(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタイン−バーウイルス関連疾患を患っていることが疑われている個人または患っている危険性のある個人のサンプルに任意に存在している、胃がんまたは鼻咽頭がんから選択されるエプスタイン−バーウイルス関連上皮悪性疾患を同定する方法であって、ヌクレオチド１６５５０４〜１６６１６６にわたっているＢＡＲＦ１読み取り枠から転写された１つまたはそれ以上のそれぞれのＲＮＡ内にある標的配列を増幅することにより同定する方法。
【請求項２】
それぞれのＲＮＡの増幅に使用される対になっているオリゴヌクレオチドが、
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’を備える５’−ＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’［配列番号：２３］と５’−ＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧ−３’［配列番号：２４］とから成るＢＡＲＦ１に対して特異的な一対のオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
転写をベースにした増幅技術を使用して、ＲＮＡが増幅されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅技術がＮＡＳＢＡ法であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｍＲＮＡの増幅と検出に使用することができるオリゴヌクレオチドに関する。さらに本発明は、エプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患と非悪性疾患の診断のための方法を提供する。
【０００２】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、「インソリューション」増幅又は「インサイチュー」増幅技術を使用した、ヒト（腫瘍）組織サンプルとその薄片で、また、エプスタイン−バーウイルス感染細胞を潜在的に含有するそのほかの生物学的サンプルで、循環末梢血細胞でのエプスタイン−バーウイルス遺伝子発現の検出にとくに適している。
【０００３】
（一般的な背景）
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、バーキットリンパ腫（ＢＬ）のアフリカの（風土病又はｅ）形態に関連して最初は発見された、至る所にあるヒトヘルペスである。その後、そのウイルスはまた、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）に関連して発見され、また感染性単核細胞症（ＩＭ）の原因病原体となることが示されている。感染は通常、初期小児期の間に起こるが、一般的には結果的に非顕性の症状発現となり、時には軽い症状を伴う。しかし、青年期又は成人期の間の感染は、末梢血に非定型のリンパ球があることにより特徴付けられる感染性単核細胞症（ＩＭ）を引き起こす可能性がある。しかし、こうしたリンパ球の大部分はＴリンパ球であるが、そのリンパ球には、エプスタイン−バーウイルス感染Ｂリンパ球の小集団も含まれている。Ｂリンパ球の感染はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも達成することが可能である。こうした細胞は形質転換されて培養培地で無制限に増殖され、「不朽化された」、「感染潜伏された」又は「成長形質転換された」細胞と言われてきた。知りうる限りでは、エプスタイン−バーウイルスに感染したすべての患者は生涯、感染潜伏したままの状態になっている。このことは、循環末梢血リンパ球の間にあるエプスタイン−バーウイルスゲノム陽性形質転換Ｂ細胞が生涯にわたって少数で継続的に存在することと、口腔咽頭部に存在するウイルスが継続的に、しかし周期的に発散されることに反映される。
【０００４】
広範な、大半の症例では、エプスタイン−バーウイルス感染は、一時的に衰弱するリンパ球増殖性疾患に結果的に罹患するが、常に良性であり、また自己限定的なものである。しかし、ある種の免疫抑制患者では、その結果は病状の進行した悪性疾患につながっていく、制御されないリンパ球増殖になる可能性がある。これは、治癒過程で免疫抑制された患者特にシクロスポリンＡで治療されている臓器移植を受けた小児で起こり、あるいは、ＨＩＶに感染した患者の場合でのように日和見感染的に免疫抑制されている患者、あるいはＸＬＰ（Ｘ染色体性リンパ球増殖性症候群）遺伝子を保因している罹患男性の場合のように薬物等により意図的に免疫抑制されている患者で起こる。これらの症例では、結果的に生じる悪性疾患は、エプスタイン−バーウイルス感染性Ｂ細胞のポリクローナル増殖に由来する。さらに、こうした患者では、制御されていないそのウイルスの上皮複製が口腔性毛髪状白斑の病変部で検出可能である。従って、免疫応答が、エプスタイン−バーウイルス感染の制御においては中心的な役割を演じる。
【０００５】
（エプスタイン−バーウイルス遺伝子と分子診断的なアプローチ）
長年の間、リンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）とも名付けられているバーキットリンパ腫（ＢＬ）誘導細胞系統とエプスタイン−バーウイルス形質転換末梢血Ｂ細胞は、エプスタイン−バーウイルス仲介形質転換と腫瘍発生を研究するためのプロトタイプモデルシステムであると考えられた。
【０００６】
数年間の間に、プロトタイプウイルス菌株Ｂ９５−８のＤＮＡ配列全体が決定された。この配列の分析は８０オープン読み取り枠（Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０；２０７〜２１１（１９８４））以上が同定されるという結果となった。エプスタイン−バーウイルス読み取り枠の命名法は、ウイルスゲノムにおける位置をベースにしている。その名前は、発現が始まるＢａｍＨ１又はＥｃｏＲ１制限断片のイニシャルで始まる。名前における第３の特徴は、ＬかあるいはＲかどうかであるが、その発現が標準的な地図上で左方向であるか、又は右方向であるかどうかによる。（そうすると、ＢＬＬＦ２は、ＢａｍＨ１制限断片Ｌで始まる第２左方向読み取り枠である。）
【０００７】
基本的には、３つの異なった遺伝子転写パターンが、さまざまなエプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患において観察されてきた。最近のデータではこのタイプ分けシステムを複雑なものにしている付加的な転写物の存在が示されているが、これらのパターンは、潜伏期タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩと呼ばれている。潜伏期タイプＩは、エプスタイン−バー核酸抗原１（ＥＢＮＡ−１；ＢＫＲＦ１）と、小さな非コードＲＮＡエプスタイン−バー初期ＲＮＡ１および２（ＥＢＥＲ−１およびＢＫＲＦ２）の発現により特徴付けられる。さらに最近では、これらの転写物内に多数含まれている小さなオープン読み取り枠のなかに潜在的なタンパク質コード能力を持ち合わせている転写物の新規なセット（ＢＡＦＲ０）が、潜伏期タイプＩパターンを発現させるすべての細胞で発見された。潜伏期タイプＩＩは、上述のタイプＩ転写物に加えて、潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ−１；ＢＮＬＦ１）およびＬＭＰ−２Ａ／−２Ｂ（ＢＮＲＦ１）の発現により特徴付けられている。ＬＭＰ２転写物は、これらの転写物がそのウイルスゲノム上で末端反復と交わるため、ウイルスゲノムが共有結合的に閉じられた環状形態にある場合にのみ発現することができるが、そのウイルスゲノムがその線形「細胞溶解現象」状態にある場合には形成することはできない。潜伏期タイプＩＩＩは、タイプＩＩプログラム転写物に加えて、核抗原ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−４（また、それぞれＥＢＮＡ−２、−３、−４、−６、−５とも呼ばれる）の発現により特徴付けられる。異なった潜伏期に関連している転写プログラムの発現は、メチル化のレベルや細胞分化などの宿主細胞パラメータにより影響を受ける。その結果として、エプスタイン−バーウイルス遺伝子発現は、ウイルスゲノムのメチル化状態により、異なったプロモーター部位から始まることが観察可能である。
【０００８】
さまざまなエプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患に対する異なった潜伏期タイプのウイルス転写プロフィールの発現の関連性は、近年では、腫瘍生検標本から誘導されたＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、あるいは腫瘍組織又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（異種移植（ヌード）マウスのなかに含まれる）増殖腫瘍細胞系統およびリンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）のものから選択的に単離されたポリアデニル化ｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーの分析によって、主に決定されてきた。これらのタイプの分析法を使用して、タイプＩ潜伏期はｉｎ  ｖｉｖｏでバーキットリンパ腫（ＢＬ）の腫瘍細胞において、またｉｎ  ｖｉｔｒｏでは特発性バーキットリンパ腫（ＢＬ）細胞系統でみられる。タイプＩＩ潜伏期は、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、特発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞／ＮＫ細胞／Ｂ−ＮＨＬ細胞）と、免疫不全宿主における胸腺及び耳下腺がんのＮＰＣ、エプスタイン−バーウイルス陽性症例にみられるが、一方、タイプＩＩＩ潜伏期パターンはｉｎ  ｖｉｔｒｏで保存されているたいていのＢＬならびにリンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）において、また免疫無防備状態の患者で主に観察される前悪性リンパ球増殖や免疫芽細胞性リンパ腫において見られる。後者の集団では、特発性溶解性筋肉腫もまたみられ、それはタイプＩＩパターンを発現させることがある。一方、非免疫無防備状態の患者における胃がんは、むしろタイプＩ潜伏期パターンを発現させることが発見されている。健康なエプスタイン−バーウイルスキャリアにおいて検出可能である、真に潜伏性に感染したＢ細胞の正確な転写パターンについてはまだ、コンセンサスはない。これらの潜伏性感染Ｂ細胞の単離に使用される方法により、ＥＢＮＡ−１転写物、ＥＢＥＲ転写物、ＬＭＰ−２転写物が発見された。しかしまた、ＥＢＮＡ−１のみの転写物、あるいはＥＢＥＲの転写物にＬＭＰ−２転写物を加えたものだけを含むパターンが記載されている。
【０００９】
Ｂ細胞と腫瘍組織におけるウイルス（潜伏性）遺伝子転写のこれらの異なったパターンが実際に「大量の」（腫瘍）物質における転写を表わしているのであって、各個々の（腫瘍）細胞の発現パターンは必ずしも反映していないということは十分に理解すべきである。ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＬＭＰ−１などの定義されたエプスタイン−バーウイルス潜伏期関連遺伝子生成物に対してモノクローナル抗体を使用して、さまざまなエプスタイン−バーウイルス関連腫瘍の薄片の免疫組織化学（ＩＨ）分析によって、異なった実像が明らかになる。最近の研究では、免疫組織化学の方法を使用して、ＡＩＤＳと移植後関連免疫芽細胞リンパ腫における腫瘍細胞の大半は潜伏期タイプＩに合致するパターン（ＥＢＥＲ−１／−２とＥＢＮＡ−１のみが検出可能）を示すが、一方、少数は潜伏期タイプＩＩ（ＥＢＮＡ−１プラスＬＭＰ−１）か、又はＥＢＮＡ−１およびＥＢＮＡ−２の共同発現により特徴付けられる潜伏期の１つの新規な形態かのいずれかを発現することが分かっている（Ｏｕｄｅｊａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７（１９９５）９２３〜９３３）。潜伏期タイプＩＩＩを示唆するようなＥＢＮＡ−２とＬＭＰ−１を共同発現する細胞は稀に観察されているだけである。これは、異なったエプスタイン−バーウイルスに結び付けられる悪性疾患に関連しているウイルス遺伝子発現の古典的な実像が、さらに詳細なこれらの発見物を組み込むように改訂されなければならないということを意味しているといえる。
【００１０】
事実、明瞭に異なったエプスタイン−バーウイルスコード遺伝子が、異なったエプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患で発現されることが発見されるにつれて、さらにもっと異なる実像が明らかになってきている。ときには、ウイルスのライフサイクルの（初期）細胞溶解期に属すると以前には考えられていたウイルス遺伝子生成物が検出可能なこともあり、おそらくそれは局所的な影響の下で細胞溶解現象のウイルス複製にスイッチする誘因となる腫瘍細胞由来のものであると考えられる。この現象は、サイトケラチンフィラメントの形成によりわかるように腫瘍細胞の小さな病巣における細胞溶解現象の反復のスイッチが細胞分化に関連している鼻咽頭がん（ＮＰＣ）で明瞭に観察することができる。あるいは、こうした細胞溶解遺伝子生成物は、潜伏性ウイルスゲノムを保有しているＢ細胞を浸潤し、また分化させる腫瘍、あるいはエプスタイン−バーウイルスにより生成段階で感染したと考えられる局所内皮細胞および特殊な上皮細胞に由来しているものであることも考えられる。
【００１１】
潜伏期関連遺伝子生成物と局所細胞溶解ウイルス複製に明瞭に結び付いている遺伝子発現に加えて、エプスタイン−バーウイルス初期遺伝子に属すると通常考えられているいくつかのウイルス遺伝子が、選択エプスタイン−バーウイルス関連腫瘍で発現することがわかっている。これらの遺伝子には、ある種のエプスタイン−バーウイルス悪性疾患の病因において１つの機能を有していることが考えられる細胞遺伝子のウイルスホモログが含まれている。例えば、アポトーシス抵抗性を提供し、またＢ−ＮＨＬ細胞で専らほとんど発現することがみつかっているヒトＢＣｌ−２ホモログであるＢＨＲＦ１、あるいはＮＰＣとＯＨＬでは発現するが、ＨＤとそのほかのリンパ腫では発現しない細胞ＩＣＡＭ−１のホモログであるＢＡＲＦ１、あるいは免疫無防備患者における免疫芽細胞性リンパ腫で主にみつかっている局所免疫調整活性を付与するヒトＩＬ−１０のウイルスホモログであるＢＣＲＦ１、あるいは細胞サイクリンＢ１にある種の類似性を有していて、正常細胞周期制御を無効にする上で機能することが考えられるＢＤＬＦ２がある。
【００１２】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて潜伏性から細胞溶解サイクル遺伝子発現へのスイッチを効果的に仲介する遺伝子は、検出可能な完全な細胞溶解サイクルの導入がなくてもｉｎ  ｖｉｖｏに発現するのをみつけることができ、この状態は制限又は不完全細胞溶解遺伝子発現(restricted or abortive lytic gene expression)といわれる。
【００１３】
したがって、単一細胞レベルでは、エプスタイン−バーウイルス遺伝子発現はその腫瘍全体に均一に分配されるのではなく、また異なった腫瘍細胞集団はエプスタイン−バーウイルス遺伝子の（少々）異なったパターンを発現すると考えられる。そのため、全腫瘍生検サンプルから調製された核酸抽出物におけるエプスタイン−バーウイルス遺伝子発現を分析することに加えて、単一細胞レベルでのウイルス遺伝子発現についての情報が、腫瘍細胞におけるエプスタイン−バーウイルスゲノムの転写活性を正確に説明するためには必要となる。
【００１４】
細胞溶解現象遺伝子発現にスイッチすることは、細胞がよりアポトーシスに対して抵抗が少なく、またより免疫原性であり、したがって薬物／放射線治療、宿主（免疫性）サーベイランスや修復メカニズムに対してより感受性が増すことになるなどといった治療の成功に積極的に関連することが示唆されてきた。このため、潜伏期関連遺伝子転写を分析することに加えて、腫瘍におけるエプスタイン−バーウイルスコードウイルス細胞溶解遺伝子生成物の正確な検出と相対的定量化が行われれば、診断及び予後と関連を有するものとなる。
【００１５】
上述のように、エプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患の特異的な診断とモニタリングにおけるその使用に加えて、ウイルス遺伝子発現の分析は、検出可能なＥＢＮＡ−１およびＥＢＥＲ発現のない場合にウイルス細胞溶解遺伝子の発現によって特徴付けられる口腔の毛髪状白斑の鑑別診断において、また自己限定的又は非悪性進行性を有しているかもしれない急性および慢性／持続性Ｂ細胞リンパ球増殖を診断するための妥当性を有するものになると考えられる。
【００１６】
これらすべての発見により、エプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患と前悪性リンパ球増殖の診断のためのウイルス遺伝子発現のタイプとレベルの正確な判定の妥当性が示されている。
【００１７】
腫瘍又は腫瘍でない場合は患部組織の標本におけるウイルス遺伝子発現の分析に加えて、又はその代わりに、循環におけるウイルス感染（腫瘍）細胞の検出と定量化と、これらの細胞におけるウイルス遺伝子発現の分析は、移植後およびＡＩＤＳ患者やＡＩＤＳではない免疫無防備患者(immuno-compromised individuals)などのすでに罹患している患者における循環系腫瘍細胞の検出又はリスクを有している患者の事前のスクリーニングを目的に適用できるだけではなく、抗腫瘍治療の効果をモニターするためにも適切であり、分子診断のより利用しやすい手段を提供することになる。
【００１８】
特定の患者標本におけるウイルスＤＮＡのレベルを定量化することにより達成することができるエプスタイン−バーウイルス関連腫瘍負荷の測定のほかに、ウイルス遺伝子転写の定性的および定量的分析が、鑑別診断や予後には欠かせないものであり、また、治療介入戦略を決定するのには適切なものであると考えられる。
【００１９】
核酸か、あるいは免疫学的試薬かのいずれかを使用した分子分析には、関係している標的分子の詳細な知識、とくに菌株／エピトープ変異に関する知識が必要とされる。異なったエプスタイン−バーウイルス菌株と分離株の間で高度に保存されている遺伝子のセグメントとエピトープの選択は、上に示唆されているように、世界中の臨床診断に適用することができる診断用試薬の設計と開発にとっては非常に重要なものである。一方、潜在的な、修飾された機能を伴うタンパク質の発現につながる突然変異、欠失、又は特定のウイルス遺伝子生成物のなかへの挿入の分析は、疫学的、また病因学的な研究にとっては貴重なものとなり、また潜在的に診断用に適切であると考えられる。例えば、エプスタイン−バーウイルス菌株の変異は、エプスタイン−バーウイルス菌株タイプＡおよびＢのなかに鑑別することができる特定の配列を含んでいる、特にエプスタイン−バー核抗原（ＥＢＮＡ）−２および−３遺伝子の配列を分析することにより決定することができ、そのＢ菌株はＡＩＤＳ関連リンパ腫に、また地球上の或る場所には比較的より頻繁にある。一方、配列変異（特に、点突然変異および欠失）は、ＥＢＮＡ−１、潜伏性膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２、およびＺＥＢＲＡに関しては説明がなされており、これらをコードしている遺伝子のＬＭＰ−１特異的３０ｂｐ欠失突然変異体はより強力な腫瘍表現型に関連している。
【００２０】
ウイルスＤＮＡ、発現ＲＮＡ、タンパク質を特異的に分析するための技術の有用性が、正確な診断に必要となる。ＤＮＡ標的セグメントの増幅に関する技術の１つの例は、いわゆる「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」である。適当なプライマーセットと組み合わせたＰＣＲは、ウイルスＤＮＡの検出には非常に適している。一方、適当な抗体試薬と組み合わせた免疫組織化学は、腫瘍関連ウイルスタンパク質を視覚化する場合には選択対象となる方法である。ウイルスＲＮＡの高度のコピー数は、実質的にすべてのエプスタイン−バーウイルス関連腫瘍において、きわめて高度のコピー数で発現されるＥＢＥＲ−１、および−２の検出のためにルーチンに適用されるようなＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションにより検出することができる。ウイルスｍＲＮＡの低コピー数の検出には、ＲＴ−ＰＣＲおよび核酸配列をベースにした増幅（ＮＡＳＢＡ法）などのより感受性の高い技術が必要とされる。ＲＴ−ＰＣＲの適用は、ウイルスＤＮＡバックグラウンドにおけるウイルス遺伝子発現を可能にし、したがってその使用を、スプライシングされたウイルス遺伝子の選択セットのみに限定するために、スプライシングされたｍＲＮＡが必要であり、それによって深刻に阻害されている。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ反応のＰＣＲ部分において高い温度を必要とするため、インサイチュー診断アプローチへのその適用を深刻な程度にまで限定してしまっている。
【００２１】
ＲＴ−ＰＣＲのもう１つの欠点は、ゲノムＤＮＡの増幅を退けてしまうような、転写物内にある、関心の対象であるスプライシング部位を必要とすることであり、また、それが２ステップの反応であるという事実である。これらの制限は、ウイルスｍＲＮＡ発現を、組織抽出におけるものと、単一細胞レベルでのインサイチュー分析によるものとの両方で分析するＮＡＳＢＡアプローチを使用することにより克服される。ＮＡＳＢＡ法は、読み取り枠又はウイルスＤＮＡバックグラウンドにおけるエキソン特異的ウイルスｍＲＮＡの選択的増殖を可能にし、また、細胞形態学に影響を与えることなく、腫瘍組織の薄片における（ウイルス性）ｍＲＮＡ発現の視覚化を可能にする（インサイチューＮＡＳＢＡ法）。ＮＡＳＢＡ法はイントロン配列にわたる特異的なプライマーセットを選択する必要性によっては制限をうけないため、エキソン特異的プライマー、プローブを利用することができる。ＮＡＳＢＡ法はまた、発現したウイルス遺伝子における遺伝子変異の、より簡単で、また広範な適用可能な分析を可能にする。ＮＡＳＢＡ法を使用して、ゲノムＤＮＡではなくＲＮＡが、スプライシング部位から独立して増幅される。
【００２２】
そのスプライシングパターンをベースにして、エプスタイン−バーウイルス転写物の４つのタイプを区別することができる。すなわち、
ＥＢＮＡ−１転写物のような、コード領域ではなくて非コード領域において拡張的にスプライシングされた転写物（Ｋｅｒｒら、Ｖｉｒｏｌ；１８７：１８９〜２０１（１９９２））。
【００２３】
ＬＭＰ１およびＬＭＰ２のように、コードドメインにおいてスプライシングされる転写物（Ｌａｕｘら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ：７０：３０７９〜８４（１９８９））。
【００２４】
ＥＢＥＲ１およびＥＢＥＲ２転写物のような、まったくスプライシングされない転写物（Ｃｌｅｍｅｎｓら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ：１７：８１〜９２（１９９３））。
【００２５】
そのスプライシングパターンが知られていない転写物。これらは、ＢＡＲＦ１のような、単に「初期」転写物である。（Ｚｈａｎｇら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；  ６２（２）：１８６２〜９（１９８８））。ＢＤＬＦ２およびＢＣＲＦ１（Ｖｉｅｉｒａら、ＰＮＡＳ；８８（４）：１１７２〜６（１９９１））。
【００２６】
本発明は、ある種のエプスタイン−バーウイルス  ｍＲＮＡの検出に関し、また本発明は、増幅において使用するのに適しているオリゴヌクレオチドを提供し、またこれらのｍＲＮＡのその後の検出を提供する。本発明によるオリゴヌクレオチドの結合部位は以下のエプスタイン−バーウイルス遺伝子のなかに位置している。すなわち、
エプスタイン−バー初期ＲＮＡ１（ＥＢＥＲ−１）、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）、潜伏性膜タンパク質１（ＬＭＰ−１）、ＬＭＰ−２、ｖＩＬ１０（ＢＣＲＦ−１）、ＢＡＲＦ１、ＢＤＬＦ２（すべてはＢａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．３１０、ｐｐ２０７〜２１１、１９８４の命名法により特徴付けられている）。
【００２７】
本発明の１つの実施態様は、１０〜３５ヌクレオチド長であり、以下のものから構成される群から選択される１つの配列の１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むオリゴヌクレオチドに関する。すなわち、
ＥＢＮＡ−１、［ヌクレオチド１０７９５０〜１０９８７２にわたっているＢＫＲＦ１読み取り枠］、
ＥＢＥＲ−１、［ヌクレオチド６６２９〜６７９５にわたっている読み取り枠］、
ＬＭＰ−１、［ヌクレオチド１６９４７４〜１６９２０７にわたっているＢＮＬＦ１読み取り枠］、
ＬＭＰ−２、［ヌクレオチド５８〜２７２、３６０〜４５８、５４０〜７８８、８７１〜９５１、１０２６〜１１９６、１２８０〜１４９５、１５７４〜１６８２にそれぞれわたっているエキソン２、３、４、５、６、７、８］、
ｖＩＬ１０、［ヌクレオチド８６７５〜１０１８４にわたっているＢＣＲＦ１読み取り枠］、
ＢＡＲＦ１、［ヌクレオチド１６５５０４〜１６６１６６にわたっている読み取り枠］、又は、
ＢＤＬＦ２、［ヌクレオチド１３２３８９〜１３１１３０にわたっている読み取り枠］、そこでは、ヌクレオチド番号にわたっているすべての読み取り枠はＢａｅｒら、１９８４によるものである。
【００２８】
本発明による好適なヌクレオチドは、１０〜３５ヌクレオチド長であり、また、以下のものから構成される群から選択される１つの配列の少なくとも１０ヌクレオチドの１つの断片を含む。すなわち、
【００２９】
【化９】
0004472171.tif 000002
若しくはその相補的配列（ＥＢＮＡ−１）、又は、
【００３０】
【化１０】
0004472171.tif 000003
若しくはその相補的配列（ＥＢＥＲ−１）、又は、
【００３１】
【化１１】
0004472171.tif 000004
若しくはその相補的配列（ＬＭＰ−１）、
【００３２】
【化１２】
0004472171.tif 000005
若しくはその相補的配列（ＬＭＰ−２）、
【００３３】
【化１３】
0004472171.tif 000006
若しくはその相補的配列（ＢＡＲＦ−１）、
【００３４】
【化１４】
0004472171.tif 000007
若しくはその相補的配列（ｖＩＬ１０（ＢＣＲＦ１））、
【００３５】
【化１５】
0004472171.tif 000008
若しくはその相補的配列（ＢＤＬＦ２）。
【００３６】
本発明の１つの好適な実施態様は、適当なプロモーター配列にリンクされている１つのオリゴヌクレオチドに関する。
【００３７】
本発明のより好適な実施態様は、以下のものを含む、１つのセットとして使用するためのエプスタイン−バーウイルス配列内にある１つの標的配列の増幅に関する一対のヌクレオチドに関する。すなわち、
１．２，５’−ＣＴＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣ−３’［配列番号：２］、と
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’（ＥＢＮＡ−１）を備える２．１，５’−ＡＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＧＣＡＴＣＣ−３’［配列番号：３］；
又は
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’を備える１．１，５’−ＣＧＧＧＣＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡ−３’［配列番号：６］と、
２．２，５’−ＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡ−３’［配列番号：７］（ＥＢＥＲ−１）；
又は
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’を備える１．１，５’−ＡＴＡＣＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴ−３’［配列番号：１２］、と
２．１，５’−ＣＡＴＣＧＴＴＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡ−３’［配列番号：１４］（ＬＭＰ−１）；
又は
１．２，５’−ＡＧＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣ−３’［配列番号：１８］、と
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’（ＬＭＰ−２）を備える２−１，５’−ＡＧＣＡＴＡＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＣＧＴＧＣＣ−３’［配列番号：１９］；
又は
１．２，５’−ＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’［配列番号：２３］、と
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’（ＢＡＲＦ１）を備える２．１，５’−ＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧ−３’［配列番号：２４］；
又は
１．１，５’−ＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＡＧＴＧＧＴＣ−３’［配列番号：２７］、と
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’（ｖＩＬ１０（ＢＣＲＦ１））を備える２．２，５’−ＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣ−３’［配列番号：３０］；
又は
Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’を備える１．１，５’−ＣＴＡＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣ−３’［配列番号：３２］と、
２．１，５’−ＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣ−３’［配列番号：３４］、又は、
２．２，５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＧＴＣＣＧＣＧＧ−３’［配列番号：３５］（ＢＤＬＦ２）。
【００３８】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマーおよびプローブなどの、１つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドから成る分子をいう。
【００３９】
本明細書で使用されている「プライマー」という用語は、ＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ポリメラーゼなどの核酸重合のためのヌクレオチドと薬剤の存在下で適当な条件（例えば、緩衝液、塩類、温度、ｐＨ）下に置かれた場合に、核酸鎖（鋳型又は標的配列）に相補的であるプライマー伸長生成物の合成の開始点として活動することができる、天然か（例えば、制限断片として）、あるいは、合成されて産生されるかのいずれかのオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長生成物の合成をはじめるため十分に長くなければならない。１つの典型的なプライマーには、標的配列に対して実質的に相補的（Ｐ１）又は相同性（Ｐ２）である配列の長さで、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。しかしいくらかより長めのプライマーが望ましい。通常プライマーは約１５〜２６ヌクレオチドであるが、より長いプライマーを用いてもよい。
【００４０】
正常であれば、プライマーの１つのセットは、少なくとも２つのプライマーから成り、１つは「上流」、および１つは「下流」プライマーであり、それらが一緒になって増幅された配列（前述のプライマーを使用して増幅される配列）を定義している。
【００４１】
本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、プロモーター配列にリンクしていてもよい。「プロモーター配列」という用語は、認識されている配列に結合し、またＲＮＡ転写物が産生されることによって転写のプロセスを開始するＲＮＡポリメラーゼによりとくに認識される核酸配列の領域を定義している。原則的には、そのプロモーター配列に関して、開始配列を認識することができる公知のポリメラーゼ、また入手可能なポリメラーゼについてのプロモーター配列が用いられる。公知であって、また有用なプロモーターとは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７あるいはＳＰ６などのある種のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。
【００４２】
本発明の配列から成るオリゴヌクレオチドには、こうした変更が有意な程度まで得られる生成物又は収量に悪影響を与えないという程度まで、主要なものではない核酸基の欠失、付加、および／または置換が含まれていてもよいと理解される。
【００４３】
本発明のもう１つの好適な実施態様は、長さが１０〜３５ヌクレオチドであり、また、以下のものから成る群から選択される１つの配列を有する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００４４】
検出可能な標識を備える
【００４５】
【化１６】
0004472171.tif 000009
（ＢＤＬＦ２）。前述のオリゴヌクレオチドは、本発明によるオリゴヌクレオチドを使用して生成される増幅配列の検出のために使用してもよい。前述の配列を含むプローブもまた、本発明の一部である。
【００４６】
検出プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド配列は、検出可能な部分により標識することが可能である。さまざまな標識部分が当該技術分野で知られている。前述の標識部分は、例えば、放射性化合物であるか、検出可能な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））か、あるいは、比色、蛍光、化学ルミネセンスあるいは、電気化学ルミネセンスシグナルなどの検出可能なシグナルを生成することができる何らかのほかの標識部分かのいずれかである。前述の標識が使用されている好適な分析システムは、電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）をベースにした分析法又は酵素ゲル測定法（ＥＬＧＡ）をベースにした分析法である。
【００４７】
本発明のもう１つの好適な実施態様は、本発明によるオリゴヌクレオチドを使用して、ヒト組織（抽出物）、末梢血、白血球、体液、腫瘍細胞系統などにおけるエプスタイン−バーウイルス特異的ＲＮＡ配列の検出のための方法に関する。前述の方法は以下のステップを含む。すなわち、
本発明と適当な増幅試薬による（一対の）オリゴヌクレオチドを使用して前述のｍＲＮＡ内にある標的配列を増幅するステップと、
検出プローブとして本発明によるオリゴヌクレオチドを用いて、増幅された核酸を任意に含むサンプルを反応させるステップと、
増幅された配列とプローブの間に形成されるハイブリッドを検出するステップである。
【００４８】
核酸を増幅させるためのさまざまな技術が当該技術分野では公知のものである。ＤＮＡ標的セグメント増幅用技術の１つの例は、いわゆる「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ技術により、特定の標的セグメントのコピー数はサイクル数に伴って指数関数的に急激に増加する。一対のプライマーが使用され、また各サイクルにおいて、ＤＮＡプライマーは二本鎖ＤＮＡ標的配列のその二本鎖のそれぞれの３’側にアニールされる。プライマーは、二本鎖ＤＮＡを再び生成するために、さまざまなモノヌクレオチドの存在下に、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。二本鎖ＤＮＡの鎖は、熱変性により互いに分離され、また各鎖は、プライマーのアニーリングと、またその結果としての以下のサイクルにおける伸長のための鋳型として、役に立つ。ＰＣＲ法はＳａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５，１９８５と、欧州特許第ＥＰ  ２００３６２号と第ＥＰ  ２０１１８４号に説明されている。
【００４９】
核酸の増幅のためのもう１つの技術は、いわゆる転写をベースにした増幅システム（ＴＡＳ）である。ＴＡＳ法は、国際特許出願第ＷＯ  ８８／１０３１５号に記載されている。転写をベースにした増幅技術は通常、機能的プロモーターを含む鋳型を生成するために、それらのうちの１つはプロモーター配列を含む２つのオリゴヌクレオチドにより標的核酸を処理するこを含む。ＲＮＡの複数のコピーは前述の鋳型から転写され、また、さらなる増幅のためのベースとして役立たせることができる。
【００５０】
等温下の持続的転写をベースにした増幅方法は、欧州特許第ＥＰ  ３２９８２２号に説明されているように、いわゆるＮＡＳＢＡプロセス（“ＮＡＳＢＡ”法）である。ＮＡＳＢＡ法には、Ｔ７プロモータを含む鋳型からＲＮＡの複数のコピーを転写するため、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの使用が含まれる。
【００５１】
ＲＮＡ増幅（本発明による本方法を用いるものなど）に関して、ＮＡＳＢＡ技術、又はもう１つの転写をベースにした増幅技術は、１つの好適な技術である。ＲＴ−ＰＣＲ法がウイルス転写の検出のために使用される場合には、ｍＲＮＡ−およびＤＮＡ−誘導ＰＣＲ生成物の区別が必要となる。ＩＥＡ  ｍＲＮＡなどのスプライシング転写に関しては、エキソン−イントロン構造を使用することができる。しかし、後期構造タンパク質をコードするｍＲＮＡ種は、非スプライシング転写によってほとんど全部がコードされる。ＲＴ−ＰＣＲ法に先立ちＤＮＡアーゼ処理を用いることができる（Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ  １６７，７４０〜７４３，１９９３；  Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ８，２６１〜２７１，１９９４）が、しかし、ときには汚染ＤＮＡを十分に除去することに失敗する（Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら、１９９３）。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲとは対照的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写をベースにしているＮＡＳＢＡ（Ｋｉｅｖｉｔｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ；  ３５：２７３〜８６）は、ＲＮＡをその標準的な標的としてのみ使用しているため、ＲＮＡ−とＤＮＡ−誘導増幅生成物の間の区別を必要としない。ＮＡＳＢＡ法は、ＤＮＡのバックグラウンドでもＲＮＡ標的の特異的な増幅を可能にする。
【００５３】
この方法は、ＨＩＶ感染患者から採取される全血サンプルにおけるエプスタイン−バーウイルス転写物の分析のために使用された。
【００５４】
臨床上のサンプルにおけるエプスタイン−バーウイルスの検出用試験キットはまた、本発明の一部になっている。本発明による試験キットは、本発明による一対のオリゴヌクレオチドと、本発明によるオリゴヌクレオチドから成るプローブを含んでいてもよい。こうした試験キットはさらに、ＤＮＡおよびまたはＲＮＡポリメラーゼやモノヌクレオチドなどの適当な増幅試薬を含む。本発明による方法を用いて使用することができる試験キットは、増幅と、エプスタイン−バーウイルス特異的ＲＮＡ配列のその後の検出のための本発明によるオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００５５】
本発明はさらに、以下の実施例により例示される。
【００５６】
実施例１
ＥＢＮＡ−１  ｍＲＮＡの検出のための特異的プライマーとプローブの選択と最適化
地球上の異なった地域から得られた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養されたバーキットリンパ腫（ＢＬ）とリンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）細胞系統の大きなパネルから、また、さまざまなエプスタイン−バーウイルス陽性腫瘍組織から採取された新鮮な腫瘍生検標本から、ＢＫＲＦ１読み取り枠の特異的ヌクレオチド配列が決定され、またプロトタイプＢ９５−８配列により整列される。驚くべきことに、Ｂ９５−８配列と比較すると、後者（Ｂ９５−８）を突然変異菌株にするというよりも互いに整列させる場合には、エプスタイン−バーウイルスのフィールド分離菌株はより多く保存されていたということがこれらのデータから明らかになった。さらに、東南アジアから得られたＮＰＣ−およびＬＣＬ誘導配列の間では、共通したある種の突然変異がより多く観察され、一方、ほかの突然変異は中央アフリカから得られたＬＣＬおよびＢＬ誘導分離菌株の間では共通しているものが多く見られ、地域的な菌株の相違を示していた。異なったリンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）の分析においては、Ｂ９５−８形質転換系統は、内因性ウイルス形質転換（＝自発性成長）系統から誘導されたリンパ球芽様細胞系統（ＬＣＬ）からははっきりと区別することができた。
【００５７】
これらの分析によりまた、研究されたすべての分離菌株の間で高度に保存されていたＢＫＲＦ１配列内に特異的な領域が明らかになった。これらの領域は、ＮＡＳＢＡを使用してＢＫＲＦ１エキソン特異的および感受性ｍＲＮＡ増幅に対して適用することができた配列を検索するのに利用された。
【００５８】
ＢＫＲＦ１の保存領域内で選択された多数の候補配列から、４つのプライマーセットと対応する検出プローブが合成され、また、エプスタイン−バーウイルスゲノム陰性Ｂ細胞（ＢＪＡＢ又はＲＡＭＯＳ細胞）の固定した数（ｎ＝５０，０００）で作成されたエプスタイン−バーウイルスゲノム陽性Ｂ細胞（ＪＹ細胞）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成ランオフ転写物と希釈シリーズを使用して増幅の絶対的及び相対的感度を測定するのに利用された。
【００５９】
これらの実験では、「標準的」ＮＡＳＢＡプロトコル（以下を参照）を使用して、ＢＫＲＦ１特異的ｍＲＮＡ配列についてのもっとも感度が高く、また特異的な増幅は、配列番号：５を伴う検出プローブと組み合わせた、配列番号：２と配列番号：３を伴ったプライマーＥＢＮＡ１−１．２と−２．１を使用して達成できたことが判明した。
【００６０】
図１は、ＢＫＲＦ１配列から誘導されたプライマーセットの２つの組み合わせを使用して、典型的なＮＡＳＢＡ反応の結果を図示している。２０３  ｂｐの特異的な増幅生成物を付与するプライマーの組み合わせ（２．１を伴う１．２）は、５０，０００エプスタイン−バーウイルス陰性ＲＡＭＯＳ細胞のバックグラウンドにおいて、１０エプスタイン−バーウイルス感染ＪＹ細胞の検出を可能にする。
【００６１】
「標準的」ＮＡＳＢＡプロトコル
エプスタイン−バーウイルス陽性および陰性細胞および／または組織サンプルは他所に説明されているように、ＮＡＳＢＡ細胞溶解現象緩衝液を用いて常套的に処理された。ＮＡＳＢＡ反応は反応毎１００ｎｇ総量ＲＮＡを使用して、Ｋｉｅｖｉｔｓらにより記載されているように（別の方法が記載されていない限り）実施された。水性細胞／組織誘導ＲＮＡ溶液が、シリカをベースにした単離方法（Ｂｏｏｍら、欧州特許第０３８９０６３  Ｂ１号、米国特許第５，２３４，８０９号）により得られ、またＮＡＳＢＡ反応において直接使用された。ＲＮＡｚｏｌ法（Ｃｉｎｎａ  Ｂｉｏｔｅｘ社製）により得られるようにＥＢＥＲ１−ＲＮＡのイソプロパノール沈降物は３０分間１４，０００ｒｐｍでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器で遠心分離にかけられた。ＲＮＡペレットは７０％エタノールで洗浄され、１０〜１５分間の間真空下で乾燥させ、またＲＮアーゼを含まない水のなかで溶解された。各サンプルの５マイクロリットル（μｌ）が５  ｘ  ＮＮ緩衝液４μｌ（２００ｍＭ  トリス，ｐＨ８．５，６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３５０ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＤＴＴ，各ｄＮＴＰの５ｍＭ、１０ｍＭ  ｒＡＴＰ，ｒＵＴＰ，ｒＣＴＰと７．５ｍＭ  ｒＧＴＰ，２．５ｍＭ  ＩＴＰ）、４μｌプライマー混合液（７５％  ＤＭＳＯにおける各プライマーの１μＭ）、２μｌのＲＮアーゼを含まない水と混ぜ合わされた。サンプルは、酵素混合液５μｌ（６．５ｍＭソルビトール、３，４μｇ  ＢＳＡ，０．０８  Ｕ  ＲＮＡｓａＨ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、３２．０  Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、６．４４  Ｕ  ＡＭＶ−ＲＴ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製））と混ぜ合わせた後、５分間６５℃まで熱せられ、４１℃まで冷却させた。反応は９０分間４１℃にてインキュベートされた。反応生成物は、ＴＢＥにおいて１．５％アガロースを使用してゲル電気泳動法により評価された。ＮＡＳＢＡ生成物は、毛管ブロッティングによりそのゲルからナイロンフィルター（Ｑｕｉａｂｒａｎｅ、Ｑｕｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州チャッツワース市）に移され、また標準的な手順を使用して特異的γ３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされた。放射能はＫｏｄａｋ  ＸＡＲ−１フィルムを使用して検出された。
【００６２】
実施例２
最適化プライマーセットを使用しての付加的ＥＢＶ  ＲＮＡ標的の検出
同様に、配列比較とプライマー最適化研究によりＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＥＢＥＲ−１、とそのほかのエプスタイン−バーウイルス遺伝子標的に対してエプスタイン−バーウイルスコードしたｍＲＮＡの検出用試薬の特異的セットの選択が可能になった。いくつかの標的に関しては、その結果が図２、パネルＡ〜Ｄに示されている。
【００６３】
図２のパネルＡとＢは、ＥＢＮＡ１に関して説明されているように、５０，０００エプスタイン−バーウイルス陰性ＲＡＭＯＳ細胞におけるエプスタイン−バーウイルス陽性ＪＹ細胞の希釈シリーズについてのＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２に対するＮＡＳＢＡ反応の結果を示している。
【００６４】
そのデータは、２４８  ｂｐの生成物を付与する２．１（配列番号：１４）と組み合わせたＬＭＰ−１特異的プライマーセット１．１（配列番号：１２）が、５０，０００エプスタイン−バーウイルス陰性ＲＡＭＯＳ細胞のバックグラウンドのなかで１〜１０  ＪＹ細胞に相当するｍＲＮＡの検出を可能にしていることを示している。１９６  ｂｐの生成物を付与する、２．１（配列番号：１９）と組み合わせたＬＭＰ−２セット１．２（配列番号：１８）は、５０，０００  ＲＡＭＯＳ細胞の存在下で１ＪＹ細胞の明瞭な検出を可能にしており、これは２２６  ｂｐの生成物を付与する、２．２（配列番号：２０）とのＬＭＰ−２セット１．１（配列番号：１７）の組み合わせよりも少々良好である。
【００６５】
図２のパネルＣは、ＥＢＥＲ−１の分析的感度を測定するＮＡＳＢＡ測定法の結果を示している。これらの結果は、１４０ｂｐの生成物を付与する、２．２（配列番号：７）とＥＢＥＲ１．１（配列番号：６）とのプライマー組み合わせが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成ＲＮＡランオフ転写法を使用して、１００  ＲＮＡ分子の検出を可能にしている。
【００６６】
図２のパネルＤは、５０，０００  ＲＡＭＯＳ細胞におけるＪＹ細胞の希釈シリーズから分離されたＲＮＡを伴うＥＢＥＲ１  ＮＡＳＢＡの結果を示しており、また約１００  ＪＹ細胞相当量が検出可能であることを示している。シリカ分離手順の間、小さなサイズのＲＮＡ分子の喪失により、無反応のものも認められた。
【００６７】
実施例３
ＥＢＶ−ＲＮＡ単離とＮＡＳＢＡ反応条件の最適化
ＤＭＳＯ、ＫＣｌ又はベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）の濃度などのＲＮＡ単離方法又はＮＡＳＢＡ反応条件の最適化は、その特異性を損なうことなくエプスタイン−バーウイルス特異的ＲＮＡの検出の感度を改善することができる。
【００６８】
図３Ａは、小さな分子重量ＥＢＥＲ１  ＲＮＡの単離に関する２つのＲＮＡ単離方法の比較を示している。この２つはＪＹ細胞のようなエプスタイン−バーウイルス形質転換細胞には非常に豊富に存在している。しかしこの２つはＢｏｏｍらのシリカ法によっては高度に効率的には分離されない。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成１７０  ｂｐランオフ転写物の標準化された容量は、ＲＮＡｚｏｌ（Ｃｉｎｎａ  Ｂｉｏｔｅｘ社製）とＢｏｏｍ単離法を使用して、ＲＮＡ単離に対する投入量として使用された。単離されたＲＮＡは１４０  ｂｐの生成物を付与する、プライマー１．１（配列番号：６）と２．２（配列番号：７）を用いたＮＡＳＢＡ法に関する投入物として使用された。ＲＮＡｚｏｌ法はこの小さなＥＢＥＲ１  ＲＮＡの１０〜１００倍さらに効率的な抽出レベルであるという結果が示されている。
【００６９】
ＲＮＡｚｏｌ法は、５００  ｂｐを超えるＲＮＡ分子には適用されないが、Ｂｏｏｍ法と比較して、小さなＥＢＥＲ１分子を単離するには、より効率的である（図示せず）。
【００７０】
さらに、ＮＡＳＢＡでの、特異的ＲＮＡの増幅の効率は、化学物質の付加によって、関連している酵素の加工処理能力を改善すること（ＫＣｌ又はＭｇＣｌ２）か、あるいは増幅および標的ＲＮＡ（ベタイン又はＤＭＳＯ）における２次構造の形成を減少させることのいずれかが改善される可能性がある。
【００７１】
図３Ｂは、５０，０００  ＲＡＭＯＳ細胞における１００  ＪＹ細胞の標準化されたＲＮＡ抽出物でエプスタイン−バーウイルス特異的ＢＤＬＦ２  ＲＮＡ転写物の特異的検出に適用されるＫＣｌ濃度における変化の影響が示されている。４０〜６０ｍＭの間のＫＣｌ濃度はこの転写（図３Ｂ）に関しては最適であるが、一方、たいていのほかの標的に関しては、これは６０〜７０ｍＭであった。
【００７２】
さらに、図３Ｃに示されているように、ＮＡＳＢＡ反応混合液に対して６００ｍＭまでベタインを付加すると、有意な２次構造形成を示すＩＬ１０（ｖ−ＩＬ１０）のウイルスホモログをコードするＢＣＲＦ１遺伝子からエプスタイン−バーウイルス特異的ＲＮＡの検出が大幅に改善された（データ図示せず）。この場合、ＲＮＡは３０ｍＭ酪酸誘導エプスタイン−バーウイルス陽性ＲＡＪＩ細胞から単離された。
【００７３】
実施例４
ヒト腫瘍生検標本におけるエプスタイン−バーウイルス  ｍＲＮＡ  発現の検出へのＮＡＳＢＡの適用
健康なエプスタイン−バーウイルス保有患者において、ＥＢＶ−ＤＮＡは潜伏して感染した循環ならびに組織浸潤Ｂ細胞に存在し、また散発性ウイルス産生Ｂ細胞又は上皮細胞により体液内に分泌されるビリオンに存在する可能性があるため、異なったエプスタイン−バーウイルス潜伏期プログラムに関連しているウイルス特異的ＲＮＡの検出は、腫瘍形成にリンクしている宿主における異常なウイルス活性を診断する１つの手段を提供しうる。健康なキャリアの組織と体液におけるウイルスＲＮＡ転写物のレベルは、エプスタイン−バーウイルスがこれらの症例では１０５〜１０８Ｂ細胞でたった１つしかいないと推定されるため、Ｂ細胞の精製なしでは検出に関しては非常に低いことが考えられる。したがって、非精製細胞又は組織におけるウイルスＲＮＡの検出は、エプスタイン−バーウイルス関連（悪性）疾患が疑われる症例では診断および予後上で価値があると考えられる。ＮＡＳＢＡ法は、ウイルスＤＮＡゲノムの存在によっては影響されないいずれかのウイルスＲＮＡ種の直接検出が可能にするため、ヒト材料におけるウイルス転写活性の分析に対する優れた、また独特なツールを提供する。ＥＢＮＡ１はエプスタイン−バーウイルス感染のすべての病期で発現することが考えられるため、その検出はウイルスの存在と転写活性の１つの直接的な反映であるといえる。エプスタイン−バーウイルス陽性および陰性凍結腫瘍生検のシリーズから、４ミクロン切片が切り出され、拡散を放出させるためにＮＡＳＢＡ細胞溶解緩衝液により直接処理され、さらにシリカビーズ上で単離された。
【００７４】
単離ＲＮＡの品質は、１％アガロースにて電気泳動の後、１８Ｓ／２８ＳリボソームＲＮＡバンドの検出によりチェックされ、またさらに構成的に発現したヒトｓｎＲＮＰタンパク質Ｕ１ＡをコードするＵ１Ａ  ｍＲＮＡの存在に関して分析された。ＥＢＶ−ＥＢＮＡ１  ｍＲＮＡ  は、図１に説明されているようなＢＫＲＦ１特異的プライマーセット１．２と２．１を使用してＮＡＳＢＡ法により、また他所に報告されているように、Ｑ／Ｕ／Ｋスプライシング部位の周囲に位置している特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ法によって検出された。この分析の結果は表１に掲載されているが、表１には、ＮＡＳＢＡ法がＲＴ−ＰＣＲ法よりも大幅に大きな感度を用いて、エプスタイン−バーウイルス陽性ヒト腫瘍組織誘導抽出物におけるＥＢＮＡ−１  ｍＲＮＡ配列の特異的な検出を可能にし、また、劣性のＲＮＡ品質又はＲＴ−ＰＣＲ阻害薬剤を用いてのサンプル中での検出をも可能にしているのが明確に示されている。
【００７５】
実験の第２のシリーズでは、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ１  ＲＮＡの存在は、ヒトパピローマウイルスの検出のために収集された子宮頸部の掻爬において分析された。そのいくつかのサンプルにはＢＡＭ−Ｗ領域由来のプライマーを使用してＥＢＶ−ＤＮＡ  ＰＣＲ法により測定されたＥＢＶ−ＤＮＡが含まれていた。宿主細胞ＲＮＡの存在と品質が、上で示されたように、チェックされた。結果は表２に示されており、ＨＰＶ−ＤＮＡ（表示せず）とＥＢＶ−ＤＮＡの存在にもかかわらず、これらのサンプルにおいてはＥＢＶ−ＲＮＡはまったく検出されなかったことを示している。これは、ＥＢＶ−ＮＡＳＢＡの特異性を示すものである。
【００７６】
実施例５
鼻咽頭がん（ＮＰＣ）とホジキン病（ＨＤ）におけるＮＡＳＢＡ仲介検出とエプスタイン−バーウイルス特異的ＲＮＡ転写の分化
エプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患は、公知の潜伏期プログラムに限定されないがそれと関連しているウイルス遺伝子転写のはっきりとしたパターンによって特徴付けられるため、ヒト組織又は体液におけるウイルス転写活性の鑑別的な分析は、診断上重要であると考えられる。図５に示されているように、ＮＡＳＢＡ法はＢＡＲＦ１とＬＭＰ２遺伝子から誘導されたウイルス転写物の鑑別的な検出により本実施例で示されているように、この目的のための優れたツールを提供する。
【００７７】
異なったヒト腫瘍におけるエプスタイン−バーウイルス特異的遺伝子転写の検出と分析のため、組織ＲＮＡは、Ｂｏｏｍ法を使用してＮＡＳＢＡ法の細胞溶解緩衝液のなかで溶解された凍結腫瘍材料の４μｍ薄片から抽出された。
【００７８】
図４Ａと４Ｂは、図２に示されているように、ＢＡＲＦ１−特異的γ３２Ｐ標識プローブ（配列番号：２６）によって検出可能な２５２  ｂｐ産物を産生するＢＡＲＦ１−１．２（配列番号：２３）プラスＢＡＲＦ１−２．１（配列番号：２４）のプライマーの組み合わせ、１９６  ｂｐ産物を産生するＬＭＰ２−１．２（配列番号：１８）とＬＭＰ１−２．１（配列番号：１９）の組み合わせを使用して、ＢＡＲＦ１およびＬＭＰ２遺伝子それぞれから誘導されたウイルス特異的ＲＮＡの検出に関する結果を示している。その結果は、ＢＡＲＦ１転写はＮＰＣには特異的であるが、ＨＤでは検出可能ではなく、一方、ＬＭＰ２遺伝子は両方のタイプの腫瘍で転写されることが示されている。
【００７９】
これらの結果から、異なったエプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患を伴う患者から得られたヒト生検材料におけるエプスタイン−バーウイルス転写活性の特異的な検出と鑑別におけるＮＡＳＢＡ分析の使用法が示されている。
【００８０】
実施例６
単一細胞レベルでの特異的遺伝子発現の検出のためのインサイチューＮＡＳＢＡ法
エプスタイン−バーウイルス遺伝子転写は、個々の腫瘍細胞でさまざまに変化し、ヒト組織サンプルにおける周囲の悪性細胞に比べると、腫瘍浸潤性Ｂ細胞や分化上皮細胞では異なっている可能性もあるため、単一細胞レベルでエプスタイン−バーウイルス遺伝子発現を分析することは重要なことである。
【００８１】
さらに、感染（形質転換）細胞だけではなく、また周囲の正常組織や腫瘍浸潤性リンパ球におけるウイルス誘導性宿主特異的遺伝子発現の分析は、ウイルス病因やそのウイルスに対する宿主応答を理解するためには重要であると考えられる。細胞抽出物における遺伝子転写物の分析は、単一細胞レベルで情報を提供することはなく、また（ＲＴ−）ＰＣＲ技術のたいていのものでは、組織学的検査に関して必要とされる細胞形態学的保存状態に非常によく適合するというわけではない。
【００８２】
ＮＡＳＢＡ法は、それが高温サイクリングを欠いているため、増幅反応の間に組織や細胞形態を破壊することなく、またしたがって、豊富に存在しているわけではないウイルスと宿主細胞転写物のインサイチュー検出や、免疫細胞化学的検出を回避する分泌宿主やウイルス生成物の合成に関連している遺伝子発現に関するインサイチュー検出には非常によく適している。
【００８３】
実施例７
エプスタイン−バーウイルス関連がんのためのマーカーとしてのエプスタイン−バーウイルス特異的ＢＡＲＦ１−ＲＮＡ
エプスタイン−バーウイルス関連悪性疾患は、以前に示されている、異なった潜伏期プログラムに関連しているウイルス遺伝子転写のはっきりとしたパターンにより特徴付けられている。
【００８４】
ヒト組織又は体液におけるウイルス転写活性のパターン分析を使用した鑑別診断は臨床診断上重要である。
【００８５】
リンパ腫と胃がん（ＧＣ）、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）などの、上皮腫（エピテリオーマ）とも呼ばれる攻撃的なリンパ球に富んだ上皮悪性疾患の間の鑑別は、治療上の選択肢の観点からは明確な重要性を有している。
【００８６】
上皮に生存しているエプスタイン−バーウイルスに対する特異的なマーカーの有用性は明確な利点となる。
【００８７】
図６に図示されているように、ＢＡＲＦ１−ＲＮＡの転写物は、胃がん（ＧＣ）、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）ではとくに検出されるが、エプスタイン−バーウイルス陽性ホジキン病（ＨＤ）ならびにＴ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）又は対照組織では検出されない。
【００８８】
したがって、ＢＡＲＦ１転写物は、エプスタイン−バーウイルスに関連している上皮悪性疾患の鑑別診断のための特異的なマーカーを提供する。
【００８９】
ＮＡＳＢＡ法は、本実施例において示されているように、この目的に対する優れたツールを提供する。
【００９０】
異なったヒト腫瘍において、エプスタイン−バーウイルス特異的遺伝子転写の検出と分析に関しては、ＲＮＡは、シリカをベースにしたＢｏｏｍ法を使用して、ＮＡＳＢＡ細胞溶解緩衝液のなかで溶解される凍結腫瘍材料の１０μｍ薄片から抽出された。
【００９１】
図６は、ＢＡＲＦ１特異的γ３２Ｐ標識プローブ（配列番号：２６）により検出可能な２５２  ｂｐ産物を産生する、ＢＡＲＦ１−１．２（配列番号：２３）プラスＢＡＲＦ１−２．１（配列番号：２４）のプライマー組み合わせを使用して、ＢＡＲＦ１遺伝子から誘導されたウイルス特異的ＲＮＡのＮＡＳＢＡ仲介検出に関する結果を示している。
【００９２】
陽性対照（＋対照）には、ＢＡＲＦ１遺伝子により安定的に形質転換されたエプスタイン−バーウイルス陰性Ｌｏｕｃｋｅｓバーキットリンパ腫細胞系統由来のＲＮＡが含まれる。
【００９３】
陰性対照（−対照）は、エプスタイン−バーウイルス陰性胃がんから単離されたＲＮＡから成る。またエプスタイン−バーウイルス陰性Ｂ細胞系統ＲＡＭＯＳからＲＮＡは特異性対照として含められている。
【００９４】
ＨＤおよびＴ−ＮＨＬマーカーされているレーンは、エプスタイン−バーウイルス陽性ホジキンリンパ腫（ＨＤ）とエプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）のそれぞれから単離されたＲＮＡを用いたＢＡＲＦ１分析を表わしているが、その両方とも、同じ抽出ＲＮＡサンプル上でＮＡＳＢＡ法によるインサイチュー染色ならびにＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２  ＲＮＡ発現によりエプスタイン−バーウイルス特異的ＥＢＥＲ  ＲＩＳＨおよびＬＭＰ１タンパク質を示した。
【００９５】
鼻咽頭がん（ＮＰＣ）と両方の胃がん（ＧＣ）サンプルは凍結組織切片上のＥＢＥＲ  ＲＩＳＨ分析によりエプスタイン−バーウイルス陽性であった。
【００９６】
すべてのサンプルは、陽性Ｕ１Ａ  ＲＮＡ反応により定義されているように良好な品質のＲＮＡを有していた。
【００９７】
ＢＡＲＦ１転写はＮＰＣとＧＣに特異的であり、またＥＢＶ＋ＨＤとＴ−ＮＨＬでは検出可能ではなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＢＫＲＦ１配列由来のプライマーセットの２つの組み合わせを使用する、典型的なＮＡＳＢＡ反応の結果を図示している。
【図２Ａ】  ＥＢＮＡ１に関して説明されているように、５０，０００エプスタイン−バーウイルス陰性ＲＡＭＯＳ細胞におけるエプスタイン−バーウイルス陽性ＪＹ細胞の希釈シリーズ上のＬＭＰ−１とＬＭＰ−２に関するＮＡＳＢＡ反応の結果を示している。
【図２Ｂ】  ＥＢＮＡ１に関して説明されているように、５０，０００エプスタイン−バーウイルス陰性ＲＡＭＯＳ細胞におけるエプスタイン−バーウイルス陽性ＪＹ細胞の希釈シリーズ上のＬＭＰ−１とＬＭＰ−２に関するＮＡＳＢＡ反応の結果を示している。
【図２Ｃ】  ＥＢＥＲ−１の分析的感度を測定するＮＡＳＢＡ測定法の結果を示している。
【図２Ｄ】  ５０，０００  ＲＡＭＯＳ細胞においてＪＹ細胞の希釈シリーズから分離されたＲＮＡを用いたＥＢＥＲ１  ＮＡＳＢＡ法の結果を示し、約１００  ＪＹ細胞相当量が検出可能であることを示している。
【図３Ａ】  小分子重量ＥＢＥＲ１  ＲＮＡに関する２つのＲＮＡ単離方法を比較したものが呈示されている。
【図３Ｂ】  エプスタイン−バーウイルス特異的ＢＤＬＦ２  ＲＮＡ転写物の特異的検出に適用される、ＫＣｌ濃度における変化の影響を示している。
【図３Ｃ】  エプスタイン−バーウイルス特異的ＢＣＲＦ１  ＲＮＡ転写物の特異的検出に適用されているＮＡＳＢＡ反応混合液にベタインを付加することについての影響を示している。
【図４Ａ】  ＢＡＲＦ１とＬＭＰ２遺伝子のそれぞれから誘導されたウイルス特異的ＲＮＡの検出に関する結果を示している。
【図４Ｂ】  ＢＡＲＦ１とＬＭＰ２遺伝子のそれぞれから誘導されたウイルス特異的ＲＮＡの検出に関する結果を示している。
【図５】  図５は、標準的な組織学的手順を使用して、アガロースのなかで作成し、ホルマリンで固定してパラフィンで包埋されたＪＹ細胞におけるＬＭＰ２特異的遺伝子発現のインサイチューＮＡＳＢＡ法による検出の結果を示している。
【図６】  図６は、ＢＡＲＦ１特異的γ３２Ｐ標識プローブ（配列番号：２６）によって検出可能な２５２  ｂｐ生成物を産生する、ＢＡＲＦ１−１．２（配列番号：２３）プラスＢＡＲＦ１−２．１（配列番号：２４）のプライマー組み合わせを使用して、ＢＡＲＦ１遺伝子から誘導したウイルス特異的ＲＮＡのＮＡＳＢＡによる仲介検出に関する結果を示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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