(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属し、微生物の菌体にＴＮＦ産生誘導活性を有し、かつ、微生物の培養液中にリステリア・モノサイトゲネスに対して生育抑制作用を有する抗菌性物質を産生することを特徴とする、新規微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する新規微生物及び該新規微生物による物質に関し、詳細には、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物と、その新規微生物の菌体によるＴＮＦ誘導活性物質と、その新規微生物が産生する抗菌性物質とに関する。
【０００３】
本発明に係る新規微生物の菌体によるＴＮＦ誘導活性物質は、制癌効果を有する物質として利用できる。
【０００４】
また、本発明に係る新規微生物が産生する抗菌性物質は、本発明に係る新規微生物の菌体培養時に培地中等に産生するもので、リステリア症の原因となる病原菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して生育抑制作用を有し、リステリア症の発生を防ぐために利用できる。
【０００５】
【従来の技術】
【０００６】
ＴＮＦとは、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）の略称であり、体内に於て乳酸菌等の微生物が入ったとき、それを抗原として免疫を担う細胞マクロファージより誘導分泌されるタンパク質サイトカインの一つであり、癌の壊死を引き起こす因子が含まれている。
【０００７】
従来、ＴＮＦ誘導活性を有する菌については、ストレプトコッカス  パイオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ），ラクトバチルス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ），ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）等が知られ、これらの菌体によるＴＮＦ誘導活性物質が知られている。
【０００８】
一方、リステリア症は、致命率の高い（１５〜３３％）疾病であり、原因菌であるリステリア・モノサイトゲネスは低温でも増殖をする特徴をもち、食品衛生上、最も注目される菌の一つである。
【０００９】
該リステリア症は、リステリア・モノサイトゲネスに汚染された植物、肉、動物を介して経気道、経口、接触感染し、新生児、乳児及び免疫力の低下したものに感染し、髄膜炎や敗血症を起こすものである。
【００１０】
１９８０年代に入り、欧州諸国でチーズ等の食品を感染源とする人の集団リステリア症が相次ぎ、人におけるリステリア症が食品媒介感染症の一つであることが明らかとなった。
【００１１】
その後もリステリア症については、イギリスでミートパテやフランクフルターなど食肉が感染源と思われる事例がいくつか報告されている。
【００１２】
従来、リステリア・モノサイトゲネスに対して生育抑制作用を有する抗菌性物質を産生するものとしては、ペディオコッカス・アシヂラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、及び人や動物の腸内の常在菌である腸内の有害菌を抑える働きを持つエンテロコッカス属に属する微生物が知られており、該微生物による抗菌性物質が知られている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、従来は、ＴＮＦ誘導活性物質の基になる微生物と、抗菌性物質を産生する微生物が異なり、ＴＮＦ誘導活性物質の基になり、かつ、抗菌性物質を産生する微生物は知られていない。
【００１５】
即ち、微生物の菌体にＴＮＦ産生誘導活性を有し、かつ、微生物の培養液中にリステリア・モノサイトゲネスに対して生育抑制作用を有する抗菌性物質を産生するものは未だ見いだされていない。
【００１６】
そのため、従来は、抗腫瘍活性物質及び抗菌性物質を得るためには、個々の微生物が必要であり、抗腫瘍活性物質の製造に於て副生する培養液や、抗菌性物質の生産に於て副生する菌体は利用できず、廃棄処理する必要があった。
【００１７】
従って、本発明は、ＴＮＦ誘導活性物質、抗菌性物質の両者の製造に利用でき、その生産物全てを有効利用できる新規微生物を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、抗腫瘍活性物質及び抗菌性物質を同時に生産する菌株であれば複数の用途に利用でき、また、抗腫瘍活性物質を有する菌体と抗菌性物質を含む培養液を別々に利用する場合にも菌体、培養液共に廃棄物とならずコストの削減になると考え、両条件を満足する菌の検索を行い、エンテロコッカス属に属する新規微生物エンテロコッカス  フェシウム  Ｓ１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ｓ１）が、ＴＮＦ産生誘導活性、抗菌性物質産生能力、共に満足できるものであることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明の課題を解決するための手段は、下記の通りである。
【００２１】
第１に、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物。
第２に、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物の菌体によるＴＮＦ誘導活性物質。
第３に、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物が産生する抗菌性物質。
【００２２】
なお、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物が産生する抗菌性物質には、該新規微生物が産生する抗菌性物質含有物も含まれる。
【００２３】
このような抗菌性物質含有物としては、培養した培地、即ち培養液、培養上清等をあげることができる。
【００２４】
上記の受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９１８として寄託されているエンテロコッカス属に属する新規微生物（以下、ＥＦ−Ｓ１という）は、平成８年（１９９６年）１０月２５日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、次の菌学的性質を有するものである。
【００２５】
（１）形態
【００２６】
・菌の大きさは０．６〜１．２μｍで数個から十数個が連なる連鎖球菌である。
・グラム陽性で非運動性、非胞子形成菌である。
・多形成はなく、色素形成をしない。
【００２７】
（２）生理学的性質
【００２８】
・アンモニアの生成：＋
・０．１％メチレンブルーミルクの還元：＋
・チロシンの脱炭酸：＋
・テトラゾリウムの還元：＋
・カタラーゼの生成：−
・生育温度  １０℃：＋，４５℃：＋
・６．５％ＮａＣｌ耐性：＋
・ｐＨ９．６耐性：＋
・ＶＰテスト：＋
・レバン生成：−
・ゼラチン液化能：−
・リトマスミルクの凝固：＋
・糖の資化性
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−リボース：＋
Ｄ−キシロース：＋
グルコネイト：＋
グルコース：＋
フラクトース：＋
ガラクトース：＋
マンノース：＋
ラムノース：＋
セロビオース：＋
ラクトース：＋
マルトース：＋
メリビオース：−
シュクロース：＋
ラフィノース：−
サリシン：＋
トレハロース：＋
メレジトース：−
マンニトール：＋
ソルビトール：−
スターチ：−
・分離源：子牛の腸内
【００２９】
これらの結果を元に、ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ２（１９９２）で照会したところ、ＥＦ−Ｓ１は、他の既知の菌株の性状との比較、あるいは後に述べるＥＦ−Ｓ１のＴＮＦ誘導活性及び培養して得られる抗菌性物質の指示菌株に対する抗菌スペクトル等の違いからも、新規な菌株であると考えられた。
【００３０】
この新規な菌株であるＥＦ−Ｓ１を培養し、分離した菌体はＴＮＦ誘導活性物質を有した。
【００３１】
また、その培養液を硫安塩析した沈殿より、新規な抗菌性物質が得られた。
【００３２】
この抗菌性物質は、ポリペプチドまたはこれらを複合する複合体であることが確認された。
【００３３】
上記の抗菌性物質について、供試菌株を０．０４％接種したＮｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ社製）、または、ＭＲＳ  ａｇａｒ（ＯＸＯＩＤ社製）を分注した平板培地に直径５ミリの孔を切り、上記の硫安塩析沈殿物を２０μｌずつ分注し、それぞれ供試菌株の最適温度で培養し、孔の周囲に生じた阻止円の直径を測定することで、抗菌スペクトルの試験を行った。
【００３４】
この抗菌スペクトルの試験の結果を、表１，表２に示す。
【００３５】
【表１】
0004458559.tif 000002
【００３６】
【表２】
0004458559.tif 000003
【００３７】
表１，表２から分かるように、本発明に係る抗菌性物質は、グラム陽性菌に対してのみ抗菌活性を示し、狭い阻害スペクトルを示すことから、典型的なバクテリオシンの特徴を表している。
【００３８】
また、上記の抗菌スペクトルの試験の際の硫安塩析沈殿物について、熱安定性、及び各種酵素に対する感受性を測定した。
【００３９】
なお、熱安定性、及び各種酵素に対する感受性試験は、次の方法により実施した。
【００４０】
（１）熱安定性試験
【００４１】
上記の硫安塩析沈殿物を蒸留水に溶解し、沸騰水中で３０分加熱し、冷却後上記の方法でエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１３３９８を検定菌として試験し、阻止円の形成の有無により感受性の陽性、陰性を測定した。
【００４２】
（２）酵素に対する感受性試験
【００４３】
上記の硫安塩析沈殿物を蒸留水に溶解し、各種酵素を０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６時間反応させた。エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１３３９８を検定菌として上記の方法で阻止円の形成の有無により感受性の陽性、陰性を測定した。
【００４４】
熱安定性、及び各種酵素に対する感受性試験の結果を、表３に示す。
【００４５】
【表３】
0004458559.tif 000004
【００４６】
表３より、ＥＦ−Ｓ１の産生する抗菌性物質は、耐熱性があり、プロテアーゼ、トリプシンに対して感受性があるが、ペプシン非感受性であることがわかる。
【００４７】
本発明に係る抗菌性物質は、上記した方法によって得ることができ、またポリペプチドまたはその複合体であって、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ、Ｐｒｏｎａｓｅ、Ｐａｐａｉｎ、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ  ＮＦ、Ｔｒｉｐｓｉｎで消化されず、１００℃で３０分加熱しても安定性を示すものである。
【００４８】
本発明に係る新規微生物であるＥＦ−Ｓ１とその新規微生物が産生する抗菌性物質、及び、抗菌性物質含有物は、食品の保存、特に低温でのリステリア・モノサイトゲネスの生育を抑制することに使用できる他に、家畜等への生菌剤などに使用できる。
【００４９】
【実施例１】
【００５０】
培地として、ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ（ＯＸＯＩＤ社製）を用い、本発明に係るＥＦ−Ｓ１の前培養液を２％接種し、３０℃で１６時間培養した。
培養後、遠心分離（８０００ｒｐｍ）により菌体と培養液とを分離した。
菌体は、培養液を取り除く目的で洗浄した後に殺菌（１０５℃，３０分間）を行い、凍結乾燥した。
得られた乾燥菌体は、培養液１リットルあたり２．８２ｇ、ＴＮＦ誘導活性が２．３６Ｕ／ｍｌ±０．４０（ｎ＝３）であり、ＴＮＦ誘導活性に優れたＴＮＦ誘導活性物質であった。
また、培養液は有機酸による影響を取り除くため、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一晩透析を行い、抗菌性物質を得た。
抗菌性物質を含有する透析膜内液は、１ｍｌあたり２２００ＡＵの抗菌活性を示した。
なお、ＡＵとは、透析膜内液を希釈し抗菌スペクトルと同じ方法で抗菌活性を測定した際の阻止円を生じる最大希釈率とした。
【００５１】
【試験例１】
【００５２】
上記実施例１で得たＴＮＦ誘導活性物質について、本発明に係るＥＦ−Ｓ１によって誘導されたＴＮＦ（腫瘍壊死因子）誘導活性測定値を、市販品であるピシバニール（中外製薬製）と比較した。
なお、測定値はＣａｒｓｗｅｌｌ等の方法による。
その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
0004458559.tif 000005
【００５４】
表４より、ＥＦ−Ｓ１の有するＴＮＦ誘導活性はピシバニールの約１．２５倍であり、菌体をＴＮＦ誘導活性物質として利用できることがわかる。
【００５５】
【試験例２】
【００５６】
本発明に係る抗菌性物質について、ＥＦ−Ｓ１の培養時間と抗菌活性の関係を調べた。
【００５７】
そして、図１に、ＥＦ−Ｓ１の増殖曲線と抗菌性物質の生産性の関係を表した。
図１によると、抗菌活性は培養後１２時間まで急激に上昇し、２０時間まで最高値の活性を保った。
これは菌数の上昇とほぼ同じ傾向を示している。
【００５８】
【試験例３】
【００５９】
ＭＲＳ０．２寒天培地（ペプトン１．０％，肉エキス０．８％，酵母エキス０．４％，グルコース０．２％，ツイーン８０  ０．１％，リン酸水素２カリウム０．２％，酢酸ナトリウム０．５％，クエン酸アンモニウム０．２％，硫酸マグネシウム０．０２％，硫酸マンガン０．００５％，寒天１．５％  ｐＨ７．４）を１２１℃で１５分間滅菌し、６０℃に冷却後、滅菌シャーレに１０ｍｌずつ分注し、冷却し固化させ平板培地とした。
ＭＲＳ０．２ソフト培地（上記ＭＲＳ０．２寒天培地の寒天含有量を０．７％としたもの）を１２１℃で１５分間滅菌し、５５℃に冷却し、リステリア・モノサイトゲネスＹ−４，Ｙ−７，Ｙ−１４，Ｙ−１７を３７℃で一晩培養した培養液を０．７％加えて上記のＭＲＳ０．２寒天培地の上に重層し冷却し固化した。
この上に直径７ミリの孔を切り、実施例１にあげた透析膜内液２５μｌを接種し、３０℃で一晩培養し、生育阻止円の直径を測定した。
その結果、リステリア・モノサイトゲネス４株とも直径２０ミリ以上の大きな阻止円を形成した。
【００６０】
【発明の効果】
【００６１】
本発明によれば、菌体に強いＴＮＦ誘導活性物質を有し、リステリア・モノサイトゲネスに対し、生育抑制作用のある抗菌性物質を産生する新規微生物を提供することができる。
【００６２】
即ち、本発明によれば、ＴＮＦ誘導活性物質、抗菌性物質の両者の製造に利用でき、その生産物全てを有効利用できる新規微生物を提供することができる。
【００６３】
本発明に係るポリペプタイドまたはその複合体からなる抗菌性物質は、リステリア症の原因となる人畜共通の病原菌であるリステリア・モノサイトゲネスに対して強い抗菌性を示し、耐熱性を有し、リステリア症予防に効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る抗菌性物質について、ＥＦ−Ｓ１の増殖曲線と抗菌性物質の生産性の関係を表すグラフ
【図１】
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