(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えによって結合したAβおよびPPIシャペロンを含む可溶性Aβ-シャペロン複合体の製造方法であって：
組換えによって結合したAβおよびPPIシャペロンを含むAβ-シャペロン複合体を可溶化する工程、
およびバッファーを生理的条件に調節する工程を含み、
ここで、形成されたAβ-シャペロン複合体は、7.4のpHを有し、20 mMリン酸ナトリウムおよび150 mM塩化ナトリウムからなる溶液中で測定した場合に少なくとも100 nMまで溶解でき、該生理的条件が、5.0〜8.5のpHおよび10〜200mMの塩濃度であり、該PPIシャペロンがFkpA、SlyDおよびトリガー因子からなる群から選択される、製造方法。
【請求項２】
7.4のpHを有し、20 mMリン酸ナトリウムおよび150 mM塩化ナトリウムからなる溶液中に少なくとも100 nMまで溶解できる複合体であって：
Aβ、および
ペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンを含み、
ここで、Aβとペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンとが組換えによって結合しており、該ペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンがFkpA、SlyDおよびトリガー因子からなる群から選択される、複合体。
【請求項３】
7.4のpHを有し、20 mMリン酸ナトリウムおよび150 mM塩化ナトリウムからなる溶液中に少なくとも100 nMまで溶解できる組換えポリペプチドであって：
Aβ、
ペプチド性リンカー、および
ペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンを含み、該ペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンがFkpA、SlyDおよびトリガー因子からなる群から選択される、組換えポリペプチド。
【請求項４】
AβペプチドがAβ（1〜40）、Aβ（1〜42）およびAβ（1〜43）からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
イムノアッセイにおける請求項２記載のAβ-シャペロン複合体または請求項３記載の組換えポリペプチドの使用。
【請求項６】
請求項２記載の可溶性Aβ-シャペロン複合体または請求項３記載の組換えポリペプチド、およびAβ測定を行うための補助試薬を含む試薬の少なくとも1つの構成物を含むキット。
【請求項７】
AβペプチドがAβ（1〜40）、Aβ（1〜42）およびAβ（1〜43）からなる群から選択される、請求項２記載の可溶性複合体。
【請求項８】
AβペプチドがAβ（1〜40）、Aβ（1〜42）およびAβ（1〜43）からなる群から選択される、請求項３記載の組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病（AD）の診断に関する。本発明は特に、可溶性Aβ-シャペロン複合体の生成、ならびにかかるシャペロン-Aβ複合体の、特にイムノアッセイにおけるAβの検出における有利な使用、および免疫原としてのその使用を教示する。
【０００２】
背景
アルツハイマー病（AD）は、徐々に甚大な精神的不全をもたらし、ついには死をもたらす進行性の記憶、認識、理論、判断および情動安定性の喪失で臨床的に特徴付けられる変性脳障害である。ADは、高齢のヒトにおける進行性精神的不全（痴呆）の非常に一般的な原因であり、米国で4番目に一般的な医学的死因を表すと考えられている。ADは、世界中の全ての人種および民族で見られ、現在および未来の公衆衛生の主な問題をもたらす。
【０００３】
ドイツでは、約65,000件のADが、毎年新たに診断される。該疾患は、現在米国だけで約200万〜300万人が罹患していると推定されている。ADは現在不治である。効果的にADを予防するか、またはその症状もしくは進行を後退させる処置は、現在知られていない。
【０００４】
ADを有する個体の脳は、老人斑と呼ばれる特徴的な病変および神経細線維もつれを示す。これらの病変の多数は、一般的に、AD患者の記憶および認知の機能に重要なヒト脳のいくつかの野で見られる。より制限された解剖学的分布におけるより少ない数のこれらの病変が、臨床的ADを有さない高齢のヒトの脳に時々見られる。老人斑およびアミロイド血管症はまた、ある年齢を超えた21トリソミー（ダウン症候群）を有する個体の脳、およびダッチ型（HCHWAD）のアミロイドーシスを有する遺伝性脳出血を特徴付ける。
【０００５】
現在のところ、ADの確定的な診断は、通常該疾患で死亡した患者の脳組織、またはまれに、侵襲性神経外科処置の過程で取られた小さい生検された脳組織の試料における前述の病変の観察を要する。ADおよび上述の他の障害に特徴的な老人斑および脈管内アミロイド沈着（アミロイド血管症）の主な化学的構成物は、もともとアミロイドβペプチド（Aβ）、または時々βAP、AβPまたはβ/A4と呼ばれる約39〜43アミノ酸の、およそ4.2キロダルトン（kD）のタンパク質である。現在のところ、名称Aβが、このポリペプチドを記述するのに一般的に認められている。
【０００６】
Aβは、Glenner, G.G.およびWong, C.W., Biochem. Biophys. Res. Commun. 120 (1984) 885-890で最初に精製され、報告された部分的なアミノ酸配列であった。最初の28アミノ酸に関する単離方法および配列データは、米国特許第4,666,829号に記載されている。40を超える数のアミノ酸を有するAβの形態は、Kang, J.ら, Nature 325 (1987) 733-736によって最初に報告された。
【０００７】
Roher, A.E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 10836-10840は、Aβ（1〜42）が有意な量の異性体化およびラセミ化アスパルチル残基を有する神経炎性局面の主な構成物（90％）であることを示した。該筆者らはまた、Aβ（17〜42）もまた散在性の斑において支配的（70％）であり、一方でAβ（1〜40）が髄膜血管斑の主な構成物であり、全Aβの60％を含み、実質の脈管内では沈着Aβ（1〜42）は全Aβの75％に相当することを示した。
【０００８】
Iwatsubo, T.ら, Neuron 13 (1994) 45-53は、Aβ42（43）陽性老人斑が散発性AD脳におけるAβの主な種であることを示した。
【０００９】
ここ数年の間に行われた分子生物学的およびタンパク質化学的分析によって、Aβは、通常、ヒトを含む種々の動物の多くの組織中で細胞によって産生される、アミロイド前駆体タンパク質（APP）と呼ばれる大いにより大きい前駆体タンパク質の小さい断片であることが示された。APPをコードする遺伝子の構造の知識によって、Aβが、APPのカルボキシル末端から、α、βおよびγセクレターゼと呼ばれる一連の酵素によって切断されたペプチド断片として生じることが立証された。Aβ断片がAPPから切断されて、その後アミロイド斑として脳組織中ならびに脳および髄膜の血管の壁に沈着する正確な生化学的機構は、現在のところ知られていない。
【００１０】
いくつかの方向の根拠により、進行性の脳でのAβの沈着は、ADの病因において、重要な役割を果たし、認知の症状に数年または数十年先立つことができる（総説として、Selkoe, D.J., J. Neuropath. and Exp. Neurol. 53 (1994) 438-447; およびSelkoe, D.J., Neuron 6 (1991) 487参照）ことが示唆される。
【００１１】
基礎となるADの機構の理解においてなされてきた前進にもかかわらず、該疾患の診断で用いるための方法を開発する必要が未だある。
【００１２】
多数の生化学的電子顕微鏡および免疫化学的研究によって、Aβは正常なpHの生理的溶液中で高度に不溶性であることが報告された。例えば、Glenner, G.G.およびWong, C.W., Biochem. Biophys. Res. Commun. 122 (1984) 1131-1135; Masters, C.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 4245-4249; Selkoe, D.J.ら, J. Neurochem. 46 (1986) 1820-1834参照。
【００１３】
さらに、この不溶性は、親タンパク質（APP）を細胞の脂質膜中に固定する領域の一部を構成するある範囲の疎水性アミノ酸を含むAβのアミノ酸配列から予測され、該アミノ酸配列と一致する。APPのAβ部分等の疎水性、脂質固定タンパク質は、細胞膜または膜断片と関連し続けていると予測され、したがって生理的細胞外液中に存在しないと予測される。前述の研究および他の多くから、生理的溶液中のAD脳アミロイド沈着から精製された天然のAβ、またはAβ配列を含む合成ペプチドの不溶性が報告されている。脳アミロイド沈着からのAβの抽出およびその後の可溶化には、強力な、非生理的溶媒および変性剤の使用が必要であった。
【００１４】
ヒト組織の細胞外液を模倣した生理的緩衝化塩溶液は、一様にAβを可溶化できなかった。
【００１５】
イムノアッセイは一般的に、生理的pHで行われる。したがって、生理的バッファー条件で可溶性のポリペプチドは、例えばELISA（酵素結合イムノソルベント検定法）等の種々のイムノアッセイ方法において広範に、例えば特定の疾患の診断およびスクリーニングに用いられる。
【００１６】
生理的バッファー条件で不溶性なために、および粘着性の性質のために、Aβペプチドはイムノアッセイに用いにくい。例えば、サンドイッチアッセイ形式において、Aβは扱いにくい。なぜなら、Aβは集合しやすく、沈殿しやすくさえあるからである。粘着性の性質のために、Aβはまた、非特異的結合による誤った結果を導き得る。
【００１７】
強力にカオトロピックな試薬または適切な界面活性剤によってAβを可溶化することができるが、かかる方法で可溶化された物質は、診断用手段としての限られた役にしか立たない。
【００１８】
生理的バッファー条件におけるAβの不溶性は、さらにこのタンパク質を、通常の（生）化学的手順の非常に困難な標的にする。非常に大部分の「標識化学」、すなわち標識、例えばマーカー群のポリペプチドへの結合に用いられる化学的手順は、求核化学に基づき、したがって約pH6〜約pH8のpH領域にやや制限され、そのため多少生理的なバッファー条件でのみ作用する。これらの通常の手順は、例えば「Bioconjugation」, M. AslamおよびA. Dent編, McMillan Reference, London (1998), pp.216-363のAslam, M.およびDent, A., The preparation of protein-protein conjugatesに記載されるように、適切に働かないか、またはAβペプチドを用いて行うことが困難である。
【００１９】
したがって、Aβを容易に溶解できる形態、Aβが例えば生理的pHで可溶性で、溶液中で安定で、かつ／または生成および／または操作に便利な形態で提供する必要が非常に大きい。
【００２０】
本発明の課題は、Aβが、生理的バッファー条件で容易に溶解できる形態で提供され得るかどうかを調べることであった。
【００２１】
本発明者らは、折りたたみヘルパー（folding helper）、例えばペプチジルプロリルイソメラーゼ（PPI）クラスの多くのメンバー、特にFKBPファミリーのメンバーが、触媒活性を示すだけでなく、アミロイド生成性タンパク質、つまりより一般的にはAβペプチドのように集合しがちなタンパク質の可溶性に対して強烈で有益な効果を引き起こすことを見出した。それらは、そうでなければ（すなわち、シャペロンされていないか、単離された形態で）集合しがちなタンパク質と可溶性複合体を形成することによってそのようにする。生理的条件下でほとんど溶けないかまたは不溶性のAβは、一旦適切なPPIシャペロンとの複合体の形で存在すれば、穏やかな生理的条件下（すなわち、界面活性剤またはカオトロピック剤等の添加物を可溶化する必要がない）で可溶性であるとわかった。そのため、本発明者らは、例えばAβ（1〜42）ペプチド（そうでなければ集合しがちな）タンパク質およびSlyD、FkpAまたは他のFKBPを可溶性付与シャペロンとして含む可溶性Aβ-シャペロン複合体を生成することができた。
【００２２】
AβペプチドおよびPPIクラスシャペロンを含む可溶性複合体は、例えばAβペプチドおよびPPIクラスシャペロンのいずれも含む単一の組換えタンパク質から得ることができる。Aβおよびシャペロンのペプチジルプロリルイソメラーゼクラスから選択されるシャペロンを含む組換えタンパク質を説明する。
【００２３】
最も興味深いことに、AβおよびPPIシャペロンのいずれも含む融合タンパク質は、例えば容易に可溶化および再生され得、例えば複合体の便利な標識ができるようになる可溶性分子内Aβ-シャペロン複合体を形成することが見出されている。
【００２４】
イムノアッセイにおける標準物質として使用するために、容易に溶解できる形態でAβを提供することが今や可能である。また、標識によってAβ抗原が修飾されたり悪影響を受けたり（例えば立体構造に関して）しないように、シャペロンのみが標識されている標識シャペロン-Aβ複合体を生成することもできる。
【００２５】
本発明者らが本明細書中に記載するAβ-シャペロン複合体は、用いられる検出形式に関係ない、イムノアッセイのための可溶性標識Aβペプチドを生成する便利な手段を提供する。
【００２６】
AβおよびSlyDを含む新規の複合体は、例えば生理的条件下で容易に溶解でき、便利なpH範囲で容易に標識され得、免疫学的技術によるAβの検出または免疫化に大いに有利に用いられ得る。
【００２７】
詳細な説明
本発明は、共有結合したAβおよびPPIシャペロンを含む可溶性Aβ-シャペロン複合体の製造方法であって：該ポリペプチドを可溶化する工程、およびバッファーを生理的条件に調節する工程を含み、ここで、形成されたAβ-シャペロン複合体は、7.4のpHを有し、20 mMリン酸ナトリウムおよび150 mM塩化ナトリウムからなる溶液中で測定した場合に少なくとも100 nMまで可溶性である製造方法に関する。
【００２８】
本発明のAβペプチドまたは「Aβ」は、Aβのアミノ酸位38、39、40、41、42または43で終わるAβ分子のC末端を含む少なくとも20個の連続したアミノ酸長のAPPの任意の断片であり得る。より好ましくは、Aβペプチドは少なくとも30個のアミノ酸長である。好ましくは、AβはAβのアミノ酸１で始まってC末端で終わる全長Aβである。好ましいC末端は、それぞれAβ残基40、42または43で終わるペプチドである。Aβのアミノ酸１からアミノ酸42までのアミノ酸（＝Aβ（1〜42））およびAβのアミノ酸１からアミノ酸43までのAβ（＝Aβ（1〜43））を含むAβ形態が特に好ましい。
【００２９】
下記で、Aβは時々「標的タンパク質」とも呼ばれる。
【００３０】
非ヒトの他の哺乳動物種由来のAβおよび天然に存在するか、または合成で生成されたAβのバリアントもまた大いに有利に用いられ得、また本発明に含まれることは、当業者に明らかである。ヒトAβおよび自然に存在するそのバリアントが最も好ましい。
【００３１】
タンパク質は、20 mMリン酸ナトリウムpH 7.4、150 mM NaClからなるバッファーに50 nM以下の濃度で可溶性である場合、「本質的に不溶性」であると見なす。Aβはかかるバッファーに本質的に不溶性であり、集合体および／または沈殿を形成する。
【００３２】
しかしながら、本発明のAβ-シャペロン複合体は、20 mMリン酸ナトリウムpH 7.4、150 mM NaClからなるバッファーに「可溶性」である。かかるバッファーに、標的タンパク質Aβは、Aβ-PPIシャペロン複合体に含まれる場合、100 nM以上の濃度で可溶性である。
【００３３】
用語「複合体」は、Aβに対応するペプチドドメインおよびシャペロンに対応するペプチドドメインが互いに相互作用し、それによってシャペロンがAβに可溶化効果を付与することを示すために用いられる。
【００３４】
可溶性シャペロン-標的タンパク質複合体の生成は、可溶化バッファー状態から、すなわち標的タンパク質およびシャペロンのいずれも可溶性であるバッファーから始まる。適切なバッファーは、「非生理的」または「可溶化」バッファーと呼ばれ得、標的タンパク質およびPPIシャペロンのいずれもが変性していないか、または少なくとも不可逆的に変性していないという要件を満たさなければならない。かかるバッファー条件から開始すると、シャペロンは標的タンパク質に結合し、非生理的条件から生理的条件へのバッファー条件の変化が、標的タンパク質の沈殿なしに可能である。
【００３５】
適切な（非生理的）バッファー、すなわち標的タンパク質およびPPIシャペロンのいずれもが可溶性であるバッファーは、高pHもしくは低pH、または高カオトロピック塩濃度またはこれらの組み合わせを使用する。
【００３６】
シャペロンおよびAβペプチドは別々のポリペプチドとして用いられ得るが、本発明者らは、両方のタンパク質を共有結合させることが有利であることを観察した。かかる共有結合は、従来の化学的架橋手順によって可能である；しかしながら、好ましくは、共有結合はAβペプチドおよびシャペロンを含む組換えポリペプチドを生成することによって達成される。
【００３７】
さらに好ましい態様において、本発明は、組換え的に結合されたAβおよびペプチジルプロリルイソメラーゼクラスから選択されたシャペロンタンパク質を含むタンパク質を、適切なバッファー条件下で可溶化する工程、ならびにその後バッファーを生理的条件に調節する工程を含む、可溶性Aβ-シャペロン複合体の生成方法に関する。このように、7.4のpHを有し、20 mMリン酸ナトリウムおよび150 mM塩化ナトリウムからなるバッファーに少なくとも100 nMまで可溶性である分子内複合体が得られる。最も好ましくは、この方法は、いわゆる封入体から開始して行われる。
【００３８】
PPIシャペロンおよびAβを含む分子内複合体を生成する場合には、可溶化バッファーは、好ましくはやや高濃度のカオトロピック塩、例えば6.0 M塩化グアニジニウムを有する、約7.8のpHのバッファーである。再生に際して、標的タンパク質はその天然様構造および分子内可溶性複合体形態をとる。
【００３９】
本発明は、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（PPIまたはPPIase）と呼ばれる折りたたみヘルパーのクラス由来のシャペロンの使用を教示する（Dartigalongue, C.およびRaina, S., Embo J. 17 (1998) 3968-3980と比較）。このファミリーの周知の例は、CypA、PpiD（Dartigalongue, C.およびRaina, S.,前掲; Schmid, F.X., Molecular chaperones in the life cycle of proteins, A.L. FinkおよびY. Goto編, Marcel Decker Inc., New York (1998), pp.361-389）、FkpA（Danese, P.N.ら, Genes Dev. 9 (1995) 387-398）およびトリガー因子（Crooke, E.およびWickner, W., Proc. Natl. Sci. USA 84 (1987) 5216-5220; Stoller, G.ら, Embo J. 14 (1995) 4939-4948）と呼ばれるメンバーである。
【００４０】
ペプチジルプロリルイソメラーゼは、3つのファミリー、パルブリン（parvuline）（Schmid, F.X.,前掲; Rahfeld, J.U.ら, FEBS Lett. 352 (1994) 180-184）、シクロフィリン（Fischer, G.ら, Nature 337 (1989) 476-478、およびFKBPファミリー（Lane, W.S.ら, J. Protein Chem. 10 (1991) 151-160）に再分される。FKBPファミリーは、興味深い生化学的特性を示す：このメンバーは、もともとマクロライド系抗生物質、例えばFK 506およびラパマイシンに対する結合能によって同定された（Kay, J.E., Biochem J.314 (1996) 361-385）。
【００４１】
いくつかのプロリルイソメラーゼは、種々の機能の種々のサブユニットまたはモジュール、例えば酵素活性を示すモジュールおよびシャペロンまたは結合活性を示すモジュールを含む。かかるFKBPファミリーのモジュールメンバーは、FkpA（Ramm, K.およびPluckthun, A., J. Biol. Chem. 275 (2000) 17106-17113）、SlyD（Hottenrott, S.ら, J. Biol. Chem. 272 (1997) 15697-15701）およびトリガー因子（Scholz, C.ら, Embo J. 16 (1997) 54-58）を含む。好ましくは、シャペロンのPPIクラスのFKBPファミリーのメンバーが用いられる。
【００４２】
さらなる態様において、真核生物由来のホモログを用いるのが好ましく、ヒト由来のPPIaseを用いるのが非常に好ましい。なぜならこれらのPPIaseはヒト血清由来の抗体によって認識されないはずであり、そのため血清学的分析（すなわちヒト抗体の検出に基づく分析）に干渉しないはずだからである。
【００４３】
いつも分子シャペロンの完全な配列を用いなければならないわけではないことは、周知であり、理解されている。必要な能力および機能を依然として有するシャペロンの機能的断片（いわゆるモジュール）もまた用いられ得る（WO 98/13496と比較）。
【００４４】
例えば、FkpAは、不活性な前駆体分子として細菌の細胞質ゾル中で合成され、細胞質膜を横切って転位されるペリプラズムのPPIである。FkpAの活性型（成熟FkpAまたはペリプラズムのFkpA）は、シグナル配列（アミノ酸1〜25）を欠き、したがって前駆体分子のアミノ酸26〜270を含む。FkpAに関して関連のある配列情報は、公共のデータベース、例えば「SWISS-PROT」から、受託番号P 45523で容易に得ることができる。
【００４５】
FkpAと近縁な関係にあるもの、すなわちSlyDは、触媒およびシャペロン機能を担う構造化N末端ドメイン、ならびに非常にヒスチジンおよびシステイン残基に富む、主に構造化されていないC末端からなる（Hottenrott, S.ら, J. Biol. Chem. 272 (1997) 15697-15701）。本発明者らは、アミノ酸1〜165を含む、C末端がトランケートされたSlyDのバリアントが効率的にAβに対するその可溶化機能を発揮することを見出した。野生型SlyDの場合と異なり、ジスルフィドシャッフリングを損なう危険性は、用いられるトランケートされたSlyDバリアント（1〜165）においてうまく回避される。
【００４６】
上で検討したシャペロンのバリアントは、1つまたは数個のアミノ酸置換または欠失を有し、本発明の方法を行うのにも用いられ得る。
【００４７】
勿論、本発明は具体的に言及したペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのメンバーの使用に制限されず、同じシャペロンのクラス由来だが異なる細菌の種由来のシャペロンを用いても行われ得る。
【００４８】
代替の供給源由来の適切なシャペロンおよびPPIシャペロンの適切な断片または変異体は、実施例に記載されるような手法を用いて容易に選択され得る。PPIシャペロンの好ましい代替の供給源は、ペスト菌、コレラ菌、パスツレラ・ムルトシダおよび梅毒トレポネーマである。
【００４９】
本発明の好ましい態様において、結合能のあるPPIaseシャペロンは、細菌の細胞質ゾルで高発現の遺伝子産物を産生する方法でAβペプチドに組換え的に結合される。結合能のあるPPIaseは、本発明で言及される場合、その触媒的PPIase活性と無関係に、少なくとも、広範なAβペプチド基質（すなわち、基質結合またはシャペロンモチーフ）への結合を媒介する機能単位を含む。
【００５０】
モジュラーPPIが優先的に、変性したまたは部分的に変性したタンパク質に結合することが知られている（例えば、Scholzら, 前掲）。現在、PPIaseがタンパク質の折りたたみを触媒するだけでなく、かかるタンパク質と安定な複合体を形成する著しい特性を有し、そのため可溶性を付与することが見出されている。驚くべきことに、研究されたPPIase（TF、SlyDおよびFkpD等）は天然様Aβペプチドに結合し、そのため、例えば該ペプチドを可溶化する。
【００５１】
モデル生体分子間、例えば抗体と抗原との間の複合体形成に関する情報は多量にある（総説として、Braden, B.C.およびPoljak, R.J., Faseb J. 9 (1995) 9-16参照）。通常、複合体の形成および解離は平行して起こる；複合体および結合パートナーは自由平衡状態で（in free equilibrium）同時に存在する。同様に、本発明で説明されているように、PPIシャペロンと、Aβのようなアミロイド生成性タンパク質との間の複合体に関しても同じことが言えるようである。
【００５２】
複合体の形成は、本発明で説明されているように、特に重要な特性である。なぜなら、PPIシャペロンと、それ自体では本質的に不溶性なタンパク質であるAβとの間の複合体は、例えば生理的バッファー条件下で容易に溶解できるということが現在見出されているからである。生理的条件下で可溶性な抗原は、診断への応用に大いに有利である。これらは、例えば標準物質として、直接使用され得る。さらに、これらは適切なマーカーまたは適切な結合基に結合させ得る。
【００５３】
アミロイド生成性ペプチドの典型的な例として、Aβペプチドは非常に操作しにくく、極めて珍しい特性を示す。すでに言及したように、Aβ分子の最も重要な特性の1つは、生理的バッファー条件下での不溶性である。
【００５４】
通常生理的バッファー条件は、動物の血漿または血清中に見られる塩およびpH条件に相当すると理解され、約7.4のpH値および約150 mMの塩濃度で定義される。本発明のAβ-シャペロン複合体は、これらのバッファー条件下で容易に溶解できる。その中に存在するAβは、免疫学的に活性があり、そのため天然様構造を示す。適切な界面活性剤の非存在下、または適切な界面活性剤による前処理なしでAβは生理的バッファー条件下（例えば、20 mMリン酸ナトリウム pH 7.4、150 mM NaCl）で本質的に不溶性であるのに対し、記載される本発明の複合体は、適切なプロトコールに従った再折りたたみの後に、容易に溶解できる。Aβは、本発明の複合体に含まれている場合、少なくとも100 nMの濃度で、好ましくは1μM以上の濃度で、最も好ましくは10μM以上の濃度で溶解できる。このように、溶解度は低いナノモル濃度から約マイクロモル濃度まで実質的に上昇する。
【００５５】
本発明の範囲をよりよく理解するために、可溶化および再生に適用されるバッファー条件は必要に応じて変更され得、適切であり得、かつ本発明の過度な制限として理解されてはならず、本発明は広範囲のバッファー条件に渡ってうまく行われることは、強調する必要がある。
【００５６】
生理的バッファーの全体の塩濃度は、シャペロン-Aβ複合体が解離しないように注意が払われ、Aβが溶液中に留まっている限りは重要でない。好ましくは、生理的バッファーは、少なくとも10 mMかつ多くとも200 mMのバッファー系を含む。バッファー構成物の残りは、あるとしても、有意なバッファー容量を有さない塩、例えば塩化ナトリウムであり得る。生理的バッファーは、好ましくは20〜500 mMの間、より好ましくは50〜300 mMの間、最も好ましくは100〜200 mMの間の塩濃度を有する。
【００５７】
本発明の方法において、生理的バッファーは、5.0〜8.5の範囲のpH値を有する範囲であり得；より好ましくはかかるバッファーの範囲はpH5.5〜pH8.3の間である。さらにより好ましくは、かかる生理的バッファー条件は、上に示されたような塩濃度および6.0〜8.0の間のpH値によって定義され；最も好ましくは、かかる生理的バッファーのpHは6.5〜7.8の間である。
【００５８】
本発明の好ましい態様は、組換えによってペプチジルプロリルイソメラーゼに結合したAβペプチドを含む可溶性Aβ-シャペロン複合体の生成方法であって：該方法は該組換えAβ-シャペロンポリペプチドの可溶化およびバッファーの生理的条件への調節を含む。そうした場合にAβペプチドは単独で、本発明の組換えタンパク質の一部として自然に沈殿するのに、これは驚くべきことに上記方法において溶液中に留まる。この重要な発見は、Aβペプチドとシャペロンとの間の分子内複合体の形成のためである見込みが最も高い。
【００５９】
大腸菌におけるAβの組換え生成の場合、組換え的に生成されたAβは、好ましくは封入体の形で得られる。この物質は、高度にカオトロピックな試薬、例えば7.0 M塩化グアニジニウム（guanidinium tchloride）を用いて可溶化される。Aβポリペプチドは、これらの条件下で、大部分が構造化されていない。適切な工程でバッファーを生理的バッファー条件に変えることにより、溶液中のAβは、その天然様構造として認められるものを呈する。（集合体のような）迷光粒子（light-straying particles）に関する情報は、標準的UVスペクトルから容易に得ることができる。
【００６０】
ここで強調するべき重要なことは、Aβ-ペプチドシャペロン複合体内のAβペプチドは、本発明によると、生理的バッファー条件への移行の間に、天然様折りたたみと見なされるものを採用することである。逆にAβペプチドは、カオトロピック剤によって中性pHで可溶化され、大部分が構造化されておらず、そのため秩序立った立体構造エピトープを失っている。また、代替的に界面活性剤を用いることによってAβペプチドを可溶化することも可能である。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をうまく用いてAβが可溶化された。しかしながら、かかる「SDS可溶性物質」は、例えばイムノアッセイにおける使用のために選り抜きの物質ではない。さらに（上述のように）かかるイムノアッセイは好ましくはAβの立体構造エピトープと反応する抗体を利用し、界面活性剤が立体構造エピトープを部分的に廃することは考慮しないわけにはいかない。
【００６１】
好ましくは、本発明のAβ-シャペロン複合体は、そこに含まれるAβが天然様に折りたたまれていることを特徴とする。かかる複合体中の天然様に折りたたまれたAβは、例えば所望の免疫学的または物理的特性を示す。
【００６２】
可溶性シャペロン-Aβ複合体の生成は、非生理的バッファー条件から始まる。「非生理的」バッファーは、二つの要求、(a)Aβの変性がその天然様構造と可逆的であること、および(b)PPIシャペロンの変性がその天然様構造と可逆的であること、を満たさなければならない。かかるバッファー条件から開始して、シャペロンがアミロイド生成性標的タンパク質に結合し、非生理的条件から多少生理的な条件へのバッファー条件の変化が、アミロイド生成性Aβペプチドを含むポリペプチドの沈殿なしに、可能である。
【００６３】
シャペロンは通常変性タンパク質に結合してそれらに作用し、それによってそれらの正しい（再）折りたたみを容易にするのに対し、本発明の基礎となる状態は著しく異なる。シャペロン機能の習慣的な見解と異なり、本発明の方法において、シャペロンは、そうでなければAβが不溶性で集合および／または沈殿するバッファー条件で、天然様に折りたたまれたタンパク質に結合し、このタンパク質を安定化するようである。
【００６４】
本発明の好ましい態様において、PPIシャペロンは、FkpA、SlyDおよびトリガー因子を含む群から選択される。
【００６５】
特にFkpAまたはSlyDがAβの可溶性を向上させ、それとやや安定な複合体を形成することが見出されている。したがって、さらに好ましい態様は、シャペロンがFkpAおよびSlyDを含む群から選択されることを特徴とする。最も好ましくは、シャペロンSlyDは、Aβに可溶性を付与するために用いられる。
【００６６】
さらに上述のように、シャペロンの断片もまた、所望の機能を引き起こすのに用いられ得る。FKBPのような、触媒モジュールおよび結合モジュールを含むモジュラーシャペロンの場合、かかる断片が少なくとも結合ドメインを含むこと、またはかかる断片が少なくとも結合ドメインに匹敵する機能を本質的に示すことが好ましい。PPIシャペロンの好ましい機能的断片は、例えば大腸菌由来のEcSly D（1〜165）である。EcSlyDに対応するSly Dホモログもまた、本発明の好ましい態様を表す。
【００６７】
FKBP12は、FKBPファミリーのヒトのメンバーであり、本質的にPPIaseの触媒イソメラーゼドメインを含む。これはさらなるポリペプチド結合ドメインを欠くために、FKBPファミリーの他のメンバーと比較して実質的に減少した、変性されたかまたは部分的に折りたたまれたタンパク質基質に対する結合アフィニティーを示す。FKBP12の変性および再折りたたみは可逆的過程であることが示されている（Egan, D.A.ら, Biochemistry 32 (1993) 1920-1927; Scholz, C.ら, J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707）。本発明者らは、FkpA（25〜270）およびSlyD（1〜165）の再折りたたみおよび変性が可逆的であり、そのため本明細書中に記載される方法の中枢の要件を満たすことを見出す。
【００６８】
可溶性Aβシャペロン複合体はまた、（例えば組換え技術によって生成された）PPIシャペロンを、従来のペプチド合成によって得られたか、または組換えによって生成されたかのいずれかのAβと混合することによっても調製され得る。しかしながら、上述のように、好ましくは、かつ極めて容易に、PPIシャペロンおよびAβを含む組換えポリペプチドの適切な処理によってAβが可溶性の形態で得られる。
【００６９】
好ましい態様では、本発明は、Aβ、およびペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンを含有し、ここでAβおよびペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンが共有結合している、7.4のpHを有しかつ20mMリン酸ナトリウムおよび150mM塩化ナトリウムからなる溶液に少なくとも100nMで可溶性である複合体に関する。
【００７０】
複合体形成は、解離および再会合が平行して起こる動的過程である。これは、例えば、SlyDとAβとの間の分子間会合および分子内（例えば、融合構築物における）会合の両方について真実である。Aβは生理的バッファーから沈殿するので、両方のパートナーの濃度は、非臨界または非凝集濃度の遊離形態のAβのみが存在すること、および大部分のAβが結合し、Aβ-シャペロン複合体の形態で安定であることを確実にするように選ばれなければならない。
【００７１】
両方のドメインが共有結合する場合、1:1(Aβ対PPIシャペロン)の比が可溶性複合体を形成するのに十分であることが見出されている。Aβ対シャペロンの最も有利なモル比は、１：１および１：２である。
【００７２】
組換え結合形態のAβペプチドおよびPPIシャペロンを含有する可溶性複合体は、本発明による非常に好ましい態様を表す。かかる組換えポリペプチドに含まれる最も好ましいAβペプチドは、Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、およびAβ(1-43)からなる群より選ばれる。
【００７３】
少なくとも１つのAβドメインおよび少なくとも１つのPPI-シャペロンドメインを含有する組換えタンパク質に関して、非生理的から生理的バッファー条件への移行は、種々の方法で達成されうる。Aβドメインと、例えばSlyDドメインとの間の可溶性分子間複合体は、透析、迅速な希釈またはマトリックス支援再折り畳みによって非生理的バッファー条件を生理的バッファー条件に調整することにより容易に得られる。マトリックス支援再折り畳みは好ましい方法の代表である。可溶性Aβ-シャペロン複合体を含有する、このようにして得られる溶液は、さらなる修飾のために直接使用されうる。
【００７４】
好ましくは、本発明の組換えポリペプチドは、１つのシャペロンドメイン当たり１つのAβドメインを含む。なおさらに好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのAβドメインおよび少なくとも２つのPPI-シャペロンドメインを含有する組換えタンパク質に関する。１つのAβドメインおよび２つのPPI-シャペロンを含有する組換えポリペプチドもまた好ましい。
【００７５】
本発明による可溶性Aβ-シャペロン複合体を得るために使用される組換えポリペプチドは、標準的な分子生物学技術により発現される。好ましくは、シャペロン遺伝子は、Aβおよびシャペロンの遺伝子情報の両方ならびに任意に適切なペプチドのリンカー配列の遺伝子情報を含有する発現ベクターの標的タンパク質遺伝子の上流のフレームに配置される。かかる組換え融合タンパク質の大規模産生のための好ましい宿主は大腸菌である。
【００７６】
好ましい態様では、本発明は、Aβおよびシャペロンのペプチジルプロリルイソメラーゼクラスから選択されたシャペロンを含有する可溶性複合体に関する。組換えポリペプチドの最も好ましいPPIシャペロン部分は、任意の輸出シグナルペプチド（対応する前駆体分子の）を欠失し、成熟PPIシャペロンに対応する。この好ましい態様では、組換えタンパク質は機能性シグナル配列を欠失しているので、遺伝子産物は、細菌細胞質ゾルにおいて蓄積する。
【００７７】
例えば、組換え産生SlyD-Aβに含まれるAβの顕著な特徴は、「シャペロンされていない」Aβと比べて優れた溶解性である。興味深いことに、「カオトロピック材料」(すなわち、6.0〜7.0M GuHCl中のSlyD-Aβ)が種々の方法で再折り畳みされ得、全て熱力学的に安定な可溶性天然様形態を生じる。再折り畳みは、透析および迅速な希釈の両方により、ならびに再生サイズ排除クロマトグラフィーまたはマトリックス支援再折り畳みにより高収量で達成される。これらの知見は、この共有結合形態において、Aβ-SlyD融合ポリペプチドは準安定なタンパク質よりも熱力学的に安定であることを示唆している。
【００７８】
組換えSlyD-Aβポリペプチドは、異なる折り畳み必要条件を有する２つのタンパク質ドメインを含有する。精製プロトコルは、初期変性工程を含むので、シャペロンの折り畳みが可逆的であることが不可欠である。実際、共有結合タンパク質複合体内のSlyDおよびAβの両方の可逆的変性および再折り畳みに関する説得力のある分光学的証拠がある。
【００７９】
Aβ、ペプチドリンカー、およびペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロンを含有し、7.4のpHを有し、20mMリン酸ナトリウムおよび150mM塩化ナトリウムからなる溶液中に少なくとも100nMで可溶性である組換えポリペプチドも好ましい。
【００８０】
かかる組換えポリペプチドのペプチドリンカー配列は、使用されるAβおよびシャペロンドメインの最適な分子内会合を確実にするように選ばれる。好ましくは、かかるリンカー配列は、約20アミノ酸長であり、柔軟性および可溶性の両方を支持するアミノ酸、例えば、グリシンおよびセリンを含有する。好ましくは、リンカーは10〜50アミノ酸長である。より好ましい長さは12〜40アミノ酸であり、最も好ましいリンカーは15〜35アミノ酸を含有する。Aβおよびシャペロンの両方は、常に近位にある（例えば、適切なリンカーによりまとまっている）。好ましい態様では、組換えポリペプチドは、柔軟性のあるリンカーを介して標的タンパク質に結合した成熟FkpAまたは情報はトランケートされたSlyD（アミノ酸１〜165）を含有する。これは、データが示すように、さらなる安定化効果をもたらす。
【００８１】
PPIシャペロンとAβとの間の分子内複合体の一部としてのAβは、可溶性であり、かつ安定であることが驚くべきことに見出された。かかる複合体のAβの改善された安定性は、さらなる利点をもたらす。例えば、完全に再生した組換えAβ-シャペロン分子を非常に容易に得ることができる。組換えタンパク質は、カオトロピック剤(例えば、塩化グアニジニウム)での処理により最初に可溶性になる。適切な生理的バッファーで平衡化したゲル濾過カラムに可溶性物質を単純に通過させることにより、共有結合タンパク質ドメインを含有する完全に再生したタンパク質が得られうる。
【００８２】
マトリックス支援再折り畳みはまた容易に、大いに好都合に適用され得る、実施例２および図２参照。非常に簡便な再生および容易な精製工程において、可溶性SlyD-SlyD-Aβ融合タンパク質は約90％の純度で得られることが示されている。
【００８３】
かかる複合体Aβ内のAβが生理的バッファー条件下、例えば、20mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムバッファー、pH7.4で、可溶性形態で存在することは、本発明の複合体の非常に重要な特徴である。遊離Aβとは異なり、かかる複合体中に含まれるAβは、粘着性でもなく、凝集傾向もない。これは、治療および診断適用に極めて有利である。好ましい態様では、本発明は、Aβペプチドおよびシャペロンのペプチジルプロリルイソメラーゼクラスから選ばれるシャペロンを含有する分子内複合体を含有し、生理的バッファー条件下で可溶性である試薬の組成物に関する。
【００８４】
天然様の折り畳まれたAβおよびシャペロンのペプチジルプロリルイソメラーゼクラスから選ばれるシャペロンを含有する可溶性複合体は、本発明の非常に好ましい態様を表す。
【００８５】
Aβでの免疫化に関して、「可溶性かつ天然様」Aβを提供することにより成される前進は全く明白である。今や初めて、可溶性かつ天然様のAβは、生理的バッファー条件下で注射に利用可能である
【００８６】
好ましい態様では、記載される可溶性複合体は、医薬として使用するための試薬の組成物を製造するために使用される。試薬の組成物は、生理的に許容されうる賦形剤と共にAβ-シャペロン複合体、および適切である場合、適切な添加物および／または従来の補助的物質を含有する。
【００８７】
Aβ-シャペロン複合体を含有する試薬の組成物を形成すること、および哺乳動物における免疫応答を引き起こすためにかかる組成物を使用することは、本発明によるさらに好ましい態様を表す。記載される複合体は、公知の他のいかなるAβ免疫原よりも大いにAβエピトープを利用可能にする。それ故、新規免疫原は、より広い免疫応答を誘導することが予測される。
【００８８】
診断手順に関して、本発明の可溶性Aβシャペロン複合体の明白な利点は、例えば、生理的バッファー条件下でのAβペプチドの増大した可溶性、および／または診断感受性における増大、および／または存在するコンフォメーションエピトープの数の増大、および／またはAβ-シャペロン複合体を容易に標識できる可能性である。
【００８９】
標識に関して、化学結合の様式およびストラテジーは、今や要求に応じて選択されうる。ポリペプチドの場合、-SH、-NH2または-COO-残基ならびにチロシンの-OH基、ヒスチジンのイミダゾール基、またはトリプトファンの複素環イミノ基を標的化する結合化学は利用可能である。いくつかの適切な結合化学が、これらの官能基の各々について公知である(Aslam, M.およびDent, A., 前出)。決まりきったタンパク質結合化学は、タンパク質が作動バッファー条件下で、例えば、約５〜8.5のpH範囲内で、可溶性であることを必要とする。
【００９０】
周知の標識は、固相結合基のようなマーカー基またはエフェクター基である。標識した可溶性Aβ-シャペロン複合体は、本発明によるさらに好ましい態様を表す。
【００９１】
標識基は、色素、化学発光基（例えば、アクリジニウムエステルもしくはジオキセタン）または蛍光色素（例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体）等の発光標識基等の任意の公知の検出可能なマーカー基から選ばれうる。標識基の他の例は、ルテニウムまたはユウロピウム複合体等の発光金属複合体、酵素（例えば、ELISAまたはCEDIA(クローン酵素ドナー免疫アッセイ、例えば、EP-A-0 061 888)に使用されるような）、および放射性同位体である。
【００９２】
エフェクター基は、例えば、バイオアフィニティー(bioaffine)結合対の１つのパートナーを含む。アッセイを行っている間、エフェクター基は、バイオアフィン結合対のもう一方のパートナーと特異的に、および好ましくは非共有結合的に相互作用する。適切な結合対の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン等のビオチンアナログ／アビジンもしくはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、およびレセプター／リガンド、例えば、ステロイドホルモンレセプター／ステロイドホルモンである。好ましい結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。ジゴキシンおよびビオチンならびにそのアナログのようなハプテンが特に好ましい。
【００９３】
免疫アッセイは当業者に周知である。かかるアッセイを行う方法および実用的応用および手順は関連する教科書に要約されている。関連する教科書の例は、Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, ”Practice and theory of enzyme immunoassays”, R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier編, Amsterdam (1990), pp. 221-278) および免疫学的検出方法を扱っている種々の巻”Methods in Enzymology”, S.P. Colowick, N.O. Caplan編, Academic Press (1980)), 特に70, 73, 74, 84, 92および121巻である。
【００９４】
本発明は、免疫アッセイにおける可溶性シャペロン-Aβ複合体の使用に関する。AβおよびPPIシャペロンを含有する可溶性複合体は、Aβペプチドの検出のための免疫アッセイにおける標準的な材料として好適に使用される。さらに好ましい態様では、AβおよびPPIシャペロンを含有する標識可溶性複合体がAβに対する抗体の検出のための免疫アッセイおいて使用される。
【００９５】
新規シャペロン-Aβ複合体は、かかる複合体のシャペロンを誘導体化する可能性を提供し、抗原(Aβ)自身の修飾を必要としない。一般に、第２の化学的部分によるポリペプチドの修飾、例えば、その分子への標識の結合は、ポリペプチドに負に影響する危険性を含むことが一般に認められている。例えば、調査中のエピトープは妥協され得るか、またはかかる標識は非特異的結合を引き起こしうる。本発明によれば、今やシャペロン-Aβ複合体内のシャペロンを特異的に誘導体化することができる。
【００９６】
免疫アッセイのような、特異的結合アッセイの分野における診断試薬は、通常、キットの形態で最もよく提供され、これは、アッセイを行うために必要とされる１つまたは複数の特異的結合剤、および助剤を含む。それ故、本発明はまた、本発明によるAβ-シャペロン複合体を含有する試薬の少なくとも１つの組成物およびAβ測定を行うための助剤を含有する免疫学的キットに関する。好ましくは、Aβ-シャペロン複合体を含有する試薬の組成物は液体形態で提供される。
【００９７】
別の態様では、AβおよびPPIシャペロンを含有する可溶性複合体はまた、ヒトまたは非ヒト動物等の被験体における免疫応答を誘発するために使用されうる。可溶性複合体は、賦形剤または担体を含みうるもの等の組成物中で被験体に投与されうる。かかる組成物はまたアジュバントを含みうる。従来のアジュバントの例としては、フロイントの不完全、フロイントの完全、Merck 65、AS-2、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール等の界面活性物質が挙げられるがこれらに限定されない。他の有用なアジュバントとしては、細菌莢膜多糖、デキストラン、IL-12、GM-CSF、CD40リガンド、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-13、IL-18または任意のサイトカインまたは細菌DNA断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
１回の投与量（投与）の可溶性複合体組成物が与えられうる。しかし、例えば１回、２回、３回またはそれより多くのブースト投与量が１回目の投与に続きうる。被験体に投与される投与の回数は、可溶性複合体組成物に対する被験体の応答に一部依存する。本発明の範囲内で、適切な回数の投与は、可溶性複合体に対して動物を免疫するのに必要とされる任意の回数を含む。
【００９９】
可溶性複合体組成物の２回目の投薬(ブースター)は、最初の投与後の約７日〜１年の間に与えられうる。１回目と２回目の投与の間の時間は、14日〜６ヶ月、21日〜３ヶ月、しばしば最初の投与後約28日〜２ヶ月でありうる。３回目の投与(２回目のブースター)は、１回目の投与後約14日〜10年、例えば、１回目の投与後約14日〜３年、しばしば約21日〜１年、非常にしばしば約28日〜６ヶ月でありうる。引き続くブースターは、２週間間隔、１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月から10年間隔で投与されうる。
【０１００】
典型的には、抗原に対して動物を免疫するのに十分である可溶性複合体の量が被験体に投与される(すなわち、「免疫学的に有効な投与量」または「治療的に有効な投与量」)。「免疫学的に有効な投与量」を達成するのに十分な量は、被験体の体重および全般的な健康状態、ならびに処方する医師または他の有資格者の判断に一部依存する。
【０１０１】
可溶性複合体の有効量は、免疫応答の誘導を達成するために動物モデルにおいて処方されうる；かかるデータは、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化するために使用されうる。投与量は、典型的には、約1fg〜約100μg、しばしば1pg〜約100μg、さらにしばしば約1ng〜約50μg、通常約100ng〜約50μgである。いくつかの態様では、投与量は約1fg〜約100μg/kg被験体体重、しばしば約1pg〜約100μg、さらにしばしば約1ng〜約50μg、通常約100ng〜約50μg/kg被験体体重である。
【０１０２】
本発明の可溶性複合体含有組成物は、種々の方法および種々の形態で投与されうる。可溶性複合体組成物は、バッファー、糖質、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤および／または防腐剤；水、油、食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液、緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤等のほぼ生理的な条件に必要とされる他の薬学的に許容されうる補助物質等の担体および賦形剤を含みうる。従来のアジュバントはまた組成物に取り込まれうる。
【０１０３】
任意の適切な担体が本発明の組成物を投与するために使用され得るが、担体のタイプは投与の形態に応じて変化する。化合物はまた、リポソーム内に封入されうる。生分解性ミクロスフェア(例えば、米国特許第5,942,252号に記載されるもの等)が担体としていくつかの場合に好都合である。
【０１０４】
滅菌濾過等の従来技術により達成されるような組成物の滅菌が望ましい。得られる水溶液はそのまま使用するために包装してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【０１０５】
本発明の可溶性複合体組成物は、注射(例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等)、吸入、局所投与、坐薬、経皮貼布の使用または経口を含む種々の方法で投与され得る。
【０１０６】
投与が注射による場合、組成物は、水溶液、好ましくはハンク溶液、リンゲル溶液、20mMリン酸塩150mM塩化ナトリウムバッファー(pH7.4)、または生理的食塩水バッファー等の生理的に適合するバッファー中に製剤化されうる。
溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の製剤化剤を含みうる。あるいは、組成物は、使用する前に、適切なビヒクル、例えば、無菌発熱物質非含有水で形成するために粉体形態でありうる。吸入送達組成物は、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用を伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアゾール噴霧でありうる。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することにより決定されうる。例えば、吸入器または注入器において使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、タンパク質の粉体混合物およびラクトースまたはスターチ等の適切な粉体ベースを含有して製剤化されうる。局所投与のために、組成物は、当該分野で周知であるように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁物等として製剤化されうる。いくつかの態様では、投与は経皮貼布による。坐剤組成物はまた、従来の坐剤ベースを含むように製剤化されうる。
【０１０７】
投与が経口である場合、組成物は、組成物と薬学的に許容されうる担体とを組み合わせることにより容易に製剤化されうる。固体担体はマンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等を含む；かかる担体は経口摂取のために錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物等の形成を可能にする。かかる製剤は、粉体、カプセルおよび錠剤でありうる；適切な賦形剤は、糖、セルロース調製物等の充填剤、造粒剤、および結合剤でありうる。
【０１０８】
結合断片(例えば、F(ab)2)および単鎖バージョンを含むポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造する方法は周知である。しかし、多くの抗原は十分な抗体応答を引き起こすことができない。ある態様では、本発明の可溶性複合体および抗原を含有する組成物は、動物に投与され、そのようにして動物における免疫応答を誘発する。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は標準的な技術によって、その後に調製される。
【０１０９】
以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。発明の意図を逸脱することなく示される手順において変更がなされうることが理解される。
【実施例】
【０１１０】
実施例１  SS-Aβ(1-42)発現ベクターの構築
シャペロンSlyDをコードする遺伝子は、大腸菌(Ec)の染色体から決まりきったクローニング手順により単離された。組換え発現のために、SlyDのアミノ酸１〜165(=EcSlyD)をコードするDNA構築物を調製した。融合パートナーとしてEcSlyD(1-165)(=SS)を２回および標的タンパク質としてAβ(1-42)を含有する発現ベクターを構築した。
【０１１１】
Novagen(Madison, WI, USA)のpET24a発現プラスミドに基づいて、以下のクローニング工程を行った。ベクターをNdeIおよびXhoIで消化し、タンデム-EcSlyDおよびAβ(1-42)を含有する半合成カセットを挿入した：
0004459819.tif 000002
【０１１２】
得られたプラスミドの挿入物を配列決定し、所望の融合タンパク質をコードしていることを見出した。
【０１１３】
挿入されたカセットの核酸配列(＝配列番号：１)を以下に示す：
0004459819.tif 000003
【０１１４】
得られた融合ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す(＝配列番号：２)：
0004459819.tif 000004
0004459819.tif 000005
【０１１５】
実施例２：SS-Aβ(1-42)融合タンパク質の産生および精製
発現プラスミドを保有する大腸菌BL21(DE3)細胞をLB培地＋カナマイシンにおいてOD600(600nmでの光学密度)が１になるまで増殖させ、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を最終濃度1mMまで添加することにより細胞質ゾル過剰発現を37℃の増殖温度で誘導した。誘導の４時間後、細胞を遠心分離により収集し(5000xgで20分)、-20℃で凍結させ、保存した。細胞溶解のために、凍結ペレットを室温の50mM Tris/HCl pH8.5, 7.0M GuHCl, 5mMイミダゾール中に再懸濁し、得られた懸濁物をPolytronic(登録商標)PT3100ホモジナイザー(Kinematica)での処理にさらに供した。遠心分離(20000xg, 4℃, 30分)および濾過後、溶解物を前述の溶解バッファーで予め平衡化したNi-NTA(ニッケル-ニトリロ三酢酸)カラムにアプライした。
【０１１６】
過剰の洗浄工程(>20カラム体積の溶解バッファー)後、マトリックス結合タンパク質を再折り畳みさせるために、カオトロピック溶解バッファーを50mMリン酸ナトリウムpH7.8, 100mM塩化ナトリウムに置換した。少なくとも10カラム体積の再折り畳みバッファーをアプライし、残存するカオトロピックまたは干渉濃縮物中にGuHClが存在しないことを確実にした。最後に、ネイティブな融合タンパク質を50mMリン酸ナトリウムpH7.8, 100mM塩化ナトリウム中の5〜500mMイミダゾール勾配を適用することにより溶出させた。タンパク質を含有する画分をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により純度について評価し、プールした。
【０１１７】
興味深いことに、SS-Aβ(1-42)は可溶性タンパク質として溶出する。Aβ(1-42)自身のよく知られた疎水性にも関わらず、組換え産生およびマトリックス再折り畳み融合タンパク質のUVスペクトルはいかなる凝集傾向も示唆しない。図１に示されるように、生理的バッファー条件中のSS-AβのUV-吸収スペクトルのベースラインは、横座標(310nmより高い)とほぼ等しく、従って自己会合または凝集現象から生じる迷光粒子は存在しないことを示す。実際、図１に示されるスペクトルの形状は、診断ツール（例えば、Aβ免疫アッセイのための標準として）または免疫原として有用であることが証明されるはずであるAβ(1-42)ペプチドを含有する可溶性の取り扱いが容易な融合ポリペプチドを指す。
【０１１８】
手短にいえば、本明細書に記載される方法は、可溶性形態の高量(>20mg融合タンパク質/大腸菌細胞集団の湿潤重量g)のAβの簡便な組換え産生を容易にする。
【０１１９】
融合タンパク質SS-Aβ(1-42)は、Ni-NTAカラムから、約150mMイミダゾールで溶出する。融合タンパク質を含有するプール画分の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により評価した。SDS-PAGEにより示されるように、単一組み合わせ産生および再生工程において得られる融合ポリペプチドの純度は、単純な単一工程クロマトグラフィープロトコル後に90％を超える(図２参照)。
【０１２０】
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、マトリックス支援再折りたたみおよびグラジエント溶出後のSS-Aβ（1〜42）のUVスペクトルである。50 mMリン酸ナトリウムpH7.8および100 mM塩化ナトリウムのバッファー中の約150 mMイミダゾール濃度でNi-NTA（ニッケルニトリロ三酢酸）カラムから溶出したAβ-シャペロン複合体。UVスペクトルは、36μMのタンパク質濃度でモニタリングされた。スペクトルの形状（特に波長領域＞300 nmにおいて）は、「シャペロンされた」アルツハイマーAβペプチドの顕著な可溶性を強調する。集合または会合減少を示す迷光効果は観察されない。明らかに、シャペロンキャリアSlyD-SlyD（＝SS）は、そうでなければ集合しがちなペプチドAβ（1〜42）に例外的な可溶性を付与する。
【図２】図２は、SDS-PAGEによって文書化されたSS-Aβ（1〜42）の精製を示す。マトリックス支援再折りたたみによって得られるようなSS-Aβ（1〜42）を、SDS-PAGEによって分析した。示されている試料は：Novagenのタンパク質標準M12（レーン１）、カオトロピック溶解後の不溶性画分（レーン２）、カオトロピック溶解後の可溶性画分（レーン３）、Ni-NTAフロースルー（flowthrough）（レーン５）、マトリックス支援再折りたたみ後のSS-Aβ（1〜42）を含む溶出プール（レーン７）である。レーン４およびレーン６には、サンプルをアプライしなかった。ゲルは、組換え的に生成された可溶性SS-Aβ（1〜42）が簡単な一段階再生／精製プロトコールによって入手可能（90％を超える驚くべき高い純度で）であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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