(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染した細胞生物の機能不全を治療するための候補化合物の治療活性および／または可能性のある副作用を測定する方法であって、
前記方法が実施されるその時点で、前記副作用が顕在化しておらず、
標的核酸の少なくとも１回の酵素的増幅によって、前記生物から得られる血液試料において内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を、核の核酸および／またはその遺伝子産生物の量に対して測定し、
前記相対比が同一アッセイで測定され、
前記細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物、前記核の核酸および／または前記その遺伝子産生物が、末梢血単核細胞から得られ、
前記治療活性がＨＩＶ関連疾患に対するものであることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
薬物の治療活性および／または可能性のある副作用を測定する方法であって、
前記方法が実施されるその時点で、前記副作用が顕在化しておらず、
標的核酸の少なくとも１回の酵素的増幅によって、ＨＩＶ感染した生物から得られる血液試料において内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を、核の核酸および／またはその遺伝子産生物の量に対して測定し、
前記相対比が同一アッセイで測定され、
前記細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物、前記核の核酸および／または前記その遺伝子産生物が、末梢血単核細胞から得られ、
前記治療活性がＨＩＶ関連疾患に対するものであることを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記薬物が少なくとも３ヵ月の期間使用されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物が慢性疾患の治療に使用されることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物または薬物がヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの類似体を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの類似体がフルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、フルオロウラシルおよび／またはゲンシタビンを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物または薬物が、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣおよび／またはテノホフィルを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物に前記化合物または薬物が与えられていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
核酸の一方の量を他方の量で割ることによって前記相対比を直接測定することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記相対比が基準曲線との比較によって測定されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞生物であって、多細胞もしくは単細胞の、肉眼で見える、もしくは微生物である細胞生物の疾患の診断および／または機能の測定に関する。
【０００２】
細胞生物の機能（不全）を検討する疾患診断医は、古典的には、前記生物への広範な侵入を採用して、前記機能不全の種々の面についての関連情報を入手することができる。これらの侵入は実に多様で、たとえば、その範囲は、種々の患者から得た尿試料を調べることによって腎臓結石の相対比を検出することから、内視鏡によって腸の潰瘍の有無を探索することから、核磁気共鳴法（ＮＭＲ)によって検出可能な腫瘍をスクリーニングすることから、血漿におけるインスリン濃度および／またはグルコース濃度を調べることによって糖尿病を検出することから、癌遺伝子の転写レベルを測定することによって癌易発性を測定することなどに至るまでのものがある。
【０００３】
現在のところ、動物や植物のような高等生物の疾患または機能不全（逆に、健康または適正な機能）の検出は、これらの生物から得た試料を調べ、これらの試料を実験室で検討することに大いに依拠している。生物の機能不全の疾患（の局面）の判断、同定、または検出が可能な有益な方法が見つけられたときには、一般にそれは前記疾患もしくは機能不全（の局面）の治療に有用な化合物もしくは方法の試験もしくはスクリーニングにも有用であり、または前記疾患もしくは機能不全（の局面）の誘発に関与する化合物もしくは方法の試験もしくはスクリーニングに有用であり、診断に用いたのと同じもしくは類似の方法を用いて、当該疾患もしくは機能不全の治療および／もしくは誘発におけるかかる化合物もしくは方法の有用性の評価が一般に可能である。明らかに、生命科学の研究室は常に、疾患または機能不全に関するおよび疾患または機能不全の誘発および／または治療に関する化合物または方法に関するさらなる情報を得るために、生物へのさらなる他の侵入を必要としている。
【０００４】
本発明は、細胞生物の機能（不全）を測定する方法であって、細胞生物から得られる試料に存在するもう１つの核酸または遺伝子産生物に対して内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなる生物の機能（不全）を測定する方法を提供する。発明という点では、相対比は、前記第２の核酸および／またはその遺伝子産生物の量に対する前記第１の内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の量を意味する。前記相対比は、たとえば、（とりわけ）前記第２の核酸および／またはその遺伝子産生物の量で前記第１の核酸および／またはその遺伝子産生物の量を割る、またはその逆で測定することができる。一方または双方の化合物の量は、参照値で割る、または参照値から差し引くこともできる。細胞生物の機能性を測定することは、本明細書では、前記細胞生物が自然な健康状態にあるのか、または前記生物が、疾患および／または（毒性）化合物の影響を幾分受けているのかを決定することを意味する。前記疾患および／または（毒性）化合物は臨床症状が存在するような程度まで前記生物を冒してもよい。もう１つの方法としては、前記疾患および／または（毒性）化合物は、臨床症状は（未だ）顕在化していないが前記生物を冒していてもよい。
【０００５】
内部共生体細胞小器官は、真核細胞の進化において極めて早期に原核の細菌から派生したと考えられている真核細胞の小器官であり；これらの細菌は（考えられているように）早期の真核細胞と共生を行い、現在ではこれらの内部共生体細胞小器官を含む真核細胞は一般にそれらなしでは生存することができず；ミトコンドリアなしで適正に機能する現存の真核細胞はなく、ほとんどの植物は、原色素体、またはそれに由来する小器官、たとえば、葉緑体、エチオプラスト、アミロプラスト、エライオプラストもしくは有色体が存在しない場合、少なくとも機能不全であると考えられている。これらの細胞小器官は一般に、少なくとも部分的自己複製体であると思われ、幾分核の支配下にあるものの、依然としてかなりの自律性を持つ。
【０００６】
特に、本発明は、前記試料（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で検出可能な必須の核の核酸の量に対して、または、たとえば、前記試料の核もしくは細胞質分画もしくは一部に存在する前記核の核酸（核の核酸は、本明細書では、染色体ＤＮＡおよびそれから転写されたＲＮＡを含む）の遺伝子産生物（ｍＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドのような転写および／または翻訳に由来する）に対して、内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定する方法を提供する。小核リボヌクレオタンパクの成分をコードするＤＮＡもしくは相当するｍＲＮＡ、または染色体ＤＮＡに由来するそのほかの本質的に共通の核酸は、その普遍的な存在によって、試験には特に有用である。このようにして、本発明は、たとえば、ミトコンドリアおよび／または原色素体に関連する疾患のような、内部共生体細胞小器官に関連する疾患を調べるための方法を提供する。内部共生体細胞小器官に関連する疾患は、本明細書では、前記内部共生体細胞小器官の核酸の量および／または少なくとも１つの特性が自然の状況に比べて変化している状態を意味する。たとえば、前記核酸の発現が低下してもよい。たとえば、前記小器官のＤＮＡに欠失によってコードされた内部共生体細胞小器官に関連する疾患は、多数の異なった症候群で顕在化し、異形成のために発現が変動することが多く（従って一般に臨床項目のみを調べることによっては検出しにくく）、それによって１つの細胞の中で変異型および野生型の核酸を見い出すことができ、それによって分布が変化しうる。内部共生体細胞小器官に関連する疾患は冒された個体の加齢に伴って悪化することが多い。内部共生体細胞小器官に関連する疾患は、種々の薬剤でほかの疾患を治療したあとに認められうることも多く、治療中、回避したいと思うそれらの薬剤の種々の副作用に寄与する。本明細書で提供されるような方法を用いることによって今やそれらの副作用をさらによく調べることができる。
【０００７】
さらに、本発明は、前記試料（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で検出可能な第２の（識別可能な）内部共生体細胞小器官の核酸の量に対して、または前記内部共生体細胞小器官の核酸の遺伝子産生物（ｍＲＮＡまたは（ポリ）ペプチド）のような転写およびまたは翻訳によって誘導可能な）に対して、第１の内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の前記相対比を測定する方法を提供する。発明の態様の１つでは、方法は、ｍｔＤＮＡのような細胞小器官のＤＮＡと、相当する転写的に誘導可能な細胞小器官のＲＮＡ、たとえば、関連するｍｔＲＮＡまたは翻訳された遺伝子産生物との間の比を測定することを含む。この方法で転写または翻訳のレベルを測定することができる。転写および／または翻訳の自然のレベルと比べた転写および／または翻訳のレベルの変化は、前記細胞小器官の機能の変化を示す。前記変化した機能は、疾患ゆえのおよび／または特定の治療の副作用ゆえの前記小器官の機能不全であってもよい。前記機能不全は、たとえば転写レベルの低下を含んでもよい。もう１つの方法として、前記変化した機能はたとえば、内部共生体細胞小器官に関連する疾患を治療するおよび／または治す間での前記細胞小器官の改善された機能であってもよい。
【０００８】
前記機能不全は、同様に転写レベルの低下を含んでもよい。疾患または疾患の治療は、内部共生体細胞小器官のＤＮＡの量の減少を含んでもよい。しかしながら、前記減少は少なくとも前記疾患の第１段階にて前記ＤＮＡの転写の増加によって少なくとも部分的に補うことができる。このように、前記内部共生体細胞小器官のＤＮＡに由来するＲＮＡの量は、前記内部共生体細胞小器官のＤＮＡの量に比べて全く、または相対的にあまり減少しなくてもよい。次いで疾患または治療の徴候となる副作用はまだ（完全に）感知されなくてもよい。しかしながら、前記内部共生体細胞小器官のＤＮＡの量のさらなる減少の際に、前記ＤＮＡに由来するＲＮＡの量も最終的には有意に低下するであろう。次いで副作用が生じうる。従来、副作用の顕在化に際して、疾患が治療されるか、または治療が減らされるもしくは止められる。しかしながら、この従来の方法では、患者はすでに副作用に悩まされている。しかしながら、本発明の方法では、臨床症状を含む副作用を予測することができる。たとえば、内部共生体細胞小器官の核酸の転写および／または翻訳のレベルの変化は、たとえば、（将来の）副作用を含む前記生物の機能不全のような、細胞生物の機能の変化を示す。核の核酸またはその遺伝子産生物の量に対する内部共生体細胞小器官のＤＮＡおよび／またはその遺伝子産生物の相対比の変化も細胞生物の機能の変化を示す。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの態様では、２つの識別可能な小器官のＤＮＡの遺伝子産生物または関連する遺伝子産生物の間の比が測定される。態様の１つでは、前記第１の内部共生体細胞小器官の核酸および前記第２の内部共生体細胞小器官の核酸が同一種類の小器官から得られる、本発明の方法が提供される。前記小器官はたとえばミトコンドリアを含む。
【００１０】
本発明の方法は特に、疾患の段階を決めるのに好適である。まだ本質的には全くまたはほとんど臨床症状はないが、生物は疾患にすでに冒されていることがありえる。しかしながら、臨床症状は本質的に存在しないが、第２の核酸および／またはその遺伝子産生物の量に対する第１の内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比はすでに変化していることがありえる。実施例に示すように、前記相対比の前記変化は、臨床症状の前、および／または乳酸ピルビン酸の比の測定のような従来の検査の前に測定することができ、生物の機能の変化を示すことができる。従って、前記相対比は特定の疾患の段階を測定するのに極めて好適である。従って、本発明は、態様の１つにおいて、疾患に悩む、または疾患に悩むリスクにある生物から得られる試料での内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなる、疾患の段階を測定する方法を提供する。
【００１１】
疾患の段階を測定する本発明の方法は診断に使用することができる。たとえば、特定の時間間隔で本発明の方法によって日常的に人々を検査することができる。もう１つの方法としては、何らかの臨床症状を有した際に人々を検査することができる。前記相対比における変化が疾患の特定の程度を示す。前記疾患の種類は本発明の方法によって診断される必要はない。本発明のそのほかに可能性のある用途は、可能性のある薬物または医薬組成物の有益な活性および／または副作用を調べる候補薬剤、たとえば、候補となる抗菌化合物、抗生物質化合物、細胞増殖抑制化合物などにある。たとえば、本発明は、細胞生物、好ましくは候補化合物を付与されている同一種もしくは属に属するような前記生物もしくは本質的に関連する生物から得られる試料における内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなり、前記生物の機能不全の治療における有用性を測定することにおいて、前記化合物の治療活性および／または可能性のある副作用を測定する方法を提供する。前記候補化合物を特定の生物に投与した後、前記生物の、内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比が変化すれば、これは前記生物に投与した際、治療活性および／または副作用が前記化合物に関係したことを示す。さらに、このことはまた、本質的に関連する生物において治療活性および／または副作用が前記化合物に関係したことも示す。従って、細胞生物の機能不全の治療のための候補化合物の治療活性および／または副作用を測定するには、本発明の方法において正確に同一の生物を使用する必要はない。また、本質的に関連する生物を使用することもできる。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、生物、好ましくは薬物が付与されている生物から得られる試料における内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなる、前記薬物の治療活性および／または可能性のある副作用を測定する方法を提供する。本発明という点では、治療活性は、少なくとも部分的に疾患を治療する能力を意味する。本発明の実施形態の１つでは、治療活性はＨＩＶ関連疾患および／または腫瘍関連疾患に対する治療活性を含む。前記薬物は、任意で抗レトロウイルス療法を併用した細胞増殖抑制剤を含んでもよい。オランダにおけるＡＴＨＥＮＡ試験によれば、抗レトロウイルス療法を受けている患者の４０パーセントが有害な副作用のために抗レトロウイルス療法を変更する必要がある。従って、本発明の方法は、（重篤な）臨床症状が本質的に存在する前に副作用を検出することができるので、かかる療法の間、極めて望ましい。次いで、前記臨床効果が本質的に存在する前に前記療法をすでに止めるか、および／または変更することができる。その場合、前記臨床症状はなくてもよいし、さらに少ない程度に存在するようになってもよい。これによって多数の苦しみが防がれる。従って、好ましい態様では、本発明の方法が実施される際、前記副作用が本質的に顕在化しない本発明の方法が提供される。本発明という点では、「本質的に顕在化しない」は、前記副作用が（未だ）ないか、または臨床症状によってごく一部に顕在化することを意味する。
【００１３】
１つの態様では、前記化合物または薬物が細胞増殖抑制剤を含む本発明の方法が提供される。一般に使用される細胞増殖抑制剤は、たとえば、アルキル化化合物、細胞分裂抑制性細胞増殖抑制剤、抗腫瘍性抗生物質、およびトポイソメラーゼ阻害剤を含む。これに限られるわけではないが、たとえば、クロラムブシル、サイクロホスファミド、エストラムスチン、イホサミド、メルファランチオテパブサルファン、トレオサルファンカルムストン、ロムスチンシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラアスチンデカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンドセタキセル、パクリタキセルダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンイリノテカン、トポテカントポシド、テニポシド、アムサクリン、アスパラギナーゼ、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、メトトレキセートおよび／またはラルチトレキセドを含む。抗レトロウイルス療法および／または腫瘍関連疾患の治療の間、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの類似体が使用されることが多い。これらの類似体は、生物における複製および／または転写過程を妨害するので、副作用の高いリスクを含む。次いで、内部共生体細胞小器官の核酸の量が同様に変化することが多い。従って、本発明の方法は、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの類似体を含む薬物で生物が治療される場合、極めて好適である。
【００１４】
１つの態様では、本発明は、前記化合物または薬物がヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの類似体を含む本発明の方法を提供する。かかる類似体の非限定例は、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、フルオロウラシル、および／またはゲンシタビンである。さらにもう１つの態様では、前記化合物または薬物がＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣおよび／またはテノホフィルを含む本発明の方法が提供される。本発明の方法では、前記生物または本質的に関連する生物は、好ましくは前記化合物または生物が付与される。
【００１５】
たとえば、ＨＩＶ関連疾患のような疾患の治療は長期間行われなければならない。本発明の方法は、長期間にわたる疾患の治療の間、特に好適である。前記長期間の間、多数の副作用が誘発されうるが、たとえ臨床症状が（未だ）なくても今や定期的に患者をモニターすることができる。従って、態様の１つでは、前記薬物が少なくとも３ヵ月間、好ましくは少なくとも６ヵ月間、さらに好ましくは少なくとも１２ヵ月間使用される本発明の方法が提供される。態様の１つでは、前記薬物は、慢性疾患の治療に使用される。慢性疾患は、本明細書では、完全に治療することができない疾患を意味する。個体がいったん前記疾患に罹ると、臨床症状が広範に変化するとしても前記疾患は常に前記個体に存在する。前記症状は前記個体によって気付かれないことがあってもよい。慢性疾患はたとえば、ＨＩＶ関連疾患を含む。
【００１６】
化合物の副作用は、本明細書では前記化合物の目的以外の効果を意味する。前記副作用は、望ましくない効果であってもよい。たとえば、治療用化合物は、疾患に対抗してもよく、同時に生物の代謝を低下させてもよい。次いで、前記代謝の前記低下は、（負の）副作用と言われる。もう１つの方法として、化合物の副作用は、たとえば、さらに別の疾患に対する免疫のような有益な効果であってもよい。
【００１７】
また本明細書では、たとえば、除草剤、殺虫剤、抗菌化合物、抗生物質化合物のような（選択的）毒素検査への使用が提供される。本発明は、細胞生物、好ましくは候補化合物を付与されている前記生物または関連する生物から得られる試料における内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなる、たとえば、細胞増殖抑制効果またはさらに細胞毒性効果を有することによって、前記生物の機能不全を誘発するための有用性を測定することにおいて、候補化合物の毒性活性を測定する方法を提供する。
【００１８】
好ましい実施形態では、第１の生物および本質的に関連する第２の生物に対して本明細書で提供されるような方法（好ましくは並行実験）を用いてまたは適用して、所望の異なった科もしくは目に属していれば、しかし、好ましくは少なくとも異なった類もしくは門、最も好ましくは生物の異なった界に属していれば、選択性も検査する。選択性の態様は、たとえば、第１の標的生物（たとえば、細菌または寄生虫）における（所望であれば細胞の中の）化合物を調べ、同様にその宿主またはその細胞、本質的に無関係の第２の生物、たとえば、哺乳類もしくは植物を調べることによって、または前記化合物によって、作物植物またはその細胞を調べ、同様に本質的に無関係の雑草植物またはその細胞を調べることによって、たとえば選択的毒性または選択的治療効果を測定することによって調べられる。個体に由来する腫瘍細胞のような異常細胞と並行して、または比較して、同一個体に由来する正常細胞を調べることも提供され、類似のまたは関連した疾患を持つ前記個人またはそのほかの治療に使用するための腫瘍特異的、または少なくとも選択的に細胞増殖抑制性または細胞毒性の化合物を検出し、またはスクリーニングする。
【００１９】
本発明の方法によって、普通、たとえば、標的核酸の増幅のような、少なくとも１回の処理工程の後、前記試料に存在する前記核酸およびまたは遺伝子産生物の量を測定することによって、相対比が測定される。前記量を測定した後、一方の量を他方で割ることによって前記相対比を測定することができる。
【００２０】
微量の標的核酸を検出することができ、酵素的増幅を用いて定量することができる。酵素的増幅法の例は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）１、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）２、ＳＤＡ、ＴＭＡなどである。反応に２つのプライマー配列を加えることによって標的核酸配列の特異的増幅を達成することができる。増幅された領域に特異的なプローブによって増幅反応終了時に前記増幅された領域を検出することができる。もう１つの方法として、前記増幅反応３において前記増幅された核酸を生成する間に増幅された領域を検出することができる。後者のプロトコールでは、プローブが相補的核酸とハイブリッド形成した後、前記プローブに結合した標識のシグナルが検出可能になる。増幅反応においてリアルタイムで相同性検出を可能にするかかるプローブの例はＴａｑＭａｎ３およびモレキュラービーコンプローブ４；５である。
【００２１】
標的核酸配列の定量は一般に、同一プライマーを用いて増幅され、競合配列と標的核酸配列２；６の識別ができる配列を含有する競合分子を添加することによって達成される。増幅された競合配列と標的核酸配列との比を用いて前記標的核酸配列を定量することができる。競合配列または標的核酸配列の検出は、たとえば、競合配列または標的核酸配列の増幅された領域に特異的なプローブによって増幅反応終了時に、または増幅反応において前記増幅された核酸を生成する間に達成することができる。後者のプロトコールでは、プローブが相補的核酸とハイブリッド形成した後、前記プローブに結合した標識のシグナルが検出可能になり、前記標的が閾値レベルを超過する場合；陽性までの時間またはサイクル数。定量のための別の方法では定量には、競合物７を加えずに陽性までの時間を用いることができる。
【００２２】
本発明の方法は、とりわけ、細胞生物の機能（不全）を測定すること、候補薬剤を検査すること、および選択的毒性を検査することに極めて好適である。本発明の方法を用いて多数の反応が行なわれており、有用なツールであることが判明している（実施例参照）。結果における二重拡散を回避すると、本発明の方法を用いて一層さらに正確な結果を得ることができる。一般に、本発明の方法の結果における二重拡散は、異なった反応混合物における条件の多様性によって得られる。たとえば、試料に存在する特異的な核酸を検出し、定量することができるには、増幅工程が必要であることが多い。しかしながら、核酸１の反応混合物の温度は、核酸２の反応混合物の温度よりもやや高くてもよい。これによって核酸１のさらに高い収率を生じる可能性があり、従って、反応混合物１の温度が反応混合物２の温度と正確に同じ場合に得られるよりも高い、核酸２に対する核酸１の量の比が生じる可能性がある。前記反応混合物の前記温度の差のために、測定された比は、最初の試料に存在する２種類の核酸の本当の比と同一ではない。同様に、たとえば、添加される酵素の量のようなそのほかの条件における微細な変動が、核酸１および核酸２の測定された量における変動を招きうる。従って、核酸１と核酸２の測定された量は互いに独立して変化する可能性がある。前記測定された量における独立した変動は前記測定された量の計算した比において一層さらに大きな変動を生じる可能性がある。これを結果における二重拡散と呼ぶ。従って、二重拡散は、本明細書では少なくとも２つの反応混合物における少なくとも１つの反応条件による、得られた結果における少なくとも１つの変動を意味する。たとえば、容積の総量も２つの反応混合物の間でやや異なる可能性がある。
【００２３】
特殊な場合によっては、結果における二重拡散は、特定の疾患および／または治療による、生物における内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比の変動を超えることがあってもよい。たとえば、ＨＩＶの治療にはウイルスポリメラーゼの阻害剤が使用されることが多い。ウイルスポリメラーゼの阻害剤は、ミトコンドリアポリメラーゼガンマにも影響を及ぼす可能性がある。従って、ＨＩＶの治療中、ミトコンドリアポリメラーゼガンマの量が減少する可能性があり、それは細胞当りのミトコンドリアの量の低下を招く可能性がある。たとえば、ミトコンドリアの５０％の減少は副作用を招く可能性がある。核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの比は因子２によって減らされる可能性がある。しかしながら、前述の条件における変動のために、因子２によるミトコンドリアＤＮＡの減少は、場合によっては、前記比の測定の二重拡散の範囲内にあることもできる。従って、結果における二重拡散のために、この生物学的に重要なミトコンドリアの量における差異が確実に検出されない可能性がある。このように場合によっては、二重拡散は、核酸および／またはその遺伝子産生物における生物学的に重要な差異の検出の信頼性を損なうことができる。従って、本発明の実施形態の１つは、第２の核酸および／またはその遺伝子産生物の量に対する、前記生物から得られる試料における第１の内部共生体細胞小器官の核酸および／またはその遺伝子産生物の相対比を測定することを含んでなる、結果において二重拡散のない、細胞生物の機能を測定する方法を提供する。同一アッセイで前記比を測定することによって、本発明の好ましい実施形態では、前記二重拡散を防ぐことができる。このことは、処理工程および／または少なくとも第２の核酸および／またはその遺伝子産生物の量の測定を同一アッセイで行うことを意味する。本発明の観点では、アッセイは通常、１つの反応混合物を利用する。好ましくは、本発明のアッセイの成分はすべて前記アッセイの中で無作為に混合される。前記反応混合物は１つの反応管に存在してもよい。
【００２４】
しかしながら、当業者は結果における二重拡散を防ぐさらなる方法を考え付くことができる。たとえば、彼／彼女は、（半）透過性の膜で別々の部分に分割されている反応容器を使用することができる。前記別々の部分で少なくとも１つの反応条件が独立して変化する限り、二重拡散は回避され、得られる結果はさらに正確である。
【００２５】
本発明の実施形態の１つでは、少なくとも２つの標的配列が１つのアッセイで増幅される。前記２つの標的配列は、前記内部共生体細胞小器官の核酸および第２の核酸であってもよい。このように、本発明の実施形態の１つでは、前記内部共生体細胞小器官の核酸および第２の核酸の同一アッセイにおける増幅を含んでなる本発明の方法が提供される。少なくとも２つの標的配列を１つのアッセイで増幅する場合、前記アッセイでの反応条件における多様性は、前記アッセイに存在する各配列の得られる量に独立して影響を及ぼすことができる。たとえば、前記アッセイに存在する各配列の得られる量は、同一の温度、同一の総体積などに影響される。増幅反応の間で増幅された核酸を生成している間に２つの特異的なプローブを用いることによって２つの標的配列の検出を達成することができる。前記２つのプローブはそれぞれ、前記２つのプローブを識別することができ、それによって前記２つの異なった標的配列を識別することができる異なった標識を有してもよい。双方のリアルタイム増幅反応の陽性までの時間並びに相対的な蛍光の上昇の傾きを関係付けることによって定量を達成することができる。好ましくは、事前に基準曲線を創る。次いで、得られた値を前記基準曲線と比較することによって前記核酸の定量を行うことができる。このようにして、たとえば、競合分子のような内部標準は必要がない。１つのアッセイにおける２つの標的の相対的定量の方法は、２つの別々のアッセイにおける定量に比べて改善された精度を有し、必要な時間や試薬が少ない。我々は、同一試験管における２つの増幅の重複が、２つの標的の比を即座に示すことを見い出した。双方の増幅反応の条件は同一であり、内部または外部の補正因子の必要がなく、それらの条件の変動が除外される。従って、今や、結果における二重拡散が回避される。このように、態様の１つでは、本発明は、核酸の一方の量を他方で割ることによって相対比を直接測定する方法を提供する。好ましくは、前記相対比は、基準曲線との比較によって測定される。本発明という点では、直接測定するということは、たとえば、前記２つの特異的プローブの２つの異なった蛍光標識の強度を比較することによって２つの標識の比を即座に示すことが可能であることを意味する。この実施形態では、核酸の一方の量を他方で割ることは、相当する蛍光標識の強度を他方で割ることによって行われる。前記相対比が直接測定される本発明の方法では、内部標準は使用しない。
【００２６】
１つの態様では、前記細胞小器官の核酸、前記その遺伝子産生物、前記第２の核酸および／または前記その遺伝子産生物が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／または線維芽細胞から得られる本発明の方法が提供される。特に、ＰＢＭＣの使用は、前記生物からの血液試料を使用することができるので好ましい。血液試料は得やすく、相対的に大量が利用可能であることが多い。従って、好ましい実施形態では、前記試料が血液試料を含む本発明の方法が提供される。
【００２７】
本発明の方法は、一定の含量の標的核酸および／またはその遺伝子産生物に対して変動する含量の標的核酸および／またはその遺伝子産生物を定量するのに特に有用である。例は、核遺伝子（２倍体細胞当り２）の一定の細胞含量のＤＮＡに対する変動する細胞含量のミトコンドリアＤＮＡの定量である。もう１つの例は、スプライシングに関与するＲＮＡをコードするＳＮＲＰＵ１Ａのような細胞の生存に必須である構成的に発現しているＲＮＡまたは普遍的に存在する核ＤＮＡに由来するそのほかの本質的に共通の核酸に対するミトコンドリアＲＮＡのような変動して発現されるＲＮＡの定量を含む。我々は、因子２〜３の相対比を測定することが可能であることを見い出した。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、前記第１の核酸がＲＮＡを含み、前記第２の核酸がＤＮＡを含む本発明の方法を提供する。本発明の方法は、たとえば、Ｕ１Ａのような核遺伝子のＤＮＡの細胞含量に対するミトコンドリアＲＮＡの細胞含量の定量に特に好適である。これを実施例２２に示す。
【００２９】
さらに、本発明は、本発明に基づく方法を実施するための少なくとも１つの手段を含む診断用キットを提供し、前記キットは、内部共生体細胞小器官に関連するまたはそれに由来する核酸の増幅および検出に選択的な少なくとも１つのプライマーまたはプローブのセット、および所望であれば、たとえば、本明細書の詳細な説明で例示されることができるまたはさもなければ公知である、必要な増幅試薬を含む。特に、本発明は、前記キットが細胞小器官に関連する核酸の増幅のために１より多くのプライマーまたはプローブのセットを含み、好ましくは、ＳＮＲＰ特異的なプライマーまたはプローブのような染色体に関連する核酸の増幅のためのプライマーまたはプローブのセットを補完された診断用キットを提供する。特に、本発明は、細胞小器官に関連する核酸配列を増幅するための、表１の少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含むキットを提供する。キットに提供される場合、前記増幅試薬がＰＣＲまたはＮＡＳＢＡの増幅に必要とされるような、逆転写活性を持つ酵素を含むことは当然好ましい。当然、本発明に基づく方法で使用するための、核酸以外の遺伝子産生物を検出する手段を含むキットも提供される。
【００３０】
本発明はさらに、薬物、除草剤、殺虫剤、抗菌剤、細胞増殖抑制剤などの調製において本発明に基づく方法によって入手可能なまたは検出可能な化合物の使用、および本発明に基づく方法によって入手可能なまたは誘導可能なまたは同定可能な薬物、除草剤、殺虫剤、抗菌剤などを提供する。
【００３１】
本発明は、本明細書の詳細な説明においてさらに説明されるが、その際、ほとんどの実施例は、例示の目的で、細胞におけるエネルギーの供給および使用の要であるミトコンドリアを調べることを指向している、しかしながら、植物細胞に炭水化物を供給する要である葉緑体のようなそのほかの内部共生体細胞小器官を用いた試験に同一の原理が適用されることは容易に理解されるであろう。
【００３２】
実施例
使用した材料および一般的な方法論
表１に、実施例で使用したプライマーおよびプローブを要約する。２０μ１の反応容積にて標準のＮＡＳＢＡ核酸増幅反応を行い、それには、４０ｍＭのトリスｐＨ８．５、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのｄＮＴＰ（各）、２ｍＭのｒＮＴＰ（各）、０．２μＭのプライマー（各）、０．０５μＭの分子標識、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、６．４単位のＡＭＶ  ＲＴ、３２単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８単位のＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）および投入量の核酸が含有された。ＲＮＡにおけるいかなる副次的構造も変性させ、プライマーをアニーリングするために、酵素混合物の添加に先立って、酵素、ソルビトールおよび／またはウシ血清アルブミンを除く完全な混合物を２分間６５℃に加熱した。混合物を４１℃に冷却した後、酵素を加えた。蛍光光度計（サイトフロー２０００）の中にて４１℃で９０分間増幅を行い、毎分、蛍光シグナルを測定した（５３０／２５ｎｍおよび４８５／３０ｎｍのフィルターセットを用いて）。ＤＮＡ標的配列の増幅については、６５℃の変性工程を９５℃２〜５分間の変性工程に置き換えた。
【００３３】
定量を達成するには、特定のプライマーセットに対する希釈系列の標的配列を増幅させ、反応が陽性になる時点（陽性までの時間、ＴＴＰ）を投入した核酸の量に対してプロットした。このようにして、未知の投入量による反応のＴＴＰ値を読むのに使用することができる較正曲線を創った。ＲＮＡおよびＤＮＡの典型的な標準曲線の例を図１に示す。
【００３４】
標的配列の一部については、コピーの信頼できる絶対量を測定して、希釈系列は利用しなかった。これらの系列には、ＤＮＡまたはＲＮＡのコピーの代わりの測定値として、たとえば、細胞当量またはＥＴ単位のような任意の単位を与えた。その結果、ＲＮＡよりもＤＮＡが少ないと思われることが時々あり、これは予想されていたことと全く反対である。
【００３５】
当業者に知られた標準条件下で、標準の培養液にて、実施例で規定されるような薬剤または想定上の毒性または刺激性の化合物を加えて細胞（線維芽細胞およびＰＢＭＣ）を培養した。ブーム（Boom）らによって記載された方法によって核酸を細胞から単離し、（Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillan PM, van der Noordaa J, 1990  核酸の迅速かつ簡便な精製方法、J. Clin Microbiol;28(3):495-503）またはキアゲンから購入した専用単離キットを用いて単離し（ドイツ、キアゲン社）製造元のプロトコールに従って使用した。少量の単離した核酸をアガロースゲル上にて分析し、残りはさらに分析するまで−８０℃に保存した。普通、水で核酸を１０倍に希釈し、希釈した核酸５μｌをＮＡＳＢＡ増幅反応における投入量として使用した。
【００３６】
実施例１
この実施例では、本発明に基づく方法でどの種類の比を測定し得るのかおよび診断的意味においてそれらが有しうる意味を説明する。
【００３７】
本発明はたとえば、染色体ＤＮＡに対する細胞小器官のＤＮＡの相対比を測定することを提供する。この比は、正常値または時を経て少なくとも２つの時点で測定された値と比べた場合、細胞当りの細胞小器官の減少または増加を示す。また、染色体にコードされたＲＮＡに対する細胞小器官のＲＮＡの比を測定することも提供される。この比は、正常値または時を経て少なくとも２つの時点で測定された値と比べた場合、細胞の活性化状態（すなわち、転写状態）について標準化された、細胞当りの細胞小器官の転写活性の低下または上昇を示す。
【００３８】
染色体ＤＮＡに対する細胞小器官のＲＮＡの比を測定することも提供される。この比は、正常値または時を経て少なくとも２つの時点で測定された値と比べた場合、細胞当りの転写活性の低下または上昇を示す。
【００３９】
細胞小器官のＲＮＡに対する細胞小器官のＲＮＡの比を測定することも提供される。この比は、正常値または時を経て２つの時点で測定された値と比べた場合、細胞小器官における転写の低下または上昇を示し、特定のｍＲＮＡ（および従ってタンパク）のレベルを達成する転写レベルでの調節を指している。
【００４０】
染色体にコードされるＲＮＡに対する細胞小器官のＲＮＡの比を測定することも提供される。この比は、正常値または時を経て２つの時点で測定された値と比べた場合、染色体のＲＮＡ転写レベルに関連した細胞における転写の低下または上昇を示し、細胞小器官の活性化状態を指し、それは、染色体ＲＮＡが細胞小器官のタンパク質またはそのそのほかの成分をコードしていることが測定された場合、特に有用である。
【００４１】
実施例２
それぞれ２種類の濃度、３μＭおよび３０μＭの抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。対照として薬剤を含まず、臭化エチジウムとともに細胞を培養した。臭化エチジウムは細胞からミトコンドリアＤＮＡを完全に枯渇させることが知られており、細胞のミトコンドリア含量の効果を達成するという点で陽性対照である。１週間間隔で細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡのプロトコールで、ミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２およびプローブＭｔＤｍｂ）の量および染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量について分析した。ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ添加および添加剤なしの培養は、４週間の培養において染色体ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの比の測定可能な差異を示さなかった。臭化エチジウム添加の培養は、予想通り、ミトコンドリアＤＮＡ含量の低下を示した。ＤＤＣに関する結果を図２に示す。
【００４２】
図２におけるデータは、対数２桁を超えて、細胞当りのミトコンドリアＤＮＡが減少し、それによって抗ウイルス剤ＤＤＣのミトコンドリア毒性を明瞭に示している。
【００４３】
実施例３
それぞれ２種類の濃度、３μＭおよび３０μＭの抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。対照として薬剤を含まず、臭化エチジウムとともに細胞を培養した。臭化エチジウムは細胞からミトコンドリアＤＮＡを完全に枯渇させることが知られており、細胞のミトコンドリア含量の効果を達成するという点で陽性対照である。１週間間隔で細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡのプロトコールで、ミトコンドリアＲＮＡ（プライマーＭｔＲｐ１およびＭｔＲｐ２およびプローブＭｔＲｍｂ）の量および染色体にコードされたＲＮＡ（プライマーＳｎｒｐＲｐ１およびＳｎｒｐＲｐ２およびプローブＳｎｒｐＲｍｂ）の量について分析した。ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ添加および添加剤なしの培養は、４週間の培養において染色体にコードされたＲＮＡに対するミトコンドリアＲＮＡの比の測定可能な差異を示さなかった。臭化エチジウム添加の培養は、予想通り、ミトコンドリアＲＮＡ含量の低下を示した。ＤＤＣに関する結果を図３に示す。図３におけるデータは、対数２桁を超えて、細胞当りのミトコンドリアＲＮＡが減少し、それによって抗ウイルス剤ＤＤＣのミトコンドリア毒性を明瞭に示している。３週間の時点で極めて低い値を有するが、これはおそらく測定の若干の異常値である。
【００４４】
実施例４
それぞれ２種類の濃度、３μＭおよび３０μＭの抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。対照として薬剤を含まず、臭化エチジウムとともに細胞を培養した。臭化エチジウムは細胞からミトコンドリアＤＮＡを完全に枯渇させることが知られており、細胞のミトコンドリア含量の効果を達成するという点で陽性対照である。１週間間隔で細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡのプロトコールで、ミトコンドリアＲＮＡ（プライマーＭｔＲｐ１およびＭｔＲｐ２およびプローブＭｔＲｍｂ）の量および染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量について分析した。
【００４５】
ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ添加および添加剤なしの培養は、４週間の培養において染色体ＤＮＡに対するミトコンドリアＲＮＡの比の測定可能な差異を示さなかった。臭化エチジウム添加の培養は、予想通り、ミトコンドリアＲＮＡ含量の低下を示した。ＤＤＣに関する結果を図４に示す。
【００４６】
図４におけるデータは、ほぼ対数３桁を超えて、細胞当りのミトコンドリアＲＮＡの量が減少し、それによって抗ウイルス剤ＤＤＣのミトコンドリア毒性を明瞭に示している。３週間の時点で極めて低い値を有するが、これはおそらく測定の若干の異常値である。
【００４７】
実施例５
それぞれ２種類の濃度、３μＭおよび３０μＭの抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。対照として薬剤を含まず、臭化エチジウムとともに細胞を培養した。臭化エチジウムは細胞からミトコンドリアＤＮＡを完全に枯渇させることが知られており、細胞のミトコンドリア含量の効果を達成するという点で陽性対照である。１週間間隔で細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡのプロトコールで、ミトコンドリアＲＮＡ（プライマーＭｔＲｐ１およびＭｔＲｐ２およびプローブＭｔＲｍｂ）の量およびミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２およびプローブＭｔＤｍｂ）の量について分析した。
【００４８】
ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ添加および添加剤なしの培養は、４週間の培養においてミトコンドリアＤＮＡに対するミトコンドリアＲＮＡの比の測定可能な差異を示さなかった。臭化エチジウム添加の培養は、予想通り、ミトコンドリアのＲＮＡおよびＤＮＡの含量の低下を示した。ＤＤＣに関する結果を図５に示す。
【００４９】
図５におけるデータは、ミトコンドリアのＲＮＡに対するＤＮＡの比が４週間にわたって有意に変化しなかったことを明瞭に示している。図５の３週間時点はミトコンドリアの際立った低い値を有するが、この測定値はおそらく測定の若干の異常値である。
【００５０】
実施例６
それぞれ２種類の濃度、３μＭおよび３０μＭの抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。対照として薬剤を含まず、臭化エチジウムとともに細胞を培養した。臭化エチジウムは細胞からミトコンドリアＤＮＡを完全に枯渇させることが知られており、細胞のミトコンドリア含量の効果を達成するという点で陽性対照である。１週間間隔で細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡのプロトコールで、染色体にコードされているＲＮＡ（プライマーＳｎｒｐＲｐ１およびＳｎｒｐＲｐ２およびプローブＳｎｒｐＲｍｂ）の量および染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量について分析した。
【００５１】
ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ、臭化エチジウムを添加した培養および添加剤を含まない培養は、４週間の培養での比において測定可能な変化を示さなかった。ＤＤＣの結果を図６に示す。
【００５２】
図６におけるデータは、４週間にわたって染色体のＲＮＡに対するＤＮＡの比が有意に変化しなかったことを明瞭に示している。
【００５３】
実施例７
３０μＭの濃度での抗ウイルス剤、ＤＤＣの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。その期間の後、ＤＤＣの非存在下にて細胞培養を継続した。ＤＤＣ非存在下での培養期間の間、２週間間隔で１２週間にわたって細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡプロトコールで、ミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２およびプローブＭｔＤｍｂ）および染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量について分析した。分析の結果を図７に示す。
【００５４】
図７の結果は、培養からＤＤＣを除いた後、細胞当りのミトコンドリアの量は対数の２桁を超えて増加していることを明瞭に示している。この結果は、細胞に未だいくらかのミトコンドリアがあれば、ＤＤＣの毒性効果を覆し、新しい増殖細胞を再配置できることを示している。
【００５５】
実施例８
３０μＭの濃度での抗ウイルス剤、ＤＤＣの存在下、生体外で線維芽細胞を４週間培養した。その期間の後、ＤＤＣの非存在下にて細胞培養を継続した。ＤＤＣ非存在下での培養期間の間、２週間間隔で１２週間にわたって細胞の一部を回収し、記載されたＮＡＳＢＡプロトコールで、ミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２およびプローブＭｔＤｍｂ）および染色体にコードされたＲＮＡ（プライマーＳｎｒｐＲｐ１およびＳｎｒｐＲｐ２およびプローブＳｎｒｐＲｍｂ）の量について分析した。分析の結果を図８に示す。
【００５６】
図８の結果は、培養からＤＤＣを除いた後、細胞当りのミトコンドリアの量は対数の２桁を超えて増加していることを明瞭に示している。この結果は、ＤＤＣの毒性効果を覆すことができ、ＲＮＡおよびそれに続くタンパク質の合成で示されるようにミトコンドリアの機能が回復することを示している。
【００５７】
実施例９
それぞれ６μＭおよび６０μＭの濃度の抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下にて、健常供血者の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生体外で５日間培養した。対照として、ＤＭＳＯ添加の培養および薬剤なしの培養を行った。ＤＭＳＯは薬剤を可溶化する溶媒の一部である。５日後、細胞を回収して、記載されたＮＡＳＢＡプロトコールで、ミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２およびプローブＭｔＤｍｂ）および染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量について分析した。
【００５８】
ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ、ＤＭＳＯ添加の培養および添加剤なしの培養は、５日間の培養における比に測定可能な変化を示さなかった。ＤＤＣに関する結果は図９に示す。
【００５９】
図９の結果は、５日間の培養の間の対数１桁を超える、細胞当りのＰＢＭＣのミトコンドリアＤＮＡの減少を明瞭に示している。
【００６０】
実施例１０
それぞれ６μＭおよび６０μＭの濃度の抗ウイルス剤、ＤＤＣ、ＡＺＴおよびＤ４Ｔの存在下にて、健常供血者の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生体外で５日間培養した。対照として、ＤＭＳＯ添加の培養および薬剤なしの培養を行った。
【００６１】
ＤＭＳＯは薬剤を可溶化する溶媒の一部である。５日後、細胞を回収して、記載されたＮＡＳＢＡプロトコールで、ミトコンドリアＲＮＡ（プライマーＭｔＲｐ１およびＭｔＲｐ２およびプローブＭｔＲｍｂ）および染色体にコードされるＲＮＡ（プライマーＳｎｒｐＲｐ１およびＳｎｒｐＲｐ２およびプローブＳｎｒｐＲｍｂ）の量について分析した。
【００６２】
ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ、ＤＭＳＯ添加の培養および添加剤なしの培養は、５日間の培養における比に測定可能な変化を示さなかった。ＤＤＣに関する結果は図１０に示す。興味深いことに、図１０の結果は、用いたＤＤＣの最高濃度で５日間の培養期間の間の細胞当りのＰＢＭＣのミトコンドリアＲＮＡの減少を明瞭には示していない。これは実施例９で示すミトコンドリアＤＮＡとは対照的である。おそらく、転写の上昇によってミトコンドリアＤＮＡの減少が補われ、ミトコンドリアＲＮＡのレベルが維持されている。このメカニズムによってミトコンドリアＲＮＡの低下は遅延する。
【００６３】
その結果、ミトコンドリアＲＮＡは、ミトコンドリア機能の現在の状況の反映であり、ミトコンドリアＤＮＡは、（近い）将来ミトコンドリア機能に何が生じるのかを予想し、従ってさらに予後的特徴を有する。
【００６４】
実施例１１
プライマーおよびプローブ、ルビスコ−ＤＮＡｐ１、ルビスコ−ＤＮＡｐ２、ルビスコ−ＤＮＡ  ＭＢ、ルビスコ−ＲＮＡｐ１、ルビスコ−ＲＮＡｐ２およびルビスコ−ＲＮＡ  ＭＢ（表１）を用いて、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ（コメ）の葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡを定量することができ、オリザＤＮＡｐ１、オリザＤＮＡｐ２、オリザＤＮＡｍｂ、オリザＲＮＡｐ１、オリザＲＮＡｐ２およびオリザＲＮＡｍｂ（表１）を用いて染色体ＤＮＡとＲＮＡの比を測定することができる。当業者に既知であるＰＣＲおよびＮＡＳＢＡのような増幅方法を用いて、細胞の葉緑体の核酸量を測定することによって、除草剤（またはその他の）化合物の適用中に、植物の状態を評価することができる。一方、雑草に好適なプライマーのセットを用いて、望ましくない植物の損傷をモニターすることができる。これらの分子ツールは植物の１群を特異的に攻撃し、その他を攻撃しない新しい除草剤の研究に大変都合が良いことは明らかである。
【００６５】
実施例１２
この実施例では、ＤＮＡ標的配列のためのＮＡＳＢＡ核酸増幅反応が２０μｌの反応容積で行われ、それは、４０ｍＭのトリスｐＨ８．５、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのｄＮＴＰ（各）、２ｍＭのｒＮＴＰ（各）、０．２μＭのプライマー（各）、０．０５μＭの分子標識、１．５単位制限酵素ＭｓｐＩ、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μｌのウシ血清アルブミン、６．４単位のＡＭＶ  ＲＴ、３２単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８単位のＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）および投入量の核酸を含有した。ＤＮＡを変性させ、プライマーをアニーリングするために、酵素混合物の添加に先立って、酵素、ソルビトールおよび／またはウシ血清アルブミンを除く完全な混合物を３７℃にて２５分間インキュベートし、続いて２分間９５℃に加熱した。混合物を４１℃に冷却した後、酵素を加えた。蛍光光度計（サイトフロー２０００）の中にて４１℃で９０分間増幅を行い、毎分、蛍光シグナルを測定した（５３０／２５ｎｍおよび４８５／３０ｎｍのフィルターセットを用いて）。
【００６６】
定量を達成するには、特定のプライマーセットに対する希釈系列の標的配列を増幅させ、反応が陽性になる時点（陽性までの時間、ＴＴＰ）を投入した核酸の量に対してプロットした。このようにして、未知の投入量による反応のＴＴＰ値を読むのに使用することができる較正曲線を創り、投入した量を推定した。健常供血者からの新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生体外で５日間培養した。５日後、細胞を回収し、「使用した材料および一般的な方法論」において記載されたＮＡＳＢＡプロトコールによって、染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤ２ｐ２およびプローブＳｎｒｐＤｍｂ）の量を分析し、本実施例に記載のＮＡＳＢＡプロトコールと比較した。図１１に明らかに見ることができるように、制限酵素によって予備処理したＤＮＡのＮＡＳＢＡ反応はそうでないものよりもはるかに上手く行く。この観察に対する理論的根拠は、ｐ１プライマーのＴ７プロモーター部分の３’に創られるＭｓｐＩからの直接的な伸長である。
【００６７】
実施例１３
プライマーおよびプローブ、ｔＲＮＡ−Ｌ−Ｄｐ１、ｔＲＮＡ−Ｌ−Ｄｐ２、ｔＲＮＡ−Ｌ−Ｄ  ＭＢ、ｐｅｔＢＲＮＡｐ１、ｐｅｔＢＲＮＡｐ２およびｐｅｔＢＲＮＡ  ＭＢ（表１）を用いてＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ（コメ）の葉緑体のＤＮＡおよびＲＮＡを定量することができ、オリザＤＮＡｐ１、オリザＤＮＡｐ２、オリザＤＮＡｍｂ、オリザＲＮＡｐ１、オリザＲＮＡｐ２およびオリザＲＮＡｍｂ（表１）を用いて染色体ＤＮＡとＲＮＡの比を測定することができる。当業者に既知であるＰＣＲおよびＮＡＳＢＡのような増幅方法を用いて、細胞の葉緑体の核酸量を測定することによって、除草剤（またはその他の）化合物の適用中に、植物の状態を評価することができる。一方、雑草に好適なプライマーのセットを用いて、望ましくない植物の損傷をモニターすることができる。これらの分子ツールは植物の１群を特異的に攻撃し、その他を攻撃しない新しい除草剤の研究に大変都合が良いことは明らかである。
【００６８】
実施例１４
ＳｎｒｐＤＮＡを含有する１０００分子のプラスミドをミトコンドリアＤＮＡを含有する４ｘ１０５、２ｘ１０５、１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４または１０４分子のプラスミドと混合し、反応に対する投入量として用いた。１つの試験管でＳｎｒｐ核ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡを増幅するためにプライマーと標識が異なることを除いて、実施例１２と同様に反応ミックスを調製した。反応ミックス（二重ミックス）は、２セットのプライマーおよび標識：標識ＳｎｒｐＤｍｂ（ＲＯＸ標識）およびＭｔＤｍｂ＿２（ＦＡＭ標識）（各０．０５μＭ）と共にＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２、並びにＭｔＤｐ１＿２およびＭｔＤｐ２＿２（各０．２μＭ）を含有した。制限酵素の消化、増幅および検出は、実施例１２のように行った。蛍光光度計（サイトフロー２０００）のフィルターセットは、ＦＡＭ標識とＲＯＸ標識（ＦＡＭについては４８５／２０および５３０／２５；ＲＯＸについては５９０／２０および６４５／４０）を同時に測定するように適合させた。２つの競合する増幅による二重反応では、蛍光曲線の傾きの比は、時間の経過によって各増幅された種の分子の量の比に比例する（図１２を参照のこと）。
【００６９】
実施例１５
５μＭのｄｄＣの非存在下および存在下でＰＢＭＣを培養した。５日後、ＰＢＭＣ試料を取り出した。ブームらによって記載された方法に従って１０５個のＰＢＭＣから核酸を単離し、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素を含まない５０μｌの水に溶解した。１：１０および１：１００の希釈を作製し、５μｌの希釈物（それぞれ１０００個および１００個のＰＭＢＣに相当する）を反応ミックスに投入し、特異的な標的を増幅した。並行して、ＳｎｒｐＤＮＡを含有する１０３分子のプラスミドをミトコンドリアＤＮＡを含有する４ｘ１０５、２ｘ１０５、１０５、または５ｘ１０４分子のプラスミドと混合し、混合物を反応への投入量として使用した。１つの試験管でＳｎｒｐ核ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡを増幅するためにプライマーと標識が異なることを除いて、実施例１２と同様に反応ミックスを調製した。反応ミックス（二重ミックス）は、２セットのプライマーおよび標識：標識ＳｎｒｐＤｍｂ（ＲＯＸ標識）およびＭｔＤｍｂ＿２（ＦＡＭ標識）（各０．０５μＭ）と共にＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２、並びにＭｔＤｐ１＿２およびＭｔＤｐ２＿２（各０．２μＭ）を含有した。制限酵素の消化、増幅および検出は、実施例１２のように行った。蛍光光度計（サイトフロー２０００）のフィルターセットは、ＦＡＭ標識とＲＯＸ標識（ＦＡＭについては４８５／２０および５３０／２５；ＲＯＸについては５９０／２０および６４５／４０）を同時に測定するように適合させた。２つの競合する増幅による二重反応では、蛍光曲線の傾きの比は、時間の経過によって各増幅された種の分子の量の比に比例する。プラスミドのＳｎｒｐＤＮＡ／ミトコンドリアＤＮＡ混合物のデータを用いて標準曲線を創り、それによって、５μＭのｄｄＣの非存在下および存在下における１：１０および１：１００に希釈したＰＢＭＣ試料のＳｎｒｐＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの未知の比を算定することができた（図１３を参照のこと）。
【００７０】
実施例１６
重篤な乳酸アシドーシスの結果として死亡したＨＩＶ感染患者からの４つの血液試料を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のミトコンドリア含量について分析した。試料１は死亡の１年前、試料２は死亡の３ヵ月前、試料３は死亡の１．５ヵ月前、および試料４は死亡直前に採取した。血液を用い、ファイコール−イソパック精製によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。５％ＤＭＳＯを加えた培養液中でＰＢＭＣを生存可能に凍結し、使用まで液体窒素中に保存した。
【００７１】
ブーム法を用いて１０５個のＰＢＭＣから核酸を抽出した。１０００個のＰＢＭＣに相当する核酸を、ミトコンドリアＤＮＡ（プライマーＭｔＤｐ１およびＭｔＤｐ２並びにプローブＭｔＤｍｂ）を測定するＮＡＳＢＡおよび染色体ＤＮＡ（プライマーＳｎｒｐＤｐ１およびＳｎｒｐＤｐ２並びにプローブＳｎｒｐＤｍｂ）を測定するＮＡＳＢＡのための投入量として使用した。プライマーおよびプローブの配列については表１を参照のこと。このアッセイの結果は、染色体ＤＮＡコピー当りのミトコンドリアＤＮＡのコピーとして表される（図１４を参照のこと）。
【００７２】
実施例１７
この実施例ではプラスミドにおける異なった比のミトコンドリアおよび染色体のＤＮＡ標的を分析した：２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／８ｘ１０３のＭｔＤＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／２ｘ１０４のＭｔＤＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／４ｘ１０４のＭｔＤＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／１０５のＭｔＤＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／２ｘ１０５のＭｔＤＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／４ｘ１０５ＭｔＤＮＡ、および２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／８ｘ１０５のＭｔＤＮＡの分子が包含された。１つの試験管で染色体ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡを増幅するためにプライマーと標識が異なることを除いて、実施例１２と同様に反応ミックスを調製した。
【００７３】
反応ミックス（二重ミックス）は、２セットのプライマーおよび標識：標識ＳｎｒｐＤｍｂ＿２（ＦＡＭ標識）およびＭｔＤｍｂ＿３（ＲＯＸ標識）（各０．０４μＭ）と共にＳｎｒｐＤＰ１およびＳｎｒｐＤ２Ｐ２（第１のプライマーセット、各０．２μＭ）、並びにＭｔＤＰ１＿２およびＭｔＤＰ２＿２（第２のプライマーセット、各０．３μＭ）を含有した。制限酵素の消化、増幅および検出は、実施例１２のように行った。蛍光光度計（サイトフロー２０００またはイージーＱアナライザ）のフィルターセットは、ＦＡＭ標識とＲＯＸ標識（ＦＡＭについては４８５／２０および５３０／２５；ＲＯＸについては５９０／２０および６４５／４０）を同時に測定するように適合させた。２つの競合する増幅による二重反応では、蛍光曲線の傾きの比は、時間の経過によって各増幅された種の分子の量の比に比例する。結果は図１６に示す。ＦＡＭとＲＯＸのシグナルの傾きの比の間の関係は、投入されたミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの比に対して線形であった。この結果を用いて、較正曲線を作成することができ、標準較正曲線から細胞当りのミトコンドリアＤＮＡのコピー数を算出することができる。
【００７４】
実施例１８
抗ウイルス剤、ｄｄＣ（３０μＭ）の存在下で線維芽細胞を４週間培養した。その期間の後、ｄｄＣの存在下、または非存在下で細胞培養をさらに６週間継続した。培養のこの期間の間に、細胞の一部を回収し、当業者に既知の常法を用いて乳酸−ピルビン酸の比について分析した。乳酸−ピルビン酸の比の測定結果を図１７に示す。
【００７５】
図１７のデータは、ｄｄＣの存在下で乳酸−ピルビン酸の比は増加するが、有意な増加は培養の４週間後にしか認められないことを明瞭に示している。ｄｄＣの存在下で継続した培養の間、乳酸−ピルビン酸の比は高いままであるが、ｄｄＣの非存在下で４週間継続した培養では乳酸−ピルビン酸の比は正常レベルに低下する。
【００７６】
さらに、同一試料を用いて、実施例１７に記載されるようにミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの比を測定した。結果を図１８に示す。
【００７７】
図１８のデータは、ｄｄＣの存在下で線維芽細胞はそのミトコンドリアＤＮＡ（上の図における黒線の降下）を失うことを明瞭に示している。ミトコンドリア含量における有意な低下は２週間後にすでに認められ、ｄｄＣ存在下３週間後ではミトコンドリアＤＮＡはほとんど認めることができない。これらの結果は、有意な変化が４週間後にのみ認めることができた従来の乳酸−ピルビン酸の測定とは対照的である。これらの結果は、時を経た機能への効果に関するミトコンドリアＤＮＡ含量の測定の予想的値を明瞭に示している。
【００７８】
ｄｄＣの存在下で継続した培養では、ミトコンドリアＤＮＡの量は極めて低いままであった（左下２つ）。ｄｄＣ非存在下で継続した培養は、線維芽細胞のミトコンドリアＤＮＡの量における明瞭な回復を示している（右下２つ）。
【００７９】
実施例１９
抗ウイルス剤、ｄｄＣ（５μＭ）および対照としての相当する濃度の、その薬剤の溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でＰＢＭＣを１１日間培養した。培養のこの期間の間、２日毎に細胞を回収し、実施例１７に記載されるようにミトコンドリアＤＮＡとＵｌａＤＮＡの比について分析した。結果を図１９に示す。
【００８０】
この実験のデータは、ｄｄＣの存在下での培養においてＰＢＭＣのミトコンドリアＤＮＡ含量は急速に低下することを明瞭に示している。２日目に、ｄｄＣの存在下で培養したＰＢＭＣのミトコンドリアＤＮＡ含量は対照に比べて２０％減少した。ｄｄＣ存在下の培養で１１日目には、ＰＢＭＣにおけるミトコンドリアＤＮＡのコピー数は検出不能のレベルまでさらに減少している。
【００８１】
実施例２０
４８人のＨＩＶ−１感染患者を、ＡＺＴ、ＡＺＴ＋ｄｄＩまたはＡＺＴ＋ｄｄＣのいずれかの抗ウイルス療法に無作為に振り分けた。治療開始後、０、４、２４および４８週目に採血した。血液を用いてファイコール−イソパック精製によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。５％ＤＭＳＯを加えた培養液にてＰＢＭＣを生存可能に凍結し、使用まで液体窒素中に保存した。
【００８２】
ブーム法を用いて１０５個のＰＢＭＣから核酸を抽出した。実施例１７に記載されるようなミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの双方を測定する１試験管リアルタイム二重ＮＡＳＢＡの投入量として、１０００個のＰＢＭＣに相当する核酸を用いた。このアッセイの結果は、患者試料の細胞（すなわちＰＢＭＣ）当りのミトコンドリアＤＮＡ含量として表される。結果を表２に要約する。
【００８３】
治療開始時の患者ＰＢＭＣのｍｔＤＮＡ含量を４、２４および４８週目におけるｍｔＤＮＡ含量と比較し、統計学的に有意な変化について分析した（表３および図２０＋２１を参照のこと）。データは、ＡＺＴ＋ｄｄＩまたはｄｄＣを含有する治療を受けている患者が彼らのＰＢＭＣのミトコンドリアＤＮＡにおいて有意な減少を体験していることを示す。
【００８４】
実施例２１
この実施例では、プラスミドにおけるミトコンドリアＲＮＡ標的と染色体ＤＮＡ標的の異なった比を分析した：２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／５ｘ１０４のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／２．５ｘ１０５のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／５ｘ１０５のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／２．５ｘ１０６のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／５ｘ１０６のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／１０７のＭｔＲＮＡ、２ｘ１０３のＵｌａＤＮＡ／２．５ｘ１０７のＭｔＲＮＡの分子が包含された。１つの試験管で染色体ＤＮＡとミトコンドリアＲＮＡを増幅するためにプライマーと標識が異なることを除いて、実施例１２と同様に反応ミックスを調製した。反応ミックス（二重ミックス）は、２セットのプライマーおよび標識：標識ＳｎｒｐＤｍｂ（ＲＯＸ標識）およびＭｔＲｍｂ（ＦＡＭ標識）（各０．０４μＭ）と共にＳｎｒｐＤＰ１およびＳｎｒｐＤ２Ｐ２（第１のプライマーセット、各０．１μＭ）、並びにＭｔＲＰ１＿２およびＭｔＲＰ２＿２（第１のプライマーセット、各０．４μＭ）を含有した。プライマーおよびプローブの配列については表１を参照のこと。制限酵素の消化、増幅および検出は、実施例１２のように行った。蛍光光度計（サイトフロー２０００またはイージーＱ）のフィルターセットは、ＦＡＭ標識とＲＯＸ標識（ＦＡＭについては４８５／２０および５３０／２５；ＲＯＸについては５９０／２０および６４５／４０）を同時に測定するように適合させた。
【００８５】
２つの競合する増幅による二重反応では、蛍光曲線の傾きの比は、時間の経過によって各増幅された種の分子の量の比に比例する。結果は図２２に示す。ＦＡＭとＲＯＸのシグナルの傾きの比の間の関係は、投入されたミトコンドリアＲＮＡと染色体ＤＮＡの比に対して線形であった。この結果を用いて、較正曲線を作成することができ、標準較正曲線から細胞当りのミトコンドリアＲＮＡのコピー数を算出することができる。
【００８６】
実施例２２
抗ウイルス剤、ｄｄＣ（３０μＭ）の存在下にて線維芽細胞を８週間培養した。その期間の後、ｄｄＣの存在下、また非存在下にて細胞培養をさらに８週間継続した。培養のこの期間の間、異なった時点で細胞の一部を回収し、実施例２１に記載されるようにミトコンドリアＲＮＡと染色体ＤＮＡの比について分析した。結果を図２３に示す。
【００８７】
図２３のデータは、ｄｄＣの存在下、線維芽細胞はミトコンドリアＲＮＡを失うことを明瞭に示す。ｄｄＣの存在下で継続した培養では、ミトコンドリアＲＮＡの量は極めて低いままである。ｄｄＣの非存在下で継続された培養は、線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡの量の明らかな回復を示している（１０、１２、１４および１６週時点）。
【００８８】
実施例２３
ＰＢＭＣにおけるミトコンドリアＲＮＡ含量について抗ウイルス療法（ＡＺＴ＋ｄｄＩ）で治療されている２人のＨＩＶ−１感染患者を分析した。治療開始後、０、４、２４および４８週目に採血した。血液を用いてファイコール−イソパック精製によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。５％ＤＭＳＯを加えた培養液にてＰＢＭＣを生存可能に凍結し、使用まで液体窒素中に保存した。
【００８９】
ブーム法を用いて１０５個のＰＢＭＣから核酸を抽出した。実施例２１に記載されるようなミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの双方を測定する１試験管リアルタイム二重ＮＡＳＢＡの投入量として、１０００個のＰＢＭＣに相当する核酸を用いた。このアッセイの結果は、患者試料の細胞（すなわちＰＢＭＣ）当りのミトコンドリアＤＮＡ含量として表される。結果を表４に要約する。
【００９０】
患者１および２のＰＢＭＣのミトコンドリアＲＮＡ含量は、この試験の期間および適用された療法（薬剤および用量）によって有意に変化するとは思えない。ヌクレオシド類似体を含む療法によって誘発されるミトコンドリアＲＮＡの変化をさらに上手く評価するために、さらに多くの個人および異なった療法を含むように本試験を拡大する予定である。
【００９１】
【表１】
0004472253.tif 000002
【００９２】
【表２】
0004472253.tif 000003
【００９３】
【表３】
0004472253.tif 000004
【００９４】
【表４】
0004472253.tif 000005
【００９５】
【表５】
0004472253.tif 000006
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> プリマゲン  ホールディング  ベー．フェー．
<120> 内部共生体細胞小器官の検査およびそれで識別可能な化合物
<160> 46
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer MtD p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<400> 1
aattctaata cgactcacta tagggagaag agccgttgag ttgtggta              48
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer MtD p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 2
tctccatcta ttgatgaggg tctta                                       25
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtD mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 3
gcatgcccct cctagcctta ctactaatgc atgc                             34
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtD p1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 4
aattctaata cgactcacta tagggaagaa ccgggctctg ccatcttaa             49
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtD p2_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 5
gtaatccagg tcggtttcta                                             20
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtD mb_2
<220>
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<222> (1)..(32)
<400> 6
ggacccccca cacccaccca agaacagggt cc                               32
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer SnrpD
p1
<220>
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<222> (1)..(49)
<400> 7
aattctaata cgactcacta tagggagagg cccggcatgt ggtgcataa             49
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer SnrpD
p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 8
ttccttacat ctctcacccg cta                                         23
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrpD mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 9
gcatgctgta accacgcact ctcctcgcat gc                               32
<2 10> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer SnrpD2
p2
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<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 10
tgcgcctctt tctgggtgtt                                             20
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer MtR p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(47)
<400> 11
aattctaata cgactcacta tagggaggag aagatggtta ggtctac               47
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer MtR p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<400> 12
cgatatggcg ttcccccgca taaa                                        24
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtR mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 13
gctccgaagc ttctgactct tacctccccg gagc                             34
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtR p1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(47)
<400> 14
aattctaata cgactcacta tagggagagg agacacctgc taggtgt               47
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtR p1_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<400> 15
aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtagactgt tcaacctgtt            50
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtR p2_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 16
ggtgcccccg atatggcgtt cc                                          22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtR p2_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 17
gtaataatct tcttcatagt aa                                          22
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer SnrpR
p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 18
aattctaata cgactcacta tagggagagg cccggcatgt ggtgcataa             49
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer SnrpR
p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 19
cagtatgcca agaccgactc aga                                         23
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrpR mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 20
cgtacgagaa gaggaagccc aagagccacg tacg                             34
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
p1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<400> 21
aattctaata cgactcacta tagggagaag aagatgacaa aggcctggcc            50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
p1_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<400> 22
aattctaata cgactcacta tagggagaaa aaggcctggc ccctcatctt            50
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
p2_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 23
tccatggcag ttcccgaga                                              19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
p2_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 24
cactatttat atcaacaacc                                             20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
p2_4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 25
tcaatgagaa gatcaagaa                                              19
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpR
mb_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 26
cgatcgagtc cctgtacgcc atcttccgat cg                               32
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
Rubisco-DNA p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 27
aattctaata cgactcacta tagggggata atttcattac cttcacgag             49
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
Rubisco-DNA p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 28
ggagtcctga actagccgca g                                           21
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe
Rubisco-DNA MB
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 29
gcatgcggta gataaactag atagctaggc atgc                             34
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
Rubisco-RNA p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 30
aattctaata cgactcacta taggggagtt gttgttattg taagtc                46
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
Rubisco-RNA p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 31
caagtcttat gaattcctat ag                                          22
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe
Rubisco-RNA-MB
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 32
gctagcacac agggtgtacc cattatgcta gc                               32
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
OryzaDNA p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<400> 33
aattctaata cgactcacta tagggggatc ttaattacat gccgttca              48
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
OryzaDNA p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 34
aaaggtgccg gttctcacta                                             20
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe OryzaDNA
mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<400> 35
gctagcctct gcaagcttca tcagtaatag gctagc                           36
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
OryzaRNA p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(51)
<400> 36
aattctaata cgactcacta taggggctaa tgcccttttc ttttcttcct c          51
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
OryzaRNA p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 37
catattggct ttcgaagatt                                             20
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe OryzaRNA
mb
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<400> 38
gctagccttc agccattatt caagatggtg gctagc                           36
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
tRNA-L-D p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 39
aattctaata cgactcacta taggggggtt ctagttcgag aaccgcttg             49
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
tRNA-L-D p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 40
gcgaaatcgg tagacgctac g                                           21
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe tRNA-L-D
MB
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 41
gctagccaac ttccaaattc agagaagcta gc                               32
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer petB
RNA p1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<400> 42
aattctaata cgactcacta tagggaaacc ggtagcaact tgtactag              48
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer petB
RNA p2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 43
ggtttcggta tctctggaat atgag                                       25
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe petB RNA
MB
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 44
gctagcgagg aacgtcttga gattcagcta gc                               32
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe SnrnpD
mb_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 45
cgcatgctgt aaccacgcac tctcctcgca tgcg                             34
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: probe MtD mb_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 46
cgtacgtgat atcatctcaa cttagtatcg tacg                             34
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＤＮＡおよびＲＮＡの標識配列のための標準曲線の例を示す図である。
【図２】ＤＤＣの存在下で培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの比を示す図である。
【図３】ＤＤＣの存在下で培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡと染色体にコードされるＲＮＡの比を示す図である。
【図４】ＤＤＣの存在下で培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡと染色体ＤＮＡの比を示す図である。
【図５】ＤＤＣの存在下で培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡとミトコンドリアＤＮＡの比を示す図である。
【図６】ＤＤＣの存在下で培養した線維芽細胞における染色体にコードされるＲＮＡと染色体ＤＮＡの比を示す図である。
【図７】ＤＤＣと共に４週間培養した後、ＤＤＣの非存在下にて培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの比を示す図である。
【図８】ＤＤＣと共に４週間培養した後、ＤＤＣの非存在下にて培養した線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡと染色体にコードされるＲＮＡの比を示す図である。
【図９】ＤＤＣの存在下にて５日間培養したＰＢＭＣにおけるミトコンドリアＤＮＡと染色体ＤＮＡの比を示す図である。
【図１０】ＤＤＣの存在下にて５日間培養したＰＢＭＣにおけるミトコンドリアＲＮＡと染色体にコードされるＲＮＡの比を示す図である。
【図１１】制限酵素ＭｓｐＩの予備処理の有無に関するＳＮＲＮＰ  ＤＮＡ  ＮＡＳＢＡの比較を示す図である。
【図１２】ミトコンドリアＤＮＡを含有する４ｘ１０５（Ａ）、２ｘ１０５（Ｂ）、１０５（Ｃ）、５ｘ１０４（Ｄ）、２．５ｘ１０４（Ｅ）または１０４（Ｆ）分子のプラスミドと混合したＳｎｒｐＤＮＡを含有する１０００分子のプラスミドの反応時の蛍光を示す図である。曲線（Ｇ）は、経時的に相当する蛍光の傾きの比に対してプロットしたＳｎｒｐ核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの増幅された分子の量の比である。
【図１３】ミトコンドリアＤＮＡを含有する４ｘ１０５（Ａ）、２ｘ１０５（Ｂ）、１０５（Ｃ）または５Ｘ１０４（Ｄ）分子のプラスミドと混合したＳｎｒｐＤＮＡを含有する１０００分子のプラスミドの反応時の蛍光を示す図である。標準曲線（Ｅ）は、図Ａ〜Ｄに由来する経時的に相当する蛍光の傾きの比に対してプロットした増幅されたプラスミドＳｎｒｐ核ＤＮＡに対するプラスミドミトコンドリアＤＮＡの分子の量の比である；黒丸はデータ点を示す。５μＭのｄｄＣの存在下（Ｈ、Ｉ）および非存在下（Ｆ、Ｇ）におけるＰＢＭＣの１：１０（Ｆ、Ｈ）および１：１００（Ｇ、Ｉ）希釈。図Ｅでは、四角形はｄｄＣの非存在下で培養したＰＢＭＣを表し、菱形は５μＭのｄｄＣの存在下で培養したＰＢＭＣを表す。
【図１４】乳酸アシドーシスで死亡したＨＩＶ−１感染患者の４つの血液試料における染色体ＤＮＡコピー当りのミトコンドリアＤＮＡのコピーを示す図である。時間時点に関するさらなる説明については本文を参照のこと。
【図１５Ａ】ＨＩＶ−１感染患者におけるＣＤ４陽性細胞の数およびＨＩＶ−１のＲＮＡ量を示す図である。Ｘ軸の下のｄｄＣおよびＡＺＴを伴う棒はこれらの薬剤で治療した期間を示す。Ｘ軸の下の４つの矢印は、ミトコンドリアＤＮＡ含量および乳酸−ピルビン酸比に関してＰＢＭＣを分析した時点を示す。時点４のおよそ１ヵ月後、患者は乳酸アシドーシスで死亡した。
【図１５Ｂ】左図は、ＰＢＭＣ試料番号１〜４の乳酸−ピルビン酸比を示す。これらのＰＢＭＣでは乳酸−ピルビン酸比の上昇を測定することはできない。右図は、ＰＢＭＣ試料１〜４のミトコンドリアＤＮＡ含量を示す。この実験では、ミトコンドリアＤＮＡ含量の明瞭な減少を認めることができる。
【図１６】投入量として染色体ＤＮＡに対する異なった比のミトコンドリアＤＮＡを用いたＲＯＸ（染色体ＤＮＡ、灰色の線）およびＦＡＭ（ミトコンドリアＤＮＡ、黒色の線）の蛍光シグナルの経時的蛍光を示す図である。下図には、シグナルの比とＤＮＡの比との間の線形関係を示す。
【図１７】ｄｄＣの存在下で４週間培養し、その後、ｄｄＣの存在下および非存在下で培養を継続した線維芽細胞にて測定された乳酸−ピルビン酸の比を示す図である。
【図１８】ｄｄＣの存在下で培養した線維芽細胞におけるＲＯＸ（染色体ＤＮＡ、灰色の線）およびＦＡＭ（ミトコンドリアＤＮＡ、黒色の線）の蛍光シグナルの経時的蛍光を示す図である。上の左から右へ、ｄｄＣの存在下、それぞれ１、２、３および４週間培養した。下の左の２つの図：ｄｄＣの存在下にてそれぞれ７および１０週間培養を継続した。下の右の２つの図：ｄｄＣの非存在下にてそれぞれ７および１０週間培養を継続した。
【図１９】ｄｄＣの非存在下（点付きの棒）および存在下（白抜きの棒）での培養中のＰＢＭＣにおけるミトコンドリアのパーセントを示す棒グラフである。対照（ＤＭＳＯ）におけるミトコンドリアＤＮＡの量を各所定の時点にて１００％に設定する。
【図２０】それぞれ、ＡＺＴ、ＡＺＴ＋ｄｄＩおよびＡＺＴ＋ｄｄＣで治療されている３つの患者群におけるミトコンドリアＤＮＡ含量の低下を示す図である。棒の上のＰ値は、時間０、治療開始時点と比べたミトコンドリアの有意な変化を示す。
【００９７】
【図２１】それぞれ、ＡＺＴ、ＡＺＴ＋ｄｄＩおよびＡＺＴ＋ｄｄＣで治療中の３人の患者におけるミトコンドリアＤＮＡ含量を示す図である。
【図２２】投入量として染色体ＤＮＡに対する異なった比のミトコンドリアＲＮＡを用いたＲＯＸ（染色体ＤＮＡ、灰色の線）およびＦＡＭ（ミトコンドリアＲＮＡ、黒色の線）の蛍光シグナルの経時的蛍光を示す図である。下図には、シグナルの比と、ＲＮＡとＤＮＡの比との間の線形関係を示す。
【図２３】ｄｄＣの存在下で先ず８週間培養し、その後ｄｄＣと共におよびｄｄＣなしで１６週目まで培養を継続した線維芽細胞におけるミトコンドリアＲＮＡの量を表す棒を示す図である。
【図２４】有害な副作用のために抗レトロウイルス治療を変更している患者のＡＴＨＥＮＡ試験を示す図である。
【図２５】ＮＤＡ−ＮＡＳＢＡ増幅法の模式図を示す図である。
【図２６】表１に示す増幅プライマーの部分が位置することを示す２つの領域を持つミトコンドリアＤＮＡの遺伝子地図を示す図である。表１に示すその他の増幅用プライマーはミトコンドリアのゲノムのその他の領域に位置するが、この図では示されていない。
【図１】
0004472253.tif 000007
【図２】
0004472253.tif 000008
【図３】
0004472253.tif 000009
【図４】
0004472253.tif 000010
【図５】
0004472253.tif 000011
【図６】
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【図７】
0004472253.tif 000013
【図８】
0004472253.tif 000014
【図９】
0004472253.tif 000015
【図１０】
0004472253.tif 000016
【図１１】
0004472253.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0004472253.tif 000020
【図１５Ａ】
0004472253.tif 000021
【図１５Ｂ】
0004472253.tif 000022
【図１６】
0004472253.tif 000023
【図１７】
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【図１８】
0004472253.tif 000025
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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