(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを増幅する方法であって，
（ａ）  ＤＮＡを含むサンプルを提供し，ここでＤＮＡは単一の細胞のゲノムまたはその染色体またはそのフラグメントであり；
（ｂ）  増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適した条件下で制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレアーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドがリン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオチドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；
（ｃ）  少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリングさせ，ここで
（ｃａ）  （ｃａａ）  同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであり；
（ｃａｂ）  前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにライゲートさせ；そして
（ｃａｃ）  前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除去し；または
（ｃｂ）  （ｃｂａ）  同時にまたは続いて，５'末端のヌクレオチドがリン酸化されている第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにハイブリダイズさせ，ここで第２のプライマーは第１のプライマーよりも長く；そして
（ｃｂｂ）  前記第１のプライマーおよび第２のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにライゲートさせ；または
（ｃｃ）  （ｃｃａ）  工程（ｃ）の前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを，５'オーバーハングが生成するように前記３'オーバーハングにハイブリダイズさせ；そして
（ｃｃｂ）  工程（ｃｃａ）の前記プライマーを前記ＤＮＡフラグメントの凹型５'末端にライゲートさせ；
（ｄ）  生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして
（ｅ）  前記ＤＮＡフラグメントを工程（ｃａ）もしくは（ｃｂ）の前記第２のプライマーまたは工程（ｃｃ）の前記プライマーの相補鎖とハイブリダイズしうるプライマーで増幅する
の各工程を含む方法。
【請求項２】
前記単一の細胞が，播種性腫瘍細胞，末梢血細胞，骨髄吸引物からの細胞，腫瘍生検からの細胞，臍帯血から得られた細胞，リンパ節から得られた細胞および／または微小切開組織から得られた細胞である，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが１コピーの二本鎖ＤＮＡ配列の形で存在する，請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡフラグメントの数的多量性が維持される，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記方法が，工程（ａ）の前にＤＮＡを含む前記サンプルをプロテイナーゼで消化する工程（ａ'）を含み，かつ工程（ｂ'）における蛋白質消化の後にプロテイナーゼが不活性化される，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記プロテイナーゼが熱不安定性である，請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである，請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記プロテイナーゼが工程（ｂ'）において熱不活性化される，請求項５−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡフラグメントが≦３ｋｂｐのサイズを有する，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡフラグメントが，２００−４００ｂｐの平均長を有する，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記制限エンドヌクレアーゼが，その制限部位中にシトシン／グアニンを含まない，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記制限エンドヌクレアーゼが４つの規定された塩基を有するモチーフを認識する，請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記制限エンドヌクレアーゼがコンセンサス配列ＴＴＡＡを認識する，請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのイソシゾマーである，請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃａａ）において，前記第２のプライマーが前記第１のプライマーより長い，請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃａａ）において，前記第２のプライマーのアニーリング温度が，前記第１のプライマーの前記第２のプライマーおよび前記５'オーバーハングへのハイブリダイズ温度より高い，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃａａ）において，前記第１のプライマーが１１または１２ヌクレオチドを含み，前記第２のプライマーが２１ヌクレオチドを含む，請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃａａ）または工程（ｃｂａ）において，前記第１のプライマーが前記第２のプライマーに少なくとも部分的に相補的である，請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの配列が非縮重である，請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃａａ）において用いられる前記第１のプライマーが配列番号２に示される配列からなり，および／または工程（ｃａａ）において用いられる前記第２のプライマーが配列番号１に示される配列からなる，請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが，ＤＮＡフラグメントと別に互いにハイブリダイズされ，工程（ｃａ）または工程（ｃｂ）の前に前記ＤＮＡフラグメントに加えられる，請求項１−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃａａ）における第１のプライマーの最後の３'ヌクレオチドがｄｄ−ヌクレオチドである，請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記単一の細胞の全部の核ゲノムが増幅される，請求項１−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記単一の細胞が化学的に固定された細胞である，請求項１−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）−（ｅ）が１つの反応容器中で実施される，請求項１−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
増幅されたＤＮＡを分析する方法であって，
（ａ）請求項１−２５のいずれかに記載の方法により増幅されたＤＮＡフラグメントを得；そして
（ｂ）増幅されたＤＮＡフラグメントをＤＮＡ分析のために使用する
の各工程を含む方法。
【請求項２７】
増幅されたＤＮＡを分析する方法が，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ），代表相違分析（ＲＤＡ），分析的ＰＣＲ，制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析，一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析，ＤＮＡ配列分析，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ），フィンガープリント分析および／またはＦＩＳＨ分析である，請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２０において定義される第１のプライマーおよび／または第２のプライマーを含む、請求項１−２５のいずれかに記載の方法のためのキット。
【請求項２９】
請求項２０において定義される第１のプライマーおよび／または第２のプライマーの，請求項１−２５のいずれかに記載の方法のためのキットの製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は，ＤＮＡを増幅する新規な方法に関する。該方法は，ＤＮＡまたは単一の細胞の全ゲノム，染色体またはそのフラグメントの増幅に特に有用である。さらに本発明は，該方法の，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）分析，蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析，一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析，ＤＮＡ配列分析，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ）分析，フィンガープリント分析および／または制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析等の，医療，法医学，診断または科学的目的のためのＤＮＡ分析における用途に関する。
【０００２】
本明細書の全体を通して，いくつかの文献が引用されている。本明細書に引用される各文献（製造元の仕様書，指示などを含む）は，本明細書の一部としてここに引用されるが，引用される文献のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０００３】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は，ＤＮＡを増幅するための非常に強力なインビトロの方法であり，これは１９８５年に最初に導入された（Ｓａｉｋｉ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４）。ＰＣＲは，熱変性，プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の繰り返しにより，１つの標的ＤＮＡ分子を容易に検出しうる量に増幅することができる。
【０００４】
最初はＰＣＲは標的ＤＮＡ中の単一の遺伝子座を増幅するために適用されたが，多数の遺伝子座を同時に増幅するのに用いられることが増えてきている。このＤＮＡの一般的増幅のためにしばしば用いられるプライマーは，ゲノム中の反復配列に基づくものであり，このプライマーにより適当に配置された反復間のセグメントを増幅することができる。散在反復配列（Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＰＣＲ（ＩＲＳ−ＰＣＲ）は，ヒト染色体特異的および領域特異的ライブラリを作成するために用いられている（Ｎｅｌｓｏｎ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６６８６−６６９０）。ヒトにおいては，最も多い反復のファミリーはＡｌｕファミリーであり，半数体ゲノム中に９００，０００要素が含まれ，したがって，平均間隔は３−４ｋｂであると見積もられている（Ｈｗｕ（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３８７５−３８７９）。しかし，ＩＲＳ−ＰＣＲの主な短所は，ＡｌｕまたはＬ１等の反復配列がゲノム全体にわたって均一に分布していないことである。例えば，Ａｌｕ要素は，ヒト染色体の明縞（ｌｉｇｈｔ  ｂａｎｄ）に優先的に見いだされる。したがって，そのようなＰＣＲ法によってこれらの領域に対するバイアスが得られ，一方，他の領域はより少なく表され，したがって増幅されないかまたは検出可能なレベル以下でしか増幅が得られない。さらに，この技術は，多量の反復ファミリーが同定されている種においてのみ適用可能であり，ショウジョウバエ，およびあまりよく特徴決定されていない動物および植物などの他の種については，この方法を適用することができない。
【０００５】
ＩＳＲ−ＰＣＲを用いるよりも一般的な増幅は，“縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ”（ＤＯＰ−ＰＣＲ）を用いることにより行うことができ，これは種に依存しないという追加の利点を有する（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，７１８−７２５）。ＤＯＰ−ＰＣＲは，ＰＣＲプロトコルの最初の低温アニーリングサイクルの間に，用いられる部分的に縮重したオリゴヌクレオチドの３’末端により特定される短い配列からプライミングが行われるという原理に基づく。これらの短い配列は頻繁に生ずるため，標的ＤＮＡの増幅は多数の位置で同時に進行する。
【０００６】
ＤＯＰ−ＰＣＲは，純粋かつ十分な量の所望のＤＮＡ，例えば，フロー・ソート染色体，微小切開染色体縞または単離された酵母人口染色体（ＹＡＣｓ）を得ることができるのであれば，高レベルの単一コピー配列を含有するライブラリを生成するために適用することができる。しかし，ＤＯＰ−ＰＣＲは，単一の細胞のＤＮＡ含有物の十分かつ均一な増幅を提供することができそうにない（Ｋｕｕｋａｓｊａｒｖｉ（１９９７），Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ  １８，９４−１０１）。
【０００７】
ＰＣＲの感度は，単一の細胞中の特定の標的ＤＮＡの分析を可能とする（Ｌｉ（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，４１４−４１７）。これは，初期胚からの単一の細胞を用いる移植前の遺伝的疾病診断（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ（１９８９），Ｌａｎｃｅｔ  １，３４７−３４９），および単一の精子（Ｃｕｉ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，９３８９−９３９３），または卵母細胞（Ｃｕｉ（１９９２），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，７１３−７１７）を用いる遺伝的組換え分析の開発につながった。しかし，これらのすべての場合において，単一の細胞は，所定の標的配列について１回しか分析することができず，任意の１つの細胞の遺伝子型を独立して確認することは不可能である。
【０００８】
“プライマー伸長前増幅”（ＰＥＰ）と称される方法は，単一の細胞中に存在するＤＮＡ配列の多コピーを作成することにより，この問題を回避することに向けられている。ＰＥＰは，１５塩基の完全に縮重したオリゴヌクレオチドのランダム混合物をプライマーとして用い，このことにより，ランダムに分配された部位からのＤＮＡ配列の増幅を行う。単一のヒト半数体細胞中のゲノム配列の約７８％を３０回以上コピーしうると見積もられている（Ｚｈａｎｇ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５８４７−５８５１）。しかし，これまでのところ，単一の細胞の全ゲノムの完全かつ均一な増幅は，ＰＥＰ等の方法を用いては証明されていない。
【０００９】
代表相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）と称される方法は，正常ゲノムと腫瘍ゲノムとの対の間の相違を発見する，サブトラクトＤＮＡハイブリダイゼーション技術である（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，９４６−９５１）。ＲＤＡに必要なＤＮＡの示されている最少量は３ｎｇであり，これは約１ｘ１０3個の細胞に相当する。しかし，ＲＤＡによってはゲノム配列の７０％しか再現性をもって増幅することができない（Ｌｕｃｉｔｏ（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，４４８７−４４９２）。したがって，代表相違分析による単一の細胞の全ゲノムの均一かつ完全な増幅は不可能である。
【００１０】
したがって，上述の先行技術を考慮して，ゲノムＤＮＡ，特に単一の細胞からのゲノムＤＮＡの，実質的に均一な，好ましくは完全な増幅を可能とする方法が求められている。
【００１１】
すなわち，技術的課題は，上述の要求を満たし，上述の欠点を排除する手段および方法を提供することである。
【００１２】
この技術的課題は，本発明により特徴づけられる態様を提供することにより解決される。
【００１３】
すなわち，本発明は，以下の各工程を含む，ＤＮＡを増幅する方法に関する：
（ａ）  ＤＮＡを含むサンプルを提供し；
（ｂ）  増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適当な条件下で制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレアーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドがリン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオチドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；
（ｃ）    少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリングさせ，ここで
（ｃａ）  （ｃａａ）  同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであり；
（ｃａｂ）  前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにライゲートさせ；そして
（ｃａｃ）  前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除去し；または
（ｃｂ）  （ｃｂａ）  同時にまたは続いて，５'末端のヌクレオチドがリン酸化されている第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにハイブリダイズさせ；そして
（ｃｂｂ）  前記第１のプライマーおよび第２のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにライゲートさせ；または
（ｃｃ）  （ｃｃａ）  前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記３'オーバーハングにハイブリダイズさせて，５'オーバーハングを生成させ；そして
（ｃｃｂ）  前記プライマーを，前記ＤＮＡフラグメントの凹型５'末端にライゲートさせ；
（ｄ）  生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして
（ｅ）  前記ＤＮＡフラグメントを，工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖とハイブリダイズしうるプライマーで増幅する。
【００１４】
本発明にしたがって用いる場合，“類似する長さのＤＮＡフラグメント”との用語は，統計学的レベルにおいて同等の長さのサイズを有するフラグメントを意味する。同等の長さのＤＮＡフラグメントとは，例えば，５０±５ｂｐまたは４ｋｂｐ±０．４ｋｂｐのフラグメントである。好適に生成されるＤＮＡフラグメントの長さの範囲は，約５０ｂｐと約４ｋｂｐとの間であることが有利である。より長いまたは短いＤＮＡフラグメントも用いることができるが，これらは上で規定されたフラグメントより少ない程度で増幅されるかまたは表される。好ましくは，ＤＮＡフラグメントは≦３ｋｂｐのサイズを有し，より好ましくは前記ＤＮＡフラグメントは約１０００ｂｐの平均長を有し，特に好ましいものは約２００−４００ｂｐのフラグメントである。
【００１５】
本明細書において用いる場合，“５’オーバーハング”との用語は，例えば制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡのスタガー切断により提供される５’リン酸基を意味し，ＤＮＡの５’末端での一本鎖オーバーハングを表す。
【００１６】
本明細書において用いる場合，“プライマー”との用語は，オリゴヌクレオチドを表し，精製された制限消化生成物などの天然に生ずるものであっても，合成により製造されたものでもよい。プライマーは，本発明の方法における最大の効率のためには好ましくは一本鎖であり，好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明の方法において用いる前に，前記プライマーを精製することは，一般に認識されている。そのような精製工程は，ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を含み，当業者には知られている。
【００１７】
本明細書において用いる場合，“制限エンドヌクレアーゼ”との用語は，二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列においてまたはその近くで切断しうる細菌の酵素を表す。
【００１８】
本明細書において用いる場合，“フィルイン”との用語は，３’ヒドロキシル末端において開始され，相補鎖のフィルインを行うＤＮＡ合成反応を表す。このＤＮＡ合成反応は，好ましくは，ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で行う。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ，例えばＴａｑポリメラーゼが一般に用いられ，当業者にはよく知られている。
【００１９】
本発明にしたがう，“ハイブリダイズする”との用語は，２つのポリヌクレオチド鎖が相補的ヌクレオチドの間の水素結合により対を形成することを表す。このハイブリダイゼーションには，プライマーが前記５’オーバーハングに直接隣接してハイブリダイズするハイブリダイゼーション，ならびに，プライマーと前記ＤＮＡフラグメントの凸型（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）または凹型（ｒｅｃｅｄｉｎｇ）末端との間にギャップが生成するハイブリダイゼーションが含まれる。例を挙げると，前記第２のプライマーとＤＮＡフラグメントの５’末端との間にギャップが形成される場合，このギャップはＴａｑポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼによりフィルインされるため，アニーリングおよびハイブリダイゼーション工程の前または間に前記Ｔａｑポリメラーゼを加える態様において，本発明の方法を便利に実施することができる。
【００２０】
本発明の方法において用いられる，プライマーを表すオリゴヌクレオチドは，特に，コンピュータに基づく配列分析および実験室マニュアル（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ（１９８９））により表される，当該技術分野における技術水準にしたがって，同定し，取得し，試験することができる。
【００２１】
さらに，本発明の方法の上述の工程のための条件の設定は，当業者の技術の範囲内であり，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（上記引用文献）または本明細書の実施例に記載されたプロトコルにしたがって決定することができる。本発明にしたがって用いることができる，より広い範囲のハイブリダイゼーション条件のさらなる例は，とりわけ，Ａｕｓｕｂｅｌ，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），またはＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ）"Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ"ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）に記載されている。
【００２２】
上述の引用から，ＤＮＡを増幅する以下の方法のオプションが好ましく，該方法は，以下の工程を含む：
（ａ）  ＤＮＡを含むサンプルを提供し；
（ｂ）  増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適した条件下で，制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレアーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドがリン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオチドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；
（ｃ）  少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリングさせ，ここで
（ｃａ）  （ｃａａ）  同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであり；
（ｃａｂ）  前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにライゲートさせ；そして
（ｃａｃ）  前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除去し；
（ｄ）  生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして
（ｅ）  前記ＤＮＡフラグメントを工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖にハイブリダイズしうるプライマーで増幅する。
【００２３】
２つのプライマーを続いてハイブリダイズさせる場合，第１のプライマーはハイブリダイゼーション後に５’オーバーハングを形成し，これに第２のプライマーが続いてハイブリダイズする。
【００２４】
本発明は，実施例２および３に示されるように，上述の工程の組み合わせにより実質的に均一かつ完全なＤＮＡの増幅が可能であるという驚くべき知見に基づく。詳細には，本発明の方法は，以下のように例示される。
【００２５】
増幅すべきＤＮＡサンプルは，単一の細胞，例えば，骨髄支質細胞，末梢血からの単一（腫瘍状）細胞，臍静脈血液またはリンパ節からの単一の細胞を単離し，これをプロテイナーゼで消化することにより得ることができる。プロテイナーゼ活性を不活性化した後，前記サンプルＤＮＡを，ＭｓｅＩ等の４ヌクレオチド認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化して，約２００−４００ｂｐの類似する長さのＤＮＡフラグメントを得ることができる。
【００２６】
第１のプライマーおよび第２のプライマーのアニーリングおよびハイブリダイゼーションは，配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むプライマー，および配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むより長い第２のプライマーを加えることにより行うことができる。前記第１のプライマーは，前記プライマーの最後の３’ヌクレオチドがジデオキシ（ｄｄ）−ヌクレオチドであるように，さらに修飾することができる。以下のライゲーション反応におけるプライマーの最終濃度は５μＭであった。本発明において用いられるプライマーと増幅すべきＤＮＡとの間の比率は，３Ｍｉｏ：１の範囲であり，より好ましくは前記比率は３００，０００：１の範囲であり，最も好ましくは前記比率は３０，０００：１の範囲であった。さらに，前記プライマーは，これらを前記ＤＮＡサンプルに加える前に，互いにプレハイブリダイズさせることができる。
【００２７】
アニーリング反応は，前記制限酵素の不活性化をも行う温度，すなわち６８℃で開始した。前記第２のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにライゲーションさせ，これに対し，前記第１のプライマーはライゲーションさせなかった。これは，ライゲーションに必要な５’リン酸が利用可能ではなかったためである。したがって，反応温度を，そのようなライゲーション反応を実施することができる温度，すなわち１５°Ｃまでゆっくり低下させた。ライゲーションは，ＡＴＰおよびＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを前記プライマーおよびＤＮＡフラグメントに加えることにより行った。ライゲーション後，温度を，前記プライマーが前記ＤＮＡフラグメントから解離するより高い温度（例えば約６８°Ｃ）に変化させることを含む変性工程により，前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除去した。前記第２のプライマーは前記ＤＮＡフラグメントにライゲートしたままであった。
【００２８】
得られた前記ＤＮＡフラグメント上の５’リン酸伸長を，実施例に示すように，ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で適当な条件下でＤＮＡポリメラーゼ（この場合はＴａｑおよびＰｗｏポリメラーゼ）を加えることによりフィルインした。
【００２９】
次に，実施例２および３に詳細に記載されるように，前記第２のプライマーを濃度１μＭで用いて，得られた混合物をＰＣＲ増幅した。
【００３０】
次に，実施例３に記載されるように，増幅生成物をさらに分析した。
【００３１】
本発明の方法は，従来技術の方法において挙行しなければならない特別の用心深い処置には実質的に依存しない。例えば，本発明の方法を用いる場合，所望のＤＮＡを増幅前に抽出または精製することは必要ない（これはＤＮＡの喪失につながりうる）。
【００３２】
すなわち，ＤＮＡ増幅についての上述の方法とは異なり，本発明の方法は，異なるアダプターにライゲーションした選択配列をさらに使用するために便利かつ最適な増幅条件下で実施することができる。
【００３３】
本発明の方法は，抽出されていないＤＮＡサンプルからのものであっても，単一の細胞の全ゲノムの増幅を初めて可能としたものである。このことにより，例えば，個々の単離された播種性腫瘍細胞のゲノム分析が可能となり，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を単一の細胞に適用することが可能となる。したがって，本発明の方法は，例えば，単一の細胞において，転移可能性を有する播種性腫瘍細胞の播種および異所性成長を促進するかもしれない個々の遺伝的変化を同定する手段を提供する。そのような単一の播種性細胞のゲノムプロファイルは，ある種のクローン性遺伝子型が播種的事象に関連しているか否かに関する有用な情報を提供することができる。
【００３４】
さらに，本発明の方法は，ＣＧＨを個々の細胞に再現性をもって適用することを初めて可能とした。これに対し，“全ゲノム増幅”用の他のプロトコル，例えばＰＥＰ，ＤＯＰ−ＰＣＲおよびＡｌｕ−ＰＣＲは，試験ＤＮＡの起源が単一の細胞，単一染色体またはそれらの一部である場合，ＣＧＨにより均質の染色パターンを与えない。個々の単一の細胞に対するＣＧＨのこの再現性のある適用は，とりわけ，ＤＯＰおよびＰＥＰ技術においてこれまでに用いられてきたオリゴヌクレオチドのプライマー結合部位の複雑さを劇的に減少させる非縮重プライマーを用いるという事実により説明することができる。以前は多数であったこれらの異なる部位は，同等に多数の異なる特定のＰＣＲ条件を必要とし，これは同じ反応の間に行うことは不可能である。さらに，本発明の増幅方法は，ゲノム中の反復配列（ＩＲＳ−ＰＣＲ等）に依存しないため，そのような反復配列がより少ない頻度で存在するか，または存在しない種からの単一の細胞のゲノムＤＮＡを，信頼性をもって増幅することが可能である。
【００３５】
本発明の方法の好ましい態様においては，増幅されるＤＮＡは，単一の細胞のゲノムまたは染色体またはそのフラグメントである。驚くべきことに，本発明の方法は，播種性腫瘍細胞，リンパ節から得られた細胞，末梢血細胞，骨髄吸引物からの細胞，腫瘍生検からの細胞，微小切開組織から得られた細胞などの，単一の細胞の分析に特に有用であることが見いだされた。後述の実施例に示されるように，本発明の方法はまた，単一の細胞が興味深いかもしれない遺伝的情報を含むことがまれである場合に，その任意の単一の細胞（またはその染色体もしくはフラグメント）のゲノムの分析に有用である。まれである前記単一の細胞は，とりわけ，上述した細胞，または母体の静脈血液中の胚／胎児細胞等でありうる。本発明の方法は，複雑な（細胞）集団中の遺伝的変種のクローン的進化事象，とりわけ末梢血，骨髄等から単離される単一のマイクロ転移性細胞のクローン的進化の評価に特に有用である。
【００３６】
単一の二倍体細胞のＤＮＡ含有量は，わずか６−７ｐｇである。従来のＤＮＡ増幅方法，例えばＤＯＰ−ＰＣＲにおいては，全ＤＮＡの有効な増幅には，少なくとも２５ｐｇのＤＮＡ（４個の二倍体細胞に相当）が必要である。しかし，実施例３，４，５および６に示されるように，本発明の方法は，単一の細胞の全ゲノムを信頼性をもって増幅し分析する手段を提供する。
【００３７】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記ＤＮＡは，１コピーの二本鎖ＤＮＡ配列の形で存在する。
【００３８】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記ＤＮＡフラグメントの数的多量性は本質的に維持される。本発明にしたがって見いだされてきたように，本発明の方法は，ゲノム配列を再現性をもって増幅することができる。通常は８０％，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，最も好ましくは９９％またはそれ以上のゲノム配列を本発明の方法により増幅することができ，実施例４において示されるように，これらのゲノム配列のそれぞれについて，増幅生成物の量は，それらのゲノム中におけるコピー数に実質的に対応する。したがって，本発明の方法を用いると，前記ＤＮＡ増幅の前と後でゲノム配列間の比率が同じに維持されるように，所定のサンプルのＤＮＡを増幅することが可能である。上述したように，ＲＤＡ（Ｌｕｃｉｔｏ（１９９８），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５，４４８７−４４９２）等の方法は，ゲノム配列の７０％しか増幅されないような増幅を提供する。先行技術方法により増幅されたＤＮＡフラグメントがその相対的な数的多量性を維持しているか否かは疑わしい。
【００３９】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記方法は，工程（ａ）の前に，ＤＮＡを含む前記サンプルをプロテイナーゼで消化する工程（ａ'）を含み，かつ，工程（ｂ'）における蛋白質消化の後，プロテイナーゼを不活性化する。好ましくは，前記プロテイナーゼは熱不安定性である。したがって，前記プロテイナーゼは，工程（ｂ'）において熱不活性化することができる。本発明の方法の好ましい態様においては，前記プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。
【００４０】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレアーゼはその制限部位中にシトシン／グアニンを含まない。ゲノムのシトシンおよびグアニン残基はメチル化される可能性があり，これが制限酵素による酵素的切断を減少させうることが，当該技術分野においてよく知られている。
【００４１】
本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレアーゼは，４つの規定された塩基を有するモチーフを認識する。そのようなエンドヌクレアーゼは，その認識部位に４つの特徴的なヌクレオチドを有する酵素（例えばＭｓｅＩ），ならびに追加の不定（ｗｏｂｂｌｅ）塩基が制限部位中に存在する酵素（例えばＡｐｏＩ）を含む。好ましくは，前記制限エンドヌクレアーゼはコンセンサス配列ＴＴＡＡを認識する。
【００４２】
本発明の方法の最も好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレアーゼはＭｓｅＩまたはそのイソシゾマーである。前記制限酵素を使用することの利便性は実施例２において示される。
【００４３】
第１のプライマーは第２のプライマーより長くてもよいが，さらに別の好ましい態様においては，本発明は，工程（ｃａａ）において前記第２のプライマーが前記第１のプライマーより長いことを特徴とする，上述の方法に関する。実施例において示されるように，適切な長さの差は８−１２ｂｐである。
【００４４】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，実施例２において示されるように，工程（ｃａａ）における前記第２のプライマーのアニーリング温度は，前記第１のプライマーの前記第２のプライマーおよび前記５'オーバーハングへのハイブリダイズ温度より高い。
【００４５】
本発明の方法の特に好ましい態様においては，工程（ｃａａ）において，前記第１のプライマーは１１または１２ヌクレオチドを含み，前記第２のプライマーは２１ヌクレオチドを含む。
【００４６】
本発明の方法にしたがって，工程（ｃａａ）または工程（ｃｂａ）において，前記第１のプライマーは前記第２のプライマーに少なくとも部分的に相補的であることが理解される。特に好ましい態様においては，前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーは，パリンドローム配列を含む。
【００４７】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの配列は非縮重である。上述するように，当業者に知られる他の方法，例えばＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｔｅｌｅｎｉａｓ（１９９２），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，７１８−７２５）は，縮重オリゴヌクレオチドまたは部分的に縮重したプライマーの使用に基づく。そのような縮重プライマーは，自己アニーリングして，それ自身が標的配列に結合することを（互いに）阻害し，増幅効率が減少するという高い危険を伴う。
【００４８】
さらにより好ましい態様においては，工程（ｃａａ）において用いられる前記第１のプライマーは配列番号２に示される配列を有し，および／または工程（ｃａａ）において用いられる前記第２のプライマーは配列番号１に示される配列を有する。
【００４９】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，上述の方法の工程（ｃａａ）における第１のプライマーの最後の３'ヌクレオチドは，前記プライマーがポリメラーゼ活性（例えばＴａｑポリメラーゼ活性）により伸長されないように修飾されている。当業者には，そのような修飾およびそのような修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法はよく知られている。これらの修飾の１つは，上述の工程（ｃａａ）における第１のプライマーの３'末端にｄｄ−ヌクレオチドを付加することでありうる。
【００５０】
別の好ましい態様においては，本発明の方法の前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを，前記ＤＮＡフラグメントとは別に互いにハイブリダイズさせ，これらが互いにハイブリダイズした後に前記ＤＮＡフラグメントに加える。ハイブリダイズしたプライマーを前記ＤＮＡフラグメントに加えることは，工程（ｃａ）または工程（ｃｂ）の前に行う。そのようなプライマーのプレハイブリダイゼーションにより，とりわけ，前記ＤＮＡフラグメントへのハイブリダイゼーション効率がより高くなり，染色体ＤＮＡへの干渉を回避することができる。
【００５１】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，単一の細胞の本質的に全核ゲノムが増幅される。
【００５２】
本発明の方法により，通常は８０％，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，最も好ましくは９９％またはそれ以上の，全核ゲノムを増幅することができる。
【００５３】
本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記単一の細胞は化学的に固定された細胞である。細胞または組織を化学的に固定する１つの方法はホルマリンである。他の方法も当業者にはよく知られている。
【００５４】
本明細書に記載される本発明の方法は，異なる起源のＤＮＡ，例えば凍結切片および／または冷凍切片および／またはパラフィン包埋，ホルマリン固定標本から単離した固形腫瘍ＤＮＡに適用することができる。数十年間，これらの組織切片は，主として組織病理学診断のために保存されていた。単一の細胞または組織病理学組織からの限定された量の細胞を含む小サンプルを，特定の遺伝的変化についてスクリーニングし，同じ組織の明確に異なる組織病理学的特徴を示す他の領域と，または対照の目的で見かけ上正常な組織の領域と比較することができる。保管されている組織材料からの腫瘍ゲノム中のコピー数配列変化の包括的なスクリーニングは，固体腫瘍における細胞遺伝学的変化に関する知識を著しく増加させることができるであろう。これらの細胞遺伝学データを，組織学および組織化学的結果および臨床的追跡データと直接比較することが可能となる。
【００５５】
さらに，本発明の方法は，微小切開および／またはレーザー微小切開（例えば，レーザーマイクロビームマイクロ切開，好ましくは，レーザー圧カタパルトと組み合わせたもの）の材料，とりわけ，本明細書の実施例に示されるような，凍結切片からの材料に由来する，単一の細胞のＤＮＡの増幅に用いることができる。
【００５６】
本発明の方法のさらに好ましい態様においては，工程（ａ）−（ｅ）は，１つの反応容器中で実施される。このことにより，起こりうるテンプレートの喪失を回避することができ，さらに，コンタミネーションを伴うかもしれず，面倒な，反応容器の追加の開閉を回避することができるという利点を有する。
【００５７】
当業者には明らかなように，本発明の方法および／または本発明の方法により得られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，診断アッセイにおいて，および研究道具として特に有用である。前記増幅されたＤＮＡフラグメントは，とりわけ，標的ＤＮＡがわずかの量でしか入手できない領域および分野，例えば法医学調査（とりわけ，ＤＮＡフィンガープリンティング），古生物学および／または古考古学において有用である。さらに，本発明の方法および／または該方法により得られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，ヒトおよび動物の胚の移植前診断において特に有用である。前記方法および／または前記増幅されたＤＮＡフラグメントは，さらに，とりわけ，チップ技術と組み合わせて，サンプル，例えば食品または血液サンプルまたは液体サンプル中の夾雑生物のＤＮＡを同定するアッセイに用いることができる。さらに，本発明の方法および／または前記方法により得られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，医薬組成物または診断溶液中の夾雑ＤＮＡの検出に有用であろう。
【００５８】
したがって，本発明は，さらに，上述の方法により得られる増幅されたＤＮＡフラグメントの，ＤＮＡ分析の方法および技術における使用に関する。そのような方法および技術は，出生前診断，法医学，病原性分析または生物学的／生化学的研究において日常的に用いられており，当業者には知られている。
【００５９】
本発明の方法の使用の特に好ましい態様においては，ＤＮＡ分析の方法は，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）−，代表相違分析（ＲＤＡ）−，分析的ＰＣＲ−，制限酵素長多型分析（ＲＦＬＰ）−，一本鎖コンフォメーション多型分析（ＳＳＣＰ）−，ＤＮＡ配列−，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ）−，フィンガープリント−および／またはＦＩＳＨ−分析である。
【００６０】
コピー数，構造および遺伝子の発現およびＤＮＡ配列の変化をゲノム全体にわたってスクリーニングする種々の技術が利用可能となる。これらには，分子細胞遺伝学技術（例えば，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）および多色蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）），ならびに分子遺伝学技術（例えば，代表相違分析（ＲＤＡ），ディファレンシャルディスプレイ，遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）およびマイクロアレイ技術）が含まれる。ＣＧＨは，全ゲノムの包括的分析を可能とした最初の分子細胞遺伝学の道具であった（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，８１８−８２１）。ＣＧＨは，ＤＮＡ配列のコピー数変化のスクリーニングを可能とし，ＤＮＡ標本中で獲得されたまたは喪失された染色体領域のマップを提供する。ＤＮＡのコピー数変化は癌の病原性に重要であるため，ＣＧＨのほとんどの用途は癌研究におけるものである。
【００６１】
改変したインシトゥーハイブリダイゼーションに基づくＣＧＨにおいては，異なるように標識された試験（緑）および参照（赤）ＤＮＡを，正常中期スプレッドに共ハイブリダイズさせる。中期染色体上では，試験ゲノムと参照ゲノムとの間のコピー数の相違は，緑：赤の蛍光強度の相違として見られる。試験ＤＮＡにおけるＤＮＡ獲得および増幅は，増加した蛍光比を有する染色体領域として見られ，喪失および欠失により比は減少する。
【００６２】
ＣＧＨの癌研究に対する重要な貢献は，癌遺伝子の推定上の位置を，特にＤＮＡ増幅を生じている染色体部位において，正確に示してきたことである。ある癌においては，ＣＧＨにより，多数の部分領域染色体獲得およびＤＮＡ増幅が発見されている。オンコジンおよび薬剤耐性遺伝子はＤＮＡ増幅により上方制御されることが知られているため，癌におけるＤＮＡ増幅部位は癌の進行において重要な役割を有する新規遺伝子の位置を正確に示すことができると推測されている。腫瘍の進行は，局所的な，ゆっくり成長する腫瘍が，侵襲性，転移性および難治性の癌へとしだいに遷移することを包含すると考えられている。この進行は，重要な遺伝子に影響を及ぼす遺伝的変化の段階的累積により引き起こされると考えられている。ＣＧＨは，クローン性遺伝的変化のゲノムスケールの情報を提供することにより，腫瘍進行プロセスの生物学基礎の分析において非常に有用である。同じ患者から異なる進行段階で採取した２つの癌標本を分析することができる。例えば，原発性腫瘍においては見られないが，その転移物には生じている遺伝的変化は，転移性進行に重要な役割を有する遺伝的変化および遺伝子の位置を正確に示すための情報を与えることができるであろう。
【００６３】
転移性再発は，個々の腫瘍細胞の初期の播種により引き起こされ，これらは原発性腫瘍が診断され外科的に除去される前に，その原発部位を離れて循環中に入る。これらの細胞の大部分は，免疫系により排除されるかまたはアポトーシスを生じるが，一部は循環中の危険を逃れて生存し，第２の部位で組織に侵入し，数年間休眠状態を保った後，最終的に成長して転移となる。この転移形成の初期段階（最小の後遺症）は，腫瘍細胞が少なくかつ分散しているときは，癌の"アキレスの踵"であり，臨床的転移を予防する新規な治療方法の開発のための有望な標的である。
【００６４】
したがって，個々の腫瘍細胞をＣＧＨ等の方法によりスクリーニングするためには，そのような細胞の全ゲノムを均一かつ正確に増幅することが望ましい。したがって，上述の方法は，個々の腫瘍細胞をＣＧＨによりスクリーニングするのに特に有用であり，したがって，例えば新生物疾患またはそのような疾患に罹患していると疑われる患者の早期診断を可能とする。“新生物疾患”との用語は，単一の細胞における悪性形質転換の開始から，進行した癌疾病（遠位固形転移を含む）までの全スペクトルを意味することが意図されている。
【００６５】
ＣＧＨおよびＤＯＰ−ＰＣＲに基づいて，これまでのところ再現性のある増幅に必要な標的ＤＮＡの最小量は５０ｐｇであり，これは８個の二倍体細胞に相当する（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１，１９０７−１９１４）。より少ない量のゲノムＤＮＡは，再現性をもって増幅することができなかった。本発明の方法を用いて，１回の試験に必要なＤＮＡの量をさらに減少させることが可能である。
【００６６】
本発明の方法は，例えば続いてＣＧＨにおいて用いるための均一に増幅されたＤＮＡを提供するのみならず，サンプルがわずかの量のＤＮＡしか含まないような別の技術および方法のために，最少量のＤＮＡであっても，信頼性のある均一な増幅を可能とする。例えば，法医学科学においては，最近数年間にＤＮＡタイピング方法はますます重要になってきている（Ｌｅｅ（１９９４），Ａｍ．Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｍｅｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１５，２６９−２８２）。ＰＣＲおよびＲＦＬＰ分析（フィンガープリント分析とも称される）は，精子，血液痕跡または個々の細胞等に見いだされるわずかの量の入手可能なＤＮＡを用いて実施される。
【００６７】
本発明の方法の別の重要な用途は，母体血液中の胚または胎児細胞を用いる出生前診断である。妊婦の母体血液から濃縮された胚細胞または胎児細胞を染色体異常の出生前診断に使用することが可能であるということは，羊水穿刺または絨毛膜絨毛サンプリング等の現在の方法に代わる非侵襲的代替法を求める者にとって長い間望まれていたゴールであった。新規な疾病遺伝子の位置決定および同定により，単一遺伝子疾患または染色体異常等のリスクについての，胎児における変異分析または連関研究が可能となる。本発明の方法は，移植前の遺伝的疾患の診断または母体血液から単離された胎児細胞の診断のための方法の正確性ならびに適用可能性を改良し，このことにより単一の細胞のレベルで分析を行うことが可能となり，したがって，あらかじめ細胞を濃縮する必要性を回避することができる。実施例に示されるように，本発明の方法は，母体血液，とりわけ臍帯血から単離された単一の胎児細胞または胚細胞からのＤＮＡの信頼しうる増幅を提供する。
【００６８】
さらに本発明は，少なくとも１つのプライマーおよび／または上で定義した第１のプライマーおよび／または第２のプライマーを含むキットに関する。好適には，本発明のキットはさらに，前記プライマーに加えて，プロテイナーゼ，制限酵素，ＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ），ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ），Ｐｗｏポリメラーゼ，および／またはＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ，ならびに反応緩衝液および／または保存溶液を任意に含んでいてもよい。さらに，本発明のキットの一部をバイアル中に個別に包装してもよく，容器または多容器ユニット中に組み合わせて包装してもよい。実施例において有用なように示されているように，プロテイナーゼＫ消化，４塩基切断制限エンドヌクレアーゼおよび上で定義したプライマーは，本発明の方法に適切である。すなわち，本発明のキットは，好ましくは，プロテイナーゼＫ，４塩基切断制限エンドヌクレアーゼ（例えばＭｓｅＩ），Ｔａｑおよび／またはＰｗｏポリメラーゼ），上で定義したプライマーおよび／またはＴ４リガーゼを含む。本発明のキットは，本発明の方法を実施するために有利に用いることができ，とりわけ，上で参照した種々の用途，例えば診断キット中でまたは研究道具として用いることができる。さらに，本発明のキットは，科学的目的および／または診断目的に適した検出手段を含んでいてもよい。キットの製造は，好ましくは，当業者に知られる標準的方法にしたがう。
【００６９】
さらに，本発明は，上で定義した第１のプライマーおよび／または第２のプライマーの，本発明の方法を実施するためのキットの製造における使用に関する。
【００７０】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して，分脈によりそうではないことが示されない限り，"含む"との用語，および"含んでいる"等のその変形は，記載される整数もしくは工程，または整数もしくは工程の群が含まれるが，その他の整数もしくは工程，または整数もしくは工程の群が含まれないことを意味するものと理解されるであろう。
【００７１】
図面の簡単な説明
図１．ダウン症候群の患者の末梢血リンパ球のＣＧＨプロファイル。有意であると考えられるためには，黒い中線からの偏差は右（染色体獲得）または左（染色体喪失）の点線を横切らなければならない。黒い水平バーは，異質染色質ＤＮＡが優勢であるために分析から除いた領域を示す。染色体２１（ブロックされた異質染色質の領域を除く）は完全に増幅されたことが見いだされたが，他の染色体はすべて正常なプロファイルを示した。中線からの偏差は，右（染色体獲得）または左（染色体喪失）を横切らなければならない。
【００７２】
図２．ＭＣＦ−７細胞株からおよび同じ細胞株の単一の細胞から，ＰＣＲ増幅後に調製した１μｇのニックトランスレーションしたＤＮＡを用いる慣用的なＣＧＨ実験のＣＧＨプロファイルの比較。両方の実験について，単一の細胞と細胞株との間の差異を比較するために，染色体２，３，８，１９および２０が示されている。単一の細胞のプロファイルは上部パネルに示され，細胞株のプロファイルは下部パネルに示されている。染色体記号の右側のバーは，試験ＤＮＡの染色体獲得を示し，左側のバーは染色体喪失を示す。染色体１０は，いずれのサンプルにおいても変化は認められなかった１つの例である。中線からの偏差は，右（染色体獲得）または左（染色体喪失）を横切らなければならない。
【００７３】
図３．ＹＡＣクローンを有するＭＣＦ−７細胞の，２ｐ２５（赤）および２ｑ３１（緑）についての２色間期ＦＩＳＨ。右上の細胞においては，２ｐ領域については３つのシグナルを同定することができるが，２ｑについては２つしか同定することができない。他の細胞は，２ｐおよび２ｑプローブの両方について２つのシグナルを示す。
【００７４】
図４．乳癌患者の骨髄からの単一の播種性腫瘍細胞の単離。免疫染色の後，細胞懸濁物をピペットでスライド上に置き免疫蛍光細胞について調べた（Ａ）。（Ｂ）は，明るい細胞質染色および周りの細胞がバックグラウンド蛍光を示さないことを示す。次に，細胞をガラスキャピラリーにより吸引し（Ｃ），新たなスライドに移した。全可視野には他の細胞が含まれていなかったため，蛍光細胞以外の細胞は移さなかった。ここから，細胞を取り出して増幅管に移した。（Ｄ）は，細胞の染色体の変化を示す。
【００７５】
図５．ＣＵＰ症候群を有する患者の４つの単一腫瘍細胞（Ｔ＃１−Ｔ＃４）および１つの正常細胞のＣＧＨプロファイル。同一および相違する所見を比較するために，染色体２，５，７および１５を選択した。染色体２，５および１５上の喪失はすべての腫瘍細胞に共通していたが，染色体７の喪失はＴ＃２についてのみ見いだされた。他のプロファイルにおけるものと同様に，染色体喪失は染色体記号の左側の垂直バーで示される。
【００７６】
図６．（Ａ）ＡＰＣ遺伝子にリンクしたＤ５Ｓ３４６座におけるジヌクレオチド反復多型を用いるＬＯＨ分析（上部），およびＡＰＣ遺伝子のエクソン１５中のＡｌｗ２１Ｉ部位のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（下部）。最初の実験においては，４つの腫瘍細胞のすべてが１つのアレルの喪失を示し，一方，単一の対照細胞は，＃２を除き，２つのアレルを含んでいた。ＡＰＣのＰＣＲ−ＲＦＬＰ実験においては，１つの対照細胞（＃３）を除くすべての細胞が２つのアレルを有しており，一方，腫瘍細胞は未切断フラグメントのみを含有していた。腫瘍細胞＃４のフラグメントは増幅されなかった（−，負対照；Ｍ１０，１０ｂｐラダー；Ｍ５０，５０ｂｐラダー；Ｍ，アガロースゲル電気泳動用のマーカー）。
【００７７】
（Ｂ）コドン２１５において見いだされる変異の配列。単一の対照細胞は，ｎｔ６４３にＡを有する野生型配列を含んでおり（上部の２つの配列），一方，腫瘍細胞はこの位置で変異しており，Ａ→Ｇ変異を示した（下部の２つの配列）。８個の細胞のうち４個の配列が示されている。
【００７８】
図７．腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のエクソン６のＳＳＣＰ分析。３つの正常細胞および３つの腫瘍細胞，ならびに転移物からの生検について，ＳＳＣＰ分析を行った。単一の正常細胞のＰＣＲ産物は，腫瘍細胞のものとは異なる位置に移動した。すべての腫瘍細胞中で点突然変異は容易である。興味深いことに，腫瘍細胞に加えて正常間質性または浸潤性細胞を明らかに含む生検サンプルにおいては，両方のバンドを認めることができる。
【００７９】
図８．新生男児の臍帯から単離された単一のリンパ球のＣＧＨプロファイル。細胞は，妊娠中の母体の末梢血中の胎児からの細胞を検出するためにしばしば用いられるマーカーである，胎児ヘモグロビンに対する抗体を用いて染色した。女性ＤＮＡはＣＧＨ実験において対照ＤＮＡとして働く。次に，ハイブリダイゼーションの質を，この実験の設計の結果として，Ｘ染色体の“喪失”およびＹ染色体の“獲得”を示すことにより評価することができる。示されるように，性別を判定することに成功し，すべての常染色体は正常なプロファイルを示した。
【００８０】
図９．フィンガープリント分析のための単一の細胞中の多型の同定。マイクロサテライトＰＣＲにおいては，バンドのサイズは多型に対応する。したがって，多型の同定には，この方法によりサイズが変化しないことが必要である。ここでは，１２個の単一の細胞に由来するジヌクレオチドマイクロサテライトマーカー（Ｄ５Ｓ１９７５）のＰＣＲ産物が，数千個の細胞のＤＮＡから生成したバンド（＋）の次に示される。個々の細胞から増幅されたマーカーの２つのアレルおよび正対照は，同じサイズに移動した。ヘテロ接合性の喪失は観察されなかった。
【００８１】
図１０．（Ａ）：マイクロマニピュレーションによる，アルカリホスファターゼを用いるＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色細胞の単離。（Ｂ）：実施例１５に記載されるように，ｍａｂ  Ａ４５  Ｂ／Ｂ３で免疫細胞化学的に染色した２４個の連続的に単離した細胞のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）のゲノム配列のＰＣＲ分析。免疫蛍光標識と比較して，感度の喪失は観察されず，ＣＫ１９  ＰＣＲにより例示される全ゲノム増幅は，すべての細胞において成功した。（Ｃ）：図１０Ｂの細胞番号４のＣＧＨプロファイル。ゲノム中に種々の異常が存在する。
【００８２】
本発明を以下の生物学的例を参照して説明する。これらの例は，単なる例示であり，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００８３】
実施例１：ＤＮＡの消化
比較研究において，４塩基モチーフを認識するいくつかの制限酵素について，これらが本発明の方法に適当な０．２−２ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントを生成することができるか否かについて試験した。４塩基が等分に分布し，消化が完全であるという前提で，２５６ｂｐ（４4）の平均長を有するフラグメントが予測された。５種類の酵素を試験した：ＴａｑＩ（ＴＣＧＡ），Ｃｓｐ６Ｉ（ＧＴＡＣ），ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ），ＡｃｉＩ（ＣＣＧＣ，ＧＣＧＧ）およびＭｓｅＩ（ＴＴＡＡ）。その認識部位中にＣ／Ｇを含まない酵素であるＭｓｅＩのみが，１００−１５００ｂｐの長さの範囲に見られるスメアーを生成し，したがって，これをプロトコルにおいて用いた。
【００８４】
実施例２：単一の細胞のＤＮＡの増幅
テンプレートの喪失を回避するため，すべての調製工程は１つの管の中で行った。ＤＮＡ単離，制限酵素消化，プライマーライゲーションおよびＰＣＲ増幅については，すべての緩衝液および条件は，最も高い信頼性および再現性を補償するよう，最適の能力に調節した。一般に，高濃度のプロテイナーゼＫ，ＭｓｅＩ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑポリメラーゼが最高の結果を与えた。
【００８５】
１μｌのｐｉｃｋ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．３，７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）中の単一の細胞（例えば，末梢血リンパ球または骨髄支質細胞）を，２μｌのプロテイナーゼＫ消化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，５０ｍＭ酢酸カリウム（０．２μｌのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ），０．６７％ＴＷＥＥＮ（Ｓｉｇｍａ），０．６７％Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ），０．６７ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に加え，加熱蓋を有するＰＣＲ機器中で，４２℃で１０時間インキュベートした。プロテイナーゼＫを，８０℃で１０分間不活性化した。プロテイナーゼＫを不活性化した後，ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は，５μｌ中で，０．２μｌのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ，０．５μｌ  ＭｓｅＩ（１０Ｕ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１．３μｌ  Ｈ2Ｏを加えることにより，３７℃で３時間行った。プライマーのアニーリングは，各０．５μｌ（１００μＭ保存溶液，Ｍｅｔａｂｉｏｎ）の，ＭｓｅＬｉｇ２１プライマー（配列番号１，（５’−ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴ−３’）で示される）およびＭｓｅＬｉｇ１２プライマー（配列番号２，（５’−ＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣ−３’）で示される），０．５μｌのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒおよび１．５μｌのＨ2Ｏを加えて，ＰＣＲ反応中のプライマーの最終濃度を１μＭとして行った。アニーリングは，６５°Ｃの温度で開始し（ライゲーションの前に制限酵素を不活性化することにも役立つ），１℃／分の勾配で１５℃まで低下させた。１５℃において，１μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え，プライマーとＤＮＡフラグメントを一夜ライゲーションさせた。
【００８６】
一次ＰＣＲ増幅のためには，３μｌのＰＣＲ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ，緩衝液１），２μｌのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）および３５μｌのＨ2Ｏからなる４０μｌを，１０μｌの反応容量に加えた。ＰＣＲプログラムは，６８°Ｃで４分間の変性工程から開始し，ＭｓｅＬｉｇ−１２オリゴヌクレオチドを除去し，１μｌ（３．５Ｕ）のＴａｑおよびＰｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ）のＤＮＡポリメラーゼ混合物を加え，３分間インキュベーションしてフィルイン反応を行った。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒを，９４°Ｃ（４０秒間），５７°Ｃ（３０秒間），６８°Ｃ（１分１５秒間）を１４サイクル；９４°Ｃ（４０秒間），５７°Ｃ（３０秒間），６８°Ｃ（１分４５秒間）を３４サイクル；および９４°Ｃ（４０秒間），５７°Ｃ（３０秒間），６８°Ｃ（５分間）の最終サイクルとなるようプログラムした。
【００８７】
プライマーの選択に関しては，ＨＰＬＣ精製およびアニーリング／ライゲーション反応における高濃度（５μＭ）が，成功の必須要件であった。これらの条件下における，消化した単一の細胞のＤＮＡの増幅により，１μｇの高分子量ＤＮＡの完全消化と類似するサイズのスメアーが得られた。
【００８８】
実施例３：末梢血リンパ球からの増幅したＤＮＡを用いるＣＧＨ
単一の非固定およびパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定末梢血リンパ球から単離したＤＮＡを実施例２に記載されるように増幅し，１μｇのニックトランスレーションした非増幅胎盤ＤＮＡと競合的にハイブリダイズさせた。標識は，ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅをｄＴＴＰ／ｂｉｏ−ｄＵＴＰの比率７／１と組み合わせたときに最も効率的であった。再増幅は，３０μｌ中で，０．５μｌ  ＬｉｇＭｓｅ−２１プライマー（１００μＭ），１μｌ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，各１０ｍＭ，８．６ｍＭ  ｄＴＴＰ）および１．３μｌビオチン−１６−ｄＵＴＰ（１ｍＭ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１ＸＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液中の１３ＵのＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）および０．５μｌの１次ＰＣＲを用いて実施した。温度を，９４°Ｃ（１分間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（２分間）を１サイクル；９４°Ｃ（４０秒間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（１分３０秒間）を１４サイクル；９４°Ｃ（４０秒間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（２分間）を９サイクル，および追加の最終伸長工程を７２°Ｃで５分間に設定して，全体で２５サイクルをプログラムした。２μｇの再増幅標識ＤＮＡを用いる前に，ＭｓｅＩ消化によりプライマーを除去した。対照ＤＮＡ，ならびにＭＣＦ−７細胞株ＤＮＡのニックトランスレーション，中期スプレッドの調製およびハイブリダイゼーションは，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  ２，１９０７−１４に公表されているように実施した。画像はＳｅｎｓｙｓ  ＣＣＤカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＸＡ−ＲＦ８顕微鏡（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で捕捉した。試験ＤＮＡと対照ＤＮＡの比率の定量的評価は，ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ（１９９５），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １９，２７−４１にしたがい，ＬｅｉｃａソフトウエアパッケージＱ−ＣＧＨを用いて行った。各実験において，プログラムの要件を満たす７−１２の中期スプレッドを評価した。実験の間，プロファイルはより平滑になり，ＰＣＲ増幅し標識した対照ＤＮＡをニックトランスレーションした染色体の代わりに用いたとき，結果には変化がなかった（図１：ＰＣＲ標識対照ＤＮＡ，および図２：０．５μｇニックトランスレーションした対照ＤＮＡを比較されたい）。０．５μｇの対照ＤＮＡを，単一の細胞について記載したように修飾し，増幅し，ジゴキシゲニン−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いる再増幅反応において標識した。より平滑なＣＧＨプロファイルは，おそらくは，これらの条件下で，２つのＤＮＡサンプルについて，反復配列についてのフラグメントサイズおよびブロッキング効率が同一であることを反映しているのであろう。
【００８９】
７回の独立した単一細胞実験において，得られたＣＧＨプロファイルは（ＣＧＨは，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２，１９０７−１９１４）により記載されたように行った），中線からの有意な偏差として検出しうる，ＰＣＲに関連した染色体獲得または喪失を示さなかった。実際，分析したすべての場合において，ドナーの性別を確認することができた。ＰＦＡ固定は，実験の結果に影響を及ぼさなかった。
【００９０】
実施例４：ダウン症候群の患者における染色体変化の検出
単一細胞分析により既知の染色体変化を検出しうるか否かを判定するために，ダウン症候群の患者の血液サンプルからの単一のリンパ球のＤＮＡ，およびそのＤＮＡを単離し，実施例２に記載のように増幅した。ＣＧＨプロファイルは，１つの検出しうる異常として染色体２１の獲得を示した（図１）。
【００９１】
実施例５：単一のＭＣＦ−７細胞における染色体変化の検出
ＭＣＦ−７乳癌細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）からの単一の細胞，およびＭＣＦ−７細胞から直接単離した１μｇの増幅されていないＤＮＡの比率プロファイルを比較することにより，より複雑な数値変化の検出を検証した（図２および表１）。単一細胞ＣＧＨにおいて検出された染色体２ｐの追加の獲得は，ＰＣＲアルチファクトによるものではなく，ＣＥＰＨ−ＹＡＣｓ６９５ｈ７および９６３ｄ１１プローブを用いて行った２色間期ＦＩＳＨ（ＦＩＳＨ分析はＬｅｎｇａｕｅｒ（１９９２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，２５９０−６に記載のように行い，それぞれ２ｐ２５および２ｑ３１にマップされた）においても認められた。
【００９２】
表２にまとめられているように，評価したすべての細胞の１６％は２ｐについて３つのシグナルを示したが，２ｑについては２つしか示さなかった（図３）。細胞集団の１６％にしか存在しない数的多量性は，プールされたＤＮＡから作成したＣＧＨプロファイルを変化させないが（ｄｕ  Ｍａｎｏｉｒ（１９９５），上掲），この小さい方のサブクローンからの単一の細胞を用いてＣＧＨを行えば，明確に見ることができるようになるであろう。
【００９３】
表１．ＭＣＦ−７および同じ細胞株の単一の細胞において見いだされる変化の比較
ＭＣＦ−７において見いだされる変化のほとんどは，単一の細胞においても検出することができる。細胞株または単一細胞のいずれかにおいて異なる変化は下線で示されている。
【００９４】
【表１】
0004475488.tif 000002
【００９５】
表２．乳癌細胞株ＭＣＦ−７からの細胞および正常リンパ球についての間期細胞遺伝学の結果
それぞれの場合について，１００個の核を評価した。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
実施例６：原発性乳癌の患者からの単一の腫瘍細胞のＣＧＨ分析
非常にまれな骨髄中の個々の腫瘍細胞を，モノクローナルサイトケラチン抗体Ａ４５Ｂ／Ｂ３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）を用いる間接免疫蛍光により，骨髄吸引物において同定した。Ａ４５Ｂ／Ｂ３により認識されるサイトケラチンのエピトープは，サイトケラチン８，１８およびヘテロダイマー８／１８および８／１９にマッピングされている（Ｓｔｉｇｂｒａｎｄ（１９９８），Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１９，１３２−５２）。
【００９８】
骨髄サンプルの吸引および単核細胞の単離は，記載されたように実施した（Ｐａｎｔｅｌ（１９９６），Ｌａｎｃｅｔ  ３４７，６４９−６５３）。細胞をＰＢＳ中で洗浄し，０．２％ＰＦＡ中で５分間固定した。５％ＡＢ−血清を用いる非特異的結合のブロッキング，ならびに２％ペプトン／ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌＡ４５−Ｂ／３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）とのインキュベート（各１０分間）を，０．０５％サポニン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で実施して，細胞を透過性にした。細胞を２％ペプトン／ＰＢＳ中で洗浄した後，検出のため，抗原抗体複合体を，ＰＥコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともにインキュベートした（１０分間）。
【００９９】
すべての単一の細胞は，細胞懸濁物からマイクロマニピュレーションにより単離した。骨髄細胞を２５０，０００細胞／０．８ｃｍ2の密度で，容量２００μｌ中で，顕微鏡スライド上に播種した。単一の蛍光細胞を直径約３０μｍのガラスピペット中に吸引し，新たなスライドに移した。単一の細胞のみが移されたことを確認した後，この細胞を最後に１μｌのピック緩衝液中に取り出し，ＰＣＲ反応管中に入れた。
【０１００】
国際分類にしたがってｐＴ３，ｐＮ１，ｐＭ０，ｐＧ３と段階づけられた，遠位転移の形跡を有しない原発性乳癌と診断された患者の骨盤骨からの骨髄吸引物において，非染色骨髄細胞の中に検出された単一の免疫蛍光標識細胞をマイクロマニピュレーションにより取り出し，追加の細胞が不注意で吸引されていないことを可視的に確認するため，新たなスライドに移した（図４Ａ−Ｃ）。このスライドから細胞を取り出して最終反応管に移した。図４Ｄは，この細胞においてＣＧＨ分析により見いだされた染色体獲得および喪失を示し，これは，乳癌について先に報告されている染色体不均衡と一致した。例えば，８ｑおよび１７ｑで観察された増幅は，３つの最も一般的な獲得のうちの２つであり，８ｐおよび１３ｑの喪失もまた乳癌において頻繁に生ずることが知られている（Ｆｏｒｏｚａｎ（１９９７），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １３，４０５−９）。
【０１０１】
実施例７：ＣＵＰ症候群の患者からの腫瘍細胞のＣＧＨ分析
実施例６と同じ方法を，４つの個々のサイトケラチン陽性腫瘍細胞，および原発病巣が不明の癌（ＣＵＰ症候群）の患者の骨髄から単離された４つの非染色対照細胞（この患者は最初に肝転移を示した）に適用した。４つの腫瘍細胞のＣＧＨ分析の所見は，図５および表３にまとめられており，ゲノム変化の非常に一致したパターンを示した（表３）。特に，いわゆるコンセンサス欠失領域−３ｐ，５ｑ，１０ｑ，１３ｑ，および１７ｐ−の明確な喪失は，サイトケラチン陽性細胞が小細胞肺癌由来であることを示唆した（Ｒｉｅｄ（１９９４），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４，１８０１−６）。特徴的な肺病巣の臨床画像および転移の組織病理学試験により，"小細胞から中間細胞−最も有望には上皮−腫瘍"であることが診断され，したがって，ＣＧＨに基づく疑いが確証された。
【０１０２】
表３．ＣＵＰ症候群の患者の骨髄から単離された４つの個々のサイトケラチン陽性細胞のＣＧＨの結果のまとめ
いくつかの中線からの偏差は有意に達しなかったが，それぞれの遺伝子座において対照細胞と比較して有意な変化を有する他の腫瘍細胞に対するプロファイルと非常に類似していた。これらはかっこ内に示される。１つの細胞に独特の変化は下線で示される。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
実施例８：ヘテロ接合性喪失の分析
上皮腫瘍においてヘテロ接合性の喪失および変異を検出するために，ＣＵＰ症候群の患者からの４つすべての腫瘍細胞（実施例７を参照）および４つの非染色骨髄細胞の増幅ＤＮＡを，ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）および変異の存在について調べた。単一の細胞におけるＬＯＨの検出には，２つのアレルＤＮＡ鎖を切断し，アダプターにライゲーションし，ほぼ同一の様式で増幅することが必要である。５ｑ２１上のＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子のＬＯＨ分析については，遺伝子の４０ｋｂ下流に位置するジヌクレオチド反復多型Ｄ５Ｓ３４６およびエクソン１５中に位置する多型Ａｌｗ２１Ｉ部位を用いた（Ｇｒｏｄｅｎ（１９９１），Ｃｅｌｌ  ６６，５８９−６００）。１６ｑ２２上のＥ−カドヘリン遺伝子に密接にリンクしているＤ１６Ｓ３０１９マーカー（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，４０２−５）を適用して，Ｅ−カドヘリンのＬＯＨを評価した。それぞれの染色体のＣＧＨの結果はすでに５ｑおよび１６ｑからの染色体物質の喪失を示唆していたため，各対照細胞からの２つのアレルおよび各腫瘍細胞からの１つのアレルの増幅により，３つのマーカーのそれぞれについて１２のフラグメント（正常細胞について４ｘ２，および腫瘍細胞について４ｘ１）が得られ，合計して３６個の独立して増幅されたフラグメントが得られると計算された。図６ＡにおいてＡＰＣについて示されているように，いずれのアレルも，分析した２つのマーカーのそれぞれについて，４つの対照細胞の３つから増幅することができた。一次ＰＣＲ産物をＨ2Ｏで１：５に希釈した。この希釈物１μｌを特異的ＰＣＲにおいて用いた。この特異的ＰＣＲは，標準的プライマー条件下で，Ｄ１６Ｓ３０１９座，Ｄ５Ｓ３４６座，ＡＰＣ  ＰＣＲ−ＲＦＬＰおよびｐ５３遺伝子のエクソン２−９の配列で実施した（Ｆｕｔｅｒａｌ（１９９１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，６９７７）。マイクロサテライト分析のゲル条件は，Ｌｉｔｔ（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５，２８０−４に記載されるように実施し，ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎとのインキュベーションにより発色させ，蛍光イメージングを行った。ＡＰＣ  ＰＣＲ−ＲＦＬＰの分析は，５μｌのＰＣＲ産物を容量３０μｌ中で，１５ＵのＡｌｗ２１Ｉ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で３時間消化することにより行った。結果は，臭化エチジウム染色アガロースゲルで可視化した。
【０１０５】
対照細胞＃２および＃３において見いだされた喪失は第２のマーカーについては見られなかったが，すべての腫瘍細胞は両方の実験においてＬＯＨを示した。Ｅ−カドヘリンについても類似の結果が得られた。すべての対照細胞は，情報を与え，２つのアレルを示したが，４つの腫瘍細胞はすべて１つのアレルを喪失していた。合計して，３６個の予測されたフラグメントのうち３３個が増幅され検出された。これらのデータは，この方法の相当の信頼性を示すのみならず，予想される喪失を追加のマーカーにより制御する必要があることを示す（図６Ａ）。
【０１０６】
ＰＣＲの初期サイクルの間のＴａｑポリメラーゼエラーを回避するために，Ｔａｑポリメラーゼと校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）酵素であるＰｗｏポリメラーゼとの混合物を用いた。４つすべての腫瘍細胞のＣＧＨプロファイルが１７ｐの喪失を示したため，ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の残りのアレルが変異により不活性化されているか否かを調べた。ｐ５３は，ヒト癌において最も一般的に変異している腫瘍抑制遺伝子であり，この変異は肺癌腫の約５０％で生ずる（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ（１９９４），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，４８５５−７８）。大部分の変異がコアドメイン中に位置するため，エクソン４−９を配列決定のために増幅した。すべてのエクソンの増幅が成功したことから，一次ＰＣＲの条件は，はるかに小さいフラグメントも存在するが，１３７４ｂｐ程度の長い生成物を生ずるのに十分に強いものであることが証明された。これらのエクソン中にはＭｓｅＩ部位が含まれておらず，このことは，増幅の成功の必要条件である。ｐ５３遺伝子領域中のＭｓｅＩ切断部位のマップは，４つのエクソン含有フラグメントを予測した：１つは，エクソン２，３および４を含む１３７４ｂｐ，第２はエクソン５および６を含む１０３２ｂｐ，第３はエクソン７を含む７２２ｂｐフラグメント，および第４はエクソン８および９を含む５５８ｂｐである。４つすべての腫瘍細胞の配列決定は，ｐ５３のコドン２１５においてセリンからグリシンへの変化をもたらすＡ→Ｇ変異を示し，これはこれまでにいくつかのヒト癌において記載されている（Ｈａｉｎａｕｔ（１９９８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６，２０５−１３）。４つの正常骨髄細胞は，ｐ５３のコドン２１５において野生型配列を含んでおり（図６Ｂ），ＴａｑポリメラーゼエラーがＡ→Ｇ変異の原因であることは事実上排除される。腫瘍細胞および対照細胞ＤＮＡのエクソンにおいては野生型配列からの他の変化は見いだされず，このことは，Ｔａｑポリメラーゼにより誘導される変異は，適用した条件下ではむしろまれであることを示す。
【０１０７】
実施例９：直接配列決定およびＳＳＣＰによるＤＮＡ配列分析
ｐ５３のコドン２１５における前記Ａ→Ｇ変異の検出の後，前記点突然変異を一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）により検出することが可能であるか否かについて試験した。一本鎖コンフォメーション多型は，異なる配列の一本鎖ＤＮＡ鎖が非変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の間に異なる移動度を示すという原理に基づく。この方法の戦略は，遺伝子の目的とするセグメントをＰＣＲにより増幅し，次に，変性ＤＮＡの移動度を既知の配列の対照セグメントの移動度と比較することである。配列中の単一の点突然変異はゲルにおける移動挙動をすでに変化させており，この方法は，ＤＮＡのセグメント中の変異の存在の検出に非常に適している。非変性条件下で，一本鎖ＤＮＡは折り畳まれた構造を示し，これは本質的に分子内相互作用により，したがって配列により決定される。ＤＮＡ配列中に変異的変化が生ずることにより，折り畳まれた構造が変化する。すなわち，ＳＳＣＰ分析においては，変異した配列の検出は，ポリアクリルアミドゲル電気泳動において変化した移動度により判定される。この方法は，分析すべき各フラグメントについて感度を調節しなければならない。重要な変数は，フラグメントの長さ（理想的には１２０−３５０ｂｐ），および流すゲルの温度である。ＳＳＣＰは，いったん確立されれば，高価かつ煩雑な配列決定をすることなく，多数のプローブを同時にスクリーニングできるという利点を有する。しかし，変異を特定するためには，変化した移動挙動を有するフラグメントを続いて配列決定すべきである。
【０１０８】
この実験においては，ＣＵＰ症候群の患者からの３つの単一のサイトケラチン陰性細胞およびすでに配列決定した癌細胞の移動挙動を比較した。図７に示されるように，すべてのサイトケラチン陽性細胞において変異を見いだすことができたが，正常細胞は変化した移動度を示さなかった。
【０１０９】
実施例１０：  レーザー微小切開単一細胞のＣＧＨ
多くの臨床サンプルの分析には，目的とする細胞を周囲組織から単離することが必要である。この方法がレーザー支援マイクロ切開の設定においても働くか否かを試験した。より進歩した技術の１つにおいては，レーザーマイクロビームマイクロ切開（ＬＭＭ）をレーザー圧捕捉（ＬＰＣ）と組み合わせる。細胞を切り出し，続いて管中に捕捉する。混同を生ずる変種の導入を回避するため，そのような切開された正常リンパ球の核サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）を調製し，次にＬＭＭおよびＬＰＣにより単一の細胞を単離した。ＤＮＡ調製およびＣＧＨは，実施例１−３に記載のように実施し，結果は予測されたとおりであった。正常細胞についてはプロファイルは正常であり，この方法が，懸濁物から単離された細胞と同様に，微小切開した単一の細胞に適用可能であることが示された。
【０１１０】
実施例１１：リンパ節からの単一の播種性腫瘍細胞の単離
リンパ性転移は，腫瘍細胞が播種するための非常に重要な方法であり，しばしば患者の予後を決定する。種々の研究において，免疫組織化学／免疫細胞化学により検出しうる播種性腫瘍細胞は，患者の結果を予測することが示されてきた。これらの細胞の遺伝的変化はこれまでのところよく特徴決定されていない。リンパ節からの細胞懸濁物を調製し，本発明の適用について試験した。細胞懸濁物は，ＢｉｏｒａｄからのＭｅｄｉ−Ｍａｃｈｉｎｅを用いて，製造元の指示にしたがって調製した。腫瘍細胞は，ＥｐＣＡＭエピトープを認識し，リンパ節においてサイトケラチン抗体よりもむしろ特異的であることが示されている，ＤａｋｏからのｍａｂＢｅｒ−ＥＰ４で染色することにより検出した。染色した細胞を単離し，単一の細胞のＤＮＡを上述のように調製した。次に，ＣＧＨを実施した。正常な非染色細胞は正常なプロファイルを示し，腫瘍細胞においては，種々の異常を検出することができた。
【０１１１】
実施例１２：末梢血からの単一の循環腫瘍細胞の単離
骨髄およびリンパ節から単離された播種性腫瘍細胞の分析と同様に，悪性腫瘍疾病を有する患者の末梢血の細胞を調べた。癌腫患者の末梢血細胞を，サイトケラチン抗体Ａ４５Ｂ／Ｂ３を用いて，および黒色腫患者の末梢血細胞をヒト黒色腫関連コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に対するｍａｂ９．２．２７（Ｒ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡより）を用いて，スクリーニングした。Ｂ−ＣＬＬ患者の血液を，ＣＤ２４に対する抗体（Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＢＬ４７８からの抗体）を用いてスクリーニングした。この方法は，骨髄およびリンパ節から単離した細胞を用いた場合と同様に働いた。
【０１１２】
実施例１３：単一のＨｂ−Ｆ陽性細胞の単離および特性決定
妊娠中および分娩後２７年間までの母体の静脈血液中の，小児からの細胞の培養物を１つの研究に示されたように検出することができる（Ｂｉａｎｃｈｉ（１９９６），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ９３，７０５−７０９）。妊娠中，これらの細胞は，母体および子供に危険のない出生前診断に有用でありうる。母体中の持続性のマイクロキメラ現象（ｍｉｃｒｏｃｈｉｍｅｒｉｓｍ）は，女性において自己免疫疾病の罹患率が高いことと関連づけられてきた。これらの胎児細胞を検出する１つの方法は，赤芽球を検出するために胎児ヘモグロビン（Ｈｂ−Ｆ）に対する抗体を用いることである。この抗体（Ｈｂ−Ｆに対するマウスｍａｂ：Ｃｏｌｔａｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＨＦＨ００）は，新生児臍帯血中で赤芽球を検出するために用られた。単一の細胞を単離し，本発明の方法を記載されたように適用した。ＣＧＨプロファイルはすべての染色体について正常であった。図８に示されるように，男児は健康であった。
【０１１３】
実施例１４：単一の細胞のフィンガープリント
ゲノム中に１つのみ存在する配列の増幅の信頼性は，多数の実験において，９０％であることが示された。これは，ヘテロ接合性の喪失の分析にとっては重要な値である。しかし，フィンガープリント分析のためには，配列が信頼性をもって増幅されることのみならず，多型を同定することができることが重要である。このことを試験するために，３０００個の細胞を用いるＰＣＲ反応から得られたバンドのサイズを，単一の細胞から得られたものと比較した。マイクロサテライト分析の既知の限界内で，バンドは陽性対照と比較して変化した移動挙動を示さないことが検出された。このことは図９に示される。したがって，単一の細胞から多型バンドを同定することができ，フィンガープリントを得ることができる。
【０１１４】
実施例１５：日常実験および診断方法のための酵素的に染色した単一の細胞の単離
多くの診断および日常実験用途のためには，免疫蛍光を回避することが有利である。日常実験の光学顕微鏡を含む実験のために細胞を調製する方法を試験した。第１の実験においては，ＤＮＡに損傷を与えることなく，アルカリホスファターゼを用いるいずれの酵素染色反応を適用しうるかを試験した。市販のいくつかのアルカリホスファターゼの基質，例えば，ニュフクシン（Ｎｅｕｆｕｃｈｓｉｎ）およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｂｉｏｒａｄ）の種々の調製物を試験した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴで染色された単一の細胞のみが増幅に成功した。次の工程においては，日常実験のスライドから無傷の細胞を単離した。これを行うためには，ＰＢＳ中の細胞を特別の正に帯電したスライド（Ｍｅｎｚｅｌ）上にピペットで置いた。これらはここで３０分以内に接着する。ＰＢＳを廃棄し，スライドを風乾する。この処理の後，日常実験の染色方法，例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色を用いるＡＰＡＡＰ技術（アルカリホスファターゼ−抗−アルカリホスファターゼ技術）を適用することができる。非イオン性界面活性剤をＰＢＳに加えると，後に染色細胞の単離のためのマイクロマニピュレーションの間に接着力を回避することが助けられる。これらの実験の結果は，図１０に示される。
【０１１５】
すべてのＣＧＨ−，ＬＯＨ−およびＳＳＣＰ−実験，すなわち，サイトケラチン抗体，Ｂｅｒ−ＥＰ４および抗−Ｈｂ−Ｆで染色した，末梢血からの正常細胞，骨髄，血液およびリンパ節からの腫瘍細胞を用いる実験もまた，本発明の方法を用いて実施し，同等に優れた結果が得られた。
【０１１６】
実施例１６：種々の起源の単一の細胞への本発明の方法の適用
まとめると，本発明の方法は，細胞が由来する組織の起源，細胞集団または環境中のまれな細胞を検出するために用いられる抗体，および／または標識の選択（蛍光染料または酵素的に活性化された基質，例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ）にかかわらずに働くということができる（表４を参照）。
【０１１７】
表４．種々の組織および診断設定からの個々の細胞に対する単一細胞ＰＣＲの適用
【表４】
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ＢＭ＝骨髄；ＬＮ＝リンパ節
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ダウン症候群の患者の末梢血リンパ球のＣＧＨプロファイル。
【図２】  ＭＣＦ−７細胞株からおよび同じ細胞株の単一の細胞から，ＰＣＲ増幅後に調製した１μｇのニックトランスレーションしたＤＮＡを用いる慣用的なＣＧＨ実験のＣＧＨプロファイルの比較。
【図３】  ＹＡＣクローンを有するＭＣＦ−７細胞の，２ｐ２５（赤）および２ｑ３１（緑）についての２色間期ＦＩＳＨ。
【図４】  乳癌患者の骨髄からの単一の播種性腫瘍細胞の単離。
【図５】  ＣＵＰ症候群を有する患者の４つの単一腫瘍細胞（Ｔ＃１−Ｔ＃４）および１つの正常細胞のＣＧＨプロファイル。
【図６】  ＡＰＣ遺伝子にリンクしたＤ５Ｓ３４６座におけるジヌクレオチド反復多型を用いるＬＯＨ分析（上部），およびＡＰＣ遺伝子のエクソン１５中のＡｌｗ２１Ｉ部位のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（下部），ならびにコドン２１５において見いだされる変異の配列。
【図７】  腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のエクソン６のＳＳＣＰ分析。
【図８】  新生男児の臍帯から単離された単一のリンパ球のＣＧＨプロファイル。
【図９】  フィンガープリント分析のための単一の細胞中の多型の同定。
【図１０】  マイクロマニピュレーションによる，アルカリホスファターゼを用いるＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色細胞の単離，および実施例１５に記載されるように，ｍａｂ  Ａ４５  Ｂ／Ｂ３で免疫細胞化学的に染色した２４個の連続的に単離した細胞のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）のゲノム配列のＰＣＲ分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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