(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ酵素（ＸＥＴ）の生産方法であって、
（ａ）適切な栄養培地中で前記ＸＥＴ酵素の生産を助成する条件下に微生物のＸＥＴを発現する、ｉ）子嚢菌門から選択される真菌及びii）バシラス属からなる群から選択された微生物を培養し、（ｂ）その後、前記栄養培地から前記ＸＥＴ酵素を回収することを含んでなるとともに、
前記子嚢菌門から選択される真菌が、コニオチリウム、フォマ、ジプロジア、プロウリフチア、フィロスチクタ、セプトリア、ツベウフィア、アルタナリア、エムベリシア、チアロスポレラ、ガリエラ、オエドセファルム、シュードプレクタニア、ピロネマ、ボトリチス、アポスファエリア、ペスタロチア、ペスタロチオプシス、ケタピオスポラ、ポロニア、ノズリスポリウム、キシラリア、シトスポラ、ジスキュラ、フォモプシス、コリネウム、セイマトスポリウム、フザリウム、バーチシリウム、ボルテラ、ルルボルシア、コレトトリチャム、アスペルギルス、ユーロチウム、ユーペニシリウム、ペニシリウム、ペトロミセス及びタラロミセス属からなる群に属する菌株から選択される、方法。
【請求項２】
前記子嚢菌類が、ジプロジア・ゴシッピナ、プロウリフチア・リベシア、フィロスチクタ属、セプトリア属、ツベウフィア・アマゾネンシス、アルタナリア属、エムベリシア・ヒアシンシ、フォマ・ネオロバ、フォマ・トロピカ、コニオチリウム属、コニオチリウム・オリバセウム、コニオチリウム・ズンキ、チアロスポレラ属、チアロスポレラ・ファセオリナ、ガリエラ・セレビカ、シュードプレクタニア・ニグレラ、ピロネマ・ドメスチクム、オエドセファルム属、ボトリチス・シネレア、アポスファエリア属、ペスタロチア属、ペスタロチオプシス属、ポロニア・プンクタタ、キシラリア属、ノズリスポリウム属、フザリウム・ソラニ、バーチシリウム属、ボルテラ・ブキシ、ケタピオスポラ・ロドデンドリ、ルルボルシア・ウニセプタタ、コレトトリチャム・アキュラツム、コレトトリチャム・クラッシペス、シトスポラ属、ジスキュラ属、フォモプシス属、フォモプシス・キルシ、コリネウム・カスタネイコラ、セイマトスポリウム・リケニコラ、アスペルギルス・タマリ、ユーロチウム・ケバリエリ、ユーペニシリウム・ジャバニクム、ペニシリウム・カプスラツム、ペニシリウム・オルソニ、ペニシリウム・ピノフィルム、ペニシリウム・ロケホルチ、ペニシリウム・イタリクム、ペニシリウム・バールキュロスム、ペニシリウム・カネセンス、ペトロミセス・アリアセウス及びタラロミセス・フラブスからなる群に属する菌株から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ酵素（ＸＥＴ）の生産方法であって、
（ａ）適切な栄養培地中で前記ＸＥＴ酵素の生産を助成する条件下に微生物のＸＥＴを発現する、ｉ）トラメテス、コルチシウム、スエヒロタケ、ステレウム及びツブリクリニスの属からなる群に属する菌株から選択された担子菌である真菌、及び、ii）バシラス属からなる群から選択された微生物を培養し、
（ｂ）その後、前記栄養培地から前記ＸＥＴ酵素を回収することを含む方法。
【請求項４】
前記真菌が、トラメテス・ヒルスタ、コルチシウム・ロセウム、シゾフィルム属、ステレウム・ヒルスツム及びツブリクリニス・スブラツスからなる群に属する菌株から選択された担子菌である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ酵素（ＸＥＴ）の生産方法であって、
（ａ）適切な栄養培地中で前記XET酵素の生産を助成する条件下に微生物のＸＥＴを発現する、ｉ）ジコトモクラジウム、シャジクケカビ、ゴングロネラ、スポロジニエラ及びケカビ属からなる群に属する菌株から選択される接合菌類である真菌、及び、ii）バシラス属からなる群から選択された微生物を培養し、
（ｂ）その後、前記栄養培地から前記ＸＥＴ酵素を回収することを含む方法。
【請求項６】
前記真菌がジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ、アクチノムコル・エレガンス、ゴングロネラ・ブトレリ、ムコル・ミエヘイ小変属（Mucor miehei var. minor）及びスポロジニエラ・ウムベラタからなる群に属する菌株から選択される接合菌類である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ酵素（ＸＥＴ）の生産方法であって、
（ａ）適切な栄養培地中で前記ＸＥＴ酵素の生産を助成する条件下に微生物のＸＥＴを発現する、ｉ）ビアラエ・インスキュルプタ、アウレオバシジウム・プルランス、キルキノトリチャム属、クリプトクライン属、エリシオプシス属、エピコクム・ニグラム、グリオクラジウム属、ヘリコロイジオン・イレグラエ、ヘンデルソニア属、マリアンネ属、ミクロスフェロプシス属、ラムラリア属、ザルコポジウム属、スパジコイデス属、スペイロプシス・ペダトスポラ、スポロトリチャム・エキシレ、トリコセシウム属、トリマトストロマ・アビエテス、ツバキア・ドリーナ、ヴィースネリオミセス属、及びチゴスポリウム・マソニからなる群に属する菌株から選択される栄養胞子真菌である真菌、及び、ii）バシラス属からなる群から選択された微生物を培養し、
（ｂ）その後、前記栄養培地から前記ＸＥＴ酵素を回収することを含む方法。
【請求項８】
前記バシラス属の菌株がバシラス・アルカロフィルス寄託番号DSM 11404である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られたＸＥＴ調製物の、セルロース材料を処理するための使用。
【請求項１０】
前記処理がセルロース材料に改善された強度特性及び／または改善された形状保持特性及び／または改良された耐しわより特性を与える請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）を含むＸＥＴ調製物であって、前記ＸＥＴがジコトモクラジウム・ヘッセルチネイから得られるとともに、前記ＸＥＴが配列番号１に示されたアミノ酸配列を含む、調製物。
【請求項１２】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）を含むＸＥＴ調製物であって、前記ＸＥＴがチアロスポレラ・ファセオリナから得られるとともに、前記ＸＥＴが配列番号２に示されたアミノ酸配列を含む、調製物。
【請求項１３】
微生物のキシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ＸＥＴ）を含むＸＥＴ調製物であって、前記ＸＥＴがチアロスポレラ・ファセオリナから得られるとともに、前記ＸＥＴが配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むか、または前記ＸＥＴは、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、調製物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は微生物キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ（XET）及びそれらの生産及び使用に関する。
発明の背景
キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ（XET）は、植物由来の既知の酵素である。我々の知る限りにおいて、微生物由来のXETは今まで記載されたことがない。
ステフェン・シー・フライ（Stephen C.Fry）等は「BioChem. J」（1992）282、第821〜828頁で、XETはミクロフィブリル間のキシログルカン鎖の切断及び再結合の原因であり、したがって、XETは植物の細胞膨張に必要な壁を緩める原因となることを示唆している。
XETは植物の形態と構造を調節するのに用いられることが示唆されてきた（EP 562836号、第２頁27〜28行参照）。
XETはすべての植物、特にすべての陸の植物に存在すると信じられている。XETは、ジコチレドン、モノコチレドン、特にイネ科のモノコチレドン及びユリ科のモノコチレドン並びにコケ及び苔類のコケ植物から抽出されてきた（「BioChem. J」（1992）282, P.823参照）。
継続中の特許出願PCT／DK96／00538号（WO 97／23683号）において、XET酵素での処理後にセルロース材料は強度特性の改良及び／または形状維持特性の改良及び／または耐しわより性（anti-wrinkling）の改良を得ることが分かった。
XET酵素はいくつかの非常に興味ある用途を有する。だから、本発明の目的は、たとえば、上記用途に有用な微生物に由来するキシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼを提供することである。微生物由来のキシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼは、それらを容易に大量に生産し得るという大きな利点をもつだろう。
発明の簡単な開示
XET活性は圧倒的大多数の系統学的に分散された微生物により生産されることがスクリーニングアッセイにより見い出された。
したがって、本発明は、XETを発現する微生物の培養により生産し得るキシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼに関し、特に本発明は、
（ａ）適切な栄養培地において、XET酵素の生産を助成する条件下で、微生物XETを発現する微生物を培養し、
（ｂ）その後、栄養培地からXET酵素を回収することを含む、キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ酵素（XET）を生産する方法に関する。
更に、本発明はセルロース材料を処理するための本発明のXET調製物の使用及び上記微生物XET調製物に関する。
【図面の簡単な説明】
本発明を更に添付の図面を参照して説明する。そこで、
図１は、例５により得られた、ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ（Dichotomocladium hesseltinei）、チアロスポレラ・ファセオリナ（Tiarosporella phaseolina）及びシュードプレクタニア・ニグレラ（Pseudoplectania nigrella）のXET活性のpHプロフィールを示す（△：チアロスポレラ・ファセオリナ、□：シュードプレクタニア・ニグレラ及び◆：ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ）。
図２は、例５により得られた、ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ、チアロスポレラ・ファセオリナ及びシュードプレクタニア・ニグレラのキシログルカナーゼ活性のpHプロフィールを示す（△：チアロスポレラ・ファセオリナ、□：シュードプレクタニア・ニグレラ及び◆：ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ）。
発明の詳細な説明
本発明は微細物の培養により生産し得るキシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ調製物に関する。
本出願においては、XETは真菌及び細菌により生産されることが分かり、そして、XETは酵母によっても生産されることが予期される。
「XET−紙」をXET生産微生物を同定するのに用いた。「XET−紙」は継続中の出願PCT／GB96／02351号（WO 97／11193号）に記載されている。それは、標識されたオリゴ糖に浸したキシログルカン被覆紙である。
標識オリゴ糖、キシログルカン含浸紙及びXET活性についてのドット−ブロット試験は次のように製造またはなされた。
標識オリゴ糖の製造
還元糖、４−Ｏ−〔４−Ｏ−〔４−Ｏ−〔６−Ｏ−α−Ｄ−キシロピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−６−Ｏ−（２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−キシロピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−６−Ｏ−（２−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−キシロピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−グルコース（「XLLG」）（１ｇ）を１ｇのシアノホウ水素化ナトリウム（NaCNBH3）を含有する25mlの炭酸水素アンモニウムの飽和水溶液中に溶解し、25℃の暗所で７日間インキュベートし、還元的アミノ化させる。次いで乾燥により、炭酸水素アンモニウムを除去し、XLLGの（ニンヒドリン反応性）アミノ化誘導体を、たとえば、ゲル透過クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーにより精製する。生成物は、オリゴサッカリジル−１−アミノ−１−デオキシアルジトール、すなわち、還元末端Ｄ−グルコース成分が１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトールにより置換された、XLLGの誘導体であると信じられる。
オリゴサッカリジル−１−アミノ−１−デオキシアルジトール（50mg）を３mlの３％ホウ砂（テトラホウ酸ジナトリウム、pH＝9.0〜9.5）に溶解し、0.75mlの乾燥ジメチルホルムアミド（DMF）中の10mgのリサミン  ローダミン  スルホニルクロリド（米国、Molecular Probes Inc.から購入）の新しく調製した溶液を撹拌しながら徐々に加え、混合物を暗所で１夜インキュベートする。更に、10mgのリサミン  ローダミン  スルホニルクロリドを含有する0.75mlのDMFを加え、混合物を更に８時間インキュベートする。鮮かなピンク色のオリゴサッカリジル−１−アミノ−１−デオキシアルジトール−リサミン−ローダミン複合体（XLLGol-SR）をゲル透過クロマトグラフィー及びその後のＣ18−シリカゲルカラム上の逆相クロマトグラフィーで精製する。水を用いる後者のカラムの洗浄後、メタノールグラジエントを適用し、XLLGol-SRが約50％メタノール中に溶離する。
キシログルカン含浸紙の製造
ワットマンNo.１ろ紙をキシログルカンの１％水溶液で湿めらせ、乾燥させる。XLLGol-SR調製物を580nm（Ａ580）で0.2の吸収を与えるのに十分な75％水性アセトンに希釈する。次いで、ワットマンNo.１紙のキシログルカン被覆紙をこの溶液に浸し、再乾燥させる。この製品を「XET紙」という。次にXET紙の適当な大きさの片（たとえば、72×108mm）を非吸収性媒体、たとえば、透明なアセテートのシート上に非水性接着剤で接着させる。
XET活性のためのドット−ブロット試験
（ｉ）少量のXET活性について試験される溶液をXET紙の片のしるしをつけた位置にピペットで移す。しみが４μｌなら、試料の間のスペースは好都合に９mm（センターからセンター、すなわち、標準の96−ウエル試験プレート形式のように）であり得る。
（ii）次に、XET紙をすばやく２枚のプラスチックシート（たとえば、オーバーヘッドプロジェクターで用いられるようなアセテートシート）の間に固定し、たとえば、20℃で１時間インキュベートする。
（iii）次いで、インキュベートしたXET紙及びそのプラスチック裏打ちを約150mlの溶剤〔たとえば、新しく調製されたエタノール／ギ酸／水（容量で１：１：１）〕を含有する皿に（紙の側を下にして）入れる。前記溶剤は、紙から未反応XLLGol-SRを除去するが、XETが触媒したトランスグリコシル化のためにキシログルカン中に導入されることになったXLLGol-SRは除去しないだろう。さて、紙はプラスチック裏打ちから容易に離れる。
（iv）次に紙を流水で５分間、次いで、約100mlのアセトンで５分間すすぎ、次に完全に乾燥させる。所望なら、80℃のオーブン中での５分間の処理により乾燥を促進することができる。
（ｖ）次に紙を短波長の紫外線ランプで調べる（たとえば、254nmで放射する。適当な眼及び皮膚保護物を着用すべきである。）。活性XETはピンク（オレンジ蛍光）色のしみで示され、それをたとえば、走査分光蛍光度計を用いて定量できる。
XET酵素
我々は、XET活性を有する微生物酵素は、トランスグリコシラーゼであるか（それらはヒドロラーゼ活性を欠くか、非常に低いヒドロラーゼ活性のみを有することを意味する）、またはキシログルカンのトランスグリコシル化と加水分解の両方を触媒することができるかのいずれかであることを見い出した。
トランスグリコシル化活性と加水分解活性の両方を有するXET酵素は、植物から得られたXET酵素についても記載されている（「Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.」1995, 46: p.509）。
系統分類
本明細書で用いられる系統分類は、世界中に広がった網（http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX）で用いられるNIHデータベース（Entrez. 1996年春版）中で用いられるシステムに主に基礎を置く。
Entrezデータベースに含まれていない微生物の分類に関して、次の一般的に用いられ、世界中に広がり、受け入れられる参考書を用いた。
子嚢菌類（Ascomycetes）について：Eriksson, O.E. & Hawksworth, D.L.「Systema Ascomycetum」vol 12（1993）
担子菌類（Basidiomecetes）について
0004472787.tif 000002
接合菌類（Zygomecetes）について：O’Donnell, K.：Zygomycetes in culture「Unversity of Georgia, US」p.257（1979）
一般的な菌類学参考文献：
Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C.及びPegler, D.N.「Dictionary of the fungi」International Mycological Institute, p.616（1995）
Von Arx, J.A.「The genera of fungi sporrulating in culture」p.424（1981）
好ましい真菌
本発明の好ましい態様においては、XET調製物は、真菌、特に、担子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、子嚢菌門（Ascomycota）に属する真菌または栄養胞子（Mitosporic）真菌の培養により生産される。
好ましい担子菌門の菌株は、コリオラレス（Coriolales）、シゾフィラレス（Schizophyllales）、ステレアレス（Stereales）またはキセナスマタレス（Xenasmatales）目に属する、帽菌類（Hymenomycetes）菌株、特にコリオラセ（Coriolaceae）、コルチシアセ（Corticiaceae）、シゾフィラセ（Schizophyllaceae）、ストレアセ（Streaceae）またはツブリクリナセ（Tubulicrinaceae）の科の一つに属する菌株である。好ましい属は、次のトラメテス（Trametes）、コルチシウム（Corticium）、スエヒロタケ（Schizophyllum）またはツブリクリニス（Tubulicrinis）の一つである。好ましい種は、次のトラメテス・ヒルスタ（hirsuta）、コルチシウム・ロセウム（roseum）、シゾフィルム種、ステレウム・ヒルスツム（Stereum hirsutum）またはツブリクリニス・スブラツス（subulatus）の一つである。
好ましい子嚢菌門は、小房子嚢菌類（Loculoas comycetes）、盤菌類（Discomycetes）、核菌類（Pyrenomycetes）、及びプレクトミケス（Plectmycetes）の綱に属する菌株、好ましくは、クロイボタケ（Dothideales）、リチスマタレス（Rhytismatales）、チャワンタケ（Pezizales）、レオチアレス（Leotiales）、マメザヤタケ（Xylariales）、ヒポクレアレス（Hypocreales）、ハロスファエリアレス（Halosphaeriales）、フィラコラレス（Phyllachorales）、ジアポルテ（Diaporthales）及びコウジカビ（Eurotiales）目に属するものである。
好ましい菌株は、ボトリオスファエリアセ（Botryosphaeriaceae）、ドチオラセ（Dothioraceae）、ミコスファレラセ（Mycosphaerellaceae）、ツベウフィアセ（Tubeufiaceae）、プレオスポラセ（Pleosporaceae）、レプトスファエリアセ（Leptosphaeriaceae）、リチスマタセ（Rhytismataceae）、ザルコゾマタセ（Sarcosomataceae）、ピロネマタセ（Pyronemataceae）、アスコボラセ（Ascobolaceae）、スクレロチニアセ（Sclerotiniaceae）、アムフィスファエリアセ（Amphisphaeriaceae）、キシラリアセ（Xylariaceae）、ヒポクレアセ（Hypocreaceae）、ハロスファエリアセ（Halosphaeriaceae）、フィラコラセ（Phyllachoraceae）、バルサセ（Valsaceae）、メランコニダセ（Melanconidaceae）及びトリココマタセ（Trichocomataceae）科に属する菌株、特に、ジプロジア（Diplodia）、プロウリフチア（Plowrightia）、フィロスチクタ（Phyllostica）、セプトリア（Septoria）、ツベウフィア（Tubeufia）、アルタナリア（Alternaria）、コニオチリウム（Coniothyrium）、フォマ（Phoma）、エムベリシア（Embellisia）、チアロスポレラ（Tiarosporella）、ガリエラ（Galiella）、シュードプレクタニア（Pseudoplectania）、ピロネマ（Pyronema）、オエドセファルム（Oedocephalum）、ボトリチス（Botrytis）、アポスファエリア（Aposphaeria）、ペスタロチア（Pestalotia）、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）、ポロニア（Poronia）、ノズリスポリウム（Nodulisporium）、キシラリア（Xylaria）、フザリウム（Fusarium）、バーチシリウム（Verticillium）、ボルテラ（Volutella）、ケタピオスポラ（Chaetapiospora）、ルルボルシア（Lulworthia）、コレトトリチャム（Colletotrichum）、シトスポラ（Cytospora）、ジスキュラ（Discula）、フォモプシス（Phomopsis）、コリネウム（Coryneum）、セイマトスポリウム（Seimatosporium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ユーロチウム（Eurotium）、ユーペニシリウム（Eupenecillium）、ペニシリウム（Penicillium）、ペトロミセス（Petromyces）及びタラロミセス（Talaromyces）属に属する菌株である。
ジプロジア・ゴシッピナ（Diprodia gossypina）、プロウリフチア・リベシア（Plowrightia ribesia）、フィロスチクタ（Phyllosticta）種、セプトリア（Septoria）種、ツベウフィア・アマゾネンシス（Tubeufia amazonensis）、アルタナリア（Alternaria）種、エムベリシア・ヒアシンシ（Embellisia hyacinthi）、フォマ・ネオロバ（Phoma neoloba）、フォマ・トロピカ（tropica）、コニオチリウム（Coniothyrium）種、コニオチリウム・オリバセウム（olivaceoum）、コニオチリウム・ズンキ（dunckii）、チアロスポレラ・ファセオリナ（Trarosporella phaseolina）、チアロスプレラ種、ガリエラ・セレビカ（Galiella celebica）、シュードプレクタニア・ニグレラ（Pseudoplectania nigrella）、ピロネマ・ドメスチクム（Pyronema domesticum）、オエドセファルム（Oedocephalum）種、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、アポスファエリア（Aposphaeria）種、ペスタロチア（Pestalotia）種、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）種、ポロニア・プンクタタ（Poronia punctata）、キシラリア（Xylaria）種、ノズリスポリウム（Nodulisporium）種、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、バーチシリウム（Verticillium）種、ボルテラ・ブキシ（Volutella buxi）、ケタピオスポラ・ロドデンドリ（Chaetapiospora rhododendri）、ルルボルシア・ウニセプタタ（Lulworthia uniseptata）、コレトトリチャム・アキュラツム（Colletotrichum aculatum）、コレトトリチャム・クラッシペス（crassipes）、シトスポラ（Cytospora）種、ジスキュラ（Discula）種、フォモプシス・イリシス（Phomopsis ilicis）、フォモピシス・キルシ（cirsii）、コリネウム・カスタネイコラ（Coryneum castaneicola）、セイマトスポリウム・リケニコラ（Seimatosporium lichenicola）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、ユーロチウム・ケバリエリ（Eurotium chevalieri）、ユーペニシリウム・ジャバニクム（Eupenicillum javanicum）、ペニシリウム・カプスラツム（Penicillium capsulatum）、ペニシリウム・オルソニ（olsonii）、ペニシリウム・ピノフィルム（pinophilum）、ペニシリウム・ロケホルチ（roqueforti）、ペニシリウム・イタリクム（italicum）、ペニシリウム・カネスセンス（canescens）、ペニシリウム・バールキュロスム（verruculosum）、ペトロミセス・アリアセウス（Petromyces alliaceus）及びタラロミセス・フラブス（Talaromyces flavus）の種が好ましい。
有用な接合菌門の例は、ケカビ（Mucorales）目に属する菌株、好ましくは、イトエダカビ（Chaetocladiaceae）及びムコラセ（Mucraceae）科に属する菌株である。
好ましい菌株は、ジコトモクラジウム（Dichotomocladium）、シャジクケカビ（Actinomucor）、ゴングロネラ（Gongronella）、スポロジニエラ（Sporodiniella）及びケカビ（Mucor）属、特にジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ（hesseltinei）、アクチノムコル・エレガンス（Actinomucor elegans）、ゴングロネラ・ブトレリ（butleri）、スポロジニエラ・ウムベラタ（Sporodiniella umbellata）及びムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）微小変異体属に属する。
不確定の分類法の菌株の例はビアラエ・インスキュルプタ（Vialaea insculpta）である。
栄養胞子真菌に属する菌株の例はアクロドンチウム・クラテリホルメ（Acrodontium crateriforme）、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、キルキノトリチャム（Circinotrichum）種、クリプトクリネ（Cryptocline）種、エリシオプシス（Ellisiopsis）種、エピコクム・ヌグルム（Epicoccum nugrum）、グリオクラジウム（Gliocladium）種、ヘリコロイジオン・イレグラレ（Helicorhoidion irregulare）、ヘンデルソニア（Hendersonia）種、マリアンネ（Mariannaea）種、ミクロスフェロプシス（Microsphaeropsis）種、ラムラリア（Ramularia）種、ザルコポジウム（Sarcopodium）種、スパジコイデス（Spadicoides）株、スペイロプシス・ペダトスポラ（Speiropsis pedatospora）、スポロトリチャム・エキシレ（Sporotrichum exile）、スチルベラ（Stilbella）種、トリコセシウム（Trichothecium）種、トリマトストロマ・アビエテス（Trimmatostroma abietes）、ツバキア・ドリーナ（Tubakia dryina）、ヴィースネリオミセス（Wiesneriomyces）種及びチゴスポリウム・マソニ（Zygosporium masonii）である。
好ましい細菌
他の面では、本発明は細菌の培養によって生産し得る新規なXET調製物に関する。
好ましい細菌はグラム陰性またはグラム陽性である。
XET−生産グラム陽性菌の例は、バシラスに属する菌株である。
好ましい菌株
次の菌株はXET陽性であることが見い出された。
１．ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ．菌株のAcc番号：CBS 164.61.
分類：接合菌門ケカビ目イトエダカビ科（Chaetocladiaceae）
２．アクチノムコル・エレガンス．菌株のAcc番号の例：CBS 154.86.
分類：接合菌門ケカビ目イトエダカビ科
３．ムコル・ミエヘイ微小変異体．菌株のAcc番号：ATCC 36018.
分類：接合菌門ケカビ目ムコラセ科（Mucoraceae）
４．ゴンクロネラ・ブトレリ．ゴングロネラ・ブトレリの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に、受託番号．CBS 448.97として寄託された。
分類：接合菌門ケカビ目イトエダカビ科
５．スポロジニエラ・ウムベラタ．菌株のAcc番号：CBS 195.77.
分類：接合菌門ケカビ目ムコラセ
６．フィロスチクタ種．中国のピテコロビウム（Pithecolobium）種の葉から単離された。分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目ミコスファレラセ科
７．セプトリア（Septoria）種．セプトリア種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1996年１月２日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 831.95として寄託された。
分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目ミコスファレラセ科
８．ジプロジア・ゴシッピナ．ジプロジア・ゴシッピナの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1996年３月12日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 274.96として寄託された。
分類：子嚢菌門小房子嚢菌クロイボタケ目ボトリスフェリアセ（Botrysphaeriaceae）
９．プロウリフチア・リベシア．デンマークのリベス（Ribes）種から単離した。分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目ドチオラセ（Dothioraceae）
10．ツベウフィア・アマゾネンシス．菌株のAcc番号：ATCC 42524
分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目ツベウフィアセ
11．アルタナリア種．分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目プレオスポラセ（Pleosporaceae）
12．エムベリシア・ヒアシンシ．種のAcc番号：IMI 211561.分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目プレオスポラセ
13．フォマ・ネオロバ．分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目プレオスポラセ
14．フォマ・トロピカ．種のAcc番号の例CBS 537.66.分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目プレオスポラセ
15．コニオチリウム種．分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目レプトスフェリアセ（Leptosphaeriaceae）
16．コニオチリウム・オリバセウム．種のAcc番号の例CBS 304.68.分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目レプトスフェリアセ
17．コリオチリウム・ズンキ．分類：子嚢菌門小房子嚢菌綱クロイボタケ目レプトスフェリアセ
18．チアロスポレラ・ファセオリナ．チアロスポレラ・ファセオリナ（Macrophomina種）の菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 446.97として寄託された。分類：子嚢菌門盤菌綱リチスマタレス目リチスマタセ（Rhytismataceae）
19．チアロスポレラ種．分類：子嚢菌門盤菌綱リチスマタレス目リチスマタセ
20．ガリエラ・セレビカ．日本で収集された標本から単離した。分類：子嚢菌門盤菌綱ペチザレス目ザルコソマタセ（Sarcosomataceae）
21．シュードプレクタニア・ニグレラ．シュードプレクタニア・ニグレラの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 444.97として寄託された。分類：子嚢菌門盤菌綱ペチザレス目ザルコソマタセ
22．ピロネマ・ドメスチクム．ノルウェーからの標本から単離された。分類：子嚢菌門盤菌綱ペチザレス目ピロネマタセ（Pyronemataceae）
23．オエドセファルム種．分類：子嚢菌門盤菌綱ペチザレス目アスコポラセ（Ascobolaceae）
24．ボトリチス・シネレア．ボトリチス・シネレアの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 447.97として寄託された。分類：子嚢菌門盤菌綱レチオチアレス目スクレロチニアセ
25．アポスファエリア種．分類：子嚢菌門盤菌綱レチオチアレス目スクレロチニアセ
26．ペスタロチア（Pestalotia）種．ペスタロチア種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 445.97として寄託された。分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目アムフィスファエリアセ
27．ペスタロチオプシス種．分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目アムフィスファエリアセ
28．ポロニア・プンクタタ（Poronia punctata）．スエーデンからの標本から単離された。分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目キシラリアセ
29．キシラリア種．ジャマイカのモナで成長している、シュロであるザバル・ジャマイセンシス（Sabal jamaicensis）の葉から単離された。分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目キシラリアセ
30．ノズリスポリウム種．分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目キシラリアセ
31．フザリウム・ソラニ．インドのメイズの穀粒の標本から単離された。分類：子嚢菌門核菌綱ヒポクレアレス目ヒポクレアセ（Hypocreaceae）
32．バーチシリウム種．バーチシリウム種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1996年１月２日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 830.95として寄託された。分類：子嚢菌門核菌綱ヒポクレアレス目ヒポクレアセ
33．ボルテラ・ブキシ．菌株のAcc番号IMI 049467.分類：子嚢菌門核菌綱ヒポクレアレス目ヒポクレアセ
34．ケタピオスポラ・ロドデンドリ．分類：子嚢菌門核菌綱キシラリアレス目キシアリアセ種、ヒポネクトリアセ（Hyponectriaceae）
35．ルルボルシア・ウニセプタタ．ルルボルシア・ウニセプタタの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 442.97として寄託された。分類：子嚢菌門核菌綱ハロスファエリアレス目ハロスファエリアセ
36．コレトトリチャム・アキュラツム．分類：子嚢菌門核菌綱フィラコラレス（Phyllachorales）目フィラコラセ
37．コレトトリチャム・クラッシペス．分類：子嚢菌門核菌綱フィラコラレス目フィラコラセ
38．シトスポラ種．シトスポラ種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託に関する国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月23日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 424.97として寄託された。分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目バルサセ
39．シトスポラ種．シトスポラ種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託に関する国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月23日にCentraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 425.97として寄託された。分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目バルサセ
40．ジスキュラ種．分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目バルサセ
41．フォモプシス・イリシス．分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目バルサセ
42．フォモプシス・シルシ．分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目バルサセ
43．コリネウム・カスタネイコラ（castaneicola）．分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目メランコニダセ（Melanconidaceae）
44．セイマトスポリウム・リヘニコラ．分類：子嚢菌門核菌綱ジアポルタレス目メランコニダセ
45．アスペルギルス・タマリ．菌株のAcc番号の例：CBS 821.72.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
46．ユーロチウム・ケバリエリ．菌株のAcc番号の例：CBS 472.91.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
47．ペニシリウム・カプスラツム．菌株のAcc番号の例：CBS 273.86.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
48．ペニシリウム・オルソニ．菌株のAcc番号の例：CBS 523.89.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
49．ペニシリウム・ピノフィルム．菌株のAcc番号の例：CBS 440.89.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
50．ペニシリウム・ロケホルチ．菌株のAcc番号の例：CBS 167.91.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
51．ペニシリウム・イタリクム．菌株のAcc番号の例：IMI 078 681.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
52．ペニシリウム・カネセンス．菌株のAcc番号の例：CBS 579.70.エジプトの塩鉱山（salt mine）から単離された。分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
53．ユーペニシリウム・ジャバニクム．菌株のAcc番号の例：CBS 448.74.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
54．ペニシリウム・バールキュロスム．菌株のAcc番号の例：CBS 563.92.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
55．タラロミケス・フラブス．菌株のAcc番号：ATCC 52201.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
56．ペトロミケス・アリアセウス．菌株のAcc番号：CBS 511.69.分類：子嚢菌門プレクトミケス綱ユーロチアレス目トリココマタセ
57．トラメテス・ヒルスタ．デンマークで収集された標本から単離された。分類：担子菌門帽菌綱コリオラレス目コリオラセ
58．スエヒロタケ種．スエヒロタケ種の菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年１月28日に、Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）に受託番号CBS 443.97として寄託された。分類：担子菌門帽菌綱シゾフィラレス目シゾフィラセ
59．コルチシウム・ロセウム．デンマークで収集された標本から単離された。分類：担子菌門帽菌綱アレウロジスカレス（Aleurodiscales）コルチアセ（Cortiaceae）
60．ツブリクリニス・スブラツス．デンマークで収集した標本から単離された。分類：担子菌門帽菌綱キセナスマタレス目ツブリクリナセ（Tublicrinaceae）
61．ステレウム・ヒルスツム．デンマークで収集した標本から単離された。分類：担子菌門帽菌綱ステレアレス目ストレアセ
62．アクロドンチウム・クラテリホルメ．分類：栄養胞子真菌
63．アウレオバシジウム・プルランス．分類：栄養胞子真菌
64．キルキノトリチャム種．分類：栄養胞子真菌
65．クリプトクライン種．分類：栄養胞子真菌
66．エリシオプシス種．分類：栄養胞子真菌
67．エピコクム・ニグルム．分類：栄養胞子真菌
68．グリオクラジウム種．分類：栄養胞子真菌
69．ヘリコロイジオン・イレグラレ．分類：栄養胞子真菌
70．ヘンデルソニア種．分類：栄養胞子真菌
71．マリアンネ種．分類：栄養胞子真菌
72．ミクロス・フェロプシス種．分類：栄養胞子真菌
73．ラムラリア種．分類：栄養胞子真菌
74．ザルコポジウム種．分類：栄養胞子真菌
75．スパジコイデス株．菌株のAcc番号IMI 203428.分類：栄養胞子真菌
76．スペイロプシス・ペダトスポラ．分類：栄養胞子真菌
77．スポロトリチャム・エキシレ．菌株のAcc番号：350.47.分類：栄養胞子真菌
78．スチルベラ種．分類：栄養胞子真菌
79．トリコセシウム種．分類：栄養胞子真菌
80．トリマトストロマ・アビエテス．分類：栄養胞子真菌
81．ツバキア・ドリーナ．分類：栄養胞子真菌
82．ヴィースネリオミセス種．分類：栄養胞子真菌
83．チゴスポリウム・マソニ．分類：栄養胞子真菌
84．ビアラエ・インスキュルプタ（Vialaea insculpta）．分類：未定
85．バシラス・アルカロフィルス．バシラス・アルカロフィルスの菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により、1997年２月12日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに、受託番号DSM 11404として寄託された。
XETの生産
本発明のXET酵素は、適切な炭素源と窒素源を含有する栄養培地（このような培地は当業界で既知である）上での上記の微生物菌株の好気培養により生産し得る。
代りに、本発明のXET酵素を、たとえば、上述の菌株の１つからの適当な遺伝情報を含有する形質転換宿主生物体の好気培養により生産し得る。したがって、本発明は、キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ酵素（XET）の生産方法であって、
（ａ）XET酵素の生産を助成する条件下で、微生物のXETを発現する形質転換宿主微生物を適切な栄養培地中で培養し、
（ｂ）その後、前記栄養培地から前記XET酵素を回収することを含む、方法にも関する。
前記形質転換体は、当業界で既知の方法により調製及び培養できる。
XETをコードするDNA配列のクローン化
本発明のXET酵素をコードするDNA配列は、当業界で周知の種々の方法を用いて、当該XETを生産するあらゆる微生物から単離することができる。
まず、研究すべきXETを生産する生物体からの染色体DNAまたはメッセンジャーRNAを用いて、ゲノムDNA及び／またはcDNAライブラリーを構築しなければならない。次に、XETのアミノ酸配列が既知であるなら、相同の標識化オリゴヌクレオチドのプローブを合成し、当該生物体から調製したゲノムライブラリーまたはcDNAからXETをコードするクローンを同定するのに用いることができる。代りに、既知のXET遺伝子に相同な配列を含有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを、低ストリンジェントのハイブリダイズ及び洗浄条件を用いて、XETをコードするクローンを同定するためのプローブとして用いることができる。
さらにXETをコードするクローンを同定するための他の方法は、発現ベクター、たとえば、プラスミドへのゲノムDNAまたはcDNAの断片の挿入、得られるDNAライブラリーを用いるXET−陰性宿主生物体の形質転換、次いで形質転換細胞の寒天皿上への塗布及び上記アッセイを用いることによるXETを発現するクローンを同定させることを包含するだろう。
代りに、酵素をコードするDNA配列を、確立された標準的方法、たとえば、エス．エル．ボカージュ（S.L.Beaucage）及びエム．エイチ．カルーサーズ（M.H.Caruthers）により、「Tetrahedron Letters」22（1981）、第1859〜1869頁に記載されたホスホアミダイト法またはマッテス（Matteths）等により「The EMBO J.」３（1984）、第801〜805頁に記載された方法により合成で製造することができる。ホスホアミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、たとえば、自動DNA合成機中で合成され、精製され、アニールされ、結合され適当なベクター中にクローン化される。
最後に、DNA配列は、標準的な技術に従って（全DNA配列の種々な部分に相当する適切な断片として）合成、ゲノムまたはcDNA起原の断片を結合することにより調製された、混合ゲノム及び合成起原、混合合成及びcDNA起原または混合ゲノム及びcDNA起原であってよい。DNA配列は、例えば、米国特許4,683,202号またはアール．ケー．サイキ（R.K.Saiki）等の「Science」239（1988）第487〜491頁に記載されたように、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により調製することもできる。
XETの発現
本発明にしたがって、上記方法または当業界で既知任意の代替方法により生産したXETをコードするDNA配列は、酵素の形で、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び、任意に、リプレッサー遺伝子または種々の活性化因子遺伝子を包含する発現ベクターを用いて発現させることができる。
本発明のXET酵素をコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクターは、好都合に組換えDNA手順を受けさせることができる任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、ベクターを取り込む宿主細胞に依存するだろう。したがって、ベクターは自己複製ベクター、すなわち、染色体外自主独立体として存在するベクターでよく、その複製は、染色体の複製、たとえば、プラスミド、バクテリオファージまたは染色体外要素、ミニクロモソームまたは人工染色体には依存しない。代りに、ベクターは、宿主細胞に取り込まれたときに、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体といっしょに複製されるものであってもよい。
ベクターにおいて、DNA配列は適切なプロモーター配列と操作可能に結合しなければならない。プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるDNA配列でよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。本発明のXETを、特に細菌の宿主中で、コードするDNA配列の転写を指令するために適切なプロモーターの例は、大腸菌のlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（coelicolor）のアガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バシラス・リケニホルミス（licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バシラス・ステアロテルモフィラス（stearothermophilus）のマルトゲン（maltogenic）アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バシラス・アミロリケファシエンス（Amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バシラス・ズブチリスのxylA及びxylB遺伝子等のプロモーターである。真菌における転写について、有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエのTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパルチンプロテイナーゼ、Ａ．ニガー（niger）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼ、Ａ．オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザエのトリオースホスフェート  イソメラーゼまたはＡ．ニズランス（nidulans）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。
本発明の発現ベクターは、適切な転写ターミネーター及び真核生物においては、本発明のXET酵素をコードするDNA配列に操作可能に結合したポリアデニル化配列も含んでもよい。終結及びアデニル化配列は適切にはプロモーターと同じ源から由来することができる。
ベクターはさらに、当該宿主細胞中でベクターの複製を可能とするDNA配列を含んでもよい。上記配列の例はプラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1及びpIJ702の複製の開始点である。
ベクターは選択可能なマーカー、たとえば、その遺伝子産物が宿主細胞における欠損を補足する遺伝子、たとえば、Ｂ．ズブチリスもしくはＢ．リケニホルミスからのdal遺伝子、または抗生物質耐性、たとえば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性またはテトラサイクリン耐性を与える遺伝子も含むことができる。さらに、ベクターはアスペルギルス選択マーカー、たとえば、ヒグロマイシン耐性を起こすマーカーであるamdS, argB, niaD及びsCを含むことができるか、または選択は、たとえば、WO 91／17243号に記載したような共形質転換、によって達成することもできる。
細胞内発現が、いくつかの点で、たとえば、特定の細菌を宿主細胞として用いる時に、有利であるが、発現が細胞外であることが一般に好ましい。
XET酵素をコードし、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をそれぞれ含有する本発明のベクターを構築するのに適切な手順は当業者に周知である（たとえば、Sambrook等の「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第２版、Cold Spring Harbor、1989年参照）。
上に定義した本発明のDNA構築体または発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、本発明のXETの組換え生産における宿主細胞として有利に用いられる。XETをコードする本発明のDNA構築体を、宿主の染色体にそのDNA構築体（１以上のコピーで）を組み込むことにより好都合に形質転換することができる。この組込みは一般に、DNA配列が細胞中により安定に維持されるようであるので有利であると考えられている。宿主の染色体へのDNA構築体の組込みは通常の方法、たとえば、同種または異種組換えにより実施し得る。代りに、異なった型の宿主細胞に関して、細胞を上記の発現ベクターで形質転換できる。
本発明の細胞は、高級生物体、たとえば、哺乳動物または昆虫の細胞でもよいが、好ましくは微生物の細胞、たとえば、細菌または真菌（酵母を含む）細胞である。
適切な細菌の例は、グラム陽性菌、たとえば、バシラス・ズブチリス、バシラス・リケニホルミス（licheniformis）、バシラス・レンツス（lentus）、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロテルモフィルス、バシラス・アルカロフィルス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・コアグランス（coagulans）、バシラス・サーキュランス（circulans）、バシラス・ラウツス（lautus）、バシラス・メガテリウム（megaterium）、バシラス・スリンギエンシス（thuringiensis）もしくはストレプトミセス・リビダンス（lividans）もしくはストレプトミセス・ムリヌス（murinus）またはグラム陰性菌、たとえば、大腸菌である。細菌の形質転換は、たとえば、プロトプラスト形質転換によるか、または自体公知なやり方でコンピテント細胞を用いて行なわれる。
酵母生物体は好ましくはサッカロミセスまたはシゾサッカロミセスの種から選択され、たとえば、サッカロミセス・セレビシエである。糸状菌は有利には、アスペルギルスの種に属し、たとえば、アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・ニガーである。真菌細胞は、自体公知方法で、プロトプラストの形成及びプロトプロストの形質転換、その後の細胞壁の再生を包含する過程により形質転換される。アスペルギルス宿主細胞の形質転換の適切な手順は欧州特許第238023号に記載されている。
さらに他の観点では、本発明は本発明のXET酵素を生産する方法に関し、その方法は、上記の宿主細胞をXETの生産を助成する条件下に培養し、細胞及び／または培地からXETを回収することを含む。
細胞を培養するのに用いられる培地は、当該宿主細胞を増殖させ、本発明のXETの発現を得るのに適切な任意の好都合な培地でよい。適切な培地は商業的な供給者から得ることができるか、または、公表された処方（たとえば、American Type Culture Collectionのカタログに記載されているような）に従って製造することができる。
宿主細胞から分泌されたXETは、遠心またはろ過により培地から細胞を分離し、塩、たとえば、硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分を沈澱させ、その後クロマトグラフィー手順、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を用いることを含む、周知の手順により培地から好都合に回収することができる。
工業用途
本発明に従って、XET酵素の処理後、セルロース材料は強度特性及び／または形状維持特性及び／または耐しわより性が改善される。XET酵素は、キシログルカン分子を再配置及び結合する能力を有し、キシログルカン分子はセルロース繊維に水素結合し、それにより上述の特性が達成される。
XET酵素の効果を促進するために、ある場合には、セルロース材料にキシログルカンを加え、それにより、酵素がもっとセルロース材料と結合できるようにすることが有利かもしれない。
XET酵素を用いるセルロース材料の処理は水中で行うことができるか、または特定の成分、たとえば、緩衝液及び／または湿潤剤及び／または安定剤及び／またはポリマー及び／または水の活性を低下させる有機成分、たとえば、DMSOの存在で水中で行うことができる。
緩衝液は適切には、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、アジピン酸塩、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、炭酸塩（特にアルカリ金属もしくはアルカリ土金属、特に炭酸ナトリウムもしくはカリウムまたはアンモニウム及びHCl塩）、ジアミン、特にジアミノエタン、イミダゾール、Trisまたはアミノ酸緩衝液である。
湿潤剤はセルロース材料の湿潤性を改善するのに役立つ。湿潤剤は好ましくは非イオン界面活性剤型である。
安定剤はXET酵素を安定化する薬剤である。
本発明によると、水性培地中のXETの濃度は、１ｇのセルロース材料当り0.01〜1000μｇの酵素タンパク質、好ましくは１ｇのセルロース材料当り0.05〜100μｇの酵素タンパク質でよい。
一般に（セルロース材料とXET酵素を含有する）反応培地を少なくとも数分間インキュベートすることが適当であろう。１分〜20時間のインキュベート時間が一般的に適切であり、特に30分〜10時間のインキュベート時間が、しばしば、好ましいだろう。
本発明の過程における反応培地の温度は、当該XET酵素に適当なように、10〜90℃の範囲、特に15〜70℃の範囲が適切である。
本発明をさらに、次の非−限定例で説明する。
例１
陽性XET菌株のスクリーニング
培地
PD寒天：39ｇのジャガイモデキストロース寒天、DIFCO 0013、1000mlまで脱イオン水を加え、121℃で15〜20分でオートクレーブ処理。
YPG寒天：４ｇの酵母抽出物（DIFCO 0127）、
１ｇのKH2PO4（Merck 4873）、
0.5gのMgSO4・7H2O（Merck 5886）、
15ｇのデキストロース（Roquette 101-0441）、
20ｇの寒天（Merck 1614）、
脱イオン水1000mlまで、
121℃15〜20分のオートクレーブ処理。
MEA：20ｇの麦芽抽出物粉末（Difco 0186）、
１ｇのグルコース（Roquette France 1010441）、
20ｇの寒天（Merck 1614）、
脱イオン水1000mlまで、
121℃で15分のオートクレーブ処理。
培地Ａ  フラスコ当り：30ｇの小麦のぬか、45mlの次の溶液：10ｇのロフェク（rofec）（Roquette 101-0441）、10ｇのNH4NO3（Merck 1187）、10ｇのKH2PO4（Merck 4873）、40ｇのSolcafloc（ベルギー国Gent 9000のDicalite-Europe-Nordから得られるDicacel）、0.75ｇのMgSO4・7H2O（Merck 5886）、15ｇのCaCO3、水道水で1000mlに、pH 6.5に調整。121℃で40分間オートクレーブ処理。
培地Ｂ  20ｇの大豆ひき割り粉、５ｇのマルトデックス01（Roquette 101-7845）、15ｇの小麦のふすま、３ｇのペプトン（Difco 0118）、10ｇのセルロースアビセル（avicel）（Merck 2331）、0.2mlのプルローニック（PE-6100, 101-3068）、１ｇのオリーブ油、1000mlまでの脱イオン水。２枚のじゃま板つき500mlエルレンマイヤーフラスコ中で100ml。121℃で40分間オートクレーブ処理。
培地Ｃ  100ｇのスクロース、40ｇの大豆ひき割り粉、10ｇのNa2HPO4・12H2O（Merck 6579）、0.1mlのプルローニック（PE 6100）、水道水1000mlまで。100mlの培地を有する２枚のじゃま板つきエルレンマイヤーフラスコの中0.5ｇのCaCO3。121℃で40分間のオートクレーブ処理。使用する直前に、100mlの培地当り10mlの１ＭのNaHCO3、pH９を加える。
発酵手順
ペトリ皿（９cm）中の寒天またはPDA, YPGもしくはMEA（培地のリスト参照）を有するスラント上に、真菌の株を維持した。１つの寒天スラントを10mlの滅菌水で洗い流し、３mlを１つの振とうフラスコに接種するのに用いた。
次の増殖条件下で、振とうフラスコ中で真菌の株を増殖させた。
培地：Ａ及びＢ（培地のリスト参照）
温度：26℃
RPM：Ａ：静置
Ｂ：125〜200
インキュベート時間：Ａ：６〜30日
Ｂ：２〜21日
細菌の単離物を次のものからなるTY寒天pH９を有するる寒天斜面上に維持した。
20ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、0.7mlのFeCl2・4H2Oの１％溶液、0.1mlのMnCl2・4H2Oの１％溶液、1.5mlのMgSO4・7H2Oの１％溶液、20ｇの寒天及び1000mlまでの脱イオン水。121℃で20分間のオートクレーブ処理。プレートに注ぐ前に、10mlの１ＭのNaHCO3  pH９を100mlの寒天に加える。
スラントを30℃で４日間インキュベートした。１つのスラントを10mlの滅菌水で洗い流し、各フラスコに接種するのに３mlを用いた。
細菌を培地Ｃを含有する振とうフラスコ中で、30℃で４日間、300rpmで増殖させた。
活性試験
Ｂ及びＣで生産した培養ブイヨンを10,000rpmで10分間遠心した。上清をXET活性について試験した。
200mlの水道水を、小麦のふすま及び完全に増殖した培養を有する各フラスコに加え、200rpmで２時間振とうした。培養ブイヨンを次に遠心し、上清をXETについて試験した。
XET分析
上記の「ドット−ブロット」アッセイを用いて、標本を分析した。
結果
上記方法を用いて、１つのバシラス種及び数個の異なった分類学上の群に属する真菌が陽性であることが分かった。結果を下表に示す。
バシラス・アルカロフィルスは培地Ｃ  pH９（培地のリスト参照）で30℃、300rpmで４日間増殖した時に陽性であった。
0004472787.tif 000003
0004472787.tif 000004
0004472787.tif 000005
0004472787.tif 000006
例２
ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイのXETの精製と特徴づけ
15のPDA寒天斜面にジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ（CBS 164.61）を接種し、26℃で７日間インキュベートした。それらを0.1％のTween 80を有する約250mlの滅菌蒸留水で洗い流し、培地Ｂ（２〜３ml／フラスコ）を含有する80個の振とうフラスコに接種するのに用いた。フラスコを200rpm、26℃で５日間振とうした。その時間の後、培養ブイヨンを4000rpmで15分間遠心した。
キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ（XET）を含有する上清を次の方法を用いて精製した。
ろ過助剤を培養ブイヨンに加え、ろ布を通してろ過した。この溶液をさらにザイツ深さろ過プレートを通してろ過し、透明な溶液を得た。ろ液のpHをpH 8.0に調整し、ろ液を脱イオン水で希釈して、20mM Tris／HCl、pH 8.0と同じ導電率とした。
XET酵素を20mM Tris／HCl、pH 8.0中で平衡化したＱ−セファロースFFカラムに適用し、酵素を増加する直線NaClグラジエント（０→0.5Ｍ）で溶出した。XET活性は１つのピークとして溶出した。プールしたXETをセファデックスＧ25カラム上の20mM Tris／HCl、pH 8.0に移動し、20mM Tris／HCl、pH 8.0中で平衡化したＱ−セファロースFFカラム上で再クロマトグラフした。カラムを増加する直線NaClグラジエント（０→0.2Ｍ）を用いて溶出した。XETを含有する分画をプールし、（NH4）2SO4を加えて、1.4Ｍの最終濃度にした。フェニル  トヨパール（Phenyl Toyopearl）650Sカラムを1.4Ｍの（NH4）2SO4、10mM  コハク酸、pH 7.0中で平衡化し、このカラムにXET酵素を適用し、減少する直線（NH4）2SO4グラジエント（1.4→０Ｍ）で溶出した。XETを含有する分画をプールし、10kDaカット−オフ再生セルロース膜を用いて限外ろ過セルで濃縮した。濃縮された酵素を100mM H3BO3、10mM  ジメチルグルタル酸、２mM CaCl2、pH 7.0中で平衡化したスーパーデックス（Superdex）200サイズ排除カラムに適用した。スーパーデックス200カラムから溶出した分画をSDS-PAGEにより分析し、純粋なXET分画をプールした。
ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイXETはＭr＝24kDaのバンドとしてSDS-PAGE上を移動する。24kDa成分のＮ−末端アミノ酸配列決定をSDS-PAGE及びPVDF膜上の電気ブロットの後で行なった。次のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号１）が、推測できるだろう。
Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.
本発明は配列番号１に示されたアミノ酸配列を含む微生物のXET酵素または配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも80％相同、好ましくは配列番号１と少なくとも85％相同、より好ましくは配列番号１と少なくとも90％相同、さらにより好ましくは配列番号１と少なくとも95％相同、特に配列番号１と少なくとも98％相同であるXETにも関する。
既知のアルゴリズム、たとえば、リプマン及びパーソンにより「Science」227（1985）第1435頁に記載されたもので実施され、それぞれのアミノ酸配列の比較がＸ％の同一性を示すなら、ポリペプチドは親のXETにＸ％相同であると考えられる。
さらに、ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイXETの質量分析は23006Daの値を示した。
例３
チアロスポレラ・ファセオリナ（Tiarosporella phaseolina）XETの精製と特徴づけ
15のPDA寒天斜面にチアロスポレラ・ファセオリナ（CBS 446.97）を接種し、26℃で７日間インキュベートした。それらを0.1％のTween 80を有する約250mlの滅菌蒸留水で洗い流し、培地Ｂ（２〜３ml／フラスコ）を含有する80個の振とうフラスコに接種するのに用いた。フラスコを200rpm、26℃で７日間振とうした。その時間の後、培養ブイヨンを4000rpmで15分間遠心した。
キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ（XET）を含有する上清を次の方法を用いて精製した。
ろ過助剤を培養ブイヨンに加え、ろ布を通してろ過した。この溶液をさらにザイツ深さろ過プレートを通してろ過し、透明な溶液を得た。ろ液を３kDaカット−オフポリエーテルスルホン膜での限外ろ過により濃縮し、次いで蒸留水でダイアルフィルトレートして、導電率を低下させた。濃縮された酵素のpHを5.0に調整した。濃縮された酵素の導電率は1.7mS／cmであった。
XET酵素を20mM CH3COOH／NaOH、pH 5.0中で平衡化したＱ−セファロースFFカラムに適用し、酵素を増加する直線NaClグラジエント（０→0.5Ｍ）で溶出した。XET活性は１つのピークとして溶出した。プールしたXETを透析により20mM CH3COOH／NaOH、pH 4.0に移した。透析した酵素を20mM CH3COOH／NaOH、pH 4.0中で平衡化したSOURCE 30Sカラムに適用した。カラムの洗浄後、XET活性を増加する直線NaClグラジエント（０→0.5Ｍ）を用いて溶出した。XET活性を有する分画をプールし、20mM Tris／HCl、pH 8.0に対して透析した。透析された酵素を20mM Tris／HCl、pH 8.0中で平衡化したSOURCE 30Qカラムに適用した。カラムの洗浄後、XET活性を増加する直線NaClグラジエント（０→0.5Ｍ）で溶出した。XET活性を有する分画をプールし、10kDaカット−オフ再生セルロース膜を用いて限外ろ過セルで濃縮した。濃縮された酵素を100mM H3BO3、10mM  ジメチルグルタル酸、２mM CaCl2、pH 7.0中で平衡化したスーパーデックス200サイズ排除カラムに適用した。スーパーデックス200カラムから溶出された分画をSDS-PAGEにより分析し、純粋なXET分画をプールした。
チアロスポレラ・ファセオリナXETはＭr＝24kDaのバンドとしてSDS-PAGE上を移動する。24kDa成分のＮ−末端アミノ酸配列決定をSDS-PAGE及びPVDF膜上の電気ブロットの後で行なった。次のＮ−末端アミノ酸配列（配列番号２）が、推測できるだろう。
Xaa-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-Val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys
本発明は配列番号２に示されたアミノ酸配列を含む微生物のXET酵素または配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも80％相同、好ましくは配列番号２と少なくとも85％相同、より好ましくは配列番号２と少なくとも90％相同、さらにより好ましくは配列番号２と少なくとも95％相同、特に配列番号２と少なくとも98％相同であるXETにも関する。
既知のアルゴリズム、たとえば、リプマン及びパーソンにより「Science」227（1985）第1435頁に記載されたもので実施され、それぞれのアミノ酸配列の比較がＸ％の同一性を示すなら、ポリペプチドは親のXETにＸ％相同であると考えられる。
例４
シュードプレクタニア・ニグレラXETの精製と特徴づけ
15のPDA寒天斜面にシュードプレクタニア・ニグレラ（CBS 444.97）を接種し、26℃で７日間インキュベートした。それらを0.1％のTween 80を有する約250mlの滅菌蒸留水で洗い流し、培地Ｂ（２〜３ml／フラスコ）を含有する80個の振とうフラスコに接種するのに用いた。フラスコを200rpm、26℃で７日間振とうした。その時間の後、培養ブイヨンを4000rpmで15分間遠心した。
キシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ（XET）を含有する上清を次の方法を用いて精製した。
ろ過助剤を培養ブイヨンに加え、ろ布を通してろ過した。この溶液をさらにザイツ深さろ過プレートを通してろ過し、透明な溶液を得た。ろ液のpHをpH 5.0に調整し、ろ液を脱イオン水で希釈して、20mM CH3COOH／NaOH、pH 5.0と同じ導電率とした。
XET酵素を20mM CH3COOH／NaOH、pH５中で平衡化したＳ−セファロースFFカラムに適用し、酵素を増加する直線NaClグラジエント（０→0.25Ｍ）で溶出した。XET活性は一つのピークとして溶出した。プールしたXETをセファデックスＧ25カラム上に20mM Hepes／NaOH、pH 7.0に移し、20mM Hepes／NaOH、pH 7.0中で平衡化したＱ−セファロースFFカラム上に適用した。カラムを増加する直線NaClグラジエント（０→0.5Ｍ）で溶出した。XET含有分画をプールし、透析により20mM CH3COOH／NaOH、pH 5.0に移した。SOURCE 15Sカラムを20mM CH3COOH／NaOH、pH 5.0で平衡化し、透析した酵素を適用した。カラム洗浄後、XET活性を増加する直線NaClグラジエント（０→0.2Ｍ）で溶出した。XET活性を有する分画をプールし、10kDaカット−オフ再生セルロース膜を用いて限外ろ過セルで濃縮した。濃縮された酵素を20mM CH3COOH、100mM NaCl、pH 5.0中で平衡化したスーパーデックス200サイズ排除カラムに適用した。スーパーデックス200カラムから溶出された分画をSDS-PAGEにより分析し、純粋なXET分画をプールした。
シュードプレクタニア・ニグレラXETはＭr＝58kDaのバンドとしてSDS-PAGE上を移動する。SDS-PAGE及びPVDF膜上の電気ブロットの後に、58kDaの成分はブロックされたＮ−末端を有していることが分かった。
シュードプレクタニア・ニグレラXETの高度に精製された調製物を還元及びアルキル化した。次に、酵素の標本をLys-Cで分解した。ペプチドをTFA／ANを用いて、SMARTシステムにおいて、長いVydac C18上のRP-HPLCにより単離し、TFA／イソプロパノール中で再精製した。選択されたペプチドをエドマン分解により分析した。
表１において、８ペプチドから得られた配列を示す。２つのペプチドはグルカナーゼ様酵素及びキシラナーゼ様酵素と相同であることが分かったが、大部分は、既知の配列と全く相同性がないかまたは無関係な相同性を示しただけであった。
0004472787.tif 000007
例５
ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ、チアロスポレラ・ファセオリナ及びシュードプレクタニアニグレラXET及びキシログルカナーゼのpHプロフィール
ジコトモクラジウム・ヘッセルチネイ、チアロスポレラ・ファセオリナ及びシュードプレクタニアニグレラのキシログルカン  エンドトランスグルカナーゼをそれらのpHプロフィールについてチェックした。純粋な酵素を緩衝液中でpH 3.0〜11.0の範囲に希釈して、最終希釈におけるタンパク質濃度が同じ、すなわちＡ280＝0.004とした。次いで標本をXET−ドット−ブロットアッセイ（前に記載した）を用いてXETについて分析した。蛍光点を視覚で判断し、０〜10に等級をつけた。したがって、図１に用いた単位は独断的な単位である。
図１から、XETはpH３〜pH11、特にpH４〜pH９の間で活性であることが分かる。
XET活性を有するすべての単離物をキシログルカナーゼ活性についても試験した。２つの酵素の間の割合は単離体から単離体に変化する。酵素をXET pHプロフィール活性のためのと同じ緩衝液で最終タンパク質濃度が同じとなるまで希釈し、キシログルカナーゼ活性を分析した。AZCLキシログルカンを用いた。用いられたキシログルカナーゼ方法は次のとおりである。
基質：脱ミネラル水中に懸濁した0.4％  AZCL−キシログルカン
緩衝液：100mM H3BO3、10mM  ジメチルグルタル酸、２mM CaCl2、pH７
分析：
−エッペンドルフ熱混合機（thermomixer）に40℃でスイッチを入れる。
−500μｌの0.4％  AZCL−キシログルカンと500μｌの緩衝液を混合し、氷の上に置く。
−20μｌの酵素を加え、適切な色に達するまで、エッペンドルフ熱混合機中でインキュベートする。
−標本を０℃で遠心すると同時に、さらなる反応を防止するため標本を氷浴に戻す。
−200μｌの標本をミクロタイタープレートに移し、青色を650nmで測定する。
結果を図２に示す。
例６
チアロスポレラ・ファセオリナCBS番号446.97からのキシログルカン  エンドトランスグリコシラーゼ酵素（XET）のクローン化及び発現
寄託された生物体：
チアロスポレラ・ファセオリナCBS番号446.97
他の菌株：
酵母菌株：用いられたサッカロミセス・セレビシエはW3124〔van den Hazel, H.B; Kielland-Brandt, M.C., ; Winther, J.R「J.Biochem.」207, p.277〜283, 1992（MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prb1::LEU2; cir+）〕であった。
大腸菌株：DH10B（Life Technologies）
プラスミド：
アスペルギルス発現ベクターpHD414はプラスミドp775の誘導体である（欧州特許第238 023号に記載されている）。pHD414の構築はさらにWO 93／11249号に記載されている。
pYES 2.0（Invitrogen）
培地：
YPD：
10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、H2Oで900ml。オートクレーブ処理。100mlの20％グルコース（滅菌ろ過された）を加える。
YPM：
10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、H2Oで900ml。オートクレーブ処理。100mlの20％マルトデキストリン（滅菌ろ過された）を加える。
10×基本塩：
75ｇの酵母窒素塩基、113ｇのコハク酸、68ｇのNaOH, H2Oを加えて1000mlにして、滅菌ろ過する。
SC-URA：
100mlの10×基本塩、28mlのビタミンを含まない、20％のカザミノ酸、10mlの１％トリプトファン、H2Oを加えて、900mlにする。オートクレーブ処理。3.6mlの５％トレオニン及び100mlの20％グルコースまたは20％ガラクトースを加える。
SC−寒天：
SC-URR、20ｇ／ｌ寒天を加える。
AZCLキシログルカン（Megazyme、オーストラリア）
酵母における発現クローン化
酵母における発現クローン化をエイチ．ダルボージェ等により記載されたように（H.Dalboege等「Mol.Gen.Genet」（1994）243: 253-260; WO 93／11249; WO 94／14953、これらを本明細書に参考として組み入れる）行った。総RNAの抽出のすべての個々の工程、cDNA合成、ムング豆（Mung bean）ヌクレアーゼ処理、T4 DNAポリメラーゼを有するブラント末端化及びライブラリーの構築は上記参考文献に従って行なった。
mRNA単離のためのチアロスポレラ・ファセオリナCBS番号446.97の発酵手順：
増殖した菌糸体を有するプレートから、チアロスポレラ・ファセオリナCBS番号446.97を100mlの培地Ｂ（培地参照）を含有する振とうフラスコに接種した。培養を26℃及び200rpmで７日間インキュベートした。得られた培養ブイヨンをミラクロス（miracloth）でろ過し、菌糸体を液体窒素中に凍結して落下させた。
（H.Daboege等「Mol.Gen.Genet」（1994）243: 253-260; WO 93／11249; WO 94／14953）に記載されているように、この培養からの菌糸体からmRNAを単離した。
総RNAの抽出をチオシアン酸グアニジン、その後の5.7Ｍ CsClクッションを通す限外ろ過で行ない、ポリ（A）+ RNAの単離をWO 94／14953号に記載された手順を用いて、オリゴ（dT）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーで行なった。
cDNA合成：
RNアーゼH方法〔Gubler及びHoffman（1983）「Gene」25: 263-269, Sambrook等（1989）「Molecular cloning: A laboratory manual」Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY〕により、二本鎖cDNAを５ｇのポリ（A）+ RNAから合成した。ポリ（A）+ RNA（５μｇのDEPC処理水中に５μｇ）を予備シリコン表面処理されたRNアーゼのないエッペンドルフ管中で70℃で８分間加熱し、氷上で失活させ、最終容積の50μｌで、１mMのdATP, dGTP及びdTTP並びに0.5mMの５−メチル−dCTP（Pharmacia）、40単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ  インヒビター（RNasin, Promega）、1.45μｇのオリゴ（dT）18-Not Ｉプライマー（Pharmacia）並びに1000単位のSuper ScriptII RNアーゼH逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories）を含有する、逆転写酵素緩衝液（50mM Tris-Cl、pH 8.3、75mM KCl、３mM MgCl2、10mM DTT、Bethesda Research Laboratories）と組み合せた。第１の鎖cDNAをその反応混合物を45℃で１時間インキュベートすることにより合成した。合成後、mRNA：cDNAハイブリッド混合物を、MicroSpin S-400 HR（Pharmacia）回転カラムを通して、製造者の使用説明書に従って、ゲルろ過した。
ゲルろ過後、200μｌの各dNTP、60単位の大腸菌DNAポリメーラーゼＩ（Pharmacia）、5.25単位のRNアーゼH（Promega）及び15単位の大腸菌DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim）を含有する250μｌの第２鎖緩衝液（20mM Tris-Cl、pH 7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM（NH4）2SO4、0.16mM bNAD+）中で前記ハイブリッドを希釈した。第２鎖cDNA合成を反応管を16℃で２時間、さらに25℃で15分、インキュベートすることにより行った。反応を最終濃度20mMまでEDTAを添加することにより停止し、フェノール抽出及びクロロホルム抽出した。
Mung豆ヌクレアーゼ処理：
２本鎖cDNAを２体積の96％ EtOH、0.2体積の10Ｍ NH4Acの添加により−20℃で12時間沈澱させ、遠心により回収し、70％ EtOHで洗浄し、乾燥させ、25単位のMung豆ヌクレアーゼ（Pharmacia）を含有する30μｌのMung豆ヌクレアーゼ緩衝液（30mM NaAc、pH 4.6、300mM NaCl、１mM ZnSO4、0.35mM DTT、２％グリセロール）中に再懸濁した。１本鎖ヘアピンDNAを反応混合物を30℃で30分間インキュベートすることにより、クリップ留めし、その後、70μｌの10mM Tris-Cl、pH 7.5、１mM EDTAを加え、フェノール抽出し、２体積の96％ EtOH及び0.1体積の３Ｍ NaAc、pH5.2で、氷上で30分間沈澱させた。
T4 DNAポリメラーゼを用いるブラント末端化
２本鎖のcDNAを遠心により回収し、0.5mMの各dNTP及び５単位のT4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含有する30mlのT4 DNAポリメラーゼ緩衝液（20mM Tris-酢酸塩、pH 7.9、10mM MgAc、50mM KAc、１mM DTT）中で、反応混合物を16℃で１時間インキュベートすることによりブラント末端化した。EDTAを20mMの最終濃度まで加えることにより反応を停止させ、その後、フェノール抽出及びクロロホルム抽出し、２体積の96％ EtOHと0.1体積の3Ｍ NaAc、pH 5.2を加えることにより、−20℃で12時間沈澱させた。
アダプター連結反応、Not Ｉ消化及びサイズ選択：
フィルイン反応後、cDNAを遠心で回収し、70％のEtOHで洗浄し、乾燥させた。cDNAのペレットを、2.5μｇの非−回文式のBst XIアダプター（Invitrogen）及び30単位のＴ４リガーゼ（Promega）を含有する、25μｌの連結反応緩衝液（30mM Tris-Cl、pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）中に再懸濁させ、16℃で12時間インキュベートした。65℃で20分間加熱し、次いで、氷上で５分間冷却させることにより反応を停止させた。接着したcDNAを、20μｌの水、５μｌの10×Not Ｉ制限酵素緩衝液（New England Biolabs）及び50単位のNot Ｉ（New England Biolabs）の添加により、Not Ｉ制限酵素で消化し、その後、37℃で2.5時間インキュベートした。反応を65℃で10分間加熱することにより停止した。cDNAを１×TBE中で、0.8％ SeaPlaque GTG低融点アガロースゲル上のゲル電気泳動によりサイズ分画し、連結していないアダプター及び小さいcDNAを分離した。cDNAを0.7kbでのカットオフでサイズ選択し、製造者の使用説明書に従って、b-Agarase（New England Biolabs）を用いることによりゲルから救出し、２体積の96％ EtOHと0.1体積の３Ｍ NaAc、pH 5.2を加えることにより−20℃で12時間沈澱させた。
ライブラリーの構築：
方向性のサイズ選択されたcDNAを遠心により回収し、70％ EtOHで洗浄し、乾燥させ、30μｌの10mM Tris-Cl、pH 7.5、１mM EDTA中に再懸濁した。cDNAを製造者の使用説明書に従って、MicroSpinS-300 HR（Pharmacia）回転カラムを通すゲルろ過により脱塩した。５μｌの２本鎖cDNA（反応管  ＃１及び＃２）、15単位のＴ４リガーゼ（Promega）及び30ng（管  ＃１）、40ng（管  ＃２）及び40ng（管  ＃３、ベクターバックグラウンド対照）のBst XI−Not Ｉ切断pYES 2.0ベクターを含有する、10μｌの連結反応緩衝液（30mM Tris-Cl、pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）中で、３つの試験連結反応を実施した。連結反応を16℃で12時間インキュベートし、70℃で20分間加熱し、各管に10μｌの水を加えることにより行った。１μｌの各連結反応混合物を、（Sambrook等（1989）「Molecular Cloning: A laboratory manual」Cold Spring Harbor lob., Cold Spring Harbor, NY）に記載されているように、40μｌのエレクトロコンピテント大腸菌DH10B細胞にエレクトロポレートした。最適条件を用いて、プールからなる大腸菌にライブラリーを確立した。各プールは、形質転換された大腸菌をLB＋アンピシリン寒天プレート上に分散させ、37℃での24時間のインキュベーション後に15.000〜30.000コロニー／プレートを与えることにより作った。プレートに20mlのLB＋アンピシリンを加え、細胞をこの中に懸濁させた。細胞懸濁液を50ml管中で37℃で１時間振とうしたQIAGENプラスミドキットを用いて、製造者の使用説明書に従って細胞からプラスミドDNAを単離し、−20℃で貯蔵した。個々のプールからの精製プラスミドDNA（100ng／ml）の１μのアリコートをエレクトロポレーション（Becker及びGuarante（1991）「Methods Enzymol.」194: 182-187）によりＳ．セレビシエW3124に形質転換し、形質転換体を２％のグルコースを含有するSC寒天上に塗布し、30℃でインキュベートした。
陽性コロニーの同定：
キシログルカナーゼ陽性コロニーを見つけることにより、コロニーを間接的にXETについてスクリーンした。
３〜５日の増殖後、寒天プレートを、0.1％のAZCLキシログルカンを含有するSC-URA寒天（20％のガラクトース添加）プレートのセット上に、レプリカ塗布した。これらのプレートを30℃で３〜７日間インキュベートした。キシログルカナーゼ陽性コロニーは、青光輪で囲まれたコロニーとして同定した。
酵素陽性コロニーからの細胞を単一のコロニー分離のために寒天上に分散させ、酵素生産単一コロニーを同定されたキシログルカナーゼ生産コロニーの各々について選択した。
すべてのキシログルカナーゼ陽性コロニーをXETについて試験し、陽性であることが分かった。
アスペルギルス中で発現するcDNA遺伝子の単離
XET生産酵母コロニーを50mlガラス試験管中の20mlのYPDブイヨンに接種した。試験管を30℃で２日間振とうした。3000rpmで10分間の遠心により細胞を収集した。
WO 94／14953号に従ってDNAを単離し、50mlの水に溶解した。DNAを標準的手順により大腸菌に形質転換した。標準的手順を用いて、大腸菌からプラスミドDNAを単離し、制限酵素分析により分析した。cDNA挿入断片を制限酵素BamH Ｉ及びXba Ｉを用いて切除し、アスペルギルス発現ベクターpHD414に連結反応させ、プラスミドpA2XG80を得た。
Qiagen精製プラスミドDNAのpA2XG80のcDNA挿入物（Qiagen, USA）を、製造者の使用説明書に従って、Applied Biosystems ABI PRISM（商標）377 DNAシークエンサーを用いて、Taqデオキシ末端循環配列決定キット（Perkin Elmer, USA）及び合成オリゴヌクレオチドプライマーで配列決定した。
アスペルギルス・オリザエまたはアスペルギルス・ニガーの形質転換
WO 95／02043号の第16頁第21行〜第17頁第12行（参照により本明細書に組み入れる）に記載されたようにして、プロトプラストを調製する。
100μｌのプロトプラスト懸濁液を10μｌのSTC（1.2Ｍ  ソルビトール、10mM Tris-HCl、pH＝7.5、10mM CaCl2）中の５〜25μｇの適当なDNAと混合する。プロトプラストとp3SR2（プラスミドを担持するＡ．ニズランスamdS遺伝子）（Tove Christensen等「Bio／Technology」pp.1419-1422, Vol.6、1988年12月）と混合する。混合物を室温で25分間放置する。0.2mlの60％ PEG4000（BDH 29576）、10mM CaCl2及び10mM Tris-HCl、pH 7.5を加え、注意深く混合し（２回）、最後に0.85mlの同じ溶液を加え、注意深く混合する。混合物を室温に25分間放置し、2500ｇで15分間回転させ、そして、ペレットを２mlの1.2Ｍ  ソルビトールに再懸濁する。もう１回の沈降後、プロトプラストをバックグラウンド増殖を阻害するために、1.0Ｍ  スクロース、pH 7.0、窒素源としての10mM  アセトアミド及び20mM CsClを含有する最少プレート〔Cove「Biochem.Biophys.Acta」113（1966）51-56〕上に分散させる。37℃での４〜７日間のインキュベートの後、胞子を取り、単一のコロニーのために分散させる。この手順を繰り返し、２回目の再単離の後、単一のコロニーの胞子を限定された形質転換体として貯蔵する。
Ａ．オリザエ形質転換体の試験
各々のＡ．オリザエ形質転換体を10mlのYPM（下記参照）に接種し、増殖させる。30℃での２〜５日間のインキュベート後、上清を除去する。
先に記載したXETドット−ブロットアッセイを用いることによりXET活性を同定する。
次の配列（配列番号３）が、クローン化に用いたBamH Ｉ及びNot Ｉ認識部位を包含するXG80のpYES 2.0におけるcDNA挿入断片（チアロスポレラ・ファセオリナからのXET）である。
0004472787.tif 000008
次の配列（配列番号４）はXG80のコード領域のアミノ酸配列である。
0004472787.tif 000009
本発明は配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む微生物のXET酵素または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも80％相同、好ましくは配列番号４と少なくとも85％相同、より好ましくは配列番号４と少なくとも90％相同、更により好ましくは配列番号４と少なくとも95％相同、特に配列番号４と少なくとも98％相同であるXETにも関する。
既知のアルゴリズム、たとえば、リップマン及びピアソンにより「Science」227（1985）第1985頁に記載されたもの、で実施され、それぞれのアミノ酸配列の比較がＸ％の同一性を表わすなら、ポリペプチドは親XETにＸ％相同であると考えられる。
クローンCl.XG80を1998年２月24日に受託番号DSM 12032として寄託した。
配列表
（１）一般情報
（iii）配列の数：４
（２）配列番号：１についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：27アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列番号：１：
0004472787.tif 000010
（２）配列番号：２についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：24アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列番号：２：
0004472787.tif 000011
（２）配列番号：３についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：975塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）
（xi）配列番号：３：
0004472787.tif 000012
（２）配列番号：４についての情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：244アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列番号：４：
0004472787.tif 000013
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【図１】
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【図２】
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