(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉに対する抗体の測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行う測定方法であって、非特異的反応による影響を抑制し盲検値を低減するため、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体を使用することを特徴とする、酵素免疫測定法による試料中のＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉｉに対する抗体の測定方法。
【請求項２】
試料中のＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉに対する抗体の測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行うに当たり、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体を使用することを特徴とする、試料中のＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉに対する抗体の測定において非特異的反応による影響を抑制し盲検値を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の測定対象物質の測定を酵素免疫測定法により行うための測定試薬及び測定方法であって、特に測定の盲検値が高い試薬及び測定方法において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴とするものである。
本発明は、特に化学、生命科学、臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した試料中に含まれる微量の測定対象物質の測定試薬及び測定方法は種々のものが知られている。
【０００３】
中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施されている。
この免疫学的測定方法のうち、抗原又は抗体に酵素、放射性同位元素、又は蛍光色素のような微量の差を識別できる標識物を結合させて、抗原抗体反応の特異性を利用することにより、試料中の抗原又は抗体の存在を免疫学的に測定しようとする標識物による免疫学的測定方法は、比較的短時間に簡便に実施でき、かつ再現性も良いことから汎用されている。
【０００４】
この標識物による免疫学的測定方法のうち、標識物として酵素を用いるものを酵素免疫測定法（ＥＩＡ法；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）という。このＥＩＡは、抗原又は抗体の一方を酵素で標識し、抗原抗体反応の結果を酵素反応に変換して発色させ、抗原又は抗体を定性的又は定量的に測定しようというものである。また、ＥＩＡ法のうち固相を利用したものをＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）と呼ぶ。これら酵素免疫測定法は、放射性同位元素を標識物質として使用する放射免疫測定法と同等の感度を持ち、放射能汚染の危険性もないため、広く利用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、酵素免疫測定法は高感度であるがゆえ、試料中に含まれる測定対象物質以外の種々の微量成分の影響を受けやすく、いわゆる非特異的反応を受けることが少なくないのが実状である。
これらの非特異的反応は、盲検値として測定され、測定の特異性、ひいては正確性を著しく損ねるものである。
【０００６】
この酵素免疫測定法において、標識物質として用いるペルオキシダーゼ等の酵素の酵素反応には、オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）やテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の感度の高い色原体が用いられている。
しかし、この高感度化故に、測定対象物質と抗原又は抗体との抗原抗体反応とは無関係な副反応とも言える非特異的反応による影響が増幅され、盲検値が高くなってしまい、つまり、特異性が悪くなってしまう。
これにより、試料中の測定対象物質の存在の有無の判定、又は試料中の測定対象物質の濃度の測定が難しくなり、正確に行われなくなる。
そして、ひいては、疾病の診断を誤る危険性も生じる。
【０００７】
例えば、夏型過敏性肺炎を診断する場合には、罹患が疑われる人の血清中の「夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗体」の測定等を行う。
これは、「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ」に対するヒトの抗体が血清試料中に存在するか否かの判定、又はその抗体の存在量（濃度）の測定を、夏型過敏性肺炎の原因微生物である「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ」という真菌由来の抗原成分を固定化したマイクロプレート、及びペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、酵素免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行うものである。
このため、「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ」に対する抗体を含まない健常人の血清試料においても、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体との非特異的反応が多く検出されてしまい、すなわち盲検値が高くなり、「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ」に対する抗体の有無の判定、又は濃度の測定が極めて難しいものとなっていた。
【０００８】
そこで、非特異的反応が生じ、盲検値が高い測定試薬及び測定方法において、この非特異的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させることができ、特異性が高く正確に試料中の測定対象物質の測定が行える測定試薬及び測定方法が求められていた。
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、標識物質であるペルオキシダーゼによる酵素反応の色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用するものを用いて、非特異的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させて、特異性、そして正確性を高めた酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料中の測定対象物質の測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行うための試薬であって、かつ測定の盲検値が高い試薬において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴とする、酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定試薬である。
【００１１】
本発明の測定試薬においては、測定対象物質が、抗体であることが好適である。
【００１２】
また、本発明の測定試薬においては、「測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」を含むことが好適である。
【００１３】
そして、本発明の測定試薬においては、測定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗体であることが好適である。
【００１４】
更に、本発明の測定試薬においては、夏型過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉであることが好適である。
【００１５】
また、本発明は、試料中の測定対象物質の測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行う測定方法であって、かつ測定の盲検値が高い測定方法において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴とする、酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定方法である。
【００１６】
本発明の測定方法においては、測定対象物質が、抗体であることが好適である。
【００１７】
また、本発明の測定方法においては、「測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」を用いることが好適である。
【００１８】
そして、本発明の測定方法においては、測定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗体であることが好適である。
【００１９】
更に、本発明の測定方法においては、夏型過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉであることが好適である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明による試料中の測定対象物質の測定試薬及び測定方法は、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行うための試薬及び測定方法において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用することにより、測定の盲検値が高い測定試薬及び測定方法においても正確な測定が行えるものである。
【００２１】
本発明の測定試薬及び測定方法では、測定の盲検値が高い測定試薬及び測定方法において、非特異的反応による影響を抑えるために、標識物質であるペルオキシダーゼによる酵素反応に使用する色原体をＯＰＤやＴＭＢ等の高感度なものから、４−アミノアンチピリン、及びフェノール若しくはその誘導体の組み合わせ、又は、４−アミノアンチピリン、及びアニリン誘導体の組み合わせの低感度のものに変えることにより、非特異的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させ、特異性を向上させることができるものである。
【００２２】
なお、本来の測定反応である、測定対象物質と抗原又は抗体との抗原抗体反応（免疫反応）を逃さず捉えるため、測定反応に用いる標識物質結合抗体又は標識物質結合抗原の濃度を高めることが好ましい。
【００２３】
すなわち、これにより、標識物質であるペルオキシダーゼの酵素反応に使用する色原体を、従来と比べ低感度のものに変え、これにより低下した感度を、標識物質として用いるペルオキシダーゼを結合させたペルオキシダーゼ結合抗体又はペルオキシダーゼ結合抗原の使用濃度を従来よりも高めて補うことにより、測定の特異性を向上させることと、測定の感度を向上させることの両方の目的を達成することができる。
【００２４】
本発明の測定試薬及び測定方法において、試料中の測定対象物質の測定を行う際の手順は、公知の酵素免疫測定法の手順に準じて行えばよい。
【００２５】
この操作の手順であるが、測定対象物質が抗体であり、サンドイッチ法により測定を行う場合を例に取り、以下説明を行う。
【００２６】
▲１▼  『「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」（例えば、測定対象物質である抗体にとっての抗原、又はこの抗原の抗原決定基を有する物質等）と結合することができる抗体』を担体に固定化し、更に、前記の「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」を結合させて、「測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」の順に結合させて固定化させたものを調製する。
【００２７】
▲２▼  次に、この担体の「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」等を固定化した部分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。
【００２８】
これにより、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」の結合を形成させる。
【００２９】
▲３▼  この添加・接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」であって前記の「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」と同一又は異なる物質（例えば、抗体、又は抗原等）に標識物質であるペルオキシダーゼを結合させたもの（「ペルオキシダーゼ標識結合物質」）の一定量を、この担体の「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」等を固定化した部分に添加して一定時間接触させる。
【００３０】
この操作により、試料中に測定対象物質である抗体が存在する場合には、「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」の結合を形成させる。
【００３１】
▲４▼  次に、担体に結合していない未結合の「ペルオキシダーゼ標識結合物質」を洗浄分離する。（Ｂ／Ｆ分離）
【００３２】
▲５▼  そして、「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」の結合により担体に結合したペルオキシダーゼ標識結合物質のペルオキシダーゼ活性を測定することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【００３３】
この測定においては、担体とペルオキシダーゼ標識結合物質が試料中の測定対象物質等を介して、「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」と結合するので、担体に間接的に結合したペルオキシダーゼ標識結合物質の量を測定することにより試料中に含まれていた測定対象物質の有無、又は量を測定することができるものである。
【００３４】
「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合することができる物質−この物質と結合することができる抗体−担体」の結合により担体に結合したペルオキシダーゼ標識結合物質のペルオキシダーゼ活性の測定であるが、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用し、更に過酸化水素を存在させて反応させ、色原体よりロイコ型色素を生成させて、その生成したロイコ型色素の量を吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行えばよい。
【００３５】
本発明における酵素免疫測定法は、例えば、サンドイッチ法、又は競合法等の手法により行うことができる。
【００３６】
また、本発明における酵素免疫測定法は、例えば、１ステップ法、又は２ステップ法等の手法により行うことができる。
【００３７】
また、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、担体として磁性体よりなる物質又は磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。
【００３８】
本発明の試料中の測定対象物質の測定において、担体としては、抗原又は抗体等を固定化することができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に限定することなく使用することができる。
【００３９】
これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、又は発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用いられている担体については、問題なく用いることができる。
【００４０】
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の担体を用いることができる。
【００４１】
また、前記の担体を強磁性体で被覆又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を用いることもできる。
【００４２】
標識物質であるペルオキシダーゼを、抗原又は抗体等に結合させる方法は、化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【００４３】
この化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、標識物質であるペルオキシダーゼと、抗原又は抗体等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、ペルオキシダーゼと、抗原又は抗体等のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００４４】
担体に、抗原又は抗体等を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【００４５】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した抗原若しくは抗体等を、担体の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は、抗原若しくは抗体等と担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【００４６】
例えば、緩衝液等に溶解した抗原若しくは抗体等を、担体の固定化したい部分に添加し接触させ、又は、抗原若しくは抗体等と担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【００４７】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、担体又は担体の固定化したい部分と、抗原又は抗体等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、担体、担体の固定化したい部分、又は抗原若しくは抗体等のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【００４８】
更に、非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、抗原又は抗体等を固定化させた担体のこの固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００４９】
標識物質であるペルオキシダーゼを結合させた抗原若しくは抗体、又は測定対象物質等を溶解させる溶液、あるいは試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【００５０】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【００５１】
この緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕などの緩衝剤の水溶液等を挙げることができる。
【００５２】
また、標識物質であるペルオキシダーゼを結合させた抗原若しくは抗体、又は測定対象物質等を溶解させる溶液、あるいは試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【００５３】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００５４】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノ
0004491572.tif 000002
キシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００５５】
標識物質としては、ペルオキシダーゼを用いるが、このペルオキシダーゼとしては、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
また、ペルオキシダーゼの使用濃度は、１６０〜６４０ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ  ｍＵ／ｍｌの濃度範囲で用いることが好ましい。
【００５６】
なお、本発明においては、前記の『「測定対象物質の抗体と結合することができる物質」と結合することができる抗体』が、Ｄ−８株由来のマウス抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ・モノクローナル抗体であることが好適である。
このＤ−８株由来のマウス抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ・モノクローナル抗体は、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉの近縁の菌種との交差反応性が認められない抗体である。〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１巻，７号，１９４９−１９５１頁，１９９３年〕
この近縁の菌種との反応性が認められないＤ−８株由来のマウス抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ・モノクローナル抗体を用いると、近縁の菌種との反応性のないＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉの抗原を「測定対象物質である抗体と結合することができる物質」として担体に結合することができるため、高い特異性が得られて好ましい。
【００５７】
本発明の測定方法及び測定試薬においては、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用する。
【００５８】
ここでフェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００５９】
また、アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシ．ニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００６０】
また、色原体の使用濃度であるが、４−アミノアンチピリンは１０〜１０００ｍＭの濃度範囲で使用することが好ましく、またフェノール若しくはその誘導体、又はアニリン誘導体は、６〜３００ｍＭの濃度範囲で使用することが好ましい。
【００６１】
本発明の測定試薬及び測定方法における測定対象物質としては、測定の盲検値が高いものが好適である。
このような測定対象物質の例として、夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗体等を挙げることができる。
【００６２】
本発明において、試料としては、前記の測定対象物質が存在する可能性があり、かつその測定対象物質の存在の有無の確認又は場合によっては定量を行おうとする液状のものをいう。
【００６３】
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液；穀物、野菜、果物、魚介類、肉類又は加工食品等の食品、水、茶、コーヒー、牛乳、又は果汁等の飲料、そして、飲料水、河川水、湖沼水、海水、又は土壌の懸濁液等の環境分析用試料等が挙げられる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６５】
〔実施例〕（本発明による、抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定）
【００６６】
血清試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定を、本発明の測定方法及び測定試薬、並びに従来の測定方法及び測定試薬により行い、本発明の測定方法及び測定試薬の効果を確かめた。
【００６７】
１．測定試薬の調製
【００６８】
▲１▼  リン酸等張化緩衝液の調製
精製水約８０ｍｌに、リン酸水素二ナトリウム・十二水の０．２９ｇ、リン酸二水素カリウムの０．０２ｇ、塩化ナトリウムの０．８ｇ、及び塩化カリウムの０．０２ｇを加えて溶解し、精製水で全量１００ｍｌとして、リン酸等張化緩衝液を調製した。
【００６９】
▲２▼  ブロッキング液の調製
精製水約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの０．８８ｇを加えて溶解した後、塩酸を加えてｐＨ８．０に調整した。
更に、カゼインナトリウムの０．５ｇ、アジ化ナトリウムの０．２ｇを加えて溶解した後、精製水で全量１００ｍｌとした。
【００７０】
▲３▼  試料希釈液の調製
精製水の約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの１１．６８ｇを加えて溶解し、塩酸を加えてｐＨ８．０に調整した。
更に、カゼインナトリウムの０．５ｇ、アジ化ナトリウムの０．２ｇを加えて溶解した後、精製水で全量１００ｍｌとした。
【００７１】
▲４▼  洗浄液の調製
精製水の約８０ｍｌに、リン酸水素二ナトリウム・十二水の０．２９ｇ、リン酸二水素カリウムの０．０２ｇ、塩化ナトリウムの０．８ｇ、塩化カリウムの０．０２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）の０．０５ｇを加えて溶解し、精製水で全量１００ｍｌとした。
【００７２】
▲５▼  ＰＯＤ標識抗体希釈液
精製水の約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの０．８８ｇ、ラクトース・一水和物の１．０ｇを加えて溶解し、塩酸を加えてｐＨ８．０に調整した。
更に、カゼインナトリウムの０．５ｇ、硫酸ゲンタマイシンの０．０１ｇを加えて溶解した後、精製水で全量１００ｍｌとした。
【００７３】
▲６▼  Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートの調製
【００７４】
ａ）Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原
Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ株をＹｅａｓｔを加えたＳａｂｏｕｒａｕｄ培地にて２週間培養し、培養上清を得た。
この培養上清を濃縮後、０．１％アジ化ナトリウムを加えて、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原とした。
【００７５】
ｂ）Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原固定化マイクロプレート
前記ａ）で調製したＴ．ａｓａｈｉｉ抗原を、５μｇ／ｍｌとなるようにリン酸等張化緩衝液に加えた。
これをマイクロプレートのウェルに各１００μｌずつ分注し、その後３７℃で１６〜２０時間放置して、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原を各ウェルの内壁に固定化させた。
【００７６】
次に、このマイクロプレートのウェル内の液を除き、洗浄液で２回洗浄を行った。
その後、各ウェルにブロッキンク液を２００μｌずつ分注して、各ウェルのブロッキングを行った。
そして、このマイクロプレートのウェル内の液を除き、洗浄液で２回洗浄を行った。
以上の操作により調製したものを、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートとした。
【００７７】
なお、対照として、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原は用いず、その代わりにブロッキング液を用いて、前記操作の通りに調製したものを、対照マイクロプレートとした。
（この対照マイクロプレートでは、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原は固定化されていない。）
【００７８】
２．試料
【００７９】
▲１▼  患者血清試料
夏型過敏性肺炎の患者８名の血清１０μｌの各々に、試料希釈液１，０００μｌをそれぞれ加えて希釈して、８種類の患者血清試料を調製した。
【００８０】
▲２▼  正常血清試料
健常人１０名の血清１０μｌの各々に、試料希釈液１，０００μｌをそれぞれ加えて希釈して、１０種類の正常血清試料を調製した。
【００８１】
３．測定
【００８２】
▲１▼  本発明による測定
８種類の患者血清試料の各々の１００μｌを、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルと対照マイクロプレートのウェルの各々に添加し、３７℃で１５時間反応させた。
【００８３】
その後、これらのウェルを洗浄液にて洗浄した後、ＰＯＤ標識抗体希釈液で１，０００倍に希釈したＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ社製；Ａ０１７０、Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。
次いで、各ウェルを洗浄液にて洗浄した。
【００８４】
この後、本発明法・色原体液〔１ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、２０ｍＭ  フェノール、及び０．００６％  過酸化水素を含む０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を１５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。
【００８５】
この反応の後、各ウェルに、本発明法での反応停止液（８Ｍ  塩酸グアニジン水溶液）を１５０μｌずつ添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの吸光度（主波長４９０ｎｍ、副波長６５５ｎｍ）を測定した。
【００８６】
そして、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ａ）から対照マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ｂ）を差し引いて吸光度差（Ｃ）を算出した。
【００８７】
この患者血清試料の本発明の測定における測定結果を、表１に示した。
【００８８】
【表１】
0004491572.tif 000003
【００８９】
また、正常血清試料についても、この操作により測定を行い、吸光度を得て、吸光度差を算出した。
【００９０】
この正常血清試料の本発明の測定における測定結果を、表２に示した。
【００９１】
【表２】
0004491572.tif 000004
【００９２】
▲２▼  従来の方法による測定
１０種類の患者血清試料の各々の１００μｌを、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルと対照マイクロプレートのウェルの各々に添加し、３７℃で５．５時間反応させた。
【００９３】
その後、これらのウェルを洗浄液にて洗浄した後、ＰＯＤ標識抗体希釈液で５，０００倍に希釈したＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ社製；Ａ０１７０、Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３時間反応させた。
次いで、各ウェルを洗浄液にて洗浄した。
【００９４】
この後、従来法・色原体液〔「ＯＰＤ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｔａｂｌｅｔ  Ｓｅｔｓ」（Ｓｉｇｍａ社製；Ｐ９１８７；オルト−フェニレンジアミンを含有）の１錠を精製水２０ｍｌで溶解し、０．００６％の濃度になるように過酸化水素水を添加したもの。〕を１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で２０分間反応させた。
【００９５】
この反応の後、各ウェルに、従来法での反応停止液（４Ｎ  硫酸水溶液）を５０μｌずつ添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの吸光度（主波長４９０ｎｍ、副波長５５０ｎｍ）を測定した。
【００９６】
そして、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ａ）から対照マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ｂ）を差し引いて吸光度差（Ｃ）を算出した。
【００９７】
この患者血清試料の従来方法の測定における測定結果を、表３に示した。
【００９８】
【表３】
0004491572.tif 000005
【００９９】
また、正常血清試料についても、この操作により測定を行い、吸光度を得て、吸光度差を算出した。
【０１００】
この正常血清試料の従来方法の測定における測定結果を、表４に示した。
【０１０１】
【表４】
0004491572.tif 000006
【０１０２】
４．考察
正常血清試料（１０種類）の従来方法の測定による測定結果を示した表４において、吸光度差（Ｃ）の値は、０．３７６〜２．０６８となっており、測定の盲検値が非常に高いものであることが分かる。
【０１０３】
これに対して、同じ正常血清試料の本発明の測定による測定結果を示した表２において、吸光度差（Ｃ）の値は、０．０５７〜０．４６３となり、これはそれぞれ従来方法における吸光度差の値の９〜２２％であって、盲検値を低減できていることが分かる。
【０１０４】
つまり、本発明による測定は、非特異的な反応の影響を抑制し、盲検値を低減させて、測定の特異性を高めることにより、正確な測定を行えるものであることが分かる。
【０１０５】
また、患者血清試料（８種類）の従来方法の測定による測定結果を示した表３において、吸光度差（Ｃ）の値は、２．６７６〜２．９４７である。
【０１０６】
これに対して、同じ患者血清試料の本発明の測定による測定結果を示した表１において、吸光度差（Ｃ）の値は、１．９９３〜２．９９８であり、従来方法における吸光度差の値と大きな差がないことが分かる。
つまり、患者血清試料の測定において、本発明による測定は、従来方法と同等の吸光度、すなわち同等の感度を有するものであることが分かる。
【０１０７】
以上のことより、本発明の測定試薬及び測定方法は、測定の感度を犠牲にすることなく、非特異的な反応の影響を抑え、盲検値を低減し、特異性を高めて、正確な測定が行える測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
そして、それ故、疾病の診断を正確に行うことができる測定試薬及び測定方法であることが確認できた。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明の酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定試薬及び測定方法は、非特異的反応が生じ、盲検値が高い測定試薬及び測定方法においても、この非特異的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させることができ、特異性高く正確に試料中の測定対象物質の測定を行うことができる測定試薬及び測定方法である。