(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物（人を除く）において一酸化窒素の内因的生成を阻害する方法であって、哺乳動物の内因的に生成される一酸化窒素の生成量の減少を十分引き起こすだけの量のテトラサイクリン化合物を該哺乳動物に与えることを含み、前記テトラサイクリン化合物が6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンであり、テトラサイクリン化合物の量が１日あたり0.1〜30mg/kgであることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
該テトラサイクリン化合物が該哺乳動物において抗菌活性をもたない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該テトラサイクリン化合物がメタロプロテイナーゼ阻害活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該哺乳動物が一酸化窒素の内因的生成の亢進を特徴とする症状をもつ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物が一酸化窒素依存性糸球体炎症をもつ、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該哺乳動物が変形性関節症をもつ、請求項４記載の方法。
【請求項７】
更にステロイド系又は非ステロイド系抗炎症剤の抗炎症量を該哺乳動物に与えることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
試験管内の哺乳動物細胞培養物又は哺乳動物生体外組織培養物又は哺乳動物器官における内因的一酸化窒素生成を阻害する方法であって、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンであるテトラサイクリン化合物を前記細胞培養物、前記組織培養物又は前記器官に提供することを含み、一酸化窒素生成の測定量が誘導一酸化窒素合成酵素の発現又は活性を表している上記方法。
【請求項９】
過剰の内因的一酸化窒素生成により特徴づけられる症状をもつ哺乳動物（人を除く）の治療方法であって、該哺乳動物において一酸化窒素生成を十分阻害するだけの量のテトラサイクリン化合物を該哺乳動物に投与することを含み、前記テトラサイクリン化合物が6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンであり、テトラサイクリン化合物の量が１日あたり0.1〜30mg/kgであることを特徴とする、前記方法。
【請求項１０】
該炎症症状が急性炎症症状である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
該炎症症状が慢性炎症症状である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
該テトラサイクリン化合物が該哺乳動物において抗菌活性をもたない、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
該テトラサイクリン化合物がメタロプロテイナーゼ阻害活性を有する、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物における一酸化窒素の内因的生成を阻害するための組成物であって、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンであるテトラサイクリン化合物を含むことを特徴とする、前記組成物。
【請求項１５】
該テトラサイクリン化合物が該哺乳動物において抗菌活性をもたない、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
該テトラサイクリン化合物がメタロプロテイナーゼ阻害活性をもつ、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
該哺乳動物が内因的一酸化窒素生成の亢進を特徴とする症状を有する、請求項14記載の組成物。
【請求項１８】
該哺乳動物が一酸化窒素依存性糸球体炎症を有する、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
該哺乳動物が変形性関節症である、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
更にステロイド系又は非ステロイド系抗炎症剤の抗炎症量を含む、請求項14記載の組成物。
【請求項２１】
試験管内の哺乳動物細胞培養物又は哺乳動物生体外組織培養物又は哺乳動物器官における一酸化窒素生成を阻害するための組成物であって、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンを含む上記組成物。
【請求項２２】
過剰な内因的一酸化窒素生成を特徴とする症状をもつ哺乳動物の治療用医薬組成物であって、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンを含む上記組成物。
【請求項２３】
該症状が急性炎症症状である、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
該症状が慢性炎症症状である、請求項22記載の組成物。
【請求項２５】
該テトラサイクリン化合物が該哺乳動物において抗菌活性をもたない、請求項22記載の組成物。
【請求項２６】
該テトラサイクリン化合物がメタロプロテイナーゼ阻害活性をもつ、請求項22記載の組成物。
【請求項２７】
テトラサイクリン化合物を含む、炎症症状をもつ哺乳動物の治療用医薬組成物であって、前記哺乳動物が内因的一酸化窒素生成の亢進を特徴とする症状を有し、前記テトラサイクリン化合物が、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンである上記組成物。
【請求項２８】
哺乳動物が一酸化窒素依存性糸球体炎症を有する、請求項27記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、生物系において一酸化窒素の生成を減少させる方法に関する。更に詳細には、本発明は、哺乳動物における誘導一酸化窒素合成酵素の阻害に関する。
一酸化窒素(以後NO)は、様々な細胞によって産生されかつそれらに作用すると共に炎症や自己免疫仲介組織破壊に関与する最近認識された多機能伝達物質である。NOの生成は、一酸化窒素合成酵素(シンターゼ又はシンテターゼ、以後NOS)と呼ばれる偏在性酵素系によって触媒される。NOSは、L-アルギニン(一般アミノ酸)のL-シトルリンと一酸化窒素への混合機能酸化を触媒する哺乳動物において天然に発現した酵素である。該酵素は、L-アルギニンのグアニジノ窒素を取り除いて一酸化窒素を形成する。NOS酵素のイソ型が数種同定されており、一般的には２つのタイプ:構成NOS(以後cNOS)と誘導NOS(以後iNOS)に分けられる。NOS酵素のタイプと機能に関する詳細は、例えば、米国特許第5,478,946号及び同第5,468,630号にも見られ、それらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。ヒト誘導NOSを発現することができるcDNAクローンは米国特許第5,468,630号に記載された。
NOS酵素の産物の一酸化窒素は、その形成に関与するNOS酵素のイソ型に依存してシグナリング分子か又はエフェクター分子として機能することがわかってきた。構成型のNOSは少量のNOを生成し、グアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックグアノシン一リン酸(cGMP)の形成をもたらす。また、cGMPは内皮依存性血管弛緩及び神経伝達を含むいくつかの特定の機能を仲介する。対照的に、誘導一酸化窒素合成酵素(iNOS)と呼ばれる誘導イソ型の酵素によってNOが非常に多量に生成される。iNOSによって生成したNOは、マクロファージの細胞障害活性を仲介することがわかってきた。iNOSを生成する他の細胞としては、内皮細胞、好中球、クッパー細胞及び肝細胞、及びサイトカインで刺激されたマウス線維芽細胞が含まれる。NOは脳における化学メッセンジャーでもあり、別のNOSイソ型によってそこで生成されることもわかってきた。
いくつかの生理活性はNOによるものであった。ヒスタミンやブラジキニンのような血管作動性物質はNOの生成を刺激する。NOは、血流や血管透過性を亢進させる強力な血管弛緩物質である。インターロイキン-1(IL-1)は、膵島においてiNOSの発現を誘導する。NOは、島機能に対するIL-1の阻害作用の伝達物質であることがわかってきた。iNOSの他の誘導物質は細菌内毒素であり、NOが内毒素ショック又は敗血症ショックの伝達物質として含まれることが示される。酵素の他の誘導物質は、γインターフェロン、腫瘍壊死因子及び他の炎症サイトカインが含まれる(Collierら1989)。例えば、腫瘍壊死因子は、敗血症ショックと関連がある全身性低血圧に関係することがわかってきた。
NOSは様々な炎症組織において過剰発現され(増加した量、たいていは異常な量で発現される)、結果としてNOの合成と作用のモジュレーションが炎症症状や自己免疫症状を治療する新規な方法を示すことができたと想定される(Vaneら1994,Schmidtら1994)。Vaneと共同研究者らは、NOを動物モデルにおいて炎症の重要な伝達物質とした(Vaneら,1994)。試験した場合には自己免疫疾患(慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病)においてNO形成が亢進することがわかり、いくつかの古典的炎症症状(紅斑、血管の漏れ)はNOS阻害剤で逆転する(Schmidtら1994,Nathanら1994,Marletta 1994)。組織損傷の伝達物質としてNOの最も注目せずにはいられない証明は、その疾患の動物モデルにおいて行われた実験(McCartney-Francisら1993,Stefanovic-Racicら1994)及びヒト変形性関節症(OA)(Aminら1995a)と慢性関節リウマチ(RA)(Sakuraiら1995)の実験を含む関節炎の研究で判明した。
ヒトOA罹患軟骨は生体外条件下で軟骨損傷を十分引き起こすだけの量でNOを自発的に放出させ得ることが最近見出された(Aminら1995a)。“変形性関節症罹患NOS”(OA-NOS)と呼ばれる誘導NOSは、OA罹患軟骨では過剰発現されるが正常な軟骨では検出されない。誘導OA-NOSは、神経NOS(分子量とα-NOS抗体中の抗体交差反応性に基づく)と133kD iNOS(IL-1β+TNFα+LPSでアップレギュレーションしたNF-κBとシクロヘキサイミドに感受性がある)と同様の性質がある。NOは、プロテオグリカンやコラーゲンII型の合成の阻害(Taskiranら1994,Caoら1996)及びメタロプロテイナーゼ活性のアップレギュレーション(Murrellら1995)を含む、マトリックス分解を増強することが既知である。
一酸化窒素合成酵素の阻害剤がいくつか同定された。それらの阻害剤のほとんどはL-アルギニン、NOS酵素の天然基質の誘導体である。例えば、NG-メチル-L-アルギニンやL-Nω-ニトロアルギニンはNO合成の競合阻害剤である。米国特許第5,358,969号には、急性又は慢性炎症疾患におけるNO形成阻害が記載されている。その方法は、メチル-、1,1-ジメチル-、又はアミノ-置換グアニジン化合物のNO阻害量を哺乳動物に投与することが含まれている。米国特許第5,246,970号及び同第5,246,971号も参照されたい。
米国特許第5,216,025号には、ある低血圧患者において昇圧剤を増強するNO阻害剤としての使用が記載されている。その阻害剤としては、アルギニンのグアニジノアミノ基上の水素を別の種類の原子又は分子で置換するNG-置換アルギニンが含まれている。
米国特許第5,478,946号には、一酸化窒素合成酵素を調節して間接的にcGMPレベルを調節すると言われる不飽和グアニジノ化合物が開示されている。その化合物は、不飽和グアニジノ骨格の種々の部位にC6-C12アリール基を含む種々の置換基が含まれている。
米国特許第5,480,999号には、構造ABの化合物が開示されており、Aは利用できる酸機能を有するシクロオキシゲナーゼ阻害剤であり、Bはアルギニン類縁体である。該化合物は、同じ構造内にシクロオキシゲナーゼ阻害活性とNOS阻害活性が混合していると言われている。
一酸化窒素の生成は他の方法でも阻害される。例えば、NOの生成はテトラヒドロビオプテリンのようなiNOSの補因子の活性を妨害する化合物によって阻害される。また、NOの正味の生成は一酸化窒素スカベンジャーによって減少する。これらの種類の方法に適すると言われる化合物は、例えば、米国特許第5,449,688号に開示されており、その明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。テトラヒドロビオプテリン合成阻害剤としては、例えば、2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジンが挙げられている。NOスカベンジャーとしては、例えば、ヘモグロビン及びジエチルジチオカルバメート(DETC)が挙げられている。
テトラサイクリンとその多くの化学誘導体は特に成功した種類の抗生物質をなしている。テトラサイクリンそのもの及びスポロサイクリン等を含むある種のテトラサイクリン化合物は、種々の細菌に対して効用がある広範囲スペクトル抗生物質である。親化合物のテトラサイクリンは次の一般構造を有する。
0004451930.tif 000002
多環の番号体系は次の通りである。
0004451930.tif 000003
テトラサイクリン、及び5-OH(テラマイシン)及び7-Cl(オーレオマイシン)誘導体は天然に存在し、全て周知の抗生物質である。天然のテトラサイクリンは抗生物質特性を失わずに修飾されるが、構造のある種の要素はそうするように保持されなければならない。テトラサイクリン基本構造に行われれる修飾及び行われない修飾はMitscher(1978)によって調べられた。Mitscherによれば、テトラサイクリン環系の5〜9位の修飾は抗生物質特性の完全な消失を引き起こさずに行われる。
しかしながら、環系の基本構造の変化、又は1〜4位又は10〜12位の置換基の置換は、一般的には、抗生物質活性がかなり低い又は実質的にない合成テトラサイクリンを生じる。例えば、4-デジメチルアミノテトラサイクリンは、一般的には、非抗菌テトラサイクリンであると考えられる。
最近、速やかに吸収され半減期が長いテトラサイクリンが抗菌活性と独立して生物学的効果を示すことが確立された(Golubら1991,Golubら1992,Uittoら1994)。かかる効果としては、コラゲナーゼ(MMP-1)、ゲラチナーゼ(MMP-2)及びストロメリシン(MMP-3)を含むマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害、及び病原性組織破壊の予防が含まれる(Golubら1991)。慢性関節リウマチ(RA)のような炎症関節炎においては、そのマトリックスメタロプロテイナーゼはリウマチ様滑膜のホモジェネートや培養物において同定され、炎症滑液において検出され、増殖パンヌスや滑膜において免疫学的に及び原位置ハイブリッド形成によって局在化された(Brinckerhoff 1991)。そのメタロプロテイナーゼは、OA罹患関節においてアップレギュレーションされることが既知である(Greenwald 1994,Mohtaiら1993)。おもしろいことに、Yuら(1992)によりドキシサイクリンを予防的に投与するとイヌモデルにおいては重篤なOAが顕著に減退したことが示された。関節炎の治療においてミノサイクリン(半合成テトラサイクリン)の安全性と効能を評価するために、二重盲検のランダム化した多中心の試験から薬剤が安全でありかつ軽度及び中程度関節炎に罹った患者に有効であることが示された(Tilleyら1995)。更に、テトラサイクリンやメタロプロテイナーゼの阻害剤は、腫瘍の進行(DeClerckら1994)、骨吸収(Rifkinら1994)及び血管形成(Maragoudakisら1994)を抑え、抗炎症性を有する(Ramamurthyら1994)ことが最近の研究により示された。
しかしながら、一般的には感染症の治療に有効であるテトラサイクリン抗生物質の使用は望ましくない副作用をまねくことがある。例えば、抗生物質のテトラサイクリンを長期投与すると腸内菌相のような健康な菌相を減少又は消失させることがあり、抗生物質耐性微生物の産生又は酵母や真菌の発育過度をまねくことがある。従って、抗コラーゲン分解活性が示される用途での使用に抗菌活性を減弱又は欠除する化学的に修飾したテトラサイクリンが好ましい。
上記の観点から、一酸化窒素の生成を阻害するという現在の方法を過度の一酸化窒素レベルと関連のある臨床結果において迅速かつ選択的な低下を行うために特異的でかつ効率のよい化合物が用いられる新規な方法で補足することが求められていることは明らかである。
従って、本発明の目的の１つは、新規な種類の一酸化窒素阻害剤を与えることにより一酸化窒素生成の阻害剤の同定と使用において上記の制限を克服することである。新規な阻害剤は、特異的でかつ相対的に高活性でNOの生成を阻害すると思われる。更に、その種類の阻害剤は他の目的に対してヒトにおいて使用が既に承認されたという利点があり、臨床使用での採用が早いことがかなり見込まれることを意味する。他の利点や目的も医師に出てきやすい。
発明の要約
そこで、これらの及び他の目的がテトラサイクリン化合物を指定された結果を得るのに効果的である量で生物系に与えることにより該系における一酸化窒素の生成又は一酸化窒素合成酵素の発現又は活性を阻害する方法を提供する本発明によって達成されることを発見した。
好ましくは、本方法は、該系に与えられるレベルではほとんど抗菌活性がないテトラサイクリン化合物を用いる。更に好ましくは、該テトラサイクリン化合物はメタロプロテイナーゼ阻害活性を有する。非常に好ましいテトラサイクリン化合物としては、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン又はミノサイクリンが含まれる。
実施態様においては、本方法は、一酸化窒素の生成量の減少を十分引き起こすだけの量のテトラサイクリン化合物を生物系に与えることが含まれる。
好ましくは、生物系は、組織内で一酸化窒素生成の亢進を特徴とする症状をもつ哺乳動物である。本方法は、組織内で異常に高いレベルの誘導一酸化窒素合成酵素活性を特徴とする症状をもつ哺乳動物である。本発明の方法によって治療可能な症状としては、例えば、一酸化窒素依存性糸球体炎症及び変形性関節症のような炎症疾患が挙げられる。
本方法は、更に、ステロイド系又は非ステロイド系抗炎症剤の抗炎症量を生物系に与えることが含まれる。
本方法は、生物系が試験管内細胞系又は生体外組織又は器官系であり、一酸化窒素生成の測定量が誘導一酸化窒素合成酵素の発現又は活性を示す場合に用いられる。
他の実施態様においては、本発明は、炎症症状をもつ哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物において一酸化窒素生成を十分阻害するだけの量のテトラサイクリン化合物を該哺乳動物に投与することを特徴とする、前記方法である。炎症症状は、急性炎症症状或いは慢性炎症症状であってもよい。
他の実施態様においては、本発明は、生物系において誘導一酸化窒素合成酵素の発現又は活性を阻害する方法であって、誘導一酸化窒素合成酵素発現又は活性を十分阻害するだけの量のテトラサイクリン化合物を該生物系に投与することを特徴とする、前記方法である。
従って、本発明は、生体内、試験管内、及び生体外生物系において一酸化窒素の生成を阻害する新規な方法を提供する。新規な臨床治療プロトコールは、新規な本方法を用いて、特に誘導一酸化窒素合成酵素の発現を妨害することにより一酸化窒素の生成(及び結果としての病状)を減少又は消失させることが可能である。NO生成の亢進又はiNOSの過剰発現を特徴とする種々の疾患及び症状が本明細書に記載されるテトラサイクリン化合物を投与することにより治療される。NO生成の量又はiNOS発現又は活性の量を示すことができる新規な分析法も提供される。
本発明のこれらの及び他の利点は、本明細書に示される詳細な説明及び実施例から理解されるであろう。詳細な説明及び実施例は、本発明の理解を高めるが本発明の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
本発明の好適実施態様は、例示と説明のために選ばれたが、決して本発明の範囲を制限するものではない。本発明のある態様の好適実施態様を添付の図面に示す。
図1A〜図1Cは、ドキシサイクリンとミノサイクリンによる関節軟骨器官培養内での一酸化窒素生成の用量依存性阻害を示す経時グラフである。
図2A〜図2Bは、ドキシサイクリンとミノサイクリンによる細胞培養内でのマウスマクロファージ(RAW264.7細胞)の一酸化窒素生成の用量依存性阻害を示す経時グラフである。
図3は、iNOSを生成するために刺激した(LPSで)マウスマクロファージ細胞によるL-[3H]-アルギニンのL-[3H]-シトルリンへの変換の用量依存性減少を示す薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートの走査像である。
図4は、ドキシサイクリンとミノサイクリンの試験管内LPS刺激マウスマクロファージにおけるiNOSの比活性に対する効果が最少であることを示すヒストグラムである。
図5は、試験管内のLPS刺激マウスマクロファージによるiNOS発現に対するドキシサイクリンとミノサイクリンによる用量依存性阻害を示すウェスタンブロットのデンシトメトリー走査である。
図6A及び図6Bは、ドキシサイクリン(図６A)とミノサイクリン(図6B)によるLPS刺激マクロファージにおけるiNOS mRNA合成の特異的で用量依存性の阻害を示すRT-PCRで作製したmRNAの電気泳動分離像である。
図6C及び図6Dは、ドキシサイクリン(図６C)とミノサイクリン(図6D)によるLPS刺激マクロファージにおけるiNOS mRNA合成の特異的で用量依存性の阻害を示すノーザンブロットのホスホイメージャー走査である。
好適実施態様の詳細な説明
本発明は、試験管内、生体内及び生体外生物系において一酸化窒素(NO)を阻害する方法に関する。本方法は、分析系、例えば、細胞におけるNOの生成又はiNOSの発現又は活性を分析する分析系において使用するために適応される。好ましくは、本方法は、哺乳動物のような生きている動物においてNO生成を阻害するために用いられる。特に、本方法は、炎症疾患や他の症状において増加した又は過度のNO生成と関連がある又はそれによって仲介された病状や他の結果に対して哺乳動物を防御する手段を提供する。本方法は、一酸化窒素生成及び/又は誘導一酸化窒素合成酵素の発現又は活性の阻害剤としてのテトラサイクリン化合物の使用が含まれる。
本発明は、テトラサイクリン化合物が誘導一酸化窒素合成酵素によって仲介された一酸化窒素の生成を阻害するという出願人による予期しない所見に基づいて開発された。テトラサイクリン化合物がコラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害することは既知である。しかしながら、誘導一酸化窒素合成酵素はメタロプロテイナーゼではなく、依然としてiNOS活性とコラゲナーゼ活性間の関係が確認されている。出願人は、テトラサイクリンがiNOSを発現することができる系において一酸化窒素の生成を阻害することを予想する生理的又は生化学的根拠を知らない。従って、抗メタロプロテイナーゼ活性を有するテトラサイクリンが顕著なNO生成阻害活性を有することが見出されたことは驚くべきことである。更に驚くべきことは、コラゲナーゼの阻害剤としてのテトラサイクリン化合物の相対効力がNO生成の阻害剤としての相対効力と同様のヒエラルキーによって反映されることがわかってきたことである。出願人は、この予期しない一致を説明する理論的根拠を知らないが一酸化窒素生成の上昇と関連がある又はそれを特徴とすると思われる様々な疾患に対してかなり治療上の関係をもつと共に治療過程を予想することを援助すると思われる。
本発明は、試験管内、生体外又は生体内生物系を用いて行われる。本明細書に用いられる“生物系”という用語は、本方法が行われる試験管内、生体内及び生体外系を含む系の種類を意味する。例えば、本方法は、生きている哺乳動物(生体内)、及び培養細胞系(試験管内)及び培養器官系(生体外)で用いられる。本発明の生体内実施は、医学的又は獣医学的疾患、症状又は症候群の軽減又は好転での適用を可能にする。他の使用は、実験用又は臨床用の実験室において用いられる分析系が含まれる。
本発明によって治療可能な医学的又は獣医学的症状は哺乳動物において生じる。哺乳動物としては例えば、ヒト、及びイヌやネコのようなペット動物、ラットやマウスのような実験動物、及びウマやウシのような農場動物が含まれる。
本発明は、白血球(例えば、好中球やマクロファージ)や他の細胞のような細胞によって誘導一酸化窒素合成酵素による一酸化窒素の生成につながる広範囲スペクトルの疾患の予防又は治療に関する。特に、本発明の方法は、NO生成が正常な増加又は異常な増加の双方を含む系において通常のレベルをかなり超えて亢進する症状を減弱又は阻害するのに有効である。
本発明を、炎症疾患の治療ついて、詳しくは糸球体腎炎と変形性関節症について特に説明する。これらの例示的治療においては、最新式の試験管内及び生体外標準モデルを用いた。例えば、ラットメサンギウム細胞をγインターフェロン(γIFN)で処理することによりNO生成が誘導されるモデルを用いた。また、OA罹患軟骨又はリポ多糖刺激マウスマクロファージでのようにNO生成が亢進する他のモデルを用いた。これらの方法は、生体内治療法で効能があると予想される物質を同定するために用いられる。しかしながら、本発明の方法はNO生成又はiNOS発現又は活性が役割を果たす他の様々な疾患を除いて腎炎や変形性関節症の治療に限定されないことは理解される。
例えば、NOは、例えば、マラリア、老化、糖尿病及び卒中、及びアルツハイマー病やハンチントン病のような神経変性疾患を含む様々な医学的症状に関係することがわかってきた。NOは、好中球が心筋を攻撃することが判明した梗塞後の再灌流付随損傷を含む心臓病に関係することもわかってきた。更に、膵島におけるNO合成の誘導は若年性糖尿病の罹患の原因である。これらの症状の多くがサイトカイン発現の変化を特徴とするので、おそらくは誘導NOSの異常に高い発現又は活性が付随した病状の主因である。本発明は、これらの疾患をいずれも治療するために用いられる。
本発明によって治療される主要な疾患は炎症を特徴とする疾患である。炎症は、一般的には、２つの広いカテゴリーの症状:急性炎症と慢性炎症に大まかに分けられると認識されている。急性炎症は一般的には相対的に短期間であり、約数分から約1〜2日間続く。主な特徴は、血流の増加、液体及び血漿タンパク質の滲出(浮腫)及び白血球、主に好中球の遊走である。慢性炎症は、長期間、例えば、数日〜数週間以上であり、組織学的にリンパ球とマクロファージの存在及び血管と結合組織の増殖を伴う。例えば、Cotranら(1989),Chandrasoma & Taylor(1991)を参照されたい。
炎症は、熱、発赤、腫脹、疼痛及び機能喪失によって現れる。炎症の原因は多く、微生物感染症(例えば、細菌感染症及び真菌感染症)、物理的物質(例えば、火傷、放射線及び外傷)、化学物質(例えば、毒素及び苛性物質)、組織壊死及び種々の免疫反応のような要因が含まれる。NOは、そのような傷害に対する免疫応答や炎症応答で生じる多くの反応生成物の１つであると考えられる。特に、慢性炎症に共通の高レベルのNO生成は、そのような症状によく見られる非特異的組織破壊のおそらく一因である。
本発明によって治療できる炎症症状は、例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、急性及び慢性感染症(ジフテリアや百日咳を含む細菌や真菌);風邪を含む、急性及び慢性気管支炎、副鼻腔炎、及び上気道感染症;急性及び慢性胃腸炎及び大腸炎;急性及び慢性膀胱炎及び尿道炎;急性及び慢性皮膚炎;急性及び慢性結膜炎;急性及び慢性漿膜炎(心膜炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎及び腱炎);尿毒性心膜炎;急性及び慢性胆嚢炎;急性及び慢性膣炎;急性及び慢性葡萄膜炎;薬剤反応;昆虫刺傷;火傷(熱、薬品及び電気);及び日焼けが挙げられる。
従って、本発明の方法は、かかるNO関連症状を予防、阻害、又は改善するために用いられる。本発明の方法は、誘導NOSの過剰発現が関係する症状を予防、阻害、又は改善するために用いられる。
本方法は、生物系において一酸化窒素の生成を低下させるのに有効な量でテトラサイクリン化合物を供給又は投与することを含む。阻害は、誘導一酸化窒素合成酵素の発現又は活性のダウンレギュレーションの結果として生じる。例えば、ドキシサイクリン(及び他のテトラサイクリン化合物)が細胞培養内でiNOSの転写を阻害するらしいことがわかった。そのような酵素の発現低下は、典型的には、組織内のNO生成低下をもたらす。
本発明に従って用いられるテトラサイクリン化合物の量は、iNOS発現又は活性を効果的に阻害する量である。テトラサイクリン化合物の量は、iNOS発現又は活性を著しく低下させる場合又はNO生成を低下させる場合にはiNOSを効果的に阻害する量である。
好ましくは、テトラサイクリン化合物は抗菌活性がほとんど或いは全くない量で与えられる。テトラサイクリン化合物は、微生物の増殖をほとんど妨げない場合にはほとんど抗菌性ではない。従って、本方法は、抗菌性を低下又は除去するために化学的に修飾したテトラサイクリン化合物を用いることが有利である。かかる化学修飾したテトラサイクリンの使用は、有益な微生物の無差別の死滅、及びかかる化合物の抗菌量の使用によく伴う耐性のある微生物の出現のようなある種の欠点を避けつつ抗菌テトラサイクリンより高いレベルで用いられるので本発明に好ましい。
本発明は、抗菌活性を有するテトラサイクリン化合物を用いることもできる。しかしながら、かかる化合物は、好ましくは抗菌作用がほとんどなく組織内に含まれるiNOS活性を阻害するのに効果的である量で用いられる。このタイプの好ましい化合物としては、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン及びミノサイクリンが含まれる。
本発明の方法に有効なテトラサイクリン化合物は、用量依存方式で有益な効果を示すことがわかってきた。従って、幅広い範囲内で、多量のテトラサイクリン化合物を投与すると少量の投与より大きな程度までiNOS活性を阻害することが認められた。更に、毒性が見られるレベルより少ない用量で効能が認められた。
患者に対する最大用量は、望ましくない又は過度の副作用を引き起こさない最大用量である。例えば、テトラサイクリン化合物は、約0.1〜約30mg/kg/日、好ましくは約1〜約18mg/kg/日の量で投与される。本発明のための副作用としては、臨床上有意な抗菌活性、及び毒性作用が含まれる。例えば、約50mg/kg/日の過度の用量はヒトを含むほとんどの哺乳動物に副作用を生じると思われる。いずれにしても、医師はその分野での熟練と知識によって導かれ、本発明は記載した現象を得るために効果的な投薬が制限されずに含まれる。
好ましい化学修飾したテトラサイクリンは、環構造の4位にジメチルアミノ基のないものである。そのような化学修飾したテトラサイクリンとしては、例えば、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、4-デジメチルアミノ-5-オキシテトラサイクリン、4-デジメチルアミノ-7-クロロテトラサイクリン(CMT-4)、4-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-6)、5a,6-アンヒドロ-4-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、4-デジメチルアミノ-12a-デオキシテトラサイクリン(CMT-7)及び6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)が挙げられる。また、ニトリルを生成するために2炭素位で修飾したテトラサイクリン、例えば、テトラシクリノニトリルは、非抗菌性抗iNOS剤として有用である。
更に、低抗菌活性用に修飾したテトラサイクリンの例としては、6-α-ベンジルチオメチレンテトラサイクリン、テトラサイクリンのモノ-N-アルキル化アミド、6-フルオロ-6-デメチルテトラサイクリン又は11α-クロロテトラサイクリンが挙げられる。
本発明の使用に適した特に好ましいテトラサイクリン化合物としては、6-デメチル-6-デオキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-3)、6-α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-8)、4-デジメチルアミノテトラサイクリン(CMT-1)、ドキシサイクリン及びミノサイクリンが挙げられる。
ある場合には、限定した生物分布のみを有するテトラサイクリン化合物が活性の局在化に好ましい。そのような実質的に局所分布を示すCMT-2、CMT-6及び他のCMTは、広範囲の全身系阻害を示さずに損傷部位のiNOS活性を示す点で局在化した効能に好ましい。例えば、これらの非吸収性CMTの局所適用は、CMTを飲み込んだ場合でさえかなりの程度まで吸収されないので口の病変に望ましい。
従って、賦形剤中約25％(w/w)までの量のテトラサイクリン化合物の局所適用が徴候によっては適する。更に好ましくは約0.1〜約10％の量のテトラサイクリン化合物の適用が本発明のiNOSを効果的に阻害すると考えられる。これらの量は治療される患者においてほとんど毒性を誘発しないと思われる。
テトラサイクリン化合物の併用又はコーディネートした局所及び全身系投与が本発明によって企図される。例えば、CMT-2又はCMT-6のような非吸収性テトラサイクリン化合物は局所投与され、CMT-1、CMT-3、CMT-7又はCMT-8のような患者においてかなりの吸収と効果的な体組織分布が可能なテトラサイクリン化合物は全身系に投与される。
テトラサイクリン化合物は、組織において炎症を阻害することができる補助剤と共に投与される。同時投与が可能な好ましい抗炎症剤としては、ステロイド系、好ましくは非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)が含まれる。適切なNSAIDがそのような化合物の様々な種類より選ばれる。そのような種類としては、例えば、アセチルサリチル酸及びジフルニサルのようなサリチル酸塩;インドメタシン、スリンダック、トルメチン、ジクロフェナック及びエトドラックのような酢酸;フルルビプロフェン、ナプロキセン及びケトプロフェンのようなプロピオン酸;及びメクロフェナメートのようなフェナメート;及びピロキシカムのようなオキシカムが挙げられる。一般的には、NSAIDの量は罹患組織内の炎症を十分阻害するだけの量である。抗炎症量は、用いられるNSAID及び他のわかっている要因に依存し、医師によって容易に求められる。
本発明の方法において使用するための好ましい医薬組成物は、当業者がわかっている適切な医薬担体(使薬)又は賦形剤中テトラサイクリン化合物の組合わせが含まれる。非経口投与(例えば、静脈内注射)はテトラサイクリンの好ましい送達経路であり、テトラサイクリン化合物を適切な希釈剤、担体等と共に含む組成物が容易に処方される。経腸使用も企図され、錠剤のような製剤が化合物を供給するために用いられる。また、テトラサイクリン化合物の送達は局所適用が含まれる。従って、担体は局所使用に適することが好ましい。そのような局所使用に適すると思われる組成物は、ゲル剤、軟膏剤(salves)、ローション剤、化粧クリーム剤(ointments)等として含まれる。テトラサイクリン化合物の非抗菌量は、支持基剤又はマトリックス等と混合されて皮膚に直接適用される予めパッケージされた外科用又は火傷の手当て用品又は包帯を与える。
下記の実施例は、本発明を更に理解することを援助するために示される。用いられる具体的な材料及び条件は、本発明を具体的に説明するためのものであり、その適切な範囲に限定しない。
実施例1
腎メサンギウム細胞を50U/mlγインターフェロン(IFN-γ)と10μg/ml細菌リポ多糖(LPS)を含む培養液中で培養した。試験培養液は、(a)添加剤なし;(b)CMT-5、認知できる抗コラゲナーゼ活性のないテトラサイクリン誘導体;(c)CMT-1、適度な抗コラゲナーゼ活性を有するテトラサイクリン誘導体;又は(d)CMT-3とCMT-8、高レベルの抗コラゲナーゼ活性を有する誘導体を含有した。CMT添加剤は、1、2.5、5及び10μg/mlの濃度で含めた。NO生成はグリース反応で分析し、iNOS含量はウェスタン分析で測定した。
腎メサンギウム細胞をCMT-3及びCMT-8に曝すことにより24〜72時間からNO生成の時間依存性阻害が得られた。48時間で薬剤濃度5μg/ml(P<0.O1)の効果が最大(>80％)であった。細胞をCMT-1とインキュベートすると高薬剤濃度(10μg/ml)にもかかわらず48時間後に顕著でないNO生成阻害を生じた(〜60％の対照)。NO生成の変化は、5μg/mlで48時間テトラサイクリン化合物に曝した後にウェスタン分析により測定した細胞のiNOS含量の変化により対応させた。しかしながら、CMT-5はNO生成又はiNOS発現に対して識別できる効果がなかった。
腎損傷を誘発するためのIFN-γの使用は、当該技術において既知の糸球体腎炎のモデルである。糸球体腎炎はNOの生成亢進を特徴とする。従って、当業者は、NO生成の阻害方法を示すこのモデルの能力を評価する。上記に示した結果からある種の化学修飾テトラサイクリン化合物、即ち、高コラーゲン分解活性を有するものが腎メサンギウム細胞においてNO生成を阻害することができることがわかる。更に詳しくは、これらの化合物はその細胞においてiNOSタンパク質を阻害するのに有効である。従って、最少でのこれらの薬剤はNO依存性糸球体炎の治療に有効である。しかしながら、更に一般的には、糸球体腎炎におけるこれらの化合物の効用は異常なNO生成を特徴とする他の生物系及び他の病態におけるこれらの化合物のNO生成阻害活性を意味する。
実施例2〜6
生体外条件の変形性関節症罹患ヒト軟骨からの一酸化窒素の自発的放出及びリポ多糖刺激マウスマクロファージにおけるiNOS活性についてテトラサイクリン化合物の作用を評価した。これらの酵素のイソ型は共に試験管内ヒドロコルチゾンとTGF-βによる薬理的介入に対する異なる感受性を示した(Aminら1995a)。下記の実施例2〜6に記載されるように、ここで(a)ドキシサイクリンとミノサイクリンは共にiNOS(ミノサイクリン≧ドキシサイクリン)と誘導OA-NOS(ドキシサイクリン＞ミノサイクリン)の活性を阻害する;(b)ドキシサイクリンとミノサイクリンはiNOS mRNAとタンパク質発現のレベルのiNOS発現を阻害してその比活性をダウンレギュレーションする;(c)iNOSのアセチル化剤又は競合阻害剤(即ち、L-アルギニンの類縁体)と異なり、ドキシサイクリンとミノサイクリンはL-アルギニン→L-シトルリン変換分析において試験管内iNOSの触媒活性を直接阻害しないことがわかった。
実施例2
ヒトOA罹患軟骨における誘導OA-NOS発現に対するテトラサイクリンの影響
テトラサイクリン、例えば、ドキシサイクリン又はミノサイクリンが生体外条件下でヒトOA-NOS活性を遮断するかを調べた。本実験については以前のレポートに基づいて一般に認められた薬理的に適切な濃度を使用した(Greenwald 1994,Yuら,1991,Coleら,1994,Mallyaら,1994)。OA罹患軟骨を、膝置換術を受ける手術前の少なくとも2週間ステロイド系/非ステロイド系抗炎症剤のない状態の進行性OAに罹った患者から入手した。OA罹患軟骨片(図1A〜図1C)を0.1％BSA/内毒素を含まない培養液中で5〜80μg/mlのドキシサイクリン又はミノサイクリン(Sigma Chemical社、ミズーリ州セントルイス)と共に生体外条件下で24、48及び78時間インキュベートした。
器官培養内OA-iNOSの分析を基本的には以前に記載されたように行った(Aminら1995a)。概要としては、OA罹患軟骨を5〜80μg/mlのドキシサイクリンとミノサイクリンの存在又は不在(対照)下にインキュベーター(37℃)内で24〜72時間培養した。ELISAリーダーを用いて、変更したグリース反応(Gilliamら1993)による培養液中の安定な最終生成物の量、亜硝酸塩を測ることによりNOSの活性を異なる時間にモニターした。0、24、48及び72時間に自発的に放出したNO量(亜硝酸塩の蓄積により測定した)は、各々0、4.8±0.38、16.4±0.7及び17.8±0.9μMであった。データを放出した亜硝酸塩μM±(SD)、n=3-4として示す。対になっていないスチューデントのt検定を用いて統計を導いた。図1A〜図1Cは、異なる患者からの試料による3回の同じ実験のうちの1回を示すデータをまとめた経時グラフ(1A=24時間;1B=48時間;1C=72時間)である。
図1A〜1Cに示された結果からドキシサイクリンとミノサイクリンが各々用量依存方式でOA罹患軟骨のNO生成を顕著に阻害したことが示される。これらのデータからドキシサイクリンはOA-NOS活性を阻害する能力がより強力であることが示される。例えば、72時間でのドキシサイクリンのIC50はミノサイクリンの54μg/mlに比べて32μg/mlであった。これらの実験からドキシサイクリンとミノサイクリンは生体外OA-NOSによる進行中のNO生成を遮断しただけでなく対照培養内で亜硝酸塩が蓄積し続ける条件下で少なくとも72時間軟骨器官培養内で亜硝酸塩蓄積の低下を引き起こしたことが示される。我々の実験においてNO生成を阻害したドキシサイクリンの濃度は、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害に必要とされるものに匹敵する(Greenwald 1994,Yuら1991,Coleら1994,Mallyaら1994)。マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は、軟骨分解に対して著明な効果がある(Coleら1994,Mitchellら1994)。コラゲナーゼやゲラチナーゼのようなタンパク質分解酵素の活性を阻害することによる軟骨分解を妨害する20〜50μg/mlドキシサイクリンの効果は、プロテオグリカンロスを遮断し、プロテオグリカンロスに伴う細胞死を減少させることである(Coleら1994)。
実施例3
マウスマクロファージにおけるiNOSに対するテトラサイクリンの影響
我々の最近の実験からヒト誘導OA-NOSがサイズ、免疫反応性、及びTGF-β及びヒドロコルチゾンに対する感受性に基づいてマウスやヒトのiNOSと異なることが示された(Aminら1995a)。従って、刺激したマウスマクロファージにおけるiNOSによるNO生成に対するテトラサイクリンの影響を評価した。
RAW264.7マウスマクロファージ細胞(アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、メリーランド州ロックビル)をドキシサイクリン又はミノサイクリン（5〜80μg/ml)と共に又は含めずに1〜2時間インキュベートし、続いて100ng/mlのLPS(Sigma Chemical社、ミズーリ州セントルイス)を添加することにより活性化してiNOSを誘導した(Stuehrら1991)。14〜20時間インキュベートした後、培養液を用いて、変更したグリース反応により亜硝酸塩の蓄積を評価した(Gilliamら1993)。データを図2A〜図2Bに示す。数値を一定の時間に蓄積した亜硝酸塩のμMとして表す;n=3。対になっていないスチューデントのt検定を用いて統計を導いた。データは3回の同じ実験のうちの1回を示した。
図2A〜2Bは、14時間(図2A)と20時間(図2B)のインキュベーションで5〜80μg/mlのドキシサイクリンの存在下にLPSで刺激した細胞における亜硝酸塩蓄積の濃度依存性阻害を示すグラフである。本実験のドキシサイクリンのIC50は、これらの細胞において14時間のインキュベーションで72μg/ml及び20時間のインキュベーションで22μg/mlであった。同じ組の実験においては、ミノサイクリンを5〜80μg/mlの範囲の濃度で投与した。RAW264.7細胞における14時間のインキュベーションで17μg/ml及び20時間のインキュベーションで12μg/mlであった。20時間のインキュベーションではキシサイクリンとミノサイクリンの効力に有意な差は見られなかった(IC50に基づく)が、いずれの時間においてもNOのiNOS仲介生成を>50％だけ阻害するためにドキシサイクリンはミノサイクリンに比べてかなり高い濃度が必要であった。
上記実施例2及び3から、ドキシサイクリンとミノサイクリンは共にLPSで刺激したOA罹患関節軟骨及びマウスマクロファージ共にNO生成を阻害することが示される。更に、これらの実験からiNOSと誘導OA-NOSは、TGF-βとヒドロコルチゾンに対するこれらの酵素の既知の感受性のほかにドキシサイクリン、ミノサイクリンに対して異なる感受性をもつことが示される(Aminら1995a)。この所見から、2種類の異なる細胞(即ち、好中球と線維芽細胞)において2種類のコラゲナーゼの形、MMP-8(IC507〜15μg/ml)とMMP-1(IC50140μg/ml)がテトラサイクリンに対して異なる感受性を示すことに留意することは興味深いことである(Suomalainenら1992)。更に、2つの密接に関連した細胞系で発現した同じ酵素がテトラサイクリンに対して微分感受性をもつことも留意されなければならない。例えば、2つの骨芽細胞系、UMR 106-01(IC50>200μg/ml)とROS 17/2.8(IC50=20〜30μg/ml)においてはゲラチナーゼ活性を評価した場合にドキシサイクリンに対して微分感受性を示した(Vemilloら1993)。軟骨スライスとマクロファージ細胞におけるNOS活性に関してテトラサイクリンの微分IC50に寄与する他の要因は、軟骨を浸透しかつ軟骨細胞に作用するその薬剤の性質によるものである(Gilmanら1993)。
実施例4〜6
上記実施例2と3に基づいてマウスマクロファージモデルにおけるNOS発現についてテトラサイクリンの作用メカニズムを解明することが求められた。このモデルは、(a)iNOSの生化学、酵素学及び分子生物学がこれらの細胞において十分に確認される(Nathanら1994,Stuehrら1991,Salveminiら1993,Xieら1994);(b)ドキシサイクリンとミノサイクリンに対するiNOSの微分感受性が2つの密接に関係した化合物の作用に観点を与える;及び(c)数回試みた後、軟骨の構築を妨げずにOA罹患軟骨から直接OA-NOSの発現を正確に及び再現性をもって定量することができないことは軟骨細胞機能に重要な役割を果たしているので用いた。
RAW264.7誘導細胞を用いて次の仮説を調べた。テトラサイクリンは、(i)iNOSタンパク質の発現に影響せずにiNOSの触媒活性のみ低下させる;(ii)iNOSの触媒活性とiNOSタンパク質の発現の双方が低下し、培養液中で亜硝酸塩の蓄積が累積的に低下するようになる;又は(iii)iNOSタンパク質の発現を低下させるので酵素の比活性を低下させ、続いて亜硝酸塩の生成を低下させる。
これらの代替的仮説を試験するために、(i)無細胞抽出液中のiNOSの触媒活性、(ii)酵素の比活性、(iii)タンパク質レベルでのiNOSの合成、及び(iv)iNOS mRNAの蓄積についてドキシサイクリンとミノサイクリンの作用を調べた。これらの実験を下記実施例4〜6で述べる。
実施例4A
iNOSの触媒活性に対するテトラサイクリンの影響
マウスマクロファージ細胞(RAW264.7)を20〜80μg/mlドキシサイクリン又はミノサイクリン、10μMヒドロコルチゾン(Sigma Chemical社、ミズーリ州セントルイス又は75μM L-NMMAと1〜2時間インキュベートし、続いて100mg/mlのLPSを添加し、16〜18時間インキュベートした。無細胞抽出液を各時間の終わりに調製した。Aminら(1995b)とVyasら(1996)に記載されたようにL-[3H]-アルギニン→L-[3H]-シトルリンの変換をモニターすることにより無細胞抽出液中のiNOSの比活性を求めた。
無細胞抽出液を次のように調製した。LPSとインキュベートすることにより誘導した後、細胞を4℃で沈降させ、各10μg/mlのキモスタチン、アンチペイン、ロイペプチン及びペプスタチン、1mM DTT及び1mM PMSFを含むトリスバッファー(10mM、pH7.4)に懸濁した。3サイクルの急速凍結-解凍後、細胞をポリトロンPT1200ホモジェナイザー(Kinematica AG,スイス)で溶解した。ライゼートを16,000rpm、4℃で60分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液として用いた。
抽出液中のタンパク質を、標準としてBSAを用いてBCA分析試薬により測定した(Smithら1985)。iNOS分析用反応混合液は、トリス50mM(pH7.8);BSA 1mg/ml;DTT 1mM;CaCl22mM;FAD 10μM;BH410μM;L-アルギニン30μM;NADPH 1mMからなる。反応混合液に1μl(250nM)のL-[3H]-アルギニン(Dupont NEN、マサチューセッツ州ボストン)(1mCi/ml=37.0MBq/ml)をスパイクした。20分後、反応混合液を90℃で5分間加熱することにより分析を停止した。10マイクロリットル(=100,000cpm)の上清を活性化AVICEL TLCプレート(Analtech、デアウェア州ニューアーク)にスポットした。TLCプレートをエタノール:水:アンモニア(80:16:4)からなる溶媒系で展開した。L-[3H]-シトルリンのスポットの定量をバイオスキャンシステム200イメージングスキャナにより行った。
図3は、pmolシトルリン/min/mgタンパク質として表される種々の実験条件下のiNOS酵素の比活性を示す走査像である。阻害％は、モジュレーターの存在しないときのLPS刺激細胞に対する比較を表す。データは3回の実験のうちの1回を示す。図3に示されるように、マウスマクロファージをドキシサイクリンか又はミノサイクリンに曝すと対照のLPS刺激活性に比べた場合に用量依存方式で細胞ライゼート中のiNOSの触媒活性が阻害される。20、40及び80μg/mlのドキシサイクリンは、iNOS活性を各々57％、72％及び85％だけ顕著に遮断する。同じ濃度のミノサイクリンもiNOS活性を45％、69％及び69％だけ遮断する。予想されるように、正の対照、10μMヒドロコルチゾンと75μM L-NMMAはiNOS活性を各々60％と64％だけ遮断する。細胞ライゼートにおいてiNOS活性を阻害するドキシサイクリンとミノサイクリンのIC50は〜20〜30μg/mlであった。
実施例4B
試験管内iNOSの比活性に対するテトラサイクリンの影響
最近の実験から酵素に対する直接の効果によりドキシサイクリンがコラゲナーゼを阻害することが示された(Yuら1991,Smithら1994)。提唱されたメカニズムの１つは、プロコラゲナーゼがドキシサイクリンの存在下の活性化の際に不活性な断片まで縮小することである。アスピリンやN-アセチルイミダゾールのようなアセチル化剤(Aminら1995b)、及びL-アルギニンの競合阻害剤(Schmidtら1994,Nathanら1994,Marletta 1994)が試験管内でiNOS触媒活性を阻害することが最近わかった。iNOS活性に対するドキシサイクリンとミノサイクリンの直接の影響を評価するために、これらの薬剤を存在させずにRAW264.7細胞をLPSで16時間誘導し、L-アルギニン→L-シトルリン変換分析におけるiNOS酵素源として無細胞抽出液を調製した。
酵素含有無細胞抽出液の別個の分割量を20〜80μg/mlドキシサイクリン、20〜80μg/mlミノサイクリン、1mM N-アセチルイミダゾール及び200μM L-NMMAと各々15分間プレインキュベートした後、補因子を加えることにより酵素反応を開始した。記載したiNOS反応を開始する補因子を添加する15分前にメタノール(MeOH)、NAI(N-アセチルイミダゾール)のキャリヤーを含む種々のモジュレーターを加えた。比活性を計算し、阻害％をもとのLPS刺激抽出液と比較した。100％比活性は200pmolシトルリン/min/mgタンパク質であった。図4に示されたデータは2回の同じ実験の1回である。
図4から、N-アセチルイミダゾール又はL-NMMAと異なり、ドキシサイクリンとミノサイクリンが無細胞抽出液中のiNOSの比活性に対してほとんど影響がないことがわかる。ミノサイクリンとドキシサイクリンは、無細胞抽出液中のiNOSによって触媒した進行中のL-アルギニン→L-シトルリン反応を遮断しない。これらの実験からiNOSに対するこれらの薬剤の作用がプロコラゲナーゼのようなメタロプロテイナーゼについて報告されたものと異なるらしいことが示される(Yuら1991,Smithら1994)。
実施例5
マウスマクロファージにおけるiNOSタンパク質発現に対するテトラサイクリンの影響
テトラサイクリンがiNOSの活性に直接影響しなかったことが示された上記データに基づいて、iNOSタンパク質発現を調べることに取りかかった。RAW264.7細胞をドキシサイクリン又はミノサイクリン(20〜80μg/ml)と共に又は含めずに又はヒドロコルチゾン(10μM)と共に100ng/ml LPSで活性化した。無細胞抽出液を上記のように調製した。抽出液について抗iNOS特異抗体を用いてウェスタンブロッティングにより133kD iNOSを分析した。
BCA試薬(Pierce,イリノイ州ロックフォード)で測った同量のタンパク質(25〜50μg)をSDS-PAGEゲルに充填し、染色してゲル上のタンパク質バンドの強さを調べることにより種々のタンパク質画分の濃度を証明した。同じ細胞抽出液からウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット膜を抗マウスiNOSモノクローナル特異抗体(Transduction Laboratories,ケンタッキー州レキシントン)で製造業者によって指定されたようにプローブした。同じブロットをDr.James L.Lessard(Children’s Hospital Medical Center,オハイオ州シンシナティ)から寛大に援助された抗アクチン抗体でプローブした。ECLウェスタンブロットシステムを用いてブロットを展開した(Amersham,イリノイ州アーリントンハイツ)。モレキュラーダイナミクス(カリフォルニア州サニービル)製のデンシトメーターを用いてバンドの定量を行った。図5は代表例である。
図5からドキシサイクリン(20μg/mlで11％;40μg/mlで24％;80μg/mlで65％)とミノサイクリン(20μg/mlで14％;40μg/μlで49％;80μg/μlで83％)双方の存在下にiNOSタンパク質発現の用量依存性阻害が示される。比較により、正の対照、ヒドロコルチゾンは43％の阻害を示した。(データは4回の実験のうちの1回を示す。)20〜80μg/mlのドキシサイクリン又はミノサイクリンで処理した同じ試料においてβアクチンの合成レベルに対してはほとんど効果がなく(データは示されていない)、iNOSに対するドキシサイクリンとミノサイクリンの効果は特異的であることが示された。
タンパク質発現の阻害がNOS活性の阻害とみなした論文と一致して各テトラサイクリン誘導体の亜硝酸塩蓄積とタンパク質発現の阻害のIC50が同じであることは留意されなければならない。実際に、両薬剤は無細胞抽出液においてiNOSタンパク質発現を阻害したがL-アルギニン→L-シトルリン変換を遮断しなかったので、主にiNOSタンパク質発現の阻害によるiNOSの触媒活性の低下がドキシサイクリンとミノサイクリンで処理した細胞における亜硝酸塩の蓄積低下を説明していると我々は結論する。
実施例6A
iNOS mRNAの発現に対するテトラサイクリンの影響
ドキシサイクリンとミノサイクリンは酵素の合成前にiNOSを抑制することができ、iNOSタンパク質発現、比活性及び亜硝酸塩の蓄積の阻害をもたらす。この蓄積は、マクロファージにおいてはTGF-β1、シクロスポリン、ヒドロコルチゾン、NF-κB阻害剤及びある程度まではFe++がmRNA発現を低下させ、続いてiNOSタンパク質の翻訳速度を低下させることによりiNOS発現を抑制する所見に基づく(Nathanら1994,Vodovotzら1993)。更に、Pfeilschifterら(1995)による最近の研究からデキサメタゾンが多重レベル(iNOSの転写を含む)で作用してメサンギウム細胞におけるIL-β誘導iNOS発現を抑制することがわかった。従って、テトラサイクリンがiNOSタンパク質発現を阻害したレベルを求めるために、ドキシサイクリンとミノサイクリンの存在又は不在下にLPSで処理したRAW264.7細胞についてiNOS mRNAを半定量的RT-PCRにより分析した。
細胞中のiNOSとβアクチンのmRNAの存在は、全RNAの逆転写(RT)に続いてcDNAのPCR増幅により分析した。iNOSのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’-ACG GAG AAG CTT AGA TCT GGA GCA GAA GTG-3’(142-171)(配列番号1)及び5’-CTG CAG GTT GGA CCA CTG GAT CCT GCC GAT-3’(767-796)(配列番号2)であった。βアクチンのセンス及びアンチセンスプライマーは、各々5’-TCC TTC GTT GCC GGT CCA CA-3’(44-63)(配列番号3)及び5’-CGT CTC CGG AGT CCA TCA CA-3’(534-552)(配列番号4)であった。iNOS cDNAの予想PCR産物は654bpであり、βアクチンcDNAは508bpであった。ポリメラーゼ連鎖反応は、自動DNAサーマルサイクル(Perkin-Elmer Cetus,コネチカット州ノーウォーク)で行った。全RNAをTRI試薬(MRC社,オハイオ州シンシナティ)を用いて抽出した。cDNAをSuperScriptTM RNase H逆転写酵素(Gibco BRL,メリーランド州ゲーゼルバーグ)を用いて同量(1〜5μg)の全RNAから調製した。同量のcDNAを用いてPCRによりmRNAを増幅した。PCR増幅を1.5mM MgCl2、500ng iNOSプライマー、100ngβアクチンプライマー、0.2mMの各dNTP、2.5単位のTaq DNAポリメラーゼ(Gibco)を含む50μl溶液中で行った。cDNA増幅のサイクル条件は、iNOSとβアクチン共に30サイクルの94℃で1分、55℃で1〜2分及び72℃で3分であった。PCR産物を1.0％アガロースゲルによる電気泳動で分析した。
RAW264.7細胞におけるiNOSとβアクチンmRNA発現のRT-PCR分析をLPS±ドキシサイクリン又はミノサイクリンで刺激した後に行った。RAW細胞をドキシサイクリン/ミノサイクリン又は10μMヒドロコルチゾンの存在又は不在下にLPSで刺激した。同量のRNAについて上記のようにiNOSとβアクチン発現を分析した。
図6A及び図6BからiNOSタンパク質を阻害した濃度(20〜40μg/ml)のドキシサイクリンとミノサイクリンが用量依存方式でiNOS mRNA発現を顕著に低下させた(＞50％)ことがわかる。予想したように、ヒドロコルチゾン処理細胞はLPS刺激細胞と比べてiNOS mRNAの減少(50〜100％)を示した。“RT対照”は、鋳型としてRAW264.7細胞からのLPS刺激RNAを用いて逆転写酵素の不在下のRT-PCRの調製を示すものである。RT対照試料はmRNAを生じなかった。データは2回の同じ実験のうちの1回と個別の実験を示す。iNOS PCRシグナルは、図6A及び図6Bに示されるβアクチンで標準化した。
実施例6B
iNOS mRNAの発現に対するテトラサイクリンの影響
実施例6Aと同じ単独のiNOS mRNA単離手順において、RAW細胞をドキシサイクリンとミノサイクリン及び10μMヒドロコルチゾンの存在又は不在下にLPSで刺激した。次に、ドキシサイクリンとミノサイクリンの存在下のiNOS発現の効果を正確に評価するために細胞によって発現したiNOS mRNAのノーザンブロット分析を行った。プローブは、上記のiNOSとβアクチンcDNAのプローブとした。
本例においては、TRI試薬(MRC社、オハイオ州シンシナティ)を用いて全RNAを単離した。Church & Gilbert(1984)によって記載されたようにノーザンブロット分析を行った。概要としては、30μgのRNAを1％アガロースホルムアルデヒドゲルの電気泳動にかけた。次に、ゲルをナイロン膜(ζプローブ,Bio-Rad Laboratories,ニューヨーク州メルビル)に毛管作用により移した。その膜をDr.James Cunningham(Harvard Medical School,マサチューセッツ州ボストン)から寄贈の[32P]-dCTP標識iNOS cDNA(4kb SmaI断片)とハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後、ブロットを-70℃でスクリーンを増感しつつコダックX線フィルム(Kodak,ニューヨーク州ロチェスター)に24〜48時間曝した。βアクチンプローブをクロンテック(カリフォルニア州パロアルト)から購入し、上記のようにプローブした。iNOS/βアクチンバンドの強さの定量はホスホイメージャー(Molecular Dynamics,カリフォルニア州サニービル)を用いて行った。
図6C及び図6Dは、ドキシサイクリン(図6C)とミノサイクリン(図6D)の存在下と不在下のmRNA発現を示すノーザンブロットである。iNOS mRNA発現の用量依存性阻害はいずれの例においても明らかである。iNOS発現の阻害％をβアクチンシグナルに対して標準化した。ドキシサイクリンについては、mRNA発現の阻害は20μg/mlで68％、40μg/mlで75％及び80μg/mlで79％であり、ヒドロコルチゾンは73％だけ発現を阻害した。ミノサイクリンについては、mRNA発現の阻害は20μg/mlで39％、40μg/mlで49％及び80μg/mlで77％であり、ヒドロコルチゾンは76％だけ発現を阻害した。図6C〜図6Dに示されるデータは2回の同じ実験のうちの1回を表している。
実施例6Aと6Bから共に20〜40μg/mlのドキシサイクリンとミノサイクリンがiNOS mRNA発現を顕著に遮断したことが示される。これらの実験からiNOSに対するドキシサイクリンとミノサイクリンの作用が全細胞抽出液における酵素のNOSタンパク質と比活性の低下に寄与するiNOS mRNAのレベルであることが示される。80μg/ml濃度のテトラサイクリンでさえmRNAレベルでのiNOS発現を完全には阻害できないのでこれらの薬剤の存在下にNO生成の余地が残ることは留意されなければならない。この段階の実験ではテトラサイクリンがiNOS転写を阻害するか又はiNOS mRNAを分解に対して感受性にするか又はその両者かは不明である。種々の酵素及び細胞機能に対してドキシサイクリンとミノサイクリンが広範囲スペクトルの効果があるために、共通の標的(NF-κB)が除外されないことは非常に起こり得ることである。iNOS発現(mRNA、比活性及び亜硝酸塩蓄積)に対するドキシサイクリン/ミノサイクリンの阻害作用が〜40〜80μg/ml濃度でプラトーに達し、それを超えるとNOS活性の阻害が達成されなかったことは留意されなければならない。従って、これらの化合物は、NOS活性を＞95％阻害し得る酵素(例えば、L-MMA)の競合阻害剤と異なる。しかしながら、薬理的濃度のテトラサイクリンは我々の実験ではNOS活性の＞50％阻害を達成した。関節炎の動物モデルにおいて示されるように生体内NOS阻害の中程度の効果(10〜50％)でさえ炎症事象(例えば、足の腫脹)に対して著明な減弱効果があることからこれは重要なことである。
我々のデータから以前の他のデータによる知見と共に、テトラサイクリンが抗菌活性と独立した機能の多様性を与えることが示される。これらの機能は、ここではMMP阻害、腫瘍進行阻害、骨吸収阻害(DeClerckら1994,Rifkinら1994)、血管形成阻害(Maragoudakisら1994)及び炎症阻害(Ramamurthyら1994)のほかにNOS発現とNO生成の阻害が含まれる。テトラサイクリンのいくつかの性質(Greenwaldら1994)が、上に挙げた病態及び徴候の多くに同様の効果を示す(Vanerら1994,Schmidtら1994,Murrellら1995,Farias-Eisnerら1994,Kastenら1994,Pipili-Synetosら1993,Pipili-Synetosら1994)ことが既知である他の多機能シグナリング分子、NOを標的にする新たに発見した能力に部分的に寄与するものであると我々は推測する。我々の実験から同様のIC50のテトラサイクリンがMMPに対して二重に作用する:(a)MMPの比活性を酵素レベルで阻害する(Yuら1991);及び(b)MMP活性をアップレギュレーションすることが報告されたNO生成を阻害する(Murrellら1995)ことが示される。更に、NOが軟骨上のIL-1のいくつかの異化作用を仲介することが既知であるので(Taskiranら1994,Caoら1996,Murrellら1995)、テトラサイクリンによるNOS活性阻害は関節炎における軟骨分解に対しても保護効果を示すことができる。
我々の実験から、テトラサイクリンが酵素レベルでの直接阻害(メタロプロテイナーゼについて報告された)によってではなくタンパク質発現とNOS活性の低下をもたらすNOS mRNA発現の阻害によってiNOS活性を阻害することが示される。テトラサイクリン系化合物のこのユニークな性質が、様々な病態に対するNOの安全で許容しうるモジュレーターとして有望な候補にする。
このように、本発明の好ましい実施態様であると現在思われるものを記載してきたが、他の及びこれ以後の実施態様が本発明の真意から逸脱することなく行われると共に下記に示される請求の範囲の真の範囲内に属するような修正及び変更も全て包含するものであることを当業者は理解するであろう。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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