(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)に示すタンパク質
(a)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
(b)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつタンパク質変性を抑制する機能を有するタンパク質
(c)配列番号１又は３記載の塩基配列により表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、タンパク質変性を抑制する機能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質を他のタンパク質と共存させ、当該他のタンパク質の変性を抑制することを特徴とするタンパク質の変性抑制法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱などの環境ストレスによって生じるタンパク質の変性を抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は複数のアミノ酸がペプチド結合により連なったポリペプチドである。タンパク質がその特性を発現するためには分子内または分子間の相互作用により形成される特有の三次構造（立体構造）が重要である。一般にタンパク質は熱などの環境的ストレスを加えると、その立体構造が変化し、その特性が不可逆的に消失してしまう場合が多い。従って、このような環境変化に対し、タンパク質をいかに安定な状態に保つかが、タンパク質を扱う上で常に課題として挙げられている。
また、遺伝子組み換え技術による有用タンパク質生産において、大腸菌等の宿主菌内に過剰生産されたタンパク質が不活性な封入体として目的タンパク質が生産され、生産効率が低下するといった課題が挙げられている。
【０００３】
上記問題点の解決策としてこれまで精力的に研究がなされ、さまざまな改善案が提案されている。近年、タンパク質の立体構造形成及び構造変化に関与する因子として分子シャペロンに関心が高まっている。分子シャペロンは熱ショックタンパク質の一群であり、細胞が温度変化など様々な環境ストレスにさらされた際に生産される。これらは原核生物、真核生物を問わず広く存在しており、特に大腸菌から生産される分子シャペロンとしてGroEが良く知られている。このGroEはタンパク質の種類を選ばず、非特異的にタンパク質の立体構造形成に関与することが明らかにされている。例えば上記GroEの構成体であるGroELは７個のサブユニットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なった、合計14サブユニットからなる特徴的な構造を有している。GroELは、ドーナツ構造の凹部に変性タンパク質を捕捉し、ATPなどのヌクレオチドの消費と、補助因子であるGroESの結合に伴って、効率的に正しい立体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている。このシャペロニンをタンパク質の安定化に応用する試みがいくつかなされている。例えば特開平7-67641号公報には「酵素含有溶液にシャペロニンタンパク質及びATPなどのヌクレオチドを含有せしめ、溶液中の酵素を安定化する方法」が提案されている。また特開平7-48398号公報には、「化学的に変性された不活性タンパク質、遺伝子操作等で使用された形質転換体の中に蓄積された不活性なタンパク質などを活性タンパク質に再生させることを目的として、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）より精製したシャペロニンを用いる方法」が提案されている。
【０００４】
これらはいずれもシャペロニンが有するタンパク質の立体構造形成作用を利用したものであり、熱や変性剤によって立体構造が変形した際、タンパク質のポリペプチド鎖を本来の立体構造に巻き戻す（折り畳む）作用により、目的を達成するものである。
【０００５】
しかしながら、シャペロニンは一般的にATP、CTP、UDPといった高エネルギー物質を共存させる必要がある。また、シャペロニンは目的タンパク質と1:1のモル比率で作用するため、分子量が100万Daに近い高分子量のシャペロニンでは、非常に高濃度のシャペロニンを用いる必要があり経済性に欠ける。
【０００６】
一方、PPIase（Petidyl prolyl cis-trans isomerase）は、免疫抑制剤として知られるサイクロスポリン及びFK506のターゲット分子であり、それぞれの免疫抑制剤に対する感受性からシクロフィリンタイプ及びFKBP（FK506 binding protein）タイプに大別される。また、両者の免疫抑制剤に非感受性でアミノ酸配列のホモロジーも異なるパーブリン(Parvulin)タイプが近年見つかってきている。PPIaseはポリペプチド鎖中プロリン残基のN末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒することにより、タンパク質高次構造の再生速度を促進させる機能(PPIase活性)を有することから、上記シャペロニンと同様にタンパク質の安定化や不活性タンパク質の再生に利用できるものとして期待されていた。発明者らは、これまで古細菌由来のFKBPタイプPPIaseに着目し、研究を行ってきた。その結果、興味深いことに、それら由来のFKBPタイプPPIaseには、上記PPIase活性だけでなく、本来シャペロニンの機能とされていた、タンパク質巻き戻りの収量そのものを増大させる活性やタンパク質の不可逆的凝集を抑制する活性（シャペロン様活性）を有することを明らかにしてきた（Maruyama et al., 2000, Front Biosci. 2000 Sep 1,5,D821-836）。PPIaseは上記シャペロンとは異なり、ATPなどといった高エネルギー物質が不要であるといった利点がある。
【０００７】
さらに、これまで市販されているPPIaseは、例えばシグマ社からシクロフィリンタイプ及びFKBPタイプのものがそれぞれ２種類、１種類ずつ上市されているが、いずれも動物由来のものであり、その安定性は低く、4℃または-20℃という低温で保存する必要があった。このように動物由来のPPIaseは熱に非常に弱い。一方、古細菌由来のPPIaseは熱に強く、高温条件下に長時間放置されても活性を失わない。このため、古細菌由来のPPIaseは、新たなPPIase試薬としてその利用が期待されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
古細菌由来のPPIaseの大部分はFKBPタイプである。また、FKBPタイプのPPIaseは、分子量が17-18 kDa程度の短いタイプのものと分子量が26-33 kDa程度の長いタイプのものとに分類される（Maruyama, T and Furutani, M Front Biosci. 2000 Sep 1,5,D821-836; Iida et al., 2000, Gene 256,319-326 )。古細菌由来の26-33 kDaからなるFKBPタイプPPIaseは、その約17-18 kDa からなるN末端ドメイン部分にPPIase活性を担う領域があり、残りのC末端ドメイン部分はタンパク質の凝集を抑制する機能を有する、２機能性のPPIaseである。26-33 kDaタイプのPPIaseのN末端ドメインは短いタイプのものと相同性の高い領域であるが、17-18 kDaタイプのものに比べPPIase活性が弱く、例えば、好熱性古細菌であるメタノコッカス・サーモオートトロフィカム(Methanococcus thermoautotrophicum)由来のPPIaseは、16kDaタイプのPPIaseの1/1000以下程度の活性しか示さない (Ideno et al.,2000, Eur.J.Biochem 267,3139-3148)。
25-35 kDaタイプのPPIaseにおいても、高機能を示すものが見出されれば、その利用価値は非常に高い。本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、25-35 kDaタイプの高機能PPIaseを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）及びメタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）由来のPPIaseが、26-33 kDaタイプに属するものであるにもかかわらず、非常に強いシャペロン様活性を持つことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の(a)〜(c)に示すタンパク質である。
(a)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
(b)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつPPIase活性またはシャペロン様活性を有するタンパク質
(c)配列番号１又は３記載の塩基配列により表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする超好熱性又は好熱性古細菌由来のタンパク質であって、PPIase活性またはシャペロン様活性を有するタンパク質
また、本発明は、上記のタンパク質を他のタンパク質と共存させ、当該他のタンパク質の変性を抑制することを特徴とするタンパク質の変性抑制法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、以下の(a)〜(c)に示すタンパク質を含む。
(a)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
(b)配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつPPIase活性またはシャペロン様活性を有するタンパク質
(c)配列番号１又は３記載の塩基配列により表されるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする超好熱性又は好熱性古細菌由来のタンパク質であって、PPIase活性またはシャペロン様活性を有するタンパク質
(a)〜(c)のタンパク質は、いずれも26-33kDaのFKBPタイプのPPIaseである。
(a)のタンパク質は、パイロコッカス・ホリコシ又はメタノコッカス・ヤナシイ由来のPPIaseである。
【００１２】
(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質に、PPIase活性またはシャペロン様活性を失わせない程度の変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、PPIase活性またはシャペロン様活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。本発明でいうPPIase活性は、例えばフィッシャーらが提案したキモトリプシンカップルドアッセイで評価することができる(Fischer et al., 1984, Biomed.Biochim.Acta 43,1101-1111)。一方、シャペロン様活性は、ロダネーゼやクエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などをモデル酵素とし（河田  1998,バイオサイエンスとインダストリー56, 593-598）、これらを6Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、PPIaseやシャペロニンを含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や変性タンパク質の凝集の抑制率で評価することができる。変性タンパク質の再生率を評価する方法にはホロビッチらの方法が(Horowitz, 1995, Methods Mol. Biol.40,361-368)、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法(Taguchi et al. 1994, J.Biol.Chem.269, 8529-8534)などがそれぞれ挙げられる。
【００１３】
(c)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる好熱性古細菌又は超好熱性古細菌由来のPPIaseである。(c)のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度であり、好ましくは「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度であり、更に好ましくは「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１又は配列番号３記載の塩基配列により表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、60％以上の相同性、好ましくは75％以上の相同性、更に好ましくは90％以上の相同性を指す。
【００１４】
本発明のタンパク質は、例えば、以下のような方法により得られる。
まず、好熱性古細菌または超好熱性古細菌を培養し、得られた菌体をSDSなどの菌可溶化剤を用いて溶菌後、フェノール抽出及びエタノール沈殿法などの手法により、ゲノムDNAを抽出する。本発明で用いられる超好熱性又は好熱性古細菌としては、アシディアヌス(Acidianus)属、メタロスファエラ(Metallosphaera)属、スティジオロバス(Stygiolobus)属、スルフォロバス(Sulfolobus)属、スルフロコッカス(Sulfurococcus)属及びスルフリスファエラ(Sulfurisphaera)属などのスルフォロバレス(Sulfolobales)目、アエロパイラム(Aeropyrum)属、デスルフロコッカス(Desulfurococcus)属、ステッテリア(Stetteria)属、スタフィロサーマス(Staphylothermus)属、サーモディスカス(Thermodiscus)属、イグネオコッカス(Igneococcus)属、サーモスファエラ(Thermosphaera)属及びスルフォフォボコッカス(Sulfophobococcus)属、ハイパーサーマス(Hyperthermus)属、パイロディクティウム(Pyrodictium)属及びパイロロバス(Pyrolobus)属などのイグネオコッカレス(Igneococcules)目、パイロバキュラム(Pyrobaculum)属、サーモプロテウス(Thermoproteus)属、サーモフィラム(Thermofilum)属及びカルドコッカス(Caldococcus)属などのサーモプロテアレス(Thermoproteales)目、アーキオグロブス(Archaeoglobus)属及びフェログロブス(Ferroglobus)属などのアーキオグロバレス(Archaeoglobales)目、メタノサーマス(Methanothermus)属、メタノバクテリウム(Methanobacterium)属、メタノサーモバクター(Methanothermobacter)属及びメタノスファエラ(Methanosphaera)属などのメタノバクテリアレス(Methanobacteriales)目、メタノコッカス(Methanococcus)属、メタノサーモコッカス(Methanothermococcus)属、メタノカルドコッカス(Methanocaldococcus)属及びメタノイグニス(Methanoignis)属などのメタノコッカレス(Methanococcales)目、メタノミクロバイアレス(Methanomicrobiales)目、メタノザルチナ(Methanosarcina)属などのメタノザルチナレス(Methanosarcinales)目、メタノパイラレス(Methanopyrales)目、パイロコッカス(Pyrococcus)属及びサーモコッカス(Thermococcus)属などのサーモコッカレス(Thermococcales)目、サーモプラズマ(Thermoplasma)属及びピクロフィラス(Picrophilus)属などのサーモプラスマレス(Thermoplasmales)目などの古細菌が挙げられる。これらの古細菌の中でも超好熱性古細菌由来のものを使用するのが好ましく、とりわけパイロコッカス属及びメタノコッカス属の古細菌を使用するのが好ましい。
【００１５】
このようにして得られたゲノムDNAを適当な制限酵素で切断後、適当なベクターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターにはλファージ由来の各種ベクター例えばλgt10やλZAPなどのファージミドDNA、あるいはpUC18やpBR322等のプラスミドベクターを用いることができる。
【００１６】
一方、異なる生物種由来のFKBPタイプPPIase遺伝子間でホモロジーの高い領域のアミノ酸配列をもとに、それに相当するDNAを合成し、PCRに用いるプライマーとする。ホモロジーの高い領域の一例としては、例えば、図１のPPIase中の25〜32番目のアミノ酸配列、137〜144番号のアミノ酸配列などを挙げることができる。このようなプライマーを用いて上記ゲノムDNAを鋳型とするPCRを行えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の部分断片を得ることができる。上記部分断片は[32P]などの放射性元素や、ジコキシゲニンなどの非放射性化合物で標識することにより、遺伝子スクリーニングのプローブとして用いることができる。
【００１７】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の全塩基配列を得るためには上記ゲノムDNAライブラリーを、大腸菌などの宿主に導入しておき、ラベル化した上記プローブと強く結合するクローンを選択すればよい。
塩基配列の決定はサンガー法やマキシム−ギルバート法といった一般的な方法によって決定することができる。以上の手順により、翻訳開始コドンから終止コドンを含む本発明のタンパク質をコードする全DNA塩基配列を単離することができる。上記操作により、単離した本発明のタンパク質をコードするDNAは適宜pETシステムなどの発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることにより、本発明のタンパク質を大量調製することが可能である。
【００１８】
不安定なタンパク質の変性抑制のためには、目的のタンパク質を本発明のタンパク質と共存させればよい。本発明のタンパク質は、耐熱性に優れるだけでなく、優れた耐冷性、耐有機溶媒性なども示すため、タンパク質の様々な変性に対して抑制効果を発揮する。共存させる手段としては、例えば、目的のタンパク質に本発明のタンパク質を混合する手段、本発明のタンパク質を目的のタンパク質をコードするDNAと共発現させる手段などを挙げることができる。目的のタンパク質と混合する場合、その比率はモル比で、目的タンパク質1に対し、0.1-500の比率が好適である。また、共発現は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、例えばpACYC系プラスミドの発現プロモータの下流部に挿入しておけばよい。例えば、目的タンパク質がpETなどのcolE1系のDNA複製開始領域を持つ発現ベクターに挿入されている場合、pACYCベクターはそれらと宿主菌内で共存可能であるため、それぞれのプラスミドを別の薬剤耐性マーカーを所有させておけば、両者の遺伝子は宿主内で共存する。両者の遺伝子はそれぞれのプロモーター制御下で発現が可能となる。逆に目的タンパク質をpACYC系に、PPIase遺伝子をColE1系に組み込んでおいても差し支えない。この共発現系を利用すれば、例えば目的タンパク質を大腸菌などで発現する場合、封入体などの変性体として発現されるタンパク質を、可溶化画分に生産させることが可能となる。本発明のタンパク質を共発現させれば、目的タンパク質の変性が抑制されると共に、PPIase活性及びシャペロン様活性などの効果により封入体形成が妨げられ、可溶性画分として生産される。
本発明のタンパク質は耐熱性に優れ、運搬、保存などの際有利である。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕  超好熱性古細菌のゲノムDNAの調製
PPIase遺伝子は、パイロコッカス・ホリコシ及びメタノコッカス・ヤナシイよりクローニングした。パイロコッカス・ホリコシ(MD151)は理化学研究所より入手し、メタノコッカス・ヤナシイは、DSMより入手した。
【００２０】
パイロコッカス・ホリコシ及びメタノコッカス・ヤナシイの菌懸濁液をそれぞれ約50 μl採取し、15000 rpm×5分間遠心分離することにより、菌体を回収した。TE緩衝液500μlにて2回菌体を洗浄した後、0.1% SDSを含むTE緩衝液に懸濁し、95℃にて60分間溶菌処理を行った。等量のTE緩衝液飽和フェノール及びクロロホルムにて除タンパク処理を行った後、エタノールにてそれぞれのゲノムDNAを沈殿させた。
【００２１】
〔実施例２〕  PPIase遺伝子の増幅及びクローニング
図1及び図２に示したパイロコッカス・ホリコシ由来PPIaseの配列情報及びメタノコッカス・ヤナシイ由来PPIaseの配列情報をもとに、パイロコッカス・ホリコシ由来のPPIase（以下、「PHFK」と略記する）遺伝子及びメタノコッカス・ヤナシイ由来のPPIase（以下、「MJFKL」と略記する）遺伝子をPCR法によって増幅した。遺伝子増幅用のプライマーとしては、PHFKについてはPHFK-F1及びPHFK-R1を、MJLFKについてはMJFKL-F1及びMJFKL-R1をそれぞれ用いた（表１）。これらのプライマーには制限酵素サイトを設けた。また、PCRの反応組成及び反応サイクルは、それぞれ表２び表３に示すとおりである。DNAポリメラーゼは、TaKaRa社Ex. Taqを使用した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
【表３】
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【００２５】
PCR法によって得られた各々の増幅産物を、2%アガロースゲル電気泳動により分離後、DNA断片を含むバンド部分を切り出し、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿により目的DNAの抽出を行った。DNA断片を滅菌水に溶解し、各約10〜100 ngに対して10倍量のpT7 blue Tプラスミドベクター (Novegen)を加え、さらに16℃にて１時間処理することによりDNA断片をライゲーションした。
【００２６】
上記ライゲーション液をそれぞれコンピテントセル大腸菌JM109株に加えることによりトランスフォーメーションした。これら菌株の懸濁液を100 μg ml-1アンピシリンナトリウム、100 μM IPTG及び0.004 % X-Galを含有するLB寒天培地に接種し、一晩37℃にて培養し、得られたホワイトコロニーについて、その菌株のゲノムDNAを鋳型とするPCRを行い、DNA断片に対応するプライマーで増幅されるコロニーを陽性コロニーとした。陽性コロニーからPT7プラスミドDNAを回収した後、プラスミドを鋳型とし、BIG Dye (PERKIN-ELMER)を用いたシーケンス反応（プライマーはT7プロモータープライマー及びU-19リバースプライマー）を行うことにより、得られたPCR産物の塩基配列を決定した。この配列をデータベース上のパイロコッカス・ホリコシまたはメタノコッカス・ヤナシイのゲノムDNAの塩基配列と比較した結果、PPIase遺伝子の配列と相違ないことを確認した。パイロコッカス・ホリコシ及びメタノコッカス・ヤナシイのPPIase遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号３に、それから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号４に示す。
【００２７】
〔実施例３〕  PPIaseの発現系構築
PPIase遺伝子を含むそれぞれのpT7 blueプラスミドDNAについて制限酵素処理を行い、PPIase遺伝子断片の切り出しを行った。制限酵素はNde I及びHind IIIの組み合わせをそれぞれ用いた。切断した遺伝子断片は2%アガロースゲルにより、分離・抽出した後、あらかじめ制限酵素処理したpET21aプラスミドDNA (Novagen)にライゲーションした。得られたライゲーション反応液をコンピテントセル大腸菌JM109株に加えることによりトランスフォーメーションした後、PPIase遺伝子を含む陽性コロニーからpET21aプラスミドDNAを回収し、このプラスミドをコンピテントセル大腸菌 BL21 (DE3)株にトランスフォーメーションした。
【００２８】
〔実施例４〕  PPIaseの精製
得られた組み換え大腸菌を用いてPHFK及びMJFKLの発現を試みた。2Lの三角フラスコに2×YT培地 (Yeast Extract 16 g L-1, BACTO TRYPTON 20 g L-1, NaCl 5g L-1, アンピシリン 100 μg ml-1, pH7.5) 700 mlを入れ、PHFK遺伝子又はMJFKL遺伝子を含む組み換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。35℃で24時間回転培養（110 rpm）した後、遠心分離（10000 rpm×10 min）にて菌体を回収した。
得られた菌体は1 mM EDTAを含む25 mM HEPES緩衝液（pH6.8）20 mlに懸濁し、-20℃にて一晩凍結保存した。菌体を超音波破砕後、下記に示したa〜dの陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返した。精製した菌体破砕液をSDS-PAGEで分離したところ、MJFKLを発現させた大腸菌の場合も（図３レーン４）、PHFKを発現させた大腸菌の場合も（図３レーン６）ともに単一のバンドとして検出された。なお、図３中のレーン１は分子量マーカー、レーン２は野生型大腸菌の菌体破砕液、レーン３はMJFKLを発現させた大腸菌の未精製菌体破砕液、レーン５はPHFKを発現させた大腸菌未精製菌体破砕液を試料としとしている。
【００２９】
a.  DEAE Toyopearl column (16 mm x 60 cm; TOSOH Co., Ltd.)
A液: 25 mM HEPES-KOH 緩衝液 (pH 6.8)
B液: 0.5 M NaCl を含む25 mM HEPES-KOH 緩衝液 (pH 6.8)
(0-300 min: B液0-100%の直線グラジエント、300-420 min: B液100 %)
流速:1 ml min-1
b.  HiLoad 26/60 Superdex 200pg column (26 mm x 60 cm; Amersham Pharmacia )
溶離液: 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0; 0.15 M NaCl含有)
流速: 3 ml min-1
c.  TSKgel SuperQ-5PW column (7.5 mm x 7.5 cm; TOSOH Co., Ltd.)
A液: 25 mM HEPES-KOH 緩衝液 (pH 6.8)
B液: 0.5 M NaCl を含む25 mM HEPES-KOH 緩衝液 (pH 6.8)
(0-10 min: B液0 %、10-60 min: B液0-100%の直線グラジエント)
流速:1 ml min-1
d.  TSKgel G3000 SWXL column (7.5 mm x 30 cm; TOSOH Co., Ltd.)溶離液: 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0; 0.15 M NaCl含有)
流速: 0.5 ml min-1
【００３０】
〔実施例５〕PHFKのタンパク質熱変性抑制効果（１）
大腸菌(BL21 DE3)の菌体破砕液上清液の熱変性に対するPHFKの影響を検討した。すなわち、PHFKを発現させた大腸菌を超音波破砕し、遠心分離により上清を得た。タンパク質濃度を2.5mg/mlとし、20〜100 ℃の温度範囲にて30分間熱処理した。遠心分離の後、上清について16%アクリルアミドゲルを用いたSDS電気泳動で、上清に残存するタンパク質を検出した（図４）。また、上清の残存タンパク質濃度を定量した（図５）。対照として、PHFKを発現させた大腸菌の代わりに野生型大腸菌を用い、上清中のタンパク質の検出及び定量を行った。
【００３１】
図４及び図５に示すように、PPIaseが存在する場合には大腸菌の大部分のタンパク質が凝集せず、上清中に残存していた。一方、PPIaseが存在しない場合には、処理温度の上昇に伴い検出タンパク質の量が少なくなり、高温処理時には上清中にはほとんどタンパク質が残存していなかった。
【００３２】
〔実施例６〕PHFKのタンパク質熱変性抑制効果（２）
野生型大腸菌(BL21 DE3)を超音波破砕し、遠心分離により上清を得た。タンパク質濃度を2.1mg/mlとし、さらにPHFKを最終濃度1mg/mlとなるように添加し、20〜100 ℃の温度範囲にて30分間熱処理した。遠心分離の後、上清について16%アクリルアミドゲルを用いたSDS電気泳動で、上清に残存するタンパク質を検出した（図６）。対照として、PHFKを添加せずに上清に残存するタンパク質の検出を行った。
【００３３】
図６に示すように、PPIaseを添加した場合には大腸菌の大部分のタンパク質は残存したが、PPIaseを添加しなかった場合には検出されるタンパク質の量は処理温度の上昇に伴い減少していた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、熱や有機溶剤などによるタンパク質の変性を抑制し、不可逆的な凝集形成を防ぐことができる。また、この変性抑制効果により、組み換えタンパク質生産において問題となる、封入体形成を抑制することができる。その他、本発明は、変性タンパク質の再生、タンパク質試薬の安定化、さらには新規免疫抑制剤、生理活性物質の探索に有用である。
【００３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  PHFK遺伝子の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列を示す図
【図２】  MJFKL遺伝子の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列を示す図
【図３】  MJFKL又はPHFKを発現する大腸菌の菌体破砕液の電気泳動図
【図４】  PHFK存在及び非存在下における菌体破砕液上清の電気泳動図
【図５】  PHFK存在及び非存在下における菌体破砕液上清中のタンパク質量を示す図
【図６】  PHFK添加及び無添加時における菌体破砕液上清の電気泳動図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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