(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）抗原、還元剤およびカオトロピック剤を含む、抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２】
前記還元剤がジチオスレイトール、チオグリセロールおよびメルカプトエタノールからなる群から選択される、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３】
前記還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項４】
ＤＴＴの濃度が約１ｍＭから約２００ｍＭである、請求項３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項５】
ＤＴＴの濃度が約５ｍＭから約１００ｍＭである、請求項３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項６】
ＤＴＴの濃度が約１０ｍＭである、請求項３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項７】
さらに緩衝剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項８】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項７に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項９】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、請求項８に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１０】
リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）の濃度が約１５ｍＭから約１００ｍＭである、請求項９に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１１】
さらに界面活性剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１２】
前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）からなる群より選択される、請求項１１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１３】
前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項１２に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１４】
ＳＤＳの濃度が約０．０１％から約０．５％である、請求項１３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１５】
さらに抗細菌剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１６】
前記抗細菌剤がアジ化ナトリウムである、請求項１５に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１７】
前記アジ化ナトリウムの濃度が約０．０１％から約０．３％である、請求項１６に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１８】
さらにキレ−ト剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１９】
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項１８に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２０】
ＥＤＴＡの濃度が約１ｍＭから約１０ｍＭである、請求項１９に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２１】
さらに非特異的結合のブロッキング剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２２】
前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される、請求項２１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２３】
前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンである、請求項２２に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２４】
ゼラチンの濃度が０．０５％から約１．０％である、請求項２３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２５】
前記カオトロピック剤がチオシアン酸ナトリウムおよびチオシアン酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２６】
前記カオトロピック剤がチオシアン酸アンモニウムである、請求項２５に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２７】
前記チオシアン酸アンモニウムの濃度が約１０ｍＭから約５００ｍＭである、請求項２６に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２８】
さらに緩衝剤、キレート剤、非特異的結合のブロッキング剤、カオトロピック剤、抗細菌剤および界面活性剤を含む、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２９】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムであり、前記キレート剤がＥＤＴＡであり、前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンであり、前記カオトロピック剤がチオシアン酸ナトリウムであり、前記抗細菌剤がアジ化ナトリウムであり、そして前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項２８に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３０】
２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％  ゼラチン、１００ｍＭ  チオシアン酸アンモニウム、０．０９％  アジ化ナトリウムおよび０．１％  ＳＤＳを含む、請求項２９に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３１】
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  チオシアン酸アンモニウム、０．０６％  ＳＤＳ、０．２５％  魚ゼラチンおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含む、請求項２９に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３２】
ＨＣＶ抗体の検出のための改良されたイムノアッセイキットであって、この改良は、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）抗原、還元剤およびカオトロピック剤を含む、ＨＣＶ抗原のための抗原希釈剤または緩衝液を含む、改良されたイムノアッセイキット。
【請求項３３】
前記還元剤がジチオスレイトール、チオグリセロールおよびメルカプトエタノールからなる群から選択される、請求項３２に記載の改良されたイムノアッセイキット。
【請求項３４】
前記還元剤がジチオスレイトールである、請求項３２に記載の改良されたイムノアッセイキット。
【請求項３５】
Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対して指向された抗体の検出のための改良されたアッセイであって、この改良は、請求項１に記載の抗原希釈剤または緩衝液を含む、改良されたアッセイ。
【請求項３６】
少なくとも１個のＨＣＶ抗原、ならびに還元剤およびカオトロピック剤を含む抗原希釈剤または緩衝液を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、出願番号６０／０５９、７０３号に対して米国特許法１１９条に基づく優先権を主張し、これによって、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般にイムノアッセイの分野に、具体的には、抗ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のための、抗原、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原を安定化する緩衝液に関する。
【０００３】
（発明の背景）
一般に、イムノアッセイは、ウイルスに特に関連するエピトープを最初に決定し、次いで、どのエピトープが、開発されるアッセイに好ましいかを決定することによって行われる。特定のエピトープが単離された場合、これらの配列は、決定され、そして、エピトープ調製のための遺伝的物質が生成される。化学的または生物学的手段のいずれかによりタンパク質を生成する方法は、既知であり、例えば、特定のエピトープに対して抗体の存在を検出するために使用されるアッセイである。高度に選択性および感受性のイムノアッセイは、一般に患者に感染している疑いのある病原体の主要な免疫優性エピトープを含む。
【０００４】
ウイルス、ＨＣＶについて、主要な免疫優性の線状エピトープは、ウイルスポリタンパク質のコア、ＮＳ（非構造的）３、ＮＳ４およびＮＳ５領域から同定されている。ＨＣＶコアタンパク質および推定のマトリックスタンパク質は、ＨＣＶに対する抗体を含むヒト血清サンプルに対してアッセイされ、そしてＨＣＶタンパク質内のいくつかの免疫優性な領域が規定されている。Ｓａｌｌｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９２、３０：１９８９−１９９４（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。ドメインＣ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５を含むＨＣＶ−１ポリタンパク質のタンパク質ドメインが同定され、そしてこれらのおおよその境界は、ＷＯ９３／００３６５（本明細書中でその全体が参考として援用される）において提供される。さらに、ＨＣＶの構造的領域由来の配列を有する個々のポリペプチドは、ＨＣＶ患者の血清の試験において有用な免疫優性エピトープを得るために設計されている。Ｋｏｔｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、４４８６−４４８９（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０００５】
ＨＣＶ抗体検出のための現在えり抜きのアッセイは、手動アッセイであるＯｒｔｈｏ  ３．０  ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡにおける使用のためにカイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）が製造した組換えＨＣＶ抗原は、ｃ２００（ｎｓ−３、ｃ１００）、ｃ２２およびＮＳ−５である。このｃ３３ｃおよびｃ２２抗原は、非常に免疫原性である。ｃ３３ｃおよびｃ２２に対する抗体はまた、初期のセロコンバージョンパネルにおいて見出される。ＨＣＶ抗体の有病率は、５８％〜９５％まで異なり、最も高い検出率はｃ３３ｃポリペプチドについて得られ、次いでｃ２２ポリペプチドについてである。Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、１００１１−１００１５（これは、本明細書中でその全体を参考として援用される）。しかし、液相においてＨＣＶ抗原を安定化する問題に遭遇している。液相におけるＨＣＶ抗原の安定性の欠如は、現在のＨＣＶ抗体検出アッセイの主要な欠点である。従って、抗ＨＣＶイムノアッセイのための抗原緩衝液を開発することは、Ｏｒｔｈｏ  ３．０  ＥＬＩＳＡと同じ抗原を利用して試みられており、ここでこの緩衝液は、ＨＣＶ抗原を安定化する。さらに、既存の自動化された機械（例えば、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ）に試薬、緩衝液およびプロトコールを適応させることが試みられている。従って、現在、抗ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のために液相でＨＣＶ抗原の安定性を改良する必要がある。このような改良されたアッセイ試薬および方法は、血液供給物および他の生物学的液体のスクリーニングにおいてＨＣＶ抗体のより良い検出を提供する。この緩衝液が、液相で不安定であり得る他の抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原）のために使用され得ることを意図する。
【０００６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、液相における抗原、特にＨＣＶ組換え抗原を安定化し得る、還元剤を含む、抗原希釈剤または緩衝液に関する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、還元剤を含む抗原希釈剤または緩衝液を使用したイムノアッセイを関する。
【０００８】
別の局面において、改良されたイムノアッセイキットが提供され、この改良は、還元剤を含む、ＨＣＶ抗原のための抗原希釈剤または緩衝液の使用を含む。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該技術分野の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００１０】
時間に関する試薬安定性は、重要な問題である。緩衝液で希釈され、同じ日に試験されたｃ３３ｃ抗原は、下記のＭａｇｉｃ  Ｌｉｔｅアッセイプロトコールを使用すると機能的であった。しかし、３７℃でストレスをかけた場合、この試薬は、初期のセロコンバージョンパネルに対して５０％を越える免疫反応性を失う。液相におけるｃ３３ｃは、ゆっくりと「凝集」し得、または不溶と成り得る。既知の成分（例えば、糖、ゼラチン、グリセロール、架橋試薬および抗酸化剤）は、ｃ３３ｃ免疫反応性を安定化するために試用された。還元形態でｃ３３ｃ抗原を保持することは、２４時間以上、さらに少なくとも７日までの期間、３７℃で初期のｃ３３ｃセロコンバージョンパネルについて免疫活性を維持し得る（Ｏｒｔｈｏ  ３．０  ＥＬＩＳＡの性能に匹敵する）ことを発見した。この還元剤は、ｃ３３ｃ分子内のシステイン基間のジスルフィド結合を還元し、おそらくｃ３３ｃ免疫反応性および溶解度を改良している。ｃ３３ｃのための抗原希釈剤の出現の前には、液相において従来のライト（ｌｉｔｅ）試薬では３７℃でこのような長期抗原安定性を示すものはなかった。同様の実験は、以下に示すようにｃ２００および多くのエピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ−６）について行われた。従って、本発明は、抗ＨＣＶイムノアッセイにおける使用に関して、ＨＣＶ抗原を安定化するための抗原希釈剤または緩衝液を提供する。本発明の抗原希釈剤または緩衝液は、例えば、ＥＬＩＳＡおよびＣＬＩＡのようなイムノアッセイにおいて使用され得る。
【００１１】
本発明は、液相においてＨＣＶ抗原の改良された安定性を提供する抗原希釈剤または緩衝液に関する。本明細書に使用されているように、「抗原希釈剤または緩衝液」とは、抗原が含まれる溶液をいう；それは、緩衝能力を有してもよいし、有さなくてもよい。特に、本発明は、Ｏｒｔｈｏ  ３．０  ＥＬＩＳＡなどにおける、組換えＨＣＶ抗原に関して改良された安定性のための抗原希釈剤または緩衝液に関する。本発明は、例えば、抗原希釈剤または緩衝液に対して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を添加することによって達成された。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、還元剤を含む。本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＤＴＴ、ゼラチン、チオシアン酸アンモニウム、アジ化ナトリウムおよびＳＤＳを含む。しかし、これらの個々の試薬は、本質的に同じ機能を果たす同様の試薬によって置換され得る。例えば、ＤＴＴは、さらなる還元剤（例えば、チオグリセロール、メルカプトエタノールなど）と置換され得る。リン酸ナトリウムは、ホウ酸ナトリウムおよび他の緩衝液によって置換され得る。ゼラチンは、ＢＳＡおよび他の非特異的結合のブロッキング剤で置換され得る。チオシアン酸ナトリウムは、チオシアン酸アンモニウムおよび他のカオトロピック剤と置換され得る。ＳＤＳは、多くの界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、および他の界面活性剤など）によって置換され得る。アジ化ナトリウムは、他の抗細菌剤によって置換され得る。さらに、ＥＤＴＡは、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および他のキレート剤によって置換され得る。当業者は、本発明の試薬の代わりとなり得る試薬に精通している。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含む。さらに好ましくは、この希釈剤は、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ．６．５）を含む。最も好ましくは、この希釈剤は、２４または２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含む。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約３ｍＭ〜約７ｍＭのＥＤＴＡを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭのＤＴＴを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭのＤＴＴを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、１０ｍＭのＤＴＴを含む。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０５％〜約１％のゼラチンを含む。さらに好ましくは、この希釈剤は、約０．１％〜約０．５％のゼラチンを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、０．２％のゼラチンを含む。
【００１７】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１０ｍＭから約５００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。さらに好ましくは、この希釈剤は、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、１００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０１％〜約０．３％のアジ化ナトリウムを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約０．０５％〜約０．２％のアジ化ナトリウムを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、０．０９％のアジ化ナトリウムを含む。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０１％〜約０．５％のＳＤＳを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約０．０５％〜約０．２％のＳＤＳを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、０．１％のＳＤＳを含む。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施態様において、手動アッセイのためのＨＣＶ抗原希釈剤は、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％  ゼラチン、１００ｍＭ  チオシアン酸アンモニウム、０．０９％  アジ化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳを含む。
【００２１】
自動化されたアッセイに関しては、ｃ３３ｃのための好ましい抗原緩衝液は、５０ｍＭ  リン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  チオシアン酸アンモニウム、０．０６％  ＳＤＳ、０．２５％  魚ゼラチンおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含む。
【００２２】
表１は、好ましいＨＣＶ緩衝液を示す。
【００２３】
【表１】
0004427182.tif 000002
【００２４】
本発明のＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、周知の媒体調製技術によって調製され得る。本発明のＨＣＶ抗原希釈剤の調製の好ましい実施態様は、表２に示される。
【００２５】
【表２】
0004427182.tif 000003
【００２６】
本発明のＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、手動および自動化されたアッセイにおいて使用され得る。本発明の抗原希釈剤または緩衝液は、多くのＨＣＶ抗原（ｃ３３ｃ、ＭＥＦＡ−６、ｃ２２ｐ、ｃ１００ｐ、ＮＳ−５およびｃ２００を含むが、これらに限定されない）で使用され得る。これらのＨＣＶ抗原は、当該分野で慣用的に使用される組換え手順によって調製され得る。
【００２７】
ＨＣＶｃ３３ｃ（ＮＳ３）およびｃ１００（ＮＳ４）領域配列は、免疫優性コアからのエピトープを含み、そしてＣｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、１００１１−１００１５に記載されるように調製された。ｃ２００抗原は、ｃ３３ｃおよびｃ１００抗原からなる融合タンパク質である。ｃ２２（１１９アミノ酸）およびＮＳ５（９４２アミノ酸）抗原は、ｃ１００−３（３６３アミノ酸）抗原の生成について以前記載された方法を使用して、ヒトスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）とのＣ末端融合物として、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の内部抗原として発現された。Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４、３６２−３６４（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）；およびＣｏｕｓｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９８７、６１、２６５−２７５（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）。ｃ３３ｃ抗原（３６３アミノ酸）は、５−１−１抗原の合成について記載された方法によってＥ．ｃｏｌｉ中で内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとして発現された。Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４、３５９−３６２（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。組換えＨＣＶ抗原は、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８９、１００１１−１００１５に記載されるように精製された。本発明において、全ＨＣＶ抗原は、ＳＯＤ融合タンパク質として調製された。しかし、他の適切な融合タンパク質は、融合パートナーを認識する適切な抗体の利用可能性に依存して作製され得る。
【００２８】
ＭＥＦＡ−６は、Ｃ型肝炎ポリタンパク質のコア、エンベロープ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域からのエピトープを含み、これらは、ＨＣＶ株１、２、および３からの等価な抗原決定基を含む。ＨＣＶエピトープについてコードする様々なＤＮＡセグメントは、ＰＣＲ増幅によって、または合成オリゴヌクレオチドによって構築された。以下の表３は、ＭＥＦＡ−６カセットにおける各エピトープのアミノ酸セグメント、様々なエピトープの線状配置およびコピー数を記載する。ＭＥＦＡ−６カセットは、本明細書中でその全体が参考として援用される１９９７年５月２３日に出願された出願、ＰＣＴ  ＵＳ９７／０８９５０に記載されるように調製された。
【００２９】
表３に示したように、ＭＥＦＡ−６抗原は、以下を含む：コアおよびＮＳ５領域からの多コピーのＨＣＶエピトープ；ＮＳ４  ５−１−１領域からの異なった血清型エピトープ；ｃ１００のＣ末端領域、Ｅ１およびＥ２領域、ならびにＨＣＶ  ＮＳ３（ｃ３３ｃ）領域からの単一コピーの主要な線状エピトープ。ＭＥＦＡ−６についての一般的構造式は、ｈＳＯＤ−−Ｅ１−Ｅ２−ｃ３３ｃ−５−１−１（タイプ１）−５−１−１（タイプ３）−５−１−１（タイプ２）−ｃ１００−ＮＳ５（２コピー）−コア（２コピー）である。この抗原は、酵母において大変高い発現レベルを有し、高度に均一になるまで精製され、そして下記のイムノアッセイにおいて高い感度および高い選択性を示す。ＭＥＦＡ−６は、１９９７年５月２０日に出願された出願第０８／８５９，５２４号（その全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように調製された。
【００３０】
【表３】
0004427182.tif 000004
【００３１】
検出可能なマーカーとしては、発色団、抗体、抗原、酵素、切断産物が検出可能な酵素反応性化合物、ローダミンまたはローダミン誘導体、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物、これらのマーカーの誘導体および／または組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。本実施例では、化学発光化合物であるジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）が使用された。任意のマーカーでの標識化がＭＥＦＡ−６または他のエピトープの最適な検出および抗原性を得るための条件下で行われる。ＤＭＡＥが、アッセイにおいて検出マーカーである場合、生じるＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ結合物は、トレーサーであり、ＤＭＡＥは、ＮａＯＨ／Ｈ2Ｏ2と反応させたときに、発光によって検出可能である。
【００３２】
ポリペプチド、抗体または合成ペプチド抗原は、ＤＭＡＥに共有結合した反応性部分とアミノ酸側鎖（例えば、リジンε側鎖またはシステインチオール）との反応によってＤＭＡＥで標識された（１９９５年１０月１９日に公開された、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｓ  ＣｏｒｐのＷＯ  ９５／２７７０２（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。例えば、本明細書中で記載されたＨＣＶ抗原は、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇから得られたＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−サクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル−１０−（３’−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート）とリジン側鎖のアミノ基との反応によって標識された。アミノ酸側鎖のチオールは、ＤＭＡＥ−ＥＤ−ＭＣＣまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−ＢｒＡｃ（Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して標識され得る。標識手順は、一般にＷＯ  ９５／２７７０２に記載された通りであり、各抗原について最適な検出および抗原性を提供するために必要に応じて条件は変化する。
【００３３】
【実施例】
（実施例１：手動アッセイ）
マジックライトアナライザーシステムＩＩ（Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ；ＭＬＡ  ＩＩ）を手動アッセイのために使用する。体積、濃度、時間および温度のようなパラメーターが手引きのために提供されるが、しかるべく調整され得る。簡潔には、試験サンプルの１０μｌのアリコートを、対応するチューブに添加した。試験サンプルは、好ましくは、おそらく抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体（例えば、血漿または血清）ならびに適切なコントロールである。各チューブに１００μｌの抗原希釈剤または緩衝液を加え、３７℃で６分間インキュベートする。各チューブに約６０μｇ／アッセイの最終濃度でラット抗ヒトＩｇＧ抗体（ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ）と結合体化した常磁性粒子（ＰＭＰ）を含む１００μｌの固相緩衝液を加える。しかし、他の抗ヒトＩｇＧ抗体が適切である。好ましくは、常磁性粒子は、直径が約１０μｍより小さい。ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ粒子をＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７５％  ＢＳＡ、０．１％  カゼイン、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％  酵母抽出物、０．２５％  Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、０．００５％  ＳＯＤ、０．０９％  ＮａＮ3および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む希釈剤で希釈し得る。続いて、ＤＭＡＥと結合体化した組換えＨＣＶ抗原（ＨＣＶ抗原／ＳＯＤ融合タンパク質）（例えば、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ、ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥおよびｃ２００−ＤＭＡＥ）を約０．１μｇ／アッセイ〜約１μｇ／アッセイの濃度で５０μｌの容量のリガンド試薬（ＬＲ）希釈剤中に加える。好ましくは、アッセイ当たりに約２５×１０6光ユニット当量（相対光ユニット、ＲＬＵ）が存在するようなリガンド試薬量を各サンプルに加える。このおおよその量の光ユニット当量は、単一のリガンドの添加、または多くのリガンドについて好ましい。ＬＲ希釈剤は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ3および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。完全な混合を保証するために、このチューブを１回当たり５〜１０秒間づつ６回ボルテックスミキサーで攪拌する。サンプルチューブを１８分間、３７℃でインキュベートする。サンプルチューブを磁石上に３分間（ＰＭＰ粒子を沈降させるのに十分な時間）置く。このサンプルをＰＭＰ粒子を保持するために磁石を使用してデカントする。ＰＭＰ粒子を１ｍｌのＰＢＳでボルテックスして２回洗浄する。洗浄溶液は、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ3および１ｍＭ  ＥＤＴＡである。混合、インキュベート、沈降およびデカントを行なう工程は、少なくとも１回繰り返され得る。各チューブに１００μｌの水を加え、ＰＭＰ粒子を再懸濁する。次いで、チューブをＭＬＡ−ＩＩ機器に配置し、そして発光を２秒間測定する。
【００３４】
（実施例２：自動化アッセイ）
上記の手動抗ＨＣＶアッセイをＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ装置を使用して、自動化使用に適応させた。以下の手順を使用する。簡潔には、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒシステムは、以下の工程を自動的に行う：１）１０μｌのサンプルをキュベットに分配する；２）１００μｌの補助希釈緩衝液、１００μｌのＬｉｔｅ試薬／固相、５０μｌの抗原試薬２（例えば、ＭＥＦＡ−６）、５０μｌの抗原試薬１（例えば、ｃ３３ｃ）を分配し、そして３７℃で１８分間混合物をインキュベートする；３）混合物から固相を分離し、非結合試薬を吸引する；４）洗浄試薬１でキュベットを洗浄する；５）各３００μｌの酸性試薬および塩基性試薬を分配し、化学発光反応を開始する；そして６）システム作動指示またはオンラインヘルプシステムに記載されるように、選択されたオプションに従って結果を報告する。固相／Ｌｉｔｅ試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシン  Ｂ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固相および４５×１０6試験Ｌｉｔｅ試薬（抗ＳＯＤ*ＤＭＡＥ抗体）を含む。補助の希釈緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．７５％  ＢＳＡ、０．００３％  酵母、０．０５ｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ  アンホテリシン  Ｂ、２４ｍｇ／Ｌ  硫酸ゲンタマイシン、０．０５ｇ／Ｌ  腹水  ＩｇＧ１および０．１ｇ／Ｌ  腹水  ＩｇＧ２Ａ（ブロッキング抗体）を含む。洗浄試薬は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０を含む。酸性試薬は、０．５％  Ｈ2Ｏ2／０．１Ｎ  ＨＮＯ3を含む。塩基性試薬は、界面活性剤とともに０．２５Ｎ未満のＮａＯＨを含む。
【００３５】
（実施例３：ｃ３３ｃを用いた手動アッセイ）
ｃ３３ｃＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１において上記した方法論を使用してアッセイ当たり１００ｎｇのｃ３３ｃで行った。抗原希釈剤は、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ  チオシアン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％魚ゼラチン、０．０９％アジ化ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。このアッセイを３×１０6ＲＬＵ／１０μｌ、３０μｇ／アッセイのＰＭＰで行った。アッセイを種々の時間および種々の温度下で行った。例えば、アッセイを４℃で０日目、４℃で３日目、３７℃で１日目、３７℃で２日目、３７℃で３日目および３７℃で６日目に行った。
【００３６】
１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サンプルチューブに加えた。サンプルは以下のものを含んでいた：ランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ２およびｒ３）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ）、セロコンバージョンパネル（ＰＨＶ９０５−５、ＰＨＶ９０７−４およびＰＨＶ９０４−６）、ＨＣＶ患者サンプル（ＦＦ２５９３１）およびセロコンバージョンサンプル（６２１４−０９および６２１２−０４）。結果を表４に示す。感度を光学密度単位のアッセイ検出カットオフによって除したアッセイサンプルの光学密度（ｓ／ｃｏ）として報告する。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値より下の相対光単位（ＲＬＵ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カットオフ値よりずっと上のＲＬＵを示した。
【００３７】
比較の目的で、いくつかのサンプル（表４を参照のこと）からのＨＣＶ抗体の検出をまた、Ｏｒｔｈｏ  ３．０および市販のストリップイムノブロットアッセイ（ＲＩＢＡ・  ３．０  Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、どちらのアッセイがＨＣＶ抗体検出のための確認試験として臨床的に使用されるかについて行った。ＲＩＢＡ法に従って、組換えＨＣＶ抗原をゲル電気泳動で分離し、そして患者の血清と接触させた。分離した抗原との反応性を標識２次抗体を使用してイムノブロットアッセイによって実施する。アッセイの結果をプラス／マイナスのスケールで記録する。Ｅｈｅｌｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９１、３３７、９１２−９１３（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。Ｏｒｔｈｏ  ３．０アッセイを製造者の指示に従って行った。ｃ３３ｃ、ｃ２２ｐ、ｃ１００ｐおよびＮＳ−５をこれらの試験のためのＨＣＶ抗原として使用した。
【００３８】
簡潔には、ＲＩＢＡ・３．０アッセイを以下のように行った。アッセイ開始の約３０分前に、キットを冷蔵（２〜８℃）から取りだし、そしてキットの成分を室温（１５〜３０℃）に至らしめた。必要な数のストリップをシールしたホイルポーチから取り除き、そしてアッセイチューブ立て中でそれぞれのチューブの中に置いた。１ｍｌの検体希釈剤をストリップ全体が液体で覆われるように各チューブに加えた。２０μｌの適切な検体またはコントロールを、対応するチューブに加えた。チューブにふたをし、反転して混合した。チューブを備えたラックをロッカーに置き、そしてゴムバンドまたはテープで固定した；ラックを室温（１５〜３０℃）で４〜４．５時間揺り動かした（１６〜２０サイクル／分で）。チューブは、ふたをはずし、そして液体を廃棄物容器へと完全に吸引した。１ｍｌの検体希釈剤を各チューブに加えた。チューブはふたをし、ロッカー上のラックに置き、そして室温で３０〜３５分間揺り動かした。次いで、液体を吸引した。１ｍｌの作業洗浄緩衝液を各チューブに加え、次いで、液体およびストリップを３０ｍｌの作業洗浄緩衝液を含む洗浄容器に注いだ（洗浄容器当たり最高２０ストリップ）。洗浄容器を完全に作業洗浄緩衝液で満たし（総容量、６０ｍＬ）、次いで、洗浄液をデカントした。ストリップを保持するため、洗浄容器をデカントしながらやさしく転がした。６０ｍｌの作業洗浄緩衝液を加え、旋回し、次いでストリップを保持しながら洗浄液をデカントした。ストリップ当たり１ｍｌの結合物を各洗浄容器に加えた（洗浄容器当たり最低１０ｍｌ）。洗浄容器をロータリシェイカー上で１１０±５ｒｐｍ、９〜１１分間、室温（１５〜３０℃）で回転した。作業基質を使用前１時間までに調製した。結合物インキュベーションの終了に際して、結合物をデカントし、ストリップを６０ｍｌの作業洗浄緩衝液を加え、そして旋回することにより洗浄した。洗浄液をデカントし、この工程をさらに２回繰り返した。最終洗浄液をデカントした。ストリップ当たり１ｍｌの作業基質を各洗浄容器に対して加えた（洗浄容器あたり最低１０ｍｌ）。洗浄容器をロータリシェイカー上で１１０±５ｒｐｍ、１５〜２０分間、室温（１５〜３０℃）で回転した。作業基質をデカントし、そしてストリップを６０ｍｌの蒸留水または脱イオン水を加え、旋回することによって洗浄した。洗浄液をデカントし、この工程をさらに１回繰り返した。ストラップを保持するため、洗浄容器をデカントしながらやさしく回転した。ピンセットを使用して、ストリップを吸収紙に移し、そして過剰な水をブロットした。ストリップを暗所、室温で少なくとも３０分間風乾した。ストリップを３時間以内に判読した。検体における抗ＨＣＶ反応性を各ストリップのヒトＩｇＧ（レベルＩおよびレベルＩＩ）内部のコントロールバンドの強度と各抗原バンドの強度を比較することによって決定した。抗体の同定を抗原バンドの特定の位置によって規定した。抗原／ペプチドバンドの強度を以下のように内部ＩｇＧコントロールの強度に関して記録した：なし（−）、レベルＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度より小さい（−／＋）、レベルＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度と等しい（１＋）、レベルＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度より大きく、そしてレベルＩＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度より小さい（２＋）、レベルＩＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度と同等（３＋）、およびレベルＩＩ  ＩｇＧコントロールバンドの強度より大きい（４＋）。
【００３９】
（実施例４：ｃ２００を用いた手動アッセイ）
ｃ２００  ＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、様々な量の還元剤を用いて実施例１に記載されたように行った。安定化緩衝液は、還元剤の量を除いて実施例３と同じであった。このアッセイを３×１０6ＲＬＵ／１０μｌ、３０μｇ／アッセイ  ＰＭＰで行った。アッセイを種々の時間で、そして種々の量の還元剤下で行った。例えば、アッセイを２０ｍＭ  ＤＴＴを使用して３７℃で１日後（バイアル１）行い、ＤＴＴなしで３７℃で１日後（バイアルＩＩ）、そして２０ｍＭ  ＤＴＴを試験前に加えた場合、３７℃で１日後（バイアルＩＩＩ）行った。バイアルＩＩおよびＩＩＩをまた、３日後に試験した。
【００４０】
１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サンプルチューブに加えた。サンプルは、以下を含んでいた：様々な希釈でのランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ２、ｒ３、ｒ４およびｒ５）、セロコンバージョンパネル（ＰＨＶ９０４−６およびＰＨＶ９０６−１）およびＨＣＶ患者サンプル（ＦＦ２５９３１）。結果を表５に示す。ｓ／ｎは、平均陰性値で除した感度である。
【００４１】
（実施例５：ＭＥＦＡ−６およびｃ３３ｃを使用した手動アッセイ）
ＭＥＦＡ−６およびｃ３３ｃＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１において上記された方法論を使用して、アッセイ当たり１００ｎｇのＭＥＦＡ−６および８５ｎｇのｃ３３ｃで行った。ＭＥＦＡ−６のための安定化緩衝液は、５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％  ＢＳＡ、および１％  チオグリセロールを含んでいた。このｐＨ９．５でＭＥＦＡ−６は安定なので、還元剤は必要ない。ｃ３３ｃのための緩衝液は、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％魚ゼラチン、１００ｍＭ  チオシアン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含んでいた。アッセイを４．５×１０6ＲＬＵ／１０μｌの抗ＳＯＤ*ＤＭＡＥ、３０μｇ／アッセイＰＭＰで行った。アッセイを種々の時間で、そして種々の温度下で行った。例えば、アッセイを４℃で７日目に、そして３７℃で７日目に行った。
【００４２】
１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サンプルチューブに加えた。サンプルは、ランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ２、ｒ３およびｒ４）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ）、セロコンバージョンパネル（ＰＨＶ９０５−５、ＰＨＶ９０９−１、ＰＨＶ９０９−２およびＰＨＶ９０９−３）、セロコンバージョンサンプル（６２１２−０２および６２１４−０９）およびセロコンバージョンコントロールパネル（ＳＣ−００３０Ａ、ＳＣ−００３０Ｂ、ＳＣ−００３０Ｃ、ＳＣ−００３０Ｄ、ＳＣ−００４０Ａ、ＳＣ−００４０Ｂ、ＳＣ−００４０Ｃ、ＳＣ−００４０ＤおよびＳＣ−００４０Ｅ）を含んでいた。結果を表６に示す。感度を、光学密度単位のアッセイ検出カットオフによって除したアッセイサンプルの光学密度（ｓ／ｃｏ）として報告した。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値より下の相対光単位（ＲＬＵ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カットオフ値よりずっと上のＲＬＵを示した。
【００４３】
比較の目的で、いくつかのサンプルからのＨＣＶ抗体の検出（表６を参照のこと）をまた、実施例３で記載されているように、Ｏｒｔｈｏ  ３．０およびＲＩＢＡ・３．０によって行った。
【００４４】
（実施例６：ＭＥＦＡ−６を用いた手動アッセイ）
ＭＥＦＡ−６  ＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１で上記された方法論を使用してアッセイ当たり１００ｎｇのＭＥＦＡ−６を用いて行った。ＭＥＦＡ−６の緩衝液は、５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％  ＢＳＡおよび１％  チオグリセロールを含んでいた。アッセイを４．５×１０6ＲＬＵ／１０μｌの抗ＳＯＤ*ＤＭＡＥ、３０μｇ／アッセイ  ＰＭＰで行った。アッセイを４℃で７日目に行った。
【００４５】
１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サンプルチューブに加えた。サンプルは、ランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ２およびｒ３）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ）およびセロコンバージョンコントロールパネル（ＳＣ−００３０Ａ、ＳＣ−００３０Ｂ、ＳＣ−００３０ＣおよびＳＣ−００３０Ｄ）を含んでいた。結果を表７に示す。感度を光学密度単位のアッセイ検出カットオフによって除したアッセイサンプルの光学密度（ｓ／ｃｏ）として報告した。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値より下の相対光単位（ＲＬＵ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カットオフ値よりずっと上のＲＬＵを示した。
【００４６】
比較の目的で、いくつかのサンプルからのＨＣＶ抗体の検出（表７を参照のこと）をまた、上記のようにＯｒｔｈｏ  ３．０およびＲＩＢＡ・３．０によって行った。前述の実施例は、本発明を例示することを意味し、そしていかなる方法でも本発明を制限するとは解釈されない。当業者は、本発明の精神および範囲内である改変を認識する。本明細書中で引用されたすべての参考文献は、ここでその全体が参考として援用される。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
【表７】
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