(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた一定の電流源を適用する工程、
（ｂ）  電極間の電位差を監視する工程、
（ｃ）  ストリップに試料を適用する工程、
（ｄ）  電位差が前以て決められた閾値の電圧より下に低下する時刻を記録することにより試料検出時刻を決定する工程、
（ｅ）  試料に、前以て決められた一定の電圧をかける工程、
（ｆ）  一定の電圧適用後に前以て決められた時刻の電気的応答を測定する工程、並びに
（ｇ）  測定された電気的応答を使用して被検体濃度を計算する工程、
を記載順に含んでなる、併置された作業及び比較電極を含む型式の電気化学的診断用ストリップに適用される生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定法。
【請求項２】
電気的接続において、
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた電流をかけるための手段、
（ｂ）  電極間の電位差を監視するための手段、
（ｃ）  試料検出を示すための、電位差が、前以て決められた閾値の電圧より下に低下する時刻を決定するための手段、
（ｄ）  試料に、前以て決められた一定の電圧を適用するための試料検出に応答する手段、
（ｅ）  もたらされる電気的応答を測定するための手段、並びに
（ｆ）  測定された電気的応答を使用することにより被検体濃度を計算するための手段、を含んでなる、診断用ストリップの作業及び比較電極間に適用された、生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定のための計器。
【請求項３】
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた一定の電流源をかける工程、
（ｂ）  電極間の電位差を監視する工程、
（ｃ）  ストリップに試料を適用する工程、
（ｄ）  電位差が前以て決められた閾値の電圧より下に低下する時刻を記録することにより試料検出時刻を決定する工程、
（ｅ）  試料に前以て決められた一定の電圧をかける工程、
（ｆ）  第１の前以て決められた時刻後に、試料に第２の前以て決められた電圧をかける工程、
（ｇ）  第１の前以て決められた時刻後に、前以て決められた時刻の電気的応答を測定する工程、並びに
（ｈ）  測定された電気的応答を使用して被検体濃度を計算する工程、
を記載順に含んでなる、併置された作業及び比較電極を含む型式の電気化学的診断用ストリップに適用される、生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的流体中の被検体の濃度を測定するための電気化学的装置、より具体的には、流体が装置の作業及び比較電極間に電気的接続をもたらす時刻を決定するための機構に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学の様々な診断法は、流体中の被検体濃度を決定するための、血液、尿、又は唾液のような生物学的流体のテストを伴う。被検体のうちで最も興味深いものはグルコースであり、臨床実験室、開業医のオフィス、病院及び家庭で、生物学的流体の試料のグルコース濃度をテストするために、酵素に基づいた組成物を取り込んでいる乾燥相の試薬ストリップが集中的に使用されている。実際、試薬ストリップは、多数の、我国の推定１６００万人の糖尿病患者に対する日常の必需品になってきた。糖尿病は血液化学に危険な異常を誘起する可能性があるので、それは視力喪失、腎不全、及びその他の重篤な医学的結果の原因となる可能性がある。これらの結果の危険性を最小にするために、大部分の糖尿病患者は、彼ら自身で定期的にテストし、それに従って、例えば食餌制限によりそして／又はインスリン注射により彼らのグルコース濃度を調整しなければならない。何人かの患者は１日に４回以上もの頻度で彼らの血中グルコース濃度をテストしなければならない。
【０００３】
彼らの食餌を制限しなければならない糖尿病患者は糖の摂取を調整しそして／又はインスリン注射を投与すること、そしてこれに関して血中グルコース濃度の頻回のテストにより指示されなければならない患者は早急な、安価なそして正確なグルコース決定システムをもつことが特に重要である。
【０００４】
一つのタイプのグルコース測定システムは、乾燥試薬ストリップ上の血中グルコースの酸化を検出することにより電気化学的に操作される。試薬は概括的に、グルコース酸化酵素又はグルコース脱水素酵素のような酵素並びにフェロセン又はフェリシアニドのような酸化還元メディエーターを含む。この型式の測定システムは、引用することにより本明細書中に取り込まれている、Ｎａｋａｍｕｒａ等に対して１９８０年９月２３日認可の米国特許第４，２２４，１２５号、Ｈｉｇｇｉｎｓ等に対して１９８５年１０月８日認可の同第４，５４５，３８２号、及びＮａｎｋａｉ等に対して１９９３年１１月３０日認可の同第５，２６６，１７９号に記載されている。
【０００５】
電気化学的グルコース測定器は、そのシステムがグルコース濃度の決定を実施する際にそれぞれ電荷、電流又は電圧を測定することを伴うかに応じて電量計、電流計、又は電圧計として特徴をもつことができる。それぞれの場合に、電気的信号をその後の正確に計測された期間にストリップに与えなければならないので、血液試料が試薬に接触する時点を規定することが重要である。
【０００６】
１９９３年１１月３０日に認可のＮａｎｋａｉ等の米国特許第５，２６６，１７９号は、試料適用時刻が、一定の電圧がそれに適用される一対の電極間の抵抗の低下の時刻と規定されている、血中グルコース測定のための電気化学的システムにつき開示している。
【０００７】
１９９４年１１月２２日認可のＷｈｉｔｅ等の米国特許第５．３６６，６０９号は、血液を乾燥グルコース試薬ストリップに適用した時刻を決定するために電極間の抵抗の低下を監視する同様な原理につき記載している。両者の特許において、乾燥試薬ストリップに対する血液試料の導入によりもたらされる抵抗の変化を追跡するために作業及び比較電極間に一定の電圧をかける。
【０００８】
正確な結果のために、試料検出法は被検体濃度を乱れさせてはならず、被検体の乱れを最小にするための幾つかの方法が説明された。
【０００９】
１９７９年１２月２８日に出願されたＱｕａｄｅ等のドイツ（ＤＤＲ）特許出願第１４８，３８７号は、電気構成部品の数の減少をも可能にしながら、電位差静止モード（一定にかけられた電圧）及び電流静止モード（一定にかけられた電流）の間の早急な切り替えを可能にする、新規の電気回路を使用する電気化学的測定法を開示している。当該回路の目標は測定の開始前の試料の乱れを最小にすることである。
【００１０】
１９８１年１１月２４日に出願されたＢａｒｔｅｌｓ等のドイツ（ＤＤＲ）特許出願第２０８，２３０号は、これもまた試料の乱れを最小にすることを試みている電気化学的測定法を開示している。当該測定装置は追加的電流計制御ループを使用せずに測定開始前の電流を最小にするためにダイオードを使用する回路を含む。更に、当該回路は正確で早急な様態で電圧測定モードに切り替える。
【００１１】
１９９０年７月１０日に認可されたＬｉｔｔｌｅｊｏｈｎ等の米国特許第４，９４０，９４５号は、血液試料のｐＨを測定することができるポータブル装置を開示している。当該装置は試料室の外側の充填電極と、室の内側の２個の電極の一方との間に一定の電流をかけることによりセル中の試料の存在を検出する。インピーダンスが少なくとも２桁の次元まで減少すると、測定器は十分な試料が提供されたことを認識してビープを発する。次に、充填電極を試料セル内に２個の電極を含む回路から切断し、電位差計法で測定する。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、併置された作業及び比較電極を含む型式の、電気化学的診断用ストリップに適用される生物学的流体の試料中の被検体の濃度を測定するための方法を提供する。本方法は、
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた一定の電流源をかけること、
（ｂ）  電極間の電位差を監視すること、
（ｃ）  ストリップに試料を適用すること、
（ｄ）  電位差が前以て決められたしきい値電位差より下に低下する時刻を記録することにより試料検出時刻を決定すること、
（ｅ）  試料に、前以て決められた一定の電圧をかけること、
（ｆ）  一定の電圧をかけた後の前以て決められた時刻の電気的応答を測定すること、並びに
（ｇ）  測定された電気的応答を使用して被検体濃度を計算すること、
を含んでなる。
【００１４】
診断用ストリップに適用された生物学的流体の試料中の被検体濃度を測定するための計測器は、電気的接続において
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた電流をかけるための手段、
（ｂ）  電極間の電位差を監視するための手段、
（ｃ）  試料の検出を示すために、電位差が前以て決められたしきい値の電圧より下に低下する時刻を決定するための手段、
（ｄ）  試料に、前以て決められた一定の電圧をかけるための試料検出に応答する手段、
（ｅ）  もたらされる電気的応答を測定するための手段、並びに
（ｆ）  測定された電気的応答を使用することにより被検体濃度を計算するための手段、
を含んでなる。
【００１５】
本発明は、電気化学的診断用ストリップの反応区域に適用される試料が電極間の隙間を架橋する時刻を著しく正確に規定することを含む、被検体濃度を電気化学的に測定するための方法及び装置を提供する。試料の適用時刻を決定すること（より正確には試料検出時間、我々はこれらの語を相互交換的に使用する）は、試料に対して実施される測定のより高度な正確さ及び精度を可能にする。
【００１６】
試料適用時刻の決定のための本法の利点は、試料検出のために一定の弱い電流をかけることが、一定の電圧をかけた以前の当該技術分野の方法に比して試料の乱れを最小にする点である。後者の方法を使用すると、試料の適用はタイミングを開始するための規定されたしきい値を越える電流を誘起する。試料処理率は制約されているので、センサーがしきい値が越えられたことを認識する前に電流は具体的に実質的なものになるであろう。強い電流が認識されると、メディエーターに、対応して大きい乱れが認識される。これは特に低い被検体濃度においては不正確な測定値に導く可能性があろう。
【００１７】
試料適用を検出するために一定の電圧をかける以前の当該技術分野の方法は、初期電流が概して、被検体濃度の減少とともに減少するというもう一つの欠点を有する。従って、低被検体試料に対する初期の試料検出時刻を決定することはより困難である。同様な理由により、電流のしきい値を低く過ぎて設定すると、それはノイズにより誤って起動される可能性がある。問題を更に複雑にさせることには、高濃度の赤血球細胞の存在もまた、初期電流を減少させる。
【００１８】
被検体及び赤血球細胞濃度は本発明の方法に影響を与えない。同様に、検出の引金は信号電圧の大きい変動であるので、ノイズは重要な問題ではない。
【００１９】
本発明は生物学的流体中の被検体濃度を測定する電気化学的方法に関する。簡略化のために、下記の説明は全血の試料中のグルコース濃度の測定に力点を置く、しかし医学的診断技術分野の専門家は、その説明がその他の流体（唾液、尿、間隙流体、等のような）中のその他の被検体（コレステロール、ケトン体、アルコール、等のような）を監視するために応用することができることを認識するであろう。
【００２０】
水性試料中の被検体濃度を測定するための電気化学的（電流滴定）法は、電流滴定に適したインピーダンスをもつ２個の電極をもつ電気化学的セル中の反応区域中に試料を配置することを伴う。被検体を電極又は酸化還元試薬と直接応答させて、被検体濃度に対応する量の酸化性（又は還元性）物質を形成させる。次に酸化性（又は還元性）物質の量を電気化学的に測定する。この型式の測定法はその反応区域中に試料が検出される時点を正確に規定しなければならない。これが、試料が適用された直後に電気化学的波形（すなわち、電圧）をかけることを可能にし、保温期間又は反応時間を正確に規定する。順次、これが、下記に説明されるように、測定法の正確さ及び精度を改善させる。
【００２１】
本発明は試料検出時刻を決定するための改善された方法及び装置を提供する。
本方法は、電気化学的診断用ストリップの電極上に弱い一定の電流源をかけること、及び電極間の電位差を監視することを伴う。電極間には乾燥した隙間が存在するので、無視可能な電流が初期に流れる。試料がストリップに適用され、隙間を充填すると、測定された電圧は急速に減少して、テスト時間を開始させる。このように試料が適用されたことを認識すると、装置は一定電流モードから一定の電圧モードに切り替わる。一定の電圧モードにおいては、電流又は電荷はどちらも時間の関数として測定されて、被検体濃度の計算を可能にさせる。この方法はタイミング−開始回路により信号応答に導入される誤差を最小にし、従って低い検出制限値を可能にする。それらの電気構成部品は単純で安価である。
【００２２】
図１は本発明の試料−検出法を表す、適用電流及び測定電圧のプロットである。ゼロ時間の前に（すなわち、試料が導入される前に）、一定の電流（ここでは例えば１μＡ）を電極間にかけるが、無視可能な電流が流れる。より弱い電流は乱れを減少させ、特に低い被検体濃度に対して好ましい。測定された電圧は回路の電力供給電圧−この場合５ボルトにより決定される。試料がセル中に導入されると（ゼロ時間）、適用電流が電極間を流れることができ、測定された電圧は急速に低下する。電圧がしきい値電圧より下に低下すると、装置は一定の適用電流から一定の適用電圧に切り替わる。
【００２３】
図２は試料検出後の時間の関数としての、適用電圧及び測定電流を表すグラフである。試料は時間ｔ＝０で検出され、その直後に電圧が作業及び対抗電極間にかけられる。その結果、電流が電極間を流れる。既知の被検体濃度をもつ試料を使用してそのシステムの目盛り決めを実施後に、前以て決められた時刻後の電流は被検体濃度の指標である。前以て決められた時間の期間は重要ではない。流体が血液であり、被検体がグルコースである場合は、それは概括的には少なくとも約３秒である。その期間は概括的に、試薬を溶解し、容易に測定可能なメディエーターの量を減少させるのに十分な時間を提供する。すべての事項が等しいとすると、高いヘマトクリットにおいては、より長い時間が必要である。実際的に言うと、使用者は概して、出来るだけ早く読み取り値を知りたがる。より長く待つ動機づけを持たない場合は１０秒の期間が具体的には満足である。もちろん、前以て決められた時刻が一旦設定された後は、正確で精密な結果は、毎回、同一の時間を使用することを必要とする。どちらにしても、電流決定の精度はｔ＝０の決定の精度に依存している。
【００２４】
図３は代替的方法における測定電流及び適用電圧対時間のグラフを表す。この方法においては、前以て決められた時刻後に、電極に第２の電圧のパルスをかける。概括的には、第２のパルスは、前以て決められた時刻の直後に（全測定時間を最小にするために）かけられるが、遅延は許容される。再度、再生可能な結果は、再生可能な方法を要求し、従って、この方法においても同様に、ｔ＝０点を正確に決定することが重要である。第２のパルスは減衰電流を伴う、電極を通る電流に正のスパイクを誘起する。システムの目盛り決定後に、被検体濃度は、単独でも又は図２に示された電流測定と組み合わせても、減衰率から決定することができる。電流は概括的に、第２のパルス適用の約１秒後に開始し、その後少なくとも数秒間継続する期間にわたり、指数関数的に減衰する。
【００２５】
図４は電流ではなく、電荷を測定した図３の方法を表す。図３のグラフと同様に、被検体濃度は第２の電圧がかけられる後に、固定された時間における総電荷からそして／又は減衰率から決定することができる。
【００２６】
図５は前記の方法における使用に適した「薄層」装置１０を表す。支持体１２は、その上に作業電極を形成するＰｄ被膜１６が付着された−具体的にはスパッタリングにより−ポリエステルの土台１４である。バッファー、メディエーター、及び酵素からなる乾燥試薬は電極の片方の端１８の近位に付着されている。スペーシング層２０は電気化学的セルを区画する切り抜き部２２をもつ両面粘着物である。具体的にはスペーサーは約２００μｍ未満の厚さである。上部層２４は、その上に、比較電極を形成するＡｕ被膜２８が付着された−具体的にはこれもスパッタリングにより−ポリエステルの層２６である。
【００２７】
前記型式の装置は、ＧＯＤ*が還元された酵素である、次の反応によりグルコース濃度を決定するためのグルコース酸化酵素（ＧＯＤ）／フェリシアニドシステムを使用することができる。
反応１    グルコース＋ＧＯＤ  →  グルコン酸＋ＧＯＤ*
反応２    ＧＯＤ*＋２フェリシアニド  →  ＧＯＤ＋２フェロシアニド。
フェリシアニド（［Ｆｅ（ＣＮ）6］3-）は、ＧＯＤ*をその触媒状態に復帰させるメディエーターである。酵素の触媒であるＧＯＤは、過剰なメディエーターが存在する限りグルコースを酸化し続けるであろう。フェロシアニド（［Ｆｅ（ＣＮ）6］4-）は全体的反応の生成物である。実際にはしばしば少量は存在するが、理想的には、フェロシアニドは最初は存在しない。反応が終結後のフェロシアニドの濃度（電気化学的に測定）がグルコースの初期の濃度を示す。全体的反応は反応１と２の総計である。
0004573400.tif 000002
「グルコース」は具体的にβ−Ｄ−グルコースを意味する。
【００２８】
このシステムの詳細は引用により本明細書に取り込まれているＰＣＴ出願の国際公開第９７／１８４６５号パンフレットに記載されている。
【００２９】
図６は本発明を実施するのに適した回路の一態様を表す。最初に、位置１のスイッチ１０５により、ストリップに一定の電流源をかける。電流源は作動性（operational）増幅器１０４、電圧標準１０２、並びに抵抗器１０１及び１０３からなる。電流は抵抗器１０３に対する電圧標準１０２の比率により決定される。
抵抗器１０１は必要なバイアスを発生するために使用される。作動性増幅器１１０及び抵抗器１０９は電流−電圧変換器として使用される。最初に、ストリップ上に試料を伴わない場合は、地点１０７と１０８の間の抵抗は非常に大きく、ストリップ中を通過する電流は無視できる。この状態においては、作動性増幅器１０４の出力電圧（Ｖ１）は高い。試料がストリップに適用されると、その抵抗は著しく低下し、そして一定の電流がストリップ中を流れるので、Ｖ１が低下する。Ｖ１はアナログ−ディジタル変換器１１１を通ってマイクロプロセッサー１１２に供給される。マイクロプロセッサー１１２は、この減少された電圧を試料検出として認識して、１０５を位置２に切り替えて、ストリップを電流源から切断して、それを電圧源１０６に接続する。この状態で、作動性増幅器１１０の出力電圧（Ｖ２）を測定することにより時間電流滴定（chronoamperometric measurement）を実施することができる。この電圧はストリップを通過する電流に比例する。
【００３０】
次の実施例は本発明を表すが、どんな意味においても制約する意図はもたれない。
【００３１】
【実施例】
図６の回路図は、Ｐｄ及びＡｕ電極を有する、図５に示された型式の薄層電気化学的グルコースストリップであるストリップＳを使用して設定された。Ｐｄ電極はバッファー、グルコース、脱水素酵素（ＰＱＱ）、及びフェリシアニドの層で被覆された。乾燥グルコースストリップの作業電極と対抗／比較電極間に、一定の弱い（〜１μＡ）乱れない電流をかけた。ストリップが乾燥していたので、作業及び対抗／比較電極間の抵抗は本質的に無限であった。全血の試料がセル上に適用された後に、電圧の低下が認められた。約５０ないし５００ｍＶのしきい値が開始時間を起動させた（約３００ｍＶのしきい値が好ましい）。試料が検出された後に、機器は一定電流の適用から一定電圧の適用に切り替えた。時間の関数としての試料を通る電流の測定値がグルコース濃度の計算を可能にした。
【００３２】
以上の説明及び実施例は本発明の実施の具体的説明であるが、どんな意味においても制約しないことは、当業者には理解されるであろう。本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、本明細書に提示された細部の変更が実施可能である。
【００３３】
本発明の特徴と態様を以下に示す。
【００３４】
１．  （ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた一定の電流源を適用すること、
（ｂ）  電極間の電位差を監視すること、
（ｃ）  ストリップに試料を適用すること、
（ｄ）  電位差が前以て決められたしきい電圧より下に低下する時刻を記録することにより試料検出時刻を決定すること、
（ｅ）  試料に、前以て決められた一定の電圧をかけること、
（ｆ）  一定の電圧適用後に、前以て決められた時刻の電気的応答を測定すること、並びに
（ｇ）  測定された電気的応答を使用して被検体濃度を計算すること、
を含んでなる、併置された作業及び比較電極を含む型式の電気化学的診断用ストリップに適用される生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定法。
【００３５】
２．  測定された電気的応答が前以て決められた時刻に試料を通過する電流である、第１項の方法。
【００３６】
３．  測定された電気的応答が、試料検出時刻から前以て決められた時間までに試料を通過する電荷である、第１項の方法。
【００３７】
４．  前以て決められた時刻後に、第２の前以て決められた電圧をかけること及び第２の前以て決められた電圧をかけた後に第２の電気的応答を測定することを更に含んでなる、第１項の方法。
【００３８】
５．  第２の電気的応答が試料を通過する電流の減衰率である、第４項の方法。
【００３９】
６．  第２の電気的応答が第２の電圧が適用された後の前以て決められた時間内に試料を通過する電荷である第４項の方法。
【００４０】
７．  電気的接続において、
（ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた電流を適用するための手段、
（ｂ）  電極間の電位差を監視するための手段、
（ｃ）  試料検出を示すための、電位差が、前以て決められたしきい電圧より下に低下する時刻を決定するための手段、
（ｄ）  試料に、前以て決められた一定の電圧を適用するための試料検出に応答する手段、
（ｅ）  もたらされる電気的応答を測定するための手段、並びに
（ｆ）  測定された電気的応答を使用することにより被検体濃度を計算するための手段、
を含んでなる、診断用ストリップの作業及び比較電極間に適用された生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定のための計測器。
【００４１】
８．  もたらされる電気的応答を測定するための手段が電流計である、第７項の計測器。
【００４２】
９．  もたらされる電気的応答を測定するための手段が電量計である、第７項の計測器。
【００４３】
１０．  試料に第２の前以て決められた電圧をかけるための手段及び、第２のもたらされた電気的応答を測定するための手段を更に含んでなる、第７項の計測器。
【００４４】
１１．  第２のもたらされた電気的応答を測定するための手段が電流計である、第１０項の計測器。
【００４５】
１２．  第２のもたらされた電気的応答を測定するための手段が電量計である、第１０項の計測器。
【００４６】
１３．  （ａ）  作業及び比較電極間に、前以て決められた一定の電流源を適用すること、
（ｂ）  電極間の電位差を監視すること、
（ｃ）  ストリップに試料を適用すること、
（ｄ）  電位差が、前以て決められたしきい電圧より下に低下する時刻を記録することにより試料検出時刻を決定すること、
（ｅ）  試料に、前以て決められた一定の電圧をかけること、
（ｆ）  第１の前以て決められた時刻後に、試料に第２の前以て決められた電圧をかけること、
（ｇ）  第１の前以て決められた時刻後に、前以て決められた時刻の電気的応答を測定すること、並びに
（ｈ）  測定された電気的応答を使用して被検体濃度を計算すること、
を含んでなる、併置された作業及び比較電極を含む型式の電気化学的診断用ストリップに適用される、生物学的流体の試料中の被検体濃度の測定法。
【００４７】
１４．  測定された電気的応答が、試料中を通る電流の減衰率である、第１３項の方法。
【００４８】
１５．  測定された電気的応答が、第２の前以て決められた電圧がかけられた後の、前以て決められた時間内に試料を通過する電荷である、第１３項の方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試料−検出法を表す適用電流及び測定電圧対時間のグラフである。
【図２】本発明の測定法のための適用電圧及び生成電流応答対時間のグラフである。
【図３】本発明の代替的測定法のための適用電圧及び電流応答対時間のグラフである。
【図４】本発明のもう一つの代替的測定法の電荷対時間のグラフである。
【図５】本発明の測定法における使用に適した電気化学的装置を表す。
【図６】本発明における使用に適した回路図である。
【図１】
0004573400.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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