(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス粒子の集団を生成するための方法であって、
（ａ）ウイルス粒子の放出を促進する条件を含む条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞をインキュベートする工程を含み、それによりウイルス粒子が、細胞を溶解することなく該プロデューサー細胞から該培養培地へ放出される；ここで、ウイルス粒子の放出を促進する条件は：
（ｉ）２００ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍの重量オスモル濃度、２９．５℃〜４５．５℃の温度、および１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌのグルコース濃度から選択される１つ以上の条件を含み；および
（ｉｉ）６．９５〜８．０５のｐＨ条件を含み；ならびに
（ｂ）細胞を溶解することなく細胞培養培地からウイルス粒子を採取し、それによりウイルス粒子の集団を得る工程を包含し、ここで、ウイルスはアデノ随伴ウイルスであるところの、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、前記ウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であり、そして、前記プロデューサー細胞が、以下：
（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここで該ＡＡＶパッケージング遺伝子の各々が、ＡＡＶ複製タンパク質またはＡＡＶキャプシド形成タンパク質をコードする、遺伝子；
（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター；および
（ｉｉｉ）ＡＡＶについてのヘルパーウイルス機能；
を含む細胞である、方法。
【請求項３】
ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度およびｐＨ、温度およびｐＨまたは重量オスモル濃度、温度およびｐＨの組み合わせである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度およびｐＨの組み合わせである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ウイルス粒子の放出を促進する条件が、温度およびｐＨの組み合わせである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ウイルス粒子の放出を促進する条件が、重量オスモル濃度、温度およびｐＨの組み合わせである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
ｐＨが７．１５〜７．２５、７．３５〜７．４５、７．５５〜７．６５、７．７５〜７．８５、または７．９５〜８．０５である、請求項３〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ｐＨが７．３５〜８．０５である、請求項３〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ｐＨが７．９５〜８．０５である、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
培養培地の開始ｐＨが７．９５〜８．０５である、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
培養培地のｐＨが、培養中測定され、７．９５〜８．０５で維持される、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
培養培地の重量オスモル濃度が、培養中測定され、２００ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、４００ｍＯｓｍ、または５００ｍＯｓｍで維持される、請求項３、４、および６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
培養培地の重量オスモル濃度が、培養中測定され、２００ｍＯｓｍ〜４００ｍＯｓｍで維持される、請求項３、４、および６〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
重量オスモル濃度が３００ｍＯｓｍである、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
開始重量オスモル濃度が３００ｍＯｓｍである、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養培地の重量オスモル濃度が、ＮａＣｌまたは他の塩、マンノースまたはグルコースを用いて調節される、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養培地の重量オスモル濃度が、ＮａＣｌを用いて調節される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
温度が３０．５℃〜３１．５℃、３３．５℃〜３４．５℃、３６．５℃〜３７．５℃、３８．５℃〜３９．５℃、または４１．５℃〜４２．５℃である、請求項３および５〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
温度が３６．５℃〜４０．５℃である、請求項３および５〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
温度が３８．５℃〜３９．５℃である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
グルコース濃度が４ｇ／Ｌである、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
プロデューサー細胞が、ヘルパーウイルス機能の導入後４８〜９６時間培養される、請求項２〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ヘルパーウイルス機能が、ヘルパーウイルスによって提供される、請求項２〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
該ヘルバーウイルスが、アデノウイルスである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２〜２４のいずれか１項記載の方法であって、
ｃ）少なくとも１つの正に荷電したアニオン交換樹脂でｒＡＡＶプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーする工程；および
ｄ）工程ｃ）のｒＡＡＶ粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、カチオン交換クロマトグラフィーまたは接線流濾過によって精製して、ｒＡＡＶベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
工程（ｄ）が、カチオン交換クロマトグラフィーである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｄ）が、接線流濾過である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
請求項２〜２４のいずれか１項記載の方法であって、
ｃ）カチオン交換樹脂でＡＡＶプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーする工程；
ｄ）工程ｃ）のｒＡＡＶ粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製する工程；および
ｅ）工程ｄ）のｒＡＡＶ粒子を含有するクロマトグラフィー画分を、ヘパリン硫酸クロマトグラフィーによって精製し、ｒＡＡＶベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２〜２４のいずれか１項記載の方法であって、
少なくとも１つの正に荷電したアニオン交換樹脂および少なくとも１つの負に荷電したカチオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂でＡＡＶプロデューサー細胞培養培地をクロマトグラフィーし、ｒＡＡＶベクター粒子の精製集団を生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３０】
該ｒＡＡＶベクターが、２つのＡＶＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む、請求項２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
該ＡＡＶプロデューサー細胞が、該ＡＡＶプロデューサー細胞のゲノムに安定に組み込まれる少なくとも１つのＡＡＶパッケージング遺伝子を含む、請求項２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
該ＡＡＶプロデューサー細胞が、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子を含む、請求項２〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
該ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子が、前記ＡＡＶプロデューサー細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
該プロデューサー細胞が、付着依存性哺乳動物細胞株である、請求項２〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
該プロデューサー細胞が、懸濁適合化哺乳動物細胞株である、請求項２〜３３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府によって援助された研究のもとでなされた発明の権利の陳述）
本発明は、部分的に、国立保健研究所（ＮＩＨ）の助成金Ｒ４４ＤＫ４４６０によって援助された研究の間になされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、遺伝子移入に使用され得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびその調製物の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞溶解することなくプロデューサー細胞からウイルス粒子を放出することによる、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞性タンパク質を実質的に含まない、組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物の生成方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型に感染する。しかし、アデノ随伴ウイルスは、形質転換性でなく、そして、いずれのヒト疾患の病因とも関係していない。ＤＮＡのレシピエント宿主細胞への導入は、一般的に、その細胞の正常の代謝を妨げることなく、そのＤＮＡの長時間の残留および発現をもたらす。
【０００４】
遺伝子移入、特にヒト遺伝子治療における使用のための組換えＡＡＶベクター調製物の、所望される特徴は、少なくとも３つ存在する。第１に、このベクターが、標的組織における有効な集団の細胞に形質導入するために、十分に高い力価で生成されるべきであることが、好ましい。インビボでの遺伝子治療は、代表的には、大多数のベクター粒子を必要とする。例えば、いくつかの処置は、１０8を超える粒子を必要とし得、そして気道への直接的送達による嚢胞性線維症の処置には、１０10を超える粒子を必要とし得る。第２に、このベクター調製物が、複製コンピテントなＡＡＶ（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下において複製し得る、表現型としての野生型ＡＡＶ）を、本質的に含まないべきであることが、好ましい。第３に、このｒＡＡＶベクター調製物は、全体として、他のウイルス（例えば、ＡＡＶ生成に使用されるヘルパーウイルス）ならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞性タンパク質、および脂質および糖質のような他の成分を本質的に含まず、その結果、遺伝子治療の状況において、免疫応答を生じる危険性を、最小化するか、または除去することが、好ましい。この後者の点は、ＡＡＶの状況において特に重要である。なぜならＡＡＶは、ＡＡＶ生成のプロセスの間に、有効に複製されて、そしてパッケージングされるために、ヘルパーウイルス（代表的にはアデノウイルス）との同時感染またはヘルパーウイルス機能のその他の提供が必要である、「ヘルパー依存性」ウイルスであるからである。さらに、アデノウイルスは、遺伝子治療適用の状況において、宿主免疫応答を生じることが観察されている（例えば、Ｂｙｒｎｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：１０１５、１９９５；ＭｃＣｏｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１５５３、１９９５；およびＢａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：１５１、１９９５を参照のこと）。本発明の方法は、以下に詳細に記載および説明されるように、ｒＡＡＶベクター調製物のこれらおよび他の所望の特徴に取り組む。
【０００５】
ＡＡＶウイルス学、および遺伝学の一般的な総説は、他で利用可能である。読者は、特にＣａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」、第Ｉ巻、１６９〜２２８ページ（１９８９）、およびＢｅｒｎｓ、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、１７４３〜１７６４ページ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９０）を参照し得る。ＡＡＶは、複製欠損ウイルスであり、このことは、宿主細胞におけるＡＡＶの複製およびパッケージングサイクルを完成するために、ＡＡＶがヘルパーウイルスに依存することを意味する。ＡＡＶ複製を支持し得るヘルパーウイルスは、アデノウイルスによって例示されるが、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスのような他のウイルスを含む。ＡＡＶゲノムは、一般的に、パッケージング遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐ（他の必要な機能は、ヘルパーウイルスおよび宿主細胞からトランスで提供される）を含む。
【０００６】
実例として、ＡＡＶ２血清型の直鎖状ゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列によっていずれかの末端で終結する。ＩＴＲの間には、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するために使用される、３つの転写プロモーターｐ５、ｐ１９、およびｐ４０が存在する（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５５６７〜５５７１）。ＩＴＲ配列は、シスにおいて必要であり、そして、機能的な複製起点、細胞ゲノムへの組み込み、ならびに宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよびレスキューを提供するのに十分である。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、ウイルスゲノムの複製およびキャプシド化の機能を、それぞれ提供し、そしてこれらの産物がトランスで存在することで十分である。
【０００７】
ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：２０７７〜２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３、Ｇｅｎｅ  ２３：６５〜７３）、または、直接的な平滑末端の連結（ＳｅｎａｎｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１〜４６６６）のような手順によって、細菌プラスミド中に導入されてきた。そのようなＡＡＶ組換えプラスミドの哺乳動物細胞への、適切なヘルパーウイルスを使用する、トランスフェクションは、全くプラスミド配列を含まないＡＡＶゲノムのレスキューおよび切り出し、レスキューされたゲノムの複製、および子孫の感染性ＡＡＶ粒子の生成をもたらす。
【０００８】
治療目的の異種ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターは、細菌プラスミド中のＡＡＶコード配列の部分を、異種ポリヌクレオチドで置換することによって、構築され得る。ｒＡＡＶベクター構築の一般的原理はまた、別に概説されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：５３３〜５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９を参照のこと。ＡＡＶのＩＴＲは、一般的に保持されている。なぜなら、ベクターのパッケージングは、ＩＴＲがシスで存在することを必要とするからである。しかし、ＡＡＶゲノムの他のエレメント、特に、１つ以上のパッケージング遺伝子は、省略され得る。ベクタープラスミドは、省略されたパッケージング遺伝子を、代替的な供給源を介してトランスで供給することにより、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされ得る。多数の刊行物が、ｒＡＡＶベクターを生成するアプローチを記載する。Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３（１９８８）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９（１９８８）。Ｓａｍｕｌｓｋｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８、１９８９）；Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９（１９９２）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）および対応する米国特許第５，６５８，７７６号（Ｆｌｏｔｔｅらによる）；ＷＯ９５／１３３９２（Ｔｒｅｍｐｅら）；ＷＯ９６／１７９４７（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｎ）。
【０００９】
ｒＡＡＶベクター調製物の高力価は、特に有用であるが、高力価のｒＡＡＶの生成（特にラージスケール手順において）が、混入するヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスすなわち「Ａｄ」）、ヘルパーウイルスタンパク質（例えば、Ａｄタンパク質）、および／または細胞性タンパク質の有意な量を生じ得るので、混入するウイルスおよび／またはウイルス性もしくは細胞性タンパク質を実質的に含まない高力価調製物の生成のために使用され得る、ｒＡＡＶの拡大縮小可能な生成方法を設計することが特に重要となった。
【００１０】
組換えＡＡＶベクターの高力価調製物を生成する方法が、記載されている。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００は、ヘルパーウイルスでの感染の際にｒＡＡＶベクターを生成し得る細胞株の培養；アデノウイルスのようなヘルパーウイルスでの細胞の感染、および細胞の溶解を記載する。ＡＡＶおよび他のウイルス産生方法および系がまた、例えば、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４〜１２５０；Ｐａｕｌら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９〜６１５；Ｃｌａｒｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４〜１１３２に記載されている。
【００１１】
細胞を溶解しなければ、感知し得る量のＡＡＶがプロデューサー細胞から放出されないという普及している意見に起因して、パッケージング細胞を使用する組換えＡＡＶ粒子を生成するために使用される先行技術の方法は、細胞溶解工程を必要とした。例えば、ＣｈｉｒｉｃｏおよびＴｒｅｍｐｅ（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７６：３１〜４１を参照のこと。しかし、細胞溶解物は、インビボでの使用に適切である前に、ｒＡＡＶベクターから分離されなければならない種々の細胞性成分を含む。
【００１２】
本発明の開示は、細胞を溶解することなくプロデューサー細胞から放出されるｒＡＡＶベクターの高力価産生を達成する方法を提供し、そしてそのような技術が組換えＡＡＶベクター調製物の大規模産生のために使用され得ることを実証する。
【００１３】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を生成するための、方法および物質を提供する。この方法は、当該分野において典型的であるような、細胞を能動的に溶解することなく、プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の放出を包含する。この方法は、以前に記載された産生方法に比べ、明確かつ顕著な利点を提供する。この方法はまた、非溶解性であるウイルスおよび／または一般に放出されないウイルス（すなわち、非出芽ウイルス）に適用可能である。
【００１５】
従って、１つの局面において、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子のようなウイルス粒子の集団を産生する方法を提供する。この方法は、以下の工程：ａ）細胞からのＡＡＶ粒子の放出を促進する条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞をインキュベートする工程であって、これによりｒＡＡＶ粒子がプロデューサー細胞から培養培地中に放出される工程、ここで、このプロデューサー細胞は、以下、（ｉ）１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子であって、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製タンパク質またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター；ならびに（ｉｉｉ）ＡＡＶのためのヘルパーウイルス、またはＡＡＶのためのヘルパーウイルス機能を含む。次に、放出されたｒＡＡＶ粒子を、培養培地から、収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）または収集（ｈａｒｖｅｓｔ）し得る。ｒＡＡＶウイルス粒子の放出を促進する条件は、本明細書において記載され、そしてｐＨ、浸透圧、溶存酸素、富化された培地、および温度が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
いくつかの実施態様において、この方法はさらに、種々の精製および／または不活性化工程を含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、この方法はさらに、以下の工程を包含する：少なくとも１つの陽荷電アニオン交換樹脂および少なくとも１つの陰荷電カチオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂において、ＡＡＶプロデューサー細胞上清をクロマトグラフして、ｒＡＡＶベクター粒子の精製された集団を生成する工程、またはアニオン交換樹脂においてＡＡＶプロデューサー細胞上清をクロマトグラフして、その後に、接線流濾過（ＴＦＦ）する工程。ヘパリン硫酸クロマトグラフィーもまた、使用して、さらにこのウイルスを精製し得る。
【００１７】
本発明の方法において、細胞が懸濁中にあるようにか、または細胞の固体支持体への付着を促進する条件下にあるように、細胞培養を行い得る。従って、いくつかの実施態様において、プロデューサー細胞を、組織培養フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、タンクリアクター、ファーメンター、およびバイオリアクター、フラスコストックリアクター、ホローファイバーシステム、充填された（ｐａｃｋｅｄ  ｂｅｄ）リアクター（そして必要に応じてミクロキャリアを使用する）からなる群から選択される容器中で培養される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施態様において、この方法によって産生された組換えＡＡＶベクター調製物は、複製コンピテントなＡＡＶ、ならびにヘルパーウイルスおよび細胞性タンパク質を実質的に含まず、そして細胞性ＤＮＡを実質的に含まないｒＡＡＶウイルス粒子の精製された集団を生じる。
【００１９】
本発明はさらに、本発明の産生方法のいずれかに従って産生される、ｒＡＡＶ粒子の集団を提供する。好ましくは、粒子の集団は、１，０００の感染性ｒＡＡＶ粒子あたり、約１未満の感染性アデノウイルス粒子を含み、好ましくは、１０6ｒＡＡＶあたり１未満であり、なおより好ましくは、１０9中に約１未満であり、さらにより好ましくは、１０10中に約１未満である。
【００２０】
本発明のこれら、および他の実施態様は、下記の記載において概説される。
【００２１】
（発明の実施の態様）
本発明者らは、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、ならびに細胞のタンパク質および他の成分を実質的に含まないアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を産生するための方法を開示した。この方法は、一般的に、プロデューサー細胞を、そのプロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件下で培養する工程（これは、一般的に、維持する工程を包含する）を伴う。
【００２２】
ＡＡＶの分野では、細胞が溶解されない限り、ＡＡＶはその細胞から放出されないが、その細胞の核には維持されるということが十分に確証されている。従って、ｒＡＡＶ粒子を産生するために、細胞を溶解しなければならないと広く一般的に考えられている。当該分野の教示とは対照的に、本発明者らは、細胞を溶解することを伴わずにｒＡＡＶ粒子が細胞から放出され得ること、そしてさらに、種々の制御された環境条件下でプロデューサー細胞を維持することによって、ｒＡＡＶ粒子の放出が増加され得ることを発見した。これらの条件を用いると、以前に獲得されたよりも高い力価でｒＡＡＶ粒子を産生し得る。本明細書中に記載の条件下で培養された細胞は、細胞あたりでより多いウイルスを産生し、そして培養培地により多いウイルスを放出し、そしてなおさらに重要なことに、細胞内に保持されるＡＡＶより高い感染性を有するＡＡＶの集団を放出し得る。換言すれば、感染性に対するＤＮＡｓｅ耐性粒子の比率が、細胞内に保持されるＡＡＶのこの比率と比較して、細胞培養培地に放出されるＡＡＶ集団ではより小さくなり得る（例えば、図４を参照のこと）。さらに、溶解が本発明の方法では必須の工程ではないので、ｒＡＡＶ粒子が細胞上清から収集され得、従って、後の必要に応じた精製工程を単純化する。あるいは、溶解もまた実施され得る。
【００２３】
いくつかの実施態様では、本発明は、感染性ウイルス粒子の放出または優先的放出の方法を提供する。この感染性粒子の優先的放出は、ウイルス産生の状況において特に重要である。この状況では、非感染性粒子と対立して多数の感染性粒子を含む集団を産生することが非常に所望される。
【００２４】
本明細書中に記載の方法および原理は、通常保持される（すなわち、放出されない）多くの他のウイルス（特にアデノウイルス）に適用されることが理解される。ＡＡＶを本明細書中で例示する。
【００２５】
哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生およびプロセシングのための種々の方法が以下に詳細に記載され、そしてこのような技術の使用の例証を以下の実施例に提供する。本発明の方法によって産生されるｒＡＡＶ粒子は、遺伝子移入ベクターとして特に有用である。このようなベクターを使用する方法は当該分野において公知であり、そしてそれを本明細書中に記載する必要はない。
【００２６】
導入の目的で、宿主細胞または「プロデューサー」細胞を、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングのために使用することは典型的である。そのようなプロデューサー細胞（通常は、哺乳動物宿主細胞）は、一般的に、ｒＡＡＶ産生のために、いくつかの異なるタイプの成分を含むか、またはそれを含むように改変される。第１の成分は、複製し得かつ宿主パッケージング細胞によってベクター粒子中にパッケージングされ得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノム（すなわち、「ｒＡＡＶプロベクター」）である。このｒＡＡＶプロベクターは、異種ポリヌクレオチド（または「トランスジーン」）を、通常含む。この異種ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子治療の状況において、別の細胞を遺伝的に改変することが所望される（なぜなら、そのようなトランスジーンのｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングは、種々の哺乳動物細胞にそのトランスジーンを送達するために、効率的に使用され得るからである）。このトランスジーンは、好ましくは、ＡＡＶベクターの切り出し、複製およびパッケージング、ならびにベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みの間に認識される配列を含む、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。第２の成分は、ＡＡＶ複製にヘルパー機能を提供し得るヘルパーウイルスである。アデノウイルスが一般的に使用されるが、他のヘルパーウイルスもまた、当該分野において公知であるように使用され得る。あるいは、必要とされるヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルスから遺伝子的に単離され得、そしてそのコードする遺伝子が、トランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）ヘルパーウイルス機能を提供するために使用され得る。ＡＡＶベクターエレメントおよびそのヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）は、同時かまたは任意の順番で連続的のいずれかで、その宿主細胞に導入され得る。そのプロデューサー細胞に提供されるべきＡＡＶ産生のための最終成分は、複製およびキャプシド形成タンパク質をそれぞれ提供する、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子のような「ＡＡＶパッケージング遺伝子」である。ＡＡＶパッケージング遺伝子のいくつかの異なるバージョンが、提供され得る（野生型ｒｅｐ−ｃａｐカセット、ならびにｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が、ネイティブのプロモーターの制御下に残されたままであり得るか、または異種プロモーターに作動可能に連結され得る、改変ｒｅｐおよび／またはｃａｐカセットを含む）。そのようなＡＡＶパッケージング遺伝子は、当該分野において公知であり、そして以下により詳細に記載されるように、一過的または安定的のいずれかで、宿主パッケージング細胞中に導入され得る。
【００２７】
本発明の方法に従って、ｒＡＡＶ粒子は、インタクトな（すなわち、溶解されていない）細胞から、細胞培養培地（「上清」）に放出される。ＡＡＶ複製、キャプシド形成および放出を許容する条件下で宿主細胞を培養した後、その上清を処理して、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、細胞のタンパク質、そして重要なことに細胞のＤＮＡを実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の高力価調製物を産生し得る。そのような技術を使用する、処理技術および例示的プロトコールの詳細な説明を、以下に提供する。
【００２８】
（定義）
「ベクター」は、本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合して、そして細胞へのそのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合物をいう。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００２９】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、そして、そのウイルス自体か、またはその誘導体をいうために使用され得る。この用語は、そうでないことが要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスをいい、そしてまた組換えＡＡＶベクター（すなわち、「ｒＡＡＶベクター」）としてもいう。
【００３０】
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において使用する場合、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）配列（代表的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列）を含むＡＡＶベクターをいう。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。この用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
【００３１】
「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全て）、およびキャプシド形成したｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子をいう。従って、ｒＡＡＶ粒子の産生は必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含む。なぜなら、そのようなベクターはｒＡＡＶ粒子内に含まれているからである。
【００３２】
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子のアセンブリおよびキャプシド形成を生じる、一連の細胞内事象をいう。
【００３３】
ＡＡＶの「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をいう。これらは、試験された全てのＡＡＶ血清型において見出され、そして以下および当該分野において記載されている。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」という。
【００３４】
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞により複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスをいう。ＡＡＶについて種々のそのようなヘルパーウイルスが、当該分野において公知であり、これにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が挙げられる。サブグループＣの５型アデノウイルスが最も一般的に使用されるが、このアデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが、公知であり、そしてＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる；これらもまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。
【００３５】
「ヘルパーウイルス機能」とは、ＡＡＶ複製およびＡＡＶパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノム中にコードされる機能を言う（本明細書中に記載される複製およびパッケージングのための他の要求とともに）。本明細書中に記載される場合、「ヘルパーウイルス機能」は多くの方法で提供され得、その方法は、例えば、ヘルパーウイルスをプロデューサー細胞に提供することによるもの、または必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランス（ｔｒａｎｓ）でプロデューサー細胞に提供することによるものを含む。
【００３６】
用語「ｔｓＨＶ」とは、温度感受性ヘルパーウイルスをいう。このウイルスは、ＡＡＶの複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を提供し得るが、それ自体の複製に関して、温度感受性である（すなわち、このウイルスは、「許容」温度では複製し得るが、「非許容」温度においては、低効率で複製するか、または好ましくは、全く複製しない）。ｔｓＨＶがＡＡＶ複製の補助を提供する能力はまた、温度感受性であり得るが、本発明の使用に好ましいｔｓＨＶは、ＡＡＶが複製し得るが、ｔｓＨＶの複製にとっては非許容的な温度で、ＡＡＶの複製を効率的に支持する。そのようなｔｓＨＶの例を以下に記載する。
【００３７】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が向性（ｔｒｏｐｈｉｃ）である細胞に送達され得るポリヌクレオチド成分を含むものである。この用語は、ウイルスの複製能力を意味する必要は、全くない。感染性ウイルス粒子を計数するアッセイは、本開示および当該分野において、他の箇所に記載される。ウイルス感染性は、Ｐ：Ｉ比または全ウイルス粒子対感染ウイルス粒子の比として表現され得る。
【００３８】
「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）とは、感染性の野生型表現型ウイルスをいい、そしてまた、感染した細胞（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下）において複製し得る。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは、機能的なＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を、一般的に必要とする。本明細書に記載される好ましいｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠損のために、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製コンピテントでない。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベクターは、複製コンピテントＡＡＶがＡＡＶパッケージング遺伝子と進入するｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生じる可能性を最少化するために、ＡＡＶパッケージング遺伝子配列を完全に欠損する。本明細書において記載される好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）を（存在するとしても）ほとんど含まない調製物である（好ましくは、１０2ｒＡＡＶ粒子あたり、約１ｒｃＡＡＶ未満、より好ましくは、１０4ｒＡＡＶ粒子あたり約１ｒｃＡＡＶ未満、さらにより好ましくは、１０8ｒＡＡＶ粒子あたり約１ｒｃＡＡＶ未満、なおより好ましくは、１０12ｒＡＡＶ粒子あたり約１ｒｃＡＡＶ未満、最も好ましくは、ｒｃＡＡＶを含まない）。
【００３９】
ｒＡＡＶ粒子の「放出」とは、ｒＡＡＶ粒子がインタクトなプロデューサー細胞から細胞培養液に入ること、すなわち、ｒＡＡＶ粒子が細胞を溶解せずに放出されることを意味する。例えば、所定のプロデューサー細胞の培養物中では、いくつかの細胞は溶解し、細胞死の状態にあることが理解される。しかし、本発明は、代表的に当該分野で使用されるように、意図的な細胞溶解を実施することなしにｒＡＡＶ粒子の放出を促進する方法を提供する。用語プロデューサー細胞からの「放出」および「分泌」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語プロデューサー細胞からの「ｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件」とは、プロデューサー細胞を増殖させるための条件を言い、これは、プロデューサー細胞から培養培地に、増加されたｒＡＡＶ粒子の放出に導くか、または増強されたｒＡＡＶ粒子の放出に導く。プロデューサー細胞から培養培地へのｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件は本明細書中に記載されており、これは、一般的ではあるが、必ずしも細胞性代謝を増強する条件であるわけではない。プロデューサー細胞から培養培地へのｒＡＡＶ粒子の「放出を促進すること」とは、放出を増強する環境的条件下で培養されなかったプロデューサー細胞からのｒＡＡＶ放出と比較した場合、プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の放出が増大されていることを意味する。この増加は、任意の検出可能な増加であり得、例えば、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％または２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍である。当該分野において周知であるように、細胞集団が、所定の開始培養条件下で増殖する場合、この細胞の代謝性副産物が、特定の培養条件（例えば、ｐＨおよび重量モル浸透圧濃度）を変更する。ｒＡＡＶ粒子の放出を促進する環境的条件下で、１つ以上のこれらのパラメーターが必要に応じて制御され、すなわち規則的な間隔でモニターされ、そして適切な範囲（すなわち、放出を促進する範囲）内にパラメーターを維持するために調節される。これらの条件の設定および／または制御は以下においてより詳細に議論される。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドあるいはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得、そして非ヌクレオチド成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーへのアセンブリの、前または後になされ得る。本明細書において使用する場合、用語ポリヌクレオチドとは、互換可能に、２本鎖および１本鎖分子をいう。他に特定されるか、または必要とされない限り、本明細書に記載の本発明の任意の実施態様において、ポリヌクレオチドは、２本鎖形態、および２本鎖形態を形成することが公知であるかまたは予想される、２つの相補的な１本鎖形態の各々の両方を含む。
【００４２】
「遺伝子」とは、転写そして翻訳された後に、特定のタンパク質をコードし得る、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。
【００４３】
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え（体）」とは、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限または連結工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物を生じる他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、それぞれ、起源のポリヌクレオチド構築物の複製物、および起源のウイルス構築物の子孫を含む。
【００４４】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（ポリヌクレオチドの複製、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシング、翻訳または分解を含む）に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響し得、その性質を増強、または阻害し得る。当該分野において公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして通常プロモーターから下流に（３’方向に）位置するコード領域の転写を開始し得るＤＮＡ領域である。
【００４５】
「作動可能に連結した」とは、遺伝子エレメントの近傍位置をいい、ここで、このエレメントは、予想された様式において、作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、そのプロモーターは、コード領域に作動可能に連結する。そのプロモーターとコード領域の間には、この機能的関係が維持される限り、介在残基が存在し得る。
【００４６】
「発現ベクター」とは、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、そして意図された標的細胞においてタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、コード領域に作動可能に連結された制御エレメントを含み、その標的でのタンパク質の発現を容易にする。制御エレメント、および発現のためにその制御エレメントが作動可能に連結された遺伝子（単数または複数）の組み合わせは、時として、「発現カセット」といい、当該分野において公知でありそして利用可能な大多数の発現カセットが、当該分野において利用可能な成分から容易に構築され得る。
【００４７】
「異種」とは、比較されるその他の実体とは遺伝型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブなコード配列から取り出され、そして天然には連結されていることが見出されないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。
【００４８】
「遺伝子改変」とは、遺伝子エレメントが、有糸分裂または減数分裂以外によって細胞中に導入されるプロセスをいう。このエレメントは、細胞にとって異種であり得るか、またはその細胞に既に存在するエレメントのさらなるコピーか、もしくは改善されたバージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該分野において公知の任意のプロセス（例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触）を通して、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入か、または感染によって行われ得る。好ましくは、遺伝子エレメントは、細胞中の染色体またはミニクロモソーム中に導入される；しかし、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変更する任意の改変は、この用語に含まれる。
【００４９】
遺伝子配列が、インビトロにおける細胞の延長された培養の間に、その機能の実施のために利用可能である場合、その細胞は、この配列で「安定的に」改変、形質導入、または形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によってまた遺伝される遺伝子改変が導入されるという点で、「遺伝的に」改変される。
【００５０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。この用語はまた、改変された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、または標識成分との結合）アミノ酸のポリマーを含む。「ＣＦＴＲ」、「ｐ５３」、「Ｅ１Ａ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物の状況において議論される場合、インタクトなタンパク質の所望の生物学的機能を保持する、各々のインタクトなポリペプチド、またはその任意のフラグメントもしくは遺伝的に操作された誘導体をいう。同様に、ＣＦＴＲ、ｐ５３、Ｅ１Ａ遺伝子および遺伝子治療における使用のための他のこのような遺伝子は（代表的に、レシピエント細胞に送達される「トランスジーン」という）、インタクトなポリペプチド、または所望の生物学的機能を有する、任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
「単離された」プラスミド、ウイルス、または他の物質とは、この物質または類似物質が天然に存在するかまたはもともとそこから調製されるところにもまた存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物をいう。それゆえ、例えば、単離された物質は、供給源混合物から、この物質を富化する精製技術を使用することにより調製され得る。富化は絶対基準（例えば、溶液中の容量あたりの重量）に対して測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質に関して測定され得る。本発明の実施態様の富化を増加することは、さらにより好ましい。従って、例えば、２倍の富化が好ましく、１０倍の富化はより好ましく、１００倍の富化はより好ましく、１０００倍の富化はさらにより好ましい。
【００５２】
ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子に対する感染性ヘルパーウイルス粒子の比が少なくとも約１０2：１；好ましくは、少なくとも約１０4：１；より好ましくは、少なくとも約１０6：１；なおより好ましくは、少なくとも約１０8：１である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」といわれる。調製物はまた、好ましくは、等量のヘルパーウイルスタンパク質を含まない（すなわち、もし上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在するならば、タンパク質はヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果と同程度に存在する）。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の夾雑物は、ＳＤＳゲル上のクマシー染色または銀染色のバンドの存在として、一般的に観察され得る（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）。
【００５３】
ウイルスの生成、複製、またはパッケージングの記載において使用される場合、「効率」とは、方法の有用な性質（特に、増殖速度、および１細胞あたり生成さえるウイルス粒子の数）をいう。「高効率」生成は、特定の培養期間の過程にわたり、１細胞あたり少なくとも１００のウイルス粒子、好ましくは１細胞あたり、少なくとも約１０，０００、そしてより好ましくは、少なくとも約１００，０００粒子の生成を示す。なおより好ましくは、「高効率」生成は、１細胞あたりの粒子のこれらの生成レベル、ならびに、粒子を生成する細胞の最大数（例えば、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％）を含む。実施例６は１生成細胞あたり９３，０００〜１２３，０００ｒＡＡＶ粒子を生じる培養条件（「完全培地」）を記載する。本発明の文脈において、効率はまた、細胞中に保持されたウイルス粒子と比較したウイルス粒子の放出の割合または程度によって考慮され得る。効率はまた、感染性のウイルス粒子に対する全体のウイルス粒子の比または相対的な割合（例えば、「Ｐ／Ｉ」比）によって考慮され得る。生成の効率のパラメーターを決定するためのアッセイ（例えば、複製単位および感染性センターアッセイ）は、当該分野で公知である。
【００５４】
（一般的技術）
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者にとって公知である、従来の分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に例示される。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊｏｈｎ  Ｅ  Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５）；ならびに「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４）を参照のこと。
【００５５】
（プロデューサー細胞からｒＡＡＶ粒子の放出を促進する条件）
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の集団を生成するための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の培養培地への放出を促進する条件下で、細胞培養培地中でプロデューサー細胞の集団をインキュベートする工程。次いで、放出されたｒＡＡＶ粒子は、細胞培養培地から回収され得る。これによりウイルス粒子の集団を獲得する。
【００５６】
プロデューサー細胞から培養培地へＡＡＶ（ｒＡＡＶを含む）粒子の放出を促進（または増強する）条件としては、培養培地のｐＨ；培養培地の重量モル濃度；温度；培養培地中の所定のイオンの濃度；細胞密度；培養培地中の溶存酸素濃度；培養培地中のグルコース濃度；培養培地中のアミノ酸の濃度；および細胞周期同調化を促進する条件が挙げられるがこれらに限定されない。これらのパラメーターのいずれか１つ以上が、この細胞がＡＡＶ粒子を放出する間、適切な範囲（すなわち、放出を促進する範囲）内で維持される。１つのパラメーター（すなわち、条件）は、放出を促進するために十分であり得、２つ以上のパラメーターの組み合わせが、各々その独自の適切な範囲の内で同時に維持され得る。さらに、１つのパラメーターに適切な範囲は、任意のさらなるパラメーターのいずれか用いられるか否かに依存して変化し得る。１つのパラメーターが一定時間、適切な範囲内に保持される場合、第２のパラメーターが第１のパラメーターと同じかまたは異なる間隔の間、第２の適切な範囲内で維持され得る。あるいは、条件は、連続的に使用され得る。例えば、ｐＨのコントロールは、増殖の１つの相、温度の制御の間により生じ得る。
【００５７】
これらのパラメーターを変化させること、およびプロデューサー細胞が所定の環境条件下で維持されない場合、放出したｒＡＡＶの量に対して、ｒＡＡＶの培養培地インキュベートへの放出が増強されるか否かを決定することは、十分、当業者の能力の範囲内である。プロデューサー細胞からのｒＡＡＶ粒子の増強した（または増加した）放出は、当該分野の公知の任意の多数の方法により測定され得る。この方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：複製中心アッセイ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）および感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）のような機能的アッセイ；ｃａｐ遺伝子産物のための免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）；ＨＰＬＣ；ならびに任意の多数のＤＮＡ検出方法（ウイルスＤＮＡの存在を検出するため）（たとえば、スロットブロット）。
【００５８】
一般に、任意のこれらの条件は、当該分野で公知の標準的方法および装置を用いて、必要な程度および／または所望の程度までモニタリングおよび制御され得る。この条件は、測定され、そしてその適切なレベル（すなわち、ウイルス放出を促進するレベル）へその条件を維持または回復するために調節がなされる。本発明者らは、培養条件を適切または適当に維持することの失敗がウイルス粒子放出の休止を生じ得るが、他の条件（例えば、重量モル濃度）が特定のレベルに維持される必要はない（ただし、このパラメーターに関しては最初の培養条件の設定が十分である）ことを観察した。モニタリングおよび調節されることが必要である条件について、例えば、バイオリアクターおよび／または培地灌流システムが用いられ得る。これらのシステムは好ましい。なぜなら、それらは培養条件のより注意深いコントロールを可能にするからである。しかし、ＡＡＶ粒子の十分な放出および／または所望の放出を可能にする培養条件の十分なコントロールおよび調節を可能にする任意のシステムが適切である。この条件を提供するためのコントロール機構の他の例が本明細書において提供される。
【００５９】
１つの実施態様において、プロデューサー細胞は、ウイルス粒子放出を促進するｐＨ条件下で増殖される。一般に培養培地のｐＨは約７．０〜約８．５、好ましくは約７．４〜約８．５、より好ましくは約７．５〜約８．０の範囲内で維持される。なおより好ましくは、そして特には、ｐＨが放出を促進するために用いられる唯一の条件である場合、ｐＨは約８．０である。バイオリアクターは、例えば、ｐＨの＋／−０．０５への制御を可能にし、そしてさらにより正確なコントロールが利用可能であり（例えば、＋／−０．０１へ）、そして１〜３分ごとまたはそれ未満でさえｐＨをモニターし得る。いくつかの実施態様において、少なくとも約６７％の総ウイルス粒子が培養上清において見出されるｐＨ条件下で細胞は増殖される。他の実施態様において、ウイルス粒子の少なくとも約８０％、少なくとも約８２％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％が培養上清中でみられるようなｐＨ条件下で、細胞は増殖される。好ましくは、培養上清における、Ｐ／Ｉすなわち粒子対感染性の比は、約４，０００未満、より好ましくは約３，０００未満、より好ましくは約２，０００未満、より好ましくは、１，７００未満、より好ましくは約１，５００未満である。いくつかの実施態様において、細胞は約ｐＨ８で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始）から約９６時間で収集される。他の実施態様において、細胞は約ｐＨ８で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始）から約７２時間で収集される。他の実施態様において、細胞は、約ｐＨ８で培養され、そしてヘルパーウイルスでの感染（またはへルパーウイルス機能の導入もしくは開始）から約４８時間で収集される。
【００６０】
いくつかの実施態様において、ｐＨ以外の条件（単数または複数）がウイルス放出を促進するために用いられる。例えば、他の実施態様において、ウイルス放出を促進するために温度が用いられる。一般に、培養培地の温度は約３０℃〜約４５℃、好ましくは約３２℃〜約４２℃、より好ましくは約３５℃〜約４０℃で維持される。なおより好ましくは、そして特には、温度が放出を促進するための唯一の条件である場合、温度は約３７℃〜約３９℃である。バイオリアクターは、例えば、温度を＋／−０．５℃にコントロールし得、そして約３０秒ごと程度にモニターし得る。
【００６１】
他の実施態様においては、重量オスモル濃度がウイルス放出を促進するために用いられる。一般に培養培地の重量オスモル濃度は、約１００ｍＯｓＭ〜約６５０ＯｓＭ、好ましくは約１５０ｍＯｓＭ〜約５００ｍＯｓＭ、好ましくは約２００ｍＯｓＭ〜約４００ｍＯｓＭ、なおより好ましくは約３００ｍＯｓＭで開始されるかおよび／または維持される（特に、重量オスモル濃度が放出を促進するために用いられる唯一の条件である場合）。当該分野で十分に理解される用語、重量オスモル濃度は、水１ｋｇあたりの溶質分子の数として規定される。一般に、ＮａＣｌおよび他の塩、マンニトール、グルコースのような化合物が重量オスモル濃度に寄与する。重量モル濃度は、例えば、浸透圧計を用いる凝固点降下のような当該分野の標準的技術を用いて測定され得る。
【００６２】
本発明の方法において用いられ得る他の条件としては、以下の任意の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：インスリン、ＥＧＦおよびＦＧＦのような増殖因子；グルコース濃度；溶存酸素濃度；強化培地（例えば、さらなるグルコースおよび／または他の栄養素（例えば、ビタミンおよびアミノ酸））。グルコース濃度は、一般に約０．１〜約２０ｇ／ｌ；より好ましくは約０．５〜約１５ｇ／ｌ；より好ましくは約１〜約１０ｇ／ｌである。酸素濃度（代表的には、例えば、溶存酸素電極または血液ガス分析器により測定される）は、通常、空気に対して約１０％〜約２００％、好ましくは、空気に対して約２０％〜約１００％、好ましくは空気に対して約３０％〜約７５％である。一般に、細胞密度が高くなればなるほど、培地はより強化される。培地条件は、潅流のような当該分野で公知の技術を用いて維持および／または補充され得る。
【００６３】
プロデューサー細胞は、ウイルスの培地への放出を促進するために適切な時間間隔で増殖される。一般に、細胞は、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日までの間増殖され得る。約１０日後（または、用いられる培養条件および特定のプロデューサー細胞に依存して、より早く）、産生のレベルは一般的に有意に低下する。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は、一般に、本明細書において記載される適切なプロデューサー細胞において、ヘルパーウイルス機能を供給することに基づいて開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染（またはウイルス産生開始）後、約４８時間〜約１００時間、好ましくは約４８時間〜約９６時間、好ましくは約７２時間〜約９６時間、好ましくは約６８時間〜約７２時間に回収される。本実施例では、結果は通常、例えば、「２日」、「３日」などの日数で表現される。これらの表示は通常、ヘルパーウイルスでの感染から測定したさらなる日数を示す。すなわち、「３日」で報告される結果は、一般に、その結果がヘルパーウイルス機能の導入の時点から約２日（すなわち４８時間）で得られたことを示す。
【００６４】
上記のように、放出を促進する条件の任意の１つ以上の、任意の組み合わせが用いられ得る。例えば、細胞は以下の任意の１つ以上の条件のもとで増殖され得る：（ａ）約８．０のｐＨ；（ｂ）約３９℃の温度；（ｃ）約３００ｍＯｓＭ；（ｄ）強化培地（約２〜３日間）。「強化培地」は、一般に、血清が減少され得るか排除さえされ得るように、さらなる無機塩（例えばＭｇ2、Ｃａ+2）、ビタミン、および／または補因子について強化されたことを意味する。好ましい実施態様では、細胞は以下の条件のもとで増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（ｂ）約ｐＨ８．００；（ｃ）約３９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約９６時間で回収される。好ましい実施態様において、細胞は以下の条件下で増殖される：（ａ）約ｐＨ８．００；（ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約９６時間で回収される。別の実施態様において、細胞は以下の条件下で増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（ｂ）約ｐＨ８．００；（ｃ）約３９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約７２時間で回収される。別の実施態様において、細胞は、以下の条件下で増殖される：（ａ）約ｐＨ８．００；（ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約７２時間で回収される。別の実施態様では、細胞は以下の条件のもとで増殖される：（ａ）約３００ｍＯｓｍ；（ｂ）約ｐＨ８．００；（ｃ）約３９℃；（ｄ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約４８時間で回収される。別の実施態様では、細胞は以下の条件下で増殖される：（ａ）約ｐＨ８．００；（ｂ）約３９℃；および（ｃ）そしてヘルパーウイルスでの感染から約４８時間で回収される。
【００６５】
いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持され、そして培養物は約３９℃の温度で増殖される。いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持され、そして重量オスモル濃度（少なくとも開始オスモル濃度）は約３００ｍＯｓｍである。いくつかの実施態様では、ｐＨは、約８．０に維持され、そして重量オスモル濃度（少なくとも開始オスモル濃度）は約３００ｍＯｓｍであり、そして培養物は約３９℃の温度で増殖される。
【００６６】
いくつかの実施態様において、細胞は同調化される。これは，例えば、特にヘルパーウイルス機能の付加前に、ストレス条件に細胞を供することにより達成され得る。同調化は、全体的生産性に寄与し得る。ストレスの可能性のある形態としては、栄養ストレス、浸透性ストレス、ｐＨストレス、温度ストレス、有酸素ストレス、機械的ストレス、放射ストレスおよび毒素ストレスが挙げられるがこれらに限定されない。栄養ストレスが課される非限定的な例は、１つ以上のアミノ酸において欠乏している培地においてプロデューサー細胞を培養することである。
【００６７】
本発明はまた、ウイルス放出を促進する因子または条件でプロデューサー細胞（すなわち、インタクトなプロデューサー細胞）を処置する方法（例えば、細胞を透過性にする因子（例えば、イオノフォアまたは毒素（例えば、細菌毒素）、浸透性ショック）での処置）を含むこともまた理解される。これらの実施態様について、培養集団のプロデューサー細胞は、一般にその統合性を保持する（すなわち、溶解されない）（しかし、任意の細胞培養集団における場合、いくつかの細胞は溶解され得る）。一般に、以下のほぼ任意の割合未満の細胞が溶解される：５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、３％、２％、１％。あるいは、一般に、以下のほぼ少なくとも任意の割合の細胞内容物が細胞内で保持される（すなわち、細胞膜に保持される）：４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％。
【００６８】
（放出されたウイルス粒子の収集および精製）
プロデューサー細胞は、懸濁液中で、または適切な表面に付着されて培養され得る。懸濁液または固定化培養の方法は、当該分野で公知である。放出されたウイルス粒子の集団の生成の際、その放出されたウイルス粒子は、さらに使用するために収集および／または精製され得る。以下により詳細に考察するように、培養培地中のウイルス粒子は、プロデューサー細胞から当該分野で公知の方法（例えば、遠心分離または濾過（例えば、中空繊維膜中での接線流濾過））を使用して分離される。好ましくは、１つ以上のさらなる精製工程が、プロデューサー細胞を培養培地から分離した後に行われる。このような工程の例には、適切なフィルターまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用しての濃縮が含まれるが、これらに限定されない。種々の産生および精製方法が、ＷＯ９９／１１７６４（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００）（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載される。
【００６９】
いくつかの実施態様において、培養上清（細胞が除去された後）は、反対電荷のイオン性クロマトグラフィーに供される。いくつかの実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に行われる。その他の実施態様において、陽イオン交換は、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に行われる。いくつかの実施態様において、培養上清は、ヘパリン硫酸上でクロマトグラフィーに、好ましくは、反対電荷のイオンクロマトグラフィーの処置後に、より好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー上での培養上清の処置、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーの後に、供される。これらの技術は、より詳細に以下に記載される。
【００７０】
例示のために、培養上清、または陰イオン交換もしくは陽イオン交換カラムから溶出され、および／もしくは接線流濾過によって濃縮された調製物は、ヘパリン硫酸を含むカラムに結合させることによって精製され得る。次いで、ＡＡＶは、このようなカラムから塩を含有する緩衝液（例えば、ＮａＣｌの直線勾配）を使用して溶出され得る。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからプールされた画分から得られるＡＡＶは、ＴＭＥＧ＋１００ｍＭのＮａＣｌ中にて３００Ｋの接線流濾過膜を使用して濃縮され、そしてダイアフィルトレーションされ得る。この濃縮物は、１ｍｌのヘパリン硫酸カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  「Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ」カラム）上に注入され、ＮａＣｌの直線勾配を使用して溶出され得る。
【００７１】
以下の節は、本発明の産生システムおよび方法のより詳細な構成要素を記載する。
【００７２】
（ヘルパーウイルス機能およびＡＡＶを含むプロデューサー細胞）
本発明の方法において、ウイルス複製およびカプセル化に必要とされる成分を含むプロデューサー細胞は、適切な条件下（すなわち、ウイルス放出を促進する条件）で培養される。いくつかの基準は、本明細書中に記載されるｒＡＡＶ粒子の産生における使用のための細胞の選択に影響を及ぼす。最初の事項として、その細胞は、選択されたヘルパーウイルスを用いる場合、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを可能にするものでなければならない。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞は、ＡＡＶによって生産的に感染され得、そして多くの細胞もまたアデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染され得るので、多くの種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれらの基準を有効に満足することは明白である。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、組換えＡＡＶベクター調製物の大規模生産を容易にするために培養物中で容易に増殖され得るものである。しかし、このような細胞の多くもまた、この基準を有効に満たす。大規模生産が所望される場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択にも影響を与える。例えば、以下および当該分野においてより詳細に記載されるように、いくつかの生産技術および培養容器もしくはチャンバーが付着細胞または接着細胞の増殖のために設計されており、他方、他のものが懸濁細胞増殖のために設計されている。後者の場合、従って、宿主細胞は、好ましくは、懸濁増殖に適合されたかまたは適合可能である。しかし、接着またはアンカー依存性とみなされる細胞および細胞株の場合でさえ、（以下に記載されるように）懸濁増殖しうる細胞について連続的に選択することによってアンカー依存性親株の懸濁適合性改変体を誘導させることが可能である。
【００７３】
温度感受性のヘルパーウイルスが使用される場合、その細胞は、そのヘルパーウイルスの複製に非許容性である条件下でｒＡＡＶベクターを有効に複製し得なければならない。例示のために、アデノウイルスｔｓ１４９をｔｓへルパーウイルスとして使用する場合（以下に記載されるように）、その細胞は、３２℃を充分超える温度、好ましくは、約３９．５℃でｒＡＡＶ複製およびパッケージングを支持し得なければならない。ヒト２９３細胞は、これらの規準を満たす細胞株の一例であるが、他の多くの細胞および細胞株がこの比較的高温でｒＡＡＶを複製し得る。
【００７４】
最終的に、複製およびパッケージングに必要であるヘルパーウイルス（またはヘルパーウイルス機能）、ｒＡＡＶベクター配列、およびすべてのＡＡＶ配列は、同じ細胞に存在しなければならない。１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子がベクターから別個に提供される場合、以下を含む宿主細胞が提供される：（ｉ）１以上のＡＡＶパッケージング遺伝子、ここでこのＡＡＶパッケージング遺伝子は各々が、ＡＡＶ複製またはキャプシド形成タンパク質をコードする；（ｉｉ）ｒＡＡＶベクターまたはプロベクターを使用してこの宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチド、ここで、このｒＡＡＶベクターまたはプロベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲに隣接してその異種ポリヌクレオチドを含み、そしてそのＡＡＶパッケージング遺伝子において欠損している；ならびに（ｉｉｉ）必要なヘルパーウイルス機能をコードするヘルパーウイルスまたは配列。しかし、これらのエレメントの１以上が単一のレプリコンにおいて合わせられ得ることにも注意すべきである。例示のために、ヘルパーウイルスはまた、ｒＡＡＶプロベクターまたはＡＡＶパッケージング遺伝子を含み得る。
【００７５】
ヘルパーウイルスは好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを感染させるのに充分なレベルで細胞培養物中に導入されるが、そうでなければ得られた調製物に存在するヘルパーウイルスの量を制限するために、最低限に維持され得る。１〜１００の感染多重度すなわち「ＭＯＩ」が使用され得るが、５〜１０のＭＯＩが代表的に適切である。
【００７６】
同様に、ＡＡＶベクターおよび／またはパッケージング遺伝子が一過的にパッケージング細胞に導入される場合（安定に導入されるのとは反対に）、それらは、好ましくは、培養物中の細胞のほとんどを遺伝的に改変するのに充分なレベルで導入される。一般的に必要な量は、細菌プラスミドとして供給される場合１０6細胞あたり１０μｇのオーダーであり；あるいはＡＡＶ粒子として供給される場合は、１０5細胞あたり１０8粒子である。最適な量の決定は、当業者の技術範囲内である慣用的な力価決定の実施である。
【００７７】
これらのエレメントは、同時または任意の順に連続的に、その細胞に導入され得る。その細胞がそのエレメントのいずれかによって遺伝的に変化している場合、その細胞は、次のエレメントが導入される前に、選択され得そして増殖させられ得る。
【００７８】
１つの好ましい実施態様において、ヘルパーウイルスは、最後に細胞に導入されて、常在性のｒＡＡＶベクターのレスキューおよびパッケージングを行う。この細胞は、一般的に、ＡＡＶパッケージング遺伝子に必要な程度にまで既に補充されている。好ましくは、ｒＡＡＶベクターまたはパッケージング遺伝子のいずれか、またはより好ましくはその両方が、その細胞に安定に組み込まれる。他の組合せも可能であることも容易に理解される。このような組合せは、本発明の範囲内に含まれる。
【００７９】
一旦宿主細胞に必要なエレメントが提供されると、その細胞は、ＡＡＶ複製に許容性である条件下で培養されて、ｒＡＡＶベクターの複製、パッケージングおよび放出をさせる。適切な培養時間は、多くの考慮に依存し、そして上記で議論したように変化し得る。培養時間は好ましくは、産生レベルのピークに対応するように調整され、そして代表的には３〜６日間である。好ましくは、少なくとも１００のウイルス粒子が１細胞当たり産生され；より好ましくは１細胞当たり、少なくとも約１０００粒子、なおより好ましくは１細胞当たり少なくとも約１０，０００粒子産生される。好ましくは、２×１０5細胞当たり，少なくとも０．５×１０6、より好ましくは少なくとも約１×１０6細胞、さらにより好ましくは少なくとも約２×１０6ＲＵ／ｍｌ  ＡＡＶベクターが、培養期間の間に産生される。必要に応じて、大規模生産方法（例えば、懸濁培養または接線流濾過）が使用され得る。次いで、ＡＡＶ粒子が収集され、そしてそれらを調製するために使用された細胞から単離される。
【００８０】
本発明の方法によって得られるｒＡＡＶ粒子の調製物は、好ましくは、高密度の感染性ＡＡＶ粒子を含み、そしてヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質および細胞砕片、および他の混入物を実質的に含まない。所望の特性は、以下を含む：
・  公知の標準を用いて複製アッセイまたは定量ハイブリダイゼーション比較において決定される場合、少なくとも１０7、好ましくは少なくとも約１０8、より好ましくは少なくとも約１０9ＲＵ／ｍｌの濃度
・  １０8ＲＵのｒＡＡＶ粒子あたり、１０3以下、好ましくは約１０2以下、より好ましくは１０1以下のヘルパーウイルスの感染性粒子
・  ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質（例えば、アデノウイルスのヘキソンまたはペントンファイバー）についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、タンパク質ベース（重量／重量）で、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満、さらにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスによる混入物
・  ＳＤＳゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質または細胞特異的タンパク質についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．０１％未満、さらにより好ましくは約０．００１％未満のヘルパーウイルスまたは細胞タンパク質（重量／重量）による混入物
・  好ましくは、その調製物はまた、細胞の脂質、糖質および／または核酸のような他の潜在的な細胞成分を実質的に含まない。
【００８１】
本開示に概説される方法は、小さな実験バッチまたは１０〜１００リットル以上の調製バッチを調製するのに適切である。大規模バッチ調製について、以下の特性もまた所望される：
・  この調製物において、合計少なくとも１０10、好ましくは１０12、そしてより好ましくは１０14ＲＵのＡＡＶベクター粒子。
【００８２】
必要に応じて、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ粒子について富化するため、ヘルパーウイルス粒子を枯渇させるため、または他の方法で被験体への投与に適切にさせるためにさらに処理され得る。精製技術は、等密度勾配遠心分離およびクロマトグラフィー技術を含み得る。感染性ヘルパーウイルス活性の減少は、当該分野で公知なように、熱処理またはｐＨ処理による不活化を含み得る。他の処理としては、濃縮、濾過、ダイアフィルトレーション、または適切な緩衝液もしくは薬学的な賦形剤との混合が挙げられ得る。調製物は、分配のために単位用量および多用量アリコートに分割され得、これは、そのバッチの本質的な特徴（例えば、抗原性内容物および遺伝的内容物の均質性、および混入するヘルパーウイルスの相対比）を保持する。
【００８３】
上記に記載のような種々の所望の特性を示すヘルパーウイルスおよびＡＡＶの調製物の生成のための例示的な技術は、以下の節において提供される。
【００８４】
ウイルス調製物の感染性力価の決定のための種々の方法が当該分野で公知である。力価決定のための１つの方法は高処理能力力価決定アッセイである。高処理能力力価決定アッセイにおいて、各々が哺乳動物細胞のアリコートおよびウイルス調製物のアリコートを含む培養ウェル（ならびに、例えば、細胞単独、ウイルス単独を含むコントロールウェル、および何も含まないコントロールウェル）のアレイが確立される。培養ウェルのアレイは、例えば、マイクロタイター容器の形態においてであり得る。代表的に、力価測定されるウイルス調製物のアリコート（例えば、連続希釈したアリコート）をその細胞に添加し、次いで、その細胞およびウイルスを、ウイルスの複製を可能にする条件（代表的には、哺乳動物宿主細胞に適した増殖条件）下でインキュベートする。ウイルスの複製後、ウイルス核酸を、一般に、哺乳動物細胞の溶解によって放出させる（必要に応じて溶解を促進する条件または薬剤を用いて）。複数の溶解物における核酸（ウイルス核酸を含む）を、核酸を結合する条件下で（タンパク質および他の混入物を除去するのに適切な洗浄）メンブレンに移しそして固定する。このメンブレンは好ましくは、もとのアレイの個々のウェルが、次いで、（各培養ウェルの溶解物由来の）核酸（これは、そのメンブレン上の対応する位置に結合している）の「プール」によって表される培養アレイの複製または鏡像である。次いで、そのメンブレンと、標識したウイルス特異的（またはウイルス挿入物特異的）プローブとをハイブリダイズすることを使用して、そのアレイの点の各々、および対応して、もとの培養ウェルの各々における、ウイルス特異的核酸の相対量を同定および定量し得る。核酸の移動、結合、洗浄、およびハイブリダイゼーションのための条件および材料は、慣用的な分子生物学技術から適合され得る（例えば、「ドットブロット」ハイブリダイゼーション（当該分野で記載されるような）。
【００８５】
（ＡＡＶベクターおよびＡＡＶパッケージング遺伝子の選択および調製）
本明細書に記載される産生方法において使用されるプロデューサー細胞は、ｒＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶベクターは、通常ＡＡＶゲノムの大部分を構成するＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の全てまたは一部の代わりに、目的の異種（すなわち、非ＡＡＶ）ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型ＡＡＶゲノムにおける場合のように、ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、上記の２つのＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する。ｒＡＡＶ構築物が単一の（代表的には改変された）ＩＴＲに隣接するバリエーションもまた、当該分野において記載され、そして本発明とともに使用され得る。
【００８６】
任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが、適切である。なぜなら、種々の血清型は、遺伝子レベルにおいてさえ、機能的および構造的に関連するからである（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ、編（１９８８）の１６５〜１７４頁；およびＲｏｓｅ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１、１９７４を参照のこと）。全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される、類似の複製特性を明らかに示す；そして、その全ては一般的に３つの関連するキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２で発現されるタンパク質）を有する。関連性の程度は、ゲノム長の全体にわたる、血清型の間の広範な交差ハイブリダイゼーションを示すヘテロ２重鎖分析；およびＩＴＲに対応する末端での、類似の自己アニーリングセグメントの存在によって、さらに示唆される。類似の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が、類似の調節性制御下にあることを、示唆する。種々のＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ２が最も一般に使用される。
【００８７】
ｒＡＡＶベクターは、異種ポリヌクレオチドを含有する。このポリヌクレオチドは、代表的には、遺伝子治療（例えば、特定の表現型の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）の状況において、標的細胞に機能を提供する能力のために興味深い。そのような、異種ポリヌクレオチドまたは「トランスジーン」は、一般的に、所望の機能またはコード配列を提供するのに十分な長さのものである。ＡＡＶ２粒子内へのキャプシド化のために、トランスジーンは、好ましくは、約５ｋｂ未満であるが、より長い配列のＡＡＶウイルス粒子内へのパッケージングを可能とするために、他の血清型および／または改変が使用され得る。
【００８８】
異種ポリヌクレオチドの転写が意図される標的細胞において所望される場合、これはそれ自体のプロモーターか、または異種プロモーター（例えば、当該分野において公知のように、標的細胞内の転写の所望のレベルおよび／または特異性に依存する）に、作動可能に連結され得る。種々の型のプロモーターおよびエンハンサーが、この状況での使用に適切である。構成性プロモーターは、遺伝子転写の継続するレベルを提供し、一方、誘導性プロモーターは、一般的に、インデューサーの非存在下において低い活性を示し、そしてインデューサーの存在下でアップレギュレートされる。プロモーターおよびエンハンサーはまた、組織特異的であり得る；すなわち、これらは、特定の細胞型においてのみ、（おそらくそれらの細胞においてのみ独特に見出される遺伝子調節エレメントに起因して）その活性を示す。
【００８９】
プロモーターの例示的な例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）エンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターおよびＬＴＲエレメントを含む種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーター）、ステロイドホルモン誘導性プロモーター、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来のプロモーターが、挙げられる。組織特異的プロモーターの例としては、種々のサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）プロモーター（肺における発現のため）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現のため）、およびアルブミンプロモーター（肝臓での発現のため）が挙げられる。非常に多種の他のプロモーターが公知であり、そして一般的に当該分野において入手可能であり、そして、そのようなプロモーターの多くの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのような配列データベースにおいて入手可能である。
【００９０】
意図された標的細胞において、翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオチドはまた、好ましくは、翻訳を容易にする制御エレメントもまた含有する（例えば、リボソーム結合部位、すなわち、「ＲＢＳ」、およびポリアデニル化シグナル）。従って、異種ポリヌクレオチドは、一般的に、適切なプロモーターに作動可能に連結した、少なくとも１つのコード領域を含み、そして、例えば、作動可能に連結したエンハンサー、リボソーム結合部位、およびポリＡシグナルを含有し得る。異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域、または同一かまたは異なるプロモーターの制御下の１つより多いコード領域を含有し得る。制御エレメントおよびコード領域の組み合わせを含む全体のユニットは、しばしば、発現カセットと称される。
【００９１】
異種ポリヌクレオチドは、組換え技術によって、ＡＡＶゲノムのコード領域中に、または好ましくは、その代わりに（すなわち、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組み入れられ、そして好ましくは、いずれかの側でＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する。このことは、ＩＴＲがコード配列の上流および下流の両方に、いずれか一方は直接の近傍位置において、好ましくは（必要ではないが）複製コンピテントなＡＡＶゲノムを再生し得る組換えの可能性を減少するために、ＡＡＶ起源の介在配列を全く含まずに出現することを意味する。単一のＩＴＲが、通常２つのＩＴＲを含む配置に関連する機能を行うのに十分であり得（ＷＯ９４／１３７８８）、従って、単一のＩＴＲのみを有するベクター構築物が、本発明のパッケージング方法および生成方法に関連して使用され得る。
【００９２】
ｒｅｐのネイティブのプロモーターは、自己調節性であり、そして生成されるＡＡＶ粒子の量を制限し得る。ｒｅｐ遺伝子はまた、異種プロモーターと作動可能に連結され得る（ｒｅｐは、ベクター構築物の一部として提供されるか、または別々に提供される）。ｒｅｐ遺伝子の発現によって、強力にはダウンレギュレートされない異種プロモーターはいずれも適切である；しかし、誘導性プロモーターは、好ましい。なぜなら、ｒｅｐ遺伝子の構成性発現は、宿主細胞に負の影響を有し得るからである。非常に多種の誘導性プロモーターが、当該分野において公知であり、そして例は上記に列挙されている。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを相補するために使用されるヘルパーウイルスによって誘導されるサブクラスである。多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた、記載され、これには、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質によって誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６または１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導されるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーターが、挙げられる。
【００９３】
ヘルパーウイルス誘導性プロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）を同定および試験するための方法は、記載されている。ＷＯ９６／１７９４７（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００９４】
種々のＡＡＶゲノムの相対的なキャプシド形成の大きさが制限されるので、このゲノム内への大きい異種ポリヌクレオチドの挿入は、ＡＡＶ配列の一部を除去することを必要とする。１以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製コンピテントなＡＡＶ（「ｒｃＡＡＶ」）を生成する確率を減少するために、いずれの場合においても所望される。従って、ｒｅｐ、ｃａｐまたはその両方のコード配列またはプロモーター配列は、これらの遺伝子によって提供される機能がトランスに提供され得るので、好ましくは除去される。
【００９５】
生じたベクターは、これらの機能において「欠損性」であるといわれる。このベクターを複製およびパッケージングするために、この損失した機能を、種々の損失ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子産物に必要な機能を共にコードする、１つのパッケージング遺伝子または複数のパッケージング遺伝子で相補する。パッケージング遺伝子またはパッケージング遺伝子カセットは、ベクター配列と離れて提供されるパッケージング遺伝子との間で、複製の間に相同組換えを最小化するために、好ましくは、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接されず、そして好ましくは、ｒＡＡＶゲノムと実質的な相同性を全く共有しない。相同性および対応する組換えの頻度のレベルは、相同性配列の長さ、および共有される同一性のレベルを増加することによって増加する。所定の系において関係する相同性のレベルは、当該分野で公知のように、理論的に決定され、そして実験的に確認される。しかし、代表的に、組換えは、たとえ重複配列の全長にわたって少なくとも８０％同一であっても、その重複配列が約２５ヌクレオチド配列未満である場合か、またはたとえ重複配列の全長にわたって少なくとも７０％同一であっても、その重複配列が約５０ヌクレオチド配列未満である場合には、実質的に減少または排除され得る。もちろん、さらに低いレベルの相同性は、それらが組換えの確率をさらに減少するので、好ましい。重複相同性を全く有さなくとも、ｒｃＡＡＶを生成するいくらかの残存頻度があることは明らかである。ｒＣＡＡＶを生成（例えば、非相同組換えにより）する頻度のなおさらなる減少は、ＷＯ９８／２７２０４（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載されるように、ＡＡＶの複製およびキャプシド形成の機能を「分裂」させることによって得られ得る。
【００９６】
ｒＡＡＶベクター構築物、およびその相補的パッケージング遺伝子構築物は、多くの異なる形態で本発明において実用され得る。ウイルス粒子、プラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞は全て、このような構築物をパッケージング細胞内に、一過的または安定的のいずれかで導入するために使用され得る。他の組み合わせも可能である。
【００９７】
ＡＡＶベクターおよび相補的パッケージング遺伝子は、もし存在する場合、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、またはこれらの任意の組み合わせの形態で提供され得る。あるいは、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子のいずれか、またはその両方は、遺伝子改変された（好ましくは、遺伝的に改変されるか、または安定に組み込まれた）真核生物細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、またはその両方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の発生は、信頼のおけるレベルで発現される材料の、確立された供給源を提供する。従って、種々の異なる遺伝子改変された細胞は、当該分野（特に、米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９８／２３０１８；米国特許第５，６５６，７８５号；ＷＯ９８／２７２０４）に記載されるように、本発明の状況において使用され得る。
【００９８】
従って、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、プラスミド中に存在し得るか、そして／またはプロデューサー細胞のゲノム内に安定に組み込まれ得る。
【００９９】
（細胞内への遺伝物質の導入）
当該分野で記載され、そして本明細書および上記で引用された参考文献の両方において説明されるように、遺伝物質を、プロデューサー細胞内に、このような細胞を形質転換または形質導入するための任意の種々の手段（例えば、細菌プラスミドを用いたトランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、および脂質ベースの種々の任意の組成物を用いる導入（しばしば「リポフェクション」と呼ばれるプロセス））を用いて導入し得る。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該分野で記載され、そして広く利用可能である。
【０１００】
適切に改変されたプロデューサー細胞の選択は、当該分野の任意の技術により実施され得る。例えば、細胞を改変するために用いられるポリヌクレオチド配列は、当該分野で公知のような１つ以上の検出可能または選択可能マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子）と同時に挿入され得るか、またはそれらに作動可能に連結され得る。導入されたポリヌクレオチドの獲得、局在化および／または維持についての試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（サザンブロッティングおよび当該分野で公知の他の手順など）を用いて実施され得る。発現の試験は、遺伝子的に改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析によるか、または対応する遺伝子産物に対する間接的な免疫蛍光により容易に実施され得る。パッケージング能力および効率の試験および確認は、細胞に、ＡＡＶの残りの機能的成分およびヘルパーウイルスを導入し、ＡＡＶ粒子の産生を試験することにより得られ得る。細胞が、複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合、一般に、それらを、細胞に別々に導入し、各工程を順次確証することが（必須ではないが）より便利である。このような技術を記載する参考文献は、本明細書に引用されたものを含む。
【０１０１】
（ヘルパーウイルスの選択および調製）
上記のように、ＡＡＶは、自己複製欠損であるパルボウイルスであり、そして一般に、特定の複製機能を供給するヘルパーウイルスに依存しなければならない。種々のヘルパーウイルスが、本発明の方法において使用され得る。
【０１０２】
多くのこのようなヘルパーウイルスが同定され、これらは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイルスおよびＨＨＶ−６を含むがこれらに限定されない）、およびポックスウイルス（特にワクシニア）を含む。これらウイルスのいずれかを本発明とともに用い得る。
【０１０３】
頻繁に、ヘルパーウイルスは、意図される宿主細胞に感染し得る、あるタイプおよびサブグループのアデノウイルスである。サブグループＣのヒトアデノウイルス、特に血清型１、２、４、６、および７が一般に用いられる。血清型５が一般に好ましい。アデノウイルスの特徴および増殖パターンは当該分野で公知である。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら編、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」中の、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、７７１〜８１６頁を参照のこと。
【０１０４】
必須ではないが、原則的に、ヘルパーウイルス株は、最終的に遺伝子治療を受ける被験体中で複製欠損であることが所望される。従って、ｒＡＡＶ調製物中に存在する任意の残存ヘルパーウイルスは、複製不能である。Ｅ１Ａ領域、またはＥ１Ａ領域およびＥ３領域の両方が除去されたアデノウイルスは、大部分のヒト細胞に対して感染性ではない。それらは、失われた活性を相補し得る許容細胞株（例えば、ヒト２９３細胞株）中で複製され得る。ヘルパー機能と関連するようであるアデノウイルスの領域、およびそうでない領域は、同定され、そして当該分野で記載されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓｉら、ＷＯ９７／１７４５８、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。
【０１０５】
（条件的感受性ヘルパーウイルスの使用）
「条件的感受性」ヘルパーウイルスもまた、ヘルパーウイルス活性を提供するために使用され得る。ＷＯ９９／１１７６４を参照のこと。このようなヘルパーウイルス株は、ＡＡＶがそれ自身効果的なゲノム複製を行わない少なくとも１セットの条件下で、宿主細胞中でのＡＡＶ複製を支持し得る性質を最小限有さなければならない。ヘルパーウイルス活性が、インタクトなウイルス粒子として提供される場合、一般に、このウイルスが、第２のセットの条件下で、宿主細胞中で複製し得ることが必要である。第１のセットの条件は、第２のセットの条件と、容易に制御可能な特徴（必要な補因子（例えば、カチオン）の存在または非存在、阻害薬物の存在または非存在、または温度のような環境条件におけるシフトなど）が異なる。最も簡便には、２つの条件の差異は、温度であり、そしてこのような条件的感受性ウイルスは、それゆえ、温度感受性ヘルパーウイルス（ｔｓＨＶ）と呼ばれる。
【０１０６】
「温度感受性」または「ｔｓ」ヘルパーウイルスは、特定の温度範囲（「許容」温度範囲）、代表的には約１５〜３５℃、そして好ましくは約２０〜３２℃で、真核細胞中でその遺伝物質を複製し得るものである。しかし、「非許容」温度では、たとえその他の条件が同じに保たれたとしても、遺伝物質の複製の速度は、実質的により低く、少なくとも１０倍低く；通常少なくとも約１００倍より低く；および好ましくは少なくとも約１０００倍低い。代表的には、この温度は、約３５〜５０℃、一般に、約４２℃である。このような、ｔｓヘルパーウイルスの代表的な実施例では、このウイルスは、約２０〜３２℃の温度のような比較的低温度で効率的に複製し得るが、約３７〜４２℃の温度のような比較的高温では効果的に複製し得ない。ウイルス感染細胞は、それにもかかわらず、非許容温度で、ＡＡＶ産生のためのヘルパー機能を含むがこれに限定されない、ウイルスに起因し得るいくつかの代謝プロセスを示し得ることが理解される。
【０１０７】
温度感受性ヘルパーウイルスは、感染細胞を許容温度で培養することにより、大量に産生し得る。次いでＡＡＶベクターは、ベクターエレメントおよび温度感受性ヘルパーウイルスを含む細胞を、非許容温度で培養することにより産生され得る。ベクター調製物は、ヘルパーウイルス成分を実質的に含んでいない。
【０１０８】
多数の温度感受性アデノウイルス改変体が当該分野で記載されている；例えば、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１）；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６５：３０４、１９７０）；Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：８２７、１９７１）；およびＳｈｉｒｏｋｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：４７４、１９７４）により記載された改変体を参照のこと。相補性分析は、このような改変体が、複数の異なる相補性グループに入ることを示している（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３４：４１９、１９７４）。このことは、アデノウイルス複製サイクル中の多くの工程に温度感受性を与え得ることを示唆する。
【０１０９】
ＡＡＶ複製のヘルパー機能は、アデノウイルスサイクルの一部分のみがインタクトであることを必要とするので、非許容温度で、種々の変異体のヘルパー機能を試験することは、ヘルパー機能をマッピングするための手段を提供する。例えば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：３１７、１９７１）は、温度感受性トリアデノウイルス改変体がＡＡＶ１およびＡＡＶ２の複製を支持することを報告した。Ｉｔｏらは、ヒトアデノウイルス７の温度感受性変異体ｔｓ１３（Ａｄ７ｔｓ１３）が、野生株と同じく効率的に非許容温度でＡＡＶ複製を補助することを報告した。Ｄｒａｋｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６０：２３０、１９７４）は、３つのグループの、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）の温度感受性変異体によるＡＡＶ４抗原合成の相補を報告した。Ｈａｎｄａら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ．  ２９：２３９、１９７５）は、ヒトアデノウイルス変異体Ａｄ５ｔｓ３６、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔｓ１４９、Ａｄ１２ｔｓＡ２７５、Ａｄ１２ｔｓＢ２２１、およびＡｄ１２ｔｓＣ２９５によるＡＡＶ１ウイルス産生に対するヘルパー活性を報告した。Ｏｓｔｒｏｖｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０４：５０２、１９８０）は、温度感受性変異体、Ａｄ５ｔｓ１２５、Ａｄ５ｔｓ１３５、Ａｄ５ｔｓ１５７、Ａｄ５ｔｓ１１６、およびＡｄ５ｔｓ１４２、ならびに宿主範囲変異体ｈｒ６がＡＡＶ複製を支持する（ｈｒ３は支持しない）ことを報告した。Ｍａｙｏｒら（Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３５：５４５、１９７７）は、Ａｄ３１ｔｓ９４ではなくＡｄ３１ｔｓ１３が、非許容温度でＡＡＶ１産生を支持したことを報告した。
【０１１０】
Ｓｔｒａｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：７４２、１９７６）は、Ａｄ５ｔｓ１２５が、アデノウイルスがそれ自身複製しない条件下で、ＡＡＶ２複製を支持したことを報告した。彼らは、この性質を用いてＡＡＶ複製の間に形成されるＤＮＡ中間体を研究した。Ｍｙｅｒｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）は、ヘルパー機能に関して定量的研究を実施し、そしてＡｄ５ｔｓ１４９が非許容温度で、１細胞あたり２０，０００の感染性ＡＡＶ粒子の産生を支持したが、その一方、Ａｄ５ｔｓ１０７は、１細胞あたりほんの約１００粒子を生産したに過ぎないことを示した。Ａｄ５ｔｓ１０７は、７２ｋＤａ  ＤＮＡ結合タンパク質コード領域中に変異を有するので、彼らは、このタンパク質が、ＡＡＶ  ＲＮＡ発現において役割を果たすと結論付けた。より最近、Ｃａｒｔｅｒら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１：４７３、１９９２）は、完全に機能的な７２ｋＤａタンパク質が、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の定量的な転写後の発現に必要であることを提唱した。
【０１１１】
ヘルパーウイルスの選択された株の条件感受性改変体は、適切な変異誘発および選択戦略により生成され得る。例えば、ウイルスは、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、または５−ブロモ−２−デオキシウリジンで変異誘発され得る。所望の許容条件下で、適切な真核細胞において増加し得るが、所望の非許容条件下ではそうではない候補が選択される。例として、例えば、３２℃で増加するが、３９．５℃では増加しないアデノウイルス温度感受性変異体が得られ得る。３９．５℃対３２℃でのプラーク形成効率比は、好ましくは、１０-4より少なく、そしてより好ましくは１０-5より少ない。温度感受性アデノウイルスの適切な選択プロセスのさらなる例は、例えば、Ｅｎｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８、１９７２；およびＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１１：９５、１９７１に見出され得る。温度感受性ではなく、宿主範囲感受性であるアデノウイルス改変体の記載は、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７：３１９、１９７７に見出され得る。本発明における使用に有効な温度感受性変異体は、例えば、代替のヘルパーウイルス様単純ヘルペス１（ＨＳＶ１）、または単純ヘルペス２（ＨＳＶ２）から調製され得る。例えば、ＨＳＶ１についてＳｃｈａｆｆｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：５７、１９７３；ＨＳＶ２についてＥｓｐａｒｚａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：５５４、１９７４を参照のこと。背景のセクションで示したように、多数の条件感受性ヘルパーウイルスが記載され、そしてそれらを開発または記載した科学者から、または公的な寄託機関から得られ得る。
【０１１２】
この株は、非許容条件下でブロックされる機能が、ＡＡＶの高効率複製に必要であるものではないような、その複製サイクルにおけるステージで条件感受性を与えなければならない。使用のためのそのヘルパーウイルス株の選択は、ヘルパーウイルスおよびＡＡＶの複製要件の両方の公知の生物学を参照してなされ得る。
【０１１３】
本発明で使用のための例示のヘルパーウイルスは、Ａｄ５血清型の温度感受性アデノウイルスｔｓ１４９（Ａｄ５ｔｓ１４９）である。最適化条件下で、この株を用いて、野生型Ａｄ５により支持されるレベルに一致またはそれを超えるレベルでｒＡＡＶを産生し得る。ｔｓ１４９は、位置７５６３においてＣ−ＧからＡ−Ｔへの単一のトランジションを有する（Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ４：５３、１９９０）。これは、ＤＮＡポリメラーゼの残基４１１のアミノ酸ロイシンのフェニルアラニンへの変化を生じる。このＤＮＡポリメラーゼは、アデノウイルスのＥ２転写ユニット内に含まれる。しかし、この領域にマッピングされるその他のｔｓ変異体は、あまり適切ではない。特に、このＥ２転写ユニットはまた、７２ｋＤａ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）のコード領域を含む。検出可能なＤＢＰを産生しない株（Ａｄｄ／８０２）は、ＡＡＶ複製を支持するが、そのレベルは１オーダーの大きさ減少する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１：４７３、１９９２）。Ａｄｔｓ１２５（これもまたＤＢＰコード領域にマッピングされる変異を含む）は、野生型Ａｄ５を用いるよりも一般にかなり低いレベルであるが（Ｍｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６５、１９８０）、ＡＡＶ複製を支持する（Ｓｔｒａｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０、１９７６）。従って、本発明における使用のための適切な温度感受性アデノウイルスベクターは、感受性が、ゲノムのＥ２Ａ領域、好ましくはＤＮＡポリメラーゼコード領域にマップされるベクターを含む。
【０１１４】
当業者は、候補ヘルパーウイルス株のパネルを、候補細胞中で、そのヘルパーの自己複製に非許容的である条件下で用いるｒＡＡＶ複製アッセイを実施することにより、ヘルパーウイルスとしての使用にどのウイルス株が適切であるかを容易に決定し得る。温度感受性改変体について、スクリーニングは、株の既知の性質に従って非許容温度で行われる。非許容温度は、一般に、許容温度より高く、代表的には約３５〜５０℃、好ましくは３８〜４５℃、より好ましくは約３９．５℃である。対応する野生型ウイルスにより支持されるレベルの１オーダーの大きさの中にあるレベルでＡＡＶ複製を支持する改変体が好ましい。スクリーニングを実施することで、当業者は、本開示の他の教示を取り込むべきである。特に、野生型ウイルスでピークのＡＡＶ産生を与える時間培養することによるスクリーニングは、不十分である。候補ヘルパーウイルスをより長い期間用い、次いでピーク収穫時間にある野生型ウイルスと比較する速度論的マトリックスが設定されるべきである。
【０１１５】
一旦、適切なヘルパーウイルス株が選択されたなら、それは、本発明において多くの異なる形態で履行され得る。ウイルス粒子、ウイルスプラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞のすべてが用いられ得る。
【０１１６】
１つの実施態様では、ヘルパーウイルスのゲノム（または最小限、ヘルパー機能をコードするヘルパーウイルスゲノムの領域）が宿主細胞中に導入され、ＤＮＡプラスミド、または相補的機能を提供する複数のプラスミドの形態にあるｒＡＡＶベクターの複製に用いられる。アデノウイルスの実験操作のための手順は、当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」：Ｍｕｒｒａｙ  ＥＪ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第７巻、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ：Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１：１０９−１２８を参照のこと。こらは、アデノウイルスの増殖、滴定、および精製、同時トランスフェクションおよびインビボ組換えの詳細なプロトコルを提供する。アデノウイルスプラスミドは、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａから市販されている。
【０１１７】
別の実施態様では、宿主細胞は、アデノウイルス遺伝子で安定にトランスフェクトされるか、または遺伝子的に改変されてｒＡＡＶ複製に必須の機能を提供する。あるいは、宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの部分のみが遺伝子的に改変され得、次いでアデノウイルス粒子またはプラスミドで感染またはトランスフェクトされる。特許出願ＷＯ９５／２７０７１およびＷＯ９５／３４６７１は、遺伝的に改変されてアデノウイルス機能を提供する宿主細胞を記載し、これは、種々の欠損アデノウイルス構築物の複製性質を補完する。
【０１１８】
なお別の実施態様では、ＡＡＶ複製に用いられる宿主細胞は、自己複製し得る（しかし非許容条件下ではそうではない）ヘルパーウイルスで感染される。十分なＭＯＩを提供する必要な株の任意の調製物が用いられ得る。ＧＭＰおよびその他の規制要件を維持することにおいて、および商業的目的のスケールアップを容易にするために、好ましくは、ヘルパーウイルスの調製物は、高密度の感染性粒子を含み、そして細胞残渣およびその他の夾雑物を実質的に含まない。所望の性質は以下を含む：
・ＴＣＩＤ50アッセイで測定したとき、少なくとも１０6、好ましくは少なくとも約１０8、より好ましくは少なくとも約１０10ＩＵ／ｍｌの密度。
・総タンパク質またはアデノウイルスヘキソンに対するアデノウイルスＤＮＡの比は、ウイルス粒子の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約８０％が、アデノウイルスＤＮＡを含むことを示す。
・タンパク質について染色されたＳＤＳゲル、またはエチジウムブロマイドで染色された制限ヌクレアーゼ消化物のアガロースゲルにより検出されるとき、タンパク質またはＤＮＡレベルの非アデノウイルス物質による、２０％より少ない、好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約１％より少ない夾雑物。
・生産バッチあたり、合計少なくとも１０9、好ましくは少なくとも約１０11、より好ましくは少なくとも約１０13ＩＵ。
【０１１９】
ヘルパーウイルスは、ウイルス複製について許容性である任意の細胞において調製され得る。アデノウイルスについて、好ましい細胞は、２９３細胞およびＨｅＬａ細胞を含む。伝統的に、これらの細胞は、アデノウイルスの複製のために用いられる場合、それらは、プレート培養において使用されてきた。これらの方法は、一般に、野生型アデノウイルスよりも１または２対数分低いレベルで温度感受性アデノウイルスの複製を支持する。
【０１２０】
従って、播種密度の増加を許容する培養技術を使用することが好ましい。懸濁培養に適合させた２９３細胞およびＨｅＬａ細胞改変体が利用可能である。ＨｅＬａは、細胞増殖、生存度、および懸濁物中の形態の理由のために好ましい。これらの細胞を十分な密度（２×１０6／ｍｌ）で増殖させて、温度感受性アデノウイルス株の複製速度の低下を補い得る。一旦樹立されると、細胞にそのウイルスを感染させ、そして十分な時間（一般的に３〜７日間および代表的に約５日間）許容温度で培養する。
【０１２１】
接線流濾過は、当該分野において、その灌流、濃縮および採取の目的のために大容量の哺乳動物細胞を処理するために使用される技術である。例えば、Ｄｏｒｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：４９４、１９９０；Ｍａｉｏｒｅｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３７：１２１、１９９１を参照のこと。この技術は、本発明における使用のためのヘルパーウイルスの調製のために懸濁培養物を用いて使用することが推奨される。ＨｅＬａ  Ｓ３細胞は、７５０〜１５００秒-1の剪断力に耐え、これにより細胞の濃縮および使用した培地のダイアフィルトレーションが可能になる。
【０１２２】
ウイルスを、使用した培地からまたはその細胞の微量流動化によるかのいずれかで、その培養物から採取する。その培養物において産生されたヘルパーウイルスのレベルは、代表的に少なくとも１０7ＩＵ／ｍｌであり、そして好ましくは少なくとも約３×１０7ＩＵ／ｍｌである。
【０１２３】
上記の記載に従って調製されたヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶ複製のために使用される宿主細胞を感染させるために直接使用され得る。より通常には、このウイルスは、使用前に単離および濃縮される。ヘルパーウイルスを精製および濃縮するための現在の方法は、代表的には、等密度ＣｓＣｌ勾配を含む。この方法は、時間集約的および労働集約的であり、多数の開放処理工程を必要とし、そして規模拡大が困難である。その代わり、クロマトグラフィーによる精製が推奨される。読者は一般に、Ｐｒｉｏｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３０、１９９５；およびＨｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１４０３、１９９５を参照する。アデノウイルスの温度感受性株の単離のために特に好ましいのは、アニオン交換クロマトグラフィー、特にｐＨ７．４での連続的なＮａＣｌ勾配を用いるポリエチレンイミンの樹脂においてである。
【０１２４】
（本発明における使用のために好ましい、ＡＡＶの産生および精製）
ヘルパーウイルスを用いる場合、例示の目的で、「上流」および「下流」のプロセス相へとＡＡＶの産生および精製の議論を分割することが簡便である；「上流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるＡＡＶの産生、および「粗」ＡＡＶ調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出することをいう。「下流」プロセシングは、そのＡＡＶ調製物を精製するために使用され得る（例えば、細胞タンパク質および／または他の混入物からＡＡＶを単離するために）。
【０１２５】
本発明の好ましい局面において、ＡＡＶの上流および下流のプロセシングは、混入する細胞タンパク質、ならびに混入する任意のヘルパーウイルス（例えば、Ａｄ）またはヘルパーウイルスタンパク質を実質的に減少および／または除去するように設計された様式で実施される。これらの物質のいずれも、遺伝子移入のために使用される最終のｒＡＡＶベクター調製物において実質的なレベルで存在する場合、免疫応答の誘発に寄与し得る。
【０１２６】
以下の節は、例示の目的で、ｒＡＡＶの産生のために使用され得る技術を記載する。
【０１２７】
（（ｉ）ＡＡＶ上流処理）
ＡＡＶベクターは、必要なＡＡＶパッケージング遺伝子（例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）；少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する異種非ＡＡＶポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プロベクター；およびＡＡＶのためのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）を含む、哺乳動物細胞株から産生され得る。これらの成分は、種々の構成で細胞中に導入され得る。ＡＡＶは、任意の種々の哺乳動物細胞において複製され得そしてパッケージングされ得るので、ＡＡＶの産生のために改変され得そして使用され得る多数の細胞株が存在する。
【０１２８】
例示のために、ＡＡＶベクターは、細胞株（例えば、「Ｃ１２」（Ｋ．Ｒ．Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１１２４−１１３２、１９９６によって記載される）または「Ｃ１３７．５」株（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｌｌｅｎら、ＷＯ９６／１７９７４による、共有に係る同時係属中の出願に記載される）から産生され得る。この細胞株は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物ならびにベクター構築物を含むように操作されている。必要に応じて、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ構築物を含む、Ｃ１２またはｃｌ３７のような細胞株は、ベクター構築物を含むプラスミド（例えば、ｐｔｇＡＡＶ−ＣＦ）でトランスフェクトされ得る。または、ｒｅｐおよびｃａｐを含むプラスミド（例えば、ｐＲＳ５）、ならびにベクター構築物を含むプラスミドで細胞がトランスフェクトされ得る。この細胞は、アデノウイルスに感染させられ得るか、またはアデノウイルス遺伝子を含むＤＮＡでトランスフェクトされ得る。
【０１２９】
種々のこのようなＡＡＶ「プロデューサー」細胞が、本明細書において引用された参考文献および当該分野で記載されるように、産生され得る。
【０１３０】
ＡＡＶプロデューサー細胞は、哺乳動物細胞の増殖に一般的に適切であり、ＡＡＶ複製にもまた一般的に許容性である条件（培地、温度などを含む）下で増殖され得る。例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２懸濁培地は、その細胞の増殖について好ましく、そしてＤＭＥＭ培地単独は、ＡＡＶベクター産生について好ましい。当該分野で公知であるように、いくつかの細胞型および細胞株は、接着依存性である傾向にあるが、他の細胞は、懸濁物中で増殖し得；そして多くの接着依存性細胞もまた、懸濁増殖し得る改変体について富化しそして最終的に選択する手段として懸濁条件下で細胞のサイクルを行うことにより、懸濁物中での増殖に「適合」され得る。従って、ＡＡＶ産生のための細胞増殖は、その選択されたプロデューサー細胞株が、比較的接着依存性であるか、または懸濁適合されているか否かに一部依存して、任意の種類の容器において、実施され得る。接着依存性細胞の増殖のためのこのような容器はとして、例えば、組織培養フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアおよびバイオリアクター（例えば、中空繊維、充填ベッドまたは流動化ベッドのバイオリアクター）が挙げられる。懸濁適合した哺乳動物細胞株のための容器としては、例えば、スピナーフラスコ、タンクリアクター、およびエアリフト醗酵槽が挙げられる。
【０１３１】
ＡＡＶ複製は、一定時間、およびウイルス産生が最適になる、増殖周期における点まで進行し（好ましくは、中期から後期の対数増殖期（代表的には１〜３日間））、その時点の後、そのウイルス粒子を培養上清から採取する。
【０１３２】
接線流濾過（ＴＦＦ）は、大容量の細胞をプロセスしそして採取するために都合よく使用され得る。ＴＦＦは、動物細胞を灌流し、濃縮し、そして採取するために使用され得る。例えば、ＴＦＦを使用して、１秒あたり３０００までの平均壁剪断速度での層流条件下で細胞をプロセスし得る（例えば、Ｍａｉｏｒｅｌｌａ、Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３７：１２１−１２６、１９９１）。ＴＦＦ限外濾過を用いるウイルスの大規模濃縮は、Ｒ．Ｐａｕｌら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：６０９−６１５、１９９３により記載されている。
【０１３３】
このような技術を用いた例示的な産生の実施は、以下に記載される。
【０１３４】
（（ｉｉ）ＡＡＶ下流処理）
上記に記載されるように、ヘルパーウイルス粒子（例えば、Ａｄ粒子）を実質的に含まないＡＡＶの調製物を得ることは特に有利である。さらに、ＡＡＶベクター調製物はまた、好ましくは、ヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質（これはまた、免疫原性であり得る）を実質的に含まない。しかし、ＡＡＶ産生のための技術の適性に影響を与えるさらなるセットの限定が存在する。すなわち、遺伝子治療のためのＡＡＶの産生に特に有用であるために、その技術は、「大規模化可能」である（すなわち、大規模製造用デバイスおよび手順に関して適用可能である）ことが最も所望される。この後者のセットの限定は、塩化セシウム分離（これは、大規模調製手順にはあまり適していない）のような利用可能な標準的な技術の有用性を有効に減少または排除する。
【０１３５】
好ましくは、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶまたはＡｄの可能な精製について当該分野において言及されている種々の手順とは対照的である、イオン交換クロマトグラフィー手順によってさらに精製される。特に、当該分野で記載されているこのような手順は、代表的に、単一の型のイオン性分離、時に他の種類のクロマトグラフィー手順との組合せを使用する（例えば、Ｋ．Ｔａｍａｙｏｓｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５０７−５１３（１９９６）、およびＷＯ９６／２７６７７、１９９６年９月１２日を参照のこと）。しかし、ＡＡＶ産生の場合、連続的な反対のイオン交換クロマトグラフィーの組合せが、ヘルパーウイルス粒子およびタンパク質、ならびに細胞タンパク質を実質的に含まないＡＡＶ調製物の生成に特に有効である。両方の反対のイオン性交換の組合せは、その生成およびＡＡＶベクター調製物において代表的に生じる種々の粒子およびタンパク質混入物の全て除去するのに特に有効である。
【０１３６】
任意の種々のカチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂がこれらの手順に関して使用され得、その基礎的な特性は、それぞれ、負荷電基および正荷電基の利用可能性であり、それらの基に対して、ＡＡＶは、少なくともある程度（最も好ましくは、上記に記載のような１つ以上の混入物、すなわち、Ａｄ粒子およびタンパク質、ならびに哺乳動物細胞タンパク質の相対的結合親和性とは実質的に異なる程度に）結合し得る。理論に拘束されることは望まないが、アニオン交換工程は、アデノウイルスからＡＡＶを分離するのに特に有効であると考えられる；一方、両方の工程（しかし、特にカチオン交換工程）が、細胞タンパク質からＡＡＶを分離するのに特に有効であると考えられる。本発明者らはまた、以下に記載および例示されるように、アニオン交換、次いで接線流濾過を使用した。以下にさらに記載されるように、本発明者らは、ＡＡＶ調製物がヘパリン硫酸上のクロマトグラフィーによって高度に濃縮され得ることを見出した。
【０１３７】
例示のために、上記のように明澄化したＡＡＶ溶解物は、正に荷電したアニオン交換カラム（例えば、Ｎ荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、三級アミンもしくは四級アミン、またはＰＥＩベースの樹脂））または負に荷電したカチオン交換カラム（例えば、ＨＳ、ＳＰ、ＣＭまたは任意のスルホ、ホスホ、もしくはカルボキシベースのカチオン樹脂）にロードされ得る。そのカラムは、緩衝液（例えば、クロマトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得る。そのカラムは、ＮａＣｌ濃度の増加勾配で溶出され得、そして画分が集められ得、そしてＡＡＶおよび／または混入物の存在についてアッセイされ得る。
【０１３８】
他の手順が、当該分野で公知なように、荷電以外の特徴によって媒介される分子間会合に基づいて、上記のアニオンおよびカチオン交換手順に代わり、好ましくはそれに加えて、使用され得る。このような他の手順は、リガンド−レセプター対（例えば、抗体−抗原、またはレクチン−炭水化物相互作用）に基づく分子間会合、ならびにその分子の他の属性に基づく分離（例えば、サイズおよび／または形状に基づく分子篩クロマトグラフィー）を含む。ほんの１つの例をみると、濾過物または部分精製したＡＡＶ調製物が、ＡＡＶ特異的抗体を含むカラムにロードされ得る。このカラムは、ＡＡＶを結合し得る。このカラムは、緩衝液でリンスして、混入するタンパク質を除去し得、次いで漸増濃度のＮａＣｌの勾配または段階を用いて溶出し、そして画分が集められ得る。あるいは、このようなカラムは、ロード緩衝液のｐＨとは異なるｐＨの緩衝液で溶出され得る。
【０１３９】
ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分において同定され得る。このピークをプールし得、そしてそのプールを緩衝液（例えば、ＴＭＥＧまたは等価物）を用いて希釈または透析またはダイアフィルトレートして塩濃度を減少させ得る。
【０１４０】
このプールは、正に荷電したアニオン交換カラムおよび／または負に荷電したカチオン交換カラム（例えば、上記に言及されるもの）に注入され得る。このカラムは緩衝液（例えば、クロマトグラフィー緩衝液Ａ／ＴＭＥＧ）で洗浄され得る。このカラムは、漸増濃度のＮａＣｌの勾配で溶出され得、そして画分が集められ得る。ＡＡＶおよびアデノウイルスのピークは、感染性アッセイによってあるいは核酸ハイブリダイゼーションまたは免疫アッセイによって画分中で同定され得る。そのピークは、これらのアッセイのいずれかの結果に基づいてプールされ得る。
【０１４１】
上記のアニオン交換カラムから溶出されたＡＡＶ含有画分のプールは、接線流濾過（ＴＦＦ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＵｌｔｒａｓｅｔｔｅまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎユニット）によって濃縮され得そして精製され得る。適切な分子量カットオフ（例えば、１００，００または３００，０００カットオフ）のメンブレンは、代表的に再生セルロースまたはポリエーテルスルホンのようなポリマーから構成される。この調製物は、そのメンブレンを通して濾過され、そしてその産物が保持される。保持された物質は、リンゲル平衡塩溶液および５％グリセロールのような適切な緩衝液の連続的な洗浄を使用して、そのメンブレンを用いてダイアフィルトレートされ得る。最終のサンプルは、その産物について非常に富化されており、そして０．２μフィルターを通して滅菌濾過され得、そして使用のために保存され得る。
【０１４２】
接線流濾過を用いたアニオン交換カラム後の物質からのＡＡＶの精製および濃縮において、３００，０００分子量カットオフメンブレンは、１００，０００分子量カットオフメンブレンよりも、高収量の複製単位をもたらした。
【０１４３】
アデノウイルスの除去のために用いられ得る、さらなる工程は、所望である場合、熱不活化工程（本明細書において記載されるような）を用いた溶離液プールを処理する工程、次いで濾過（例えば、その調製物をＴＴＦに供する前に）を包含する。しかし、本発明者らは、上記の「アニオン交換からＴＦＦ」手順が検出可能なアデノウイルスを含まないＡＡＶ調製物を生じ、そしてより良い収率の精製されたＡＡＶをもたらしたこと見い出した。
【０１４４】
例示的な産生は、以下に記載されるような技術を使用して行う。
【０１４５】
上記の記載は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞タンパク質を実質的に含まない組換えＡＡＶベクターの高力価の調製物を生成するための方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、これらの方法に改変が当業者によって適用されることが理解される。
【０１４６】
以下に提示される実施例は、当業者にとってさらなるガイドとして提供され、そしていかなる形でも限定することは意図されない。
【０１４７】
（実施例）
（実施例１）
（一般的な方法）
（ベクター調製物中のｒＡＡＶ力価の定量：スロットブロットアッセイ）
ｒＡＡＶ  ＤＮＡスロットブロットアッセイを以下のように行った。サンプルのアリコートを、ヌクレアーゼで消化して、キャプシド化していないＤＮＡを除去した。次いで、このサンプルを、１．０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとともに０．４Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃で変性した。サンプルおよびｒＡＡＶ標準物を希釈し、そしてスロットブロットマニホールドを用いてナイロンメンブレン上に濾過し、そして０．４Ｍ  ＮａＯＨで洗浄した。このフィルターを、32Ｐ標識したヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリダイズした。このプローブは、ＡＡＶＣＦベクターから約１．５ｋｂのフラグメント（予測した１．４４８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応する）を検出した。
【０１４８】
（ｒＡＡＶを測定するためのマイクロタイター感染度アッセイ）
マイクロタイター感染度アッセイを以前に記載のように行った。Ａｔｋｉｎｓｏｎら、（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６（１１）：２８２１−２８２３。簡潔には、感染性ウイルスを測定するための高スループットマイクロタイター感染度アッセイを以下のように行った。系列希釈された細胞を含まない上清のアリコート（１０μｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で増殖させたＨｅＬａクローン３７細胞に接種した。３日後、感染細胞を、変性溶液（１／１０容量の４．０Ｍ  ＮａＯＨ、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加）で処理および溶解させた。溶解物を、Ｓｉｌｅｎｔ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＢｉｏｄｙｎｅＢプレート（Ｐａｌｌ）に移し、そしてナイロンメンブレン上に真空濾過した。このメンブレンを洗浄し、変性し、32Ｐ標識したヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡ制限フラグメントとハイブリダイズした。このプローブは、ＡＡＶＣＦベクターから約１．５ｋｂのフラグメント（予測した１．４４８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応する）を検出した。ベクター複製を、内因性ゲノムＣＦＴＲバンドと比較して定量化し、そして複製単位として表現した。１複製単位（ＲＵ）は、約１．８ｋｂである内因性ゲノムＣＦＴＲバンドのシグナル強度に相当するシグナル強度として規定される。系列希釈された既知のベクター標準物の直線回帰を用いて、サンプル中のベクター濃度を外挿および計算した。
【０１４９】
（産生培地）
表１および表２は、細胞の増殖およびｒＡＡＶの産生に適切な培地成分の濃度を（ｍｇ／ｌで）提供する（ブランクは、濃度０を示す）。一般には、血清レベルが減少することが好ましい。例えば、これらの実験に使用した培地は、約１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んだ。
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
【表２】
0004472182.tif 000003
【０１５２】
（実施例２）
（プロデューサー細胞溶解物におけるｒＡＡＶベクター粒子産生に対するｐＨの効果）
ＪＬ１４細胞を、３リットルのバイオリアクター中に約３×１０5細胞／ｍｌで接種し、表２中に示される１．５リットルのｒＡＡＶ培地中で増殖させた。ＪＬ１４細胞でバイオリアクターにおける培養培地を接種した２日後、このバイオリアクターに、新鮮な培地を注ぎ、１日あたり０．４容量で開始し、次いで、その後２４時間毎にこの量を２倍にした。５日後、または細胞密度が６×１０6細胞／ｍｌに達したときに、３×１０8細胞を取り出し、そして標準条件（すなわち、ｐＨを変化させる）下で増殖させた。バイオリアクター中に維持した細胞を、７５０ｍｌの培養培地の容量に濃縮し、そして３容量の培地交換を、ｐＨ７．２の産生培地（すなわち、表２の培地）で行って、培地を交換し、その結果、細胞培養物の最終容量は７５０ｍｌであった。アデノウイルス５型は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手したストックから増殖させた。アデノウイルスを７５０ｍｌの産生培地に希釈し、そしてこの細胞に添加し（感染多重度（ＭＯＩ）＝１０）、１．５リットルの最終容量にした。アデノウイルスでの感染を、３７℃にて１時間進行させた。
【０１５３】
感染を進行させた後、１×１０5細胞を、５つの別々のスピナーフラスコの各々に移した。５つのフラスコ中の容量を、それぞれ、ｐＨ６．６、７．０、７．２、７．４、および７．８の産生培地で１．５リットルにした。スピナーフラスコの内容物を別々のバイオリアクターに移し、次いで、これを個別に、ｐＨ６．６、７．０、７．２、７．４、および７．８で維持した。他の培養培地パラメーターは以下の通りであった：温度＝３７℃；溶存酸素濃度（ＤＯ2）＝３０％；および攪拌＝１５０ｒｐｍ。
【０１５４】
温度、ｐＨ、ＤＯ2、細胞密度、浸透圧モル濃度、およびグルコース／ラクテートを、毎日モニターした。細胞サンプルを感染後２日目および３日目に採取し、そして溶解させた。細胞溶解物を、ＤＮＡｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）スロットブロットアッセイおよびマイクロタイター感染度アッセイによってアッセイした。
【０１５５】
図１Ａおよび１Ｂは、様々なｐＨレベルでの細胞あたりのＤＲＰを表した、２つの別々の実験の結果を示す棒グラフである。黒棒は、感染後２日目のＤＲＰ／細胞を示す；斜線棒は、３日目のＤＲＰ／細胞を示す。ｐＨ７．２、ｐＨ７，４およびｐＨ７．８にて維持した培養物中のＤＲＰ／細胞は、感染後２日目および３日目から劇的に減少したが、この減少は、コントロール細胞培養物においては見られなかった。総細胞密度は、これらの培養条件のもとでは認め得るほどに変化しなかった。
【０１５６】
（実施例３）
（細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対するｐＨの効果）
簡単には、ＡＡＶプロデューサー細胞をバイオリアクター中で増殖させた。次いで細胞にＭＯＩ＝１０でＡｄ５を感染させ、そしてこれを１．５リットルのバイオリアクター中の懸濁液中の低血清培地（表２を参照のこと）に接種した。培養物を多様な高いｐＨレベル（７．２から８．０）で維持した。次いで培養物を、細胞数、生存度、グルコース消費、乳酸産生、ｐＨ、浸透圧モル濃度、およびＡＡＶ産生について毎日モニターした。以下に示されるように、ｐＨが７．４まで上昇した場合、ＡＡＶ産生に増加が見られた；上清中に放出されたＡＡＶ粒子の数のさらにより劇的な増加を伴った（これはｐＨが上昇するにつれ増加した）：
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
要するに、ｐＨが上昇するにつれて、本発明者らは、上清中に放出されたＡＡＶ粒子の数の急激な増加、および上清：細胞結合粒子のパーセンテージのシフト（ｐＨ７．２でほとんど全てが細胞結合から、ｐＨ８．０でほとんどが上清である（９２％）まで）を観察した。
【０１５９】
ｒＡＡＶベクター産生に対するｐＨの効果をさらに評価するために、ＪＬ１４細胞を、注入バイオリアクター中で上記のように（表１に記載される培地を使用する）１０7細胞／ｍｌの密度まで増殖させた。この細胞培養物を、７５０ｍｌの容量まで濃縮し、そしてその培地を、３回ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）を行うことによって交換した。総容量を、１０のＭＯＩでアデノウイルスを含む産生培地で１．５リットルにした。感染を、１時間進行させた。
【０１６０】
感染を進行させた後、１×１０5細胞を、５つの別々のスピナーフラスコの各々に移した。５つのフラスコ中の容量を、ｐＨ７．２、７．４、７．６、７．８および８．０の産生培地で１．５リットルにし、そしてコントロールフラスコにした（ｐＨは開始レベルで維持しない）。スピナーフラスコの内容物を別々のバイオリアクターに移し、次いで、これを個別に、ｐＨ６．６、７．０、７．２、７．４、および７．８で維持した。バイオリアクターを、定常レベル±０．０５ｐＨ単位のｐＨに維持した。他の培養培地パラメーターは以下の通りであった：温度＝３７℃；溶存酸素濃度（ＤＯ2）＝３０％；および攪拌＝１５０ｒｐｍ。細胞および培養上清（培養培地）を、２日目および３日目に採取した。
【０１６１】
結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そして様々なｐＨレベルで維持したバイオリアクターにおけるｒＡＡＶ産生の結果を示す（総ＤＲＰとして表す）。各棒の上の百分率は、細胞溶解物中の総ＤＲＰのパーセンテージである。各棒の黒い部分は、細胞溶解物中のＤＲＰを示し、一方、各棒の斜線部分は、細胞培養培地中のＤＲＰを示す。感染の２日後に、総ＤＲＰの２９％が、ｐＨ８．０で維持した培養の培養培地中にあり、一方、感染の３日後に、培養培地における総ＤＲＰの百分率は、９２％に上昇した。感染の３日後に、培養培地中の総ＤＲＰのパーセントは、ｐＨ７．４で６７％、ｐＨ７．６で８２％、ｐＨ７．８で７３％およびｐＨ８．０で９２％であった。ｐＨ７．２で維持した培養は、この実験における細胞培養培地中ではＤＲＰを全く生じなかった。
【０１６２】
ｐＨ７．２、７．４、７．６、７．８および８．０で維持したバイオリアクターからの感染の２日後および３日後の細胞溶解物および培養培地を、感染度アッセイを用いて複製単位（ＲＵ）についてアッセイした。このデータを、図３Ａおよび３Ｂに示す。総細胞密度は、これらの培養条件下では明らかには変化しなかった。
【０１６３】
図３Ａおよび３Ｂは、示したｐＨレベルで培養を維持した場合の、培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における感染の２日後（３Ａ）および３日後（３Ｂ）にアッセイした総複製単位（ＲＵ）を示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテージを示す。これらのデータは、細胞培養培地中に放出されたｒＡＡＶ粒子が、感染度アッセイにおいて機能的であることを実証する。
【０１６４】
図４は、示したｐＨレベルで維持したバイオリアクターからの、感染の３日後の細胞溶解物（各棒の黒い部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）から採取したｒＡＡＶ粒子の粒子：感染度（Ｐ／Ｉ）比を示す棒グラフである。これらのデータは、細胞培養培地中に放出されたｒＡＡＶベクターの大部分が感染性であることを示す。
【０１６５】
（実施例４）
（細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出の対する浸透圧モル濃度の効果）
培養培地における開始時の浸透圧モル濃度の、細胞培養培地へのｒＡＡＶの放出に対する効果をアッセイするために、ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。個々のバイオリアクターにおける開始時の重量オスモル濃度を、それぞれ、１３０、２００、３００、４００、および５００  ｍＯｓｍにした。各リアクターにおいて、そのｐＨを、ｐＨ８．０（±０．０５）；温度＝３７℃；ＤＯ2＝３０％；およびｓ攪拌＝１５０ｒｐｍに維持した。感染の２、３および４日後に、細胞溶解物および細胞培養培地を収集し、そしてｒＡＡＶベクター産生について分析した。
【０１６６】
結果を図５〜７に示す。
【０１６７】
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおける、感染の２日後（５Ａ）、３日後（５Ｂ）および４日後（５Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＤＲＰのパーセンテージを示す。これらのデータは、細胞培養培地が３００  ｍＯｓｍの開始時重量オスモル濃度を有する場合に、総ＤＲＰの４１％、５９％、および８０％が、それぞれ、２、３、および４日目に細胞培養培地中に存在することを示す。３００  ｍＯｓｍの開始時の細胞培養培地の重量オスモル濃度は、試験した他の開始時重量オスモル濃度と比較して、細胞培養培地中の総ｒＡＡＶベクターの最大パーセンテージを与えた。総細胞密度は、これらの培養条件下では明白には変化しなかった。
【０１６８】
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、示した開始時重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおける、感染の２日後（６Ａ）、３日後（６Ｂ）および４日後（６Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテージを示す。これらのデータは、培地に放出されたｒＲＲＶベクターが感染性であることを示す。
【０１６９】
図７は、示した開始時重量オスモル濃度を有するバイオリアクターからの、３および４日目の細胞培養培地中のｒＡＡＶ粒子のＰ／Ｉ比を示す棒グラフである。
【０１７０】
（実施例５）
（細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対する温度の効果）
ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、３１℃、３４℃、３７℃、３９℃、および４２℃にそれぞれ個別に維持したバイオリアクターに移した。これらの温度を、±０．５℃に維持した。各リアクター中のｐＨを、８．０（±０．０５）；攪拌＝１５０ｒｐｍ；ＤＯ2＝３０％に維持した。感染の２、３および４日後に、細胞溶解物および細胞培養培地を、ｒＡＡＶ粒子について分析した。
【０１７１】
結果を図８および９に示す。
【０１７２】
図８Ａ〜Ｃは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリアクターにおける、感染の２日後（８Ａ）、３日後（８Ｂ）および４日後（８Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＤＲＰのパーセンテージを示す。このデータは、培養培地を３９℃で維持した場合に、総ＤＲＰの６６％、６７％、および５７％が、それぞれ２、３、および４日で細胞培養培地中に見出されたことを示す。このデータはさらに、培養培地を３９℃で維持した場合に、３７℃または４２℃に比べて、より高いパーセンテージのＤＲＰが細胞培養培地中に見出されたことを示す。
【０１７３】
図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、示した温度で細胞培養培地を維持したバイオリアクターにおける、感染の２日後（９Ａ）、３日後（９Ｂ）および４日後（９Ｃ）に細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解物（各棒の黒い部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ａにおける各棒の上のパーセンテージは、細胞培養培地における総ＲＵのパーセンテージを示す。図９Ａにおける各棒の上のパーセンテージは、細胞溶解物における総ＲＵのパーセンテージを示す。このデータは、培養培地を３９℃で維持した場合に、総ＲＵの８０％、９７％、および９８％が、それぞれ２、３、および４日目に細胞培養培地中に見出されたことを示す。総細胞密度は、これらの培養条件下で明白には変化しなかった。
【０１７４】
（実施例６）
（細胞培養培地へのｒＡＡＶベクター粒子の放出に対する培養培地補充物の効果）
ＪＬ１４細胞を、本質的に実施例２に記載のように、バイオリアクターにおいて増殖させ、そしてアデノウイルスに感染させた。細胞を、以下のような様々な培地を含むバイオリアクターに移した：（１）ＤＭＥＭ；（２）ＤＭＥＭ＋４ｇ／リットル  グルコース；（３）ＤＭＥＭ＋４ｇ／リットル  グルコース＋４ｍＭグルタミン；（４）ＤＭＥＭ＋４ｇ／リットル  グルコース＋４ｍＭグルタミン＋アミノ酸＋ビタミン（「完全」）；（５）２×ＤＭＥＭ。全ての開始時重量オスモル濃度を、２８５〜３００  ｍＯｓｍに調整した。他のパラメーターを以下の通りに  した：温度を３９℃に維持した；ｐＨを  ８．０に維持した；ＤＯ2＝３０％；および攪拌＝１５０ｒｐｍ  。感染の３日後に、細胞培養上清を、ｒＡＡＶベクター粒子についてアッセイした。
【０１７５】
これらの結果を、図１０、１１、および１２に示す。
【０１７６】
図１０は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の３日後の培養培地中の総ＤＲＰを示す棒グラフである。
【０１７７】
図１１は、示した様々な培地中で増殖させる培養における、感染の３日後の培養培地中の総ＲＵを示す棒グラフである。
【０１７８】
図１２は、示した様々な培地中で培養物を増殖させた場合の、細胞培養培地中のウイルス粒子のＰ／Ｉ比を示す棒グラフである。
【０１７９】
前述の本発明を例示および理解の明白さの目的のための例としていくらか詳細に示したが、当業者が、特定の変化および改変を実施することは明らかである。それゆえ、記載および例は、添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａおよび１Ｂは、種々のｐＨレベルでの、細胞あたりのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）として表される、２つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。示されるｐＨレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後２日目（黒色棒）および感染後３日目（斜線棒）にアッセイした。
【図１Ｂ】  図１Ａおよび１Ｂは、種々のｐＨレベルでの、細胞あたりのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）として表される、２つの個別の実験の結果を示す棒グラフである。示されるｐＨレベルに細胞培養物を維持し、そして細胞溶解産物を、感染後２日目（黒色棒）および感染後３日目（斜線棒）にアッセイした。
【図２Ａ】  図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そしてこれは、種々のｐＨレベルで維持されたバイオリアクターにおける、感染後２日目（２Ａ）および感染後３日目（２Ｂ）の、総ＤＲＰとして表されるｒＡＡＶ産生の結果を示す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解産物中のＤＲＰを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のＤＲＰを表す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率を示す。
【図２Ｂ】  図２Ａおよび２Ｂは棒グラフであり、そしてこれは、種々のｐＨレベルで維持されたバイオリアクターにおける、感染後２日目（２Ａ）および感染後３日目（２Ｂ）の、総ＤＲＰとして表されるｒＡＡＶ産生の結果を示す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率である。各棒の黒色部分は細胞溶解産物中のＤＲＰを表し、一方、各棒の斜線部分は細胞培養培地中のＤＲＰを表す。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物中の総ＤＲＰの百分率を示す。
【図３Ａ】  図３Ａおよび３Ｂは、示されるｐＨレベルに培養物を維持した場合の、細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解産物（各棒の黒色部分）における、感染後２日目（３Ａ）および感染後３日目（３Ｂ）の総複製単位（ＲＵ）を示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図３Ｂ】  図３Ａおよび３Ｂは、示されるｐＨレベルに培養物を維持した場合の、細胞培養培地（各棒の斜線部分）および細胞溶解産物（各棒の黒色部分）における、感染後２日目（３Ａ）および感染後３日目（３Ｂ）の総複製単位（ＲＵ）を示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図４】  図４は、示されるｐＨに維持されたバイオリアクター由来の、感染後３日目に細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）から収集したｒＡＡＶ粒子の粒子：感染性（Ｐ／Ｉ）比率を示す棒グラフである。
【図５Ａ】  図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図５Ｂ】  図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図５Ｃ】  図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（５Ａ）、感染後３日目（５Ｂ）、および感染後４日目（５Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図６Ａ】  図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図６Ｂ】  図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図６Ｃ】  図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、示される開始重量オスモル濃度を細胞培養培地が含むバイオリアクターにおいて、感染後２日目（６Ａ）、感染後３日目（６Ｂ）、および感染後４日目（６Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図７】  図７は、示される開始重量オスモル濃度を有するバイオリアクター培養物由来の、３日目および４日目の細胞培養培地におけるｒＡＡＶ粒子のＰ／Ｉ比率を示す棒グラフである。
【図８Ａ】  図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図８Ｂ】  図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図８Ｃ】  図８Ａ〜Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（８Ａ）、感染後３日目（８Ｂ）、および感染後４日目（８Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＤＲＰを示す棒グラフである。各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＤＲＰの百分率を示す。
【図９Ａ】  図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ａの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ａの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図９Ｂ】  図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ｂの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ｂの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図９Ｃ】  図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、示される温度に細胞培養培地が維持されたバイオリアクターにおいて、感染後２日目（９Ａ）、感染後３日目（９Ｂ）、および感染後４日目（９Ｃ）の細胞溶解産物（各棒の黒色部分）および細胞培養培地（各棒の斜線部分）における総ＲＵを示す棒グラフである。図９Ｃの各棒の上部の百分率は、細胞培養培地における総ＲＵの百分率を示す。図９Ｃの各棒の上部の百分率は、細胞溶解産物における総ＲＵの百分率を示す。
【図１０】  図１０は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後３日目の培養培地における総ＤＲＰを示す棒グラフである。
【図１１】  図１１は、示される種々の培地において増殖した培養において、感染後３日目の培養培地における総ＲＵを示す棒グラフである。
【図１２】  図１２は、示される種々の培地において培養物を増殖した場合の、細胞培養培地におけるウイルス粒子のＰ／Ｉ比率を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】  図１３は、実施例６に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組成を提供する。
【図１３Ｂ】  図１３は、実施例６に記載の培地補給物についてのアミノ酸およびビタミン組成を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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