(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とすることを特徴とする敏感肌の評価方法。
【請求項２】
毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とすることを特徴とする敏感肌の評価方法。
【請求項３】
角質細胞を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の敏感肌の評価方法。
【請求項４】
被験者の評価対象部位の角質細胞を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌を有する人の前記評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の敏感肌の評価方法。
【請求項５】
角質細胞を採取するための採取手段と、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことを特徴とする敏感肌の評価キット。
【請求項６】
角質細胞を採取するための採取手段と、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことを特徴とする敏感肌の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敏感肌かどうかを簡便かつ確実に評価することができる生化学的指標を用いた新規な敏感肌の評価方法及びその評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
敏感肌とは、明らかな皮膚病変なしに不利、有害な反応が起こりやすい肌として捉えられている。または、敏感肌は、健常肌より外界刺激に対する抵抗性が低く、容易に皮膚トラブルを生ずる肌とも言える。近年、敏感肌を意識する女性が増加する傾向にあり、化粧品等についてもより刺激の少ないものが要望されるようになってきている。また、化粧品によるスキンケア、ケミカルピーリングの施術等を実施するに際し、美容専門家が問診等を通じて、ユーザーの肌が敏感肌であるかどうかを評価し、その結果に応じて、ユーザーの肌に合った化粧品、ケミカルピーリング剤等が用いられている。
【０００３】
従来は、このように美容専門家による問診が必要とされたが、問診によらずとも、ユーザーの肌が敏感肌であるかどうかを評価することができれば、ユーザーの肌により適した化粧品やケミカルピーリング剤を簡単に選択することができ、それによって、皮膚の炎症等の肌トラブルや副作用を回避し、化粧品によるスキンケアやケミカルピーリングの施術等の有益性をより高めることができる。このため、問診によらずとも、敏感肌であるかどうかを客観的に判別する方法が求められている。
【０００４】
なお、ユーザーに負担を与えるため、敏感肌の評価という美容目的に、非特許文献１に開示されているような外科的に皮膚を摘出する方法を含ませることは適当ではない。
【０００５】
特許文献１には、マーカー遺伝子としてカルプロテクチンを用いて、皮膚へのＵＶ照射傷害を評価する方法が開示されている。しかし、この方法は、ＵＶ照射傷害に関するものであり、敏感肌の評価方法ではない。また、この方法では評価にＵＶ照射が必要であるため、簡便な方法とは言えない。
【０００６】
敏感肌であるかどうかを評価するための方法として、特許文献２に、顔の角質細胞と、体表に於ける露出回数の少ない部位の角質細胞とを採取し、これらの大きさの比を指標とし、肌質を鑑別する方法が開示されている。また、特許文献３には、年齢に対する標準角質細胞面積と被験者より採取した角質細胞の平均細胞面積との差を指標とする、肌の鑑別法が開示されている。しかし、これらの方法は大きさ・面積等の外観を評価するものであり、評価方法、定量化方法、各披験者の個体差に起因した誤差が発生する等の問題があった。
【特許文献１】ＷＯ０２／０９０９３４０号公報
【特許文献２】特開２００１−１０８６７４号公報
【特許文献３】特開平１１−３０４７９８号公報
【非特許文献１】M.Grewe, J Invest Delmatol 2000, vol 114, pp1108-1112
【非特許文献２】Eckert RT et al., J Invest Dermatol 2004, vol.123, pp23-33.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、敏感肌であるかどうかを客観的に評価する方法が望まれている。その評価方法は、外科的に皮膚を摘出する、皮膚に刺激を与える等のユーザーに負担を与える方法ではないことが必要である。また、外観を評価するものではなく、生化学的指標を用いた評価方法が望ましい。そこで本発明は、ユーザーに負担を与えることなく、敏感肌かどうかを簡便かつ確実に評価することができる生化学的指標を用いた新規な敏感肌の評価方法及びその評価キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、テープストリッピングといった角層の表層部分のみを１枚の角質テープで採取する簡単な方法で獲得した角質細胞において、敏感肌由来の角質細胞のカルプロテクチンの存在量は、健常肌由来のそれに比べて有意に高いことを見出した。カルプロテクチンの存在量は、紫外線や化学物質等の刺激を皮膚へ与えることなく獲得した角質細胞から評価できる。このことより、カルプロテクチンを指標として簡便に敏感肌を評価するという本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００９】
本発明の請求項１記載の敏感肌の評価方法は、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２記載の敏感肌の評価方法は、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とすることを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項３記載の敏感肌の評価方法は、請求項１又は２記載の敏感肌の評価方法であって、角質細胞を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項４記載の敏感肌の評価方法は、被験者の評価対象部位の角質細胞を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌を有する人の前記評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項５記載の敏感肌の評価キットは、角質細胞を採取するための採取手段と、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項６記載の敏感肌の評価キットは、角質細胞を採取するための採取手段と、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の請求項１記載の敏感肌の評価方法によれば、敏感肌は、健常肌にくらべて角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量が有意に高いため、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標として、簡便に肌が敏感肌であるかどうかを評価できる。
【００１６】
本発明の請求項２記載の敏感肌の評価方法によれば、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量として、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定することで、より確実に敏感肌の評価ができる。
【００１７】
本発明の請求項３記載の敏感肌の評価方法によれば、請求項１又は２記載の敏感肌の評価方法において、健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を基準として、採取した角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を評価することにより、より正確に敏感肌の評価ができる。
【００１８】
本発明の請求項４記載の敏感肌の評価方法によれば、請求項１又は２記載の敏感肌の評価方法において、健常肌を有する人の同一評価対象部位から採取した角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を基準として、被験者の評価対象部位から採取した角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を評価することにより、より正確に敏感肌の評価ができる。
【００１９】
本発明の請求項５記載の敏感肌の評価キットによれば、角質細胞を採取するための採取手段と、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことにより、簡便に敏感肌の評価をできる敏感肌の評価キットを提供することができる。
【００２０】
本発明の請求項６記載の敏感肌の評価キットによれば、角質細胞を採取するための採取手段と、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段と、を備えたことにより、簡便に敏感肌の評価をできる敏感肌の評価キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明の敏感肌の評価方法は、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を指標とすることを特徴とする。
【００２３】
カルプロテクチン（Ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ）とは一連のカルシウム応答性タンパク質として知られるＳ１００タンパク質Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が一分子ずつ対をなして生成するヘテロダイマーであり、シグナル伝達のメディエーターである。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９はいずれも好中球・単球に多く存在することが知られ、血管内皮細胞などに結合して炎症作用へ関与することがよく研究されている。血漿中のカルプロテクチン及びＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９は急性または恒常性炎症のマーカーとしても用いられている。一方、正常皮膚ではいずれの分子も毛包上皮や顆粒層で若干発現が認められるものの、一般に発現量は少ないとされている。しかしながら、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は乾癬などの病態や、光線曝露やバリア破壊などの外界刺激により表皮中における発現が亢進することもよく知られている。アクチビンA高発現マウスは過増殖が特徴であるが炎症は認められないことから、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９またはその両方が炎症以外に増殖反応に関与することが示唆されている（非特許文献２）。
【００２４】
本発明における敏感肌とは、明らかな皮膚病変なしに不利、有害な反応が起こりやすい肌である。また、健常肌より外界刺激に対する抵抗性が低く、容易に皮膚トラブルを生ずる肌とも言える。一方、健常肌とは、上記のような敏感肌の性質を示さない健康で正常な肌である。敏感肌においては、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が高くなる、高周波伝導度（角層水分量）が低くなる等の傾向があることが知られている。また、敏感肌では、かぶれや肌荒れが起こる場合がある。
【００２５】
肌荒れとは広義における肌の劣化した状態を意味し、掻痒による掻破やアトピー性皮膚炎の悪化劣化の結果引き起こされる肌荒れ、乾燥による肌荒れ等が挙げられる。したがって、本発明でいう敏感肌と肌荒れは異なるものである。
【００２６】
本発明において角質細胞とは、皮膚の一番上にある角質を構成している細胞である。角質細胞は、体の外からの異物や刺激から皮膚を守る働きを有する。
【００２７】
本発明における評価対象部位は、角質細胞が入手できる部分であれば、いかなる部位をも包含しうるが、主な部位としては顔面の頬、額を挙げることができる。従来の方法に従い、これらの部位の皮膚由来の角質細胞を得ることができる。しかし、前述のように、外科的に皮膚を摘出する等の方法は、ユーザーに負担を与えるため、例えば、テープストリッピング、擦過等の簡便に角質細胞を得られる方法が好ましい。
【００２８】
こうして用意した各試料におけるカルプロテクチンの存在量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、カルプロテクチンに対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。
【００２９】
各試料からカルプロテクチンをそれ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法等を介して可溶性画分を調製する抽出方法によってカルプロテクチンを抽出した後に、測定するのが好ましい。
【００３０】
敏感肌は、健常肌にくらべて角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量が有意に高いため、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標として、簡便に肌が敏感肌であるかどうかを評価できる。本発明に用いる角質細胞は、テープストリッピングといった角層の表層部分のみを１枚の角質テープで採取する簡単な方法で採取することができる。また、本発明は、皮膚に紫外線や化学物質等の刺激を与えることなくカルプロテクチンの存在量を測定できる。このため、ユーザーに負担を与えることなく、ユーザーの肌が敏感肌であるかどうかを評価することができるため、ユーザーの肌により適した化粧品やケミカルピーリング剤を簡単に選択することができ、それによって、皮膚の炎症等の肌トラブルや副作用を回避し、化粧品によるスキンケアやケミカルピーリングの施術等の有益性をより高めることができる。
【００３１】
また、本発明の敏感肌の評価方法は、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とする。健常肌由来の角質細胞では、毛穴部近傍以外の角質細胞においてカルプロテクチンをほとんど検出できないのに対して、敏感肌由来の角質細胞では、毛穴部近傍以外の角質細胞においてもカルプロテクチンが検出できる。例えば、カルプロテクチンを認識するカルプロテクチン抗体と、カルプロテクチン抗体を認識する蛍光性色素で標識された二次抗体カルプロテクチンとを、角質細胞と反応させ、これを蛍光顕微鏡で観察することで、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在を視覚的に確認し、それを指標とすることで、より確実に敏感肌の評価ができる。
【００３２】
本発明の敏感肌の評価方法は、角質細胞を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する比較工程と、を備えるものである。以下にこの評価方法について説明する。
【００３３】
まず、上記のようにして測定されたカルプロテクチンの存在量を健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較する。また、被験者のある評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定し、測定されたカルプロテクチンの存在量を、健常肌を有する人の同一評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量と比較してもよい。健常肌を有する人の角質細胞のカルプロテクチンの存在量は、複数人の健常肌を有する人からのデータの平均値を使用することによって、より客観的な評価ができる。
【００３４】
このように比較した結果、測定されたカルプロテクチンの存在量が、健常肌のカルプロテクチンの存在量より有意に大きい場合には、敏感肌を有すると評価する。この健常肌は、カルプロテクチンを測定する者から採取してもよく、カルプロテクチンを測定する者と異なる者から採取してもよい。
【００３５】
また、被験者のある評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量が、健常肌を有する人の同一評価対象部位の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量より有意に大きい場合にも、敏感肌を有すると評価する。
【００３６】
敏感肌を有すると評価する場合、測定されるカルプロテクチンの存在量の程度により、敏感肌の程度を評価できる。すなわち、測定されるカルプロテクチンの存在量が健常肌のそれと比較して著しく多い場合は、その肌は、敏感肌の性質を強く示し、健常肌より外界刺激に対する抵抗性が顕著に低く、きわめて容易に皮膚トラブルを生ずる敏感肌であると評価できる。また、測定されるカルプロテクチンの存在量が健常肌のそれと比較して少量だけ増加している場合は、その肌は、健常肌より外界刺激に対する抵抗性が低く皮膚トラブルを生ずるという敏感肌であるものの、その性質を強く示さないと評価できる。
【００３７】
本発明の敏感肌の評価キットは、角質細胞を採取するための採取手段と、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段とを備える。角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段の代わりに、毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するように測定手段を構成してもよい。角質細胞を採取するための採取手段は、角質細胞を採取できる手段であれば特に限定されない。例えば、上記のように角質テープ等を、角質細胞を採取するための採取手段としてもよい。この手段を実施するために、キットに、例えば角質テープを含ませることができる。角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段としては、カルプロテクチンの存在量を測定できる手段であれば特に限定されない。例えば、上記のようにカルプロテクチンに対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイを行うための試薬や器具を、カルプロテクチンの存在量を測定するための測定手段としてもよい。この手段を実施するために、キットに、例えばカルプロテクチンを認識するカルプロテクチン抗体と、カルプロテクチン抗体を認識する標識された二次抗体とを測定手段として含ませることができる。さらに、本発明の敏感肌の評価キットには、上記手段の実施を容易にする、試薬類（例えば、緩衝剤等）や器具（マイクロタイタープレート、ピペット等）を含めることができる。
【００３８】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
（実験１）経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）測定
本人が敏感肌と感じる被験者（１０名）および健常者（９名）に洗顔を行ってもらい、その３０分後に経皮蒸散水分量（ＴＥＷＬ）をＣｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａ社製テバメーター（ＴＭ２１０）で測定した。敏感肌を有すると自己申告した被験者（１０名）を敏感肌群、健常肌を有すると自己申告した健常者（９名）を健常肌群とした。
【００４０】
（実験２）角質細胞中のカルプロテクチン定量
実験１の測定後、被験者及び健常者から角質テープにより角質細胞を採取した。角質細胞を採取した角質テープ（２５×４５ｍｍ）を２ｍｍ角程度に細切してＰＢＳ７５０μL中に分散させ、氷冷下超音波破砕後４℃にて遠心して得られた上清を定量用のサンプルとした。ＰＲＯＴＥＩＮ Ａｓｓａｙ,Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により検定した総タンパク質濃度は６９３±３７ｎｇ／ｍL程度であった。この溶液１００μLについてＭＲＰ８／１４ＥＩＡ（Ｂuｈｌｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ製）を用いて、マニュアルに従い定量を行った。
【００４１】
（実験１）及び（実験２）の結果
実験２で得たカルプロテクチン量を敏感肌群と健常肌群で比較した。図１は、敏感肌及び健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を示した図である。敏感肌群で有意に顔面角質細胞のカルプロテクチン量が高いことが明らかになった。
【００４２】
さらに、実験１で得たＴＥＷＬを敏感肌群と健常肌群で比較した。敏感肌群で有意に顔面角質細胞のＴＥＷＬが多かった（図２の表）。前述のように、敏感肌では、皮膚バリア機能の指標として測定するＴＥＷＬが増加する傾向があることが知られており、図２の結果はそれに合致する。被験者及び健常者から得られたＴＥＷＬとカルプロテクチン量の相関を調べたところ、比較的よい相関が得られた（図２のグラフ）。
【００４３】
以上のことより、敏感肌由来の角質細胞中のカルプロテクチンの存在量は、健常肌のそれに比べて有意に高く、カルプロテクチンと敏感肌を関連付けることができることが明らかになった。
【実施例２】
【００４４】
（実験３）角質細胞中のカルプロテクチン免疫染色
洗顔の１５分後、医療用アロンアルファＡ（三共製薬）をシランコートスライド上に少量（約直径３ｍｍ程度）出して、直ちに対象の評価部位に軽く接着させ３分間保持したのち、ゆっくりと剥がして角質細胞を採取した。これをエタノール２分、洗浄（ＰＢＳ溶液に３分）、３％ＰＦＡ含有ＰＢＳ溶液１０分、洗浄（ＰＢＳ溶液に５〜１０分を３回繰返し）、０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ溶液１０分、洗浄（ＰＢＳ溶液に５〜１０分を３回繰返し）、１０％ヤギ血清（ニチレイ）で１時間ブロッキングした後、マウス抗ヒトＭＲＰ８／１４モノクローナル抗体Ｔ−１０２３（ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＡＧ）１μg/ｍＬのＰＢＳ希釈液を４℃で一晩反応させた。洗浄（ＰＢＳ溶液に５〜１０分を３回繰返し）後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体の２００倍希釈ＰＢＳ溶液を１時間反応させた。
【００４５】
（実験３）の結果
顕微鏡の写真を表したのが図３である。上段は、敏感肌の角質細胞の同一部位を蛍光顕微鏡（上段左）及び光学顕微鏡（上段右）で観察した結果の写真である。下段は、健常肌の角質細胞の同一部位を蛍光顕微鏡（下段左）及び光学顕微鏡（下段右）で観察した結果の写真である。カルプロテクチンが存在している箇所では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体により蛍光を発する。カルプロテクチンが存在している代表的な部位を矢印で示した（毛穴部近傍、毛穴部近傍以外の角質細胞）。
【００４６】
蛍光顕微鏡の写真を比較すると、毛穴部近傍では、健常肌でも敏感肌でもカルプロテクチンが存在することが確認できた。一方、毛穴部近傍以外の角質細胞では、敏感肌のみでカルプロテクチンが認められた。角質テープでは毛穴の深部の蛋白質までは採取しにくいことを考えると、角質テープにより採取・検出されたカルプロテクチンは毛穴部近傍以外に存在するものであると考えられ、すなわち、敏感肌群では毛穴部近傍以外の角質細胞におけるカルプロテクチン量が亢進していると推定された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】敏感肌及び健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量を示した図である。グラフの点は、それぞれ被験者及び健常者のカルプロテクチンの存在量を示す。
【図２】敏感肌及び健常肌の角質細胞におけるＴＥＷＬの群間比較の結果と、敏感肌及び健常肌の角質細胞におけるカルプロテクチン量とＴＥＷＬの相関を示した図である。
【図３】敏感肌及び健常肌の角質細胞の顕微鏡写真を示した図である。上段は、敏感肌の角質細胞の同一部位を蛍光顕微鏡（上段左）及び光学顕微鏡（上段右）で観察した結果の写真である。下段は、健常肌の角質細胞の同一部位を蛍光顕微鏡（下段左）及び光学顕微鏡（下段右）で観察した結果の写真である。カルプロテクチンが存在している代表的な部位を矢印で示した（毛穴部近傍、毛穴部近傍以外の角質細胞）。
【図１】
0004469762.tif 000002
【図２】
0004469762.tif 000003
【図３】
0004469762.tif 000004