(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）認識種Ｂに対する少なくとも１つの結合部位を有する少なくとも１つの固定結合構成要素Ａ及び（ｂ）結合構成要素Ａに結合することが可能であり、そして基質Ｓに対する少なくとも１つの結合部位を含む、少なくとも１つの認識種Ｂを含み、結合構成要素Ａの認識種Ｂへの結合が分子対形成系の形で起こることを特徴とし、ここで、分子対形成系がピラノシル−核酸、１つ若しくはそれ以上のアミノシクロヘキシルエタン酸（ＣＮＡ）単位を有する核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は１つ若しくはそれ以上の［２−アミノ−４−（カルボキシメチル）シクロへキシル］核酸塩基を有する核酸から選択される核酸及び／又はその類似体を含むことを特徴とする、認識系。
【請求項２】
ピラノシル−核酸のピラノシル部分が、リボース、アラビノース、リキソース又はキシロースから選択されることを特徴とする、請求項１記載の認識系。
【請求項３】
核酸及び／又はその類似体が、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、１つ又はそれ以上のアミノシクロヘキシルエタン酸（ＣＮＡ）単位を有する核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは１つ又はそれ以上の［２−アミノ−４−（カルボキシメチル）シクロへキシル］核酸塩基を有する核酸から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の認識系。
【請求項４】
核酸及び／又はその類似体の核酸塩基が、プリン、２，６−ジアミノプリン、６−プリンチオール、ピリジン、ピリミジン、アデニン、グアニン、イソグアニン、６−チオグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、シトシン、イソシトシン、インドール、トリプタミン、Ｎ−フタロイルトリプタミン、ウラシル、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、ベンゾトリアゾール又はアクリジンから選択されることを特徴とする、請求項１−３のいずれか１項記載の認識系。
【請求項５】
核酸類似体が、リボピラノシルアデノシン、リボピラノシルグアノシン、リボピラノシルチミジン、リボピラノシルシトシン、リボピラノシルトリプタミン、リボピラノシル−Ｎ−フタロトリプタミン、リボピラノシルウラシル又はそれらの［２−アミノ−４−（カルボキシメチル）リボピラノシル］誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項記載の認識系。
【請求項６】
核酸及びその類似体の長さが少なくとも４−５０ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項記載の認識系。
【請求項７】
結合構成要素Ａがキャリアー上に固定されていることを特徴とする、請求項１−６のいずれか１項記載の認識系。
【請求項８】
キャリアーが、セラミック、金属、貴金属、ガラス、プラスチック、前述の成分の結晶成分又は薄層、あるいは生体分子フィラメント、セルロース、構造タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項７記載の認識系。
【請求項９】
結合構成要素Ａが、以下から選択される２つ又はそれ以上の分子種：
（ｉ）  ペプチド、ペプトイド、タンパク質、直線オリゴ糖又は多糖、核酸及びその類似体から選択される直線構成の分子；あるいは
（ｉｉ） 複素環単量体；あるいは
（ｉｉｉ）  以下から選択される非直線構成の分子：（ａ）分枝オリゴ糖若しくは多糖；又は（ｂ）抗体、及びＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）若しくはＦａｂ断片から選択されるその機能部分、
の共有結合、準共有結合又は超分子結合による結合により、キャリアー上に固定されていることを特徴とする、請求項７又は８記載の認識系。
【請求項１０】
結合構成要素Ａが、キャリアーの定められた部位に、マトリックスの形で固定されていることを特徴とする、請求項７−９のいずれか１項記載の認識系。
【請求項１１】
キャリアーの定められた部位がアドレス化されることを特徴とする、請求項１０記載の認識系。
【請求項１２】
結合構成要素Ａがキャリアーのキャリアー電極上に固定されていることを特徴とする、請求項７−１１のいずれか１項記載の認識系。
【請求項１３】
認識種Ｂが生体分子であることを特徴とする、請求項１−１２のいずれか１項記載の認識系。
【請求項１４】
生体分子が、
（ｉ）ペプチド、ペプトイド、以下から選択されるタンパク質：受容体又はその機能部分；抗体又はＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）若しくはＦａｂ断片から選択されるその機能部分；あるいは
（ｉｉ）脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素から選択される細胞構成要素；あるいは
（ｉｉｉ）ウイルス、キャプシド又はウイロイドから選択されるウイルス構成要素；あるいは
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアセチル化誘導体及び活性部分；あるいは
（Ｖ）構造的に異なるオリゴマー性若しくはポリマー性ペプチド、ペプトイド、糖、又は核酸のアンサンブルの物質ライブラリー、
から選択されることを特徴とする、請求項１３記載の認識系。
【請求項１５】
固定結合構成要素Ａが、多様な認識種Ｂに対する多様な結合部位を含み、それにより多様な認識種Ｂが該結合構成要素Ａに結合することが可能であることを特徴とする、請求項１−１４のいずれか１項記載の認識系。
【請求項１６】
少なくとも１つのさらなる認識種Ｂが結合構成要素Ａ上に固定されていることを特徴とする、請求項１−１５のいずれか１項記載の認識系。
【請求項１７】
（ａ）少なくとも２＋ｎの異なる認識種Ｂ１、Ｂ２、…、Ｂｎに対する少なくとも２＋ｎの異なる結合部位、及び固定結合構成要素Ａ上に固定されている、認識種Ｂ１、Ｂ２、…、Ｂｎとは異なるさらなる認識種Ｂ（ｎ＋３）を有する、少なくとも１つの固定結合構成要素Ａ、及び
（ｂ）少なくとも（ｎ＋３）の異なる認識種Ｂ１、Ｂ２、…、Ｂ（ｎ＋３）、ここでｎは０−２０の整数である、を含むことを特徴とする、請求項１５又は１６記載の認識系。
【請求項１８】
認識種Ｂ１、Ｂ２、…、Ｂｎが物質ライブラリーから生じることを特徴とする、請求項１７記載の認識系。
【請求項１９】
認識種Ｂ（ｎ＋３）の構造が既知であることを特徴とする、請求項１７又は１８記載の認識系。
【請求項２０】
異なる認識種Ｂが同一の基質Ｓを認識することを特徴とする、請求項１５−１９のいずれか１項記載の認識系。
【請求項２１】
基質Ｓが、
（ｉ）薬剤及び植物保護活性化合物、代謝物、生理学的メッセンジャー物質、リード構造の誘導体、病理学的変化の場合にヒト又は動物体内で産生され又は増加した量で産生される物質、又は遷移状態類似体；あるいは
（ｉｉ）ペプチド、ペプトイド、以下から選択されるタンパク質：受容体又はその機能部分；抗体又はＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）若しくはＦａｂ断片から選択されるその機能部分；あるいは
（ｉｉｉ）脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素から選択される細胞構成要素、あるいは
（ｉｖ）ウイルス、キャプシド又はウイロイドから選択されるウイルス構成要素；あるいは
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉＶ）のアセチル化誘導体；あるいは
（ｖｉ）複素環単量体；あるいは
（ｖｉｉ）分枝オリゴ糖又は多糖から選択される非直線構成の分子、あるいは
（ｖｉｉｉ）構造的に異なるオリゴマー性若しくはポリマー性ペプチド、ペプトイド、糖、核酸、エステル類、アセタール類若しくは複素環単量体、脂質、又はステロイドのアンサンブルの物質ライブラリー、あるいは
（ｉｘ）薬剤の標的構造、薬剤受容体、電位依存性イオンチャネル、輸送体、酵素又は微生物の生合成単位から選択されることを特徴とする、請求項１−２０のいずれか１項記載の認識系。
【請求項２２】
イムノアッセイ系であることを特徴とする、請求項１−２１のいずれか１項記載の認識系。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれか１項記載の認識系により補助される、試料中の基質Ｓの同定のための方法であって、
（ａ）基質Ｓを認識する認識種Ｂを試料と接触させ、
（ｂ）同時に又は連続して固定認識種Ｂと接触させ、そして
（ｃ）固定結合構成要素Ａ、認識種Ｂ及び基質Ｓの複合体の形成を検出することを特徴とする、前記方法。
【請求項２４】
複合体の形成が、温度、塩、溶媒、電気泳動法から選択される物理的パラメーターにより調節されることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
複合体が、認識種Ｂの放射能又は蛍光標識化、酵素標識化、酸化還元標識化、スピン標識化により、あるいは複合体自体により、電極プロセス、周囲での又は電極上での酸化還元プロセスで、あるいはインピーダンス測定又は直接電流測定から選択される物理的パラメーターにより、検出されることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２６】
認識種Ｂ及び基質Ｓの複合体が、さらなる段階において単離されることを特徴とする、請求項２３−２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
認識種Ｂ及び基質Ｓの複合体が、認識種Ｂ及び基質Ｓの結合平衡又は共有架橋が確立された後、単離されることを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
診断のための基質Ｓの発見のため、触媒の調製のため、及び／又は電気的構成要素の調製のため、薬剤活性化合物若しくは植物保護活性化合物の発見のため、最適化のため及び／又は調製のための、請求項１−２２のいずれか１項記載の認識系の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、
（a）認識種Bに対する少なくとも1つの結合部位を有する少なくとも1つの固定結合構成要素A、および
（b）結合構成要素Aに結合することが可能であり、そして基質Sに対する少なくとも1つの結合部位を含む、少なくとも1つの認識種Bを含み、結合構成要素Aの認識種Bへの結合が分子対形成（pairing）系の形で起こる認識系に関する。
【０００２】
アレイ（array）は、分析物の同時測定に、特に分析法および診断に重要な役割を果たす、固定認識種の配置（arrangement）である。例は、ペプチドアレイ（Fodorら, Nature 1993, 364, 555）および核酸アレイ（Southernら, Genomics 1992, 13, 1008；米国特許第5,632,957号）である。
【０００３】
実験分析系において、アレイは、事象の限局的発生の結果、特に単純で、迅速なそして再現可能なデータ分析である。この例は、物理的マルチチャンネル検出装置から実験室医学におけるマイクロタイタープレートにまで渡る。
【０００４】
アレイはまた、情報の貯蔵およびプロセシングにも使用でき、そしてナノテクノロジーの基本的構造要素である。
【０００５】
さらなる重要な適用分野は、生物学、生化学、医学および薬理学に見出すことが可能である。例えば、EP-A1-0 461 462は、フィールド状に置かれそして固定されている抗原を1つまたはそれ以上の抗体と接触させる、イムノアッセイを記載する。WO 96/01836は、例えば、遺伝子断片の検出に用いられ、そしてしたがって、例えば病原性細菌の診断につながる、異なる配列のDNA分子のアレイを記載する。
【０００６】
超分子相互作用による固定はまた、アレイ適用の他にも知られている。例えば、抗−抗体を有する賦形剤（excipient）を、該賦形剤に共有結合している抗原により固定してもよい。イムノアッセイの分析系は、大部分、酵素イムノアッセイ（EIA）に基づいており、EIAでは酵素的に触媒される反応は、抗原−抗体または抗原−抗体−抗−抗体複合体の存在を示す。複合体に含まれる単位の1つは、この場合、キャリアー上に固定されているか、または例えば組織構成要素の形で、それ自体キャリアーである。
【０００７】
この種のシグナル増幅法はしかし、特に定量的情報の信頼性および定量化の点で、不都合な点がある。小型化アレイの特に不都合な点は、調製の経費および出費である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、単純で、信頼性があり、選択性が高く、そしてさらに安価な認識系を見つけることであった。
【０００９】
したがって本発明は、
（a）認識種Bに対する少なくとも1つの結合部位を有する少なくとも1つの固定結合構成要素Aおよび
（b）結合構成要素Aに結合することが可能であり、そして基質Sに対する少なくとも1つの結合部位を含む、少なくとも1つの認識種Bを含み、結合構成要素Aの認識種Bへの結合が分子対形成系の形で起こることを特徴とする認識系に関する。
【００１０】
こうした対形成系は、非共有的相互作用の超分子系であり、該系は選択性、安定性および可逆性によりきわだっており、そしてそれらの特性は、好ましくは熱力学的に、すなわち温度、pHおよび濃度により影響される。こうした対形成系はまた、例えばその選択的特性により、潜在的な新規特性を有するクラスター会合物（associate）を得るため、異なる金属クラスターを一緒にするための「分子接着剤」として用いてもよい（例えば、R. L. Letsingerら, Nature 1996, 382, 607-9；P. G. Schultzら, Nature 1996, 382, 609-11を参照されたい）。
【００１１】
したがって、対形成系が非共有的相互作用を介した結合構成要素Aの認識種Bとの会合（association）により形成されるならば、特に好都合である。非共有的相互作用は、特に、水素架橋、塩架橋、スタッキング、金属リガンド、電荷移動錯体および疎水性相互作用である。
【００１２】
特定の態様において、本発明にしたがった分子対形成系は、核酸およびその類似体を、特にペントース、好ましくはペントピラノースまたはペントフラノースの形で含む。一般的に、ペントースはリボース、アラビノース、リキソースまたはキシロースから選択される。ピラノシル−RNA（p-RNA）、1つまたはそれ以上のアミノシクロヘキシルエタン酸（CNA）単位を有する核酸、ペプチド核酸（PNA）、あるいは1つまたはそれ以上の［2−アミノ−4−（カルボキシメチル）シクロへキシル］核酸塩基を有する核酸が特に好ましい。ピラノシル核酸（p-NA）および特にp-RNAが特に好ましい。
【００１３】
p-NAは、一般的に天然RNAに対し異性体である構造種であり、該p-NAにおいて、ペントース単位はピラノース型で存在し、そしてC-2'およびC-4'位間でホスホジエステル基により反復して連結されている。「核酸塩基」はここでは、規範的核酸塩基A、T、U、C、Gを意味するが、イソグアニン／イソシトシンおよび2,6−ジアミノプリン／キサンチンの対も意味し、そして本発明の意味においてはまた、他のプリンおよびピリミジン、例えばプリン、2,6−ジアミノプリン、6−プリンチオール、ピリジン、ピリミジン、イソグアニン、6−チオグアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、インドール、トリプタミン、N−フタロイルトリプタミン、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、ベンゾトリアゾールまたはアクリジンがあり、そして好ましくは、リボピラノシルアデノシン、リボピラノシルグアノシン、リボピラノシルチミジン、リボピラノシルシトシン、リボピラノシルトリプタミンまたはリボピラノシル−N−フタロトリプタミン、リボピラノシルウラシルまたはそれらの［2−アミノ−4−（カルボキシメチル）リボピラノシル］誘導体がある。
【００１４】
p-NA、すなわちリボースに由来するp-RNAは、Eschenmoserらにより最初に記載された（Pitsh, S.ら, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161；Pitsch, S.ら, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621；Angew. Chem. 1996, 108, 1619-1623を参照されたい）。これらはもっぱらいわゆるワトソン−クリック対の、すなわちプリン−ピリミジンおよびプリン−プリン対の、逆平行で、可逆的に「融解」する、準直線状のそして安定な二重鎖を形成する。反対向きのキラリティーのホモキラルp-RNA鎖は同様に、調節可能に対形成し、そして形成された二重鎖において厳密に非らせんである。この特異性は、超分子単位を構築するのに重要であり、これがリボピラノースリン酸骨格の比較的低い柔軟性と、そして塩基平面の鎖軸への強い傾斜およびこれにより生じる、生じた二重鎖における鎖内（intercatenary）塩基スタッキングに対する傾向と関連しており、そして最終的に、骨格構造における、2',4'−シス−二置換リボピラノース環の関与に起因していると考えることが可能である。
【００１５】
これらの有意により優れた対形成特性により、p-NAは、DNAおよびRNAと比較すると、超分子単位の構築における使用のための、好ましい対形成系となっている。これらは天然核酸に直交性（orthogonal）の対形成系を形成し、すなわち、これらは天然型に発生するDNAおよびRNAと対を形成せず、これは、特に診断分野に好都合である。
【００１６】
したがって、p-NA、および特にp-RNAは、強固にそして熱力学的に調節可能な対形成系を形成するため、p-NAは、ナノテクノロジー分野における使用、例えば新規成分、診断および治療、並びにまたマイクロエレクトロニクス、フォトニクス、オプトエレクトロニクス構成要素の調製、並びに超分子単位を得るため分子種を一緒にすること、例えばタンパク質アセンブリーの（コンビナトリアル）合成に、特に適している（例えば、A. Lombardi, J. W. Bryson, W. F. DeGrado, Boimolekuls (Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504を参照されたい）。したがって、機能的、好ましくは生物学的単位、例えばタンパク質またはDNA／RNA断片に、例えば天然核酸に干渉しないp-RNA暗号を提供する可能性があるため、さらなる適用は、特に診断および薬剤発見分野に帰着する（例えばWO 93/20242を参照されたい）。
【００１７】
本発明にしたがい、核酸およびその類似体の長さは、少なくとも約4−50、好ましくは少なくとも約4−25、特に少なくとも約4−15、とりわけ少なくとも約4−10ヌクレオチドである。
【００１８】
一般的に、結合構成要素Aはキャリアー上に固定されている。
「固定されている」という用語は、本発明の意味において、2つまたはそれ以上の分子種、例えば直線構成を有する分子、特にペプチド、ペプトイド、タンパク質、直線オリゴ糖または多糖、核酸およびその類似体、あるいは単量体、例えば複素環、特に窒素複素環、あるいは非直線構成を有する分子、例えば分枝オリゴ糖または多糖、または抗体およびその機能部分の会合による、共有結合、準共有結合または超分子結合の形成を意味するものとして理解される。抗体の機能部分は、例えばFv断片（SkerraおよびPluckthun (1988) Science 240, 1038）、一本鎖Fv断片（scFv；Birdら (1988), Science 242, 423；Hustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879）またはFab断片（Betterら (1988) Science 240, 1041）である。
【００１９】
このように、キャリアーへの結合は、一般的に共有的、準共有的、超分子的または物理的、例えば磁気的に（A. R. Shepardら (1997) Nucleic Acids Res., 25, 3183-3185, No.15）、電場において、または分子ふるいを通して行われる。結合構成要素Aはそれにより、キャリアーの位置で直接合成されるかまたはキャリアーの特定の位置に「連結」される。例は、シッフ塩基の過ヨウ素酸（periodote）酸化および還元アミノ化を介した結合およびキャリアー法、好ましくは二カルボン酸リンカー、エチレンジアミンホスホアミデートリンカーのN−ヒドロキシスクシミドエステル、メルカプト、ヨードアセチルまたはマレイミド法および／または共有または非共有ビオチンリンカー法である。
【００２０】
「キャリアー」という用語は、本発明の意味において、固体あるいはゼラチン型で存在する成分、特にチップ成分を意味するものとして理解される。適切なキャリアー成分は、例えば、セラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック、キャリアー特に前述の成分の結晶成分または薄層、あるいは（生体）分子フィラメント、例えばセルロース、構造タンパク質である。
【００２１】
したがって、特定の態様は、本発明にしたがった認識系であって、ここで結合構成要素Aは、共有結合、準共有結合または超分子結合による、2つまたはそれ以上の分子種、例えば直線構成の分子、特にペプチド、ペプトイド、タンパク質、直線オリゴ糖または多糖、核酸およびその類似体、あるいは単量体、例えば複素環、特に窒素複素環、あるいは非直線構成の分子、例えば分枝オリゴ糖または多糖、または抗体およびその機能部分、例えばFv断片、一本鎖Fv断片（scFv）またはFab断片、の会合により、キャリアー上に固定されている。
【００２２】
さらなる態様において、結合構成要素Aは、キャリアーの定められた部位に、好ましくはマトリックスの形で固定されており、キャリアーの定められた部位は、好ましくはアドレス化されている。
【００２３】
好ましい認識系にしたがい、適切な相補配列を有する流動（mobile）（緩衝液）相中の分子は、適切なアドレスの位置でのみ超分子複合体を自発的に形成するであろう。特定の機能、例えば、抗体機能を有するさらなる単位を、これらの流動相補的アドレスに、化学的（結合体）または超分子化合物形成（複合体）により結合させれば、用いたアドレスパターンに依存して、同一の固定アレイ上に異なる機能アレイが広がるであろう。
【００２４】
こうしたモジュール式系の大きな利点は、まったく異なる適用に対するキャリアー単位の同一の一回限りの提供であり、そして例えばタンパク質、酵素または生存細胞からの保存不可能な生体結合体および対形成ラジカルのin situ生成である。
【００２５】
さらなる利点は、基質結合事象およびキャリアー位置での測定可能結合事象の段階的生成であり、すなわち、基質は完全に妨げられない方式で、可溶性のアドレス化された構成要素（認識種B）と第一の複合体を形成し、そしてその後キャリアー位置の空間に、対形成方式で結合構成要素A上に固定してもよい。
【００２６】
電気的に読み取り可能なシグナルが、例えば結合事象中、キャリアー電極のインピーダンス作用のシグナル増幅により、生成されるため、結合構成要素Aがキャリアーのキャリアー電極上に固定されていることが、さらに特に好ましい。適切な電極プロセスは、R. P. Andres (1996) Science, 272, 1323-1325に記載されており、そして適切なインピーダンス測定はM. Stelzleら (1993) J. of Physical Chem., 97, 2974-2981に記載されている。
【００２７】
適切な認識種Bは、例えば、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、例えば受容体またはその機能部分、例えば膜受容体の細胞外ドメイン、抗体またはその機能部分、例えばFv断片、一本鎖Fv断片（scFv）またはFab断片、あるいは細胞構成要素、例えば脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素、あるいはウイルス、ウイルス構成要素、例えばキャプシド、またはウイロイド、あるいはそれらの誘導体、例えばアセテート類およびその活性部分、あるいは物質ライブラリー、例えば構造的に異なる化合物、好ましくはオリゴマー性またはポリマー性ペプチド、ペプトイド、糖、核酸のアンサンブルから選択される生体分子である。
【００２８】
該生体分子は、通例、結合構成要素Aに対する結合領域を含み、該領域は、好ましくは、上述の核酸またはその類似体の1つである。一般的に該生体分子はここで、選択された核酸または類似体に、リンカーを介して結合している。例えば、ウラシルに基づくリンカーが適切であり、ここで好ましくはウラシルの5位が修飾されており、例えばN−フタロイルアミノエチルウラシルであるが、またインドールに基づくリンカー、好ましくはトリプタミン誘導体、例えばN−フタロイルトリプタミンであってもよい。
【００２９】
特定の態様において、固定結合構成要素Aは、多様な認識種Bに対する多様な結合部位を含み、それにより多様な認識種Bが結合構成要素Aに結合することが可能である。
【００３０】
さらなる態様において、少なくとも1つのさらなる認識種Bが結合構成要素A上に固定されている。
【００３１】
したがって、本発明にしたがったさらなる認識系は、
（a）少なくとも2+nの異なる認識種B1、B2、…、Bnに対する少なくとも2+nの異なる結合部位、および固定結合構成要素A上に固定されている、認識種B1、B2、…、Bnとは異なるさらなる認識種B（n+3）を有する、少なくとも1つの固定結合構成要素A、および
（b）少なくとも（n+3）の異なる認識種B1、B2、…、B（n+3）、ここでnは0−20、好ましくは0−10、特に0−5、とりわけ0または1の整数である、
を含むことにより特徴付けられる。
【００３２】
さらなる態様において、認識種B1、B2、…、Bnは物質ライブラリーから生じる。
【００３３】
物質ライブラリーの複合体の構造分析のため、認識種B（n+3）の構造が既知であり、および／または異なる認識種Bが同一の基質Sを認識することが特に好都合である。
【００３４】
「基質」という用語は、本発明の意味において、本発明にしたがった認識系により認識されるものとして意図される、非−キャリアー結合物質を意味するものとして理解される。基質Sは、一般的に、分子、好ましくは薬剤および植物保護活性化合物、代謝物、生理学的メッセンジャー物質、リード構造の誘導体、病理学的変化の場合にヒトまたは動物体内で産生されまたは増加した量で産生される物質、または遷移状態類似体、またはペプチド、ペプトイド、タンパク質、例えば受容体またはその機能部分、例えば膜受容体の細胞外ドメイン、抗体またはその機能部分、例えばFv断片、一本鎖Fv断片（scFv）またはFab断片、あるいは細胞構成要素、例えば脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素、あるいはウイルス、ウイルス構成要素、例えばキャプシド、またはウイロイド、あるいはそれらの誘導体、例えばアセテート類、あるいは単量体、例えば複素環、特に窒素複素環、あるいは非直線構成の分子、例えば分枝オリゴ糖または多糖、あるいは物質ライブラリー、例えば構造的に異なる化合物、好ましくはオリゴマー性またはポリマー性ペプチド、ペプトイド、糖、核酸、エステル類、アセタール類または単量体、例えば複素環、脂質、ステロイドのアンサンブル、あるいは薬剤の標的、好ましくは薬剤受容体、電位依存性イオンチャネル、輸送体、酵素または微生物の生合成単位から選択される。
【００３５】
物質ライブラリーは、コンビナトリアル化学の分野の当業者に知られる。例は、ペプチド配列の順列により生成される、容易にアクセス可能なペプチドライブラリーである。こうしたライブラリーが対を形成すれば、まったく新規の超分子または複合体が生じる。かなりの数の生じ得る複合体は、抗体のエピトープ同様、基質分子に対する認識領域を含む可能性がある。該態様はしたがって、こうした確率的な結合事象のスクリーニングを可能にする。結合体ライブラリーの1つがキャリアーに結合しているならば、その同一性（例えばペプチド配列）はコドンアドレスにより直接決めることが可能であり、またはアドレスが一定であれば、単にその位置により決めることが可能である。アレイは、対形成鎖の1つに対しいわゆるコードライブラリーを生成し、そして超分子ライブラリーの複合体分析を簡素化する。
【００３６】
さらなる好ましい態様において、本発明にしたがった認識系はイムノアッセイである。
【００３７】
本発明の別の主題はまた、本発明にしたがった認識系により補助される試料中の基質Sの同定のための方法であって、
（a）基質Sを認識する認識種Bを試料と接触させ、
（b）同時にまたは連続して固定認識種Bと接触させ、そして
（c）固定結合構成要素A、認識種Bおよび基質Sの複合体の形成を検出する
前記方法である。
【００３８】
特に、本発明にしたがった方法において、複合体の形成は、温度、塩、溶媒、電気泳動法などの物理的パラメーターにより調節される。
【００３９】
一般的に、形成された複合体は、認識種Bの標識化、例えば放射能または蛍光標識化、酵素標識化、酸化還元標識化、スピン標識化により、あるいは複合体自体、例えば化学プロセスによるなどの電極プロセス、例えば周囲でのまたは電極上での酸化還元プロセスにより、あるいは物理的パラメーター、例えばインピーダンス測定または直接電流測定により、検出される。
【００４０】
したがって、基質の特別な増幅または濃縮前段階は、多くの適用に必要とされず、これは特に好都合である。対形成事象前および後の該位置の化学的および物理的不均質性（heterogeneity）は、さらに、直接電子工学法を用い、非常に好都合なことにはソフトウェアによるパラメーター化または基準化により、除去することが可能である。
【００４１】
こうした適用に重要な基質分子が、それ自体天然の対形成系DNAおよびRNAの分子である可能性があり、そしてしたがってアドレス化に干渉するように相互作用するであろう問題は、特に安定で、選択的なそして非天然の対形成系、例えばp-NAを用いることにより解決される。
【００４２】
本発明はしたがって、認識種、好ましくは天然DNAまたはRNA鎖およびタンパク質、この場合は好ましくは抗体または抗体の機能部分が、明確にp-NA断片、好ましくはp-RNA断片によりコードされている方法に関する。これらはその後、固体キャリアー上の関連するコドンとハイブリダイズさせてもよい。したがって、常に新規の、診断上有用なアレイを固体キャリアー上に構築することが可能であり、これは、ハイブリダイゼーション条件の調整によるだけで、望ましい位置での常に新規の認識種の組み合わせを含む、アレイの形のコドンを備える。分析物、例えば生物学的試料、例えば血清またはそれに匹敵するものをその後、適用すると、検出されるべき種がその後、特定のパターンでアレイに結合し、該パターンはその後、間接的に（例えば認識種の蛍光標識化により）または直接（例えばコドンの連結点でのインピーダンス測定により）記録される。ハイブリダイゼーションをその後、再びコドンを含むキャリアーのみが残るように、適切な条件（温度、塩、溶媒、電気泳動法）により除去する。これにその後、再び他の認識種を装填し、そして例えば、同一の分析物に対して別の試料の測定のために用いる。アレイ構成における認識種の常に新規の配置および対形成系としてのp-NAの使用は、他の系に比べ、特に好都合である。例えばWO 96/13522を参照されたい。
【００４３】
本発明にしたがった方法において、認識種Bおよび基質Sの複合体をまた、さらなる段階で単離してもよい。これに関し、例えば、複合体は、認識種Bおよび基質Sから、認識種Bおよび基質Sの結合平衡または共有架橋を凍結した後、単離される。
【００４４】
本発明にしたがった認識系は、したがって、診断のための基質Sの発見のため、触媒の調製のため、および／または電気的構成要素の調製のため、特に、薬剤活性化合物または植物保護活性化合物の発見のため、最適化のためおよび／または調製のため、特に非常に適切である。
【００４５】
したがって、合成されるアドレスにしたがい、存在するコドンアレイ上でin situで対形成することにより試験系を形成するキットを、異なる疑問または診断上の問題に対して迅速に組み立てることが可能である。生体分子、例えば非常に一般的には細胞またはウイルス構成要素、非常に詳細にはモノクローナル抗体またはそれらの機能部分が好ましい。
【００４６】
【実施例】
実施例1
式4' AGGCAIndT 2'のリンカーを用いた、リンカーを含むp-RNAオリゴヌクレオチドの合成：
1.1  オリゴヌクレオチドの固相合成
A、G、C、Tは、核酸塩基アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンであり、そしてIndは核酸塩基の形のリンカーとしてのアミノエチルインドール（インドールCH2−CH2−NH2）である。
【００４７】
完全自動固相合成を各場合で15μmolで行った。合成サイクルは以下の段階からなる：
（a）脱トリチル化：CH2Cl2（79 ml）中の6% DCA（ジクロロ酢酸）で5分。
（b）CH2Cl2（20 ml）、アセトニトリル（20 ml）で洗浄、そしてその後アルゴンで洗い流し（flushing）；
（c）カップリング：樹脂を活性化剤（CH2Cl2（0.2 ml）中の0.5MピリジンHCl）で洗浄、そしてその後、1／1の比の活性化剤（0.76 ml）および対応する核酸塩基のホスホルアミダイト（0.76 ml：8等量；アセトニトリル中0.1M）で30分処理；
（d）キャッピング：PerSeptive Biosystems, Inc.、米国テキサス州の50% Cap A（10.5 ml）および50% Cap B（10.5 ml）で2分処理（Cap A：THF、ルチジン、無水酢酸；Cap B：1−メチルイミダゾール、THF、ピリジン）。
（e）酸化：ヨウ素溶液（アセトニトリル100 ml、H2O 46 mlおよびsym−コリジン9.2 ml中のヨウ素400 mg）120 mlで2分処理；および
（f）アセトニトリル（22 ml）で洗浄。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの続くHPLC精製を容易にするため、最後のDMT（ジメトキシトリチル）基は除去しなかった。最後の修飾ホスホルアミダイトとのカップリングを検出するため、樹脂1%での合成の後、UV（503 nm）中でトリチルカチオン吸収を行った。
1.2  オリゴヌクレオチドの後処理
アリルエステル保護基の除去を、CH2Cl2（15 ml）中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（272 mg）、トリフェニルホスフィン（272 mg）および炭酸水素ジエチルアンモニウムで5時間室温に置いて、行った。ガラスキャリアーをその後、CH2Cl2（30 ml）、アセトン（30 ml）および水（30 ml）で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除くため、樹脂を水性0.1Mジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム水和物溶液でリンスした。上述の洗浄過程を、逆の順にもう一回行った。樹脂をその後、高真空中で10分乾燥させた。ガラスキャリアーからの除去段階を、脱ベンゾイル化と同時に、24%ヒドラジン水和物水溶液（6 ml）中で4℃で行った。RP 18上でのHPLCチェック（18−25時間）の後、活性化（アセトニトリル、20 ml）Waters Sep-Pakカートリッジにより、オリゴヌクレオチド「トリチルON」からヒドラジンを取り除いた。ヒドラジンをTEAB、0.1M（30 ml）で洗浄した。オリゴヌクレオチドをその後、アセトニトリル／TEAB、0.1M（10 ml）で溶出した。これをその後、断片配列を除去するため、HPLCにより精製し、そしてDMT脱保護（80%強度水性ギ酸30 ml）を行った。最終脱塩（Sep-Pakカートリッジと共にTEAB緩衝0.1M／アセトニトリル：1／1による）により、純粋なオリゴヌクレオチドを得た。
実施例2
N−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミドによるp-RNAのヨードアセチル化
p-RNA配列：4' AGGCAIndT 2'、分子量＝2266.56 g/mol、実施例1にしたがい調製された。
【００４９】
p-RNAの1等量を、0.1モル炭酸水素ナトリウム溶液（pH 8.4）に溶解し（350 nmol当たり1 ml）、そしてDMSO中のN−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミド溶液で処理した（1 mg当たり40μl）。バッチをアルミホイルで暗くし、そして室温で30−90分置いた。
【００５０】
反応の進行を分析用HPLCによりモニターした。標準的条件は：
緩衝液A：水中の0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液B：水：アセトニトリル、1：4中の0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
勾配：10%Bで開始し、40分で50%B
カラム成分：Merck Darmstadt GmbHの10μM LiChrosphere（登録商標） 100 RP-18；250 x 4 mm
出発成分の保持時間：18.4分
この場合の産物の保持時間：21.1分
反応が完了した後、バッチを水で4倍の体積に希釈した。Waters Sep-PakカートリッジRP-18（15 oD 2 gパッキングから）を2 x 10 mlのアセトニトリルおよび2 x 10 mlの水で活性化し、オリゴヌクレオチドを適用し、そして染み込ませ、そして塩および試薬を除去するため反応容器を2 x 10 mlの水で洗浄し、3 x 10 mlの水で再洗浄し、そしてまず5 x 1 mlの50：1、水：アセトニトリルで、そしてその後1：1で溶出した。1：1分画に溶出された産物は非常に純度が高かった。分画を冷暗所で濃縮し、混合しそして再度濃縮した。
【００５１】
収量はUV吸収分光法により260 nmで測定した。
質量分析：
配列    4' AGGCAInd（CH2CH2NHCOCH2-I）T 2'
計算質量：2434.50 g/mol
測定質量MH22+：1217.9 g/mol＝2433
実施例3
p-RNAの配列（His）6のペプチドへの結合
ヨードアセチル化p-RNA（分子量＝2434.50 g/mol）を緩衝液系に溶解し（114 nmol当たり1000μl）、そしてその後、緩衝液中のペプチドの溶液で処理した（（His）6ペプチドの2 mol等量）。
緩衝液系：Riedel-de Haenからのホウ砂／HCl緩衝液を、水中のEDTA二ナトリウム塩の10ミリモル溶液と1：1の比で混合し、そしてHClでpH 6.3に調整した。これにより 5 mM Na2EDTAを含む溶液が得られた。
【００５２】
反応が完了するまでバッチを室温で暗所に置いた。反応はHPLC分析によりモニターした。反応が完了した後、バッチをRP-HPLCにより直接精製した。分画を冷暗所で濃縮し、混合しそして再度濃縮した。残渣を水に取り、そして脱塩した。Waters Sep-PakカートリッジRP-18（15 oD 2 gパッキングから）を2 x 10 mlのアセトニトリルおよび2 x 10 mlの水で活性化し、オリゴヌクレオチドを適用し、そして染み込ませ、そして塩を除去するため反応容器を2 x 10 mlの水で洗浄し、3 x 10 mlの水で再洗浄し、そして水：アセトニトリル、1：1で溶出した。産物分画を濃縮し、混合しそして再度濃縮した。
【００５３】
収量はUV吸収分光法により260 nmで測定した。これらは理論値の70−95%に達した。
HPLC分析：
緩衝液A：水中の0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
緩衝液B：水：アセトニトリル、1：4中の0.1モルの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
勾配：10%Bで開始し、40分で50%B
カラム成分：Merck Darmstadt GmbHの10μM LiChrosphere（登録商標） 100 RP-18；250 x 4 mm
産物の保持時間：16.9分
質量分析：
配列    4' AGGCAInd（CH2CH2NHCOCH2-（His）6T 2'
計算質量：MH22+：1626.9 g/mol
測定質量MH22+：1626.0 g/mol
相補的配列、4' Ind（CH2CH2NHCOCH2-（His）6TGCCT 2'を同様に調製した。
【００５４】
計算質量：MH22*：1436.2 g/mol
測定質量MH22*：1436.4 g/mol
p-RNA上の認識領域の形成のためのペプチドライブラリーもまた、同様に結合させた。
【００５５】
UV溶液実験において、ヒスチジンサブユニットの基質（ニッケルイオン）との相互作用は、それ自体、対形成特性に影響することを立証することが可能であった。各場合の5μM p-RNAの、10 mM Tris HCl、150 mM超純粋NaCl中の結合溶液は、UV対形成実験において32℃のTmを示し、該Tmは鎖当たり10等量のニッケルイオンを添加した後10℃上昇して42℃になった。したがって、検出、すなわちここでは基質の認識は、非常に好都合なことにアドレス化自体を伴い；これはキャリアーマトリックス上での固定化プロセスに対応する。
実施例4
アドレス化可能認識系上の抗体／抗原認識の直接電気的検出
2つの蒸気沈着金電極の単純マトリックスを、アドレス化可能な認識系の例として用いた（図8を参照されたい）。
【００５６】
商業的に入手可能なチオール還元抗体単位（Rockland Immunochemicals、米国ペンシルバニア州）を、上述のようなヨードアセチル化p-RNA配列に結合させた。
【００５７】
相補的p-RNA単位4' Ind？TAGGCAAT 2'を1 mM水性EDTAおよびホウ砂緩衝液pH 9.5中の100等量のTrautの試薬により、アミノリンカー上でチオール活性化し、6時間後、逆相HPLクロマトグラフィーにより精製し、そして新たに清浄化された2つの金電極の1つにUV光により一晩結合させた。この電極のみが、対形成により抗体−p-RNA結合体に結合する（図9を参照されたい）。
【００５８】
本図は、緩衝液条件1/15 mol/l Na2HPO4、KH2PO4、pH 7.4および室温の条件下での、固定抗体の抗体−抗原複合体化の前および後の、記載された種類の新たに清浄化された電極に一晩直接結合されたチオ還元抗体のインピーダンスシグナル（さらなる配線なし；分光計Solarton Instruments 1260インターフェース；Solarton SI 1287）を示す。
【００５９】
商業的に入手可能な抗原（Rockland ImmunochemicalsのヒトIgG−F（ab'）2分画）がフルオレセイン標識されているように、選択される場合では、蛍光標識により認識結果を確認することが可能であった（図10を参照されたい）。
【００６０】
以下の図は、より詳細に本発明を記載することを意図しており、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、認識されるべき基質の周りにin situで生成される認識種の一般的な原理を図式的に示す。複合体化単位（ペプチド）は、キャリアーマトリックスにより識別されることが可能である。熱力学的または力学的調節下で形成される結合ポケットは、基質との複合体としてここで形成される。すべてのB単位に相補的な対形成単位Aは、キャリアー上に固定されている。
【図２】  図2は、固体キャリアー上の固定認識構造（アレイ）の配置を図式的に示す。
【図３】  図3は、超分子アレイのモジュール式生成を図式的に示す。異なるイムノアッセイを、選択的対形成領域でアドレス化することにより、同一のアンチコドンキャリアー上で構築している。
【図４】  図4は、4つのキャリアー位置（電極）を有するアレイの構築および測定原理を図式的に示す。
【図５】  図5は、UV分光学およびインピーダンス分光学による、アンチコドン−コドン分子の対形成の検出を図式的に示す。温度を下げることにより、鎖が対形成し、緩衝液上清が薄くなり、上清のUV消光が減少し、そして電極二重層の変化がインピーダンス測定に作用する。
【図６】  図6は、アドレス化イムノアレイの機能を図式的に示す。電極3のみが抗体対形成鎖結合体に対し適切なアドレスを持つ。適切な抗原が添加されると、他の電極での緩衝液の単なる変化と異なり、電極1でのインピーダンスが変化する。
【図７】  図7は、2つの相補的p-RNAアドレスでの温度誘導UV対形成実験の冷却曲線を示し、該アドレスには各々、ヒスチジンペプチドが結合している。対形成により、基質としてのニッケルイオンに対する認識領域が生成される。基質は、遷移温度Tmの明確な増加を導き、これはヒスチジンラジカルなしでは観察されない。
【図８】  図8は、2つの蒸気沈着金電極の単純マトリックスを図式的に示す。
【図９】  図9は、インピーダンス分光学による、アレイの1つの電極位置での抗原−抗体複合体の直接電気的検出を示す。
【図１０】  図10は、蛍光による、アドレス化電極での抗原−抗体複合体のさらなる検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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