(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞に発現ベクターを導入する方法において、
ａ）細胞による発現ベクターの取り込みを可能とする条件下で、哺乳動物細胞を発現ベクターと接触させる工程であって、発現ベクターが異種タンパク質をコードする第１DNA配列、増幅可能なマーカーをコードする第２DNA配列、および配列番号：１からなるＥＢＶ−ＴＲ配列を含んで成るものである工程、
ｂ）工程ａ）から得た細胞を、増幅可能なマーカーをコードする細胞の選択を可能とする条件下の選択培地中で成長させる工程；および
ｃ）工程ｂ）から得た異種タンパク質を発現する細胞を回収する工程、
を含んで成る上記方法。
【請求項２】
ｄ）工程ｃ）で回収した細胞を、さらに選択を行うことを可能とする条件下で成長させる工程をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２DNA配列が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン シンテターゼおよび多剤耐性遺伝子から成る群から選択される増幅可能なマーカーをコードする、 請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１DNA配列が、第VIII因子、第VIII因子の誘導体、インターロイキン−４およびIL-4の誘導体から成る群から選択される異種タンパク質をコードする、 請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）およびｄ）の少なくとも１工程を無血清条件下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
異種タンパク質をコードする第１DNA配列、増幅可能なマーカーをコードする第２DNA配列、および配列番号：１のEBV-TR配列を含む第３DNA配列を含んで成る発現ベクター。
【請求項７】
増幅可能なマーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
配列番号：１のEBV-TR配列を含んで成るベクターでトランスフェクトしたCHO細胞から誘導されるIL-4ダブルムテインを発現するCHOクローン。
【請求項９】
ベクターpSH135でトランスフェクトした請求項８に記載の細胞系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
関連出願：MSB-7241（米国特許出願番号第09/209,920号）、「哺乳動物の遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞（Human Hybrid Host Cell for Mammalian Gene Expression)」と命名されたChoの出願、およびMSB-7255（米国特許出願番号第09/209,916号）、「第VIII因子のための発現系（Expression System for factorVIII）」と命名されたChoらの出願は、関連する主題を含む。両出願は1998年12月10日に出願された。
【０００２】
発明の背景
分野：本発明は一般に、遺伝子操作の施された哺乳動物細胞系からの生物学的に活性なタンパク質の生産に関する。具体的には本発明は、発現ベクターの宿主哺乳動物細胞系のゲノムDNAへの組込みを増強させるエプスタイン-バーウイルス末端反復配列を含有する新規な発現ベクターに関する。
背景：部位特異的組込みによる発現ベクターのゲノムDNAへの安定な組込み効率を増すために、多くの試みがなされてきた。
【０００３】
投入DNAの宿主細胞ゲノムへのランダムな非相同的な組込みは、目的とする相同的組換えよりも100倍以上高い頻度で起こる（Thomas et al.,1987,Cell 51:503-512)。しかしホットスポット、例えば超可変ミニサセライトDNAを使用する相同的組換えは哺乳動物細胞中で２つの欠損プラスミド間のランダム組換えよりも頻繁に起こることが示された（Wahls et al.,1990,Cell 60:95-103)。
【０００４】
自己抗原の細胞性タンパク質がSun et al.により単離された(1994,Proc Natl Acad Sci USA 91:8646-8650)。このタンパク質は末端反復結合タンパク質、すなわちTRBPと同定された。末端反復結合タンパク質の２つの末端反復結合部位(TRBS1およびTRBS2)もSun et al.により単離された。彼らはTRBPが反復細胞性DNA中に存在する配列、例えば数可変縦列反復（variable-number tandem repeats:VNTR)および免疫グロブリン重鎖クラススイッチ領域に結合することに気づいた。
【０００５】
末端反復結合タンパク質は、エプスタイン−バーウイルス末端反復（EBV-TR）のＧ−リッチ領域に結合する。EBV-TRはプロセッシングおよびビリオンDNAのパッケージングに関与する（Zimmermann et al.,1995,J Virol 69:3147-3155)。EBV-TRは染色体DNAへの組込み(Matsuo et al.1984,Science 226:1322-1325)および感染後のゲノムの環化現象（event）に関与している。このような配列はEBVビリオンDNAの開裂およびパッケージングに必須の要素である（Hammerschmidt et al.,1989,Nature(London)340:393-397；Zimmermann et al.,J Virol, 69:3147-3155)。このようなデータは組換え現象においてEBV-TR配列の重要な役割を示している。したがって、我々はトランスフェクトした細胞から誘導されるクローンにおけるEBV-TRの組込み現象を試験した。
【０００６】
発明の要約
我々は今、選択可能なマーカーおよびEBV-TR配列を含む発現ベクターでトランスフェクトした細胞が、同じ選択条件下でEBV-TR配列を含まない同じ発現ベクターでトランスフェクトした細胞に比べて、選択剤に耐性の細胞数において５〜10倍の増加を示すことを見いだした。薬剤選択下でのより高い生存率は、EBV-TRを含むベクターがベクターのゲノムDNAへの組込み頻度を強化できることを示している。
【０００７】
本発明の発現ベクターは、EBV-TR配列およびジヒドロ葉酸シダクターゼ(dhfr)のような選択可能なマーカーを含む。好適なEBV-TR配列は、不死化したリンパ芽球細胞系6F11に由来するTRBP-結合領域のコア部分を含む402bp配列（図１に与える）である。好適な態様では哺乳動物遺伝子発現ベクターは、CMVエンハンサーおよびプロモーター、エプスタイン-バーウイルスに由来するイントロン配列（Cho et al.への米国特許第5,854,021号明細書に記載されているようなMIS）、タンパク質コード配列の挿入を可能にするための独自な制限酵素部位HpaI、およびポリＡ領域に加えて薬剤選択マーカーおよび図１に示すEBV-TR配列をもつプラスミド骨格を含んで成る。このベクターをpSH131（図２を参照にされたい）と命名する。このベクターは目的とするタンパク質の適切なDNAコード配列を哺乳動物細胞に導入し、無血清培地でタンパク質発現の長期培養を安定化させるために使用する。１つの好適な態様では、IL-4ムテイン(mutein)の配列をpSH131にクローン化し、そして生成したベクターはpSH135である。このEBV-TR配列はpCIS25D（B-ドメイン欠損rFVIIIを発現するためのベクター、BDD-FVIIIと命名）にも直接連結し、そして生成したベクターはpCIS25DTRである。
【０００８】
好適な増幅可能なマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr)であるが、グルタミン シンテターゼ(gs)および多剤耐性遺伝子(mdr)のような他のマーカーに置き換えることもできる。このような増幅可能なマーカー(dhfr、gsおよびmdr)は選択可能なマーカーでもある。好適な選択可能なマーカーは、neo（ネオマイシ耐性に関するアミノグリコシド ホスフォトランスフェラーゼ）である：さらにhph（ヒグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ）およびhisD（ヒスチジノール  デヒドロゲナーゼ）のような他の好適なマーカーに置き換えることができる。
【０００９】
トランスフェクトする宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞であることができる。選択遺伝子の細胞の染色体DNAへの組込みが受け入れられることが知られている細胞系が最適であり；例えばヒト 胚性腎細胞（例えば293S細胞）、293SとＢ細胞起源のヒトハイブリッド（例えばHKB11；ATCC寄託番号CRL 12568、MSB-7241、「哺乳動物の遺伝子発現のためのヒト ハイブリッド宿主細胞(Human hybrid host cell for mammalian gene expression)」と命名された本出願と同日に出願されたChoへの米国特許出願を参照にされたい、この出願は引用により本明細書に編入する）、チャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）、ベビィ ハムスターの腎臓(BHK-21) 、マウス骨髄腫およびヒトＢ-細胞である。
【００１０】
１つの役立つ例として、我々はdhfrおよびEBV-TR配列を含む発現ベクターでトランスフェクトしたCHO(dhfr-)細胞が、同じ選択条件下でEBV-TR配列を含まない同じ発現ベクターでトランスフェクトした細胞に比べて、メトトレキセート(MTX）耐性細胞の数において約５〜10倍の増加を表したことを示す。
【００１１】
本明細書で使用する場合、無血清条件とは血清を加えない培地で細胞の成長が起こる条件を意味する。
【００１２】
具体的態様
EBV-TRを含む発現ベクターの構築
B95/8 EBVシークエンシング データの170,476から170,856のDNA配列を包含する（P.J.Farrell、「エプスタイン−バーウイルスゲノム（Epstein-Barr Virus Genome)」、進歩したウイルス腫瘍学（Advanced Viral Oncology)で：G.Klein編集；ラベンス出版社（Ravens Press)、ニューヨーク 1989、第103〜132頁)、図１に記載したEBV-TR配列の381bpフラグメントを、EBVにより不死化されたリンパ芽球細胞である6F11細胞（ATCC CRL9652）から調製した鋳型DNAから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作成した。２つのプライマー(配列番号：１から誘導したフラグメント5'-GGCAATGGAGCGTGACGAAG-3'および5'-CTCATCACGGTCACGCATGG-3'）を作成して、6F11細胞DNA中のEBV-TR配列の381bpフラグメントを増幅した。PCR産物をリン酸化し、そして制限エンドヌクレアーゼNaeIにより切り出した553bpフラグメントを除去した後に発現ベクターpSM97に連結した。生成したベクターはpSH31（図２）であり、これをアメリカン タイプ カルチャー コレクション、ATCC98879に寄託した。
【００１３】
pSH131(402bp)中のEVB-TR配列のDNAシークエンシングデータは、予想されたサイズ(381bp)よりも大きかった。この主な差異は９bp要素からの４bp（GTGTTGGCG）および10bp要素からの７bp（GGTCATGGGG）から成る11-bpの反復(GGCGGGTCATG)である。Zimmermann et al.（1996,J Virol 69:3147-3155)により記載されているEBV-TR中のEBV DNA分子の両端は、９bp要素（GTGTTGGCG）および11bp要素（GGGTCATGGGG）から成る（すべてのフラグメントは配列番号：１に由来する）。pSH131中の11bp要素は、１bpが欠損していた；すなわち我々は10bpのみを観察した。観察された11bp要素の反復の理由は、pSH131（402bp）中のEBV-TR配列がB95/8 DNAではなく6F11 DNAを使用して作成されたからかもしれない。6F11細胞をEBVにより不死化し、そしてEBV-DNAの鎖状化形を有するが（Cho and Tran,1993,Virology 194:838-842）、B95/8EBVは感染ウイルスである。したがって、pSH131(402bp)のEBV-TR配列は、この鎖状化EVB-DNAから誘導した。
【００１４】
IL-4ダブル  ムテイン(IL-4dm)をコードするDNA配列を、pSM97およびpSH１３１のHpaI部位に挿入した。生成したプラスミドはpSH134(pSM97中のIL-4dm)およびpSH135(pSH131中のIL-4dm)。使用したIL-4dmは、本質的にはSebaldへの欧州特許第0613499号に記載されている（これは引用により本明細書に編入する）。このIL-4dmは121位（アルギニン）および124位（チロシン）においてアスパラギン酸へ変化したアミノ酸を有する非修飾IL-4の誘導体である。
【００１５】
EBV-TR配列のPCR産物はpCIS25DのSalI部位にも挿入し、これはＢ-ドメインが欠失した第VIII因子（BDD-FVIII）をコードする発現ベクターである。生成したプラスミドはpCIS25DTRである。すべての４つの発現ベクター、pSH134およびpSH135、pCIS25D、およびpCIS25DTRは同じ機能的dhfr遺伝子を有する。マップに関しては図２を参照にされたい。
【００１６】
【実施例】
実施例１
一過性のトランスフェクション アッセイにおいて
レポーター遺伝子の発現に及ぼすEBV-TRの効果
２百万個のCHO（dhfr-陰性）およびHKB（ヒト−ヒトハイブリッド細胞系：ATCC CRL-12568）細胞を、提供されたプロトコールに従いカチオン性リポソーム DMRIE-C試薬（ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、ロックビル、メリーランド州）を使用して６-ウェルプレート中の５μgのプラスミドDNA(pSH134およびpSH135)を用いて別々にトランスフェクトした。両発現ベクターでCHOおよびHKB細胞をトランスフェクションした２または３日後に、上清をELISAによりIL-4dmの発現について試験した。図３に示すように、繰り返した一過性のトランスフェクションアッセイにおける２つの異なるトランスフェクション体から、pSH134に由来するIL-4dmの発現レベルはpSH135に由来するレべルに大変類似していた。このような結果はEBV-TRがIL-4dmレポーター遺伝子の発現に効果を及ぼさないことを示している。このような結果はEBV-TRがベクター中の遺伝子発現、例えばdhfrに及ぼす機能を強化しないかもしれないことを示している。これはEBV-TRの存在が、dhfr遺伝子の発現の増加以外のメカニズムを通して生存率を上げ、すなわちこのメカニズムにはベクターの組み込みの上昇が関与しているかもしれないことを意味している。
【００１７】
実施例２
EBV-TRを含むベクターを用いてトランスフェクトした細胞の薬剤選択
CHO（dhfr-）細胞を、ライフ テクノロジー(Life Technology)により提供されたプロトコールに従いカチオン性リポソーム DMRIE-C試薬を使用して、５μgのpSH134および５μgのpSH135を用いて別々にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞（96ウェルプレートあたり５×105細胞）を、r-インスリン、トランスフェリンおよび50nM MTXを補充し、そしてヒポキサンチンおよびチミジンを欠く無血清培地で選択した。成長−陽性ウェルは、50nM MTXを含む選択培地で最初に選択してから２週間後に計数した。MTX−耐性クローンはmockトランスフェクト細胞からは誘導されなかった。結果を表１に示す。実施例１（IL-4dm）は、50nMのメトトレキセートを補充し、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く無血清培地で行った。実施例２（IL-4dm）は、50nMのメトトレキセートを補充した血清（５％）を含有する選択培地で行った。実施例３（BDD-FVIII）および実施例４（BDD-FVIII）は、実施例１の無血清選択培地で行った。
0004500448.tif 000002
1トランスフェクションにEBV-TRを欠く発現ベクターを使用した。
2トランスフェクションにEBV-TRを含む発現ベクターを使用した。
3この比はEBV-TRを欠く発現ベクターでトランスフェクトした細胞に対して、EBV-TRを有するベクターでトランスフェクトした細胞の成長+比を示す。
4多数のコロニーが多くの成長−陽性ウェルで成長していたので、成長−陽性コロニーの実際の数は各ウェルで計数された成長−陽性数よりも大変高い。
【００１８】
選択培地に細胞をまいてから２週間後、pSH135(EBV-TRを含む)でトランスフェクトした細胞は、pSH134(EBV-TRを含まない)でトランスフェクトした細胞よりも約10倍高い選択比を示したが、EBV-TRはIL-4の発現に及ぼす機能に強化を示さなかった（図３）。CHO（dhfr-)細胞も、DMRIE-C試薬を使用して５μgのpCIS25Dおよび５μgのpCIS25DTRでトランスフェクトした。細胞は上記と同じ条件下で選択した。pCIS25DTRでトランスフェクトした細胞は、pCIS25Dでトランスフェクトした細胞よりも約３倍から約16倍高い選択比を示した（表１）。このような結果は発現ベクター中のEBV-TRの配列が、遺伝子治療のためにインビボでベクターの組込みを増大させるために使用できることを示している。
【００１９】
実施例３
無血清条件下での高い生産細胞系の選択
pSH135でトランスフェクトしたCHO（dhfr-陰性)細胞は、トランスフェリン、組換えインスリンおよびメトトレキセート(50nM)を補充した無血清選択培地を使用して、96-ウェルプレートにまいた（ウェルあたり５×105細胞）。選択培地はヒポキサンチンおよびチミジンを欠く。増幅（50および100nMのMTX）から３カ月後、1G9と名付けた最初の群の１つを震盪フラスコを使用して懸濁培養に適用した。高レベルのIL-4dm生産性（〜５pg/c/d）が無血清培地およびトランスフェリンおよび組換えインスリンを補充したアルブミンを含まない培地で少なくとも約10週間、続いて観察された。
【００２０】
実施例４
安定な組込み
実施例２に記載したようにpCIS25DTRでトランスフェクトしたCHO細胞に由来する、BDD-FVIIIをスクリーニングするCHOクローンの1つを、選択薬剤（MTX）の不在下でその生産安定性について試験した。このクローンはMTXを欠く培地中で６カ月間の成長期間中、BDD-FVIIIを分泌し続けた。このクローンに由来するすべての単一細胞クローンも選択陽性であった。このような結果はEBV-TR配列を含むベクターの組込みが安定な組込みであることを示している。
【００２１】
結論
高レベルのタンパク質を分泌する安定な細胞系の誘導化は大変単調で、しかも労力を要する仕事である。これは少なくとも一部は目的とする遺伝子の安定な組込みおよび増幅の機会の低さによる。高い分泌コロニーを得るためには、一般に多数の薬剤耐性コロニーをスクリーニングする必要がある。したがって我々は本明細書で、EBV-TR配列を有するベクターが増大された薬剤選択比をもたらすことを記載し、これはトランスフェクトされた遺伝子の高い組込み率を示している。表１に示すように、トランスフェクトされた細胞は無血清条件下でも選択および増幅することが可能であった。
【００２２】
上記実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、当業者には変更も生じるだろうと思われる。従って本発明の範囲は、前記特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
【外１】
0004500448.tif 000003
【図２】  選択比を比較するために使用する発現ベクターを示す。すべてのプラスミドはpBR322骨格に基づき構築し、そしてdhfr発現単位を含む。目的タンパク質をコードするすべての遺伝子は、CMVエンハンサー／プロモーター(CMVe/p)の制御下にあり、５'-イントロン（MISまたはCIS）をこの遺伝子の５'-末端に配置した。
【図３】  CHOおよびHKB細胞を使用して４回繰り返した一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、pSH134およびpSH135に由来するIL-4ムテインの発現に及ぼすEBV-TRの効果を示す。
【配列表】
0004500448.tif 000004
【図１】
0004500448.tif 000005
【図２】
0004500448.tif 000006
【図３】
0004500448.tif 000007