(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴから得られた組織をオーキシンを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、続いて、このカルスを光照射条件下で培養してアントシアニン生産細胞を獲得し、続いて、このアントシアニン生産細胞を光照射条件下で且つオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で培養してオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖する寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を獲得し、続いて、この獲得した寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法。
【請求項２】
イチゴから得られた組織をオーキシンを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、続いて、このカルスを光照射条件下で且つオーキシンを添加した固体培地で培養してアントシアニン生産細胞を獲得し、続いて、このアントシアニン生産細胞を、光照射条件下で且つオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で培養してオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で増殖するアントシアニン生産細胞を獲得し、以下、オーキシン濃度とサイトカイニン濃度を更に低減させた培地で培養してオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で増殖するアントシアニン生産細胞を獲得する工程を繰り返し、最終的にオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖する寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を獲得し、続いて、この獲得した寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法。
【請求項３】
請求項１，２いずれか１項に記載のイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法において、イチゴから得られた組織として、イチゴの葉から得られた組織を採用することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法において、イチゴから得られた組織からカルスを形成する固体培地には、サイトカイニンが添加されていることを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法。
【請求項５】
イチゴの細胞を培養して得た寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を、オーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖させた後、該増殖細胞からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
アントシアニンは、植物の花，果実若しくは茎葉に存在する赤，青，紫系統の色素である。このアントシアニンは食品の着色材や繊維の着色素材として実用価値が高く、天然及び栽培植物からの採取や、植物の細胞を培養しての製造など多様な製造方法が検討されている。また、近年アントシアニンを着色用の色素として用いるだけでなく、その抗酸化性などの機能についても多くの研究がなされている。
【０００３】
ところで、イチゴには多量のアントシアニンが含まれており、従来、一般的には、イチゴからアントシアニンを製造する方法として、生若しくは乾燥したイチゴ果実から、使用目的に適合した抽出溶剤でアントシアニンを抽出する方法が採用されている。
【０００４】
しかし、この一般的な方法は、抽出液に果実成分の糖質，酸味成分，臭い成分等の夾雑物が混在してしまい、該夾雑物の除去工程として、前記抽出液に濾過，濃縮，乾燥若しくはイオン交換クロマトグラフィー等の複雑で長時間かかる分離，精製工程を加える必要がある。従って、この一般的な方法には、夾雑物の除去工程が厄介であるという問題点がある。
【０００５】
また、イチゴ細胞を培養し、該培養細胞からアントシアニンを製造する方法として、特開平５−１５３９９４号，特開平５−１５３９９５号，特開平５−１５３９９６号，特開平５−１５３９９７号，特開平５−１５３９９８号のような、合成植物ホルモンのオーキシン及びサイトカイニンを使用した培養方法でイチゴ細胞を培養する方法が提案されている（以下、従来例という。）。
【０００６】
しかし、この従来例は、合成植物ホルモンのオーキシン及びサイトカイニンを使用してイチゴ細胞を培養し、該培養細胞からアントシアニンを製造する為、製造されるアントシアニンにはオーキシン及びサイトカイニンが含まれることになり、製造されたアントシアニンを食品用色素として使用する場合、前記オーキシン及びサイトカイニンの完全な除去工程が必須となる。
【０００７】
また、従来例は、アントシアニンを生産していない状態のイチゴ培養細胞の培養条件を変えることにより、該培養細胞にアントシアニンを製造する能力を付与するものである為、培養細胞のアントシアニン生産能力の検定を常時行う必要があり、この検定が厄介である。また、そのアントシアニン生産能が確実に維持されることも保証されておらず、安定なアントシアニン製造方法とは必ずしも言い難い。
【０００８】
従って、これら従来のイチゴからアントシアニンを製造する技術は、いずれも改善すべき問題点があり、十分なアントシアニン製造技術とは言えない。
【０００９】
本発明は、上記問題点を解決するもので、イチゴ細胞を培養してアントシアニンを製造する手法を用いながら、このイチゴ細胞の培養にはオーキシンとサイトカイニンを必要とせず、しかも、このイチゴ培養細胞から良好にアントシアニンを製造することができる極めて実用性に秀れたイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨を説明する。
【００１１】
イチゴから得られた組織をオーキシンを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、続いて、このカルスを光照射条件下で培養してアントシアニン生産細胞を獲得し、続いて、このアントシアニン生産細胞を光照射条件下で且つオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で培養してオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖する寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を獲得し、続いて、この獲得した寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に係るものである。
【００１２】
また、イチゴから得られた組織をオーキシンを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、続いて、このカルスを光照射条件下で且つオーキシンを添加した固体培地で培養してアントシアニン生産細胞を獲得し、続いて、このアントシアニン生産細胞を、光照射条件下で且つオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で培養してオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で増殖するアントシアニン生産細胞を獲得し、以下、オーキシン濃度とサイトカイニン濃度を更に低減させた培地で培養してオーキシン濃度とサイトカイニン濃度が所定濃度より低い培地で増殖するアントシアニン生産細胞を獲得する工程を繰り返し、最終的にオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖する寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を獲得し、続いて、この獲得した寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に係るものである。
【００１３】
また、請求項１，２いずれか１項に記載のイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法において、イチゴから得られた組織として、イチゴの葉から得られた組織を採用することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に係るものである。
【００１４】
また、請求項１〜３いずれか１項に記載のイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法において、イチゴから得られた組織からカルスを形成する固体培地には、サイトカイニンが添加されていることを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に係るものである。
【００１５】
また、イチゴの細胞を培養して得た寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５を、オーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖させた後、該増殖細胞からアントシアニンを抽出することを特徴とするイチゴ培養細胞を用いたアントシアニンの製造方法に係るものである。
【００１６】
【発明の作用及び効果】
イチゴから得られた組織をオーキシンを添加した固体培地で培養してカルスを形成し、続いて、該カルスを光照射条件下で培養するとアントシアニン生産細胞が得られる。
【００１７】
続いて、このアントシアニン生産細胞を光照射条件下で且つオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で培養すると、増殖できずに死んでしまうアントシアニン生産細胞と、オーキシンとサイトカイニンを含まない培地でも増殖するアントシアニン生産細胞とに分かれる（寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５は、このオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖するアントシアニン生産細胞である。）。
【００１８】
このオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖するアントシアニン生産細胞をオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で培養し、該培養されたアントシアニン生産細胞からアントシアニンを抽出すると、オーキシン及びサイトカイニンが含まれないアントシアニンが得られる。
【００１９】
本発明は上述のようにするから、イチゴの培養細胞を用いたアントシアニン製造が合成植物ホルモンのオーキシンやサイトカイニンを全く使用せずに可能となり、抽出，精製工程も大幅に簡略化され、生産効率が向上することになる。
【００２０】
また、本発明により製造したイチゴのアントシアニンは、イチゴ果実を原料とした製造の場合に懸念される、残留農薬，ダイオキシン，環境ホルモン等の不純物の混入や、また、従来例のようなオーキシンやサイトカイニン等の合成植物ホルモンの混入等、食品色素としては好ましくない成分が混在する可能性が理論的に排除される為、アントシアニンの食品色素としての安全性が確保され、食品の商品性向上が期待される。
【００２１】
また、本発明により得られたアントシアニンを生産するイチゴ培養細胞は、光照射条件下で常時赤色を呈しており、常時イチゴ培養細胞のアントシアニン生産能を外観の観察により確認，管理することが容易に可能であり、安定したイチゴのアントシアニン製造を行うことができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例について、以下に説明する。
【００２３】
カルスの形成
イチゴの葉を通常使用される殺菌剤で処理し、無菌環境下で数ｍｍ四方の組織断片にカットする。
【００２４】
続いて、植物細胞培養に通常使用されるＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ）、Ｂ５（Ｇａｍｂｏｒｇ）などの基本培地に、合成植物ホルモンとしてオーキシン或いはオーキシン及びサイトカイニン、更に、蔗糖，ゲランガムを添加した培地に、前記組織断片を置床し、２５℃で培養することによりカルスの形成を行う。
【００２５】
このカルスの形成に使用されるオーキシンは、通常使用される２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下、２，４−Ｄという）やナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡという）やインドール酢酸（以下ＩＡＡという）などであり、また、サイトカイニンは、通常使用されるベンジルアデニン（以下、ＢＡという）やカイネチン（以下、Ｋｉｎという）などであるが、上述のようにサイトカイニンを用いない方法でも良い。また、これらの合成植物ホルモン濃度は、０．１ｍｇ／リットル〜１０ｍｇ／リットルの範囲であり、これも通常カルス形成に使用される濃度範囲である。
【００２６】
続いて、得られたカルスを前記の培地及び培養条件を用いて増殖を行い、白色〜クリーム色の細胞を得る。
【００２７】
尚、このイチゴの植物組織片からのカルス形成及びカルスの増殖に使用される培養方法は広く一般的に使用されている条件であり、通常の手法である。また、イチゴの果実等からカルスを形成しても良い。
【００２８】
アントシアニン生産細胞の獲得
続いて、得られた白色〜クリーム色の細胞を光照射条件下で培養を行い、光照射条件下でアントシアニンを生産する赤色細胞（アントシアニンにより赤色になっている。）を肉眼，ルーペなどを用いて検索する。尚、使用する培地は前記カルスから細胞を得る際に使用した培地と同様のものである。
【００２９】
続いて、検索により発見した赤色細胞を周辺の赤色でない細胞と共に新しい培地に移し、赤色細胞の増殖を試みる（以下、新しい培地に細胞を移して培養を行うことを継代培養という。）。
【００３０】
通常、光照射条件下で培養した植物細胞に出現するアントシアニン生産を行う赤色細胞は継代培養によって増殖せず、周辺の増殖した赤色でない細胞群の中で褐変，枯死したり、増殖中に該赤色細胞の赤色が薄くなり、増殖した白色細胞中で赤色が消失してしまうことが多い。しかし、中には継代培養によっても赤色を維持したまま増殖するものがあり、この継代培養によっても増殖するアントシアニン生産を行う赤色細胞を獲得する。
【００３１】
尚、検索により発見した赤色細胞のみを継代培養する方法でも良いが、この場合、細胞一つ一つのレベルで分離作業を行わねばならず、該分離作業が厄介となる。従って、本実施例では、周辺の赤色でない細胞と共に新しい培地に移すという方法を採用している。
【００３２】
続いて、このアントシアニンを生産する赤色細胞を検索する作業と、該アントシアニンを生産する赤色細胞の増殖とを繰り返し行い、継代培養を行っても褐変，枯死しないで増殖するアントシアニン生産を行う赤色細胞を獲得する。続いて、得られたアントシアニン生産を行う赤色細胞のアントシアニン生産能を高めるために、より赤色の濃い、増殖の早いアントシアニン生産細胞を選抜し、更に、継代培養を繰り返し行い、アントシアニン生産細胞を獲得する。
【００３３】
増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞の獲
得
前記アントシアニン生産細胞の獲得により獲得した光照射条件下でアントシアニン生産を行う赤色細胞は、増殖とアントシアニン生産に合成植物ホルモンのオーキシンとサイトカイニンを必要とし、このアントシアニン生産細胞をオーキシン及びサイトカイニン無添加の培地で継代培養を行うと、増殖せず、細胞は著しい褐変を生じ、枯死してしまう。そのため、増殖とアントシアニン生産に合成植物ホルモンのオーキシン及びサイトカイニンを必要としないアントシアニン生産細胞を得るために、以下の手段を講じる。
【００３４】
アントシアニン生産細胞が安定した増殖とアントシアニン生産を行っている培地中のオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を所定濃度より各１／２濃度に低減させて継代培養を行う。この時、アントシアニン生産細胞の一部若しくは多くがダメージを受け、増殖の停止及び細胞の褐変を生じ枯死するが、増殖能及びアントシアニン生産能力が低下しつつも生存するものが得られる。この生存したアントシアニン生産細胞を、前記オーキシンとサイトカイニンを各１／２濃度に低減させた培地で継代を繰り返し、増殖能の回復とアントシアニン生産能の向上を図る。
【００３５】
続いて、増殖能及びアントシアニン生産能が十分回復したアントシアニン生産細胞を、再び合成植物ホルモンのオーキシンとサイトカイニン無添加の培地で培養を試み、オーキシン及びサイトカイニン無添加培地での増殖能及びアントシアニン生産能の検定を行う。
【００３６】
この検定で、細胞増殖の停止と細胞の褐変及び枯死が生じ、オーキシンとサイトカイニンの必要性が確認された場合は、オーキシン濃度とサイトカイニン濃度を更に各１／２濃度（最初の１／４濃度）に低減させて同様の継代培養を行う。
【００３７】
以下、同様の手段により、アントシアニン生産細胞の増殖に必要なオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を徐々に低減させていく。
【００３８】
尚、この培地中のオーキシン濃度及びサイトカイニン濃度の低減化率は、夫々の濃度を１／２の低減率とすることが好適であるが、低減化率は１／２である必要はない。例えば、褐変及び枯死する細胞が多くなく、細胞の増殖能とアントシアニン生産能が維持されていれば１／１０若しくはこれ以下の低減化率でも良く、また、低減化率が１／２であっても、細胞増殖能またはアントシアニン生産能の著しい低下を生ずる場合は、２／３，３／４のような低減化率を用いる。
【００３９】
以上の操作および工程を繰り返し行い、最終的に増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞を獲得する。更に、このアントシアニン生産細胞のより一層安定した増殖とアントシアニン生産能の向上を選抜及び継代培養を繰り返すことにより図る。
【００４０】
このオーキシンとサイトカイニンを含まない培地で増殖するアントシアニン生産細胞は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託している（受託年月日：平成１２年３月２８日，受託番号：寄託細胞ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７９５）。
【００４１】
以上の実施例により獲得した、増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞は、光照射条件下で常時アントシアニンを生産して赤色を呈している為、アントシアニン製造原料としての色素生産能の確認が外観から直接行えることになり、いつでも大量培養によるアントシアニン製造を開始することが可能である。また、培養方法も多様な手段を用いることが可能であり、液体培地による大量培養にも適応可能である。
【００４２】
尚、本実施例では、この増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞を得る為に約４年の年月を要した。
【００４３】
アントシアニンの抽出
前工程で獲得した、増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞は、培養後、培地と分離し、従来既知の方法を用いてアントシアニンを抽出，精製することができる。
【００４４】
例えば、十分に培地成分を除去した生の増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞、若しくは、該細胞に凍結乾燥などの乾燥処理を行った細胞から、塩酸酸性エタノール溶液などの抽出溶媒を用いて１回〜複数回抽出操作を行ってアントシアニンを抽出し、この抽出液を減圧乾固などの方法で濃縮乾燥し、水に溶解させた後、不溶物を除去すれば、アントシアニン水溶液が得られ、更にイオン交換樹脂などを使用したクロマトグラフィー手法などを用いて分離精製する方法によって、より高純度のアントシアニンを製造する、などの方法である。
【００４５】
また、本実施例では、最終的に得られたアントシアニン生産細胞の培養に合成植物ホルモンを使用していないため、必ずしも従来の抽出及び精製方法を用いる必要はなく、生若しくは乾燥した細胞から、有機酸、例えばリンゴ酸，クエン酸、酢酸等で酸性にしたエタノール溶液を用いて抽出を行うことにより、直接製品であるアントシアニン溶液が製造できる。
【００４６】
このアントシアニン溶液は、必要に応じて濃縮若しくは減圧乾固等の操作により、任意のアントシアニン濃度の製品となる、更に精製を必要とする場合は、イオン交換樹脂などを使用したクロマトグラフィー手法などを用いて分離精製を行えば良い。
【００４７】
以上の各工程により、イチゴ培養細胞からアントシアニンが製造できる。
【００４８】
以下、本実施例によるイチゴ培養細胞を用いたアントシアニン製造の実験例を示す。
【００４９】
実験例
カルスの形成
イチゴ（品種名は女峰：Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）の若い葉を、０.１％界面活性剤水溶液に入れて３０秒間超音波洗浄を行い、７０％エタノール溶液中に１０秒間浸漬した後、滅菌水で洗浄した。その後、界面活性剤を０.１％含有する１％次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬した後、滅菌水で２回洗浄した。次いで葉の周辺部を切り捨てた後、５×５ｍｍ程度となるように葉の組織を切り出しカルス形成の試料とした。カルス形成に用いた培地はＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ）基本培地に蔗糖３０ｇ／リットル、０.２％のゲランガムを添加し、これにオーキシンとして２，４−Ｄ，ＩＡＡ，ＮＡＡを各０.１，１,１０ｍｇ／リットル、サイトカイニンとしてＢＡ，Ｋｉｎを各０，０.１，１，１０ｍｇ／リットルを添加した固体培地を使用し、イチゴの葉の組織断片を置床し、温度２５℃、暗黒下で４〜６週間培養しカルスを形成した。このカルス形成の結果を表１に示した。
【００５０】
【表１】
0004491655.tif 000002
【００５１】
このように、多くのオーキシン濃度とサイトカイニン濃度の組み合わせ条件下でカルスの形成が確認された。
【００５２】
続いて、形成されたカルスを葉の組織断片から分離し、カルスが形成されたものと同じオーキシン濃度とサイトカイニン濃度の新しい培地で継代培養を行い、増殖の良好なもの、カルスが固い組織とならずソフトなもの、細胞が白色で増殖中若しくは増殖後に褐変，黒変などの変色を生じないものなどを選定基準として選抜を行い、さらに光照射条件下でわずかでもアントシアニン生産が認められ、赤色を呈する細胞が散見されることなどを条件に最適オーキシン濃度及びサイトカイニン濃度の組み合わせ条件を選定した。この結果、オーキシンとしてＮＡＡを１ｍｇ／リットル、サイトカイニンは無添加の培地を選定した。
【００５３】
続いて、選定した条件で培養している細胞を増殖させ、更に、オーキシンとサイトカイニンの種類と濃度を種々組み合わせた培地条件で同様の選定基準により、再びオーキシン及びサイトカイニンの最適条件を詳細に検討した結果、オーキシンとしてＮＡＡを２.０ｍｇ／リットル、サイトカイニンとしてＢＡを０.２ｍｇ／リットルを添加した培地条件を選定した。この培地を用いて細胞を培養することにより、前に選定した培地条件より更に安定した増殖を示し、細胞の褐変が減少した。このように一度の培地選定を行うだけではなく、更により最適な培地条件を検討することが安定した培養細胞を得る手法であった。
【００５４】
続いて、この最適培地条件下で培養している細胞を多数の固体培地上で培養し、アントシアニン生産細胞の選抜材料とした。
【００５５】
アントシアニン生産細胞の獲得
前記カルスの形成で良好な増殖特性を示し、光照射条件下でアントシアニンを生産する赤色細胞の散見される細胞が得られたので、増殖するアントシアニン生産細胞の獲得を試みた。
【００５６】
培養条件は前記カルスの形成時に使用したものと同様、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ）基本培地に蔗糖３０ｇ／リットル，０.２％のゲランガムを添加し、これにオーキシンとしてＮＡＡを２.０ｍｇ／リットル，サイトカイニンとしてＢＡを０.２ｍｇ／リットルを添加した固体培地を使用し、２５℃，白色蛍光灯を用い照度５０００Ｌｕｘ，２４時間照明で培養を行った、継代期間は２週間とした。この培養条件下では、増殖終了前後にアントシアニンを生産する赤色細胞がわずかに出現するが、この赤色細胞は次の継代培養時に、増殖した白色の細胞中に消失してしまい、この培養条件下では増殖するアントシアニン生産細胞は得られなかった。
【００５７】
続いて、その他の培養条件は変更せずに、基本培地をＭＳ培地からＢ５改変培地（Ｂ５培地の無機塩類成分にＭＳ培地の有機物成分を組み合わせた培地組成）に変更し、光照射条件下で継代培養を行った。この継代培養では、アントシアニン生産を行う赤色細胞は、培養期間中を通じて出現し、さらに出現頻度が高くなることが認められた。
【００５８】
この赤色細胞を選抜して継代培養を行う操作を繰り返すことにより、増殖中に褐変，枯死したり、赤色が消失したりしないアントシアニン生産細胞が出現した。
【００５９】
このアントシアニン生産細胞を継代培養により徐々に増やし、アントシアニン生産能の高い、赤色の濃い細胞を選抜し培養を行った。
【００６０】
この選抜及び培養操作を繰り返し行うことによって、下記表２に示されるように、イチゴ果実より約４倍高濃度のアントシアニン生産が可能な赤色細胞を獲得した。
【００６１】
【表２】
0004491655.tif 000003
【００６２】
このアントシアニン生産細胞は、さらに選抜を繰り返すことにより、より高濃度のアントシアニン生産能を獲得できることが期待される。
【００６３】
増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞の獲
得
前記アントシアニン生産細胞の獲得により獲得した光照射条件下でアントシアニンを行う赤色細胞は、増殖とアントシアニン生産に合成植物ホルモンのオーキシンとサイトカイニンを必要としたが、このアントシアニン生産細胞をオーキシン及びサイトカイニン無添加の培地で継代培養を行うと、増殖は全くせず、細胞は著しい褐変を生じ、枯死した。そのため、増殖とアントシアニン生産に合成植物ホルモンのオーキシン及びサイトカイニンを必要としない細胞を得るために、以下の手段を講じた。
【００６４】
安定した増殖とアントシアニン生産を行っている培地中のオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を各１／２濃度（ＮＡＡ１.０ｍｇ／リットル、ＢＡ０.１ｍｇ／リットル）に低減させて継代培養を行った。この時、一部あるいは多くの細胞がダメージを受け、増殖の停止及び細胞の褐変を生じ枯死したが、培養しているアントシアニン生産細胞の特性が全ての培養容器中の細胞で一様であることはないため、増殖能及びアントシアニン生産能力が低下しつつも生存する細胞が得られた。
【００６５】
この生存した細胞を、同培地（ＮＡＡ１.０ｍｇ／リットル、ＢＡ０.１ｍｇ／リットル）で継代培養を繰り返し、増殖能の回復とアントシアニン生産能の向上を図った。
【００６６】
続いて、増殖能及びアントシアニン生産能が十分回復した細胞を再び合成植物ホルモンのオーキシンとサイトカイニン無添加の培地で培養を試み、オーキシン及びサイトカイニン無添加培地での増殖能及びアントシアニン生産能の検定を行った。しかし、この検定でも、細胞増殖の停止と細胞の褐変及び枯死が生じ、オーキシンとサイトカイニンの強い必要性が確認されたため、さらにオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を各１／２濃度に低減させて同様の継代培養を行い、アントシアニン生産細胞の増殖に必要なオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を徐々に低減させた。
【００６７】
この時、アントシアニン生産能と増殖性を低減化前の状態にまで回復させるには多くの継代培養数と期間を要するため、必ずしも低減化前の状態にまで回復させる必要はないが、次回の低減時に培地中のオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を各１／２濃度に低減させた場合に、アントシアニン生産能の大幅な低下や増殖の停止及び細胞の褐変を生じ枯死するようでは継代培養に耐えられないため、回復状態を調整する必要があった。
【００６８】
以上の操作及び工程を繰り返し行い、本実験例示では、培地中のオーキシン濃度とサイトカイニン濃度を各１／１６００（ＮＡＡ０.００１２５ｍｇ／リットル、ＢＡ０.０００１２５ｍｇ／リットル）に低減し、６回選抜及び継代培養を行うことにより、最終的に増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞を獲得した。継代数が少ない場合はイチゴ培養細胞が容易にオーキシン及びサイトカイニンの低減化に対応が可能であり、増殖能とアントシアニン生産能の回復が速やかである。また、継代数が多い場合はアントシアニン生産能と増殖能の回復が困難であった。このようにして本実験例で獲得した、増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞は、オーキシン及びサイトカイニンの低減化に約４年を要した。
【００６９】
続いて、このアントシアニン生産細胞のより安定した増殖とアントシアニン生産能の回復を選抜及び継代培養を繰り返すことにより図った。その結果、前記表２に示されるような、オーキシン及びサイトカイニンの低減化前の状態には至らないが、イチゴ果実に比し２倍までアントシアニン生産能が回復した。更に、選抜と継代培養を繰り返すことにより、より高いアントシアニン生産能を獲得することが容易に予想できる。
【００７０】
また、このＢ５改変培地で獲得した増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞は、ＭＳ培地で培養を行うと、増殖能及びアントシアニン生産能は低下するものの、増殖及びアントシアニン生産を行うため、アントシアニン製造の原料とすることができた。
【００７１】
この工程で獲得した、増殖及びアントシアニン生産に合成植物ホルモンを必要としないイチゴ培養細胞は培養後、培地と分離し、十分に培地成分を除去した後に凍結乾燥を行った。この乾燥細胞から、３〜５％リンゴ酸エタノール溶液を用いて２回抽出を行うことにより、ほぼ完全にアントシアニンは抽出され、アントシアニン溶液が製造できた。また抽出溶液を３〜５％クエン酸エタノール溶液、３〜５％酢酸エタノール溶液を用いて抽出した場合も同様に抽出できた。また、十分に培地成分を除去した生の培養細胞からも同様に抽出できた。次いで、このアントシアニン溶液を濃縮することにより、任意のアントシアニン濃度の製品が製造可能であった。さらに、このアントシアニン溶液を用いて、従来既知の精製操作を行い、次いで、イオン交換樹脂を使用しアントシアニンを分離精製した。
【００７２】
以上の各工程により、イチゴからアントシアニン生産細胞を得、該アントシアニン生産細胞をホルモンフリーで培養可能な状態とし、該ホルモンフリーで培養できるアントシアニン生産細胞からアントシアニンを製造することができた。
【００７３】
本実施例は上述のようにするから、イチゴの培養細胞を用いたアントシアニン製造が合成植物ホルモンのオーキシンやサイトカイニンを全く使用せずに可能となり、抽出，精製工程も大幅に簡略化され、アントシアニンの生産効率が向上することになる。
【００７４】
また、本実施例により得られるイチゴのアントシアニンには、イチゴ果実を原料とした製造方法の場合に懸念される、残留農薬，ダイオキシン，環境ホルモンなどの不純物が混在するおそれがなく、また、従来例のようにオーキシンやサイトカイニン等の食品には好ましくない成分が混在する可能性も論理的に排除される為、アントシアニンを使用した食品の商品性向上が期待されることになる。
【００７５】
また、本実施例におけるアントシアニンを生産するイチゴ培養細胞は、光照射条件下で常時赤色を呈している為、常にイチゴ培養細胞のアントシアニン生産能を外観の観察により確認，管理することが容易であり、安定したイチゴのアントシアニン製造を行うことができる。