(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア・コリを培地中で培養し、該培地中にＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸を蓄積させ、該培地から該Ｌ−アミノ酸を採取する、発酵法による前記Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
前記エシェリヒア・コリが、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ遺伝子の固有のプロモーターをより強力なプロモーターで置換すること、該遺伝子の固有のシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列をより効率的なＳＤ配列で置換すること、又は該遺伝子を含む組み換えＤＮＡで該細菌を形質転換することにより、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性が増強されるように改変され、かつｙｄｄＧオープンリーディングフレームを含む組み換えＤＮＡで該細菌を形質転換することによりｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現が増強するように改変されたエシェリヒア・コリである、方法。
【請求項２】
前記エシェリヒア・コリが、染色体上のＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の固有のプロモーターがホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子のプロモーターで置換され、ＦｒｕＲタンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えＤＮＡで形質転換されたエシェリヒア・コリである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エシェリヒア・コリが、染色体上のＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の固有のＳＤ配列がファージＴ７由来φ１０遺伝子のＳＤ配列で置換されたエシェリヒア・コリである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、エシェリヒア・コリに由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｙｄｄＧオープンリーディングフレームをコードする遺伝子が、エシェリヒア・コリに由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含む配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、かつＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、以下のＤＮＡ（ａ）または（ｂ）を含む、請求項６に記載の方法。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１６２３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、または（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜１６２３のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブと、６０℃で、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記エシェリヒア・コリが、さらにセリンによるフィードバック阻害を受けない変異型ｓｅｒＡ対立遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転換されたものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、具体的には発酵によりＬ−アミノ酸を生産する方法、より具体的には、細菌エシェリヒア・コリに由来する遺伝子に関する。前記遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、すなわちＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンのような芳香族Ｌ−アミノ酸の生産を改善するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然源から得られる微生物株、又は特にＬ−アミノ酸生産を増強するように改変されたそれらの変異体を利用した発酵方法により工業的に生産されている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸生産を増強する方法について記載する多くの技法が開示されている。例えば、かかる技法には、微生物を組換えＤＮＡで形質転換することが含まれる（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号参照）。これらの技法の多くは、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること、および／または標的Ｌ−アミノ酸のフィードバック阻害に関与する酵素を脱感作させることに基づいている（例えば、日本国出願公開番号第５６−１８５９６号（１９８１年）、ＷＯ９５／１６０４２号または米国特許第５，６６１，０１２号および同第６，０４０，１６０号を参照）。
【０００４】
ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびエリスロース４−リン酸（Ｅ４ｐ）は、芳香族Ｌ−アミノ酸に関する一般的な生合成経路の必須前駆体である。また、ホスホエノールピルビン酸は、他のいくつかの細胞プロセスに関与する重要な中間体である。野生型エシェリヒア・コリ（E. coli）では、主要なＰＥＰ消費物は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）である。他のＰＥＰ消費酵素は、ｐｐｃ遺伝子によりコードされるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされるピルビン酸キナーゼである。E. coliにおいてＰＥＰ生成をもたらす反応は、それぞれｅｎｏ、ｐｐｓＡおよびｐｃｋＡ遺伝子によりコードされる解糖系酵素エノラーゼならびに糖新生酵素ホスホエノールピルビン酸シンターゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰカルボキシキナーゼ）により触媒される（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington
D.C., 1996）。
【０００５】
したがって、ＰＥＰおよびＥ４Ｐ生合成の特定の経路の最適化により、芳香族Ｌ−アミノ酸の生産を改善することができる。特に、ＰＥＰ供給を増加させることは、芳香族Ｌ−アミノ酸生産を増加させる標準的な方法である。細胞においてＰＥＰ供給を増加させる方法の１つは、非ＰＴＳ炭素源を用いて、ホスホトランスフェラーゼ系におけるＰＥＰ消費を回避することである。別の方法は、グルコースの取り込みおよびリン酸化をＰＥＰ非依存性にすることである。ＰＥＰ供給を増加させるさらに別の方法は、ＰＥＰを、ピルビン酸およびオキザロ酢酸のようなその誘導体からリサイクルさせることである。解糖におけるＰＥＰ利用を防止するためのＰＥＰカルボキシラーゼまたはＰＥＰキナーゼの不活性化もまた利用することができる。ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子の両方の同時不活性化は、グルコースからＬ−フェニルアラニンへの炭素の流れを有意に増加させる（Grinter, N.J., ChemTech, 1998, 33-37 (July)）。他方で、不活性化したｐｐｃ遺伝子を含有するＬ−フェニルアラニン生産E. coli菌株におけるＬ−フェニルアラニンの有意に増加された形成は、酢酸およびピルビン酸のような望ましくない副生成物の生成の増加を伴う（Miller J.E. et al., J. Ind. Microbiol.,, 1987, 2, 143-149）。
【０００６】
ピルビン酸を変換してＰＥＰに戻すことは、ｐｐｓＡ遺伝子によりコードされるホスホエノールピルビン酸シンターゼの過剰発現により実施され得る。この場合、炭素フラックスは、ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸７−リン酸）生産に対して好結果に向かう（Patnaik R. and Liao J.C., Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60,
3903-3908、米国特許第５９０６９２５号、米国特許第５９８５６１７号、米国特許第６４８９１００号、ＰＣＴ出願ＷＯ９６０８５６７Ａ１号）。コリネ型細菌細胞においてホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を増大させることは、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−セリンのようなＬ−アミノ酸の生産の増加を招くことが示された（ＰＣＴ出願ＷＯ００５６８５９Ａ１号）。同様に、コリネ型細菌細胞またはエシェリヒア属に属する細菌においてホスホエノールピルビン酸シンターゼの活性を増強させることは、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産に有用であることが示された（欧州特許出願ＥＰ０８７７０９０Ａ１号）。
【０００７】
ジカルボン酸または酢酸の存在下での生育、ＰＥＰおよび解糖経路の中間体の形成は、特に、ＡＴＰ依存性反応においてＰＥＰを生ずるＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰｃｋＡ）によるオキザロ酢酸の脱炭酸を必要とすることが知られている。他方で、グルコースの存在下での生育は、ｐｐｃ遺伝子に関する最高の発現およびｐｃｋＡ遺伝子に関する最低の発現を示す（Teroaka H. et al., J. Biochem. 1970, 67, 567-575, Goldie H., J. Bacteriol. 1984, 59, 832-838）。
【０００８】
化学量論的経路分析を用いて、ピルビン酸をＰＥＰにリサイクルさせる新規経路が提唱されたが、実験上証明されなかった。この仮定上のサイクルは、オキザロ酢酸をＰＥＰに変換するＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰｃｋＡ）およびグリオキシル酸シャントから構成されると考えられた（Liao J.C. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 52, 129-140）。
【０００９】
細菌、腸内細菌科の微生物の細胞におけるｐｃｋＡ遺伝子および／またはｙｉｆＡおよびｙｔｆＰオープンリーディングフレームの弱化（アテニュエーション）または停止（スイッチオフ）は、Ｌ−スレオニンの生産に有用である（ＰＣＴ出願ＷＯ０２２９０８０Ａ２号）。しかし、今のところ、Ｌ−アミノ酸生産菌の細胞におけるＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の増強が、Ｌ−アミノ酸生産の増加を引き起こすことができるという事実を記載した報告はない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、芳香族Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増強すること、および同菌株を用いた芳香族Ｌ−アミノ酸の製造法を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性が増強されるように改変された、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、前記ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性が、ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の発現が増強されるように前記細菌の染色体上の前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の発現制御配列を改変することにより、又は該遺伝子のコピー数を増加させることにより増強される、前記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前記遺伝子の固有の（native）プロモーターが、より強力なプロモーターで置換された、前記細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、前記遺伝子の固有の（native）ＳＤ配列が、より効率的なＳＤ配列で置換された、前記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、エシェリヒア属に属する細菌に由来する、前記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含む配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、かつＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする、前記細菌を提供することである。（以降、前記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質を、本発明のタンパク質（単数または複数）として示す。）
【００１７】
本発明のさらなる目的は、前記ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子が、以下のＤＮＡ（ａ）または（ｂ）を含む、前記細菌を提供することである。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１６２３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、または
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜１６２３のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記ストリンジェントな条件が、６０℃で、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件である、前記細菌を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、前記細菌が、ｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現が増強されるようにさらに改変された、前記細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンからなる群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である、前記細菌を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を蓄積させ、該培地から該Ｌ−アミノ酸を採取する、芳香族Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンからなる群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である、前記方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、前記細菌が、芳香族アミノ酸生合成に関する遺伝子の発現が増強されたものである、前記方法を提供することである。
【００２４】
Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−トリプトファン生産菌を用いたＬ−トリプトファンの製造を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者等は、ｐｃｋＡ遺伝子の転写および／または翻訳の増強が、Ｌ−トリプトファン生産株で発現される場合に、Ｌ−トリプトファン生産を増強することができることを見出した。ｐｃｋＡ遺伝子は、ＰＥＰカルボキシキナーゼをコードし、ＰＥＰカルボキシキ
ナーゼは、オキザロ酢酸のＰＥＰへの変換を触媒する。こうして本発明は完成された。
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、あるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌であり、その結果、標的Ｌ−アミノ酸の生産が増強される。より具体的には、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属する芳香族Ｌ−アミノ酸生産菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌のような芳香族Ｌ−アミノ酸生産菌であり、同細菌は、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性が増強されるように改変されている。より具体的には、本発明の細菌は、ｐｃｋＡ遺伝子を含むＤＮＡを保持し、同細菌の染色体中に改変された発現制御配列を有し、Ｌ−トリプトファンを生産する能力が増強されている。
【００２７】
「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語は、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種により付与または増強され得る。本明細書中で使用する「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語はまた、野生株または親株よりも大量に、培地中にＬ−アミノ酸を生産、蓄積することが可能な細菌を意味し、好ましくは、微生物が、０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で培地中に標的Ｌ−アミノ酸を生産、蓄積させることが可能であることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンを包含し、好ましくはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンのような芳香族Ｌ−アミノ酸を包含する。
【００２８】
「エシェリヒア属に属する細菌」という用語は、前記細菌が、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類されることを意味する。本発明で使用するエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられる。
【００２９】
「ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性」という用語は、ＡＴＰを消費し、かつＡＤＰおよび二酸化炭素を放出しながら、オキザロ酢酸をホスホフェノールピルビン酸に変換する反応を触媒する活性を意味する。ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性は、例えばKrebs A.およびBridger W.Aにより記載される方法により測定することができる（Can. J. Biochem., 1980, 58, 309-318）。
【００３０】
「ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性が増強されるように改変される」という用語は、細胞１個当たりのＰＥＰカルボキシラーゼの活性が、非改変株、例えば野生型株の活性よりも高くなることを意味する。例えば、細胞１個当たりのＰＥＰカルボキシキナーゼ分子の数が増加した株、ＰＥＰカルボキシキナーゼ１分子当たりの比活性が増大した株等が含まれる。さらに、比較の対象となる野生型株としては、例えばエシェリヒア・コリＫ−１２が挙げられる。ＰＥＰカルボキシキナーゼの細胞内活性の増強の結果として、培地中に蓄積したＬ−トリプトファンの量が増加するという効果が得られる。
【００３１】
細菌細胞におけるＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の増強は、ＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子の発現の増強により達成することができる。ＰＥＰカルボキシキナーゼとして、エシェリヒア属に属する細菌に由来する遺伝子、及びにコリネ型細菌のような他の細菌に由来する遺伝子のいずれをも使用することができる。これらのうちで、エシェリヒア属に属する細菌に由来する遺伝子が好ましい。
【００３２】
エシェリヒア・コリ（ＥＣ番号４．１．１．４９）のＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子として、ｐｃｋＡ遺伝子が明らかになっている（GenBankアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３１２８０の配列中のヌクレオチド番号３５３０４５６〜３５３２０７８）。したがって、ｐｃｋＡ遺伝子は、前記遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて調製したプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。他の微生物のＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子は、同様にして得ることができる。
【００３３】
エシェリヒア属またはその等価物に由来するｐｃｋＡ遺伝子は、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードするＤＮＡを包含する：
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含む配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、かつＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質。
【００３４】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の活性が失われない限り、タンパク質（Ａ）において１または複数の位置において１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。本明細書中で言及する「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置またはタイプによって異なるが、「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質（Ａ）に関して２〜５０、好ましくは２〜２５、より好ましくは２〜１０であり得る。（Ａ）で定義したタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば（Ａ）で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変により得られ得る。例えば、部位特異的変異誘発法を使用することができ、その結果、アミノ酸残基（単数または複数）の欠失、置換、挿入または付加が特定部位で行われる。このような改変ＤＮＡは、従来法により、例えば突然変異を発生させる試薬または他の条件で処理することにより得ることができる。そのような方法としては、ヒドロキシアミンによる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの処理、又はＵＶ照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸のような試薬による前記ＤＮＡを保持する細菌の処理が挙げられる。
【００３５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、天然多様性によるエシェリヒア属に属する細菌の種々の菌株又は変異株において見出すことができる変異体を包含する。かかる変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｐｃｋＡ遺伝子または該遺伝子の一部とハイブリダイズし、かつＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及する「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ非特異的ハイブリッドが形成されない条件を包含する。例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーション用の通常の洗浄条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ，好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件を挙げることができる。変異体をコードし、かつｐｃｋＡ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ用のプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列も使用することができる。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて生産されるオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡフラグメントを用いたＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションの洗浄条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳであり得る。
【００３６】
ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性は、例えばＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子フラグメントを、エシェリヒア属に属する細菌において機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結することにより調製された組換えＤＮＡで、エシェリヒア属に属する細菌を形質転換することにより増強することができる。ＰＥＰカルボキシラーゼの活性は、形質転換体株において酵素をコードする遺伝子のコピー数の増加の結果として増強される。
【００３７】
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、従来法により前記ＤＮＡを細菌細胞へ導入し、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させ、かつ細菌細胞中のタンパク質の活性を増強することを意味する。ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性はまた、ＰＥＰカルボキシキナーゼをコードする遺伝子の転写および／または翻訳を増強することにより増強することができる。したがって、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が、細菌の染色体上の（Ａ）または（Ｂ）で定義したようなタンパク質をコードするＤＮＡの発現制御配列の変更により増強されるものを包含する。遺伝子発現の増強は、本発明のＤＮＡを固有のプロモーターの代わりに、より強力なプロモーターの制御下に位置させることにより達成することができる。「固有の（native）プロモーター」という用語は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置し、かつ遺伝子の発現を促進する機能を有する野生型生物に存在するＤＮＡ領域を意味する。ｐｃｋＡ遺伝子の固有のプロモーターの配列は、Ramseier T.M.等により提示されており（Mol. Microbiol., 1995, 16, 6, 1157-1169）、アクセッション番号Ｕ２１３３２５のもとでＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて入手可能である。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度を評価する方法は、例えば、Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H.により記載されている（Promoters
in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）。
【００３８】
ＦｒｕＲタンパク質（Ｃｒａ−カタボライトリプレッサー／アクチベーターとしても知られている）は、炭素の流れの方向を調節する包括的な調節タンパク質である。最も中心的な炭水化物代謝経路における重要な酵素は、ＦｒｕＲタンパク質により媒介される腸内細菌におけるカタボライトリプレッションのｃＡＭＰ非依存性メカニズムの標的物である。適切な外因性の糖基質の存在下で、ＰＴＳの重要なタンパク質をコードする幾つかの遺伝子を含む解糖経路およびエントナー・ドゥドロフ経路の酵素をコードする遺伝子の発現が活性化される。同時に、糖新生、グリオキシル酸シャントおよびクレブス回路経路の重要な酵素をコードする遺伝子の発現が阻害される。ＦｒｕＲタンパク質は、これらの遺伝子のすべての発現を調節する。ＦｒｕＲは、解糖経路およびエントナー・ドゥドロフ経路の重要な酵素の合成を抑制し、他の３つの経路の重要な酵素の合成を活性化する（Esherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。ｐｃｋＡ遺伝子によりコードされるＰＥＰカルボキシキナーゼは、糖新生酵素である。ＰppsAプロモーターはＦｒｕＲタンパク質により最大２０倍以上活性化されるのに対して、ＰpckAプロモーターは、ＦｒｕＲにより最大４倍活性化されるにすぎないことが知られている（Saier M.H., Jr., and Ramseier T.M., J. Bacteriol., 1996, 178, 12, 3411-3417）ため、ＰppsAプロモーターは、ｆｒｕＲ遺伝子を構成的に発現する株において、ＰpckAプロモーターよりも強力なプロモーターであると仮定することができる。
【００３９】
翻訳の増強は、固有のＳＤ配列の代わりに、より効率的なシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）を、本発明のＤＮＡに導入することにより達成することができる。ＳＤ配列は、リボソームの１６Ｓ  ＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流の領域である（Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1974, 71, 4, 1342-6）。「固有の（native）ＳＤ配列」という用語は、野生型生物に存在するＳＤ配列を意味す
る。プロモーター領域の一部である、ｐｃｋＡ遺伝子の固有のＳＤ配列のヌクレオチド配列は、Ramseier T.M.等により提示されてりおり（Mol. Microbiol., 1995, 16, 6, 1157-1169）、アクセッション番号Ｕ２１３２５のもとでＥＭＢＬ／GenBankデータベースにおいて入手可能である。ファージＴ７由来のφ１０遺伝子のＳＤ配列は、効率的なＳＤ配列として例示することができる（Olins P.O. et al., Gene, 1988, 73, 227-235）。
【００４０】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化および連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の通常の方法であってよい。これらの方法は、例えばSambrook, J., and Russell D., 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【００４１】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を本来的に有する細菌への前記ＤＮＡの導入により得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、既にＤＮＡを保持する細菌に、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を付与することにより得ることができる。
【００４２】
本発明のタンパク質の活性を増強する親株として、エシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌、例えば変異型ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼを欠損したE. coli株ＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＤＳＭ１０１２２）およびＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＤＳＭ１０１２３）（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害を受けないｓｅｒＡ対立遺伝子を有するE.
coli株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）（米国特許６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼを欠損したE. coli株ＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６３）およびＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４）（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたE. coli株ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ（ＷＯ９７０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等が使用され得る。
【００４３】
これまでに、本発明者らは、どのＬ−アミノ酸の生合成経路にも関与しない膜タンパク質をコードするｙｄｄＧ遺伝子の野生型対立遺伝子が、微生物中でマルチコピー型ベクター上で増幅された場合、Ｌ−フェニルアラニンおよび他のいくつかのアミノ酸アナログに対する耐性が微生物に付与されることを確認している。さらに、ｙｄｄＧ遺伝子は、遺伝子のさらなるコピーがそれぞれの生産株の細胞に導入されると、Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−トリプトファンの生産を増強することができる（ＷＯ０３０４４１９２号）。Ｌ−トリプトファン生産菌は、ｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現、又はｔｒｐＥＤＣＢＡオペロンの遺伝子、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、ａｒｏＬ、ａｒｏＡおよびａｒｏＣ遺伝子等の芳香族アミノ酸の共通経路の遺伝子、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣ遺伝子等のＬ−セリン生合成の遺伝子等を含むＬ−トリプトファン生合成に有効な遺伝子の発現を増強するようにさらに改変することができる。
【００４４】
本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を蓄積させ、該培地から該Ｌ−アミノ酸を採取する、芳香族Ｌ−アミノ酸の製造方法を包含する。
また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−トリプトファンを蓄積させ、該培地から該Ｌ−トリプトファンを採取する、Ｌ−トリプトファンの製造方法を包含する。
【００４５】
本発明では、Ｌ−トリプトファンのようなＬ−アミノ酸の培養、培地からの採取および精製等は、従来の発酵法に類似した様式で実施され得る。従来の発酵法では、アミノ酸は、微生物を用いて生産される。培養に使用される培地は、培地が炭素源、窒素源、および
ミネラル、ならびに必要であれば、微生物が生育に必要とする適切な量の栄養分を含む限りは、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、グルコースおよびスクロースのような各種炭水化物、および各種有機酸が挙げられる。選択した微生物の同化作用の様式に応じて、エタノールおよびグリセロールを含むアルコールを使用してもよい。窒素源として、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような各種アンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解産物および発酵微生物の消化物のような天然窒素源を使用することができる。ミネラルとして、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用される。必要であれば、さらなる栄養分を培地に添加することができる。例えば、微生物が生育のためにチロシンを必要とする場合（チロシン栄養要求性）、十分量のチロシンを培地に添加することができる。
【００４６】
培養は、好ましくは好気性条件下で、例えば２０〜４２℃、好ましくは３７〜４０℃で、通気しながら振とうおよび／または攪拌することにより行われる。培養液のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養液のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基および緩衝液で調節することができる。通常、１日〜５日の培養で、液体培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００４７】
培養後、細胞のような固形分は、遠心分離または膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて標的Ｌ−アミノ酸を、イオン交換、濃縮および／または結晶化方法により収集および精製することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を、非限定的な実施例を参照して、より具体的に説明する。本実施例では、アミノ酸は、別記しない限りＬ−体である。
【００４９】
実施例１：ｆｒｕＲ、およびセリンによるフィードバック阻害を受けないタンパク質をコードする変異型ｓｅｒＡ遺伝子を保持するプラスミドの構築
Ｌ−トリプトファン生産株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）（米国特許第６，１８０，３７３号）は、セリンによるフィードバック阻害を受けないタンパク質をコードする変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するｐＧＨ５プラスミドを含有する。ｓｅｒＡ５遺伝子の増幅は、Ｌ−トリプトファンの前駆体であるセリンの量を増加させるのに必要である。
【００５０】
他方で、ＰppsAプロモーターはＦｒｕＲタンパク質により最大２０倍以上活性化されるのに対して、ＰpckAプロモーターは、ＦｒｕＲにより最大４倍活性化されるに過ぎないことも知られている（Saier M.H., Jr., and Ramseier T.M., J. Bacteriol., 1996, 178, 12, 3411-3417）。ＰpckAプロモーターをＰppsAプロモーターで置換することによりＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を増強することが目的であるため、ｆｒｕＲ遺伝子を構成的に発現させる必要があった。
【００５１】
前記の２つの目標を達成するために、Ｌ−トリプトファン生産株中のプラスミドｐＧＨ５を、以下の構想により構築されるｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲプラスミドで置換した。
【００５２】
ｐＧＨ５プラスミドの既知のヌクレオチド配列（米国特許第６，１８０，３７３号）に基づいて、配列番号３（プライマーＡ）および配列番号４（プライマーＢ）に示すプライマーを合成した。プライマーＡは、ｓｅｒＡ５遺伝子の開始コドン領域にある配列に相補的であた、'末端に導入された制限酵素ＸｂａＩ認識部位を有する。プライマーＢは、ｓｅｒＡ５遺伝子の終結コドン領域の配列に相補的であり、５'末端に制限酵素ＳａｌＩ認識部位を有する。
【００５３】
ｐＧＨ５プラスミドは、通常の方法により単離した。ＰＣＲは、以下の条件：９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒で、Ｔａｑポリメラーゼ（MBI Fermentas）を用いて２５サイクル、「ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＣＲＥｘｐｒｅｓｓ  ＰＣＲシステム」で実施した。
【００５４】
同時に、ｆｒｕＲ遺伝子の増幅を行った。E. coli株Ｗ３３５０の染色体ＤＮＡは、通常の方法により単離した。プライマーＣ（配列番号５）およびプライマーＤ（配列番号６）を使用した。プライマーＣ（ｆｒｕＲ遺伝子の開始コドン領域に相補的）は、ＳａｌＩ制限部位を含有する。プライマーＤ（ｆｒｕＲ遺伝子の終止コドン領域に相補的）は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒、Ｔａｑポリメラーゼ（MBI Fermentas）を用いて２５サイクル。
【００５５】
前記のようにして得られたｓｅｒＡ５およびｆｒｕＲ遺伝子を含有するＰＣＲフラグメントをＳａｌＩで処理した後、連結させた。連結産物をＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化して、同じ制限酵素であらかじめ処理したｐＭＷ−ＰlacUV5−ｌａｃＺプラスミド（Mashko S.V., et al., Biotekhnologiya(rus), 2001, 5, 3-20）に挿入した。このようにして、ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲプラスミドが得られた。
【００５６】
実施例２：E. coli由来のｙｄｄＧ遺伝子のクローニング
Ｌ−トリプトファン生産に有用な膜貫通タンパク質をコードするｙｄｄＧ遺伝子を、配列番号７（プライマーｙｄｄｇ１）およびプライマー８（プライマーｙｄｄｇ２）に表されるプライマーを用いてクローニングした。プライマーｙｄｄｇ１は、５’末端に導入された制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を有するｙｄｄＧ遺伝子の終結コドンの下流にある９１〜１１４ｂｐの配列に相補的である。プライマーｙｄｄｇ２は、５’末端に導入された制限酵素ＳａｌＩ認識部位を有するｙｄｄＧ遺伝子の開始コドンの上流にある２２４〜２００ｂｐの配列に相補的である。
【００５７】
E. coli株ＴＧ１の染色体ＤＮＡは、通常の方法により調製した。ＰＣＲは、以下の条件：９５℃で４０秒、４７℃で４０秒、７２℃で４０秒、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas)を用いて３０サイクル下で、「Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００」で実施した。自身のプロモーターを有するｙｄｄＧ遺伝子を含有する得られたＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理して、同じ酵素であらかじめ処理した多コピー型ベクターｐＡＹＣＴＥＲ３に挿入した。こうして、プラスミドｐＹＤＤＧ２が得られた。
【００５８】
ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、ｐＡＹＣ３２の誘導体である。ｐＡＹＣ３２は、中程度のコピー数のベクターであり、非常に安定であり、ストレプトマイシン耐性に関するマーカーを含有するプラスミドＲＳＦ１０１０に基づいて構築される（Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Broad-host range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167）。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、以下のように、ｐＡＹＣ３２プラスミドへ、そのプロモーターの代わりにｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよび強力なターミネーターｒｒｎＢを導入することにより得られた。まず、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーは、配列番号９および配列番号１０に示すプライマーを用いたＰＣＲにより得られた。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で処理した。ターミネーターｒｒｎＢはまた、配列番号１１および配列番号１２に示すプライマーを用いたＰＣＲにより得られた。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で処理した。続いて、これらの２つのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ制限酵素であらかじめ処理したｐＡＹＣ３２プラスミドに連結させた。こ
のようにして、ｐＡＹＣＴＥＲ３プラスミドが得られた。
【００５９】
実施例３：E. coli染色体におけるＰppsAプロモーターおよびＳＤφ10を保持するハイブリッド調節因子によるｐｃｋＡ遺伝子の固有の上流領域の置換
ｐｃｋＡ遺伝子発現を増強するために、E. coli染色体に由来するｐｐｓＡ遺伝子のプロモーター領域（ＰppsA）を、ファージＴ７に由来するφ１０遺伝子のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）に連結させた。「Ｒｅｄ媒介性組込み（Red-mediated integration)」とも呼ばれるDatsenko K.A.およびWanner B.L.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,
97, 6640-6645）により記載される方法を用いて、このフラグメントを、固有の領域の代わりに、E. coli株ＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）の染色体上のｐｃｋＡコード領域の上流に組み込んだ。さらに、前記細菌の染色体の相当する領域に組み込まれたＤＮＡフラグメントは、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を保持していた（図１）。ｐｃｋＡ遺伝子の上流に位置する置換された固有の領域のヌクレオチド配列を配列表（配列番号１）に示す。組換えプラスミドｐＫＤ４６を含有するE. coli株ＢＷ２５１１３は、the E. coli. Genetic Stock Centre, Yale University, New Haven, USAから得ることができ、そのアクセッション番号は、ＣＧＳＣ７６３０である（ＷＯ０２１０３０１０Ａ１号）。
【００６０】
前記人工ＤＮＡフラグメントの構築は、以下の工程により達成された。まず、「上流」領域におけるＢｇｌＩＩ制限部位、ＰppsAプロモーター、および「下流」領域におけるｐｃｋＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに直接連結させたファージＴ７φ１０遺伝子由来のＳＤ配列を有するＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲにより取得した。E. coli Ｗ３３５０株由来の染色体ＤＮＡをＰＣＲにおける鋳型とした。ＰＣＲは、プライマー１（配列番号１３）およびＰ２（配列番号１４）を用いて行った。プライマー１は、ＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。プライマー２は、ファージＴ７φ１０遺伝子のＳＤ配列ならびにｐｃｋＡオープンリーディングフレーム由来の３６個のヌクレオチドを含有する。細菌染色体へのフラグメントのさらなるＲｅｄ媒介性組込みのために、ｐｃｋＡ遺伝子由来の配列をプライマー２に導入した。
【００６１】
すべての場合において、ＰＣＲは、増幅用「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」を用いて行った。総容量５０μｌの反応混合物は、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（「Fermentas」、Lithuania）５μｌ、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、利用されるプライマーをそれぞれ２０ｎＭ、および１ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（「Fermentas」、Lithuania）を含む。染色体ＤＮＡ０．５μｇを、さらなるＰＣＲによる増幅用の鋳型ＤＮＡとして反応混合物に添加した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９５℃での５分間の最初のＤＮＡ変性、続いて＋９５℃での３０秒間の変性と、＋５５℃での３０秒間のアニーリングと、＋７２℃での３０秒間の伸長とを２５サイクル、および＋７２℃での７分間の最終ポリメライゼーション。
【００６２】
同時に、所望のＤＮＡフラグメントの構築の第２段階を行った。ＣｍR遺伝子は、鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ０６４０３、「Fermentas」、Lituania）、ならびにプライマーＰ３（配列番号１５）およびプライマーＰ４（配列番号１６）を用いたＰＣＲにより増幅した。プライマーＰ３は、前もって得たＰppsAプロモーターを含有するＤＮＡフラグメントを連結させるのに使用するＢｇｌＩＩ制限部位を含む。プライマーＰ４は、E. coliに由来するｐｃｋＡ遺伝子の上流に位置し、かつ細菌染色体へのフラグメントのさらなるＲｅｄ媒介性組込みに必須である３６個のヌクレオチドを含む。
【００６３】
続いて、増幅したＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により濃縮して、「GenElute Spin Columns」(「Sigma」、USA）による遠心分離によりゲルから抽出した後、エ
タノール沈殿を行った。
【００６４】
２つの得られたＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した後、Ｔ４リガーゼ（Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: MOlecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて連結させた。
【００６５】
連結させた産物を、プライマーＰ２およびプライマーＰ４を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、総容量５０μｌ、１０×ＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡ緩衝液（「Sigma」、USA）５μｌ、ｄＮＴＰをそれぞれ２００μＭ、利用されるプライマーをそれぞれ２０ｎＭおよび１μ  ＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡポリメラーゼ（「Sigma」、USA）を含有する反応混合物中で行った。前記の連結させたＤＮＡ産物およそ５０ｎｇを鋳型ＤＮＡとして混合物に添加した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９５℃での５分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃での３０秒間の変性と、５５℃での３０秒間のアニーリングと、７２℃での４分間の伸長とを２５サイクル、および７２℃で７分間の最終ポリメライゼーション。
【００６６】
ｐｃｋＡ遺伝子の上流の構築したＤＮＡ領域の構造を図１に示す。構築したＤＮＡ領域のヌクレオチド配列は、配列番号１８に示す。
【００６７】
前記のようにして得られ、かつ精製されたＤＮＡフラグメントは、E. coli株ＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）の細菌染色体へのエレクトロポレーションおよびＲｅｄ媒介性組込みに使用した。熱感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６（Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97,6640-6645）を、Ｒｅｄ媒介性組換え系に関与するファージλ由来遺伝子のドナーとして使用した。
【００６８】
ＢＷ２５１１３（ｐＫＤ４６）の細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する液体ＬＢ培地中で３０℃で一晩生育させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、Ｒｅｄ系の遺伝子をコードするプラスミドを誘導するのに使用される）を含有するＳＯＢ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、トリプトン  ２０ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １０ｍＭ）で１：１００に希釈して、細菌培養物の光学密度ＯＤ600＝０．４〜０．７に達するまで、３０℃で生育させた。細菌培養物１０ｍｌ分の生育させた細胞を氷冷脱イオン水で３回洗浄した後、水１００μｌ中に懸濁させた。脱イオン水中に溶解したＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）１０μｌを細胞懸濁液に添加した。製造業者の指示書に従って、「Bio-Rad」製のエレクトロポレーター（USA）（番号１６５−２０９８、バージョン２−８９）によりエレクトロポレーションを実施した。ショックを与えた細胞をＳＯＣ培地（Sambrook et al., 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）１ｍｌに添加して、３７℃で２時間インキュベートした後、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天上へ広げた。２４時間以内に生育したコロニーを、プライマーＰ４（配列番号１６）およびプライマーＰ５（配列番号１７）を用いたＰＣＲにより、ｐｃｋＡ遺伝子の上流にあるＣｍRマーカーの存在について試験した。同じコロニーを、プライマーＰ１（配列番号１３）およびプライマーＰ５（配列番号１７）を用いたＰＣＲにより、ｐｃｋＡ遺伝子の上流にあるＰppsAプロモーターの存在についても試験した。これらの試験において、単離したばかりのコロニーを水２０μｌ中に懸濁させ、それらのうちの１μｌをＰＣＲで使用した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９５℃での１０分間の最初のＤＮＡ変性、続いて９５℃での３０秒間の変性と、５５℃での３０秒間のアニーリングと、７２℃での１分間の伸長とを３０サイクル、７２℃で７分間の最終ポリメライゼーション。試験したＣｍRコロニーの幾つかは、所望の１７４９ｎｔおよび６９７ｎｔＤＮＡフラグメントを含有しており、それぞれE. coli染色体中にＰppsAプロモーターおよびＳＤφ10を保持するｐｃｋＡ遺伝子の上流
にある構築されたＤＮＡ領域全体ならびにハイブリッド調節因子の存在が確認された。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去された。得られた株をE. coli株ＢＷ２５１１３（Ｃｍ−ＰppsA−ＳＤφ10−ｐｃｋＡ）と命名した。
【００６９】
実施例４：トリプトファン生産に対する増強されたｐｃｋＡ遺伝子発現の効果
トリプトファン生産E. coli株ＳＶ１６４（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２）を、トリプトファン生産に対する増強されたｐｃｋＡ遺伝子発現の効果を評価するための親株として使用した。ＳＶ１６４株は、米国特許第６，１８０，３７３号に詳述されている。
【００７０】
トリプトファン生産に対するＰppsAプロモーターおよびファージＴ７φ１０遺伝子のＳＤの制御下でのｐｃｋＡ遺伝子発現の増強の効果を試験するために、E. coli株ＢＷ２５１１３（Ｃｍ−ＰppsA−ＳＤφ10−ｐｃｋＡ）の染色体からの前記ＤＮＡフラグメントを、Ｐ１形質導入によりトリプトファン生産E. coli株ＳＶ１６４（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ）に移入した（Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）。次に、プラスミドｐＹＤＤＧ２をＳＶ１６４（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ）株および得られた形質導入株の両方に導入した。
【００７１】
ＳＶ１６４（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２）およびＳＶ１６４  ＰppsA−ＳＤφ10−ｐｃｋＡ（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２）株の両方を、アンピシリン３０μｇ／ｍｌおよびストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを添加した栄養ブロス３ｍｌ中で３７℃で振とうしながら一晩培養した。得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中のテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する発酵培地３ｍｌに接種して、２５０ｒｐｍでロータリーシェーカーで３７℃で４８時間培養した。
【００７２】
発酵培地の組成を表１に示す。
【００７３】
【表１】
0004500980.tif 000002
【００７４】
培養後、培地中に蓄積したＬ−トリプトファンの量をＴＬＣで定量した。蛍光指示薬なしのＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層でコートした１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を使用した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝１６：１６：３：９（ｖ／ｖ）で展開した。アセトン中のニンヒドリンの２％水溶液を可視化試薬として使用した。
【００７５】
結果を表２に示す。
【００７６】
【表２】
0004500980.tif 000003
【００７７】
表２からわかるように、ｐｃｋＡ遺伝子発現の増強は、ＳＶ１６４（ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ）株のトリプトファン生産性を改善した。
【００７８】
本発明を、それらの好ましい実施形態を参照して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、等価物を使用することができることは、当業者には明らかであろう。外国の優先権書類ＲＵ２００３１０９４７７号を含む本明細書中で引用した参照文献はすべて、その全体が参照により本出願の一部として取込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、芳香族Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増強することができ、前記菌株を用いて芳香族Ｌ−アミノ酸を生産する方法が提供される。本発明は、発酵産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ｐｃｋＡ遺伝子の上流にある構築した染色体領域の構造を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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