(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる融合タンパク質、又は
Ｂ）配列番号１のアミノ酸において１又は数個のアミノ酸残基が置換、挿入、付加及び／又は欠失されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫原性を有する融合タンパク質
を含む、抗原に基づく抗マラリアワクチンであって、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）由来のグルアミン酸リッチタンパク質（ＧＬＵＲＰ）とメロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)の両方に対して免疫応答を生じさせることができる、抗原に基く抗マラリアワクチン。
【請求項２】
前記Ｂ）の融合タンパク質が、以下の方法：
ｉ）マラリアに現在又は以前感染した動物又はヒトから取得したリンパ球からのＩＦＮ−γの放出又はこれらのＴ細胞の増殖を検出することによる、in vitro細胞応答の測定；
ｉｉ）免疫化個体又はマラリアに感染したヒト由来のＴ細胞株を使用することによる、ＩＦＮ−γの放出の誘導又はＴ細胞増殖の検出の測定、ここで当該Ｔ細胞株は、生きたＰ．ファルシパルム（P. falciparum)、当該寄生生物由来の抽出物、又は培養ろ液を用いて、１０〜２０日間、ＩＬ−２を加えて、成長されている;
ｉｉｉ）最大で１００μｇの上記融合タンパク質を、P.ファルシパルムに臨床的に感染又は亜臨床的に感染した個体に皮内注射又は局所パッチ投与後に、陽性ＤＴＨ応答としてのin vivo細胞応答の測定；
ｉｖ）免疫化又は感染個体において特異的抗体応答によるin vitro液性応答反応のＥＬＩＳＡ技術又はウエスタンブロットを用いた測定、ここで上記融合タンパク質は、ニトロセルロース膜又はポリスチレン表面のいずれかに吸着される；
のうちの１により評価した場合に免疫原性である、請求項１に記載の抗原に基づくワクチン。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からなる融合タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の抗原に基づくワクチン。
【請求項４】
プラスモジウム・ファルシパルム由来のタンパク質の免疫原性断片をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原に基づくワクチン。
【請求項５】
以下の：
Ａ）  配列番号１のアミノ酸配列、又は
Ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、挿入、付加及び／又は欠失されたアミノ酸配列
からなる融合タンパク質であって、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）由来のグルアミン酸リッチタンパク質（ＧＬＵＲＰ）とメロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)の両方に対して免疫応答を生じさせることができる、前記融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列に由来し、かつ免疫原性を有する前記融合タンパク質が、以下の方法：
ｉ）マラリアに現在又は以前感染した動物又はヒトから取得したリンパ球からのＩＦＮ−γの放出又はこれらのＴ細胞の増殖を検出することによる、in vitro細胞応答の測定；
ｉｉ）免疫化個体又はマラリアに感染したヒト由来のＴ細胞株を使用することによる、ＩＦＮ−γの放出の誘導又はＴ細胞増殖の検出の測定、ここで当該Ｔ細胞株は、生きたＰ．ファルシパルム（P. falciparum)、当該寄生生物由来の抽出物、又は培養ろ液を用いて、１０〜２０日間、ＩＬ−２を加えて、成長されている;
ｉｉｉ）最大で１００μｇの上記融合タンパク質を、P.ファルシパルムに臨床的に感染又は亜臨床的に感染した個体に皮内注射又は局所パッチ投与後に、陽性ＤＴＨ応答としてのin vivo細胞応答の測定；
ｉｖ）免疫化又は感染個体において特異的抗体応答によるin vitro液性応答反応のＥＬＩＳＡ技術又はウエスタンブロットを用いた測定、ここで上記融合タンパク質は、ニトロセルロース膜又はポリスチレン表面のいずれかに吸着される；
のうちの１により評価した場合に免疫原性である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
プラスモジウム・ファルシパルム由来の１以上のタンパク質の１以上の免疫原性断片をさらに含む、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記免疫原性断片が、ＣＳ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５、ＭＳＰ６、ＡＭＡ１、Ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、ＲＡＰ１、ＥＢＡ−１７５、ｐｆＥＭＰ１、ＥＸＰ１、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、Ｐｆ２５、Ｐｆ４５／４８、Ｐｆ２３０、Ｐｆ２７、Ｐｆ１６、又はＰｆ２８から選ばれる、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
組換えラクトコッカスｓｐ(Lactococcus sp)から請求項５〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
配列番号２の配列を含む核酸。
【請求項１２】
請求項５〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)由来の少なくとも１の別のタンパク質、例えば、メロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)と遺伝子操作により結合されたプラスモジウム・ファルシパルムのグルタミン酸リッチ・タンパク質(ＧＬＵＲＰ)に由来する融合タンパク質を含む抗原に基くマラリア・ワクチン、又はこの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むワクチン、並びにそうしたワクチンの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
マラリアは、世界の人口の４０％に感染しており、毎年推定で１.５〜２.７百万人が死亡する(５７)。このことは、甚大な人的被害と感染地域の進行を防ぐ負担を示している。マラリアは現在、アフリカ、アジア、及びラテンアメリカの熱帯の貧困地域にほぼ限られているが、以前に撲滅された地域にも再伝染している。マラリアは、世界の公衆衛生問題の大きな問題の一つである。
【０００３】
殺虫剤耐性ベクターの出現及び薬剤耐性原虫細胞の出現により、新たなより良い制御手段についての投資が増加している。マラリア・ワクチンは、マラリアの負担を劇的に軽減する可能性を有する。しかしながら、感染防御免疫に基く機構について我々の理解が不十分であるので、特定の防御マーカーを明らかにすることが必要とされている。
【０００４】
原虫の生活環の様々な段階で発現されるいくつかの鍵となる原虫抗原に対して、適切な液性及び細胞性免疫応答を誘導することが、効果的なマラリア・ワクチンに必要とされる。生活環の各段階は、ワクチン化の機会を提供する。
【０００５】
二つの証拠により、マラリア・ワクチンが実現可能であるということが提案される：
第一に、マラリア原虫に繰り返し晒されると、確かな臨床免疫、つまり、原虫と防御抗体が同時に存在する相関免疫状態を発達させるということは、立証された意見である。臨床的に免疫化された人は、通常低い原虫密度を有し、こうした免疫は、死亡率の低下にかなり有効である。
第二に、ヒト並びに動物モデルにおける実験により、免疫化が次回の原虫感染に対する免疫を誘導することができることが確かめられ、ワクチンがマラリアの制御の現実的なツールになりうることが示唆された。
【０００６】
今では古典的な実験において、Cohenとその同僚は、臨床的に免疫化された人から精製された抗体を受動伝達することによって、生命を脅かすＰ.ファルシパルム(P.falciparum)感染を患うアフリカの子供において、急性マラリア発症を寛解することができたということを示した(１０)。Druilheとその同僚は、Cohenの結果を確かめた(４２)。彼らは、臨床的にマラリアで免疫化された西アフリカ人由来のＩｇＧが、系統-独立方式において、薬剤耐性Ｐ.ファルシパルム・マラリアを患う無症候性のタイ人の子供の原虫負荷を実質的に減じることができると示した。
【０００７】
これらの画期的な受動伝達実験は、無性段階の原虫負荷を低減/除去する点で抗体が重要であるということを証明した。
【０００８】
しかしながら、同じ「感染防御」ＩｇＧ製剤(４２)についてのin vitro調査により、抗体が抗体自身に基いて原虫の成長を阻害するのではなく、血液単核細胞と共同的に作用して原虫増殖を制御することが示された(５)。この原虫を含むメカニズムは、抗体依存性細胞阻害(ＡＤＣＩ)(５、２６、３１)と呼ばれる。細胞親和性抗体、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ３が血液単核細胞のＦｃγＩＩａ受容体を介して血液単核細胞へと結合することにより、腫瘍壊死因子-αなどの殺傷因子の放出が引き起こされることが最近の研究によりさらに示された。
【０００９】
免疫-疫学的研究は、臨床免疫の獲得と単球ＦｃγＲＩＩａ受容体によく結合するＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体のレベルとの間の相関を示すことにより、単球依存性、抗体媒介性メカニズムの関連性を支持した(１、４１)。この受容体が臨床マラリアに対する免疫の発達に関与するという推定は、ＦｃγＲＩＩａのアレル多型が、Ｐ.ファルシパルム・マラリアに対する感受性の違いと関連するという発見(４５)により支持される。ＦｃγＲＩＩａ−Ａｒｇ１３１アレルについてホモ接合であるケニア人の幼児は、ヘテロのＡｒｇ/Ｈｉｓ１３１の遺伝子型を有する子供と比較して、高密度Ｐ.ファルシパルム感染による危険性が低いということが報告された(４５)。ＦｃγＩＩａ-Ａｒｇ１３１遺伝子型が、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３に強く結合する(一方、ＦｃγＩＩａ-Ｈｉｓ１３１の遺伝子型は結合しない)ので、この発見により、単球により媒介されるＰ.ファルシパルムの殺傷は、in vivoにおける原虫封じ込めの重要なメカニズムであるという考えが支持される。さらに、Acuan et al.,(２)により、ＩｇＧ３及びＩｇＧ１ではなく、特定のＩｇＧ２抗体のレベルが、ブルキナファソの人々において臨床マラリアからの防御と関連するということが発見された。続いて、ＦｃγＲＩＩａの配列決定により、試験対象の７０％が、ＦｃγＲＩＩａ-Ｈ１３１アレルを有したということが明らかにされた。このアレルは、ＩｇＧ２に強く結合し(５６)、ＩｇＧ２がブルキナファソの人々において細胞親和性サブクラスとして作用することを示唆する。まとめると、これらの観測により、ＦｃγＲＩＩａの遺伝子型は、臨床マラリアに対する免疫を発達させるための重要な因子であり、そしてin vitroのＡＤＣＩモデルの有効性を支持していることが示唆される。
【００１０】
薬剤耐性病の発生率が増加しているため、マラリア・ワクチンの開発は、世界的にマラリアを制御する取り組みにおいて優先度が高いとますます認識されるようになった。候補ワクチンの臨床評価を促進するため、特にワクチン化により与えられる防御のin vitro相関の検証を促進するために、新しいツールは必要とされる。ＡＤＣＩは、そうしたツールの一つを提供する(１３)。現在最も注目される血液段階のワクチン候補であるＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＡＭＡ１、及びＲＥＳＡは、臨床試験用に先ず選ばれた。なぜなら、これらの候補は、前臨床動物モデルにおいて成長阻害抗体を誘導する能力を有したからである(９,１６、１６、３０、５５)。しかしながら、当初の見込みにもかかわらず、これらの候補は一般的に、被験者においてほとんど免疫原性を有しないことが証明され (１８、２５、２９、４３)、そして誘導された抗体は、in vitroにおけるＰ.ファルシパルムの成長を阻害することができなかった。このように、in vitro浸潤阻害アッセイは、免疫の代替マーカーとしてはまだ役に立たない。
【００１１】
メロゾイト浸潤の阻害を反映するヒトの防御との適切な相関を欠くことにより、臨床免疫化されたヒトにおける殺傷メカニズムを反映する別のin vitroモデルの開発が促される。Druilheとその同僚は、抗体が、ヒト血液単球と共同的に作用してin vivoで原虫成長を制御すると仮説を立て、そしてこの殺傷メカニズムのin vitro相関-つまりＡＤＣＩアッセイを開発した。我々は、ＡＤＣＩ-有効ヒト抗体の標的であるＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の二つの抗原を同定した。
【００１２】
プラスモジウム・ファルシパルムグルタミン酸リッチタンパク質(ＧＬＵＲＰ)およびメロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)は、両方とも、ヒトＩｇＧ抗体により標的とされる。ヒトＩｇＧ抗体は、in vitroでは単球-依存的な方式(３６、５２)で、そしてin vivoではヒト化ＳＣＩＤマウスモデルで、原虫成長を阻害することができる。これらの抗原に対するヒト抗体の同様の効果は、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ特異的細胞親和性抗体(ＩｇＧ１とＩｇＧ３)のレベルがマラリア発症のリスクの低減と関連するということを示すいくつかの免疫-疫学的研究によっても提案される(１１、３８、５０)。
【００１３】
ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の発見は、精製されたアフリカ人の免疫グロブリンＧによる免疫の受動伝達をin vitro分析することに基いた(５、６、１４、４２)。これらの研究により、Ｐ.ファルシパルムに対する防御における推定のエフェクター・メカニズムが説明され(１２)、そして続いて関連する原虫分子が同定された。これらのヒトＩｇＧ抗体により認識される主要Ｂ細胞エピトープは、ＧＬＵＲＰ27-489とＭＳＰ３212-257領域の保存配列にそれぞれ位置した。これらの研究は、生物学的に活性な抗体の標的としてＧＬＵＲＰのＮ末端領域(ＧＬＵＲＰ27-489) (５２)とＭＳＰ３のＣ末端領域(ＭＳＰ３210-380)(３６)を同定した。
【００１４】
これらの抗原の異なる領域については、様々なアフィニティ-タグと融合させて、エスケリキア コリ(Escherichia coli)においてすでに作られていた。そうした付加的な配列は精製にとって有利である一方、それらは潜在的な問題を引き起こす。なぜならそうした配列に対して応答する宿主免疫応答は、これらの抗原の繰り返し使用をできなくしうるからである。
【００１５】
免疫疫学的調査は、抗-ＧＬＵＲＰ及び抗-ＭＳＰ３ＩｇＧ抗体と、獲得された感染防御との関連性を確かにした：
ＧＬＵＬＲＰについて、ジエルモ(Dielmo)、セネガル(３８)、ドゥドゥワ、ガーナ(１１，５０)、及びオード(OoDo)、ミャンマー(Soe Soe、未発表)において行われた３の独立した研究により、ＧＬＵＲＰ特異的ＩｇＧ３及び/又はＩｇＧ１抗体のレベルとマラリア発症に対する感染防御とのあいだの統計的に有意な相関が示された。年齢と関連するＰ.ファルシパルムに対する暴露についての効果を混同する操作の後でさえも、この相関はかなり有意であった。これらの結果は、ＧＬＵＲＰに対する天然ＩｇＧ抗体が、ガンビアの子供における病気に対する防御と関連し、そしてリベリア及びブルキナファソの子供における高レベル原虫血症に対する防御と関連したという以前の研究を確かにした。
【００１６】
ＭＳＰ３について、細胞親和性抗体対非細胞親和性抗体(ＩｇＧ１＋ＩｇＧ３／ＩｇＧ２＋ＩｇＧ４＋ＩｇＭ)の高い比率(＞２)は、マラリア発症を患ったことがない人とマラリア発症を患ったことがある人との区別を可能にする。このことは、８年以上日々臨床監視下におかれたジエルモ(Dielmo)の約２００人の村民の全ての年齢の群において見られた(３７)。個人のレベルでは、抗ＭＳＰ３・ＩｇＧ３の出現は、同じ分子に対する別のアイソタイプの抗体又は他の５つの抗原に対するいずれのアイソタイプの抗体とは対照的に、感染防御と強く関連した(３７)。
血清疫学的データーにおける同様の一貫性は、従来Ｐ.ファルシパルム・マラリアに対するワクチンとして有力な候補であったＭＳＰ１により例示される別のマラリア・ワクチン候補については一般的ではない。
【００１７】
これらのヒトＩｇＧ抗体により認識される主要Ｂ細胞エピトープは、ＧＬＵＲＰ27-489とＭＳＰ３212-257領域における保存配列にそれぞれ位置する(３６、５０、５１)。これらの研究は、生理的に活性である抗体の標的として、ＧＬＵＲＰのＮ末端領域(ＧＬＵＲＰ27-489)(５２)とＭＳＰ３のＣ末端領域(ＭＳＰ３210-380)(３６)を同定した。
【００１８】
４４の地域から単離されたＰ.ファルシパルム及び実験系統Ｐ.ファルシパルム由来のＧＬＵＲＰ27-489とＭＳＰ３210-380領域の配列分析により、ＡＤＣＩ有効ヒト抗体により標的されるＧＬＵＲＰ(Ｐ１、Ｐ３、及びＰ４)(４８)及びＭＳＰ３(ｂペプチド)において定義されたエピトープは、ほとんど完全に保存されていることが示され、それによりこれらのエピトープは、機能的に制約をうけ、そしてアミノ酸レベルでの変動を受けないということが示唆される。ＧＬＵＲＰ27-489領域中の異なるエピトープの中で、Ｐ３ペプチドは、最も重要であるようだ。なぜなら、アフィニティー精製されたＰ３ペプチドに対するヒト抗体は、in vitroにおいて最も強いＡＤＣＩ効果を媒介するからである。ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３中の主要Ｂ細胞エピトープの保存は、さらにＰ.ファルシパルムと、チンパンジーの天然原虫であり近縁の原虫であるプラスモジウム・レイケノビ(Plasmodium reichenowi)との間でこれらのエピトープがほとんど同一であるという観測結果、並びに臨床的に免疫化された７１人の成人リベリア人由来の血漿ＩｇＧ抗体が、両方の種由来のＧＬＵＲＰ27-500を表す組換えタンパク質に対して同一の結合パターンを示すという観測結果によりさらに支持される。
【００１９】
これらの発見により、生物的に有効なヒト抗体により認識されるＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３Ｂ細胞エピトープは、地理的に遠いＰ.ファルシパルム分離株の間で保存され、そして機能的に制約されるということが示され、これらにより、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３に基くワクチンが、世界中の広範囲の原虫種を防ぎうることが示唆される。
【００２０】
ＧＬＵＲＰ(５２)及びＭＳＰ３(３６)に対するアフィニティー精製された天然ヒト抗体は、単球依存的な方式で原虫成長を阻害するが、一方、別の７個のマラリア・ワクチン候補に基いてアフィニティー精製されたコントロール抗体は、類似の効果を発揮することができない(４７)ということがin vitro実験により示された。
【００２１】
組換えタンパク質(ＧＬＵＲＰ27-489、及びＧＬＵＲＰ705-1178)と、ＬＵＲＰ・Ｒ０領域、Ｐ３(ＧＬＵＲＰ93-207)、Ｓ３(ＧＬＵＲＰ407-434)、及びＬＲ６７(ＧＬＵＲＰ85-312)(５０、５１)のそれぞれに由来する合成ペプチドの両方に対する天然ＩｇＧ抗体であって、アフィニティー精製された抗体を使用して同様の阻害効果が得られる。
【００２２】
アフィニティー精製されたＭＳＰ３ｂ特異的ヒト抗体を、Ｐ.ファルシパルムに感染したＨｕ-ＲＢＣ・ＢＸＮマウスに受動伝達するin vivo実験は、クロロキンに誘導される原虫除去と同じくらい早い原虫除去を示し、そしてそれはアフリカ人の全ＩｇＧにより誘導される原虫除去よりも早かった(３)。後者の観察により、選択的抗体による免疫化が全原虫により誘導される免疫より強い免疫を引き起こすということが示される(３)。
【００２３】
フロイント完全アジュバント中の組換えＭＳＰ３で免疫化されたヨザル(Aotus monkeys)は、実験的Ｐ.ファルシパルム感染に対し完全に防御された。リスザル(Saimiri sciureus)の免疫化によって、Ａｌ(ＯＨ)3に吸着されるＧＬＵＲＰ27-500が、無毒性であり、免疫原性であり、そしてＰ.ファルシパルムを認識する抗ＧＬＵＲＰ抗体の高いタイターを誘発することが、ＩＦＡにより示された(８)。Ｐ.ファルシパルムが感染した赤血球で感染させた後、三匹のサルの内の二匹は、部分的に防御された。この効果は、免疫原に応答して霊長類が発達させた抗体のタイター及びエピトープ特異性に直接関連した。
【００２４】
これらの発見により、ＡＤＣＩ有効抗体を誘発するＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３のＢ細胞エピトープに対する免疫応答が、in vivoでの原虫増殖を制御するというという考えが強く支持される。
【００２５】
これらの抗原の異なる領域をエスケリキア・コリ(Escherichia coli)中で産生し、様々なアフィニティ-タグと融合した(３５、５３、５４)。こうした付加配列は、精製に利点がある一方で、それらは潜在的な問題点を有する。なぜなら、そうした配列に対する宿主の免疫応答がそうした配列を繰り返し使用できなくしてしまうからである。それゆえ、ベクターがコードするアフィニティータグを有しない組換えタンパク質を産生することを狙った発現系を探索することが所望される。
【００２６】
ＭＳＰ３及びＧＬＵＲＰに基く限定された数の製剤が、さらなるワクチン開発のために選別され、そして最初にマウス(４９、５４)で、そして次にヒト以外の霊長類において、Ｐ.ファルシパルムで感染させる前臨床レベルで試験された(８)。ＧＬＵＲＰのＮ-末端領域及びＭＳＰ３のＣ末端領域は、前臨床モデルにおいて免疫原性をはっきりと証明された。ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)由来のプロモーターであって、ｐＨ及び増殖段階により制御されるプロモーターであるＰ１７０に基いた新規で高効率の発現系を使用して、ＧＬＵＲＰのＮ-末端領域及びＭＳＰ３のＣ末端領域は個別に産生された(２３、３３)。
【００２７】
我々は、ＡＤＣＩ有効ヒト抗体の標的である二つの抗原-つまりＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３-を今のところ同定し、そして個々の抗原に関して２つのフェーズ１臨床試験を行った。両方のワクチンは、被験者において強い細胞応答を誘導したが、ＩｇＧ抗体応答は並以下であった。ＧＬＵＲＰ試験の全ての被験者は、Ｐ３・Ｂ細胞エピトープに対する抗体を産生した。該抗体は、臨床的に免疫化された人におけるＡＤＣＩ有効抗体の最も目立つ標的である。ワクチンに誘導される抗体のレベルが比較的低いことは、ＧＬＵＲＰ合成ペプチド上のＢ細胞エピトープの数が限られていることに関連しているのかもしれない。
【００２８】
それゆえ、さらなるＢ細胞及びＴ細胞エピトープを含む隣接配列或いはＣＳ抗原などのＰ.ファルシパルム由来の抗原と伴に、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３を含む組換えタンパク質に基いたワクチン開発が所望される。また、ベクターがコードするアフィニティータグを伴わない組換えたんぱく質を産生する発現系、例えば、Ｌ.ラクチスの使用も所望される。
【発明の開示】
【００２９】
発明の要約
改良されたワクチン誘導性抗体発現をもたらすマラリア・ワクチンが開示される。このワクチンは、プラスモジウム・ファルシパルム由来の少なくとも１の別のタンパク質、例えば、メロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)と遺伝子操作により結合されたプラスモジウム・ファルシパルムのグルタミン酸リッチ・タンパク質(ＧＬＵＲＰ)から生じた融合タンパク質、又はこの融合タンパク質をコードする対応のヌクレオチド配列を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、プラスモジウム・ファルシパルム由来の少なくとも１の別のタンパク質と遺伝子操作により結合されたプラスモジウム・ファルシパルム・グルタミン酸リッチタンパク質(ＧＬＵＲＰ)に由来する融合タンパク質、又は該融合タンパク質のホモログを含む抗原に基くマラリア・ワクチンを開示する。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様は、ＧＬＵＲＰに遺伝子操作により結合されたタンパク質が、プラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト表面タンパク質３(ＭＳＰ３)に由来し、ここで該融合タンパク質が好ましくは配列番号１に表されるアミノ酸配列を有するワクチンである。
【００３２】
別の実施態様では、ワクチンは、配列番号１を含み、そしてさらにプラスモジウム・ファルシパルム由来のタンパク質の免疫原性エピトープを含む。
【００３３】
配列番号１に表されるアミノ酸配列と、プラスモジウム・ファルシパルム由来の１以上のタンパク質の１以上の免疫原性エピトープ、例えばＣＳ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５、ＭＳＰ６、ＡＭＡ１、Ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、ＲＡＰ１、ＥＢＡ−１７５、ｐｆＥＭＰ１、ＥＸＰ１、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、Ｐｆ２５、Ｐｆ４５／４８、Ｐｆ２３０、Ｐｆ２７、Ｐｆ１６、又はＰｆ２８をさらに含む融合タンパク質とを有する融合タンパク質が開示される。
【００３４】
本発明はまた、組換え菌、例えばラクトコッカス属から上記融合タンパク質を製造することに関する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、上記融合タンパク質をコードする核酸、並びにワクチンを製造するための該核酸の使用に関する。ワクチンに使用される好ましい実施態様の核酸は、配列番号２において示される配列である。
【００３６】
さらに別の実施態様において、ワクチンは、上記融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＢＣＧを含む。
【００３７】
ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３に基くワクチンが、同じタイプの免疫応答、つまり、高レベルの細胞親和性抗体を誘導し、そしておそらく免疫系の標的として互いに相補するので、それぞれのＧＬＵＲＰ25-500及びＭＳＰ３212-382の領域は、新規の遺伝子発現系であるラクトコッカス・ラクチス中に組換えハイブリッドとして一緒に導入される。この発現系は、Ｌ.ラクチス由来であり、ｐＨ及び増殖段階により制御されるプロモーターであるＰ１７０に基く(７、２３、３３、５６)。この遺伝子発現系は、Ｐ１７０プロモーターに特異的に開発された単純発酵手順を利用する。Ｌ.ラクチスは、以下の理由：
i)  Ｌ.ラクチスは、特性を明らかにされ一般的に安全と認められた(ＧＡＲＳ)工業微生物であり、発酵乳製品の生産における使用が最もよく知られている
ii)  Ｌ.ラクチスは、規定の合成培地において成長できる
iii)  組換えタンパク質は、培養上清中に分泌され、そこから簡単に精製できる、及び
iv)  L.ラクチスは毒性物質を作り出さない
という理由から発現宿主として選択された。
【００３８】
ＧＬＵＲＰのＮ末端領域及びＭＳＰ３のＣ末端領域は、キメラ融合タンパク質の形で、ハイブリッドタンパク質として、Ｌ.ラクチスを使用して製造された。
【００３９】
モンタニド(Seppic)をアジュバントとして使用して、マウスにおいてハイブリッド・タンパク質の免疫原性を試験した。最近の臨床試験において、モンタニドをＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３それぞれに由来する長い合成ペプチドと共に使用した。ハイブリッド・タンパク質での免疫化は、それら二つの分子の混合による免疫化と比較して、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３ドメイン各々に対するより強い抗体応答を一貫して作り出した。
【００４０】
ＭＳＰ３特異的抗体応答について差が強調され、それによりＧＬＵＲＰ・Ｒ０領域に位置するＴ細胞エピトープが、ＭＳＰ３領域におけるＢ細胞エピトープの助けとなるということが示唆された。このことは、他のマラリア抗原とも使用されうるＧＬＵＲＰ抗原の驚くべき能力である。
【００４１】
対照的に、動物が、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３の混合体で注射されたとき、個々のマウスは、どちらかの分子に対する優勢な抗体応答を高める傾向があった。いくつかの動物において、ＧＬＵＲＰが、優勢の免疫原であり、一方別の動物では、ＭＳＰ３が優勢の免疫原であった。
【００４２】
ハイブリッドは、臨床的に免疫化されたアフリカ人成人の天然ＩｇＧ抗体によって、個々の抗原より効率的に認識された。
【００４３】
ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド・タンパク質はそれゆえ、個々のＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３分子と比較して４つの主な利点を有する：
ｉ)  ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド・タンパク質は、個々の分子のいずれの組み合わせよりも免疫原性が高く、
ii)  ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド・タンパク質は、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の両方に対して強い免疫応答を作り出し、
iii)  ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド・タンパク質は、１回の臨床試験において、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の両方を試験することを許容し、そして
iv)  ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３との間の融合接続部において新たなエピトープを含まないことが、マウス及び非ヒト霊長類における前臨床試験により示されたので、ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド・タンパク質は、個々の分子と同じくらい安全であると予想される。
【００４４】
Ｐ.ファルシパルムから同定された別の抗原であってＧＬＵＲＰ抗原に対する融合パートナーとして適切である抗原は、ＣＳ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５、ＭＳＰ６、ＡＭＡ１、Ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、ＲＡＰ１、ＥＢＡ−１７５、ｐｆＥＭＰ１、ＥＸＰ１、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、Ｐｆ２５、Ｐｆ４５／４８、Ｐｆ２３０、Ｐｆ２７、Ｐｆｌ６、又はＰｆ２８である。
【００４５】
定義
融合タンパク質
組換え融合タンパク質は、１の遺伝子の異なる領域由来のヌクレオチド配列を遺伝子操作で結合すること、及び/又は２以上の別の遺伝子由来のヌクレオチド配列を結合することにより取得されるヌクレオチド配列によりコードされる。これらのヌクレオチド配列は、Ｐ.ファルシパルム由来であるが、該ヌクレオチド配列は、別の生物、クローニング手順に使用されるプラスミド、又は他のヌクレオチド配列由来でありうる。
【００４６】
免疫原性断片又はエピトープ
免疫原性断片又はエピトープは、生物学的サンプルにおいて又は現在若しくは過去にマラリアなどの微生物に感染した人において、免疫応答を誘導するタンパク質の一部として定義される。
免疫応答は、以下の方法のうちの１の方法によってモニターされうる。
【００４７】
・  in vitroにおける細胞応答は、現在又は過去にマラリアに感染した人又は動物から採取されたリンパ球からの関連サイトカイン、例えばＩＦＮ-γなどの放出により、又は、該リンパ球のＴ細胞の増殖を検出することにより、測定される。誘導は、ポリペプチド又は免疫原性成分を、１ウェルあたり１×１０5細胞〜３×１０5細胞を含む懸濁液に加えることにより行われる。血液、脾臓、肝臓、又は肺から細胞を単離し、そして２０μｇ/ｍｌ(懸濁液)以下の濃度をもたらす量のポリペプチド又は免疫原性成分を加え、そして２日から５日間刺激を行った。細胞増殖をモニターするため、細胞を放射性標識されたチミジンでパルス標識し、そして１６〜２２時間インキュベーションしたのちに、液体シンチレーションカウンターにより増殖を検出した。ポジティブ応答は、バックグラウンド＋標準偏差×２以上の応答である。ＩＦＮγの放出は、当業者に周知のＥＬＩＳＡ法により測定されうる。ポジティブ応答は、バックグラウンド＋標準偏差×２以上の応答である。ポリペプチドに対する免疫応答をモニターするとき、ＩＦＮ−γ以外の別のサイトカイン、例えば例えばＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＧＦ−βなどは適切でありうる。サイトカイン(例えば、ＩＦＮ−γ)の存在を検出する他のより感度の高い方法は、ＥＬＩＳＰＯＴ法である。ＥＬＩＳＰＯＴ法では、血液、脾臓、肝臓、又は肺から単離した細胞を、好ましくは１〜４×１０6細胞／ｍｌの濃度に希釈し、そして２０μｇ／ｍｌ以下の濃度になるポリペプチド又は免疫原性成分の存在下で１８〜２２時間インキュベーションを行った。この後、細胞懸濁液を１〜２×１０6／ｍｌに希釈し、そして抗ＩＦＮ−γでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移し、好ましくは４〜１６時間インキュベーションした。ＩＦＮ−γ産生細胞は、標識された抗ＩＦＮ−γ二次抗体を使用することによって測定され、そして適切な基質はスポットを生じさせる。このスポットを精査顕微鏡を使用して計数した。ＰＣＲ技術を使用することにより、適切なサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を測定することも可能である。通常、１以上のサイトカインは、例えばＰＣＲ、ＥＬＩＳＰＯＴ、又はＥＬＩＳＡを使用して計測されるだろう。特定のポリペプチドにより誘導されるこれらのサイトカインのいずれかの量の有意な増加又は減少は、ポリペプチドの免疫学活性の評価において使用されうることが、当業者によって理解されるだろう。
【００４８】
・  in vitro細胞応答は、免疫化された個人又はマラリア感染患者由来のＴ細胞系列を使用することにより測定されうる。ここで、Ｔ細胞系列は、生きたＰ.ファルシパルム、原虫からの抽出液、又は培養ろ液のいずれかと共に、ＩＬ−２を加えて１０〜２０日間成長させた。懸濁液１ｍｌあたり２０μｇ以下のポリペプチドを、１ウェルあたり１×１０5細胞〜３×１０5細胞を含むＴ細胞系列に加え、そしてインキュベーションを２〜６日間行って誘導を行った。ＩＦＮ−γの誘導又は別の適切なサイトカインの放出をＥＬＩＳＡにより検出した。Ｔ細胞の刺激を、上記の放射性標識されたチミジンを使用し、細胞増殖を検出することによりモニターした。両方のアッセイについて、ポジティブ応答は、バックグラウンド＋標準偏差×２以上の応答である。
【００４９】
・  in vivo細胞応答は、Ｐ.ファルシパルムに臨床的又は亜臨床的に感染した患者に、最大１００μｇのポリペプチド又は免疫原性の部分を皮内注射又は局所パッチ投与した後のポジティブＤＴＨ応答として測定した。ポジティブ応答は、注射又は適用後７２〜９６時間で少なくとも５ｍｍの直径を有した。
【００５０】
・  in vitroにおける液性応答は、免疫化された又は感染した人における特異的抗体応答により測定される。抗体の存在は、ＥＬＩＳＡ技術、或いはポリペプチド又は免疫原性部分がニトロセルロース膜又はポリスチレン表面に吸着されるウエスタンブロッティングにより測定されうる。血清を好ましくはＰＢＳ中に１：１０〜１：１００に希釈し、吸着されたポリペプチドに加え、そしてインキュベーションを１〜１２時間行った。標識された二次抗体を使用することにより、特異的抗体の存在は、例えばＥＬＩＳＡにおいて、ＯＤを計測することにより測定され(ここでポジティブ応答は、バックグラウンド＋標準偏差×２である)、或いはウエスタンブロッティングにおいて視覚的反応により測定されうる。
【００５１】
・  別の適切なパラメーターは、アジュバント中のポリペプチドでワクチン化した後に、或いはＤＮＡワクチン化の後に誘導される動物モデルの感染防御を計測することである。適切な動物モデルは、霊長類、モルモット、又はマウスを含み、これらの動物は、感染される。誘導された感染防御の読み取りは、非ワクチン化動物と比べて低減した原虫密度、非ワクチン化動物と比べて延長された生存期間、及び非ワクチン化動物と比べた体重減少の低下を読み取ることでありうる。
【００５２】
ホモログタンパク質
ホモロジーは、本発明の融合タンパク質のアナログ又はバリアントとして定義される。融合タンパク質は、特定のアミノ酸により特徴付けられ、そして特定の核酸配列によりコードされる。そうした配列が、組換え又は合成方法により産生されるアナログ及びバリアントを含むことが理解されるだろう。ここでそうしたポリペプチド配列は、組換えポリペプチド配列中の１以上のアミノ酸の置換、挿入、添加、又は欠失により改変され、そして本明細書中に記載されるいずれの生物学的アッセイにおいて免疫原性である。置換は好ましくは「保存的」である。置換は好ましくは、コドン使用における静的置換であり、該置換はアミノ酸配列に変化をもたらさないが、タンパク質発現を亢進するために導入されうる。置換は、以下の表にしたがって定義される。二列目の同じブロック、好ましくは三列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換されうる。三列目のアミノ酸は、１文字表記で表される。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
ワクチン、タンパク質
本発明は、本発明に従った融合タンパク質を含むワクチン組成物に関する。そうしたワクチン組成物の最適能力を保証するために、免疫学的に及び医薬として許容される担体、ワクチン、又はアジュバントを含むことが好ましい。
【００５５】
本発明のタンパク質が動物により認識される有効なワクチンは、動物モデルにおいて、非ワクチン化動物と比較して、マラリア原虫で感染させた後の血中及び標的組織中の原虫負荷を低減し、生存期間を延長し、そして/又は体重減少を減らすことができる。
【００５６】
さらに、本発明の融合タンパク質は、炭化水素又は脂質成分、例えば担体に結合されるか、又は他の方法(例えばアセチル化など)において改変されうる。
【００５７】
微生物中で産生されたとき、本発明の融合タンパク質は、特別の処置が成されなければ、通常アセチル化されない。アセチル化ポリペプチドは、細胞中、血中又は体内、並びに組織液中でより安定でありうるので、アセチル化は利点がある。さらに、アセチル化は、未変性のＰ.ファルシパルム抗原の構造及び立体配置を模倣する、構造及び立体配置をポリペプチドに与えうる。
【００５８】
適切な担体は、ポリペプチド(一つ又は複数)が疎水性非共有結合性相互作用により結合するポリマー、例えばポリスチレンなどのプラスチック、或いはポリペプチド(一つ又は複数)が共有結合で結合するポリマー、例えば多糖、又はウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、若しくは鍵穴カサガイ・ヘモシアニンなどのポリペプチドからなる群から選ばれる。適切な溶媒は、希釈液及び懸濁剤からなる群から選ばれる。アジュバントは、好ましくはジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロミド(ＤＤＡ)、ＱｕｉｌＡ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイント不完全アジュバント、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、一リン酸化脂質Ａ(ＭＰＬ)、トレハロース・ジミコレート(ＴＤＭ)、トレハロース・ジベヘネート、及びムラミル・ジペプチド(ＭＤＰ)からなる群から好ましくは選ばれる。
【００５９】
活性成分としてペプチド配列を含むワクチン製剤は、一般的に当該技術分野によく知られており、米国特許第4,608,251号、第4,601,903号、第4,599,231号、及び4,599,230号において例証される。これら全ての文献を本明細書中に援用する。
【００６０】
ワクチンのためのアジュバント効果を達成する別の方法は、水酸化アルミニウム、又はリン酸(ミョウバン)、合成糖ポリマー(Ｃａｒｂｏｐｏｌ)などの試薬を使用することを含み、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集体、ペプシン処理(Fab)抗体をアルブミンに再賦活することによる凝集体、Ｃ.パルブムなどの細菌細胞又はグラム陰性細菌の内毒素若しくはリポ多糖要素の混合液、生理的に許容されるオイル溶媒、例えばマンニドモノオレエート(mannide mono-oleate)(Aracel A)中の乳濁液、又は保護置換として使用されるパーフルオロカーボン(フルゾール-DA)の２０％溶液の懸濁液は、使用されうる。別の可能性は、免疫調節物質、例えばサイトカイン又は合成IFN-γ誘導因子、例えばポリI:Cを上記アジュバントと組み合わせて使用することを含む。
【００６１】
アジュバント効果を達成するための別の興味深い可能性は、Gosselin et al., 1992 (19)において記載される技術を使用することである。手短に言えば、本発明の抗原などの適切な抗原は、単球/マクロファージのＦｃγ受容体に対する抗体(又は抗原結合性の抗体断片)に結合されうる。
【００６２】
ワクチンは、投与剤形に適した方式で、及び治療有効及び免疫原性である量で投与される。投与される量は、治療される対象、例えば免疫応答を上昇させる個人の免疫系の能力、並びに所望される防御の程度に左右される。適切な投与量範囲は、ワクチンあたり活性成分数百μgのオーダーであり、好ましくは約０.１μg〜１０００μg、例えば、約１μg〜３００μg、そして特に１０μｇ〜５０μgである。初回投与と追加免疫投与の適切な投与計画は、変動可能であるが、初回投与の後に、接種又は別の投与を行うことが典型とされる。
【００６３】
適用様式は、広く変動しうる。ワクチン投与の慣用方法のいずれもが、適用されうる。これらは、生理的に許容される固体塩基又は医薬として許容される分散剤中の経口適用、注射などによる非経口投与を含むと信じられている。ワクチン投与量は、投与経路に左右され、そしてワクチン接種される人の年齢、及び、それよりは少ない程度ではるが、ワクチン化される人の大きさに従って変化するだろう。
【００６４】
ワクチンは、慣用的に注射、例えば皮下又は筋肉内注射により非経口的に投与される。投与の別の方法に適したさらなる製剤は、坐薬及び、いくつかの場合において経口製剤を含む。坐薬では、従来の結合剤及び担体は、例えばポリアルカレン・グリコール又はトリグリセリドを含み、そうした坐薬は、活性成分を０.５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含む混合体から形成される。経口製剤は、そうした通常使用される賦形剤、例えば医薬品質のマンニトール、ラクト-ス、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続性放出製剤、又は粉末の形態をとり、そして特に１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含む。
【００６５】
多くの例において、ワクチンの複数回投与が必要とされるだろう。特に、ワクチンは、マラリア感染を妨げるため及び/又は確立されたマラリア感染を治療するために投与されうる。感染を妨げるために投与されるとき、感染の臨床兆候又は症状が出てくる前にワクチンは予防的に与えられる。
【００６６】
遺伝的多様性のために、異なる個人は、同じタンパク質に対して様々な強さの免疫応答で反応しうる。それゆえ、本発明に従ったワクチンは、免疫応答を増大させるために、いくつかの異なるタンパク質を含みうる。ワクチンは、２以上のポリペプチド又は免疫原性部分を含みうる。ここでタンパク質の全ては上で定義されるとおりであるか、又はいくつかのペプチド(全部ではない)は、Ｐ.ファルシパルム又は他の微生物由来でありうる。後者の例では、上で説明されるポリペプチドの基準を必ずしも満たさないポリペプチドは、それ自身の免疫原性に起因して作用しうるか、又は単にアジュバントとして作用しうる。
【００６７】
ワクチンは、１〜２０、例えば２〜２０、さらに３〜２０の異なるタンパク質又は融合タンパク質、例えば３〜１０の異なるタンパク質又は融合タンパク質を含みうる。
【００６８】
本発明はまた、ヒトを含む動物を、例えばＰ.ファルシパルムにより引き起こされるマラリアに対して免疫化する方法に関し、ここでこの方法は、本発明の融合タンパク質、又は上に記載される本発明のワクチン組成物、或いは以下に記載される生ワクチンを動物に投与することを含む。
【００６９】
本発明は、本発明に従った免疫原性組成物を製造する方法に関する。該方法は、本発明に従った融合タンパク質を調製、合成又は単離し、そして培地中に融合タンパク質を可溶化又は分散し、そして場合により他の抗原及び/又は担体、溶媒及び/又はアジュバント物質を加えることを含む。
【００７０】
本発明の別の態様は、組換え微生物中に本発明のハイブリッド・タンパク質を産生することであり、本ハイブリッド・タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現することに加え、さらに、例えば結核などのマラリア以外の別の疾患に対する治療又は防御効果を有する１以上の抗原を発現する。これらの別の抗原は、分離した抗原として発現されうるし、又は本発明のハイブリッド・タンパク質に融合する抗原として発現されうる。Ｔｂに対して有効な別の抗原の例は、ＥＳＡＴ６、ＣＦＰ７、ＣＦＰ１０、ＣＦＰ２９、ＯＲＦ２ｃ、ＴＢ１３、ＭＰＴ５９、α−クリスタリン、Ｒｖ０２８５、並びにそれらのハイブリッドであるが、この構想は、ＴＢ、又はＴＢのみに対する抗原に制限されない。
【００７１】
ワクチンＤＮＡ
本発明の核酸断片は、抗原のin vivo発現を達成するために使用されうる。つまり、核酸断片は、Ulmer et al 1993において概説されるように、いわゆるＤＮＡワクチンとして使用されうる。この文献は援用される。
【００７２】
それゆえ、本発明は、本発明に従った核酸断片を含むワクチンに関し、このワクチンは、ワクチンが投与された動物(ヒトを含む)による抗原のin vivo発現をもたらし、発現された抗原量は、動物(ヒトを含む)においてＰ.ファルシパルムにより引き起こされる感染に対する実質的に増大した抵抗性を与えるために十分な量である。
【００７３】
そうしたＤＮＡワクチンの効力は、免疫応答を調節する能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片と共に発現生成物をコードする遺伝子を投与することにより亢進されうる。
【００７４】
組換え生ワクチン
ワクチンに対して細胞性免疫応答を効果的に活性化する一の可能性は、非病原性微生物ワクチン又はウイルスワクチンにおいて適切な抗原を発現することにより達成されうる。そうした微生物の周知の例は、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ(Mycobacteriumu bovis BCG)、サルモネラ(Salmonella)、及びシュードモナ(Pseudomona)であり、そしてウイルスの例はワクシニア・ウイルス及びアデノウイルスである。
【００７５】
それゆえ本発明の別の重要な態様は、現在利用できる生ＢＣＧワクチンに性質を付け加えることであり、ここで上で定義される１以上の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の１以上のコピーは、微生物のゲノム中に、該微生物がタンパク質を発現しそして分泌することを許容する様式で取り込まれる。本発明のヌクレオチド配列の１より多いコピーを取り込むことは、免疫応答を高めると考えられる。
【００７６】
本発明の別の態様は、上で定義される１以上の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現し、そしてさらに例えばミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)により引き起こされる結核などのマラリアとは異なる病気に対する治療又は防御効果を有する１以上の抗原を発現する非病原性微生物、例えばＬ.ラクチス又はＢＣＧである。これらの別の抗原は、分離した抗原として、又は本発明のハイブリッド・タンパク質に融合した抗原として発現されうる。Ｔｂ(サンガー・データーベース受入番号により識別される)に対して効果的である別の抗原の例は、Ｒｖ３８７５(ＥＳＡＴ６)、Ｒｖ１８８６ｃ(Ａｇ８５Ｂ)、Ｒｖ０２８８(ＣＦＰ７)、Ｒｖ３８７４(ＣＦＰ１０)、Ｒｖ０７９８ｃ(ＣＦＰ２９)、Ｒｖ２０３１ｃ(α-クリスタリン)、及びＲｖ０２８５、又は断片、或いはそれらのハイブリッドであり、最も好ましくは、ＥＳＡＴ６−Ａｇ８５Ｂハイブリッドであるが、この構想は、ＴＢ又はＴＢのみに対する抗原に限定されない。
【００７７】
そうしたＤＮＡワクチンの効果は、免疫応答を調節する能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片と共に、発現生成物をコードする遺伝子を投与することによって高められうる。たとえば、リンフォカイン前駆体又はリンフォカイン(例えばＩＮＦ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-１２)をコードする遺伝子は、２つの分離されたＤＮＡ断片を投与することにより、又は同じベクター内に含まれる両方のＤＮＡ断片を投与することによって、投与されうる。
【００７８】
別の可能性は、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスなどの弱毒化ウイルス中に、本発明に従ったポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことである(４０)。組換えワクシニアウイルスは、感染した宿主細胞の細胞質中で複製することができ、そして関心のタンパク質は、それゆえ、マラリアに対する防御を誘導することを想定される免疫応答を誘導することができる。
【００７９】
治療ワクチン
本発明は、Ｄ.Ｌｏｗｒｙ(Lowry et al.,1999)により示された文献に記載される治療用ワクチンとして、本発明の融合タンパク質又は核酸を使用することに関する。治療性質を有する抗原は、ワクチンとして投与されたとき、実験動物においてマラリア感染の重篤度を低減する能力又は以前の感染の再活性化を妨げる能力に基いて同定されうる。治療ワクチンとして使用される組成物は、ワクチン用に上で記載される様に調製されうる。
【実施例】
【００８０】
実施例１：材料と方法
細菌種、プラスミド、及び成長条件
指示されたプラスミドを含むE.コリDH10B(K12, F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ Δm15 ΔlacX74 deoRrecA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG)(Life Technologies)をエリスロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含むルリア・ブロス（ＬＢ）中で成長させた。指示されたプラスミドを含むＬ.ラクチスＭＧ１３６３（１７）を０.５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを加えたＭ１７ブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌｔｄ.）又は３×ＳＡ・ＩＶ培地と名付けられる合成アミノ酸（ＳＡ）強化培地に１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを加えた培地中で成長させた。固形ＬＢ又はＭ１７培地に２００又は１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンをそれぞれ加えた。ベクターであるｐＰＳＭ１０１３（図１）は、ｐＡＭβ１レプリコンに基く多コピー数発現プラスミド（４６)であり、最適分泌シグナル-ペプチド配列ＳＰ３１０ｍｕｔ２(Ravn, P., Arnau, J., Madsen, S.M., Vrang, A., 及びIsraelsen, H. 未発表)とのインフレーム融合体の構築を可能にする固有制限酵素部位を含む。ペプチドのｍＲＮＡは、プラスミドがコードする翻訳開始部位から翻訳され、そしてｐＨ及び増殖段階誘導性のＬ.ラクチスプロモーター、Ｐ１７０から転写される（７，２３，３３）。ｐＨ７以上では、Ｐ１７０プロモーターからの転写は実質的にない。しかしながら、ｐＨ６.５以下の定常段階に移ると、転写が誘導される。プラスミドｐＡＭＪ３２８は、全てのｌａｃＺ制御配列を欠失して、ｌａｃプロモーターからの転写を避け、そしてシグナルペプチドを欠失する新たなクローニング領域を作ることにより、ｐＰＳＭ１０１３から派生させた（３２）。
【００８１】
Ｌ.ラクチス中でＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３を発現するプラスミドの構築
全てのプラスミドは、Ｅ.コリＤＨ１０Ｂ中で構築し、そして(２２)で記されるように電気穿孔によりＬ.ラクチスＭＧ１３６３に形質転換した。全てのプラスミドコンストラクトをＤＮＡシーケンスにより確かめた。
ｐＭＳＴ７３.  ＦＶＯglurpの非繰り返し領域をプライマー：５’-CCC AGA TCT ACA AGT GAG AAT AGA AAT AAA C [79から100のヌクレオチド] (Ｍ５９７０６のＡＴＧ開始コドンのＡから数える)、及び５’-CCC AGA TCT TGC TTC ATG CTC GCT TTT TT CCG AT [1475から1500のヌクレオチド]で増幅し；ＢｇｌＩＩで切断し、そして得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで切断したｐＰＳＭ１０１３中にクローニングした。
【００８２】
ｐＫＢＲ５.  ｐＭＳＴ７３プラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、得られたｇｌｕｒｐインサートを含むＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ-ＳａｌＩで切断したｐＡＭＪ３２８にクローニングした。
【００８３】
ｐＫＢＲ７.  Ｆ３２ｇｌｕｒｐの非繰り返し領域を、プライマー５'-AAG TAG ATC TAC TAA TAC AAG TGA GAA TAG AAA TAA AC[73 〜100のヌクレオチド]、及び５'-GTT CAG ATC TTT ATT CAT GAT GGC CTT CTA GC[1519〜1542のヌクレオチド]で増幅し；得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで切断し、そしてＢｇｌＩＩで切断したｐＰＳＭ１０１３にクローニングした。
【００８４】
ｐＫＢＲ８.  プラスミドｐＫＢＲ７を、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、そしてｇｌｕｒｐインサートをＢａｍＨＩ-ＳａｌＩ切断ｐＡＭＪ３２８にクローニングした。
【００８５】
ｐＫＢＲ９.  Ｆ３２・ＭＳＰ３のＣ末端領域をプライマー５’-CCC AGA TCT AAA GCA AAA GAA GCT TCT AGT TAT[628〜651のヌクレオチド]と５'-ATT AGA TCT CAT TTA ATG ATT TTT AAA ATA TTT GGA TA[1118〜1140のヌクレオチド] (L07944の開始コドンＡＴＧのＡから数える)で増幅し；得られたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩで切断し、ＢｇｌＩＩで切断したｐＰＳＭ１０１３中にクローニングした。このＭＳＰ３領域は、ＦＣ２７アレル(受入番号Ｌ０７９４４)のＭＳＰ３領域と、ＭＳＰ３の可変位置での以下の残基を除いて同一である。７３５(Ｔ→Ｃ)及び９４８(Ａ→Ｇ)。
【００８６】
ｐＫＢＲ１０.  プラスミドｐＫＢＲ９をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、そしてＭＳＰ３インサートをＢａｍＨＩ-ＳａｌＩで切断したｐＡＭＪ３２８にクローニングした。
【００８７】
ｐＫＢＲ１１.  ｐＫＢＲ９のＢｇｌＩＩ-断片を、ＢｇｌＩＩで部分的に切断したｐＫＢＲ５にクローニングして、ｇｌｕｒｐ79-1500とＭＳＰ３628-1140との間のインフレーム融合をもたらした。このハイブリッド分子は、ＧＬＵＲＰ中の可変位置での以下の残基を除いてＦ３２アレルに一致する。Ｌｅｕ-５０、Ａｓｎ−５３、Ｇｌｕ-６５、Ａｓｐ-１２９、Ｇｌｕ−２２４、Ｐｒｏ-５００。
【００８８】
発酵
プラスミドｐＫＢＲ８(ＧＬＵＲＰ)、ｐＫＢＲ１０(ＭＳＰ３)、又はｐＫＢＲ１１(ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド)を含むＬ.ラクチスＭＧ１３６３の発酵を２Ｌの発酵器中の、エリスロマイシン(１μｇ/ｍｌ)、酵母抽出物(０.５％)、及びグルコース(１.５％)を加えた３×ＳＡ・ＩＶ培地(１Ｌ)で、３０℃で行った。培養液の開始ｐＨを７.４に合わせた。Ｌ.ラクチスＭＧ１３６３は、成長の間乳酸を産生するので、細胞密度が増加するにつれてｐＨは減少する。約３時間の成長の後に、ｐＨは６に減少し、そして２ＭのＫＯＨをｐＨ制御様式で加えることにより、さらに８時間、細胞密度が約ＯＤ600＝８となるまでこのレベルを維持した。５０％グルコース溶液を塩基と平行して加えた。なぜならこの添加により細菌の収量を増大する傾向があるからである。Pellicon2 Duraporeフィルター(PVDF、0.22μｍ、０.１ｍ2)(Millipore)で限外ろ過することにより細菌細胞を培養上清(外に出されたタンパク質を含む)から取り除いた。培養上清をすぐに使用するか、または-２０℃で貯蔵した。
【００８９】
組換えタンパク質の精製
組換えＧＬＵＲＰ、ＭＳＰ３、及びハイブリッド分子について、組換え戦略を開発した。Pellicon XL Biomax ８フィルター(ポリプロピレン-膜、５００００Da、５０ｃｍ2)を備えるMillipore Labscale(商標)TFFシステムで無細胞培養上清を濃縮した。そしてSephadex G-２５カラム(C２６/４０、１７０ｍｌ)上で濃縮液を２０ｍＭビス-Ｔｒｉｓ(ｐＨ６.４)にバッファー交換を行った。０〜１ＭのＮａＣｌの勾配を、１ｍｌ/分の流速でカラム緩衝液中に適用することにより、組換えタンパク質を最初に５ｍｌHiTrapQ Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)カラム上で精製した。所望の組換えタンパク質を含む分画(２ｍｌ)を貯めて、そして２０ｍＭビス-Ｔｒｉｓ(ｐＨ６.４)に対して透析し、そして５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)カラムに適用した。組換えタンパク質をカラム緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌ勾配により溶出させた。ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３を、単一ピークで溶出し、一方ハイブリッドを２ピークで溶出した。所望のピークを含む分画(２ｍｌ)貯め、そして１Ｍ(ＮＨ4)2ＳＯ4に調節し、そして流速１ｍｌ/分で２０ｍＭビス-トリス(ｐＨ６.４)中の１〜０Ｍの(ＮＨ4)2ＳＯ4の勾配を適用することにより、５mlのPhenyl Sepharose High Pherformance(Phamacia Biotech)でさらに精製した。全ての分画の分析を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより行った。タンパク質濃度をＢＣＡ(商標)タンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, Illinois, USA)により計測した。
【００９０】
免疫化及びマウスＩｇＧの精製
３０匹のＢＡＬＢｃ/ＣＦ１マウス(27)の雌マウス(7〜10週齢)をランダムに３群に割り当てた。２群を尻尾の付け根に皮下注射で２０μgのＧＬＵＲＰ27-500−ＭＳＰ３212-380ハイブリッド(ｇｒ７)、又は１５μgのＧＬＵＲＰ25-512と５μｇのＭＳＰ３212-380(ｇｒ８)の混合液でそれぞれ免疫化した。三番目の群(ｇｒ９)は、１５μｇのＧＬＵＲＰ25-512を尻尾の付け根に注射され、そして５μｇのＭＳＰ３212-380を肩に注射された。全ての免疫原をMontanide(商標)で乳化し、そして各マウスを2週間の間隔で３回注射し、そして０、１４、２８、及び３５日目に採血した。群ｇｒ７、８、及び９の動物から３５日目に採取した貯蔵血清サンプル及び貯蔵された０日目サンプルから全ＩｇＧを、(ＮＨ4)2ＳＯ4沈殿により精製し、そして続いてＤＥＡＥカラム上で精製した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡ及び血清サンプル
酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を以前に詳細に記載されるとおりに行った(５４)。ＧＬＵＲＰ25-512、ＭＳＰ３212-380、及びＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380の被膜濃度は、それぞれ０.５、１.０、及び０.５μｇ/ｍｌであった。マラリアに臨床的に免疫化されたリベリア人成人からの血漿、又はマラリアに晒されたことのないデンマーク人ドナーの血漿(５１)、及びマウスの血漿の段階希釈を、各抗原で被膜されたＥＬＩＳＡプレート上で試験した。そして吸光度を血漿希釈度に対してプロットした。異なる血漿サンプルにおいて、抗ハイブリッド抗体応答と抗ＧＬＵＲＰ抗体及び抗ＭＳＰ３抗体応答のそれぞれを比較するために、抗体タイターを曲線の平行部分においてＡ４９２＝１０００の吸光度をあたえる血漿希釈度として定義した。
【００９２】
競合ＥＬＩＳＡアッセイ
組換えＧＬＵＲＰ25-518及びＭＳＰ３212-380並びにそれら二つの抗原の混合体を、様々な濃度(３.２×１０-5μｇ/ｍｌ〜１００μｇ/ｍｌ)でＰＢＳ中の１.２５％(ｗ/ｖ)ミルク粉末液に希釈されたＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッドで免疫化されたマウスの貯蔵血漿に加えた。使用される血漿希釈液を約２５００の吸光度(Ａ４９２)を与えるように調節した。抗原-抗体混合体を４℃で一晩インキュベーションし、そして続いてＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッドで被膜したＥＬＩＳＡプレートに対する反応性を測定した。
【００９３】
間接免疫蛍光抗体(ＩＦＡ)試験.
ＩＦＡを以前に報告されるように行った(５)。簡潔に説明すると、Ｐ.ファルシパルムＮＦ５４のシゾント期を主に含む薄いＲＢＣフイルムを、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳｐＨ７.４)中に段階希釈された精製マウスＩｇＧを３０分間、３７℃で湿箱中でインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後に、ＰＢＳ中に１：３００希釈されたマウス抗体をＡＬＥＸＡ・Ｆｌｕｏｒ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ(Molecular probe,USA)に晒した。洗浄した後にスライドをＵＶ光の元で試験した。指標タイターは、目に見える免疫蛍光を産生する抗体の最大希釈度であった。
【００９４】
ＧＬＵＲＰ及びＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３のＲＰ−ＨＰＬＣ分析
タンパク質Ｃ４カラム(ＶＹＤＡＣ(商標)、214TP54、USA)を使用して、ＨＰＬＣシステム(Phamacia, Sweden)上でサンプルを分析した。分析をアセトニトリル：Ｈ2Ｏ：ＴＦＡ緩衝液システム中で行った。精製されたサンプルを１：２のＡ-緩衝液(Ｈ2Ｏ+０.１％(ｗ/ｖ)ＴＦＡ)中に希釈し、そしてカラムにアプライし、直線的勾配０〜８０％のＢ緩衝液(８０％アセトニトリル+０.１％(ｗ/ｖ)ＴＦＡ)カラム体積の２０倍を使用して、溶出を行った。溶出をＵＶ-Ａｂｓ.２１４mmによりモニターした。ピークを集め、そしてHetoVac(Heto,Denmark)で吸引して乾燥し、そして次の実験まで４℃に維持した。
【００９５】
Ｍａｌｄｉ-Ｔｏｆ・ＭＳ及びＥＳ-ＭＳ
ペプチド・マス・マッピング用のサンプルを、クマシー染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルから切り出した。基本的に記載(４４)されたとおりに、バンドの半分(約１μｇのタンパク質)を洗浄し、乾燥し、還元し、そしてヨードアセトアミドでアルキル化し、その後に改変トリプシン(Promega,USA)により一晩切断した。切断後の液の上清を、Poros２０R２逆相物質(PerSeptive,USA)で一杯にしたGELoader Tips(Eppendorff, Germany)にアプライし、そして０.８μlのα-シアノヒドロキシケイ酸(７０％アセトニトリル/３０％水中２０μg/μl)を直接ＭＡＬＤＩ標的に溶出した(２８)。レフレクター・モードで行われるPerSeptive Voyager STR(PerSeptive, USA)上で分析を行ない、そして結果をＧＰＭＡＷ ｖｅｒ.５.０２(Lighthouse data, Denmark)において分析した。
ＲＰ−ＨＰＬＣからの分画(約２０μｇタンパク質)について無処理タンパク質熱スプレー質量分析を行った。サンプルを乾燥し、そして５％ギ酸に２０ｐmol/μlの濃度に再溶解し、その後にナノスプレー源を使用してマイクロマスＱＴＯＦ(Micromass,UK)で分析した。
【００９６】
実施例２：Ｌ.ラクチスにおけるｇｌｕｒｐ及びＭＳＰ３の発現
ｇｌｕｒｐ79-1500及びＭＳＰ３628-1140領域をコードするＰＣＲ断片は並べてクローン化し、それによりベクターによりコードされるシグナル・ペプチドとＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380融合タンパク質との間でインフレーム融合(ｐＫＢＲ１１、図１)を作り出す。このハイブリッドは、これらのｇｌｕｒｐとＭＳＰ３断片を結合することにより作られる２個の追加のアミノ酸残基を含む。比較のために、個々のｇｌｕｒｐ73-1542とＭＳＰ３628-1140断片はまたクローン化される(ｐＫＢＲ８及びｐＫＢＲ１０、図１)。プラスミドをＬ.ラクチスＭＧ１３６３中に形質転換し、そして得られた株を材料と方法において記載されるように発酵器中で成長させた。成長培地のｐＨを６に維持して、Ｐ１７０プロモーターからの最適の転写を達成した(３３)。全ての３の組換えタンパク質を、培養上清中に分泌し、ここでＨｉＴｒａｐＱ及びＳＰセファロース・カラム上の連続的イオン交換により精製し、続いて、フェニルセファロース上の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った。続いて、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、プラスミドｐＫＢＲ１１(レーン１)、ｐＫＢＲ８(レーン２)、及びｐＫＢＲ１０(レーン３)が１３６、１００、及び３６ｋＤａの主要生成物をそれぞれ産生することが示された(図２Ａ)。さらなる低分子量バンドが、精製されたＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３標品ひおいて観察された。免疫ブロッティングにより分析されるとき、レーン２及び３における小さい生成物は、全長生成物と同様に、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３に対する抗体により特異的に認識され、それらはｍＲＮＡの不完全な翻訳からもたらされるか、及び/又はもとのタンパク質生成物をプロテアーゼが分解することによりもたらされるということが示唆された。ＳＤＳ-ＰＡＧＥで精製されたレーン２のバンドをＭＡＬＤＩ・ＭＳトリプシン・ペプチドマッピングすることにより、この低分子量タンパク質が、ＧＬＵＲＰ25-514からもたらされたということが確認された(データ未掲載)。ＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380及びＧＬＵＲＰ25-514標本の純度を、材料と方法において記載されるＨＰＬＣにより評価した。ＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380及びＧＬＵＲＰ25-514は、単一主要ピークを与えた(図２Ｂ)。ＥＳＭＳにより測定すると、ＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380及びＧＬＵＲＰ25-514の分子量は、それぞれ７４９５０と５６５１８Ｄａ(±２０Ｄａ)であった。２個の組換えタンパク質は各々、ベクターがコードするＮ末端に結合するアミノ酸残基、Ａ−Ｅ−Ｒ−Ｓを含む(図１)と仮定すると、これらの分子量は、推定値７４９３９と５６５１８とよく一致する。こうして、ＧＬＵＲＰ27-500-ＭＳＰ３212-380、及びＧＬＵＲＰ25-514の組換えタンパク質は、無傷であり、予測されたアミノ酸残基を含む。
【００９７】
実施例３：Ｌ.ラクチス中に産生されるＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３の抗原性
組換えタンパク質の抗原性は、マラリアに対し臨床的に免疫化されたリベリア人の７１成人からの血漿に対して評価された(図３)。血漿サンプルの段階希釈は、各組換えタンパク質でコートされた分離されているプレート上で試験され、そして抗原-特異的タイターを、１０００の吸光度を与える希釈度として定義した。予想されたように、異なる血漿は、異なる量のＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３特異的ＩｇＧ抗体を含んだ(図３Ａ)。一般的に、ハイブリッド-特異的抗体タイターは、ＧＬＵＲＰ25-514及びＭＳＰ３抗原各々で記録された抗体タイターを超えており(図３Ｂ及びＣ)、ハイブリッド分子がＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３抗原決定因子をそれぞれ適切に提示するということを示している。
【００９８】
実施例４：組換えＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３生成物の免疫原性
ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド分子が、ＧＬＵＲＰ25-514とＭＳＰ３212-380の個々の混合体と比較して、優れた免疫原であるかを決定するために、ＢＡＬＢｃ/ＣＦ１マウスの群をモンタニド中のハイブリッド分子で皮下的に免疫化するか、或いはＧＬＵＲＰ25-514とＭＳＰ３212-380を１のシリンジ内で混合して免疫化するか若しくは２の異なる部位において別々に注射することにより免疫化した。三回目の注射の後に、３５日目の血清をＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３それぞれに対するＩｇＧ抗体反応性について試験した。ＧＬＵＲＰ-ＥＬＩＳＡタイターの平均が、ハイブリッド群において、他の２つの群に比べてわずかに高かった一方、ＭＳＰ３-ＥＬＩＳＡタイターの平均は、ハイブリッドを受けた群において、ＭＳＰ３212-380とＧＬＵＲＰ25-514を二つの異なる部位で受けた群と比較(図４Ａの群７と群９との比較)して、４.３倍高かった(Kruskal Wallis検定、Ｐ＜０.００４)。個々のレベルでは、ハイブリッドで免疫化されたマウスは、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３ドメインの両方に強く反応する一方で、二つの分子を組み合わせて免疫化されたマウスは、ＧＬＵＲＰ又はＭＳＰ３のいずれかに対する優勢な抗体応答を高める傾向がある。抗−ハイブリッドＩｇＧ抗体は、ヒト抗体の周知のエピトープを含むＰ３、Ｐ４、Ｐ１１、及びＳ３ペプチドに主に向けられているが(５１)、そうしたエピトープを含まないペプチドＰ５とＰ９もまた認識される(図４Ｂ)。ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３特異的ＩｇＧサブクラスの特性が、全てのワクチン製剤に類似している(図４Ｃ)一方で、ＧＬＵＲＰ特異的ＩｇＧ抗体は、カッパー軽鎖を使用する傾向があり、そしてＭＳＰ３特異的ＩｇＧ抗体は、ラムダ軽鎖を使用する傾向がある。この軽鎖の違いは、ハイブリッドで生じていようと個々の分子の混合体に対して生じていようと、全てのＧＬＵＲＰ又はＭＳＰ−３特異的抗体について見つかっている。
ハイブリッドに対するマウス抗体の特異性は、競合−ＥＬＩＳＡにより分析された(図５)。ハイブリッドに対する抗体は、純粋にＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３に特異的であるようだ。なぜなら、溶解性のＧＬＵＲＰ25-514とＭＳＰ３212-380の混合体が、完全に抗−ハイブリッド抗体の、固定ＧＬＵＲＰ27-500−ＭＳＰ３212-380に対する結合を完全に阻害できるからである。こうして、ＧＬＵＲＰ−ＭＳＰ３ハイブリッド分子のコンストラクトは、重なり合っている部位において新しいＢ細胞エピトープを作らなかった。
【００９９】
実施例５：マウス抗ＧＬＵＲＰ及び抗ＭＳＰ３血清の未変性ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３との反応性
組換えＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３の免疫原性は、原虫誘導タンパク質を３種の組換えタンパク質、つまりハイブリッド、ＧＬＵＲＰ25-514、及びＭＳＰ３212-380それぞれで免疫化されたマウスからの血清で免疫ブロッティングすることにより、調べられた。図６において示されるように、ＧＬＵＲＰ25-514、ＭＳＰ３212-380、及びハイブリッドで免疫化されたマウス由来の血漿は、約２２００００Ｄａ(レーン１)、４８０００Ｄａ(レーン２)、及びその両方(レーン３)のポリペプチドをそれぞれ認識した。
【０１００】
実施例６：合成ペプチドに従って作られたＧＬＵＲＰとＭＳＰ３との間の抗原競合
免疫原
使用されるＭＳＰ３とＧＬＵＲＰ領域は、合成ペプチドに従って作られた：
【化１】
0004573773.tif 000003
【０１０１】
免疫化
２０匹のＢＡＬＢｃ雌マウス(７〜１０週齢)を、ランダムに４の群に割り当て、そしてＭＳＰ３とＧＬＵＲＰの異なる組み合わせで皮下注射することにより免疫化した。
１.  群１１０を５μｇのＬＲ５５で免疫化した。
２.  群１１１を５μｇのＬＲ６７で免疫化した。
３.  尻尾の付け根に皮下注射することにより、群１１２を５μｇのＬＲ５５と５μｇのＬＲ６７の混合体で免疫化した。
４.  群１１３に尻尾の付け根で５μｇのＬＲ５５を与え、そして５μｇのＬＲ６７を肩に注射した。
全ての免疫原をモンタニドＩＳＡ７２０中に乳濁化し、そして各々のマウスは、３回の注射を２週間の間隔で受けて、そして０、１４、２８、及び３５日で採血された。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ
３５日目の血漿サンプルの段階希釈液を、それぞれ０.５μｇ／ｍｌのＬＲ５５又はＬＲ６７でコーとしたＥＬＩＳＡプレート上で試験し、そして吸光度を、血漿希釈度に対してプロットした。抗体タイターを曲線の平行部においてＡ４９２＝１.００の吸光度をあたえる血漿希釈度として定義した。
【０１０３】
結果
合成ペプチドに従って作られたＭＳＰ３とＧＬＵＲＰの混合体に対するバランスのとれた免疫応答を得るために適しているかどうかを確かめるために、ＢＡＬＢｃマウスの４群を、それぞれ皮下注射で１)ＬＲ５５(ｇｒ１１０)、２)ＬＲ６７(ｇｒ１１１)、３)ＬＲ５５とＬＲ６７を１のシリンジ内で混ぜ合わせたもの(ｇｒ１１２)、或いは４)ＬＲ５５とＬＲ６７を離れた二つの部位に注射する(ｇｒ１１３)。血清を最初の注射から３５日後に集め、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３それぞれに対する抗体応答性を試験した。ＬＲ５５又はＬＲ６７のみで免疫化されたマウスはそれぞれ、ＬＲ５５又はＬＲ６７のいずれかに強く反応した(図７(ａ)及び７(ｂ))。同様に、異なる部位に注射されて二つの分子で免疫化されたマウスは、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３ドメインの両方に強く反応した(図７(ｄ))、一方、１のシリンジ中の２個の分子の組合せで免疫化されたマウスは、ＬＲ５５に対してのみ反応した(図７(ｃ)。
この結果は、ＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３の個々の生成物の混合体が、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３との間の抗原競合を起こすことなく、一のワクチン製剤において投与することができないということを強く支持する。
【０１０４】
参考文献
【表２】
0004573773.tif 000004
【表３】
0004573773.tif 000005
【表４】
0004573773.tif 000006
【表５】
0004573773.tif 000007
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ｐｆｐＰＳＭ１０１３及びｐＡＭＪ３２８、並びにＬ.ラクチスに使用される発現コンストラクトの模式図。文字で表される制限酵素部位をコードするベクターの位置、プロモーターＰ１７０、シャイン-ダルガルノ配列(ＳＤ)、及び３１０ｍｕｔ２シグナルペプチドが表される。シグナルペプチドは、アミノ酸番号３２と３３の間で切断されることが予測され、そうして成熟組換えタンパク質のＮ末端中にＡｌａ-Ｇｌｕ残基を残す。ｇｌｕｒｐ及びＭＳＰ３のヌクレオチド番号は、Ｍ５９７０６及びＬ０７９４４それぞれのＡＴＧコドンのＡに対するものである。
【図２ａ】(Ａ) Ｌ.ラクチスＭＧ１３６３中に産生され、精製されたＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ融合タンパク質(レーン１)、ＧＬＵＲＰ25-514(レーン２)、及びＭＳＰ３212-380(レーン３)のクマシーブルーで染色された１２.５％ポリアクリルアミドゲル。(Ｂ)ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッドタンパク質、及びＧＬＵＲＰ25-514のそれぞれのＣ４カラム上のＨＰＬＣ分析。分子量マーカーの大きさ(キロダルトン)が示される。
【図２ｂ】(Ｃ)ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッドとＧＬＵＲＰ25-514の推定のアミノ酸配列及びペプチドマッピング。ＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３の最初の４個のアミノ酸配列(Ａｌａ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｓｅｒ)は、クローニング・ベクターｐＳＭ１０１３由来である。ペプチド・マス・マッピングのサンプルは、クマシー染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルから切り出された。基本的に(４４)に記載されるように、バンドの半分(約１μｇのタンパク質)を洗浄し、乾燥し、還元し、そしてヨードアセトアミドでアルキル化し、その後、改変トリプシン(Promega、USA)により一晩切断させた。切断後の液の上清を、Poros２０R２逆相物質(PerSeptive,USA)で一杯にしたGELoader Tips(Eppendorff, Germany)にアプライし、そして０.８μlのα-シアノヒドロキシケイ酸(７０％アセトニトリル/３０％水中２０μg/μl)を直接ＭＡＬＤＩ標的に溶出した(２８)。リフレクトモードのPerSpective Voyager STR(PerSpective, USA)上で分析を行ない、そして結果をGPMAW ver.５.０２(Lighthouse data、Denmark)において分析した。MALDI-TOFスペクトルにおいてペプチドによりカバーされる配列に、下線をひき、そして配列の全カバー割合を示した。
【図３】マラリアに臨床的に免疫化された成人リベリア人からの７１の血漿サンプルにおいて、抗原由来のＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３のペアに応答するＩｇＧ抗体のパターン。相関係数及びＰ値は、各パネルにおいて提供される。
【図４】マウスにおける抗体応答。１０匹のマウスの群を、ハイブリッド(ｇｒ７)、一つのシリンジ中のＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の混合体(ｇｒ８)、又は異なる部位において異なるシリンジ中のＧＬＵＲＰとＭＳＰ３で免疫化した。(Ａ)３５日目の血漿サンプルを、ＧＬＵＲＰ25-514又はＭＳＰ３212-3でコートされたＥＬＩＳＡプレート上で抗体反応性について試験した。ボックス・プロットは、２５％と７５％の中央値を示した。そして僅差は、データーの範囲を示した。(Ｂ)ＧＬＵＲＰ・Ｂ細胞エピトープを提示する８個のペプチドでのマウス血清の累積応答(５１)。(Ｃ)結果がパネルＡで表されるマウスのアイソタイプ応答。棒グラフの各々は、ＧＬＵＲＰ-特異的ＥＬＩＳＡ及びＭＳＰ３-特異的ＥＬＩＳＡの平均吸光度(±ＳＥＭ)を表す。
【図５】ハイブリッドは、Ｂ細胞エピトープ由来のＧＬＵＲＰ及びＭＳＰ３のみを含む。ハイブリッドで免疫化されたマウスからの血清プールは、ＧＬＵＲＰ、ＭＳＰ３、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の混合体、又はハイブリッドで適切な濃度で前以ってインキュベーションされ、その後に、ハイブリッドでコートされたＥＬＩＳＡに加えられた。ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３の混合液でインキュベーションする前に、ハイブリッドは、ハイブリッドに結合するＩｇ抗体により完全に阻害された。
【図６】Ｐ.ファルシパルムＮＦ５４の免疫ブロット分析。全細胞抽出液を、７.５％ポリアクリルアミド・ゲル上で分離し、そしてＧＬＵＲＰ25-514(レーン１)、ＭＳＰ212-380(レーン２)、及びＧＬＵＲＰ-ＭＳＰ３ハイブリッド(レーン３)で免疫化したマウス由来の血漿で免疫ブロッティングを行った。分子量マーカーの大きさ(キロダルトン)を示した。
【図７】合成ペプチドに従って作られたＭＳＰ３とＧＬＵＲＰの混合体に対するバランスのとれた免疫応答を得るために適しているかどうかを確かめるために、ＢＡＬＢｃマウスの４群を、それぞれ皮下注射で１)ＬＲ５５(ｇｒ１１０)、２)ＬＲ６７(ｇｒ１１１)、３)ＬＲ５５とＬＲ６７を１のシリンジ内で混ぜ合わせたもの(ｇｒ１１２)、或いは４)ＬＲ５５とＬＲ６７を離れた二つの部位に注射する(ｇｒ１１３)。血清を最初の注射から３５日後に集め、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３それぞれに対する抗体応答性を試験した。ＬＲ５５又はＬＲ６７のみで免疫化されたマウスはそれぞれ、ＬＲ５５又はＬＲ６７のいずれかに強く反応した(図７(ａ)及び７(ｂ))。同様に、異なる部位に注射されて二つの分子で免疫化されたマウスは、ＧＬＵＲＰとＭＳＰ３ドメインの両方に強く反応した(図７(ｄ))、一方、１のシリンジ中の２個の分子の組合せで免疫化されたマウスは、ＬＲ５５に対してのみ反応した(図７(ｃ)。
【図１】
0004573773.tif 000009
【図２ａ】
0004573773.tif 000010
【図２ｂ】
0004573773.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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