(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼにＯｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−８）、Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−９）、Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−１０）よりなる群から選ばれたいずれかのＮ−メチルグルカミド系界面活性剤を１種類以上配合せしめることを特徴とするリパーゼの安定化方法。
【請求項２】
リパーゼにＯｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−８）、Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−９）、Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ（略号：ＭＥＧＡ−１０）よりなる群から選ばれたいずれかのＮ−メチルグルカミド系界面活性剤を１種類以上配合されてなることを特徴とするリパーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リパーゼの安定化方法および特に試薬組成中においても安定化されたリパーゼ組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
産業上、リパーゼほどその機能が多岐方面で有用視されている酵素はないと考えられる。その利用分野は、例えば、光学分割等の化学合成プロセスへの適用用途、油脂加工、洗剤等の工業用途、医薬品用途、および診断薬用途などが挙げられるが、詳細に見れば更に多様な展開がなされている酵素である。
【０００３】
診断薬用途においては、リパーゼは動脈硬化症や高カイロミクロン血症などの指標となる中性脂肪（トリグリセライド）の測定用酵素として広く利用されている。元来、血液中のトリグリセライド測定法の流れは、アルカリ鹸化による化学的加水分解法を経てグリセロールを生じ、さらに酸化、比色反応を経由するクロモトロープ酸法やアセチルアセトン法に代表される化学的な測定法から、簡便性、精度、正確性においてすぐれた特性を有するリパーゼを用いた酵素法が広く普及してきている。
【０００４】
リパーゼを用いるトリグリセライド測定法には多くの報告があるが、リパーゼにより生成したグリセロールを更にグリセロールデヒドロゲナーゼまたはグリセロール  ３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた紫外部測定系とグリセロール  ３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いた可視部測定系に大別される。現在は後者が主流となっている。
診断薬用途のリパーゼに求められる品質としては、血清、血漿トリグリセイドに対する作用性は言うまでもなく、最近の液状試薬の流れの中で、以前にも増して酵素の安定性に対する要求が高くなっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
診断薬用途のリパーゼについては、市場に既に数種類が流通されており、その反応性や安定性等の品質面も一定水準以上にある。またリパーゼの安定性は緩衝液、防腐剤、界面活性剤、添加剤等の組成に依存することが大きい。従来知られている安定化剤であるグリセロール、グリシン（Methods  Enzymol.129,691(1986)）、メルカプトエタノール（J.Biol.Chem.,247,6212(1972)）、トリトンＸ−１００（Enzyme  Handbook,3,  Springer-Verlag,  Berlin  Heiderberg(1991)）、トリトンＮ−１０１、デオキシコール酸（Methods  Enzymol.129,716(1986)）、Ｍｇ2+、ＢＳＡ（東洋紡績（株）酵素カタログ）、塩類（特開平１−６０３８１号公報）等では試薬組成中では求められる安定性を維持するのに十分な性能を有していなかった。また診断薬用途におけるリパーゼの使用に際しては、界面活性剤の使用が器材やラインへの吸着回避、妨害物質の影響回避のために必須であるが、上記化合物を添加しても十分な安定性を保つことができないことが多かった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、リパーゼに特定種類の界面活性剤を配合することによりリパーゼの安定化の実現が可能であることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）リパーゼにＮ−メチルグルカミド系界面活性剤、グルコシド系界面活性剤、エマルゲン４３０、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７００及びＣＨＡＰＳよりなる群から選ばれる界面活性剤を１種類以上配合せしめることを特徴とするリパーゼの安定化方法。
（２）Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤がＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０よりなる群から選ばれたいずれかである（１）の安定化方法。
（３）グルコシド系界面活性剤がオクチル−β−グルコシド、オクチル−β−チオグルコシドよりなる群から選ばれたいずれかである（１）の安定化方法。
（４）リパーゼにＮ−メチルグルカミド系界面活性剤、グルコシド系界面活性剤、エマルゲン４３０、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７００及びＣＨＡＰＳよりなる群から選ばれる界面活性剤を１種類以上配合されてなることを特徴とするリパーゼ組成物。
（５）Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤がＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０よりなる群から選ばれたいずれかである（４）のリパーゼ組成物。
（６）グルコシド系界面活性剤がオクチル−β−グルコシド、オクチル−β−チオグルコシドよりなる群から選ばれたいずれかである（４）のリパーゼ組成物。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施態様として、リパーゼを含む緩衝液中に、Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤、グルコシド系界面活性剤、エマルゲン４３０、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９００及びＣＨＡＰＳの群から選ばれる界面活性剤を１種類以上配合せしめることによるリパーゼの安定化方法がある。
【０００８】
従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によって変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。いずれも高価ではあるが、液状診断薬には有用である。該緩衝液のｐＨは、５．０〜９．０の範囲で使用目的に応じて調整される。
【０００９】
本発明において用いられるリパーゼとは、ＥＣ３．１．１．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
トリグリセリド＋Ｈ2Ｏ→ジグリセリド（モノグリセリド）＋脂肪酸
本発明において、上記酵素は、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヒューミコラ（Humicola）属、ノイロスポラ（Neurospora）属、リゾプス（Rhizopus）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。
【００１０】
また、本発明のリパーゼには、ＥＣ、３．１．１．３４に分類される以下の反応を触媒する酵素も含まれる。
トリグリセライド＋Ｈ2Ｏ→モノグリセリド（又はジグリセリド）＋脂肪酸
本発明において、上記酵素は、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属，リゾプス（Rhizopus）属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。
リパーゼを含む緩衝液中のリパーゼの濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常約０．１〜２０Ｕ／ｍｌの範囲で好適に用いられる。
【００１１】
本発明において用いられる界面活性剤としては、例えば、Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤、グルコシド系界面活性剤、エマルゲン４３０（Polyoxyethylene；花王製）、Ｂｒｉｊ９８（Polyoxyethylene(20) oleylether；シグマ製）、Ｂｒｉｊ７００Polyoxyethylene(100) stearylether；シグマ製）及びＣＨＡＰＳ（3-[(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propane sulfonate；ロシュ製）が挙げられる。
Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤としては、ＭＥＧＡ−７（Heptanoyl-N-  methylglucamide）、ＭＥＧＡ−８（Octanoyl−N-methylglucamide）、ＭＥＧＡ−９（Nonanoyl-N-methylglucamide）、ＭＥＧＡ−１０（Decanoyl-N-methylglucamide）等が挙げられる。なかでも、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０が好ましい。
グルコシド系界面活性剤としては、オクチル−β−グルコシド、オクチル  α−グルコシド、オクチル−β−チオグルコシド、オクチル  β−チオガラクトシド等が挙げられる。なかでも、オクチル−β−グルコシド、オクチル−β−チオグルコシドが好ましい。
【００１２】
リパーゼを含む緩衝液のの濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは０．００５％以上、特に好ましくは０．０１〜０．３％の範囲で使用される。  本発明において、リパーゼ溶液には、さらに防腐剤、他の界面活性化剤などをリパーゼの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。
防腐剤としては、アジ化ナトリウム、キレート剤、抗生物質、防菌剤、防黴剤などが挙げられる。界面活性化剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性化剤などが挙げられる。また、該緩衝液中にはトリグリセライド測定に必要な他の試薬が含まれていても良い。
【００１３】
トリグリセライド測定試薬としては、一般にリパーゼの他、グリセロール測定試薬が含有される。グリセロール測定試薬としては、紫外部測定試薬と可視部測定試薬が含有される。
紫外部測定試薬としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）+が含有されるが、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ，グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬の方が正確性が高い。
可視部測定試薬としては、グリセロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体が含有されるが、グリセロールオキシダーゼ、ＡＴＰ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体を含有する試薬の方が正確性が高い。
【００１４】
本発明における上記安定剤を含むリパーゼ組成物は、安価に、しかも他の組成物に悪影響を与えることなく、良好に活性保持ができる。また、いずれの起源のリパーゼにも応用可能である。
【００１５】
リパーゼ活性の測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
＜試薬＞
Ａ．オリーブ油エマルジョン液
Ｂ．発色試薬
５％トリトンＸ−１００溶液  ４．０ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン  ０．０４ｍｌ、アミノアンチピリン  ４ｍｇ、ＡＴＰ  ２４．２ｍｇ、塩化マグネシウム  ４０，７ｍｇ、グリセロールキナーゼ  ２００単位、Ｌ−αーグリセロリン酸オキシダーゼ  ５００単位、ペルオキシダーゼ  ３００単位を５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）２００ｍｌに溶解する。
＜測定条件＞
（１）オリーブ油エマルジョン液２ｍｌを試験管に採り、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．２ｍｌを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１５分間反応させた後、０．２Ｍ  ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止する。
（４）生成する不溶物を濾紙濾過で除く。
（５）濾液の０．０５ｍｌを試験管に採り、発色試薬３．０ｍｌを加えて混合した後、３７℃にて１５分間加温し、５４５ｎｍにおける吸光度を測定する。
（６）盲検はオリーブ油エマルジョン液２．０ｍｌを３７℃で１５分間放置後、ＴＣＡ溶液２．０ｍｌを加えて調製し、以下上記同様に操作して吸光度を測定する。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１）
シュードモナス属由来のリパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１１）１Ｕ／ｍｌを０．１ｍＭ  塩化カルシウムを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液に添加し、各種界面活性剤を０．０５％添加後、４０℃で７日間保温し、活性残存率（すなわち、溶解直後の活性値に対する活性値の割合）を調べた。緩衝液中での活性残存率（すなわち、安定性）を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0004427696.tif 000002
【００１９】
一般的に使用される界面活性剤トリトンＸ−１００を共存させることにより安定性は低下した。他の界面活性剤（ＭＥＧＡ−８）も同様であった。一方、ＭＥＧＡ−８（物質名：Octanoyl-N-methylglucamide）はリパーゼを安定化させる効果があり、無添加時より活性残存率は高かった。また該界面活性剤を用いた時のリパーゼの反応性も良好であった。
【００２０】
（実施例２）
シュードモナス属由来のリパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１１）１Ｕ／ｍｌを０．１ｍＭ  塩化カルシウムを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液に添加し、Ｎ−メチルグルカミド系界面活性剤、グルコシド系界面活性剤、その他配糖体系界面活性剤を０．０５％添加後、４０℃で７日間保温し、活性残存率（すなわち、溶解直後の活性値に対する活性値の割合）を調べた。緩衝液中での活性残存率（すなわち、安定性）を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２に示されるようにＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９（Nonanoyl-N-methylglucamide）、ＭＥＧＡ−１０（Decanoyl-N-methylglucamide）のＮ−メチルグルカミド類、オクチル−βーグルコシド、オクチル−βーチオグルコシドのグルコシド類で安定化効果が認められた。 また、以上の界面活性剤を用いた時のリパーゼの反応性も良好であった。
【００２３】
（実施例３）
シュードモナス属由来のリパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１１）１Ｕ／ｍｌを０．１ｍＭ  塩化カルシウムを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液に添加し、実施例１、２以外の界面活性剤を０．０５％添加後、４０℃で７日間保温し、活性残存率（すなわち、溶解直後の活性値に対する活性値の割合）を調べた。緩衝液中での活性残存率（すなわち、安定性）を表３に示す。
【００２４】
【表３】
0004427696.tif 000004
【００２５】
上記において検討した界面活性剤の全てにおいて安定化効果が認められた。しかしながら、リパーゼの反応性に対してはコール酸ナトリウムを除いて効果がなかった。コール酸ナトリウムを組み合わせて添加することによって、反応性は回復した。
【００２６】
【発明の効果】
上述したように、本発明においては、リパーゼを含む組成物中に特定種類の界面活性剤を共存せしめることより、従来よりはるかに安定な組成物が得られる。