(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分析の方法であって、以下：
１以上の異種細胞を魚に導入する工程であって、該魚がゼブラフィッシュである工程；
該魚を薬剤と接触させる工程；および
該細胞または該魚の特性を分析する工程、
を包含し、該分析工程は、該特性が該薬剤の投与に応答性であるか否かを決定することを含む、方法。
【請求項２】
前記異種細胞が、少なくとも前記分析工程まで生存可能に残存する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記魚を培養し、これによって、前記異種細胞が該魚において増殖する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、分化マーカー、前記魚の生存、前記異種細胞の最初の導入部位に対する移動、該異種細胞または該魚の細胞の死、あるいは該異種細胞の増殖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異種細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記異種細胞を前記魚から回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記異種細胞を前記魚に導入する前または後に、該細胞をウイルスに感染させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析工程が、前記癌細胞に対する前記薬剤の効果をモニターする工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌細胞が、ヒト細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌細胞が、ヒト細胞株由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、ヒト腫瘍由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記魚がゼブラフィッシュの胚である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記導入工程が、前記異種細胞を前記魚の胚形態に微量注入する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、前記魚を含む培地中に導入されるか、または該魚への注射によって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤の効果が、前記癌細胞が該薬剤を伴わずに導入されたコントロールの魚における増殖または転移と比較した、該癌細胞の増殖または転移の阻害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記魚がゼブラフィッシュの胚であり、前記方法が、前記薬剤が前記魚における細胞に対する活性を有するか否かを決定するためのアッセイを実行する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
薬学的組成物として前記薬剤を薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
癌細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、以下
１以上の癌細胞を魚の集団に導入する工程であって、該魚がゼブラフィッシュである工程；
該薬剤を該魚の集団に投与する工程；および
該魚の集団における該癌細胞の発生に対する該薬剤の効果をモニターする工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記魚が、ゼブラフィッシュの胚である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞を増殖させる工程であって、以下
１以上の異種細胞を魚に導入する工程であって、該魚がゼブラフィッシュであり、該異種細胞がヒト細胞である工程；
該異種細胞が増殖する条件下で、該魚を培養する工程；および
該増殖された細胞を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記細胞が、増殖の過程において分化し、そして該細胞が、分化した組織として回収される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記異種細胞が、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、ニューロン、膵臓細胞、肝細胞、神経膠細胞および腎細胞からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞または病原体についてサンプルを分析する方法であって、以下：
患者から得られた細胞または細胞集団を、微量注入によりゼブラフィッシュに導入する工程；および
該細胞または細胞集団の特性を検出して、該細胞または細胞集団が癌細胞または病原体を含むか否かを示す工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
細胞集団が前記ゼブラフィッシュに導入され、検出される前記特性が細胞の増殖または転移であり、増殖または転移の検出は、該細胞集団が癌細胞を含むことを示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病原体が、細菌、ウイルスまたは真菌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ゼブラフィッシュがゼブラフィッシュの胚である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記魚が野生型のゼブラフィッシュである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記魚が変異体のゼブラフィッシュである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年１２月１日に出願された、６０／１１０，４６４の優先権を主張する。共有に係る同時係属中のＵＳＳＮ６０／１００，９５９（１９９８年９月１８日出願）およびＵＳＳＮ６０／０７５，７８５（１９９８年２月２２日出願）ならびにＷＯ９９／０３８５２は、関連する主題に関する。上記出願の各々は、全ての目的にためにその全体が参考として援用される。
【０００２】
（背景）
現在、マウスは、細胞移植アッセイについての選り抜きのモデル系である（Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８）。細胞が若齢マウスまたは成体マウスに注射され、それに続いて、そのマウスに化合物を注射し、そして生存度および腫瘍サイズについて試験される（Ｙａｎｇら、１９９７；Ｋａｔｓａｎｉｓら、１９９８）。細胞拒絶を防止するために、ヒト細胞の移植は、Ｎｕｄｅマウス系統またはＳＣＤＩマウス系統のいずれか由来の、免疫抑制されたマウスを使用して実施されなければならない（Ｙａｎｇら、１９９７；Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８；Ｋａｔｓａｎｉｓら、１９９８）。しかし、これらのマウスは、免疫応答を示さないので、これらは、正常マウスよりも強くなく、そしてその化合物の毒性効果により感受性である。さらに、これらの動物は、発生および維持するために高い費用がかかる。さらに、マウスは、子宮で（ｅｎ  ｕｔｅｒｏ）発生するので、マウス胚をアッセイすることが不可能であり、発生プロセスに対する化合物の効果の評価を非常に複雑にする。中空繊維モデル（ここで、腫瘍細胞で満たされた小さい管が、マウスの種々の部位に移植される）もまた、薬物スクリーニングに使用される。移植片に対する薬物の腫瘍細胞殺傷効果をモニターすることによって、研究者は、薬物が異なる経路で投与される場合に、実際にどの薬物が、その腫瘍部位に対してその効果を生じるかを試験し得る（例えば、静脈内  対  経口）。
【０００３】
動物モデルの制限は、ＮＣＩおよび他にヒト細胞の培養物中で薬物候補をまた試験するように駆り立て、そして、このＩｎｓｔｉｔｕｔｅは、現在、全ての主要なヒト悪性腫瘍のサンプルを含む、６０のヒト腫瘍細胞株のパネルに依存する。試験されるべき薬物は、腫瘍細胞型に基づいて、このパネルのサブセットに供給され、そしてそれらの細胞殺傷活性がモニターされる。
【０００４】
クローン原性アッセイもまた、実行される。この方法において、細胞株または患者の腫瘍細胞は、ペトリ皿または培養フラスコ中で増殖され、そして種々の抗癌処置に対するこれらの細胞応答が、モニターされる。しかし、これらのアッセイもまた、問題を有する。時折、これらのアッセイは行えない。なぜなら、それらの細胞が、培養物中で簡単に分裂しないからである。さらに、結果は、抗癌薬物が、体内でどのように機能するか予測しない。
【０００５】
ヒト発癌の正確なモデルについての継続的な探索において、ＮＣＩは、最近、組織型に基づいて細胞を再分類することを始めた−例えば、それらの細胞が保有する遺伝的欠損の型に従う、乳癌  対  結腸癌。特定の欠損を相殺する薬物が最も効果的に処方されることを可能にするために、研究者はまた、特定の欠損を矯正する薬物が同定され得るか否かを決定するために、各患者の腫瘍における遺伝子欠損を分析するための技術を開発している。なぜなら、次いで、これらは、各々の個々の腫瘍細胞構成に適合され得るからである。
【０００６】
ヒトにおける癌発生のより良好なモデルを作製するために、研究者は、現在、遺伝子変異に関連するヒト癌の増加した知見を利用している。彼らは、遺伝的にマウスを改変し、その結果、これらのマウスは、オンコジーンを促進する癌の異常な活性化またはヒトにおいて癌を導く腫瘍サプレッサー遺伝子の損失のいずれかの、同じ種の変化を保有する。このマウスが、ヒト腫瘍と同じように挙動する腫瘍を発生することであることが希望である。ある変異体マウス系統は、例えば、機能的ＡＰＣ遺伝子（欠失または不活性化される場合に結腸癌を誘導する腫瘍サプレッサー）を欠失する。現在まで、これらの結果は混乱している。
【０００７】
（特許請求される発明の要旨）
本発明は、魚を使用する細胞分析の方法を提供する。このような方法は、１以上の異種細胞を魚に導入する工程、およびその細胞または魚の特性を分析する工程を包含する。これらの方法は、魚の胚（特に、ゼブラフィッシュ胚）への異種細胞の導入に適切である。導入された細胞は、少なくともそのアッセイ工程が実施されるまで、生存可能に存続する。いくつかの細胞型は、レシピエントの魚における増殖を生じる。いくつかの方法において、この魚は、薬剤と接触され、そしてその分析工程が、その特性がその薬剤の投与に応答性であるか否かを決定する。分析され得る異種細胞または魚の特性としては、分化マーカー、ｒ、魚の生存、異種細胞の増殖、異種細胞の最初の導入部位に対する移動、異種細胞または魚の細胞の死、あるいは該異種細胞の増殖が挙げられる。いくつかの方法において、この異種細胞は、癌細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は、幹細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は、分化した細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は、ヒト細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は、細菌細胞または真菌細胞である。いくつかの方法において、この細胞は、ウイルス感染された細胞である。いくつかの方法はさらに、レシピエントの魚から異種細胞を回収する工程をさらに包含する。
【０００８】
本発明はさらに、癌細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングする工程を提供する。いくつかの方法は、１以上の癌細胞を魚の集団に導入する工程、薬剤をこの魚の集団に投与する工程、およびこの魚の集団におけるこれらの癌細胞の発生に対するこの薬剤の効果をモニターする工程を包含する。いくつかの方法において、このモニターする工程は、この魚におけるこれらの癌細胞の発生に対するこの薬剤の効果についてのＥＣ５０を決定する工程を包含する。いくつかの方法において、このモニターする工程は、この魚の集団に対するこの薬剤のＬＤ５０を決定する工程をさらに包含する。必要に応じて、この方法は、複数の薬剤について繰り返され、そして低いＥＣ５０｜ＬＤ５０比を有する薬剤が、キャリアを用いて薬学的組成物として処方される。
【０００９】
本発明はさらに、細胞を増殖させる工程を提供する。このような方法は、１以上の異種細胞を魚に導入する工程、これらの細胞が増殖する条件下でこの魚を培養する工程、およびこの増殖された細胞を回収する工程を包含する。いくつかの方法において、この細胞は、増殖の過程において分化し、そしてこれらの細胞は、分化した組織として回収される。いくつかの方法において、回収された細胞は、患者に移植され、この患者は、必要に応じて、この異種細胞が得られた患者と同じ患者である。
【００１０】
本発明はさらに、癌細胞または病原体についてサンプルを診断する方法を提供する。このような方法は、細胞の集団を含む患者からサンプルを得る工程；この細胞の集団を魚に導入する工程；およびこの細胞の集団の特性を検出して、この集団が癌細胞または病原体を含むか否かを示す工程を、包含する。
【００１１】
（定義）
最終分化をしない幹細胞は、制限なく分裂し得、そして子孫を生じ、この子孫が、分裂を続け得るかまたは分化し得る。幹細胞は、全能性、多能性または単能性であり得る。全能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）は、成体生物体の全ての細胞型を生じ得る。多能性幹細胞は、１つより多くの分化細胞型を生じ得る。単能性細胞は、単一の分化細胞型を生じ得る。幹細胞は、小さいサイズ、低顆粒性、核に対する細胞質の低い比率、ならびにオステオポンチン、コラーゲンおよびアルカリホスファターゼを発現しないことにより、一般的に特徴付けられる。幹細胞は、表皮系、腸系、上皮系および造血系について公知である。骨、軟骨、脂肪および３つの型の筋肉（平滑筋、骨格筋および心筋）の細胞についての幹細胞が、一般的な間葉幹細胞前駆体と考えられる（Ｏｗｅｎら、Ｃｉｂａ  Ｆｄｎ．Ｓｙｍｐ．１３６、４２〜４６、（１９８８）；Ｏｗｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．８７、７３１〜７３８（１９８７））。
【００１２】
分化マーカーのセットは、同定され得、かつ特定の細胞型に特異的な、１つ以上の表現型特性を意味する。分化マーカーは、細胞系統の種々の段階で一過的に提示され得る。系統への拘束なしに再生し得る多能性細胞は、細胞系統への拘束がなされる場合に、失われ得る、マーカーのセットを発現する。前駆細胞は、その細胞が成熟に向かって細胞系統経路を通って進行する時に発現され続け得るか、または発現されない続けないかもしれない、分化マーカーのセットを発現する。成熟細胞により排他的に発現される分化マーカーは、通常、細胞産物、細胞産物を産生するための酵素およびレセプターを産生するための酵素のような機能的な特性である。
【００１３】
特異的細胞型についての分化マーカーのいくつかの例は、次のようである。同じ細胞または細胞のクローン集団においてともに同定される場合の、心臓ミオシンアイソザイム発現、およびクレアチンキナーゼアイソザイム発現の心臓特異的パターンが、心筋細胞についてのマーカーである。心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ）はまた、光学顕微鏡分析による、その分岐した外見、およびギャップジャンクションを形成する能力により認識され得る。このような細胞は、コンフルエントな細胞を横切る電位を形成することおよびそれらの細胞を横切るシグナルの伝達を検出することにより、認識され得る。筋肉のα−アクチンｍＲＮＡ、および平滑筋細胞アクチンは、筋細胞の分化マーカーである。細胞またはクローン集団において同定される場合の、ミオシンアイソザイム発現、およびクレアチンキナーゼアイソザイム発現の筋特異的パターンは、骨格筋細胞についてのマーカーである。骨芽細胞は、骨基質物質を分泌し、細胞または細胞のクローン集団において共に同定される、ＡＬＰ、オステオカルシン発現、ＰＴＨ誘導型ｃＡＭＰ発現および骨鉱化作用（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）能力は、骨芽細胞についての分化のマーカーである。軟骨細胞は、軟骨を分泌する。細胞または細胞のクローン集団において同定されるアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）およびコラーゲンＩＩＢ型は、軟骨細胞についてのマーカーである。ケラチノサイトはケラチンを分泌し、そして市販されている染料を用いて認識され得る。脂肪細胞は、脂質を産生し、そしてＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色により認識され得る。
【００１４】
細胞は、異なる個体から得られる場合、個々の魚に対して異種である。代表的には、この異なる個体は、魚以外の種由来であり、例えば、哺乳動物由来である。
【００１５】
(詳細な説明)
（Ｉ．全般）
本発明は、後の分析または回収のための、異種細胞を魚に導入するための方法を提供する。この魚は、異種細胞が、多くの生理学的プロセス（増殖、分化、発現、分泌、および転移を含む）を受け得る、インビボインキュベーターを提供する。この方法は、細胞プロセスに対する効果ついての潜在的薬物のスクリーニング、細胞治療または組織工学における後の使用のための細胞の増殖、ならびに増殖細胞および／または転移細胞の存在についての患者の生検の診断を含む、多くの適用を有する。この方法は、他の種（特に、ヒト）由来の細胞が、異なる種間の体温の相違に関わらず魚において増殖し得るという見識を、幾分、前提とする。例えば、ヒトの体温は、約３６℃であり、一方、ゼブラフィッシュは、２７℃で通常発生し、そして３２℃以上の温度では、生育され得ない。本出願は、異種細胞が、それにもかかわらず、魚において生存および／または増殖し得る証拠を提供する。
【００１６】
マウスのような実験動物と比較して、移植アッセイのために魚を使用することにはいくつかの利点がある。第１に、初期の魚の胚は、まだ免疫系を発生していなく、そして先天性免疫系の任意の効果から隔離されており、その結果、異種細胞は、免疫拒絶に供されない。第２に、魚の胚の小さなサイズのために、比較的少数の移植細胞（例えば、胚あたり１，１０、または１０００細胞）を分析および／または回収することが可能である。第３に、いくつかの型の魚の胚は、比較的透明であり、これは、細胞を用いる多くの生理学的プロセスの直接の顕微鏡観察を容易にする。第４に、魚の胚は、異種細胞と潜在的薬物との接触を容易にする溶液中で、培養され得る。
【００１７】
一般に、それらのネイティブな環境において増殖する細胞（例えば、ＪＫ細胞）はまた、魚に移植された場合も増殖する。それらのネイティブな環境において増殖可能でない細胞（例えば、ＣＣＬ３７リンパ細胞）は、通常、魚において増殖しないが、いくつかの事例において、適切な増殖因子または他の因子を用いた処置により、増殖するよう誘導され得る。誘導された細胞は、代表的には、以下に記載される種々の分析を行うのに十分な期間（例えば、少なくとも１時間、および代表的には少なくとも１日、ならびに時には３日、１週間以上まで）、生存可能に存続する。増殖を受ける細胞は、レシピエントの魚の構成要素として、好ましくは、少なくとも１回、５回または１０回の倍加を受ける。一般的に、未分化細胞は、魚への導入において分化を受けるが、一方、最終分化細胞は、その状態のままである。異種細胞は、レシピエントの魚とは異なる種から得られ得、そして代表的には、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、霊長類、および特にヒト；細菌、植物および鳥類）から得られる。
【００１８】
任意の型の魚が、異種細胞のためのレシピエントとして使用され得る。適切な魚の例としては、真骨魚類（特に、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオまたはフグ）が挙げられる。異なる型の魚を培養するための手順は、類似であり、そして例えば、Ｍｅｄａｋａ（ｋｉｌｌｉｆｉｓｈ）：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｉｎｓ（Ｋｅｉｇａｋｕ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．編、１９７５）により記載される。細胞は、代表的に、魚の胚の形態に導入される。細胞の導入のための胚発生の好ましいステージは、１２８細胞ステージ、２５６細胞ステージ、１ｋ細胞ステージ、高いステージ（ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｓｔａｇｅ）（卵黄細胞上の高所に位置する（ｐｅｒｃｈｅｓ）胚盤（ｂｌａｓｔｏｄｉｓｃ）によって特徴づけられる）、長楕円ステージ（ｔｈｅ  ｏｂｌｏｎｇ  ｃｅｌｌ）（卵黄細胞を圧縮する胚盤を有し、肺胞の動物−植物軸（ｔｈｅ  ａｎｉｍａｌ−ｖｅｇｅｔａｌ  ａｘｉｓ）が短縮する）、および球ステージ（ｓｐｈｅｒｅ  ｓｔａｇｅ）（動物−植物軸に沿った継続的な短縮化が、なめらかでほとんど球形の後期胞胚を生成する）である。代表的には、少なくとも、１、１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００の細胞が、レシピエントの魚に導入される。
【００１９】
ゼブラフィッシュおよび特にゼブラフィッシュ胚は、異種細胞の移植のために好ましいレシピエントである。ゼブラフィッシュにおけるパターン形成および発生の分子的基礎は、ヒトと同一かまたは類似しているかのいずれかである（ＣｈｅｎおよびＦｉｓｈｍａｎ、１９９６；ＧｒａｎｔｏおよびＮｕｓｓｅｌｉｅｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ、１９９６、Ｗｙｌｉｅ編、１９９６）。さらに、胸腺は約７２時間で形成することから、この時間までに免疫系はまだ発生しておらず、初期ゼブラフィッシュ胚は、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔ）（または異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ））に対し良好な耐性を示す。この耐性は、同種移植片がゼブラフィッシュにおいて極度に良好に許容され、そして多年の間、移植実験において使用されている事実により示される。さらに、胚は透明であることから、内部形態学的変化（器官発生、腫瘍の転移および成長を含む）ならびに薬物の効果が、容易に試験され得る。単回交配が、１００〜２００の外部で受精された卵を産生するので、多数の胚が、細胞に注入され得る。化学物質が魚が泳ぐ溶液に直接添加され得、インタクトな胚に浸透し、薬物の曝露およびその後の試験を比較的簡単にする。このゼブラフィッシュはまた、他の動物モデルを越える利点を提供する。なぜなら、ゼブラフィッシュ胚は、他の動物胚が発生するよりも、より迅速に発生するからである。一般に、ゼブラフィッシュの体制プラン（ｂｏｄｙ  ｐｌａｎ）、器官、組織および他の系は、他の脊椎動物モデル（例えば、マウス）における類似の構成要素が発生するよりもずっとより迅速に発生する。ゼブラフィッシュの脊椎動物体制プラン全体は、代表的には、２４時間内に確立される。十分に機能する心血管系は、発生から最初の２４時間内に明らかになる（ＳｔａｉｎｉｅｒおよびＦｉｓｈｍａｎ、１９９４）。ゼブラフィッシュの残りの器官（腸、肝臓、腎臓および血管系を含む）は、４８時間内に確立される。孵化したゼブラフィッシュの胚は、１２０時間内に形態発生をほぼ完了する。これにより、その胚を、操作および観察に非常に利用しやすくし、そして高処理能力の自動化された観察および検出手順に受け入れられる（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）ようにする。
【００２０】
ゼブラフィッシュの胚は、水からの酸素および卵黄からの栄養の拡散により生存し得、従って完全な循環システムがなくても早期発生の間は十分耐えられる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９９５）。単一のゼブラフィッシュ胚は、発生の最初の６日間、１００マイクロリットル程度の液量で、維持され得；続いて、胚は、個々のマイクロタイターウェルまたはマルチウェルプレートの培養物中で維持され得る。試験化合物は、魚が浸けられている溶液に直接添加され得る。ゼブラフィッシュ胚に添加されたこの試験化合物は、インタクトな胚に直接浸透し、このことは、このマルチウェル形式を、高処理能力および自動化された化合物スクリーニングにとって特に魅力的にする。
【００２１】
ゼブラフィッシュは、外部で受精されるので、胚の操作は比較的容易である。細胞移植は、マイクロインジェクション（ゼブラフィッシュで十分に確立された技術）により実行される（ＨｏおよびＫａｎｅ、１９９０；Ｈａｒｎｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら、１９９６）。単回交配は１００〜３００の胚を産生し得るので、多数の異種移植宿主胚の生成が、比較的簡単である。さらに、近交系が利用可能であり、そして数千の魚が、水槽の小部屋で安価に生育され得る。ゼブラフィッシュアッセイの潜在的な重大な利点はコストである。現在、平均的なマウスアッセイは、政府によりなされる場合、約１６３０ドルかかり、そして商業的になされる場合、２９００ドルかかる。この高いコストは、マウスの育種および維持の高いコストならびに非常に手動的な注射および引き続く分析について自動化の欠如に起因する。対照的に、ゼブラフィッシュは、維持が比較的安く、そして胚が、個々のマイクロウェルに配置され得ることから、標準的な液体操作装置を用いた自動化分析が可能である。脊椎動物モデル系の鍵となる特徴の比較は、以下である。
【００２２】
【化１】
0004522587.tif 000002
（ＩＩ）癌の処置のための薬剤
本方法は、癌細胞に対する毒性ならびに／あるいは癌細胞の増殖および／または転移を阻害する能力について薬剤をスクリーニングする手段を提供する。この方法は、癌細胞を１つ以上の魚に移植し、そしてスクリーニングされるべき薬剤を投与することにより機能する。代表的に、この癌細胞はまた、比較の目的のために、薬剤を受けていない１以上のコントロールの魚に移植されるが、歴史的コントロールもまた使用され得る。次いで、この癌細胞の運命は、同時性コントロール動物または歴史的コントロール動物と比較して、この魚においてモニターされる。このコントロール動物において、癌細胞は存続され、増殖および／または転移する。処置された動物において、薬剤の所望の活性は、癌細胞の増殖の阻害、および／または転移の阻害、ならびに／または細胞の完全な排除により表される。
【００２３】
いくつかの方法において、魚細胞に対する薬剤の効果はまた、薬剤の副作用の尺度としてモニターされる。ゼブラフィッシュのような魚の透明な性質は、魚の組織および器官の発生に対する薬剤の任意の摂動の可視化を容易にする。さらに、魚の胚内でのｍＲＮＡおよびタンパク質の組成および分布が、インサイチュハイブリダイゼーションによりモニターされ得る。処置された魚に対する薬剤の効果は、その薬剤の副作用の尺度として、同時性コントロールまたは歴史的コントロールと比較され得る。理想の薬剤は、魚細胞に対する副作用に対して高い比率の癌細胞に対する活性を示す。
【００２４】
（１．スクリーニングされる薬剤）
癌細胞に対する活性についてスクリーニングされる薬剤、または以下に記載される他の型のアッセイにおける薬剤は、ペプチドまたは低分子、ホルモン、成長因子、およびサイトカインのコンビナトリアルライブラリー由来であり得るか、または天然に存在する分子であり得るか、もしくは製薬工業によって合成された化学化合物の現存のレパートリーに由来し得る。コンビナトリアルライブラリーは、１段階ごとの様式で合成され得る多数の型の化合物について作製され得る。このような化合物としては、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ置換型グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大きいコンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ  ９５／１２６０８、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ  ９３／０６１２１、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＷＯ  ９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ＷＯ  ９５／３５５０３およびＳｃｒｉｐｐｓ、ＷＯ  ９５／３０６４２（このそれぞれは、すべての目的のために参考として援用されている）に記載のコードされた合成的ライブラリー（ｅｎｃｏｒｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＥＳＬ）法により構築され得る。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ方法により作製され得る。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ  ９１／１８９８０を参照のこと。スクリーニングされる化合物はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから得られ得る。既知の抗腫瘍性活性を有する既存の化合物または薬物もまた、副作用プロフィールに対する決定された活性に対してスクリーニングされ得る。
【００２５】
（２．癌細胞）
癌細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物における癌組織から得られた初代細胞を含む。いくつかの異なる癌細胞型（血液細胞に発症する白血病、骨格筋または結合組織において発症する肉腫、および上皮細胞において発症する癌腫を含む）があり、癌の最も一般的な型としては、乳癌、結腸癌、肺癌が挙げられる。癌細胞としてはまた、リンパ腫、芽腫、神経膠腫、奇形腫および神経線維腫が挙げられる。癌細胞はまた、無限に増殖し、かつマウスのような実験動物において腫瘍を生じる細胞株を含む。癌細胞はまた、実験動物において腫瘍を生じないが、癌細胞を正常細胞と区別する少なくとも１つの分化マーカーを保有する前癌細胞を含む。前駆体癌細胞は、しばしば無限に増殖する能力によりさらに特徴付けられる。
【００２６】
（３．細胞投与の経路）
癌細胞および他の細胞は、代表的に、マイクロインジェクションにより魚の胚に投与される。この魚は、代表的に野生型であるが、魚の変異体系統もまた、治療薬剤と特異的な遺伝的欠陥との間の相互作用の分析のために使用され得る。魚は、代表的に、初期段階の胚であるが、幼生ゼブラフィッシュまたは成体ゼブラフィッシュもまた使用され得る。細胞は、魚の胚の卵黄または魚の胚の体内のいずれかまたは両方に注入され得る。細胞は、単一または複数の部位で注入され得る。魚の胚は、代表的に、薬剤の投与前の期間に培養され、癌細胞が新しい環境に適応し、増殖および／または転移することを可能にする。癌細胞の移植に生存しない任意の魚は、薬剤の投与の前に除去され得る。
【００２７】
（４．薬剤の投与）
薬剤は、癌細胞（または他の細胞）の魚への導入の前、同時、または後で投与され得る。通常、薬剤は、癌細胞の導入、およびその後のこの癌細胞がゼブラフィッシュにおいて増殖および／または転移を開始するのに十分な期間の後に投与される。この間隔は、代表的に、細胞導入後１２時間〜３６時間であり、好ましくは、細胞導入後約２４時間である。薬剤の投与後、魚はさらなる期間培養され、代表的には、少なくとも約２４時間、および時には１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月、あるいは死ぬまで培養される。代表的なモニタリングレジメンは、８日間または魚が死ぬまで２４時間ごとにモニターする。その後、この魚は、さらに１ヶ月間、２４時間ごとにモニターされる。
【００２８】
薬剤は、魚を含む培地にこの薬剤を添加することにより簡単に投与され得る。このアプローチは、魚の胚に麻酔薬および他の化学物質を導入するために長く使用されていた（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、１９９３）。あるいは、薬剤は、癌細胞と同じ部位または他の場所で魚に微量注入され得る。
【００２９】
（５．薬剤の活性評価）
癌細胞に対する薬剤の活性は、処置なしで同じ用量の癌細胞を受けた同時制御動物もしくは履歴制御動物に対して、注射された癌細胞を除去するかもしくはその数を減少させるか、それらの増殖を阻害もしくは除去する、および／またはそれらの転移を阻害もしくは予防する、その能力である。移植された癌細胞およびそれらの子孫の運命は、レシピエント魚に見出されない癌細胞抗原に特異的な抗体を用いて免疫染色することによってモニターされ得る。いくつかの型の癌細胞が、癌細胞の不透明な性質によって、目視により、魚細胞と区別され得る。癌細胞はまた、移植前または移植後に標識され得る。適切な標識としては、蛍光標識が挙げられる。あるいは、細胞は、癌細胞によって特異的に取り込まれる色素を用いて標識され得る。モニタリングは、薬剤の投与後に間隔を開けて行われる。例えば、２４時間の間隔が適切である。染色パターンは、胚における細胞のおよその数およびその位置を示す。細胞数は、増殖の指標である。細胞における位置の変化（例えば、経時的な細胞クラスターの分配）は、細胞転移の指標である。薬剤の活性は、ＥＣ５０として表され得る。ＥＣ５０は、処置した魚の５０％において所望の終点活性を達成するために必要とされる薬剤の用量を意味する。所望の終点の例としては、癌細胞の除去、癌細胞の増殖速度を阻害するに有意な能力、および癌細胞の転移を阻害するに有意な能力が挙げられる。
【００３０】
薬剤はまた、腫瘍誘発性新脈管形成を阻害するに有意な能力についてスクリーニングされ得る。魚への移植後、癌細胞は、周囲の魚内皮細胞における新たな血管増殖を促進する、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）を分泌する。ゼブラフィッシュは、新脈管形成を分析するために特に適切である。なぜなら、それらの透明な性質は、血管を顕微鏡下で直接可視化することが可能であるからである。ゼブラフィッシュにおける新脈管形成をモニターするための手順は、ＷＯ９９／０３８５２に詳細に記載される。手短には、宿主胚は、以下の通りに染色される：胚を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして内因性アルカリホスファターゼ活性について染色する。固定後、胚を１００％メタノールで一晩、−２０℃にて処理する。胚を再水和し、そしてＮＴＭＴ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で室温にて平衡化し、次いで７５ｍｇ／ｍｌ  ＮＢＴおよび５０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ホスフェートで染色する。必要に応じて、腫瘍細胞および魚細胞の発現プロフィールは、潜在的な抗新脈管形成剤での処置の前および後に決定され得る。示差的に発現された遺伝子のプロフィールが同定される。このようなプロフィールは、新たな血管が容易には観察できない他の動物またはヒト被験体に対する薬物のアッセイに用いられ得る。
【００３１】
上記のスクリーニング方法は、複数の魚において標準的なマイクロプレートウェル形式を用い、このマイクロプレートの１以上のウェルにおいて魚全体（代表的には、胚の段階）を用いて並行して行われ得る。この形式は、複数の魚に対して同じ薬剤をスクリーニングするために、または複数の魚に対して複数の薬剤をスクリーニングするために、用いられ得る。サンプル操作および検出手順の両方は、色素および化合物の迅速な再現性のある適用ならびに標的化合物の自動化スクリーニングのために、市販の機器およびソフトウェアシステムを用いて自動化され得る。
【００３２】
（６．副作用の評価）
抗癌治療薬として用いられ得る化合物を同定することに関連した困難の１つは、癌細胞の増殖を停止させるために用いられる多くの化合物がまた、増殖している非癌細胞に対して有害な効果を有することである。小児に罹患した癌を扱う場合にこれは特に問題である。なぜなら、小児の器官および組織の多くが依然として増殖および発達しているからである。魚細胞および／または胚形成に対する薬剤投与の副作用は、薬剤の投与後に間隔を置いてモニターされ得る。代表的に、投与された薬剤の活性を評価するための測定と同時に測定が行われる。
【００３３】
魚における壊死組織を分析するための方法は、同時係属中の出願ＷＯ９９／０３８５２に記載される。壊死組織は、例えば、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、測色法、化学ルミネセンス、デジタル画像解析または標準的なマイクロプレートリーダー技術を含む種々の技術によって検出され得る。例えば、魚胚は、細胞死活性（例えば、アポトーシスまたは壊死）の検出を可能にする、膜不透性の核染色蛍光色素を用いて染色され得る。好ましい色素としては、その多くが市販されている、キノリウム色素ファミリーの色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））が挙げられる。ベンゾチアゾリウム−４−キノリウムは、生きている胚の細胞のインタクトな膜を通過できない。しかし、この色素は、膜が不連続になったかまたは破壊された（細胞死を受けている細胞の特徴、ＬｉｅｐｉｎｓおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ，１９９４）、死んだ細胞または死につつある細胞に侵入して、死んだ細胞または死につつある細胞のＤＮＡへとインターカレート（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）し得る。ＤＮＡにインターカレートしたら、この色素は、激しく蛍光性になり、単一蛍光顕微鏡を用いての標識細胞の迅速な検出を可能にする。シグナルの大きさは、壊死細胞の数の尺度として役立つ。この蛍光色素は代表的に、魚を含む培地中に色素を添加することによって魚に投与される。あるいは、この色素は、魚に直接注射され得る。
【００３４】
可視的スクリーニングを行うことに加えて、魚組織における特異的分子変化が、ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションまたは特定のタンパク質の抗体染色によって検出され得る。ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションは、魚における慣用的な分子アプローチである（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、１９９３）。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからのジゴキシゲニン標識キットは、ＲＮＡプローブを標識するために用いられ得る。ホールマウント（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の通りに実施され得る：胚を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、プロテイナーゼＫで軽く消化し、そして６５℃でハイブリダイズする。アルカリホスファターゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を用いてシグナルを検出する。ＮＢＴ／Ｘ−ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で染色した後、胚を１００％メタノール中で漂白し、４％パラホルムアルデヒド中で再度固定し、そしてＰＢＳ中で保存する。複数インサイチュハイブリダイゼーションを、マルチウェルディッシュにおいて異なる魚に対して同時に行い得る。
【００３５】
ストレプトアビジン（アビジン）結合体化レポーター酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）の使用に基づく迅速染色手順を用いて、カルボキシラーゼ酵素を、胚全体の肝臓において検出し得る。このような酵素は天然でビオチン化される。これらのビオチニル−リジン含有酵素（例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよび他のカルボキシラーゼ）は、主に肝臓に位置する。この群の酵素は肝臓に濃縮されているので、染色は器官特異的である。
【００３６】
例として、胚（３、４、５または８日齢）を、パラホルムアルデヒドで１時間、室温にて固定し、そしてメタノール１００％で一晩、−２０℃にて処理した。この胚を、ＰＢＳＴで再水和し、そして漂白溶液（Ｈ2Ｏ2１０％）で２０分間処理した。ＰＢＳＴでの洗浄後、胚を、ブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中、３％  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）においてインキュベートした。胚を、ストレプトアビジン結合体化ペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）（ブロッキング溶液中での１：１００希釈物）とともに、振盪しながら室温にて２時間インキュベートした。次いで、これらを、ＰＢＳＴで２０分間づつ３回洗浄し、そしてジアミノベンジジン（ＤＢＡ）染色溶液（１ｍｌのＤＢＡストック溶液［ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５ｇのジアミノベンジジン／ｌ］、９ｍｌのＰＢＳ、１０μｌのＨ2Ｏ2［３０％］）を用いてペルオキシダーゼについて染色した。通常、特異的肝臓染色は、１〜５分間で可視化される。染色を、水での何回かの洗浄によって停止させた。
【００３７】
さらに、半数致死濃度（ＬＣ５０）についての値は、化合物の連続希釈物を投与し、そしてどの比率の魚が各希釈物で死ぬかを決定することにより、決定され得る。ＬＣ５０は、胚の５０％の致死を引き起こすために必要とされる濃度である。１００または１，０００のような高い治療ウィンドウ（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｗｉｎｄｏｗ）（ＬＣ５０／ＥＣ５０）を示す化合物は、良好な潜在的薬物候補である。なぜなら、治療濃度での毒性が低いからである。
【００３８】
（７．他のスクリーニングアッセイ）
癌細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングするために用いられたストラテジーおよび原理と密接に類似したストラテジーおよび原理を用いて、他の細胞型に対する薬剤についての種々のアッセイを行い得る。例えば、薬剤が、移植された病原性細胞（例えば、細菌細胞または真菌細胞）に対する細胞傷害性についてスクリーニングされ得る。薬剤はまた、移植された細胞のウイルス感染または病因を阻害する能力についてスクリーニングされ得る。このような方法では、異種細胞を、魚への移植の前または後にウイルスと接触させ得る。ウイルスは通常、レシピエント魚に感染することなく、移植された異種細胞に感染するウイルスである。この方法は、培養で複製できない、増殖するウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびいくつかの株のＨＰＶ（例えば、ＲｏｓｅｎおよびＧｒｅｔｃｈ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ５，３９３−３９９（１９９９）））について特に有用である。この方法はまた、移植されたヒト細胞のＨＩＶおよびヘルペスウイルスの感染を研究するために有用である。薬剤は、ウイルスの導入の前または後に投与されて、それぞれ、予防活性および治療活性を試験し得る。
【００３９】
薬剤はまた、正常細胞に対する、細胞分化および／または増殖を促進する活性についてスクリーニングされ得る。上記の任意の型の薬剤が用いられ得るが、増殖因子（例えば、サイトカイン、ＧＭ−ＣＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦおよび幹細胞因子）が特に適切である。分化状態の変化は代表的に、１以上の分化マーカーのセットんいおける変化を観察することにより示される。このような薬剤は、一旦同定されたら、損傷組織もしくは壊死組織のインサイチュでの修復を促進するために、または細胞治療もしくは組織操作におけるその後の使用のためにインビトロで細胞の分化および／もしくは増殖を促進するために、治療的価値を有する。しばしば、このような方法において用いられる細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞および間葉幹細胞を含む、幹細胞である。例えば、薬剤は、ニューロンへの神経幹細胞の分化を促進する活性について試験され得る。活性は、神経導入または成熟細胞の分化マーカーからモニターされ得る。同様に、薬剤は、筋細胞への心臓幹細胞の分化を促進する活性について試験され得、活性は、励起レベル、拍動能力または成熟細胞の分化マーカーによってモニターされる。
【００４０】
薬剤はまた、分化した細胞の種々の機能を促進または阻害する活性についてスクリーニングされ得る。このような機能としては、タンパク質の発現または分泌の促進が挙げられる。このような機能を有すると同定された薬剤は、コード配列が遺伝子治療によって被験体に導入される内因性タンパク質または外因性タンパク質の発現を調節するための治療において有用である。例えば、薬剤は、島細胞からのインスリンの分泌を促進する能力についてスクリーニングされ得る。あるいは、薬剤は、遺伝子治療において用いられるべきヒト幹細胞へと遺伝子操作によって導入された外因性酵素の発現を促進する能力について試験され得る。
【００４１】
（８．細胞治療および組織操作方法）
移植方法はまた、細胞治療または組織操作において使用されるべき細胞を培養するために有用である。このような方法は、インビトロで増殖できない細胞、またはその特性がインビトロ増殖によって有害に影響する細胞について特に有用である。いくつかの方法では、魚は、移植された細胞の増殖のためのインキュベーターとして役立ち、最終的な分化状態に到達せずに細胞の数が有意に増殖するのを可能にする。次いで、このような細胞は、この魚から回収され、そして組織再生が必要な部位で患者に導入される。次いで、細胞は、レシピエントにおいてインサイチュでさらなる増殖および分化を受ける。エキソビボ細胞治療のための方法は、Ｍａｙｈｅｗら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．４，３２５−３４（１９９８）；Ｗａｋｉｔａｎｉら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．４，４２９−４４（１９９８）によって記載される。他の方法では、魚における細胞の増殖は、認識可能な異種組織型（例えば、皮膚のパッチ）への分化をもたらす。次いで、異種組織は魚から採取され、そして被験体へとインタクトで移植される。例えば、異種皮膚は、魚から取り出され得、そして被験体における損傷または失われた皮膚のパッチを置き換え得る。皮膚移植についての方法は、Ｍａｎｓｂｒｉｄｇｅら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ４，４０３−１４（１９９８）によって考察される。他の方法では、異種細胞は、遺伝子治療に適切な核酸配列を用いて形質転換される。次いで、この異種細胞は、患者への導入の前に増幅のために魚に導入される。他の方法では、ヒトの造血幹細胞が、ヒト血小板および赤血球の大規模産生のために魚に導入され、ヒト血小板および赤血球は、患者の処置のために収集され得る。他の方法では、ヒト骨髄細胞が魚に増幅のために導入され、続いて、収集され、そして自己骨髄移植または同種異系骨髄移植において使用される。このような方法の他の適用としては、組織操作のための骨格の生成、軟骨の生成、心臓弁（ｈａｒｔ  ｖａｌｖｅ）、骨修復、靭帯修復、半月板（ｍｅｎｉｓｃｈａｌ）インプラント、自己軟骨細胞移植、神経再生脈管形成、および膵細胞、肝細胞もしくはグリア細胞の増殖が挙げられる。
【００４２】
（９．他の治療方法）
いくつかの方法では、魚は、その後ワクチンとして使用される癌細胞が増殖するためのインキュベーターを提供する。このような方法では、癌細胞は、患者の生検から得られ、魚に移植され、そして増殖する。次いで、移植された細胞と比較して数がかなり増加した、増殖した細胞が収集される。次いで、収集された細胞は殺傷され、そして患者に再度移植される。殺傷された細胞は、患者中に残存する生癌細胞に対する免疫応答を刺激する腫瘍抗原を保有する（例えば、Ｅｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６，３３６−４１（１９９９）；Ｃａｒｒ−Ｂｒｅｎｄｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２，４１５−２２（１９９９）を参照のこと）。収集された細胞はまた、実験動物において免疫原として用いられて、患者における受動免疫治療のための抗体を生成し得る。
【００４３】
他の方法では、癌細胞および非癌細胞の混合集団は、患者から入手される。細胞は、クローン単離体へと分離され、そして異なるクローン単離体が異なる魚に導入される。次いで、細胞を、魚中で増殖させる。増殖後、細胞を、癌特異的抗原の存在についてスクリーニングする。このような抗原を欠く細胞は、それらの宿主魚から回収され、そしてその細胞を入手した患者へと再度移植される。このような方法は、骨髄移植患者において癌細胞および非癌細胞を区別するために特に有用である。
【００４４】
（１０．診断方法）
本方法はまた、被験体からの生検の診断に使用され得る。生検された細胞は、魚に移植され、そして第ＩＩ節において記載した通りに、特に増殖および／または転移についてモニターされる。移植された細胞の増殖および／または転移は、生検が癌細胞を含むことの表示である。増殖および／または転移の割合は、腫瘍の悪性度および患者の予後の指標である。移植された細胞はまた、種々の抗新生物処置（例えば、放射線および化学療法）を用いてスクリーニングされて、特定の患者における癌細胞に対してどの治療が最も適切であるかが決定され得る。このバイオアッセイを用いて、骨髄、末梢血および体液における残りのリンパ腫細胞のクローン原性の可能性が決定され得る。類似の方法を用いて、患者からの組織サンプルにおける細胞病原体またはウイルス病原体を検出し得る。レシピエント魚内で細胞を培養することは、病原体がより容易に検出される増幅を提供する。このような方法は、移植された組織を受けた患者由来の生検を分析するために特に有用である（例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｔｎ．３，３２２−７（１９９９）；Ｃａｒｍａｎら，Ｊ．Ｈｅｐｔａｔｏｌ．２，１９５−２０１（１９９９年８月）を参照のこと）。
【００４５】
（１１．調査適用）
魚に細胞を移植することはまた、多数の基本的調査適用を有する。例えば、この方法を用いて、同じ生物からの他の細胞型とは独立して細胞系列の分化をモニターし得る。このようなことは、最後までは分化していない細胞を、魚の集団に移植し、次いで移植された細胞および／または宿主魚における分化のマーカーを経時的にモニターすることにより、達成され得る。ｍＲＮＡに相補的なプローブを含むアレイは、モニタリングのために適切な手段を提供する（例えば、ＷＯ９７／１０３６５を参照のこと）。プローブの適切な選択により、ｍＲＮＡの同じ混合物において、魚ｍＲＮＡを移植細胞のｍＲＮＡと区別することが可能である。あるいは、微小組織操作を用いて、別個の組織サンプルを異種細胞および宿主細胞から調製し得る。このような発現パターンは、薬物スクリーニングアッセイにおいてそれ自体有用である。例えば、特定のパターンが、特定の文化状態に特有であると決定された場合、そのパターンを、分化を阻害または促進する能力についてのスクリーニング薬剤において終点として用い得る。
【００４６】
（実施例１：Ｈｅｐ２細胞の移植）
ヒト細胞をゼブラフィッシュ胚に移植することの実行可能性を試験するために、本発明者らは、ヒト癌組織由来の細胞（ヌードマウスに注射した場合に致死的な腫瘍を形成することが以前に示された（Ｗｅｎｇｅｒら，１９９５；Ｃｈｉｎら，１９９７）ヒト胚芽細胞腫由来のＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５））を移植した。腫瘍を形成することに加えて、ＨｅｐＧ２細胞はまた、血管誘導タンパク質であるＶＥＧＦを含む、正常な肝細胞において存在する多数の因子を分泌する。このことは、腫瘍増殖を見ること、ならびに死んだ細胞および死につつある細胞を同定する生体染色の使用の両方により、ＶＥＧＦの効果（ＨｅｐＧ２細胞の増加した血管形成および心臓の欠陥を含む）（ＤｒａｋｅおよびＬｉｔｔｌｅ，１９９５；Ｆｅｕｃｈｔら，１９９７）について観察することにより、ＨｅｐＧ２細胞の生存能力をアッセイすることを可能にした。さらに、本発明者らは、視覚的外観、およびヒト抗原を認識するがゼブラフィッシュ抗原を認識しない特異的抗体を用いることの両方により、ＨｅｐＧ２細胞を同定し得る。
【００４７】
（Ａ．材料および方法）
（１．細胞培養）
ＨｅｐＧ２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）手順に記載される通りに維持した。手短には、細胞を、グルタミン、必須アミノ酸およびピルベートを補充したＭＥＭ（最少必須培地）（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を、８０％コンフルエンスになるまで増殖させ、そしてトリプシン／ＥＤＴＡを添加することにより収集し、同じ培養培地で２回洗浄し、そして注射の直前にＰＢＳ中に再懸濁した。
【００４８】
（２．移植）
用いられる移植技術は、ＨｏおよびＫａｎｅ，１９９０によって記載される技術と類似する。手短には、細胞をＰＢＳ中に再懸濁した後、細胞を、先端のｉ．ｄ．直径が１５ミクロンで、そしてｏ．ｄ．直径が１８ミクロンの、引いたガラスマイクロピペットに充填した。これは、容易な胚の貫通およびインタクトな細胞の注入を可能にする。このマイクロピペットを、マイクロマニピュレーターおよび空気式Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に取り付けた。このマイクロマニピュレーターを用いて、マイクロピペットの先端を、胚に挿入し、そしてＣｅｌｌ  Ｔｒａｍからの陽圧を用いて１０〜５０個の細胞をチップから放出した。移植を、胚の以下の３つの異なる領域において行った（図６）：
１）宿主における移植細胞の位置についての演繹的知識を伴わずに、胚の動物部分へと；
２）卵黄細胞においてランダムな位置へと；および
３）胚と卵黄球との縁部へと。
【００４９】
さらに、以下の２つの型の移植を行った：ａ）単一部位移植；およびｂ）細胞が一緒に凝集する代わりに組織全体に分配される、複数部位移植。全ての移植を、発生の高次の段階（１０００〜２０００細胞）でまたはその付近で行った。
【００５０】
（３．胚の操作）
胚を、野生型成体魚間の自然交配によって生成した。注射前に、４〜８細胞期の胚を、プロテアーゼ（１ｍｇ／ｍｌの胚培地）で５分間処理して、卵殻を除去する。次いで、胚を、胚培地中で５回洗浄して、プロテアーゼおよび消化された卵殻の両方を除去した。次いで、胚を、高次の段階の発生に到達するまで、ガラスビーカーにおいて胚培地中で２７℃で数時間回復させた。次いで、この胚を、胚培地中で１％アガロースから作製された保持ウェル中に配置した。３０〜４０個の胚を、並行して、かつ方向付けて並べた。移植後、胚を保持トレイから取り出し、そして寒天でコーティングした培養プレートに置き、そして回復させた。２４時間後、この胚を新たな培養プレートに移し、そして魚水（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で実験の持続時間の間維持した。
【００５１】
（４．細胞の標識）
収集前、細胞を、ＤｉＩ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ溶液（０．３Ｍスクロース中の０．０５％  ｄｉＩ）中で１５分間インキュベートした。ＤｉＩは、移植移動研究（Ｓｅｒｂｅｄｚｉｊａら，１９９２）を含む種々の長期の細胞追跡適用において用いられる親油性カルボシアニントレース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）である。上方蛍光顕微鏡法（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて、ＤｉＩ標識は、個々の移植細胞ならびに細胞塊の両方において可視化された。
【００５２】
（５．移植した細胞の抗体検出）
ＨｅｐＧ２移植細胞を、抗ヒトケラチノサイト１８抗体（ＲＥＦ）を用いて免疫検出した。サイトケラチン１８は、中間径フィラメントタンパク質であり、このタンパク質は、種々の条件下でＨｅｐＧ２中で発現することが示された（Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２９：５５０−８（１９９８））。移植胚を、パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定し、そしてメタノール１００％を用いて−２０℃で一晩処理した。この胚を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で再水和し、そして漂白溶液（Ｈ2Ｏ2  １０％）で２０分間処理した。ＰＢＳＴで洗浄した後、この胚をブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中、２０％  非働化ウシ血清、１％  ＤＭＳＯ）中で室温で１時間、振盪しながらインキュベーションした。次いで、一次抗体（モノクローナルマウスＩｇＧ抗ヒトケラチノサイト１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を、添加し（１：２０００希釈）、そして室温で振盪しながら２時間インキュベートした。同じブロッキング溶液で４回洗浄を行い、次いで、二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ）を添加し（１：２０００希釈）、そして室温で振盪しながら２時間インキュベートした。胚を同じブロッキング溶液で２回洗浄し、そして最終的にＮＴＭＴ溶液（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．５）で平衡化した。最後に、この胚を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いてアルカリホスファターゼについて染色し、そして光学顕微鏡下で可視化した。
【００５３】
（６．脈管染色）
胚を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして内因性アルカリホスファターゼ活性について染色した。固定後、胚を−２０℃でアセトンを用いて透過化処理し、次いで、７５ｍｇ／ｍｌ  ＮＢＴおよび５０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ホスフェートを用いて染色する。
【００５４】
（７．ウェスタンブロット分析）
絨毛膜を剥がした（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅｄ）胚を、１×ＳＤＳゲルローディング緩衝液中で再懸濁し、２分間煮沸し、そして１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上清サンプルを、１０％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を標準物質として用いた。電気泳動後、タンパク質を、４℃で１２０〜２００ｍＡを用いて４時間の間、ニトロセルロース膜に転写した（ＢＡ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）。このフィルターを、５％ミルク含有ＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で一晩ブロッキングした。次いで、このフィルターを、一次抗体（モノクローナルマウスＩｇＧ抗ヒトケラチノサイト１８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：２０００希釈）とともに室温で３０分間振盪しながらインキュベートした。同じブロッキング溶液で４回洗浄を行い、次いで、二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ）を添加し（１：２０００希釈）、そして室温で振盪しながら２時間インキュベートした。抗ケラチノサイト１８結合反応を、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＴＭＢ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（３，３’−５，５’テトラ−メチル−ベンジジン）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて可視化した。
【００５５】
（８．抗体染色）
胚を、移植して２４時間後に採取し、そしてマウスＩｇＧ抗ヒトケラチノサイト１８モノクローナル抗体（ＨｅｐＧ２細胞を認識するが、内因性魚抗原には結合しない）で染色した。この抗体を使用して、本発明者らは、肺組織および卵黄の両方で標識細胞を検出し得た。本発明者らはさらに、これらの細胞が、しばしば移植細胞により誘導されると予測される形態学的欠損の部位と隣接していたことを観察した。
【００５６】
（９．ＢＲＵ標識）
５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、有糸分裂Ｓ期マーカーである。増殖についてアッセイするために、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）の３μＭ溶液を、以前細胞を移植した異種移植片の２４時間ゼブラフィッシュ胚に注入した。胚を、２４時間インキュベートして、移植細胞および宿主細胞のＤＮＡにＢｒｄＵを組み込ませた。次いで、胚を採取し、４％  ＰＦＡを用いて室温で固定し、そして１００％メタノールで脱水した。
【００５７】
（Ｂ．結果）
細胞を注入した３５７胚のうち８０％が注入後２４時間生存した。不透明なＨｅｐＧ２細胞が、生存動物の約１０％において観察された。注入位置とその後の胚における細胞観察との間に明らかな相関は認められなかった。移植して２４時間後、ＨｅｐＧ２細胞が可視化された胚は、３つの異なる群に分けることができた：
１．正常と認められたが、卵黄に大きな細胞塊を有した胚（図１）、
２．正常と認められたが、胚体（ｂｏｄｙ）において個々の細胞を有した胚（図２）、および
３．形態的欠損および大きな細胞塊を有した胚（図３）。
【００５８】
群１および３ともに、ＨｅｐＧ２細胞が腫瘍を形成する能力の例を証明する。両方の場合において、観察された細胞塊は、時間がたつにつれてより大きくなり、このことは、ＨｅｐＧ２細胞が増殖していたことを示唆する。さらに、この塊が、胚体中に存在する場合、本発明者らは、細胞塊の物理的存在だけでは説明できない、胚に対する催奇形効果を観察した（図４）。このことは、ＨｅｐＧ２細胞が胚をもたらす因子を分泌していることを示唆する。さらに、本発明者らは、しばしば、細胞塊に取り込まれたゼブラフィッシュ細胞を観察した（図５）。このことは、ＨｅｐＧ２細胞がゼブラフィッシュ細胞を形質転換してい得ることを示唆した。第２群はまた、ＨｅｐＧ２細胞が魚の胚に転移し得ることを示唆する。いくつかの例においては、大きなＨｅｐＧ２細胞塊を有する胚は、移植して４８〜７２時間後に死亡した。対照的に、小さな塊または散在した個々の細胞を有する胚は、７日間生存し、この時点で実験を終了した。
【００５９】
胚において、（ゼブラフィッシュまたは他の種の）外因性ＶＥＧＦ（これは、ＨｅｐＧ２細胞により分泌されることが公知である）は、脈管形成の増加および心臓欠損の両方を引き起こす（ＤｒａｋｅおよびＬｉｔｔｌｅ、１９９５；Ｆｅｕｃｈｔら、１９９７）。これらの現象はともに、認識できるＨｅｐＧ２細胞塊を有する胚において観察された。図５は胚を示し、ここで、ＨｅｐＧ２細胞は、心膜に存在していた。心臓は、明らかに先天異常である。卵黄に大きな細胞塊を有する胚の脈管形成についての内因性アルカリフォスファターゼ染色は、卵黄中および卵黄周辺の血管の過剰生成を示した。卵黄において、これらは、通常には観察されない。本発明者らはまた、大きな脈管（背側の大動脈および背側静脈を含む）の厚さの増加を観察した。
【００６０】
移植ＨｅｐＧ２細胞が肉眼で認識できることを確認するために、本発明者らは、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）およびヒトＡＦＰ（ｆＡＦＰ）の存在について異種移植片胚を試験した（これらの２つのタンパク質は、通常は、培養物中でＨｅｐＧ２細胞により分泌され、そして肝細胞癌と診断された患者の血液中に存在する）（Ｈｕｂｅｒ、１９８５；Ｅｒａｉｓｅｒら、１９９８；Ｌｏｕｈａら、１９９７）。高レベルのｈＶＥＧＦはまた、ゼブラフィッシュおよび他の脊椎動物における心臓発達に対する有害効果と相関づけられた（Ｄｒａｋｅら、１９９５；Ｆｅｕｃｈｔら、１９９７、Ｓｅｒｂｅｄｚｉｊａ、１９９９）。これらの実験のために、異種移植片胚を、ｈＶＥＧＦまたはｈＡＦＰのいずれかに対するヒト特異的抗体で染色し、そしてこれらの抗体をＲＰＥ標識した二次抗体を用いて検出した。ＤｉＩおよびＲＰＥの蛍光スペクトルは類似しているので、移植を未標識ＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。胚を移植して２４〜７２時間後に採取した。移植細胞は、タンパク質の生成を含む適切な細胞特性を示す。ＶＥＧＦについて染色した胚（１００）のうち１００％が、細胞塊中に標識細胞を含んでいた。さらに、ｈＶＥＧＦ陽性胚のうち５０％において、個々のＲＰＥ標識細胞は、細胞塊の非常に近くに検出された。ｈＶＥＧＦ染色で示されたように、ｈＡＦＰについて染色した胚のうち１００％が、細胞塊中に標識細胞を有した（図５Ｃおよび５Ｄ）。ｈＶＥＧＦ染色とは対照的に、ｈＡＦＰ陽性胚において、胚が採取された時間に拘わらず、細胞塊の外で観察された細胞は存在しなかった。ｈＶＥＧＦおよびｈＡＦＰ抗体の両方について、染色をＨｅｐＧ２細胞に制限した。ｈＶＥＧＦ標識もｈＡＦＰ標識も、異種移植片ではないコントロール胚においては観察されなかった。
【００６１】
増殖についてアッセイするために、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）の３μＭの溶液を、細胞を以前移植した異種移植片の２４時間ゼブラフィッシュ胚に注入した。胚を、２４時間インキュベートして、移植細胞および宿主細胞のＤＮＡにＢｒｄＵを組み込ませた。次いで、胚を採取し、４％  ＰＦＡを用いて室温で固定し、そして１００％メタノールで脱水した。抗ＢｒｄＵおよび抗ＣＫ１８二重標識：ＢｒｄＵを組み込んだＨｅｐＧ２細胞を同定するために、胚をＢｒｄＵおよびＣＫ１８に対する抗体を用いて二重染色した。このプロトコルは、上記の抗体プロトコルと同様であったが、以下を改変した：１）ブロッキング溶液中でのインキュベーション前に、ＢｒｄＵ標識胚を、２Ｎ  ＨＣｌ中に３０分間浸漬して、抗体に対するＤＮＡの接近性を増大させた；２）抗ＣＫ１８およびそのＲＰＥ結合体化二次抗体とともにインキュベーションした後に、胚を、ＢｒｄＵに対するＦＩＴＣ結合体化モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。次いで、この抗体を、エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
【００６２】
全ての増殖細胞（移植細胞および宿主細胞の両方を含む）を標識した。具体的には、増殖ＨｅｐＧ２細胞を同定するために、本発明者らは、ヒト特異的抗ＣＫ１８抗体を用いて二重標識実験を行った。本発明者らは、ＢｒｄＵおよび抗ＣＫ１８を、それぞれＦＩＴＣ結合体化二次抗体およびＲＰＥ結合体化二次抗体を用いて検出した。以前に記載されたように、移植を未標識ＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。ＨｅｐＧ２細胞塊が肉眼で認識される１００の異種移植片胚を、移植して２４時間後に採取した。次いで、ＢｒｄＵの３μＭ溶液を、異種移植片胚のうち８０の卵黄へ注入した。次いで、この胚を、さらに２４時間発生させ、その後固定および染色した。抗ＢｒｄＵ抗体を用いて、ＨｅｐＧ２細胞および宿主細胞両方を標識したが、ＨｅｐＧ２細胞のみが両方の抗体によって標識された（図７）。ＢｒｄＵ注入の後に、８０の異種移植片胚のうち７２が両方の抗体で標識された細胞を含んでいた。対照的に、コントロール異種移植片胚（ＢｒｄＵを注入しなかった）は、抗ＣＫ１８標識細胞のみを含んでいた。この実験は、移植ＨｅｐＧ２細胞がゼブラフィッシュ胚において増殖することを明らかに示した。ゼブラフィッシュ胚中のＨｅｐＧ２細胞塊は、成体マウス中の異種移植片ＨｅｐＧ２腫瘍と組織学的に類似している。ＨｅｐＧ２細胞塊が、マウスモデルおよびそれらのヒト対応モデルにおいて生じた腫瘍に形態学的に類似していることを決定するために、本発明者らは、移植して２４時間後および４８時間後に採取した異種移植片胚の組織学的試験を行った。ゼブラフィッシュ胚中の細胞塊は、マウスで観察された腫瘍（７〜１０ｍｍ；Ｖｕｃｅｎｉｋら、１９９８）より小さかった（直径１００〜３００μｍ）が、細胞塊中のＨｅｐＧ２細胞の一般的形態は、類似していた（Ｋｌｅｉｎら、１９８９）。具体的には、ＨｅｐＧ２細胞は丸く、そして小さな細胞質を有した（図８）。ＨｅｐＧ２細胞は、組織切片中で容易に同定可能であった。なぜなら、ＨｅｐＧ２細胞の核は、ゼブラフィッシュ細胞の核より、大きくかつ密集していたからである。宿主細胞とは対照的に、ＨｅｐＧ２細胞は、非常に密集し、細胞間にほとんどまたは全く細胞外空間が存在しなかった。より小さな核を有する細胞（ゼブラフィッシュ細胞と予測される）もまた、ＨｅｐＧ２細胞塊中に存在した。細胞塊のいずれにも空胞のある空間があるという証拠は存在しなかった。このことは、移植細胞が死滅していたことを示唆した。
【００６３】
転移を確認するために、本発明者らは、数日間にわたり追跡し得る標識細胞を移植した。移植の前に、ＨｅｐＧ２細胞をＤｉＩで標識し、次いで、トリプシン／ＥＤＴＡを添加し、２回培養培地で洗浄することにより採取し、そして宿主胚中に移植する前に、ＰＢＳ中に再懸濁した。移植して２４時間後に、宿主胚をスクリーニングして、標識細胞の単一塊を有する胚を同定した。本発明者らは、これらの胚を観察し続け、細胞塊が残っている細胞をチェックし、そして胚の他の領域にいきわたらせた。標識細胞がＨｅｐＧ２細胞であったことを確認するために、本発明者らは、抗サイトケラチン１８抗体を用いて胚を染色した。本発明者らは、１００の胚を移植した；発生の２４時間で生存した胚のうち９５全てが、標識細胞塊を含んでいた。次いで、標識細胞の単一の粘着性塊を含んでいた２４の胚を続けて観察して選択した。発生の４８時間で、２２／２４の胚が、本来の細胞塊の外側にＤｉＩ標識細胞を含んでいた（図９）；発生の７２時間で、個々のＤｉＩ標識細胞を含んでいた２２全ての胚は、血管系と関連づけられた。具体的には、個々の細胞を、以下に見出した：１）背側血管および／または身体中心部の静脈に隣接した尾の間葉において、２）頭側脈管に隣接する頭部全体に、および３）心筋または心内膜のいずれかにおける心臓の壁内部に。６日間までに、新たな細胞塊を尾（図９）および頭で観察した。このことは、個々の標識ＨｅｐＧ２細胞が、初期の時点でそれらの位置で観察され、増殖していることを示した。
【００６４】
（Ｃ．結論）
上記の実験は、ヒト癌細胞がゼブラフィッシュの成長温度（すなわち、本出願においては２７℃）で生存することができないという従来の知見が正しくないことを示す。さらに、細胞は、生存するばかりでなく、ＨｅｐＧ２がヌードマウスに注入された場合に形成された腫瘍に類似し得る塊を形成するようである。さらに、いくつかの腫瘍は、ゼブラフィッシュ胚に転移するようである。従って、ゼブラフィッシュを用いて、ヒト癌細胞に対する活性についての薬剤をスクリーニングし得る。
【００６５】
（実施例２：他のヒト細胞株およびヒト腫瘍細胞を用いた移植）
いくつかの他のヒト細胞型を、ＨｅｐＧ２細胞について記載した同じ方法を用いてゼブラフィッシュに移植した。結果を、表１にまとめる。
【００６６】
【表１】
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全ての特性は、顕微鏡観察により決定した。細胞塊の存在は、移植細胞のいくらかの増殖を示す。細胞塊増殖は、より過剰な増殖を示す。移植細胞が、ＨｅｐＧ２およびＣＣＬ−１８細胞についての場合と同じように、胚全体にわたって存在することは、転移を示す。ＣＮＳ中のＮＴ２Ｄ細胞（神経幹細胞）の存在は、移植細胞がレシピエント魚内からの内因性シグナル伝達に応答することを示す。
【００６７】
前述から、本発明が以下のように簡潔に表され得る多くの使用を包含することは明らかであるはずである。本発明は、異種細胞の生存を維持および／または異種細胞を増殖するために、レシピエントとして魚の使用を包含する。本発明はさらに、細胞の応答についての潜在的な薬物をスクリーニングするために魚に導入した異種細胞の使用を包含する。本発明はさらに、患者の処置のための医薬の製造に関して、魚に導入された異種細胞の使用を包含する。本発明はさらに、患者組織サンプル内の病原体または癌細胞の診断のために、魚に移植された異種細胞の使用を包含する。前述の発明は、明確性および理解の目的でいくらか詳細に記載されてきたが、本開示を読むと、形態および詳細の種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者に明らかである。上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定するためではない；本発明の他の改変は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲に包含される。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるのではなく、代わりに、添付の特許請求の範囲を参照して均等物の全範囲に沿って決定されるべきである。本出願に引用される全ての刊行物、参考文献および特許文献は、個々の刊行物各々または特許文献が、個々に記載されているのと同じように、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【００６８】
参考文献
【００６９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  移植後２４時間での、ＨｅｐＧ２細胞が卵黄（Ｙ）中で細胞塊（矢印）として可視化された胚。細胞塊を除き、胚は全く正常にのように見える。眼（Ｅ）および耳胞（ＯＴ）を、位置づけのために印している。
【図２】  移植後４８時間での、ＨｅｐＧ２細胞が体内で個々の細胞（矢印）として可視化された胚。背びれ（ＤＦ）、腹びれ（ＶＦ）および卵黄（Ｙ）を、位置づけのために印している。
【図３】  移植後２４時間での、ＨｅｐＧ２細胞が形態学的欠陥と関連する細胞の大きな細胞塊（矢印）として可視化された胚。尾（Ｔ）および卵黄を、位置づけのために印している。
【図４】  移植後４８時間で、ＨｅｐＧ２細胞は、胚の心膜において大きな細胞塊（長い矢印）として見られ得る。ＨｅｐＧ２細胞の存在は、大きさが減少し、そして不規則に拍動することが観察された発生中の心臓（短い矢印）に対する、催奇効果を有したようであり、おそらく、ＨｅｐＧ２細胞からのＶＥＧＦの分泌によって引き起こすようである。心房（Ａ）、心室（Ｖ）および卵黄を、印している（Ｙ）。
【図５】  移植後４８時間で、ＨｅｐＧ２細胞は、尾の背側部分上の細胞の塊として可視化される。ゼブラフィッシュの細胞は、この細胞塊（矢印）に取り込まれる。脊索（Ｎｏ）、背びれ（ＤＦ）、腹びれ（ＶＦ）および卵黄（Ｙ）を、位置づけのために印している。
【図６】  移植を、高いステージの胚における、以下の３つの異なる領域において実行した：胚（Ｅｍ）の動物部分（宿主における移植された細胞（長い矢印）の位置の予備知識なしで）；卵黄細胞（Ｙ；矢じり）におけるランダムな位置および；胚と卵黄球（ｙｏｌｋ  ｂａｌｌ）との間の縁（短い矢印）。
【図７】  移植後４８時間での、異種移植胚におけるＨｅｐＧ２細胞のＢｒｄＵおよびｃＫ−１８抗体染色（Ａ）卵黄の位置およびＨｅｐＧ２細胞塊の位置を示す暗視野画像；（Ｂ）ローダミンフィルターセットを用いた同じ胚のエピ蛍光（Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像は、細胞塊に対するＣＫ１８の位置を示す。ＣＫ１８染色は、宿主組織またはコントロール胚において観察されなかった。（フルオレセインフィルターを使用した同じ胚のＣＯエピ蛍光画像は、ＨｅｐＧ２細胞塊におけるＢｒｄＵ標識を示す。卵黄が球状であることから、卵黄のシンシチウム層のＢｒｄｕ標識されたほとんどの細胞が焦点外にある）白矢印は、ＢｒｄＵを用いて標識された宿主細胞を示している。
【図８】  移植されたＨｅｐＧ２細胞は、腫瘍細胞形態を有する。（Ａ）異種移植胚を通る斜矢状（ｏｂｌｉｑｕｅ  ｓａｇｉｔｔａｌ）断面の明視野画像。脊索（ＮＣ）および前中枢神経系（ＡＮＴ．ＣＮＳ）が、標識化または位置付けされる。（Ｂ）および（Ｃ）細胞塊および前ＣＡＮの高倍率像。ＨｅｐＧ２細胞の核は、宿主核より大きくそして色が明るい。ＨｅｐＧ２細胞塊は、細胞外空間をほとんどまたは全く有さない、密接に詰め込まれた細胞を含む。
【図９】  異種移植胚における衛星細胞塊形成。移植後７２時間および１４４時間の同じ異種移植胚の位相差画像および蛍光画像。７２時間で、初期塊（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｓｓ）（Ｐ）の細胞は、分散するようである。１４４時間までに、位相差および蛍光の両方で可視化される衛星細胞塊は、胚の尾全体に存在した。位置付けのために、肛門を印す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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