(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａキナーゼを特異的に認識し、以下の特性：
前記ヒトまたはマウスのオーロラ−Ａタンパク質を含有するメンブレン上に固定することができる、
免疫沈降により前記ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａタンパク質の検出、適切な場合には精製を可能にする、
前記オーロラ−Ａタンパク質が分泌される生物組織の染色を可能にする、および
前記ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａタンパク質の酵素活性を阻害しない、
を有する抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体が、以下の工程：
−ゲノム中にオーロラ−ＡをコードするヒトｃＤＮＡが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを１５日間にわたってマウスに５回注射し、前記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養において不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で前記マウスの免疫感作に用いられた前記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、この第１のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物由来の内因性オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第２のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第３のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第４のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した前記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、先に定義した特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
により得られる、
パスツール研究所のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−３０５０で寄託されているハイブリドーマにより分泌され、３５ＣＩ抗体とも呼ばれる、前記抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトまたは動物での癌のインビトロ診断法を行うための、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
乳癌、胃癌、および結腸直腸癌を含む充実性腫瘍のインビトロ診断法を行うための、請求項２項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＰＣＮＡタンパク質のマーカーを含む細胞増殖マーカーを併用する、請求項２または３に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトまたは動物での、請求項３に記載の癌のインビトロ検出法であって、以下の工程：
−個体から採取した生物試料の存在下に請求項１に記載のモノクローナル抗体を置く工程（該抗体は、適切な場合には固体支持体上に固定される）、
−前の工程中に前記モノクローナル抗体と前記生物試料中に存在し得る前記オーロラ−Ａタンパク質とで形成された複合体中の前記オーロラ−Ａタンパク質に結合した前記モノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体に結合した前記オーロラ−Ａタンパク質のいずれかを認識する、標識化された試薬を用いて、前記生物試料中に存在し得る前記オーロラ−Ａタンパク質を検出し、適切な場合には定量化する工程（これは必要な場合には前記固体支持体を適当にリンスした後に行う）、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
前記標識化された試薬が、標識化された抗体である、請求項５に記載の癌のインビトロ検出方法。
【請求項７】
前記生物試料中の、正常な生理学的値より低いまたは高いオーロラ−Ａタンパク質の量の決定が、診断される癌に対してそれぞれ良好なまたは劣悪な予後を示すことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下：
請求項１に記載の抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体、
適切な場合には、ＰＣＮＡタンパク質のマーカーを含む細胞増殖マーカー、
を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のインビトロ検出方法を行うためのキット。
【請求項９】
前記マーカーが、抗ＰＣＮＡ抗体である、請求項８に記載のインビトロ検出方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、哺乳動物のオーロラ−Ａキナーゼに対するモノクローナル抗体、該抗体を得る方法、並びに癌の診断または予後に関連する該抗体の使用および癌処置用の医薬組成物での該抗体の使用である。
【０００２】
オーロラ−Ａタンパク質キナーゼは癌遺伝子であり、ラット−１細胞でのその過剰発現は形質転換された表現型の出現を引き起こすのに十分であり、これらの形質転換細胞を免疫不全マウスへ移植することにより腫瘍が現れる（Bischoffら、1998; Zhouら、1998）。このキナーゼをコードする遺伝子は、２０ｑ１３で染色体２０上に位置し、多数の腫瘍（乳癌、大腸癌、胃癌）で頻繁に検出される単位複製配列である。
【０００３】
オーロラ−Ａタンパク質キナーゼの過剰発現は多数の腫瘍で観察されている。興味深いことに、異常な量でのこのキナーゼの存在は、ＰＣＮＡなどの特異的な増殖マーカーで染色されることにより検出される増殖には相関しない。したがって、オーロラ−Ａは細胞の腫瘍態様の特異的なマーカーである（Tanakaら、1999; Takahashiら、2000）。
【０００４】
オーロラ−Ａは、オーロラと呼ばれるタンパク質キナーゼの複遺伝子性のファミリーに属し、このファミリーは、オーロラ−Ａ（先に記載）、オーロラ−Ｂ（Prigentら、1999）、およびオーロラ−Ｃ（Bernardら、1998）の３つのメンバーを含む。オーロラ−Ａだけが真の腫瘍誘発力を有するが、他２つのキナーゼもまた、同じ腫瘍で過剰発現することが見出された（GietおよびPrigent, 1999）。
【０００５】
オーロラ−Ａをコードする遺伝子の増幅は、これらの腫瘍におけるタンパク質キナーゼの異常に高い活性の存在に関係している。さらに、培養細胞におけるこのキナーゼの異所性過剰発現は、形質転換された表現型を出現させるのに十分であり、免疫不全マウスへ移植されたこれらの細胞により腫瘍の出現が引き起される。
【０００６】
オーロラ−Ａキナーゼの過剰発現は、細胞の癌状態に非常に密接に関連している。オーロラ−Ａキナーゼのこの過剰発現により、細胞の多倍数性が誘導され、中心体の増幅が引き起こされるが、これら２つの事象は例えば乳癌の劣悪な（poor）予後に先行して起こる。
【０００７】
したがって、癌の病理でこのキナーゼの発現をｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの双方で正確に測定することができることが重要である。
【０００８】
今や、オーロラ−Ａタンパク質キナーゼの発現の測定は優良なモノクローナル抗体の使用に完全に依存している。
【０００９】
しかしながら、オーロラ−Ａタンパク質キナーゼに対する十分に特異的なモノクローナル抗体は今まで得ることができていないし、市販されてもいない。
【００１０】
本発明の対象は、実験研究の目的での使用並びに癌の診断、予後、および処置の分野での使用を考えて、十分な特異性及び感応性をもってこのタンパク質と結合する信頼性のある抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体を提供することである。
【００１１】
本発明は、ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａキナーゼを特異的に認識し、以下の特性：
上記ヒトまたはマウスのオーロラ−Ａタンパク質を含有するメンブレン上に固定することができる、
免疫沈降により上記ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａタンパク質の検出、適切な場合には精製を可能にする、
上記オーロラ−Ａタンパク質が分泌される生物組織の染色を可能にする、および
上記ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａタンパク質の酵素活性を阻害しない、
を有する抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体が、以下の工程：
−ゲノム中にオーロラ−ＡをコードするヒトｃＤＮＡが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを１５日間にわたってマウスに５回注射し、上記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養物中で不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で上記マウスの免疫感作に用いられた上記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第１のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物由来の内因性（endogenous）オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第２のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第３のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第４のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した上記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、先に定義した特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
により得られるモノクローナル抗体に関する。
【００１２】
したがって、本発明の対象は、より具体的には、３５Ｃ１抗体とも呼ばれる先に記載のモノクローナル抗体であり、該抗体は、２００３年６月１２日にパスツール研究所のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−３０５０として寄託されたハイブリドーマにより分泌される。
【００１３】
本発明の対象はまた、ヒトまたは動物における癌のインビトロ診断法または予後法を行うための、上記定義のモノクローナル抗体の使用、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の使用である。
【００１４】
本発明の対象は、より具体的には、乳癌、胃癌、および結腸直腸癌などの充実性腫瘍のインビトロ診断法または予後法を行うための上記定義のモノクローナル抗体の使用、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の使用である。
【００１５】
本発明は、ＰＣＮＡタンパク質のマーカーなどの細胞増殖マーカー（Tanakaら、1999; Takahashiら、2000）と、上記定義のモノクローナル抗体の併用、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の併用にも関する。
【００１６】
本発明の対象はまた、ヒトまたは動物における先に定義した癌のインビトロ診断法または予後法であって、以下の工程：
個体から採取した生物学的試料の存在下に先に定義したモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体を置く工程（該抗体は適切な場合には固体支持体上に固定される）、
前の工程中にモノクローナル抗体と生物試料中に存在し得る上記オーロラ−Ａタンパク質との間で形成された複合体中の上記オーロラ−Ａタンパク質に結合した上記モノクローナル抗体または上記モノクローナル抗体に結合した上記オーロラ−Ａタンパク質のいずれかを認識する有標の試薬、特に有標の抗体を用いて、上記生物学的試料中に存在し得る前記オーロラ−Ａタンパク質を検出し、適切な場合には定量化する工程（これは必要な場合には上記固体支持体を適当にリンスした後に行う）、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１７】
有利なことに、先に言及した方法に関連し、生物試料の関数として決定される生理学的閾値より低いまたは高いオーロラ−Ａタンパク質の量の決定は、診断される癌に対してそれぞれ良好なまたは劣悪な予後を示す。
【００１８】
本発明の対象はまた、以下：
先に定義した抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体、
適切な場合には、ＰＣＮＡタンパク質のマーカー、特に抗ＰＣＮＡ抗体などの細胞増殖マーカー、
を含むことを特徴とする先に定義した診断方法を行うためのキットである。
【００１９】
本発明はまた乳癌、結腸直腸癌、および胃癌などの癌の処置を意図した医薬の調製のための、上記定義のモノクローナル抗体の使用、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の使用にも関する。
【００２０】
したがって、本発明の対象は、より具体的には、上記定義のモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体を、薬学的に許容し得るビヒクルと併せて含有する医薬組成物である。
【００２１】
本発明の対象はまた、オーロラ−Ａキナーゼ活性の低下を上記抗体を用いて測定する、オーロラ−Ａキナーゼの阻害剤のスクリーニング方法を行うための上記定義のモノクローナル抗体の使用、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の使用である。
【００２２】
本発明の対象は、より具体的には、以下：
−種々の癌（乳癌、結腸癌など）に由来する系などの細胞を、試験された阻害剤により処置する工程、
−上記定義のモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体を用いてオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを免疫沈降し、具体的には以下のパラグラフ３．ｇ）に従った方法によりキナーゼ活性を測定する工程、
を含むことを特徴とするオーロラ−Ａキナーゼの阻害剤をスクリーニングする方法である。
【００２３】
本発明はまた、以下の工程：
−ゲノム中にオーロラ−ＡをコードするヒトｃＤＮＡが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを１５日間にわたってマウスに５回注射し、上記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養において不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で上記マウスの免疫感作に用いられた上記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第１のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物由来の内因性オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第２のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第３のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Ａタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第４のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した上記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、上記定義の特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
を含むことを特徴とする、上記定義のモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した３５Ｃ１抗体の調製方法に関する。
【００２４】
上記定義の３５Ｃ１モノクローナル抗体の詳細な説明およびそれを得る方法により本発明をさらに例説する。
【００２５】
オーロラ−Ａ（配列番号１）をコードするヒトｃＤＮＡを細菌発現ベクター（ｐＥＴ２９  Novagene）に挿入した。
【００２６】
タンパク質キナーゼをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細菌中で産生し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００２７】
次いで、実験室で精製されたタンパク質をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に注射した。
【００２８】
１５日にわたる５回の注射後、マウスを犠牲死させ、マウスの脾臓細胞と培養において不死化されたハムスターの細胞とを融合させてハイブリドーマを得た。
【００２９】
次いで、９６０の量で得られたハイブリドーマを、ウエスタンブロットを用いて、免疫化に用いられたタンパク質を認識する抗体を産生するそれらの能力につき試験した。
【００３０】
次いで、この第１のスクリーニング後の陽性のハイブリドーマを、ウエスタンブロットを用いて、培養ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物由来の内因性オーロラ−Ａタンパク質を認識するそれらの能力につき試験した。
【００３１】
次いで、この第２のスクリーニング後の陽性のハイブリドーマを、培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができるそれらの能力につき試験した。
【００３２】
次いで、この第３のスクリーニング後の陽性のハイブリドーマを、ウエスタンブロットを用いて、培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Ａタンパク質を認識するそれらの能力につき試験した。
【００３３】
この第４のスクリーニング後の陽性のハイブリドーマを、培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識するそれらの能力につき試験した。
【００３４】
これらのすべての基準に対応するハイブリドーマを保持し、クローニングして純粋なクローンを得た。このクローンを３５Ｃ１と命名した。
【００３５】
該３５Ｃ１は、ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａキナーゼを認識する抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体を分泌する。
【００３６】
ヒトおよびマウスのオーロラ−Ａキナーゼを特異的に認識するこの抗オーロラ−Ａモノクローナル抗体は以下の特性を有する：
該抗体は、ウエスタンブロット（ニトロセルロースまたはナイロンメンブレン上でのタンパク質の間接免疫検出）に用いることができる、
該抗体は、培養細胞中のタンパク質を間接免疫検出により位置を特定することを可能にする、
該抗体は、インビトロでのキナーゼの酵素活性を阻害しない、
該抗体は、無細胞抽出物由来のオーロラ−Ａキナーゼを免疫沈降により精製することを可能にする、
該抗体は、オーロラ−Ａのキナーゼ活性を阻害しないので、病理を示す組織から調製されるタンパク質抽出物でのキナーゼ活性をアッセイするのに用いることができる。
【００３７】
１）組み換えオーロラ−Ａタンパク質の精製
ヒトオーロラ−ＡキナーゼをコードするｃＤＮＡを、６個の追加のヒスチジン残基を含有する組み換えタンパク質の産生を可能とする細菌発現ベクターｐＥＴ２９（供給者Novagen）中にクローニングした。タンパク質分解酵素が欠失し、かつ、凍結融解後にリゾチームの産生によって自己溶解する（これらの特性はすべてタンパク質の精製を容易にする）E.coli細菌（供給者Promega）のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を用いた。増殖期（ＯＤ600＝０．６）における細菌中のオーロラ−Ａ−（Ｈｉｓ）６−タンパク質の過剰発現は、１mMのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を添加することにより２２℃で４時間にわたって誘導する。次いで、自己溶解特性に加えてリゾチームおよび超音波を用い、４℃で細菌を溶解した。次いで、オーロラ−Ａ−（Ｈｉｓ）６−タンパク質をニッケルカラムＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（供給者Qiagen）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Qiagenの指示書に従って、２５０mMのイミダゾールでタンパク質を溶出した。次いで、精製タンパク質をcentricon YM-10（供給者Millipore）に通過させ、ＰＢＳ溶液（ＮａＣｌ  １３６mM、ＫＣｌ  ２６mM、Ｎａ2ＨＰＯ4  ２mM、ＫＨ2ＰＯ4  ２mM、ｐＨ７．２）中に置いた。タンパク質画分１５μgを調製し、凍結乾燥し、４℃で保存した。
【００３８】
２）マウスの免疫感作
５０％フロイント完全アジュバント（供給者Sigma）に希釈した組み換えオーロラ−Ａタンパク質１５μgで、腹腔内経路により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。次いで、３週間の間隔をおいて、５０％フロイント完全アジュバントに希釈したオーロラ−Ａタンパク質１５μgでマウスに２度注射した。抗オーロラ−Ａ抗体がマウスの血液中に検出されたとき、該マウスを犠牲死させ、脾臓を取り除いた。ダウンス型のホモジェナイザーにより、懸濁している細胞をこの脾臓から得た。
【００３９】
これらの脾臓細胞を、マウスミエローマに由来し、かつ、ＥＣＡＣＣから得られるＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（Shulmanら、1978）と融合した。５０％ポリエチレングリコール１５００（供給者Roche）中で３７℃において９０分にわたり、脾臓細胞１００×１０6個とＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞２０×１０6個との間で融合を行った。次いで、ＨＡＴ選択培地（供給者Sigma Chemicals）を含有する１０個の９６ウェルの皿内に細胞を分注した。
【００４０】
３）ハイブリドーマのスクリーニング
ａ）ＥＬＩＳＡ
４μg/mlの組み換えオーロラ−Ａタンパクを含有するＰＢＳ１００μlをＥｌｉｓａプレート（９６ウェルプレート）の各ウェル中に投入し、４℃で３６時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、ウェルを３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、供給者Sigma）を含有するＰＢＳで満たし、該プレートを４℃で一晩インキュベートした。次の日、各々の融合上清１００μlを、組み換えオーロラ−Ａを含有するこれらの９６ウェルプレートに移した。これらのプレートを周囲温度で２時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した後、ホスファターゼ結合抗マウス抗体（Sigma Biochemical）とともにインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで２回、ＡＰ溶液（１００mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５、１００mM  ＮａＣｌおよび５mM  ＭｇＣｌ2）で１回洗浄した。合成ホスファターゼ基質（４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物塩）（供給者Merck）を５mg/ml含有するＡＰ溶液５０μlでウェルを満たした後、ウェル中に黄色の染色が現れることにより、モノクローナル抗体の存在を検出した。
【００４１】
ｂ）組み換えタンパク質に対するウエスタンブロット
９６ウェルプレート（８×１２）１０枚をＥＬＩＳＡ試験により分析したが、あまり再現性ある結果が出なかった。次いで、以下の方式により、これらのプレートをウエスタンブロットにより試験した。従来に記載された技術（Roghiら、1998）に従い、組み換えオーロラ−Ａタンパク質をポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブレン上に移した。メンブレンを切り取りオーロラ−Ａタンパク質が移動した位置に対応する領域を単離した。５％ミルクを含有するＴＢＳＴ溶液（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５％  Tween  20）中で４℃で２時間インキュベーションすることにより、メンブレン側をブロッキングした。次いで、２．５％ミルクを含有するＴＢＳＴ溶液で１：１００に希釈された細胞上清とともに４℃で１時間、各メンブレン端をインキュベーションした。製造者が薦める希釈でペルオキシダーゼまたはホスファターゼ（供給者Sigma Chemicals）のいずれかと結合させた第２の抗マウス抗体を用いて、免疫複合体を同定した。反応物の現像を、ペルオキシダーゼ（供給者Amersham Pharmacia Biotech）の場合には、供給者の指示書に従って化学発光技術により実施し、ホスファターゼの場合には製造者の指示書に従って２つの基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（供給者Sigma Chemicals）を用いて比色法により実施した。
【００４２】
各プレートのウェルを、各プレートの各縦列に対応する８個のプールにグループ分けした。組み換えオーロラ−Ａタンパク質に対するウエスタンブロットにより、各プールにおけるモノクローナルの存在を分析した。試験された１２０個のプールのうち、１９個のプールだけが陽性反応を生じた。
【００４３】
各陽性プールに対応する８ウェルの各々を、どのウェルが抗体を含有しているかを特定する目的で、同じウエスタンブロット技術により、別々に試験した。図１はプール番号２で得られた結果の例を示しているが、この特定の場合ではウェルＡおよびＢだけが抗体を含有しており、該ウェルを保持した。
【００４４】
試験された１２０個のプールのうち、１９個のプールだけを保持したが、その理由はそれらが非常に強い陽性反応を示したからである。これらの１９個のプールの中で、２３ウェルだけが組み換えオーロラ−Ａタンパク質に対する抗体を含有していた。
【００４５】
ｃ）内因性ヒトオーロラ−Ａタンパク質に対するウエスタンブロット
今回は同じウエスタンブロット技術を用いて、培養ヒト細胞から調製された全無細胞抽出物のすべてのタンパク質からオーロラ−Ａタンパク質を認識することができる上清を特定した。
【００４６】
選んだ細胞はＨｅＬａ細胞であった。抽出物を約１０6個の細胞を含有する培養皿から調製し、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上に堆積させる溶液に対応するいわゆるLaemmli溶液（Laemmli 197０）１mlで皿中の細胞を溶解し、溶液を９０℃で１０分間インキュベートし、音波処理し、遠心分離し、上清１０μlをゲル上に堆積させた。
【００４７】
ＨｅＬａ細胞の抽出物に対して行ったウエスタンブロットにより、先に選択した２３の上清のうち、１２だけが４６kD（オーロラ−Ａの予想サイズ）のタンパク質を認識することができる抗体を含有していた。
【００４８】
ｄ）ヒト細胞に対する免疫蛍光法
培養ヒト細胞の中心体を装飾することができる抗体を選択するために、追加の工程をスクリーニングに取り入れた。細胞の選択は乳癌に由来する細胞系ＭＣＦ７に対するものとしたが、その理由はこれらの細胞中でオーロラ−Ａタンパク質が過剰発現することが報告されていたからである。
【００４９】
用いた技術は間接免疫蛍光法である。細胞を１２ウェルの皿（供給者Corning Inc）中の丸いガラススリップ上で４８時間培養した。次いで、スリップをＰＢＳ溶液で洗浄し、冷メタノール（−２０℃）で細胞を固定した。次いで、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中において周囲温度で３０分間、細胞をインキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、スリップをＰＢＳに１：５０に希釈したハイブリドーマ上清とともに周囲温度で１時間インキュベーションした。細胞を再びＰＢＳで３回洗浄した後、フルオレセイン＜＜ＦＩＴＣ＞＞（供給者Sigma Chemicals）と結合した第２の抗マウス抗体とともに周囲温度で１時間インキュベーションした。スリップをＰＢＳで３回洗浄し、抗退色剤を含有するMowiol中でブレードとスリップとの間に細胞を置いた。Leica DMRXA蛍光顕微鏡で観察を行い、白黒カメラ（ＣＯＨＵ）で撮った画像をLeica Qfishソフトウエアで処理した。
【００５０】
先に保持した１２の上清のうち、４つだけがＭＣＦ７細胞の中心体および紡錘体極を装飾することができる抗体を含有していた。この位置特定は、オーロラ−Ａキナーゼに対して予期した位置づけと正確に対応する。
【００５１】
ｅ）内因性マウスオーロラ−Ａタンパク質に対するウエスタンブロット
スクリーニングの選択性を増大させる目的で、マウスのオーロラ−Ａのオーソロガスなタンパク質に対して４つの上清を試験した。培養マウス細胞であるｍ−ＩＣｃ１２細胞の無細胞抽出物に対するウエスタンブロットにより第１のスクリーニングを行った。ヒト細胞について無細胞抽出物を調製し、上述と同じ方法でウエスタンブロットを行った。上清のうち２つは、４６kD（マウスオーロラ−Ａキナーゼに対しても予想されるサイズ）のタンパク質を認識することができた。
【００５２】
ｆ）マウス細胞に対する免疫蛍光法
ウエスタンブロットを用いて先に特定した２つの上清が培養マウス細胞の中心体を装飾することができるかどうかを検証した。ＬＬＣ１細胞を選択したが、その理由は該ＬＬＣ１細胞が非常に高い分裂指数を示すためである。２つの抗体のうち１つだけが中心体および紡錘体極におけるタンパク質の位置特定を可能とし、この位置特定はマウスのオーロラ−Ａタンパク質キナーゼについて予想されたものであった。
【００５３】
ｇ）オーロラ−Ａキナーゼ活性のアッセイ
オーロラ−Ａキナーゼ活性の測定を、図５ではミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）４μg（供給者Sigma Chemicals）をまたは図６ではＧＳＴ−Ｈ３タンパク質を産生する細菌の抽出物１０μlを含有する、１μＣｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ３０００Ｃｉ／mmoleを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０mM  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  ５０mM、ＤＤＴ  １mM、ＭｇＣｌ2  １０mM、およびＡＴＰ  １０μM（供給者Amersham Pharmacia Chemicals）２０μl中で行った。反応物を３７℃で１０分間インキュベーションした。反応物１０μlを計数中（図５）、またはポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上での移動、乾燥、オートラジオグラフィーによる検査の後（図６）に解析した。
【００５４】
ｈ）選択されたモノクローナルのクローニング
選択した上清は、融合後に得られた細胞の不均一混合物（heterogeneous mixture）を含有していた。限界希釈を行ってこれらの細胞を継代培養し、２０のクローンを得た。組み換えオーロラ−Ａタンパク質に対するウエスタンブロットを用いてこれらの２０のクローンの上清を試験すると、８つが陽性反応を生じた。これらの８つの上清をヒトＨｅＬａ細胞の抽出物、マウスｍ−ＩＣｃ１２細胞の抽出物に対して試験した。２つの上清だけを保持した。
【００５５】
これらの２つの上清を限界希釈により再び再クローニングし、前述のように再試験した。この最後のクローニングの目的は、継代培養後に再生産され得る抗体産生レベルを維持するクローンを選択することであった。
【００５６】
２つのクローンのうち１つだけが安定であることが分かり、それを３５Ｃ１と命名し、モノクローナルの保存および産生のために保持した。
【００５７】
ｉ）３５Ｃ１モノクローナルの特性（図を参照のこと）
該抗体は、ウエスタンブロットを用いて全無細胞抽出物中でヒトおよびマウスのオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを特異的に認識する（図１）。
【００５８】
該抗体は、培養ヒト細胞およびマウス細胞内でオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを位置を特定する（図３）。
【００５９】
該抗体は、ヒトＭＣＦ７の抽出物由来のオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを免疫沈降させる（図４）。
【００６０】
該抗体は、オーロラ−Ａのキナーゼ活性を阻害しない（図５）。
【００６１】
したがって、該抗体は、オーロラ−Ａタンパク質が該抗体と未だ組み合わさっている間、該オーロラ−Ａタンパク質の免疫沈降およびそのキナーゼ活性の測定を可能にする（図６）。
【００６２】
３５Ｃ１モノクローナルのこれらの特性により、該抗体はオーロラ−Ａタンパク質キナーゼの研究に選択すべきツールとなる。
【００６３】
該抗体を充実性腫瘍の診断法および予後法で用いることができる。オーロラ−Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルは、乳癌細胞の遺伝的不安定性およびグレードのい高い腫瘍と密接に相関している（Miyoshiら、2001）。このことは乳癌では非常に明確に確立された。一方、十分に特異的なモノクローナル抗体がないゆえに、オーロラ−ＡｍＲＮＡの量と癌のグレードとのこうした相関関係は、タンパク質レベルではまだ明らかにすることができていない。抗オーロラ−Ａ３５Ｃ１モノクローナルにより、このタイプの測定が可能となる。該抗オーロラ−Ａ３５Ｃ１モノクローナルにより、一方ではオーロラ−Ａタンパク質の量の測定（ウエスタンブロットおよび免疫組織化学的測定）が可能となり、他方では腫瘍中のオーロラ−Ａ活性の測定（免疫沈降）が可能となり、したがって、それを下回るおよび上回る場合に決定される癌の予後がそれぞれ良好または劣悪である、オーロラ−Ａの量の閾値の決定が可能となる。
【００６４】
さらに、３５Ｃ１抗体により、インビボにおけるオーロラ−Ａキナーゼ活性の阻害剤の有効性試験が可能になる。例えば阻害剤で先に処置したＨｅＬａ細胞からオーロラ−Ａタンパク質キナーゼを免疫沈降させ、その活性をインビボで測定する。これにより、とりわけ、インビボにおける阻害剤の安定性の評価が可能になる。
【００６５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ウエスタンブロットによるハイブリドーマのスキャニング。精製組み換えオーロラ−Ａタンパク質をポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上に沈着させ、ニトロセルロースメンブレン上に移した。メンブレンをケシ色（poppy red）に染色し、オーロラ−Ａに対応するバンドを切り出した。各パネルはオーロラ−Ａを有するメンブレン片に対応する。融合後、細胞を９６ウェルの皿に分注した。上清のアリコートの抗オーロラ−Ａモノクローナルの存在をスクリーニングするために、各列のウェルをプールでグループ分けし、これを各皿に対して行う。次いで、各プールをウエスタンブロットの１〜１２の右側列を用いて試験した。プールが陽性であるとみなされる（ここではプール番号１）と、このプールを構成する各ウェル（ＡからＨまで）の上清を個別に再試験した。この特定の場合に、ウェルＡおよびＢが抗体を含有したが、ウェルＢだけを保持した。
【図２】ウエスタンブロット。全無細胞抽出物をポリアクリルアミドＳＤＳゲル上で分離し、ゲルをニトロセルロースメンブレン上に移した。ウェル１は抽出物を含有しないが、ウェル２は抽出物１０μl（１mlあたり１０6個の細胞に相当する）を含有する。４６kDのオーロラ−Ａタンパク質だけが検出される。
【図３】ヒトおよびマウス細胞中のオーロラ−Ａの間接免疫検出。ヒト細胞はＭＣＦ７であり、マウス細胞はＬＬＣ１である。免疫蛍光法において、ＤＡＰＩ（青）、γ−チューブリン（赤）、およびオーロラ−Ａ（緑）を染色することによりＤＮＡを検出した。
【図４】オーロラ−Ａの免疫沈降。タンパク質をプロテインＡ−セファロースに結合した３５Ｃ１抗体により免疫沈降させる。免疫沈降物をポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分離し、ゲルを移し、免疫複合体を３５Ｃ１モノクローナルで明らかにした。ウェル１：３５Ｃ１抗体のみ；ウェル２：プロテインＡ−セファロースのみで行う免疫沈降；ウェル３：３５Ｃ１モノクローナル抗体で行った免疫沈降；ウェル４：実験室で調製された抗体で行った免疫沈降。
【図５】３５Ｃ１モノクローナル抗体の存在下で測定された精製ヒト組み換えオーロラ−Ａキナーゼの活性。アフリカツメガエル（xenopus）属のオーロラ−Ａタンパク質に対する、ヒトタンパク質と交差しない１Ｃ１抗体を対照として用いる。ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）を基質として用いてキナーゼ活性を測定する。
【図６】ダイナビーズプロテインＡ上に固定された３５Ｃ１抗体により免疫沈降された内因性オーロラ−Ａタンパク質の活性。リン酸化することができるたった１つのセリンを含む基質上でキナーゼ活性を測定する。該基質はＨ３ヒストンの尾部（セリン１０を有する）と融合したＧＳＴ構築物である。セリン１０をアラニンに置き換えた対照の基質も用いる。ウェル１、４、および７は精製組み換えオーロラ−Ａを含有し、用いる。ウェル２、５、および８は免疫沈降された組み換えオーロラ−Ａを含有し、抗体およびプロテインＡ−セファロースに固定される。ウェル３および６はキナーゼを含有しない。ウェル３、４、および５はリン酸化可能な基質であるＧＳＴ−Ｈ３（Ｓ）を含有し、ウェル６、７、および８はリン酸化が可能でない、キナーゼに対するＧＳＴ−Ｈ３（Ｓ／Ａ）基質を含有する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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