(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FcγRIIAと結合するよりも少なくとも１０倍大きい親和性でFcγRIIBの細胞外ドメインと特異的に結合する可変領域を含む単離されたIgG 抗体であって、当該可変領域がヒト細胞の表面に内在的に発現するFcγRIIBと特異的に結合する上記抗体、または当該可変領域を含むそのフラグメント。
【請求項２】
Ig-FcのFcγRIIBとの結合をブロックする、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における下流シグナル伝達分子の活性を抑制する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における下流シグナル伝達分子の活性、または抗体依存性細胞応答を増強する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、Ｂ細胞受容体を介するシグナル伝達を活性化するか、またはFcεRIにより誘導される肥満細胞活性化を抑制する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、ATCC受託番号がPTA-4591であるクローン2B6により産生される抗体またはATCC受託番号がPTA-4592であるクローン3H7により産生される抗体とのFcγRIIBの結合に対して競合する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記フラグメントが、F(ab')2フラグメントまたはF(ab)フラグメントである、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体フラグメント。
【請求項９】
前記抗体が、その可変領域がFcγRIIAと結合するより少なくとも100倍大きい親和性でFcγRIIBの細胞外ドメインに結合する、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する第１の重鎖-軽鎖対および腫瘍抗原と特異的に結合する第２の重鎖-軽鎖対を含む、二重特異的抗体である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
前記抗体が、治療薬、細胞毒、または異種ポリペプチドに機能しうる形で連結しており、上記異種ポリペプチドが細胞表面受容体と免疫特異的に結合する抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
前記細胞表面受容体が腫瘍抗原である、請求項１１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
前記抗体のFc域のFcγRに対する親和性を変更する少なくとも一つの改変をFc域にさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
上記Fc域が、野生型Fc域を含む比較しうる抗体がFcγRIIIAに結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAに結合する、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
癌患者の癌を治療するための医薬の製造における、請求項４に記載の治療上有効量の抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１６】
前記使用が、癌患者の癌を治療するための医薬の製造のための、癌抗原に特異的に結合しかつ細胞障害性である第２の抗体との併用であり、上記癌が上記癌抗原によって特徴づけられるものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌抗原がMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、pI5、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルスウイルス-E6、ヒトパピローマウイルスウイルス-E7、またはMUC-1である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記使用が、患者の疾患を治療するための医薬の製造における、細胞死滅によらないで治療効果を媒介する第２の抗体との併用である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記第２の抗体が抗Fas抗体である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
患者のＢ細胞悪性腫瘍を治療するための医薬の製造における、請求項３に記載の治療上有効量の抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
それを必要とする患者の自己免疫障害を治療するための医薬の製造における、請求項３に記載の治療上有効量の抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項２３】
前記自己免疫障害が慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬、またはエリテマトーデスである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
それを必要とする患者のIgEを介するアレルギー障害を治療または予防するための医薬の製造における、請求項３に記載の治療上有効量の抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項２５】
前記IgEを介するアレルギー障害が喘息、アレルギー鼻炎、胃腸アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、または糸球体腎炎である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１に記載の治療上有効量の抗体またはそのフラグメント、およびワクチン組成物の使用であって、上記抗体またはそのフラグメントが、被験者におけるワクチン組成物に対する免疫応答を増強するための医薬組成物の製造において、上記ワクチン組成物に対する上記被験者の免疫応答を増強するのに有効な量である、上記使用。
【請求項２７】
被験者の自己免疫疾患を検査する方法であって、
(a)上記被験者からの生物学的サンプルを請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントの有効な量と接触させるステップ；および
(b)上記抗体またはそのフラグメントの結合を検出し、検出可能なマーカーのバックグラウンドまたは標準レベルを超える検出は上記被験者が自己免疫疾患を有することを示すとするステップを含む上記方法。
【請求項２８】
(i) 治療上有効な量の請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント；および
(ii) 製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
前記抗体またはそのフラグメントが、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における下流シグナル伝達分子の活性、または抗体依存性細胞応答を増強するものであり、
(i) 癌抗原に特異的に結合する細胞傷害抗体；および
(ii) 製薬上許容される担体を含む医薬組成物を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書にその全文が組み入れられる2002年4月14日に出願された米国特許仮出願第60/403,266号の優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するより大きい親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに関する。本発明は、本発明の抗体を投与して治療抗体のエフェクター機能を増強することにより、治療抗体の治療効果を増強する方法を提供する。本発明はまた、本発明の抗体を投与することにより、ワクチン組成物の効力を増強する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
2.1  Fc受容体と免疫系におけるその役割
抗体-抗原複合体の免疫系細胞との相互作用は、広範囲の系列の応答をもたらし、その範囲はエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒、および食作用から、免疫調節シグナル、例えばリンパ球増殖および抗体分泌にまで及ぶ。全てのこれらの相互作用は、抗体または免疫複合体のFcドメインの、造血性細胞上の特定の細胞表面受容体との結合を介して開始される。抗体と免疫複合体がトリガーする細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造的不均一性からもたらされる。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると思われる構造的に関係のあるリガンド結合ドメインを共有する。
【０００４】
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるFc受容体は、免疫グロブリン分子のFc部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Fc受容体の鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Fc受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって定義される。IgGに対するFc受容体はFcγR、IgEに対するFc受容体はFcεR、そしてIgAに対するFc受容体はFCαRと呼ばれる。異なるアクセサリー細胞は異なるアイソタイプの抗体に対するFc受容体を持ち、抗体のアイソタイプが所与の応答にどのアクセサリー細胞が関わるかを決定する（Ravetch J. V.ら 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92；Gerber J. S.ら 2001 Microbes and Infection, 3:131-139；Billadeau D. D.ら 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109):161-1681；Ravetch J. V.ら 2000, Science, 290:84-89；Ravetch J. V.ら, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J. V. 1994, Cell, 78(4):553-60に総括されている）。色々なFc受容体、それを発現する細胞、およびそのアイソタイプ特異性を表１にまとめる（「免疫生物学：健康と病気における免疫系（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease）」, 第4版. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから引用）。
【０００５】
FCγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関係ドメインのC2セットに関係する細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを持つ内在性膜糖タンパク質である。３種の公知のFcγRがあり、それぞれFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）と呼ばれる。３種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる；しかし３種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先から、恐らくは遺伝子複製により生じたことを示唆する。本発明は具体的にFcγRII（CD32）に焦点を合わせる。
【０００６】
FcγRII（CD32）
FcγRIIタンパク質は40KDa内在性膜糖タンパク質であり、モノマーIgに対して低親和性（106M-1）であるので複合したIgGとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含む全ての造血細胞上に存在する最も広く発現されるFcγRである。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖中に２つだけの免疫グロブリン様領域を有し、従って、IgGに対してFcγRIより遥かに低い親和性を有する。３種のヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-A、FcγRII-BおよびFcγRII-C）が存在し、それらは全て凝集体または免疫複合体のIgGと結合する。
【０００７】
FcγRII-AとFcγRII-Bの細胞質内ドメイン内には明確な相違があるので、受容体ライゲーションに対して２つの機能的に異種の応答を創出する。基本的な相違は、A-アイソタイプが細胞活性化、例えば食作用および呼吸バーストに至る細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、B-アイソタイプは抑制的シグナルを開始し、例えばＢ細胞活性化を抑制することにある。
【０００８】
FcγRを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソタイプ間の構造的相違からもたらされる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ITAM）または免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ITIM）が、この異なる応答を説明する。これらの構造へ補給される細胞質酵素の相違が、FcγR媒介細胞の応答結果を規定する。ITAMを含有するFcγR複合体はFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAであるが、ITIMを含有する複合体はFcγRIIBだけである。
【０００９】
ヒト好中球はFcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を経由するFcγRIIAクラスター形成は、ITAMとともにITAMリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼを凝集するのに役立つ。ITAMリン酸化はSykキナーゼとのドッキング部位として役立ち、その活性化は下流の基質（例えば、PI3K）の活性化をもたらす。細胞活性化により前炎症性メディエーターが放出される。
【００１０】
FcγRIIB遺伝子はＢリンパ球上に発現され；その細胞外ドメインはFcγRIIAと96％同一であって、識別できない形でIgG複合体と結合する。FcγRIIBの細胞質ドメイン中のITIMの存在がFcγRの抑制サブクラスを規定する。最近、この抑制の分子的原理が確立された。活性化FcγRと同時にライゲートすると、FcγRIIBのITIMはリン酸化されて、イノシトールポリリン酸5'-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを引き付け、これがホスホイノシトールメッセンジャー（ITAMを含有するFcγRを介するチロシンキナーゼ活性化の結果として放出される）を加水分解し、その結果、細胞内Ca++の流入を抑制する。従って、FcγRIIBの架橋は、FcγRライゲーションに対する活性化応答を消失し、細胞応答性を抑制する。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌が停止する。
【表１】
0004459810.tif 000002
【００１１】
2.2 関連疾患
2.2.1 癌
新生物または腫瘍は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物質であり、良性または悪性でありうる。良性腫瘍は一般的に局在化したまま残る。悪性腫瘍はまとめて癌と名付けられる。用語「悪性」は一般的に、腫瘍が近隣の体構造を侵害かつ破壊し、そして離れた部位まで拡大して死を引き起こしうることを意味する（総括は、RobbinsおよびAngell, 1976, 「基礎病理学（Basic Pathology）」, 第2版, W. B. Saunders Co. , Philadelphia, pp.68-122を参照）。癌は身体の多くの部位に生じうるのであって、その起源に依存して異なる挙動を示す。癌細胞は、その起源となる身体部位を破壊し、次いで他の身体部分に拡大し、そこで新しい増殖を開始してさらに破壊を引き起す。
【００１２】
毎年120万人以上の米国人が癌に罹っている。癌は米国における死因の第２位であり、もし現在の傾向が続くと、癌は2010年には第１の死因になると予想される。肺および前立腺癌が米国における男性の癌死因のトップである。肺および乳癌が米国における女性の癌死因のトップである。米国の男性２人のうちの１人は、人生のある時期に癌と診断されうる。米国の女性３人のうちの１人は、人生のある時期に癌と診断されうる。
【００１３】
癌の治療法はまだ見出されていない。現在の治療選択肢、例えば手術、化学治療および放射線治療は、しばしば効果がないかまたは重症の副作用を示す。
【００１４】
癌治療
現在、癌治療は患者の新生物細胞を根絶する外科手術、化学治療、ホルモン治療および／または放射治療に関わりうる（例えば、Stockdale, 1998, 「癌患者管理の原理（Principles of Cancer Patient Management）」, in Scientific American: Medicine, vol.3, RubensteinおよびFederman, 編、第12章、第IV節を参照）。最近、癌治療はまた、生物学的治療または免疫治療にも関わりうる。これらの手法は全て、患者にとって大きい欠点を有する。例えば、外科手術は、患者の健康によっては禁忌であるかまたは患者に受入れられない。さらに、外科手術は完全に新生物組織を除去することができない。放射治療は、新生物組織が放射線に対して正常組織より高い感受性を有するときにのみ有効であり、かつ放射治療はしばしば厳しい副作用を誘引しうる。ホルモン治療は単独の薬物として投与することは稀であり、たとえ有効でありうるとしても、他の治療法により癌細胞の大部分を除去した後に、癌の再発を予防または遅延するためにしばしば使用される。生物学的治療／免疫治療は数が限られており、発疹もしくは腫脹、発熱、悪寒および疲労を含むインフルエンザ様症候、消化器問題、またはアレルギー反応などの副作用を生じうる。
【００１５】
化学治療については、癌治療に利用しうる様々な化学治療薬が存在する。癌化学治療薬の大部分は、DNA合成を直接、またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成を抑制することにより間接的に抑制して、DNA複製および随伴する細胞分裂を防止することにより作用する（例えば、Gilmanら, 「グッドマンとグリマンの、治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics）」, 第8版（Pergamom Press, New York, 1990）を参照）。これらの薬物はアルキル化薬、例えばニトロソ尿素、抗代謝物、例えばメトトレキセートおよびヒドロキシ尿素、ならびに他の薬物、例えばエトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどを含み、必ずしも細胞周期特異的でないが、DNA複製に対するそれらの効果によってS期に細胞を死滅させる。他の薬物、具体的にはコルヒチンおよびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチンは、微小管アセンブリーを妨害して有糸分裂停止をもたらす。化学治療プロトコルは一般的に、治療効力を増加するために化学治療薬の組み合わせを投与することに関わる。
【００１６】
様々な化学治療薬を利用しうるが、化学治療は多数の欠点を有する（例えば、Stockdale, 1998, 「癌患者管理の原理（Principles Of Cancer Patient Management）」 in 「科学的なアメリカの医薬（Scientific American Medicine）」, vol.3, RubensteinおよびFederman編、第12章、第10節を参照）。ほとんど全ての化学治療薬は毒性があり、化学治療は、厳しい吐気、骨髄抑制、免疫抑制などの顕著な、かつしばしば危険な副作用を起こす。さらに、化学治療薬を組合わせて投与しても多くの腫瘍細胞は化学治療薬に耐性があるかまたは耐性を発現する。実際、治療プロトコルで使用される特定の化学治療薬に耐性のあるこれらの細胞が、特定の処置に使用される薬物の作用機構と異なる機構により作用する他の薬物に対しても耐性のあることがしばしば立証されていて；この現象は多面的薬物または多剤耐性と呼ばれる。このように、薬物耐性があるため、多くの癌は標準の化学治療処置プロトコルに抵抗性のあることが判っている。
【００１７】
代わりの癌治療法、特に標準の癌治療、例えば外科手術、放射治療、化学治療、およびホルモン治療に抵抗性があることが証明されている癌の治療法の必要性は非常に大きい。希望が持てる代替法は免疫治療であり、この方法では癌抗原特異的抗体が癌細胞を特異的に標的とする。免疫応答の特異性を装備することに向けて大きな努力がなされていて、例えばハイブリドーマ技術が腫瘍選択的モノクローナル抗体の開発を可能にしていて（Green M. C.ら, 2000 Cancer Treat Rev., 26:269-286；Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl. 14):43-51を参照）、この数年間、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration）は最初の癌治療用のモノクローナル抗体：非ホジキンリンパ腫用のリツキシン（Rituxin）（抗CD20）および転移性乳癌用のヘルセプチン（Herceptin）［抗(c-erb-2/HER-2)］を認可している(Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res., 3: 86-90)。しかし抗体エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性（「ADCC」）を媒介する能力は、このような治療に対する妨げとなる。このような免疫治療の有効性を改善する方法が、従って必要である。
【００１８】
2.2.2  炎症性疾患と自己免疫疾患
炎症は、身体の白血球と化学品が我々の身体を、外来物質、例えば細菌およびウイルスによる感染から保護するプロセスである。通常、痛み、腫脹、罹患域の熱と赤みを特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学品がこのプロセスを制御し、指定されかつ自己限定的なカスケードで血液または罹患組織中に放出される。この化学品の放出は傷害または感染域への血流を増加し、そして赤みと熱を生じる。化学品のいくらかは組織中への液の漏れを引起して、腫脹をもたらす。この保護プロセスは神経を刺激し、痛みを生じる。これらの変化は、関係領域で限られた期間だけ起こるときは身体の利益に働く。
【００１９】
自己免疫および／または炎症性障害において、免疫系は、戦うべき外来物質が無いと炎症性応答をトリガーし、身体の通常は保護性の免疫系が間違って自身を攻撃することによりそれ自身の組織に障害を与える。多くの色々な自己免疫障害が身体を色々な方法で冒している。例えば、多発性硬化症の個体は脳が冒され、クローン病の個体は腸が冒され、そして慢性関節リウマチの個体は様々な関節の滑膜、骨および軟骨が冒されている。自己免疫障害は１以上のタイプの身体組織の破壊を進めるので、器官の異常な増殖、または器官機能の変化が生じうる。自己免疫障害は、１つの器官もしくは組織だけを冒しうるしまたは複数の器官と組織を冒しうる。自己免疫障害により通常冒される器官および組織としては、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば、甲状腺または膵臓）、筋肉、関節、および皮膚が挙げられる。自己免疫障害の例としては、限定されるものでないが、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫内耳疾患、重症筋無力症、ライター症候群、グレーヴズ病、自己免疫肝炎、家族性腺腫様ポリープ症および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００２０】
慢性関節リウマチ（RA）および若年性慢性関節リウマチは炎症性関節炎である。関節炎は、関節における炎症を記載する一般用語である。全てではないが、いくつかのタイプの関節炎は狙いの間違った炎症の結果起こる。慢性関節リウマチに加えて、炎症に関連する他のタイプの関節炎としては、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎関節炎、および痛風性関節炎が挙げられる。慢性関節リウマチは、身体の両側の関節（例えば、両方の手、手首または膝）で起こる慢性関節炎のタイプである。この対称性が慢性関節リウマチをその他の関節炎から識別するのに役立つ。関節を冒すだけでなく、慢性関節リウマチは時折、皮膚、眼、肺、心臓、血液または神経を冒しうる。
【００２１】
慢性関節リウマチは、世界の人口の約1％を冒し、そして潜在的に障害を与えている。米国における慢性関節リウマチの発生率はほぼ290万である。女性は男性より２〜３倍多く冒されている。慢性関節リウマチが発症する典型的な年齢は25〜50である。若年性慢性関節リウマチは、71,000人の若い米国人（18歳以下）を冒しており、少年より６倍多くの少女を冒している。
【００２２】
慢性関節リウマチは、身体の免疫系が関節の潤滑液を分泌する滑膜を外来として誤って同定する場合に起こる自己免疫障害である。炎症が生じ、関節内および周囲の軟骨と組織が損傷または破壊される。重症の事例では、この炎症が他の関節組織および周囲の軟骨に広がり、骨と軟骨を侵食または破壊して関節変形をもたらしうる。身体は損傷した組織を瘢痕組織と置き換え、その結果、関節内の正常な空間は狭小になって、骨はお互いに融合する。慢性関節リウマチは硬直、腫脹、疲労、貧血、体重減少、発熱、およびしばしば、身体不自由な苦痛を創出する。慢性関節リウマチの共通の症候群の数例としては、覚醒時の１時間以上継続する関節硬直；特定の指または手首の腫脹；関節周囲の軟組織の腫脹；および関節の両側の腫脹が挙げられる。腫脹は痛みを伴うかまたは伴わずに起こることもあり、かつ進行して悪化するかまたは進行前に数年間同じ状態で留まることもある。
【００２３】
慢性関節リウマチの診断は、複数の因子の組み合わせに基づいて行われ、その因子としては、痛みのある関節の具体的な位置と対称性、朝の関節硬直の存在、皮膚下の瘤および小節（リウマチ小節）の存在、慢性関節リウマチを示すＸ線試験結果、および／またはリウマチ因子と呼ばれる血液試験の陽性結果が挙げられる。全てではないが、慢性関節リウマチを患う多くの人は、リウマチ様因子抗体を血液中に有する。リウマチ様因子は慢性関節リウマチを患っていない人にも存在しうる。他の疾患もリウマチ様因子を血液中に産生しうる。このような訳で、慢性関節リウマチの診断は複数因子の組み合わせに基づいて行われ、血液中のリウマチ様因子の存在だけによらない。
【００２４】
該疾患の典型的な経過は持続性であるが振動性の関節症候群の１つであって、ほぼ10年後に患者の90％は骨と軟骨に構造的障害を示しうる。小パーセントは完全に消滅する短期の病気を有し、そして他の小パーセントは多数の関節変形および時折は他の疾患の徴候を伴う非常に重い疾患を有する。炎症プロセスは関節内の骨と軟骨の侵食または破壊を生じる。慢性関節リウマチでは、自己免疫周期の持続性抗原提示、Ｔ細胞刺激、サイトカイン分泌、滑膜細胞活性化、および関節破壊が存在する。疾患は個体および社会の両方に対して大きな影響を与え、顕著な痛み、障害性機能および能力障害だけでなく、数百万ドルに価する保健費用および賃金損失も生じる（例えば、NIHウエブサイトおよびNIAIDウエブサイトを参照）。
【００２５】
現在、関節炎に利用しうる治療法は、抗炎症薬または免疫抑制薬を用いて関節の炎症を軽減することに重点が置かれている。関節炎に最初に使われる治療薬は、通常、抗炎症薬、例えばアスピリン、イブプロフェンおよびCox-2阻害剤、例えばセレコキシブおよびロフェコキシブである。「２番目に使われる薬物」は、金、メトトレキセートおよびステロイドを含む。これらは十分確立された関節炎の治療薬であるが、これらの治療薬だけではごく僅かの患者しか治らない。最近、慢性関節リウマチの病原の理解が進んで、メトトレキセートが、サイトカインまたは組換え可溶性受容体に対する抗体と組合わせて使用されている。例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αに対する組換え可溶性受容体が、関節炎の治療でメトトレキセートと併用して使用されている。しかし、メトトレキセートと抗TNFα薬、例えばTNF-αに対する組換え可溶性受容体の組合わせで治療した患者のほぼ50％しか臨床上有意な改善を示さない。多数の患者は、治療にも関わらず不応のまま留まっている。慢性関節リウマチを患う患者にとって困難な治療問題はまだ残っている。多くの現行治療法は高度の副作用発症があるかまたは疾患進行を完全に防止することができない。今までのところ、治療は理想的でなく、そして治癒はあり得ない。もっと効果的に慢性関節リウマチおよび他の自己免疫障害を治療する新規の治療薬が必要とされている。
【００２６】
2.2.3 アレルギー
免疫を介するアレルギー（過敏症）反応は、アレルギー症候群の発現をもたらす原因となる機構によって４つの型（I〜IV）に分類される。Ｉ型アレルギー反応は、IgEを介する、肥満細胞および好塩基球からの血管作用性物質、例えばヒスタミンの放出により特徴付けられる。これらの物質の放出と続いてのアレルギー症候群の徴候は、アレルゲンに結合したIgEの、肥満細胞および好塩基球の表面上のその受容体との架橋により開始される。Ｉ型アレルギー反応に罹った個体において、２回目のアレルゲンへの曝露は、IgE産生に必要な３細胞相互作用にメモリーＢおよびＴ細胞が関わる結果として、アレルゲンに特異的なIgE抗体の高レベルの産生をもたらす。産生される高レベルのIgE抗体は、肥満細胞および好塩基球上のIgE受容体のアレルゲンに結合したIgEによる架橋の増加をもたらし、これは順に、これらの細胞の活性化、および薬理学的メディエーターの放出をもたらし、これがＩ型アレルギー疾患の臨床徴候に関わる。
【００２７】
IgEに対する親和性の異なる２種の受容体が同定されかつ特徴付けられている。高親和性受容体（FcεRI）は肥満細胞および好塩基球の表面上に発現される。低親和性受容体（FcεRII/CD23）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球およびランゲルハンス細胞を含む、多くの細胞型上に発現される。高親和性IgE受容体は３つのサブユニット（α、βおよびγ鎖）から成る。複数の研究は、α鎖だけがIgEの結合に関わり、βおよびγ鎖（膜貫通または細胞質タンパク質である）はシグナル伝達イベントに必要であることを実証している。IgEが肥満細胞および好塩基球上のFcεRIと結合するために必要なIgE構造の同定は、IgEを介するアレルギーを治療または予防する方法を工夫する上で非常に重要である。例えば、IgE受容体結合部位を解明すると、IgEの受容体保持細胞との結合をin vivoでブロックするペプチドまたは小分子を同定することができる。
【００２８】
現在、IgEを介するアレルギー反応は、抗ヒスタミンおよび副腎皮質ステロイドなどの薬物を用いて治療され、この治療法は、アレルギー反応に関連する症候群を、肥満細胞および好塩基球から放出される血管作用性物質の効果を相殺することにより軽減することを企てている。高用量の抗ヒスタミンと副腎皮質ステロイドは有害な効果（例えば、中枢神経系障害、便秘など）がある。従って、Ｉ型アレルギー反応を治療する他の方法が必要とされる。
【００２９】
Ｉ型アレルギー障害を治療するための一手法は、血清中の可溶性（遊離した）IgEと反応し、IgEを肥満細胞および好塩基球上のその受容体との結合からブロックし、そして受容体に結合したIgEとは結合しない（すなわち、これらは非アナフィラキシー誘発性である）モノクローナル抗体の産生である。２種のこのようなモノクローナル抗体が、IgEを介するアレルギー反応を治療する臨床開発の進んだ段階にある（例えば、Chang, T. W. , 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62を参照）
IgEを介するアレルギー反応の最も有望な治療薬の１つは、内在性IgEの適当な非アナフィラキシー誘発性エピトープに対する能動免疫である。Stanworthら（米国特許第5,601,821号）は、異種担体タンパク質とカップリングしたヒトIgEのCεH4ドメインから誘導したペプチドをアレルギーワクチンとして利用する方法を記載している。しかし、このペプチドは、未変性の可溶性IgEと反応する抗体の産生を誘導しないことが示されている。さらに、Hellman（米国特許第5,653,980号）は、全長CεH2-CεH3ドメイン（ほぼ220アミノ酸長さ）の外来担体タンパク質との融合に基づく抗IgEワクチン組成物を提案している。しかし、Hellmanが提案した抗IgEワクチン組成物により誘導される抗体は、恐らく確実にアナフィラキシーを生じるであろう、というのは、IgE分子のCεH2とCεH3ドメインのいくつかの部分に対する抗体は、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE受容体と架橋し、アナフィラキシーのメディエーターを産生することが示されているからである（例えば、Stadlerら, 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102:121-126を参照）。従って、アナフィラキシー抗体を誘導しないIgEを介するアレルギー反応の治療法に対する必要性は残ったままである。
【００３０】
アナフィラキシーの誘導に対する大きな関心から、Ｉ型アレルギー障害の治療に対する他の手法の開発が行われていて、この手法は、動物に投与されると抗IgEポリクローナル抗体の産生を誘導しうるミモトープから成る（例えば、Rudolf,ら, 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321を参照）。Kricekら（国際公開第WO 97/31948号）は、ファージディスプレイされたペプチドライブをモノクローナル抗体BSWI7を用いてスクリーニングし、IgE受容体結合のコンフォメーションを模倣しうるペプチドミモトープを同定した。これらのミモトープは恐らく遊離した未変性IgEと反応するが受容体に結合したIgEと反応しないとともに、IgEをその受容体との結合からブロックするポリクローナル抗体を誘導するために使用しうる。Kricekらは、IgE分子のいずれの部分とも相同性がなく、従って本発明に開示したペプチドとは異なるペプチドミモトープを開示している。
【００３１】
当技術分野を概観して証拠づけたように、癌、自己免疫疾患、炎症性障害、またはアレルギーなどの障害を治療または予防する現行方法の治療効力を増強する必要性は残ったままである。特に、癌の治療に利用される治療抗体のエフェクター機能、特に細胞傷害性効果を増強する必要性がある。当技術分野の現状はまた、アレルギー障害を治療または予防するには不足である（例えば、抗体治療またはワクチン治療により）。
【発明の開示】
【００３２】
３．発明の概要
FcγRIIAとFcγRIIBの細胞外ドメインは95％同一であり、従ってこれらは多数のエピトープを共有する。しかし、FcγRIIAとFcγRIIBは非常に異なる活性を示す。基本的な相違は、FcγRIIAが食作用および呼吸性バーストなどの細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、FcγRIIBは抑制するシグナル伝達を開始することにある。本発明以前において、本発明者らの知るところでは、ヒト細胞上に発現される未変性ヒトFcγRIIAと未変性ヒトFcγRIIBの相違を識別する抗体の存在は同定されていない；免疫応答をモジュレートする上でのその特有な活性と役割を考えると、未変性ヒトFcγRIIBであってかつ未変性ヒトFcγRIIAでないことを認識する抗体が必要である。本発明は、部分的に、このような未変性ヒトFcγRIIB特異的抗体の発見に基づくものである。
【００３３】
本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIA、さらに特に未変性ヒトFcγRIIAと結合するより大きい親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIB、さらに特に未変性ヒトFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本明細書に使用される「未変性（native）」は、哺乳類動物細胞において内因的に細胞上に発現されたかまたは遺伝子組換えにより発現されたが、細菌細胞中に発現されたかまたは単離されたおよび変性されたのではないFcγRIIBまたはFcγRIIAを意味する。本発明のある特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より少なくとも２倍大きい親和性でFcγRIIBと結合する。本発明の他の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍、少なくとも106倍、少なくとも107倍、または少なくとも108倍大きい親和性でFcγRIIBと結合する。好ましい実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIAと結合する親和性より100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、または108倍大きい親和性でFcγRIIBと結合する。好ましくは、これらの結合親和性は、凝集IgGでなく単量体IgGにより決定され、結合は可変ドメインを経由する（例えば、Fabフラグメントは類似の結合特性を有する）。一実施形態においては、本発明の抗体は、Pulfordら, 1986 Immunology 57:71-76に開示されたKB61と名付けられたモノクローナル抗体、またはWeinrichら, 1996, Hybridoma 15:109-116に開示されたII8D2と名付けられたモノクローナル抗体ではない。他の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、KD61またはII8D2と同じエピトープと結合しないおよび／または同じエピトープとの結合について競合しない。好ましくは、本発明の抗体は、FcγRIIB2アイソタイプの位置135〜141に対応するアミノ配列SDPNFSIと結合しない。
【００３４】
本発明は、当技術分野で公知の特異性を評価する標準的方法により決定して、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明は、例えば、ウェスタンブロットまたはラジオイムノアッセイにより決定して、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明は、例えば、FcγRIIB結合に対して直線範囲のELISAアッセイで決定して、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関する。本発明の一実施形態において、本発明は、ELISAアッセイで決定してFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、細菌または哺乳類動物系で産生される上記抗体またはそのフラグメントに関する。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、上記抗体の定常ドメインはさらに少なくとも１以上のFc活性化受容体に対して増強された親和性を有する上記抗体またはそのフラグメントに関する。さらに他の特定の実施形態においては、上記Fc活性化受容体はFcγRIIIである。
【００３６】
本発明の一実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントはFcγRIIBのIgG結合部位をブロックし、例えばブロッキングELISAアッセイにおいて、凝集した標識されたIgGのFcγRIIBとの結合をブロックする。或る特定の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、ELISAブロッキングアッセイにおいて、凝集した標識されたIgGの結合を、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、または99.9％だけブロックする。さらに他の特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントは上記ELISAアッセイにおいて、上記凝集した標識されたIgGの結合を完全にブロックする。
【００３７】
本発明の他の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、FcγRIIBのIgG結合部位をブロックし、二重染色FACSアッセイで測定して、上記凝集した標識されたIgGのFcγRIIBとの結合をブロックする。
【００３８】
本発明は、FcγRIIBの活性をモジュレートする（すなわち、作動する（agonize）かまたは拮抗する（antagonize））抗体の使用を包含する。本発明の一実施形態においては、本発明の抗体はFcγRIIBの少なくとも1つの活性を作動する、すなわちシグナル伝達を誘発する。作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の作動性抗体は、FcγRライゲーションに対する活性化応答の鈍化および細胞応答の抑制をもたらすFcγRIIBのクラスター形成を模倣してもよい。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は少なくともFcγRIIBの少なくとも1つの活性を拮抗し、すなわち、シグナル伝達をブロックする。例えば、本発明の抗体は凝集IgGのFcγRIIBとの結合をブロックする。
【００４０】
本発明は、FcεRIが誘導する肥満細胞活性化を抑制する抗体を提供する。本発明はさらに、単球細胞においてFcγRIIAを介するマクロファージ活性化を抑制する抗FcγRIIB抗体を提供する。本発明はまた、Ｂ細胞受容体を介するシグナル伝達を抑制する抗FcγRIIB抗体も提供する。
【００４１】
或る特定の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体はFcγRIIBのリガンド結合部位をブロックする。さらなる特定の実施形態においては、ブロッキング活性は免疫複合体がトリガーする活性化のネガティブ調節をブロックし、その結果、免疫応答を増強することができる。さらなる特定の実施形態においては、免疫応答の増強は抗体依存細胞応答を増加する。他の特定の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はFcγRIIB受容体のＢ細胞および／またはFc受容体との架橋をブロックし、Ｂ細胞、肥満細胞、樹状細胞、またはマクロファージを活性化する。
【００４２】
本発明は、FcγRIIAと比較してFCγRIIBに対する特異性をもつ新規のモノクローナル抗体の産生を包含する。特に本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するより大きい親和性で、FcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗FcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法であって、(a)１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを、精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントを用いて免疫感作するステップ；(b)上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ培養細胞株を作るステップ；(c)上記ハイブリドーマ培養細胞株を、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ培養細胞株についてスクリーニングするステップを含む上記方法を提供する。本発明は上記方法により産生されるいずれの抗体も包含する。或る特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIA、特にヒトFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合する抗FcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法であって、(a)１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを、精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントを用いて免疫感作するステップ；(b)上記マウスを、免疫応答を誘発するために十分な時間追加免疫感作するステップ；(c)上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ培養細胞株を作るステップ；(d)上記ハイブリドーマ培養細胞株を、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ培養細胞株についてスクリーニングするステップを含む上記方法を提供する。好ましくは実施形態においては、上記マウスを少なくとも４ヶ月の期間にわたって４回追加免疫感作する。本発明の一実施形態においては、上記マウスの免疫応答を増強することが当技術分野で公知のアジュバントと混合しておいた精製したFcγRIIBを用いて、上記マウスを免疫感作する。本発明の或る特定の実施形態においては、上記免疫原性フラグメントはFcγRIIBの可溶性細胞外ドメインである。ハイブリドーマ培養細胞株は、当技術分野で公知の標準技術（例えば、ELISA）を用いてスクリーニングすることができる。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるモノクローナル抗体を提供する。他の実施形態において、本発明は、クローン2B6または3H7により産生されるモノクローナル抗体と結合を競合しかつFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと結合するおよび／またはクローン2B6または3H7により産生されるモノクローナル抗体と同じFcγRIIBのエピトープと結合しかつFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに本発明はそれぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するハイブリドーマ培養細胞株2B6または3H7を提供する。
【００４４】
本発明の方法はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドも包含する。一実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの重鎖または軽鎖をコードする単離された核酸配列を提供する。本発明はまた、上記核酸を含むベクターにも関する。本発明はさらに重鎖をコードする第１の核酸分子および軽鎖をコードする第２の核酸分子を含むベクターであって、上記重鎖および軽鎖がFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの重鎖および軽鎖である上記ベクターを提供する。或る特定の実施形態においては上記ベクターは発現ベクターである。本発明はさらに、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドのベクターを含有する宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明は、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有する寄託したハイブリドーマクローンにより産生される抗体の重鎖および軽鎖またはその部分、例えば、CDR、可変ドメインなどをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００４５】
本発明はさらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを産生する方法も提供する。本発明の抗体またはそのフラグメントは当技術分野で公知の抗体を産生する方法により、特に、培養ハイブリドーマ細胞からの分泌により、化学合成により、または当技術分野で公知の遺伝子組換え発現技術により産生することができる。或る特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIB特異的抗体を遺伝子組換えにより産生する方法であって、(i)異種プロモーターと機能しうる形で連結された第１の核酸分子およびそれと同じかまたは異なる異種プロモーターと機能しうる形で連結された第２の核酸を含有する宿主細胞を培地中で上記抗体を発現するために好適な条件下で培養するステップであって、上記第１の核酸および第２の核酸がFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの重鎖および軽鎖をそれぞれコードする上記ステップ；および(ii)上記培地から上記抗体を回収するステップを含む上記方法に関する。
【００４６】
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体、そしてさらに好ましくは、ヒト化またはヒト抗体である。或る特定の実施形態においては、本発明の抗体はヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。他の特定の実施形態においては、本発明の抗体は特異的にまたは選択的にFcγRIIBの１以上のエピトープを認識する。本発明の他の実施形態は、FcγRIIBに対する本発明の抗体の親和性を増加するためのファージディスプレイ技術の使用を包含する。当技術分野で公知のいずれのスクリーニング方法（例えば、ELISA）を利用して、増加したFcγRIIBに対するアビディティを有する突然変異抗体を同定してもよい。他の特定の実施形態においては、本発明の抗体を、当技術分野で周知の抗体スクリーニングアッセイ（例えば、BIACOREアッセイ）を用いてスクリーニングし、3x10-3s-1未満のKoff速度を有する抗体を同定する。
【００４７】
本発明は、生物学的サンプル中のFcγRIIBの存在を特異的に検出する（すなわち、FcγRIIBを検出するがFcγRIIAを検出しない）ための本発明の抗体の使用を包含する。
【００４８】
活性化および抑制Fc受容体、例えば、FcγRIIAおよびFcγRIIBは、これらの受容体のバランスがとれた機能および好適な細胞免疫応答にとって極めて重要である。本発明は、Fc受容体シグナル伝達経路におけるこのようなバランスおよび調節制御の喪失に関連する疾患を治療するための本発明の抗体の使用を包含する。従って、本発明のFcγRIIB抗体は免疫応答を調節する上での、例えば自己免疫性もしくは炎症性疾患またはアレルギー応答に関係する免疫応答を抑制する上での用途を有する。本発明のFcγRIIB抗体はまた、例えば治療抗体を介する細胞傷害性を増強するある特定のエフェクター機能を改変するために使用することもできる。
【００４９】
本発明の抗体は、例えば、一実施形態においては、単一薬物治療法として癌を予防または治療するために有用である。本発明の一実施形態においては、本発明の抗体はＢ細胞悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病を予防または治療するために有用である。他の実施形態においては、本発明の抗体は、癌を予防または治療するために、特に細胞障害性をもつ癌抗原特異的治療抗体の細胞傷害性活性を強化して腫瘍細胞死滅を増強するおよび／または抗体依存性細胞傷害性細胞（「ADCC」）活性、補体依存性細胞傷害性（「CDC」）活性、または治療抗体の食作用を増強する上で有用である。本発明は、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、上記患者に治療上有効な量の、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する第１の抗体またはそのフラグメント、および上記癌抗原と特異的に結合し細胞傷害性である第２の抗体を投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、癌抗原により特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合しかつ、抗体が単量体であるときは、その定常ドメインがさらに１以上のFc活性化受容体、例えばFcγRIIIAに対して増加した親和性を有する抗体またはそのフラグメント、および上記癌抗原と特異的に結合し細胞傷害性である抗体の治療上有効な量を、上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。ある特定の実施形態においては、上記Fc活性化受容体はFcγRIIIAである。
【００５０】
他の実施形態において、本発明は、細胞傷害性抗体を用いて治療する被験者において抗体を介する細胞傷害性効果を増強する方法であって、本発明の抗体またはそのフラグメントを上記細胞傷害性抗体の細胞傷害性効果を増強するのに十分な量だけ上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、細胞傷害性抗体を用いて治療する被験者において抗体を介する細胞傷害性効果を増強する方法であって、抗体が単量体であるときは、さらにFc活性化受容体に対して増強された親和性を有する本発明の抗体またはそのフラグメントを、上記細胞傷害性抗体の細胞傷害性効果を増強するのに十分な量だけ上記患者に投与することを含む、上記方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、さらに１以上のさらなる癌治療の実施を含む方法を提供する。
【００５１】
本発明はさらに、(i)FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの治療上有効な量；および(ii)製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、(i)FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの治療上有効な量；および(ii)癌抗原と特異的に結合する細胞傷害性抗体；および(iii)製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
本発明は、本発明の抗体の使用であって、細胞を死滅させて抗体の治療活性を増強することを介してその治療効果を媒介するいずれかの治療抗体と組合わせての上記使用を包含する。ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、抗体を介するエフェクター機能を増強することにより抗体の治療活性を増強する。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、食作用および標的の腫瘍細胞のオプソニン作用を増強することにより細胞傷害性抗体の治療活性を強化する。本発明のさらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的腫瘍細胞の破壊における抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（「ADCC」）を増強することにより抗体の治療活性を強化する。
【００５３】
複数の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の使用であって、細胞を死滅させて抗体の治療活性を増強することを介してその治療効果を媒介しない治療抗体と組合わせての上記使用を包含する。特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の、作動活性をもつ治療用アポトーシス誘導抗体、例えば抗Fas抗体と組合わせての使用を包含する。治療用アポトーシス誘導抗体は、当技術分野で公知のアポトーシス経路をモジュレートするいずれかの死受容体、例えばTNFR受容体ファミリーメンバーに特異的であってもよい。
【００５４】
本発明は、マクロファージを介する腫瘍細胞進行および転移をブロックするための本発明の抗体の利用を包含する。本発明の抗体は、マクロファージ浸潤が起こる固体腫瘍の治療に特に有用である。本発明の拮抗性抗体は、腫瘍部位に局在化するマクロファージの集団を低減または排除することにより、腫瘍細胞転移を制御、例えば低減または排除するのに特に有用である。本発明はさらに、マクロファージ以外のFcγRIIBを発現する免疫エフェクター細胞、例えば樹状細胞を効果的に枯渇させるかまたは排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いる免疫エフェクター細胞の効果的枯渇または排除は、エフェクター細胞の集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、そして最も好ましくは99％だけの低減である。
【００５５】
複数の実施形態において、本発明の作動性抗体は、黒色腫細胞の腫瘍を含む非造血性起源の腫瘍を治療するのに特に有用である。複数の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の使用であって、腫瘍細胞それ自身の上に発現されないが腫瘍間質を含む周囲の反応性および腫瘍を支持する非悪性腫瘍細胞上に発現される腫瘍抗原と免疫特異的に結合する治療抗体と組合わせての上記使用を包含する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、線維芽細胞上の腫瘍抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）と免疫特異的に結合する抗体と組合わせて使用される。
【００５６】
本発明は、それを必要とする患者の自己免疫障害を治療する方法であって、上記患者に１以上の本発明の抗体の治療上有効な量を投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまたそれを必要とする患者の自己免疫障害を治療する方法であって、さらに上記患者に１以上の抗炎症薬、および／または１以上の免疫調節薬の治療上有効な量を投与することを含む上記方法も提供する。
【００５７】
本発明はまた、それを必要とする患者の炎症性障害を治療する方法であって、上記患者に１以上の本発明の抗体の治療上有効な量を投与することを含む上記方法も提供する。本発明はまた、それを必要とする患者の炎症性障害を治療する方法であって、さらに上記患者に１以上の抗炎症薬、および／または１以上の免疫調節薬の治療上有効な量を投与することを含む上記方法も提供する。
【００５８】
本発明は、被験者におけるワクチン組成物に対する免疫応答を増強する方法であって、上記被験者に、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントおよびワクチン組成物を、上記抗体またはそのフラグメントが上記被験者において上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増強するために有効な量だけ投与されるように、投与することを含む上記方法を提供する。本発明の抗体を用いて、ワクチン組成物の抗原に対する体液性および／または細胞媒介応答を増強することができる。本発明の抗体は当技術分野で公知のいずれのワクチンと組合わせて使用してもよい。本発明は、特定の障害を予防または治療するための本発明の抗体の使用であって、特定の抗原または抗原に対する増強された免疫応答が疾患または障害を治療または予防するために有効である上記使用を包含する。
【００５９】
本発明はまた、感染病原体に対する免疫治療を増強する方法であって、本発明の抗体を既に病原体、例えばHIVまたはHSVに感染している患者に投与して感染した細胞のオプソニン作用および食作用を増強する上記方法も提供する。
【００６０】
本発明は、障害性アポトーシスを介するシグナル伝達を伴う疾患、例えば癌、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、欠乏Fasを介するアポトーシスを伴う疾患を治療する方法であって、本発明の抗体を抗Fas抗体と組合わせて投与することを含む上記方法を包含する。
【００６１】
他の実施形態において、本発明は、被験者における自己免疫疾患を診断する方法であって、(i)上記被験者からの生物学的サンプルを有効量の本発明の抗体と接触させるステップ；および(ii)上記抗体またはそのフラグメントの結合を検出し、バックグラウンドまたは標準レベルを超える上記検出可能なマーカーの検出は上記被験者が自己免疫疾患を有することを示すとするステップを含む上記方法を提供する。
【００６２】
本発明はさらに、その必要がある患者におけるIgE媒介アレルギー障害を治療または予防する方法であって、上記患者に本発明の作動性抗体の治療上有効な量を投与することを含む上記方法も提供する。本発明はまた、その必要がある患者におけるIgEを介するアレルギー障害を治療または予防する方法であって、上記患者に本発明の抗体を、IgEを介するアレルギー障害を治療または予防するために使用される他の治療抗体またはワクチン組成物と組合わせて投与することを含む上記方法も提供する。
【００６３】
3.1  定義
本明細書に使用される用語「FcγRIIBと特異的に結合する」および類似の用語は、FcγRIIBまたはそのフラグメントと特異的に結合しかつ他のFc受容体、特にFcγRIIAと結合しない抗体またはそのフラグメントを意味する。さらに、当業者は、FcγRIIBと特異的に結合する抗体はその抗体の可変ドメインまたは定常ドメインを介して結合しうることを理解うる。もしFcγRIIBと特異的に結合する抗体がその可変ドメインを介して結合すれば、当業者は、それは凝集していない、すなわち単量体であることを理解する。FcγRIIBと特異的に結合する抗体は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公知の他のアッセイにより測定して、他のペプチドまたはポリペプチドとより低い親和性で結合しうる。好ましくは、FcγRIIBまたはそのフラグメントと特異的に結合する抗体またはフラグメントは他の抗原と交差反応しない。FcγRIIBと特異的に結合する抗体またはフラグメントは、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公知の他のアッセイにより同定することができる。抗体またはそのフラグメントは、実験技術、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定して、いずれの交差反応性抗原よりも高い親和性でFcγRIIBと結合する場合、FcγRIIBと特異的に結合する。抗体特異性に関する考察は、例えば、Paul, 編, 1989, 「基礎免疫学、第2版（Fundamental Immunology Second Edition）」, Raven Press, New York p.332-336を参照。
【００６４】
本明細書に使用される用語「抗体」は、モノクローナル、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化（camelized）抗体、１本鎖Fv（scFv）、１本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、細胞内発現抗体（intrabody）、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Idおよび抗-抗Id抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1およびIgA2）またはサブクラスであってもよい。
【００６５】
本明細書に使用される、ポリペプチドまたはタンパク質の文脈での用語「誘導体」は、アミノ酸残基置換、欠失または付加の導入により改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書に使用される用語「誘導体」はまた、改変されている、すなわち、いずれかのタイプの分子のポリペプチドまたはタンパク質との共有結合により改変されているポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定されるものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、限定されるものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む当業者に公知の技術を用いる化学修飾により作ることができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導された元のポリペプチドまたはタンパク質と類似のまたは同一の機能を持つ。
【００６６】
本明細書に使用される、非タンパク質誘導体の文脈での用語「誘導体」は、第１の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機または無機分子を意味する。有機分子の誘導体は、限定されるものでないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミン基の付加または欠失により改変された分子を含む。有機分子はまたエステル化、アルキル化および／またはリン酸化されてもよい。
【００６７】
本明細書に使用される用語「障害」および「疾患」は互換的に使用され、被験者の症状を意味する。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自身の細胞、組織および／または器官に対する被験者の免疫学的反応によって生じた細胞、組織および／または器官傷害により特徴付けられる被験者の症状を意味する。用語「炎症性疾患」は用語「炎症性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴付けられる被験者の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を随伴してもしなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害により生じても生じなくてもよい。従って、ある特定の障害は自己免疫と炎症性障害の両方により特徴付けられてもよい。
【００６８】
本明細書に使用される用語「癌」は、細胞の異常な無制御の増殖から生じる新生物または腫瘍を意味する。本明細書に使用される、癌は明確に白血病およびリンパ腫を含む。複数の実施形態において、癌は局在したまま残る良性腫瘍を意味する。他の実施形態において、癌は近隣の身体構造に侵入しかつ破壊しそして遠隔部位に広がる悪性腫瘍を意味する。複数の実施形態においては、癌は特定の癌抗原を随伴する。
【００６９】
本明細書に使用される用語「免疫調節薬（immunomodulatory agent）」と、限定されるものでないが、免疫調節薬（immunomodulatory agents）を含むその変化は、宿主の免疫系をモジュレートする薬物を意味する。ある特定の実施形態においては、免疫調節薬は免疫抑制薬である。ある特定の実施形態においては、免疫調節薬は免疫刺激薬である。免疫調節薬は、限定されるものでないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣薬、および有機分子を含む。
【００７０】
本明細書に使用される用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳類動物、そして最も好ましくはヒトにおいて、抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドまたはタンパク質の断片を意味する。免疫原性活性を有するエピトープは、動物における抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性活性を有するエピトープは、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイにより確認される、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００７１】
本明細書に使用される用語「断片」は、他のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5連続アミノ酸残基、少なくとも10連続アミノ酸残基、少なくとも15連続アミノ酸残基、少なくとも20連続アミノ酸残基、少なくとも25連続アミノ酸残基、少なくとも40連続アミノ酸残基、少なくとも50連続アミノ酸残基、少なくとも60連続アミノ酸残基、少なくとも70連続アミノ酸残基、少なくとも80連続アミノ酸残基、少なくとも90 連続アミノ酸残基、少なくとも100連続アミノ酸残基、少なくとも125連続アミノ酸残基、少なくとも150連続アミノ酸残基、少なくとも175連続アミノ酸残基、少なくとも200連続アミノ酸残基、または少なくとも250連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態においては、ポリペプチドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。
【００７２】
本明細書に使用される用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNAおよびRNA分子の組合わせまたはハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、限定されるものでないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に有益な属性、例えばヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の増加を与える改変された主鎖を有するDNAまたはRNA分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は１本鎖、２本鎖であっても、１本鎖と２本鎖の両方の部分を含有してもよく、そして３本鎖部分を含有してもよい、しかし好ましくは２本鎖DNAである。
【００７３】
本明細書に使用される「治療上有効な量」は、FcγRIIBに関連する疾患または障害およびFc受容体シグナル伝達経路の調節の喪失に関係する疾患を治療または管理するためにまたは他の治療法、例えば、治療抗体、ワクチン治療法などの治療効力を増強するために十分な治療薬の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延または最小限にする、例えば癌の拡大を遅延または最小限にするために十分な治療薬の量を意味してもよい。治療上有効な量は、疾患の治療または管理における治療上の利益を与える治療薬の量を意味してもよい。さらに、本発明の治療薬についての治療上有効な量は、疾患の治療または管理における治療上の利益を与える、例えば、疾患を治療または管理するのに十分な治療抗体の治療効力を増強するために十分な、治療薬単独の量、または他の治療法と組合わせての量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量に関係して用いる場合、この用語は、全体の治療を改善し、欲しない効果を軽減するかまたは回避し、または他の治療薬との相乗による治療効力を増強する量も包含しうる。
【００７４】
本明細書に使用される用語「予防薬」は、障害の予防に、または障害の再発または拡大の予防に使用される薬物を意味する。予防上有効な量は、過剰増殖性疾患、特に癌の再発または拡大、または限定されるものでないが、過剰増殖性疾患の素因がある、例えば、遺伝的に癌の素因があるまたは先に発癌物質に曝された患者を含む、患者におけるそれらの発生を予防するために十分な予防薬の量を意味してもよい。予防上有効な量はまた、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬の量を意味してもよい。さらに、本発明の予防薬に関する予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬単独のまたは他の薬物と組合わせての量を意味する。本発明のFcγRIIB抗体の量に関係して用いる場合、この用語は、全体の予防を改善しまたは予防効力または他の予防薬、例えば、限定されるものでないが、治療抗体との相乗を増強する量も包含しうる。
【００７５】
本明細書に使用される用語「予防」は、予防薬または治療薬の投与から得られる、被験者における障害の１以上の症候群の再発または発症の予防を意味する。
【００７６】
本明細書に使用される用語「組合わせて（in combination）」は、２種以上の予防および／または治療薬の使用を意味する。用語「組合わせて」は、予防および／または治療薬を、障害のある被験者に投与する順序を制限しない。第１の予防薬または治療薬を投与した後（例えば5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、または12週後）に、第２の予防薬または治療薬を、障害のある被験者に投与してもよい。
【００７７】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明は下記参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
５．好ましい実施形態の説明
5.1  FcγRIIB特異的抗体
本発明は、FcγRIIA、好ましくは、ヒトFcγRIIA、さらに好ましくは未変性ヒトFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、さらに好ましくはヒト未変性FcγRIIBと特異的に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）またはその断片を包含する。好ましくは本発明の抗体は、未変性ヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと結合する。ある特定の実施形態においては、抗体またはそのフラグメントはFcγRIIBと、FcγRIIAと結合するより２倍、４倍、６倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、または108倍大きい親和性で結合する。１つの特定の実施形態においては、抗体は、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体である。本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物寄託国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures）の条項のもとで、American Type Culture Collection（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110）に2002年８月13日に寄託し、それぞれ受託番号PTA-4591およびPTA-4592のもとで受託されていて、これは本明細書に参照により組み入れられる。特定の実施形態において、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を持つ抗体を包含する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体はヒトであるかまたはヒト化されていて、好ましくはクローン3H7または2B6により産生される抗体のヒト化バージョンである。さらに好ましい他の実施形態においては、本発明の抗体はさらにFc活性化受容体、例えば、FcγRIIIA、FcγRIIIBなどと結合しない。
【００７９】
特定の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントはFcγRIIBの少なくとも１つの活性を作動する。本発明の一実施形態においては、上記活性はＢ細胞受容体を介するシグナル伝達の抑制である。他の実施形態においては、本発明の作動性抗体はＢ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路中の１以上の下流シグナル伝達分子の活性を抑制する。さらに他の実施形態においては、本発明の作動性抗体は、FcγRIIBのリン酸化またはSHIP補充を増強する。本発明のさらなる実施形態においては、作動性抗体はＢ細胞受容体を介するシグナル伝達経路におけるMAPキナーゼ活性またはAkt補充を抑制する。他の実施形態においては、本発明の作動性抗体は、FcγRIIBを介するFcεRIシグナル伝達の抑制を作動する。特定の実施形態においては、上記抗体はFcεRIが誘導する肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を抑制する。他の実施形態においては、本発明の作動性抗体は、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの補充を刺激し、SHIPリン酸化およびそのShcとの会合を刺激し、またはMAPキナーゼファミリーメンバー（例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38など）の活性化を抑制する。さらに他の実施形態においては、本発明の作動性抗体はp62dokのチロシンリン酸化およびそのSHIPおよびrasGAPとの会合を増強する。他の実施形態においては、本発明の作動性抗体は単球またはマクロファージのFcγRを介する食作用を抑制する。
【００８０】
他の実施形態においては、本発明の抗体、またはそのフラグメントは、FcγRIIBの少なくとも1つの活性を拮抗する。一実施形態においては、上記活性はＢ細胞受容体を介するシグナル伝達の活性化である。特定の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体は、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における１以上の下流シグナル伝達分子の活性を増強する。さらに他の特定の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はFcγRIIBのリン酸化またはSHIP補充を減少する。本発明のさらなる実施形態においては、拮抗性抗体はＢ細胞受容体を介するシグナル伝達経路におけるMAPキナーゼ活性またはAkt補充を増強する。他の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はFcγRIIBを介するFcεRIシグナル伝達の抑制を拮抗する。特定の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はFceRIが誘導する肥満細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増強する。他の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はFcγRIIBのリン酸化を抑制し、SHIPの補充を抑制し、SHIPリン酸化およびそのShcとの会合を抑制し、MAPキナーゼファミリーメンバー（例えば、Erk1、Erk2、JNK、p38など）の活性化を増強する。さらに他の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はp62dokのチロシンリン酸化およびそのSHIPおよびrasGAPとの会合を抑制する。他の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体はFcγRを介する単球またはマクロファージの食作用を増強する。他の実施形態においては、本発明の拮抗性抗体は脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子の食作用、クリアランスを防止する。
【００８１】
本発明の抗体は、限定されるものでないが、モノクローナル抗体、合成抗体、遺伝子組換えで作られた抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、１本鎖Fv（scFv）、１本鎖抗体、Fabフラグメント、F（ab'）フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、細胞内発現抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。特に、本発明の方法に使用される抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、上記免疫グロブリン分子がFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含む。
【００８２】
本発明の方法に使用される抗体は、鳥類および哺乳類動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源由来であってもよい。好ましくは、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書に使用される「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーからまたはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【００８３】
本発明の方法に使用される抗体は単特異的、二特異的、三特異的またはさらに多特異的であってもよい。多特異的抗体はFcγRIIBの色々なエピトープと免疫特異的に結合してもまたはFcγRIIBのエピトープだけでなく異種エピトープ、例えば異種ポリペプチドまたは固体支持材料の両方と免疫特異的に結合してもよい。例えば、国際公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793；Tutt,ら、1991, J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681,号、第4,925,6480号、第5,573,920号、および第5,601,819号；およびKostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547-1553；Todorovskaら、2001, Journal of Immunological Methods、248:47-66を参照。
【００８４】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は多特異的であって、FcγRIIBに対して、および癌抗原もしくは他の細胞表面マーカー（例えば特定の疾患もしくは障害を治療もしくは予防する上で死滅させるように設計した細胞に特異的な）に対して、または他のFc受容体（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIIBなど）に対する特異性を備える。
【００８５】
特定の実施形態においては、本発明の方法に使用される抗体は、ATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を持つクローン2B6または3H7によりそれぞれ産生される抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、１個以上の相補性決定領域（CDR）、好ましくは６個のCDR全てを含む）（例えば、重鎖CDR3）である。他の実施形態においては、本発明の方法に使用される抗体は、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を持つクローン2B6または3H7から産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合しおよび／または、ELISAアッセイまたは他の適当な競合イムノアッセイにより測定して、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を持つクローン2B6または3H7から産生されるマウスモノクローナル抗体と競合し、そしてまた、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと結合する。
【００８６】
本発明の方法に使用される抗体は、いずれかの型の分子の抗体との共有結合により改変された誘導体を含む。例えば、限定されるものでないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより改変されている抗体を含む。多数の化学的修飾のいずれかを公知技術により実施してもよく、それらの技術は、限定されるものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【００８７】
ヒトにおける抗体のin vivo用途およびin vitro検出アッセイを含む複数の用途では、ヒト、キメラまたはヒト化抗体を使用することが好ましいであろう。完全なヒト抗体がヒト被験者の治療処置には特に所望される。ヒト抗体は当技術分野で知られる様々な方法により作ることができ、それらは、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ方法を含む。また米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；および国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照；これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【００８８】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を無作為に、相同組換えによりマウス胚幹細胞中に導入することができる。あるいは、ヒト可変域、定常域、および多様域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚幹細胞中に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座を別々にまたは同時に導入することにより無機能化することができる。特にJH域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を阻止する。改変された胚幹細胞を拡大して胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作る。次いでキメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作る。トランスジェニックマウスを通常の手法を用いて選択した抗原、例えば本発明のポリペプチドの全てまたは一部を用いて、免疫感作する。該抗原に対するモノクローナル抗体は免疫化トランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが抱くヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞分化中に再配置し、次いでクラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を用いると、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生することが可能である。このヒト抗体を産生する技術の総括については、LonbergおよびHuszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）を参照すること。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生させる技術ならびにこのような抗体を産生させるプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735；および米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照、これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。さらに、Abgenix, Inc.（Freemont、CA
）およびMedarex（Princeton、NJ）などの会社は以上に記載したのと類似の技術を用いて選択した抗原に対するヒト抗体の提供を契約することができる。
【００８９】
キメラ抗体は、抗体の色々な部分が色々な免疫グロブリン分子、例えば非ヒト抗体から誘導された可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有する抗体から誘導された分子である。キメラ抗体を産生させる方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202；Oiら, 1986, BioTechniques 4:214；Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；および米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。非ヒト種からの１以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができ、それらの技術は、例えばCDR-グラフト化（EP 239,400；国際公開WO 91/09967；および米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）または再表面形成（EP 592,106；EP519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7:805；およびRoguskaら, 1994, PNAS 91:969）、およびチェーンシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）を含む。以上確認した参考文献は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【００９０】
しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、CDRドナー抗体からの対応する残基により置換して抗原結合を改変、好ましくは改善しうる。これらのフレームワーク置換は当技術分野で周知の方法により、例えばCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、かつ配列を比較して特定位置の異常なフレームワーク残基を同定することにより、同定される（例えば、米国特許第5,585,089号；およびRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【００９１】
ヒト化抗体は、所定の抗原と結合することができ、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワークおよび実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRを含む抗体、変異体またはそのフラグメントである。ヒト化抗体は、全てのまたは実質的に全てのCDR域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のCDR域に対応する少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの全てを実質的に含み、かつ全てのまたは実質的に全てのフレームワーク域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク域である。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常域の部分も含む。通常、抗体は軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有しうる。抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4域を含んでもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含むいずれかのクラスの免疫グロブリン、およびIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むいずれかのアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは補体結合定常ドメインであり、ヒト化抗体が細胞傷害性活性を示しかつクラスは典型的にはIgG1であることが所望される。そのような細胞傷害性活性が所望でない場合は、定常ドメインはIgG2クラスであってもよい。ヒト化抗体は１種以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでもよく、所望のエフェクター機能を最適化する特定の定常ドメインの選択は当業界の技術に包含される。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR域は親配列、例えばドナーCDRと正確に対応する必要はなく、あるいは、コンセンサスフレームワークを少なくとも1つの残基の置換、挿入または欠失により突然変異させて、その部位におけるCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたはインポート抗体に対応しないようにしてもよい。しかし、このような突然変異は大規模なものではないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、さらにしばしば90％、そして最も好ましくは95％超が親フレームワーク域（FR）およびCDR配列の残基に対応するであろう。ヒト化抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生させることができ、それらの方法としては、限定されるものでないが、CDRグラフト化（欧州特許EP 239,400；国際公開WO 91/09967；および米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）または最表面形成(欧州特許EP592,106およびEP519、596；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498；Studnickaら, 1994, Protein Engineering 7 (6):805-814；およびRoguskaら, 1994, PNAS 91:969-973)、チェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）、および例えば、米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開WO 9317105、Tanら, 2002, J. Immunol. 169:1119-25、Caldasら, 2000, タンパク質 Eng. 13:353-60、Moreaら, 2000, Methods 20:267-79、Bacaら, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguskaら, 1996, Protein Eng. 9:895-904、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu, 1994, Gene 150:409-10、Pedersenら, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73、Jonesら, 1986, Nature 321:522-525、Riechmannら, 1988, Nature 332:323、ならびにPresta, 1992, Curr. OP. Struct. Biol. 2:593-596に開示された技術を含む。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、CDRド���ー抗体からの対応する残基により置換して抗原結合を改変、好ましくは改善しうる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えばCDRとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列を比較して特定位置の異常なフレームワーク残基を同定することにより、同定される（例えば、米国特許第5,585,089号；およびRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【００９２】
さらに、当業者に周知の技術を利用し、本発明の抗体を順に用いて抗イディオタイプ抗体を作製することができる（例えば、Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7: 437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438を参照）。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を用いる方法を提供する。
【００９３】
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体を包含する（例えば、Muyldermansら, 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230；Nuttallら, 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253；ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開WO 94/04678およびWO 94/25591；米国特許第6,005,079号；を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。一実施形態において、本発明は、単一ドメイン抗体を形成するように改変を施した２つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００９４】
本発明の方法はまた、哺乳類動物、好ましくはヒトにおいて、15日より長い、好ましくは20日より長い、25日より長い、30日より長い、35日より長い、40日より長い、45日より長い、2ヶ月より長い、3ヶ月より長い、4ヶ月より長い、または5ヶ月より長い半減期（例えば、血清半減期）を有する抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。哺乳類動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはそのフラグメントのより長い半減期は、哺乳類動物における上記抗体または抗体フラグメントのより高い血清力価をもたらし、従って、上記抗体または抗体フラグメントの投与頻度を低減し、および／または投与すべき上記抗体または抗体フラグメントの濃度を低減する。in vivo半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術により作製することができる。例えば、in vivo半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、FcドメインとFcRn受容体の間の相互作用に関わることが同定されているアミノ酸残基を改変する（例えば、置換、欠失または付加する）ことにより作製することができる。本発明の抗体は、Wardら（米国特許第6,277,375 B1号を参照）に記載された生物学的半減期を増加する方法により遺伝子操作することができる。例えば、本発明の抗体をFc-ヒンジドメインで遺伝子操作してin vivoまたは血清半減期を増加することができる。
【００９５】
半減期の増加した抗体またはそのフラグメントは、上記抗体または抗体フラグメントにポリマー分子、例えば高分子量ポリエチレングリコール（PEG）を結合することにより作製することができる。PEGを上記抗体または抗体フラグメントに、多機能性リンカーを用いてまたは用いないで、上記抗体または抗体フラグメントのN-またはC-端末にPEGの部位特異的複合を介して、またはリシン残基上のε-アミノ基を経由して結合することができる。生物学的活性の消失を最小限にする直鎖または分枝ポリマー誘導体化を利用する。複合の程度をSDS-PAGEおよび質量分析計によりによりきめ細かくモニターして、PEG分子と抗体の適当な複合を保証する。未反応PEGは抗体-PEG複合体から例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィにより分離することができる。
【００９６】
本発明の抗体はまた、哺乳類動物循環系中に実質的に免疫原性応答無しに注入できる組成物を得るために、Davisら（米国特許第4,179,337号を参照）に記載の方法およびカップリング剤により改変してもよい。
【００９７】
本発明はまた、フレームワークまたは可変域に突然変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）をもつ本発明の抗体のいずれかのアミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの使用も包含する。好ましくは、これらの抗体の突然変異は、免疫特異的に結合する特定の抗原に対する抗体のアビディティおよび／または親和性を維持するかまたは増強する。当業者に公知の標準技術（例えば、イムノアッセイ）を用いて特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【００９８】
本発明は、好ましくは、Fc域に抗体の１以上のFcγRとの結合親和性を変化させる改変を含む抗体を包含する。１以上のFcγRと変化した結合親和性をもつ抗体を改変する方法は当技術分野で公知であり、例えば、PCT公開公報WO 99/58572、WO 99/51642、WO 8/23289、WO 89/07142、WO 88/07089、ならびに米国特許第5,843,597号および第5,642,821号を参照すること、これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。本発明は、2003年1月9日出願の米国特許出願第60/439,498号、および2003年3月19日出願の米国特許出願第60/456,041号に開示された突然変異をいずれも包含し、これらはそれぞれ本明細書に参照により組み入れられる。いくつかの実施形態において、本発明は、FcγR、例えば、FcγRIIIAを活性化する親和性が変化した抗体を包含する。好ましくは、このような改変はまた、Fcを介するエフェクター機能の変化も有する。Fcを介するエフェクター機能に影響を与える改変は当技術分野では周知である（米国特許第6,194,551号を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。本発明の方法に従って改変することができるアミノ酸は、限定されるものでないが、プロリン329、プロリン331、およびリシン322を含む。好ましくは、プロリン329、331およびリシン322をアラニンにより置換するが、いずれか他のアミノ酸による置換も意図される。国際公開WO 00/42072および米国特許第6,194,551号を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【００９９】
ある特定の実施形態においては、Fc域の改変はFc域の１以上の突然変異を含む。Fc域の１以上の突然変異は改変された抗体を介するエフェクター機能、他のFc受容体（例えば、Fc活性化受容体）との改変された結合、改変されたADCC活性、または改変されたC1q結合活性、または改変された補体依存細胞傷害活性、またはそれらのいずれかの組合わせをもつ抗体をもたらす。
【０１００】
本発明はまた、変化したオリゴ糖含量をもつ抗体も提供する。本明細書に使用されるオリゴ糖は、２以上の単純な糖類を含有する糖鎖を意味し、本明細書においてこれらの２つの用語は互換的に使用することができる。本発明の糖鎖部分は、当技術分野で一般的に使用される命名法を参照して記載される。糖鎖化学の総説については、例えば、Hubbardら, 1981 Ann. Rev. Biochem., 50:555-583を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。この命名法では、例えば、Manはマンノースを表し；GlcNacは2-N-アセチルグルコサミンを表し；Galはガラクトースを表し；Fucはフコースを表し、そしてGlcはグルコースを表す。シアル酸は短縮記号により記載され、NeuNAcが5-N-アセチルノイラミン酸、そしてNeuNGcが5-グリコールノイラミン酸を表す。
【０１０１】
一般的に、抗体は糖鎖成分を重鎖定常域の保存された位置に含有し、ヒトIgGの30％まではグリコシル化Fab域を有する。IgGは単一のＮ結合したAsn297（CH2ドメインに存在する）において２本アンテナ（biantennary）の糖鎖構造を有する（Jefferisら, 1998, Immunol. Rev. 163:59-76；Wrightら, 1997, Trends Biotech 15:26-32）。ヒトIgGは典型的には次の構造の糖鎖を有する：GlcNAc(フコース)-GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)2。しかし、IgG間で糖鎖含量に変動があり、これが機能の変化をもたらし、例えば、Jassalら, 2001 Bichem. Biophys. Res. Commun. 288:243-9；Groeninkら, 1996 J. Immunol. 26:1404-7；Boydら, 1995 Mol. Immunol. 32:1311-8；Kumpelら, 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51を参照。本発明は、Asn297に結合した糖鎖成分に変化のある抗体を包含する。一実施形態においては、糖鎖成分は末端GlcNAcの片方または両方および／または第３のGlcNacアーム（２等分するGlcNac）にガラクトースおよび／またはガラクトース-シアル酸を有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は実質的に１以上の選択された糖基を含まず、例えば、１以上のシアル酸残基、１以上のガラクトース残基、１以上のフコース残基を含まない。実質的に１以上の選択された糖基を含まない抗体は、当業者に公知の通常の方法を用いて調製することができ、その方法は、選択された糖基を糖鎖成分に付加する能力を欠く宿主細胞中に例えば遺伝子組換えにより抗体の本発明の抗体を産生させ、組成物の抗体の約90〜100％が糖鎖成分と結合した選択された糖基を欠くようにする方法を含む。このような抗体を調製するための代わりの方法は、例えば、１以上の選択された糖基の付加を防止または低下する条件のもとでの細胞の培養、または１以上の選択された糖基の翻訳後の除去を含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明は組成中の抗体の約80-100％がその糖鎖成分上に、例えば、Asn297上に糖鎖結合フコースを欠くことを特徴とする、実質的に均一な抗体調製物を産生する方法を包含する。該抗体は、例えば、(a)フコース代謝に欠陥がありそこに発現されるタンパク質をフコシル化する能力の低下した、遺伝子操作で作った宿主細胞の使用；(b)フコシル化を防止または低減する条件のもとでの細胞の培養；(c)例えばフコシダーゼ酵素を用いるフコース翻訳後の除去；または(d)フコシル化されていない産物を選択する抗体の精製、により調製することができる。最も好ましくは、所望の抗体をコードする核酸を、そこに発現される抗体をフコシル化する能力の低下した宿主細胞において発現させることである。好ましい宿主細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、例えば、Lec13 CHO細胞（レクチン耐性CHO突然変異培養細胞株；Ribka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1):51-62；Ripkaら, 1986 Arch. Biochem. Biophys. 249(2):533-45）、CHO-K1、DUX-B11、CHO-DP12またはCHO-DG44であって、これらは抗体が実質的にフコシル化されないように改変されている。このように、細胞がフコシルトランスフェラーゼ酵素、または他の酵素、またはフコースをＮ結合オリゴ糖へ添加するのに関わる基質の改変された発現および／または活性を提示して、その結果、酵素が細胞中で低減した活性および／または低下した発現レベルを有するようにしてもよい。フコース含量の変化した抗体を産生する方法については、例えば、WO 03/035835およびShieldsら, 2002, J. Biol. Chem. 277 (30):26733-40を参照；両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態においては、糖鎖修飾の変化は、次の１以上をモジュレートする：抗体の可溶化、抗体のサブ細胞輸送および分泌の亢進、抗体アセンブリーの促進、コンフォメーション純度および抗体を介するエフェクター機能。特定の実施形態においては、糖鎖修飾の変化は、糖鎖修飾の無い抗体と比較して、抗体を介するエフェクター機能を増強する。抗体を介するエフェクター機能の変化をもたらす糖鎖修飾は当技術分野で周知である（例えば、Shields R. L.ら, 2001, J. Biol. CHEM. 277(30):26733-40；Davies J.ら, 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4):288-294を参照）。他の特定の実施形態においては、糖鎖修飾の変化は本発明の抗体のFcγRIIB受容体との結合を増強する。本発明の方法による糖鎖修飾の変化は、例えば、抗体の糖鎖含量増加または抗体の糖鎖含減少を含む。糖鎖含量を改変する方法は当業者に公知であり、例えば、Wallickら, 1988, Journal of Exp. Med. 168(3):1099-1109；Taoら, 1989 Journal of Immunology, 143(8):2595-2601；Routledgeら, 1995 Transplantation, 60(8):847-53 ；Elliottら 2003; Nature Biotechnology, 21:414-21；Shieldsら 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(30):26733-40を参照；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本発明は、１以上のグリコシル化部位を含み、１以上の糖鎖成分が抗体と共有結合した抗体を包含する。他の実施形態において、本発明はFc域に１以上のグリコシル化部位および１以上の修飾を含む抗体を包含し、先に開示した抗体および当業者に公知の抗体のとおりである。好ましい実施形態においては、Fc域の１以上の修飾は、野生型Fc域を含む抗体と比較して、FcγR、例えば、FcγRIIIAを活性化する抗体の親和性を増強する。Fc域に１以上のグリコシル化部位および／または１以上の修飾をもつ本発明の抗体は増強された抗体を介するエフェクター機能、例えば、増強されたADCC活性を有する。いくつかの実施形態において、本発明はさらに抗体の糖鎖成分と直接的にまたは間接的に相互作用することがわかっているアミノ酸の１以上の修飾を含む抗体を含み、それらのアミノ酸は限定されるものでないが、位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299、および301のアミノ酸を含む。抗体の糖鎖成分と直接的にまたは間接的に相互作用するアミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、Jefferisら, 1995 Immunology Letters, 44:111-7を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１０６】
本発明は１以上のグリコシル化部位を抗体の１以上の部位中に導入することにより、好ましくは抗体の機能性、例えば、FcγRIIBとの結合活性を変化させることなく改変されている抗体を包含する。グリコシル化部位を本発明の抗体の可変域および／または定常域中に導入することができる。本明細書に使用される「グリコシル化部位」は、抗体中のオリゴ糖（すなわち、お互いに連結された２以上の単糖を含有する糖鎖）が特異的にかつ共有結合により結合している相手のいずれか特定のアミノ酸配列である。オリゴ糖側鎖は典型的には抗体主鎖とＮまたはＯ結合のいずれかを経由して連結される。Ｎ結合グリコシル化はオリゴ糖成分のアスパラギン残基の側鎖との結合を意味する。Ｏ結合グリコシル化はオリゴ糖成分のヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンとの結合を意味する。本発明の抗体は１以上のグリコシル化部位を含んでもよく、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化部位を含む。当技術分野で公知のＮ結合またはＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を本発明に従って利用してもよい。本発明の方法に従って有用であるＮ結合グリコシル化部位の例は、アミノ酸配列：Asn-X-Thr/Ser（式中、Xはいずれのアミノ酸であってもよくかつThr/Serはトレオニンまたはセリンを示す）である。このような部位は、本発明が関わる技術分野で周知の方法を用いて、本発明の抗体中に導入することができる。例えば、「in vitro突然変異誘発、組換えDNA：短期過程（"In Vitro Mutagenesis" Recombinant DNA: A Short Course）」, J. D. Watson,ら W. H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp.106-116を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。本発明の抗体中にグリコシル化部位を導入する方法の例は、抗体のアミノ酸配列を修飾するか突然変異させて所望のAsn-X-Thr/Ser配列を得る方法であってもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明はグリコシル化部位を加えるかまたは欠失することにより本発明の抗体の糖鎖含量を改変する方法を包含する。抗体の糖鎖含量を改変する方法は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第6,218,149号；EP 0 359 096 B1；米国公開US 2002/0028486；WO 03/035835；米国公開US 2003/0115614；米国特許第6,218,149号；米国特許第6,472,511号を参照；これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の糖鎖含量を抗体の１以上の内因性糖鎖成分を欠失することにより改変する方法を包含する。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明の抗体のエフェクター機能を改変する方法であって、本明細書に開示したまたは当技術分野で公知の方法を用いて抗体の糖鎖含量を改変する上記方法を包含する。
【０１０９】
当業者に公知の標準技術を用いて抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができ、例えば、アミノ酸置換をもたらす位置指定突然変異およびPCRを介する突然変異が挙げられる。好ましくは、誘導体は、元来の抗体またはそのフラグメントと比較して、15アミノ酸未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸未満の置換、2アミノ酸未満の置換を含む。好ましい実施形態においては、誘導体は１以上の予定した非必須アミノ酸残基においてなされる保存アミノ酸置換を有する。
【０１１０】
本発明はまた、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％,または少なくとも99％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体またはそのフラグメントを包含する。本発明はさらに、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のCDRのアミノ酸配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％,または少なくとも99％同一である１以上のCDRのアミノ酸配列を含む上記抗体または抗体フラグメントを包含する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性の決定は、BLASTタンパク質サーチを含む当業者に公知のいずれの方法により決定してもよい。
【０１１１】
本発明はまた、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる上記抗体または抗体フラグメントの使用を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および／または可変重鎖のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる可変軽鎖および／または可変重鎖を含む上記抗体または抗体フラグメントを提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を有するクローン2B6または3H7により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のCDRのヌクレオチド配列とストリンジェントな状態下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる１以上のCDRを含む上記抗体またはそのフラグメントを提供する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、限定されるものでないが、フィルターに結合したDNAとの6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて１回以上の0.2xSSC／0.1％SDS中での約50-65℃における洗浄、高ストリンジェントな条件、例えばフィルターに結合したDNAとの6xSSC中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて１回以上の0.1xSSC／0.2％SDS中での約60℃における洗浄、または当業者に公知のいずれか他のストリンジェントな条件を含む（例えば、Ausubel, F. M.ら, 編 1989 「分子生物学の現行プロトコル（Current Prot
ocols in Molecular Biology）」, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY, at pages.6.3.1〜6.3.6および2.10.3を参照）、これらは本明細書に参照により組み入れられる。
【０１１２】
5.1.1  抗体複合体
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なポリペプチド；またはその部分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100アミノ酸のポリペプチド）と遺伝子組換えにより融合したまたは化学的に複合した（共有および非共有結合により複合した）抗体を包含する。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こってもよい。抗体を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または複合することにより、抗体を用いて、例えば異種ポリペプチドを特定の細胞型に、in vitroまたはin vivoでターゲティングしてもよい。異種ポリペプチドと融合したまたは複合した抗体はまた、当技術分野で公知の方法を用いて、in vitroイムノアッセイにおよび精製法に使用することができる。例えば、PCT公開WO 93/2 1232；EP 439,095；Naramuraら, Immunol. Lett., 39:91-99, 1994；米国特許第5,474,981号；Gilliesら, PNAS, 89:1428-1432, 1992；およびFellら, J. Immunol., 146:2446-2452, 1991を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１１３】
さらに抗体を治療薬または所与の生物学的応答を改変する薬物成分と複合させることができる。治療薬または薬物成分は古典的な化学治療薬に限定されると考えてはならない。例えば、薬物成分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、毒素例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素（すなわち、PE-40）、またはジフテリア毒素、リシン（ricin）、ゲロニン（gelonin）、およびヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルスタンパク質、タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、限定されるものでないが、α-インターフェロン（IFN-α）、β-インターフェロン（IFN-β）を含むインターフェロン、神経成長因子（NGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、アポトーシス薬（例えば、TNF-α、TNF-β、PCT公開WO 97/33899に開示されたAIM I）、AIM II（PCT公開WO 97/34911）、Fasリガンド（Takahashiら, J. Immunol., 6:1567-1574, 1994）、およびVEGI（PCT公開WO 99/23105）、血栓薬または抗血管形成薬（例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチン）、または生物学的応答改変剤、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）)、マクロファージコロニー刺激因子、（「M-CSF」）、または増殖因子（例えば、成長ホルモン（「GH」）；プロテアーゼ、またはリボヌクレアーゼが挙げられる。
【０１１４】
抗体をマーカー配列、例えばペプチドと融合して精製を容易にすることができる。好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配列はヘキサ-ヒスチジンペプチド、例えばとりわけ、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）として提供されるタグであり、これらの多くは市販されている。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824, 1989に記載の通り、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは融合タンパク質の精製を好都合にする。精製に有用な他のペプチドとしては、限定されるものでないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグルチニン"HA"タグ（Wilsonら, Cell, 37: 767 1984）および「フラグ」タグ（Knappikら, Biotechniques, 17(4):754-761, 1994）が挙げられる。
【０１１５】
本発明はさらに抗体フラグメントと融合または複合した異種ポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドをFabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、またはそれらの部分と融合または複合させることができる。ポリペプチドを抗体部分と融合または複合する方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら, 1991, PNAS 88:10535-10539；Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVilら, 1992, PNAS 89:11337-11341（上記参考文献は参照によりその全てが組み入れられる）を参照。
【０１１６】
さらなる融合タンパク質を、遺伝子-シャッフリング、モチーフ-シャッフリング、エキソン-シャッフリング、および／またはコドン-シャッフリング（まとめて「DNAシャッフリング」と呼ぶ）の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを用いて本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を改変することができる（例えば、さらに高い親和性およびさらに低い解離速度をもつ抗体またはそのフラグメント）。一般的には、米国特許第号5,605,793；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hansson,ら, 1999, J. Mol. Biol. 287:265；ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照(これらの特許および開示は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる)。抗体またはそのフラグメント、またはコードされた抗体またはそのフラグメントは、誤りがちなPCRによる無作為突然変異、無作為ヌクレオチド挿入または遺伝子組換え前の他の方法で処理することにより改変することができる。FcγRIIBと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１以上の部分を、１以上の異種分子のモチーフ、セクション、パーツ、ドメイン、フラグメントなどの１以上の成分と組換えることもできる。
【０１１７】
本発明はまた、診断もしくは治療薬または血清半減期の増加が所望されるいずれか他の分子と複合した抗体を包含する。抗体を診断に用いて、例えば、臨床試験操作の一部として疾患、障害または感染の発生または進行をモニターし、例えば所与の治療体制の効力を決定することができる。抗体を検出可能な物質とカップリングすることにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属が挙げられる。検出可能な物質を、直接的に抗体とまたは間接的に中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を介して、当技術分野で公知の技術によりカップリングまたは複合することができる。例えば、本発明による診断薬として使用する抗体と複合することができる金属イオンに対する米国特許第4,741,900号を参照。かかる診断および検出は、抗体を様々な酵素を含む検出可能な物質とカップリングすることにより実施することができ、それらの酵素としては、限定されるものでないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、塩基性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子団複合体、例えば、限定されるものでないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン；蛍光物質、例えば、限定されるものでないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン；蛍光物質、例えば、限定されるものでないが、ルミノール；生物発光物質、例えば、限定されるものでないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性物質、例えば、限定されるものでないが、ビスマス（213Bi）、炭素（14C）、クロム（51Cr）、コバルト（57Co）、フッ素（18F）、ガドリニウム（153Gd、159Gd）、ガリウム（68Ga、67Ga）、ゲルマニウム（68Ge）、ホルミウム（166Ho）、インジウム（115In、113In、112In、111In）、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、ランタン（140La）、ルテチウム（177Lu）、マンガン（54Mn）、モリブデン（99Mo）、パラジウム（103Pd）、リン（32P）、プラセオジム（142Pr）、プロメチウム（149Pm）、レニウム（186Re、188Re）、ロジウム（105Rh）、ルテニウム（97Ru）、サマリウム（153Sm）、スカンジウム（47Sc）、セレン（75Se）、ストロンチウム（85Sr）、硫黄（35S）、テクネチウム（99Tc）、タリウム（201Tl）、スズ（113Sn、117Sn）、トリチウム（3H）、キセノン（133Xe）、イッテルビウム（169Yb、175Yb）、イットリウム（90Y）、亜鉛（65Zn）；様々なポジトロン放出断層撮影に用いるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。
【０１１８】
抗体を、治療成分、例えば細胞毒（例えば、細胞増殖抑制または殺細胞薬）、治療薬または放射性元素（例えば、α線-エミッタ、γ線-エミッタなどと複合することができる。細胞毒または細胞傷害薬は、細胞に有害であるいずれかの薬剤である。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン,リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定されるものでないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロロジアミン白金(II)（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名称ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１１９】
さらに、抗体を治療成分、例えば放射性物質または大環状キレート剤（放射性金属イオン（上記放射性物質の例を参照）を複合するために有用である）と複合することができる。ある特定の実施形態においては、大環状キレート剤は、抗体とリンカー分子を経由して結合することができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"-テトラ酢酸（DOTA）である。このようなリンカー分子は当技術分野では公知であり、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943-50に記載されていて、それぞれ、参照によりその全てが組み入れられる。
【０１２０】
このような治療成分を抗体と複合する技術は周知であり、例えば、Amonら,「癌治療法における薬物の免疫ターゲティング用モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」, in 「モノクローナル抗体と癌治療法（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）」, Reisfeldら (編), 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.；Hellstromら,「薬物送達用の抗体（Antibody For Drug Delivery）」, in 「制御された薬物送達（Controlled Drug Delivery）」 (第2版), Robinsonら (編), 1987, pp.623-53, Marcel Dekker, Inc. )；Thorpe, 「癌治療法における細胞傷害薬の抗体担体：総説（Antibody Careeres  Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」, in 「モノクローナル抗体'84：生物学的および臨床応用（Monoclonal Angibodies '84 : Biological And Clinical Applications）」, Pincheraら (編), 1985, pp.475-506)；「癌治療法における放射性標識抗体の治療用途の分析、結果、ならびに将来予測（Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）」, in 「癌検出および治療用のモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy）」, Baldwinら (編), 1985, pp.303-16, Academic Press；and Thorpeら, Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を参照。
【０１２１】
複合した治療成分を伴うかまたは伴わない、単独でまたは細胞傷害性因子と組合わせて投与される抗体またはそのフラグメントを治療薬として用いることができる。
【０１２２】
あるいは、抗体を第２の抗体と複合して、米国特許第号4,676,980にSegalが記載した抗体へテロ複合体を作ることができる、この特許は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１２３】
抗体はまた固体支持体と結合してもよく、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。このような固体支持体としては、限定されるものでないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１２４】
5.2  本発明のモノクローナル抗体の免疫感作、スクリーニング、抗体の同定および特徴付け
モノクローナル抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いて調製することができ、それらは、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはそれらを組合わせた利用を含む。例えば、モノクローナル抗体は当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら, 「抗体：研究室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版. 1988)；Hammerling,ら, in: 「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）」, pp.563-681（Elsevier, N. Y., 1981）（これらは共に、参照によりその全てが組み入れられる）に教示の技術を含むハイブリドーマハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されるものでない。用語「モノクローナル抗体」は、いずれかの真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を意味するものであり、上記抗体が産生される方法を意味するものでない。
【０１２５】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生させかつスクリーニングする方法は日常的に行われかつ当技術分野で周知されている。限定されるものでない例においては、マウスを目的の抗原またはかかる抗原を発現する細胞を用いて免疫感作することができる。免疫応答が検出されれば、例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出されれば、マウス脾を採集して脾細胞を単離する。次いで脾細胞を周知の技術によりいずれかの適当な骨髄腫細胞と融合する。ハイブリドーマを選択しかつ限界希釈によりクローニングする。次いでハイブリドーマクローンを、抗原と結合できる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含有する腹水液は、マウス腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種して作製することができる。
【０１２６】
或る特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する方法であって、１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウス（米国特許第5,877,396号および米国特許第5,824,487号を参照）をヒトFcγRIIBの精製細胞外ドメイン、アミノ酸1-180を用いて免疫感作するステップ、上記マウスの脾細胞からハイブリドーマ培養細胞株を産生させるステップ、および上記ハイブリドーマ培養細胞株を、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ培養細胞株について、スクリーニングするステップを含む上記方法を提供する。他の特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIB、特にヒトFcγRIIBと特異的に結合するFcγRIIBモノクローナル抗体を産生する方法であって、さらに、精製したFcγRIIBまたはその免疫原性フラグメントを用いて１以上のFcγRIIAトランスジェニックマウスを免疫感作するステップ、上記マウスを免疫応答を誘発するのに十分な回数だけ追加免疫感作するステップ、上記１以上のマウスの脾細胞からハイブリドーマ細胞を産生させるステップ、およびFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマ培養細胞株について上記ハイブリドーマ培養細胞株をスクリーニングするステップを含む上記方法を提供する。本発明の一実施形態においては、上記マウスを、当技術分野で公知の免疫応答を増強するいずれかのアジュバントと混合されている精製FcγRIIBを用いて免疫感作する。本発明の方法で使用しうるアジュバントとしては、限定されるものでないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、全細菌（BCG、コリネバクテリウム（Corynebacterium）parvum種、サルモネラ（Salmonella）minnesota種）および細胞壁骨格を含む細菌成分、トレハロースジミコレート（trehalose dimycolate）、モノホスホリル脂質A、結核菌のメタノール抽出性残基（MER）、完全または不完全フロイントアジュバント；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、ヨード酢酸塩およびコレステリルヘミコハク酸塩；裸のDNAアジュバントが挙げられる。本発明の方法で使用しうる他のアジュバントとしては、コレラ毒素、パラポックス（parapox）タンパク質、MF-59（Chiron Corporation；Biegら, 1999, Autoimmunity, 31(1):15-24も参照、これは本明細書に参照により組み入れられる)、MPL（登録商標）（Corixa Corporation；また、Lodmell D. I.ら, 2000 Vaccine, 18:1059-1066；Ulrichら, 2000, Methods in Molecular Medicine, 273-282；Johnsonら, 1999, Journal of Medicinal Chemistry, 42:4640-4649；Baldridgeら, 1999 Methods, 19:103-107も参照、これらは全て本明細書に参照により組み入れられる）、RC-529アジュバント（Corixa Corporation；Corixa社のアミノアルキルグルコサミニド-4-リン酸（AGP）化学ライブラリーからのリード化合物、www. corixa. comも参照）、およびDETOXTMアジュバント（Corixa Corporation；DETOXTMアジュバントはMPL（登録商標）アジュバント（モノホスホリル脂質A）および放線菌細胞壁骨格を含む；Etonら, 1998, Clin. Cancer Res, 4(3):619-27；およびGubta R.ら, 1995, Vaccine, 13(14):1263-76も参照、これらは両方とも本明細書に参照により組み入れられる）が挙げられる。
【０１２７】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術により作製することができる。例えば、FabおよびF(ab')2フラグメントは、免疫グロブリン分子のタンパク分解切断により、パパイン（Fabフラグメントを作るため）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを作るため)などの酵素を用いて産生することができる。F(ab')2フラグメントは完全な軽鎖、ならびに重鎖の可変域、CH1域およびヒンジ域を含有する。
【０１２８】
例えば、抗体は当技術分野で公知の様々なファージディスプレイを用いて作製することができる。ファージディスプレイ法において、機能性抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面にディスプレイされる。特定の実施形態においてはこのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメイン、例えばFabおよびFvまたはジスルフィド結合安定化Fvをディスプレイすることができる。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、標識した抗原または固体表面もしくはビーズと結合したまたは捕獲された抗原を用いて、選択または同定することができる。この方法に使用されるファージは典型的にはfdおよびM13を含む繊維状ファージである。抗原結合ドメインはファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかと遺伝子組換えにより融合したタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン、またはそのフラグメントを作るために利用しうるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら, J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995；Amesら, J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；Kettleboroughら, Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994；Persicら, Gene, 187:9-18, 1997；Burtonら, Advances in Immunology, 57:191-280, 1994 ；PCT出願PCT/GB 91/01134 ；PCT公開WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/1 1236；WO 95/15982；WO 95/20401；および米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5,969,108号に記載された方法が挙げられ；これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１２９】
以上の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体、またはいずれか他の所望のフラグメントを含む全抗体を作製し、そして所望の宿主、例えば、以下に詳しく記載した哺乳類動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む所望の宿主に発現させることができる。例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを遺伝子組換えにより産生する技術も、当技術分野で公知の方法、例えば、PCT公開WO92/22324；Mullinaxら, BioTechniques, 12 (6):864-869, 1992；およびSawaiら, AJRI, 34:26-34, 1995；およびBetterら, Science, 240:1041-1043, 1988（これらはそれぞれ参照によりその全てが組み入れられる）に開示の方法を用いて利用することもできる。１本鎖Fvおよび抗体を産生させるために利用しうる技術の例は、米国特許第号4,946,778および5,258,498；Hustonら, Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991；Shuら, PNAS, 90:7995-7999, 1993；およびSkerraら, Science, 240:1038-1040, 1988に記載の技術を含む。
【０１３０】
ファージディスプレイ技術を用いてFcγRIIBに対する本発明の抗体の親和性を増加することができる。この技術は、本発明のコンビナトリアル方法に利用しうる高親和性抗体を得るのに有用でありうる。親和性成熟（affinity maturation）と呼ばれる技術は、FcγRIIBまたはその抗原性フラグメントを用いる突然変異誘発またはCDRウォーキングおよび再選択を使って、最初のまたは親抗体と比較したとき、より高い親和性で抗原と結合する抗体を同定する（例えば、Glaserら, 1992, J. Immunology 149:3903を参照）。単一ヌクレオチドよりむしろ全コドンを突然変異誘発すると、アミノ酸突然変異の半無作為レパートリーが得られる。それぞれが単一CDR中の単一アミノ酸変更だけ異なりかつそれぞれのCDR残基に対して可能なアミノ酸置換をそれぞれ示す変異体を含有する、変異体クローンのプールから成るライブラリーを構築することができる。固定した突然変異体を標識した抗原と接触させることにより、抗原と結合親和性が増加した突然変異体をスクリーニングすることができる。当技術分野で公知のいずれのスクリーニング方法を用いて、抗原に対するアビディティの増加した突然変異抗体を同定することができる（例えば、ELISA）（Wuら, 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037；Yeltonら, 1995, J. Immunology 155:1994を参照）。軽鎖を無作為化するCDRウォーキングも可能である（Schierら, 1996, J. Mol. Bio. 263:551を参照）。
【０１３１】
本発明の抗体を、エピトープマッピングによりさらに特徴付けて、FcγRIIAと比較してFcγRIIBに対する最大の特異性を有する抗体を選択することができる。抗体のエピトープマッピング法は当技術分野で周知であり、本発明の方法の範囲に包含される。ある特定の実施形態においては、FcγRIIBの１以上の領域を含む融合タンパク質を本発明の抗体のエピトープのマッピングに用いることができる。特定の実施形態においては、融合タンパク質は、ヒトIgG2のFc部分と融合したFcγRIIBのある領域のアミノ酸配列を含有する。それぞれの融合タンパク質は、アミノ酸置換および／または受容体のある特定領域の同族受容体由来の対応領域との置換え、例えば、以下の表２に示すようなFcγRIIAをさらに含んでもよい。pMGX125およびpMGX132はFcγRIIB受容体のIgG結合部位を含有し、前者はFcγRIIBのＣ端末と結合しかつ後者はFcγRIIAのＣ端末と結合するのでＣ端末結合を区別するために用いることができる。その他のものはIgG結合部位にFcγRIIA置換およびFcγIIAまたはFCγIIBのＮ端末に置換を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのを助けることができる。
【表２】
0004459810.tif 000003
【０１３２】
融合タンパク質を、本発明の抗FcγRIIB抗体との結合を確認する生物学的アッセイ、例えばELISAに用いることができる。他の実施形態においては、エピトープ特異性のさらなる確認を、FcγRIIA配列由来の残基と置換えられた特定の残基をもつペプチドを用いて行うことができる。
【０１３３】
本発明は、本発明の抗体の機能、特にFcγRIIBシグナル伝達をモジュレートする活性を同定するためのある特定の特徴付けアッセイを利用する本発明の方法により産生した抗体の特徴付けを包含する。例えば、本発明の特徴付けアッセイは、FcγRIIBのITIMモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定するかまたはＢ細胞受容体が行うカルシウム動員の抑制を測定することができる。本発明の特徴付けアッセイは細胞に基づくアッセイであってもまたは無細胞のアッセイであってもよい。
【０１３４】
当技術分野では、肥満細胞中のFcγRIIBの高親和性IgE受容体、FcεRIとの共凝集は抗原が誘導する脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の抑制をもたらすことが十分確立されている（Metcalfe D. D.ら 1997, Physiol. Rev. 77:1033；Long E. O. 1999 Annu Rev. Immunol 17:875）。このシグナル伝達経路の分子的詳細は最近解明されている（Ott V. L., 2002, J Immunol. 162(9):4430-9）。FcεRIと共凝集すると、FcγRIIBはそのITIMモチーフ中のチロシン上で速やかにリン酸化され、次いでSrc相同性-2含有イノシトール-5-ホスファターゼ（SHIP）、SH2ドメイン-含有イノシトールポリリン酸5-ホスファターゼを補充し、これが順にリン酸化されてShcおよびp62dokと結合する（p62dokは、アダプター分子のファミリーのプロトタイプであって、シグナル伝達ドメイン、例えばアミノ末端プレクストリン相同性ドメイン（PHドメイン）、PTBドメイン、およびPXXPモチーフおよび多数のリン酸化部位を含有するカルボキシ末端領域を含む）（Carpinoら, 1997, Cell, 88:197; Yamanshiら, 1997, Cell, 88:205）。
【０１３５】
本発明は、１以上のIgEを介する応答をモジュレートする本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けることを包含する。好ましくは、IgEに対する高親和性受容体およびFcγRIIBに対する低親和性受容体を同時発現する培養細胞株を、IgEを介する応答をモジュレートする上での本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けるのに使用しうる。特定の実施形態においては、ラット好塩基球性白血病培養細胞株（RBL-2H3；Barsumian E. L.ら 1981 Eur. J. Immunol. 11:317、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）由来の細胞を全長ヒトFcγRIIBによりトランスフェクトして、本発明に使用しうる。RBL-2H3はよく特徴づけられたラット培養細胞株であって、IgEを介する細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するために広く使われている。FcγRIIBは、RBL-2H3細胞に発現されかつFcεRIと共凝集すると、FcεRIが誘導するカルシウム動員、脱顆粒、およびサイトカイン産生を抑制する（Malbecら, 1998, J. Immunol. 160:1647；Daeronら, 1995 J. Clin. Invest. 95:577；Ottら, 2002 J. of Immunol. 168:4430-4439）。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗FcγRIIB抗体を、FcεRIが誘導する肥満細胞活性化の抑制について特徴づけることを包含する。例えば、FcγRIIBによりトランスフェクトされているラット好塩基球性白血病培養細胞株（RBL-H23; Barsumian E. L.ら 1981 Eur. J. Immunol. 11:317）由来の細胞をIgEを用いて感作し、ウサギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントにより刺激してFcεRIを単独で凝集させるか、または全ウサギ抗IgGにより刺激してFcγRIIBおよびFcεRIを凝集させる。この系において、下流シグナル伝達分子の間接モジュレーションを、感作および刺激した細胞に対する本発明の抗体の付加によりアッセイすることができる。例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化およびSHIPの補充とリン酸化、限定されるものでないが、ERKL、Erk2、JNK、またはp38を含むMAPキナーゼファミリーメンバーの活性化；ならびにP62dokのチロシンリン酸化およびSHIPおよびRasGAPとのその会合をアッセイすることができる。
【０１３７】
FcεRIが誘導する肥満細胞活性化の本発明の抗体による抑制を決定するアッセイの１つ例は、：RBL-H23細胞をヒトFcγRIIBを用いてトランスフェクトするステップ；RBL-H23細胞をIgEにより感作するステップ；ならびにRBL-H23細胞をウサギ抗マウスIgGのF(ab')2を用いて（対照として、FcεRIを単独で凝集させてFcERIを介するシグナル伝達を誘発する）、またはRBL-H23細胞を全長ウサギ抗マウスIgGを用いて（FcγRIIBとFcεRIを共凝集させてFcERIを介するシグナル伝達の抑制をもたらす）刺激するステップを含んでもよい。全ウサギ抗マウスIgG抗体により刺激されている細胞を、本発明の抗体とともにさらにインキュベートしてもよい。本発明の抗体とともにプレインキュベートされている細胞および本発明の抗体とともにプレインキュベートされていない細胞のFcεRIに依存する活性を測定し、そしてこれらの細胞におけるFcεRIに依存する活性のレベルを比較すると、本発明の抗体によるFcεRIに依存する活性のモジュレーションを示しうる。
【０１３８】
上記のアッセイの例を利用して、例えば、FcγRIIB受容体とのリガンド（IgG）結合をブロックするおよびFcγRIIBとFcεRIの共凝集を防止することによりFcγRIIBを介するFcεRIシグナル伝達の抑制を拮抗する抗体を同定することができる。このアッセイは同様に、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を増強するおよびFcγRIIBとFcεRIの共凝集を促進することによりFcγRIIBが介在するFcεRIシグナル伝達の抑制を作動する抗体を同定する。
【０１３９】
好ましい実施形態においては、FcεRIに依存する活性は、少なくとも１以上の次の活性である：下流シグナル伝達分子のモジュレーション（例えば、FcγRIIBのリン酸化状態のモジュレーション、SHIP補充のモジュレーション、MAPキナーゼ活性のモジュレーション、SHIPのリン酸化状態のモジュレーション、SHIPとShc会合のモジュレーション、P62dokのリン酸化状態のモジュレーション、P62AKとSHIP会合のモジュレーション、P62dokとRasGAP会合のモジュレーション、カルシウム動員のモジュレーション、脱顆粒、およびサイトカイン産生のモジュレーション、さらに他の好ましい実施形態においては、FcεRIに依存する活性はセロトニン放出および／または細胞外Ca++流入および／またはIgEに依存する肥満細胞活性化である。当業者にとって、FcγRIIBとFcεRIの共凝集はFcγRIIBチロシンリン酸化を刺激し、SHIPの補充を刺激し、SHIPチロシンリン酸化およびSHCとの会合を刺激し、そして、限定されるものでないが、Erk1、Erk2、JNK、p38を含むMAPキナーゼファミリーメンバーの活性化を刺激することは公知である。当業者にとって、FcγRIIBとFcεRIの共凝集はP62dokのチロシンリン酸化増強、およびそのSHIPおよびRasGAPとの会合を刺激することも公知である。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本発明の抗FcγRIIB抗体はIgEを介する応答をモジュレートするその能力について肥満細胞または好塩基球の脱顆粒を、好ましくは細胞に基づくアッセイでモニタリングおよび／または測定することにより特徴付けられる。好ましくは、このようなアッセイで用いる肥満細胞または好塩基球はヒトFcγRIIBを含有するように、当業者に公知の標準遺伝子組換え法で遺伝子操作により作製されている。特定の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はIgEを介する応答をモジュレートするその能力について、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ（顆粒に含有された酵素）放出アッセイにおいて特徴付けられる。肥満細胞と好塩基球からのβ-ヘキソサミニダーゼ放出は急性アレルギーおよび炎症症状における原発性の出来事である（Aketaniら, 2001 Immunol. Lett. 75:185-9；Aketaniら, 2000 Anal. Chem. 72:2653-8）。限定されるものでないが、セロトニンおよびヒスタミンを含む他の炎症性メディエーターの放出をアッセイして、本発明の方法に従ってIgEを介する応答を測定してもよい。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、例えば肥満細胞および好塩基球からのβ-ヘキソサミニダーゼを含有する顆粒の放出は細胞内カルシウム濃度に依存するプロセスであり、FcεRIの多価抗原との架橋により開始される。
【０１４１】
IgEを介する応答を媒介する本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けるためのアッセイの一例は、β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイであって、次のステップ：ヒトFcγRIIBによりRBL-H23細胞をトランスフェクトするステップ；マウスIgE単独によるまたはマウスIgEおよび本発明の抗FcγRIIB抗体による細胞を感作するステップ；細胞を様々な濃度のヤギ抗マウスF(ab)2、好ましくは0.03μg/mL〜30μg/mLにより約1時間刺激するステップ；上清を採集するステップ；細胞を溶解するステップ；および上清中に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を比色アッセイにより、例えばp-ニトロフェニル N-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いて測定するステップを含む上記アッセイである。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性は全活性に対する放出された活性のパーセントとして表現される。放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を測定して抗原単独；IgE単独；IgEと本発明の抗FcγRIIB抗体で処置した細胞と比較する。特定の作用機構により束縛されることを意図するのでないが、細胞をマウスIgE単独で感作してポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2フラグメントによりチャレンジすると、ポリクローナル抗体がFcεRIと結合したマウスIgEの軽鎖を認識するので、FcεRIの凝集と架橋が起こり；これが順に肥満細胞活性化および脱顆粒をもたらす。他方、細胞をマウスIgEと本発明の抗FcγRIIB抗体で感作してポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab)2フラグメントによりチャレンジすると、FcεRIとFcγRIIBの架橋が起こり、FcεRIが誘導する脱顆粒の抑制をもたらす。いずれの場合にも、ヤギ抗マウスF(ab)2は用量に依存するβ-ヘキソサミニダーゼ放出を誘導する。いくつかの実施形態においては、FcγRIIB受容体と結合しかつFcεRIと架橋した抗FcγRIIB抗体は抑制経路の活性化に影響を与えない、すなわち、抗FcγRIIB抗体の存在のもとで脱顆粒のレベルの変化はない。他の実施形態においては、抗FcγRIIB抗体は、抗FcγRIIB抗体が結合すると、抑制受容体、FcγRIIBのさらに強い活性化を媒介し、FcεRIとの効果的架橋およびホモ凝集したFcγRIIBの抑制経路の活性化を可能にする。
【０１４２】
本発明はまた、本発明の抗FcγRIIB抗体のIgEを介する細胞応答に対する効果の、当業者に公知の手法を使うカルシウム動員アッセイを用いる特徴付けを包含する。カルシウム動員アッセイの例は、次のステップ：好塩基球または肥満細胞をIgEにより感作するステップ；細胞をカルシウム指示薬、例えばFura2とともにインキュベートするステップ；上記のように細胞を刺激するステップ；ならびに、細胞内カルシウム濃度を例えばフローサイトメトリーを用いてモニタリングおよび／または数値化するステップを含んでもよい。本発明は、細胞内カルシウム濃度を当業者に公知の方法によりモニタリングおよび／または数値化するステップを包含する
好ましい実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体はIgEを介する細胞活性化を抑制する。他の実施形態においては、本発明の抗FcγRIIB抗体は、FcγRIIBにより調節される抑制経路をブロックするかまたはFcγRIIBに対するリガンド結合部位をブロックし、そして免疫応答を増強する。
【０１４３】
ヒト肥満細胞を研究する能力は好適な長期ヒト肥満細胞培養が存在しないことによって限定されている。最近、２種の新規の幹細胞因子依存性ヒトマスト培養細胞株（LAD1およびLAD2と呼ばれる）が肥満細胞肉腫患者由来の骨髄アスピレートから確立された（Kirshenbaumら,Leukemia research, 印刷中）。両方の培養細胞株はFcεRIと複数のヒト肥満細胞マーカーを発現することが記載されている。本発明は、IgEを介する応答に対する本発明の抗体の効果を評価するための本発明の方法におけるLAD1およびLAD2細胞の使用を包含する。特定の実施形態においては、細胞に基づくβ-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ、例えば上記のようなアッセイをLAD細胞に用いて、本発明の抗FcγRIIB抗体によるIgE-を介する応答のモジュレーションを決定することができる。アッセイの例においては、ヒト肥満細胞、例えば、LAD1をキメラヒトIgE抗ニトロフェノール（NP）を用いて初回刺激し、そしてBSA-NP、多価抗原、および細胞脱顆粒によりチャレンジし、上清中に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼを測定することによりモニターする（Kirshenbaumら, 2002, Leukemia research, 印刷中）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、もしヒト肥満細胞が、当技術分野で公知の標準方法例えば、FACS染色を用いて測定して、内在性FcγRIIBの低い発現を有すれば、本発明の抗FcγRIIB抗体を介する抑制経路の活性化の差異をモニターおよび／または検出することが困難でありうる。従って、本発明はFcγRIIB発現がサイトカインおよび特定の増殖条件を用いてアップレギュレートされうる代わりの方法を包含する。FcγRIIBはヒト単球培養細胞株、例えば、THP1およびU937において（Tridandapaniら, 2002, J. Biol. Chem., 277(7):5082-5089）および一次ヒト単球（Pricopら, 2001, J. of Immunol., 166:531-537）においてIL4により高度にアップレギュレートされることが記載されている。U937細胞のジブチリル環状AMPによる分化（differentiation）はFcγRIIの発現を増加することが記載されている（Cameronら, 2002 Immunology Letters 83,171-179）。従って、検出の感度を上げるために、本発明の方法に利用するヒト肥満細胞における内在性FcγRIIB発現を、サイトカイン、例えば、IL-4、IL-13を用いてアップレギュレーションしてもよい。
【０１４５】
本発明はまた、本発明の抗FcγRIIB抗体をＢ細胞受容体（BCR）を介するシグナル伝達の抑制に対する特徴付けも包含する。BCRを介するシグナル伝達は、Ｂ細胞の活性化および増殖、抗体産生などの少なくとも１以上の下流の生物学的応答を含む。FcγRIIBとBCRの共凝集は、細胞周期進行および細胞生存率の抑制をもたらす。さらに、FcγRIIBとBCRの共凝集はBCRを介するシグナル伝達の抑制をもたらす。
【０１４６】
具体的に、BCRを介するシグナル伝達は、次の少なくとも１以上を含む：下流シグナル伝達分子のモジュレーション、例えば、FcγRIIBのリン酸化状態、SHIP補充、Btkおよび／またはPLCZの局在化、MAPキナーゼ活性、（抗アポトーシスシグナル）の補充、カルシウム動員、細胞周期進行、および細胞増殖。
【０１４７】
FcγRIIBを介するBCRシグナル伝達の抑制の多数のエフェクター機能はSHIPを介して媒介されるが、最近、リポ多糖により活性化されたSHIP欠失マウス由来のＢ細胞はカルシウム動員、Ins(1,4,5)P3産生、およびErkおよびAktリン酸化の、有意なFcγRIIBを介する抑制を表すことが実証されている（Brauweiler A.ら, 2001, Journal of Immunology, 167(1):204-211）。従って、ex vivoでSHIP欠失マウス由来のＢ細胞を用いて本発明の抗体を特徴付けることができる。本発明の抗体によるBCRシグナル伝達のFcγRIIBを介する抑制を確認するアッセイの１つの例は、次のステップ：SHIP欠失マウスから脾Ｂ細胞を単離するステップ、上記細胞をリポ多糖を用いて活性化するステップ、および上記細胞をF(ab')2抗IgMにより刺激してBCRを凝集させるかまたは抗IgMにより刺激してBCRをFcγRIIBと共凝集させるステップを含みうる。無傷の抗IgMにより刺激してBCRがFcγRIIBと共凝集させた細胞を、さらに本発明の抗体とともにプレインキュベートすることができる。細胞のFcγRIIBに依存する活性を当技術分野で公知の標準技術により測定することができる。本発明の抗体とともにプレインキュベートしておいた細胞のFcγRIIBに依存する活性のレベルを、プレインキュベートしていない細胞と比較すると、レベルの比較はFcγRIIBに依存する活性の本発明の抗体によるモジュレーションを示しうる。
【０１４８】
FcγRIIBに依存する活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーによる細胞内カルシウム動員を測定するステップ、Aktおよび／またはErkのリン酸化を測定するステップ、BCRを介するPI（3,4,5）P3の蓄積を測定するステップ、またはFcγRIIBを介する増殖Ｂ細胞を測定するステップを含んでもよい。
【０１４９】
アッセイを用いて、例えば、FcγRIIB受容体に対するリガンド（IgG）結合部位をブロッキングすることにより、BCRシグナル伝達のFcγRIIBを介する抑制をモジュレートする、およびFcγRIIBとBCRの共凝集を防止することにより、BCRシグナル伝達のFcγRIIBを介する抑制を拮抗する抗体を同定することができる。アッセイを用いてまた、FcγRIIBとBCRの共凝集を増強する、およびBCRシグナル伝達のFcγRIIBが介在する抑制を作動する抗体を同定することもできる。
【０１５０】
本発明は、ヒト単球/マクロファージにおけるFcγRIIを介するシグナル伝達に対する本発明の抗FcγRIIB抗体を特徴付けることに関する。FcγRIIBの、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ITAM）を抱く受容体との共凝集は、SHIPをそのエフェクターとして用いるFcγRを介する食作用をダウンレギュレートするように作用する（Tridandapaniら 2002, J. Biol. Chem. 277(7):5082-9）。FcγRIIAのFcγRIIBとの共凝集は、FcγRIIBのITIMモチーフ上のチロシン残基の速やかなリン酸化をもたらし、SHIPのリン酸化、SHIPのShcとの会合、および120および60〜65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化を促進する。さらに、FcγRIIAのFcγRIIBとの共凝集は、細胞制御に関わりアポトーシスを抑制するセリン-トレオニンキナーゼであるAktのリン酸化のダウンレギュレーションをもたらす。
【０１５１】
本発明はさらに、本発明の抗FcγRIIB抗体を、ヒト単球/マクロファージにおけるそれらのFcγRが介在する食作用の抑制について特徴付けることを包含する。例えば、ヒト単球培養細胞株由来の細胞であるTHP-1を、FcγRIIBに対するマウスモノクローナル抗体IV.3のFabフラグメントおよびヤギ抗マウス抗体を用いて（FcγRIIA単独で凝集させるために）、または全IV.3マウスモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス抗体を用いて（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させるために）を用いて刺激してもよい。この系において、本発明の抗体を刺激された細胞に加えて、下流シグナル伝達分子のモジュレーション、例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化、SHIPのリン酸化、SHIPのShcとの会合、Aktのリン酸化、および120および60〜65kDaの分子量を有するタンパク質のリン酸化をアッセイしてもよい。さらに、単球培養細胞株のFcγRIIBに依存する食作用効率を本発明の抗体の存在および不在において直接測定してもよい。
【０１５２】
ヒト単球/マクロファージにおけるFcγRを介する食作用の本発明の抗体による抑制を確認するための他のアッセイの例は、次の操作：THP-1細胞を、IV.3マウス抗FcγRII抗体のFabおよびヤギ抗マウス抗体を用いて（FcγRIIA単独で凝集させてFcγRIIAを介するシグナル伝達を誘発するために）、またはマウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体を用いて（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させてFcγRIIAを介するシグナル伝達を抑制するために）を用いて刺激する操作を含んでもよい。マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体を用いて刺激されている細胞を、本発明の抗体とともにさらにプレインキュベートしてもよい。本発明の抗体とともにプレインキュベートされている刺激された細胞と本発明の抗体を用いてプレインキュベートされていない細胞のFcγRIIAに依存する活性を測定し、そしてこれらのFcγRIIAに依存する活性のレベルを比較すると、本発明の抗体によるFcγRIIAに依存する活性のモジュレーションが示されうる。
【０１５３】
上記のアッセイの例を利用して、例えば、FcγRIIB受容体とのリガンド結合をブロックするおよびFcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を防止することによりFcγRIIBを介するFcγRIIAシグナル伝達の抑制を拮抗する抗体を同定することができる。このアッセイは同様に、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を増強するおよびFcγRIIBとFcγRIIAの共凝集を促進することによりFcγRIIBが介在するFcγRIIAシグナル伝達の抑制を作動する抗体を同定する。
【０１５４】
本発明の他の実施形態において、本発明は、先に記載の方法（Tridandapaniら, 2000, J. Biol. CHEM. 275: 20480-7）による、THP-1細胞のフルオレセイン化IgG-オプソニン化されたヒツジ赤血球（SRBC）を貪食する能力を測定することによる、本発明の抗体の機能の特徴付けに関する。例えば、食作用を測定する例示のアッセイは：THP-1細胞を本発明の抗体を用いてまたはFcγRIIと結合しない対照抗体を用いて処理するステップ、上記細胞の活性レベルを比較し、細胞の活性の差（例えば、ロゼット形成（rosetting）活性（IgGコートされたSRBCを結合するTHP-1細胞の数）、接着活性（THP-1細胞と結合したSRBCの総数）、および食作用速度）が本発明の抗体によるFcγRIIAに依存する活性のモジュレーションを示すものであるステップから成る。このアッセイを用いて、例えば、FcγRIIB受容体のリガンド結合をブロックするおよび食作用のFcγRIIBを介する抑制を拮抗する抗体を同定することができる。このアッセイはまた、FcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIBを介する抑制を増強する抗体も同定することができる。
【０１５５】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体はヒト単球/マクロファージにおけるFcγRIIBに依存する活性を、少なくとも１以上の次の方法でモジュレートする：下流シグナル伝達分子のモジュレーション（例えば、FcγRIIBのリン酸化状態のモジュレーション、SHIPリン酸化のモジュレーション、SHIPおよびShc会合のモジュレーション、Aktのリン酸化のモジュレーション、さらなる120および60〜65kDa付近のタンパク質のリン酸化のモジュレーション）および食作用のモジュレーション。
【０１５６】
本発明は、治療抗体のエフェクター細胞機能に対する抗体の効果、例えば、治療抗体の腫瘍特異的ADCC活性を増強するそれらの能力を同定するための当業者に公知のアッセイを用いる、本発明の抗体の特徴付けを包含する。本発明の方法に従って使用しうる治療抗体としては、限定されるものでないが、抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、抗微生物抗体（例えば、細菌および単細胞寄生生物）が挙げられ、その例を本明細書（第5.4.6節）に開示する。特に、本発明は、本発明の抗体を、治療抗体、例えば腫瘍特異的モノクローナル抗体の、FcγRを介するエフェクター細胞機能に対するそれらの効果について特徴付けることを包含する。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例としては、限定されるものでないが、抗体に依存する細胞を介する細胞傷害性、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、C1q結合、および補体依存性細胞を介する細胞傷害性が挙げられる。当業者に公知のエフェクター細胞機能活性を決定するためのいずれの細胞に基づくまたは無細胞アッセイを用いてもよい（エフェクター細胞アッセイについては、Perussiaら, 2000, Methods Mol. Biol. 121:179-92；Baggioliniら, 1998 Experientia, 44(10):841-8；Lehmannら, 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2):229-42；Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45:147-64；Munnら, 1990 J. Exp. Med., 172:231-237、Abdul-Majidら, 2002 Scand. J. Immunol. 55:70-81；Dingら, 1998, Immunity 8:403-411を参照、これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０１５７】
本発明の抗体を、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞において、治療抗体のFcγRを介するADCC活性に対するそれらの効果について、当業者に公知の標準方法のいずれかを用いてアッセイすることができる（例えば、Perussiaら, 2000, Methods Mol. Biol. 121:179-92を参照）。本明細書に使用される用語「抗体に依存する細胞を介する細胞傷害性（Antibody-dependent cell-mediated cytotxicity）」および「ADCC」は、当技術分野で通常および慣用の意味を持ち、FcγRを発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞およびマクロファージなどの単球細胞）が標的細胞上の結合した抗体を認識して次いで標的細胞の溶解を起こす、in vitroの細胞を介する反応を意味する。原則として、いずれの活性化FcγRを持つエフェクター細胞もトリガーされるとADCCを媒介することができる。ADCCを媒介する初代細胞（primary cells）のNK細胞はFcγRIIIを単独に発現するであるが、単球は、活性化の状態、局在化、または分化の状態に依ってFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現することができる。造血性細胞に対するFcγR発現の総括については、例えば、Ravetchら, 1991, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92を参照すること、これは参照により本明細書にその全てが組み入れられる。
【０１５８】
エフェクター細胞の白血球は１以上のFcγRを発現してエフェクター機能を果たす。好ましくは、該細胞は少なくともFcγRIIIを発現してADCCエフェクター機能を果たす。本発明の方法に使用しうるエフェクター細胞は、限定されるものでないが、末梢血単核球（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞はその未変性供給源から、例えば本明細書に記載の血液またはPBMCから単離することができる。好ましくは、本発明のADCCアッセイに使用されるエフェクター細胞は、好ましくは正常なヒト血液から当業者に公知の標準方法を用いて、例えば、フィコール‐パーク（Ficoll-Paque）密度勾配遠心分離法を用いて精製した末梢血単核球（PBMC）である。例えば、PBMCを全血液をフィコール‐ハイパーク（Ficoll-Hypaque）上に層形成させることにより単離し、細胞を500gで室温にて30分間遠心沈降する。白血球層をエフェクター細胞として採集することができる。本発明のADCCアッセイに使用される他のエフェクター細胞は、限定されるものでないが、単球から誘導されるマクロファージ（MDM）を含む。本発明の方法でエフェクター細胞として使用されるMDMは、好ましくは凍結されたストックとして得るかまたは新鮮なものとして利用する（例えば、Advanced Biotechnologies, MDから）。最も好ましい実施形態においては、洗い分けられた（elutriated）ヒト単球を本発明のエフェクター細胞として使用する。洗い分けられたヒト単球は活性化受容体であるFcγRIIIAおよびFcγRIIAならびに抑制受容体であるFcγRIIBを発現する。ヒト単球は市販されていて、凍結されたストックとして得て、10％ヒトAB血清を含有する基本培地中でまたはヒト血清および25〜50ng/mL GM-CSFを伴う基本培地中で解凍してもよい。細胞中のFcγRの発現レベルは、例えば、FACS分析を用いて直接決定することができる。あるいは、FcγRIIBの発現レベルはマクロファージで増加するので、細胞をマクロファージに成熟させた後に染色する。FcγRの発現レベルを決定するのに使用しうる抗体は、限定されるものでないが、抗ヒトFcγRIIA抗体、例えばIV.3-FITC；抗FcγRI抗体、例えば32.2 FITC；および抗FcγRIIIA抗体、例えばCD16-PE、3G8を含む。最も好ましくは、MDMをIFNγを用いて刺激し、さらに培養中の単球の生存率を増強すると報じられるサイトカイン、例えばGM-CSFおよび／またはM-CSFの200単位/mLを用いて処理する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、IFNγはFcγR、特にFcγRIおよびFcγRIIIAの発現をアップレギュレートする。本発明の方法に使用するエフェクター細胞中の様々なFcγRの発現は、当業者に公知の方法を用いてFACS分析により決定することができる。
【０１５９】
本発明のADCCアッセイで使用される標的細胞は、限定されるものでないが、乳癌培養細胞株、例えば、ATCC受託番号HTB-30をもつSK-BR-3（例えば、Trempら, 1976, Cancer Res. 33-41を参照）；Ｂリンパ球；Burkittsリンパ腫から誘導される細胞、例えば、ATCC受託番号CCL-86をもつRaji細胞（例えば、Epsteinら, 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34:231-240を参照）、ATCC受託番号CCL-213をもつDaudi細胞（例えば、Kleinら, 1968, Cancer Res. 28: 1300-10を参照）；卵巣癌培養細胞株、例えば、OVCAR-3（例えば、Hamilton, Youngら、1983を参照）、SK-OV-3、PA-1、CAOV3、OV-90、およびIGROV-1（NCIレポジトリーから入手しうる；Benardら, 1985, Cancer Research, 45:4970-9；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）が挙げられる。標的細胞はアッセイする抗体の抗原結合部位により認識されなければならない。本発明の方法に使用する標的細胞は、癌抗原の低度、中度、または高度の発現レベルを有してもよい。癌抗原の発現レベルは、通常の当業者に公知の方法、例えば、FACS分析を用いて決定することができる。例えば、本発明は、Her2/neuが色々なレベルで発現される卵巣癌細胞、例えばIGROV-1（Her2/neuの低度の発現を特徴とする）またはOVCAR-3（Her2/neuの高度の発現を特徴とする）の使用を包含する。本発明の方法に標的細胞として使用しうる他の卵巣癌培養細胞株は、OVCAR-8（Hamiltonら, 1983, Cancer Res. 43:5379-89、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）；BT-549、MCF7、およびHS578Tを含み、これらは全てNCIレポジトリーから入手しうる。
【０１６０】
本発明の抗体の治療抗体のADCC活性に対する効果を決定するアッセイの例は、51Cr放出アッセイに基づくものであり：標的細胞を[51Cr]NA2CrO4（この細胞膜浸透性分子は細胞質タンパク質と結合して自発的に細胞から遅い速度で放出されるが、標的細胞壊死後には大量に放出されるので通常標識付けに用いられる）を用いて標識するステップ；好ましくは、標的細胞が１以上の腫瘍抗原を発現して、標的細胞の細胞表面上に発現された腫瘍抗原と免疫特異的に結合する１以上の抗体により標的細胞をオプソニン化するステップ；本発明の抗体、例えば、2B6、3H7の存在または不在のもとで、オプソニン化され放射標識された標的細胞を、マイクロタイタープレートにおいて標的細胞対エフェクター細胞の好適な比でエフェクター細胞と組合わせるステップ；細胞の混合物を好ましくは16〜18時間、好ましくは37℃でインキュベートするステップ；上清を採集するステップ；および上清サンプル中の放射活性を分析するステップを含むものである。次いで本発明の抗体の存在または不在のもとでの治療抗体の細胞傷害性を、例えば、次式：％溶解＝（実験cpm−標的漏れcpm）/（界面活性剤溶解cpm−標的漏れcpm）x100％、あるいは、％溶解＝（ADCC-AICC）/（最大放出−自発性放出）を用いて決定することができる。特異的溶解は式：特異的溶解＝本発明の分子を用いる％溶解−本発明の分子の不在での％溶解、を用いて計算することができる。グラフを、標的：エフェクター細胞比または抗体濃度を変えることによって作ることができる。
【０１６１】
さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、抗体に依存する細胞の細胞傷害性（ADCC）に対して、先に記載された方法（例えば、Dingら, Immunity, 1998 ,8:403-11を参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に従い特徴付けられる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本発明はin vitroに基づくアッセイおよび／または動物モデルで治療抗体のADCC活性を増強する本発明の抗体の機能を特徴付けることを包含する。
【０１６３】
特定の実施形態において、本発明は卵巣癌モデルおよび／または乳癌モデルを用いて特定の腫瘍特異的ADCCを増強する本発明の抗体の機能を決定することを包含する。
【０１６４】
好ましくは、本発明のADCCアッセイは、使用される癌培養細胞株の間で癌抗原の発現レベルが様々である少なくとも1つの癌抗原の発現により特徴付けられる、２以上の癌培養細胞株を用いて実施する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、癌抗原の発現レベルが様々である２以上の培養細胞株におけるADCCアッセイの実施は、本発明の抗体の腫瘍クリアランスのストリンジェンシーの決定を可能にしうる。一実施形態においては、本発明のADCCアッセイは第１の癌培養細胞株と第２の癌培養細胞株を含む２つの癌培養細胞株を用いて実施し、ここで第１の癌培養細胞株は癌抗原の高度の発現レベルにより特徴付けられ、そして第２の癌培養細胞株は癌抗原の低度の発現レベルにより特徴付けられる。
【０１６５】
例示のアッセイにおいては、OVCAR3、卵巣癌培養細胞株が腫瘍抗原、Her2/neuおよびTAG-72を発現する腫瘍標的として役立ちうる；活性化FcγRIIAおよび抑制FcγRIIBを発現するヒト単球をエフェクターとして使用しうる；そして腫瘍特異マウス抗体、4D5およびCC49を腫瘍特異的抗体として使用しうる。OVCAR-3細胞はATCCから入手しうるしかつ複合化学治療の後に卵巣の進行性乳頭状腺癌を患う患者の悪性腹水から誘導することができる。Hamilton, Young,ら, 1983。好ましくは、OVCAR-3細胞を0.01mg/mlウシインスリンを補充した培地中で拡大する。2x106生OVCAR-3細胞を、年齢と体重に整合したNOD-SCIDかつヌード胸腺欠損マウス中にMatrigel（Becton Dickinson）を用いて皮下（s.c）に注入してもよい。腫瘍の推定重量は式：長さx（幅）2/2により計算することができて、好ましくは3グラムを超えない。足場に依存する腫瘍を6〜8週後に単離し、腫瘍1グラム当たり1μgのコラゲナーゼ（Sigma）を加えることにより、細胞を一夜インキュベーション後に解離させることができる。次いで細胞を腹腔内注射して異種移植モデルを確立し、そして、本明細書に記載のとおり、本発明の抗FcγRIIB抗体による腫瘍特異的抗体、例えば、CC49と4D5のADCCの増強を試験するためのADCCアッセイの標的として試験することができる。
【０１６６】
CC49と4D5抗体を分泌するハイブリドーマは、ATCCから入手しうるしかつ重鎖の軽鎖ヌクレオチド配列は公知である（Ricon, Gourlieら, 1993；Carter, Preserら, 1992）。好ましくは、4D5とCC49抗体を当業者に公知の標準方法を用いてキメラ化し、ヒトFc配列、例えば、IgG1のヒト定常域をマウス抗体の可変域にグラフトしてエフェクター機能を与える。キメラ4D5およびCC49抗体はそれらの可変域を経由して標的培養細胞株とおよびFc域を経由してヒトエフェクター細胞上に発現されるFcγRと結合する。CC49はTAG-72；腺癌細胞および卵巣癌上に高度に発現される多数の高分子量ムチンを指向する（Lastroriaら, 1998；Szpakら, 1989；Sheerら, 1988）。4D5はHer2/neu、上皮増殖因子受容体を指向する（Carterら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-9）。次いで本発明の抗体を利用して、抑制FcγRIIBのブロッキングによる腫瘍特異的抗体のADCC活性の増強を研究することができる。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、少なくとも１つの活性化FcγR、例えば、FcγRIIAを発現するエフェクター細胞が活性化すると抑制受容体（FcγRIIB）の発現が増強され、FcγRIIAのADCC活性が抑制されるのでこれが腫瘍のクリアランスを制限する。しかし、本発明の抗体はブロッキング抗体、すなわち、抗体として役立って抑制シグナルが活性化されるのを防止し得るので、従って活性化シグナル、例えば、ADCC活性が長期間持続されてさらに強力な腫瘍のクリアランスをもたらしうる。
【０１６７】
好ましくは、ADCCアッセイに使用する本発明の抗体を改変して少なくとも１つのアミノ酸改変を含ませて、そのエフェクター機能を減少し、最も好ましくは廃止する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体を改変してADCCアッセイに使用する本発明の抗体を改変して少なくとも１つのアミノ酸改変を含ませて、活性化FcγR、例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAとの結合を低減する一方、本発明の野生型抗体と比較して最大限のFcγRIIBブロッキング活性を保持する。本発明の抗体を当業者に公知のまたは本明細書に開示したいずれの方法によって改変してもよい。エフェクター機能を破壊することが公知のいずれのアミノ酸改変を本発明の方法に従って用いてもよい。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体を、位置265が改変される、例えば、位置265がアラニンと置換されるように改変する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体のマウス定常域を位置265のアミノ酸のアラニンとの置換を含む対応するヒト定常域と交換して、エフェクター機能を廃止する一方、FcγRIIBブロッキング活性を維持する。ELISAアッセイに基づいて、IgG1重鎖の位置265の単一アミノ酸変化はFcγRとの結合を有意に低減し、腫瘍質量の低減をもたらすことが示されている（Shieldsら、2002およびClynesら、2000）。他の実施形態においては、本発明の抗体を改変して位置297を改変する、例えば、位置297をグルタミンと置換して、Ｎ結合グリコシル化部位を消失させる（Sheildsら、2001；Sondermannら、2000；Jefferisら、1995を参照、これらは全て本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。この部位における改変はFcγRとの全ての相互作用を廃止すると報じられている。好ましい実施形態においては、本発明の抗体のマウス定常域を、位置265および／または297のアミノ酸の置換を含む対応するヒト定常域と交換し、エフェクター機能を廃止する一方、FcγRIIBブロッキング活性を維持する。
【０１６８】
本発明の抗体の存在または不在のもとで腫瘍特異的抗体のADCC活性を決定するアッセイの例は、非放射性ユウロピウムに基づく蛍光アッセイ（BATDA、Perkin Elmer）であり、次のステップ：標的細胞を、エステルの加水分解により細胞膜と親水性リガンドを形成するアセトキシルメチルエステルの蛍光増強エステル（TDA）を用いて標識するステップ；この複合体は細胞を離れられず、エフェクターによる細胞が溶解するときだけ放出されるステップ；エフェクター細胞に対する標識した標的を、抗腫瘍抗体と本発明の抗体の存在のもとで加えるステップ；標的とエフェクター細胞の混合物を6〜16時間、好ましくは37℃にてインキュベートするステップを含むものであってもよい。ADCC活性の程度は、放出されてユウロピウム（DELFIA試薬；PerkinElmer）と相互作用するリガンドの量を測定することによってアッセイすることができる。リガンドとユウロピウムは、非常に安定な高度に蛍光性のキレート（EuTDA）を生成し、測定される蛍光は溶解される細胞数に正比例する。パーセント比溶解を式：（実験溶解−自発性溶解／全溶解−自発性溶解）x100％により計算することができる。ADCCアッセイにおいて、NK活性はウサギ抗アシアロGM1抗体（WAKO Pure chemical, Richmond, VA）のF(ab)2を用いて排除しうる。このin vitroアッセイを対照に用いて、本明細書に記載のin vivo腫瘍クリアランスモデルに対する条件を確立することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態においては、もし蛍光に基づくADCCアッセイの感度が治療抗体のADCC活性を検出するのに低すぎれば、本発明は放射性に基づくADCCアッセイ、例えば51Cr放出アッセイを包含する。放射性に基づくアッセイを、蛍光に基づくADCCアッセイの代わりにまたは組合わせて実施してもよい。
【０１７０】
本発明の抗体を特徴付けるための51CR放出アッセイの例は、次のステップ：2x106OVCAR-3細胞を50μCi51CRを用いて12時間標識するステップ；細胞をトリプシン処理するステップ；5x103細胞を96ウエルプレートに加えるステップ；標的細胞を抗体4D5とCC49を用いて本発明の抗体の存在および不在のもとで特定の濃度で（好ましくは4D5とCC49は1〜15μg/mLの様々な濃度である）オプソニン化するステップ；オプソニン化された標的細胞を単球由来のマクロファージ（MDM）（エフェクター細胞）に、好ましくは10:1〜100:1の様々な比で加えるステップ；細胞の混合物を16-18時間37℃にてインキュベートするステップ；上清を回収するステップ；および上清の放射活性を分析するステップを含むものであってもよい。次いで、本発明の抗体の存在および不在のもとでの4D5とCC49の細胞傷害性を、例えば、次式：％溶解＝（実験cpm−標的漏れcpm）/（界面活性剤溶解cpm−標的漏れcpm）x100％、あるいは、％溶解＝（ADCC-AICC）/（最大放出−自発性放出）を用いて決定することができる。特異的溶解は式：特異的溶解＝本発明の分子を用いる％溶解−本発明の分子の不在での％溶解、を用いて計算することができる。グラフを、標的：エフェクター細胞比または抗体濃度を変えることによって作ることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、蛍光に基づくADCCアッセイおよび／または放射性に基づくADCCアッセイが本発明の抗体の存在のもとで治療抗体のADCC活性を検出するのに十分な感度がないときは、本発明は、先に記載された単球を介する細胞傷害性アッセイを包含する（Kleinerman、Gano,ら、1995）。IFN-γはin vitroで単球を初回免疫すると殺腫瘍性になることが示されている（Adams & Marino 1981）。いくつかの実施形態においては、もしユウロピウムに基づくアッセイと51Cr放出アッセイの両方でADCC活性の検出ができなければ、OVCAR-3細胞と活性化単球を用いる単球を介する細胞傷害性アッセイの改変法を使用しうる。単球を介する細胞傷害性アッセイの例は次のステップ：指数増殖期の腫瘍細胞を一夜0.5μCi3[H]チミジンとともにインキュベートするステップ；細胞を洗浄して未結合標識を除去するステップ；細胞をトリプシン処理するステップ；標識した標的細胞を接着性IFNγ-活性化単球（エフェクター細胞）に100:1〜10:1の様々なエフェクター：標的比で24時間、好ましくは37℃にて加えるステップ；非接着性細胞を除去するステップ；細胞に新鮮培地を再供給するステップ；および細胞をさらに2日間培養するステップを含むものであってもよい。好ましくはアッセイを、抗体の不在で、1〜15μg/mL抗腫瘍抗体の存在で、および活性化単球とともに、抗FcγRIIB抗体（1〜15μg/mL）とプレインキュベートしてまたは抗FcγRIIB抗体および腫瘍細胞と共インキュベートして実施する。好ましくはアッセイを、無処理単球を用いて平行して実施する。溶解物の放射活性は、式：［単球および抗体とともに培養した標的細胞の放射活性（cpm）-IFNγと抗体の存在で単球とともに培養した標的細胞の放射活性］／単球および抗体とともに培養した標的細胞の放射活性 x 100により決定することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態においては、本発明のFcγRIIB抗体のin vivo活性は異種移植ヒト腫瘍モデルで決定する。腫瘍は前記の癌培養細胞株のいずれかを用いて確立することができる。いくつかの実施形態においては、腫瘍を、癌抗原の低度の発現を特徴とする第１の癌培養細胞株と同じ癌抗原の高度の発現を特徴とする２つの癌培養細胞株を用いて確立しうる。次いで、腫瘍クリアランスを当業者に公知の方法を用いて、第１および第２の癌培養細胞株上の癌抗原と免疫特異的に結合する抗腫瘍抗体、および適当なマウスモデル、例えば、Balb/cヌードマウスモデル（例えば、Jackson Laboratories, Taconic）を用いて、養子性で伝達したヒト単球およびMDMをエフェクター細胞として用いて決定することができる。次いで前記の抗体のいずれかをこの動物モデルで試験して腫瘍クリアランスにおける本発明の抗FcγRIIB抗体のトール（tole）を評価することができる。
【０１７３】
本発明の抗体のin vivo活性を試験する方法の例は、次のステップ：癌抗原の発現を特徴とする癌培養細胞株を用いる異種移植マウスモデルを確立するステップ、および、腫瘍クリアランスを媒介する上で、癌培養細胞株に発現される癌抗原に特異的な抗体に対する本発明の抗体の効果を決定するステップを含んでもよい。好ましくは、そのin vivo活性を、第１の癌培養細胞株は低レベルで発現される第１の癌抗原で特徴付けられかつ第２の癌培養細胞株は第１の癌培養細胞株と比較して高いレベルで発現される同じ癌抗原により特徴付けられる２つの癌培養細胞株を用いて平行して試験する。従って、これらの実験は腫瘍クリアランスにおける本発明の抗体の役割の評価の厳格性を増加しうる。例えば、腫瘍をIGROV-1培養細胞株を用いて確立し、そしてHer2/neu特異的抗体の腫瘍クリアランスにおける本発明の抗FcγRIIB抗体の効果を評価してもよい。マウスを４のグループに配置して毎週３回モニターしてもよい。異種移植腫瘍モデルを確立するために、5x106の生細胞、例えば、IGROV-1、SKBR3を、例えばマウス、例えば、３つの年齢および体重の整合した雌性ヌード胸腺欠損マウスに、例えばMatrigel（Becton Dickinson）を用いて皮下注射してもよい。腫瘍の推定重量は式：長さx（幅）2/2により計算することができて、好ましくは3グラムを超えない。拡大のための細胞のin vivo継代については、足場に依存する腫瘍を単離し、その細胞を、コラゲナーゼを好ましくは腫瘍1グラム当たり1μg加えることにより、37℃で解離させることができる。皮下経路によるIGROV-1細胞の注射が好ましい。IGROV-1細胞の皮下注射は速く増殖する腫瘍を生じる一方、腹腔内経路は腹膜癌腫症を誘導してマウスが2ヶ月で死亡する（Benardら, 1985, Cancer Res. 45: 4970-9）。IGROV-1細胞は５週以内に腫瘍を形成するので、腫瘍細胞注射後の第1日にエフェクターとしての単球を、Her2/neuに特異的な治療抗体、例えばCh4D5および本発明の抗体；例えば前記キメラ2B6または3H7とともに、腹腔内に同時注射する。好ましくは、抗体は、マウス体重（mbw）1グラム当たりそれぞれ4μgを注射する。最初の注射の後、抗体の注射は毎週、その後は４〜６週間行う。ヒトエフェクター細胞を２週に１回補充する。マウスの１グループは治療抗体を受給しないが、それぞれ抗腫瘍および抗FcγRIIB抗体に対するアイソタイプ対照抗体としてN297A突然変異体を含むキメラ4D5およびヒトIgG1を注射するであろう。
【０１７４】
以下の表３は、本発明による腫瘍クリアランス研究のセットアップの例である。表３に示すように、６グループで全48マウスそれぞれが本発明の抗体の腫瘍クリアランスにおける役割を、１つの標的とエフェクター細胞組み合わせを用いておよび２つの異なる組み合わせの抗体濃度を用いて試験するために必要であろう。グループＡでは腫瘍細胞だけを注射し；グループＢでは腫瘍細胞と単球を注射し；グループＣでは腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体（ch4D5）を注射し；グループＤでは腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体、および抗FcγRIIを注射し；グループＥでは腫瘍細胞、単球および抗FcγRIIB抗体を注射し；グループＦでは腫瘍細胞、単球、Ch4D5（N297A）、およびヒトIgG1を注射する。当業者は様々な抗体組合わせの様々な抗体濃度を、記載した腫瘍モデルで試験できることを理解するであろう。好ましくは、乳癌培養細胞株、例えばSKBR3を用いる研究を上記実験と平行して実施する。
【表３】
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【０１７５】
異種移植腫瘍モデルの終点は、腫瘍のサイズ、マウスの体重、生存時間および癌の組織化学的および組織病理学的試験に基づいて、当業者に公知の方法を用いて決定する。表３のマウスのグループをそれぞれ評価するであろう。好ましくはマウスを週３回モニターする。腫瘍増殖の判定基準は、腹部膨張、腹腔の明白なマス（mass）の存在であってもよい。好ましくは腫瘍重量対接種後日数の推定を計算するであろう。他のグループと比較したグループＤのマウスの上記判定基準の比較が、腫瘍クリアランスの増強における本発明の抗体の役割を規定するであろう。好ましくは、抗体で処置した動物は、対照グループ後さらに２ヶ月観察下に置かれるであろう。
【０１７６】
代わりの実施形態においては、養子性で移すエフェクター細胞よりむしろ、マウスエフェクター細胞上にヒトFcγRIIBを発現するヒトFcγRIIB「ノックイン」マウスを本発明の抗体のin vivo活性を確立するために用いることができる。ヒトFcγRIIBを発現する創立者マウスはヒトFcγRIIBのマウスFcγRIIB遺伝子座への「ノックイン」により作製することができる。次いで創立者をヌードバックグラウンド上に戻し交配することができ、ヒトFcγRIIB受容体を発現しうる。得られるマウスエフェクター細胞は内因性の活性化FcγRIAおよびGcγRIIIAならびに抑制ヒトFcγRIIB受容体を発現しうる。
【０１７７】
本発明の抗体のin vivo活性をさらに、異種移植マウスモデルでヒト一次腫瘍由来の細胞、例えば、ヒト一次卵巣および乳癌由来の細胞を用いて試験してもよい。癌患者からの腹水および胸膜の浸出液サンプルをHer2/neuの発現について当業者に公知の方法を用いて試験してもよい。卵巣癌患者からのサンプルを6370gで20分間4℃にて腹水を遠心沈降することにより処理し、赤血球を溶解し、そして細胞をPBSにより洗浄してもよい。腫瘍細胞においてHer2/neuの発現が確認されると、異種移植腫瘍モデルを確立するための皮下接種用に２つのサンプル、メジアンおよび高い発現細胞を選択してもよい。次いで単離された腹水をマウス中に腹腔内注射して細胞を拡大する。ほぼ10マウスに腹腔内注射し、それぞれのマウス腹水をさらに２マウスに継代して全20マウスから腹水を取得し、それを用いて80マウスのグループを注射することができる。胸膜浸出液サンプルを腹水と類似の方法を用いて処理してもよい。胸膜浸出液サンプルからのHer2/neu+腫瘍細胞をマウスの右および左の乳パッド中に注射してもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態においては、もし腹水または胸膜浸出液サンプル中の新生物細胞のパーセントが他の細胞サブセットと比較して低ければ、新生物細胞をin vitroで拡大してもよい。他の実施形態においては、腫瘍細胞をCC49抗体（抗TAG-72）でコーティングした磁性ビーズを用いて先に記載の通り精製してもよく、例えば、Barkerら, 2001, Gynecol. Oncol. 82:57,63を参照、これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。簡単に説明すると、CC49抗体でコーティングした磁性ビーズを用いて卵巣腫瘍細胞を分離し、これをビーズから37℃にて一夜インキュベーションにより脱着することができる。いくつかの実施形態においては、もし腫瘍細胞がTAG-72抗原を欠くのであれば、抗体カクテル、例えば、Stem Cell Technologies, Inc.（カナダ）が提供する抗体カクテルを用いるネガティブ除去（negarive depletion）を利用して腫瘍細胞を濃縮してもよい。
【０１７９】
他の実施形態においては、Her2/neuに加え、他の腫瘍マーカーを用いて非腫瘍細胞からの腹水および胸膜浸出液サンプルから得られる腫瘍細胞を分離することができる。胸膜浸出液または乳組織の場合、最近、CD44（接着分子）、B38.1（乳癌／卵巣癌特異マーカー）、CD24（接着分子）をマーカーとして利用しうることが報じられている、例えば、Al Hajj,ら, 2003, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 100:3983,8を参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。腫瘍細胞が精製されると、これをマウス中に皮下注射して拡大することができる。
【０１８０】
好ましくは、患者の腹水および胸膜浸出液に免疫組織化学および組織化学を実施し、異常増殖の構造的特徴を分析する。このような方法は当業者に公知であって、本発明に包含される。モニターしうるマーカーは、例えばサイトケラチン（炎症性および間葉細胞からの卵巣新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2neu陽性新生物細胞から中皮細胞を分離するため）；およびCD45（サンプル中の細胞集団の残りから炎症性細胞を分離するため）を含む。続いてのさらなるマーカーは、CD3（Ｔ細胞）、CD20（Ｂ細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）を含む。当業者は、上記の免疫組織化学および組織化学的方法が、本発明の方法に用いるいずれの腫瘍細胞に対しても同様に応用されることを理解するであろう。腫瘍細胞の皮下接種後に、マウスの臨床および解剖学的変化を行う。必要により、マウスを剖検して全腫瘍負荷を特定の器官局在化と関係づけてもよい。
【０１８１】
特定の実施形態においては、腫瘍をOVCAR-3細胞およびヒト卵巣癌腹水を用いて確立する。腹水は好ましくは試験する抗体に対するエフェクターと腫瘍標的の両方を含有する。OVCAR-3培養細胞株は好ましくは単球をエフェクターとして移す。次いで両方のこれらの卵巣腫瘍の供給源を養子性でNOD/SCIDおよびヌードマウスに移し、そして腫瘍クリアランスを腫瘍特異的抗体と本発明の抗FcγRIIB抗体を用いて決定することができる。
【０１８２】
好ましくは、OVCAR-3細胞を、0.01mg/mlウシインスリンを補充した培地中で拡大する。
【０１８３】
2x106生OVCAR-3細胞を、年齢および体重に整合したNOD-SCIDおよびヌード胸腺欠損マウス中にマトリゲル（Matrigel）（Becton Dickinson）とともに皮下注射してもよい。腫瘍の推定重量は式：長さx（幅）2/2により計算することができて、好ましくは3グラムを超えない。足場に依存する腫瘍を6〜8週後に単離し、腫瘍1グラム当たり1μgのコラゲナーゼ（Sigma）を加えることにより、細胞を一夜インキュベーション後に解離させることができる。次いで細胞を腹腔内注射して異種移植モデルを確立し、そして、本明細書に記載のとおり、本発明の抗FcγRIIB抗体によるADCCの増強を試験するためのADCCアッセイの標的として試験することができる。
【０１８４】
上記の腫瘍細胞調製物の腹腔内注射は腹水形成による腹部膨張を発生しうるので、これを採集して腹腔を洗浄して腫瘍細胞を収集する。10x106のin vivo継代したOVCAR-3細胞を第0日に１グループ当たり8マウスに表４に示すように腹腔内注射することができる。11.5x106細胞の注射は可視的な腹部膨張を40〜50日に生じることが報じられている（Hamilton, Youngら、1983）。腫瘍細胞注射後28および42日に、治療抗体、例えばch4D5およびchCC49（先に記載のとおり調製しておいた）ならびに本発明の抗体、例えば2B6を、マウス体重１グラム当たり2μgおよび5μgにて、それぞれの時点に同時注射しうる。腫瘍の確立前の２時点における抗腫瘍抗体の注射は、腫瘍マーカーの最適発現が変わりうるので腫瘍クリアランスを様々な増殖段階において評価することを可能にしうる。抗体を受けないマウスのグループには無菌リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を用いて偽注射しうる。
【表４】
0004459810.tif 000005
【表５】
0004459810.tif 000006
【０１８５】
表４および５に示すとおり、腫瘍のクリアランスを増強する上での抗FcγRIIB抗体の役割を評価するために８マウスの10グループがそれぞれ必要であろう。グループＡでは腫瘍細胞だけが注射され；グループＢでは腫瘍細胞と単球が注射され；グループＣでは腫瘍細胞、単球および抗腫瘍抗体が注射され；グループＤでは腫瘍細胞、抗腫瘍抗体、抗FcγRIIB抗体、および単球が注射され；グループＥでは腫瘍細胞、抗FcγRIIB抗体、および単球が注射される。マウスのグループＤ-対-他グループから得られる結果の比較は、腫瘍クリアランス速度を増強する上での抗FcγRIIB抗体の役割を規定するであろう。
【０１８６】
いくつかの実施形態においては、患者からの卵巣癌腹水を、本発明の抗体のin vivo 活性を決定するための腫瘍細胞の供給源として用いてもよい。卵巣癌腹水の約18〜20サンプルを患者から得てもよい。次いで３卵巣癌腹水サンプルに対する異種移植腫瘍モデルを確立してもよい。これらのサンプルをスピンして処理し、腹水を2500gにて20分間4℃で遠心沈降し；赤血球を溶解した後、細胞をPBSを用いて洗浄することができる。細胞を次の通り処理してもよい：スライドを組織病理学的かつ免疫化学的分析のために、異種移植腫瘍モデルを確立する前に、当業者に公知の方法を用いて染色し、新生物細胞のパーセント対エフェクター細胞集団および腫瘍モデルの確立に影響を与える他の細胞サブセットを分析する。免疫組織化学的方法により決定したサンプル中の新生物細胞および十分なエフェクター細胞を評価した後、腹水をNOD-SCIDおよびヌードマウス中に直接、腹腔内注射して腫瘍を確立してもよい。腫瘍クリアランスおよび抗FcγRIIB抗体の役割を次いで先に記載のように試験してもよい。
【０１８７】
5.2.1  抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の抗体（例えば、それぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592をもつクローン2B6または3H7から産生したマウスモノクローナル抗体）、または本発明の免疫感作法により産生した他のモノクローナル抗体、およびそれらのヒト化バージョンをコードするポリヌクレオチド、ならびに上記ポリヌクレオチドを産生する方法も含む。
【０１８８】
本発明は、ATCC受託番号PTA-4591をもつ、配列番号１に開示された2B6抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、ATCC受託番号PTA-4591をもつ、配列番号３に開示された2B6抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１８９】
本発明の方法はまた、様々なストリンジェンシー、例えば、高度のストリンジェンシー、中度のまたは低度のストリンジェンシー条件のもとで、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。ハイブリダイゼーションは様々なストリンジェンシーの条件下で実施することができる。例示であって限定するものでないが、低度のストリンジェンシーの条件を用いる操作は次の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78,6789-6792も参照）。DNAを含有するフィルターを、6時間40℃で、35％ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl（pH 7.5）、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中で処理する。ハイブリダイゼーションを、次の改変：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10％（wt/vol）硫酸デキストラン、および5〜20 X 106cpm 32P-標識したプローブの使用、を施した同じ溶液中で実施する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で18-20時間40℃にてインキュベートし、次いで1.5時間55℃にて2X SSC、25mM Tris-HCl（pH 7.4）、5mM EDTA、および0.1％SDSを含有する溶液中で洗浄する。洗浄液を、新鮮な溶液により置換え、さらに1.5時間60℃にてインキュベートする。フィルターをブロットし乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに曝露する。必要であれば、フィルターを３回65〜65℃で洗浄してフィルムに再曝露する。使用しうる低度のストリンジェンシーの他の条件は当技術分野で周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションに使用される）。例示であって限定するものでないが、高度のストリンジェンシーの条件を用いる操作は次の通りである。DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを8時間から一夜、65℃で、6X SSC、50mM TRIS-HCL（pH 7.5）、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAから成るバッファー中で実施する。フィルターを48時間、65℃で、100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20 X 106cpmの32P標識したプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中でハイブリダイゼーションする。フィルターの洗浄を37℃で1時間、2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll、および0.01％BSAを含有する溶液中で実施する。次いで、50℃で45分間、0.1X SSC中で洗浄した後、オートラジオグラフィにかける。使用しうる高度のストリンジェンシーの他の条件は当技術分野で周知である。このようなストリンジェンシーの適当な条件の選択は当技術分野で周知である（例えば、Sambrookら, 1989, 「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照；またAusubelら編, in 「研究室技術マニュアルの分子生物学シリーズにおける現行プロトコル（the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals）」, （著作権）1987-1997, 「現行プロトコル（Current Protocols）」, （著作権）1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.も参照；特に、Dyson, 1991, 「核酸の固定とハイブリダイゼーション分析（Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis）」 In 「必須の分子生物学：実践的手法（Essential Molecular Biology : A Practical Approach）」, Vol. 2, T. A. Brown, 編, pp.111-156, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UKを参照）。
【０１９０】
ポリヌクレオチドを得ることはできるし、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を当技術分野で公知のいずれかの方法により決定することができる。
【０１９１】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源（例えば、抗体を発現するいずれかの組織または細胞、例えば、本発明の抗体、例えば2B6または3H7を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から単離された核酸、好ましくはポリA+RNAから作製されたcDNAライブラリー）からの核酸から、Ig特異的プローブとのハイブリダイゼーションおよび／または配列の3'および5'末端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いるPCR増幅により、または同定する特定の遺伝子配列、例えば抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより作製することができる。次いでPCRにより作製される増幅された核酸を、複製可能なクローニングベクター中に当技術分野で周知のいずれかの方法を用いてクローニングすることができる。
【０１９２】
抗体のヌクレオチド配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を遺伝子操作する当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、位置指定突然変異誘発、PCRなどを用いて遺伝子操作して（例えば、Sambrookら, 1990, 「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編, 1998, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照、これらは両方とも本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）、色々なアミノ酸配列を有する抗体を作製することが、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を創出することができる。
【０１９３】
特定の実施形態においては、１以上のCDRを、日常の組換えDNA技術を用いてフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は未変性またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、そして好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域のリストは、例えば、Chothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479を参照）。好ましくは、フレームワーク領域とCDRの組合わせにより作製されるポリヌクレオチドは、上記抗体がFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、先に考察したように、１以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内になされ、そして好ましくは、そのアミノ酸置換が本発明の抗体のFcγRIIBとの結合を改善する。
【０１９４】
他の実施形態においては、当技術分野で利用しうるヒトライブラリーまたはいずれかの他のライブラリーを、当技術分野で公知の標準技術によりスクリーニングして本発明の抗体をコードする核酸をクローニングしてもよい。
【０１９５】
5.2.2  抗体の組換え発現
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られると、抗体を産生するためのベクターを、組換えDNA技術により当技術分野で周知の技術を用いて作ることができる。当業者に周知の方法を利用して、抗体をコードする配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが挙げられる（例えば、Sambrookら, 1990, 「分子クローニング、研究室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」, 第2版 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら編, 1998, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照）。
【０１９６】
抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、通常の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、トランスフェクトした細胞を次いで通常の技術により培養して本発明の抗体を産生することができる。特定の実施形態においては、抗体の発現を構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターにより制御する。
【０１９７】
本発明の組換え抗体を発現するために利用する宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）、または好ましくは、特に全組換え免疫グロブリン分子を発現するためには、真核生物細胞であってもよい。特に、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと連携した哺乳類動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）は免疫グロブリンに対して有効な発現系である（Foeckingら, 1998, Gene 45:101 ；Cockettら, 1990, Bio/Technology 8:2）。
【０１９８】
様々な宿主-発現ベクター系を利用して本発明の抗体を発現することができる。このような宿主-発現系は抗体のコード配列を産生し続いて精製することができるビヒクルを意味するが、また、適当なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされると本発明の抗体をin situで発現することができる細胞も意味する。これらとしては、限定されるものでないが、微生物、例えば免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌（E.coli）および枯草菌（B. subtilis））；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属Saccharomyces Pichia）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびタバコモザイクウイルス（TMV））に感染させたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または哺乳類動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）から誘導されたプロモーターを含有する組換え発現構築物を抱く哺乳類動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、リンパ球（lymphotic cells）（米国特許第5,807,715号を参照）、Per C.6細胞（Crucellが開発したラット網膜細胞））が挙げられる。
【０１９９】
細菌系においては、発現する抗体に対して意図される用途に依って多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するために大量のこのようなタンパク質を産生させる場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが所望される。このようなベクターとしては、限定されるものでないが、抗体コード配列を個々にベクター中にlacZコード領域のフレーム内でライゲートして融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌（E.coli）発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO J. 2: 1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）；などが挙げられる。pGEXベクターはまた、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために利用することもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズとの吸収および結合、続いて遊離グルタチオンの存在のもとでの溶出により容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含んで、クローニングされた標的遺伝子産物がGST成分から放出されるように設計する。
【０２００】
昆虫系においてはオートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）（ACNPV）を外来遺伝子を発現するためのベクターとして利用される。ウイルスはガ科Spondptera frugiperda細胞中で増殖する。抗体コード配列を個々にウイルスの非必須領域（例えば、多角体遺伝子）中にクローニングしてACNPVプロモーター（例えば、多角体プロモーター）の制御下に配置する。
【０２０１】
哺乳類動物宿主細胞においては、多くのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部（tripartite）リーダー配列とライゲートしてもよい。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムにin vitroまたはin vivo組換えにより挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、域E1またはE3）での挿入により、感染した宿主中に生存しかつ免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照）。特定の開始シグナルも、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要でありうる。これらのシグナルは、開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは全体のインサートの翻訳を保証する所望のコード配列のフレームと同じフェーズになければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源、天然および合成のものであってよい。発現の効率は、適当なエンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどにより増強することができる（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照）
さらに、宿主細胞株を選択して、挿入配列の発現をモジュレートするかまたは遺伝子産物を所望の特定の様式で改変しかつ処理することができる。このようなタンパク質産物の改変（例えばグリコシル化）および処理（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。色々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変に対する特徴的かつ特定の機構を有する。適当な培養細胞株または宿主系を選んで、発現される外来タンパク質の正しい改変とプロセシングを保証することができる。この目的で、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化に対して細胞機構を持つ真核生物宿主細胞を用いてもよい。このような哺乳類動物宿主細胞としては、限定されるものでないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030およびHs578Bstが挙げられる。
【０２０２】
組換えタンパク質を長期間、高収率産生させるためには、安定な発現が好ましい。例えば、安定して本発明の抗体を発現する培養細胞株を遺伝子操作により作ることができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、宿主細胞を適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御したDNAを用いて形質転換してもよい。宿主細胞を適当なかつ選択可能なマーカーにより制御されるDNAにより形質転換してもよい。外来DNAを導入した後に、遺伝子操作した細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖し、次いで選択培地に切替えてもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を与えるので、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組込んで増殖して巣を形成し、順にクローニングされて培養細胞株に拡大されうる。この方法を有利に用いて本発明の抗体を発現する培養細胞株を遺伝子操作で作製することができる。このように遺伝子操作で作製した培養細胞株は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物をスクリーニングしかつ評価する上で特に有用である。
【０２０３】
多くの選択系を利用することができ、限定されるものでないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子をそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞において使用することができる。また、抗代謝産物耐性を以下の遺伝子を選択の基本に用いることができる：メトトレキセート耐性を与えるdhfrR（Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hareら, 1981, Proc. NATL. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. NATL. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215)；ならびにハイグロマイシン耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30: 147）。組換えDNA技術の技術分野で公知のかつ利用しうる方法は、Ausubelら編, 1993 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, 「遺伝子導入と発現、研究室マニュアル（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual）」, Stockton Press, NY；およびin Chapters 12 and 13, Dracopoliら(編), 1994, 「ヒト遺伝学の現行プロトコル（Current Protocols in Human Genetics）」, John Wiley & Sons, NY.；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1、に記載されている。
【０２０４】
本発明の抗体の発現レベルはベクター増幅により増加することができる（総括は、Bebbington and Hentschel, 「DNAクローニングにおける哺乳類動物細胞のクローニングした遺伝子を発現するための遺伝子増幅に基づくベクターの利用（The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning）」, Vol.3, Academic Press、New York、1987を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルが増加するとマーカー遺伝子のコピー数は増加しうる。増幅領域は抗体のヌクレオチド配列と関係しているので、抗体の産生も増加しうる（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２０５】
宿主細胞を、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターと同時トランスフェクトしてもよい。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドを等しく発現することができる同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを用いてもよい。このような状況では、軽鎖は重鎖の前に配置して無毒の重鎖が過剰になるのを避ける（Proudfoot, 1986, Nature 322: 52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197）。重鎖および軽鎖をコードする配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０２０６】
本発明の抗体が組換えにより発現されると、これを当技術分野で公知の抗体を精製するためのいずれかの方法により、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、特にタンパク質Ａ後の特異的抗原に対するアフィニティにより、およびサイズカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解度、、またはタンパク質を精製するためのいずれかの他の標準技術により精製することができる。
【０２０７】
5.3  予防および治療方法
本発明は抗体に基づく治療法であって、１以上の本発明の抗体を動物、好ましくは哺乳類動物、そして最も好ましくはヒトに投与することに関わり、疾患、障害、または感染に関連する、FcγRIIBの異常なレベルまたは活性に関連する、および／または、FcγRIIB活性に関連する免疫機能を改変するかまたは第２の治療抗体の細胞傷害性活性を増強するかまたはワクチン組成物の効力を増強することにより治療可能な、症候群を予防、治療、または改善するための上記治療法を包含する。いくつかの実施形態においては、１以上の本発明の抗体の投与による治療は、１以上の治療薬の投与、例えば、限定されるものでないが、化学治療、放射治療、ホルモン治療、および／または生物学的治療／免疫治療と組合わせて行われる。
【０２０８】
限定されるものでないが、本発明の予防および治療化合物は、限定されるものでないが、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後改変されたタンパク質を含むタンパク質、抗体などを含むタンパク質性分子；小分子（1000ダルトン未満）、無機または有機化合物；限定されるものでないが、２本鎖または１本鎖DNA、２本鎖または１本鎖RNA、ならびに３重らせん核酸分子を含む核酸分子含む。予防および治療化合物は、いずれの公知の生物（限定されるものでないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む）由来または合成分子のライブラリー由来のものであってもよい。
【０２０９】
抗体は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載した製薬上許容される組成物で提供することができる。以下に詳しく説明したように、本発明の抗体は、癌（特に受動免疫治療または癌ワクチンの効力を増強するため）、自己免疫疾患、炎症性障害、またはアレルギー（例えば、アレルギーを治療するためにワクチンの効力を増強するため）を治療する方法に使用することができる。
【０２１０】
疾患、障害、または感染の予防およびまたは治療薬として機能する本発明の抗体を、疾患、障害、または感染に関連する１以上の症候群を治療、予防または改善するために、動物、好ましくは哺乳類動物、そして最も好ましくはヒトに投与することができる。本発明の抗体を、FcγRIIBの異常レベルまたは活性に関連したおよび／またはFcγRIIB活性に関連する免疫機能を改変することにより治療可能な疾患、障害、または感染を治療、予防または管理するのに有用な１以上の他の予防および／または治療薬と組合わせて投与することができる。ある特定の実施形態においては、本発明の１以上の抗体を哺乳類動物、好ましくはヒトに、癌治療に有用な他の１以上の治療薬とともに同時に投与する。用語「同時に」は、予防または治療薬を正確に同じ時点に投与することに限定されるのでなく、むしろ本発明の抗体と他の薬剤を被験者に続けてかつ本発明の抗体が他の薬物と一緒に作用しうるような時間間隔内に投与してそれらがそのように投与されなかった場合より増加した利益を与えることを意味する。例えば、それぞれの予防または治療薬を同じ時点で投与するかまたは異なる時点でいずれの順に続けて投与してもよい；しかし、もし同じ時点で投与しない場合、それらは十分近い時点で投与して所望の治療または予防効果を与えなければならない。それぞれの治療薬を別々に、いずれの適当な剤形で、そしていずれの好適な経路により投与してもよい。
【０２１１】
様々な実施形態においては、予防または治療薬を1時間未満離して、約1時間離して、約1時間〜約2時間離して、約2時間〜約3時間離して、約3時間〜約4時間離して、約4時間〜約5時間離して、約5時間〜約6時間離して、約6時間〜約7時間離して、約7時間〜約8時間離して、約8時間〜約9時間離して、約9時間〜約10時間離して、約10時間〜約11時間離して、約11時間〜約12時間離して、24時間以下離してまたは48時間以下離して投与する。好ましい実施形態においては、２以上の成分を同じ患者訪問の際に投与する。
【０２１２】
本明細書に使用される投与量と投与頻度は、治療上有効かつ予防上有効な用語に包含される。投与量と投与頻度はさらに、典型的には、それぞれの患者に特有の因子によって、投与される特定の治療または予防薬、癌のタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の医療歴に依存して変化しうる。医師はこのような因子および次の事項、例えば文献に報じられるおよび「医師のデスクリファレンス（Physician's Desk Reference）」（第56版、2002）に推奨される投与量を考慮して好適な治療計画を選択することができる。
【０２１３】
本発明の抗体はまた、他のモノクローナルまたはキメラ抗体と一緒に、または例えば、抗体と相互作用しかつ免疫応答を増加するエフェクター細胞の数または活性を増加するのに役立つリンホカインまたは造血性増殖因子（例えば、IL-2、IL-3およびIL-7など）と一緒に有利に利用してもよい。本発明の抗体はまた、疾患、障害、または感染を治療するために用いる１以上の薬物、例えば抗癌薬、抗炎症性薬または抗ウイルス薬と一緒に有利に利用してもよく、これらは、例えば、以下の第5.4.6および5.4.5節に詳しく記載した通りである。
【０２１４】
5.3.1  癌
本発明の抗体を単独でまたは当技術分野で公知の癌性細胞の原発腫瘍の増殖または転移を抑制または低減する他の治療抗体と一緒に用いてもよい。一実施形態においては、本発明の抗体を癌免疫治療に用いられる抗体と一緒に用いてもよい。本発明は、このような免疫治療の効力を、治療抗体のエフェクター機能、例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用などの効力を増加することにより増加するために、本発明の抗体の他の治療抗体との併用を包含する。特定の作用機構により束縛されることを意図しないが、本発明の抗体は、好ましくは単球およびマクロファージ上のFcγRIIBをブロックして、例えば、FcγRの活性化を介する腫瘍のクリアランスを増強することにより、治療上の利益である腫瘍特異的抗体の臨床効力を増強する。従って、本発明は、癌抗原と特異的に結合しかつ細胞傷害性である他の抗体と組合わせて投与するときに、癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供する。本発明の抗体は、特に細胞傷害性活性をもつ癌抗原特異的治療抗体の細胞傷害性活性を増強して本発明の抗体による腫瘍細胞死滅を増強する上で、および／または例えば治療抗体のADCC活性またはCDC活性を増強する上で、癌の予防または治療に有用である。特定の実施形態において、本発明の抗体は、単独でまたは細胞傷害性治療抗体と組合わせて投与すると、癌性細胞（cancerous cell）の原発腫瘍の増殖または転移を、本発明の上記抗体の不在のもとでの原発腫瘍の増殖または転移と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％だけ抑制または低減する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は細胞傷害性治療抗体と組合わせて、癌（cancer）の原発腫瘍の増殖または転移を、上記抗体の不在のもとでのその増殖または転移と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％だけ抑制または低減する。
【０２１５】
正常から悪性状態への移行は、遺伝的および後成的変化に関わる多段階プロセスである。実際、この進行を容易にする多数の変化が細胞制御回路に起こって、腫瘍細胞は、通常、組織ホメオスタシスを制御する末端分化と静止状態の実施を行わなくなる。ある特定の遺伝子は癌細胞の侵襲性および転移性ポテンシャル、例えばCSF-1（コロニー刺激因子1またはマクロファージコロニー刺激因子）と関係付けられている。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、CSF-1は腫瘍部位へマクロファージを補給して腫瘍の進行を促進することにより、腫瘍進行および転移を媒介しうる。マクロファージは、恐らく血管形成因子、例えばチミジンホスホリラーゼ、血管内皮由来増殖因子の分泌；増殖因子、例えば腫瘍細胞上でパラ分泌因子として作用しうる上皮増殖因子の分泌により、腫瘍進行および転移を媒介する上で栄養性役割を有し、従って、血管中への腫瘍細胞遊走および侵襲を促進すると考えられる（例えば、Linら, 2001, J. Exp. Med. 193(6):727-739；Linら, 2002, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasam 7(2):147-162；Schollら, 1993, Molecular Carcinogenesis, 7:207-11；Clynesら, 2000, Nature Medicine, 6(4):443-446；Fidlerら, 1985, Cancer Research, 45:4714-26を参照）。
【０２１６】
本発明は、本発明の抗体を用いてマクロファージを介する腫瘍細胞進行および転移をブロックすることを包含する。本発明の抗体は、マクロファージ浸潤が起こる固体腫瘍を治療する上で特に有用である。本発明の拮抗性抗体は、腫瘍部位に局在化するマクロファージの集団を低減または排除することにより、特に腫瘍細胞転移を制御、例えば低減または排除するのに有用である。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は単独で腫瘍細胞転移を制御するために使用される。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の拮抗性抗体は、単独で投与されると、マクロファージ上の抑制FcγRIIBと結合し、効果的にマクロファージの集団を低減し、従って腫瘍細胞進行を制限する。本発明の拮抗性抗体は、腫瘍部位に局在化するマクロファージを低減するか、または好ましくは排除する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、限定されるものでないが、乳癌、子宮癌および卵巣癌を含む、CSF-1の過剰発現により特徴付けられる癌の治療に使用される。
【０２１７】
本発明はさらに、FcγRIIBを発現するマクロファージ以外の免疫エフェクター細胞、例えば樹状細胞を効果的に除去または排除する抗体を包含する。本発明の抗体を用いる免疫エフェクター細胞の効果的な除去または排除は、エフェクター細胞の集団の50％、60％、70％、80％、好ましくは90％、そして最も好ましくは99％だけの低減でありうる。従って、本発明の抗体は、単独でまたは第２の抗体、例えば、抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体、および抗微生物抗体などの治療抗体と一緒になって治療効力を増強する。いくつかの実施形態においては、治療抗体は癌細胞または炎症性細胞に対して特異性を有する。他の実施形態においては、第２抗体は正常細胞と結合する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体をFcγRIIBを発現するエフェクター細胞を除去するために単独で使用すると、Fc活性化受容体を介するシグナル伝達経路が効果的に増強される。第２抗体、例えば、治療抗体との組合わせで使用すると、抗体のFcを介するエフェクター機能を増加することにより、第２抗体の効力が増強される。
【０２１８】
本発明の方法および組成物により治療または予防することができる癌および関係する障害は、限定されるものでないが、次が挙げられる：白血病、例えば、限定されるものでないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病白血病（erytroleukemia leikemias）および脊髄形成異常症候、慢性白血病、例えば、限定されるものでないが、慢性骨髄球性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病；赤血球増加症（polycythemia vera）；リンパ腫、例えば、限定されるものでないがホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば、限定されるものでないが、うつ積（smoldering）多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、プラズマ細胞白血病、単生プラズマ細胞腫および延髄外プラズマ細胞腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性モノクローナル免疫グロブリン血症；重鎖疾患；骨および結合組織肉腫、例えば限定されるものでないが、骨肉腫（bone sarcoma）、骨肉腫（osteo sarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、軟骨、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（hemangiosarcoma）、線維肉腫、カポージ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば限定されるものでないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、原発脳リンパ腫；乳癌、例えば、限定されるものでないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状腺乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌；副腎癌、例えば、限定されるものでないが、褐色細胞腫および副腎皮質性癌；甲状腺癌、例えば、限定されるものでないが乳頭または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌；膵臓癌、例えば、限定されるものでないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば、限定されるものでないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症；眼癌、例えば、限定されるものでないが、眼黒色腫、例えば虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫、および網膜芽細胞腫；膣癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、腺癌、および黒色腫；外陰部癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病；頸癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌；子宮癌、例えば、限定されるものでないが、子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、例えば、限定されるものでないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍；食道癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、プラズマ細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば、限定されるものでないが、腺癌、肉芽腫性（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、広汎拡大型、悪性リンパ腫、リポ,肉腫、���維肉腫、および癌肉腫；大腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば、限定されるものでないが、肝細胞性癌および肝芽腫、胆嚢癌、例えば、限定されるものでないが、腺癌；胆管癌、例えば、限定されるものでないが、乳頭状癌、結節型および広汎型；肺癌、例えば、限定されるものでないが、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌；精巣癌、例えば、限定されるものでないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非精上皮腫、胚性癌、テラトーマ癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば、限定されるものでないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌；基底癌；唾液腺癌、例えば、限定されるものでないが、腺癌、粘膜表皮性癌、およびアデノイド嚢胞癌；咽頭癌、例えば、限定されるものでないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状；皮膚癌、例えば、限定されるものでないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端部黒子黒色腫；腎臓癌、例えば、限定されるものでないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂および／または子宮）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、例えば、限定されるものでないが、移行細胞癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、骨膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる（このような障害の総括については、Fishmanら, 1985, Medicine, 第2版, J. B. Lippincott Co. , Philadelphia、およびMurphyら, 1997, 「十分な情報に基づく決定：癌診断、治療、および回復の全書（Informed Decisions : The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery）」, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照）。
【０２１９】
従って、本発明の方法と組成物はまた、様々な癌または他の異常増殖性疾患の治療または予防に有用であり、それらの疾患としては（限定されるものでないが）、次が挙げられる：癌、例えば、膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌；、例えば扁平上皮細胞癌；リンパ系統の造血性腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫；骨髄球性系統の造血性腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病；間葉起源の腫瘍、例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えば、黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫；中枢および末梢神経性系の腫瘍、例えば、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫；間葉起源の腫瘍、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；および他の腫瘍、例えば、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌。アポトーシスにおける異常により生じる癌を本発明の方法と組成物により治療することも意図している。このような癌としては、限定されるものでないが、p53突然変異をもつ濾胞性癌、ホルモン依存性の乳房腫瘍、前立腺および卵巣、および前癌病変、例えば家族性腺腫様ポリープ症、および骨髄形成異常症候群が挙げられる。特定の実施形態においては、卵巣、膀胱、乳房、大腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮における悪性腫瘍または異常増殖性変化（例えば、化生および異形成症）、または過剰増殖性障害を本発明の方法と組成物により治療または予防する。他の特定の実施形態においては、肉腫、黒色腫、または白血病を本発明の方法と組成物により治療または予防する。
【０２２０】
癌抗原と関係する癌は、癌抗原と結合しかつ細胞傷害性である抗体と組合わせて、本発明の抗体の投与により治療または予防することができる。或る特定の実施形態においては、本発明の抗体は、特定の癌抗原に対する抗体の、抗体を介する細胞傷害性効果を増強する。例えば、限定されるものでないが、次の癌抗原と関係する癌は、本発明の抗体により治療または予防することができる。KS 1/4汎癌抗原（PerezおよびWalker, 1990, J. Immunol. 142:32-37；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415）、卵巣癌抗原（CA125）（Yuら, 1991, Cancer Res. 51(2):48-475）、前立腺酸性リン酸（prostatic acid phosphate）（Tailorら, 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1) : 4928）、前立腺特異的抗原（HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910；Israeliら, 1993, Cancer Res. 53:227-230）、黒色腫関係抗原p97（Estinら, 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44）、黒色腫抗原gp75（Vijayasardahlら., 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380）、高分子量黒色腫抗原（HMW-MAA）（Nataliら., 1987, Cancer 59:55-3；Mittelmanら, 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144））、前立腺特異的膜抗原、癌胎児抗原（CEA）（Foonら, 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294）、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結腸直腸腫瘍関係抗原、例えば：CEA、TAG-72（Yokataら, 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408）、C017-lA（Ragnhammar, 1993, Int. J. Cancer 53:751-758）；GICA 19-9（Herlynら, 1982, J Clin. Immunol. 2: 135）、CTA-1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19（Ghetieら, 1994, Blood 83: 1329-1336）、ヒトB-リンパ腫抗原-CD20（REFFら, 1994, Blood 83:435-445）、CD33（Sgourosら, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430）、黒色腫特異的抗原、例えばガングリオシドGD2（Salehら, 1993, J. Immunol., 151,3390-3398）、ガングリオシドGD3（Shitaraら, 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380）、ガングリオシドGM2（Livingstonら, 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044）、ガングリオシドGM3（Hoonら, 1993, Cancer Res. 53: 5244- 5250）、細胞表面抗原の腫瘍特異的移植型（TSTA）、例えばウイルスにより誘導した腫瘍抗原、例えばT-抗原DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原、腫瘍胎児性抗原-α-フェトプロテイン、例えば大腸、膀胱腫瘍癌胎児性抗原のCEA（Hellstromら, 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188）、分化抗原、例えばヒト肺癌抗原L6、L20（Hellstromら, 1986, Cancer Res. 46:3917-3923）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原-Gp37（Bhattacharya-Chatterjeeら、1988、J. of Immun. 141:1398-1403）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原、例えばEGFR（上皮増殖因子受容体）、HER2抗原（p185HER2）、多形性上皮ムチン（PEM）（Hilkensら, 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359）、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1（Bernardら, 1989, Science 245:301-304）、分化抗原（Feizi, 1985, Nature 314:53-57）例えば、胎性赤血球および一次内胚葉に見出されるＩ抗原、胃腺癌に見出されるI（Ma）、乳上皮に見出されるM18およびM39、骨髄性細胞に見出されるSSEA-1、結腸直腸癌に見出されるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、およびD156-22、結腸腺癌に見出されるTRA-1-85（血液型群H）、C14、肺腺癌に見出されるF3、胃癌に見出されるAH6、胚性癌細胞に見出されるYハプテン、LeY、A431細胞に見出されるTL5（血液型群A）、EGF受容体、膵臓癌に見出されるE1シリーズ（血液型群B）、胚性癌細胞に見出されるFC10.2、胃腺癌、腺癌に見出されるCO-514（血液型群Lea）、腺癌に見出されるNS-10、結腸腺癌に見出されるCO-43（血液型群Leb）、G49、EGF受容体、（血液型群ALeb/Ley）、大腸癌に見出される19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に見出されるTSA7、黒色腫に見出されるR24、胚性癌細胞に見出される4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4-8細胞段階胚に見出されるSSEA-3、SSEA-4。他の実施形態においては、抗原は皮膚Ｔ細胞リンパ腫から得たＴ細胞受容体誘導ペプチドである（Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照）。
【０２２１】
本発明の抗体を当技術分野で公知のいずれかの治療癌抗体と組合わせて用いて治療効力を増強してもよい。例えば、本発明の抗体を、癌治療に治療上の効用を示している表３の抗体とともに用いることができる。本発明の抗体は、上記治療癌抗体の少なくとも一つの抗体を介するエフェクター機能を増強することにより治療癌抗体の治療効力を増強する。或る特定の実施形態においては、抗体は、上記治療癌抗体の補体に依存するカスケードを増強することによりその治療効力を増強する。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的とした腫瘍細胞の食作用とオプソニン作用を増強することによりその治療効力を増強する。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗体は、標的とした腫瘍細胞の破壊における抗体に依存する細胞を介する細胞傷害性（"ADCC"）を増強することによりその治療効力を増強する。
【０２２２】
本発明の抗体を、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発された（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（CpG）系産物と組合わせて用いることもできる。例えば、本発明は、癌を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物における、CpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Warrenら, 2002, Semin Oncol., 29 (1 Suppl 2):93-7；Warrenら, 2000, Clin Lymphom, 1(1):57-61も参照、これは本明細書に参照により組み入れられる）。
【０２２３】
本発明の抗体を、細胞死滅を介しない治療効果を有する治療抗体と組合わせて使用し、抗体の治療活性を強化することができる。特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の治療アポトーシスを誘導する作動活性をもつ抗体、例えば抗Fas抗体と組合わせた使用を包含する。抗Fas抗体は当技術分野で公知であり、例えば、Jo2（Ogasawaraら, 1993, Nature 364:806）およびHFE7（Ichikawaら, 2000, Int. Immunol. 12:555）を含む。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、FcγRIIBは、抗Fasを介するアポトーシスを促進することが示唆されていて、例えば、Xuら, 2003, Jounal of Immunology, 171: 562-568を参照。実際、FcγRIIBの細胞外ドメインはFas受容体に対する架橋剤として役立ち、機能性複合体を形成させてFasに依存するアポトーシスを促進することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は抗Fas抗体とFcγRIIBの相互作用をブロックし、Fasを介するアポトーシス活性の低減に導く。Fasを介するアポトーシス活性の低下をもたらす本発明の抗体は、望ましくない副作用、例えば肝毒性を有する抗Fas抗体と組合わせると特に有用である。他の実施形態においては、本発明の抗体は抗Fas抗体とFcγRIIBの相互作用を増強し、Fasを介するアポトーシス活性の増強に導く。本発明の抗体の治療アポトーシスを誘導する作動活性をもつ抗体との組合わせは、治療効力を増強する。
【０２２４】
本発明の方法を用いる治療アポトーシスを誘導する抗体は、当技術分野で公知のアポトーシス経路のモジュレーション用のいずれかの死受容体、例えば、TNFR受容体ファミリーに特異的であってもよい。
【０２２５】
本発明は、障害性アポトーシスを介するシグナル伝達による疾患、例えば、癌、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、欠乏性Fasを介するアポトーシスによる疾患を治療する方法であって、本発明の抗体を抗Fas抗体と組合わせて投与することを含む上記方法を包含する。
【０２２６】
いくつかの実施形態においては、本発明の作動性抗体は、黒色腫細胞の腫瘍を含む非造血性由来の腫瘍を治療するのに特に有用である。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の作動性抗体の効力は、部分的に、黒色腫細胞の腫瘍を含む非造血性由来の腫瘍がFcγRIIBを発現して、FcγRIIB抑制経路を活性化することにある。最近の実験は、実際、黒色腫細胞におけるFcγRIIBの発現は抗腫瘍抗体との直接的相互作用により（例えば、抗腫瘍抗体のFc域と結合することにより）細胞質内に依存する方法で腫瘍増殖をモジュレートすることを示している（Cassardら, 2002, Journal of Clinical Investigation, 110(10):1549-1557）。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、腫瘍細胞それ自身に発現されないでむしろ腫瘍間質を含む周囲の反応性および腫瘍を支持する非悪性細胞に発現される腫瘍抗原と免疫特異的に結合する治療抗体と組合わせた本発明の抗体の使用を包含する。腫瘍間質は、新血管を形成する内皮細胞および腫瘍脈管構造を取り囲む間質繊維芽細胞を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗体を、内皮細胞上の腫瘍抗原と免疫特異的に結合する抗体と組合わせて用いる。好ましい実施形態においては、本発明の抗体を、繊維芽細胞上の腫瘍抗原、例えば繊維芽細胞活性化タンパク質（FAP）と免疫特異的に結合する抗体と組合わせて用いる。FAPは、限定されるものでないが、肺、乳、および結腸直腸癌を含む多くの固体腫瘍の間質繊維芽細胞に高度に発現される95KDaのホモダイマーII型糖タンパク質である（例えば、Scanlanら, 1994, Proc. Natl. Acad. USA, 91:5657-61；Parkら, 1999, J. Biol. Chem., 274:36505-12；Rettigら, 1988, Proc. NATL. Acad. Sci. USA 85:3110-3114；Garin-Cheseaら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7239を参照)。FAPと免疫特異的に結合する抗体は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に包含され、例えば、Wuestら, 2001, Journal of Biotechnology, 159-168；Mersmannら, 2001, INT. J. CANCER, 92:240- 248；米国特許第6,455,677号を参照すること；これらの全ては本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０２２８】
最近、IgEは腫瘍増殖のメディエーターであることが示唆されていて、実際、IgEを標的とした即効性の過敏性およびアレルギー炎症応答に関わる可能性のある自然の機構であることが報じられている（総括は、例えば、Millsら, 1992, Am. Journal of Epidemiol. 122:66-74；Erikssonら, 1995, Allergy 50:718-722を参照）。実際、最近の研究は、IgEを腫瘍細胞に搭載すると腫瘍増殖を低減し、複数の事例では腫瘍拒絶が起こることを示している。その研究によれば、IgEを搭載した腫瘍細胞は治療ポテンシャルを持つだけでなく、生得的免疫エフェクター機構およびＴ細胞を介する適応性免疫応答の活性化を含む長期の抗腫瘍免疫を得る、Realiら, 2001, Cancer Res. 61:5516-22を参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。本発明の拮抗性抗体は、IgEを介する癌治療法の効力を増強するために、IgEの投与と組合わせて、癌を治療および／または予防するために使用することができる。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体は腫瘍のIgE治療の治療効力を、抑制経路をブロックすることにより増強する。本発明の拮抗性抗体は、(i)腫瘍増殖の遅延を増強すること；(ii)腫瘍進行の速度の低下を増強すること；(iii)腫瘍拒絶を増強すること；または(iv)IgE単独による癌の治療と比較して保護免疫を増強することにより、IgEを介する癌治療法の治療効力を増強することができる。
【０２２９】
癌治療法ならびにそれらの投与量、投与経路および推奨される用法は当技術分野で公知であって文献に記載されている、例えば、「医師のデスクリファレンス（Physician's Desk Reference）」（第56版、2002）を参照、これは本明細書に参照により組み入れられる。
【０２３０】
5.3.2  Ｂ細胞悪性腫瘍
本発明の作動性抗体は、Ｂ細胞悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病を治療または予防するのに有用である。FcγRIIBは、悪性リンパ腫、特にＢ細胞非ホジキンリンパ腫の染色体転座による調節解除の標的である（Callanan M. B.ら, 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(1):309-314を参照）。従って、本発明の抗体は、いずれかのＢ細胞系統の慢性リンパ性白血病を治療または予防するのに有用である。Ｂ細胞系統の慢性リンパ性白血病は、Freedmanが総括している（Freedman, 1990, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4:405による総括を参照）。いずれの作用機構に束縛されることも意図しないが、本発明の作動性抗体は、Ｂ細胞増殖および／または活性化を抑制してＢ細胞悪性腫瘍を抑制または防止する。本発明はまた、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防および／または治療するための当技術分野で公知の他の治療法（例えば、化学治療および放射治療）と組合わせた本発明の作動性抗体の使用も包含する。本発明はまた、Ｂ細胞悪性腫瘍を予防および／または治療するための当技術分野で公知の他の抗体と組合わせた本発明の作動性抗体の使用も包含する。例えば、本発明の作動性抗体をGoldenbergら（米国特許第6,306,393号）が開示した抗C22または抗CD19抗体と組合わせて使用することができる。
【０２３１】
本発明の抗体はまた、Oncoscint（標的：CEA）、Verluma（標的：GP40）、Prostascint（標的：PSMA）、CEA-SCAN（標的：CEA）、Rituxin（標的：CD20）、Herceptin（標的：HER-2）、Campath（標的：CD52）、Mylotarge（標的：CD33）、およびZevalin（標的：CD20）と組合わせて使用してもよい。
【０２３２】
5.3.3  自己免疫疾患および炎症性疾患
本発明の作動性抗体を用いて自己免疫疾患または炎症性疾患を治療または予防することができる。本発明は、被験者における自己免疫性または炎症性障害に関連する１以上の症候群を予防、治療、または管理する方法であって、上記被験者に治療上有効な量の本発明の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む上記方法を提供する。本発明はまた、被験者における炎症性障害に関連する１以上の症候群を予防、治療、または管理する方法であって、さらに上記被験者に治療上有効な量の１以上の抗炎症薬を投与することを含む上記方法も提供する。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する１以上の症候群を予防、治療、または管理する方法であって、さらに上記被験者に治療上有効な量の１以上の免疫調節薬を投与することを含む上記方法も提供する。第5.4.5節は抗炎症薬および免疫調節薬の限定されるものでない例を提供する。
【０２３３】
本発明の抗体はまた、自己免疫疾患または炎症性疾患を予防および／または治療するための当技術分野で公知のいずれかの抗体と組合わせて使用することもできる。炎症性障害を治療または予防するために使用される抗体の限定されるものでない例を表6Aに掲げ、自己免疫障害を治療または予防するために使用される抗体の限定されるものでない例を表6Bに掲げる。本発明の抗体は、例えば、表6Aおよび表6Bに掲げる治療抗体の治療効力を増強することができる。例えば、限定されるものでないが、本発明の抗体は表6Aおよび表6Bの抗体のいずれかにより処置される被験者の免疫応答を増強することができる。
【０２３４】
本発明の抗体はまた、Orthoclone OKT3、ReoPro、Zenapex、Simulec、Synagis、およびRemicadeと組合わせて使用することもできる。
【０２３５】
本発明の抗体を、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発された（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（CpG）に基づく製品と組合わせて用いることもできる。例えば、本発明は、自己免疫性または炎症性障害を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物における、CpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Weeratnaら, 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71、これは本明細書に参照により組み入れられる）。
【０２３６】
本発明の抗体を投与することにより治療できる自己免疫障害の例は、限定されるものでないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎（celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ‐ストラウス症候群、瘢痕類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギヤン‐バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫を介する糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発無ガンマグロブリン血症、原発胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レーノー現象、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば疱疹状皮膚炎脈管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害の例は、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。本明細書の第2.2.2節に記載の通り、いくつかの自己免疫障害は炎症性症状と関連している。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害の間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けられる。本発明の方法によって予防、治療または管理することができる炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。
【０２３７】
本発明の抗体を用いて炎症性障害を患う動物、特に哺乳動物が罹る炎症を軽減することもできる。特定の実施形態において、抗体は動物の炎症を、上記抗体を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％だけ軽減することができる。他の実施形態においては、抗体の組合わせは動物の炎症を、上記抗体を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％だけ軽減することができる。
【０２３８】
本発明の抗体を用いて、移植の拒絶を予防することができる。
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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5.3.4  アレルギー
本発明は、それを必要とする被験者におけるIgEを介するおよびまたはFcεRIを介するアレルギー障害を治療または予防する方法であって、上記被験者に治療上有効な量の本発明の作動性抗体またはそのフラグメントを投与することを含む上記方法を提供する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体は、急性かつ遅発性アレルギー応答に寄与するFcεRIが誘導する肥満細胞活性化を抑制するのに有用である（Metcalfe D.ら 1997, Physiol. Rev. 77:1033）。好ましくは、本発明の作動性抗体は、当技術分野で使用されているIgEを介するアレルギー障害を治療または予防する通常の方法と比較して、増加した治療効力および／または低下した副作用を有する。IgEを介するアレルギー障害を治療または予防する通常の方法は、限定されるものでないが、抗炎症性薬（例えば、経口および吸入による喘息用の副腎皮質ステロイド）、抗ヒスタミン薬（例えば、アレルギー鼻炎およびアトピー性皮膚炎用）、システイニルロイコトリエン（例えば、喘息治療用）；抗IgE抗体；および特定の免疫治療または除感作を含む。
【０２３９】
IgEを介するアレルギー応答の例としては、限定されるものでないが、喘息、アレルギー鼻炎、胃腸アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、アトピー性皮膚炎、じんま疹、アナフィラキシー、または糸球体腎炎が挙げられる。
【０２４０】
本発明は、FcεRIおよびヒトFcγRIIBと複合体を形成する、すなわちFcεRIおよびヒトFcγRIIBと特異的に結合するように遺伝子操作で作製した分子、例えば免疫グロブリンを包含する。好ましくは、このような分子は、IgEおよびFcεRIに媒介される障害に治療効力を有する。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、これらの遺伝子操作した分子の治療効力は、部分的に、肥満細胞および好塩基球機能を抑制するその能力に因る。
【０２４１】
特定の実施形態においては、FcεRIおよびヒトFcγRIIBと特異的に結合する分子は、FcεRIに対する結合部位およびFcγRIIBに対する結合部位を含むキメラ融合タンパク質である。このような分子は、当業者に公知の標準組換えDNA手法に従って遺伝子操作で作製することができる。好ましい特定の実施形態において、本発明の方法に用いるキメラ融合タンパク質は、huFcεを抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')単鎖のC-末端域と連結するためのブリッジとして使われる領域と融合した本発明の抗FcγRIIBモノクローナル抗体のF(ab')単鎖を含む。本発明の方法に用いるキメラ融合タンパク質の一例は次を含む：VL/CH(FcγRIIB)-ヒンジ-VH/CH(FcγRIIB)-リンカー-CHε2-CHε3-CHε4。キメラ分子用のリンカーは長さが５、10、好ましくは15アミノ酸であってもよい。リンカーの長さを変えて分子のFcγRIIBおよびFcεRIとの結合を最適化してもよい。特定の実施形態においては、リンカーは15アミノ酸リンカーであり、配列：(Gly4Ser)3から成る。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、フレキシブルなペプチドリンカーは鎖対合を容易にしかつ可能なリフォールディングを最小化し、そしてこのリンカーはまた、キメラ分子が２つの受容体、すなわち、細胞上のFcγRIIBおよびFcεRIに到達してそれらと架橋することを可能にする。好ましくは、キメラ分子を、共存しうるプロモーター、例えばサイトメガロウイルスプロモーターとともに哺乳類動物発現ベクター、例えばpCI-neo中にクローニングする。本発明の方法に従って調製される融合タンパク質は、FcεRI（CHε2CHε3）に対するおよびFcγRIIB（VL/CL、-ヒンジ-VH/CH）に対する結合部位を含有しうる。本発明の方法に従って調製される融合タンパク質をコードする核酸は、好ましくは、293細胞にトランスフェクトさせて、分泌されるタンパク質を当技術分野で公知の通常の方法を用いて精製する。
【０２４２】
キメラ分子のヒトFcεRIおよびFcγRIIBの両方との結合は、FcγRとの結合を決定するための当業者に公知の通常の方法を用いて評価することができる。好ましくは、
本発明のキメラ分子は、例えば抗原が駆動する脱顆粒および細胞活性化の抑制を、抑制することにより、IgEを介する障害を治療する上での治療効力を有する。IgEが駆動するFcεRIを介する肥満細胞脱顆粒をブロックする上での本発明のキメラ分子の効力は、ヒトに用いる前に、ヒトFcεRαおよびヒトFcγRIIBを発現するように遺伝子操作されているトランスジェニックマウスにおいて確認してもよい。
【０２４３】
本発明は、IgEに媒介されるおよび／またはFcεRIに媒介されるアレルギー障害を治療および／または予防するための二特異的抗体の使用を提供する。二特異的抗体（BsAb）は、通常、別の抗原上の異なるエピトープと結合する。BsAbは潜在的な臨床効用を有し、ウイルス、ウイルス感染した細胞および細菌病原体を標的とするためにならびに血栓崩壊薬を血餅に送達するために使用されている（Cao Y., 1998 Bioconj. Chem 9:635-644；Koelemijら, 1999, J. Immunother., 22,514-524；Segalら, Curr. Opin. Immunol., 11,558-562）。BsIgGおよび他の関係する二特異的分子を作る技術は利用しうる（例えば、Carterら, 2001 J. of Immunol. Methods, 248,7-15；Segalら, 2001, J. of Immunol. Methods, 248,7-15を参照、これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２４４】
本発明は、抗FcγRIIB抗体の１つのF(ab')および利用しうるモノクローナル抗huIgE抗体の１つのF(ab')を含有し、同じ細胞の表面上の２つの受容体、FcγRIIBおよびFcεRIと凝集する二特異的抗体を提供する。当技術分野で公知のおよび本明細書に開示したいずれの手法を用いて本発明の方法に使用する二特異的抗体を作製してもよい。特定の実施形態においては、BsAbを、先に記載のように、抗FcγRIIB抗体と抗huIgE抗体のF(ab')フラグメントを化学的に架橋することにより作製しうるのであって、例えば、Glennieら, 1995, 「腫瘍免疫生物学（Tumor Immunobiology）」, Oxford University press, Oxford, p.225を参照；これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。F(ab')フラグメントは、ペプシンによる限定されたタンパク分解とメルカプトエタノールアミンにより還元してフリーのヒンジ領域スルフヒドリル（SH）基をもつFab'フラグメントを得ることにより作製することができる。Fab'(SH)フラグメント上のSH基を過剰のO-フェニレンジマレイミド（O-PDM）を用いてアルキル化して遊離マレイミド基（mal）を得てもよい。２つの調製物Fab'(mal)およびFAB'(SH)を適当な比、好ましくは1:1で組合わせてヘテロダイマー構築物を作製してもよい。BsAbをサイズ排除クロマトグラフィにより精製し、当業者に公知の技術を用いてHPLCにより特徴付けることができる。
【０２４５】
特に、本発明は、FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと結合する第１の重鎖-軽鎖対およびIgE受容体と結合する第２の重鎖-軽鎖を含み、ここで上記第１の重鎖-軽鎖対が最初にFcγRIIBと結合することを条件とする二特異的抗体を包含する。本発明の二特異的抗体は、当技術分野で公知の標準技術を用いて遺伝子操作で作製し、FcγRIIBとの結合がIgE受容体との結合に優先することを保証することができる。当業者であれば、二特異的抗体を、例えば、IgE受容体と結合する親和性より大きい親和性で上記二特異的抗体がFcγRIIBと結合するように遺伝子操作することを理解しうる。さらに、二特異的抗体を、当技術分野で公知の技術により遺伝子操作して、抗体のヒンジサイズの長さを、例えばリンカーを付加することにより増加して、同じ細胞上のIgE受容体およびFcγRIIB受容体との結合にフレキシビリティをもつ二特異的抗体を得ることができる。
本発明の抗体はまた、当技術分野で公知のIgE-を介するアレルギー障害を治療または予防するための他の治療抗体または薬物と組合わせて用いることもできる。例えば、本発明の抗体を次のいずれかと組合わせて用いることができる：アゼラスチン、アステリン（Astelin）、ジプロピオン酸ベクロメタゾン吸入薬、バンセリル（Vanceril）、ジプロピオン酸ベクロメタゾン鼻吸入／スプレー薬、バンセナーゼ（Vancenase）、ベコナーゼ・ブデソニド鼻吸入／スプレー薬、リンコート・セチリジン、ジルテック・クロルフェニラミン、シュードエフェドリン、デコナミン（Deconamine）、スダフェド（Sudafed）、クロモリン、ネイサルクロム（Nasalcrom）、インタル（Intal）、オプチクロム（Opticrom）、デスロラタジン、クラリネックス、フェキソフェナジンおよびシュードエフェドリン、アレグラD、フェキソフェナジン、アレグラ・フルニソリド鼻スプレー、ネイサリド（Nasalide）・プロピオン酸フルチカゾン鼻吸入／スプレー薬、フロナーゼ（Flonase）・プロピオン酸フルチカゾン経口吸入薬、フロベント、ヒドロキシジン、ビスタリル（Vistaril）、アタラックスロルタジン、シュードエフェドリン、クラリチンD、ロラタジン、クラリチン、プレドニゾロン（prednisolone）、プレドニゾロン（Prednisolone）、ペジアプレド（Pediapred）経口液、メドロール・プレドニゾン、デルタゾン、プレドサロメテロール液（Liquid Predsalmeterol）、セレベント・トリアムシノロンアセトニド吸入薬、アズマコート・トリアムシノロンアセトニド（Azmacort triamcinolone acetonide）鼻吸入／スプレー薬、ナサコート（Nasacort）、またはナサコートAQ（NasacortAQ）。本発明の抗体を、生得および獲得免疫応答のアクチベーターとして開発されている（Coley Pharmaceuticals）または現在開発中であるシトシン-グアニンジヌクレオチド（「CpG」）系製品と組合わせて使用することができる。例えば、本発明は、IgEを介するアレルギー障害を治療および／または予防するための本発明の方法と組成物におけるCpG 7909、CpG 8916、CpG 8954（Coley Pharmaceuticals）の使用を包含する（Weeratnaら, 2001, FEMS Immunol Med Microbiol., 32(1):65-71も参照、これは本明細書に参照により組み入れられる）。
【０２４６】
本発明は、当技術分野で公知のアレルギー障害を治療するためのいずれかの治療抗体、例えば、XolairTM（オマリズマブ；Genentech）；rhuMAB-E25（BioWorld Today, Nov. 10, 1998, p.1；Genentech）；CGP-51901（ヒト化抗IgE抗体）などとの組合わせた本発明の抗体の使用を包含する。
【０２４７】
さらに、本発明は、当技術分野で公知のアレルギー障害を治療するための他の組成物と組合わせた本発明の抗体の使用を包含する。特に、Carsonら（米国特許第6,426,336号；米国出願US 2002/0035109 Al；米国出願US 2002/0010343は本明細書に参照によりその全てを組み入れられる。
【０２４８】
5.3.5  免疫調節薬と抗炎症薬
本発明は自己免疫疾患および炎症性疾患を治療する方法であって、本発明の抗体の他の治療薬と併用した投与を含む上記方法を提供する。免疫応答調節薬の例は、限定されるものでないが、メトトレキセート、ENBREL、REMICADETM、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド抗生物質（例えば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、副腎皮質ステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（sirolimus）、ミゾリビン、デオキシスパグアリン（deooxyspergualin）、ブレキナール（brequinar）、マロノニトリルアミンド（malononitriloaminde）（例えば、leflunamide）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられる。
【０２４９】
抗炎症薬は、炎症性および自己免疫障害の治療に成功をおさめており、現在、このような障害のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に周知のいずれの抗炎症薬を本発明の方法に使用してもよい。抗炎症薬の限定されるものでない例は、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDS）、ステロイド抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬、およびメチルキサンチンを含む。NSAIDの例は、限定されるものでないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（CELEBREXTM）、ジクロフェナク（VOLTARENTM）、エトドラク（LODINETM）、フェノプロフェン（NALFON）、インドメタシン（INDOCINTM）、ケトララク（ketoralac）（TORADOLTM）、オキサプロジン（DAYPROTM）、ナブメントン（nabumentone）（RELAFENTM）、スリンダク（CLINORILTM）、トルメンチン（tolmentin）（TOLECTINTM）、ロフェコキシブ（VIOXXTM）、ナプロキセン（ALEVETM、NAPROSYNTM）、ケトプロテン（ACTRONTM）およびナブメトン（RELAFENTM）を含む。このようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、COX-1および／またはCOX-2）を阻害することにより機能する。ステロイド抗炎症薬の例は、限定されるものでないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRONTM）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（DELTASONETM）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン（azulfidine）、およびエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンを含む。
【０２５０】
5.3.6  抗癌薬および治療抗体
特定の実施形態においては、本発明の方法は、１以上の血管新生阻害剤の投与、例えば、限定されるものでないが：アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）；抗血管原性抗トロンビンIII；アンギオザイム（Angiozyme）；ABT-627；Bay12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS-275291；軟骨から抽出された阻害剤（CDI）；CAI；CD59補体フラグメント；CEP-7055；Col3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン（コラーゲンXVIII断片）；フィブロネクチン断片；Gro-beta；ハロフジノン；ヘパリナーゼ；ヘパリン六糖断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）；IM-862；インターフェロンα/β/γ；インターフェロン誘導性タンパク質（IP-10）；インターロイキン-12；クリングル5（プラスミノーゲンフラグメント）；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤（TIMPs）；2-メトキシエストラジオール；MMI270（CGS 27023A）；MoAb IMC-1C11；ネオバスタット；NM-3；パンゼム；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；血小板因子-4（PF4）；プリノマスタット（Prinomastat）；プロラクチン16KD断片；プロリフェリン（Proliferin）関連タンパク質（PRP）；PTK787/ZK222594；レチノイド；ソリマスタット（Solimastat）；スクアラミン；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；テトラヒドロコルチゾール-S；テトラチオモリブデン酸塩；サリドマイド；トロンボスポジン1（TSP-1）；TNP-470；トランスホーミング増殖因子β（TGF-b）；バスキュロスタチン（Vasculostatin）；バソスタチン（Vasostatin）（カルレチクリン断片）；ZD6126；ZD6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）；およびビスホスホン酸塩の投与を包含する。
【０２５１】
本発明の抗体と組合わせて本発明の様々な実施形態において使用することができる本発明の医薬組成物および投与剤形およびキットを含む抗癌薬としては、限定されるものでないが、アシビシン（acivicin）；アクラルビシン（acralvicin）；アコダゾール塩酸塩（acodazole hydrochloride）；アクロニン（acronine）；アドゼレシン（adozelesin）；アルデスロイキン（aldesleukin）；アルトレタミン（altretamine）；アンボマイシン（ambomycin）；アメタントロン酢酸塩（ametantrone acetate）；アミノグルテチミド（aminoglutethimide）；アムサクリン（amsacrine）；アナストロゾール（anastrozole）；アントラマイシン（anthramycin）；アスパラギナーゼ（asparaginase）；アスペルリン（asperlin）；アザシチジン（azacitidine）；アゼテパ（azetepa）；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット（batimastat）；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド（bicalutamide）；ビスアントレン塩酸塩（bisantrene hydrochloride）；ビスナフィドジメシラート（bisnafide dimesylate）；ビゼレシン（bizelesin）；ブレオマイシン硫酸塩（bleomycin sulfate）；ブレキナールナトリウム（brequinar sodium）；ブロピリミン（bropirimine）；ブスルファン（busulfan）；カクチノマイシン（cactinomycin）；カルステロン（calusterone）；カラセミド（caracemide）；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン（carboplatin）；カルムスチン（carmustine）；カルビシン塩酸塩（carubicin hydrochloride）；カルゼルシン（carzelesin）；セデフィンゴール（cedefingol）；クロラムブシル（chlorambucil）；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン（cisplatin）；クラドリビン（cladribine）；クリスナトールメシラート（crisnatol mesylate）；シクロホスファミド（cyclophosphamide）；シタラビン（cytarabine ）；デカルバジン（dacarbazine）；ダクチノマイシン（dactinomycin）；ダウノルビシン塩酸塩（daunorubicin hydrochloride）；デシタビン（decitabine）；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デザグアニン（dezaguanine）；デザグアニンメシラート（dezaguanine mesylate）；ジアジコン（diaziquone）；ドセタキセル（docetaxel）；ドキソルビシン（doxorubicin）；ドキソルビシン塩酸塩（doxorubicin hydrochloride）；ドロキシフェン（droloxifene）；ドロキシフェンクエン酸塩（droloxifene citrate）；ドロモスタノロンプロピオン酸塩（dromostanolone propionate）；デュアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキセート（edatrexate）；エフロルニチン塩酸塩（eflornithine hydrochloride）；エルサミトルシン（elsamitrucin）；エンロプラチン（enloplatin）；エンプロメート（enpromate）；エピプロピジン（epipropidine）；エピルビシン塩酸塩（epirubicin hydrochloride）；エルブロゾール（erbulozole）；エソルビシン塩酸塩（esorubicin hydrochloride）；エストラムスチン（estramustine）；エストラムスチン燐酸ナトリウム（estramustine phosphate sodium）；エタニダゾール（etanidazole）；エトポシド（etoposide）；エトポシド燐酸塩（etoposide phosphate）；エトプリン（etoprine）；ファドロゾール塩酸塩（fadrozole hydrochloride）；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド（fenretinide）；フロキシウリジン（floxuridine）；フルダラビン燐酸塩（fludarabine phosphate）；フルオロウラシル（fluorouracil）；フルロシタビン（flurocitabine）；フォスキドン（fosquidone）；フォストリエシンナトリウム（fostriecin sodium）；ゲムシタビン（gemcitabine）；ゲムシタビン塩酸塩（gemcitabine hydrochloride）；ヒドロキシ尿素（hydroxyurea）；イダルビシン塩酸塩（idarubicin hydrochloride）；イフォスファミド（ifosfamide ）；イルモフォシン（ilmofosine ）；インターロイキンII（組換えインターロイキンII、またはrIL2を含む）、インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-1a；インターフェロンγ-1b；イプロプラチン（iproplatin）；イリノテカン塩酸塩（irinotecan hydrochloride）；ランレオチド酢酸塩（lanreotide acetate）；レトロゾール（letrozole）；ロイプロリド酢酸塩（leuprolide acetate）；リアロゾール塩酸塩（liarozole hydrochloride）；ロメトレキソールナトリウム（lometrexol sodium）；ロムスチン（lomustine）；ロソキサントロン塩酸塩（losoxantrone hydrochloride）；マソプロコール（masoprocol）；メイタンシン（maytansine）；メクロレタミン塩酸塩（mechlorethamine hydrochloride）；メゲストロール酢酸塩（megestrol acetate）；メレンゲストロール酢酸塩（melengestrol acetate）；メルファラン（melphalan）；メノガリル（menogaril）；メルカプトプリン（mercaptopurine）；メトトレキセート（methotorexate）；メトトレキセートナトリウム（methotorexate sodium）；メトプリン（metoprine）；メツレデパ（meturedepa）；ミチンドミド（mitindomide）；ミトカルシン（mitocarcin）；ミトクロミン（mitocromin）；ミトギリン（mitogillin）；ミトマルシン（mitomalcin）；ミトマイシン（mitomycin）；ミトスパー（mitosper）；ミトタン（mitotane）；ミトキサントロン塩酸塩（mitoxantrone hydrochloride）；ミコフェノール酸（mycophenolic acid）；ノコダゾール（nocodazole）；ノガラマイシン（nogalamycin）；オルマプラチン（ormaplatin）；オキシスラン（oxisuran）；パクリタキセル（paclitaxel）；ペガスパルガーゼ（pegaspargase）；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine ）；ペプロマイシン硫酸塩（peplomycin sulfate）；ペルホスアミド（perfosfamide ）；ピポブロマン（pipobroman）；ピプロスルファン（piposulfan）；ピロキサントロン塩酸塩（piroxantrone hydrochloride）；プリカマイシン（plicamycin）；プロメスタン（plomestane）；ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）；ポルフィルマイシン（porfiromycin）；プレドニムスチン（prednimustine）；プロカルバジン塩酸塩（procarbazine hydrochloride）；ピューロマイシン（puromycin）；ピューロマイシン塩酸塩（puromycin hydrochloride）；ピラゾフリン（pyrazofurin）；リボプリン（riboprine）；ログレチミド（rogletimide）；サフィンゴル（safingol）；サフィンゴル塩酸塩（safingol hydrochloride）；セムスチン（semustine）；シムタラゼン（simtrazene）；スパルフォセートナトリウム（sparfosate sodium）；スパルソマイシン（sparsomycin）；スピロゲルマニウム塩酸塩（spirogermanium hydrochloride）；スピロムスチン（spiromustine）スピロプラチン；（spiroplatin）；ストレプトニグリン（streptonigrin）；ストレプトゾシン（streptozocin）；スルフェヌル（sulofenur）；タリソマイシン（talisomycin）；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；テガフール（tegafur）；テロキサントロン塩酸塩（teloxantrone hydrochloride）；テモポルフィン（temoporfin）；テニポシド（teniposide）；テロキシロン（teroxirone）；テストラクトン（testolactone）；チアミプリン（thiamiprine ）；チオグアニン（thioguanine）；チオテパ（thiotepa）；チアゾフリン（tiazofurin）；チラパザミン（tirapazamine）；トレミフ���ンクエン酸塩（toremifene citrate）；トレストロン酢酸塩（trestolone acetate）；トリシリビンリン酸塩（triciribine phosphate）；トリメトレキセート（trimetrexate）；トリメトレキセートグルクロン酸塩（trimetrexate glucuronate）；トリプトレリン（triptorelin）；ツブロゾール塩酸塩（tubulozole hydrochloride）；ウラシルムスタード（uracil mustard）；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド（vapreotide）；ベルテポルフィン（verteporfin）；ビンブラスチン硫酸塩（vinblastine sulfate ）；ビンクラスチン硫酸塩（vincristine sulfate）；ビンデシン（vindesine）；ビンデシン硫酸塩（vindesine sulfate）；ビネピジン硫酸塩（vinepidine sulfate）；ビングリシネート硫酸塩（vinglycinate sulfate）；ビンロイロシン硫酸塩（vinleurosine sulfate）；ビノレルビン酒石酸塩（vinorelbine tartrate）；ビンロシジン硫酸塩（vinrosidine sulfate）；ビンゾリジン硫酸塩（vinzolidine sulfate）；ボロゾール（vorozole）；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジノスタチン（zinostatin）；ゾルビシン塩酸塩（zorubicin hydrochloride）が挙げられる。他の抗癌薬としては、限定されるものでないが、20-epi-1,25ジヒドロキシビタミンD3；5-エチニルウラシル；アビラテロン（abiraterone）；アクラルビシン（aclarubicin）；アシルフルベン（acylfulvene）；アデシペノール（adecypenol）；アドゼレシン（adozelesin）；アルデスロイキン（aldesleukin）；全TK拮抗薬；アルトレタミン（altretamine）；アンバムスチン（ambamustine）；アミドックス（amidox）；アミフォスチン（amifostine ）；アミノレブリン酸（aminolevulinic acid）；アンルビシン（amrubicin）；アンサクリン（amsacrine）；アナグレリド（anagrelide）；アナストロゾール（anastrozole）；アンドログラホリド（andrographolide）；血管新生阻害剤；拮抗薬D；拮抗薬G；アントラレリックス（antarelix）；抗背方化形態発生タンパク質-1（anti-dorsalizing morphogenic protein-1）；抗男性ホルモン、前立腺癌薬、；抗女性ホルモン薬；抗ネオプラストン薬（antineoplaston）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィディコリングリシン酸塩（aphidicolin glycinate）；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；ara-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（asulacrine）；アタメスタン（atamestane）；アトリムスチン（atrimustine）；アキシナスタチン1（axinastatin 1）；アキシナスタチン2（axinastatin 2）；アキシナスタチン3（axinastatin 3）；アザステロン（azasetron）；アザトキシン（azatoxin）；アザチロシン（azatyrosine）；バッカチン（baccatin）III誘導体；バラノール（balanol）；バチマスタット（batimastat）；BCR/ABL拮抗薬；ベンゾクロリン（benzochlorins）；ベンゾイルスタウロスポリン（benzoylstaurosporine）；βラクタム誘導体；βアレチン（β-alethine）；βアクラマイシンB（betaclamycin B）；ベツリン酸；bFGF阻害薬；ビカルタミド（bicalutamide）；ビスアントレン（bisantrene）；ビスアジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド（bisnafide）；ビストラテンA（bistratene A）；ビゼルシン（bizelesin）；ブレフラート（breflate）；ブロピリミン（bropirimine）；ブドチタン（budotitane）；ブチオニンスルホキシミン（buthionine sulfoximine ）；カルシポトリオール（calcipotriol）；カルホスチンC（calphostin C）；カンプトテシン誘導体；カナリポックス（canarypox）IL-2；カペシタビン（capecitabine）；カルボキサミド-アミノ-ト��アゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨抽出阻害剤；カルゼレシン（carzelesin）；カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）；カスタノスペルミン（castanospermine ）；セクロピンB（cecropin B）；セトロレリックス（cetrorelix）；chlorlns；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト（cicaprost）；cis-ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）A；コリスマイシン（collismycin）B；コンブレタスタチンA4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン（crambescidin）816；クリスナトール（crisnatol）；クリプトフィシン（cryptophycin）8；クリプトフィシンA誘導体；キュラシンA；シクロペントアントラキノン（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスファート（cytarabine ocfosfate）；細胞溶解性因子；サイトスタチン（cytostatin）；ダクリキシマブ（dacliximab）；デシタビン（decitabine）；デヒドロジデム
ニン（dehydrodidemnin）B；デスロレリン（deslorelin）；デキサメタゾン（dexamethasone）；デキシホスファミド（dexifosfamide ）；デキスラゾキサン（dexrazoxane）；デキスベラパミル（dexverapamil）；ジアジコン（diaziquone）；ディデムニン（didemnin）B；ジドックス（didox）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール、9-；ジオキサマイシン（dioxamycin）；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラステロン（dolasetron）；ドキシフルリジン；（droloxifene）；ドロナビノール（dronabinol）；デュオカルマイシン（duocarmycin）SA；エベスレン（ebeslen）；エコムスチン（ecomustine）；エデルホシン（edelfosine ）；エドレコロマブ（edrecolomab）；エフロルニチン（eflornithine ）；エレメン（elemene）；エミテフル（emitefur）；エピルビシン（epirubicin）；エプリステリド（epristeride）；エストラムスチン（estramustine）類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール（etanidazole）；エトポシド（etoposide）燐酸塩；エキセメスタン（exemestane）；ファドロゾール（fadrozole）；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド（fenretinide）；フィルグラスチン（filgrastim ）；フィナステリド（finasteride）；フラボピリドール（flavopiridol）；フレゼラスチン（flezelastine）；フルアステロン（fluasterone）；フルダラビン（fludarabine）；フルオロダウノルニシン塩酸塩（fluorodaunorunicin hydrochloride）；ホルフェニメキス（forfenimex）；ホルメスタン（formestane）；ホストリエシン（fostriecin ）；ホテムスチン（fotemustine ）；ガドリニウムテキサヒドリン（gadolinium texaphyrin）；硝酸ガリウム（gallium nitrate）；ガロシタビン（galocitabine）；ガニレリックス（ganirelix）；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン（gemcitabine）；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム（hepsulfam）；ヘルグリン（heregulin）；ヘキサメチレンビスアセタミド；ヒペリシン（hypericin）；イバンドロン酸（ibandronic acid）；イダルビシン（idarubicin）；イドキシフェン（idoxifene）；イドラマントン（idramantone）；イルモフェシン（ilmofosine ）；イロマスタット（ilomastat）；イミダゾアクリドン（imidazoacridones）；イミキモド（imiquimod）；免疫刺激性ペプチド；インスリン様増殖因子-1受容体阻害剤；インターフェロン作動薬；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン（iobenguane）；ヨードドキソルビシン（iododoxorubicin）；イポメアノール（ipomeanol、4-）；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン（irosogladine）；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin）B；イタセトロン（itasetron）；ジャスプラキノリド（jasplakinolide）；カハラリド（kahalalide F）；ラメラリン-N-トリアセタート（lamellarin-N triacetate）；ランレオチド（lanreotide）；レイナマイシン（leinamycin）；レノグラスチン（lenograstim ）；レンチナン硫酸塩（lentinan sulfate）；レプトールスタチン（leptolstatin）；レトロソール（letrozole；白血病抑制因子）；（白血球αインターフェロン）；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン（leuprorelin）；レバミソール（levamisole）；リラロゾール（liarozole）；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド（lissoclinamide）7；ロバプラチン（lobaplatin）；ロンブリシン（lombricine）；ロメトレキソール（lometrexol）；ロニダミン（lonidamine）；ロソキサントロン（losoxantrone）；ロバスタチン（lovastatin）；ロキソリビン（loxoribine）；ルルトテカン（lurtotecan）；ルテチウムテキサフィリン（lutetium texaphyrin）；リソフィリン（lysofylline）；溶解性ペプチド；マイタンシン（maitansine）；マンノスタチン（mannostatin）A；マリマスタット（marimastat）；マソプロコル（masoprocol）；マスピン（maspin）；マトリリシン（matrilysin）阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル（menogaril）；メルバロン（merbarone）；メテレリン（meterelin）；メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド（metoclopramide）；MIF阻害剤；ミフェプリストーン（mifepristone）；（miltefosine ）；ミリモスチム（mirimostim）；ミスマッチ２本鎖RNA；ミトグアゾーン（mitoguazone）；ミトラクトール（mitolactol）；マイトマイシン（mitomycin）類似体；ミトナフィド（mitonafide）；ミトトキシン繊維芽細胞増殖因子-サポリン（mitotoxin fibroblast growth 因子-saporin）；ミトキサントロン（mitoxantrone ）；モファロテン（mofarotene）；モルグラモスチン（molgramostim）；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質A+マイコバクテリウム細胞壁 sk）；モジダモル（modidamol）；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍サプレッサー1に基づく治療法；マスタード抗癌薬；マイカペルオキシド（mycaperoxide）B；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（myriaporone）；N-アセチルジナリン；N-置換ベンズアミド；ナファレリン（nafarelin）；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン（naloxone+pentazocine）；ナパビン（napavin）；ナフテルピン（naphterpin）；ナルトグラスチム（nartograstim）；ネダプラチン（nedaplatin）；ネモルビシン（nemorubicin）；ネリドロン酸（neridronic acid）；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド（nilutamide）；ニサマイシン（nisamycin）；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物抗酸化薬；ニトルリン（nitrullyn）；O-6-ベンジルグアニン（O-6-ベンジルguanine）；オクトレチド（octreotide）；オキセノン（okicenone）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（onapristone）；オンダセトロン（ondansetron）；オンダセトロン（ondansetron）；オラシン（oracin）；経口サイトカインインデューサー；オルマプラチン（ormaplatin）；オサテロン（osaterone）；オキサリプラチン（oxaliplatin）；オキサウノマイシン（oxaunomycin）；パクリタキセル（paclitaxel）；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（palauamine）；パルミトイルリゾキシン（palmitoylrhizoxin）；パミドロン酸（pamidronic acid）；パナキシトリオール（panaxytriol）；パノミフェン（panomifene ）；パラバクチン（parabactin）；パゼリプチン（pazelliptine）；ペガスパルガーゼ（pegaspargase）；ペルデシン（peldesine）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン（pentostatin）；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン（perflubron）；ペルホスファミド（perfosfamide ）；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン（phenazinomycin）；フェニル酢酸塩；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル（picibanil）；ピロカルピン塩酸塩（pilocarpine hydrochloride ）；ピラルビシン（pirarubicin）；ピリトレキシム（piritrexim）；プラセチン（placetin）A；プラセチン（placetin）B；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；��金錯体；白金化合物；白金-トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム（porfimer sodium）；ポルフィロマイシン（porfiromycin）；プレドニゾン（prednisone）；プロピルビスアクリドン（propyl bis-acridone）；プロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Aに基づく免疫調節薬；タンパク質キナーゼC阻害剤；タンパク質キナーゼC阻害剤（微細藻類の）；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン（purpurin）；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体；raf拮抗薬；ラルチトレキセド（raltitrexed）；ラモセトロン（ramosetron）；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤（ras farnesyl protein transferase inhibitors）；ras阻害剤；ras-GAP阻害剤；脱メチル化レテルリプチン（retelliptine demethylated）；レニウムRe186エチドロン酸塩（rhenium Re 186 etidronate）；リゾキシン（rhizoxin）；リボザイム；RIIレチンアミド（RII retinamide）；ログレチミド（rogletimide）；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド（romurtide）；ロキニメキス（roquinimex）；ルビギノンBL（rubiginone BL ）；ルボキシル（ruboxyl）；サフィンゴル（safingol）；セントピン（saintopin）；SarCNU；サルコフィトール（sarcophytol）A；サルグラモスチン（sargramostim）；Sdi 1模倣物；セムスチン（semustine ）；老化誘導阻害剤（senescence derived inhibitor）1；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；１本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン（sizofiran）；ソブゾキサン（sobuzoxane）；ナトリウムボロカプテート（sodium borocaptate）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン（somatomedin）結合タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルフォシン酸（sparfosic acid）；スピカマイシン（spicamycin）D；スピロムスチン（spiromustine）；スプレノペンチン（splenopentin）；スポンジスタチン（spongistatin）1；スクアラミン（squalamine）；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド（stipiamide）；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン（sulfinosine）；超活性血管作用性腸ペプチド拮抗薬；スラジスタ（suradista）；スラミン（suramin）；スワイソニン（swainsonine）；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン（tallimustine）；タモキシフェンメチオジト（tamoxifen methiodide）；タウロムスチン（tauromustine）；タザロテン（tazarotene）；テコガランナトリウム；テガフール（tegafur）；テルルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン（temoporfin）；テモゾロミド（temozolomide）；テニポシド（teniposide）；テトラクロロデカオキシド（tetrachlorodecaoxide）；テトラゾミン（tetrazomine）；サリブラチン（thaliblastine）；チオコラリン（thiocoraline）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン（thymalfasin）；サイモポエチン受容体作動薬；サイモトリナン（thymotrinan）；甲状腺刺激ホルモン（thyroid stimulating hormone）；スズエチルエチオプルプリン（tin ethyl etiopurpurin）；チラパザミン（tirapazamine）；二塩化チタノセン；トプセンチン（topsentin）；トレミフェン（toremifene）；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン（tretinoin）；トリアセチルウルジン；トリシリビン（triciribine）；トリメトレキセート（trimetrexate）；トリプトレリン（triptorelin）；���ロピセトロン（tropisetron）；ツロステライド（turosteride）；チロシンキナーゼ阻害剤；（tyrp宿主ins）；（UBC 阻害剤）；ウベニメックス（ubenimex）；泌尿生殖器洞誘導増殖阻害剤因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド（vapreotide）；バリオリン（variolin）B；ベクター系、赤血球遺伝子治療法；ベラレゾル（velaresol）；ベルミン（vermine ）；ベルジン（verdins）；ベルテポルフィン（verteporfin）；ビノレルビン（vinorelbine）；ビンキサルチン（vinxaltine）；ビタキシン（vitaxin）；ボロゾール（vorozole）；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジラスコルブ（zilascorb）；およびジノスタチンスチマラマー（zinostatin stimalamer）が挙げられる。好ましいさらなる抗癌薬は5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０２５２】
本発明の方法に使用することができる治療抗体の例は、限定されるものでないが、HERCEPTIN（登録商標）（Trastuzumab）（Genentech, CA）（転移性乳癌の患者を治療するためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体である）；REOPRO（登録商標）（abciximab）（Centocor）（血餅形成の予防用の血小板上抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体である）；ZENAPAX（登録商標）（daclizumab）（Roche Pharmaceuticals、Switzerland）（免疫応答抑制薬）（急性腎他移植片拒絶の予防用の免疫抑制、ヒト化抗CD25モノクローナル抗体である）；PANOREXTM（マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体である）（Glaxo Wellcome/Centocor）；BEC2（マウス抗イディオタイプ（GD3エピトープ）IgG抗体である）（ImClone System）；IMC-C225（キメラ抗EGFR IgG抗体である）（IMClone System）；VITAXINTM（ヒト化抗AVβ3インテグリン抗体である）（Applied Molecular Evolution/Medimmune）；Campath 1H/LDP-03（ヒト化抗CD52 IgG1抗体である）（Leukosite）；Smart M195（ヒト化抗CD33 IgG抗体である）（Protein Design Lab/Kanebo）；RITUXANTM（キメラ抗CD20 IgG1抗体である）（IDEC Pharm/Genetech、Roche/Zettyaku）；LYMPHOCIDETM（ヒト化抗 CD22 IgG抗体である）（Immunomedics）；ICM3（ヒト化抗ICAM3抗体である）（ICOS Pharm）；IDEC-114（霊長類化抗CD80抗体である）（IDEC Pharm/Mitsubishi）；ZEVALDSFM（放射標識したマウス抗CD20抗体である）（IDEC/Schering AG）；IDEC-131（ヒト化抗CD40L抗体である）（IDEC/Eisai）；
IDEC-151（霊長類化抗CD4抗体である）（IDEC）；IDEC-152（霊長類化抗CD23抗体である）（IDEC/Seikagaku）；SMART 抗CD3（ヒト化抗CD3 IgGである）（Protein Design Lab）；5G1.1（ヒト化抗補体因子5（C5）抗体である）（Alexion Pharm）；D2E7（ヒト化抗TNF-α抗体である）（CAT/BASF）；CDP870（ヒト化抗TNF-αFabフラグメント（Celltech）；IDEC-151（霊長類化抗CD4 IgG1抗体である）（IDEC Pharm/Smithkline Beecham）；MDX-CD4（ヒト抗CD4 IgG抗体である）（Medarex/Eisai/Genmab）；CDP571（ヒト化抗TNF-αIgG4抗体である）（Celltech）；LDP-02（ヒト化抗α4β7抗体である）（LeukoSite/Genentech）；オルトクローンOKT4A（ヒト化抗CD4 IgG抗体である）（Ortho Biotech）；ANTOVATM（ヒト化抗CD40L IgG抗体である）（Biogen）；ANTEGRENTM（ヒト化抗VLA-4 IgG抗体である）（Elan）；およびCAT-152（ヒト抗TGF-β2抗体である）（Cambridge Ab Tech）が挙げられる。
【０２５３】
本発明の抗体と組合わせて使用することができる治療抗体の他の例を表７に掲げる。
【表７】
0004459810.tif 000013
【０２５４】
0004459810.tif 000014
【０２５５】
0004459810.tif 000015
【０２５６】
0004459810.tif 000016
【０２５７】
5.3.7  ワクチン治療
本発明は、被験者のワクチン組成物に対する免疫応答を増強する方法であって、上記被験者にFcεRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントおよびワクチン組成物を投与することを含み、ここで上記抗体またはそのフラグメントが上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増強することを特徴とする上記方法を提供する。或る特定の実施形態においては、上記抗体またはそのフラグメントは、ワクチンが指向している抗原の抗原提示および／または抗原プロセシングを増強することにより上記ワクチン組成物に対する免疫応答を増強する。当技術分野で公知のいずれのワクチン組成物も、本発明の抗体またはそのフラグメントと組合わせて有用である。
【０２５８】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗体の、当技術分野で公知のいずれの癌ワクチン、例えば、CanvaxinTM（Cancer Vax, Corporation、黒色腫および大腸癌）；Oncophage（HSPPC-96；Antigenics；転移性黒色腫）；HER-2/neu癌ワクチンなどと組合わせての使用も包含する。本発明の方法と組成物に使用される癌ワクチンは、例えば、抗原特異的ワクチン、抗イディオタイプワクチン、樹状細胞ワクチン、またはDNAワクチンであってもよい。本発明は、本発明の抗体のSegalら（米国特許第6,403,080号、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）が記載した細胞に基づくワクチンとの併用を包含する。本発明の抗体と一緒に用いる細胞に基づくワクチンは自家性または同種異系であってもよい。簡単に説明すると、Segalらが記載した癌に基づくワクチンはGenitrix, LLCのオプソノカイン（Opsonokine）（TM）製品に基づく。オプソノカイン（Opsonokine）（TM）は遺伝子操作により作製したサイトカインであり、腫瘍細胞と混合すると自動的に細胞の表面に付着する。「飾られた（decorated）」細胞をワクチンとして投与すると、細胞上のサイトカインは受給者中の重要な抗原提示細胞を活性化する一方、その抗原提示細胞が腫瘍細胞を摂取することを可能にする。次いで抗原提示細胞は「キラー」Ｔ細胞に身体全体の類似腫瘍細胞を見付けて破壊するように指示する。このようにして、オプソノカイン（Opsonokine）（TM）製品は腫瘍細胞を強力な抗腫瘍免疫治療薬に変換する。
【０２５９】
一実施形態において本発明は、本発明の抗体の当技術分野で公知のいずれのアレルギーワクチンと組合わせての使用も包含する。本発明の抗体は、例えば、Linhartら（2000, FASEB Journal, 16 (10): 1301-3、これは参照により組み入れられる）が記載した、花粉アレルギーに対するワクチン接種に利用される大オオアワガエリ（major timothy）花粉アレルゲンをコードする組換えハイブリッド分子と組合わせて使用することができる。さらに本発明の抗体は、Hornerら（2002, Allergy, 57 Suppl, 72:24-9、これは参照により組み入れられる）が記載した、DNAに基づくワクチン接種と組合わせて使用することができる。本発明の抗体は、Choiら（2002, Ann. アレルギーAsthma Immunology, 88 (6):584-91）およびBarlanら（2002, Journal Asthma, 39 (3):239-46）（両方とも、参照により本明細書にその全文が組み入れられる）が記載した、カルメット‐ゲラン杆菌（「BCG」）ワクチン接種と組合わせて、IgE分泌を下方調節するために使用することができる。本発明の抗体は食物アレルギーを治療する上で有用である。特に本発明の抗体は、ワクチンまたは当技術分野で公知の他の免疫治療（Hourihaneら, 2002, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2 (3):227-31を参照）と組合わせて、ピーナッツアレルギーを治療するために使用することができる。
【０２６０】
本発明の方法および組成物は、抗原に対する免疫が所望される場合にワクチンと組合わせて使用することができる。このような抗原は当技術分野で公知のいずれの抗原であってもよい。本発明の抗体は、例えば感染病原体、罹患したまたは異常な細胞、例えば、限定されるものでないが、細菌（例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、好気性菌、スピロヘータ、ミコバクテリア、リケッチア属、クラミジア属など）、寄生虫、真菌（例えば、カンジダアルビカンス、アスペルギルス属など）、ウイルス（例えば、DNAウイルス、RNAウイルスなど）、または腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用してもよい。ウイルス感染は、限定されるものでないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）；A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、または他の肝炎ウイルス；サイトメガロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス-1（-2、-3、-4、-5、-6）、ヒトパピローマウイルスウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、パラインフルエンザウイルス（PIV）、エプスタイン・バーウイルス、またはいずれか他のウイルス感染を含む。
【０２６１】
本発明は、ワクチン組成物の抗原に対する体液性および／または細胞を介する応答を増強するための本発明の抗体の使用を包含する。本発明はさらに、特定の抗原または抗原に対する免疫応答の増強が疾患または障害を治療または予防するために有効である場合、特定の障害を予防または治療するための本発明の抗体の使用も包含する。このような疾患および障害は、限定されるものでないが、ウイルス感染、例えばHIV、CMV、肝炎、ヘルペスウイルス、麻疹など、細菌感染、真菌および寄生虫感染、癌、ならびに特定の抗原に対する免疫応答を増強することにより治療または予防するのに受入れられる他の疾患または障害を含む。
【０２６２】
5.4  組成物および投与の方法
本発明は、本発明の抗体を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患、障害または感染に関連する１以上の症候群を治療、予防、および改善する方法であって、被験者に有効な量の本発明の融合タンパク質もしくは複合分子、または本発明の融合タンパク質もしくは複合分子を含む医薬組成物を投与することによる上記方法も提供する。好ましい態様においては、抗体または融合タンパク質または複合分子は、実質的に精製されている(すなわち、実質的にその効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を含まない)。特定の実施形態においては、被験者は動物、好ましくは哺乳類動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルおよびヒト）である。好ましい実施形態においては、被験者はヒトである。
【０２６３】
様々な送達系が公知であり、本発明の抗体を含む組成物を投与するために利用することができ、例えばリポソーム中の封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、核酸のレトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。
【０２６４】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体を本発明の抗体の標的を定めて送達するためのリポソームに入れて製剤する。リポソームは、同心に配置した水相を封入するリン脂質二重層から構成される小胞である。リポソームは典型的には様々なタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む。リポソームの成分は生物膜の脂質配置と同様に二重層の立体配置に置かれる。リポソームは、部分的に、その生物共存性、低免疫原性、および低毒性の故に、特に好ましい送達小胞である。リポソームの調製方法は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に含まれる、例えば、Epsteinら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688；Hwangら, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4；米国特許第4,485,045号および第4,544,545号を参照；これらは全て参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０２６５】
本発明はまた、長い血清半減期、すなわち長い循環時間をもつリポソームを調製する方法、例えば米国特許第5,013,556号に開示された方法も包含する。本発明の方法に使用される好ましいリポソームは循環から速やかにクリアーされない、すなわち、単核の貪食細胞系（MPS）に取込まれることはない。本発明は、当業者に公知の方法を用いて調製される立体的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機構に束縛されることを意図
しないが、立体的に安定化したリポソームは嵩張ったかつ高度にフレキシブルな親水成分とともに脂質成分を含有し、これがリポソームの血清タンパク質との欲しない反応を低下し、血清成分によるオプソニン化を低下し、そしてMPSによる認識を低下する。立体的に安定化したリポソームは、好ましくはポリエチレングリコールを用いて調製される。リポソームおよび立体的に安定化したリポソームの調製については、例えば、Bendasら, 2001 Bio Drugs, 15(4):215-224；Allenら, 1987 FEBS Lett. 223:42-6；Klibanovら, 1990 FEBS Lett., 268:235-7；Blumら, 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029:91-7；Torchilinら, 1996, J. Liposome Res. 6:99-116；Litzingerら, 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190:99-107；Maruyamaら, 1991, Chem. Pharm. Bull., 39:1620-2; Klibanovら, 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allenら, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13:285-309を参照；これらはすべて参照により本明細書にその全文が組み入れられる。本発明はまた、特定の器官を標的とするように工夫したリポソームも包含する。例えば、米国特許第号4,544, 545を参照。本発明の組成物および方法に使用する特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により作製することができる。リポソームを規定した孔サイズのフィルターを通して押出し、所望の直径を有するリポソームを得る。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のフラグメント、例えば、F(ab')をリポソームと、先に記載された方法を用いて複合化してもよい（例えば、Martinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288を参照、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）。
【０２６６】
本発明の抗体はまた、免疫リポソームとして製剤してもよい。免疫リポソームは、本発明の抗体またはそのフラグメントが共有結合または非共有結合によりリポソーム表面と結合していることを特徴とするリポソーム組成物を意味する。抗体をリポソーム表面と結合する化学は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に包含され、例えば、Allenら, 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44；Hansenら, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239:133-44を参照；これらは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。最も好ましい実施形態においては、本発明の方法と組成物に使用する免疫リポソームはさらに立体的に安定化させる。好ましくは、本発明の抗体を共有結合または非共有結合により、リポソームの脂質二重層に安定して根付いた疎水性アンカーと結合する。疎水性アンカーの例としては、限定されるものでないが、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルイノシトール（PI）が挙げられる。抗体と疎水性アンカーの間の共有結合を達成するために、当技術分野で公知の生化学手法のいずれを用いてもよく、例えば、J. Thomas August, ED., 1997, 「遺伝子治療：薬理学の進歩（Gene Therapy : Advances in Pharmacology）」, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p.399-435を参照、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。例えば、抗体分子上の官能基を、疎水性アンカーと結合しているリポソーム上の活性基と反応させてもよい、例えば、抗体上のリシン側鎖のアミノ基を、水溶性カルボジイミドを用いて活性化したリポソームと結合しているN-グルタリルホスファチジルエタノールアミンとカップリングさせてもよく；または還元した抗体のチオール基を、ピリジルチオプロピオニル-ホスファチジルエタノールアミンなどのチオール反応性アンカーを経由してリポソームとカップリングさせてもよい。例えば、Dietrichら, 1996, Biochemistry, 35:1100-1105；Loughreyら, 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901:157-160；Martinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288；Martinら, 1981, Biochemistry, 20:4429-38を参照；これらはすべて参照により本明細書にその全文が組み入れられる。特定の作用機構に束縛されることを意図しないが、本発明の抗体を含む免疫リポソーム製剤は、抗体を標的細胞、すなわち、抗体が結合するFcγRIIB受容体を含む細胞の細胞質へ送達するので、特に治療薬として有効である。免疫リポソームは、好ましくは、血液、特に標的細胞中で長い半減期を有し、標的細胞の細胞質内部に移行することができ、それにより治療薬の消失またはリソソーム内経路による分解を避ける。
【０２６７】
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む免疫リポソームを包含する。いくつかの実施形態においては、免疫リポソームはさらに１以上の本明細書に開示したさらなる治療薬を含む。
【０２６８】
本発明の免疫リポソーム組成物は、１以上の小胞を形成する脂質、本発明の抗体またはそのフラグメントまたは誘導体、および場合によっては親水性ポリマーを含む。小胞を形成する脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖、例えばアシル鎖と極性ヘッド基を有する脂質である。小胞を形成する脂質の例としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、および糖脂質、例えば、セレブロシド、ガングリオシドが挙げられる。さらなる本発明の製剤に有用な脂質が当業者に公知であり、本発明の範囲に包含される。いくつかの実施形態において、免疫リポソーム組成物はさらに、リポソームの血清半減期を増大する親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールおよびガングリオシドGM1を含む。親水性ポリマーをリポソームと複合化する方法は当技術分野で周知であり、本発明の範囲に包含される。免疫リポソームおよびそれらを調製する方法の総括については、例えば、PCT国際公開第WO 97/38731号、Vingerhoeadsら, 1994, Immunomethods, 4:259-72；Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7):791-799；Abraら, 2002, Journal of liposome research, 12(1&2):1-3；Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2):267-281；Bendasら, 2001 BioDrugs, 14 (4):215-224；J. Thomas August, 編, 1997,「遺伝子治療：薬理学の進歩（Gene Therapy : Advances in Pharmacology）」, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA., p.399-435を参照、これらは全て参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０２６９】
本発明の抗体を投与する方法は、限定されるものでないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）を含む。特定の実施形態においては、本発明の抗体を筋肉内、静脈内、または皮下に投与する。組成物をいずれの普通の経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、かつ他の生物学的活性薬と一緒に投与してもよい。投与は全身に対してでもまたは局所に対してであってもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエーロゾル化剤を用いる製剤の使用により肺投与を利用することもできる。例えば、米国特許第号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；および4,880,078；ならびにPCT公開WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；およびWO 99/66903を参照、これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０２７０】
本発明はまた、本発明の抗体を、ヘルメットによりシールした容器、例えば、アンプルまたは小袋（サッシェ）中にパッケージし、抗体の量を表示して提供する。一実施形態においては、本発明の抗体を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物をヘルメットによりシールした容器に入れて供給し、そして例えば水または生理食塩水を用いて被験者に投与するために適当な濃度に再構築してもよい。好ましくは、本発明の抗体を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物をヘルメットによりシールした容器に入れて少なくとも5mg、さらに好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、または少なくとも75mgの単位用量にて供給する。凍結乾燥した本発明の抗体はその元来の容器中で2〜8℃の間で貯蔵しなければならず、かつ抗体は、再構築後12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与しなければならない。代わりの実施形態においては、本発明の抗体を、液剤形で、ヘルメットによりシールした容器に入れて、抗体、融合タンパク質、または複合分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、抗体の液剤形を、ヘルメットによりシールした容器に入れて、少なくとも1mg/ml、さらに好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/mlの抗体を供給する。
【０２７１】
障害に関連するの１以上の症候群の治療、予防または改善するために有効でありうる本発明の組成物の量は、標準の臨床技術により決定することができる。製剤で用いるべき正確な用量はまた、投与経路、および病状の重篤度にも依存しうるので、医師の判断およびそれぞれの患者環境によって決定しなければならない。有効な用量をin vitroまたは動物モデル試験系から誘導した用量-応答曲線から外挿することもできる。
【０２７２】
本発明に包含される抗体について患者に投与される投与量は、典型的には、0.0001mg/kg〜100mg/kg患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kgまたは0.01〜0.10mg/kg患者体重である。一般的に、外来ポリペプチドに対する免疫応答の故に、ヒト抗体はヒト体内において他種由来の抗体より長い半減期を有する。従って、ヒト抗体は投与量の低減および投与頻度の低減がしばしば可能である。さらに、例えば、脂質化などの修飾により抗体の取込みおよび組織貫入を増強することにより、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与の量と頻度を低減することができる。
【０２７３】
一実施形態において、患者に投与される本発明の抗体の投与量は、単一薬治療として用いるとき、0.01mg〜1000mg/日である。他の実施形態においては、本発明の抗体を他の治療組成物と一緒に用い、患者に投与される投与量は上記抗体を単一薬治療法として用いるときより低い。
【０２７４】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所投与することが所望されうる；この投与は、例えば、限定されるものでないが、局所注入により、注射により、またはシラスチック（sialastic）メンブランなどのメンブランまたは繊維を含む多孔質、非孔質、またはゼラチン状材料からなる移植片を用いて達成することができる。好ましくは、本発明の抗体を投与するとき、抗体または融合タンパク質を吸収しない材料を使うように注意しなければならない。
【０２７５】
他の実施形態においては、組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, in 「感染症と癌の治療法におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）」, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss, New York, pp.353-365 (1989)；Lopez-Berestein, ibid. , pp.3 17-327 を参照；一般的には前掲を参照）。
【０２７６】
さらに他の実施形態においては、組成物を制御放出または持続放出系で送達することができる。当業者に公知のいずれの技術を利用して、本発明の１以上の抗体を含む持続放出製剤を作ることができる。例えば、米国特許第4,526,938号；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ningら, 1996,「ヒト大腸癌の腫瘍内放射免疫治療  持続放出ゲルを用いる異種移植片（Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel）」 Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら, 1995, 「長循環エマルジョンの抗体を介する肺ターゲティング（Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions）」 PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, 「心血管応用のためのbFGF抗体に対する生物分解性ポリマー担体（Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application）」 Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, 「局所送達のための、組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化（Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery）」 Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照、これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる。一実施形態においては、ポンプを制御放出系に用いる（Langer, 前掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507；およびSaudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。他の実施形態においては、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を達成することができる（例えば「制御放出の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；「制御放出薬生物学的活性、医薬品設計と性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）」, Smolen およびBall (編), Wiley, New York (1984)；RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；（またLevyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照）；米国特許第5,679,377号；米国特許第5,916,597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989,463号；米国特許第5,128,326号；PCT公開WO 99/15154；およびPCT公開WO 99/20253を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、限定されるものでないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピリジン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸（PLA）、ポリ(乳酸-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに他の実施形態においては、制御放出系を治療標的（例えば、肺）の近位に配置して、その結果、全身用量の一部分しか必要としないようにすることができる（例えば、Goodson, in 「制御放出の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, 前掲, vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照）。他の実施形態においては、制御放出移植片として有用なDunnら（米国特許第号5,945,155を参照）によるポリマー組成物を使用する。この特定の方法は、生物活性物質のポリマー系からのin situ制御放出に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所にあってもよい。他の実施形態においては非ポリマー持続送達系を使用し、この場��、被験者体内の非ポリマー移植片を薬物送達系として利用する。体内に移植すると、移植片の有機溶媒は周囲組織液中に散逸、分散または浸出して非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体のミクロ多孔質マトリックスを形成する（米国特許第5,888,533号を参照）。
【０２７７】
制御放出系は、Langer（1990, Science 249:1527-1533）による総括に考察されている。当業者に公知のいずれの技術を用いて本発明の１以上の治療薬を含む持続放出製剤を作ってもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；国際公開WO 91/05548およびWO 96/20698；Ningら, 1996, RadioTherapy & Oncology 39:179-189；Songら, 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照、これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０２７８】
特定の実施形態においては、本発明の組成物が抗体をコードする核酸である場合、核酸をin vivo投与してそのコードされた抗体の発現を促進することができる；それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築しかつそれを細胞内に取込まれるように投与することにより、例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第4,980,286号を参照）、または直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメントにより（例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤を用いてコーティングして、または核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（例えば、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）などによる。あるいは、核酸を細胞内に導入して宿主細胞DNAに組込んで相同的組換えにより発現させてもよい。
【０２７９】
抗体について、被験者に投与される治療上または予防上有効な投与量は、典型的には、0.1mg/kg〜200mg/kg被験者体重である。好ましくは、被験者に投与される投与量は、0.1mg/kg〜20mg/kg被験者体重、そしてさらに好ましくは1mg/kg〜10mg/kg被験者体重である。本発明の抗体の投与の用量と頻度はまた、例えば脂質化などの修飾による抗体または融合タンパク質の取込みおよび組織貫入（例えば、肺中への）の増強によって低減することもできる。
【０２８０】
本発明の抗体の治療上または予防上有効な量を用いる被験者の治療は、単一治療または、好ましくは、シリーズの治療を含んでもよい。好ましい例においては、被験者を約0.1〜30mg/kg体重、毎週１回、約1〜10週間、好ましくは約2〜8週間、さらに好ましくは約3〜7週間、そしてなおさらに好ましくは約4、5、または6週間の範囲で、本発明の抗体を用いて治療を行う。他の実施形態においては、本発明の医薬組成物を毎日１回、毎日２回、または毎日３回投与する。他の実施形態においては、医薬組成物を毎週１回、毎週２回、毎２週１回、毎月１回、毎６週１回、毎２月１回、毎年２回または毎年１回投与する。治療に使用する抗体の有効な投与量は、特定の治療のコースにわたって増加または減少しうることも理解されるであろう。
【０２８１】
5.4.1  医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純なまたは非殺菌の組成物）および単位投与剤形の調製に利用することができる医薬組成物（すなわち、被験者または患者に投与するのに好適である組成物）を含む。そのような組成物は、本明細書に開示した予防および／もしくは治療薬またはこれらの薬剤と製薬上許容される担体の組合わせの予防上または治療上有効な量を含む。好ましくは、本発明の組成物は本発明の抗体および製薬上許容される担体の予防上または治療上有効な量を含む。
【０２８２】
ある特定の実施形態において医薬組成物は、FcγRIIAが結合する親和性より大きい親和性でFcγRIIBと結合する治療上有効な量の抗体またはそのフラグメント、特異的に癌抗原と結合する細胞傷害性抗体、および製薬上許容される担体を含む。他の実施形態においては、上記医薬組成物はさらに１以上の抗癌薬を含む。
【０２８３】
特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」は、連邦または州政府の規制当局により認可されたまたは米国薬局方もしくは他の一般的に認められた動物そして特にヒトにおける使用に対する薬局方に掲げられたことを意味する。用語「担体」は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全）、賦形剤、または治療薬を投与するのに用いるビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水および油などの無菌液であってもよく、石油、動物、植物または合成起源、例えばピーナッツオイル、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの無菌液を含む。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩水およびブドウ糖およびグリセロール水溶液もまた、特に注射溶液として液状担体として利用することができる。好適な製薬腑形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。所望であれば、組成物はまた、小量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤などの剤形であってもよい。
【０２８４】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与剤形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、ヘルメットによりシールした容器、例えばアンプルまたは小袋（サシェット）に入れ、活性薬の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合、無菌製薬品質の水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を注射により投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、その成分が投与前に混合されるようにすることができる。
【０２８５】
本発明の組成物を、中性または塩形態として製剤してもよい。製薬上許容される塩としては、限定されるものでないが、アニオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導されるアニオンと形成した塩、およびカチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンと形成した塩を含む。
【０２８６】
5.4.2  遺伝子治療
特定の実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子治療法の方法により、疾患、障害、または感染に関連する１以上の症候群を治療、予防、または改善する。遺伝子治療法は、被験者への発現されたまたは発現されうる核酸の投与により実施する治療法を意味する。本発明のこの実施形態においては、核酸はそのコードした抗体または融合タンパク質を産生して治療または予防効果を媒介する。
【０２８７】
当技術分野で利用しうるいずれの遺伝子治療用の方法を本発明に従って使用することができる。方法の例を以下に記載する。
【０２８８】
遺伝子治療法の方法の一般的総括については、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11 (5) :155-215を参照。利用することができる組換えDNA技術の技術分野で公知の方法は、Ausubelら (編), 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」 John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, 「遺伝子導入および発現  研究室マニュアル（Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual）」, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０２８９】
好ましい態様においては、本発明の組成物は抗体をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な宿主中において抗体を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能しうる形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは、誘導可能な、構成的な、かつ場合によっては、組織特異的である。他の特定の実施形態においては、抗体コード配列およびいずれか他の所望の配列がゲノム内の所望の部位における相同的組換えを促進する領域にフランキングし、その結果、抗体をコードする核酸の染色体内発現を可能にする核酸分子が使用される（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 86:8932-8935；ならびにZijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０２９０】
他の好ましい態様においては、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能しうる形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは、誘導可能な、構成的な、かつ場合によっては、組織特異的である。他の特定の実施形態においては、融合タンパク質のコード配列およびいずれか他の所望の配列がゲノム内の所望の部位における相同的組換えを促進する領域にフランキングし、その結果、融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現を可能にする核酸分子が使用される。
【０２９１】
核酸の被験者中への送達は、直接的（この場合には被験者を核酸または核酸を運ぶベクターに直接曝す）または間接的（この場合には細胞を最初に核酸にin vitroで形質転換し、次いで被験者中に移植する）のいずれであってもよい。これらの２つの手法は、それぞれ、in vivoまたはex vivo遺伝子治療法として公知である。
【０２９２】
特定の実施形態においては、核酸配列を直接in vivoに投与し、そこで発現してコードされた産物を発現する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、実施することができる；例えば、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築しかつそれを細胞内に取込まれるように投与することにより、例えば、欠陥または弱毒化レトロウイルスまたは他のベクターを使った感染により（米国特許第4,980,286号を参照）、または裸のDNAの直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤を用いてコーティングし、リポソーム、ミクロ粒子、もしくはマイクロカプセル内に封入し、またはそれらを核に進入することが知られるペプチドと連結して投与することにより、受容体を介するエンドサイトーシスを受けるリガンドと連結して投与すること、（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）（これを用いて受容体を特異的に発現する細胞型を標的とする）などによる。他の実施形態においては、核酸-リガンド複合体（このリガンドはエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、リソソーム分解を回避させることができる。さらに他の実施形態において、核酸は、特異的受容体をターゲティングすることにより、細胞特異的取込みと発現をin vivoで標的にすることができる（例えば、PCT公開WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO 93/20221を参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、そして発現のために宿主細胞DNA内に相同的組換えによって組込ませることができる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 ；およびZijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０２９３】
特定の実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを利用することができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNA中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療法に利用する抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を１以上のベクター中にクローニングして、ヌクレオチド配列の被験者中への送達を容易にする。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら、（1994, Biotherapy 6:291-302）に見出すことができ、これは、化学治療にさらに耐性のある幹細胞を作る目的でmdr 1遺伝子を造血性幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献には：Clowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Kleinら, 1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114がある。
【０２９４】
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用しうる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達するビヒクルとして魅力がある。アデノウイルスは自然で呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引起す。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染することができるので有利である。KozarskyおよびWilson（Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993）はアデノウイルスに基づく遺伝子治療法の総括を報じている。Boutら（Human Gene Therapy, 5:3-10,1994）は、遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの利用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434；Rosenfeldら, 1992, Cell 68 :143-155；Mastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公開W0 94/12649；ならびにWangら, 1995, Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターを利用する。
【０２９５】
アデノ随伴ウイルス（AAV）も遺伝子治療における利用が報じられている（例えば、Walshら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第5,436,146号を参照）。
【０２９６】
遺伝子治療に対する他の手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介するトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、遺伝子を組織培養物中の細胞に導入することに関わる。通常、導入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択のもとに置いて、取上げられかつ導入した遺伝子を発現する細胞を単離する。次いでこれらの細胞を被験者に送達する。
【０２９７】
この実施形態においては、核酸を細胞中に導入した後に、得られる組換え細胞をin vivo投与する。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば、限定されるものでないが、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いるトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、細胞融合、染色体融合遺伝子導入（chromosome-mediated gene transfer）、微小核融合遺伝子導入（microcell mediated gene transfer）、スフェロプラスト融合などにより実施することができる。外来遺伝子を細胞中に導入するための多数の技術は当技術分野で公知であり（例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；およびClin. Pharma. Ther. 29:69-92,1985を参照）、受給細胞の必要な発生および生理学的機能が破壊されないことを条件として本発明に従って利用することができる。その技術は核酸の細胞への安定な導入を提供して、核酸が細胞により発現され、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝してかつ発現されるものでなければならない。
【０２９８】
得られる組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血性幹または祖先細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。細胞の使用予想量は、所望の効果、患者状態などに依存し、当業者が決定しうる。
【０２９９】
遺伝子治療の目的で核酸を導入する相手の細胞は、いずれの所望の、利用しうる細胞型を包含してもよく、限定されるものでないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばTリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹または祖先細胞、特に造血性幹または祖先細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含む。
【０３００】
好ましい実施形態においては、遺伝子治療に使用される細胞は被験者自己のものである。
【０３０１】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する一実施形態においては、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞中に導入して、その細胞またはその子孫により発現されうるようにし、次いでその組換え細胞をin vivoで投与して治療効果を与える。特定の実施形態においては、幹または祖先細胞を用いる。単離してin vivoで維持することができる。いずれの幹および／または祖先細胞も潜在的に、本発明のこの実施形態に従って利用することができる（例えば、PCT公開WO 94/08598；StempleおよびAnderson, 1992, 細胞7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A :229；ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照）。
【０３０２】
特定の実施形態においては、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能しうる形で連結されて、適当な転写誘導物質の存在または不在を制御することにより核酸の発現を制御しうる誘導プロモーターを含む。
【０３０３】
5.4.3  キット
本発明は、本発明の抗体を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１以上の他の予防または治療薬を、医薬パックまたはキット中に含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも含む。場合によってはこのような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式であって、ヒト投与用の製造、使用または販売行政当局による認可を反映する注意書きを添付してもよい。
【０３０４】
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態においては、キットは１以上の本発明の抗体を含む。他の実施形態においては、キットはさらに、癌の治療用に有用な１以上の他の予防または治療薬を、１以上の容器中に含む。他の実施形態においては、キットはさらに、１以上の癌に関連する癌抗原と結合する１以上の細胞傷害性抗体を含む。ある特定の実施形態において、他の予防または治療薬は化学治療薬である。他の実施形態において、予防または治療薬は生物学的またはホルモン治療薬である。
【０３０５】
5.5  治療上の効用の特徴付けおよび実証
本発明の医薬組成物または予防または治療薬の複数の形態は、好ましくは、in vitro、例えば細胞培養系で、および次いでin vivo、例えば動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデル系で所望の治療活性について試験した後に、ヒトに使用する。例えば、特定の医薬組成物の投与が示されるかどうかを確認するために用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイであって、患者組織サンプルを培養で増殖し、医薬組成物と曝すかまたはそうでなければ接触させ、そしてこのような組成物の組織サンプルに対する効果、例えば、軟寒天中での増殖および／またはコロニー形成または３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の抑制または減少を観察する上記アッセイを含む。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、治療上最も有効な予防または治療分子をそれぞれの個々の患者に対して同定することができる。あるいは、患者からの細胞を培養する代わりに、治療薬と方法を、腫瘍または悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。様々な特定の実施形態においては、in vitro アッセイを、自己免疫性または炎症性障害（例えば、Ｔ細胞）に関わる細胞型の代表的細胞を用いて実施し、本発明の医薬組成物がこのような細胞型に対して所望の効果を有するかを確認することができる。当技術分野の多数のアッセイ標準を用いて、このような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は、3H-チミジン組込みを測定することにより、直接細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／またはコロニー形成または３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の減少などに基づいて視覚で評価することができる。
【０３０６】
予防および／または治療薬の組合わせは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系としては、限定されるものでないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の特定の実施形態においては、予防および／または治療薬の組合わせはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されていて、当業者に周知である。予防および／または治療薬は、反復して投与することができる。予防および／または治療薬を投与する時間的体制、およびこのような薬剤を別々にまたは混合物として投与するかどうかなどの操作のいくつかの態様は、様々であるうる。
【０３０７】
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上にFcγRを発現するトランスジェニックマウス、例えば、米国特許第5,877,396号（これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる）に記載されたいずれかのマウスモデルである。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限定されるものでないが、ヒトFcγRIIIAを運ぶマウス、ヒトFcγRIIAを運ぶマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIIAを運ぶマウス、ヒトFcγRIIBとヒトFcγRIIAを運ぶマウスが挙げられる。
【０３０８】
本発明の予防および／または治療薬が一度試験されていると、それらを臨床試験に試験してそれらの効力を確立することができる。臨床試験を確立することは、当業者に公知の普通の方法論に従って実施しうるのであって、本発明の組成物の最適の投与量と投与経路だけでなく毒性プロファイルも日常の実験を利用して確立することができる。
【０３０９】
本発明の組合わせ治療法の抗炎症性活性は、当技術分野で公知のかつCrofford L. J.およびWilder R. L.（「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals）」 in 「関節炎と近縁症状：リウマチ学の教科書（Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology）」, McCartyら (編), 第30章 Lee and Febiger, 1993)に記載の様々な炎症性関節炎の実験動物モデルを利用して決定することができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的かつ自発性動物モデルはまた、本発明の組合わせ治療法の抗炎症性活性を評価するために利用することもできる。以下は例として掲げたいくつかのアッセイであり、限定されるものではない。
【０３１０】
当技術分野で公知のかつ広く利用される関節炎または炎症性疾患用の主な動物モデルとしては、アジュバントが誘導する関節炎ラットモデル、コラーゲンが誘導する関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに、抗原が誘導する関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルが挙げられ、これらは全て、Crofford L. J. and Wilder R. L. （「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals）」 in 「関節炎と近縁症状：リウマチ学の教科書（Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology）」, McCartyら (編), 第30章 Lee and Febiger, 1993、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる)に記載されている。
【０３１１】
本発明の組合わせ治療法の抗炎症性活性は、カラゲナンが誘導する関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラゲナンが誘導する関節炎はまた、ウサギ、イヌおよびブタにおける慢性関節炎または炎症の研究にも利用されている。定量的な組織形態計測的評価を用いて治療効力を決定する。このようなカラゲナンが誘導する関節炎モデルを利用する方法は、Hansra P.ら,「ラットにおけるカラゲナンが誘導する関節炎（Carrageenan-induced Arthritis in the Rat）」, Inflammation, 24(2):141-155, (2000)に記載されている。また、ザイモサンが誘導する炎症動物モデルも普通に利用されてかつ当技術分野で公知である。
【０３１２】
本発明の組合わせ治療法の抗炎症性活性はまた、カラゲナンが誘導するラットの足浮腫（paw edema）の抑制を、Winter C. A.ら,「抗炎症薬用アッセイとしての、カラゲナンが誘導するラット後足浮腫（Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs）」Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)に記載の方法の改変法を用いて測定することにより評価することもできる。このアッセイはほとんどのNSAIDの抗炎症性活性に対する一次in vivoスクリーニングとして使われていて、ヒト効力を予測すると考えられている。試験予防または治療薬の抗炎症性活性は、ビヒクルを投与した対照グループと比較した試験グループの後足重量増加の抑制として表現される。
【０３１３】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを用いて、本発明の組合わせ治療法の効力を評価することもできる（Kimら, 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537；Strober, 1985, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は動物に誘導することができるヒト炎症性腸疾患である。硫酸化多糖体（限定されるものでないが、アミロペクチン、カラゲーン、アミロペクチン硫酸およびデキストラン硫酸を含む）または化学刺激剤（限定されるものでないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）および酢酸を含む）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができる。
【０３１４】
喘息に対する動物モデルを利用して、本発明の組合わせ治療法の効力を評価することもできる。このようなモデルの一例は、マウス養子性導入モデルであり、このモデルでは、TH1またはTH2受給マウスのエーロアレルゲン吸入誘発により、気道へのTHエフェクター細胞の遊走が起こり、激しい好中球（TH1）および好酸球（TH2）肺粘膜炎症性応答を起こす（Cohnら, 1997, J. Exp. Med. 1861737-1747）。
【０３１５】
自己免疫障害用の動物モデルを利用して、本発明の組合わせ治療法の効力を評価することもできる。自己免疫障害、例えばＩ型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身エリテマトーデス、および糸球体腎炎に対する動物モデルが開発されている（Flandersら, 1999, Autoimmunity 29:235-246；Kroghら, 1999, Biochimie 81:511-515；Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19:12-24）
さらに、当業者に公知のいずれのアッセイを利用して、本発明に開示した自己免疫および／または炎症性疾患に対する組合わせ治療法の予防および／または治療効用を評価してもよい。
【０３１６】
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および効力は、標準の細胞培養または実験動物における、例えば、LD50（集団の50％に対する致死用量）およびED50（集団の50％における治療上有効な用量）を確認するための医薬操作により確認することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比として表現される。大きい治療指数を示す予防および／または治療薬が好ましい。毒性副作用を表す予防および／または治療薬を使用することはできるが、このような薬物を罹患組織の部位を標的に定める送達系を設計して無感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それにより、副作用を軽減するように注意しなければならない。
【０３１７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに使用する予防および／または治療薬の投与量の範囲を処方するのに利用することができる。このような薬物の投与量は、好ましくは、ED50を含みかつ少しの毒性しかないか無毒の循環濃度の範囲内にある。投与量は、利用する投与剤形および投与経路に依存して変わりうる。本発明の方法に使用するいずれの薬物に対しても、治療上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルで、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症候群の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方してもよい。このような情報を利用して、ヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィにより測定することができる。
【０３１８】
本発明に従って使用される治療法の抗癌活性はまた、当技術分野で公知でありかつ「抗癌剤開発用腫瘍モデルの関連性（Relevance of Tumor Models for Anticancer Development）」 (1999, 編 FiebigおよびBurger)；「腫瘍学に対する貢献（Contributions to Oncology）」 (1999, Karger)；「腫瘍学研究におけるヌードマウス（The Nude Mouse in Oncology Research）」 (1991, 編 Boven and Winograd)；およびAnticancer Drug Development Guide (1997 編 Teicher）（これらは本明細書に参照により本明細書にその全文が組み入れられる）に記載されている、癌研究用の様々な実験動物モデル、例えばSCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片をもつヌードマウス、動物モデル、例えば、ハムスター、ウサギなどを用いることにより決定することもできる。
【０３１９】
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトで使用する前に、好ましくは、in vitroで、次いでin vivoで、所望の治療または予防活性について試験する。治療薬と方法は、腫瘍または悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野の多くのアッセイ標準を利用してこのような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖は3H-チミジン組込みを測定することにより、直接細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／またはコロニー形成または３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成の減少などに基づいて視覚で評価することができる。
【０３２０】
治療に用いる化合物は、限定されるものでないが、ヒトで試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む好適な動物モデル系で、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。次いで、化合物を適当な臨床試験に使用することができる。
【０３２１】
さらに、当技術分野で公知のいずれかのアッセイを用いて、本明細書に開示した組合わせ治療法の予防および／または治療効用を、癌、炎症性障害、または自己免疫疾患の治療または予防について評価することができる。
【０３２２】
5.6  診断方法
標識した本発明の抗体を診断目的に用いて、疾患、障害または感染を検出、診断、またはモニターすることができる。本発明は、疾患、障害または感染、特に自己免疫疾患を検出または診断する方法であって、(a)被験者の細胞または組織サンプル中のFcγRIIBの発現を、FcγRIIBと免疫特異的に結合する１以上の抗体を用いてアッセイするステップ；および(b)抗原のレベルを対照レベル、例えば正常組織サンプル中のレベルと比較して、抗原の対照レベルと比較したアッセイした抗原のレベルの増加は疾患、障害または感染を示すとするステップを含む上記方法を提供する。
【０３２３】
本発明の抗体を使用し、生物学的サンプル中のFcγRIIBレベルを本明細書に記載のまたは当業者に公知の古典的免疫組織学的方法を用いて評価することができる（例えば、Jalkanenら, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985；Jalkanenら, 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096を参照）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）を含む。好適な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、酵素標識、例えば塩基性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えばヨウ素（125I, 131I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（121In）、およびテクチニウム（99mTC）；発光標識、例えばルミノール；および蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミンが挙げられる。
【０３２４】
本発明の一態様は、ヒトにおける疾患、障害、または感染の検出および診断である。一実施形態においては、診断は、a)被験者にFcγRIIBと免疫特異的に結合する標識した抗体の有効量を投与する（例えば、非経口、皮下、または腹腔内に）ステップ；b)投与後ある時間の間、標識した抗体が被験者の部位に選択的に濃縮してそこでFcγRIIBが発現される（そして無結合の標識した分子がバックグラウンドレベルまでクリアされる）のを待つステップ；c)バックグラウンドレベルを測定するステップ；およびd)被験者中の標識した抗体を検出して、標識した抗体のバックグラウンドレベルを超える検出は被験者が疾患、障害または感染を有することを示すとするステップを含む。この実施形態に従って、抗体を、当業者に公知のイメージングシステムを用いて検出可能であるイメージング成分により標識する。バックグラウンドレベルは、検出された標識した分子の量を、特定の系に対して先に決定した標準値と比較することを含む様々な方法により決定することができる。
【０３２５】
被験者のサイズと使用するイメージングシステムが、診断イメージを作るために必要なイメージング成分の量を決定しうることは当技術分野で理解されるであろう。ヒト被験者に対する放射性同位体成分の場合、注射される放射能の量は通常約5〜20ミリキューリーの99mTcであろう。標識した抗体を次いで選択的に特定のタンパク質を含有する細胞の位置に蓄積させる。in vivo腫瘍イメージングは、S. W. Burchielら, 「放射標識した抗体とそのフラグメントの免疫薬物動態学（Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibody and Their Fragments）」 in 「腫瘍イメージング：癌の放射化学的検出、第13章（Tumor Imaging :The Radiochemical Detection of Cancer, Chapt. 13）」, S. W. BurchielおよびB. A. Rhodes, 編, Masson Publishing Inc. (1982)に記載されている。
【０３２６】
使用する標識のタイプおよび投与様式を含む複数の変数に依存して、標識した分子が被験者の部位に選択的に濃縮しうるためのかつ無結合の標識した分子がバックグラウンドレベルにクリアされるための投与後の時間間隔は、6〜48時間または6〜24時間または6〜12時間である。他の実施形態においては、投与後の間隔は5〜20日または5〜10日である。
【０３２７】
一実施形態においては、疾患、障害または感染のモニタリングを、例えば最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年などに疾患、障害または感染の診断を繰返すことによって実施する。
【０３２８】
被験者中の標識した分子の存在は、in vivo走査に対する当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。これらの方法は、使用する標識のタイプに依存する。当業者は特定標識を検出するための適当な方法を決定することができよう。本発明の診断に利用しうる方法とデバイスは、限定されるものでないが、コンピューター断層撮影（CT）、位置放出断層撮影（PET）などの全身走査、磁気共鳴イメージング（MRI）、およびソノグラフィを含む。
【０３２９】
特定の実施形態においては、分子を放射性同位体により標識し、患者において放射線応答外科機器（Thurstonら、米国特許第5,441,050号）を用いて検出する。他の実施形態においては、分子を蛍光化合物により標識し、患者において蛍光応答走査機器を用いて検出する。他の実施形態においては、分子を位置放出性金属により標識し、患者においてポジトロン放出断層撮影を用いて検出する。さらに他の実施形態においては、分子を常磁性標識により標識し、患者において磁気共鳴イメージングを用いて検出する。
【０３３０】
6.  実施例
6.1  モノクローナル抗体の調製
マウスモノクローナル抗体を、クローン3H7または2B6からそれぞれATCC受託番号PTA-4591およびPTA-4592を用いて産生させた。FcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を作製した。トランスジェニックFC8RIIAマウス（Dr. Ravetch Laboratory, Rockefeller Universityにおいて作製された）を、ヒトFcγRIIB受容体の細胞外ドメイン、残基1〜180をコードするcDNAによりトランスフェクトしておいた293細胞の上清から精製されたFcγRIIBを用いて免疫感作した。これらのマウスの脾細胞からのハイブリドーマ培養細胞株を産生し、そしてFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIBと特異的に結合する抗体についてスクリーニングした。
【０３３１】
6.2  抗体スクリーニングおよび特徴付け
材料と方法
ハイブリドーマ培養からの上清を、FcγRIIAまたはFcγRIIBに対する免疫活性についてELISAアッセイを用いてスクリーニングする。それぞれの場合、プレートを100ng/wellのFcγRIIAまたはFcγRIIBを用いてコーティングする。抗体の特定の受容体との結合はヤギ抗マウスHRP複合抗体により650nmにおける吸収をモニターして検出する。
【０３３２】
ブロッキングELISA実験においては、ハイブリドーマ上清からの抗体の、凝集IgGのFcγRIIBとの結合をブロックする能力をモニターする。プレートを適当な「ブロッキング薬」を用いてブロックし、洗浄バッファー（PBS＋0.1％Tween）を用いて３回洗浄する（200μl/ウエル）。プレートをハイブリドーマ上清を用いて１時間37℃でプレインキュベートする。ブロッキングに続いて、固定した量の凝集ビオチン化ヒトIgG（1μg/ウエル）をウエルに加え、凝集物をFcγRIIB受容体と結合させる。この反応は、２時間37℃にて実施する。次いで検出をモニターし、さらに洗浄の後、ストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体を用いて処理して結合した凝集IgGを検出する。650nmにおける吸収は結合した凝集IgGと比例する。
【０３３３】
β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイにおいては、ハイブリドーマ上清からの抗体の、Fｃεが誘導するβ-ヘキソサミニダーゼの放出を抑制する能力をモニターする。RBL-2H3細胞をヒトFcγRIIBによりトランスフェクトし；細胞を、0.03μg/mL〜30μg/mLの範囲の様々な濃度のヤギ抗マウスF(ab)2フラグメントを用いて刺激し；マウスIgE単独（0.01μg/mLにて）を用いてまたは抗FcγRIIB抗体を用いて感作する。１時間インキュベーションした後、細胞を遠心沈降し；上清を採集し；そして細胞を溶解する。上清に放出されたβ-ヘキソサミニダーゼ活性を、比色アッセイでp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニドを用いて測定する。放出β-ヘキソサミニダーゼ活性を、全活性と比較して放出された活性のパーセントとして表現する。
【０３３４】
FACS ANALYSIS
FcγRIIBを発現するCHO細胞を様々な抗体を用いて染色してFACSにより分析する。一シリーズの実験において、細胞を直接標識してモノクローナル抗体が受容体を認識するかを確認する。
【０３３５】
ブロッキングFACS実験においては、ハイブリドーマ上清からの抗体の、凝集IgGのFcγRIIBとの結合をブロックする能力をモニターする。各サンプルについて約100万個の細胞（FcγRIIBを発現するCHO細胞）を、氷上で30分間2μｇのアイソタイプ対照（マウスIgG1）とともにまたは2B6または3H7抗体とともにインキュベートする。細胞をPBS+1％BSAを用いて１回洗浄し、そして1μgの凝集ビオチン化ヒトIgGとともに30分間氷上でインキュベートする。細胞を洗浄し、二次抗体、すなわち結合した抗体を検出するためのヤギ抗マウスFITC、および結合した凝集ビオチン化ヒトIgGを検出するためのストレプトアビジン-PE複合体を加えて、氷上で30分間インキュベートする。細胞を洗浄してFACSにより分析する。
【０３３６】
Ｂリンパ球を、FcγRIIBおよびCD20の存在を検出するために染色する。各サンプルに対する200μLの「バッフィコート（buffy coat）」を氷上で2ugのアイソタイプ対照またはモノクローナル抗体、2B6または3H7とともにインキュベートする。細胞を１回PBS+1％BSAを用いて洗浄して1μlのヤギ抗マウス-PE抗体とともに30分間氷上でインキュベートする。細胞を１回洗浄してCD20-FITC抗体（2μg）をサンプルに加え、氷上で30分間インキュベートする。全てのサンプルをPBS+1％BSAを用いて１回洗浄し、そしてFACSにより分析する。
【０３３７】
ADCCアッセイ
Her2/neu抗原を発現する4〜5x106個の標的細胞（IGROV-1またはSKBR-3細胞）を、ビス(アセトキイメチル)2,2':6',2"-テルピリジン-t-6"-ジカルボキシラート（DELFIA BATDA試薬、Perkin Elmer/Wallac）を用いて標識する。BATDA試薬を細胞に加え、混合物を37℃にて好ましくは5％CO2のもとで、少なくとも30分間インキュベートする。次いで細胞を生理学的バッファー、例えば0.125mMスルフィンピラゾールを含むPBS、および0.125mMスルフィンピラゾールを含有する培地を用いて洗浄する。標識した標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに、ほぼ50:1、75:1、または100:1のエフェクター：標的比となるように加える。PBMCを、全血液をFicoll-Hypaque（Sigma）上に重ね、室温で30分間500gにて遠心回転した。白血球層をユウロピウムに基づくADCCアッセイ用のエフェクターとして採集した。凍結したまたは新しく単離した洗い分けられた単球（Advanced Biotechnologies, MD）をエフェクターとして腫瘍標的培養細胞株とともに100:1〜10:1の様々なエフェクター：標的比で用いて、抗体の濃度を1〜15μg/mlで滴定する。凍結ストックとして得てサイトカインにより刺激した単球をADCCアッセイにおけるエフェクター細胞として用いる。もし凍結単球が最適な作用をすればそれを日常的に使用し、そうでなければ新しい細胞を使用する。MDMは、培養中の単球の生存と分化を増強することが知られるサイトカインGM-CSFまたはM-CSFを用いる処理により調製しうる。MDMをサイトカインを用いて刺激し、様々なFcγR（I、IIA、IIB、およびIIIA）の発現をFACS分析により確認しうる。
【０３３８】
エフェクターおよび標的細胞を、少なくとも２時間、16時間まで、37℃にて、5％C02下で、標的細胞、Her2/neu上に発現される抗原に特異的な抗腫瘍抗体の存在のもとで、かつ抗FcγRIIB抗体の存在または不在のもとでインキュベートする。N297A突然変異を含有するように遺伝子操作されているキメラ4D5抗体をネガティブ対照として用いる、それはこの抗体は腫瘍標的細胞と可変域を経由して結合するからである。この部位のグリコシル化が喪失すると、抗体のFc域のFcγRとの結合は無くなる。市販されるヒトIgG1/kは抗FcγRIIB抗体に対するアイソタイプ対照として役立つ。細胞上清を採集して酸性ユウロピウム溶液（例えば、DELFIAユウロピウム溶液、Perkin Elmer/Wallac）を加える。形成されるユウロピウム-TDAキレートの蛍光、時間分割蛍光光度計（例えば、Victor 1420、Perkin Elmer/Wallac）で定量する。最大放出（MR）と自発性放出（SR）とを、標的細胞の1％TX-100および培地単独とのインキュベーションによりそれぞれ確認する。抗体非依存性細胞傷害性（AICC）を標的およびエフェクター細胞の抗体の不在のもとでのインキュベーションにより測定する。それぞれのアッセイは好ましくは３重で実施する。平均パーセント比溶解は、実験放出(ADCC-AICC)/(MR-SR)x100として計算する。
【０３３９】
3H7クローンから産生されるモノクローナル抗体の特徴付け
ハイブリドーマ培養の色々なバッチの直接結合
ハイブリドーマ培養の色々なバッチのFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合を、ELISAアッセイを用いて比較した（図1A）。上清番号1、4、7、9、および3を特異的結合について試験し、その結合を市販抗体、FL18.26と比較した。図lA（左パネル）に示すように、クローン7からの上清がFcγRIIBと最大の結合を有し、この結合は、飽和条件のもとで市販抗体のFcγRIIBとの結合より約４倍高い。しかし、クローン7からの上清は、FcγRIIAに対して右パネルに見られるようにほとんど親和性がないが、市販抗体はFcγRIIAと少なくとも4倍より高く結合する。
【０３４０】
3H7クローンから産生される抗体の、FcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合
粗製3H7上清および精製3H7上清の結合を測定した（図1B）。それぞれの場合、上清を70μg/mlの濃度で供給し、6倍まで希釈した。図1に示すように、飽和条件のもとで、3H7上清はFcγRIIAと結合するより4倍高くFcγRIIBと結合する。タンパク質Gカラムを用いて精製すると、3H7上清のそれぞれの免疫原との絶対的結合が改善される。
【０３４１】
3H7クローンから産生される抗体による、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgG結合のブロッキング
もしハイブリドーマ上清中に存在する抗体がIgG結合部位においてFcγRIIBと結合してIgG結合をブロッキングすれば、凝集IgGは受容体と結合できず、従って650nmにおける吸収を検出することはできない。抗体は事実上、FcγRIIB上のIgG結合部位をブロックする「ブロッキング剤」である。対照として、ブロッキングなし、対照上清、および3H7クローンからの上清を用いてELISAを実施した。図2に示すように、3H7上清は完全にIgG結合をブロックした、それは、650nmにおける吸収を欠くことから明らかなように、凝集IgGが受容体と結合することができないからである。しかし、対照上清はIgG結合をブロックせず；凝集IgGは650nmの読みにより明らかなように受容体と結合する。対照上清はブロッキングなしで行った状況に類似する。
【０３４２】
3H7クローンから産生される抗体の、細菌および哺乳類動物FcγRIIBに対する直接結合の比較
図３に示すように、3H7クローンからの上清は哺乳類動物および細菌FcγRIIBと比較的結合する。飽和条件のもとで、3H7上清は細菌および哺乳類動物FcγRIIBと、FcγRIIAと結合するより3倍高く結合する。このように、3H7クローンからのモノクローナル抗体は転写後改変（例えば、グリコシル化）されている哺乳類動物FcγRIIBと特異的に結合することができる。
【０３４３】
3H7クローンから産生される抗体の、FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIIAとの直接結合
3H7培養細胞株からのハイブリドーマ培養からの上清の、FcγRIIA、FcγRIIIAおよびFcγRIIBとの直接結合をELISAアッセイを用いて比較した(図４)。
【０３４４】
クローン3H7から産生した抗体はFcγRIIIAに対する親和性がなく、かつFcγRIIAと結合するより4倍大きい親和性でFcγRIIBと結合する。
【０３４５】
2B6クローンから産生されるモノクローナル抗体の特徴付け
2B6クローンから産生される抗体の直接結合の、FcγRIIに対する他の３種の市販モノクローナル抗体との比較
クローン2B6から産生される抗体のFcγRIIAおよびFcγRIIBとの結合をFcγRIIに対する３種の他の市販抗体、AT10、FL18.26、およびIV.3のそれと、ELISAアッセイで比較する。図５、パネルＡに見られるように、クローン2B6から産生される抗体は、他の市販抗体より4.5倍高くFcγRIIBと結合する。さらに、他の３種の市販抗体がFcγRIIAと飽和しうる方法でクローン2B6からの抗体がFcγRIIAと結合するより2倍大きい親和性で結合するにも関わらず、クローン2B6から産生される抗体は、FcγRIIAに対して最小の親和性しか有しない（図５、パネルＢ）。
【０３４６】
クローン2B6から産生される抗体による、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgG結合のブロッキング
クローン2B6から産生される抗体の、FcγRIIBに対する凝集ヒトIgGの結合をブロックする能力を、ブロッキングELISAアッセイにより研究し、クローン3H7から産生される抗体のそれと比較した。図6Aに示すように、対照上清はIgG結合部位上のFcγRIIBと結合せず、凝集IgGが受容体と結合できるので、従って650nmにおける吸収は最大である。しかし、クローン3H7はIgG結合を75％までブロックする。クローン2B6はIgG結合部位を完全にブロックし、凝集IgGは受容体と結合できないので、非常に高い希釈率ですら、650nmにおける吸収が検出されない。図6Bはバーチャートのデータを示す。
【０３４７】
二重染色FACSアッセイを用いる、2B6抗体と凝集IgGのFcγRIIBとの結合における競合
二重染色FACSアッセイを用いて、クローン2B6から産生される抗体を、全長哺乳類動物FcγRIIBによりトランスフェクトしたCHO細胞において特徴付けた。
【０３４８】
図７、パネルＣに示すように、CHO細胞において、細胞をモノクローナル抗体とともにプレインキュベートした後に、ビオチン化凝集IgGに染色が観察されないので、クローン2B6から産生される抗体は、凝集IgGのFcγRIIB受容体との結合を効果的にブロックする。細胞は下側右パネルでのみ染色され、ほとんどの細胞が2B6クローンからのモノクローナル抗体と結合したことを示す。IgG1をアイソタイプ対照として使う対照実験、パネルＡにおいて、すなわち細胞を細胞アイソタイプ標識したIgGによって染色すると、モノマーIgGはFcγRIIBと検出可能な親和性で結合しないので染色は観察されないが、パネルＢにおいて、FcγRIIBと結合することができる凝集IgGによって、細胞の約60％は染色される。
【０３４９】
モノクローナル抗FcγRIIB抗体およびCD20共染色（co-stain）ヒトＢリンパ球
二重染色FACSアッセイを利用してヒトＢリンパ球においてクローン2B6および3H7から産生される抗体を特徴付けした。細胞をＢリンパ球集団を選択するためにFITCと複合した抗CD20抗体を用いて染色するだけでなく、さらにクローン3H7および2B6から産生される抗体をヤギ抗マウスペルオキシダーゼを用いて標識した。水平軸は抗CD20抗体蛍光の強度を表し、垂直軸はモノクローナル抗体蛍光の強度を表す。図８、パネルＢおよびＣに示すように、細胞を抗CD20抗体ならびにクローン3H7および2B6から産生された抗体について二重染色したが、クローン2B6から産生される抗体はクローン3H7から産生される抗体より強い染色を示した。パネルＡはアイソタイプ対照、マウスIgG1の染色を示す。
【０３５０】
FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色
安定してFcγRIIBを発現するCHO細胞を、IgG1アイソタイプ対照（図9A；左パネル）を用いてまたは3H7ハイブリドーマ（図9B；右パネル）からの上清を用いて染色した。ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ複合抗体を二次抗体として利用した。次いで細胞をFACSにより分析した；3H7ハイブリドーマからの上清を用いて染色した細胞は、強い蛍光シグナルおよび右へのピークシフトが見られ、3H7ハイブリドーマから産生された上清によるCHO細胞中のFcγRIIBの検出を示す。2B6ハイブリドーマから産生された上清を用いて染色した細胞もまた、IgG1を用いて染色した細胞と比較して、有意な蛍光および右へのピークシフトが見られ、2B6ハイブリドーマから産生された上清によるCHO細胞中のFcγRIIBの検出を示す。
【０３５１】
2B6によるβ-ヘキソサミニダーゼ放出の抑制
ヒトFcγRIIBを発現するトランスフェクタントをマウスIgEを用いて感作し、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントを用いてチャレンジしてFcεRIを凝集させた。ポリクローナル抗体はFcεRIと結合したマウスIgE抗体の軽鎖を認識するの能力があるので架橋が起こる。この実験を図10Aに図解する。マウスIgEを用いて感作しかつ2B6抗体を用いてプレインキュベートしたトランスフェクタントもポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントを用いてチャレンジしてFcεRIをFcγRIIBと架橋させた。図10Bに示すように、2B6抗体およびIgEを用いてプレインキュベートした細胞を、ヤギ抗マウスF(ab')2を用いてチャレンジすると、低い量のβ-ヘキソサミニダーゼ放出が観察された。図10Bに見られるように、2B6抗体は抑制受容体活性をブロックしない。むしろFcεRIとの架橋は抑制経路を活性化し、β-ヘキソサミニダーゼ放出の有意な減少をもたらす。これらのデータはまた、ヒトFcγRIIB抑制受容体はラット好塩基球において効果的にシグナル伝達しうることを示す。
【０３５２】
in vitro ADCCアッセイ
IGROV-1、OVCAR-8、およびSKBR-3細胞がHer2neu抗原を発現するかどうかを確認するために、細胞を、精製4D5またはch4D5抗体を用いて氷上で染色し；無結合の抗体をナトリウムアジドを含有するPBS/BSAバッファーを用いて洗浄除去し、そして4D5またはch4D5の結合を、PEと複合したヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒト抗体（Jackson Laboratories）によりそれぞれ検出した。無関係なIgG1抗体（Becton Dickinson）を非特異的結合に対する対照として使った。図11に示すように、卵巣腫瘍培養細胞株は乳癌培養細胞株より低いHer2/neu抗原を発現し、これらの培養細胞株を平行して評価することにより、本発明の抗体、FcγRIIB抗体による腫瘍クリアランスのストリンジェンシーを決定しうる。
【０３５３】
ヒト単球は活性化と抑制受容体の両方を発現するADCCに関わるエフェクター集団である。FcγRの発現を、FACS分析により複数ロットの凍結単球を用いて試験した（これらの細胞は腫瘍クリアランスにおけるch2B6の役割を研究するためのエフェクターとして養子移入しうるので）。市販の洗い分けられ凍結された単球を10％ヒトAB血清を含有する基本培地中、およびヒト血清および25〜50ng/ml GM-CSFを含む基本培地中で解凍した。細胞を、IV.3-FITC（抗huFcγRIIA）、32.2-FITC（抗FcγRI）、CD16-PE（Pharmingen）または3G8（抗FcγRIII）-ヤギ抗マウスPE、3H7（抗FcγRIIB）、および単球用のCD14マーカー（PHARMINGEN）を用いて、関係するアイソタイプ対照とともに、直接染色するか、またはマクロファージに7〜8日間成熟させ（MDM）、プラスチックへ移しとった後に染色した。新しく解凍した単球と培養単球を表す２人のドナーからのMDMの代表的なFACSプロファイルを、図12に示す。これらの結果は、FcγRIIBが単球（ドナーに依って5〜30％）中に軽度に発現されることを示す。しかし、この発現は、マクロファージに成熟するにつれて増加する。予備的データは、ヒト腫瘍標本中の腫瘍浸潤マクロファージはFcγRIIBに対して陽性に染色されることを示す。FcγRのパターンおよび形態学的にマクロファージに分化する能力は、凍結単球の複数ロットで再現性のあることが見出された。これらのデータは、この細胞供給源が養子移入実験用に十分であることを示す。
【０３５４】
ch4D5はPBMCを用いて卵巣および乳癌培養細胞株に有効なADCCを媒介する
抗Her2/neu抗体のADCC活性をユウロピウムに基づくアッセイで試験した。卵巣培養細胞株、IGROV-1、および乳癌培養細胞株、SKBR-3を、ヒトPBLをエフェクター細胞とする4時間アッセイにおける標識した標的として用いた。図13は、ch4D5がHer2neuを発現する標的の溶解を媒介する機能的活性を有することを示す。本発明の抗体の、抗Her2/neu抗体のADCC活性に対する効果を続いて測定する。
【０３５５】
ヒト腫瘍培養細胞株を用いる異種移植マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体のin vivo活性
６〜８週齢雌性Balb/cヌードマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME；Taconic）を用いて異種移植卵巣および乳癌モデルを確立した。マウスはBIOCON, Inc. Rockville, Maryland（添付プロトコルを参照）で維持する。マウスを異種移植モデル用のバイオセーフティレベル-2施設で、腹水-由来卵巣細胞および胸膜浸出液由来乳癌細胞を腫瘍供給源として用いて飼育する。マウスをこれらの実験のために4グループに配置し、毎週３回モニターする。マウスの重量と生存時間を記録し、そして腫瘍を増殖するための判定基準は腹部膨張および明白な腫瘍とする。明らかな不快または腫瘍が5グラムに達する徴候を示すマウスを二酸化炭素を用いて安楽死させ剖検に付した。抗体で処理した動物は、対照グループの後、さらに２ヶ月間観察下に置く。
【０３５６】
腫瘍培養細胞株による異種移植腫瘍モデルの確立
異種移植腫瘍モデルを確立するため、5x106個の生IGROV-1またはSKBR-3細胞を3年齢かつ相応の体重をもつ雌性ヌード胸腺欠損マウスにマトリゲル（Matrigel）（Becton Dickinson）とともに皮下注射する。腫瘍の推定重量を、式：長さx（巾）2/2により計算して3グラムを超えないようにする。拡大のための細胞のin vivo継代については、足場に依存する腫瘍を単離し、その細胞を、コラゲナーゼ（Sigma）を好ましくは腫瘍1グラム当たり1μg加えることにより、37℃にて一夜で解離させる。
【０３５７】
IGROV-1細胞の皮下注射は増殖の速い腫瘍を生じる一方、腹腔内経路はマウスを2ヶ月で死亡させる腹膜癌腫症を誘導する。IGROV-1細胞は５週以内に腫瘍を形成するので、腫瘍細胞注射後の第1日にエフェクターとしての単球を、治療抗体ch4D5および2B6とともに、腹腔内にマウス体重（mbw）1グラム当たりそれぞれ4μgにて同時注射する（表８）。最初の注射の後、抗体の注射を毎週、その後は４〜６週間行う。ヒトエフェクター細胞を２週に１回補充する。マウスの１グループは治療抗体を受給しないが、それぞれ抗腫瘍およびch2B6抗体に対するアイソタイプ対照抗体としてch4D5 N297AおよびヒトIgG1を注射しうる。
【表８】
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【０３５８】
表８に示されるように、１標的とエフェクター組合わせ、２つの異なる組合わせの抗体濃度による腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割を試験するために、6グループの48マウスをそれぞれ必要とする。これらのグループは、A）腫瘍細胞、B）腫瘍細胞および単球、C）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体、ch4D5、D）腫瘍細胞、単球、抗腫瘍抗体ch4D5、および抗FcγRIIB抗体、例えば、ch2B6、E）腫瘍細胞、単球、および抗FcγRIIB抗体,例えば、ch2B6、およびF）腫瘍細胞、単球、ch4D5 N297A、およびヒトIgG1である。様々な抗体濃度の組合わせを類似のスキームで試験することができる。
【０３５９】
乳癌培養細胞株、SKBR-3を用いる研究を、SKBR-3細胞過剰発現Her2neuとしてのIGROV-1モデルと平行して実施する。これは腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割の評価のストリンジェンシーを増加しうる。IGROV-1細胞を用いる腫瘍クリアランス研究の成果に基づいて、他の標的による将来の実験の実験設計に改変を加える。
【０３６０】
異種移植腫瘍モデルの終点は、表xxにおける各グループに対する腫瘍のサイズ（マウス体重）、生存時間、および組織学報告に基づいて決定する。マウスを週３回モニターし；増殖腫瘍の判定基準は腹部膨張、腹腔の明白なマスの存在である。腫瘍重量-対-接種後日数の推定を計算する表８のグループＤマウス-対-他のグループのマウスからの３つの判定基準に基づいて、腫瘍クリアランスの増強における抗FcγRIIB抗体の役割を規定しうる。明らかな痛みのまたは5グラムの腫瘍重量に達する徴候を示すマウスを二酸化炭素を用いて安楽死させ、剖検に付する。抗体で処理した動物はこの時点の後、２ヶ月間観察する。
【０３６１】
ヒト一次卵巣および乳癌由来の細胞による異種移植マウスモデルにおけるFcγRIIB抗体のin vivo活性
癌腫症の患者由来の浸出液から単離した腫瘍細胞を移入することにより、一次卵巣および乳癌から一次腫瘍を確立する。これらの研究を臨床に翻訳するために、異種移植モデルを２人の卵巣患者および２人の乳癌患者からの腹水-および胸膜浸出液由来の腫瘍細胞を用いてそれぞれ評価する。乳癌細胞の供給源としての胸膜浸出液、および悪性乳組織の移植を用いて異種移植マウスモデルが成功裏に確立されている；例えば、Sakakibaraら, 1996, Cancer J. SCI. AM. 2:291を参照、これは参照により本明細書にその全文が組み入れられる。これらの研究は初代細胞の腫瘍クリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の広範囲の応用を確認しうる。腫瘍クリアランスを、抗腫瘍抗体ch4D5および抗FcγRIIB抗体、例えばch2B6を用いて、ヒト単球を養子移入されたBalb/cヌードマウスモデルにおいて試験する。
【０３６２】
ヒト腹水および胸膜浸出液由来の一次腫瘍細胞
卵巣癌の患者からの腹水および乳癌患者から胸膜浸出液は、St. Agnes Cancer Center, Baltimore, Marylandにより供給される。患者からの腹水および胸膜浸出液は40-50％腫瘍細胞を含有しえて、高発現のHer2neu+腫瘍細胞をもつサンプルを用いて異種移植モデルを確立しうる。
【０３６３】
異種移植腫瘍モデルを確立する前に、腹水および胸膜浸出液サンプルを新生物細胞上のHer2/neuの発現について試験する。腫瘍モデルの確立に影響を与えうる新生物細胞-対-他細胞サブセットのパーセントを確認しうる。卵巣および乳癌の患者からの腹水および胸膜浸出液をそれぞれ日常的に分析して新生物細胞上のHer2/neu+の発現レベルを確認する。FACS分析を用いて臨床サンプル中のHer2/neu+新生物細胞のパーセントを確認する。高パーセントのHer2/neu+新生物細胞をもつサンプルを選択してBalb/cマウスにおける腫瘍の惹起に使う。
【０３６４】
組織化学と免疫化学
組織化学と免疫組織化学を卵巣癌の患者の腹水および胸膜浸出液について実施し、新生物の構造的特性を分析する。モニターするマーカーは、サイトケラチン（炎症性および間葉細胞からの卵巣新生物および中皮細胞を同定するため）；カルレチニン（Her2/neu陽性新生物細胞からの中皮を分離するため）；およびCD45（サンプル中の細胞集団の残部から炎症性細胞を分離するため）である。以下のさらなるマーカーはCD3（Ｔ細胞）、CD20（Ｂ細胞）、CD56（NK細胞）、およびCD14（単球）を含みうる。
【０３６５】
免疫組織化学染色用に、凍結セクションおよびパラフィン固定組織を標準技術により調製する。凍結ならびに脱パラフィンしたセクションを同様の染色プロトコルで染色する。スライドを3％過酸化水素中に漬けて組織の内在性ペルオキシダーゼをクエンチし、PBSによって5分間洗浄する。セクションをブロックし、一次抗体ch4D5を加えて血清を30分間ブロックした後にサンプルをPBSにより３回洗浄する。ビオチンと複合した二次抗ヒト抗体を加えて30分後にスライドをPBS中で5分間洗浄する。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Vector Labs）を加えて30分後に洗浄する。スライドを新鮮な基質DAB溶液中でインキュベートすることにより発色し、その反応を水道水で洗浄することにより停止する。H&E染色のために、スライドを脱パラフィンし、次いで色々なアルコール濃度で水和する。スライドを水道水で洗浄し、ヘマトキシリン中に5分間置く。過剰の染色を酸-アルコール、続いてアンモニア、および水を用いて除去する。スライドをエオシン中に置き、続いてに90〜100％アルコールより洗浄して脱水する。最後に、スライドをキシレン中に置き、固定液を用いてマウントして長期保存する。全ての場合に、腫瘍細胞のパーセントをパパニコラ（Papanicolaou）染色により決定する。
【０３６６】
組織化学染色
２人の異なる卵巣癌患者からの腹水をヘマオキシリンおよびエオシン（H & E）およびギムザにより染色して、腫瘍細胞および他の細胞型の存在を分析した。組織化学染色の結果を図14に示す。
【０３６７】
マウスモデル
卵巣癌患者からのサンプルを、腹水を6370gにて、20分間、4℃で遠心沈降により処理し、赤血球を溶解した後、細胞をPBSにより洗浄した。各サンプル中のHer2neu+腫瘍細胞のパーセントに基づいて中度および高度に発現する２サンプルを選択し、皮下接種して異種移植モデルを確立し、腫瘍のクリアランスにおける抗FcγRIIB抗体の役割を評価した。
【０３６８】
腫瘍細胞は無処理の腹水の細胞サブセットの40〜50％を構成し、精製後にほぼ10〜50x106の腫瘍細胞が腹水2リットルから得られたと報じられている（Barkerら, 2001, Gynecol. Oncol. 82:57-63）。単離された腹水細胞をマウス中に腹腔内注射して細胞を拡大する。ほぼ10マウスを腹腔内注射し、そしてそれぞれのマウス腹水をさらに2マウス中にそれぞれ継代して全20マウスから腹水を得て、これを用いて80マウスのグループを注射する。胸膜浸出液を腹水と同様な方法で扱い、Her2neu+腫瘍細胞を上部右および左乳パッドのマトリゲル（matrigel）に注射する。腫瘍細胞の皮下注射後、マウスを臨床および解剖学的変化を試験する。必要であれば、マウスを剖検して全腫瘍負荷と特定器官局在化との相関を調べる。
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
【図１Ａ】3H7クローンから産生した抗体のFcγRIIBおよびFcγRIIAとの直接結合を示す。いくつかのハイブリドーマ培養から得た抗体のFcγRIIとの直接結合を、市販抗FcγRII抗体のそれと、プレートを該受容体によりコーティングしたELISAアッセイで比較した。色々な希釈（1:10）の上清をプレート上でインキュベートした。結合した抗体は、ヤギ抗マウスHRP複合抗体を用いて検出し、その吸収を650nmでモニターした。
【図１Ｂ】3H7クローンから産生した抗体のFcγRIIBおよびFcγRIIAとの直接結合を示す。3H7ハイブリドーマ培養から得た抗体（図1Aの上清n.7）のFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合を、粗製型（左パネル）および精製型（右パネル）で、図1Aと同じELISAアッセイを用いて比較した。
【図２】3H7ハイブリドーマから産生した抗体と凝集ビオチン化ヒトIgGのFcγRIIBに対する結合の競合を示す。FcγRIIBとの結合に対して、3H7抗体の凝集ビオチン化ヒトIgGと競合する能力をブロッキングELISA実験を用いて測定した。FcγRIIBによりコーティングしたELISAプレートを3H70抗体を含有する上清および同じハイブリドーマ細胞由来であるが抗体を含有しない上清（ネガティブ対照）とともにインキュベートした。200ng/wellから開始して、次いで色々な希釈（1:3）の凝集ビオチン化ヒトIgGをプレートに加え、そして結合した凝集物を複合したストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼを用いて検出し、反応物をTMBにより現像して吸収を650nmでモニターした。
【図３】3H7抗体の、細菌系または哺乳類動物系で産生したFcγRIIBとの直接結合の比較を示す。3H7抗体のFcγRIIBとの直接結合はELISAアッセイを用いて測定した。細菌または哺乳類動物が産生したFcγRIIBとの結合を比較した。抗体滴定は直接の上清から開始して、その後1:10で希釈を続けた。結合した抗体をヤギ抗マウスHRP複合抗体を用いて検出し、反応物をTMBにより現像し、そしてその吸収を650nmでモニターした。
【図４】3H7抗体のFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAとの直接結合を示す。精製3H7抗体の、哺乳類動物系に発現されたFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAとの直接結合を、ELISAアッセイを用いて比較した。ELISAプレートを３種の受容体（100ng/ウエル）を用いてコーティングした。精製3H7抗体の色々な希釈液をコーティングしたプレート上でインキュベートした。ヤギ抗マウスHRP複合抗体を、結合した特異的抗体の検出に使用し、反応物をTMBにより現像して吸収を650nmにてモニターした。
【図５】クローン2B6由来の精製した抗体のFcγRIIAおよびFcγRIIBとの直接結合能力の比較を、３種のFcγRIIに対する市販モノクローナル抗体と比較して示す。2B6抗体のFcγRIIA（上右パネル）およびFcγRIIB（上左パネル）との結合を、３種のFcγRIIに対する他の市販抗体と比較した。使用したELISAフォーマットは図４に記載したものと同じである。
【図６】クローン2B6から産生した抗体と凝集ビオチン化ヒトIgGのFcγRIIBに対する結合の競合を示す。パネルＡ：  FcγRIIBとの結合について、クローン2B6由来の上清中に存在する抗体の凝集ビオチン化ヒトIgGと競合する能力を、ブロッキングELISA実験を用いて測定した。2B6抗体競合能力を、ハイブリドーマからのネガティブ上清のそれとおよび3H7抗体のそれと比較した。FcγRIIBを用いてコーティングしたELISAプレートを色々な希釈（1:10）の上清とともにインキュベートした。洗浄後、プレートを固定した量の凝集ビオチン化ヒトIgG（1mg/ウエル）とともにインキュベートし、結合した凝集物を複合したストレプトアビジン-HRPを用いて検出した。反応物をTMBにより現像して吸収を650nmでモニターした。パネルＢ：パネルＡに記載したのと同じブロッキングELISAを、精製2B6抗体を用いて実施し、使用したブロッキング抗体の或る濃度（4mg/ウエル）から得たデータをバーチャートで表現した。FcγRIIBに対する凝集ヒトIgG結合をブロックする2B6能力をマウスIgG1アイソタイプ対照と比較した。
【図７】二重染色FACSアッセイを用いて確認した、FcγRIIBに対する結合における2B6抗体と凝集ビオチン化ヒトIgGの競合。二重染色FACSアッセイを実施し、全長哺乳類動物FcγRIIBにより安定してトランスフェクトしておいたCHO-K1細胞を用いて2B6抗体を特徴付けた。パネルＡ：トランスフェクタント細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照を用いて染色し、次いでヤギ抗マウスFITC複合抗体およびストレプトアビジン-PEを用いて処理した。パネルＢ：トランスフェクタント細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照を用いて染色した後に凝集ビオチン化ヒトIgGを用いて染色し、そしてヤギ抗マウスFITC複合抗体を用いて標識して結合したモノクローナル抗体を検出しかつ複合したストレプトアビジン-PEを用いて標識して結合した凝集物を検出した。パネルＣ：細胞を2B6抗体を用いて染色し、抗体を洗浄により除去し、そして細胞を凝集ビオチン化ヒトIgGとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、そしてヤギ抗マウスFITC複合抗体を用いて標識して結合したモノクローナル抗体を検出しかつ複合したストレプトアビジン-PEを用いて標識して結合した凝集物を検出した。
【図８】ヒトＢリンパ球のモノクローナル抗FcγRIIB抗体およびCD20同時染色を示す。ヒト血液から得た細胞（バッフィーコート）を抗CD20-FITC複合抗体（Ｂリンパ球集団を選択するために）ならびに3H7および2B6を用いて染色した。結合した抗FcγRIIB抗体をヤギ抗マウスPE複合抗体により検出した。Ａ：細胞を抗CD20-FITC抗体およびマウスIgG1アイソタイプ対照を用いて同時染色した。Ｂ：細胞を抗CD20-FITC抗体および3H7抗体を用いて同時染色した。Ｃ：細胞を抗CD20-FITC抗体および2B6抗体を用いて同時染色した。
【図９Ａ】FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色を示す。CHO/IIＢ細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照（左パネル）および3H7抗体（右パネル）を用いて染色した。細胞に結合した抗体をヤギ抗マウスPE複合抗体を用いて標識した。
【図９Ｂ】FcγRIIBを発現するCHO細胞の染色を示す。CHO/IIＢ細胞をマウスIgG1アイソタイプ対照（左パネル）および2B6抗体（右パネル）を用いて染色した。細胞に結合した抗体をヤギ抗マウスPE複合抗体を用いて標識した。
【図１０】β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイを示す。Ａ：β-ヘキソサミニダーゼ放出アッセイの図解。ヒトFcγRIIBを発現するトランスフェクタントをマウスIgEを用いて感作し、ポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントによりチャレンジしてFcεRIと凝集させた。ポリクローナル抗体はFcεRIと結合したマウスIgE抗体の軽鎖を認識する能力があるので架橋が起こる。マウスIgEを用いて感作しかつ2B6抗体とともにプレインキュベートしたトランスフェクタントもポリクローナルヤギ抗マウスIgGのF(ab')2フラグメントによりチャレンジしてFcεRIをFcγRIIBと架橋させた。Ｂ：ヒトFcγRIIBを発現するRBL-2H3細胞においてヤギ抗マウスF(ab)2により誘導されるβ-ヘキソアミニダーゼ放出。放出β-ヘキソサミニダーゼ活性は全活性と比較した放出活性パーセントとして表現した。
【図１１】卵巣および乳癌培養細胞株はHer2/neuを様々なレベルで発現することを示す。A)精製ch4D5による卵巣IGROV-1の染色、B)精製4D5抗体による卵巣OVCAR-8の染色、およびC)精製ch4D5による乳癌SKBR-3細胞の染色後に、フィコエリトリン（PE）と複合したヤギ抗ヒト抗体を用いて処理した。関連アイソタイプ対照IgG1を抗Her2neu抗体による染色の左に示される。
【図１２】溶出した単球は全てのFcγRを発現することを示す。Ａ．ドナー１から得たMDM。Ｂ．ドナー２から得たMDM、ヒト血清またはヒト血清およびGMCSF中で拡大した。Ｃ．解凍して直ぐ染色した単球。単球から誘導されたマクロファージをヒトFcγR受容体に特異的な抗体を用いて染色した。それぞれのプロットにおける黒色のヒストグラムはバックグラウンド染色を示す。各パネル中の白色のヒストグラムは特異的抗ヒトFcγR抗体を用いた染色を示す。
【図１３】ch4D5は、PBMCを用いて卵巣および乳癌培養細胞株に有効なADCCを媒介する。抗体依存性溶解から差引いた特異的溶解を、A)卵巣腫瘍培養細胞株、IGROV-1（エフェクター：標的比75:1にて）およびB)乳腫瘍培養細胞株、SKBR-3（エフェクター：標的比50:1にて）について、表示した色々な濃度のch4D5を用いて示した。
【図１４】ヒト卵巣腹水の組織化学的染色は腫瘍細胞および他の炎症性細胞を示す。A)卵巣腫瘍を患う患者の腹水のH&E染色。３つの新生物細胞を、不規則なサイズと形状、分散した細胞質、および不規則な濃度の核により同定することができる。B)卵巣の重症腫瘍を患う患者からの無処理腹水のギムザ染色は、短い矢印により示した２つの背中合わせに位置した中皮細胞を示す。また、長い矢印で示した５つの悪性上皮細胞のクラスターも示されている。赤血球がバックグラウンドに見られる。C)卵巣重症腫瘍の他の患者のギムザ染色は中皮細胞、リンパ球、および上皮新生物細胞（矢印）から成る細胞のクラスターを示す。
【図１５】Ch4D5は、PBMCを用いる卵巣および乳癌培養細胞株による効果的なADCCを媒介する。
【図１６】ヒト卵巣腹水の組織化学的染色は腫瘍細胞と他の炎症性細胞を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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