(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号：2に示されるアミノ酸配列またはプラスミドDSM 12666に含有されるcDNAによってコードされるアミノ酸配列を含む、少なくとも成熟型のタンパク質をコードする核酸分子と、
（b）配列番号：1に示されるヌクレオチド配列もしくはプラスミドDSM 12666に含有されるcDNAのヌクレオチド配列、または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（c）アミノ酸配列が配列番号：2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子と、
（d）一方の鎖が（a）または（b）に規定される核酸分子のいずれか一方とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子と、
（e）（a）、（b）、（c）または（d）に規定される核酸分子のいずれか1つによってコードされるタンパク質のオルタナンスクラーゼの酵素活性を有する断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（f）ヌクレオチド配列が、（a）、（b）、（c）、（d）または（e）に規定される核酸分子の配列から遺伝暗号が縮重のために逸脱する核酸分子と
からなる群より選択される、オルタナンスクラーゼ（Alternansucrase）の生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２】
請求項1記載の核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項４】
核酸分子が調節要素にセンス方向に接続して、原核細胞または真核細胞における翻訳可能なRNAの転写および合成を確実にしている、請求項3記載のベクター。
【請求項５】
アクセッション番号DSM 12666で寄託されているプラスミドpAlsu-pSK。
【請求項６】
請求項1記載の核酸分子または請求項3もしくは4記載のベクターで形質転換した宿主細胞、または該宿主細胞の子孫であり且つ請求項1記載の核酸分子または請求項3もしくは4記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
微生物の細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌（E. coli）細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
【請求項９】
オルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質またはオルタナンスクラーゼの酵素活性を有するその断片を調製するための方法であって、請求項6から8のいずれか一項記載の宿主細胞を、タンパク質の合成が可能な条件下において培養し、且つタンパク質を培養細胞および/または培地から単離する方法。
【請求項１０】
請求項1記載の核酸分子によってコードされるタンパク質もしくはオルタナンスクラーゼの酵素活性を有するその断片、または請求項9記載の方法により調製されるタンパク質もしくはオルタナンスクラーゼの酵素活性を有するその断片。
【請求項１１】
請求項1記載の核酸分子または請求項3もしくは4記載のベクターで形質転換したトランスジェニック植物細胞、または該植物細胞の子孫であり且つ請求項1記載の核酸分子または請求項3もしくは4記載のベクターを含むトランスジェニック植物細胞であって、オルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、植物細胞において翻訳可能なmRNAの転写を可能にする調節要素の制御下にあるトランスジェニック植物細胞。
【請求項１２】
請求項11記載の植物細胞を含有する植物。
【請求項１３】
糖貯蔵性またはデンプン貯蔵性植物である、請求項12記載の植物。
【請求項１４】
請求項11記載の植物細胞を含有する、請求項12または13記載の植物の繁殖材料。
【請求項１５】
請求項12または13記載の植物からオルタナンを抽出および単離する段階を含む、オルタナン（Alternan）を調製する方法。
【請求項１６】
オルタナンおよび/またはフルクトースを調製する方法であって、
（a）請求項6から8のいずれか一項記載の宿主細胞がショ糖含有培地にオルタナンスクラーゼを分泌し、且つ
（b）オルタナンおよび/またはフルクトースが培地から単離される
方法。
【請求項１７】
宿主細胞が固定される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
オルタナンおよび/またはフルクトースを調製する方法であって、
（a）ショ糖のオルタナンおよび/またはフルクトースへの転換を可能にする条件下において、ショ糖含有溶液が請求項10記載のタンパク質と接触させられ、且つ
（b）オルタナンおよび/またはフルクトースが溶液から単離される
方法。
【請求項１９】
タンパク質が担体材料に固定される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
オルタナンおよび/またはフルクトースを調製する方法であって、
（a）ショ糖のオルタナンおよび/またはフルクトースへの転換を可能にする条件下において、ショ糖含有溶液が請求項10記載のタンパク質およびアクセプター分子に接触させられ、
（b）オルタナンおよび/またはフルクトースが溶液から単離される、
方法。
【請求項２１】
アクセプター分子が、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびメチル-α-D-グルカンからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質が固定される、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
請求項15から22のいずれか一項による方法および化粧製品または食品として使用するのに好適な形態の得られたオルタナンの調製物を含む、化粧製品または食品生産物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はオルタナンスクラーゼ（alternansucrase）をコードする核酸分子に関する。さらに、本発明は、本明細書に記載する核酸分子で形質転換したベクターと、宿主細胞と、植物細胞と、該細胞を含有する植物とに関する。さらに、オルタナンスクラーゼをコードするDNA分子を挿入することによって、炭水化物オルタナンを合成するトランスジェニック植物を作製する方法を記載する。さらに、オルタナン（alternan）を調製する方法を記載する。
【０００２】
その開示内容が参照として本明細書に組み入れられている従来の報告は以下に引用されている。
【０００３】
オルタナンは、グルコース単位を含む多糖である。グルコース単位はα-1,3-およびα-1,6-グリコシド結合を介して互いに結合し、該2種類の結合は主に交互に出現する。しかし、オルタナンは鎖状多糖ではなく、分岐を含有してもよい（Seymourら, Carbohydrate Research 74, (1979), 41〜62）。その物理化学的特性のために、製薬業界において、例えば、薬学的に活性な成分の担体として、また線維、化粧品および食品業界において添加剤としてオルタナンの適用の可能性が考察されている（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77〜85; Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278〜283）。さらに、アラビアゴムの代用品として使用することができる（Cote, Carbohydrate Polymers 19, (1992), 249〜252）。
【０００４】
産業界は、オリゴ糖および多糖、詳細には、古典的な有機合成ではほとんどまたは全く入手することができないオルタナンを製造する生物工学的な方法に高い関心を寄せている。有機合成化学の古典的な方法と比較して、生物工学的な方法には利点がある。例えば、酵素触媒反応は、一般に、かなり高い特異性（位置特異性、立体特異性）および高い反応速度を示し、より穏やかな反応条件下で進行して、高い収率を得る。これらの要因は、新規オリゴ糖および多糖を製造する際に顕著に重要である。
【０００５】
オルタナンは、オルタナンスクラーゼの生物活性を有する酵素を使用して酵素的に製造される。オルタナンスクラーゼは、ショ糖から開始して、オルタナンおよびフルクトースの形成を触媒することができるグルコシルトランスフェラーゼ群に属する。これまで、オルタナンスクラーゼは細菌ストレプトコッカスミュータンス（Streptococcus mutans）（Mukasaら （J. Gen.Microbiol.135（1989）、2055〜2063）; Tsumoriら (J. Gen. Microbil. 131 (1985), 3347〜3353)）およびグラム陽性菌の特定の菌株であるリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）にだけ見出されており、それらは、一般に、例えば、デキストラン形成デキストランスクラーゼなどの他の多糖形成酵素と共に、またはアルターナナーゼなどの多糖分解酵素と共に存在している。このように、天然の存在する株はオルタナン以外にデキストランも産生する。
【０００６】
これまでは、オルタナンは、部分的に精製したタンパク質を使用した無細胞系において、またはリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）のオルタナンスクラーゼ産生菌を使用した発酵によって調製されている。
【０００７】
オルタナンスクラーゼを精製するための種々の精製方法が記載されている（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85; Lopez-Munguiaら, Annals New York Academy of Science 613 (1990), 717〜722; CoteおよびRobyt, Carbohydrate Research 101 (1982), 57〜74）。これらの方法は複雑で、比較的費用がかかり、一般に、タンパク質の収率が低い（Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278〜283）。これらの方法はどれも純度の高いオルタナンスクラーゼタンパク質を生成できないので、タンパク質の配列決定およびそれに対応するDNA配列の単離はこれまで成功していない。これらの方法により精製されたオルタナンスクラーゼタンパク質がインビトロにおけるオルタナンの調製に使用される場合には、オルタナンスクラーゼ調製物に含有されるデキストランスクラーゼタンパク質残基が生成されるオルタナン内にデキストラン不純物を生じる。オルタナンとデキストランの分離は比較的時間と費用がかかる（Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18 (1997), 278〜283）。オルタナンスクラーゼタンパク質の酵素調製物中に含有されるデキストランスクラーゼタンパク質不純物の別の欠点は、基質であるショ糖の一部がデキストランに転換されて、オルタナンに転換されず、オルタナンの収率が低下することである。
【０００８】
リューコノストク（Leuconostoc）による発酵調製法もオルタナンとデキストランの生成物の混合物を形成する。リューコノストク（Leuconostoc）株由来のオルタナンスクラーゼの量を増加するために、オルタナンスクラーゼを分泌し、デキストランスクラーゼと比較して、高い割合の量のオルタナンスクラーゼを形成する変異体NRRL B-21138などの変異体が単離されている。しかし、このような変異体をショ糖と共に発酵すると、得られるオルタナンには常にデキストラン不純物が含まれる（Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18(1997), 278〜283）。
【０００９】
上記に考察されている先行技術からわかるように、これまでは、高度に精製されたオルタナンスクラーゼタンパク質を提供することはできなかった。
【００１０】
このように、本発明は、時間を節約し、高価でない方法でオルタナンを生成することができる手段および方法を提供するという問題に対処している。
【００１１】
この問題は、本発明の特許請求の範囲に特徴付けられている態様を提供することによって解決される。
【００１２】
結果として、本発明は、
（a）配列番号：2に示されるアミノ酸配列またはプラスミドDSM12666に含有されるcDNAによってコードされるアミノ酸配列を含む少なくとも成熟型のタンパク質をコードする核酸分子と、
（b）配列番号：1に示されるヌクレオチド配列またはプラスミドDSM12666に含有されるcDNAのヌクレオ
チド配列、または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（c）アミノ酸配列が配列番号：2に示されるアミノ酸配列と少なくとも40%の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子と、
（d）一方の鎖が（a）または（b）に規定されるような核酸分子とハイブリダイズする核酸分子と、
（e）（a）、（b）、（c）または（d）に規定されるような核酸分子のいずれか1つによってコードされるタンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（f）ヌクレオチド配列が、（a）、（b）、（c）、（d）または（e）に規定する核酸分子の配列から遺伝暗号が縮重することによって逸脱する核酸分子と
からなる群より選択される、オルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１３】
結果として、本発明は、オルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質をコードし、好ましくは、配列番号：2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１４】
オルタナンスクラーゼ（E.C.2.4.1.140）の酵素または生物活性を有する酵素は、ショ糖のオルタナンとフルクトースへの転換を触媒することができる酵素を意味することが理解される。この転換は、外部アクセプター（例えば、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオース等）が存在する場合でも、存在しない場合でも生ずることができる。外部アクセプターが存在しない場合には、ショ糖から開始するオルタナンスクラーゼは、フルクトースと、グルコース単位を含む多糖であり、その骨格が主にα-1,3-およびα-1,6-グリコシド結合によって交互に互いに結合されたグルコース単位からなる高分子オルタナンの放出を触媒する。α-1,3-およびα-1,6-結合したグルコース単位の割合に関しては、文献は異なる値を示している。Mukasaら(J. Gen. Microbiol. 135(1989), 2055〜2063)によると、オルタナンは76mol%のα-1,3-結合したグルコースおよび24mol%のα-1,6-結合したグルコースからなる。Tsumoriら(J. Gen. Microbiol. 131(1985), 3347〜3353)は49.1mol%のα-1,6-結合したグルコースおよび33.9mol%のα-1,3-結合したグルコースと、13.6mol%の末端グルコースおよび3.3mol%のα-1,3,6-分岐グルコースを含有するポリグルカンとしてオルタナンを記載している。マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオースおよびメチル-α-D-グルカンなどの外部アクセプターが存在する場合には、オルタナンスクラーゼは、グルコース残基が主にα-1,6-およびα-1,3-グリコシド結合によって交互に連結されているα-D-グルカン鎖の合成およびこれらの多糖アクセプターにおけるフルクトースの合成を触媒することができる。使用するアクセプターに応じて、形成される生成物は構造が異なる。オルタナンスクラーゼの酵素活性は、例えば、Lopez-Munguia(Annals New York Academy of Science 613 (1990), 717〜722)によって記載されているように、または本出願の実施例に記載されているように検出することができる。
【００１５】
本発明は、詳細には、配列番号：1に示されるヌクレオチド配列を含有する核酸分子またはその一部に関し、好ましくは、配列番号：1に示されるコード領域を含む分子または対応するリボヌクレオチド配列に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、オルタナンスクラーゼをコードし、その一方の鎖は上記の分子の1つにハイブリダイズする核酸分子に関する。
【００１７】
本発明はまた、オルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質である、配列番号：2に示されるアミノ酸配列全体と相同性を有する、即ち少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、特に好ましくは少なくとも80%、特には少なくとも90%が同一であるタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１８】
本発明はまた、オルタナンスクラーゼをコードし、配列が上記の核酸分子のヌクレオチド配列から遺伝暗号の縮重によって逸脱する核酸分子に関する。
【００１９】
本発明はまた、上記配列の全体または一部に相補的である配列を有する核酸分子に関する。
【００２０】
配列番号：1に示される核酸配列は、例えば、細胞外オルタナンスクラーゼをコードする。分泌は、配列番号：2のN末端のはじめの約39アミノ酸基を含むシグナル配列によって確実となる。ある状況では、成熟したタンパク質だけが、天然型シグナル配列を伴わないで、および/または他のシグナル配列を伴って、発現されることが望ましい場合がある。このように、上記の核酸分子は、少なくともオルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質の成熟型だけをコードする。
【００２１】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは、例えば、Sambrookら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第2版(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.)に記載されているストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましい意味において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションが以下の条件下で起こることを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：
2×SSC; 10×デンハルト溶液（Fikoll 400 + PEG + BSA; 比  1:1:1）; 0.1% SDS: 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 μg/mlのニシン精子DNA; 50μg/mlのtRNA;または、
0.25 Mのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2;
1 mM EDTA
7％SDS
ハイブリダイゼーション温度T  =60℃
洗浄緩衝液:    2×SSC; 0.1% SDS
洗浄温度T  =60℃。
【００２２】
本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、原則として、このようなタンパク質を発現する任意の生物のオルタナンスクラーゼをコードすることができる。
【００２３】
本発明の分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えば、微生物のゲノムライブラリーから単離することができる。または、それらは、遺伝子操作または化学的合成によって調製することができる。
【００２４】
このような核酸分子は、本発明の分子またはこれらの分子の一部またはこれらの分子の逆相補鎖を使用して、例えば、標準的な方法によるハイブリダイゼーションによって（例えば、Sambrookら, 1989、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）同定および単離することができる。
【００２５】
配列番号：1に示されるものと同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその一部は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用する断片は、通常の合成技術によって調製し、その配列が本発明の核酸分子と実質的に一致している合成断片であってもよい。
【００２６】
本発明の核酸分子にハイブリダイズする分子は、本発明のオルタナンスクラーゼをコードする上記核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子の変異型も含む。本明細書において、断片は、記載されているタンパク質の1つをコードするのに十分長く、好ましくはオルタナンスクラーゼの生物活性を示す核酸分子の一部を意味すると理解される。これに関連して、誘導体という用語は、これらの分子の配列が上記核酸分子の配列と1箇所以上の部位において異なり、これらの配列と高い程度の相同性を示すことを意味する。これに関しては、相同性は少なくとも40%の配列の同一性、特には少なくとも60%の同一性、好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の同一性を意味する。上記核酸分子からの逸脱は、欠失、置換、挿入および/または組換えによって行われる。
【００２７】
好ましくは、相同性の程度は、それぞれの配列を配列番号：1のコード領域のヌクレオチド配列と比較することによって決定する。比較する配列が同じ長さでない場合には、相同性の程度は、好ましくは、長い方の配列のヌクレオチド残基と同一の短い方の配列のヌクレオチド残基の割合をいう。相同性の程度は、欧州分子生物学研究所（European Molecular Biology Laboratory）, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, GermanyにおいてJulie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg. DE)およびToby Gibson(Giboson@EMBL-Heidelberg. DE)によって供給されるClustalWプログラム（Thompsonら, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673〜4680）などの既知のコンピュータプログラムを使用して従来どおりに決定することができる。ClustalWは、IGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Celluaire, B. P. 163, 67404 IIIkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)およびEBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)およびEBI(European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK)の全てのミラーサイトを含むいくつかのウェブサイトからダウンロードすることもできる。
【００２８】
ある配列が本発明による基準配列と、例えば、90%の同一性を有するかどうかを判定するためにClustalWプログラムバージョン1.8を使用する場合に、DNA配列のアライメントについては以下の方法で設定する：
KTUPLE=2、TOPDIAGS=4、PAIRGAP=5、DNAMATRIX:IUB、GAPOPEN=10、GAPEXT=5、MAXDIV=40、TRANSITIONS:unweighted.
【００２９】
ClustalWプログラムバージョン1.8を使用するタンパク質配列のアライメントのためには、設定は以下のようである：KTUPLE=1、TOPDIAG=5、WINDOW=5、PAIGAP=3、GAPOPEN=10、GAPEXTEND=0.05、GAPDIST=8、MAXDIV=40、MATRIX=GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。
【００３０】
さらに、相同性は、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：2に記載するアミノ酸配列と少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも60%、よりさらに好ましくは少なくとも80%、特には少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%の配列の同一性を示すことを意味する。
【００３１】
相同性は、さらに、対応する核酸分子間またはそれらによってコードされるタンパク質間に機能的および/または構造的同等性があることを意味する。上記分子と相同で、これらの分子の誘導体核酸分子は、一般に、同じ生物機能を有する改変のあるこれらの分子の変異型である。それらは天然に存在する変異型、例えば、他の微生物の配列または突然変異体であってもよく、該突然変異体は天然に形成されても、または故意の突然変異誘発によって作製されてもよい。さらに、変異型は合成によって作製された配列であってもよい。対立遺伝子の変異型は天然に存在する変異型または合成により作製された変異型または組換えDNA技術によって作製された変異型であってもよい。
【００３２】
さらに好ましい態様において、「誘導体」という用語は、
0004554083.tif 000002
からなる群より選択される、少なくとも1つ、さらに好ましくは少なくとも3つ、よりさらに好ましくは少なくとも5つ、特には少なくとも10個、特に好ましくは少なくとも20個のペプチドモチーフを含むタンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００３３】
本発明の核酸分子の様々な変異型によってコードされるタンパク質は、共通のある種の特徴を有する。これらには、例えば、酵素活性、分子量、免疫学的反応性、立体配座等および例えば、ゲル電気泳動での移動性、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係数、溶解度、分光学的特性、安定性、至適pH、至適温度等などの物理特性が含まれる。
【００３４】
オルタナンスクラーゼ（E.C.2.4.1.140）はグルコシルトランスフェラーゼ群に属する酵素である。これまでは、オルタナンスクラーゼ活性は植物では見出されておらず、細菌ストレプトコッカスミュータンス（Streptococcus mutans）（Mukasaら (J. Gen. Microbiol. 135(1989), 2055〜2063); Tsumoriら (J. Gen. Microbiol. 131(1985), 3347〜3353)）および細菌リューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）の特定の株、例えばNRRL B-1355、NRRL B-1498およびNRRL B-1501において見出されている。一般に、これらの株をショ糖含有培地で増殖させると、これらの株は、異なるグルコシルトランスフェラーゼを含有し、且つオルタナンスクラーゼを除けばデキストランスクラーゼを分泌する。一般に、これらの2つのスクラーゼはそれらによって合成される多糖に対する高い結合親和性を有し（Lopez-Munguiら, Annals New York Academy of Sciences 613(1990), 717〜722）、結果として、これらの多糖は、ショ糖含有培地上で増殖したリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）からの酵素の精製においてタンパク質から分離しなければならない（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85; Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18(1997), 278〜283）。
【００３５】
外部アクセプターが存在しない場合には、オルタナンスクラーゼは、ショ糖から出発して、フルクトースおよびグルコース単位を含む多糖であり、その骨格は主にα-1,3-およびα-1,6-グリコシド結合によって交互に互いに結合されたグルコース単位からなり、光散乱測定データによると、分子量が>107であるはずである（Cote, Carbohydrate Polymer 19(1992)、249〜252）高分子オルタナンの放出を触媒する。現在までに、末端フルクトース残基を有するオルタナンの報告はない。にもかかわらず、オルタナンにおける末端フルクトース単位の存在は完全には排除できない。Lopez-Munguiaら（Enzyme Microb. Technol. 15(1993)77〜85）は、オルタナンはデキストラナーゼによる分解を受けないことを記載している。しかし、オルタナンはいわゆるアルターナーゼによる分解が可能で、それによって、重合度が異なるリング形状オリゴマーのオルタナンが生成されうる（Bielyら, Eur. J. Biochem. 226(1994), 633〜639）。高分子オルタナンの超音波処理により、オルタナンの分子量を<106まで低下することができる（Cote, Carbohydrate Polymers 19(1992), 249〜252）。この超音波処理したオルタナンの水溶液を調製すると、これらの溶液はアラビアゴムの水溶液に匹敵するレオロジー特性を示す。約3500の分子量を有するいわゆる「限界オルタナン」は、アルスロバクターグロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（NRRL B-4425）のイソマルトデキストラナーゼを使用した酵素分解によって生成することができる（Cote, Carbohydrate Polymers 19(1992), 249〜252）。
【００３６】
例えば、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオースおよびメチル-α-D-グルカンなどの外部アクセプターが存在する場合には、オルタナンスクラーゼは、該ショ糖アクセプターにおいて、グルコース部分が主にα-1,6-およびα-1,3-グリコシド結合によって交互に互いに結合しているα-D-グルカン鎖の合成およびフルクトースの合成を触媒する。使用するアクセプターに応じて、得られる生成物は構造が異なり、分子量は高分子量オルタナンより小さく、重合度は<15である。重合の程度により、これらの生成物はオリゴオルタナンとも呼ばれる（Pelencら, Sciences Des Aliments 11(1991), 465〜476）。しかし、本発明の範囲内では、外部アクセプターが存在する場合に調製することができるこれらの低分子量生成物もオルタナンと呼ぶ。
【００３７】
部分的に精製されたオルタナンスクラーゼタンパク質によりオリゴオルタナンを調製する際には、マルトースがアクセプターであり（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85）、高収量のオリゴオルタナンを生成する。パノース（重合度（d.p.）は3）は、α-1,6-グリコシド結合の形成によりマルトースから形成される第一のアクセプター生成産物である。
【００３８】
それとは対照的に、イソマルトースはあまり効果的でないアクセプターであり、オリゴオルタナンの収率は低い（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85）。
【００３９】
オルタナンスクラーゼは比較的安定であり、40℃において50 mMの酢酸緩衝液、pH 5.4中では半減期が2日である（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85）。酵素は40℃およびpH値5.6において最大活性を示す（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85）。
【００４０】
基質であるショ糖が存在しない場合には、オルタナンスクラーゼは不均化反応を触媒して、オルタナンは（部分的に）転位される。特に、デキストランスクラーゼが混入している部分的に精製されたオルタナンスクラーゼ調製品をオリゴオルタナンを調製するために使用した場合には、高い程度の不均化率が見出され、オリゴオルタナンは完全に転位される（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15(1993), 77〜85）。
【００４１】
SDS PAGE測定によるオルタナンスクラーゼの分子量は、異なる数値が見出されることがある：それぞれ、135kDa、145kDa、173kDaおよび196kDa（Leathersら, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18(1997), 278〜283; Kim & Robyt, Enzyme Microb. Technol. 16 (1994), 659〜664; Zhanley & Smith, Applied and Environmental Microbiology 61(3)(1995), 1120〜1123）である。
【００４２】
オルタナンスクラーゼの酵素活性を、例えば、Lopez-Munguiaら（Annals New York Academy of Science 613 (1990), 717〜722）に記載されているように、または本出願の実施例に記載されているように示すことができる。
【００４３】
1活性単位（1u）は、1分間に1μmolのフルクトースを放出する酵素の量として定義することができる。
【００４４】
本発明の核酸分子はDNA分子、詳細にはゲノム分子であってもよい。さらに、本発明の核酸分子はRNA分子であってもよい。本発明の核酸分子は、例えば、天然起源から入手されても、または合成もしくは組換え技術によって作製されてもよい。
【００４５】
本発明の核酸分子により、高純度および/または十分な量の組換えオルタナンスクラーゼタンパク質、並びにこれらの酵素活性を有し、インプランタ（in planta）においてオルタナンを形成する遺伝子的に操作された植物を産生する宿主細胞が調製されうる。本発明の範囲内において、「高純度」という用語は、本発明によるタンパク質が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、よりさらに好ましくは少なくとも95%の純度を示すことを意味する。さらに、宿主細胞を使用してオルタナンを生成する、および/または組換えオルタナンスクラーゼタンパク質を生成するために用いられる手段および方法が提供される。結果として、本発明の核酸分子を提供することにより、比較的費用がかからず、時間を比較的節約できる方法によって、高純度のオルタナンを生成することができる。
【００４６】
好ましい態様において、本発明の核酸分子は微生物、好ましくは細菌、さらに好ましくはグラム陽性菌、特に好ましくはリューコノストク（Leuconostoc）属に属する細菌に由来する。リューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）種に属する細菌の核酸分子が特に好ましい。
【００４７】
本発明はまた、本発明の核酸分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、特に少なくとも15ヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの鎖長を有する。それらは本発明の核酸分子に特異的にハイブリダイズする、すなわち、それらは、他のタンパク質、特に他のグルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に全くまたはごくわずかな程度しかハイブリダイゼーションしないという点において特徴付けられている。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、PCR反応などの増幅技術のプライマーとして、または関連遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００４８】
さらに、本発明は、ベクター、詳細には、本発明の上記核酸分子を含有する、プラスミド、コスミド、ウィルス、バクテリオファージおよび遺伝子技術に通常使用される他のベクターに関する。本発明の好ましい態様において、本発明のベクターにより真菌細胞または微生物細胞を形質転換する。好ましくは、このようなベクターは植物細胞を形質転換するのに好適である。特に好ましくは、このようなベクターは、本発明の核酸分子、およびおそらく隣接する調節領域を植物細胞ゲノムに導入することを可能にする。その例は、アグロバクテリア（Agrobacteria）を介した遺伝子導入に使用することができるバイナリーベクターであり、すでに市販されているものもある。
【００４９】
別の好ましい態様において、ベクターに含有される核酸分子は、調節要素に接続されて、原核細胞または真核細胞における転写および翻訳可能なRNAの合成を確実にしている。
【００５０】
原核細胞または真核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）における本発明の核酸分子の発現は、これらの分子によってコードされる酵素の酵素活性のより正確な特徴づけを可能にするので興味深い。さらに、デキストランスクラーゼまたは他の多糖形成性酵素もしくは多糖分解性酵素などの干渉酵素を含有しないこのような原核細胞または真核細胞内でこれらの酵素を発現することが可能である。さらに、分子生物学において通常の方法（例として、Sambrookら, 1989,「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning , A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NYを参照のこと）によって、核酸分子に異なる突然変異を挿入して、生物特性が改変されたと思われるタンパク質を合成することが可能である。一方、これに関連して、DNAコード配列の5'側または3'側末端からの漸進的欠失によって核酸分子を作製し、該核酸分子により、それに相当する短くなったタンパク質が合成される欠失変異を作製することが可能である。例えば、ヌクレオチド配列の5'末端のこのような欠失により、微生物における酵素の分泌を担うアミノ酸配列を同定することができる（輸送ペプチド）。
【００５１】
これにより、対応する配列の除去によってもはや分泌されないが、対応する宿主生物の細胞内に残存し、または、他のシグナル配列の付加により、例えば、色素体、ミトコンドリア、液胞のような他のコンパートメントに局在化する酵素を計画的に作製できる。
【００５２】
一方、アミノ酸配列の改変が、例えば、酵素活性または酵素の制御に影響を与える位置における点変異の導入も考えられる。このように、例えば、立体および部位選択性が改良された、またはKm値が改良された突然変異体、または細胞に通常存在し、アロステリック制御もしくは共有結合性修飾によって実現される制御機序をもはや受けない突然変異体を作製することが可能である。
【００５３】
さらに、基質または生成物特異性が改良された突然変異体を作製することができる。さらに、活性-温度プロフィールが改良された突然変異体を作製することが可能である。
【００５４】
さらに、植物における発現の場合には、本発明の核酸分子への突然変異の導入により、遺伝子発現の割合、および/または本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の活性を増加させることができる。
【００５５】
原核細胞における遺伝子工学では、本発明の核酸分子またはこれらの分子の一部をプラスミドに導入し、DNA配列の組換えにより突然変異または配列改変が可能になる。
【００５６】
標準的な方法（Sambrookら, 1989,「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning , A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USAを参照のこと）により、塩基の交換が可能になり、また、天然の配列または合成の配列を付加することができる。DNA断片にアダプターおよびリンカーを適用することによって、これらの断片を互いに接続することができる。さらに、好適な制限酵素部位を提供したり、余剰DNAまたは制限酵素部位を除去する遺伝子工学的方法を使用することができる。挿入、欠失または置換が可能であるそのような場合には、インビトロ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションを使用することができる。一般に、配列解析、制限酵素解析、および生化学的および分子生物学的な他の方法を解析方法として実施することができる。
【００５７】
さらに、本発明は、1999年2月4日にアクセッション番号DSM12666でDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkullturen(DSMZ), Braunschweigに寄託されたプラスミドpAlsu-pSK（図2および実施例2を参照）と、プラスミドDSM12666のインサートに含有され、オルタナンスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とに関する。さらに、本発明はまた、プラスミドDSM12666のインサートにハイブリダイズする核酸分子に関する。また、本発明は、遺伝暗号の縮重によりプラスミドDSM12666の核酸分子の配列からヌクレオチド配列が逸脱する核酸分子に関する。さらに、本発明は、プラスミドDSM12666のインサートの配列と相同性を有する、すなわち、少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも80%、よりさらに好ましくは90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列の同一性を有する核酸分子に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、本発明の上記の核酸分子または本発明のベクターで形質転換された宿主細胞、詳細には原核細胞または真核細胞と、このような形質転換された細胞の子孫で、本発明の核酸分子またはベクターを含有する細胞とに関する。
【００５９】
別の好ましい態様によると、宿主細胞は微生物細胞である。本発明に関しては、「微生物」という用語は、Schlegelの「Allgemeine Mikrobiologie」（Georg Thieme Verlag, 1985, 1〜2）で定義される細菌および全ての原生生物（例えば、真菌、詳細には、酵母、藻類）を含む。本発明の好ましい態様は、藻類の細胞およびアスペルギルス（Aspergillus）属、バチルス（Baccilus）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属またはピチア（Pichia）属に属する宿主細胞に関する（Rodriguez, Journal of Biotechnology 33(1994), 135〜146, Romanos, Vaccine, Vol. 9(1991), 901 et seq.）。本発明の特に好ましい態様は大腸菌（E. coli）細胞に関する。オルタナンスクラーゼは、特に好ましくは、宿主細胞によって分泌される。組換えオルタナンスクラーゼを産生するためのこのような宿主細胞の作製は当業者に周知の方法によって実施することができる。
【００６０】
本発明の好ましい態様において、本発明の宿主細胞は、多糖形成性および/または多糖分解性酵素などの干渉性酵素活性を示さない。
【００６１】
異なる発現系の参照は、例えば、Methods in Enzymology 153(1987), 385〜515、Bitterら(Method in Enzymology 153 (1987), 516〜544)およびSawersら(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996), 1〜9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996), 500〜4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456〜463、Griffithsら, Methods in Molecular Biology 75(1997), 427〜440)に含まれている。酵母発現系の総説は、例えば、Hensingら(Antonie van Leuwenhoe 67(1995), 261〜279)、Bussineauら(Developments in Biological Standardization 83(1994), 13〜19)、Gellissenら(Antonie van Leuwenhoek 62(1992), 79〜93)、Fleer(Current Opinion in Biotechnology 3(1992), 486〜496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991), 742〜745)およびBuckholz(Bio/Technology 9(1991), 1067〜1072)に示されている。
【００６２】
発現ベクターは文献に広く記載されている。一般に、それらは、選択した宿主における複製を確実にする選択マーカー遺伝子および複製起点だけでなく、細菌またはウィルスプロモーターおよびほとんどの場合、転写終結シグナルを含有する。プロモーターと終結シグナルの間には、コードDNA配列の挿入を可能にする少なくとも1つの制限酵素部位またはポリリンカーが存在する。対応する遺伝子の転写を天然に制御するDNA配列が選択した宿主生物において活性である場合には、プロモーター配列として使用することができる。しかし、この配列は他のプロモーター配列と交換してもよい。遺伝子の構成的な発現を生ずるプロモーターおよび接続後の遺伝子の発現を計画的に制御することができる誘導性プロモーターを使用することが可能である。これらの特性を有する細菌およびウィルスプロモーターは文献に詳細に記載されている。微生物（例えば、大腸菌、S.セレビシエ（S. cerevisiae））における発現の調節配列は文献に十分に記載されている。接続後の遺伝子の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えば、T7プロモーター（Studierら、Methods in Enzymology 185(1990), 60〜89）、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoerら, in RodriguezおよびChamberlin(編),「プロモーター、構造と機能（Promoters, Structure and Function）」; Praeqer, New York, (1982), 462〜481; DeBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983), 21〜25)、lp1、rac(Borosら, Gene 42(1986), 97〜100)である。一般に、タンパク質量は、微生物の増殖サイクルの中期から対数期の終わりごろまでが最も高い。従って、タンパク質を合成するために、好ましくは、誘導性プロモーターを使用する。これらのプロモーターは、構成的プロモーターより高いタンパク質収量を生じることが多い。高度に構成的なプロモーターを使用すると、クローニングした遺伝子が連続的に転写および翻訳されるので、結果として、他の本質的な細胞機能のためのエネルギーが損失し、その結果、細胞増殖が低下する（Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie(1995). Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heiderberg, Berlin, Oxford, p. 342）。従って、最適な量のタンパク質を入手するためには、2段階の過程を使用することが多い。はじめに、宿主細胞を比較的高い細胞密度まで最適な条件下で培養する。第二の段階では、使用するプロモーターの種類に応じて転写が誘導される。これに関連して、ラクトースまたはIPTG(=イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)によって誘導することができるtacプロモーターは特に好適である（deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983), 21〜25）。転写終結シグナルも文献に記載されている。
【００６３】
オルタナンスクラーゼをコードするDNAによる宿主細胞の形質転換は、一般に、例えば、Sambrookら, (「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」第2版、(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York; 「酵母遺伝学の方法、実験コースマニュアル（Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990)に記載されているような標準的な方法によって実施することができる。宿主細胞は、使用する特定の宿主細胞の必要条件、詳細にはpH値、温度、塩濃度、通気性、抗生物質、ビタミン、微量元素等を満たす栄養培地中で培養される。
【００６４】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質および生物学的に活性なそれらの断片と、本発明による宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下において培養され、その後タンパク質が培養細胞および/または培地から単離される、それらの調製方法とに関する。
【００６５】
本発明の好ましい態様によると、オルタナンスクラーゼは組換え的に作製されたタンパク質である。本発明に関しては、これは、タンパク質をコードするDNA配列を宿主細胞内に挿入し、それを宿主細胞内で発現することによって作製されるタンパク質である。次いで、タンパク質を宿主細胞および/または培地から単離することができる。
【００６６】
本発明の核酸分子により、現在、高純度で、および/または十分な量の組換えオルタナンスクラーゼタンパク質を産生する宿主細胞を作製することができる。本発明の範囲内では、「高純度」という用語は、本発明によるタンパク質が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%の程度の純度を示すことを意味する。オルタナンスクラーゼを、いかなる不都合な多糖合成作用も持たない宿主細胞において生成することができるので、これまでは、特定のリューコノストク（Leuconostoc）株からしか入手できなかったオルタナンスクラーゼタンパク質を、例えば、デキストランスクラーゼ、多糖などの他の成分から精製する、すでに上記した時間および費用がかかる方法は不要である。さらに、ショ糖が存在しない場合にオルタナンスクラーゼタンパク質を生成することができる宿主細胞およびベクターを使用することもできるので、結果として多糖からのオルタナンスクラーゼタンパク質の追加の分離は必要ない。さらに、好適な宿主細胞ベクターを選択することにより、オルタナンスクラーゼタンパク質を十分な量で提供することができるが、これはこれまで記載されていた系では可能ではなかった。
【００６７】
宿主細胞によって生成されるオルタナンスクラーゼは、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、HPLC逆相クロマトグラフィー等などの従来の精製方法によって精製することができる。
【００６８】
オルタナンスクラーゼをコードし、宿主細胞において発現される本発明の核酸分子を改変することにより、その特性により、培地からの単離がより容易であるポリペプチドを宿主細胞内で生成させることができる。従って、発現されるタンパク質は、付加的なポリペプチド配列との融合タンパク質として発現させることができ、その特異的な結合特性によりアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離を可能にする（例えば、Hoppら, Bio/Technology 6(1988), 1204〜1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8(1990), 88〜93）。
【００６９】
本発明の別の態様は、オルタナンスクラーゼ、詳細には微生物、好ましくはグラム陽性菌、特にはリューコノストク（Leuconostoc）属の微生物、特に好ましくはリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のオルタナンスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質に関する。算出によってもとめた場合に、配列番号：2に示されるタンパク質の分子量は228.96 kDaである。本発明はまた、229 kDa±120 kDa、好ましくは229 kDa±50 kDa、特に好ましくは230 kDa±25 kDaの分子量を有するオルタナンスクラーゼに関する。算出によって求めた場合に、成熟したタンパク質の分子量は224.77 kDaである。
【００７０】
本発明の核酸分子を提供することにより、遺伝子工学法により初めてオルタナンスクラーゼ発現植物細胞を作製することができるが、これまでは、古典的な培養方法では細菌および真菌遺伝子を植物内で発現させることができないので、不可能であった。
【００７１】
従って、本発明はまた、本発明の核酸分子もしくは本発明のベクターによって形質転換されたトランスジェニック植物細胞またはこのような細胞の子孫のトランスジェニック植物細胞に関する。このオルタナンスクラーゼの生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は植物細胞内での翻訳可能なmRNAの転写を可能にする調節要素の制御下にある。
【００７２】
例えば、本発明のタンパク質に対応する核酸分子の発現によって、そのタンパク質の活性を導入することは、遺伝子工学によってそれに対応して改変された植物細胞においてオルタナンを生成する可能性を開く。このように、植物細胞における本発明の核酸分子の発現が可能であり、野生型には存在しない付加的な、対応するオルタナンスクラーゼ活性を導入することができる。さらに、例えば、温度依存性または基質もしくは生成物特異性が改良された本発明のオルタナンスクラーゼを得るために、当業者に周知の方法により本発明の核酸分子を改変することが可能である。このような方法は、上記の別のところでさらに詳細に記載されている。
【００７３】
DNAを植物宿主細胞に挿入することができる複数の技術が利用可能である。これらの技術には、形質転換菌としてアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用したT-DNA、プロトプラストの融合、注入、DNAのエレクトロポレーション、微粒子銃法によるDNAの挿入、および他の可能性のある方法による植物細胞の形質転換が含まれる。
【００７４】
植物細胞のアグロバクテリアを介した形質転換の使用は広範に検討されており、EP 120 516; Hoekema、「植物のバイナリーシステム（The Binary Plant Vector System）」、Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam(1985)、第5章; Fraleyら, Crit. Rev. Plant Sci. 4 (1993), 1〜46およびAnら, EMBO J. 4(1985), 277〜287に十分に記載されている。ジャガイモの形質転換に関しては、例えば、Rocha-Sosaら(EMBO J.8(1989),29〜33)を参照のこと。
【００７５】
アグロバクテリウムに基づいたベクターによる単子葉植物の形質転換も記載されている（Chanら, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491〜506; Hieiら, Plant J. 6(1994) 271〜282; Dengら, Science in China 33(1990), 28〜34; Wilminkら, Plant Cell Reports 11(1992), 76〜80; Mayら, Bio/Technology 13(1995), 486〜492; ConnerおよびDormisse, Int. J. Plant Sci. 153(1992), 550〜555; Ritchieら Transgenic Res. 2(1993), 252〜265）。単子葉植物を形質転換する別の系は、微粒子銃法（WanおよびLemaux, Plant Phisiol. 104(1994), 37〜48; Vasilら, Bio/Technology 11(1993), 1553〜1558; Ritalaら, Plant Mol. Biol. 24(1994)317〜325; Spencerら, Theor. Appl. Genet. 79(1990), 625〜631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過された細胞のエレクトロポレーション、ガラスファイバーによるDNAの挿入による形質転換である。トウモロコシの形質転換は、特に、文献に繰り返し記載されている(例えば、国際公開公報第95/06128号、欧州特許第0 513 849号、欧州特許第0 465 875号、欧州特許第29 24 35; Frommら, Biotechnolory 8, (1990), 833〜844; Gordon-Kammら, Plant Cell 2, (1990), 603〜618; Kozielら, Biotechnology 11(1993), 194〜200; Morocら, Ther. Appl. Genet. 80, (1990), 721〜726)。
【００７６】
他の種類の穀類の成功した形質転換は、例えば、大麦（WanおよびLemaux, supra; Ritalaら, supra; Krensら,Nature 296(1982), 72〜74）および小麦（Nehraら, Plant J. 5(1994), 285〜297）について記載されている。一般に、植物細胞において活性な任意のプロモーターは、植物細胞において核酸分子を発現するのに好適である。構成的にまたは特定の組織においてのみ、植物の発生における特定の時期または外部からの影響によって決定される時期に本発明の植物における発現が生じるようにプロモーターを選択することができる。プロモーターは植物と同種または異種であってもよい。
【００７７】
好適なプロモーターは、例えば、構成的な発現を導くカリフラワーモザイクウィルスの35S RNAのプロモーター（例えば、US-A-5,352,605を参照）およびユビキチンプロモーター（例えば、US-A-5,614,399参照）、ジャガイモにおける塊茎特異的発現を導くパタチン遺伝子プロモーターB33(Rocha-Sosaら, EMBO J. 8(1989),23〜29)、または光合成を行っている組織だけにおける発現を確実にするプロモーター、例えばST-LS1プロモーター（Stockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987), 7943〜7947; Stockhausら, EMBO J. 8(1989)2445〜2451）、Ca/b-プロモーター（例えば、US-A-5,656,496、US-A-5,639,952、Bansalら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 3654〜3658）およびルビスコSSUプロモーター（例えば、US-A-5,034,322; US-A-4,962,028）または内胚乳特異的発現を導く小麦のグルテリンプロモーター（HMWプロモーター）（Anderson, Theoretical and Applied Genetics 96, (1998), 568〜576, Thomas, Plant Cell 2(12), (1990), 1171〜1180）、イネのグルテリンプロモーター（Takaiwa, Plant Mol. Biol. 30(6)(1996), 1207〜1221, Yoshihara, FEBS Lett. 383(1996), 213〜218, Yoshihara, Plant and Cell Physiology 37(1996), 107〜111）、トウモロコシの萎縮（shurunken）プロモーター（Maas, EMBO J. 8(11)(1990), 3447〜3452, Werr, Mol. Gen. Genet. 202(3)(1986), 471〜475, Werr, Mol. Gen. Genet. 212(2), 1988, 342〜350）、USPプロモーター、ファゼオリンプロモーター（Sengupta-Gopalan, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82(1985), 3320〜3324, Bustos, Plant Cell 1(9)(1989),839〜853）またはトウモロコシのツェイン遺伝子のプロモーター（Pedersenら,Cell 29(1982), 1015〜1026; Quatroccioら, Plant Mol. Biol. 15(1990), 81〜93）。しかし、外部からの影響によって決定される時期のある特定の時点においてのみ活性化されるプロモーターも使用することができる（例えば、国際公開公報第93/07279号を参照）。これに関連して、簡単な誘導を可能にするヒートショックタンパク質のプロモーターが特に興味深い。さらに、ビシアファイバ（Vicia faba）および他の植物において種子特異的発現を確実にするビシアファイバのUSPプロモーターなどの種子特異的プロモーターを使用することができる（Fiedlerら, Plant Mol. Biol. 22(1993), 669〜679; Baumleinら, Mol. Gen. Genet. 225(1991), 459〜467）。さらに、国際公開公報第91/01373号に記載されているような果実特異的プロモーターも使用することができる。
【００７８】
さらに、転写を適切に終結し、転写物の安定化に対して機能すると考えられている、ポリ-A-尾部を転写物に付加する働きをする終結配列が存在してもよい。このような要素は文献に記載されており（例えば、Gielemら, EMBO J. 8(1989), 23〜29）、随意に交換可能である。
【００７９】
このような細胞は、特に、これらの細胞に天然に存在しない本発明の核酸分子を含有するという事実によって天然型の植物細胞から識別することができる。さらに、本発明のこのようなトランスジェニック植物細胞は、本発明の核酸分子の少なくとも1コピーがゲノムに安定に組み込まれているという点において、天然型の植物細胞と識別することができる。
【００８０】
さらに、本発明の植物細胞は、好ましくは、以下の特徴の少なくとも1つによって天然型植物細胞から識別することができる：挿入された本発明の核酸分子が植物細胞にとって異種である場合には、トランスジェニック植物細胞は挿入された本発明の核酸分子の転写物を有することが見出される。後者は、例えば、ノーザンブロット解析によって検出することができる。本発明の植物細胞は、好ましくは、挿入された本発明の核酸分子によってコードされたタンパク質を含有する。これは、例えば、免疫学的方法、詳細にはウェスタンブロット解析によって示すことができる。
【００８１】
トランスジェニック植物細胞は、当業者に周知の方法により植物全体に再生することができる。
【００８２】
本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物細胞の再生によって得ることができる植物に関する。さらに、本発明は、上記のトランスジェニック植物細胞を含有する植物に関する。
【００８３】
ほとんどの植物において、植物内での光合成が行われている際に形成される糖の形態で、すなわち主にショ糖の形態で光同化物は対応する標的器官に輸送される。ショ糖はオルタナンスクラーゼの重合反応の基質であるので、単子葉および双子葉の全ての植物は、オルタナンスクラーゼ発現に関しては、原則的に、本発明の核酸分子によって改変することができる。
【００８４】
オルタナンスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする本発明の核酸分子の植物における発現は、例えば、植物からおそらく得られると思われる抽出物の粘度を改良するために使用することができ、該改良はオルタナンの合成によって達成される。これに関連して、例えば、トマトは興味深い。トマト果実におけるオルタナンスクラーゼの発現により、オルタナンが合成され、例えば、トマトピューレまたはトマトケチャップを製造するために、これらの果実から得られる抽出物の粘度が改良される。
【００８５】
本発明の核酸分子の発現は、ショ糖含量または貯蔵ショ糖含量が高い植物の器官において特に有利である。このような器官は、例えば、テンサイのビートまたはサトウキビの茎である。これらの植物は、通常、あまり多くのデンプンを貯蔵しないので、これらの植物からオルタナンスクラーゼによって合成されるオルタナンは純粋な形態で単離されると思われる。
【００８６】
植物細胞においてショ糖の生合成が行われる部位は細胞質ゾルである。しかし、貯蔵部位は液胞である。テンサイまたはジャガイモの貯蔵組織への輸送中、または種子の内胚乳への輸送中、ショ糖はアポプラストを通過しなければならない。このように、3つ全てのコンパートメント、すなわち細胞質ゾル、液胞、アポプラストはオルタナンを合成するために核酸分子を発現させる。さらに、色素体はまた、例えば、アミロプラストにおける細菌のフルクトシルトランスフェラーゼの発現によって示されるようにする。同様に、基質としてショ糖を必要とするフルクトシルトランスフェラーゼはアミロプラストにおける「アミロフルクタン」の形成を媒介することができた（Smeekens, Trends in Plant Science, Vol 2, No. 8(1997), 286〜288）。
【００８７】
デンプンの生合成およびデンプンの貯蔵が通常アミロプラスト内で行われる、ジャガイモおよびトウモロコシなどのデンプン生成植物の場合では、アポプラスト、細胞質ゾルまたは液胞におけるオルタナンスクラーゼの発現により、これらのコンパートメントにおいてオリゴ糖および/または多糖がさらに合成されると思われ、これは収量の全体的な増加を意味することができる。
【００８８】
ジャガイモの場合と同様に、アミロプラストにおいて合成されるデンプンはアポプラスト、細胞質ゾルまたは液胞において合成されるオルタナンから分離されうることから、まさに同じ植物をデンプンとオルタナンを回収するために使用することができる。
【００８９】
さらに、トランスジェニックジャガイモおよびトランスジェニックトウモロコシは周知であり、塊茎および殻粒におけるデンプン合成は、アンチセンス構築物によってADP-グルコース-ピロホスホリラーゼを阻害することにより完全に阻止される。ジャガイモの場合には、可溶性の糖、詳細にはショ糖およびグルコースは代わりに例えば塊茎に蓄積する（Muller-Rpberら, EMBO J. 11(1992), 1229-1238）。オルタナンは、基質としてショ糖を使用するオルタナンスクラーゼの発現によって、これらの植物の細胞質ゾル、液胞またはアポプラストにおいて生成されうる。
【００９０】
従って、本発明の別の態様において、本発明の植物細胞は、野生型植物の対応する細胞と比較して、低いADPグルコースピロホスホリラーゼ（AGPase）活性によってさらに特徴づけられる。
【００９１】
AGPaseをコードするDNA分子は当業者に周知であり、例えば、Muller-Roberら(Mol. Gen. Genet. 224(1)(1990), 136〜146)に記載されている。AGPaseをコードするDNA分子を使用することにより、組換えDNA技術によって（例えば、アンチセンス、リボザイムまたはコサプレッション（cosuppression）によって）、AGPase活性が低下した植物を作製することができる。さらに、例えば、AGPase活性が減少したトウモロコシのAGPase突然変異体（brittle-2およびshrunken-2）は当業者に周知である。
【００９２】
「減少した」という用語は、対応する野生型細胞と比較したとき、少なくとも10%、さらに好ましくは少なくとも50%、よりさらに好ましくは少なくとも80%のAGPase活性の低下を意味する。
【００９３】
AGPaseの活性は、Muller-Roberら(Mol. Gen. Genet. 224(1)(1990), 136〜146)または当業者に周知の方法により測定することができる。
【００９４】
オルタナンスクラーゼによって触媒される反応は、グルコース部分がショ糖から既存の炭水化物アクセプターに直接転位するという事実によって識別される。一方、植物の場合には、ショ糖からの鎖状グルカンの生合成は、最初にショ糖がグルコースとフルクトースに分離し、次いで活性な中間体ADP-グルコースに転換されるように進行する。グルコース部分がデンプン合成酵素によってADPグルコースからすでに既存しているグルカンに転位され、それによってADPが放出される。ショ糖から2分子のADPグルコースへの転換にはいくつかのエネルギー消費反応が必要である。従って、オルタナンスクラーゼによって触媒される反応の消費エネルギーは、植物細胞においてショ糖から多糖を合成する際の消費エネルギーと比較して実質的に低く、これにより、本発明の核酸分子を含有する植物では合成されるオリゴ糖および/または多糖の収率が高くなることができる。
【００９５】
植物において核酸分子を発現する際には、原則として、合成されたタンパク質を植物細胞の任意のコンパートメント（例えば、細胞質ゾル、色素体、液胞、ミトコンドリア）または植物（例えば、アポプラスト）に局在化することができる可能性がある。特定のコンパートメントへの局在化をさせるためには、適宜、コード領域をDNA配列に結合して、対応するコンパートメントへの局在化を確実にしなければならない。使用するシグナル配列を、酵素をコードするDNA配列と同じ読み枠内に組み込まれなければならない。
【００９６】
色素体への局在化を確実にするために、以下の輸送ペプチドの1つを使用することが考えられる：色素体フェレドキシン：Jansenら(Current Genetics 13(1988), 517〜522)に含まれるホウレンソウのNADP+オキシドレダクターゼ（FNR）。詳細には、そこに開示されているcDNA配列のヌクレオチドの-171位〜165位の配列を用いることができ、その配列は5'非翻訳領域および輸送ペプチドをコードする配列を含む。別の例は、成熟したワキシー（waxy）タンパク質の最初の34のアミノ酸残基を含むトウモロコシのワキシータンパク質の輸送ペプチドである（Klosgenら, Mol. Gen. Genet. 217(1989), 155〜161）。成熟タンパク質の最初の34アミノ酸を含まないこの輸送ペプチドを使用することも可能である。さらに、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット（Wolterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988）、846〜850; Nawrathら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1994), 12760〜12764)、NADPリンゴ酸（malat）デヒドロゲナーゼ（Gallardoら, Planta 197(1995), 324〜332）、グルタチオンレダクターゼ（Creissenら, Plant J. 8(1995), 167〜175）またはR1タンパク質（Lorberthら、Nature Biotechnology 16,(1998), 473〜477)のシグナルペプチドを使用することができる。
【００９７】
液胞内への局在を確実にするために、以下の輸送ペプチドの1つを使用することが考えられる：パタチン（patatin）タンパク質のN末端配列（146アミノ酸）（Sonnewaldら, Plant J. 1(1991), 95〜106）またはMatsuokaおよびNeuhaus, Journal of Experimental Botany 50(1999), 165〜174; ChrispeelsおよびRaikhel, Cell 68(1992), 613〜616; MatsuokaおよびNakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991), 834〜838; BednarekおよびRaikhel, Plant Cell 3(1991), 1195〜1206; NakamuraおよびMatsuoka, Plant Phys. 101(1993), 1〜5によって記載されているシグナル配列。
【００９８】
ミトコンドリア内で局在を確実にするために、例えば、Braunら(EMBO J. 11,(1992), 3219〜3227)に記載されている輸送ペプチドを使用することが考えられる。アポプラスト内の局在を確実にするために、以下の輸送ペプチドの1つを使用することが考えられる：プロテイナーゼインヒビターII-遺伝子のシグナル配列（Keilら, Nucleic Acid Res. 14(1986), 5641〜5650; von Schaewenら, EMBO J. 9(1990), 30〜33）、Erwinia amylovoraのレバンスクラーゼ遺伝子（GeierおよびGeider, Phys. Mol. Plant Pathol. 42(1993), 387〜404）のシグナル配列、Solanum tuberosumのパタチン遺伝子B33の、最初の33アミノ酸をコードする断片のシグナル配列（Rosahlら, Mol. Gen. Genet. 203(1986), 214〜220）またはOshimaら(Nucleic Acid Res. 18(1990), 181)によって記載されている遺伝子のシグナル配列。
【００９９】
配列番号：1に示される核酸配列は細胞外オルタナンスクラーゼをコードする。配列番号：2のN末端の最初の約39アミノ酸残基を含むシグナル配列によって確実に分泌される。
【０１００】
トランスジェニック植物は、原則として、任意の植物種の植物であってもよく、すなわち、それらは単子葉植物および双子葉植物であってもよい。好ましくは、植物は、栄養、技術的、詳細には産業上の目的のために人によって栽培される有用な植物である。それらは、好ましくは、例えば、穀類種（ライムギ、大麦、エンバク、小麦、キビ、サゴ等）、イネ、エンドウ、インゲンマメ（marrow pea）、キャッサバおよびジャガイモのようなデンプン貯蔵植物；トマト、セイヨウアブラナ、大豆、アサ、アマ、ヒマワリ、ササゲ、クズウコン、線維形成植物（例えば、アマ、アサ、綿）、オイル貯蔵植物（例えば、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、大豆）およびタンパク質貯蔵植物（例えば、マメ科草、穀類、大豆）である。本発明はまた、果樹およびヤシに関する。さらに、本発明は馬草植物（例えば、アルファルファ、クローバー、ライグラスなどの馬草および牧草）および野菜植物（例えば、トマト、レタス、チコリ）および観賞植物（例えば、チューリップ、ヒヤシンス）に関する。糖貯蔵および/またはデンプン貯蔵植物が好ましい。サトウキビおよびテンサイ、並びにジャガイモ植物、トウモロコシ、イネ、小麦およびトマト植物が特に好ましい。
【０１０１】
本発明のさらに別の主題は、形質転換されていない野生型の細胞/形質転換されていない野生型の植物と比較したとき、オルタナンを合成するトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を作製する方法である。本発明の方法では、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の発現および/または活性は、オルタナンスクラーゼの発現および/または活性を示さない対応する野生型の細胞/野生型の植物と比較したとき、増加されている。詳細には、このような方法は植物細胞内において本発明による核酸分子を発現することを含む。本発明による核酸分子は、好ましくは、プロモーターに連結されて、植物細胞内での発現を確実にする。特に好ましい態様において、本発明の方法は、本発明による核酸分子を植物細胞に導入し、この細胞から植物を再生することを含む。
【０１０２】
発現のこのような増加は、例えば、ノーザンブロット解析によって検出することができる。活性の増加は、植物細胞から誘導されたオルタナンスクラーゼ活性について、タンパク質抽出物を試験することによって検出することができる。オルタナンスクラーゼの酵素活性は、例えば、Lopez-Munguiaら(Annals New York Academy of Sciences 613,(1990), 717〜722)に記載されているように、または本出願の実施例に記載されているように測定することができる。
【０１０３】
本発明はまた、本発明の植物の繁殖材料に関する。「繁殖材料」という用語は、栄養生殖的にまたは生殖的に子孫を生成するのに好適な植物の成分を含む。栄養生殖的な繁殖の好適な手段は、例えば、挿し穂、カルス培養物根茎または塊茎である。他の繁殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養等が含まれる。好ましい繁殖材料は塊茎および種子である。本発明はまた、例えば、果実、種子、塊茎または根株などの、本発明の植物の収穫可能な部分に関する。
【０１０４】
本発明の別の態様は、本発明の植物からオルタナンを抽出し、単離する段階を含む、オルタナンを調製するための方法に関する。
【０１０５】
本発明の植物からのオルタナンの抽出および単離は、沈殿、抽出、およびクロマトグラフィー方法などの標準的な方法によって実施することができる。
【０１０６】
さらに、本発明は、本発明の植物または本発明の繁殖可能な物質から得ることができるオルタナンに関する。
【０１０７】
さらに、本発明は、オルタナンおよび/またはフルクトースを調製するための方法であって、本発明の宿主細胞がショ糖含有培地にオルタナンスクラーゼを分泌し、オルタナンスクラーゼおよび/またはフルクトースを培地から単離する方法に関する。
【０１０８】
本発明の方法の好ましい態様は、組換え的に作製され、宿主細胞によって培地に分泌されたオルタナンスクラーゼを使用するので、細胞を破砕する必要性がなく、タンパク質をさらに精製する必要性がない。その理由は、分泌されたタンパク質は上清から得ることができるからである。培地の残渣は、透析、逆浸透圧、クロマトグラフィー方法等などの分析技術に有用な方法によって取り出すことができる。同じ方法を、培地に分泌されたタンパク質の濃縮に適用する。微生物によるタンパク質の分泌は、通常、N末端シグナルペプチド（シグナル配列、リーダーペプチド、輸送ペプチド）によって仲介される。シグナル配列を有するタンパク質は、微生物の細胞膜を透過することができる。タンパク質の分泌は、オルタナンスクラーゼをコードする対応する領域に、シグナルペプチドをコードするDNA配列を付加することによって達成することができる。
【０１０９】
発現されるオルタナンスクラーゼの天然のシグナルペプチドが好ましく、リューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NRRL B 1355のオルタナンスクラーゼのシグナルペプチド（配列番号：2のN末端の最初の約25〜45アミノ酸残基を参照）が特に好ましい。
【０１１０】
クレブシエラオキシトーカ（Klebsiella oxytoca）M5A1のα-CGTaseのシグナルペプチド（Fiedlerら, J. Mol. Biol. 256(1996), 279〜291）またはGenBankアクセッション番号X86014として入手可能な配列のヌクレオチド11529位〜11618位によってコードされるシグナルペプチドが最も好ましい。
【０１１１】
オルタナンおよび/またはフルクトースの調製には、細胞内で生じる多糖のほとんどの合成反応に必要である活性化されたグルコース誘導体も補因子も必要ない。このように、オルタナンスクラーゼ分泌微生物をショ糖含有培地で培養でき、分泌されたオルタナンスクラーゼが培地中でオルタナンおよびフルクトースを合成することができる。
【０１１２】
天然にオルタナンスクラーゼを分泌するリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）の宿主細胞とは異なり、本発明により使用される宿主細胞は、デキストランスクラーゼなどの不都合な多糖合成副反応を有するタンパク質を分泌しないという利点を有するので、結果として、細胞の外には、オルタナン以外には、費用および時間がかかる方法でしかアルタナンと分離することができない他の多糖が形成されえない。さらに、本発明の好ましい態様による宿主細胞は、生成されたオルタナンの収率を低下するいかなる不都合な多糖分解副作用も持たない。
【０１１３】
本発明の方法は、オルタナン以外にフルクトースを産生する。フルクトースは、いわゆる「フルクトース高含有シロップ」（HFCS）の高価でない単離に使用することができる。一方では、フルクトースを調製するための従来の方法は、インベルターゼによるショ糖の酵素的な分解またはほとんど酸加水分解によって生じる、デンプンのグルコース単位への分解、およびグルコースイソメラーゼによるグルコースのフルクトースへのその後の酵素的な転換を提供する。しかし、両方法は、グルコースとラクトース混合物をもたらす。結果として、2つの成分がクロマトグラフィー方法によって互いに分離されなければならない。
【０１１４】
本発明の方法の2つの反応生成物の分離、または基質のショ糖からの反応生成物の分離は、例えば、フルクトースの透過を可能にするが、ショ糖および/またはオルタナンの透過は可能にしない膜を使用して実施することができる。このような膜によるフルクトースの連続的な除去が提供される場合には、ショ糖の多少不完全な転換が生じる。
【０１１５】
オルタナンおよびフルクトースの単離は標準的な方法によって実施することができ、または例えば、本明細書の実施例に記載されているように実施することができる。
【０１１６】
本発明の一態様によると、宿主細胞は、微生物、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）を起源とする。
【０１１７】
別の態様において、本発明の方法は真菌宿主細胞、詳細にはサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母細胞を用いて実施される。酵母は、細胞外ショ糖を分解するインベルターゼを分泌するので、オルタナンスクラーゼの酵素活性によりショ糖含有培地中でオルタナンを生成する酵母細胞を用意に使用することができない。酵母は、ヘキソーストランスポーターにより容易に生じたヘキソースを取り込む。しかし、suc2欠損遺伝子を保有し、従ってインベルターゼを分泌できない酵母株が記載されている（Reismeierら, EMBO J. 11(1992), 4705〜4713）。さらに、これらの酵母細胞は、ショ糖を細胞内に取り込むことができる輸送系を含有していない。このような株が、培地中にオルタナンスクラーゼを分泌するように、本発明の核酸分子によって改変される場合には、フルクトースおよびオルタナンはショ糖含有培地で合成される。得られるフルクトースはその後酵母細胞によって取り込まれうる。
【０１１８】
本発明の方法の別の好ましい態様において、本発明の宿主細胞は固定された形態で存在する。
【０１１９】
一般に、宿主細胞は、アルギネート、ポリアクリルアミド、ゼラチン、セルロースまたはキトサンなどの好適な材料中に細胞を封入することによって固定される。しかし、担体材料への細胞の吸着または共有結合することも可能である（BrodeliusおよびMosbach, Method in Enzymology Vol. 135(1987), 222〜230）。細胞を固定化する利点は、液体培養より実質的に高い細胞密度が達成されるということである。これにより、生産性が高くなる。さらに、安定性を維持する方法のための費用と同様に、培養物を撹拌および通気するための費用が削減される。別の重量な局面は、連続的なオルタナン生産が可能になり、結果として、発酵過程中に通常生じる非増殖期をなくす、または少なくとも大幅に減少させることができる。
【０１２０】
本発明の別の態様はオルタナンおよび/またはフルクトースを調製するための方法であって、
（a）ショ糖をオルタナンおよび/またはフルクトースへ転換することを可能にする条件下において、ショ糖含有溶液が本発明のタンパク質と接触させられ、
（b）オルタナンおよび/またはフルクトースが溶液から単離される
方法に関する。
【０１２１】
この態様において、本発明は従って、細胞を含まない酵素調製物によってインビトロにおいてオルタナンおよび/またはフルクトースを調製する方法に関する。この場合には、例えば、オルタナンスクラーゼを分泌する微生物を、オルタナンスクラーゼタンパク質の形成を可能にするショ糖非含有培地において定常期まで培養する。遠心分離によって細胞を培地から除去した後、分泌された酵素を上清から回収することができる。その後、オルタナンおよび/またはフルクトースを合成するために、酵素をショ糖含有溶液に添加することができる。無細胞系におけるオルタナンの上記の合成と比較して、この方法は、反応条件をよりよく制御することができ、反応生成物を実質的により純度高く、より容易に精製するという利点を提供する。タンパク質の精製はすでに上記してあるように実施することができる。
【０１２２】
本発明の方法の好ましい態様は精製したオルタナンスクラーゼを使用する。精製したオルタナンスクラーゼは、タンパク質を合成する細胞の細胞成分をほとんど含まず、多糖合成作用（例えば、デキストランスクラーゼ）または分解作用を有するタンパク質の混入および／または（多糖）アクセプターの混入がない酵素を意味することが理解される。「精製したオルタナンスクラーゼ」という用語は、好ましくは、少なくとも70%、好ましくは少なくとも85%、特に好ましくは少なくとも95%の純度を有するオルタナンスクラーゼを意味する。
【０１２３】
オルタナンおよび/またはフルクトースを生成するために精製タンパク質を使用することは種々の利点を提供する。部分的に精製したタンパク質抽出物を用いて実施する方法と比較して、本発明の方法の反応培地は、タンパク質を精製するためまたは遺伝子操作によって調製するために使用される産生菌株（微生物）についてのいかなる残渣も含有しない。
【０１２４】
さらに、精製したタンパク質の使用は、食品および薬学業界への適用に有利である。反応培地はその組成に規定され、不必要な成分を全く含有しないということにより、同様に、生成物がその成分に関してより正確に規定される。特に、これらの生成物はトランスジェニック微生物の痕跡を全く示さないので、遺伝子工学によって作製されたこれらの生成物の食品および薬学業界の認可を得る手順には実質的に少量の書類しか必要ない。
【０１２５】
さらに、部分的に精製したオルタナンスクラーゼ調製物を使用した無細胞系に関するこれまでに記載されたインビトロにおける方法とは異なり、精製したオルタナンスクラーゼを使用した本発明の方法は、本発明のタンパク質の高純度のために、デキストランスクラーゼおよびデキストランが混入することなく、高純度のオルタナンを調製することができるという利点を有する。さらに、本発明の方法により、例えば、基質のショ糖の一部を望ましくないデキストランに転換すると思われ、時間および費用のかかる方法を使用することで、オルタナンからの分離ができないデキストランスクラーゼの不都合な副反応によって生じる損失を生じることなく、オルタナンを高収率で生成することができる。
【０１２６】
本発明の方法は、オルタナン以外にフルクトースを生成する。フルクトースは、いわゆる「フルクトース高含有シロップ」（HFCS）の高価でない回収に使用することができる。本発明の方法は、精製したオルタナンスクラーゼを使用するので、高純度の生成物を生ずる。従って、イオン交換により緩衝塩を除去するための費用のかかる工程段階を含む、トウモロコシデンプンからHFCSを調製するための従来の方法と比較して、（CrabbおよびMitchinson, TIBTECH 15(1997), 349〜352）、本発明の方法はフルクトースの費用のかかる精製を必要としない。
【０１２７】
本発明の方法の別の好ましい態様は組換えにより調製したオルタナンスクラーゼを使用する。
【０１２８】
別の好ましい態様によると、オルタナンスクラーゼの酵素活性を有する酵素を担体材料に固定する。
【０１２９】
オルタナンスクラーゼの固定は、合成反応の触媒酵素を容易に反応混合物から回収でき、数回再使用することができるという利点を提供する。酵素の精製は、通常、費用および時間がかかるので、酵素を固定し、再使用することにより、実質的に経費を節約できる。別の利点は、いかなる残存タンパク質も含有しない反応生成物の純度である。
【０１３０】
タンパク質を固定するために利用できる多数の担体材料があり、担体材料への結合は共有結合または非共有結合を介して実施することができる（総説は、Methods in Enzymology 135, 136, 137を参照のこと）。広範に使用されている担体材料には、例えば、アガロース、アルギネート、セルロース、ポリアクリルアミド、シリカまたはナイロンが含まれる。
【０１３１】
本発明の別の態様によると、（担体材料に固定された）オルタナンスクラーゼは、2枚の膜の間に存在する。一方の膜は、フルクトースを透過させるが、ショ糖およびオルタナンは透過させず、他方の膜はショ糖を透過させるが、オルタナンは透過させない。基質の供給は、ショ糖を透過させる膜を通して実施される。合成されたオルタナンは、2枚の膜の間の空間に残存し、放出されたフルクトースは、フルクトースだけを透過させる膜を介して反応平衡から常に除去することができる。このような配置により反応生成物は効率的に分離され、純粋なフルクトースが産生される。
【０１３２】
さらに、イオン交換クロマトグラフィーによるフルクトースの分離が記載されている（「デンプン加水分解産物、世界の技術、製造、および適用（Starch Hydrolysis Products, Worldwide Technology, Production, and Application）」,F. W. Schenck, R. E. Hebeda編, (1992), VCH Publishers, Inc., New York）。
【０１３３】
従って、一方では、純粋なフルクトースを調製するためのオルタナンスクラーゼの使用は、比較的高価でない基質であるショ糖を出発材料として使用することができるという利点を含み、他方では、付加的な酵素的な転換またはクロマトグラフィー方法を使用することなく、フルクトースを容易に反応混合物から単離することができる。
【０１３４】
さらに、本発明は、オルタナンおよび/またはフルクトースを調製する方法であって、
a）ショ糖のオルタナンおよび/またはフルクトースへの転換を可能にする条件下において、ショ糖含有溶液が本発明のタンパク質およびアクセプター分子と接触させられ、且つ
（b）オルタナンおよび/またはフルクトースが溶液から単離される
方法に関する。
【０１３５】
本発明の範囲内において、アクセプター分子は、オルタナンスクラーゼが鎖伸長反応を触媒することができる分子を意味することが理解される。反応開始時に反応混合物に添加することができるアクセプターは、好ましくは、炭水化物または炭水化物誘導体である。外部アクセプターを使用することにより、本発明に関しては、オルタナンと呼ばれる低分子生成物が生成される。炭水化物アクセプターは、好ましくは、オリゴ糖または多糖であり、詳細には、デキストラン、グリコーゲンまたはアミロペクチンなどの分岐多糖であり、好ましくは、鎖状多糖であり、特に好ましくは、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオースおよびメチル-α-D-グルカンからなる群より選択される糖である。これらのアクセプターにおいてオルタナン鎖の伸長が生じる場合には、その後、遊離体より分子量が大きい生成物が形成される。マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオースおよびメチル-α-D-グルカンを使用する場合には、外部炭水化物アクセプターが存在しない場合に調製することができるオルタナンより分子量が小さい生成物が得られる。
【０１３６】
調製されるオリゴオルタナンの分子量のサイズは使用するショ糖/アクセプター比に依存する。例えば、生成物の重合度は、ショ糖/イソマルトース比が増加するにつれて、増加する。
【０１３７】
さらに、ショ糖／アクセプター比が、オリゴオルタナン収率に影響を及ぼす。例えば、オリゴオルタナンの収率は、ショ糖/イソマルトース比が低下するにつれて、増加する。
【０１３８】
本発明者らが主張するオルタナンスクラーゼを使用してオリゴオルタナンを製造するこれまで記載した方法は、炭水化物アクセプターマルトースが存在する場合に、オリゴオルタナンおよびオリゴデキストランの産出された生成物の混合物だけを精製した（Pelencら, Sciences Des Aliments 11(1991), 465〜476）。この場合には、オリゴデキストランの合成は、おそらく、オルタナンスクラーゼ調製物のデキストランスクラーゼ混入物による。この方法と比較して、本発明の方法は、いかなるデキストランスクラーゼ混入物も含有しない、組換えにより生成したオルタナンスクラーゼタンパク質を使用することにより、オリゴデキストランが同時に形成されることなく、オリゴオルタナンが調製されるという利点を提供する。従って、本発明の方法は、オリゴデキストランを分離する費用のかかる追加の精製段階を必要とすることなく、オリゴオルタナンを提供することを可能にする。
【０１３９】
別の好ましい態様によると、オルタナンスクラーゼの酵素活性を有する酵素を担体材料に固定する。
【０１４０】
本発明の方法の別の好ましい態様によると、組換えにより作製されたオルタナンスクラーゼを使用する。
【０１４１】
さらに、本発明はオルタナンを含有する最終生産物に関する。これに関しては、最終生産物は、化粧製品、好ましくは、食品、飼料、特に好ましくは薬学的製品を意味することが理解される。
【０１４２】
最後に、本発明は、本発明の上記オルタナン製造方法の1つを含む上記生成物を調製するための方法と、このようにして得られた、対応する生成物の上記適用の1つに好適な形態のオルタナンとに関する。
【０１４３】
これらの態様および他の態様が開示され、当業者に明らかであり、本発明の説明および実施例に含まれる。本発明の意図する範囲内において使用することができる、上記の方法、手段および適用の1つに関する追加の文献は、例えば、電子的な方法を用いることによって、例えば、公開図書館から、当技術分野から入手することができる。この目的は、特に、例えば、アドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlでインターネットによりアクセス可能な「メドライン（medline）」などの公開データベースによって達成することができる。他のデータベースおよびアドレスは当業者に周知であり、例えば、アドレスhttp://www.lycos.com.でインターネットから入手することができる。生物工学の特許および特許出願に関する出典および情報に関する総説はBerks, TIBTECH12(1994),352〜364に含まれている。
【０１４４】
実施例
実施例で使用するベクター
1.pBinAR-N
標準的な方法（Sambrookら,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA （1989））を用いて、多様なポリリンカー（図10参照）を、プラスミドpBinAR（HofgenおよびWillimitzer, Plant Science 66（1990）, 221〜230）の35SプロモーターとOCSターミネ−ターの間に挿入した。生成プラスミドはpBinAR-Nと命名した。
【０１４５】
2.pBinAR-Hyg-N
標準的な方法（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA （1989））で、35Sプロモーター、ポリリンカー、OCSターミネーターを含むpBinAR-NからEcoRI/HinDIII断片を単離した。次にこの断片をプラスミドpBIB-Hyg（Becker, Nucleic Acids Research 18（1990）203）の同じ制限酵素切断部位に連結した。得られたプラスミドはpBinAR-Hyg-Nと命名した。
【０１４６】
3.pBinAR-pat-Hyg
オリゴヌクレオチドSp-pat-5'およびSp-pat-3'（配列番号：48および配列番号：49を参照）を用いて、ジャガイモ由来のパタチンタンパク質（Sonnewaldら, Plant J. 1（1991）, 95〜106で用いられたものと配列が異なる配列番号：50を参照）のリーダーペプチドをコードするDNA分子を、プラスミドpgT5（Rosahlら, Mol.Gen.Genet. 203（1986）, 214〜220；Sonnewaldら, Plant J. 1（1991）, 95〜106）を鋳型としたPCR法で増幅した。生成PCR産物を制限酵素XbaIとSalIで切断し、あらかじめ制限酵素SpeIおよびSalIで直鎖状にしておいたプラスミドpBinAR-Hyg-Nに連結した。得られたプラスミドはpBinAR-pat-Hygと命名した。
【０１４７】
PCRの条件：
緩衝液とポリメラーゼは、Boehringer Mannheim社製（Pwoポリメラーゼ番号1644947）を使用した。
DNA    0.2 ng
10×緩衝液＋MgSO4  5 μl
dNTP（各10 mM）  1 μl
プライマー Sp-pat-5'  120 nM
プライマー Sp-pat-3'  120 nM
Pwoポリメラーゼ  1.0ユニット
滅菌水を加えて50 μlとした。
【０１４８】
反応条件：
段階1  95℃  2分30秒
段階2  95℃  30秒
段階3  64℃  30秒
段階4  72℃  30秒
（1サイクル毎に1秒追加）
段階5  72℃  5分
段階2〜4を周期的に35回繰り返した。
【０１４９】
4.pBinAR-FNR-Hyg
オリゴヌクレオチドSp-fnr-5'およびSp-fnr-3'（配列番号：51および52を参照）を用いて、ホウレンソウに由来するFNRタンパク質の輸送ペプチドをコードするDNA分子を、プラスミドp6SocFNR-15（Jansenら, Current Genetics 13（1988）, 517〜522）を鋳型としたPCR法で増幅した。生成したPCR産物を制限酵素XbaIおよびSalIで切断し、SpeI/SalIで開環したpBinAR-Hyg-Nにクローニングした。得られたプラスミドはpBinAR-fnr-Hygと命名した。
【０１５０】
PCRの条件：
緩衝液とポリメラーゼは、Gibco BRL社製（プラチナTaq DNAポリメラーゼ High Fidelity 番号1304〜011）を使用した。
DNA    0.2 ng
10×緩衝液    5 μl
MgSO4    2.0 μl
dNTP（各10 mM）    1 μl
プライマーSp-fnr-5'    150 nM
プライマーSp-fnr-3'    150 nM
TaqプラチナHifiポリメラーゼ    1.5ユニット
滅菌水を加えて50 μlとした
【０１５１】
反応条件：
段階1    95℃    2分30秒
段階2    95℃    30秒
段階3    58℃    30秒
段階4    68℃    20秒
（1サイクル毎に1秒追加）
段階5    68℃    3分
段階2〜4を周期的に35回繰り返した。
【０１５２】
実施例1：リューコノストクメゼンテロイデス NRRL-B1355由来のオルタナンスクラーゼのクローニング
オルタナンスクラーゼの単離および配列決定
リューコノストクメゼンテロイデスのNRRL-B1355株を、5%ショ糖を添加した乳酸桿菌用MRS培地（Difco）1 l中で、2日間28℃で培養した。培養後、20,000×gで30分間遠心後、上清に等量の10%トリクロロ酢酸を混合して、4℃で16時間撹拌した。次に同溶液を10,000×gで30分間遠心した。このように得られた沈殿を4.5 mlの40 mM Tris-HCl（pH 8.8）に溶解し、その後（約0.5 mlの）2 M Tris-塩基で中和した。このタンパク質溶液を、Toplab Gesellschaft  fur angewandte Biotechnologie mbH社, Martinsried、ドイツに送り、タンパク質配列の決定を委託した。同社では、このタンパク質溶液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルをクーマシーブルーで染色し、次に染色液を10%酢酸で脱色した。このタンパク質を酵素で切断するために、タンパク質のバンドをゲルから切り出し、分子ふるいを通して断片化した（孔は30 μm×100 μm）。破砕したゲルは次に半分に濃縮したインキュベーション緩衝液（12.5 mM Tris、0.5 mM EDTA（pH 8.5））で2分間洗浄した。遠心後、緩衝液を除いてゲルを「Speedvac」で1時間乾燥させた（残存水分は約5%、ゴム状）。続いて、12.5 mM Tris/HCl（pH 8.5）（酵素：タンパク質＝1:10）および0.1%のラウリルマルトサイト（laurylmaltosite）の400 μl中のエンドプロテイナーゼLysCの溶液を調製した。この溶液200 μlを試料に添加し、ヒートブロックシェイカーで37℃で一晩インキュベートした。ペプチド断片を溶出するために1% TFAを添加し、1時間インキュベート後に2回遠心し、10%ギ酸、20%イソプロパノール、60%アセトニトリルで3時間かけて溶出した。次に得られたペプチド断片をHPLCでそれぞれの断片が分離した（カラムにSuperspher 60 RP select B（Merck, Darmstadt）2 mm×125 mmを使用し、緩衝液Aに0.1%トリフルオロ酢酸、緩衝液Bに0.085% TFAのアセトニトリル溶液を使用し、流速を0.2 ml/分、勾配は60分あたり5％〜60％とし、検出波長は206 nmとした）。回収したペプチド断片は次に、自動シーケンサーProcise 492（Applied Biosystems, PE）で配列を決定した。手順は、Hunkapillerの文献（Hunkapillerら, Meth. Enzymol. 91（1983）, 399〜413）を元に、改変した段階的なエドマン分解法に従った。
【０１５３】
六種のペプチド配列（配列番号：5〜9および21を参照）を特定し、lysC-66、lysC-67、lysC-82、lysC-83、lysC-88および「N末端」と命名した。
【０１５４】
リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355に由来するゲノムDNAライブラリーの調製
リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355（ATCCから購入）を、2%（w/v）のグルコースと50 mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）を添加した100 mlのYT培地（Sambrookら、上記引用）で、28℃で36時間培養した。遠心して集菌後、ゲノムDNAをAusubelらの方法（「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」第1巻, Greene and John Wily & Sons（1994）,USA）により単離した。
【０１５５】
リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355から得た100 μgのゲノムDNAを、0.001ユニットの制限酵素Sau3Aで30分間かけて部分的に切断し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、エタノールで沈殿させた。リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355から得た2.5 μgの部分切断されたDNAを、BamHIで切断し、脱リン酸化したベクターpBKCMV BamHI（Stratagene）1 μgに、メーカー指定の条件下（Stratagene、pBKファージミドベクター使用説明書およびT4 DNAリガーゼ・ライゲーションキット）でT4 DNAリガーゼを用いてライゲーションした。ライゲーション混合物2 μlを、ギガパックIIゴールド（Gigapack III Gold）（Stratagene）にメーカー指定の使用説明書に従ってパッケージングし、ファージ量を決定して保存した。
【０１５６】
オルタナンスクラーゼ遺伝子単離用プローブの調製
精製したオルタナンスクラーゼタンパク質（上記参照のこと）をトリプシン消化して得たペプチド配列lysC-66（配列番号：5）、lysC-67（配列番号：6）、lysC-82（配列番号：7）、lysC-83（配列番号：8）、lysC-88（配列番号：9）に、ペプチドlysC-82とlysC-83について逆翻訳を行った後、ペプチドlys82とlysc83を、縮重したオリゴヌクレオチド（配列番号：10、配列番号：11）の合成用に選択した。前記オリゴヌクレオチドは、NRRL-B1355のゲノムDNAに対するPCR反応プライマーとして用いた。オリゴヌクレオチド内でNで示した位置はすべて、プライマー合成時にイノシンで置換した。
【０１５７】
PCRの反応条件
反応混合物は、Taqポリメラーゼ（Gibco BRL）用の緩衝液で調製した。
【０１５８】
反応混合物：
Taqポリメラーゼ（Gibco）
DNA    100 ng（NRRL-B1355のゲノム）
dNTP    2.5 mM（各ヌクレオチドについて）
プライマー    10 μl（0.2 μMを含む溶液）
10×バッファー    5 μl
塩化マグネシウム    2 mM
ポリメラーゼ    1ユニット
水を添加して50 μlとした。
【０１５９】
段階1    95℃    3分
段階2    95℃    1分
段階3    58℃    2分
段階4    72℃    2分
段階5    72℃    10分
段階2〜4を周期的に40回繰り返した。
【０１６０】
PCR反応から生じた837 bpの断片（配列番号：12）末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化して、SmaIで切断したpBlueSkriptベクター（Stratagene）にクローニングした。得られたプラスミドをpAlsu-PCR-lysc82/83と命名した。インサートの配列を決定し、対応するタンパク質配列へコンピューター上で翻訳後、データベースの比較をスイスプロット・データベースで行った。その結果から、既知の糖転移酵素（P49331、P11001、P68987、P13470、P27470、P29336）との間に相同性が認められた。
【０１６１】
リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355由来のゲノムDNAライブラリーに由来する約5,000個のファージを、プレート上に、製造業者（Stratagene）の指示する栄養分を含む溶液を用いて培養し、37℃で12時間インキュベートした後、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いでこのニトロセルロースフィルターを1.5 M塩化ナトリウム、0.5 M苛性ソーダ溶液に2分間浸漬してファージを変性した後、1.5 M 塩化ナトリウム、0.5 M Tris-HCl（pH 8.0）に5分間浸漬してフィルターを中和した。0.2M Tris-HCl、2×SSCでフィルターを洗浄後、UV架橋反応（Stratagene社のStratalinker、120,000 μJで30秒間）を行い、ファージDNAをメンブレンに結合させた。このフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液（5×SSC、0.5% BSA、5×デンハルト、1% SDS、40 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）、100 mg/lニシン精子DNA、25%ホルムアルデヒド）中で42℃で6時間インキュベートした。プラスミドpAlu-PCR-lysc82/83から単離したインサート30 ngを、マルチプライムキット（Boehringer Mannheim）を用いてα-32P dCTP（ICN Biomedicalds）で放射性標識した。この放射標識プローブを、プレハイブリダイゼーション混合物に添加し、フィルターをこのハイブリダイゼーション混合物中で42℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション混合物を除去した後、フィルターを洗浄液（0.1×SSC、0.5% SDS）で3回にわたり55℃で15分間洗浄した。その後、X線フィルム（Kodak）をフィルターに重ねて18時間感光させた。ハイブリダイズしたシグナルを示すファージコロニーを同定、単離して、SM培地に再懸濁後に再び、単一のプラークとして認められることができるような分離した状態でプレート上で培養した。これらのファージを、ニトロセルロースフィルターに転写し、処理およびハイブリダイゼーションを上記条件下で行った後、ハイブリダイズした各ファージについて、放射性遺伝子プローブを用いて個々に単離した。単離したファージについて、製造業者（Stratagene）の指定する方法で、インビボ除去（in vivo excision）を行った後、クローンAS-19B1とAS-19B2をプラスミドとして単離した。両クローンを完全に配列決定したところ（配列番号：13、14）（Agowa）、両者に1008 bpの重複が認められた。配列番号：13と配列番号：14を連結し、可能なすべての読み枠についてコンピューターによる翻訳を行ったところ、ATGコドン（配列番号：1の678位から680位に対応）から始まる一つの連続した読み枠であることが判明した。この読み枠上に停止コドンは認められなかったので、別のクローンを単離して、オルタナンスクラーゼの完全なコード配列を確認することとした。
【０１６２】
そこで、リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-1355由来のゲノムDNAライブラリーに由来する約5,000個のファージについて、上述のマルチプライムキット（Boehringer Mannheim）を用いて放射性標識したクローンAS-19B2の断片の一部を用いて再びハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブは、AS-19B2のHindIII（AS-19B2のインサート中にある制限酵素切断部位）/SalI（pBKCMVのファージミドベクターをポリリンカーで切断する）断片を用いて調製した。該断片は上述の読み枠をコードする配列の3'端の372塩基を含む。ファージライブラリーのスクリーニング、選択、およびファージのプラスミドへの形質転換は、上述の条件で行った。このように単離したクローンAS-28B（配列番号：15参照）とAS-29Ba（配列番号：16）の完全な配列解析を行ったところ、クローンAS-19B2（配列番号：14）とAS-28B間に、同一の960塩基（配列番号：1の4863位〜5823位の塩基に対応）の重複を、また、クローンAS-19B2とAS-29Ba（配列番号：16）間に、同一の567塩基（配列番号：1の5256位〜5823位の塩基に対応）の重複を同定することができた。クローンAS-28BとAS-29Baには、同一の1523塩基を有する（配列番号：1の5256位〜6779位の塩基に対応）。クローンAS-19B1、AS-19B2、およびAS-28Bの配列をコンピュータで連結したところ、ATGコドンで始まる連続した読み枠（完全配列の678位〜680位の塩基）が出現した。この読み枠にも停止コドンが含まれていなかった。クローンAS-19B1、AS-19B2、AS-28B、AS-28Baの配列をつなげたところ、「ATG」コドン（配列番号：1の678位〜680位の塩基に対応）で始まり、「TAA」（配列番号：1の6849位〜6851位の塩基に対応）で終わる2057アミノ酸残基をコードするひとつの読み枠を同定することができた。このコード領域のほかに、構成されたクローンの単離・同定されたクローンの統合DNA配列全体（配列番号：13〜16）には、5'領域に677塩基が、また3'領域に2469塩基がそれぞれオルタナンスクラーゼの非コード領域の配列として含まれていた（図1参照）。
【０１６３】
実施例2：大腸菌形質転換用プラスミドpAlsu-pSKの構築と、タンパク質抽出物の酵素活性試験
プラスミドAS-19B2、AS-19B1、AS-28B、およびAS-29Ba（実施例1参照）を以下の手順でつなげた。クローンAS-19B1のNotI（ベクターpBK CMW（Novagen）のポリリンカー中の制限酵素切断部位）/ClaI断片を、ベクターpBluescript SK（Stratagene）の同じ制限酵素切断部位に挿入した（クローニングの第一段階）。AS-19B2のClaI/XhoI断片、AS-28BのXhoI/MluI断片、AS-28BのMluI/BsaB1断片（ベクターの平滑化ApaI制限酵素切断部位にクローニングされたBsaBI切断断片）を、第一クローニング段階から得られたクローンに連続的に挿入して、プラスミドpAlsu-pSKを得た（図2参照）。このプラスミドには、リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355由来のオルタナンスクラーゼの完全なコード配列に加えて、5'領域の677 bpの非コード配列（プロモーター領域）と、3'領域の539 bpの配列が含まれる（配列番号：17）。
【０１６４】
次にプラスミドpAlsu-pSKを大腸菌（DH5α、Fermentas社製）に導入して形質転換した。この菌を次に27℃で2日間にわたり、50 mlの「TB培地」（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA （1989）に記載されている組成（0.5%のグルコースを添加）または、以下の組成からなる発酵培地で培養した：KH2PO4 1.5 g/l、(NH4)2SO4 5.0 g/l、 NaCl 0.5 g/l、Na-クエン酸 1.0 g/l、Fe2＋SO4×7H2O、0.075 g/l、酵母エキストラクト 0.5 g/l、トリプトン 1.0 g/l、グルコース 15.0 g/l、MgSO4×7,H2O 0.3 g/l、CaCl2×2H2O 0.014 g/l、無機塩類10 ml/l、H3BO3 2.5 g/l、CoCl2×6H2O 0.7 g/l、CuSO4×5H2O 0.25 g/l、MnCl2×4H2O 1.6 g/l、ZnSO4×7H2O 0.3 g/l、Na2MoO4×2H2O 0.15g/l、ビタミンB1（チアミン）0.005 g/l。
【０１６５】
すべての培養液にアンピシリンを100 mg/lとなるように添加した。遠心して集菌し、2 mlの50 mM Na-リン酸緩衝液（pH 7.2）に再懸濁して、フレンチプレスで破砕した。続いて、再び遠心して破砕した細胞の固形粒子を除き、上清（以降（タンパク質）抽出物と呼ぶ）を、無菌ろ過（Sterivex GV 0.2 μm、millipore）してから分析に用いた。
【０１６６】
タンパク質抽出物によるオルタナンのインビトロ調製
オルタナンのインビトロ調製には、各200 μlの抽出物について、100 mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）および20%（w/v）ショ糖各2 ml中で、100 μlの10 mMマルトースの存在下および非存在下で活性を調べた。反応混合物を37℃で24時間インキュベートした。マルトース非存在下で等量のエタノールを用いて沈殿させても重合体の沈殿は認められなかった。マルトースを含むバッチについては、HPLCクロマトグラフィー（Dionex PA-100カラム、ランニング緩衝液として150 mM NaOH、溶出緩衝液として150 mM NaOH＋3 M酢酸ナトリウム緩衝液の勾配）を行ったところ、オリゴマーの形成が認められた（図3参照）。
【０１６７】
活性判定用ゲル
各タンパク質抽出物20 mlを6% SDS-PAAゲルにアプライし、ゲル1枚あたりの電流を20 mA流して分離した（ゲルにアプライする前には、抽出物を95℃で変性しなかった）。次いで、抽出物のスクラーゼ活性の有無を、MillerとRobytの方法（Analytical Biochemistry 156（1986）, 357〜363）で調べた。
【０１６８】
対照（デキストランスクラーゼNRRL-B-512F、調製法は実施例3参照）では重合活性が認められた。プラスミドpAlsu-pSKを含む上述の大腸菌細胞のタンパク質抽出物では、重合体形成活性は認められなかった。
【０１６９】
実施例3：リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B512Fに由来するデキストランスクラーゼのクローニングと発現
ゲノムDNAの単離
リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B512F（ATCCから入手）を、1%ショ糖と50 mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）を添加したYT培地（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY（1989））で28℃で48時間培養した。遠心して集菌後、ゲノムDNAをAusubelらの方法（「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」, 第1巻, Greene and John Wiley & Sons（1994）, USA）で分離した。
【０１７０】
デキストランスクラーゼ遺伝子のPCRによる増幅とpET24aへのクローニング
デキストランスクラーゼの組換え体を大腸菌で発現させるために、デキストランスクラーゼをコードする遺伝子を、PCR増幅後に発現ベクターpET24a（Novagen）にクローニングした。この目的で、デキストランスクラーゼをコードする配列の5'末端にEagI制限酵素切断部位を、また3'末端にXhoI制限酵素切断部位を導入し、並びに国際公開公報第89/12386号の配列に由来する用いたPCRプライマー（5'b512-1：5'-ACTgCggCCgCATgCCATTTACAgAAAAAg-3'；配列番号：3および3'b512：5'-ACTgCTCgAgTTATgCTgACACAgCATTTC-3'；配列番号：4）も導入した。次にpET24aのポリリンカー中の対応する制限酵素切断部位にクローニングした。生成プラスミドはUL5-20と命名した。
【０１７１】
PCRの反応条件
緩衝液とポリメラーゼは、Gibco BRL社製を使用した。
DNA    100 ng（NRRL-B512FのゲノムDNA）
10×緩衝液    5 μl
MgCl2    4 mM
5'プライマー    50 ng
3'プライマー    50 ng
dNTP    1 mM（各ヌクレオチドについて）
Pfuポリメラーゼ    0.5ユニット
水を添加して50 μlとした。
【０１７２】
段階1    95℃    4分
段階2    95℃    1分
段階3    55℃    1分
段階4    72℃    5分
段階5    72℃    10分
段階2〜4を周期的に40回繰り返した。
【０１７３】
組換えデキストランスクラーゼの調製
プラスミドUL5-20を含む大腸菌BL21（DE3）を、YT培地（上記参照）でOD600が0.8になるまで37℃で培養した。次に細胞をに0.2 mMのIPTGを加え、新たに18℃で24時間培養した。遠心して集菌し、リン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）に再懸濁後、菌体をフレンチプレスで破砕した。この得られた溶液を遠心して不溶性画分を除き、デキストランスクラーゼを含む上清を得た。これを下記の本明細書では抽出物と表現する。
【０１７４】
実施例4：オルタナンスクラーゼのコード領域のPCRによる増幅とpET24aへのクローニング
オルタナンスクラーゼのコード領域を、リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355株のゲノムDNAを鋳型に用いたPCR反応で増幅した（下記反応条件を参照）。プライマーA1-4（配列番号：18）を用いて5'端にNheI制限酵素切断部位を導入し、プライマーA1-5（配列番号：19）を用いて3'端にSalI制限酵素切断部位を導入した。約6200 bpの断片を単離した。
0004554083.tif 000003
【０１７５】
PCRの反応条件（Gibco BRL社製キット）：
DNA    1 μl
10×緩衝液    5 μl
10 mM（各dNTPにつき）    2 μl
50 mM MgSO4    2 μl
プライマー    各1 μl
プラチナDNAポリメラーゼ    0.2 μl
滅菌水    37.8 μl
【０１７６】
段階1    95℃    2分
段階2    95℃    20秒
段階3    47℃    20秒
段階4    68℃    7分（1サイクル毎に3秒延長）
段階5    68℃    15分
段階2〜4を周期的に35回繰り返したあとに、段階5に進んだ。
【０１７７】
生成されたPCR断片を標準的な方法で精製し、制限エンドヌクレアーゼNheIとSalIで処理し、同酵素で同様に切断したベクターpET24a（Novagen）にライゲーションし、ライゲーション産物を大腸菌に導入して形質転換した。プラスミド調製および制限酵素切断後、3つの陽性クローンを選択した。これらはそれぞれ、pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、およびpAlsu-pET24a-21と命名した（図4参照）。いずれも配列番号：20で示した配列をインサートとして含んでいた。
【０１７８】
実施例5：振盪フラスコ培養と発酵槽における組換えオルタナンスクラーゼの大腸菌での発現
振盪フラスコ培養
プラスミドpAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21、およびpET24aを、Novagen社より入手した大腸菌BL21（DE3）に導入して形質転換した。3 mlのYT培地（Sambrookら,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）」, 第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY（1989））で37℃で3時間の前培養を行った後に、炭素源としてデキストロースの代わりに0.2%のグルコースを含むそれぞれ50 mlのDavis最小培地（DIFCO Manual, 「微生物学のための脱水素培地および試薬（Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology）」, 第10版, Detroit Michigan, USA（1984））の2つのレプリカをつくって振盪フラスコで37℃でOD600が約0.8になるまでそれぞれ培養した。遠心して再懸濁後、2つのレプリカ培養液のうちひとつを、炭素源かつ誘導物質として1%のラクトースを含むDavis最小培地（DMA）中で、27℃でさらに16時間培養した。個々の培養液の細胞を遠心して集菌し、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）に再懸濁し、実施例2で述べた手順でタンパク質抽出物を調製した。
【０１７９】
発酵槽
大腸菌BL21（DE3）に形質転換したクローンpAlsu-pET24a-21を、2 lの発酵槽（Biostad B; B.Braun, Melsungen）内で、下記条件で培養した。
【０１８０】
培地：
発酵用培地：KH2PO4 1.5 g/l、(NH4)2SO4 5.0 g/l、NaCl 0.5g/l、Na-クエン酸 1.0 g/l、Fe2＋SO4×7H2O 0.075 g/l、酵母エキストラクト 0.5 g/l、トリプトン 1.0 g/l、グルコース 15.0 g/l、MgSO4×7H2O 0.3 g/l、CaCl2×2H2O 0.014 g/l、無機塩類10 ml/l、H3BO3 2.5 g/l、CoCl2×6H2O 0.7 g/l、CuSO4×5H2O 0.25g/l、MnCl2×4H2O 1.6 g/l、ZnSO4×7H2O 0.3 g/l、Na2MoO4×2H2O 0.15g/l、ビタミンB1（チアミン）0.005 g/l。
【０１８１】
炭素源：グルコース（1.5%（w/v））が培地に含まれ、70%（w/v）のグルコース溶液を添加する。
【０１８２】
自動制御されるpHは、アンモニアおよびリン酸によってpH 7.0+/-0.1）調節される。培地のpO2が20%となるように、撹拌装置による調節を行った。
【０１８３】
条件：
1.5 lの発酵用培地に50 mlの前培養液を添加した。
【０１８４】
細胞はまず当初含まれていたグルコースが消費されるまで37℃で培養した。次に、それらを同じ温度で、摂食速度がグルコースについて9 g×l-1×h-1で、OD600が40になるまで培養した。この際、培地の温度は20℃に下げ、グルコース添加量を2g×l-2×h-1に減らした。培養液温度が20℃のとき、0.2 mMのIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（Sigma））を添加して誘導した。20℃でさらに18時間培養後、遠心して集菌し、50 mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）に再懸濁し、抽出物を実施例2に記載されたように調製した。
【０１８５】
実施例6：組換えオルタナンスクラーゼ活性のSDS PAGEによる分析、過ヨウ素酸酸化およびシッフ試薬による染色
プラスミドpAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21、およびpET24a（対照）をそれぞれ含む大腸菌の振盪フラスコ培養物（BL21（DE3）株）からタンパク質抽出物を調製した。二種の異なる抽出物を、異なる抽出物で形質転換した細胞からそれぞれ調製した。ひとつは、IPTG誘導前に調製した該抽出物であり、もうひとつはIPTGで誘導して培養終了時に調製したものである。振盪フラスコ培養物（実施例5参照）由来のこれらの抽出物の活性は、SDS PAGEでタンパク質を分離して検出し、次いで50 mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）で洗浄してSDSを除き、ゲルを50 mMの酢酸ナトリウム（pH 5.3）、5%（w/v）ショ糖溶液中で37℃で16時間インキュベートした。その後、形成された重合体を過ヨウ素酸で酸化し、酸シッフ試薬（MillerおよびRobyt, Analytical Biochemistry 156,（1986）, 357〜363）で染色した。
【０１８６】
図5は、クローニングベクターpET24aを含む両抽出物（IPTG誘導前後に調製した抽出物）でもスクラーゼ活性が認められなかったことを示す。プラスミドpAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、およびpAlsu-pET24a-21を用いて形質転換された株では、すべてのタンパク質抽出物で誘導後にスクラーゼ活性が認められた（1本のバンドに集約された）。
【０１８７】
IPTG誘導前では、そのような活性を示すバンドは認められなかった。
【０１８８】
ゲルで形成された重合体が、酸シッフ試薬を用いた上述の方法で染色されうることから、いかなる染色もされない純粋なα-1,3-結合ユニットが含まれないと考えられる。
【０１８９】
ベクターpAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、およびpAlsu-pET24a-21にそれぞれ含まれる遺伝子が、オルタナンスクラーゼとは別に少なくともひとつのデキストランスクラーゼを発現するリューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B1355株から単離されたことから、プラスミドに含まれる核酸配列がオルタナンスクラーゼを実際にコードしているか否かを、この染色法では明瞭に決定できなかった。デキストランとオルタナンは、両重合体ともにα-1,6結合を含むことからいずれもこの方法で検出される。
【０１９０】
実施例7：組換え的に調製したオルタナンスクラーゼの熱処理後の酵素活性試験と、オルタナンスクラーゼの特異性に関する試験
重合化活性を証明するために、振盪フラスコ培養液からの抽出物を用いた（実施例5参照）。抽出物100 μlをそれぞれ反応緩衝液（50 mM酢酸ナトリウム（pH 5.3）、20%ショ糖）2 mlに添加し、37℃で24時間インキュベートした。比較のために95℃で10分間処理して不活性化した抽出物と、ベクターpET24aを含む大腸菌BL21（DE3）に由来する抽出物を用いた。重合体の形成は、不活性化を行わなかったバッチでのみで認められ、一方、95℃で10分間処理したバッチと、pET24aを含むBL21（DE3）に由来する抽出物を用いたバッチでは重合体の形成は全く認められなかった。すべてのバッチに等量の無水エタノールを添加したところ、不活性化しなかったバッチからのみ重合体が沈殿した。この結果はオルタナンスクラーゼの活性を明瞭に示すものである。なぜならNRRL B-1355に存在するデキストランスクラーゼは、45℃で30分間の処理で不活性化された一方で、オルタナンスクラーゼは同条件下で活性を保っていたためである（Lopez-Munguiaら, Enzyme Microb. Technol. 15（1993）, 77〜85）。反応混合物から放出されるグルコースおよびフルクトースと、24時間後の時点で反応混合物物に残存するショ糖の両者についてのカップリング酵素検定による酵素学的解析から、不活性化されなかった抽出物中にのみにフルクトースが存在することが明らかとなった。
【０１９１】
酵素試験を実施する際には、精製タンパク質または粗タンパク質抽出物を、異なる希釈率で5%のショ糖および50 mMの酢酸（pH 5.5）を含む1 mlのバッチに添加して37℃でインキュベーションした。5分後、10分後、15分後、20分後、25分後、30分後に、これらのバッチから10 μlずつを抜き取り、直ちに95℃に加熱してオルタナンスクラーゼの酵素活性を停止させた。続いてカップリング測光試験を行い、オルタナンスクラーゼの作用で放出されたフルクトースおよびグルコース量と、ショ糖消耗量をそれぞれ決定した。この目的で、1〜10 μlの不活性化試料を、50 mMイミダゾール緩衝液（pH 6.9）、2 mM MgCl2、1 mM ATP、0.4 mM NAD、0.5 U/mlヘキソキナーゼ1 ml中に添加した。約1 uのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（リューコノストクメゼンテロイデス由来）、約1 uのホスホグルコースイソメラーゼ、および約5 uのインベルターゼを連続的に添加した後に、340 nmにおける吸光度の変化を測定した。続いて、放出されたフルクトースおよびグルコース量と、ショ糖消耗量をそれぞれランベルト・ベールの法則にしたがって計算した。
【０１９２】
対照のバッチ（抽出物を95℃で処理して不活性化したものと、pET24aを含む大腸菌に由来する抽出物）では、フルクトースの顕著な放出およびショ糖量の減少はそれぞれ、24時間後の反応バッチで認められなかった。
【０１９３】
これらの結果から、プラスミドpAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、およびpAlsu-pET24a-21にそれぞれコードされたスクラーゼの特異性が、グルコシル転移酵素の特異性であることが確認された。数株のリューコノストク属について記載されているフルクトシル転移酵素の存在は、この酵素が存在すればグルコースが認められるはずであることから除外される。
【０１９４】
実施例8：大腸菌から調製したオルタナンスクラーゼによるオルタナンの生産
プラスミドpAlsu-pET24a-3（実施例4参照）を含む大腸菌BL21（DE3）を発酵させて得た抽出物100 mlに、900 mlの反応緩衝液（50 mM酢酸ナトリウム（pH 5.3）、20%ショ糖）を添加して37℃で24時間インキュベートした。等量の無水エタノールを反応混合物に添加したところ、オルタナンの沈殿が生じた。この沈殿を50%エタノールで2回洗浄して凍結乾燥させた。反応に使用したショ糖量を元にした乾燥重合体の収率は60%であった。
【０１９５】
実施例9：デキストラナーゼによる消化後のオルタナンおよびデキストランのHPLCによる分析
実施例7で調製した100 mgの重合体と、デキストランT10（Pharmacia）100 mgをそれぞれ1 mlの水に溶解した。これらの溶液40 μlを各々700 μlの反応緩衝液（50 mMリン酸カリウム（pH 5.7）、8ユニットのデキストラナーゼ、ICN Biomedicals Inc.番号190097）を添加し、37℃で16時間インキュベートした。デキストラナーゼで処理していない50 μlの重合体溶液（図6参照）と、デキストラナーゼで処理した50μlの重合体溶液（図7）をHPLC（Dionex、カラムPA-100、NaOH/NaOH-NaAc勾配）で分析した。
【０１９６】
デキストランT10の場合は、重合体が切断されて低分子量の多様な分子になることが明瞭に観察される。全体的に高分子量のデキストランは、デキストラナーゼの作用で、より小さな単位（大部分がイソマルトース）に変換される。これと対照的にオルタナンの場合は、短鎖オリゴ糖のみが、デキストラナーゼとのインキュベーション後に少量現れる。オルタナンの大部分は、デキストラナーゼで消化されない。この結果は、組換えオルタナンスクラーゼで調製された産物がデキストランではなく、デキストラナーゼによる酵素的消化をほとんど受けないことが知られているオルタナンであることを示唆している（Lopez-Mungiaら, Enzyme Microb. Technol. 15,（1993）, 77〜85）。
【０１９７】
実施例10：デキストラナーゼ非存在下におけるオルタナンのインビトロ調製
振盪フラスコ培養からの100 μlの抽出物（実施例5参照）に、2mlの反応緩衝液（50 mM酢酸ナトリウム（pH 5.3）、20%ショ糖）を添加した。50ユニットのデキストラナーゼ（Biomedicals Inc.番号190097）を、別のバッチにさらに添加した。酵素抽出物の代わりに、リューコノストクメゼンテロイデスNRRL-B512Fに由来するデキストランスクラーゼを含む二種の対応するバッチを対照とした。これら二種のバッチの一種は、デキストラナーゼを追加的に混合したものであった。
【０１９８】
エタノールで沈殿を生じさせた後、デキストランスクラーゼおよびデキストラナーゼを含む反応バッチでは、重合体形成は全く認められなかった。他のすべてのバッチでは重合体の形成が認められた。
【０１９９】
実施例11：オリゴオルタナンのインビトロ調製とHPLCによる分析
オリゴオルタナンを実施例2で述べた通りに、マルトースの存在下でタンパク質抽出物を用いて調製し、次にHPLCクロマトグラフィー（実施例2参照）で検出した（図8参照）。比較のためにバッチの一部分を、オリゴオルタナンの調製後に50ユニットのデキストラナーゼ（Biomedicals Inc.番号190097）と混合し、その後さらにHPLCクロマトグラフィーを行って分離した（図9参照）。2つのクロマトグラムの比較から、オリゴオルタナン（αおよびβ-アノマー）（保持時間は15.87〜16.61分）を示すと考えられる2本のピークの高さだけでなく、最初の徴候がデキストラナーゼの作用なしに既に肉眼で観察可能である他のすべてのピークの高さもまた変化しないままであることがわかる。この結果は、組換え手法で調製したオルタナンスクラーゼの作用により、オリゴデキストランを同時に産生することなくオリゴオルタナンを調製できることを示唆している。オリゴデキストランは、デキストラナーゼによる消化を受けやすく、オリゴデキストランの存在下では、HPLCのクロマトグラムにおける最高のピークが低くなるはずであると考えられる。
【０２００】
実施例12：オルタナンのメチル化分析
インビトロで産生されたオルタナンをさらに分析する目的で、メチル化分析を行った。
【０２０１】
過メチル化
過メチル化は、NaOH/MelのDMSO溶液を用いるCiucanuとKerek（Carbohydr. Res. 131（1984）, 209〜218）の方法か、または調製直後のLi-Dimsyl/Mel（Dimsyl＝メチルスルフィニルカルバニオン）のDMSO溶液を室温で使用するHakomoriの方法（Journal of Biochemistry 55（1964 FEB）, 205〜208）を改変して行った。すべての反応は窒素雰囲気中で行った。過メチル化産物は、ジクロロメタンで過剰なヨウ化メチルを抽出して分離した。DMSOおよび塩類は、最終的に洗浄して除去した。
【０２０２】
部分的にメチル化された酢酸ソルバイト（sorbitacetate）への分解（メチル化分析）
過メチル化されたグルカンを、2 Nのトリフルオロ酢酸とともに120℃で1〜3時間かけて加水分解した。冷却後に窒素で酸を除去した。生成したグルカンを少量のトルエンとともに蒸留し、その後、NaBD4の1Nアンモニア溶液で還元し、最後にピリジン/アセトアニリドでアセチル化した（3時間、90℃）。産物はジクロロメタンで抽出し、NaHCO3で洗浄した。有機相中の同産物は、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【０２０３】
アセチル化産物の分析
アセチル化産物の分析を、Carlo-Erba社製の、オンカラムインジェクター、25 m CPSol8CB、およびFID検出器付きのモデルGC 6000 Vegaのクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィーで行った。キャリアガスには水素（80 kPa）を用いた。
【０２０４】
出現ピークの同定と積分は、Sweetらの方法（Carbohydr. Res. 40（1975）, 217）で行った。
【０２０５】
結果
ガスクロマトグラフィーで以下に挙げる主な成分が同定された。
0004554083.tif 000004
【０２０６】
また、1,4,5-および1,3,4,5-ソルバイトおよび他のテトラアセチル成分（1,5,x,y）も少量（相対量0.2〜0.4 mol%）認められた。これらの成分は、不完全なメチル化の結果であると考えられる。
【０２０７】
加水分解の長さ（時間を太字で示す）を変えて行った数回の実験で、上述の成分について以下に挙げる量が認められた（MA＝メチル化分析1；MA-b＝メチル化分析2）。
mol%で表した値
0004554083.tif 000005
【０２０８】
実施例13：植物用の発現カセットの構築：液胞および色素体におけるオルタナンスクラーゼの発現
プラスミドAlsu-pET24aを鋳型として、また、PCR用プライマーにAl-5'-1.2とAl-3'-2.2（配列番号：53および配列番号：54参照）を用いて、リューコノストクメゼンテロイデスに由来するオルタナンスクラーゼのコード領域を増幅し、次に制限酵素SalIおよびPstIで切断した。その後、得られた断片をSalI/SdaI処理したプラスミドa）pBinAR-pat-Hygおよびb）pBinAR-fnr-Hygにクローニングした。
【０２０９】
得られたプラスミドは、a）pat-Alsu-Hyg（図11参照）および、b）fnr-Alsu-Hyg（図12参照）と命名した。
【０２１０】
注：細菌の分泌シグナルペプチドは、PCRプライマーを選択することでコーディング配列から除いた。
【０２１１】
PCRの条件：
緩衝液とポリメラーゼは、Boehringer Mannheim製（Pwoポリメラーゼ番号1644947）を使用した。
DNA    0.5 ng
10×緩衝液＋MgSO4    5 μl
dNTP（各10 mM）    2 μl
プライマーSp-AS-5'    100 nM
プライマーSp-AS-3'    100 nM
Pwoポリメラーゼ    1.0ユニット
滅菌水を添加して50 μlとする
【０２１２】
反応条件：
段階1    95℃    2分30秒
段階2    95℃    30秒
段階3    47℃    30秒
段階4    68℃    7分
（1サイクル毎に3秒追加）
段階5    68℃    15分
段階2〜4を周期的に35回繰り返した。
【０２１３】
実施例14：遺伝子導入植物におけるオルタナンスクラーゼ発現のノーザンブロットによる分析
アグロバクテリウムを用いてプラスミドpat-Alsu-Hygおよびfnr-Alsu-Hygでそれぞれ形質転換したジャガイモの葉または塊茎をMM 200型のミル（Retsch GmbH & Co. KG, 42781 Haan, Germany）を用いて30 Hzで50秒間かけて微粉状にした。RNAはLogemannらの方法（Anal. Biochem. 163（1987）, 16-20）で抽出した。ひとつの試料につき50 μgのRNAをホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲルに添加した。電気泳動後にRNAをナイロンメンブレン（Hybond N, Amersham, UK）にキャピラリートランスファー法（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA （1989））で移した。核酸はUV架橋反応でメンブレンに転写した（Stratalinker、Stratagene社製）。
【０２１４】
メンブレンを、ハイブリダイゼーション緩衝液（25%（v/v）ホルムアミド、250 mMリン酸ナトリウム（pH 7.2）、250 mM塩化ナトリウム、1 mM EDTA、7%（w/v）SDS、25%（w/v）ポリエチレングリコール6000、0.25 mg/ml切断サケ精子DNA）で42℃で6時間プレハイブリダイズした。次いで、放射標識プローブを加えたハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーションを42℃で一晩行った。放射標識プローブは、Random Primed DNAラベリングキット（Boehringer Mannheim, 1004760）と、プラスミドpAlsu-pSK由来の約4 kbのKpnI/XhoI断片を用いて、製造業者のマニュアル通りに調製した。メンブレンを3×SSCで50℃で1回20分間洗浄し（Sambrookら, 「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」,第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA （1989））、0.5×SSCで1回20分間洗浄してから、x線フィルムを一晩感光させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  クローンAS-19B1、AS-19B2、AS-28BおよびAS-29Baの対応する重複断片によるリューコノストクメゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NRRL B1355のゲノムライブラリーのスクリーニング後にクローニングした配列領域全体の直線マップである。
【図２】  プラスミドマップpAlsu-pSKである。
【図３】  HPLCクロマトグラム：マルトースが存在する場合のオリゴオルタナンの調製物（実施例2）である。
【図４】  プラスミドマップpAlsu-pET24aである。
【図５】  スクラーゼ活性のその後のアッセイのSDS PAGE（実施例6を参照）である。以下のタンパク質抽出物を使用している
1+2) pAlsu-pET24a-3を含有する大腸菌（E. coli）BL21(DE3)
3+4) pAlsu-pET24a-7を含有する大腸菌BL21(DE3)
5+6) pAlsu-pET24a-21を含有する大腸菌BL21(DE3)
7+8) pET24aを含有する大腸菌BL21(DE3)
1,3,5,7)IPTGで誘導する前の培養物
2,4,6,8)培養終了時の培養物
【図６】  デキストランT10のHPLCクロマトグラムである。
【図７】  デキストラナーゼ消化後のデキストランT10のHPLCクロマトグラムである。
【図８】  オリゴオルタナンのHPLCクロマトグラムである。
【図９】  デキストラナーゼ消化後のオリゴオルタナンのHPLCクロマトグラムである。
【図１０】  プラスミドpBinAR-Nのポリリンカーを含む発現カセットのマップである。
【図１１】  プラスミドマップpat-Alsu-Hygである。
【図１２】  プラスミドマップfnr-Alsu-Hygである。
【配列表】
0004554083.tif 000006
0004554083.tif 000007
0004554083.tif 000008
0004554083.tif 000009
0004554083.tif 000010
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0004554083.tif 000014
0004554083.tif 000015
0004554083.tif 000016
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0004554083.tif 000020
0004554083.tif 000021
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0004554083.tif 000023
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0004554083.tif 000038
0004554083.tif 000039
0004554083.tif 000040
0004554083.tif 000041
【図１】
0004554083.tif 000042
【図２】
0004554083.tif 000043
【図３】
0004554083.tif 000044
【図４】
0004554083.tif 000045
【図５】
0004554083.tif 000046
【図６】
0004554083.tif 000047
【図７】
0004554083.tif 000048
【図８】
0004554083.tif 000049
【図９】
0004554083.tif 000050
【図１０】
0004554083.tif 000051
【図１１】
0004554083.tif 000052
【図１２】
0004554083.tif 000053