(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第１位〜第２６４位に示す２６４個のアミノ酸からなる、ことを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列番号：１に記載の塩基配列の第４３位〜第８３４位に示す７９２個のヌクレオチドからなる、ことを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを発現可能に含む細胞。
【請求項５】
大腸菌、動物細胞、または、昆虫細胞である請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記動物細胞が、卵母細胞である請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第１位〜第２６４位に示す２６４個のアミノ酸からなるタンパク質の製造方法であって、請求項４に記載の細胞を培養し、および、当該細胞が産生した当該タンパク質を回収する、工程を含む、ことを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第１位〜第２６４位に示す２６４個のアミノ酸からなるタンパク質に対する抗体。
【請求項９】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または、ペプチド抗体である請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第１位〜第２６４位に示す２６４個のアミノ酸からなるタンパク質の検出方法であって、請求項８に記載の抗体を試料に作用させ、および、当該試料における当該抗体と当該タンパク質との間の免疫学的結合を検出する、工程を含む、ことを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または、ペプチド抗体である請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は単離されたヒトの新規アクアポリン（本明細書において「ｈｉＡＱＰ」と称する)遺伝子およびタンパク質、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種（これらを「誘導体」と総称する）、それらの断片（以下、それら全てを「ｈｉＡＱＰｓ」と称する）ならびにそれらの検出に関する。本発明はまた、ｈｉＡＱＰｓを含む医薬用、診断用、研究用組成物、それらの製造方法および使用に関する。更に本発明は、ｈｉＡＱＰｓタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニスト、ｈｉＡＱＰｓを用いた薬物のスクリーニング方法に関する。更に本発明は、ｈｉＡＱＰｓ遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞、ｈｉＡＱＰｓタンパク質に対する抗体および該抗体を産生する細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
1992年にPrestonらは、赤血球膜に多量に存在するCHIP28（Channel like membrane intrinsic protein of 28kDa）のｃＤＮＡをクローニングし、該タンパク質をアフリカツメガエルの卵に発現させ、CHIP28が特異的に水分子を透過させる水チャンネルであることを証明した（Preston, G. M. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 11110, 1991、Preston, G. M. et al. ; Science, 256, 385, 1992）。その後、類似タンパク質が次々と同定され、遺伝子ファミリーが存在していることが明らかとなった。これらの水チャンネルは構造的、機能的に類似しているため、アクアポリン（以下、AQPと称する）ファミリーと呼ばれている（Agre, P. et al. ; Am. J. Physiol., 265, 1993）。また、AQPは水のみならず、各種低分子物質（例えば、グリセロール、尿素）をも通過させることが知られている（Silberstein, C. et al. ; Braz. J. Med. Biol. Res., 32(10), 1303-1313, 1999）。AQPはMIP（Major intrinsic protein）ファミリーと呼ばれる膜タンパク質の一群に属している。MIP/AQPファミリーのタンパク質は細胞膜を６回貫通する膜タンパク質である。さらに、アスパラギン（N）、プロリン（P）、アラニン（A）の３つのアミノ酸が連なったNPAボックス配列が２回保存されている。
【０００３】
哺乳類においては、現在までに少なくとも１０種のアクアポリンがクローニングされている。AQPは全身の至る所にｍＲＮＡの発現が認められている（Kenichi, I. et al. ; Clin. Exp. Nephrol., 1(4), 247-257, 1997）。例えば、AQP0（Chandy, G. et al. ; J. Memb. Biol., 159, 29-39, 1997）は眼のレンズファイバー細胞、AQP1（Preston, G. M. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11110-11114, 1991）は赤血球、毛細血管内皮細胞、脳脈絡膜上皮細胞、角膜内皮細胞、紅彩、毛様体、レンズ上皮細胞、気管（支）上皮細胞、肺胞上皮細胞、近位尿細管上皮細胞、ヘンレ下降脚上皮細胞、胆嚢上皮細胞、汗腺上皮細胞等、AQP2（Fushimi, K. et al. ; Nature, 361, 549-552, 1993）は集合管上皮細胞、AQP3（Ishibashi, K. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6269-6273, 1994）は集合菅上皮細胞、結膜上皮細胞、大腸吸収上皮細胞、気管上皮細胞、胃上皮細胞、小腸吸収上皮細胞、髄膜等、AQP4（Hasagawa, H. et al. ; J. Biol. Chem., 269, 5497-5500, 1997）は集合菅上皮細胞、グリア細胞、脳室上皮細胞、胃壁側細胞、気管支上皮細胞、網膜、紅彩、毛様体上皮細胞等、AQP5（J. Biol. Chem., 270, 1908-1912, 1995）は唾液腺上皮細胞、涙液腺上皮細胞、角膜上皮細胞、肺胞上皮細胞等、AQP6（Ma, T. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 197, 654-659, 1993）は腎、AQP7（Ishibashi, K. et al. ; J. Biol. Chem., 272, 20782-20786, 1997）は近位尿細管上皮細胞、精子、心臓、脂肪細胞、骨格筋、AQP8（Ishibashi, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 237, 714-718, 1997、Koyama, K. et al. ; J. Biol. Chem., 272, 30329-30333, 1997）は精子、肝細胞、膵臓、大腸吸収上皮細胞、唾液腺上皮細胞等、AQP9（Ishibashi, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 244, 268-274, 1998）は白血球、肝臓、肺、脾臓等に発現している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
消化管には１日に約２Lの水分が入る一方、１日に約７〜８Lの水分が消化液として分泌されている。しかし、大腸を経て糞便と共に体外へ排泄される水分は約０．１Lにすぎず、消化管で水分の大部分（９９％）が吸収されている。ヒトは高張性の食事をしても低調性の食事をしても、例えば十二指腸・上部空腸等内の浸透圧に応じて水分が腸管壁を出入りし、腸管内部の浸透圧を等張に保っている。消化管は水分・栄養分等を吸収する器官であると同時に、消化液・酸の中和のための液体等を分泌する器官でもあるにも拘わらず、消化管における水チャンネルの関与については殆ど研究されていなかった。ゆえに、本発明者らは消化管における新規アクアポリンのクローニングを試み、ｈｉＡＱＰのクローニングに成功した。
【０００５】
従って本発明は、ｈｉＡＱＰ遺伝子およびタンパク質、腸管における水分または低分子物質の調節機構の解明、炎症性腸疾患などの下痢をきたす各種疾患の発症機構の解明、さらにｈｉＡＱＰに基づく各種疾患の診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できるものを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号２のアミノ酸番号１〜２６４に示すアミノ酸２６４個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸番号１〜２６４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片、
（２）配列番号１の塩基番号４３〜８３４に示す塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜２６４に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸番号１〜２６４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（３）（２）に記載の塩基配列を含むことを特徴とするベクター、
（４）（２）に記載の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞、
（５）（４）に記載の形質転換細胞を培養し、産生されたタンパク質を採取することを特徴とする（１）記載のタンパク質の製造法、
（６）細胞が大腸菌、動物細胞または昆虫細胞である、（５）に記載の製造法、
（７）ｉＡＱＰ遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト動物、
（８）ｉＡＱＰ遺伝子の機能を欠損させたノックアウトマウス、
（９）（１）に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体、
（１０）ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはペプチド抗体である（９）記載の抗体、
（１１）（９）または（１０）に記載の抗体と（１）に記載のタンパク質またはその断片との免疫学的な結合に基づいて、該タンパク質またはその断片を測定する方法、
（１２）（１）に記載のタンパク質の機能を刺激するアゴニスト、
（１３）（１）に記載のタンパク質の機能を阻害するアンタゴニスト、
（１４）（１）に記載のタンパク質、（２）に記載の塩基配列、または（４）に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする薬物のスクリーニング方法、
（１５）（１４）に記載のスクリーニング方法によって得られた薬物、
を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ヒト新規ＡＱＰのクローニングに成功した。配列番号２に示す新規ＡＱＰ（以下、ｈｉＡＱＰと称する）アミノ酸配列中には、ＮＰＡボックス配列が２カ所存在していた（アミノ酸番号８２〜８４、２１４〜２１６）。また、ｈｉＡＱＰは他のアクアポリンファミリーと同様の３次構造を形成し、Ｎ末端およびＣ末端共に細胞内に存在していると予想される。また、前記特徴を有するｈｉＡＱＰは４量体を形成していると考えられる。配列番号２に示すｈｉＡＱＰ（アミノ酸番号１〜２６４）のアミノ酸配列は、アミノ酸２６４個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列は塩基数７９２個から成る。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に示した。
【０００８】
本明細書において使用するｈｉＡＱＰ遺伝子とは、特記しない限り、配列番号１に示す塩基配列、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種、並びにそれらの断片を含むものとする。また、本明細書において使用するｈｉＡＱＰタンパク質とは、特記しない限り、配列番号２に示すアミノ酸配列（ポリペプチド）、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種、それらの断片を含むものとする。これらは天然または人工的に作製されたものを問わず、本発明には前記記載の全てが包含される。
【０００９】
また、本発明には、実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列、および実質的に配列番号２に示すアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。さらに、これらのアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明に含まれる。配列番号２に示すアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列とは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の性質を有する範囲内で、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入等の改変を有するアミノ酸配列をいう。これら改変体は天然または人工的作製物を問わない。ここで同等の性質とは、水分子を透過性させる機能に代表される水チャンネルとしての活性、機能等を有すること、そして類似の３次構造のコンフォメーションをとることなどを称する。
【００１０】
さらに、本発明には、配列番号１に記載の塩基配列またはその断片を含む塩基配列、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列に相補的な塩基配列（以下、特定配列と称する）とストリンジェントな条件下ハイブリダイズすることができる塩基配列も含まれる。さらに、本発明の塩基配列には、ＤＮＡのみならずＲＮＡも含まれる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、例えば、５×ＳＳＣ、５％デンハート溶液（０．１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ４００、０．１％ ＰＶＰ）、０．５％ ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、３７℃にて一夜インキュベートし、ついで室温にて０．１％ ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで洗浄する条件である。ＳＳＣの代わりに適宜ＳＳＰＥを使用してもよい。この様にして得られた塩基配列は、少なくとも特定配列と５０％以上のホモロジーを有すると考えられる。特定配列とストリンジェントな条件下ハイブリダイズすることができる塩基配列によってコードされるタンパク質は、ｈｉＡＱＰタンパク質と同等の性質を持つものが多いと考えられ、ｈｉＡＱＰタンパク質と同等の性質を有する限り、該タンパク質も本発明に含まれる。
上記方法によって、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット等のホモログ（ｉＡＱＰ）を取得することができ、これらタンパク質も本発明に含まれる。
【００１１】
本明細書中で使用する相同体とは、相同性（ホモロジー）が高い塩基配列またはアミノ酸配列であり、ホモロジーが少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上のものをいう。配列中に欠失や挿入が存在する場合には、ギャップ結合を許した相同性検索を行うと良い。例えば、マルチプル・アライメント（商品名：SODHO、富士通）の手法を用いて検索することができる。また、相同性検索のアルゴリズムには、最も厳密なSmith-Watermanアルゴリズムを用いることができる。その他、FASTAやBLAST等のデータベースをインターネットを通じて利用することができる。
【００１２】
本明細書中で使用する変異体とは、例えば、対立遺伝子（アレル）、Single Nucleotide Polymorphisms（ＳＮＰs）等を挙げることができる。また、塩基配列の変異はコドンの縮重の範囲内で変化したものも本発明の塩基配列に含まれる。
塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドから成るプライマーを利用した部位特異的変異導入法（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 5662, 1984）等に従って行うことができ、こうして得られた人工的遺伝子変異体も本発明の塩基配列に含まれる。また、コドンの縮重の範囲を超えた場合であっても、変異したコドンによって翻訳された変異アミノ酸が、正常アミノ酸と類似の性質であることが好ましい。例えば、脂肪族アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン間での変異、中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン、アスパラギンおよびグルタミン間での変異、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸間での変異、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジンおよびヒスチジン間での変異、水酸基を有するセリンおよびトレオニン間での変異、芳香環を有するフェニルアラニンおよびチロシン間での変異等、アミノ酸の性質・機能・特性等が類似のものであるのが好ましい。これら人工的または天然に変異したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。人工的には、ＰＣＲ法を用いて遺伝子に部位特異的変異を起こすことができ、その他公知の方法を用いて任意の場所に変異を起こさせることができる。
【００１３】
本明細書中で使用する修飾体とは、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ミリストイル化、グリコシル化、水酸化、リン酸化、硫酸化、ホルミル化、メチル化、ポリエチレングリコール化、脂質結合、ヌクレオチド結合、金属結合（カルシウム付加体等）、他のタンパク質（アルブミン等）との融合体、二量体等の改変を通常の技術を用いて施すことができる。例えば、グリコシル化は宿主を大腸菌として発現させた場合には起こらないため、グリコシル化を企図する場合には、真核細胞に発現すると良い。昆虫細胞も哺乳細胞と同様に翻訳後にグリコシル化を行うため好適な宿主細胞として使用することができる。
【００１４】
本明細書中で使用する多型性変種とは、例えば、染色体ＤＮＡの構造や形態の差異により生じる多型性、ある遺伝子が対立遺伝子に変化したために生じる多型性等をいう。一般に真核生物の遺伝子は多形現象を示すことが多く、この現象によって１個あるいはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあり、また、その場合であってもタンパク質の活性が保持される場合もある。ゆえに、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な水チャンネルとしての機能を有する限り全て本発明に含まれる。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、本発明のタンパク質の特徴を有する限り全て本発明に含有される。改変とは、置換、欠失、付加および／または挿入を含むと解する。
【００１５】
本明細書中で使用する断片とは、例えば、上述したｈｉＡＱＰが有するアミノ酸配列中の任意の断片を意味し、例えば、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、NPAボックスを含有する断片等を挙げることができ、またこれら断片を融合させた断片を挙げることができる。
【００１６】
ｈｉＡＱＰ遺伝子取得方法
本発明のｈｉＡＱＰ遺伝子はいかなる方法で得られるものであっても良い。例えば、本発明のｈｉＡＱＰをコードする塩基配列は、該タンパク質を発現している細胞からｍＲＮＡを調製して、常法により二本鎖ＤＮＡに変換して得ることができる。ｍＲＮＡの調製にはグアニジンイソチオシアネート・塩化カルシウム法（Chirwin, et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979）等を用いることができる。全ＲＮＡからのポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製はオリゴ（ｄＴ）を結合した担体、例えばセファロースあるいはラテックス粒子等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。上記のごとくして得られたＲＮＡを鋳型にして、３’末端に存在するポリ（Ａ）鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）またはランダムプライマーあるいはｈｉＡＱＰのアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素で処理し（Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982、Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983、Gene, 25, 263, 1983）、この様にして得られたｃＤＮＡ鎖を、例えばE.coli RNaseH、E.coli DNA polymerase 1、E.coli DNA ligaseで処理し、DNA鎖に変換することにより、二本鎖cDNAを得ることができる。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターに組み込み、大腸菌等を形質転換して、あるいはインビトロパッケージングを施した後、大腸菌等にトランスフェクトすることによりｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００１７】
ここで用いることができるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されなく、ファージベクターについても宿主内で増殖できるものであれば特に制限されない。クローニング用ベクターとして、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が挙げられる。また、免疫学的スクリーニングに供する場合には、宿主内でｈｉＡＱＰ遺伝子を発現させることができるプロモーターを有するベクターであることが好ましい。
【００１８】
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Maniatisらの方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）等を参考にすることができる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunhらの方法（DNA cloning, a practical approach, 1, 49, 1985）等を参考にすることができる。
【００１９】
上記発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、例えば、リポポリアミン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ハナハン法、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、マイクロインジェクションおよびエレクトロポーレーション等の方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition）がある。インビトロパッケージングは、市販のキット（Stratagene社製、Amersham社製）を用いることによって簡便に行うことができる。
【００２０】
上記方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、ｈｉＡＱＰタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング方法を組み合わせて行うことができる。例えば、32Ｐで標識したプローブを作製し、コロニーハイブリダイゼーション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975）、プラークハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition、Cold Spring Harbor Laboratory, 2, 108, 1989）により目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングすることができる。また、ＰＣＲ法によりクローンを選択することもできる。さらに、ｃＤＮＡを発現しうるベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した場合には、ｈｉＡＱＰを認識する抗体を用いることにより目的のクローンを選択することができる。
【００２１】
また、ｈｉＡＱＰ遺伝子を発現する細胞よりｈｉＡＱＰ遺伝子を単離する際には、例えば、該発現細胞をＳＤＳまたはプロテナーゼKを用いて溶解し、フェノール処理を行う。不用のＲＮＡは、リボヌクレアーゼにより消化して、得られるＤＮＡを制限酵素により消化し、こうして生じるＤＮＡ断片をファージまたはコスミドで増幅してライブラリーを作製する。その後、目的のクローンを選択し、ｈｉＡＱＰ遺伝子を取得することができる。
【００２２】
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977）またはサンガー法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977）によって決定することができる。ｈｉＡＱＰ遺伝子は、上記得られたクローンから制限酵素等によって切り出すことにより得ることができる。
【００２３】
ｈｉＡＱＰ塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、ｈｉＡＱＰ発現細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲ法によりクローニングすることも可能である。また、ＰＣＲによらず、ｈｉＡＱＰ塩基配列をもとにプローブを作製・合成し、直接ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、目的とするｃＤＮＡを得ることもできる。本発明の遺伝子を、これらの方法により得られた遺伝子の中から、その遺伝子の塩基配列を確認することにより選択することができる。本発明の遺伝子は、例えばホスホイミダイト法（Mattencci, M. D. et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3185, 1981）等の化学合成を用いる常法に従って製造することもできる。
【００２４】
発現ベクターの作製方法
本発明はまた、ｈｉＡＱＰｓ塩基配列を含むことを特徴とするベクターも提供する。ベクターは例えば、ｈｉＡＱＰｓタンパク質を発現することができるものであれば特に制限されないが、プラスミドベクター、ＲＮＡベクター、ＤＮＡベクター、ウィルスベクター、ファージベクター等を用いることができる。具体的には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ、ｐＹＥＳ２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳｅｃＴａｇ２、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｐＥＴ、ｐＢＡＣ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＢＳ、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴもしくはＰｈａｒｍａｃｉａ社製のｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢＰＶ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ等が挙げられる。
【００２５】
発現ベクターにライゲーションしたｈｉＡＱＰｓのｃＤＮＡ配列は、プロモーターに機能的に連結させる。プロモーターは例えば、ファージλＰＬプロモーター、E.coli ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、Ｔ７およびＴ３プロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーターが挙げられる。特に、真核細胞に使用するプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、ＲＳＶプロモーター、メタロチオネインプロモーターがある。また、発現ベクターは、形質転換した宿主を選択可能にすべきマーカーおよびエンハンサーを含有しても良い。マーカーには、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等がある。エンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期エンハンサープロモーター、アデノウィルスエンハンサー等がある。
【００２６】
形質転換細胞の作製方法
さらに、本発明は上記したようなベクターによりこれらが保持する本発明の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞を提供する。本明細書における形質転換細胞に用いる宿主細胞としては、好ましくは動物細胞および昆虫細胞であるが、本発明の発現ベクター中のｈｉＡＱＰｓタンパク質を発現することが可能な全ての細胞（微生物を含む）が挙げられる。
【００２７】
本明細書における動物細胞もしくは昆虫細胞としては、それぞれヒト由来の細胞、アフリカツメガエルの卵母細胞、ハエもしくはカイコ由来の細胞が挙げられる。例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、マウス繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ（登録商標)細胞等がある。本明細書における微生物とは、大腸菌もしくは酵母等が含まれる。これら宿主への導入は上記した方法を用いることができる。特に基礎的研究に使用する細胞としては、AQPファミリーの遺伝子が発現していないことが知られている、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いるのが好ましい。
【００２８】
本発明のｈｉＡＱＰ発現細胞は、消化管の水分調節に関わるｈｉＡＱＰ機能の解析に用いることができる。また、本発明の細胞は腸管における水分または低分子物質の調節機能低下に基づく各種疾患の治療・予防剤等の開発過程において有用な薬物のスクリーニングに用いることができる。また、糖鎖のあるｈｉＡＱＰタンパク質の製造に用いることができる。
【００２９】
タンパク質取得方法
本発明は、上記したような本発明の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生されたｈｉＡＱＰを採取する、ｈｉＡＱＰの製造法にも関する。細胞の培養、タンパク質の分離、精製も、自体公知の方法によって行うことができる。
【００３０】
本発明のタンパク質は、それ自体、単離・精製・認識しやすいように組換え融合タンパク質として発現させることができる。組換え融合タンパク質とは目的タンパク質をコードする塩基配列により発現されたタンパク質のＮ末端側または／およびＣ末端側に適当なペプチド鎖を付加して発現させたタンパク質が包含される。発現したタンパク質の精製を容易にする目的で、細胞外分泌シグナルを有する融合タンパク質として発現させても良い。タンパク質の発現は、例えば、組換え発現後のアフリカツメガエルの卵母細胞の膜成分をSDS-PAGEを用いて分離した後、ｈｉＡＱＰのC末端側ペプチドを免疫原として得られるウサギ抗血清を用いたウェスタンブロット法により確認することができる。また、卵母細胞を固定し、ｈｉＡＱＰに対する抗体に蛍光標識を付した免疫蛍光法によっても確認することができる。また、タンパク質は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等のタンパク質産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法、免疫沈降法等の公知の精製方法を用いて得ることができる。
【００３１】
遺伝子利用方法
配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、ｈｉＡＱＰ遺伝子を検出するためのプローブを設定することができる。あるいは、これらの塩基配列を含むＤＮＡやＲＮＡを増幅するためのプライマーを設定することができる。与えられた配列をもとにプローブやプライマーを設定することは当業者が日常的に行っている。設定された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成によって得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、様々な形式のハイブリダイゼーションアッセイに利用することができる。あるいはＰＣＲの様な塩基の合成反応に利用することができる。プライマーに利用するオリゴヌクレオチドは少なくとも１０塩基、好適には１５〜５０塩基の長さとするのが望ましく、プローブに利用するオリゴヌクレオチドは１００塩基から全長の長さであることが望ましい。また、ｈｉＡＱＰタンパク質をコードする遺伝子変異の検出およびＳＮＰの検出等にも用いることができことから、ｈｉＡＱＰ遺伝子変異によって生ずる疾患の診断に用いることができる。例えば、炎症性腸疾患などの下痢をきたす各種疾患等の診断に利用できるものと予想される。また、ｈｉＡＱＰ遺伝子を生体内に導入し発現させることによる遺伝子治療にも有用である。
【００３２】
さらに、本発明が提供するｈｉＡＱＰのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在するｈｉＡＱＰ遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域を取得することも可能である。具体的には特開平６−１８１７６７号、J. Immunol., 155, 2477, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 92, 3561, 1995）等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可能である。本明細書中で言うプロモーター領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御するＤＮＡ領域を、エンハンサー領域とはイントロン、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域に存在する遺伝子の発現を増強するＤＮＡ領域を言う。
【００３３】
タンパク質利用方法
本発明のｈｉＡＱＰタンパク質は、腸管における水分または低分子物質の調節機構の解明、炎症性腸疾患などの下痢をきたす各種疾患等の発症機構の解明、さらにｈｉＡＱＰに基づく疾患の診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できる可能性がある。また、ｈｉＡＱＰｓに対する抗体を作製する際の抗原として用いることができる。さらに、以下に詳説するアゴニストまたはアンタゴニスト等、例えば腸管での水チャンネル機能に影響を及ぼすという点で有用であると考えられる薬物のスクリーニング方法にも利用できる。
【００３４】
アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、また、本発明のｈｉＡＱＰの機能を刺激するアゴニストにも関する。本発明は、また、本発明のｈｉＡＱＰの機能を阻害するアンタゴニストにも関する。特開平１１−２７９１９４号には、アクアポリン分子自身のアミノ酸配列の一部を含むペプチドが、アクアポリン開口作用を有していることを示しており、本発明のアゴニストまたはアンタゴニストにはｈｉＡＱＰ自身のアミノ酸配列の一部を含むペプチドであってもよい。ペプチドは固相法、液相法、遺伝子工学的手法、酵素処理等の公知の技術を用いて合成でき、HPLC等を用いて精製することができる。
【００３５】
例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞にＡＱＰのｍＲＮＡを注入すると、水の透過性を上昇させることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6269-6273, 1994、Science, 256, 385-387, 1992）。そこで、ｈｉＡＱＰの全長をコードするｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、ｈｉＡＱＰタンパク質を発現させる。その後、低張な培養液中に卵母細胞を移し、ｈｉＡＱＰを注入していない対照群の卵母細胞体積と比較するすることにより水の透過性を求めることができる。
【００３６】
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、例えば、上記ｈｉＡＱＰタンパク質発現細胞に候補阻害剤とｈｉＡＱＰに対する抗体を作用させる競合的実験系を用いることができ、ｈｉＡＱＰに対する抗体の結合割合から候補阻害剤をスクリーニングすることができる。その他、自体公知の方法によりアゴニストまたはアンタゴニストの同定、単離を行うことができる。また、アンタゴニストにはｈｉＡＱＰ遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸も含まれる。
【００３７】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、ｉＡＱＰ遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト動物に関する。ここで、ｉＡＱＰ遺伝子とは、ｉＡＱＰをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡあるいは合成ＤＮＡを含む。また、遺伝子の発現には転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は、ｉＡＱＰの機能あるいは発現調節の研究、ｉＡＱＰが関与すると予想される疾患のメカニズム解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
【００３８】
本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位（エンハンサー、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、付加および／または挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降するように人工的に修飾することができる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができ、トランスジェニック動物を得ることができる。
【００３９】
トランスジェニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンスＲＮＡを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス・トランスジェニック動物や、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトした動物、点突然変異ＤＮＡを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。
【００４０】
本明細書中でいうトランスジェニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む広義の意味に解する。本発明におけるトランスジェニック動物は、ｉＡＱＰの機能あるいは発現調節の研究、ヒトにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
【００４１】
トランスジェニック動物の作製方法は、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などがある。その他、レトロウィルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法等が開発されている。
【００４２】
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M. Lavitranoet ら、Cell, 57, 717, 1989）。あるいはバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系やサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系等によるｉｎ ｖｉｖｏにおける部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。また、レトロウィルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。
【００４３】
マイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作製方法は、例えば、以下に示すようにして行われる。
【００４４】
まず、発現制御に関わるプロモーター、特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリＡシグナルから基本的に構成されるトランスジーンが必要である。プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジェニック動物が系統間で異なるため、各系統間で発現様式・発現量を確認する。非翻訳領域やスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリAシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス（５〜６週齢）、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。
【００４５】
効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよい。受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵子の雄性前核にインジェクションピペット中の遺伝子を注入する。注入した卵子を輸卵管に戻すための動物（偽妊娠雌マウス等）を用意し、一匹に対して約１０〜１５個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否かを、尾の先端部からゲノムＤＮＡを抽出し、サザン法あるいはＰＣＲ法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を挿入したポジティブクローニング法により確認することができる。さらに、トランスジーンの発現を確認するため、ノザン法もしくはＲＴ−ＰＣＲ法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質またはその断片に対する特異的抗体によって、ウェスタンブロッティングを行ってもよい。
【００４６】
ノックアウトマウス
本発明のノックアウトマウスは、ｉＡＱＰ遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックアウトマウスとは相同組換え技術により任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジェニックマウスをいう。ＥＳ細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス（キメラとは、2個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。
【００４７】
相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別にはＰＣＲを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明できる。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。
【００４８】
抗体の作製方法
本発明はまた、ｈｉＡＱＰまたはその断片を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体が含まれる。ｈｉＡＱＰまたはその断片に対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ペプチド抗体）または抗血清は、本発明のｈｉＡＱＰまたはの断片等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。特に、ｈｉＡＱＰの機能を制御できる抗体は抗体含有医薬品として有用である。
【００４９】
本発明のｈｉＡＱＰまたはその断片は、投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または希釈剤、担体と共に温血動物に対して投与される。投与に際して抗体産生を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は通常１〜６週毎に１回づつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、好ましくはマウスおよびラットが用いられる。ラットにはＷｉｓｔａｒおよびＳＤ系ラット等が好ましく、マウスにはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６およびＩＣＲ系マウス等が好ましく用いられる。
【００５０】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ｈｉＡＱＰと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 1975）やその変法（J. Immunol. Method, 39, 285, 1980、Eur. J. Biochem., 118, 437, 1981、Nature, 285, 446, 1980）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。さらに融合効率を高めるために、適宜レクチン、ポリ−Ｌ−リジンもしくはＤＭＳＯを添加することもできる。
【００５１】
骨髄腫細胞としては例えばＸ−６３Ａｇ８、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が挙げられるが、好ましくはＳＰ２／０が用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：２０〜２０：１であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）を１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗ｈｉＡＱＰ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ｈｉＡＱＰ抗原を直接または担体と共に吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ｈｉＡＱＰ抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したｈｉＡＱＰを加え、固相に結合した抗ｈｉＡＱＰモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。
【００５２】
抗ｈｉＡＱＰモノクローナル抗体の選別およびクローニングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行われる。選別、クローニングおよび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地、またはハイブリドーマ培養用無血清培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ｈｉＡＱＰ抗体価の測定と同様にして測定できる。すなわち、測定方法としてはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いることができるが、以下に示すようなＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００５３】
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングは以下の方法に準じて行うことができる。
免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの表面に固定化する。次に、非特異的吸着を防止する目的で、ＢＳＡ、ＭＳＡ、ＯＶＡ、ＫＬＨ、ゼラチンもしくはスキムミルク等を各ウェルに固定化する。この各ウェルにハイブリドーマ培養上清液を添加し、一定時間放置し免疫反応を行わせる。ＰＢＳ等を洗浄液として各ウェルを洗浄する。この洗浄液中には界面活性剤を添加することが好ましい。酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置する。標識酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。同じ洗浄液で各ウェルを洗浄後、使用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる。添加したハイブリドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する場合は酵素反応が進行し基質溶液の色が変化するので、スクリーニングが可能となる。
【００５４】
クローニングは、通常半固体アガー法や限界希釈法等のそれ自体公知の方法で行うことができ、具体的には前記の方法で目的とする抗体を産生するウェルを確認した後、クローニングを行いシングルクローンを得る。クローニング法としては、培養プレート１ウェル当たりに１個のコロニーが形成するようにハイブリドーマ細胞を希釈して培養する限界希釈法等を用いると良い。限界希釈法によるクローニングには、コロニー形成能を高めるために支持細胞を用いるか、インターロイキン６などの細胞増殖因子を添加しても良い。その他、ＦＡＣＳおよびシングルセルマニプレーション法を用いてクローニングすることができる。クローン化されたハイブリドーマを、好ましくは無血清培地中で培養し、至適量の抗体をその上清に加える。この様にして得られた単一のハイブリドーマは、フラスコや細胞培養装置を用いて大量培養を行うか、動物の腹腔内で増殖させる（J. Immunol. Meth., 53, 313, 1982）ことにより、モノクローナル抗体を得ることができる。フラスコ内で培養を行う場合は、０〜２０％のＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含む細胞培養用培地（IMDM、DMEM、RPMI１６４０およびMEM等）を用いて行うことができる。動物の腹腔内で増殖させる場合は、細胞融合に使用した骨髄腫細胞の由来となった動物と同種、同系統の動物または胸腺欠損ヌードマウス等を使用することが好ましく、予めプリスタン等の鉱物油を投与してからハイブリドーマを移植する。１〜２週間後腹腔内に骨髄腫細胞が増殖し、モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。
【００５５】
本発明によるモノクローナル抗体は、ｈｉＡＱＰに特異的なエピトープを認識するものを選択することによって、他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的にそのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも５以上のアミノ酸残基、望ましくは７〜２０アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるエピトープは、そのタンパク質に固有のエピトープを示すと言われている。従って、配列番号２および４のいずれかに記載されたアミノ酸から選択され、かつ連続する少なくとも５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明におけるｈｉＡＱＰ特異的なモノクローナル抗体といえる。配列番号２および４に記載されたアミノ酸配列の間で保存されたアミノ酸配列を選べば、ｈｉＡＱＰに共通のエピトープを選択することができる。あるいは各配列に特異的なアミノ酸配列を含む領域であれば、それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクローナル抗体を選択することができる。
【００５６】
抗ｈｉＡＱＰモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、硫安沈殿法、イオン交換体（例えばＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施すことができる。精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止する目的で、例えばヒト血清アルブミンを０．０５〜２％の濃度で添加する。その他、グリシン、α−アラニン等のアミノ酸類、特にリジン、アルギニンおよびヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコースやマンニトール等の糖類または塩化ナトリウム等の塩類を添加しても良い。ＩｇＭ抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られているため、β−プロピオノラクトンおよび無水酢酸で処理しても良い。
【００５７】
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させても良いが、例えばウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカップリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００５８】
抗体の利用方法
ｈｉＡＱＰまたはその断片に対するモノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体は、ｈｉＡＱＰを発現している細胞に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。これらの抗体を用いて、本発明のｈｉＡＱＰまたはその断片との免疫学的な結合に基づき、ｈｉＡＱＰまたはその断片を測定することができる。具体的にこれらの抗体を用いてｈｉＡＱＰまたはその断片を測定する方法としては、例えば、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりｈｉＡＱＰまたはその断片を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識化ｈｉＡＱＰと検体中のｈｉＡＱＰまたはその断片を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のｈｉＡＱＰまたはその断片を測定する競合法を利用して検体中のｈｉＡＱＰまたはその断片を測定する方法が挙げられる。
【００５９】
サンドイッチ法によるｈｉＡＱＰまたはその断片の測定においては、まず、固定化抗体とｈｉＡＱＰまたはその断片とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体−ｈｉＡＱＰ標識化抗体を形成させる２ステップ法もしくは固定化抗体、標識化抗体およびｈｉＡＱＰまたはその断片を同時に混合する１ステップ法などを用いることができる。
【００６０】
測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。
【００６１】
抗体の固層化には、公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ−スクシニイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートおよびＮ−スクシニイミジル−２−マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸などを用いるカルボジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。
【００６２】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質および金属キレート等を使用するのが好ましい。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド等が挙げられ、発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン等が挙げられ、放射性物質としては１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ等が挙げられるが、これらに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。さらに、抗体にビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサールまたはフルオレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。好ましくは西洋わさびペルオキシダーゼを標識化酵素として用いる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができる。
【００６３】
標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤を用いる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質溶液としてＨ２Ｏ２を用い、発色剤として２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を使用することができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてオルトニトロフェニルフォスフェート、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができ、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明には、また、前述のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および試薬類をキット化したのものも含まれる。
【００６４】
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−オルトフェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，４’−ジチオピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。また、抗体としては、場合によっては、そのフラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体をアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、あるいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。
【００６５】
測定対象は、血漿、血清、血液、尿、組織液等の体液、各種細胞、組織、糞便等、ｈｉＡＱＰを含む試料であれば限定されない。
【００６６】
ヒト化抗体の作製方法
ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。また、マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、ヒトにとっては異種タンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。そこで、ヒトに抗体を投与する場合にはヒトに対し抗原性を低くした抗体が好ましい。
【００６７】
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウィルス（ＥＢＶ）で形質転換する方法、さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、遺伝子工学を利用しキメラ抗体、ヒト化抗体を作製する方法などがある。キメラ抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された抗体であり、ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を改変して、H鎖とL鎖の相補性決定部（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。
【００６８】
キメラ抗体の作製方法として、まずマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（Ｖ領域）を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体定常部（Ｃ領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる。公知のキメラ抗体の関連技術として、特開平０５−３０４９８９号、特開平０４−３３０２９５号、WO9106649、特開昭６３−０３６７８６号、特公平０６−９８０２１号等がある。
【００６９】
また、最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発された。
ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位（ＣＤＲ：Complementary determining reagion、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）し、抗体分子のCDRを除いた全分子をヒト化した抗体である。本抗体はヒト・マウス・キメラ抗体より、マウスの抗体部分が少ないため、抗原性が少なく安全性が高いと言われている。ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、ヒト／マウスのヘテロミエローマであるSHM-D 33株（ATCC CRL 1668）またはRF-S1株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融合効率が得られる。これらの親細胞を用いて得られたハイブリドーマはフィーダー細胞なしでクローニングが可能であり、ＩｇＧタイプの抗体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。親細胞の培養には、１５％ＦＣＳを加えたＥＲＤＦ培地を用い、その他の操作はマウスの場合と同様である。また、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用いるのが好ましい。充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合にはin vitroで抗原感作を行うこともできる。我が国では現在、成人性Ｔ細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。ヒト化抗体の製造方法およびその関連技術については、米国Genentech社（WO9222653、WO9845332、WO9404679、WO9837200、WO9404679、）および英国Celltech社（WO9429451、WO9429351、WO9413805、WO9306231、WO9201059、WO9116927、WO9116928、WO9109967、WO8901974、WO8901783）等が特許出願している。
【００７０】
上記示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
【００７１】
組成物
ｈｉＡＱＰポリヌクレオチドまたはタンパク質は、炎症性腸疾患などの下痢をきたす各種疾患等の診断、予防および治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できる可能性がある。また、これら公知の医薬との併用または配合もできる。
【００７２】
本発明の医薬組成物はｈｉＡＱＰポリヌクレオチドおよびタンパク質、ｈｉＡＱＰタンパク質の機能を刺激する物質（アゴニスト）または阻害する物資（アンタゴニスト）、ｈｉＡＱＰタンパク質に対する抗体等の物質（以下、これらを総じてｈｉＡＱＰ関連物質と称す）等が含まれる。ｈｉＡＱＰ関連物質は、そのままあるいは水に希釈する等の各種処理を施して使用することができるが、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。この場合、該物質の配合量は製品に応じて適宜選択されるところではあるが、通常全身投与製剤の場合には、０．００１〜５０重量％、特に０．０１〜１０重量％とすることができ、０．００１％より少ないと満足する作用が認められない可能性があり、また、５０％を越えると製品そのものの安定性や香味等の特性が損なわれる可能性がある。
【００７３】
投与経路は経口投与および静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与等が適宜選択できる。
【００７４】
本発明のｈｉＡＱＰ関連物質は塩として製剤中に含有されていてもよい。薬剤学的に許容される塩としては、例えば無機塩基、有機塩基等の塩基との塩、無機酸、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸などの酸付加塩等が挙げられる。無機塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム、アンモニウム等が挙げられる。有機塩基としては、例えば、エタノールアミン等の第一級アミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン等が挙げられる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等が挙げられる。酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００７５】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。また、口腔内局所投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００７６】
前記示した剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書に言うＤＤＳ製剤とは、除法化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤を言う。
【００７７】
ＤＤＳの構成要素には基本的に薬物、薬物放出モジュール、おおいおよび治療プログラムから成り、各々の構成要素について、特に放出を停止させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、投与部位の生体組織と反応しないおおいが好ましく、さらに、設定された期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが好ましい。薬物放出モジュールは基本的に薬物貯蔵庫、放出制御部、エネルギー源および放出孔または放出表面を有している。これら基本的構成要素は全て揃っている必要はなく、適宜追加あるいは削除等を行い、最良の形態を選択することができる。
【００７８】
ＤＤＳに使用できる材料としては、高分子、シクロデキストリン誘導体、レシチン等がある。高分子には不溶性高分子（シリコーン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン・ビニルアルコール共重合体、エチルセルロース、セルロースアセテート等）、水溶性高分子およびヒドロキシルゲル形成高分子（ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート架橋体、ポリアクリル架橋体、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、水溶性セルロース誘導体、架橋ポロキサマー、キチン、キトサン等）、徐溶解性高分子（エチルセルロース、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステル等）、胃溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリビニルピロリドン、メタアクリル酸ジメチルアミノエチル・メタアクリル酸メチルコポリマー等）、腸溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、アクリル酸系ポリマー等）、生分解性高分子（熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリシアノアクリレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリβヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトン等）があり、剤型によって適宜選択することができる。
【００７９】
特に、シリコーン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、メチルビニルエーテル・無水マレインサン共重合体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、セルロースアセテートは浸透圧ポンプの材料として使用でき、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースは徐放性製剤の膜素材として使用でき、ポリアクリル架橋体は粘膜付着剤として使用できる。
【００８０】
また、製剤中にはその剤形（経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤形）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等の添加剤を加えて製造することができる。
【００８１】
それぞれ具体例を挙げて例示するが、これらに特に限定されるものではない。
〔溶剤〕精製水、注射用水、生理食塩水、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン
〔賦形剤〕デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール、〔コーティング剤〕白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロースおよび上記した高分子〔基剤〕ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤
〔結合剤〕デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ
〔滑沢剤〕ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、コムギデンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール
〔崩壊剤〕デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース
〔溶解補助剤〕シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール
〔懸濁化剤〕アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤
〔粘稠剤〕カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム
〔乳化剤〕アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン
〔安定剤〕亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質
〔緩衝剤〕リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸
〔等張化剤〕塩化ナトリウム、ブドウ糖
〔無痛化剤〕塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコール
〔保存剤〕安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール
〔矯味剤〕白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン
〔芳香剤〕トウヒチンキ、ローズ油
〔着色剤〕水溶性食用色素、レーキ色素。
【００８２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例により限定的に理解されるべきでないことはもちろんである。
【００８３】
サブクローニング
ヒト小腸cDNAライブラリー（TAKARA社製）を鋳型にして、センス鎖（１回目）：SYG GBG SHC ACH TSA ACC C（配列番号３）、センス鎖（２回目）：CTG GAT CCA ACC CDG CNG TSW CHB TDG C（配列番号４）、アンチセンス鎖（１および２回目）：TGA ATT CGG DCC MAR RKM NCR RGC（配列番号５）のプライマーを用いてセミネスティッドＰＣＲを施行し、それをサブクローニングした。１回目のＰＣＲの反応液組成は、鋳型を５μL、１０×ＰＣＲバッファーを５μL、dNTPを５μL、Taqを０．５μL、上記１回目のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを各１００pmolを加え、全量で５０μLとした。ＰＣＲ条件は、９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。２回目のＰＣＲの反応液組成は、１回目のＰＣＲ産物を５μL、１０×ＰＣＲバッファーを５μL、dNTPを５μL、Taqを０．５μL、上記２回目のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを各１００pmolを加え、全量で５０μLとした。ＰＣＲ条件は１回目と同様に施行した。２回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物（約４００塩基対）をEcoR1／BamH1で制限酵素処理したpGEM3Zベクター（Promega社）にライゲーションした。その後、エレクトロポレーション法で大腸菌MC1061株を形質転換し、ＬＢ（Amp+）プレート（１００μg／mLのアンピシリンを含有）に播いた。得られた各コロニーから常法通りにプラスミドを抽出し、蛍光シークエンサー（ABI社）を用いてサイクルシークエンス法による塩基配列の決定を行った。得られた各クローンの配列につきGenBankで相同性を調べ、新規のクローン、ｈｉＡＱＰを明らかにした。
【００８４】
アンチセンスＲＮＡプローブの作製
サブクローニングにて得られたｈｉＡＱＰのＤＮＡ断片（配列番号１に示す塩基番号３０４〜６９１）をインサートに含むpGEM3Zベクター（Promega社）を、制限酵素BamH1を用いてプラスミドＤＮＡの直線化を行った。その後、フェノール抽出、エタノール沈殿をし、０．１μg／μLとなるようにＤＮＡを精製水に溶解し、鋳型ＤＮＡを作製した。
【００８５】
次に、10×転写バッファー2μL、100 mM ＤＴＴ 2μL、RNasin（登録商標）40U、ATP,GTP,CTP（各2.5mM）混合液4μL、240μM UTP 1μL、鋳型ＤＮＡ（0.1μg/μL）4μL、α−32P-UTP（10〜20μCi/μL）2μL、ＲＮＡポリメラーゼ（15〜20U/μL）1μLを全量20μLとなるよう精製水で調製し、３７℃、６０分間反応させた。25UのDNase（RNaseフリー）を加え、３７℃、３０分間反応させ、鋳型ＤＮＡを消化させた。フェノール/CIAA、CIAA抽出し、酢酸アンモニウムを加えてエタノール沈殿を行った。その後、20μLのハイブリダイゼーションバッファーに溶解し、−２０℃で保存し、アンチセンスＲＮＡプローブを作製した。RNase プロテクションアッセイでは32Pでラベルしたプローブを作製し、in situ ハイブリダイゼーションでは35Sでラベルしたプローブを作製した。
【００８６】
>コロニーリフト
ヒト小腸cDNAライブラリー（組換菌体型）（TAKARA社）を径１４cmのLB（Amp+）プレート数枚に、１枚当たり１×１０５cfuとなるように播き培養した。コロニーをナイロンメンブレンに写しとり、常法通り32PでラベルしたアンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションを施行した。陽性のコロニーを１個分離することができた。
【００８７】
シークエンス
コロニーリフトにて分離されたクローンから常法通りにプラスミドを抽出した。そのプラスミド内の既知の配列よりプライマーを作製し、蛍光シークエンサー（ABI社）を用いてサイクルシークエンス法による塩基配列の決定を行った。新たに解読できた塩基配列をもとに、次々に新しくプライマーを作製しシークエンスを行った。その結果、5'-UTRおよびポリAを含むｈｉＡＱＰのｃＤＮＡの全長（約２．３Kb）を決定した（配列番号１）。
【００８８】
RNase プロテクションアッセイ
組織の全ＲＮＡと、32PラベルしたアンチセンスＲＮＡプローブを用いてRNaseプロテクションアッセイ（Koyama, Y et al. ; J. Biol. Chem., 272, 30329-30333, 1997、Yamamoto, T. et al. ; Am. J. Physiol., 272, F198-F204, 1997、Melton, D. A. et al. ; Nucl. Acids Res., 12, 7035-7056, 1984、Kreig, P. A. et al. ; Methods in Enzymology, 155, 397-415, 1987、Sambrook, J. et al. ; Molecular cloning, A laboratory manual, Cold spring harbor laboratory press, 1989）を行った。アンチセンスＲＮＡプローブは、バクテリオファージのT7プロモーターとＲＮＡポリメラーゼを用いたin vitro転写系を利用した。
【００８９】
各組織ＲＮＡサンプル０．５μgをエタノールに沈殿させドライアップを行った。また、上記32PでラベルしたアンチセンスＲＮＡプローブも真空乾燥機でドライアップを行い、３０μLのハイブリダイゼーションバッファーに溶解させた。これらを混合し、８５℃、５分間加熱、変性後、４５℃で１２時間アニールさせた。その後冷却し、終濃度４０μg/mL RNaseA、２μg/mL RNaseT1に調製したRNase ３００μLを加え、３０℃、６０分間反応させた。１０％ ＳＤＳ １０μL、プロテナーゼＫ ５μLを添加し、３７℃、３０反応させRNaseを失活させた。次に、１００μLのフェノール/CIAAを加え抽出後、３０μgのｔＲＮＡと３００μLの１００％エタノールを加えてエタノール沈殿を行い、ドライアップし５μLのサンプル泳動用バッファーに溶解させた。
【００９０】
９５℃、５分間熱処理後、６％の変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。その結果、ｈｉＡＱＰのｍＲＮＡは十二指腸と空腸のみに認められた（図１）。レーン１：食道、レーン２：胃、レーン３：十二指腸、レーン４：空腸、レーン５：回腸、レーン６：虫垂、レーン７：大腸、レーン８：直腸、レーン９：肝臓、レーン１０：胆のう、レーン１１：大脳、レーン１２：唾液腺、レーン１３：肺、レーン１４：心臓、レーン１５：腎臓、レーン１６：精巣、レーン１７：胎盤。
【００９１】
in situ ハイブリダイゼーション
空腸の凍結切片と35Sでラベルした上記アンチセンスＲＮＡプローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションを行った。すなわち、空腸の凍結切片は、室温下乾燥させ、４％パラホルム溶液、ＰＢＳにて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄した。その後、プロテアーゼＫ ５μg/mL、500mM ＮａＣｌを含む10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで１０分間処理し、組織を調製した。組織切片にプローブを含んだハイブリダイゼーションバッファーをかけ、５５℃、一晩反応させた。その後、４×ＳＳＣにて洗浄し、２×ＳＳＣ、10mMβ−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡで室温下、１０分間×２回洗浄した。その後RNaseＡ ２０μg／mLを含む５００0mMＮａＣｌ、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで３７℃、３０分処理した。次に、0.1×ＳＳＣ、1mM ＥＤＴＡ、１０mMβ−メルカプトエタノールで５５℃、４時間、続いて0.5×ＳＳＣで室温下、１０分間×２回洗浄した。最後に、エタノールを用いて脱水し、オートラジオグラフィーに供した。その結果、ｈｉＡＱＰのｍＲＮＡは吸収上皮細胞、特に絨毛先端部の吸収上皮細胞にシグナルが認められた。
【００９２】
アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた機能的発現解析
ｈｉＡＱＰが有する水の透過性を調べるために、AQPファミリーが発現していないことが知られているアフリカツメガエルの卵母細胞を用い、Science, 256, 385-387, 1992、およびProc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6269-6273の方法に準じて行った。また、アフリカツメガエルの卵母細胞はProc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6585-6589, 1985に準じて行った。
【００９３】
ｈｉＡＱＰｃＤＮＡ（5'-UTRおよびポリAを含む）含有プラスミドをNot1で制限酵素処理し、直線化を行った。これを鋳型として、常法通りにCapped ｃＲＮＡを作製した。
【００９４】
雌性アフリカツメガエルを麻酔し、ステージ５または６の卵母細胞を単離した。単離した卵母細胞をmodified Barth' buffer（以下、ｍＢＢと称す）（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８８ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ3）2、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、ペニシリン＋ストレプトマイシン１０μｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．６）に浮遊させた。次に、タイプIIコラゲナーゼ2mg/mLで瀘胞細胞を除去し、洗浄後、１２時間培養し、実験用卵母細胞を調製した。調製した卵母細胞にｈｉＡＱＰのｃＲＮＡ１０ngを５０nLの精製水に溶解し（コントロールは５０nLの精製水のみ）滅菌したガラス製マイクロピペットを用いてマイクロインジェクションした。２０℃、２００mOsmのｍＢＢで４８時間インキュベーションした後、７０mOsmのｍＢＢに卵母細胞を移し、そのサイズの変化をビデオマイクロスコピー（顕微鏡：OLYMPUS(SZH10)、CCDカメラ：Ikegami(FCD-10)にてモニターした。
【００９５】
低浸透圧へ移す前の体積（Ｖｏ）と低浸透圧へ移して２分後の体積（Ｖ）を計測した。Ｖ／Ｖｏを計算し、水透過性の増加の程度を比較した。
式
Ｖ／Ｖｏ＝（Ａ／Ａｏ）3/2
Ａｏ：低浸透圧へ移す前の面積
Ａ  ：低浸透圧へ移して２分後の面積
（Science, 256, 358-387, 1992）
その結果、水の透過性は有意に上昇した（図２参照）。尚、ポジティブコントロールとして、ヒトＡＱＰ８（Genbank Accession No. AF067797）のｃＲＮＡをインジェクションした卵母細胞も同様に計測した。
【００９６】
【発明の効果】
本発明のｈｉＡＱＰタンパク質は、アクアポリンファミリーに共通の構造を有しており、それらに特有の機能を有している。従って、腸管における水分または低分子物質の調節機能の解明、炎症性腸疾患などの下痢をきたす各種疾患等の発症機構の解明、さらにｈｉＡＱＰに基づく各種疾患の診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規ヒトアクアポリン（ｈｉＡＱＰ）のｍＲＮＡの組織特異的発現を表す、プロテクションアッセイによって得られた泳動パターンを示す図である。
【図２】ｈｉＡＱＰが有する水透過性の機能をアフリカツメガエル卵母細胞を用いて調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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