(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性シグマ−１受容体遺伝子中に中断を含む突然変異を含むゲノムを有する、内因性シグマ−１受容体に欠陥のある非−ヒト突然変異体哺乳動物であり、
前記遺伝子中断が検出可能なレベルの内因性シグマ−１受容体を欠く非−ヒト突然変異体哺乳動物を生じさせるとともに、
前記非−ヒト突然変異体哺乳動物が生殖能力を有するマウスであり、
アクセスナンバーＣＥＣＴ５７３７でＣＥＣＴに供託され、ｐＨＲ５３ＴＫとして識別されるベクターを用いて、内因性シグマ−１受容体内に機能的中断を導入して得られる、
非−ヒト突然変異体哺乳動物。
【請求項２】
前記非−ヒト突然変異体哺乳動物が、前記突然変異に対しホモ接合性の突然変異体である、請求項１に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物。
【請求項３】
アクセスナンバーＣＥＣＴ５７３７でＣＥＣＴに供託され、ｐＨＲ５３ＴＫとして識別されるベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターによりトランスフェクトされた内因性シグマ−１受容体遺伝子を含んで成るゲノムを有す宿主細胞。
【請求項５】
内因性シグマ−１受容体遺伝子を含むゲノムを有す前記宿主細胞が、シグマ−１受容体遺伝子の産物を正常に発現する分化した細胞、及び非−ヒト多能性胚細胞の中から選定される、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
突然変異したシグマ−１受容体遺伝子の対立遺伝子を含んで成る、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の内因性シグマ受容体に欠陥のある非−ヒト突然変異体哺乳動物又はその子孫から由来する単離細胞であって、内因性シグマ−１受容体遺伝子の中断を含む突然変異を有し、前記遺伝子中断が検出可能なレベルの内因性シグマ−１受容体を欠く非−ヒト突然変異体哺乳動物を生じさせる、単離細胞。
【請求項８】
シグマ−１受容体遺伝子の突然変異した対立遺伝子の両方を含んで成る、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
増殖させた及び任意に不死化させた、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の内因性シグマ−１受容体に欠陥のある非−ヒト突然変異体哺乳動物の子孫であって、内因性シグマ−１受容体遺伝子の中断を含む突然変異を有し、前記遺伝子中断が検出可能なレベルの内因性シグマ−１受容体を欠く非−ヒト突然変異体哺乳動物を生じさせる、子孫。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物を作製する方法であって、内因性シグマ−１受容体遺伝子の対立遺伝子と請求項３に記載の陽性−陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターとの間での細胞中での相同性組換えによる細胞ゲノムに存在する内因性シグマ−１受容体遺伝子中への機能的中断の導入、陽性−陰性選定マーカー技術による相同組換え体の選定、胚の中への前記相同性組換え体の導入、偽妊娠している雌性哺乳動物受容体中へのそれらの移植及びそれらの出産、胚芽株によりそれらの子孫に前記相同組換え体の遺伝子型を効果的に伝播できるキメラの選定；前記キメラを非−ヒト野生型哺乳動物と交配させて、ヘテロ接合突然変異体を得て、内因性シグマ−１受容体遺伝子を中断させて、そして所望されるならば前記ヘテロ接合変異体を互いに交配させて、ホモ接合変異体を得ること、を含んで成る、方法。
【請求項１２】
In vivo検査において導入されるコントロール動物としての、請求項１又は２に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物の使用。
【請求項１３】
中枢神経系疾患を予防及び／又は治療する；
記憶障害を予防及び／又は治療する；
ストレス症状を予防及び／又は治療する；
薬剤依存症を予防及び／又は治療する；
無感覚症を生じる；或いは
神経保護を生じること、
を意味する潜在的に有用な化合物を評価するための、請求項１又は２に記載のシグマ−１受容体に欠陥のある非−ヒト突然変異体哺乳動物の使用、又は、請求項４又は５に記載のシグマ−１受容体に欠陥のある細胞株の使用。
【請求項１４】
検査される化合物と請求項１又は２に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物とを接触させ、そして前記化合物との接触の応答として前記非−ヒト突然変異体哺乳動物中での生理学的な変化の存在又は不存在を検出することを含んで成る、内因性シグマ−１受容体遺伝子に欠陥のある非−ヒト哺乳動物で検査される化合物の効果を決定するための方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物に検査される化合物を投与し；機能的内因性シグマ−１受容体を発現するコントロール非−ヒト哺乳動物へ前記検査される化合物を投与し；そして当該コントロール非−ヒト哺乳動物と比較した場合、前記化合物が前記非−ヒト突然変異体哺乳動物の表現型に影響を有するかどうかを観察すること、を含んで成る、内因性シグマ−１受容体遺伝子に欠陥のある非−ヒト哺乳動物で検査される化合物の効果を決定するための方法。
【請求項１６】
細胞が請求項１又は２に記載の非−ヒト突然変異体哺乳動物から単離又は樹立されたものである細胞集団又はそれらの均質化物の中に検査される化合物を導入し、機能的シグマ−１受容体を発現するコントロール非−ヒト哺乳動物細胞の集団、又はそれらの均質化物へ検査される前記化合物を投与し、そして前記検査される化合物が、コントロール非−ヒト哺乳動物の当該細胞と比較した場合、前記非−ヒト突然変異体哺乳動物の細胞中の前記シグマ−１受容体の発現に影響を有するか否かを観察もしくは分析すること、を含んで成る前記シグマ−１受容体を発現する細胞へ、及び前記シグマ−１受容体を発現しない細胞への化合物の効果を決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性のシグマ受容体に欠陥のある非-ヒト突然変異体哺乳動物、前記突然変異体動物由来細胞、及びそれらの応用に関する。本発明は、また内因性シグマ受容体に欠陥のある前記非-ヒト突然変異体哺乳動物を作製するために有用である陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターにも関する。
【背景技術】
【０００２】
シグマ受容体は異なるリガンドに親和性を有す結合サイトであり、そのいくつかは活性の異なる医薬である。最初のシグマ受容体の関心は、ハロペリドール、又はN-アリルノルメタゾシン(SKF-10047)等の他の精神様活性を引き起こす化合物のような典型的な抗精神病作用物質に高親和性を示す、抗精神病薬の作用におけるそれらの潜在的役割のためであった。追って、シグマ受容体は他の生理学的メカニズムに関与することができることが発見された。
【０００３】
タイプ−１及びタイプ−２シグマ受容体として公知である、シグマ受容体の２つのサブクラスが同定され、それらの薬理学的プロファイル、機能及び分子サイズにより、区別することができる。両タイプは典型的な抗精神病薬、特にハロペリドールに高から中程度の親和性を見せる。しかしながらタイプ-1シグマ受容体は、(+)-ペンタゾシン、(+)-SKF10047及び他の(+)-ベンゾ-morfanesに高親和性を見せる一方、タイプ-2シグマ受容体はこれらの化合物に低親和性を見せる。タイプ-1シグマ受容体は、典型的に25 kDaの分子量を有す一方、タイプ-２のシグマ受容体の分子量は18-21 kDaである(両ケースともフォトアフィニティーマーキングにより決定された)。
【０００４】
タイプ1  シグマ受容体
シグマ-1受容体として以後言及される、タイプ-1 シグマ受容体は、多数の成体哺乳動物組織(中枢神経系、卵巣、睾丸、胎盤、副腎腺、脾臓、肝臓、腎臓、胃腸管等)及びその初期段階の胚発達において発現する非-オピオイド(opiaceous)タイプ受容体であり、そして多くの数の生理学的な機能に明らかに関与する。SKF-10047、(+)-ペンタゾシン、ハロペリドール及びrimcazole等の多種の医薬へのその高い親和性が発表され、特に鎮痛剤、精神安定剤、抗うつ剤、抗健忘症剤、抗精神病剤、及び神経保護活性剤とのリガンドが公知であるので、シグマ-1受容体の研究は、無痛覚症、不安、嗜癖、健忘症、うつ病、精神分裂病、ストレス、神経保護及び精神病に関連した過程における可能な限りの生理学的役割の見地から、薬理的に非常に重要である〔1〕、〔2〕及び〔3〕。しかしながら、シグマ-１受容体により行われる実際の役割は、なお未知で不可解なものである。事実、その特異的内因性リガンドは未知であるが、プロゲステロン及びテストステロンのような内因性ヒトステロイドと相互作用すると信じられている。
【０００５】
モルモットのシグマ-１受容体をコードするcDNA配列、ヒトのcDNA配列及びシグマ-1受容体遺伝子、マウスのcDNA配列及びシグマ-1受容体遺伝子、並びにラットのシグマ-1受容体をコードするcDNAが全て発表されている。
【０００６】
シグマ-1受容体をコードする遺伝子配列を得るための最初の作業は、Hanner等〔4〕による。この作業では、(+)[3H]ペンタゾシン等の一定の放射活性的にマークした化合物への本受容体の特異的結合特性を用いて、最初にタンパク質、そしてその後それをコードしたｃDNAクローンを得た。cDNAゲノムバンクから単離された当該クローンは、モルモット (C. porcellus)肝mRNA〔1857塩基対によるcDNA、GenBankデータベース、アクセスコードZ66537〕から調製された。次にcDNA配列に基づき、いくつかのワークグループは、配列相同性によりヒトcDNA〔５〕(1653塩基対によるcDNA、GenBankデータベース、アクセスコード:HSU75283)、マウスcDNA及び遺伝子〔６〕(1567塩基対によるcDNA、GenBankデータベース、アクセスコード:AF030198；6973塩基対による遺伝子、GenBankデータベース、アクセスコード: AF030199)、ラットcDNA〔７〕(1582塩基対によるcDNA、GenBankデータベース、アクセスコード:AF004218)、及びヒト遺伝子〔８〕(プロモーター(3589塩基対、GenBankデータベース、アクセスコード:AF001975)、エクソン1、2及び3(757塩基対、GenBankデータバンク、アクセスコード:AF001976)並びにエクソン4(1630塩基対、GenBankデータベース、アクセスコード: AF001977) を含むそれぞれ３つのDNAフラグメントの中に記載された遺伝子))を連続的にクローニングした。
【０００７】
ヌクレオチド及びアミノ酸に基づく両方のそれらの配列中での相同性の分析は、それらの中の相同性の高さの程度を明示する。それらの配列の知識は、シグマ受容体中の変化に関連した生理学及び病理学、並びに前記受容体、もしくは前記受容体が関与する受容体中の変化に関連した治療又は予防病理学のために潜在的に有用である医薬の有効性の研究を意図した動物モデルを開発するために使用できる。
【０００８】
タイプ−2 シグマ受容体
シグマ-２受容体として以後言及される、タイプ-２シグマ受容体は、多数の成体哺乳動物組織(神経系、免疫系、内分泌系、肝臓、腎臓、等)において発現する受容体である。シグマ-2受容体は、細胞増殖の制御、又は細胞発達において重要な役割を果たす新規のアポトーシス経路における要素と成り得る。この経路は、細胞内の膜と連結し、細胞小器官からカルシウムを放出する能力も有する小胞体及びミトコンドリア等のカルシウムを蓄える細胞小器官中に位置するシグマ-2受容体から成ると思われる。当該カルシウムシグナルは、正常細胞のためのシグナリング経路において、及び／又はアポトーシス誘導において使用することができる。
【０００９】
シグマ-2受容体のアゴニストは、細胞形態学における変化、細胞系のいくつかのタイプにおけるアポトーシスを誘導し、そしてp-糖タンパク質mRNAの発現を制御するため、それらは癌治療のための抗腫瘍薬として潜在的に有用である。事実、シグマ-2受容体アゴニストは、一般の抗腫瘍薬に耐性であるDNAが損傷した乳房の腫瘍細胞株でアポトーシスを誘導することが観察された。更に、シグマ-２受容体のアゴニストは、当該アゴニストが細胞毒性でない濃度でそれらの抗腫瘍薬の細胞毒性効果を増強させる。従って、シグマ-2受容体のアゴニストは、アポトーシスを誘導する投与量で、又は他の抗腫瘍薬の薬剤耐性を戻すため、当該薬とのコンビネーションにおいて、サブ−トキシック投与量で抗腫瘍薬として使用することができ、それによって抗腫瘍薬をより低用量で使用することができ、そしてその副作用をかなり軽減することができる。シグマ-2受容体のアゴニストは、癌の画像診断において、SPECT又はPET等の画像診断技術により、腫瘍及びそれらの転移を視認化する非浸襲性薬としても使用できる。それ故に、シグマ-2受容体は、癌と戦うツールのための非常に重要なターゲットを構成する。
【００１０】
シグマ-2受容体のアンタゴニストは、典型的な抗精神病薬により引き起こされる不可逆的運動副作用を予防することができる。事実、シグマ-2受容体のアンタゴニストは、ハロペリドール等の典型的な抗精神病薬による慢性的な精神病の治療のために、患者に発現する遅延運動障害の減弱した有効性を改善させるための薬として有用であり得ることが見出された。有用であるとされるシグマ-2受容体が遮断されたシグマ-2受容体は、変性疾患(degenerative disorders)において一定の役割を果たすとも思われる。シグマ-2受容体の更なる情報は、W.D.Bowenによる論文を参照〔３〕。
【００１１】
シグマ-2受容体は多数の生理学的機能に関与していると思わるが；シグマ-1受容体と一緒にした場合のシグマ-2受容体による果たされる実際の役割は全く知られていないので、それらの理解を増やす必要がある。前記シグマ-2受容体が関与する生理学的機能の理解に寄与するその他は、受容体が関与する生理学及び病理学を研究するため、及び前記受容体が関与する病理学的治療及び予防において潜在的に有用である薬剤の効果を研究するために、意図される動物モデルの開発から成る。
【００１２】
“ノックアウト”技術
哺乳動物の遺伝子操作は、特異的遺伝子を発現するトランスジェニック動物を得ることができ、或いは特異的突然変異により不活性化された遺伝子を有すことができる (“ノックアウト”又は突然変異体動物)。いずれの場合も、in vivoで所定の遺伝子の機能の分析を可能にする研究室動物の実験モデルをデザインするためのそれらの潜在的な使用は、明白である。
【００１３】
突然変異体動物を作製するための“ノックアウト”技術は十分に確立されていて、そして多くの刊行物の対象となっている。例として、以下の米国特許を引用してよい：特に米国特許No.5,464,764、米国特許No.5,487,992、米国特許No.5,627,059、米国特許No.5,631,153、米国特許No.6,194,633、米国特許No.6,207,876、米国特許No.6,239,326、米国特許No.6,245,963、米国特許.No.6,245,965及び米国特許No.6,252,132。 
【００１４】
遺伝子発現の欠乏は、突然変異体動物に対し新規の表現型を与えることができる。動物により発現されない遺伝子に依存し、一定の病理的変化を多かれ少なかれ感受性にするようにすることができる。これらの突然変異動物は、in vivoでの遺伝子の役割の研究のため、並びに本遺伝子産物の欠失、或いは本遺伝子産物の発現、又は不十分な発現に関連した病理学的治療又は予防に潜在的に有用であり得る化合物の研究において有益なモデルである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
シグマ受容体は異なる薬理学的活性による化合物への親和性を示すことが発表されたが、それらの受容体により果たされる実際の役割は現在のところ知られていないため、内因性シグマ受容体により果たされる役割をin vivoにおいて研究するための動物モデルを作製することは必須である。内因性シグマ受容体に欠陥のある突然変異体動物は、それらの受容体によりin vivoにおいて果たされる役割を明確にするために寄与し、及びそれらのシグマ受容体の無効又は不十分な発現に関連する治療過程に潜在的に重要となる化合物をデザイン及び評価することができるであろう。当該発明は、現在の要求される解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本発明は、内因性シグマ受容体の少なくとも１つの対立遺伝子、及び好適には両対立遺伝子が挿入された外因性DNAを含む、体性及び胚芽細胞を有し、かくして内因性シグマ受容体遺伝子の産物を発現しない突然変異体非-ヒト導入動物である、非-ヒト突然変異体動物に関する。前記シグマ受容体は、シグマ-１受容体、又はシグマ-2受容体等の任意のシグマ受容体であってよい。特定の態様では、内因性シグマ対立遺伝子中に挿入された内因性DNAは、陽性選定マーカーを含む。
【００１７】
それ故に１の観点では、本発明は生育非-ヒト哺乳動物に関し、そのゲノムは突然変異させたシグマ受容体遺伝子を含み、そして前記内因性シグマ受容体の検出可能レベルのメッセンジャーRNA又はタンパク質を欠く。特定の態様では、前記非-ヒト突然変異体哺乳動物は、内因性シグマ1受容体に欠陥がある突然変異体マウス等の哺乳動物クラスに属する非-ヒト動物である。当該シグマ-1受容体に欠陥があるマウスは、生育可能であり、生殖能力があり、そして研究室条件下おいて、遺伝的に類似する前記突然変異体を欠くマウスからそれらを区別する任意の徴候を明示しない。安定した条件でのコントロール下におけるシグマ-１受容体のマウス突然変異体は、それらの野生で生まれた兄弟から区別することができる。シグマ-1受容体の機能(又は機能障害)は、不安、うつ病、精神分裂病、又は精神病等の中枢神経系における疾患に関連すると仮定された。当該シグマ-1受容体は、抗健忘症、及び神経保護的活性を有すると思われ、そして無痛覚症、嗜癖又はストレスの認知及び導入にも関連した。病理学的条件で引き起こされるヒトにおけるこれらの状況のため、シグマ-1受容体に欠陥のあるマウスは、前記シグマ-1受容体が関与する前記状況の研究のため、並びに病理学的変化及び条件の影響を制御又は緩和するためにデザインされた薬剤を検証及び／又は開発するため、の両方で有用と成り得る。
【００１８】
他の特定の態様では、前記非-ヒト突然変異体哺乳動物は、内因性シグマ-2受容体に欠陥がある突然変異体マウス等の哺乳動物クラスに属する非-ヒト動物である。シグマ-2受容体は、癌と戦うための診断及び治療ツールをデザインするために非常に重要なターゲットであり、並びに／或いは化合物は、抗精神病薬による継続治療を受ける患者における運動性副作用を妨げ、軽減し、又は緩和することができると思われる。このように、シグマ-2受容体に欠陥を有するマウスは、癌の診断又は治療のためにデザインされた薬剤を検証及び／又は開発するために、変性過程を予防及び／又は治療するためにデザインされた薬剤を検証及び／又は開発するために、そして抗精神病薬の患者への継続投与に関連した副作用、特に運動性副作用、を予防、減少、もしくは緩和するための薬剤を検証及び／又は開発するために、有用と成り得る。
【００１９】
細胞ゲノム中に存在する内因性シグマ受容体遺伝子中の突然変異は、内因性シグマ受容体の対立遺伝子と、前記内因性シグマ受容体遺伝子中に存在するヌクレオチド配列に対応する相同性領域を含む陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターとの間の前記細胞中での相同性組換えにより挿入することができ、そして陽性-陰性選定マーカー技術（臨月まで担持される適正な妊娠のための雌性受容体中へ後に移植する胚芽中に導入される）により相同性組換え体を選定することができる。その胚芽株を経由してそれらの子孫へ相同性組換え体の遺伝子型を効果的に遺伝させることができる当該キメラを、内因性シグマ受容体遺伝子を中断させるための突然変異体ヘテロ接合体を得るために野生非-ヒト哺乳動物と交配させ、そして後に、当該突然変異体へテロ接合体を、突然変異体ホモ接合体を生産するためにその他の一つと交配させ、古典的なメンデル対立遺伝子の分離を続けて起こす。
【００２０】
特定の態様では、内因性シグマ受容体に欠陥のある前記非-ヒト突然変異体哺乳動物は、前記突然変異のためのヘテロ接合性突然変異体である一方、他の特定の態様では、前記非-ヒト突然変異体哺乳動物は、前記突然変異のためのホモ接合性突然変異体である。
【００２１】
内因性シグマ受容体に欠陥がある非-ヒト突然変異体哺乳動物の子孫は、本発明の更なる観点を構成する。
【００２２】
他の観点では、当該発明は、増殖させることができ、そして任意に不死化させることができる、内因性シグマ受容体に欠陥がある前記非-ヒト突然変異体哺乳動物から単離された細胞に関する。これらの細胞はヘテロ接合体（即ち内因性シグマ受容体遺伝子のための１つの突然変異体対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を含む）、或いはホモ接合体（即ち内因性シグマ受容体遺伝子のための２つの突然変異体対立遺伝子を含む）と成り得る。
【００２３】
本発明の他の観点では、シグマ受容体遺伝子における機能的中断を導入するために有用な：a)陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列の5’末端に位置する第一の相同性領域（前記第一の相同性領域がシグマ受容体遺伝子の第一の配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有す）；b)陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列；c)陽性選定マーカーカーカーをコードする前記ヌクレオチド配列の3’末端に位置する第二の相同性領域（前記第二の相同性領域がシグマ受容体遺伝子の第二の配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、当該第二のシグマ受容体遺伝子は、野生型内因性シグマ遺伝子におけるシグマ受容体遺伝子の前記第一の配列に対し3’に位置する）;及びd)陰性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列、を含む陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターに関する。
【００２４】
他の観点では、当該発明は、前記陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターが、前記ベクターと前記宿主細胞の対応の内因性シグマ受容体遺伝子との間の相同性組換えにより導入され、この内因性シグマ受容体遺伝子中の機能的な中断を生み出す、宿主細胞に関する。特定の態様では、前記宿主細胞は、シグマ受容体遺伝子の産物を正常に発現する分化した細胞であり、又は胚盤胞として知られる着床前段階における胚の内部の細胞塊から確立されたES胚幹細胞等の未分化の不死の多能性細胞である。特異的態様では、これらのES胚細胞はマウス細胞である。
【００２５】
本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、内因性シグマ受容体により果たされる役割をin vivoで研究するため、そして前記遺伝子、もしくは前記遺伝子が関与する産物の無効又は不十分な発現に関連した病理学的変化を治療するための潜在的に重要な化合物をデザイン及び評価するための動物モデルとして使用され得る。更に、本発明の前記非-ヒト突然変異体哺乳動物は、細胞培養のため起源細胞を使用できた。
【００２６】
本発明の更なる観点は、記載の概要及び特許請求の範囲における当業者に明白であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
１つの観点では、本発明は、内因性シグマ受容体に欠陥のある非-ヒト突然変異体哺乳動物を提供し、本明細書において以後、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物として言及し、そのゲノムはシグマ受容体遺伝子中での中断を含む突然変異を含んで成る。
【００２８】
本明細書において使用される用語“非-ヒト哺乳動物”とは、マウス等の哺乳動物クラスに属する任意の非-ヒト動物を含む。本明細書において使用される用語“本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物”とは、操作された非-ヒト哺乳動物を言うので、内因性シグマ受容体に欠陥があり、即ち、シグマ受容体遺伝子産物の正常な発現を妨げる突然変異を有するために、内因性シグマ受容体の検出レベルのメッセンジャーRNA又はタンパク質が欠如する。“本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物”という表現は、ヘテロ接合の変異体(それらは内因性シグマ受容体遺伝子の突然変異体対立遺伝子及び野生型対立遺伝子を含む)及びホモ接合体の両方を含む。本発明の特定の好適な態様では、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、ホモ接合の突然変異体であり、即ち、遺伝子産物の検出不能発現をもたらす内因性シグマ受容体遺伝子の突然変異体対立遺伝子の両方を含む。
【００２９】
本明細書において使用される用語“シグマ受容体”とは、タイプ-1シグマ受容体(シグマ-1)及びタイプ-2シグマ受容体(シグマ-2)に関する。
【００３０】
本発明の非-ヒト哺乳動物のゲノム中に存在する突然変異は、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の体性細胞又は胚芽細胞のいずれかにおいて存在することができる。好都合には、前記突然変異は本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の胚芽細胞中に存在することによって、その子孫へ当該突然変異を遺伝させる能力を与える。その結果、本発明の特定の態様では、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は生殖能力があり、そしてその子孫へその突然変異を遺伝させることができる。
【００３１】
本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物に存在する突然変異は、前記内因性シグマ受容体に欠陥がある非-ヒト突然変異体哺乳動物に発生する、内因性シグマ受容体遺伝子中の機能的中断を引き起こす、挿入、欠失又は厳密な突然変異を含む。特定の態様では、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物のゲノムは、内因性シグマ受容体遺伝子中に挿入された突然変異内に導入遺伝子を含む。図説によると、前記導入遺伝子はネオマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子等の陽性選択マーカー、又は本発明により提供された陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターとの関連で以下に述べる任意の他の陽性選択マーカーをコードする遺伝子を含む。
【００３２】
本発明の特定の態様では、突然変異体マウスは、内因性シグマ-1受容体中において欠陥を有し、内因性シグマ-1受容体遺伝子に対しホモ接合性であり、生殖能力を提供し、そのゲノムはneo遺伝子を含む前記遺伝子中に中断を含む。
【００３３】
本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、細胞ゲノム中に存在する内因性シグマ受容体遺伝子の中での機能的中断の挿入を含む過程により得ることができる。特定の態様では、前記機能的中断は、適した細胞、例えば前記シグマ受容体遺伝子を正常に発現する分化した細胞、又はES多能性胚細胞等のゲノム中に存在するシグマ-1受容体遺伝子又はシグマ-2受容体遺伝子等、の内因性シグマ受容体遺伝子中で相同性組換えにより、前記細胞中に陽性-陰性選定マーカーを有す相同性組換えベクターを導入することにより、及び陽性-陰性選定マーカー技術により相同性組換え体を選定することにより導入され、それは本明細書において以後記載するように本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物を作製するために使用することができる。或いは、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、両親として働く本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物間での古典的な交配技術、又は体外受精により作成することができる。
【００３４】
他の観点では、本発明は多能性胚ESヘテロ接合細胞の組換え体クローンを提供し、即ち、突然変異させたシグマ受容体の対立遺伝子の一つを有する。これらの細胞からキメラ及びシグマ受容体に欠陥があるこれらの非-ヒト突然変異体哺乳動物を得ることが可能である。特定の態様では、前記多能性胚ESヘテロ接合細胞はマウス細胞であり、これよりキメラを得ることができ、またこれよりシグマ受容体に欠陥がある突然変異体マウスを得ることができる。
【００３５】
他の観点では、本発明は陽性陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターを提供し、本発明の以下のベクターは：
ａ）陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列の5’末端に位置する第一の相同性領域（前記第一の相同性領域が、シグマ受容体遺伝子の第一の配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有す）； 
ｂ）陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列の3’末端に位置する第二の相同性領域（前記第二の相同性領域が、前記シグマ受容体遺伝子の第二のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、シグマ受容体遺伝子のこの第二の配列が、野生型内因性シグマ遺伝子におけるシグマ受容体遺伝子の第一の配列に対し3’に位置する）;及び
ｄ）陰性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列、を含んで成る。
【００３６】
当該シグマ受容体は、シグマ-１、又はシグマ-２受容体等の任意のシグマ受容体になることができる。
【００３７】
本発明のベクターは、相同性組換え技術により細胞ゲノム中に含まれる、シグマ-1受容体又はシグマ-2受容体遺伝子等の内因性シグマ受容体遺伝子に機能的中断を挿入するために使用することができ、そして相同性組換え体の陽性-陰性選定マーカーは、内因性シグマ受容体に欠陥がある非-ヒト突然変異体哺乳動物を作成するために使用することができる。
【００３８】
陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ前記第一及び第二の相同性領域に対応する、前記シグマ受容体遺伝子の配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列とその5'及び3'位おいて隣接する。本明細書において使用されるヌクレトチド配列は、前記ヌクレオチド配列と宿主細胞中の内因性シグマ遺伝子の配列との間の相同性組換えを許容するために、前記ヌクレオチド配列が前記シグマ受容体遺伝子の配列と十分に相同性である場合、シグマ受容体遺伝子に“実質的に同一”である。典型的に、前記第一及び第二の相同性領域のヌクレオチド配列は、相同性組換えの目的とされる内因性シグマ受容体のヌクレオチド配列と少なくとも90％、好適には95％、及びより好適には100％同一である。好都合には、前記第一及び第二の相同性領域は、目的とされる内因性対立遺伝子に関して同遺伝子系である(即ち、前記相同性領域のDNAは、本発明のベクターが挿入されるであろう細胞と同一遺伝子系の遺伝子バンク由来の細胞から単離される)。前記相同性領域は、本発明のベクターが前記細胞中へ挿入される場合、本発明のベクターと宿主細胞中の内因性シグマ受容体遺伝子との間の相同性組換えを許容するために十分に長くなくてはならない。典型的に、前記相同性領域の合計の長さは、少なくとも5キロ塩基(kb)、及び好適には少なくとも10kbである。
【００３９】
特定の態様では、前記第一及び第二の相同性領域は、相同性組換えにより除去され、そして陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列により置き換えられる前記遺伝子の領域と隣接している内因性シグマ受容体遺伝子の対応のヌクレトチド配列と実質的に同一であるそれらのヌクレオチド等から選定される。 
【００４０】
前記第一及び第二の相同性領域は、組換え体の相同性における内因性シグマ受容体の感知され得るレベルの欠如を起こさせるために挿入されるだろう中断を有する内因性シグマ受容体遺伝子配列に従って選定され、従って得られた内因性シグマ受容体に欠陥のある突然変異体動物にも依存するだろう。モルモットにおいてシグマ-1受容体をコードするcDNA配列、ヒトにおけるcDNA配列及びシグマ-１受容体、並びにラットにおいてシグマ-1受容体をコードするcDNA配列は、〔4〕-〔8〕で発表された。未だ公知となっていないヌクレオチド配列を持つ動物の内因性シグマ-1受容体をコードするゲノム又はcDNAは、高い相同性が特に観察された公知のシグマ-1受容体遺伝子の配列を考慮して、かかる種の遺伝子ライブラリーから慣習的な方法によって得ることができる。更に、ゲノムDNA又はcDNA配列上の情報、好適にはシグマ-2受容体遺伝子の情報は、刊行物又は核酸配列もしくはタンパク質配列のデータベースから得ることができ、或いはそれらを発現する細胞の遺伝子ライブラリーからの必要な修飾を伴う慣習的な方法によって、本明細書の実施例１及び２で記載されたものと同じ戦略、又はシグマ-1受容体遺伝子をコードする配列を得るため、他の著者によってなされた必要な修飾を伴うおよそ類似する戦略〔4〕によって、内因性シグマ-2受容体をコードする代替のゲノム又はcDNAクローンを得ることができる。
【００４１】
前記第一及び第二の相同性領域は、適宜イニシエーターオリゴヌクレトチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はRT/PCR(逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応)を用いることなどにより、導入されるだろう中断を有すシグマ受容体遺伝子のヌクレオチド配列を考慮した慣習的な方法により得ることができる。実施例1.1は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の単離を記載する。
【００４２】
特定の態様では、本発明のベクターは、そのヌクレオチド配列がマウスシグマ-1受容体遺伝子の6.8kbの第一のヌクレオチド配列と実質的に同一である第一の相同性領域、及びそのヌクレオチド配列がマウスシグマ-1受容体遺伝子中の前記遺伝子の3.1kbの第二のヌクレオチド配列と実質的に同一である第二の相同性領域を含み、前記遺伝子の区切られた1.9kb(図5参照)は、本発明のベクターとの相同性組換えにより除去される。
【００４３】
陽性選定マーカーをコードする核酸配列は、それを含む細胞に陽性選定マーカー特性を与え、即ち、前記陽性選定マーカーを含みそして発現する細胞を、それを含まない細胞に対して選定することができる。陽性選定マーカーをコードするヌクレオチド配列は、前記マーカーの発現を独自に調節し、陽性発現カセットを構成している制御要素を作用可能式に結合させることができ、或いは本発明のベクターを構築することができるので、前記マーカーの発現を、内因性シグマ受容体遺伝子を制御する要素の調節下で起こすことができる。任意の陽性選定マーカーの殆どが本発明のベクターを構築するために使用することができる。陽性選定マーカーの図式例は、例えば、米国特許No.5,464,764の記載に見つけることができる。特定の態様では、本発明のベクターは、G418硫酸塩等の抗生物質ネオマイシン又はその類似物による治療に関連する細胞死への耐性を与える、neo遺伝子を含む核酸配列を含んで成る。
【００４４】
陰性選定マーカーをコードする核酸配列は、それぞれ第一及び第二の相同性領域5'又は3'末端へ置かれ、そして陰性選定マーカー発現カセットを構成している前記陰性選定マーカーの発現を調節する制御要素へ作用可能式に結合される。好都合には、陰性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列は、シグマ受容体遺伝子の任意の配列と実質的に“同一性でない”ので、陰性選定マーカーをコードする核酸配列は、前記配列間の相同性組換えを許容するシグマ受容体遺伝子の任意の配列と十分に相同でない、即ち、陰性選定マーカー及びシグマ受容体遺伝子の配列をコードする前記ヌクレオチド配列のヌクレオチド間の同一性の程度は、所望されない組換えを予防するため、45%未満、好適には30%未満であるべきである。更に、本ヌクレオチド配列は、好都合には、非-ヒト哺乳動物ゲノムのいかなる他の配列と同一でない。当該陰性選定マーカーは、それを含む細胞に陰性選定マーカー特性を与え、即ち、それは、前記陰性選定マーカーを含まない細胞を、前記陰性選定マーカーを含みそして発現するそれらの細胞から選定することができ、後者は陰性選定マーカー試薬の作用のために死に、一方それらを含まない細胞は生き残るであろう。殆どの任意の陰性選定マーカーは、本発明のベクターを構築するために使用することができるが、当業者は、前記陰性選定マーカーをコードするヌクレオチドが、内因性シグマ受容体遺伝子のヌクレオチド配列、もしくは非-ヒト哺乳動物ゲノムの任意の他の配列と実質的に同一でないという条件を満足するものを選定するであろう。陰性選定マーカーを例示は、例えば米国特許 No. 5,464,764に見出すことができる。本発明の特定の態様では、本発明のベクターは単純ヘルペスウィルス(HSV)のチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を含むヌクレオチド配列を含んで成る。DNA合成は、前記tk遺伝子を含み、そして発現する細胞中で妨げることができる。これらの細胞は、陰性選定マーカー薬として、ガンシクロビル、又は任意の機能的に同等のヌクレオチド類似物を用いて除去することができる。
【００４５】
特異的な態様では、本発明のベクターは、マウスシグマ-1遺伝子のそれぞれ第一及び第二の配列と実質的に同一である、第一及び第二の相同性領域、neo遺伝子を含むヌクレオチド配列、並びにtk遺伝子を含むヌクレオチド配列、を含む陽性-陰性選定マーカーを有す相同性組換えベクター、例えばpHR53TKとして公知であるベクター(図7参照)であり、それは相同性組換えにより内因性シグマ-1受容体遺伝子を含むES胚性マウス細胞等のマウス細胞に形質転換するため、そして第一に内因性シグマ-1受容体遺伝子の突然変異した対立遺伝子の１つを有すマウス細胞、そして第二にゲノムの残りの野生対立遺伝子における第二の相同性組換え現象により内因性シグマ-1受容体の検出レベルのメッセンジャーRNA又はタンパク質を欠くマウス細胞を得るため、使用することができる。実施例1.2は、pHR53TKベクターの構造を詳細に記載する。
【００４６】
陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターは、制限酵素及び結合酵素による消化、並びにSambrook等〔17〕により発表されたものと同様の慣習的な方法により構築することができる。
【００４７】
本発明のベクターは、相同性組換え体を選定するため“陽性-陰性”選定技術を用いることができ、これは、ベクターとして本ベクターが挿入された細胞を選定することを可能にし、なぜならこれらは、ベクターと内因性シグマ受容体遺伝子との間の相同性組換えの結果として陽性選定マーカーを含みそして発現するが、陰性選定マーカーは失ったものであるからである。
【００４８】
本発明のベクターは、非ヒト哺乳動物細胞ゲノム中に存在するシグマ-1受容体遺伝子、又はシグマ-2受容体遺伝子等の内因性シグマ受容体遺伝子に機能的中断を挿入するために使用することができ、及び組換え体相同性（組換え体宿主細胞）を作り出すことができ、即ち、内因性シグマ受容体に欠陥のある非-ヒト突然変異体哺乳動物を作製するために使用できる。この目的のため、本発明の当該ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション等、好適にはエレクトロポレーションにより細胞中へ内因性DNAを挿入するために適する任意の慣習的な方法によって前記細胞中に挿入される。宿主細胞中へ本発明のベクターを導入後、本発明のベクターと内因性シグマ受容体遺伝子との間の相同性組換えを許容する状況下で適した期間培養する。当該相同性組換え体は、陽性-陰性選定マーカー過程により選定され、そして内因性シグマ受容体遺伝子の遺伝子座において相同性組換えの存在を、正常な内因性対立遺伝子(野生型)及び相同性組換え体対立遺伝子を区別することを許容するプローブを用いたサザンブロット分析等の慣習的な技術によって分析する。実施例2.1は、マウスES胚性細胞における相同性組換えによるマウスシグマ-1受容体遺伝子の不活性化、及び桑実胚凝集技術によるマウスシグマ-1受容体遺伝子中の突然変異によるキメラマウス(キメラ)の生産を説明し、CD-1非-同系繁殖系の雌性等であり、それらのアルビノ毛皮は、得られた相同性組換え過程において使用されるES R1細胞由来の129X1/SvJと129S1/Sv系との間の交配により作製されたF1ハイブリッドラットの色素化された毛皮特性から明確に区別され得る受容体系の雌性とそれぞれのキメラを交配させることにより、前記突然変異の胚芽株による伝播を評価する。
【００４９】
突然変異させたシグマ受容体遺伝子の対立遺伝子を含む相同性組換え体は(組換え体宿主細胞)は、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物を作製するために使用できる。この目的のため、内因性シグマ受容体遺伝子に中断を含む組換え体宿主細胞は、8-細胞期(桑実胚)中の胚の状態にある組換え細胞を凝集させる等の、慣用的な方法により胚中に導入され、それはその後、偽妊娠している雌性哺乳動物受容体へ移植され、当該胚が受け入れられる。得られる動物は、分析される胚芽経路により突然変異を遺伝することができるキメラである。キメラは、体性細胞及び胚芽細胞中の内因性シグマ遺伝子を中断させるためのヘテロ接合の突然変異体を得るために、野生型非-ヒト哺乳動物と交配させた胚芽株により、効率的に宿主細胞の遺伝子型をそれらの子孫に遺伝させることができる。当該ヘテロ接合の突然変異体は、その後、ホモ接合の突然変異体を得るためにそれらの自身の間で交配させる。実施例2.2は、内因性シグマ-1受容体遺伝子のための突然変異体マウス(ヘテロ接合性及びホモ接合性)の生産を記載し、実施例2.3中で記載するように前記遺伝子に欠陥があることを、対応のヘテロ接合の突然変異体マウスにおける発現及び機能の構造的分析により実証する。
【００５０】
本発明の追加の観点を構成する当該発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の子孫は、当該発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物(両親)との間の古典的な交配技術、或いは本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の卵子及び／もしくは精子の体外受精、又は核移植によるクローニング、並びに突然変異を伝達する突然変異細胞、或いは胚性又は体性細胞の核を伴う、後の核摘出卵子の再構築等の慣習的な方法により得ることができる。本明細書において使用される用語“子孫”及び“本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の子孫”とは、非-ヒト哺乳動物を起源的に形質転換させた後のそれぞれの世代のいずれか及び全ての子孫に関する。
【００５１】
本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、in vivo実験のためのコントロール動物として使用することができる(以下を参照)。更に、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、体性の、胎児の、又は胚の細胞の起源として使用でき、それは一度単離及び培養された場合、in vitro検査で使用できる。更に、所望されるならば、慣用技術〔18-21〕を用いて前記細胞から不死化細胞株を調製することが可能である。このように、他の観点では、本発明は本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物から由来する単離された細胞株提供する。特定の態様では、本発明により提供される細胞株が、検出レベルのマウスシグマ-1受容体を欠く前記細胞株を含むシグマ-1受容体遺伝子中に突然変異を含むマウスES胚性細胞の細胞株等のネズミ細胞株である。
【００５２】
本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物は、内因性シグマ受容体、特にシグマ-1受容体又はシグマ-2受容体によってin vivoで果たされる役割を研究するためのモデル動物として、及びin vivo試験へ導入するためのコントロール動物としても使用できる。
【００５３】
シグマ-1受容体は、不安、うつ病又は精神分裂病等の中枢神経系の疾患、健忘症等の記憶変化、並びにストレス及び薬剤依存症に関与すると思われる。更に、前記シグマ-1受容体は、無感覚症及び神経保護プロセスに関与していると思われる。このように、本発明により提供されるシグマ-1受容体に欠陥のある非-ヒト突然変異体哺乳動物は、前記シグマ-1受容体が関与する変化及び病理学的症状への影響を調節又は緩和するためのかかる状況の研究、並びにデザインされた薬剤の検証及び/又は開発において有用であり得る。
【００５４】
このように他の観点では、本発明は、以下：
不安、精神分裂病、又はうつ病等の中枢神経系疾患を予防及び/又は治療する；
健忘症等の記憶変化を予防及び/又は治療する；
ストレス症状を予防及び/又は治療する；
薬剤依存症を予防及び/又は治療する；
無感覚症を生じる；或いは
神経保護を生じる、を意味する潜在的に有用である化合物を評価するための、シグマ受容体-1に欠陥がある、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の使用、又は本発明により提供される細胞株の使用に関する。
【００５５】
シグマ-2受容体は、癌及び/又は変性過程と戦うための、並びに／或いはハロペリドール等の抗精神病薬による継続治療を受ける患者に引き起こされる、抗精神病薬の投与に関連する運動の二次的変化(motor secondary alterations)等の二次的病変を予防、軽減、又は緩和することができる化合物をデザインするための、診断及び治療ツールの両方をデザインするターゲットであると思われる。従って、シグマ-2受容体に欠陥がある非-ヒト哺乳動物は、変性過程の診断及び/又は治療のためにデザインされた薬剤を検証及び／又は開発するために、或いは抗精神病薬の患者への継続投与に関連した副作用、特に運動性服作用を予防、減少、又は軽減するためにデザインされた薬剤を検証及び/又は開発するために有用であり得る。
【００５６】
従って、本発明の他の観点は、：
癌の診断又は治療；
変性過程の予防及び／又は治療、或いは
抗精神病薬の投与に関連した副作用の予防、減少、又は緩和
するためにデザインされた薬剤を検証及び／又は開発するために、シグマ-2受容体に欠陥がある、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の、又は本発明により提供される細胞株の使用に関する。
【００５７】
他の観点では、本発明は、シグマ-1受容体又はシグマ-2受容体等の内因性シグマ受容体に欠陥のある非-ヒト哺乳動物への検査化合物の効果を決定するための方法に関し、前記化合物との接触に対する応答として、前記非-ヒト突然変異体哺乳動物中の生理学的変化の存在又は不存在を検査及び検出する化合物との接触において、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物を設置することを含み；或いは、代わりにコントロール非-ヒト哺乳動物に検査される前記化合物を投与すれば、シグマ-1受容体又はシグマ-2受容体等の対応の内因性シグマ受容体を発現し、そしてコントロール非-ヒト哺乳動物と比較した時、前記化合物が前記非-ヒト突然変異体哺乳動物の発現型に影響を有するか否かを観察する。表現型への観察し得る任意の影響は、原則として考慮されるシグマ受容体の機能（又は機能障害）に関連づけることができる。
【００５８】
他の観点では、本発明はシグマ受容体、例えばシグマ-1受容体又はシグマ-2受容体、を発現する細胞上への、並びに前記シグマ受容体を発現しない細胞上への化合物の影響を決定するための方法に関し、当該方法は細胞群、又は均質化した前記細胞中へ前記検査化合物を導入することを含んで成り、ここで前記細胞は、コントロール非-ヒト哺乳動物の細胞の集団へ、又は対応する機能のシグマ受容体を発現するそれらの均質化物へ、前記検査化合物を投与する、単離細胞、或いは本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物から樹立された細胞であり、そしてコントロール非-ヒト哺乳動物細胞との比較において、本発明の非-ヒト突然変異体哺乳動物の細胞中に前記シグマ受容体の発現に前記検査化合物が影響を有するか否かを観察又は分析する。原則として、発現型への任意の観察し得る影響は、機能（又は機能障害）或いは考慮されるシグマ受容体に関連する。
【００５９】
以下の実施例は本発明を説明し、そしてそれらの範囲を制限するものとして考慮されるべきでない。実施例１及び実施例２の組合せは、マウスシグマ-1受容体の検出レベルを欠く内因性シグマ-1受容体遺伝子中に突然変異を有するマウスの作製手順を詳細に説明する。実施例１は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の単離及びクローニング、並びに陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターの構築を説明する一方、実施例２は、ESマウス細胞のトランスフェクション及びネズミシグマ-1受容体に欠陥のある突然変異体マウスの作製を説明する。
【実施例１】
【００６０】
マウスシグマ-1受容体遺伝子の単離及びクローニング、並びに陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターの構築
【００６１】
1.1 マウスシグマ-1受容体遺伝子の単離
マウスシグマ-1 受容体ｃDNA及び遺伝子〔8〕のために発表された配列を用いて、４つのオリゴヌクレオチドを、前記遺伝子を単離及びクローンするためにデザインした。MS1、MS2、MS3及びMS4として公知であるこれらのオリゴヌクレオチドの特質は、表Ｉに詳細に記載する。公開されたマウスcDNA及び遺伝子配列に関するそれらのオリゴヌクレオチドの関連部位を、図１に図式で示す。
【表１】
0004515915.tif 000002
【００６２】
これらのオリゴヌクレオチドを、標準のPCR及びRT/PCRプロトコール〔9〕を用いて、NMRI及びBALB/Cマウス系のゲノムDNA及び総RNAからサイズを予測することにより特異的DNAフラグメントを得るために使用した。最初に、それぞれ1160及び2264塩基対(bp)のゲノムDNAフラグメント上でPCRにより生産するために、MS1/MS3及びMS2/MS4オリゴヌクレオチド対を用いた。更に、RT-PCRによる総RNAからの1020bpフラグメントに相応するcDNAを、MS2/MS4オリゴヌクレオチド対からクローン化した。得られたDNAフラグメントを、標準方法〔9〕により Bluescript KS+ (Stratagene)プラスミドベクター中でサブクローン化した。図1は、cDNA及び遺伝子配列により得られたプラスミドを記載する。特に、MS2/MS4オリゴヌクレオチドから得られた1020bp cDNAフラグメントに相当する、pmcS1/Nプラスミドを記載し、それは後、シグマ-1受容体遺伝子のゲノムクローンを得るために使用した。
【００６３】
マウスシグマ-1受容体遺伝子に相当する多種のゲノム及びcDNAフラグメントのPCR及びRT/PCRによるクローニングは、マウス遺伝子バンクの全体ゲノムクローンの単離において使用される特異的なゲノムプローブを提供した。今後の目標は、本遺伝子中のマウス突然変異体を得ることであり、多能性胚ES細胞〔10〕において、相同性組換え過程を最適化するために、同遺伝子系配列クローン(即ち、同一マウス系由来)を得ることが必要である。当該マウスES細胞が使用され、ES R1細胞〔11〕を２つの129/Svマウスサブ-系統(129X1/SvJ×129S1/SvJ)のF1ハイブリッドから得た。従って、129/Svマウス(Stratagene, Cat. Nr. #946313) 由来のDNAから調製された商業的遺伝子バンクからのゲノムクローンの単離にアプローチすることに決定した。遺伝子バンクからの1×106組換え体クローンを分析し、プレート毎におよそ170,000 ファージを有する6つの大きなプレートに分配した(Nunc、243 mm×243 mm、530 cm2)。その後２つの連続的なレプリカをナイロン(商標)膜(Hybond-N, Amersham)中のそれぞれのプレートで得た。これらの膜を、慣習的なプロトコール〔9〕に従って、pmcS1/Nプラスミド挿入に対応する特異的なプローブによりハイブリダイズした。
【００６４】
最初に、9つの特異的シグナルが同定され(対のレプリカの両方)、そして陽性シグナルを与えるプレート中に存在するバクテリオファージを慣習的なプロトコール〔9〕により精製した。前記オリゴヌクレオチドの使用(MS1、MS2、MS3及びMS4)、及びサザンブロット分析は、マウスシグマ-1受容体遺伝子全体を含むそれらの選定されたクローンの４つ(λSg1、λSg2、λSg5、λSg6)を証明することができた。図２は４つの前記バクテリオファオージのクローンの重複したマップにより得られたマウス-1受容体と隣接する配列のマップを示す。当該新規生産物は遺伝子に取り囲まれる約30キロ塩基(kb)の構造的マップを確認し、それはデータベース中に蓄積された公表された情報をしのぐ(7 kb未満、遺伝子周辺の中心化)〔6〕。これらの配列を陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターの構築において使用されるプラスミド中でサブ-クローンした。図3は、5'及び3'遺伝子領域中に位置する配列に相当するゲノム配列より得た多様な起源クローンを示す。
【００６５】
1.2 ESマウス細胞中のシグマ-1受容体遺伝子の突然変異による不活性化のための陽性陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクター(pHR53TK)の構築
pHR53TKと命名された陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターの構築において、連続的なクローニングを支持しそして開始するために使用したプラスミドは、ベクターpHM2〔12〕(8451塩基対、GenBankデータベース、アクセスコード：X76682)であり、それは他のマウス遺伝子の効果的な不活性化を導く相同性組換えベクターを調製するために以前に用いて成功した（例えば〔13〕参照）。
【００６６】
BglII制限酵素での消化によるpmgS1 Eag6.7プラスミド(図3参照)から、マウスシグマ-1受容体の3'相同性配列を運搬する3.1 kbフラグメントを得た。この3.1 kb Bgl IIフラグメントを、そのBglIIの唯一の切断部位が8171部位に位置する同一の酵素で以前消化したpHM2プラスミドに挿入し、11.6kbのサイズのpHR3A中間体プラスミドを作製した。次に、マウスシグマ-1受容体の5'相同性配列であったpHR3Aプラスミド上の、Pml I制限酵素(pHM2プラスミドに関連する2259部位)の唯一の切断サイトに挿入し、λSg6バクテリオファージDNAから、SalＩ及びSacII酵素での消化により、6.8 kbフラグメントを得た(図2)。SacIIサイト(マウスシグマ-1受容体遺伝子配列のAF030199配列の3356部位)及びPml I (pHR3Aベクターの)のDNA配列を平滑末端化した後、当該配列融合は、もとのpHM2ベクター〔12〕中に存在するlacZインジケーター遺伝子の残存アミノ酸を有するシグマ-1受容体遺伝子の特に最初の４つのアミノ酸の機能的な転写を得ることができた。シグマ-1受容体遺伝子5'相同性配列の付加は、pHR53中間体プラスミドを得ることを許容し、それは、GenBank AF030199に供託されたもとの遺伝子配列に相関し、3356(SacII)及び5263(BglII)部位の間の遺伝子から削除（欠失）されるヌクレオチドを正確に区切る。実際にこれは、マウスシグマ-1受容体遺伝子をコードする配列の殆ど全ての配列を含む1907ヌクレオチドの除去を引き起こす。図4は、配列の正確な制限をグラフで表し、その除去はマウスES細胞中の相同性組換えにより意図された(実施例1.3)。図5は、pHR53ベクター中に存在し、前記30kbで重複していることに相関する、サイズ6.8及び3.1を有す5'及び3'相同性配列部位の相関性部位を示す。これらの5'及び3'相同性配列、即ち1.9kbサイズで除去されるシグマ-1受容体遺伝子範囲を区切る。
【００６７】
pHR53ベクターを構築するために使用されるDNAフラグメントの存在、及び正確な融合を検証するため、それらの末端を配列決定した。特にマウスシグマ-1受容体遺伝子をコードする最初のヌクレオチドとlacZインジケーター遺伝子をコードする配列間の転写的融合は、図６に示す通り検証した。
【００６８】
最終的に、陽性選定マーカー過程(pHM2プラスミド中に存在するネオマイシン耐性遺伝子)に適用される陽性-陰性選定マーカーを有する相同性組換えベクターを得るため、陰性選定マーカー過程を組合せ〔14〕(ガンシクロビル耐性遺伝子、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、HSV-TKはpHM2プラスミド中に存在しないが、pPNT〔15〕プラスミド中に存在する)、HSV-TK遺伝子を有する発現カセットを、pSX〔12〕ベクター中で得られたHSV-TK遺伝子を有す中間構成体によりpHR53プラスミドのNotＩ制限サイトにおいてクローン化し、後のサイズ20.8 kbのプラスミドpHR53TKベクターを作製した。そのマップを図7に示す。当該pHR53TKプラスミドはアクセスナンバーCECT 5737を得て2002年10月4日にCECTに供託した。
【実施例２】
【００６９】
内因性シグマ-1受容体遺伝子に欠陥のある突然変異体マウスの作製
2.1 マウスES細胞における相同性組換えによるシグマ-1受容体遺伝子の不活性化、及び前記突然変異を有するキメラマウスの生産
【００７０】
pHR53TKベクターを構築した後、SalI制限酵素(図7)による消化によって線形化した。その後20μgのpHR53TK線形化ベクターは、エレクトロポレーションによって(エレクロポレーション条件：500μF、250V)、9.6×106 ES R1細胞〔11〕をトランスフェクトするために使用した。24時間後、陽性選定マーカー過程を、300μg/mlのG418抗生物質を付加することによって開始した。48時間後、2μMの最終濃度に到達するまで、陰性選定マーカー過程の間、薬剤ガンシクロビルを付加した。８日後、個々にサブ培養した独立の組換え体クローン(G418及びガンシクロビルに耐性)を同定することができた。全過程は、多能性ES細胞の天然の分化を阻害するために、G418-耐性マウス胚性繊維化細胞(MEFs)及びL.I.F.(白血病阻害因子)成長因子の存在下で実施した。全てのプロトコールでは、トランスフェクション及び操作したマウスES細胞〔10〕を培養するための文献の記載に従った(陽性-陰性選定マーカーに関する情報は、例えば米国特許No.5,464,764、米国特許No.5,487,992、米国特許No.5,627,059及び米国特許No.5,631,153中に見出すことできる)。
【００７１】
マウスES細胞の計272組変え体クローンを文献〔9〕中に記載されたサザンブロット法により分析した。本発明の目的である２つのプローブ、5'プローブ及び3'プローブは、制限フラグメントのサイズにある２つの多形性を同定するために、pHR53TKベクター中に含まれるマウス-1受容体遺伝子の相同性範囲から離れてデザインされた。従って、HindIII 制限酵素による消化、及び5'プローブの使用は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の突然変異体対立遺伝子(19kb)から野生対立遺伝子(10.7kb)を区別することを許容する。同様に、EcoRI制限酵素による消化、及び3'プローブの使用は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の突然変異体対立遺伝子(11.9kb)から野生対立遺伝子(13.7kb)を区別することを許容する。図8は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の突然変異体と野生対立遺伝子を区別するために使用された実験デザインを示す。
【００７２】
分析した個々の272個のES細胞クローンの12個(即ち4.4％)は、5'プローブ及び3'プローブを用いて予測した多形性を示す(図8)。図9は、それらの12個のES細胞クローンに相当するゲノムDNAのサザンブロット分析の結果を示す。
【００７３】
これによれば、ES細胞の4個の個々の陽性組換え体クローンを、桑実胚凝集技術を用いて、文献〔10〕、〔11〕に発表された手順によって、対応のキメラのマウス（キメラ）を作製する過程へと選定した。CD-1マウス系統の8細胞期（桑実胚）にある胚による、組換え体ES細胞を凝集させるための実験条件は(平均10個)、凝集過程において４％のES細胞の条件化した培地を使用することを含む。
【００７４】
これらの条件を使用して、382個の凝集及び移植胚から、妊娠をうまく進行させた40個の中から胎児の出産に至ったキメラを最初に19個同定し、そこから得られた11個の生き残ったキメラを同定した。表IIは、使用した凝集過程の要約を示す。
【表２】
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【００７５】
11個の生き残りのキメラは、キメラ作製のための通常のプロトコールに含まれる奨励手順に従い、個々のES細胞の対応の２つのクローン、クローン#8及びクローン#175を得て、それは、突然変異体マウス〔10〕の異常な表現型を生み出し得る特異的クローンへの先天性の問題を避けるために、少なくとも２つの個々のクローンからの突然変異体を獲得することを必要とする。
【００７６】
突然変異の遺伝子系統によるこの伝播後を、CD-1受容体系統（そのアルビノ毛皮は相同性組換え過程〔11〕において使用されるES R1細胞由来である129Sv系統の色素化された毛皮特性から明確に区別される）の雌性と対応のキメラを交配させることにより評価した。
【００７７】
表III は、同定した11のキメラで実施した色素化された表現型(ES細胞に存在する遺伝子型に関連する)のための伝播分析の結果を説明する。
【表３】
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【００７８】
伝播性分析では、４つの個々のキメラ(クローン#175から由来する１つ及びクローン#8から由来する３つ)が、胚芽株によりES細胞遺伝子型をその子孫へ効率よく(100％)伝播させることを可能にしたことを示す。これらのF1動物は、突然変異体対立遺伝子の存在を分析するため、及び対応の突然変異体マウスを作製するための継代交配により使用される。
【００７９】
2.2 シグマ-1受容体遺伝子における突然変異体マウスの生産
得られた11個のキメラ（使用された２つの組換え体ESクローン示す個体）の４個の胚芽株への伝播を、CD-1アルビノマウスとの交配から得られたF1子孫の色素化の存在により検証した後、シグマ-1受容体遺伝子の突然変異した対立遺伝子の存在が検証された。色素化の検出は、突然変異した対立遺伝子の存在を保証するものではなく、もとのES細胞全体から50％のみが突然変異を運搬する対立遺伝子を遺伝する一方、残りの50％は野生対立遺伝子を遺伝するであろう。この理由により、突然変異体及び野生ホモ接合性個体の後の同定のため、特異的に３つの遺伝子型：野生ホモ接合性体、ヘテロ接合体(突然変異を運搬する)及び突然変異体ホモ接合体(表IV参照)の明白な同定を許容する慣習的な方法〔9〕を用いた２つの分析的な検査をPCR技術(PCR-シグマ及びPCR-Neo、図10)によりデザインした。
【表４】
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【００８０】
PCR-シグマ技術は、シグマ-1受容体遺伝子の２つの対立遺伝子の１つが完全である時、1.16kbの特異的DNAフラグメントを増幅するのみ可能であるMS1及びMS3オリゴヌクレオチド(表I)を使用する。同様に、PCR-Neoは、ES細胞中で最初に検出される突然変異を運搬する２つの対立遺伝子の仮に１つのみが0.7kbの特異的DNAフラグメントを増幅するネオマイシン耐性(neo 遺伝子)(Neo 1 (SEQ. ID. NO: 5)及び Neo 2 (SEQ. ID. NO: 6))を与える遺伝子の内部の２つの特異的オリゴヌクレオチドを使用する。
【００８１】
表Vは、伝播キメラとCD-1雌性を交配させることによるF1結果物において得られた個体の中でヘテロ接合性個体の同定を詳細に示す。色素化された個体のみを、PCR-Neoによって分析した。分析の0.7kbバンドの検出は、シグマ-1受容体遺伝子の１つの対立遺伝子中の突然変異を運搬する個体を示す。２つのクローンのそれぞれの色素化個体のおよそ半分は、チンチラマウスに相当する。他の半分は野生毛皮が有色であるアグーチマウスである。同様に、それぞれ分析した２つのクローンの中で、半分よりわすかに少ない有色化したF1個体が、ヘテロ接合体であることが見出され、従って突然変異を運搬する。
【表５】
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【００８２】
使用したそれぞれのESクローンの十分なヘテロ接合性個体を同定した後(両性別とも)、古典的遺伝学(メンデル)法則に従い、得られた第二世代（F2）中で突然変異体個体（突然変異体対立遺伝子のためのヘテロ接合性）を得るために、これらのヘテロ接合性個体間で交配させた。
【００８３】
作製したF2動物のために得られた遺伝子型は、２つの前記PCR分析検査(PCR-シグマ及びPCR-Neo)(表IV参照)に基づく。これらの交配の結果、及び第二世代個体に得られた３つの遺伝子型のそれぞれの総数を表VIに記載する。
【表６】
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【００８４】
メンデルの法則によれば、同一の遺伝子座の２つの異なる対立遺伝子を有す２つのヘテロ接合性個体を交配させた結果、以下の通り分配されるであろう：25%野生個体(+/+)、 50%ヘテロ接合性個体(+/-)及び25%突然変異体ホモ接合性個体(-/-)。表VIIはメンデルの法則に従い予測される結果と、F2(表VI)において得られた結果を比較する。
【表７】
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【００８５】
これらのデータの統計学的分析は、両ケースとも一覧表のp=0.05 及び(3-1=2) 2 自由度(χ2 =5.991)(クローンES #175 χ2=3.785；クローン ES #8χ2=0.125)より低いχ2理論値を導くことから、メンデルで予測された遺伝子型分離に適合させることを可能にする(p=0.05)。従って、理論上予測される数値に対し同定された突然変異体における軽度の減少は、統計学的に重要でない。
【００８６】
この最初の分析の追加の結論として、突然変異体のホモ接合性雄性及び雌性が同程度に得られることを付け加えるべきである。予測数値(いずれの性別の50％)と適合する同定された突然変異体ホモ接合体の性別分離は、この時点ではいずれも統計学的に重要な偏差を観察しない。クローンES #175の28個の突然変異体の場合、13個が雄性であることを検出し、クローンES #8の11個の突然変異体の場合、4個が雄性であることを検出した。両数値は正常値からのアプローチであり、そして分離に従い予測された(p=0.05、自由度=1、χ2 理論値=3,841)(クローンES #175χ2 =0.143；クローンES #8χ2 =0.818)。
【００８７】
更に、雄性及び雌性の両突然変異体ホモ接合体は生殖能力があることが見出されたため、本突然変異の安定した集団を得ることを可能にした。外部からの又は観察できる明示がないことは、野生マウスから突然変異体マウスへ明らかに分化することを見出した。しかしながら、当該マウスは、当業界において慣用的な方法〔16〕を用いて、無感覚症、嗜癖、うつ病、精神病、及び精神分裂病の過程におけるその役割を明らかにすることを意味するパラダイムによりシグマ-1受容体遺伝子中の突然変異の効果を評価するために、完全に分析される。
【００８８】
当該突然変異は、２つの異なる混合された遺伝子バンク(129Sv×CD-1及び129Sv×C57BL/6J)中で得られ、そして分析される。
【００８９】
2.3 シグマ-1受容体遺伝子のための突然変異体マウスにおける、構造的な発現及び機能分析
マウスシグマ-1受容体遺伝子突然変異体マウスを作製した後、実際に突然変異体マウスがシグマ-1受容体遺伝子に欠陥があることを検証するために、遺伝子(DNA)、その発現(メッセンジャーRNA)、タンパク質及び活性(機能) の欠損を分析した。
【００９０】
第一に、突然変異体及び野生対立遺伝子を明白に検出できるプローブ5’及び3’に関連した多形性の存在を研究した。このため、シグマ-1受容体遺伝子中の野生のゲノムDNA、ヘテロ接合性、及び突然変異体マウスを分析した。サザンブロット分析の結果を図11に示す。得られた結果は、予測された実験デザインに従って突然変異体対立遺伝子の存在を明白に結論づけることができる。
【００９１】
第二に、正常に存在する遺伝子を有する突然変異体、ヘテロ接合性及び野生マウス中の多種器官のシグマ-1受容体遺伝子の発現を研究した〔5〕。これらの発現分析を、当業界において発表されたプロトコール〔9〕によるノーザンブロット技術により実施した。図12は、突然変異体ホモ接合性動物の総RNAに相当するゲルレーンにシグナルが存在しないことを示し、それ故にシグマ-1受容体遺伝子を欠くことを示す。従って、シグマ-1受容体遺伝子を欠くだけでなく、その発現を裏付けることができるメッセンジャーRNA(転写)を探すことも不可能である。確かに、突然変異体マウスは、シグマ-1受容体遺伝子を発現しない。
【００９２】
第三に、突然変異体、ヘテロ接合性及び野生マウスの脳中のシグマ-1受容体遺伝子の発現は、特異的なポリクローナル抗体の方法によるタンパク質抽出物中で、対応のタンパク質の位置を定めることにより評価した。このためにウェスタンブロット技術を用いた。シグマ-1遺伝子のホモ接合突然変異体マウスからの脳タンパク質抽出物中、検出可能タンパク質レベル(シグマ-1受容体)を見出した場合に得られた結果を図13に示す。
【００９３】
第四に、マウスシグマ-1受容体の活性(機能)を、[3H]-ペンタゾシンリガンドへの特異的結合検査により評価した。簡潔には、突然変異体(-/-)、ヘテロ接合体(+/-)及び野生(+/+)マウスの脳が均質化され、そして均質化は、膜フラクションを得るために、異なる速度で数回遠心分離した。その後、得られた膜フラクションのサンプルを、本受容体のための最適結合条件(37℃、130-170分)で[3H]-ペンタゾシン放射性リガンドと共に培養し、サンプルをろ過し、洗浄し、そしてろ過の中で存在する放射活性カウントを読み取った〔22〕。得られた結果を図14に示し、そしてホモ接合変異体マウスにおける活性(機能)の欠如を示す。
【００９４】
第五に、シグマ-1受容体の機能を、既知の挙動パラダイム及びプロトコールに従って評価した。この意味において、統計的に重要な差異は、分析された検査又はパラダイムのリストよれば、突然変異体及び野生マウスの挙動間に統計学的に重要な差異は見出されなかった。統計的に重要な差異は、SKF-10047リガンド(データ非開示)により誘導される過剰活性(過剰運動性)応答において、野生マウスにのみ、観察された。
【００９５】
生物学的材料供託
pHR53TKプラスミドベクターを含むpHR53TKとして公知であるEscherichia Coli Top10F’培養は、Spanish Collection of Standard Cultures (Coleccion Espaola de Cultivos Tipo)、CECT、Burjasot、Valencia(スペイン)にアクセスナンバーCECT5737のもとで供託された。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、それぞれRT-PCR又はPCR法により得られた第一のcDNA (図1A)及びゲノム(図1B)クローンを図式で示す。図1AはMS2/MS4オリゴヌクレオチドから得られた1020塩基対を有するcDNAフラグメントに相当するpmcS1/Nプラスミドを示す(表Ｉ参照)。
【００９７】
【図２】図2 は、公表された遺伝子配列を取り囲む5'及び3'配列により単離された重複する４つのバクテリオファージクローン(λSg1、λSg2、λSg5、λSg6)に相当するマップにより得られたマウスシグマ-１受容体と近隣の配列のマップを示す。制限酵素の略語は図３に記載する。黒塗り四角部分はマウスシグマ-1受容体遺伝子の４つのエクソンに相当する。
【００９８】
【図３】図3は、相同性組換えベクターを構築する中で使用されるサブ配列のために同定されたマウスシグマ-1受容体遺伝子の5’及び3’領域に位置した対応の配列を挿入するゲノムDNAにより得られた、多種起源のプラスミドを図式で示す。当該制限酵素の略語を含む。黒塗りボックスはマウスシグマ-1受容体遺伝子の４つのエクソンに対応する。
【００９９】
【図４】図４は、参照としてAF030199配列を用いて、マウスES細胞における相同性組換え過程により削除されるマウスシグマ-1受容体遺伝子の配列を図式で示す。黒塗り四角部分はコードされた範囲を表し、一方、斜線四角部分は、転写される5'及び3'配列を表すが、翻訳はされない。
【０１００】
【図５】図５は、マウスシグマ-1受容体遺伝子を不活性化するためpHR53TK相同性組換えベクター中に包含させるために選定された、それぞれ6.8及び3.1 kbサイズの5'及び3'相同性配列を図式で示す。制限酵素の略語は図３に記載する。
【０１０１】
【図６】図６は、マウスシグマ-1受容体遺伝子の5’相同性領域とpHM2ベクター中に存在するlacZインジケーター遺伝子の第一のヌクレオチドとの間の転写的融合におけるDNA配列の検証を図解する。
【０１０２】
【図７】図７はES胚細胞中のマウスシグマ-1受容体遺伝子の不活性化のための相同性組換えベクターのマップを示す。ES細胞におけるそのトランスフェクションのためのベクター線形化点を同定するための一つの制限サイトSalIを示す。
【０１０３】
【図８】図８は、サザンブロット分析における制限酵素消化に関連した多形性による分析におけるマウスシグマ-1受容体遺伝子の野生対立遺伝子から、突然変異体対立遺伝子を区別するために使用される実験デザインを図解する。
【０１０４】
【図９】図９は、多形性が予想されることを示す組換え体ES細胞クローンの12個の陽性クローンに相当するゲノムDNAの5’プローブ及び3’プローブの両方によるサザンブロット分析の結果を示す。レーンC及びMは、コントロールES細胞DNA及び分子量マーカーを表す。
【０１０５】
【図１０】図１０は、シグマ-1受容体遺伝子の突然変異体及び野生対立遺伝子を運搬するマウスの遺伝子型を確立するために使用したPCR分析検査のスキームを示す。
【０１０６】
【図１１】図１１は、それぞれHindIII 及びEcoRI酵素でのゲノムDNAの消化、並びに5’及び3’プローブによる連続的なハイブリダイゼーションによる野生ホモ接合体(+/+)、ヘテロ接合体(+/-)及び突然変異体ホモ接合体(-/-)のサザンブロットの結果を示す。DNAフラグメントの大きさは実験デザイン(図８)で予測された値と一致する。
【０１０７】
【図１２】図１２は、マウス野生ホモ接合体(+/+)、ヘテロ接合体(+/-)及び突然変異体ホモ接合体(-/-)から単離されたRNAの肝臓、腎臓、脳及び心臓の全体におけるマウスシグマ-1受容体(mSR1)のノーザンブロット分析の結果を示す。リボソームRNAの 写真は、ボトムエリア中に含まれるロードコントロールとして使用した。
【０１０８】
【図１３】図１３は、マウスシグマ-1受容体のための特異的ポリクローナル抗体を用いるマウス脳中のシグマ-1受容体遺伝子の発現を図解するマウス野生ホモ接合体(+/+)、ヘテロ接合体(+/-)及び突然変異体ホモ接合体(-/-)のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【０１０９】
【図１４】図１４は、[3H]-ペンタゾシンリガンドへの特異的結合検査によりマウスシグマ-1受容体の活性(機能)を図解する。図14Aは、リガンド濃度(横軸)の機能として、野生ホモ接合性、ヘテロ接合性及び突然変異体ホモ接合性マウスのシグマ-1受容体への前記リガンドの特異的結合(縦軸)を表すグラフである。図14Bは、前記シグマ-1受容体(野生ホモ接合性、ヘテロ接合性及び突然変異ホモ接合性マウス)のもとの機能として結合したリガンド濃度(横軸)と対比させた“結合したリガンド／遊離リガンド”(B/F)率(縦軸)を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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