(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子およびＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を細胞中に組み込む工程、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸またはそのラセミ混合物を含む細胞培地中で細胞を培養する工程、および
（ｃ）細胞培地からＤ−アミノ酸を単離する工程
を含んでなる、細胞中でＤ−アミノ酸を生成する方法であって、
細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｃｕｓ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される前記方法。
【請求項２】
Ｄ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が非機能的になるように細胞中にＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子突然変異を導入する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｄａｄＡ遺伝子が非機能的になるようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞にｄａｄＡ遺伝子突然変異を導入する工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｃｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子がＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子またはＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞中にラセミ化酵素遺伝子を組み込む工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ラセミ化酵素遺伝子が、アラニンラセミ化酵素、グルタメートラセミ化酵素、アスパルテートラセミ化酵素およびフェニルアラニンラセミ化酵素からなる群より選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ラセミ化酵素遺伝子が、アラニンラセミ化酵素である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−アミノ酸が天然または非天然Ｄ−アミノ酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
天然または非天然Ｄ−アミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、シトルリン、システイン、ヒスチジンおよびリシンからなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
天然Ｄ−アミノ酸がフェニルアラニンである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルパルテートおよび前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｌ−アミノ酸がアセパルテートである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｌ−アミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、バリン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、オルニチン、セリン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルアラニン、ジヒドロキシフェニルアラニン、シトルリン、システイン、ヒスチジンおよびリシンからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｄ−アミノ酸のエナンチオマー過剰率が９４％より高い収量でＤ−アミノ酸を生成することを特徴とする請求項１の細胞の培養を用いてＤ−アミノ酸を調製する方法。
【請求項１７】
エナンチオマー的に純粋なＤ−アミノ酸を調製する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子およびＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子がプラスミドを用いて細胞中に組み込まれる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子、Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子および、フェニルピルビン酸の生成を増加させるためのｐｈｅＡ遺伝子、ａｒｏＨ遺伝子またはそれらの混合物を細胞中に組み込む工程、
（ｂ）Ｌ−アミノ酸またはそのラセミ混合物を含む細胞培地中で細胞を培養する工程、および
（ｃ）細胞培地からＤ−フェニルアラニンを単離する工程
を含んでなる、細胞中でＤ−フェニルアラニンを生成する方法であって、
細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｃｕｓ，ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される前記方法。
【請求項２０】
Ｄ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が非機能的になるように細胞中にＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子突然変異を導入する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｄａｄＡ遺伝子が非機能的になるようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞にｄａｄＡ遺伝子突然変異を導入する工程をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子である請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子がＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子またはＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子である請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
細胞中にラセミ化酵素遺伝子を組み込む工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
ラセミ化酵素遺伝子が、アラニンラセミ化酵素、グルタメートラセミ化酵素、アスパルテートラセミ化酵素およびフェニルアラニンラセミ化酵素からなる群より選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ラセミ化酵素遺伝子が、アラニンラセミ化酵素である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルパルテートおよび前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
Ｌ−アミノ酸がアセパルテートである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
培地が基質としてＬ−フェニルアラニンを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｄ−フェニルアラニンのエナンチオマー過剰率が９４％より高い収量でＤ−フェニルアラニンを生成することを特徴とする請求項１９の細胞の培養を用いてＤ−フェニルアラニン酸を調製する方法。
【請求項３２】
エナンチオマー的に純粋なＤ−フェニルアラニンを調製する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子およびＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子がプラスミドを用いて細胞中に組み込まれる請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ基転移酵素遺伝子およびＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子またはＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を含んでなる組換え細胞であって、
細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｃｕｓ，ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからなる群より選択される前記方法である前記組換え細胞。
【請求項３５】
Ｄ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が非機能的になるように細胞中にＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子突然変異を更に含む請求項３４に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ラセミ化酵素遺伝子をさらに含む請求項３４に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ遺伝子がアラニンラセミ化酵素である請求項３６に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、Ｄ−アミノ酸を製造するための材料および方法に関する。特に、本発明は、組換え宿主細胞を用いる天然および非天然の両方のＤ−アミノ酸の調製に関する。具体的には、本発明は、エナンチオマー的に純粋なＤ−アミノ酸を製造するために組換え細胞を用いる発酵プロセスに関する。
発明の背景
グリシン、トレオニンおよびイソロイシンを除いて、共通の天然産アミノ酸の各々は、偏光面を回転させる方向により左旋性または右旋性と呼ばれる２つの光学異性体の１つとして存在する。不斉炭素を有さないグリシンは光学異性体を有さない。各々２つの不斉炭素を有するトレオニンおよびイソロイシンは、各々４つの光学異性体を有する。アラニンおよびグルタミンのような一部のアミノ酸は右旋性であり、正（右回り）回転を発生させる。フェニルアラニンやトリプトファンのような他のものは、左旋性であり、負（左回り）回転を発生させる。すなわち、アミノ酸は、単離時に光学異性を反映するように１−またはｄ−アミノ酸と呼ぶことができる。所定のアミノ酸により生じる特定の回転は、温度およびｐＨにより変化する。
従来法により、アミノ酸のα−炭素の回りの立体配置がグリセルアルデヒドのＤ立体異性体（エナンチオマー）に相当するかＬ立体異性体に相当するかに基づき、アミノ酸は（前記ｄまたはｌの表示に対して）ＤまたはＬとも呼ばれるが、これは独断的な基準である。一部のアミノ酸は中性ｐＨで水溶液中に入れたときに右旋性であることにも拘わらず、その基準によれば大部分の天然産アミノ酸はＬアミノ酸となる。アミノ酸に作用する大部分の酵素は、アミノ酸のＬ−型のみを認識する非対称結合領域を有する。従って、大部分の天然産タンパクはＬ−アミノ酸を含む。
しかしながら、Ｄ−アミノ酸が生成され細胞により利用される例外がある。これらの中で主用なものは、特定の微生物によるＤ−グルタメートおよびＤ−アラニンの生成である。Ｄ−グルタメートおよびＤ−アラニンは、主に細菌細胞中で生成され、ムレインの合成において利用される。Ｄ−グルタメートおよびＤ−アラニンの不存在下では、不完全な細菌細胞壁が形成され、細胞溶解につながる。大部分の細菌は、直接合成ではなく、アミノ酸特異的ラセミ体によって対応するＬ−アミノ酸を転化させることによりＤ−アミノ酸を生成する。例えば、多くの細菌細胞は、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンとの間の双方向転化を触媒してＬ−アラニンとＤ−アラニンとのラセミ（５０：５０）混合物を発生させるアラニンラセミ体を有する。同様に、グルタメートラセミ化酵素はＤ−グルタメートとＬ−グルタメートとのラセミ混合物を生成し、前者は細胞壁中に取りこまれ、後者は特にタンパクの生成に利用される。これらの２つの酵素の特異性は、いずれか一方が欠けると不完全な細胞壁形成により細胞が溶解することにより示される。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の一員のような特定の細菌は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼとして知られている酵素の状態でＤ−アミノ酸を形成するためにラセミ化酵素の代替物を有する。そのような酵素は、種々のＤ−アミノ酸および対応するα−ケト酸のアミノ交換を可逆的に触媒する。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５８７０においてマンニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）は、アミノ転移酵素（アミノトランスフェラーゼ：aminotransferase）で触媒することによりＤ−アラニンおよびＤ−グルタメートを微生物的に合成する方法を報告している。マンニングは、２頁において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素の使用を報告しているが、該公報は、実際には、痕跡量以上のＤ−アミノ酸の合成を効果的に触媒することができないＤ−アミノ転移酵素の好熱性種のクローニング、単離および使用のみを報告している。さらに、マンニングは、エナンチオマー的に純粋なＤ−アミノ酸を触媒するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素または他の任意のＤ−アミノ転移酵素を単離または使用するいかなる手段も報告していない。
マンニングのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素への言及は誤りであるという証拠が、マンニングの公報の２頁に見られ、ここでマンニングはＤ−アミノ転移酵素ＤＮＡをプラスミドｐＩＣＴ１１３上にクローニングしたと述べている。ＳｔｏｄｄａｒｄらのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１９６巻：４４１頁および４４２頁（１９８７年）に報告されているように、プラスミドｐＩＣＴ１１３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ属ではなくＤ−アミノ転移酵素の好熱性種を担持する。この事実の重要性は、好熱性種がＤ−フェニルアラニンの多量の生成を効果的に触媒することができず、従って、Ｄ−フェニルアラニン酸の生成のための組換え法において役に立たないということである。
本出願の前において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素の唯一の報告はＴｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎら（編）、４６４頁（１９８５年）において見られる部分的Ｃ−末端配列である。しかしながら、本発明から明らかであるように、その部分的配列は誤りであり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素の単離において有用ではない。従って、組換え手段または他の手段によるＤ−アミノ酸の製造においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素を報告している先行文献はない。他のＤ−アミノ転移酵素は単離されているが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ種により生成されるものとは違って、Ｄ−フェニルアラニンがこれらの酵素にとって比較的乏しい基質である。Ｔａｎｉｚａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６４巻：２４４５および２４４９頁（１９８９年）。
本発明は、エナンチオマー的に純粋な天然および非天然Ｄ−アミノ酸を生成する組換え材料および方法を提供する。
発明の概要
本発明は、天然および非天然Ｄ−アミノ酸の生成のための材料および方法に関する。特に、本発明は、組換え宿主細胞を用いてＤ−アミノ酸を生成するための発酵法に関する。
特に、本発明は、
（ａ）Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子およびＬ−アミノ脱アミノ酵素（デアミナーゼ：deaminase）遺伝子を細胞中に組み込む工程、
（ｂ）細胞培地中で細胞を培養する工程、および
（ｃ）細胞培地からＤ−アミノ酸を単離する工程
を含んでなる、細胞中でＤ−アミノ酸を生成する方法に関する。
本発明は、また、
（ａ）Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子、Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子および、フェニルピルベートの生成を増加させるための手段を細胞中に組み込む工程、
（ｂ）細胞培地中で細胞を培養する工程、および
（ｃ）細胞培地からＤ−フェニルアラニンを単離する工程
を含んでなる、細胞中でＤ−フェニルアラニンを生成する方法にも関する。
本発明の方法は、さらに、Ｄ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が非機能的になるようにＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子突然変異種を細胞中に導入する工程を含んでよい。
本発明は、また、エネンチオマー的に純粋なＤ−アミノ酸の生成において用いるための組換え細胞の調製にも関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｄ−アミノ酸を生成するための本発明の方法を説明する一般的概略図である。
図２は、本発明の方法を用いるＤ−フェニルアラニンの生成を説明するスキームである。図２において、以下の略語を用いる：Ｅ４Ｐはエリスロース−４−ホスフェート、ＰＥＰはホスホエノールピルベート、およびＤＡＨＰは３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−ホスフェートである。
図３は、プラスミドｐＩＦ１００２の構築を示す概略図である。
図４は、プラスミドｐＩＦ１００３の構築を示す概略図である。
図５は、プラスミドｐＩＦ３１８の構築を示す概略図である。
図６は、プラスミドｐＪＮ３２６の構築を示す概略図である。
図７は、プラスミドｐＩＦ３１９の構築を示す概略図である。
図８は、プラスミドｐＩＦ３２０の構築を示す概略図である。
図９は、プラスミドｐＩＦ３２１の構築を示す概略図である。
図１０は、プラスミドｐＩＦ３３３の構築を示す概略図である。
図１１は、プラスミドｐＡＬＲ１８の構築を示す概略図である。
図１２は、プラスミドｐＰＴ３６２の構築を示す概略図である。
図１３は、プラスミドｐＰＴ３６３の構造を示す概略図である。
図面の簡単な説明
本発明は、Ｄ−アミノ酸を生成するための材料および方法に関する。本発明の一般的方法を図１に示す。本発明は、細菌細胞中に、Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子（ｄａｔ）およびＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子（ｌａｄ）が導入される方法に関する。Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子産物、すなわち、Ｄ−アミノ転移酵素（Ｄａｔ）が、Ｄ−アミノ酸基質とケト酸前駆体との間のアミノ基転移反応を触媒する。アミノ基転移反応において、ケト酸前駆体をその対応するＤ−アミノ酸に転化し、Ｄ−アミノ酸基質をそのケト酸型に転化する。すなわち、Ｄ−アミノ酸基質は、アミノ基転移反応においてアミノ供与体として機能する。
Ｌ−アミノ転移酵素遺伝子産物、すなわち、Ｌ−アミノ転移酵素（Ｌａｔ）は細胞中に天然に存在する。Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子産物は、細胞中において基質としてのケト酸前駆体に関してＬ−アミノ転移酵素遺伝子産物と競合する。Ｌ−アミノ転移酵素は、ケト酸前駆体の状態のＬ−アミノ酸を形成するようなＬ−アミノ酸基質とケト酸前駆体との間のアミノ基転移反応を触媒する。しかしながら、Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を細胞中に導入されると、その遺伝子産物は、細胞中に存在する任意のＬ−アミノ酸のその対応するケト酸状態への脱アミノ反応を触媒する。Ｌ−アミノ酸の脱アミノ反応によりに形成されるケト酸は、Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子により、基質として用いられるさらなるケト酸前駆体を提供する。Ｄ−アミノ転移酵素によりケト酸前駆体をその対応するＤ−アミノ酸型に転化することは、Ｄ−アミノ酸産物を脱アミノ化するＤ−アミノ脱アミノ酵素を生成するように細胞中に存在するＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が存在しないので、不可逆的である。
本発明の好ましい態様において、Ｄ−アミノ転移酵素およびＬ−アミノ転移酵素に利用できる望ましい基質を過剰に生成するために、アミノ酸基質およびケト酸前駆体の生成のための酵素をコードする遺伝子を細胞中に組み込むこともできる。組み込まれる遺伝子は、ラセミ化酵素遺伝子または、アミノ酸基質またはケト酸前駆体の生合成に関与する律速酵素をコードする遺伝子であることができる。あるいは、アミノ酸基質及び／又はケト酸前駆体を、Ｄ−アミノ酸の生成中に細胞のための培地の一部として提供することができる。基質としてＬ−アミノ酸またはラセミ体アミノ酸を含む細胞培地の場合、細胞培地の一部として添加されたＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に転化するためのラセミ化酵素を過剰に製造するように、ラセミ化酵素遺伝子が好ましく細胞中に導入される。さらに、Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子産物の存在は、細胞中に存在するＬ−アミノ酸を脱アミノ化してＤ−アミノ転移酵素が基質として用いるための対応するケト酸前駆体を生成させる。
本発明の方法で用いるのに好適な細胞は、限定はされないが、以下の細菌細胞を含む：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｃｕｓ，ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ。本発明のもう一つの好ましい態様において、細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
本発明のもう一つの好ましい態様において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞の使用は、穏やかな好熱性であり、それにより、反応速度が速い高温においてＤ−アミノ酸の調製を行うことができるというさらなる利点を有する。従って、Ｄ−アミノ酸を調製するための製造時間が短縮される。
一つの好ましい態様において、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓからのＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓからのＤ−アミノ転移酵素遺伝子が細胞に導入される。これらの遺伝子の両方が、以下の表１に示すような非常に広い基質範囲を有する酵素をコードする。基質は、天然と非天然の両方のＤ−およびＬ−アミノ酸を含む。さらに、これらの酵素の基質範囲は、標準的突然変異手段を用いてそれぞれの遺伝子を突然変異させることにより増える。
0004548864.tif 000002
もう一つの好ましい態様において、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓからのＬ−アミノ脱アミノ酵素およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓからのＤ−アミノ転移酵素遺伝子を細胞中に導入する。
本発明の一つの好ましい態様において、好ましい宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ｐＩＦ３である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ｐＩＦ３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ．から得ることのできるＲＹ３４７菌株（ＡＣＴＴ受託番号６９７６６）である。ｐＩＦ３菌株は、Ｍｉｌｌｅｒら著，ここで参考として取り入れる、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）に記載のように、バクテリオファージＰ１での形質導入によりＬ−アミノ転移酵素遺伝子ｔｙｐＢ＋およびｉｌｖＥの野生型複製が細胞中の染色体に導入されている点において、ＲＹ３４７と異なる。ｔｙｐＢ＋およびｉｌｖＥ遺伝子は、ケト酸前駆体をその対応するＬ−アミノ酸型に転化するＬ−アミノ転移酵素をコードする。
野生型アミノ転移酵素遺伝子ｔｙｒＢ＋およびｉｌｖＥをｐＩＦ３細胞に再度導入することは、ＲＹ３４７よりも細胞成長が向上するというさらなる利益を有するが、これは、おそらくＬ−アミノ転移酵素遺伝子産物のなんらかの定義されていないさらなる機能によるものである。特に、好ましいＬ−アミノ転移酵素遺伝子は、限定はされないが、ａｓｐＣ、ｔｙｒＢおよびｉｌｖＥを含む。
本発明のＤ−アミノ酸の生成において用いられる細胞の染色体は、Ｍｉｌｌｅｒら著，ここで参考として取り入れる、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２年）に記載のような標準的技術を用いて突然変異させることができる。一つの特別の態様において、ｄａｄＡ遺伝子が非機能的になるようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞にｄａｄＡ遺伝子突然変異種が導入される。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞は、遺伝子ｄａｄＡおよびｄａｄＸを含むｄａｄオペロンを有する。ｄａｄＸ遺伝子は、Ｄ型とＬ型の間でのアミノ酸のラセミ化に関与するアラニン性ラセミ化酵素をコードする。ｄａｄＡ遺伝子は、ある範囲のＤ−アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を行うＤ−アミノ脱アミノ酵素をコードする。ｄａｄオペロンはＤ−アラニンの存在下に誘発され、Ｄ−アミノ脱アミノ酵素およびＤ−アラニンラセミ化酵素を生成する。ＤａｄＸおよびＤａｄＡ酵素は、Ｄ−アラニンの取り込みおよびピルベートへの異化に関与する膜複合体を形成する。ＤａｄＡ酵素は、Ｄ−フェニルアラニンのような他のＤ−アミノ酸を脱アミノ化することもできる。従って、Ｄ−アミノ酸の過剰生成に関与するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞において、ＤａｄＡ酵素の生成を防止するようにｄａｄＡ遺伝子を突然変異させることが有利である。
さらに、Ｌ−アミノ転移酵素遺伝子ａｓｐＣ、ｉｌｖＥ、ｔｙｒＢまたはＤ−アミノ脱アミノ酵素ｄａｄＡ遺伝子中に突然変異を含むＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ菌株を、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（エール大学、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から得ることができる。例えば、Ｌ−アミノ転移酵素遺伝子ａｓｐＣ、ｉｌｖＥ、およびｔｙｒＢ中に突然変異を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＤＧ３０、ＤＧ３１、ＤＧ３４およびＤＧ、およびＤ−アミノ脱アミノ酵素ｄａｄＡ遺伝子中に突然変異を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＥＢ１０５を、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得ることができる。
標的遺伝子の生体外発生フラグメントを宿主細胞染色体に運び込む温度感受性組換えプラスミドを用いて部位特異的に、欠失を含む突然変異種を細胞の染色体に導入することができる。例えば、プラスミドと宿主細胞との間の組換えを認識するためにプラスミド複製制御領域の温度感受性性質を用いることができるプラスミドｐＨＳＧ４１５が米国特許第５，３５４，６７２号に開示されている。プラスミド上の標的遺伝子の欠失複製を、ｐＨＳＧ４１５を用いて細胞の染色体上の同じ遺伝子の野生型複製に交換することができる。その後の宿主細胞からのプラスミドの損失により、標的遺伝子において細胞が突然変異される。従って、ｐＨＳＧ４１５は、宿主細胞染色体を突然変異させる、または突然変異された宿主細胞染色体中に野生型遺伝子を再導入して戻す効果的手段を提供する。
本発明の一つの好ましい態様において、細胞中にＤ−フェニルアラニンを生成する方法は、細胞中にＤ−アミノ転移酵素遺伝子およびＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を組み込むことを含む。Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子産物は、Ｄ−アラニン基質とケト酸前駆体、フェニルピルベートの間のアミノ基転移反応を触媒して、Ｄ−フェニルアラニンおよびピルベートが生成される。基質Ｄ−アラニンおよびフェニルピルベートは、通常、細胞中に存在し、前者は細胞壁中への組み込まれるものであり、後者は、Ｌ−フェニルアラニン生合成の反応経路の最後の前駆体である。さらに、天然に存在するＬ−アミノ転移酵素遺伝子産物が、Ｌ−フェニルアラニンとピルベートを生成するようなＬ−アラニンとフェニルピルベートとの間のアミノ基転移反応を触媒する。しかしながら、細胞中にＬ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を導入すると、合成されたＬ−フェニルアラニンの大部分を脱アミンしてフェニルピルベートに戻すＬ−アミノ脱アミノ酵素が生成され、一方、存在するＬ−フェニルアラニンの残りはタンパクの生成に用いられる。脱アミノ反応の結果として生成されるフェニルピルベートは、基質としてＤ−アミノ転移酵素により利用されてさらにＤ−フェニルアラニンを生成することができる。細胞中でのＤ−フェニルアラニンの生成は、Ｄ−フェニルアラニンを脱アミノするようなＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が細胞中に存在しないので、不可逆である。
本発明の方法を用いるＤ−アミノ酸の製造において、アミノ基転移反応においてアミノ供与体として用いるためのＤ−アミノ酸基質を高水準で有することが望ましい。例えば、Ｄ−フェニルアラニンの調製において、細胞へのＤ−アラニンの添加により、アミノ基転移反応のためのＤ−アラニン基質の高水準が保証される。
本発明の好ましい態様において、アラニンのラセミ混合物が、発酵中に、細胞培養の一部として細胞に添加される。さらに、アラニンラセミ化酵素をコードする細胞質アラニンラセミ化酵素遺伝子（ａｌｒ）が細胞中に導入される。アラニンラセミ化酵素が、細胞中において、５０／５０のＤ−、Ｌ−アラニン平衡を維持する。Ｄ−アミノ転移酵素の作用により細胞中でＤ−アラニンが消費されるので、アラニンラセミ化酵素はＬ−アラニンをＤ−アラニンに転化させる。このようにして、細胞壁中に導入される少量は別として、アミノ基転移反応においてアミノ供与体として用いるためのＤ−アラニン基質として、Ｄ−、Ｌ−アラニン混合物の全てがＤ−アミノ転移酵素遺伝子に利用される。一つの好ましい態様において、細胞中に組み込まれたａｌｒ遺伝子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローニングされる。
Ｄ−アミノ酸の生成中に細胞培養に添加することができる他の適当なアミノ供与体は、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパルテート、または前記Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物である。好ましくは、存在するアミノ供与体に依存して、グルタメートラセミ化酵素、アスパルテートラセミ化酵素またはフェニルアラニンラセミ化酵素のようなラセミ化酵素遺伝子も細胞中に組み込まれる。従って、Ｄ−アミノ転移酵素は、アミノ基転移反応に用いるのに有用なＤ−アミノ供与体基質を多量に有する。
細胞中でのＤ−フェニルアラニンの生成を増加させるために、フェニルピルベートを生成する律速酵素をコードする遺伝子を導入することにより、細胞中でケト酸前駆体、すなわちフェニルピルベートの量を増加させることができる。細胞性芳香族アミノ酸生合成経路からのフェニルピルペート生成が、二つの律速酵素、ＰｈｅＡおよびＡｒｏＨにより制御される。ＰｈｅＡおよびＡｒｏＨをコードする遺伝子を細胞中に導入すると、フェニルピルベートが過剰に生成される。従って、フェニルピルベートの量の増加は、Ｄ−フェニルピルベートに転化するための、Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子産物のより多くの基質を提供する。
細胞中でのケト酸前駆体の量は、対応するＬ−アミノ酸を細胞に添加することにより増加させることもできる。Ｌ−アミノ酸の添加の場合、Ｌ−アミノ脱アミノ酵素がＬ−アミノ酸を脱アミノして対応するケト酸前駆体を形成させる。次に、ケト酸前駆体を、Ｄ−アミノ転移酵素が対応するＤ−アミノ酸に転化する基質として用いることができる。
本発明は、外因性Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子および外因性Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子を含む組換え細胞にも関する。本発明の組換え細胞は、さらに、細胞中にＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子突然変異を含むことができ、それによりＤ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子が非機能的になる。本発明の組換え細胞は、さらに、外因性アラニンラセミ化酵素遺伝子、外因性ａｒｏＨ遺伝子および外因性ｐｈｅＡ遺伝子を含むことができる。外因性Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子であってよく、外因性Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子はＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子またはＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  Ｌ−アミノ脱アミノ酵素遺伝子であってよく、外因性ラセミ化酵素遺伝子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍラセミ化酵素遺伝子であってよい。
本発明の組換え細胞の培養は、エナンチオマー的に純粋なＤ−アミノ酸を生成するために用いられる。開示された方法を用いて生成されるＬ−アミノ酸に対するＤ−アミノ酸のエナンチオマー過剰率（ｅｅ）は、存在するＤ−アミノ酸の量からＬ−アミノ酸の量を引き、Ｄ−とＬ−の両方のアミノ酸の合計量で割り、１００をかけることにより決められる。好ましい態様において、Ｄ−フェニルアラニンは実質的に純粋な状態で高収率で得られる。Ｄ−フェニルアラニンを生成する方法は図２に示す。
本発明の組換え細胞の培養を用い、Ｄ−アミノ転移酵素遺伝子産物のためのフェニルピルベート基質およびＤ−アラニンのさらなる原料としてＤ−、Ｌ−アラニンおよびＬ−フェニルアラニンを添加すると、Ｄ−フェニルアラニン１３．６６ｇ／ｌおよびＬ−フェニルアラニン０．４７ｇ／ｌが得られ、エナンチオマー過剰率は９４％であった。発酵プロセス中にＤ−、Ｌ−アラニンのみを培養に添加すると、Ｄ−フェニルアラニン４．１５ｇ／ｌが得られＬ−フェニルアラニンは得られず、エナンチオマー過剰率は１００％であった。対照的に、発酵プロセス中にＤ−、Ｌ−アラニンまたはＬ−フェニルアラニンを細胞培養に添加しない場合、Ｄ−フェニルアラニン１．１２ｇ／ｌおよびＬ−フェニルアラニン０．４７ｇ／ｌが得られ、エナンチオマー過剰率は４１％であった。
本発明の方法により生成したＤ−アミノ酸は、当業者に良く知られている手順を用いて単離することができる。例えば、開示された方法を用いて調製されたＤ−アミノ酸を単離する一つの方法を以下に示す。発酵完了時に、発酵ブロスを細胞から傾瀉する。Ｄ−アミノ酸産物の濃度を上げるためにブロスの体積を減らすことができる。ブロスの減少は、典型的には、減圧下にブロスを３０℃〜１００℃の温度に加熱することにより行われる。次に、Ｄ−アミノ酸を、ブロスのｐＨをアミノ酸産物の等電点から±１℃の範囲に調節することにより沈澱させる。ｐＨ調整中、Ｄ−アミノ酸産物は沈澱する。沈澱に続いて、Ｄ−アミノ酸を、濾過、遠心分離または傾瀉を含む標準的方法によりブロスから分離する。単離したＤ−アミノ酸産物を次に洗浄し、乾燥する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中において、アミノ酸アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが、それらのケト酸前駆体から直接合成される。発酵中に組換え細胞にＬ−アミノ酸またはラセミ混合物を添加することに加えて、特定のケト酸のための律速酵素を生成する遺伝子を導入することにより、所望のアミノ酸のケト酸前駆体を過剰に生成することができる。
以下の実施例は、本発明を実施する態様をより具体的にかつ詳細に説明するものである。それらは単なる例示であり、出発材料及び／又はプロセスパラメーターに小さな変化および修正を加え得ることが理解される。そのような変化がプロセスを実質的に変えない程度まで、以下の請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲に入るものと考えられる。
実施例１
Ｄ−アミノ転移酵素ＤＮＡの単離
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓの培養物を、Ｄ−アミノ転移酵素ＤＮＡの源としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ＡＴＣＣ受託番号１０２０８号）から得た。培養物を、未補足ＬＢ培地上にすじを付け、そして３７℃で一晩増殖させた。染色体ＤＮＡを製造するために、単一コロニーを、使用して、１Ｌフラスコで５０ｍＬルリアブロスに接種し、それを３００ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪させた。その後、細胞を５分間、１０，０００Ｇで遠心分離することによって回収し、０．８５％生理食塩水で洗浄し、そして５分間再度、１０，０００Ｇで遠心分離した。生じたペレットを、５ｍｌの１０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。アリコート量の５０μｌＲＮａｓｅＡを添加し、そして溶液を、穏やかに混合した。続いて、１０ｍｌの０．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫを混合溶液に添加し、それをその後、透明になるまで３７℃でインキュベートした。その後、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を、３００ｍＭの最終濃度まで添加した。穏やかなフェノール抽出を、相の界面に見ることができる白色沈澱がなくなるまで水相にほとんど等しい量のフェノールを用いて行った。その後、水相を取出し、そして染色体のＤＮＡを２．５容積のエタノールを用いて沈澱させた。ＤＮＡペレットを、取出し、３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）に再溶解させた。エタノール沈澱を行い、そしてＤＮＡペレットを取出し、乾燥させ、２ｍｌ蒸留水に溶解させた。ＤＮＡ濃度は、１５０μｇ／ｍｌであると測定した。上に記述される方法に加えて、細菌のＤＮＡの単離のための標準的方法が知られ、そして例えば、分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２．４．１−２．４．５（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年）で報告されており、ここに参照して組込まれる。
その後、上に記載されるとおりに得られた染色体のＤＮＡを、ＭｂｏＩで部分的に消化させた。２−１０ｋｂの範囲でフラグメントを生じる理想的な消化を、１３μｇの染色体のＤＮＡを用い、そして２．５ＭｂｏＩ（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で４０分間消化させて得た。上で示されるとおりおよそ１３μｇの染色体のＤＮＡを、バイオラボズ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＭｂｏＩ緩衝液中、３７℃で１００μｌの総量で２．５ＵのＭｂｏＩを用いて部分的に消化させた。１７μｌのサンプルを、５、１０、２０、３０、４０分に取り、そして１５μｌのサンプルを、５０分に取った。氷上に載せたサンプルに存在するあらゆる制限酵素を破壊するため、全サンプルを６５℃に加熱た。５μｌアリコート量の各サンプルを、ここで参照して組込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら（編集）、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：６．３−６．３２（１９８９年）で記述されるとおりのＴＢＥ緩衝液を使用して、０．８％アガロースゲル上で電気泳動させた。電気泳動のデータから、４０分で取られたサンプルは、２−１０ｋｂサイズ範囲で大部分のＤＮＡを含有すること、およびそれが、Ｄ−アミノ転移酵素の発現のためのプラスミドｐＩＦ３０６でライブラリーを構築するのに使用されるそれらのフラグメントであることが決定された。
プラスミドｐＩＦ３０６を、ｐＢＲ３２２（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から誘導した。ｐＩＦ３０６を構築するために、修飾ｐｈｅＡプロモーターを、ｐＢＲ３２２の単一のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩ部位の間に挿入した。ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｐｈＩ挿入部内に、単一のＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位が存在する。修飾ｐｈｅＡプロモーターを、その配列が以下の：
0004548864.tif 000003
のとおりであるもののような、共同所有のＦｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍらにより、参照してここに組込まれる米国特許第５，１２０，８３７号で特徴づけられるものから誘導した。
その各々がＭｂｏＩによって製造されたものに適合しうる末端を生じるＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで、ｐＩＦ３０６を完全に消化することによって、ベクターＤＮＡを製造した。消化を、２時間、０．５μｇのプラスミドＤＮＡおよび２単位の各酵素を用いて、２０μｌの総量で、３７℃で行った。４．２５ｋｂおよび１．２５ｋｂのフラグメントを生成し、１％アガロースＴＢＥゲル上での電気泳動によって分離した。所望の４．２５ｋｂのフラグメントを、ゲルから切り取り、そしてゲル抽出キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州チャッツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ））を用いて回収した。その後、そのフラグメントを、ＤＮＡの末端を脱リン酸化して、再環化を防ぐために、３７℃で１時間、製造業者の指示にしたがってバイオラボズの緩衝液番号２番中の１単位の酵素と一緒に、２０μｌの容積で子牛腸のフォスファターゼ（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で処理した。その後、酵素を含まないＤＮＡフラグメントを単離するために、混合物をＰＣＲ精製キット（キアゲン）で処理した。
ｐＩＦ３０６ベクターフラグメントを、およそ２０ｎｇのベクターフラグメントを、残りのおよそ１２μｌの４０分の部分的消化物と合わせることによって、ＡＴＣＣ第１０２０８号の染色体のＤＮＡの４０分の部分的消化物（上を参照）から得たフラグメントにライゲートした。ライゲーションは、製造業者の指示にしたがってタカラ・ライゲーションキット（タカラ・バイオケミカルズ，パンベラ・コーポレーション（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いて達成された。ライゲーションを、１７℃で２時間行い、その時に、ＤＮＡを、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて５０μｌの最終容量で回収した。生じたプラスミドを、２５μＦ電気容量で２．５ｋｖに設定したバイオ−ラッド・ジーンパルサーTMおよび２００オームの抵抗に設定したバイオ−ラッドのパルス・コントローラーを使用して電気泳動にかけることによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＸＬ１−Ｂｌｕｃ（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））に導入した。
形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンで補足したＬＢ培地の上に載せた。およそ２０，０００の形質転換体を、生成しそして貯蔵した。その後、プラスミドＤＮＡを、ここで参照して組込まれる分子クローニング：実験室マニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、２版、１９８９年）で報告されたとおり単離した。生じるプラスミドＤＮＡを、２５μＦ電気容量で２．５ｋｖに設定したバイオ−ラッド・ジーン・パルサーTMおよび２００オーム抵抗に設定したバイオ−ラッドのパルス・コントローラーを用いた電気泳動によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＷＭ３３５に組込んだ。株ＷＭ３３５を、オランダ国（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ステイト・ユニバーシティー・オブ・ユトレヒト（Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）、デパートメント・オブ・モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）のファバゲン・コレクション（Ｐｈａｂａｇｅｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得ることができ、そしてＬｕｇｔｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４巻：４９９−５０６頁（１９７３年）で報告され、ここに参照して組込まれた。細胞を、０．２ｃｍのギャップでバイオラッド・ジーン・パルサーTMのキューベットでパルスにかけた。形質転換されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を、６００ｎｍで０．７の光学密度まで育成（５０ｍｌ培養物）した。その後、細胞を、５分間１０，０００Ｇで遠心分離することによって回収し、そして３０ｍｌの脱イオン化蒸留水で洗浄した。細胞を、再回転させ、そして２００μｌ脱イオン化蒸留水で再懸濁させ、そして４０μｌの細胞を、１０μｌの回収ライゲーションミックスと混合し、そして電気穿刺キューベット上に載せた。単一パルスを、そのキューベットにかけ、５００μｌＳＯＣ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、そして細胞懸濁液と混合した。その後、キューベットの内容物を、２０ｍｌのｐｖｃ管に移し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、適切な培地に載せ、そして以下に示すとおり選択した。ＤＮＡを微生物に形質転換／トランスフェクションさせる多数の培地が知られており、そして本発明による方法で使用できる。例えば、Ｃｈａｎｇら（編集）、電気泳動および電気融合についての指針（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９２年）参照。
形質転換体を、５０μｇ／ｍｌチミンおよび６０μｇ／ｍｌアンピシリンを補足されるが、Ｄ−グルタメートを欠く、ＬＢ培地に載せた。Ｄ−グルタメートを作ることのできる形質転換体のもののみが、その培地で生存できる。文献中の報告により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓが、グルタメートのラセミ体を欠くと考えられるので、そのような細胞の全ては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのｄａｔ遺伝子を担持する形質転換体であることが必要とされる。しかし、２つの異なるクラスの形質転換体は、上で記述された手段によって単離し、一方は、ｄａｔ遺伝子を担持し、そして他方は、グルタメートのラセミ体を担持した。ラセミ体含有クローンを、ｐＩＦ１００１と表し、そしてｄａｔ含有クローンをｐＩＦ１００２として表した。図３は、ｐＩＦ１００２の構築を示す概要図である。
各々の場合に、クローンを、制限エンドヌクレアーゼ消化によってマッピングし、そして遺伝子を、配列した。コードしたタンパク質のｄａｔ遺伝子の配列および推定アミノ酸配列は、配列番号：２番および３番に示される。ｄａｔ遺伝子が、他の公知ｄａｔ遺伝子配列のみと高度の配列相同性を示すことが分かった。Ｔａｎｉｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻：２４５０−２４５４頁（１９８９年）参照。しかし、ｐＩＦ１００２中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのｄａｔ遺伝子によってコードされたＤ−アミノ転移酵素のＣ−末端アミノ酸配列は、Ｃ−末端配列のみが公表されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのＤ−アミノ転移酵素の他の公表された報告のみのものと一致しなかった。Ｃｈｒｉｓｔｅｎら（編集）、４６４頁（１９９５年）のＴｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓで報告されたその配列は、Ｖａｌ−Ｉｌｅ−（Ｐｈｅ−Ｔｙｒ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：４）であった。反対に、本発明に提供されるとおりの修正Ｃ−末端配列は、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号：５）である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのＤ−アミノ転移酵素コード遺伝子を単離するために、Ｃｈｒｉｓｔｅｎで報告される配列を使用することが、試みられたが、結果が得られなかった。
その後、両方のクローンを、ｄａｔ遺伝子の存在についての生物学的アッセイにかけた。そのアッセイは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１３巻：１０８−１１３頁（１９）で報告され、ここで参照して組込まれた。簡便には、ＷＭ３３５細胞中のｐＩＦ１００１またはｐＩＦ１００２の培養を、５０μｌ／ｍｌのチミンおよび２００μｌ／ｍｌアンピシリンで補足された５０ｍｌのＬＢ培地に設定した。培養物を、３７℃で振盪インキュベーター内の５００ｍｌフラスコで一晩育成した。５分間、１０，０００Ｇで遠心分離することによって、細胞を収穫し、そしてｐＨ８．５で５０ｍＭリン酸カリウムで洗浄した。細胞を、再度遠心し、そしてｐＨ８．５で１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムに取った。その後、細胞を、１０００  ｌｂｓ／インチ2でフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ）を用いて溶解させ、そして溶解物を、３０分間、マイクロフュージ内で１４，０００Ｃで遠心分離し、その時、上清を、マイクロピペットで抽出した。生じた細胞抽出物を、ここで参照して組込まれた、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１３巻：１０８−１１３頁（１９）で報告されたとおり乳酸デヒドロゲナーゼ結合アッセイを用いて分析にかけた。アッセイ混合物は、０．３Ｍリン酸カリウム、ｐＨ８．５、２５ｍＭのＤ−アラニン、２５ｍＭα−ケトグルタレート、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、７０μｇ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼおよび５０μｌの細胞抽出物を含有した。反応は、２５℃で、１ｍｌキューベット中のＮＡＤＨおよび乳酸デヒドロゲナーゼを、他の成分に添加することによって開始させた。反応は、ＮＡＤＨの酸化の証拠として３３８ｎｍでの吸収での変化を生じた。非特異的酸化について修正するために、細胞抽出物を欠くアッセイ混合物を使用する対照アッセイを行った。追加の対照として、Ｄ−アラニンを欠くアッセイ混合物を用いてアッセイを行った。未形質転換ＷＭ３３５細胞の抽出物および対照は、吸収で基本的に同一の変化を生じた、一方で、ｐＴＦ１００２を担持するＷＭ３３５細胞は、対照より３０倍多く過剰で吸収における変化を示した。ｄａｔ含有クローンは、高いコピー数のプラスミドｐＩＦ３０６での過剰発現の結果であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓの抽出物より約１００倍大きい活性のレベルを示した。プラスミドｐＩＦ１００１は、対照のものと同一の活性を示した。
実施例２
プラスミドｐＩＦ１００３の構築
プラスミドｐＩＦ１００３は、プラスミドｐＬＧ３３８（Ｓｔｏｋｅｒら、Ｇｅｎｅ  １８巻：３５５−３４１頁（１９８２年））の分配（Ｐａｒ）遺伝子座を担持するｐＩＦ１００２の誘導体である。プラスミドｐＬＧ３３８の分配遺伝子座（Ｓｔｏｋｅｒら、Ｇｅｎｅ  １８巻：３５５−３４１頁（１９８２年））。分配遺伝子座は、細胞分裂の間にプラスミド分配を制御し、そうすることで、プラスミドベクターで分離安定性が増加することに寄与する。それはプラスミド維持において抗生物質の選択の必要性を減少または排除させる上で有用である。分配遺伝子座は、オリゴヌクレオチドプライマー：
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とのＰＣＲを使用してｐＬＧ３３８から単離できる。
その後、生じる９９２ｂｐフラグメントを、制限酵素ＳｐｈＩおよびＢｓｐＥＩ（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で消化させ、そして生じた９６５ｂｐのＳｐｈＩからＢｓｐＥＩのフラグメントを、キアクイック・ゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（キアゲン）を用いて単離し、続いて１％アガロースＴＢＥゲルで電気泳動を行った。その後、このフラグメントを、ｐＩＦ１００２のＢｓｐＥＩ開裂および部分的ＳｐｈＩ開裂によって生じた５．８ｋＢのＤＮＡフラグメントにライゲートして、ｐＩＦ１００３を生じた。図４は、ｐＩＦ１００３の構築物を示す概要図である。
実施例３
プラスミドｐＩＦ３２１の構築
宿主細胞でＤ−フェニルアラニンの生成を可能にするベクターを構築するために、ｄａｔ遺伝子を、ＰＣＲを用いてｐＩＦ１００２から単離した。ｄａｔ−コーディング領域の増幅を、０．２ｍｌの商標マイクロアンプ（ＭｉｃｏｒＡｍｐTM）反応試験管（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））中の商標アンプリタック（ＡｍｐｌｉｔａｑTM）ＰＣＲキット（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））を用いて達成し、それに１００ｎｇのｐＩＦ１００２ＤＮＡ（１μｌ）、１０ナノモル／ｍｌの濃度でプラスミド：
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の各々５μｌ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ（各１０ｍＭ）の各々２μｌ；１５ｍＭのＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＫＣｌ2、１００ｍＭ  トリス（ｐＨ８．３）、および０．０１％ゼラチンを含有する１０μｌの緩衝液；ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌで０．５μｌ、アンプリタック（ＡｍｐｌｉｔａｑTM））；および蒸留水を加えて、１００μｌの総量にした。各々、試験管に栓をし、そしてパーキンエルマーの９６００サーマル・サイクラーに入れた。増幅を、９４℃で３分間予備加熱し、続いて９４℃で３０秒間変性させ、５０℃で３０秒間アニーリングし、そして７２℃で、９０秒間伸長させることを２５サイクル行った。反応混合液を、４℃で保存した。
生じたおよそ９１４ｂｐＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＮｃｏＩで消化させ、そしてその後産物を、製造業者の指示に従ってライゲーション・キット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（タカラ・バイオケミカルズ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いてｐＩＦ３０６の４．５ｋｂ  ＢａｍＨＩからＮｃｏＩのフラグメントにライゲートさせた。生じるプラスミドは、ｐＩＦ３１８と示された。ｐＩＦ３１８の構築物は、図５に示される。
ｐＩＦ３１９プラスミドは、ここに参照して組込まれた共同所有の米国特許第５，３５４，６７２号に開示されたｐＬＧ３３８プラスミドに基づき、カナマイシン耐性遺伝子を担持する強力な宿主株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＷ８５７と争うことを避けるために、カナマイシン耐性マーカーをクロラムフェニコール耐性マーカーに置換えられた。プラスミドｐＩＦ３１９は、ここに参照して組込まれる共同所有の米国特許第５，１２０，８３７号に開示されるとおりのｐｈｅＡ３４遺伝子、およびｐＬＣ３３８中の特徴的なＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間の合成オペロンでのａｒｏＨ遺伝子を含む。ｐｈｅＡ３４対立遺伝子は、酵素のフェニルアラニン媒介フィードバック阻害を実質的に減少させるｐｈｅＡコーディング配列中での改変を含む。それは、アテニュエーター配列を欠き、そして結合遺伝子の発現を増大させるｐｈｅＡプロモーター領域の解除向性をも含む。ｐｈｅＡ３４およびｐｒｏＨの存在は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、およびあらゆるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋ１２株でのフェニルピルベートへの経路を効果的に解除する。プラスミドｐＩＦ３１９も、ｐＪＮ３０７で特徴的なＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位の間にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのａｒｏＨ遺伝子を導入し、続いてＢａｍＨＩ部位にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのａｓｐＣプロモーターを導入することによって、米国特許第５，１２０，８３７号に開示されるｐＪＮ３０７から誘導できる。ａｒｏＨ遺伝子を、プライマー
0004548864.tif 000006
を用いたＰＣＲによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０から単離した。生じたＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで開裂し、そしてｐＪＮ３０７の同様の開裂によって生成された８ｋｂのフラグメントにライゲートした。その後、ａｓｐＣプロモーター領域を、生じた中間体プラスミド中の特徴的なＢａｍＨＩ部位に挿入した。ａｓｐＣプロモーター領域を、プライマー
0004548864.tif 000007
を用いたＰＣＲによってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０から単離した。その後、生じたおよそ２７８ｂｐのフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで開裂し、そして特徴的なＢａｍＨＩ部位で開裂したベクターにライゲートした。生じたライゲーションは、ＢｉｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩで単独にのみ開裂されえなかったＤＮＡ配列を生じ、そしてしたがって、ａｓｐＣプロモーターの配向を確認するための簡単な手段を提供する。生じた構築物は、ｐＪＮ３２６である。ｐＪＮ３２６の構築物は、図６に示される。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで開裂させてほとんど（５２０ｂｐ）のカナマイシン耐性遺伝子を欠失させ、そしてｐＨＳＧ４１５のクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを挿入することによって、プラスミドｐＪＮ３１９をｐＪＮ３２６から生成した。ｐＨＳＧ４１５のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、プライマー
0004548864.tif 000008
を用いたＰＣＲによって単離した。生じたおよそ１１９１ｂｐのフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで開裂し、そしてｐＪＮ３２６の類似の開裂により生成された８．８７ｋｂのフラグメントにライゲートした。生じたプラスミドは、ｐＩＦ３１９である。ｐＪＮ３１９の構築物を、図７に示す。
ｐＩＦ３２０プラスミドを構築するために、ｐＩＦ３１８プラスミドを、ｄａｄＸ遺伝子を挿入するためのＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで開裂した。上に示されたＭＢ１８１０プライマーは、そのプライマーにＮｃｏＩ部位を重ね合せるＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含む。それは、ｄａｄＸを導入して、ｄａｔおよびｄａｄＸを含む合成オペロンを形成するのに使用されるＢａｍＨＩ部位（および下流ＳｐｈＩ部位）である。ｄａｄＸ遺伝子配列は、ジーンバンク・データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ）、参照コードＥＣＯＤＡＤＡＸから得た。その配列から、ＰＣＲプライマー
0004548864.tif 000009
を設計し、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ受託番号第２７３２５号）からｄａｄＸ遺伝子を単離するのに使用された。増幅条件は、まさに上述のとおりであった。その遺伝子は、その生来のプロモーターなしで単離し、そしてｄａｔ遺伝子挿入のすぐ下流にライゲートされる。増幅すると、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで開裂されたおよび１１７１ｂｐのフラグメントになり、そして、同様に消化させたｐＩＦ３１８にライゲートさせておよそ４．８ｋｂのフラグメントを形成した。生じたプラスミドは、ｐＩＦ３２０と示され、そして合成オペロン中にｄａｔおよびｄａｄＸ遺伝子を担持する。ｐＩＦ３２０の構築物は、図８に示される。
その後、ｐＩＦ３２１と示されるさらなるプラスミドを構築した。プラスミドｐＩＦ３２１は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩでｐＩＦ３２０を開裂し、そしてｄａｔおよびｄａｄＸ遺伝子を担持する２．１ｋｂのフラグメントを単離することによって生成され、その後、それはｐＩＦ３１９の同様の開裂によって産生された９．２ｋｂフラグメントにライゲートされた。ｐＩＦ３２１の構築物は、図９に示される。ｐＩＦ３２１プラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ−から−ＳｐｈＩのフラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ−プロモーター−ｄａｔ−ｄａｄＸ−ＳｐｈＩ）で単離され、そしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのトリプトファン−依存性ＤＡＨＰシンターゼをコードするａｒｏＨ遺伝子と一緒に、上述のｐｈｅＡ３４対立遺伝子を含むｐＩＦ３１９にライゲートされたｐＩＦ３２０のｄａｔおよびｄａｄＸ遺伝子を含んだ。
実施例４
プラスミドｐＩＦ３３３の構築
プラスミドｐＩＦ３３３を生成するために、プラスミドｐＩＦ３２１を、最初に、酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩを用いて開裂して、６．９ｋＢおよび４．５ｋＢのフラグメントを得た。６．９ｋＢのフラグメントは、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）のゲル抽出キット（キアゲン）を用いて単離し、続いて１％アガロースＴＢＥゲルで電気泳動にかけた。その後、このフラグメントを、ｐＢＲ３２２（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））のＳｐｈＩおよびＳａｌＩ開裂から生成された８９ｂｐのフラグメントにライゲートし、そして同様に２％アガロースＴＢＥゲルから単離した。生じたプラスミドは、ｐＩＦ３３３である。ｐＩＦ３３３の構築物は、図１０に示される。
実施例５
ｐＡＬＲ１８の構築
アラニン・ラセミ体をコードするａｌｒ遺伝子を、ＡＴＣＣから得たＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＡＴＣＣ受託番号第１９５８５号から単離した。ａｌｒ遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマー：
0004548864.tif 000010
を用いたＰＣＲによって単離された。
１０９８ｂｐのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで開裂し、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）のゲル抽出キット（キアゲン）を用いて単離し、続いて１％アガロースＴＢＥゲルで電気泳動にかけた１０８２ＢａｍＨＩからＳｐｈＩのフラグメントを生じた。その後、このフラグメントを、ｐＩＦ３３３の５．７ｋＢのフラグメントにライゲートして、ｐＡＬＲ１８を生成した。ｐＡＬＲ１８の構築物は、図１１に示される。
実施例６
Ｌ−アミノデアミナーゼ遺伝子の単離およびｐＰＴ３６３プラスミドの構築
Ｌ−アミノデアミナーゼ遺伝子（ｌａｄ）を、２分の延長時間および以下のオリゴヌクレオチド：
0004548864.tif 000011
を用いた標準条件下で行われるＰＣＲ反応を用いて、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ受託番号第１９６９２号の染色体から単離した。
フラグメントを、酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩによって開裂し、そして同様の開裂から産生されたｐＡＬＲ１８の６．８４ｋｂフラグメントにライゲートした。生じたプラスミドは、ｐＰＴ３６２と名づけられた。ｐＰＴ３６２の構築物は、図１２に示される。
プラスミドｐＰＴ３６３を、ｐＰＴ３６２およびプラスミドｐＩＦ３２１から生成した。ｐＰＴ３６２およびｐＩＦ３２１の両方は、ＸｈｏＩおよびＡｐｏＩで開裂した。ｐＰＴ３６２の４．６７ｋＢフラグメントおよびｐＩＦ３２１の７．４９ｋＢフラグメントを単離し、そしてライゲートしてｐＰＴ３６３を生成した。ｐＰＴ３６３の構築物は、図１３に示される。
実施例７
株ＩＦ３の構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ｐＩＦ３は、ＲＹ３４７（ＡＴＣＣ受託番号第６９７６６号）から誘導された。ＲＹ３４７は、ここに参照して組込まれる、Ｍｉｌｌｅｒら、「細菌遺伝学での短いコース」（Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）で記述されるとおりの標準Ｐ１形質導入方法論を用いてｔｙｒＢ＋に形質導入した。ｔｙｒＢ＋形質導入体を選択することは、チロシンの栄養要求性突然変異の損失であり、同様にその株は、イソロイシンの栄養要求性突然変異の損失のために選択するｉｌｖＥ＋に形質導入された。生じた単離物は、ｐＩＦ３と示された。
実施例８
外部アミノ供与体の添加なしのＤ−フェニルアラニンの製造の発酵プロセス
株ＩＦ３を、プラスミドｐＰＴ３６３およびｐＩＦ１００３で形質転換させた。形質転換ＩＦ３株を、１Ｌの以下の育成培地：
0004548864.tif 000012
を含む２８００ｍｌフェルバッハ・フラスコに接種するのに使用した。
その株を、８００−９００クレット単位に育成し、そして発酵槽に接種するのに使用した。発酵槽は、バイオラフィット７８−１００（セント・ゲルメイン−エン・ライ、フランス国（Ｓｔ  Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ  Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ））２０Ｌであった。以下は、発酵槽が操作される条件である。
0004548864.tif 000013
使用された発酵培地は、以下の表に列記される。
0004548864.tif 000014
発酵プロセスの間、グルコースを、可変速度で供給して、最初の１２時間で１０−１５ｇ／ｌ、その後残りの時間１ｇ／ｌ未満の濃度に、４８時間で総量１２０４ｇに達した。発酵により、産生されるべき１．１２ｇ／ｌのＤ−フェニルアラニンおよび０．４７ｇ／ｌのＬ−フェニルアラニンになる。
実施例９
アミノ供与体として供給されたＤ−、Ｌ−アラニンの添加を伴うＤ−フェニルアラニンの産生のための発酵
実施例９の発酵プロセスは、以下の局面以外は実施例８の発酵プロセスと同じであった。総グルコース供給は、４８時間で１９７６ｇであった。酵母抽出物を、２ｇ／ｌで使用した。発酵培地は、Ｄ−、Ｌ−アラニン供給を含み、それにより総量１４００ｍｌの１６７ｇ／ｌのＤ−、Ｌ−アラニンが、発酵の最初から１２時間を初めとして１．９ｍｌ／分の速度で供給された。発酵により、産生されるべき４．１５ｇ／ｌのＤ−フェニルアラニンおよび０ｇ／ｌのＬ−フェニルアラニンを生じた。
実施例１０
アミノ供与体としてＤ−、Ｌ−アラニンの、そしてケト酸前駆体としてＬ−フェニルアラニンの添加を伴うＤ−フェニルアラニンの産生のためのプロセス
実施例１０の発酵プロセスは、以下の局面以外は、実施例８と同じであった。発酵に使用される育成培地は、以下の表に列記される。
0004548864.tif 000015
供給されるグルコースの量は、５２時間で２０２１ｇだった。発酵培地としては、Ｄ−、Ｌ−アラニン供給が挙げられ、それにより、総量１４００ｍｌの１６７ｇ／ｌのＤ−、Ｌ−アラニンが、発酵の最初から１２時間を初めとして１．９ｍｌ／分の速度で供給された。さらに、Ｌ−フェニルアラニンを、Ｄ−、Ｌ−アラニンのときと同じ濃度と速度で供給した。発酵により、産生されるべき１３．６６ｇ／ｌのＤ−フェニルアラニンおよび０．８７ｇ／ｌのＬ−フェニルアラニンを生じた
実施例１１
プラスミドｐＰＴ３６１の構築
プラスミドｐＰＴ３６１を、以下のとおりｐＩＦ３０６から誘導した。ｐＩＦ３０６を、酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで開裂した。３．９ｋｂフラグメントを、単離し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
0004548864.tif 000016
を用いて、Ｗ３１１０染色体からのＰＣＲによって生成されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｉｌｖＥ遺伝子を含む同様に開裂したフラグメントにライゲートした。
生じたベクターは、ｐＩＦ３０７と名づけられた。プラスミドｐＩＦ３０７を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで開裂し、そして４．１ｋＢフラグメントを単離した。これを、ｐＬＧ３３８から得たカナマイシン耐性遺伝子を含有する、同様に開裂および精製された９８２ｂｐのＤＮＡフラグメントにライゲートした。これは、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
0004548864.tif 000017
でＰＣＲを用いて生成された。
生じる開裂プラスミドは、ｐＩＦ３１２と名づけられた。プラスミドｐＩＦ１２を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで開裂し、そしてファージ・ラムダ・Ｃ１８５７遺伝子にライゲートし、それは、同様に開裂され、続いてテンプレートとしてラムダ・ＺａｐＩＩベクター（ストラジェン（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））、および以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
0004548864.tif 000018
を用いたＰＣＲによって単離した。
生じたプラスミドをｐＰＴ３５３と名づけた。その後、このプラスミドを、ＰｓｔＩおよびＥａｇＩで開裂し、そして３．１７ｋｂのフラグメントを単離した。これを、ｐＩＦ１００３の同様の開裂によって生成された同様に開裂した２．５ｋｂフラグメントにライゲートした。生じたベクターを、単離された４．７ｋｂフラグメントと名づけた。これを、以下のオリゴヌクレオチドリンカー
0004548864.tif 000019
にライゲートされた。
生じたプラスミドは、ｐＰＯＴ２と名づけられた。このプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで開裂し、そして３．９ｋｂフラグメントを単離した。これを、テンプレートとしてｐＩＦ３１９プラスミドＤＮＡを、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって単離されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むフラグメントにライゲートした。
0004548864.tif 000020
生じたプラスミドは、ｐＰＯＴ３と名づけられた。これは、ＢａｍＨＴおよびＳｐｈＩで開裂した。４．８ｂｐのフラグメントを単離し、そしてＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｔｓ  Ｌａｄ遺伝子を含む同様に開裂したフラグメントにライゲートした。これを、ＡＴＣＣ第１９６９２号由来の染色体から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
0004548864.tif 000021
を用いたＰＣＲで単離した。
実施例１２
Ｌａｄアミノ酸基質の測定
表１に列記された各々のアミノ酸基質を、以下の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）Ｌａｄアッセイを用いたＬａｄ酵素に適切な基質であることが測定された。使用される全ての化合物は、ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。
アッセイミックスは、表１に列記される１０ｍｇ／ｍｌのアミノ酸基質の内の１つ、および７．５のｐＨを示す１００ｍＭトリスＨＣｌを含む。アッセイミックス（２ｍｌ）を、Ｌａｄ遺伝子を含有するプラスミドｐＰＴ３６１を含む株Ｗ３１１０から得た１００ｍｇの細胞ペレットに添加した。
細胞を、１Ｌ振盪フラスコ内で、３７℃で２００ｍｌのＬＢ培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ））の一晩培養から製造した。細胞を、１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一度洗浄し、そして遠心分離でペレットにした。３７℃で１６時間、０．００５ｍｌの反応ミックスをシリカＴＬＣプレート番号６０番Ｆ−２５４（イーエム・サイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、オハイオ州シンシナティー（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））上にスポットを付けて、反応を行った。
以下の溶媒：水（４０％）；メタノール（４０％）；およびアセトニトリル（２０％）を用いて、クロマトグラフィーを行った。ＴＬＣプレートを、空気乾燥し、そしてエタノール中の２％ニンヒドリンを噴霧し、そしてその後１０分間焼いた。
表１に列記されたアミノ酸の各々をそれらの対応のケト酸に転化することを、同時クロマトグラフィーの公知水準に対するアミノ酸誘導スポットの不在によって測定した。表１に列記されたアミノ酸基質の各々が、Ｌａｄ酵素に適切な基質であることが分かった。
実施例１３
Ｄａｔケト酸基質の測定
Ｄａｔ酵素を、以下の条件下の結合酵素アッセイで表１に列記した各ケト酸基質で分析した。使用される化合物の全てを、ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。
アッセイミックスは、５００ｕ／ｍｌのＤａｔ；３０ｍＭ  Ｄ−アラニン；３０ｍＭケト酸基質；０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ；および１００ｍＭトリスＨＣｌを含んだ。アッセイ混合物のｐＨは、８．３であった。０．８５ｍｌのアッセイミックス、０．０５ｍｌのＤ−ラクテート、および０．５−１．０のＯ．Ｄ．650でプラスミドｐＩＦ１００３を含む０．１ｍｌのＷ３１１０細胞（ＡＴＣＣ第２７３２５号）を含む１ｍｌの溶液を用いて、アッセイを行った。
細胞を、１Ｌ振盪フラスコ内で、３７℃で２００ｍｌのＬＢ培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ））の一晩培養から製造した。細胞を、１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一度洗浄し、そして遠心分離し、そして水に取った。表１中のケト酸基質の各々の反応を、３７℃でΔＡ340を測定することによって観察した。表１中のケト酸基質アッセイの各々は、Ｄａｔ酵素に適切な基質であることが分かった。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：９５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000022
配列番号：２
配列の長さ：１４２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：４２７．．１２７５
配列
0004548864.tif 000023
0004548864.tif 000024
配列番号：３
配列の長さ：２８３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0004548864.tif 000025
配列番号：４
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0004548864.tif 000026
配列番号：５
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0004548864.tif 000027
配列番号：６
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000028
配列番号：７
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000029
配列番号：８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000030
配列番号：９
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000031
配列番号：１０
配列の長さ：３７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000032
配列番号：１１
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000033
配列番号：１２
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000034
配列番号：１３
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000035
配列番号：１４
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000036
配列番号：１５
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000037
配列番号：１６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000038
配列番号：１７
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000039
配列番号：１８
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000040
配列番号：１９
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
0004548864.tif 000041
配列番号：２０
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２１
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２２
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：７４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：３０
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：３１
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：３２
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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配列番号：３３
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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