(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム膜にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが結合せしめられたことを特徴とするリポソーム
【請求項２】
薬剤または遺伝子が封入されているものである、請求項１に記載のリポソーム
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品をはじめ医学・薬学分野において応用し得る、癌などの標的細胞・組織を認識し局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療用のドラッグデリバリーシステムや診断用の細胞・組織センシングプローブとして利用できるリポソーム、および薬剤あるいは遺伝子等を封入したリポソームに関する。 
【背景技術】
【０００２】
米国の国家ナノテク戦略（ＮＮＩ）によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その５年間の研究開発目標の１つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の発症率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向ＤＤＳの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向ＤＤＳナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に１０兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。 
【０００３】
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向（ターゲティング）ＤＤＳとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアーであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。 
【０００４】
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは”ミサイルドラッグ”ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖蛋白質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖蛋白質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
【０００５】
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、シグレック、ガレクチンなどの各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいＤＤＳリガンドとして注目されてきている
（非特許文献１,2http://www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf）。
【０００６】
外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、癌などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのＤＤＳ材料として多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合するが、生体内では期待される標的細胞や組織にターゲティングされないものがほとんどである（非特許文献3,4）。糖鎖の分子認識機能を利用したＤＤＳ材料の研究開発においても、糖鎖を有する糖脂質を導入したリポソームについて若干の研究が知られているが、それらの機能評価は生体外（in vitro）によるもののみであり、糖鎖を有する糖蛋白質を導入したリポソームの研究はほとんど進んでいない
（非特許文献5,8,http://www.gak.co.jp/TIGG/71PDF/yamazaki.pdf）。
したがって、糖脂質や糖蛋白質の多種多様な糖鎖を結合したリポソームについての調製法と生体内動態（in vivo）解析を含めた体系的な研究は、これまで未開発で今後の進展が期待される重要課題である。
【０００７】
【非特許文献１】Yamazaki, N., Kojima, S., Bovin, N.V., Andre, S., Gabius, S. and Gabius, H.-J. (2000) Adv. Drug Delivery Rev. 43, 225-244.
【非特許文献２】Yamazaki, N., Jigami, Y., Gabius, H.-J., Kojima, S (2001) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13, 319-329.
【非特許文献３】Forssen, E. and Willis, M. (1998) Adv. Drug Delivery Rev. 29, 249-271.
【非特許文献４】高橋俊雄・橋田充編(1999)、今日のＤＤＳ・薬物送達システム、159-167頁、医薬ジャーナル社、大阪
【非特許文献５】DeFrees, S.A., Phillips, L., Guo, L. and Zalipsky, S. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 6101-6104.
【非特許文献６】Spevak, W., Foxall, C., Charych, D.H., Dasqupta, F. and Nagy, J.O. (1996) J. Med. Chem. 39, 1018-1020.
【非特許文献７】Stahn, R., Schafer, H., Kernchen, F. and Schreiber, J. (1998) Glycobiology 8, 311-319.
【非特許文献８】Yamazaki, N., Jigami, Y., Gabius, H.-J., Kojima, S (2001) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 13, 319-329.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の課題は、各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン（糖鎖認識蛋白質）に対して特異的な結合活性を有する糖鎖を結合したリポソームであって、実際の生体内の細胞、組織を識別して薬剤あるいは遺伝子を効率的に輸送し得るリポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、リポソーム表面の性質あるいは該表面に結合させる糖鎖およびリンカー蛋白質について種々の実験、検討を加え、糖鎖の構造により各組織への指向性を実際に制御できることに加え、リポソーム表面および／またはリンカー蛋白質を水和処理すれば、各組織に対するリポソームの移行量をさらに増大し得、これにより薬剤あるいは遺伝子を標的細胞、組織に効率的に輸送できることを見いだし、さらに、親水化処理手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンによる処理が最も好ましいとの知見を得て、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）  リポソーム膜にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが結合せしめられたことを特徴とするリポソーム
（２）  薬剤が封入されているものである、上記（１）に記載のリポソーム
【発明の効果】
【００１０】
上記実施例１３に示したように、ルイスＸ型三糖鎖とヒト血清アルブミン（リンカー）とリポソームとが結合したリポソーム、シアリルルイスＸ型四糖鎖とヒト血清アルブミン（リンカー）とリポソームとが結合したリポソーム、3’-シアリルラクトサミン三糖鎖とヒト血清アルブミン（リンカー）とリポソームとが結合したリポソーム、6’-シアリルラクトサミン三糖鎖とヒト血清アルブミン（リンカー）とリポソームとが結合したリポソームを作製し、マウスでの各種組織への体内動態、特に癌組織への取込についてエールリッヒ固形癌担癌マウスを用いて解析した結果、糖鎖の分子構造の差を利用することによって、実際の生体においてリポソームの各種組織への体内動態を促進あるいは抑制して制御することができ、これに基づく効率の良い癌組織をはじめとする目的組織（血中、肝臓、脾臓、肺、脳、癌組織、炎症組織、リンパ節）へのターゲティング機能をＤＤＳ材料に付与することができることが明らかとなった。このように、本発明により、医学・薬学分野において極めて有用な、標的指向性を制御し得るリポソームを提供することができた。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本発明のリポソームは、第１〜第４図に示されるように、その表面すなわち脂質層に糖鎖が、ヒト血清アルブミンのようなリンカー蛋白質を介して、共有結合している。但し、第１〜４図においては、糖鎖−蛋白質はリポソームに１つしか結合していない様に記載されているが、これら図（第５図を含めて）は模式図であって、実際には、糖鎖−リンカー蛋白質はリポソーム表面に多数結合している。
糖鎖としては、例えば、第１図に示されるルイスＸ型三糖鎖(Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc)、第２図に示されるシアリルルイスＸ型四糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）、第３図に示される３’−シアリルラクトサミン三糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4GlcNAc）、および第４図に示される6’-シアリルラクトサミン三糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-6Gal.beta.1-4GlcNAc  ）が挙げられ、リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。 
【００１２】
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１a、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。 
【００１３】
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等をを挙げることができる。
【００１４】
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節ことも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。
【００１５】
とりわけ、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。続いて、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。 
【００１６】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２００１０−３０２６８６号）等も用いることが可能ではあるが、本発明においては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。
【００１７】
本発明のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチン（糖鎖認識蛋白質）による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。
【００１８】
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。
【００１９】
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
【００２０】
本発明においては、リポソームに、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させるが、この手段としては、まず、リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ(Ｏ２ＣＣＨ３)４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白も、親水性化するのが好ましく、これには  リンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
【００２１】
これを具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
【００２２】
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの結合反応を行い、リポソーム表面を親水性化することにより本発明のリポソームを得ることができる。
【００２３】
リポソーム表面およびリンカー蛋白質の親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー蛋白質表面が親水性化されることによって、  糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチン（糖鎖認識蛋白質）により認識されることに起因するものと思われる。 
【００２４】
本発明においては、糖鎖は、リポソーム上のリンカー蛋白質に結合させるが、これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜４に示されるようなリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
【００２５】
本発明においては、使用する糖鎖の構造を種々選択することにより、各標的細胞、組織に対する指向性を制御することができる。例えば、実施例における図６〜１３においては、図１〜図４に示されるルイスXGATA三糖鎖、シアリルルイスX型四糖鎖、3’-シアリルラクトサミン三糖鎖、6’-シアリルラクトサミン三糖鎖の４種の糖鎖修飾リポソーム(LX、SLX、3SLN、6SLN)は、ガン組織、炎症組織に対して全般的に指向性が高いが、シアリルルイスＸ型四糖鎖修飾リポソーム（SLX）は、特にリンパ節、脳、肝臓、脾臓に、３’−シアリルラクトサミン三糖鎖修飾リポソーム（3SLN）はガン組織、脳、血中に、６’-シアリルラクトサミン三糖鎖修飾リポソーム(6SLN)は、肺、血中に対する指向性がそれぞれ特に高い。
【００２６】
したがって、本発明のリポソームに、治療あるいは診断に供しうる薬剤あるいは遺伝子を封入することによって得られるリポソーム製剤は、ガン組織、炎症組織、各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤あるいは診断剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図れるものである。
【００２７】
リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類の脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。 
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例を示すが本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕リポソームの調製 
リポソームは既報の手法（Yamazaki, N., Kodama, M. and Gabius, H.-J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35：40：5：15：5の割合の合計脂質量45.6mgにコール酸ナトリウムを46.9mg添加し、クロロホルム／メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液（pH 8.4）3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜（Amicon Co.,USA）とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム（平均粒径100nm）10mlを調製した。
【００２９】
〔実施例２〕リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
実施例１で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜（Amicon Co.,USA）とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate  (BS3; Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたtris(hydroxymethyl)aminomethane 40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とtris(hydroxymethyl)aminomethaneとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にtris(hydroxymethyl)aminomethaneの水酸基が配位して水和性化された。
【００３０】
〔実施例３〕リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（HSA）の結合
既報の手法（Yamazaki, N., Kodama, M. and Gabius, H.-J. (1994) Methods Enzymol. 242, 56-65）により、カップリング反応法を用いて調製した。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
【００３１】
〔実施例４〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上へのルイスＸ型三糖鎖の結合
ルイスＸ型三糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、（実施例３）で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のルイスＸ型三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにルイスＸ型三糖鎖の結合を行った。その結果、図1で示されるルイスＸ型三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：ＬＸ ） 2ml（総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm）が得られた。
【００３２】
〔実施例５〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上へのシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合 
シアリルルイスＸ型四糖鎖(Calbiochem Co.,USA)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、（実施例３）で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSA に結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のシアリルルイスＸ型四糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにシアリルルイスＸ型四糖鎖の結合を行った。その結果、図2で示されるシアリルルイスＸ型四糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：ＳＬＸ） 2ml（総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm）が得られた。
【００３３】
〔実施例６〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上への3’-シアリルラクトサミン三糖鎖の結合
3’-シアリルラクトサミン三糖鎖(Seikagakukogyou Co.,Japan)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して3’-シアリルラクトサミン三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、（実施例３）で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の3’-シアリルラクトサミン三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに3’-シアリルラクトサミン三糖鎖の結合を行った。その結果、図3で示される3’-シアリルラクトサミンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：３ＳＬＮ） 2ml（総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm）が得られた。
【００３４】
〔実施例７〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上への6’-シアリルラクトサミン三糖鎖の結合
6’-シアリルラクトサミン三糖鎖(Seikagakukogyou Co.,Japan)50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して6’-シアリルラクトサミン三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の6’-シアリルラクトサミン三糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに6’-シアリルラクトサミン三糖鎖の結合を行った。その結果、図4で示される6’-シアリルラクトサミンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：６ＳＬＮ） 2ml（総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm）が得られた。
【００３５】
〔実施例８〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上へのtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例３で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP; Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にtris(hydroxymethyl)aminomethane(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにtris(hydroxymethyl)aminomethaneの結合を行った。その結果、図5で示されるtris(hydroxymethyl)aminomethaneとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム（略称：ＴＲＩＳ ） 2ml（総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm）が得られた。
【００３６】
〔実施例９〕リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（HSA）上の親水性化処理
実施例４〜７において調製された4種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA 蛋白質表面の水和性化処理を行った。４種の糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、tris(hydroxymethyl)aminomethane 13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である水和性化処理された4種類の糖鎖結合リポソーム複合体（略称：  ＬＸ、ＳＬＸ、３ＳＬＮ、６ＳＬＮ）を各2mlを得た。
【００３７】
〔実施例１０〕各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定
実施例４〜７および実施例９で調製した４種の糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999) Drug Delivery System, 14, 498-505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E-selectin; R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体（蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg）を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo-NHS-biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon-30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を表１に示す。
【表１】
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【００３８】
〔実施例１１〕クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識
クロラミンT（Wako Pure Chemical Co.,Japan）溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/ml 並びに5mg/ml となるように用事調製して用いた。  （実施例４）から（実施例９）により調製した4種の糖鎖結合リポソーム並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソームとを50μl ずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I-NaI（NEN Life Science Product,Inc.USA）を15μl、クロラミンT溶液を10μl 加え反応させた。5 分ごとにクロラミンT溶液10μl を加え、この操作を2 回繰り返した後15 分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μl 加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G-50（Phramacia Biotech.Sweden）カラムクロマト上に乗せ、PBS で溶出、標識体を精製した。最後に、非標識-リポソーム複合体を添加して比活性（4 x 106 Bq/mg protein）を調整して５種類の125I標識リポソーム液を得た。
【００３９】
〔実施例１２〕各種の糖鎖結合リポソーム複合体の担癌マウスでの各組織への分布量の測定
Ehrlich ascites tumor（EAT）細胞（約2×107 個）を雄性ddY マウス（7 週齢）大腿部皮下に移植し、癌組織が0.3-0.6gに発育（6-8 日後）したものを本実験に用いた。この担癌マウスに（実施例１１）により125I標識した4種の糖鎖並びにtris(hydroxymethyl)aminomethane結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合となるように尾静脈に注入投与し、60 分後に組織（血液、肝臓、脾臓、肺、脳、癌組織、癌の周囲の炎症組織、リンパ節）を摘出、各組織の放射能をガンマカウンタ（Aloka ARC 300）で測定した。なお、各組織への放射能分布量は、投与全放射能に対する各組織1g 当たりの放射能の割合（％投与量 /g組織 ）で表示した。この結果を図６〜図１３に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ルイスX型三糖鎖を結合したリポソームの模式図である。
【図２】シアリルルイスX型四糖鎖を結合したリポソームの模式図である。
【図３】3’-シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの模式図である。
【図４】6’-シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの模式図である。
【図５】比較試料としてのtris(hydroxymethyl)aminomethaneを結合したリポソームの模式図である。
【図６】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の血中への分布量を示す図である。
【図７】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の肝臓への分布量を示す図である。
【図８】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の脾臓への分布量を示す図である。
【図９】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の肺への分布量を示す図である。
【図１０】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の脳への分布量を示す図である。
【図１１】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の癌組織への分布量を示す図である。
【図１２】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後の炎症組織への分布量を示す図である。
【図１３】５種のリポソーム複合体の静脈内投与６０分後のリンパ節への分布量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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