(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるとともに、８−ヒドロキシヘスペレチンを含有することを特徴とするレモン発酵物。
【請求項２】
前記発酵原料中よりも高濃度のフラバノンアグリコンを含有することを特徴とする請求項１に記載のレモン発酵物。
【請求項３】
アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるとともに、前記発酵原料中よりも高濃度のフラバノンアグリコンを含有することを特徴とするレモン発酵物。
【請求項４】
前記発酵原料をレモン果実から果汁を搾汁した後の搾汁残渣とすることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載のレモン発酵物。
【請求項５】
抗酸化作用を有することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載のレモン発酵物。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のレモン発酵物の製造方法であって、
アスペルギルス・アワモリを用いて、前記発酵原料を微生物発酵処理することを特徴とするレモン発酵物の製造方法。
【請求項７】
前記微生物発酵処理に先立って、アスペルギルス・アワモリを含む培地を好気的条件下で振盪培養する予備培養処理を行った後、その予備培養処理後の培地を前記発酵原料に付着させて微生物発酵処理を行うようにしたことを特徴とする請求項６に記載のレモン発酵物の製造方法。
【請求項８】
前記微生物発酵処理を２〜１４日間行うことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載のレモン発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、健康機能の向上作用を増大させて付加価値を高め、飲料品や医薬品等に利用することができるように構成されたレモン発酵物及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、発酵原料としてのレモン果実又はその一部を微生物発酵処理することにより、その発酵原料中のフラバノン配糖体を微生物変換し、より健康機能向上作用の高い成分を生成させるように構成されたレモン発酵物及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
レモン果実は、果汁、果皮、じょうのう膜及びさのうから構成されており、エリオシトリンやヘスペリジン等のフラバノン配糖体が多量に含有されている。前記エリオシトリンは高い抗酸化性を有しており、前記ヘスペリジンはビタミンＰとして知られ、抗アレルギー作用、抗ウィルス作用及び抗炎症作用があることが確認されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、レモン果実又はその一部を用いて前記フラバノン配糖体よりもさらに健康機能の向上効果が高い成分を効率よく得ることができたという知見に基づいてなされたものである。その目的とするところは、健康機能の向上作用を増大させてその付加価値を高めることができるように構成されたレモン発酵物及びその製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のレモン発酵物は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるとともに、８−ヒドロキシヘスペレチンを含有することを特徴とするものである。
【０００５】
請求項２に記載の発明のレモン発酵物は、請求項１に記載の発明において、前記発酵原料中よりも高濃度のフラバノンアグリコンを含有することを特徴とするものである。
【０００６】
請求項３に記載の発明のレモン発酵物は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるとともに、前記発酵原料中よりも高濃度のフラバノンアグリコンを含有することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項４に記載の発明のレモン発酵物は、請求項１から請求項３のいずれかに記載の発明において、前記発酵原料をレモン果実から果汁を搾汁した後の搾汁残渣とすることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項５に記載の発明のレモン発酵物は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の発明において、抗酸化作用を有することを特徴とするものである。
請求項６に記載の発明のレモン発酵物の製造方法は、請求項１から請求項５のいずれかに記載のレモン発酵物の製造方法であって、アスペルギルス・アワモリを用いて、前記発酵原料を微生物発酵処理することを特徴とするものである。
【０００９】
請求項７に記載の発明のレモン発酵物の製造方法は、請求項６に記載の発明において、前記微生物発酵処理に先立って、アスペルギルス・アワモリを含む培地を好気的条件下で振盪培養する予備培養処理を行った後、その予備培養処理後の培地を前記発酵原料に付着させて微生物発酵処理を行うようにしたことを特徴とするものである。
【００１０】
請求項８に記載の発明のレモン発酵物の製造方法は、請求項６又は請求項７に記載の発明において、前記微生物発酵処理を２〜１４日間行うことを特徴とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
レモン発酵物は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）に分類される黒麹菌を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるものである。このレモン発酵物には、有効成分として高い抗酸化作用を有する８−ヒドロキシヘスペレチン（8-hydroxyhesperetin）が含有されており、例えば飲料品、食品、医薬品等の素材に添加して健康増進活性を有する健康食品や健康ドリンク等に利用される。また、このレモン発酵物には、前記発酵原料中よりも高濃度のフラバノンアグリコン（エリオディクティオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン等）も含有されており、健康機能の向上に寄与している。
【００１２】
発酵原料としては、収穫後のレモン果実又はそのレモン果実の構成成分が用いられる。なお、これら発酵原料は、冷蔵保存又は冷凍保存されたものであっても構わない。前記レモン果実の構成成分としては、レモン果実から剥離、分離若しくは単離されたレモンの果皮（アルベド及びフラベド）、じょうのう膜並びにさのうから選ばれる少なくとも１種が使用される。さらに、この発酵原料としては、レモン果実から分離された部分を用いることもできるが、製造に要する手間を省くとともにレモン果実の有効利用を容易に図ることができることから、レモン果実から果汁を搾汁した後の搾汁残渣を使用するのが最も好ましい。この搾汁残渣には、レモンの果皮（アルベド及びフラベド）と、じょうのう膜と、さのうの一部と、搾汁しきれなかった極少量のレモン果汁とが含まれている。
【００１３】
この発酵原料中には、エリオディクティオール（eriodictyol）とルチノース（Ｌ−ラムノシル−Ｄ−グルコース）との配糖体であるエリオシトリン（eriocitrin）、ヘスペレチン（hesperetin；3',5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavanone;Ｃ16Ｈ14Ｏ6）とルチノースとの配糖体であるヘスペリジン（hesperidin）（ビタミンＰ）、ナリンゲニン（naringenin；4',5,7-trihydroxyflavanone）とネオヘスペリジオース（neohesheridiose）との配糖体であるナリンジン（naringin）等のフラバノン配糖体が含有されている。これらのフラバノン配糖体は、レモン果実の構成成分のうち、レモン果汁以外の構成成分に高い濃度で含まれている。また、これらのフラバノン配糖体のうちエリオシトリンは、他の柑橘類と比較してレモン中に多量に含まれている。
【００１４】
微生物発酵処理は、前記黒麹菌を発酵原料に接種した後、所定の発酵条件下で前記黒麹菌に発酵原料中のフラバノン配糖体を微生物変換させる処理である。この微生物変換は、主として黒麹菌の栄養菌糸が生産するグルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ）によりフラバノン配糖体からフラバノンアグリコンを遊離させるアグリコン生成過程と、その生成されたフラバノンアグリコンを、主として胞子形成期にある黒麹菌から生産されるヒドロキシラーゼによってヒドロキシ化するヒドロキシ化過程とを備えている。そして、これら両過程により、前記発酵原料が微生物変換されたレモン発酵物中には、エリオディクティオールやヘスペレチン等のフラバノンアグリコンと、前記ヘスペレチンがヒドロキシ化された８−ヒドロキシヘスペレチンとが共存している。
【００１５】
前記８−ヒドロキシヘスペレチンは、下記化１で示される構造を有している。
【００１６】
【化１】
0004522624.tif 000002
この８‐ヒドロキシヘスペレチンは、化学式がＣ16Ｈ14Ｏ7で、分子量が約３１９のフラボノイド化合物（3',5,7,8-tetrahydroxy-4'-methoxyflavanone 又は 2,3-dihydro-5,7,8-trihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one）であり、ヘスペレチンの８位に水酸基を備えた有機化合物である。この８−ヒドロキシヘスペレチンは、メタノール、エタノール及びジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に可溶で、若干溶解性は悪いが水にも可溶である。さらに、前記ヘスペレチンには抗酸化作用がほとんど見られないのに対し、この８−ヒドロキシヘスペレチンはα−トコフェロール（ビタミンＥ）とほぼ同等又はそれ以上の抗酸化活性を有している。
【００１７】
前記黒麹菌を発酵原料に接種する方法としては、それら黒麹菌の胞子を発酵原料に直接振りかけて付着させることができる。また、予め前記黒麹菌を含む培地を好気的条件で振盪培養する予備培養処理を行った後、その予備培養処理後の培地を発酵原料全体に行き渡るように振りかけて付着させたり、前記予備培養後の培地中に発酵原料を浸漬させることによって接種することも可能である。これらの接種方法のうち、発酵原料の微生物発酵処理が比較的均一に進むことから、予備培養処理後の培地を発酵原料に振りかけて付着させるのが最も好ましい。
【００１８】
前記予備培養処理は、微生物発酵処理に用いられる黒麹菌を予め十分に増殖させるとともに活性化させることによって、微生物発酵処理を迅速かつ円滑に進行させるために行われる。この予備培養処理は、２０〜４０℃の好気的条件下で最低５日以上行われ、好ましくは前記黒麹菌の菌糸体が培地表面を３分の１程度覆う状態となるまで行われる。
【００１９】
前記培地としては、ポテトデキストロース含有培地やツァペック培地等の糸状菌用培地又はオカラ等の有機物を含有する種々の液体培地が好適に使用される。さらに、この予備培養処理では、前記黒麹菌の生育を良好にするために、培養開始時点における培地のｐＨを３〜７に調整するのが好ましい。また、前記振盪培養する際の振盪速度としては、好ましくは５０ｒｐｍ／分以上、より好ましくは５０〜２００ｒｐｍ／分である。この振盪速度が５０ｒｐｍ／分未満の場合には、前記黒麹菌を含有した培地全体が好気的でないため、菌糸の増殖が十分にできない。また、振盪速度が２００ｒｐｍ／分を越える場合には、培地の揺れが激しく、前記黒麹菌の菌体形成が抑制されるおそれがある。
【００２０】
上記予備培養処理により活性化された黒麹菌を発酵原料に接種する場合の微生物発酵処理条件としては、微生物発酵処理を好気的条件で行うことが容易であることから、例えば有底筒状に形成された培養皿等の底部が広く深さが浅い培養容器が好適に用いられる。さらに、この培養容器の底面に万遍なく発酵原料を広げるように載置するとよい。また、発酵温度としては、前記黒麹菌の生育に好適な条件として、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃で行われる。加えて、前記黒麹菌の生育に好適な条件として、暗所で微生物発酵処理を行うのが好ましい。
【００２１】
８−ヒドロキシヘスペレチンを多量に得るための微生物発酵処理の発酵期間としては、好ましくは２〜１４日、より好ましくは２〜１０日、さらに好ましくは３〜８日である。この発酵期間が２日未満の場合には、前記黒麹菌による微生物発酵がほとんど進行していないことから十分な量の８−ヒドロキシヘスペレチンが生成されていない。逆に１４日を越える場合には、微生物変換により生成された８−ヒドロキシヘスペレチンの分解が進み、抗酸化作用が低下する。
【００２２】
また、フラバノンアグリコン（エリオディクティオール、ヘスペレチン、ナリンゲニン等）を多量に得るための発酵期間としては、前記８‐ヒドロキシヘスペレチンの場合よりも若干短く、好ましくは２〜１２日、より好ましくは２〜８日、さらに好ましくは３〜７日である。この発酵期間が２日未満の場合には、前記黒麹菌による微生物発酵がほとんど進行していないことから十分な量のフラバノンアグリコンが生成されていない。逆に１２日を越える場合には、微生物変換により生成されたフラバノンアグリコンの分解が進むおそれがある。
【００２３】
上記微生物発酵処理により得られるレモン発酵物は、発酵により繊維質の分解が進み非常にもろくて崩れやすい状態となる。このレモン発酵物中には、発酵途中で繊維質の分解が不十分な発酵原料や発酵中に形成された接種菌株の菌糸体等の固形分が存在しており、その固形分は微生物発酵処理前の発酵原料と比較し、体積で約１０分の１程度となる。このレモン発酵物は、そのまま飲料品、食品、医薬品等の素材に添加するか、或いはミキサーやホモジナイズ処理した後に前記素材に添加して利用することが可能である。また、前記レモン発酵物中に生成された抗酸化作用等を有する有効成分を精製した後、前記素材中に添加するように構成してもよい。
【００２４】
このレモン発酵物中の有効成分を精製する際には、まず、接種菌体及び未発酵原料を主体とする固形分を取り除く固形分除去処理が行われる。この固形分除去処理は、前記固形分を含有するレモン発酵物を極性溶媒中に浸漬させ、有効成分を溶媒中に移行させて抽出した後、ガーゼや粗メッシュ等で濾過又は２０００×ｇ、３０分間程度の軽い遠心分離を行って固形分を取り除く処理である。なお、前記レモン発酵物を極性溶媒中で抽出する際の抽出条件としては、常温で２時間以上抽出するのが抽出効率の面からも好ましい。
【００２５】
前記極性溶媒としては、メタノール、エタノール、それらの水溶液又は水が好適に用いられる。また、ブタノールやイソプロパノール等の低級アルコール又はそれらの水溶液も使用可能である。さらに、この極性溶媒としては、大量のレモン発酵物を処理する場合の経済的な観点から、好ましくはメタノール、その水溶液又は水が用いられ、精製コスト面から最も好ましくは水が用いられる。また、飲料品、食品、医薬品等の素材にそのまま添加する場合には、エタノール、その水溶液又は水を用いるのが好ましい。また、前記黒麹菌を死滅させて微生物発酵を停止させるためには、メタノール、エタノール又はその高濃度（例えば２０容量％以上）の水溶液を用いるのが好ましい。
【００２６】
さらに、前記固形分除去処理後のレモン発酵物中に含まれるペクチンを主体とする水溶性繊維成分を分離除去するための繊維分除去処理を行うことも可能である。この繊維分除去処理は、前記固形分除去処理後のレモン発酵物を遠心分離して、水溶性繊維成分を（遠心管等の底部に）沈澱させることによって除去する処理である。なお、この繊維分除去処理は、前記極性溶媒としてメタノール又はエタノールを用いた場合には１１０００×ｇ、２０分間程度の遠心力で遠心分離すればよく、前記極性溶媒として水又は水溶液を用いた場合にはそれよりも強い遠心力で遠心分離される。
【００２７】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  レモン発酵物は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）に分類される黒麹菌を用いて、レモンの果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるものである。このため、このレモン発酵物は、発酵原料中に含まれるフラバノン配糖体（ヘスペリジン）が前記黒麹菌により微生物変換された８−ヒドロキシヘスペレチンを含有しており、微生物発酵処理前の発酵原料と比較して極めて高い抗酸化作用を発揮することができる。また、このレモン発酵物は、発酵原料中に含まれるフラバノン配糖体（エリオシトリン）が前記黒麹菌により微生物変換されたエリオディクティオールを含有しており、微生物発酵処理前の発酵原料と比較して極めて高い健康機能向上作用を発揮することができ、その付加価値を容易に高めることができる。
【００２８】
そして、このレモン発酵物は、前記８−ヒドロキシヘスペレチンにより生体内で活性酸素を消去して過酸化脂質の生成を抑制し、酸化ストレスに起因する癌、動脈硬化、糖尿病の合併症等の生活習慣病の予防に役立てることができるうえ、酸化ストレスを低減させることができる。さらに、前記８−ヒドロキシヘスペレチン及びエリオディクティオールにより、健康の維持や疲労の回復等に役立てることができる。また、ヘスペレチン及びナリンゲニンも前記エリオディクティオールと同様に、発酵原料よりも高濃度で含有されていることから、健康機能の向上効果を高めることができる。さらに、このレモン発酵物は、飲料品、食品、医薬品等の素材に添加することによって健康食品や健康ドリンク等の様々な製品に利用することが可能であることから、レモンの利用拡大を容易に図ることができる。
【００２９】
・  発酵原料としてレモン果実から果汁を搾汁した後の残渣を用いることによって、レモン果汁よりも高い濃度でフラバノン配糖体が含有されていることから、フラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンの製造効率を容易に高めることができる。さらに、前記の搾汁残渣は、これまでほとんど利用されることがなく廃棄処分されていたものであることから、本実施形態のレモン発酵物を製造するための原料として用いることにより、その有効利用を図ることができるとともに製造コストを容易に低減させることができる。加えて、このレモン発酵物の製造後には、前記発酵原料の１０分の１程度の固形分が廃棄処分されるにとどまり、廃棄物の体積を顕著に減量させることができる。このため、廃棄にかかる運搬コストを容易に低減させることができるうえ、食品リサイクル法を遵守するのが極めて容易となる。
【００３０】
・  レモン発酵物は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）に分類される黒麹菌を用いて、レモンの果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することにより、前記発酵原料中に含まれるフラバノン配糖体を微生物変換してフラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンを生成させることによって製造される。このため、高い健康機能向上効果を発揮するとともにその付加価値を高めることができるレモン発酵物を極めて容易に製造することができる。
【００３１】
さらに、前記微生物発酵処理に先立って前記黒麹菌の予備培養処理を行うことにより、微生物発酵処理に用いる黒麹菌を予め十分に増殖させるとともに活性化させ、微生物発酵処理を迅速かつ円滑に進行させることができる。加えて、微生物発酵処理を２〜１４日間行うことによって、多量のフラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンを含有するレモン発酵物を容易に製造することができる。
【００３２】
また、固形分除去処理によりレモン発酵物中の固形分を取り除くことによって、取り扱い性や機能成分の濃度を容易に向上させたレモン発酵物を容易に製造することができる。さらに、この取り除かれた固形分は、次の微生物発酵処理における発酵スターターとしても再利用することが可能であり、この場合には廃棄物をより一層減量させることができる。
【００３３】
前記固形分除去処理に続いて、繊維分除去処理によりレモン発酵物中の水溶性繊維成分を取り除くことによって、抗酸化作用をより一層増強させたレモン発酵物を容易に製造することができる。さらに、この取り除かれた水溶性繊維成分は、整腸作用を有する機能性食品や飲料品等に添加して再利用することが可能であり、レモンの利用拡大及び有効利用をさらに効果的に図ることができる。
【００３４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜レモン発酵物の製造＞
本実験では、微生物発酵処理に以下の菌株を使用した。なお、ＡＴＣＣはAmerican Type Culture Collection、ＲＩＢは国税局醸造研究所、ＩＡＭは(財)応用微生物学研究奨励会より分譲を受けた菌株を示す。
アスペルギルス・ニガー属
・Aspergillus niger              ＡＴＣＣ−１０５４９、３８８５７
アスペルギルス・アワモリ属（ニガー属と分けない分類もある）
・Aspergillus awamori            ＲＩＢ−２８０４
・Aspergillus shirousami         ＩＡＭ−２４１４、ＲＩＢ−２５０３
・Aspergillus usami              ＩＡＭ−２１８５、ＲＩＢ−２００１
・Aspergillus japonicus          ＡＴＣＣ−２０２３６
また、上記２足菌株との比較としてアスペルギルス・サイトイ菌株（ＩＡＭ−２２１０）を使用した。これら菌株の予備培養処理は、ｐＨを５．０に調整し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース−ブロス培地（ＤＩＦＣＯ社製）をフラスコ内に５００ｍｌ用意し、培地が十分に冷めた後に分譲菌株を接種し、１００ｒｐｍの好気的条件下で振盪培養することにより行った。そして、培地に菌を接種して７日経過し、フラスコ内で菌体が十分に育成された予備培養処理後の培地液を微生物発酵処理に用いる接種用菌とした。
【００３５】
発酵原料としては、レモン果実と、レモン果実から果汁を搾汁した後に残った搾汁残渣との２種類を用いた。レモン果実は果実を８等分にカットしたもので、搾汁残渣は、レモン果実のうち、果皮とじょうのう膜、及びさのうの一部が残ったもの（極僅かながら果汁も含まれている）である。本実験では、前記発酵原料を通気性が良くなるように予めオートクレーブ滅菌した底部の広い容器（有底円筒状の容器）に万遍なく広げて置き、上記接種用菌をその発酵原料全体に行き渡るように振りかけることにより接種を行った。菌を接種した後の果実及び搾汁残渣は、３０℃の恒温室内で暗黒条件下にて微生物発酵処理を行った。
【００３６】
そして、上記菌株接種後所定日数経過後の各レモン発酵物をサンプリングし、それらサンプル（固形分を含むレモン発酵物）を１００ｇあたり５００ｍｌのエタノールに浸漬させ、３７℃の暗黒条件下で２日間、有効成分の抽出操作を行った。抽出後の液を１１０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上澄み液を以下の分析に使用した。また、比較例（コントロール）として、レモン果実及び搾汁残渣１００ｇ（未発酵）を５００ｍｌのエタノールに浸漬させ、３７℃の暗黒条件下で２日間、有効成分の抽出操作を行った後、抽出後の液を１１０００×ｇで３０分間遠心分離して得られた上澄み液を以下の分析に使用した。
【００３７】
＜抗酸化活性の測定＞
上記レモン発酵物（レモン果実及び搾汁残渣発酵物抽出液）と、コントロールの未発酵物抽出液とを用いて、ＤＰＰＨ（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazy）によるラジカル捕捉能の測定を実施した。
【００３８】
本試験に使用する試薬の準備として、ＤＰＰＨ２０ｍｇをエタノール１００ｍｌに溶解させた後０．８０μｍのミリポアフィルターで濾過することにより、５００μＭのＤＰＰＨ溶液を作製した。また、バッファーにはＴｒｉｓ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）を用いた。
【００３９】
まず、前記ＤＰＰＨ溶液２ｍｌとＴｒｉｓ緩衝液０．８ｍｌとを混合した混合液に、各サンプル液を０．２ｍｌ加えて合計３ｍｌの反応液を調製し、ボルテックスでよく攪拌した後に室温暗所に置き２０分間反応させた。なお、コントロール（ブランクテスト）としては、前記サンプル液の代わりに水０．２ｍｌを使用して同様に反応を行った。また、比較のため、前記サンプル液の代わりに５０〜１００μＭの範囲内の各種濃度のα−トコフェロール標準液０．２ｍｌを加えた区分も用意し、同様に反応を行った。
【００４０】
次に、各反応液を再度攪拌した後、マイクロシリンジにて各反応液１０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製のＬＣ−１０Ａ）にインジェクトした。このＨＰＬＣの溶媒には、十分に脱気したメタノール／蒸留水＝７０／３０を使用し、流速１ｍｌ／分の条件で測定を行った。測定用のカラムにはＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＣＴＹＬ−８０ＴＳ（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）、カラム温度３５℃、ＵＶ検出器の波長は５１７ｎｍで測定を行った。
【００４１】
溶出開始からおよそ９分後にＤＰＰＨのピークが出現することから、そのピーク高さ（HEIGHT）を測定し、下記数１により各サンプルのＤＰＰＨラジカル捕捉能（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００４２】
【数１】
0004522624.tif 000003
【００４３】
【表１】
0004522624.tif 000004
その結果、発酵菌種による差異として、アスペルギルス・ニガーは抗酸化能の上昇が見られるのが早く、アスペルギルス・サイトイでは逆に抗酸化能の上昇がやや遅くなる傾向が見られた。また、レモン果実発酵物と搾汁残渣発酵物との比較では最も高い値を示した発酵菌種が違っていたものの、これら両発酵物はすべての区で発酵前と比較し抗酸化能の向上が確認された。なお、上記α−トコフェロール標準液５０，７５，１００，１２５μＭを加えた区分のラジカル捕捉能はそれぞれ１８．２，４０．６，５２．９，６９．５％であった。従って、レモン果実及び搾汁残渣（果皮、じょうのう膜及びさのう）を、アスペルギルス・ニガーやアスペルギルス・アワモリ等に分類される黒麹菌を用いて２〜１４日間微生物発酵処理することにより、極めて高い抗酸化能を持つレモン発酵物が得られることが確認された。以下にレモン果実及び搾汁残渣それぞれの結果について詳細を記す。
【００４４】
レモン果実発酵物の中では、Aspergillus awamori RIB-2804 で５日間微生物発酵処理した区分が最も高い抗酸化活性を示し、未発酵果実と比較し２倍以上抗酸化能が向上していることが確認された。Aspergillus shirousami 、Aspergillus niger及び Aspergillus saitoi でも微生物発酵処理前と比較し抗酸化能の向上が確認された。なお、Aspergillus shirousami 、Aspergillus awamori 及び Aspergillus niger で微生物発酵処理を行った場合、Aspergillus saitoi を上回る抗酸化性を有する発酵物が得られることが確認された。また、発酵期間は５〜１０日が最適との結果となった。
【００４５】
レモン搾汁残渣発酵物の中では、Aspergillus niger ATCC-10549 で７日間微生物発酵処理した区分が最も高い抗酸化活性を示し、未発酵搾汁残渣と比較し２倍近くまで抗酸化能が向上していることが確認された。Aspergillus awamori、Aspergillus shirousami 、Aspergillus usami 、Aspergillus japonicus 及び Aspergillus saitoi でも微生物発酵処理前と比較し抗酸化能の向上が確認された。なお、Aspergillus shirousami 、Aspergillus awamori、Aspergillus usami 、Aspergillus japonicus 及び Aspergillus niger で微生物発酵処理を行った場合、Aspergillus saitoi を上回る抗酸化性を有する発酵物が得られることが確認された。また、発酵期間は、Aspergillus niger を除き５〜１０日が最適との結果となった。
【００４６】
以上の結果から、アスペルギルス・サイトイ（フェニシス）以外のアスペルギルス属黒麹菌、具体的にはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・シロウサミ、アスペルギルス・ウサミ及びアスペルギルス・ジャポニクスを用いて微生物発酵処理を行うことにより、より高い抗酸化能を有するレモン果実及び搾汁残渣発酵物を得ることができることが確認された。
【００４７】
＜レモン発酵物中の成分の確認＞
上記レモン発酵物中に含まれる有効成分（代表的なフラバノン配糖体、フラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチン（８ＯＨ−ＨＥ））の含有量を以下の方法で確認した。なお、前記含有量は、発酵原料の湿重量（Fresh Weight）１００ｇから生成された重量（ｍｇ）を示す（以下、便宜的にｍｇ／１００ｇＦＷと記載する）。すなわち、上記レモン発酵物（レモン果実及び搾汁残渣発酵物抽出液）と、コントロールの未発酵物抽出液とをそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ１０Ａ）を用いて、下記分析条件にて成分の分析を行い、レモン果実及び搾汁残渣の微生物発酵処理前後における各有効成分の変動について確認を実施した。
Column            ：      YMC-Pack ODS-A A303 (250x4.6mmI.D.)
Mobile phase      ：      40%methanol-water
Flow rate         ：      １ml/min
Injection volume  ：      10μl
Column Temperature：      40℃
紫外吸光度        ：      λ=280nm
なお、この試験では、先に我々が単離した８−ヒドロキシヘスペレチン（特願２００１−７３５７７の＜ヘスペリジン変換物の製造＞）及びエリオシトリンをそれぞれ１００ｐｐｍ濃度でエタノール中に溶解させた標準サンプルと、市販のフラバノン配糖体（ナリンジン、ナリルチン、ネオエリオシトリン、ヘスペリジン、ネオヘスペリジン）、及び市販のアグリコン（ナリンゲニン、エリオディクティオール、ヘスペレチン）をそれぞれ１００ｐｐｍの濃度でエタノール又はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた標準サンプルを作成し、これら標準品を前記抽出液と同条件にて分析し、各抽出液中における含有量（ｍｇ／１００ｇＦＷ）を定量した。結果を上記表１に示す。
【００４８】
その結果、微生物発酵処理前の段階で各発酵原料中にフラバノン配糖体は非常に多量に含まれていたものの、フラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンはほとんど存在していないことが確認された。さらに、同じ重量で比較すると果実よりも搾汁残渣のほうがフラバノン配糖体をより高濃度で含んでいることから、フラボノイド変換を目的とする処理を行う場合、搾汁残渣は非常に好適な発酵原料であるといえる。
【００４９】
この結果は、レモンの果実及び搾汁残渣にアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ等の黒麹菌を接種し微生物発酵処理を進めていくことで、レモン果実及び搾汁残渣（果皮、じょうのう膜及びさのう）中に大量に存在するフラバノン配糖体が減少し、その代わりにフラバノンアグリコンや８−ヒドロキシヘスペレチンの生成が見られたものと理解される。このフラバノン配糖体からフラバノンアグリコン、８−ヒドロキシヘスペレチンへの変換は、黒麹菌由来の酵素作用によりフラバノン配糖体（ヘスペリジン）についている糖が切断されてフラバノンアグリコン（ヘスペレチン）になり、さらに生成されたフラバノンアグリコンの一部に黒麹菌由来の酵素が働き水酸基が付加されて８−ヒドロキシヘスペレチンが生成されたものであると考えられる。
【００５０】
上記のように黒麹菌由来の酵素の働きにより、フラバノン配糖体から変換されたフラバノンアグリコン（エリオディクティオール）は、レモン発酵物の抗酸化能を高め、かつ、体内への吸収性を向上させるというメリットがあり、健康機能の向上に大きく寄与する。さらにフラバノンアグリコン（ヘスペレチン）に水酸基が付加された８−ヒドロキシヘスペレチンは、α−トコフェロール（ビタミンＥ）と同等以上の抗酸化能を有し、レモン発酵物の抗酸化能をより一層高めることに寄与する。
【００５１】
また、上記結果から、フラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンの生成量が多いサンプルでは、ＤＰＰＨラジカル捕捉能もほぼ比例しつつ高まる傾向が見られ、微生物発酵処理により生成されたフラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンは、レモン発酵物全体の抗酸化能にとって大きく寄与していることが確認された。一部、合致しないデータもあるが、微生物を用いた発酵のため各サンプルで多少のバラツキがある点を差し引けば、フラバノンアグリコン、８−ヒドロキシヘスペレチンの変換効率の優れている菌株（アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・アワモリ）は、抗酸化能の評価とほぼ相関した結果が得られたといえる。
【００５２】
以上の結果から、抗酸化能の比較的低かったフラバノン配糖体が、黒麹菌を用いて微生物発酵処理することにより抗酸化能が高く体内吸収性に優れたフラバノンアグリコン及び８−ヒドロキシヘスペレチンに変換されたことが確認された。さらに、その変換物を含有するレモン発酵物は、非常に高い抗酸化作用を発揮し、健康機能を著しく向上させる働きを有することが強く示唆される。また、フラバノンアグリコンへの微生物変換は、アスペルギルス・サイトイより、アスペルギルス・ニガーやアスペルギルス・アワモリのほうが効率良く変換されることも明らかとなった。
【００５３】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  発酵原料としてレモン果実から搾汁したレモン果汁を用いてもよい。
・  レモン発酵物中に、好ましくは１．５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは３〜１００ｍｇ／１００ｇＦＷ、より一層好ましくは１０〜５０ｍｇ／１００ｇＦＷ、さらに好ましくは１０〜３０ｍｇ／１００ｇＦＷのエリオディクティオールを含有するとよい。
【００５４】
・  レモン発酵物中に、好ましくは０．４ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは０．５〜１００ｍｇ／１００ｇＦＷ、より一層好ましくは０．６〜３０ｍｇ／１００ｇＦＷ、さらに好ましくは１．０〜２０ｍｇ／１００ｇＦＷのヘスペレチンを含有するとよい。
【００５５】
・  レモン発酵物中に、好ましくは０．３ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、より好ましくは０．８〜２０ｍｇ／１００ｇＦＷ、さらに好ましくは１．０〜１０ｍｇ／１００ｇＦＷの８−ヒドロキシヘスペレチンを含有するとよい。
【００５６】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  前記発酵原料よりも高い抗酸化活性を有することを特徴とする請求項５に記載のレモン発酵物。
【００５７】
・  前記発酵原料をレモン果実とすることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載のレモン発酵物。
・  前記フラバノンアグリコンは、エリオディクティオール、ヘスペレチン及びナリンゲニンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項２から請求項５のいずれかに記載のレモン発酵物。前記フラバノンアグリコンは、エリオディクティオール及びヘスペレチンであることを特徴とする請求項２から請求項５のいずれかに記載のレモン発酵物。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
本発明のレモン発酵物によれば、健康機能の向上作用を増大させてその付加価値を高めることができる。また、本発明のレモン発酵物の製造方法によれば、健康機能の向上作用を増大させてその付加価値を高めることができるレモン発酵物を容易に製造することができる。