(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体に喘息発症の危険性があるか否かを判定する方法であって、
a) 配列番号 1またはその相補体の少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーのヌクレオチドを判定するステップであって、該FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の3950、4243、4312、4490、4670、4687、4968、5140、5213、5364、5594、6370、6693、6763、7445、7870、16288、16347、16383、16440、24361、28336、28368、36183、36509、38681、42440および42445番の塩基からなる群より選択される、上記ステップと、
b) ステップa)で得られる結果と喘息発症の危険性とを相関させるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記バイアレリックマーカーのヌクレオチドを、前記個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの両コピーについて判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判定ステップの前に、バイアレリックマーカーを含む前記配列の一部を増幅するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅をPCRによって行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記判定をハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、または酵素ベースのミスマッチ検出アッセイによって行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子型と、ロイコトリエン経路が関与している疾患、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答およびロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関する副作用から選択される形質との間の関連性を検出するための方法であって、
a)  形質陽性個体群における少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの頻度を判定するステップであって、該FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の3950、4243、4312、4490、4670、4687、4968、5140、5213、5364、5594、6370、6693、6763、7445、7870、16288、16347、16383、16440、24361、28336、28368、36183、36509、38681、42440および42445番の塩基からなる群より選択される、上記ステップと、
b)  対照個体群における前記FLAP関連バイアレリックマーカーの頻度を判定するステップと、
c)  前記遺伝子型と前記形質との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判定するステップと、を含む方法。
【請求項７】
ハプロタイプと、ロイコトリエン経路が関与している疾患、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答およびロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関する副作用から選択される形質との間の関連性を検出する方法であって、
a)  以下のステップ：
i）形質陽性個体群の各個体について、少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、
ii）前記個体群の各個体について、第2のFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、
iii）ステップi)およびii)において特定された遺伝子型にハプロタイプ決定法を適用し、ハプロタイプの頻度の推定値を得るステップと
により、形質陽性個体群における少なくとも1つのハプロタイプの頻度を推定するステップであって、該FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の3950、4243、4312、4490、4670、4687、4968、5140、5213、5364、5594、6370、6693、6763、7445、7870、16288、16347、16383、16440、24361、28336、28368、36183、36509、38681、42440および42445番の塩基からなる群より選択される、上記ステップと、
b)   以下のステップ：
i）対照個体群の各個体について、少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、
ii）前記個体群の各個体について、第2のFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、
iii）ステップi)およびii)において特定された遺伝子型にハプロタイプ決定法を適用し、ハプロタイプの頻度の推定値を得るステップと
により、対照個体群における前記ハプロタイプの頻度を推定するステップと、
c)  前記ハプロタイプと前記形質との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判定するステップと、を含む方法。
【請求項８】
前記ハプロタイプ決定法が、非対称PCR増幅、特定のアレルの二重PCR増幅、クラーク(clark)アルゴリズム、期待値−最大化アルゴリズムからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子型を判定するステップa)およびb)を、前記個体群の各々から得てプールした単一の生物学的試料について行う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子型を判定するステップa)およびb)を、前記個体群における各個体由来の生物学的試料について別々に行う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質が喘息である、請求項６〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照個体群が形質陰性個体群である、請求項６〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記症例対照個体群が無作為個体群である、請求項６〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記FLAP関連バイアレリックマーカーが配列番号1の4670、16347、16440、28336、28368、38681または42445番の塩基から選択される、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記FLAP関連バイアレリックマーカーが配列番号1の28368番の塩基である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号 3の少なくとも6アミノ酸の連続スパンを含む、単離されたポリペプチド、精製されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含む、前記キット。
【請求項１７】
配列番号 3の少なくとも6アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエピトープ含有断片に選択的に結合可能な単離または精製された抗体を含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記エピトープが配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含む、前記キット。
【請求項１８】
配列番号 1の15〜50ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補体からなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記スパンが、配列番号1の3950、4243、4312、4490、4670、4687、4968、5140、5213、5364、5594、6370、6693、6763、7445、7870、16288、16347、16383、16440、24361、28336、28368、36183、36509、38681、42440および42445番の塩基からなる群より選択されるFLAP関連バイアレリックマーカーを含む、前記キット。
【請求項１９】
前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の4490、4670、4687、4968、5140、5213、5364、6370、6693、6763、38681、42440、42445、3950、4243、4312または5594番の塩基、およびこれらの相補体からなる群から選択される、請求項18に記載のキット。
【請求項２０】
前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の7445、7870、16288、16383、24361、28336、28368、36183または36509番の塩基、およびこれらの相補体からなる群から選択される、請求項18に記載のキット。
【請求項２１】
前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、配列番号1の16347または16440番の塩基、およびこれらの相補体からなる群から選択される、請求項18に記載のキット。
【請求項２２】
前記連続スパンが18〜47ヌクレオチド長であり、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心から4ヌクレオチド以内にある、請求項18〜21のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが前記連続スパンからなり、前記連続スパンが25ヌクレオチド長であり、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心にある、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号1の3927〜3973、4220〜4266、4289〜4335、4467〜4513、4647〜4693、4664〜4710、4945〜4991、5117〜5163、5190〜5236、5341〜5387、5571〜5617、6347〜6393、6670〜6716、6740〜6786、7422〜7468、7847〜7893、16265〜16311、16324〜16370、16360〜16406、16417〜16463、24338〜24384、28313〜28359、28345〜28391、36160〜36206、36486〜36532、38658〜38704、42417〜42463または42422〜42468番の塩基を有する配列およびそれらの相補配列から選択される配列からなる、請求項22に記載のキット。
【請求項２５】
前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在する、請求項18〜21のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に位置し、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在する、請求項18〜21のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に位置し、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列中のFLAP関連バイアレリックマーカーの20ヌクレオチド上流の範囲内に位置する、請求項18〜21のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列の前記FLAP関連バイアレリックマーカーの1ヌクレオチド上流に位置する、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号1の3930〜3949、4223〜4242、4292〜4311、4470〜4489、4650〜4669、4667〜4686、4948〜4967、5120〜5139、5193〜5212、5344〜5363、5574〜5593、6350〜6369、6673〜6692、6743〜6762、7425〜7444、7850〜7869、16268〜16287、16327〜16346、16363〜16382、16420〜16439、24341〜24360、28316〜28335、28348〜28367、36163〜36182、36489〜36508、38661〜38680、42420〜42439または42425〜42444番の塩基を有する配列および配列番号1の3951〜3970、4244〜4263、4313〜4332、4491〜4510、4671〜4690、4688〜4707、4969〜4988、5141〜5160、5214〜5233、5365〜5384、5595〜5614、6371〜6390、6694〜6713、6764〜6783、7446〜7465、7871〜7890、16289〜16308、16348〜16367、16384〜16403、16441〜16460、24362〜24381、28337〜28356、28369〜28388、36184〜36203、36510〜36529、38682〜38701、42441〜42460または42446〜42465番の塩基を有する配列から選択される配列からなる、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
配列番号1の3851〜3869、4120〜4138、4373〜4391、4814〜4833、4956〜4972、5524〜5542、6218〜6235、6522〜6539、7120〜7137、7513〜7531、16114〜16132、24072〜24089、27978〜27995、36020〜36039、36318〜36337、38441〜38460または42233〜42253番の塩基を有する配列および配列番号1の4171〜4189、4372〜4390、4773〜4792、5026〜5043、5405〜5422、5978〜5996、6652〜6672、6772〜6790、7557〜7574、7914〜7933、16515〜16533、24408〜24425、28384〜28401、36446〜36465、36652〜36669、38820〜38840または42731〜42749番の塩基を有する配列から選択される配列またはその相補体からなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キット。
【請求項３１】
配列番号 3の少なくとも6の連続スパンを含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含む、前記キット。
【請求項３２】
配列番号1の少なくとも15ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 1のヌクレオチド位置1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976、および36927〜43069のうち少なくとも1つを含んでなる、前記キット。
【請求項３３】
配列番号 1の少なくとも15ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 1の16348位のCを含む、前記キット。
【請求項３４】
配列番号 1の少なくとも15ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 1のヌクレオチド位置7612〜7637、24060〜24061、24067〜24068、および27903〜27905を含んでなる、前記キット。
【請求項３５】
配列番号 1の少なくとも15ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 1の7445位のA、7870位のA、16288位のT、16383位のA、24361位のT、28336位のG、28368位のT、36183位のA、36509位のGからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、前記キット。
【請求項３６】
配列番号 2の少なくとも15ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含む喘息の発症リスクの診断用キットであって、前記連続スパンが、配列番号 2の197位のT、453位のA、または779位のGを含む、前記キット。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが固相支持体に付着されている、請求項18〜36のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドがアレイに固定されている、請求項18〜36のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記アレイが、各ポリヌクレオチド位置を知ることができるアドレス指定可能なアレイである、請求項38に記載のキット。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドが標識をさらに含む、請求項18〜39のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(技術分野)
本発明はFLAP遺伝子のゲノム配列に関する。本発明はまた、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーに関し、さらには、これらのマーカーとロイコトリエン経路が関与している喘息などの疾患との間の関連性にも関する。本発明によれば、ロイコトリエン経路が関与している疾患に対して個体が持つ素因を判定するための手段と、かかる疾患を診断し、かつロイコトリエン経路作用薬に対する最終的な治療応答を予測/検出する手段とが得られる。
【０００２】
(発明の背景)
西洋社会では、喘息や関節炎などロイコトリエン合成が能動的な役割を果たす炎症性疾患の進展が大きな健康問題の1つとなっている。
【０００３】
たとえば、欧米諸国での喘息有病率は過去一世紀にわたって確実に増え続けており、人口の約10%が喘息に羅患している。1994年には米国だけをとってみても1400万人以上(このうち480万人(6.9%)は18歳未満)が羅患しているが、1982年に同じ疾患が認められたのはわずか800万人にすぎなかった。毎年5000人以上が命を落としている(1993年にはこのうちの342人が25歳未満であった)。英国では7人に1人の子供が喘息を持ち、米国に至っては小児科救急処置室に運ばれてくる患者の1/3が喘息によるものである。このように、喘息は小児期において最もよく見られる慢性疾患なのである。
【０００４】
気管支喘息は単独の疾患ではなく、気道起炎性の変化と気管支の反応性亢進を特徴とし、気道閉塞として定義される多因子性の症候群のことである。実際の喘息発作を引き起こす刺激の例としては、アレルゲン(敏感な人の場合)、エクササイズ(冷気が刺激の1つになり得る)、気道感染、二酸化硫黄などの大気汚染物質があげられる。喘息患者は、生活を脅かすほど、あるいは場合によっては致命的ともなり得るほどひどい呼吸困難(息を吐くことができない状態)、喘鳴、咳といった発作を繰り返す。
【０００５】
喘息の発露には遺伝的な要因と環境による要因の両方が関与しているであろうと思われる。ほとんどの患者で喘息の発作は病理学的に次のような状態を生じる2フェーズからなるものである。
−気管支平滑筋の攣縮による気管支痙攣を主な症状とする中間フェーズ。このフェーズに関与している細胞は、ヒスタミンを放出する好酸球の他、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血小板活性化因子を放出するマクロファージ、血小板、肥満細胞である。白血球走化性因子活性化因子および起炎性細胞遊走因子に収縮因子が加わることで、白血球がこの領域に引き寄せられ、次のフェーズへの準備が整えられる形となる。
−血管拡張、浮腫、粘液分泌および気管支痙攣を含む特別なタイプの炎症からなる後期フェーズ。これは、サイトカイン放出活性T細胞や好酸球から放出される炎症性メディエーターによって引き起こされる。あるいは、軸索反射によって放出されるニューロペプチドが原因になっている可能性もある。これらのメディエーターはダメージや気管支上皮の損傷などを引き起こす。
【０００６】
識別可能な喘息発症素因因子のうち最も強力なものがアトピー、すなわち一般的な空気アレルゲンに対するIgE媒介応答の発症因子である。IgEが細胞のIgE受容体と結合すると系は初回刺激を受けた状態になるため、関連のあるアレルゲンに継続的に曝露されると喘息発作が起こるのである。喘息症例の大半(95%)がアトピーと何らかの関連性がある。
【０００７】
上述したような喘息に対する作用だけでなく、ロイコトリエンは一般に宿主防衛能に関与しており、炎症性腸疾患、乾癬および関節炎など、喘息以外の即時型過敏症ならびに炎症性疾患に重要な役割を果たしている。
【０００８】
ロイコトリエン経路
ロイコトリエンはリポキシゲナーゼ経路からの生成物である。リポキシゲナーゼはサイトゾルに存在する可溶酵素であり、肺や血小板、肥満細胞、白血球細胞に認められる。このグループに属する主な酵素が、ロイコトリエン生合成の初発段階をつかさどる酵素の5-リポキシゲナーゼである。
【０００９】
ロイコトリエンの生合成における最初のステップでは、(たとえば免疫複合体やカルシウムイオノフォアによる)細胞刺激時に、膜リン脂質からアラキドン酸が放出される。次に、アラキドン酸は5-リポキシゲナーゼ(5-LO)によってロイコトリエンA4に代謝され、細胞膜に移動して「5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク」(FLAP)と呼ばれるタンパク質と関連した状態になる。これは無傷細胞でのロイコトリエン合成には欠かせないものである。また、5-LOにはロイコトリエンA4活性もある。
【００１０】
次いで、不安定なエポキシド中間生成物であるロイコトリエンA4(LTA4)は、加水分解によってロイコトリエンB4(LTA4-加水分解活性)に変化するか、あるいはグルタチオン抱合によってロイコトリエンC4(LTC4-合成酵素活性)とその代謝物であるロイコトリエンD4およびロイコトリエンE4を産生する。LTB4は主に好中球によって産生され、システイニル-ロイコトリエン(LTC4、LTD4、LTE4)は主に、好酸球、肥満細胞、好塩基球、マクロファージによって産生される。
【００１１】
LTB4は好中球とマクロファージの両方に対する強力な走化因子である。好中球では膜接着分子を上方制御し、毒性酸素生成物の産生と顆粒酵素の放出を促進する。マクロファージおよびリンパ球では増殖およびサイトカイン放出を刺激する。このように、LTB4はあらゆるタイプの感染症における重要なメディエーターなのである。
【００１２】
システイニル-ロイコトリエンは呼吸器系および心臓脈管系に作用する。呼吸器系では、細気管支の筋肉を攣縮させ、粘液の分泌量を増やす強力な収縮因子となる。心臓脈管系では多くの血管で血管拡張を引き起こすが、冠血管拡張薬としても機能する。システイニル-ロイコトリエンは喘息において特に重要な物質である。
【００１３】
FLAP(5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク)
FLAPは、アラキドン酸と特異的に結合し、アラキドン酸伝達タンパク質として作用して5-LOを活性化する、18-kDの膜結合ポリペプチドである。FLAP遺伝子は31kbよりも長く、小さなエキソン5つと大きなエキソン4つで構成されている(本願明細書に援用するGenBank 182657, Kennedyら1991の他、エキソン１についてGenbank M60470、エキソン２についてGenbank M63259、エキソン３についてGenbank M63260、エキソン４についてGenbank M63261、およびエキソン５についてGenbank M6322を参照のこと)。
【００１４】
5-LOとFLAPが作用してアラキドン酸を代謝する細胞内部位は核膜であり、好中球と単球のイオノフォア活性化によって5-LOは非沈殿領域から核膜に移動する。FLAP機能阻害因子はサイトゾルから膜への5-LOの移動を阻害し、5-LOの活性化を阻害する。したがって、これらの因子は抗炎症薬の候補として興味深いものである。特に、FLAPに対するアンタゴニストは、システイニルロイコトリエンがこうした喘息応答を媒介する上で果たす重要な役割をサポートしている、アレルゲン誘因気管支収縮剤応答を抑えることができるのである。
【００１５】
薬理遺伝子学
疾患感受性または薬剤に対する応答性の点で個体差が生じる原因を見極めるために、薬理遺伝子学では、ゲノムテクノロジーを用いて遺伝子における多型を特定する。このような多型は、疾患感受性、病因および進展すなわち具体的には、薬効、薬剤耐性または薬剤の毒性を左右する要因である薬剤応答経路(薬剤代謝カスケードを含むがこれに限定されるものではない)に関与している生物学的経路の一部である。
【００１６】
この点についてみると、さまざまな疾患に関与している起炎現象と薬理遺伝子学との関連性は極めて深い。これらの現象が羅病率の高い多くの深刻な疾患の要となっているのと、効率的な新薬設計用の炎症経路のターゲッティングには重篤な副作用を伴う危険性が多くつきまとうことの両方が理由である。強力な炎症性分子である生成物を産生するため、ロイコトリエン経路は特に興味深いものである。
【００１７】
癌、高血圧、糖尿病などの広く知られた疾患のほとんどは多遺伝子性の(複数の遺伝子が関与している)ものである。その上、これらの疾患は、汚染物質、化学薬品、食事などの環境因子によって変化する。このため、多くの疾患が多因子性であると言われている。つまり、遺伝的な要因と環境による要因の両方が相互作用することで生じるのである。
【００１８】
たとえば、喘息の発症に環境因子がおよぼす明らかな影響の他に、喘息患者のいる家族についてクラスター形成と分離のパターンを分析したところ、喘息には遺伝的な要素が絡んでいる可能性が認められた。しかしながら、喘息に特異な表現型が定義されていないことが、喘息に関連のある遺伝子を高信頼度で検出する上での大きなハードルとなっている。
【００１９】
喘息は一般に、臨床検査と生物学的な試験によって診断される。喘息を伴う気管支の非特異的な反応性亢進は、ヒスタミンやメタコリンなどの気管支収縮薬を患者に投与したことが原因で発生する空気流の変化を基準に判定される。アトピーは、血清のIgE力価を測定する皮膚プリックテストによって検出される。喘息の特徴である徴候(夜の喘鳴および息切れなど)の検出には標準的な問診も用いられているが、これらの徴候は喘息にだけ見られるものではない。
【００２０】
しかしながら、喘息を調べる生理学的または生物学的な血液検査には、確実なものが1つもない。喘息とその発症の病態生理学については次第に明らかになってきているにもかかわらず、症例を見ると喘息の有病率および喘息発作の重症度が過小評価されていると思われる。結果として、喘息に対して適切な処置を施すのが遅れることが多く、炎症を一層進展させてしまうことになる。このため、効率的かつ高信頼度の喘息診断試験が必要なのである。
【００２１】
薬効および薬の毒性も複雑性疾患と同じように遺伝的な要因を伴う多因子性の形質であるとみなせる場合がある。これについては、理論的にみて薬剤応答に関与していると推測される遺伝子のカテゴリーが3つある。すなわち、標的疾患と結びつく遺伝子、薬剤の作用様式に関連のある遺伝子、そして薬剤の代謝に関与する遺伝子である。
【００２２】
喘息の研究における主な薬理遺伝子学的目標は、薬剤応答に関連のある遺伝子を探すことである。このような遺伝子が見つかれば、まず第一に、薬剤耐性研究で有害イベントの発生率を減らし、薬効についての研究では応答者と非応答者の患者亜集団を一層良く定義し、さらにこれらの研究から得られる結果を組み合わせて、効力/耐性に関する予測データをもとに薬剤の用法を個別に決定できるようにすることで、遺伝子が薬剤開発計画を改善するためのツールとなり得るのである。
【００２３】
また、薬理遺伝子学によって、応答率を高めるおよび/または特定の治療から非応答者を排除する、あるいは望ましくない副作用を削減および/または望ましくない副作用の危険性が有意に高い対応の治療患者から除外するために、ターゲット薬の新しい設計を決定し、かつ既存の薬剤の用途を最適化するツールも得られる。
【００２４】
薬理遺伝子学の上述した2つ目の用途についてみると、ロイコトリエン経路も有用である。ロイコトリエン経路によって機能する多くの抗喘息薬および抗炎症薬はいまだに開発の途中であり、このうちの多くに何らかの重大な副作用が認められるためである。
【００２５】
たとえば、抗喘息薬には大きく分けて気管支拡張剤と抗炎症剤の2つのカテゴリーがある。気管支拡張剤は、疾患の中間フェーズの気管支痙攣を逆転させる上で有効である。気管支拡張剤として利用される薬剤としては、(たとえばサルブタモールなどの平滑筋に直接作用することで気管支を拡張する)β2-アドレノセプターアゴニスト、(テオフィリンなどの)キサンチン、(臭化イプラトロピウムなどの)ムスカリン受容体アンタゴニストがあげられる。これらの薬剤は、発作症状に対する短期治療薬の代表である。
【００２６】
抗炎症剤は、どちらの喘息フェーズでも炎症性成分の産生阻害または防止に有効である。これらの薬剤としては、グルココルチコイド、クロモグリク酸ナトリウム、ヒスタミンH1-受容体アンタゴニストがあげられる。これらの薬剤は、喘息の状態に対する既存の長期治療薬の代表である。
【００２７】
しかしながら、現在用いられている抗喘息薬はいずれも、この疾患のある患者すべてを事実上「治癒」させるわけではないので、決して満足のいくものではない。この点について言えばグルココルチコイドが最も興味深い活性化合物であるが、グルココルチコイドを用いることで、望ましくない重篤な副作用(グルココルチコイドを吸入する場合だと咽頭カンジダ症や発生障害、骨粗鬆症など、全身投与の場合だと気分障害や食欲亢進、糖尿病患者のグルコース調節能の喪失)が生じる可能性がある。
【００２８】
近年になって、一層効果的かつ選択性の高いロイコトリエン生合成インヒビター(5-LOおよびFLAP-結合インヒビターなど)が開発され、気管支喘息および他の炎症性疾患に対する新規な治療方法として用いられている。たとえば、Abbott Laboratories(イリノイ州アボットパーク)から販売されている5-LOインヒビターZileuton(Zyflo(R))を用いることによって、気道機能を改善して喘息に関連のある徴候を減らせることが分かっている。
【００２９】
残念なことに、Zileutonの治験では、喘息の急性憎悪や消化不良、肝酵素値の上昇などの望ましくない副作用が報告されている。また、肝臓で取り除かれる薬物同士の薬物相互作用についての懸念もある。
【００３０】
このため、効率的および高信頼度の喘息診断試験の開発に対する需要だけでなく、使用者に対する副作用と毒性を弱めた上でロイコトリエン経路に作用する一層効果的かつ標的の絞られた治療ストラテジーを開発することにも需要がある。これを比較的短期間で達成するための方法の1つが薬理遺伝子学的な結果を利用して既存の薬物または薬物候補の用法を一層明確に定義し、患者の標的亜集団に対する利益/危険率を高めることである。
【００３１】
(発明の開示)
本発明は、制御領域も含めてFLAP遺伝子のゲノム配列全体を単離してキャラクタリゼーションすることから出たものである。FLAPのゲノム配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも本発明の一部である。本発明のさらに他の目的は、本発明に記載のいずれかのヌクレオチド配列を含む組換えベクター、特に、FLAPの制御領域またはFLAP酵素をコードする配列を含む組換えベクターならびに、前記ヌクレオチド配列または組換えベクターを含む細胞宿主にある。本発明はまた、FLAP遺伝子の発現を調節または阻害する分子のスクリーニング方法も包含する。さらに、本発明は、FLAPタンパク質の新規なアレル変異体も含む。
【００３２】
また、本発明は、FLAPゲノム配列内に位置するバイアレリックマーカーにも関するものである。これらのバイアレリックマーカーは、FLAP遺伝子の特定のアレルとロイコトリエン経路が関与する炎症性疾患などの疾患との間の統計的に有意な関連性、あるいはFLAP遺伝子の特定のアレルとロイコトリエン経路に作用する薬剤、好ましくはZileutonの投与によって生じる副作用またはロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いての治療に対する有益な応答のいずれかとの間の統計的に有意な関連性を特定するための有用なツールである。これらの関連性は本発明の範囲内に包含される。
【００３３】
具体的には、本発明は、被検者集団で確認およびキャラクタリゼーションしたFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーのアレルと喘息との間の遺伝的な関連性を特定することから出たものである。
【００３４】
ロイコトリエン経路が関与する炎症性疾患などの疾患、特に、喘息や関節炎、乾癬および炎症性腸疾患などの疾患に対するヒトの遺伝的な感受性を分子レベルで検出するための方法および生成物が得られる。この方法および生成物を上述したような疾患の診断や段階化、予後の判定およびモニタリングに使用することができる。これらのプロセスを治療方法の中に取り込むことも可能である。また、本発明によれば、薬物の用途を最適化し、新規な薬物の候補となり得る物質をスクリーニングするための個別のストラテジーをはじめとして治療学的に見て適したソリューションが効率的に設計および評価される。
【００３５】
(配列表に列挙した配列の簡単な説明)
配列番号 1は、5'制御領域(上流の非転写領域)、エキソン、イントロン、3'制御領域(下流の非転写領域)を有するFLAPのゲノム配列を含む。
配列番号 2は、5'UTRおよび3'UTRのあるヒトFLAP完全cDNAを含む。
配列番号 3は、配列番号 2のcDNAでコードされたFLAPタンパク質を含む。
配列番号 4および 5は、バイアレリックマーカーA14のアレル1またはアレル2のいずれかと、その周囲の配列とを含む。
配列番号 6および7は、バイアレリックマーカーA14に対する増幅プライマーの配列を含む。
配列番号 8は、バイアレリックマーカーA14のマイクロシークエンシングプライマーの配列を含む。
配列番号 9および10は、バイアレリックマーカーA19のアレル1またはアレル2のいずれかと、その周囲の配列とを含む。
配列番号 11および 12は、バイアレリックマーカーA19に対する増幅プライマーの配列を含む。
配列番号 13は、バイアレリックマーカーA19のマイクロシークエンシングプライマーの配列を含む。
配列番号 14は、実施例2においてさらに説明する別のPU5'配列を含んでいるプライマーを含む。
配列番号 15は、実施例2においてさらに説明する別のRP5'配列を含んでいるプライマーを含む。
【００３６】
(発明の詳細な説明)
ロイコトリエン合成では5-LOがFLAPと関連している。確かに、直接的な5-LOインヒビターの作用か、あるいはFLAPに結合する間接的なロイコトリエン生合成インヒビターの作用のいずれかによって、ロイコトリエン産生を制御できるように見える。
【００３７】
本発明は、FLAPコード化遺伝子におけるバイアレリックマーカーの同定およびキャラクタリゼーションと、ロイコトリエン経路が関与する疾患と関連のある有意な多型の同定とに関する。好ましくは、この多型は喘息と関連のあるものである。
【００３８】
ロイコトリエン経路が関与している疾患に対する遺伝的な感受性を高信頼度で検出するアッセイの設計に、同定済の多型を使用する。また、これらの多型を薬物スクリーニングプロトコルの設計に使用して、新薬または既存の薬物の持つ治療効果および副作用の可能性を効率よく正確に評価することができる。
【００３９】
I.  定義
本発明を一層詳細に説明する前に、下記の定義によって、本発明の説明で用いる用語の意味と範囲を示し、定義する。
【００４０】
「FLAP遺伝子」という用語は、本願明細書で使用するにあたり、FLAPタンパク質をコードするゲノム配列、mRNA配列およびcDNA配列を包含する。ゲノム配列の場合、FLAP遺伝子には、FLAP遺伝子のコード配列の発現を制御する未変性の制御領域も含まれる。
【００４１】
本願明細書において同義に用いられるものとして、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、2つ以上のヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のいずれかで構成されるRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド配列を含む。本願明細書において、形容詞としての「ヌクレオチド」という用語は、特に長さを限定せず一本鎖または二本鎖のRNA配列、DNA配列またはRNA/DNAハイブリッド配列を含む分子を示す。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、１個の分子を意味する個々のヌクレオチドまたは多種多様なヌクレオチド、あるいは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドである場合はプリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分およびリン酸基またはリン酸ジエステル結合を含む、大きな核酸分子に含まれる個々の単位を示す名詞としても使用する。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、(a)選択的結合基、(b)プリンからなる類似の形態、(c)ピリミジンからなる類似の形態、(d) 類似の糖類のうち少なくとも1つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」、例えば、類似の結合基、プリン、ピリミジンおよび糖などからなる修飾ヌクレオチドなどを包含するものとして使用する。たとえばPCT公開第WO 95/04064号を参照のこと。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは50%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチド、最も好ましくは90%より多くが従来のデオキシリボースヌクレオチドで構成される。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ex vivo生成またはこれらの組み合わせの他、従来技術において周知の精製方法を用いるなど、周知のどのような方法で調製したものであってもよい。
【００４２】
本願明細書では、他の核酸、炭水化物、脂質およびタンパク質(ポリヌクレオチドの合成に使用される酵素など)を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクター、あるいは線状ポリヌクレオチドから共有結合的に緊密なポリヌクレオチドを分離することを示す上で、「精製された」という表現を使用する。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリヌクレオチド配列およびコンホメーション(線状vs.共有結合的に緊密を呈する限り、実質的に純粋なものである。実質的に純粋なポリヌクレオチドは通常、約50%、好ましくは60〜90%w/wの核酸試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%を上回る。ポリヌクレオチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリヌクレオチドバンドを可視化するなどの方法によって示すことができる。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００４３】
本願明細書において、「単離された」という表現で示す物質は、その本来あるべき環境(たとえば、天然由来のものである場合は自然環境)から取り出されたものでなければならない。たとえば、生きた動物が持つ天然由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたとは言わないが、同じポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドを天然系で共存しているいくつかの物質またはすべての物質から分離すると、これは単離されたことになる。かかるポリヌクレオチドは、ベクターおよび/またはかかるポリヌクレオチドの一部の場合がある。あるいは、ポリペプチドが組成物の一部であることもある。このような状態であっても、そのベクターや組成物が天然環境の一部をなしているのでなければ、単離されているとする。
【００４４】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さとは無関係にアミノのポリマーを示す。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を指定するものでもこれを除外するものでもなく、たとえば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などが共有結合的に付加されたポリペプチドもポリペプチドという用語に明示的に包含される。さらに、この定義には、1種またはそれ以上のアミノ酸類似物(たとえば、非天然由来のアミノ酸、生物学的な独立系における天然でのみ発生するアミノ酸、哺乳動物の系由来の修飾アミノ酸などを含む)を含有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドの他、従来技術において周知の天然由来および非天然由来の他の修飾も含まれる。
【００４５】
本願明細書では、核酸、脂質、炭水化物、他のタンパク質を含むがこれに限定されるものではない他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを示す上で、「精製された」という表現を使用する。ポリペプチドは、試料の少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリペプチド配列を呈する限り、実質的に純粋なものである。実質的に純粋なポリペプチドは通常、約50%、好ましくは60〜90%w/wのタンパク質試料を含み、より一般には純度が約95%、好ましくは約99%を上回る。ポリペプチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの従来技術において周知のさまざまな手段を適用し、次いでゲルの染色時に単一のポリペプチドバンドを可視化するなどの方法によって示されている。特定の目的では、HPLCまたは従来技術において周知の他の手段によって一層高い解像度を得ることができる。
【００４６】
本願明細書では、「組換えポリペプチド」という用語を、人為的に設計され、もとの天然環境にある連続したポリペプチド配列には見られないポリペプチド配列を少なくとも2つ有するポリペプチドを示すものとして使用する。あるいは、組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを示すものとして使用する。
【００４７】
本願明細書において、「抗体」という用語は、ポリペプチド単体または少なくとも1つの結合ドメインで構成される複数のポリペプチドの集合を意味する。この場合、抗体結合ドメインは、抗体分子の可変ドメインの折り畳みで形成され、内面形状および電荷の分布が抗原の抗原決定基の特徴と相補的な三次元結合空間を形成する。これによって、抗原に対する免疫反応が可能になる。抗体としては、結合ドメインを有する組換えタンパク質の他、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2断片をはじめとする断片があげられる。
【００４８】
本願明細書において、「抗原決定基」は、抗原-抗体反応の特異性を決定する抗原分子、この場合はFLAPポリペプチドの一部である。「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、空間コンホメーションにわずか3個のアミノ酸を含むことができるものであるが、これはエピトープ独特の特徴である。通常、エピトープにはこのようなアミノ酸が少なくとも6個含まれており、一般にはこのようなアミノ酸が少なくとも8〜10個含まれる。エピトープを構成しているアミノ酸の判定方法としては、x線結晶解析、二次元核磁気共鳴の他、H. Mario Geysenら、1984、PCT公開公報第WO 84/03564号および同第WO 84/03506号などに記載されているようなPepscan法をはじめとするエピトープマッピングがあげられる。
【００４９】
本願明細書全体を通して、ポリヌクレオチドまたは核酸を同じように示すのに「ヌクレオチド配列」という表現を用いることがある。正確に言うと、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸材料自体を包含するため、特定のDNAまたはRNA分子を生化学的に特徴付ける配列情報(すなわち、4つの塩基文字を組み合わせた文字の羅列)に限定されるものではない。
【００５０】
「上流」という用語は、本願明細書では、特定の基準点からポリヌクレオチドの5'末端に向かう位置を示す。
【００５１】
「塩基対の」および「Watson & Crick塩基対の」という表現は、本願明細書では同義に用いられ、アデニン残基が2つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、シトシン残基およびグアニン残基が3つの水素結合によって結合した二重らせん状のDNAの配列同様に、配列に同一性があるため互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す(Stryer, L., 1995を参照のこと)。
【００５２】
「相補的」または「これらの相補体」という用語は、本願明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとWatson & Crick塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。この用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、2つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【００５３】
「アレル」という用語は、本願明細書では、ヌクレオチド配列の変異体を示すために使用される。複相生物は、アレル形態がホモ接合性のこともあればヘテロ接合性のこともある。
【００５４】
「プロモーター」という用語は、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要な細胞合成装置が認識できるDNA配列を示す。
【００５５】
プロモーターなどの制御配列に「作用的に結合した」配列は、前記調節エレメントの核酸に対する位置および配向が正しく、興味の対象となる核酸の発現とRNAポリメラーゼの開始を制御できる状態を意味する。本願明細書において、「作用的に結合した」という用語は、ポリヌクレオチドエレメントが機能的に連鎖をなした結合状態を示す。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響するような場合、これらのプロモーターやエンハンサーがコード配列に作用的に結合しているという。正確には、2つのDNA分子(プロモーター領域を有するポリヌクレオチドと所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドなど)間の結合によって(1)フレームシフト突然変異の導入が生じない、あるいは(2)プロモーターを有するポリヌクレオチドがコーディングポリヌクレオチドの転写を指示する性能に影響が出ない場合に、これら2つのポリヌクレオチドが「作用的に結合した」状態にあるという。
【００５６】
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列と相補であり、標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイズするのに使用される特異的オリゴヌクレオチド配列を示す。DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかが触媒するヌクレオチド重合の開始点として機能するのがプライマーである。
【００５７】
「プローブ」という用語は、試料中に存在する特異的ポリヌクレオチド配列の同定に使用できる定義済の核酸セグメント(あるいは下記において定義するようなポリヌクレオチドなどのヌクレオチド類似セグメント)であって、同定対象となる特異的ポリヌクレオチド配列の相補配列であるヌクレオチド配列を有する前記核酸セグメントを示す。
【００５８】
「ヘテロ接合率」という用語は、本願明細書では、特定のアレルでヘテロ接合的である個体群が集団に出現する率を示す。バイアレリックの系では、ヘテロ接合率は平均で2Pa(1-Pa)に等しい。式中、Paは共通アレルの最小頻度を意味する。遺伝研究に役立つものとするために、遺伝マーカーのヘテロ接合性を適当なレベルに定め、無作為に選択した個人がヘテロ接合的になる確率が最も高くなるようにする必要がある。
【００５９】
「遺伝子型」という用語は、本願明細書では、個体または試料中に存在するアレルの同一性を示す。本発明の文脈では、遺伝子型は、個体または試料中に存在するバイアレリックマーカーアレルのことを示すものであると好ましい。試料または個体のバイアレリックマーカーでの「遺伝子型を判定する」という表現は、バイアレリックマーカーの部分で個体が保持している特異的ヌクレオチドまたは特定のアレルを特定することである。
【００６０】
「変異」という用語は、本願明細書では、異なるゲノムまたは個体間の頻度1%未満のDNA配列の違いを示す。
【００６１】
「ハプロタイプ」という用語は、個体または試料中に存在するアレルの組み合わせを示す。本発明の文脈では、ハプロタイプは、特定の個体において見出され、表現型に関連している場合があるバイアレリックマーカーアレルの組み合わせを示すものであると好ましい。
【００６２】
「多型」という用語は、本願明細書では、異なるゲノムまたは個体間で2以上の選択的ゲノム配列またはアレルが出現することを示す。「多型の」という表現は、特異的ゲノム配列の2以上の変異体が個体群に見出される可能性がある状態を示す。「多型部位」は、バリエーションが発生する座である。単一ヌクレオチド多型は、単一塩基対の変化である。一般に、単一ヌクレオチド多型は、多型部位で1つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることである。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入も単一ヌクレオチド多型の原因である。本発明の文脈では、「単一ヌクレオチド多型」は、単一ヌクレオチド置換を示すものであると好ましい。一般に、異なるゲノム間または異なる個体間では、多型部位は2つの異なるヌクレオチドによって占められることがある。
【００６３】
「バイアレリックマーカー」は一塩基多型で構成される。したがって、各バイアレリックマーカーが遺伝子に含まれるポリヌクレオチド配列の2種類の形態に対応することになり、これらを互いに比較すると、1カ所でヌクレオチドに修飾が見られる。通常、ヌクレオチドの修飾ではヌクレオチド同士の入れ替えが起こる(たとえばTの代わりにCなど)。一般に、本発明によるバイアレリックマーカーの共通性の少ないアレル頻度は1%を上回り、好ましくは頻度が10%を上回り、さらに好ましくは頻度が少なくとも20%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも0.32)、さらに一層好ましくは頻度が少なくとも30%(すなわち、ヘテロ接合率は少なくとも0.42)であることが実証されている。共通性の少ないアレル頻度が30%以上のバイアレリックマーカーを「高品質バイアレリックマーカー」とする。
【００６４】
本願明細書において、「バイアレリックマーカーを定義する」という表現は、バイアレリックマーカーの多型塩基が配列に含まれていることを意味する。バイアレリックマーカーを定義する配列は、バイアレリックマーカーの多型塩基が含まれてさえいれば、意図した用途に応じてどのような長さのものとしてもよい。この配列の長さは1〜500ヌクレオチド長であり、好ましくは5ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチドまたは40ヌクレオチド長から200ヌクレオチド長の範囲、さらに好ましくは30〜50ヌクレオチド長である。好ましくは、バイアレリックマーカーを定義する配列としては、バイアレリックマーカーA1〜A28からなる群から選択される多型塩基があげられる。いくつかの実施形態では、バイアレリックマーカーを定義する配列に、P1〜P28からなる群から選択される配列のうちの1つが含まれる。同様に、「マーカー」または「バイアレリックマーカー」という用語を使うには、(必ずしも明白ではないが)多型アレルを実際に同定できるだけの十分な長さを持つ配列でなければならない。この長さは通常、少なくとも4ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長あるいは40ヌクレオチド長である。
【００６５】
本発明はまた、FLAP関連バイアレリックマーカーにも関するものである。「FLAP関連バイアレリックマーカー」および「FLAP遺伝子のバイアレリックマーカー」という用語は、本願明細書では、FLAP遺伝子と連鎖不平衡状態にあるあらゆるバイアレリックマーカーに関するものとして同義に用いられる。FLAP関連バイアレリックマーカーという用語には、図1に示す遺伝的なバイアレリックマーカーと非遺伝なバイアレリックマーカーの両方を含むが、これに限定されるものではない。
【００６６】
本願明細書において、「非遺伝な」という用語は、配列番号 1のヒトFLAPゲノム配列に見られるヌクレオチド位置の外で生じるFLAP関連バイアレリックマーカーならびにポリヌクレオチドおよびプライマーを示すものとして用いられる。本願明細書において、「遺伝的な」という用語は、配列番号 1のヒトFLAPゲノム配列に見られるヌクレオチド位置の内側で生じるFLAP関連バイアレリックマーカーならびにポリヌクレオチドおよびプライマーを示すものとして用いられる。
【００６７】
ポリヌクレオチドにおいてこのポリヌクレオチドの中心に対するヌクレオチドの位置は、本願明細書では以下の通りとする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が奇数である場合は、ポリヌクレオチドの3'末端および5'末端から等距離にあるヌクレオチドをそのポリヌクレオチドの「中心に」あるとみなし、中心のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドまたは中心のヌクレオチド自体を「中心から1ヌクレオチド以内」とする。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が奇数であれば、たとえばポリヌクレオチドの中心にある5カ所のヌクレオチド位置はいずれも中心から2ヌクレオチド以内ということになる。ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数が偶数である場合は、このポリヌクレオチドの中心は結合であり、ポリヌクレオチドの中心のヌクレオチドは存在しない。したがって、中心の2つのヌクレオチドのいずれも「中心から1ヌクレオチド以内」とみなされ、ポリヌクレオチドの中心にある4つのヌクレオチドはいずれも「中心から2ヌクレオチド以内」という具合になる。1つ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失が絡む多型の場合は、多型の置換、挿入または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの3'末端からの距離と、多型の置換、挿入または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの5'末端からの距離との差が、0ヌクレオチドまたは1ヌクレオチドの場合に、その多型、アレルまたはバイアレリックマーカーがポリヌクレオチドの「中心にある」とする。この差が0〜3の場合、その多型は「中心から1ヌクレオチド以内」であるとされる。差が0〜5の場合、その多型は「中心から2ヌクレオチド以内」であるとされる。差が0〜7であれば、その多型は「中心から3ヌクレオチド以内」という具合になる。
【００６８】
「形質」および「表現型」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、生物の可視的な性質、検出可能な性質またはこれ以外の場合であれば測定可能な性質一切を意味するものであり、一例としては疾患の徴候または疾患に対する感受性があげられる。本願明細書では通常、ロイコトリエン経路が関与している疾患の徴候または疾患に対する感受性を示すときに「形質」または「表現型」という用語を用いる。あるいは、この用語を、ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する個体の応答またはロイコトリエン経路に作用する薬剤の副作用の徴候またはこうした副作用に対する感受性を示すのに用いる。
【００６９】
「ロイコトリエン経路が関与している疾患」という用語は、ロイコトリエンに対する細胞応答、産生または発現の乱れに結びつく状態を示す。ロイコトリエン経路が関与している疾患としてはアンギナ、内毒素ショック、乾癬、アトピー性湿疹、関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、腱炎、滑液包炎、潰瘍性結腸炎、アレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、糸球体腎炎、片頭痛、さらには特に喘息があげられるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
「ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する応答」という用語は、個体の化合物代謝機能、プロドラッグをアクティブドラッグに変える機能、個体での薬物の薬動学(吸収、分布、排泄)および薬動力学(受容体関連)を含むがこれに限定されるものではない薬効を示す。本発明の文脈では、薬物に対する「ポジティブな応答」を、疾患に関連する徴候または治療対象となる状態が軽減される応答と定義することができる。本発明の文脈では、薬物に対する「ネガティブな応答」を、薬剤投与後の観察で薬剤に対するポジティブな応答に欠ける状態、あるいは徴候や副作用の軽減が認められない応答と定義することができる。
【００７１】
「ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する副作用」という用語は、薬物の主要な薬理学的作用がおよぶことで生じる治療の有害作用、あるいは独特な宿主因子と薬物とが相互作用することによって生じる、特異体質による有害反応を示す。ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いる治療に関係する副作用は、好ましくは、喘息や感染、頭痛などの炎症性疾患の急性増悪、さらに好ましくは肝臓のトランスアミナーゼ濃度の上昇である。
【００７２】
「ロイコトリエン経路に作用する薬剤」という用語は、好ましくは、細胞または動物でロイコトリエン経路に関与する酵素または調節分子の活性または濃度を調節する薬物または化合物を示す。好ましくは、BAYx 1005、MK-886、MK-0591などのFLAPインヒビター、Zileuton、BAY-G576、RS-43，179、Wy-47,288、ビタミンA、BW A4Cなどの5-リポキシゲナーゼインヒビター、zafirlukast、ICI 204,219、MK-571、MK-679、ONO-RS-411、SK&F 104,353、Wy-48,252などのロイコトリエンLTD4受容体アンタゴニスト、ロイコトリエンB4受容体アンタゴニスト、ロイコトリエンC4合成酵素インヒビター、ロイコトリエンA4加水分解インヒビターの群からこれらの薬剤を選択することができる。「ロイコトリエン経路に作用する薬剤」にはさらに、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、ロイコトリエン受容体アンタゴニストおよびロイコトリエン類似物も含まれる。さらに、「ロイコトリエン経路に作用する薬剤」には、ロイコトリエンの形成および作用を調節する化合物も含まれる。
【００７３】
上述した化合物の中には、米国特許第4,873,259号、同第4,970,215号、同第5,310,744号、同第5,225,421号および同第5,081,138号または欧州特許第EP 0 419 049号に記載されているものもある。これらの特許の内容を本願明細書に援用する。
【００７４】
「個体」という用語は、本願明細書では脊椎動物を示し、特に、哺乳動物種の仲間を示す。個体には、家畜、競技用動物、実験動物、霊長類、人間が含まれるがこれに限定されるものではない。好ましくは、個体は人間である。
【００７５】
(変異体と断片)
ポリヌクレオチド
本発明は、本願明細書において述べるポリヌクレオチドの変異体および断片、特に、本発明による1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーを含んでいるFLAP遺伝子の変異体および断片にも関するものである。
【００７６】
ポリヌクレオチドの変異体は、本願明細書で使用する用語として、基準ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然由来のバイアレリック変異体などの天然由来の変異体であっても、天然には産生されないことが分かっている変異体であってもよい。ポリヌクレオチド、細胞または生物で用いられているものと同様の突然変異誘起技術によって、上記のような非天然由来のポリヌクレオチド変異体を作製してもよい。違いには通常は限りがあるため、基準のヌクレオチド配列と変異体のヌクレオチド配列は全体的に見れば類似しており、多くの領域が同一である。
【００７７】
変異体のヌクレオチドが変化しても表現型としては無変化の場合もある。これは、そのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸には変化がないということを意味する。
【００７８】
しかしながら、ヌクレオチドが変化することで、基準配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸に置換、付加、欠失、融合および切り詰めが生じることもある。置換、欠失または付加には、1つまたはそれ以上のヌクレオチドが関与することがある。変異体もコード領域または非コード領域の一方または両方で変化する場合がある。コード領域が変わると、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加が生じ得る。
【００７９】
本発明の文脈では、ポリヌクレオチドによって、FLAP成熟タンパク質と実質的に同じ生物学的機能または活性が維持されるポリペプチドがコードされる実施形態が特に好ましいものである。
【００８０】
ポリヌクレオチド断片は、特定のヌクレオチド配列、好ましくはFLAP遺伝子およびその変異体のヌクレオチド配列と一部が完全に同一であるが全てが同じではない配列を有するポリヌクレオチドである。この断片は、FLAP遺伝子のエキソンまたはイントロンの一部であってもよい。あるいは、FLAP遺伝子の制御配列の一部であってもよい。このような断片には、バイアレリックマーカーA1〜A28のうち少なくとも1つの多型塩基、これらの相補体、あるいはバイアレリックマーカーA1〜A28の1つまたはそれ以上と連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーが含まれると好ましい。
【００８１】
このような断片は、「自立状態」すなわち、他のポリヌクレオチドの一部であったり他のポリヌクレオチドと融合したものでなくてもよく、この断片よりも大きな単一のポリヌクレオチドでその一部または領域をなすものであってもよい。しかしながら、この断片よりも大きな1つのポリヌクレオチドは複数の断片で構成されていてもよい。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド断片の代表例として、約4、6、8、15、20、25、40、10〜20、10〜30、30〜55、50〜100、75〜100または100〜200ヌクレオチド長の断片があげられる。好ましい断片は、P1〜P28の断片など約47ヌクレオチド長で、本願明細書で述べるFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを少なくとも1つを含んでいるものである。もちろん、ポリヌクレオチドP1〜P28はこれよりも短くても長くてもよいが、少なくとも、断片の一末端に位置し得るバイアレリックマーカーの多型塩基を有するものであると好ましいことは理解できよう。
【００８３】
ポリペプチド
本発明は、変異FLAPタンパク質をはじめとして、本願明細書で説明するポリペプチドの変異体、断片、類似物および誘導体にも関する。
【００８４】
変異体は、1)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)で置換されたものであり、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号でコードされたものであってもコードされていないものであってもよいものであるか、2)1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるか、3)変異FLAPがポリペプチドの半減期を延ばす化合物(たとえばポリエチレングリコール)などの他の化合物と融合したものであるか、4) リーダー配列または分泌配列、変異FLAPまたはプレタンパク質配列の精製に用いられる配列などの変異FLAPと付加アミノ酸が融合したものでよい。このような変異体については、当業者であれば理解できよう。
【００８５】
ポリペプチド断片というのは、特定のポリペプチド配列、好ましくはFLAP遺伝子およびその変異体によってコードされたポリペプチドと一部が完全に同一であるが全てが同じではない配列を有するポリペプチドである。好ましい断片としては、ロイコトリエンの生合成において何らかの役割を果たすFLAPタンパク質の活性領域断片、抗原特性を有し、かつFLAPタンパク質に対する抗体の産生に利用できる領域の断片があげられる。
【００８６】
このような断片は、「自立状態」すなわち、他のポリペプチドの一部であったり他のポリペプチドと融合したものでなくてもよく、この断片よりも大きな単一のポリペプチドでその一部または領域をなすものであってもよい。しかしながら、この断片よりも大きな1つのポリペプチドは複数の断片で構成されていてもよい。
【００８７】
本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、約5、6、7、8、9または10〜15、10〜20、15〜40、あるいは30〜55アミノ酸長の断片があげられる。好ましい断片は、FLAPタンパク質に少なくとも1つのアミノ酸変異部分が含まれている断片である。
【００８８】
厳密なハイブリダイゼーション条件
一例であり限定するものではないが、厳密度の高い条件を用いて行われる手順は次の通りである。6ラSSC、トリス-HCl(pH7.5)50mM、EDTA 1mM、0.02% PVP、0.02%フィコール、0.02% BSAおよび変性サケ精子DNA 500μg/mlで構成される緩衝液にて、65℃で8時間から一晩かけて、DNAを含有するフィルターをプレハイブリダイゼーションする。好ましいハイブリダイゼーション温度である65℃にて48時間、変性サケ精子DNA 100μg/mlと32P標識プローブ5〜20ラ106cpmとを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルタをハイブリダイズさせる。あるいは、SSC緩衝液(1ラSSCが0.15M NaClおよび0.05 Mクエン酸 Naに相当)の存在下、65℃でハイブリダイゼーションステップを行うことができる。続いて、2ラSSC、0.01% PVP、0.01%フィコールおよびBSA 0.01%を含有する溶液中で37℃で1時間、次いで0.1ラSSCで50℃にて45分かけてフィルタを洗浄することができる。あるいは、2ラSSCと0.1% SDSまたは0.5ラSSCと0.1% SDSまたは0.1ラSSCと0.1% SDSを含有する溶液で68℃にて15分間隔でフィルタを洗浄することができる。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブをオートラジオグラフィによって検出することが可能である。厳密度が高く使用可能な他の条件は当業者間で周知のものであり、Sambrookら、1989およびAusubelら、1989に引用されている(その記載内容全体を本願明細書に援用する)。これらのハイブリダイゼーション条件は、約20ヌクレオチド長の核酸分子に適している。上述したハイブリッド条件が当業者間で周知の技術を用いて所望の核酸長に応じて調整されることは、言うまでもないことであろう。適したハイブリッド条件は、たとえばHames and Higgins(1985)またはSambrookら(1989)の本に開示されている教示内容に沿ったものなどである。
【００８９】
核酸またはポリペプチド間の同一性
「配列同一性率」および「相同率」という用語は、本願明細書ではポリヌクレオチドおよびポリペプチドの比較結果を示すものとして同義に用いられ、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列2つを比較することによって求められるものである。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、2つの配列の最適なアライメントについての基準配列(付加や欠失がないもの)と比較したときに付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれていることがある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出する。相同については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALW(Pearson and Lipman, 1988、Altschulら、1990、Thompsonら、1994、Higginsら、1996、Altschulら、1990、Altschulら、1993)があげられるが、何らこれらに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)(たとえば、Karlin and Altschul, 1990、Altschulら、1990、Altschulら、1993、Altschulら、1997を参照のこと)を用いてタンパク質配列およびヌクレオチド配列の相同性を評価する。特に、5つの専用BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施する。
【００９０】
(1)  BLASTPおよびBLAST3で、アミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較
(2)  BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較
(3)  BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列(両方の鎖)を6つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較
(4)  TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を、6つの読み枠(両方の鎖)すべてで翻訳したヌクレオチド配列データベースと比較
(5)  TBLASTXでヌクレオチドのクエリー配列を6つの読み枠で翻訳したものを、ヌクレオチド配列データベースの6つの読み枠で翻訳したものと比較
【００９１】
BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたはヌクレオチド配列データベースから得られた被検配列との間で、本願明細書では「ハイスコアセグメント対」と呼ぶ類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定(すなわち整列化)されると好ましい。好ましくは、使用するスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである(Gonnetら、1992、Henikoff and Henikoff, 1993)。このマトリックスほど好ましいものではないが、PAMまたはPAM250マトリックスも使用できる(たとえば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978を参照のこと)。BLASTプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計学的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計学的な有意性を求めるKarlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計学的な有意性を評価すると好ましい(Karlin and Altschul, 1990を参照のこと)。
【００９２】
II.  FLAPのゲノム配列
FLAP遺伝子は医薬品の研究開発と非常に関連性の深いものであるにもかかわらず、FLAP遺伝子とその調節エレメントの配列変化の程度や性質に関する知識が本願発明者らには不足している。ヒトFLAPのcDNAおよびゲノム配列の一部のクローニングと配列決定はすでになされている(Kennedyら、1991; Dixonら、1988)。しかしながら、FLAPの調節エレメントを含む完全ゲノム配列についてはいまだに説明がついていないのである。
【００９３】
本発明には、配列番号 1のFLAP遺伝子のゲノム配列またはその変異体、あるいはこれに対する相補配列が包含される。配列番号 1のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドまたはその変異体、あるいはこれに対する相補配列を精製、単離、あるいは組換えることが可能である。このFLAPゲノム配列には、エキソンおよびイントロンが含まれている。FLAPイントロンのポリヌクレオチド由来の核酸をオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用し、被検試料に含まれるFLAP遺伝子のコピーの存在を検出したり、あるいはFLAP配列内で標的ヌクレオチド配列を増幅したりすることができる。
【００９４】
本発明には、配列番号 1のヌクレオチド配列またはその相補配列またはその断片と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%あるいは95%のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を有する、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも包含される。配列番号 1のヌクレオチド配列とのヌクレオチド差は一般に、核酸全体にランダムに分布させることができる。とはいえ、好ましい核酸は配列番号 1のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド差がエキソンに含まれるコード配列の外に優先的にくるようなものである。これらの核酸ならびにその断片および変異体を、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用して、被検試料に含まれるFLAP遺伝子のコピーの存在を検出したり、あるいはFLAP配列内で標的ヌクレオチド配列を増幅したりすることができる。
【００９５】
FLAPゲノム核酸には5エキソンが含まれている。エキソン1は、配列番号 1のヌクレオチド配列の7709位のヌクレオチドで開始して7852位のヌクレオチドで終止する。エキソン2は、配列番号 1のヌクレオチド配列の16236位のヌクレオチドで開始して16335位のヌクレオチドで終止する。エキソン3は、配列番号 1のヌクレオチド配列の24227位のヌクレオチドで開始して24297位のヌクレオチドで終止する。エキソン4は、配列番号 1のヌクレオチド配列の28133位のヌクレオチドで開始して28214位のヌクレオチドで終止する。エキソン5は、配列番号 1のヌクレオチド配列の36128位のヌクレオチドで開始して36605位のヌクレオチドで終止する。本発明はまた、FLAP遺伝子のエキソン少なくとも2つの組み合わせを含み、ポリヌクレオチドが核酸の5'-末端から3'-末端まで配列番号 1と同じ順序で前記核酸内に位置する、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸についても扱う。
【００９６】
また、本発明は、FLAPタンパク質をコードし、好ましくは本願明細書で説明するバイアレリック多型を少なくとも1つ有し、さらに好ましくは後述する方法を用いて測定される形質誘因変異を有するFLAP遺伝子を含む、精製されたおよび/または単離された核酸にも関するものである。いくつかの実施形態では、FLAP遺伝子には、P1〜P13、P15、P17〜P28の配列またはこれらに対する相補配列、あるいはその断片または変異体のうち1つまたはそれ以上が含まれる。好ましいポリヌクレオチドは、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補配列からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを少なくとも1つ有する。さらに、本発明によれば、プライマーおよびプローブとして用いて、バイアレリックマーカーを持つ断片を増幅したり、バイアレリックマーカーアレルを検出したりすることができるポリヌクレオチドが得られる。
【００９７】
本発明の特に好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を有し、前記連続スパンが、配列番号 1のヌクレオチド位置1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976、および36927〜43069のうち少なくとも1、2、3、5または10カ所を含むものである、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。本発明の他の好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を有し、配列番号前記連続スパンの配列番号 1の16348位のCを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。本発明のさらに好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を有し、前記連続スパンが配列番号 1のヌクレオチド位置7612〜7637、24060〜24061、24067〜24068、27903〜27905、および28327〜28329を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。このセクションで述べるポリヌクレオチドが任意のサイズおよび配列の核酸断片で構成されたものであってもよいことに注意されたい。本発明の別の好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、前記連続スパンが、配列番号 1の7445位のA、7870位のA、16288位のT、16383位のA、24361位のT、28336位のG、28368位のT、36183位のA、36509位のGからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。
【００９８】
このセクションには「FLAPのゲノム配列」というタイトルを付したが、このセクションで述べるポリヌクレオチドが、FLAPのゲノム配列を片側またはこのようなゲノム配列2つ以上の間でフランキングして任意のサイズおよび配列の核酸断片で構成されたものであってもよいことに注意されたい。
【００９９】
FLAP遺伝子の制御領域
FLAP遺伝子のゲノム配列には、この遺伝子の5エキソンを含むFLAP転写領域の境界をなす非コーディング5'-フランキング領域と非-コーディング3'-フランキング領域の両方に制御配列が含まれている。FLAP遺伝子の5'-制御配列には、配列番号 1のヌクレオチド配列の1位のヌクレオチドと7708位のヌクレオチドとの間、さらに好ましくは配列番号 1の1位と7007位との間にポリヌクレオチド配列に位置するポリヌクレオチドの配列が含まれる。FLAP遺伝子の3'-制御配列には、配列番号 1のヌクレオチド配列の36606位のヌクレオチドと43069位のヌクレオチドとの間に位置するポリヌクレオチド配列が含まれる。
【０１００】
FLAPコーディング領域の5'末端と3'末端の両方に位置する調節エレメントのあるポリヌクレオチドを有効に利用して、興味の対象となる異種ポリヌクレオチドの転写翻訳活性を制御することができる。前記ポリヌクレオチドは、FLAP制御領域に対して異種のものである。
【０１０１】
このため、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列の1位のヌクレオチドと7708位のヌクレオチドとの間、さらに好ましくは配列番号 1の1位と7007位との間に位置するポリヌクレオチド配列、配列番号 1の36606位のヌクレオチドと43069位のヌクレオチドとの間に位置するポリヌクレオチド配列、あるいはその相補配列またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドを有する、精製された核酸、単離された核酸および組換え核酸にも関する。
【０１０２】
また、本発明は、配列番号 1のヌクレオチド配列の1位のヌクレオチドと7708位のヌクレオチドとの間、さらに好ましくは配列番号 1の1位と7007位との間に位置するポリヌクレオチド配列と、配列番号 1の36606位のヌクレオチドと43069位のヌクレオチドとの間に位置するポリヌクレオチド配列、あるいはその変異体またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドと比較して、ヌクレオチド同一性が少なくとも95%、有利にはヌクレオチド同一性が99%、好ましくはヌクレオチド同一性が99.5%、最も好ましくはヌクレオチド同一性が99.8%であるポリヌクレオチドを有する、精製または単離された核酸にも関する。
【０１０３】
本発明の別の目的は、本願明細書にて定義する厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号 1の1位のヌクレオチドと7007位のヌクレオチドとの間に位置するポリヌクレオチド配列と、配列番号 1の36606位のヌクレオチドと43069位のヌクレオチドとの間に位置するポリヌクレオチド配列、これらに対する相補配列、あるいはその変異体またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを有する、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸からなる。
【０１０４】
さらに、本発明は、
-配列番号 1のヌクレオチド配列の1位のヌクレオチドと7708位のヌクレオチドとの間、さらに好ましくは配列番号 1の1位と7007位との間にあり、かつ、A1〜A11およびA25〜A28、あるいはその相補配列またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを有するポリヌクレオチド配列と、
-配列番号 1の36606位のヌクレオチドと43069位のヌクレオチドとの間にあり、A22〜A24およびこれらの相補体、あるいはその相補配列またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを有するポリヌクレオチド配列と、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを有する、精製された核酸、単離された核酸および組換え核酸にも関する。
【０１０５】
本発明による配列番号 1の「生物学的に活性な」断片は、組換え細胞宿主で組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための制御領域として機能するポリヌクレオチドの断片を有するまたは選択的にこの断片からなる前記ポリヌクレオチドを対象としたものである。
【０１０６】
本発明の目的で、核酸またはポリヌクレオチドは、前記調節ポリヌクレオチドが転写調節情報と翻訳調節情報を持つヌクレオチド配列を含み、このような配列が所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または所望のポリヌクレオチドと「作用的に結合した」状態に位置する場合に、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための制御領域として「機能する」。
【０１０７】
5'-制御配列または3'-制御配列の好ましい断片は、約1500または1000ヌクレオチド長、好ましくは約500ヌクレオチド長、さらに好ましくは約400ヌクレオチド長、一層好ましくは300ヌクレオチド長、最も好ましくは約200ヌクレオチド長である。
【０１０８】
本発明の調節ポリヌクレオチドは、たとえばSambrookら(1989)の本に記載されているように、適当な制限酵素を用いて切断することで配列番号 1のポリヌクレオチドから調製可能である。この調節ポリヌクレオチドは、Bal31(Wabikoら、1986)などのエキソヌクレアーゼ酵素で配列番号 1のポリヌクレオチドを消化して調製することも可能である。さらに、本願明細書の他の箇所で述べるような核酸の化学合成によって調節ポリヌクレオチドを調製することもできる。
【０１０９】
本発明による調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物でのコード配列の発現に使用できる組換え発現ベクターの一部をなすものであると都合がよいことがある。
【０１１０】
本発明の好ましい5'-調節ポリヌクレオチドとしては、FLAP cDNAの5'-非翻訳領域(5'-UTR)、あるいはその生物学的に活性な断片または変異体があげられる。
【０１１１】
本発明の好ましい3'-調節ポリヌクレオチドとしては、FLAP cDNAの3'-非翻訳領域(3'-UTR)、あるいはその生物学的に活性な断片または変異体があげられる。
【０１１２】
本発明のさらに他の目的は、
a)(i)配列番号 1の1位で開始し7708位で終止する、さらに好ましくは配列番号 1の1位で開始し7007位で終止するポリヌクレオチドまたはその相補配列と、
(ii)配列番号 1の1位で開始し7708位で終止する、さらに好ましくは配列番号 1の1位で開始し7007位で終止するヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド同一性が少なくとも95%であるポリヌクレオチドまたはその相補配列と、
(iii)配列番号 1の1位で開始し7007位で終止するヌクレオチド配列と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補配列と、
(iv)(i)、(ii)および(iii)のポリヌクレオチドの生物学的に活性な断片または変異体と、
からなる群から選択される調節ヌクレオチド配列を有する核酸と、
b)上記(a)にて定義した核酸に作用的に結合した、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは興味の対象となる核酸と、
c)任意に、3'-調節ポリヌクレオチド、好ましくはFLAP遺伝子の3'-調節ポリヌクレオチドを有する核酸と、
を有する、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドからなるものである。
【０１１３】
上記にて定義した核酸の特定の実施形態では、前記核酸が、FLAP cDNAの5'-非翻訳領域(5'-UTR)あるいはその生物学的に活性な断片または変異体を含む。
【０１１４】
上記にて定義した核酸の第2の特定の実施形態では、前記核酸が、FLAP cDNAの3'-非翻訳領域(3'-UTR)あるいはその生物学的に活性な断片または変異体を含む。
【０１１５】
制御配列は、A1〜A11およびA22〜A28からなる群から選択されるバイアレリックマーカーならびにこれらの相補体を有するものであってもよい。
【０１１６】
上述した核酸によってコードされるポリペプチドには、原核生物由来または真核生物由来のタンパク質をはじめとして、さまざまな性質および起源ものを利用できる。FLAP制御領域の制御下で発現されるポリペプチドとして、バクテリア抗原、菌類抗原またはウイルス抗原があげられる。また、たとえば「ハウスキーピング」タンパク質といった細胞内タンパク質などの真核生物タンパク質、受容体などの膜結合タンパク質、サイトカインなどの分泌タンパク質なども包含される。特定の実施形態では、所望のポリペプチドはFLAPタンパク質であってもよく、特にアミノ酸配列が配列番号 3であるタンパク質である。
【０１１７】
上述したポリヌクレオチド、通常はRNA分子によってコードされる所望の核酸は、FLAPコード配列などの所望のコーディングポリヌクレオチドに対して相補なものであってもよいため、アンチセンスポリヌクレオチドとして有用である。
【０１１８】
このようなポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞または宿主生物で所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現させてもよい。
【０１１９】
III.  FLAP cDNA配列
本発明によれば、配列番号 2のFLAP cDNAが得られる。この配列番号 2のcDNAにも5'-UTR領域と3'-UTR領域とが含まれている。5'-UTR領域は、配列番号 2の1位のヌクレオチドで開始して74位のヌクレオチドで終止する。3'-UTR領域は、配列番号 2の561位のヌクレオチドで開始して875位のヌクレオチドで終止する。ポリアデニル化部位は、配列番号 2の851位のヌクレオチドで開始して856位のヌクレオチドで終止する。
【０１２０】
結果として、本発明は、FLAP cDNAの5'UTRおよび3'UTRのヌクレオチド配列、これらに対する相補配列、あるいはそのアレル変異体を有する、精製された核酸、単離された核酸および組換え核酸にも関する。
【０１２１】
本発明の別の目的は、配列番号 2のヌクレオチド配列、これに対する相補配列、あるいはその変異体または断片を有する、精製された核酸、単離された核酸または組換え核酸である。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、配列番号 2の配列からなるか、実質的に配列番号 2の配列からなる、あるいは配列番号 2の配列を有する、精製されたFLAP cDNA、単離されたFLAP cDNAまたは組換えFLAP cDNAがあげられる。本発明の特に好ましい実施形態としては、配列番号 2の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列を含む、前記連続スパンの配列番号 2の197位(A13)のT、453位(A20)のA、あるいは779位(A21)のGを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。
【０１２２】
ほとんどのバイアレリック多型ではサイレントなヌクレオチド置換であるが、バイアレリックマーカーA20は、対応するFLAPポリペプチドの127位のバリンがイソロイシンに変わるアミノ酸の変化を伴う。
【０１２３】
本発明のFLAP遺伝子のコード配列を含む上記にて開示したポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドを適当な発現シグナルの制御下におけば所望の宿主細胞または所望の宿主生物で発現させることができるものである。発現シグナルは、本発明のFLAP遺伝子の制御領域に含まれる発現シグナルであっても、外来調節ヌクレオチド配列であってもよい。このようなポリヌクレオチドは、適当な発現シグナル下におくことで、これを発現させるためのベクターに挿入することができるものである。
【０１２４】
このセクションには「FLAP cDNA配列」というタイトルを付したが、このセクションで述べるポリヌクレオチドが、FLAPのゲノム配列を片側またはこのようなゲノム配列2つ以上の間でフランキングして任意のサイズおよび配列の核酸断片で構成されたものであってもよいことに注意されたい。
【０１２５】
コード領域
FLAP読み枠は、配列番号 2の対応するmRNAに含まれている。正確に言うと、有効FLAPコード配列(CDS)は、配列番号 2のポリヌクレオチド配列の75位に位置するヌクレオチド(ATGコドンの最初のヌクレオチド)から560位に位置するヌクレオチド(TGAコドンの最後のヌクレオチド)の範囲におよぶ。本発明はまた、配列番号 3の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8または10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを有し、前記連続スパンが配列番号 3のアミノ酸127位にイソロイシン残基を有する、ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換えポリヌクレオチドを例示するものである。
【０１２６】
FLAP遺伝子のコード配列を含む上記にて開示したポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドを適当な発現シグナルの制御下におけば所望の宿主細胞または所望の宿主生物で発現させることができるものである。発現シグナルは、本発明のFLAP遺伝子の制御領域に含まれる発現シグナルであっても、対照的にシグナルは外来調節ヌクレオチド配列であってもよい。このようなポリヌクレオチドは、適当な発現シグナル下におくことで、これを発現および/または増幅させるためのベクターに挿入することができるものである。
【０１２７】
IV.  ポリヌクレオチドコンストラクト
本願明細書では、「ポリヌクレオチドコンストラクト」および「組換えポリヌクレオチド」という用語を同義なものとして使用する。この用語は、人為的に設計され、もとの天然環境にある連続したヌクレオチド配列には見られないヌクレオチド配列を少なくとも2つ有する、線状または環状の、精製または単離されたポリヌクレオチドを示す。
【０１２８】
組換え細胞宿主およびトランスジェニック動物での時間的および空間的FLAP遺伝子発現を指揮できるDNAコンストラクト
FLAPタンパク質の合成がなされなくなることで、生理学的および表現型の面でどのような結果が生じるのかを研究するために、細胞レベルと多細胞生物レベルの両方で、本発明は、FLAPゲノム配列またはcDNの特定のアレル、さらには配列番号 1と配列番号 2のFLAPヌクレオチド配列またはその断片に関して1種またはそれ以上の塩基が置換、欠失、あるいは付加されたゲノム配列またはcDNAのコピーをコンディショナル発現できるDNAコンストラクトおよび組換えベクターを包含する。これらの塩基置換、欠失または付加は、エキソン、イントロンまたは制御配列のいずれかに位置するものであるが、好ましくは5'-制御配列またはFLAPゲノム配列のエキソンまたは配列番号 2のFLAP cDNAである。好ましい実施形態では、FLAP配列が、本発明のバイアレリックマーカー、好ましくはA1〜A28のバイアレリックマーカーのうちの1つを有する。
【０１２９】
本発明では、本発明において述べるポリヌクレオチドのうちいずれか1つを含む組換えベクターを例示する。
【０１３０】
第1の好ましいDNAコンストラクトは、Gossen. ら(1992, 1995)およびFurth ら(1994)に記載されているような、FLAP遺伝子発現を制御するためにE. coli転移因子Tn110から得たテトラサイクリン耐性オペロンtetを主な構成要素とするものである。このようなDNAコンストラクトは、Tn10(tetop)から得られるtetオペレーター配列を7つ有し、これらの配列がFLAP遺伝子の最小プロモーターまたは5'-制御配列に融合している。前記最小プロモーターまたは前記FLAP制御配列は、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドかポリペプチド(FLAPポリペプチドまたはそのペプチド断片)のいずれかをコードする、興味の対象となるポリヌクレオチドに作用的に結合されている。このDNAコンストラクトは、同じ細胞が、HCMVIE1エンハンサー/プロモーターまたはMMTV-LTRなどのプロモーターによる制御下にある単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質VP16の活性化ドメインに融合した野生型(tTA)または突然変異体(rTA)レプレッサーのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む場合に、興味の対象となるヌクレオチド配列のコンディショナル発現系として機能する。特に、本発明の好ましいDNAコンストラクトは、tetオペレータ配列を有するポリヌクレオチドと、tTAレプレッサーまたはrTAレプレッサーをコードする配列を有するポリヌクレオチドの両方を含む。
【０１３１】
特定の実施形態では、コンディショナル発現DNAコンストラクトが、突然変異体テトラサイクリンレプレッサーrTAをコードする配列を含む。興味の対象となるポリヌクレオチドの発現は、テトラサイクリンの非存在下でサイレントであり、テトラサイクリンが存在すると誘起される。
【０１３２】
相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト:  交換ベクター(replacement vector)
第2の好ましいDNAコンストラクトは、5'-末端から3'-末端に、(a)FLAPゲノム配列に含まれる第1のヌクレオチド配列と、(b)ネオマイシン耐性に対するマーカー(neo)などのポジティブ(positive)選択マーカーを含むヌクレオチド配列と、(c)FLAPゲノム配列に含まれ、第1のFLAPヌクレオチド配列(a)よりも下流のゲノムに位置する第2のヌクレオチド配列と、を含む。
【０１３３】
好ましい実施形態では、このDNAコンストラクトは、ヌクレオチド配列(a)の上流またはヌクレオチド配列(c)の下流に位置するネガティブ選択マーカーも含む。ネガティブ選択マーカーは、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子(Thomasら、1986)、ハイグロマイシンβ遺伝子(Te Rieleら、1990)、hprt遺伝子(Van der Lugtら、1991; Reidら、1990)またはジフテリア毒A断片(Dt-A)遺伝子(Nadaら、1993; Yagiら、1990)からなるものであると好ましい。ポジティブ選択マーカーは、FLAPタンパク質をコードする配列を中断するようにFLAPエキソン配列内に位置するものであると好ましい。これらの交換ベクターについては、たとえば、Thomasら(1986; 1987)、Mansourら(1988)およびKollerら(1992)に記載されている。
【０１３４】
第1のヌクレオチド配列(a)および第2のヌクレオチド配列(c)は、FLAP制御配列、イントロン配列、エキソン配列、あるいは制御配列および/またはイントロン配列および/またはエキソン配列の両方を含む配列内のどこにでも位置する。ヌクレオチド配列(a)および(c)のサイズは、1〜50kb、好ましくは1〜10kb、さらに好ましくは2〜6kb、最も好ましくは2〜4kbの範囲である。
【０１３５】
相同的組換えを可能にするDNAコンストラクト:  Cre-LoxP系
これらの新規なDNAコンストラクトでは、P1ファージの部位特異的組換え系を利用している。P1ファージは、Creと呼ばれるリコンビナーゼを有する。このリコンビナーゼは、loxP部位の34塩基対と特異的に相互作用する。loxP部位は、8bpの保存配列で分離された13bpのパリンドローム配列2つで構成される(Hoessら、1986)。同一の配向を有する2つのloxP部位間のCre酵素による組換えによって、DNA断片に欠失が生じる。
【０１３６】
Cre-loxP系と相同的組換え法との併用について、Guら(1993, 1994)にはじめて明らかにされた。簡単に説明すると、ゲノムの標的位置に挿入する対象となる問題のヌクレオチド配列が、少なくとも2つのloxP部位を同一配向で有し、これらの部位が組換えゲノムから切除すべきヌクレオチド配列のそれぞれの末端に位置する。切除現象を起こすには、組換え細胞宿主の核内にリコンビナーゼ(Cre)酵素がなければならない。リコンビナーゼ酵素は、(a)Arakiら(1995)に記載されているようにCre酵素を直接所望の細胞に接種するか、あるいはBaubonisら(1993)に記載されているように前記酵素を細胞にリポフェクションすることによって、この酵素を含む培地で組換え細胞宿主をインキュベートする方法、(b)細胞宿主を、組換え細胞宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性であってもよい)と作用的に結合されたCreコード配列を含み、Guら(1993)およびSauerら(1988)に記載されているようにして組換え細胞宿主に導入されるベクターでトランスフェクトする方法、(c)組換え細胞宿主で機能するプロモーター(任意に誘導性であってもよい)と作用的に結合されたCreコード配列を含み、Guら(1994)に記載されているようにランダム挿入現象または相同的組換え現象によって細胞宿主のゲノムに挿入されるポリヌクレオチドを、細胞宿主のゲノムに導入する方法のいずれかによって、所望のタイミングで導入可能なものである。
【０１３７】
特定の実施形態では、選択可能なマーカーが同一配向のloxP部位によってフランキングされるように相同的組換えによってFLAP遺伝子に挿入される配列を有するベクターが構築される。Cre酵素での処理によって、選択可能なマーカーが除去され、相同的組換え現象によって挿入されていた興味の対象であるFLAP配列が残る可能性がある。また、2つの選択可能なマーカーすなわち、組換え現象を探査するためのポジティブ選択マーカーと、相同的組換え現象を探査するためのネガティブ選択マーカーが必要である。Cre-loxP系で用いるベクターおよび方法については、Zouら(1994)に記載されている。
【０１３８】
このため、本発明の第3の好ましいDNAコンストラクトは、5'-末端から3'-末端に、(a)FLAPゲノム配列に含まれる第1のヌクレオチド配列と、(b)ポジティブ(positive)選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する2つの配列を同一配向でさらに有するヌクレオチド配列と、(c)FLAPゲノム配列に含まれ、第1のFLAPヌクレオチド配列(a)よりも下流のゲノムに位置する第2のヌクレオチド配列と、を含む。
【０１３９】
loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する配列は、ヌクレオチド配列(b)内でコンディショナル切除が探査されるヌクレオチド配列の境界となる適した位置に位置すると好ましい。特定の実施形態では、相同的組換え現象から所望の時間経過後に切除がなされるようにするために、2つのloxP部位がポジティブ選択マーカー配列の両側に位置している。
【０１４０】
上述した第3のDNAコンストラクトを使用する方法の好ましい実施形態では、リコンビナーゼが認識する2つの部位、好ましくは2つのloxP部位で境界が定められているポリヌクレオチド断片が所望のタイミングで切除される。これは、組換え宿主細胞のゲノム内に、プロモーター配列、好ましくは誘導性プロモーター、より好ましくは組織特異的プロモーター配列、最も好ましくはGuら(1994)に記載されているような誘導性で組織特異的なプロモーター配列に作用的に結合されたCre酵素をコードする配列が存在するためである。
【０１４１】
組換え細胞宿主のゲノム中にCre酵素が存在することで、上述したようなloxP部位を含む興味の対象であるFLAP由来配列を持つ第1のトランスジェニック動物と、Guら(1994)に記載されているように適当なプロモーター配列に作用的に結合されたCreコード配列を持つ第2のトランスジェニック動物の2種類のトランスジェニック動物を繁殖できる場合がある。
【０１４２】
AntonおよびGraham(1995)およびKanegaeら.(1995)に記載されているように、Cre遺伝子を含むためCre酵素の移入に必要な細胞の感染または器官のin vivo感染が可能なアデノウイルスベースのベクターを用いることで、Cre酵素発現の空間時間制御を行うことができる。
【０１４３】
上述したDNAコンストラクトを使用して、本発明の所望のヌクレオチド配列、好ましくはFLAPゲノム配列またはFLAP cDNA配列、最も好ましくはFLAPゲノム配列またはcDNA配列の変化したコピーを、標的ゲノムの予め定められた位置内に導入し、標的遺伝子の変化したコピーを作出する(ノックアウト相同的組換え)か、あるいは標的遺伝子のコピーを相同的組換え現象が可能な程度に十分な相同性を持つ別のコピーと交換する(ノックイン相同的組換え)ことができる。特定の実施形態では、上述したDNAコンストラクトを使用して、本発明のバイアレリックマーカーを少なくとも1つ、好ましくはA1〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを少なくとも1つ、さらに好ましくはA1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを少なくとも1つ有するFLAPゲノム配列またはFLAP cDNA配列を導入することができる。
【０１４４】
核アンチセンスDNAコンストラクト
対応するFLAP遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールとして、本発明のバイアレリックマーカー、好ましくはFLAP遺伝子の開始コドンを含む断片を有するヌクレオチド配列配列番号 2のオリゴヌクレオチド断片を有する本発明のベクターを含む他の組成物。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いた好ましい方法は、Sczakielら(1995)に記載されている手順またはPCT出願第WO 95/24223号に記載されている手順である。
【０１４５】
FLAP mRNAの5'末端と相補であるポリヌクレオチド(15〜200bp長)からアンチセンスツールを選択すると好ましい。一実施態様では、所望の標的遺伝子の異なる部分に対して相補である異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせを使用する。
【０１４６】
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンATGまたはスプライシング部位のいずれかを含むFLAPのmRNAsの配列に対して相補なものである。本発明によるさらに好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、FLAP mRNAのスプライシング部位に対して相補なものである。
【０１４７】
好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼII転写物が3'末端でポリ(A)なしで産生されるように自己切断リボザイム配列と交換された3'ポリアデニル化シグナルを有する。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、Liuら(1994)などに記載されているように、核からの搬出ができないものである。好ましい実施形態では、これらのFLAPアンチセンスポリヌクレオチドが、Ecknerら(1991)に記載されている構造ような、切断された転写物が3'-5'ポリヌクレオチド末端加水分解しないように安定させるためのヒストンの幹-ループ構造をリボザイムカセット内に含む。
【０１４８】
V.  FLAP遺伝子のバイアレリックマーカー
本発明はまた、FLAP関連バイアレリックマーカー、好ましくはロイコトリエン経路が関与している疾患、最も好ましくは喘息に関連したバイアレリックマーカーにも関するものである。FLAP関連バイアレリックマーカーという用語には、A1〜A28で示すバイアレリックマーカーを含む。本発明はまた、これらのバイアレリックマーカーのセットにも関するものである。
【０１４９】
FLAPのゲノム配列で28個のバイアレリックマーカーが同定された。これらのバイアレリックマーカーを実施例3の表2に示す。これらのマーカーのFLAPゲノム配列およびcDNA上の位置を表2に示し、一塩基多型として配列番号 1のフィーチャーに示す。表2には、P1〜P28で示す47ヌクレオチド長のポリヌクレオチドの配列番号 1上の位置も示してある。これらのポリヌクレオチドは、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを有し、前記バイアレリックマーカーを定義するものである。1つのFLAPバイアレリックマーカーの多型塩基を含有する核酸の増幅を可能にする複数対のプライマーを実施例2の表1に列挙する。3つのバイアレリックマーカーすなわちA13、A20およびA21がエキソン領域に位置している。このうち2つはFLAPタンパク質のアミノ酸配列を修飾するものではない。しかしながら、バイアレリックマーカーA20はFLAPタンパク質のバリンをイソロイシンに変える。
【０１５０】
本発明は、FLAP遺伝子の配列、好ましくはA1〜A28からなる群から選択されるバイアレリックマーカーの配列、好ましくはA1〜A13、A15およびA17〜A28ならびにこれらの相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーに位置するバイアレリックマーカーの多型塩基を有する精製および/または単離されたヌクレオチド配列にも関するものである。任意に、前記バイアレリックマーカーは、A1〜A10およびA22〜A28からなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーは、A11〜A13、A15、A17〜A21からなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーは、A14またはA16のいずれかである。この配列は8〜1000ヌクレオチド長であり、好ましくは、配列番号 1および配列番号 2またはその変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む連続した少なくとも8、10、12、15、18、20、25、35、40、50、60、70、80、100、250、500または1000ヌクレオチドを有する。これらのヌクレオチド配列は、考慮対象のバイアレリックマーカーのアレル1またはアレル2のいずれかの多型塩基を有する。任意に、前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心から6、5、4、3、2または1ヌクレオチドの位置にあってもよく、あるいは前記ポリヌクレオチドの中心にあってもよい。任意に、前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在してもよい。任意に、バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在してもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列におけるFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーから2、4、6、8、10、12、15、18、20、25、50、100、250、500または1000ヌクレオチド以内または少なくとも2、4、6、8、10、12、15、18、20、25、50、100、250、500または1000ヌクレオチド上流に位置してもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列におけるFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーから1ヌクレオチド上流に位置してもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドがさらに標識を有していてもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドが固相支持体に付着可能なものであってもよい。さらに他の実施形態では、上記にて定義したポリヌクレオチドを単独または組み合わせで使用することができる。
【０１５１】
本発明はさらに、FLAPタンパク質をコードする核酸であって、前記核酸が、A1〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーの多型塩基、好ましくはA1〜A13、A15およびA17〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるバイアレリックマーカーの多型塩基を有する核酸に関する。
【０１５２】
また、本発明はヌクレオチド配列に関し、好ましくは、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを定義する配列、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列を有し、前記断片が多型塩基を含む、精製および/または単離されたヌクレオチド配列に関する。好ましくは、バイアレリックマーカーを定義する配列として、ポリヌクレオチドP1〜P13、P15およびP17〜P28またはこれらの相補体のうちの1つの多型塩基があげられる。いくつかの実施形態では、バイアレリックマーカーを定義する配列が、P1〜P13、P15およびP17〜P28、その相補配列またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有し、前記断片が多型塩基を有する。
【０１５３】
本発明はまた、上記にて定義した精製および/または単離されたヌクレオチド配列のセットに関する。特に、精製および/または単離されたヌクレオチド配列のセットが、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーの組み合わせを定義する配列からなる群を有する。好ましくは、バイアレリックマーカーのアレルの組み合わせが喘息に関連するものである。
【０１５４】
好ましい実施態様では、本発明は、精製および/または単離されたヌクレオチド配列のセットであって、各配列がFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを定義する配列を有し、バイアレリックマーカーを定義する配列の約30〜100%、好ましくは約40〜60%、さらに好ましくは50〜60%が、P1〜P28、好ましくはP1〜P13、P15およびP17〜P28、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択され、前記断片が多型塩基を有するものであることを特徴とするヌクレオチド配列のセットに関するものである。
【０１５５】
特に、本発明は、精製および/または単離されたヌクレオチド配列のセットであって、各配列がFLAP遺伝子の異なるバイアレリックマーカーを定義する配列を有し、前記バイアレリックマーカーが、P1〜P28およびその相補配列、好ましくはP1〜P13、P15およびP17〜P28およびその相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に含まれるものであるか、あるいはバイアレリックマーカー、好ましくはFLAP遺伝子、バイアレリックマーカーA1〜A28の配列に位置するものであるか、あるいはここで定義するセットのマーカーのうち1つと連鎖不平衡状態にあるマーカーであるヌクレオチド配列に関するものである。
【０１５６】
また、本発明は、P1〜P28、好ましくはP1〜P13、P15およびP17〜P28、これらに対する相補配列、あるいはその断片または変異体からなる群から選択される、少なくとも2、好ましくは4、5、6、7、8ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチド配列のセットであって、前記断片が多型塩基を有するヌクレオチド配列のセットに関するものである。このセットが、FLAP遺伝子の各連鎖不平衡領域でバイアレリックマーカーを定義するヌクレオチド配列を少なくとも1つ有するものであると好ましい。
【０１５７】
本発明はさらに、P1〜P13、P15およびP17〜P28、これらに対する相補配列、あるいはその断片または変異体からなる群から選択され、前記断片が多型塩基を有するヌクレオチド配列に関する。
【０１５８】
さらに他の実施形態では、表2に列挙するバイアレリックマーカーのうちの1つの多型塩基を有する配列が、No. 10-517、10-518、10-253、10-499、10-500、10-522、10-503、10-504、10-204、10-32、10-33、10-34、10-35、10-36、10-498、12-628、12-629(表1に列挙)として示す配列の核酸またはその変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなるものであるか、あるいはこれに含まれ、あるいはこれらを有する連続スパンを有するヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【０１５９】
VI.  オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー
FLAP遺伝子由来のポリヌクレオチドは、少なくとも配列番号 1または配列番号 2のヌクレオチド配列、その断片または変異体のコピーが被検試料中にあることを検出する上で有用なものである。
【０１６０】
特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドまたはその相補配列の連続スパンを含み、前記連続スパンが、配列番号 1のヌクレオチド位置1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976および36927〜43069のうち少なくとも1、2、3、5または10カ所を含むものがあげられる。本発明の他の好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドまたはその相補配列の連続スパンを有し、前記連続スパンが配列番号 1の16348位のCを含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。本発明によるさらに好ましい核酸としては、配列番号 1の少なくとも26、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドまたはその相補配列の連続スパンを有し、前記連続スパンが、配列番号 1のヌクレオチド位置7612〜7637、24060〜24061、24067〜24068、27903〜27905、および28327〜28329を含む、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドがあげられる。さらに別の好ましいプローブおよびプライマーには、配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンまたはその相補配列が含まれ、前記連続スパンが、配列番号 1の7445位のA、7870位のA、16288位のT、16383位のA、24361位のT、28336位のG、28368位のT、36183位のA、36509位のGからなる群から選択されるヌクレオチドを有するものが含まれる。
【０１６１】
このため、本発明は、上記にて定義した厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号 1のヌクレオチド配列1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976、36927〜43069またはその変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択される核酸と特異的にハイブリダイズすることを特徴とする核酸プローブまたはプライマーにも関するものである。
【０１６２】
特に好ましいプローブおよびプライマーは、配列番号 2の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドまたはその相補配列の連続スパンを有し、前記連続スパンが、配列番号 2の197位(A13)のT、453位(A20)のA、あるいは779位(A21)のGを含む。
【０１６３】
本発明はまた、変化したロイコトリエン代謝に関連のあるアレル、好ましくはFLAP遺伝子多型に関連のあるアレル、さらに好ましくは喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患に関連のあるFLAP遺伝子のアレルを検出するためのオリゴヌクレオチドおよび一組のオリゴヌクレオチドにも関する。これらのオリゴヌクレオチドは、FLAP遺伝子とハイブリダイズ可能であり、好ましくは多型FLAP遺伝子とハイブリダイズ可能であり、さらに好ましくは、特定のアレルが、喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患と関連のある多型部位を含むFLAP遺伝子の領域とハイブリダイズ可能であることを特徴とするものである。このオリゴヌクレオチドは、DNA増幅およびマイクロシークエンシングなどのさまざまなプロセスで利用するプライマーとして、あるいはハイブリダイゼーション解析におけるDNA認識用のプローブとして有用なものである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、P1〜P28およびその相補配列からなる群から選択される配列、さらに好ましくはP1〜P13、P15、P17〜P28およびその相補配列からなる群から選択される配列の多型塩基を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、P1〜P28およびその相補配列のうちの1つ、任意にP1〜P13、P15、P17〜P28およびその相補配列のうちの1つにおける多型塩基などのFLAP遺伝子の多型塩基のすぐ隣に3'末端を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、FLAP遺伝子におけるバイアレリックマーカーの異なるアレル同士を区別でき、前記バイアレリックマーカーは、A1〜A28およびこれらの相補体、任意にA1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択される。たとえば、オリゴヌクレオチドは、バイアレリックマーカーA1〜A28およびこれらの相補体、任意にA1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体のうちの1つを含む、バイアレリックマーカーの1つのアレルと特異的にハイブリダイズすることができる。もう1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、配列B1〜B17、C1〜C17、D1〜D28、E1〜E28、P1〜P28、これらの相補配列のうちの1つを有する。任意に、オリゴヌクレオチドが、配列B1〜B17、C1〜C17、D1〜D13、D15、D17〜D28、E1〜E13、E15、E17〜E28、P1〜P13、P15、P17〜P28、これらの相補配列のうちの1つを有する。
【０１６４】
一実施形態において、本発明は、配列番号 1または2のヌクレオチド8〜50個およびこれらの相補体の連続スパンからなるか、または実質的にこの連続スパンからなり、この範囲が前記配列にFLAP関連バイアレリックマーカーを含み、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A14およびA16ならびにこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記連続スパンが18〜47ヌクレオチド長であり、かつ前記バイアレリックマーカーが、ポリヌクレオチドの中心から6、5、4、3、2または1ヌクレオチドの位置にあり、好ましくは前記ポリヌクレオチドの中心から4ヌクレオチドの位置にあり、任意に、前記ポリヌクレオチドが、前記連続スパンからなり、前記連続スパンが25ヌクレオチド長であり、かつ前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの中心にあり、任意に、前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在し、任意に、前記連続スパンの3'末端が前記ポリヌクレオチドの3'末端に位置し、かつ前記バイアレリックマーカーが前記ポリヌクレオチドの3'末端に存在する、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１６５】
もう1つの実施形態において、本発明は、配列番号 1または2の8〜50ヌクレオチドまたはこれらの相補体の連続スパンからなるか、または実質的にこの連続スパンからなり、前記連続スパンの3'末端が、前記ポリヌクレオチドの3'末端に位置する、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドおよび組換えポリヌクレオチドを包含する。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列におけるFLAPのバイアレリックマーカーから少なくとも2、4、6、8、10、12、15、18、20、25、50、100、250、500または1000ヌクレオチド以内または少なくとも2、4、6、8、10、12、15、18、20、25、50、100、250、500または1000ヌクレオチド上流に位置するか、新規な配列またはマーカーのシークエンシング、増幅または位置決定における意図した用途に適した任意の位置に位置する。特定の実施形態では、前記ポリヌクレオチドの3'末端が前記配列におけるFLAP関連バイアレリックマーカーの20ヌクレオチド上流以内に位置し、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28ならびにこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーがA14またはA16およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーであり、任意に、前記ポリヌクレオチドの3'末端が、前記配列における前記FLAP関連バイアレリックマーカーより1ヌクレオチド上流に位置し、任意に、前記ポリヌクレオチドが実質的に、配列D1〜D28およびE1〜E28から選択される配列からなり、任意に、前記ポリヌクレオチドが実質的に、配列D1〜D13、D15、D17〜D28、E1〜E13、E15およびE17〜E28から選択される配列からなる。さらに別の実施形態では、本発明は、配列B1〜B17およびC1〜C17から選択される配列からなる、または実質的にこの配列からなる、単離されたポリヌクレオチド、精製されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを包含する。これらのプライマーには、いずれかの末端において、シークエンシングで有用なさらに別のポリヌクレオチドを付加することができる。好ましくは、プライマーPUが配列番号 14の別のPU5'配列を含み、プライマーRPが配列番号 15のRP5'配列を含む。
【０１６６】
別の実施形態では、本発明は、ハイブリダーゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイおよび酵素ベースのミスマッチ検出アッセイに使用して、配列番号 1または2のFLAP関連バイアレリックマーカーまたはこれらの相補体におけるヌクレオチドの同一性を判定するポリヌクレオチドと、配列番号 1または2のFLAP関連バイアレリックマーカーまたはこれらの相補体を含むヌクレオチドのセグメントを増幅するのに使用できるポリヌクレオチドを包含し、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、A1〜A10およびA22〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、A11〜A13、A15、A17〜A21およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択され、任意に、A14およびA16およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記ポリヌクレオチドは本願明細書にて開示する配列を含んでもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドは、本願明細書にて述べるいずれのポリヌクレオチドからなるものであってもよく、あるいは実質的にこれらのポリヌクレオチドからなるものであってもよい。好ましいポリヌクレオチドをハイブリダーゼーションアッセイに使用し、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定してもよい。別の好ましいポリヌクレオチドをシークエンシングまたはマイクロシークエンシングアッセイに使用して、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定してもよい。第3の好ましいポリヌクレオチドを、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイに使用して、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定してもよい。第4の好ましいポリヌクレオチドを、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを含むポリヌクレオチドのセグメントの増幅に使用してもよい。任意に、前記増幅をPCRまたはLCRによって行ってもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを固相やアレイ、アドレス指定可能なアレイに付着させてもよい。任意に、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
【０１６７】
したがって、本発明によるプライマーおよびプローブは、増幅対象となるFLAP遺伝子の鎖に対して「実質的に」相補となるように合成される。プライマー配列は、必ずしもDNA鋳型の配列を正確に反映したものでなくてもよい。わずかなミスマッチであれば、ハイブリッド条件の厳密度を緩くすることで対応可能である。有用なプライマーの設計に利用できるさまざまな方法のうち、当業者であればOSPコンピュータソフトウェアを利用することができる。(Hillier & Green, 1991を参照のこと)。
【０１６８】
安定したハイブリッドの形成は、DNAの融点(Tm)に左右される。Tmは、プライマー長またはプローブ長、溶液のイオン強度およびG+C含有量に左右される。プライマーまたはプローブのG+C含有量が高くなればなるほど融点も高くなる。G:C対は水素結合3つで保持されているが、A:T対には水素結合が1つしかないためである。本発明のプライマーおよびプローブのGC含有量は、通常、10〜75%の範囲であり、好ましくは35〜60%、より好ましくは40〜55%の範囲である。
【０１６９】
好ましくは、本発明のプライマーおよびプローブの長さは、10〜100ヌクレオチド、好ましくは10〜50、10〜30またはより好ましくは10〜25ヌクレオチドの範囲とすることができる。これよりも短いプライマーおよびプローブでは標的ヌクレオチド配列に対する特異性を欠きやすく、一般に鋳型との間の十分に安定したハイブリッド複合体を形成するには温度を低めにする必要がある。一方、上記の範囲よりも長いプライマーおよびプローブは作製に費用がかかり、まれに自己ハイブリダイズによってヘアピン構造が形成されてしまう。特定のセットのアッセイ条件でのプライマーおよびプローブについての適当な長さは、当業者によって経験的に決定し得る。
【０１７０】
本発明のプローブはさまざまな目的に有用である。これらのプローブを、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションまたはmRNAに対するノーザンハイブリダイゼーションに利用することができる。また、プローブを用いてPCR増幅産物を検出することもできる。さらに、他の手法を用いてFLAP遺伝子またはmRNAにおけるミスマッチの検出に利用することもできる。一般に、これらのプローブはFLAP遺伝子コード配列と相補なものであるが、イントロンおよび制御配列に対するプローブも考慮される。
【０１７１】
たとえば適した配列のクローニングおよび制限の他、たとえばNarangら(1979)のホスホジエステル法、Brownら(1979)のホスホジエステル法、Beaucageら(1981)のジエチルホスホルアミダイト法およびEP 0 707 592に記載されている固相法などの方法による直接的な化学合成による方法をはじめとする適当な何らかの方法を用いて、プライマーおよびプローブを調製することができる。これらの文献の開示内容を本願明細書に援用する。
【０１７２】
検出プローブは一般に、PCT国際特許出願公開第WO 92/20702号に開示されているペプチド核酸、米国特許第5,185,444号、同第5,034,506号および同第5,142,047号などに開示されているモルホリノ類似物などのヌクレオチド配列または未荷電の核酸類似物である。これらの特許の開示内容を本願明細書に援用する。プローブに付した標識のタイプに応じて、増幅反応によって生成される単位複製配列の捕捉または検出にプローブを用いる。このプローブは標的配列の増幅には関与しないため、プローブに別のdNTPが付加されることのないように、プローブを「非伸展可能な」状態にしてもよい。類似物はそれ自体が伸長不可能であるため、ヒドロキシル基が伸長に関与できなくなるようにプローブの3'末端を修飾することで、核酸プローブを伸長不可能にすることができる。たとえば、プローブの3'末端を捕捉標識または検出標識で官能化し、ヒドロキシル基を消費するかブロックする。あるいは、3'ヒドロキシル基を単に切断、置換または修飾してもよい。1993年4月19日出願の米国特許出願第07/049,061号には、プローブを伸長不可能にするのに使用できる修飾について記載されている。
【０１７３】
プローブについては、アイソトープ、レポーター分子または蛍光標識などを用いて直接標識するか、ビオチンなどを用いて間接的に標識(後からストレプトアビジン複合体を結合させてもよい)するのが好ましい。プローブ標識手法は当業者間で周知である。プローブの存在をアッセイすることによって、特定の試料における標的DNA配列の有無を検出することができる。これと同じ標識をプライマーにも利用することができる。たとえば、有用な標識としては、放射性物質(32P、35S、3H、125I)、蛍光染料(5-ブロモデソキシウリジン(5-bromodesoxyuridin)、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン)があげられる。好ましくは、ポリヌクレオチドの3'末端および5'末端を修飾する。核酸断片の非放射性標識の一例が、フランス特許第FR-7810975号またはUrdeaら(1988)またはSanchez-Pescadorら(1988)に記載されている。また、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能にするという点で構造上の特徴を有する場合がある。このような構造上の特徴としては、たとえば、Urdeaらによって1991年に説明されたものや欧州特許第EP 0 225 807(Chiron)号に記載されているものなどの枝分れDNAプローブがあげられる。
【０１７４】
本発明のプライマーおよびプローブはいずれも、固相に適宜固定化することができる。固相は当業者間で周知のものであり、反応トレーの穴の壁面、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ(または他の動物)の赤血球、duracytesなどを含む。「固相」は非常に重要なものというわけではなく、当業者によって選択可能である。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズまたは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターの穴の壁、ガラスチップまたはシリコンチップ、ヒツジ(または他の適した動物)の赤血球およびduracytesはいずれも、好適な例である。
【０１７５】
固相に核酸を固定化するための好適な方法としては、イオン的相互作用、疎水的相互作用、共有結合的相互作用などがあげられる。本願明細書では、「固相（solid phase）」は不溶性または以後の反応によって不溶性にすることのできるあらゆる材料を意味する。捕捉試薬を引きつけて固定化する固有の性能によって固相を選択することができる。
【０１７６】
あるいは、捕捉試薬を引きつけて固定化する機能を有する別の受容体を固相に保定することができる。別の受容体としては、捕捉試薬自体または捕捉試薬に共役結合される荷電物質と反対の電荷に荷電した荷電物質をあげることができる。
【０１７７】
さらに別の選択肢として、受容体分子は、固相に固定化(付着)され、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する機能を有するものであれば、どのような特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子は、アッセイの実行前またはアッセイの実行時に捕捉試薬の固相材料への間接的な結合を可能にするものである。このため、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、検査チューブのガラス表面またはシリコン表面、マイクロタイターの穴、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ(または他の適した動物)の赤血球、duracytesおよび当業者間で周知の他の構成などを固相とすることができる。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドは、固相にて個々にまたは少なくとも2種類、5種類、8種類、10種類、12種類、15種類、20種類または25種類の本発明のポリヌクレオチドのグループで単一の固相に付着または固定化することができるものである。また、本発明によるもの以外のポリヌクレオチドを1種またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドと同一の固相に付着させてもよい。
【０１７９】
結果として、本発明は、配列番号 1および配列番号 2、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸の試料中における有無の検出方法であって、
a)  配列番号 1および配列番号 2のヌクレオチド配列、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から(form)選択される核酸に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な1つまたは複数の核酸プローブとアッセイ対象試料とを接触させるステップと、
b)  試料中でプローブと核酸との間に生成されるハイブリッド複合体を検出するステップと、を含む検出方法についても扱う。
【０１８０】
本発明はさらに、配列番号 1および配列番号 2、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸の試料中における有無の検出キットであって、
a)  配列番号 1および配列番号 2のヌクレオチド配列、その断片または変異体、あるいはこれらに対する相補配列からなる群から(form)選択される核酸に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な1つまたは複数の核酸プローブと、
b)  任意に、ハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬と、を有する検出キットに関する。
【０１８１】
検出方法および検出キットの第1の好ましい実施形態では、1つまたは複数の核酸プローブを検出可能な分子で標識する。検出方法および検出キットの第2の好ましい実施形態では、1つまたは複数の核酸プローブを基質に固定化しておく。検出方法および検出キットの第3の好ましい実施形態では、1つまたは複数の核酸プローブが、ヌクレオチド配列B1〜B17、C1〜C17、D1〜D28、E1〜E28、P1〜P28からなる群から選択される配列か、A1〜A28またはこれらの相補体、あるいはこれらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるバイアレリックマーカーのいずれかを含む。
【０１８２】
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを有する基質を用いて、FLAP遺伝子の標的配列を検出または増幅することができる。また、これを用いてFLAP遺伝子のコード配列または非コード配列の変異を検出することもできる。
【０１８３】
本願明細書に記載のポリヌクレオチドはいずれも、固相上のオーバーラップ領域内または無作為に選択した位置に付着されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、一定順序のアレイで付着されてもよい。この場合、各ポリヌクレオチドは、固相上の他のいかなるポリヌクレオチドの付着部位とも重複しない別の領域に付着される。好ましくは、別の位置を記録し、アッセイ手順の一部としてアクセスできるように、このようなポリヌクレオチドの一定順序のアレイを「アドレス指定可能な」ように設計する。アドレス指定可能なポリヌクレオチドアレイは一般に、異なる既知の位置にある基質の表面に結合する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置を正確に知ることができるので、これらの「アドレス指定可能な」アレイがハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用なものとなる。当業者間で周知のアドレス指定可能なアレイテクノロジーを本発明のポリヌクレオチドと併用することが可能である。これらのポリヌクレオチドアレイの特定の一実施形態は、GenechipsTMとして周知であり、米国特許第5,143,854号、PCT国際出願公開第WO 90/15070号および同第92/10092号にその概略が説明されている。これらのアレイは一般に、機械的な合成方法または光指向性合成方法を用いて作製できる。これらの方法では、フォトリソグラフィによる方法と固相オリゴヌクレオチド合成との組み合わせを利用している(Fodorら、1991)。オリゴヌクレオチドアレイの固相への固定化は、一般に「Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis(VLSIPSTM)」と呼ばれるテクノロジーの開発によって可能になったものである。このテクノロジーでは一般に、チップの固体表面上でプローブを高密度アレイ状に固定化する。VLSIPSTMテクノロジーの一例は、米国特許第5,143,854号および同第5,412,087号ならびにPCT国際出願公開第WO 90/15070号、同第WO 92/10092号および同第WO 95/11995号にあげられている。これらの公報では、光指向性合成法などの手法によってオリゴヌクレオチドアレイを形成する方法について説明されている。固相に固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することを目的とした設計戦略では、ハイブリダイゼーションパターンと配列情報を最大化しようという試みの中で、チップ上でオリゴヌクレオチドアレイを順序付けて表示するための別のプレゼンテーション戦略が開発された。このようなプレゼンテーション戦略の一例が、PCT国際出願公開第WO 94/12305号、同第WO 94/11530号、同第WO 97/29212号および同第WO 97/31256号に開示されている。
【０１８４】
本発明のオリゴヌクレオチド配列の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブマトリックスを有効利用してFLAP遺伝子に生じる変異を検出することができる。この特定の目的のために、既知の変異を持つ遺伝子とのハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列が含まれるように、プローブを特別に設計する。既知の変異とは、たとえばHuangら(1996)またはSamsonら(1996)によって用いられている手法などを用いて同定済のFLAP遺伝子における変異を意味する。
【０１８５】
FLAP遺伝子の変異の検出に用いられるもう1つの手法は、高密度DNAアレイを使用するものである。高密度DNAアレイの単位要素を構成している各オリゴヌクレオチドプローブを、FLAPゲノムDNAまたはcDNAの特異的なサブシーケンスに一致するように設計する。このため、標的遺伝子配列のサブシーケンスに対して相補なオリゴヌクレオチドからなるアレイを用いて、野生型遺伝子配列と標的配列との同一性を判定し、その量を測定し、標的配列とFLAP遺伝子の基準の野生型遺伝子配列との差を検出する。このような設計のうちの1つに4Lタイル状アレイがあるが、このアレイは、4つ一組のプローブ(A、C、G、T)で実現され、好ましくは15個のヌクレオチドオリゴマーで実現されるものである。4つのプローブのセット各々において、ミスマッチのあるプローブよりも完全な相補体の方が強くハイブリダイズされる。したがって、4Lのプローブを含むタイル状アレイすなわち、既知の野生型基準配列に含まれている可能性のあるすべての変異を含む全プローブセットで、長さLの核酸標的の変異が探査される。標的配列に1塩基でも違いがあると、15merプローブセットのタイル状アレイのハイブリダイゼーションシグナルが乱れる。結果として、変異位置をフランキングするプローブのシグナルすなわち「フットプリント」に特徴の損失ができることになる。この手法はCheeらによって1996年に説明されているものであり、その内容を本願明細書に援用する。
【０１８６】
結果として、本発明は、プローブおよびプライマーとして上述したポリヌクレオチドを少なくとも1つ有する核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明は、プローブおよびプライマーとして上述したポリヌクレオチドを少なくとも2つ有する核酸のアレイに関する。
【０１８７】
本発明のさらに他の目的は、P1〜P28、B1〜B17、C1〜C17、D1〜D28およびE1〜E28からなる群から選択される配列少なくとも1つまたはこれらと相補配列、あるいはその少なくとも8、10、12、15、18、20、25、30または40ヌクレオチドからなる断片、あるいはA1〜A28からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを有する配列を少なくとも1つ、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーを有するヌクレオチド配列のアレイで構成される。
【０１８８】
本発明はまた、P1〜P28、B1〜B17、C1〜C17、D1〜D28およびE1〜E28またはこれらに対して相補配列、あるいはその連続した少なくとも8ヌクレオチドで構成される断片からなる群から選択される配列のうち少なくとも2つ、またはA1〜A28、これらに対して相補配列からなる群から選択されるバイアレリックマーカー、または任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーを含む配列のうち少なくとも2つを含むヌクレオチド配列のアレイに関する。
【０１８９】
VII.  バイアレリックマーカーの同定
本発明のバイアレリックマーカーが生成できる好ましい方法には2つの方法がある。第1の方法では、無関係な個体から得たDNA試料を一緒にプールし、続いて興味の対象となるゲノムDNAを増幅して配列決定する。このようにして得られたヌクレオチド配列を解析し、有意な多型を同定する。
【０１９０】
この方法の大きな利点の1つは、DNA試料をプールすることで、実施しなければならないDNA増幅反応とシークエンシング反応の回数が実質的に減ることにつながるという事実にある。さらに、この方法は非常に感受性の高いものであるため、この方法で得られるバイアレリックマーカーは関連性解析を行えるだけの十分な情報性を持っているのが普通である。
【０１９１】
第2のバイアレリックマーカー生成方法では、DNA試料のプールを設けず、増幅とシークエンシングを個別に行う。次に、このようにして得られるヌクレオチド配列を同じように解析し、有意な多型を同定する。
【０１９２】
この第2の方法を使用すると、実質的に第1の方法よりも多い回数のDNA増幅反応とシークエンシング反応を行わなければならないことは容易に理解できよう。さらに、この方法で得られるバイアレリックマーカーの方が関連性解析を行うための情報性という点でも劣ることがある。たとえば、頻度の低いアレルの頻度が約10%未満になることもあり得るのである。さらに、このような情報性の低いバイアレリックマーカーを関連性解析に含めて形質との潜在的な遺伝的関連性を特定しようとすると、場合によっては原因変異を直接同定できることがあるが、浸透度次第では珍しい変異である可能性が残ることも理解できよう。この方法は、候補遺伝子内での関連性解析を行うためにバイアレリックマーカーの同定が必要な場合に用いるのが好ましいことが多い。
【０１９３】
以下、本発明のマーカーを生成するために本願発明者らが使用した好ましい方法の様々なパラメーターについて説明する。
【０１９４】
1.  DNA抽出
本発明のバイアレリックマーカーを生成する上でのソースとなるゲノムDNA試料は、民族性のバックグラウンドが明らかになっている異種起源の個体群に対応する無関係な個体から得たものであると好ましい。
【０１９５】
DNA試料を得る個体の数は、好ましくは約10〜約1000、好ましくは約50〜約200個体の範囲で実質的に変えることができる。通常、特定の個体群の多型性に十分な多様性を持たせ、できるだけ多くのマーカーを同定かつ統計的に有意な結果を生成するためには、少なくとも約100個体からDNA試料を集めることが好ましい。
【０１９６】
解析対象となるゲノムDNAのソースに関して言えば、特に制限なくどのような被検試料でも用いることが可能である。これらの被検試料としては、本願明細書において説明する本発明の方法によって試験可能な生物学的試料があげられる。また、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液の他、呼吸器、腸管および泌尿生殖器、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などでのさまざまな外分泌液のヒトおよび動物の体液、細胞培養の上清などの生物学的な流体、腫瘍組織および非腫瘍組織、リンパ節組織を含む固定組織標本、骨髄吸引液および固定細胞標本などもあげられる。本発明の文脈で使用されるゲノムDNAの好ましいソースは、各ドナーの辺縁末梢静脈血から採取したものである。
【０１９７】
DNA抽出の手法は当業者間で周知である。好ましい実施形態を実施例1で詳細に説明する。
【０１９８】
特定個体群の各個体からのゲノムDNAを抽出したら、各DNA試料の画分を分離した上で、分離した画分を等量ずつ1つにまとめてDNAのプールを作製すると好ましい。しかしながら、当業者であれば、プールした配列またはプールしていない配列のいずれを増幅するか選択すればよい。
【０１９９】
2.  DNA増幅
DNA増幅方法を用いることで、ゲノムDNA試料でのバイアレリックマーカーの同定を容易にすることができる。増幅ステップのためにDNA試料をプールしても、プールせずにおいてもよい。
【０２００】
DNA増幅手法は当業者間で周知である。本発明の文脈で使用できる増幅手法としては、EP-A- 320 308、WO 9320227およびEP-A-439 182(これらの内容全体を本願明細書に援用する)に記載されているリガーゼ連鎖反応(LCR)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、RT-PCR)、Guatelli J. C., ら(1990)およびCompton J.(1991)に記載されているヌクレオチド配列にもとづく増幅法(NASBA)、欧州特許出願第4544610号に記載されているようなQ-β増幅、Walkerら(1996)およびEP A 684 315に記載されているようなSDA、PCT公開第WO 9322461号(その内容を本願明細書に援用する)に記載されているような標的媒介増幅などの手法があげられるが、これに限定されるものではない。
【０２０１】
LCRおよびGap LCRは指数的増幅手法であり、いずれもDNA分子にアニールされた隣接プライマーを結合するDNAリガーゼに依存している。リガーゼ連鎖反応(LCR)ではプローブ対を使用するが、これには一次(第1および第2)プローブ2本と二次(第3および第4)プローブ2本が含まれている。プローブはすべて標的に対してモル過剰な状態で使用される。第1のプローブは標的鎖の第1のセグメントとハイブリダイズし、第2のプローブは標的鎖の第2のセグメントとハイブリダイズする。第1のセグメントと第2のセグメントが連続しているため、一次プローブは5'ホスフェート-3'ヒドロキシルの関係で互いに当接し、リガーゼは2本のプローブと共有結合的に融合すなわち連結して融合産物となることができる。また、第3の(二次)プローブは第1のプローブの一部にハイブリダイズすることが可能であり、第4の(二次)プローブは同様の当接方法で第2のプローブの一部にハイブリダイスすることができる。もちろん、標的が最初に二本鎖である場合は、二次プローブも第1の例で標的相補体にハイブリダイズする。一次プローブの連結鎖がいったん標的鎖から分離されると、その後は第3および第4のプローブとハイブリダイズするが、これを連結して相補的な二次連結産物が得られる。連結産物は機能的に標的またはその相補体に相当するものだということを理解するのは重要なことである。ハイブリダイゼーションと連結のサイクルを繰り返すことで、標的配列を増幅することができる。複合的なLCR法については、すでに説明がなされている(WO 9320227)。Gap LCR(GLCR)は、プローブ同士が隣接しているのではなく、2〜3塩基分だけ離れた状態で行われるLCRである。
【０２０２】
mRNAの増幅について見ると、mRNAをcDNAに逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行うこと、米国特許第5,322,770号に記載されているように両方のステップに1つの酵素を用いること、あるいはMarshallら(1994)に記載されているように非対称Gap LCR(RT-AGLCR)を使用することは、いずれも本発明の範囲内である。AGLCRはGLCRに手を加えてRNAの増幅を可能にしたものである。
【０２０３】
PCRテクノロジーは、本発明で用いられる好ましい増幅手法である。さまざまなPCR手法が当業者間で周知である。PCRテクノロジーについては、White(1997)および「PCR Methods and Applications」というタイトルの刊行物(1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。これらのPCR手順の各々で、増幅対象となるヌクレオチド配列の両側のPCRプライマーを、dNTPおよびTaqポリメラーゼ、PfuポリメラーゼまたはVentポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼと共に、適宜調製した核酸試料に付加する。試料中の核酸を変性させ、PCRプライマーを試料中の相補ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後のプライマーを伸長させる。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長をもう1サイクル開始する。このサイクルを複数回繰り返し、プライマー部位間のヌクレオチド配列を含む増幅断片を作出する。PCRについては、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号をはじめとするいくつかの特許にも説明されている。各公報の内容を本願明細書に援用する。
【０２０４】
PCRテクノロジーは、新しいバイアレリックマーカーの同定に使用される好ましい増幅手法である。本発明の目的に適したPCR反応の代表例を実施例2に示す。
【０２０５】
本発明の一態様は、好ましくはPCRテクノロジーを用いて行う、被検試料におけるヒトFLAP遺伝子、特に配列番号 1のゲノム配列または配列番号 2のcDNA配列、あるいはその断片またはその変異体の増幅方法である。この方法は、標的FLAPコード化配列またはその一部を含んでいる可能性のある被検試料と、一対の増幅プライマーおよび最終的にはいくつかの例で、所望の増幅反応が起こっているか否かを確認するための、単位複製配列の内部領域とハイブリダイズ可能な検出プローブを有する増幅反応試薬とを接触させるステップを含む。
【０２０６】
このため、本発明は、被検試料におけるヒトFLAP遺伝子配列、特に配列番号 1のゲノム配列または配列番号 2のcDNA配列の一部、あるいはその変異体の増幅方法であって、
a)  配列番号 1および配列番号 2、その断片または変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列に含まれる標的FLAP遺伝子配列を含んでいる疑いのある被検試料と、上述し、増幅対象となるポリヌクレオチド領域の両側に位置する一対の増幅プライマーを有する増幅反応試薬とを接触させるステップと、
b)  任意に、増幅産物を検出するステップと、を含む方法にも関する。
【０２０７】
本発明はまた、被検試料におけるヒトFLAP遺伝子配列、特に配列番号 1のゲノム配列または配列番号 2のcDNA配列の一部、あるいはその変異体を増幅するためのキットであって、
a)  増幅対象となるFLAP領域の両側に位置する一対のオリゴヌクレオチドプライマーと、
b)  任意に、増幅反応に必要な試薬と、を含むキットにも関する。
【０２０８】
上記の増幅方法およびキットの一実施形態では、増幅領域に対して相補配列を有する標識プローブとのハイブリダイゼーションによって増幅産物を検出する。上記の増幅方法およびキットのもう1つの実施形態では、プライマーが、ヌクレオチド配列B1〜B17、C1〜C17、D1〜D28およびE1〜E28からなる群から選択される配列を有する。上記の増幅方法およびキットの好ましい実施形態では、増幅産物が、本発明の多型塩基、特に、A1〜A28からなる群から選択されるバイアレリックマーカーの多型塩基、任意に、A1〜A13、A15およびA17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるバイアレリックマーカーの多型塩基を有する。プライマーは、特に、増幅対象となる領域に近い位置のゲノム配列の鎖のいずれかの配列、たとえば、増幅されるエキソンに隣接する非コード配列との間で、十分な相補性を有することを特徴とするものである。
【０２０９】
本発明の第1の実施形態では、本願発明者らによって生成されたゲノム配列情報を使用して、バイアレリックマーカーを同定する。配列決定後のゲノムDNA断片を使用して、500bpの断片増幅用のプライマーを設計する。これらの500bpの断片をゲノムDNAから増幅し、バイアレリックマーカーについてスキャンする。OSPソフトウェア(Hillier L.およびGreen P., 1991)を用いてプライマーを設計してもよい。いずれのプライマーも、シークエンシングプライマーとして機能する共通のオリゴヌクレオチド尾部を特定の標的塩基の上流に含むものであってもよい。当業者であれば、こうした目的で利用できるプライマー伸長物に馴染みがあるであろう。
【０２１０】
候補遺伝子をコードするゲノム配列の増幅に有用な好ましいプライマーとしては、遺伝子のプロモーター、エキソンおよびスプライス部位に的が絞られる。遺伝子のこうした機能的領域に位置すると、バイアレリックマーカーが最終的に原因変異をとげる確率が高くなる。本発明の好ましい増幅プライマーとしては、実施例2に開示するヌクレオチド配列B1〜B17およびヌクレオチド配列C1〜C17があげられる。
【０２１１】
3.  増幅したゲノムDNAの配列決定と多型の同定
次に、本発明のプライマーで上述したようにして生成した増幅産物の配列を、当業者が容易に利用できる周知の方法で決定する。好ましくは、染料プライマーサイクルシークエンシングプロトコルを使用して、増幅したDNAで自動ジデオキシターミネーターシークエンシング反応を行う。
【０２１２】
ゲル画像解析とDNA配列抽出に続いて、配列の品質を評価するためのソフトウェアを用いて配列データを自動的に処理する。
【０２１３】
上述したようにして得られた配列データに対して、ピークの形状、ピーク間解像度、特定の配列範囲における低信頼度のピークの数、ノイズレベルに基いて品質管理と確認のステップを行う。信頼性が低いと考えられる配列データを廃棄する。
【０２１４】
この第1の配列の品質解析後、増幅した断片配列各々またはそのプールから多型を検出する。多型検索については、電気泳動パターンに見られるピークの重なりに基づいて行う。これらのピークは、明らかに異なる2色で認められるものであり、配列の同じ位置にある2種類のヌクレオチドに対応している。特定のピーク同士の比率の条件と、同じ色の周囲のピークと特定のピークとの比率の条件がピーク高で満たされている場合に、そのピークを有意なものとみなすことができる。
【０２１５】
しかしながら、バックグラウンドノイズが原因で2つのピークの存在がアーチファクトとなる可能性もあるため、次の2つの対照例を用いてこうしたアーチファクトを排除する。
- 2つのDNA鎖の配列決定をし、ピーク同士を比較する。確実な結果を得るためには両方の鎖の上で多型を検出しなければならない。
- 異なるプールおよび/または個体から得た同一の増幅産物のすべてのシークエンシング電気泳動パターンを比較する。これらの異なるDNAについて、均一性、ホモ接合のピーク高さとヘテロ接合のピーク高との比を制御する。
【０２１６】
周知のアレル頻度のプールで配列決定を行って確認すると、100個体からなるプールの配列決定によって検出されるバイアレリック多型の頻度の検出限界は、マイナーアレルで約0.1である。しかしながら、プーリング法によって検出されたバイアレリック多型のうち90%を超える多型では、マイナーアレルの頻度が0.25を上回っている。したがって、この方法で選択したバイアレリックマーカーの頻度は、マイナーアレルで少なくとも0.1、メジャーアレルで0.9未満、好ましくはマイナーアレルで少なくとも0.2、メジャーアレルで0.8未満、さらに好ましくはマイナーアレルで少なくとも0.3、メジャーアレルで0.7未満である。よって、ヘテロ接合率は0.18を上回る値、好ましくは0.32を上回る値、さらに好ましくは0.42を上回る値である。
【０２１７】
別の実施形態では、バイアレリックマーカーが個々のDNA試料のシークエンシングによって検出され、このようなバイアレリックマーカーのマイナーアレルの頻度は0.1未満であってもよい。
【０２１８】
4.  本発明のバイアレリックマーカーの確認
個体群に両方のアレルが存在することを確認して、遺伝マーカーとしての多型の有用性を評価する。バイアレリックマーカーの確認は、本発明の方法で個体のグループの遺伝子型を判定し、両方のアレルが存在することを示して行う。アレルの遺伝子型判定に使うものとしては、マイクロシークエンシングが好ましい方法である。遺伝子型判定ステップによる確認は、グループの各個体から採取した個体試料ごとに行ってもよいし、2つ以上の個体から採取した試料のプールについて遺伝子型を判定して行ってもよい。問題のアレルに対して個体がヘテロ接合的なものである場合には、1個体でグループを形成することもできる。好ましくは、1つのグループに少なくとも3個体が含まれるようにし、さらに好ましくは1つのグループに5個体または6個体が含まれるようにする。これによって、1回の確認試験で試験対象となるバイアレリックマーカー2つ以上を確認できることが多いためである。しかしながら、確認試験を行う対象が小さなグループの場合、サンプリングエラーが原因で被検個体のいずれにも2つのアレルがなかった場合に、偽陰性の結果となってしまうことがある。したがって、配列内の特定の位置に真のバイアレリックマーカーがあることを示す場合よりも、特定の最初の結果がアーチファクトであるということを示す上で確認プロセスの有用性が落ちてしまう。
【０２１９】
5.  本発明のバイアレリックマーカーの頻度の評価
バイアレリックマーカー部位における最小共通アレルの頻度を決定することにより、有効なバイアレリックマーカーの遺伝マーカーとしての有用性をさらに評価する。共通性の少ないアレルの頻度が高くなればなるほど、関連性解析でのバイアレリックマーカーの有用性は高くなる。最小共通アレルの決定は、本発明の方法で個体のグループの遺伝子型を判定し、両方のアレルが存在することを示して行う。遺伝子型判定ステップによる頻度判定は、グループの各個体から採取した個体試料ごとに行ってもよいし、2つ以上の個体から採取した試料のプールについて遺伝子型を判定して行ってもよい。このグループの大きさは、全体が個体群を代表できるだけのものでなければならない。好ましくは、このグループには少なくとも20個体が含まれ、さらに好ましくはグループには少なくとも50個体が含まれ、最も好ましくはグループには少なくとも100個体が含まれる。もちろん、グループが大きくなればなるほどサンプリングエラーが減るため、頻度決定の精度も高くなる。本発明の特定のバイアレリックマーカーの共通性が低いアレルの頻度については、表2を参照のこと。共通性の少ないアレルの頻度が30%以上のバイアレリックマーカーを「高品質バイアレリックマーカー」とする。
【０２２０】
また、本発明は、個体群におけるFLAP関連バイアレリックマーカーのアレル頻度の推定方法であって、a)  本発明の方法に従って、前記バイアレリックマーカーでの前記個体群の個体の遺伝子型を判定し、b)  前記個体群における前記バイアレリックマーカーの比例表示(proportional representation)を判定する方法に関する。また、本発明の個体群におけるアレル頻度の推定方法には、本願開示内容に記載の限定内容を含むあらゆる方法、あるいは下記の方法を単独または組み合わせたものが包含される。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、FLAP関連バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの比例表示の判定が、前記個体群の各個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの両方のコピーについてヌクレオチドの同一性を判定し、個体群ごとに前記FLAP関連バイアレリックマーカーでの前記ヌクレオチドの比例表示を算出することによってなされるものであってもよい。任意に、比例表示の判定が、前記個体群の特定数の個体または各個体から採取した生物学的試料のプールに本発明の遺伝子型判定を行い、前記ヌクレオチドの比例量を算出して全体と比較してなされるものであってもよい。
【０２２１】
VIII.  バイアレリックマーカーでの個体の遺伝子型判定方法
本発明の1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーでの遺伝子型を生物学的試料で判定するための方法が得られる。これらの方法はいずれも、in vitroにて行うことのできるものである。かかる遺伝子型判定方法は、従来技術において周知の手法でFLAPバイアレリックマーカー部位でのヌクレオチドの同一性を判定することを含む。これらの方法には、関連性解析時の症例-対照個体群を遺伝子型判定する用途の他、特定の形質に関連していることが知られているバイアレリックマーカーのアレルを検出する状況で用途がある。いずれの場合も、個体のゲノム中に含まれるバイアレリックマーカーの両方のコピーを判定し、個体が特定のアレルについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを判定することができる。
【０２２２】
これらの遺伝子型判定方法は、単一の個体から得た核酸試料またはプールしたDNA試料で行うことができる。
【０２２３】
上述したバイアレリックマーカーの同定によって、プローブおよびプライマーとして使用できる適当なオリゴヌクレオチドを設計し、興味の対象となる多型性部位を含むFLAP遺伝子をそのような多型性の検出のために増幅することができる。
【０２２４】
バイアレリックマーカーの同定について上述した方法と同様の方法を用いて、あるいは後述するような他の遺伝子型判定方法を用いて、遺伝子型判定を行うことができる。好ましい実施形態では、異なる個体から採取して増幅したゲノム断片の配列同士を比較し、新しいバイアレリックマーカーを同定するが、診断や関連性解析での用途で既知のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定する場合はマイクロシークエンシングを使用する。
【０２２５】
また、本発明は、生物学的試料におけるFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を判定することを含む遺伝子型判定方法に関する。任意に、生物学的試料が単一の被検体由来のものである。任意に、前記バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を前記個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの両方のコピーについて判定してもよい。任意に、前記方法をin vitroにて実施してもよい。任意に、生物学的試料が複数の被検体由来のものであってもよい。任意に、上述した遺伝子型判定方法がさらに、前記判定ステップの前にバイアレリックマーカーを含む前記配列の一部を増幅することを含んでもよい。任意に、ここで、前記増幅を、宿主細胞中に複製起点および前記一部を含む組換えベクターのPCR、LCRまたは複製によって行ってもよい。上記の遺伝子型判定方法の判定するステップを、ハイブリッドアッセイ、シークエンシングアッセイ、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、マイクロシークエンシングアッセイのいずれかによって行ってもよい。したがって、本発明は、FLAP関連バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定することを含む、生物学的試料の遺伝子型判定方法も包含する。また、本発明の遺伝子型判定方法には、本願開示内容に記載の限定内容を含むあらゆる方法、あるいは下記の方法を単独または組み合わせたものが包含される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28およびこれらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーである。
【０２２６】
遺伝子型判定対象DNAのソース
所望の特異ヌクレオチド配列を含んでいることが明らかであるか、あるいはその疑いが認められるのであれば、精製状態または非精製状態のどのような核酸ソースでも起始核酸として使用できる。上述したように、細胞、組織、体液などからDNAまたはRNAを抽出すればよい。本発明の遺伝子型判定方法において使用される核酸は、哺乳動物ソースから得られるが、核酸試料が得られる被検体および個体群は一般的に人間であると理解されている。
【０２２７】
バイアレリックマーカーを有するDNA断片の増幅
本発明によるバイアレリックマーカーを1種またはそれ以上含むヌクレオチドセグメントを増幅するための方法およびポリヌクレオチドが得られる。バイアレリックマーカーを有するDNA断片の増幅は、さまざまな方法や目的で利用されるものであり、遺伝子型判定に限定されるものではないことは理解できよう。ただし、すべてではないとはいえ多くの遺伝子型判定法では、興味の対象となっているバイアレリックマーカーを有するDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。このような方法によって、バイアレリックマーカーにわたっているか、あるいはこれに対して遠位または近位にある部位と配列を含む配列の濃度または総数が明らかに増す。診断アッセイでも本発明のバイアレリックマーカーを持つDNAセグメントの増幅に依存する場合がある。DNAの増幅は従来技術において周知のいずれかの方法で行えばよい。増幅手法については、上記「バイアレリックマーカーの同定」のセクションVII.(2)にて説明したとおりである。
【０２２８】
後述するように、これらの増幅方法の中には、単一ヌクレオチド多型の検出に特に適しており、標的配列の増幅と多型ヌクレオチドの同定を同時に行うことのできるものがある。
【０２２９】
バイアレリックマーカーを上述したようにして同定することで、本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片を増幅するためのプライマーとして利用可能な適切なオリゴヌクレオチドを設計できる。増幅は、本願明細書に記載の新規なバイアレリックマーカーの発見にもともと使っていたプライマーか、あるいは本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片の増幅が可能な任意のプライマーのセットを用いて行うことができる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明によって、本発明のバイアレリックマーカー1種またはそれ以上を有するDNA断片を増幅するためのプライマーが得られる。いくつかの実施形態では、配列P1〜P28、任意にP1〜P13、P15、P17〜P28およびこれらの相補配列のうちの1つの多型塩基を含む配列を増幅できるようにプライマー対を適合させる。好ましい増幅プライマーを実施例2に列挙する。列挙したプライマーはごく一例であり、1つまたはそれ以上の本発明のバイアレリックマーカーを含む増幅産物を産生する他のどのようなプライマーセットでもよいことは理解できよう。
【０２３１】
増幅対象となるセグメントの長さはプライマー間の間隔によって決まる。本発明の文脈では、バイアレリックマーカーを持つ増幅セグメントは大きさが少なくとも約25bp〜35kbpであることができる。25〜3000bpの増幅断片が一般的であり、50〜1000bpの断片が好ましく、100〜600bpの断片が極めて好ましい。本発明の好ましい実施形態では、増幅および配列決定用の複数対のプライマーが、本発明のマーカーのうちの1つに対応する多型部位から500bp未満、好ましくは100bp未満、さらに好ましくは50bp未満に位置するFLAP遺伝子の領域と十分な相補性を有するものである。「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」で説明したように、増幅プライマーを標識または固相に固定化してもよい。
【０２３２】
バイアレリックマーカーでのDNA試料の遺伝子型判定方法
従来技術において周知の適当な方法を用いて、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドを同定することができる。検出対象となるバイアレリックマーカーアレルが同定され、本発明において具体的に明記されているため、この検出は、当業者であればさまざまな手法のうち適当なものを用いて実施できる単純なものである。多くの遺伝子型判定方法では、興味の対象となっているバイアレリックマーカーを持つDNA領域をあらかじめ増幅しておく必要がある。現時点では標的またはシグナルを増幅するのが好ましいが、超高感受性で増幅を必要としない検出方法も本遺伝子型判定方法に包含される。バイアレリック多型の検出に利用することのできる当業者間で周知の方法としては、従来のドットブロット解析、Oritaら(1989)に記載されている一本鎖立体構造多型解析(SSCP)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二重鎖解析、ミスマッチ切断検出、Sheffieldら(1991)、Whiteら(1992)、Grompeら(1989および1993)に記載されている他の従来の手法があげられる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、米国特許第4,656,127に記載されているような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いるものがある。
【０２３３】
好ましい方法では、シークエンシングアッセイ、酵素ベースのスマッチ検出アッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイによって、バイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接判定する。いくつかの好ましい方法について以下に述べる。極めて好ましい方法はマイクロシークエンシング法である。「シークエンシング」という用語は、本願明細書では、二重鎖プライマー/鋳型複合体のポリメラーゼ伸長を意味し、従来のシークエンシングとマイクロシークエンシングの両方を含むものとする。
【０２３４】
1)  シークエンシングアッセイ
本発明のプライマーを用いて上記にて生成した増幅産物の配列を、当業者間で周知かつ利用できる方法で決定できる。好ましくは、染料プライマーサイクルシークエンシングプロトコルを使用して、増幅したDNAで自動ジデオキシターミネーターシークエンシング反応を行う。配列解析によって、多型部位に存在する塩基を同定することができる。
【０２３５】
2)  マイクロシークエンシングアッセイ
特定の個体群のプールまたは選択した個体から採取したDNAまたはRNA試料のPRCによって得られる増幅断片に含まれる候補領域のマイクロシークエンシング反応によって、これらの個体についての多型解析を行うことができる。
【０２３６】
この解析のために、上述した条件と同様の条件下でDNA試料にPCRを行い、候補領域を増幅する。次に、ddNTP(各ddNTPに特異的な蛍光)と、興味の対象となる多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズできる適当なオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーとを用いて、ゲノム増幅産物の自動マイクロシークエンシング反応を行う。相補蛍光ジデオキシヌクレオチド類似物を用いてDNAポリメラーゼによって3'末端で特異的に伸長させると(温熱サイクリング)、プライマーが沈降して取り込まれなかった蛍光ddNTPが除去される。さらに、蛍光ddNTPが取り込まれた反応産物をABI 377配列決定装置での電気泳動によって解析し、取り込まれた塩基の同一性を判定して、試料に存在する多型マーカーを同定する。
【０２３７】
本発明の文脈で使用可能な一般的なマイクロシークエンシング手順の一例を実施例4に示す。実質的に結果を何ら変えることなく、当業者らが電気泳動方法やddNTPの標識などのこの手順での特定のパラメータを変更できることは理解できよう。
【０２３８】
MALDI-TOF質量分析を利用して、伸展させたプライマーを解析してもよい。マイクロシークエンシングプライマーに加わった質量によって多型部位の塩基を同定する(Haff and Smirnov, 1997を参照のこと)。
【０２３９】
上述したプロセスのさらに他の選択肢として、いくつかの固相マイクロシークエンシング反応が開発されている。興味の対象となるDNA断片のPCR増幅産物またはオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーのいずれかを固定化すること以外は、基本的なマイクロシークエンシングプロトコルは上述したものと同一である。たとえば、ビオチン標識DNAとストレプトアビジン被覆マイクロ滴定ウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン粒子との相互作用を利用して固定化を行うことができる。
【０２４０】
このような固相マイクロシークエンシング反応では、取り込まれたddNTPを放射線標識する(本願明細書に援用するSyv舅en, 1994を参照のこと)か、あるいはフルオレセインと結合させる(本願明細書に援用するLivak & Hainer, 1994を参照のこと)ことができる。放射線標識ddNTPの検出は、シンチレーションベースの手法で行うことができる。フルオレセイン結合ddNTPの検出は、アルカリホスファターゼと抱合した抗フルオレセイン抗体の結合後、色素生産性基質(p-ニトロフェニルホスフェートなど)と共にインキュベートすることを基本としている。
【０２４１】
考え得る他のレポーター検出対としては、ジニトロフェニル(DNP)に結合したddNTPと抗DNPアルカリホスファターゼ抱合体(本願明細書に援用するHarjuら、1993を参照のこと)およびo-フェニレンジアミンを基質として用いたビオチン標識ddNTPと西洋わさびペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン(本願明細書に援用するWO 92/15712を参照のこと)があげられる。
【０２４２】
アルカリホスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体とフルオレセイン結合ddNTPとをベースにした診断キットが、PRONTOの名前でGamidaGen Ltd.から販売されている。
【０２４３】
さらに他のマイクロシークエンシング手順として、Nyrenら(1993)は、酵素発光度測定無機ピロリン酸検出アッセイ(enzymatic  luminometric inorganic pyrophosphate detection assay (ELIDA))でDNAポリメラーゼ活性を検出することを含む固相DNAシークエンシング法の概念を示した。PCR増幅産物をビオチン標識してビーズに固定化する。マイクロシークエンシングプライマーをアニールし、この混合物のアリコート4つをDNAポリメラーゼと4種類のddNTPのうちの1つで別々にインキュベートする。反応後、得られた断片を洗浄し、4種類のdNTPすべてを用いたプライマー伸長反応での基質として利用する。DNA指向重合反応の進捗をELIDAでモニタリングする。最初の反応でddNTPが取り入れられると、続くdNTP反応の際にピロリン酸が形成されることはない。一方、最初の反応でddNTPを取り入れられないと、dNTP反応の際に過剰なピロリン酸放出が起こり、ELIDA反応の間を通して光が発生する。ELIDAの結果から、プライマーの後ろにある最初の塩基が容易に導き出される。
【０２４４】
Pastinenら(1997)は、固相ミニシークエンシング原理をオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用する単一ヌクレオチド多型の複合検出方法について説明している。固相(DNAチップ)に付着されたDNAプローブの高密度アレイについては後述する。
【０２４５】
一態様では、本発明によって、ポリヌクレオチドと、マイクロシークエンシングアッセイを行うことによって本発明のバイアレリックマーカー1種またはそれ以上の遺伝子型を判定する方法が得られる。好ましくは、バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。好ましいマイクロシークエンシングプライマーとしては、ヌクレオチド配列D1〜D28およびE1〜E28があげられる。任意に、マイクロシークエンシングプライマーとしては、ヌクレオチド配列D1〜D13、D15、D17〜D28、E1〜E13、E15、E17〜E28があげられる。より好ましいマイクロシークエンシングプライマーは、ヌクレオチド配列E11、D12、D13、D14、D15、D16、E18、D19、E20からなる群から選択される。実施例4に列挙するマイクロシークエンシングプライマーはごく一例であり、多型ヌクレオチドのすぐ隣に3'末端があるどのようなプライマーでも使用できることは理解できよう。同様に、マイクロシークエンシング解析が、どのようなバイアレリックマーカーまたは本発明のバイアレリックマーカーの組み合わせに対して実行してもよいものであることも理解できよう。本発明の一態様は、バイアレリックマーカー部位でのヌクレオチドの同一性を判定するため、実施例4に列挙するマイクロシークエンシングプライマー、あるいはその連続したヌクレオチド少なくとも8個、12個、15個、20個、25個、30個、40個または50個からなる断片であって、対応するバイアレリックマーカーのすぐ上流に3'末端を有する断片のうち1つまたはそれ以上を含む固相である。
【０２４６】
3)  ポリメラーゼおよびリガーゼを利用したミスマッチ検出アッセイ
一態様では、本発明によれば、ポリヌクレオチドと、アレル特異的増幅アッセイによって、生物学的試料で本発明の1種またはそれ以上のバイアレリックマーカーのアレルを判定する方法とが得られる。本発明のバイアレリックマーカーを含むDNA断片を増幅するための方法、プロモーター、および様々なパラメータについては、上記の「バイアレリックマーカーを有するDNA断片の増幅」ですでに説明した。
【０２４７】
アレル特異的増幅プライマー
アレル特異的増幅すなわち選択的な戦略によって、バイアレリックマーカーの2つのアレルを区別することができる。これによって、他方のアレルが増幅されることなく一方のアレルだけが増幅される。アレル特異的増幅では、プライマー対のうち少なくとも1つのメンバーが、本発明のバイアレリックマーカーの多型塩基を有するFLAP遺伝子領域とハイブリダイズ可能な程度の相補性を有するものである。このようなプライマーは、バイアレリックマーカーの2つのアレルを区別することができる。
【０２４８】
これは、多型塩基を増幅プライマーの１つの3'末端に位置させることによって達成可能である。このようなアレル特異的プライマーは、バイアレリックマーカーに存在する2つのアレルのうち一方を含む核酸試料と併用する限りにおいて、増幅反応またはシークエンシング反応を選択的に開始する傾向がある。プライマーの3'末端からの伸長がゆえに、この位置近辺でのミスマッチは増幅に阻害的な悪影響を及ぼすためである。したがって、適切な増幅条件下で、これらのプライマーはその相補アレルでのみ増幅を指示する。正確なミスマッチ位置の判定方法およびこれに対応するアッセイ条件については当業者間で周知である。
【０２４９】
連結／増幅を利用した方法
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」(OLA)では、標的分子の一本鎖の当接配列にハイブリダイズできるように設計された2つのオリゴヌクレオチドを利用する。一方のオリゴヌクレオチドをビオチン標識し、他方を検出可能な状態で標識する。正確な相補配列が標的分子中に見つかった場合は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするため、末端が当接して捕捉および検出が可能なライゲーション基質が得られる。OLAは、単一ヌクレオチド多型を検出でき、Nickersonら(1990)に説明されているPCR法と有利に併用される。この方法では、PCRを用いて標的DNAの指数的な増幅を行い、これをOLAを用いて検出する。
【０２５０】
単一ヌクレオチド多型の検出に特に適している他の増幅方法としては、上記の「バイアレリックマーカーの同定」(2)において説明したLCR(リガーゼ連鎖反応)およびGap LCR(GLCR)があげられる。LCRでは二対のプローブを用いて特定の標的を指数的に増幅する。各オリゴヌクレオチド対の配列を選択し、これらの対が標的の同一鎖の当接配列とハイブリダイズできるようにする。かかるハイブリダイゼーションによって、鋳型依存性リガーゼの基質が形成される。本発明によれば、バイアレリックマーカー部位の同一鎖の近位配列と遠位配列とを有するオリゴヌクレオチドを用いてLCRを実施することができる。一実施形態では、いずれかのオリゴヌクレオチドを、バイアレリックマーカー部位を持たせるように設計する。かかる実施形態では、オリゴヌクレオチド上のバイアレリックマーカーと相補な特異的ヌクレオチドが標的分子に含まれているかまたは欠けている場合にオリゴヌクレオチドが連結できるように反応条件を選択する。別の実施形態では、WO 90/01069に記載されているように、オリゴヌクレオチドにはバイアレリックマーカーを持たせず、標的分子とハイブリダイズさせたときに「間隙」が形成されるようにする。次いで、この間隙を相補dNTPまたは別のオリゴヌクレオチド対で「満たす」(DNAポリメラーゼによって媒介)。このように、各サイクルの終了時、各一本鎖には次のサイクルの間に標的として機能できる相補体があり、所望の配列の指数関数的なアレル特異的増幅が達成される。
【０２５１】
核酸分子のあらかじめ選択された部位でのヌクレオチドの同一性を判定するためのもう1つの方法に、リガーゼ/ポリメラーゼ媒介Genetic Bit AnalysisTMがある(WO 95/21271)。この方法は、あらかじめ選択された部位に存在するヌクレオチドと相補なヌクレオシド三リン酸をプライマー分子の末端に組み入れ、第2のオリゴヌクレオチドと連結させるものである。反応の固相に接着された特異的標識の検出または溶液での検出によって反応を監視する。
【０２５２】
4)  ハイブリダイゼーションアッセイ法
本発明は、好ましくは10〜50ヌクレオチドからなり、かつ、FLAP遺伝子のゲノム配列に位置するバイアレリックマーカーによって定義される多型配列とハイブリダイズ可能な十分な相補性を有し、好ましくは、標的配列のわずか1ヌクレオチドの違いも区別できる十分な特異性を有することを特徴とするプローブのグループにも関するものである。
【０２５３】
これらのプローブの長さは、10、15、20、あるいは30〜100ヌクレオチドの範囲とすることができ、好ましくは10〜50、さらに好ましくは40〜50ヌクレオチドの範囲とすることができる。特に好ましいプローブは25ヌクレオチド長である。他の好ましいプローブは47ヌクレオチド長である。これは、FLAP遺伝子の多型部位、好ましくは本発明のバイアレリックマーカーのうちの1つに対応する多型部位に対して相補な中心のヌクレオチドと、中心のヌクレオチドの両側にあり、多型部位の両側にあるFLAP遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相補な23個のヌクレオチド配列とを含む。任意に、本発明のバイアレリックマーカーは、配列P1〜P28およびこれらの相補配列に多型塩基を有する。任意に、本発明のバイアレリックマーカーは、配列P1〜P13、P15、P17〜P28およびこれらの相補配列に多型塩基を有する。
【０２５４】
多型を解析することができ、増幅したFLAPコード配列でのハイブリダイゼーション反応によって対応するアレルの頻度を定量化した。増幅反応については上述したようにして実施することができる。かかる反応に都合良く利用できるハイブリッドプローブとしては、好ましくは、FLAP遺伝子のゲノム配列に位置するバイアレリックマーカーの1つによって定義された多型部位とハイブリダイズ可能な十分な相補性を有し、標的アレルとわずか1塩基しか違わない任意のアレルとを区別できる十分な特異性を有するものがあげられる。
【０２５５】
ハイブリダイゼーション反応の前に本発明のバイアレリックマーカーを含む標的DNAを増幅してもよい。プローブと標的DNAとの間に形成される安定したハイブリッド二重鎖の有無を検出することによって、試料中の特定のアレルの存在を検出する。ハイブリッド二重鎖の検出は、さまざまな方法で行うことができる。標的またはプローブに結合する検出可能な標識を利用し、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にするさまざまな検出アッセイ形式が周知である。一般に、ハイブリダイゼーション二重鎖をハイブリダイズされなかった核酸から分離し、二重鎖に結合した標識を検出する。当業者であれば、洗浄ステップを取り入れて余分な標的DNAまたはプローブ、結合しなかったコンジュゲートなどを洗い流してもよいことは理解できよう。さらに、プライマーおよびプローブにある標識を用いてハイブリッドを検出するには、標準的な異種アッセイフォーマットが適している。
【０２５６】
最近開発された2種類のアッセイでは、分離または洗浄を必要とせずにハイブリッドベースのアレルを区別できる(Landegren U. ら、1998を参照のこと)。TaqManアッセイでは、累積する増幅産物に特異的にアニールされたDNAプローブを消化するため、TaqManDNAポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。蛍光エネルギー移動によって相互作用するドナーアクセプター染料対でTaqManプローブを標識する。増幅時に進行中のポリメラーゼによってTaqManプローブが切断されると、消光アクセプタ染料からドナー染料が解離し、ドナー蛍光が大幅に増大する。2つのアレル変異体を検出するのに必要なすべての試薬を反応の最初に組み合わせ、結果をリアルタイムで監視することができる(Livakら、1995を参照のこと)。選択的均質ハイブリダイゼーションを利用した手順では、分子的な指標がアレルの区別に用いられる。分子的な指標は、均質溶液中での特異的核酸の存在を示すヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。標的に結合すると、内部的に消光するフルオロフォアの蛍光を保持する立体配置的な再編成が起こる(Tyagiら、1998)。
【０２５７】
5)  オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイに対するハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイが選択された位置で固相(チップ)に付着した基本的な構造によって、多型情報に効率的にアクセスできる。各DNAチップには、格子状のパターンに配置され、ダイム硬貨程度の大きさまで小型化された個々の合成DNAプローブを数千から数百万含むことができる。これらのDNAチップについては、セクション「オリゴヌクレオチドアレイ」の「オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ」に詳細を示す。
【０２５８】
チップテクノロジーは、すでにさまざまな事例に応用されて成功をおさめている。たとえば、突然変異のスクリーニングが、S. cerevisiae突然変異株においてBRCA1遺伝子、突然変異体およびHIV-1ウイルスのプロテアーゼ遺伝子でなされる(本願明細書に援用する、Haciaら、1996、Shoemakerら、1996、Kozalら、1996を参照のこと)。
【０２５９】
バイアレリック多型を検出可能なチップは少なくとも、Affymetrix (GeneChip)、Hyseq (HyChip and HyGnostics)、Protogene Laboratoriesの3社から提案されている。
【０２６０】
DNAチップテクノロジーの使用に伴う制約の1つに、アレイでチップに付着したプローブと核酸とのハイブリダイゼーションが単なる液相反応ではないということがある。考えられる改善策として、DNAプローブがアクリルアミドマトリックスに共有結合した疎水領域で互いに独立させたポリアクリルアミドゲルパッドを使うことがある。
【０２６１】
多型を検出するために、バイアレリックマーカーP1〜P28、任意にP1〜P13、P15、P17〜P28およびこれらに対する相補配列などの本発明のバイアレリックマーカーのうちの1つの少なくとも一部を含むプローブを、in situまたは従来の合成方法によって合成し、当業者間で周知の方法を用いて適当なチップに固定化する。チップの固相表面は、ケイ素またはガラスで作られていることが多いが、ポリマー膜であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、チップが、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも20ヌクレオチド長、さらに好ましくは、その少なくとも25ヌクレオチド長の断片のヌクレオチド配列のアレイを有するものであってもよい。さらに他の実施形態では、チップが、P1〜P28、D1〜D28、E1〜E28、またはこれらと相補配列、またはその少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片からなる群から選択される配列少なくとも1つを含むアレイを有するものであってもよい。任意に、チップが、P1〜P13、P15、P17〜P28、D1〜D13、D15、D17〜D28、E1〜E13、E15、E17〜E28、またはこれらと相補配列、またはその少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片からなる群から選択される配列少なくとも1つを含むアレイを有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、チップが、P1〜P28、D1〜D28、E1〜E28、またはこれらと相補配列、またはその少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片からなる群から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個またはそれ以上の配列のアレイを有するものであってもよい。任意に、チップが、P1〜P13、P15、P17〜P28、D1〜D13、D15、D17〜D28、E1〜E13、E15、E17〜E28、またはこれらと相補配列、またはその少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片からなる群から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個またはそれ以上の配列のアレイを有するものであってもよい。
【０２６２】
解析対象となる候補領域を含む核酸試料を単離し、増幅し、レポーター基で標識する。このレポーター基には、フィコエリトリンなどの蛍光基を用いることができる。次に、流体工学ステーション(fluidics station)を用いてチップに固定化したプローブと標識した核酸をインキュベートする。たとえば、Manzら(1993)は、流体工学装置、特にマイクロキャピラリー装置をシリコン基板およびガラス基板上に製造することについて説明している。
【０２６３】
反応終了後、チップをスキャナに挿入し、ハイブリダイゼーションのパターンを検出する。レポーター基から放出されるシグナルとしてハイブリダイゼーションデータを収集する。このレポーター基は、すでに核酸に取り込まれており、この時点ではチップに付着したプローブと結合している。核酸試料の配列と完全にマッチするプローブの方が、ミスマッチプローブよりも強いシグナルを発するのが普通である。チップに固定化された各プローブの配列と位置は分かっているため、そこから特定のプローブにハイブリダイズされた核酸の同一性を判定できる。
【０２６４】
単一ヌクレオチド多型解析では一般に、核酸試料に認められ多型塩基の同一性のみが異なる候補領域の一部の位置にわたる、4つ(塩基のタイプごとに1つ)一組のオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは2つ(バイアレリックマーカーの塩基のタイプごとに1つ)一組のオリゴヌクレオチドプローブを設計する。特定の位置での一連のプローブ各々に対するハイブリダイゼーションの相対強度から、プローブの多型塩基に対応する塩基を同定することができる。バイアレリック多型の検出では、核酸試料の一塩基ミスマッチを同定するため、ハイブリダイゼーションの厳密度を一層高く(一層短い時間で低塩濃度かつ高温)する必要がある。
【０２６５】
直接電場制御を使うことで、一塩基変異の特定精度が改善される(Nanogen)。プラスの場では、負に荷電した核酸の輸送率が高まり、ハイブリダイゼーション率が10倍に増える。この手法を利用して、15秒未満で一塩基対ミスマッチを検出する(Sosnowskiら、1997を参照のこと)。
【０２６６】
5)  統合系
多型の解析に使用できるもう1つの技術にマルチコンポーネント統合系があげられる。この系では、PCRおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを単一機能の装置で簡略化かつ区分化する。かかる手法の模範例が、PCR増幅とキャピラリー電気泳動とをチップに統合することについて説明した米国特許第5,589,136号に開示されている。
【０２６７】
主にマイクロ流体系を使用する場合に統合系の使用を考慮することができる。これらの系は、ガラス、ケイ素、石英またはプラスチックウェーハ上に設計されたマイクロチャネルのパターンがマイクロチップ内に含まれたものである。試料の動きを、マイクロチップの異なるエリアで印加される電力、電気浸透的または流体静動力によって制御し、機能的な顕微値を得ると共に稼働部材なしでポンプ移動させる。電圧を変えることでマイクロ加工されたチャネル間での流体の流れを制御し、マイクロチップの異なる部分にポンプ送りする流体の流量を変化させる。
【０２６８】
バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するために、核酸増幅、マイクロシークエンシング、キャピラリー電気泳動、レーザー誘導蛍光検出などの検出方法に、マイクロ流体系を組み合わせてもよい。第1のステップでは、好ましくはPCRによってDNA試料を増幅する。次に、ddNTP(各ddNTPに特異的な蛍光)と、標的多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズする適当なオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーとを用いて、増幅産物の自動マイクロシークエンシング反応を行う。3'末端での伸長終了後、キャピラリー電気泳動によって、取り込まれなかった蛍光ddNTPからプライマーを分離する。キャピラリー電気泳動で用いられる分離媒質としては、たとえば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランを用いることができる。単一ヌクレオチドプライマー伸長産物に取り込まれたddNTPを蛍光検出によって同定する。このマイクロチップを使用すれば、少なくとも96〜384個の試料を並行して処理できる。これには、ddNTPの通常の4色レーザー誘起蛍光検出を使うことができる。
【０２６９】
IX.  関連性解析
現在の遺伝子マッピングで用いられている2つの主なストラテジーすなわち、連鎖解析および関連性解析によって、喘息感受性または抗喘息薬に対する個体応答などの特定の形質に関連のある遺伝子を同定することができる。連鎖解析では、複数の羅患個体を含む家系の調査を必要とし、現在のところ一遺伝子性遺伝形質(monogenic inherited-trait)または主働遺伝子性遺伝形質(oligogenic inherited-trait)の検出に有効である。これとは逆に、関連性解析では無関係な形質陽性(T+)個体におけるマーカーアレルの頻度を調べ、無作為に選択した対照個体または好ましくは形質陰性(T-)の対照例と比較し、通常は多遺伝子性遺伝の検出に利用される。
【０２７０】
遺伝的形質のマッピング方法としての関連性解析は、連鎖不平衡の現象をベースにしたものである。2つの遺伝座が同一の染色体上にある場合は、これらの遺伝座の同一の染色体セグメント上にあるアレルのセット(ハプロタイプと呼ばれる)がまとまったブロックとして後の世代に次々と受け継がれていくことが多い。組換えによって変化することがなければ、ハプロタイプは血統間を通して継承されるだけでなく個体群を通しても継承される可能性がある。結果として個体群レベルでは同一染色体上の異なる座に特定のアレルの対がランダムではない状態で座位することになるわけだが、このような遺伝子のランダムな組み合わせからのずれを連鎖不平衡(LD)と呼ぶ。
【０２７１】
特定の遺伝子における特定のアレルが特定の形質Tの発生に直接的に関与している場合は、その頻度はT+個体群の方がT-個体群よりも統計的に高くなる。連鎖不平衡が存在するため、形質誘発アレル(TCA)を持つハプロタイプに存在する他のすべてのアレルの頻度もT-個体に比べてT+個体での方が高くなる。したがって、形質誘発アレルと連鎖不平衡状態にある任意のアレルと形質との間の関連性が分かれば、そこから特定のアレル領域に形質関連遺伝子が存在するかどうかを十分に推測することができる。形質誘発アレルを見出すために考え得る機能的多型をすべてスクリーニングしなくても、連鎖不平衡によって限られた数の遺伝的多型(特にバイアレリックマーカー)を持つT+個体群とT-個体群での相対頻度を解析することができる。
【０２７２】
その他にも、ゲノムレベルでの関連性解析と候補遺伝子関連性解析の2通りの方法を利用して、関連性解析の実施することも可能である。ゲノムレベルでの関連性解析では、ゲノム全体にわたって等間隔で配座した遺伝マーカーをスクリーニングすることを基本としている。候補遺伝子を用いる方法は、興味の対象となる形質に関連する生物学的経路に関与している可能性のある遺伝子に特異的に位置する遺伝マーカーを研究することに基づくものである。候補遺伝子解析では、形質のバイオロジーに関する情報がいくらかでも入手可能である場合に、特定の形質に関する遺伝子と遺伝子多型を明らかに手っ取り早く得ることができる。
【０２７３】
候補遺伝子由来のバイアレリックマーカーを用いて関連性解析を行うための一般的な戦略には、個体のグループ2つ(後述するように十分に定義された表現型によって特徴付けられる形質+と形質-の対照個体)を走査し、両方のグループでバイアレリックマーカーのアレル頻度を測定および統計的に比較する方法がある。
【０２７４】
解析したバイアレリックマーカー少なくとも1つまたはそれ以上に形質との間に統計的に有意な関連性があることが確認できた場合、関連のあるアレルが形質を誘発する直接的な原因になっている(関連のあるアレルがTCAである)か、あるいは関連のあるアレルがTCAと連鎖不平衡状態にあるかのいずれかであると仮定できる。候補遺伝子の機能に比してみた関連のあるアレルの特異的な特徴から、関連のあるアレルと形質(原因形質または連鎖不平衡の形質)との間の関連性をさらに認識できるのが普通である。候補遺伝子内の関連のあるアレルがTCAである可能性がほとんどないが、実際のTCAと連鎖不平衡状態にあることが明らかになった場合は、関連のあるマーカー付近でシークエンシングを行ってTCAを見つけることができる。
【０２７５】
本発明の他の目的は、FLAP遺伝子の配列の1つまたはいくつかのバイアレリックマーカーのアレルと形質との関連性を特定およびキャラクタリゼーションするための方法を提供することにある。前記遺伝子型と形質との間の関連性の検出方法であって、a)  本発明の方法に従って、形質陽性個体群における少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの頻度を判定するステップと、b)  本発明の方法に従って、対照個体群における少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの頻度を判定するステップと、c)  前記遺伝子型と前記形質との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判定するステップと、を含み、任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、形質が疾患、好ましくはロイコトリエン経路が関与している疾患、最も好ましくは喘息、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答またはロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関する副作用である。任意に、前記遺伝子型を判定するステップa)およびb)を、前記個体群の各々から採取してプールした単一の生物学的試料について行ってもよい。任意に、前記遺伝子型を判定するステップa)およびb)を、前記個体群またはその亜集団における各個体由来の生物学的試料について別々に行ってもよい。任意に、前記対照個体が形質陰性対照例または無作為対照例であってもよい。
【０２７６】
本発明は、個体群におけるバイアレリックマーカーのセットでのハプロタイプ頻度の推定方法であって、a)  前記個体群に含まれる各個体ごとに、本発明の方法に従って少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、b)  前記個体群の各個体のゲノムに存在する第2のバイアレリックマーカーの両コピーについて、前記第2のバイアレリックマーカー部位におけるヌクレオチドの同一性を判定することによって前記第2のバイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、c)  ステップa)およびb)において特定されたヌクレオチドの同一性にハプロタイプ決定法を適用し、前記頻度の推定値を得るステップと、を含む方法も包含する。また、本発明のハプロタイプ頻度の推定方法には、本願開示内容、特に「統計学的方法」に記載の限定内容を含むあらゆる方法、あるいは下記の方法を単独または組み合わせたものが包含される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記ハプロタイプ決定方法を、非対称PCR増幅、特定のアレルの二重PCR増幅、クラークアルゴリズム、期待値−最大化アルゴリズムによって実施する。
【０２７７】
本発明によれば、FLAP遺伝子のゲノム配列のいくつかのバイアレリックマーカーでのアレルを有するハプロタイプと形質との関連性を特定およびキャラクタリゼーションするための方法を提供が得られる。この方法は、a)  形質陽性個体と対照個体において本発明によるバイアレリックマーカーのグループの遺伝子型を判定するステップと、b)  ハプロタイプと形質との間に統計的に有意な関連性を確立するステップと、を含む。さらに他の実施形態では、FLAP遺伝子のゲノム配列のいくつかのバイアレリックマーカーでのアレルを有するハプロタイプと形質との関連性を特定およびキャラクタリゼーションするための方法は、a)  本発明の方法によって形質陽性個体群における少なくとも1つのハプロタイプの頻度を推測するステップと、b)  本発明の方法によって対照個体群における前記ハプロタイプの頻度を推測するステップと、c)  前記ハプロタイプと前記形質との間に統計的に有意な関連性があるかどうかを判定するステップと、を含む。また、本発明のハプロタイプと表現型との間の関連性を検出する方法には、本願開示内容に記載の限定内容を含むあらゆる方法、あるいは下記の方法を単独または組み合わせたものが包含される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、形質が疾患、好ましくはロイコトリエン経路が関与している疾患、最も好ましくは喘息、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答またはロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関する副作用である。任意に、前記対照個体が形質陰性対照例または無作為対照例である。任意に、前記方法が、ステップc)の前に、前記形質陽性個体群と前記対照個体群における表現型を判定するステップをさらに含む。
【０２７８】
形質がロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答または逆に副作用である場合は、先に述べた本発明の方法はさらに、a)  ロイコトリエン経路が関与している特定の疾患に羅患しているとして診断された被検体の個体群または同齢集団を選択するステップと、b)  ロイコトリエン経路に作用する特定の薬剤を前記被検体の同齢集団に投与するステップと、c)  薬剤投与の成果をモニタリングし、治療に対して形質陽性または形質陰性である個体を特定するステップと、d)  DNAを含む生物学的試料を前記同齢集団から採取し、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーでの特定のアレルまたは複数のアレルのセットの有無について、このDNAを試験するステップと、e)  形質陽性個体と形質陰性個体との間でバイアレリックマーカーでのアレルの分布を解析するステップと、f)  統計分析を行って、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーのアレルの有無と治療関連の形質との間に統計的に有意な関連性があるか否かを判定するステップと、のうち、いくつかまたはすべてを含む。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体からなる群から選択される。バイアレリックマーカーの特定のアレルまたは本発明のバイアレリックマーカーのグループを含むDNAの有無についての試験および有無の検出については、本発明にて説明するようにして実施できる。
【０２７９】
また、本発明には、個体に喘息発症の危険性があるか否かを判定する方法であって、a)  本発明の方法によって、少なくとも1つのFLAP関連バイアレリックマーカーの遺伝子型を判定するステップと、b)  ステップa)の結果と喘息発症の危険性とを相関付けるステップと、を含み、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A28からなる群から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、バイアレリックマーカーA2、A14、A16、A18、A19、A22、A23から選択され、任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーがバイアレリックマーカーA19である方法も包含される。
【０２８０】
1)  形質陽性(形質+)個体と対照個体からのDNA試料の収集(組み入れ基準)
個体群ベースの関連性解析では、家族性遺伝とは無関係であるが、特定の遺伝マーカーまたはマーカーのセットの有病率を症例対照個体群で比較する。これは、血縁のない症例(羅患または形質陽性)個体と血縁のない対照(未羅患または形質陰性または無作為)個体とを比較することに基づく症例対照研究である。この対照群は、未羅患個体または形質陰性個体で構成されると好ましい。また、対照群は、民族が症例個体群と一致すると好ましい。さらに、対照群は、研究対象となる形質についての既知の主な混乱要因が症例個体群と一致する(たとえば、年齢に依存する形質の場合は年齢が一致する)ものであると好ましい。理想的には、2つの試料の個体を疾患の状態だけが異なると思われる形でペアにする。以下、「形質陽性個体群」、「症例個体群」および「羅患個体群」という用語を同義のものとして使用する。
【０２８１】
本願明細書に記載するものなどの効率的かつ有意な関連性解析を実施するために、
研究対象の形質が研究対象の個体群で並数分布し、重複せずに明確な２つの表現型すなわち形質+および形質-が得られるのが好ましい。
【０２８２】
それにもかかわらず、たとえこのような並数分布がなかったとしても(事実、一層複雑な遺伝的形質の場合などにはあり得る)、形質+表現型の群と形質-表現型の群に入れる個体を慎重に選択すれば、本願明細書において提案する関連性による方法で遺伝的形質を解析することはできる。選択手順としては、研究対象の形質における非並数表現型スペクトルから両端の個体を選択し、これらの形質+個体群と形質-個体群に、明らかに両極にあって好ましくは表現型に重複のない個体が含まれるようにする。
【０２８３】
形質+個体群および形質-個体群についての組み入れ基準の定義は、本発明における重要な態様の1つである。
【０２８４】
組み入れ基準の典型的な例としては、喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患またはZileutonなどの抗喘息薬での治療後の肝トランスアミナーゼ濃度の評価があげられる。統計学的な観点からみると、特定の個体群で肝トランスアミナーゼ濃度が標準的な分布曲線を描いているとみなした場合、最適な組み入れ基準に沿った極端な表現型を有する個体が、肝トランスアミナーゼ濃度の最も低い個体と肝トランスアミナーゼ濃度の最も高い個体にそれぞれ対応する。
【０２８５】
劇的に異なるが比較的均一な表現型を選択すると、研究対象となる個体群のサンプルサイズが十分に有意であるという前提で、関連性解析において効率的な比較を行うことができ、遺伝レベルでの著しい差異を検出できる可能性もある。
【０２８６】
通常、本願において説明するものなどの関連性解析に用いられる形質+個体群および形質-個体群は、並数分布の場合は対応する形質それぞれが100%を示す、表現型的にみて一様な個体の個体群で構成される。
【０２８７】
形質の分布が並数分布ではない場合は、形質+個体群および形質-個体群は各々が研究対象の個体群全体の1〜98%、好ましくは1〜80%、さらに好ましくは1〜50%、最も好ましくは4〜35%であり、グループの中で極端な表現型を呈する個体から選択される、表現型的にみて一様な個体の個体群で構成される。2つの形質表現型の違いが明確になればなるほど、バイアレリックマーカーで関連性を観察できる確率が高くなる。
【０２８８】
1)  ロイコトリエン経路が関与する疾患、好ましくは喘息への羅患、2)  ロイコトリエン経路に作用する薬剤の投与後に観察された副作用、好ましくはZileuton投与後の肝トランスアミナーゼ濃度の上昇の証拠、3)  ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する特定の応答の証拠に基づき、臨床的な組み入れ基準に従って50〜300の形質+個体、好ましくは約100個体からなる第1のグループを募集する。
【０２８９】
いずれの場合も、ほぼ同数の形質陰性個体を研究対象に含める。これらの個体については、先に定義した臨床的な基準がないことを確認する。形質+と形質-のいずれの個体も血縁のない症例である。
【０２９０】
本発明の文脈では、一回の関連性解析を実施した。考慮した形質は喘息であった。形質+個体および形質-個体からのDNA試料の収集については、実施例5で説明する。
【０２９１】
2)  形質+個体および形質-個体の遺伝子型判定
「バイアレリックマーカーでのDNA試料の遺伝子型判定方法」という見出しの部分で上述した方法のうちいずれか1つを用いて、上述した個体群各々におけるバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定することができる。バイアレリックマーカーの生成について上述した条件と同様の条件で各個体から採取したDNA試料についてゲノムPCRを行い、これによって得られる増幅断片を解析するのが好ましい。
【０２９２】
好ましい実施形態では、増幅したDNA試料に対して、蛍光ddNTP(各ddNTPに特異的な蛍光)と、多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズする適当なオリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーとを用いて、自動マイクロシークエンシング反応を行う。遺伝子型の判定については実施例5でさらに説明する。
【０２９３】
3)  単発のマーカー関連性解析およびハプロタイプ頻度解析
表現型と遺伝子型、ここではバイアレリックマーカーにおけるアレルまたはかかるアレルから構成されるハプロタイプでのアレルの相関の統計学的な有意性を判定する方法を従来技術において周知の統計学的試験によって判定できるが、この場合は統計学的な有意性の許容閾値が必要である。特定の方法および有意性閾値の利用方法は当業者間で周知のものである。
【０２９４】
症例個体群と対照個体群とにおけるバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定し、研究対象のバイアレリックマーカーアレルと形質との相関を表す頻度に何らかの統計学的な有意差が認められるか否かを判定するためにこれらの頻度を統計学的な試験結果と比較することにより、関連性の試験を行う。同様に、症例個体群と対象個体群において、特定のバイアレリックマーカーセットについて考え得るあらゆるハプロタイプの頻度を推定してハプロタイプ解析を行い、これらの頻度を統計学的検定を用いて比較して研究対象の表現型(形質)とハプロタイプとの間に統計学的に有意な相関が認められるか否かを判定する。遺伝子型と表現型との間の統計学的に有意な関連性を調べるための試験に有用な統計学的なツールを用いてもよい。好ましくは、ここで用いる統計学的検定は自由度1のカイ二乗検定である。P値を算出する(P値は、観察された値以上の統計値が偶然に発生する確率を示す)。
【０２９５】
好ましい実施形態では、別の診断試験用の前向きなものとしてか、あるいは早期の予防的治療用の予備的な起始点としての診断上の有意性、バイアレリックマーカー関連性に関係のあるp値が、単発のバイアレリックマーカー解析では好ましくは約1×10-2以下、さらに好ましくは約1×10-4以下であり、2つまたはそれ以上のマーカーを利用するハプロタイプ解析では、約1×10-3以下、さらに好ましくは1×10-6以下、最も好ましくは約1×10-8以下である。これらの値は、マーカーが1つであろうと複数のマーカーを併用したものであろうと、どのような関連性解析にも応用できるものと思われる。
【０２９６】
当業者であれば、上述した値の範囲を起始点として使用し、本発明のバイアレリックマーカーを用いた関連性解析を行うことができる。この場合、本発明のバイアレリックマーカーとロイコトリエン経路が関与している疾患との間の有意な関連性を証明し、診断や薬剤でスクリーニングの目的で利用することができる。
【０２９７】
偽陽性の問題に対処するために、同一の症例対照個体群について無作為に定めたゲノム領域で同様の解析を行ってもよい。1998年11月10日出願で発明の名称が「Methods, Software And Apparati For Identifying Genomic Regions Harboring A Gene Associated With A Detectable Trait(検出可能な形質に関連のある遺伝子を持つゲノム領域を同定するための方法、ソフトウェアおよび装置)」である係属中の米国仮特許出願第60/107,986号(その内容全体を本願明細書に援用する)に記載されているようにして、無作為に定めた領域と候補領域で得られる結果を比較する。
【０２９８】
単一マーカーでの関連性
関連性解析は通常、連続した2つのステップで行われる。第1フェーズでは、少数のバイアレリックマーカー(通常は2〜10個のマーカー)の頻度を、形質+個体群と形質-個体群の両方において判定する。解析の第2フェーズでは、さらに高密度のマーカーのセットを用いて、特定の形質の原因である遺伝座の位置をさらに正確に求める。しかしながら、FLAP遺伝子の場合などがあてはまるのであるが、研究対象の候補遺伝子が比較的短い場合は、1回のフェーズだけでも十分に有意な関連性が得られると思われる。
【０２９９】
FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーのセットとロイコトリエン経路が関与している疾患、特に喘息との間に相関が認められる本発明の好ましい一実施形態では、関連性解析の第1ステップの結果(その詳細については実施例7で説明する)から、喘息はバイアレリックマーカーA19(10-35/390、アレルT)と最も強く関連しているように思われる。これらの関連性についての詳細は実施例7にあげておく。
【０３００】
本発明の範囲内で、バイアレリックマーカーA1〜A28をはじめとして、好ましくは喘息と関連のあるマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーである他のバイアレリックマーカーでも同様の関連性解析を行うことができる。
【０３０１】
当業者であれば、異なる形質+個体群および形質-個体群で上記にて定義した本発明のバイアレリックマーカーを利用して、同様の関連性解析をごく普通に行うことができる。バイアレリックマーカーA1〜A28をはじめとするFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを用いた考え得る関連性解析の他の好適な例には、次の個体群に関する解析が含まれる。
ロイコトリエン経路が関与している疾患に羅患した形質+個体群と健常な未羅患個体群あるいは、
ロイコトリエン経路に作用する薬剤での治療を受け、かかる治療の結果として副作用が生じた形質+個体群形質と、同一の薬剤で治療を受けたが副作用の認められなかった形質-個体群あるいは、
ロイコトリエン経路に作用する薬剤での治療を受け、有益な応答を示した形質+個体群と、同一の薬剤で治療を受けたが何ら有益な応答が認められなかった形質-個体群。
【０３０２】
ハプロタイプ頻度解析
ハプロタイプ解析は、個々のマーカーが関わる解析の統計学的な有意性が高まるという点で興味深いものである。特に、バイアレリックマーカーのセットの情報性を組み合わせることで、関連性解析によって得られる結果の価値を高め、単一のマーカーでの研究による偽陽性データおよび/または偽陰性のデータを排除することができる。
【０３０３】
ハプロタイプ頻度解析の第1ステージでは、同定された本発明のバイアレリックマーカーのさまざまな組み合わせに基づいて考え得るハプロタイプの頻度を判定し、形質+個体と形質-個体の異なる個体群で比較する。この解析で統計的に有意な結果を得るのに必要な形質+個体の数は通常、30〜300の範囲であり、好ましい個体数は50〜150の範囲である。同じことが解析に使う未羅患の対照例にもあてはまる。
【０３０４】
最初の解析の結果から、試験した形質+個体と形質-個体のハプロタイプ頻度と、評価した各ハプロタイプについての推定ｐ値が得られる。
【０３０５】
FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーと喘息との関連性において、いくつかのハプロタイプが有意なものとして示された(図3を参照のこと)。たとえば、好ましいハプロタイプは、バイアレリックマーカーA19(10-35/390)のアレルTを有している。さらに好ましいハプロタイプ(図3のHAP1)は、マーカーA14(10-33/234)のアレルAとマーカーA19(10-35/390)のアレルTを有している。このハプロタイプは、喘息との関連性の点で極めて有意であるとみなされる。他の有意なハプロタイプについては実施例8で述べる。
【０３０６】
上述した第1段階でのハプロタイプ解析の統計学的有意性を確認するために、症例対照個体から得た遺伝子型判定データをプールし、形質表現型に関して無作為化して、さらに別の解析を行うとよい場合がある。個々の遺伝子型判定データを2つのグループに無作為に割り当てる。このとき、各グループには第1段階で得られたデータの蓄積に用いた症例対照個体群から同数ずつの個体が含まれるようにする。第2のステージでのハプロタイプ解析は、これらの人為的なグループ、好ましくは第1段階での解析のハプロタイプに含まれていたマーカーのうち相対危険度係数が最も高かったマーカーについて行うと好ましい。この実験を少なくとも100〜10000回繰り返す。このように繰り返し行うことで、試験したハプロタイプが偶然に得られる確率を判定することができる。
【０３０７】
喘息と考慮対象にした3種類のハプロタイプとの間の関連性について、無作為化したハプロタイプ解析を1000回または10000回繰り返し、結果を図4に示す。これらの結果から、ハプロタイプHAP1で得られたものに匹敵するp値のあるハプロタイプは、1000回の繰り返しではゼロ、10,000回繰り返してもわずか1つだということが分かる。これらの結果は、ハプロタイプと喘息との関連性の統計学的な有意性を明らかに立証するものである。
【０３０８】
上述した方法を使用して、単一マーカーアレルまたはハプロタイプの関連性を評価することで、特定の形質、特に本発明の文脈にあっては疾患、好ましくはロイコトリエン経路が関与している疾患、より好ましくは喘息が保因者に発生する危険度を推定することができる。使用する基準試料個体群に合わせて相対危険度の有意性の閾値を定める。危険因子に関する評価については「統計学的方法」の部分で詳細に説明する。
【０３０９】
もちろん、上記にて列挙したロイコトリエン経路が関与している疾患、特に喘息を治療する現場にいる当業者の方々には、本発明は、ロイコトリエン経路が関与している特定タイプの疾患を発症する危険性のある個体や、ロイコトリエン経路に作用する薬剤による治療に対する副作用を示すまたはこれに応答するあるいはしない個体を絶対的に特定することを意図したものではなく、疾患を発症する度合いまたは尤度、あるいは前記薬剤での治療に対して特定の個体で副作用または応答が観察される度合いまたは尤度を示すことを意図したものであることを理解して頂きたい。
【０３１０】
しかしながら、特定の環境では、この情報を用いて予防治療を開始したり、有意なハプロタイプを持っている個体で、軽い症状などの危険な徴候を予測できるという点で、この情報は極めて価値のあるもなのである。発作が極めて激しく、適切な処置をすみやかに施さないと致命傷ともなり得る喘息などの疾患では、潜在的な素因について知っていれば、たとえこの素因が絶対的なものでなかったとしても、極めて有意な形で効率的な治療を行いやすくなる。同様に、潜在的な副作用に対する診断素因を治療にあたる医師に認識させ、かかる副作用が治験時に認められないようにすることも可能であろう。
【０３１１】
X.  統計学的方法
一般に、形質および遺伝子型を試験して統計的に有意な相関性を示すための従来技術において周知の方法であれば、どのような方法でも利用できる。
【０３１２】
1)  個体群でのハプロタイプ頻度の推定方法
2つ以上の座で複相個体がヘテロ接合する場合、ハプロタイプの配偶子相は分からない。家系における系統学的な情報を用いて配偶子相を推論できることもある(Perlinら、1994)。系統学的な情報が得られない場合は、別の戦略を使ってもよい。1つの可能性として、多発性部位ヘテロ接合的な複相体を解析から除外し、ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体の個体のみを保持するようにしてもよいが、この方法では、試料構成の偏りと低頻度ハプロタイプの過小評価が生じる可能性がある。もう1つの可能性としては、非対称性PCR増幅(Newtonら、1989、Wuら、1989を参照のこと)または限界希釈によって1本の染色体を単離し、次いでPCR増幅する(Ruanoら、1990を参照のこと)などの方法で、1本の染色体を独立に研究することができる。さらに、十分に近い関係のバイアレリックマーカーを得るために、特定のアレルの二重PCRによって試料をハプロタイプ判定してもよい(Sarkar, G.およびSommer S.S., 1991)。これらの方法は、技術的に複雑である、追加コストがかかる、大規模で一般化できない、あるいは偏りが出る可能性があるなどの理由で、完全に満足のいくものというわけではない。こうした問題を解決するために、PCR増幅したDNA遺伝子型の相を推論するClark A.G.(1990)が導入したアルゴリズムを使用してもよい。簡単に説明すると、この原理では、曖昧さのない個体である完全ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体を調べ、試料に存在するハプロタイプの予備リストを埋めるのを開始する。次に、同一試料に含まれる他の個体で前に認識したハプロタイプが出現する可能性をスクリーニングする。結果がポジティブであったものについては、すべての個体の相情報が解明されるか、あるいは未解明として定められるかのいずれかになるまで、すでに認識されたハプロタイプのリストに相補ハプロタイプを追加する。この方法では、多重ヘテロ接合性の個体各々に単一のハプロタイプを割り当てるが、これらの個体に2つ以上のヘテロ接合部位がある場合には複数のハプロタイプもあり得る。あるいは、ハプロタイプを各個体に割り当てずに個体群においてハプロタイプ頻度を推定する方法を利用することもできる。好ましくは、ハーディワインベルグ比を推測してハプロタイプ頻度の最大尤度期待値が得られる期待値−最大化(EM)アルゴリズム(Dempsterら、1977)に基づく方法(無作為交配)を使用する(Excoffier L.およびSlatkin M., 1995を参照のこと)。EMアルゴリズムは、データが曖昧であるおよび/または不完全である場合に有用な繰り返し最尤推定法を汎用化したものである。EMアルゴリズムを用いてヘテロ接合体をハプロタイプに分ける。EMアルゴリズムは、たとえばEM-HAPLOプログラム(Hawley M.  E. ら、1994)やArlequinプログラム(Schneiderら、1997)などを用いて利用できる。個体群におけるハプロタイプの頻度の判定または推定には、従来技術において周知の他のどのような方法を用いてもよい(Lange K., 1997; Weir, B.S., 1996を参照のこと)。以下、EMアルゴリズムについて簡単に説明する。
【０３１３】
血縁のない個体N個からなる標本をK個のマーカーについてタイピングする。観察するデータは相が不明のK座表現型であり、これをF種類の表現型に分類できるものとする。考えられる基礎ハプロタイプがH個あるとする(Kがバイアレリックマーカーの場合、H=2K)。
【０３１４】
表現型jについて遺伝子型cjがあり得ると仮定する。よって、以下の式が得られる。
【０３１５】
【数１】
0004472173.tif 000002
式中、Pjは表現型jの確率、hkおよびhlは遺伝子型iを構成する2つのハプロタイプである。ハーディワインベルグ平衡に基づいて、pr(hk,hl)は次のようになる。
【０３１６】
【数２】
0004472173.tif 000003
【０３１７】
EMアルゴリズムの連続したステップは次のように説明できる。
【０３１８】
ハプロタイプ頻度の初期値から開始して、
【数３】
0004472173.tif 000004
が得られる。これらの初期値から遺伝子型頻度を推定(推測ステップ)し、もう一組のハプロタイプ頻度(最大化ステップ)を推定する。
【数４】
0004472173.tif 000005
ハプロタイプ頻度のセットの変化が極めて小さくなるまで上記の2つのステップを繰り返す。
【０３１９】
停止基準は、2回の繰り返しでハプロタイプ頻度間に見られる差が最大でも10-7未満になった時点とすることができる。所望の推定精度でこれらの値を調節することができる。
【０３２０】
s回目の繰り返しにおいて、推測ステップで以下の式から遺伝子型頻度を算出する。
【０３２１】
【数５】
0004472173.tif 000006
この場合、表現型jに遺伝子型iが発生し、hkおよびhlが遺伝子型を構成する。それぞれの確率は、上記の式1および2から導き出される。
【０３２２】
次に、最大化ステップでは、特定の遺伝子型頻度についてもう一組のハプロタイプ頻度を推定するだけである。この方法は、遺伝子カウント法(Smith, 1957)として周知である。
【０３２３】
【数６】
0004472173.tif 000007
式中、δitは遺伝子型iにおけるハプロタイプtの数を示す指標変数である。この指標変数の値は、0、1または2である。
【０３２４】
最終的に得られる推定値が最尤推定値になるようにするためには、出発値(values of departures)がいくつか必要である。得られた推定値を比較し、推定値間に差がある場合は最尤度につながる推定値の方を保持する。
【０３２５】
2)  マーカー間の連鎖不平衡算出方法
さまざまな方法を用いて任意の2つの遺伝位置間の連鎖不平衡を算出することができる。実用上、個体群から得たハプロタイプデータに統計学的な関連性試験を適用して連鎖不平衡を求める。
【０３２６】
マーカーMiにアレル(ai/bi)を有し、マーカーMjにアレル(aj/bj)を有する本発明のバイアレリックマーカー(Mi, Mj)を少なくとも1つ含む任意のバイアレリックマーカー対間の連鎖不平衡を、Piazzaの式によってアレルの組み合わせ(ai, aj; ai, bj; bi, ajおよびbi, bj)それぞれについて算出することができる。
Δaiaj=ルートθ4-ルート(θ4+θ3)(θ4+θ2)、式中、
θ4= - - = Miにアレルaiがなく、Mjにアレルajがない遺伝子型の頻度
θ3= - + = Miにアレルaiがなく、Mjにアレルajがある遺伝子型の頻度
θ2= + - = Miにアレルaiがあり、Mjにアレルajがある遺伝子型の頻度
【０３２７】
Weir(Weir B.S., 1996)によって説明されているようなδ(複合遺伝子型不平衡係数)に対する最尤推定(MLE)法に基づいて、アレルの組み合わせ(ai, aj; ai, bj; bi, ajおよびbi, bj)それぞれについてバイアレリックマーカー対(Mi, Mj)間の連鎖不平衡(LD)を算出することもできる。複合連鎖不平衡に対するMLEは次のとおりである。
Daiaj=(2n1 + n2 + n3 + n4/2)/N  2(pr(ai).pr(aj))
(式中、n1=Σ表現型(ai/ai, aj/aj)、n2=Σ表現型(ai/ai, aj/bj)、n3=Σ表現型(ai/bi, aj/aj)、n4=Σ表現型(ai/bi, aj/bj)、Nは試料中の個体の数である。)
【０３２８】
ハプロタイプデータがなく遺伝子型データしか利用できない場合でも、この式によってアレル間の連鎖不平衡を推定することができる。
【０３２９】
マーカー間の連鎖不平衡を算出するためのもう1つの手段は以下のとおりである。ハーディワインベルグ平衡を満たす一対のバイアレリックマーカーMi(ai/bi)およびMj(aj/bj)について、上述した方法で特定の個体群から4つの可能なハプロタイプ頻度を推定することができる。
【０３３０】
aiとajとの間の配偶子不平衡の推定は、単に、
【数７】
0004472173.tif 000008
である。式中、pr(ai)はアレルaiの確率であり、pr(aj)はアレルajの確率である。また、pr(ハプロタイプ(ai, aj))は、上記の式3において推定されるとおりである。
【０３３１】
一対のバイアレリックマーカーでは、MiとMjとの間の関連性を説明するのに必要な不平衡値は1つのみである。
【０３３２】
次に、上記の値に対する正規化値を次のようにして算出する。
D'aiaj = Daiaj / max(-pr(ai).pr(aj) ,-pr(bi).pr(bj))  (Daiaj<0)
D'aiaj = Daiaj / max(pr(bi).pr(aj) , pr(ai).pr(bj))  (Daiaj>0)
【０３３３】
他の連鎖不平衡算出方法を使用してもよいことは、当業者であれば容易に理解できよう。
【０３３４】
適当なヘテロ接合率を持つ一組のバイアレリックマーカーでの連鎖不平衡を求めるには、50〜1000の血縁のない個体、好ましくは75〜200、より好ましくは100前後の血縁のない個体を遺伝子型判定すればよい。
【０３３５】
3)  危険因子の評価
危険因子(遺伝疫学では、危険因子はマーカー座における特定のアレルまたはハプロタイプの有無である)と疾患との間の関連性は、オッズ比(OR)および相対危険度(RR)によって測定される。P(R+)がRを持った個体で疾患が発症する可能性、P(R-)が危険因子のない個体での確率である場合、相対危険度は2つの確率の比にすぎない。すなわち、
RR= P(R+)/P(R-)
である。
【０３３６】
症例対照研究では、サンプリング設計であるために相対危険度の直接的な基準を得ることができない。しかしながら、オッズ比から出現率の低い疾患の相対危険度に良く近似した値を得ることができる。この値は次のように算出できる。
OR=(F+/(1-F+))/(F-/(1-F-))
ここで、F+は症例で危険因子に曝露される頻度であり、F-は対照例で危険因子に曝露される頻度である。F+およびF-は、研究のアレル頻度またはハプロタイプ頻度を使用して算出され、基本となる遺伝モデル(優性、劣性、相加・によって変わるものである。
【０３３７】
特定の危険因子の形質を示す個体群における個体の割合について説明する、寄与危険度(AR)をさらに推定することができる。この測定は、疾患病因論および危険因子の公衆衛生的な影響に関する特異的因子の役割の定量化する上で重要である。この測定の公衆衛生との関係は、興味の対象となる曝露がなければ防止可能な個体群における疾患症例の割合を推定することにある。ARは次のように定められる。
AR=PE(RR-1) /(PE(RR-1)+1)
ARはバイアレリックマーカーアレルまたはバイアレリックマーカーハプロタイプに起因する危険である。PEは、大きな個体群内でのアレルもしくはハプロタイプへの曝露の頻度である。ＲＲは、研究の対象となる形質の個体群全体における出現率が比較的低い場合、オッズ比で近似できる相対的危険度である。
【０３３８】
XI.  本発明のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーの同定
第1のバイアレリックマーカーを興味の対象となるゲノムの領域で同定後、本発明の教示内容を使用して当業者は、この第1のマーカーと連鎖不平衡状態にある別のバイアレリックマーカーを容易に同定することができる。上述したように、形質に関連した第1のマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカーはいずれも形質に関連することになる。したがって、特定のバイアレリックマーカーと形質の間で関連性が実証された後は、この形質に関連した別のバイアレリックマーカーを見出すことが、特にこの領域のバイアレリックマーカーの密度を増加させるために非常に興味深いこととなる。形質との相関が最も高い1つのマーカーまたは複数のマーカーのセット付近で原因遺伝子または突然変異が見出されるであろう。
【０３３９】
また、本発明は、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカー、好ましくは1つのアレルが形質と関連しているFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーを同定およびキャラクタリゼーションするための方法に関する。一実施形態では、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーが、FLAP遺伝子を持つゲノム領域内であるが、FLAP遺伝子自体からみれば外に位置する。別の実施形態では、FLAP遺伝子のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカー自体がFLAP遺伝子内に位置する。この方法は、a)  複数の個体から得た第1のバイアレリックマーカーを有するゲノム断片を増幅するステップと、b)  第1のバイアレリックマーカーを持つゲノム領域で第2のバイアレリックマーカーを同定するステップと、c)  前記第1のバイアレリックマーカーと第2のバイアレリックマーカーとの間の連鎖不平衡解析を実施するステップと、d)  前記第1のマーカーと連鎖不平衡状態にある前記第2のバイアレリックマーカーを選択するステップと、を含む。
【０３４０】
一実施形態では、第2のバイアレリックマーカーの配列を決定して同定するステップが、FLAP遺伝子内で第2のバイアレリックマーカーの配列を決定することを含む。さらに別の実施形態では、第2のバイアレリックマーカーの配列を決定して同定するステップが、FLAP遺伝子の増幅領域内で第2のバイアレリックマーカーの配列を決定することを含む。
【０３４１】
同定後は、バイアレリックマーカーと形質との関連性を判定する方法、形質の素因を有する個体を特定する方法、疾患の治療方法、薬剤での治療にポジティブまたはネガティブな応答を示す可能性のある個体を特定する方法、薬物の使用方法をはじめとして、本願明細書に記載のどの方法にもFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にある配列を利用できる。特に、FLAP遺伝子でバイアレリックマーカーと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーを使用して、喘息に対する素因のある個体や、Zileutonなどの抗喘息薬での治療にポジティブまたはネガティブな応答を示す素因のある個体を特定できる。
【０３４２】
バイアレリックマーカーの同定および連鎖不平衡解析の実施方法については、本願明細書では「統計学的方法」の項で説明しているが、これは過度に実験を行わなくても当業者らが実施可能なものである。したがって、本発明は、特異的バイアレリックマーカーA1〜A28と連鎖不平衡状態にあり、特定の形質との関連性という点で同様の特徴を呈すると思われるバイアレリックマーカーにも関する。XII.  FLAP遺伝子での形質誘発変異の同定
【０３４３】
形質+個体および形質-個体から得たFLAP遺伝子の配列を比較することで、検出可能な表現型の原因であるFLAP遺伝子における変異を同定できる。配列決定対象となる形質+個体が形質に関連のあるとされるハプロタイプを持つものであり、配列決定対象となる形質-個体が形質に関連のあるハプロタイプを持たないものであると好ましい。検出可能な表現型は、ロイコトリエン経路が関与している疾患、ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する応答またはこの薬剤での治療に関係した副作用を含む、変化したFLAP機能がさまざま形で現れるものであってもよい。変異には、FLAP遺伝子の点変異、欠失または挿入が含まれる場合がある。変異は、FLAPタンパク質に対するコーディング配列内またはPG1遺伝子の調節領域内に位置する場合がある。
【０３４４】
このような変異の検出に用いられる方法は通常、a)  形質陽性患者および形質陰性対照例のDNA試料から得た形質に関連のあるバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループを含むFLAP遺伝子の領域を増幅するステップと、b)  増幅した領域を配列決定するステップと、c)  形質陽性患者のDNA配列と形質陰性対照例のDNA配列とを比較するステップと、d)  形質陽性患者に特異な変異を判定するステップと、を含む。
【０３４５】
上述したようにしてオリゴヌクレオチドプライマーを構築し、FLAP遺伝子のエキソン、イントロンまたはプロモーター領域の各々の配列を増幅する。
【０３４６】
各プライマー対を使用して、このプライマーを得たエキソンまたはプロモーターを増幅する。増幅は、好ましくは実施例で上述したPCR条件を用いて、形質陽性患者と形質陰性患者の対照から採取したゲノムDNA試料について行う。次に、ゲノムPCRから得られる増幅産物に、好ましくは自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応でのシークエンシングを行い、好ましくはABI 377シークエンサにて電気泳動させる。ゲル画像解析およびDNA配列抽出に続いて、ABI配列データを自動的に解析して形質陽性個体と形質陰性個体における配列のバリエーションの有無を検出する。各個体について両方のDNA鎖の配列を判定することによって、配列を確認する。
【０３４７】
次に、上述した手法などの多型解析手法を利用して、形質陽性個体と形質陰性個体の以前より大きな個体群をスクリーニングすることによって、疾患、ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する有益な応答またはこの薬剤での治療に関係のある副作用などの検出可能な表現型の原因である疑いのある候補多型を確認する。検出可能な表現型との間に統計的に有意な相関を呈する多型が、検出可能な表現型の原因であると思われる。
【０３４８】
本発明の文脈で観察されるFLAP遺伝子のバイアレリック多型の大半は、FLAPタンパク質のアミノ酸配列を大幅に変えるようには見えない。また、これらの多型はスプライシング配列に位置しているようにも思えない。しかしながら、この多型が1つまたはそれ以上の組織での基本的なFLAP発現の変化に関連している場合がある。かかる多型が原因で、FLAP DNAの転写率やFLAP mRNA安定性、FLAP mRNAの翻訳率がいずれは変わってくる可能性があるのである。
【０３４９】
バイアレリック多型は、さらに発現修飾因子によってFLAP発現の変調が変化することにも関連している場合がある。「発現修飾因子」という用語には、FLAP遺伝子発現の変調によってFLAPの作用を変調する化合物も包含することを意図している。
【０３５０】
特異的多型の有無についてタイプ分けした個体から得た組織試料を解析することで、異なる組織での基本的なFLAP発現レベルを判定できる。ELISA、タンパク質定量化用RIA、ノーザンブロットまたは他のハイブリダイゼーション解析、mRNA定量化用の定量的RＴ-PCRなど、都合の良い方法を適宜使用することができる。このようにして、組織特異的発現と遺伝子型とを相関させることができる。これらの方法のうちのいくつかについて、下記の「試薬のスクリーニング」という見出しを付した部分で詳細に説明する。
【０３５１】
さらに、初めて観察されたFLAP遺伝子と喘息との高い関連性から、FLAP遺伝子のあらゆる変異の位置を特定して研究する必要があるということを裏付けるものとなる。変異が起こると、ロイコトリエン代謝のおよぶ範囲、結果としてロイコトリエン経路が関与する特定の状態の個体に対して治療上のさまざまな代案を考慮する際になされる治療的な選択肢のおよぶ範囲に影響が出る。
【０３５２】
FLAP遺伝子内には原因変異の可能性が多数ある。原因変異の1つとしてFLAPタンパク質のアミノ酸変化が考えられるが、これはFLAP基質特異性および/または活性の変動要因となり得るものである。タンパク質同士の相互作用あるいはタンパク質とリガンドとの相互作用を解析する方法については、下記の「試薬のスクリーニング」という見出しの部分で詳細に説明する。
【０３５３】
もう1つ、FLAP遺伝子の制御領域、特にその在来プロモーター配列の修飾が原因変異として考えられる。特定のプロモーター配列についての発現アッセイによって基本的な発現レベルを判定し、この種の変異を研究することができる。このアッセイは、FLAPコード配列または検出可能なマーカー配列で実行すればよい。組織特異性を判定するために、異なるソースから得た細胞でアッセイを実行する。いくつかの方法について、下記の「試薬のスクリーニング」という見出しの部分で詳細に説明する。
【０３５４】
本願明細書において使用する「基本的な発現レベル」という用語は、本発明のバイアレリックマーカーの関連性のあるアレルを持たない個体で通常観察されるFLAP発現レベルを示すことを意図している。
【０３５５】
もう1つの実施形態では、検出可能な表現型を発現している個体からゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーなどの核酸試料を得ることによって、検出可能な表現型を誘発する突然変異体FLAPアレルを単離することができる。この核酸試料を、FLAP遺伝子の関連のあるバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループの領域に位置する1つまたはそれ以上のプローブと接触させたり、あるいはこのバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループの増幅に特異的なPCR-タイプ分け可能なプライマーと接触させることができる。本願明細書で定義するプローブとハイブリダイズする核酸またはPCRによって増幅される核酸についてシークエンシング反応を行って、突然変異を同定することができる。検出可能な表現型の原因である変異を含んでいるFLAP遺伝子領域を後述するものなどの診断手法に利用してもよい。たとえば、本願明細書にて
説明するようなマイクロシークエンシングオリゴヌクレオチド、増幅用の検出可能な表現型の原因である変異を含んでいるオリゴヌクレオチド、あるいはハイブリダイゼーションに基づく診断を利用して、検出可能な表現型に羅患している個体や後に検出可能な表現型を発症する危険性のある個体を検出することができる。また、検出可能な表現型の原因であるFLAPアレルを遺伝子治療に利用してもよい。検出可能な表現型の原因であるFLAPアレルを発現ベクターにクローニングし、本願明細書で説明するような突然変異体FLAPタンパク質を発現させることもできる。
【０３５６】
XIII.  遺伝診断法での本発明のバイアレリックマーカー
本発明のバイアレリックマーカーを利用して、特異的な遺伝子型の結果として検出可能な形質を発現する個体または遺伝子型がゆえに後に検出可能な形質が発生する危険性のある個体を特定できる診断試験を開発することができる。本診断法を用いて解析する形質は、ロイコトリエン経路が関与している疾患、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する有益な応答またはロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関係のある副作用など、どのような検出可能な形質であってもよい。
【０３５７】
本発明による診断手法では、被検者が検出可能な形質が発生する危険度増大に関連のあるバイアレリックマーカーパターンを有するか否か、あるいは特定の突然変異の結果として個体に検出可能な形質が認められるか否かを、家系解析、単精子DNA解析または体細胞ハイブリッドなど、ハプロタイピング用の個々の染色体の解析が可能な方法をはじめとするさまざまな方法を利用して判定できる。
【０３５８】
本発明によれば、個体がFLAP遺伝子の変異または多型が原因の疾患を発症する危険性があるか否か、あるいは疾患に羅患しているか否かを判定するための診断法が得られる。また、本発明によれば、ロイコトリエン経路に作用する薬剤に対して個体がポジティブな応答を示す可能性があるか否か、またはロイコトリエン経路に作用する薬剤に対する有害副作用が個体に発生する危険性があるか否かを判定するための方法が得られる。
【０３５９】
これらの方法では、個体から核酸試料を採取し、アレル少なくとも1つまたはバイアレリックマーカーハプロタイプ少なくとも1つが核酸試料に含まれ、形質発症の危険性または特定のFLAP多型または変異(形質誘発アレル)を持っていることでその形質が発現される危険性があるか否かを判定する必要がある。
【０３６０】
好ましくは、このような診断法では、個体から核酸試料を採取し、上記VIIIにて説明した方法でこの試料の遺伝子型を判定する。この診断は単一のバイアレリックマーカーに基づくものであってもバイアレリックマーカーのグループに基づくものであってもよい。
【０３６１】
こうした方法ではいずれも、被検体から核酸試料を採取し、バイアレリックマーカーA1〜A28、これらの相補体またはこれらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーのうち、1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーパターンを判定する。
【０３６２】
一実施形態では、核酸試料についてPCR増幅を行い、検出可能な表現型に関連のある多型が同定された領域を増幅する。増幅産物のシークエンシングを行い、その個体に検出可能な表現型に関連のある1種またはそれ以上のFLAP多型があるか否かを判定する。増幅産物の生成に利用するプライマーは、プライマーB1〜B17およびC1〜C17を含むものであってもよい。あるいは、上述したようにして核酸試料にマイクロシークエンシング反応を施し、その個体にFLAP遺伝子の変異または多型性が原因の検出可能な表現型に関連のある1種またはそれ以上のFLAP多型があるか否かを判定する。マイクロシークエンシング反応で利用するプライマーとしては、プライマーD1〜D28およびE1〜E28があげられ得る。もう1つの実施形態では、検出可能な表現型に関連のある1種またはそれ以上のFLAPアレルに特異的にハイブリダイズする1種またはそれ以上のアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと核酸試料とを接触させる。ハイブリダイゼーションアッセイに利用されるプローブとしては、プローブP1〜P28、その相補配列または多型塩基を含むその断片があげられ得る。もう1つの実施形態では、増幅反応時にアレル特異的オリゴヌクレオチドと併用する場合、増幅産物産生能を持つ第2のFLAPオリゴヌクレオチドと核酸試料とを接触させる。増幅反応時に増幅産物が認められれば、その個体は検出可能な表現型に関連のある1種またはそれ以上のFLAPアレルを有していることになる。
【０３６３】
好ましい実施形態では、A2、A14、A16、A18、A19、A22、A23、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される少なくとも1つのバイアレリックマーカーに位置するヌクレオチドの同一性を判定し、検出可能な形質が喘息である。もう1つの好ましい実施形態では、A14およびA19、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される多型部位の少なくとも1つに位置するヌクレオチドの同一性を判定する。さらに好ましい実施形態では、多型部位A19、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーに位置するヌクレオチドの同一性を判定する。本発明では、本発明のポリヌクレオチドを含む診断キットについてもさらに説明する。
【０３６４】
特定の環境では、この診断法を用いて予防治療を開始したり、有意なハプロタイプを持っている個体が軽い症状などの危険な徴候を予測できるという点で、この診断法は極めて価値のあるもなのである。喘息など、発作が極めて激しく、適切な処置をすみやかに施さないと致命傷ともなり得る疾患では、潜在的な素因について知っていれば、たとえこの素因が絶対的なものではなくても、極めて有意な形で効率的な治療を行いやすくなる。
【０３６５】
本発明は、1種またはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドと、必要な試薬の一部またはすべてと、FLAP関連バイアレリックマーカーにおけるヌクレオチドの同一性を判定することによって、被検体の遺伝子型を判定するための指示書とを含む診断キットも包含する。キットに含まれるポリヌクレオチドは、任意に、固相に付着されていてもよく、あるいは、ポリヌクレオチドのアレイの一部であるかまたはアドレス指定可能なアレイであってもよい。このキットでは、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、あるいはポリメラーゼおよび/またはリガーゼを用いたミスマッチ検出アッセイを含むがこれに限定されるものではない従来技術で周知のいずれかの方法で、マーカー位置におけるヌクレオチドの同一性を判定することができる。本願において説明するいずれかの遺伝子型判定方法を実施する目的で、従来技術において周知の製造処方法を用いて診断キットを製造することができる。好ましくは、このようなキットによって、FLAP関連バイアレリックマーカーから選択されるバイアレリックマーカーのアレルを判定してもよい。任意に、被検体がロイコトリエン経路が関与している疾患に羅患する危険性、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に対する被検体の有益な応答、ロイコトリエン経路に作用する薬剤を用いた治療に関係のある被検体での副作用に鑑みて、判定結果をスコアリングするための指示書をキットに入れておいてもよい。
【０３６６】
XIV.  ロイコトリエン経路が関与している疾患の治療
本発明は、薬物を用いた治療、好ましくはロイコトリエン経路に直接または間接的に作用する薬物を用いた治療に対して、被検体がポジティブな応答を示す可能性を判定する方法にも関する。
【０３６７】
この方法では、前記薬物に対してポジティブな応答を示す個体からなる第1の個体群と、前記薬物に対してネガティブな応答を示す個体からなる第2の個体群とを特定する。前記薬物に対するポジティブな応答に関連のある第1の個体群で1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーを同定するか、あるいは前記薬物に対するネガティブな応答に関連のある第2の個体群で1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーを同定する。バイアレリックマーカーの同定には、本願明細書にて説明する方法を利用してもよい。
【０３６８】
次いで、被検患者から(form)DNA試料を採取する。このDNA試料を解析し、薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上が含まれているか否か、あるいは、この薬物での治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上が含まれているか否かを判定する。いくつかの実施形態では、DNA試料を解析し、薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNAに含まれる被検体、あるいは、この薬物での治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNAに含まれていない被検体を特定する。
【０３６９】
他の実施形態では、薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNA試料に含まれている場合および/または薬物での治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNA試料に含まれていない場合に、臨床試験で被検者に薬物を投与する。好ましい実施形態では、薬物がZileutonなどの抗喘息薬である。他の実施形態では、ネガティブな応答が、肝トランスアミナーゼレベルの上昇などの1つまたはそれ以上の副作用を含む。本発明の方法を利用して、薬物に対して良好な応答を示す可能性のある個体からなる個体群について薬効の評価を行ってもよい。
【０３７０】
また、本発明は、薬物、好ましくはロイコトリエン経路に直接または間接的に作用する薬物の臨床試験方法にも関する。この方法は、a)  薬物、好ましくは個体からなる異質個体群に、ロイコトリエン経路に直接または間接的に作用できる薬物を投与するステップと、b)  前記薬物に対してポジティブな応答を示す個体からなる第1の個体群を特定し、前記薬物に対してネガティブな応答を示す個体からなる第2の個体群を特定するステップと、c)  前記薬物に対するポジティブな応答に関連のある前記第1の個体群のバイアレリックマーカーおよび/または前記薬物に対するネガティブな応答に関連のある前記第2の個体群のバイアレリックマーカーを同定するステップと、d)  前記薬物に対するポジティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNAに含まれている個体および/または前記薬物に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカーのアレル1つまたはそれ以上がDNAに含まれていない個体を選択するステップと、d)  前記個体に前記薬物を投与するステップと、を含む。
【０３７１】
このような方法は、望ましくない副作用を引き起こすおよび/またはこの薬剤を通常投与している患者個体群の一部で薬の効果がみられない薬物の投与に起因する利益/危険比を高める上で非常に有用であると思われる。
【０３７２】
個体が喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患に羅患していると診断された場合、選択試験を実施し、治療に対するポジティブな応答、あるいは、副作用または無応答を含んでもよい治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレルが個体のDNAに含まれているか否かを判定する。
【０３７３】
上述した検出方法によって本発明の方法を用いて治療の対象とする患者を選択することができる。選択対象となる個体は、治療に対するネガティブな応答に関連のあるバイアレリックマーカー1つまたはバイアレリックマーカーのグループのアレルがDNAに含まれていない個体であると好ましい。
【０３７４】
患者の遺伝素因を判定したら、臨床医は、患者で観察される特定の副作用が報告されていない治療法、あるいはかろうじて報告されてはいるが不十分である治療法、好ましくは患者のDNAでみられるものと同一の1つまたは複数のバイアレリックマーカーが関与していないアレル関連性から、適当なものを選ぶことができる。ロイコトリエン経路が関与している疾患の治療に有用な薬物をいくつか選択できる。ロイコトリエン経路に作用する化合物については、たとえば、米国特許第4,873,259号、同第4,970,215号、同第5,310,744号、同第5,225,421号、同第5,081,138号あるいはEP 0 419 049号(これらの開示内容を本願明細書に援用する)に記載されている。
【０３７５】
XV.  FLAPタンパク質およびポリペプチド断片
「FLAPポリペプチド」という用語は、本願明細書では、本発明のあらゆるタンパク質およびポリペプチドを含むものとする。また、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドならびにこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも本発明の一部を構成する。本発明は、例示するものである。単離または精製されたFLAPタンパク質を含む、ヒトから得たFLAPタンパク質であって、配列番号 3の配列からなる、あるいは実質的に配列番号 3の配列からなる、あるいは配列番号 3の配列を含み、かつ、配列番号 3の127位にイソロイシンを有する。本発明のFLAPタンパク質は、配列番号 3のアミノ酸127位のバリン残基をイソロイシン残基で置換した、ヒトFLAPのアミノ酸配列の天然由来の変異体をベースにしたものであることに注意されたい。本願明細書では、配列番号 3のアミノ酸127位を含む変異体タンパク質およびその断片を総称して「127-Ile変異体」または127-Ile FLAPポリペプチド」と呼ぶ。
【０３７６】
本発明は、配列番号 3の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、さらに好ましくは配列番号 3の少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを有し、前記連続スパンが、配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含む、単離されたポリペプチド、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドを例示するものである。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の連続スパンが、FLAPタンパク質配列のアミノ酸の欠失、付加、交換、切断を含む突然変異部位または機能的突然変異を含む。
【０３７７】
FLAPタンパク質は、ヒトまたは哺乳動物の組織試料から単離されるか、あるいはヒトまたは哺乳動物の遺伝子から発現されたものであると好ましい。本発明のFLAPポリペプチドは、従来技術において周知の一般に用いられる発現方法によって生成できる。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好都合な宿主に適した発現ベクターに連結する。組換えポリペプチドの形成には真核生物宿主系と原核生物宿主系の両方を使用する。さらに一般的な系のうちのいくつかの概要。次に、ポリペプチドを溶解細胞または培地から単離し、意図した用途に合う程度まで精製する。精製は、微分抽出、塩分画、クロマトグラフィ、遠心分離などの従来技術において周知のいずれかの方法で行う。タンパク質のさまざまな精製方法については、たとえば、Methods in Enzymologyを参照のこと。
【０３７８】
また、短めのタンパク質断片であれば化学的な合成によって作出する。あるいは、本発明のタンパク質をヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出する。タンパク質の精製方法は従来技術において周知であり、一例としては、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を破壊した後、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、密度による遠心沈降およびゲル電気泳動によってポリペプチドを微分抽出および分離することがあげられる。
【０３７９】
配列番号 2をはじめとするどのようなFLAP cDNAを用いてFLAPタンパク質およびポリペプチドを発現させてもよい。好ましいFLAP cDNAは、バイアレリックマーカーA21のアレルAを有する。発現対象となるFLAPタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、従来のクローニングテクノロジーを用いて発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させる。発現ベクターのFLAPインサートは、FLAPタンパク質の完全なコード配列を有するものであってもその一部を有するものであってもよい。たとえば、FLAP由来のインサートが、配列番号 3のFLAPタンパク質の連続した少なくとも10アミノ酸を含み、前記連続したアミノ酸がアミノ酸127位のイソロイシン残基を有するポリペプチドをコードしてもよい。
【０３８０】
発現ベクターは、従来技術において周知の哺乳動物、酵母、昆虫またはバクテリアの発現系であればどのようなものであってもよい。ジェネティクスインスティテュート社(マサチューセッツ州Cambridge)、ストラタジーン社(カリフォルニア州La Jolla)、プロメガ社(ウィスコンシン州Madison)およびインビトロゲン社(カリフォルニア州San Diego)をはじめとするさまざまな提供業者から、市場販売されているベクターおよび発現系を入手することができる。必要があれば、Hatfield, らの米国特許第5,082,767号に説明されているように発現ベクターを導入する特定の発現生物に合わせて配列のコドンコンテキストおよびコドンペアリングを最適化し、発現を促進して正しいタンパク質折り畳みを容易にする。
【０３８１】
一実施形態では、cDNAのポリAシグナルによるFLAP cDNAの完全コーディング配列を発現ベクターでプロモーターに作用的に結合させる。あるいは、FLAPタンパク質の一部をコードする核酸に、開始部位として機能するメチオニンがない場合は、従来の手法を利用して開始メチオニンを核酸の第1コドンの隣に導入することができる。同様に、FLAP cDNAから得たインサートにポリAシグナルがない場合は、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5(ストラタジーン)からポリAシグナルを抜き、これを哺乳動物の発現ベクターpXT1(ストラタジーン)に組み込むことで、上記の配列をコンストラクトに付加することができる。pXT1は、モロニーマウス白血病ウイルスから得られるLTRとgag遺伝子の一部とを含む。コンストラクトにおけるLTRの位置がゆえに、安定したトランスフェクションを効率よく行うことができる。ベクターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。FLAPタンパク質またはその一部をコードする配列がポリAシグナルに対して正しい位置にくるように慎重に注意を払いながら、FLAP cDNAまたはその一部と相補的であり、5'プライマーに組み込まれたPst Iと、対応するcDNA 3'プライマーの5'末端におけるBglIIとに対する制限エンドヌクレアーゼ配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配列番号 3のFLAP cDNAを含むバクテリアベクターからFLAPタンパク質またはその一部をコードする核酸をPCRによって得る。このようにして生じるPCR反応によって得られる精製断片をPstIで消化し、エキソヌクレアーゼで平滑末端化し、Bgl IIで消化し、精製してpXT1に連結し(この時点でポリAシグナルを含む)、BglIIで消化する。
【０３８２】
産物の説明部分で概説した条件下でリポフェクチン(ニューヨーク州Grand Island、ライフテクノロジーズ社)を使用して、連結産物をマウスNIH 3T3細胞にトランスフェクトする。G418(ミズーリ州St. Louis、シグマ社)600ug/ml中にてトランスフェクト細胞の増殖後にポジティブなトランスフェクタントを選択する。
【０３８３】
あるいは、FLAPタンパク質またはその一部をコードする核酸をpED6dpc2(マサチューセッツ州Cambridge、ジェネティクスインスティテュート社)にクローニングする。このようにして得られるpED6dpc2コンストラクトを、COS 1細胞などの適当な宿主細胞にトランスフェクトする。メトトレキセート耐性細胞を選択し、増殖させる。
【０３８４】
上述した手順を用いて、検出可能な表現型またはその一部の原因である突然変異体FLAPタンパク質を発現させることもできる。
【０３８５】
硫安沈殿またはサイズまたは電荷に応じたクロマトグラフィを用いた分離などの従来の精製法を利用して、発現タンパク質を精製する。核酸インサートによってコードされたタンパク質を、標準的な免疫クロマトグラフィ法を用いて精製してもよい。このような手順では、細胞エキスなど発現FLAPタンパク質またはその一部を含有する溶液を、FLAPタンパク質またはその一部に対する抗体を取り付けたクロマトグラフィマトリックスを仕込んだカラムに入れる。発現タンパク質を免疫クロマトグラフィのカラムに結合させる。その後、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。次いで、特異的に結合した発現タンパク質をカラムから分離し、標準的な手法を用いて回収する。
【０３８６】
FLAPタンパク質またはその一部の発現を確認するために、FLAPタンパク質またはその一部をコードするインサートを含む発現ベクターを含有する宿主細胞から発現したタンパク質を、インサートを含まない発現ベクターを含有する宿主細胞から発現したタンパク質と比較することができる。インサートを含む発現ベクターを含有する細胞から得た試料には、インサートを含まない発現ベクターを含有する細胞から得た試料にはないバンドが存在することから、FLAPタンパク質またはその一部が発現されていることが分かる。通常、このバンドはFLAPタンパク質またはその一部に見られる移動度を有する。しかしながら、このバンドの移動度は、グリコシル化、ユビキチン結合または酵素切断などによる修飾の結果として生じるはずの移動性とは異なる場合がある。
【０３８７】
発現FLAPタンパク質またはその一部を特異的に認識できる抗体については後述する。
【０３８８】
抗体産生ができない場合は、FLAPタンパク質またはその一部をコードする核酸を、キメラポリペプチドを用いる精製スキームで使用するように設計した発現ベクターに組み込む。このような戦略では、FLAPタンパク質またはその一部をコードする核酸を、キメラのもう片方をコードする遺伝子と共にインフレームで挿入する。キメラのもう片方は、β-グロビンまたはニッケル結合ポリペプチドコード化配列である。このようにして、β-グロビンまたはニッケルに対する抗体を有するクロマトグラフィのマトリックスを用いてキメラタンパク質を精製する。プロテアーゼ切断部位をβ-グロビン遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドとFLAPタンパク質またはその一部との間で操作する。これによって、キメラの2つのポリペプチドがプロテアーゼで消化されて互いに分離する。
【０３８９】
β-グロビンキメラの生成に有用な発現ベクターの1つに、pSG5(ストラタジーン)があげられる。これは、ウサギβ-グロビンをコードするものである。ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンIIによって、発現転写物のスプライシングが容易になり、コンストラクトに組み込まれたポリアデニル化シグナルによって発現のレベルが増大する。これらの手法は分子生物分野の当業者間で周知のものである。標準的な方法は、Davisら(1986)などの方法テキストにおいて公開されている。さらに、ストラタジーン社、ライフテクノロジーズ社またはプロメガ社からの多くの方法を利用できる。また、In vitro ExpressTM Translation Kit(ストラタジーン)などのin vitro翻訳系を用いてコンストラクトからポリペプチドを生成してもよい。
【０３９０】
本発明のFLAPポリペプチドと結合する抗体
発現されたFLAPタンパク質またはその断片に上述したように特異的に結合できる抗体を生成するには、どのようなFLAPポリペプチドまたはタンパク質全体を利用してもよい。本発明の抗体組成物は、FLAPタンパク質の127-Ile変異体に特異的に結合またはこれを特異的に結合できる。FLAPの127-Ile変異体に特異的に結合する抗体組成物として機能するには、ELISAやRIA、他の抗体ベースの結合実験において、FLAPの全長127-Val変異体の結合親和性よりもFLAPの全長127-Ile変異体の結合親和性の方が少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、50%あるいは100%高くなければならない。
【０３９１】
本発明の好ましい実施形態では、抗体組成物が、配列番号 3の少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエピトープ含有断片に選択的に結合またはこれを選択的に結合可能であり、前記エピトープが、配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を有し、前記抗体組成物が任意にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【０３９２】
また、本発明は、FLAPポリペプチドの少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも12、15、20、25、50または100アミノ酸の連続スパンを有し、前記連続スパンが、配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含むポリペプチドを、抗体の作出に使用すること対象としている。好ましい実施形態では、かかるポリペプチドは、127-Ile変異体の有無を検出する抗体の作出に有用なものである。
【０３９３】
抗体の調製には、抗体が結合すると望ましいFLAPとは異なる種のFLAPを発現する、野生型またはトランスジェニック動物の非ヒト動物または哺乳動物と、FLAPを発現しない動物(すなわち本願明細書で説明するFLAPノックアウトアニマル)が特に有用である。FLAPノックアウトアニマルは、FLAP曝露領域の大半または全体を外来抗原として認識し、FLAPエピトープのアレイが拡がった抗体を産生する。さらに、127-Ile変異体に対する特異的結合を得る上で、アミノ酸を10〜30個しか含まない小さめのポリペプチドが有用なこともある。また、FLAPの抗原配列と類似の種を産生する動物の体液性免疫系は、動物の天然FLAP種と抗原配列との違いを優先的に認識し、抗原配列における独特な部位に対する抗体を産生する。このような手法は、127-Ile変異体に特異的に結合する抗体を得る上で特に有用である。
【０３９４】
XVI.  組換えベクター、細胞宿主およびトランスジェニック動物
組換えベクター
本願明細書では、二本鎖または一本鎖で、環状または線状であり、細胞宿主あるいは単細胞の宿主生物または多細胞の宿主生物に導入する対象として探査される興味の対象となるポリヌクレオチドを少なくとも1つ有するDNAまたはRNA分子を示すのに「ベクター」という用語を用いる。
【０３９５】
本発明は、FLAPゲノム配列由来の調節ポリヌクレオチドを有する組換えベクターのファミリあるいはFLAPゲノム配列から得られるコードポリヌクレオチドを包含する。したがって、本発明はさらに、配列番号 1の核酸に含まれる調節ポリヌクレオチドまたはFLAPコード配列を有するポリヌクレオチドの一方または両方を有する組換えベクターについても扱う。
【０３９６】
一般に、本発明の組換えベクターは、制御配列およびコード配列ならびに上記にて定義したような任意のFLAPプライマーまたはプローブを含む、本願明細書にて説明するポリヌクレオチドのうちいずれを有するものであってもよい。
【０３９７】
第1の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターを使用して、配列番号 1のFLAPゲノム配列由来またはFLAP cDNA、たとえば配列番号 2のcDNAを由来する挿入したポリヌクレオチドを適当な細胞宿主において増幅する。このポリヌクレオチドは、組換えベクターの複製ごとに増幅される。
【０３９８】
本発明による組換えベクターの第2の好ましい実施形態は、本発明の調節ポリヌクレオチドまたはコード核酸のいずれか一方または両方を含む発現ベクターからなる。特定の実施形態では、発現ベクターを用いてFLAPポリペプチドを発現させ、これを精製したり、たとえば、リガンドスクリーニングアッセイで利用、あるいはFLAPタンパク質に対する特異的な抗体を産生するための免疫原として利用することができる。他の実施形態では、発現ベクターを用いてトランスジェニック動物を作出したり、発現ベクターを遺伝子治療に利用したりする。発現を起こさせるには、ベクターに適当なシグナルを与えてやる必要がある。前記シグナルとしては、宿主細胞で興味の対象となる遺伝子の発現を促進するウイルスソースおよび哺乳動物ソースの両方から得られるエンハンサー/プロモーターなどのさまざまな調節エレメントがあげられる。本発明の発現ベクターには一般に、産物を発現する永久的で安定した細胞クローンを作出するための主要な薬剤選択マーカーが含まれている。これらのベクターは、ポリペプチドの発現と薬剤選択マーカーの発現とを結びつける要素だからである。
【０３９９】
特に、本発明は、FLAP調節ポリヌクレオチドから選択される制御配列の制御下、あるいは外因性制御配列の制御下で、FLAPタンパク質、好ましくは配列番号 3のアミノ酸配列の配列番号FLAPタンパク質、さらに好ましくは127位にイソロイシン残基を有する配列番号 3のアミノ酸配列配列番号のFLAPタンパク質、またはその変異体または断片をコードする核酸を含む、発現ベクターに関する。
【０４００】
したがって、本発明の好ましい発現ベクターは、(a)  その中に含まれるFLAP制御配列がこれと作用的に結合したコードポリヌクレオチドの発現を促進する(b)  FLAPコード配列が制御配列と作用的に結合し、適当な細胞宿主および/または宿主生物での発現が可能になっている群から選択される。
【０４０１】
FLAP関連バイアレリックマーカーを含む核酸を有する組換えベクターも本発明の一部である。好ましい実施形態では、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。
【０４０２】
本発明のベクターで見つけることのできるエレメントのうちのいくつかについて、下記のセクションで一層詳細に説明する。
【０４０３】
1.  本発明の発現ベクターの一般的な特徴
本発明による組換えベクターは、染色体性、非染色体性、半合成および合成DNAからなるものであってもよい、YAC(酵母人工染色体)、BAC(バクテリア人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは線状DNA分子ですらも含むが、これに限定されるものではない。かかる組換えベクターは、以下に示すものの組み合わせを含む転写単位を有するものであってもよい。
(1)  遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝子エレメント、たとえばプロモーターまたはエンハンサーなど。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は長さ約10〜300bpでプロモーターに作用して転写量を増す。
(2)  mRNAに転写され、最終的にはポリペプチドに翻訳される構造配列またはコード配列。前記構造配列またはコード配列は、(1)で述べた調節エレメントと作用的に結合している。
(3)  適当な転写開始配列および転写終結配列。酵母または真核生物の発現系で使用することを意図した構造単位は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むものであると好ましい。あるいは、リーダー配列または輸送配列のない状態で組換えタンパク質を発現させる場合、Ｎ末端残基を含むものであってもよい。この残基を、後に発現した組換えタンパク質から切断し、あるいは切断せずに、最終産物を得るようにしてもよい。
【０４０４】
一般に、組換え発現ベクターには、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、下流の構造配列の転写を指図するための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。翻訳開始配列および翻訳終結配列、好ましくは翻訳されたタンパク質の分泌を細胞周辺腔あるいは細胞外培地に指示できるリーダー配列と共に、適当な相で異種構造配列をアセンブルする。所望の配列を哺乳動物の宿主細胞でトランスフェクトおよび発現するようにベクターを調節した特定の実施形態では、好ましいベクターに、所望の宿主での複製開始点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、さらには必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、5'-フランキング非転写配列が含まれることになる。SV40起点などSV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位およびポリアデニル化部位を用いて所望の非転写遺伝子エレメントを得るようにしてもよい。
【０４０５】
宿主生物における在来遺伝子の発現あるいは生物学的に不活性なFLAPタンパク質の産生に関係のある遺伝子欠損を補正する上で、配列番号 3のFLAPポリペプチドあるいはその断片または変異体をin vivoで発現させると有益なことがある。
【０４０６】
本発明ではさらに、主に、治療対象となる患者の体内に適切な遺伝物質を導入することによって、配列番号 3のFLAPポリペプチドまたはその断片または変異体をin vivoで産生するために設計された組換え発現ベクターについても扱う。この遺伝物質をあらかじめ生物から抽出した抽出した細胞にin vitroで導入し、続いて修飾された細胞を前記生物で適当な組織にin vivoにて直接再導入してもよい。
【０４０７】
2.  調節エレメント
プロモーター
異種遺伝子が発現される細胞宿主を考慮して、本発明による発現ベクターで使用する好適なプロモーター領域を選択する。興味の対象となるヌクレオチド配列の発現制御用のプロモーターが標的細胞で核酸の発現を指示できるのであれば、どのプロモーターを使うかは重要ではない。したがって、ヒトの細胞が標的である場合は、ヒトまたはウイルスのプロモーターなどのヒトの細胞で発現可能なプロモーターに隣接し、このプロモーターの制御下にある核酸コード領域の位置決めをすると好ましい。
【０４０８】
適切なプロモーターは、発現を制御する対象となる核酸とは異種のものであってもよく、発現対象となるコード配列を含むネイティブなポリヌクレオチドにに対して内因性のものであってよい。また、プロモーターは一般に、コンストラクトプロモーター/コード配列が挿入された組換えベクター配列とは異種のものである。
【０４０９】
たとえばCAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、さらに好ましくはpKK232-8およびpCM7ベクターなどを使用して、所望の遺伝子から任意にプロモーター領域を選択することができる。
【０４１０】
好ましいバクテリアプロモーターは、LacI、LacZ、T3またはT7バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター、gpt、λPR、PLおよびtrpプロモーター(EP 0036776)、ポリヘドリンプロモーター、あるいはバキュロウイルス由来のp10タンパク質プロモーター(Kit Novagen)(Smithら、1983; O'Reillyら、1992)、λPRプロモーターまたはtrcプロモーターである。
【０４１１】
真核生物のプロモーターとしては、CMV即時初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、マウスメタロチオネイン-Lがあげられる。好都合なベクターおよびプロモーターの選択方法については当業者の知識の範囲内である。
【０４１２】
プロモーターの選択についても遺伝子工学分野の当業者であればなし得ることである。たとえば、Sambrookら(1989)の本やFullerら(1996)によって説明されている手順を参照すればよい。
【０４１３】
他の調節エレメント
cDNAインサートを使用する場合、一般に、遺伝子転写物を適宜ポリアデニル化するためにポリアデニル化シグナルを含む形が必要になる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を正しく実施する上で重要なことではないと思われる。また、かかる配列のうちヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のものを利用できる。さらに、ターミネーターも発現カセットのエレメントとして考えられる。これらのエレメントは、メッセージレベルを高め、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするよう機能するものである。
【０４１４】
上述したような適当なDNA配列、さらに好ましくは、FLAP遺伝子調節ポリヌクレオチド、配列番号 1またはその断片またはその変異体および配列番号 2からなる群から選択されるFLAPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはその両方を含むベクターを利用して、適当な宿主を形質転換し、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を可能にすることができる。
【０４１５】
3.  選択可能なマーカー
このようなマーカーは、発現コンストラクトを含む細胞の容易な同定を可能にする細胞を同定可能な状態で変化させるものである。形質転換した宿主細胞の選択用の選択可能なマーカー遺伝子は、真核生物の細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性であり、S. cerevisiaeではTRP1、E. coliではテトラサイクリン耐性、リファンピシン耐性またはアンピシリン耐性、放線菌ではレバンサッカラーゼであると好ましい。後者のマーカーはネガティブ選択マーカーである。
【０４１６】
4.  好ましいベクター
バクテリアベクター
代表的ではあるが限定するものではない一例として、バクテリアで使用するのに有用な発現ベクターには、遺伝子エレメントpBR322(ATCC 37017)を有する業務販売されているプラスミドに由来するバクテリア複製開始点および選択可能なマーカーがあげられる。かかる業務用ベクターとしては、たとえば、pKK223-3(スウェーデンUppsalaのファルマシア社)およびGEM1(米国ウィスコンシン州Madisonのプロメガバイオテク社)があげられる。
【０４１７】
当業者間では好適なベクターが他にも多数知られており、業務販売されているが、これには次にあげるバクテリアベクターなどがある。pQE70、pQE60、pQE-9(キアゲン)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(ストラタジーン); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(ファルマシア); pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(ストラタジーン); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア); pQE-30(QIAエクスプレス)。
【０４１８】
バクテリオファージベクター
P1バクテリオファージベクターには、約80〜約100kbの範囲の大きなインサートが含まれていることがある。
【０４１９】
p158またはp158/neo8などのP1バクテリオファージベクターの構築については、Sternberg(1992, 1994)に非常によく説明されている。40kbを上回る大きなポリヌクレオチドを挿入するために、FLAPヌクレオチド配列を持つ組換えP1クローンを設計することができる(Linton M.F. ら、1993)。トランスジェニック実験用のP1 DNA作出用としては、McCormickら,(1994)に記載されているプロトコルが好ましいプロトコルである。
【０４２０】
バキュロウイルスベクター
配列番号 6のFLAPポリペプチドまたはその断片または変異体の発現に適したベクターが、昆虫細胞および昆虫細胞株で増殖可能なバキュロウイルスベクターである。特定の適した宿主ベクター系に、Spodoptera frugiperda由来のSF9細胞株(ATCC NーCRL 1711)をトランスフェクトするのに用いられるpVL1392/1393バキュロウイルス伝達ベクター(Pharmingen)がある。
【０４２１】
配列番号 6のFLAPポリペプチドまたはその断片または変異体のバキュロウイルス発現系での発現に適した他のベクターとしては、Chaiら(1993)、Vlasakら(1983)およびLenhardら(1996)によって説明されているものがあげられる。
【０４２２】
ウイルスベクター
特定の一実施形態では、アデノウイルスからベクターを得る。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、FeldmanおよびSteg(1996)またはOhnoら(1994)によって説明されているものである。本発明の特定の実施形態による別の好ましい組換えアデノウイルスに、ヒトアデノウイルス2型または5型(Ad 2またはAd 5)または動物起源のアデノウイルスがある(フランス特許出願第FR-93.05954号)。
【０４２３】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターも一般に、外因性ポリヌクレオチドを特にヒトを含む哺乳動物にin vivoで伝達する上で利用できる組換え遺伝子移入系であるとされている。これらのベクターによって、遺伝子を効率よく細胞に伝達し、伝達された核酸を宿主の染色体DNAに安定して取り込むことができる。
【０４２４】
本発明のレトロウイルスによるin vitroまたはin vitroでの遺伝子移入ビークルの調製または構築用として特に好ましいレトロウイルスとしては、Mink-Cell Focus Inducingウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスがあげられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aウイルスおよび1504Aウイルス、Abelson(ATCC No VR-999)、Friend(ATCC No VR-245)、Gross(ATCC No VR-590)、Rauscher(ATCC No VR-998)およびモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC No VR-190、PCT出願公開第WO 94/24298号)があげられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、Bryan高力価(ATCC No VR-334、VR-657、VR-726、VR-659およびVR-728)があげられる。他の好ましいレトロウイルスベクターに、Rothら(1996)、PCT出願公開第WO 93/25234号、PCT出願公開第WO 94/ 06920号、Rouxら、1989、Julanら、1992およびNedaら、1991に記載されているものがある。
【０４２５】
本発明で考慮しているさらに他のウイルスベクター系にアデノ随伴ウイルス(AAV)がある。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイクルを得るためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然由来の欠損性ウイルスである。(Muzyczkaら、1992)。また、これは自己のDNAを非分裂細胞に組み込み、安定した組み込みの頻度を高くすることのできる限られたウイルスのうちの1つである。(Flotteら、1992; Samulskiら、1989; McLaughlinら、1989)。AAVの持つ有利な特徴の1つは、形質転換細胞に対する一次細胞の形質導入効率が落ちることで得られるものである。
【０４２６】
BACベクター
大きなゲノムDNA断片(100〜300kb)をE. coliに安定して維持するために、バクテリア人工染色体(BAC)クローニング系(Shizuyaら、1992)を開発した。好ましいBACベクターは、Kimら(1996)に記載されているpBeloBAC11ベクターからなるものである。ベクターのBam HI部位またはHind III部位への連結を可能にする酵素で部分消化済のサイズ選択ゲノムDNAを用いて、上記のベクターでBACライブラリーを作製する。これらのクローニング部位をフランキングするのは、RNA転写またはPCR法による末端プローブの作出に使用可能なT7およびSP6 RNAポリメラーゼ転写開始部位である。E. coliでのBACライブラリーの作製後、宿主細胞から超らせん円(circle)としてBAC DNAを精製する。サイズ判定とBACのレシピエント細胞への導入前に、これらの環状分子を線状にする。2つのNot I部位によってクローニング部位をフランキングし、クローニングしたセグメントをNot Iでの消化によってベクターから切除できるようにする。あるいは、独特のcosN部位で切断を行う市販の酵素λ-Terminaseを用いるBACベクター処理によって、pBeloBAC11ベクターに含まれるDNAインサートを直線化してもよい。この切断法によってインサートDNAとBAC配列の両方を含む完全長BACクローンが得られる。
【０４２７】
5.  組換えベクターの移入
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドコンストラクトを発現させるためには、これらのコンストラクトを細胞に移入しなければならない。この移入は、実験室での細胞株の形質転換手順などでin vitroにて実施してもよいし、あるいは特定の疾患状態の治療などでin vivoまたはex vivoで実施してもよい。
【０４２８】
1つの機序が、発現コンストラクトを感染性のウイルス粒子に包埋するウイルス感染である。
【０４２９】
本発明では、ポリヌクレオチドを哺乳動物の培養細胞に伝達するための非ウイルス的な方法もいくつか考慮している。これらの方法としては、リン酸カルシウム沈澱反応(Grahamら、1973; Chenら、1987)、DEAE-デキストラン(Gopal、1985)、電気穿孔(Tur-Kaspaら、1986; Potterら、1984)、直接マイクロインジェクション(Harlandら、1985)、DNA担持リポソーム(Nicolauら、1982; Fraleyら、1979)、受容体媒介トランスフェクション(WuおよびWu、1987; 1988)があげられるが、これに限定されるものではない。これらの手法の中には、in vivoまたはex vivoでの用途にうまく適合させられるものもある。
【０４３０】
発現ポリヌクレオチドを細胞に移入した後、これをレシピエント細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。この組み入れは、相同的組換え(遺伝子交換)によって同族位置および方向で行ってもよいし、あるいは無作為に非特異的な位置に組み込んでもよい。さらに別の実施形態では、DNAの別個のエピソーム型セグメントとして核酸を細胞で安定して維持することができる。このような核酸セグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞のサイクルとは独立した、あるいはこれと同調した維持と複製ができる程度に配列をコードする。
【０４３１】
タンパク質またはペプチドをin vivoにて脊椎動物の細胞内部に移入する方法についての特定の一実施形態は、生理学的に許容可能なキャリアと興味の対象となるポリペプチドを作用的にコードする、裸のポリヌクレオチドとを有する調製物を細胞を有する組織の間質空間に導入し、これによって裸のポリヌクレオチドを細胞の内部に取り込んで生理学的な効果を持たせるステップを含む。これは特にin vitroでの伝達に適用可能であるが、in vivoでも同様に適用できる。
【０４３２】
「裸の」ポリヌクレオチドを含む、in vitroおよびin vivoで使用される組成物については、PCT出願公開第WO 90/11092号(Vical Inc.)およびPCT出願公開第WO 95/11307号(Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa)ならびにTacsonら(1996)およびHuygenら(1996)による文献に記載されている。
【０４３３】
本発明のさらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを含む本発明の裸のポリヌクレオチド細胞への伝達を、粒子衝突(biolistic)で行うことができる。前記粒子は、Kleinら(1987)によって説明されているように、細胞膜を穿孔して細胞を死滅させずに細胞に入り込むことができるように高い速度まで加速されたDNA被覆微粒子である。
【０４３４】
さらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに包埋する(GhoshおよびBacchawat, 1991; Wongら、1980; Nicolauら、1987)。
【０４３５】
特定の実施形態において、本発明によれば、本願明細書に記載のFLAPタンパク質またはポリペプチドのin vivo産生用の組成物が得られる。この組成物は、このポリペプチドを作用的にコードする裸のポリヌクレオチドを生理学的に許容されるキャリアの溶液中に含み、組織に導入して組織の細胞に前記タンパク質またはポリペプチドを発現させるのに適している。
【０４３６】
所望の宿主生物に注入するベクターの量は、注入部位によってさまざまである。表示用量としては、ベクター0.1〜100μgの範囲で動物の体、好ましくはマウスの体などの哺乳動物の体に注入する。
【０４３７】
本発明によるベクターの別の実施形態では、宿主細胞、好ましくは処理対象となる動物から事前に採取した宿主細胞、さらに好ましくは筋細胞などの体細胞にin vitroにてベクターを導入することができる。以後のステップで、所望のFLAPポリペプチドまたはその所望の断片をコードするベクターで形質転換した細胞を動物の体に再導入し、体内の組換えタンパク質を局所的または体全体に移入する。
【０４３８】
細胞宿主
本発明の別の目的は、本願明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの1つで形質転換した宿主細胞またはこれにトランスフェクトさせた宿主細胞からなる。上述したものなどの組換えベクターで形質転換された(原核細胞)宿主細胞またはこれにトランスフェクトさせた(真核細胞)宿主細胞があげられる。
【０４３９】
大まかに言うと、本発明の組換え宿主細胞は、本願明細書に記載のポリヌクレオチドまたは組換えベクターのうち任意のものを含む。
【０４４０】
本発明による他の組換え細胞宿主は、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含むポリヌクレオチドを有する。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。
【０４４１】
本発明の発現ベクター用のレシピエントとして用いる好ましい宿主細胞は次のとおりである。
a)  原核宿主細胞  大腸菌株(I.E.DH5-α菌株)、枯草菌、サルモネラ菌、シュードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカスなどの種から得られる菌株。
b)  真核宿主細胞  HeLa細胞(ATCC NーCCL2; NーCCL2。1; NーCCL2。2)、Cv 1細胞(ATCC NーCCL70)、COS細胞(ATCC NーCRL1650; NーCRL1651)、Sf-9細胞(ATCC NーCRL1711)、C127細胞(ATCC Nー CRL-1804)、3T3(ATCC Nー CRL-6361)、CHO(ATCC Nー CCL-61)、ヒト腎293(ATCC Nー 45504; Nー CRL-1573)およびBHK(ECACC Nー 84100501; Nー 84111301)。
c)  他の哺乳動物の宿主細胞。
【０４４２】
ヒトをはじめとする哺乳動物の細胞でのFLAP遺伝子発現を不完全にするか、あるいは本発明に従って動物細胞のゲノムにおけるFLAP遺伝子相当物をFLAPポリヌクレオチドと交換してFLAPゲノム配列またはFLAP cDNA配列を挿入した状態でFLAP遺伝子発現を行うことができる。このような遺伝的な変化は、上述した特異的DNAコンストラクトを用いる相同的組換え現象によって生み出すことのできるものである。
【０４４３】
使用できる宿主細胞の1種にマウス接合体などの哺乳動物接合体がある。たとえば、NaCl 100mM、スペルミン30μM、スペルミジン70μMを含有する、トリス-HCl 10mM、pH 7.4、EDTA 250μM中、BACインサートであれば1ng/ml、P1バクテリオファージインサートであれば3ng/μlからの濃度範囲にあらかじめ調節した精製DNA分子などの、興味の対象となっている精製DNA分子をマウス接合体に微量注射する。微量注射するDNAの大きさが大きい場合、Schedlら(1993)に記載されているように、ポリアミンを用いて塩濃度を高くし、DNAが機械的に破壊されてしまうのを防止することができる。
【０４４４】
本願明細書で説明したDNAコンストラクトをはじめとする本発明のポリヌクレオチドのうちいずれかを、胚性幹細胞(ES)細胞株、好ましくはマウスのES細胞株に導入することができる。着床前胚盤胞の内部細胞塊の多分化能を持つ未分化細胞からES細胞株を得る。好ましいES細胞株としては、ES-E14TG2a(ATCC nー CRL-1821)、ES-D3(ATCC nー CRL1934およびnー CRL-11632)、YS001(ATCC nー CRL-11776)、36。5(ATCC nー CRL-11116)があげられる。ES細胞を未分化状態に維持するために、胚性表現型を保存する適当なシグナルを提供し、かつES細胞接着のマトリックスとして機能する成長抑制支持細胞の存在下でこれを培養する。好ましい支持細胞は、実質的にどのようなマウス菌株でも13〜14日目の胚組織から樹立される一次胚線維芽細胞からなるものであり、これをAbbondanzoら(1993)に記載されているようにして培養中で保持し、Robertson(1987)に記載されているようにして輻射によって成長を抑制するか、あるいはPease and Williams(1990)に記載されているように抑制濃度のLIFを用いることで成長を抑制する。
【０４４５】
宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で利用して、組換え配列にコードされた遺伝子産物を得ることができる。
【０４４６】
宿主を適宜形質転換して増殖させて適切な細胞密度にした後、温度シフトまたは化学誘導などの適切な手段によって、選択したプロモーターを誘発し、細胞をさらに培養する。
【０４４７】
一般に、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的な手段で破壊し、得られる粗エキスを以後の精製用に保持する。
【０４４８】
凍結融解サイクルの繰り返し、超音波処理、機械的な破壊または細胞溶解剤を使用するなどの都合の良い方法によって、タンパク質の発現に使用される微生物細胞を破壊することができる。かかる方法は当業者間で周知のものである。
【０４４９】
トランスジェニック動物
本願明細書では、「トランスジェニック動物」または「宿主動物」という用語を、本発明の核酸のうち1つが含まれるようゲノムを遺伝的および人工的に操作した動物を示すものとして用いる。好ましい動物は、非ヒト哺乳動物であり、本発明による核酸の挿入によってゲノムを人工的かつ遺伝的に変化させたMus(マウスなど)、Rattus(ラットなど)およびOryctogalus(ウサギなど)から選択される属に分類されるものが含まれる。一実施形態では、本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターでの相同的組換えによって破壊されたFLAP遺伝子を有する動物および非ヒト宿主哺乳動物を包含する。
【０４５０】
本発明のトランスジェニック動物はいずれも、その複数の細胞の中に、クローニングによって得られた組換えDNA配列または合成DNA配列を有する。この配列は、具体的には、FLAPコーディング配列、FLAP調節ポリヌクレオチドまたは本願明細書にて説明するようにアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列を含む精製された核酸または単離された核酸のうちの1つである。
【０４５１】
大まかに言うと、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明で説明するポリヌクレオチド、組換えベクターおよび細胞宿主のうちいずれを含むものであってもよい。
【０４５２】
本発明のさらに他のトランスジェニック動物は、その体細胞および/または生殖系列細胞に、A1〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるバイアレリックマーカーを有するポリヌクレオチドを含有する。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。
【０４５３】
第1の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物は、細胞の分化に関係のあるさまざまな病理の研究、特に、天然のFLAPタンパク質あるいは突然変異体FLAPタンパク質をコードするポリヌクレオチドの1つまたは複数のコピーをゲノム内に挿入したトランスジェニック動物に関する研究を行う上での良好な実験モデルとなり得る。
【０４５４】
第2の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物が、FLAP遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で、興味の対象となっている所望のポリペプチドを発現させ、興味の対象となっているタンパク質の合成において高い収率をあげ、結果としてかかるタンパク質を組織特異的に発現させることができる。
【０４５５】
ノックアウトアニマルを含む本発明のトランスジェニック動物は、当業者間で周知の従来の手法で設計できるものである。トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作出方法の詳細については、1989年10月10日発行の米国特許第4,873,191号,1995年11月7日発行の米国特許第5,464,764号および1998年8月4日発行の米国特許第5,789,215号、Capecchi, M.R.(1989a)、Capecchi, M.R.(1989b)、Tsuzuki, T.およびRancourt, D.E.(1998)などに記載されている。これらの文書を本願明細書に援用する。
【０４５６】
本発明は、本発明の新規なポリヌクレオチドを有するノックアウトベクターと、かかるノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたFLAP遺伝子を有する哺乳動物の宿主細胞および非ヒト宿主哺乳動物とを包含する。
【０４５７】
本発明のトランスジェニック動物は、ゲノムに外来遺伝子物質が組み込まれた動物を生み出す手順を応用することによって作出される。この手順では、FLAPコーディング配列、FLAP調節ポリヌクレオチド、または本願明細書に記載したようなFLAPアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列のうち、いずれかをコードする遺伝物質またはその一部を採取する必要がある。
【０４５８】
本発明の組換えポリヌクレオチドを胚性細胞またはES幹細胞株に挿入する。この挿入は、Thomasら(1987)に記載されているように、エレクトロポレーションで行うのが好ましい。エレクトロポレーションの対象となる細胞をスクリーニング(たとえば選択可能なマーカーによる選択、PCR解析またはサザンブロット解析などにより)し、好ましくは相同的組換え現象によってゲノムに外来性の組換えポリヌクレオチドが組み込まれたポジティブ細胞を見出す。本発明で利用できるポジティブ-ネガティブ選択手順の一例は、Mansourら(1988)に説明されている。
【０４５９】
次に、Bradley(1987)に記載されているように、ポジティブ細胞を単離し、クローニングし、3.5日胚のマウス胚盤胞に注入する。次に、胚盤胞をメスの宿主動物に挿入し、妊娠満期まで成長させる。
【０４６０】
あるいは、Woodら(1993)またはNagyら(1993)に記載されているように、ポジティブES細胞を、2.5日胚、8〜16細胞期(桑実胚)の時点での胚と接触させる。内部移行中のES細胞は、生殖細胞系を生み出す細胞を含む胚盤胞を迅速にコロニー化する。
【０４６１】
メスの宿主の子孫を試験し、どの動物がトランスジェニックであるか(たとえば、どの動物が外来性DNA配列を有し、どの動物が野生型なのか)を判定する。
【０４６２】
このため、本発明は、本発明による核酸、組換え発現ベクターまたは組換え宿主細胞を含むトランスジェニック動物にも関するものである。
【０４６３】
本発明のトランスジェニック動物由来の組換え細胞株
本発明のさらに他の目的は、本願明細書において説明するトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞からなるものである。一実施形態では、本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたFLAP遺伝子を有する非ヒト宿主哺乳動物由来の細胞および動物由来の細胞を包含する。
【０４６４】
Chou(1989)およびShayら(1991)に記載されているようにして、たとえばSV40ラージT抗原などのonc遺伝子を発現するベクターでの一次細胞培養物のトランスフェクションなどによって、本発明によるトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られる細胞から組換え細胞系細胞株をin vitroにて樹立する。
【０４６５】
XVII.  ロイコトリエン経路に作用する薬剤のスクリーニング
さらに他の実施形態では、本発明は、ロイコトリエン経路に作用し、ロイコトリエン経路が関与している疾患、特に喘息に関連のあるFLAP遺伝子のアレルがDNAに含まれている患者の治療に適していることがある新規な薬剤または候補物質のスクリーニング方法に関する。
【０４６６】
好ましい実施形態では、本発明は、肝トランスアミナーゼ濃度の上昇などの望ましくない副作用を伴うことなく、ロイコトリエン生合成を変化させる機能、好ましくは活性候補物質を識別する機能について候補物質をスクリーニングするための方法に関する。この方法は、a)  5-LOと、好ましくは変化されたロイコトリエン経路に関連があり、さらに好ましくは喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患に関連のある、1つまたはそれ以上のFLAP関連バイアレリックマーカーにアレルを有するFLAP遺伝子か、あるいは上述した方法で判定される形質誘発変異を有する変異FLAP遺伝子のいずれかとを発現する細胞株、器官、または哺乳動物を提供するステップと、b)  候補物質を得るステップと、c)  候補物質の機能を試験してロイコトリエン生合成を変化させ、特に5-LOおよび/または細胞株またはトランスジェニック哺乳動物によって産生されたFLAPと相互作用させるおよび/または5-LOとFLAPとの相互作用を変化させるおよび/またはFLAPの発現レベルを調節するステップと、を含む。
【０４６７】
上記の方法の一実施形態では、この方法は、5-LOと、好ましくは変化されたロイコトリエン経路に関連があり、さらに好ましくは喘息などのロイコトリエン経路が関与している疾患に関連のある、1つまたはそれ以上のFLAP関連バイアレリックマーカーのアレルを有するFLAP遺伝子と、上述した方法で判定される形質誘発変異を有する変異FLAP遺伝子とを発現する細胞株、器官、または哺乳動物を提供することを含む。前記バイアレリックマーカーは、A1〜A28およびこれらの相補体からなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記FLAP関連バイアレリックマーカーが、A1〜A13、A15、A17〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択されるものであってもよい。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A1〜A10およびA22〜A28、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A11〜A13、A15、A17〜A21、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。任意に、前記バイアレリックマーカーが、A14またはA16、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記バイアレリックマーカーが、A2、A14、A16、A18、A19、A22、A23、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、前記バイアレリックマーカーが、A14およびA19、これらの相補体、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記バイアレリックマーカーが、バイアレリックマーカーA19、その相補体を含み、あるいは任意に、これらと連鎖不平衡状態にあるバイアレリックマーカーを含む。
【０４６８】
候補物質は、結合または他の分子内相互作用によって、5-LOまたはFLAPと相互作用またはこれを調節できる物質である。かかる物質は、既存の薬物に対する応答性のない患者にとっては興味の対象となり得るものである。スクリーニングについては、in vitroでの方法またはin vivoでの方法のいずれかを用いて実施すればよい。
【０４６９】
in vitroでの方法は、5-リポキシゲナーゼ活性化およびロイコトリエン合成判定などでFLAP遺伝子の考慮対象のアレルを発現する形質転換細胞で、あるいは、FLAP結合実験によってFLAPの考慮対象のアレル変異体によってコードされるFLAPでなど、さまざまなやり方で実施できる。
【０４７０】
本発明のスクリーニングアッセイは主に、候補物質のスクリーニングなど、5-LOまたはFLAPの活性に影響する候補物質の持つ機能を判定し、ロイコトリエン経路で5-LOまたはFLAPの機能を阻害または調節するものを特定することによるものである。
【０４７１】
薬物スクリーニングの1つの方法では、5-LOおよびFLAP遺伝子の考慮対象のアレルを発現する組換えポリヌクレオチドで安定的に形質転換された真核宿主細胞を利用する。かかる細胞は、生存可能な状態または固定された状態で、標準的な結合実験に利用できるものである。たとえば、LTB4合成などのロイコトリエン経路産物の形成を判定したり、かかる産物の形成が被検薬剤によって干渉される度合いを検討できる。
【０４７２】
一般に、この方法には、5-LOと、1つまたはそれ以上のバイアレリックマーカーの特定のアレルおよび/または上述した変異を含むDNA配列によってコードされた異なる形態のFLAPとをを発現する形質転換細胞を調製することを含む。続いて、5-LOおよびFLAPを発現する細胞を候補物質で試験し、この物質がロイコトリエン経路の機能にどれだけ影響するかを判定して、5-LOの酵素学的活性またはFLAPの活性に影響するためヒトで使用するのに適したものを特定する。
【０４７３】
このような薬物スクリーニングアッセイの代表的な例を以下にあげておく。当業者であれば、過度に実験を行わなくてもこれらの例で用いるパラメーターを変更できることは理解できよう。
【０４７４】
5-LOインヒビターのスクリーニング
5-LO遺伝子およびFLAP遺伝子の考慮対象のアレルの両方を発現する細胞によって生成された5-LO産物を評価することで、薬効を評価できる。上述したようにして適当なベクターを用いて事前に形質転換された、研究対象の5-LO遺伝子およびFLAP遺伝子のアレルの両方を発現する真核細胞を、遠心分離(300g、5分、室温)で収穫し、適切な緩衝剤で洗浄する。次いで細胞を緩衝剤に再懸濁させ、37℃にて好ましくは細胞密度5×106細胞/mlであらかじめ温める。細胞懸濁液のアリコートを考慮対象の薬剤で好ましくは5分間37℃にてインキュベートする。カルシウムイオノフォアA23187およびアラキドン酸を添加して反応を開始する。37℃でのインキュベーションに続いて、HPLC解析の内標準としてプロスタグランジンB2を含有するメタノールを添加して反応を停止させる。5-LO反応生成物をクロロホルムで抽出し、窒素流下で乾燥させ、HPLC溶剤に再懸濁させる。この試料を好ましくはメタノール/水/酢酸(75:25:0.01)のアイソクラチック溶剤系を用いた逆相HPLCで解析する。好ましくは270nmおよび234nmで溶出を観察する。ピークエリアを信頼できる標準による基準曲線でのピークエリアと比較して5-LO生成物の量を正確に測定し、プロスタグランジンB2内標準を用いて判定する抽出効率のわずかな差を補正する。この方法については、Dixonら(1990)およびAbramovitzら(1993)にさらに詳細に説明されている。これらの文献の開示内容を本願明細書に援用する。
【０４７５】
FLAPインヒビターのスクリーニング
上述したFLAPタンパク質またはその一部を薬物スクリーニング手順に使用し、FLAP活性のアゴニスト、アンタゴニスト、あるいはインヒビターである分子を同定することができる。かかる解析に使用するFLAPタンパク質またはその一部については、溶液中に遊離させた状態であっても固相に結合させておいてもよい。あるいは、FLAPタンパク質またはその一部を細胞の表面で発現させることもできる。この細胞は、FLAPタンパク質またはその一部を自然に発現するか、あるいは、上述したものなどの発現ベクターからFLAPタンパク質またはその一部を発現する。
【０４７６】
薬物スクリーニングの方法の1つでは、FLAPタンパク質またはその一部が発現されるように組換えポリヌクレオチドで安定して形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を従来の競合的結合実験または標準的な直線結合試験に使用する。たとえば、FLAPタンパク質またはその一部と被検薬との間の複合体形成を直接結合実験で測定することができる。あるいは、被検薬のFLAPタンパク質またはその一部と既知のリガンドとの間の複合体形成を防げる機能についても測定できる。
【０４７７】
たとえば、FLAPインヒビター結合実験は、インドールロイコトリエン生合成インヒビターであるMK-886がFLAPに高い親和性および特異性で結合することの観察に基づくものであってもよい。放射線標識したMK-886類似物すなわち125Ｉ-L-691-831を用いる競合実験によって、考慮対象の薬物とFLAPとの結合を評価できる。好ましくは2 107細胞を含む、FLAPの考慮対象のアレルを発現する細胞の懸濁液を500×gで10分間遠心分離する。次に、ペレット化した細胞を溶解緩衝液に再懸濁させる。この懸濁液を氷上で20秒ずつ3回バーストして超音波処理を行う。細胞溶解を目視によって確認する。125Ｉ-L-691-831の他に考慮対象の薬剤とを含有するウェルとこれ以外には何も含有しない(対照)ウェルに細胞溶解試料を添加して結合を開始する。プレートを室温にて20分間インキュベートする。次に、試料を濾過して洗浄する。結合125Ｉ-L-691-831をカウンターで判定する。考慮対象の薬物の非存在下での結合と存在下での結合の差として特異的な薬剤結合を定義する。このFLAP結合実験については、Charlesonら(1992)によってさらに詳細に説明されている。
【０４７８】
あるいは、PCT国際出願公開第WO 84/03564号に開示されているような高スループットスクリーニング法を利用してもよい。この手法では、FLAP結合活性について試験する小さなペプチドを表面で多数合成し、そこに固定する。被検ペプチドをFLAPタンパク質またはその一部と接触させた後、洗浄ステップを実施する。被検化合物と結合したFLAPタンパク質またはその一部の量を従来の手法で定量化する。
【０４７９】
FLAPタンパク質またはその一部を表面に固定し、被検化合物と接触させる方法もある。水洗ステップの後、FLAPタンパク質またはその一部に結合した被検化合物の量を測定する。
【０４８０】
5-LOとFLAPとの間の相互作用のインヒビターでのスクリーニング
5-LOとFLAPタンパク質との間の相互作用を評価することで、薬効を評価できる。
【０４８１】
Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログNo. K1604-1、クロンテック社)などのツーハイブリッドシステムを使用して、5-LOとFLAPタンパク質との間の相互作用を評価することができる。Matchmaker Two Hybrid System 2(カタログNo. K1604-1、クロンテック社)に添付のマニュアルに説明されているように、FLAPタンパク質またはその一部をコードする核酸を、酵母の転写アクチベーターGAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAとインフレームにくるように発現ベクターに挿入する。5-LO cDNAまたはその一部を、GAL4の活性化ドメインをコードするDNAと同一フレームにくるように第2の発現ベクターに挿入する。2つの発現プラスミドを酵母へ形質転換し、各発現ベクターでの選択可能なマーカーの発現と、HIS3遺伝子のGAL4依存性発現のみを選択的に行う選択培地プレートに上記の酵母を蒔く。ヒスチジンを含まない培地で成長できるトランスフェクタントをGAL4依存性lacZ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選択とlacZアッセイのいずれにおいても陽性である細胞では、FLAPタンパク質と5-LOタンパク質が相互作用する。
【０４８２】
別の方法では、FLAPタンパク質またはその一部を含むアフィニティーカラムを作製することができる。この方法の中には、アフィニティーカラムにキメラタンパク質を含み、FLAPタンパク質またはその一部がグルタチオンSトランスフェラーゼと融合しているものがある。5-LOタンパク質をアフィニティーカラムに仕込む。アフィニティーカラムに保持された5-LOタンパク質を測定し、FLAPタンパク質と5-LOタンパク質との間の相互作用を評価することができる。
【０４８３】
5-LOタンパク質とFLAPタンパク質との関連性を、Edwards et Leatherbarrow(1997)に記載されているようなオプティカルバイオセンサを用いて評価することもできる。この方法の主な利点は関連性の比率を判定できる点にある。一般には、FLAP分子を(カルボキシメチル(carboxymethl)デキストランマトリックスによって)センサー表面に結合させ、5-LO分子の試料をFLAP分子と接触した状態で配置する。FLAP分子に対して5-LO分子が結合することで、屈折率および/または厚さが変化する。この変化をバイオセンサーで検出する。ただし、上記の方法は、変化がエバネッセント場(センサー表面から数百ナノメータの範囲)で起こる場合にのみ利用できる。このため、候補薬がFLAPタンパク質と5-LOタンパク質との関連性にどのような影響をおよぼすかを容易に測定できる。
【０４８４】
発現修飾因子のスクリーニング
発現修飾因子のスクリーニングはFLAP遺伝子のアレル1つまたはアレルのグループに特異な修飾因子の検出に利用できるものであるため、この因子のスクリーニングは重要である。in vitro転写アッセイで、候補の修飾因子を投与または動物や細胞などの発現系と組み合わせることによって、修飾因子に対する応答のFLAP発現での変化を判定できる。
【０４８５】
修飾因子がFLAP転写および/または定常のmRNAレベルにどのような影響をおよぼすのかを判定できる。基本的な発現レベルの場合と同様に、組織特異的な相互作用が興味の対象となる。発現修飾因子のFLAP活性に対して影響をおよぼす機能と標的多型の存在との相関を得る。多種多様な条件での効果を判定するために、さまざまな修飾因子の群をスクリーニングしてもよい。
【０４８６】
国際特許出願公開第WO 97/05277号(その内容全体を本願明細書に援用する)に記載されているような長いプローブを用いて、溶液ハイブリダイゼーションによってFLAPの発現レベルおよびパターンを解析する。簡単に説明すると、上述したFLAP cDNAまたはFLAPゲノムDNAまたはその断片を、バクテリオファージ(T3、T7またはSP6)RNAポリメラーゼプロモーターのすぐ下流のクローニング部位に挿入し、アンチセンスRNAを作出する。好ましくは、このFLAPインサートは、ゲノムDNA配列またはcDNA配列、特に本発明のバイアレリックマーカー少なくとも1つを含む配列または変異FLAPをコードする配列のうち少なくとも100以上の連続したヌクレオチドを含むものである。プラスミドを直線化し、修飾リボヌクレオチド(すなわち、ビオチン-UTPおよびDIG-UTP)を含むリボヌクレオチドの存在下、転写を行う。過剰な二重標識RNAを興味の対象となる細胞または組織から単離したmRNAと溶液中でハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションは、標準的な厳密さの条件下(80%ホルムアミド、0.4M NaCl緩衝液中、pH7〜8にて40〜50℃で16時間)で行う。ハイブリダイズされなかったプローブを、一本鎖RNA特異なリボヌクレアーゼ(すなわち、RNase CL3、T1、Phy M、U2またはA)で消化して除去する。ビオチン-UTP修飾が存在することで、ストレプトアビジン被覆したマイクロタイタープレート上でハイブリッドを捕捉できる。DIG修飾が存在することで、アルカリホスファターゼに結合した抗DIG抗体を使用するELISAによってハイブリッドを検出して定量化できる。
【０４８７】
アレイを用いてFLAP遺伝子発現の定量解析を行ってもよい。本願明細書において、アレイという用語は、これとハイブリダイズできるmRNAの発現を特異的に検出できるだけの十分な長さの複数の核酸で構成される、一次元、二次元または多次元の集合体を意味する。たとえば、このアレイは、発現レベルを評価したい遺伝子由来の複数の核酸を含むものであってもよい。このアレイには、FLAPゲノムDNA、FLAP cDNA配列またはこれと相補配列またはその断片、特に少なくとも1つの本発明のバイアレリックマーカーを有する配列または変異FLAPをコードする配列を含んでもよい。好ましくは、この断片は少なくとも15ヌクレオチド長である。他の実施形態では、この断片は少なくとも25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも50ヌクレオチド長である。より好ましくは、断片は少なくとも100ヌクレオチド長である。もう1つの好ましい実施形態では、断片は100ヌクレオチド長よりも長いものである。いくつかの実施形態では、断片は500ヌクレオチド長よりも長いものであってもよい。
【０４８８】
たとえば、Schenaら(1995および1996)によって説明されているように、cDNAマイクロアレイを用いてFLAP遺伝子発現の定量解析を行うことができる。完全長FLAP cDNAまたはその断片をPCR増幅し、高速の装置を用いてシリル化顕微鏡スライドガラス上で96穴マイクロタイタープレートからアレイ化する。プリントされたアレイを湿ったチャンバ内でインキュベートし、アレイのエレメントを再水和させ、0.2%SDSで1分間を1回と、水で1分間を2回、水素化ホウ素ナトリウム溶液中で5分間を1回のサイクルで洗浄する。このアレイを95℃で2分間、水中に沈め、0.2%SDSに移して1分おき、2回水洗し、風乾させて25℃で暗所に保管する。
【０４８９】
細胞または組織のmRNAを単離するか、あるいは市販されているものを入手し、逆転写のサイクルを1回行ってプローブを調製する。このプローブを14ラ14mmのカバーガラス下で60℃にて6〜12時間で1cm2のマイクロアレイとハイブリダイズさせる。このアレイを厳密度の低い洗浄用緩衝液(1ラSSC/0.2%SDS)中にて25℃で5分間洗浄した後、厳密度の高い洗浄用緩衝液(0.1ラSSC/0.2%SDS)中にて室温で10分間洗浄する。独自に用意したフィルタセットを用いた蛍光レーザー走査装置によって、0.1ラSSC中でアレイをスキャンする。独立した2つのハイブリダイゼーションの比の平均を取ることによって、正確な分化発現(differential expression)測定値を得る。
【０４９０】
Pietuら(1996)によって説明されているように、cDNAアレイの完全長FLAP cDNAまたはその断片を用いてFLAP遺伝子発現の定量解析を行ってもよい。完全長FLAP cDNAまたはその断片をPCR増幅し、膜に接種する。次に、さまざまな組織または細胞由来のmRNAを放射性ヌクレオチドで標識する。ハイブリダイゼーションと制御した条件下での洗浄後、ホスホイメージングまたはオートラジオグラフィによって、ハイブリダイズされたmRNAを検出する。実験を2回重複して行った後、分化的に発現されたmRNAの定量解析を行う。
【０４９１】
あるいは、Lockhartら(1996)およびSosnowskyら(1997)によって説明されているように、高密度ヌクレオチドアレイを利用してFLAPゲノムDNA、FLAP cDNAまたはその断片を用いた発現解析を行うこともできる。FLAPゲノムDNA配列、FLAP cDNA配列、特に少なくとも1つの本発明のバイアレリックマーカーを有する配列または変異FLAPをコードする配列、あるいはこれと相補配列からヌクレオチド15〜50個で構成されるオリゴヌクレオチドをチップ上で直接合成する(Lockhartら、1996)か、あるいは合成後にチップにアドレス指定する(Sosnowskiら、1997)。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約20ヌクレオチド長のものである。
【０４９２】
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料などの適当な化合物で標識したFLAP cDNAプローブを適当なmRNA集団から合成した後、平均サイズ50〜100ヌクレオチドにランダムに断片化する。次いで、前記プローブをチップとハイブリダイズさせる。上記Lockhartらによって説明されているように洗浄し、異なる電界を印加(Sosnowskyら、1997)した後、染料または標識化合物を検出して定量化する。ハイブリダイゼーションを2回重複して行う。異なるcDNA試料で同一の標的オリゴヌクレオチドについてcDNAプローブからのシグナル強度を比較解析することで、FLAP mRNAが分化的に発現していることが分かる。
【０４９３】
トランスジェニック動物を用いたスクリーニング
in vivoでの方法ではトランスジェニック動物を利用して薬物スクリーニングを行うことができる。興味の対象となるバイアレリック多型少なくとも1つを含む核酸を用いて、遺伝的に修飾した非ヒト動物を生成したり、あるいは細胞株で部位特異的遺伝子改変したりすることができる。「トランスジェニック」という用語には、欠失があるかFLAP遺伝子の活性に何らかの他のノックアウトがある、宿主細胞に安定して伝達された外因性FLAP遺伝子を有する、あるいはレポーター遺伝子に作用的に結合した外因性FLAP遺伝子を有する、遺伝的に修飾された動物を包含することを意図している。FLAP座を変化させる相同的組換えによってトランスジェニック動物を作出することができる。あるいは、核酸コンストラクトをゲノムに無作為に組み込む。安定して組み入れるためのベクターとしては、たとえば、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物のウイルス、YACがあげられる。興味の対象となるのは、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなどの他、特にラットやマウスなどのげっ歯類を例とするトランスジェニック哺乳動物である。トランスジェニック動物によって、候補薬の効果と毒性の両方を研究することができる。
【０４９４】
XVIII.  コンピュータ関連の実施形態
本願明細書において、「本発明の核酸コード」という用語は、a)  配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンであって、配列番号 1のヌクレオチド位置1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976、および36927〜43069のうち少なくとも1つを含む連続ものと、b)  配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンであって、配列番号 1の16348位のCを含むものと、c)  配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンであって、配列番号 1のヌクレオチド位置7612〜7637、24060〜24061、24067〜24068、27903〜27905、および28327〜28329を含むものと、d)  配列番号 1の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンであって、配列番号 1の7445位のA、7870位のA、16288位のT、16383位のA、24361位のT、28336位のG、28368位のT、36183位のA、36509位のGからなる群から選択されるヌクレオチドを含むものと、e)  配列番号 2の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000ヌクレオチドの連続スパンであって、配列番号 2の197位のT、453位のA、または779位のGを含むものと、f)  上記のヌクレオチド配列のうちいずれか1つに対して相補的であるヌクレオチド配列、のうちいずれか1つを含む、あるいは本質的に上記のうちいずれか1つからなる、あるいは上記のうちいずれか1つからなるヌクレオチド配列を包含する。
【０４９５】
「本発明の核酸コード」という用語はさらに、配列番号 1のヌクレオチド位置1〜7007、8117〜15994、16550〜24058、24598〜27872、28413〜35976、および36927〜43069のうち少なくとも30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000の連続スパンと相同的なヌクレオチド配列と、上記の配列すべてと相補配列も包含する。相同配列は、これらの連続スパンに対して少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%または75%相同な配列を意味する。相同については、BLAST2Nをデフォルトのパラメーターで使用したり、いずれかのパラメーターを変更して使用するなど、本願明細書に記載のいずれかの方法で判定できる。相同配列には、本発明の核酸コードのチミンの代わりにウリジンがあるRNA配列を含んでもよい。本発明の核酸コードが、伝統的な一符号形式(Stryer, Lubert. Biochemistry, 第3版 W. H Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照のこと)または配列でのヌクレオチドの同一性を記録する他の任意の形式またはコードで表現できることは理解できよう。
【０４９６】
本願明細書において、「本発明のポリペプチドコード」という用語は、配列番号 3の少なくとも6、8、10、12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸の連続スパンを含み、配列番号 3のアミノ酸127位のイソロイシン残基を含む連続スパンを含むポリペプチド配列を包含する。本発明のポリペプチドコードが、伝統的な一符号形式または三文字形式(Stryer, Lubert. Biochemistry, 第3版 W. H Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の内側を参照のこと)または配列でのヌクレオチドの同一性を記録する他の任意の形式またはコードで表現できることは理解できよう。
【０４９７】
本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードは、コンピュータによる読み取りおよびアクセスが可能な任意の媒体に格納、記録および操作が可能なものであることは、当業者であれば理解できよう。本願明細書において、「記録された」および「格納された」という語は、コンピュータ媒体に情報を記録するプロセスを意味する。当業者であれば、コンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録するための周知の方法のうち任意のものを採用し、本発明の核酸コード1つまたはそれ以上、あるいは、本発明のポリペプチドコード1つまたはそれ以上を有する製品を生成することが容易にできる。本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードが少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個または50個記録されたコンピュータ読み取り可能な媒体である。本発明のもう1つの態様は、本発明のポリペプチドコードが少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個または50個記録されたコンピュータ読み取り可能な媒体である。
【０４９８】
コンピュータ読み取り可能な媒体としては、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体および磁気/光媒体があげられる。たとえば、コンピュータ読み取り可能な媒体としては、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、CD-ROM、DVD、RAM、ROMならびに当業者間で周知の他の媒体などが利用できる。
【０４９９】
本発明の実施形態は、システムを含み、特に、本願明細書に記載された配列情報が記録されたコンピュータシステムを含む。本願明細書において、「コンピュータシステム」は、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列、本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列、あるいは他の配列の記録および/または解析に使用される、ハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント、データ記憶コンポーネントを意味する。このコンピュータシステムは、上述したコンピュータ読み取り可能な媒体と、配列データにアクセスし、これを操作するためのプロセッサとを含むものであると好ましい。
【０５００】
コンピュータは、中央処理装置(CPU)と、データを記録するための1つまたはそれ以上のデータ記憶コンポーネントと、データ記憶コンポーネントに記録されたデータを検索するための1つまたはそれ以上のデータ検索装置とを備える汎用システムであると好ましい。当業者であれば、現在入手可能なコンピュータシステムであればいずれも適したものであることを容易に理解できよう。
【０５０１】
特定の一実施形態では、コンピュータシステムには、好ましくはRAMとして実装された主記憶デバイスに接続されたバスに接続されたプロセッサ、ハードドライブなどのデータ記憶デバイス1つまたはそれ以上および/またはデータが記録された他のコンピュータ読み取り可能な媒体が含まれる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムがさらに、データ記憶コンポーネントに記憶されたデータを読み取るためのデータ検索装置1つまたはそれ以上を含む。データ検索装置の代表例としては、たとえば、フロッピーディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、ハードディスクドライブ、CD-ROMドライブ、DVDドライブなどがあげられる。いくつかの実施形態では、データ記憶コンポーネントが、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどの、制御ロジックおよび/またはデータが記録されたコンピュータ読み取り可能なリムーバブルメディアである。コンピュータシステムは、データ検索装置に挿入された後でデータ記憶コンポーネントから制御ロジックおよび/またはデータを読み取るための適当なソフトウェアを含むかまたは適当なソフトウェアでプログラミングされたものであると都合がよいことがある。本発明の核酸コードのヌクレオチド配列、あるいは本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列にアクセスしてこれを処理するためのソフトウェア(サーチツール、比較ツール、モデリングツールなど)を実行時に主記憶デバイスに常駐させておいてもよい。
【０５０２】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムがさらに、コンピュータ読み取り可能な媒体に記録された本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと、コンピュータ読み取り可能な媒体に記録された基準のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列とを比較するための配列コンペアラを備えるものであってもよい。「配列コンペアラ」は、コンピュータシステムに実装され、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と、配列または構造がデータ記憶手段の中に記録された他のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列および/またはペプチド類、ペプチドを模倣した物質および化学物質を含むがこれに限定されるものではない化合物とを比較する1つまたはそれ以上のプログラムを意味する。たとえば、配列コンペアラは、コンピュータ読み取り可能な媒体に記録された本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列と、コンピュータ読み取り可能な媒体に記録された基準配列とを比較し、相同性、生物学的機能と関係のあるモチーフまたは構造的なモチーフを特定するものであってもよい。本願特許明細書の他の部分で述べるさまざまな配列コンペアラプログラムは、特に本発明の態様で使用することを意図したものである。
【０５０３】
したがって、本発明の一態様は、プロセッサと、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードが記録されたデータ記憶デバイスと、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと比較される基準のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が検索可能な状態で記録されたデータ記憶デバイスと、比較を実行するための配列コンペアラとを備えるコンピュータシステムである。配列コンペアラは、比較する配列同士の相同率示すものであってもよいし、あるいは本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードの構造的なモチーフを特定するものであってもよい。また、配列コンペアラは、これらの核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列における構造的なモチーフを特定するものであってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコード少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個または50個からなる配列をデータ記憶デバイスに記録することができる。
【０５０４】
本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードと基準のヌクレオチド配列との相同率を判定するための方法であって、相同率を判定するコンピュータプログラムを用いて核酸コードと基準のヌクレオチド配列とを読み取るステップと、コンピュータプログラムを使用して核酸コードと基準のヌクレオチド配列との相同を判定するステップと、を含む方法である。このコンピュータプログラムは、相同率を判定するためのさまざまなコンピュータプログラムのうち任意のものであればよく、BLAST2Nをデフォルトのパラメーターで使用したり、いずれかのパラメーターを変更して使用するものなど、本願明細書に具体的に列挙するものを含む。この方法は、上述したコンピュータシステムを用いて実現可能なものである。また、コンピュータプログラムを用いて上述した本発明の核酸コード2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個または50個を読み取り、核酸コードと基準ヌクレオチド配列との間の相同性を判定して上記の方法を実施してもよい。
【０５０５】
あるいは、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列と基準のヌクレオチド配列とを比較し、1つまたはそれ以上の位置で本発明の核酸コードが基準のヌクレオチド配列と異なっているか否かを判定するコンピュータプログラムであってもよい。任意に、かかるプログラムは、基準のポリヌクレオチドの配列または本発明の核酸コードの配列に対する、挿入、欠失または置換されたヌクレオチドの長さおよび同一性を記録する。一実施形態では、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列が、基準のヌクレオチド配列に対する単一ヌクレオチド多型(SNP)を1つまたはそれ以上含むか否かを判定するプログラムであってもよい。これらの単一ヌクレオチド多型が各々一塩基置換、挿入、または欠失を有するものであってもよい。
【０５０６】
本発明のもう1つの態様は、本発明のポリペプチドコードと基準のポリペプチド配列との相同率を判定するための方法であって、相同率を判定するコンピュータプログラムを用いて本発明のポリペプチドコードと基準のポリペプチド配列とを読み取るステップと、コンピュータプログラムを使用してポリペプチドコードと基準のポリペプチド配列との相同性を判定するステップと、を含む方法である。
【０５０７】
したがって、本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードが1つまたはそれ以上のヌクレオチドで基準のヌクレオチド配列と異なっているか否かを判定するための方法であって、ヌクレオチド配列同士の差を識別するコンピュータプログラムを用いて核酸コードと基準のヌクレオチド配列とを読み取るステップと、コンピュータプログラムを使用して、核酸コードと基準のヌクレオチド配列との差を識別するステップと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムが、単一ヌクレオチド多型を同定するプログラムである。この方法は上述したコンピュータシステムで実現可能なものである。また、コンピュータプログラムを用いて本発明の核酸コード少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個または50個と基準のヌクレオチド配列とを読み取り、コンピュータプログラムを使用して核酸コードと基準のヌクレオチド配列との差を識別することによって上記の方法を実施してもよい。
【０５０８】
他の実施形態では、コンピュータベースのシステムに、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特徴を識別するためのアイデンティファイアをさらに備えてもよい。
【０５０９】
「アイデンティファイア」は、上述した本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特定の特徴を識別する1つまたはそれ以上のプログラムを意味する。
【０５１０】
本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードについては、さまざまな形式でさまざまなデータ処理装置プログラムに記録して操作することが可能である。たとえば、MicrosoftWORDまたはWORDPERFECTなどのワードプロセッサ用のファイルとしてテキスト形式で記録できる。あるいは、DB2、SYBASE、ORACLEなどの当業者間で周知のさまざまなデータベースプログラムでASCIIファイルとして記録してもよい。また、配列コンペアラ、アイデンティファイア、あるいは本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードとの比較に用いられる基準のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のソースとして、多くのコンピュータプログラムおよびデータベースを利用できる。以下、本発明を限定するものではないが、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと併用するのに有用なプログラムおよびデータベースの参考として一覧をあげておく。使用可能なプログラムおよびデータベースとしては、MacPattern (EMBL)、DiscoveryBase (Molecular Applications Group)、GeneMine (Molecular Applications Group)、Look (Molecular Applications Group)、MacLook (Molecular Applications Group)、BLAST and BLAST2 (NCBI)、BLASTN and BLASTX (Altschulら、1990)、FASTA (PearsonおよびLipman, 1988)、 FASTDB (Brutlagら、1990)、Catalyst (Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.)、Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.)、HypoGen (Molecular Simulations Inc.)、Insight II、(Molecular Simulations Inc.)、Discover (Molecular Simulations Inc.)、CHARMm (Molecular Simulations Inc.)、Felix (Molecular Simulations Inc.)、DelPhi、(Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM、(Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、Modeler (Molecular Simulations Inc.)、ISIS (Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、EMBL/Swissproteinデータベース、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medicinal Chemistryデータベース、Derwents's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース、Genseqnデータベースがあげられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の開示内容から、当業者であれば他の多くのプログラムおよびデータベースについても分かるであろう。
【０５１１】
本願明細書全体を通して、さまざまな刊行物や特許公報、特許出願公開公報を引用している。かかる刊行物や特許公報、公開特許明細書の開示内容を本願の開示内容に援用し、本発明が属する技術分野の状況を一層明らかにする。
【０５１２】
(実施例)
実施例1
FLAPバイアレリックマーカーの検出:  DNA抽出
血縁がなく健常なドナーを用いた。ドナーはフランス人の異種個体群として十分な多様性を呈していた。100名の個体からDNAを抽出し、バイアレリックマーカーを検出するために試験を行った。
【０５１３】
各ドナーからEDTAの存在下で辺縁末梢静脈血30mlを採取した。2000rpmで10分間遠心後に細胞(ペレット)を収集した。溶解液(最終容積50ml、トリス10mM、pH7.6、MgCl2 5mM、NaCl 10mM)で赤血球を溶解した。溶解液中にペレットを再懸濁させた後、上澄み中に残留している赤血球を除去するのに必要な回数だけこの溶液を遠心(10分間、2000rpm)した。
【０５１４】
白血球のペレットを以下の組成を有する溶解液3.7mlで42℃で終夜溶解した。- 3ml TE 10-2(トリス-HCl 10mM、EDTA 2mM)/NaCl 0.4M
- 200μl SDS 10%
- 500μl K-プロテイナーゼ(TE 10-2 /NaCl 0.4M中にK-プロテイナーゼ2mg)
【０５１５】
タンパク質を抽出するために、1ml飽和NaCl(6M)(1/3.5v/v)を添加した。強く撹拌した後、溶液を1000rpmで20分間遠心した。
【０５１６】
DNAを沈降させるために、100%エタノール2〜3容量を上記の上澄みに添加し、この溶液を2000rpmで30分間遠心した。DNA溶液を70%エタノールで3回洗浄して塩を除去し、2000rpmで20分間遠心した。ペレットを37℃で乾燥させ、TE 10-1を1mlまたは水1mlの中に再懸濁させた。260nmODを測定することによって(1単位OD＝50μg/ml DNA)、DNA濃度を評価した。
【０５１７】
DNA溶液中にタンパク質が存在すると判定するために、OD 260/OD 280の比を求めた。後述する以後のステップではOD 260/OD 280比が1.8〜2の間にあるDNA調製物のみを使用した。
【０５１８】
各個体から得たDNAを等量ずつ混合してプールを作出した。
【０５１９】
実施例2
バイアレリックマーカーの検出:  ゲノムDNAのPCRによる増幅
先に得たDNAのプールについて、実施例1のDNA試料の特異的ゲノム配列を増幅した。また、50個体の試料を同様に増幅した。
【０５２０】
下記のプロトコルでPCRアッセイを行った。
最終容積                                                    25μl
DNA                                                      2ng/μl
MgCl2                                                      2mM
dNTP(各々)                                              200μM
プライマー(各々)                                        2.9ng/μl
Ampli Taq Gold DNAポリメラーゼ                    0.05単位/μl
PCR緩衝液(10×=0.1M トリス-HCl pH8.3    0.5M KCl)      1x
【０５２１】
FLAP遺伝子の配列情報(本願明細書に援用するGenBank 182657、Kennedyら、1991)およびOSPソフトウェア(Hillier & Green, 1991)を用いて、第1のプライマーの各対を設計した。この第1のプライマーは約20ヌクレオチド長であった。それぞれの配列を以下の表1に開示する。
【０５２２】
【表１】
0004472173.tif 000009
【０５２３】
好ましくは、プライマーは、シークエンシングに有用である、増幅対象の特異塩基の上流に共通のオリゴヌクレオチドの尾を含んでいた。
【０５２４】
プライマーPUは、PU 5'付加配列TGTAAAACGACGGCCAGT(配列番号 14)を含む。プライマーRPは、RP 5'配列CAGGAAACAGCTATGACC(配列番号 15)を含む。
【０５２５】
GENSET UFPS 24.1合成機において、ホスホルアミダイト法によってこれらのプライマーを合成した。
【０５２６】
DNA増幅はGenius IIサーモサイクラーで行った。94℃で10分間加熱した後、40サイクルを行った。各サイクルの構成は、94℃で30秒、55℃で1分、72℃で30秒である。最終的な伸長のために、72℃で7分間で増幅を終了した。蛍光光度計およびインターカレート剤(Molecular Probes)としてのPicogreenを用いて、96穴マイクロタイタープレート上で、どの程度の量の増幅産物が得られたのかを判定した。
【０５２７】
実施例3
バイアレリックマーカーの検出
増幅したゲノムDNAのシークエンシングおよび多型の同定
実施例2で得られた増幅DNAのシークエンシングをABI 377シークエンサで実施した。ダイターミネーターでのサイクルシークエンシングプロトコルを用いた自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応によって、増幅産物の配列を判定した。シークエンシング反応での反応産物をシークエンシングゲルに仕込み、配列を求めた。
【０５２８】
プールした増幅断片でのバイアレリックマーカーの有無を検出することによって、配列データを多型についてさらに評価した。多型探査は、同一位置に異なる塩基が座位することで生じる電気泳動パターンのピークの重畳の有無に基づいて行った。
【０５２９】
17個の増幅断片を解析した。これらのセグメントでは、28個のバイアレリックマーカーが検出された。バイアレリックマーカーの局在を表2に示す。
【０５３０】
【表２】
0004472173.tif 000010
【０５３１】
BMは「バイアレリックマーカー」を示す。all1およびall2はそれぞれ、バイアレリックマーカーのアレル1およびアレル2を示す。「Freq.of all2」は、個体群がコーカソイドのフランス人対照例であるバイアレリックマーカー10-204/326以外のコーカソイドのアメリカ人対照個体群でのアレル2の頻度をパーセンテージで示す。頻度はコーカソイドのフランス人起源の無作為供血者の個体群に対応する。
【０５３２】
Kennedyら、1991において多型A14(10-33-234)およびA16(10-33-327)が観察された。しかしながら、その個体群での頻度は不明であったため、本願発明者らによる結果が得られるまではこれを有効なバイアレリックマーカーとみなすことはできなかった。
【０５３３】
実施例4
マイクロシークエンシングによる多型の確認
実施例3で同定したバイアレリックマーカーをさらに確認し、マイクロシークエンシングによってそれぞれの頻度を判定した。マイクロシークエンシングを実施したのは実施例1で述べた各個体のDNA試料であった。
【０５３４】
バイアレリックマーカーの検出について上述したようにして、同一のプライマーセットを使用し、PCRによって個体をゲノムDNAから増幅した(表1)。
【０５３５】
マイクロシークエンシングで使用する好ましいプライマーは約19ヌクレオチド長であり、考慮対象の多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズした。その配列を下記の表3に示す。
【０５３６】
【表３】
0004472173.tif 000011
【０５３７】
Mis 1およびMis 2はそれぞれ、FLAP遺伝子の非コード鎖とハイブリダイズするマイクロシークエンシングプライマーまたはFLAP遺伝子のコード鎖とハイブリダイズするマイクロシークエンシングプライマーを示す。
【０５３８】
マイクロシークエンシング反応を次のようにして実施した。
【０５３９】
マイクロタイタープレートで、PCR産物5μlを、精製混合物2U SAP(エビ アルカリリン酸塩)(アマシャムE70092X))5μl、2UエキソヌクレアーゼI(アマシャムE70073Z)、SAP緩衝液(200mM トリス-HCl pH8、100mM MgCl2)1μlに添加した。反応混合物を37℃で30分間インキュベートした後、94℃で10分かけて変性させた。次に、マイクロシークエンシングオリゴヌクレオチド(19mer、GENSET、粗合成、5 OD)10pmolと、1U Thermosequenase(アマシャムE79000G)と、Thermosequenase緩衝液(260mM トリス HCl pH9.5、65mM MgCl2)1.25μlと、両方の多型塩基に対応する多型部位のヌクレオチドに対して相補な2種類の適当な蛍光ddNTP(11.25nM TAMRA-ddTTP; 16.25nM ROX-ddCTP; 1.675nM REG-ddATP; 1.25nM RHO-ddGTP; パーキンエルマー、ダイターミネーターセット401095)とを含有するマイクロシークエンシング反応混合物20μlを各ウェルに加えた。94℃で4分間の後、Tetrad PTC-225サーモサイクラー(MJリサーチ)にて、55℃で15秒、72℃で5秒、94℃で10秒のPCRサイクルを20回実施した。マイクロタイタープレートを1500rpmで10秒間遠心した。取り込まれなかったダイターミネーターをMgCl2 2mM19μlと100%エタノール55μlで沈殿させて除去した。室温にて15分間インキュベートした後、マイクロタイタープレートを4℃にて3300rpmで15分間遠心した。上澄みを破棄し、マイクロプレートが乾燥するまで減圧下(Speed Vac)で蒸発させ、試料をホルムアミドEDTA添加液2.5μLに再懸濁させ、95℃で2分間加熱した。マイクロシークエンシング反応物0.8μlを10%(19:1)ポリアクリルアミドシークエンシングゲルに仕込んだ。ABIプリズム377 DNAシークエンサーでデータを収集し、ＧＥＮＥSCANソフトウェア(パーキンエルマー)を用いて処理した。
【０５４０】
実施例5
喘息とFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーとの関連性解析:  羅患個体および未羅患個体からのDNA試料の収集
本関連性解析では、喘息すなわちロイコトリエン経路が関与している疾患を調査対象の疾患形質とした。
【０５４１】
喘息個体群は抗喘息薬Zileutonを評価するための臨床研究に参加した297名の個体であった。これら297名の喘息個体のうち90%以上がコーカソイド民族のバックグラウンドを持っていた。
【０５４２】
対照個体群は未羅患個体であった。この関連性解析では、コーカソイドのフランス人個体群(190個体)またはコーカソイドのアメリカ人個体群(286個体)のいずれかを対照個体群として用いた。好ましい対照個体群はコーカソイドのアメリカ人個体群である。喘息個体群は本質的にUS個体からなる個体群だからである。
【０５４３】
実施例6
喘息とFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーとの関連性解析:  羅患個体および対照個体の遺伝子型判定
関連性解析を行うための汎用的な戦略は、上述した個体群各々に含まれるすべての個体から得たDNA試料を個々にスキャンし、これらの個体群各々での上述したバイアレリックマーカーのアレル頻度を求めることであった。
【０５４４】
各個体から得たDNA試料に対して行ったゲノムPCRによって得られた増幅断片にマイクロシークエンシング反応を施し、各個体群における上述したバイアレリックマーカーのアレル頻度を判定した。上述したPCRおよびマイクロシークエンシングプライマーを使用して、実施例2および4において詳細に説明したようにしてゲノムPCRおよびマイクロシークエンシングを実施した。
【０５４５】
実施例7
喘息とFLAP遺伝子のバイアレリックマーカーとの関連性解析
A)  コーカソイドのフランス人対照個体群での喘息遺伝子についての関連性解析  本関連性解析では、293名の喘息個体と185名のコーカソイドのフランス人対照例を用いる。
【０５４６】
図2(A)に示されるように、マーカー10-32/357および10-35/390で喘息との高い関連性が認められた。この関連性は極めて有意である(p値がマーカー10-32/357で1.95×10-3、マーカー10-35-390では1.75×10-3)。このため、各マーカーをベースにした試験を行い、これら2種類のマーカー10-32/357および10-35/390を診断に利用することができる。他の2種類のマーカーすなわち33/234と35/358で個別試験の際に中程度の関連性がみられた。
【０５４７】
B)  コーカソイドのアメリカ人対照個体群での喘息遺伝子についての関連性解析  本関連性解析では、297名の喘息個体と286名のコーカソイドのアメリカ人対照例を用いる。
【０５４８】
図2(B)に示されるように、バイアレリックマーカー10-35/390で喘息との高い関連性が認められた。この関連性は極めて有意である(p値=2.29×10-3)。2種類のマーカー10-32/357および10-33/234で個別試験の際に弱いの関連性がみられた。
【０５４９】
バイアレリックマーカー10-35/390はFLAPのゲノム配列に位置している。したがって、関連性解析の結果からFLAP遺伝子の多型が喘息と関係しているように思われる。バイアレリックマーカー10-35/390またはこのマーカーを含むバイアレリックマーカーの組み合わせをベースにした試験を行い、このマーカーを診断に利用することができる。
【０５５０】
実施例8
関連性解析:  ハプロタイプ頻度解析
各マーカーの統計学的な力を高める方法の1つにハプロタイプ関連性解析がある。
【０５５１】
実施例7で述べた喘息個体群とコーカソイドのアメリカ人対照個体群で、10-253/298、10-32/357、10-33/175、10-33/234、10-33/327、10-35/358、10-35/390、12-628/306、12-629/241からなる群から選択されるバイアレリックマーカーを含む、考え得るすべてのハプロタイプの頻度を推定し、カイ二乗統計検定(自由度1)によってこれらの頻度を比較して、FLAPマーカーと喘息との関連性についてのハプロタイプ解析を実施した。期待値−最大化(EM)アルゴリズム(Excoffier L & Slatkin M, 1995)を適用し、EM-HAPLOプログラム(Hawley ME, Pakstis AJ & Kidd KK, 1994)を使用して、ハプロタイプを推定した。
【０５５２】
このようにして得られた最も有意なハプロタイプを図3に示す。
【０５５３】
図3にHAP1〜HAP7として示す好ましい2マーカーハプロタイプには、マーカー10-33/234(アレルA)またはマーカー10-35/390(アレルT)が含まれている。さらに好ましい2マーカーハプロタイプHAP1(10-33/234でA、10-35/390でT)のp値は8.2×10-4であり、オッズ比は1.61であった。推定ハプロタイプ頻度は症例で28.3%、US対照例で19.7%であった。他の2種類のハプロタイプHAP2(10-33/234でA、12-629/241でG)およびHAP3(10-33/327でT、10-33/390でT)のp値はそれぞれ1.6×10-3と1.8×10-3、オッズ比は1.65と1.53、ハプロタイプ頻度は喘息個体群で0.305と0.307、US対照個体群で0.210および0.224であった。
【０５５４】
好ましい3マーカーハプロタイプには、マーカー10-33/234(アレルA)およびマーカー10-35/390(アレルT): HAP37、HAP38、HAP39およびHAP41が含まれている。さらに好ましい3マーカーハプロタイプHAP37(10-33/234でA、10-33/390でT、12-628/306でC)のp値は8.6×10-4であり、オッズ比は1.76であった。推定ハプロタイプ頻度は症例で26.5%、US対照例で17.1%であった。さらに別の3マーカーハプロタイプHAP40(10-33/234でA、12-628/306でC、12-629/241でG)も有意である。
【０５５５】
4マーカーハプロタイプ(HAP121〜HAP125)、5マーカーハプロタイプ(HAP247および248)、6マーカーハプロタイプ(HAP373)でも有意なp値が認められた。マーカー10-35/390を含まないハプロタイプHAP124以外、これらのハプロタイプはいずれもマーカー10-33/234(アレルA)およびマーカー10-35/390(アレルT)を含んでいる。10-235/298(アレルC)、10-35/358(アレルG)、12-628/306(アレルC)および12-629/241(アレルG)からなる群から他のマーカーを選択する。
【０５５６】
喘息個体群とコーカソイドのフランス人対照例とを用いたハプロタイプ頻度解析では、10-33/234にA、10-35/390にTを有するさらに好ましいハプロタイプ(図3のHAP1)も有意である。特に、このハプロタイプではp値が2.7×10-3でオッズ比が1.67であった。推定ハプロタイプ頻度は症例で28.3%、フランス人対照例で19.2%であった(図4を参照のこと)。
【０５５７】
ハプロタイプHAP1が本発明のさらに好ましいハプロタイプである。このハプロタイプを喘息の診断に利用することができる。さらに、喘息と関連のある有意なハプロタイプの大半にバイアレリックマーカー10-35/390(アレルA)が含まれているため、これも診断に利用できるものと思われる。
【０５５８】
コンピュータで1000回または10,000回繰り返した表現型並べ替え検定を行い、ハプロタイプ解析で得られた結果の統計学的な有意性を評価した。このコンピュータシミュレーションでは、喘息個体および対照例の個体から得られたデータをプールし、図3にまとめたデータを得るのに用いた症例対照個体群と同数の個体を含む2つのグループに無作為に振り分けた。この人為的なグループで、喘息との関連性が最も高かったハプロタイプHAP1に含まれる2つのマーカーについてハプロタイプ解析を実施した。この実験を1000回および10,000回繰り返し、結果を図4に示す。これらの結果から、ハプロタイプHAP1で得られたものに匹敵するp値のあるハプロタイプは、1000回の繰り返しではゼロ、10,000回繰り返してもわずか1つだということが分かる。これらの結果は、ハプロタイプと喘息との関連性の統計学的な有意性を明らかに立証するものである。
【０５５９】
実施例9
FLAPの127-Ile変異体に対する抗体組成物の調製
FLAPタンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェクトした細胞または形質転換細胞から、実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを単離する。たとえばAmiconフィルター装置での濃度などによって、最終調製物のタンパク質濃度を数μg/mlのレベルに調節する。この状態で、タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を以下のようにして調製する。
A.  ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
【０５６０】
Kohler, G. and Milstein, C. (1975)の古典的な方法またはこれから派生した方法によって、FLAPタンパク質またはその一部のエピトープに対するモノクローナル抗体をマウスハイブリドーマから調製することができる。Harlow, E., and D. Lane. 1988も参照のこと。
【０５６１】
簡単に説明すると、数週間にわたって、数マイクログラムのFLAPタンパク質またはその一部をマウスに繰り返し接種する。このマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールによって脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)で系を成長させて過剰な未融合細胞を破壊する。融合が成功した細胞を稀釈し、希釈アリコートをマイクロタイタープレートのウェルに接種して培養成長を継続する。ウェルの上清中の抗体を、Engvall, E.(1980)が初めて明らかにしたようなELISAなどのイムノアッセイまたはこれから派生した方法によって検出し、抗体産生クローンを同定する。選択された陽性クローンを培養し、そのモノクローナル抗体産物を収集して使用できるようにする。モノクローナル抗体を得るための詳細な手順については、Davis, L. ら Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記載されている。
【０５６２】
B.  免疫化によるポリクローナル抗体産生
適当な非ヒト動物をFLAPタンパク質またはその一部で免疫化することによって、FLAPタンパク質またはその一部の異種起源のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を調製することができる。これは、免疫原性を高めるように修飾してもよいし修飾せずにおくことも可能である。適当な非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳動物が選択され、通常、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマである。あるいは、FLAP濃度を高めた未精製調製物を用いて抗体を作出することもできる。このようなタンパク質、断片または調製物を、従来技術において周知の適当なアジュバント(たとえば、水酸化アルミニウム、RIBIなど)の存在下で非ヒト哺乳動物に導入する。また、タンパク質、断片または調製物を抗原性を高める作用薬で前処理してもよい。このような作用薬は従来技術において周知であり、一例としては、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、B型肝炎表面抗原およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などがあげられる。周知の手順に従って免疫化動物から得られる血清を収集し、これを処理して試験する。血清に望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体が含まれている場合、免疫親和性クロマトグラフィによってポリクローナル抗体を精製してもよい。
【０５６３】
抗原と宿主種の両方に関係のある多くの要因が効果的なポリクローナル抗体産生に影響する。また、接種部位および用量に対する宿主動物の応答性には差があり、抗原量が不適切な場合と過剰な場合はいずれも低力価抗血清が作出される。少量(ngレベル)の抗原を複数の皮内部位に投与すると最も信頼性の高い結果が得られるように思われる。ポリクローナル抗血清を作出して処理するための手法は従来技術において周知である。たとえば、Mayer and Walker (1987)などを参照のこと。Vaitukaitis, J. ら(1971)にはウサギでの効果的な免疫化プロトコルが記載されている。
【０５６４】
一定間隔で追加免疫注射を行い、たとえば濃度が分かっている抗原に対する寒天での二重免疫拡散によって半定量的に測定した抗体力価が低下しはじめたところで、抗血清を収集することができる。たとえば、Ouchterlony, O. ら (1973)などを参照のこと。この抗体のプラトー濃度は通常、血清(約12μM)の0.1〜0.2mg/mlの範囲にある。Fisher, D., (1980)に記載されているようにして競合的結合曲線を作成し、抗血清の抗原に対する親和性を判定する。
【０５６５】
モノクローナル抗体法またはポリクローナル抗体法のいずれかに従って調製した抗体調製物は、生物学的試料中の抗原産生物質の濃度を判定する定量的なイムノアッセイにおいて有用なものである。また、これらの調製物は、生物学的試料中の抗原の存在を半定量的あるいは定性的に同定するのにも用いられる。さらに、タンパク質を発現する細胞を殺す目的あるいは体内のタンパク質濃度を落とす目的で治療用組成物に抗体を使用してもよい。
【０５６６】
以上、本発明の好ましい実施形態について例示および説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく当業者によってさまざまな変更が可能であることは理解できよう。
【０５６７】
参考文献
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【０５６８】
配列表の自由文字列
添付の配列表には以下の自由文字列を使用する。
潜在的5'制御領域
停止
refでの配列との相同
分岐ヌクレオチド
〜の欠失
refで
多型塩基
または
潜在的
相補体
プローブ
上流増幅プライマー
下流増幅プライマー
多型アミノ酸ValまたはIle
シークエンシングオリゴヌクレオチドプライマーPU
シークエンシングオリゴヌクレオチドプライマーRP
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のバイアレリックマーカーの相対位置を示すFLAP遺伝子の図である。
【図２】  喘息個体290例とコーカソイドのアメリカ人対照280例でFLAPバイアレリックマーカーと喘息との間の関連性を研究した結果を示す。図2は、本発明のバイアレリックマーカーのうちのいくつかと喘息との関連性を示すグラフであり、y軸に各マーカーのカイ二乗値のp値の対数の絶対値(ベース10ログ)、x軸にFLAP遺伝子エレメントに対する各マーカーの概算推定位置を示してある。
【図３】  本発明のバイアレリックマーカーからなるハプロタイプと喘息との間のハプロタイプ関連性解析の結果を示す表である(297症例vsコーカソイドのアメリカ人対照286例)。
【図４】  1000回を超える頻度繰り返して行った並べ替え検定結果を含む、ハプロタイプ頻度解析の結果を示す表である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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