(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体における、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列に相応する相補的両塩基配列から、下記の組合わせ（１）又は（２）を構成する２種の塩基配列のそれぞれから選ばれる相補的両塩基配列の、それぞれ少なくとも１種の１５〜３０塩基連続する塩基配列を選んで、これを基にした遺伝子増幅用プライマーを用いた遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物を用いて、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）を検出する、ウイルスの検出方法。
（１）ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５２７６〜５３１０番目及び同５３５４〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列の組、
（２）ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目及び同５４２５〜５４４６番目に相応する相補的両塩基配列の組。
【請求項２】
遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、下記の組み合わせを構成する相補的両塩基配列である、請求項１に記載のウイルスの検出方法。
（１）配列番号１および／または同２、ならびに、配列番号５、同６、同７および同８からなる群から選ばれる１種以上の塩基配列の組、
（２）配列番号３および／または同４、ならびに、配列番号９で表される塩基配列の組、
（３）配列番号３および／または同４、ならびに、配列番号１０で表される塩基配列の組。
【請求項３】
ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）に対して得られる遺伝子増幅産物は、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列の全部又は一部を含み、かつ、この相補的両塩基配列の部分を用いてノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）に対する遺伝子検出を行うことにより、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）を検出する、請求項１又は２に記載のウイルスの検出方法。
【請求項４】
ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）に対して得られる遺伝子増幅産物は、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目、または、同５３５４〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列の全部又は一部を含み、かつ、この相補的両塩基配列の部分を用いてノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）に対する遺伝子検出を行うことにより、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）を検出する、請求項１又は２に記載のウイルスの検出方法。
【請求項５】
ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）の検出の指標となる遺伝子増幅産物は、遺伝子検出用プローブとして用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項６】
遺伝子検出用プローブは、配列番号１１、同１２、同１３、同１４、及び、同１５からなる群から選ばれる１種以上の相補的両塩基配列を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項５に記載のウイルスの検出方法。
【請求項７】
遺伝子検出用プローブは、モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molrcularbeacon Probe)、または、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe) である、請求項５又は６に記載のウイルスの検出方法。
【請求項８】
ウイルスの検出方法は、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）の定量的な検出方法である、請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスの検出方法。
【請求項９】
以下に示す遺伝子増幅用プライマー及び／又は遺伝子検出用プローブを含む、請求項５に記載のウイルスの検出方法を行うための、ウイルス検出用キット。
（１）遺伝子増幅用プライマー：下記の組合わせ（ａ）又は（ｂ）を構成する、２種の塩基配列のそれぞれから選ばれる相補的両塩基配列の、それぞれ少なくとも１種の１５〜３０塩基連続する塩基配列。
（ａ）ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５２７６〜５３１０番目及び同５３５４〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列の組、
（ｂ）ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目及び同５４２５〜５４４６番目に相応する相補的両塩基配列の組。
（２）遺伝子検出用プローブ：上記の遺伝子増幅用プライマーを用いて、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）の遺伝子から得られる遺伝子増幅産物に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、検出用の標識が付加されている遺伝子検出用核酸プローブ。
【請求項１０】
遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、下記の組み合わせを構成する相補的両塩基配列である、請求項９に記載のウイルスの検出用キット。
（１）配列番号１および／または同２、ならびに、配列番号５、同６、同７および同８からなる群から選ばれる１種以上の塩基配列の組、
（２）配列番号３および／または同４、ならびに、配列番号９で表される塩基配列の組、
（３）配列番号３および／または同４、ならびに、配列番号１０で表される塩基配列の組。
【請求項１１】
遺伝子検出用プローブは、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列に対して相補的な塩基配列の全部又は一部を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項９又は１０に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１２】
遺伝子検出用プローブは、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目、または、同５３５４〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列に対して相補的な塩基配列の全部又は一部を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項９又は１０に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１３】
遺伝子検出用プローブは、配列番号１１、同１２、同１３、同１４、及び、同１５からなる群から選ばれる１種以上の相補的両塩基配列を含む遺伝子検出用核酸プローブである、請求項９〜１２のいずれかに記載のウイルス検出用キット。
【請求項１４】
遺伝子検出用核酸プローブは、モレキュラー  ビーコン  プローブ(Molrcularbeacon Probe)、または、タック−マン  プローブ(Taq-Man Probe) である、請求項９〜１２のいずれかに記載のウイルス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウイルスの検出方法に関する発明である。
背景技術
食中毒というと、通常は、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌、病原性大腸菌などのバクテリア（細菌性食中毒）や、フグやキノコなどに含まれる自然毒（自然毒食中毒）が連想される。しかしながら、ウイルス、例えば、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）、ロタウイルス、アストロウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなどによる食中毒も非常に多く発生し、特に、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）は、典型的な食中毒性ウイルスであることが、最近の疫学的調査から明らかになってきた。
ＮＬＶｓは、米国で発生した集団胃腸炎患者から、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓとして、１９７２年にはじめて検出された。電子顕微鏡では、不明瞭な表面構造をもった、直径約３０ｎｍの、小型の球形ウイルスとして観察され、以降、このような形態をもったウイルス群は、総称して、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ  Ｒｏｕｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｖｉｒｕｓ：ＳＲＳＶ）と呼ばれるようになった。一方、１９７４年、英国で流行した、冬季嘔吐症の患者から、獣医学ではよく知られていた、ダビデの星と形容される特徴的な表面構造の、直径約３０ｎｍのカリシウイルスが、ヒト由来ではじめて検出された。以降、このような形態を有するウイルス群は、古典的ヒトカリシウイルスと呼ばれるようになった。
これらのウイルスは、組織培養細胞や実験動物における増殖が非常に困難で、糞便材料を用いたボランティアによる分離・培養が唯一の方法であった。このため、ウイルスの性状分析が非常に困難であったが、１９９０年、Ｘ．Ｊｉａｎｇらのグループにより、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓのゲノムがクローニングされ、以降、これらのウイルスの遺伝子解析が精力的に行われた。その結果、ＳＲＳＶも古典的ヒトカリシウイルスも、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡを有する、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｓｉｖｉｒｉｄａｅ）に属することが明らかになった。さらに、カリシウイルス科の分類が異なる４属からなるということが、第１１回国際ウイルス学会で報告された。
これに伴い、ＳＲＳＶと呼ばれていたウイルス群は、Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ＮＬＶｓ）属に、古典的ヒトカリシウイルスと呼ばれたウイルス群は、Ｓａｐｐｏｒｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ＳＬＶｓ）属に属することとなった。また、多くの臨床検体中から検出したウイルスゲノムの塩基配列の蓄積から、ＮＬＶｓは、さらに、Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｏｕｔｈｅｒｐｔｏｎ  ｖｉｒｕｓなどのｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（ＧＩ）と、Ｈａｗａｉｉ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｒｕｓなどのｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（ＧＩＩ）の２つの遺伝子群に分類できることが明らかとなっている。
ＮＬＶｓの人への感染は、主に、食品（魚介類や水）を介して起こる。冬季に頻発するウイルス性食中毒のほとんどは、カキなどの貝類を摂食したことによるものと推定され、感染源としてカキからＮＬＶｓが検出されたという報告例も多数ある。また、ＮＬＶｓによって汚染されたサンドウィッチを摂食したために感染したという報告例もあり、感染者の糞便からも容易に感染すると考えられている（このウイルスは、感染力が強く、食品中数個から１００個程度のわすかなウイルスで感染することが知られている）。
食中毒が起こった場合、その原因と汚染源の特定は、非常に重要な要素であることはいうまでもない。すなわち、食中毒の原因を特定することにより、適切な治療方法を選択して、食中毒患者の一刻も早い回復を試みるべきであり、さらに、汚染源を一刻も早く特定して、食中毒の拡大を阻止するべきである。
特に、病原性微生物に起因する食中毒の原因と汚染源の特定のためには、原因となる病原性微生物を検出・特定して（食中毒の原因の特定）、食中毒患者の食事の履歴などを基に、食中毒の原因となった食品や食品製造設備をすること（食中毒の汚染源の特定）が必要である。
従来、上記のＮＬＶｓの検出は、電子顕微鏡観察により行われてきたが、この方法は、操作自体が煩雑であるばかりか、ウイルス量が少ないと、迅速・的確な検出が困難である。特に、ＮＬＶｓは、わずかなウイルス量で感染可能であるので、汚染食品などから迅速・的確に検出する必要性が非常に大きいにもかかわらず、その実現が困難であった。また、この電子顕微鏡を用いた検出法は、電子顕微鏡という大掛かりな設備が必要であり、この方法でウイルスを検出可能な施設自体が限られていた。
ところが、近年の遺伝子解析技術の進展に伴い、より高感度で迅速な、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子解析も広く行われるようになってきた。この方法でウイルス検出を行うためには、特定の領域の遺伝子を増幅するための遺伝子増幅用プライマーや、所望する遺伝子増幅産物を、特定の遺伝子領域の存在を指標にして検出する検出用プライマーなどを設計して用いる必要がある。このようなプライマーの設計は、ＮＬＶｓなどのウイルスにおいては、特に困難な問題がある。すなわち、ウイルスにおいては、遺伝子変異が容易に起こり、このため、前回流行した食中毒の原因ウイルスと、今回流行しているウイルスが、同一の範疇のウイルスであっても、ウイルス検出に用いるべきプライマーが、前回と今回の食中毒に関して異なるものを用いなければ検出することができない可能性が大きいという問題を抱えている。無論、正確な汚染源の特定のためには、ウイルスの変異株毎に異なる検出用プライマーなどを用いる必要性も認められるが、これは、食中毒の原因ウイルスと感染源の特定が、おおむね行われた後に、確認の目的で行えば十分であり、それよりも、迅速な特定をすることが、食中毒患者への治療方針の確定と汚染の拡大防止のためには優先されるべきである。
この問題を解決するためには、検出対象のウイルスの遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域を見出し、かかる遺伝子領域に対応した検出用プライマーなどを設計して、これを用いたウイルスの検出手段を提供することが必要である。
本発明が解決すべき課題は、ＮＬＶｓの遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域を見出し、この知見を基に、ＮＬＶｓの迅速・的確な検出手段を提供することにある。
発明の開示
上記の課題の解決のために、鋭意検討を重ねた本発明者は、ついに、ＮＬＶｓのうち、ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩの遺伝子における高度保存領域（ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〜ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍）を見出し、さらに、この知見を基に、ＮＬＶｓのうち、ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩに属するウイルスの迅速・的確な検出手段を見出し、本発明を完成した。
まず、本発明を提供するにあたり、基本的な知見である、ノーウォーク様ウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＮＬＶｓ）のｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ〔以下、ＮＬＶｓ（ＧＩ）ともいう〕の遺伝子における高度保存領域について説明する。
本発明者は、ＮＬＶｓ（ＧＩ）遺伝子の高度保存領域を見出すために、以下の試験を行った。
試験の内容
（１）糞便検体とＲＮＡ試料の調製
１９９８年から２０００年にかけて、埼玉県衛生研究所で、電子顕微鏡により、ＮＬＶｓ粒子が確認された、非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体を用いて、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子解析を行った。
具体的には、各々の糞便検体を、滅菌蒸留水で１０％（Ｗ／Ｖ）程度に懸濁し、５分間遠心分離（３０００×ｇ）を行った。遠心上清１４０μＬより、ＲＮＡ抽出用キット（ＱＩＡ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ：ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従って、核酸を抽出し、５０μＬの滅菌蒸留水に懸濁して、ＲＮＡ試料とした。
（２）ＮＬＶｓ遺伝子の全長シークエンスの決定と遺伝子解析
上記のようにして得られたＲＮＡ試料より、Ｏｒｉｇｏ  ｄＴをプライマーに用い、ｃＤＮＡを合成し、かかるｃＤＮＡから、ＬｏｎｇＲＴ−ＰＣＲを行うことによって得られた、遺伝子増幅産物の塩基配列を、ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８９  １７（１５）：６０８７−１０２）による、ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにより決定した。ゲノム５’末端の配列の決定は、３種類のＲＡＣＥ法（ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ）により行った。
この遺伝子解析の結果、上記のＲＮＡ試料から、新たな１株〔ＮＬＶｓ（ＧＩ）（ＳｚＵＧ１）〕の遺伝子の全塩基配列を決定し（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０９７７４登録）、さらに、１７株より、２６配列の部分塩基配列を決定した（＃Ｐ１，＃４ａ，＃４ｂ，＃４ｃ，＃４ｄ，＃６，＃７，＃８，＃１０，＃１９ａ，＃１９ｂ，＃１９ｃ，＃２４ａ，＃２４ｂ，＃２４ｃ，＃２４ｄ，＃３６  ｃｏｎｓ，＃８２，＃８３  ｃｏｎｓ，＃１０５ａ，＃１０５ｂ，＃１０９  ｃｏｎｓ，＃１１１  ｃｏｎｓ，＃１１２  ｃｏｎｓ，＃１１５  ｃｏｎｓ）。さらに、これらの新たな変異株に加えて、プロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）を含めた、既にＧｅｎｂａｎｋに登録されている、既知のＮＬＶｓ（ＧＩ）の変異株（Ｌ０７４１８／Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，Ｌ２３８２８−２ＫＹ−８９／８９／Ｊ，Ｕ０４４６９−２／ＤＳＶ３９５，ＡＦ０９３７９７  ＢＳ５，９５／Ｍａｌｔａ，Ｍｕｓｇｒｏｖｅ／８９／ＵＫ，Ｔｈｉｓｔｌｅｈａｌｌ／９０／ＵＫ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ／９４／ＵＫ，Ｓｉｎｄｌｅｓｈａｍ／９５／ＵＫ，Ｗｈｉｔｅｒｏｓｅ／９６／ＵＫ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ／９３／ＵＫ）を含めた塩基配列を用いて、ゲノムの多様性を調べ、最も保存性の高い遺伝子領域を検索した。
ここで、本発明において、遺伝子領域を表示する基準としては、上記のＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）（Ｍ８７６６１  Ｎｏｒｗａｌｋ）の遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ配列）を用いた。第１図は、ゲノムの多様性を調べた結果を示す図面である。第１図のｉ）のグラフにおいて、横軸は、５’末端から数えた、上記のＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列の番号であり、縦軸は、保存性の度合いを示している（縦軸の数値が大きいほど、各株の塩基配列が共通して、遺伝子の保存性が高く、逆に、その数値が小さいほど、各株の塩基配列が変化に富んでおり、保存性が低いことを示している）。また、第１図のｉｉ）は、上記の塩基配列を有する遺伝子の、ＮＬＶｓ（ＧＩ）における機能を示している。
第１図に示す、ＮＬＶｓ（ＧＩ）遺伝子の解析の結果、最も、各株の遺伝子の相同性が高い領域は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍からＯＲＦ２領域のＮ末端近傍であり、最大値９０％以上の塩基配列の相同性を示した。
第２Ａ図〜第２Ｄ図は、このＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〔第２Ａ図〕からＯＲＦ２領域のＮ末端近傍〔第２Ｃ図，第２Ｄ図：第２Ｂ図は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２中間に位置する領域を示している〕のＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。第２Ａ図〜第２Ｄ図において、左端には、用いたＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株の名称が示してあり、その最上段がプロトタイプ（基準株）の塩基配列を示している〔本発明において基準となる塩基配列番号は、この最上段に示すプロトタイプ（基準株）の塩基配列番号である〕。各株の塩基配列の表示〔プロトタイプ（基準株）を除く〕において、「．」は、プロトタイプ（基準株）の塩基と同一の塩基であることを示し、空欄の場合には、そのプロトタイプ（基準株）の塩基に相当する塩基が存在しないことを示している。また、最下段の「＊」は、全ての株について同一の塩基であることを示し、最下欄の「．」は、株間で、何らかの塩基の相違があることを示している。
（３）結論
これらのＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子の保存性の検討の結果により、ＮＬＶｓ（ＧＩ）において、その検出に向けて利用可能な程度の遺伝子の保存性を示す塩基配列部分は、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２０１〜５７００番目に相応する部分であり、殊に、同５２７６〜５４４６番目に相応する部分は、高度の保存性が認められることが明らかとなった〔「相応する」とは、変異株を含んだＮＬＶｓ（ＧＩ）おいて、遺伝子解析の結果、上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列のことを意味する。具体的には、上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列の核酸に対して、ストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０ｍＭ以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な塩基配列のことを意味する。具体的には、第２Ａ図〜第２Ｄ図において示される様々なＮＬＶｓ（ＧＩ）の上記プロトタイプのｃＤＮＡの塩基配列で示される遺伝子領域に相応する塩基配列が例示される〕。
本発明は、かかるＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子の保存性についての遺伝子解析の結果に基づき、高度の保存性を有する遺伝子領域〔ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２０１〜５７００番目に相応する部分：以下、このような遺伝子領域を、保存性領域ともいう〕の核酸の塩基配列を活用して、ＮＬＶｓ（ＧＩ）を、迅速・的確に検出する手段に関するものであり、具体的には、検体における、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２０１〜５７００番目、好適には、５２７６〜５４４６番目、さらに好適には、５２７６〜５３８０番目および／または５３１９〜５４４６番目に相応する相補的両塩基配列の核酸を指標として、ノーウォーク様ウイルス（ＧＩ）を検出するウイルスの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
なお、本発明において、「相補的」とは、上記したように、ある塩基配列の核酸に対して、ストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０ｍＭ以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な程度の相補性を有する塩基配列のことを意味し、「相補的両塩基配列」とは、＋鎖に対する−鎖の関係を有する相補的塩基配列、および／または、−鎖に対する＋鎖の関係を有する相補的塩基配列の双方を含む塩基配列という意味である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。
具体的に、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の保存性領域についての知見を、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出の指標として用いるに際しては、保存性領域を、核酸増幅法を用いて増幅して、保存性領域の遺伝子増幅産物を得ることが前提となる。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法を一例とする各種の核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。これらの核酸増幅法を用いるには、選択する核酸増幅法に基づいた遺伝子増幅用プライマーを設計・調製して用いる必要がある。このような遺伝子増幅用プライマーは、増幅を企図する遺伝子領域を、５’→３’の順方向（Ｆｏｒｗａｒｄ）と逆方向（Ｒｅｖｅｒｓｅ）に向けて遺伝子を増幅する＋−プライマーで挟み込むべく設計することが通常である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも、鋳型となる遺伝子において、相補的に結合するべき領域に正しく結合することが必要であり、特徴的な塩基配列に対してのみ相補的であるための最低限の塩基数は確保されていることが必要である。このような遺伝子増幅用プライマーにおける塩基数は、少なくとも１０塩基以上であり、好適には、１５〜３０塩基程度である。また、相補的に結合するべき領域の３’末端側から数えて５塩基分の領域に対しては、可能な限り厳密な相補性を有するように遺伝子増幅用プライマーを設計することが好適である。
また、遺伝子増幅用プライマーの基となるべき遺伝子領域は、少なくとも、遺伝子増幅産物に、保存性領域や高度保存性領域（後述する）に相応する相補的両塩基配列が含まれることが必要である。かかる観点から、遺伝子増幅用プライマーは、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２７６〜５３１０番目、同５３１９〜５３４９番目、同５３５４〜５３８０番目および同５４２６〜５４４６番目からなる群の塩基配列を基準として選ばれた１０塩基以上、好適には、１５〜３０塩基連続する相補的両塩基配列であることが好ましい。
このように、本検出方法におけるＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出指標となる、保存性領域に相応する塩基配列の核酸は、かかる保存性領域から、少なくとも２種類の１０塩基以上連続する塩基配列、好適には、１５〜３０塩基連続する相補的両塩基配列を選んで、これを基にした遺伝子増幅用プライマーを用いた、前記の遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物として得られるものである。そして、得られるべき遺伝子増幅産物は、前記保存性領域のうち、特に高度の保存性を有する、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のｃＤＮＡの塩基配列の５２７６〜５４４６番目に相応する部分（以下、高度保存性領域ともいう）を含むことが好適である。また、この高度保存性領域から得られる遺伝子増幅産物に含まれる塩基配列を、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のｃＤＮＡの相補的両塩基配列の５２７６〜５３８０番目および／または５３１９〜５４４６番目に対応する部分とすることが、さらに好適である。
さらに、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子の高度保存性領域において、さらに高度の保存性を有する領域（以下、特別保存性領域ともいう）が、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３８０番目に相応する塩基配列であり、最も高度の保存性を示す領域（以下、最高保存性領域ともいう）が、同塩基配列の５３１９〜５３４９番目および同５３５４〜５３８０番目に相応する塩基配列であることから、遺伝子増幅用プライマーの基となる塩基配列が、下記の組合わせ▲１▼または▲２▼を構成する、２種の基準となる塩基配列のそれぞれから選ばれる相補的両塩基配列であることが好適である。
▲１▼ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２７６〜５３１０番目および同５３５４〜５３８０番目に相応する相補的両塩基配列の組。
▲２▼ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目および同５４２６〜５４４６番目に相応する相補的両塩基配列の組。
▲１▼の組の遺伝子増幅用プライマーの組を用いることにより、ＮＬＶｓ（ＧＩ）に由来する遺伝子増幅産物には、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５３１９〜５３４９番目に相応する塩基配列が含まれることとなり、▲２▼の組の遺伝子増幅用プライマーの組を用いることにより、ＮＬＶｓ（ＧＩ）に由来する遺伝子増幅産物には、ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５３５４〜５３８０番目に相応する塩基配列が含まれることとなる。そして、これらの最高保存性領域の遺伝子の塩基配列を検出可能な手段、最も典型的には、検出目的となる核酸のうち、最高保存性領域の一部またはすべてを含む相補的両塩基配列に対して相補的な検出用核酸プローブを用いて、検出目的とする遺伝子の増幅産物を、定量・検出して、その定量検出結果を指標として、ＮＬＶｓ（ＧＩ）を、迅速・的確に検出することが可能となる。
上述した全ての遺伝子増幅用プライマーは、後述する本検出用キットの構成要素として用いることができる遺伝子増幅用プライマーとして用いることができる。
なお、本検出方法を適用すべき検体は、ＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出すべき全てのものが対象となる。例えば、食中毒患者において、ＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出すべき場合には、典型的には、食中毒患者の糞便、場合によっては、嘔吐物、血液等を検体として用いることが可能である。また、食品や食品生産設備においてＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出すべき場合には、対象となる食品そのものや、食品生産設備における付着物、食品生産者の衣服等を検体とすることが可能である。さらに、各種の汚水や排水、海水、河川水、湖水等の水系の水を検体として用いることも可能である。これらの検体からの遺伝子の入手方法は、用いる検体の種類に応じて適切な方法を選択することが可能であるが、概ね用いる検体を水等に浸漬または懸濁して、これらの水から得られる上清画分から、酸フェノール法（ＡＧＰＣ法：Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）などの常法により、ウイルスＲＮＡを抽出することにより行うことができる。かかるウイルスＲＮＡに対して、選択する遺伝子増幅法による処理、例えば、逆転写酵素を用いたウイルスＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの調製などを行い、この核酸試料を、上記の遺伝子増幅用プライマーを用いて、遺伝子増幅を行うことにより、所望する遺伝子増幅産物を得ることができる（所望する遺伝子増幅産物の確認は、一般的には、電気泳動により、目的となる大きさの遺伝子増幅産物が認められるか否かにより行われる）。
上述したように、このようにして得られる遺伝子増幅産物の保存性領域、より好適には、高度保存性領域に相応する相補的両塩基配列、さらに好適には、特別保存性領域に相応する相補的両塩基配列、特に好適には、最高保存性領域に相応する相補的両塩基配列を、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の存在の指標として検出することにより、ＮＬＶｓ（ＧＩ）を、迅速・的確に検出することができる。
遺伝子増幅産物の特定の塩基配列を、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の存在の指標として検出する手段としては、常法、典型的には、遺伝子増幅産物の上述したウイルス検出の指標となるべき相補的両塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む検出用核酸プローブ（例えば、蛍光標識や放射性同位体標識を施した核酸）を利用して、遺伝子増幅産物中の検出すべき塩基配列の存在を、ハイブリダイゼーションなどにより、ネガティブまたはポジティブに確認する方法などを用いることができる。一般的に、これらの検出手段は、得られた遺伝子増幅産物に対して、遺伝子増幅操作終了後に行うものであるが、このような方法であると、遺伝子増幅反応後に、チューブを開けて、分析サンプルを取り出さなければならないため、実験設備や試薬を、遺伝子増幅産物で汚染させてしまう機会を増やす上、余分な時間と労力が必要であり、さらに、汚染された遺伝子増幅産物は、その後の実験テンプレートとなって、偽陽性となる機会を与える可能性もあり、実際の検出現場においては、重大な問題となっている。そこで、汚染などの危険を回避し、さらに、検出操作に費やす時間を可能な限り短縮するために、遺伝子増幅操作の過程において、遺伝子増幅産物中の特定の塩基配列の存在をモニタリングすることが可能な手段を用いることが好適である。このような方法の代表的なものとして、例えば、▲１▼モレキュラー  ビーコン  プローブ（Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法、および、▲２▼タック−マン  プローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法を挙げることができる。
▲１▼モレキュラー  ビーコン  プローブ（Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中または増幅過程終了後に、蛍光でモニターするために使用できる、ヘアピン型のハイブリダイゼーションプローブ（モレキュラー  ビーコン  プローブ）を用いる、遺伝子の検出方法である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８  １６：４９−５３）。モレキュラー  ビーコン  プローブを構成する核酸の末端は、互いに相補的になっており、通常は、これらの末端同士が結合して、いわゆるステム構造を形成し、かかるステム構造におけるループ部分は、遺伝子増幅産物の目的とする領域（保存性領域、高度保存性領域、特別保存性領域または最高保存性領域：以下、保存性領域などともいう）に対して相補的となるように設計されている。さらに、蛍光体と非蛍光の消光剤が、核酸の両端にそれぞれ結合しており、溶液中で遊離しているときは、ヘアピン構造を形成するため、蛍光剤と消光剤はお互いに作用して蛍光は消えている。しかし、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物が存在する場合には、ループ部分が、その相補的な塩基配列に結合し、その結果、プローブ全体の構造が変化して、蛍光体と消光剤が離れて、消光剤の蛍光体に対する消光効果が解消するために、蛍光体が本来の蛍光を発するようになる。この消光効果の解消による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列〔ＮＬＶｓ（ＧＩ）の保存性領域など〕の存在を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中のＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出することができる。
なお、モレキュラー  ビーコン  プローブにおける、上述した蛍光標識と消光剤の標識は、通常、核酸の５’末端に、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）や６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７，２’，７’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＥＴ）などのフルオレセイン系蛍光色素や、５−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＡＲＡ）などのローダミン系蛍光色素を標識し、さらに、同３’末端に、４−（４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）などの消光剤を標識することにより行うことができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４：３０３−３０８など）。
▲２▼タック−マン  プローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた検出方法は、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅産物の形成を、増幅過程中に、蛍光でモニターするために使用できる、ハイブリダイゼーションプローブ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ）を用いる、遺伝子の検出方法である〔実験医学  Ｖｏｌ．１５  Ｎｏ．７（増刊）ｐ４６〜５１，１９９７など〕。タック−マン  プローブは、５’末端には、フルオレセイン系の蛍光色素（レポーター色素）が、３’末端には、ローダミン系の蛍光色素（クエンチャー色素）が、それぞれ標識された核酸である。レポーター色素とクエンチャー色素が、核酸を介して結合している状態では、ホエルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギーにより、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素により抑制されている。これに対して、プライマーおよびタック−マン  プローブが、遺伝子増幅産物のタック−マン  プローブの核酸に相補的な核酸をアニーリングして、伸長反応が進むと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エンドヌクレアーゼ活性により、タック−マン  プローブの５’末端から加水分解が起こり、５’末端のレポーター色素が、３’末端のクエンチャー色素から離脱すると、抑制されていたレポーター色素の蛍光強度が増加する。レポーター色素による蛍光強度の増加は、核酸に相補的な塩基配列を有する遺伝子増幅産物の増加に比例する。そして、この蛍光強度の増加をモニタリングすることにより、遺伝子の増幅過程終了後のみならず、遺伝子の増幅過程においても、目的の塩基配列〔ＮＬＶｓ（ＧＩ）の保存性領域など〕の存在を検出することができる。つまり、上記の蛍光強度の増加を指標に、検出試料中のＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出することができる。
なお、タック−マン  プローブにおける、上述した蛍光標識は、通常、核酸の５’末端に、６−ＦＡＭやＴＥＴなどのフルオレセイン系の蛍光色素を、同３’末端に、ＴＡＭＡＲＡなどのローダミン系の色素を、常法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３  ２１（１６）：３７６１−３７６６など）に従って行うことができる。
上述した全ての検出用核酸プローブは、後述する本検出用キットの構成要素として用いることができる検出用核酸プローブとして用いることができる。
本検出方法におけるＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出は、目的とする塩基配列を有する遺伝子増幅産物などの検出は、上述した手段により、目的とする核酸を定量して検出することも可能であり、定量を伴わなわずに、例えば、陽性若しくは陰性という定性情報として検出することも可能である。この遺伝子増幅産物などの検出情報（定量値や定性情報）を指標に、これと検体中のＮＬＶｓ（ＧＩ）の存在・非存在、さらには存在量と関連付けることによって、所望するＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出を行うことができる。
本発明においては、本検出方法を用いるための、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出用キット（以下、本検出用キットともいう）も提供される。
本検出用キットには、通常、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の保存性領域などをＲＴ−ＰＣＲ法などにより増幅するために用いる、増幅用プライマー、および／または、遺伝子増幅産物における保存性領域を検出するためのプローブが含まれるが、これらの双方が含まれることが好適である。
遺伝子増幅用プライマーは、ＮＬＶｓ（ＧＩ）遺伝子において、保存性領域などを、ＲＴ−ＰＣＲ法などの遺伝子増幅手段により、遺伝子増幅産物として、産生することが可能な核酸である。また、検出用核酸プローブは、保存性領域などの塩基配列に対応する配列に対して相補的な塩基配列の核酸を含む検出用核酸プローブである。検出用核酸プローブは、上記のごとく、相補的な塩基配列に、蛍光標識や放射性標識を施した基本的な態様の核酸プローブを用いることができるが、殊に、遺伝子増幅過程においてＮＬＶｓ（ＧＩ）を検出する場合には、相補的な塩基配列の核酸を、上述のモレキュラー  ビーコン  プローブ、または、タック−マン  プローブを検出用核酸プローブにおいて組み入れたものを用いることが好適である。
本検出用キットに含めることができる、遺伝子増幅用プライマーおよび遺伝子検出用核酸プローブについては、本検出方法の欄において述べた通りで、さらに、実施例においても具体例を示している。
実施例
以下、本発明の実施例を説明する。ただし、本実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔プライマーおよびプローブの調製〕
本実施例におけるＮＬＶｓ（ＧＩ）の検出は、以下の遺伝子増幅用核酸プライマーおよび遺伝子検出用核酸プローブを用いて行った。下記の核酸は、ＡＢＩ３９４８全自動核酸合成精製システム（アプライドバイオシステム社）を用いて化学合成した。
遺伝子増幅用プライマー
〔Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｐｒｉｍｅｒ〕
＊セットＡで使用（Ｍｉｘ）
５’ＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴＹＣＴＧＣＣＣＧ  ３’（配列番号１：プロトタイプの５３３１〜５３４８番に相応）
５’ＡＣＣＧＣＲＡＴＣＴＹＴＴＧＣＣＣＧ  ３’（配列番号２：プロトタイプの５３３１〜５３４８番に相応）
＊セットＢで使用（Ｍｉｘ）
５’ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＣＣＡＴＧＡ  ３’（配列番号３：プロトタイプの５２９１〜５３１０番に相応）
５’ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＴＣＡＴＧＡ  ３’（配列番号４：プロトタイプの５２９１〜５３１０番に相応）
＊セットＣで使用（Ｍｉｘ）
５’ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＣＣＡＴＧＡ  ３’（配列番号３：プロトタイプの５２９１〜５３１０番に相応）
５’ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＴＣＡＴＧＡ  ３’（配列番号４：プロトタイプの５２９１〜５３１０番に相応）
〔Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｒｉｍｅｒ〕
＊セットＡで使用〔Ｍｉｘ〕
５’ＧＧＢＴＣＡＧＣＴＧＴＲＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧ  ３’（配列番号５：プロトタイプの５４２５〜５４４６番の相補鎖に相応）
５’ＧＧＢＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧ  ３’（配列番号６：プロトタイプの５４２５〜５４４６番の相補鎖に相応）
５’ＧＧＢＴＣＡＧＣＴＧＴＲＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧ  ３’（配列番号７：プロトタイプの５４２５〜５４４６番の相補鎖に相応）
５’ＧＧＢＴＣＡＧＣＡＴＴＲＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧ  ３’（配列番号８：プロトタイプの５４２５〜５４４６番の相補鎖に相応）
＊セットＢで使用
５’ＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＹＡＣ  ３’（配列番号９：プロトタイプの５３５４〜５３７５番の相補鎖に相応）
＊セットＣで使用
５’ＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴ３’（配列番号１０：プロトタイプの５３５７〜５３７７番の相補鎖に相応）
遺伝子検出用核酸プローブ
〔タック−マンプローブ〕
＊セットＡで使用
５’ＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＣ  ３’（配列番号１１：プロトタイプの５３５５〜５３８０番に相応）
＊セットＢで使用
５’ＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＹＧＣＧ  ３’（配列番号１２：プロトタイプの５３３３〜５３４９番の相補鎖に相応）
＊セットＣで使用（Ｍｉｘ）
５’ＡＧＡＴＹＧＣＧＡＴＣＹＣＣＴＧＴＣＣＡ  ３’（配列番号１３：プロトタイプの５３２１〜５３４０番の相補鎖に相応）
５’ＡＧＡＴＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡ  ３’（配列番号１４：プロトタイプの５３２１〜５３４０番の相補鎖に相応）
本例で用いたタック−マンプローブは、いずれも、５’末端にＴＥＴを標識し、３’末端にＴＡＭＡＲＡを標識した（標識方法は、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３  ２１（１６）：３７６１−３７６６」記載の方法に従った）。
〔モレキュラー  ビーコン  プローブ：小文字はステム部分〕
＊セットＡで使用
５’ｃｃｇｔｃｇＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣｃｇａｃｇｇ  ３’（配列番号１５：大文字部分：プロトタイプの５３５５〜５３７８番に相応）
＊セットＢで使用
５’ｃｃｇｃｔｇＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＹＧＣＧｃａｇｃｇｇ  ３’（配列番号１２：大文字部分：プロトタイプの５３３３〜５３４９の相補鎖に相応）
＊セットＣで使用（Ｍｉｘ）
５’ｃｃｇｃｔｇＡＧＡＴＹＧＣＧＡＴＣＹＣＣＴＧＴＣＣＡｃａｇｃｇｇ  ３’（配列番号１３：大文字部分：プロトタイプの５３２０〜５３４０番の相補鎖に相応）
５’ｃｃｇｃｔｇＡＧＡＴＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡｃａｇｃｇｇ  ３’（配列番号１４：大文字部分：プロトタイプの５３２０〜５３４０番の相補鎖に相応）
本例で用いたモレキュラー  ビーコン  プローブは、いずれも、５’末端にＴＥＴを標識し、３’末端にＤＡＢＣＹＬを標識した（標識方法は、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４：３０３−３０８」記載の方法に従った）。
また、上記の各プローブについては、それぞれ、表示されている塩基配列の核酸に対する相補的（厳密な意味）な塩基配列の核酸も化学合成して、遺伝子検出用プローブと共に用いた。
〔ウイルスの検出〕
（１）前述したＮＬＶｓ（ＧＩ）遺伝子の高度保存領域の検討試験において用いた、１９９８年から２０００年にかけて、埼玉県衛生研究所で、電子顕微鏡により、ＮＬＶｓ粒子が確認された、非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体から抽出したＲＮＡ試料について、本検出方法を行った。
まず、各ＲＮＡ試料について、逆転写反応を行った。具体的には、各ＲＮＡ試料（８μＬ）と、逆転写反応用液１２μＬ〔１０ｍＭ  ｄＮＴＰ溶液１μＬ，７５ｐｍｏｌのｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ，３０ｕｎｉｔｓのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ），２００ｕｎｉｔｓのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ（−）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＵＳＡ），１００ｍＭ  ＤＴＴ１μＬおよび５倍逆転写バッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で、全量が１２μＬとなるように、滅菌蒸留水で希釈したもの〕を混合し、４２℃で、１時間以上反応させた後、酵素失活反応を、７０℃で１５分間行うことにより、各ＲＮＡ試料に対するｃＤＮＡ（ＲＴ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を調製した。次いで、ＰＣＲ反応は、上記のセットＡ、セットＢまたはセットＣの核酸を、遺伝子増幅用プライマーセットとして、ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ，ＵＳＡ）を用い、反応液（Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬ，ＲＴｐｒＯｄｕｃｔｓ５μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ５００ｎＭ  ｅａｃｈ，蛍光プローブ（タック−マンプローブ：セットＡの遺伝子増幅用プライマーの系については、セットＡ用のタック−マンプローブを用い、同セットＢの系については、セットＢ用のタック−マンプローブを用い、同セットＣの系については、セットＣ用のタック−マンプローブを、それぞれ用いた）５〜２０ｐｍｏｌ，全量５０μＬになるように滅菌蒸留水で調整）を調製し、ＡＢＩ７７００（ＡＢＩ，ＵＳＡ）で、ＰＣＲ反応時〔サイクルは、５０℃・２分間→９５℃・１０分間→（９５℃ｓｅｃ→５６℃・３分間）×５０サイクル〕の蛍光強度を経時的に測定した。
ＮＬＶｓ（ＧＩ）のプロトタイプ（基準株）のｃＤＮＡの塩基配列の５２０７〜５６９６番に相当する、ＳｚｕＧＩ株のｃＤＮＡを、常法により、ｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）にクローニングしたものを、ＮＬＶｓ（ＧＩ）特異的なポジティブコントロールとして検討した。その結果、上記の検出によって、プライマー／プローブセットＡ，Ｂ，Ｃ共に、１０１〜１０７コピーのＮＬＶｓ（ＧＩ）遺伝子を検出することが可能であり（検出限界：１０１コピー／１反応）、かつ、Ｃｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を参照することで、定量的に検出可能であることが明らかとなった。
また、先述の非細菌性胃腸炎患者４４名の糞便検体のうち、１６例（３６．４％）で、ＮＬＶｓ（ＧＩ）が検出された。残りの２８例（６３．６％）は、ＮＬＶｓ（ＧＩ）ネガティブであったが、この２８例全てにおいて、別法により、ＮＬＶｓ（ＧＩＩ）が検出された。この２つのタイプのＮＬＶｓの検出結果を合わせると、ＮＬＶｓの検出率は１００％であった。
また、上記と同様の系において、各遺伝子増幅用プライマーセットＡ，Ｂ，Ｃに対応するモレキュラービーコンプローブＡ，Ｂ，Ｃを用いた場合も、同様の結果が得られた。
（２）上記の糞便検体に代えて、本検出方法を、実際に食品において用いることが可能であることを示すために、生カキを検体として、これに対して、本検出方法を用いた。
生カキ４０個体において、個体毎に摘出した中腸腺に滅菌蒸留水を添加した後に、３回の融解凍結操作を行って、組織を破砕し、これに対して２０分間の遠心分離（１００００×ｇ）を行った。これにより得られた遠心上清１４０μＬより、ＱＩＡ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を、プロトコールに従い用いて核酸を抽出し、これを５０μＬの滅菌蒸留水に懸濁して、これを生カキのＲＮＡ試料とし、上記（１）の手順に準じて（遺伝子増幅用プライマーは、セットＢを用いた）、モレキュラービーコンプローブ（セットＢ）を用いて、本検出方法を行った。
その結果、３個体の生カキから、ＮＬＶｓ（ＧＩ）が検出された。
（１）（２）の結果から、本検出方法により、ＮＬＶＳ（ＧＩ）を、迅速・的確に検出可能であることが明らかになった。また、上述したように、遺伝子検出用プライマーに、ＮＬＶＳ（ＧＩ）特異的な遺伝子検出用核酸プローブを用いて、遺伝子増幅工程をモニターすることにより、定量的な検出をすることが可能であり、極めて高感度で効率的なウイルス検出手段を提供し得ることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＮＬＶｓ（ＧＩ）の遺伝子において、高度に保存されている遺伝子領域が見出され、さらに、この知見を基に、ＮＬＶｓの迅速・的確な検出手段が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ＮＬＶｓ（ＧＩ）ゲノムの多様性を調べた結果を示す図面である。
第２Ａ図は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。
第２Ｂ図は、ＯＲＦ１領域のＣ末端近傍〜ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面である。
第２Ｃ図は、ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面の一方である。
第２Ｄ図は、ＯＲＦ２領域のＮ末端近傍をコードするＮＬＶｓ（ＧＩ）の各株における塩基配列を並列比較した図面の他方である。
【図１】
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【図２Ａ】
0004437525.tif 000007
【図２Ｂ】
0004437525.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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