(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）からなるコア、（２）ポロキサマー(poloxamer)からなる前記コアの外部に位置する水和ゲル膜、及び（３）前記コア及び前記水和ゲル膜に物理的に固定されているヘパリンを含む、ナノ粒子、及び
（Ｂ）前記ヘパリンとナノ粒子の表面で特異的結合されている、成長因子、ケモカイン、細胞外基質蛋白質及びアンチトロンビンIIIの中から選択された一つ以上の蛋白質薬物
を含む徐放型薬物伝達製剤。
【請求項２】
前記生分解性高分子は、重量平均分子量が５，０００〜１００，０００であることを特徴とする請求項１に記載の徐放型薬物伝達製剤。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、直径が４００ｎｍ以下であり、表面電荷が−４０ｍＶ以下であり、多分散指数が０．１未満であることを特徴とする請求項２に記載の徐放型薬物伝達製剤。
【請求項４】
（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を、ジメチルスルホキシド、テトラグリコール、乳酸エチル及びエタノールの中から選択された有機溶媒に溶解して有機溶液を得る段階、
（２）ヘパリン及びポロキサマー(poloxamer)とを水に溶かして水溶液を得る段階、
（３）前記有機溶液を前記水溶液に添加して分散させる段階
を含む工程で水和ゲル膜を有するナノ粒子を製造し、
（４）前記ナノ粒子をＰＢＳ溶液に再分散させた後、成長因子、ケモカイン、細胞外基質蛋白質及びアンチトロンビンIIIの中から選択された一つ以上の蛋白質薬物を充填させる段階
を含むことを特徴とする徐放型薬物伝達製剤の製造方法。
【請求項５】
前記生分解性高分子は、重量平均分子量が５，０００〜１００，０００であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、直径が４００ｎｍ以下であり、表面電荷が−４０ｍＶ以下であり、多分散指数が０．１未満であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性高分子、生体適合性高分子乳化剤及び多糖類を含み、内部のコア、及び多糖類が物理的に固定されている外部の水和ゲル膜からなっているナノ粒子とこれを用いた徐放型薬物伝達システム（薬物伝達製剤）及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子、ホルモンのような治療用蛋白質やペプチドなどは、生体内で半減期が非常に短く、親水−疎水界面上で容易に変性するので、疎水性の合成薬物に比較して徐放型伝達システムの開発が非常に難しい。このような理由から、去る１０余年間蛋白質伝達用マイクロ粒子またはナノ粒子の開発研究において追求してきた核心技術は、活性の低下なしに粒子に蛋白質薬物を充填することに帰着した。最近登録された特許文献１及び特許文献２を見ても、未だ既存の活性低下問題を解決しておらず、活性低下の最小化のために新しく開発される高分子はそれらの安定性確保のために多くの時間が必要であることが分かる。
また、特許文献３では、生体適合性高分子であるポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（以下、「ＰＬＧＡ」という）を超低温冷媒に噴射してマイクロ粒子を製造する方法を用いて蛋白質伝達用マイクロ粒子を製造した。ところが、この工程は、エマルジョン蒸発(emulsion evaporation)工程が不要なので、薬物の活性低下は多少減少するが、ＰＬＧＡ及びＰＬＧＡを溶解するために使用される有機溶媒の疎水性により蛋白質薬物の活性低下が生ずるという問題点が発生した。
【０００３】
また、特許文献１では、生体適合な親水性高分子であるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」という）をプラスミノゲンアクチベータ(plasminogen activators)と混合して超低温冷媒に噴射する方式でナノ粒子を製造しており、この場合も、親水性高分子の使用により蛋白質の活性低下が多少見られたが、ナノ粒子製造の際に使用される架橋剤によって蛋白質の安定性に深刻な問題が引き起こされた。
また、特許文献２では、ＰＬＧＡ高分子に、蛋白質とイオン結合を行うことが可能な機能基を導入した後、蛋白質薬物−ナノ粒子複合体を製造して蛋白質薬物を充填したが、この場合も、高分子−蛋白質薬物の複合体形成の際に蛋白質の変形が引き起こされ、ＰＬＧＡ高分子の変形によって使用される高分子の安定性がさらに要求されるという問題点があった。
一方、水和ゲル膜による蛋白質薬物の徐放出システムは、殆どの場合、対象物質が水和ゲル内で拡散によって放出される方法を用いるが、このような拡散を用いた方法は、一般に長い放出時間が得られず、初期バースト(initial burst)が非常に大きく現われるという問題点がある。
【特許文献１】米国特許第６，５８６，０１１号公報
【特許文献２】米国特許第６，６１６，９４４号公報
【特許文献３】米国特許第５，０１９，４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、従来のかかる技術的問題点を解決するために鋭意研究した結果、生分解性高分子、生体適合性高分子乳化剤及び多糖類を含み、内部のコア、及び外部の水和ゲル膜からなっているナノ粒子であって、多糖類の一部が水和ゲル膜に物理的に固定されている多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子と、これを含む徐放型薬物伝達システムが、蛋白質薬物の安定化に非常に効果的であるうえ、初期バーストを大きく減少させて蛋白質薬物の徐放出にも大きく寄与することを確認することにより、本発明の完成に至った。
そこで、本発明の目的は、蛋白質薬物の安定性及び徐放出の効果に優れ、特に薬物の初期バーストを大幅に減らすことが可能な、多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、このようなナノ粒子及び有効量の薬物を含む徐放出薬物伝達システムを提供することにある。
また、本発明の別の目的は、このようなナノ粒子及びこれを用いる徐放出薬物伝達システムを製造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明及び図面によってさらに明確に説明される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一様態によれば、（１）生分解性高分子からなるコア、（２）生体適合性高分子乳化剤からなる外部の水和ゲル膜、及び（３）前記コア及び水和ゲル膜に物理的に固定されている多糖類を含む、多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子を提供する。
さらに具体的な一様態によれば、（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）及びポリ（ヒドロキシバレレート）の中から選択された一つ以上の生分解性高分子からなるコア、（２）ポロキサマー(poloxamer)、ポロキサミン(poloxamine)、ポリビニルアルコールまたはアルキルアルコールのポリエチレングリコールエーテルの中から選択された一つ以上の生体適合性高分子乳化剤からなる水和ゲル膜、（３）前記コア及び前記水和ゲル膜と物理的に固定されているヘパリン、アルジネート、ヒアルロン酸、キトサンから選択された一つ以上の多糖類を含むナノ粒子であって、内部のコア及び前記多糖類が固定されている外部の水和ゲル膜からなっていることを特徴とする多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子を提供する。
本発明において、「生分解性高分子」は、ｐＨ６〜８の生理溶液(physiological solution)に露出されたときに分解できる高分子を意味し、望ましくは、生体内で体液または微生物などによって分解できる高分子を意味する。
【０００６】
本発明で使用可能な生分解性高分子の代表的な例には、下記化学式１のＰＬＧＡ、ポリ乳酸（以下、「ＰＬＡ」という）、ポリグリコール酸（以下、「ＰＧＡ」という）、ポリ（カプロラクトン）（以下、「ＰＣＬ」という）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）（以下、「ＰＨＢ」という）、ポリ（ヒドロキシバレレート）またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されず、特に多糖類が添加された生体適合性高分子乳化剤水溶液に添加され、多糖類で機能化されたナノ粒子を製造するに充分であれば、例示した高分子に限定されない。中でも、生分解性高分子として、生体内毒性のないものと米国ＦＤＡから承認されたＰＬＧＡを使用するのが望ましい。
生分解性高分子の分子量が５，０００未満であれば、ナノ粒子の形成の際に分子自体の凝集が難しく収率が減少し、粒子内に多糖類が不安定に固定されるという問題が発生するので、生分解性高分子は、重量平均分子量(average Mw)が５，０００〜１００，０００が望ましく、さらに望ましくは５０，０００〜１００，０００である。
【化１】
0004567569.tif 000002
本発明で使用された「生体適合性高分子」は、生体組織または血液と接触して組織をk壊死させたり血液を凝固させない組織適合性(tissue compatibility)及び血液適合性(blood compatibility)を備えている高分子を意味し、「生体適合性高分子乳化剤」とは、生体適合性を持つと共に、分離された２つ以上の相を混和させる乳化性を持つ高分子を意味する。
【０００７】
本発明で使用可能な生体適合性高分子乳化剤の代表的な例には、ポロキサマー(poloxamer)、ポロキサミン(poloxamine)、ポリビニルアルコール、アルキルアルコールのポリエチレングリコールエーテルまたはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。中でも、生体適合性高分子乳化剤として、生体内毒性のないものと米国ＦＤＡから承認されたポロキサマーを使用するのが望ましい。
本発明において、多糖類は、成長因子またはアンチトロンビンIIIなど多様な蛋白質またはペプチドと相互作用をし、これにより蛋白質の３次元構造を保ち、生物学的活性を増加させ、加水分解を阻害して蛋白質を安定化させる役割をする全ての多糖類が使用できる。
本発明で使用可能な多糖類の代表的な例には、下記化学式２のヘパリン、アルジネート、ヒアルロン酸、キトサンまたはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。中でも、多糖類として、生体内毒性のないものと米国ＦＤＡから承認された、陰イオン性多糖類であるヘパリンを使用するのが望ましい。
【化２】
0004567569.tif 000003
【０００８】
このような本発明に係るナノ粒子は、内部のコア、外部の水和ゲル膜、及びこれに物質的に固定された多糖類を含むが、このような多糖類は、蛋白質薬物と特異的結合をして蛋白質薬物を安定化させ、初期バーストを大幅に減らして徐放出を増進させる。
本発明において、多糖類が水和ゲル膜に「物理的に固定」されているということは、化学反応による化学的結合ではなく、物理的方法によって結合していることを意味し、吸着(adsorption)、凝集(cohesion)、エンタングルメント(entanglement)、エントラップメント(entrapment)などによる非化学的固定を含むが、これらに限定されない。
多糖類が水和ゲル膜内に物理的方法で固定され、且つ別途の化学的反応による変化が発生しないため、その各構成成分が生体適合性を有していれば、本発明に係るナノ粒子及び薬物伝達システムもまた生体適合性を持つという長所がある。
【０００９】
本発明に係るナノ粒子は、最終製品の滅菌過程を滅菌フィルタを用いて簡単に処理できるという側面から、直径４００ｎｍ以下のものが望ましく、ナノ粒子の表面電荷は、水和ゲル膜内蛋白質の効果的な充填を考慮して−４０ｍＶ以下であることが好ましい。また、多分散指数は０．１未満であることが望ましく、これは、一般に、多分散指数が０．１未満の場合、安定的な単分散分布を有するナノ粒子と見なすためである。
本発明の他の様態によれば、（１）本発明のナノ粒子、及び（２）ナノ粒子に含まれている多糖類と特異的結合を行うことが可能な有効量の蛋白質薬物を含む徐放型薬物伝達システムを提供する。
本発明で使用された「特異的結合」は、本発明に係る蛋白質薬物及び多糖類間にのみ特異的結合が行われて生体条件で相対的に安定した状態の複合体を形成することを意味するもので、共有結合または非共有結合を全て含む概念である。特に、蛋白質の３次元構造を保ち、生物学的活性を増加させ、加水分解を阻害して蛋白質を安定化させる多糖類−蛋白質間の相互作用を含む概念である。
【００１０】
本発明で使用される蛋白質薬物は、多糖類と特異的結合が可能な全ての蛋白質及びポリペプチドを含み、特に血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial growth factor、ＶＥＧＦ)、線維芽細胞増殖因子(Fibroblast growth factor、ＦＧＦ)、血小板組織成長因子(platelet-derived growth factor、ＰＤＧＦ)などの成長因子、ケモカイン、細胞外基質蛋白質及びアンチトロンビンIII(Antithrombin III)の中から選択された一つ以上の蛋白質が好ましい。
本発明のまた別の様態によれば、（１）生分解性高分子を低濃度において細胞毒性がない有機溶媒に溶解して有機溶液を得る段階と、（２）多糖類及び生体適合性高分子乳化剤を水に溶かして水溶液を得る段階と、及び（３）有機溶液を水溶液に添加して分散させる段階とを含む、多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の具体的な様態によれば、（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）またはポリ（ヒドロキシバレレート）の中から選択された一つ以上の生分解性高分子を、ジメチルスルホキシド、テトラグリコール、乳酸エチル、エタノールの中から選択された有機溶媒に溶解して有機溶液を得る段階と、（２）ヘパリン、アルジネート、ヒアルロン酸及びキトサンから選択された一つ以上の多糖類及びポロキサマー(poloxamer)、ポロキサミン(poloxamine)、ポリビニルアルコールまたはアルキルアルコールのポリエチレングリコールエーテルの中から選択された一つ以上の生体適合性高分子乳化剤とを水に溶かして水溶液を得る段階と、及び（３）前記有機溶液を前記水溶液に添加する段階を含む、多糖類で機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明において、「低濃度において細胞毒性がない有機溶媒」とは、ナノ粒子内に残留しうる低濃度において細胞毒性がないものと報告された有機溶媒を意味する。望ましくは、１０％（ｗ／ｗ）未満の濃度において細胞毒性がないものと報告されたジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という）またはテトラグリコールが望ましいが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明において、水は、特別な毒性などを示さない生体内適合性を示すものであればいずれも使用可能であり、蒸留水などに限定されない。また、本発明において、有機溶液を水溶液に添加して分散させる方法は、通常用いられる全ての分散方法が使用可能である。
生分解性高分子が溶けている有機溶媒は、以後、多糖類の添加された生体適合性高分子乳化剤が溶解された水溶液に分散して、多糖類で機能化されたナノ粒子を形成させるが、この際、生体適合性高分子乳化剤が溶解された水溶液に添加される多糖類の量は、ナノ粒子の多分散指数(polydispersity)と収得率を考慮して水溶液上の生体適合性高分子乳化剤の質量に対し１０％以下を保つことが好ましい。
【００１３】
また、生体適合性高分子乳化剤水溶液は、粒子の外部に形成される水和ゲル膜の厚さと効率的な粒子形成のための水溶液の粘度を考慮して５％以下の濃度が好ましい。
また、生分解性高分子を含む有機溶液の体積は、使用される生体適合性高分子乳化剤水溶液の体積に対して特別な限定を要するものではないが、ナノ粒子内有機溶媒の残留とこれによる細胞毒性を考慮して水溶液の体積に対し１０％以下にすることが好ましい。
本発明のまた別の様態によれば、本発明によるナノ粒子をＰＢＳ溶液に再分散させた後、蛋白質薬物を充填させる段階を含む、徐放型薬物伝達システムの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
上述した本発明によれば、単分散ナノ粒子の水和ゲル膜内にヘパリンを物理的方法によって固定化する技術を開発した。ヘパリンで機能化されたナノ粒子に充填された蛋白質は活性を保って放出され、ヘパリンとの特異的結合は対象蛋白質薬物の徐放出を誘導した。このような結果は、活性が保たれる蛋白質薬物充填法の開発と持続性蛋白質薬物伝達システムの開発に有用に応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の内容を実施例を通じて具体的に説明する。但し、下記の実施例は本発明の内容を説明するためのものであって、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【００１６】
（実施例）
比較例１：親水化された水和ゲル膜を有するナノ粒子の製造
ＰＬＧＡ４０ｍｇをジメチルスルホキシド２mlに完全に溶解させた後、５％ポロキサマー水溶液３０mlにゆっくり添加してナノ粒子を製造した。ナノ粒子溶液のうち、粒子の生成に参与していないポロキサマーとジメチルスルホキシドは、高速遠心分離の後に上澄み液を分離する方式で除去し、回収されたナノ粒子は、蒸留水あるいはＰＢＳ(phosphate buffered saline、ｐＨ７．４)溶液に再分散させた。
【００１７】
実施例１〜５：ヘパリンで機能化された水和ゲル膜を有するナノ粒子の製造
図１に図式的に示したように、ヘパリンがそれぞれ１０、３０、６０、１２０、２４０ｍｇ含有された５％ポロキサマー水溶液３０mlに、ＰＬＧＡ４０ｍｇが溶解されたジメチルスルホキシド２mlをゆっくり添加してナノ粒子を製造した。ナノ粒子溶液に存在する過量のヘパリン、ポロキサマーとジメチルスルホキシドは、高速遠心分離の後に上澄み液を分離する方式で除去し、回収されたナノ粒子は、蒸留水あるいはＰＢＳ溶液に再分散させた。
【００１８】
比較例２：モデル蛋白質リゾチームが充填されたナノ粒子の製造
比較例１で製造したナノ粒子を高速遠心分離によって分離し、ＰＢＳ溶液に再分散させた後、モデル蛋白質であるリゾチーム１ｍｇを充填した。
【００１９】
実施例６〜７：モデル蛋白質リゾチームが充填されたヘパリン−機能化ナノ粒子の製造
実施例２、４でそれぞれ製造したナノ粒子を高速遠心分離によって分離し、ＰＢＳ溶液に再分散させた後、モデル蛋白質であるリゾチーム１ｍｇを充填した。
【００２０】
実施例８〜９：ＶＥＧＦが充填されたヘパリン−機能化ナノ粒子の製造
実施例４で製造したナノ粒子を用いて実施例６〜７と同様の方法でＶＥＧＦを充填した。ナノ粒子１ｍｇ当たりそれぞれ１５．６ｎｇ及び１５６ｎｇのＶＥＧＦを充填した。
【００２１】
実験例１：ナノ粒子の大きさ、表面電荷、構成成分質量比、多分散指数の観察
大塚電子株式会社(Otsuka Electronics Co.)のＥＬＳ−８０００を用いて、動的光散乱法によって製造されたナノ粒子の大きさを測定し、電気泳動光散乱法を用いて粒子の表面電荷を測定した。
図２に示すように、ポロキサマー水溶液上のヘパリン量を増加させるにつれ、合成されたナノ粒子の表面電荷は−２６．０±１．１から−４４．４±１．２ｍＶに増加し、大きさは１２３．１±２．０から１８８．１±３．９に変化した。ヘパリンは強い陰電荷を帯びた物質なので、マイナスの値で増加する表面電荷は生成された粒子の表面にさらに多くのヘパリンが存在することを示す。
粒子を構成する各成分の質量比を得るために、まず、ナノ粒子溶液を凍結乾燥してナノ粒子の乾燥重量を計算した。粒子状態でａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ Ｘａ分析(C. Chauvierre et al., Biomaterials 25(2004) 3081-3086)を行い、粒子表面層に存在するヘパリンの量を計算し、粒子を溶かして全体ヘパリンを回収した後、ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ Ｘａ分析を通じて粒子内の全体ヘパリン量を計算した。最終的に！１Ｈ ＮＭＲ分析を通じて粒子内のＰＬＧＡとポロキサマーの比を計算して各成分の質量比を決定した（表１）。
表１に示すように、物理的に固定化されているヘパリンは殆ど粒子表面層に存在し、また、製造された粒子において強く結合していないヘパリンとポロキサマーは高速遠心分離によって除去されたので、ヘパリンは、ＰＬＧＡナノ粒子内に物理的方法によって固定化されており、ポロキサマーからなる粒子の表面層内に大部分存在することが分かった。水和ゲル層を作るポロキサマーは、ポロキサマーの疎水性部分とやはり疎水性のＰＬＧＡとの引力によって粒子製造の際に安定化されるものと思われ、ヘパリンのカルボキシル基とポロキサマーの親水性部分であるポリエチレングリコール部分との引力によって粒子の生成中にヘパリンが表面層に固定されるものと思われる。
【００２２】
比較例１、実施例２、４によって製造されたナノ粒子を構成する各成分の質量比を表１に示す。
【表１】
0004567569.tif 000004
表１に示したように、ポロキサマー水溶液内に溶解されたヘパリンの量が増加するほど、粒子表面の水和ゲルに存在するヘパリンの量も一緒に増加する結果を示した。ところが、ナノ粒子の多分散指数と収得率を考慮し、ポロキサマー水溶液内に添加されるヘパリンの量は１２０ｍｇ以下を保つことが好ましい。特に、ポロキサマー水溶液内のヘパリンの量がそれぞれ０、３０、１２０ｍｇの条件で製造したナノ粒子の場合、それぞれ０、２．４、４．７重量％のヘパリンが含まれたナノ粒子が作られた。
【００２３】
実験例２：モデル蛋白質の試験管内(in vitro)徐放出効果及び安定化効果の観察
前記比較例２、実施例６、７で製造した薬物が充填されたナノ粒子に対して、蛋白質薬物の徐放出と安定化効果を確認するために、次のような試験管内条件で放出様相を測定した。
リゾチームが充填されたナノ粒子分散溶液を透析用チューブ（dialysis tube、ＭＷＣＯ ５００Ｋ）に仕込んだ後、無限希釈条件を満足する過量のＰＢＳ溶液を用いて、放出されたリゾチームを回収し、その量をＭｉｃｒｏ ＢＣＡ蛋白質定量法を用いて定量した。リゾチームの回収に使用されるＰＢＳ溶液は、毎日新しいＰＢＳ溶液に交替され、蛋白質定量時まで、サンプルは４℃で保管された。
図３はこのような放出実験の結果として、時間の経過に伴って、ナノ粒子から放出されるリゾチームの累積放出量（％）を示したグラフである。ヘパリンが含まれていないナノ粒子の場合には３日以内に充填量の２／３が放出され、ナノ粒子内の固定化されたヘパリンの量が増加するにつれて蛋白質の徐放出形態が観察された。これに対し、ヘパリン含量４．７重量％のナノ粒子の場合には初期バーストなしに最大１９日まで放出が進行した。
また、図４に示すように、ヘパリンで機能化されたナノ粒子から放出されたリゾチームの生物学的活性を測定し、これを通じて、ナノ粒子の水和ゲル膜内に固定化されたヘパリンによって充填された蛋白質が安定化されることを確認した。
【００２４】
実験例３：ＶＥＧＦの試験管内(in vitro)徐放出効果及び安定化効果の観察
実施例８で製造した薬物充填ナノ粒子に対してＶＥＧＦの放出特性を次のように観察した。まず、透析用チューブ（ＭＷＣＯ ５００ｋ）に、ＶＥＧＦが充填されたナノ粒子溶液を仕込んだ後、無限希釈条件のＰＢＳ溶液を用いて、放出されたＶＥＧＦを回収した。ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)を用いて、回収されたＶＥＧＦを定量し、蛋白質定量時まで、サンプルは−３０℃で保管した。
図５はこのような放出実験の結果として、ヘパリン含量４．７重量％のナノ粒子から放出されるＶＥＧＦの累積放出量（％）を示したグラフである。ナノ粒子１ｍｇ当たり１５．６ｎｇのＶＥＦＧを充填した場合、初期バーストなしに３７日まで当該薬物の８５％が持続的に放出された。
一方、蛋白質薬物の充填比率を１０倍増加させた場合（ナノ粒子１ｍｇ当たり１５６ｎｇのＶＥＧＦを充填）に対しても、前記と同一の条件で実験を行い、その結果をやはり図５に示した。時間経過に伴う蛋白質の累積放出量（％）が同様に観察され、これによりＶＥＧＦの徐放出はナノ粒子の水和ゲル膜内に固定化されているヘパリンとの特異的結合によって誘導されたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヘパリンで機能化されたナノ粒子の製造工程を図式的に示す図である。
【図２】ポロキサマー水溶液に溶解されたヘパリン量の増加によるナノ粒子の大きさと表面電荷の変化を示すグラフである。
【図３】ヘパリン含量の異なるナノ粒子から放出されるモデル蛋白質であるリゾチーム(lysozyme)の累積放出量（％）を示すグラフである。
【図４】ヘパリンで機能化されたナノ粒子から放出されたリゾチームのミクロコッカスリソデイクティクス(Micrococcus lysodeikticus)の細胞壁に対する生物学的活性測定で計算された蛋白質濃度とマイクロＢＣＡ蛋白質定量法で計算された蛋白質濃度間の比較によって、放出されたリゾチームの生物学的活性変化を測定したグラフである。
【図５】ヘパリン含量４．７重量％のナノ粒子から放出される対象蛋白質である血管内皮細胞成長因子(vascular endotherial growth factor、以下「ＶＥＧＦ」という)の累積放出量（％）を示すグラフである。（ここで、■はナノ粒子１ｍｇ当たり１５．６ｎｇのＶＥＧＦを充填した場合であり、□はナノ粒子１ｍｇ当たり１５６ｎｇのＶＥＧＦを充填した場合である。）
【図１】
0004567569.tif 000005
【図２】
0004567569.tif 000006
【図３】
0004567569.tif 000007
【図４】
0004567569.tif 000008
【図５】
0004567569.tif 000009