(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プロモーター、
ｂ）前記プロモーターに操作可能に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
ｃ）前記プロモーターの下流でかつ、前記コーディング配列の上流にある、配列番号：1のＭＩＳ配列
を含んでなる発現ベクター。
【請求項２】
ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
コーディング配列が、ｔＩＣＡＭ１（４５３）をコードする請求項１の発現ベクター。
【請求項４】
増幅マーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンターゼ及び多剤耐性遺伝子からなる群より選ばれる請求項２記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、遺伝子工学技術で作製された哺乳類細胞系から生物学的に活性のあるタンパク質を生産することに関する。具体的には、本発明は、ＣＭＶプロモーターのすぐ下流でかつタンパク質コーディング配列の上流にある、エプスタイン−バールウイルス由来の５’−イントロン配列（５’−ＩＳ）のＭＩＳを含んでいる新規な発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子増幅は、哺乳類細胞におけるタンパク質生産を増大するために最も一般的に用いられる方法である。目的のタンパク質コーディング配列の増幅のためには、通常、そのタンパク質をコードしている機能的転写単位を増幅マーカーに共有結合的に連結する。次に、転写単位及び増幅マーカーを含んでなる発現ベクターを適切な細胞にトランスフェクトし、続いて付随する選択を可能とする薬剤を用いて増幅する。
【０００３】
最も広く用いられる遺伝子増幅方法は、メトトレキサート（ＭＴＸ）の増加する濃度を用いてジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞と共にｄｈｆｒ発現ベクターを使用することを含む（Ｋｅｌｌｅｍｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：７２３−７２９、１９９１）。組織プラスミノーゲンアクチベータ、エリスロポエチン及び因子VIIIを初めとする多数の商業価値のあるタンパク質がこの方法により生産されている（Ｋａｕｆｍａｎへの米国特許第４，７４０，４６１号及びＫａｕｆｍａｎ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１７５０−１７５９、１９８５を参照）。この方法は、通例、内在性ｄｈｆｒ遺伝子の存在のために、ｄｈｆｒを欠失していない細胞宿主には拡張されていない。
【０００４】
しかしながら、ｄｈｆｒ陽性の細胞宿主を治療タンパク質を発現するために用いた成功例も報告されている。米国特許第４，９６５，１９９号（Ｗｏｏｄ等、１９９０）には、ｄｈｆｒ陽性のベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１細胞）での因子VIIIの生産方法が記述されている。この方法は、（i）ｄｈｆｒ配列に連結した因子VIIIをコードするＤＮＡ配列及びネオマイシン耐性を与える選択マーカーで宿主細胞を同時トランスフェクションし、（ii）Ｇ４１８を含んでいる選択培地でトランスフェクションされたものを選択し、そして（iii）メトトレキサート（ＭＴＸ）の増加する量を含んでいる培地中でＧ４１８耐性細胞を増幅することを含む。
【０００５】
Ｗａｌｌｓ等（Ｇｅｎｅ、８１：１３９−１４９、１９８９）は、ヒト胚腎臓細胞で機能的プロテインＣを発現するためにｄｈｆｒ／ＭＴＸ同時増幅方法を使用することに関して報告している。Ｏｋａｍｏｔｏ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８：５５０−５５３、１９９０）も、ヒトリンパ球様細胞における顆粒球刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の増幅及び発現を記述している。
【０００６】
組み換えＤＮＡ技術の最近の進歩にもかかわらず、因子VIIIの高い生産性を有する組み換え細胞クローンの誘導は依然として困難なままである。Ｇｏｒｍａｎ（１９８７年９月１７日に開示された欧州特許出願公開第０２６０１４８号、引用することにより本明細書の内容となる）は、プロモーターの下流でかつ因子VIIIをコードしているＤＮＡの上流に安定化配列（ＣＩＳと表示されるイントロン配列）を有する発現ベクター（ｐＣＩＳ−Ｆ８）の構築を記述している。このベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター及びエンハンサー、因子VIIIをコードしているＤＮＡ及び３’転写終結配列で構築された。この安定化配列が存在しないと、因子VIIIの発現は試験したどの細胞型にも見られなかった。この安定化配列は、プロレラキシンをコードしているＤＮＡ配列にも連結された。一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクションアッセイにおける両タンパク質の分泌は、安定化配列の存在に依存した。
【０００７】
Ｓｔｏｌｚｅｎｂｕｒｇ等（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、１０３：２０９−２１４、１９９４）は、ｍｕＮＴＳ２の１８０ｂｐ相同領域が哺乳類細胞における増幅促進活性のために必須であることを述べた。しかしながら、この配列を用いた安定な遺伝子発現は認められなかった。
【０００８】
【発明の構成】
本発明者は、利用できる技術を用いて構築された新規な発現ベクターを用いることにより、タンパク質発現を著しく増加することが可能であることを見いだした。ベクターの詳細並びにその作製及び使用方法を以下に記述する。
【０００９】
本明細書に記述された発現ベクターは、ＣＭＶのプロモーター及びエンハンサー、２個の同一なドナー部位及びそれに続く単一のアクセプター部位を含んでいるイントロン配列、レポーター遺伝子を挿入するための唯一の制限酵素部位（ＨｐａＩ）並びにポリ−Ａ領域、それに続く選択マーカー及びプラスミドバックボーンを含んでなる。好ましい態様において、イントロン配列はエプスタイン−バールウイルス由来であり、ＭＩＳと表示される。このベクターをｐＳＭ９７と称する。このベクターは、レポーター遺伝子、すなわち、所望する適切なＤＮＡコーディング配列を哺乳類細胞に導入して、これらの細胞によるタンパク質発現を増加し、そして長期間の培養におけるタンパク質の発現を安定化するために用いられる。一つの好ましい態様において、レポーター遺伝子の配列は可溶性ｔＩＣＡＭ−１（４５３）（Ｇｒｏｖｅ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６０１５−６０２３、１９９１を参照）をコードする。得られたベクターは、ｐＳＭ９８である。
【００１０】
上流（５’）イントロン配列、例えば、ＭＩＳを含んでいる発現ベクターは、５’−ＩＳを含まないベクターの増幅と比較した場合、意外にも、ｄｈｆｒ／ＭＴＸ系で発現ベクターの増大した増幅を示した。ベクターの効率よい増幅により、レポーター遺伝子産物、例えば、可溶性ｔＩＣＡＭ−１（４５３）をより多量に安定に発現できた。
【００１１】
好ましい増幅マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）及び多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）のような他のマーカーを代用することができるけれども、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）である。トランスフェクトする細胞宿主はあらゆる哺乳類細胞であることができ、そしてｄｈｆｒ欠失である必要はない。染色体ＤＮＡに選択遺伝子を組み込むことが知られている細胞系が最も望ましく、例えば、ヒト胚腎臓（２９３Ｓ）、ヒトＢ−細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）及びマウス骨髄腫細胞系である。
【００１２】
５’−ＩＳを含むまたは含まないベクターでトランスフェクトした細胞からのｔＩＣＡＭ−１（４５３）の分泌は、一時的トランスフェクションアッセイ及び増幅工程の間の初期でさえほとんど同じであった。しかしながら、ベクターｐＳＭ９８から誘導された（ＭＴＸを用いた遺伝子増幅後の）個々のクローンからのｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌は、５’−ＩＳ配列を欠くベクターｐＳＨ９２から誘導されたクローンのものより多量でかつ安定であった。多量に分泌する細胞系は、５’−ＩＳを含むベクターからのｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列のより多い（サザン分析から概算された、細胞当たり２０コピーより多い）組み込まれたベクターコピー数を保有していた。一方、５’−ＩＳを含んでいないベクター由来の細胞系は、長期間の培養で不安定であり、ｔＩＣＡＭ−１（４５３）のより少ない組み込まれたベクターコピー数を保有していた（サザン分析から概算された、細胞当たり２、３コピー）。従って、５’−ＩＳを含んでいるベクターを用いて、トランスフェクトされた哺乳類細胞系の生産性を高め、かつ安定化することができる。
【００１３】
【好適な態様の記述】
発現ベクターの構築
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）のＢＭＬＦ１と命名された読み枠からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＭＩＳ配列を作製した。このＭＩＳ配列は、Ｂ９５−８ ＥＢＶの８４，１２２から８４，２２７までのイントロン配列を含んでいるＢ９５−８エプスタイン−バールウイルスの８４，１０５から８４，２６２までのＤＮＡ配列を包含している（Ｆａｒｒｅｌｌ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第８巻、Ｇ．Ｋｌｅｉｎ編集、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；ジーンバンク登録番号Ｘ００７８４）。２個のプライマー（５’ＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴ３’（配列番号２）及び（５’ＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴ３’（配列番号３））は、指向性クローニングのためにフラグメント（ＭＩＳ）のそれぞれ５’及び３’末端にＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）及びＨｐａＩ（ＧＴＴＡＡＣ）配列の伸長した制限酵素部位を有する。ＰＣＲ増幅には、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＃Ｎ８００８−００７０）に記述されたプロトコルを用い、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＃Ｎ８０１−０１５０）で反応を行った。ＰＣＲ反応混合物中のＭｇＣｌ2濃度は１．５ｍＭから４．０ｍＭまでで変えた。鋳型ＤＮＡの変性は９５℃で１０分間行った。９５℃で１分間の最初の融解工程で増幅サイクルを開始し、次に６０℃で１分間のアニーリング工程及び７２℃で１分間の伸長工程を続けた。このサイクルを３０回繰り返し、そして反応を停止し、４℃で一晩保持した。ＰＣＲ増幅したフラグメントをＨｐａＩ及びＣｌａＩで消化し、次に（因子VIII配列をまず除去した後に）ｐＣＩＳ−Ｆ８のＣｌａＩ及びＨｐａＩ部位に挿入した。得られたＭＩＳを含むプラスミドをｐＳＭ９５と称した。図２参照。このＭＩＳ配列は、ドナー部位を含む７１ｂｐ配列の予期しない反復を含むことによって、元のＥＢＶ配列と異なる。従って、ＭＩＳ配列（２２９ｂｐ）は、２個のドナー部位及び１個のアクセプター部位を有する（図１参照）。
【００１４】
次に、ＳａｃII及びＣｌａＩ消化によりｐＳＭ９５からイントロン配列ＣＩＳを除去した。残ったバックボーンをＫｌｅｎｏｗで平滑末端にし、再連結した。この得られたプラスミドｐＳＭ９７は、ｏｒｉ及びａｍｐr遺伝子を含んでいるプラスミドバックボーンに、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー（ＣＭＶｅ／ｐ）、ＭＩＳ、クローニングのための唯一のＨｐａＩ部位、ポリＡシグナル及びＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒからなる。ｐＨＲＲ８−２（Ｇｒｅｖｅ、Ｊ．Ｍ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６０１５−６０２３、１９９１）からＨｉｎｄIII及びＸｂａＩでの消化により調製したｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列を平滑末端にし、ｐＳＭ９７のＨｐａＩ部位に挿入した。ｐＳＭ９７中のｔＩＣＡＭ−１（４５３）の正しい方向のものをｐＳＭ９８と称した（図２）。ｐＳＨ９２は、ＭＩＳ配列を欠いていることを除いてｐＳＭ９８と同じである（図３）。プラスミドＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ等による編集、８６−９４、１９８２）に記述された方法により調製した。
【００１５】
ｔＩＣＡＭ１（４５３）を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体Ｃ９２．５（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９９３−７９９７、１９９１）を丸底マイクロタイタープレートに吸着させた。１％ ＢＳＡを含んでいるＰＢＳの溶液での処理によりこれらのプレートをブロックし、次にｔＩＣＡＭ−１（４５３）を含んでいるサンプルとインキュベートした。次に、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ビオチン化したｔＩＣＡＭ−１（４５３）の異なるエピトープに対する第二のモノクローナル抗体Ｃ７８．５（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ等、１９９１、上記）とインキュベートした。洗浄後、これらのプレートをＨＲＰ−ストレプトアビジンとインキュベートした。次に、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応させ、そして１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。４５０／５７０ｎｍでＯＤを読み取り、そして精製したｔＩＣＡＭ−１（４５３）の標準曲線と比較することにより、ｔＩＣＡＭ−１（４５３）濃度を測定した。
【００１６】
発現ベクターを試験するための一時的トランスフェクションアッセイ
発現ベクターの生物学的活性を試験するために、ベクターｐＳＨ９２及びｐＳＭ９８で２９３Ｓ細胞をトランスフェクトした。各実験で、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから提供されたプロトコルに従って陽イオン性リポソームＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１０４５９−０１４）とプレインキュベートした３μｇの各ベクターＤＮＡと同数の細胞（〜２ｘ１０6細胞／ウェル）を混合した。ベクターＤＮＡ濃度をＤＮＡ蛍光光度計（Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｄｅｌ ＴＫＯ １００）を用いて注意深く測定し、そしてアガロースゲルで確認した。ＤＮＡ及びＤＭＲＩＥ−Ｃのカクテル（１ｍｌ）と細胞を５時間インキュベーションした後、５％ＦＢＳを補足した新しい培地をウェルに加えた。トランスフェクション後２ないし３日目に細胞数を数えた。ｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。繰り返した一時的トランスフェクションアッセイから、我々は、（５’−イントロン配列（５’−ＩＳ）を含むまたは含まない）２種の異なるベクターでトランスフェクトした２９３Ｓ集団にｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌の明らかな違いがないことを認めた。表１参照。これらの結果は、ｐＳＭ９８中の５’−ＩＳが一時的トランスフェクションアッセイにおけるｔＩＣＡＭ−１（４５３）の発現に対して直接的な影響を及ぼさないことを示す。この結果は、一時的トランスフェクションアッセイにおいてある種のタンパク質の発現に対して安定化効果を示したＧｏｒｍａｎの特許と異なる。
【００１７】
【表１】
0004450438.tif 000002
【００１８】
表１．  ５’−ＩＳを含む及び含まない発現ベクターｐＳＭ９８及びｐＳＨ９２をそれぞれ用いた一時的トランスフェクションアッセイにおけるｔＩＣＡＭ−１（４５３）発現の比較
主として、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ ３００（ＢＴＸ）セットを７１５Ｖ／ｃｍ及び３００μＦで用いたエレクトロポレーションで、５−１０ ｘ １０6細胞を１０μｇの発現ベクターｐＳＨ９２及びｐＳＭ９８でトランスフェクションすることにより生産細胞系を樹立した。トランスフェクトした細胞を６ウェル（ウェル当たり３ｍｌ）型で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足した培地１８ｍｌ中で培養した。トランスフェクション後２ないし３日目に、トランスフェクション効率を調べるためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。１０％の透析したＦＢＳを補足した、ダルベッコの修正イーグル培地並びにヒポキサンチン及びチミジンを欠いた栄養混合物Ｆ−１２（１：１）からなるメトトレキサート（５０ｎＭ）を含んでいる選択培地で９６ウェル型（２００μｌ／ウェル）当たり約１０6細胞を培養した。このメトトレキサートを含んでいる選択培地をＭＴＸ−ＳＭと呼んだ。各ウェルの培地の半分（１００μｌ）を新しいＭＴＸ−ＳＭと毎週交換した。
【００１９】
ｔＩＣＡＭ−１（４５３）の生産性をトランスフェクション後３週目に９６ウェルプレートからＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェル型の最も高いシグナルのウェルの細胞を６ウェル型に移した。生産性を繰り返して測定した後、発現ベクターを増幅するために、通常４−６集団の最もよく分泌している最初の集団を増加する濃度のＭＴＸ（５０、１００及び２００ｎＭ）でさらに処理した。単一の細胞クローンを得るために、１００ｎＭ及び２００ｎＭ ＭＴＸの段階で９６ウェル型（０．５−２細胞／ウェル）を用いて限界希釈クローニング（ＬＤＣ）に付した。細胞を接種した後１週及び２週目に、各ウェルの単一細胞増殖を調べるために９６ウェルプレートを顕微鏡下で試験した。ＬＤＣの間及びその後、ＭＴＸは選択培地から除かれたが、１０％の透析したＦＢＳは含まれた。接種後約２週目にＥＬＩＳＡにより生産性を測定した。単一細胞から増殖した最も多量に分泌しているウェルの細胞を６ウェル型に移し、そして最も高いレベルのｔＩＣＡＭ−１（４５３）を分泌するクローンを選択するために比生産性（ｐｇ／細胞／日）を繰り返し測定した。最もよいクローン（４−６クローン）の無血清培地への適応をＴ７５組織培養瓶を用いて培養培地中の血清含有量を徐々に減少することにより行った。高い生産性を示すクローンを誘導する工程の要約の図４を参照。我々は、ｐＳＨ９２から誘導されたクローンが増加した増幅工程を通して生産不安定性を示すことを認めた。
【００２０】
ｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローン中の組み込まれたゲノムコピー数
ポリメラーゼ連鎖反応により調製したｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列のフラグメント（６６３ｂｐ）をプローブとするサザンブロットハイブリダイゼーションから、細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数を測定した。個々のクローンから調製された細胞ＤＮＡを用いて、基本的にＳｏｕｔｈｅｒｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３−５１７、１９７５）及びＷａｈｌ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３６８３−３６８７、１９７９）に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍのプロトコルに記述されたようにサザン分析を行った。全細胞ＤＮＡを調製するために、対数増殖期の細胞を集め、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。このペレットを少量のＰＢＳ／溶解バッファー（２：１）に再懸濁した。溶解バッファーは３％サルコシル、７５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ ８及び２５ｍＭ ＥＤＴＡからなった。ＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍｌの最終濃度）と３７℃で６０分間インキュベーションした後、プロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌの最終濃度）を加え、５０℃で一晩インキュベーションを続けた。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８で飽和したフェノールを等量加え、この懸濁液を穏やかに混合した。遠心分離後、ＤＮＡを含んでいる水相を有機相から分離した。きれいな中間相が見られるまでフェノール処理を繰り返し、続いてクロロホルムで同様に抽出した（２ないし３回）。２容量の冷えた無水エタノールを加え、そしてゆっくりと混合することにより、水相中のＤＮＡを沈殿させた。白色の沈殿したＤＮＡを封緘したパスツールピペットを用いて巻きつけた。アルコールを完全に乾燥した後、ＤＮＡを少量の１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ ８、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。２６０及び２８０ｎｍで吸収を測定することによりＤＮＡ濃度を決定した。
【００２１】
組み込まれたゲノムコピー数を測定するために、細胞当たり１、５、２０及び５０ゲノムに等しいＥｃｏＲＩ消化したｐＳＭ９８ ＤＮＡを細胞ＤＮＡと一緒にゲルに添加した。細胞当たり２−３コピーに等しい内在性ＩＣＡＭ−１遺伝子由来の４．４ｋｂの内部コントロールは、少ないコピー数（半数分裂の３倍体（ｈａｐｌｏｔｒｉｐｌｏｉｄ）の染色体数を有する２９３Ｓ細胞の場合、３コピー）を測定するための優れた対照となった。サザン分析で検出されたｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列の大きさは、ＥｃｏＲＩで発現ベクターを消化した後、完全なＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ＭＩＳ及び完全なｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列を含んでいる２．３ｋｂであった。ベクターｐＳＨ９２から誘導されたクローンの大部分において細胞当たりの組み込まれたｔＩＣＡＭ−１（４５３）（２．３ｋｂの大きさ）コーディング配列のコピー数は、２９３Ｓクローンの細胞当たりの内在性ＩＣＡＭ−１（４．４ｋｂの大きさ）のコピー数と同等であった（図５及び６）。しかしながら、ｐＳＭ９８でトランスフェクトした２９３Ｓ及びＣＨＯ細胞から誘導されたクローンは、細胞当たりより多数の組み込まれたベクターコピー数（２０−４０）を保有した（図６、図７）。
【００２２】
比生産性及び細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数の比較
２群のクローンの間で顕著な相関関係が見られた（図７）。５’−ＩＳを含む発現ベクターから誘導されたクローン群は、多数の組み込まれたベクターコピー数（〜２０コピー／細胞）と共に高い生産性（〜２０ｐｇ／細胞／日）を示した。ＩＣＡＭ−１コーディング配列の非翻訳領域に５’−ＩＳを欠いたベクターから誘導されたクローン群は、より低いレベルのｔＩＣＡＭ−１（４５３）（１−１０ｐｇ／細胞／日）を分泌し、そしてより少数の組み込まれたベクターコピー数（２−３コピー／細胞）を保有した。後者の群は安定な生産体ではなく、すなわち、比生産性は長期間の培養中に減少し、そして凍結／解凍した細胞から元の生産性を回復することは非常に困難または不可能であった。これらの結果は、タンパク質コーディング配列の５’非翻訳領域に位置するイントロン配列がｄｈｆｒ／ＭＴＸ増幅系における発現ベクターＤＮＡの増幅を高めることを示す。これは、ｍＲＮＡ安定化機能の以前の報告（Ｈｕａｎｇ及びＧｏｒｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：９３７−９４６、１９９０）に加えた５’−ＩＳの機能の意外な新しい報告である。
【００２３】
【実施例】
ｔＩＣＡＭ−１（４５３）の連続生産
（ｐＳＭ９８でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞から誘導された）クローン４Ｈ９−２３を無血清培地に適応させ、そして生産性を減少せずに無血清培地ＭＩＣＴ４．１中で１年以上保持した。この期間の間に、我々は、ＳＦＭに適応後６週、３カ月及び８カ月目で細胞を凍結した。保持した培養物及び凍結／解凍した細胞からｔＩＣＡＭ−１生産性を測定し、そして〜２０ｐｇ／細胞／日の比生産性及び８０−１００μｇ／ｍｌの毎日の力価で安定であることが観察された。ｐＳＭ９８から誘導された３個のＣＨＯクローン（Ｂ９−Ｈ１２、Ｂ９−Ｈ１２−Ｇ１１及びＢ９−Ｅ１０）を無血清培地に適応させた。３クローンは全て、生産性を減少せずに無血清培地中で５カ月以上安定であった（１０−２０ｐｇ／細胞／日）。２９３Ｓクローン（４Ｈ９−２３）及びＣＨＯクローン（Ｂ９−Ｅ１０）を連続灌流しながらバイオリアクター中で保持した。３カ月培養後凍結したアンプルから解凍した４Ｈ９−２３細胞は、２ｇ／ｌのヒト血清アルブミン、１０μｇ／ｌのインシュリン及び１１μｇ／ｌのトランスフェリンを補足したＭＩＣＴ４．１中で１０週の研究の間に３００ｍｇ／ｌ／日の最大の生産性（容量生産性）を示した。Ｂ９−Ｅ１０は、１００日の研究の間にヒト血清アルブミンを含まない同じ培地を用いて４００−５００ｍｇ／ｌ／日の容量生産性を示した。詳細なファーメンター（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）データは示さない。
【００２４】
結論
安定なタンパク質発現を増大するために、哺乳類細胞系にタンパク質のＤＮＡコーディング配列を導入するための新規な哺乳類細胞発現ベクターが開発された。このベクターは、ＣＭＶプロモーターのすぐ下流にあるエプスタイン−バーウイルス由来のイントロン配列（ＩＳ）及び唯一のクローニング部位（ＨｐａＩ）をポリＡ領域と共に含んでなる。この発現ベクターは、トランスフェクトした細胞において向上した増幅効率を示し、そして大量に生産する安定な細胞クローンの誘導を助成する。このベクターは、いくつかの宿主哺乳類細胞におけるｔＩＣＡＭ−１（４５３）の増加し、かつ安定した生産のために特に有用である。
【００２５】
上記の実施例を与えられれば、当業者にとってその変形は容易に明らかであると認識される。従って、上記の実施例は具体例を挙げた説明とだけ解釈されるべきであり、そして本発明は以下の請求項によってのみ制限されるべきであると考えられる。
【００２６】
本発明の特徴及び態様を示せば以下のとおりである。
【００２７】
１．  ａ）プロモーター、
ｂ）そのプロモーターに適切に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
ｃ）プロモーターの下流でかつコーディング配列の上流にある、２個の同一のドナー部位及び１個のアクセプター部位を含んでなるイントロン配列
を含んでなる発現ベクター。
【００２８】
２．  ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる上記１の発現ベクター。
【００２９】
３．  コーディング配列が、ｔＩＣＡＭ１（４５３）と実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記１の発現ベクター。
【００３０】
４．  コーディング配列がｔＩＣＡＭ１（４５３）をコードする上記１の発現ベクター。
【００３１】
５．  ａ）プロモーター、
ｂ）そのプロモーターに適切に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
ｃ）プロモーターの下流でかつコーディング配列の上流にあるＭＩＳ配列を含んでなる発現ベクター。
【００３２】
６．  ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる上記５の発現ベクター。
【００３３】
７．  増幅マーカーが、デヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ及び多剤耐性遺伝子からなる群から選択される上記６の発現ベクター。
【００３４】
８．  コーディング配列が、ｔＩＣＡＭ１（４５３）と実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記５の発現ベクター。
【００３５】
９．  コーディング配列がｔＩＣＡＭ１（４５３）をコードする上記５の発現ベクター。
【００３６】
１０．  以下のＤＮＡ配列
AACTAGCAGC ATTTCCTCCA ACGAGGATCC CGCAGGTAAG AAGCTACACC
GGCCAGTGGC CGGGGCCCGA TAACTAGCAG CATTTCCTCC AACGAGGATC
CCGCAGGTAA GAAGCTACAC CGGCCAGTGG CCGGGGCCGT GGAGCCGGGG
GCATCCGGTG CCTGAGACAG AGGTGCTCAA GGCAGTCTCC ACCTTTTGTC
TCCCCTCTGC AGAGAGCCAC ATTCTGGAA   (配列番号：ｌ)
を含んでなるＤＮＡ分子。
【００３７】
１１．  ａ）  増幅マーカー及びＭＩＳ配列を含んでなる発現ベクターで哺乳類細胞群をトランスフェクトし、
ｂ）  増幅剤の存在下でこれらの細胞を増殖させ、そして、
ｃ）  工程ｂの細胞から、高い生産性を有している少なくとも一種の細胞系を選択する
工程を含んでなる哺乳類細胞系の安定なタンパク質発現を増大する方法。
【００３８】
１２．  哺乳類細胞が、ヒト胚腎臓細胞、ヒトＢ−細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞由来の細胞、ヒトＢ−細胞由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞由来の細胞及びマウス骨髄腫細胞由来の細胞からなる群から選択される上記１１の方法。
【００３９】
１３．  ａ）  プロモーター、コーディング配列並びにプロモーター及びコーディング配列の間に位置するイントロン配列を有し、さらに増幅マーカーを含んでなる発現ベクターで細胞の集団をトランスフェクトし、
ｂ）  増幅剤の存在下でこれらの細胞を増殖させ、そして、
ｃ）  工程ｂの細胞から、染色体ＤＮＡに組み込まれたベクターＤＮＡの増加したコピー数を有している少なくとも一種の細胞を選択する
ことを含んでなる、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたベクターからのＤＮＡのコピー数を増加する方法。
【００４０】
１４．  イントロン配列がＭＩＳである上記１３の方法。
【００４１】
１５．  哺乳類細胞が、ヒト胚腎臓細胞、ヒトＢ−細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞由来の細胞、ヒトＢ−細胞由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞由来の細胞及びマウス骨髄腫細胞由来の細胞からなる群から選択される上記１３の方法。
【００４２】
１６．  コーディング配列が、ｔＩＣＡＭ１（４５３）に実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記１３の方法。
【００４３】
１７．  コーディング配列がｔＩＣＡＭ１（４５３）をコードする上記１３の方法。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、ＣＭＶプロモーター、５’−イントロン配列（ＭＩＳ）及びＨｐａＩクローニング部位の直線地図を示す。平行した地図は、ＭＩＳ配列内の１７７ｂｐイントロンの位置を示す。
（ｂ）は、ｐＳＭ９８中のＭＩＳのヌクレオチド配列を示す。表示したものは、ＥＢＶ由来のヌクレオチド配列（括弧でくくられた、２２９ｂｐ、配列番号１）並びにその２個のドナー部位（開き括弧記号）及び１個のアクセプター部位（閉じ括弧記号）である。２個の反復配列（２ ｘ ７１ｂｐ）に下線を引く(細線及び太線)。（図に挙げた全配列は配列番号４である。）
【図２】ベクターｐＳＭ９８の構築方法を例示している流れ作業図を示す。
【図３】プラスミドｐＳＨ９２及びｐＳＭ９８からの最初の３，０００ｂｐの直線地図を示す。発現ベクターｐＳＨ９２は、ＣＭＶプロモーターの３’末端に平滑末端にしたｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディング配列（実線の矢印）を含む。ｐＳＭ９８は、ｔＩＣＡＭ−１（４５３）コーディン配列（実線の矢印）の非翻訳の５’末端に５’−イントロン配列ＭＩＳ（線影をつけたボックス）を保有する。
【図４】ｔＩＣＡＭ１（４５３）分泌クローンを誘導する全体的な工程を例示している流れ作業図を示す。
【図５】ｐＳＨ９２でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞から誘導されたｔＩＣＡＭ−１（４５３）を分泌するクローンのゲル電気泳動後のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す図に代わる写真である。各レーンは、以下のものを示す。
１．細胞当たり５０ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
２．細胞当たり２０ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
３．細胞当たり５ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
４．細胞当たり１ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
５．２９３Ｓ細胞ＤＮＡ
６ないし１４．ｐＳＨ９２でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞由来の９個のｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローンから調製した細胞ＤＮＡ。
【図６】ｐＳＨ９２またはｐＳＭ９８のいずれかでトランスフェクトした２９３Ｓ細胞から誘導されたｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローンのゲル電気泳動後のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す図に代わる写真である。各レーンは、以下のものを示す。
１ないし４．ｐＳＭ９８でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞由来の４個のｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローンから調製した細胞ＤＮＡ
５．細胞当たり５０ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
６．細胞当たり２０ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
７．細胞当たり５ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
８．細胞当たり１ゲノムコピーと等しい基準プラスミドＤＮＡ
９．２９３Ｓ細胞ＤＮＡ
１０ないし１３．ｐＳＨ９２でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞由来のｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローンから調製した細胞ＤＮＡ
１４ないし１７．ｐＳＭ９８でトランスフェクトした２９３Ｓ細胞由来のｔＩＣＡＭ−１（４５３）分泌クローンから調製した細胞ＤＮＡ。
【図７】サザン分析から概算した組み込まれたコピー数及びＥＬＩＳＡにより測定したクローンの生産性を比較する図である。個々のクローンは、５’−イントロン配列を含むベクター（ｐＳＭ９８）または５’−イントロン配列を含まないベクター（ｐＳＨ９２）のいずれかを用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ）または２９３Ｓ細胞（２９３Ｓ）のいずれかに由来する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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