス（Gonias）及びピゾ（Pizzo）による測定法（Gonias，S.L.，Pizzo，S.V.，J．Biol．Chem．（1982），258，5764-5769）または原子吸光スペクトル（AAS）により、特定される。
平均で、上記記載の方法により、約１〜３０分子の細胞増殖抑制性化合物が蛋白１分子に結合しており、１〜２分子の細胞増殖抑制性化合物がＰＥＧ１分子に結合している。蛋白複合体又はＰＥＧ複合体の純度は、分析カラムによるＨＰＬＣ（Bio-RadからのBio-Sil SEC 250（300mm×7.8mm）、移動相：通常０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、５％ＣＨ3ＣＮ−ｐＨ７．０又はMacherey and NagelからのNucleogel（登録商標）aqua-OH 40若しくは60、移動相：通常０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、３０％メタノール−ｐＨ７．０）により、調べる。そうするとき、トランスフェリン、アルブミン及びポリエチレングリコールの複合体は、＞９０％の純度を示す。
蛋白複合体又はＰＥＧ複合体は、溶液形態では０〜５℃で、凍結形態ではＴ＝−２０℃ないし−７８℃で、保存することができる。更に、複合体の溶液は、凍結乾燥し、その凍結乾燥物を＋５℃〜−７８℃で保存することができる。
本発明の目的は、請求項１〜３の１つによる、約２〜３０当量の細胞増殖抑制性化合物を積載し．それが蛋白と、例えばトランスフェリン又は腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と、好ましくはトランスフェリンと、請求項３に挙げられているビスマレインイミド化合物の一つを介して、或いは脂肪族又は芳香族ビスマレインイミド化合物を介して、複合体化されたアルブミンからなる化学免疫複合体にもある。そのようにして、通常ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はＴＨＦ（チオール化試料の容量の約１〜１０％）の溶剤の最小量に溶解した細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体を用い、アルブミンに導入されたチオール基の約８０〜９０％が、反応され、そして約５〜６０分後、通常ＤＭＦ、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、アセトニトリル又はＴＨＦ（チオール化試料の容量の約１〜１０％）である溶剤の最小量に溶解したビスマレインイミド化合物の１．５〜２０倍過剰量が加えられる。約５〜２０分後、溶液を遠心分離し、形成された蛋白複合体を、通常、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５又は０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５の塩緩衝液中での、引き続くゲル濾過（例えば、セファデックス（登録商標）Ｇ１０又はＧ２５）により、細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体及びビスマレインイミド化合物から分離する。次いで、こうして修飾されたアルブミン複合体は平均で約１．５個のチオール基を含む前記蛋白の一つと反応させられ、そして得られた細胞増殖抑制性化合物を積載したアルブミンと前記蛋白からなる化学免疫複合体を、通常、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．５〜８．０、０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．５〜８．０の塩緩衝液中での、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（会社：ファルマシア）又はヒドロキシアパタイトカラム（会社：ファルマシア又はBio-Rad）により、分離される。
また、先ず、平均で約１．５個のチオール基を含む前記蛋白の一つとビスマレインイミド化合物の１．５〜１０倍過剰量とを反応させ、次いで、形成された蛋白複合体を、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５、０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜７．５又は０．１〜０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3の脱気された塩緩衝液中での、引き続くゲル濾過（例えば、セファデックス（登録商標）Ｇ１０又はＧ２５）により、ビスマレインイミド化合物から分離し、次いで、こうして修飾された平均で約１．５当量のビスマレインイミド化合物を含む蛋白複合体を、アルブミンに導入された約８０〜９０％のチオール基が既に細胞増殖抑制性マレインイミド誘導体と反応している修飾されたアルブミン複合体と反応させることも可能である。得られた細胞増殖抑制性化合物を積載したアルブミン分子と前記蛋白からなる化学免疫複合体を、０．０２５Ｍナトリウムボレート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜８．０、０．００４Ｍホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ６．０〜８．０又は０．１〜０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3の脱気された塩緩衝液中での、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（会社：ファルマシア）又はヒドロキシアパタイトカラム（会社：ファルマシア又はBio-Rad）により、分離される。
以下の実施例により、本発明を制限することなく、更に詳しく本発明を説明する。
具体的実施例
工程１：マレインイミド化合物及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物の合成
ｐ−マレインイミドベンゾフェノン
ｐ−アミノベンゾフェノン１４．０ｇ（７０mmol）をアセトン７０mlに溶解し、アセトン４０mlに溶解したマレイン酸無水物７．０ｇ（７０mmol）を室温下１５分間で滴下した。これを室温で３時間撹拌した。次いで、沈殿を濾別し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥した（収率：９３％）。Ｎ−（ｐ−アミノベンゾフェニル）−マレイン酸アミド１９．３ｇ（６５．４mmol）及び無水酢酸ナトリウム２．６ｇ（３１．０mmol）を、５５℃で、無水酢酸５０mlに溶解し、この温度で２時間撹拌した。続いて、６０℃で、無水酢酸を水流真空下で除去した。残渣に水３００mlを加え、７０℃で２時間撹拌した。この時間に沈殿した沈殿物を吸引し、水で洗浄し、溶解し、アセトンから及び再結晶した（収率：９４％）；融点：１５０℃；Ｒｆ値：０．７０（酢酸エステル／ヘキサン  ６／１）；計算値：Ｃ：７３．６４％  Ｈ：３．９７％  Ｎ：５．０５％、Ｃ17Ｈ11ＮＯ3；実測値：Ｃ：７３．１５％  Ｈ：３．９６％  Ｎ：５．００％。
ｐ−マレインイミドフェニル酢酸
ｐ−アミノフェニル酢酸２５．０ｇ（１６６．９mmol）をメタノール２５０mlに懸濁し、加熱しながらその溶液にアセトン５００mlを追加した。アセトン１００mlにマレイン酸無水物１９．２５ｇ（１６６．９mmol）を溶解し、４０℃に予め冷却しておいた該溶液に６０分間で滴下した。これを室温で６０分間撹拌した。次いで、この反応混合物を約３００mlまで濃縮し、−２０℃に冷却しておいた。沈殿を吸引し、アセトンで洗浄し、高真空下に乾燥した（収率：８２％）。Ｎ−（４−酢酸フェニル）マレイン酸アミド１８．０ｇ（７２mmol）をトルエン２．４リットルに懸濁し、加熱還流した。加熱しながら、トリエチルアミン１４．７ｇ（２０．２ml、１４４mmol）を加え、続いて加熱して水分離器で２時間還流した。次いで、形成された赤色オイルからそれを蒸留し、真空下溶媒を除去した。黄色残渣を水３００mlに溶解し、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＝２にした。酸性溶液を酢酸エステルで抽出した（５０mlで６回）。合わせた酢酸エステル相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下に除去した。生成物を、酢酸エステル／ヘキサンから再結晶した（収率：５１％  黄色結晶）；融点：１５８℃；Ｒｆ値：０．４５（酢酸エステル／メタノール  ２／１）；計算値：Ｃ：６２．３４％  Ｈ：３．９２％  Ｎ：６．０９％、Ｃ12Ｈ9ＮＯ4；実測値：Ｃ：６１．８４％  Ｈ：４．４３％  Ｎ：５．５９％。
ｐ−マレインイミドフェニル酢酸クロライド
ｐ−マレインイミドフェニル酢酸１．０ｇ（４．３３mmol）をジクロロメタン２５mlに懸濁し、２．５倍過剰量のシュウ酸ジクロライド（１．３７ｇ、９４５μｌ；１０．８２mmol）で希釈した。反応混合物を３０〜４０℃に加熱して水分を除去し、１５時間撹拌した。次いで、真空下に溶媒を除去し、高真空下に乾燥した。トルエンから結晶化し黄色粉末（収率：５９％）を得た；融点：１５４℃；Ｒｆ値：０．２９（酢酸エステル／ヘキサン  ４／１）
元素分析：計算値：Ｃ：５８．９１％  Ｈ：３．３０％  Ｎ：５．７５％  Ｃｌ：１４．４９％
（Ｃ12Ｈ8ＮＯ3Ｃｌ）；実測値：Ｃ：６０．６１％  Ｈ：３．６４％  Ｎ：５．１３％  Ｃｌ：１３．８０％
ｐ−マレインイミドフェニル酢酸ヒドラジド・ＣＦ3ＣＯＯＨ
ｐ−マレインイミドフェニル酢酸クロライド３．５ｇ（１４mmol）を、tert−ブチルカルバゼート（２．８７ｇ、２１．１mmol）と共に、無水テトラヒドロフラン５０mlに溶解し、室温で２時間撹拌した。テトラヒドロフランを高真空下に除去し、残渣を酢酸エステル５００ml中に取った。酢酸エステル相を、２回各１２５mlの水と振盪し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶液を留去により濃縮し、溶解し、酢酸エステル／ヘキサンから及び再結晶した。生成物を吸引し、高真空下に乾燥した（収率：９０％）；融点：１５２℃で分解；Ｒｆ値：０．５０（テトラヒドロフラン／ヘキサン  ３／１）。ｐ−マレインイミドフェニル酢酸ヒドラジノ−tert-ブチルカルバゼート２．５ｇ（７．２５mmol）をトリフルオロ酢酸１２mlに溶解し、室温で１時間撹拌した。続いて、トリフルオロ酢酸を高真空下に除去し、残渣をエーテル５０mlに懸濁した。沈殿を吸引し、乾燥エーテルで洗浄し、高真空下に乾燥した（収率：８２％  黄色粉末）；融点：１１２℃；Ｒｆ値：０．０６（テトラヒドロフラン／ヘキサン  ３／１）。
計算値：Ｃ：４６．８０％  Ｈ：３．３４％  Ｎ：１１．７０％
（Ｃ14Ｈ12Ｎ3Ｏ5Ｆ3）  実測値：Ｃ：４６．９５％  Ｈ：３．２４％  Ｎ：１１．５１％。
マレインイミドアセトアルデヒド
アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール９１．６ｇ（１００ml、６８９mmol）を酢酸エステル２００mlに溶解した。その後、酢酸２００mlに溶解したマレイン酸無水物６７．５ｇ（６８９mmol）を撹拌下に滴下し、６０分間氷冷した。これを室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を半量まで濃縮し、−２０℃に冷却した。２４時間後、得られた沈殿を真空下に吸引し、酢酸エステル及びエーテルで洗浄し、続いて高真空下に乾燥した（収率：９０％）。Ｎ−（アセトアルデヒド  ジエチルアセタール）マレイン酸アミド３０．９５ｇ（１３３．８mmol）をトルエン９００mlに溶解し、そこにトリエチルアミン１４．２ｇ（１９．６ml、１４０．５mmol）を加え、そして反応混合物を水分離器で１５時間煮沸した。その後、溶剤を真空下で除去した。残ったシロップをジエチルエーテル３５０mlに取り、各５０mlの水で３回抽出した。エーテル相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶剤を真空下に除去し、そして残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（酢酸エステル／ヘキサン  １／１  収率：無色シロップ３６％）；；Ｒｆ値：０．４９（酢酸エステル／ヘキサン  １／１）
計算値：Ｃ：５８．１５％  Ｈ：７．４９％  Ｎ：６．１７％
（Ｃ10Ｈ15ＮＯ4）  実測値：Ｃ：５８．１０％  Ｈ：６．９８％  Ｎ：６．３５％。
マレインイミドアセトアルデヒド  ジエチルアセタール２０．１ｇ（９４．３mmol）をジクロロメタン３５０mlに溶解し、撹拌しつつシリカゲル６０  ４０．２ｇを加えた。３０％硫酸４．０ｇを加え、６０時間還流した。次いで、シリカゲルを濾別し、反応溶液を水５０mlで４回抽出した。ジクロロメタンを硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発濃縮した。残ったシロップを溶解し、酢酸エステル／ヘキサン（１：１０）から再結晶した（収率：１５％白色結晶）；融点：６８〜６９℃；Ｒｆ値：０．５２（ＴＨＦ／ヘキサン  ３／１）
計算値：Ｃ：５１．７６％  Ｈ：３．６２％  Ｎ：１０．０６％
（Ｃ6Ｈ5ＮＯ3）  実測値：Ｃ：５１．４８％  Ｈ：４．１４％  Ｎ：９．６０％。
２−マレインイミドエチルクロロフォルメート
２−ヒドロキシエチルマレインイミド２．０ｇ（１４．２mmol）を無水ジクロロメタン１５０mlに溶解し、トリホスゲン１．５６ｇ（４．８mmol）で希釈した。トリエチルアミン４７９mg（６６０μｌ；４．８ｍｍｏｌ）を加えた後、これを室温下７２時間撹拌し、次いで溶剤を真空下に除去し、そして残渣をシリカゲルを介したカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（展開媒体：酢酸エステル／ヘキサン  ２／１  収率：無色固体８０％）；融点：４５℃；Ｒｆ値：０．６９（酢酸エステル／ヘキサン  ２／１）；  計算値：Ｃ：４１．２５％  Ｈ：２．９５％  Ｎ：６．８８％  Ｃｌ：１７．４１％
（Ｃ7Ｈ6ＮＯ4Ｃｌ）  実測値：Ｃ：４１．１１％  Ｈ：３．００％  Ｎ：６．８８％  Ｃｌ：１６．９４％。
ビスマレインイミド化合物の合成：
１，４−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−マレインイミドベンジル−ブタン
２．３６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のマレインイミド安息香酸クロリドと０．４４ｇ（５ｍｍｏｌ）の１，４−ジアミノブタンとを、それぞれ６０ｍｌの酢酸エチルに溶解した。三つ口フラスコに４０mlの酢酸エチルを入れた。攪拌しながら室温下で、両溶液を３０分間かけて同時に滴下した。滴下中に淡黄色の沈殿が析出した。これを２時間攪拌し、沈殿を吸引してジエチルエーテルで洗浄した。淡黄色の固体を溶解してアセトンから再結晶させ、水で洗浄した後に再びエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。淡黄色固体として２．１ｇ（３．９ｍｍｏｌ、理論の７５％）の生成物が得られた。ＤＣ：シリカゲル、ＴＨＦ／ヘキサン  ４：１、Ｒf-値：０．３０（ＴＨＦ／ヘキサン  ３／１）、Ｆｐ．：２２１℃（分解）；Ｃ26Ｈ22Ｎ4Ｏ6（４８６ｇ／ｍｏｌ）計算値：Ｃ：６４．２０％Ｈ：４．５３％  Ｎ：１１．５２％  Ｏ：１９．７５％；実測値：Ｃ：６２．５７％  Ｈ：４．５５％  Ｎ：１０．６７％
アジピン酸ジヒドラジドとｍ−マレインイミドアセトフェノンからのジアシルヒドラゾン
１．０ｇ（４．６５ｍｍｏｌ）のｍ−マレインイミドアセトフェノンを３６８ｍｇ（２．１１ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジドとともに４０ｍｌの無水メタノールに溶解した。反応混合物に１００μｌのトリフルオロ酢酸を添加し、室温で１５時間攪拌した。このようにして析出した沈殿を吸引し、それぞれ３０ｍｌのメタノール×２とそれぞれ５０ｍｌのジエチルエーテル×４で洗浄した。その後、生成物を減圧下で乾燥した。ＤＣ：シリカゲル、ＴＨＦ／ヘキサン  ４：１、Ｒf＝：０．３６、Ｆｐ．：２４０℃（分解）；Ｃ30Ｈ28Ｎ6Ｏ6（５６８ｇ／ｍｏｌ）計算値：Ｃ：６３．３８％  Ｈ：４．９３％  Ｎ：１４．７９％；実測値：Ｃ：６３．１８％  Ｈ：４．８３％  Ｎ：１５．０３％
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物の合成
４−アセトフェノンカルボン酸−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−エステル
２．２ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のアセトフェノン−４−カルボン酸と１．５２ｇ（１．３ｍｍｏｌ）と２０ｍｇのＤＭＡＰを４０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した後に、２０ｍｌのＴＨＦに溶解させた２．７ｇのＤＣＣを、冷却しながら１時間で滴下した。反応混合物を冷却しながら１２時間攪拌し、濾過し、減圧下でＴＨＦを除去し、残渣を溶解して酢酸エステル／メタノール  １：１から再結晶した。
Ｒf＝０．７１、Ｆｐ．：１４０℃；Ｃ13Ｈ11ＮＯ5（２６１ｇ／ｍｏｌ）；計算値：Ｃ：５９．７７％  Ｈ：４．２１％  Ｎ：５．３６％；実測値：Ｃ：６０．１％  Ｈ：４．２％  Ｎ：５．０％
４−カルボキシルベンゾイルヒドラジド
２５ｇ（１３８．９ｍｍｏｌ）のテレフタル酸モノメチルエステルを２００ｍｌのＴＨＦに懸濁し加熱還流する。４０．５ｍｌ（８３３．４ｍｍｏｌ、６ｅｑ）のヒドラジン一水和物を分割添加すると、生成物が白色固体として析出する。過剰のＴＨＦを留去し、残渣を水に溶解する。濃ＨＣｌの添加により、ｐＨを約４に調節する。形成する白色沈殿を吸引し、半濃ＨＣｌで洗浄する。生成物を減圧下で乾燥し、溶解してメタノール性苛性ソーダ溶液から再結晶する。理論的可能な収量の９９．３％に相当する２４．８４ｇ（１３８ｍｍｏｌ）の生成物が無色針状結晶の形態で得られる。Ｃ8Ｈ8Ｎ2Ｏ3（１８０ｇ／ｍｏｌ）；計算値：Ｃ：５３．３３％  Ｈ：４．４４％  Ｎ：１５．５５％；実測値：Ｃ：５２．４１％  Ｈ：４．２６％  Ｎ：１４．６８％
Ｎ−ターシャリーブチルオキシカルボニル−４−カルボキシベンゾイルヒドラジド
２０ｇ（０．１１ｍｏｌ）の４−カルボキシベンゾイルヒドラジドを２００ｍｌのＴＨＦに懸濁し、ビス−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート２３．９８ｇ（０．１１ｍｏｌ）のＴＨＦ５０ｍｌ溶液で希釈する。室温で４８時間撹拌後、ＴＨＦを減圧下で除去し、オイル状残渣を４００ｍｌの酢酸エチルに取り、それぞれ１００ｍｌの水で４回抽出する。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥した後、それを半分に濃縮して４℃に冷却する。無色の結晶が形成され、吸引してジエチルエーテルで洗浄する。理論的可能な収量の９８．４％に相当する３０．３ｇ（０．１０８ｍｍｏｌ）の生成物が得られる。
Ｃ13Ｈ16Ｎ2Ｏ5（２８０ｇ／ｍｏｌ）
計算値：  Ｃ：５５．７１％  Ｈ：５．７１％  Ｎ：１０．００％
実測値：  Ｃ：５６．９４％  Ｈ：５．５６％  Ｎ：９．７９％
Ｎ−ターシャリーブチルオキシカルボニル−４−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルボニル）ベンゾイルヒドラジド
４ｇ（１４．２９ｍｍｏｌ）のＮ−ターシャリーブチルオキシカルボニル−４−カルボキシベンゾイルヒドラジドを３．２９ｇ（２８．６ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと１７．４ｍｇのＤＭＡＰとともに１００ｍｌのＴＨＦに溶解し、４℃で３．２３ｇ（１５．７２ｍｍｏｌ）のＤＣＣ溶液を滴下して希釈する。４℃で１２時間攪拌し室温で４８時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解しそれぞれ５０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で１０回抽出する。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥した後、それを半分に濃縮して４℃に冷却する。無色の針状晶が形成され、吸引して少量のジエチルエーテルで洗浄する。理論的可能な収量の９８．６％に相当する５．３ｇ（１４．０９ｍｍｏｌ）が得られる。Ｃ17Ｈ18Ｎ3Ｏ7（３７６ｇ／ｍｏｌ）；計算値：Ｃ：５４．２６％  Ｈ：４．７９％  Ｎ：１１．１８％；
実測値：Ｃ：５２．６５％  Ｈ：５．５３％  Ｎ：１０．５６％
４−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）カルボニル）ベンゾイルヒドラジドトリフルオロアセテート
３ｇ（７．９８ｍｍｏｌ）のＮ−ターシャリーブチルオキシカルボニル−４−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルボニル）ベンゾイルヒドラジドを１０ｍｌの無水トリフルオロ酢酸で希釈し室温で２時間攪拌する。激しく攪拌しながら、５０ｍｌのジエチルエーテルを添加する。形成した固体を吸引し、ジエチルエーテルで数回洗浄する。減圧下で乾燥した後、理論的可能な収量の９６．１％に相当する３．０ｇ（７．６７ｍｍｏｌ）の生成物が白色粉末として得られる。Ｃ14Ｈ12Ｎ3Ｏ7Ｆ3（３９１ｇ／ｍｏｌ）；計算値：Ｃ：４２．９７％  Ｈ：３．０７％  Ｎ：１０．７４％；
実測値：Ｃ：４３．４９％  Ｈ：３．４２％  Ｎ：１０．７４％
工程２：細胞増殖抑制性化合物のマレインイミドおよびヒドロキシスクシンイミド誘導体の合成
クロラムブシルカルボン酸ヒドラジド
クロラムブシル（１．０ｇ；３．２９ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2に溶解して塩化オキサリル（４３１μｌ；４．８ｍｍｏｌ）で希釈し、これを３０−４０℃で１５時間攪拌した。次いで、溶液を蒸発により濃縮し、塩化オキサリルの残渣を高減圧下で除去する。さらに、得られた褐色シロップを２０ｍｌの無水ＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、室温で攪拌しながら、２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解したｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（４５７ｍｇ；３．４５ｍｍｏｌ）を１時間で滴下することにより、合成されたオキサリルカルボン酸クロリドを直ちに反応させた。これを３６時間攪拌し、不溶部分から濾別し、溶液を減圧下で約３ｍｌに濃縮した。得られたクロラムブシル−ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼートは褐色シロップで、カラムクロマトグラフィー（展開媒体：酢酸エステル／ヘキサン  ２／１；Ｒf-値：０．５２）を用いて精製した。収量：７００ｍｇ（１．６７ｍｍｏｌ；理論値の５１％）。クロラムブシル−ｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（７００ｍｇ；１．６７ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温で攪拌しながら１０ｍｌのトリフルオロ酢酸で希釈し、１時間攪拌し、次いで溶媒とトリフルオロ酢酸を高減圧下で除去して淡褐色の固体を形成した。
［４−（４−ビス（２−クロロエチル）アミノフェニル）］酪酸ヒドラジド（トリフルオロ酢酸塩）および４−アセトフェノンカルボン酸−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−エステルのカルボキシルヒドラゾン誘導体
クロラムブシルカルボン酸ヒドラジド（トリフルオロ酢酸塩；７２１ｍｇ；１．６７ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、室温で攪拌しながら４−アセトフェノンカルボン酸−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−エステル（４７９ｍｇ；１．８３ｍｍｏｌ）で希釈した。２０分後、反応溶液を蒸発により濃縮した。残渣を溶解して酢酸エステル／ヘキサンから再結晶した。収量：２９０ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ；理論の４０％）淡黄色結晶；
（Ｃ27Ｈ31Ｎ4Ｏ6Ｃｌ2，Ｍｒ５７７）
計算値：  Ｃ：５６．２％  Ｈ：５．４％  Ｎ：９．７％  Ｃｌ：１２．１％
実測値：  Ｃ：５６．３％  Ｈ：５．６％  Ｎ：１２．４％  Ｃｌ：１１．７％
Ｎ1−（２−マレインイミドエチルオキシカルボニル）−５−フルオロウラシル
５００ｍｇ（３．８４ｍｍｏｌ）の５−フルオロウラシルを１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、５０５ｍｇ（６９６μｌ；４．９９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンで希釈した。この溶液に、１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した１０１６ｍｇ（４．９９ｍｍｏｌ）の２−マレインイミドエチルクロロホルメートを滴下し、これを室温で１５時間攪拌した。その後、溶媒を水流減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＬＯＢＡＲR（登録商標）−カラム；展開媒体：酢酸／ヘキサン  １．５／１；収率６１％）を用いて精製した。融点：１３２℃、Ｒf-値：０．６４（ジオール；酢酸／ヘキサン  ２／１）
計算値：  Ｃ：４４．２９％  Ｈ：２．６８％  Ｎ：１４．０９％，（Ｃ11Ｈ8Ｎ3Ｏ6Ｆ）；
実測値：  Ｃ：４４．２９％  Ｈ：２．６８％  Ｎ：１３．５８％
Ｎ1−（ｍ−マレインイミドベンゾイルオキシメチル）−５−フルオロウラシル
１５００ｍｇ（１１．５５ｍｍｏｌ）の５−フルオロウラシルと２．２５ｍｌ（２５．４ｍｍｏｌ）の３７％ホルムアルデヒド溶液を２時間攪拌しながら６０℃に加熱した。その後、水を高減圧下で除去し、テトラヒドロフラン８０ｍｌ中のＤＭＡＰ２０ｍｇを添加して残渣を溶解した。この溶液に、５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した３．０１ｇ（１３．８５ｍｍｏｌ）のｍ−マレインイミド安息香酸と２．８５８ｇ（１３．８５）のＤＣＣを添加し、その後に室温で１５時間攪拌した。沈殿を濾別し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を約２０ｍｌの酢酸に取り、不溶分から濾別した。溶液を蒸発により濃縮し、残渣にクロマトグラフを行った（１．シリカゲル（酢酸エステル／ヘキサン  ２／１）；収率：５％  白色粉末）。融点：分解＞２５０℃；Ｒf-値：０．３２（酢酸／ヘキサン  ２／１）
元素分析  計算値：  Ｃ：５５．９８％  Ｈ：２．９２％  Ｎ：１２．２４％；  （Ｃ16Ｈ10Ｎ3Ｏ6Ｆ）
実測値：  Ｃ：５５．５１％  Ｈ：２．８７％  Ｎ：１１．７２％
ドキソルビシンとｐ−マレインイミドフェニル酢酸クロリドとの３’−アミノアミド誘導体
５００ｍｇ（０．８６ｍｍｏｌ）の塩酸ドキソルビシンを５０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、１０１３ｍｇ（４．３０ｍｍｏｌ）のｐ−マレインイミドフェニル酢酸クロリドと７１９μｌ（５２２ｍｇ；５．１６ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンとを添加した。溶液を室温で１５時間攪拌した。ＤＭＦを高減圧下で除去して残渣を５ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、濾過してシリカゲルカラム（テトラヒドロフラン／ヘキサン  ３／１）上で精製した。１８９ｍｇの赤色生成物（２９％）；Ｒf-値：０．２６（酢酸エチル／ヘキサン  ３／１）；融点：１１０℃；
（Ｃ39Ｈ36Ｎ2Ｏ14）；
計算値：  Ｃ：６１．８４％  Ｈ：４．７５％  Ｎ：３．７０％；
実測値：  Ｃ：６１．３５％  Ｈ：５．１４％  Ｎ：３．４５％
ドキソルビシンと４−（（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）カルボニル）ベンゾイルヒドラジドトリフルオロアセテートのＣ−１３−ベンゾイルヒドラゾン誘導体
０．２ｍｍｏｌの塩酸ドキソルビシンおよび１．０ｍｍｏｌの４−（（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）カルボニル）ベンゾイルヒドラジドトリフルオロ酢酸塩を１００ｍｌのメタノールに溶解した。この溶液に１００μｌのＣＦ3ＣＯＯＨを添加し、反応混合物を室温で３６時間攪拌した。次いで、溶液を約５０ｍｌに濃縮した。アセトニトリルを濁度に達するまで添加し、懸濁液を−２０℃で２４時間冷却した。生成物を遠心分離手段により集め、溶解してメタノール／アセトニトリルから再結晶した。２７６ｍｇ；Ｒf-値（逆相、アセトニトリル／０．００５Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．０）＝７０／３０）：０．３３、融点：＞２５０℃（分解）、（Ｃ39Ｈ40Ｎ4Ｏ14Ｃｌ）
計算値：  Ｃ：５６．８３％  Ｈ：４．８６％  Ｎ：６．８０％  Ｃｌ：４．３１％
実測値：  Ｃ：５７．０４％  Ｈ：５．１４％  Ｎ：６．５５％  Ｃｌ：４．１２％
以下の実施例により記載される、シス−配位した白金（II）ユニットを有するマレインイミド誘導体の製造方法：Ｎ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタン  ジクロロ白金（II）−４工程合成
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−１，２−ジアミノエタン
ジクロロメタン１００ｍｌにＮ−（２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタン２０．８ｇ（２００ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に対し、ジクロロメタン２００ｍｌにビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル無水物４７．９６ｇ（２２０ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ）を溶解したものを室温下に１時間で滴下した。これを室温で１２時間攪拌し、次いでジエチルエーテル１００ｍｌで希釈し、水１５０ｍｌで抽出した。硫酸ナトリウム上で有機相を乾燥させた後、真空下で濃縮した。生成物の精製はカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン（１：１．５），Ｒf−値：（酢酸エチル／ヘキサン  １：１．５）：Ｒｆ＝０．１８）を用いて行った。収量：３０ｇ（９８．６８ｍｍｏｌ）、Ｃ14Ｈ28Ｎ2Ｏ5（３０４ｇ／ｍｏｌ）の元素分析；計算値：Ｃ：５５．２６％  Ｈ：９．２１％  Ｎ：９．２１％；実測値：Ｃ：５５．５０％  Ｈ：９．１８％  Ｎ：９．０２％
Ｎ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−１，２−ジアミノエタン
テトラヒドロフラン５０ｍｌ及びトリエチルアミン４ｍｌ（２８．９ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）中のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−１，２−ジアミノエタン８ｇ（２６．３ｍｍｏｌ）の溶液に対し、テトラヒドロフラン１００ｍｌにマレインイミド安息香酸クロライド６．８２ｇ（２９ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）を溶解した溶液を室温下に１時間かけて攪拌しながら滴下する。さらに室温下で８時間攪拌した後、ＤＣに従って、反応を完結する。反応で形成したトリエチルアンモニウムクロライドをろ別する。真空下でテトラヒドロフランと過剰のトリエチルアミンを除去した後、生成したオイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：酢酸エチル／ヘキサン（１：１），Ｒf値：（酢酸エチル／ヘキサン  １：１）＝０．２）を用いて精製する。理論可能収量の７２．６％に相当する黄色油状生成物の収量：９．６ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）。Ｃ25Ｈ33Ｎ3Ｏ8の元素分析（５０３ｇ／ｍｏｌ）；計算値：Ｃ：５９．６４％  Ｈ：６．５６％  Ｎ：８．３５％；実測値：Ｃ：６０．０４％  Ｈ：６．７７％  Ｎ：８．２４％
Ｎ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタン  ジヒドロクロリド
Ｎ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−ターシャリーブチルオキシカルボニル−１，２−ジアミノエタン６ｇ（１１．９３ｍｍｏｌ）を、ジエチルエーテル中の１Ｍ  ＨＣｌ溶液６０ｍｌ（５ｅｑ）を室温下で攪拌しながら希釈する。室温で４８時間攪拌した後、微細結晶性沈殿をＧ４ガラスフリットで吸引し、無水エチルで複数回洗浄してＨＣｌ残渣を取り除き、真空下で乾燥した。生成物３．０ｇ（７．９８ｍｍｏｌ）が微粉の黄色固体として得られ、理論可能収量の６６．９％に相当する。
Ｃ15Ｈ19Ｎ3Ｏ4Ｃｌ2（３７５．９ｇ／ｍｏｌ）の元素分析
計算値：Ｃ：４７．８９％，Ｈ：５．０５％，Ｎ：１１．１７％，Ｃｌ：１８．８６％；
実測値：Ｃ：４６．９７％，Ｈ：５．４２％，Ｎ：１０．０３％，Ｃｌ：１７．６３％
Ｎ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタン  ジクロロ白金（II）
Ｋ2ＰｔＣｌ4  １０４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタン  ジヒドロクロリド９４．２ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を各々５ｍｌの２０％テトラヒドロフラン／水に溶解させ、少しずつ混合した。当初赤かったＫ2ＰｔＣｌ4溶液の脱色が進み；淡黄色の沈殿を生成する。最後の添加の約１時間後、沈殿をＧ４ガラスフリットを用いて吸引することが可能である。少量の水及び２０％テトラヒドロフラン／水、最後にジエチルエーテルで連続的に洗浄される。真空下で乾燥した後、生成物１０６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）が微細結晶物質として得られ、理論可能収量の７２％に相当する。
Ｃ15Ｈ17Ｎ3Ｏ4ＰｔＣｌ2（５６９ｇ／ｍｏｌ）の元素分析；  計算値：Ｃ：３１．６３％，Ｈ：２．９９％，Ｎ：７．３８％，Ｐｔ：３４．２９，Ｃｌ：１２．４６％；  実測値：Ｃ：３１．１９％，Ｈ：３．３７％，Ｎ：６．７９％，Ｐｔ：３２．３５％，Ｃｌ：１２．９５％
工程３：担体タンパク質のチオール化
チオール化の方法は次の実施例により詳細に示される：各々、３２ｍｇのヒト血清トランスフェリン（９８％結晶，Ｍｒ８０，０００）［又はヒト血清アルブミン２８．４ｍｇ（９８％結晶，Ｍｒ６６５００）］を、アルゴン（ｃ（トランスフェリン／アルブミン）＝４．０×１０-4Ｍ）で脱気された１ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ ホウ酸ナトリウム，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．０）に溶解させ、新たに製造した１００μｌの４．０×１０-2Ｍイミノチオラン溶液（脱気された緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ−ｐＨ＝８．０）１ｍｌにイミノチオラン５．５ｍｇを溶解したもの）で希釈した。６０−７０分後、０．０５Ｍ ホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ７．５の展開緩衝液を用いたチオール化トランスフェリン又はアルブミンのゲルろ過（カラム１．０ｃｍ×１０ｃｍ，セファデックスＧ．２５）で、過剰のイミノチオランを分離する。ゲルろ過が完了した後のタンパク質濃度は２８０ｎｍ ∈280＝９２３００Ｍ-1ｃｍ-1，ｃ［トランスフェリン］＝２．４×１０-4Ｍ）又は∈280＝３５７００Ｍ-1ｃｍ-1，（ｃ［アルブミン］＝２．２×１０-4Ｍ）で測定し、導入されたＨＳ基の数は、４１２ｎｍ ∈412＝１３６００Ｍ-1ｃｍ-1）（ｃ［ＨＳ基］＝７．４×１０-4Ｍ又は７．７×１０-4Ｍ）においてエルマン試薬で測定した。ｃ［ＨＳ基］／ｃ［トランスフェリン］比は３．１であり、ｃ［ＨＳ基］／ｃ［アルブミン］比は３．５であった。下記の表は、異なる数のＨＳ基がトランスフェリン又はアルブミンに導入される反応条件を要約する。
0004573916.tif 000005
0004573916.tif 000006
かくして単離されたタンパク質サンプルを工程４における下記の反応に直接用いた。
工程４：チオール化担体タンパク質（工程３）又はポリエチレングリコールに対する細胞増殖抑制性化合物の誘導体（工程２）のカップリング：
方法−複合体製造のためのＦＰＬＣ：Ｐ−５００ ポンプ、ＬＣＣ５０１ コントローラー（Pharmacia）及びＬＫＢ ２１５１ ｕｖ−モニター、緩衝液：標準ホウ酸塩：０．０２５Ｍホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ７．５又はホスフェート緩衝液：０．００４Ｍ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ７．４。複合体のタンパク質濃度はピアス製（Pierce）（ＵＳＡ）のＢＣＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｅｓｓａｙで測定した。
ドキソルビシンの３’−アミノアミド誘導体及びｐ−マレインイミドフェニル酢酸（アミド1）とのトランスフェリン複合体
３．５ｍｌのチオール化トランスフェリンサンプル（３．３個のＨＳ基が導入）を標準ホウ酸塩で３０ｍｌに希釈し、ＤＭＦにアミド1（Ｍｒ７４２．６８）を溶解した溶液１ｍｌ（ＤＭＦ１．０ｍｌに１．８ｍｇを溶解）を添加し、混合した。１０分後、アミコン（Amicon）製ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）-１０ コンセントレーター，ＦＲＧ（４℃で６０分及び４５００Ｕ／分）で溶液を約２．０ｍｌに濃縮した。この濃縮サンプルをＳｉｇｍａ １１２遠心機で遠心（５分）し、過剰分をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５Ｆカラム（カラム１．０ｃｍ×１０ｃｍ）に適用し、複合体を分離した（保持容量：３．５−７．０ｍｌ）。結合されたドキソルビシン量は、ドキソルビシンのイプシロン値∈495＝１０６５０Ｍ-1ｃｍ-1で測定した。この測定値から、この波長での対応するトランスフェリンの寄与が除かれ、∈［Ｔｆ］495＝４１００Ｍ-1ｃｍ-1であった。結合されたドキソルビシンの濃度は３２２μＭであり、トランスフェリンの濃度は１０１μＭであった。
［４−（４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−フェニル）］ブタン酸ヒドラジド及び４−アセトフェノン  カルボン酸−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−エステルのカルボキシヒドラゾン誘導体のアルブミン複合体
リン酸緩衝液５ｍｌの２．２ｍｌに溶解したアルブミン６６．５ｍｇを、ＤＭＦにカルボキシヒドラゾン誘導体を溶解させた溶液０．１ｍｌ（ＤＭＦ ０．１ｍｌに１．２ｍｇを溶解）を混合し、１０分後に遠心し、過剰分をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５Ｆカラム（カラム１．０ｃｍ×１０ｃｍ）に適用し、複合体を分離した（保持容量：３．７−７．１ｍｌ）。結合されたクロラムブシル量は、エプシュタイン（Epstein et al.,Anal,Chem,1955,27,1435-1439）に従うテストに基づいて測定した。この方法では２８０μＭであった。
ＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ−ＳＨ ２０，０００（α−メトキシ−ω−チオ−ポリエチレングリコール）及びＮ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタンジクロロ白金（II）からなるポリエチレングリコール複合体
１００ｍｇのＣＨ3Ｏ−ＰＥＧ−ＳＨ ２０，０００（０．００５ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液５ｍｌに溶解し、ＤＭＦ２５０μｌに溶解したＮ−（Ｏ−（３−マレインイミドベンゾイル）−２−ヒドロキシエチル）−１，２−ジアミノエタンジクロロ白金（II）５．７ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）と混合した。２０分後、反応混合物を遠心し、過剰分をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５Ｆカラム（カラム２．０ｃｍ×１５ｃｍ）に適用し、複合体を分離した。結合された白金複合体量は、ゴニアス及びピッツォ（Gonias,S.L.,Pizzo,S.V.J.Biol,Chem.1982,258,5764-5789）に従うテストに基づいて測定した。この方法では３８０μＭであった。
ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ ２０，０００（α．ω−ビス−チオ−ポリエチレングリコール）及びＮ’−（２−マレインイミドエチルオキシカルボニル）−５−フルオロウラシルからなるポリエチレングリコール複合体
１００ｍｇのＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ ２０，０００（０．００５ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液５ｍｌに溶解し、ＤＭＦ２５０μｌに溶解したＮ’−（２−マレインイミドエチルオキシカルボニル）−５−フルオロウラシル３．０ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）とを混合する。３０分後、反応混合物を遠心し、過剰分をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５Ｆカラム（カラム２．０ｃｍ×１５ｃｍ）に適用し、複合体を分離した。結合された５−フルオロウラシル量は、∈260＝６５２０Ｍ-1ｃｍ-1で測定した。この方法では４６０μＭであった。
ドキソルビシン（アミド1）で負荷したアルブミン及びトランスフェリンからなる複合体
ヒト血清アルブミン３０ｍｇをアルゴンにより脱気された２．０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．０に室温（ＲＴ）で溶解した。この混合物に対し、２５０μｌの脱気された０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．０中に溶解したイミノチオラン２．９ｍｇを溶解した溶液１８３μｌを加え、徹底的に混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、過剰のイミノチオランをゲルろ過で分離した。タンパク質濃度および遊離ＳＨ基の濃度の測定結果は、次の値で示すとおりである；ｃ［アルブミン］＝１．４４×１０-4ｍｏｌ／ｌ，ｃ［ＳＨ基］＝１．２５×１０-3ｍｏｌ／ｌ。アルブミン分子当たりのＳＨ基の平均数は、両者の濃度の商から求めて８．７であった。チオール化アルブミン溶液２．０ｍｌをさらなる反応に用いた。ドキソルビシンの３’−アミノアミド誘導体及びｐ−マレインイミドフェニル酢酸（アミド1）でタンパク質当たり８．７個のＳＨ基の７個を中和するため、まずタンパク質溶液を標準ホウ酸緩衝液で１０ｍｌに希釈した。次いで、振とうしながら、ＤＭＦ１ｍｌにアミド１４０ｍｇが溶解した溶液４０μｌを添加し、室温で１０分インキュベートした。その後、サンプルを５分間遠心（３，０００ｇ，４℃）した。過剰分は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０００コンセントレーター（登録商標）（会社：アミコン）を用いて約１ｍｌまでに濃縮した（３，０００ｇ，３×１５分、４℃）。次いで、ヒト血清トランスフェリン２５ｍｇを１．２ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ ホウ酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．０）に溶解し、アルゴンで脱気した。この混合物に対し、脱気した緩衝液（０．１Ｍ ホウ酸ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．０）２５０μｌにイミノチオラン２．９ｍｇを溶解した溶液１５μｌを加え、徹底的に混合し、室温で１時間混合し、インキュベートした。その後、過剰のイミノチオランをゲルろ過で分離した。タンパク質濃度および遊離ＳＨ基の測定（エルマンによる試験）の結果は、次の値であった：［トランスフェリン］＝１．２０×１０-4ｍｏｌ／ｌ，［ＳＨ基］＝１．９６×１０-4ｍｏｌ／ｌ。トランスフェリン分子当たりのＳＨ基の平均数は両者の濃度の商から求めて１．６であった。
このようにチオール化したトランスフェリン溶液1.9mlを、更なる反応のためにまず標準のホウ酸緩衝液で１０mlに希釈した。その後、反応混合物に、DMF 200μl中1,4−ジアミノ−N,N’−ジ−m−マレインイミドベンジル−ブタンを10mg含有する溶液72μlを加えた。室温で10分後、濁った混合物を遠心分離した（5分間、3,000g、4℃）。過剰の溶液を注ぎ捨て、容量が600μlになるまでセントリコン3,000コンセントレーター（登録商標）（Centricon 3,000 concentratorR）中で濃縮した。過剰のビスマレインイミドを除去するために、それをセファデックス25（Sephadex 25）で濾過した。このように修飾されたトランスフェリン溶液1,500μlを、ドキソルビシンを負荷した上記アルブミン溶液500μlに加え、徹底的に混合し、室温で１５分間インキュベートした。その後、該溶液を容量が150μlになるまでマイクロコン10コンセントレーター（登録商標）（Microcon 10 concentratorR）（会社：アミコン（Amicon））中で濃縮した。濃縮した蛋白質溶液をゲルクロマトグラフィーに通してその成分（モノマー、ダイマー、オリゴマー）に分離した。カラムの寸法：ｈ：40cm、φ：1cm、ループ：100μl、定常相：スーパーデックス200 ファルマシア（Superdex 200 Pharmacia）、移動相：ホウ酸緩衝液pH6.8；４℃においてN2でガス化、流速：1ml/分、検出：測光,λ＝280nm、保持容量：オリゴマー：9.5ml−11.5ml、トリマー：11.7ml−12.6ml、ダイマー：12.7ml−14.4ml、モノマー：14.5ml−18.5ml。
導入されたアミド1に関する所望のダイマーの収率は、20−30％であった。
生物学的研究
in vitro及びin vivoでの複合体の有効性の実施例として、本発明中に開示した複合体の活性−又は毒性プロフィールの代表である、下記ドキソルビシン複合体の生物学的データを示す。複合体の有効性は、”コロニー−形成アッセイ”及び標準的な科学的実施に従う細胞培養中でのBrdU（5−ブロモ−2−デスオキシウリジン）の取り込みを用いて決定した。実施例として、以下のドキソルビシン複合体のIC70値（”コロニー−形成アッセイ”−７種の異種移植片）：蛋白質＝トランスフェリン（T）又はアルブミン（A）を示す。
0004573916.tif 000007
これら実験条件下、上記に列挙した合成された複合体は、結合していない細胞増殖抑制性の化合物と、同等又はそれ以上の有効性を示した。対応するポリエチレングリコール複合体は、同等の挙動を示した。
更に、上記記載の複合体は、遊離のドキソルビシンに比して、異種移植可能な裸の（naked）−マウスモデル、乳房癌MDA-MB-435及び乳房癌MCF-7において、遊離のドキソルビシンに比較して、総計で明瞭に毒性減少（致死及び体重減量の減少、胃腸領域におけるより少ない副作用）、及び同等又は改善された腫瘍−抑制効果と共に相対的な腫瘍容量における増加の安定化を示し、これは、表中のトランスフェリン複合体T-DOXO-HYDの実施例中に示されている：
動物：Ncr：nu/nu 雌、腫瘍：乳房癌MCF-7皮下注射
治療：日（d）16、日（d）23静脈注射
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投与量は使用可能なドキソルビシンの量を参照する。等モルの投与量（8mg/kg）の場合は、T-DOXO-HYDは、ドキソルビシンと比較して致死及び体重減量の減少において有効性を示した。実験中に使用したもっとも高い投与量（12mg/kg）の場合は、ドキソルビシンでの治療においては、非常に高い致死（各々７動物中５及び７動物中７）を示した。この投与量でのトランスフェリン複合体での治療では、全く致死を認めず、抗腫瘍の有効性は優れていた。