(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ該ポリペプチドがバニロイド化合物に結合する、単離バニロイド受容体ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有し、かつ該ポリペプチドがバニロイド化合物に結合する、請求項１記載の単離バニロイド受容体ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または2記載のバニロイド受容体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項3記載のポリヌクレオチドを含む、組換え型発現ベクター。
【請求項５】
請求項3記載のポリヌクレオチドまたは請求項4記載のベクターを含む組換え型宿主細胞。
【請求項６】
真核細胞である、請求項5記載の組換え型宿主細胞。
【請求項７】
請求項１または2記載のバニロイド受容体ポリペプチドの製造方法であって、以下の段階を含む方法：
a）バニロイドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を、ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する段階；および
b）宿主細胞培養物からポリペプチドを回収する段階。
【請求項８】
請求項１または2記載のバニロイド受容体ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
【請求項９】
バニロイド受容体ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
請求項1または2記載の単離バニロイド受容体ポリペプチドを試験化合物と接触させる段階；および
バニロイド受容体ポリペプチドに対する試験化合物の特異的結合を検出する段階。
【請求項１０】
バニロイド化合物がバニロイド受容体ポリペプチドとの結合活性を有する、試料中のバニロイド化合物を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
バニロイド化合物を含むと思われる試料を、バニロイド受容体ポリペプチドを発現する請求項6記載の真核宿主細胞培養物と接触させる段階；および
バニロイド受容体を発現する宿主細胞においてバニロイド受容体活性に関連した細胞反応の変化を検出する段階。
【請求項１１】
検出がバニロイド受容体発現宿主細胞における細胞内カルシウム濃度の変化を検出することによる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
バニロイド受容体活性に関連した細胞反応が細胞内カルシウム濃度の増加である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
実質的に精製された請求項1または2記載のバニロイド受容体ポリペプチドと適当な薬学的担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１４】
トランスジェニック動物が、請求項1記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するか、または、該ポリヌクレオチドがノックアウトされた、バニロイド受容体遺伝子機能に関するヒト以外のトランスジェニック動物モデル。
【請求項１５】
バニロイド受容体機能が、バニロイド化合物結合、バニロイド化合物結合により誘導されるカルシウムイオンの流入、バニロイド誘発性膜電流、バニロイド化合物の結合により誘導される細胞死の誘導、および熱に対するバニロイド化合物結合により誘導される反応からなる群より選択される、請求項14記載のヒト以外のトランスジェニック動物モデル。
【請求項１６】
バニロイド受容体機能を調節する生物学的活性物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
候補物質を請求項1または2記載の哺乳類バニロイド受容体ポリペプチドと組み合わせる段階；および
バニロイド受容体機能に及ぼす該物質の作用を決定する段階。
【請求項１７】
バニロイド受容体機能を調節する生物学的活性物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
候補物質を請求項6記載の宿主細胞と組み合わせる段階；および
該宿主細胞におけるバニロイド受容体機能に及ぼす該物質の作用を決定する段階。
【請求項１８】
バニロイド受容体機能を調節する生物学的活性物質をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
候補物質を請求項14記載のヒト以外のトランスジェニック動物モデルと組み合わせる段階；および
該動物におけるバニロイド受容体機能に及ぼす該物質の作用を決定する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バニロイド化合物に対する受容体およびそのようなバニロイド化合物受容体に関連するポリペプチドをコードする核酸およびアミノ酸配列、ならびに疾患の診断、試験、および治療にこれらの配列を用いることに関する。
【０００２】
発明の背景
疼痛は、侵害受容器と呼ばれる知覚神経の特定のグループの末梢終末が、侵害的な化学、機械、または熱刺激によって活性化される場合に始まる。その細胞体が様々な知覚神経節に存在するこれらの神経は、組織損傷に関する情報を脊髄および脳の疼痛処理中枢に伝達する（疼痛の分野（マグローヒル、ニューヨーク、1987））。侵害受容器は部分的に、多くの「ホット」でスパイシーな食物の活性成分であるトウガラシ（capsicum peppers）の天然物であるカプサイシンに対する感受性を特徴とする。哺乳類では、侵害受容器終末がカプサイシンに暴露されると、最初に疼痛が認識されて、神経伝達物質を局所的に放出する。持続的な暴露では、これらの終末はカプサイシンのみならず、他の侵害刺激（スゾルクサニ（Szolcsanyi）、「疼痛研究におけるカプサイシン（Capsaicin in the Study of Pain ）」、ウッド（Wood）編、255〜272頁、アカデミックプレス、ロンドン、1993）に対しても不応性となる。侵害受容器の脱感作という後者のような現象が起こることは、ウイルスおよび糖尿病性ニューロパシーからリウマチ性関節炎に至る疼痛疾患の治療に、逆説的と思われるカプサイシンを鎮痛薬として使用することの根拠となっている（キャンベル（Campbell）、「カプサイシンと疼痛研究（Capsaicin and the Study of Pain ）」、ウッド（Wood）編、255〜272頁、アカデミックプレス、ロンドン、1993）；スザラシ（Szallasi）ら、1996、Pain 68：195〜208）。侵害刺激に対するこのような感受性低下の一部は、炎症性メディエータの枯渇のような侵害受容器における可逆的変化の表れである可能性があるが、長期にわたる反応性の欠如は、カプサイシン暴露後の侵害受容器の死滅またはその末梢神経終末の破壊によって説明することができる（ジャンクソ（Jancso）ら、1977、Nature 270：741〜743；スゾルクサニ（Szolcsanyi）、上記）。
【０００３】
カプサイシンに対する反応性は、侵害刺激（化学、熱、および機械刺激）に反応してシグナルを伝達する知覚神経求心性繊維を定義するために用いられている；しかし、正確な作用機序はなお不明である。電気生理学的（ビーバン（Bevan）ら、1990 Trends Pharmacol. Sci. 11：330〜333；オウ（Oh）ら、1996、J. Neuroscience 16：1659〜1667）および生化学的（ウッド（Wood）ら、1988、J. Neuroscience 8：3208〜3220）研究から、カプサイシンが非選択的な陽イオンチャンネルの形成または活性化を通じて細胞質膜伝導性を増加させることによって侵害受容器を興奮させることが明らかに示されている。カプサイシンは疎水的特性を有するため、その作用が膜脂質に対する直接的な障害によって媒介される可能性を除外することは難しいが（ファイジン（Feigin）ら、1995、Neuroreport 6：2134〜2136）、カプサイシン誘導体が構造活性相関を示し、用量依存的な反応を誘発するという知見により（スゾルクサニ（Szolcsanyi）ら、1975 Drug Res. 25：1877〜1881；スゾルクサニ（Szolcsanyi）ら、1976 Drug Res. 26：33〜37）、この化合物が知覚神経上または知覚神経内部の特異的受容体部位で作用することは一般的に容認されている。競合的カプサイシンアンタゴニストであるカプサゼピンの開発（ビーバン（Bevan）ら、1992、Br. J. Pharmacol. 107：544〜552）およびトウダイグサ科（Euphorbia）植物から得られたカプサイシンの細胞作用を模倣する超強力なカプサイシン類似体であるレシニフェラトキシンの発見（ドフリース（deVries）ら、1989、Life Sci. 44：711〜715；スザラシ（Szallasi）、1989 Neuroscience 30：515〜520）によって、カプサイシンが受容体を通じてその作用を媒介することがさらに示唆されている。レシニフェラトキシンはナノモルで有効性であることから、侵害受容器上の飽和可能なカプサイシンおよびカプサゼピン感受性結合部位を可視化するために、高親和性放射リガンドとして使用されている（スザラシ（Szallasi）、1994、Gen. Pharmac. 25：223〜243）。バニロイド部分はカプサイシンおよびレシニフェラトキシンの必須構造成分となるため、これらの化合物について提案される作用部位はより一般的にバニロイド受容体と呼ばれている（スザラシ（Szallasi）、上記）。カプサイシン、レシニフェラトキシン、およびアンタゴニストであるカプサゼピンの作用は、神経の初代培養を用いて生理学的に十分に特徴付けがなされている（例えば、スゾルクサニ（Szolcsanyi）、「知覚神経受容体に及ぼすカプサイシンの作用（Actions of Capsaicin on Sensory Receptor）」、ビーバン（Bevan）ら、「カプサイシンの細胞作用機序（Cellular Mechanism of the Action of Capsaicin）」、およびジェームス（James）ら、「カプサイシン受容体（The Capsaicin Receptor）」、これらは全て「疼痛研究におけるカプサイシン（Capsaicin in the Study of Pain）」、1993、アカデミックプレス（株）の中のそれぞれ1〜26、27〜44および83〜104頁に含まれる；ビーバン（Bevan）ら、1990、上記、を参照のこと）。
【０００４】
カプサイシンおよびカプサイシン類の鎮痛的役割は、多様な疾患に関連した疼痛および炎症の治療にそれらを用いる際に非常に重要である（例えば、フスコ（Fusco）ら、1997、Drugs 53：909〜914；トウヒード（Towheed）ら、1997、Semin. Arthritis Rheum. 26：755〜770；アペンディーノ（Appendino）ら、1997、Life Sci. 60：681〜696（レシニフェラトキシンの活性および応用について記載）；「疼痛研究におけるカプサイシン（Capsaicin in the Study of Pain）」、アカデミック・プレス、255〜272頁の中に含まれる、キャンベル（Campbell）ら、「カプサイシンとその類似体の臨床応用」を参照のこと）。カプサイシンおよびカプサイシン関連化合物は疼痛知覚を誘発し、痛覚過敏を引き起こして自律神経反射を活性化し（例えば、血圧の変化を誘発する）、神経終末からペプチドおよび他の推定伝達物質の放出を引き起こす（例えば、気管支収縮および炎症を誘発する）が、これらの化合物に知覚神経が持続的に暴露されると、正常な機械的感受性または運動機能を損なうことなく、しかも明確な中枢神経系抑制を起こすことなく、多種類の知覚侵害刺激に対する神経の脱感作が起こる。カプサイシンおよび関連化合物が非常に重要で治療的価値があるのはこの最終的な現象のためである。
【０００５】
カプサイシンおよび関連化合物ならびに知覚求心性繊維に及ぼすそれらの作用に強い関心が持たれているにもかかわらず、これらの化合物がその作用を媒介する受容体はこれまで単離および分子の特徴付けが行われていなかった。このように、新規カプサイシン受容体結合化合物のスクリーニングもしくは特徴付けを行う、または疼痛および／または炎症に関する内因性の組織由来メディエータを同定する優れた系の開発はかなり遅れている。今日まで、カプサイシン受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして化合物の活性を評価する唯一の手段は、培養または無傷の動物の知覚神経に及ぼすその作用を調べることであった。本発明によりこの問題は解決される。
【０００６】
概要
本発明はバニロイド受容体ポリペプチドおよびバニロイド受容体関連ポリペプチド、特にカプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドと共に、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を特徴とする。関連する局面において、本発明は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞を特徴とする。他の関連する局面において、本発明は、例えば外因性の野生型または改変したカプサイシン受容体コードポリヌクレオチド配列が存在するために、カプサイシン受容体の発現が変化しているトランスジェニック動物を特徴とする。本発明はまた、カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびにカプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドを産生する方法にも関する。
【０００７】
一つの局面において、本発明はカプサイシン受容体ポリペプチドに結合する化合物、好ましくはカプサイシン受容体ポリペプチドに結合してカプサイシン受容体生物活性に関連した細胞反応（例えば、細胞内カルシウム流出入）に影響を及ぼす化合物を同定する方法を特徴とする。
【０００８】
もう一つの局面において、本発明は、カプサイシン受容体ポリペプチドを発現する細胞（例えば、卵母細胞（例えば両生類の卵母細胞））にバニロイド化合物を含むと思われる試料を接触させること、およびカプサイシン受容体発現宿主細胞におけるカプサイシン受容体活性に関連した細胞反応の変化を検出することによって、バニロイド化合物がカプサイシン受容体ポリペプチドとの結合活性を有する、試料中のバニロイド化合物を検出する方法を特徴とする。好ましくは、カプサイシン受容体活性に関連した細胞反応は、カプサイシン受容体発現宿主細胞における細胞内カルシウム濃度の変化である。方法は、天然物（例えば、天然物抽出物）に由来する試料中のバニロイド化合物を検出するために用いることができ、または鎮痛剤（例えば、バニロイド類似体、治療用抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、補充遺伝子療法のためのカプサイシン受容体コードヌクレオチド）、芳香増強剤等として用いられる候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【０００９】
本発明のさらにもう一つの局面は、ヒト疾患および疼痛を伴う症候群の診断および治療に、カプサイシン受容体ポリペプチドおよびその特異的抗体を用いることに関する。
【００１０】
もう一つの局面において、本発明は、カプサイシン受容体コードトランスジーンを発現しているヒト以外のトランスジェニック哺乳類、およびそのようなトランスジェニック哺乳類をカプサイシン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト候補体のスクリーニングに用いることを特徴とする。
【００１１】
本発明の主な目的は、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの発現（例えば、組換え宿主においてまたは有機化学療法の一部として標的細胞において）に用いられる、および例えば、カプサイシン受容体結合化合物（特に、カプサイシン受容体媒介活性に影響を及ぼす化合物）の同定に用いられる単離ポリペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明を以下にさらに詳細に説明する。
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、およびその断片または一部と共に、ペプチド核酸（PNA）、断片、その一部またはアンチセンス分子、ならびに一本鎖または二本鎖となりうる、およびセンスまたはアンチセンス鎖を表すことができるゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを指す。「ポリヌクレオチド」を特異的ポリヌクレオチド配列（例えば、カプサイシン受容体コードポリヌクレオチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードポリヌクレオチド）を指すために用いる場合、「ポリヌクレオチド」は列挙したポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば縮重変異体であるポリヌクレオチド、または列挙したポリペプチドの生物活性変異体または断片をコードするポリヌクレオチドを含むことを意味する。同様に、本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、または蛋白質を指す。本明細書において「ポリペプチド」を天然に存在する蛋白質分子のアミノ酸配列を指すために列挙する場合、「ポリペプチド」等の用語はアミノ酸配列を、列挙した蛋白質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列であると制限することを意味するのではない。「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、アンチセンスポリヌクレオチドが、カプサイシン受容体ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる、所定のポリヌクレオチド配列の転写または翻訳に関連したポリヌクレオチド配列（例えば、カプサイシン受容体をコードするポリヌクレオチドのプロモーター）を含む、所定のポリヌクレオチド配列（例えば、カプサイシン受容体をコードするポリヌクレオチド配列）と相補的であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを意味する。特に重要なものは、カプサイシン受容体コードまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードポリヌクレオチドの転写および／または翻訳をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害することができるアンチセンスポリヌクレオチドである。
【００１４】
本明細書において用いられる「ペプチド核酸」という用語は、リジンのようなアミノ酸残基およびアミノ基が付加されているオリゴマーを含む分子を指す。これらの小分子は抗遺伝子物質とも呼ばれ、核酸のその相補（鋳型）鎖に結合することによって、転写伸長を停止させる（ニールセン（Nielsen）ら、1993、Anticancer Drug Des 8：53〜63）。
【００１５】
本明細書において用いられるように、「カプサイシン受容体」または「カプサイシン受容体ポリペプチド」とは、i）本来のカプサイシン受容体ポリペプチド、ii）カプサイシン受容体ポリペプチドの生物活性断片、iii）カプサイシン受容体ポリペプチドの生物活性ポリペプチド類似体、またはiv）カプサイシン受容体ポリペプチドの生物活性変異体、のアミノ酸配列を有する組換え型または非組換え型ポリペプチドを意味する。本発明のカプサイシン受容体ポリペプチドは、如何なる種、特にヒト、齧歯類（例えばマウスもしくはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマを含む哺乳類、好ましくはラットまたはヒトから得てもよく、天然、合成、半合成、または組換えであれ如何なる起源から得てもよい。本明細書において用いられる「カプサイシン受容体」という用語には、本明細書において詳細に説明するバニロイド受容体サブタイプ1（VR1）が含まれるが、VR1に限定するつもりはなく、特に一般的に受容体サブタイプVR1およびVR2を指すために用いてもよい。
【００１６】
本明細書において用いるように、「カプサイシン受容体関連ポリペプチド」とは、本明細書において「VRRP-1」または「VR2」と呼ぶ、i）本来のカプサイシン受容体関連ポリペプチド、ii）カプサイシン受容体関連ポリペプチドの生物活性断片、iii）カプサイシン受容体関連ポリペプチドの生物活性ポリペプチド類似体、またはiv）カプサイシン受容体関連ポリペプチドの生物活性変異体、のアミノ酸配列を有する組換え型または非組換え型ポリペプチドを意味する。本発明のカプサイシン受容体ポリペプチドは、如何なる種、特にヒト、齧歯類（例えばマウスもしくはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマを含む哺乳類、好ましくはラットまたはヒトから得てもよく、天然、合成、半合成、または組換えであれ如何なる起源から得てもよい。本明細書において用いられる「カプサイシン受容体関連ポリペプチド」という用語はまた、同じ種（例えば、ラットまたはヒトカプサイシン受容体ポリペプチド）のカプサイシン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約40％、好ましくは少なくとも約45％、より好ましくは少なくとも約49％同一性を有する如何なるポリペプチドも含む。「カプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列」という用語はまた、同じ種のカプサイシン受容体ポリペプチドのヌクレオチド配列と少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約55％、より好ましくは少なくとも約59％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、カプサイシン受容体関連ポリペプチドはカプサイシン受容体と相互作用する。本明細書に用いられる「カプサイシン受容体関連ポリペプチド」は、本明細書に詳細に説明するバニロイド受容体関連ポリペプチド１（VRRP-1）を含むが、VRRP-1に限定するつもりはない。
【００１７】
本明細書において用いるように、「抗原性アミノ酸配列」とは、単独または担体分子と関連して、哺乳類において抗体反応を誘発することができるアミノ酸配列を意味する。
【００１８】
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの「変異体」は、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列として定義される。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する、例えばロイシンをイソロイシンに置換するような「保存的」変化を有しうる。よりまれに、変異体は「非保存的置換」、例えばグリシンのトリプトファンへの置換を有しうる。類似の軽度の変化でも同様にアミノ酸の欠失もしくは挿入またはその双方を含むことができる。生物学的または免疫学的活性を阻害することなく、いずれの、およびどれほど多くのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばDNAスター・ソフトウェアを用いて発見することができる。
【００１９】
「欠失」はその中で１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在するカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化として定義される。
【００２０】
「挿入」または「付加」は、天然に存在するカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれアミノ酸またなヌクレオチド残基１つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
【００２１】
「置換」とは、天然に存在するカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸またはヌクレオチド１つ以上がそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに置換された結果である。
【００２２】
「生物学的に活性」とは、天然に存在するカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの構造的、調節的、または生化学的機能をそれぞれ有するカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連蛋白質を指す。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然、組換え型、または合成カプサイシン受容体（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド）、またはそのオリゴヌクレオチドの、適当な動物または細胞における特異的免疫反応誘発能、および特異的抗体との結合能を定義する。
【００２３】
本明細書において用いられる「誘導体」という用語は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする核酸の化学的改変を指す。そのような改変の例は、水素をアルキル、アシル、またはアミノ基に置換することであろう。核酸誘導体は天然のカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの本質的な生物学的特徴を保持するポリペプチドをコードするであろう。
【００２４】
本明細書において用いられるように「単離」という用語は、化合物が天然に存在する環境とは異なる環境に存在する対象化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を記述することを意味する。「単離」とは、対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物、および／または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも60％、好ましくは75％、および最も好ましくは90％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す。
【００２６】
「ストリンジェンシー」とは、典型的に約Tm-５℃（プローブのTmより５℃下）からTmの約20℃〜25℃下の範囲で起こる。当業者によって理解されるように、ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために、または類似もしくは関連するポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出するために用いることができる。
【００２７】
本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「それによって核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と結合するプロセス」を含むであろう（クームス（Cooms）、1994、「バイオテクノロジー辞典（Dictionary of Biotechnology）」、ストックトン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州）。ポリメラーゼ連鎖反応技術において行われるように増幅は、ディーフェンバッハ（Dieffenbach）ら、1995、PCRプライマー、実験マニュアル、コールドスプリングハーバープレス、プレインビュー、ニューヨーク州に記載されている。
【００２８】
「トランスジーン」という用語は、本明細書において哺乳類、特に生存している動物の哺乳類細胞のゲノムに挿入されている、または人為的に挿入されようとする遺伝子材料を記述するために用いられる。
【００２９】
「トランスジェニック動物」とは、その細胞の一部に染色体外エレメントとして存在する、またはその生殖系列DNA（その細胞のほとんどまたは全てのゲノム配列において）に安定に組み入れられた非内因性（例えば異種）核酸配列を有するヒト以外の動物、通常哺乳類を意味する。異種核酸は、そのようなトランスジェニック動物の生殖系列に、例えば宿主動物の胚または胚幹細胞の遺伝子操作によって導入される。
【００３０】
トランスジーンの「ノックアウト」とは、好ましくは標的遺伝子の発現が検出不能または有意でなくなるように、標的遺伝子の機能の低下が起こる遺伝子配列の変化を意味する。例えば、カプサイシン受容体遺伝子のノックアウトは、カプサイシン受容体発現が検出できないか、または有意でないレベルで存在するに過ぎないように、カプサイシン受容体の機能が実質的に低下していることを意味する。本発明の「ノックアウト」トランスジェニック体は、カプサイシン受容体遺伝子またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを有するトランスジェニック動物となりうる。「ノックアウト」にはまた、例えば標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を暴露した場合、標的遺伝子部位での組換えを促進する酵素（例えば、Cre-lox系におけるCre）を導入した場合、または標的遺伝子の変化を生後に指向する他の方法を行う場合に標的遺伝子の変化が起こりうる、条件的ノックアウトも含まれる。
【００３１】
標的遺伝子の「ノックイン」とは、例えば、標的遺伝子のさらなるコピーを導入することによって、または標的遺伝子の内因性コピーの発現を増強する調節配列を機能的に導入することによって、標的遺伝子の発現が変化する（例えば、発現の増加（異所を含む）または発現の減少）宿主細胞ゲノムにおける変化を意味する。例えば、本発明の「ノックイン」トランスジェニック体は、カプサイシン受容体遺伝子のヘテロ接合またはホモ接合ノックインを有するトランスジェニック動物となりうる。「ノックイン」はまた、条件付きノックインを含む。
【００３２】
本明細書に提供する主な遺伝子配列は以下の通りである：
0004444493.tif 000002
【００３３】
発明の概要
本発明は、カプサイシン受容体ポリペプチド（例えば、本明細書に記述のバニロイド受容体サブタイプ1（VR1）ポリペプチド）およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド（例えば、本明細書に記述のバニロイド受容体関連ポリペプチド１（VRRP-1；またはVR2））をコードするポリヌクレオチド配列の同定および単離に基づいている。対応する遺伝子配列はセクリスト（Seqlist）において得られ、上記の表に記載する。したがって、本発明はカプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチドと共に、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるカプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドを含む。
【００３４】
カプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチドは、当初、カプサイシン受容体ポリペプチドコード配列が細胞解析において機能的カプサイシン受容体の発現を促進することから単離された。簡単に説明すると、カプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチドは、哺乳類または両生類宿主細胞に発現させると、アゴニストであるカプサイシンに暴露した際に宿主細胞において細胞内カルシウム濃度の増加を促進した。この研究によって、本明細書においてバニロイド受容体サブタイプ１（VR1）と呼ばれるカプサイシン受容体をコードするポリヌクレオチド配列が同定および単離された。次に、カプサイシン受容体コードVR1配列を用いて、PCR増幅によって関連ポリペプチドをコードする配列を単離し、その結果カプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列が単離および同定され、VRRP-1（VR2）はその一例である。
【００３５】
本発明はまた、カプサイシン受容体結合化合物、特にカプサイシン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するカプサイシン受容体結合化合物の同定に、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド核酸およびアミノ酸配列を使用することを含む。本発明はさらに、本明細書のカプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドとの相同性を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の同定および単離を容易にするのみならず、カプサイシン受容体生物活性に関連した疾患および／または疼痛を伴う症候群の診断、予防、および治療に、本明細書に開示のポリヌクレオチドを使用することを含む。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、哺乳類（ヒトを含む）におけるカプサイシン受容体、受容体サブタイプ、およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの構造、位置、および発現を明らかにするために、ならびに疾患状態または臨床疾患（特に急性および慢性疼痛または炎症を含む疾患）と、受容体の構造、発現、または機能の欠損または変化との関連の可能性を調べるために、分子プローブとして用いることができる。
【００３７】
カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列
本発明に従って、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いて、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをそれぞれ発現する組換え分子を産生することができる。本発明において用いられる核酸組成物は、適当であれば本発明のカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの全てまたは一部をコードしてもよい。DNA配列の断片は、従来の方法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、制限酵素消化によって、PCR増幅等によって得てもよい。たいていの場合、DNA断片は少なくとも約10連続ヌクレオチドであり、通常少なくとも約15ヌクレオチド、より通常、少なくとも約18ヌクレオチド〜約20ヌクレオチド、より通常、少なくとも約25〜約50ヌクレオチドであろう。そのような小さいDNA断片はPCR、ハイブリダイゼーションスクリーニング等のプライマーとして有用である。より大きいDNA断片、すなわち100 ヌクレオチド以上の断片はコードされたポリペプチドの産生に有用である。
【００３８】
ラットカプサイシン受容体（サブタイプVR1）の核酸および推定アミノ酸配列を配列番号：１および２に示す。ヒトカプサイシン受容体（サブタイプVR1）の核酸および推定アミノ酸配列は、配列番号：８〜９および26〜27に示す。マウスカプサイシン受容体サブタイプVR1をコードするヌクレオチド配列は配列番号：10および11の配列を含む。ニワトリカプサイシン受容体サブタイプVR1は配列番号：24および25として示される。
【００３９】
ラットカプサイシン受容体関連ポリペプチド１（VRRP-1；またはサブタイプVR2）の核酸および推定アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：３および４に示される。ヒトカプサイシン受容体関連ポリペプチド（ヒトVR2と呼ぶ）をコードする配列は配列番号：５〜７、および20〜23のヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの変異体も含む。好ましい変異体は、カプサイシン受容体サブタイプVR1またはVR2のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列類似性、より好ましくは少なくとも90％のアミノ酸配列類似性、さらにより好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列類似性を有する変異体である。
【００４１】
遺伝コードの縮重の結果として、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードし、そのいくつかは既知のおよび天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を有する、ヌクレオチド配列の多数の縮重変異体を産生することができることは当業者によって認識されると思われる。本発明は、可能性があるコドンの選択に基づいて組合せを選択することによって作製することができるヌクレオチド配列について考えられるありとあらゆる変異体を含む。これらの組合せは、天然に存在するカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝子コードに従って行うことができ、そのような変異体は全て本明細書において特に開示されると考えられる。
【００４２】
カプサイシン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびその変異体は好ましくは、適当に選択されたストリンジェンシー条件下で天然に存在するポリペプチドのヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるが、これは、実質的に異なるコドンを使用する受容体をコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を産生する場合に都合がよいであろう。コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される回数に応じて、特定の原核または真核発現宿主においてポリペプチドの発現が起こる割合が増加するように選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなく、カプサイシン受容体、カプサイシン受容体関連ポリペプチドおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変化させる他の理由には、天然に存在する配列から生じた転写物より望ましい特性を有するRNA転写物を産生することが含まれる。
【００４３】
カプサイシン受容体ポリペプチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチドおよび／またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列は、合成化学によって完全に合成することができ、その後本出願の提出時に当技術分野で周知の試薬を用いて、合成遺伝子を利用可能な多くのDNAベクターおよび発現系のいずれかに挿入することができる。その上、合成化学を用いてカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列に変異を導入することができる。
【００４４】
カプサイシン受容体サブタイプVR1またはVR2の提供された核酸配列のいずれかのヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。特に重要なものは、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのコード配列（例えば配列番号：１のヌクレオチド81〜2594位）、他のそのような配列（配列番号：２（例えば、配列番号：２のアミノ酸残基636〜706位）に存在するアミノ酸残基の連続したストレッチをコードする配列）との相同性を共有するカプサイシン受容体コード配列またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列の領域、および他のカプサイシン受容体コード配列および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列と相同性を有する領域を表す他の配列、と共に様々な種のカプサイシン受容体コード配列またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列を独自に同定する配列と、様々なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列である。特に重要であるのは、ヒトカプサイシン受容体ポリペプチドまたはヒトカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするカプサイシン受容体VR1またはVR2ポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、本明細書に参照として組み入れられるベルガー（Berger）ら、1987、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology、152巻、アカデミックプレス、サンジエゴ、カリフォルニア州に記載のように、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Tm）に基づき、規定されたストリンジェンシーで用いることができる。
【００４５】
本発明に従って用いることができる、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする変化したアミノ酸配列は、同じまたは機能的に同等なカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリペプチドが得られる異なるヌクレオチドの欠失、挿入または置換を含む。蛋白質はまた、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチドが得られるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含むことができる。カプサイシン受容体の生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性に基づいて、故意のアミノ酸置換を行うことができる。例えば、陰性荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる；陽性荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれる；ならびに類似の親水性値を有する非荷電極性基を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００４６】
カプサイシン受容体の対立遺伝子と共にカプサイシン受容体関連ポリペプチドの対立遺伝子もまた、本発明に含まれる。本明細書において用いるように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」という用語はカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのもう一つの形である。対立遺伝子は変異に起因し（すなわち核酸配列の変化）、一般に変化したmRNAおよび／またはポリペプチドを生じるが、これらは変化した構造を有する場合もあれば有しない場合もあり、または天然に存在するカプサイシン受容体もしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドと比較して機能的である場合もあれば機能的でない場合もある。所定の遺伝子は対立遺伝子型を有しないか、１個、または多くの対立遺伝子型を有する可能性がある。対立遺伝子を生じる共通の変異変化は、一般にアミノ酸の天然の欠失、付加または置換が原因である。これらのタイプの変化のそれぞれは、単独で、または他の変化と共に起こってもよく、所定の配列において１回または複数回起こってもよい。
【００４７】
他の種からのカプサイシン受容体コードポリヌクレオチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードポリヌクレオチドの単離
カプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチドコードポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用いて、本明細書に開示のカプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの相同体を同定およびクローニングすることができる。特に重要なものは、相同体が互いに実質的な配列類似性を有する、すなわち少なくとも40％、通常少なくとも60％、より通常少なくとも75％、通常少なくとも90％、より通常少なくとも95％の配列類似性を有する、哺乳類の相同体（特に開示のラットカプサイシン受容体コードおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列のヒト相同体）である。カプサイシン受容体の哺乳類相同体は同様に、推定されるポアループおよび第６の膜貫通ドメインの近傍で本明細書に開示のカプサイシン受容体と高度の類似性を示す可能性がある。これらの領域において、カプサイシン受容体相同体は高度の配列類似性、例えば少なくとも約40％のアミノ酸配列同一性、通常少なくとも約60％〜75％のアミノ酸配列同一性で、少なくとも約40％のヌクレオチド配列類似性、通常少なくとも約60％〜90％のヌクレオチド配列類似性を示す可能性がある。
【００４８】
配列類似性は、保存されたモチーフ、コード領域、隣接領域等のより大きい配列のサブセットであってもよい基準配列に基づいて計算される。基準配列は通常長さが少なくとも約18ヌクレオチド、より通常少なくとも約30ヌクレオチドであり、比較される完全な配列と同じ長さであってもよい。アルツシュル（Altshul）ら（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜10に記述のBLASTのような配列分析のアルゴリズムは当技術分野で周知である。プローブが非常に特異的な領域、例えば5'調節領域における10個の独自のヌクレオチドから作製される、またはより特異性が低い、例えば3'領域におけるヌクレオチドから作製されるものであれ、プローブが、カプサイシン受容体をコードする天然に存在する配列、対立遺伝子、または関連する配列のみを同定するか否かは、プローブの特異性およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（最高、高、中、低）によって左右されるであろう。
【００４９】
本発明のプローブを関連配列の検出に用いる場合、プローブは、本明細書に記載のカプサイシン受容体ポリペプチドコード配列またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードのいずれかからのヌクレオチドの、好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％を含む。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、提供されたVR1およびVR2ヌクレオチド配列、または天然に存在するカプサイシン受容体コード配列のプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含むその対応するするゲノム配列に由来することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、放射線核種（例えば、PまたはS）、または酵素標識（例えばアビジン／ビオチンカップリング系を通じてプローブとカップリングしたアルカリフォスファターゼ）等を含む多様なリポーター分子によって検出されるように標識することができる。
【００５０】
特定のハイブリダイゼーションプローブは、mRNAプローブを産生するために、提供された核酸配列をベクターにクローニングすることによっても産生することができる。当技術分野で既知であって市販されているそのようなベクターを用いて、適当なRNAポリメラーゼ（例えば、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ）および適当な放射活性標識ヌクレオチドを用いて、インビトロでRNAプローブを合成することができる。
【００５１】
類似の配列を有する核酸は、低ストリンジェンシー条件、例えば50℃で10×SSC（0.9 M生理食塩液／0.09 Mクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションおよび１×SSC中で55℃での洗浄を行っても結合し続けることによって検出される。配列の同一性はストリンジェントな条件下、例えば50℃以上、0.1×SSC（９ mM生理食塩液／0.9 mMクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって決定してもよい。プローブ、特に標識したDNA配列のプローブを用いることによって、相同体または関連する遺伝子を単離することができる。相同な遺伝子は、如何なる種、例えば霊長類、特にヒト；ラットおよびマウスのような齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）、カエンホラブディティス（Caenhorabditis）等に由来してもよい。特に重要なのは、ヒトカプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチドおよびヒトカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードポリヌクレオチドの同定および単離である。
【００５２】
カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド核酸配列を用いて、天然に存在するゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを産生することができる。配列は周知の技法を用いて特定の染色体または染色体の特定の領域にマッピングすることができる。これらの中には、染色体スプレッドとのインサイチューハイブリダイゼーション、フローソーティングした染色体調製物、またはプライス（Price）1993；Blood Rev. 7：127〜34およびトラスク（Trask）1991；Trends Genet. 7：149〜54の論評に見られるように、酵母の人工染色体、細菌の人工染色体、細菌のP1構築物または単染色体cDNAライブラリのような人工染色体構築物が含まれる。染色体スプレッドの蛍光インサイチューハイブリダイゼーションは、例えば、ベルマ（Verma）ら、1988、「ヒト染色体：基本技術マニュアル（Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques）」、パーガモン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州に記載されている。
【００５３】
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列の染色体マッピングから得られた情報は、さらなる遺伝子マップデータと相関させることができる。カプサイシン受容体コード配列、またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列の物理的染色体マップ上での位置と、特定の疾患（または特定の疾患に対する素因）との相関は、遺伝子疾患に関連したDNA領域の範囲を定める際に有用となりうる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常、キャリア、または罹患した人における遺伝子配列の差（例えば、転座、逆位等による染色体の位置の差、またはカプサイシン受容体もしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列の挿入変異もしくは欠失によるカプサイシン受容体コード領域におけるその他の差）を検出することができる。そのような情報から利益が得られる可能性がある障害の例は、複合限局（complex regional）疼痛症候群、反射交感神経ジストロフィー、帯状疱疹後神経痛、乾癬、気道過敏疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患）、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病性ニューロパシー、AIDS関連ニューロパシー、および遺伝性ニューロパシー（例えばカプサイシン受容体機能障害に関連するもの）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００５４】
カプサイシン受容体コードポリヌクレオチド配列の伸長
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーターおよび調節エレメントのような上流の配列を検出するために、部分的ヌクレオチド配列および当技術分野で既知の様々な技法を利用して伸長させることができる。ゴビンダ（Gobinda）ら、1993；PCR Methods Applic. 2：318〜22は、既知の座に隣接する不明の配列を検索するために万能プライマーを用いる直接法として、「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を開示している。最初にゲノムDNAをリンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。同じリンカープライマーおよび最初のプライマーより内側のもう一つの特異的プライマーを用いて、増幅された配列に第二ラウンドのPCRを行う。各ラウンドのPCR産物を適当なRNAポリメラーゼで転写して逆転写酵素を用いてシークエンシングする。
【００５５】
逆PCRは、既知の領域に基づいた多様なプライマーを用いて配列を増幅または伸長させるために用いることができる（トリグリア（Triglia）ら、1988、Nucleic Acids Res. 16：8186）。プライマーはOLIGO（登録商標）4.06プライマー分析ソフトウェア（1992；ナショナル・バイオサイエンシズ・インク、プリマス、ミネソタ州）、または他の適当なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチド、GC含有量が50％以上、および約68℃〜72の温度で標的配列とアニーリングするように、デザインすることができる。この方法は、遺伝子の既知の領域において適した断片を作製するためにいくつかの制限酵素を用いている。次に断片を分子内ライゲーションによって環状化して、PCR鋳型として用いる。
【００５６】
捕獲PCR（ラガーストローム（Lagerstrom）1991、PCR Methods Applic.1：111〜19）は、ヒトおよび酵母の人工染色体DNAにおける既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅法である。捕獲PCRはまた、PCRの前に、操作された二本鎖配列をDNA分子の未知の部分に配置させるために、多数の制限酵素消化およびライゲーションを必要とする。
【００５７】
未知配列を検索するために用いることができるもう一つの方法は、パーカー（Parker）ら、1991：Nucleic Acids. Res. 19：3055〜60の方法である。さらに、ゲノムDNAの「中に入る」ためにPCR、ネステッドプライマー、およびプロモーター・ファインダーライブラリ（プロモーター・ファインダー（登録商標）クロンテック（パロアルト、カリフォルニア州））を用いることができる。このプロセスはライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン連結部の発見に有用である。好ましくは全長のcDNAを同定するために用いられるライブラリはより大きいcDNAを含めるようにサイズを選択されている。より好ましくは全長のcDNAを同定するために用いられるcDNAライブラリは、そのようなライブラリが対象配列の5'領域を含む配列をより多く含むという点において、ランダムプライマーを用いて作製されるcDNAライブラリである。ランダムにプライミングしたライブラリは、オリゴd(T)ライブラリによって全長のcDNAが得られない場合には特に有用となりうる。ゲノムライブラリは、対象配列の5'非翻訳調節領域の同定および単離にとって好ましい。
【００５８】
毛細管電気泳動は、PCR産物のヌクレオチド配列の大きさを分析するため、ヌクレオチド配列を確認するため、またはシークエンシングするために用いることができる。迅速なシークエンシングの系はパーキン・エルマー、ベックマンインストルメンツ（フュラートン、カリフォルニア州）および他の企業から利用できる。毛細管シークエンシングは、電気泳動分離用流動性ポリマー、異なる４つのレーザー活性化蛍光色素（各ヌクレオチドについて１個）、および蛍光色素によって放出された波長を検出するための電荷カップリング装置カメラを用いることができる。アウトプット／光の強度を、適当なソフトウェア（例えば、パーキン・エルマー社のゲノタイパー（登録商標）およびシークエンシングナビゲーター（登録商標））を用いて電気信号に変換する。試料のローディングからコンピューター分析および電子データ表示までの全てのプロセスはコンピューターにより制御される。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量しか存在しないDNAの小片のシークエンシングに特に適している。毛細管電気泳動はM13ファージDNAの350 bpまでを30分で再現性よくシークエンシングする（ルイス・マルチネス（Ruiz-Martinez）ら、1993、Anal. Chem. 65：2851〜2858）。
【００５９】
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの産生
本発明に従って、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの断片、融合蛋白質、およびその機能的同等物を含む）は、適当な宿主細胞においてカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの発現を指向する組換えDNA分子において用いることができる。遺伝子コードの固有の縮重性により、実質的に同じまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を用いて、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをクローニングおよび発現させることができる。当業者によって理解されるように、天然に存在しないコドンを有するカプサイシン受容体コードヌクレオチド配列およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードヌクレオチド配列を産生することが有利であろう。例えば発現率を増加させるため、または望ましい特徴を有する（例えば、天然に存在する配列から生じた転写物より長い半減期）組換えRNA転写物を産生するために、特定の原核生物、または真核生物宿主にとって好ましいコドン（ミュレイ（Murray）ら、1989 Nuc. Acids. Res. 17：477〜508）を選択することができる。
【００６０】
本発明のヌクレオチド配列を操作して、多様な理由から、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を促進する変化を含むが、これらに限定しない、カプサイシン受容体コード配列またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列を変化させるために操作することができる。例えば、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変化させるため、コドン選択性を変化させるため、スプライス変異体を産生する等のために、当技術分野で周知の技術、例えば部位指向変異誘発を用いて変異を導入することができる。
【００６１】
本発明のもう一つの態様において、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする天然の、改変した、または組換えポリペプチドを、融合蛋白質をコードする異種配列とライゲーションすることができる。そのような融合蛋白質はまた、異種ポリペプチド配列がカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドから切断されて精製することができるように、カプサイシン受容体ポリペプチドコード配列（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列）と異種ポリペプチド配列との間の切断部位を含むように操作することができる。
【００６２】
本発明の別の態様において、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、全合成または部分合成することができる（例えば、カルタース（Caruthers）ら、1980、Nuc Acids. Res. Symp. Ser. 215〜23、ホルン（Horn）ら、Nuc. Acids. Res. Symp. Ser. 225〜32）。または、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのアミノ酸配列を全合成または部分合成するために、ポリペプチドそのものを化学的方法によって産生することができる。例えば、ペプチド合成は様々な固相技法（ロベルジ（Roberge）ら、1995、Science 269：202〜204）を用いて行うことができ、例えば、ABI 431Aペプチドシンセサイザー（パーキン・エルマー社）を用いて、製造元の説明書に従って自動合成を行うことができる。
【００６３】
新たに合成されたポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、クレイトン（Creighton）1983、「蛋白質、構造と分子の基本（Proteins, Structures and Molecular Principles）」、WH フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ニューヨーク州）によって実質的に精製することができる。合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（例えば、エドマン分解法；クレイトン（Creighton）、上記）。さらに、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド、またはその一部のアミノ酸配列は、変異ポリペプチドを作製するために、直接合成の際に変化させることができ、および／または化学的方法を用いて他の蛋白質からの配列、またはその一部と組み合わせることができる。
【００６４】
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド発現系
本発明は、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの個々の、または組み合わせた発現（例えば共発現）を含む。生物学的に活性なカプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドを発現するために、カプサイシン受容体ポリペプチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチド、および／またはその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを有するベクターに挿入する。当技術分野で周知の方法を用いて、望ましいポリペプチドコード配列および適当な転写または翻訳制御手段を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技法、合成技法およびインビボ組換えまたは遺伝子組換え技法が含まれる。そのような技法はサムブルック（Sambrook）ら、1989、「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバープレス、プレインビュー、ニューヨーク州、およびアウスユベール（Ausubel）ら、1989「分子生物学の現行プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州に記載されている。
【００６５】
多様な発現ベクターおよび／または宿主細胞系を用いてカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列を発現することができる。これらには、両生類の卵母細胞（例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞）；組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）にトランスフェクトさせた、または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）によって形質転換した植物細胞系；または動物（例えば、哺乳類）細胞系が含まれるが、これらに限定しない。好ましくは本発明の配列、特にカプサイシン受容体コード配列は、哺乳類細胞系（例えばヒト胎児腎細胞（例えばHEK細胞））、両生類の卵母細胞（例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞に相補的カプサイシン受容体コードRNAを注射することによって）、または培養において容易に増殖させることができ、カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列を一過性もしくは安定に発現、好ましくは安定に発現するように形質転換もしくはトランスフェクトすることができる他の宿主細胞、において発現する。
【００６６】
宿主細胞は、カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに関して、細胞が、挿入された配列の発現を調節する、または発現された蛋白質を望み通りに処理することができるか否かによって、選択することができる。ポリペプチドのそのような改変には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、燐酸化、脂質付加、およびアシル化が含まれるがこれらに限定しない。蛋白質の「プレプロ」型の切断を含む翻訳後のプロセシングも、ポリペプチドの正確な折り畳み、膜への挿入、および／または機能のために重要であるかも知れない。HEK 293、CHO、HeLa、MDCK、WI38、アフリカツメガエルの卵母細胞、およびその他のような宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的メカニズムを有しており、導入された異物ポリペプチドの正確な改変およびプロセシングが確実に行われるように選択してもよい。
【００６７】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの発現に用いられるベクターは、その中にカプサイシン受容体ポリペプチドが発現される宿主細胞、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドが単一の構築物から共発現されるのか、または異なる構築物から共発現されるのか、そして産生されるポリペプチドについて意図している用途を含む多様な要因によって変化するであろう。例えば、大量のカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドを必要とする場合（例えば抗体産生のため）、容易に精製することができる融合蛋白質の高レベル発現を指向するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターには、例えば、Bluescript（登録商標）（ストラタジーン社；ポリペプチドβ-ガラクトシダーゼハイブリッド蛋白質を産生する）のような多機能大腸菌クローニング発現ベクター、およびpGEXベクター（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州；グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合蛋白質を産生する）を含む細菌発現ベクターが含まれる。宿主細胞が酵母（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）である場合、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHのような構成的または誘導型プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる。例えば、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）、およびグラント（Grant）ら、1987、Methods in Enzymology 153：516〜544を参照のこと。
【００６８】
宿主細胞が哺乳類細胞の場合、多くの発現系を用いることができる。例えば、発現ベクターは、アデノウイルス、SV40、CMV、またはRSVヌクレオチド配列に由来する発現系のようなウイルスに基づく発現系に由来することができる。発現効率は、用いる細胞系にとって適当なエンハンサーを含めることによって増強することができる（シャーフ（Scharf）ら、1994 Results Probl Cell Differ. 20：125〜62；ビットナー（Bittner）ら、1987、Methods in Enzymol. 153：516〜544）（例えばRSVエンハンサーは哺乳類宿主細胞において発現を増加させるために用いることができる）。
【００６９】
これらの系における「制御エレメント」または「調節配列」とは、その強度および特異性は異なるが、対象とするヌクレオチド配列の転写および翻訳を促進するために宿主細胞蛋白質と相互作用するベクター、エンハンサー、プロモーターおよび3'非翻訳領域のような非翻訳領域である。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導型プロモーターを含む如何なる数の適した転写および翻訳エレメントも用いることができる。そのような制御エレメントまたは調節配列は、カプサイシン受容体コードポリヌクレオチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコードヌクレオチドが発現される宿主細胞に応じて選択される。例えば、哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスからのプロモーターが最も適当である。カプサイシン受容体ポリペプチドコード配列および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列の多数のコピーを含む細胞株を産生することが望ましい場合、SV40またはEBVに由来するベクターを他の選択的ベクターエレメント、例えば適当な選択マーカーと共に用いることができる。
【００７０】
カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列を効率よく翻訳するためには、特異的開始シグナル、例えばATG開始コドンおよび細菌発現のための隣接領域も必要となる場合がある。その開始コドンおよび上流の配列を含む本来の配列を適当な発現ベクターに挿入する場合には、さらなる転写制御シグナルは必要でない。コード配列のみ、またはその一部が発現ベクターに挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性転写制御シグナルを提供しなければならない。さらに、全インサートの転写を確実にするために開始コドンは正しいリーディング・フレームに存在しなければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは様々な起源に由来することができ、天然であっても合成であってもよい。
【００７１】
組換えポリペプチドを長期にわたって高収率で産生することが望ましい場合には、安定な発現が好ましい。例えば、カプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドを安定に発現する細胞株を、ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を栄養に富む培地で増殖させてから選択培地に暴露することができる。選択培地に対する抵抗性を付与する選択マーカーは、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定な抵抗性の形質転換細胞を、宿主細胞タイプにとって適当な細胞培養技法を用いて増殖させることができる。
【００７２】
如何なる数の選択系も形質転換した細胞株を回収するために用いることができる。これらの中には、それぞれtk-またはaprt-細胞において用いることができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ウィグラー（Wigler）ら、1977 Cell 11：223〜32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ロウイ（Lowy）ら、1980、Cell 22：817〜23）遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。同様に、抗代謝物質または抗生物質抵抗性を選択の根拠として用いることができる；例えばメソトレキサートに対する抵抗性を付与するdhfr（ウィグラー（Wigler）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 77：3567〜70）；およびアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する抵抗性を付与するnpt（コルベール・ガラピン（Colbere-Garapin）ら、1981、J. Mol. Biol. 150：1〜14）。さらなる選択遺伝子、例えばそれによって細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するtrpB、またはそれによって細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するhisDが記述されている（ハートマン（Hartman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 85：8047〜51）。選択マーカーはまた、アントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質であるGUS、およびルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンのような肉眼で確認できるマーカーを含む。そのような肉眼で確認できるマーカーは、形質転換体の同定および特定のベクター系に帰することができる一過性または安定な蛋白質発現量の定量に有用である（ローズ（Rhodes）ら、1995 Methods Mol. Biol. 55：121〜131）。
【００７３】
または、カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに対するコード配列を含み、それらを発現する宿主細胞は、当技術分野で既知の多様な技法によって同定することができる。これらの技法には、核酸または蛋白質を検出および／または定量するためのDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、および蛋白質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術が含まれるがこれらに限定しない。
【００７４】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の有無は、プローブ、カプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または断片を用いたDNA-DNA、DNA-RNAハイブリダイゼーション、またはPCR増幅によって検出することができる。核酸増幅に基づく解析法には、望ましいDNAまたはRNAを含む形質転換体を検出するために、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを使用することが含まれる。本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、少なくとも約10ヌクレオチドおよび多くとも約60ヌクレオチド、好ましくは約15〜30ヌクレオチド、より好ましくはプローブまたはアンプリマーとして用いることができる約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を指す。
【００７５】
蛋白質特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、特定の蛋白質の発現を検出および測定するための多様なイムノアッセイ法は当技術分野に既知である。例には酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）が含まれる。これらおよび他の解析法は、例えばハンプトン（Hampton）ら、1990、「血清学的方法実験マニュアル（Serological Methods, A Laboratory Manual）」、APSプレス、セントポールMN＆マドックス（St Paul MN and Maddox）ら、1983、J. Exp. Med. 158：1211に記載されている。
【００７６】
多様な検出可能な標識および結合技法は当技術分野で既知であり、様々な核酸およびアミノ酸解析において用いることができる。カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列に関連した配列を検出するために、標識したハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを産生する手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識したヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。または、mRNAプローブを産生するために、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をベクターにクローニングすることができる。mRNAプローブを産生するためのベクターおよび方法は当技術分野で周知である。適したリポーター分子または標識には、それぞれが本明細書に参照として組み入れられる、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号および第4,366,241号に記載のように、放射線核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素産生物質と共に、基質、共因子、阻害剤、磁性粒子等が含まれる。
【００７７】
好ましい態様において、カプサイシン受容体活性を調べる機能的解析法を用いて、カプサイシン受容体を発現する宿主細胞をスクリーニングして選択する。例えば、機能的なカプサイシン受容体を発現する宿主細胞は、カプサイシン受容体結合化合物（例えばカプサイシンまたはレシニフェラトキシン）に暴露した際の細胞内カルシウム濃度の変化に関してスクリーニングすることができる。カプサイシン受容体結合化合物がカプサイシン受容体アゴニストである場合、アゴニスト化合物とカプサイシン受容体との結合により、カプサイシン受容体コード核酸を発現する宿主細胞において細胞内カルシウム濃度の増加が起こる。細胞内カルシウム濃度をモニターする方法および組成物（例えば、fura-2）は当技術分野で周知である。
【００７８】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの精製
そのコードポリヌクレオチドを同定した後のポリペプチドの製造法は、当技術分野で周知である。カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によって形質転換した宿主細胞は、コードされるポリペプチドの細胞培養での発現および培養からの回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞によって産生されたポリペプチドは、配列および／または使用したベクターに応じて分泌されるか、または細胞内に保存されてもよい。当業者によって理解されるように、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞または真核細胞膜を通じてコードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列と共にデザインすることができる。
【００７９】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドの精製は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列とインフレームで発現させる場合に精製促進ドメインを有する融合蛋白質を提供する、１つ以上のポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列を含む組換え構築物を用いることによって促進することができる（クロール（Kroll）ら、1993 DNA Cell Biol. 12：441〜53）。さらに精製を促進するために、精製ドメインとカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード配列との間に切断可能なリンカー配列を含むことができる。
【００８０】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチド（そのポリペプチドのそれぞれが本来のアミノ酸配列の一部を有するポリペプチドを含む）はまた、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって産生することができる（例えば、スチュワート（Stewart）ら、1969、「固相ペプチド合成（Solid-Phase Peptide Synthesis ）」、WHフリーマンカンパニー、サンフランシスコ；メリフィールド（Merrifield）、1963、J. Am. Chem. Soc. 85：2149〜2154）。カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの様々な断片は、個別に化学合成して、全長の分子を産生するために化学的方法を用いて組み合わせることができる。
【００８１】
人工合成または組換え産生後に望ましいポリペプチドを精製する方法はルーチンであり、当技術分野で周知である。
【００８２】
カプサイシン受容体ポリペプチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチド、およびカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする核酸の使用
上記の用途のほかに、本明細書に開示のヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、抗体産生、カプサイシン受容体機能に影響を及ぼすカプサイシン受容体結合結合化合物およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド結合化合物の同定（例えば、薬物スクリーニング解析において）、およびカプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド配列の同定を含む、多様な方面で用いることができる。さらに、カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列を診断解析（例えば、出生前または生後の診断）に用いることができる。さらに、カプサイシン受容体コード配列およびそのコードされたポリペプチドはまた、試料中（例えば天然物から、例えばチリペッパー抽出物）のカプサイシン含有量を評価する、または物質（例えば、食品に対する芳香増強添加剤として用いられる候補物質）のカプサイシン促進作用を評価する解析法に用いることができる。
【００８３】
本発明の配列のこれらおよび他の適用は、下記により詳細に説明する。
【００８４】
カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド結合化合物のスクリーニング
そのそれぞれが生物学的に活性な断片もしくは免疫原性断片を含むカプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドまたはそのオリゴペプチドは、例えば、カプサイシン受容体に特に結合してその機能に影響を及ぼすことによって、またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに特異的に結合してカプサイシン受容体とのその相互作用に影響を及ぼし、それによってカプサイシン受容体受容体活性に影響を及ぼすことによって、カプサイシン受容体活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするために用いることができる。そのような化合物の同定は多様な薬物スクリーニング技術を用いて行うことができる。特に重要なものは、カプサイシン受容体機能に影響を及ぼす活性を有する物質の同定である。そのような物質は、少なくとも一部カプサイシン受容体活性に関連した炎症疾患（例えば、乾癬、気道過敏疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患））、関節炎（例えば、変形性関節炎、リウマチ性関節炎）の治療開発の、および鎮痛薬として用いるための候補物質である。ヒト細胞に対して毒性が低い物質のスクリーニング解析は特に重要である。そのような試験において用いられるポリペプチドは溶液中で遊離である、固相支持体に結合している、細胞表面上に存在する、または細胞内に存在することができる。本発明のスクリーニング解析は、一般に物質のカプサイシン受容体ポリペプチドとの結合能またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドとの結合能、および／またはカプサイシン受容体関連またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド関連生物活性（すなわち、機能的解析または放射リガンド結合解析を用いた解析法）の誘発または阻害能に基づいている。
【００８５】
本明細書において用いられる「物質」という用語は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの望ましい生理的機能を変化させる（すなわち、誘発または阻害する）、または模倣することができる分子、例えば蛋白質または製剤を記述する。一般的に、様々な濃度に対する異なる反応を得るために多数の解析混合物を物質の異なる濃度について平行して実施する。典型的に、これらの濃度の一つは陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出限界以下である。
【００８６】
候補物質は多数の化学クラスを含むが、典型的にそれらは有機分子、好ましくは分子量50以上で約2,500ダルトン以下の有機小分子である。候補物質は蛋白質との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、典型的に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基１個、好ましくは官能化学基少なくとも２個を含む。候補物質はしばしば、上記官能基１個以上によって置換された環状炭素または複素環式構造および／または芳香環または多芳香環構造を含む。候補物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、その構造的類似体またはその組合せを含むがこれらに限定しない。
【００８７】
候補物質は合成または天然化合物のライブラリを含む多様な起源から得られる。例えば、ランダムオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向合成のために多数の手段を利用できる。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形での天然化合物のライブラリ（カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに影響を及ぼす内因性因子を同定するためにヒト組織からの抽出物を含む）は利用可能であり、容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリおよび化合物は従来の化学、物理、および生化学手段によって容易に改変され、組合せライブラリを作製するために用いてもよい。構造的類似体を産生するために、既知の薬剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような指向またはランダム化学改変を行ってもよい。
【００８８】
好ましくは、用いられる薬剤スクリーニング技法は、カプサイシン受容体、カプサイシン受容体関連ポリペプチドに対する適した結合親和性を有する、および／または望ましいカプサイシン受容体関連またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド関連反応を誘発する化合物の高処理能スクリーニングを提供する。例えば、異なる小さいペプチド試験化合物を、プラスチックピン、または他の表面（例えば、1984年９月13日に公開されたゲイセン（Geysen）、国際公開公報第84/03564号を参照のこと）のような固相基質上で多数合成することができ、ペプチド試験化合物をカプサイシン受容体ポリペプチド（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド）と接触させ、未反応物質を洗浄して、結合したカプサイシン受容体（または結合したカプサイシン受容体関連ポリペプチド）を検出可能な標識によって検出する、またはカプサイシン受容体活性（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド活性）に関連した生物活性の検出によって検出する。精製したカプサイシン受容体または精製したカプサイシン受容体関連ポリペプチドはまた、インビトロ薬物スクリーニング技法において用いるためにプレートに直接コーティングすることができる。または、非中和抗体を用いてポリペプチドを捕獲して、これを固相支持体に固定することができる。
【００８９】
本発明はまた、カプサイシン受容体特異的中和抗体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド特異的中和抗体が、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの結合に対して、試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニング解析を使用することを含む。このようにして、抗体は、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドと１つ以上の抗原性決定因子を共有するポリペプチドの存在を検出するために用いることができる。
【００９０】
候補物質のスクリーニング
カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド結合物質を同定するために、標識したインビトロ結合解析、蛋白質結合を調べるイムノアッセイ法等の多様な解析法を用いてもよい。例えば、カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドを大量に産生することによって、蛋白質に結合する、蛋白質の作用を調節または模倣するリガンドまたは基質を同定することができる。精製した蛋白質はまた、３次元結晶構造の決定に用いてもよく、これを分子間相互作用のモデリングに用いることができる。
【００９１】
スクリーニング解析は、１つ以上の分子が標識に結合し、標識が直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する結合解析であってもよい。様々な標識には、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等の対が含まれる。特異的結合メンバーに関しては、既知の技法に従って、相補的メンバーを通常、検出を提供する分子で標識する。
【００９２】
本明細書に記述のスクリーニング解析には多様なその他の試薬を含んでもよい。解析法が結合解析である場合、これらの中には、最適な蛋白質・蛋白質結合、蛋白質・DNA結合を促進するため、および／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させるために用いられる塩、中性蛋白質、例えばアルブミン、界面活性剤等の試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のような解析効率を改善する試薬を用いてもよい。必須の結合を提供する成分の混合物は如何なる順序で加えてもよい。インキュベーションは適した温度、典型的に４〜40℃で行われる。インキュベーション期間は最適な活性が得られるように選択されるが、迅速な高処理能のスクリーニングを促進するように最適にしてもよい。典型的に0.1〜１時間で十分であろう。
【００９３】
機能的カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドスクリーニング解析
好ましくは、カプサイシン受容体結合化合物は、カプサイシン受容体発現宿主細胞における陽イオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、グアニジニウム、コバルト、カリウム、セシウム、ナトリウム、および塩素、好ましくはカルシウム）の細胞内濃度に及ぼす作用、リガンド活性化伝導、細胞死（すなわち例えば形態学的解析、化学解析または免疫学的解析法を用いてモニターすることができる受容体媒介細胞死）、カプサイシン受容体発現細胞の脱分極（例えば、電圧感受性蛍光色素を用いて）、セカンドメッセンジャー産生（例えば、ラジオイムノアッセイ法またはELISAによって検出することができる環状GMPレベルの変化を検出することによって（例えばウッド（Wood）ら、1989、J. Neurochem. 53：1203〜1211を参照のこと））、カルシウム誘導リポーター遺伝子発現（例えば、ジンティ（Ginty）1997、Neuron 18：183〜186を参照のこと）、またはカプサイシン受容体活性に関連した他の容易に解析可能な生物活性、またはカプサイシン受容体活性の阻害のような、カプサイシン受容体機能に関連した生物活性をモニターする機能的解析において、アゴニストまたはアンタゴニスト作用の有無をスクリーニングする。好ましくは、機能的解析は、多数の試料を同時にスクリーニングする高処理能スクリーニングを用いて、例えば、カプサイシン受容体活性の変化に関連する蛍光の変化の検出に基づく機能的解析法を用いて解析することができる、カプサイシン受容体の生物活性の検出に基づく。そのような機能的解析法はカプサイシン受容体アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとしての活性の有無について候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【００９４】
好ましい態様において、カプサイシン受容体発現細胞（好ましくは組換えカプサイシン受容体発現細胞）は、蛍光標識カルシウム（例えばfura-2）で予めローディングする。カプサイシン受容体発現細胞を候補となるカプサイシン受容体結合化合物に暴露して、その化合物に対する暴露の影響をモニターする。カプサイシン受容体アゴニスト活性を有する候補化合物は、カプサイシン受容体発現細胞と接触させると、対照細胞（例えば、候補化合物の非存在下でのカプサイシン受容体発現細胞、カプサイシン受容体コード核酸を含まない宿主細胞、既知のカプサイシン受容体アゴニストに暴露されたカプサイシン受容体発現細胞）と比較して細胞内カルシウムのカプサイシン受容体による増加を誘発する。同様に、機能的カプサイシン受容体解析を用いて、既知のカプサイシン受容体アゴニストの活性を遮断する（例えば、カプサイシンまたはレシニフェラトキシンの活性を遮断する、または競合する）、既知のカプサイシン受容体アンタゴニストの活性を遮断する（例えば、カプサゼピンの活性を遮断する、または競合する）、および／またはカプサイシン受容体アンタゴニストとしての活性を有する候補化合物を同定することができる。
【００９５】
もう一つの態様において、本発明は、カプサイシン受容体関連ポリペプチドに結合し、それによって例えば宿主細胞における陽イオンの細胞内濃度によって検出されるカプサイシン受容体関連機能に対してアゴニストまたはアンタゴニスト作用を誘発する化合物を同定する方法を含む。このため、機能的解析はカプサイシン受容体（例えば、VR1）のみを発現する宿主細胞、ならびにカプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドを共発現する（例えばVR1およびVRRP-1）細胞を接触させることを含む。カプサイシン受容体関連ポリペプチドの機能に影響を及ぼすことによってカプサイシン受容体活性に影響を及ぼす化合物は、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドを共発現する細胞におけるカプサイシン受容体関連活性に影響を及ぼすが、カプサイシン受容体のみを発現する宿主細胞におけるカプサイシン受容体関連活性には有意な影響を及ぼさない化合物である。例えば、カプサイシン受容体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチドを共発現する細胞において細胞内カルシウムのカプサイシン受容体媒介増加を誘発するが、カプサイシン受容体のみを発現する細胞では誘発しない化合物は、カプサイシン受容体関連ポリペプチドとの相互作用を通じてカプサイシン受容体アゴニスト活性を誘発する化合物であると同定される。
【００９６】
本発明のスクリーニング解析によって同定されたカプサイシン受容体活性に影響を及ぼす物質を含む薬学的組成物および他の組成物
カプサイシン受容体結合化合物およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド結合化合物は、カプサイシン受容体媒介生理学的反応を誘発または阻害するために有用であり、慢性疼痛、炎症、およびカプサイシン受容体媒介活性に関連した他の生理的反応に関連した症状を緩和するための薬学的組成物において特に有用となりうる。
【００９７】
望ましい薬理活性を有する化合物は、カプサイシン受容体活性が原因で起こる疾患の治療のために、宿主に対して生理学的に許容される担体と共に投与してもよい。または、同定された化合物は、カプサイシン受容体機能を増強、調節、またはそうでなければ操作するために用いてもよい。治療物質は、局所、皮下、腹腔内、血管内、経口、クモ膜下、表皮、小胞内（例えば、神経因性膀胱症候群を治療するための膀胱洗浄の場合のように）、非経口的等のような多様な方法で投与してもよい。喘息のような疾患に関連したカプサイシン受容体関連炎症の治療にとって、吸入治療は特に重要である。
【００９８】
投与様式に応じて化合物は多様な方法で製剤化してもよい。治療的に活性な化合物の製剤中の濃度は約0.1〜100重量％まで変化してもよい。薬学的組成物は、顆粒、錠剤、丸剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏、ローション剤等のような様々な剤形に調製することができる。選択された投与経路に適した製薬等級の有機または無機担体および／または希釈剤を用いて、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製することができる。当技術分野で既知の希釈剤には、水性基剤、植物および動物油ならびに脂肪が含まれる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適当なpH値を維持するための緩衝剤、および皮膚透過促進剤を補助物質として用いることができる。
【００９９】
さらに、カプサイシン受容体活性に影響を及ぼす物質を含む組成物（例えば、カプサイシン受容体に結合することによって、またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに結合することによって）は、防御スプレー（例えば、「コショウスプレー」）での使用、またはそのようなスプレーの解毒剤としての使用を含む、他の応用において有用である。本発明のスクリーニング法は、例えば、カプサイシン様活性を有するが、カプサイシンに関連した望ましからぬ副作用の１つ以上を欠損する、または副作用が実質的に減少している薬剤の同定を含む、この目的のために多様な方面において用いることができる。例えば、カプサイシンがスプレー抑止剤として有効である場合、カプサイシンに対する暴露は致命的となりうる。本発明のスクリーニング法は、このように、望ましい抑止作用を有するが、防御スプレーにおいて通常用いられる量の暴露によって死に至る可能性がない化合物を同定するために用いることができる。その上、本発明のスクリーニング法を用いて、哺乳類の種が異なればカプサイシン受容体に異なる影響を及ぼす化合物を同定することができ、このように属または種特異性を有するカプサイシン受容体に実質的に影響を及ぼすカプサイシン受容体アゴニストおよびアンタゴニストの同定およびデザインが可能である。このように、例えば、本発明の方法によって、ヒトのカプサイシン受容体を実質的に刺激しない、イヌまたはクマのカプサイシン受容体に対するカプサイシン受容体アゴニストが同定できる。これはイヌカプサイシン受容体を発現する宿主細胞においてカプサイシン受容体関連生物活性を誘発するが、ヒトカプサイシン受容体を発現する宿主細胞では比較的弱い、またはほとんど生物活性を示さない化合物のスクリーニングによって得られる。
【０１００】
治療的有効用量
有効用量の決定は当業者の技術範囲内である。いずれの化合物についても、治療的有効用量はまず細胞培養解析、例えば組換え型カプサイシン受容体を発現する宿主細胞を用いて、または通常、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタを用いる動物モデルのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を得るためにも用いることができる。次に、そのような情報を用いて、ヒトでの投与の用量および経路を決定することができる。治療的有効用量は、望ましい生理作用を提供する（例えば、カプサイシン受容体媒介炎症もしくは疼痛に関連した症状を緩和する、または温度感覚の喪失を提供する）物質（例えば、カプサイシン受容体アゴニストもしくはアンタゴニストとしての活性を有する化合物）、ポリペプチド、または抗ポリペプチド抗体の量を指す。
【０１０１】
そのような化合物の治療的効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法、例えばED（集団の50％において治療的に有効な用量）およびLD（集団の50％にとって致命的である用量）によって決定することができる。治療作用と毒性作用との用量比が治療指数であり、比LD/EDとして表記する。治療指数が大きい薬学的組成物が好ましい。細胞培養解析および動物試験から得られたデータは、ヒトで用いる場合の用量範囲を決定するために用いられる。そのような化合物の用量は好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を示さないED50を含む循環中の濃度範囲内に存在する。実際の用量は、例えば用いる投与剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。
【０１０２】
正確な用量は治療すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。用量および投与は活性部分の十分なレベルが提供されるように、または望ましい作用が維持されるように調節される。考慮に入れてもよいさらなる要因は、疾患状態の重症度、治療部位の位置；患者の年齢、体重および性別；食事、投与時間および投与回数；薬剤の併用；反応過敏症；および治療に対する忍容性／反応が含まれる。長時間作用型の薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、毎週、２週間に１回に投与することができる。
【０１０３】
正常な用量は投与経路に応じて変化してもよい。特定の用量および投与方法に対するガイダンスが文献に示されており、一般に当技術分野の医師に利用できる。カプサイシンおよびカプサイシン類似体を臨床応用で用いることおよびその投与方法は当技術分野で周知である（例えば、全文が参照として本明細書に組み入れられる、キャンベル（Campbell）ら、1993、「カプサイシンとその類似体の臨床応用（Clinical Applications of Capsaicin and Its Analogues）」、「疼痛研究におけるカプサイシン（Capsaicin in the Study of Pain）」、255〜272頁；米国特許第5,5690,910号（カプサイシンを含む局所抗炎症組成物）；米国特許第5,296,225号（口顔疼痛の治療に対するカプサイシンを含む局所組成物）；米国特許第5,290,816号（神経原性炎症の脱感作のためのレシニフェラトキシンを含む局所クリーム）；米国特許第4,997,853号（表層部疼痛を治療するためのカプサイシンを含む局所組成物）；米国特許第5,403,868号（鎮痛薬および抗炎症薬として有用なカプサイシン誘導体）；米国特許第4,939,149号（知覚神経求心性C繊維および熱調節脱感作を引き起こすレシニフェラトキシンの投与）；米国特許第4,536,404号（カプサイシンの適用による帯状疱疹後神経痛の局所治療）を参照のこと）。カプサイシン受容体アゴニストおよびアンタゴニストの投与に関するさらなる全般的ガイダンスは、例えば、米国薬局方（USP）第17版、710〜711頁；および医師の卓上参考書（Physician's Desk Reference）、1996、メディカル・エコノミクス・コーン、モンベール、ニュージャージー州（特に、それぞれカプサイシンを含む、1054のドロラック（登録商標）、1056のゾストリックス（登録商標）、および1056のゾストリックス-HP（登録商標）局所鎮痛クリームを参照のこと）；および「レミントンの製薬科学（Remingtons' Pharmaceutical Sciences）」最新版、マック・パブリッシングカンパニー、イートン、ペンシルバニア州に見ることができる。
【０１０４】
試料中のカプサイシン含有量を定量する、または候補となる食品添加物のカプサイシン活性を決定する解析におけるカプサイシン受容体コードポリヌクレオチドの使用
カプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチドおよびカプサイシン受容体ポリペプチドは、試料が食品に由来する、または着香剤として用いられる候補物質を含む（例えば食物または食品におけるスパイスとしての使用）、試料中にカプサイシンまたはカプサイシン活性を有する物質を検出するために定性的、または定量的に決定する解析において用いることができる。この解析法は、求心性神経に及ぼすその鎮痛作用と共に、カプサイシンが食物を「スパイシーホット」にする原因であるバニロイドファミリー化合物のメンバーであるという事実を利用している。例えば、カプサイシンはコショウに存在する（例えば、タイのグリーンポブラノベルデ(green poblano verde)、ハベネロ（habenero）、およびグエロ（guero）コショウを参照のこと）。コショウの抽出物におけるカプサイシンの量を決定する従来の解析法には、コショウ試料からの化合物の冗長な抽出および高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）による定量が含まれる（例えば、ウッドバリー（Woodbury）、1980、J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63：566〜558を参照のこと）。次にカプサイシンの量を、「辛さ」の尺度であるスコビル（Scoville）熱単位の数と相関させる。
【０１０５】
本発明の解析法は、試料中のカプサイシンの量を検出するために単離カプサイシン受容体ポリペプチドを利用し、このように、条件解析において化学抽出法を用いる必要がない。用いられるカプサイシン受容体ポリペプチドは、溶液中に存在する固相支持体に結合するか、または組換え宿主細胞の表面上に存在してもよい。カプサイシンのカプサイシン受容体ポリペプチドへの結合は、上記のスクリーニング解析において記述のように検出される。
【０１０６】
好ましくは、試料中のカプサイシンまたはカプサイシン活性を有する化合物の解析は上記の機能的解析法を用いて行う。より好ましくは、機能的解析法は、カルシウム感受性蛍光色素（例えば、fura-2、indo-1、fluo-3）を予めローディングしたカプサイシン受容体発現組換え真核細胞（好ましくは哺乳類細胞または両生類の卵母細胞）を用いる。次に、試料中のカプサイシンまたはカプサイシン様化合物の有無および／または量は、カプサイシン受容体媒介細胞作用、例えば電圧活性化細胞膜伝導の変化、または検出できるように標識した陽イオンの細胞内レベルの変化を測定することによって決定される。例えば、検出できるように標識した陽イオンが蛍光標識カルシウムである場合、予めローディングした宿主細胞をカプサイシン含有試料に暴露すると、カプサイシンのカプサイシン受容体ポリペプチドへの結合が起こり、カプサイシン受容体による細胞内カルシウムの増加が起こり、これは容易に検出および定量することができる。例えば、試験試料による細胞内カルシウム流入レベルを対照試料（例えば、カプサイシンの量がわかっている試料）に関連した細胞内カルシウム流入と比較する。次に、電流、細胞内カルシウム濃度、または他のカプサイシン受容体媒介現象の変化の程度は、カプサイシンの濃度と相関し、これを今度はスコビル熱単位に割付することができる。
【０１０７】
同様に、食物または食品を「ホット」にするために食品添加物として用いられる候補物質は、カプサイシン受容体媒介細胞反応（例えば、電圧活性化伝導または細胞内陽イオン濃度の変化）の誘発能に関してスクリーニングすることができる。本解析法は、例えばカプサイシン受容体への暴露によって誘発された反応に基づいて、辛さの測定を客観的に決定することができるという長所を有する。
【０１０８】
カプサイシン受容体コード配列を検出するためのカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの診断的使用
カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、例えばカプサイシン受容体発現、特定のカプサイシン受容体多形または変異、および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド発現に関連した状態または疾患の診断（例えば、出生前または生後の診断）に用いることができる。例えば、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをそれぞれ検出するために、生検から得られた液体または組織のインサイチューハイブリダイゼーションまたはPCR解析において用いることができる。適した定性的または定量的方法には、サザンもしくはノザン分析、ドットブロット、またはその他の膜に基づく技術；PCR技術；ディップスティック、pIN、チップおよびELISA技術が含まれる。これらの技術は全て当技術分野において周知であり、市販の多くの診断キットの基礎となっている。疾患が確定すれば、カプサイシン受容体関連疾患に対して必要に応じて、治療物質を投与するか、またはその他の介入もしくは予防措置を開始する。
【０１０９】
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド配列に基づくオリゴヌクレオチドは、カプサイシン受容体ポリペプチド発現、疾患に関連したカプサイシン受容体多形の検出、および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド発現を評価するPCRに基づく技法において用いることができる。PCR増幅法は、米国特許第4,683,195号および第4,965,188号に記載されている。そのようなオリゴマーは一般的に化学合成され、または酵素的もしくは組換え的に産生される。オリゴマーは一般的に２つのヌクレオチド配列を含み、１つはセンス方向（5'から3'へ）、およびもう一つはアンチセンス（3'から5'へ）であり、特定の遺伝子または疾患を同定するために最適な条件下で用いられる。近縁のDNAまたはRNA配列を検出および／または定量する場合には、同じ２つのオリゴマー、より内側の（nested）オリゴマーセット、またはオリゴマーの縮重プールであっても、低ストリンジェント条件下で用いることができる。
【０１１０】
本発明の特定の分子の発現を定量するためのさらなる方法には、放射標識（メルビー（Melby）ら、1993、J. Immunol. Methods 159：235〜44）、またはビオチン結合（デュプラー（Duplaa C）、1993、Anal Biochem. 229〜36）ヌクレオチド、対照核酸の共増幅、および標準曲線による実験結果の補間が含まれる。対象オリゴマーが様々な希釈で存在し、分光測光的または比色定量的検出によって迅速な定量が得られるELISA形式で解析を行うことによって、多数の試料をより時間的効率よく定量することができる。
【０１１１】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドコード核酸の治療的使用
カプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共にそのポリペプチドは、カプサイシン受容体機能障害（例えば、罹患していない患者におけるカプサイシン受容体活性と比較してカプサイシン受容体の増加、または罹患していない患者におけるカプサイシン受容体活性と比較してカプサイシン受容体の減少）に関連した疾患の治療に有用となる可能性がある。さらに、ドミナント・ネガティブなカプサイシン受容体コード配列の発現は、カプサイシン受容体活性レベルの上昇に関連した疾患において治療的に有用となる可能性がある。カプサイシン受容体とカプサイシン受容体関連ポリペプチドとの相互作用が疾患に関連している場合、これらのポリペプチドの相互作用は、例えばカプサイシン受容体とカプサイシン受容体関連ポリペプチドの相互作用ドメインに対応するペプチドの導入によって破壊することができる。その上、腫瘍細胞における野生型カプサイシン受容体配列の発現によって、そのような腫瘍細胞はカプサイシン受容体媒介細胞死に対してより感受性となる可能性がある。
【０１１２】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクシニアウイルスまたは様々な細菌プラスミドに由来する発現ベクターは、標的とする臓器、組織、または細胞集団にヌクレオチド配列を輸送するために用いることができる。好ましくは、カプサイシン受容体ポリペプチドコード配列を輸送して発現させる標的細胞は神経細胞であり、より好ましくは神経細胞においてカプサイシン受容体活性を増強するための求心性神経である。アンチセンスカプサイシン受容体ポリヌクレオチドを発現する組換え型ベクターは、当技術分野で周知の方法に従って構築することができる（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、上記、およびアウスユベール（Ausubel）ら、上記を参照のこと）。
【０１１３】
または、望ましいカプサイシン受容体コード断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェクトさせることによって、カプサイシン受容体をコードする遺伝子の発現を減少させることができる。そのような構築物は翻訳されないセンスまたはアンチセンス配列を細胞に満たすことができる。DNAへの組み込みが行われない場合でも、そのようなベクターは、全てのコピーが内因性ヌクレアーゼによって機能しなくなるまでRNA分子を転写し続けることができる。カプサイシン受容体の発現および活性を調節するそのようなアプローチは、疼痛症候群および／またはカプサイシン受容体活性に関連した炎症疾患の治療において有用となりうる。
【０１１４】
遺伝子発現の改変は、カプサイシン受容体をコードする遺伝子の制御領域（すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロン）に対してアンチセンスである分子、DNA、RNA、またはPNAをデザインすることによって得ることができる。リーダー配列の転写開始部位、例えば−10〜＋10位の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセンス分子はまた、転写物のリボゾームへの結合を防止することによってmRNAの翻訳を防止するようにデザインすることができる。同様に、発現の阻害は「三重らせん」塩基対形成法を用いて得ることができる。三重らせん対が形成されると、二重らせんはポリメラーゼ、転写因子、または調節分子が結合するために十分に開くことができなくなる。三重らせんDNAを用いた最近の治療的進歩については、ジー（Gee JE）ら、（ヒュバー（Huber）ら、1994、「分子的免疫的アプローチ（Molecular and Immunologic Approaches）」、フツラパブリッシング・カンパニー、マウントキスコ、ニューヨーク州）によって論評されている。本発明のアンチセンス分子は、化学的オリゴヌクレオチド合成、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成法に関する技法を含む、RNA分子の合成に関して当技術分野で既知の方法によって調製することができる。そのようなDNA配列は、適したRNAポリメラーゼプロモーター（例えばT7またはSP6）を有する多様なベクターに組み入れることができる。または、アンチセンスRNAの構成的または誘導的合成において有用なアンチセンスcDNA構築物を、細胞株、細胞、または組織に導入することができる。
【０１１５】
特に、RNA分子をアンチセンス療法のために投与する場合、RNAは細胞内安定性および半減期を増加するように改変することができる。考えられる改変には、分子の5'および／または3'末端での隣接配列の付加、または分子の骨格内にホスホジエステラーゼ結合ではなくてホスホロチオエートもしくは2'O-メチル結合を使用することを含むが、これらに限定しない。この考え方は本来PNAを産生するためのものであったが、イノシン、ケオシン、およびウィブトシンのような新しい塩基と共に、内因性のエンドヌクレアーゼによって容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および類似の改変型を含めることによって、これらの分子の全てに拡大することができる。
【０１１６】
ベクターを細胞または組織に導入する方法には下記に記載する方法が含まれ、これらはインビボ療法にとって等しく適している。
【０１１７】
好ましい態様において、カプサイシン受容体ポリペプチドコードポリヌクレオチドは、臓器化学療法を行うことが望ましい標的腫瘍細胞にインビボで導入される。本発明のこの局面は、カプサイシン受容体のアゴニスト（例えば、カプサイシン、レシニフェラトキシン）および／または温度への暴露に対する反応の範囲を利用している。例えば、カプサイシン受容体アゴニストの低濃度（例えば、ナノモル範囲のカプサイシン受容体アゴニスト濃度、例えば約200 nM〜約800 nM）は、カプサイシン受容体刺激および細胞内カルシウム流入に関連している。カプサイシン受容体が神経細胞に発現されている場合、低濃度のカプサイシン受容体アゴニストによってカプサイシン受容体を刺激した後に神経の脱感作が起こる。しかし、カプサイシン受容体アゴニストの高濃度（例えば、マイクロモル範囲のカプサイシン受容体アゴニスト濃度、例えば、約１μM〜約10 μM）は神経変性および細胞死を媒介する。アゴニスト濃度および／または熱刺激がカプサイシン受容体発現標的腫瘍細胞における細胞死の媒介に十分であるが、正常なカプサイシン受容体発現細胞には実質的に影響を及ぼさないか、またはそのような正常細胞への影響がかなり少ない場合、カプサイシン受容体ポリペプチドを腫瘍細胞に発現させれば、カプサイシン受容体アゴニストの高濃度の局所投与、または熱刺激もしくはその双方に対する局所的な暴露によって、腫瘍細胞死を実質的に選択的に促進することができる。
【０１１８】
または、腫瘍細胞に導入されたカプサイシン受容体ポリペプチドは、臓器化学療法に反応してより高い選択性が得られる（すなわち、内因性の野生型カプサイシン受容体の活性化を全くまたはほとんど示さない腫瘍細胞において発現されるカプサイシン受容体の活性化が得られる）ように操作することができる。例えば、カプサイシン受容体は、野生型のカプサイシン受容体との結合能が実質的に減少している特異的カプサイシン受容体アゴニスト類似体と結合するように改変することができる。したがって、変化したカプサイシン受容体を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は、変化したカプサイシン受容体ポリペプチドに対する特異性を有するアゴニストを投与することによって、野生型カプサイシン受容体を発現する細胞に実質的な影響を及ぼすことなく選択的に刺激することができる。または、腫瘍細胞は、改変されたカプサイシン受容体がアゴニストに対してより反応性を示す場合（すなわち、アゴニストに対してより反応性が高い、野生型と比較してアゴニストに対する親和性が増加しており、それによって、内因性カプサイシン受容体の活性化が全くない、またはほとんどない改変した受容体の活性化を可能にする、および／または野生型カプサイシン受容体より熱刺激に対する反応性がより高くなるように改変される）、改変したカプサイシン受容体をコードする配列によってインビボで形質転換することができる。これらの態様によってこのように、変化したカプサイシン受容体標的臓器化学療法の高濃度またはより高濃度の投与が可能となり、それによって、より選択的な臓器化学療法が可能となる。
【０１１９】
抗カプサイシン受容体および抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体
カプサイシン受容体特異的抗体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド特異的抗体は、天然に存在する、または組換え型カプサイシン受容体ポリペプチドもしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのそれぞれのいずれかを発現する細胞を同定するためと共に、カプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの発現および／または機能に関連した状態および疾患の診断に有用である。例えば、抗カプサイシン受容体抗体および抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体は、受容体蛋白質のレベルの増加もしくは減少、および／または異常な蛋白質プロセシングもしくはオリゴマー形成を検出するために用いることができる。
【０１２０】
本発明の抗カプサイシン受容体ポリペプチド抗体および抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体には、ポリクローナル、モノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、Fab断片およびFab発現ライブラリによって産生される断片が含まれるが、これらに限定しない。特に重要な抗体には、例えばカプサイシン受容体機能を刺激するおよび／またはカプサイシン受容体結合化合物のカプサイシン受容体への結合を遮断する抗体が含まれる。そのような抗体は例えば、疼痛症候群における疼痛の調節、カプサイシン受容体結合物質のスクリーニング解析、および試料中でのカプサイシン受容体活性化化合物の測定において有用となる可能性がある。
【０１２１】
抗体産生に適したカプサイシン受容体ポリペプチドおよびカプサイシン受容体関連ポリペプチドは、生物活性である必要はない；むしろポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドは抗原性でありさえすればよい。カプサイシン受容体特異的抗体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド特異的抗体の産生に用いられるポリペプチドは、一般に、少なくともアミノ酸5個、好ましくは少なくともアミノ酸10個を含むアミノ酸配列を有する。好ましくは、抗原性カプサイシン受容体ポリペプチドおよび抗原性カプサイシン受容体関連ポリペプチドは、本来のカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドのエピトープをそれぞれ模倣する。短いポリペプチドに対して特異的である抗体は、カプサイシン受容体ポリペプチドもしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドを担体に結合させることによって、またはカプサイシン受容体ポリペプチドもしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをもう一つの蛋白質（例えば、キーホール・リンペット・ヘモシアニン）と融合させることによって、および担体と結合したキメラ分子を抗原として用いることによって、産生することができる。一般に、抗カプサイシン受容体抗体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体は当技術分野で周知の方法によって産生することができる。組換え型免疫グロブリンは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,816,567号に従って産生することができる。
【０１２２】
様々な宿主、一般に哺乳類または両生類宿主は、抗カプサイシン受容体抗体および抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体（例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス）を産生するために用いることができる。一般に、抗体は免疫原性特性を保持しているカプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチド（本来のポリペプチド、断片またはオリゴペプチドの如何なる部分も含む）によって宿主を免疫することによって（例えば、注射によって）産生される。宿主の種に応じて、宿主の免疫応答を増強するために様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、フロイントのアジュバント、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニンおよびジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定しない。BCG（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）はおそらく有用なヒトアジュバントである。
【０１２３】
モノクローナル抗体は培養した不死化細胞株によって抗体分子が産生される如何なる技法も用いて調製することができる。これらの技法には、コーラー＆ミルスタイン（Kohler and Milstein、1975、Nature 256：495〜497）によって初めて記述されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（コスバー（Kosbor）ら、（1983）、Immunol Today 4：72；コート（Cote）ら、（1983）Proc Natl Acad. Sci 80：2026〜2030）およびEBVハイブリドーマ技法（コール（Cole）ら、（1985）、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、アランRリス・インク、ニューヨーク、ニューヨーク州、77〜96頁）が含まれるがこれらに限定しない。
【０１２４】
さらに、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るために、「キメラ抗体」を産生するために開発された技法である、ヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングを用いることができる（モリソン（Morrison）ら、1984 Proc Natl Acad. Sci.81：6851〜6855；ニューバーガー（Neuberger）ら、1984、Nature 312：604〜608；タケダ（Takeda）ら、1985 Nature 314：452〜454）。または、一本鎖抗体を産生するために記述された技法（米国特許第4,946,778号）を、カプサイシン受容体特異的またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド特異的である一本鎖抗体の産生に応用することができる。
【０１２５】
抗体はインビボで、またはオーランディ（Orlandi）ら（1989、Proc Natl Acad Sci 86：3833〜3837）およびウィンター（Winter）ら（1991、Nature 349：293〜299）に開示された組換え免疫グロブリンライブラリもしくは非常に特異的な一連の結合試薬をスクリーニングすることによって、産生することができる。
【０１２６】
カプサイシン受容体ポリペプチドまたはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに対する特異的結合部位を有する抗体断片も産生することができる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製することができるFab断片が含まれるがこれらに限定しない。または、望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定するためにFab発現ライブラリを構築することができる（ヒューズ（Huse）ら、1989 Science 256：1275〜1281）。
【０１２７】
確立された抗体特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いた競合的結合または免疫放射測定解析に関する多様なプロトコールは当技術分野で周知である。そのようなイムノアッセイ法には、典型的に例えばカプサイシン受容体ポリペプチドと特異的抗カプサイシン受容体抗体との複合体形成、ならびにカプサイシン受容体抗体複合体形成の検出および定量が含まれる。特異的カプサイシン受容体蛋白質上の２つの非干渉的エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いた２部位のモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイ法が好ましいが、競合的結合解析法もまた用いることができる。これらの解析法はマドックス（Maddox）ら、1983、J Exp Med 158：1211に記載されている。
【０１２８】
カプサイシン受容体特異的またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド特異的抗体を用いた診断解析
特定のカプサイシン受容体抗体およびカプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体は、カプサイシン受容体の異常な発現または機能を特徴とする状態または疾患の診断（例えば、ニューロパシーを検出するために皮膚におけるカプサイシン受容体発現の検出、またはカプサイシン受容体関連障害または疾患を有するおよび／またはカプサイシン受容体アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤によって治療している患者をモニターする解析法において）に有用である。例えば、異常なカープ（carp）機能は、カプサイシン受容体関連ポリペプチドの過剰産生または過小産生が原因である可能性がある；このように抗カプサイシン受容体関連抗体は、これらの変化を定性的または定量的に検出するために用いることができる。カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドに関する診断解析には、試料中（例えば、細胞または組織の抽出物）のカプサイシン受容体を検出するために、検出できるように標識した抗カプサイシン受容体抗体または抗カプサイシン受容体関連ポリペプチドを用いる方法が含まれる。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変して、または改変せずに用いることができる。ポリペプチドおよび抗体は、リポーター分子に対する共有結合または非共有結合によって標識することが多い。そのような多様な適したリポーター分子は当技術分野で既知である。抗体結合を検出および定量する方法は当技術分野で周知である。
【０１２９】
カプサイシン受容体ポリペプチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチドおよび／またはそれに対する抗体を含む薬学的組成物
本発明はまた、カプサイシン受容体ポリペプチド、抗カプサイシン受容体ポリペプチド抗体、カプサイシン受容体関連ポリペプチド、または抗カプサイシン受容体関連ポリペプチドを、単独で、または滅菌した生体適合性の薬学的担体と共に投与することができる安定化化合物のような少なくとも１つのもう一つの物質と併用して含むことができる薬学的組成物を含む。本発明の薬学的組成物は、賦形剤または薬学的に許容される担体と混合した薬学的組成物において、患者に単独で、または他の物質、薬剤もしくはホルモンと併用して投与することができる。本発明の一つの態様において、薬学的に許容される担体は薬学的に不活性である。
【０１３０】
カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドは、例えばカプサイシン受容体アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する内因性因子の作用を緩和するために、または患者に投与されるカプサイシン受容体アゴニストまたはアンタゴニストの作用を遮断または調節するために、投与することができる。抗カプサイシン受容体ポリペプチド抗体および／または抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体は、望ましいようにカプサイシン受容体を刺激するように、または例えばカプサイシン受容体との競合的結合を通じて、内因性もしくは外因性カプサイシン受容体結合アゴニストもしくはアンタゴニストの作用を遮断するために投与することができる。カプサイシン受容体ポリペプチド、カプサイシン受容体関連ポリペプチド、抗カプサイシン受容体抗体および／または抗カプサイシン受容体関連ポリペプチド抗体を含む薬学的製剤は当技術分野で既知の方法に従って製剤化することができる。
【０１３１】
カプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物
カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする核酸を用いて、ヒト以外の遺伝子改変動物または細胞株における部位特異的遺伝子改変体を作製することができる。「トランスジェニック」という用語は例えば、カプサイシン受容体遺伝子活性（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド活性）の欠失またはその他のノックアウト、宿主細胞に安定に伝播される外因性カプサイシン受容体遺伝子（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子）、変化したカプサイシン受容体（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド）遺伝子発現を有する「ノックイン」、またはリポーター遺伝子に機能的に結合した外因性カプサイシン受容体もしくはカプサイシン受容体関連ポリペプチドプロモーター、を有する遺伝子改変動物を含むと解釈される。特に重要なものは、カプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド機能のホモ接合およびヘテロ接合ノックアウトおよびノックインである。
【０１３２】
トランスジェニック動物は、内因性カプサイシン受容体座（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド座）が変化している相同組換えによって作製してもよい。または、核酸構築物をランダムにゲノムに組み入れる。安定な組み込みに適したベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。重要なものはトランスジェニック哺乳類、好ましくはハツカネズミ属（Mus）（例えばマウス）、クマネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）、オリクトログス（Oryctologus）（例えばウサギ）およびメソクリセツス（Mesocricetus）（例えばハムスター）からなる群より選択される属の哺乳類である。
【０１３３】
「ノックアウト」動物は、内因性カプサイシン受容体機能（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド機能）が実質的に減少する、または消失するように遺伝子操作されている。異なるアプローチを用いて「ノックアウト」を得てもよい。例えば、本来のカプサイシン受容体相同体（または本来のカプサイシン受容体関連ポリペプチド相同体）の全てまたは一部の染色体欠失を誘導してもよい。非コード領域、特にプロモーター領域、3'調節配列、エンハンサーの欠失、またはカプサイシン受容体遺伝子および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子の発現を活性化する遺伝子の欠失。機能的ノックアウトはまた、本来の遺伝子の発現を遮断するアンチセンス構築物を導入することによって得てもよい（例えば、リ＆コーエン（Li and Cohen）（1996）、Cell 85：319〜329）。
【０１３４】
カプサイシン受容体遺伝子機能（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子機能）の条件付きノックアウトもまた、本発明の範囲内に含まれる。条件付きノックアウトは、標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を暴露した場合、標的遺伝子部位で組換えを促進する酵素（例えば、Cre-loxP系におけるCre）を導入した場合、または標的遺伝子変化を指向するその他の方法を行った場合に、カプサイシン受容体遺伝子機能（および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子機能）に欠損を示すトランスジェニック動物である。
【０１３５】
例えば、カプサイシン受容体遺伝子機能の条件付きノックアウトを有するトランスジェニック動物はCre-loxP組換え系を用いて産生することができる（例えば、キルビー（Kilby）ら、1993 Trends Genet 9：413〜421）。CreはloxPと呼ばれる２つの認識配列間のDNAを切除する酵素である。この系はカプサイシン受容体の条件付きノックアウトを作製する多様な方法において用いることができる。例えば、異なるトランスジェニックマウス２匹を産生することができる；１匹はloxP部位に隣接するカプサイシン受容体配列に対するトランスジェニックであり、もう１匹はCreに対するトランスジェニックである。Creトランスジーンは、誘導型または発生的に調節されるプロモーター（グ（Gu）ら、1993、Cell 73：1155〜1164；グ（Gu）ら、1994 Science 265：103〜106）の制御下、または組織特異的もしくは細胞タイプ特異的プロモーター（例えば、神経特異的プロモーター）の調節下に置くことができる。カプサイシン受容体トランスジェニック動物をCreトランスジェニックと交配させて、発生期にCreを発現する細胞に限ってカプサイシン受容体遺伝子を欠損する子孫を作製する。
【０１３６】
外因性カプサイシン受容体遺伝子および／または外因性カプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製してもよい。外因性遺伝子は通常、動物宿主とは異なる種に由来する、またはそうでなければそのコードまたは非コード配列が変化している。導入された遺伝子は野生型遺伝子、天然に存在する多形、または遺伝子操作された配列、例えばコードもしくは非コード領域における欠失、置換、または挿入に関してこれまでに記述された配列であってもよい。導入された配列はカプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードしてもよい。導入された遺伝子がコード配列である場合、通常、構成的または誘導型であってもよいプロモーター、および宿主動物において発現に必要なその他の調節配列に機能的に結合している。
【０１３７】
重要な特異的構築物には、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードするアンチセンスポリヌクレオチド、カプサイシン受容体発現またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド発現をそれぞれ遮断するカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド配列に基づくリボザイムを含むがこれらに限定しない。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムはまた、ドミナントネガティブ変異の発現および対応する遺伝子の過剰発現を遮断するであろう。構築物によってコードされるカプサイシン受容体および／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドが、それが発現される宿主の種とは異なる種に由来する場合（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒトカプサイシン受容体の発現）、宿主におけるカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする構築物の発現もまた重要である。対応する遺伝子の発現がアップレギュレーションされれば表現型の変化が容易に検出される、lacZのような検出マーカーをカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド座に導入してもよい。カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子のプロモーター領域をリポーター遺伝子と共に利用する構築物も重要である。切断されたまたは変化した（例えば変異）カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドをコードする配列を有する構築物も重要である。
【０１３８】
改変した細胞または動物は、カプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの機能および調節の研究において有用である。そのような改変した細胞または動物はまた、例えばカプサイシン受容体またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの機能を調べる研究と共に、侵害受容神経発生に関する研究においても有用である。動物は、機能的研究、薬物スクリーニング等において、カプサイシン受容体機能、またはカプサイシン受容体機能に関連した疾患または状態（例えば、カプサイシン受容体欠損またはその他の変化したカプサイシン受容体活性）に関連した症状に及ぼす候補薬物の作用を調べるために用いてもよい。そうでなければ正常では産生されない細胞において（例えば、異所性発現）カプサイシン受容体ポリペプチドおよび／またはカプサイシン受容体関連ポリペプチドの発現を提供することによって、細胞挙動の変化を誘導することができる。
【０１３９】
相同組換えのためのDNA構築物は、望ましい遺伝子改変を有するカプサイシン受容体遺伝子（またはカプサイシン受容体関連ポリペプチド遺伝子）の少なくとも一部を含み、標的座との相同性領域を含む。ランダム組換えのための構築物は、組換え媒介のための相同性領域を含む必要はない。陽性および陰性選択マーカーを含めると都合がよい。相同組換えを通じて標的遺伝子改変を有する細胞を産生する方法は、当技術分野で既知である。哺乳類細胞をトランスフェクトさせる様々な技法に関しては、ケオウン（Keown）ら、1990 Methods in Enzymology 185：527〜537を参照のこと。
【０１４０】
胚性幹（ES）細胞に関しては、ES細胞株を用いてもよく、または胚細胞は宿主、例えばマウス、ラット、モルモット等から新たに得てもよい。そのような細胞は、白血病阻止因子（LIF）のような適当な増殖因子の存在下で適当な繊維芽細胞フィーダー層上で増殖する。ESが形質転換されている場合、それらを用いてトランスジェニック動物を作製してもよい。形質転換後、細胞を適当な培地中でフィーダー層上に播種する。構築物を含む細胞は選択的培地を用いることによって検出する。コロニーが増殖するために十分な時間が経過した後、それらをとりだして、構築物の相同組換えまたは組み込みの発生率を分析する。陽性であるコロニーを胚の操作および胚盤胞注射に用いてもよい。胚盤胞は４〜６週齢の過剰排卵した雌から得る。ES細胞をトリプシン処理して改変した細胞を胚盤胞の卵割腔に注射する。注射した後、胚盤胞を仮親の雌のそれぞれの子宮角に戻す。次に雌を満期まで妊娠を継続させ、得られた仔を構築物を有する変異細胞の有無に関してスクリーニングする。異なる表現型の胚盤胞およびES細胞を提供することによって、キメラ子孫は容易に検出することができる。
【０１４１】
キメラ動物を改変遺伝子の有無に関してスクリーニングする。改変を有するキメラ動物（通常、キメラ雄性）を野生型動物と交配させて、ヘテロ接合体を形成し、ヘテロ接合体を交配させてホモ接合体を産生する。遺伝子の変化によって発生の何らかの時点で死亡を生じる場合、組織または臓器を同種異系またはコンジェニック移植片または移植体として、またはインビトロ培養において維持する。
【０１４２】
遺伝子機能の研究は、哺乳類以外のモデル、特にC.エレガンス（C. elegans）、D.メラノガスター（D. melanogaster）およびS.セレビジエ（S. cerevisiae）のような生物学的および遺伝的によく特徴付けがなされた生体を用いてもよい。例えば、カプサイシン受容体遺伝子またはカプサイシン受容体遺伝子のプロモーター領域の線虫相同体にトランスポゾン（Tc1）挿入を行ってもよい。神経細胞の機能に関与する生理的および生化学経路を決定するために、カプサイシン受容体遺伝子配列を用いて、定義された遺伝子病変をノックアウトまたは補ってもよい。ヒト遺伝子がより下位の真核生物モデルにおける変異を補うことができることは周知である。
【０１４３】
カプサイシン受容体ポリペプチドを有するバイオセンサー膜
カプサイシン受容体ポリペプチドは熱に対して反応性を有するために、カプサイシン受容体ポリペプチドは、温度変化を検出するためのバイオセンサーとして用いることができる。バイオセンサーは、その中にカプサイシン受容体ポリペプチドが組み入れられた脂質膜（またはその他の媒体）を通過するイオン電流の電気化学的測定を利用している。カプサイシン受容体ポリペプチドを熱によって刺激すると、カプサイシン受容体ポリペプチドは膜を通過するイオン（例えばカルシウム）運動を促進し、これを脂質二重膜を通過する電流の変化として検出する。温度および／または温度変化は、二重層を通過する電気伝導のカプサイシン受容体ポリペプチド活性化による相対的増加と相関しうる。
【０１４４】
両親媒性分子を溶液中で凝集させると、単層、ミセル、黒膜、および小胞が単一の成分を有する、または複数の成分を有する多ラメラ型である小胞またはリポソームのような二次元または三次元配置を形成できることがよく知られている。膜は脂質、長鎖（C12〜C24）有機化合物と共に、物理的に補強するためのプラスチック材料等のポリマーの如何なる適した組合せを含んでもよい。対象蛋白質を組み込む脂質二重層を製造するための方法および組成物は、バイオセンサーの電気機械的成分を製造するための方法および組成物と共に、当技術分野において周知である（例えば、それぞれが対象受容体（すなわち、カプサイシン受容体）を組み入れるバイオセンサーの製造および使用に関する参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,328,847号（生化学スイッチを有する薄膜センサー）；米国特許第5,443,955号（受容体膜およびイオノフォア開閉）；米国特許第5,234,566号（イオンチャンネルバイオセンサー膜の感度および選択性）；米国特許第5,074,977号（デジタルバイオセンサーおよびこれを用いる方法）；および米国特許第5,156,810号（電気的、光学的、および機械的シグナルを用いたバイオセンサー）を参照のこと）。
【０１４５】
本発明のバイオセンサーは、膜が少なくとも一つのカプサイシン受容体ポリペプチドを含む、少なくとも１つの脂質膜を含む。カプサイシン受容体ポリペプチドは、リガンド（例えば、カプサイシン）またはカプサイシン受容体活性を媒介するその他のイフェクター（例えば、熱）と接触した場合に機能しうるため、膜におけるカプサイシン受容体の方向性はバイオセンサーの機能にとって実質的に重要ではない。
【０１４６】
従来のマイクロエレクトロニクス装置では、センサーに適切にパワーを供給し、熱を検出する前に脂質二重層を通過する一定の直流電圧を提供し、および温度変化によって誘発されるカプサイシン受容体活性化後のイオン電流の流れを測定する。誘発された電流シグナルを伴う電気的ノイズに基づき、膜の整合性を測定する設備を検出エレクトロニクスに組み入れれば、さらに望ましいであろう。
【０１４７】
一般に、カプサイシン受容体ポリペプチド含有二重層を通過する伝導の変化を検出することによって、本発明のバイオセンサーを用いて熱を検出する。例えば、カプサイシン受容体ポリペプチド脂質二重層は、脂質二重層の第一の界面（「熱検出界面」）が、カプサイシン受容体によって輸送することができる選択的な陽イオン（例えば、カルシウム、またはマグネシウムのような陽イオン、好ましくはナトリウム）を含む中性pHの緩衝液と接触し、一方、カプサイシン受容体ポリペプチド脂質二重層の第二の界面が、二重層の熱検出界面が浸されている緩衝液中での選択した陽イオン濃度より有意に低い選択した陽イオン濃度を有する中性pH緩衝液と接触するように、提供される。二重層の熱検出界面を温度変化に暴露すると、熱はカプサイシン受容体機能を促進して二重層を通じて選択した陽イオンを輸送し、その結果二重層の伝導の変化が起こる。伝導の変化は温度変化と相関する。
【０１４８】
以下の実施例は本発明を説明するために提供されるのであって、本発明の範囲を制限するために含めるのではない。
【０１４９】
実施例
実施例1：ラット・カプサイシン受容体をコードするDNAの発現クローニング
様々な細胞表面受容体およびイオンチャンネルをコードするcDNAを得るために、アフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的解析が用いられている（Brakeら、1995 Nature 371:519〜523）が、この方法はカプサイシン受容体クローンの同定ではうまくいかないことが判明した。カルシウムイオンの知覚神経への流入を誘発するカプサイシンの能力に基づく哺乳類細胞の発現クローニング戦略を開発した。まず、本質的に文献（Brakeら、前記）記載のとおりに、齧歯類後根神経節プラスミドcDNAライブラリをpcDNA3（Invitrogen）中に作成した。ラット新生仔（P1）およびマウス成体後根神経節由来のポリアデニル化RNA混合物を用い、Not1制限酵素切断部位を含むオリゴ（dT）プライマーを用いて第一鎖cDNAを生成した。第二鎖の合成およびBstX1アダプターの結合に続き、cDNAをNot1で消化した。cDNAおよびBstX1/Not1−直鎖化pcDNA3をそれぞれ酢酸カリウム勾配で精製し、これらをライゲートし、電気穿孔法によりDH5α菌に形質転換した。得られた2.4×10の個々の細菌クローンを144のプールに分け、-80℃で保存した。
【０１５０】
SV40ラージT抗原を構成的に発現するHEK293（ヒト胎児腎臓）細胞を、培地A（10%ウシ胎仔血清補足DMEM（Hyclone）、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミン）中、37℃、5%COで維持した。別に示す場合を除き、35mmの組織培養皿に3.2×10で播種したほぼコンフルエントな細胞を用いて一過性トランスフェクションを実施した。24時間後、培地を1mlの培地B（10%透析ウシ胎仔血清補足DMEM、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミン）で置き換えた。37℃で2時間培養後、細胞を12μgのプラスミドDNAでリン酸カルシウム沈殿キット（Specialty Media）を用いてトランスフェクトした。翌日、1mMのEDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を1回洗浄し、培養皿から洗い出して遠心沈降（200×g、5分、22℃）により集め、培地Bに再度懸濁し、次いでポリオルニチンでコートしたカバーグラス上に再度播種した。この条件下で、各細胞は約200の異なるcDNAをコードするプラスミドを獲得した。
【０１５１】
6から24時間後、10μMのfura-2アセトキシメチルエステルおよび0.02%のプレウロン酸（Molecular Probes）を含むCIB緩衝液（130mM NaCl、2mM KCl、2.5mM CaCl、0.6mM MgCl、1.2mM NaHCO、10mMグルコース、10mM Hepes、pH7.45）中で細胞にfura2をのせ、次いでCIBで2回洗浄した。比測定カルシウム画像化法を様々なフィルターホイール（Sutter Instrument）および増感CCDカメラ（Hamamatsu）を装備したNikon Diaphot蛍光顕微鏡を用いて実施した。二画像（340nmおよび380nmで励起、510nmで発光）を収集し、疑似カラー比測定画像を実験中モニターした（Metafluor画像化ソフトウェア、Universal Imaging）。細胞を最初は200mlのCIB中で画像化し、その後望まれる2倍の濃度のカプサイシンを含むCIB 200mlを加えた。刺激後、細胞を60〜120秒間観察した。ライブラリの各プールについて、8個のウェルそれぞれで1つの顕微鏡視野（細胞300〜500個）を解析した。
【０１５２】
解析したほとんどのプールまたはpcDNA3単独でトランスフェクトした細胞はカプサイシンに対する反応性を示さなかったが、cDNAライブラリ・プールの1つでトランスフェクトした細胞の1%から5%はカプサイシン処理により細胞質カルシウム濃度の著しい上昇を示した。このプール由来のcDNAをさらに小さいプールに細分し、これらのサブプールをHEK293細胞に再度トランスフェクトした。これらのサブプールのいくつかでトランスフェクトした細胞集団のうち、より大きい細胞分画がカプサイシンに反応し、カプサイシン受容体をコードするcDNAがこの集団内で濃縮されたことを示している。トランスフェクトした細胞の70%よりも多くにカプサイシン反応性を与える単一のプラスミドが単離されるまで、プールの細分化と再解析の過程を続けた。カプサイシン反応性を与えるクローンには3kbのcDNAインサートが含まれた。
【０１５３】
実施例2：カプサイシン受容体をコードするcDNAの塩基配列決定と特徴付け
3kbのcDNAインサートの塩基配列を、自動シーケンサー（ABI）を用いて決定した。相同性検索をノンリダンダントなGenbankデータベースおよびESTデータベース（dbest）に対してblastn、blastx、およびtblastx検索プログラムを用いて行った。親水性をHopp-Woodsアルゴリズムおよびウィンドウサイズ10×47を用いて計算した。ラットDRGライブラリから単離した個々のcDNAおよびマウスDRG cDNA由来PCR産物の塩基配列決定により、インサートの起源はラットであることが判明した。単離したラット・カプサイシン受容体コードポリヌクレオチドの配列（配列番号：1）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号：2）を図1に示す。バニロイド部分はカプサイシンおよびレシニフェラトキシンの必須化学成分を構成しているため、これらの化合物の提案される作用部位はより一般的にはバニロイド受容体と呼ばれている（Szallasi 1994 Gen. Pharmac. 25:223〜243）。したがって、新しくクローニングしたcDNAはバニロイド受容体サブタイプ1からVR1と命名した。本明細書において用いられる「カプサイシン受容体」という用語はVR1を含むが、VR1に制限されることはない。
【０１５４】
VR1をコードするcDNAはアミノ酸838個の蛋白質をコードするヌクレオチド2514個のオープンリーディングフレームを含み、推定分子量は95kDである（図1および2A）。親水性分析により、VR1は膜貫通領域5と6の間に別の短い疎水性部分（灰色の領域）を有する、6つの膜貫通ドメインを含むポリトピックな蛋白質であることが示唆される（図1に「TM」および黒い枠で示し、ほとんどがβシートであると推定される（図1B参照））。アミノ末端の親水性部分（432aa）は、比較的プロリンの多い領域と、それに続く3つのアンキリンリピートドメイン（白い枠）を含む。カルボキシル末端（154aa）は認識可能なモティーフを全く含まない。
【０１５５】
蛋白質データベースの相同性検索により、VR1と、プロトタイプメンバーにショウジョウバエ網膜蛋白質TRPおよびTRPL 32、33が含まれる推定ストアオペレーテッドカルシウムチャンネル（SOC）の系統のメンバーとの間に著しい類似性が認められた（図1C）。この系統のメンバーは、細胞内カルシウムストア34の枯渇に反応して細胞外カルシウムが細胞内に入るのを仲介すると提唱されている。これらの蛋白質はその推定される位相構成と、複数のアミノ末端アンキリンリピート33の存在に関して、VR1と類似している。また、VR1と、イオン透過経路33に寄与していると考えられる膜貫通ドメイン5および6の間の短い疎水性領域を含む、6番目の膜貫通領域内およびその近接のSOCとの間にも著しいアミノ酸配列類似性がある。これらの領域以外に、VR1はSOCと配列の類似性がほとんどなく、VR1はこのチャンネル蛋白質系統の遠い類縁であることが示唆される。VR1のカルシウムイオン透過性が高いことから、我々はそれでもこれがSOCとして機能する可能性を検討した。
【０１５６】
発現配列タグ（EST）データベース相同性検索により、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸の両方のレベルでVR1と高度の類似性を持ついくつかのヒトクローンが明らかとなった（図1C）。異なる起源から別々に単離されたこれら部分的cDNAの3つは、推定されるVR1ポアループおよび6番目の膜貫通ドメインの近くの配列をコードする。図2Cに示しているとおり、これらのクローンの1つ（hVR、Genbankアクセッション番号T12251）とVR1の対応する領域との類似性は非常に高く（アミノ酸同一性68%で、示した領域内の類似性84%）、ヒトVR1オルトローグまたは密接に関連したサブタイプであろうと示唆される。VR1の他のドメインに対応するヒトESTクローンは同等の類似性を示し（データは示していない）、同じヒト転写物の断片に相当すると考えられる。
【０１５７】
実施例3：VR1はストアオペレーテッドカルシウムチャンネル（SOC）として機能しない
VR1とSOCとの間のアミノ酸配列の類似性により、カプサイシン受容体がSOCとして機能することが示唆された。このことを調べるために、当技術分野において周知の方法にしたがい、VR1を発現する細胞内カルシウム枯渇卵母細胞でカルシウム依存性内向き電流を調べた。
【０１５８】
簡単に言うと、cRNA転写物をNot1で直鎖化したVR1のcDNA鋳型からT7 RNAポリメラーゼ17を用いて合成した。脱小胞アフリカツメガエル卵母細胞に0.5〜5ngのVR1 cRNAを注入した。注入の4から7日後、2電極電位固定記録を、Geneclamp 500増幅器（Axon Instruments）およびMacLab A/D変換器（Maclab）を用いて実施した（IC曲線および熱刺激実験ではE＝-60mV、他のすべての実験では-40mV）。記録チャンバーを、90mM NaCl、1.0mM KCl、2.4mM NaHCO、0.1mM BaCl、1.0mM MgCl、および10mM HEPESを含むカエルリンガー液（pH7.6）を用いて流速2ml/min、室温で灌流した。ストアオペレーテッド電流解析を実施する前に、卵母細胞を、1mM EGTAおよび1μM Thapsigarginを含み、カルシウムおよびバリウムを含まないカエルリンガー液中で1〜2時間インキュベートした。電位固定記録中、これらの卵母細胞を2mM Ca2+を含みEGTAを含まないカエルリンガー液に間欠的に曝露して、カルシウム依存性電流（2分間隔で15秒のパルス）を検出した（Petersenら1995 Biochem J. 311：41〜44）。
【０１５９】
水を注入した対照卵母細胞において、以前に記載されているとおり（Petersenら、前記）、明らかな枯渇誘発電流が認められた。VR1発現卵母細胞では、この反応に定量的または定性的相違は観察されなかった（データは示していない）。さらに、枯渇刺激カルシウム流入の阻害物質であるSKF96365（Merrittら1990Biochem J. 271：515〜522）を適用しても、VR1発現卵母細胞におけるカプサイシン誘発電流にまったく影響がなかった。したがって、VR1はこれらの環境において機能性SOCではないようである。
【０１６０】
実施例4：カプサイシン受容体の知覚神経特異的発現
神経性および非神経性ラット組織におけるVR1転写物の分布を、ノーザン法およびインサイチューハイブリダイゼーション分析の両方で評価した。成体Sprague-DawleyラットをCO中での窒息により安楽死させ、組織を新鮮摘出した。ポリA+ RNAをイソチオシアン酸グアニジニウム中で溶解後オリゴdTセルロース上で精製するか、またはFastTrackキット（Invitrogen）を用いて精製した。各試料約2μgを0.8%アガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレン（Hybond N、Amersham）に移し、全VR1 cDNAに相当するP標識プローブでハイブリダイズした。ブロットを高ストリンジェンシーで洗浄し、オートラジオグラフィにかけた。カプサイシン受容体cDNAをプローブとして調べた後、対照として放射性同位体標識シクロフィリンcDNA断片をプローブに用いて同じフィルターを再度調べた（例えば、試料間の相対RNA負荷で補正するため）。
【０１６１】
インサイチューハイブリダイゼーション組織化学評価のために、成体雌Sprague-Dawleyラットを麻酔し、PBS中4%パラホルムアルデヒドで灌流した。後根神経節、三叉神経節および脊髄を摘出し、液体N中で凍結し、OCT封入剤中に包埋し、クリオスタット上で切断した。切片（15ミクロン）を、Geniusキット（Boeringer Mannheim）を用いたVR1 cDNA（nt1513〜2483）の1kb断片のインビトロ転写により生成したジゴキシゲニン標識cRNAを用いて55℃で終夜処理し、これをプローブとして調べた。切片をアルカリ性ホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニンFab断片で、製造者の指示にしたがって展開した。
【０１６２】
ノーザンブロット解析およびインサイチューハイブリダイゼーション組織化学評価の両方により、VR1転写物が後根および三叉神経節内で選択的に発現されることが示された。約4kbのmRNA種が三叉神経節および後根知覚神経節で顕著に発現されたが、これらの神経節はいずれもカプサイシン感受性ニューロンを含むことが明らかにされている。この転写物は、脊髄および脳を含む試験した他の組織のいずれにも存在しなかった。ずっと小さいRNA種（約1.5kb）が腎臓で検出されたが、この転写物が機能性VR1蛋白質をコードしうるかどうかは不明である。
【０１６３】
知覚神経節内の細胞VR1発現パターンを評価するためのインサイチューハイブリダイゼーションにより、VR1が後根および三叉神経節両方の直径が小さいニューロンサブセット内に主として発現されることが示された。このことは、ほとんどのカプサイシン感受性神経が比較的小サイズから中サイズの細胞体を有するという知見と一致する（Holzer 1991 Pharmacol. Rev. 43：143〜201、Janscoら1977 Nature 270：741〜743）。VR1転写物が後根神経節のニューロンにおいて主として発現されるのとは対照的に、近接する脊髄後角では目に見えるシグナルはまったく認められなかった。放射性同位体標識レシニフェラトキシンの結合部位が後角で検出されているが、これらの部位は隣接する後根神経節内の一次侵害受容器から突き出しているシナプス前終末上にあると考えられている（Holzer 1991、前記）。ここで得た結果はこの解釈を支持するものである。
【０１６４】
実施例5：アフリカツメガエル卵母細胞におけるVR1の薬理学評価
クローニングしたカプサイシン受容体の薬理学的性質を知覚神経節における本来のバニロイド部位の性質と比較するために、VR1は発現卵母細胞であり、細胞全体の電位固定分析に用いて、様々なバニロイドアゴニスト（カプサイシン、レシニフェラトキシン）およびアンタゴニスト（カプサゼピン）に対するその電気生理学的反応を定量的に調べた。VR1をアフリカツメガエル卵母細胞中で、カプサゼピン阻害曲線を作成する際にBaClの代わりにCaCl（2mM）を用いた他は前述（実施例3）のとおりに発現させた。アゴニストであるカプサイシンおよびレシニフェラトキシンを順にVR1を発現する同じアフリカツメガエル卵母細胞に適用した。膜電流を細胞全体の電位固定装置において記録した（V＝-40mV）。
【０１６５】
カプサイシンおよびレシニフェラトキシンの試験の結果を図10A〜10Bに示す。バーはアゴニストを適用した期間を指す。負の固定電位で、カプサイシンまたはレシニフェラトキシンへの曝露によりVR1発現卵母細胞に用量依存性の内向き電流反応が生じたが、水を注入した対照細胞では生じなかった。知覚神経で観察された（Winterら1990 Brain Res. 520：131〜140、Liuら1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：738〜741）とおり、カプサイシン誘発性の電流反応はアゴニスト除去後速やかにベースラインに戻ったが、レシニフェラトキシンへの反応は、洗浄期間を延長した後でも回復しないことが多かった。これらのアゴニストの50%有効濃度は本来のバニロイド受容体で報告されている濃度（Ohら、前記、Bevanら1992 Br. J. Pharmacol. 107：544〜552）と桁は同じで、レシニフェラトキシンはカプサイシンに比べて約20倍強力であった（それぞれEC＝39.1nMと711.9nM）。これらの分析から得たHill係数（それぞれ1.95と2.08）より、受容体の完全活性化には2個以上のアゴニスト分子の結合を必要とすることが示唆され、やはり以前に記載されている本来のバニロイド受容体の性質と一致している（Ohら、前記、Szallasi 1994 Gen. Pharmac. 25：223〜243）。
【０１６６】
図11Aおよび11Bに示しているとおり、VR1発現卵母細胞におけるカプサイシン誘発反応は競合的バニロイド受容体アンタゴニストであるカプサゼピンにより本来の受容体を阻害する濃度（IC＝283.5nM）で阻止された（図10A〜10B）。電流軌跡により、カプサゼピン（cpz；10μM）によるカプサイシン作用（cap；0.6μM）の阻止は可逆的であることが示されている。バニロイド受容体のもう一つの薬理学的特性は、非競合的アンタゴニストであるルテニウムレッド（RR、10μM）に対する感受性であり、ルテニウムレッドもカプサイシン誘発反応（cap；0.6μM）を可逆的に阻止した（図11A）。レシニフェラトキシン（50nM）に対する反応も同様に、カプサゼピン（5μM）またはルテニウムレッド（10μM）により可逆的に拮抗された（データは示していない）。
【０１６７】
実施例6：HEK293胎児腎臓細胞で発現された組換えカプサイシン受容体のパッチクランプ分析
実施例1でクローニングした組換えカプサイシン受容体を、カプサイシン受容体を発現するHEK293細胞におけるパッチクランプ分析を用いた試験でさらに特徴付けた。HEK293細胞を対照ベクター（カプサイシン受容体をコードする配列のないpcDNA）でトランスフェクトした。パッチクランプ記録を一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞を用いて22℃で実施した。細胞全体について記録するための標準水浴溶液には、140mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl、2mM CaCl、10mM HEPES、10mMグルコース、pH7.4（NaOHで調製）が含まれた。カルシウムを含まない水浴溶液では、CaClを除き、5mM EGTAを追加した。
【０１６８】
1価カチオン置換実験では、細胞全体の形状を対照水浴溶液中で得た後、水浴溶液を140mM NaCl（またはKClもしくはCsCl）、10mMグルコース、および10mM HEPES（それぞれNaOH、KOHまたはCsOHでpH7.4に調整）に交換し、電圧ランプを用いて逆転電位を測定した。2価カチオンの透過性実験では、水浴溶液を110mM MgCl（またはCaCl）、2mM Mg(OH)（またはCa(OH)）、10mMグルコース、10mM HEPES、pH7.4（HClで調製）に交換した。
【０１６９】
アウトサイド・アウトパッチ記録の水浴溶液およびインサイド・アウトパッチ記録のピペット溶液には、140mM NaCl、10mM HEPES、pH7.4（NaOHで調整）が含まれた。インサイド・アウトパッチ記録の水浴溶液ならびにアウトサイド・アウトパッチ記録およびイオン置換実験のピペット溶液には、140mM NaCl、10mM HEPES、5mM EGTA、pH7.4（NaOHで調整）が含まれた。細胞全体の記録のピペット溶液には、140mM CsCl（または130mMアスパラギン酸Csおよび10mM NaCl）、5mM EGTA、10mM HEPES、pH7.4（CsOHで調整）が含まれた。液間電位差を別の実験で直接測定した。液間電位差は用いた溶液では3mVを超えず、このオフセットに対して補正は行わなかった。
【０１７０】
細胞全体の記録データを20kHzで収集し、分析のために5kHzでフィルターにかけた（Axopatch 200増幅器およびpCLAMPソフトウェア、Axon Instruments）。単一のチャンネル記録データを10kHzで収集し、1kHzでフィルターにかけた。1価カチオンのナトリウムに対する透過性の比（P/P）を次式により計算した：P/P＝exp(ΔVF/RT)、ただしVは逆転電位、Fはファラデー定数、Rは気体定数、およびTは絶対温度である。2価カチオンの等価性測定ではP/Pを次式により計算した：P/P＝[Na]exp(ΔVF/RT)(1+exp(ΔVF/RT))/4[Y]。イオン活性係数0.75（ナトリウム）および0.25（カルシウムまたはマグネシウム）を補正因子として用いた。
【０１７１】
図3は、-60mVでアスパラギン酸Cs充填ピペットを用いたカプサイシン受容体発現HEK293細胞の細胞全体の電位固定分析の結果を示す図である。これらのデータは、カプサイシン処理中にのみ生じ（カプサイシンが存在する（1μM）期間をプロットの上のバーで示している）、カプサイシンの水浴適用直後に短い潜時で現れる、内向きのカチオン特異的電流を示している。このような電流は、模擬トランスフェクトした対照細胞では観察されなかった。図4は、拡大した時間スケール上の、-100mVから+40mVまでの電圧増加（400ms）を示している。カプサイシン不在下の電流（a）をカプサイシン存在下で得た電流（b）から差し引いた。このデータ分析によって、電流が時間には依存せず、受容体依存性であることが判明した。カルシウムを含まない媒質中でも、カプサイシン誘発電流は-60mVの固定電位（図3）と-100から+40mVまでの電圧増加中（増分20mV、図4）のいずれにおいても時間に依存していなかった。この性質により、その後の実験で定常状態反応条件下でのカプサイシン仲介性電流の特徴付けが可能となった。これらのデータから得た電流−電圧相関から、このような反応が培養した後根神経節ニューロンで観察される（図4、Ohら、前記）のと類似の著しい外向きの整流作用を示すことが明らかにされている。これらの実験で用いたパッチピペットはアスパラギン酸セシウムで充填されていたが、水浴溶液は主に塩化ナトリウムで構成されていたため、観察された0mVに近い逆転電位（E＝0.5±0.9mV、n＝13）は、カプサイシン仲介性反応がカチオン選択的チャンネルの解放に関与していることを示している。
【０１７２】
知覚神経において、バニロイド誘発電流は1価および2価カチオンの混合物によって運ばれる（Bevanら1990 Trends Pharmacol. Sci. 11：330〜333、Ohら、前記、Woodら1988 J. Neuroscience 8：3208〜3220）。この現象をVR1を発現する哺乳類細胞で、VR1発現細胞におけるカプサイシン誘発電流に対する様々なカチオンの相対的寄与を調べる一連のイオン置換実験を通して調べた。異なるカチオン組成の溶液に浸けた細胞で確立した相関（図5；Na（a）、K（b）、Cs（c）、Mg（d）、またはCa（e）から、VR1が1価のカチオンは区別しないが、2価のカチオンに対しては顕著な選択性を示すことが判明した。細胞外NaCl（140 mM）を等モル濃度のKClまたはCsClと置換しても逆転電位が有意に変わることはなかった（それぞれE＝-0.7±1.2mV、n＝8、-1.5mV、n＝9、-4.3±0.9mV、n＝8。P/P＝0.94、P/P＝0.85）。細胞外NaClを等張性（112mM）MgClまたはCaClに置換すると、Eはそれぞれ14.4±1.3mV（n＝3）または24.3±2.3mV（n＝7）にシフトした。したがって、図5にまとめているとおり、これらのデータからカプサイシン受容体を発現する細胞膜がカプサイシン活性化電流に対し次のような相対的カチオン透過性を有することが明らかにされた：Ca＞Mg≫Na≒K≒Cs。VR1のカルシウムイオンに対する相対的透過性は非常に高く（P/P＝9.60、P/P＝4.99）、ほとんどの非選択的カチオンチャンネルで観察される値よりも高く、またこの特性が顕著なNMDA型グルタミン酸受容体で報告されている値（P/P＝10.6）（Mayerら1987 J. Physiol. 394：501〜527）と同等である。調べたすべての水浴溶液で、外向きに整流する電流−電圧相関が観察されたが、この特徴はMgClまたはCaClを含む水浴溶液ではあまり目立たなかった。
【０１７３】
培養した知覚神経において、バニロイド誘発反応の電気生理学的分析により、これらが動力学的に複雑で、持続的なバニロイド曝露により脱感作することが明らかにされている（Liuら、前記、Yeastら1992 J. Physiol. 446：390P）。この電気生理学的脱感作（これはインビボでバニロイドにより生じる生理学的脱感作の基盤をなすと考えられる）は、部分的に、細胞外カルシウムの存在に依存するようである（Yeastら、前記、Holzer 1991 Pharmacol. Rev. 43：143〜201）。VR1発現細胞がカプサイシンに反応する能力のカルシウム依存性を試験するために、細胞全体の電流反応をカルシウムを含む標準水浴溶液とカルシウムを含まない溶液の両方で試験した（図6A〜F）。カプサイシン（1μM）を5分ごとに適用した。ピペット溶液にはCsClを用いた。1回目の適用のピークに対する3回目の適用終了時の電流比は、カルシウムを含まない溶液では95.3±2.6%（n＝3）で、カルシウム含有溶液では13.0±4.3%（n＝5）であった（T検定、p＜0.00001）。事実、細胞外カルシウム不在下では、VR1をトランスフェクトした細胞におけるカプサイシン誘発反応は、長時間のアゴニスト適用中または連続的なアゴニスト攻撃により脱感作をほとんど、または全く示さなかった（1回目と3回目の適用の間で4.7±2.3%の低下、n＝3）。対照的に、カルシウム含有水浴溶液中で誘発された反応は、少なくとも2つの別々の成分で構成された。すなわち1つは脱感作（1回目と3回目の適用の間で87±4.3%の低下、n＝5）と、1つは相対的に非脱感作である。したがって、バニロイド誘発反応の脱感作および多相性動力学は、神経以外の状況でも再現可能で、周囲のカルシウム濃度への依存性により区別することができる。
【０１７４】
トランスフェクトした細胞から切り出した膜パッチにおいて、VR1反応の挙動も調べた。インサイド・アウト（I/O）またはアウトサイド・アウト（O/O）パッチをVR1でトランスフェクトした細胞から切り出し、カプサイシン（1μM）を水浴溶液に加え、対称性140mM NaCl中、所定の固定電位で分析した。図7に示したデータ中の破線は、チャンネルが閉鎖した状態を示す。他のパッチでは、複数の同時チャンネル解放が認められた。カプサイシン存在下でのみ単一振幅の大きくてよく分離した電流が観察され（図7）、このことからカプサイシンによってゲート制御されるイオンチャンネルがこれらのパッチに存在し、その活性化は可溶性細胞質成分に依存しないことが示される。図7に示したデータから計算した、平均単チャンネル振幅の電流電圧曲線（±s.e.m.、図8）も、顕著な外向き整流を示している。単チャンネルレベルの電流電圧相関は、類似のイオン条件下でのその外向き整流と0mVに近い逆転電位のため、本質的に細胞全体で確立したものと同一であった。正電位での76.7pSおよび負電位での35.4pSの単一コンダクタンスが、ナトリウムを唯一の電荷担体とした場合に観察された。これら単チャンネルの性質は、以前にバニロイド受容体について記載された性質を反映している（Ohら、前記、Forbesら1988 Neurosci. Lett. Suppl. 32：S3）。
【０１７５】
バニロイドの作用部位は、これら化合物の親油性を反映して、細胞質膜の細胞外に制限されないことが示唆されている（Jamesら「疼痛研究におけるカプサイシン（Capsaicin in the Study of Pain ）」（Wood編）83〜104頁（アカデミックプレス、ロンドン、1993）。興味深いことに、カプサイシンは、VR1発現細胞から切り出したパッチのいずれの側に加えた場合にも同じ反応を引き起こすことができ（図7）、バニロイドが脂質二重層を透過または交差してその作用を仲介することができるとする考えに一致している。可能性は低いが、外見上一致する説明としては、バニロイド受容体が細胞質膜の両側に、機能的に同等のカプサイシン結合部位を有するということがある。
【０１７６】
これらのデータから、クローニングされたカプサイシン受容体は、パッチクランプ分析において、野生型カプサイシン受容体で報告されているのと非常に類似した挙動を示すことが明らかである。
【０１７７】
実施例7：バニロイド濃度定量のための組換えカプサイシン受容体の利用
長年にわたって認められているとおり、種々のトウガラシの相対的辛味は非常に広い範囲にわたり、これは部分的にはバニロイド含量の差を反映している。今日まで、トウガラシをその相対的「辛味」に関して評価する方法は、主観的な精神物理学的解析（この場合、値はScovilleの単位で表される）（Scoville 1912 J. Am. Pharm. Assoc. 1：453〜454）またはカプサイシン含量の生化学的定量（Woodbury 1980 J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63：556〜558）に頼ってきた。クローニングしたバニロイド受容体のトウガラシ抽出物に対する電気生理学的反応がこれらのトウガラシの疼痛誘発能力に比例していたかどうかをさらに探究するために、異なる数種のトウガラシ（15g、Thai green、poblano verde、habanero、およびwax）を細かく刻み、50mlの無水エタノールを用いて室温で終夜抽出した。可溶性抽出物を真空乾燥により15倍に濃縮し、次いで電気生理学的解析のためにカエルリンガー液で1000倍に希釈した。等量の画分（トウガラシ重量に対して標準化）を、アフリカツメガエル卵母細胞中で発現させた組換えカプサイシン受容体を活性化する能力について試験した。2電極電圧クランプ解析法を用いて各トウガラシ抽出物が誘発した電流を定量的に測定することにより、カプサイシン受容体の活性化を評価した。反応を純粋なカプサイシンで得られた反応に対して標準化した（10μMを100に設定）。データを図11に示す（各値は、それぞれ別の卵母細胞から、4回個別に定量した値の平均値を示している。適用は30秒間）。クローニングした受容体のトウガラシ試料およびカプサイシン対照試料に対する相対的反応をヒストグラムに示し、典型的電流軌跡をヒストグラムの各バーの右に示す。水を注入した細胞では、抽出物により反応は誘発されなかった。
【０１７８】
カプサイシン受容体のトウガラシ抽出物に対する相対的反応は、従来の分析およびScovilleの熱単位の割当てにより求めた各トウガラシの相対的辛味に相関している。さらに、主観的な精神物理学的評価（Berkeleyら「トウガラシ：料理の本（Peppers：A Cookbook）」1〜120頁（SimonおよびSchuster、ニューヨーク、1992）により求めたこれら変異型トウガラシの「辛味」較差は、VR1活性化物質としての順位序列強度に相関していた。
【０１７９】
実施例8：カプサイシンはVR1発現細胞の死を誘導する
カプサイシンは、インビボおよびインビトロで一次求心性侵害受容器を選択的に破壊する神経毒であることが広く認められている（Janscoら1977 Nature 270：741〜743、Woodら1988 J. Neuroscience 8：3208〜3220）。この選択的毒性が単に受容体発現の特異性を反映しているだけであるのか、または知覚神経の他の性質もしくはそれらの環境に依存してるのかどうかを明らかにするために、バニロイド受容体を発現する非神経細胞を殺すカプサイシンの能力をインビトロで調べた。HEK293細胞をベクター単独（pcDNA3）、pcDNA3中で1:50に希釈したバニロイド受容体cDNA（VR1 1：50）またはバニロイド受容体cDNA単独（VR1）のいずれかで一過性にトランスフェクトした。14時間後、培地をカプサイシン（3μM、黒いカラム）または担体（0.3%エタノール、白いカラム）を含む培地で置き換えた（図12）。37℃で7時間後、死んだ細胞のパーセンテージをエチジウムホモダイマー染色を用いて定量した。データは代表的実験から3回の測定の平均±s.e.m.で表している。星印はエタノール処理細胞からの有意差を示している（T検定、P＜0.0001）。3回の独立の実験で同様の結果が得られた。
【０１８０】
図12に示しているとおり、カプサイシンへの連続的曝露数時間以内に、VR1でトランスフェクトしたHEK293細胞は、形態学的に、また生体染色を用いて調べたところ、大量の死を示した。これとは対照的に、ベクター単独でトランスフェクトした細胞は、この処理により死ぬことはなかった。細胞死の特徴は、顕著な細胞質腫脹、細胞質内容物の融合、および最終的溶解であった。したがって、非神経細胞でのVR1発現は、バニロイド処理した知覚神経で観察された細胞毒性を再現することができる。ヘキスト色素33342を用いた染色により、アポプトーシスによる細胞死28に伴うことが多い核分断の証拠は認められなかった（データは示していない）。また、これらの知見は、バニロイドが誘発する侵害受容器の死（Bevanら1990 Trends Pharmacol. Sci. 11：330〜333）、グルタミン酸塩が誘発する毒性刺激（Choi 1994 Prog. Brain Res. 199：47〜51）、および様々なイオンチャンネルの突然変異を構成的に活性化することにより生じる神経変性（Hongら1994 Nature 367：470〜473、Hess 1996 Neuron 16：1073〜1076）に対して提唱されている、過剰なイオン流入の結果生じる壊死性の細胞死と一致する。
【０１８１】
実施例9：水素イオンがVR1に対するカプサイシンの作用を強化する
感染、炎症、または虚血の結果生じる組織pHの低下が、哺乳類における疼痛を引き起こしうる。この作用は、プロトンの侵害受容神経表面の興奮性チャンネルを活性化する能力によるものとされている。これらの反応のサブセットが、バニロイドが誘発するものと類似の動力学、イオン選択性、およびルテニウムレッドによる拮抗作用を含む、共通の性質を有すると報告されている（Bevanら1994 Trends Neurosci. 17：509〜512）。さらに、水素イオンの閾下濃度が、知覚神経における低濃度カプサイシンの作用を増強することが明らかにされている（Petersenら1993 Pain 54：37〜42、Kressら1996 Neurosci. Lett. 211：5〜8）。したがって、プロトンはバニロイド受容体の外因性活性化物質またはモジュレーターとして作用している可能性があると提唱されている（Bevanら1994前記）。
【０１８２】
この可能性に取り組むために、クローニングしたバニロイド受容体に対する水素イオンの影響を、卵母細胞発現系を用いて調べた。カプサイシン（0.3μM）を試験期間中を通して投与した（図13において矢印で期間を示している）（V＝-40mV）。水浴溶液のpHを実験中に変化させた（図13において横棒で示している）。VR1発現卵母細胞は、カプサイシンを含まないpH6.3の水浴溶液に対して反応を示さなかった。水を注入した対照卵母細胞は、カプサイシンまたはpH6.3の水浴溶液のいずれに対しても反応を示さなかった（データは示していない）。9つの独立したVR1発現卵母細胞から得た電流反応を図14にまとめている。各カラムの灰色部分は、pH 7.6でカプサイシンによって誘発された最大電流を示し、黒い部分はpHを6.3に変化させたことによって誘発された追加の電流を表す。
【０１８３】
水浴溶液pHの突然の低下（7.6から5.5）は、カプサイシン不在下でVR1を活性化するには不十分で（この処理を施したVR1発現卵母細胞で大きな内向き電流を示したのは10%未満であった（データは示していない））、水素イオン単独ではこの蛋白質を効率よく活性化することはできないことが示唆される。次に、VR1活性化に対するカプサイシンおよびpHの両方の影響を調べた。VR1発現卵母細胞を、pH7.6でカプサイシン最大下濃度（500nM）で処理した（図13）。電流反応がいったん比較的安定なプラトーに達したら、pH6.3で同じ濃度のカプサイシンを含む溶液に卵母細胞を曝露した。これらの条件下で、内向き電流は最初のプラトーよりも5倍高い新しいプラトーに速やかに上昇した。pH7.6に戻すと直ちに、卵母細胞の反応は最初のプラトーに低下し、カプサイシンを除去するとすぐにベースラインに戻った。10μMのカプサイシンに対してはpHを低下しても反応は増強されず（データは示していない）、この増強作用はアゴニストの飽和下濃度でのみ認められた。これらの結果より、水素イオン単独ではVR1を活性化するのに十分ではないが、水素イオンはカプサイシン誘発反応を顕著に増強しうることが示唆される。
【０１８４】
実施例10：バニロイド受容体は有害な熱によって活性化される
カルシウム流入、コンダクタンス、ならびにカプサイシンおよびRR反応性におけるVR1活性に対する温度上昇の影響を調べた。
【０１８５】
a）細胞内カルシウムに対する熱の影響
カルシウム流入を仲介するVR1活性に対する熱の影響を、トランスフェクトしたHEK293細胞と前述の蛍光カルシウム流入スクリーニング法を用いて調べた。顕微鏡による蛍光カルシウム画像化法を用いて、加熱したカルシウム画像化緩衝液の添加前と添加直後に細胞を分析した（22℃のCIB 150ml中の細胞に65℃のCIB 300mlを適用した）。これらの条件下で、細胞を約45℃の最大温度に一過性に曝露した。
【０１８６】
ベクター単独でトランスフェクトした細胞では、細胞質の遊離カルシウムに軽度で散在性の変化が認められたにすぎなかったが、VR1発現細胞ではその高い割合で熱処理数秒以内にカルシウム濃度の著しい上昇が認められた。これらの反応は数分以内におさまり、その後のカプサイシンによる攻撃で特徴的カルシウム反応が起こることから、熱に対する反応が特殊な信号を発する事象で、非特異的な膜の摂動または細胞の完全性破壊の結果ではないことが示唆される。
【０１８７】
b）コンダクタンスに対する熱の影響
VR1でトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞全体のパッチクランプ分析（Vhold＝-60mV）を実施して、特定の熱誘発性膜電流がこの現象に関連しているかどうかを調べた。水浴溶液の温度を22℃から48℃に上げ（加熱）、次いで22℃に戻し、その後カプサイシン（0.5μM）を水浴に加えた。イオンの条件は図2のデータで記載したものと同一であった。電圧ランプ（500msで-100から+40mV）を反応の前および間と反応中に適用した。
【０１８８】
これらの細胞を温度の急速な上昇（25秒で22℃から50℃、水浴中サーミスターでモニターした）に曝露すると、大きな内向き電流（-60mVで791±235pA、n＝9）が生じ、これはその後の500nMでのカプサイシン適用により誘発された電流の大きさと典型的に類似であった（図15A）。熱およびバニロイド誘発反応はいずれも外向き整流作用を示し、これらが同じものによって仲介されていることが示唆される（図15B）。比較すると、ベクターでトランスフェクトした対照細胞の熱誘発反応はずっと小さく、整流作用は示さなかった（131±23nA、n＝8）。加えて、VR1でトランスフェクトした細胞における熱反応は刺激適用中に脱感作したが、ベクターでトランスフェクトした対照細胞で観察された小さい熱反応は脱感作しなかった。これらの結果より、VR1がそれ自体で、または他の細胞構成成分と関連して、熱変換器としてはたらいていることが示唆される。
【０１８９】
c）卵母細胞におけるVR1の熱活性化
VR1が異なる細胞環境で熱に対する同様の反応を仲介することができるかどうかを明らかにするために、VR1の熱活性化を卵母細胞系で試験した。VR1 cDNAまたは水のいずれかを注入した卵母細胞を、2電極電圧クランプ（Vhold＝-60mV）にかけ、その間、灌流緩衝液の温度を22.7℃から所定のレベルにまで上げ、次いで60秒間一定に保った。得られた内向き電流の強さを平均±s.e.m.で図16に示している（VR1、n＝8；水、n＝6の独立した細胞）。星印は水を注入した卵母細胞からの有意差を示す（T検定、P＜0.0005）。
【０１９０】
水を注入した対照卵母細胞では、灌流液温度の急速な上昇により、小さい内向き電流が生じ、50℃まで直線的に上昇した（図16）。VR1発現卵母細胞は、40℃までの温度では同様の反応を示したが、この閾値よりも上では、これらの反応は対照のものよりも有意に大きかった。したがって、この非哺乳類細胞においてさえ、VR1仲介性の温度反応特性は熱侵害受容器で報告されているもの（Fields、前記）と顕著な一致を示している。
【０１９１】
d）ルテニウムレッドによるVR1熱活性化の阻害
熱がカプサイシン受容体を通じて特異的に作用するかどうかをさらに調べるために、前述の系のVR1発現卵母細胞でルテニウムレッドの熱仲介性反応を阻害する能力を試験した。図17に示す電流軌跡は、代表的VR1または水注入卵母細胞から所定の刺激を連続適用中に生成した（V＝-60mV）。
【０１９２】
VR1を注入した卵母細胞は次のような内向き電流反応平均値±s.e.m.を示した（n＝5）：カプサイシン（1μM）、1221±148nA；熱（50℃）、2009±134nA；熱＋ルテニウムレッド（10μM）、243±47nA。ルテニウムレッドによる阻害は有意であった（88±2%、n＝5、ペアードT検定、P＜0.0001）。ルテニウムレッド不在下で連続的熱パルスを与えた場合には、電流反応の低下は見られなかった。水を注入した卵母細胞は、カプサイシンに対して反応を示さず、熱に対してもずっと小さい反応（338±101nA、n＝5）を示した。ルテニウムレッドはこれらの反応を21±26%阻害したにとどまった（n＝5、ペアードT検定、P＜0.1）。
【０１９３】
これらのデータより、VR1がこの熱反応に直接関与していることが示される。ルテニウムレッドを適用すると、VR1発現卵母細胞の熱に対する反応は有意に低下した（88±2%、n＝5）が、対照細胞で見られたより小さい反応は、21±26%（n＝5）低下したにすぎなかった（図17）。合わせて考えると、これらの知見は、VR1が有害な熱により活性化されるが、無害な熱によっては活性化されないという仮説を強く支持するものである。
【０１９４】
実施例11：マウスVR1遺伝子の染色体内分布と単離
マウスVR1遺伝子の染色体内分布を、当技術分野において周知の方法に従い蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を用いて調べた。簡単に言うと、マウスVR1遺伝子の一部をコードするマウスゲノムDNAの90〜100kbのインサートを含む細菌人工染色体を、ラットVR1由来プローブを用いたPCR分析およびサザンハイブリダイゼーションにより単離した。このインサートをジゴキシゲニンで標識し、マウス染色体の中期スプレッドに適用した。次いで、蛍光標識した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、VR1遺伝子がハイブリダイズした染色体上の位置を可視化した。
【０１９５】
VR1遺伝子は、染色体11の末端小粒に対する異質染色質−真正染色質の境界から約49%の、マウス染色体11のB3バンドに位置していた。マウス染色体のこの領域は、ヒト染色体17、特に17p11〜13、17pter、および17qterとシンテニックである。したがって、ヒトVR1遺伝子はヒト染色体上の類似の領域に位置する可能性が高い。
【０１９６】
マウスVR1遺伝子の塩基配列を当技術分野において周知の方法にしたがって決定した。マウスVR1のヌクレオチド（配列番号：10）およびアミノ酸（配列番号：11）配列を、下記の配列リストに提示する。ラットおよびマウスVR1アミノ酸配列は、95%よりも高い同一性を示す。
【０１９７】
実施例12：カプサイシン受容体関連ポリペプチドVRRP-1の同定
VR1を用いたGenbankデータベース検索により、VR1に類似の多くのヒトおよびマウスEST配列が明らかとなった。これらのEST配列の位置関係から、1つ（下記参照）を除くこれらすべてが同一または非常に類似の遺伝子をコードしていることが示唆され、これらはVR1遺伝子のヒトおよびマウス型の断片に相当することが示唆される。分析したすべての領域で、コードされるヒトおよびマウス蛋白質の推定配列はお互いに非常に同一性が高かったが、ラットVR1に対しては約50%の同一性しかなかった。マウスVR1蛋白質はラットVR1蛋白質に対して50%よりも類似性が高いため、我々はこれらのEST配列が関連蛋白質のヒトおよびマウス型をコードしているに違いないと結論し、この蛋白質をVRRP-1と命名した。VRRP-1は本発明が含むカプサイシン受容体関連ポリペプチドの一例である。
【０１９８】
マウス脳、ラット脳、およびヒトCCRF-CEM細胞から得たVRRP-1遺伝子の一部を、ヒトおよびマウスEST配列のコンセンサスに基づいたPCRプライマー（GAC CAG CAA GTA CCT CAC（配列番号：12）およびC TCC CAT GCA GCC CAG TTT ACT TCC TCC ACC CTG AAG CAC CAG CGC TCA（配列番号：13）））を用いてクローニングした。全長ラットVRRP-1 cDNAを、ラットPCR産物を放射性同位体標識プローブに用いてラット脳cDNAライブラリから単離した。ラットVRRP-1 cDNA（配列番号：3、アミノ酸配列番号：4））はラットVR1とアミノ酸レベルで約49%同一（配列番号：2（ラットVR1）および4（ラットVRRP-1））であり、ヌクレオチドレベルで約59%同一（配列番号：1（ラットVR1）および3（ラットVRRP-1））である。
【０１９９】
VRRP-1はカプサイシンまたは熱により活性化されないようである。予備的証拠により、VRRP-1がVR1と相互作用する可能性が示唆される。
【０２００】
実施例13：ヒトカプサイシン受容体VR1の同定
VR1とVRRP-1およびGenbankデータベースの他の配列との比較により、VR1とVRRP-1は相互に密接に関連しており、1つの例を除いて他のいかなるクローニング配列との関連性よりも密接であることが示唆される。ヒトCCRF-CEMリンパ球様細胞から得た1つのEST配列（アクセッション番号AA321554、配列番号：8）は、ラットVR1の推定カルボキシ最末端ドメイン（配列番号：2のアミノ酸残基774から838、図18の略図の領域2参照）に少なくとも71%同一で、少なくとも80%類似のアミノ酸配列（配列番号：9）をコードする。さらに、ラットVR1（配列番号：1）およびヒトEST AA321554（配列番号：8）はヌクレオチドレベルで75%同一である。加えて、EST AA321554はラットVR1の停止コドンと同じ位置に停止コドンを含む。これとは対照的に、EST AA321554の一部とラットVRRP-1のカルボキシ末端との間には相同性がある（図18の領域1参照）が、ラットVRRP-1ポリペプチドはラットVR1ポリペプチドおよびEST AA321554がそれから由来すると考えられる蛋白質よりも短い。さらに、領域1の中でも、ラットVR1とEST AA321554との間には、ラットVR1とラットVRRP-1との間、またはラットVRRP-1とEST AA321554との間よりも高い相同性がある。したがって、ヒトEST配列AA321554はラットVR1のヒト型（オルトローグ）に相当する。
【０２０１】
CCRF-CEM細胞から単離したcDNAまたはヒト知覚神経節cDNAからこの断片を増幅するために、ヒト配列に基づくPCRプライマーを設計した。得られた断片をプローブに用いてヒトゲノムDNAライブラリをスクリーニングし、CCRF-CEM細胞またはヒト知覚神経節cDNAから全長ヒトVR1 cDNA配列を得る。得られたヒトVR1ゲノム断片を用いて、VR1遺伝子の染色体内分布をFISHにより確認する。ヒトVR1遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能を、前述の機能解析法を用いて確認する。ヒトVR1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、当技術分野において周知の方法にしたがって決定する。
【０２０２】
実施例14：ヒトカプサイシン受容体関連ポリペプチドVRRP-1の同定
ラットVRRP-1配列を用いてGenbankデータベースをスクリーニングし、他の生物からのカプサイシン受容体関連ポリペプチドを同定した。スクリーニングにより、ラットVRRP-1の別々の3領域と相同性を有するいくつかのヒトおよびマウスEST配列を同定し、これらの領域を領域A、B、およびCと呼ぶ。領域A、B、およびCは、ヒトおよびマウスVRRP-1をコードするESTが密集するVRRP-1配列の部分に相当し、それぞれ5'から3'方向に位置づけられる。領域Aは、ラットVRRP-1ヌクレオチド配列のだいたい残基580から残基850を含み、領域Bはだいたいヌクレオチド残基960から残基1730を含み、領域Cはだいたいヌクレオチド残基1820から残基2505を含む。これらの領域それぞれに対応するヒトおよびマウスEST配列のまとめを、下記の表に示す。
【０２０３】
【表】
ラットVRRP-1に対応するヒトおよびマウスEST配列
0004444493.tif 000003
【０２０４】
これらのヒトおよびマウスEST配列を用いて、領域A、Ｂ、およびCそれぞれのコンセンサスヌクレオチド配列を決定することができる。領域A（配列番号：5）、領域B（配列番号：6）、および領域C（配列番号：7）に対するヒトVRRP-1のコンセンサスヌクレオチド配列を下記の配列表に示す。コンセンサス配列を用いてPCRプローブを設計し、当技術分野において周知の方法を用いて全長VRRP-1をコードする断片を単離することができる。
【０２０５】
実施例15．ヒトVRRP-1のクローニング
ラットVR1ヌクレオチドおよび蛋白質配列を用いて、genbankデータベースを関連するものについて検索した。ラットVR1に相同性を示す多くの発現配列タグ（EST）配列が見いだされた。これらの起源はヒトおよびマウスであった。これらの配列は互いに、またラットVR1と密接な関係にあり、また1つのヒト配列を除くすべてが同じ蛋白質をコードすると考えられること、およびこの蛋白質はマウス配列によってコードされる蛋白質と高度に相同であることが判明した。これらのヒトおよびマウス蛋白質の推定配列はラットVR1蛋白質と約50%同一であったが、お互いはそれよりもずっと高度に関連していた。
【０２０６】
ヒトおよびマウスEST配列を用いて、PCRプライマーを設計し、これを次いでラット脳由来cDNAに対して用いてこの推定蛋白質のほとんどをコードするDNA断片を増幅した。この断片を放射性同位体標識し、ハイブリダーゼーションプローブに用いてラット脳由来cDNAライブラリから全長cDNAを単離した。このcDNA（ラットVRRP-1）は、入手可能なEST配列から推定して、ラットVR1蛋白質と49%同一、およびヒトVRRP1蛋白質（配列番号：23）と74%同一の761aaの蛋白質（配列番号：3）をコードする。ラットVRRP-1 mRNAは知覚神経節ならびに脳、脊髄、脾臓、肺、および大腸などの他の組織で発現される。
【０２０７】
ヒトおよびマウスEST配列を用いて、ヒト由来cDNA源からヒトVRRP-1配列の増幅を可能にするPCRプライマーを設計した。ヒトCCRF-CEM細胞由来cDNAを用いて、ヒトVRRP-1 cDNAの断片を増幅して配列決定し、それにより報告されているEST配列のサブセットとのその同一性を確認した。続いて、推定されるヒトVRRP-1配列の5'および3'末端に対するPCRプライマーを用い、ヒトEST配列のラットVRRP-1との位置関係により推定ヒトcDNAの正しいサイズである約2500bpのDNAバンドを、CCRF-CEM由来cDNAから増幅した。
【０２０８】
実施例16．ニワトリVR1相同体のクローニング
ラットVR1のアミノ酸配列に基づき変性オリゴヌクレオチドを設計した。ニワトリゲノムDNAを鋳型に用いてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために、VR1アミノ酸残基638〜644および676〜682にそれぞれ対応するオリゴヌクレオチドODJ3885およびODJ3887をプライマーに用いた。
ODJ3885（配列番号：28）−5' TT(TC)AA(AG)TT(TC)AC(GATC)AT(ATC)GG(GATC)ATG
ODJ3887（配列番号：29）5' CAT(GATC)A(GA)(GATC)GC(GAT)AT(GATC)A(GA)CAT(AG)TT
【０２０９】
約130bpの産物が得られ、これを単離してベクターpT-Adv（Clontech）にライゲートした。これらプラスミドクローンのいくつかのインサートを配列決定した。ニワトリゲノムDNA由来の産物は次の2クラスに分けられた：一つは非常に近い相同体に対応しており、もう一つは幾分異なる相同体に対応している。
CVR-PCR1（配列番号：30）
TTCAAGTTCACGATTGGGATGGGTGACCTGGATTTTCATGAACATGCCAGATTCAGATACTTTGTCATGCTTCTGCTGCTGCTTTTTGTGATCCTCACCTACATCCTTTTGCTCAACATGCTTATAGCCCTTATA
CVR-PCR2（配列番号：31）
TTCAAGTTCACTATTGGGATGGGAGACCTGGAGTTTACAGAGAACTACAGGTTCAAGTCTGTGTTTGTCATCCTTTTGGTTCTCTATGTCATCCTTACGTACATCCTCCTGCTCAATATGCTTATAGCCCTAATG
【０２１０】
CVR-PCR2を含む150bpのEcoRI断片をハイブリダイゼーションプローブに用いて、ニワトリ胚後根神経節（DRG）から単離したRNA由来cDNAライブラリからのクローンをスクリーニングした。いくつかのハイブリダイズするプラスミドを同定した。これらのうちの2つはラットVR1のニワトリオルトローグに相当すると考えられる。これらpCVR2の1つのインサートを完全に配列決定した（配列番号：24）。推定蛋白質配列（配列番号：25）はラットVR1と67%のアミノ酸同一性を示す。ラットおよびニワトリVR1 cDNAのコーディング領域のヌクレオチド配列も67%の同一性を示す。pCVR2でトランスフェクトしたHEK293細胞の電気生理学的分析およびカルシウム画像化分析により、コードされた蛋白質がプロトンおよび高用量のバニロイド、レシニフェラトキシンには反応するが、カプサイシンおよびラットVR1を活性化する加熱プロトコルには反応しないことが示されている。
【０２１１】
実施例17．ヒトバニロイド受容体のクローニング
ヒトゲノムDNAを鋳型にしてのODJ3885およびODJ3887を用いたPCR反応から130bpの産物が得られた。このバンドを精製し、pT-Advにクローニングした。いくつかのクローンのインサートを配列決定し、その結果これらはすべてラットVR1の非常に近い相同体またはオルトローグをコードすることが明らかとなった。ヌクレオチド配列（配列番号：26）はラットVR1の対応する領域と91%同一である。この45コドン部分について推定蛋白質配列はラットVR1のものと同一である。
【０２１２】
この新しい配列を用いて、他のPCRプライマーを設計し、ヒトcDNA源からVR1相同配列のより大きい部分の増幅が可能となった。ヒトDRG由来cDNAを鋳型に用いてのPCR反応に、VR1アミノ酸残基423〜429に対応するプライマーODJ4018と、ヒトEST AA321554の配列から誘導したプライマーODJ3767を用いた。
ODJ4018（配列番号：32）5' TA(TC) TT(TC) AA(TC) TT(TC) TT(TC) GT(GATC) TA 3'
ODJ3767（配列番号：33）5' AAA AGG GGG ACC AGG GC 3'
【０２１３】
得られた産物をゲル電気泳動で分離し、以前のPCR分析から誘導した150bpのプローブとのハイブリダイゼーションのためにナイロンメンブレンに移した。約1100bpのハイブリダイズする断片を同定した。これは、ラットVR1配列中のこれらプライマーの位置から産生が推定されるサイズである。
【０２１４】
この断片を配列分析のためにクローニングした。得られた配列データを用いて、この配列に対応する全長ヒトcDNAをクローニングするためのプライマーを設計した。これはRACE PCRクローニング法を用いて達成される［Frohman, M.A. (1993) Methods Enzymol, 218：340〜358］。これはまた、小さいPCR断片HVR-PCR1の配列から誘導したプライマーを用いて実施してもよい。
【０２１５】
前述の明細書中に記載したすべての出版物および特許は参照として本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、前述の本発明の方法およびシステムに様々な修正および変更を加えられることが、当業者には明らかであると思われる。本発明を特定の好ましい態様に関して述べてきたが、請求される本発明の範囲はこのような特定の態様に不当に制限されるべきではないことが理解されるべきである。事実、本発明を実施するために記載された形態の、分子生物学または関連する技術分野の技術者には明らかな様々な改変が、特許請求の範囲内であることが意図される。
【０２１６】
本発明のヌクレオチドおよびポリペプチド配列を記載する前に、前述の特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬は、当然のことながら変動しうるため、本発明がこれらに制限されるものではないことが理解されるべきである。同様に、本明細書において用いられる用語は特定の態様を説明することだけを目的としており、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるということも理解されるべきである。
【０２１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形（「a」、「an」、および「the」）は、前後の文脈からそうではないことが明らかに示されている場合を除き、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば「宿主細胞（a host cell）」と記載する場合はこのような宿主細胞の複数を含み、「この抗体（the antibody）」と記載する場合は1つまたは複数の抗体および当業者には周知のその等価物を含み、その他も同様である。
【０２１８】
別に定義する場合を除き、本明細書において用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の技術者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で記載されている方法、装置および材料に類似または同等のいかなるものも、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置および材料は本明細書に記載されている。
【０２１９】
本明細書に記載の発明に関連して用いられると考えられる出版物中に記載されている例えば細胞株、ベクター、および方法を説明および開示するために、本明細書において言及したすべての出版物は参照として本明細書に組み入れられる。本明細書中で論じられている出版物は、本出願の提出日より前にそれらが開示されているためだけに提供されている。本明細書のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日付を早める権利が本発明者らには無いと自認したと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図1Aは、カプサイシン受容体アミノ酸配列に存在する推定ドメインを示す。白い枠はアンキリンリピートドメインを示し；黒い枠は推定膜貫通ドメインを示す；および灰色の枠は可能性があるポアループドメインを示す。黒丸は推定蛋白質キナーゼA燐酸化部位を示す。
【図１Ｂ】  図1Bはカプサイシン受容体の推定される膜トポロジーおよびドメイン構造を示す。「A」と表記された白い丸はアンキリンドメインを示す；黒い部分は膜貫通ドメインを示し；および灰色の影をつけた領域は可能性があるポアループ領域を示す。「i」および「o」はそれぞれ、膜内側および外側の葉状器官を示す。
【図１Ｃ】  図1Cはカプサイシン受容体VR1を関連する配列と共に配置して示す。同一の残基に濃い影をつけて保存的置換には薄い影をつけている。
【図２】  図２は、カプサイシン受容体を発現するHEK293細胞の細胞全体の電位固定分析の電流トレースである。
【図３】  図３は図３に示したデータに関して−100 mV〜＋40 mVまでの電圧増加（400 ms）を示すプロットである。
【図４】  図４は、図４からのデータの電流・電圧曲線を示すグラフである。
【図５】  図５は、カプサイシンに暴露して、イオン組成を変化させた条件下で調べた組換え型カプサイシン受容体発現細胞の膜から発生した電圧のグラフである。a＝NaCl；b＝KCl；c＝CsCl；d＝MgCl；e＝CaCl。
【図６】  図6A〜6Fは細胞全体の電位固定実験においてカプサイシン誘発電流に及ぼす細胞外カルシウムの影響を示すグラフである。
【図７】  図７は、アウトサイド・アウト（O/O）およびインサイド・アウト（I/O）パッチを用いてカプサイシン受容体を発現するHEK293細胞におけるカプサイシン誘発電流の単チャンネル挙動を示すグラフである。
【図８】  図８は、図７において得られたデータの電流・電圧関係を示すグラフである。
【図９Ａ】  図9Aは、カプサイシン受容体を発現するアフリカツメガエル卵母細胞における細胞全体の電位固定実験に及ぼすカプサイシンおよびレシニフェラトキシンの作用を示すグラフである。バーはアゴニストを適用した期間を指す。細胞全体の電位固定装置において膜電流を記録した（V＝−40 mV）。
【図９Ｂ】  図9Bは、VR1-発現卵母細胞におけるカプサイシン（四角）およびレシニフェラトキシン（白丸）の濃度反応曲線を示すグラフである。図9Bでは、それぞれの卵母細胞において１μMカプサイシンで得られた反応に対して膜電流を標準化して、カプサイシンに対する最大反応の割合として表記した。各点は、異なる卵母細胞５個の平均値（±s.e.m.）を表す。
【図１０Ａ】  図10Aは、細胞全体の電位固定実験においてカプサイシン誘発電流に及ぼすカプサゼピンの作用を示すグラフである。スラッシュマークはそれぞれ２および３分の洗浄期間を表す（n＝３）。cap＝カプサイシン；cpz＝カプサゼピン；RR＝ルテニウムレッド。各点は異なる卵母細胞４個を表す。各卵母細胞におけるカプサイシン（0.6 μM、白い菱形）によって誘発された電流反応に対して、電流反応を標準化した。スラッシュはそれぞれ２および12分の洗浄期間を示す（n＝３）。
【図１０Ｂ】  図10Bは細胞全体の電位固定試験におけるカプサイシン反応のカプサゼピン阻害曲線を示すグラフである。
【図１１】  図11は、いくつかの異なる赤トウガラシの相対的カプサイシン含有量を反映する対応する電流トレースを示すヒストグラムである。
【図１２】  図12は、カプサイシン受容体コードcDNAを一過性にトランスフェクトさせたHEK293細胞における細胞死の誘導を示すグラフである。白いカラム＝担体（エタノール）単独に暴露した細胞；黒いカラム＝カプサイシンに暴露した細胞；pcDNA3＝カプサイシン受容体コードDNAを含まない対照細胞；VR1（１：50）＝対照pcDNA3で50倍希釈したカプサイシン受容体コードcDNAを一過性にトランスフェクトさせた細胞。星印はエタノール処理細胞に対する有意差を示す。
【図１３】  図13は、カプサイシン受容体を発現する卵母細胞におけるカプサイシン受容体活性に及ぼす水素イオンの影響を示す電流トレースである。capオン＝カプサイシン添加時間；capオフ＝カプサイシン除去時間。水浴のpHは実験中、横棒で示すように変化させた。
【図１４】  図14は、異なるカプサイシン受容体発現卵母細胞９個から得られた電流反応の概要を示すグラフである。それぞれのカラムの灰色部分は、pH 7.6でカプサイシンによって誘発された最大電流を示し、黒い部分は水浴のpHを6.3に変化させたことによって誘発されたさらなる電流を表す。
【図１５Ａ】  図15Aは全パッチクランプ分析によって決定した、カプサイシン受容体発現HEK293細胞におけるカプサイシン受容体活性に及ぼす熱およびカプサイシンの影響を示す電流トレースである。
【図１５Ｂ】  図15Bは図15Aにおいて得られたデータの電流・電圧関係を示すグラフである。
【図１６】  図16はカプサイシン受容体を発現するアフリカツメガエルの卵母細胞における無害ではない侵害熱刺激によるカプサイシン受容体の活性化を示すグラフである。星印は水を注入した対照卵母細胞に対する有意差を示す。
【図１７】  図17は、カプサイシン受容体を発現するアフリカツメガエルの卵母細胞および水を注入した対照卵母細胞に及ぼすカプサイシン、熱、および熱＋ルテニウムレッド（RR）の影響を示す代表的な電流トレースを示す。
【図１８】  図18はラットVR1、ラットVRRP-1、およびヒトEST配列AA321554の関係を示す略図である。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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