(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）単一カラム内で血液試料を、Ａ抗原を保有する第一の試薬赤血球及びＢ抗原を保有する第二の試薬赤血球と混ぜるとともに、その際に、前記第一及び第二の試薬赤血球の一つを区別して染色し；
（ｂ）凝集が起こるのに十分な条件下で前記混合物をインキュベートし；
（ｃ）前記単一カラム内のインキュベートされた混合物に目視分析を施し、前記第一及び／又は第二の試薬赤血球の凝集あるいはそれらの欠如を判定し；そして
（ｄ）凝集の目視分析の結果を分析して、ＡＢＯうら式血液型を判定する
ことを特徴とする、うら試験におけるＡＢＯうら式血液型の分析方法。
【請求項２】
前記目視分析を施される単一カラムが、チューブ及びカラム凝集技法からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カラム凝集技法が、カラム凝集試験反応であり、カセット形態の分離容器内で行なわれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液試料が血清又は血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）その中に、Ａ抗原を保有する試薬赤血球の第一の集団及びＢ抗原を保有する試薬赤血球の第二の集団を有する容器であって、前記試薬赤血球の第一又は第二の集団の一つが区別して染色される容器；
（ｂ）カラム凝集反応容器からなる、ＡＢＯうら式血液型試験を行なうための反応手段；並びに
（ｃ）単一カラム内でＡＢＯうら式血液型試験を行なうための使用説明書であって、前記単一カラムに目視分析を施し、前記抗体を検出して特定する使用説明書
を含む、単一カラム内でＡＢＯうら式血液型試験を行なうための血液分析凝集試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液型判定の分野に、特におもておよびうら血液型検査の同時判定に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液型血清学は、患者に関連した輸血または臓器移植の前に、血液ドナーと患者レシピエントとの間の血球適合性の判定を要する。血球適合性は、患者の血清中に含有される抗体とドナーからの血球上に存在する抗原との間の免疫反応が起きないことにより判定される。
【０００３】
多数の異なる血液型抗原が、すべての個体の赤血球表面に見出される。遺伝された遺伝子生成物であるこれらの抗原は、一卵性双生児を除いてすべての個体間で唯一無二であると思われる組合せで存在する。血液型判定は、一般に、抗原が存在することを、そして存在しないことを、通常は試験される抗原に対する抗体を用いて判定する赤血球の検査方法である。さらに、人が彼または彼女の赤血球上に特定の赤血球抗原を有していない場合、彼または彼女の血清はその抗原に対する抗体を含有し得る。血清中に抗体が存在するか否かは、その人の免疫系が特定の抗原またはそれと非常によく似た何かにより過去に誘発試験を受けたことがあり、そしてそれに応答したか否かによっている。例えば、赤血球がＡ型である、即ち赤血球上に「Ａ」抗原を有する人は、彼または彼女の血清中に抗Ｂ抗体を有する。したがって、このような人がＢ型血液を投与された場合、免疫反応が起きて、重篤な臨床的結果が考えられる。
【０００４】
さらに考慮すべきこととして、ヒトの身体は花粉、食物、細菌およびウイルス中の抗原に絶えず曝されている、ということに留意する必要がある。これらの「天然」抗原は外見上ヒトの血液型抗原に非常によく似ているので、それらはほとんどすべての感受性ヒトを刺激して抗体を産生させる。したがって、ある種の抗体は、赤血球が相互抗原を欠いているヒトの血清中に予期される。したがって、二次判定検査はしばしば、患者／ドナー血清に関して実施される。血清中のＡＢＯ式血液型系の予期される抗体に関する検査は、「うら」血液型判定と呼ばれる。
【０００５】
ＡＢＯ式血液型判定系の抗体は、一般に、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）である。これらの抗体は、１分子当たり10個の抗原結合部位を有する。ＩｇＭ抗体は赤血球間の距離に亘るのに十分な大きさで、したがってそれらが遠心分離されると、細胞は格子「細胞−抗体−細胞−抗体」で一緒に結合され、凝集体中に一緒に凝集したままである。例えば、抗ＡをＡ型血球またはＡＢ型血球に付加し、混合物を遠心分離した場合、血球は、再懸濁されても血球塊中に残存する。同一抗体を用いた場合、Ｏ型およびＢ型血球は個々の細胞として懸濁する。一抗体、例えばＩｇＭ抗体により引き起こされる凝集は、直接凝集反応と呼ばれる。
【０００６】
輸血医学において、最も高頻度で実施される検査は、前記の理由のために、ＡＢＯ式血液型の判定である。当業界の最新事情は、赤血球上のＡ、Ｂ抗原を別々に、そして時としてＡ＋Ｂを一緒に検査すること（おもて検査）であり；そして血清または血漿中の抗Ａおよび抗Ｂ抗体に関して試験する（うら検査）判定（クロスチェック）である。したがって、最低で４つの、しかし７つという多くの別々の検査（試料赤血球上のＡ、Ｂ、Ａ＋Ｂ抗原；Ａ1 、Ａ2 、Ｂ、Ｏ試薬赤血球を用いた試料血清／血漿中の抗Ａおよび抗Ｂ）がルーチンに用いられる。これらの判定（おもておよびうら検査）実践の各々による結果は、一致しなければならない。したがって、米国一国だけで、血液センターで血液型を判定するために、年間約1 億400 万の検査が実施される。
【０００７】
1900年代初頭以来、 Ashby（J. Exp. Med. 29:267 （1919））およびCoombs（Brit. J. Exp. Pathol. 26:255（1945））の研究とともに、「ランドシュタイナー」法（ Landsteiner, Science 73:405（1931））として既知の一般的アプローチは、ある血液型抗体（例えば抗Ａまたは抗Ｂ）を含有する標準実験室試験管に患者の赤血球を付加し、混合して抗体／抗原結合反応を起こさせ、そして次に遠心分離してきた。試験される抗原が存在する場合、抗体／抗原結合が起こって、患者の赤血球の凝集が生じる。試験管を手で振盪して、底の「凝集化」細胞の遠心分離ボタンを除去する。次に、除去細胞が「凝集」されたか否か、そしてどの程度かに関して、主観的判定が成される。
【０００８】
1900年代中頃、試験の主観性を最小限にして誤りを低減するために、この技法を簡易化する試みが成された。適合性検査の結果の多少恒久的な記録は、その表面の少なくとも一部に必要な免疫化学試薬を有する、湿潤性で、非吸収性、またはいくつかの場合には吸収性の検査スライドまたは検査カードを用いることにより生じ得る、ということが認識された。これに関して、米国特許第2,770,572 号、第2,850,430 号、第3,074,853 号、第3,272,319 号、第3,424,558 号、第3,502,437 号および第3,666,42号、ならびに欧州特許出願第0 104 881-A2号は、このような検査カードおよび関連装置の選択例を示す。マイクロプレートでの血液型判定の利点としては、多数の試料の操作がより容易であること、計器を用いた凝集反応の客観的測定、ならびに結果の編集および管理のためのコンピューターインターフェーシングが挙げられる。コンピューター制御ロボットおよび高スループット分光測光的読取機を備えた多数の高価で且つ公共の用に供される系が血液バンクオートメーションのために導入されてきた（Chung, et al., Transfusion 33:384 （1992））。
【０００９】
市販の血液型分類キットは、ゲル形態の試薬を充填した特別なマイクロチューブ中での赤血球抗原および抗体反応の検出改良を伴って導入されてきた（Lapierre, et al., Transfusion 30:109（1990））。血液型判定のための決定点としての血球凝集反応の使用に内在する問題を克服するための固相技法は、Scott （Transfusion Med. Rev. 5:60（1991））により再検討された。近年、Growe 等（Transfusion Med. Rev. 10:44 （1996））は、血液センターだけでなく、病院の輸血ラボラトリーにも適用可能な赤血球抗原の自動判定および血清抗体スクリーニング手法の実施および使用を報告した。試料の血液型を判定するためのこれらの方法には、特定の判定試薬を入れた少なくとも７つの異なるウエルが用いられねばならない。大規模血液型判定に用いられる手法はすべて、本質的に、凝集反応ベースの方法を、そして単一試験管／ウエル中の唯一の抗原または抗体の確定のためにも、使用する。蛍光標識化試薬を用いた別々に同定可能な反応も、米国特許第4,550,017 号および第4,748,129 号において、血液型判定用途に関して報告されている。
【００１０】
最新手法は、決定点として赤血球の凝集反応を利用する。前記のように、これは試験管中で、スライド表面で、マイクロプレートで、およびカラム凝集管中で成し遂げられる。後者２つの方法は、手動で、または自動化器械により実施され得る。どの方法も、おもておよびうら検査の両方を実施するためには、血清（または血漿）を血球と分離する必要がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、単一検査においておもておよびうら検査の両方を実施する方法を開発することは興味深いが、一方、検査前に血液試料を分離する必要がないことが好ましい。このような方法は、血液バンク技術者が赤血球上の血液型抗原ならびに血清中の臨床的意義を有する抗体を同時に確定できるようにする。このような方法は、実施される個々の検査数をかなり低減し、即ち血液センターで実施される検査の数の年間約5000万〜1 億件の低減を提供して、時間と経費の有意の節約をもたらす。我々は、それらの凝集体が別個のものであるよう、試料赤血球（ＲＢＣ）の試薬ＲＢＣとの区別を可能にする技術を開発した。さらに、本明細書中に開示された新規の方法は、標識判定抗体試薬を用いて、試料中で予備生成された抗体からそれらの反応を識別する。本発明の検査は血液試料を分離する必要を伴わずに成され、したがって全血（ＷＢ）に関して成され得る。本明細書中に開示された検査は自動計器で用いられ得るが、この場合、さらなる利点は血清を血球と分離する必要がないことにより得られる。さらに、おもておよびうら検査の同時検査は、血液型を判定し、型を確証するのに必要な検査（おもて＆うら検査）の数を低減する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光標識化実施態様では、おもて検査において、モノクローナル抗体が標識される。うら検査に関しては、試薬赤血球が標識される。さらなる利点は、混合赤血球集団を識別する（肉眼的にまたは自動読取機を介して）能力にある。例えば、うら検査は、２つでなく１つの検査で実施され、実施される検査数の低減をもたらす。さらなる用途は抗体スクリーニングであり、この場合、２つの別々の検査の代わりに２種の細胞のプールが一緒に用いられ、実施される検査数の低減をもたらす。
【００１３】
視覚系のために細胞を着色する能力は、試験管、マイクロプレート、スライドおよびカラム凝集技法（CAT ）、ならびに検査プラットフォーム、例えばビトロスVitros（商標）250 、750 または950 （Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY ）スライド法を用いる既存の血液型検査プラットフォームへの適用を有する。
【００１４】
Vyas等は米国特許第5,776,711 号において、「同時」ＡＢＯおよびＲＨ（Ｄ）式血液型判定または抗体スクリーニング法を開示する。しかしながら、ＡＢＯ式血液型判定を実施するための多数の検査を同様に低減しようと試みる一方で、本発明は、試料の赤血球ＡＢＯ状況、ならびにＡおよび／またはＢ抗原に対する抗体の存在を同時検査する。さらに、本発明は、分離された血清および赤血球構成成分ではなく、全血を用いた。標識化試薬赤血球の本発明の使用はさらに、Vyas等の合成ビーズの使用とは異なる。
【００１５】
ＡＢＯ式血液型の同時分析は、適切な蛍光色素で試薬赤血球を標識し、そして蛍光色素標識で適切なモノクローナル抗体を選択することにより実行され得る。血球およ凝集体は、顕微鏡スライドまたは等価物上でのレーザー走査血球計算により測定され得る。スライド上の血球は、走査レーザー光源により照明される。典型的には、用いられるレーザー光源としては、青色アルゴンイオンレーザーおよび／または赤色ヘリウム−ネオンレーザーが挙げられる。蛍光および光散乱は、レーザー走査血球計算器（Compucyte, Cambridge, MA）により確定され得る。
【００１６】
おもておよびうら検査の同時判定におけるレーザー走査血球計算法の使用を以下に示す。血球または血球群（凝集体）はレーザー光線により走査され、照射光は血球または血球群により散乱され、そして散乱強度は血球（または凝集体）のサイズおよび形状に関連する。例えば、個々の赤血球は小型凝集体より少ない光を散乱し、これは順に、大型凝集体より少ない光を散乱する。
【００１７】
同様に、血球または血球群（凝集体）がレーザー光線により走査される場合、照射光は、血球に結合されていた蛍光色素（単数または複数）から蛍光を誘発し得る。蛍光色素が試薬赤血球と血球当たり相対的に均一に結合される場合、蛍光強度は凝集体サイズに関連する。例えば、個々の赤血球は小型凝集体より少ない蛍光を発し、これは順次、大型凝集体より少ない蛍光を発する。
【００１８】
散乱光と蛍光の組合せの使用は、異なる種類の凝集体を区別する場合にいずれかのパラメーター単独よりも信頼性がある。
これら２つのパラメーターの他に、蛍光色素に結合されたモノクローナル抗体も、当該血球（および凝集体）を標識するために用いられ得る。照射レーザー光線により励起されると血球から発光される蛍光は、血球または凝集体の亜集団を区別するためのこれらのモノクローナル抗体と血球または凝集体との結合についてのさらに別の情報をもたらす。
【００１９】
同時ＡＢＯ式判定のための５つのパラメーター（前方散乱、側方散乱および３つの蛍光チャンネル）ドットプロット分析を、図１Ａ〜Ｄに示す。
フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を用いてもＡＢＯ式血液型の同時分析を実施し得る、と当業者には理解され得る。
フローサイトメトリーでは、測定される血球および凝集体は迅速移動液流の中心に導入されて、均一速度で小型直径開口部から単一列で流される。粒子は、鞘流の周囲層により流れの中心に流体力学的に集中される。流れ内の血球は、それらが光源により照明される測定ステーションを通過し、2.5X102 〜106 血球／分の速度で測定が成される。レーザー光源は血球の測定に用いられる。用いられる典型的レーザー光源としては、アルゴンイオンレーザー（ＵＶ、青色および緑色光）、クリプトンレーザー（黄色および赤色光）、ヘリウム−カドミウムレーザー（ＵＶおよび青色光）およびヘリウム−ネオンレーザー（赤色光）が挙げられる。蛍光および光散乱は、フローサイトメーター、例えばCytoronAbsolute （商標）フローサイトメーター（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ ）の使用により確定され得る。
【００２０】
蛍光顕微鏡では、測定される血球および凝集体は顕微鏡スライドまたは等価物上で読み取られる。血球は、典型的には白色光源により、または実質的に単色の光源により照明される。ここでは、レーザー光源は単色光の光源としても用いられ得る。凝集体の存在は白色光で査定され、関連する蛍光は単色光および適切なフィルターで査定され得る。肉眼または自動読み取りが、これらの読み取りの一方または両方のために用いられ得る。
【００２１】
肉眼的検出技法は、本明細書中で意図されるおもておよびうら血液型判定にも用いられ得る。カラム凝集反応検査（ＣＡＴ）を用いるこのような方法は、BioVue（商標）カセット（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY ）を使用する。このようなカセットは、微小粒子マトリックスを付加されるカラムを含有する。このようなマトリックスは、緩衝液中に分散された適切な血液型判定抗体で覆われて、初期反応帯を形成し得る。
【００２２】
ＣＡＴは、自動読取りシステムを用いて、凝集反応結果を解釈し得る。このような読取り機の１つは、全自動システムであるOrtho AutoVue （商標）（Ortho-Clinical Diagnotics, Inc., Rochester, NY）に存在し、ＣＡＴを実施する。自動読取り機は、ＣＣＤ（荷電カップリング装置）モノクロビデオカメラおよび画像処理ボードおよびＩＢＭコンパチブルＰＣから成るコンピューター映像システムである。読取り機は先ず、デジタル化され、画像処理ソフトウエアにより処理される反応の映像を獲得して反応特徴を抜き出し、次にこれは反応分類プログラムにより用いられる。これらの特徴は、反応を陰性と陽性とに分けるために、そして７つの慣用的反応の種類または等級のうちの１つへの翻訳のために用いられる。線状統計学的パターン認識道具である弁別分析が用いられて、陰性反応と弱反応とを区別する。
【００２３】
ＣＡＴに用いられるさらに別の読取り機は、BioVue（商標）読取り機２（Ortho-Clinical Diagnotics, Inc., Rochester, NY）全自動システムである。この読取り機は、１２のBioVueカセットのための自動ローダーを有し、そしてハロゲンランプ光源および画像分析特徴を有して、ＲＢＣ波長を基礎にした血球同定を可能にし、それにより凝集反応結果を解釈する。画像獲得は、ＣＣＤカメラおよびデジタル化ボードにより成される。
【００２４】
本発明は、血液の分析方法であって、（ａ）血液試料を、検出可能な標識に結合された抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体と反応させ；（ｂ）血液試料を、標識化Ａ抗原および標識化Ｂ抗原を保有する試薬赤血球と反応させ；（ｃ）当該試料に血球計算分析を施し；そして（ｄ）当該血球計算分析を分析してＡＢＯ式血液型を判定することを特徴とする方法を提供する。血液試料は全血であり得るし、前記の工程（ａ）および（ｂ）で用いられる血液試料は同一の非分割試料であり得るか、または同一患者からの試料の異なる部分であり得る。抗体に結合された検出可能標識は、蛍光標識、例えばＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ、フィコビリタンパク質（フィコエリトリンを含む）、フィコビリタンパク質のエネルギー転移複合体、ペリジニンクロロフィリンタンパク質、カスケードブルー、ＡＭＣＡ、反応性インドカルボシアニン、ＴＲＩＴＣ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコシアニン（ＰＣ）およびインドジカルボシアニン（Ｃｙ５（商標））であり得る。逆に、標識化Ａ抗原および標識化Ｂ抗原は、ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ、フィコビリタンパク質（フィコエリトリンを含む）、フィコビリタンパク質のエネルギー転移複合体、ペリジニンクロロフィリンタンパク質、カスケードブルー、ＡＭＣＡ、反応性インドカルボシアニン、ＴＲＩＴＣ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコシアニン（ＰＣ）およびインドジカルボシアニン（Ｃｙ５（商標））から成る群から選択される蛍光色素であり得る。
【００２５】
本発明は、（ａ）その中に標識化抗Ａ抗体および標識化抗Ｂ抗体を有する第一容器、ならびに（ｂ）その中に標識化Ａ型抗原および標識化Ｂ型抗原を保有する標識化試薬赤血球を有する第二容器を包含する血液分析キットを意図する。抗Ａ抗体はＩｇＭ−ＦＩＴＣを包含し、そして抗Ｂ抗体はＩｇＭ−ＦＩＴＣを包含し得る。試薬赤血球は、Ａ１、Ａ２、Ｂおよび／またはＯ型であり、そして反応性染料（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、親油性染料（例えばメロシアニン540 またはＤｉＩＣ18（３）−ＤＳ）、反応性親油性染料、膜構造物と反応する染料、および蛍光染料と複合化したモノクローナル抗体（これらのモノクローナル抗体の反応性は赤血球上の共通構造物（例えば抗グリコフォリン−ＰＥ複合体）とのものである）から成る群から選択される蛍光色素で標識され得る。好ましくは、蛍光色素はＤｉＩＣ18（３）−ＤＳである。キットは、カラム凝集技法（ＣＡＴ）カセット、例えばBioVue（商標）カセットを付加的に包含し得る。
【００２６】
本発明の方法は、同時おもておよびうらＡＢＯ式血液型判定を実施するためであって、（ａ）血液試料を、検出可能な標識に結合された抗体である抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体と反応させ；（ｂ）血液試料を、標識化Ａ抗原および標識化Ｂ抗原を保有する試薬赤血球と反応させ；（ｃ）試料に血球計算または蛍光顕微鏡分析を施し；そして（ｄ）血球計算または蛍光顕微鏡分析を分析してＡＢＯ式血液型を判定することを特徴とする。さらに本方法は血液を分析するためであって、（ａ）血液試料を抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体と反応させ、（ｂ）血液試料をＡ抗原を保有する試薬赤血球と、そしてＢ抗原を保有する試薬赤血球と反応させ、（ｃ）当該試料に目視分析を施し、そして（ｄ）当該目視分析を分析してＡＢＯ式血液型を判定することを特徴とする。工程（ｂ）の試薬赤血球は、染色され得る。本方法は、カラム凝集技法により実施され、その結果は、自動読取り機、例えばOrtho AutoVue （商標）システム自動読取り機またはOrtho BioVue（商標）読取り機２により自動的に読み取られる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明によれば、同時おもておよびうらＡＢＯ式血液型検査が種々の実施態様に関して記載される。本発明は、BIOVUEの商品名でOrtho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, New York からカセット形態で製造され、そして販売されているカラム凝集検査（ＣＡＴ）反応および分離容器とともに用いられ得る。結果は、AutoVue （商標）自動読取り機コンピューター映像システムまたはBioVue（商標）読取り機２（ともに本明細書中で前記したシステム）を用いて確定され得る。
【００２８】
本明細書中に開示された検査を実行するためのその他の手段は、試験管、マイクロプレート、スライドおよび検査プラットフォーム、例えばVitros（商標）スライド法を用いることである。結果は、フローサイトメトリー、例えばCytronAbsolute（商標）またはレーザー走査血球計算器または本明細書中に前記した方法を用いて確定され得る。
【００２９】
うら血液型判定のために典型的に用いられる試薬ＲＢＣは、それらの表面にＡ1 、Ａ2 、Ｂまたは非ＡＢＯ型抗原（Ａ1 型、Ａ2 型、Ｂ型、Ｏ型）を有する。これらの血球は、試薬ＲＢＣの凝集を引き起こす予備生成抗体を検出するのに有用である。おもて血液型検査に関しては、モノクローナル抗Ａおよび抗Ｂが用いられて、試料赤血球表面のそれらのそれぞれの抗原の存在を検出する。
【００３０】
他の血液型抗原、例えばＤ、Ｃ、Ｅ、ｃ、ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、Ｐ1 、Ｌｅa 、Ｌｅb 、Ｋ、ｋ、Ｊｓa 、Ｆｙa 、Ｆｙb 、Ｊｋa 、Ｊｋb 、Ｌｕa およびＬｕb 、ならびに多数のその他のものの存在を同時判定することは、本発明の教示の範囲内である。本発明の方法は、おもてまたはうら血液型検査の蛍光または肉眼的検出を可能にし、そして好ましい実施態様では、同時おもておよびうら血液型検査を可能にする。
【００３１】
蛍光検出系
蛍光検査実施態様では、試薬ＲＢＣ、モノクローナル抗Ａ（マウスモノクローナルＩｇＭから精製）または抗Ｂ抗体（これもマウスモノクローナルＩｇＭから精製）、あるいは３つすべてが蛍光染料で標識され、そして、（１）循環抗体を伴う試薬ＲＢＣ、および（２）ＲＢＣ表面抗原を伴うモノクローナル抗Ａまたは抗Ｂ抗体が、488nm レーザーを用いて、例えばCompucyte レーザー走査血球計算器を用いて検出される。あるいは、抗血清は蛍光的に標識される必要はないが、しかし光散乱により検出され得る。結果は、レーザーフローサイトメトリーにより、例えばOrtho CytoronAbsolute （商標）フローサイトメーターを用いてさらに判定され得る。蛍光顕微鏡も用いられ得る。
【００３２】
同時おもておよびうら血液型判定のために、標識化Ｂ試薬ＲＢＣがＡ型ＷＢの存在下でＦＩＴＣ標識化抗Ａを伴って存在する検査が実施された（図１Ａおよび２参照。実施例１参照）。ＦＩＴＣ標識化抗Ａは、ＷＢ試料中のＡ型赤血球を凝集し、緑色凝集体を生じ得た。ＷＢの血漿中の予備生成抗Ｂは橙色標識化試薬Ｂ型ＲＢＣを凝集して橙色凝集体を生じ得た。同様の検査を、Ｂ、ＡＢおよびＯ型ＷＢを用いて実施した（図１Ｂ〜Ｄおよび図３〜５参照）。
【００３３】
緑色および／または橙色凝集体の存在を基礎にして、４つの腫瘍ＡＢＯ式血液型の各々と相関する反応性の４つの異なるパターンが観察された（表１参照）。したがって、ある検査では、ＡＢＯ式血液型は、おもておよびうら血液型を同時に確定することにより判定された。Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯ型ＷＢの存在下で、相互的に、標識化Ａ1 試薬ＲＢＣおよびＦＩＴＣ標識化抗Ｂが混和された。さらに、緑色および／または橙色凝集体の存在を基礎にした凝集反応の４つの異なるパターンが観察され、各々、特定のＡＢＯ式血液型に対応した。したがって、ＡＢＯ式血液型を判定し、確証するために、２つの検査が実施される（表１参照）。混合蛍光（混合緑色および橙色）を有するいくつかの凝集体が検出された（図６〜８参照）。これらは、非標識化血球の凝集体中またはその付近の標識化血球のトラッピング／近接から、あるいは標識化血球の凝集体中またはその付近の標識化抗体のトラッピングまたは近接に起因する。混合緑色／橙色凝集体の存在は、結果の解釈を妨げなかった。検査２を用いるＡＢＯ式血液型の各々に関する代表的データシートを、表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004554766.tif 000002
【００３５】
表１の結果は、Compucyte レーザー走査血球計算器を用いて確定した。しかしながら、凝集体を判定するためのその他の手段が意図され、標識化抗血清が必要な場合も必要でない場合もあり、その例としては本明細書中に前記した方法が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書中に記載した種々の検査は別々に、またはそれらの任意の組合せで実施され得るが、しかしおもておよびうら検査を同時に実施するのが本発明の好ましい方法である。
【００３６】
蛍光染料は、試薬血球を（うら検査用）そしてモノクローナル抗Ａおよび抗Ｂ抗体を（おもて検査用）標識するために用いられる。試薬血球を標識するための好ましい蛍光標識としては、１，１‘−ジオクタデシル−３，３，３’，３‘−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸（ＤｉＩＣ18（３）−ＤＳ）が挙げられる。この染料は、488nm 青色アルゴンレーザー光で励起されると血球に橙色の蛍光を発光させる。この実施態様に有用なその他の蛍光標識としては、反応性染料（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、親油性染料（例えばメロシアニン540 ）、反応性親油性染料（ＤｉＩのクロロメチルベンズアミドおよびメチルベンズアミド誘導体、ＤｉＩのスルホン化誘導体、ならびにＤｉＯのスルホン化誘導体）、膜構造物と反応する染料、および蛍光染料と複合化するモノクローナル抗体が挙げられるが、これらのモノクローナル抗体の反応性は赤血球上の共通構造物（例えば抗グリコフォリン−ＰＥ複合体）とのものである。
【００３７】
モノクローナル抗体を標識するための好ましい蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。ＦＩＴＣ標識は、488nm 青色アルゴンレーザーで励起されるとこの抗体が結合するあらゆる血球に緑色の蛍光を発光させる。ＦＩＴＣは、488nm アルゴンイオンレーザーにより励起され得るタンパク質反応性、低分子量蛍光色素染料の種類の一成員であり、これらはすべて本発明のモノクローナル抗体標識目的に有用である。この種類の別の例は、ＢＯＤＩＰＹ（Molecular Probes, Eugene, OR）で、これもこのようなレーザーで励起されると緑色の蛍光を発光する。その他の考え得る有用な蛍光色素としては、フィコビリタンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコビリタンパク質のエネルギー転移複合体（例えばDuoChrome （商標）（Becton Dickinson, San Jose, CA）、ＣＹ５（商標）（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ ）等）、ならびにペリジニンクロロフィリンタンパク質（PerCP （商標）（Becton Dickinson, San Jose, CA））が挙げられる。前述の染料はすべて488nm 青色アルゴンイオンレーザーにより励起されるが、しかし励起波長光源と発光染料のその他の組合せも考えられる。いくつかの例を以下に挙げる：ＵＶ励起によるカスケードブルーおよび７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）；緑色励起によるフィコエリトリン、反応性インドカルボシアニン（Ｃｙ３（商標））およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；赤色励起によるアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコシアニン（ＰＣ）およびインドジカルボシアニン（Ｃｙ５（商標））。
【００３８】
前記の蛍光検査系と代替的に、蛍光標識（ＦＩＴＣ）で抗血清を標識する必要はない。凝集体は、この分野の当業者の技術の範囲内であるような、このサイズおよび種類の粒子に関する適切な設定で設定された光散乱に基づいて検出され得る。
うら検査条件
凝集反応の結果を最適化するために、それは先ず、標識化試薬ＲＢＣおよび標識化モノクローナル抗体対全血の使用比を確定する。したがって、凝集反応の読み取りは、最大にされ、余分の標識は用いられない。擬陰性の数が低減されるため、特異性の改良は適切な検査比の確定の結果である。
【００３９】
ＲＢＣの標識化
ＤｉＩＣ18（３）−ＤＳ標識化試薬ＲＢＣを用いたうら検査のために、全血中の相対的抗体に対する特異性を有して凝集するその比率の試薬ＲＢＣの能力を基礎にして、試薬ＲＢＣ対全血の所望の比率を確定した。特に標識化Ａ1 試薬ＲＢＣを、種々の比率でＢ型全血と混和した。作業試薬ＲＢＣ濃度を確定するために、５％、10％および40％の試薬ＲＢＣ懸濁液を検査した。２μM のＤｉＩ−ＤＳの溶液を用いた。タグ化ＲＢＣをCytoronAbsolute （商標）フローサイトメーターで分析し、平均蛍光を測定した。約５％〜約10％のＲＢＣの濃度が有用であり、平均蛍光はより低濃度のＲＢＣを用いた場合に匹敵できるほど明るかったため、約５％ＲＢＣ懸濁液が最も好ましい。しかしながら、十分に検出可能な蛍光またはバックグラウンドを上回る検出可能数の蛍光事象を提供する試薬ＲＢＣの濃度、ならびに実際的可能性の見地から使用を思いとどまることのない濃度まで、例えば試薬の容量が用いられ得る。表２は、使用したＤｉＩ−ＤＳの濃度で検査された種々の比率の試薬ＲＢＣを用いて得られた平均蛍光を示す。
【００４０】
【表２】
0004554766.tif 000003
【００４１】
ＤｉＩ−ＤＳ濃度の範囲
本発明のうら検査の局面に関するＤｉＩ−ＤＳ濃度の有用な範囲を確定するために、５つの異なる最終濃度のＤｉＩ−ＤＳを、５％ＲＢＣ懸濁液に対して検査した。これらの細胞を、CytoronAbsolute （商標）に関して分析した。平均蛍光および％ＣＶ（変異係数）を測定した。陽性を検査される５μモル〜40μモルのＤｉＩ−ＤＳの濃度は、あるいは20％未満の％ＣＶを有する十分に明るいシグナルを提供する任意の濃度が、本実施態様において意図される。最小ＣＶで最も明るいシグナルを有するので、４０μモル溶液が好ましい（表３参照）。
【００４２】
【表３】
0004554766.tif 000004
【００４３】
うら検査  −  ＤｉＩ標識化ＲＢＣ＆全血（ＷＢ）
次に、橙色標識化Ａ型試薬ｒｂｃがＢ型またはＯ型全血中では凝集するが、Ａ型またはＡＢ型ＷＢ中では凝集しない条件を確定した。相互的に、標識化Ｂ試薬ＲＢＣがＡ型またはＯ型ＷＢと橙色凝集体を形成するがしかしＢ型またはＡＢ型ＷＢとは形成しない条件を確定した。488nm 青色アルゴンレーザー光を用いたCompucyte レーザー走査血球計算器の最大ピクセルマップ上での橙色および緑色シグナルの相対位置により、着色凝集体を確定した。
【００４４】
異なる組合せを調製することによりＷＢ対標識化ＲＢＣの比率を確定し、標準血液バンク血清学技法を用いて検査した。ＷＢ検査用に、５％懸濁液を用いた。凝集反応が観察されたが、しかしながら、検査混合物中のＲＢＣの濃度は一貫した凝集反応結果を生じるには十分ではなかった、ということを我々は見出した（表４参照）。
【００４５】
【表４】
0004554766.tif 000005
【００４６】
５％標識化ＲＢＣ懸濁液を40％に濃縮し、その５μL を５μL のＷＢに付加した。結果は好ましく、凝集反応が観察されたので、したがって他の比率は検査しなかった。
おもて検査  −  ＦＩＴＣ標識化抗体＆全血
同様に、標識化モノクローナル抗体を用いたおもて検査のために、ＷＢ中の相対的血球抗原に対する特異性を有して凝集するその比率の標識化抗体の能力を基礎にして、標識化抗体対全血の所望の比率を先ず確定した。特にＦＩＴＣ標識化抗ＡをＡ型ＷＢで滴定して、緑色凝集体がＡ型またはＡＢ型ＷＢ中では生成するが、しかしＢ型またはＯ型ＷＢ中では生成しない条件を確定した。相互的に、次に、標識化抗ＢがＢ型またはＡＢ型ＷＢと緑色凝集体を形成するが、しかしＡ型またはＯ型ＷＢとは形成しない条件を確定した。488nm 青色アルゴンレーザー光を用いたCompucyte レーザー走査血球計算器の最大ピクセルマップ上での橙色および緑色シグナルの相対位置により、着色凝集体を測定した。
【００４７】
次に、蛍光標識対抗体の比率を確定した。全血を有する50μL を用いて、３つの異なる稀釈で、容量標識化抗体分画を検査した（表５参照）。
【００４８】
【表５】
0004554766.tif 000006
【００４９】
* 陰性対照
**  AABB Technical Manual, 12 th edition; pg607 に定義されている等級分類系
１：100 稀釈液は、ＬＳＣを用いて最良の結果を示したので、さらなる検査用に選定した。これらの結果に基づいて、50μL のＦＩＴＣ：抗体を１：100 稀釈で、および５μL のＤｉＩ−ＤＳ標識化ＲＢＣを用いた。しかしながら、使用される標識：抗体の範囲は、バックグラウンド（低端）および前地帯（高端）を上回る検出可能な蛍光を生じる任意の濃度であり得る。
【００５０】
目視検出系
赤血球の色を変える能力は、視的にまたは分光測光的に（吸光度または反射率により）、即ち蛍光を検出する必要を伴わずに、実施される２つの血球集団の同時検査を可能にする。例えば、シアニドまたはアジドに曝露された赤血球は明赤色から褐色に変わると予測される。赤色凝集体は、その場合、褐色凝集体から肉眼で検出され得る。赤血球ヘモグロビンの固有の色の変更がこの実施態様により意図されるが、しかし、赤血球に発色団を単に結合させるかまたはそうでなければ会合させると、それらのスペクトル特性が別の方法で検出可能的に変化し得る。
【００５１】
目視検出実施態様では、おもておよびうら検査は、カラム凝集法（ＣＡＴ）を用いて、例えばBioVueカセットを用いることにより実施され得る。おもて血液型検定は、本発明のマトリックスに付加されていた円柱状装置を用いることにより、本明細書中に前記したカラム凝集装置を利用して実施され得る。抗血清を含有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は生理学的適合性緩衝液中に分散されて、それらを浸漬するための微小粒子のマトリックスに付加されて、そしてマトリックスから注入口に向かって延びて、初期反応帯を形成する。適量のこのような抗体は、一般的に抗体の抗原親和性および特異性によって、当業者によりルーチンに最適化され得る。抗体は、それらの反応性を増強し、そして比特異的結合を防止するのに役立つことが当業界で既知の適切な添加材、例えば高分子量ポリマー等も含有し得る。
【００５２】
これらの例としては、ポリビニル、デキストラン、ゼラチンおよびポリエチレングリコールが挙げられる。低分子量ポリマーも、溶液の密度を増大するために付加され得る。
この説明では、Ｂ型血球に対する抗体が付加された場合、患者試料中に含有されるＢ型血球は抗体と結合して、マトリックスの上部付近でトラッピングされる集合血球の層を形成する。この実施例では、Ａ型血球は凝集せず、遠心分離すると装置の底に溜まる。しばしば、患者の血球は弱く反応する変異体を含有し得る。中等度の反応は、カラムマトリックス全体の小型散乱凝集体により実証され得るが、一方陰性物質はマトリックスカラムの底部にボタンを形成する。図６は、カラム凝集法を用い、それによりＡ型およびＢ型血球が別々に標識されるうら検査を示す。メーカーの使用説明書通りに、試料血清をカラムの上部に供給し、そしてそれにしたがって試験管をインキュベートし、遠心分離する。試薬Ａ血球は存在する抗Ａ抗体とともに凝集するが、一方試薬Ｂ血球はカラムの底部に通過する。これは、試料血清がＢ型であったことを示す。
【００５３】
試薬ＲＢＣ（Affirmgen （商標）Ａ1 およびＢ型血球, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ ）を、0.2 ％の最終濃度でアジ化ナトリウム（ＮａＮ3 ）で処理した。ＮａＮ3 はヘモグロビン中の鉄を低減し、色を典型的赤色から濃褐色または栗色に変色した。同一Affirmagenロットからの未処理血球を、対照として用いた。未処理対照および処理済み検査血球を、メーカーの指図通りにBioVueうら検査カセット中のＢ型血清を用いて別々に検査した（10μl の３〜５％赤血球および40μl の血清；次にメーカーの使用説明書にしたがって、BioVue（商標）遠心分離器で５分間遠心分離した）。Ｂ型血清はＡ1 型血球を凝集するがしかしＢ型血球を凝集しない、と予測される。未処理対処理血球の凝集反応において差は観察されなかったが、但し、未処理血球は赤色で、処理血球は褐色であった（本明細書中の実施例２および表６を参考）。
【００５４】
前記の目視検出系を用いる凝集反応結果の自動判定は、AutoVue （商標）自動読取り機コンピューター映像システムまたはBioVue（商標）読取り機２（ともに本明細書中に前記）の使用により成し遂げられ得る。
本明細書中に開示したような凝集体の目視観察が望ましい場合には、先ず、無色血球または血球に付着している無色粒子を、視覚的に知覚可能な凝集反応を実行するのに適した染料で染色するのが好ましい。赤血球のヘモグロビンは、染色しなくても、自然に、このような適切な色を提供する。前記のようなＡＢＯ式赤血球、ならびにＤ、Ｃ、Ｅ、ｃ、ｅ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、Ｐ1 、Ｌｅa 、Ｌｅb 、Ｋ、ｋ、Ｊｓa 、Ｆｙa 、Ｆｙb 、Ｊｋa 、Ｊｋb 、Ｌｕa およびＬｕb 抗原等を含有する血球に関して、直接凝集試験を実施し得る。同様に、特定の抗原または抗原を含有する血球に対する抗体の存在に関して血清を検査する場合、それらを既知の抗原と混合し得る。未知の血清が提供された既知の抗原に対する抗体を含有する場合、反応体は凝集され、それらがマトリックス上を移動したりまたはそれを通って下降する場合にはトラッピングされるが、一方陰性血清は、反応を実行せず、凝集物はトラッピングされない。
【００５５】
血液血清学的状況での使用に関して、本発明の方法を詳細に説明してきた。しかしながら、おもておよびうら検査の両方において、配位子のそれらの結合相手との結合の結果として粒子が反応するように、粒子と会合する任意の結合配位子を包含する同時おもておよびうら血液型結合検定を実行することは本発明の意図内である、と理解されるべきである。例えば、試料ＲＢＣから分離された血漿または血清を用いてルーチン的に実施される「抗体スクリーニング」検定は、本明細書中に開示したように用いられる標識化試薬赤血球とともに全血を用いて実施され得る。あるいは、血清または血漿が用いられ得るが、しかし抗体スクリーニングまたは抗体同定を実施するために必要な検査の数は、１種類の非標識化試薬赤血球と１種類の標識化試薬赤血球を混合することにより、50％低減され得る。赤血球おもておよびうら検査系を説明したが、その他の系もこの方法で最適化され得る、と当業者は理解する。
【００５６】
【実施例】
以下の実施例は本発明を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
蛍光検出実施態様
パートＡ−試薬調製
１mlのエタノール（Sigma, St Louis, MO ）をＤｉＩ−ＤＳの１mgバイアルに付加し、激しく混合して１mg/Ml の濃度にすることにより、親油性蛍光膜標識１，１‘−ジオクタデシル−３，３，３’，３‘−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸（ＤｉＩ−ＤＳ）（Molecular Probe Inc., Eugene, OR）のストック溶液を調製した。ストック溶液は、遮光されて室温で６ヶ月間貯蔵され得る。
【００５７】
ストック溶液をハンクス平衡塩溶液（HBSS）（Sigma ）で80μM の濃度に稀釈することにより、ＤｉＩ−ＤＳの作業溶液を調製した。未使用作業溶液は廃棄した。
パートＢ−赤血球（ＲＢＣ）蛍光標識化
血液型がＡ１、ＢおよびＯであるヒトドナーから、全血をVacutainerアデノシンシトレートデキストロース（ＡＣＤ）防腐試験管（Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ）中に収集した。約3000x g で５分間の遠心分離によりＲＢＣを分離し、３〜５mlのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Gibco ）中で２回洗浄し、各洗浄後に、約3000x g で３〜５分間遠心分離した。ＨＢＳＳを稀釈剤として用いて、５％ＲＢＣ懸濁液を調製した。
【００５８】
等容量（0.1 〜５ml）の５％ＲＢＣ懸濁液およびＤｉＩ−ＤＳ作業溶液を試験管中に併合し、37℃で30分間インキュベートして、遮光した。試験管を10分毎に軽く手動で攪拌した。標識化ＲＢＣを３〜５mlのＰＢＳで３回洗浄し、約3000x g で５分間遠心分離した。ＨＢＳＳ中に再懸濁して、５％溶液とした。
Imunocount II ソフトウエアを用いたCytoronAbsolute （商標）フローサイトメーター（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Raritan, NJ ）で、橙色蛍光を確証した。
【００５９】
光散乱パラメーターを基礎にしてＲＢＣをゲート制御し、ゲート化ＲＢＣと会合する蛍光を測定した。バックグラウンドを上回る蛍光の測定は、十分な標識化を示した。蛍光標識の代わりに等容量のＰＢＳ（0.1 〜５ml）とともにインキュベートした同一ＲＢＣの陰性対照を平行して実行した。
パートＣ−抗体のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化
マウスモノクローナル抗Ａ、クローンMH04およびマウスモノクローナル抗Ｂ、クローンNB10.5A5を、 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.,製造所から組織培養形態で入手した。標準的方法を用いて、モノクローナル抗体を一部精製し、濃縮した。
【００６０】
精製抗Ａおよび抗Ｂを、標準プロトコールにしたがって、炭酸塩緩衝液、ｐＨ9.5 中で透析し、ＦＩＴＣで標識した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＦＩＴＣ標識化抗体を遊離ＦＩＴＣから分離した。280nm および492nm での個々の分画の吸光度を確定した。各分画に関するＦ／Ｐ（フルオレセイン／タンパク質）モル比を、以下の式を用いて算出した：
Ｆ＝A495/0.15
Ｐ＝［A280- （A495x0.32 ）］/1.2
Ｆ／Ｐ比＝（Ｆ／Ｐ）ｘ2.39
最高Ｆ／Ｐ比を有する３つの分画を、本発明の蛍光同時おもておよびうら検査実施態様に用いた。
【００６１】
0004554766.tif 000007
パートＤ−全血（ＷＢ）中での同時おもて／うら血液型判定および検査の解釈−レーザー走査血球計算器（ＬＳＣ）
抗Ｂ  ＦＩＴＣ標識化抗体中に稀釈したＤｉＩ−ＤＳ  Ａ標識化ＲＢＣを我々は調製した。抗体を２％ウシ血清アルブミンおよび１％アジ化ナトリウムを有す留0.5ml のＰＢＳ中で１：100 に稀釈した。下記のサブパート１〜４に示すように、９容量の稀釈抗体を１容量の標識化血球と混合した。55μL のＷＢを５μL のＷＢに付加した。試験管をClay-Adams（Parsippany, NJ）血清遠心機中で約3500rpm で15秒間遠心分離した。ＲＢＣを静かに再懸濁した。３μL の反応混合物を７μL のＰＢＳに付加し、次にカバーガラスを適用することにより、スライドを調製した。
【００６２】
ＬＳＣ（Compucyte, Cambridge, MA）を用いて、スライドを分析した。
サブパート１
本明細書中のパートＤの物質および手法を用いて、Ａ型全血を使用した。Ａ型全血はＡ型赤血球に対する抗体を含有しないため、標識化試薬赤血球との凝集体は形成され得ない。さらに、Ａ型全血はＢ抗原を保有しないため、抗Ｂ  ＦＩＴＣとの凝集体は形成され得ない。図１Ａは、Ａ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。予測通り、凝集体の領域で、側方散乱プロットには何の事象も検出されない。さらに、緑色対橙色プロットにおいてさらに分析される側方散乱から得られる事象は何もない。
【００６３】
サブパート２
本明細書中のパートＤの物質および手法を用いて、Ｂ型全血を次に検査した。Ｂ型全血はＡ型赤血球に対する抗体を含有するため、標識化試薬赤血球との凝集体が形成されるべきである。さらに、Ｂ型全血はＢ抗原を発現するため、抗Ｂ  ＦＩＴＣと凝集体を形成すべきである。図１Ｂは、Ｂ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットに事象が検出される。予測通り、緑色対橙色プロットにおいてこれらの事象をさらに分析して、試薬血球（橙色陽性）および被験ＲＢＣ（緑色陽性）の両方の凝集体の存在を、我々は確証する。
【００６４】
サブパート３
本明細書中のパートＤの物質および手法を用いて、ＡＢ型全血を次に検査した。ＡＢ型全血はＡ型赤血球に対する抗体を含有しないため、標識化試薬赤血球との凝集体は形成されるべきでない。しかしながら、ＡＢ型全血はＢ抗原を発現するため、抗Ｂ  ＦＩＴＣと凝集体を形成すべきである。図１Ｃは、ＡＢ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットに事象が検出される。予測通り、緑色対橙色プロットにおいてこれらの事象をさらに分析して、試薬血球（橙色陽性）の凝集体を観察できなかったが、しかし被験ＲＢＣ（緑色陽性）の凝集体の存在を、我々は確証する。
【００６５】
サブパート４
最後に、本明細書中のパートＤの物質および手法を用いて、Ｏ型全血を次に検査した。Ｏ型全血はＡ型赤血球に対する抗体を含有するため、標識化試薬赤血球との凝集体が形成される。しかしながら、Ｏ型全血はＢ抗原を発現しないため、抗Ｂ  ＦＩＴＣと凝集体を形成しない。図１Ｄは、Ｏ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットに事象が検出される。予測通り、緑色対橙色プロットにおいてこれらの事象をさらに分析して、試薬血球（橙色陽性）の凝集体を観察したが、しかし被験ＲＢＣｒｂｃ（緑色陽性）の凝集体を、我々は観察しなかった。
【００６６】
実施例２
目視検出実施態様
パートＡ  −  着色赤血球の調製
Ａ1 およびＢ型赤血球の市販調製物（Affirmagen）を、Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.（Raritan, NJ ）から入手した。Ａ1 型ＲＢＣの２つの１Mlアリコートをバイアルから取り出して、別々の試験管中に入れた。一方のアリコートを20μl の10％ＮａＮ3 （Mallinckrodt, Paris, KY ）と混和した。他方のアリコートは処理せずに、対照として用いた。各試験管に蓋をして、内容物を周囲温度で16時間インキュベートした。一夜処理後、ＮａＮ3 処理ＲＢＣは褐色となったが、一方未処理対照は赤色のままであった。
【００６７】
パートＢ  −  うらBioVueカラム検査−二重カラム検定
異なるカラム（表６のカラム３および４）中で、10μl のＡ１血球＋40μl のＢ型血清を用いて、標準BioVueうら検査カセットで、アジ化ナトリウム処理血球を検査した。未処理Ａ１およびＢ血球である対照血球を、それぞれカラム１および２中で処理した。メーカーの使用説明書にしたがって遠心分離後、凝集Ａ１血球は、未処理対照血球（カラム１）および処理被験血球（カラム３）ともにビーズカラムの上部で観察されたが、これは、Ｂ型血清中の抗Ａの存在を示す。非凝集Ｂ血球は、未処理対照血球（カラム２）および処理被験血球（カラム４）ともにカラムの底部で観察されたが、これは抗Ｂの非存在を示す。未処理対照血球は外観が赤色で、処理被験血球は褐色であった。これらの結果は、Ａ１およびＢ血球の処理が、ビーズカラム中で凝集するそれらの能力を損なわなかったことを示した。
【００６８】
パートＣ  −  うらBioVueカラム検査−単一カラム検定
実施例２のパートＢにおいて、Ａ１およびＢ型血球を別々のカラム中で処理して、試料のうら血液型判定をした。次に、一方のカラムで、10μl のＡ１未処理血球（赤色）＋10μl のＢ型処理血球（褐色）を40μl のＢ型血清と併合した。遠心分離後、２つの異なる血球集団が観察された。凝集化（Ａ１）血球はビーズカラムの上部で観察され、そして非凝集化褐色（Ｂ）血球はカラムの底部で観察された（表６のカラム５）。結果は、正しいうら血液型が、正常の２つのカラムの代わりに１つのカラム（１検査）で確定され得たことを示した。相互的に、10μl の処理Ａ1 血球と10μl の非処理Ｂ血球を、本明細書中のパートＢにしたがって検査し、結果は、凝集化褐色（Ａ1 ）血球および非凝集化赤色（Ｂ）血球を検出し得た（表６のカラム６）。
【００６９】
このパートＢおよびＣからの結果を、表６に示す（図９参照）。
【００７０】
【表６】
0004554766.tif 000008
【００７１】
注：カラムはすべて、示された赤血球の他に、40μl のＢ型血清を含有した。
untr  未処理対照血球
tr  処理済み血球
【図面の簡単な説明】
【図１】同時おもておよびうらＡＢＯ式血液型判定の４色レーザー走査血球計算分析のグラフを示す。パネルＡは、Ａ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットには何の事象も検出されない。さらに、緑色対橙色プロットにおいてさらに分析される側方散乱から得られる事象は何もない。パネルＢは、Ｂ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットにおいて事象が検出される。これらの事象が緑色対橙色プロットにおいてさらに分析される場合、試薬血球（橙色陽性）および被験ｒｂｃ（緑色陽性）の両方の凝集体の存在を、我々は確証する。混合蛍光（混合緑色および橙色）を有するいくつかの凝集体が検出された。パネルＣは、ＡＢ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットにおいて事象が検出される。これらの事象が緑色対橙色プロットにおいてさらに分析される場合、試薬血球（橙色陽性）の凝集体を観察することはできないが、しかし被験ｒｂｃ（緑色陽性）の凝集体の存在を、我々は確証する。混合蛍光（混合緑色および橙色）を有するいくつかの凝集体が検出された。パネルＤは、Ｏ型全血を用いた抗Ｂ  ＦＩＴＣおよびＡ標識化ＲＢＣの前方（ｘ軸）および側方（ｙ軸）散乱（それぞれ緑色最大ピクセルおよび橙色最大ピクセル）を示す。凝集体の領域で、側方散乱プロットにおいて事象が検出される。これらの事象が緑色対橙色プロットにおいてさらに分析される場合、試薬血球（橙色陽性）の凝集体を我々は観察するが、しかし被験ｒｂｃ（緑色陽性）の凝集体の存在は確証されない。
【図２】同時おもておよびうら血液型判定の予測結果の略図を示す。図２は、標識化Ａ試薬ＲＢＣおよび標識化抗ＢとＡ型全血との混和物は凝集体を生じないことを示す。
【図３】Ｂ型ＲＢＣと抗Ｂ（緑色）および抗Ａ−Ａ試薬血球（橙色）の凝集体を生じる、標識化Ａ試薬ＲＢＣおよび標識化抗ＢとＢ型全血との混和物の略図を示す。
【図４】ＡＢ型ＲＢＣ−抗Ｂ（緑色）の凝集体を生じる、標識化Ａ試薬ＲＢＣおよび標識化抗ＢとＡＢ型全血との混和物の略図を示す。
【図５】抗Ａ−Ａ型試薬血球（橙色）の凝集体を生じる、標識化Ａ試薬ＲＢＣおよび標識化抗ＢとＯ型全血との混和物の略図を示す。
【図６】緑色凝集体、橙色凝集体、および混合橙色／緑色凝集体を示し、その各々が緑色対橙色最大ピクセルスペクトル上で異なる散乱を示す。
【図７】緑色対橙色最大ピクセルスペクトルに関する橙色凝集体、緑色凝集体および混合橙色／緑色凝集体の相対位置を示す略図である。
【図８】緑色対橙色最大ピクセル散乱スペクトルに関する橙色凝集体、緑色凝集体および混合橙色／緑色凝集体の相対位置（密度）を示す略図である。
【図９】ＣＡＴ系におけるＢ型血清のうら検査の肉眼的検出の模式図である。標識化試薬ＡおよびＢ型赤血球はＢ型血清と混和されて、褐色凝集体を生じ、これは、延伸分離後、ＣＡＴ系のゲルカラムの上部で観察される。未反応標識化試薬Ｂ型血球は、カラムの底部で観察される。
【図１】
0004554766.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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