(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を有するとともに、該キナーゼを初期エンドソームへ輸送する機能を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項４】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を持つタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を有するとともに、該キナーゼを初期エンドソームへ輸送する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた、請求項５〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを検出するための遺伝子検出器具。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン・１リン酸の産生を触媒する酵素であるヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する新規タンパク質、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
背景技術
スフィンゴシンは、アミノ酸のセリンと脂肪酸との縮合により合成されるアミノアルコールの一種である。一方、スフィンゴシン・キナーゼは、このスフィンゴシンをリン酸化し、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理現象を引き起こす生理活性物質スフィンゴシン・１リン酸を産生する酵素である。尚、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列は、１９９８年にスピーゲルらのグループにより同定された（Ｋｏｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，２３７２２−２３７２８参照）。
上記スフィンゴシン・１リン酸のレセプターであるＥｄｇ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ）レセプターは、これまでに１から７までの７種類が報告されているが、現在スフィンゴシン・１リン酸のレセプターと考えられているものは、Ｅｄｇ１、Ｅｄｇ３、Ｅｄｇ５（別称：Ｈ２１８又はＡｇｒ１６）、Ｅｄｇ６の４種類である。スフィンゴシン・１リン酸は、これらのＥｄｇレセプターを介して細胞内へシグナル伝達することになるが、このシグナル伝達機構の詳細については、現在世界的に研究されている。
リピッドアクティベーター又はリピッドメディエーターと呼ばれる物質が細胞の種々の機能を調節する重要な働きをすることが最近分かってきた。その中の一つが上記スフィンゴシン・１リン酸であり、上記Ｅｄｇレセプターを介して、細胞増殖能など多彩な細胞調節機能を有する脂質由来の細胞増殖因子と考えられている。
尚、スフィンゴシン・１リン酸の代謝経路及びそのシグナル伝達については、例えば、実験医学Ｖｏｌ．１８  Ｎｏ．２（増刊）２０００  ８０（１８０）−８１（１８１）頁などに記載されており、同文献にも記載されるように、スフィンゴシン・１リン酸は、細胞膜のスフィンゴミエリンが、セラミド、スフィンゴシンと代謝され、スフィンゴシン・キナーゼによってリン酸化されることで生成する。
ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１も、上記のように、スフィンゴシンをリン酸化してスフィンゴシン・１リン酸を生成する重要な酵素であるが、このスフィンゴシン・キナーゼ１の働きがどのように調節されているのか、その活性調節機構については現在のところよく分かっていない。また、このスフィンゴシン・キナーゼ１に結合するタンパク質の存在についてもこれまでに報告がない。
スフィンゴシン・１リン酸は、上記シグナル伝達機構により、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理機能に関与し、ひいては、これらの生理機能に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）にも深く関与していると考えられている。従って、もし上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合するタンパク質の存在が明らかにされれば、このタンパク質は、上記スフィンゴシン・キナーゼ１の働きを調節する候補タンパク質として、このような病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に重要な貢献をもたらすものと期待される。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する新規タンパク質、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
発明の開示
本願発明者は、スフィンゴシン・キナーゼ１に結合し、その活性を調節する新規タンパク質を探索する目的で、イーストツーハイブリッドスクリーニングを行った。その結果、スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する新規タンパク質ＲＰＫ１１８、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成させるに至った。
第一に、本発明に係るタンパク質は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を持つことを特徴としている。
ここで、上記「結合する性質を持つ」とは、後述の実施例に記載される方法等により、上記スフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認することができることをいい、換言すれば、本発明のタンパク質が、上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する領域を有することをいう。また、酵素とその基質（即ち、スフィンゴシン・キナーゼ１とその基質スフィンゴシン）との間の結合は、ここにいう「結合」には含まれない。
本発明に係るタンパク質は、スフィンゴシン・キナーゼ１と結合することにより何らかのかたちでその活性を調節していると考えられる。一方、スフィンゴシン・キナーゼ１によりリン酸化されたスフィンゴシン・１リン酸は、上記のように、Ｅｄｇレセプターを介して細胞内にシグナルを伝達し、上述した種々の生理機能に関与していると考えられている。それゆえ、本発明に係るタンパク質は、これらの生理機能ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、これらの生理機能やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる可能性がある。
また、後述のように、本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８が細胞内顆粒輸送に関与している可能性から、目的タンパク質の分解やリサイクルをコントロールすることにより、種々の応用が可能になる。例えば、（１）内分泌疾患の治療：糖尿病患者のインスリン受容体の分解抑制など、（２）感染症の治療：マラリヤ感染における原虫の分解促進など、（３）免疫疾患の治療：Ｃ型肝炎ウィルスのマクロファージによる分解促進効果による抗原提示を介した抗体産生能力の増強など、への利用が考えられる。
本発明に係るタンパク質は、細胞などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＭｙｃ、ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
本発明に係るタンパク質は、さらに、下記ａ）〜ｄ）のいずれかの特徴によって特定されるものであってもよい。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる第１の領域を有する。
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる第２の領域を有する。
ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列とからなる第３の領域を有する。
ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
後述のように、本願発明者がヒトから単離した本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。このタンパク質ＲＰＫ１１８は、上記第１の領域としてのＰＸ  ｄｏｍａｉｎ、上記第２の領域としてのＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎ、上記第３の領域としてのＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎを有している。このうち、第３の領域であるＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎが、上記スフィンゴシン・キナーゼ１との結合領域と考えられる。
第二に、本発明に係るタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴としている。
ここで、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されることを意味する。
このように、上記タンパク質は、換言すれば、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、この変異タンパク質の性質は特に限定されるものではなく、例えば、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能について、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と同様の結合能を持つものであってもよいし、結合領域に変異を生じさせることにより結合能を増強したもの、結合能が弱まったもの、あるいは結合能が失われたものであってもよい。
第三に、本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るいずれかのタンパク質をコードすることを特徴としている。
上記「ポリヌクレオチド」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡや、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの転写元のゲノムＤＮＡが含まれる。
また、上記「ポリヌクレオチド」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「ポリヌクレオチド」は、本発明のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、本発明のタンパク質をコードする配列をベクター配列につないで本発明のポリヌクレオチドを構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明のポリヌクレオチドを所望に増幅させることができる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号６に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドや、配列番号６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ここで、１若しくは数個の塩基の欠失、置換、挿入、及び／又は付加とは、公知のＤＮＡ組換え技術、変異導入方法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されることを意義する。
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。例えば、配列番号６に示されるポリヌクレオチドが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（線虫、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８の更なる機能解析、同タンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、上記ポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、本発明のポリヌクレオチドすなわち本発明の遺伝子の発現解析に利用することができる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明に係る抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施の一形態について図面に基づいて説明すれば、以下のとおりである。
（１）本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８、及びその遺伝子の配列、構造等
本願発明者は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合し、その活性を調節する新規タンパク質を探索する目的で、イーストツーハイブリッド（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いてラット脳のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行った。そして、得られたｃＤＮＡクローンについて更に解析を進め、ヒト脳のｃＤＮＡライブラリーから上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する分子量１１８，０００の新規タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードする遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を決定することに成功した。尚、上記イーストツーハイブリッド法によるスクリーニング等については、後述の実施例において詳述する。
決定した全長ｃＤＮＡ配列のうち、本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域の塩基配列が、配列番号６に示される（図１〜３にも同配列を示す）。尚、決定した全長ｃＤＮＡ配列は、上記ＯＲＦ領域のほか５’側及び３’側にそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものであった。
上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。図４にも同配列を各アミノ酸１文字表記の形で示す。
図５には、解析の結果明らかになった上記タンパク質ＲＰＫ１１８の模式的構造が示される。上記タンパク質ＲＰＫ１１８は、１０６６個のアミノ酸からなり、同図に示すように、ＰＸ  ｄｏｍａｉｎ（第１の領域）、ＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎ（第２の領域）、及びＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ（第３の領域）の３つのドメインを有している。上記ＰＸ  ｄｏｍａｉｎは、配列番号１、及び図４の灰色で囲まれた領域として示されるように、上記ＲＰＫ１１８の９番目のアミノ酸から１２８番目のアミノ酸までの領域に相当する。上記ＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎは、配列番号２、及び図４の実線で囲まれた領域として示されるように、上記ＲＰＫ１１８の２３９番目のアミノ酸から３０７番目のアミノ酸までの領域に相当する。上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列との２つの部分からなる。このうち、比較的短い第１の部分（ＰＳＫ１）は、上記ＲＰＫ１１８の３４０番目のアミノ酸から４２６番目のアミノ酸までの領域に相当し、比較的長い第２の部分（ＰＳＫ２）は、上記ＲＰＫ１１８の９０６番目のアミノ酸から１０６６番目のアミノ酸までの領域に相当する（図４の黒帯領域参照）。
上記ＰＸ  ｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎは、それぞれ既知のソーティングタンパク質が持つＰＸ  ｄｏｍａｉｎ、ＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎと呼ばれる領域と相同性が高いことから命名したものである。かかる相同性から、上記ＲＰＫ１１８のＰＸ  ｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎは、おそらく細胞内小胞輸送におけるソーティング（細胞内の目的の場所に小胞を運ぶ）に関与しており、上記ＲＰＫ１１８は、ＰＸ  ｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１を細胞内の特定の場所に輸送・運搬するソーティングタンパク質として機能していると考えられる。
後述の実施例に示されるように、ＲＰＫ１１８の発現は、スフィンゴシン・キナーゼ１の少なくとも一部を初期エンドソームに局在させ、また、初期エンドソームに存在して細胞内顆粒輸送に関わるリン脂質（後述のＰｔｄＩｎｓ（３））とＲＰＫ１１８とが結合することから、ＲＰＫ１１８がアダプター分子としてスフィンゴシン・キナーゼ１を初期エンドソームに運ぶ役割を担っている可能性が高い。
上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＰＳＫ）は、タンパク質翻訳の際に重要なｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ（ＲＳＫ３）と構造類似性を示す新たな領域であり、ＲＳＫ３の相同部位は代謝活性に重要な役割を果たしている。
図６はＲＰＫ１１８のＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎと、ＲＳＫ３のＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎとを比較した図であり、ＰＳＫ１はキナーゼサブドメインＩ〜Ｖに対応し（図６（ａ））、ＰＳＫ２はキナーゼサブドメインＶＩ〜ＸＩに対応している（図６（ｂ））。しかし、ＲＰＫ１１８は、図６（ａ）に示されるように、ＲＳＫ３のキナーゼサブドメインＩにおいて、ＡＴＰの結合に必須であるＧｘＧｘｘＧモチーフが変異している。また、図６（ｂ）に示されるように、ＲＳＫ３のキナーゼサブドメインＶＩＩにおいて、Ｍｇ２＋の酵素への感受性を付与するＤＦＧモチーフも変異している。つまり、ＲＰＫ１１８は、タンパク質リン酸化に必要な部位が欠如しており、リン酸転移酵素の活性が欠損していると思われる。このドメインの生理機能は不明である。尚、このドメインは、このようにリン酸化に必要な部位を欠如していることから、擬似（ｐｓｅｕｄｏ）キナーゼドメイン、即ちＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎと命名した。また、ＲＳＫ３との構造類似性から、本発明のタンパク質を「ＲＰＫ１１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ＰＳＫ  ｄｏｍａｉｎｓ）」と命名した。
さらに解析の結果、上記ＲＰＫ１１８におけるスフィンゴシン・キナーゼ１との結合サイト（結合領域）は、上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎのうちＣ末端側の上記第２の部分（ＰＳＫ２）に存在することが判明した。
以上のように、本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８は、Ｃ末端側のＰ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１と結合し、Ｎ末端側のＰＸ  ｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１を細胞内の特定の領域に運搬するソーティングタンパク質として作用していると考えられる。
また、データベース検索によりＲＰＫ１１８のオルソログをキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）から同定し、ＲＰＫ１１８が新規の、高度に保存された遺伝子ファミリーに属することを明らかにした（図５）。同図に示すように、キイロショウジョウバエおよび線虫とも、ＲＰＫ１１８と同様に、ＰＸ，ＥＳＰ，ＰＳＫ１，およびＰＳＫ２ドメインを有する。これに対して、ヒト由来のＲＰＫ６０は、ＥＳＰ，ＰＳＫ１，ＰＳＫ２ドメインを有するが、ＰＸドメインを持たない。この遺伝子は、未知のキナーゼとしてアクセッションＮｏ．ＡＡＤ３０１８２に報告されたものであるが機能は未だ不明であり、ＲＰＫ１１８と同様の機能を有している可能性がある。
上記本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認する方法は、特に限定されるものではなく、タンパク質間の相互作用を調べる公知の種々の方法を用いることができ、例えば、ＨＡ等のエピトープ及びその抗体を利用した免疫沈降−ウエスタンブロット法により、両タンパク質の結合の有無を調査することができる。
（２）本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの取得方法
以上、本発明に係るタンパク質であるＲＰＫ１１８の配列、構造、機能、及びその遺伝子（ポリヌクレオチド）などの諸特徴について説明したが、以下では、本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの取得方法について説明する。
上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトのゲノムＤＮＡライブラリーやヒト脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、上記ＲＰＫ１１８の機能上重要と考えられる領域（例えば、上記ＰＸ  ｄｏｍａｉｎ、ＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎ又は  Ｐ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）の中から選択し、ヒトやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＲＰＫ１１８と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ＲＰＫ１１８のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒトのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得されたポリヌクレオチド（上記ＲＰＫ１１８又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れ、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記タンパク質ＲＰＫ１１８等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、適切な条件下で目的のタンパク質を精製することが可能である。
また、上記ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質を作製する方法としては、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊  新細胞工学実験プロトコール  秀潤社  ２４１−２４８（１９９３）」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られているが、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、上記タンパク質ＲＰＫ１１８の変異タンパク質を作製する場合、結合領域である上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎに変異を生じさせることにより、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能について、野生型のＲＰＫ１１８に比べて結合能が増強された変異タンパク質、結合能が弱まった変異タンパク質、あるいは結合能が失われた変異タンパク質を作製できる可能性が高い。同様に、スフィンゴシン・キナーゼ１の輸送・運搬に関係すると考えられる上記ＰＸ  ｄｏｍａｉｎ又はＥＳＰ  ｄｏｍａｉｎに変異を導入することにより、野生型のＲＰＫ１１８に比べて運搬能が増強された変異タンパク質、運搬能が弱まった変異タンパク質、あるいは運搬能が失われた変異タンパク質を作製できる可能性が高い。
上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド（変異遺伝子）についても、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入する方法や、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入方法を用いてＤＮＡを改変し、作製することができる。
（３）本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの利用
本発明に係るポリヌクレオチドは、発現ベクターに導入し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れることで、形質転換体を作製することができる。上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
また、本発明に係るポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質とＧＦＰとを融合させた融合タンパク質を発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
本発明に係るポリヌクレオチドの一部配列またはその相補配列は、遺伝子検出器具のプローブとして利用可能である。遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。尚、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの長さは、その特徴的・特異的配列により目的遺伝子の発現を検出できるものであれば特に限定されるものではないが、合成オリゴヌクレオチドの場合は１０以上３０以下が好ましく、１５以上２５以下がより好ましい。
本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、ＲＰＫ１１８タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
（実施例）
〔実施例１：ＲＰＫ１１８の遺伝子配列の決定〕
本願発明者は、以下のように、上記タンパク質ＲＰＫ１１８及びその遺伝子（全長ｃＤＮＡ）を単離し、各配列を決定した。
図７及び配列番号７には、マウス由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列が示される。このｃＤＮＡ配列をもとに、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて上記スフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡをクローニングした。
次に、上記スフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡクローンをｂａｉｔ（餌）に用い、市販のラット脳のｃＤＮＡライブラリーからイーストツーハイブリッド（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法によるスクリーニングを行った。このイーストツーハイブリッド法は、市販のキット（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ３  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、キットの手順に従って行った。
上記イーストツーハイブリッド法によって得られたポジティブクローンの配列を基に、ヒト脳のｃＤＮＡライブラリーから同一の配列部分を持つｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡは、５’端側が欠けていたので、さらに５’−ＲＡＣＥ法により、欠失していた５’端側を回収し、全長のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。尚、５’−ＲＡＣＥ法は市販のキットを用い、キットの手順に従って行った。また、塩基配列の決定には市販のシークエンサーを用いた。
〔実施例２：ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認する免疫沈降〕
さらに、得られた全長ｃＤＮＡ配列をもとにタンパク質ＲＰＫ１１８を発現させ、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能を調べたところ、当該タンパク質ＲＰＫ１１８はスフィンゴシン・キナーゼ１と結合することが確認された。
図８は、免疫沈降−ウエスタンブロット法により、タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認した実験結果を示す図である。
実験では、哺乳類の発現ベクターｐＣＭＶ５を用い、全長ＲＰＫ１１８、ＰＳＫ２断片、およびＰＳＫを欠くＲＰＫ△ＰＳＫ断片を、各々ベクターｐＣＭＶ５にＦＬＡＧエピトープ標識とともにサブクローン化した。一方、ＣＯＳ７細胞を６０ｍｍ組織培養皿で〜７０％コンフルエントに培養し、各培養皿に対して、上記各ベクター（プラスミドＤＮＡ）３μｇ、および１２μｌのＦｕｇｅｎｅ−６試薬を用いて形質転換した。
上記のように各ベクターをＣＯＳ７細胞に感染させ、ＦＬＡＧ標識したタンパク質ＲＰＫ１１８（ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８）、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片、ＰＳＫ１およびＰＳＫ２ドメインを含む３１４から１０６６残基までの配列を欠くＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫをそれぞれ発現させた。さらに、上記各タンパク質について、ＨＡ標識したスフィンゴシン・キナーゼ１（ＨＡ−ＳＰＨＫ１）と共発現させたものを用意した。
そして、それぞれのＣＯＳ７細胞を、冷溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ  ９７（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ））で溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）および抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫沈降―免疫ブロット分析を行った。
図８にその結果が示される。同図の右側のレーンから順番に、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片のみ発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８のみ発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫ及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫのみ発現させた場合、ＨＡ−ＳＰＨＫ１のみ発現させた場合、いずれも発現させなかった場合の試料である。
１〜３段目のパネルは、免疫沈降（ＩＰ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、免疫ブロット（ＩＢ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）を用いた場合であり、つまり、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて各試料に対し免疫沈降を行った後、各免疫沈降物に対して抗ＦＬＡＧ抗体による免疫ブロット（ウエスタンブロット）を行った結果を示す。４段目のパネルは、上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の発現を確認するため、各試料であるＣＯＳ７細胞の溶解物について、免疫沈降を行わず、直接抗ＨＡ抗体による免疫ブロットを行った結果を示す。５段目のパネルは、免疫沈降（ＩＰ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、免疫ブロット（ＩＢ）に抗ＨＡ抗体（ａｎｔｉ−ＨＡ）を用いた場合の結果を示す。
同図に示すように、上記ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８及び上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方をＣＯＳ７細胞に発現させた試料について、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させ抗ＨＡ抗体で免疫ブロットを行ったところシグナルが得られたことから、タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合が確認された。
同様に、上記ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片及び上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方をＣＯＳ７細胞に発現させた試料について、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後、抗ＨＡ抗体での免疫ブロットによりシグナルが得られたことから、スフィンゴシン・キナーゼ１（ＳＰＨＫ１）との結合部位はＰＳＫ２部位内に存在することが確かめられた。
実施例１で説明したイーストツーハイブリッド法によるスクリーニングの際に、上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列のうち９０１番目から１０６６番目までのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが陽性クローンとして得られたことから、ＰＳＫ２領域がＳＰＨＫ１との結合サイトと推定されたが、上記の実験結果はそのことを裏付けるものであった。
一方、ＰＳＫ２を含まないＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫは、上記の実験でＳＰＨＫ１との相互作用を示さなかった。
〔実施例３：ＲＰＫ１１８のリン酸化活性機能を調べるキナーゼアッセイ〕
ＲＰＫ１１８がリン酸化活性機能を有するか確かめるために、以下のキナーゼアッセイを行った。
ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８またはＦＬＡＧリボソーマルＳ６キナーゼ３（ＲＳＫ３）を発現するＣＯＳ７細胞を、冷溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，およびプロテアーゼインヒビター）で溶解した。溶解物中のＦＬＡＧ標識タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降され、免疫沈降物にＳ６ペプチド（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２５０μＭを加えた後、または加えずに洗浄し、洗浄後にタンパク質キナーゼ活性を測定した。このときＰ−８１ペーパーに吸収されたＳ６ペプチドへの３２Ｐの結合は、Ｃｅｒｅｎｋｏｖ  ｃｏｕｎｔｉｎｇによって決定され、免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、Ｆｕｊｉｘ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｉｚｅｒ，ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃ１．，Ｊａｐａｎ）を用いて定量した。
実験結果を図９に示す。図９（ａ）は自己リン酸化について、（ｂ）は基質Ｓ６ペプチドのリン酸化について調べたものである。免疫沈降されたＲＰＫ１１８は、良好に発現しており、また同条件でＲＳＫ３は自己リン酸化および基質Ｓ６ペプチドのリン酸化について高いキナーゼ活性を示していたにもかかわらず、ＲＰＫ１１８は、自己リン酸化についても基質Ｓ６ペプチドのリン酸化についてもキナーゼ活性を示さなかった。
〔実施例４：ヒト組織におけるＲＰＫ１１８の発現を調べるノーザンブロッティング〕
ヒト各組織におけるＲＰＫ１１８の発現を調べるために、ＲＰＫ１１８ｍＲＮＡのヒト各組織における発現を以下のノーザンブロッティングにより分析した。
まず、ゲルの各レーンごとに１μｇのヒト各組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）を電気泳動した後、３２Ｐ−標識された長さ９００ｂｐのＲＰＫ１１８のＢａｍＨ１断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。バンドはＦｕｊｉｘ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｉｚｅｒ，ＢＡＳ２０００により可視化された。
その結果、図１０に示されるように、ＲＰＫ１１８は種々の組織に発現しており、特に骨格筋、脳、心臓、胎盤、腎臓、肝臓で高レベルの発現が検出された。尚、同図において下段のパネルは、βアクチンをコントロール用のプローブとして用いた結果を示すものである。
〔実施例５：ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１とのＣＯＳ７細胞における局在〕
ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１（ＳＰＨＫ１）との相互作用をさらに詳しく検討するため、免疫蛍光法を用いてＲＰＫ１１８およびＳＰＨＫ１の細胞内局在等を調べた。
ＲＰＫ１１８をｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＥＴＥＣＫ）にクローン化したベクター、および実施例２で使用したＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８、ＨＡ−ＳＰＨＫ１発現ベクターを任意の組み合わせでＣＯＳ７細胞に共発現させて、各標識タンパク質をＣＯＳ７細胞内に発現させた。
形質転換されたＣＯＳ７細胞はカバースリップ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に、細胞数１０６／ｍｌの密度で播種され、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％トライトンＸ−１００で１０分間処理した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックした。その後、ＣＯＳ７細胞は１次抗体（ＦＬＡＧ，ＨＡ，初期エンドソームの内在マーカーである初期エンドソーム抗原ＥＥＡ１）とともに２５℃で１時間保温し、３回洗浄した後、蛍光色素と結合した２次抗体とともに２５℃で１時間保温した。なお、ＥＥＡ１抗体はＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）のものを使用した。
その後、ＣＯＳ７細胞を共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ１０２４）を使用して観察した。顕微鏡観察の結果を図１１に示す。図１１（ａ）〜（ｃ）は、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８とＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８とを共発現するＣＯＳ７細胞において、両タンパク質の共局在を確かめたもので、これによりＧＦＰ−ＲＰＫの有効性が確認された。ＲＰＫ１１８は、細胞質に拡散的に分布し、完全な共局在を示しているところでは小さな点状または輪状の構造で存在していた（図１１（ａ）〜（ｃ）矢印）。対照的に、ＧＦＰベクターのみを発現しているＣＯＳ７細胞では、ＧＦＰが細胞全体に拡散的に分布していた。
図１１（ｄ）〜（ｆ）は、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８を発現したＣＯＳ７細胞において、初期エンドソームの内在マーカー（ＥＥＡ１）を免疫染色したものである。これによると、ＥＥＡ１はＧＦＰ−ＲＰＫ１１８と良好な共局在を示しており（図１１（ｄ）〜（ｆ）矢印）、ＲＰＫ１１８が点状または輪状に局在している場所がエンドソームであることを示している。
ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１を同時に発現しているＣＯＳ７細胞では、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８は図１１（ｇ）に示されるように細胞質（核以外）に拡散し、初期エンドソームと見られる位置にも存在した。これはＲＰＫ１１８だけをＣＯＳ７細胞で発現させた場合も同様である。一方、ＨＡ−ＳＰＨＫ１は図１１（ｈ）に示されるように、細胞質に網状に分散し、初期エンドソームにも存在した。また、すべてではないがいくつかの細胞ではエンドソーム構造がＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方にラベルされた（図１１（ｉ）矢印）。ＲＰＫ１１８の点状または輪状構造のエンドソーム局在パターンは、比較的低レベルでタンパク質発現させた細胞でも観察されたので、高レベルのタンパク質発現の結果とは考えられない。さらに、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８と共発現させた場合とは異なり、ＨＡ−ＳＰＨＫ１を単独発現させた細胞において、初期エンドソーム構造がＨＡ−ＳＰＨＫ１に染色されたものはほとんど観察されなかった。
ＳＰＨＫ１の初期エンドソームへの輸送にＲＰＫ１１８が直接関与しているのか調べるために、ＰＳＫ２断片をＲＰＫ１１８およびＳＰＨＫ１と共発現させた場合の影響を検討した。ＰＳＫ２断片をＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１とともにＣＯＳ７細胞で発現させると、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８の染色パターンはほとんど変わらなかったが（図１１（ｋ））、ＨＡ−ＳＰＨＫ１はエンドソームを標識せずに細胞質および周縁領域に分布していた（図１１（ｌ））。これは、ＰＳＫ２断片がＳＰＨＫ１との結合をＲＰＫ１１８と競合することによりドミナントネガティブに機能する結果と考えられる。以上の結果は、ＲＰＫ１１８がＳＰＨＫ１の初期エンドソームへの輸送（リクルートメント）に重要であることを示すものである。なお、図１１（ｊ）は、細胞の位置を示すために、ＤＩＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）で細胞の概形写真をとったものである。
〔実施例６：ドットブロットオーバーレイアッセイ〕
最近の研究により、ＰＸドメインを含むタンパク質は、特異的に膜表面のホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）を認識することが分かってきた。そこで、ＲＰＫ１１８もＰＸドメインを介してＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合するか確かめるため、ドットブロットオーバーレイアッセイを行い、ＲＰＫ１１８のホスホイノシチド結合特異性を調べた。
Ｓｆ９細胞発現システムで組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＰＫ１１８を生成し、さらにグルタチオン−セファローズ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。精製ＧＳＴ−ＲＰＫ１１８をプローブに使用し、種々のリン脂質が付着され、ＢＳＡブロックされたニトロセルロースフィルター（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）と反応させた。その後、フィルターを洗浄し、フィルターに結合したＧＳＴ−ＲＰＫ１１８は、抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｏｍａｃｉａ）を用いて可視化された。
実験結果を図１２に示す。図１２には、リン脂質として、それぞれ、ＰｔｄＩｎｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３，４−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＬｙｓｏＰｔｄＯＨ，ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ；ＬｙｓｏＰｔｄＣｈｏ，ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰｔｄＥｔｎ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰｔｄＳｅｒ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ；ＰｔｄＣｈｏ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰｔｄＯＨ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉ；ＳＰＰ（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が付着されたニトロセルロースフィルターが示されており、抗ＧＳＴ抗体により、ＲＰＫ１１８が結合したものが染色されている。
これによれば、ＲＰＫ１１８は、他のホスホイノシチドと比べてＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐに特異的に結合している。また、ＲＰＫ１１８は、ホスファチジルイノシトール５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（５））と弱く相互作用するが、ホスホチジルイノシトール４，５−２リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）、またはホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５））Ｐ３とは全く相互作用しなかった。さらに、ＲＰＫ１１８のＰＸドメインを欠失させた変異体ＲＰＫ１１８△ＰＸは、フィルターのＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合しなかった。
最近の研究により、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは、酵母菌や哺乳類において細胞内顆粒輸送に関わることが示唆されており、ＲＰＫ１１８も細胞内顆粒輸送に関与していると考えられる。ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは、初期エンドソームに存在することから、ＲＰＫ１１８はＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合し、ＳＰＨＫ１を初期エンドソームに運ぶ働きがあると推定される。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができる。
産業上の利用の可能性
本発明に係るタンパク質は、以上のように、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を持ち、好ましくは、上記第１の領域、第２の領域、及び第３の領域の少なくともいずれかの領域を有するもの、あるいは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するものである。また、本発明に係るタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものである。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号６に示される塩基配列を有するもの、あるいは、配列番号６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するものである。
それゆえ、本発明に係るタンパク質及びポリヌクレオチドは、スフィンゴシン・キナーゼ１、その酵素活性により産生されるスフィンゴシン・１リン酸、あるいはこのスフィンゴシン・１リン酸によるＥｄｇレセプターを介してのシグナル伝達が関係する種々の生理機能ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、これらの生理機能やその調節機構に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる可能性がある、という効果を奏する。
また、ＲＰＫ１１８が細胞内顆粒輸送に関与している可能性から、目的タンパク質の分解やリサイクルを促進または抑制する技術への利用、より具体的には、（１）内分泌疾患の治療：糖尿病患者のインスリン受容体の分解抑制など、（２）感染症の治療：マラリヤ感染における原虫の分解促進など、（３）免疫疾患の治療：Ｃ型肝炎ウィルスのマクロファージによる分解促進効果による抗原提示を介した抗体産生能力の増強など、への利用が考えられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施の一形態に係るタンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（１〜１２００）を示す図である。
図２は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（１２０１〜２４００）を示す図である。
図３は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（２４０１〜３２０１）を示す図である。
図４は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列を示す図である。
図５は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８および他のタンパク質の構造を比較して示した図である。
図６（ａ）および図６（ｂ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と他のタンパク質ＲＳＫ３との間で構造的類似を示す部位のアミノ酸配列を比較して示した図である。
図７は、マウス由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列を示す図である。
図８は、免疫沈降−ウエスタンブロット法により、上記タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認した実験結果を示す図である。  図９（ａ）および図９（ｂ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８および他のタンパク質ＲＳＫ３のリン酸化機能を調べた実験結果を示す図である。
図１０は、ヒトの各組織における上記タンパク質ＲＰＫ１１８の発現を調べたノーザンブロッティングの実験結果を示す図である。
図１１（ａ）〜（ｌ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８およびスフィンゴシン・キナーゼ１を共発現したＣＯＳ７細胞などで、その共局在および局在箇所を調べた実験結果を示す図である。
図１２は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と種々のリン脂質との結合性を調べた実験結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
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【図１０】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１１（ｃ）】
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【図１１（ｄ）】
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【図１１（ｅ）】
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【図１１（ｆ）】
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【図１１（ｇ）】
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【図１１（ｈ）】
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【図１１（ｉ）】
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【図１１（ｊ）】
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【図１１（ｋ）】
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【図１１（ｌ）】
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【図１２】
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