(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のメソ孔を備えているメソポーラスシリカ構造体において、
樹状の骨格部を有し、且つ
該骨格部を、その長手方向に直交し、且つ貫通しているメソ孔が、５００ｎｍ四方に存在するメソ孔のうち、９０％以上を占めることを特徴とするメソポーラスシリカ構造体。
【請求項２】
前記樹状の骨格部は、枝分かれした該骨格部同士がつながってマクロ孔を形成しているか、あるいは、隣り合う該骨格部間には、マクロ孔サイズの間隙が形成されていることを特徴とする請求項１記載のメソポーラスシリカ構造体。
【請求項３】
前記複数のメソ孔が、ハニカム状に配列していることを特徴とする請求項１記載のメソポーラスシリカ構造体。
【請求項４】
前記複数のメソ孔は、極大値を含む１０ｎｍ以内の範囲内に８０％以上のメソ孔が分布している孔径分布を有することを特徴とする請求項１記載のメソポーラスシリカ構造体。
【請求項５】
前記メソ孔内に生体物質を担持していることを特徴とする請求項１に記載のメソポーラスシリカ構造体。
【請求項６】
複数の粒子が成型されてなる多孔体において、
該粒子が請求項１から５のいずれか１項に記載のメソポーラスシリカ構造体からなることを特徴とする多孔体。
【請求項７】
検体を検出するセンサーであって、
請求項６の記載の多孔体と電極とを備え、前記検体と前記メソ孔内に担持された前記生体物質との反応に基づいた電気的出力信号を検出することを特徴とするセンサー。
【請求項８】
検体の検出方法において、
請求項１記載のメソポーラスシリカ構造体のメソ孔内に生体物質を担持させたセンサーを用意する工程と、前記センサーに検体を含む流体を付与する工程と、
前記生体物質と前記検体との反応に基づいた出力信号を検出する工程と、を含むことを特徴とする検体の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な複数のメソ孔を有する構造体、多孔体、センサー、及び、構造体の製造方法、並びに、検体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔体としては、従来からゼオライトやシリカゲルが知られている。アルミノ珪酸塩からなるゼオライトは、吸着剤、イオン交換材、さらには触媒として実用化されている。このゼオライトは、結晶性で均一な細孔径を有し、優れた特性を持つが、孔径が一般的に約１ｎｍ以下と小さいため、孔径以上の有機化合物の吸着剤等には用いることができない。また、シリカゲルは、ゼオライトに比べ大きな孔径を有するものの、その孔径分布範囲が広く、構造の制御が課題とされている。
【０００３】
このような背景の中、ゼオライトよりも孔径が大きく且つ均一な孔径をもち、さらに細孔が規則的に並んでいる、メソポーラス材料と呼ばれる材料が開発されている。
【０００４】
メソポーラス材料は、界面活性剤を利用して製造されるものであり、細孔の孔壁、即ち多孔体の骨格を構成する材料として、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２などが報告されている。
【０００５】
また、細孔の形状としては、骨格を貫通するチューブ状や骨格内に閉じ込められた球状などが知られている。多孔体の骨格の形状としては、図１５に示すように分岐部分を持たない粒状のもの（非特許文献１）や、図１６に示すように分岐した樹状の骨格を有するもの（非特許文献２）が報告されている。
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサィアティ  １２６，２００４，７４４０−７４４１（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６，２００４  ７４４０−７４４１）
【非特許文献２】ケミカル・コミュニケーション  １９９８，２４６１−２４６２（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ．，１９９８，２４６１−２４６２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、メソポーラス材料に関しては盛んに研究がなされているものの、主たる構造としては、上記非特許文献１，２に記載されているものがあるにすぎなかった。そして、これらメソポーラス材料が、バイオセンサなどの機能デバイスにも適用され得ることから、機能デバイスとして好適な新規構造体の提供が強く望まれているところである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、メソ孔を有する構造体の構造制御に関して、鋭意検討を行っていたところ、新規構造体ができることを見いだし、本発明をなすに至った。
【０００８】
本発明の目的は、メソ孔を有する新規構造体を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の別の目的は、上記新規構造体を利用した多孔体、センサー、検体の検出方法を提供するものである。
【００１０】
本発明に係る構造体は、樹状の骨格部を有し、且つ該骨格部を、その長手方向に直交し、且つ貫通している複数のメソ孔を有する構造体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新しい機能材料としての応用が可能な構造体を提供することができる。
【００１２】
例えば、カラム等に適した多孔体を提供することが可能である。さらに、センサーとして用いた場合、従来よりも感度の高いセンサーを提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に係るメソ孔を有する構造体の一実施形態について、図１を用いて説明する。
【００１４】
図１において、１２は樹状の骨格部、１３は当該骨格部が有するメソ孔、１４は骨格部を構成するメソ孔の孔壁、１１は骨格部間の間隙やマクロ孔を示している。本発明に係る構造体は、同図のように、メソ孔が骨格部１２を、その長手方向１５に交差する方向１６に貫通している。図１の符号Ａは、樹状の骨格部１２の一部分を拡大して示しており、図１の符号Ｂは樹状の骨格部１２の他の一部分の部分的な断面を拡大して示している。
【００１５】
図１に示すように、骨格部が分岐することにより樹状形状が形成される。図１の実施形態では、骨格部の分岐により、３次元網目形状が形成されている。樹状とは、骨格部が枝分かれしたもの（単に分岐構造を有するもの）だけでなく、３次元網目状のものも含む概念である。
【００１６】
メソ孔とは、２ｎｍ以上５０ｎｍ以下の孔径を有する細孔のことであり、ＩＵＰＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）において定義されている。なお、ＩＵＰＡＣでは、２ｎｍ未満の孔径を有する孔はミクロ孔、５０ｎｍより大きい孔径を有する孔はマクロ孔と定義されている。
【００１７】
なお、図１は本実施形態に係る構造体の模式図であるが、実際の構造体のＳＥＭ写真を図２に示す。同図において、樹状の骨格部１２及び骨格間の間隙１１が示されている。
【００１８】
このように本実施形態に係る構造体は、図１に示すように、隣り合う骨格部間にマクロ孔サイズの間隙１１（間隙１１のある方向からの投影面積が直径５０ｎｍより大きな円の面積以上である間隙）が空いていてもよい。また、図３に示すように骨格部が分岐を繰り返して、骨格部同士がつながることにより形成されたマクロ孔１１を有するものであってもよい。構造体は粒子や膜でもいいが、粒子が好ましく用いられる。
【００１９】
（メソ孔の形状、孔径、長さ、配列）
本実施形態におけるメソ孔１３は、図１に示したように骨格部１２の長手方向１５を横切る方向１６に、チューブ状に伸びている。交差する方向１６は、例えば長手方向１５に直交する方向である。
【００２０】
特に、電子顕微鏡で観察できる範囲内（例えば、５００ｎｍ×５００ｎｍ）において、その９０％以上のメソ細孔が、上記直交する方向に配向していることが好ましい。
【００２１】
本発明に用いられるメソ孔としては、例えば、一方の開口部から他方の開口部まで孔径が単調増加している形状、孔径が不連続に変化する形状などであってもよい。また、メソ孔自体が途中で複数に分岐する形状でもよい。
【００２２】
本発明に用いられるメソ孔の配列としては、例えば図４に示すように升目の交点にメソ孔が配列したものや、ハニカム状に細孔が配列したものに限らず、規則的或いは不規則に配列したものであっても良い。
【００２３】
本発明に用いられるメソ孔の孔径は、２ｎｍ以上５０ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以上３０ｎｍ以下である。本発明に係る構造体をどのような用途に用いるかもによるが、例えば、バイオセンサに適用する場合には、抗体等の生体物質がメソ孔に導入できるように１０ｎｍ以上であることが好ましく、生体物質の立体構造安定化の点から３０ｎｍ以下であるのがよい。なお、孔径は孔の断面形状が円であれば直径のことであり、楕円など変形した円の場合は、最も長い部分である。
【００２４】
メソ孔の長さとしては、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下が好ましい。バイオセンサー等の反応場として利用する観点からは、５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下がより好ましいものである。
【００２５】
また、メソ孔同士の間隔は、例えば、１ｎｍ〜４ｎｍ程度である。なお、隣接する複数のメソ孔の伸長方向が、同じ方向に揃っていることもより好ましいものである。
【００２６】
ここで、メソ孔の孔径の具体的測定方法について説明する。
【００２７】
粉末状態のメソ孔を有する構造体について、窒素ガス吸脱着測定を行い、細孔径に関する情報を得ることができる。具体的には、窒素ガス吸着測定の結果から、Ｂｅｒｒｅｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法により細孔径分布を求める。本発明に好適に用いられる構造体の孔径分布は、単一の極大値を示し、且つ、当該孔径分布において、６０％以上のメソ孔が、極大値を含む１０ｎｍの幅を持つ範囲に含まれる。後述する実施例によれば、例えば、８０％以上の細孔の孔径が極大値から±５ｎｍ以内の範囲内、つまり極大値を含む１０ｎｍの幅を持つ範囲内に含まれる。より好ましくは９０％以上の細孔が１０ｎｍの幅を持つ範囲内に含まれると良い。
【００２８】
メソ孔の周期性は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定からその情報を得ることができる。本実施形態に係る構造体は、ＸＲＤ測定において、１ナノメートル以上の構造周期に対応する角度領域に少なくとも１つの回折ピークを有する。これは、メソ孔が規則的に配列していることを意味する。
【００２９】
なお、隣り合う骨格部間の間隙は、マクロ孔サイズの間隙、即ち５０ｎｍより大きいことが好ましく、より好適には１００ｎｍ以上７００ｎｍ以下である。また、分岐した骨格部がつながることにより形成されるマクロ孔は、孔径が５０ｎｍより大きいことが好ましく、より好適には１００ｎｍ以上７００ｎｍ以下である。
【００３０】
（構成材料）
本発明に用いられる、骨格部１２、即ちメソ孔の孔壁を構成する材料としては、例えば、酸化シリコン、酸化チタン、あるいは酸化スズなどの酸化物が好ましく用いられる。また、無機材料（例えば、シリカ）と有機材料（例えば、ベンゼン、エチレン）とのハイブリット材料であってもよい。
【００３１】
なお、メソ孔の孔内壁にシランカップリング剤などによる被覆層を設けたり、メソ孔内に酵素、抗体、ＤＮＡなどを導入し、担持させることもできる。例えば、シランカップリング剤で細孔表面（孔内壁面）を修飾したり、酸化物を形成し得る金属を含有する金属塩の水溶液を用いてメソ孔表面を修飾することもできる。
【００３２】
（構造体の製造方法）
本発明の一実施形態によるメソ孔を有する構造体の製造方法について説明する。
【００３３】
まず、配向制御剤と、界面活性剤と、構造体の骨格部になる物質と、を含む反応溶液を用意する。
【００３４】
次に、加水分解触媒の存在下で、反応溶液を１２０℃に加熱し、水熱合成条件下で界面活性剤を含む構造体を形成する。
【００３５】
そして、構造体から界面活性剤を除去する。
【００３６】
具体的には、骨格部の原料になる物質、界面活性剤、及び配向制御剤を含む反応溶液に加水分解触媒を添加し、室温付近で攪拌した後、例えば数時間から数日間の範囲で、原料物質の縮重合反応を生じさせる。次に、溶液中にできた沈殿物を回収し、洗浄した後に乾燥させる。そして、前記沈殿物から界面活性剤を除去する。こうすると、骨格部を、その長手方向に交差する方向に貫通しているメソ孔を有する構造体が得られる。
【００３７】
前記骨格部の原料になる物質とは、ハロゲン化物、カルコゲン化物、あるいは金属アルコキシド等である。メソ孔の孔壁を酸化シリコンで形成する場合には、金属アルコキシドであるテトラエトキシシランやテトラメトキシシランが好適に用いられる。
【００３８】
界面活性剤としては、ポリエチレンオキシドを親水基として含むブロックコポリマーなどの非イオン性界面活性剤が好ましく用いられる。
【００３９】
配向制御剤としては、樹状骨格部の長手方向を横切るように界面活性剤を配向させることができる有機物であればよく、例えば、ｎ−ｄｅｃａｎｅ（Ｃ１０Ｈ２２）が挙げられる。本発明に用いられる配向制御剤の詳細な機構については、究明中であるが、界面活性剤の配向が骨格部の長手方向を横切る方向であった場合に、エントロピー的に安定な状態を生ぜしめているのかもしれない。反応時間を数時間〜数日程度、反応時の温度を１２０℃に設定することにより、粒子となる前にシリコン酸化物が積層したり、反応が進行中のシリコン酸化物粒子同士が結合することにより、樹状に成長するものと推測される。１２０℃の温度は、溶液を加熱する炉の雰囲気温度であるが、溶液は耐圧の容器の中にあり、実質的に溶液の温度も雰囲気の温度と同じになる。
【００４０】
得られた樹状の構造体は、溶液中に沈殿するので、遠心分離を用いて回収することができる。そして、自然乾燥などで回収物を乾燥させる。
【００４１】
回収した沈殿物からミセルを形成している界面活性剤を除去することで、多孔体を得ることができる。
【００４２】
なお、界面活性剤の除去方法は、細孔構造を破壊せずに界面活性剤を除去できる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、溶剤により界面活性剤を溶かし出して除去する方法や、超臨界状態の流体を付与して孔内から界面活性剤を押し出す方法、更にはオゾンを用いて酸化除去する方法などがある。
【００４３】
より好ましくは、酸素を含んだ雰囲気中で構造体を焼成して界面活性剤を除去する方法が良い。この場合、構造体を空気中で、５５０℃において５時間焼成することによって、メソポーラス構造をほとんど破壊することなく、界面活性剤を除去することができる。
【００４４】
焼成温度と時間は、細孔壁又は骨格を形成する材料と使用する界面活性剤により、適宜選択される。
【００４５】
なお、上述の方法により得られる構造体に以下の工程を付加し、生体物質担持体を製造することもできる。
【００４６】
具体的には、生体物質を含んだ溶液中に、前記メソ孔を有する構造体を入れ、攪拌することによって多孔体の穴に生体物質を吸着させる方法である。また、生体物質を、前記メソ孔に導入し易くするために、メソ孔の細孔表面（孔壁面）に官能基（例えば、アミノ基、カルボン基）を導入してもよい。このように、生体物質がメソ孔へ入りやすくなるのは、孔壁表面に存在する官能基と生体物質との電気的相互作用によるものと考えられる。
【００４７】
例えば、シランカップリング剤で細孔表面を修飾する方法や酸化物を形成し得る金属を含有する金属塩の水溶液を用いて細孔表面を修飾する方法がある。なお、シランカップリング剤は、一般的にＲ−Ｓｉ−Ｘ３の化学式で表される化合物で、分子中に２個以上の異なった官能基を持っている。上記Ｘは無機材料から成る多孔体表面と反応することができる部位である。例えば、Ｓｏｌ−Ｇｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌１９８９年第６６２頁には、メソポーラス材料が酸化シリコンである場合が記述されている。それは、細孔表面に存在するシラノール基の水素が有機ケイ素基によって置換され、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−Ｒ結合を形成し、細孔表面に有機物Ｒの層を形成する。Ｘとしては、クロル基、アルコキシ基、アセトキシ基、イソプロペノキシ基、アミノ基等である。勿論、細孔表面と反応し、Ｒの層を形成することができれば、Ｘが三官能基のものでなくても、二官能基や一官能基のカップリング剤を用いることもできる。Ｒは有機基であり、アミノ基やカルボン基、あるいはマレイミド基等である。
【００４８】
また、酸化物を形成し得る元素を含有する金属塩の水溶液を用いて細孔表面を修飾する場合は、当該酸化物層を形成し得る元素として、チタン、アルミニウム、ジルコニウム、スズ等を用いることができる。例えば、メソポーラスシリカをオキシ硝酸ジルコニウムの水溶液で処理を行うことにより、表面にジルコニウムの酸化物層を形成することが可能である。
【００４９】
図５は、生体物質をメソ孔中に担持した構造体についての模式図である。
【００５０】
同図では、生体物質２３がメソ孔の孔壁２２に囲まれて担持されている様子が示されている。２１は、図１における骨格部である。このような生体物質担持体をバイオセンサーとして用いる場合は、図５に拡大して示しているように、生体物質２３と特異的結合性を持った物質２４が反応する現象を利用する。
【００５１】
本発明者は、酵素反応や抗原抗体反応の反応場に適した構造体を検討しており、本発明に係る構造体は、このような反応場として好適であることを見いだしている。
【００５２】
本発明に用いられる生体物質としては、抗体、抗体フラグメント、ＤＮＡ、タンパク質、酵素などである。また、生体物質には、シングルストランドのＤＮＡ、Ｆａｂ抗体などの活性部位を含む断片なども含まれる。ＤＮＡ断片は、動植物や微生物から抽出し、所望の形状に切断したものでも良く、また遺伝子工学的、化学的に合成したものでも良い。
【００５３】
物質２４としては、抗原、抗体フラグメント、ＤＮＡ、タンパク質、酵素などが挙げられる。例えば、生体物質２３が抗体である場合には、生体物質と特異的な結合性を持つ物質２４は抗原となる。
【００５４】
また、不図示ではあるが、メソ孔の孔壁２２の内面と生体物質２３とを連結するアンカーを設けることも好ましいものである。
【００５５】
このアンカーには、生体物質の大きな構造変化を抑制して安定に維持する効果がある。アンカーを構成する成分としては、メソ孔を有する構造体を構成する材料と同じ構成材料であることが好ましい。前記アンカーは、生体物質に結合する部位として、水酸基、アミド基、アミノ基、ピリジン基、ウレア基、ウレタン基、カルボン基、フェノール基を有することが好ましい。さらに、アゾ基、ヒドロキシル基、マレイミド基、シラン誘導体、アミノアルキレン基等の官能基を有している化合物であってもよい。
【００５６】
個々のメソ孔には１個または２個以上の生体物質を収容できる。したがって、このメソ孔は生体物質を固定化するのに適当な大きさが必要である。
【００５７】
メソ孔のサイズと、それに固定化する生体物質のサイズとが適合する場合、生体物質表面はメソ孔の孔壁に近接するため、生体物質はメソ孔の壁壁からのｖａｎ  ｄｅｒ  ｗａａｌｓ力によりメソ孔内に吸着する。これにより、生体物質の立体構造がより一層保たれ、立体構造の変化による生体物質の失活がより一層抑制できる。なお、ｖａｎ  ｄｅｒ  ｗａａｌｓ力による保持だけではなく、静電的結合、水素結合、イオン結合の非共有結合で活性ユニットをメソ孔内に保持することも可能である。
【００５８】
（本発明に係る構造体を用いた機能デバイス）
次に、本発明に係る構造体を用いた機能デバイスについて説明する。
【００５９】
上述しているように、メソ孔に生体物質を担持した構造体は、機能デバイスとしてのバイオセンサーに適用することができる。
【００６０】
要するに、本発明の一実施形態による、検体の検出方法について説明する。
【００６１】
まず、上述した構造体のメソ孔内に生体物質を担持させたセンサーを用意し、当該センサーに検体を含む流体（液体、気体）を付与する。すると、検体を含む流体は樹状の構造体の間隙やマクロ孔を通過しながら、メソ孔内に侵入し、メソ孔内に担持された生体物質と反応する。樹状の骨格部を有する構造体の間隙やマクロ孔は流体に対するコンダクタンスが大きいために、満遍なく樹状の骨格部を有する構造体全体に行き渡り、更には、そこに連通するメソ孔内に届くことになる。メソ孔の長手方向と骨格部の長手方向が平行であると、メソ孔が骨格部の側壁に対して開口している部分の存在密度が極めて低くなるために、検体がメソ孔内に侵入する確立が極めて低くなる。本発明は、メソ孔の長手方向と骨格の長手方向が交差することにより、構造体の多数のメソ孔内で発生する生体物質と検体との反応に基づいた出力信号を検出するので、感度が向上する。
【００６２】
検体の検出原理は、詳しくは、抗原と抗体間の抗原抗体反応や、シングルＤＮＡとシングルＤＮＡ間等の特異的結合反応などを利用したものである。いずれも、電流、電圧、光量、質量、熱量等の物理量の変化を利用して、目的物質の検出を行う。検出する手段としては、酵素電極、過酸化水素電極、ＩＳＦＥＴ（Ｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）、光ファイバ、サーミスタ、水晶振動子、表面プラズモン共鳴素子等が挙げられる。
【００６３】
本発明に係る構造体は、バイオセンサー以外の機能デバイスとして、吸着剤や分離剤のようなカラムとして用いることができる。この場合には、上述した本実施形態の構造体からなる粒子を多数用意して、これらを成型して多孔体を作製するとよい。
【００６４】
そして、この多孔体と電子伝達系素子とを組み合わせて電極を設ければ、上記物理量の変化を電気的出力信号として検出することができる。
【００６５】
以下、実施例を用いて、本発明について詳述する。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
本実施例では、メソ孔の孔壁材料がシリカである構造体について説明する。
【００６７】
まず、２．４０ｇの非イオン界面活性剤であるトリブロックコポリマー（ＥＯ２０ＰＯ７０ＥＯ２０；ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）７０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０Ｈ）を７６．５ｍｌの純水に溶解した。さらに、７．５ｍｌの３６ｗｔ．％濃塩酸を添加し、室温で３０分撹拌した。続いて、配向制御剤としてｎ−ｄｅｃａｎｅを１３．９ｇ添加し、室温で２時間撹拌した。
【００６８】
さらに、この混合溶液に加水分解触媒としてＮＨ４Ｆを０．０２７ｇ、および５．１０ｇのテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を添加したものを前駆体溶液とした。最終的な前駆体溶液の組成（モル比）は、ＴＥＯＳ：ＨＣｌ：ＥＯ２０ＰＯ７０ＥＯ２０：ＮＨ４Ｆ：ｎ−ｄｅｃａｎｅ＝２５：９０：０．４：０．７：１００となるようにした。
【００６９】
この前駆体溶液を４０℃において、２０時間撹拌し、１２０℃で４８時間反応させた。得られた白色沈殿物は純水で十分に洗浄し、真空乾燥させた。
【００７０】
得られた粉末試料を、空気中５５０℃で焼成し、細孔内から界面活性剤を分解・除去し、中空の細孔とした。界面活性剤等の有機物の除去は、赤外吸収スペクトル測定法によって確認された。
【００７１】
合成されたメソポーラスシリカ粉末をＸ線回折法により評価した結果、図６のように面間隔１１．７ｎｍのヘキサゴナル構造の（１００）面に帰属する回折ピークを始め、（１１０）、（２００）、（２１０）面に帰属する回折ピークを確認した。この結果は、このメソポーラスシリカの細孔構造が、高い規則性を持ったヘキサゴナル配列を有していることを示している。
【００７２】
７７Ｋにおける窒素吸脱着等温線測定を行った結果、吸着等温線形状はＩＵＰＡＣ分類におけるＩＶ型となった。Ｂ．Ｅ．Ｔ．法によって算出された比表面積は７００ｍ２／ｇとなり、細孔容量は１．８８ｍｌ／ｇとなった。また、この吸着等温線の結果から、ＢＪＨ法により細孔径を算出すると、本実施例で合成したメソポーラスシリカの細孔径分布は、１４．３ｎｍに単一のピークを有する狭い分布となった。極大値を含む１０ｎｍ以内の範囲内に９０％以上のメソ孔が分布している孔径分布を有する構造体が得られた。
【００７３】
次に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察を行ったところ、図２のように無数の枝分かれしたロッド状の構造体（樹状の骨格部を有する構造体）が形成されていた。
【００７４】
この枝分かれしたロッド状の構造体の間隙（骨格部間の間隙）には、３００〜５００ｎｍのマクロ孔、あるいはマクロ孔サイズの間隙が形成されていた。
【００７５】
さらに高倍率でＳＥＭ観察を行ったところ、図７のように樹状の構造体の長手方向を交差する方向に直径１４ｎｍのチューブ状のメソ孔が配向していた。図７において、１１は樹状の骨格部により形成されているマクロ孔の孔径を示している。また、その断面図では図８のように、均一なチューブ状のメソ孔がハニカムパッキングした細孔構造を形成していた。尚、観察中に電子線によりメソ孔構造が破壊されることはなかった。
【００７６】
こうして、樹状の骨格部間に形成されたマクロ孔と、骨格部に形成されたメソ孔との２種類の径の異なる細孔を有する構造体（以下、階層的な構造体と称する場合がある。）を合成することができた。
【００７７】
（実施例２）
次に、実施例１において作製した構造体（メソポーラスシリカ）のメソ孔内に、酸化還元酵素の一種である西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略記する。平均直径＝４．８ｎｍ、等電点（ＩＥＰ）＝７．２）を固定化させた。そして、有機溶媒に対する耐性と熱に対する耐性とを測定した。さらに、溶液の拡散性についても検討した。
【００７８】
（１）メソ孔内への酵素固定化について
５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を用いてＨＲＰを５ｍｇ／ｍｌに調製し、この酵素溶液１ｍｌ中に、合成した前記メソポーラスシリカを１０ｍｇ添加した。混合溶液は４℃、２０時間の条件下でシェーカーを用いて攪拌し、ＨＲＰをメソポーラスシリカ細孔内に吸着させた。
【００７９】
反応終了後、４℃、１０分、２００００ｇで遠心分離を行い、ＨＲＰ−メソポーラスシリカの沈殿物は純水で３回洗浄した。この際、元の酵素溶液と上澄み液のそれぞれをＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定を行った。ＨＲＰの４０３ｎｍにおける吸収極大を利用し、吸着前後の濃度変化からＨＲＰのメソポーラスシリカへの吸着量を算出した。洗浄後の酵素固定化メソポーラスシリカは、１０時間の凍結真空乾燥を行い、粉末試料を得た。吸着したＨＲＰはメソポーラスシリカの１ｇの重量に対し、２５２ｍｇ／ｇと高い値を示した。また、リン酸緩衝液のｐＨを変化させることによって、ＨＲＰの吸着量が変化した。この結果から、ＨＲＰとメソポーラスシリカ細孔は、静電的相互作用によって固定化されているものと考えられる。
【００８０】
細孔の中にＨＲＰ分子が導入されていることは、ＨＲＰ吸着後のメソポーラスシリカにおける窒素吸着測定により、その細孔への吸着量が減少したことで確認した。
【００８１】
（２）有機溶媒に対する耐性について
メソポーラスシリカに固定化されたＨＲＰの有機溶媒中での酵素活性を評価するために、酸化剤にｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いた、トルエン中での１，２−ジアミノベンゼンの酸化反応を利用した。
【００８２】
無水トルエンに５０ｍＭの１，２−ジアミノベンゼンを含む溶液を８ｍｌとｎ−ｄｅｃａｎｅにｔ−ブチルヒドロペルオキシドを溶解して調製した１．１Ｍのｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液２ｍｌを混合した。この混合溶液１ｍｌにＨＲＰを固定化したメソポーラスシリカ１０ｍｇを加え、３７℃で反応を開始し、１，２−ジアミノベンゼンの酸化によって生成する１，２−ジニトロベンゼンの４７０ｎｍでの吸光度を測定し、経時変化を求めた。そして、トルエン溶媒中でのＨＲＰの酵素活性を決定した。
【００８３】
また比較試験としてＨＲＰそのものを０．５ｍｇ調製し、上記の酸化反応を行い、同様に４７０ｎｍでの吸光度の上昇を測定した。その結果を図９に示す。ＨＲＰ（Ｆｒｅｅ  ＨＲＰ）だけではトルエン中における酸化反応は全く起こらなかったが、ＨＲＰを固定化したメソポーラスシリカでは、非常に高い活性を示した。これは、トルエンにＨＲＰを添加した直後にＨＲＰが変性してしまったためであると考えられ、メソポーラスシリカにＨＲＰを固定化することによって高い安定性を発現していることが分かった。
【００８４】
（３）熱に対する耐性について
ＨＲＰを固定化したメソポーラスシリカおよび固定化していない通常のＨＲＰをリン酸緩衝溶液中、７０度で０〜２時間熱処理した後に、残存の酵素活性を測定した結果を図１０に示す。メソポーラスシリカ内に固定化されたＨＲＰの熱安定性は、フェノールの酸化分解速度を測定することによって決定した。フェノールの定量は４−アミノアンチピリン比色法を用いた。
【００８５】
上記ＨＲＰ吸着によって調製したＨＲＰ固定化メソポーラスシリカ１０ｍｇに、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．０）４００μｌを加え、７０℃で３０、６０、９０、１２０分間それぞれ加熱した。加熱後遠心分離を行い、ＨＲＰ固定化シリカを純水で２回洗浄した。次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）緩衝液（ｐＨ＝７．５）４００μｌ、５０００ｐｐｍフェノール水溶液  ８μｌ、３０％過酸化水素水２μｌを加えて、３７℃にて３０分間反応させた。遠心分離後、上澄み液を１５０μｌと、１Ｍのグリシン水溶液（ｐＨ＝９．６）で調製した、１％ヘキサシアノ鉄酸塩と、１％  ４−アミノアンチピリンをそれぞれ、１５０μｌ、３００μｌ加え撹拌した。その後、すばやく５００ｎｍ付近の吸光度を測定した。
【００８６】
固定化されていないＨＲＰは、７０℃、３０分の熱処理により酵素活性が半減してしまい、２時間後には初期の酵素活性に対し約１０％しか活性を示さなかった。これに対してＨＲＰを固定化したメソポーラスシリカでは、熱に対する高い安定化効果が確認された。７０℃、２時間の熱処理後も９０％以上の酵素活性を有していた。
【００８７】
上記のフェノールの酸化反応を用いて、ＨＲＰの温度依存性を測定した結果を図１１に示した。ＨＲＰおよび固定化ＨＲＰは、２５℃から１００℃で、それぞれ３０分前処理した後、酵素活性を測定した。通常のＨＲＰが７０℃、３０分の条件下において、残存活性が０％になったのに対して、階層的メソポーラスに固定化したＨＲＰは同条件下でも５０％以上の活性を示した。また、１００℃で処理をしても０％になることはなく、４０％近くの酵素活性を保持していた。
【００８８】
（４）溶液の拡散性について
次に、マクロ孔あるいは隣り合う骨格部間にマクロ孔サイズの空隙を持つことによる吸着物質の内部拡散の違いを検討する。具体的には、本発明によって調製された階層的なポーラス材料と、マクロ孔を持たない単分散性のメソポーラス材料を合成し、これらを円板状のペレットに成型し、ＨＲＰの吸着挙動を測定した。
【００８９】
上記合成方法によって合成された階層的ポーラスシリカと、マクロ孔を有していない単分散性のメソポーラスシリカの焼成粉末（非特許文献１の粒子）を各０．２ｇを計りとった。計り取ったものを錠剤成型用の加圧器を用いて、直径１５ｍｍ、厚さ１ｍｍの円板状のペレットに成型した。
【００９０】
５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を用いてＨＲＰを５ｍｇ／ｍｌに調製し、このＨＲＰ溶液５ｍｌ中に各ペレット状メソポーラスシリカを加えた。混合溶液は４℃、４８時間、シェーカーを用いてゆっくり振とうし、ＨＲＰを各メソポーラスシリカに吸着させ、ＨＲＰ溶液の４０３ｎｍにおける吸収波長の変動より、吸着量の経時変化を測定した。階層的なメソポーラスシリカは、吸着開始から約１時間で相対吸着量８０％以上の吸着を示した。この吸着量の値は、成型前の焼成粉末の場合と比較しても、ほぼ同じ値であった。
【００９１】
しかし、樹状の骨格部を備えず、マクロ細孔を持たないメソポーラス材料は、ペレット状に成型することによって、吸着速度が大きく減少した。これは、本発明の階層的なメソポーラス材料が成型ペレット中においてもマクロ孔を形成しており、高い内部拡散速度を維持しているためであると本発明者らは考察している。一方、樹状の骨格部を備えていないメソポーラス材料は、それら材料同士が成型により密に詰まり過ぎたため、吸着速度が大きく減少したものと思われる。
【００９２】
比較例１（メソ孔への酵素固定化について）
比較例として、ロッド状粒子の長軸方向に平行にチューブ状細孔径が形成されているＳＢＡ−１５を合成し、ＨＲＰの吸着及び有機溶媒中の安定効果を測定した。ＳＢＡ−１５の合成方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌第２７９号第５４８頁に記載されている。
【００９３】
合成したＳＢＡ−１５をＸ線回折法により評価した結果、面間隔９．８ｎｍのヘキサゴナル構造の（１００）面に帰属する回折ピークを確認した。また、窒素吸着等温線測定より、合成したＳＢＡ−１５は８００ｍ２／ｇの比表面積と７．４ｎｍの細孔径を有していた。
【００９４】
合成したＳＢＡ−１５を実施例１と同様のＨＲＰ吸着実験を行った。ＨＲＰの吸着量は２５ｍｇ／ｇとなり、本発明者らが合成した階層的なメソポーラスシリカに比べ、１／１０以下の非常に少ない吸着量を示した。また、ＨＲＰ吸着後の試料を用いた窒素吸着等温線解析から、ＨＲＰの吸着前後でＳＢＡ−１５の細孔容量に減少が見られず、ＨＲＰがＳＢＡ−１５細孔内にほとんど吸着していないことが分かった。
【００９５】
次に、各メソポーラスシリカへのＨＲＰの経時吸着量を測定した結果、飽和吸着量に達する時間が、本発明によるマクロ孔を有した階層的なメソポーラスシリカにおいて非常に短かった。
【００９６】
比較例２（有機溶媒に耐性について）
続いて、このＳＢＡ−１５を用いて上記方法によるＨＲＰの有機溶媒安定性の測定を行い、本発明による階層的なメソポーラスシリカとの比較を行った。僅かにＳＢＡ−１５に固定化されたＨＲＰによる酵素活性が観察された。ところが、ＳＢＡ−１５固定化ＨＲＰにおいて、反応開始と共に徐々に反応生成物である１，２−ジニトロベンゼンが確認された。これに対して、階層的なメソポーラスシリカでは、反応開始直後からＳＢＡ−１５に比べて１０倍以上の１，２−ジニトロベンゼンが確認された。
【００９７】
したがって、ＳＢＡ−１５ではロッド状粒子の長軸方向に平行にチューブ状細孔径が形成されている。このためチューブ状細孔のアスペクト比が大きく、外部から細孔の内部、および細孔内部から外部へのＨＲＰや基質の拡散が悪くなる。また、表面における細孔の開口部の数が少ないため、ＨＲＰや基質の導入が遅くなることが原因であると推察した。この結果から、本発明者らが合成した階層的なメソポーラスシリカが、マクロ孔等を持つことによってタンパク質や基質の内部拡散に優れ、生体物質等の担持体として優れている点が明らかになった。
【００９８】
（実施例３）
本実施例は、実施例１で作製した階層的なメソポーラスシリカ表面をジルコニウムの酸化物で修飾し、酸化還元酵素の一種であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤと略記、直径＝８．０ｎｍ、ＩＥＰ＝４．６）を固定化させ、熱に対する安定性を測定した例である。
【００９９】
オキシ硝酸ジルコニウム２水和物１０ｇを純水９０ｍｌに添加し、室温で溶解させ、１０ｗｔ％のオキシ硝酸ジルコニウム水溶液を調製した。この溶液に実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカを添加して、２０時間浸漬させた。その後、遠心分離により上澄みを取り除き、純水で３回洗浄し、室温で乾燥させた。
【０１００】
ジルコニウムで修飾した階層的なメソポーラスシリカをＸ線回折法により評価した結果、修飾前とほぼ同様の回折パターンを示し、メソ細孔の周期構造が壊れていないことを確認した。また、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）を用いてシリカ表面の化学結合状態を測定した結果、Ｚｒ−Ｏに起因するピークが確認され、シリカ表面にジルコニウムの酸化物層が形成されていることを確認した。
【０１０１】
続いて、ジルコニウム修飾後の階層的なメソポーラスシリカの細孔内にＧＯＤを固定化し、フェノールの酸化分解反応を用いて、安定化効果を測定した。
【０１０２】
５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いてＧＯＤを５ｍｇ／ｍｌに調製し、このＧＯＤ溶液１ｍｌ中に前記ジルコニウム修飾した階層的なメソポーラスシリカを１０ｍｇ加えた。混合溶液は４℃、２０時間の条件下でシェーカーを用いて撹拌し、ＧＯＤをメソポーラスシリカ細孔内に固定化させた。吸着後、４℃、１０分、２００００ｇで遠心分離を行い、ＧＯＤ固定化シリカを得た。ＧＯＤ固定化前後の上澄み溶液における２８０ｎｍの吸収極大を利用し、メソポーラスシリカへのＧＯＤの吸着量を算出した。ＧＯＤは１２０ｍｇ／ｇ以上の吸着量を示した。細孔の中に酵素分子が導入されていることは、窒素吸着測定装置により、その細孔への吸着量が減少したことで確認した。また、ジルコニウム修飾をしていないメソポーラスシリカでは、ＧＤＯはほとんど吸着しなかった。
【０１０３】
上記ＧＯＤ吸着によって調製したＧＯＤ固定化メソポーラスシリカおよびＧＯＤ固定化ＳＢＡ−１５の各１０ｍｇに、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．０）４００μｌを加え、７０℃で３０、６０、９０、１２０分間それぞれ加熱した。加熱後遠心分離を行い、ＧＯＤ固定化シリカを純水で２回洗浄した。次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）４００μｌ、１０％  β−Ｄ−グルコース水溶液１００μｌ、５０００ｐｐｍフェノール水溶液  ８μｌ、１００μ／ｍｌのＨＲＰ溶液１００μｌを加えて、３７℃にて３０分間反応させた。遠心分離後、実施例２と同様に５００ｎｍ付近の吸光度を測定した。
【０１０４】
固定化されていないＧＯＤは、７０℃、３０分の熱処理により相対活性が０％と失活した。これに対してメソポーラスシリカに固定化したＧＯＤでは、熱に対する高い安定化効果が確認され、７０℃、１２０分の熱処理後も７０％以上の酵素活性を有していた。
【０１０５】
また、熱処理を行っていないＧＯＤを固定化した階層的なメソポーラスシリカを用いて、３７℃におけるフェノール分解の経時変化を測定した。
【０１０６】
上記ＧＯＤ吸着によって調製したＧＯＤ固定化メソポーラスシリカ１０ｍｇに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）４００μｌ、１０％  β−Ｄ−グルコース水溶液１００μｌを加えた。さらに、５０００ｐｐｍフェノール水溶液８μｌ、１００μ／ｍｌのＨＲＰ溶液１００μｌを加えた。調整した溶液を３７℃にて所定時間反応させた。遠心分離後、実施例２と同様に５００ｎｍ付近の吸光度を測定した。この結果より、３０分後のフェノール分解濃度に対する相対活性を算出した。階層的なメソポーラスシリカに固定化したＧＯＤは、５分間の反応において１００％の相対活性を示した。
【０１０７】
これらの結果から、マクロ孔を有する階層的なメソポーラスシリカは、そのマクロ孔による高い内部拡散を有していながら、メソ孔内に固定化した酵素は高い安定効果を発現していることが明らかとなった。
【０１０８】
また、実施例１と同様にペレット状の階層的なメソポーラスシリカと、マクロ細孔を有していない単分散性のメソポーラスシリカを用いて、ＧＯＤの吸着実験を行った。上記方法によるオキシ硝酸ジルコニウム水溶液に両方のペレットを含浸させジルコニム処理を行った後、ＧＯＤの経時吸着挙動を測定した。実施例１と同様に、本発明によるペレット状の階層的なメソポーラスシリカは、成型前の粉末状の吸着挙動に比べ変化がなかった。しかし、マクロ細孔を有していない単分散性のメソポーラスシリカによるペレットでは、ほとんどＧＯＤが吸着しなかった。これは、ペレット状の単分散性メソポーラスシリカにおいては粒子同士が密に充填してしまうために内部拡散が遅く、メソ孔内にＧＯＤが充分に拡散できなかったためであると考察される。
【０１０９】
（実施例４）
本実施例は、実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカの表面を、シランカップリング剤を用いて修飾し、α−アミラーゼを共有結合によってシリカ表面に固定化させた例である。
【０１１０】
実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカ１．０ｇを、トルエンで調製した１０％（ｖ／ｖ）の３−アミノプロピル  トリエトキシシラン溶液の５０ｍｌ中に添加し、この溶液を窒素雰囲気下において、１２０℃で４８時間、撹拌した。反応後、沈殿物は濾過し、トルエン、メタノール、ジクロロメタンで洗浄した後、室温で乾燥させた。
【０１１１】
次にこの乾燥試料の１．０ｇを、リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝６．６）で調製した２．５％グルタルアルデヒド溶液の２５ｍｌに溶解させ、室温で１時間撹拌した。得られた沈殿物は純水を用いて４回以上洗浄し、その後室温において乾燥した。
【０１１２】
グルタルアルデヒドで修飾した階層的なメソポーラスシリカをＸ線回折法により評価した結果、修飾前とほぼ同様の回折パターンを示しており、メソ細孔構造が壊れていないことを確認した。また、ＦＴ−ＩＲを用いてシリカ表面に導入した官能基の同定を行った結果、Ｒ−ＣＨ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、−ＣＨＯに起因するピークがそれぞれ確認され、シリカ表面にＳｉ（ＣＨ２）３Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＨＯが共有結合していることを確認した。
【０１１３】
続いて、修飾後の階層的なメソポーラスシリカの細孔内にα−アミラーゼを固定化し、澱粉のマルトースへの加水分解反応を用いて、安定化効果を測定した。
【０１１４】
５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）を用いてα−アミラーゼを１ｍｇ／ｍｌに調製し、この溶液１ｍｌ中に、上記方法で合成・修飾した階層的なメソポーラスシリカ０．２ｇを実施例１と同様にペレット状に成型したものを添加した。混合溶液は４℃、２０時間の条件下でシェーカーを用いて含浸させ、α−アミラーゼをメソポーラスシリカ細孔内に吸着させた。反応終了後、ペレットを濾過して、純水で３回洗浄した。この際、元の酵素溶液と上澄み液のそれぞれを、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定を行った。α−アミラーゼの２８０ｎｍにおける吸収極大を利用し、吸着前後の濃度変化からメソポーラスシリカへの吸着量を算出した。吸着したα−アミラーゼは１４０ｍｇ／ｇと高い値を示した。表面修飾を行わなかった粉末状階層的なメソポーラスシリカおよびペレット状に成型した単分散性メソポーラスシリカへの、同条件でのα−アミラーゼの吸着実験では、ほとんど吸着挙動を示さなかった。したがって、マクロ細孔による高い内部拡散により、α−アミラーゼがシリカ表面に修飾した−ＣＨＯおよびα−アミラーゼの−ＮＨ２と結合し、シリカ表面に固定化されたものと考えられる。
【０１１５】
続いて、ペレット状のアミラーゼ固定化メソポーラスシリカおよび固定化していないアミラーゼを酢酸ナトリウム緩衝溶液中、２５℃から７０℃でそれぞれ熱処理した後、酵素活性を測定した。
【０１１６】
上記アミラーゼ固定化メソポーラスシリカ１０ｍｇに、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）４００μｌを加え、２５℃から７０℃で、それぞれ３０分処理した。加熱後遠心分離を行い、アミラーゼ固定化シリカを純水で２回洗浄した。同様の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、０．１２５％の可溶性澱粉を調製し、この澱粉溶液の３００μｌを洗浄後のアミラーゼ固定化シリカに添加し。４０℃で１５分反応させた。反応停止後、遠心分離により上澄みを得て、この上澄み溶液に１ｍｌの０．５Ｎ酢酸及びヨウ素−カリウム溶液（０．０１５％ヨウ素−０．１５％ヨウ化カリウム溶液）を３ｍｌ加え、よく撹拌してから７００ｎｍにおける吸収極大を測定した。通常のα−アミラーゼが６０℃、３０分の条件下において、相対活性が２０％になったのに対して、階層的メソポーラスに固定化したα−アミラーゼでは、同条件下において９０％以上の相対活性を示し、安定化効果が確認された。
【０１１７】
（実施例５）
本実施例は、実施例１で作製した階層的なメソポーラスシリカのメソ細孔表面にシングルストランドのＤＮＡを導入したものである。さらに、ハイブリダイゼーション反応を利用して、シングルＤＮＡ間の特異的反応を光学的に検出するバイオセンシング素子の一例であり、図１２はバイオセンシング素子の構成の一例を示す図である。
【０１１８】
ハイブリダイゼーションは、核酸のハイブリッド形成または核酸雑種分子形成のことをいい、核酸の１次構造、すなわち塩基配列の相同性を調べたり、相同の塩基配列をもつ核酸を検出したりする方法として用いられる。１本鎖にした核酸同士が、相補性をもつ塩基対間（Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ）で水素結合ができ、二重螺旋の２本鎖核酸を形成する性質を利用するものである。
【０１１９】
実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカおよび比較例１で使用したＳＢＡ−１５を１０％の３−アミノプロピル  トリエトキシシランの９５％エタノ−ル水溶液に１時間浸し、遠心分離機を用いて未反応溶液を除去した。エタノール洗浄した後、窒素雰囲気下において１２０℃で１時間反応させ、メソポーラスシリカ細孔表面にアミノ基を導入した。
【０１２０】
さらに、アミノ基が導入された階層的なメソポーラスシリカを１ｍＭのＧＭＢＳジメチルスルホキシド溶液に２時間浸した後にジメチルスルホキシドで洗浄し、メソポーラスシリカ細孔表面にマレイミド基を導入した。シリカ表面に各官能基が導入されたことは、ＦＴ−ＩＲによって確認された。
【０１２１】
ＤＮＡ自動合成機を用いてチオール基が導入されたＤＮＡプローブを合成した後、高速液体クロマトグラフィでＤＮＡプローブを精製した。
ＤＮＡプロ−ブ；ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−５’−ａｔａａａａｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔａ−３’
【０１２２】
次に、合成・精製された濃度２μＭのＤＮＡプローブの１０μｌとＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ、−２−エタンスルホン酸；１０ｍＭ、ｐＨ＝６。５）４０μｌと添加剤（エチレングリコール）５０μｌとを混合し、反応溶液を調製した。この混合溶液を、マレイミド基を導入した階層的なメソポーラスシリカに添加し、室温で２時間放置することによってメソポーラスシリカ表面にシングルストランドのＤＮＡを固定化した。
【０１２３】
このＤＮＡプローブ固定化メソポーラスシリカを図１２のチップ基板上溝に充填し、その他の流路を図１２のように設置することでバイオセンシング素子を作製した。この図において、１０１は基板であり、１０２は、本実施例により作製したＤＮＡプローブを固定化した階層的なメソポーラスシリカである。１０３および１０４は溶液導入管であり、１０５はそれら溶液を導入した後の溶液排出管である。
【０１２４】
ＤＮＡ自動合成機を用いてＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を持ち、５’末端がテキサスレッドで蛍光標識されたＤＮＡターゲットを合成した。次に、濃度０．１μＭのＤＮＡターゲット８０μｌと２０×ＳＳＣ（０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム、３．０Ｍ  塩化ナトリウム）１７μｌと１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液３μｌとを混合した。混合調整したハイブリダイゼーション溶液を図１２の１０３の溶液導入菅から導入した。所定時間静止後、１０５の溶液排出菅から溶液を排出した。
【０１２５】
所定時間のハイブリダイゼーション反応後、２０×ＳＳＣの１００倍希釈液を洗浄液として、１０４の洗浄液導入菅より注入し、洗浄した。次に、マイクロアレイ用スキャナーを用いてＤＮＡプローブが固定化された部分の蛍光強度（ハイブリダイゼーションシグナル）とＤＮＡプローブが固定化されていない試料の蛍光強度（バックグランドシグナル）を測定した。
【０１２６】
ＤＮＡプローブ固定化ＳＢＡ−１５は、ハイブリダイゼーションシグナルが小さく、高い蛍光強度比（ハイブリダイゼーションシグナル／バックグランドシグナル）を達成できなかった。また、ハイブリダイゼーション反応による蛍光強度の経時変化を測定したところ、飽和強度に達するまでの時間も長かった。これに対して、ＤＮＡプローブを固定化した階層的なメソポーラスシリカは、非常に短時間でハイブリダイゼーション反応が完了しており、かつ優れた蛍光強度比を達成していた。これらの結果は、階層的なメソポーラスシリカメソ細孔内へのＤＮＡプローブの高い吸着量が、蛍光のシグナルを増加させ、かつマクロ孔による優れた内部拡散が短時間でのハイブリダイゼーション反応の完了に繋がったと推察される。
【０１２７】
以上の結果より、本実施例では、上記の生体物質を固定化した階層的なメソポーラスシリカを用いることで、高感度な検出が短時間で行えるバイオセンシング素子の作製が可能となることが確認された。
【０１２８】
（実施例６）
実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカの細孔内に、マウスモノクローナル抗体（抗原はヒトの血清アルブミン）を固定化させ、抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して、目的物質の検出・測定を行った例である。
【０１２９】
実施例１で合成した階層的なメソポーラスシリカおよび比較例１で使用したＳＢＡ−１５各１０ｍｇに、マウスモノクローナルＦａｂ型抗体を純水で１ｍｇ／ｍｌに調製した溶液を１０ｍｌ添加した。溶液を４℃で６時間撹拌することにより、メソポーラスシリカのメソ細孔内に抗体を固定化させた。その後、純水で３回洗浄した。上記の抗体固定化メソポーラスシリカに、西洋わさびペルオキシダーゼで標識したヒトの血清アルブミン（ＨＲＰ−ＨＳＡと略記）溶液を添加し、室温にて所定時間（１〜４時間）反応させた。非特異吸着したＨＲＰ−ＨＳＡを除くために、この抗原−抗体固定化メソポーラスシリカを純水で数回洗浄した。その後、凍結真空乾燥を行い、この乾燥試料を３７℃で任意の時間放置した。次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）４００μｌ、５０００ｐｐｍフェノール水溶液８μｌ、３０％過酸化水素水２μｌを加えて、３７℃にて３０分間反応させた。遠心分離後、実施例２と同様に５００ｎｍ付近の吸光度を測定し、固定化された抗体に特異的に結合したＨＳＡに標識されたＨＲＰの酵素活性を測定した。
【０１３０】
また、前記階層的なメソポーラスシリカに対して、ＨＲＰ−ＨＳＡの抗体ではない非特異的なマウスイムノグロブミン抗体（マウスＩｇ）を上記の方法と同様にして固定化した。そして、前述のＨＳＡに特異的な結合をする抗体と、非特異的な抗体とを用いた場合の両者の吸光度の差を上記手順により測定した。その結果、非特異的マウスＩｇは、本実施例によるマウスモノクローナルＦａｂ型抗体固定化メソポーラスシリカに比べ、ＨＲＰ活性が明らかに小さかった。これらの結果より、メソポーラスシリカに抗体が固定化され、かつメソポーラスシリカへの抗体の固定化後も、細孔内において有効に抗原抗体反応が起きていることを確認した。
【０１３１】
上記の抗体固定化メソポーラスシリカに、ＨＲＰ−ＨＳＡ溶液を添加し、室温で所定時間（１〜４時間）反応させることにより、抗原抗体反応の経時変化を測定した。その結果、実施例２、３、４で確認されたように、階層的なメソポーラスシリカを利用した場合においてのみ、高い抗原抗体反応速度を確認した。これは、非特異吸着により細孔外に吸着したＨＲＰ−ＨＡＳ等の細孔内に固定化されていないＨＲＰ−ＨＳＡが、外部環境の影響により変性してしまい、安定化されなかったためであると考えられる。
【０１３２】
また、上記で得た抗体固定化メソポーラスシリカと固定化していないマウスモノクローナル抗体粉末を乾燥状態において３７℃で３週間保存し、抗原抗体反応によるＨＲＰ活性の経時変化を測定した。３７℃で乾燥保存を開始する直前の両者の結合活性を１００とした結果、固定化していないマウスモノクローナル抗体は１週間後には相対活性が０となり、完全に失活してしまった。一方、階層的なメソポーラスシリカに固定化したマウスモノクローナル抗体の抗原抗体反応は、３週間後においても９０％以上の相対活性を示した。
【０１３３】
（実施例７）
本実施例は、実施例１で合成した階層的メソポーラスシリカを電極上に合成し、さらにグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびメディエーターをメソ細孔内に固定化させ、グルコース濃度を測定した例である。電極としては、カーボン電極、白金電極を用いた。
【０１３４】
２．４０のトリブロックコポリマー（ＥＯ２０ＰＯ７０ＥＯ２０；ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）７０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２０Ｈ）を７６．５ｍｌの純水に溶解し、さらに７．５ｍｌの３６ｗｔ。％濃塩酸を添加し、室温で３０分撹拌した。続いて、ｎ−ｄｅｃａｎｅを１３．９ｇ添加し、室温で２時間撹拌した。さらに、この混合溶液に加水分解触媒としてＮＨ４Ｆを０．０２７ｇ、および５．１０ｇのテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を添加したものを前駆溶液とした。最終的な前駆溶液の組成（モル比）は、ＴＥＯＳ：ＨＣｌ：ＥＯ２０ＰＯ７０ＥＯ２０：ＮＨ４Ｆ：ｎ−ｄｅｃａｎｅ＝２５：９０：０．４：０．７：１００となるようにした。
【０１３５】
この前駆体溶液を４０℃において、２０時間撹拌し、１２０℃で４８時間反応させた。得られた白色沈殿物は純水で十分に洗浄した。この白色沈殿物に適宜エタノールを加え、３０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより、ペースト状の階層的メソポーラスシリカを得た。得られた試料を、カーボン電極上に塗布し、室温中で乾燥、空気中で５００℃焼成して、細孔内から界面活性剤を分解・除去し、カーボン電極上に階層的メソポーラスシリカを合成した。
【０１３６】
電極上からサンプリングしたメソポーラスシリカ粉末をＸ線回折法により評価した結果、実施例１と同様にヘキサゴナル構造の（１００）面に帰属される回折ピークを始め、（１１０）、（２００）、（２１０）面に帰属される回折ピークを確認した。
【０１３７】
５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）を用いてＧＯＤを５ｍｇ／ｍｌに調製し、この酵素溶液１０ｍｌ中に、合成した前記のメソポーラスシリカ−カーボン電極を浸漬した。４℃、２０時間の条件下でシェーカーを用いてゆっくり攪拌し、ＧＯＤを電極上のメソポーラスシリカ細孔内に吸着させた。電極上のＧＯＤ−メソポーラスシリカは純水で３回洗浄し、ＧＯＤ固定化電極を得た。ＧＯＤ固定化前後の上澄み溶液における２８０ｎｍの吸収極大を利用し、カーボン電極のみへの吸着をバックグランドとして差し引いていて、メソポーラスシリカへのＧＯＤの吸着量を算出した。ＧＯＤは２３０ｍｇ／ｇ以上の吸着量を示した。乾燥後試料はさらに、メディエーター（電子伝達物質とも言う）をメソ細孔内に担持するために、５０ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液で調製した１００ｍＭのフェリシアン化カリウム溶液１００ｍｌに１２ｈ室温で静止させた。浸漬後、遠心分離および純水で洗浄し、室温で乾燥させることによって、グルコース測定用ＧＯＤ電極を作成した。
【０１３８】
図１３に示した反応機構を利用して、グルコースの濃度を測定する。この機構を利用することにより、血液中の血糖値等を測定することが可能になる。具体的には、血液中のグルコースがセンサー部に来ると、グルコースとＧＯＤが反応するその反応したときに、グルコースは電子を放出しグルコン酸に変化する。グルコースから放出された電子は、フェリシアンイオン（［Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）６］３−）に補足される。電子を補足したフェリシアンイオン（［Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）６］３−）は、フェロシアンイオン（［Ｆｅ（ＩＩ）（ＣＮ）６］４−）に変化する。これらの反応が起こっているかどうかを作用電極で検出する。作用電極には、電圧が予め印加されており、フェロシアンイオン（［Ｆｅ（ＩＩ）（ＣＮ）６］４−）の電子を受け取る代わりに対極で、対極では水素イオン（Ｈ＋）が電子を受け取り、酸素（Ｏ２）と共に水（Ｈ２Ｏ）を生じさせる。このときの電流値を測定することにより、グルコース量を求め、血糖値を判定することができる。
【０１３９】
グルコース濃度の測定は以下のようにして行った。図１４に示す恒温セルに５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液を入れ、一定温度に維持した。作用電極として前記合成したＧＯＤ固定化カーボン電極を用い、対極には白金電極を用いた。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定した結果、高い電流値が得られた。また、標準のグルコース溶液試料を用いて電流値を測定した結果、グルコース濃度に従って、電流値が直線的に上昇した。これにより、グルコース濃度を判別し、血糖値を測定することが可能なバイオセンサーを提供することができる。
【０１４０】
（実施例８）
本実施例は、実施例１で合成した階層的メソポーラスシリカを電極上に合成し、さらにグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびメディエーターを固定化させ、グルコース濃度を測定した例である。
【０１４１】
階層的メソポーラスシリカは、上述の実施例と同様のものを用いる。メディエータ−には、フェロセンカルボン酸を用いた。フェロセンカルボン酸とメソ孔の表面を共有結合で固定化させて、ＧＯＤをメソ孔に担持した。
【０１４２】
フェロセンカルボン酸の固定化は、まず、焼成してメソ孔を形成したメソポーラスシリカコーティング電極を、シランカップリング剤よってシリル化した。テフロン（登録商標）容器中に２０ｍＭの（３−ｉｏｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＩＰＴＭＳ）を溶解したジクロロメタン溶液を用意し、電極を浸漬させ、窒素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。調製後、ジクロロメタンとエタノールで洗浄し、８０℃で乾燥した。
【０１４３】
このようにヨードプロピルシリル化された電極は、０．１３ｍＭのフェロセンカルボン酸水溶液と０．１７ｍＭのＮ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ水溶液の混合溶液中に浸漬させ、Ａｒ雰囲気下でゆっくり撹拌し、シリカ表面にフェロセンカルボン酸を固定化した。シリカ表面へのＩＰＴＭＳの導入および、エステル結合によるフェロセンカルボン酸の固定化は、それぞれＦＴ−ＩＲで確認した。これにより、フェロセンカルボン酸を共有結合でシリカ表面に固定化した。
【０１４４】
さらに、恒温セルにｐＨ＝７．４のＰＢＳを入れ、上記調製のＧＯＤ固定化カーボン電極を浸漬させ、窒素バブリングを行いながら５分間撹拌した。参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極、カウンターには白金線を用いた。電極に１００ｍＶから６００ｍＶまで電圧を挿引して、酸化電流が定常になった後、電圧を下げていきＣＶ曲線を得た。またｓｃａｎ  ｒａｔｅは１  ｍＶ／ｓとした。測定は、グルコース濃度を変えて複数回行い、飽和電流値を測定した。この時の酸化還元電位のピークは、２２０ｍＶとなった。これにより、メディエーターにフェロセンカルボン酸を用いても、バイオセンサーに応用できることが確認できた。同時に、フェロセンカルボン酸を浮遊させた状態で、酸化還元電位を測定したところ、２２０ｍＶよりも大きくなった。
【０１４５】
血中の物質が電極によって酸化・還元する時に示す酸化還元電位は、例えばアスコルビン酸では５００−６００ｍＶ、ヘモグロビンでは３００−４００ｍＶである。そこで、ピーク電流を正確に測定するためには、これらの酸化還元電位のピークとはオーバーラップせず、より低電位にピークがあるメディエータ−を用いることが重要になる。
【０１４６】
つまり、メソ孔にメディエータ−を共有結合を用いて固定化して用いることが浮遊させるよりも低電位にピークをシフトさせることができ好ましい。浮遊させたメディエータ−を用いた場合よりも、より低電位側にピークが確認できた理由は、マイナスの電場で支配されているシリカのメソ細孔内においてメディエーターが酸化されやすくなったためであり、またメディエーターが表面に固定化されているため電子のホッピングが起こり、効率的に電子を電極に運ぶことが可能になったためであると考えられる。これは、他の酵素でも同じことが言える。
【０１４７】
以上説明したように、本発明によればメソ孔を有する新規な構造体が得られる。また、本発明に係るメソポーラス材料は、内部拡散に優れ、生体物質の固定化剤やカラム剤の高精度化などに利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明に係るメソ孔を有する構造体は、例えばバイオセンサなどに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】本発明に係る構造体の模式図である。
【図２】本発明に係る構造体を走査型電子顕微鏡で見た写真である。
【図３】マクロ孔の一つの形態を示す模式図
【図４】メソ孔の配置を示した模式図
【図５】本発明に係る構造体に生体物質を担持させた場合の模式図である。
【図６】実施例１で製造されたメソポーラスシリカのＸ線回折の結果を示す図である。
【図７】本発明に係る構造体を走査型電子顕微鏡で見た写真である。
【図８】本発明に係る構造体が有するメソ孔を走査型電子顕微鏡で見た写真である。
【図９】実施例１で製造された多孔体のメソ孔に、ペルオキシダーゼを固定化し、トルエン中で酵素反応を行った場合の、転化率と時間経過を示すグラフである。
【図１０】実施例１で製造された多孔体のメソ孔に、ペルオキシダーゼを固定化し、７０℃で熱処理を行った場合の、酵素の相対活性と熱処理時間の関係を示すグラフである。
【図１１】実施例１で製造された多孔体のメソ孔に、ペルオキシダーゼを固定化し、所定の温度で３０分熱処理した場合の相対活性の温度依存性を示すグラフである。
【図１２】本発明に係る構造体をバイオセンシング素子として利用する場合の模式図である。
【図１３】本発明に係る構造体をバイオセンシング素子に利用できる反応機構を示した図である。
【図１４】本発明に係る構造体をバイオセンシング素子として利用する場合の模式図である。
【図１５】従来例を示すメソポーラスの写真である。
【図１６】従来例を示すメソポーラスの写真である。
【符号の説明】
【０１５０】
１１  マクロ孔
１２  樹状の骨格部
１３  メソ孔
１４  メソ孔の孔壁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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