(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新しい組織を形成するための、（i）所望の組織の形状に対応する既定の形状を有する浸透性の生体適合性支持体構造物、および（ii）ヒドロゲルと組織前駆細胞とを含む液体ヒドロゲル・細胞組成物を含む組織形成構造物であって、該液体ヒドロゲル・細胞組成物は支持体構造物内で固化され、組織前駆細胞は増殖して新しい軟骨組織、骨組織、または神経組織が形成されるものである、組織形成構造物。
【請求項２】
液体ヒドロゲル・細胞組成物が支持体構造物に注入されるものである、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項３】
支持体構造物が動物に埋め込まれるものである、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項４】
支持体構造物が動物に埋め込まれた後に、ヒドロゲル・細胞組成物が輸送されるものである、請求項３記載の組織形成構造物。
【請求項５】
支持体構造物が所望の組織の形に成型されるものである、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項６】
支持体構造物が、関節に隣接する関節軟骨、骨、骨の一部または骨欠損部の形に成型されるものである、請求項５記載の組織形成構造物。
【請求項７】
支持体構造物が治療すべき哺乳類の脊髄の直径を有する円柱形の形に成型されるものである、請求項５記載の組織形成構造物。
【請求項８】
ヒドロゲル・細胞組成物が、分散された組織前駆細胞を支持するヒドロゲルの固化した浮遊液である、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項９】
支持体構造物がセラミック材料を含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１０】
支持体構造物が生体分解性である、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１１】
支持体構造物がスポンジまたは発泡体を含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１２】
支持体構造物が圧縮可能である、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１３】
支持体構造物が繊維のメッシュを含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１４】
支持体構造物がポリマー繊維のメッシュを含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１５】
支持体構造物がポリグリコール酸繊維とポリ乳酸のメッシュを含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１６】
支持体構造物が、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはポリグラクチンから形成される、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１７】
支持体構造物が多孔性のヒドロキシアパタイトを含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１８】
支持体構造物が金属を含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項１９】
支持体構造物が圧縮可能ではなく、かつ弾力的ではない、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２０】
ヒドロゲルが、多糖類、蛋白質、ポリホスファゼン、ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)ブロックポリマー、エチレンジアミンのポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)ブロックポリマー、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、およびスルホン化ポリマーからなる群より選択される、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２１】
組織前駆細胞が、上皮細胞、軟骨細胞および軟骨を形成する他の細胞、マクロファージ、皮膚細胞、筋細胞、毛嚢の細胞、繊維芽細胞、臓器細胞、骨芽細胞および骨を形成する他の細胞、内皮細胞、粘膜細胞、胸膜細胞、耳管細胞、鼓膜細胞、腹膜細胞、シュワン細胞、角膜上皮細胞、歯肉細胞、神経細胞、ならびに気管上皮細胞からなる群より選択される細胞の前駆細胞である、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２２】
組織前駆細胞が、中枢神経系神経幹細胞、自律神経系神経幹細胞、または末梢神経系神経幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２３】
組織前駆細胞が、脳幹細胞および脊髄幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２４】
組織前駆細胞が神経内分泌幹細胞である、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２５】
組織前駆細胞が、膀胱、小腸、肺、心臓、腎臓、および肝臓の自律神経幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２６】
組織前駆細胞が骨形成細胞の前駆細胞であって、支持体構造物が多孔性のヒドロキシアパタイトを含む、請求項１記載の組織形成構造物。
【請求項２７】
欠損した神経組織を治療するための、（i）所望の神経組織の形状に対応する既定の形状を有する浸透性の生体適合性支持体構造物、および（ii）ヒドロゲルと神経幹細胞とを含むヒドロゲル・神経幹細胞組成物を含む組織形成構造物であって、該欠損神経組織は、以下の段階を含む方法によって治療されるものである、組織形成構造物：
該欠損組織の物理的境界を定める段階；
該欠損組織を摘出して空洞部を作製し、健康な神経組織を空洞部の表面で露出する段階；
神経幹細胞が健康な神経組織に分化するように選択される、一般的なサイズおよび形状の該空洞部において該ヒドロゲル・神経幹細胞組成物を該支持体構造物に装填する段階；および
該支持体構造物を該空洞部に埋め込み、それによって該欠損神経組織を治療する段階。
【請求項２８】
欠損神経組織が中枢神経系組織である、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項２９】
欠損神経組織が脳に存在する、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３０】
欠損神経組織が自律神経系組織である、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３１】
欠損神経組織が神経内分泌組織である、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３２】
神経幹細胞が健康な神経組織から単離される、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３３】
スペーサーが空洞部に一時的に埋め込まれ、その後支持体構造物と置換される、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３４】
ヒドロゲル・神経幹細胞組成物が、支持体構造物が空洞部の中に埋め込まれた後に該構造物に装填される、請求項２７記載の組織形成構造物。
【請求項３５】
脊髄に存在する欠損した神経組織を治療するための、請求項２７記載の組織形成構造物であって、該欠損神経組織は、以下の段階を含む方法によって治療されるものである、組織形成構造物：
該欠損脊髄組織の物理的境界を定める段階；
該欠損脊髄組織を摘出して空洞部を作製し、健康な脊髄組織を空洞部の表面で露出する段階；
一般的なサイズおよび形状の脊髄空洞部においてヒドロゲル・脊髄幹細胞組成物を支持体構造物に装填する段階；および
該支持体構造物を該脊髄空洞部に埋め込み、それによって該欠損脊髄組織を治療する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疾患または損傷によって傷害を受けた組織を修復または交換するために、既存の組織を強化するために、または本来存在しない組織を形成するために、軟骨、骨、神経系、皮膚、臓器、および上皮層のような組織を再生する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
組織の再建手術において用いられる方法および材料に関して、医学会内で多くの関心が寄せられている。新しいアプローチは、新しい組織が組織前駆細胞から増殖して、所望の形状および構造に操作される、組織エンジニアリングである。増殖および操作することができる組織のタイプには例えば、骨、および軟骨が含まれる。
【０００３】
置換軟骨に関して主な用途の一つは、様々な関節の関節表面における欠損を矯正することである。例えば、被験者の膝の損傷を受けた軟骨半月板は、人工的に操作された半月板と交換することができる。例えば、米国特許第5,041,138号（バカンティ（Vacanti）ら）を参照のこと。組織操作の他の例では、組織内の中空空間または管腔に例えば、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、または様々なヒドロゲルに浮遊させた組織前駆細胞を充填することができる。例えば、「注入可能多糖類-細胞組成物（Injectable polysaccharide-cell composition）」と題する、国際特許出願WO 94/25080号（グリフィス-シマ（Griffith-Cama）ら）を参照のこと。
【０００４】
発明の概要
本発明は、浸透性の生体適合性支持体構造の中にヒドロゲルと組織前駆細胞とを含む液体ヒドロゲル・細胞組成物を輸送することによって、被験者において新しい組織を形成する方法を特徴とする。ヒドロゲル・細胞組成物は浸透性の支持体構造を充填し、組成物が固化すると支持体構造の形状となり、細胞が増殖して複製するにつれて新しい組織が形成される。ヒドロゲル・細胞組成物を飽和させた後、支持体構造を被験者に移植することができる。または、支持体構造を被験者に埋め込んだ後、これに液体ヒドロゲル・細胞組成物を充填することができる。例えば、支持体構造を埋め込んで、シリンジまたはカテーテルを用いてヒドロゲル・細胞組成物を注入することができる。支持体構造は増殖させるべき所望の組織、例えば骨、膝の半月板、耳、臓器、鼻、脊髄の一部またはその他の組織、例えば、軟骨様組織もしくは自律神経系組織に対応するように成形することができる。
【０００５】
組織前駆細胞をヒドロゲル中に浮遊させることと、ヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造の中に輸送することを組合せることによって、新しい組織増殖の質ならびに増殖させることができる組織の形状の範囲および構造が著しく改善される。ヒドロゲル・細胞組成物は境界のはっきりした、正確に制御可能な密度を有する細胞の均一な分布を形成する。その上、ヒドロゲルは非常に大きい密度の細胞、例えば5000万個/mlを保持することができる。これらの要因は新しい組織の質および強度を改善する。さらに、ヒドロゲルは栄養分および老廃物の細胞への、および細胞からの拡散を可能にし、これによって組織増殖が促進される。
【０００６】
支持体構造は、ヒドロゲル・細胞組成物に支持体を提供し、支持体構造を満たす増殖しつつある組織の発達および形状を誘導する。組織前駆細胞を保持して浮遊させるのは支持体構造ではなくてヒドロゲルであるため、支持体構造は広範な形状および構造の如何なる形状または構造ともなりうる。特に、適した支持体構造は、ヒドロゲル・細胞組成物を保持するように、そして支持体構造内部のヒドロゲルと支持体構造外の体液との間で栄養分と老廃物の交換を可能にするように、十分に浸透性である。さらに、支持体構造は生体分解性または生体適合性となりうる。支持体構造の例には、スポンジ、発泡体、珊瑚、堅固な無機物、セラミック、またはチタン製の蜂巣状構造のような内孔を有する金属構造、薄く織り合わせたポリマー繊維のメッシュのような細い支柱の骨格、および竿状の金属、無機物、セラミックまたはプラスチックのネットワークのような厚い支柱の骨格が含まれる。
【０００７】
一般的に、一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、新しい組織を形成する方法を特徴とする：ヒドロゲルと組織前駆細胞とを含む液体のヒドロゲル・細胞組成物を得る段階；液体ヒドロゲル・細胞組成物を浸透性の生体適合性支持体構造に輸送する段階；および液体ヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造内で固化させて、組織前駆細胞を増殖させ、新しい組織を形成させる段階。
【０００８】
液体ヒドロゲル・細胞組成物は、液体組成物を支持体構造に注入することによって支持体構造に輸送することができる。
【０００９】
本方法にはさらに、動物、例えばヒトのような哺乳類に支持体構造を埋め込むことが含まれる。支持体構造を動物に埋め込んだ後、ヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造に輸送することができる。
【００１０】
もう一つの局面において、本発明は以下を含む組織形成構造を特徴とする；所望の組織の形状に対応する既定の形状を有する浸透性の生体適合性支持体構造；およびヒドロゲル・細胞組成物がヒドロゲルと組織前駆細胞とを含む、支持体構造に少なくとも部分的に充填するヒドロゲル・細胞組成物。
【００１１】
例えば、細胞は、骨形成細胞となり得て、支持体構造は多孔性のヒドロキシアパタイトを含むことができる。同様に、ヒドロゲル・細胞組成物は、分散した組織前駆細胞を支持するヒドロゲルの固化した浮遊液となりうる。
【００１２】
方法および組織形成構造は以下の特徴のいずれかを含むことができる。
【００１３】
支持体構造は、セラミック材料、金属、スポンジ、発泡体、多孔性ヒドロキシアパタイト、繊維のメッシュ（例えば、ポリグリコール酸繊維とポリ乳酸とのメッシュ）、および様々なポリマーの任意のものを含みうる。例えば、支持体構造は、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグラクチン、またはその組合せから形成することができる。同様に、支持体構造は圧縮性、堅固または弾性となりうる。
【００１４】
支持体構造は、関節に隣接する関節軟骨、骨、骨の一部、骨欠損部、または脳もしくはその他の中枢神経系組織欠損部の形のような、所望の組織の形状に形成することができる。支持体構造はまた、治療すべき哺乳類の脊髄の直径を有する円筒形状に形成することができる。支持体構造はまた、生体分解性となりうる。
【００１５】
ヒドロゲルは以下のいずれかを含むことができる：多糖類、蛋白質、ポリホスファゼン、ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)ブロックポリマー、エチレンジアミンのポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)ブロックポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリマー。
【００１６】
組織前駆細胞は以下のいずれも含むことができる：上皮細胞、軟骨細胞および軟骨を形成する他の細胞、マクロファージ、皮膚細胞、筋細胞、毛嚢、繊維芽細胞、臓器細胞、骨芽細胞および骨を形成する他の細胞、内皮細胞、粘膜細胞、胸膜細胞、耳管細胞、鼓膜細胞、腹膜細胞、シュワン細胞、角膜上皮細胞、歯肉細胞、神経細胞、中枢神経系（CNS）幹細胞のような神経幹細胞、例えば脊髄または脳幹細胞と共に、自律神経系（ANS）幹細胞、例えば小腸、膀胱、肝臓、肺、および心臓の節後幹細胞（交感神経または副交感神経および神経節を操作するため）、気管上皮細胞、肝細胞、膵細胞、ならびに心細胞。組織前駆細胞はまた、神経内分泌幹細胞となりうる。
【００１７】
もう一つの局面において、本発明は単離された哺乳類成体自律神経系神経幹細胞を特徴とする。これらの幹細胞は心臓、膀胱、腸、肺、肝臓および腎臓組織を含む体内の如何なる神経支配組織からも単離することができる。本発明はまた、単離された哺乳類神経内分泌幹細胞、例えば、膵臓（成体または胎児）から単離した細胞のような成体の細胞、または副腎髄質から単離した成体の細胞を含む。
【００１８】
本発明はまた、もう一つの局面において、欠損組織の物理的境界を定めること；欠損組織を摘出して空洞部を作製し、健康な神経組織を空洞部表面で露出すること；神経幹細胞が健康な神経組織に分化するように選択される、ヒドロゲル-神経幹細胞組成物を、一般的な大きさで空洞部の形状である支持体構造に装填すること；および支持体構造を空洞部に埋め込み、それによって欠損神経組織を治療することによって、欠損神経組織を治療する方法を特徴とする。欠損神経組織は、例えば脳もしくは脊髄のCNS組織、ANS組織、または神経内分泌組織となりうる。神経幹細胞は健康な神経組織から単離することができる。この方法において、スペーサーを一時的に空洞部に埋め込んで、後に支持体構造と交換することができる。
【００１９】
ヒドロゲル-神経幹細胞組成物は、構造を空洞部に埋め込む前または後に支持体構造の中に装填することができる。
【００２０】
もう一つの局面において、本発明は、神経系組織の試料を得ること（そして組織を約40゜Fまたはそれ未満に維持する）；第一の液体中で組織を粉砕すること；第一の液体から固形物を分離させること；固形物を第二の液体中で混合して、組織片を分解させて（例えばトリプシンのような酵素によって）混合物を形成すること；混合物を個別の細胞に粉砕して、分化した細胞を破壊すること；粉砕した混合物から固体を分離して、上皮細胞増殖因子（EGF）および選択的に繊維芽細胞増殖因子を含む培養培地に固体を浮遊させること；生存細胞が神経幹細胞であり、各継代時に粉砕して新鮮な培養培地に再浮遊される、培養培地を培養して、生存細胞を少なくとも４日毎に継代すること；ならびに単離された未分化の神経幹細胞の培養を維持するために、培養および継代段階を繰り返すことによって、未分化の哺乳類神経幹細胞、例えば神経内分泌細胞または自律神経系細胞のような成体の細胞を単離および培養する方法を特徴とする。
【００２１】
「ヒドロゲル」とは、有機ポリマー（天然または合成）が、水または他の溶液の分子を捕獲してゲルを形成する三次元の開放格子構造を構成するように固めるまたは固化すると形成される物質である。固化は例えば、凝集、凝固、疎水性相互作用、またはクロスリンクによって起こりうる。本発明において用いられるヒドロゲルは急速に固化して、適用部位に細胞を維持して、それによって貪食または細胞死に関する問題をなくし、適用部位での新しい細胞増殖を増強する。ヒドロゲルはまた、ヒドロゲル中に浮遊させる細胞に対しても生体適合性、例えば毒性でない。
【００２２】
「ヒドロゲル・細胞組成物」とは、所望の組織前駆細胞を含むヒドロゲルの浮遊液である。これらの細胞は、組織源から直接単離することができ、または培養細胞から得ることができる。「組織」とは、天然のマトリクスが特定の生存細胞によって産生される、その天然のマトリクス内に抱埋された特定の細胞の集合体または凝集体である。
【００２３】
「組織前駆細胞」とは、新しい組織の基礎を形成する細胞である。組織細胞は、肝細胞、島細胞、腸起源の細胞、腎臓起源の細胞、毛嚢の細胞、眼の硝子体の細胞、脳の細胞、および材料を主に合成、分泌または代謝するように作用するその他の細胞を含む、「臓器細胞」となりうる。組織前駆細胞は、異なる周囲条件において、多くの異なるタイプの特定の細胞を形成することができる未分化前駆細胞である、いわゆる「幹」細胞（または「前駆」細胞）を含む。例えば、脊髄幹細胞（または前駆細胞）は、運動ニューロン、知覚ニューロン、介在ニューロン、交感神経節前および副交感神経節前ニューロン、ならびに末梢神経系細胞のような、成熟脊髄組織において様々な分化した細胞タイプを形成するように誘導することができる未分化の神経細胞である。
【００２４】
これらの細胞の成熟を誘導する一つの方法は、支持体足場構造の物理特性を変化させることである。単にこれらの足場構造と接触させるだけで、細胞を分化させることができる。同様に、増殖因子またはその他のホルモンをヒドロゲルに加えることによって、これらの細胞の分化を促進することができる。
【００２５】
単離された神経内分泌幹細胞またはANS幹細胞のような「単離された」組織前駆細胞は、動物の組織内でその天然の環境から切り離された、少なくとも一時的にインビトロで培養された細胞である。この用語は、単一の単離された細胞に適用されると共に、分化した細胞をほとんどまたは全く含まない幹細胞を有意に含む、「単離された」幹細胞の培養にも適用される。
【００２６】
特に明記していない限り、本明細書において用いた全ての技術的および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記述した内容と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、有用な方法および材料を下記に記述する。本明細書に記述した全ての論文、特許出願、特許およびその他の引用文献は、参照としてその全文が本明細書に組み入れられる。主題が一致しない場合は、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は説明する目的に限られ、制限的に解釈されない。
【００２７】
本発明は多くの利点を有する。例えば、ゲル化すると、ヒドロゲル・細胞組成物は、支持体構造によって支持され、栄養分が容易に細胞に拡散して老廃物が細胞から拡散することができる均一な浮遊液を生じる。その結果、ヒドロゲルは細胞を生存させ続け、浮遊液の血管再生を可能にして、最終的に新しい組織の増殖および被験者の体内への定着を生じる。その中に液体ヒドロゲル・細胞組成物が輸送される浸透性の支持体構造は、栄養物および老廃物をなおもヒドロゲル内の細胞に、および細胞から拡散させながら、ヒドロゲル・細胞組成物を固化するための形状および構造を提供する。このように、支持体構造は新しい組織の発達および形状を誘導し、環境および周辺組織からの外的応力に抵抗することができるように誘導する、すなわち支持体構造は例えば、支持体構造を骨または軟骨に交換するために用いても、直ちに重力に耐えうる。その上、骨または軟骨において支持体構造が重力に耐える特徴を有することによって、応力がヒドロゲル・細胞浮遊液を通じて伝達され、これがヒドロゲル・細胞浮遊液において骨または軟骨の発達を促進する。
【００２８】
そのような支持体構造が存在しない場合、そのような力によってヒドロゲル・細胞組成物がより歪み、変位するために、被験者は如何なる重量または応力もヒドロゲル・細胞組成物に適用することができないと考えられる。これは、体内のあちらこちらに存在する靱帯、腱および骨のような、応力に曝される構造的組織を置換する場合と類似である。同様に、支持体構造は、圧縮力のみならず、腱を引っ張る、または皮膚を伸ばす場合のような張力にも順応することに留意されたい。そのような場合、支持体構造は腱または皮膚の弾性を模倣するのみならず、隣接する組織に典型的に縫合または接着される末端を有する。
【００２９】
複合的支持体構造もまた可能である。例えば、ヒドロゲル-骨芽細胞（または他の骨前駆細胞）組成物を装填した固体材料の中空管、例えば珊瑚、を外部に有し、ヒドロゲル-脊髄幹細胞組成物を装填した繊維メッシュのようなより軟らかい支持体を中心部に有する支持体構造を作製することができる。
【００３０】
同様に、支持体構造は、ヒドロゲル・細胞組成物の物理的特徴を、細胞に害を及ぼし、細胞へのおよび細胞からの栄養および老廃物の拡散を制限するように変化させることなく、ヒドロゲル・細胞組成物の構造的整合性および所望の形状を維持する。
【００３１】
さらに、支持体構造はそれが例えば、カニューレ、内視鏡または関節鏡によって被験者に容易に埋め込むことができるように圧縮可能で、弾力的となるようにデザインすることができる。このように、支持体構造は、成長させる所望の組織の形状に切断または成型して、カニューレを通じて変形した状態で被験者に埋め込み、所望の体腔内で膨張させ、その後液体ヒドロゲル・細胞組成物を注入することができる。新しい組織のその後の成長は支持体構造の形状をとると考えられる。
【００３２】
ヒドロゲルはまた、時間と共に徐々に膨張して空洞部を満たすように、または時間と共に組織のより大きい塊の生成を促進するようにデザインすることができる。例えば、乳房および肝臓では、遅い膨張によって、組織が増殖する際に個々の細胞に栄養を与えることを可能にすることによって大きい塊を形成する問題が解決される。もう一つの例として、ヒドロゲルは、脊椎は無傷のままである疾患によって損傷を受けた脊髄の一部を治療するために背骨の中で用いることができる。
【００３３】
さらに、ヒドロゲル・細胞組成物、特に神経幹細胞または筋細胞の組成物は、電流を伝導することができる支持体構造に装填することが可能であり、これは、細胞増殖を促進ならびに細胞増殖および遊走の方向を制御するために用いることができる。
【００３４】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなると思われる。
【００３５】
詳細な説明
本発明は、ヒドロゲル・細胞組成物を用いることによる、例えば、軟骨、骨、皮膚、上皮層、新しい臓器、ならびに脳組織、脊髄組織、および末梢および自律神経を含む中枢神経系組織のような、増殖しつつある新しい組織のための方法および組成物を提供する。新しい組織の発達および形状を誘導するために、ヒドロゲル・細胞組成物を浸透性の支持体構造に輸送して、これをヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造に輸送する前または後のいずれかに被験者に埋め込む。以下の章において、適した支持体構造、ヒドロゲル、前駆細胞または幹細胞のような細胞、および輸送方法は、説明となる実施例に沿って記述する。
【００３６】
支持体構造
支持体構造は、ヒドロゲル・細胞組成物を固化するための形状および支持体を提供する。これは浸透性で、典型的に孔状の空洞部または間隙を有し、ここに液体-ヒドロゲル組成物を充填する。例えば、支持体構造は多孔性のポリマーメッシュ、天然または合成スポンジ、所望の孔を有する珊瑚もしくはヒドロキシアパタイト片、または金属、無機、セラミックもしくはプラスチック製の支柱の基質となりうる。支持体構造の浸透性によって、支持体構造に充填されるヒドロゲル・細胞組成物（すなわち、細胞が存在する場所）内への構造外部からの栄養分の拡散が可能となり、細胞によって生成された老廃物のヒドロゲル・細胞組成物を通じての構造からの拡散が可能となり、それによってヒドロゲル・細胞組成物中の細胞の増殖が促進される。その他の液体、例えば体液を、液体ヒドロゲル・細胞組成物を充填する前に支持体構造に満たしてもよいが、ヒドロゲル・細胞組成物はこれらの液体を置換して、支持体構造内で急速に硬化するであろう。
【００３７】
支持体構造は、増殖させる組織の形状に合わせて成型する。例えば、支持体構造は、膝または肘の半月板のような軟骨様組織片、骨欠損部を修復するための骨片、耳、鼻、内部臓器、靱帯、腱、気管（導管として）、下顎、脊髄または脳もしくは皮膚の一部として成型することができる。形成される材料に応じて、支持体構造は、切断、成型、鋳造または支持体構造の所望の形状を生じる如何なる他の方法によっても成型することができる。
【００３８】
支持体構造はまた、生体適合性であり（例えば、ヒドロゲル中に浮遊させる細胞に対して毒性でない）、場合によっては支持体構造は生体分解性である。支持体構造は、ヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造に充填する前または後のいずれかに成型することができる。例えば、部分的に柔軟な支持体構造にヒドロゲル・細胞組成物を充填して、ヒドロゲルが固化すると、例えば手で所望の形状に成型することができる。
【００３９】
場合によっては、支持体構造は柔軟および／または圧縮可能であり、弾力性があることが望ましい。特に、これらの場合では、支持体構造を埋め込む際に、被験者に開けた小さい開口部から、または被験者の小さい開口部に挿入されたカニューレもしくは機器によって埋め込むことができるように、支持体構造を変形させることができる。埋め込み後、支持体構造はその所望の形状および方向に膨張する。
【００４０】
ヒドロゲル・細胞組成物は、支持体構造を被験者に埋め込む前または後のいずれかに支持体構造に注入することができる。ヒドロゲルが固化すると、ヒドロゲルは支持体構造の柔軟性および弾力性を得る。そのような弾力性および柔軟性によって、ヒドロゲル・細胞組成物を飽和させた支持体構造が圧縮および張力に適応することが可能となる。例えば、腱、靱帯、半月板、または皮膚片の組織置換物を、組織置換物を引っ張るおよび伸長させることに関連した張力に適応させ、そして組織置換物が耐える重力に関連した圧縮力にも適応させることができる。さらに、支持体構造の柔軟性および弾力性は、組織置換体の最も侵襲性の低い輸送に適応することができる、例えば支持体構造を圧縮してカニューレを通じて被験者に押し込み、その後被験者の体内で正しい位置に配置された後に膨張させることができる。
【００４１】
支持体構造はポリ無水物、ポリオルトエステル、またはポリグリコール酸のような生体適合性、または生体分解性の合成ポリマーから形成することができる。ポリマーは、得られた支持体構造が細胞を含むヒドロゲル浮遊液に対して適当な形状および支持を提供するように、そして栄養分を細胞に拡散させて細胞の成長（growth）および増殖（proliferation）を促進するように、選択すべきである。栄養物、増殖因子、分化誘導物質または脱分化誘導物質、分泌産物、免疫調節物質、炎症の阻害剤、抑制因子、細胞の分化を増強する、またはリンパネットワークもしくは神経繊維の内植を可能にする生物活性化合物、および薬剤を含む因子をポリマー支持体構造に組み入れることができる。
【００４２】
適したポリマーの例は、グリコライドとラクチドの90：10コポリマーであるポリグラクチンであり、ビクリル（VICRYL：登録商標）編み吸収縫合糸（エシコン社(Ethicon Co.)、ソマービル、ニュージャージー州）として製造される。
【００４３】
ポリマー繊維はフェルト様のポリマーマットに共に圧縮することができ、次にこれを所望の支持構造の形状に切断または他の様式で成型する。または、ポリマー繊維を共に鋳型に圧縮して、圧縮した繊維を支持体構造の所望の形状に鋳造することができる。場合によっては、繊維のメッシュに別の構造を与えるために、成型の際に、さらなるポリマーをポリマー繊維に加えることができる。
【００４４】
例えば、ポリグリコール酸を多孔性のマットに圧縮することができる繊維のメッシュとして成形し、次にこれを所望の形状に切断または他の様式で成型した後、ポリ乳酸溶液（例えば、1.0％溶液）に浸積して、繊維を結合させ、支持体構造を形成するようにそれらの形状を保持させる。ポリ乳酸はポリグリコール酸繊維のクロスリンクに結合して、これらの個々の繊維をコーティングし、これが成型した繊維の形状を固定する。ポリ乳酸はまた、繊維の間の空間を埋める。このように、支持体構造の多孔性は適当量のポリ乳酸を導入することによって特定することができる。繊維のメッシュを所望の形状に成型するために必要な圧力は全く中等度となりうる。重要なことは、ポリ乳酸の結合およびコーティング作用に十分な時間、繊維が所望の形状で固定されることである。繊維の適した長さおよび厚みは、支持体構造の所望の形状および目的に依存する。例えば、繊維の強度はその厚みと比例するが、支持体構造に加えられる外力に抵抗するために十分でなければならない。
【００４５】
または、もしくはさらに、支持体構造はその他のタイプのポリマー繊維、または当技術分野で既知の技術によって生成されたポリマー構造を含むことができる。例えば、ポリマーの膜はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって得ることができる。これらは、所望の形状の浮き彫りパターンを有する成型からポリマー溶液を蒸発させると、所望の形状に鋳造することができる。ポリマーゲルはまた、当技術分野で既知の圧縮成型技術を用いて、厚みのある浸透性のポリマー構造に成型することができる。
【００４６】
支持体構造はまた、多孔性のヒドロキシアパタイトから作製することができる、例えば化学的に改変した海洋珊瑚（例えばインターポア（Interpore：登録商標））、または多孔性を増加させるように改変して、その後所望の形状に成型することができるヒドロキシアパタイトペーストから作製することができる。改変していない海洋珊瑚を用いることができるが、これは体内で吸収される。ヒドロキシアパタイトは、ドラメル(Dremel)ドリルのような当技術分野で既知の装置を用いて、所望の支持体構造の形状に機械加工することができる。ヒドロキシアパタイトまたは珊瑚を支持体構造として使用することは、骨欠損部における増殖しつつある組織にとって特に適当である。ヒドロゲル・細胞組成物を珊瑚に沈着させる場合、針を孔内部に、珊瑚の中深くに挿入してもよく、ヒドロゲル・細胞組成物を液体として注入する。珊瑚の孔は互いに連結しているため、液体ヒドロゲル・細胞組成物は珊瑚の中を浸透して、珊瑚を飽和させ、細胞の均一な分布が得られる。
【００４７】
または、ヒドロゲルは吸引によって支持体構造から引き抜くことができ、または支持体構造は、支持体の足場構造内部でインサイチューでヒドロゲルをクロスリンクさせるために加えた物質によってクロスリンクさせる前に、ヒドロゲル溶液に浸積することができる。もう一つの代用として、幾つかのヒドロゲルは光感作によってクロスリンクすることができる。これは支持体の足場構造がヒドロゲルで飽和すると得ることができる。
【００４８】
支持体構造のサイズおよび形状は、増殖させる組織のサイズおよび形状、例えば、軟骨置換体、骨欠損部、耳、鼻、または欠損した神経組織の一部に作製した空洞部のサイズおよび形状に対応する。例えば、ヒトの脚の骨に対する支持体構造はその中心部が多孔性であり、ヒトの脚の骨と同じ長さおよび厚みとなりうる。そのような場合、ヒドロゲル・細胞組成物は支持体構造の外層と中心部の多孔性領域の双方を満たすか、または外層のみを満たして、外層で発達する組織の内壁まで栄養を輸送するための管として作用するために、中心部の多孔性領域を空のままとする。
【００４９】
もう一つの例において、脊髄損傷を修復するために用いられる支持体構造は、損傷した脊髄の寸法に対応する寸法を有する円柱である。支持体構造は構造を形成するきっかけを与えるのみならず、細胞を移植して、細胞が支持体構造と接触するようにヒドロゲル内を遊走した後の細胞分化を増強する。上皮細胞増殖因子（EGF）および繊維芽細胞増殖因子（FGF）のような増殖因子をヒドロゲルに加えて、分化、複製を増強して、繊維症を阻害することができる。
【００５０】
他の多くのタイプの支持体構造もまた可能である。例えば、支持体構造は、スポンジ、発泡体、珊瑚、生体適合性無機物、セラミック、または例えばチタン製の蜂巣構造のような内孔を有する金属構造、交互に編んだポリマー繊維のメッシュのような生体分解性の細い支柱の骨格、および、例えば竿状の金属、無機物、セラミックまたはプラスチックのネットワークのような生体分解性の厚みのある支柱の骨格から形成することができる。これらの支持体構造は既知の方法を用いて調製される。
【００５１】
ヒドロゲル
本発明の実践のために用いられるヒドロゲルは生体適合性且つ生体分解性でなければならず、好ましくはインビボで急速に固化する、すなわち埋め込まれた支持体構造に輸送された後約５分またはそれ以内に固化し、生細胞を維持することができなければならない。
【００５２】
神経幹細胞に用いるヒドロゲルは三次元で細胞を支持するために十分に粘性があるようにデザインされる。浮遊液の粘度が十分でなければ、細胞は重力によって落下して、均一に分布されず、選択的な場合より悪く機能するようにそれらの表現型が変化する。理想は、ヒドロゲルを支持し、それらの適当な環境で幹細胞の適当な細胞タイプへの分化を増強する繊維のメッシュワークを浸透させるためにヒドロゲル・細胞組成物を用いるまで、細胞を未分化の丸い形状でゲルの中に浮遊させるように維持することである。一方、ヒドロゲルは全ての細胞の遊走を防止するほど十分に粘度があってはならない、または細胞が埋め込み後に分化し始めると、細胞が樹状突起および軸索を伸ばすことを阻害するほど粘度があってはならない。
【００５３】
本発明を実施するために適した異なるヒドロゲルの例には、（1）体温で固化または設定する温度依存的ヒドロゲル、例えばプルロニクス（PLURONICS：登録商標）；（2）イオンによってクロスリンクするヒドロゲル、例えばアルギン酸ナトリウム；（3）可視光または紫外光のいずれかに対する暴露によって固まるヒドロゲル、例えば、アクリル酸末端基を有するポリエチレングリコールポリ乳酸コポリマー；および（4）pHが変化すると固まるまたは固化するヒドロゲル、例えば、テトロニクス（TETRONICS：登録商標）が含まれるが、これらに限定しない。
【００５４】
これらの異なるヒドロゲルを形成するために用いることができる材料の例には、イオンによってクロスリンクするアルギネート、ポリホスファゼン、およびポリアクリレートのような多糖類、または温度変化によって固化するポリ（オキシエチレン）-ポリ（オキシプロピレン）ブロックポリマーであるプルロニクス（登録商標）のようなブロックコポリマー（ポロキサマー（登録商標）としても知られる）、またはpHの変化によって固化するエチレンジアミンのポリ（オキシエチレン）-ポリ（オキシプロピレン）ブロックポリマーであるテトロニクス（登録商標）（ポロキサミン（登録商標）としても知られる）が含まれる。
【００５５】
イオンヒドロゲル
アルギネートまたはキトサンのようなイオン性多糖類は生細胞を浮遊させるために用いることができる。一つの例において、ヒドロゲルは、海藻から単離した炭化水素ポリマーであるアルギン酸の陰イオン塩を、カルシウム陽イオンのようなイオンとクロスリンクすることによって生成される。ヒドロゲルの強度は、カルシウムイオンまたはアルギネートの濃度のいずれかを増加させることによって増加する。例えば、米国特許第4,352,883号は、室温の水中でアルギネートを二価陽イオンとイオンクロスリンクさせて、ヒドロゲルマトリクスを形成することについて記述している。
【００５６】
組織前駆細胞をアルギネート溶液と混合して、既に埋め込まれた支持体構造に溶液を輸送して、その後インビボでカルシウムイオンの生理的濃度の存在により短時間で固化させる。または、埋め込む前に溶液を支持体構造に輸送して、カルシウムイオンを含む外部溶液中で固化させる。
【００５７】
一般的に、これらのポリマーは少なくとも部分的に水溶液、例えば水または荷電側鎖もしくはその一価イオン塩を有する水性アルコール溶液に可溶性である。陽イオンと反応することができる酸性側鎖を有するポリマーには多くの例がある、例えばポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、およびポリ（メタクリル酸）である。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、およびハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基が含まれる。陰イオンと反応することができる塩基性基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、およびポリ（ビニルイミダゾール）である。
【００５８】
ポリホスファゼンは、交互の単結合と二重結合によって離れている窒素および燐原子からなる骨格を有するポリマーである。それぞれの燐原子は２つの側鎖と共有結合している。用いることができるポリホスファゼンは、酸性であって、二価または三価陽イオンと塩架橋を形成することができる多くの側鎖を有する。酸性側鎖の例はカルボン酸基およびスルホン酸基である。
【００５９】
生体浸食性ポリホスファゼンは少なくとも２つの異なるタイプの側鎖、すなわち多価陽イオンと塩架橋を形成することができる酸性側鎖、およびインビボ条件で加水分解する側鎖、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロール、およびグルコシルを有する。生体浸食性または生体分解性ポリマー、すなわち所望の適応（通常、インビボ療法）に許容される時間内で溶解または分解するポリマーは、温度約25℃〜38℃のpH6〜8である生理的溶液に暴露した後、約５年未満、最も好ましくは約１年未満で分解する。側鎖の加水分解によって、ポリマーの浸食が起こる。加水分解する側鎖の例は、非置換および置換イミダゾールならびに側鎖がアミノ結合を通じて燐原子に結合しているアミノ酸エステルである。
【００６０】
様々なタイプのポリホスファゼンの合成および分析法が、米国特許第4,440,921号、第4,495,174号および第4,880,622号に記載されている。上記の他のポリマーを合成する方法は当業者に公知である。例えば、「ポリマー科学エンジニアリングコンサイス辞典（Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering）」、クロシュビッツ（J. I. Kroschwitz）編（ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州、1990）を参照のこと。ポリ（アクリル酸）、アルギネート、およびプルロニクス（登録商標）のような多くのポリマーが市販されている。
【００６１】
荷電側鎖を有する水溶性のポリマーは、ポリマーを、反対荷電の多価イオン、すなわちポリマーが酸性側鎖を有する場合には多価陽イオン、またはポリマーが塩基性側鎖を有する場合には多価陰イオンを含む水溶液と反応させることによってクロスリンクする。ポリマーを酸性側鎖とクロスリンクさせてヒドロゲルを形成するための陽イオンには、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、およびストロンチウムのような二価および三価の陽イオンが含まれる。これらの陽イオンの塩の水溶液をポリマーに加えると、軟らかく非常に膨張性のヒドロゲルが形成される。
【００６２】
ポリマーをクロスリンクさせてヒドロゲルを形成するための陰イオンには、低分子量ジカルボキシレートイオン、テレフタレートイオン、スルフェートイオン、およびカーボネートイオンのような二価および三価の陰イオンが含まれる。これらの陰イオンの塩の水溶液をポリマーに加えると、陽イオンに関して記述したように軟らかく非常に膨張したヒドロゲルが形成される。
【００６３】
抗体をヒドロゲルの中に流入させないが栄養分は流入させる目的のために、ヒドロゲルにおいて有用なポリマーのサイズは10,000 D〜18,500 Dの範囲内である。より小さいポリマーはより小さい孔を有するより高い密度のゲルとなる。
【００６４】
温度依存的ヒドロゲル
温度依存的、または熱感受性ヒドロゲルは本発明の方法において用いることができる。これらのヒドロゲルはいわゆる「逆ゲル化」特性を有する、すなわちそれらは室温または室温より低い温度では液体であり、より高温、例えば体温に加温するとゲル化する。このように、これらのヒドロゲルは液体として室温または室温より低い温度で容易に適用して、体温に加温されると自動的に半固体ゲルを形成する。その結果、これらのゲルは、支持体構造をまず被験者に埋め込み、その後ヒドロゲル・細胞組成物を充填する場合には特に有用である。そのような温度依存的ヒドロゲルの例は、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンF-108、F-68、およびF-127のような、プルロニクス（登録商標）（BASF-ワイアンドット）、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ならびにN-イソプロピルアクリルアミドコポリマーである。
【００６５】
これらのコポリマーは、標準的な技術によって多孔性、分解速度、転移温度、および硬度の程度のような物理特性を変化させるために操作することができる。例えば、低分子量の糖質を塩の存在下および非存在下で加えると、典型的な熱感受性ポリマーの下臨界溶液温度（LCST）に影響を及ぼす。さらに、これらのゲルを５〜25％（w/v）の範囲の濃度で４℃で分散によって調製する場合、粘度およびゲル-ゾル転移温度は影響を受けて、ゲル-ゾル転移温度が濃度に反比例する。これらのゲルは細胞を生存させ栄養を与えることができる拡散特徴を有する。
【００６６】
米国特許第4,188,373号は、熱ゲル化水性系を提供するために水性組成物中にプルロニック（登録商標）ポリオールを用いることを記述している。米国特許第4,474,751号、第4,474,752号、第4,474,753号および第4,478,822号は熱硬化性ポリオキシアルキレンゲルを利用する薬物輸送系について記述している；これらのシステムを用いると、ゲル転移温度および／またはゲルの硬度はいずれも、ポリマーの濃度のみならず、pHおよび／またはイオン強度を調節することによって改変することができる。
【００６７】
一つの例において、15℃より低い場合および50℃より上の温度では粘性の液体であって、温度が15〜50℃の間ではヒドロゲルである23％プルロニックゲルを調製することができる。
【００６８】
pH依存的ヒドロゲル
本発明の方法に用いるために適したその他のヒドロゲルはpH依存的である。これらのヒドロゲルは特定のpH値において、それより下、またはそれより上では液体であり、特定のpH、例えばヒト体内での細胞外液の通常のpH範囲である7.35〜7.45に暴露するとゲル化する。このように、これらのヒドロゲルは埋め込まれた支持体構造に液体として容易に輸送され、体内のpHに暴露されると半固体のゲルを自動的に形成する。そのようなpH依存的ヒドロゲルの例は、テトロニクス（登録商標）（BASF-ワイアンドット）エチレンジアミンのポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンポリマー、ポリ（ジエチルアミノエチルメタクリレート-g-エチレングリコール）、およびポリ(2-ヒドロキシメチルメタクリレート)である。これらのコポリマーは、標準的な技術によってその物理特性に影響を及ぼすように操作することができる。
【００６９】
光固化ヒドロゲル
本発明の方法において用いることができるその他のヒドロゲルは、可視光または紫外光のいずれかによって固化する。これらのヒドロゲルは、米国特許第5,410,016号に記述するように、水溶性領域、生体分解性領域および少なくとも２つの重合化可能領域を含むマクロマーで構成される。例えば、ヒドロゲルは、コア、コアのそれぞれの末端の伸長部、およびそれぞれの伸長部の末端のキャップを含む生体分解性、重合化可能マクロマーによって始めることができる。コアは親水性ポリマーであり、伸長部は生体分解性ポリマー、および末端キャップは可視光または紫外光、例えば長波長の紫外光に暴露されるとマクロマーをクロスリンクすることができるオリゴマーである。
【００７０】
そのような光固化ヒドロゲルの例には、ポリエチレンオキサイドブロックコポリマー、アクリレート末端基を有するポリエチレングリコールポリ乳酸コポリマー、および両端をアクリレートでキャッピングした10K ポリエチレングリコール・グリコライドコポリマーが含まれる。プルロニック（登録商標）ヒドロゲルと同様に、これらのヒドロゲルを含むコポリマーは、分解速度、結晶性の差、および硬度の程度のような物理特性を変化させるために、標準的な技術によって操作することができる。
【００７１】
組織前駆細胞
組織前駆細胞は哺乳類のドナー、例えば被験者自身の細胞から、ドナーの細胞培養物から、または樹立された細胞培養株から直接得ることができる。哺乳類はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコであってもよく、哺乳類はヒトであってもよい。同じ種の細胞および好ましくは同じ免疫学的プロフィールの細胞を、被験者または近親者のいずれかからの生検によって得ることができる。神経組織から単離した神経幹細胞の場合、それらは欠損組織に隣接する健康な組織から、または哺乳類の他の部位の健康な組織から単離することができる。
【００７２】
標準的な細胞培養技術および条件を用いて、細胞をコンフルエントになるまで培養して増殖させ、必要に応じて使用する。細胞は好ましくは特定の応用にとって十分数の細胞が得られるまで培養する。
【００７３】
免疫学的に異なるドナーからのヒト筋細胞のように、免疫反応を誘発してもよい細胞を用いる場合、レシピエントは必要に応じて、例えばステロイドおよびシクロスポリンのような他の免疫抑制剤のスケジュールを用いて免疫抑制することができる。しかし、自家細胞を用いれば、そのような免疫学的反応は防止されると考えられる。
【００７４】
細胞はドナーから直接得て、洗浄して、支持体構造に輸送する前に選択したヒドロゲルに浮遊させることができる。細胞の増殖を増強するために、細胞を支持体構造に挿入する直前にヒドロゲルに加えるまたは混合する。
【００７５】
生検によって得られた細胞を回収して、培養し、その後必要に応じて望ましくない細胞の汚染を除去するために継代する。軟骨細胞および骨芽細胞の単離は下記の実施例に記述する。中枢神経系幹細胞、例えば脳、脊髄、自律神経系細胞および神経内分泌細胞（未分化状態で維持される）の単離、培養および継代についても下記に記述する。
【００７６】
細胞生存率は、光学または走査型電子顕微鏡による視覚的観察、組織学または放射性同位元素による定量的評価を含む標準的な技術を用いて評価することができる。支持体構造に輸送された細胞の生物機能は、上記の技術と標準的な機能的アッセイ法との組合せを用いて決定することができる。
【００７７】
支持体構造に輸送してその後新しい組織を増殖することができる細胞の例には、上皮細胞；軟骨細胞および軟骨を形成する他の細胞（「軟骨形成細胞」）；マクロファージ；皮膚細胞；筋細胞；毛嚢；繊維芽細胞；臓器細胞；マクロファージ；骨芽細胞；骨膜細胞および骨を形成する他の細胞（「骨形成細胞」）；内皮細胞；粘膜細胞、例えば鼻、胃、膀胱および口腔粘膜細胞；胸膜細胞；耳管細胞；鼓膜細胞；腹膜細胞；シュワン細胞；角膜上皮細胞；歯肉細胞；気管上皮細胞；ならびに例えば脳、脊髄および自律神経系からの神経幹細胞およびニューロンを含む神経細胞が含まれる。
【００７８】
新規組成物および方法において用いられる神経幹細胞は、多様な神経系組織から単離することができる。例えば、細胞は脊髄組織、脳組織、および他の中枢神経系組織と共に、末梢神経組織、自律神経系組織から単離することができる。末梢神経系組織幹細胞は、脊髄灰白質におけるCNSに由来し、脊髄の神経幹細胞の単離について本明細書に記述するように、単離することができる。自律神経系節後幹細胞（脊髄外）は、本明細書に記述するように様々な組織から、例えば心臓、腎臓、小腸、肝臓、肺、および膀胱組織のような如何なる神経支配臓器からも、単離することができる。自律神経系節前幹細胞は脊髄灰白質に存在し、したがって脊髄幹細胞と同じ方法で、および脊髄幹細胞と共に単離される。
【００７９】
神経内分泌幹細胞は副腎髄質のような領域に認められ、細胞に分化して、エピネフリンおよびノルエピネフリンのようなカテコールアミンを生成し、またそれらがインスリン（β島）またはグルカゴン（α島）を分泌する細胞へと発達する場合には膵臓に認められる。その他の神経内分泌細胞源は副甲状腺、下垂体、および視床下部腺である。これらの細胞は成体哺乳類、例えばヒトから、自律神経系節後幹細胞と同じように単離することができ、糖尿病のような内分泌疾患を治療するために用いられる組織構築物を調製するために用いることができる。
【００８０】
単離された細胞は、様々な増殖因子に暴露された場合に細胞がニューロン、乏突起細胞、星状細胞、および他の神経組織に分化することができるという点において、未分化でなければならない。細胞は、胎児神経組織も用いることができるが、成体神経組織から単離することができる。
【００８１】
修復すべきまたは増強すべき神経組織が脊髄組織である場合、ヒドロゲル・細胞組成物において用いられる神経細胞は脊髄組織から単離することができる。同様に、脳組織を修復するためのヒドロゲル-神経幹細胞組成物は、脳組織から単離した神経細胞を含むことができる。しかし、神経組織から得られた幹細胞が十分に未分化であれば、これらの細胞は、必要とする特定の種類の神経組織に分化するように誘導することができるため、これらの細胞を何らかの神経系欠損の治療に用いることができる。
【００８２】
上皮細胞増殖因子および塩基性繊維芽細胞増殖因子のようなサイトカインを含む、単離された幹細胞は、各継代時に繰り返し粉砕する（triturate）ことによって未分化な状態で培養して維持される。単離した神経幹細胞が培養中で増殖し始めれば、それらはまた合体して多数の未分化細胞を含むニューロスフェアを形成する。これらの細胞を未分化状態で維持するために重要なことは、細胞が軸索および樹状突起を伸ばし始める前に細胞を粉砕することである。粉砕プロセスは５〜10日毎に実施すべきである；１週間間隔が申し分ないように思われる。この繰り返し粉砕および継代によって、単離された未分化の神経幹細胞を無限に培養することが可能となる。
【００８３】
ヒドロゲル・細胞組成物の調製
第一に、選択したヒドロゲルを標準的な技術によって調製する。例えば、濃度５〜25％（w/v）の範囲の生体分解性熱感受性ポリマーが本発明にとって有用である。ヒドロゲルがアルギネートである場合、これは例えば、0.1 M燐酸カリウム溶液のような水溶液に、生理的pHで、濃度0.5〜２重量％、例えば１％で溶解して、イオン性ヒドロゲルを形成することができる。
【００８４】
第二に、単離された組織前駆細胞を、再生すべき組織濃度を模倣するような濃度、例えば細胞1000万個〜１億個/ml、例えば2000〜5000万個/mlでポリマー溶液中に浮遊させる。支持体構造に輸送すべき細胞の最適な濃度は、ケースに応じてで決定し、細胞のタイプおよび支持体構造を埋め込む被験者の体内の領域に応じて変化させてもよい。最適化実験は、新しい組織の増殖を支持するために最適な粘度および細胞数を提供するために、ごく少数のパラメータ、すなわち細胞濃度またはヒドロゲル濃度を改変する必要がある。
【００８５】
例えば、下記に示すように、ラット大腿骨の形状の骨組織の新しい増殖は、直径５ mmのポリマー支持体構造の完全な厚みを貫通し、骨膜細胞約5000万個/mlを含むヒドロゲル・細胞組成物を注入後に認められた。
【００８６】
支持体構造への輸送および埋め込み
液体ヒドロゲル・細胞組成物は本明細書に記述の浸透性支持体構造のいずれかに輸送される。図１は、交互に編まれたポリマー繊維12のメッシュから形成された支持体構造10の場合について、充填された支持体構造の断面図を示す。繊維間の空間は相互に連結した孔14を形成し、これに液体ヒドロゲル・細胞組成物を充填する。輸送後短時間の間に、例えば３または５分未満に、ヒドロゲル16は固化して、それによって細胞18は支持体構造10の孔14内でヒドロゲル中に浮遊した状態で維持される。固化したヒドロゲル16は細胞を生存可能な状態に保ち、栄養分および老廃物を支持体構造の相互連絡孔を通じて拡散させ、最終的に新しい組織を増殖させ、被験者の体内に定着させる。
【００８７】
支持体構造10は、ヒドロゲルを通じて拡散させるための浸透性の通路を提供しながら、ヒドロゲル・細胞組成物を固化するための形状および構造を提供する。細胞によって増殖した組織は支持体構造の形状をとり、該支持体構造により、新しい組織が増殖する際に環境および周辺組織からの外的応力に抵抗するために十分な構造的整合性が提供される。ヒドロゲルが神経系幹細胞を含む場合のような特定の態様において、ヒドロゲルは、メッシュ構造におけるポリマー繊維のように、細胞を浮遊させ続け、支持体構造に接着させないことによって、体内に埋め込む前は未分化の状態で細胞を維持するために重要な役割を有する。埋め込み後、支持体構造は、運動、感覚、および線条体ニューロンのような異なる神経細胞になるように幹細胞の分化を促進するために重要な役割を果たす。
【００８８】
液体ヒドロゲル・細胞組成物は、支持体構造を被験者に埋め込む前または後のいずれかに成型された支持体構造に輸送することができる。輸送の特定の方法は、支持体構造が、ヒドロゲル・細胞組成物の所定の粘度に関して十分に「スポンジ様」であるか否か、すなわち支持体構造が固化する前に液体ヒドロゲル細胞組成物を容易に保持するか否かに依存すると考えられる。スポンジ様支持体構造は液体ヒドロゲル・細胞組成物に浸積して、飽和させ、その後組成物から除去することができる。次に、ヒドロゲルを支持体構造内で固化させる。次に、ヒドロゲル・細胞含有支持体構造を被験者に埋め込む。支持体構造は、ヒドロゲルが完全に固化する前に、被験者に埋め込むことができる。または、支持体構造を被験者に埋め込む前または後のいずれかにスポンジ様支持体構造に液体ヒドロゲル・細胞組成物を注入することができる。次に、ヒドロゲル・細胞組成物を固化させる。支持体構造に注入すべき液体ヒドロゲル・細胞組成物の容量は、支持体構造の容積、すなわち増殖させる所望の組織の容積より典型的には少ないが、いくぶん同等である。
【００８９】
液体組成物を容易に保持しない支持体構造は、幾分異なる方法を必要とする。これらの場合、例えば支持体構造を液体ヒドロゲル・細胞組成物に浸積して飽和させてから、部分的に固化させる。細胞含有ヒドロゲルが、支持体構造がヒドロゲルを保持することができる点まで固化すれば、部分的に固化したヒドロゲルから支持体構造を除去して、必要であれば、支持体構造の外側に接着したままである部分的に固化したヒドロゲルを除去する、例えば、構造から剥離させる。または、液体ヒドロゲル・細胞組成物は支持体構造を含む鋳型に輸送することができる。例えば、液体ヒドロゲル・細胞組成物はそうでなければ、支持体構造を含み、その外形およびサイズがマッチする液体密閉鋳型に注入することができる。次に、加熱、冷却、光の暴露、またはpH調節によってヒドロゲルを鋳型内で固化させその後ヒドロゲル・細胞含有支持体構造を鋳型から外すと、被験者に埋め込む準備ができる。
【００９０】
他の態様において、支持体構造は、被験者の例えば皮下または真皮下に埋め込み、その後例えばシリンジまたは内視鏡装置による注入によって、埋め込んだ支持体構造に液体ヒドロゲル・細胞組成物を輸送する。支持体構造に注入されるヒドロゲル・細胞組成物の容積は、支持体構造のサイズ（すなわち増殖させる所望の組織によって置換された容積）に近似すべきである。埋め込まれた支持体構造は、注入された液体ヒドロゲル・細胞組成物にとっての空間および構造的鋳型となる。上記のように、ヒドロゲル・細胞組成物のいくつかは固化する前に支持体構造から漏出してもよい。しかし、この態様において、埋め込まれた支持体構造周辺に存在する組織（例えば、筋肉、骨、軟骨）は、液体ヒドロゲル・細胞組成物を、それがゲル化するまで支持体構造内に十分拘束すると考えられる。皮膚の組織置換の場合のような他の態様において、支持体構造は、例えば、縫合または接着剤によって、被験者に外部から結合させることができる。
【００９１】
上記の場合のいずれにおいても、ヒドロゲルは用いる特定のヒドロゲルに対応する方法を用いて固化する（例えば、プルロニック（PLURONIC：登録商標）温度感受性ヒドロゲルを含む組成物はゆっくり加熱する）。
【００９２】
支持体構造を埋め込むために、哺乳類被験者の埋め込み部位は、外科的切開によって暴露して、支持体構造をその部位に直接埋め込む。または埋め込み部位は例えば、内視鏡、腹腔鏡、関節鏡、または食道鏡の助けを借りて見ることができ、それらは全て、小さい切開部を通じて支持体構造を埋め込むための機械的結合および輸送系を含むように改変することができる。埋め込みの際、部位は血液を含む体液を、例えば大量の空気または吸引によって除去する。このように、ヒドロゲル・細胞含有支持体構造は腹腔鏡、内視鏡、咽頭鏡、膀胱鏡、直腸鏡、または胸腔鏡によって、腹腔内、腹腔外、および胸腔のような管腔もしくは空洞部の内表面、またはその他の表面に導入し、その後所望の空間に埋め込むことができる。
【００９３】
埋め込み技法全体を通じて、輸送および埋め込み段階の際に細胞に生じた損傷の量は、用いる細胞に特異的な生物機能を測定することによって決定することができる。例えば、軟骨細胞を適用する場合には、新しい軟骨の整合性を、圧縮係数の決定のような、標準的な生物機械的応力分析によって評価することができる。
【００９４】
新しい組織の増殖の方向および経路を提供することに加えて、支持体構造はまた、発達途中の組織に与えられる外的応力を変化させることができることに注目することは重要である。特に、支持体構造は選択した方向に沿って外的応力を伝達または軽減することができ、これによって組織の発達を最適にすることができる。例えば、支持体構造は圧縮力に耐えることができ、それによって支持体構造内で発達しつつある骨組織への圧縮力を軽減することができる。同時に、新しい骨細胞は通常の応力下、例えば、歩行によって生じるような応力下で発達し、それによって負荷力が存在しない条件で増殖した骨組織より強い骨組織を形成する。
【００９５】
同様に、支持体構造は、伸長またはねじれ運動によって発達途中の腱または靱帯組織に与えられた外的張力を伝達することができる。そのような張力は腱および靱帯組織の増殖を促進し、そのような力が存在しない場合に増殖させた組織より強い組織を形成する。
【００９６】
支持体構造の被験者体内での配置および支持体構造の内部構築は、支持体構造が発達中の組織に対して外力をどのようにカップリングさせるかを左右する。例えば、支持体構造を構築するために用いられるポリグリコール酸繊維は、支持体構造の機械特性が異方性であるように好ましい方向に沿って向けることができる。そのような例では、支持体構造の異方性特性は、異なる筋膜平面の発達、骨格組織および心筋における筋束のような組織における束の方向、心筋内の伝導システムおよびニューロンのような極性組織の発達に影響を及ぼす可能性がある。
【００９７】
適用
ヒドロゲル・細胞組成物は異なる多くの種類の前駆細胞を支持することができ、支持体構造は新しい組織の発達および形状を誘導することができるため、新しい方法は、新しい組織を形成するために望ましい如何なる場合にも用いることができる。下記に述べる特定の応用は軟骨、骨、および神経組織の形成に関する。
【００９８】
軟骨欠損の治療
軟骨はマトリクス内に封入された細胞からなる特殊なタイプの密な結合組織である。軟骨には幾つかの種類がある。ヒアリン軟骨は、コラーゲン様繊維を含む均一なマトリクスを有する青みがかった白色のガラス様の半透明の軟骨であり、関節軟骨、肋軟骨、鼻中隔、ならびに咽頭および気管に認められる。関節軟骨は骨の関節表面を覆うヒアリン軟骨である。肋軟骨は真の肋骨および胸骨に結合する。繊維様軟骨はコラーゲン繊維を含む。黄色軟骨は軟骨細胞を保持する弾性繊維のネットワークであり、これは主に咽頭蓋、外耳、および耳管に認められる。適当な軟骨前駆細胞を回収することによって、これらの如何なるタイプの軟骨組織も本発明の方法を用いて増殖させることができる。
【００９９】
例えば、膝の軟骨半月板を置換するために新しい組織を増殖させることができる。生体適合性支持体構造は例えば、スポンジと類似の物理的構造を有し、置換すべき半月板の形状に切断または成型することができる。次に、生体分解性でもある支持体構造を関節鏡を通じて膝関節に輸送し、適当な方向に配置する。支持体構造はスポンジ様であるため、これは関節鏡によって輸送する場合には圧縮することができ、膝に適切に配置した後に再度膨張させる。その後、液体ヒドロゲル-軟骨細胞組成物をスポンジに注入して、支持体構造の孔を充填する。ヒドロゲルはその後固化して所望の半月板置換の形状をとり、浮遊させた軟骨細胞への、および該細胞からの栄養および老廃物の拡散を可能にする軟骨細胞の浮遊液を提供する。時間が経つにつれて、例えば約６週間のあいだに、浮遊液は血管を形成して、軟骨細胞は新しい軟骨様組織に増殖して、半月板の形状となり、存在する組織に定着する。
【０１００】
骨欠損の治療
もう一つの実施例において、骨膜細胞（すなわち、骨増殖細胞）を本発明において用いて、骨欠損部を満たす、または新しい骨全体を調製することができる。第一に、支持体構造を骨欠損部の寸法に合わせて作る。支持体構造をポリマー繊維から形成して、所望のサイズおよび形状に切断または成型することができ、または支持体構造をヒドロキシアパタイトまたは珊瑚片から形成して、所望のサイズおよび形状に機械加工することができる。次に、ヒドロゲル-骨膜細胞組成物を、骨欠損部内に配置させる前または後のいずれかに支持体構造に輸送することができる。必要であれば、接着剤を用いて骨欠損部内部の骨に支持体構造を接着させることができる。再度、ヒドロゲルが固化して、細胞を浮遊および維持すると、その後骨組織が増殖して、骨欠損部を満たす。場合によっては、支持体構造は新しい骨組織が完全に増殖する前でさえも何らかの部分的重力に耐えることができる。
【０１０１】
神経組織欠損部の治療
他の実施例において、ヒドロゲル・細胞組成物は、脳組織、脊髄組織、末梢神経、自律神経および神経内分泌細胞を含む中枢神経組織を形成する細胞を含むことができる。支持体構造は、卒中または他の損傷後に脊髄または脳欠損部を有する被験者に埋め込むことができ、ヒドロゲル・細胞組成物を支持体構造に注入する、または支持体構造にヒドロゲル・細胞組成物を浸透させて、埋め込むことができる。次に、支持体構造は新たに生成された神経組織の増殖および発達を誘導する。神経組織における欠損部は例えば、疾患、物理的外傷、再還流損傷、虚血、または感染症が原因であってもよい。しかし、神経組織における如何なる欠損も新しい方法を用いて治療することができる。
【０１０２】
新しいヒドロゲル-神経幹細胞組成物を用いて、体内全体の神経組織における欠損を治療することができる。例えば、梗塞した脳組織、脊髄または自律神経において損傷または切断された神経組織は、必要に応じて、支持体構造を伴って、または伴わずに、損傷した組織を新しいヒドロゲル-神経幹細胞組成物に置換することによって全て治療することができる。
【０１０３】
まず、欠損した神経組織の領域および境界部を、例えば、MRI、CATスキャン、PETスキャン、誘発電位、または血流分析を用いて明確にする。欠損した、すなわち傷害を受けたまたは損傷した神経組織の外部境界域が明確になれば、傷害または損傷を受けた組織を、空洞部を形成するためにきれいに切断して外科的に摘出し、切断の境界域（空洞部の端部または表面）に正常な健康な神経組織を残す。灰白質細胞を損傷した組織周辺の健康な組織から除去して培養すると、単離された神経幹細胞を生じ、これを培養、増殖、および継代して、治療のために十分数の細胞を得る。
【０１０４】
単離された神経幹細胞を培養および増殖する間、例えば７〜14日間のあいだに、炎症反応を全く起こさないか、起こしても最小であるようにデザインされた不活性な生体適合性スペーサー（例えば、アルギン酸カルシウムのスペーサー）を、好ましくは損傷した神経組織の摘出によって生じた空間に挿入する。この生体適合性スペーサーは、増殖因子のような薬剤、ステロイドのような抗炎症化合物、および／または損傷した組織の摘出によって生じた空間への繊維様組織の増殖を防止するためにデザインされた他の薬剤を浸透させることができる。
【０１０５】
自家細胞を十分な細胞数に増殖させた後、ヒドロゲル・細胞組成物を本明細書に記述のように調製して、支持体構造、例えば繊維様メッシュに加えて、摘出した損傷組織の形状に形成する。次にヒドロゲル・細胞組成物を装填した支持体構造を、スペーサーを除去した後に残っている空間に埋め込む。当然のことながら、培養した神経幹細胞を直ちに埋め込みに利用できる場合、スペーサーは必要ない。または、支持体構造を埋め込んでヒドロゲル-神経幹細胞組成物を例えばシリンジによって装填することができる。
【０１０６】
神経系組織に対する損傷の後可能な限り速やかに手術を行うことが好ましいが、埋め込まれた支持体構造のいずれかの側に健康な神経組織が露出するきれいな切断面が手術によって残っている限り、新しい方法を用いて、手術の数週間から数ヶ月前に起こった損傷を治療することができる。自家細胞はまた、損傷した神経組織を摘出する手術部位以外の部位から切除することができる。例えば、自家神経細胞を、定位生検を用いて摘出することができ、または針、例えば脊髄に挿入した針を用いて吸引によって得ることができる。これは、新しい培養方法に必要な細胞数は、単離された神経幹細胞のごく少量の細胞、例えば細胞約５個でよいため、このようなことが可能である。例えば、22ゲージ吸引針を用いることができる。
【０１０７】
梗塞、癌、脳卒中によって生じた組織障害、または銃による創傷、もしくは他の挫傷もしくは擦過傷を含む神経系組織に対する如何なる局所的傷害または損傷も、修復することができる。さらに、パーキンソン病のような様々な神経系疾患は、疾患を有する被験者において失われている蛋白質を発現する遺伝子を含むように遺伝子操作された神経幹細胞を含むヒドロゲル・細胞組成物を埋め込むことによって治療することができる。
【０１０８】
自律神経系欠損部の治療
交感神経および副交感神経系を含む自律神経系（ANS）は、節前および節後ニューロンに分けられる。節前ニューロン細胞体は中枢神経系に存在し、これらの節前ニューロンを形成する神経幹細胞は、本明細書に記述のCNS幹細胞単離に関する技術を用いて単離される。自律神経系節後神経幹細胞を単離する技術は実施例８に記載する。
【０１０９】
新規ヒドロゲル-ANS神経幹細胞組成物を用いて、まずこれらの細胞を宿主から単離して、EGFおよびbFGFのようなサイトカインおよびホルモンを用いて標準的な完全培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/F12）によってインキュベータ内で培養してそれらを増殖させることによって、生体の如何なる臓器系も実質的に神経支配させることができる。界面活性剤であるプルロニックF127のような生物学的不活性なヒドロゲル中での細胞株浮遊液の適当な増殖により、５〜50×106個/mlまでの濃度を得ることができる。次に、このヒドロゲル組成物を宿主の機能不全臓器（例えば、弛緩した膀胱壁、または腸の神経節欠損部分）に直接（局所的に）注射する。時間と共に、ヒドロゲルは消失し、後にANS幹細胞が残ってこれが自律神経ニューロンに分化して、既存のニューロンと自然にシナプスを形成（連絡）して、臓器の機能が回復する。
【０１１０】
臨床的適用には、自律神経系によって神経支配されている生体の如何なる臓器系または一部も含まれる。例には：糖尿病および高齢者における弛緩した膀胱、ヒルシュスプルング病のような神経節欠損腸障害、性的不能が神経支配障害によって引き起こされている場合の性機能障害、皮膚または臓器への自律神経血行問題、および血管の実際の神経支配欠損が含まれる。さらに、自律神経支配が喪失したための腺機能障害を治療することができる。
【０１１１】
さらに、ANS幹細胞は、例えば操作した臓器において、新たに形成された組織、例えば肝臓、腎臓、腸、および膀胱の細胞構築および自律神経支配を誘導するために、他の操作された組織と共に用いることができる。これらの操作された臓器は、組織前駆細胞が臓器細胞、例えば肝細胞または心筋前駆細胞と、自律神経節後神経幹細胞の双方を含む、支持体構造およびヒドロゲル・細胞組成物を含むと考えられる。
【０１１２】
神経幹細胞のさらなる用途
CNS、例えば皮質、線条体、および脊髄から単離した神経幹細胞と共にANSもまた、組織が操作された臓器を調製するために用いられる前駆細胞の混合物にこれらの神経幹細胞を含むことによって、他の操作された組織、例えば腎臓、肝臓、腸、および膀胱のような人工臓器の構築および発達を組織化する際に役立つ「有能な（smart）細胞」として用いることができる。
【０１１３】
パーキンソン病のような神経変性プロセスは、例えば米国特許第5,082,670号および第5,762,926号に記述のような、標準的な技術を用いてドーパミンを産生するように遺伝子操作して（またはドーパミンを産生する天然に存在する幹細胞によって）、そしてヒドロゲルに加えて、および／または支持体構造に注入される、自家神経幹細胞によって治療することができる。そのようなヒドロゲル-神経幹細胞組成物は、注入された細胞浮遊液の場合より、埋め込み後長い間機能するであろう。
【０１１４】
同様に、白質萎縮症のような遺伝的神経変性プロセスは、遺伝的に修復された神経幹細胞によって治療することができる。
【０１１５】
さらに、神経内分泌幹細胞は、副腎髄質または膵臓から単離することができ、糖尿病のような内分泌障害を治療するための内分泌組織構築物を調製するために用いることができる。
【０１１６】
実施例
本発明は、以下の非制限的実施例を参考にしてさらに理解されると思われる。
【０１１７】
実施例１
アルギン酸カルシウム・軟骨細胞組成物の調製
溶解度の低いカルシウム塩である硫酸カルシウムと、0.1 M燐酸カリウム緩衝液（pH 7.4）に溶解した１％アルギン酸ナトリウムと混合することによって、アルギン酸カルシウム混合物を得る。混合物は４℃では液状のままであり、その温度を15℃以上に増加するまで液状である。軟骨細胞を、標準的な技術を用いて軟骨組織、例えば、仔ウシ前肢の関節表面から単離して、混合物に約２〜５×107個/ml（例えばヒト若年関節軟骨の細胞密度の約10％を占める）の最終細胞密度となるように加える。そのような混合物は浸透性の支持体構造に輸送することができる。
【０１１８】
実施例２
熱感受性ヒドロゲル-軟骨細胞組成物の調製
生体適合性、生体分解性の可逆的熱感受性コポリマーゲルはプルロニック（登録商標）F127、F68ブロックコポリマー（BASFから入手可能）の30％重量／容積溶液を調製することによって得た。溶液は15℃未満では液状であるが、温度が15℃以上に上昇すると５〜10分以内に固化する。標準的な技術を用いて仔ウシ前肢の関節表面から軟骨細胞を単離して、最終的な細胞密度が約２〜６×107個/mlとなるようにヒドロゲル混合物に加えた。そのような混合物は浸透性の支持体構造に輸送することができる。
【０１１９】
実施例３
浸透性の支持体構造を用いたラットにおける遠位大腿骨の組織増殖の誘導
本実施例において、合成、生体適合性ポリマー支持体構造を用いて、ラットにおける遠位大腿骨を置換するために、ヒドロゲル・細胞組成物から形成された新しい骨組織の発達を誘導した。
【０１２０】
ラットを屠殺して、その遠位大腿骨を摘出した。骨を目盛り付きシリンダー内で液体に浸積させて、骨によって置換された容積を測定し、これは約１ ccであった。その後、標準的なアクリル酸成型技術を用いて大腿骨の外形鋳型を作製した。外形鋳型を用いて、ポリグリコール酸とポリアクリル酸で構成される多孔性の支持体構造を以下のように作製した。
【０１２１】
直径14ミクロンのポリグリコール酸繊維を、繊維間の距離が平均で150〜250ミクロンであるメッシュにからませた。次に、繊維のメッシュをポリ乳酸の１％溶液に約10秒間浸積して、飽和させた。水と類似の粘度を有する溶液を、繊維にコーティングして、繊維が互いに交差する場所で互いに繊維を溶接した。繊維のメッシュがまだポリ乳酸溶液で濡れている間にこれを圧縮成型して数分間乾燥させた。溶液が蒸発してポリ乳酸が乾燥した後、繊維のメッシュは鋳型の形状を保持した。技法は室温で行い、直径約200ミクロンの穴または孔を有する遠位大腿骨の形状をとる支持体構造を形成した。大腿骨そのものは長さが15 mmで、直径が３〜７ mmであった。図２は大腿骨支持体構造の写真である。
【０１２２】
次に、支持体構造をヌードマウスの背部の皮下に埋め込んだ。図３は、支持体構造を埋め込んだ後のヌードマウスの写真である。写真は明らかに、マウスの皮膚を通じて、大腿骨の形をした支持体構造の明確な構造を示している。次に、骨膜細胞を含むヒドロゲル・細胞組成物を構造支持体に注入した。
【０１２３】
骨膜細胞は骨表面から外科的に切除した骨膜片（約５ mm×３ mm）を得ることによって単離した。骨膜片を栄養分を含む組織培養皿に入れて、骨膜細胞を骨膜片から得て、一定期間増殖させた。細胞をインキュベータ内でインビトロで維持して、４週間まで増殖させた。本実施例において用いたヒドロゲルはアルギン酸カルシウムであり、その調製は実施例１に記述している。骨膜細胞をアルギン酸カルシウムに加えて、細胞約5000万個／ccの濃度を有するヒドロゲル・細胞組成物を得た。低濃度のカルシウムもまた組成物に加えた。
【０１２４】
遠位大腿骨の再測定した容積に等しいヒドロゲル・細胞組成物の容積（約１ cc）を、３ ccシリンジを用いた25ゲージ針によって、ヌードマウスの皮下に埋め込まれた支持体構造に注入した。全ての生体組織に存在するが、注入前にヒドロゲル・細胞組成物にも加えたカルシウムイオンとのイオン性クロスリンク後に、ヒドロゲルは固化した。ヒドロゲルが固化した後、支持体構造によって、細胞を含むヒドロゲル浮遊液はその形状に維持され、新しい組織が発達するまで圧力に耐える。
【０１２５】
８週間後、マウスを屠殺して、大腿骨の形状をした支持体構造を摘出して調べた。図４の写真に示すように、新しい組織は支持体構造に定着した。図５の写真に示すように、支持体構造の組織学的検査から、新しい骨におけるハバース系の出現によって示されるように、新しい組織の増殖および血管形成が示された。特に、図５は、骨細胞（明るい色で示す）が、写真の中心で血管（暗い色で示す）を取り巻いている、新しい組織の一部を示している。さらなる骨細胞は支持体構造全体を満たした。写真は20倍の顕微鏡対物レンズを通して撮影し、写真は640ミクロン×950ミクロンの断面積に対応する。
【０１２６】
実施例３は、既定の形状を有する浸透性の支持体構造の埋め込みによって、支持体構造に注入されたヒドロゲル・細胞組成物から形成された新しい組織の形状および発達が誘導されることを示している。支持体構造は機械的な力および圧縮力に耐えて、細胞ヒドロゲル組成物を所望の形状および容積を有する新しい組織に発達させる。本実施例におけるマウスモデルは、同じ技術がヒト被験者において新しい組織を形成するために有効である証拠となる。
【０１２７】
実施例４
脊髄幹細胞の単離
脊髄幹細胞はフィッシャーラットから単離した。ラットを断頭して、体部を氷に15分入れた。脊髄を摘出して、ペトリ皿の40゜Fの冷燐酸緩衝生理食塩液（PBS）中に入れた。15番のメスを用いて脊髄を丁寧に切開して灰白質を露出し、灰白質を残りの白質組織から剥離させた。白質を鉗子で切除して、灰白質細胞をPBSに浮遊させた。PBSを攪拌して、冷PBSを半分満たした遠心管に注いだ。液体を1200 rpmで５分遠心して、上清を吸引した。
【０１２８】
0.05％トリプシンの10センチリットルを細胞の入った試験管に加えて、37℃の水浴中で５分インキュベートした。この酵素分解のプロセスは、組織片を分解し、脊髄幹細胞を除く溶液中の細胞（分化した細胞）の大部分を死滅させる。
【０１２９】
５分後、トリプシンをDMEM（10％ウシ胎児血清アルブミン）によって不活化した。混合物を攪拌して、通常の口径のパスツールピペットを用いて可能な限り細かい混合物となるように細胞をピペッティングして粉砕した。この場合も、目的は幹細胞以外の細胞を全て破壊することであった。細胞をさらに、内径約100ミクロンの細い毛細管によって粉砕した。このプロセスは、その付属器および突起を破壊することによって成熟神経細胞を殺す。２回目の粉砕後、細胞を再度1200 rpmで５分遠心した。上清をデカントして捨て、残った細胞を完全なダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）／F12（ギブコ、ガイサースバーグ、メリーランド州）に浮遊させた。完全培地は、グルコース、トランスフェリン、インスリン、プトレッシン、セレニウム、ペニシリン・ストレプトマイシン、およびHEPES緩衝液を標準濃度で含む。プロゲステロンは20 ng/mlの濃度で加えた。
【０１３０】
この培養培地に上皮細胞増殖因子（EGF）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）を20 ng/mlの濃度で加えた。ヒト脊髄幹細胞を単離および増殖させる場合にも、同じ増殖培地を用いることができる。動物またはヒトの脳組織から幹細胞を単離する場合にも、同じ培養培地（DMEM）を用いることができるが、この場合はEGFのみを加えて、bFGFは加えない。
【０１３１】
単離された幹細胞は５％CO2を含むフラスコ中で37℃で、補添した増殖培地20 mlで培養した。上記のように補添した新鮮な完全DMEM/F12培地５ mlを３日毎に加えた。細胞が複製（増殖）したら、フラスコから細胞をピペッティングして、1200 rpmで５分遠心し、新鮮な補添培地（20 ml）に再浮遊させて、通常の口径のピペット（および選択的に微小毛細管ピペット）によって粉砕することによって継代する。
【０１３２】
それぞれの継代において、１つのフラスコ中の細胞を２つの等量に分割して、それぞれ20 mlの２つの異なるフラスコに再浮遊させる。最初の継代（培養後約７日）によって、細胞約100〜600万個を生じ、１週間後の２回目の継代では、細胞約200〜1200万個を生じた。３または４週間後、細胞の集団は増殖を停止し、一定レベルで維持される。細胞を毎週継代および粉砕する限り、細胞は未分化状態で無限に培養することができる。
【０１３３】
実施例５
ヒドロゲル・脊髄幹細胞組成物の調製
実施例４に記載のように単離した脊髄幹細胞約2000〜5000万個/mlを、EGF、bFGFおよび23％濃度のプルロニック（登録商標）F127を加えた完全なDMEM/F12の溶液に浮遊させた。この特定のプルロニックは15〜50℃の間で培養培地をゲル化させ、15℃未満および50℃以上では粘性の液体となる界面活性剤である。
【０１３４】
次に、ヒドロゲル・脊髄幹細胞組成物を用いて、個々の直径が約15ミクロンであるポリグリコール酸（PGA）繊維の不織メッシュに浸透させた。このメッシュは小さい綿のような外観を有し、メッシュを液体ヒドロゲル・細胞組成物に浸すことによって浸透させた。または、液体ヒドロゲルを不織メッシュに注入することができる。
【０１３５】
PGAメッシュはプルロニックゲルを毛細管作用によって保持し、動物に埋め込まれると神経幹細胞の増殖を誘導する。さらに、PGA繊維は未分化な神経幹細胞の分化を刺激する。
【０１３６】
浸透させた後、直径約３ミリメートルで長さが約４〜５ミリメートルのPGA不織メッシュの少量は、ヒドロゲル・細胞組成物約50マイクロリットルを含み、このように細胞約100〜500万個を含んだ。
【０１３７】
実施例６
ラットにおける脊髄損傷の修復
フィッシャーラット30匹を麻酔して、その脊髄を外科的に損傷させた。特に、それぞれの場合について、脊髄を２箇所において約３〜４ミリメートル離して完全に切断した。脊髄の中間部分を摘出して３〜４ミリメートルのギャップを残した。このギャップを手術の１週間後に磁気共鳴画像によって確認した。実施例５に記述のように調製したヒドロゲル・幹細胞組成物を用いて、実験動物15匹において摘出した脊髄の部分を置換した。対照動物15匹に、脊髄の一部を摘出して、３〜４mmのギャップを残すという同じ手術を施したが、ギャップを置換するためにヒドロゲル・細胞組成物を挿入しなかった。脊髄全体の創傷は全ての動物において縫合した。脊椎骨の脊柱は、椎弓板および後方突起のみを切除したため、安定なままであった。
【０１３８】
当初のラット30匹のうち、21匹が手術、または脊髄ショック、感染症もしくは脱水のような合併症のために死亡し、生存したラットは９匹であった。これらのラット９匹のうち、５匹は実験群であり、４匹は対照群であった。
【０１３９】
生存しているラットの全てに、標準的な術後の処置を行い、経時的に観察して通常食を与えた。ラットの全体的な知覚および後肢機能を２つの方法でモニターした。第一に、疼痛知覚は、頭部の運動をモニターするために、ピンを刺すことによってモニターしたが（左右後肢、左右大腿、背部、および腹部）、これは単なる反射よりむしろ疼痛知覚を示し、これは例えば後肢を引っ込めることによって示される。第二に、運動機能を反射と自発的な意図的な運動機能の双方について評価した。６週間後、対照ラット５匹は疼痛知覚を示さず、後肢の意図的な運動も示さなかった。後肢は当初弛緩していたが、約７〜10日後に痙攣性麻痺を発症した。
【０１４０】
対照的に、実験ラット４匹は後肢の様々な程度の機能が明確に回復したことを示した。ラットは全ての部位（左右後肢および大腿、背部、ならびに腹部）で疼痛の知覚を示し、明らかに自発的な意図的な運動機能を示した。肉眼的観察に基づいて、実験ラット４匹のうち最善のラットは、４週間後に右後肢の約90％機能および左後肢の約80％機能を示した。このラットは実際に、２つの後肢で全身を持ち上げて、食物と水に届いた。４週間後、中等度に回復した２匹のラットは、１つの後肢が約50〜60％機能、およびもう一つの後肢が約25％機能を示した。実験群のラット４匹中「最も悪い」ラットは、右後肢の約30％機能および左後肢の約10〜15％機能を示した。実験ラットは全て改善し続けた。
【０１４１】
実施例７
ヒドロゲルにおける単離神経幹細胞の培養
この研究において、インビトロ生存、培養の最適な細胞密度、ならびに上皮細胞増殖因子（EGF）、神経生長因子（NGF）、および10％胎仔ウシ血清（FBS）を含む様々な因子に反応した表現型発現を調べるために、神経幹細胞をプルロニック（登録商標）F127に浮遊させた。
【０１４２】
線条体幹細胞を、15日齢のBalb-Cマウス胚の線条体から採取して（実施例５に記述のように）、プロゲステロン（栄養因子として）およびEGFを含む完全なDMEM/F12（１：１）中で37℃でインキュベートした。細胞を、23％プルロニックF127を含む上記培地に500、1000および2000万個/mlで浮遊させ、５％CO2中で37℃で21日間インキュベートした。同じ起源から同じように回収した細胞をEGF 20 ng/ml、NGF 100 ng/ml、または10％FBSの非存在下（対照）または存在下で細胞500万個/mlの濃度で浮遊させて、同じようにインキュベートした。７および14日目、細胞を培養物から採取して、サイトスピンによってスライド上に沈着させ、グリア、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーとしてそれぞれ、GFAP（神経膠繊維酸性蛋白質）、NF（神経繊維）および04に対する抗体をプローブとして調べた。
【０１４３】
異なる細胞濃度の間で細胞増殖に差は認められなかった。さらに、多分化能は、GFAP、NF、および04に対する抗体染色陽性によって示されるように、広範囲のCNS細胞に分化していることによって示された。下記の表に示すように、表現型の調節は、14日目にNGFおよびFBSグループにおけるNF+細胞の増加によって示される。これは浮遊培養において認められた神経幹細胞の系列形成の調節と一致する。
【０１４４】
【表】
0004451985.tif 000002
【０１４５】
これらの実験に基づいて、プルロニックF127中で細胞500万個/mlの濃度で培養した場合に、神経幹細胞が生存して増殖することは明白である。これらの幹細胞の表現型発現は、培地のみで培養した幹細胞の場合と同様に増殖因子によって制御された。
【０１４６】
もう一つの実験において、成体ラット脊髄幹細胞を、実施例５に記述のようにPGAメッシュと共にプルロニック（登録商標）127に浮遊させた。実施例６において埋め込みに用いなかった細胞を、通常の空気および５％CO2によって37℃でインキュベートした。幹細胞はニューロスフェアを形成して、PGAメッシュに接着して、捨てるまで１週間生存した。
【０１４７】
実施例８
成体ラットの心臓、肺、肝臓、腎臓、膀胱、および腸からの自律神経節後幹細胞の単離
成体ラットを断頭によって屠殺して、体部を氷で冷却した。滅菌条件下で、心臓、肺、肝臓、腎臓、膀胱、および腸を摘出して、それぞれの臓器から組織の５ mm断片を冷PBSの入った個々のペトリ皿に入れた。それぞれの組織断片を#15のメスによって冷PBS中に強く掻き取った。掻き取った組織断片を捨てて、残りのPBSを冷PBS 10 mlに加えて、1200 rpmで５分遠心した。
【０１４８】
PBSを吸引除去し、0.05％トリプシン10 mlを沈降物に加えて、37℃の水浴中で５分インキュベートした。DMEM＋10％FSAを加えることによってトリプシンを不活化した。組織が細かい浮遊液になるまで、標本をパスツールピペットで粉砕して、組織が解離するまで口径の小さいパスツールミクロピペットで再度粉砕した。標本を1200 rpmで５分遠心した。沈降物を、20 ng/mlのEGFおよびbFGFを含むDMEM/F12に再浮遊させて、５％CO2を含む37℃のインキュベータ内に入れた。各臓器からの標本は全て、小さく、丸い神経幹細胞を数多く含んだ。フラスコの底に付着した細胞にニューロンへの稀な分化が認められた。
【０１４９】
この同じ技法を用いて、自律神経支配を有する体内の如何なる臓器からもANS神経幹細胞を抽出および単離することができる。
【０１５０】
実施例９
成体ラットの副腎および膵臓からの神経内分泌幹細胞の単離
成体ラットを断頭によって屠殺して、全身を氷中で冷却した。滅菌条件で、副腎および膵臓を摘出して組織の５ mm断片を得た。副腎組織断片を#15メスの刃で冷PBS中に強く掻き取った。膵臓組織断片を#15メスで掻き取って、冷DMEM-F12培地および内因性膵酵素を不活化する作用を有する10％FSA中に剥離させた。膵組織剥離断片を含むDMEM-F12培地を冷PBS５ mlに加えた。
【０１５１】
掻き取った組織断片を捨てて、残りのPBS（およびDMEM-F12/FSA）（幹細胞を含む）を冷PBS 10 mlに加えて、1200 rpmで５分間遠心した。PBS（およびDMEM-F12/FSA）を吸引して、0.05％トリプシン10 mlを沈降物に加えて、37℃の水浴中で５分インキュベートした。新鮮な10 mlのDMEM-F12および10％FSAを加えることによって、トリプシンを不活化した。標本は組織が細かい浮遊液になるまでパスツールピペットで粉砕して、次に組織が解離するまで口径のより小さいパスツールミクロピペットによって再度粉砕した。標本を1200 rpmで５分間遠心した。沈降物を、20 ng/ml EGFおよびbFGFを加えた完全なDMEM/F12に再浮遊させて、５％CO2を含む37℃のインキュベータ内に入れた。それぞれの腺からの標本は全て、小さく丸い神経内分泌幹細胞を数多く含んだ。
【０１５２】
この同じ技法を用いて、体内の他の腺、例えば視床、下垂体、副甲状腺および甲状腺から、そして腸管および大動脈から、神経内分泌幹細胞を抽出および単離することができる。
【０１５３】
その他の態様
本発明はその詳細な説明と共に記述してきたが、上記説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するためのものであって、制限的なものと解釈されないことを理解すべきである。
【０１５４】
その他の局面、利点、および改変は特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒドロゲル・細胞組成物を充填した浸透性の支持体構造の図である。
【図２】  ラット大腿骨形状の浸透性のポリマー支持体構造の写真である。
【図３】  図２の支持体構造を皮下に埋め込まれたヌードマウスの写真である。
【図４】  骨膜細胞を含むヒドロゲル・細胞組成物を注入して、その後図３に示すマウスから摘出した図２の支持体構造の写真である。
【図５】  図４の支持体構造の組織学を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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