(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然海水より分離したアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物を含む石油分解微生物コンソーシアと栄養源とを含む固定化担体を重油と接触させることを特徴とする重油分解方法。
【請求項２】
石油分解微生物コンソーシアが、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）と同定されるＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３９４）とＧＲ２１１−Ｐ２菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９５）と、バチルス属細菌と同定されるＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）からなる請求項１記載の重油分解方法。
【請求項３】
担体が、アルギン酸塩及び鶏卵をベースとして調製されたものである請求項１又は２記載の重油分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、船舶や精油所などから海洋や河川に流出した重油を微生物により効率よく分解して除去する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
石油の海上輸送事故や貯油タンクの破損事故などによる重油の流出は、沿岸を汚染するのみならず、長期間にわたって海洋や河川の水面上に拡散し、生態系に重大な影響を及ぼすため、しばしば社会環境上の大きな問題となっている。
ところで、通常、水面上に流出した重油成分中、低沸点画分は蒸発によって短期間に消失するが、高沸点画分は水面に拡散したり、水底に沈殿し、最終的には微生物により分解されることが知られており、このため、微生物を利用した流出油の除去方法が注目され、これまでに微生物製剤を用いて処理する方法［「用水と廃水」，第３３巻，第６５２〜６５７ページ（１９９１）］、窒素やリンなどの栄養源を持続的に補給する方法［「エンバイロンメンタル・サイエンス・アンド・テクノロジー（Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，第７巻，第５３８〜５４１ページ（１９７３）］、栄養源内包マイクロカプセルを用いる方法［「発酵工学」，第６３巻，第１４５〜１５１ページ（１９８５）］などが提案され、沿岸の漂着油及び土壌の石油汚染除去に利用されている。
しかしながら、これまでの生物的分解を利用した重油処理においては、特に希薄状態となった油分について分解速度が遅く、実用化に際し障害となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これまで実用化の際に障害となっていた、水面上に拡散した重油を微生物で分解するときの分解速度を促進するとともに長期間にわたって、効率よく分解性能を持続させる方法を提供するためになされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、石油分解微生物及び栄養源を同時固定化した担体を用い、速い分解速度で、かつ長期間にわたって円滑に重油分解を行うことができる方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、アルギン酸ナトリウム及び鶏卵で調製した担体が浮上性を示し、しかも栄養源の拡散も制御可能であること、及び石油分解微生物としてカンジダ・スピーシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ.）を用いた場合、アルカン類の分解促進因子として鶏卵中のビオチンが有効であることを見出した［「生物工学」，第７４巻，第１６３〜１６６ページ（１９９６）］。
しかしながら、さらに研究を進めた結果、天然海水より分離した石油分解微生物コンソーシアを用いれば、その中に存在するアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物の相乗作用によりさらに効率よく重油の分解を行いうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、天然海水より分離したアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物を含む石油分解微生物コンソーシアと栄養源とを含む固定化担体（以下単に固定化担体という）を重油と接触させることを特徴とする重油分解方法を提供するものである。
本発明で用いる石油分解微生物コンソーシアは、ＧＲ２１１菌群と称されるもので、アルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物が共存しており、これらの共存により単一株や単一種の微生物よりも高い分解性を示すという特徴を有している。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明方法において用いる石油分解微生物コンソーシアは、天然海水、好ましくは無菌的に採取した表層海水を、例えばＣ重油を唯一の炭素源としたＮＳＷ培地を用いた集積培養法により調製することができる。
この集積培養法は、「ビュレチン・オブ・ジャパニーズ・ソサエティ・オブ・サイエンティフィック・フィッシャリーズ（Ｂｕｌｌ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｓｃｉ．Ｆｉｓｈ．）」，第４４巻，第１１２７〜１１３４ページ（１９７８年）に記載されている方法であり、例えば次のようにして行うことができる。
【０００７】
すなわち、Ｃ重油を添加したＮＳＷ培地に、海水からろ過集菌した菌体を接種し、２０〜３０日間振とう培養したのち、さらにこの培養液をＣ重油添加ＮＳＷ培地に加え、２０〜４０日間二次培養する。次いで、この二次培養液を希釈し、Ｃ重油を加え、エマルション化した平板培地上に塗抹し、５〜１５日間培養する。
このＣ重油寒天培養で形成されたコロニーを釣菌し、上記の平板培地と同様にして調製したＣ重油寒天斜面培地に接種し、培養を行う。
純粋分離は、Ｃ重油を加えたＮＳＷ培地を用いる液体培養とＣ重油寒天平板培養を繰り返すことにより行われる。
このような純粋分離を、マリン・アガー（Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ）２２１６［デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製］の平板培地を用いて行うことにより、主として４種類の形態の異なるコロニーが得られる。これらのコロニーから取得した単一菌株の中には、Ｃ重油の分解活性をほとんど示さないものもあるが、すべてのコロニーを含む微生物コンソーシアいわゆるＧＲ２１１菌群は、非常に強力なＣ重油分解活性を示す。
【０００８】
このＧＲ２１１菌群は、アルカニボラックス属に属するＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）及びＧＲ２１１−Ｐ２菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９５）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）からなっている。これらの菌株のうち、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表配列番号１に示す塩基配列（１４９４塩基を決定）を有し、またＧＲ２１１−Ｐ２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表配列番号１の最初の３個の塩基（ＴＴＡ）は未決定であるが、残りの部分（１４９１塩基）はＧＲ２１１−Ｐ１菌株のそれと全く一致した。
【０００９】
次に、本発明方法で用いる、栄養源を含む固定化担体は公知であり（「生物工学」，第７２巻，第３６３〜３７０ページ、同誌第７３巻，第２９５〜２９９ページ）、例えば鶏卵にアルギン酸塩を加え、さらに栄養源としてアルデヒド加工尿素及びリン酸マグネシウムを混合して、棒状に押し出し、中空キトサンカプセル浮体を封じ込めたのち裁断し、塩化カルシウム溶液中で約１時間凝固処理後、凍結乾燥することにより製造することができる。このものは、水に浮上する性質を有している。
【００１０】
本発明方法においては、このようにして得た栄養源を含む固定化担体を、先に分離した微生物コンソーシアを含む培養液に２０〜６０分間浸漬して菌を担持させて用いる。この際の担体（直径１２ｍｍ、長さ約３０ｍｍ、乾燥重量約１．３ｇ）１個当りの石油分解微生物の吸着量としては、１×１０3〜１×１０8ＭＰＮ、好ましくは１×１０5〜１×１０6ＭＰＮの範囲が適当である。
【００１１】
本発明方法により重油を分解するには、重油の浮遊している水面に、前記のようにして調製された固定化担体を投入、分散させ、それに担持された石油分解微生物と重油とを接触させる。例えば、海水中に、上記の固定化担体を分散させ、浮遊している重油と接触させると、次第に海水の濁度が上昇するのが認められる。これは、微生物の増殖に伴って生産される界面活性物質に起因するものと思われる。この濁度は経時的に上昇するが、その間分解も同時に進行するため、所定の濁度以上にはならない。石油分解微生物の投入量は、重油１リットル当り、１０6〜１０10ＭＰＮの範囲内で選ばれるのが、海水の状態、天候等を考慮して適宜増減することができる。この石油分解微生物の菌数は、投入後約８〜１５日で初期の１０〜１０００倍に増加し、この間重油の著しい分散が認められる。この担体による重油の分散は、主として鶏卵に含まれる界面活性脂質等の成分によるものである。
【００１２】
Ｃ重油を添加した栄養源を含有する海水に、石油分解微生物群を投入する場合、水温が２５〜３７℃の範囲では濁度が上昇するが、６〜１０日前後経過すると、３３℃付近では上昇していた濁度が低下する。これは、上記の期間に、部分的な重油の分解が進行し、微生物が生産する界面活性物質では濁度を保つのが困難な画分が優勢になり、見掛け上の濁度が低下するためと思われる。
また、温度が２０℃から４０℃の範囲で懸濁が認められ、重油は順調に分解される。
重油中には、通常炭素数５ないし３０のアルカン類のほか、芳香族炭化水素や複素環化合物が含まれているが、本発明方法によると、これらはいずれも完全に分解され、しかも二次公害をもたらすような副生物の生成は認められない。このようにして、水面上に浮遊している重油の６０％以上を分解することができる。
【００１３】
本発明方法においては、天然海水より分離した石油分解微生物コンソーシアを用いるが、このコンソーシアは、前記したように、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）と同定されるＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）とＧＲ２１１−Ｐ２菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９５）と、バチルス属細菌と同定されるＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）からなっている。
【００１４】
ところで、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）は、米国西海岸の海底堆積物からｎ‐アルカンを炭素源として集積培養法により分離された炭化水素分解細菌であり、この細菌は、一般の従属栄養細菌のように、グルコース、スクロースなどの糖質を利用することができず、脂肪族炭化水素、酢酸などの揮発性脂肪酸、ピルビン酸など限られた炭素化合物しか利用できない特異的な炭化水素分解細菌で、新属、新種として最近報告されたものである［インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマチック・バクテリオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），第４８巻，第３３９〜３４８ページ（１９９８）］。
【００１５】
したがって、前記のＧＲ２１１−Ｐ１菌株及びＧＲ２１１−Ｐ２菌株は、石油分解能を有することが予測される。
しかしながら、バチルス属細菌のＧＲ２１１−Ｗ菌株及びＧＲ２１１−Ｙ菌株は、各々単独では石油分解能を有しない。
しかるに、本発明方法において用いる石油分解微生物コンソーシアＧＲ２１１菌群は、それを構成する菌株を単独で用いた場合よりも高いＣ重油分解性を示す。それは、おそらく以下の理由によるものと考えられる。
【００１６】
すなわち、自然界での微生物による石油分解は、様々な微生物の共同作用によって行われているものと推察される。例えば、脂肪族炭化水素のアルカンは、一部の炭化水素分解細菌により酸化され、アルコールや脂肪酸を中間分解代謝産物として生成する。この結果、炭化水素分解細菌以外の微生物でもこれらの分解産物を順次利用できるようになり、最終的に二酸化炭素として系から排除される。
さらに複雑な構造のものでも、側鎖や飽和炭化水素部分のような易分解性部分の分解からはじまり、その中間分解産物は徐々に他の微生物に受け継がれて行く。
もしこのような共同作用が機能しなければ、その微生物の分解産物が系内に蓄積し、それが分解を阻害するように機能するという大腸菌のラクトース分解で広く知られる異化抑制作用（カタボライト・リプレッション）を引き起こすことになるであろう。また、界面活性作用物質や各種ビタミンなどを生産する微生物が、石油分解菌の分解作用を促進することもあり得る。このように石油の微生物分解は、石油成分に対する直接的な分解菌以外の微生物の働きも関与することにより、効率的に促進されることになる。
【００１７】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。なお、各実施例における最適分解温度、重油分解量の測定及び重油の成分変化の測定は、次のようにして行った。
【００１８】
（１）最適分解温度；先ず、ＧＲ２１１菌群によるＣ重油分解に最適な温度条件をバイオフォトレコーダー［アドバンテック（株）製、ＴＮ−１１２Ｄ］を用いて、Ｌ字型試験管での温度勾配培養により調べた。次いで、ろ過海水及び栄養塩類を用いて調製した液体培地１０ｍｌにＣ重油［昭和シェル石油（株）製］約３０ｍｇを投入し、分解菌群の培養液０．１ｍｌを接種し、１００ｒｐｍで振とう培養後、ポリエーテルスルフォンメンブランフィルターによりろ過した海水を用いて試料を５倍希釈し、ろ過海水を対照に６６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
（２）重油分解量；石油の分散による濁度変化を６６０ｎｍの吸光度測定により、また、培養液中の残留油分をヘキサン−トルエン混合溶媒（６：４、ｖ／ｖ）を用いて抽出後、重量測定により求めた。すなわち、所要の画分及び水層をビーカーに分取し、乾固後、混合溶媒により抽出した。塩分などの混入固形物分は石英ウールを充填したカラムを通してろ別した後、ガラスバイアル管に移し、ホットプレート上６０〜８０℃で溶媒を蒸散させ、重量変化がほとんど認められなくなった時点での秤量値を残存油分量とした。
【００２０】
（３）重油の成分変化；分解の前後におけるＣ重油の成分変化及び担体に含まれる油溶性成分等の分析はガスクロマトグラフ−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津製作所（株）製ＱＰ−１０００Ａ）を用いて行った。また、ＭＳはエレクトロンイオン化法により７０ｅＶで測定した。この際、ＧＣ部はキャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ製ＳＰＢ−１、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚２５μｍ）を用い、インジェクション温度は３００℃、カラム温度は５０〜３００℃のグラジエントとし、昇温後は３００℃で一定に保った。昇温速度は毎分５℃に設定した。ベンゼンに溶解した試料１μｌ（４０μｇ）を注入し、５．１分後より３秒おきにｍ／ｚ４０〜４５０の質量範囲を測定した。
【００２１】
参考例１（栄養源固定化担体の製造）
鶏卵５８０ｇにアルギン酸ナトリウム１０ｇを添加して１時間撹拌し、栄養源としてアルデヒド加工尿素［ＣＤＵ窒素、チッソ（株）製］及びＭｇＨＰＯ4を加え混合した後、口径１２ｍｍのチューブより押し出し、３０ｍｍの長さで切断した。次いで、これを５％ＣａＣｌ2溶液中で約１時間凝固処理した後、凍結乾燥した。海水浮上性の向上を目的に中空のキトサンカプセル浮体（直径５ｍｍ、長さ１５ｍｍ、重量５３ｍｇ）を切断前に担体内部に封じ込め、栄養源−石油分解微生物同時固定化用の担体（直径１２ｍｍ、長さ約３０ｍｍ、乾燥重量約１．３ｇ）を調製した。
【００２２】
参考例２（石油分解微生物コンソーシアの調製）
１９９３年１１月１２日香川県高松市香東川河口付近より汚染することなく採取した表層海水を用いた。水温は１９．０℃、比重は１．０２２であった。同試料は５℃で保冷し、研究室に持ち帰り実験に供した。石油分解微生物はＣ重油を唯一の炭素源としたＮＳＷ培地を用いて集積培養法により分離した。集積培養培地には船舶用Ｃ重油（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。０．５％（ｗ／ｖ）のＣ重油を添加したＮＳＷ培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容の三角フラスコに、海水試料２００ｍｌをＮｕｃｌｅｐｏｒｅフィルター（直径４７ｍｍ、孔径０．２μｍ、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ  Ｃｏ．製）でろ過集菌したフィルター１枚を接種し、２０℃、２９日間１６０ｒｐｍで振とう培養した。二次集積培養はＬ字型試験管（直径１８ｍｍ）にＣ重油添加ＮＳＷ培地１０ｍｌを入れ、一次集積培養液０．１ｍｌを接種後、２０℃、３１日間、４５ｒｐｍで振とう培養した。平板培養はＮＳＷ培地に０．５％（ｗ／ｖ）のＣ重油と２％（ｗ／ｖ）の寒天を加えた平板培地を用い、二次集積培養液の希釈液をコンラージ棒で塗沫し、２０℃で１０日間行った。
Ｃ重油寒天平板培地は次の方法で調製した。培地に添加するＣ重油量の１０％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ８０を加え、超音波発生機（３００Ｗ、３０ｋＨｚ、（株）東陽理工製作所製ＵＤ−２Ｎ−３００型）で２０分間、無菌的にＣ重油を乳化分散させた。このＣ重油乳化液を培地当りのＣ重油濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにＮＳＷ寒天培地に添加した。また、Ｃ重油寒天斜面培地は平板培地と同様に調製した。
上記のＣ重油寒天平板培養で形成したコロニーを釣菌し、Ｃ重油寒天斜面培地に接種し、２０℃で培養した。純粋分離はＬ字型試験管によるＣ重油を加えたＮＳＷ培地を用いた液体培養とＣ重油寒天平板培養を繰り返すことにより行った。
このようにして、マリン・アガー（Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ）２２１６（Ｄｉｆｃｏ製）の平板培地上に４種類の形態の異なるコロニーからなる石油分解ＧＲ２１１菌群を得た。
【００２３】
参考例３（石油分解微生物コンソーシア、ＧＲ２１１菌群を構成する微生物の菌学的性質）
参考例２で得たコロニー形態の異なる４種類の細菌、すなわちＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９５）、ＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）の菌学的性質を以下に示す。
【００２４】
（Ａ）ＧＲ２１１−Ｐ１菌株
１．形態的性質
（１）細胞形態：    桿菌
（２）グラム染色性：−
（３）胞子：        −
（４）運動性：      −
２．培養所見（コロニー形態）
（１）コロニーの形：円形／点状（ｃｉｒｃｕｌａｒ／ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）
（２）コロニーの隆起状態：円錐状（ｐｕｌｖｉｎａｔｅ）
（３）コロニーの周縁：全縁（ｅｎｔｉｒｅ）
（４）コロニーの色調：クリーム色〜白色（ｃｒｅａｍ〜ｗｈｉｔｅ）
（５）表面コロニーの直径：１〜３ｍｍ
３．生理的性質
0004542230.tif 000002
0004542230.tif 000003
４．主要キノン系                              Ｑ−１１（Ｈ2）
５．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（ｍｏｌ％）＊２    ５４
注）
＊１  特徴的集落色素を生成せず
＊２  ＨＰＬＣ法による
また、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表配列番号１に示す。
【００２５】
（Ｂ）ＧＲ２１１−Ｐ２菌株
培養所見（コロニー形態）
（１）コロニーの形：点状（ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍ）
（２）コロニーの隆起状態：半レンズ状（ｃｏｎｖｅｘ）
（３）コロニーの周縁：波状／不斉歯芽状（ｕｎｄｕｌａｔｅ／ｅｒｏｓｅ）
（４）コロニーの色調：クリーム色〜白色（ｃｒｅａｍ〜ｗｈｉｔｅ）
（５）表面コロニーの直径：１〜３ｍｍ
また、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、配列表配列番号１における最初の３個の塩基部分（ＴＴＡ）は未決定のため不明であるが、残りの部分はＧＲ２１１−Ｐ１菌株のそれと全く一致する。
【００２６】
0004542230.tif 000004
【００２７】
0004542230.tif 000005
【００２８】
上記菌学的性質の試験方法は、学会出版センター発行，長谷川武治編著，「微生物の分類と同定（下）改訂版」，第９９〜１６１ページ（１９８５）、恒星社厚生閣発行，日本海洋学会編，「沿岸環境調査マニュアル［水質・微生物編］」，第３５６〜３６４ページ（１９９０）、菜根出版発行，薮内英子外著，「新しい分類学に伴走する細菌同定法」，第６１〜７３ページ及び第８８〜９７ページ（１９８７），学会出版センター発行，駒形和男編，「微生物の化学分類法」，第１４３〜１５５ページ及び第２３９〜２４２ページ（１９８２）に記載されている方法に従って行った。また、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株及びＧＲ２１１−Ｐ２菌株については、さらに「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマチック・バクテリオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，第４８巻，第３３９〜３４８ページ（１９９８）を参考にした。
また、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株及びＧＲ２１１−Ｐ２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定は、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマチック・アンド・エボリューショナリー・マイクロバイオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，第５０巻，第８３５〜８４６ページ（２０００）に記載されている方法に準じて行った。
なお、コロニー形態は、マリン・アガー（Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ）２２１６（Ｄｉｆｃｏ製）の平板培地を用いて、２０℃、１週間培養後に観察した。
【００２９】
このようにして試験して得られたＧＲ２１１−Ｐ１菌株の菌学的性質を、前記「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマチック・バクテリオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」に記載されている新属、新種のアルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）のそれと対比したところ、両者はほとんどの点において類似していた。
また、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列（１，４９４塩基を決定）を、同じ文献に記載されているアルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列情報（ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｙ１２５７９）と比較したところ、対比可能な１，４８９塩基配列領域において、１００％の相同性が認められた。
以上の結果から、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株は、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）と同定された。
【００３０】
一方、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株は、コロニー形態において、その隆起状態及び周縁がＧＲ２１１−Ｐ１菌株のそれと若干異なっていたが、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１，４９１塩基を決定）を比較した結果、対比可能な１，４８９塩基配列領域において、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株及びアルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）と１００％の相同性を示した。国際的な基準によれば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性が９７％以上の場合、両者は同種とみなされることから［「インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマチック・バクテリオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，第４４巻，第８４６〜８４９ページ（１９９４）］、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株は、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株と同様、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）に帰属すると判断した。
【００３１】
次に、ＧＲ２１１−Ｗ菌株及びＧＲ２１１−Ｙ菌株の菌学的性質を、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、ウイリアム・アンド・ウイルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）発行，エヌ・アール・クリーグ（Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）及びジェイ・ジー・ホルト（Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｔ）編，「バージェイズ・マニュアル・オブ・システィマチックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，第２巻，第１１０４〜１１３９ページ（１９８６）を参考にし、バージーズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），第９版，第５５９ページ及び第５６２ページ（１９９４）と対比した結果、いずれもバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌であることが確認された。
【００３２】
参考例４
ＧＲ２１１−Ｐ１菌株、ＧＲ２１１−Ｐ２菌株、ＧＲ２１１−Ｗ菌群及びＧＲ２１１−Ｙ菌株のｎ‐テトラデカン及びＣ重油の分解試験を次のようにして行った。
石油の分解試験には、人工海水８００ｍｌに蒸留水２００ｍｌ、ＮＨ4ＮＯ3１００ｍｇ、Ｋ2ＨＰＯ4２ｍｇを添加し、ｐＨ８．０に調整した培地（ＮＰＳＷ培地）を用いた。人工海水は孔径０．２μｍの〔マイレックス−ジーヴイ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）［ミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）製］〕を用いてろ過滅菌を行って用いた。
培養は、唯一の炭素源としてｎ‐テトラデカン５０μｌ又はＣ重油５０ｍｇを加えたＮＰＳＷ培地１０ｍｌを含んだＬ字型試験管（直径１８ｍｍ）に、試験菌株を接種し、２０℃、２週間、振とう培養（４５ｒｐｍ）を行った。ｎ‐テトラデカンは孔径０．２μｍの〔マイレックス−エフジー（Ｍｉｌｌｅｘ−ＦＧ）［ミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）製］〕を用いてろ過滅菌を行った。
【００３３】
次いで、培養液中のｎ‐テトラデカンの分析は、全培養液をヘキサンで抽出したのち、下記条件のガスクロマト分析（ＧＣ）により行った。ｎ‐テトラデカンの定量は、ｎ‐ヘキサデカンを内部標準物質に用い、残存率は菌を接種しない培地（対照区）中のｎ‐テトラデカンの残存量を基準に求めた。
【００３４】
ＧＣの分析条件
１．カラム
液相：ＢＰＸ−７０［サイアンティフィック・グラス・エンジニヤーリング・カンパニー・リミテッド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｌａｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）］
長さ：０．２２ｍｍＩＤ×２５ｍ
液相の膜厚：０．２５μｍ
２．キャリアーガス
流量：３０ｃｍ／秒
試料注入口温度：２３０℃
３．測定条件
イニシャル温度：１００℃
昇温速度：５℃／分（１５０℃まで）
１５０℃で３分間保持
２０℃／分（２２０℃まで）
２２０℃で１．５分保持
４．検出器；ＦＩＤ
【００３５】
培養液中のＣ重油の分析は、全培養液をクロロホルムで抽出し、「ジャーナル・オブ・マリン・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），第２巻，第４５〜５０ページ（１９９４）に記載されているＴＬＣ／ＦＩＤ法を参考に、内部標準物質にステアリルアルコールを用いて、イアトロスキャンＭＫ−５（ヤトロン製）により行った。Ｃ重油成分の分解率は、前記ｎ‐テトラデカン残存率と同様、菌を接種しない対照区を基準として求めた。
【００３６】
ＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）、ＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）の石油分解能は、下記のとおりである。
すなわち、ＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）によるｎ‐テトラデカンの分解率は２０℃、１４日の培養で１９．３％であった（図１）。また、本菌株のＣ重油成分の分解性は２０℃、１４日の培養で、Ｃ重油中の飽和画分の分解率は５．４％であったが、芳香族画分、レジン画分及びアスファルテン画分はほとんど分解されなかった。
石油分解ＧＲ２１１菌群から分離されたＧＲ２１１−Ｐ１菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９４）は、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）と同定され、炭化水素並びにＣ重油飽和画分に対する明確な分解活性を有していることが分かった。
【００３７】
次に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭＰ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）については、上記の方法で培養した結果、いずれもｎ‐テトラデカンやＣ重油を添加した培地で、濁度の増加や石油を乳化するような現象はみられず、対照区と同じであった。このことから、ＧＲ２１１−Ｗ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９６）及びＧＲ２１１−Ｙ菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３９７）は石油分解能を有しないものと思われる。
【００３８】
参考例５（固定化担体の製造）
参考例１で得た凍結乾燥後の栄養担体を７０％エチルアルコールを用いて滅菌後、減圧乾燥し、Ｃ重油分解微生物９．３×１０5ＭＰＮ／ｍｌを含む培養液に３０分間浸漬して栄養源−分解微生物固定化担体を調製した。なお、ここでは、栄養担体を培養液に３０分間浸漬し、微生物培養液を吸着させる操作を固定化として表わす。このようにして調製された担体１個には５×１０5〜７×１０5ＭＰＮの石油分解菌群が吸着されていた。
【００３９】
実施例１
５００ｍｌ容の三角フラスコに、海水１００ｍｌとＣ重油３００ｍｇを入れ、さらに参考例５で得た湿潤重量約２ｇの固定化担体を加え、２０℃又は３０℃に保持して往復振とう培養（振幅３０ｍｍ、１００ｒｐｍ）を行った。また、対照のため微生物を固定化しない担体を用い、同じ実験を行った。これらの結果を濁度の経時変化のグラフとして図２に示す。
図中のＡは石油分解微生物群を担持させた担体１個、Ｂは微生物を担持しない担体１個の対照実験、Ｃは石油分解微生物群を担持させた担体２個、Ｄは微生物を担持しない担体２個の対照実験のグラフである。
【００４０】
実施例２
参考例５で得た固定化担体を用い、実施例１と同様にして、２０℃において処理したときのＣ重油分解率の経時変化を、培養液中の残存油分の混合溶媒抽出重量測定により求め、図３に示す。
この図から分かるように、油分残存率は培養時間の経過とともに低下しているが、これは分解の進行によるもので、２０℃の場合、処理開始３４日後、Ｃ重油約３００ｍｇを添加すると３６％が分解除去される。
【００４１】
実施例３
実施例１と同様にしてＣ重油を分解処理した場合のＣ重油成分の変化をＧＣ−ＭＳ分析により調べた結果を図４に示す。
図４において、試料Ｃ重油のマスクロマトグラム（Ａ）に規則的に現われているピークは、分子イオン及びフラグメントイオンの値からアルカン類で、飽和炭化水素の炭素数が１個ずつ異なる物質群である。炭素数２３個以上では分子イオンピークはほとんど認められなかったが、ｍ／ｚ７１、８５、９９（それぞれ炭素数５、６、７個のアルキル基に相当）のフラグメントイオンの規則的なマスクロマトグラムパターンから高沸点側の主要なピークはいずれも炭素数が１個ずつ増加したアルカン類と同定される。炭素数が３０個を越えると含有量が少ないためと考えられるが、ピークは著しく小さいか、ほとんど認められない程度であった。
【００４２】
栄養−菌担体を用いた場合のトータルイオンクロマトグラム（Ｃ）と液体培地を用いた場合（Ｂ）のいずれも、Ｃ重油試料のＧＣ−ＭＳマスクロマトグラムに認められるアルカン類に留まらず、微少なピークを含め、大部分のピークは消滅するか著しく小さくなっていた。これは栄養−菌担体の系及び固定化担体を用いない液体培養の系いずれも著しく分解が進行していることを示している。
【００４３】
一方、担体を用いた場合に試料Ｃ重油に含まれない物質によるピークが現われた。これはＣ重油無添加の対照実験検体から抽出した試料をＧＣ−ＭＳ測定したときのマスクロマトグラム（Ｄ）に同一のリテンションタイムに相当するデータ位置にピークが認められ、また、担体抽出物と栄養−菌担体系からの残存油分の新規ピークいずれも質量スペクトルのフラグメントイオンなどのパターンが類似していたことから、担体より抽出される物質のピークと同定される。
【００４４】
試料Ｃ重油中のアルカン類のピーク間に認められる多数の微少ピーク群は、原油に一般的に含まれている芳香族あるいは複素環化合物である。分解処理後にはこれらのピークも著しく小さくなっており、ガスクロマトグラフで分離可能な成分は炭素数が３０数個までのアルカン類に留まらず、芳香族化合物、複素環化合物いずれも顕著に分解された。担体から混合溶媒により抽出されるＣ重油に含有されない物質の量は担体１個（１．３４ｇ）当り６．６ｍｇであったこと、栄養−菌担体の系から抽出したＣ重油分解試料に認められる担体成分のピーク強度及び分解実験後の残存油分量（２０３ｍｇ）を勘案すると、残留物はＧＣ−ＭＳ分析による分析の因難な成分であり、分析可能な揮発成分の残留量は著しく小さいといえる。
【００４５】
石油分解微生物により処理した試料は液体培地（Ｂ）、栄養−菌担体（Ｃ）いずれもＣ重油成分の中で炭素数が１４個末満のアルカン類に相当する低分子量化合物の場合、ピークとして識別困難なほど小さかった。
炭素数が１４個以上の領域では芳香族化合物や複素環化合物と推測されるピーク群の残留が認められたが、図４で縦軸のトータルイオンのスケールは類似したものであることから、同ピーク群はＣ重油試料と比較して著しく小さい。このことは本発明で用いた石油分解微生物が幅広い石油成分の分解性を有することを示している。
【００４６】
【発明の効果】
本発明方法は、自然海水から得られる石油分解微生物コンソーシアを利用して、海洋や河川や湖に流出した石油を効率よく、しかも有害な副生物の生成なしに分解除去できるので、環境汚染の防止手段として好適である。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＧＲ２１１−Ｐ１菌株のテトラデカンの分解能力を示すグラフ。
【図２】  本発明方法における濁度の経時的変化を示すグラフ。
【図３】  本発明方法における重油分解率の経時的変化を示すグラフ。
【図４】  本発明方法における重油成分の経時的なマスクロマトグラムの変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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