(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ４〜６．５の酸性水溶液で、生体組織又は生体由来組織を処理して染色した後、当該処理部分をｐＨ４〜６．５の酸性条件下で蛍光観察することを特徴とする生体組織又は生体由来組織の蛍光染色方法。
【請求項２】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ７〜１０の水溶液で、生体組織又は生体由来組織を処理して染色した後、当該処理部分にｐＨ４〜６．５の酸性水溶液を塗布後に蛍光観察することを特徴とする生体組織又は生体由来組織の蛍光染色方法。
【請求項３】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ４〜６．５の酸性水溶液又はｐＨ７〜１０の水溶液による組織の処理が、組織への当該水溶液の塗布又は当該水溶液への組織の浸漬である請求項１又は２項記載の蛍光染色方法。
【請求項４】
蛍光観察が、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムによる観察である請求項１〜３のいずれか１項記載の蛍光染色方法。
【請求項５】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ４〜６．５の酸性水溶液であって、生体組織又は生体由来組織を処理して染色した後、当該処理部分をｐＨ４〜６．５の酸性条件下で蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムにより蛍光観察するための生体組織又は生体由来組織用蛍光染色剤。
【請求項６】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ７〜１０の水溶液及びｐＨ４〜６．５の酸性水溶液の組み合わせであって、該ｐＨ７〜１０の水溶液で生体組織又は生体由来組織を処理して染色した後、当該処理部分にｐＨ４〜６．５の酸性水溶液を塗布後に蛍光観察するための生体組織又は生体由来組織用蛍光染色剤。
【請求項７】
フルオレセイン又はその塩を含有するｐＨ４〜６．５の酸性水溶液又はｐＨ７〜１０の水溶液による組織の処理が、組織への当該溶液の塗布又は当該溶液への組織の浸漬である請求項５又は６記載の組織用蛍光染色剤。
【請求項８】
蛍光観察が、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムによる観察である請求項６又は７記載の組織用蛍光染色剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織又は生体由来組織を簡便かつ明瞭に蛍光染色する方法及びそれに用いる染色剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織の断面像を得ることは医学生物分野において極めて重要である。従来生体より摘出した組織は化学固定、脱水、薄切、染色することにより断面像を得ることができた。
共焦点撮像システムの開発及び共焦点レーザー顕微鏡の普及により、細胞や結合組織が複雑に多層化した生物試料の断面の観察において、細胞や組織を非侵襲的に観察することが可能となった。さらに現在では、共焦点撮像システムを内蔵した医療用内視鏡が開発されている。
【０００３】
蛍光色素により生体組織及びそれに由来する試料を染色する操作は、共焦点光学システムにおける蛍光像を観察するに際して必要になる。共焦点顕微鏡及びこれを備える医療用内視鏡などを用いて生体組織の観察を行う際には、染色用の試薬は生物学的に安全な物であることが求められる。
【０００４】
従来、フルオレセインは生体に安全な蛍光造影剤として、水溶液を静脈に注射して眼底検査等に用いられてきた（非特許文献１）。また、静脈等の血管を経由しない場合においては、染色用試薬を組織表面に直接撒布し染色することができる。組織表面に染色液を撒布する方法は、摘出した臓器を染色する場合に有効な手段である。また、生体内組織を染色する場合においても、静脈に注射して灌流する染色法と比較して染色液は少量で済み、且つ体内の不要な部位への色素灌流がないという点で染色液による生体への影響を少なくできるという利点を持つ。
【０００５】
生体組織表面に撒布されたフルオレセイン溶液は組織内部に浸透し、他の一部は組織表面に液だまりとなって残る。この状態で組織に励起光を照射すると浸透したフルオレセイン分子と組織表面に溜まった同分子がいずれも蛍光を発してしまい、染色部位と非染色部位の違いが不鮮明になる。このため、組織表面に染色剤を撒布する方法では、洗浄により非染色部に残存する遊離のフルオレセイン分子を除去しなければならなかった。
遊離の色素は、染色後の組織試料を適切な緩衝液や溶液で複数回洗浄することにより、除去することが可能である。しかし、観察しようとする試料は表面が非常に繊細であり、洗浄する際には試料の変形や破損、組織の変性に注意せねばならず、洗浄操作は丁寧かつ注意深く行わなくてはならない。また、過剰な洗浄は染色を行った組織から色素を脱離（脱色）させる原因ともなる。
一方、摘出した組織試料を化学固定せずに染色し共焦点顕微鏡で観察する際には、洗浄操作の過程で組織の自己消化、細胞やタンパク質の変性などが起こってしまい、試料が生体内部での状態とは異なってしまうことが問題となる。
【非特許文献１】Gastroenterology, 127(3), 706-713, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、簡便な操作により組織を正確かつ明瞭に蛍光染色する方法及びこれに用いる染色剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、フルオレセインに着目して種々検討した。水溶液に溶解されたフルオレセインは、アルカリ側のpHで蛍光を示し、酸性溶液中ではほとんど蛍光を示さない。従って、従来から、フルオレセインはアルカリ側の溶液として用いられ、かつアルカリ条件下で蛍光観察が行われていた。しかし、本発明者が種々検討したところ、フルオレセインは酸性溶液中では、ほとんど蛍光を示さないにもかかわらず、全く意外にも、組織に結合したフルオレセインは酸性条件下で明瞭な蛍光を示すことを見出した。従って、フルオレセイン処理された組織を、蛍光観察時に酸性条件にすれば、組織に結合しているフルオレセインのみが選択的に蛍光染色でき、組織に結合していないフルオレセインはほとんど蛍光を示さないことから、煩雑な洗浄操作をすることなく、明瞭でかつ正確に組織の蛍光染色像が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液で、組織を処理した後、当該処理部分をpH７未満の酸性条件下で蛍光観察することを特徴とする組織の蛍光染色方法を提供するものである。
また、本発明は、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液であって、組織を処理した後、当該処理部分をpH７未満の酸性条件下で蛍光観察するための組織用蛍光染色剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の染色方法によれば、組織に結合したフルオレセインのみを選択的に蛍光染色できるため、明瞭で、かつ正確な染色像が得られる。すなわち、フルオレセインは通常pHの依存性が高く、pH値が高くなるほど蛍光性が高くなる傾向にあるが、蛍光観察条件を酸性条件にするという従来ではありえなかった条件で生体組織を染色することにより、生体組織内部に浸透し、組織と結合したフルオレセイン分子のみが強い蛍光を発し、且つ遊離のフルオレセイン分子は蛍光を出さないため、染色後の洗浄や灌流などの煩雑かつ侵襲のある操作を行わずに生体組織の蛍光染色像を観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明方法では、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液で組織を処理する。ここで、組織には、生体組織及び生体由来組織（摘出組織）のいずれも含まれる。生体組織としては、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、口腔、泌尿器内腔等が挙げられる。生体由来組織としては、これらの生体組織由来の組織、さらには各種の臓器、筋肉組織等由来組織が挙げられる。
【００１１】
本発明に用いられるフルオレセイン又はその塩としては、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム、フルオレセインカリウム等が挙げられるが、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム塩が特に好ましい。このうち、フルオレセイン及びフルオレセイン二ナトリウム塩（ウラニン）が特に好ましい。ここでフルオレセインは、５２０nmあたりに緑色の蛍光（４９０nmで励起）を有するため、Ａｒレーザー光（４８８nm，５１４nm）でよく励起される。ウラニンの水溶液は微量であっても光が当ると緑色の蛍光を発する分子内にキサンテン骨格を持つ染料であり、酸性型になっているものである。ウラニン色素の吸収極大は溶媒により異なるが、４５０〜４９０nmである。
【００１２】
本発明における組織の処理手段としては、組織へのフルオレセイン又はその塩を含有する溶液の塗布又は当該溶液への組織の浸漬が好ましい。ここで、組織として生体組織が対象となる場合には、塗布が好ましい。塗布手段としては、噴霧、撒布等の手段が挙げられる。組織として生体由来の組織を用いる場合は、塗布又は浸漬が用いられる。前記溶液の塗布量は、対象組織全体に溶液が到達する量であればよい。
【００１３】
蛍光観察時に前記処理部分がpH７未満の酸性条件になっていればよく、用いる前記溶液は、pH７以上の塩基性溶液であっても、pH７未満の酸性溶液であってもよい。フルオレセイン又はその塩を含有するpH７以上の塩基性溶液を用いる場合には、組織を処理した後に、当該処理部分をpH７未満の酸性溶液で洗浄した後に蛍光観察すればよい。また、フルオレセイン又はその塩を含有するpH７未満の酸性溶液を用いる場合には、組織を処理した後、そのまま蛍光観察すればよい。
【００１４】
pH７以上のフルオレセイン又はその塩を含有する溶液は、フルオレセイン又はその塩を含有する水溶液に、水溶液をpH７以上にする塩基性物質、例えば水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、グリシン等を添加することにより調製される。好ましいpHは、７〜１０であり、特に好ましいpH７〜８である。またpHの調整は緩衝剤を用いて行うのが好ましく、例えばリン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸、リジン−塩酸、アルギニン−塩酸などを用いて行うのがより好ましい。
【００１５】
pH７未満のフルオレセイン又はその塩を含有する溶液は、フルオレセイン又はその塩を含有する水溶液に、水溶液をpH7以下にする酸性物質、例えばリン酸、塩酸、炭酸、無機酸、酢酸、クエン酸などの無毒性の有機酸を添加することにより調整される。好ましいpHは４〜６．５であり、特に好ましいpHは６〜７未満である。またpH調整は緩衝剤を用いて行うのが好ましく、例えばリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどの無毒の酸性緩衝液を用いて行うのがより好ましい。
【００１６】
フルオレセイン又はその塩を含有する溶液中のフルオレセイン濃度は０．００１mg/mL〜５０mg/mL、さらに０．１〜１０mg/mLが好ましい。濃度１０mg/mL以上のフルオレセインではpH５以下では析出しやすい溶液状態であり、濃度０．００１mg/mL以下では染色性が低い。
【００１７】
前記のように、染色対象の組織の処理部分は、酸性溶液による洗浄、あるいはフルオレセイン又はその塩を含有するpH７未満の酸性溶液による処理により、pH７未満の酸性条件になっているので、遊離のフルオレセインは蛍光を生じず、組織に結合したフルオレセインのみが蛍光を生じる。
【００１８】
蛍光観察は、励起光を照射して測定すればよい。蛍光染色像は、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡又は共焦点撮像システムにより観察するのが好ましい。共焦点撮像システムには、共焦点顕微鏡、共焦点撮像システムを有する内視鏡等が挙げられる。
【００１９】
本発明の蛍光染色剤は、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液がpH７未満の酸性溶液である場合には、当該溶液だけで構成される。一方、フルオレセイン又はその塩を含有する溶液か、pH７以上の塩基性溶液である場合には、pH７未満の酸性溶液（洗浄用）との組み合せで構成される。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
実施例１
フルオレセインのｐH依存性蛍光発光
フルオレセインナトリウムの水溶液（１mg/mL）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用いてpHを調整し、励起波長４９０nm／蛍光波長５３０nmにて測定した。
蛍光測定にはマイクロプレートリーダー(コロナ製、MTP−800AFC)を使用した。
その結果、図１に示すように、フルオレセインの蛍光強度はpHが高くなるほど強くなることがわかった。
【００２２】
実施例２
フルオレセインナトリウムのラット大腸染色試験
ラット（８週齢、オス）の大腸をホルマリン固定したものを用いてpHに対する染色性の違いを観察した。大腸をリン酸緩衝生理的食塩水（１３７mmol／Ｌ  ＮａＣｌ，８．１mmol／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4，２．７mmol／Ｌ  ＫＣｌ，１．５７mmol／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4，以下ＰＢＳ（−）とする）で１０秒間洗浄した後、フルオレセインナトリウム（Sigma製，Ｆ６３７７，以下Ｆ−Ｎａとする）を調整後、酸、アルカリ、中性の緩衝液で１mg／mLに希釈した溶液に浸漬する。緩衝液はそれぞれ０．１Ｍ・リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）、０．１Ｍホウ酸緩衝液（pH９．１）、０．４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（pH４．６５）を用いた。さらにＰＢＳ（−）で１０秒間洗浄した後、１０％ホルマリンリン酸緩衝液で固定したものを共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製，ＴＣＳ−ＳＰ２）で観察した。
【００２３】
いずれも染色はよくされてはいたが、pH７．０及び９．０の緩衝液で希釈したＦ−Ｎａはバックグラウンドが高くなり、細胞の観察を行うのは適さなかった。
【００２４】
実施例３
溶媒のpH変化による色素の浸潤および蛍光性の違い
ラット（８週齢、オス）の大腸を摘出し染色試験を行った。
Ｆ−Ｎａ（Sigma製，Ｆ６３７７）を１mg／mLで調整し、０．１Ｍ・リン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）、０．１Ｍホウ酸緩衝液（pH９．１）、０．４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4緩衝液（pH４．６５）でそれぞれ０．１mg／mLに希釈した溶液をつくり、組織を１分間浸漬した。さらにＰＢＳ（−）で１０秒間洗浄した後、共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製，ＴＣＳ−ＳＰ２）にて観察を行った。結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0004555232.tif 000002
【００２６】
実施例４
Ｆ−Ｎａ（Sigma製，Ｆ６３７７）の等張条件下、pH４〜７の範囲での組織染色観察を行った。
ラット（８週齢、オス）の大腸を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（１３７mmol/Ｌ  ＮａＣｌ，８．１mmol／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4，２．７mmol／Ｌ  ＫＣｌ，１．５mmol／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4，４．４mol／Ｌ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，１．６mmol／Ｌ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ，以下ＰＢＳ（＋）とする）にて洗浄した後、各pHに調整したＦ−Ｎａ（０．１mg／mL）に１分間浸漬し、染色したものを共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製，ＴＣＳ−ＳＰ２）にて観察を行った。
ここで生理食塩水を用いての対照試験を同時に行った。静脈注射などで用いられるＦ−Ｎａの溶媒として生理食塩水が用いられるためである。
共焦点顕微鏡の撮影条件は共焦点ピンホール径を１．００airy、レンズは×２０倍及び×６３倍油浸レンズの２種類を用いる。Gain値を自動で補正するように設定し、最適な輝度にて観察を行った。
５mg／mLフルオレセインＮａ／Ｄ．Ｗ．を調整し、各pHのクエン酸リン酸緩衝液と生理食塩水を用いて希釈し０．１mg／mLとする。調整染色液に浸した後はＰＢＳ（＋）で洗浄し、観察した。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
0004555232.tif 000003
【００２８】
実施例５
実施例４で用いた大腸切片を薄切したものを観察し、染色液の浸透度を観察した。
実施例４同様pH（４．０，５．０，６．０，７．０）及び生理食塩水を用いて希釈し０．１mg／mLに調整した。
蛍光顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製、ＬＳＭ５１０）を使用し、撮影条件はピンホール径１．０及びＭａｘとして撮影し、レンズは×２０倍、×４０倍のものを用いた。
切片を観察することで上皮細胞の５０μｍ程度がよく染色されており該部分に蛍光が強くみられることが確認できた。
pHの異なる染色液を用いて観察を行ったが、組織の浸透度に大きな違いは見られなかった。
【００２９】
実施例１〜５から、フルオレセインアルカリ条件下では遊離のものも、組織に結合したものも蛍光を生じるが、酸性条件下では組織に結合したものだけが蛍光を生じることが明らかである。
【００３０】
実施例６
pHを６．０に固定し、異なる濃度で観察を行った。
Ｆ−Ｎａ（Sigma製，Ｆ６３７７）の濃度は各１０，１．０，０．１，０．０１，０．００１mg／mLとし、クエン酸リン酸緩衝液（pH６．０）で調整後、共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製，ＴＣＳ−ＳＰ２）で観察を行った。
共焦点顕微鏡の撮影条件は共焦点ピンホール径を１．００airy、レンズは×２０倍及び×６３倍油浸レンズの２種類を用いる。Gain値を自動で補正するように設定し最適な輝度にて観察を行った。
低濃度の０．０１及び０．００１mg／mLでは染色像を確認することが出来たが、輝度が低いため、鮮明な画像を得ることができなかった。
結果として、０．１〜１０mg／mLの範囲では組織浸透性のある鮮明な画像が得られた。
【００３１】
実施例７
実施例６で用いた大腸切片を薄切したものを観察し、染色液の浸透度を観察した。
実施例６同様、濃度は各１００，１０，１．０，０．１，０．０１，０．００１mg／mLとし、クエン酸リン酸緩衝液（pH６．０）で調整後、共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製，ＬＳＭ５１０）の撮影条件は共焦点ピンホール径１．０及びＭａｘにて撮影し、レンズは×２０倍、×４０倍を使用した。
その結果、濃度の違いによる観察においては高濃度のものほど粘膜固有層が濃く染色されていた。
【００３２】
【表３】
0004555232.tif 000004
【００３３】
実施例８
フルオレセインナトリウムの染色性の蛍光顕微鏡による観察
フルオレセインナトリウム（以下、Ｆ−Ｎａ）を染色後、蛍光顕微鏡（ライカ社製，ＤＭ  ＩＲＢ）にて観察を行った。
試料としてホルマリン固定されたウサギの小腸を用い、pH４．０及び９．０の条件下で観察した。
Ｆ−Ｎａを生理食塩水で１mg／mlに調整したものを各pHの０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈し、０．０１mg／mlに再調整した。
ホルマリン固定のウサギ小腸に洗浄操作を行わずにそれぞれのpHで調整した染色液を塗布し、過剰な染色液をろ紙で吸着除去した後の状態で蛍光顕微鏡観察行った。対物レンズは４０倍のものを用いた。
その結果、pH４．０のものは染色後の洗浄操作を行わなくともウサギ小腸絨毛が染色され、明瞭な蛍光像が得られた。しかしpH９．０のものは染色後にそのまま観察を行った場合、絨毛よりも組織外の液体から蛍光が発せられ不鮮明であった。希釈で用いた０．１Ｍリン酸緩衝液（pH９．０）で周辺の蛍光溶液を除去するための洗浄操作が必要であった。
【００３４】
実施例９
フルオレセインナトリウムの注腸染色
生体内においては、消化器は常に粘液を分泌したり、あるいは逆に体内に取り込まれ消化される。内視鏡での使用時と同様の環境下で本発明の効果を検証するために、生体大腸での染色性を観察した。
酸性領域とアルカリ領域の二つのｐＨでの生体大腸の染色性と共焦点顕微鏡（ライカ社製  ＴＣＳ  ＳＰ２）観察を行った。
マウス（９週齢，オス）に麻酔をかけた状態で大腸上部からシリンジ（テルモ２７Ｇ，０．４mm）を用いてＦ−Ｎａ（pH４，１mg／mL）を５００μＬ注入した。１０分後に大腸を摘出し、腸内をＰＢＳ（＋）で洗浄した。
大腸の摘出部位は盲腸側から５．５〜６．５ｃｍを切除して行った。
図２（ゲイン値４８０Ｖ，上皮から約０μｍ）から、pH４．０では組織の構造を明瞭に観察することが出来、杯細胞が不染であった。
さらにＦ−ＮａのpH９．０（１mg／mL，５００μＬ）の染色液を用いて観察を行った。pH９．０の染色液では以前のpH差による観察同様、染色部位と遊離のＦ−Ｎａのある液溜まりとの間で蛍光輝度の差がほとんどなく、組織像は不明瞭であった（図３）。
【００３５】
実施例１０
フルオレセインナトリウム染色における洗浄液のpHによる染色性の違い
フルオレセインナトリウム(以下、Ｆ−Ｎａ)は、pH７以上の水溶液中で蛍光を強く出す。pH７以上のＦ−Ｎａ水溶液で組織表面を染色すると組織内部及び組織表面の液溜まりが存在するＦ−Ｎａ分子のいずれもが蛍光性を示すため、染色された組織の観察が困難になる。
液溜まりに存在するＦ−Ｎａは組織表面を洗浄することで除去可能である。しかし洗浄操作により、組織内部のＦ−Ｎａも溶出するため、染色効果が低下する。
そこでpH７以上のＦ−Ｎａ水溶液で組織を染色後、pH７以下の酸性溶液を少量塗布(撒布)して染色に関与しない遊離のＦ−Ｎａの蛍光性を消失させ、染色後の観察を行った。結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
0004555232.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】フルオレセインの蛍光発光のｐＨ依存性を示す図である。
【図２】大腸をpH４．０のフルオレセイン溶液で処理後に蛍光観察した蛍光染色像を示す図である。
【図３】大腸をpH９．０のフルオレセイン溶液で処理後に蛍光観察した蛍光染色像を示す図である。
【図１】
0004555232.tif 000006
【図２】
0004555232.tif 000007
【図３】
0004555232.tif 000008