(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)
【化１】
0004500163.tif 000020
｛式中、Ｙは式(II)
【化２】
0004500163.tif 000021
または式(III)
【化３】
0004500163.tif 000022
の基であり、
Ｒ1はＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ2はＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ3はＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ4はＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は−Ｏ−であり、
ｍは３または４であり、そして
ｎは２である｝で表わされるが、但し、ｍが３であり、そしてＲ2およびＲ3がＣ2Ｈ5であり、そしてすべての二重結合がトランス配置に位置しているものではない式(Ｉ)の化合物、および／または立体異性体の形の式(Ｉ)の化合物および／またはこれらの形の任意の比の混合物、および／または式(Ｉ)の化合物の生理学的に許容される塩。
【請求項２】
少なくとも１つのポリエン基が少なくとも１つのシス二重結合を含む請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項３】
式(IV)
【化４】
0004500163.tif 000023
の化合物である請求項１または２に記載の式(Ｉ)の化合物およびその生理学的に許容される塩。
【請求項４】
式(Ｖ)
【化５】
0004500163.tif 000024
の化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項５】
Ｒ1およびＲ2がＨである請求項４に記載の式(Ｖ)の化合物。
【請求項６】
式(VI)
【化６】
0004500163.tif 000025
の化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項７】
Ｒ1およびＲ2がＨである請求項６に記載の式(VI)の化合物。
【請求項８】
式(VII)
【化７】
0004500163.tif 000026
の化合物である請求項１または３に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項９】
Ｒ1およびＲ2がＨである請求項８に記載の式(VII)の化合物。
【請求項１０】
式(VIII)
【化８】
0004500163.tif 000027
の化合物である請求項１または２に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項１１】
式(IX)
【化９】
0004500163.tif 000028
の化合物である請求項１０に記載の式(VIII)の化合物。
【請求項１２】
Ｒ1がＨである請求項１１に記載の式(IX)の化合物。
【請求項１３】
式(Ｘ)
【化１０】
0004500163.tif 000029
の化合物である請求項１０に記載の式(VIII)の化合物。
【請求項１４】
Ｒ1がＨである請求項１３に記載の式(Ｘ)の化合物。
【請求項１５】
１）化合物サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤの１つまたはそれ以上が培養ブロス中で増殖するまで、微生物Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １
４８６５、またはその変異体および／または突然変異体の１つを水性の栄養素培地中で培養し、
２）サーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤを単離しそして精製し、
３）そして、適切なら、式(Ｉ)の化合物を薬理学的に許容できる塩に転化することからなる請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物の製造方法。
【請求項１６】
微生物Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５、またはその変異体および／または突然変異体を、炭素源および窒素源そして慣用の無機塩および微量元素も含有する培養培地内で培養し、サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤを単離し、そして適切ならサーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤを薬理学的に許容できる塩に転化することを包含する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の化合物の製造方法。
【請求項１７】
培養が２０〜３５℃の温度および４〜１０のｐＨで好気性条件下で実施される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
医薬品を製造するための請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１９】
感染性細菌疾病の治療および／または予防のための医薬品を製造するための請求項１８に記載の化合物の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物と１つまたはそれ以上の生理学的に好適な補助物質とを含有する医薬品。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を１つまたはそれ以上の生理学的に好適な補助物質とともに投与に好適な形にすることからなる、請求項２０に記載の医薬品を製造する方法。
【請求項２２】
微生物Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーペンテマイシンと称される新規な化合物に関する。この化合物は微生物Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５から生成される。本発明はサーペンテマイシンの化学的誘導体、これを製造するための方法および、特に細菌感染疾病の治療および予防のための薬物としてのこの化合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性細菌疾病を治療するために多数の抗生物質が療法的に使用される。しかしながら、病原体は使用される医薬品に対する耐性がますます大きくなっており、β−ラクタム抗生物質、グリコペプチドまたはマクロライドのような単一の抗生物質の群に対してますます抵抗できるようになるのみか、同時にいくつかの耐性を有する多耐性有機体と称されるもののため、重大なリスクに脅かされてさえいる。市販で入手できる抗生物質のすべてに対して耐性を獲得した病原体もある。この有機体によって惹起される感染性の疾病は治療されることがもはやできない。従って、耐性有機体に対して使用できる新規な薬剤に関して大きな需要がある。数千の抗生物質が文献中に記載されているが、これらのほとんどは毒性が大きすぎるので医薬品として使用されることができない。
【０００３】
ほとんどが大環状構造のタイプに属するポリエン抗生物質の比較的多数がすでに記載されている。これらのマクロライドは生体隔膜との相互作用によって抗菌性的に作用し、従って、恒温動物に対して有害である。このタイプのものの最も重要な代表例は、その毒性にもかかわらずヒトでの治療剤として使用されるアンフォテリシンＢである。大環状ではない記載のある（Ritzau et al., Liebigs Ann. Chem. 1993, 433-435）ポリエン抗生物質の例は、１,２位置がポリエン側鎖によって置換されているフェニル環を含むサーペンテン（serpentene）である。グラム陽性およびグラム陰性のバクテリアに対する試験において、サーペンテンは枯草菌（Bacillus subtilis）に対して弱い抗生効果しか示さなかった。
【０００４】
グラム陽性バクテリアの細胞壁は特にムレインから構成されており、これは二糖類のように互いに結合しているＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸からなり、またＤ−グルタミン、Ｄ−およびＬ−アラニン、Ｌ−リジンおよびペンタグリシル単位のようにアミノ酸およびペプチドを含み、また強力に架橋している。バクテリアの細胞壁の生合成は、恒温動物代謝では見いだされない酵素を使用して実施される。従って、この酵素は恒温動物代謝によって十分に許容される抗生物質を生成するのに好適な攻撃部位であり、またムレイン生合成の阻害剤はヒトに対して有毒性であってはならない。グリコシルトランスフェラーゼ（トランスグリコシラーゼ、ＧＴ）はペプチドグリカン生合成での、従って細胞壁構造の鍵になる酵素である。この酵素つまりモエノマイシン（Kurz et al., Eur. J. Biochem. 1998, 252, 500-507）の特定の阻害剤は比較的以前からすでに知られている。モエノマイシンは極めて強力な活性を示しそして十分に許容される抗生物質であるが、しかしながら、それは胃腸管から吸収されず、また静脈内投与に続く血液からの除去もまた妨げられる。これらの理由のため、内科においてモエノマイシンを全身的に使用することはこれまでできなかった。このとき以来、極めて少数の追加的なグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤だけが文献に記載されてきた。薬物動態学または寛容性の理由で、これらの薬剤はいずれも療法に取り入れられていない。この理由のため、Current Medicinal Chem. 2000, 7, 801-820 にGoldmanおよびGangeによって最近報告されているように、新規のＧＴ阻害剤がいまだに探索されている。特定の生化学的ＧＴ試験装置を使用してスクリーニングが行われる。このアッセイは例えば Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44, 1181-1185 にVollmerおよびHoeltjeによって繰り返し記載されている。
【０００５】
Darbyら（U. Org. Chem. 1977, 42, 1960-1967）は、大環状アンヌレンのπシステムを分析するために、１,２位置でトランス−ポリエン側鎖によって置換されているフェニル化合物の合成について記載している。
【０００６】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ，ＤＳＭ  １４８６５株は、グリコシルトランスフェラーゼの極めて良好な阻害剤でありまた極めて有効な抗菌性化合物である新規な化合物を生成することができることが驚くべきことに見いだされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５株によって生成される活性化合物に関し、またこれの生理学的に許容されうる塩、エステル、エーテルおよび自明の化学的均等物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、従って、式(Ｉ)
【化１】
0004500163.tif 000002
｛式中、Ｙは式(II)
【化２】
0004500163.tif 000003
または式(III)
【化３】
0004500163.tif 000004
の基であり、
ＲはＨ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニルまたはＣ5〜Ｃ14−アリール、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−Ｏ−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、−ＮＨ−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−Ｎ(−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)2、−Ｎ(−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル)2、−Ｎ(−Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル)2、−Ｎ(−Ｃ5〜Ｃ14−アリール)2、−ＮＨ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)］、−ＮＨ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ5〜Ｃ14−アリール)］、−ＮＨ−Ｏ−Ｒ1、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−Ｓ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−Ｓ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキニルまたは−Ｏ−Ｃ5〜Ｃ14−アリールであって、ここで上記の置換基は置換されていなくてよくまたは、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニルまたはＣ5〜Ｃ14−アリールによって１回またはそれ以上置換されていてよく、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリールは置換されていなくてよくまたは、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−Ｏ−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−ＮＨ2、ハロゲンによって１回または２回置換されていてよく、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリールは−ＣＮ、アミドまたはオキシムによってさらに置換されていてよく、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニルまたはＣ5〜Ｃ14−アリールであって、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリールは置換されていなくてよくまたは、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−Ｏ−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−ＮＨ2またはハロゲンによって１回または２回置換されていてよく、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリールは置換されていなくてよくまたは、−ＯＨ、＝Ｏ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−Ｏ−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−Ｃ5〜Ｃ14−アリール、−ＮＨ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、−ＮＨ−Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、−ＮＨ2またはハロゲンによって１回または２回置換されていてよく、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリールは−ＣＮ、アミドまたはオキシムによってさらに置換されていてよく、
Ｘ1，Ｘ2およびＸ3は互いに独立に、−ＣＨ2−、−ＣＨＲ−、−ＮＨ−、−Ｎ(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)−、−Ｎ(Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル)−、−Ｎ(Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル)−、−Ｎ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)］−、−Ｎ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ5〜Ｃ14−アリール)］−、−Ｎ(Ｃ5〜Ｃ14−アリール)−、−Ｎ(Ｏ−Ｒ)−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、
ｎおよびｍは互いに独立に、２、３、４または５であり、そして
ｏは０、１、２または３である｝で表わされるが、但し、ｏが０であり、ｎが２であり、ｍが２または３であり、Ｘ2およびＸ3がＯであり、そしてＲ2およびＲ3がＣ2Ｈ5であり、そしてすべての二重結合がトランス配置に位置しているものではない式(Ｉ)の化合物、および／または立体異性体の形の式(Ｉ)の化合物および／またはこれらの形の化合物の任意の比の混合物、および／または式(Ｉ)の化合物の生理学的に許容される塩に関する。
【０００９】
Ｃ1〜Ｃ6−アルキルは炭素原子１〜６個、好ましくは１〜４個を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル、第３級−ブチルおよびヘキシルである。
【００１０】
Ｃ2〜Ｃ6−アルケニルは、１、２または３個所が不飽和である炭素原子２〜６個を有する直鎖または分枝鎖のアルケニル基、例えばアリル、クロチル、１−プロペニル、ペンタ−１,３−ジエニルおよびペンテニルである。
【００１１】
Ｃ2〜Ｃ6−アルキニルは、１または２個所が不飽和である炭素原子２〜６個を有する直鎖または分枝鎖のアルキニル基、例えばプロピニル、ブチニルおよびペンチニルである。
【００１２】
Ｃ5〜Ｃ14−アリールは、炭素原子５〜１４個を有するアリール基、例えばフェニルまたは非置換のもしくはハロゲンによって置換された１−ナフチルもしくは２−ナフチル、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル、例えばメチル、ヒドロキシル、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくは−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、例えばメトキシ、またはトリフルオロメチルである。
【００１３】
脂肪族アシル基−Ｎ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)］−は、好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキルを含むのが望ましくまた例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ヘキサノイル、アクリロイル、クロトノイルまたはプロピオロイルであり、またハロゲン例えば塩素、臭素またはフッ素によって、ＮＨ2によって、および／または−ＮＨ(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)、好ましくは−ＮＨ(Ｃ1〜Ｃ4−アルキル)、例えばメチルアミノまたはエチルアミノによってさらに置換されてよい。芳香族アシル−Ｎ［−Ｃ(＝Ｏ)−(Ｃ5〜Ｃ14−アルキル)］−は例えばＮ−ベンゾイルまたはＮ−ナフトイルであり、またハロゲン例えば塩素、臭素またはフッ素によって、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル、例えばメチルによって、ヒドロキシルによって、−ＮＨ(Ｃ1〜Ｃ6−アルキル)、好ましくは−ＮＨ(Ｃ1〜Ｃ4−アルキル)、例えばメチルアミノまたはエチルアミノ、または−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくは−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、例えばメトキシによってさらに置換されてよい。
【００１４】
ハロゲンは周期律システムの第VII族内の元素、好ましくは塩素、臭素またはフッ素である。
【００１５】
別記しないかぎり、式(Ｉ)の化合物のポリエン基中の二重結合の配置はシスまたはトランス配置であってよい。本発明は純粋な化合物および、鏡像異性体混合物およびジアステレオマー混合物のような立体異性体混合物の双方に関する。立体異性体の形は、分子内の原子または原子群の異なる空間的配列（配置）を有する一方、例えばシス−トランス異性体のように、二重結合において原子が同様に結合している化合物であると特に理解される。
【００１６】
好ましくは、式(Ｉ)の化合物中の少なくとも１つのポリエン基は、少なくとも１つのシス二重結合を含む。
【００１７】
ＲはＨであるのが好ましい。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立にＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであるのが好ましい。
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は互いに独立に−Ｏ−であるのが好ましい。
ｍは３または４であるのが好ましい。
ｎは２であるのが好ましい。
ｏは０であるのが好ましい。
【００１８】
基の一般的な定義および基の好ましい定義は、式(Ｉ)の化合物中のＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3、ｍ、ｎおよびｏは互いに独立に、相互の間で任意に組み合わされていてよい。
【００１９】
本発明は式(Ｉ)において、
ＲがＨであり、
Ｒ1がＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ2がＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ3がＨまたはＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、
Ｒ4がＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、そして
Ｘ1およびＸ2が−Ｏ−である
化合物およびその生理学的に許容されうる塩に関するのが好ましい。
【００２０】
好ましくは、本発明は式(IV)
【化４】
0004500163.tif 000005
（式中、ｍは３または４である)
の化合物によって特徴づけられる式(Ｉ)の化合物およびその生理学的に許容されうる塩に関する。
【００２１】
特に好ましくは、本発明はｍが４でありそしてポリエンの配置が式(Ｖ)
【化５】
0004500163.tif 000006
に相当する式(IV)の化合物に関する。
【００２２】
Ｒ1およびＲ2がＨである式(Ｖ)の化合物が特に好ましい。この化合物は以下の記述においてサーペンテマイシン(serpentemycin）Ａ（実験式：Ｃ20Ｈ18Ｏ4；ＭＷ＝３２２.３６）と称する。
【００２３】
さらに特に好ましくは、本発明はｎが２でありまたｍが３でありそしてポリエンの配置が式(VI)
【化６】
0004500163.tif 000007
に相当する式(IV)の化合物に関する。
【００２４】
Ｒ1およびＲ2がＨである式(VI)の化合物が特に好ましい。この化合物は以下の記述においてサーペンテマイシンＢ（実験式：Ｃ18Ｈ16Ｏ4；ＭＷ＝２９６.３３）と称する。
【００２５】
さらに特に好ましくは、本発明はｎが２でありまたｍが３でありそしてポリエンの配置が式(VII)
【化７】
0004500163.tif 000008
に相当する式(IV)の化合物に関する。
【００２６】
Ｒ1およびＲ2がＨである式(VII)の化合物が特に好ましい。この化合物は以下の記述においてサーペンテマイシンＣ（実験式：Ｃ18Ｈ16Ｏ4；ＭＷ＝２９６.３３）と称する。
【００２７】
好ましくは、本発明は式(VIII)
【化８】
0004500163.tif 000009
の化合物によって特徴づけられる式(Ｉ)の化合物およびその生理学的に許容されうる塩に関する。
【００２８】
さらに特に好ましくは、本発明はＲ2およびＲ3がＨでありそしてポリエンの配置が式(IX)
【化９】
0004500163.tif 000010
に相当する式(VIII)の化合物に関する。
【００２９】
Ｒ1がＨである式(IX)の化合物が特に好ましい。この化合物は以下の記述においてサーペンテマイシンＤ（実験式：Ｃ20Ｈ22Ｏ4；ＭＷ＝２３６.４０）と称する。
【００３０】
さらに特に好ましくは、本発明はＲ2およびＲ3がＨでありそしてポリエンの配置が式(Ｘ)
【化１０】
0004500163.tif 000011
に相当する式(VIII)の化合物に関する。
【００３１】
Ｒ1がＨである式(Ｘ)の化合物が特に好ましい。この化合物は以下の記述においてサーペンテマイシンＥと称する。
【００３２】
さらに本発明は実験式Ｃ20Ｈ18Ｏ4（サーペンテマイシンＡ）、Ｃ18Ｈ16Ｏ4（サーペンテマイシンＢおよびＣ）またはＣ20Ｈ22Ｏ4（サーペンテマイシンＤ）を有する化合物に関し、これらはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５またはその変異体および／または突然変異体の１つを、培養液中の化合物サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤが増殖するまで培地中で培養し、そして引き続いて化合物を単離し、また適当ならこれを薬理学的に許容できる塩に転化することにより得ることができる。
【００３３】
本発明は式(Ｉ)の化合物に関し、これはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５またはその変異体および／または突然変異体の１つを、培養基ブロス中の化合物サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤの１つまたはそれ以上が増殖するまで培地中で培養し、次いで化合物を単離し、適当ならこれを化学的な誘導体に転化し、そして適当ならこれを薬理学的に許容できる塩に転化することにより得ることができる。
【００３４】
サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤは、規定された構造式の点で文献的に知られた物質とは異なる。構造的に関連するポリエンカルボン酸誘導体は既知であるが、これはその化学構造、抗菌活性および／または生化学活性および他の物理特性の点で本発明の化合物とは異なる。
【００３５】
さらに本発明は
１．化合物サーペンテマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤの１つまたはそれ以上が培養基ブロス中で増殖するまで、微生物Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５、またはその変異体および／または突然変異体の１つを水性の栄養素培地中で培養し、
２．サーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤを単離しそして精製し、
３．適切なら、好適な反応剤を使用してサーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤを式(Ｉ)の化合物へと転化し、
４．そして、適切なら、式(Ｉ)の化合物を薬理学的に許容できる塩に転化する
ことからなる式(Ｉ)の化合物の製造方法に関する。
【００３６】
好適な反応剤の例はサーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤのカルボキシル基を対応するエステルに転化するために使用できるアルキル化剤である。アルキル化剤の例はヨウ化メチル、硫酸ジエチル、ジアゾメタンおよび、例えばJohn Wiley & Sonsの１９９２年刊 Advanced Organic Chemistry第４版中でJerry Marchによって述べられているような他のアルキル誘導体である。二重結合は例えば、光化学的に異性化されまたは遊離ラジカル生成剤が添加されて存在するなかで異性化されることができる。反応を選択的に実施するために、好適な保護基をそれ自体知られた仕方で反応に先立って導入するのが有利である。保護基は反応の後に除去され、次いで反応生成物が精製される。
【００３７】
これに加えて本発明は式(Ｉ)の化合物の自明の化学的均等物に関する。自明の化学的均等物は、僅かな化学的な差異を示す、つまり同じ活性を有しまたは穏和な条件下で本発明の化合物に転化される化合物である。この均等物には例えばエステル、アミド、ヒドラジド、無水物、水素化生成物、還元生成物、本発明の化合物の錯体または本発明の化合物との付加物がある。
【００３８】
式(Ｉ)の化合物を対応する薬理学的に許容できる塩に転化するために当業者に知られた方法を用いることができる。本発明の化合物の薬理学的に許容できる塩は、Remingtons Pharmaceutical Siences (17th Edition, p.1418 [1985]) に記載されているように無機塩および有機塩の双方を意味すると解される。特に好適な塩は、アルカリ金属、アンモニウムまたはアルカリ土類金属の塩、生理学的に許容されうるアミンとの塩およびＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸およびフマル酸のような無機酸または有機酸との塩である。
【００３９】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５株はグルコース、デンプン、酵母エキスまたはグリセロールを含有する栄養溶液中でサーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを生成する。
【００４０】
これに加えて、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５は僅かに変化するポリエン鎖を有する多くの副生物を生成する。
【００４１】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．の分離株は、ドイツのMascheroder Weg 1B，38124 BrunswickにあるDeutsche Sammlung von Mikroorganisms und Zellkulturen GmbH(DSM）［German collection of microorganisms and cell cultures］にブダベスト条約に従って２００２年３月１８日に寄託された。
【００４２】
エンバク−フレーク培地上でＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５は褐色〜ベージュ色の基底菌糸体とまばらな気生菌糸体を有した。培養でこれはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓを特徴づける子実体をなんら生成しなかった。
【００４３】
この方法はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５、その突然変異体および／または変異体を、炭素源および窒素源、無機塩そして適当なら痕跡量の元素を含有する培地中で好気性条件下で培養することからなる。
【００４４】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５株の代わりに、その突然変異体および変異体が本発明の化合物を合成するならこれらを使用することもできる。
【００４５】
突然変異体は、そのゲノム中の１つまたはそれ以上の遺伝子が変性されている微生物であり、本発明の化合物を生成する微生物の能力の原因である１つまたはそれ以上の遺伝子は、それらが機能的でありまた遺伝性であるように保持される。
【００４６】
このような突然変異体は、物理的手段例えば紫外線またはＸ−線を使用するような照射によって、またはエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグァニジン（ＭＮＮＧ）のような化学的突然変異原を使用することにより、またはPrentice Hallの『Biology of Microorganism』（１９８４年刊）２３８〜２４７ページにBrockらによって記載されているように、それ自体既知の仕方で生産することができる。
【００４７】
変異体は微生物の表現型である。微生物はその環境に適応する能力を有し、従って、高度に発達した生理学的融通性を示す。微生物のすべての細胞は表現型適応に関与し、変化の本質は遺伝的に条件付けられてはいずまた変更された条件下で可逆性である（H. Stolp, Microbial ecology: organismus, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, p.180, 1988）。
【００４８】
本発明の抗生物質を生成する突然変異体および変異体に対するスクリーニングは、培養ブロス中で増殖した活性化合物の生物学的活性を、例えばその抗菌効果を測定することで、あるいは別に発酵ブロス(fermentation broth)中の抗菌活性を有することが知られた化合物を、例えばＨＰＬＣ法またはＬＣ−ＭＳ法を使用して検出することで決定することにより実施されることができる。
【００４９】
培養にとって好適なそして好ましい炭素源は同化可能な炭水化物および糖アルコール例
えばグルコース、ラクトース、サッカロースまたはＤ−マンニトールであり、そして麦芽エキスまたは酵母エキスのような炭水化物を含有する天然産物でもある。好適な窒素源はアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質ならびにカゼイン、ペプトンまたはトリプトンのようなタンパク質分解生成物であり、また肉エキス、酵母エキス、粉砕した種子例えばトウモロコシ、小麦、豆類、大豆または綿の木、アルコール製造からの蒸留残渣、肉粉または酵母エキスでもあり、またアンモニウム塩および硝酸塩でもあり、特に合成的にまたはバイオ合成的に得られたペプチドでもある。無機塩および栄養溶液が含有してよい痕跡量の元素の例は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩または燐酸塩である。
【００５０】
本発明の化合物の生成は、例えば、約０.０５〜５％、好ましくは０.５〜２％の澱粉、０.０５〜３％、好ましくは０.１〜１％の酵母エキス、０.０５〜５％、好ましくは０.１〜２％のグルコース、０.２〜５％、好ましくは０.５〜２％のグリセロール、０.０５〜
３％、好ましくは０.１〜１％のＣｏｎｓｔｅｅｐ、０.０５〜３％、好ましくは０.１〜
１％のペプトン、０.０５〜３％、好ましくは０.０５〜０.５％のＮａＣｌおよび０.０５〜３％、好ましくは０.１〜１％のＣａＣＯ3を含有する栄養溶液中で特に良好に進行する。百分率の値は各々の場合、栄養溶液全体の重量を基準とする。
【００５１】
栄養溶液中でＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５はサーペンテマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤと副生物との混合物を生成する。本発明の化合物の１つまたはそれ以上の量的割合は栄養溶液の組成に応じて変化しうる。加えて、個々のポリエンカルボン酸の合成は、微生物が抗生物質を全く生成せずまたはそれを検出限界より少ない量で生成するように培地の組成によって制御することができる。
【００５２】
微生物は好気的に培養される。つまり例えば、振盪フラスコまたは培養器内で振盪または撹拌されながら浸漬されて、または適当なら空気または酸素を送り込みつつ固体の培地上で培養される。培養は約１５〜３５℃、好ましくは約２５〜３２℃、特に２７〜３０℃の温度範囲で実施することができる。ｐＨの範囲は４〜１０、好ましくは６.５〜７.５でなければならない。微生物は一般にこれらの条件下で４８〜７２０時間、好ましくは７２〜３２０時間の期間にわたって培養される。培養はいくつかの段階で実施される。つまり、１つまたはそれ以上の予備的な培養物が液体栄養培地中で最初つくられ、次にこれらの予備的培養物が例えば１：１０〜１：１００の体積比で実際の生産培地、つまり主培養物中に接種される。予備的培養は例えば、菌糸体を栄養溶液中に接種しそしてそれを約２０〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間成長させることにより行われる。菌糸体は例えば、固体または液体の培地例えば酵母−麦芽−グルコース寒天、えん麦フレーク寒天または澱粉寒天上で株を約１〜４０日、好ましくは１４〜２１日成長させることにより得ることができる。
【００５３】
培養の過程、および本発明の抗生物質の生成は当業者に知られた方法を用いて、例えばバイオアッセイにおいて生物学的活性を試験することによりまたは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー法によりモニターすることができる。
【００５４】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５は深部培養によって本発明の化合物を生産できる。本発明の化合物は菌糸体中および培養濾液中の双方に存在しうる。主な量は通常培養濾液中に存在する。従って、濾過または遠心分離によって培養溶液を分離除去するのが便利である。濾液は吸着樹脂を固相として使用して抽出される。菌糸体、そしてまた表面培養物は好適な溶媒例えばメタノールまたは２−プロパノールによって簡便に抽出される。
【００５５】
抽出は広いｐＨ範囲で実施されることができるが、中性または弱酸性の培地中で、好ましくはｐＨ３〜７の間で実施するのが便利である。抽出物は例えば真空で濃縮されそして乾燥されることができる。
【００５６】
本発明の抗生物質を単離する１つの方法は、それ自体知られた仕方で溶液分配である。
【００５７】
他の１つの精製方法は、Ｄｉａｉｏｎ(登録商標)ＨＰ−２０(Mitsubishi Casei Corp.,
Tokyo，Japan）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ(登録商標)ＸＡＤ７（Rohm and Haas，USA）、Ａ
ｍｂｅｒｃｈｒｏｍ(登録商標)ＣＧ（Toso Haas，Philadelphia，USA）などのような吸着樹脂上でのクロマトグラフィー精製方法である。これに加えて多数の逆相支持体、例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との関連で周知になったＲＰ8およびＲＰ18もまた好適である。
【００５８】
本発明の抗生物質を精製するための他の１つの選択は、シリカゲルまたはＡｌ2Ｏ3などのように正相クロマトグラフィー支持体と称されるものをそれ自体知られた方法で使用することにある。
【００５９】
別な単離方法はＦｒａｃｔｏｇｅｌ(登録商標)ＴＳＫ  ＨＷ−４０（Merk KgaA，Darmstadt，Germany）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)Ｇ−２５（Amersham，Biosciences，Uppsala，Sweden）などのような分子篩をそれ自体知られた方法で使用する方法である。これに加えて新規なポリエンカルボン酸を富化された物質から結晶化することによりこれを得ることもできる。例えば、無水であろうと含水であろうと有機溶媒およびその混合物が、または様々な塩がこの目的に好適である。本発明の抗生物質を単離しおよび精製するための追加的な方法、好ましくはｐＨ範囲４〜１０で陰イオン交換体を使用する方法である。ある量の有機溶媒が添加されている緩衝溶液の使用はこの目的に特に好適である。
【００６０】
本発明による化合物は、モエノマイシン群の抗生物質のようなグリコシルトランスフェラーゼの選択的なそして強力な阻害剤は、常に抗菌効果を示し、阻害濃度（ＩＣ50）が低いことは強力な静菌活性に関係する。本発明の化合物は、それが細菌の成長および複製を阻害し；従って、細菌感染によって惹起される疾病を治療するのに好適であるので、静菌活性を有する。表１には例として本発明のいくつかの化合物の阻害濃度（ＩＣ50）を要約する。特異性がありまた極めて効果的であるグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤を見いだすために特別な試験システムを採用した。このシステムは、試験すべき物質と接触されるグリコシルトランスフェラーゼ／3Ｈ−モエノマイシン複合体を活用する。ＧＴ−阻害効果の測定は放射能で標識されたモエノマイシンＡのグリコシルトランスフェラーゼ（ＰＢＰ  １ｂ）／3Ｈ−モエノマイシン複合体からの排除を基礎に置き、放出された3Ｈ−モエノマイシンを、固定された複合体から可溶性化合物として分離除去しまたガイガーカウンターを使用して残留放射能を測定することができる。
【００６１】
【表１】
0004500163.tif 000012
【００６２】
比較のために、サーペンテンの阻害定数（Ritzau et al., Liebigs Ann, Chem. 1993, 433-435）を測定した：ＩＣ50値は１８μＭであった。
【００６３】
従って、本発明は式(Ｉ）の化合物を好ましくは細菌感染の治療および／または予防のための医薬品として使用することにも関する。
さらに本発明は式(Ｉ）の化合物を、好ましくは細菌感染の治療および／または予防のための医薬を製造するために使用することにも関する。
【００６４】
加えて本発明はそれに従う化合物の１つまたはそれ以上を含有する医薬品に関する。
この医薬品は式(Ｉ）の少なくとも１つの化合物を生理学的に好適な補助物質の１つまたはそれ以上と混合し、そしてこの混合物を投与に好適な形にすることにより製造される。
【００６５】
一般に本発明の医薬品は経口的、局所的または非経口的に投与されるが、これを直腸経由で使用することも原則的に可能である。固体または液体のガレヌス製剤の形の例は、顆粒、粉末、錠剤、糖衣錠、(マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳濁液、懸濁液、エアゾル、ドロップまたはアンプル型の注射液であり、そしてまた活性化合物の徐放製剤であり、これの製造においては分解剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、甘味料および可溶化剤が慣用的に使用される。しばしば採用される補助物質の例で挙げることができるのは、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、滑石、乳タンパク、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物性または植物性の油、ポリエチレングリコール、ならびに滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールのような溶媒である。
【００６６】
適切なら、経口投与のための投与単位は放出を遅延しまたは比較的長い期間にわたってそれを延長するために、例えばコーティングによってまたは、好適なポリマー、ロウなどの中に活性化合物を粒子状に埋没させることによりマイクロカプセル化されることができる。
【００６７】
好都合な投与量として０.１〜１０００、好ましくは０.２〜１００ｍｇ／ｋｇ体重が投与される。この量は本発明の化合物の有効な一日量、例えば３０〜３０００ｍｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇを少なくとも含有する投与単位で投与されるのが好都合である。
【００６８】
以下の例は本発明の範囲をなんら限定することなく本発明を明確にすることが意図されている。
【００６９】
〔実施例１〕
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５のグリセロール培養
無菌の１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で栄養溶液(麦芽エキス１.０％、酵母エキス０.４％、グルコース０.４％、水中のｐＨ７.０）３０ｍｌにＡｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５株を接種し、そして回転振盪器上で２８℃および１８０ｒｐｍで７日間インキュベートした。次に各々の場合、この培養物１.５ｍｌを８０％グリセロール２.５ｍｌで希釈しそして−１３５℃で貯蔵した。
【００７０】
〔実施例２〕
エルレンマイヤーフラスコ中でのＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５の予備的培養物の調製
各々の場合、無菌の３００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で栄養溶液(グルコース１.５％、大豆粗挽き粉１.５％、Ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ ０.５％、ＣａＣＯ3 ０.２％およびＮａＣｌ ０.５％、ｐＨ７.０）にＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  
１４８６５株を接種し、そして回転振盪器上で２８℃および１８０ｒｐｍで４日間インキュベートした。主培養物に接種するためにこの予備的培養物を使用した。
【００７１】
〔実施例３〕
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５の振盪培養物中での芳香族ポリエンカルボン酸の生成の速度論
２０個のエルレンマイヤーフラスコ中で実施例２におけるようにＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５の培養を開始しそして培養物を２週間までの期間にわたって振盪器内でインキュベートした。４８、７２、９６、１０２、１２０、２４０および３１２時間後に振盪フラスコを取り出した。菌糸体を分離除去した後、そして培養濾液から芳香族ポリエンカルボン酸をＭＣＩ−Ｇｅｌ(登録商標)(Mitsubishi
Chemical Industries）によって固相抽出しそしてメタノールで溶出した後、実施例８に記載するように抽出物をＨＰＬＣによって分析した。インキュベート時間に依存して起きたＨＰＬＣの表面積単位の変化を以下の表に示す。表面積単位は生成物の濃度に比例する。
【００７２】
【表２】
0004500163.tif 000013
【００７３】
サーペンテンは９６時間後に最大の生成にすでに達していたが、サーペンテマイシンＡおよびＤの最大濃度は１０日後に始めて認められた。生成物のサーペンテマイシンＢおよびＣは１３日後にそれらの最大濃度で存在さえした。
【００７４】
〔実施例４〕
サーペンテマイシンＡを生成するためのＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５の培養
本発明の抗生物質を生成するために、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５株を３０Ｌの培養タンク内で培養した。使用した栄養溶液は以下のとおりであった：水中で可溶性澱粉１０ｇ／Ｌ；グルコース１０ｇ／Ｌ；グリセロール１０ｇ／Ｌ；Ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ（液体）２.５ｇ／Ｌ；ペプトン５ｇ／Ｌ；酵母エキス２ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ3 ３ｇ／Ｌ；滅菌前のｐＨは７.２。この栄養培地中で、良好な成長および急速な生産性が認められた。以下の条件下で培養を実施した：    滅菌：Ｔ＝１２１℃で２０分その場合で実施
接種物：６％
撹拌速度：１８０ｒｐｍ
Ｔ：２８℃
空気：０.４５ｍ3／時間
ｐＯ2：調整せず
培養中のｐＨ：約６.２；調整せず
【００７５】
この条件下で最初の７０時間以内に良好な成長が認められ；この時、培地中のＣ源は消費しつくされそして成長が停滞した。８０時間後、本発明の化合物の生成物の最初の生成を検出することができた。９８時間後に培養タンクから収穫した。
【００７６】
〔実施例５〕
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５培養液からのサーペンテマイシンＡの単離
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  ｓｐ．ＤＳＭ  １４８６５の培養が終了した後、実施例４に述べたようにして得た培養タンクからの培養ブロス２７.５リットルを、添加した約２％の濾過促進剤（Ｃｅｌｉｔｅ(登録商標)）の存在で濾過し、そして細胞培養物(１８９０ｇ）をメタノール６リットルによって抽出した。活性化合物を含有するメタノール性溶液を濾過によって菌糸体から分離しそして真空で濃縮した。濃縮物を培養濾液２５Ｌと一緒にした後、ｐＨを７に調整しそして全体を、予め用意した３リットルのＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)，ＣＨＰ２０Ｐカラムに装填した。２−プロパノールは除いて、水中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤のある勾配でカラムを溶出した。カラムの流通量（flow-through）（７リットル／時間）を画分毎に（それぞれの場合、２リットル）収集しそして抗生物質を含有する画分４から１１および１６から１９をそれぞれの場合に一緒にしそして真空で濃縮した。ＨＰＬＣを使用して画分を分析した。画分４から１１は極性のサーペンテマイシンをより多く含有する一方、画分１６から１９はサーペンテンを含有した。サーペンテンを含有する画分を、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤／アセトニトリル混合物を最初使用し、次いでトリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物の勾配０.０５％を用いて、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)１００ＲＰ−１８ｅ，２５０−２５，ＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフィーで２回精製した。純粋な抗生物質を含有する画分を凍結乾燥すると、純粋なサーペンテン１９ｍｇを得た。
【００７７】
画分４から１１中の極性のより大きい化合物を真空で濃縮した後、ＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)ＣＨＰ２０Ｐ（カラム寸法：２６ｍｍ×３００ｍｍ）上での勾配法を用いるカラムクロマトグラフィーによってこれらをもう一度精製した。勾配は、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤中での２時間にわたる１０％から６０％であった。カラムの流通量は１分あたり２５ｍＬである一方、画分の大きさは５０ｍＬであった。化合物サーペンテマイシンＢおよびＤは画分１５から３５中に存在が認められたが、画分３６から３９はサーペンテマイシンＣを含有しまた画分４０から４３はサーペンテマイシンＡを含有した。後の２つを真空で有機溶媒から除去し、その後０.０１％のアスコルビン酸を添加しそして０.０５％のトリフルオロ酢酸中の４５％アセトニトリルを使用してＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)１００ＲＰ−１８ｅ，２５０−２５，ＨＰＬＣカラム上でアイソクラチッククロマトグラフィーによる精製を実施した。純粋なサーペンテマイシンＡを含有する画分（画分３１から３５）を暗所中で凍結乾燥しそしてサーペンテマイシンＡをアルゴン雰囲気（３７ｍｇ）中に気密に保存した。ＥＳＩ-質量スペクトル分析：３２１.４（Ｍ−Ｈ）、ＥＳＩ+質量スペクトル分析：３０５.３（ＭＨ−Ｈ2Ｏ）。ＵＶ最大値：３１５および３５５ｎｍ。ＮＭＲデータを表３に示す。Ｃ原子を以下のように番号付けした。
【００７８】
【化１１】
0004500163.tif 000014
【００７９】
【表３】
0004500163.tif 000015
【００８０】
サーペンテマイシンＡ：
外観：中度極性〜極性のおよび極性の有機溶媒中に可溶でありそして水中に特には可溶でないレモン−黄色の物質。中性および温和な酸性の媒質中で安定であるが、強い酸性および強いアルカリ性の溶液中では不安定である。
サーペンテマイシンＡは光および空気に対して敏感である。
実験式：Ｃ20Ｈ18Ｏ4
分子量：３２２.３６
【００８１】
〔実施例６〕
サーペンテマイシンＢの単離およびこれに関する説明
実施例４に記載のようにして得た、１６０ｍＬのＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)ＣＨＰ２０ＰカラムからのサーペンテマイシンＢを含有する画分３６から３９を真空で濃縮しそして僅かなアセトニトリルをまだ含有する水溶液をＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)１００
ＲＰ−１８ｅ，２５０−２５，ＨＰＬＣカラム上に装填した。０.０５％のトリフルオロ
酢酸（ｐＨ２.４）中の４２％アセトニトリルを使用してアイソクラチック溶出した。カ
ラムの流通量は３９ｍＬ／分であり；画分を１９.５ｍＬごとに取り出しそしてＨＰＬＣ
によって分析した。画分２２から２４は抗生物質サーペンテマイシンＢを含有した。これらの画分を溶出剤中のアセトニトリル濃度を４０％に減少して、同一のカラム上で再度クロマトグラフィーに付した。画分３８から４２は純粋なサーペンテマイシンＢを含有し；これらは凍結乾燥すると１０.２ｍｇの抗生物質を生成した。ＥＳＩ-質量スペクトル分析：２９５.０９８５（Ｍ−Ｈ）、ＥＳＩ+質量スペクトル分析：２９７.１１６４（Ｍ＋Ｈ）でありこれらは実験式Ｃ18Ｈ16Ｏ4に相当した。ＵＶ最大値：アセトニトリル／水中の０.１％リン酸の中で３０６および３２２ｎｍ。ＮＭＲデータを表４に示す。原子の番号付けはサーペンテマイシンＡのそれと類似である。
【００８２】
【表４】
0004500163.tif 000016
【００８３】
サーペンテマイシンＢ：
外観：中度極性〜極性のおよび極性の有機溶媒中に可溶でありそして水中に特には可溶でない淡黄色の物質。中性および温和な酸性の媒質中で安定であるが、強い酸性および強いアルカリ性の溶液中では不安定である。
サーペンテマイシンＢは光および空気に対して敏感である。
実験式：Ｃ18Ｈ16Ｏ4
分子量：２９６.３３
【００８４】
〔実施例７〕
サーペンテマイシンＣの単離およびこれに関する説明
アスコルビン酸４５０ｍｇを実施例３に記載のようにして得た培養物の濾液４５リットルに添加し、そして全体を３.５リットルのＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)ＣＨＰ２０Ｐカラム（１５×２０ｃｍ）上にｐＨ４.５で装填した。２−プロパノールを除いて、ｐＨ４.５の酢酸アンモニウムの勾配０.１％によってカラムを溶出した。流通量は１５リットル／
時間であった。プロパノールを含有する流出物を画分として収集し（各々の場合、７リットル）；画分６は極性の芳香族ポリエンジカルボン酸を含有した。これを真空で濃縮し；その後、アスコルビン酸５０ｍｇを添加しそして水溶液のｐＨを３に調整し；次いで溶液を４５０ｍＬのＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)ＣＨＰ２０Ｐカラム（５ｃｍ×３０ｃｍ）上に装荷した。脱着は１００％のアセトニトリルの後、０.５％の酢酸中の勾配１０％のアセトニトリルを使用して実施し；流速２５ｍＬ／分で分画時間は１０分であった（各々の場合、２５０ｍＬ）。極性の芳香族ポリエンジカルボン酸は画分１２から１９中に存在が確認された。これらを１つに集め、真空で濃縮しそしてゲル浸透クロマトグラフィーによってさらに精製した。使用した支持体はＦｒａｃｔｏｇｅｌ(登録商標)ＴＳＫ−ＨＷ４０（カラム寸法：１０×５０ｃｍ）であり、一方、使用した移動相はアセトニトリル６０％、メタノール２０％および２５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤２０％からなるｐＨ７の混合物であった。流通量を４.５ｍＬ／分とし、画分を３０分毎に収集した（各々の場合、１３５ｍＬ）。ＨＰＬＣによって検出された画分３７から４０は化合物サーペンテマイシンＣを含有した。最終的な精製は、ｐＨ７の５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝剤／アセトニトリル移動相を使用してＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)１００ＲＰ−１８ｅ，２５０−２５上で実施した。純粋なサーペンテマイシンＣを含有する画分を１つに集めそして水／アセトニトリルを使用してＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)ＲＰ−１８ｅ，２５０−１０によって脱塩した。凍結乾燥により、サーペンテマイシンＣアンモニウム塩１５ｍｇを得た。ＥＳＩ-質量スペクトル分析：２９５.１（Ｍ−Ｈ）、ＥＳＩ+質量スペクトル分析：２７９.２（ＭＨ−Ｈ2Ｏ）でありこれらは実験式Ｃ18Ｈ16Ｏ4に相当した。ＵＶ最大値：アセトニトリル／水中の０.１％リン酸（１：１）の中で２１２、３０８および３５６ｎｍ。ＮＭＲデータを表５に示す。原子の番号付けはサーペンテマイシンＡのそれと類似である。
【００８５】
【表５】
0004500163.tif 000017
【００８６】
サーペンテマイシンＣ：
外観：中度極性〜極性のおよび極性の有機溶媒中に可溶でありそして水中には特に可溶でない淡黄色の物質。中性および温和な酸性の媒質中で安定であるが、強い酸性および強いアルカリ性の溶液中では不安定である。
サーペンテマイシンＣは光および空気に対して敏感である。
実験式：Ｃ18Ｈ16Ｏ4
分子量：２９６.３３
【００８７】
〔実施例８〕
サーペンテマイシンＤの単離およびこれに関する説明
実施例４に記載のようにして得た、１６０ｍＬのＭＣＩ  ＧＥＬ(登録商標)ＣＨＰ２０ＰカラムからのサーペンテマイシンＤを含有する画分３６から３９を真空で濃縮しそして僅かなアセトニトリルをまだ含有する水溶液をＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ(登録商標)１００ＲＰ−１８ｅ，２５０−２５，ＨＰＬＣカラム上に装荷した。０.０５％のトリフルオロ酢酸（ｐＨ２.４）中の４２％アセトニトリルを使用してアイソクラチック溶出した。カラムの流通量は３９ｍＬ／分であり；それぞれの場合、１９.５ｍＬの画分を取り出しそして実施例９に述べるようにＨＰＬＣによって分析した。画分５１から５３は抗生物質サーペンテマイシンＤを含有した。これらの画分を同一のカラム上で上述したように再度クロマトグラフィーに付したが、ただし溶出剤中のアセトニトリル濃度は４０％に減少した。画分１３から１５は純粋なサーペンテマイシンＤを含有し；これらは凍結乾燥すると３ｍｇの抗生物質を生成した。ＥＳＩ-質量スペクトル分析：３２５.５（Ｍ−Ｈ）、ＥＳＩ+質量スペクトル分析：３４９.２（Ｍ＋Ｎａ）であり、これらは実験式Ｃ20Ｈ22Ｏ4に相当した。ＵＶ最大値：アセトニトリル／水中の０.１％リン酸の中で２９９および３３８ｎｍ。ＮＭＲデータを表６に示す。原子の番号はサーペンテマイシンＡのそれと類似に付けられた。
【００８８】
【表６】
0004500163.tif 000018
【００８９】
サーペンテマイシンＤ：
外観：中度極性〜極性のおよび極性の有機溶媒中に可溶でありそして水中には特に可溶でない淡黄色の物質。中性および温和な酸性の媒質中で安定であるが、強い酸性および強いアルカリ性の溶液中では不安定である。
サーペンテマイシンＤは光および空気に対して敏感である。
実験式：Ｃ20Ｈ22Ｏ4
分子量：３２６.４０
【００９０】
〔実施例９〕
サーペンテマイシンの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
以下の条件下でＨＰＬＣを実施した。
カラム：Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ１００ＲＰ−１８ｅ(登録商標)，２５０−４、プレカラム付き
移動相：０.１％リン酸中の５０％アセトニトリル
流量：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
２１０ｎｍでのＵＶ吸収による検出
【００９１】
以下の保持時間が認められた。
サーペンテマイシンＡ    １０.１分
サーペンテマイシンＢ    ５.６分
サーペンテマイシンＣ    ７.３分
サーペンテマイシンＤ    ５.２分
【００９２】
〔実施例１０〕
サーペンテマイシンによるグリコシルトランスフェラーゼの阻害の測定
Vollmer および Hoeltjeにより述べられた（Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000, 44, 1181-1185）ようにアッセイを実施したが、ただし本例では、グリコシルトランスフェラーゼの部位に3Ｈで標識されたモエノマイシンを有する精製されたペニシリン−結合タンパク質１ｂ（ＰＢＰ１ｂ；５ｐＭ）を［３Ｈ］ベンジルペニシリンの代わりに使用した。3Ｈ−モエノマイシンはモエノマイシンＡを3Ｈ2で水素化することによりそれから得た（Kurz et al., Eur. J. Biochem., 1998, 252, 500-507）。３００μＬのメタノール中に溶解したモエノマイシン６ｍｇを１ｃｍ3のフラスコに入れ、その後パラジウム−木炭（Ｄｅｇｕｓｓａ  ＴｙｐｅＥ１０Ｎ／Ｄ）を添加した。次に空気を排出しつつフラスコに１ｃｍ3の3Ｈ2をガス注入しそれぞれ反応溶液を１５分水素化させた。反応が終点に達した時、触媒を反応混合物から濾過除去し、反応混合物をエタノール１００ｍＬによって希釈した。この溶液はグリコシルトランスフェラーゼ：3Ｈ−モエノマイシン複合物をつくるのに直接使用できた。反応生成物の全放射能：６.５６ＧＢｑ（１７７ｍＣｉ）、比活性度：１.９ＴＢｑ／ミリモル。放射性複合物をＳＰＡ  ＰＶＴ  Ｃｏｐｐｅ
ｒ  Ｈｉｓ−Ｔａｇビーズに付着した。阻害剤で置換された放射性モエノマイシンを測定した。
ＳＰＡ  ＰＶＴ  ＣｏｐｐｅｒＨｉｓ−Ｔａｇビーズ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ  ００９５；
ＰＢＳ：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  １４２００−０６７；
ＢＳＡ：Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ  １２６５７；
ＮＯＧ：ＳＩＧＭＡ  Ｏ−８００１（ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド）；
Ｔｗｅｅｎ２０：Ａｃｒｏｓ  ２３３３６−０６７；
マイクロタイタープレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ
【００９３】
測定はマイクロタイタープレート中で実施した。１０μＬの試験溶液をマイクロタイタープレートに加え、続いて3Ｈ−モエノマイシン（２５ｎＭ，３.１ｋＢｑ／ウェル）１０
μＬおよびＰＢＰ１ｂが装填されたＳＰＡビーズ（ビーズ１００μｇ、酵素４５ｎＭ）４０μＬを添加した。プレートを密封しそして室温に８時間放置した。その後、１３００ｒｐｍで遠心することによりビーズを試験溶液から分離除去しそして放射能分布をＷＡＬＬＡＣ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ(登録商標)１４５０Ｃｏｕｎｔｅｒで測定した。
【００９４】
阻害値は下式に従って算出した：
【数１】
0004500163.tif 000019