(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む試料液をシースフローセルに流し、前記シースフローセルにレーザ光を照射して前記粒子から光検出信号を検出する検出部と、
前記検出部で検出された光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する信号処理部と、
前記信号処理部によって算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う分析部と、を備えた粒子分析装置。
【請求項２】
前記信号処理部が、前記検出部で検出された光検出信号をその周波数帯域よりも周波数の高い周期でサンプリングＡ／Ｄ変換し、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算することによって前記信号波形の差分積分値を算出することを特徴とする請求項１に記載の粒子分析装置。
【請求項３】
前記信号処理部において、差分積分値を算出する処理の前処理に用いられるハイカットフィルタを設けたことを特徴とする請求項１又は２に記載の粒子分析装置。
【請求項４】
前記信号処理部はパラメータとしてさらに信号波形のピークレベルを算出し、
前記分析部は前記信号波形の差分積分値及び前記信号波形のピークレベルに基づきスキャッタグラムを作成することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子分析装置。
【請求項５】
前記検出部は、前記光検出信号として、前記粒子からの散乱光または蛍光を検出するように構成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子分析装置。
【請求項６】
フローサイトメータを用いた粒子分析方法であって、
粒子を含む試料液にレーザ光を照射して、前記試料液中の粒子から光検出信号を検出する工程と、
検出された前記光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する工程と、
算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う工程と、を備えた粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液や尿等に含まれる血球その他の各種細胞といった粒子の分析に用いる粒子分析装置および粒子分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の血球や尿中に含まれる細胞・細菌等の粒子を分析するために、各種粒子分析装置が用いられている。このような粒子分析装置としてはフローサイトメータが公知である。一般的なフローサイトメータでは、分析対象となる粒子を含有する試料液をシース液で包んでシースフローセル内で細く絞り込み、粒子を整列させて通過させ、そこにレーザ光を照射して各粒子から散乱光や蛍光等の光学的情報を得る。得られた光学的情報は光電変換素子によって光検出信号に変換され、その信号波形を処理することによって粒子の特徴を表すパラメータが算出され、それに基づいて分析対象の粒子が分類・計数される。
【０００３】
光検出信号からは、信号波形の高さ（ピークレベル）や信号波形の幅（パルス幅）等のパラメータが算出される。例えば、前方散乱光検出信号のピークレベルは粒子の大きさを表すものである。また前方散乱光検出信号のパルス幅は粒子長を表す。一方、予め粒子、例えば有核細胞に蛍光染色を施した場合などには、蛍光検出信号のピークレベルは核等の染色度合いを表し、パルス幅は蛍光染色部分長を表す。このような各粒子の特徴を表すパラメータをもとにヒストグラムを作成したり、複数のパラメータを組合わせて粒子の分布を示すスキャッタグラムを作成したりして、試料に含まれる粒子の種類・数などを統計的に解析することが行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、フローサイトメータにおいて形態・構造の単純な粒子から検出される光検出信号波形は、図７のような単純なものとなる。一方、形態・構造が複雑な粒子は信号波形も複雑になり、一つあるいは二以上の谷を有するものとなる。
また、形態・構造が単純な粒子の場合でも、複数の粒子が近接した状態でフローサイトメータの検出領域を通過（近接通過）した場合には、前記形態・構造が複雑な粒子と同様に、信号波形に谷が生じる。そのような信号波形の例を図８に示す。
【０００５】
しかしピークレベルやパルス幅といったパラメータには、信号波形の谷の状態が反映されないため、ピークレベルやパルス幅の値を比較しただけでは形態・構造が単純な粒子と複雑な粒子とを区別できないことがある。また複数の粒子が近接通過した場合は、大型で形態・構造が複雑な粒子と区別できないことがある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれらの問題点に鑑み、従来のピークレベルやパルス幅等に加え、信号波形の谷を反映したパラメータを算出する機能を有する粒子分析装置および粒子分析方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、粒子を含む試料液をシースフローセルに流し、前記シースフローセルにレーザ光を照射して前記粒子から光検出信号を検出する検出部と、前記検出部で検出された光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する信号処理部と、前記信号処理部によって算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う分析部と、を備えた粒子分析装置を提供するものである。また、本発明は、フローサイトメータを用いた粒子分析方法であって、粒子を含む試料液にレーザ光を照射して、前記試料液中の粒子から光検出信号を検出する工程と、検出された前記光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する工程と、算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う工程と、を備えた粒子分析方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において分析の対象となる粒子には、血液中の血球や尿中の細胞・細菌などといった粒子が含まれる。
【０００９】
検出部は、粒子を含む試料液をシース液で包んでシースフローセルに流し、そのシースフローセルにレーザ光を照射し、各粒子からの散乱光や蛍光等を光検出信号として検出するためのものである。この検出部には公知の光学式検出器を用いることができる。具体的には、シースフローセルは、その内部を通過する粒子から光学的情報を得るため、透明で表面が滑らかなものが好適であり、ガラス等の材質が用いられる。また照射するレーザ光としては、半導体レーザやアルゴンレーザ等が用いられる。粒子からの光学的情報を光電変換して光検出信号を検出するための光電変換素子としては、フォトダイオードやフォトトランジスタ、フォトマルチプライヤチューブ等が用いられる。その他、レンズ、ミラー等の各種光学部品が必要に応じて用いられる。
【００１０】
信号処理部は、検出部により得られた各粒子毎の光検出信号についての波形を処理し、差分積分値をはじめ各種パラメータを算出する回路からなるものである。また差分積分値の他、ピークレベル、パルス幅等がパラメータとして算出されてもよい。ピークレベル、パルス幅等のパラメータは公知のピークホールド回路やカウンタ回路等によって算出できる。
【００１１】
本発明において差分積分値とは、信号波形を微分し、その絶対値を足し合わせた値である。すなわち、図７に示したような波形に谷の無い信号の差分積分値は、その信号のピークレベルＨを２倍した値と同じになる。
【００１２】
一方、波形に谷の有る信号の差分積分値は、その信号のピークレベルを２倍した値よりも大きくなる。図８を用いてその算出例を示す。すなわち、図８の信号の差分積分値は、Ｈ１・Ｈ２・Ｈ３・Ｈ４の和で求められるところ、以下の式が成り立つ。
（Ｈ１＋Ｈ２＋Ｈ３＋Ｈ４）＝（Ｈ１×２＋Ｈ３×２）＞（Ｈ１×２）
【００１３】
Ｈ１は図８の信号のピークレベルであるので、波形に谷の有る信号の差分積分値は、その信号のピークレベルを２倍した値よりも大きくなるということが上記の式からわかる。また、この差分積分値は、波形に谷が多いほど、また谷が深いほど大きい値となり、ピークレベルを２倍した値との差も大きくなる。
【００１４】
上記のような差分積分値の性質から、粒子の形態・構造の複雑さ、あるいは粒子の近接通過を反映するパラメータとして信号波形の差分積分値が有用であることがわかる。
【００１５】
信号波形の差分積分値は、信号を一定の周期でサンプリングし、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算する回路を用いることで算出できる。なお、従来のアナログ信号処理方式では回路が複雑になり、また信号ゲインの温度変化や経年変化が生じやすいため差分積分値の信頼性を確保するのは難しい。そこでアナログ信号をその信号周波数帯域よりも十分高い周波数でサンプリングＡ／Ｄ変換し、その波形データをデジタル信号処理することによって差分積分値を算出することが好ましい。
【００１６】
なお検出された信号のＳ／Ｎ比が悪い場合には、高周波のノイズ信号が混じるために形態・構造の単純な粒子の信号であっても波形に微少な谷を多数含むこととなり、形態・構造の複雑な粒子との区別が困難になる。従って、パラメータとして差分積分値を有効に活用するには、検出された信号からノイズ信号を除去する必要がある。その対策としては、信号処理部において差分積分値を算出する処理の前処理として、ハイカットフィルタを設ける等の方法が考えられる。
【００１７】
分析部は、信号処理部で算出された各種パラメータに基づき、統計解析することで試料液中に存在する粒子を分析するものであり、マイクロコンピュータやパーソナルコンピュータ等によって構成できる。統計解析の際にはヒストグラムや、複数のパラメータを組合わせてなるスキャッタグラム等が作成されてもよい。
【００１８】
また分析部による分析結果を出力するため、本発明はさらに出力部を備えてもよい。出力部にはＣＲＴやＬＣＤ等の表示手段、あるいはプリンタ等を用いることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、図面に基づいて本発明の実施例について説明する。なお本発明が以下の実施例に限定されるわけではない。
【００２０】
図１は本実施例の構成を示す図である。検出部１では、レーザ光源１１から発せられたレーザ光がコンデンサレンズ１２により楕円形に絞られてシースフローセル１３内を通過する粒子に照射される。試料液に尿を用いる場合などは、その楕円形のサイズは、試料液の流れの方向には被検粒子径と同程度、例えば１０μｍ前後であり、試料の流れ方向と直交する方向には被検粒子径より十分大きく、例えば１５０〜４００μｍ程度である。
【００２１】
その後、前方散乱光は集光レンズ１４を介してフォトダイオード１５により検出され、前方散乱光信号として信号処理部２へ送られる。またシースフローセル１３から集光レンズ１６を介し、ダイクロイックミラー１７により反射された側方散乱光はフォトマルチプライヤチューブ１８に、ダイクロイックミラー１７を通過した側方蛍光はフォトマルチプライヤチューブ１９によってそれぞれ側方散乱光信号、側方蛍光信号として検出され、信号処理部２へ送られる。
【００２２】
以下、信号処理部２における波形処理において差分積分値を算出する回路について説明する。本実施例の信号処理部２はピークレベル、パルス幅といったパラメータを算出する回路も有するが、これらは公知であるため説明を省略する。
【００２３】
図２は信号処理部２の差分積分値算出回路を示す図である。また図３は本回路におけるタイミングチャートの概略である。本実施例の差分積分値算出回路においては、連続した光検出信号波形のうち粒子を検出した部分（粒子信号）の信号波形サンプリングデータの、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算することによって差分積分値を求める。
【００２４】
まず、検出部１で検出された光検出信号（アナログ信号）がＡ／Ｄコンバータ２１によってサンプリングＡ／Ｄ変換される。この際に用いられるサンプリングクロックは、アナログ信号の周波数帯域よりも十分に周波数の高いものである。
サンプリング周期毎にＡ／Ｄ変換された波形サンプリングデータＤ１は、比較器２２において、それが粒子信号か否かを検知するために予め設定されたディスクリレベルと比較され、このディスクリレベルより大きくなったらその信号が粒子を検出したものとみなし、比較器出力信号Ｓ１がＨＩＧＨになる。同時にサンプリングクロックに同期して波形サンプリングデータＤ１がサンプリングデータレジスタ２３にラッチされる。
【００２５】
差分器２４にはＡ／Ｄコンバータ２１からの波形サンプリングデータＤ１及びサンプリングデータレジスタ２３にラッチされていた波形サンプリングデータＤ２が送られる。ここで、サンプリングデータレジスタ２３にラッチされていたデータＤ２はＡ／Ｄコンバータ２１からのデータＤ１より１クロック前のデータであるので、これら二つの波形サンプリングデータの差の絶対値が差分器２４で算出される。
【００２６】
比較器出力信号Ｓ１がＨＩＧＨになることで制御回路２５が働き、加算イネーブル信号Ｓ２を発する。これにより、差分器２４から次々と出力される差分器出力データＤ３を足し合わせるための累積加算器２６の動作が開始する。波形サンプリングデータＤ１がディスクリレベルより小さくなり比較器２２の比較器出力信号Ｓ１がＬＯＷになると、それに呼応して制御回路２５の加算イネーブル信号Ｓ２がＬＯＷになり、累積加算器２６の動作が停止する。
【００２７】
累積加算器２６の出力データＤ４は、波形サンプリングデータＤ１がディスクリレベルより大きい期間での差分積分値である。そこで加算器２７により、さらにディスクリレベルの２倍値が加算される。そのデータ（加算器出力データＤ５）は、前記加算イネーブル信号Ｓ２がＬＯＷになったのに呼応して制御回路２５から出力されたラッチイネーブル信号Ｓ３に同期し、差分積分レジスタ２８にラッチされる。
【００２８】
一つの粒子信号波形の差分積分値について、差分積分レジスタ２８へのラッチが完了したら、次の粒子信号に備えるため累積加算器２６をクリアする。このクリア動作は前記ラッチイネーブル信号Ｓ３に呼応して制御回路２５から出力されたクリア信号Ｓ４に基づく。
【００２９】
以上のようなステップで算出された各粒子信号波形の差分積分値は、別途算出されたピークレベルやパルス幅等のパラメータとともに時系列に、メモリ（図示せず）に記憶される。
【００３０】
一試料に対する測定が終了したら、前記メモリに記憶された差分積分値、その他のパラメータが読み出され、分析部３においてスキャッタグラムの作成、統計解析が行われる。
【００３１】
図４は、本実施例を用いた粒子分析装置において分析対象の粒子を含む試料液として尿を用いた際に作成されたスキャッタグラムの一例であり、座標の縦軸には前方散乱光検出信号の波形の差分積分値の１／２の値を、横軸には前方散乱光検出信号の波形のピークレベルをとったものである。
【００３２】
波形に谷の無い信号の差分積分値はその信号のピークレベルを２倍した値と同じになり、波形に谷の有る信号の差分積分値はその信号のピークレベルを２倍した値よりも大きくなることは前記の通りである。これらのことを利用した図４のスキャッタグラム上において、形態・構造の単純な粒子は傾きが１である直線上付近に分布し、この直線より上側に分布する粒子は形態・構造の複雑な粒子又は複数の粒子が近接通過したものと判断できる。
【００３３】
尿中に含まれる粒子としては、赤血球・白血球・上皮細胞・円柱・連鎖状球菌・細菌等の各種細胞が挙げられる。これらのうち、赤血球・白血球・細菌などは形態・構造が単純な粒子であり領域４ａに分布する可能性が高く、円柱・連鎖状球菌など形態・構造が複雑な粒子、あるいは形態・構造が単純な粒子が検出部を近接通過した場合は領域４ｂに分布する可能性が高い。
【００３４】
このように、パラメータとして信号波形の差分積分値を用いることにより、形態・構造が単純な粒子と複雑な粒子、もしくは近接通過した粒子とを分類することが可能となる。また、この分析結果を従来より行われている分析による結果と組合わせて用いることで、粒子の分類精度を向上させることができる。
【００３５】
ところで、パラメータにピークレベルと差分積分値のみを用いただけでは、形態・構造が複雑な粒子と、単純な粒子が近接通過した場合とを区別するのが困難であることが考えられる。図５は、円柱の前方散乱光検出信号の波形と、二つの白血球が近接通過した場合の前方散乱光検出信号の波形とを比較したものであるが、これらは前記図４のスキャッタグラム上ではいずれも領域４ｂに出現することになる。
【００３６】
しかし、尿中に含まれる粒子においては、形態・構造の複雑な粒子はそのサイズが大型であってパルス幅も非常に大きいものとなり、形態・構造の単純な粒子が近接通過した場合のパルス幅よりもさらに大きいことが一般的である。例えば、円柱の粒子長は通常１００〜３００μｍ程度であり、白血球の粒子長は１０〜１５μｍ程度であるため、円柱のパルス幅と、白血球が近接通過した場合のパルス幅は、図５に示したように明らかに異なる大きさとなる。そこで差分積分値・ピークレベルを用いた分析に、更にパルス幅をパラメータとした分析を加味することにより、形態・構造が複雑な粒子と、単純な粒子が近接通過した場合との分類精度を向上することができる。
【００３７】
まず分析部３において、図４のスキャッタグラム上で形態・構造が複雑な粒子と、形態・構造が単純な粒子が近接通過した場合とが混在しているとされる領域４ｂを切り出す。次にその領域内に分布する粒子群につき、パルス幅をパラメータとしたヒストグラム、あるいはパルス幅とピークレベルをパラメータとしたスキャッタグラム等を作成する。
【００３８】
図６はこうして作成されたヒストグラムの一例である。座標の縦軸には粒子の度数を、横軸にはパルス幅をとり、前記図４のスキャッタグラムの領域４ｂ内に分布する粒子の度数をパルス幅毎に算出する。ここで粒子の種類に対応した閾値を予め設定しておくことにより、形態・構造が複雑な粒子、近接通過した粒子各々の計数・分類が可能となる。またこの結果を従来より行われている分析による結果と組合わせて用いることで、粒子の分類精度を向上させることができる。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、粒子の特徴を反映するパラメータとして差分積分値を用いることで、粒子の形態・構造の複雑さ、あるいは複数の粒子の近接通過という観点から粒子の分類を可能にするものである。
【００４０】
また本発明の粒子分析装置および粒子分析方法は、差分積分値をピークレベルやパルス幅といった従来のパラメータと組合わせて用いることにより、より分類精度の高い粒子分析を可能にするものである。
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の構成の概略を示す図
【図２】差分積分値算出回路を示すブロック図
【図３】差分積分値算出回路におけるタイミングチャートを示す図
【図４】本発明において作成されたスキャッタグラムを示す図
【図５】円柱の信号波形と白血球が近接通過した場合の信号波形とを比較する図
【図６】本実施例におけるヒストグラムを示す図
【図７】波形に谷の無い信号の一例を示す図
【図８】波形に谷の有る信号の一例を示す図
【符号の説明】
１  検出部
１１レーザ光源
１２コンデンサレンズ
１３シースフローセル
１４集光レンズ
１５フォトダイオード
１６集光レンズ
１７ダイクロイックミラー
１８フォトマルチプライヤチューブ
１９フォトマルチプライヤチューブ
２  信号処理部
２１Ａ／Ｄコンバータ
２２比較器
２３サンプリングデータレジスタ
２４差分器
２５制御回路
２６累積加算器
２７加算器
２８差分積分レジスタ
Ｄ１波形サンプリングデータ
Ｄ２波形サンプリングデータ
Ｄ３差分器出力データ
Ｄ４累積加算器出力データ
Ｄ５加算器出力データ
Ｓ１比較器出力信号
Ｓ２加算イネーブル信号
Ｓ３ラッチイネーブル信号
Ｓ４クリア信号
２  信号処理部
３  分析部
【図１】
0004554810.tif 000002
【図２】
0004554810.tif 000003
【図３】
0004554810.tif 000004
【図４】
0004554810.tif 000005
【図５】
0004554810.tif 000006
【図６】
0004554810.tif 000007
【図７】
0004554810.tif 000008
【図８】
0004554810.tif 000009