(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーマトリックスとその中に分散された多数の炭素粒子を含有する複合体を含む電気化学発光（ＥＣＬ）測定電極であって、多数の結合ドメインを有するパターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）を含み、その各結合ドメインは多成分試料中の１つの目的のアナライトに対する結合試薬を含有し、第１の結合ドメインは多成分試料中の第１のアナライトに対する結合試薬を含み、第２の結合ドメインは多成分試料中の第２のアナライトに対する結合試薬を含み、
これらの結合試薬は当該電極に固定化され、および当該多数の炭素粒子は露出した炭素粒子を包含し、
当該複合体はプラズマエッチングされている、
測定電極。
【請求項２】
炭素粒子は１〜３０重量％の複合体を含む、請求の範囲第１項記載の測定電極。
【請求項３】
結合試薬は電極に共有結合している、請求の範囲第１項または第２項に記載の測定電極。
【請求項４】
結合試薬は電極に非共有結合している、請求の範囲第１項または第２項に記載の測定電極。
【請求項５】
結合試薬は電極に直接固定化されている、請求の範囲第１項または第２項に記載の測定電極。
【請求項６】
結合試薬は結合対を介して電極に間接的に固定化されている、請求の範囲第１項または第２項に記載の測定電極。
【請求項７】
結合試薬は、抗体またはその断片、核酸、受容体または酵素である、請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の測定電極。
【請求項８】
炭素粒子は小繊維である、請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の測定電極。
【請求項９】
炭素粒子は、エッチングされ、または化学的に修飾されている、請求の範囲第１項から第８項のいずれか一項に記載の測定電極。
【請求項１０】
請求の範囲第１項から第９項のいずれか一項に記載の測定電極の製造方法であって、
（ａ）ポリマーマトリックスとその中に分散された多数の炭素粒子を含有する複合体をプラズマで処理する工程、および
（ｂ）こうして処理した複合体上で、パターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）を形成する工程、
を含む、製造方法。
【請求項１１】
多数の炭素粒子は露出した炭素粒子を包含する、請求の範囲第１０項記載の方法。
【請求項１２】
プラズマは、Ｏ２、Ａｒ、Ｈ２Ｏ、Ｎ２、ＮＨ３、ＣＦ４、ＳＦ６、Ｃ２Ｆ６、ＣＨＦ３、ＣＦ２Ｃｌ２、ＣＦ３Ｂｒ、ＣＦ３Ｃｌおよびこれらの組合せよりなる群から選択される原子または化合物を含有する、請求の範囲第１０項記載の方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項から第９項のいずれか一項に記載の測定電極の製造方法であって、
（ａ）ポリマーマトリックスとその中に分散された多数の炭素粒子を含有する複合体をプラズマおよび化学試薬で処理する工程、および
（ｂ）こうして処理した複合体上で、パターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）を形成する工程、
を含む、製造方法。
【請求項１４】
炭素粒子は小繊維である、請求の範囲第１３項記載の方法。
【請求項１５】
化学試薬は酸化剤である、請求の範囲第１３項記載の方法。
【請求項１６】
アナライトの検出または定量のための電気化学発光測定を実施するための装置システムで使用されるカートリッジであって、１つまたはそれ以上の請求の範囲第１項記載の電極および測定試薬を含む、カートリッジ。
【請求項１７】
測定試薬は乾燥測定試薬を包含する、請求の範囲第１６項記載のカートリッジ。
【請求項１８】
乾燥測定試薬は電気化学発光共作用物質（coreactant）である、請求の範囲第１７項記載のカートリッジ。
【請求項１９】
乾燥測定試薬は電気化学発光残基を含有する、請求の範囲第１７項記載のカートリッジ。
【請求項２０】
乾燥測定試薬は較正標準物質である、請求の範囲第１７項記載のカートリッジ。
【請求項２１】
カートリッジからの光を、測定での光を検出する光検出器へ通すための窓を包含する、請求の範囲第１６項から第２０項のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項２２】
対電極を包含する、請求の範囲第１６項から第２１項のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項２３】
参照電極を包含する、請求の範囲第１６項から第２２項のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項２４】
電気エネルギー源を包含する、請求の範囲第１６項から第２３項のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項２５】
カートリッジに導入される流体試料を閉じこめるための手段を包含する、請求の範囲第１６項から第２４項のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項２６】
アナライトの検出または定量のために電気化学発光測定を実施するための装置システムであって、
（ａ）１つまたはそれ以上の請求の範囲第１項から第９項のいずれか一項に記載の測定電極を包含するカートリッジ、および
（ｂ）各結合ドメインからの光を選択的に検出または定量する光検出器、
を含む装置システム。
【請求項２７】
炭素粒子は小繊維である、請求の範囲第２６項記載の装置システム。
【請求項２８】
カートリッジの内容物を混合する手段を包含する、請求の範囲第２６項または第２７項に記載の装置システム。
【請求項２９】
カートリッジは乾燥測定試薬を包含する、請求の範囲第２６項から第２８項のいずれか一項に記載の装置システム。
【請求項３０】
光検出器はＣＣＤである、請求の範囲第２６項から第２９項のいずれか一項に記載の装置システム。
【請求項３１】
光検出器はフォトダイオードである、請求の範囲第２６項から第２９項のいずれか一項に記載の装置システム。
【請求項３２】
カートリッジの温度を制御するための温度制御手段を包含する、請求の範囲第２６項から第３１項のいずれか一項に記載の装置システム。
【請求項３３】
露出した炭素粒子を有するポリマーマトリックスを含有する複合体を含む固相支持体であって、多数の結合ドメインを有するパターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）を含み、その各結合ドメインは、その上に沈着した多成分試料中の１つの目的のアナライトに対する結合試薬を含有し、第１の結合ドメインは多成分試料中の第１のアナライトに対する結合試薬を含み、第２の結合ドメインは多成分試料中の第２のアナライトに対する結合試薬を含み、当該複合体はプラズマエッチングされている、固相支持体。
【請求項３４】
炭素粒子は小繊維である、請求の範囲第３３項記載の固相支持体。
【請求項３５】
生物学的分子は、抗体、核酸、酵素またはペプチドを含む、請求の範囲第３３項または第３４項に記載の固相支持体。
【請求項３６】
請求の範囲第１項から第９項のいずれか一項に記載の測定電極を使用する方法であって、
（ａ）２つまたはそれ以上のアナライトと電気化学発光標識物とを含む多成分試料を当該電極に接触させ、
（ｂ）当該電極に電気化学エネルギーを負荷することによって電気化学発光標識物を発光するように誘導し、そして
（ｃ）放出された発光を検出または測定する、
ことを含む、方法。
【請求項３７】
請求の範囲第１６項から第２５項のいずれか一項に記載のカートリッジを使用する方法であって、
（ａ）２つまたはそれ以上のアナライトと電気化学発光標識物とを含む多成分試料を当該電極に接触させ、
（ｂ）当該電極に電気化学エネルギーを負荷することによって電気化学発光標識物を発光するように誘導し、そして
（ｃ）放出された発光を検出または測定する、
ことを含む、方法。
【請求項３８】
請求の範囲第２６項から第３２項のいずれか一項に記載の装置システムを使用する方法であって、
（ａ）２つまたはそれ以上のアナライトと電気化学発光標識物とを含む多成分試料を当該電極に接触させ、
（ｂ）当該電極に電気化学エネルギーを負荷することによって電気化学発光標識物を発光するように誘導し、そして
（ｃ）放出された発光を検出または測定する、
ことを含む、方法。
【請求項３９】
基質層を含み、かつ複数の結合ドメインを有するパターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）をさらに含む第１の支持体を有する電気化学発光（ＥＣＬ）測定カセットであって、その各結合ドメインは、１つまたはそれ以上の電極上にあるまたはそれに近接し、かつ当該第１の支持体上のまたはその中の凹部、くぼみまたは穴に位置し、そして当該凹部、くぼみまたは穴は少なくとも２つの別々の結合ドメインを含み、
当該１つまたはそれ以上の電極は、ポリマーマトリックスとその中に分散された多数の炭素粒子を含有する複合体を含み、各結合ドメインは多成分試料中の１つの目的のアナライトに対する結合試薬を含有し、第１の結合ドメインは多成分試料中の第１のアナライトに対する結合試薬を含み、第２の結合ドメインは多成分試料中の第２のアナライトに対する結合試薬を含み、
これらの結合試薬は当該電極に固定化され、および当該多数の炭素粒子は露出した炭素粒子を包含し、当該複合体はプラズマエッチングされている、測定カセット。
【請求項４０】
その上に複数の作用電極、および少なくとも１つの測定セルを有する第１の支持体を含む電気化学発光（ＥＣＬ）測定カセットであって、当該作用電極は、当該少なくとも１つの測定セル内にマスクによって画定される少なくとも２つの結合ドメインを有するパターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）を含み、
当該作用電極は、ポリマーマトリックスとその中に分散された多数の炭素粒子を含有する複合体を含み、各結合ドメインは多成分試料中の１つの目的のアナライトに対する結合試薬を含有し、第１の結合ドメインは多成分試料中の第１のアナライトに対する結合試薬を含み、第２の結合ドメインは多成分試料中の第２のアナライトに対する結合試薬を含み、
これらの結合試薬は当該電極に固定化され、および当該多数の炭素粒子は露出した炭素粒子を包含し、当該複合体はプラズマエッチングされている、測定カセット。
【請求項４１】
凹部、くぼみまたは穴を画定するマスクをさらに含む、請求の範囲第３９項記載の測定カセット。
【請求項４２】
第１の支持体上に複数の結合ドメインを画定するマスクをさらに含む、請求の範囲第３９項記載の測定カセット。
【請求項４３】
マスクが疎水性であって結合ドメインが親水性であるか、またはその逆である、請求の範囲第４１項または第４２項に記載の測定カセット。
【請求項４４】
第１の支持体は、基質層に隣接する１つまたはそれ以上の接着層をさらに含む、請求の範囲第３９項記載の測定カセット。
【請求項４５】
１つまたはそれ以上の試料および／または１つまたはそれ以上の試薬を結合ドメインに送達するためのチャネルをさらに含む、請求の範囲第３９項から第４４項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項４６】
第１の支持体に取り付けられた第２の支持体であって、その間に複数のウェルおよび／または複数の流体チャネルを提供する第２の支持体をさらに含む、請求の範囲第３９項から第４５項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項４７】
第２の支持体は、複数の開口部を有し、それによって、第１の支持体に取り付けられたときに複数のウェルを形成する、請求の範囲第４６項記載の測定カセット。
【請求項４８】
光は、第１の支持体、第２の支持体またはその両方によって検出される、請求の範囲第４６項記載の測定カセット。
【請求項４９】
少なくとも第１の支持体の一部が透明である、請求の範囲第３９項または第４０項に記載の測定カセット。
【請求項５０】
少なくとも第２の支持体の一部が透明である、請求の範囲第４６項記載の測定カセット。
【請求項５１】
測定カセットは、ウェルを有するマルチウェルプレートである、請求の範囲第３９項から第５０項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項５２】
結合ドメインはウェルの底に近接する、請求の範囲第５１項記載の測定カセット。
【請求項５３】
測定カセットは、９６ウェルまたは３８６ウェルのプレートである、請求の範囲第５１項または第５２項に記載の測定カセット。
【請求項５４】
測定を実施するための試薬をさらに含む、請求の範囲第３９項から第５３項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項５５】
試薬は乾燥状態で保存される、請求の範囲第５４項記載の測定カセット。
【請求項５６】
試薬は湿潤状態で保存される、請求の範囲第５４項記載の測定カセット。
【請求項５７】
電気化学発光標識物をさらに含む、請求の範囲第３９項から第５６項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項５８】
金属は、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、テクネチウムおよびタングステンよりなる群から選択される金属含有有機化合物からなる電気化学発光標識物をさらに含む、請求の範囲第３９項から第５６項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項５９】
電極は炭素からなる、請求の範囲第３９項から第５８項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６０】
電極は粒状炭素、カーボンブラック、カーボンフェルト、ガラス状炭素、炭素繊維、炭素小繊維またはそれらの組合せからなる、請求の範囲第３９項から第５８項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６１】
電極は複合材料からなる、請求の範囲第３９項から第５８項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６２】
電極は、ポリマー性材料および炭素粒子を包含する複合材料からなる、請求の範囲第３９項から第５８項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６３】
電極は、個々にアドレスが可能な電極を含む、請求の範囲第３９項から第６２項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６４】
電極に電気的に接続された電気接点をさらに含む、請求の範囲第３９項から第６３項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６５】
第１の１セットの電極に電気エネルギーを供給することができる第１の１セットの電気接点、および第２の１セットの電極に電気エネルギーを供給することができる第２の１セットの電気接点を含む、請求の範囲第６４項記載の測定カセット。
【請求項６６】
電極は、０．００１〜１０ｍｍの幅または直径である、請求の範囲第３９項から第６５項のいずれか一項に記載の測定カセット。
【請求項６７】
電気化学発光（ＥＣＬ）測定を実施するための電気化学発光測定カセットであって、
（ａ）各電極は電気化学発光を誘導することができる複数の電極、
（ｂ）マスクによって電極上に画定される複数の別々の結合ドメインを含む、パターン付けされた多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）であって、少なくとも１つの結合ドメインは、各当該複数の電極上に画定される、および
（ｃ）多成分試料を当該複数の結合ドメインと接触させて入れておくための多成分試料容器、
を含み、
各結合ドメインは多成分試料中の１つの目的のアナライトに対する結合試薬を含み、第１の結合ドメインは多成分試料中の第１のアナライトに対する結合試薬を含み、第２の結合ドメインは多成分試料中の第２のアナライトに対する結合試薬を含み、当該複合体はプラズマエッチングされている、
測定カセット。
【請求項６８】
１つの結合ドメインは電極上に含有される、請求の範囲第６７項記載の測定カセット。
【請求項６９】
２つまたはそれ以上の結合ドメインは電極上に含有される、請求の範囲第６７項記載の測定カセット。
【請求項７０】
１つまたはそれ以上の容器中に、請求の範囲第３９項から第６９項のいずれか一項に記載の測定カセットおよび１つまたはそれ以上の試薬を含むキット。
【請求項７１】
光検出器および請求の範囲第３９項から第６９項のいずれか一項に記載の測定カセットを含む装置。
【請求項７２】
電極に電気エネルギーを供給することができる電気コネクターをさらに含む、請求の範囲第７１項記載の装置。
【請求項７３】
第１の１セットの電極に電気エネルギーを供給することができる第１の１セットの電気コネクター、および第２の１セットの電極に電気エネルギーを供給することができる第２の１セットの電気コネクターをさらに含む、請求の範囲第７１項記載の装置。
【請求項７４】
光検出器は、複数の結合ドメインから放出されたＥＣＬシグナルを走査することができる、請求の範囲第７１項記載の装置。
【請求項７５】
複数のウェルからなるマルチウェルプレートであって、各ウェルは、その底の中心に置かれた請求の範囲第１項から第９項のいずれか一項に記載の測定電極の表面を有する、マルチウェルプレート。
【請求項７６】
電極表面は炭素をさらに含む、請求の範囲第７５項記載のマルチウェルプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．緒言
本発明は、電気化学発光（electrochemiluminescence）に基づく試験のためのパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面（ＰＭＡＭＳ）、さらにはＰＭＡＭＳの製造法と使用法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．診断用測定法
迅速で感度の高い診断技術に対する強い経済的なニーズが存在する。診断技術は、医療、研究、農業、獣医学、および工業市場などの種々の経済的市場において重要である。感度、必要時間、使用の簡便さ、頑丈さ、またはコストを改良すれば、これまでいずれの技術でも市場ニーズに応えることのできなかった、全く新規な診断市場を開発することができるであろう。高感度を有する診断技術もあるが、市場ニーズに応えるには高価過ぎる。また他の技術は、費用効果が高くても、種々の市場にとって頑丈さが足りない。これらの品質を組合せることのできる新規な診断技術は、診断薬事業において顕著な進歩であり好機である。
【０００３】
診断応用では多くの異なる分析技術が使用されている。これらの技術は、放射性標識、酵素結合免疫測定法、化学比色法、蛍光標識、化学発光標識、および電気化学発光標識を含む。これらの各技術は、異なる診断市場における有用性を規定し限定する、感度レベル、使用の簡便さ、頑丈さ、迅速さおよびコストの独特の組合せを有する。これらの差は、部分的には、各技術に本来的な物理的制約によるものである。例えば放射性標識は、この標識物自体が崩壊するため、本質的に頑丈ではなく、そして生じる放射性廃棄物の処分は、多くの応用にとって経済的、安全上および環境的なコストを生み出す。
【０００４】
今日使用されている多くの高感度診断技術は、第一に、試験を実施するのに熟練した技術者を必要とするため、市場が限定されている。例えば今日使用されている電気化学発光法は、熟練技術者を必要とするだけでなく、洗浄の繰り返しや準備段階を必要とする。このため、コストと廃棄物処分の必要の両方が高まる。試験法を単純にし、同時に試験当たりのコストを低下させる新規な診断法は、新規な市場を開発する上にも、既存の市場の性能を改善する上にも非常に重要で有用となるであろう。
【０００５】
２．２．電気化学発光測定法
電気化学発光（「ＥＣＬ」）は、電気的に励起した分子種が、光子を放射する現象である（例えば、リーランド（Leland）とパウエル（Powell）、１９９０，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７（１０）：３１２７−３１３１を参照のこと）。ＥＣＬが誘導される分子種はＥＣＬ標識物と呼ばれ、本明細書においてはＴＡＧとも呼ぶ。一般に使用されるＥＣＬ標識は、例えば金属がＲｕ含有およびＯｓ含有有機金属化合物［例えば、バード（Bard）ら（米国特許第５，２３８，８０８号）により開示されている、Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）３２＋残基（「Ｒｕｂｐｙ」とも呼ばれる）］を含む第VIII族の貴金属由来の有機金属化合物を含む。「ＴＡＧ１」および「Ｒｕｂｐｙ」はまた、Ｒｕ（２，２’−ビピリジン）３２＋残基の誘導体を意味する。ＥＣＬに基づく検出系の基本は、光子を放射させるためにＥＣＬ標識物を励起させる電位が必要なことである。ある電位波形が、電極表面（典型的には金属表面）と対電極にわたるＥＣＬ測定溶液に適用される（例えば、米国特許第５，０６８，０８８号、５，０９３，２６８号、５，０６１，４４５号、５，２３８，８０８号、５，１４７，８０６号、５，２４７，２４３号、５，２９６，１９１号、５，３１０，６８７号、５，２２１，６０５号を参照のこと）。ＥＣＬは、作用電極から受けた電気エネルギーにより開始される一連の化学反応の結果として、励起状態に上げられる。ＴＡＧのＥＣＬを上げる分子（例えば、シュウ酸塩またはより好ましくはトリプロピルアミン）が、有利に提供される（例えば、米国特許第５，３１０，６７８号を参照）。
【０００６】
ＥＣＬ反応中のＴＡＧの励起は典型的には、電極の表面へのＴＡＧ分子の拡散が関与する。電極によるＴＡＧ分子の励起機構は、溶液中の電気化学的メディエーター（ハアパッカ（Haapakka），１９８２，Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ．ａｃｔａ，１４１：２６３）と電極上でＴＡＧ分子を提示するビーズの捕捉（ＰＣＴ公報出願ＷＯ９０／０５３０１とＷＯ９２／１４１３９）の使用が関与する。あるいはＥＣＬは、例えば非特異的吸着（ズー（Xu）ら，１９９４，ラングミュア（Langmuir），１０：２４０９−２４１４）、Ｌ−Ｂ膜への取り込み（ザング（Zhang）ら、１９８８，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９２：５５６６）、自己集合単層への取り込み（オーベング（Obeng）ら，１９９１，ラングミュア（Langmuir），７：１９５）、および厚い（マイクロメーター）膜への取り込み（ルーベンスタイン（Rubenstein）ら，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０２：６６４１）により、作用電極の表面に直接吸着されたＴＡＧから観察されている（米国特許第５，３２４，４５７号）。同様にズー（Xu）ら（ＰＣＴ公報出願ＷＯ９６／０６９４６）は、ＤＮＡ鎖に挿入されたＴＡＧ分子から、このような鎖がアルカンチオール酸塩の自己集合単層上に固定化されたアルミニウム中心との相互作用により金電極上に吸着される時、ＥＣＬを観察している。
【０００７】
当該分野で公知の種々の装置が、ＥＣＬ反応を行い検出するのに利用可能である。例えば、ジャン（Zhang）ら（米国特許第５，３２４，４５７号）は、ＥＣＬを行うための電気化学的セルにおいて使用するための電極の例を開示している。レヴァンティス（Levantis）ら（米国特許第５，０９３，２６８号）は、ＥＣＬ反応を実施するのに使用するための電気化学的セルを開示している。カミン（Kamin）ら（米国特許第５，１４７，８０６号）は、電位制御装置を含む、ＥＣＬ反応を行い検出するための装置を開示している。ゾスキ（Zoski）ら（米国特許第５，０６１，４４５号）は、ＥＣＬ反応を誘導するための電位波形線図、ディジタルからアナログへの変換器、制御装置、電子制御装置にフィードバック情報を提供するため作用電極でＥＣＬ反応により発生する電流を検出するための、検出装置および方法を含む、ＥＣＬ反応を行い検出するための装置を開示している。
【０００８】
２．３．工業用のＥＣＬ測定法
ＥＣＬ標識物により発生する光は、診断法におけるレポーターシグナルとして使用することができる（バード（Bard）ら、米国特許第５，２２１，６０５号）。例えばあるＥＣＬ標識物は、抗体または核酸プローブのような結合物質に共有結合することができる。このＥＣＬ標識／結合物質複合体は、種々の物質の測定のために使用することができる（バード（Bard）ら、米国特許第５，２３８，８０８号）。測定法におけるＥＣＬの使用は、例えばナイト（Knight）ら、１９９４，Ａｎａｌｙｓｔ，１１９：８７９−８９０の総説にまとめられている。簡単に説明すると、ＥＣＬ法は、比較的低濃度で試料中に存在する目的のアナライトを試料の容量中で検出する方法として使用される。
【０００９】
現在までのところ、全ての工業用のＥＣＬ反応は、センチメートルのスケールの電極表面で行われている。センチメートルスケールの電極は、より大きな電極から生じるＥＣＬシグナルの増強された大きさと、各測定に必要な全試料容量を低く抑える必要性との間で比較検討されている。しかし、センチメートルスケールの電極でさえ、多くの測定に必要とされる感度を達成できない。この問題を克服するために、全ての工業用のＥＣＬ系は、コーティングした磁性ビーズを使用してＥＣＬアナライトまたは試薬を捕捉することにより感度をさらに増強している。こうしてビーズは作用電極近くに移動して感度が増強される。
【００１０】
しかし、現在利用可能な技術は多くの限界（主に、コストと複雑さ）を有し、処分可能なカートリッジを使用する低コストの測定法での使用、ならびに複数の測定を同時に行う高処理システムでの使用が限定される。
【００１１】
レベンティス（Leventis）ら（米国特許第５，０９３，２６８号）は、各アナライトについて異なるＥＣＬ標識物を使用することにより、２つ以上の異なるアナライトを同時に測定する方法を提案している（１回の測定で、各異なるアナライトに対して、異なる波長で光子を放射する）。しかし、この技術は、例えば、異なる波長で放射する有効なＥＣＬ標識物が十分な数だけ利用できないこと、および各ＥＣＬ標識について化学的条件を最適化する必要があることにより、制限されている。これらの実用上の制約により、このような多重波長、多重アナライトＥＣＬ検出系の工業化が妨げられている。
【００１２】
ＥＣＬ測定を行うための市販の方法はまた、電極を含むアッセイセルを、例えば米国特許第５，１４７，８０６号により開示されているように、希酸、希塩基、界面活性剤溶液などの使用を含む多くの方法の１つにより洗浄する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
２．４．発明の目的
従って本発明の目的は、ＥＣＬ測定を行うための新規で費用効果が高くかつ処分可能な電極を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、逐次または同時に複数のＥＣＬ測定を行うための、新規で費用効果が高いシステムを提供することであり、かつ好適な実施態様において、正確性の改善のために組み込まれた対照標準物質を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、これもまた処分可能な、複数の同時または逐次ＥＣＬ測定を行うのに適した１つまたはそれ以上の支持体からなるカセットを提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の関連する目的は、生物学的試料中の目的のアナライトに関する個々の測定を行う時間とコストを低減することである。
【００１７】
本発明のなおさらに別の関連する目的は、単一の生物学的試料中の複数の目的のアナライトについて複数の同時測定を行うための方法と装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
３．発明の要約
本発明は、支持体に固定化されている１つまたはそれ以上の結合ドメインからなるＥＣＬ反応および測定を行うためのカセットに関する。この支持体は、電気化学発光を発生させるための電極として作用する。あるいは１つまたはそれ以上の電極が追加の支持体の上にあり、この電極は、ＥＣＬを発生するように第１の支持体に近付けてもよい。このカセットは、１つまたはそれ以上の電極または１つまたはそれ以上の電極／対電極対を有しても良い。このカセットはまた、第１の支持体に近接して配置されてその間に試料含有手段を提供することができるように、および／または電極として機能するように、第２の支持体を含んでもよい。結合ドメインは、支持体表面状にパターン付けされて、目的のアナライトまたは試薬を結合するように作成される。
【００１９】
本発明はさらに、処分可能なフォーマットでの使用に適した新規の処分可能な電極に関する。これらの電極は、グラッシーカーボン、カーボンブラックまたはカーボン（黒鉛）ナノチューブのような炭素の種々のフォーマットを含んでもよい。
【００２０】
本発明はさらに、複合電極、すなわち２つ以上の材料からなる電極に関する。これらの電極は、処分可能なフォーマットでの使用に適するようにするために、性能、コストおよび加工性を制御するように作成することができる。
【００２１】
本発明はさらに、粒子が結合試薬の固体支持体として使用される測定法に関する。この粒子は、沈殿により多孔性電極上に捕捉され検出される。粒子を用いてあらかじめ作成された導電性フィルターに基づくキットが記載される。
【００２２】
本発明はさらに、２つまたはそれ以上のＥＣＬシグナルを分離するのに使用することができる電極に関する。
【００２３】
本発明はさらに、支持体またはカセット操作手段、電気化学発光を引き起こすのに有効な制御された電位波形をかけるように適合させた電位制御手段、試料からの電気化学発光を検出するための光子検出手段、および試料操作手段を提供する、試料の電気化学発光を測定するための装置に関する。
【００２４】
本発明はさらに、カセットの複数の結合ドメインを、複数の目的のアナライトを含有する試料にＥＣＬ測定条件下で接触させて、次に引き起こされる電気化学発光を検出または測定するのに有効な電位波形をかけるために、試料中の電気化学発光を測定するためのカセットの使用法に関する。
【００２５】
本発明はまた、同時に複数の電気化学発光反応を測定するのに適したカセット、その上に複数のドメインが固定化されている支持体表面、および化学反応を行うＥＣＬ測定の実施のための測定用媒体を含む成分からなるキットを提供する。
【００２６】
本発明はまた、迅速な処分可能な電気化学発光測定法である。市販のＥＣＬ測定法は、作用電極と対電極を有するフローセルを使用して行われる。本明細書に記載の処分可能な電極は、キャリーオーバーを排除するのに洗浄および／または清掃を必要とせず、永久的なフローセル電極のように均一な電極表面を再生する。
【００２７】
本発明はまた、多孔性電極の使用により反応速度の上昇を与える。測定結果を迅速に発生させたために、フォーマット化されたおよび／または多孔性の処分可能な電極が使用される。処分可能な電極を用いる測定結果は、１時間未満で得られる。好適な実施態様において、処分可能な電極からのＥＣＬ測定結果は、３０分未満で得られ、１５分未満で得られる場合もある。最も好適な実施態様において、測定結果は５分未満または最も有利な場合には１分未満で得られる。本発明の多重測定フォーマットでは、このような時間またはそれより短い時間で２つ以上のＥＣＬ測定結果が得られる。迅速な処分可能なＥＣＬシステムのためのキットが開示される。
【００２８】
さらに本発明は、携帯用のＥＣＬ診断装置を提供する。携帯用のＥＣＬ診断のためのカートリッジまたはキットは、新規の処分可能な電極と試薬パックを使用する。ＥＣＬ測定法のためのＰＭＡＭＳと電極は、携帯用のＥＣＬ装置リーダーで使用するためのキットとしてパッケージングされてもよい。そのようなキットやＥＣＬ装置リーダーは、短時間に測定結果を得るために使用される。測定結果は、前記の非常に短い時間で得られる。
【００２９】
５．発明の詳細な説明
従って本発明は、広い意味で、複数の電気化学発光測定を実施するためのカセットを含む。このカセットは、１つまたはそれ以上の目的のアナライトと特異的に結合することができる複数の結合ドメインを、その上に有する支持体より形成される。結合ドメインは、支持体上に、パターン付けされた、多重アレイの多重特異的な表面（「ＰＭＡＭＳ」）として作成される。ＰＭＡＭＳは、例えば、実施できる測定の密度の大きな上昇、および迅速にまたは同時に複数の異なる測定を実施することを可能にしたことにより、既知のＥＣＬ測定法からの有意な改良を提供する。
【００３０】
カセットは、結合ドメインに結合したＥＣＬ標識試薬からの光のＥＣＬ放出を選択的に引き起こしうる、複数の電極を含んでもよい。図４７は、ハウジング４７１７を含むカセット４７００、カセット４７１８中の電極への電気的接続、波形生成器またはポテンショスタット４７１９、ＰＭＡＭＳ４７２０から放出されるＥＣＬをイメージングするためのＣＣＤカメラ、波形生成器を制御するためのマイクロコンピューターを使用し、かつカメラ４７２１により受け取られる画像を解析する、多重アレイのＥＣＬ装置を示す。
【００３１】
図１に示される本発明の実施態様において、カセット１８０は、支持体物質１８２上に導電性物質１８１を含む作用電極を含む。複数の結合ドメイン（すなわち、ＰＭＡＭＳ１８３）はまた、試料と試薬を導入するための手段（流体チャネル１８４）と対電極１８５を含む。参照電極１８６も含有されてもよい。
【００３２】
別の実施態様において、複数の結合ドメインでＥＣＬシグナルを同時に発生するために複数の作用電極が使用される。本実施態様において、各結合ドメインからのＥＣＬシグナルは、光イメージング装置を使用せずに同定される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施態様において、規定量または前もって決められた量の１つまたはそれ以上の試薬を表面上に再現可能に固定化することが望ましい。固定化は、試薬が表面に結合している任意の方法に広く適用され、これらの方法は：共有化学結合；非特異的吸着；表面上の試薬の乾燥；静電相互作用；疎水性および／または親水性相互作用；液体またはゲル中の封じ込めまたは巻き込み；生物特異的結合（例えば、リガンド／受容体相互作用またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション）；金属／リガンド結合；キレート化、および／またはポリマー中の巻き込み、を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
表面上に固定化される試薬の量は、いくつかの方法で前もって決めることができる。例えば、表面上の試薬の量は、試薬が存在する、１つまたはそれ以上の容量および／または面積要素により規定することができる。また、表面上に固定化される試薬の個々の分子の数により規定することもできる。試薬の量は、所定の領域の特定の試薬の密度によって規定することができる。試薬の量は、表面の全面積に関して、または表面上に存在する他の試薬の量に対しての、特定の試薬を有する表面の百分率として規定することができる。試薬の量はまた、測定が目的の特異性を達成するのに十分なＥＣＬ強度を与えるために、特定の表面上に存在する必要のある試薬の量として定義することができる。具体例では、金表面の１cm2の面積がアルカンチオールの単層でコーティングされていてもよい。
【００３５】
試薬はまた、コーティングされた表面上に再現可能に固定化されていてもよい。コーティングは、いくつかの試薬の固定化を増強するのに役立ち、および／または他の試薬の固定化を低減または妨害するのに役立つことがある。表面は完全にコーティングされるか、または表面は部分的にコーティング（すなわち、パターン付けされたコーティング）することができる。コーティングは、組成が均一であるか、または異なる組成の要素を含有してもよい。具体例において、コーティングは、ある領域では免疫グロブリンＧを共有化学結合により固定化し、他の領域ではその固定化を防止する、パターン付けされた単層フィルムであってよい。
【００３６】
コーティングはまた、後の工程またはプロセスにおいて表面上に固定化される１つまたはそれ以上の試薬の量を前もって決めるのにも役立つ。あるいは、特定試薬の量は、沈積される試薬の量を制限することにより制御することができる。
【００３７】
定量的に再現可能な方法で固定化された試薬（またはコーティング）を有する表面であれば、試料からのＥＣＬシグナルを再現可能かつ定量的に測定する能力が得られ、こうして較正が可能になる。
【００３８】
概して、本発明のカセットを使用して実施される測定は、複数の別々の結合ドメインの使用が有効な測定である。例えば、このようなカセットの使用により、広い範囲の目的のアナライトの迅速および／または同時の検出または測定が可能になる。好適な実施態様において、本発明の測定法はまた、ＥＣＬ標識試薬、アナライトまたは結合表面の使用が有効な測定法である。本発明のＥＣＬ測定は、複数の結合ドメインを、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と接触させて、結合したＥＣＬ標識物からのＥＣＬ発光を引き起こすことを含んでなり、ここでＥＣＬ標識物は、アナライト上にあるか、またはアナライトの競合物質上にある、または複数の結合ドメインの上にある。
【００３９】
本発明は、（ａ）電極上に固定化された１つまたはそれ以上の結合ドメインを接触させ（接触は、ＥＣＬ標識物に標識された分子を含む試料と行われる）、（ｂ）結合ドメインでＥＣＬを引き起こすのに有効な電位波形を適用して、そして（ｃ）ＥＣＬを測定または検出することを含んでなる、目的のアナライトを検出または測定するためのＥＣＬ測定法を提供する。
【００４０】
試料という用語は、広い意味で使用される。これは、本発明の方法で使用される、ある量の任意の物質を含む。非限定例によりこれは、目的のアナライトを含有する測定される物質の一部、前処理したかまたは調製したその一部、または本発明の方法で使用されるある量の試薬を含む。
【００４１】
本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上の支持体の表面に固定化されている、１つまたはそれ以上の結合ドメインを接触させて（ここで接触は、電気化学発光標識物に結合した分子からなる試料と行われる）；（ｂ）電極を前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインに接近させて；（ｃ）前記１つまたはそれ以上の複数の結合ドメインにＥＣＬを引き起こすのに有効な電位波形を適用して；そしてＥＣＬを検出または測定することからなる、目的のアナライトを検出または測定するためのＥＣＬ測定法を提供する。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）１つまたはそれ以上の支持体の表面に固定化されており、そして（ii）複数の電極と対電極の対と共に、これらと接近させて、間を空けて整列している１つまたはそれ以上の結合ドメインを、電気化学発光標識に結合した分子からなる試料と接触させて；（ｂ）電極と対電極を、前記結合ドメインに接近させて；（ｃ）前記結合ドメインに電気化学発光を引き起こすのに有効な電位波形を適用して；そして（ｄ）電気化学発光を検出または測定するための、ＥＣＬ測定法を提供する。
【００４３】
本発明は、多成分の液体試料のある容量中の、試料中に種々の濃度で存在するかもしれない目的の複数のアナライトを検出する方法を提供する。
【００４４】
概して、複数のアナライトは、１０-3モル濃度未満で多成分試料から検出することができる。好ましくは、複数のアナライトは、多成分試料から１０-12モル濃度未満で検出することができる。
【００４５】
本発明は、不均一系測定法、すなわち、結合した標識試薬を電気化学エネルギーに暴露する前に、複数の非標識試薬が複数の結合標識試薬から分離される測定法、および均一系測定法、すなわち、複数の非結合標識試薬と結合標識試薬が、一緒に電気化学エネルギーに暴露される測定法として実施することができる、多成分試料からの検出法を提供する。
【００４６】
本発明の測定において、特定のアナライトを検出するために使用される電磁線は、ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの１つまたはそれ以上の特徴としてその位置および／または配置を同定することにより、他のアナライトに対応する電磁線から識別可能である。
【００４７】
本発明の均一系測定において、電磁線は、非結合試薬に比較した結合標識試薬により放出される電磁線の量の増加または減少として結合標識試薬により放出される、あるいはＰＭＡＭＳ内の結合ドメインのパターンに対応するパターンの１つまたはそれ以上の特徴に空間的に対応する、光源から放出される電磁線の検出より、測定される。
【００４８】
図２０に示される本発明の方法の具体例において、サンドイッチ測定法は、特定のアナライト（Ａｎ）の結合に特異的な複数の結合ドメイン（ＢＤ）をその表面上に有する支持体（５）上で行われる。アナライトを含有することが疑われる試料が結合ドメインに適用されると、アナライトは結合ドメインに結合する。アナライト（Ａｎ）を選択的に結合するのに適切で、かつＥＣＬ残基（ＴＡＧ）で標識されてＡｂ−ＴＡＧを形成する抗体（Ａｂ）は、次に結合ドメイン上のアナライトに適用される。過剰の未結合Ａｂ−ＴＡＧを結合ドメインから洗浄後、電気化学発光を引き起こすのに適切な電位波形を電極によりＴＡＧに適用して（示していない）、結合ドメイン上の任意のＴＡＧからのＥＣＬ発光を引き起こす。ＥＣＬシグナルは、光検出手段により検出されて、ディジタルコンピュータ手段により記録される。
【００４９】
本発明のさらなる実施態様、特徴および変法は、後述のように提供される。
【００５０】
５．１．結合表面の作成
本発明をさらに理解するために、支持体上の結合ドメインの作成をさらに詳細に説明する。複数のアナライトに特異的な、表面上の結合ドメインのパターン付けされたアレイは、本明細書ではパターン付けした多重アレイの多重特異的な表面またはＰＭＡＭＳと呼ばれる。ＰＭＡＭＳは、例えば、自己組立単層（「ＳＡＭ」）のパターン付けにより、支持体上に作成される（ファーガソン（Ferguson）ら，１９９３，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６（２２）：５８７０−５８７５；プライム（Prime）ら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−１１６７；ライビニス（Laibinis）ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８４５−８４７；クマール（Kumar）ら，１９８４，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９８−１５１１；バイン（Bain）ら，１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０１：５２２−５２８）。表面パターン付け法はまた、物理的エッチング（例えば、ミクロ機械加工）（アボット（Abbott）ら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１３８０−１３８２；アボット，１９９４，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．６（５）：５９６−６０２）、ミクロ石版術（microlithography）（ライビニス（Laibinis）ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８４５−８４７）、光活性化化学の使用による表面への化学基の結合（サンドバーグ（Sundberg）ら，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（４９）：１２０５０−１２０５７）、および微小型押し法（micro-stamping techniques）（クマール（Kumar）ら，１９９４，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９８−１５１１；クマールら，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６３（１４）：２００２−２００４）の使用を含む。その他の表面パターン付け法は、流体または粒子の空間的に制御された分散のための方法（例えば、マイクロペン沈積（micropen deposition）（例えば、Ｘ−Ｙ平行移動を使用する表面上に送達するための微量流体ガイドを使用して））、毛細管充填（キム（Kim）ら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：５８１）、インクジェット法（Ink-Jet technology）、またはシリンジディスペンサーを含む。これらの方法の組合せを使用して複雑な表面パターンを提供することができる。図５Ａにおいて、異なる結合特異性が、単一の支持体上に存在してもよいことを示す、単に説明目的で幾何学図形６０２として表される形非依存性結合ドメインを有する支持体６００が示される。結合ドメイン間の表面６０４は、結合試薬の沈積物を閉じこめて結合ドメインを形成するために、疎水性であるか、あるいは親水性であってよい。結合ドメインおよび／または結合ドメイン間の表面は、非特異的結合に対して交互に感受性であるか耐性であり、および／またはこれらは共有または非共有相互作用により結合試薬の付加に対して交互に感受性または耐性でもよい。疎水性相互作用による非特異的結合が、表面に結合化学種を結合させる所望の付加方法でない場合、偶発的な非特異的結合が起こるのを防止するために、洗浄剤を添加してもよい。
【００５１】
結合ドメインは、このドメインの幾何学形状に依存して、大体０．１μm〜１０mmの幅または直径または最も大きな寸法である。表面は、例えば、ＥＣＬ測定溶液に暴露される特異的な結合成分を有するように、選択的に誘導体化される。さらには、結合ドメインでの非特異的相互作用は、別々の結合ドメインの暴露された表面上にポリエチレングリコールのような残基を導入することにより、特異的結合残基を維持しながら低下する（プライム（Prime）ら，１９９３，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１０７１４−１０７２１；プライムら，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−１１６７；パレ−グロスデマンゲ（Pale-Grosdemange）ら，１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：１２−２０）。
【００５２】
ＰＭＡＭＳは、大体２〜１０８の結合ドメインを含有してよい。好ましくは、結合ドメインの数は、５０〜５００である。さらに他の実施態様において、結合ドメインの数は、２５〜１００である。さらに別の実施態様において、結合ドメインの数は２〜２０である。
【００５３】
支持体は、ガラス、プラスチック、セラミック、ポリマー材料、エラストマー材料、金属、合金、複合箔（composite foils）、半導体、絶縁体、ケイ素および／または積層材料（layered materials）などを含むが、これらに限定されない、種々の材料であってよい。誘導体化エラストマー支持体は、例えば、ファーガソン（Ferguson）ら，１９９３，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８７０−５８７５；ファーガソンら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：７７６−７７８；ショウドハリー（Chaudhury）ら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２３０−１２３２）に記載されているように作成することができる。
【００５４】
ＰＭＡＭＳがその上に作成される支持体の表面は、種々の材料、例えば、網、フェルト、繊維材料、ゲル、固体（例えば、金属から形成される）、エラストマーなどを含有してもよい。支持体表面は、種々の構造的、化学的および／または光学的性質を有してもよい。例えば、表面は、剛性または可撓性、扁平であるかまたは変形しており、透明、半透明、部分的にまたは完全に反射するかまたは不透明であってよく、そして複合性、異なる性質の領域を有してもよく、そして２つ以上の材料の複合体であってもよい。表面は、パターン付けした表面の結合領域、および／または１つまたはそれ以上の表面上で本発明の触媒作用が起こるパターン付けした領域、および／または１つまたはそれ以上の表面上の電極のアドレスが可能なアレイを有してもよい。支持体の表面は、平面状、球状、立方体状、および円筒状を含む、任意の適切な形に形作ることができる。具体例において、ＰＭＡＭＳを有する支持体は、ディップスティックである。
【００５５】
ＰＭＡＭＳを有する支持体は、炭素、例えば、粒状炭素、黒鉛、グラッシーカーボンまたはカーボンブラックを含有するか、または１つまたはそれ以上の炭素繊維を含有してもよい。これらの繊維は、無定形または黒鉛炭素であってよい。
【００５６】
ＰＭＡＭＳを有する支持体は、「炭素小繊維」、「カーボンナノチューブ（carbon nanotubes）」、「カーボンチュブール（carbon tubules）」、「小繊維」および「バッキーチューブ（buckeytubes）」を含有してもよく、これらの用語はすべて、広いクラスの炭素材料を記載するのに使用される（エム・エス・ドレセルハウス（Dresselhaus, M.S.）；ジー・ドレセルハウス（Dresselhaus, G.）；ピー・シー・エクルンド（Eklund, P.C.）；「フラーレンとカーボンナノチューブの科学（Science of Fullerrenes and Carbon Nanotubes）」、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ、カリホルニア州、１９９６、を参照されたい。これは参考のため本明細書に組み込まれる）。我々は本出願を通して、この広い範囲の炭素ベースの材料を包含するために「小繊維」および「炭素小繊維」という用語を使用する。
【００５７】
米国特許第４，６６３，２３０号、５，１６５，９０９号、および５，１７１，５６０号に開示されるような個々の炭素小繊維は特に有利である。これらは、約３．５nm〜７０nmの範囲の直径と、直径の１０2倍より大きい長さ、順序付けられた炭素原子の多くの本質的に連続的な層の外部領域および明確な内部コア領域を有してもよい。単に例示目的で述べると、炭素小繊維の典型的な直径は、約７〜２５nmの間であり、そして典型的な範囲の長さは、１μm〜１０μmであってよい。炭素小繊維はまた、炭素原子の単一の層を有してもよい。
【００５８】
炭素材料は、凝集体を形成するように製造してもよい。米国特許第５，１１０，６９３号とその引用文献に開示されるように、２つまたはそれ以上の個々の炭素小繊維は、もつれた小繊維の微視的凝集体を形成する。これらの凝集体は、５nm〜数cmの範囲の寸法を有してよい。単に説明目的で述べると、微視的凝集体の１つの型（「綿菓子（cotton candy）またはＣＣ」）は、５nm〜２０μmの範囲の直径と、０．１μm〜１０００μmの範囲の長さを有する、もつれた繊維の紡錘または棒に似ている。再び例示目的で述べると、小繊維の微視的凝集体の別の型（「鳥の巣（birds nest）、またはＢＮ」）は、０．１μm〜１０００μmの範囲の直径を有するほぼ球形であってもよい。各型のさらに大きな凝集体（ＣＣおよび／またはＢＮ）または各々の混合物が形成されることもある（下記を参照のこと）。
【００５９】
支持体に使用することができる小繊維は、個々の小繊維、１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体、１つまたはそれ以上の小繊維の懸濁液、小繊維の分散液、小繊維と他の材料（例えば、油、パラフィン、蝋、ポリマー、ゲル、プラスチック、接着剤、エポキシド、テフロン、金属、有機液体、有機固体、酸、塩基、セラミック、ガラス、ゴム、エラストマー、生体分子および媒体など）との混合物、並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
小繊維は、ある場合には磁性であり、別の場合には磁性でない。小繊維が磁性または非磁性に作られる程度は、小繊維を製造するために使用されるプロセスにより制御される。そのようなプロセスの例は、米国特許第４，６６３，２３０号、５，１６５，９０９号、および５，１７１，５６０号に開示されている。ＰＭＡＭＳは、上述の支持体の上、中、またはこれに接近させて配置される。
【００６１】
ＰＭＡＭＳは、異なる型の表面結合基から生成することができる。これらが結合する表面上の単層を形成するのに使用することができる自己組立単層は、アルカンチオール（金および他の金属に結合する）、アルキルトリクロロシラン（例えば、ケイ素／二酸化ケイ素に結合する）、アルカンカルボン酸（例えば、酸化アルミニウムに結合する）、並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。この単層は最初に形成され、次に結合化学種が結合試薬を付加するのに使用される。自己組立後の誘導体化により、さらにピンホールまたは欠陥の少ない、支持体表面上の単層のより完全な二次元結晶性パッキングが生成する。単層は、自己組立の前にまたは後に、結合試薬により誘導体化することができる。単層における規則的な欠陥は望ましく、そして単層または支持体表面の自己組立の前の誘導体化により得ることができる。結合試薬上の誘導体基（例えば、暴露される結合基）が立体的に大きいなら、暴露される末端で密にパッキングされた表面を作り出すが、金属表面に規則的な間隙を作り出す。このことは、電荷が、これらの規則的な間隙を通って、試料溶液と接触している部分に結合したＥＣＬ標識残基まで流れさせるのに有用である。
【００６２】
不完全な単層の作成法は、当該分野で公知である。不完全な単層の作成のためのその他の方法は、結合試薬の希釈溶液からの単層の形成、完了前の単層形成反応の停止、照射（例えば、イオン性粒子）、光試薬または化学試薬によるより完全な単層に損傷を与えることを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、再び型押しに墨入れすることなく反復型押し操作を行うと、ある範囲の欠陥のある単層が得られる（ウィルバー（Wilbur）ら，１９９５，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１１：８２５）。
【００６３】
ＰＭＡＭＳは、マトリックスの表面上で生成することができる。マトリックスは、非常に導電性の高い、例えば、金属電極または導電性ポリマーフィルムであるか；またはマトリックスは、絶縁体であるか；またはマトリックスは、半導体および／または中程度の導電性の材料であってよい。マトリックス材料は、イオン導電体または多孔性材料であってよい。このような多孔性材料は、支持体材料および／または導電性材料および／またはフィルター材料および／またはチャネリング材料（例えば、流体、イオン性分子種の通過を可能にする）として利用することができる。
【００６４】
多孔性材料は、さらなる材料と組合せてもよい。例えば、さらなる多孔性材料、導電性材料、半導体材料、チャネリング構造および／または溶液（例えば、イオン性流体）と共に多孔性材料から複合構造を組み立てることができる。このような複合体は、積層構造、サンドイッチ構造、および／または分散した複合体であってよい。金属電極上に支持された多孔性材料である、固体マトリックスを使用することができる。あるいは、多孔性材料は、導電性材料、半導体材料、または半導体材料と導電性材料の組合せたものの間にサンドイッチされる。１つまたはそれ以上の結合ドメインは、多孔性材料の１つの連続するスラブ上に封じ込めるか、および／または各々１つまたはそれ以上の結合ドメインを有する支持体上の複数の別々の物体に配置してもよい。多孔性材料（例えば、ゲル）の表面は、平面状、半球上であっても、または任意の規則的な若しくは不規則な形をとってもよく、および／または種々の物理的な性質（例えば、エラストマー性、剛性、低密度、高密度、密度の勾配、乾燥、湿潤など）および／または光学的性質（例えば、透明、半透明、不透明、反射性、屈折性など）および／または電気的性質（例えば、導電性、半導体性、絶縁性、可変導電性、例えば、湿潤対乾燥など）を有してもよい。多孔性材料は、２つ以上の材料の複合体でもよい。
【００６５】
チャネルのパターンは、マトリックス中に形成されてよい。多孔性材料層は、厚さ５ミクロン〜２０００ミクロンであってよい。多孔性材料層はまた、２mmより厚い場合もある。
【００６６】
孔は、部分的および／または材料全体に拡大しているか、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、５０Å〜１００００μmの広い範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、この材料は、２００Å〜５００Åの範囲の寸法のいくつかの孔と、０．５μm〜１００μmの範囲の寸法のいくつかの孔を有する。
【００６７】
材料の多孔度は、材料全体で一定であるか、または材料の位置の関数として増大または減少していてもよい。材料は、無秩序におよび／またはランダムに分配された異なるサイズの種々の孔を有してもよい。
【００６８】
例えば、材料は、生物の細胞のように大きな物体を通過させるのに十分なほど大きいいくつかの孔、タンパク質または抗体のような大きな生物学的媒体を通過させることのできるいくつかの孔、有機低分子（分子量＜１０００）のみを通過させることのできるいくつかの孔、および／またはこれらの組合せを有してよい。
【００６９】
材料の多孔度は、１つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルション、懸濁液、気体、ゲルおよび／または分散液が、材料の中に、材料の中で、および／または材料を通り抜けて拡散することができる程度であってよい。材料の多孔度は、生物学的媒体が、材料の中に、材料の中で、および／または材料を通り抜けて（能動的にまたは受動的に）拡散することができるか、あるいは何らかの手段により強制的にこれを起こすことのできる程度である。生物学的媒体の例は、全血、分画血液、血漿、血清、尿；タンパク質、抗体またはその断片、細胞、細胞より小さい粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤の溶液を含むが、これらに限定されない。多孔性材料は、生物学的媒体が、１つまたはそれ以上の層を通過できるが、その他の層は通過できないような、異なる多孔度の１つまたはそれ以上の層を有してもよい。
【００７０】
多孔性材料はまた、イオン性分子種の流れによる電流を維持することができる。さらに詳細には、多孔性材料は、多孔性の水膨潤性ゲル、例えば、ポリアクリルアミドまたは寒天である。種々のその他のゲル組成物も利用可能である（例えば、ディー・エス・ソーン（Soane, D.S.）の「バイオテクノロジーへのポリマー応用（Polymer Applications for Biotechnology）」；ディー・エス・ソーン編；サイモンとシュスター（Simon & Schuster）：エングルウッド・クリフス（Englewood Cliffs）、ニュージャージー州、１９９２年、または「医学および薬学におけるヒドロゲル（Hydrogels in Medicine and Pharmacy）」第Ｉ巻〜III巻；エヌ・エイ・ペッパス（Peppas, N.A.）編；シーアールシー出版（CRC Press）；ボカレイトン（Boca Raton）、フロリダ州、１９８７年を参照のこと）。結合ドメインは、共有および非共有結合によりマトリックスに結合させることができる。（この主題に関する多くの総説および本が書かれている；数例をあげれば、ジェイ・タンピオン（Tampion J.）およびエム・ディー・タンピオン（Tampion M.D.）の「固定化細胞：原理と応用（Immobilized Cells: Principles and Applications）」ケンブリッジ大学出版（Cambridge University Press）：ニューヨーク州、１９８７年；「固相生化学：分析および合成の側面（Solid Phase Biochemistry: Analytical and Synthetic Aspects）」、ダブリュー・エイチ・スカウテン（Scouten, W.H.）編、ジョンワイリーとサンズ（John Wiley and Sons）：ニューヨーク州、１９８３年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells）」、パートＢ、ケイ・モスバッハ（Mosbach, K.）編、エルゼビア・アプライド・サイエンス（Elsevier Applied Science）：ロンドン、１９８８年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells）」、パートＣ、ケイ・モスバッハ（Mosbach,K.）編、エルゼビア応用科学（Elsevier Applied Science）：ロンドン、１９８７年；「酵素学の方法、固定化酵素および細胞（Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells）」、パートＣ、ケイ・モスバッハ（Mosbach, K.）編、エルゼビア・アプライド・サイエンス（Elsevier Applied Science）：ロンドン、１９８７年；また、「医学および薬学におけるヒドロゲル（Hydrogels in Medicine and Pharmacy）」、上記文献も参照のこと）。例えば、タンパク質はポリアクリルアミドとＮ−アクリロイルスクシンイミドの架橋コポリマーに、タンパク質の溶液による処理によって結合させることができる。結合ドメインはまた、重合またはゲル化の前の工程において多孔性マトリックス中に組み込むことができる。１つの実施態様において、結合ドメインは、種々のカップリング化学種を使用することにより、架橋していないポリマーに結合することができる。次にこのポリマーを架橋させることができる（例えば、アミド結合、ジスルフィド、エポキシドへの求核攻撃などを含む化学種を使用して）（例えば、ポラック（Pollack）ら，１９８０，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２（２０）：６３２４−３６を参照のこと）。結合ドメインは、モノマー分子種に結合することができ、次にこれは重合の間にポリマー鎖に組み込まれる（オー・アダルスタインソン（Adalsteinsson, O.），１９７９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．６（３）：１９９−２２５を参照のこと）。さらに別の実施態様において、結合ドメインは、重合／ゲル化の間に孔に結合ドメインを捕捉することにより、または多孔性マトリックスおよび／またはフィルム中への結合ドメインの浸透により、ゲル中に取り込まれてもよい。さらに、結合ドメインは、例えば、疎水性および／またはイオン性相互作用により引き起こされる非特異的な吸着により、多孔性マトリックス（例えば、ポリマーゲルおよびフィルム）の表面上に吸着されてもよい。架橋または結合剤として、有利にはビオチンが使用される。アビジン、ストレプトアビジンまたは他のビオチン結合物質も結合ドメイン中に取り込むことができる。
【００７１】
ＰＭＡＭＳは、種々の孔サイズおよび溶媒含量を有する多孔性材料（例えば、ゲル）上に生成することができる。例えば、種々の孔サイズのポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの濃度と架橋の程度を変化させることにより調製することができる。
【００７２】
アナライトよりも小さな孔サイズを有するＰＭＡＭＳ上では、結合反応は実質的にゲルの表面上で起こる。この場合、ゲルによる濾過および／または電気泳動を利用して、ゲルの表面でアナライトを濃縮し、結合反応の速度を調節する（例えば、速度を増大させる）ことができる。速度を高めると迅速な測定（例えば、結果が出るまで短時間）において有利であり、短い時間で高感度が得られる。
【００７３】
アナライトよりも大きな孔サイズのＰＭＡＭＳでは、結合反応は、大量のゲルの中と同様に表面上で起こりうる。この場合に、濾過および／または電気泳動を利用して、結合の速度を増大させて、表面から未結合種を除去することができる。
【００７４】
ゲル上に形成されるＰＭＡＭＳは、湿潤状態で保存しても、および／または乾燥状態で保存して測定の間に再構成してもよい。ＥＣＬ測定法に必要な試薬は、保存の前にゲルに組み込まれるか（ゲル中への浸透またはゲルの形成中の取り込みにより）、および／またはこれらは測定中に添加してもよい。
【００７５】
ＰＭＡＭＳのパターン付けした結合ドメインは、液体のマトリックス中に各結合ドメインを含有する液滴または微小液滴の基質への適用により、生成することができる。次に液体の凝固および／またはゲル化は、種々の公知の方法（重合、架橋、ゲル化遷移点以下の冷却、加熱）により引き起こすことができる。凝固またはゲル化を引き起こす物質がこの液滴に含まれているため、適用後のある時点で、この液滴は凝固および／またはゲル化する。次の処理（例えば、光、放射線および／または酸化還元電位への暴露）を利用して凝固および／またはゲル化を起こしてもよい。その他の実施態様において、このような液滴または微小液滴は、スラリー、重合前混合物、粒子群、および／または実質的に固体の液滴であってよい。さらに気相析出（vapor phase deposition）を利用することができる。
【００７６】
パターン付けはまた、各々１つまたはそれ以上の結合ドメインを含有するマトリックスの積層構造を形成することにより、達成することができる。例えば、抗体に結合（標準的化学による）したアガロースを容器に注ぎ入れて、冷却することによりゲル化させた。次に他の抗体を含有する次の層を最初の層上に注ぎ入れて、ゲル化させた。この積層構造の横断面は、複数の別々の結合ドメインを提示する連続表面を与える。このような横断面を積み重ねて、もう１つの横断面を切断してさらに高密度の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳ表面を作り出すことができる。あるいは、所定の結合要素を含有するマトリックスの線を相互に接近させて作るか、かつ／あるいは積み重ねる。このような構造はまた、横断面で切断して、ＰＭＡＭＳ表面として使用することができる。
【００７７】
パターン付けはまた、分離を達成するいくつかのマトリックスの能力を利用することにより達成することができる。例えば、核酸プローブの混合物を、ポリアクリルアミドスラブ中での電気泳動により分離して、複数の別々の結合ドメインを提示する表面を生成することができるであろう。
【００７８】
微量流体ガイド（microfluidic guide）も、支持体上のＰＭＡＭＳ結合ドメインを作成するのに使用することができる。微量流体ガイドの部分的な一覧は、中空毛細管、マトリックス（例えば、多孔性または溶媒膨潤性媒体）から作られたか、および／またはマトリックスで充填された毛細管、薄膜または液滴を支持することができる固体支持体を含む。毛細管は固体であってよく、そして試薬は毛細管の外表面に沿って流れ、試薬流体リザーバーは、ＰＭＡＭＳ表面と接触させられる多孔性マトリックス先端に露出してもよい。例えば、試薬リザーバーは、所定の多孔性マトリックス先端が、何回も試薬（例えば、単層および／または結合試薬などを形成するためのアルカンチオール）を再現可能に沈積することができるように、連続的にまたは周期的に再充填される。さらに、この先端の多孔度を変化させると、表面への試薬の流れを制御することができる。異なるかまたは同一の結合試薬は、複数の毛細管中に存在してもよく、および／または多数の別別の結合物質は、所定の毛細管中に存在してもよい。毛細管をＰＭＡＭＳ（例えば、パターン付けしたＳＡＭ）表面と接触させて、そのため、ある領域が結合試薬に暴露されて、別々の結合ドメインが作り出される。各々異なる微量流体ガイド中に存在する異なる結合試薬は、同時に流体ガイドアレイから、必要に応じて金属表面、ＳＡＭなどに送達される。微量流体ガイドはまた、支持体表面への適用の前に、微小型押しに目的の分子を補充するために使用することができる。例えば、個々の微量流体ガイドは、支持体の表面への吸着を促進してＰＭＡＭＳを形成する残基（例えば、炭化水素リンカー上の遊離チオールであり、これは金への吸着を促進する）に結合した、異なる結合試薬を適用するために使用することができる。すなわち、例えば、微量流体ガイドの使用により異なる特異性の抗体を充填した微小型押しは、金表面上の目的の領域にこのような抗体を適用して、ＰＭＡＭＳの別々の結合ドメインを形成するために使用することができる。
【００７９】
微量流体ガイドはまた、小さなオリフィスを通って液滴の放出による流体の微小液滴を送達するミクロプリント装置（例えば、インクジェットプリンタ（Ink-Jet printer））の使用に関する。これらの装置の放出液滴は、加熱、静電荷、および／またはピエゾ装置からの圧力などの異なる機構により引き起こされる。２つ以上の液体のパターン付けは、多数のオリフィスおよび／または１つのオリフィスおよび適切なバルブ調節の使用により達成することができる。
【００８０】
ＰＭＡＭＳの１つの作成方法において、微量流体ガイドを使用して、表面上の別々の領域に、目的の結合試薬を含有する液滴を直接（好ましくは同時に）送達して別々の結合ドメインを形成する。結合試薬は、これが適用される表面上の化学基と結合する化学官能基を含有してもよい。別の変法において、液滴中の結合試薬は、表面に非特異的に吸着または結合される（例えば、表面上で乾燥する）。
【００８１】
あるいは、表面上に沈積した液滴は、マトリックスを形成することができる試薬を含有してもよい。このマトリックスは、固体、ポリマーまたはゲルであってよい。マトリックスの形成は、溶媒の留去によってもよい。モノマー分子種の重合でもよい。前もって形成されたポリマーの架橋でもよい。温度の調節（例えば、冷却および／または加熱）でもよい。他の方法でもよい。例えば、ポリマー分子種を冷却遷移（cooling transition）により、またはゲル化を起こす試薬の添加により冷却してもよい。固体マトリックスの形成は、光（または他の放射線）、凝固またはゲル化を誘導する試薬の添加、冷却または加熱による、電極での反応性分子種（基質を含む）の生成により誘導することができる。さらに、表面は、マトリックス形成（例えば、ゲル化または重合）を開始することができる触媒を含有してもよい。
【００８２】
好適な方法において、適用した流体またはゲルの拡散を防止するために、パターン付けした親水性／疎水性領域を使用することができる。このような流体またはゲルは、支持体の表面に結合してＰＭＡＭＳの結合ドメインを形成する結合試薬を含有してもよい。この場合、このような親水性／疎水性境界の使用は、別々の領域に生成した結合ドメインを閉じこめる助けとなる。あるいは、流体は、表面上にマトリックスを形成することができる試薬を含有し、そして結合試薬は、表面上に沈積されるとき規定される領域内に含有される。例えば、親水性／疎水性境界の助けは、液滴を規定される領域に閉じこめるために使用することができる。さらに、親水性または疎水性領域のいずれかは、マトリックスに組み込まれて（例えば、共有または非共有結合して）、基質へのマトリックスのより安定な接着を可能にする基を提示することができる（イタヤ（Itaya）とバード（Bard），１９７８，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５０（１１）：１４８７−１４８９）。別の方法において、適用される流体またはゲルは、目的のアナライトを含有する試料であり、この試料を作成したＰＭＡＭＳに適用する。１つの好適な例において、親水性溶液を含有する毛細管を使用して溶液を別々の領域に沈積して、疎水性領域に囲まれた親水性ドメインを作り出すことができる。あるいは、親水性領域に囲まれた疎水性結合ドメインを、結合試薬あるいはアナライトを含有する疎水性流体と共に使用することができる。疎水性および親水性とは、相互について、および／または適用される試料についての、すなわち、結合ドメインに適用される流体あるいはゲル試料の拡散または湿潤が制御されるための、相対的な用語である。さらに、微量流体アレイからの制御された溶液の沈積は、物理的表面の特徴（例えば、表面上のウェルまたはチャネル）を使用して達成することができる。微量流体ガイドは、カセットに含まれ、またはさらに好ましくは、使用の前に支持体に特異的な試薬を適用するのに使用することができる。
【００８３】
多数の型押しを使用して、同じ支持体表面に２つ以上の結合化学種を適用することができるか、および／または親水性および疎水性結合ドメインの両方を有する表面を作り出すことができる。例えば、親水性結合ドメインを位置１に、そして疎水性結合ドメインを位置２に必要とする領域は、以下の通り作成することができる。最初の親水性型押しは、位置１に円盤を、そして位置２により大きな環を有するように作られる。第２の疎水性型押しは、位置２に型押し１により残される環状単層の内側に適合する円盤を有するように作られる。最後に、表面を単層成分の疎水性溶液で洗浄する。
【００８４】
詳細には、ＰＭＡＭＳは、ミクロコンタクトプリンティング、すなわち、型押しにより生成する。こうして適用された単層は、表面結合基から構成され、これは、例えば、金表面については、アルカン（（ＣＨ2）ｎ）スペーサーを有するチオール基が好適である。スペーサー基は、結合基Ａに結合（好ましくは共有結合）される。「Ａ」は、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチン、あるいは利用可能な相補的結合パートナーの「Ｂ」との任意の他の適切な結合試薬であってよい。Ａ：Ｂ結合は、共有または非共有であってよく、使用可能な当該分野で公知のいくつかの結合化学種は、例えば、バード（Bard）ら（米国特許第５，２２１，６０５号および５，３１０，６８７号）により開示されている。「Ｂ」はさらに、抗体、抗原、核酸、薬剤、または試験すべき試料中の目的の１つまたはそれ以上のアナライトに結合することができる結合ドメインを形成するために適切な他の物質のような、結合試薬に結合している。Ｂはまた、ＥＣＬ  ＴＡＧまたは標識物に結合していてもよい。結合基Ｂは、異なる結合表面特異性を有する複数の「Ｂ」試薬を、単層「Ａ」結合上に配置することができる、毛細管または微量流体ガイドアレイ（図５Ａ〜５Ｃ）によりＳＡＭに送達することができる。ＡとＢはまた、単層に結合する前に結合することができる。図５Ａでは、考察したように単に例示の目的で幾何学図形６０２として、異なる結合特異性が、単一支持体６００上に存在しうることを示すために、形に非依存性の結合ドメインが表される。図５Ｂは、微量流体ガイド（例えば、毛細管）アレイ６０６の平面図を提供する。ドット６１０は、横断面のガイドである。図５Ｃは、微量流体ガイドアレイ６０８の側面図を提供する。上部と底部から出ている線は、個々の微量流体ガイド６１０である。下面の幾何学図形６１２は、個々の毛細管からの結合試薬の送達により形成される特異的な結合ドメインを表す。
【００８５】
例として、上述の最初の型押し後、露出した表面（例えば、金）領域は、結合化学種Ａを含まず、上記最初の単層と反対の親水性／疎水性である、第２のアルカンチオールと反応することができる。このように、特異的結合ドメインは表面上に作成される。
【００８６】
１つの目的のアナライトに特異的な結合試薬を各結合ドメインに使用することができるか、または多数の目的のアナライトに特異的に結合する結合試薬を使用することができる。
【００８７】
さらに別の変法において、支持体表面は、上記図５Ａに示されるように、異なる結合化学種および／または結合残基を有する物質（例えば、結合試薬、ＥＣＬ標識、ＳＡＭ）により何度も型押しすることができる。
【００８８】
パターン付けした結合試薬は、安定であるか、および／または頑丈な化学基（例えば、これらが受ける条件に耐えて残る基）であってよく、これが後であまり安定でないかまたは強い結合基に結合する。ＰＭＡＭＳ表面の作成における各工程の条件を最適化するために、および／またはＰＭＡＭＳ表面の製造法を単純化するために、多数の結合の仕方を利用することができる。例えば、最初のＰＭＡＭＳ表面は、一般的な方法で組み立てて、次に異なるＰＭＡＭＳ表面を作り出すために修飾してもよい。別の例において、一般的なＰＭＡＭＳ表面を、それ自体がＰＭＡＭＳ表面上の特定領域（例えば、結合ドメイン）に向ける結合ドメインを含有する結合試薬の溶液混合物と反応させることができる。例えば、各々異なるオリゴ（ヌクレオチド）配列を提示する結合ドメインのパターンを表面に結合する。次にこの表面を、各々表面上の配列に相補的なオリゴ（ヌクレオチド）配列に結合している、二次結合試薬の混合物を含有する溶液で処理する。このように、これらの二次結合要素のパターン付けを達成することができる。好ましくは、オリゴ（ヌクレオチド）配列は、６〜３０量体のＤＮＡである。あるセットの６〜３０量体配列は、実質的に同様な配列相補性を有するため、ハイブリダイゼーションのおよその結合定数は、所定のセット内で同様であり、相補性の低い配列とは識別可能に異なっている。別の実施態様において、二次結合要素はタンパク質（例えば、抗体）である。
【００８９】
下記セクション５．１３に記載されるように、表面上に適用された試薬または試料の湿潤または拡散を阻害するための記載された方法はまた、ＰＭＡＭＳの作成（および／または試料の適用）においても使用することができる。適用される電位（例えば、電極／対電極の対から）を使用して、試薬および／または試料の沈積および／または拡散をさらに制御することができる（例えば、アボット（Abbott）ら，１９９４，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０（５）：１４９３−１４９７を参照のこと）。
【００９０】
ＰＭＡＭＳ結合試薬は、炭素（例えば、粒状炭素、カーボンブラック、カーボンフェルト、グラッシーカーボンおよび／または黒鉛）を含有する材料上に存在してもよい。ある実施態様においてこれらはまた、炭素繊維（例えば、炭素繊維または炭素小繊維）に存在する。結合試薬は、１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体に存在してもよい。多くの実施態様において、ＰＭＡＭＳ結合試薬は、これらの炭素材料の懸濁液、炭素材料と他の材料との混合物並びにその組合せに存在してもよい。
【００９１】
ＰＭＡＭＳ結合試薬は、支持体上にまたは支持体内にまたはこれに接近して存在する複数の個々の小繊維および／または小繊維の凝集体に存在してもよい。１つの例において、結合試薬は、分散した個々の小繊維または小繊維凝集体に存在する。これらの小繊維または小繊維の凝集体は、支持体上の別々のドメイン中に間を空けて配置することができ、そして本出願で定義される結合ドメインを構成することができる。
【００９２】
別の例において、個々のこのような結合ドメインまたは複数のこのような結合ドメインは、支持体の間の空いた別々の領域内に存在する。非限定的な例として、個々のこのような結合ドメインまたは結合ドメインの集合は、支持体の凹部、くぼみおよび／または穴に存在してもよい。さらに別の例において、個々の結合ドメインまたは複数のドメインは、支持体の表面上に局在化している、水、ゲル、エラストマー、プラスチック、油などの液滴に存在してもよい。また別の例において、個々の結合ドメインは、異なる結合試薬および／または結合試薬／小繊維全体に対して異なる結合親和性を有するコーティング（パターン付けされていてもよい）により、支持体上に局在化してもよい。
【００９３】
結合ドメインは、複数の個々の小繊維上に配置されるか、および／または小繊維の凝集体は、１つまたはそれ以上の微量流体ガイド（例えば、毛細管）により支持体上に作成することができる。異なるかまたは同一の結合試薬は、複数の微量流体ガイドの中または上に存在するか、および／または多数の別々の結合試薬が、所定の微量流体ガイドの中または上に存在してもよい。毛細管は、支持体と接触（スポット付け）させるか、および／または、微量流体ガイドおよび／または表面をもう一方に対して走査または移動させながら（すなわち、字を書くときのペン様の方法）、試薬を送達することができる。微量流体ガイドは、小繊維上に存在する結合試薬を支持体に送達して、別々の結合ドメインを作り出すように、支持体のある領域が小繊維結合試薬複合体に暴露されるようにしてもよい。好適な面において、各々異なる微量流体ガイドに存在する異なる結合試薬は、ガイドアレイから同時に支持体に送達される。１つの例において、結合試薬および／またはこれらが局在化される小繊維は、支持体の表面への結合（例えば、共有または非共有相互作用）を形成する化学官能基により誘導体化される。いくつかの実施態様において、結合試薬と小繊維は、表面に非特異的に結合するか、または吸着される。さらに別の面において、小繊維上に局在化される結合試薬は、支持体の表面の凹部、くぼみおよび／または穴に送達することができる。別の例において、結合試薬は、ある結合試薬または結合試薬／小繊維全体に対してより強いかまたは弱い結合親和性を有するため、他の結合試薬と間を空けて別々に局在化される試薬のドメインを作り出す、材料でコーティングされている表面に送達される。
【００９４】
結合試薬は、磁性の１つまたはそれ以上の個々の小繊維または小繊維の凝集体上に局在化される。このような場合、磁性支持体は、磁性小繊維上に局在化した結合試薬を支持体に引きつけることができる。
【００９５】
支持体は、磁性でない領域に囲まれている、磁性であるいくつかの別々の領域を含有することができる。磁性小繊維上に局在化される結合試薬は、支持体の磁性領域上に局在化することができる。１つの例において、支持体は、かつ磁性でない領域に囲まれている、磁性である１つまたはそれ以上の領域を含有してよく、磁性領域の磁界の強さは調節するか、または切り替えることができる。この面において、このような調節された、または切り替え可能な磁界の使用は、支持体の表面から小繊維上に局在化される結合試薬を付加または放出する際に助けとなり、このため、前記ドメインを撹拌または混合するのに役立つ。
【００９６】
大体２〜１０8の結合ドメインが存在し、好ましくは２５〜５００ドメインが存在する。
【００９７】
結合ドメインは、作用電極および／または対電極上に存在することができる。
【００９８】
異なる型のＰＭＡＭＳ、支持体、および電極並びにそれらの配置について本明細書に記載される異なる実施態様はまた、相互の組合せで実施することができる。
【００９９】
ＰＭＡＭＳ支持体は、後の使用のために保存（例えば、保護表面コーティング、表面の乾燥、真空下または不活性雰囲気下の頑丈な包装、冷蔵および関連方法）することができる。
【０１００】
５．２．結合試薬
本発明の結合ドメインは、少なくとも１つの目的のアナライト（リガンド）に特異的に結合する結合試薬を含有するように作成される。別々の結合ドメイン内の結合試薬は、結合ドメインが目的の結合特異性を有するように選択される。結合試薬は、目的のアナライトを特異的に結合することができるか、またはできることが推定されることが当該分野で公知の任意の分子の中から選択することができる。目的のアナライトは、下記セクション５．１０の「実施することができるＥＣＬ測定法」に記載されるものの中から選択することができる。すなわち、結合試薬は、受容体、受容体のリガンド、抗体またはその結合部分（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）’２）、タンパク質またはその断片、核酸、オリゴヌクレオチド、糖タンパク質、多糖、抗原、エピトープ、細胞および細胞成分、細胞内粒子、炭水化物残基、酵素、酵素基質、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、有機化合物、有機金属化合物、ウイルス、プリオン、ウイロイド、脂質、脂肪酸、リポ多糖、ペプチド、細胞内代謝物、ホルモン、薬剤、トランキライザー、バルビツール酸、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖類、非生物学的ポリマー、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマー樹脂のような有機結合化合物、リポタンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、合成ポリマー、有機および無機分子などを含むが、これらに限定されない。核酸とオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチド類似体を意味し、これらには、修飾塩基または修飾糖を含有するオリゴヌクレオチド、ホスホジエステル結合以外の基本骨格化学種を含有するオリゴヌクレオチド（例えば、ピー・イー・ニールセン（Nielsen, P.E.）（１９９５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｃｌ．Ｓｔｒｅｅｔ．２４  １６７−１８３を参照のこと）、および／または他の分子への結合（共有または非共有）を形成するのに使用することができる化学基を提示するように合成または修飾されているオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない（ここで、我々は核酸またはオリゴ（ヌクレオチド）を２つまたはそれ以上の核酸塩基および／または核酸塩基の誘導体を含有するとして定義している）。
【０１０１】
本発明のＰＭＡＭＳは、異なる結合ドメインにより目的の異なるアナライトの結合を与えるために、相互に同一であり、かつ他の結合ドメインに含まれる結合試薬とは特異性の異なる結合試薬を含有する、少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の別々の結合ドメインを有してもよい。例として、このようなＰＭＡＭＳは、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）にハイブリダイズするオリゴを含有する結合ドメイン、ＨＩＶにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する結合ドメイン、ＨＩＶタンパク質または糖タンパク質に対する抗体を含有する結合ドメイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する抗体を含有する結合ドメイン、または前記の任意の部分集合からなる。
【０１０２】
ＰＭＡＭＳは、単一の結合ドメインが多数の目的のアナライトに結合することができるように、結合特異性の異なる結合試薬をその中に含有する、少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の結合ドメインを有してよい。例として、このようなＰＭＡＭＳは、Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体とＣＤ４のようなＴ細胞表面抗原に対する抗体の両方を含有する、結合ドメインからなる。
【０１０３】
ＰＭＡＭＳは、（ｉ）相互に同一であり、かつ他の結合ドメインに含まれる少なくとも１つの結合試薬とは特異性の異なる結合試薬を含有する、少なくとも１つの結合ドメイン；および（ii）結合特異性が異なる結合試薬をその中に含有する少なくとも１つの結合ドメインからなる、複数の別々の結合ドメインを有してよい。例として、（ａ）単一の本体（例えば、Ｔ細胞抗原受容体、例えば、α、β−Ｔ細胞抗原受容体またはγ、δ−Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体）の結合試薬を含有するため、この少なくとも１つの結合ドメインが、このＴ細胞抗原受容体を発現する全ての細胞に結合することができる、少なくとも１つの結合ドメイン；および（ｂ）２つの異なる結合試薬、例えば、Ｔ細胞抗原受容体に対する抗体とＣＤ４に対する抗体を含有するため、その少なくとも１つの結合ドメインが、そのＴ細胞抗原受容体を発現するＣＤ４＋Ｔリンパ球（すなわち、Ｔリンパ球の部分集団）に結合することができる、少なくとも１つの結合ドメインを有するＰＭＡＭＳが製造される。
【０１０４】
別の実施態様において、少なくとも１つの結合ドメインは、異なる分子であるが同じ結合特異性を有する結合試薬（例えば、上皮成長因子と上皮成長因子受容体に対する抗体のような結合試薬）を含有する。
【０１０５】
複数の結合試薬は、これらの試薬が、異なっており、異なる結合特異性を有するとしても、同じアナライトを認識するように、選択することができる（別の実施態様においては、異なるアナライトが認識される）。例えば、アナライトが、多くの結合残基を有するアナライト（例えば、異なる細胞表面抗原を有する細胞）である場合は、異なる結合残基に結合する異なる結合試薬は、同じアナライトを認識するであろう。別の例として、単一細胞上の異なる細胞表面抗原に対する抗体は同じ細胞を認識するであろう。さらに別の例として、単一抗原の異なるエピトープに対する抗体は、その抗原を認識するための結合試薬として使用することができる。
【０１０６】
複数の結合試薬は、複数の結合ドメイン（このような結合ドメインは、同じアナライトを認識するが異なる親和性を有する）が形成されるように、選択することができる。このようなＰＭＡＭＳの使用は、広範囲の濃度（例えば、高親和性結合ドメインは、より低い親和性結合ドメインを飽和しない条件下でアナライトで飽和される）にわたってアナライトの検出を可能にする。
【０１０７】
なおさらなる実施態様において、目的の単一アナライトに特異的に結合する結合試薬のみが、１つまたはそれ以上の結合ドメインに存在する。あるいは、２つ以上の目的のアナライトに特異的に結合する結合試薬は、１つまたはそれ以上の結合ドメインに存在する（例えば、交差反応性抗体）。特定の設計において、あるクラス（例えば、同様の特徴を有する）のアナライトに結合する結合試薬を使用することができる。
【０１０８】
結合ドメインはまた、目的の標準的アナライトに特異的で、内部標準として利用される結合試薬を含有するＰＭＡＭＳ中に組み込むことができる（例えば、結合試薬が結合するアナライトの明確な量を含有する試料と接触させることのできる結合ドメイン）。同じアナライトに特異的な結合試薬を含有する多数の結合ドメインはまた、分析結果の統計的平均化が可能になるように、ＰＭＡＭＳ中に組み込むことができる。結合試薬は、同じアナライトに特異的であるだけでなく、同一であり、このため、アナライト上の同じ結合残基を認識する。すなわち、ＥＣＬの読みを変量について照合し、正確度を改善するために統計的に平均化することができるように、同じ結合残基に特異的に結合する複数の結合ドメイン（例えば、２〜１０8個の範囲内の）を作成することができる。ＰＭＡＭＳ上の複数の結合ドメインは、単一の支持体上の、対照のアナライトまたは目的のアナライト、あるいは両方に特異的であってもよい。
【０１０９】
別の例として、１つまたはそれ以上の別々の結合ドメインは、既知の初期濃度数のＥＣＬ標識物で作成することができる。組み込まれたＥＣＬ層は、例えば、標識物の分解および温度効果をモニターするための対照として役立つ。
【０１１０】
基質（この基質は、目的のアナライトである）に対して特異的な酵素である結合試薬を使用することができ、そして基質上のこの酵素反応の産物は、レポーター物質（検出可能な物質）、例えば、ＥＣＬ反応を引き起こす産物、蛍光分子、適切な酵素との接触により色を変化する基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色性基質）などである。このような実施態様の例において、結合試薬として使用される酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であり、これは、試料中のグルコースを検出または測定するために使用することができる。ＥＣＬ標識物は、ＧＤＨを含有する結合ドメイン内、またはその近くに位置する。ＮＡＤＨは、グルコースへの酵素の作用により産生し、ＮＡＤＨはＥＣＬ標識と反応して、ＥＣＬを促進することができる（マーティン（Martin）ら，１９９３，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２８１：４７５）。
【０１１１】
バックグラウンド結合を増大させる結合試薬（すなわち、目的のアナライトだけでなく試料中の他のアナライト上に存在する結合残基にも結合する）を含有する結合ドメインを、電気化学発光の検出または測定の間のシグナル対ノイズ比を増大させるために使用することができる。例として、目的のアナライトが特異的な細胞の部分集団（例えば、ＣＤ４＋細胞）であり、かつ試料が患者からの細胞を含有する液体試料（例えば、血液）である場合、シアル酸に対する抗体を試料中の実質的に全ての細胞に対するバックグラウンド結合を増大させる結合試薬として使用し（シアル酸は、実質的に全ての細胞表面糖タンパク質の成分であるため）、そしてその細胞の部分集団に対して特異的な細胞表面糖タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＤ４に対する抗体）を結合試薬（シアル酸に対する抗体を含有する結合ドメインと同じかまたは異なる結合ドメイン中の）として使用することができる。
【０１１２】
５．３．電位波形
ＥＣＬセルの電極および対電極にかけられる電位波形（電位／時間の変化）は、ＥＣＬ反応を引き起こすのに十分なものである必要がある。この電位波形は通常、第１の電位で開始して、着実に第２の電位に移行し、第１の電位を通過して第３の電位に移行し、再度第１の電位に戻す、一定の掃引電位の形である。例えば、波形は、−０．５〜０．５ボルトの範囲の第１の電位で開始し、１〜２．５ボルトに上げて、第１の電位を通過して、０．０〜−１ボルトの範囲の第３の電位に移行してもよい。別の例として、より単純な波形で、電位を０．０〜＋３．５〜０．０に変更することができる。電位波形は、線形傾斜路、階段関数、および／またはその他の関数を組み込むことができる。電位波形は、電位が１つの電位に固定されて留まる時間を組み込むことができる。適用される電位は、１つまたはそれ以上の参照電極に対して制御されるか、または参照電極を使用しなくてもよい。さらに、負電位を使用することができる。従って、本発明のカセットからのＥＣＬ発光を誘導するために使用される電位は、ＥＣＬラベルに対する最適なＥＣＬシグナル強度と特異性、および測定媒体について、容易に選択されるであろう。
【０１１３】
いくつかの適用において、電位は、好ましくは結合ドメインから放出される光が測定されるにつれ変化する。このことは、結合ドメインに光を放出させるのに必要な電場の閾値を決定するために特に重要である。この場合、結合ドメインに適用される電位は、光を放出するのに必要な閾値以下であると考えられる値で開始して、最初の測定が放出される光により行われる。光が測定されなければ、または光が、前もって決めた閾値以下であるならば、電極対間に適用される電位は、コンピュータ制御電位供給源によるなどして、コンピュータ制御下で増大させて、もう一度光測定を行う。このプロセスは、前もって決めた適切な量の光が受けられるまで、反復することができる。このように、適用される電位は、測定シグナルとして使用することができる。
【０１１４】
電位波形は、ＡＣ成分を含有してもよい。このような波形の使用は、（例えば、電位入力と周波数が異なるシグナルをフィルターで除くことにより）ＥＣＬシグナルの検出においてより良好なシグナル対ノイズ比を可能にする。
【０１１５】
例えば、米国特許第５，３２４，４５７号および５，０６８，０８８号に開示されるような、電位および電流の設定に詳しい普通の技術者であれば、ＥＣＬ発光を引き起こすための最適な操作電位および掃引電位を容易に選択することができるであろう。
【０１１６】
ＥＣＬを生成するために要する電位は、作用電極が半導体であるか、または光に応答して電流を生成する別の残基を含有するならば、作用電極表面の発光により生成することができる。
【０１１７】
５．４．アドレスが可能な電極およびその使用法
複数の電極／対電極の対をアドレスするために多くの方法を使用することができる。このような方法のいくつかを図１４〜１８に例示する。これらの図面に例として４つの電極／対電極の対１０１、１０２、１０３、１０４、および典型的にはディジタルコンピュータであり、かつ検出手段により検出されるＥＣＬを処理するために使用されるのと同じコンピュータである波形発生器が示される。
【０１１８】
図１４において、各電極／対電極の対１０１〜１０４は、波形発生器に接続される線の対により個々にアドレスされている。例として、線１０５、１０６は、電極／対電極の対１０１にアクセスしている。適切な波形は、種々の電極／対電極の対に接続されている任意の１つまたはそれ以上の線の対に、任意の所定の時間に適用することができる。
【０１１９】
電極対をアドレスするのに要する接続部の数を低減するために、図１４の直接接続概略図の代替法が提供される。例えば、いくつかのまたは全ての電極に電気的エネルギーを与えるための、行と列のアクセス概略図が図１５に例示されている。この概略図において、複数の電極／対電極の対の各行の１つの電極２０１、２０２は、支持体２００上の共通の導電体２０５に接続されており、複数の電極／対電極の対の各行の対電極の各々は、支持体２００上の導電体２０７、２０８に接続されている。導電体２０５、２０６は、支持体２００の縁で各々接続部Ｃ１、Ｃ２に接続し、そして導電体２０７、２０８は、各々接続部Ｒ１、Ｒ２に接続する。これらの各接続部は、次に、別々の線により波形発生器に接続されている。この結果、図１５の構成において、必要な接続部および波形発生器からのシグナル線の数は、８から４に減少した。
【０１２０】
各電極対の迅速で一連のエネルギー付与を可能にするために、コンピュータ制御切り替え装置は有益である。図１６の構成は、第１のマルチプレクサー３１０に接続した複数の電極を示している。複数の対電極は第２のマルチプレクサー３２０に接続している。第１のマルチプレクサーはまた、典型的には後述される時間変動電位を供給する、電位供給源３３０の第１の極にも接続されている。第２のマルチプレクサーも、電位供給源の第２の極にも接続されている。各マルチプレクサーに電気的に接続され、ラッチ３４０に接続されている線Ａ０〜Ａ３のアドレスを使用して、コンピュータプロセッサー３５０は、任意のまたは全ての第１電極を電位供給源の第１の極に、任意のまたは全ての第２の電極を電位供給源の第２の極に選択的に接続するために、マルチプレクサーを管理することができる。
【０１２１】
図１７に示されるように、複数の電位供給源が、各電極への別々のセットのマルチプレクサーにより接続されている。第１の電位または電位の範囲が特定の電極対で必要であれば、その電位を提供する電位供給源４３０につながったマルチプレクサー４１０、４２０が、典型的にはラッチ３４０により、コンピュータプロセッサー３５０にアドレスされて、こうして問題の電極対にその特定の電位供給源を接続する。別々の電極対に異なる電位または電位の範囲が必要であるならば、異なる電位供給源４６０につながったマルチプレクサー４４０、４５０がコンピュータプロセッサーによりアドレスされて、こうして電位供給源が、つながったマルチプレクサー４４０、４５０により、電極対に接続される。
【０１２２】
この実施態様の電極アレイが、独立に駆動可能な電極対の少なくとも一部を有するならば、図１４または１５に示されるように、例えば、１つの電極対は、１つの電位供給源により駆動することができ、一方もう１つの電極対は同時に別の電位供給源で駆動される。あるいは、図１７の２つの電位供給源は、両方のセットのマルチプレクサーと並列に接続された単一の電位供給源で置換されて、同じ電位供給源から２つの電極対が駆動可能であってもよい。
【０１２３】
図１７に示される各電位供給源の二重のセットのマルチプレクサーの代わりに、図１８に示されるように複数の電位供給源５２０、５３０を提供することができる。これらの電位供給源は、コンピュータ制御電気スイッチ５１０または１セットのマルチプレクサー３１０、３２０に対するスイッチにより接続することができる。図１８に示されるように、コンピュータは、特定の電位供給源をマルチプレクサーに接続するようにスイッチ５１０を管理し、また、選択される電位供給源を目的の特定の電極対に接続するようにマルチプレクサーを管理する（これらのアドレス線Ａ０〜Ａ３にシグナルを送ることにより）。
【０１２４】
あるいは、任意の実施態様において各電極対に適用される電位を変化させることができる。これは、複数の異なる結合ドメインを有するカセットが使用されるときには特に有益である。このようなカセットは、異なる結合ドメインで異なる範囲の適用電位を必要とするかもしれない。各電極に適用される電位を変化させることのできるいくつかの異なる実施態様が企図される。
【０１２５】
有利には、コンピュータ制御電位供給源が使用される。コンピュータ制御電位供給源は、コンピュータによりアドレスを行って供給すべき特定の電位を選択することができるものである。あるいは、前もって決めた時間にわたり、特定の範囲の電位を順に適用するようにプログラムすることができる。このようなシステムにおいて、コンピュータに接続されるアドレス線および電位供給源は、コンピュータが、エネルギーを与えるべき電極対に適用される特定の電位を生成するように電位供給源をプログラムすることを可能にする。
【０１２６】
複数の電極対をアドレスするためのさらなる方法も使用することができる。例えば、そこに適用される電位を検知するように、複数の参照電極を、各複数の電極と対電極の対に接近させて配置することができる。このように、電位波形のさらなる制御を維持することができる。
【０１２７】
図３６は、本発明の別の実施態様を示している；電極のアレイ（３６００、３６０１）は、絶縁体３６０４中の間隙のパターン（例えば、穴３６０５を開けたプラスチックのシート）により分離される各々２つの表面（３６０２、３６０３）上に支持されている。各電極は、複数の間隙を横切ってもよい。各表面上の１つの電極間に電位が適用されるならば、電流は、両方の電極に接触している間隙を通過できるだけであり、このため、発生する任意の電気化学すなわちＥＣＬの位置を限定することになる。図に示される好適な実施態様において、電極（３６００、３６０１）は、支持体上の線のアレイである。この２つの表面上の２セットの電極は、相互に垂直に向いている。絶縁シートの間隙は、各表面からの電極の交差部分にのみ位置する。
【０１２８】
この実施態様は、導電性の低い導線を必要とする電極を個々にアドレスするには有利である。
【０１２９】
別の実施態様において、絶縁体３６０４は省かれ、表面は２つの表面の間に狭い間隙のみが存在するように、非常に接近させて配置される。この実施態様において、各表面上の電極間に適用される電位は、優先的に電極の交差部分で電流を通過させ（すなわち、電極間の距離が最小である場合）、このため、発生する任意の電気化学すなわちＥＣＬの位置を限定することになる。
【０１３０】
５．５．光の検出
引き起こされたＥＣＬ発光により生成される光は、本発明の装置に隣接して置かれる適切な光検出器により検出される。光検出器は、例えば、フィルム、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）あるいは他の光検出器またはカメラであってよい。光検出器は、順に発光を検出するための単一の検出器であっても、または放出光の単一または多数の波長での同時放出を検出し空間的に解像するために複数の検出器であってもよい。放出され検出される光は、可視光であっても、または赤外線または紫外線のような非可視光として放出されてもよい。検出器は、静置型であってもまたは移動可能であってもよい。放出される光または他の放射線は、カセットの結合表面の上、またはこれに隣接して位置する、レンズ、鏡および光ファイバーのガイドまたは光コンジット（単一の、多数の、固定の、または移動可能な）により、検出器に導くことができるか、あるいは検出器は光を直接受けることができる。さらに、支持体、ＰＭＡＭＳおよび電極表面自体を利用して、光の伝搬をガイドするか、または可能にすることができる。
【０１３１】
ＰＭＡＭＳは、各検出器が、１つの結合ドメインからの光のみを受けるように、光検出器のアレイの表面上に形成することができる。光検出器のアレイは、ＣＣＤチップであってよく、そして結合ドメインは、半導体装置の表面に結合されていてもよい（標準的なカップリング化学種を使用して）。
【０１３２】
結合ドメイン上、または近くの第２の表面上に沈積される液滴は、放出される光を管理または制御するためのマイクロレンズとして使用することができる。あるいは、光検出器は、カセットの前に直接向けることができ；そして、放物面反射装置またはレンズのような種々の光焦点調整装置を、任意の複数の結合ドメインからの光を検出器に向けるために光コンジットの代わりに利用することができる。少なくとも２つの別々の結合ドメインから放出される光は、同時にまたは順に測定することができる。
【０１３３】
熱ドリフト、装置の老化、または光検出器に固有の電気的ノイズによるエラーは、光測定装置と測定される結合ドメインの間の「チョッパー」手段により制御することができる。チョッパーは、光の通過を可能にする溝穴または切り抜き部を有する回転円盤のような、当業者には周知の普通の機械的なチョッパーの任意のものであってよい。あるいは光は、ＬＣＤシャッター、ＬＣＤシャッターのアレイ、固体光弁などによりチョップすることができる。あるいはＬＣＤシャッターの平面アレイ、または光学計算の分野で公知の固体光弁を使用することができる。これらの装置は、好ましくはカセットの面と、光コンジット（単数または複数）または結合ドメインからの光を光検出器に向ける光焦点調整装置との間に配置される。ある実施態様において、シャッターは、各結合ドメインの上に配置される。ＬＣＤシャッターまたは光弁を使用するとき、シャッターは、異なる光放出結合ドメインについて異なるチョッピング速度を同時に提供するために、異なる周波数で調節することができる。この方法を使用して、複数の異なる光シグナルを重ね合わせて、単一の検出器により同時に測定することができる。次に光検出器に電気的に接続した電子帯通過フィルターを使用して、電気的な単一シグナルを、各々複数の個々の光成分の１つに対応する、いくつかの電気的成分に分離することができる。上記のように、または当該分野で公知の他の機構を使用して、光をチョップすることにより、ＡＣ光波形が作り出され、これでＤＣノイズ成分を電子的に取り除くことが可能になる。
【０１３４】
また、ＥＣＬシグナルは、試薬の消耗によるシグナル変調を修正するため、標準試薬で前に測定した結果と比較して較正することができる。
【０１３５】
５．６．ＥＣＬシグナルの解析
所定の結合ドメインから発生するシグナルは、ある範囲の値を有しており、これらの値は、「アナログ」シグナルを提供する定量測定と相関している。別の方法において、各ドメインから、アナライトが存在するかまたは存在しないかのいずれかを示す「ディジタル」シグナルが得られる。
【０１３６】
統計解析は、両方の方法について使用され、そして定量的な結果を提供するために複数のディジタルシグナルを変換するのに特に有用である。しかしいくつかのアナライトは、閾値濃度を示すディジタルの存在／非存在のシグナルを必要とする。「アナログ」および／または「ディジタル」フォーマットは、別々にまたは組合せて利用することができる。他の統計的方法をＰＭＡＭＳで利用することができる。例えば、表面上のＰＭＡＭＳの濃度勾配を作ることが可能である（ショウドハリー（Chaudhury）ら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１５３９−１５４１）。この方法は、濃度勾配にわたる結合の統計解析により濃度を決定するのに使用される。濃度勾配を有するＰＭＡＭＳの多数の線形アレイは、非常に多数の異なる特異的結合試薬により生成することができる。濃度勾配は、異なる濃度の結合試薬を提示する、別々の結合ドメインよりなっていてよい。
【０１３７】
カセットの結合表面上の対照測定システムの存在もまた、シグナル変動（例えば、カセットおよび他の成分の、分解、揺らぎ、老化、温度シフト、電気回路のノイズおよび光検出装置のノイズなど）に関して対照に対する各解析の均一性を確保するために重要である。例えば、同じアナライトについての多数の重複する結合ドメイン（同じアナライトに特異的な、同一の結合試薬または異なる結合試薬を含有する）を使用することができる。別の例において、既知濃度のアナライトを使用するか、またはＰＭＡＭＳの対照ドメインを既知量のＥＣＬ標識に共有結合させるか、または溶液中の既知量のＥＣＬ標識を使用する。
【０１３８】
本発明により実施される測定により、迅速かつ効率的に大量のデータを集め、そしてこれらを、例えば、臨床情報または研究情報の集合よりなるデータベースの形で保存することができる。集められるデータはまた、迅速な法医学的または個人的な同定に使用することができる。例えば、ヒトＤＮＡ試料に暴露されるときに複数の核酸プローブを使用すると、臨床試料または研究試料を同定するために容易に使用することができる、署名（signature）のＤＮＡフィンガープリントに使用することができる。
【０１３９】
５．７．マルチアレイのための電極の作成
電極は、大体０．００１〜１０mmの幅または直径であってよい。電極対の好適な範囲では、０．０１〜１mmの大きさ（幅または直径または電極対の形状に依存して最も広い寸法）である。
【０１４０】
好ましくは、電極は、透明金属フィルムまたは半導体（例えば、各々、金またはインジウム−酸化スズ）のような適切な導電性材料から、当該分野で周知のように、例えば、液晶ディスプレイなどの組立のように、組み立てられる。カセットの組立た形において、例えば、薄膜または湿潤表面のように、第１支持体と第２支持体の間に、分析用試料を含有するのに十分な空間が残る。
【０１４１】
電極は、例えば粒状炭素、カーボンブラック、カーボンフェルト、グラッシーカーボン、炭素繊維、炭素小繊維および／または上記の凝集体を含有する材料から組み立てることができる。
【０１４２】
１つまたはそれ以上の個々の小繊維および／または１つまたはそれ以上の小繊維の凝集体は、より大きな凝集体を形成するために加工することができる（米国特許第５，１２４，０７５号）。この大きな凝集体は、マットまたは網である。以後、「小繊維マット」という用語は、小繊維がもつれているかまたは絡み合っているマットまたはアミノを説明するのに使用される。小繊維マットは典型的には５０〜４００M2／グラムの間の表面積を有する。
【０１４３】
例として、小繊維マットは、分析用および／または分取用の電気化学において、作用電極、対電極または参照電極として使用することができる。１つの例において、小繊維マットは、電気化学発光（ＥＣＬ）用の電極として使用される。
【０１４４】
ＰＭＡＭＳの結合ドメインは、小繊維マットにより支持されてよい。本発明のＰＭＡＭＳは、複数の別々の結合ドメインを有し、この内２つまたはそれ以上は、相互に同一であっても、または異なっていてもよい。小繊維マットは、１つまたはそれ以上の結合ドメインを支持する。
【０１４５】
１つまたはそれ以上の微量流体ガイドを使用して、小繊維マット上に複数の結合ドメインを作成することができる。異なるかまたは同一の結合試薬が、複数の微量流体ガイドに存在しても、および／または多数の別々の結合試薬が微量流体ガイドに存在してもよい。
【０１４６】
図２２Ａおよび２２Ｂにおいて、複数の微量流体ガイド２２０１（好ましくはアレイ内）は、小繊維マット２２００の領域に、目的の結合試薬を含有する液滴を（好ましくは同時に）送達するために使用して、別々の結合ドメイン２２０２を形成する。結合試薬は、小繊維マット上に存在する残基との結合する。結合試薬は、マットに非特異的に吸着しても、または表面上で乾燥してもよい。
【０１４７】
目的の結合試薬は、マットに吸引濾過を適用しながら、小繊維マットに送達される。この場合に、吸引濾過は、結合試薬を全く引かないか、少しまたは全ての結合試薬をマット中にまたはマットを通して吸引し、そうすることで、パターン付けプロセス中のマットの表面上の結合試薬の横への拡散の量を低下させる。
【０１４８】
小繊維マットは、懸濁液の液体が通り抜けることのできる基質（例えば、フィルター）上に炭素小繊維の懸濁液を圧縮することにより、作成される。小繊維マットを形成するのに使用することができるフィルターの例は、濾紙、ポリマー性（例えば、ナイロン）膜から形成されるフィルター、金属マイクロメッシュ、セラミックフィルター、ガラスフィルター、エラストマーフィルター、ガラス繊維フィルターおよび／またはこのようなフィルター材料の２つまたはそれ以上の組合せを含む。濾過の分野の当業者であれば、これらの材料が、固体の懸濁液の濾過に適した多くの可能な材料の一例にすぎないことを認識するであろう。
【０１４９】
図２３Ａおよび２３Ｂは、小繊維マットが、吸引濾過により作成される実施態様を例示する。炭素小繊維の分散液および／または懸濁液２３０１を、場合によりフィルター膜２３０３および／またはフィルター支持体２３０２を取りつけたフィルター２３００を使用して濾過する。懸濁液は、例えばフィルターフラスコ２３０６によって、真空供給源２３０５によりフィルターに適用される吸引を使用して濾過される。小繊維マット２３０４は、フィルター膜２３０３および／またはフィルター支持体２３０２のいずれかまたは両方の上に集まる。小繊維マット２３０４は、フィルター膜２３０３と共にまたは膜なしに、フィルターから除去することができる。
【０１５０】
別の実施態様において、小繊維の懸濁液は、圧力の使用によりフィルターを通過させられる。１つの例において、懸濁液の上の空気および／または液体の閉じこめられた層をピストンで圧縮することにより、小繊維の閉じこめられた懸濁液上に圧力がかけられる。具体例において、小繊維の懸濁液は、シリンジ内に閉じこめられ、ピストンがシリンジプランジャーであり、そしてフィルターは、使い捨てのシリンジフィルターである（多くのこのようなフィルターは、当業者には周知である）。
【０１５１】
小繊維の懸濁液は、毛細管作用によりフィルターを通過させられるか、またはフィルター中へのまたはフィルターを通っての懸濁液の吸上作用により濾過される。
【０１５２】
別の実施態様において、個々の小繊維または小繊維の凝集体は、マット中に共有結合で架橋結合される。露光されると重合する光感受性残基で誘導体化した小繊維に、光を照射する。
【０１５３】
別の実施態様において、個々の小繊維または小繊維の凝集体は、基質上に噴霧される。これは電子噴霧を使用することにより可能である。
【０１５４】
フィルターは、その孔に小繊維を捕捉するために使用して、フィルターが支持体として作用する複合マットを形成することができる。図２４において、小繊維マット２４００は、供給源２４０２により２つの大きなローラー２４０３の間に送達される小繊維のスラリー２４０１を通過させることにより作成することができる。紙またはポリマーシートの作成において見い出されるプロセスに類似している、このプロセスにおいて、ローラーは、懸濁液から液体を絞り出して、小繊維の大きな連続したマットが生成して、ここから小さなマットを切り出すことができる。
【０１５５】
小繊維マットは、自立構造（例えば、支持されていない）であるか、または支持されている。
【０１５６】
濾過の速度は、マットにおける目的の性質を達成するために変化させることができる。例えば、変化させうる性質は、構造の均一性または非均一性、小繊維または小繊維の凝集体のもつれの程度、厚み、マットの多孔度、および／またはこれらの組合せを含む。
【０１５７】
炭素小繊維の懸濁液は閉じこめられて、小繊維が懸濁している液体は除去される。１つの例において、小繊維が懸濁している液体は蒸発除去させられる。別の例において、液体は加熱により除去される。さらに別の例において、懸濁液は遠心分離にかけられて、生じた液体（例えば、上清）は除去される。別の例において、液体は吸引により除去される。
【０１５８】
懸濁液は、上述の１つまたはそれ以上のフィルター上に置かれて、懸濁液を蒸発により乾燥させる。懸濁液は、加熱またはオーブンで加熱乾燥して乾燥させるか、または液体は、凍結および液体の抽出により除去することができる。さらに別の例において、液体は、ポンプで排気して除去される。当業者には周知の多くの他の方法が、懸濁液から液体を除去するために利用可能である。
【０１５９】
濾過により小繊維マットを形成するのに適した小繊維の懸濁液は、１つまたはそれ以上の炭素小繊維を適切な液体、半固体またはゲルに分散させることにより形成することができる。適切な液体の例は、水、エタノール、メタノール、ヘキサン、塩化メチレン、緩衝液、界面活性剤、有機溶媒、生物学的媒体を含有する溶液（例えば、タンパク質、抗体またはその断片、抗原、リポタンパク質、リポサッカリド、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤、低分子の溶液、ポリマー前駆体、酸または塩基の溶液、油および／またはこれらの組合せ）を含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
小繊維の懸濁液は、音波破砕により、炭素小繊維を水性溶液に分散させることにより調製することができる。別の実施態様において、界面活性剤および／または洗浄剤を添加してもよい。
【０１６１】
小繊維マットは、大体０．０１μm〜１０，０００μmの間の厚みを有してよい。
【０１６２】
好適な実施態様において、小繊維マットは、１μm〜１００μmの間の厚みを有する。特に好適な実施態様において、小繊維マットは、幅または直径が１０mm〜２００mmの範囲である。
【０１６３】
小繊維マットは、懸濁液から残った残渣物質を除去するために、繰り返し洗浄し再濾過することができる。
【０１６４】
濾過または蒸発により作成される小繊維マットは、加熱（例えば、オーブン内で）して、濾過により除去されない懸濁液からの残渣の液体を除去する。
【０１６５】
連続濾過工程を使用して、１つまたはそれ以上の別々の層からなる小繊維のマットを形成することができる。層は、多孔度、密度、厚み、個々の小繊維および／または小繊維の微視的凝集体の粒度分布、型、小繊維凝集体の数および／またはサイズ、小繊維の化学的誘導体化（下記を参照のこと）、および／または小繊維に結合している他の物質の存在を含むが、これらに限定されない、いくつかの性質により区別することができる。
【０１６６】
図２５の多層小繊維マット２５００は、連続濾過工程により作成される。未処理の小繊維の０．５μm〜１００μmの厚さの層２５０１が第１の層を形成し；ポリ−（エチレングリコール）のような残基を組み込み、タンパク質および他の分子の吸着に抵抗する、小繊維の０．５〜１０μmの厚さの層２５０２が第２の層を形成し；１つまたはそれ以上の結合ドメイン（上記を参照のこと）を組み込む、０．５〜５μmの厚さの層２５０３が第３の層を形成する。結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体２５０４を含有し、この抗体がアナライト２５０５に結合しうる。この抗体／アナライト複合体は、標識抗体に結合することができる。標識物は、ＥＣＬ標識物であってよい。他の実施態様において、標識物は、本出願の他の部分で記載される、１つまたはそれ以上の複数の標識物であってよい。このような多層マットは、自立構造であるか、または上述の複数の可能な支持体の１つの上に支持されていてもよい。
【０１６７】
層の組合せが存在し、いくつかのまたは全ての層が異なる多層マットが形成されてよい。
【０１６８】
小繊維マットを形成するのに使用されるフィルター、小繊維、および／または小繊維マットは、コーティングされていてもよい。特定の実施態様において、コーティングは金属である。これらのコーティングは、ある部分がコーティングされ、その他の部分がコーティングされないように、パターン付けしてもよい。１つの例において、コーティングは電着により適用される。別の例において、コーティングは無電解メッキにより適用される。金属沈着の別の方法（例えば、熱または電子線沈着またはスパッタリング）も使用できる。
【０１６９】
フィルターは、金属でコーティングされ、そして小繊維は、前記金属と結合を形成する化学官能基で誘導体化される。フィルターは、金属スクリーンまたは金属シートである。
【０１７０】
小繊維マットは、平板であるかまたは変形され、規則的であるかまたは不規則であり、円形、楕円形、長方形、または多くの形の１つ、剛性または可撓性、透明、半透明、部分的にまたは完全に不透明であってよく、かつ複合性または異なる個々のまたは複合性の領域を有してもよい。
【０１７１】
マットは、円盤状であるか、またはシートから取られる断片であってよい。
【０１７２】
複数の小繊維マットは、好ましくは同時に、かつ好ましくは１つのアレイに組み立てることができる。１つの例において、微量流体ガイドのアレイは、上述のように、支持体上に複数の小繊維マットを形成する。別の例において、フィルターのアレイまたはパターン付けしたフィルター（例えば、異なる多孔度の領域を有する）が、小繊維マットのアレイを作成するのに使用される。
【０１７３】
穴のアレイを有するマスク（例えば、スクリーン）が、フィルターまたは支持体のある部分を覆うために使用され、複数の別々の小繊維マットが濾過および／または蒸発のいずれかにより同時に作られる。
【０１７４】
小繊維マットは、０．１〜３．０グラム／cm2の密度を有してよい。マットは、可変的な密度を有してもよい。例えば、機械的な力または圧力を、異なる時間にマットに適用して、密度を増大または減少させることができる。
【０１７５】
小繊維マットは孔を有してもよい。これらの孔は、部分的におよび／またはマット全体に拡張されてもよく、または孔の網の一部であってもよい。これらの孔は、大体５０Å〜１０００μmの範囲の寸法を有してよい。好適な実施態様において、小繊維物質は、２００Å〜５００Åの範囲の寸法の孔を有する。マットの多孔度は、他の因子の中でも、マットの密度に依存するようである。
【０１７６】
マットの多孔性はマット全体で一定であるか、またはマット内の位置の関数として増加または減少する。小繊維マットは、不規則におよび／またはランダムに分散した異なるサイズの広範囲の多孔を有する。
【０１７７】
小繊維マットは異なる多孔性の明確な領域を含有する。例えば、小繊維マットは、それぞれが異なる多孔性を有する１つまたはそれ以上の層を有する。小繊維マットは、マット全体の異なる多孔性のカラムを有してもよい。
【０１７８】
マットの多孔性は、異なるサイズ、形、組成、または組合せを有する、炭素小繊維の凝集物の異なる量を含有させることにより変化させてもよい。具体例において、マットはＣＣ小繊維（前述）およびＢＮ小繊維（前述）、または異なる組合せである各小繊維から作成される。例えば、小繊維マットのある孔は生物細胞のような大きな物体を通過させるのに充分なほど大きく、ある孔はタンパク質または抗体の大きさの生物学的媒体を通過させることができ、ある孔は小さな（＜１０００分子量）有機分子のみを通過させることができ、および／またはこれらの組合せである。
【０１７９】
マットの多孔性は、１つまたはそれ以上の分子、液体、固体、エマルジョン、懸濁物、気体、ゲルおよび／または分散物が、マット中に、この内部、および／またはこれを通過するようなものである。小繊維マットの多孔性は、生物学的媒体がマット内、この内部、および／またはこれを通過して分散する（能動的にまたは受動的に）か、または何らかの手段で強制されるようなものである。生物学的媒体の例としては、分画した血液、血漿、血清、尿、タンパク質溶液、抗体またはその断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、核酸、抗原、リポタンパク質、リポ多糖、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、ホルモンまたは薬剤があるが、これらに限定されない。小繊維マットは、物質が１つまたはそれ以上の層を通過し、他の層は通過しないように、多孔性の異なる１つまたはそれ以上の層を含有してもよい。
【０１８０】
小繊維マットは、別の物質によりまたはその上で支持される。例えば、支持体物質は、金属、プラスチック、ポリマー、エラストマー、ゲル、紙、セラミック、ガラス、液体、蝋、油、パラフィン、有機固体、炭素、またはこれらの２つまたはそれ以上の混合物であってよい。物質は固体または液体である。固体の場合は、１つまたは複数の穴または孔を有する。具体例では、支持体は金属メッシュ、ナイロン濾過膜または濾紙がある。支持体は、導電体、半導体および／または絶縁体でもよい。小繊維マットは、マットの導電性を上げるために別の物質、例えば金属の薄い線維、破片、または球を含有してもよい。別の例では、小繊維マットは、小繊維単独で得られるものとは異なる多孔性を作成するために、種々のサイズ、形および密度の炭素、ガラスおよび／または金属線維を含有してよい。別の面において、マットは磁気ビーズ（例えば、ダイナル（DYNAL）ビーズ）を含有する。後の例で、ビーズはマットの多孔性を変化させるのに有用であるか、またはそれ自身が結合ドメインを固定化するための支持体として使用される。
【０１８１】
米国特許第５，３０４，３２６号および５，０９８，７７１号に開示の実施態様では、小繊維は別の物質に分散される。例えば、小繊維は、油、蝋、パラフィン、プラスチック（例えば、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリエチレン、アクリロニトリルなど）、セラミックス、テフロン、ポリマー、エラストマー、ゲル、および／またはこれらの組合せ中に分散される。他の物質中の小繊維の分散物は、成形、圧縮、二次成形、注型、遠心分離、編み込み、および／または投入により、所望の形および／または型に成形される。
【０１８２】
他の炭素材料（例えば、粒状炭素、炭素繊維、グラフィチック炭素、バックミンスターフラーレン、フラーレン、またはこれらの組合せ）が、別の物質中に分散される。これらは、他の物質をこれらに結合するのに使用することができる化学的官能基で誘導体化することができる。材料は共有結合によりこれらの官能基に結合されるか、または非共有結合的に吸着される。
【０１８３】
炭素小繊維は、その表面に共有結合した化学官能基を用いて作成される。国際特許公報第９０／１４２２１号に記載のように、これらの官能基は、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ2、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル、ポリ−（エチレングリコール）、チオール、アルキル（（ＣＨ2））ｎ）基、および／またはこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これらおよび他の化学官能基が、小繊維の表面に他の物質を結合させるのに利用できる。
【０１８４】
ある化学官能基（例えば、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨＳ−エステル）が、小繊維に他の小分子を結合させるのに利用できる。このような化学的官能基と小分子の複数の可能な組合せがある。
【０１８５】
多くの実施態様においてＮＨＳ−エステル基は、求核性化学官能基が、天然のおよび／または化学的修飾により、生体分子上および／またはその中に存在する。適当な生体分子の例には、アミノ酸、タンパク質およびその断片、抗体、抗体の結合性断片、酵素、核酸、およびこれらの組合せがあるが、これらに限定されない。これは多くの可能な方法の１つであり、本明細書に記載の例および他の類似の物質および／または生体分子に一般的に適用できる。好適な実施態様において、ＥＣＬに使用される試薬は、ＮＨＳ−エステル基を介して小繊維に結合してよい。
【０１８６】
ＥＣＬ測定法に使用できる抗体は、共有結合（例えば、ＮＨＳ−エステルとの反応）により、適当なリンカー（上記）により、非特異結合により、および／またはこれらの組合せにより、１つまたはそれ以上の小繊維または小繊維マットに結合することができる。小繊維に結合したＮＨＳ−エステルに共有結合により、小繊維または小繊維マットに、核酸および／または細胞を結合することができる。
【０１８７】
小繊維および／または小繊維マットへの物質の非特異結合の程度を調節することが好ましいことがある。非限定例として、タンパク質、抗体、抗体の断片、細胞、細胞内粒子、ウイルス、血清および／または１つまたはそれ以上のその成分、ＥＣＬ標識物（例えば、ＲｕＩＩ（ｂｐｙ）３およびＲｕＩＩＩ（ｂｐｙ）３誘導）、シュウ酸塩、トリアルキルアミン、Ａｇ、アナライトおよび／またはこれらの組合せの非特異結合吸着を低下または防止することが好ましい。別の例では、生体分子の結合を増強させることが好ましい。
【０１８８】
非特異結合を低下または防止する１つまたはそれ以上の化学残基が、炭素含有電極（例えば、カーボンブラック）または１つまたはそれ以上の小繊維、１つまたはそれ以上の小繊維凝集物別の材料中の小繊維の分散物および／または小繊維マットの中、上または近傍に存在してもよい。このような残基、例えばＰＥＧ残基および／または荷電残基（例えば、リン酸塩、アンモニウムイオン）が、電極に結合してもよい。
【０１８９】
支持体、電極および／または結合ドメインに使用される物質は、非特異結合を低下させるために、界面活性剤で処理される。例えば、小繊維または小繊維マットは、当業者に公知の界面活性剤および／または洗浄剤で処理される（例えば、ツイーンシリーズ、トリトン、スパン、ブリジ（Brij））。小繊維または小繊維マットは、界面活性剤および／または洗浄剤の溶液で洗浄、浸漬、インキュベーション、音波処理、またはこれらの組合せ処理を行われる。ＰＥＧおよびＰＥＧと同様の挙動を示す分子（例えば、オリゴ糖または多糖、他の親水性オリゴマーまたはポリマー）（「ポリエチレングリコールの化学：生体工学および生体医学的応用（Polyethylene glycol chemistry: Biotechnical and biomedical applications）」、ジェイ・エム・ハリス（Harris, J.M.）編、１９９２、プレヌムプレス（Prenum Press））の溶液を、界面活性剤および／または洗浄剤の代わりにおよび／またはこれとともに使用することができる。
【０１９０】
前記したようなある物質の好ましくない非特異吸着は、競合的非特異吸着により阻止される。この競合的結合種は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でもよい。
【０１９１】
ＥＣＬ−ＴＡＧの非特異結合は、ＴＡＧの化学修飾により低下させることができる。例えば、親水性を上昇させて（例えば、親水性結合、極性結合、水素結合、および／または荷電官能基を、Ｒｕ（ｂｐｙ３）中のビピリジルリガンドに付加することにより）、こうして他の表面へのＴＡＧの非特異結合を低下させるように、修飾してもよい。
【０１９２】
炭素含有材料（例えば、カーボンブラック、小繊維、小繊維マットおよび／または別の材料に分散された炭素）に生体分子または他の媒体を固定化することが好適であり得る。抗体、抗体の断片、タンパク質、酵素、酵素基質、インヒビター、補助因子、抗原、ハプテン、リポタンパク質、リポ糖、細胞、細胞成分、細胞受容体、ウイルス、核酸、抗原、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、タンパク質結合リガンド、薬剤、および／またはこれらの組合せを結合させてもよい。エラストマー、ゲル、コーティング、ＥＣＬ標識物、酸化還元活性種（例えば、トリプロピルアミン、シュウ酸塩）、無機物質、キレート化剤、リンカーなどの物質（但し、これらに限定されない）を、小繊維に結合させることが好ましい。
【０１９３】
１つまたはそれ以上のすなわち複数の種を、小繊維または小繊維マットの表面に非特異的に結合（例えば、吸着）してもよい。
【０１９４】
生体分子または他の媒体を、非特異的吸着により小繊維または小繊維マットに結合することができる。特定の小繊維についての非特異的吸着の程度は、それぞれの性質により決定される。小繊維上に存在するある化学官能基または生体分子は、非特異結合を低下または上昇させることができる。タンパク質の表面上の疎水性および／または親水性斑点の存在は、小繊維または小繊維マットへのタンパク質の非特異結合を上昇または低下させる。親水性および／または疎水性斑点は、調節された場所での非特異結合を調節するのに使用される。
【０１９５】
炭素はアルキル（ＣＨ2）鎖および／またはカルボン酸基で誘導体化して、生体分子または媒体もしくは他の物質の非特異結合を上昇させることができる。
【０１９６】
図２６は、単一の小繊維の場合の前記実施態様の略図である。小繊維２６００はアルキル鎖２６０１により誘導体化される。生体分子２６０２、２６０３、および２６０４は、アルキル鎖に非特異的に結合する。ポリマー／エラストマー２６０５もまた結合する。
【０１９７】
誘導体化していない小繊維、小繊維凝集物および／または小繊維マットは、非特異結合により生体分子、生物学的媒体、および他の物質の固定化に使用される。
【０１９８】
ＥＣＬ  ＴＡＧは、支持体および／または電極に選択的に結合するように使用できる荷電残基を含有する。例えば、正味の陰性荷電を有する誘導体化したＥＣＬ  ＴＡＧは、より還元性の電位の電極には親和性が比較的小さく、電極電位がより酸化性になると電極に対する親和性が大きくなる。電極に対するＥＣＬ標識および／または結合試薬の親和性は、調節できるように作成される。この調節は、結合の動力学の改善または洗浄工程の効率の改善のために使用される。
【０１９９】
図２８では、共有結合により分子（生物学的または非生物学的）が小繊維に結合される。ＮＨＳ−エステル化学官能基を有する小繊維２８００は、生体分子または生物学的媒体２８０２、２８０３に対する共有結合２８０１を形成する。これらの生物学的媒体はＮＨＳ−エステル基との反応により共有結合を形成するためにアミノ基を使用する。当業者は、分子のカプリング剤としてのＮＨＳ−エステル基の一般性を認識し、固定化を達成するための適切な生体分子および適切な反応条件を選択することができる。
【０２００】
一対の残基および／または分子「Ｍ１」と「Ｓ１」（このうち１つまたはそれ以上は小繊維に結合している）は、共通の親和性または結合能力を示す。Ｍ１／Ｓ１は、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／補助因子、酵素／インヒビター、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクター、核酸／核酸、タンパク質／核酸、ウイルス／リガンド、細胞／細胞受容体などであってよい。「結合対」Ｍ１／Ｓ１の多くの組合せは、所望の結合を達成するための組合せの選択を可能にする。Ｍ１とＳ１のいずれかまたは両方が、１つまたはそれ以上の小繊維に結合してもよい。
【０２０１】
図２７と２８は、本例で可能な多くの可能な配置の一部を例示する。図２７では、アルキル鎖２７０１で非特異的に誘導体化された小繊維２７００は、別の分子２７０３に対して共通の親和性または結合能力を有する分子２７０２に結合する。分子２７０３はまた、別の分子２７０４に結合している。阻止分子２７０５は、非特異的に小繊維に吸着される。分子２７０９に対して親和性を有するリガンド２７０８を有する阻止ポリマー２７０６および／またはポリマー２７０７は、非特異的に吸着される。
【０２０２】
図２８では、小繊維２８００は２８０１を介して、生体分子２８０２と２８０３、およびリンカー分子２８０４に共有結合している。リンカー分子２８０４は、別の生体分子２８０５に対して共通の親和性または結合能力を有する。生体分子２８０３は、別のリンカー分子２８０６に対して共通の親和性または結合能力を有し、これは２８０７に共有結合している。結合パートナー２８０９に対して特異的なリガンド２８１２を有するポリマー２８０８は、小繊維に共有結合している。阻止分子（例えば、ＢＳＡ）２８１１および阻止ポリマー２８１０は、共有結合している。
【０２０３】
小繊維は、ビオチンおよび／またはビオチン化リンカーにより誘導体化され、アビジンおよび／またはストレプトアビジンがこのリンカーに結合してもよい。アビジンおよび／またはストレプトアビジンは、小繊維に結合し、ビオチン化抗体および／またはタンパク質が結合してもよい。アビジンおよび／またはストレプトアビジンは、非特異結合、共有結合、別のもしくは同じカプリング対、またはこれらの組合せにより、小繊維上に固定化されてよい。「結合対」としての（ストレプト）アビジンおよびビオチンの使用は、生体分子または生物学的媒体を他の物質に結合するために広く応用されている方法であり、当業者に公知である（スピンケ（Spinke）ら、１９９３、ラングミュア（Langmuir）９：１８２１）。
【０２０４】
結合対は、モノクローナル抗体とこの抗体に結合する抗原であってよい。
【０２０５】
複数の結合対（例えば、Ｍ１／Ｓ１／Ｍ２）が形成されてよい。Ｍ１はモノクローナル抗体、Ｓ１はＭ１に対する抗原、そしてＭ２はＳ１に結合する抗体である。この複合体は、抗体／抗原／抗体「サンドイッチ」複合体（そのような抗体は、モノクローナル抗体であってもでなくてもよい）でもよい。Ｍ２はＥＣＬ活性標識物（前述）、蛍光標識物、放射性標識物、酵素標識物、および／またはこれらの組合せでもよい。
【０２０６】
Ｍ１は、金属、金属イオン、または有機金属化合物（「キレート化剤」）と複合体を形成する残基であり、Ｓ１はＭ１と複合体を形成する金属、金属イオン、または有機金属化合物（「キレート物質」）であり、そしてＭ２はＭ１／Ｓ１複合体に結合する生体分子上の残基であってよい（ゲルション（Gershon）とキルコ（Khilko）、１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７３７１）。
【０２０７】
表面上の電極に電流を分配するための金属性電極パターンと導電性成分の作成は、当該分野で公知の方法により行われる（例えば、レベンティス（Leventis）ら、米国特許第５，１８９，５４９号を参照）。透明な表面上の金属フィルムの作成は、液晶ディスプレイを製造するために使用されており、本発明の電極の作成に容易に適用できる。ハネコ（Haneko）、１９８７、液晶テレビディスプレイ、液晶ディスプレイの原理と応用（Liquid Crystal TV Displays, Principles and Applications of Liquied Crystal Displays）、ケーティーケー・サイエンティフックパブリッシャーズ（KTK Scientific Publishers）、トーキョー、ディー・レイデルパブリシング（D. Reidel Publishing）。透明電極表面もまた、例えばディミラ（DiMilla）らの方法（１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（５）：２２２５−２２２６）に従って作成できる。０．５nmのチタンと５nmの金を透明な基板（ガラスまたはプラスチック）の上に沈積させる。ディミラ（DiMilla）らの方法（前述）により作成した薄い金の層を用いて、クマール（Kumar）の方法により透明な電気的構造を作成する。透明性を維持しながら、電流運搬性の改良のために導電性層の厚さを増加させるようにこの方法を修飾することが好ましく、これは当業者に公知である。そのような方法は、ＰＭＡＭＳの別々の結合ドメインに整列または近傍にある電極表面の作成に使用される。
【０２０８】
さらにフィルムおよび／または単層は、ジャン（Zhang）とバード（Bard）の教示するような絶縁残基（例えば、アルキル鎖）を用いるより、電極表面からＥＣＬ標識物への電位の移動を促進する残基よりなる。例えば、広範な共役系のパイ軌道重複は電子移動に使用される。このようなパイ軌道電子移動は、ポリ−ピロール又は他の結合環または２重結合構造により提供される。
【０２０９】
オリゴヌクレオチドは、電子移動を調節するために使用される。例えば、２本鎖ＤＮＡ中の重複パイ結合は、電子移動速度を増加させるために使用される。電極表面に結合したオリゴヌクレオチドは、結合ドメイン中の結合物質として使用される。相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合すると、整然とした重複パイ結合を有する２重結合が形成される。具体例において、第１のまたは第２の固定化（例えば、支持体への共有結合）されたオリゴヌクレオチドがＥＣＬ標識される。別の実施態様において、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドまたは部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列がＥＣＬ標識する。第２のオリゴヌクレオチドに相補的なまたは部分的に相補的な三次オリゴヌクレオチドが標識される（例えば、サンドイッチ測定法）。分岐したオリゴヌクレオチド鎖も使用することができる。種々のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物が使用できる（例えば、修飾塩基、および／または例えば窒素及び／もしくはイオウを有する修飾骨格を有するオリゴヌクレオチド）。差別的試験を行ってもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド複合体中のパイ重複の安定性の変動は、電子移動により追跡できる。パイ結合で安定したＥＣＬ標識２重らせんオリゴヌクレオチド対から生成するシグナル（例えば、発生するＥＣＬ光および／またはインピーダンス測定）は、より不規則な１本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルまたは予測されるシグナルに対して相関付けられる。完全に相補的なＥＣＬ標識２本鎖オリゴヌクレオチドと部分的に相補的なＥＣＬ標識２本鎖オリゴヌクレオチドの間のＥＣＬシグナルは相関し得る。さらに複数オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド複合体が利用できる。例えば、三重らせんが利用できる。
【０２１０】
電子移動速度の変化は、ＥＣＬ検出並びに電子的手段を用いて測定される。ＥＣＬ標識物は、オリゴヌクレオチド鎖に共有結合するか、および／または非共有結合的に会合（例えば、挿入）してよい。ＤＮＡから電極への電子移動に対する小さい抵抗を確保するために、ＤＮＡはリンカーを使わずに（例えば、５’チオール化ＤＮＡまたは金）または短い（＜１０原子）リンカーを用いて電極に結合されてよい。電極からＤＮＡ鎖に効率的に電子を運搬できる結合鎖が使用される（例えば、ポリアセチレン鎖）。
【０２１１】
場合により単層またはフィルムの少なくとも１つの成分が電位の移動を促進する、混合単層および／またはフィルムが使用される。あるいは、電位の移動を促進する分子または粒子が、単層またはフィルムに吸着される。前記の例として、電極表面に吸着するかおよび／またはそれに近いパイ共役単層および／または導電性微粒子が、使用される。パターン付けされた規則的な間隙が単層および／もしくはフィルム中で形成される。ＥＣＬ標識物が次に結合される長鎖アルカンチオール（すなわち、絶縁性）からなる規則的な実質的に直角のＳＡＭ中の間隙の調節パターンを用いて、ＥＣＬ標識物に付加される有効な電位が調節される。例えば図１１は、金属層１２０４を有する１つの支持体１２０２から形成されるカセット１２００、ＳＡＭパターン１２０６およびＳＡＭパターンの間の間隙１２０８を示す。
【０２１２】
ＥＣＬ標識タンパク質は、単層表面に非共有結合してもよい。ＥＣＬ標識タンパク質は、メチルが末端にあるアルカンチオールで誘導体化した金表面に吸着してもよい。金表面は、作用電極または対電極として作用する。図１１〜１３に記載のように、複数の結合ドメインが１つの支持体に導入されてよい。好適な実施態様では、結合ドメインは標識および／または非標識タンパク質および／または核酸および／または細胞および／または化学的分子種を含有する。
【０２１３】
あるいは、単層の成分の長さ（例えば、アルカンチオール単層中のアルカン鎖の長さ）を変えて、単層の予測される表面の有効電位を調節できる。
【０２１４】
広い意味でアルカンチオールは、１炭素〜１００炭素の長さの炭素鎖を有してもよい。好適な実施態様において、アルカンチオールの炭素の長さは、２〜２４炭素を含有する。アルカンチオールの炭素鎖の長さは、２〜１８炭素である。炭素鎖の長さは７〜１１炭素である。このようなアルカンチオールは、測定媒体に暴露された種々の頭部の基（例えば、メチル基、水酸基、アミン、カルボン酸、オリゴ（エチレングリコール）、リン酸基、ホスホリル基、ビオチン、ニトリロ三酢酸、グルタチオン、エポキシド、ジニトロフェニル、および／またはＮＨＳ−エステル）を含有する。他の頭部の基には、組換え融合蛋白の精製と固定化に通常使用されるリガンドがある（例えば、サッセンフェルト（Sassenfeld）、１９９０、ＴＩＢＴＥＣＨ  ８：８８−９３）。結合ドメインは、種々の密度の結合試薬を得るために、種々の程度に誘導体化される。例えば、異なる密度の活性化可能な化学種が使用されるか、および／または種々の程度に誘導体化が行われる。所望の結合密度を作成するために、種々の化学が使用される。活性化可能な基および／または結合試薬の密度を調節するために、種々の単層を使用してもよい。結合基の密度は、ＥＣＬシグナル対ノイズ比を最適化するために調節される。他の結合ドメインからの他のＥＣＬ光シグナルに関して（そのＥＣＬ光シグナルが順番にまたは同時に、および／または光検出手段で検出されようが）、電気化学的光シグナルの強度を最適化するために、結合ドメイン内の結合部位の総数が調節される。
【０２１５】
ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインに関連するＥＣＬ標識物を１回またはそれ以上活性化するために、電位波形が適用される。複数のＥＣＬ光シグナルを生成するために、ＥＣＬ標識物が結合した同じアルカンチオール誘導体化表面に、ＥＣＬ光生成を活性化するのに充分な電位が複数回適用される。電位は、ＥＣＬを可逆的に生成するのに充分なだけ適用される。電位は、ＥＣＬを擬可逆的に生成するように適用される。電位波形の擬可逆シリーズにおいて、その中でＥＣＬ標識物が会合（例えば、結合）する結合ドメインは、化学的および／または物理的に改変されてよい。適用される電位波形シリーズは、不可逆性のＥＣＬ光生成を与える。
【０２１６】
さらに、単層の成分を放出するのに充分な電位が適用される。電極表面上の容量が小さい単層成分を放出することが好ましい（例えば、電極表面上の他の支持体またはプレート）。こうして単層が破壊されると、効率的に励起されていない一部のＥＣＬ標識物さえ電極表面で励起されて電気化学発光シグナルが生成し、ＥＣＬ標識物は小さな容量に限定され、電極からの拡散が制限される。ある電位の単層破壊の程度を調節するために、種々の単層組成が使用される。強い成分間親和性を有する成分を有する単層は、単層破壊に対してより耐性がある。長いアルカン鎖チオールは、短いアルカン鎖チオールより、有効に破壊に耐える。鎖の長さを変えることにより、所望の安定性が達成される。
【０２１７】
ＥＣＬシグナルを調節するために、ＰＭＡＭＳ内の結合ドメインの修飾を行ってもよい。複数のＥＣＬシグナルを生成するために、一連の電位波形が適用される。上記複数のＥＣＬシグナルは、追加のおよび／またはより良い結果を得るために使用される。ＥＣＬシグナルの変化速度の統計解析では、１つまたはそれ以上の結合ドメインの全体の質に関連付けられる。さらに上記複数のＥＣＬシグナルは、例えばあるシリーズのうちのあるＥＣＬシグナルをフィルターして、シグナル対ノイズ比を上げるのに使用される。さらに複数電位波形パルスは、非特異結合による好ましくないシグナルの調節を低下させるために使用される。ある荷電分子種の非特異結合を防ぐために電位が加えられる。さらに、あるアナライトまたは目的の化学分子種の結合ドメインの近くの局在化を促進するために、電位が加えられる。加えられるブイ電位波形が大きな過電位（例えば、ＥＣＬの生成に必要な以上の高い電位）を与える。電位波形シリーズのまたは単一の電位波形パルスのＥＣＬシグナルを調節するために、過電位が加えられる。さらに、ＥＣＬ反応動力学および／または結合電位を化学的および／または物理的に調節するために、過電位が使用される。さらに、電極の性質および／または電子的性質に関する情報を評価および／または関連付けおよび／または外挿するために、当業者に公知の１つまたはそれ以上の電位波形および／または他の電子的プローブが使用される。
【０２１８】
好ましくは、電極と接触する追加の導電性手段を用いて、作用電極表面積を拡大することにより、ＥＣＬ反応の効率を上昇させられる。導電性物質または導電性粒子の電極の突起部分または延長部分（例えば、ワイヤーまたは針電極）は、電界がより密接にＥＣＬ標識に近づくように、電極表面積を増加させるのに使用してもよい。あるいは、電極構造のへこみまたは穴は同じ目的に役立つ。
【０２１９】
特に、図１２に示すように、ＥＣＬ標識物の周りの電界の絶対値が増加するように、導電性粒子は電極表面の間隙を埋めるかおよび／または支持体または単層をカバーする。これらの導電性粒子は、電極表面積を拡大し、従ってＥＣＬ反応の効率を増加させる。図１２は、金属層１３０４上のパターン付けしたＳＡＭ１３０６を有する支持体１３０２を有するカセット１３００を示し、ＳＡＭパターンの間の間隙を埋める導電性微粒子（例えば、図１１の１２０８）を示し、および金属表面上に拡大していることを示す。磁性導電性粒子については、磁石または磁界を、粒子を表面に引きつけるために使用できる。導電性粒子はまた、電極表面と２つの近接した支持体を有するＰＭＡＭＳの結合ドメインの間の電位を拡大するために使用することもできる。図８では、カセット９００は、多重アレイの電極を有する第１の支持体９０２から構成され、第２の支持体９０４は、ＰＭＡＭＳを有する。導電性微粒子９０６は、電位を結合ドメイン上のＥＣＬ標識物に拡大するために、反対の表面の間に位置する（データは示していない）。
【０２２０】
あるいは、導電性ポリマーは、図１３に示すＳＡＭのＥＣＬ標識物の周りの電位の拡大を促進するために、電極表面上の露出した間隙から成長する。図１３は、パターン付けしたＳＡＭ表面１４０６上に金属層１４０４を有する支持体１４０２を有するカセット１４００を示す。導電性ポリマー１４０８は、多重アレイの電極（示していない）により提供される電界を、ＳＡＭ表面上の結合ドメイン（示していない）に拡大するために、ＳＡＭ表面上で成長する。導電性ポリマーはまた、前述のように図７に示す２つの近接する支持体の電極表面とＰＭＡＭＳの間の電位を拡大するために使用される。図７では、カセット８００は、近接する支持体８０２と８０４からなる。導電性ポリマー８０６は、結合ドメイン（示していない）上のＥＣＬ標識物に向けて電位を拡大するために、反対の表面の間で成長する。
【０２２１】
図９は、複数電極アレイを有する第１の支持体１００２を有する形成されるカセット１０００を例示し、第２の支持体１００４はＰＭＡＭＳ結合表面を有し、ここで作用電極の導電性突起部分（１００６）（例えば、細いワイアーまたは他の突起部分）は、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン中のＥＣＬ標識物の周りの電界を拡大する。
【０２２２】
電極対は、種々の構成で作成される。最も簡単な構成（本明細書の添付図面に記載されている）は、非導電性の平らな表面上の金属および／または金属酸化物フィルムおよび／または半導体フィルムで作成される。これらの電極対の電極は、好ましくはこれらの間の比較的一定の幅の領域を規定し、こうして比較的一定の電界を提供する。
【０２２３】
電極の他の構成が提供される。これらの構成のいくつかは、図１９（ａ）〜（ｅ）に示される。図１９（ａ）は、互いにかみ合った櫛様の電極対を示す。この構造では、各電極は、導電体から延びる複数の指を有し、櫛様構造を形成している。電極と対電極の対は、結合ドメインに隣接して位置するか、または結合ドメインが電極と対電極の間に位置してもよい。図１９（ｂ）は、１対の同心円電極（１つは環状で１つは半環状である）を示す。図１９（ｃ）は、その直線的な端が互いに向かい合っている２つの半環状電極を示す。図１９（ｄ）は、１対の長方形の電極を示す。図１９（ｅ）は、相補的な反対に曲がった表面を有してその間に波形の間隙を形成している互いにかみ合った１対の電極を示す。
【０２２４】
電極／対電極対はまた、整列のためのＰＭＡＭＳ結合表面上の形に相補的な特異的な形に作成されてもよい。形の例を図６Ｂに示す。電極対７１４−７２０を有する支持体７１２を示す。電極対は例えば、環状７１４、互いにかみ合う７１６、三角にかみ合う７１８、または複数の電極が互いにかみ合う７２０でもよい。
【０２２５】
前記した図１４〜１９に示す実施態様において、電極対は１つの支持体の上に位置する。あるいは、図２に示すように電極対は第１および第２の反対の支持体上に位置する。
【０２２６】
５．８．カセット
カセットは、本発明の１つまたはそれ以上の支持体を含有する。カセットは、複数の結合ドメインおよび１つまたはそれ以上の作用電極を含有してもよい。
【０２２７】
図２は、支持体２６上の複数の結合ドメイン３０のそれぞれが複数の電極３２の異なる１つに隣接しているカセットを示す。対電極３８は、第２の支持体２８上で形成される。ＥＣＬ測定は、前述のように試料を結合ドメイン３０の上に置き、次に支持体２６と２８を一緒に動かして対電極３８が結合ドメイン３０のそれぞれに隣接するようにして、前述のように導線３４を介して波形発生手段によりＥＣＬ反応を開始させ、ＥＣＬシグナルを光検出手段４０、ワイアー４１、およびデジタルコンピューター手段４２を用いて検出し記録する。
【０２２８】
図３は、複数の結合ドメイン４８のそれぞれが、支持体４４上で複数の電極／これに隣接する対電極対５０の異なる１つを有するカセットを示す。支持体４６は、支持体４６が、複数の結合ドメイン４８と複数の電極５０に隣接する試料封じ込め手段を形成するように、随時支持体４４に隣接して置かれる。すなわち、ＥＣＬ反応は、電気的接続５２を介して波形発生手段５４により開始させ、ＥＣＬシグナルを光検出手段５６を用いて検出し、デジタルコンピューター手段５８を用いて記録する。
【０２２９】
図２１に示す１つまたはそれ以上の支持体を含有するカセットが提供され、各対の支持体は、結合ドメインを含有する第１の支持体１５０１の表面が、第２の支持体１５０２の上に結合ドメインを含有する表面に向かい合うように位置し、ここで各表面は電極１５０４と結合ドメイン１５０６を含有し；そのため、第１の支持体上の各結合ドメインが第２の支持体上の電極に向かい合いこれと整列し、第２の支持体の各結合ドメインは第１の支持体上の電極と向かい合いこれと整列する。
【０２３０】
図４は、ＥＣＬ電極が随時提供されるカセットを例示する。支持体６０上の結合ドメイン６４を、アナライトを含有することが疑われる試料と接触させる。支持体６２上の領域６６は、目的のアナライトを検出もしくは測定するためまたは目的の反応を実施するための反応媒体を含有する。支持体６０と支持体６２は、一緒に近づけ、そのため結合ドメイン６４と領域６６は接触し、アナライトまたは反応生成物の存在は、レポーター系（例えば、フォト検出手段６８により検出される光学的、化学発光もしくは蛍光シグナル）により測定され、疑似コンピューター手段７０により分析される。
【０２３１】
好適な実施態様において、本発明のカセットまたは装置は、複数の別々の結合ドメイン上への試料送達のための手段からなる（例えば、米国特許第５，１４７，８０６号の図１の要素１；米国特許第５，０６８，０８８号の図１の要素１を参照のこと；いずれもその全体が引用により本明細書に組み込まれる）。試料送達の手段は、静置型であってもまたは移動可能であってもよく、かつ１つまたはそれ以上の入口、穴、孔、チャネル、パイプ、微量流体ガイド（例えば、毛細管）、チューブ、スピゴットなどを含むが、これらに限定されない当該分野で公知の任意のものであってよい。流体は、例えば、ポンプ、ピペット、シリンジ、落下流、毛細管作用、吸上作用、電気泳動、圧力、真空などの種々の周知の方法により、システムを移動することができる。流体移動の手段は、カセット上に配置しても、または分離したユニット上に配置してもよい。試料は、全ての結合ドメイン上に一緒に置くことができる。あるいは、試料は、支持体上のＰＭＡＭＳへ直接流体試料を送達するための自動ピペッターにより支持体上に載せるか、または結合表面へ後から直接送達するためのカセットまたはカセットホルダー内のリザーバー中に入れることができる。
【０２３２】
支持体は、ガラス、プラスチック、セラミック、重合性材料、エラストマー材料、金属、炭素または炭素含有材料、合金、複合箔、ケイ素および／または積層材料を含む材料から調製することができるが、これらに限定されない。支持体は、非常に多様な構造的、化学的および／または光学的性質を有してよい。これらは、剛性または可撓性であり、平面であるかまたは変形しており、透明、半透明、部分的にまたは完全に反射性または不透明であってよく、そして複合性、異なる性質を有する領域を有してよく、２つ以上の材料の複合材料であってもよい。
【０２３３】
測定を実施するための試薬は、カセット上で、かつ／または分離した容器中で保存することができる。試薬は、乾燥および／または湿潤状態で保存することができる。１つの実施態様において、カセット内の乾燥試薬は、試験試料の添加により再水和される。ＥＣＬ測定を行うための試薬にはＥＣＬの共作同物質(coreactants)（例えばＴＰＡ）、緩衝液、保存剤、添加剤、賦形剤、炭水化物、タンパク質、洗浄剤、ポリマー、塩、生体分子、無機化合物、脂質などが含まれる。別々の実施態様において、試薬は、移動可能なローラーまたはピストンからの圧力により破裂開封される「ブリスターパック」中の溶液で保存される。カセットは、測定の終了後の廃棄物区画または液体廃棄物の保存用のスポンジを含有してよい。１つの実施態様において、カセットは、試験すべき生物学的試料の調製用の装置を含む。血液から細胞を除去するためのフィルターを含んでもよい。別の例において、カセットは、試料の計量用の精密毛細管のような装置を含んでもよい。
【０２３４】
支持体上の、複数の結合ドメインおよび複数の電極／対電極は、典型的には機械的手段、例えば、ガイドポスト、整列ピン、ヒンジ（各支持体間の）またはガイドエッジにより、登録された相互に近い位置に置かれる。光学ガイド手段は、支持体上に画定された光学ガイドマークを利用する支持体と電子的手段の両方の位置決めに使用することができる。電気的または磁気的登録手段を使用する他のシステムも利用可能である。
【０２３５】
カセットの支持体は、ＥＣＬ反応を引き起こす必要が生じるまで、電極対が試料に接触するのを保護するように配列することができる。例えば、電極は、取り外し可能な電極保護手段のような種々の機械的手段を使用することにより、電極の試料との接触が必要となるまで、結合ドメイン表面から分離して維持することができる。
【０２３６】
本発明のカセットまたは装置は、参照電極、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌまたは飽和カロメル電極（ＳＣＥ）からなる。
【０２３７】
支持体は、クリップ、接着剤、リベット、ピンまたは任意の他の適切な機械的保持機構により結合させることができる。これらはまた、液体試料の表面張力により、または２つの支持体の反対側に取り外し可能に置かれた圧縮手段により結合させることができる。
【０２３８】
カセットはまた、例えば、結合ドメインと電極の交互の層、または結合表面と電極表面の両方を単一支持体上に含んでなる多数の支持体を有する、３つ以上の支持体を含んでなってもよい。これは、ＥＣＬ分析セルの三次元アレイを形成する。カセットの前記の全ての成分は、場合により結合ドメイン間のいくつかの領域を除いて透明である。例えば、多数の透明結合表面、電極表面、および支持体を積み重ねることができる。
【０２３９】
第１および第２の支持体は、平面状でかつその間に試料保持容量を規定するように向かい合わせることができる。あるいは、第１および第２の支持体層は、２つの支持体およびその任意の他の成分の形が一致するならば、球形、立方体、円筒形を含む他の適切な形に構成させることができる。例えば、図１０は、２つの隣接する非平面状支持体１１０２および１１０４から形成されるカセット１１００を示している。各支持体は、形態がもう一方に対して相補的な表面を有する。いずれかの支持体も、ＰＭＡＭＳ表面または多数の電極アレイまたはその両方を有してよい。支持体の一方または両方が、もう一方の支持体の形に一致するように、エラストマー性であってよい。支持体またはカセットはまた、プレカット（precut）型に作成されても、または回転ディスペンサーから適切な長さに提供してもよい。カセットは、試料保持容量のような試料受容手段および試料分配溝、チャネル、くぼみなどをさらに含んでもよい。
【０２４０】
図３７は、マトリックス（３７０３）の中および／または上の結合ドメイン（３７０２）が表面（３７０１）上に提示されているカセットを示す。作用電極（３７０４）および対電極（３７０５）を支持する第２の表面（３７００）は、結合ドメインが作用電極にかなり近づくように置かれる。結合ドメインに結合したＥＣＬ標識から光生成をもたらす条件下で、光はいずれかの表面または両方の表面から検出することができる。光検出器のアレイ（３７０６、例えば、ＣＣＤアレイ、増強ＣＣＤアレイ、またはアバランシェフォトダイオードアレイ）は、同時に各結合ドメインからの複数の光シグナルを測定するのに使用される。光検出器アレイは、結合ドメインから生成する光を撮像する。レンズ、反射器および／または光学ガイドを利用して撮像を増強することができる。他の例において、光検出器（例えば、光検出ピクセル）のゾーンまたは領域から検出される光は、結合ドメインに相関する。画像分析を使用して、検出される光の結合ドメインとの相関を促進することができる。１つの好ましい実施態様において、表面は、エラストマー性すなわち柔軟であり、このため、電極表面と密接な接触を作ることができる。結合ドメインは、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーに結合している。さらに好ましい実施態様において、この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーである。
【０２４１】
図３８は、結合ドメイン（３８０５、３８０６、３８０７）が、対電極（３８００）上に支持される別々の物体（３８０８、３８０９、３８１０）の表面上に提示されるカセットを示している。作用電極（３８０１）は、この物体の表面に接近して置かれる。結合ドメインに結合したＴＡＧ標識した基からＥＣＬを導く条件下で、光は、いずれかまたは両方の電極（もし一方または両方の電極が透明または半透明であれば）を通して、かつ／または側面から検出することができる。光検出器のアレイ（３８０２）は、各結合ドメインからの複数の光シグナルを同時に測定するのに使用される。この物体は、エラストマー性であるか、かつ／または柔軟であり、このため、作用電極と密接な接触を形成することができる。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができるポリマーであってよい。この物体は、対電極から作用電極にイオン電流を運ぶことができる水膨潤性ポリマーであってよい。
【０２４２】
１つまたはそれ以上の結合ドメインを含有する透明支持体を、炭素電極（例えば、小繊維マット電極またはカーボンブラックまたはカーボンフェルトからなる電極）に接触させる。試薬は、支持体／結合ドメインと小繊維マットの間を、またはマットを通って結合ドメインに流れることができる。光は、結合ドメインから、透明支持体を通って検出器まで通過することができる。
【０２４３】
別の好適な実施態様において、電極は、電極の有効表面積が増大するように、光学的に半透明または透明な炭素（例えば、小繊維）の層でコーティングされる。
【０２４４】
本発明のＰＭＡＭＳ支持体および／またはカセットは、キットとして包装することが有利である。キットは、測定物、対照などを含む、ＥＣＬ反応を実施するための、本発明により調製される１つまたはそれ以上のＰＭＡＭＳ支持体からなる。対照試薬、ＥＣＬ測定用および較正用試薬などを含む試薬は、場合によりキットに含まれる。複数の異なるアナライトに特異的な複数の結合試薬を含有する試薬混合物が含まれてもよい。
【０２４５】
５．９．ＥＣＬ反応を行うための装置
１つの実施態様において、支持体上のＰＭＡＭＳ、およびこれを含有するカセットは、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン上に１つまたはそれ以上の試験試料を適用するための手段、および複数のＥＣＬ反応を開始させるための手段を含有する装置中に挿入されるように設計される。このような装置は、支持体またはカセットに基づいて複数のＥＣＬ測定を行うために、本発明により適切に変更された従来型の装置から得ることができる。本発明は、上述のセクションに記載されたＰＭＡＭＳの各具体的な実施態様を使用して、ＥＣＬ測定を行うために適合させた種々の装置を提供する。ＥＣＬ反応を行うための装置は、ゾスキ（Zoski）ら（米国特許第５，０６１，４４５号）により開示されている。必要とされる変更は、支持体および／またはカセットの操作、多数の試料送達、電圧波形の供給源による多数の電極のアドレス呼び出しおよび多数のＥＣＬシグナルの獲得および処理のための手段を含む。
【０２４６】
本発明の例示的装置の要素は図６Ａに示される。このような装置７００は、上部および下部支持体７０２、７０４、および電極ガード７１０からなる。上部支持体は、複数の電極／対電極の対（図示していない）を有する。下部支持体は、結合ドメイン７０６を有する。この装置は、カセットから電極ガードを取り外し、結合ドメインに結合したアナライトと接触させるように電極／対電極を配置することができる。試薬または流体の流路空間７０８は、結合ドメインを有する支持体の隣にある。この装置はまた、同一または個々の決められた電圧波形を、複数の各電極／対電極の対に同時または順に送って、カセット内のＥＣＬ反応を引き起こし、次に放出されるＥＣＬ放射を光子検出器（例えば、光検出手段）により測定することができる。装置はさらに、支持体および／またはカセット、またはその周囲の温度を維持し、ＥＣＬ反応条件を最適化するために必要に応じて温度を調整するための温度制御手段を含んでもよい。温度制御手段は、好ましくは加熱および冷却手段、例えば、電気抵抗性発熱体、冷却ファン、冷凍手段、および加熱もしくは冷却の任意の他の適切な供給源である。温度制御手段はまた、温度センサー、例えば、サーモスタットまたは熱電対装置、および検出される温度変化に応答して加熱または冷却手段のスイッチを入れるかまたは切るための手段をも含む。
【０２４７】
この装置はまた、ＥＣＬ反応を行うため、１つまたはそれ以上の支持体またはカセットを保持、移動および操作するための手段を提供する。装置はさらに、カセットについて上述したように、ＰＭＡＭＳ結合ドメイン上に試料を載せるための、静置型または移動可能な試料送達手段を含んでもよい。
【０２４８】
装置はまた、カセットの別々にアドレス呼び出し可能な電極接続部のアレイを、電子的電圧波形発生手段、例えば、ポテンシオスタットに電気的に接続することができる電極接触手段を含んでもよい（例えば、米国特許第５，０６８，０８８号の図５を参照のこと）。波形発生手段は、順にまたは同時に、カセット内の複数のＥＣＬ反応を独立に引き起こすための、シグナルを送達する。
【０２４９】
ＥＣＬ測定の間、作用電極と対電極の間のイオン電流は、イオンにより導電性になった液体（例えばイオン性塩を含有する水）を通って、このような液体の薄膜を通って、かつ／またはイオンにより導電性の固体マトリックスを通って流れることができる。
【０２５０】
すなわち、試料中の電気化学発光を測定するための装置は、少なくとも１つの試料を保持するための複数のセル（ここで、セルは、１つまたはそれ以上の電極と１つまたはそれ以上の対電極から形成することができる）、および複数の別々の結合ドメインからなる第１の支持体を含んでよい。電極と対電極は、第１の支持体の表面上に、または第２の支持体（ここで、第２の支持体は、第１の支持体上の結合ドメインに非常に接近している）の表面上に提供することができる。電極と対電極は対で存在してもよい。セルはさらに、作用電極に近い電圧を検出するための複数の検出電極を含んでもよい。カセットはさらに、参照電極を含有するセルを含んでもよい。
【０２５１】
装置はさらに、例えば、１つまたはそれ以上の検出手段により、カセット内で行われるＥＣＬ反応を検出することができる光検出手段を含んでもよい。このような検出手段は、単に例として、光検出手段のアレイに接続された、または放出されるとＥＣＬシグナルのアレイを走査することができる単一の光検出手段に接続された電極アレイに合い、これと隣接する位置に置かれる光ファイバーチャネルのアレイを含む。
【０２５２】
装置は、場合により、装置の種々の部品の機能を制御するために、デジタルコンピュータまたはマイクロプロセッサーを含んでもよい。
【０２５３】
装置はまた、シグナル処理手段も含む。１つの実施態様において、かつ単に例として、シグナル処理手段は、各ＥＣＬ測定の結果の移動、記録、分析および／または表示のためのデジタルコンピュータを含む。
【０２５４】
あるいは、装置は、例えば、結合表面上にわたって順にＥＣＬを引き起こすために、１つまたはそれ以上の電極／対電極の対を走査するための、電極移行手段を含む。
【０２５５】
ＰＭＡＭＳの平行アレイにおいてサイズ排除フィルターを使用することができる。
【０２５６】
５．１０．実施することができるＥＣＬ測定法
本発明で使用されるＥＣＬ標識物は、当該分野で公知のＥＣＬ標識物から選択される（前記セクション２．２、および米国特許第５，３１０，６８７号を参照）。ＥＣＬ標識物は例えば、金属含有有機化合物からなり、ここで金属は、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、テクネチウムおよびタングステンよりなる群から選択される。ＥＣＬ  ＴＡＧ試薬を調製するのに適した結合化学は公知であり、例えばバード（Bard）ら（米国特許第５，３１０，６８７号および第５，２２１，６０５号）により開示されている。結合試薬へのＥＣＬ標識物の結合手段は、共有結合および／または非共有結合でもよい。ＥＣＬ標識物は結合試薬に非共有結合（例えば、疎水性作用またはイオン性相互作用）をしてもよい。非共有結合の他の例では、ＥＣＬ標識物が（共有結合または非共有結合で）複合体に結合し、次にこれが非共有結合で結合試薬に結合する。より具体的な例は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３がリンカーを介してＮｉ（II）−トリニトリロ三酢酸錯体に共有結合することであろう。この分子は、複数のヒスチジンを含有するペプチド配列などの結合試薬に結合する。他の受容体リガンド対は、当該分野で公知であり、同様に使用することができる（サセンフェルト（Sassenfeld）、１９９０、ＴＩＢＴＥＣＨ  ８：８８−９３）。さらに、分岐ネットワーク（例えば、炭化水素リンカーを介して）として構成されている複数の有機金属化合物（例えば、Ｒｕ−含有）を含有するＥＣＬ標識物が使用できる。ＥＣＬが可能な複数の有機金属化合物残基を含有するこのような分岐ネットワークは、ＥＣＬ標識される分子上で１回または複数の位置で結合してもよい。別の実施態様において、化合物は、ポリマー鎖の長さに沿う複数の位置で結合する有機金属基を有する線状ポリマーである（例えば、線状、分岐または環状ポリマー）。
【０２５７】
当該分野で公知の種々の追加ＥＣＬ測定フォーマットで、複数の結合ドメインを使用することができる。定量測定では、既知量のＥＣＬ標識試薬が使用され、測定されるＥＣＬの量は、存在するアナライトの量を計算するために既知の標準物質に対する関係を計算する。当業者に公知の方法で前進（forward）、後退（reverse）、競合およびサンドイッチ測定法を行うことができる。競合測定法では例えば、ある量の多成分液体試料中の目的のアナライトの定量は以下のように行われる。結合表面を、同時に（ａ）結合ドメイン上に存在する結合試薬への結合において、目的のアナライトと競合することができる既知量のＥＣＬ標識リガンド、および（ｂ）目的のアナライトを含有することが疑われる試料と接触させ、ここでこの接触は、目的のアナライトとリガンドが結合試薬に対して競合して結合できる適切な条件下で行われる。試料中にアナライトが存在すると、結合ドメインに結合する競合性のＥＣＬ標識リガンドの量が減少し、このため得られるＥＣＬの量が（試料中にアナライトが存在しない場合に比較して）減少する。得られる結合ドメイン中のＥＣＬの反応を開始させ、放出される光の量を定量的に測定し、こうして試料中に存在するアナライトの量を定量する。あるいは、試料を結合表面と接触させ、次に結合表面をＥＣＬ標識リガンドに接触させてもよく、次にＥＣＬ標識リガンドは、ＰＭＡＭＳ表面上で試料からのあらかじめ結合したアナライトと競合し、あらかじめ結合したアナライトの一部を置換する。別の実施態様では、ＥＣＬ標識した物質／分子を含有するように試料を処理し、標準量の非標識アナライトを結合表面と接触させ、次にまたは同時に結合表面を試料と接触させて競合測定を行う。
【０２５８】
サンドイッチ測定法では、ＥＣＬ標識リガンドは、目的のアナライト上の２つの結合残基に特異的に結合する結合パートナーである。すなわち、ＰＭＡＭＳの結合ドメイン中の結合試薬に特異的に結合するアナライトが試料中に存在すると、ＥＣＬ標識結合パートナーに結合した、試料からのアナライトに結合した、結合ドメイン上の結合試薬から構成される「サンドイッチ」が形成される。別の競合サンドイッチ測定法では、アナライト自身のコピーが多重アレイ結合表面の結合ドメインに結合し、次に試料と接触される。次に試料を結合表面と接触させる。ＥＣＬ標識した結合パートナー（これはアナライトに特異的に結合する）は、測定溶液中に遊離のアナライト（試料から）が存在しない場合は、アナライトに結合するが、測定溶液中に遊離のアナライト（試料から）が存在する場合は競合的に阻害されるであろう。
【０２５９】
別の実施態様において、連続的標識が行われる。例えば、サンドイッチ測定法の具体例では、結合ドメインに結合したアナライトは、アナライトの複数のＥＣＬ標識した結合パートナーと順に接触される。ＥＣＬ測定と随時洗浄工程が、各異なる結合パートナーと接触させる間に行われる。こうしてアナライトの複数の異なる結合分子のＥＣＬ測定が行われる（例えば、ＣＤ８＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体陽性Ｔ細胞）。あるいは、それぞれが区別可能な波長で発光する複数のＥＣＬ標識物が、アナライト上の異なる残基に特異的な異なる結合試薬にそれぞれ結合する。さらに、アナライトの異なる結合残基に特異的な異なる結合試薬にそれぞれ結合した区別可能なレポーター手段（例えば、ＥＣＬ標識物、蛍光標識物および酵素結合標識物）を用いて、例えばＣＤ４＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体−陽性細胞をＣＤ８＋、ａ，ｂ  Ｔ細胞抗原受容体−陽性細胞と区別することができる。
【０２６０】
好適な実施態様において、結合ドメインは、標識タンパク質および／または核酸および／または細胞および／または化学的分子種を含有する。このような標識成分（例えば、ＥＣＬ標識物）は、作成の間、測定開始の前、測定中および／または測定の終了時に添加される。例えば、複数の標識成分は種々の時間に添加され、連続的読みとりが行われる。このような読み値は累積情報を与える。別の実施態様において、ＰＭＡＭＳの結合ドメインは何回も再使用できる。ある測定の終了後、ＰＭＡＭＳ表面の１つまたはそれ以上の結合ドメインの活性を再活性化させる条件下で表面を洗浄してもよい。例えば、ある結合反応は反応溶液のイオン強度を変えることにより逆転することができる。あるいは熱を用いて、結合複合体を解離させてもよい。本質的に自己再生能を有する結合ドメインもある。触媒性（例えば、酵素）官能基を含有する結合ドメインは、１回以上使用される。結合ドメインは順に使用され、こうしてバイオセンサーに応用することができる。
【０２６１】
さらに、多重アレイ多重特異的パターン付け表面に結合した結合試薬が、ＥＣＬ標識されるように、測定法をフォーマット化してもよい。試料中の目的のアナライトに結合すると、ＥＣＬ標識シグナルは定量的に変化する。例えば、この表面に結合したＥＣＬ標識結合試薬は、細胞表面上のアナライト（例えば、αおよびβＴ細胞抗原受容体抗原、またはＣＤ４もしくはＣＤ８抗原）に特異的であってよい。細胞の混合物に暴露すると、表面に結合した細胞は、多重アレイ多重特異的パターン付け表面の接近した電極表面がＥＣＬ標識した結合試薬を励起する能力を立体的に妨害し、こうしてＥＣＬシグナルを下方に変化させる。
【０２６２】
均一および不均一測定法を行うことができる。不均一測定法では、非結合標識試薬を結合した標識試薬から分離（例えば、洗浄工程により）し、次に結合または非結合標識試薬を電位に暴露する。均一測定法では、非結合標識試薬および結合標識試薬が一緒に、電位に暴露される。均一測定法では、結合標識試薬により放出されるシグナルの強度またはスペクトル特性は、非結合標識試薬により放出されるシグナルの強度より大きいかまたは小さい。この強度の差を測定することにより、各結合および非結合成分の有無を測定することができる。
【０２６３】
結合試薬をアナライトまたはその競合物およびその結合パートナーに接触させ所望の工程が終了すると、次にＥＣＬ標識物を確実にＥＣＬ誘導性の環境に置く。適切なＥＣＬ測定媒体は当該分野で公知である。そのような測定媒体は、ＥＣＬ標識物のＥＣＬを促進する分子（シュウ酸、ＮＡＤＨ、および最も好ましくはトリプロピルアミンがあるが、これらに限定されない）を含有することが有利である。このような「プロモーター」分子は溶液中で遊離状態で提供されるか、またはＰＭＡＭＳ表面、表面上の単層、結合ドメイン、電極表面、結合試薬および／またはＥＣＬ標識物などにあらかじめ結合させるかもしくはこの表面上で産生させることにより（例えば、化学反応の生成物として）提供される。接触工程から得られる結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物の周りの媒体がＥＣＬ誘導性の場合は、媒体を変化させる必要はない。あるいは、ＥＣＬ誘導性の媒体を提供するように調整または置換をすることができる。電極または対電極は、すでに結合ドメインのすぐ近傍にあるか、または結合ドメインに接近させるかもしくは接触させて、電位波形を適用し、ＥＣＬを検出または測定する。
【０２６４】
本発明の好適な実施態様において、結合試薬をアナライトもしくはその競合物およびその任意の結合パートナーに接触させる上記工程は、電極または対電極の非存在下で行い、すなわち試料が電極または対電極に接触しないようにする。これらの接触工程後、電極および対電極を、結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物の充分近くに持ってきて、ＥＣＬ反応を開始させる。
【０２６５】
ＰＭＡＭＳを有する支持体は、核酸鎖の配列決定に使用してもよい。例えば、複数の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳは、異なる結合ドメイン中の結合試薬として、既知のヌクレオチド配列の異なるオリゴヌクレオチドを用いて作成することができる。すなわち、異なる結合ドメインは、異なる既知のヌクレオチド配列の結合試薬を含有する。配列決定されるオリゴヌクレオチドの断片のオリゴヌクレオチド鎖は、次にＰＭＡＭＳ結合ドメインに結合（ハイブリダイズ）させる。配列決定される核酸はＥＣＬ標識される。ＰＭＡＭＳ上で結合測定法を行い、ＰＭＡＭＳ上の別々の結合ドメインからのＥＣＬシグナルの分布を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の配列を決定する。
【０２６６】
上記方法は、短いオリゴヌクレオチドが、別の核酸分子中のその相補的なまたは実質的に相補的な配列にハイブリダイズする能力に基づく（例えば、ストレゾスカ（Strezoska）ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０８９−１０９３；バインズ（Bains）、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７５７−５８を参照。これらは参考のため本明細書に引用される）。ハイブリダイゼーションの成功のためには所望の程度の配列相補性の程度が必要であるように、条件が選択される。あらかじめ配列の決定されたプローブへの、配列が未知のＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡ分子中の相補的な配列の存在が検出される。この方法は好ましくは、ハイブリダイゼーション反応が結合ドメインに結合したオリゴヌクレオチドプローブと溶液中の試料ＤＮＡで行われるように行う。
【０２６７】
ＰＭＡＭＳはまた、目的の機能（例えば、結合または触媒）を有する新規分子または複合体を単離、スクリーニング、および／または選択するのに利用できる。ＰＭＡＭＳは、治療のために化合物および／または鉛化合物を単離するのに使用してもよい。本発明の方法を用いて、種々の化学種の組合せにより合成される複数のペプチド、核酸、ウイルスベクター、またはポリマーを含有するＰＭＡＭＳを作成することができる。このような多種類のＰＭＡＭＳ処理した支持体は、例えばＥＣＬ標識細胞受容体への結合の迅速なスクリーニングに利用できる。１つの方法では、鉛結合ペプチド配列を単離するために、多様な関連のないペプチド配列を有する第１のＰＭＡＭＳを用いる。次に第１のＰＭＡＭＳ上の目的の分子（例えば、細胞受容体）に結合性を示すものと関係のある配列のペプチドを有するＰＭＡＭＳを使用する。このプロセスは、目的の結合特性を有するペプチドが見いだされるまで繰り返す。
【０２６８】
目的のアナライトは、例えば試料中に存在する全細胞、細胞内粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、核酸、タンパク質、抗原、リポ蛋白、リポ多糖、脂質、糖タンパク質、炭水化物残基、セルロース誘導体、抗体またはその断片、ペプチド、ホルモン、薬剤、細胞または細胞成分、有機化合物、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物、または無機分子がある。
【０２６９】
試料は、例えば固体、エマルジョン、懸濁物、液体または気体から得られてもよい。さらに、試料は、例えば体液または組織、水、食物、血液、血清、血漿、尿、便、組織、唾液、油、有機溶媒または空気から得られてもよい。試料は還元剤または酸化剤を含有してもよい。
【０２７０】
以下の物質に特異的な結合試薬を、本発明の結合表面の結合ドメインに導入することにより、本発明により以下の物質を検出または測定するための測定を行ってもよい：アルブミン、アルカリ性ホスファターゼ、ａｌｔ／ＳＧＰＴ、アンモニア、アミラーゼ、ＡＳＴ／ＳＧＯＰ、総ビリルビン、血液尿素窒素、カルシウム、二酸化炭素、塩素、総コレステロール、クレアチニン、ＧＧＴ、グルコース、ＨＤＬコレステロール、鉄、ＬＤＨ、マグネシウム、リン、カリウム、総タンパク質、ナトリウム、トリグリセリド、尿酸、耽溺薬物、ホルモン、心血管系調節物質、腫瘍マーカー、感染症抗原、アレイ誘発性抗原、免疫タンパク質、サイトカイン、貧血／代謝マーカー、カルバマゼピン、ジゴキシン、ゲンタマイシン、リチウム、フェノバルビタール、フェニトイン、プロカインアミド、キニジン、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン、アンフェタミン、抗うつ剤、バルビタール酸、ベンゾジアゼピン、カナビノイド、コカイン、ＬＳＤ、メタドン、メタクアロン、アヘン、フェニリジン、フロポキシフェン、エタノール、サリチル酸、アセトアミノフェン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、ｈＣＧ／ｂｈＣＧ、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、甲状腺ホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン、Ｔ４、ＴＵＰ、総Ｔ３、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３）、コルチゾール、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ、総クレアチニンキナーゼ、ＰＴ、ＡＰＴＴ／ＰＴＴ、ＬＤＩＳＯｓ、クレアチニンキナーゼＩＳＯｓ、ミオグロビン、ミオ軽鎖、トロポニン１、トロポニンＴ、クラミジア、淋菌、ヘルペスウイルス、ライム病、エプスタインバーウイルス、ＩｇＥ、風疹−Ｇ、風疹−Ｍ、ＣＭＶ−Ｇ、ＣＭＶ−Ｍ、トキソ−Ｇ、トキソ−Ｍ、ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、抗−ＨＢｃ、抗−ＨＢｓ、ＨＣＶ、抗−ＨＡＶ  ＩｇＭ、抗−ＨＢｃ  ＩｇＭ、抗−ＨＡＶ、ＨＢｅＡｇ、抗−ＨＢｅＡｇ、ＴＢ、前立腺特異抗原、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＡＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ｂ２−マイクログロブリン、ヘモグロビン、赤血球、ＨＢｃＡｂ、ＨＴＬＶ、ＡＬＴ、ＳＴＳ−梅毒、ＡＢＯ血液型抗原および他の血液型抗原、サイトメガロウイルス、フェリチン、Ｂ−１２、葉酸、グリコシル化ヘモグロビン、アンフェタミン、抗うつ剤および他の向精神薬。
【０２７１】
異なる結合ドメインでのＥＣＬの測定は、順にまたは同時に行われる。
【０２７２】
細胞表面タンパク質である目的のアナライトに特異的なＰＭＡＭＳは、まず細胞を含有する試料に暴露され、ここで試料中の細胞を計測することが好ましい。好適な実施態様において、既知の容量の試料および／または希釈した試料は、少なくとも１つの細胞表面抗原に特異的な複数の結合ドメインを有するＰＭＡＭＳに暴露される。結合した細胞は、次にＥＣＬ標識物に結合した第２の結合基を結合させることにより定量できる。これは、広範囲の型の細胞と相互作用することができる基（例えば、細胞膜に挿入できる疎水性基もしくは細胞表面の糖に対するレクチンに結合したＥＣＬ標識物）である。ＥＣＬ標識物は、細胞表面抗体に対する第２の抗体に結合される。より具体的な実施態様において、同じドメインに結合した数種類の型の細胞が、複数のＥＣＬ標識物で標識した第２抗体を用いることにより区別できる。細胞表面上のあるアナライトに特異的な別々の結合ドメインの数が、試料中に存在する結合性の細胞の平均数より多いことを確認することが好ましい。次に統計的方法を用いて、試料容量当たりの細胞の数を求める。この方法は、例えばウイルスのような他の粒子（ここで、結合試薬はウイルスの抗原を認識する）を計測するのに使用することもできる。ドメインは細胞のサイズに比較して小さくすることができ、こうして各ドメインについてデジタルシグナルが得られ、次にこれを統計的方法を用いてドメインの合計に対して解析することができる。ドメインは細胞の大きさに比較して大きく、従って細胞はドメインに結合することができる。この場合、各ドメインからのシグナルのレベルは、試料の容量当たりの細胞の数を与えるように較正することができる。光検出器のアレイ（例えば、ＣＣＤカメラまたはアバランシュフォトダイオードアレイ）を用いる画像解析により、細胞を計測し、細胞の形態を測定することができる。
【０２７３】
本発明は好ましくは、また５〜１５分間で１０００ＥＣＬ反応の速度でＥＣＬ反応を行う方法（例えば、測定法）を与える。
【０２７４】
５．１１．他の分析方法および／またはＥＣＬとともに使用されるＰＭＡＭＳ
ＥＣＬベースの前記方法は、他の測定法とともに使用することができる（例えば、触媒反応や他の化学反応が起きるドメインとして）。本発明の別々の結合ドメインは、他の測定法（例えば、電解質測定のような臨床化学的化学物質測定法、臨床酵素測定、血液タンパク質測定、グルコース、尿およびクレアチニン測定など）で使用することができる。ＥＣＬ測定法と組合せるかまたは本発明のＰＭＡＭＳとともに単独で使用される他の測定法には、化学発光ベースの標識、蛍光ベースの測定法、酵素結合測定系、電気化学測定法（例えば、ヒックマン（Hickman）ら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６８８−６９１を参照）、および／または共鳴検出（例えば、表面プラズモンおよび音響法）測定系がある。
【０２７５】
液滴のアレイの中に複数の異なる化学物質を有する、液滴を有するＰＭＡＳ支持体を使用することができる。各液滴は、異なる結合試薬および／または異なる化学物質を含有してもよい（すなわち、この反応媒体）。例えば、疎水性表面領域に囲まれた親水性表面結合ドメイン上にあり、液滴は親水性してもよい。液滴は、表面を覆う疎水性溶液により保護される。測定される親水性溶液は、疎水性領域に囲まれた親水性結合ドメインを有する第２のＰＭＡＭＳ上に沈積される。２つの表面は決められた近傍に来て、反対の表面の親水性ドメインと接触し、スペクトル解析を行って化学的測定の反応生成物を検出する。
【０２７６】
小繊維マットは、疎水性および／または親水性ドメインに囲まれた複数の不連続な疎水性および／または親水性ドメインがあるように、パターン付けされる。結合試薬を含有する水溶液の液滴が親水性領域上にのって、周りの疎水性領域に閉じこめられる。これらの液滴は、例えば小繊維、小繊維の凝集物、結合試薬、ＥＣＬ試薬、測定試薬、界面活性剤、ＰＥＧ、洗浄剤、例として前述した複数の生物学的分子、および／またはこれらの組合せを含有してもよい。
【０２７７】
第１のＰＭＡＭＳを覆う疎水性溶液は、上面の親水性液滴の一部のみが環境に暴露されるように、調節して除去する（例えば、蒸発、はじき）。光学化学反応のために測定される親水性溶液は次に、ＰＭＡＭＳ表面に暴露され、親水性の微小液滴と測定される溶液を混合し、分析（例えば、スペクトル）を行う。
【０２７８】
ＰＭＡＭＳ結合ドメインはまた、プレフィルターまたはフィルターとして使用される。例えば細胞特異的なＰＭＡＭＳは、ある場合にはある型の細胞のフィルターとして単独で、およびサイズ排除フィルターとともに使用できる。得られるアナライト溶液は次に、細胞内顆粒物質（例えば、ウイルス）に特異的なＰＭＡＭＳに暴露される。顆粒細胞内ＰＭＡＭＳおよび／またはサイズ排除フィルターを用いて、小分子（例えば、タンパク質、小さな化学的物質）アナライト溶液を形成させる。非特異的なアナライト相互作用を低下させるために、連続的ＰＭＡＭＳ測定系を使用して、アナライト溶液を順に精製する。
【０２７９】
支持体、電極および／または結合ドメインに使用される材料の光学的不透明度は、所望の性質を得るように変化させることができる。このような材料は、材料の厚さ、組成および／または光学密度により、半透明、透明もしくは実質的に不透明であってよい。
【０２８０】
小繊維マットの光学不透明度は、マットの厚さが増加すると増加する。非常に薄いマットは実質的に透明である。厚いマットは、実質的に不透明である。ある場合には、０．０１μm〜０．５μmの範囲の厚さのマットは実質的に透明である。他の例では、２０μmを超える厚さのマットは実質的に不透明である。０．５μm〜２０μmの間の厚さのマットは中間の不透明度を有し、これは小繊維マットの厚さが増加すると増加する。マットの具体的な厚さは、マット中に分散される材料の組成、密度、誘導体化、層の数、型および量、および／またはこれらの組合せに依存する。これはまた、使用される光の波長に依存する。
【０２８１】
ある材料がある厚さで実質的に透明であり、別の厚さでは実質的に不透明であるなら、その材料のある深さから放出される光は通過するが、別の（例えば、より深い）深さから放出される光は、材料に実質的に吸収されるかまたは分散される。１つの例では、ある材料は種々の不透明度により、光学フィルターとして使用することが可能である。
【０２８２】
小繊維マットのある深さから放出される光は、実質的にマットを通過し、小繊維マットの近傍または表面に置いた検出器で観察することができる。別の深さから放出される光は、吸収されるかおよび／またはマットにより分散され、マットの近傍または表面に置いた検出器で観察することができない。小繊維マット（および／または、光学的に類似の材料）のこの性質は、ＥＣＬ測定法において結合試薬および非結合試薬を区別するのに使用することができる。
【０２８３】
ある試薬は、多孔性材料中で充分な深さまで拡散（能動的または受動的）されるか、はじかれるか、圧力により押されて、これらの試薬からの光の放出はマットにより実質的にまたは完全に吸収されるかまたは拡散される。１つの例では、小繊維マットは、マットの表面またはその近傍で、ある試薬が通過し、ある試薬が捕捉され、および／またはある試薬が非常に薄い層に結合する、物理的および光学的フィルターの両方として作用する。１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した試薬および／または１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した分子種（これらのドメインは、小繊維マットの表面のいずれかに位置するか、またはＰＭＡＭＳ上のマットの表面の近くの層に位置する）は、マット内もしくはマットを介して拡散したり、引っ張られたりするのを妨害される。試薬がマットの表面の非常に薄い層にのみ結合するように、試薬および／または他の溶液は、小繊維マットの表面を流れるか、懸濁されるかおよび／または離れている。試薬は、１つまたはそれ以上の方向に、マットを介して１回またはそれ以上洗浄される。試薬は、小繊維マット、１つまたはそれ以上の結合ドメイン、１つまたはそれ以上の結合ドメインに結合した他のもしくは同じ試薬に結合してもよく、マット内に混入、マットを通過してもよく、またはこれらの組合せでもよい。
【０２８４】
支持体および／または電極に使用される多孔性材料は、上層が結合ドメインを有し、マット内の別の層が結合ドメインを有さない２つ以上の層を有してもよい。ある例では、小繊維マット（図２９に模式図として示す）、上層２９００は充分厚く、この層の下の層２９０１、２９０２から発生する光の通過を妨害する。この上層に結合した光源２９０４、２９０５から発生する光２９０３は、マットの表面またはその近傍に位置する検出器２９０６により検出することができる。下層２９０１、２９０２中の光源２９０７、２９０８、２９０９から発生する光は、いずれかの層またはすべての層により吸収されるかおよび／または拡散され、検出器２９０６、２９１０により検出することができない。
【０２８５】
マットを作成する前に、小繊維および／または小繊維凝集物の特定のサイズ、型、派生物を選択するのに、前濾過工程が使用される。小繊維の懸濁物を濾過するのに使用されるフィルター物質は、１つのまたは多くの孔を有する小繊維のマットである。
【０２８６】
多孔性材料（例えば、小繊維マット）は、結合ドメインのための支持体、ＥＣＬもしくは他の電気化学的応用に使用される電極、試薬の送達を調節するために使用されるフィルター、および／または種々の程度に光を伝搬、吸収および／または拡散することができる光学フィルターとして作用することができる。
【０２８７】
５．１２．エレクトロクロミックＥＣＬディスプレーパネル
本発明はまた、平面パネルディスプレーに使用される単離された電気化学的ピクセルの製造を提供する。電気的にアドレスされた時に隣接ピクセルに対して限定された作用（すなわち、限定クロストーク）を有するピクセルを作成するために、エレクトロクロミックおよび電気化学発光ベースの平面パネルディスプレーで使用するために、リトグラフ法が提唱されている（米国特許第５，１８９，５４９号を参照）。そのようなクロストークを減少させるためのリトグラフ法の限界は、電解質材料が、露光された時に導電率を変化することができなければならないことである。光誘導性の導電率調節が可能な材料を使用することなく、ピクセル間のクロストークを低下させ、こうして広範囲の異なる溶液、ゲルまたはフィルムの使用を可能にすることが、本発明の特徴である。
【０２８８】
ピクセルの活性領域である２つの電極表面は、サンドイッチ型で互いに向かい合っている２つの表面上にある。電極表面は、例えば相補的なエレクトロクロミックな材料でコーティングされる。クロストークを減少させるために、異なる電極対の間に非導電性領域を有する電極表面の間（すなわち、ピクセル要素の間）に、導電性電解性フィルムを置く。コーティングされた電極表面が親水性の場合は、電極の周りの表面の領域は疎水性にされ（例えば、マスクを介する型押しまたは沈積）、親水性導電性液滴を第１の表面上の電極にのせ（例えば、流体アレイにより）、次に第２の表面をロボットで整列させ、第１の表面と接触させ、こうして電極がそろう。こうして電解性液滴は、ピクセルの間に導電性材料を入れることなく１つのピクセル内に拘束される。ピクセルの電極対は、同じ表面上で近接して並ぶ。コーティングされた電極が親水性の場合は、両方の電極を含む領域は、親水性電極の周りで疎水性環を形成するように作成される（例えば、マスクの打ち出し法または沈積法により）。前述の２つの実施態様で記載した液滴は、疎水性溶液を用いて安定化される。溶液の粘度は、液滴アレイの安定性を上げるために上げられる。親水性と疎水性が逆転する。他の実施態様では、電極対の間またはその上のフィルムの安定性および／または導電性（例えば、導電性ポリマー）を上げるために、重合可能な溶液を含有する。さらに、ピクセル間のクロストークを制限するために、構造的特徴を利用する。例えば、電極ピクセル対に限界を規定することができる環形の型押し突起を有する弾性打ち出し（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））を使用して、フィルム間の電解溶液、ゲル、またはピクセルを単離する。あるいは並んだ電極ピクセル対を、上記電極のウェル内に置いたある表面、電解溶液、ゲルまたはフィルム上の電気的絶縁性ウェル様構造中に入れ、全表面を覆うかまたはコーティングして、各ピクセルの電解成分を単離または封じこめる。
【０２８９】
５．１３．他の化学反応に使用されるＰＭＡＭＳ
本発明のＰＭＡＭＳはまた、ＥＣＬと組合せずに化学反応を行うのに使用できる。例えば、前記セクション５．１１に記載した方法および非ＥＣＬ測定法が利用できる。
【０２９０】
試料中の目的のアナライトを検出または測定するためにカセットが提供され、該カセットは、（ａ）別々の結合ドメインの少なくとも一部は他の結合ドメインとは異なる結合特異性を有し、複数の別々の結合ドメインのそれぞれは親水性でありそして疎水性領域に囲まれている、少なくとも１つの結合表面を形成するための、その表面上の複数の別々の結合ドメインを有する第２の支持体、および（ｂ）測定表面を形成するためにその上で化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の親水性ドメインを有する第２の支持体（ここで、複数の別々の結合ドメインと複数の反応媒体は、接触させることができ、その結果各結合ドメイン上に存在する分析される試料は反応媒体と接触されて、目的のアナライトが検出または測定される）からなる。あるいは、結合ドメインは疎水性であり、第２の支持体は、反応媒体を含有する複数の疎水性ドメインを有する。
【０２９１】
本発明は、試料中の目的のアナライトを検出または測定するための方法を提供し、該方法は、（ａ）検出または測定すべきアナライトを含有する試料の液滴を、支持体表面上の複数の別々の結合ドメインにのせて、この複数の別々の結合ドメインは、他の結合ドメイン内に封じ込められた結合試薬と特異性が互いに同一である結合試薬、かつこれとは異なる結合試薬を含有する少なくとも１つの結合ドメインからなり、各別々の結合ドメインは、疎水性であるかまたは親水性であることを特徴とするが、但し各結合ドメインの周りの支持体表面の領域は、試料中の１つまたはそれ以上の目的のアナライトが結合ドメインに結合できるようにするために、（ｉ）結合ドメインが親水性なら疎水性であり、そして（ii）結合ドメインが疎水性なら親水性であり、（ｂ）第１の支持体上の液滴を、化学的測定法を行うのに適した反応媒体からなる複数の別々の親水性ドメインをその上に有する第２の支持体の表面に接触させ、そして
（ｃ）結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
【０２９２】
また試料中の目的のアナライトを検出または測定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）検出または測定すべきアナライトを含有する試料の液滴を、支持体表面上の複数の別々の結合ドメインにのせて、この複数の別々の結合ドメインは、他の結合ドメイン内に封じ込められた結合試薬と特異性が互いに同一である結合試薬、かつこれとは異なる結合試薬を含有する少なくとも１つの結合ドメインからなり、各別々の結合ドメインは、疎水性であるかまたは親水性であることを特徴とするが、但し各結合ドメインの周りの支持体表面の領域は、試料中の１つまたはそれ以上の目的のアナライトが結合ドメインに結合できるようにするために、（ｉ）結合ドメインが親水性なら疎水性であり、そして（ii）結合ドメインが疎水性なら親水性であり、
（ｂ）試料の液滴上に反応媒体の液滴をのせ、そして
（ｃ）結合ドメインに結合した目的のアナライトの存在を測定する、ことからなる。
【０２９３】
本発明のこの面の１つの具体例においてそれぞれが、基質として化学反応の順に中間体を使用する異なる酵素を取り込んで有する結合ドメインは、ＰＭＡＭＳ表面上に位置し、そのため、次の酵素の基質となるある酵素反応の生成物は、反応経路中の次に酵素の方に流れる。本発明はまた、前記方法を用いて、自己組立単層上の酵素の大量固定化（例えば、工業的応用のために）を提供する。
【０２９４】
例えば、片面または両面に酵素が固定化されたシートは、溶液容量に対する高表面積比を達成するために重ねられる。あるいは、そのような固定化酵素は、多孔性材料に結合される。さらに、そのような固定化酵素は、ディプスティック、化学反応物質、試験管または毛細管の壁面、またはインキュベーターチャンバーのような容器の壁面上でもよい。
【０２９５】
本発明の別の面において、前述したような非ＥＣＬ測定法がＰＭＡＭＳ類似体上で行われ、ＰＭＡＭＳ類似体は、非ＥＣＬ反応を行うための別々のドメインを含有し、別々のドメインは必ずしも結合試薬を取り込んでおらず、従って必ずしも結合ドメインではないという点で、該ＰＭＡＭＳ類似体は前記ＰＭＡＭＳとは異なる。このようなＰＭＡＭＳ類似体は、反応を行うための別々のドメインを有し、別々のドメインに適用される液体の分散および／または拡散を阻害するように作成される。ある実施態様において、反応媒体および／または試料を別々のドメインに封じこめるのを助けるために、ドメインは支持体表面上の周りの領域に対して疎水性または親水性である。分散または拡散を阻害するために、ウェルの使用、フェルトもしくは多孔性材料上の反応媒体または試料の沈積、ゲル、フィルムなどの上の反応媒体または試料の沈積または乾燥が行われる。このような各別々のドメインの直径または幅は１mm未満、好ましくは５０nm〜１mmの範囲であり、最も好ましくは１ミクロン〜１mmの範囲である。同じであるかまたは異なる反応媒体は、各別々のドメインに沈積されてから試料が適用されるか、または反応媒体の沈積の前に試料の適用が行われる。
【０２９６】
非ＥＣＬ測定法を行うためのＰＭＡＭＳ類似体の使用の好適な面において、複数の別々のドメイン上に反応媒体の液滴をのせ、好ましくは微量液体ガイドのアレイから同時に送達され、次に随時、安定性を向上させるかおよび／または液滴を保護するために、より粘性の高い溶液（例えば、油）を反応媒体の上にのせるか、あるいは別々のドメインの間にのせ、次に、各別々のドメインに別々に適用するか、または大量に、ドメインを含有するＰＭＡＭＳ類似体の全表面を液体試料に暴露することにより、検出または測定されるアナライトを含有する試料を各ドメインに適用する。結合ドメイン中で生じる反応を進行させ、当該分野で公知のものから選択されるレポーターおよび検出系を用いて、結果を観察する。
【０２９７】
５．１４．多孔性電極上の粒子の捕捉を用いるＥＣＬ測定法
本発明は、複合体が形成される電気化学発光結合測定法の実施方法を含む。この複合体は少なくとも、粒子と電気化学発光が可能な標識化合物とを含む。複合体はまた、ヤング・エィチ・ジェイ（Yang H.J.）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，（１９９４），１９３−１９４に記載のＥＣＬ測定法で使用されるリガンドも含む。本方法は、（ａ）複合体を形成する工程と；（ｂ）濾過して多孔性導電性電極上に複合体を採取する工程と；（ｃ）電極に電位を加えることにより発光するように、採取した複合体中の標識化合物を誘導する工程と；そして、（ｄ）電極から放出された発光を検出する工程とを、含む。
【０２９８】
電気化学発光結合測定法を実施するためのさらに別の方法において、電気化学発光測定法の成分と複合体を形成することができる粒子をまず、多孔性導電性電極上に採取する。次に、目的のアナライトを含有する試料を、多孔性導電性電極上の複数のドメインに通し、電極上で採取された粒子上で複合体を形成する。次に標識化合物を誘導して、電極に電位を加えることにより発光させ、放出された発光を検出して、目的のアナライトの存在を測定する。好適な実施態様において、その中に取り込まれる粒子を用いてあらかじめ導電性電極を調製し、使用時に、目的のアナライトを含有する試料を電極に通して複合体を形成させる。
【０２９９】
本発明は、複数の目的のアナライトの複数の電気化学発光結合測定を実施するための方法に適合することができる。このような測定法において、少なくとも粒子と標識化合物を含む複合体が形成され、これらは、各々が多孔性導電性電極を含む複数の不連続なドメイン上に採取される。すでに記載したように、標識化合物の粒子および随時他の測定成分は、溶液中で複合体を形成し、次にドメイン上で採取されるか、またはドメインはまず粒子を含有し、試料を電極に通すことにより標識化合物および随時他の測定成分と複合体を形成してもよい。
【０３００】
本発明は、高処理量測定プロセシングの標準物質フォーマット（例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート）で使用されるように適合させることができる。
【０３０１】
好適な実施態様において粒子は、測定法で内部標準として作用することができる発光分子種を含有してもよい。その発光は、測定法を較正するために測定することができる。
【０３０２】
本発明は、粒子が、結合試薬の固相支持体として使用される結合測定法を含む。粒子という用語は、そのサイズ、形または組成に何の制限もないことを意味する。粒子は、濾過により多孔性電極上で捕捉され、アナライトの存在は、粒子上の結合複合体中に存在するＥＣＬ−標識物からのＥＣＬの励起により検出される。
【０３０３】
粒子ベースの測定法は結合能力が高いため、ＥＣＬ測定法で使用されている（例えば、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９０／０５３０１およびＷＯ９２／１４１３９を参照）。これらはまた、溶液中の結合で観察される反応速度に近い速度で結合が起きることを可能にする。
【０３０４】
磁性を利用して金属表面の磁性粒子を捕捉するシステムを用いた、高感度で正確な測定法が実施されている（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９２／１４１３９；ディーバー・ディー・アール（Deaver, D.R.）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，（１９９５）７５８−７６０；ヤング・エィチ・ジェイ（Yang H.J.）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，（１９９４），１９３−１９４を参照）。この捕捉法は、標識粒子が励起されるように、粒子を電極の近くに置く。この技術は、多くの分野で非常に成功している。しかしこれは、いくつかの限界（主にコストと複雑さ）があり、処分可能なカートリッジを用いる低コスト測定法ではその使用が限定される。
【０３０５】
多孔性電極を介する濾過により粒子を捕捉するシステムは、粒子ベースの測定法の高い結合能力と優れた反応速度を利用する。これはまた、流体工学を単純化し、多種類の安価で非磁性の市販の粒子を使用でき、かつ安価で多孔性の炭素ベースの電極を使用することができる。これはまた、粒子に結合した標識物のＥＣＬ励起の効率を改善することができる。多孔性電極は、非多孔性電極（例えば、金属フィルム）よりはるかに有効な表面積を有する。電極が、多孔性でかつ繊維性の材料からなる小繊維マットなら、小繊維は、例えば粒子の大部分を包むかまたは交差して置くことにより、接触してもよい。
【０３０６】
本発明は、ＥＣＬによるアナライトの検出のための粒子を捕捉する多孔性電極を含有するカセットを含む。カセットは、ＥＣＬ−不活性なフィルター上に支持される炭素小繊維の薄いＥＣＬ−活性層からなる作用電極を含有してもよい（炭素小繊維の詳細な説明については、セクション５．１とここに引用されている文献を参照。小繊維マットの詳細についてセクション５．７を参照）。カセット内の別のチャンバーは、ストレプトアビジン被覆粒子と乾燥した結合試薬（例えば、ビオチン標識捕捉試薬とＥＣＬ−標識検出試薬）を含有する。カセットはまた、粒子を含有するチャンバーに液体試料を導入する手段、濾過により作用電極上の粒子を捕捉する手段、対電極および参照電極を提供する。本発明はまた、カセットでＥＣＬ測定法を実施するための関連システム（例えば、ホウジング、カセット中の電極への電気的接続、波形発生器またはポテンショスタット、ＰＭＡＭＳから放出されるＥＣＬをイメージングするための電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、および波形発生器を制御しカメラ４７２１により受け取られる画像を解析するためのマイクロコンピューター）を含む。
【０３０７】
粒子が濾過により捕捉される粒子ベースの測定法のための作用電極のいくつかの好適な実施態様がある。この電極が形成される材料は、適切な電気化学電位が加えられる時、その近傍にあるＥＣＬ標識物からＥＣＬを励起することができなければならない。電極が多孔性の場合は、孔のサイズは、電極中へまたはこれを介して非結合試薬の濾過を可能にするのに充分なだけ大きいが、粒子を捕捉するのに充分なだけ小さくなければならない。
【０３０８】
好ましくは作用電極は、導電性フィルターからなる。導電性フィルターは例えば、ＥＣＬを励起することができる多孔性炭素、粒状炭素の凝集物から、黒鉛炭素、炭素小繊維および／または多孔性金属から、形成されてよい。電極は、非導電性多孔性材料（例えば、金、白金および／または黒鉛繊維のマットのようなＥＣＬ−活性材料で被覆された、市販のポリマーベースの濾過膜）から構成されてよい。電極は複数の層を有してもよい。１つの実施態様において、ＥＣＬ−活性電極材料の薄膜は、より厚いＥＣＬ−不活性（しかし、導電性）材料上に沈積される。「活性」および「不活性」という用語は、ＥＣＬ標識物からＥＣＬを励起するための電極の相対的効率を意味し、この特徴は、具体的な応用でＥＣＬを開始させるのに使用されるＥＣＬ標識物の構造および条件の両方に依存する。導電性のＥＣＬ−不活性層は、活性層の全表面に沿った電気的接触を確実にするが、活性層を通って濾過した非結合ＥＣＬ標識試薬からのＥＣＬの励起を防止する。好適な実施態様において、ＥＣＬ−活性層は、炭素小繊維の薄いマットであり、ＥＣＬ−不活性支持体はステンレスの濾紙である。
【０３０９】
非共有結合および／または共有結合反応により粒子上に結合試薬を固定化する多くの方法が、当該分野で公知である。例えば粒子をストレプトアビジンで被覆し、次に特異的結合試薬を、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を使用して捕捉する。
【０３１０】
本発明での使用に適した広範囲の粒子が市販されている。これらには、他のタイプの粒子ベースの測定法で普通に使用されるビーズ、例えば、磁性、ポリプロピレン、およびラテックス粒子、固相支持体で典型的に使用される粒子（ポリスチレンおよびポリアクリルアミド粒子）、およびクロマトグラフィーへの応用で典型的に使用される粒子（例えば、シリカ、アルミナ、ポリアクリルアミド、ポリスチレン）が含まれる。粒子はまた、炭素小繊維のような繊維であってもよい。
【０３１１】
その表面に多様な官能基を有する材料が利用できる。このため、広範囲の固定化化学の使用が可能になる。ある測定法では、アナライト自身が粒子として作用することもある。例えば、特異的細胞表面抗原を有する細胞の測定（または、細胞集団中の細胞表面マーカーの量を定量するための測定）は、細胞を、抗原に対するＥＣＬ−標識抗体で処理し、次に多孔性電極上に細胞を濾過することにより行われる。
【０３１２】
本発明は、多くの異なる結合測定法（セクション５．１０に記載のものを含む）を実施するために使用できる。これらには、競合およびサンドイッチフォーマットの、免疫測定法および核酸ハイブリダイゼーション測定法がある。これらの測定法の多くは、電極の近傍の標識アナライトまたは結合試薬を検出する。必要な場合は穏やかに混合して懸濁液中の粒子上で結合試薬を実施することは、結合反応の反応速度が特に好適であるため、有利である（これらは、均一系反応の速度に近い）。
【０３１３】
あるいは、粒子を電極上に沈積させ、捕捉された粒子中に試料を流すことにより、結合反応が行われる。結合ドメインを有する粒子は、セクション５．１に記載の多くの方法により、パターン付けされたアレイ（すなわち、ＰＭＡＭＳ）上に沈積することができる。
【０３１４】
ある実施態様において、粒子は９６ウェルプレートのパターンに対応するアレイ中で、電極上に沈積される。この粒子／電極固定物は、マスク中の孔が沈積された粒子のパターンと整列するように、電極に押しつけられる。孔の壁は、ウェルの壁を画定する。電極と粒子はウェルの底および結合試薬を画定する。好ましいキットは、業界の標準を満足する任意の数の孔を有する（例えば、高処理量スクリーニングのための９６または３８４の孔）。
【０３１５】
結合試薬を有する粒子は、電極上の複数のゾーンに沈積してもよい。同じ結合試薬を有する粒子を有する２つまたはそれ以上のゾーンがあってもよい。異なる結合試薬を有する２つまたはそれ以上のゾーンがあってもよい。
【０３１６】
流体ガイドにより試料を１つまたはそれ以上のゾーンに送るか、または一回の工程ですべてのゾーンに一気に加えてもよい。
【０３１７】
あるいは、粒子を電極の表面に均一に沈積（すなわち、パターン付けしたアレイではない）し、孔を有する固定物を、電極の活性領域を画定するために電極に押しつけてもよい。
【０３１８】
１つまたはそれ以上の内部標準を含めることが、しばしば好ましいことがある。シグナルを内部標準が発生するシグナルと比較すると、測定の実施において測定カセットの製造の変動を補償することができる。内部標準として色素をを粒子内に取り込んでもよい。蛍光色素を取り込んだ粒子は市販されており、その一部は誘導してＥＣＬを放出させることができる。特定のＥＣＬ標識物と異なる色素（例えば、そのスペクトル特性、そこからＥＣＬが放出される電気化学電位、および／またはそのＥＣＬ寿命により）は、特定のＥＣＬ標識物と内部標準からＥＣＬの同時測定を可能にする。異なるスペクトル特性を有するＥＣＬ放出は、フィルター、格子、および／または規定されたスペクトル窓内での光の測定を可能にする当該分野で公知の他の技術を使用して区別することができる。
【０３１９】
粒子を使用して、１つまたはそれ以上のアナライトの１つまたはそれ以上の測定を同時に実施するためのＰＭＡＭＳを調製することができる。例えば、各懸濁物が固定化された捕捉試薬を有する粒子を含む、粒子の複数の懸濁物を調製することができる。ＰＭＡＭＳは、懸濁物の微小液滴を、例えばセクション５．１に記載の方法により、作用電極上の画定された領域に添加することにより形成される。
【０３２０】
カセットは、ＥＣＬ測定を実施するために１つだけの結合ドメインを有してもよい。この場合、ＥＣＬの強度は、単一光検出器を使用して定量してもよい。光の強度を既知濃度のアナライトから得られたものと比較すると、アナライトの定量が可能になる。使用される光検出装置は、フォトダイオード、光増幅管およびアバランシュフォトダイオードを含む。
【０３２１】
カセットは、複数の結合ドメインを含有してもよい。放出された光は、イメージングして各結合ドメインで発生するシグナルを分離することができる。イメージングは、ＣＣＤカメラのような光検出器のアレイを用いて行われる（セクション５．５を参照）。密に充填された結合ドメインの間のクロストークは、結合ドメインのアレイ上にレンズのアレイを置くことにより排除することができる。
【０３２２】
あるいは、検出器のアレイで測定される強度の数学的分析は、このようなクロストークを補償することができる。
【０３２３】
５．１５．電極上のＰＭＡＭＳを用いるＥＣＬ測定法
本発明は、電極の表面上に直接形成されるＰＭＡＭＳを含有するカセットを包含する。カセットは、支持体材料上の薄い金属フィルムを含む作用電極を含有する。複数の結合ドメイン（すなわち、ＰＭＡＭＳ）が、金属フィルムの表面上に存在する。カセットはまた、電極の表面に流体試料と試薬を導入するための手段、および作用電極でのＥＣＬの電気化学的励起を可能にする電極を含む。作用電極での電気化学電位のより良好な制御のために、参照電極もまた含まれる。ＥＣＬ測定を実施するための装置は、ハウジング、カセット中の電極への電気的接続、波形発生器またはポテンショスタットからなるカセット、ＰＭＡＭＳから放出されたＥＣＬをイメージングするためのＣＣＤカメラ、および波形発生器を制御しカメラが受けた画像を解析するためのマイクロコンピューターを含むカセットを含む。
【０３２４】
作用電極上で直接ＰＭＡＭＳを形成することは、以前のＥＣＬシステムに対していくつかの利点を有する：作用電極と結合測定法のための固相支持体を１つのユニットに組合せると、製造と処分可能なフォーマットにおけるＥＣＬ測定法の実施とが大幅に単純化され、処分可能な測定法が低コストで作成される。複数のＥＣＬ標識物を使用することなく、複数の測定法が実施できる。複数の測定法の各々からのＥＣＬの励起は、１つの作用電極／対電極の対に電位を加えることにより同時に行うことができる（結合ドメインのすべては、同じ作用電極の表面に位置している）。ＰＭＡＭＳの支持体として金属表面を使用すると、充分進歩した技術（例えば、金属上の自己集合単層（ＳＡＭ）の形成とパターン付け）の使用が可能である。
【０３２５】
作用電極は、金属（例えば、金および白金）、金属酸化物導電体、および半導体（例えば、ＩＴＯ）、炭素（例えば、黒鉛、カーボンブラック、炭素小繊維）、および導電性有機ポリマー（例えば、ポリチオフェン）を含む広範囲の材料から作成される。電極は、異なる材料の複合体でもよい。
【０３２６】
ある実施態様において作用電極は、基板上の薄い（５nm〜１０，０００nm）膜である。蒸着、重合、スパッタリング、化学的蒸着、およびメッキを含む技術によるこのようなフィルムの調製は、当該分野で公知である。好適な実施態様において作用電極は、基板上に蒸着した金の薄膜である。薄膜電極のための基板の性質は、測定系の要件により選択することができる。基板は、固体でもよく、電極を介する試料の濾過または電極に沿った試料の毛細管移動が好ましい場合は、基板は多孔性材料（例えば、濾過膜）でもよい。
【０３２７】
結合試薬は、非特異吸着により電極表面に直接固定化されるか、または電極の表面の化学的官能基への共有結合により固定化される。電極の表面に化学的官能基を導入する１つの方法は、薄膜の電子沈積または電子重合である。別のアプローチは、自己集合単層（ＳＡＭ）の調製である。電極材料上で調製できるＳＡＭの例は、金の上の有機チオール、およびＩＴＯの上の有機シラン（セクション５．１を参照）の単層を含む。図５０に示すように、ＳＡＭは、分子Ａ−Ｌ−Ｂ  ５０３２を電極５０３３の表面と反応させることにより調製され、ここでＡは、電極への分子の結合に関与する官能基であり、Ｌは結合鎖であり、そしてＢは、表面への結合試薬５０３４の結合のために使用される官能基である。あるいは、Ｂは結合試薬でもよい。
【０３２８】
好適な実施態様において、ＳＡＭは、末端が官能基化されたアルカンチオール（ＨＳ−（ＣＨ2）ｎ−Ｂ）を、基板上に沈積した金の薄膜と反応させることにより形成される。多様な官能基（Ｂ）を有するアルカンチオールが調製でき、多様な固定化化学の利用が可能である。例えば、基Ｂがカルボン酸基を含むなら、アミノ基を含有する結合試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下でエチル−３−ジアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）でＳＡＭを活性化した後に、ＳＡＭと反応させて固定化することができる。あるいは官能基Ｂはメチル基でもよく、結合試薬は非特異的な疎水性相互作用により固定化されるか、または官能基Ｂがビオチン残基を含むなら、ストレプトアビジン、または共有結合もしくはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によりストレプトアビジンに結合した他の試薬は、その表面に固定化される。
【０３２９】
結合試薬の固定化のための多くの他の化学が当該分野で公知であり、かつ使用可能である。ある場合には、表面に固定化された結合試薬の密度を調節するために、または表面の好ましい性質（例えば、非特異結合に対する耐性）を維持するために、電極表面の官能基Ｂの密度を調節することが好ましいこともある。ある官能基Ｂの表面密度の調節は、表面のＢの所望の濃度と混合したＳＡＭを産生するために決定された比率で、電極表面を、モノマーＡ−Ｌ−ＢとＡ−Ｌ−Ｃを含有する混合物で処理することにより達成される。官能基Ｃは、結合試薬Ｂを結合するために使用される固定化化学に対して耐性であるように選択され、非特異結合の低下した表面を産生するような他の好ましい性質を有してもよい。
【０３３０】
電極の表面上のＰＭＡＭＳの形成は、（ｉ）写真平板固定化；（ii）微小接触印刷；および（iii）マイクロキャピラリーアレイまたはインクジェット印刷の使用による表面への結合試薬の液滴の調節添加、とを含む、種々の方法により行われる（セクション５．１の考察を参照）。結合ドメインで修飾された表面上の領域をよりよく画定するために、パターン付けしたＳＡＭを使用することができる。例えば、微小接触印刷を使用して、金表面に円形の領域をパターン付けして、末端がカルボン酸のアルカンチオールから形成した親水性ＳＡＭを提供することができる。次に残りの金表面に、末端がメチルのアルカンチオールを反応させて、疎水性ＳＡＭを与えることができる。ＮＨＳの存在下でＥＤＣにより表面を活性化した後、各々が異なる抗体を含有する液滴を親水性の円に添加する。円の外側の表面の疎水性のために、液滴は疎水性領域に閉じこめられ、こうして固定化された結合ドメインの領域の注意深い調節が可能になる。
【０３３１】
電極上に固定化されたＰＭＡＭＳを使用して行われる測定法のタイプには、セクション５．１０に記載のものが含まれる。これらの測定法の多く（例えば、競合的およびサンドイッチフォーマットの、免疫測定法および核酸ハイブリダイゼーション測定法）は、結合試薬、ＥＣＬ−活性基（標識）で標識されたアナライトの電極表面への結合の検出に依存する。ＳＡＭの表面の標識された試薬から放出されるシグナルの強度は、ＥＣＬを励起するために使用される電位波形の性質に強く影響される。例えば、金上のアルカンチオール酸塩のＳＡＭは、良好な電気絶縁体であるが、電極表面での強い酸化または還元電位は、単層中に乱れを引き起こすことによりフィルムの絶縁性を低下させる。ＳＡＭに乱れを引き起こさない電位でのＥＣＬの励起は、電子がトンネル作用により単層を通過することが必要である。ＳＡＭに乱れを導入する電位を加えることにより、はるかに強度の強いシグナルが達成され、こうして電極への電流の妨害が低下する。これらの電位は、ＥＣＬの励起の前または実施中に適用することができる。あるいはＳＡＭは、乱れた単層を与える当該分野で公知の条件を使用して形成してもよい。単層の導電性はまた、電子の移動を促進する単層中に成分を含めることにより増加させることができる（例えば、結合基Ｌへのパイ共役系の導入）。導電性の高いＳＡＭの形成は、セクション５．７でより詳細に考察する。
【０３３２】
ある場合には、ＳＡＭに乱れを導入しない電位の使用が有利である。これらの条件下で、溶液中の非結合の標識試薬からの結合標識試薬の区別は、距離への電子トンネル作用の強い依存性のために最大になり、こうして洗浄工程の必要性が排除される。表面のＥＣＬ標識物は、溶液中のＥＣＬ標識物よりはるかに強いシグナルを与えるであろう。ＥＣＬは、結合から生じるＳＡＭとＥＣＬ標識物との導電性の変化により調節することができる。核酸ハイブリダイゼーション測定法を実施するためのこのアプローチの使用は、セクション５．７に記載される。
【０３３３】
本発明のカセットは、１つのＥＣＬ測定を実施するための１つだけの結合ドメインを含有してもよい。光の強度を既知濃度のアナライトから得られたものと比較することにより、アナライトの定量が可能になる。使用される光検出装置には、フォトダイオード、光増幅管およびアバランシュフォトダイオードがある。カセットはまた、複数の結合ドメインを含有してもよい。このようなカセットから放出された光は、各結合ドメインで生成したシグナルを分離するためにイメージングされなければならない。イメージングは、ＣＣＤカメラのような光検出器のアレイにより行われる（セクション５．５を参照）。密に充填された結合ドメインの間のクロストークは、結合ドメインのアレイ上にレンズのアレイを置くか、あるいはいくつかの結合ドメインからのシグナルの強度の数学的分析により排除することができる。
【０３３４】
５．１６．多孔性基板上のＰＭＡＭＳを用いるＥＣＬ測定法
図３７は、マトリックス３７０３の中および／またはその上の結合ドメイン３７０２が表面３７０１に提示されるカセットを示す。結合ドメイン上の結合反応の完了後、結合ドメインが作用電極のすぐ近傍にくるように、作用電極３７０４と対電極３７０５を支持する第２の表面３７００を位置させる。結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物からの発光は、片面または両方の表面から検出される。我々は、このＥＣＬの配置を「２表面」ＥＣＬ測定法と呼ぶ。
【０３３５】
図３８は、結合ドメイン３８０５、３８０６、３８０７が、対電極３８００上に支持されたマトリックスの表面に提示されているカセットを示す。結合ドメイン上の結合反応の完了後、作用電極３８０１をマトリックスの表面のすぐ近傍に位置させる。結合ドメインに結合したＥＣＬ標識物からの発光は、もし電極の一方または両方が透明かまたは半透明なら、片面または両方の電極から、および／または横から検出される。
【０３３６】
本発明はまた、ＰＭＡＭＳを含有するカセットを使用するＥＣＬ測定法を実施するための装置を包含する。図３８に記載のカセットを使用するＥＣＬ測定法を実施するための装置は、電極に電気的接続をするための手段、電極の電位を制御するための手段、マトリックスを作用電極のすぐ近傍に動かすための手段、およびＥＣＬの励起中に放出された光をイメージングするための手段を含む。
【０３３７】
この２表面法は、従来のＥＣＬ方法に対していくつかの利点を有する。複数のＥＣＬ標識物を使用することなく、複数の測定が便利に実施できる。複数の測定の各々からのＥＣＬの励起は、１つの作用電極／対電極の対に電位を加えることにより（すべての結合ドメインは、同じ作用電極の近傍に位置している）同時に実施することができる。結合反応の間、物理的バリアー（これはＥＣＬの励起の前に除去される）により作用電極は保護することができ、このため、その電子化学的性能を変化させる電極表面の汚染を防ぐことができる。サンドイッチ免疫測定法の場合について図５５に示すように、マトリックス５２００に固定化された一次抗体５２０１に結合したアナライト５２０２への、ＥＣＬ標識試薬５２０３の結合により、標識５２０４が電極表面５２０５に最適に提示される（すなわち、標識物と電極の表面の間の最少の有機物質、例えばタンパク質、核酸、または結合基）。マトリックスは、例えば電気泳動および／またはマトリックスを介する濾過により、試料の成分の濃縮および／または分離のために使用される。マトリックスは乾燥または部分的に水和された型の測定試薬の保存のための媒体として使用される。マトリックスの表面は、作用電極と等角で接触して置くことができる。
【０３３８】
ＰＭＡＭＳは好ましくは、以下の性質の１つまたは両方を有するマトリックス内および／または上に形成される。マトリックスは、作用電極と対電極の間にイオン電流を流すことができ、従って電気化学回路を完成することができる。マトリックスは好ましくは、作用電極と密着することができ、例えばマトリックスはエラストマー性および／または柔軟性である。これらの性質を有する材料は当該分野で公知であり、例えば濾過膜および水膨潤性ポリマー性ゲルなどの多孔性材料を含む。本発明のある実施態様において、例えば作用電極で励起された光がマトリックスを介して検出されるなら、マトリックスは透明であることが好ましい。
【０３３９】
ＰＭＡＭＳは、異なる孔径と溶媒含量を有する多孔性材料（例えば、ゲル）上で形成することができる。例えば、孔径の異なるポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの濃度と架橋の程度を変えることにより作成することができる。
【０３４０】
アナライトより小さい孔径を有するマトリックスでは、結合反応は実質的にゲルの表面で起きる。この場合、ゲルを介する濾過および／または電気泳動を使用して、ゲルの表面でアナライトを濃縮し、結合反応の動力学を調節（例えば、速度を増加）することができる。速度の速い方が迅速測定法では有利であり、短時間で感度が上昇する。
【０３４１】
アナライトより大きい孔径を有するマトリックスでは、結合反応はゲルの表面ならびに本体で起きる。この場合、濾過および／または電気泳動を使用して、結合の動力学を上昇させ、ならびに非結合分子種を表面から除去することができる。
【０３４２】
ゲル上に形成されるＰＭＡＭＳは湿潤状態で保存されるか、および／または乾燥状態で保存して測定時に復元することができる。ＥＣＬ測定に必要な試薬は、ゲルの形成中にゲル中に浸透させるかまたは取り込むことにより、保存前にゲル内に取り込むことができるか、および／または測定時に加えることができる。
【０３４３】
共有結合および非共有結合によるマトリックスへの結合ドメインの固定化は、当該分野で公知である。種々のマトリックス材料への結合ドメインの固定化法のいくつかの例が、セクション５．１に詳述されている。セクション５．１はまた、マトリックス上の結合ドメインをパターン付けしてＰＭＡＭＳを形成する方法を詳細に記載する。これらのパターン付け法は以下を含む：ｉ）写真平板的固定化；ii）マトリックスの表面へ微小液滴のパターン付けした適用；iii）液体型のマトリックス中の結合ドメインを含有する液滴または微小液滴の基板への適用と、次に架橋、重合、ゲル転移以下の冷却などを含む既知の技術を使用して液体の固化および／またはゲル化をして、マトリックス材料からなる基板上に明確な液滴を与える（こうして各固化した液滴は異なる結合ドメインからなる）；iv）マトリックスを使用して、例えばポリアクリルアミドスラブで電気泳動して分離を行う；そしてｖ）１つまたはそれ以上の結合ドメインを含有するマトリックスの層構造を形成。
【０３４４】
作用電極は好ましくは、適切な電気化学電位が加えられる時、表面のすぐ近傍でＥＣＬ標識物からＥＣＬを励起することができる電極材料から作成される。ある実施態様において、光は、作用電極および／または対電極を介してＰＭＡＭＳの表面から検出される。これらの場合に、透明または半透明電極材料を使用することが有利である。これらの電極材料は当該分野で公知である。例としては、インジウム酸化スズでできたフィルムならびに非常に薄い（＜３０nm）金の薄膜がある。あるいは、試料から作用電極を保護することが有利なことがある。試料をＰＭＡＭＳとインキュベーションの間、電極上の物理的バリアーはこれを保護し得る。次にＰＭＡＭＳを電極のすぐ近傍に置く前に、物理的バリアーを除去する。
【０３４５】
５．１７．複合電極上のＰＭＡＭＳを用いるＥＣＬ測定法
本発明の好適な実施態様において、電極は、多数の炭素小繊維をその中に分散して含有するポリマーの複合体である。好ましくは複合体は多孔性である。
【０３４６】
測定を実施するための好適な装置は、その中に分散した炭素小繊維と、測定法の成分に結合することができる試薬を含有する１つまたはそれ以上の結合ドメインとを含有するマトリックスを、第１の成分として含む。
【０３４７】
電気化学発光によるアナライトの検出のための装置は、その中に分散された多数の導電性粒子を有するマトリックスと、結合電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する結合ドメインとの複合体からなる電極を含んでよい。好ましくはマトリックスはポリマーであり、導電性粒子は炭素である。導電性粒子は好ましくは炭素繊維であり、炭素繊維または炭素小繊維である時最も良好な結果が得られる。
【０３４８】
複数のアナライトの検出に使用される装置はまた、本発明に包含される。そのような装置において、電極は、その中に分散された多数の導電性粒子を含有するマトリックスと、電極の表面に支持された、各ドメインが結合電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する複数の結合ドメインとからなる。
【０３４９】
ポリマーと分散された炭素小繊維を含む電極の性質は、複合体を種々の化学的および物理的工程（例えば、酸化、プラズマへの暴露、および１つまたはそれ以上の官能基の添加により電極を誘導体化することができる試薬への暴露）に付することにより修飾される。後者の方法においてポリマーが誘導体化されるか、またはその中に含有される小繊維が誘導体化されるか、または両方が誘導体化される。好ましくは複合体は、修飾するために、該複合体に存在する電気化学発光化合物で電気化学発光が起きる電位を変更するのに充分な時間、化学的または物理的処理に付される。また、その上の所望の官能基を露出するように電極を修飾することにより、ポリマーとその中に分散された多数の炭素小繊維を含む電極の性質を修飾することも本発明に包含する。本発明はまた、電気化学発光が起きる電位を変えるために化学的または物理的処理により修飾されている電極も含む。
【０３５０】
本発明は、２つ以上の材料からなる電極（すなわち、複合電極）の表面に直接形成されるＰＭＡＭＳを含有するカセットを包含する。このようなカセットのいくつかの成分は、前記した。
【０３５１】
複合電極は、支持体マトリックス中に含浸された導電性および／または電気化学的に活性な粒子からなってもよい。例えばマトリックスは、油、ロウ、パラフィン、プラスチック、セラミック、テフロン、ポリマー、エラストマー、ゲルおよび／またはこれらの組合せからなってもよい。複合電極の製造に使用することができる市販のポリマーのいくつかの例には、ＥＶＡ、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、およびＡＢＳがあるが、これらに限定されない。
【０３５２】
マトリックスは、特定の応用についての設計の要求を満たすように選択される。材料は、特定のタイプの固定化化学について適切なものでよく、特定のタイプの測定法において高い特異的シグナルおよび／または低いバックグランドシグナルを与え、および／または材料は好ましい物理的性質（例えば、可撓性、強度、化学的耐性）を有する。
【０３５３】
複合電極は、マトリックスと組合せた時に導電性の複合体を与える任意の粒子を使用して形成することができる。粒子は、炭素、例えば粒状炭素、カーボンブラック、炭素繊維、カーボンフェルトおよび好ましくは炭素小繊維である（セクション５．１と５．７）。
【０３５４】
マトリックスのための２つ以上のタイプの粒子および／または２つ以上のタイプの材料を含有する複合体が使用できる。例えば、複合電極は、導電性とＥＣＬ活性を付与するために１つのタイプの粒子を含有し、結合ドメインの支持体として別のタイプの粒子を含有してもよい。
【０３５５】
好適な実施態様において、複合電極は、炭素粒子とマトリックスの混合物からなっていてもよい。具体的な好適な実施態様では、複合電極は、炭素小繊維とポリマーからなる。米国特許第５．３０４．３２６号と第５．０９８．７７１号は、小繊維を含浸させたポリマー複合体を記載している。
【０３５６】
小繊維−ポリマー複合電極は、プラスチック材料と部品の製造の分野で公知の技術により製造することができる。例えば、平板電極は、プレスシートまたは小繊維複合体の押出しフィルムから切断することができる。流体の移動または反応チャンバーのウェルのために複雑な形または表面の特徴（例えば、くぼみまたはチャネル）を有する電極は、射出成型により形成される。
【０３５７】
複合電極は、固体または多孔性でもよい。多孔性複合体は、多孔性プラスチック材料（例えば、濾過膜）を製造するための技術を使用して形成される。多孔性複合電極を通して濾過すると、電極の表面に固定化された結合ドメインへの結合反応の動力学が改善される。
【０３５８】
結合試薬は、修飾されていない複合電極上で固定化される。例えば、結合試薬は、マトリックス上におよび／または導電性粒子上に、非特異的吸着により固定化される。マトリックスおよび導電性粒子上に存在する官能基は、試薬の固定化のために使用することができる。これらの試薬は、結合試薬として働き、および／または表面の性質（例えば、湿潤性または非特異結合に対する耐性）を変える試薬として働く。マトリックスとして使用される材料上の試薬の共有結合および非共有結合固定化法は、当該分野で公知である（セクション５．１を参照）。
【０３５９】
ある実施態様において、炭素粒子は、０．１〜９９．９重量％の複合体を含む。ある実施態様において、炭素粒子は０．５〜５０重量％の複合体を含む。好適な実施態様において、炭素粒子は１〜３０重量％の複合体を含む。特定の好適な実施態様において、炭素粒子は、２〜２０重量％の複合体を含む。
【０３６０】
複合体中の炭素小繊維の使用は特に有利である。小繊維の導電性と高いアスペクト比が、複合体中の低重量パーセントの炭素で高導電性を有する複合体の調製が可能になる（同じパーセントで存在する、小繊維以外の炭素粒子を含有する複合体と比較して）。炭素の量が多いと複合体の構造および／または加工性が影響を受けることがあるため、高導電性を有しているが炭素の量が少ない複合体は有利である。炭素小繊維を含有する複合体はまた、その大きな外表面積のために、高い結合能力を有する。小繊維を露出させるために複合体を処理（例えば、化学的手段またはプラズマへの暴露により）すると、結合能力を有効に変化させて、これを増加させる。ここで欠乏能力とは、材料のある幾何面積当たりに固定化される試薬の量を意味する（例えば、材料cm２当たりのタンパク質のナノグラム）。幾何面積とは、材料の大きさにより画定される材料の面積を意味する（例えば、１cm×１cmの大きさを有する材料の四角い片は、幾何面積１cm２を有する）。多くの材料の制限の１つは、結合能力が材料の幾何面積により制限されることである。例えば、平滑で平面的な表面（例えば、金属の表面）が使用されるなら、その平滑で平面的な表面の幾何面積にわたって分布した試薬の密に充填された単層の結合能力を超える、試薬（例えば、タンパク質、核酸、結合試薬）の結合能力を得ることは不可能かも知れない。露出した小繊維を有する複合体の使用は、この制限を克服する。小繊維を露出させると、複合体の表面に複数の突出した小繊維（各々が広い表面積を有する）を生みだし、試薬の結合に使用可能な小繊維の総表面積が、複合体の幾何面積を大幅に超えることができる。ある実施態様において、そのような複合体上の試薬の結合能力は、複合体の幾何面積にわたって分布した試薬の密に充填された単層のそれの１倍を超えることができる。別の実施態様において、そのような複合体上の試薬の結合能力は、複合体の幾何面積にわたって分布した試薬の密に充填された単層のそれの２倍を超えることができる。好適な実施態様において、そのような複合体上の試薬の結合能力は、複合体の幾何面積にわたって分布した試薬の密に充填された単層のそれの１０倍を超えることができる。別の好適な実施態様において、そのような複合体上の試薬の結合能力は、複合体の幾何面積にわたって分布した試薬の密に充填された単層のそれの１０００倍を超えることができる。
【０３６１】
ある実施態様において、炭素小繊維を含有する複合体は、複合体をマトリックスを障害するかも知れない（もしマトリックスのみが処理されたなら）ある溶媒、温度、試薬およびプロセスによる障害に対して耐性であり得る。この障害に対する耐性は、加工において有利である。例えば、複合体の誘導体化のためにある方法を使用することが可能である（例えば、マトリックスのみを溶解するが、複合体として一緒に存在する時マトリックスまたは小繊維をかなり溶解する溶媒が必要な方法）。
【０３６２】
複合電極は、化学的または物理的処理により修飾して、結合試薬の固定化を改善することができる。表面は、試薬の固定化のための官能基を導入するために処理される。使用される方法には、電磁放射、イオン化放射、プラズマまたは化学的試薬（例えば、酸化剤、親電子剤、求核剤、還元剤、強酸、および強塩基および／またはこれらの組合せ）への暴露を含む（セクション５．１８を参照）。
【０３６３】
１つの特に興味深い実施態様は、そのような複合電極の修飾、およびより広くはマトリックス（例えばポリマー）とその中に分散された１つまたはそれ以上の小繊維および／または小繊維構造体を含む複合材料（電極に限定されない）の、プラズマを用いる処理による修飾である。この処理は、処理の間にプラズマと接触する、小繊維、小繊維構造体および／またはマトリックスの表面特性を変えるために行われる。これは、処理された小繊維複合体は、必要に応じて官能基化または改変されることを意味する。本明細書に記載の教示により、当業者は、公知のプラズマ処理技術（さらなる発明または過剰な実験をすることなく）を、そのような複合材料の処理に適合させ利用することができるであろう。すなわちこの処理は、適当な反応容器中で適当な圧力かつ他の条件で、かつ適当な時間、プラズマを生成させ、それを複合材料と接触させ、そして修飾の所望の種類と程度を達成することができる。酸素、アンモニア、ヘリウムまたは他の化学的に活性なまたは不活性な気体に基づくプラズマを使用することができる。その性質に依存して、修飾された組成物は、電極（既に記載したもの）または他の応用に使用することができる。
【０３６４】
プラズマを生成するために使用される他の気体には、アルゴン、水、窒素、エチレン、四フッ化炭素、六フッ化イオウ、パーフルオロエチレン、フルオロホルム、ジフルオロ−ジクロロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、などがある。プラズマは、単一の気体または２つまたはそれ以上の気体の混合物から生成されてもよい。複合材料を２つ以上の気体に暴露することが有利なことがある。また複合材料を、複数回連続してプラズマに暴露することが有利なこともある。プラズマを生成するために使用される条件、そのような処理の持続時間、およびそのような連続的処理の間の時間を変えて、材料のある変更を行うことができる。連続的処理の間に、複合材料を処理（例えば、材料を物質で被覆し、材料の表面を洗浄するなど）することもできる。
【０３６５】
複合材料のプラズマ処理は、いくつかの変化を達成する。例えば、ポリマーとその中に分散された複数の炭素小繊維を含む複合材料は、プラズマに暴露することができる。プラズマに暴露するとポリマーがエッチングされ複合体の表面で炭素小繊維が露出され、露出した炭素小繊維の表面積が増加する（例えば、露出した小繊維の表面積が、複合体の幾何表面積より大きくなる）。プラズマに暴露すると、小繊維またはポリマーに化学的官能基が導入される。これらの官能基は、試薬の固定化のために使用される。
【０３６６】
プラズマを使用して、試薬を複合材料に結合してもよい。例えば、複合材料を、試薬を含有する溶液（例えば、界面活性剤、ポリ芳香族分子、疎水性分子、荷電分子など）に暴露すると、試薬のある量が複合材料を被覆する。試薬で被覆された複合材料は次に、プラズマに暴露することができる。プラズマに暴露すると、試薬が複合材料に結合する。別の例では、生物学的分子（例えば、タンパク質、核酸など）で被覆された複合材料をプラズマに暴露する。プラズマに暴露すると、生物学的分子が複合材料に結合する。別の例では、複合材料を１つまたはそれ以上の所望の試薬を特異的に結合する試薬（例えば、アフィニティクロマトグラフィー樹脂、生体特異的リガンドを有するポリマー）で被覆し、プラズマに暴露する。プラズマに暴露すると、試薬が複合材料に結合する。
【０３６７】
複合材料に結合した試薬は、複合体上で他の試薬を固定化するために使用することができる。例えば複合材料に結合した疎水性試薬は、複合体へのタンパク質の吸着を増強することがある。アフィニティクロマトグラフィー樹脂、生体特異的ポリマー、タンパク質などは、複合材料への生体分子の固定化を増強することがある（例えば、生体特異的におよび／または非特異的に）。
【０３６８】
プラズマはまた、複合材料上での試薬の重合を誘導するために使用することもできる。プラズマで誘導された重合の生成物を使用して、次に複合材料へ試薬を固定化する。例えば、モノマー前駆体を複合材料上に被覆することができる。プラズマに暴露すると、モノマー前駆体の一部またはすべての結合および／または重合を誘導する。別の例では、モノマーを含むプラズマで複合体を処理することにより、複合材料上にポリマーを被覆することができる。別の例では、複合体をプラズマに暴露して、モノマーまたはポリマーで複合材料を被覆し、その結果重合開始分子種を複合体上で生成し、次に複合体をモノマーで処理することができる。
【０３６９】
結合試薬をマトリックスと粒子の両方の上に固定化すると有利であるか、または結合試薬を成分の１つのみ（すなわち、マトリックスまたは粒子）に固定化すると有利である。例えば、ＥＶＡ（コポリマーまたはエチレンおよび酢酸ビニル）中の小繊維からなる複合電極を、クロム酸と硫酸の混合物で処理して、電極上にカルボン酸基を導入してもよい。次にこれらのカルボン酸基を使用して、アミド結合を形成してアミンを含有する結合試薬を固定化する。あるいは、ＥＶＡ中の小繊維の複合体を水酸化ナトリウムで処理することができる。この場合、小繊維は修飾されないが、ヒドロキシル基はポリマー上に露出される。これらの水酸化物基は次に、求核試薬を含有する結合試薬を固定化するために使用することができる。
【０３７０】
複合体の修飾により他の有用な性質が得られる。マトリックスおよび／または粒子を修飾すると、高い結合能力を有する複合電極が得られる。複合電極への親水性基の導入により、マトリックスが水和され、薄い水膨潤性ゲル層が形成される。試薬は、そのようなゲル層内に固定化され、平板な固体の表面を同じ幾何表面積で占めることができるより多くの試薬が固定化される。マトリックスの部分的分解は、導電性粒子の露出表面積を増加させ、特に粒子が溶液中に延長できる繊維である時、導電性粒子上に直接結合試薬が固定化されるための表面積の大きい電極が得られる。
【０３７１】
複合体表面を修飾すると、ＥＣＬに必要な電気化学電位がシフトすることがある。複合電極を修飾すると、ＥＣＬ標識物からのＥＣＬの励起に必要な過電位が低下または上昇し、このためいくつかのシグナル（例えば、アナライトからのシグナルおよびバックグランドシグナル）の分離が可能になる。
【０３７２】
複合電極の表面上のＰＭＡＭＳの形成は、写真平板固定化、微小接触印刷、および／またはマイクロキャピラリーアレイまたはインクジェット印刷の使用による、表面への結合試薬の液滴の調節添加を含む、種々の方法により行われる（セクション５．１を参照）。あるいは、複合電極の表面は、マスクと接触させて置くことにより、明確な領域に分類される。
【０３７３】
本発明は、ＥＣＬ測定法で使用するための処分可能なマルチウェルプレート（本明細書では、以後「ＥＣＬプレート」と呼ぶ）を包含する。ある実施態様において、ＥＣＬプレートは、導電性複合体をマルチウェルマイクロタイタープレートの形に成形（圧縮、成形、または形成）して製造される。別の実施態様において、材料のシートを通る穴のアレイを含むマスクが形成される。次にこのようなマスクは、電極に対してシールされる（電極は好ましくは、導電性複合体または小繊維マットである；小繊維マットの調製は、セクション５．７、セクション５．１８、および本明細書に引用された文献中に詳述されている）。次にマスク中の穴は、マスクを含む壁と電極を含む底によりウェルを画定するであろう。マスクと電極は、あらかじめ組み立てた処分可能なカセットとしてユーザーに提供されるか、またはキットの個々の処分可能な成分として提供される。あるいは、電極のみが処分可能である。電極は固体および／または多孔性でもよい。多孔性電極の場合は、試薬を電極を介して濾過することにより結合反応が行われる（結合測定法で使用されるマルチウェル濾過マニホールド「ドットブロット」は当該分野で公知である）。ＥＣＬプレートの異なる実施態様において、マスク中の複数の穴（前記実施態様に記載）は、複数の各電極に対してシールされ、その結果各ウェルおよび／またはウェルの群中の電極は個々に探索される。
【０３７４】
ＥＣＬプレートは、好ましくはマルチウェルマイクロタイタープレートについて使用される標準的な型で成形される。これらの標準的フォーマットは当該分野で公知であり、２４、９６、および３８４ウェルプレートがあるが、これらに限定されない。標準的フォーマットの使用は、マイクロタイタープレート上で結合反応を実施するための市販の装置の組み込みを可能にする（例えば、プレートの移動、プレートの洗浄、および／または試料の添加のための装置）。本発明は、ＥＣＬプレートの電極からＥＣＬを励起し、抽出ウェルから放出されたＥＣＬを定量するための装置を包含する。
【０３７５】
ＥＣＬプレートは、１つまたはそれ以上のアナライトについての固定化結合試薬とともに、最終ユーザーに提供される。あるいはユーザーは、ＥＣＬプレートと、結合試薬の固定化に必要な試薬（そのような結合試薬がユーザーにより提供される時）とを含むキットを提供される。
【０３７６】
複合電極は、ＥＣＬを使用しない測定法で使用してもよい。これらは、蛍光、化学発光、またはＥＬＩＳＡ型のフォーマットに基づく測定法のための固相結合支持体として使用されてよい。これらは、電流測定、または電位測定電気化学検出に基づく測定法のための固相結合支持体として使用されてもよい。
【０３７７】
５．１６．多孔性電極上のＰＭＡＭＳを用いるＥＣＬ測定法
本発明の電極は、複数の炭素小繊維のマットを含有してもよい。このようなマットは、電気化学発光測定法で使用するための電極としてよく機能することがわかっている。
【０３７８】
マットは広くは、複数の炭素小繊維と、測定試薬を含有する少なくとも１つのドメインとを含む。本発明のある実施態様において、マットは、異なる導電性の２つまたはそれ以上の層、誘導体化されたかまたはされていない炭素小繊維の２つまたはそれ以上の層、または誘導体化されたかまたはされていない小繊維の組合せ、異なる光学的不透明性の小繊維の２つまたはそれ以上の層、または異なる孔径の小繊維の２つまたはそれ以上の層を含んでよい。
【０３７９】
好ましくはこれらのマットは、電気化学発光測定法の電極として使用される。電極は、支持体と、多数の炭素小繊維を含む小繊維マットと、マットと電気的に接触するための手段とを含む。電極は、電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する結合ドメインを含有してもよい。
【０３８０】
本発明は、このような測定法で使用される電極を作成するためのキットを包含する。このキットは、支持体、小繊維マット、およびマットと電気的に接触するための手段とを含む。小繊維マットは、結合ドメインを含有してもよい。
【０３８１】
電極は、導電性または多孔性であり、好ましくは導電性かつ多孔性であり、例えば金属被覆多孔性材料からなる。電極は、ステンレスの繊維メッシュでもよい。
【０３８２】
電気化学発光測定法で使用される電極の支持体として使用される小繊維マットは、いくつかの異なる方法で調製される。そのような方法の１つでは、小繊維は、その表面に固定化された結合試薬で製造される。これらの小繊維は、媒体中に分散される。次にこれらは、溶液から濾過されて小繊維マットを生成する。
【０３８３】
あるいは小繊維マットは、媒体に小繊維を分散し、媒体から小繊維を濾過してマットを調製し、最後に小繊維マットを誘導体化して、その上に結合試薬を固定化するための小繊維マットを調製することにより、調製される。
【０３８４】
本発明は広い意味で、目的のアナライトの電気化学発光結合測定法を実施するための方法を包含する。本法は、（ａ）導電性ポリマーからなる電極と；（ｂ）結合電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する結合ドメインとからなる。
【０３８５】
本発明の方法は、生物学的試料中の複数の目的のアナライトの電気化学発光結合測定を実施するために使用することができる。この方法は、（ａ）目的のアナライトと電気化学発光が可能な標識化合物とを含有する試料を、電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する結合ドメインを含有する多数の炭素小繊維を含む電極に接触させる工程と；（ｂ）その上に電圧をかけて、発光するように電極上の標識化合物を誘導する工程と；そして（ｄ）放出された発光を検出する工程とを、含む。
【０３８６】
あるいは、この方法は、（ａ）複数の目的のアナライトと電気化学発光が可能な標識化合物とを含有する試料を、各々が電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有するドメインを含有する小繊維マットを含む複数の電極ゾーンに接触させる工程と；（ｂ）発光するように小繊維マット上に採取した標識化合物を誘導する工程と；そして（ｃ）放出された発光を測定する工程とを、含む。
【０３８７】
本発明はまた、多孔性電極を含有するカセットを包含する。カセットは、多孔性材料により支持される炭素小繊維の多孔性マットから構成される作用電極を含有する。１つまたはそれ以上の結合ドメインは、作用電極の表面上に存在する。
【０３８８】
多孔性電極は、炭素（例えば、黒鉛炭素、グラッシーカーボン、または炭素繊維）を含んでよく、特に好適な実施態様では炭素小繊維を含む。ＰＭＡＭＳの結合ドメインは、小繊維マットにより支持されてよい（セクション５．７を参照）。マットは、複数の別個の結合ドメインを支持し、その任意の２つまたはそれ以上の別個のドメインは、互いに同じであるか、またはすべてが互いに異なる。あるいは小繊維マットは、１つの結合ドメインを支持してもよい。
【０３８９】
炭素小繊維は、共有結合でまたは物理的吸着でその表面に結合した化学的官能基を用いて調製される。これらのおよび他の官能基は、小繊維の表面に他の材料を結合させるのに使用できる。例えば、ＥＣＬ測定法で使用される抗体は、１つまたはそれ以上の繊維または小繊維マットに結合することができる。
【０３９０】
小繊維マットは、誘導体化されていない小繊維、誘導体化された小繊維、または２つまたはそれ以上の異なるタイプの小繊維の混合物を含有する単一の層でもよい。小繊維マットは２つまたはそれ以上の層を有してもよい。１つまたはそれ以上の他の層に接触しているかまたはそのすぐ近傍にある、１つまたはそれ以上の明確な層から構成される小繊維のマットを形成するのに、連続的濾過工程が使用されてよい。例えば、２層の小繊維マットは、誘導体化されていない小繊維の層と生物学的分子で誘導体化された小繊維の層を含有してもよい。ある多層マットにおいて、層の間に重複または混合があってよい。
【０３９１】
小繊維マットに由来するＥＣＬシグナルは、マットの組成に依存することがある。例えば、誘導体化されていない小繊維のマットと比較して、誘導体化された小繊維のマットでＥＣＬを引き起こすには、異なる電気化学電位が必要である。電気化学電位のこの差は、測定の１つまたはそれ以上の成分に特異的であるかまたはこれに限定される。誘導体化された小繊維から構成されるマットは、バックグランドＥＣＬシグナルが観察される電気化学電位を、特定の分子種からのＥＣＬ（すなわち、測定の必要な測定法の成分からのシグナル）が観察される電気化学電位とは異なる電気化学電位にシフトさせ、こうして、特異的なシグナルとバックグランドシグナルの分離を向上させる。
【０３９２】
ある能力を有する小繊維マットを調製するのに、異なるタイプの小繊維を使用してもよい。誘導体化されていない小繊維の層と誘導体化された小繊維の層から構成されるマットでは、誘導体化されていない小繊維の層は、電気的導電体と誘導体化された小繊維の間の電気的接続を提供し、また物理的強度を提供する。誘導体化された小繊維の層は、測定の実施に必要な１つまたはそれ以上の反応物を含有する。別の実施態様において、マットは、他のシグナルの較正のための内部標準として作用する分子で誘導体化された１つまたはそれ以上の小繊維を含有してもよい。マットはまた、ＥＣＬ不活性な小繊維の層を含有し、この不活性な層は、ＥＣＬ活性な小繊維の層の物理的支持を提供する。
【０３９３】
別の材料、例えば濾過膜のような多孔性材料上に小繊維マットを支持することは有用なことがある。小繊維マットは、その表面を通して小繊維の懸濁物を濾過することにより、膜上に形成することができる。多層マットは、異なるタイプの小繊維を連続的に濾過することにより調製することができる。
【０３９４】
非導電性膜上に支持される小繊維マットへの電気的接続は、１つまたはそれ以上の導電性成分（例えば、ワイアー、金属メッシュまたは金属環）を、小繊維マットの表面に接触させるか、または導電性成分（例えば、金属ピンのアレイ）を小繊維マット中にまたはこれを通して挿入する。
【０３９５】
小繊維マットを支持するのに使用される濾過膜は、導電性であってよい。導電性フィルターの例には、金属被覆ポリマー膜、導電性ポリマー膜、金属メッシュ、カーボンペーパー、カーボンフェルト、多孔性金属フィルム、焼結金属フィルター、金属繊維フィルターおよび／または金属繊維ペーパーがある。
【０３９６】
金属被覆ポリマー膜は、これらを、熱蒸着、電子ビーム蒸着、スパッタリング、化学的蒸着またはメッキにより、１つまたはそれ以上の金属で被覆することにより調製できる。好適な実施態様において、ポリマー性濾過膜は、熱蒸着により金で被覆される。
【０３９７】
濾過膜が濾過により小繊維を効率的に捕捉しない場合、濾過効率的を改善するための方法が使用される。フィルターの表面および／または内部例に金属を沈積することにより、膜の有効孔径を減少させることができる。濾過膜は、適切なサイズの材料で栓をするかまたは閉塞することができる（すなわち、フィルターエイドを使用することができる）。小繊維とフィルターの間の結合を誘導するように、フィルターを化学的に処理することができる。結合は、共有結合、ファンデルワールス力、水素結合、電荷／電荷相互作用、または疎水性親水性相互作用、または生体特異的結合（タンパク質／リガンド、抗体／抗原など）の方法によりよる。フィルムブイは、他の機構（例えば、懸濁される液体の蒸発による、フィルターの表面への沈積）により捕捉することができる。
【０３９８】
小繊維マットを支持するフィルターは、ＥＣＬの電極として作用することができる。例には、金、白金、炭素、および／またはインジウム酸化スズ（ＩＴＯ））のまたはこれで被覆されたフィルターを含む。このような実施態様において、支持体と小繊維の両方とも、観察されたＥＣＬシグナルに寄与する。ある実施態様においては、小繊維マットを支持するフィルターは、ＥＣＬの電極として作用しない。このような小繊維マットは、小繊維マットの支持と電気的接続性を与える。このようなフィルターは小繊維マットの支持と導電性を提供するが、バックグランドＥＣＬシグナルを含む観察されたＥＣＬシグナルには寄与しない。
【０３９９】
小繊維マットはまた、非多孔性材料上で支持される。小繊維マットは、ＥＣＬ電極として作用することができる材料（例えば、金箔、白金箔、導電性複合体またはＩＴＯ）上に支持されてよい。小繊維マットは、ＥＣＬ電極として作用しない材料（例えば、ステンレス、ニッケルまたは非導電性材料）上に支持されてよい。
【０４００】
ＰＭＡＭＳは、小繊維マット上で調製できる。ＰＭＡＭＳを形成するのに必要な試薬は、前記のような微量流体ガイドによりあらかじめ形成された小繊維マットの空間的に別個の領域に送達される。例えば、微量流体ガイドのアレイ（Ｇ１、Ｇ２、．．．Ｇn）は、ストレプトアビジン被覆小繊維からなるマットの空間的に別個の領域に、ビオチン化抗体（Ａ１、Ａ２、．．．Ａn）を送達するために使用することができる。誘導体化された小繊維は、捕捉される場所で微量流体ガイドにより（例えば、濾過または蒸着により）支持体の空間的に別個の領域に送達される。例えば、微量流体ガイドのアレイ（Ｇ１、Ｇ２、．．．Ｇn）は、金被覆した限外濾過膜の空間的に別個の領域に、抗体（Ａ１、Ａ２、．．．Ａn）に共有結合した小繊維（Ｆ１、Ｆ２、．．．Ｆn）を送達するために使用することができる。その別の方法において、フィルターがメッシュのワイアーの間のスペースにより露出される時はいつも、小繊維がフィルター上に沈積するように、小繊維の懸濁物を、濾過膜に接触した物理的マスク（例えば、ワイアーメッシュ）を通して濾過してもよい。
【０４０１】
小繊維マットに固定化されたＰＭＡＭＳを使用して実施できる測定法のタイプには、セクション５．１０に記載のものがある。小繊維マットは多孔性であるため、試薬を小繊維マットを通して流し、ある場合には下の支持体を通して流して、測定を実施することができる。小繊維マット中の穴のサイズは小さい（例えば、１０〜１００００nm）ため、マットを通して試薬を流すと試薬は効率的に混合される。これにより、結合領域の表面への物質移動速度が改善されて、免疫測定を実施するのに必要な時間が短縮される。毛管作用により試料をマット内に入れるかまたはマットを通すことにより行われる測定も、同様に反応速度を上昇させるのに有効である。あるいは小繊維マットは試料中に含浸させてもよい。小繊維マットはまた、生物学的試料から好ましくない材料を除去するためのフィルターとして作用することができる。
【０４０２】
小繊維マット電極は、ＥＣＬを使用しない測定法で使用してもよい。これらは、蛍光、化学発光、またはＥＬＩＳＡ型のフォーマットに基づく測定法のための、固相結合支持体として使用してもよい。これらは、電流測定または電位測定電気化学検出に基づく測定法のための電極および／または固相結合支持体として使用されてよい。
【０４０３】
５．１９．シグナル対バックグランドを上昇させるための方法
電気化学発光測定法中の電気化学発光分子種に由来する２つまたはそれ以上のシグナルが、電気化学発光が起きる電気化学電位が異なる少なくとも２つのゾーンを有する電極で測定を行うことにより、分離できることも現在発見されている。この方法により、バックグランド電気化学発光からシグナルを分離することができ、従って測定法の性能が有意に改善される。
【０４０４】
測定法中の電気化学発光分子種に由来する２つまたはそれ以上のシグナルを分離するための別の方法では、電気化学発光分子種の１つの電気化学発光を選択的に調節する試薬を測定中に含める。例えば、分子種の１つからの電気化学発光を消滅させる試薬を加えることができる。
【０４０５】
電気化学発光分子種に由来する２つまたはそれ以上のシグナルを分離するための別の方法では、測定法中の１つまたはそれ以上の分子種から電気化学発光を生成するのに不活性な１つのゾーンを含む電極を使用して測定を実施することを含む。
【０４０６】
異なる電気化学電位でそれぞれ標識物とバックグランドの電気化学発光を誘導する電極で測定を実施することにより、バックグランドシグナルを測定の所望のシグナルから区別することができる。同様に、同じ電気化学発光化合物で標識した２つまたはそれ以上の分子種からのシグナルは、異なる電位で各標識物から電気化学発光を誘導する電極で、互いに区別することができる。これらの改良された方法は、複合電極（好ましくは炭素からなるもの）上で行われ、化学的または物理的処理により修飾して電気化学発光が起きる電気化学電位が変化したものにより、最適の結果が得られる。
【０４０７】
本発明は、目的のアナライトの電気化学発光結合測定を実施するための方法であって、（ａ）目的のアナライトと電気化学発光が可能な標識化合物とを含有する試料を、電気化学発光測定法の成分に結合することができる試薬を含有する結合ドメインを含有する多数の炭素小繊維（炭素小繊維は、電気化学発光測定法において少なくとも１つの分子種の電気化学発光が起きる電気化学電位を変更するように、化学的または物理的処理により修飾されている）を含む電極に接触させる工程と；（ｂ）電極に電位を適用することにより発光するように、電極で標識化合物を誘導する工程と；そして（ｃ）放出された発光を検出する工程とを、含む方法を包含する。
【０４０８】
研究者や臨床家の要求は、測定法の検出限界を下げ、測定法の感度を上げ、かつこれらの測定法の実施速度を上げることである。
【０４０９】
これらの要求を満たすために決定的に重要なパラメータは、シグナル対バックグランド比の最適化である。ここでは、シグナル対バックグランド比（Ｓ／Ｂ）は、測定したい試料（例えば、アナライト）の成分からのシグナルと、測定したくない試料（例えば、汚染物質）の成分からのシグナルの比であると規定する。Ｓ／Ｂ比の最適化では一般に、測定の必要な成分からのシグナルを最大にし、バックグランドシグナルを最小にする。
【０４１０】
標識分子種からのシグナルを上げるための種々の方法が当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，６５２，３３３号では、蛍光または燐光原子または蛍光標識物で標識した粒子を、測定を行う前に濃縮することができる。
【０４１１】
バックグランドシグナルを低下させるための種々の方法が当該分野で公知である。試料の汚染物質、結合しないアナライト、結合しない標識分子種、または他の成分を除去するために、洗浄工程が使用されている。
【０４１２】
１つまたはそれ以上のシグナルの検出が最適化されるように、２つまたはそれ以上のシグナルを分離することが有利である。
【０４１３】
図５８は、１つまたはそれ以上の成分の電気化学発光シグナルの電気化学電位がシフトされる方法を例示する。図５８Ａでは、試料の２つの成分（ＡとＢ）のＥＣＬシグナルが、同様の電気化学電位で現れる。従ってこれらは分離が難しい。図５８Ｂは、異なる電気化学電位に現れる２つの成分（Ａ’とＢ’）のＥＣＬシグナルを示す。成分Ｂ’のＥＣＬシグナルの電位は、異なる電位にシフトしており、成分Ａ’とＢ’のＥＣＬシグナルは容易に分離される。
【０４１４】
図５８に例示される電気化学電位の選択的シフトは、電極の近傍の１つまたはそれ以上の標識物からＥＣＬが放出される電気化学電位に従って、作用電極の材料を選択することにより行われる。あるいは、試料の１つまたはそれ以上の成分のＥＣＬシグナルの電気化学電位が変化するように、材料を化学的または物理的処理により修飾してもよい。
【０４１５】
電極の１つの領域が、別の領域とは異なる電気化学電位でＥＣＬ標識を励起するように、電極は、異なる電気化学的性質を有する２つまたはそれ以上の領域を有してもよい。電極は、層１は、試料からの１つまたはそれ以上のアナライトとＥＣＬ標識物に結合する結合試薬に誘導体化され、層２は逆に、誘導体化されていない、２層の小繊維でもよい。これはアナライトに結合しないが、バックグランドＥＣＬシグナルを与える試料の他の成分と相互作用することができる。誘導体化の結果として、層１は層２とは異なる電気化学的性質を有する。層１に結合した標識分子からのＥＣＬシグナルは、層２由来のバックグランドＥＣＬシグナルより高い電気化学電位で現れる。
【０４１６】
別の実施態様において、電気化学的性質（例えば、標識物からＥＣＬを誘発する電気化学電位および／または試料中の１つまたはそれ以上の成分のＥＣＬシグナルの強度）を変化させる化合物を、試料に加えることができる。
【０４１７】
図５９は、２つまたはそれ以上のシグナルを分離するための別の方法の略図である。試料の１つまたはそれ以上の成分のＥＣＬシグナルの強度は、試料の他の成分のＥＣＬシグナルの強度に対して低下している。図５９では、２つの成分（ＡとＢ）は、同様の電気化学電位で現れるＥＣＬシグナルを有する。図５９Ｂでは、成分Ｂ’のＥＣＬシグナルの強度の値は、成分Ａ’のＥＣＬシグナルの強度に比較して小さくなっている。
【０４１８】
図５９に例示するＥＣＬシグナルの強度の選択的変化は、試料の１つまたはそれ以上の成分のＥＣＬシグナルを消失させる材料を加えることにより行われる。あるいは作用電極は、異なる電気化学的性質を有する２つまたはそれ以上の領域を有してもよく、例えば電極は、ＥＣＬを引き起こすことができる１つまたはそれ以上の領域（Ｒ１）（「ＥＣＬ活性」）およびＥＣＬを引き起こすことができない１つまたはそれ以上の領域（Ｒ２）（「ＥＣＬ不活性」）を有してもよい。領域Ｒ１に結合した試料の成分（Ａ１）は、適切な電気化学電位の存在下でＥＣＬシグナルを与えるが、Ｒ２に結合した試料の成分（Ｂ２）はＥＣＬシグナルを与えない。
【０４１９】
「ＥＣＬ不活性」という用語は、電極または異なる電極の他の領域からのＥＣＬシグナルより実質的に小さい、ゼロでないＥＣＬシグナルを生成する電極の領域を説明することができる。ある物質は、ある条件下（例えば、緩衝液またはあるＥＣＬ標識物の存在下）ではＥＣＬ活性であり、異なる条件下ではＥＣＬ不活性であることがある。
【０４２０】
電極は、ＥＣＬ活性である小繊維と、ＥＣＬ不活性である支持体から構成されることができる。この実施態様において、小繊維と電気化学的に接触している試料の成分は、正しい電気化学電位が適用されるとＥＣＬシグナルを放出する。これに対して、ＥＣＬ不活性な支持体と電気化学的に接触しており小繊維とは接触していない試料の成分は、電気化学電位が適用してもＥＣＬシグナルを与えない。
【０４２１】
電極の光学的不透明性は、試料の１つまたはそれ以上の成分からのＥＣＬシグナルの検出を選択的に防止するために使用することができる（セクション５．１１と図２９を参照）。
【０４２２】
電極は、試料の１つまたはそれ以上の成分についてＥＣＬ活性であり、他の成分についてＥＣＬ不活性化であることがある。
【０４２３】
別の実施態様において、試料の１つまたはそれ以上の成分（Ａn）は、ＥＣＬ活性な電極と電気化学的に接触しており、試料の１つまたはそれ以上の成分（Ｂn）は、ＥＣＬ電極と電気化学的に接触していなくてもよく、すなわち電極と充分な近傍にはない。電極に適当な電気化学電位が適用されると、成分ＡnからＥＣＬシグナルが発生し、成分Ｂnからは発生しない。電極は、アナライトＡnの１つまたはそれ以上の結合ドメインを有する多孔性のＥＣＬ活性層と、多孔性のＥＣＬ不活性層から構成されてよい。試料をこの電極で濾過すると、あるアナライトＡnはＥＣＬ活性層に結合し、非結合成分はＥＣＬ不活性化層に捕捉される。電極に電位が適用されると、結合成分ＡはＥＣＬ活性層に結合しており他の成分には結合しておらず、これらはＥＣＬ不活性層中に存在するため、結合成分ＡについてＥＣＬが引き起こされる。本発明をさらに以下の例で説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０４２４】
５．２０．音波処理を利用するＥＣＬ測定法
結合反応が試薬の間で起こる多くの診断システムにおいて、試薬の混合を改善すると、反応の速度を上昇させることができる。遅い混合速度が、しばしば診断試験の完了までの進行速度を最終的に制限する。試薬の間の結合反応が起こる診断測定法の例は、免疫測定法、ＤＮＡ−プローブ測定法、臨床化学試験、受容体−リガンド結合測定法などを含む。結合速度論の遅い速度は、溶液中の試薬と固体上に存在する試薬の間の結合反応を使用する測定法を行う上で、特に制限的な制約をかけている。音波処理は、溶液中の試薬の混合、および固体の表面またはその付近に位置する試薬への溶液中の試薬の大量輸送を改善する。実験により、測定試薬の音波処理が、固相支持体を使用する結合測定を行うのに必要な時間を劇的に短縮させることを証明されている。音波処理は、約１００Hzと１０MHzの間の振動数を有する振動を包含するものと定義される。音波処理の振動数（ｆｓ）は、下記の範囲に細分することができる：低振動数音波処理（１００Hz≦ｆｓ５KHz）、超音波処理（５KHz≦ｆｓ１MHz）、および極超音波処理（１MHz≦ｆｓ＜１０MHz）。振動の振幅は、以下の範囲に細分することができる：低振幅音波処理（＜１μm）、中振幅音波処理（１〜１０μm）および高振幅音波処理（＞１０μ）。
【０４２５】
音波処理により達成される混合の改善により、終点測定と反応速度測定の両方に、容易で有用な適用が可能になる。終点測定では、目的のアナライトの濃度または量は、結合反応が完了に近づいたときにどれだけ多くの結合が起こったかを測定することにより求められる。我々は、結合反応の過程での音波処理が、結合反応が完了に近づくのに必要な時間を短縮させることを見いだした。反応速度測定では、目的のアナライトの濃度または量は、結合反応の速度を測定することにより求められる。同様に、結合反応の過程での音波処理が、結合反応の速度を上昇させることが見い出された。結合反応が速いほど、従来可能であったよりもはるかに短い時間で測定可能なシグナルが得られる。本発明は、ある種の反応の速度を非常に加速するため、このような反応を利用する測定法が、わずかおよそ数分で、しばしば３分以内で完了しうる。
【０４２６】
固体支持体上の大量輸送制限結合反応の速度は、可溶性試薬の濃度と、固体支持体へのこの試薬の大量輸送の大量輸送係数の両方の関数であろう。従って、反応速度測定の間に適用される音波処理の量、速度、および型は、慎重に制御され、かつ正確に再現可能であることが特に重要である。大量輸送係数の変動は、他の点では同一の試験で反応速度の変動を引き起こしがちであり、結果として不正確または全く役に立たない結果を与える。測定セルおよび／または固相支持体に構造的に結合した音波処理装置の使用により、迅速で、定量的で、高感度で、再現性のある反応速度測定を行うことができる。
【０４２７】
作用電極上に位置する捕捉抗体を使用するＥＣＬサンドイッチ免疫測定法では、たとえ固体支持体表面への大量輸送を増大させるためにボルテックス混合を使用した場合でさえ、結合反応は完了までに１／２時間以上かかりうることが見い出された。この時間スケールはまた、ＥＬＩＳＡやＲＩＡのような他の高感度固相結合測定法にも典型的である。我々は予想外にも、試薬の音波処理が、これらの結合反応の完了に必要な時間をおよそ数分まで短縮することを見いだした。本発明の装置と方法は、免疫測定法に限定されるものではなく、広範な結合相互作用（例えば、核酸ハイブリダイゼーション、抗原−抗体、受容体−リガンド、酵素−基質など）に有用であろう。
【０４２８】
音波処理はまた、固相支持体が複数の結合ドメインを有しており、かつ該結合ドメインのそれぞれが固相支持体上の異なる位置に存在するシステムで、有利に使用される。この場合正確かつ再現性ある結果を得るためには、試料が充分に混合されて、試料の全ての部分が全ての結合ドメインに暴露されることが必要である。大量輸送を効率的にすることにより、音波処理がこのプロセスを可能にする。
【０４２９】
また、固相支持体が多数の結合ドメインを有しており、該結合ドメインのいくつかまたは全てが異なるアナライトに特異的であるシステムにも有利に使用される。正確かつ再現性ある結果を得るためには、試料の全ての部分が支持体上の全ての結合ドメインに暴露されることが必要である（例えば、試料のある部分が、適正に混合されず、そのため試料の該部分に含まれるアナライトに特異的な結合ドメインを有する結合表面の領域に暴露されないならば、偽「陰性」の結果が得られるだろう）。
【０４３０】
本発明の装置は、実験セルがＥＣＬの励起の間音波処理される時、ＴＡＧ１とＥＣＬ共反応物トリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含有する溶液により生成するＥＣＬシグナルの３倍を超える上昇を提供する。本発明は、従って、ＥＣＬ標識とＥＣＬ共反応物の感度の高いＥＣＬ検出に適用することができる。
【０４３１】
音波処理は、固体の表面への試薬の大量輸送の速度を上昇させるだけでなく、表面からの試薬、生成物、副生物、混入物などの大量輸送の速度も上昇させる。音波処理は、置換反応（例えば、結合試薬に結合した標識アナライトの試料中に存在する未標識アナライトによる置換）の速度を上昇させるために使用することができる。音波処理はまた、固相支持体上の目的としない混入物の脱着の速度を上昇させる（すなわち、特定の測定法において発生する干渉や非特異結合の量を減少させる）ために使用することができる。さらに、音波処理は、保護コーティングなどのような望ましい材料の吸着の速度を上昇させ、そして保護コーティングなどのような消耗したか、さもなければ望ましくない材料の脱着の速度を上昇させうる。音波処理は、表面上についた粒子状混入物、例えば、細胞膜または粒子状試薬を再懸濁するために使用することができる。
【０４３２】
音波処理はまた、試料調製工程にも使用することができる。例えば、音波処理は、生物学的組織細胞、微生物、ウイルス粒子などのような物質の成分を反応媒体中に放出させるために、物質を破壊するのに使用することができる。好ましくは、該試料調製は、その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で、測定セル、例えばＥＣＬセルで行われる。
【０４３３】
さらにまた、音波処理は、２つまたはそれ以上の溶液を均質に混合するのに要する時間、固体を溶液に溶解するのに要する時間、および乾燥した物質に水を加えて元に戻すのに要する時間を短縮するために使用することができる。音波処理はまた、薄い毛管を通る流体流の速度を上昇させるのに有用である。
【０４３４】
処理音波は、種々の機械的および電気機械的装置により発生させることができる。このような装置は、偏心取付カムつきの電気モーター、電磁スピーカー、水晶発振器、振り子装置などを含む。本発明に特に適した振動数と振幅で処理音波を発生させるための好ましい装置は、圧電性物質を使用する。圧電性物質は、一般に安価で、普通に入手可能であり、軽量であり、そして広範囲の振動数と振幅にわたり処理音波を誘発することができる。便利なことに、圧電性音波処理装置は、通常サイズが小さく、そのため卓上および携帯可能な装置として特に有用になっている。最も有利なことに、圧電性装置は、非常に少量の電力で操作することができる。本発明の音波処理装置は、１０ワット未満の電力消費の圧電性装置により有効に音波処理され、そして特定の装置は、約０．２５ワットを消費する圧電性装置により機能する。好ましい圧電性装置は、ピストン−マス装置である。
【０４３５】
さらに測定物質を含有するセルへの処理音波発生器からの音波処理エネルギーの構造的結合は、顕著に効率的な設計であることが発見された。最も有効な構造的結合は、例えば、セルへの処理音波発生器の直接結合、または処理音波発生器と測定セルの間に固体連続が得られるような処理音波発生器の結合による、ソリッド接点であることが証明された。音波処理エネルギーを測定セルまたは測定セル内の固相支持体に特異的に伝達することにより、全装置を誘導して音波処理するのに比べてはるかに少ないエネルギーですむ。処理音波発生器を注意深く配置すると、測定セルの内容物のエネルギーの方向を絞ることが可能になり、測定系の他の要素による減衰の作用が減少する。構造的結合は、可逆的である（例えば、処理音波発生器とセルは、何回もつないだり切ったりされるように設計されていてもよい）か、または永続する結合を示してもよい。
【０４３６】
音波処理エネルギーの構造的結合が、多くの異なる型の配置により達成することができることを理解されたい。音波処理エネルギーの構造的結合は、具体的には（ａ）処理音波発生器と測定媒体または結合表面の間の固体界面を通しての；または（ｂ）測定媒体または結合表面に処理音波発生器から直接の、音波処理エネルギーの伝達を包含する。
【０４３７】
本発明の装置において音波処理エネルギーの構造的結合を正確に制御することができることは、本発明の重要な利点である。このような構造的結合機作の制御は、装置の構成要素の製造および同組立の正確な制御を通して容易に実行される。構造的結合機作の各構成要素（例えば、処理音波発生器、振動板など）は剛性材料から構成されてよいため、各構成要素は、正確な許容度まで製造することができる。同様に、構造的結合の機作は、実質的に同一の処理音波伝達性を有する多数の装置の作成を可能にする正確で厳密な組立に適している。
【０４３８】
本発明は、免疫測定法、核酸ハイブリダイゼーション測定法、受容体−リガンド結合測定法などのような結合測定システムに一般に適用可能である。結合反応が電極付近で起こる測定法では、電極自体の音波処理が、測定反応速度の上昇に特に有益な作用を有することが明らかになった。
【０４３９】
図６８は、本発明の実施態様による測定セル６８０１０の詳細な横断面図を例示する。測定セル６８０１０は、基部６８０１１、振動板６８０１３、および処理音波発生器６８０１６からなる。基部６８０１１は、空洞６８０１７と開口６８０１４を画定するような形になっており、そして好ましくは剛性材料である。あるいは、基部６８０１１は、可撓性材料からなる（例えば、基部６８０１１は、可撓性プラスチック容器またはブリスターパックからなる）。光学検出法を使用する測定形式（例えば、ＥＣＬ、蛍光、化学発光）では、基部６８０１１は、好ましくはアクリルなどのような透明材料であり、これによって空洞６８０１７内に生成する光を基部６８０１１に結合した検出器（示していない）により検出することができる。
【０４４０】
振動板６８０１３は、結合試薬のような試薬６８０１５のための固相支持体であり、そして好ましくは材料の薄膜またはシートからなる。詳細には、振動板６８０１３は好ましくは小繊維ポリマー複合材料である。記載のように振動板６８０１３は、開口６８０１４で基部６８０１１に結合している。好ましくは、振動板６８０１３は、開口６８０１４を覆う基部６８０１１と共にシールを形成する。
【０４４１】
処理音波発生器６８０１６は、振動板６８０１３を音波処理するための装置である。好ましくは、処理音波発生器６８０１６は、圧電性音波処理装置である。発生器６８０１６は、好ましくは電気制御回路などのような処理音波発生器制御器（示していない）により制御される。処理音波発生器６８０１６は、音波エネルギーを効率よく振動板６８０１３および試薬６８０１２に伝達するように、振動板に構造的に結合している。
【０４４２】
操作において、試薬６８０１２は空洞６８０１７中に導入される。処理音波発生器６８０１６はエネルギーを受けて、振動板６８０１３を音波処理する。振動板６８０１３は、処理音波エネルギーを空洞６８０１７に伝導し、次にそこに含まれる試薬６８０１２に伝導する。音波処理が、試薬６８０１２の混合を引き起こし、試薬６８０１２間の反応の速度を上げる。音波処理はまた、振動板６８０１３上の結合試薬６８０１５への、および同試薬からの、試薬、生成物、副生物などの大量輸送の速度を上昇させて、そのため、固相支持体での結合反応の速度を上げる。あるいは、結合試薬６８０１５を省略してもよい。
【０４４３】
別の実施態様では、非固体結合材料（示していない）を発生器６８０１６と振動板６８０１３の間に置いた。この結合材料は液体でも気体でもよい。結合材料は、可撓性プラスチック膜のような密閉容器内に保持されてもよい。別の実施態様では、結合材料は一体ピストン構造からなってもよい。処理音波発生器６８０１６からの音波処理エネルギーは、一体ピストン構造を介して振動板６８０１３に構造的に結合している。さらに別の実施態様では、試薬６８０１５が振動板の表面から省略されて、空洞６８０１７の表面上に配置される。
【０４４４】
器具６９０１０１を含む使い捨てカートリッジ６９０９０においてＥＣＬ測定を行うための測定システム６９０１００は図６９に例示される。カートリッジ６９０９０は、基部６９０９１、振動板６９０９２、対電極６９０９３、反応エンクロージャ６９０９４、試料ポート６９０９５、リード線６９０９６、および参照電極６９０９９を含む。器具６９０１００は、カートリッジ容器６９０１０８、光検出器および／またはイメージング装置６９０１０２、電気コネクター６９０１０３、作用電極と対電極の間に電位または電流を適用するための電気エネルギーの供給源６９０１０４；音波処理装置６９０１０５；音波処理装置６９０１０５を駆動するための電気エネルギーの供給源６９０１０６；および器具の制御、測定データ集積、および測定データ解析用のマイクロプロセッサ６９０１０７を含む。
【０４４５】
振動板６９０９２は、結合試薬のような試薬６９０９７Ａのための導電性固相支持体であり、かつ作用電極として機能する。好適な実施態様では、振動板６９０９２は小繊維−ポリマー複合電極であり、そして試薬６９０９７Ａはそこに固定化された抗体、核酸、受容体などのような結合試薬からなる。特に好適な実施態様では、種々のアナライトに対して特異的な結合試薬は、振動板６９０９２上の結合ドメイン中にパターン付けされる。基部６９０９１は、好ましくはアクリルなどのような剛性で透明な材料であり、これによってエンクロージャ６９０９４内で起きるＥＣＬ反応により生成する光を、検出器６９０１２により検出することができる。基部６９０９１は、反応エンクロージャ６９０９４と試料ポート６９０９５を画定するような形である。振動板６９０９２は、好ましくは基部６９０９１に密閉される。
【０４４６】
リード線６９０９６は、振動板６９０９２および対電極６９０９３への電気結合を提供する電気接点である。好ましくは、振動板６９０９２は、装置６９０１０５から基部６９０９１への音波処理エネルギーの伝達が最小になるように取り付けられる。あるいは、振動板６９０９２は、振動板６９０９２が装置６９０１０５から基部６９０９１へ、そしてそこから反応エンクロージャ６９０９４の全表面へ音波処理エネルギーを伝達するように取り付けてもよい。
【０４４７】
好ましくは、反応エンクロージャ６９０９４は、基部６９０９１の内表面により部分的に画定される。あるいは、反応エンクロージャ６９０９４は、基部６９０９１に結合する透明材料から作られた分離したエンクロージャからなる。
【０４４８】
対電極６９０９３は、好ましくは金属のような導電性材料である。参照電極６９０９９は、好ましくはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極である。電極６９０９３と６９０９９は基部６９０９１内に配置して、リード線６９０９６に結合し、そして試薬６９０９８との電気接点にあるように適合させる。場合により、参照電極６９０９８は省略してもよい。開口６９０９５は好ましくは、毛細管のような小さい管（示していない）を介する試料物質（例えば、試薬６９０９８）の挿入のために適合させる。
【０４４９】
器具６９０１０１の内表面は、カートリッジ６９０９０とその構成要素を、容器６９０１０８とその対応品の構成要素（音波処理装置６９０１０５、電気接続６９０１０３および検出器６９０１０２を含む）と受容してかつ配置すべく適合させる。好ましくは、検出器６９０１０２は、作用電極でＥＣＬ反応中に放出される光をイメージングすることができる検出器のアレイ（例えば、ＣＣＤカメラまたは感光性半導体素子アレイ）である。検出器６９０１０２は、光電子増倍管、感光性半導体素子などのような単一検出器であってもよい。器具６９０１０１へのカートリッジ６９０９０の挿入により、検出器６９０１０２がエンクロージャ６９０９４内に生成する光の多くを検出する位置に来るように、検出器６９０１０２を基部６９０９０と整列させる。
【０４５０】
音波処理装置６９０１０５は、反応エンクロージャ６９０９４に含まれる試薬６９０９８に音波処理エネルギーを伝達する振動板６９０９２を音波処理するための装置である。器具６９０１０１へのカートリッジ６９０９０の挿入により、好ましくは装置６９０１０５を振動板６９０９２と接触させるように、装置６９０１０５を振動板６９０９２の中心と整列させる。器具６９０１０１へのカートリッジ６９０９０の挿入の電極６９０９２への音波処理装置６９０１０５の構造的な結合を引き起こす。音波処理装置６９０１０５は、ピストンを含んでよい圧電性音波処理装置であるのが好ましい。好ましくは音波処理装置６９０１０５は、カートリッジ６９０９０を器具６９０１０１中に挿入するときに振動板６９０９２と接触させることができるように可動性である。
【０４５１】
容器６９０１０８へのカートリッジ６９０９０の挿入の際、リード線６９０９６を電気接続６９０１０３に結合する。電気エネルギーの供給源６９０１０４は、マイクロプロセッサ６９０１０７による制御に適合した制御可能な電位または電流供給源であってよい。あるいは、カートリッジ６９０９０が参照電極を含むならば、電源６９０１０４は好ましくはポテンシオスタットである。
【０４５２】
制御されたエネルギー供給源６９０１６は、好ましくは音波処理装置６９０１０５の操作の制御のための、従来の制御可能な電気回路駆動装置である。電源６９０１０６の操作は、マイクロプロセッサ６９０１０７により制御される。マイクロプロセッサ６９０１０７は、ソフトウェアでプログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラーなどのような従来のプロセッサ装置である。マイクロプロセッサ６９０１７は、検出器６９０１０２の操作およびエネルギー供給源６９０１０４と６９０１０６の操作を制御し、そして電源６９０１０４からの電位および／または電流データと共に検出器６９０１０２からの強度データを受け取る。好ましくは、マイクロプロセッサ６９０１０７は、さらに測定データを処理して、対応する出力をユーザーおよび／または別の装置に提供することができる。
【０４５３】
操作において、試薬６９０９８を含む試料は、試料流入ポート６９０９５を介して反応エンクロージャ６９０９４に導入される。ＥＣＬ測定を行うために必要な試薬は、すでに試料に加えられている。該試薬は、ＥＣＬ共試薬（coreagents）（例えば、トリプロピルアミン）、ＥＣＬ残基（例えば、Ｒｕ（II）（ｂｐｙ）３または誘導体（好ましくはアナライトまたはアナライトの結合パートナー、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ）、緩衝化剤、賦形剤、添加剤および保存剤に結合している）を含む。好適な実施態様では、カートリッジは、試薬６９０９７Ｂとして示される測定を行うのに必要ないくつかまたは全ての試薬と共にあらかじめ保存される。特に好適な実施態様では、試薬６９０９７Ｂは、反応エンクロージャ６９０９４内で乾燥した形態で保存される。
【０４５４】
測定を行うために、カートリッジ６９０９０は器具６９０１０１に入れて、音波処理装置６９０１０５は振動板６９０９２に構造的に結合させ、そして装置６９０１０５は電源６９０１０６により活性化して振動板６９０９２を音波処理する。次に音波処理エネルギーを振動板６９０９２を通じて試薬６９０９８に伝達する。振動板６９０９２の取付によっては、音波処理エネルギーを基部６９０９１に伝達し、そしてこれがこのようなエネルギーを反応エンクロージャ６９０９４に伝導し、こうして試薬６９０９８に伝導するようにできる。
【０４５５】
音波処理は、試薬６９０９８と試薬６９０９７Ｂの混合を引き起こすことにより、構成要素試薬６９０９８および／または６９０９７Ｂの間の反応の速度を上げ、そして振動板６９０９２への、および振動板からの試薬６９０９８および／または６９０９７Ｂの大量輸送の速度を上げる。装置６９０１０５からの音波処理エネルギーは、支持体６９０９２への試薬６９０９８および／または６９０９７Ｂの大量輸送の速度を顕著に上昇させ、それによって試薬６９０９７Ａと、試薬６９０９７Ｂと６９０９８の構成要素の間の結合反応の速度を上昇させ、そしてＥＣＬ測定を行うのに必要な時間を短縮させる。電源６９０１４によりコネクター６９０１０３とリード線６９０１０６を介して、電気エネルギーを振動板６９０９２および電極６９０９３に適用して、反応物６９０９７Ａ、６９０９７Ｂおよび／または６９０９８中の電気化学発光性残基を発光させる。ＥＣＬ反応により生成する光は、音波処理装置６９０１０５を操作しながら、またはその後に測定する（または像にする）ことができる。
【０４５６】
マイクロプロセッサ６９０１０７は、電源６９０１０４と６９０１０６の操作を制御し、電源６９０１０４からの電位および／または電流データと共に検出器６９０１０２からの強度データを受け取る。マイクロプロセッサ６９０１０７は、受け取ったデータを解析し、かつ保存してもよく、そして好ましくはユーザーまたは別の装置（示していない）に供給するために対応する出力を生成する。好ましくは、データ収集の完了時、マイクロプロセッサ６９０１０７は、カートリッジ６９０９０を器具６９０１０１から取り出すようにユーザーに通知する。マイクロプロセッサ６９０１０７からこのような通知を受け取るかあるいは測定データ収集の完了を決定したら、カートリッジ６９０９０を装置６９０１０１から取り出して、適切に処置するかまたは再利用する。
【０４５７】
別のシステム６９０１００の実施態様では、振動板６９０９２に結合したリード線６９０９６の一部を省略して、電気接続を電源６９０１０４と音波処理装置６９０１０５の間に加える。従って、対応するコネクター６９０１０３の接続も省略することができる。この実施態様では、音波処理装置６９０１０５は、振動板６９０９２への電気的補正として機能する。カートリッジ６９０９０を器具６９０１０１に挿入すると、電気エネルギーが音波処理装置６９０１０５を通して振動板６９０９２を介して試薬６９０９８に供給される。このような電気エネルギーの適用は、音波処理エネルギーの適用と同時であっても同時でなくてもよい。
【０４５８】
別の実施態様では、振動板６９０９２および／またはエンクロージャ６９０９４は試薬などで前もって被覆される。電極６９０９２の音波処理は、このような試薬の解放を引き起こすことにより、試薬をエンクロージャ６９０９４内の試薬６９０９８と混合させる。
【０４５９】
さらに別の実施態様では、乾燥試薬６９０９７Ｂは反応エンクロージャ６９０９４に前もって保存され、液体試薬６９０９８を反応エンクロージャ６９０９４に導入して乾燥試薬６９０９７Ｂと直接接触させる。音波処理装置６９０１０５の活性化により、乾燥試薬６９０９７Ｂと液体試薬６９０９８は、音波処理エネルギーが存在しないときに比べて有意に速い速度で混合される。混合した試薬は、例えば、相互におよび／または固相支持体６９０９２上の試薬と反応するか、またはここで別の試薬を加えて、また混合してもよい。異なる実施態様では、試薬６９０９７Ｂは省略される。
【０４６０】
反応エンクロージャ６９０９４の内表面は、測定を妨害する物質で被覆されうる。この妨害物質は、混入物、細胞破砕物、非特異的に結合した試薬、反応副生物などを含む。本発明のさらに別の実施態様では、音波処理装置６９０１０５が活性化されて、音波処理エネルギーがこのような物質を音波処理して解放するか、または表面での大量輸送の速度の上昇を引き起こすことによって、エンクロージャ６９０９４の内表面から妨害物質を除去する。例えば、ＥＣＬ測定は、ＥＣＬの励起のための電極を適正に調製するために結合反応の前および／または後に装置６９０１０５の活性化を伴うクリーニングサイクルを使用してもよい。これらのクリーニングサイクルは、反応エンクロージャ６９０９４への、このような妨害物質を解放するのを助けるクリーニング溶液の添加を伴ってもよい。
【０４６１】
さらに別の実施態様では、音波処理装置６９０１０５と電源６９０１０６が器具６９０１０１から省略されて、振動板６９０９２がさらに音波処理装置様装置６９０１０５を含む。さらに、電源６９０１０４は電源６９０１０６の機能を組み込んでいる。振動板６９０９２の音波処理装置を活性化するための電源６９０１０４からの電力は、コネクター６９０１０３とリード線６９０９６を介して伝導される。
【０４６２】
連続的または断続的なＥＣＬ測定では、結合反応の速度は連続的なまたは断続な間隔で測定される。このプロセスの説明は、米国特許第５，５２７，７１０号（ナカムリ（Nacamulli）ら）に見い出される。本発明は、このような測定における結合反応の速度を上昇させるよう作用し、そしてまた正確で再現性ある速度測定を与えるための再現性ある混合を提供する。音波処理も、このような測定中で連続的であるかまたは断続的であってよい。結合反応の速度を求めるための連続的または断続的測定の利点は、単一点ＥＣＬ測定に比較して感度と精度の上昇を提供することである。
【実施例】
【０４６３】
６．例
これらの例において使用した全ての炭素小繊維は、ハイパーイオンカタリシス社（Hyperion Catalysis Incorporated）、ロット番号１６６−３９−１から得られたＣＣ小繊維である。これらの小繊維は、直径約３．５nm〜７０nmの範囲であり、長さは直径の１０倍以上であり、炭素原子の多層の外側領域と別個の内部コア領域を含んでいた。
【０４６４】
６．１．微量型押しによるＭＡＢ  ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）；ダウコーニグ（Dow Corning）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。基板を、疎水性ＣＨ3が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Kumar）ら、前述、およびプライム（Prime）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を含有する。
【０４６５】
６．２．微量型押しによるＭＡＢおよび核酸ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ3が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Kumar）ら、前述、およびプライム（Prime）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または修飾核酸を含有する。
【０４６６】
６．３．エッチングによるＰＭＡＭＳ表面の作成
きれいな金表面を、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露させる（プライム（Prime ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６４−７）。先が細くとがった器具を線状に並べたものを、並べた金表面とロボットで光学レジスター接触させ、線状アレイを使用して、表面のＸ方向とＹ方向にエッチングして、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインの二次元の格子アレイを作成する。次に基板を、疎水性ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する。得られる表面を次に、窒素流中で静かに乾燥させる。親水性溶液を含有する毛細管アレイを次に、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインで整列させる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
【０４６７】
６．４．ＰＭＡＭＳ表面上でのサンドイッチ測定法
パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する実質的に透明の、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。支持体、電極アッセイ、モノログ（monologues）表面の使用が透明であるとして選択される。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。次にＰＭＡＭＳ表面を、表面に結合したアナライトに特異的な第２ＥＣＬ標識抗体を含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をＰＭＡＭＳ表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したＥＣＬ標識第２抗体を残す。
【０４６８】
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との早すぎる接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アッセイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、ＰＭＡＭＳ表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４６９】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４７０】
６．５．第１および第２ＰＭＡＭＳ表面上での測定
パターン付けされた多重特異的アレイの第１抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
【０４７１】
ＥＣＬ標識物で標識した複数の第２抗体のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性／親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第２のＰＭＡＭＳが提供される。
【０４７２】
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１抗体の位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイを第１のＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４７３】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４７４】
６．６．ＰＭＡＭＳ表面での核酸測定
パターン付けされた多重特異的アレイの１本鎖核酸プローブを表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。プローブは、目的の核酸アナライトの５’領域に相補的である。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のハイブリダイズ可能な核酸アナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する（試料は、あらかじめ変性させておく、すなわち、目的のアナライトを１本鎖にしておく）。次に試料を洗浄して、ハイブリダイズしたアナライトを表面に残す。次にＰＭＡＭＳ表面を、表面に結合した核酸アナライトの３’末端に特異的な第２ＥＣＬ標識核酸プローブを含有する溶液に暴露する。次にこの溶液をＰＭＡＭＳ表面から洗浄して、アナライトが存在するドメインに結合したＥＣＬ標識核酸プローブを表面に残す。
【０４７５】
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１のＰＭＡＭＳ上の第１抗体結合ドメインの位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイを第１のＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。
【０４７６】
電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４７７】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４７８】
６．７．光電増幅検出器を用いるＰＭＡＭＳ表面での競合的測定
目的のアナライトに特異的な、パターン付けされた多重特異的アレイの一次抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、目的のアナライトを含有することが疑われる試料と、抗体への結合に関して目的のアナライトと競合する既知のＥＣＬ標識分子を含有する試料の混合物である溶液試料に暴露する。試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトおよび／または標識した競合的結合物を表面に結合して残す。
【０４７９】
汚染作用を避けるために、試料と電極表面との接触を防ぐため、取り外し可能なバリアーにより電極アレイを保護する。次にこのバリアーをはずして、測定緩衝液で濡れた電極アレイを、ＰＭＡＭＳ表面と並べて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４８０】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４８１】
６．８．ＣＣＤ検出器を用いるＰＭＡＭＳ表面での競合的測定
パターン付けされた多重特異的アレイの第１抗体を表面に結合して含有する、透明ＰＭＡＭＳ表面を前述のように作成する。次にＰＭＡＭＳ表面を、測定すべき目的のアナライトを含有することが疑われる溶液試料に暴露する。次に試料を洗浄して、抗体の結合したアナライトを表面に残す。
【０４８２】
目的のアナライトと競合する複数の既知のＥＣＬ標識分子のパターン付けされた微小液滴が上にある、疎水性／親水性パターンが交互に存在する、保護カバーの下の第２のＰＭＡＭＳが提供される。
【０４８３】
第１のＰＭＡＭＳと位置の合っている第２のＰＭＡＭＳを保護するバリアーを取り外し、微小液滴を、第１のＰＭＡＭＳ上の第１抗体結合ドメインの位置に合わせる。第２ＰＭＡＭＳを取り外し、電極アレイをＰＭＡＭＳ表面と整列させて接触させる。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４８４】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４８５】
６．９．ＳＨ（ＣＨ2）10−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＣＨ3アルカンチオールを用いる微量微小型押しによるＭＡＢ  ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）；ダウコーニグ（Dow Corning）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ3が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）10ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Kumar）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ2）11ＯＨドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を含有する。
【０４８６】
６．１０．ＳＨ（ＣＨ2）10ＣＨ3アルカンチオールを用いる微量微小型押しによるＭＡＢと核酸ＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、整列した金表面にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に基板を、疎水性ＣＨ3が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）10ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Kumar）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させ毛細管をＳＨ（ＣＨ2）11ＯＨドメインで整列させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体または修飾核酸を含有する。
【０４８７】
６．１１．ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを用いるＰＭＡＭＳ表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、メルカプトウンデカノールと１２−メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミドの混合物（ここで、ビオチン化チオールのモル分率は０．１である）に暴露して「墨入れ」を行う（スピンケ（Spinke）ら、１９９３、ラングミュア（Langmuir）９：１８２１−５およびスピンケ（Spinke）ら、１９９３、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．９９（９）：７０１２−９を参照）。次に基板を、疎水性ＣＨ3が末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）10ＣＨ3アルカンチオール（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間（例えば、２〜１０秒間）洗浄する（クマール（Kumar）ら、前述）。次に得られる表面を、窒素流中で静かに乾燥させる。次に各毛細管中にストレプトアビジンの溶液を含有する毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させる。毛細管アレイ中の各毛細管を整列させて、ビオチン化ドメインと接触させ、毛細管アレイを除去し、表面を洗浄する。次に複数のビオチン化抗体とビオチン化核酸溶液を含有する第２の毛細管アレイを、整列した表面にロボットでピンレジスター接触させて、各ドメイン上に特異的抗体と核酸を入れる。
【０４８８】
６．１２．ＭＡＢ単一表面の作成
ケイ素表面上の金の上の交互にあわさった作用電極／対電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する（例えば、クマール（Kumar）ら、前述、を参照）。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、作用電極のパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；ダウコーニグ（Dow Corning）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した作用電極にロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができるモノクローナル抗体を含有する。
【０４８９】
６．１３．ＭＡＢ単一表面で行われる測定
６．１２に記載の支持体（前述）を作成する。それぞれが作用電極／対電極の範囲を限定する環としてパターン付けしたフォトレジストマスターから、前述のようにＰＤＭＳ型押しを作成する。電極アレイ表面を、分析される試料に暴露し、ＥＣＬ標識第２抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液溶液で洗浄する。次にＰＤＭＳ型押しを整列させ、レジスター接触させてＰＤＭＳ型押しの管を整列させ、各電極対の上の測定緩衝液の各容量成分を限定および規定する。電極対に過電位をかけて、表面から単層を放出させて、作用電極をＥＣＬ標識第２抗体に暴露する。次に透明ＰＤＭＳから放出される光を光電増幅管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４９０】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４９１】
６．１４．作用電極および対電極を有する単一表面の作成
ケイ素支持体上の金の上の交互にあわさった電極の間の、結合ドメインを有する交互にあわさった作用および対金電極対の電極アレイを、当該分野で公知の方法により作成する（例えば、クマール（Kumar）ら、前述、を参照）。この例では、電極アレイと別々の結合ドメインアレイは、支持体の同じ表面に存在する。厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、交互にあわさった電極対の間の結合ドメインのパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４（ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）；ダウコーニグ（Dow Corning）から入手できる）と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、電極アレイ表面上の整列した金結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。次に親水性溶液を含有する毛細管アレイを、電極アレイ表面上のＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインを有する毛細管を整列させて、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、アミド結合を介して親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体を含有する。
【０４９２】
６．１５．作用電極および対電極を有する単一表面上で行われる測定法
前記６．１４に記載の支持体表面を記載した方法（前述）により作成する。作成された表面を、分析される試料に暴露し、ＥＣＬ標識第２抗体の混合物で洗浄し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。電極アレイを、電位波形発生器に接続し、作用電極／対電極対に電位をかける。次に放出される光を光電子増倍管で読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４９３】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４９４】
６．１６．対電極を有する表面の作成
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、角アレイパターンで公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール性溶液（１〜１０mM）中の親水性ＯＨが末端にあるアルカンチオール、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨに暴露して「墨入れ」を行い、金表面上の整列したパターン付け対電極と角結合ドメインにロボットでピンレジスター接触させ、除去する。パターン付けした金表面は、結合ドメインを限定するアドレスが可能な環対電極から構成される。各単層結合ドメインについて、各金対電極と各金表面の間に間隙すなわち分離スペースが存在する。次に結合試薬溶液を含有する毛細管アレイを、ＳＨ（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6ＯＨドメインを有する毛細管を示す表面を、ロボットでピンレジスター接触させて、特異的抗体または核酸を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的で、親水性ドメイン上の反応性ＯＨ基に共有結合することができる抗体または核酸を含有する。
【０４９５】
６．１７．異なる表面に作用電極および対電極を有する単一の表面上で行われる測定
例６．１６に記載した支持体表面を分析すべき試料溶液に暴露させる。次に支持体表面を洗浄し、異なる特異性を有する複数のＥＣＬ標識ＭＡＢまたはＥＣＬ標識核酸を含有する溶液に暴露し、次にトリプロピルアミンを含有する測定緩衝液で洗浄する。セクション６．１６に記載のように支持体上の別々の結合ドメイン／対電極領域に対応するアレイ中に各作用電極を有する透明なアドレスが可能な作用電極アレイを作成する。２つの支持体を測定緩衝液で濡らし、ロボットでレジスターで整列したコンフォーマル接触を行う。電極アレイを、電位波形発生器に接続して、作用電極／対電極対に電位をかけ、２つの支持体の間に電界を発生させる。次に透明の作用電極から放出される光をＣＣＤで読み、シグナルをマイクロプロセッサーに送り、ここでシグナルを所望の読み出し型に変換する。
【０４９６】
読み値を、既知量の目的のアナライトの形の対照を用いて得られる読み値と比較して、アナライトの実際の量を計算する。
【０４９７】
６．１８．真空濾過によるＣＣ（分散）小繊維マットの作成
０．１％w／wＣＣ小繊維／脱イオン水を混合して、１mg／ml溶液を有するＣＣ小繊維の水性スラリーを作成した。スラリー中に４００ワットの音波ホーンを１０分〜１時間沈めて、ＣＣ小繊維をスラリーに分散させた（大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される）。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
【０４９８】
ナイロンの濾過膜（孔径０．４７μm、直径２５mm）を、直径２５mmのガラス濾過器に入れた。分散した小繊維スラリーを、吸引濾過により膜／フィルター装置を通して濾過した（図２３Ａ）。スラリーのアリコート（５ml）を２０mlの脱イオン水で希釈し、次に膜／フィルター装置で濾過する。約０．２５〜０．３g／ccの平均的なマットについて、約１００μmのマットは６つのアリコートが必要であった。
【０４９９】
分散物のすべての水がマットから除去されるまで吸引濾過を続けた（肉眼で判定）。濾過膜から直接マットを（手で）はがした。
【０５００】
オーブン中で６０℃で１０〜１５分間マットを乾燥した。使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
【０５０１】
６．１９．蒸発による金属メッシュ支持体上の小繊維マットの作成
０．１％w／wＣＣ小繊維／脱イオン水を混合して、１mg小繊維／ml溶液を有するＣＣ小繊維の水性スラリーを調製した。スラリー中に４００ワットの音波ホーンを１０分〜１時間沈めて、ＣＣ小繊維をスラリーに分散させた（大きなミクロンサイズの凝集物は、小さな凝集物または個別の線維に分散される）。分散の程度は、光学顕微鏡で追跡した。
【０５０２】
ステンレスメッシュの１cm2切片（４００カウント）を、直径２５mmの紙フィルターに入れる。スラリーの５mlのアリコートを、スクローン／フィルター紙組合せ物の表面にピペットでのせた。スラリー中の水を室温と圧力、または加熱オーブン中で蒸発させた。
【０５０３】
小繊維マットが乾燥したら、アリコートをさらに加えた。濾紙から１つのユニットとして小繊維とスクリーンをはがした。
【０５０４】
使用のためにマットを切断し、穴をあけたか、または切片にした。
【０５０５】
６．２０．ＮＨＳ−エステル官能基を有する小繊維上のアビジンの固定化
ＣＯＯＨで誘導体化した小繊維（ハイペリオンキャタリスト社（Hyperion Catalysts Inc.）から提供された）を、絶えず攪拌しながらジオキサン水溶液に〜１０mg／mlで懸濁した。２０倍モル過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、溶解させた。次に、２０倍モル過剰のエチル−ジアミノ−プロピル−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。
【０５０６】
攪拌後、上清を吸引し、固体を無水ジオキサンで３回、無水メタノールで１回洗浄し、０．４５μmのポリスルホン膜で濾過した。濾過物をさらにメタノールで洗浄し、ガラスバイアル中に入れて、重量の減少が観察されなくなるまで真空で引いた。
【０５０７】
１０．４mgのＮＨＳ−エステル小繊維をＰＢＳ−１（約７０mMリン酸塩、１５０mMＮａＣｌ）（オリゲン（ORIGEN）試薬４０２−１３０−０１、ｐＨ７．８、イゲン社（IGEN,Inc.））で洗浄した。洗浄した小繊維を２．３mlのアビジン溶液に懸濁した（８．３mgアビジン／mlＰＢＳ−１）。
【０５０８】
フラスコを絶えず回転させて懸濁物を室温で１．５時間置いた。
【０５０９】
１．５時間後、懸濁物を４℃で１６時間保存し、次に室温に戻し、ＰＢＳ−１で洗浄し、ＰＢＳ−１中で４℃で懸濁物として保存した。
【０５１０】
６．２１．炭素小繊維上のモノクローナル（抗ＡＦＰ）の固定化
炭素小繊維をＮＨＳ−エステルで官能基化して、例６．２０に記載のように作成した。
【０５１１】
１４mgの小繊維−ＮＨＳ−エステルを５００mlのＰＢＳ−１緩衝液と混合した。混合物が粘性のスラリーになるまで、２０分間音波処理した。さらに５００mlのＰＢＳ−１緩衝液を加えた。
【０５１２】
８０mlのＰＢＳ−１中全部で１．６mgの抗ＡＦＰ（アルファフェトプロテイン）抗体を、上記スラリーに加えた。室温で２．５時間反応させた。
【０５１３】
６mlのＰＢＳ−１緩衝液を加え、反応混合物を４℃で５分間遠心分離した。この操作を９回繰り返した。
【０５１４】
最後の洗浄後、上清を除去し、小繊維−抗ＡＦＰ生成物を４℃で保存した。
【０５１５】
６．２２．小繊維マットのサイクリックボルタングラム：小繊維マットと金箔電極との比較
０．５Ｍ  Ｋ2ＳＯ4中の６mM  Ｆｅ3＋／2＋（ＣＮ）6のサイクリックボルタングラムを測定した。図３０Ａにおいて、ＣＣ（分散した）の未処理の小繊維マットのＣＶは、１０、２５および５０mV／秒での測定値は０．１０mA／cmであった。例６．１８に記載のようにマットを作成した。図３０Ｂにおいて、金箔電極について測定したＣＶは、１０、２５および５０mV／秒で０．０５mA／cmであった。すべての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対する電位である。
【０５１６】
６．２３．小繊維マット電極の電気化学的性質：陽極ピーク電流とマットの厚さの比較
同じ面積（０．２０cm2）であるが異なる厚さの小繊維マットについて、０．５Ｍ  Ｋ2ＳＯ4中の６mM  Ｆｅ3＋／2＋（ＣＮ）6のサイクリックボルタングラムを測定した。陽極ピーク電流（図３１）は、２４μm〜４２５μmの範囲内でマットの厚さの増加とともに増加した。各厚さについての陽極ピーク電流もまた、走査速度の増加とともに増加した（１０mV／秒〜１５０mV／秒の範囲）。厚さの関数としての陽極ピーク電流の増加速度もまた、厚さとともに増加した。厚さ２４μmの小繊維マットは、金箔電極と同等の挙動を示した。
【０５１７】
６．２４．小繊維へのタンパク質の非特異結合
炭素小繊維（ＣＣ）へのタンパク質の非特異結合を以下のように測定した：（ｉ）Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３２＋（「ＴＡＧ１」）標識タンパク質の溶液を、平衡に達するまで既知量の炭素小繊維に暴露した；（ii）標識タンパク質／小繊維溶液を遠心分離し、上清を採取し、そして（iii）上清中に残存している標識タンパク質の量を電気化学発光（ＥＣＬ）を用いて測定した。
【０５１８】
図３２に示す曲線を作成するために、３μg／mlの誘導体化ＴＡＧ１に結合した抗ＣＥＡ抗体（誘導体化ＴＡＧ１  ＥＣＬ標識物に結合した癌胎児性抗原に対する抗体）を、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７）中の連続希釈ＣＣ（未処理）小繊維に加えた。２０分間ボルテックス混合した後、遠心分離により小繊維を除去した。上清中に残存するタンパク質（非結合）の量を測定するＥＣＬ測定は、オリゲン（ORIGEN）測定緩衝液で５倍希釈した反応混合物上清のアリコートについてオリゲン（ORIGEN）アナライザーで行った。高濃度の炭素小繊維が存在する時に、（小繊維に暴露しなかった反応混合物の物体についてのＥＣＬシグナルに対する）ＥＣＬシグナルの低下は、誘導体ＴＡＧ１で標識したタンパク質の結合の増加により得られた。
【０５１９】
６．２５．洗浄剤／界面活性剤による小繊維へのタンパク質の非特異結合の減少
例６．２．４に記載の方法を使用して、小繊維へのタンパク質結合に及ぼす界面活性剤の影響を調べた。誘導体化ＴＡＧ１／小繊維混合物に結合した抗ＣＥＡにトリトンＸ−１００を加え、溶液を２０分間インキュベートし、管を遠心分離し、オリゲン（ORIGEN）測定緩衝液で５倍希釈した上清のアリコートをＥＣＬで分析した。結果を下記表と図３３に示す。
0004486684.tif 000002
【０５２０】
トリトンＸ−１００対誘導体化したＴＡＧ１で標識したタンパク質溶液のＥＣＬ強度をプロットして得られた曲線を図３３に示す。大きい電気化学的シグナルは、上清中の誘導体化−ＴＡＧ１−標識タンパク質が多いことに対応し、小繊維に結合した誘導体化−ＴＡＧ１−標識タンパク質が少ないことを示す。１０ppm〜１００ppmまでの濃度のトリトンＸ−１００は、結合の程度を減少させ、１００〜２０００ppmの濃度は、結合の程度をさらに低下させることはなかった。
【０５２１】
６．２６．小繊維マット電極による溶液中の遊離ＴＡＧのＥＣＬ
例６．１８のように作成した小繊維マットを、図３４に示す「小繊維セル」固定具の作用電極ホルダー３４０１の取り付け部３４０３に取り付けた。ホルダー３４０１を、電気化学的セル区画３４００の底にはめた。３Ｍ  Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（サイプラス（Cyprus）＃ＥＥ００８）を、参照セルホール３４０２を介して電気化学的セル区画に取り付けた。セルに測定緩衝液（イゲン（IGEN）＃４０２−００５−０１、ロット番号＃５２９８）を充填し、ＰＭＴホルダー３４０４に取り付けた。イージーアンドジー（EG&G）、パークモデル１７５ユニバーサルプログラマーとイージーアンドジー（EG&G）、モデル１７５ポテンショスタット／ガルバノスタットを使用して、１００mV/秒で電位を０Ｖ〜＋３Ｖで掃引した。パシフィックインストルメンツ（Pacific INstruments）モデル１２６光度計により９００Ｖの電位をかけたハママツ（Hamamatsu）Ｒ５６００Ｕ−０１により測定した。ＨＥＭスナップマスター（HEM Snap-Master）により駆動したＣＩＯ−ＤＡＳ−１６０１Ａ／Ｄボードにより、アナログデータをデジタル化した。小繊維セルの水分を切り、瞬間的に１０００pMのＴＡＧ１（イゲン（IGEN）＃４０２−００４−Ｃ，ロット＃４２９７）で洗浄し、１０００pMのＴＡＧ１を充填した。測定緩衝液のように電位を掃引した。図３５は、測定緩衝液３５０１と１０００pMＴＡＧ１  ３５０２についてのＥＣＬトレース（２４．０±０．２Ｃで測定した）を示す。暗補正ＥＣＬピーク面積は、測定緩衝液については２２．１０nAで、１０００pM  ＴＡＧ１については４６．４０nAであった。
【０５２２】
６．２７．小繊維マット電極による加えた標識抗体のＥＣＬ
例６．１８に記載の方法で未処理のｃｃ−分散小繊維から０．００３５インチの厚さの小繊維マットを作成した。次に乾燥したマットを３mmの円盤にパンチし、支持体の上にのせた。この実験で使用した支持体は、スクリーン印刷した導電性金インクによりパターン付けした０．０３０インチのポリエステルシートから作成した。この導電性金インクは対電極、参照電極を形成し、作用電極および他の電極の導線を提供した。炭素含有導電性両面テープ（アドヒーシブズリサーチ（Adheseves Research））を使用して、各パターン付け支持体に２つのマット円盤を取り付けた。取り付け後、誘導体化ＴＡＧ１に結合した脱イオン水中１０μg/mlの抗ＴＳＨ抗体水溶液（Ｒｕ−ＴＨＳモノ１：２  ２６ＪＵＮ９５、イゲン（IGEN））０．５μl、または脱イオン水中１０μg／mlのＴＡＧ１誘導体化しない抗ＴＳＨ捕捉抗体抗体水溶液を（ＴＨＳポリ２６ＪＵＮ９５、イゲン（IGEN））円盤にスポットし、乾燥させた。乾燥後、マットをイゲン（IGEN）測定緩衝液に浸した。支持体上の浸したマットを、イゲン（IGEN）オリゲン（ORIGEN）１．５ベースの装置に入れ、０〜４５００mVまで５００mV／秒の走査速度を用いて、ＥＣＬを読んだ。図４３は、マット４３０１を含有するＴＡＧ１−抗体からと、マット４３０２を含有するＴＡＧ１化していない捕捉抗体からのピークＥＣＬシグナルを比較する。
【０５２３】
６．２８．サンドイッチ測定法のための小繊維マット電極を用いるＥＣＬ
前述のように抗ＡＦＰ捕捉抗体をフィルター上に固定化した。抗ＡＦＰ小繊維を脱イオン水（ｄＩ）で洗浄し、１mg／mlの濃度で再懸濁した。例６．１８に記載のように真空濾過を使用して４層の小繊維マットを作成した。未処理ＣＣ分散小繊維３mgに２mgの抗ＡＦＰ小繊維を加え、混合物をｄＩ中で総量２０mlに希釈した。希釈した混合物を０．４５μmナイロンフィルターで濾過した。次にこの最初のマット層の後に、それぞれ５mgの未処理ＣＣ分散小繊維で構成される２つのコア層が続く。次にマットのコアに、最初の層と同じ混合フィルター層をのせた。こうして、上部と下部に〜４０％抗ＡＦＰ小繊維と、コア内に〜１００％未処理小繊維のマットが得られた。この混合マットを真空下で空気乾燥し、３mmの円盤にパンチした。次にこれらの円盤を、例６．２７に記載のように支持体にのせた。乾燥し支持体にのせた抗ＡＦＰマットを、ＡＦＰカリブレーターＡ、Ｃ、およびＦ（イゲン社（IGEN,Inc.））に浸し、実験台で室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をｄＩ流で１０秒間洗浄し、次にけばのないワイプでブロットして乾燥した。次に小繊維マットを、誘導体化ＴＡＧ１イゲン社（IGEN, Inc.））で標識した抗体に血液グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ抗ＡＦＰに浸し、実験台で室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、支持した電極をｄＩ流で洗浄し、ワイプで乾燥した。次に、小繊維マットをイゲン（IGEN）測定緩衝液に浸し、例６．２７に記載のように読んだ。
【０５２４】
６．２９．ポリアクリルアミド表面上のＴＡＧ１標識アビジンのＥＣＬ検出
アクリルアミド、ビス−アクリルアミド、およびＮ−アクリロイル−Ｎ’−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，９−ジアミン（ビオチンはトリ（エチレングリコール）リンカーを介してアクリルアミド残基に結合している）を、公知の方法（過硫酸アンモニアとＴＥＭＥＤで開始する）を用いて、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。この実験で、３つのモノマー種の濃度は、それぞれ２．６Ｍ、０．０６５Ｍ、および０．０２３Ｍであった（アクリルアミドとビス−アクリルアミドのこれらの濃度により、孔径がほとんどのタンパク質より小さいゲルが得られることが報告されている）。約０．７mmの距離で離して固定した２つのガラスプレートの間にモノマーを含有する溶液の重合により、同じ厚さのスラブゲルが生成した。重合反応終了後、ゲルをＰＢＳに浸して４回交換して、取り込まれていないビオチンを洗い流した。ＰＢＳ中５０μg／mlの濃度のタンパク質を含有する溶液中でゲルを２０分間浸すことにより、誘導体化ＴＡＧ１で標識されたアビジン（ここで、アビジンは、ＮＳＢの低い修飾アビジンであるＮｅｕｔｒｏＡｖｉｄｉｎを意味し、この実験に使用した）が、ゲルの表面に結合した。ゲルをＥＣＬ測定緩衝液（２００mMリン酸ナトリウム、１００mMトリプロピルアミン、０．０２％（w／v）ツイーン２０、ｐＨ７．２）に浸して４回交換して、過剰のＴＡＧ１標識アビジンを洗い流した。図３９に示すように、ゲル（３９００）を、ガラス支持体（３９０３）にパターン付けした金の作用電極（３９０１）と対電極（３９０２）に接触させた。２つの電極の間で５００mV／秒の速度で０．０〜３．０Ｖまでそして０．０Ｖまでもどる電位勾配をつけて、ＥＣＬ光シグナルを得て、これをゲルの上に置いたＰＭＴ（３９０４）で測定した（図４０）。ビオチン含有アクリルアミド誘導体を含まないで調製したゲルは、ＥＣＬシグナルを示さなかった（図４１）。ビオチン含有ポリマーについて得られるこのシグナルは、ゲルの表面にほぼ完全に近いタンパク質の単層が存在することを示した。
【０５２５】
６．３０．ポリアクリルアミド表面でのＥＣＬサンドイッチ免疫測定
例６．２９のように、共有結合したビオチンを含有する架橋ポリアクリルアミドゲルを調製した。ストレプトアビジンをゲルの表面に吸着させて、ビオチン標識分子種を捕捉することができる結合ドメインを形成させる。表面を、トリプロピルアミン、未知濃度のアナライト、アナライトに対するビオチン標識抗体、およびアナライトに対する異なるＥＣＬ  ＴＡＧ１標識抗体を含有する溶液で処理する。アナライトが存在すると、アナライトと２つの抗体の複合体が形成され、これは次に、ストレプトアビジン表面に捕捉される。表面に存在する第２抗体に結合したＥＣＬ標識物を、例６．２９に記載のように測定する。
【０５２６】
６．３１．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬサンドイッチ免疫測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基を提示する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２抗体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２Ａ−Ｂに記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５２７】
６．３２．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬ競合免疫測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的抗体を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な抗体を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとアナライトのＥＣＬ−ＴＡＧ１標識類似体を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物で基板を処理して、測定を行う（すなわち、結合ドメインに対して、ＥＣＬ−ＴＡＧ１で標識したアナライトおよび標識していないアナライトの競合を起こさせる）。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５２８】
６．３３．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上のセルの結合に対する多重ＥＣＬ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞表面に対する抗体の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、プレポリマー溶液を各ドメインに入れる。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。結合ドメインをまず細胞の懸濁物で処理して、次にトリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２抗体および／またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面に結合した１つまたはそれ以上のセルに結合することができる結合試薬の混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５２９】
６．３４．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上のセルへのアナライトの結合の多重ＥＣＬ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および細胞の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、各細胞型を含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、異なるアナライトに結合する異なる表面構造を有する細胞を含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンとＥＣＬ−ＴＡＧ標識抗体および／またはアナライトに特異的な他の結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトの混合物を含有する試料でゲルを処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５３０】
６．３５．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬ競合ハイブリダイゼーション測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ酸で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面への結合について目的のアナライトと競合することができるＥＣＬ−ＴＡＧ１標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５３１】
６．３６．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の多重ＥＣＬハイブリダイゼーションサンドイッチ測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、およびアミノ基で官能基化した核酸プローブの混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的の核酸配列に特異的なプローブを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと表面結合プローブに相補的でない配列でアナライトに結合することができるＥＣＬ−ＴＡＧ１標識配列を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができる配列を含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５３２】
６．３７．電極上に支持されたポリアクリルアミド表面上の異なる型の多重測定
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、アレイ中に並んだ環状のへこみのパターンが得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応するシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）１８４硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11−（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨ（１〜１０mM）に暴露して、整列した金の基板と接触させ、除去する。次に基板を、チオールＨＳ−（ＣＨ2）10−ＣＨ3（エタノール中１〜１０mM）の溶液で数秒間洗浄する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ジオキサン中に塩化アクリロイルとトリエチルアミンを含有する溶液で表面を処理すると、ヒドロキシル末端ドメインがアクリル酸基で官能基化される。次にアクリルアミド、ビス−アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、アゾ−ビス−シアノバレリン酸、および例６．３１〜６．３６に記載の任意の結合試薬の混合物を含有する毛細管アレイを、整列した表面に接触させ、毛細管をアクリル酸が末端にあるドメインで整列させて、特異的プローブを含有するプレポリマー溶液を各ドメインに入れる。毛細管アレイ中の各毛細管は、目的のアナライトに特異的な結合ドメインを含有する。パターン付けしたプレポリマーの液滴を紫外線に暴露すると、表面上でそれぞれ結合ドメインを示す基板上の架橋ゲルが生成する。トリプロピルアミンと結合ドメインへの結合についてアナライトと競合するアナライトのＥＣＬ−ＴＡＧ１標識類似体および／または目的のアナライトに対するＥＣＬ−ＴＡＧ１標識第２結合試薬を含有する緩衝溶液中の、ゲル表面上の１つまたはそれ以上の結合ドメインで結合することができるアナライトを含有する試料混合物で基板を処理して、測定を行う。次に金電極（４２３２）上のポリアクリルアミド液滴（４２０３）上の結合ドメイン（４２００、４２０１、４２０２）を、図４２に記載のように、ＩＴＯ作用電極（４２０４）に接近させる。各結合ドメインから放出される光をＣＣＤカメラ（４２０５）で定量し、試料溶液に含有させた内部標準の結合ドメインと比較する。
【０５３３】
６．３８．高度に可逆性のＥＣＬ
多結晶性金電極（バイオ−アナリティカルサービシーズ（Bio-Analytical Services）から購入、２mm2）を、０．５μmと０．０３μmのアルミナスラリーで連続して手で磨き、次に１：３  Ｈ2Ｏ2／Ｈ2ＳＯ4で化学的エッチングし、そしてＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．２Ｖ〜１．７Ｖの間で希硫酸中で電気化学的サイクリングできれいにした。次にきれいな電極を、エタノールに溶解したオクチルチオール（Ｃ8ＳＨ）の希薄溶液に一晩浸した。Ｃ8ＳＨ修飾電極を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．２）に溶解した２０μlのＴＡＧ１標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で覆い、１０分間インキュベーション後表面を同じ緩衝液で充分洗浄した。
【０５３４】
ＥＣＬは、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、白金線対電極およびイージーアンドジー（EG&G）ポテンシオスタットを有する３電極セル中で行った。光の強度は、底に置いたパシフィックインストルメンツ（Pacific INstruments）光度計とハママツ（Hamamatsu）光電子増倍管で測定した。タンパク質を吸着した電極を、０．１Ｍ  ＴＰＡと０．２Ｍリン酸塩（ｐＨ７．２）の溶液に浸した。電極電位を図４４Ａに示すように、０．０Ｖと１．２Ｖの間にサイクルをさせると、高度に可逆性のＥＣＬ応答（前進および後退走査と実質的に同じ強度）が観察され、ＥＣＬプロセスの可逆性と電極上でのチオールとタンパク質層の安定性を示していた。
【０５３５】
ＰＭＴや光度計を使用せずに、ＥＣＬの場合と同じ装置を使用してサイクリックボルタン実験を行った。実験では、Ｃ8ＳＨで覆った電極（タンパク質なし）を１mMフェリシアン化カリウムの溶液（ＰＢＳ中）に入れ、電極を＋０．５Ｖ〜１．２Ｖそして逆に走査し、＋０．５Ｖ〜−０．３Ｖでもう一度走査した。＋０．５Ｖ〜−０．３Ｖの間のボルタングラムでは容量性電流のみでフェリシアンカ物のファラデー電流はなかったため、単層はそのままで１．２Ｖで脱着がないことを示している（図４４Ｂ）。
【０５３６】
６．３９．擬可逆性ＥＣＬ
電極修飾とタンパク質吸着を、前述のように行った。ＥＣＬ実験では、電位を０．０ｖと１．５Ｖの間で走査し、対応する光の強度を記録した。図４５Ａに示すように、同じサイクルの前進と後退走査の間では、異なるサイクルの間と同様に、ＥＣＬの喪失があった。１．５Ｖで酸化した後のフェリシアン化物中のチオール／Ａｕのサイクリックボルタングラムは、多量のファラデー電流を示し、１．５Ｖでのチオール単層の少なくとも部分的な脱着を示した（図４５Ｂ）。
【０５３７】
６．４０．可逆性ＥＣＬ
これらの実験では、電極修飾とタンパク質吸着を例６．３８に記載のように行った。ＥＣＬを測定するために、電極電位を２．０Ｖまでそして逆方向に０．０Ｖまで走査した。前進走査で強い光が観察された（例６．３８の可逆性条件下で観察されたものより強い光）が、図４６Ａに示すように逆走査でバックグランドまで低下した。２．０Ｖで酸化した後のフェリシアン化物中の修飾電極のサイクリックボルタングラムは、チオール単層のほとんどが脱着していることを示した（図４６Ｂ）。
【０５３８】
６．４１．パターン付け金電極上に固定化された第１抗体を用いるＥＣＬサンドイッチ免疫測定
この例では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する抗体が、ＰＳＡの免疫測定法で使用するためのパターン付け金電極上に固定化される。
【０５３９】
厚さ１〜２ミクロンの感光および現像したフォトレジストマスターを、１mm×１mm平方の斑点（ここでフォトレジストが除去される）を有するケイ素支持体上のフォトレジストの層が得られるように、公知の方法に従って作成する。シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）シリコーンエラストマー１８４と対応する硬化剤の１０：１混合物をマスターの上に注ぎ、硬化させる。重合したシルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ）を注意深くシリコンマスターから除去する。得られる弾性型押しは、エタノール中の水酸基末端チオール、ＨＳ−（ＣＨ2）11（ＯＣＨ2ＣＨ2）6−ＯＨおよびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）末端−チオールＨＳ−（ＣＨ2）11（ＯＣＨ2ＣＨ2）3ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）Ｎ（ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）2を含有する溶液に暴露して、「墨入れ」を行う。「墨入れ」を行った型押しは、金の基板と接触させ、除去して１mm×１mmＳＡＭを形成させる。基板を、エタノール中にヒドロキシルを末端に有するチオールのみを含有する溶液で数秒間洗浄して、型押し構造以外の領域へのタンパク質の非特異結合を防止する。次に得られる表面を、エタノールで洗浄し、窒素流中で乾燥させる。ＮｉＣｌ2の溶液で表面を処理し、次に抗ＰＳＡマウスモノクローナル抗体とペプチド（Ｈｉｓ）6の結合部位を提示する融合蛋白を含有する溶液で処理すると、調節された方法で表面に融合蛋白が固定化される。この方法は、表面上の固定化されたタンパク質の再現性のあるあらかじめ決められた量を与える。表面上のタンパク質の配置は、融合蛋白の一次構造中の（Ｈｉｓ）6配列の位置により調節される。固定化されたタンパク質の絶対量は、型押しされたＳＡＭ中のＮＥＡ末端チオールとヒドロキシル末端チオールの比、および型押しされた構造の表面積により調節される。ＰＳＡの較正曲線は、血清中に既知量のＰＳＡを含有する溶液を調製することにより測定される（１fM〜１μMの範囲の濃度）。前述のように作成される多くの表面をＰＳＡ較正標準物質で処理し、次に最適濃度でＰＳＡに対する第２抗体（ＴＡＧ１の誘導体で標識されている）を含有する溶液で処理される。０．１Ｍ  ＴＰＡと０．２Ｍリン酸塩（ｐＨ７．２）を含有する溶液に表面を浸して、金表面の電位を０．５Ｖ／秒の速度で０．０〜２．０Ｖの間でサイクルした時放出される光のピーク強度を測定することにより、較正曲線が測定される。試料の血清中のＰＳＡの未知濃度の測定は、ＰＳＡの濃度は、較正曲線に対する参照によりピークＥＣＬシグナルから計算される以外は、同じ方法により行われる。
【０５４０】
６．４２．ストレプトアビジンで被覆したアエロシル−２００（Aerosil-200）シリカ粒子の調製
１２nmの粒度と１７５〜２２０m２/gの反応性表面積を有するヒュームドシリカであるアエロシル−２００（デグッサ社（Degussa Corporation）、アクロン、オハイオ州、米国）は、ＮＨＳエステル基を導入するために化学修飾した。この修飾は３工程を含む：ｉ）３−アミノプロピルトリメトキシシランとの反応により粒子の表面にアミノ基を導入した。アエロシル−２００（１５５．５mg）は、５mlのトルエン中で３−アミノプロピルトリメトキシシラン（５１３mg）と合わせて、１時間還流した。シリカ粒子は４mlのトルエンで２回、４mlのメタノールで３回および４mlのジクロロメタンで３回洗浄した。各洗浄は、懸濁液の遠心分離と、これに続く新鮮溶媒へのペレットの再懸濁からなっていた；ii）アミノ基を無水コハク酸と反応させて、カルボン酸基を表面に導入した。５５．２mgの洗浄した粒子を３mlの無水ＤＭＦに再懸濁した。無水コハク酸（１０２mg）とトリエチルアミン（０．０２５ml）を加えて、懸濁液を１６時間撹拌した。さらに無水コハク酸（５０mg）を加えて、反応をさらに３時間進行させた。粒子をＤＭＦで２回、メタノールで１回、およびジクロロメタンで２回洗浄して、過剰の試薬を除去した；そしてiii）表面上のカルボン酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびエチル−３−ジアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）との反応により、ＮＨＳエステルとして活性化した。粒子（２５．１mg）を３mlの塩化メチレンに再懸濁した。ＮＨＳ（６４mg）とＥＤＣ（１１０mg）を加えて、次にこの懸濁液を３時間撹拌した。次に粒子をジクロロメタンで３回洗浄して、真空下で乾燥した。
【０５４１】
活性化シリカ粒子を、ストレプトアビジンと、活性化粒子の表面上のＮＨＳエステルとの反応により、このタンパク質で被覆した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．８５）中に０．７５０mgのストレプトアビジンを含有する溶液に、粒子（〜１．５mg）を加えた。反応を１６時間進行させた。次に粒子をＰＢＳと水で洗浄して、ＰＢＳに再懸濁して、０．１mg/mlの濃度で粒子を含有するストック懸濁液を得た。
【０５４２】
６．４３．粒子ベースのＥＣＬ測定法に使用するためのステンレス製濾紙の支持体上の小繊維マットの形成
プローブソニケーター（ブランソン・ウルトラソニック社（Branson Ultrasonic Corp.）、ダンベリー、コネチカット州、米国）を用いて、ＣＣ小繊維の懸濁液（０．２％トリトンＸ−１００水溶液中０．１mg/ml）を１５分間超音波処理して、小繊維インクを形成した。穏やかに吸引して懸濁液をステンレス製濾紙の円盤（ＧＡ−４、バエカルトファイバーテクノロジーズ（Baekart Fibre Technologies））上の直径１／８”の円形領域上に濾過した。この方法により形成されるマットの厚さは、約１μm/mlの加えた小繊維インクであった。
【０５４３】
６．４４．小繊維マット上に捕捉されたストレプトアビジンで被覆したビーズを使用するＡＦＰの粒子ベースのＥＣＬ測定法
ＡＦＰ測定は以下の工程を使用して行った：ｉ）懸濁液中のビーズの表面でのサンドイッチ免疫複合体の形成；ii）ステンレス製濾紙上に支持した小繊維マットへのビーズの濾過；およびiii）酸化電位に対して小繊維電極を走査することによる、免疫複合体中のＴＡＧ１標識抗体からのＥＣＬの検出。本測定は、ＡＦＰ測定キット（ベーリンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim））を使用して行った。この測定キットは、エレクシス・システム（Elecsys System）（ベーリンガー−マンハイム）（磁界の適用により白金電極上に磁性ビーズを捕捉するシステム）を使用するＥＣＬに基づく測定法のために設計されている。測定キットは、以下のストック溶液を含有した：ストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズ（Ｍ−２８０、ダイナル社（Dynal Inc.））を含有する懸濁液、ビオチン標識捕捉抗体（Ｒ−１）、ＴＡＧ１標識二次抗体（Ｒ−２）、および血清を模倣するように設計したマトリックスに溶解したＡＦＰを含有する一連の較正物質。
【０５４４】
本測定法用の検量線を求めるために、ストレプトアビジンで被覆したビーズのストック懸濁液（〜０．０１２mgのビーズを含有する０．０１７ml）をプラスチック管中でＲ−１（０．０１７ml）、Ｒ−２（０．０１７ml）、およびＡＦＰ較正物質（０．０１０ml）を含有するストック溶液と合わせた。この管をボルテックス混合し、次に室温で３０分間穏やかに振盪した。次に穏やかに吸引して、例６．４３に記載したように形成した小繊維マット（マット厚さ＝０．０３０mm）上に懸濁液を濾過した。マットをＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社（IGEN, Inc.））で洗浄した。次に例６．２６に記載したようにＥＣＬを測定した。各較正物質は三重測定で測定した。図４８は、ＡＦＰの濃度の関数としての、バックグラウンド補正したＥＣＬシグナルを示す。
【０５４５】
６．４５．小繊維マット上に捕捉されたストレプトアビジンで被覆したシリカビーズを使用するＡＦＰの粒子ベースのＥＣＬ測定法
ストレプトアビジンで被覆したシリカ粒子（アエロシル−２００、例６．４２に記載したように調製）を、ＡＦＰ測定キットと共に供給される磁性ビーズの代わりに使用した他は、例６．４４に記載したようにＡＦＰ測定を行った。本測定法用の検量線を求めるために、ストレプトアビジンで被覆したアエロシル−２００のストック懸濁液（０．００１mgの粒子を含有する０．０１０ml）をプラスチック管中でＲ−１（０．０１７ml）、Ｒ−２（０．０１７ml）、およびＡＦＰ較正物質（０．０１０ml）を含有するストック溶液と合わせた。この管をボルテックス混合し、次に室温で３０分間穏やかに振盪した。次に穏やかに吸引して例６．４３に記載したように形成した小繊維マット（マット厚さ＝４０mm）上に懸濁液を濾過した。マットをＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社（IGEN, Inc.））で洗浄した。次に例６．２６に記載したようにＥＣＬを測定した。各較正物質は三重測定で測定した。図４９は、ＡＦＰの濃度の関数としてバックグラウンド補正したＥＣＬシグナルを示す。
【０５４６】
６．４６．小繊維マット電極上に捕捉された蛍光染料標識ラテックスビーズから放出されるＥＣＬ
この例では、ビーズに取り込まれた蛍光染料が、ビーズベースのＥＣＬ測定法における内部標準として使用できることを示す実験を記載する。３つの型の蛍光ビーズをポリサイエンシーズ社（Polysciences Inc.）から購入した。ビーズは、取り込まれた染料の励起および発光波長が異なっていた：ｉ）カタログ＃１７６８５（ｌｅｘ＝２７３nm、ｌｅｘ＝３４０nm）。ii）カタログ＃１９３９２（ｌｅｘ＝５３０nm、ｌ＝５９０nm）。iii）カタログ＃１７７９７（ｌｅｘ＝６４１nm、ｌｅｍ＝７４０nm）。小繊維マットは、例６．４３に記載したように調製した。蛍光ビーズ（０．０１０mg）は、穏やかに吸引してマットに濾過した。マットをＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社（IGEN, Inc.））で洗浄して、例６．２６に記載したようにＥＣＬを測定した。各ビーズは三重測定で試験した。３つ全てのビーズがこれらの条件下でＥＣＬを放出した。ポリサイエンス（Polyscience）カタログ＃１７６８５、１９３９２、および１７７９７ビーズについて測定した平均積分ＥＣＬシグナルは、それぞれ０．７nA・s、６．０nA・s、および２．３nA・sであった。
【０５４７】
６．４７．金電極上に捕捉抗体を固定化するためのビオチン−ストレプトアビジン捕捉を使用するＡＦＰのＥＣＬサンドイッチ免疫測定法
この例では、免疫測定法に使用するために、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対する抗体を金電極上に固定化する。
【０５４８】
スライドガラス（１cm×１cm×０．０６cm）の一方の面を熱蒸着により金薄膜で被覆した。接着層として３nmのＴｉおよび次に１００nmのＡｕ（９９．９９％）の蒸着により金フィルムが形成された。１mMの濃度でメルカプトウンデカン酸を含有するエタノール溶液中で約１０時間にわたってスライドをインキュベートして、金フィルム上に自己集合単層（ＳＡＭ）が形成された。ＳＡＭの表面に提示されるカルボン酸基は、それぞれ０．２Ｍと５０mMの濃度で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する０．０５mlの水溶液で１０分間処理して活性化した。次に表面を水で簡単に洗浄した。表面を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．３mg/mlの濃度でストレプトアビジンを含有する０．０５mlの溶液で処理して、活性化表面にストレプトアビジンを固定化した。表面は、１Ｍのエタノールアミンを含有する０．０８mlの水溶液（ｐＨ８．５）をブロックした。３０分間のインキュベーション後、チップをＨＢＳ／ｐ２０（１０mM  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％ツイーン２０、ｐＨ７．４）で洗浄した。
【０５４９】
ＡＦＰ測定キット（ベーリンガー−マンハイム）は、ビオチン標識一次抗体のストック溶液（０．００７mg/ml）、ＴＡＧ１標識二次抗体のストック溶液（０．０１２mg/ml）、およびヒト血清を模倣するように設計した人工マトリックス中の５つの較正物質溶液からなる。測定条件はこれらの試薬に最適化されていなかった。ＡＦＰ測定を行うために、０．０２０mlの一次抗体ストック、０．０２０mlの二次抗体ストック、および０．０２０mlの較正物質溶液を合わせて、ストレプトアビジンで被覆したスライドに添加した。溶液は表面上で２０分間インキュベートした。次に表面をＨＢＳ／ｐ２０（１０mM  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％ツイーン２０、ｐＨ７．４）で洗浄した。
【０５５０】
以下の手順によりスライドの表面でＥＣＬを測定した：スライドを電気化学セルに入れた。このセルは、電気化学的に励起した金表面の面積（０．１３cm２）を画定するＯリングを含んでいた。セルはまた、Ｐｔ対電極とＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極、ならびに金フィルムに電気的に接触させる手段を含んでいた。セルは、光電子増倍管（ＰＭＴ）の下に画定された位置に保持され、ＥＣＬ放出の再現性ある検出を可能にした。ＥＣＬを励起させるために、電極を測定緩衝液（０．１Ｍトリプロピルアミン、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）ツイーン−２０、ｐＨ７．２）に浸漬して、金表面の電位を０．２V/sの速度で０Ｖ〜２Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）に傾斜させた。ＰＭＴで生成した光電流は、走査の時間にわたって積分されてnA・sの単位でＥＣＬシグナルを与えた。
【０５５１】
図５１は、溶液中のＡＦＰの濃度に対するＥＣＬシグナルのプロットを示す。
【０５５２】
６．４８．金電極に固定化したプローブへの核酸のハイブリダイゼーションの検出
この例で使用されるオリゴヌクレオチドは以下のように定義される：
ＳＣ１．２：５’ｃａ  ｇｔｔ  ｇｔｇ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｃｔａ  ｃａａ  ３’Ｃ6ジスルフィドモディファイアー
ＳＣ２．３：５’  ｔｔｇ  ｔａｇ  ｇｔｇ  ｇｃａ  ｃａｃ  ａａｃ  ｔｇ  ３’Ｃ3アミノモディファイアー
ＳＣ４．１：５’ＴＡＧ１−ｇａａ−ａａｔ−ｇｔｇ−ｃｔｇ−ａｃｃ−ｇｇａ−ｃａｔ−ｇａａ−ａａｔ−ｇａｇ  ３’
オリゴヌクレオチドはオリゴエトセトラ社（Oligos Etc. Inc.）から購入した。ＳＣ２．３は、ＮＨＳエステルを与えるＴＡＧ１の誘導体（ＮＨＳ−ＴＡＧ、イゲン社（IGEN, Inc.））と反応させてＴＡＧ１で標識した。０．１００mlのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＳＣ２．３（１３０nmol）を、ＴＡＧ−ＮＨＳ−エステルの０．５mgバイアル中の０．４００mlのＤＭＳＯと合わせた。この溶液を混合して暗所で室温で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、標識反応物を１．３８０mlの脱イオン水で希釈した。５Ｍの塩化ナトリウムを含有する水溶液（０．１２０ml）を加え、次に０．１２０mlの無水エタノールを加えた。次にこの溶液を−７０℃で少なくとも１時間インキュベートして、生成物を沈殿させた。標識オリゴヌクレオチドを５０００×ｇで１０℃で１０分間遠心分離した。生じたペレットを０．２５mlの７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で２回洗浄した。洗浄したペレットを真空下で乾燥して、暗所で−２０℃で保存した。ＳＣ４．１オリゴヌクレオチドの製造業者は、ＴＡＧ１のホスホラミジト誘導体との反応により、オリゴヌクレオチド合成中にＴＡＧ１でプローブを標識した（イゲン社（IGEN, Inc.））。
【０５５３】
スライドガラス（１cm×１cm×０．０６cm）の一方の面を熱蒸着により金薄膜で被覆した。接着層として４nmのＴｉおよび次に２００nmのＡｕ（９９．９９％）の熱蒸着により金フィルムが形成された。プラスチックのブロックにあけられた穴に対してＯリングでスライドを密閉して、金フィルムの上にウェルを形成した。Ｏリングは、溶液に接触している金フィルムの面積（０．２５cm２）を画定した。オリゴヌクレオチドＳＣ１．２は、各ウェルに、０．０１０mgのオリゴヌクレオチドを含有する０．０５０mlの溶液（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０中）を加えることにより金フィルムの表面上に固定化された。固定化は、暗所のデシケーター中で一晩進行させ、この間にオリゴヌクレオチドを含有する溶液を蒸発乾固した。次に脱イオン水で数回洗浄して過剰の試薬を除去した。
【０５５４】
金スライドの表面上のオリゴヌクレオチドのプレハイブリダイゼーションは、ＳＳＣ溶液の成分（１×）、デンハルト（Denhardts）溶液の成分（１×）、酵母ｔＲＮＡ（０．１００mg/ml）、および超音波処理したニシン精子ＤＮＡ（０．０５０mg/ml）を含有する０．０５０mlの添加により行なった。次にこのスライドを室温で３０分間激しく振盪した。プレハイブリダイゼーション工程の後、スライドをＳＳＣで洗浄して、（１×１０１２）分子のＴＡＧ１標識ＳＣ２．３（表面上に固定化された配列に相補的なオリゴヌクレオチド）、またはＴＡＧ１標識ＳＣ４．１（非特異結合を試験するために陰性対照として使用される非相補的プローブ）を含有する較正溶液とハイブリダイズさせた。ＴＡＧ１標識プローブは、プレハイブリダイゼーションに使用される０．０５０mlの溶液中の溶液として適用した。ハイブリダイゼーションは、激しく撹拌しながら室温で２時間進行させた。次に金スライドは、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣで３回洗浄し、同じ緩衝液と共に室温で３０分間インキュベートして、ＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社（IGEN, Inc.））で濯いだ。ＥＣＬは、例６．４７に記載した金フィルムの表面から励起させた。ＥＣＬはまた、ＴＡＧ１標識プローブに暴露されなかった表面からも励起させることにより、バックグラウンドシグナルの大きさを測定した。相補的プローブからのバックグラウンド補正したシグナルの値は、３．３×１０３nA・sであったが、これは、ＴＡＧ１標識プローブが表面にハイブリダイズしてＥＣＬにより検出することができたことを示している。非相補的プローブからのバックグラウンド補正したシグナルの値は、−２．２×１０１nA・sであったが、これは、非相補的プローブの結合が特異的であり、かつ非特異的結合が小さいことを示している。
【０５５５】
６．４９．小繊維とＥＶＡを含有する複合電極のシートの調製
小繊維とポリマーとを配合して、配合した材料をシートに圧縮成形して複合電極を調製した。小繊維は、１８０摂氏度の温度と１００r.p.m.の速度で二軸スクリュー計量ヘッドを有するブラベンダー・プラスチコーダー（Brabender Plasticorder）を使用して、ＥＶＡ中に配合した。９．４５グラムの小繊維は、２５．５５グラムのＥＶＡ（クオンタム化学（Quantum Chemical）、ミクロテン（Microthene）、ＦＳ−５３２）とドライブレンドした。ブレンドした材料は、１分間で混合ヘッドに加えて、材料を融解させた。混合をさらに５分間続けて、次に複合体を混合ヘッドから取り出して冷却した。電極として使用される複合体のシートを調製するために、２グラム片の配合材料を組み立てて、２枚の磨きステンレス製の板（三重めっきしたフェロタイプ板、テストライト社（Testrite Company））の間にサンドイッチにして、この組立品を液圧プレス（カーバー（Carver））で１８０摂氏度に設定した熱板の間に入れた。材料が加熱されるのを待って、複合体を１００００ポンドの全圧で平らなシートにプレスした。次にプレスから組立品を取り出し、室温まで冷却した。組立品を分離して、２０ミルの公称厚さの平らな円盤を取り出した。
【０５５６】
６．５０．クロム酸による小繊維−ポリマー複合体の酸化
炭素小繊維（２７重量％）とビニル酢酸エチルとの複合体（小繊維−ＥＶＡ）と、炭素小繊維とポリエチレンとの複合体（小繊維−ＰＥ）を使用した。複合体は、約１mm厚さの３”円盤として入手した。小繊維−ＥＶＡと小繊維−ＰＥ複合体の両方とも、室温で１時間、クロム酸を含有する溶液（ＣｒＯ３、Ｈ２ＯおよびＨ２ＳＯ４、（２９／４２／２９；ｗ／ｗ／ｗ））に円盤を浮かべることにより酸化した。クロム酸溶液との反応後、酸化された複合体を脱イオン水で４〜５回洗浄して、脱イオン水に少なくとも５分間浸漬して空気中で１時間乾燥した。
【０５５７】
６．５１．硫酸と硝酸の混合液による小繊維−ポリマー複合体の誘導体化
ＥＶＡと炭素小繊維の複合体（３”直径の平らな円盤の形態の）は、１：１比の硫酸と硝酸の混合液（１２ml）で３時間処理した。処理した複合体は水で洗浄した。水（１５０ml）と水酸化アンモニウム（３０％、１５０ml）の混合液中の処理した複合体に、亜ジチオン酸ナトリウム（１０グラム）を加えた。反応混合液を２時間還流した。この複合体を水で充分に洗浄した。
【０５５８】
６．５２．露出ヒドロキシル基を有する小繊維複合電極の調製
複合体の表面および表面近くのアセテート基の加水分解により、小繊維−ＥＶＡ複合体上のヒドロキシル基を露出させた。複合材料（ＥＶＡ中２７重量％のＣＣ小繊維）の円盤（直径３”、厚さ０．０１”）を１００mlのＮａＯＨの２Ｍ溶液に室温で１７〜２０時間浸漬した。この処理により、複合体の両側のヒドロキシル基が露出する。複合体を水とメタノールで洗浄して、次に空気中で乾燥させた。
【０５５９】
６．５３．酸化した小繊維−ポリマー複合体へのストレプトアビジンの固定化
ＥＶＡ−小繊維複合体は、例６．５０に記載したように、または酸素プラズマへの暴露により酸化した。酸化した３”円盤複合体は、真空ポンプ下で１時間乾燥して、０．１Ｍ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含有する２５mlのジクロロメタンに一晩（振盪しながら）浸漬した。ＮＨＳ活性化複合体はジクロロメタン、メタノール、脱イオン水およびメタノールで洗浄して、次に室温で乾燥させた。
【０５６０】
ストレプトアビジンの固定化のため、ＮＨＳ活性化複合体を脱イオン水で濯ぎ、ＮＨＳ−エステル活性化表面が下に向くように６mlのストレプトアビジン溶液に浮かべた。ストレプトアビジン溶液は、０．７mg/mlの濃度にＰＢＳ−１（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．８）中で調製した。複合体はストレプトアビジン溶液中で３時間振盪して、０．１％トリトンを含有する２０mlのＰＢＳ−１中で３０分間（１回）および２０mlのＰＢＳ−１中で３０分間（５回）振盪して洗浄した。このストレプトアビジン添加ＥＶＡ複合体はＰＢＳ−１中で４℃で保存した。
【０５６１】
６．５４．ＳＭＣＣ活性化による小繊維−ポリマー複合体へのタンパク質の固定化
硝酸と硫酸の混合液で（例６．５１のように）処理したＥＶＡ−小繊維複合体の３”直径の円盤は、１５mlのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）に入れた。スルホスクシンイミジジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ、１０mg）を加えて、反応混合液を室温で３時間インキュベートした。反応を停止させ、複合体はリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。０．１Ｍリン酸ナトリウム、２０mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５（３００ml）中のストレプトアビジン（４．５mg）の溶液に、トラウト試薬（Traut's reagent）（１９．８ml、２．８mg/ml）を加えた。反応混合液を室温で１時間３０分間インキュベートした。このスルフヒドリル標識ストレプトアビジンは、ＰＤ−１０（ファルマシア（Pharmacia））使い捨てサイズ排除カラム（３．５ml画分で集めた）を使用して精製した。ＳＭＣＣ処理複合体（１インチ、ＥＶＡ  ＣＣ複合体のニトロ化／還元により得られた）をスルフヒドリル標識ストレプトアビジンを含有する溶液（３．５ml）に入れて、振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。生じたストレプトアビジンで被覆した複合体は、１％トリトンＸ−１００を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で振盪して洗浄（５×２０分）した。
【０５６２】
６．５５．露出ヒドロキシル基を提示する複合電極へのストレプトアビジンの固定化
表面および表面近くにヒドロキシル基を示す小繊維−ＥＶＡ複合体にストレプトアビジンを固定化した。カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）によるヒドロキシル基の活性化によりタンパク質を固定化した。（例６．５２に記載した手順により）ＮａＯＨで処理してヒドロキシル基を露出させた小繊維−ＥＶＡ複合電極を真空下で乾燥した。乾燥複合体は、乾燥ガラスジャーの中の５０mlの無水塩化メチレンに浸漬した。この溶液に１００mg（０．６mmol）の１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を加えて、ジャーを室温で１時間穏やかに振動させた。次に複合体を塩化メチレンとメタノールで洗浄し、次に空気中で乾燥させた。ＣＤＩ活性化複合体は３／１６”の円盤に（穴あけ器を使用して）切り出した（総計９６個）。各円盤を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの底に入れた。ストレプトアビジン（０．２Ｍ重炭酸ナトリウム中の１００mlの０．１mg/ml溶液、ｐＨ８．５）を次に各ウェルに加えた。固定化は、４℃で１８〜２０時間進行させた。１００mlずつの５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に浸漬して円盤を３回洗浄して、使用するまで１００mlの５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中で保存した。
【０５６３】
６．５６．ＥＶＡと小繊維の複合電極上のＡＦＰの測定法
（例６．５３に記載したように調製した）ストレプトアビジンを固定化したＥＶＡ−小繊維複合電極を使用して、ＡＦＰ測定を行った。測定は、測定の前に１％  ＢＳＡ溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム中の１％  ＢＳＡおよび０．３％ツイーン２０、ｐＨ＝６．８）でプレブロックして、０．１Ｍリン酸ナトリウム中の０．３％ツイーン２０、ｐＨ６．８で濯いだ９６ウェルプレート中で行った。３／１６”の直径の４８個の円盤を３”直径のＥＶＡ−ＳＡ複合体から打ち抜いて、処理した表面を有する９６ウェルプレートに入れた。５０マイクロリットルのビオチン化ＡＦＰ抗体を、複合体を含むウェルに加えた。次にプレートを室温で３０分間振盪した。複合体を０．１mlのＰＢＳ−１で２回すすぎ、室温で０．０５mlの較正物質と０．０５mlのＴＡＧ１標識抗体の混合物と共に１時間振盪した。反応の終わりに、複合体を０．１５０mlのＥＣＬ測定緩衝液で濯いで、ＥＣＬを測定するまでタンパク質緩衝液（３％  ＢＳＡ、３％ツイーン２０、２５mM塩化ナトリウムおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．３）中に保存した。我々は０．５６〜７９５０ IU/mlの範囲の８種のＡＦＰ較正物質を使用した。各較正物質は、６回反復で測定した。図５３に結果を示す。
【０５６４】
６．５７．ＥＶＡと小繊維の複合電極を使用するＴＳＨのＥＣＬ測定法
測定は、ＥＶＡ−小繊維複合体（例６．５５に記載したように調製）の３／１６”直径のストレプトアビジンで被覆した円盤を使用して行った。測定試薬は、ＴＳＨ測定キット（イゲン社（IGEN, Inc.））の一部であり、そしてそれぞれ緩衝液（ＴＳＨ測定希釈液）に溶解したビオチン標識抗ＴＳＨ抗体とＴＡＧ１標識抗ＴＳＨ抗体を含んでいた。円盤は、９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに入れた。ビオチン標識抗体（０．０５mg、０．０１２mg/ml）を各ウェルに加えて、３７℃で３０分間プレートを穏やかに振盪した。ＴＳＨ測定希釈液で円盤を洗浄後、ＴＡＧ１標識抗体（０．０２５ml、６００ng/ml）と種々の量のＴＳＨを含有する溶液を加えて、３７℃でプレートをさらに６０分間振盪した。円盤は、ＴＳＨ測定希釈液で洗浄して、ＥＣＬによる分析まで、同希釈液中に保存した。
【０５６５】
６．５８．小繊維−ポリマー複合体上のＤＮＡハイブリダイゼーション測定
この例では、ＤＮＡ配列の測定を記載する。本測定は、ストレプトアビジンで被覆した複合電極上のサンドイッチ複合体の形成を伴い、この電極は、ビオチン標識捕捉プローブ（ＳＣ５）、アナライト（ＳＣ３．１）およびＴＡＧ１標識プローブ（ＳＣ４．１）を含む。ＳＣ３．１とＳＣ４．１は、例６．４８に記載されている。ＳＣ５は、オリゴエトセトラ社（Oligos Etc. Inc.）から購入し、そして配列５’−ｃａ  ｇｔｔ  ｇｔｇ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｃｔａ  ｃａａ  ｇｃａ  ｔｔａ  ｃｇｇ  ａｃｔ  ａｇｔ  ｃａｔ  ｇｇｔ  ｔｃａ  ｃａｇ  ａｇｇ−３’−ビオチンを有する。酸化小繊維−ＥＶＡ複合体は、例６．５３に記載したようにＥＤＣとＮＨＳで活性化した。プラスチックのブロックにあけられた穴に対してＯリングで円盤を密閉して、複合体の３／８”円盤の上にウェルを画定した。Ｏリングは、ウェルに入っている溶液と接触している複合体の面積（０．２５cm２）を画定した。ストレプトアビジンは、０．０５mlのストレプトアビジンの０．５mg/ml溶液（ＰＢＳ中）を各ウェルに加えることにより、円盤上に固定化した。装置を振盪しながら反応は室温で３時間進行させた。円盤は、ＰＢＳで２回、０．１０％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで１回およびＰＢＳでさらに２回洗浄した。
【０５６６】
ビオチン標識オリゴを捕捉するために、我々は、０．０５mlのＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社（IGEN,Inc.））中の１０１３分子のＳＣ５を加えて、激しく振盪しながら室温で２時間インキュベートした。過剰なＳＣ５は、ＰＢＳ、０．１０％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ、およびＥＣＬ測定緩衝液で洗浄して除去した。次にＥＣＬ測定緩衝液中のＳＣ４．１（０．０２５ml中１０１２分子）とＳＣ３．１（０．０２ml中の種々の量）を加えた。ハイブリダイゼーション反応は４時間進行させた。次に過剰の試薬は、ＰＢＳ、０．１０％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ、およびＥＣＬ測定緩衝液で洗浄して除去した。次に円盤をＥＣＬ装置に入れて、ＥＣＬシグナルを測定した。図５４は、ＳＣ３．１の量の関数としてＥＣＬシグナルを示す。
【０５６７】
６．５９．小繊維複合電極の表面積の測定法
複合電極の表面から突き出る小繊維の量は、二重層静電容量の測定から推定することができる。電極は、直径０．２５インチの複合体の円盤を打ち抜いて、電気塗料で銅線を取り付けて１つの表面に電気的に接触させて調製した。任意のむき出しの銅線はエポキシ中に密閉した。電極を使用して、−０．２Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌと＋０．８Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌの間のいくつかの電位の走査速度（例えば、５、１０および２５mV/秒）で、アルゴンをパージした０．５Ｍ  Ｋ２ＳＯ４中のサイクリックボルタングラム（cyclic voltammograms）を記録した。二重層荷電電流Ｉｄｌは、サイクリックボルタングラムの広く平らな領域、典型的には＋０．２５Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌで測定した。走査速度に対するＩｄｌでのプロットの傾きは、二重層静電容量Ｃｄｌとしてとられる。１０μF/cm２の小繊維表面積の平均値、および２００M２/グラムの小繊維表面積を使用して、電解質に露出される小繊維の量を推定することができる。
【０５６８】
６．６０．ＮＨＳエステル官能基化小繊維の調製
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（０．３５ｇ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（０．６０mg）を、２５mlのジオキサン中に２２０mgのカルボキシル化小繊維（ハイパーイオン触媒社（Hyperion Catalysts Inc.））を含有する懸濁液に加えて、この混合物を音波処理（ソニファイアー（Sonifier）２５０、ブランソン・ウルトラソニックス（Branson Ultrasonics））して、室温で一晩撹拌した。反応は、焼結ガラスロートで小繊維からの反応物の真空濾過により停止させた。小繊維をジオキサン（３×１５ml）およびメタノール（充分に）で洗浄し、次に真空下で乾燥して、２２０mgのＮＨＳエステル活性化小繊維を得た。
【０５６９】
６．６１．ＮＨＳエステル小繊維へのストレプトアビジンの結合
ＮＨＳエステル修飾小繊維（２．１mg、例６．６０に記載したように調製）を、４００μｌ  ＰＢＳ−１緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．８）中で最も低い出力設定で５分間音波処理（ソニファイアー（Sonifier）２５０、ブランソン・ウルトラソニックス（Branson Ultrasonics））した。ストレプトアビジンの溶液（１５０μｌ  ＰＢＳ−１中２．４mg）を分散小繊維懸濁液と混合して、混合物（６５０μｌ）を室温で３時間穏やかに振盪した。小繊維は、多数回サイクルの反復遠心分離、および以下の緩衝液（１％トリトンＸ−１００を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム（１回）、ＰＢＳ−１（２回）、０．１％トリトンＸ−１００を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム（１回）、およびＰＢＳ−１（４回））を連続して使用する再懸濁により洗浄した。ストレプトアビジン添加小繊維をＰＢＳ−１中で４℃で保存した。
【０５７０】
６．６２．ナイロン膜フィルター上の極薄小繊維マット（ＵＴＦＭ）の製作
ＣＣ小繊維のストック懸濁液（水中１mg/ml）をトリトンＸ−１００の水溶液（０．２％（ｗ／ｖ））に希釈して、ＣＣ小繊維を０．１mg/mlの濃度で含有する水性懸濁液を調製した。３０％のデューティサイクルを使用し、かつ出力制御を３の値に設定して５分間音波処理して、プローブソニケーター（ソニファイアー（Sonifier）２５０、ブランソン・ウルトラソニックス（Branson Ultrasonics））でＣＣ小繊維を微細に分散した。次に４mlの懸濁液をトリトンＸ−１００の水溶液で４０mlの容量まで希釈して、音波処理した懸濁液の０．０１mlの濃度までさらに希釈した。
【０５７１】
真空濾過によりナイロン膜（孔径０．４５mm、直径４７mm）上にＵＴＦＭを調製した（小繊維マットの濾過用の装置の一例に関する図２４を参照のこと）。約２６インチのＨｇの真空を使用して４つのあ４mlずつのアリコートで、微細に分散した小繊維をナイロン膜上に濾過した。膜上に濾過されずに残る液体が痕跡量になるまで（目視観察による）、真空濾過を続けた。次にマットを濾過装置から取り出し、２片の新しい乾燥した濾紙の間に圧縮して、６０℃で約１０〜１５分間オーブンで平らに乾燥させた。
【０５７２】
使用する容量は、異なる面積および／または厚さの電極に応じて見積もることができた。
【０５７３】
６．６３．二層極薄小繊維マット電極上の核酸ハイブリダイゼーション測定法
例６．６１に記載したように、分散したＣＣ炭素小繊維上にストレプトアビジンを共有結合で固定化した。全部で１００μgの小繊維を、ＢＳＡ  １mg/ml（ｗ／ｖ）の濃度で含有する溶液に懸濁して、小繊維の占有されていない部位をブロックした。次にブロックした小繊維を遠心分離して１mlの脱イオン水に再懸濁した。５分間音波処理（ソニファイアー２５０、ブランソン・ウルトラソニックス）して、この懸濁液を再分散した。
【０５７４】
例６．６２に記載したように極薄小繊維マット（ＵＴＦＭ）を調製した。ＵＴＦＭを調製後、例６．６２に使用したものと同じ条件下で第１層へ１７μｌのストレプトアビジン−小繊維の懸濁液を濾過して、第２層を形成した。
【０５７５】
ＤＮＡハイブリダイゼーション測定を行うために、我々は、相補的「ＴＡＧ付けした」オリゴヌクレオチド（２８塩基対、ＴＡＧ１−ＮＨＳエステルで末端標識されている）とハイブリダイズさせた「捕捉」オリゴヌクレオチド（２８塩基対、５’位でビオチン化されている）を使用した。本測定は以下の工程により用意した：ｉ）種々の濃度のビオチン標識オリゴと一定の過剰な（１０１２分子）ＴＡＧ１標識オリゴを含有する較正物質溶液を調製；ii）５０μm/secの流速で極薄小繊維マット（１溶液当たり１つのＵＴＦＭ）により較正物質溶液（５０μｌ）を濾過して、小繊維マット中のストレプトアビジン被覆小繊維へビオチン化複合体を捕捉；iii）５０μｌのＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社）によりＵＴＦＭを洗浄し未結合試薬を除去、そしてiv）ＵＴＦＭ（および結合したオリゴヌクレオチド複合体）を測定セルに移して（図３４）ＥＣＬを測定。図５５は、本測定が、ＴＡＧ１標識オリゴヌクレオチドを高感度で測定して、広いダイナミックレンジにわたって線形の応答を与えたことを示す。
【０５７６】
６．６４．二層極薄小繊維マット電極上のＡＦＰのサンドイッチ免疫測定法
例６．６１に記載したように、ストレプトアビジンで被覆した（かつＢＳＡでブロックした）小繊維の懸濁液を調製した。懸濁液をＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社）に希釈して、７mg/mlの小繊維のストック懸濁液を得た。溶液を氷水浴に入れて（ストレプトアビジンの変性を防ぐため）、２０％のデューティサイクルを使用し、かつ出力制御を１．５の値に設定して、５分間音波処理（ソニファイアー２５０、ブランソン・ウルトラソニックス）して小繊維を再分散した。
【０５７７】
真空濾過装置を使用して、ナイロン濾過膜（０．４５mm孔径）上に二層ＵＴＦＭ電極を調製した。濾過装置は膜上に１／８”直径の面積を画定し、これにより濾過が起きた。誘導体化していない０．０１mg/mlの小繊維を含有する８７．５μｌの微細に分散した懸濁液（例６．６２に記載したように調製）を（吸引して）濾過して、誘導体化していない小繊維の層を形成した。誘導体化していない小繊維の層に、ストレプトアビジンで被覆した小繊維の５０μｌのストック懸濁液を濾過して、第２層を形成した。
【０５７８】
ビオチン化ＡＦＰ抗体の５０μｌのストック溶液、ＴＡＧ１標識ＡＦＰ抗体の５０μｌのストック溶液、および既知濃度のＡＦＰを含有する１０μｌのいくつかのストック溶液の１つを合わせて、ＡＦＰ測定試薬（エレクシス（Elecsys）、ベーリンガー−マンハイム）を濾過の前に混合した。合わせた溶液は次に、５インチのＨｇの真空圧を使用して制御された流速で、吸引して濾過した。各試料は濾過するのに３０〜５０分かかった。次にマットを１５０μｌのＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社）で洗浄し、取り出して乾燥させた。マットは測定セル（図３４）に移して、ＥＣＬを測定した。図５６は、較正物質溶液におけるＡＦＰの濃度の関数としてのＥＣＬシグナルを示す。
【０５７９】
６．６５．非導電性濾過膜上の金の導電性フィルムの形成
ワットマン（Whatman）のナイロン膜フィルター（０．４５μm孔径）は、バルザースＭＥＤ０１０ミニデポジションシステム（Balzers MED 010 Minideposition System）を使用してスパッタリングした金で被覆した。沈積は、アルゴンプラズマ（５×１０−２mbarの圧力で）と１００mAの放電電流を使用して行った。
【０５８０】
６．６６．金で被覆したナイロン濾過膜上に形成した極薄小繊維マット電極上のＡＦＰのサンドイッチ免疫測定法
例６．６１に記載したように、ストレプトアビジンで被覆した（かつＢＳＡでブロックした）小繊維の懸濁液を調製した。懸濁液をＥＣＬ測定緩衝液（イゲン社）に希釈して、２８mg/mlの小繊維の濃度のストック懸濁液を得た。溶液を氷水浴に入れて（ストレプトアビジンの変性を防ぐため）、２０％のデューティサイクルを使用し、かつ出力制御を１．５に設定して、５分間音波処理（ソニファイアー２５０、ブランソン・ウルトラソニックス）して小繊維を再分散した。
【０５８１】
導電性のＡｕで被覆したナイロン濾過膜（１００nm金フィルム、例６．６５に記載したように調製）から全部で３６個の５／１６”直径の円盤を打ち抜き、（穴あけ器を使用して）切り取って５／１６”直径の円盤を形成した。円盤は、９６個もの試料を制御された真空圧下で一度に濾過することが可能な多重試料濾過装置のウェルに入れた。この装置により、試料を各円盤上の３／１６”直径の円形領域に濾過する。ストレプトアビジンで被覆した小繊維の８２．５μｌのストック溶液を（２６インチのＨｇの真空を使用して）円盤上に濾過して、単層ＵＴＦＭを形成した。ビオチン化ＡＦＰ抗体の５０μｌのストック溶液、ＴＡＧ１標識ＡＦＰ抗体の５０μｌのストック溶液、および既知濃度のＡＦＰを含有する１０μｌのいくつかのストック溶液の１つを合わせることにより、ＡＦＰ測定試薬（エレクシス（Elecsys）、ベーリンガー−マンハイム）を濾過の前に混合した。合わせた溶液は次に、５インチのＨｇの真空圧を使用して制御された流速で、吸引して濾過した。各試料は濾過するのに３０分かかった。次にマットを１５０μｌの測定緩衝液で洗浄し、次いで取り出して、３．０％  ＢＳＡ、３．０％ツイーン−２０、２５mM  ＮａＣｌ、および１００mM  ＮａＨ２ＰＯ４を含有するタンパク質緩衝液中で保存した。マットは測定セル（図３４）に移して、ＥＣＬを測定した。図５７は、較正物質溶液におけるＡＦＰの濃度の関数としてのＥＣＬシグナルを示す。
【０５８２】
６．６７．２つの異なる電極上のＡＦＰ測定：シグナルとバックグラウンドのボルタンメトリックな分解能
２つの複合電極上でＡＦＰ測定法を開発した。２７重量％のＣＣ小繊維を含有するエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマーから両方の電極を調製した。１つの電極（「加水分解ＥＶＡ」電極）は、水酸化カリウムで処理し、ＣＤＩで活性化し、そしてストレプトアビジンに暴露した（例６．５５のように）。もう一方の電極（「クロム酸ＥＶＡ」電極）は、クロム酸で処理し、ＮＨＳとＥＤＣで処理してストレプトアビジンに暴露した（例６．５３のように）。
【０５８３】
ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体、ＴＡＧ１標識抗ＡＦＰ抗体およびＡＦＰを含有するサンドイッチ複合体を、例６．５６に記載した手順によりこの２つの電極の３／１６”の円盤上に捕捉した。
【０５８４】
各電極は、電極の活性面積（１／８”直径）を画定するガスケット（内径１／８”、外径７／８”、および厚さ０．０１７”）を用いてＥＣＬ試験セル（図３４）中に設置した。試験セルは、３電極電気化学セルと、作用電極、と平行な光学窓を含む黒いデルリン（Delrin）の本体からなっていた。電極は、３Ｍ  Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、白金メッシュ対電極、および作用電極としての小繊維−ＥＶＡ複合体であった。試験セルを、約１mlの測定緩衝液で充填し、光を通さない箱に入れて、試作品の電気ヒーターで約３３℃に加熱した。試験セルの光学窓は、ＰＭＴの前方に置き、箱を閉じた。いくつかの光電流範囲（すなわち、１０nA/V、３０nA/V、１００nA/V、３００nA/V、および１０００nA/V）を使用して、１秒時定数フィルターによりアナログモードで作動するパシフィックインストルメンツ（Pacific Instruments）モデル１２６光度計を用いて、９００ＶでＰＭＴに電源を供給した。電気化学セルは、イージーアンドジー（EG&G）パークモデル１７５（PARC Model 175）ユニバーサルプログラマー（Universal Programmer）とイージーアンドジー（EG&G）パークモデル１７３（PARC Model 173）ポテンショスタット／ガルバノスタットにより制御した。３Ｍ  Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０Ｖで１００ｓ遅延後、電位は、１００mV/sで０Ｖ（Ｅ０）から、−０．８Ｖの下限（Ｅ１）に、２．３Ｖの上限（Ｅ２）に、および０Ｖの終止電位（Ｅ３）に掃引した。電流範囲は１mA/Vに設定した。試験セルの周囲の大気温度は、コールパーマー（Cole Parmer）サーミスタ温度計とプローブを用いて測定した。全てのアナログデータ（温度、光、適用電位、および電流）は、ピラミッド（Pyramid）１００MHzペンティアム（Pentium）コンピュータでＨＥＭデータ社（HEM Data Corp.）のウィンドウズＪ（Windows J）用のスナップ−マスター（Snap-Master）により制御した、コンピュータボード社（Computer Boards Inc.）ＣＩＯ−ＤＡＳ１６０２／１６  Ａ／Ｄボードにより１０Hzでデジタル化した。生データから、適用電位に対するＥＣＬとボルタンメトリック電流のプロットを作成して、最大陽極電流、ＥＣＬピーク電位（ＥＣＬピークでの適用電位）、平均ＥＣＬ暗電流（出発電位と０．５Ｖの間の平均光）、および暗補正積分ＥＣＬ（所定の電位範囲にわたる平均ＥＣＬと平均暗ＥＣＬの間の差の全てを、所定電位範囲の継続時間（秒）により掛け算した）を含むいくつかのデータを計算した。
【０５８５】
ＡＦＰ測定由来のボルタンメトリーは、使用される電極に依存する。加水分解ＥＶＡにおけるＡＦＰ測定についてのボルタングラムは、１．４Ｖで開始し約１．８Ｖで陽極ピークを有する不可逆性酸化波からなる。最大陽極電流は、２．３Ｖで発生する。−０．８Ｖと１．４Ｖの間ではほとんど電流は流れなかった。クロム酸処理ＥＶＡ由来のボルタングラムは、０．７Ｖで開始しいくつかの不確定の陽極ピーク（約１．１、１．５、および２．０Ｖ）と２．３Ｖで最大陽極電流を有する、非常に広い不可逆酸化波からなる。−０．８と０．７Ｖの間ではほとんど電流は流れなかった。
【０５８６】
加水分解ＥＶＡでは、高電位側に少量のテーリングを有するピークからなる痕跡ＥＣＬが生じた。ピーク電位は、ブランクシグナルの１．８５Ｖからアナライトシグナルの１．７５Ｖへとわずかにシフトした。クロム酸処理ＥＶＡでは２つの接近したピークが生じたが、これらは両方ともアナライト濃度に比例した。これらのピークは、約１．６Ｖと約１．２５Ｖにあった。低アナライト濃度では、１．６Ｖのピークが優勢であるが、高アナライト濃度では１．２５Ｖのピークが優勢であった。クロム酸処理は、ピーク−ピーク分解能を約１００mV（加水分解ＥＶＡ）から約３５０mVに増大させた。このピークシフトは、アナライトに感受性の高いことが示された第１のピークを分析し、かつ分析に使用されるブランクシグナルの量を減少させるのに充分であった。
【０５８７】
同様な実験において、我々は、ＡＦＰ較正物質１（主としてＥＣＬ測定緩衝液、図６０）とＡＦＰ較正物質３（図６１）の痕跡ＥＣＬを比較した。図６０において、測定緩衝液に対応するＥＣＬシグナルは、１．５Ｖで最大のピークとして出現する。図６１においても、測定緩衝液のＥＣＬシグナルは１．５Ｖにあるが；１．０Ｖの追加のピークは、ＴＡＧ１標識相補抗体を含むサンドイッチ複合体中のアナライト由来のシグナルに対応する。
【０５８８】
６．６８．小繊維−ＥＶＡ複合体の押出しシートの調製
我々は、２７０グラムのカーボンナノチューブ（ＨＣＩフィブリルズ（HCI Fibrils）、ＣＣ等級）と７３０グラムのエチル酢酸ビニル（ＥＶＡ、クオンタム・ミクロテン（Quantum Microthene）ＦＥ５３０）をヘンシェル・ラブ（Henschel lab）ミキサー中で２分間混合した。ナノチューブ−ＥＶＡ混合物は、密閉ホッパーに真空移送し、１８０℃でバス（Buss）ＰＲ４６ニーダーで配合して、バス（Buss）クロスヘッドペレット製造機に供給した。ペレットはガラ（Gala）乾燥機で乾燥した。このプロセスにより、２７重量％の小繊維を含有する複合体が得られた。
【０５８９】
押出しの前に、配合ナノチューブ−ＥＶＡ複合体のペレットを、８０℃で少なくとも１２時間乾燥した。乾燥したペレットを、ブラベンダーＰＬ２０００プラスチコーダー（Brabender PL2000 Plasti-Corder）（２：１圧縮比スクリューと６”フレックスリップダイ（flex-lip die）を取り付けた３／４”２５：１  Ｌ／Ｄ単一スクリュー押出し機）中に不足供給した。押出し機の３つの加熱ゾーンとダイの温度は２４５℃であった。押出し機の出力ダイから、ナノチューブ−ＥＶＡ複合体の連続リボン（〜１５cm幅、〜１mm厚さ）を製造して、無視できる引落率で周囲温度でコンベヤーベルト上に集めた。以後の全ての実験には、コンベヤーベルトに接触しなかった複合体の表面を使用した。
【０５９０】
６．６９．ＥＣＬ免疫測定用の小繊維複合体を化学修飾するための酸素プラズマの使用
炭素小繊維とＥＶＡの複合体（２７重量％小繊維）を酸素（Ｏ２）ガスから生成したプラズマに暴露した。複合体を２０００Ｗで１０分間（２０kW分）プラズマに暴露した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル官能基（ＮＨＳ−エステル）を導入するために、プラズマ処理した小繊維−ＥＶＡ複合体（１２６cm２）を、無水塩化メチレン（５０ml）中で室温で２時間、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７００mg、アルドリッチ（Aldrich）１３０６７−２から）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．６ｇ、アルドリッチ（Aldrich）１６１４６−２から）と反応させ、次にメタノールと水で濯いで、アルゴンガス流を吹きつけ乾燥した。ＮＨＳ−エステル誘導体化複合体を、ＰＢＳ−１緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．８、５０ml）中で室温で４時間、ストレプトアビジン（５mg、ピアース（Pierce）２１１２５から）と共にインキュベートした。次に複合体をＰＢＳ−１中の１％トリトンＸ−１００で３０分間振盪しながら洗浄し、ＰＢＳ−１で３０分間３回各回振盪しながら洗浄した。
【０５９１】
６．７０．小繊維複合体を化学修飾するための酸素プラズマ（４０KW分）と次のＮＨ３／Ｎ２プラズマ（４：１、１２０KW分）の使用
炭素小繊維とＥＶＡの複合体（１２３cm２）（２７重量％小繊維）を最初に酸素（Ｏ２）ガスから生成したプラズマに暴露した。複合体は、２０００Ｗで２０分間（４０kW分）プラズマに暴露した。次に複合体をアンモニア（ＮＨ３）ガスと窒素（Ｎ２）ガスの混合物（それぞれ４：１比のガス）から生成したプラズマに暴露した。複合体を、このプラズマに２０００Ｗで６０分間（１２０kW分）暴露した。マレイミド官能基を形成するために、プラズマ処理小繊維ＥＶＡ複合体を、ＰＢＳ−１（５０ml）中で振盪しながら室温で３時間、スルホ−ＳＭＣＣ（Sulfo-SMCC）（３５mg、ピアース（Pierce）：２２３２２から）と共にインキュベートした。次に複合体を水（１０分振盪しながら６０ml）で１回およびＰＢＳ−１で３回（各回１０分振盪しながら６０ml）洗浄した。
【０５９２】
活性化複合体上へ固定化用のＩｇＧを調製するために、ジチオトレイトール（５mg、シグマ（Sigma）Ｄ−９７７９から）を抗ＡＦＰＩｇＧ溶液（ベーリンガー・マンハイムから）（５００μｌ  ＰＢＳ−１緩衝液中５．５mg）に加えた。この混合物を室温で３０分間インキュベートした（混合するために回転させながら）。この手順により、ＩｇＧ上のチオール基が暴露（「ＩｇＧ−（ＳＨ）ｎ」）した。「ＩｇＧ−（ＳＨ）ｎ」を、カラムクロマトグラフィーにより精製して、次に２０mM  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ−１緩衝液に希釈した。
【０５９３】
マレイミド活性化複合体（６０cm２）は、精製した「ＩｇＧ−（ＳＨ）ｎ」溶液（３０mlの２０mM  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ−１緩衝液中の５．５mg「ＩｇＧ−（ＳＨ）ｎ」）と共に室温で２．５時間インキュベートした。複合体は１％トリトンＸ−１００（６０ml）で２０分間振盪しながら１回、およびＰＢＳ−１で２０分間３回各回振盪しながら洗浄した。抗ＡＦＰ−ＩｇＧ複合体をＰＢＳ−１中で保存した。
【０５９４】
ＡＦＰ測定は、抗ＡＦＰ−ＩｇＧ複合体上で行った。９６ウェルプレートをＢＳＡでプレ被覆した。複合体の個々の円盤（３／１６”直径）は、金属穴あけ器で打ち抜いた。各円盤は、ＴＡＧ１標識ＩｇＧ（１００μｌ）を含有する溶液と、既知量のＡＦＰを含有する試料（２０μｌ）と共に室温で６０分間インキュベートした。インキュベーション後円盤を、ＰＢＳ−１（２００μｌ）で３回濯いで、ＢＳＡ測定希釈液（１００μｌ）中で保存した。図６２は、ＡＦＰを含有する試料とＡＦＰを含有しない試料（バックグラウンド試料）のＥＣＬシグナルの間の差のｌｏｇのプロットを、試料中のＡＦＰ濃度のｌｏｇの関数として示す。
【０５９５】
６．７１．水／アルゴンプラズマ中で酸化した複合体電極へのタンパク質の吸着
小繊維−ＥＶＡ複合電極（例６．６８に記載したように調製）を、アドバンスト・プラズマ・システムズ（Advanced Plasma Systems）シリーズＣプラズマ反応器（１時間、２０００Ｗ、３００mtorr）中で水飽和アルゴンから生成したプラズマで処理した。複合体（〜８０cm２）は、１００mMリン酸中０．２mg/mlの濃度で抗ＡＦＰモノクローナル（ベーリンガー−マンハイム）を含有する２０mlの溶液（ｐＨ７．５）に入れて、室温で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。複合体を１００mMリン酸（ｐＨ７．５）で洗浄して、同じ溶液中で−４℃で保存した。放射性標識を使用して、円盤に吸着した抗体の量を求めると、２．９pmolであった。
【０５９６】
これらの円盤でＡＦＰのサンドイッチ免疫測定を行った。ＡＦＰを含有する試料（２０μｌ）を、１２μg/mlの濃度でＴＡＧ１標識二次抗体（ベーリンガー−マンハイム）を含有する５０μｌの溶液と合わせた。表面をこの混合物で処理して、次にリン酸緩衝液で洗浄した。複合電極をトリプロピルアミンを含有する溶液（測定緩衝液、イゲン（IGEN））と接触させ、複合電極の電位を０Ｖ〜−０．８Ｖ〜２．３Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）まで、０．１V/sの走査速度で走査して、ＥＣＬを測定した。既知量のＡＦＰを含む試料について観察されたＥＣＬシグナルを、図６３に示す。
【０５９７】
６．７２．１５重量％の小繊維を含有する小繊維−ＥＶＡ複合電極を使用するＡＦＰ測定法
２７重量％の小繊維を含有する小繊維−ＥＶＡ複合体のペレットを、追加のＥＶＡと配合して、１５重量％の小繊維を含有する小繊維−ＥＶＡ複合体を製造した。この複合体を、例６．６８に記載したものと類似した手順により押し出してシートにした。複合体をアルゴン／水プラズマで処理して、例６．７１に記載したように抗ＡＦＰ抗体で被覆した。放射性標識した抗体を使用する試験では、わずか１５重量％の小繊維を含有するこれらの複合体が、２７重量％の小繊維を含有する他の複合体（２．９pmol、例６．７１を参照のこと）よりも多くの抗体（３．１３pmol）を吸着することが示された。例６．７１に記載したようにＡＦＰ測定において抗体で被覆した複合体を使用した。既知量のＡＦＰを含有する試料について観察されたＥＣＬシグナルを図６４に示す。わずか１５重量％の小繊維を含有する複合体は、２７重量％の小繊維を含有する複合体（図６３、例６．７１）よりもわずかに高いＥＣＬシグナルを与えた（図６４）。
【０５９８】
６．７３．プラズマ酸化した複合体上のオクタデシルアミンのプラズマグラフトした層へのタンパク質の吸着
小繊維−ＥＶＡ複合体（例６．６８に記載したように調製）を、クロロホルム中に１mg/mlの濃度でオクタデシルアミンを含有する溶液中に２時間浸漬した。複合体を空気中で乾燥した（乾燥工程の間複合体のシートを平らに保つために端におもりを載せた）。次に複合体を、アドバンスト・プラズマ・システムズ（Advanced Plasma Systems）シリーズＣプラズマ反応器（１時間、２０００Ｗ、３００mtorr）中で酸素プラズマで処理した。次に複合体を、５mMリン酸（ｐＨ７．５）中にアビジンを含有する溶液（１．２５mg/ml）中に浸漬して、アビジンで被覆した。過剰のアビジンは、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して除去した。１２５Ｉ標識ストレプトアビジンと、１２５Ｉおよびビオチン標識ウサギＩｇＧを使用する放射性同位体実験により、我々は３０〜４３pmolのストレプトアビジンを固定化し、ストレプトアビジンが＞２．２pmolのビオチン標識抗体を結合できたことを証明した。
【０５９９】
ＡＦＰのサンドイッチ免疫測定をこれらの円盤で行った。表面をビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を含有する１００μｌの溶液（７μg/ml、ベーリンガー−マンハイム）で３０分間振盪しながら処理して、次にリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。２０μｌの試料を、ＴＡＧ１標識二次抗体（ベーリンガー−マンハイム）を１２μg/mlの濃度で含有する１００μｌの溶液と合わせた。表面をこの混合物で６０分間振盪しながら処理し、次に測定緩衝液（イゲン）で洗浄した。複合電極をトリプロピルアミンを含有する溶液（測定緩衝液、イゲン）と接触させ、０．１V/sの走査速度で０Ｖ〜−０．８Ｖ〜２．３Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）まで複合電極の電位を走査して、ＥＣＬを行った。既知量のＡＦＰを含む試料について観察されたＥＣＬシグナルを図６５に示す。
【０６００】
６．７４．プラズマ処理複合体上にグラフトした官能基へのタンパク質の結合
小繊維−ＥＶＡ複合体（例６．６８に記載したように調製）は、アドバンスト・プラズマ・システムズ（Advanced Plasma Systems）シリーズＣプラズマ反応器（１０００Ｗ、３分、３００mtorr）中でアルゴンプラズマで処理した。複合体を反応器から取り出して、直ぐに４％（ｗ／ｖ）のアクリル酸（蒸留）またはアリルアミンを含有する無酸素水溶液に入れた。複合体をこれらの溶液中で３０℃で３時間インキュベートして、次に水で充分に洗浄して、空気中で乾燥した。例６．６９に記載したものと類似した方法によりＮＨＳエステルとしてカルボン酸基を活性化して、グラフトおよび／または重合したアクリル酸残基によりストレプトアビジンを固定化した。例６．７０に記載したのもと類似した方法により、複合体上にマレイミド基を導入した後、グラフトおよび／または重合したアリルアミン残基によりチオール標識ストレプトアビジンを固定化した。我々は、これらの複合体はビオチン標識試薬に結合でき、ＥＣＬ標識からＥＣＬを励起することができることを証明した。我々は、ビオチンとＴＡＧ１基で標識した過剰のウサギＩｇＧで材料を処理した後、複合電極由来のＥＣＬを測定した。結合ＩｇＧからのＥＣＬを、複合電極をトリプロピルアミンを含有する溶液（測定緩衝液、イゲン）と接触させ、０．１V/sの走査速度で０Ｖ〜−０．８Ｖ〜２．３Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して）まで複合電極の電位を走査して、生成した。アクリル酸とアリルアミンで処理した複合体により、それぞれ２０３nAsおよび１２３nAsの積分ＰＭＴ電流が得られた。
【０６０１】
６．７５．ＥＣＬ免疫測定のための小繊維複合体にアビジンを結合させるためのプラズマの使用
プラズマを使用して、アビジンを複合材料の表面に融合させた。融合は、最初に小繊維−ＥＶＡ複合体のブロック（例６．６８）を０．５mg/mlのアビジン溶液に３時間浸漬して行った。６０mlのＰＢＳ−１を３回取り替えて洗浄後、複合体を空気乾燥し、ストリップに切断して、ＡｒまたはＯ２プラズマのいずれかで６００ワットで５分間（３０００Ｗ分）処理した。これらの実験は、シリーズＢプラズマ反応器（エイピーエス・テクノロジーズ（APS Technologies）で行った。
【０６０２】
複合体のプラズマ処理後、５／１６”円盤を打ち抜いて、ビオチン化１２５Ｉ−ＩｇＧの結合を使用する放射性標識実験により、固定化された活性アビジンの量を測定した。アビジンがその表面に結合した複合体は、０．２５５pmol（Ａｒプラズマ処理）および１．８９９pmol（酸素プラズマ処理）のＩｇＧを結合した。
【０６０３】
ビオチン化−ＴＡＧ１−ＩｇＧ（ＢＴＩ）を使用する結合測定も行った。ＢＴＩを４１nMの濃度で使用して、結合した量をＥＣＬにより定量した。Ｏ２プラズマ融合アビジンの場合に、４μＭのｄ−ビオチンを、ＢＴＩとのインキュベーションの前に、いくつかのチップと共に１時間インキュベートした。これは、ビオチンとアビジンの間の相互作用に帰因する結合量を評価するために行った。測定したＥＣＬ：ＡｒプラズマおよびＯ２プラズマのシグナルは、それぞれ１０４２４nA秒および８１７９nA秒であった。
【０６０４】
６．７６．親和性マトリックスを小繊維複合体に結合するためのプラズマの使用
ビオチンを担持するアクリルビーズ（１２５mg）（シグマ（Sigma）＃Ｂ−３２７２、ロット＃５７Ｆ４０３４）を微細に粉砕した。この粉末を約２０mlの脱イオン水に懸濁して、ボルテクサー（vortexer）で充分に混合した。懸濁液を取り出し、０．４５ミクロンフィルター（ゲルマンサイエンシーズ（Gelman Sciences）＃４５９８）により濾過した。濾過した懸濁液を小繊維−ＥＶＡ複合体（２７重量％の小繊維、例６．６８を参照のこと）のいくつかの５／１６”直径の円盤上で乾燥した。
【０６０５】
いくつかの円盤をＯ２プラズマで１００００Ｗ分プラズマ処理した；他は０２で１２００００Ｗ分プラズマ処理した。プラズマ処理後、円盤をＰＢＳ−１中で１０分間３回洗浄し、次にＰＢＳ−１で３回濯いですべての未結合断片を除去した。
【０６０６】
洗浄後、誘導体化した複合体を、０．２mg/mlのストレプトアビジンと共に室温で２時間インキュベートし、濯いでＰＢＳ−１緩衝液中で保存した。ストレプトアビジンで被覆した複合体の円盤（直径３／１６”）を打ち抜いて、９６ウェルプレートのウェルに入れた。ビオチン化抗ＡＦＰ抗体を含有する溶液を各ウェルに加えた。円盤は、振盪しながら３０分間インキュベートし、次にＰＢＳ−１緩衝液で洗浄した。１００μｌのＴＡＧ１標識抗ＡＦＰ抗体と２０μｌの既知濃度のＡＦＰを含有する試料をウェルに加えて、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。次に円盤を測定緩衝液で３回濯いで、例６．７１に記載したようにＥＣＬを測定した。図６６は、試料中のＡＦＰの濃度の関数としてのＥＣＬシグナルのｌｏｇのプロットを示す。
【０６０７】
６．７７．乾燥試薬を使用し洗浄工程を必要としないＥＣＬベースの結合測定法
小繊維−ＥＶＡ複合体（例６．６８に記載したように調製）は酸素プラズマ中で酸化して、ストレプトアビジンで被覆した（例６．６９に記載したように）。複合電極を５／１６”直径の円盤に切断して、この円盤を、円盤の一方の表面が溶液に接触して配置されたホルダーに入れた。円盤を、撹拌しながら１時間、ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を含有する１００μｌの溶液（７．５μg/ml、ベーリンガー−マンハイム）で処理し、次にリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。次に以下の溶液：ＴＡＧ１標識抗ＡＦＰ抗体（１２μg/ml、ベーリンガー−マンハイム）、リン酸（２００mM）、トリプロピルアミン（２００mM）、ウシ胎児血清（２％）、ショ糖（２％）、クロロアセトアミド（０．１％）、およびトリトンＸ−１００（０．０２％）（ｐＨ７．６）の添加および凍結乾燥により、測定に必要な他の試薬を表面上で乾燥した。ＡＦＰ測定は、９５μｌの試料を円盤の表面上の乾燥した試薬に加えて、振盪しながら１時間インキュベートして行った。ＥＣＬは、複合電極の上の溶液に対電極と参照電極を挿入して、４．８V/sの走査速度で対電極の電位を０Ｖ〜−０．８Ｖ〜２．３Ｖまで走査して、励起させた。図６７は、既知量のＡＦＰを含有する溶液について光電子増倍管で測定したＥＣＬシグナルを示す。
７．参考文献の引用
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際に前記説明と添付図面から、当業者にとっては、本明細書に記載されるものに加えて本発明の種々の変形態様が明らかであろう。このような変形態様は、本請求の範囲に含むものと解釈される。種々の刊行物が本明細書に引用されており、これらの開示はその全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０６０８】
【図１】電極上に複数の結合ドメインが存在する本発明のカセットを例示する。  図１Ａは、複数の結合ドメイン１４が支持体１０上に存在し、複数の対応する電極１６が支持体１２上に存在しているため、支持体の接近により、電極が各結合ドメインに近接するように配置される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。
【図２】支持体２６上の複数の結合ドメイン３０が、各単一の電極３２に近接しているため、支持体２６と２８の接近により、各対電極３８が各結合ドメイン３０に近接するように配置される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。
【図３】複数の結合ドメイン４８が、支持体４４上でこれらに近接する電極と対電極の対を有する、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。支持体４６は、場合により支持体４４に近接して配置されて、このため、支持体４６が結合ドメイン４８と電極５０に近接する試料含有手段を提供してもよい。
【図４】支持体６０上の複数の結合ドメイン６４が、アナライトを含有することが疑われる試料と接触される、本発明のカセットを形成する２つの支持体を例示する。支持体６２は、目的のアナライトを検出または測定するための反応媒体を含有する領域６６を有しているため、支持体６０と支持体６２の接近により、結合ドメイン６４と領域６６が相互に接触する。
【図５Ａ】多重アレイの多重特異的な結合表面のためにパターン付けされた結合ドメインの平面図を例示する。幾何学図形の三角形、四角形および円形は、異なるアナライトに特異的な結合ドメインを表す。結合ドメインは、疎水性であっても親水性であってもよい。周囲の表面は、結合ドメインからの結合試薬またはアナライトの拡散を少なくするために、結合ドメインの反対の性質（親水性または疎水性）を有していてよい。
【図５Ｂ】別々の結合ドメインに結合試薬および／またはアナライトを送達するための微量流体ガイド（microfluidic guide）の平面図を例示する。各ドットは、微量流体ガイド（例えば、毛細管）の断面図を例示する。
【図５Ｃ】微量流体ガイドの側面図を例示しており、パターン付けされた結合ドメインの多重アレイに結合試薬および／またはアナライトを送達するための、合わせたまたは整列させた微量流体ガイドの接近を示す。各微量流体ガイドは、別々の結合ドメインに異なる結合試薬を送達してもよい。
【図６Ａ】パターン付けした多重アレイの多重特異的な結合ドメインを有する表面との、合わせた電極の多重アレイの接近を例示する。取り外し可能な電極保護バリアが、電極アレイと結合表面アレイとの間に示される。全体の組立品は、複数のＥＣＬ反応を実施するためのカセットからなる。
【図６Ｂ】合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極のアレイの接近を例示する。電極は、結合ドメインと相補的な形であっても他の形（例えば、相互にかみ合う形）であってもよい。
【図７】合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで、導電性ポリマーが電極の表面から、電極アレイと結合ドメインの間の間隙を横切って成長して、試料のＥＣＬ標識周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図８】合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで導電性粒子が両方の成分の間に散在して電位の場を拡大する。試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大することにより、ＥＣＬ反応の効率は増強される。導電性粒子は、容易な操作が可能になるよう磁気を帯びていてもよい。
【図９】合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここで電極は、電極表面と結合ドメインとの間の間隙中に延びる微細な突起を有して、これにより試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図１０】合わせたまたは整列させた、アドレスが可能な作用電極と対電極、および相補的な結合表面の、接近したアレイの側面図を例示しており、ここでこれらの表面は、平行ではないが、代わりに相補的な形で一方を他方に適合させている。
【図１１】その上に、カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層を有する支持体の側面図を例示する。金属層上に自己組立単層（self-assembled monolayers）（「ＳＡＭ」）のアレイがパターン付けられている。
【図１２】カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層をその上に有する支持体の側面図を例示する。金属層上にＳＡＭのアレイがパターン付けられており、導電性微粒子がパターン付けされたＳＡＭの間の散在が示され、これにより、試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大して、ＥＣＬ反応の効率を増大させる。
【図１３】カセットの形で単一の電極と結合表面組立品を提供する金属層をその上に有する支持体の側面図を例示する。金属層上に自己組立単層すなわちＳＡＭのアレイがパターン付けられており、試料のＥＣＬ標識の周囲の電位の場を拡大してＥＣＬ反応の効率を増大させるように、ＥＣＬ標識からの導電性ポリマーおよび／または繊維の成長が例示される。
【図１４】コンピュータにより制御される電極対のアレイを有する支持体の線図である。
【図１５】電極対のアレイを有する支持体の線図である。
【図１６】電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するためのコンピュータシステムの線図である。
【図１７】電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するための、複数の電位供給源とマルチプレクサーを有するコンピュータシステムの線図である。
【図１８】電極対のアレイを有する支持体、および各電極対のエネルギー補給を制御するための、複数の切り替え電位供給源を有するコンピュータシステムの線図である。
【図１９】（ａ）〜（ｅ）は、いくつかの代替の電極−対電極の対の組合せの平面図である。
【図２０】サンドイッチ測定法が完了した支持体を例示する。
【図２１】支持体上の２つの逆のＰＭＡＭＳ表面を例示する。
【図２２Ａ】微量流体ガイド（２２０１）と小繊維マット（２２００）のアレイを例示する。
【図２２Ｂ】小繊維マット（２３０３）上の結合ドメイン（２２０２）を例示する。
【図２３Ａ】真空濾過により小繊維マットを形成するための装置を例示する。
【図２３Ｂ】濾過膜（２３０３）上の小繊維マット（２３０４）を例示する。
【図２４】小繊維マットを製造するためのローラーの使用を例示する。
【図２５】上層が測定のために使用される結合ドメインを有する、多層小繊維マットの略図を示す。
【図２６】非特異的な結合を増強する残基で誘導体化した小繊維の略図を示しており、生物学的および非生物学的ないくつかの種が表面に結合する。
【図２７】非特異的な結合を増強する残基で誘導体化した小繊維の略図を示しており、誘導体化した小繊維に結合したいくつかの種を示し、いくつかの種はさらにリガンドに結合している。
【図２８】小繊維に共有結合したいくつかの種を例示しており、いくつかの種は、さらに追加の物質に結合する。
【図２９】マット上またはマット内の光の供給源の位置に依存して、光を通過させるか、および／または光を吸収するか、および／または光を散乱することができる光学フィルターとしての、多層小繊維マットの使用を例示する。
【図３０Ａ】炭素小繊維マット電極上の電気化学的測定からの周期的ボルタンモグラムを例示する。
【図３０Ｂ】金箔電極上の電気化学的測定からの周期的ボルタンモグラムを例示する。
【図３１】マットの厚さの関数としての小繊維マットの電気化学的性質と、走査速度を比較する。
【図３２】小繊維上の非特異的な結合は、タンパク質溶液中の小繊維の濃度が上昇するに従い、一般に上昇することを例示するプロットを示す。
【図３３】界面活性剤の使用により、ＥＣＬ−ＴＡＧ１標識タンパク質と炭素小繊維との間の非特異的な結合を低減させることができることを証明する。
【図３４】電気化学的性質および小繊維マット電極上のＥＣＬを測定するのに使用される、実験的セルの平面略図を示す。
【図３５】電極として小繊維マットおよび１０００pMのＴＡＧ１（実線）溶液を使用して得られたＥＣＬシグナル、および測定緩衝液からのシグナル（ＴＡＧ１なし）（点線）を示す。
【図３６】支持される電極の２つのアレイが、パターン付けされた誘電層により分離されている、２つの表面のＰＭＡＭＳ装置の略図を示す。
【図３７】一方の支持体上に複数の結合ドメイン（３７０２）を、そしてもう一方の支持体上に電極と対電極を有する装置を例示する。
【図３８】結合ドメインが、対電極上に支持された別個の物体の表面に提示されている、カセットを示す。
【図３９】作用電極および対電極と接触するゲルを示す。
【図４０】作用電極および対電極と接触するＥＣＬ標識ゲルからの、ＥＣＬ強度と周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４１】作用電極および対電極と接触する非ＥＣＬ標識ゲルからの、ＥＣＬ強度と周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４２】ＥＣＬに使用される２つの表面のカセットの略図を示す。
【図４３】小繊維マットが、マットに吸着した抗体−ＴＡＧ１のＥＣＬのための電極として使用することができることを証明する。
【図４４Ａ】電極に固定化されたＴＡＧ１標識タンパク質のＥＣＬ強度を示す。
【図４４Ｂ】コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４５Ａ】固定化ＥＣＬ  ＴＡＧ１標識タンパク質からのＥＣＬシグナルの準可逆的反復発生を示す。
【図４５Ｂ】コーティングの部分的保存を示す、コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４６Ａ】固定化ＥＣＬ  ＴＡＧ１標識タンパク質からのＥＣＬシグナルの不可逆的発生を示す。
【図４６Ｂ】コーティングの実質的な消失を示す、コーティングされた電極の周期的ボルタンモグラムを示す。
【図４７】多重アレイのＥＣＬ装置と、ＥＣＬシグナルの発生および分析のためのコントローラー手段を有するマイクロプロセッサーを示す。
【図４８】ストレプトアビジン被覆ダイナルビーズ（Dynal beads）上のサンドイッチ複合体の形成、小繊維マット電極上のビーズの捕捉、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図４９】ストレプトアビジン被覆シリカ粒子上のサンドイッチ複合体の形成、小繊維マット電極上の粒子の捕捉、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図５０】表面上への結合試薬の固定化のためのＳＡＭの使用を説明する略図である。
【図５１】金電極上のアルカンチオール酸塩のストレプトアビジン被覆ＳＡＭ上のサンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図５２】「２表面」測定法中の作用電極へのＴＡＧ残基の提示を例示する。
【図５３】ストレプトアビジン被覆、酸化、ＥＶＡ−小繊維複合体上のサンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図５４】ストレプトアビジン被覆、酸化、ＥＶＡ−小繊維複合体上の核酸サンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、核酸ハイブリダイゼーション測定法の用量応答を示す。
【図５５】ＴＡＧ１標識オリゴヌクレオチドへのビオチン標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ストレプトアビジン被覆小繊維複合体上の核酸サンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＤＮＡ測定法の用量応答を示す。
【図５６】ナイロン膜上のストレプトアビジン被覆ＵＴＦＭ上のサンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図５７】金被覆ナイロン膜上に形成されたストレプトアビジン被覆ＵＴＦＭ上のサンドイッチ複合体の形成、およびＥＣＬによる結合複合体の検出を含む、ＡＦＰ免疫測定法の用量応答を示す。
【図５８】１つまたはそれ以上の成分についての電気化学電位がシフトしているＥＣＬシグナルを例示する。
【図５９】試料の１つまたはそれ以上の成分についてのＥＣＬ電位の強度が、試料の他の成分のＥＣＬシグナルに比較して低下しているＥＣＬシグナルを例示する。
【図６０】ＥＣＬ測定緩衝液である試料のＥＣＬトレースを示す。
【図６１】ＡＦＰを含有する試料のＥＣＬトレースを示す。
【図６２】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、結合試薬の支持体としてのおよび作用電極としての、プラズマ処理小繊維−ポリマー複合体を使用して行なった。
【図６３】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、結合試薬の支持体としてのおよび作用電極としての、プラズマ処理小繊維−ポリマー複合体を使用して行なった。
【図６４】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、結合試薬の支持体としてのおよび作用電極としての、プラズマ処理小繊維−ポリマー複合体（１５重量％の小繊維）を使用して行なった。
【図６５】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、結合試薬の支持体としてのおよび作用電極としての、プラズマ処理小繊維−ポリマー複合体を使用して行なった。
【図６６】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、結合試薬の支持体としてのおよび作用電極としての、プラズマ処理小繊維−ポリマー複合体を使用して行なった。
【図６７】ＡＦＰ測定法のＡＦＰの濃度（IU／ml）の関数としてのＥＣＬシグナル（Ｓ−Ｂ、ＥＣＬシグナル（Ｓ）とバックグランドシグナル（Ｂ）との差）のプロットを示す。ＥＣＬ介在ＡＦＰ測定は、乾燥試薬を使用しかつ洗浄工程無しで行なった。
【図６８】本発明の好適な実施態様に従う測定セルの略図を示す。
【図６９】本発明の好適な実施態様に従う測定系の略図を示す。
【図１】
0004486684.tif 000003
【図２】
0004486684.tif 000004
【図３】
0004486684.tif 000005
【図４】
0004486684.tif 000006
【図５Ａ】
0004486684.tif 000007
【図５Ｂ】
0004486684.tif 000008
【図５Ｃ】
0004486684.tif 000009
【図６Ａ】
0004486684.tif 000010
【図６Ｂ】
0004486684.tif 000011
【図７】
0004486684.tif 000012
【図８】
0004486684.tif 000013
【図９】
0004486684.tif 000014
【図１０】
0004486684.tif 000015
【図１１】
0004486684.tif 000016
【図１２】
0004486684.tif 000017
【図１３】
0004486684.tif 000018
【図１４】
0004486684.tif 000019
【図１５】
0004486684.tif 000020
【図１６】
0004486684.tif 000021
【図１７】
0004486684.tif 000022
【図１８】
0004486684.tif 000023
【図１９】
0004486684.tif 000024
【図２０】
0004486684.tif 000025
【図２１】
0004486684.tif 000026
【図２２Ａ】
0004486684.tif 000027
【図２２Ｂ】
0004486684.tif 000028
【図２３Ａ】
0004486684.tif 000029
【図２３Ｂ】
0004486684.tif 000030
【図２４】
0004486684.tif 000031
【図２５】
0004486684.tif 000032
【図２６】
0004486684.tif 000033
【図２７】
0004486684.tif 000034
【図２８】
0004486684.tif 000035
【図２９】
0004486684.tif 000036
【図３０Ａ】
0004486684.tif 000037
【図３０Ｂ】
0004486684.tif 000038
【図３１】
0004486684.tif 000039
【図３２】
0004486684.tif 000040
【図３３】
0004486684.tif 000041
【図３４】
0004486684.tif 000042
【図３５】
0004486684.tif 000043
【図３６】
0004486684.tif 000044
【図３７】
0004486684.tif 000045
【図３８】
0004486684.tif 000046
【図３９】
0004486684.tif 000047
【図４０】
0004486684.tif 000048
【図４１】
0004486684.tif 000049
【図４２】
0004486684.tif 000050
【図４３】
0004486684.tif 000051
【図４４Ａ】
0004486684.tif 000052
【図４４Ｂ】
0004486684.tif 000053
【図４５Ａ】
0004486684.tif 000054
【図４５Ｂ】
0004486684.tif 000055
【図４６Ａ】
0004486684.tif 000056
【図４６Ｂ】
0004486684.tif 000057
【図４７】
0004486684.tif 000058
【図４８】
0004486684.tif 000059
【図４９】
0004486684.tif 000060
【図５０】
0004486684.tif 000061
【図５１】
0004486684.tif 000062
【図５２】
0004486684.tif 000063
【図５３】
0004486684.tif 000064
【図５４】
0004486684.tif 000065
【図５５】
0004486684.tif 000066
【図５６】
0004486684.tif 000067
【図５７】
0004486684.tif 000068
【図５８】
0004486684.tif 000069
【図５９】
0004486684.tif 000070
【図６０】
0004486684.tif 000071
【図６１】
0004486684.tif 000072
【図６２】
0004486684.tif 000073
【図６３】
0004486684.tif 000074
【図６４】
0004486684.tif 000075
【図６５】
0004486684.tif 000076
【図６６】
0004486684.tif 000077
【図６７】
0004486684.tif 000078
【図６８】
0004486684.tif 000079
【図６９】
0004486684.tif 000080