(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中を検出しそして区別するための方法であって
ａ．患者の少なくとも１つの体液を解析し、脳卒中の少なくとも４つのマーカーの存在および濃度を検出し、ここで
ｉ．第一のマーカーはミエリン塩基性タンパク質であり、
ｉｉ．第二のマーカーはＳ１００タンパク質のベータアイソフォームであり、
ｉｉｉ．第三のマーカーはニューロン特異的エノラーゼであり、
ｉｖ．第四のマーカーは脳内皮細胞膜タンパク質である
そして
ｂ．前記解析から得られた情報から、虚血性または出血性大脳事象が起こったか確かめ、そして特定の種類の大脳事象を区別する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記体液が、血液、血液産物および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項１に定義される方法。
【請求項３】
前記解析の各々が、同一体液試料に対して行われる、請求項１に定義される方法。
【請求項４】
前記解析の少なくとも１つが、第一の体液試料に対して行われ、そして前記解析の少なくとも別の１つが、第二の体液試料に対して行われる、請求項１に定義される方法。
【請求項５】
前記第一および前記第二の体液試料が異なる時点で採取される、請求項４に定義される方法。
【請求項６】
前記脳内皮細胞膜タンパク質が、トロンボモジュリン、二量体または四量体型のグルコース輸送体１、ニューロセリン／ＨＴ７、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、Ｐ−糖タンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に定義される方法。
【請求項７】
前記解析の少なくとも１つが、前記マーカーに特異的な抗体と前記体液を接触させることを含む、請求項１に定義される方法。
【請求項８】
前記解析の少なくとも１つが、酵素標識イムノアッセイ法で行われる、請求項７に定義される方法。
【請求項９】
請求項１に定義される方法であって、さらに、前記体液を第五のマーカータンパク質に関し解析する段階を含み、前記の第五のマーカータンパク質が、前記の第一、第二または第三のマーカーの１つと同一の特異的細胞型を有し、そして同一の特異的細胞型を有する前記の第一、第二または第三のマーカーより高い分子量を有する、前記方法。
【請求項１０】
前記解析の少なくとも１つが、前記マーカーに特異的な抗体と前記体液を接触させることを含む、請求項９に定義される方法。
【請求項１１】
前記解析の少なくとも１つが、酵素標識イムノアッセイ法で行われる、請求項１０に定義される方法。
【請求項１２】
請求項１に定義され、そしてさらに、前記患者由来の第二の体液試料を、前記の４つのマーカーに関し、解析する段階を含む方法であって、前記の第二の体液試料が、段階ａで解析される前記体液に続く時点で採取される、前記方法。
【請求項１３】
確認しそして区別する前記段階が、前記の４つのマーカー各々に関し、前記解析で検出される濃度レベルを、前記マーカー各々に関するあらかじめ定義された閾値レベルと比較することを含む、請求項１に定義される方法。
【請求項１４】
４つの異なるマーカータンパク質各々に特異的な、固体支持体上に固定されている、少なくとも４つの抗体であって
ａ．第一のマーカータンパク質がミエリン塩基性タンパク質であり、そして第一の抗体がそれに特異的であり、
ｂ．第二のマーカータンパク質がＳ１００タンパク質のベータアイソフォームであり、そして第二の抗体がそれに特異的であり、
ｃ．第三のマーカータンパク質がニューロン特異的エノラーゼであり、そして第三の抗体がそれに特異的であり、そして
ｄ．第四のマーカータンパク質が脳内皮細胞膜タンパク質であり、そして第四の抗体がそれに特異的であり、および各々、前記マーカータンパク質の１つに結合する、少なくとも４つの標識抗体を含む、脳卒中を検出しそして区別するための診断キット。
【請求項１５】
前記の４つの抗体各々が同一固体支持体上に固定されている、請求項１４に定義される診断キット。
【請求項１６】
前記の４つの抗体の少なくとも１つが、第一の固体支持体上に固定されており、そして前記の４つの抗体の少なくとも別の１つが、第二の固体支持体上に固定されている、請求項１４に定義される診断キット。
【請求項１７】
前記標識抗体の少なくとも１つが、酵素標識抗体を含む、請求項１４に定義される診断キット。
【請求項１８】
前記脳内皮細胞マーカータンパク質が、トロンボモジュリン、二量体または四量体型のグルコース輸送体１、ニューロセリン／ＨＴ７、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、Ｐ−糖タンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に定義される診断キット。
【請求項１９】
請求項１４に定義される診断キットであって、そしてさらに、第五のマーカータンパク質に特異的な第五の抗体であって、前記の第五のマーカータンパク質が、前記の第一、第二または第三のマーカーの１つと同一の特異的細胞型を有し、そして同一の特異的細胞型を有する前記の第一、第二または第三のマーカーより高い分子量を有する、前記の第五のマーカータンパク質に結合する第五の標識抗体を含む、診断キット。
【請求項２０】
前記の第五の標識抗体が、酵素標識抗体を含む、請求項１９に定義される診断キット。
【請求項２１】
虚血性および出血性大脳事象を区別して評価するための方法であって
ａ．患者の一つまたはそれ以上の体液サンプルを解析し、虚血マーカータンパク質のミエリン塩基性タンパク質、Ｓ１００タンパク質のベータアイソフォーム、およびニューロン特異的エノラーゼの存在および濃度レベルを検出し、
ｂ．前記患者の一つまたはそれ以上の体液サンプルを解析し、脳内皮細胞膜タンパク質の存在および濃度レベルを検出し、そして
ｃ．前記解析から得られた情報から、虚血性または出血性大脳事象の発生を確かめ、そして特定の種類の大脳事象を区別する
ことを含む、前記方法。
【請求項２２】
確認しそして区別する前記段階が、前記の１つまたはそれ以上の虚血マーカータンパク質および前記脳内皮細胞膜タンパク質に関し、前記解析で検出される濃度レベルを、前記虚血マーカータンパク質各々および前記脳内皮細胞膜タンパク質に関するあらかじめ定義された閾値レベルと比較することを含む、請求項２１に定義される方法。
【請求項２３】
前記体液が、血液、血液産物および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項２１に定義される方法。
【請求項２４】
前記脳内皮細胞膜タンパク質が、トロンボモジュリン、二量体または四量体型のグルコース輸送体１、ニューロセリン／ＨＴ７、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、Ｐ−糖タンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に定義される方法。
【請求項２５】
前記脳内皮細胞膜タンパク質がトロンボモジュリンである、請求項２４に定義される方法。
【請求項２６】
請求項２１に定義される方法であって、さらに前記体液を解析し、前記ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ１００タンパク質のベータアイソフォームまたはニューロン特異的エノラーゼの１つと同一の特異的細胞型を有する二次的マーカータンパク質の存在および濃度レベルを検出し、それにより、出血性または虚血性大脳事象の発症時点を決定することが可能であることを含む、方法。
【請求項２７】
前記の二次的マーカータンパク質が、同一の特異的細胞型を有する、前記ミエリン塩基性タンパク質、Ｓ１００タンパク質のベータアイソフォームまたはニューロン特異的エノラーゼより高い分子量を有する、請求項２６に定義される方法。
【請求項２８】
前記解析の各々が、同一体液試料に対して行われる、請求項２１に定義される方法。
【請求項２９】
前記解析の少なくとも１つが、第一の体液試料に対して行われ、そして前記解析の少なくとも別の１つが、第二の体液試料に対して行われる、請求項２１に定義される方法。
【請求項３０】
前記の第一および前記の第二の体液試料が異なる時点で採取される、請求項２９に定義される方法。
【請求項３１】
複数の前記体液試料が、あらかじめ決定された時間間隔で得られ、そして解析され、そして前記解析からの情報を、時間の関数として比較し、それにより、虚血性または出血性大脳事象の進行を決定することが可能である、請求項２１に定義される方法。
【請求項３２】
前記解析の各々が、前記タンパク質に特異的な抗体と、前記体液を接触させることを含む、請求項２１に定義される方法。
【請求項３３】
前記解析の少なくとも１つが、酵素標識イムノアッセイ法で行われる、請求項３２に定義される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本出願は、被験者が脳卒中を有しているか、そしてもしそうであれば、異なる種類の脳卒中の間の区別をするための方法に関する。より詳細には、該方法は、被験者の体液を、少なくとも４つの選択される脳卒中マーカーに関し解析することを含む。また、該方法で使用するための診断装置およびキットも記載される。
【０００２】
ヒトの健康に対する脳卒中の影響は、死亡率に関し考慮すると非常に大きく、そして障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）を考慮すると、さらにより圧倒的である。例えば、脳卒中は、米国では、虚血性心臓疾患およびすべての型の癌に続き、第三の主な死因である。生き残った人々に関しては、脳卒中は障害の主な原因である。脳卒中による直接的な医療費および雇用損失費用は、毎年、数１０億ドルに相当する。すべての脳卒中のおよそ８５％が虚血性（血栓性および塞栓性）であり、残りは出血性である。
【０００３】
脳卒中は、療法および診断技術両方に関し、サービスの行き届いていない市場である。米国だけで、毎年７００，０００を超える人々が脳卒中にかかる。この数の数倍が脳卒中にかかると疑われ、診断は、コンピューター補助断層撮影法（ＣＡＴ）スキャンおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、高価な技術によってのみ、確認される。しかし、これらの洗練された技術は、すべての病院で利用可能なわけではなく、そしてこれらは、初期段階の虚血性脳卒中を診断するのには十分に感度が高くない。
【０００４】
脳卒中は、通常、立会い診察（ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ）として、神経学者により行われる臨床的診断である。脳卒中を診断する現在の方法には、症状評価、病歴、胸部Ｘ線、ＥＣＧ（電気的心臓活性）、ＥＥＧ（脳神経細胞活性）、脳損傷を評価するＣＡＴスキャン、および体内映像を得るＭＲＩが含まれる。いくつかの血液試験を行い、内部出血に関し検索を行ってもよい。これらには、完全血球算定、プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、血清電解質および血液グルコースが含まれる。
【０００５】
脳卒中の直接の原因を決定するのは、診断が主に画像技術に頼っている所見に際し、特に困難である可能性がある。脳梗塞のおよそ５０％は、ＣＡＴスキャンでは不可視である。さらに、ＣＡＴスキャンが出血性脳卒中の同定には非常に感度が高い可能性があるとしても、脳卒中の評価中、大脳虚血にはそれほど感度が高くなく、そして通常、脳卒中発症２４ないし３６時間後で陽性である。結果として、迅速な治療の好機の幅は、通常、現在の診断技術により脳卒中が陽性に同定されたときには、終了しているであろう。
【０００６】
脳卒中の治療には、予防的療法、例えば血圧を調節しそして減少させ、そしてしたがって、脳卒中の可能性を減少させる、抗高血圧および抗血小板薬剤が含まれる。また、血栓溶解薬剤、例えばｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）の開発は、虚血性脳卒中患者の治療に有意な前進を提供したが、有効であり、そして急性脳卒中からの損傷を最小限にするためには、治療を非常に初期に、例えば症状発症約３時間後に始めることが必要である。これらの薬剤は、脳への血流を遮断し、そして脳卒中のおよそ８０％の原因である血管凝塊を溶解する。しかし、これらの薬剤はまた、出血のリスクを増加させる副作用も示す可能性がある。多様な神経保護剤、例えばカルシウムチャンネル拮抗剤は、虚血性傷害の結果としての脳に対する損傷を停止させることが可能である。これらの薬剤の治療幅は、典型的には、凝塊溶解剤より広く、そしてこれらは出血のリスクを増加させない。
【０００７】
医師が、大脳事象の初期段階で、適切な療法薬剤を処方するのを可能にするため、脳卒中を早期に診断し、そして脳卒中の種類を同定するための診断技術が必要である。脳卒中の多様なマーカーが知られ、そしてこうしたマーカーの測定のための解析技術が当業に記載されてきている。本明細書において、「マーカー」という用語は、大脳虚血性または出血性事象中に脳から放出されるタンパク質または他の分子を指す。こうしたマーカーには、脳に特異的なタンパク質のアイソフォームが含まれる。
【０００８】
文献には、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）濃度が、ニューロン組織への十分な損傷、頭部外傷およびＡＩＤＳ痴呆後に増加すると報告されてきている。さらに、抗ＭＢＰ抗体を用いた超微細構造免疫細胞化学研究により、ＭＢＰがもっぱらミエリン鞘に局在することが示されると報告されてきている。したがって、ＣＳＦまたは血清中のＭＢＰレベルを急性脳血管疾患における大脳損傷のマーカーとして用いることが示唆されてきている。Ｓｔｒａｎｄ，  Ｔ．ら，  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｓ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｒａｉｎ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｏｋｅ，  Ｓｔｒｏｋｅ（１９８４）１５；１３８−１４４を参照されたい。ＣＳＦ中のＭＢＰ濃度の増加は、血栓性脳卒中発症約４ないし５日に最も明らかであり、一方、大脳出血の場合、増加はほぼ発症直後に最高である。Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｅｘ，  Ａ．ら，  Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｐｈｙｘｉａｔｅｄ  ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９９４）９３；２３４−２４０を参照されたい。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の患者は、ＭＢＰに関し、正常ＣＳＦ値を有するが、脳梗塞および出血の患者は上昇値を有することも見出されてきている。脳梗塞の場合、第一ないし第二の腰椎穿刺由来のＣＳＦ中のＭＢＰ濃度が有意に増加し、一方、大脳内出血の患者は、第一の腰椎穿刺で、すでに顕著に上昇したレベルに到達していた。ＭＢＰ放出の動力学的相違は、出血性および虚血性脳卒中の差別的な診断に有用である可能性があると報告された。ＣＳＦ中のＭＢＰレベルはまた、ＣＴスキャンでの大脳損傷の可視性および患者の短期結果に相関する。さらに、ＭＢＰ濃度は、脳損傷の度合いと共に増加し、そして高い値は、患者の劣った短期予後を示した。Ｓｔｒａｎｄ，  Ｔ．ら、先の引用を参照されたい。
【０００９】
Ｓ１００タンパク質は、神経学的損傷を評価し、そして脳損傷の度合いを決定し、そして脳病変の度合いを決定する、有用なマーカーとしてとらえることが可能な、別のマーカーである。したがって、脳卒中による、脳病変および神経学的損傷の診断および評価の補助として使用することが示唆されてきている。Ｍｉｓｓｌｅｒ，  Ｕ．，  Ｗｅｉｓｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，  Ｃ．およびＫａｐｓ，  Ｍ．，  Ｓ１００  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ，  Ｓｔｒｏｋｅ（１９９７）２８；１９５６−６０を参照されたい。
【００１０】
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）もまた、治療評価における特定の適用を用いた脳卒中の研究における、神経学的損傷の有用なマーカーと示唆されてきている。Ｔｅａｓｄａｌｅ，  Ｇ．およびＪｅｎｎｅｔｔ，  Ｂ．，  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｍａ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ，  Ｌａｎｃｅｔ（１９７４）２；８１−８４を参照されたい。
【００１１】
患者が患う脳卒中の種類、発生開始、事象の位置、適切な薬剤での治療から利益を受けるであろう適切な患者の同定、および治療の結果として出血するリスクがある患者の同定に関する、時機を得た情報を提供することが可能な診断技術がいまだに必要である。こうした技術は、医師が、迅速に、患者に必要とされる適切な治療を決定し、そして早期介入を可能にするデータを提供することが可能である。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、脳卒中を迅速に診断しそして区別するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、血栓性脳卒中および出血性脳卒中の間を区別するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、患者の体液を、少なくとも４つの脳卒中マーカーに関し、解析することを含む、方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、脳卒中の発症時点に関連する情報を提供することが可能な方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、該方法で使用するための診断アッセイ装置を提供することである。
発明の概要
これらのそして他の目的および利点は、患者が脳卒中を患っているか、そしてもしそうであれば、事象が血栓性または出血性であるかを決定することが可能な方法を提供することにより、本発明にしがたい、達成される。該方法にしたがい、患者体液を、４つの分子に関し解析する。これらは細胞型特異的であり、このうち３つは特異的な虚血マーカー、すなわちＳ１００タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および特異的ニューロンエノラーゼ（ＮＳＥ）であり、そして１つは脳内皮膜タンパク質、例えばトロンボモジュリン（Ｔｍ）である。該方法は、脳に特異的なマーカータンパク質のアイソフォームを解析する。
【００１５】
これらのマーカーの解析は、体液の同一試料または体液の多数の試料に対し、行ってもよい。後者の態様では、異なる体液試料を同時にまたは異なる時点で採取してもよい。
【００１６】
患者体液の解析は、体液が収集された約４５ないし５０分以内に行うことが可能であるため、本発明の方法にしたがって得られる情報は、脳卒中の決定的に重要な初期の段階、例えば症状発症３ないし６時間後以内に提供することが可能である。該データは、脳卒中の症状を提示しているまたは脳卒中を有すると疑われる患者の治療法の決定を補助することにより、医師にとって重要である可能性がある。該データは、脳卒中を判定し、または排除し、そして虚血性および出血性脳卒中の間を区別し、そしてしたがって、出血を増加させるリスクのため、出血性脳卒中の患者が、凝塊溶解治療薬を投与されるのを排除することが可能である。該データはまた、治療の結果として出血のリスクがある患者、すなわち妥協脳血管系を持つ患者を同定することも可能である。さらに、該方法は、適切な治療薬および介入に関し、患者選択を改善する可能性がある、介入の結果に関連する初期段階予後情報を提供することが可能である。本発明の方法は、画像技術のかなり前の診断法である。さらに、これらのデータは、脳内の脳卒中の位置および脳に対する損傷の度合いを示すと共に、脳卒中の度合いが増加しているか決定することが可能である。脳卒中に関連する脳梗塞は、不適切な酸素処理のためできる、死んだおよび死につつある脳組織で構成され、これは、典型的には、虚血発症後の急性期中、大きさが増加する。異なる時点で採取された体液試料中のマーカーを測定することにより、脳卒中の進行を確かめることが可能である。
【００１７】
本発明はここで、付随する図と組み合わせ、その多様な好ましい態様に関し、さらに詳細に記載されるであろう。
好ましい態様の説明
本発明の方法にしたがって解析されるマーカーは、循環中に放出され、そして血液および他の体液中に存在する。好ましくは、血液、またはそれらを含むいかなるものでもよい血液産物、例えば、血漿、血清、細胞溶解血液（例えば低張緩衝液または界面活性剤の処理によるもの）、並びにその希釈物および調製を本発明にしたがい解析する。別の好ましい態様において、ＣＳＦ中のマーカーの濃度を測定する。
【００１８】
「正常以上」および「閾値以上」という用語は、本明細書において、健常個体、すなわち大脳事象、すなわち虚血、機械的または感染性であってもよい脳に対する損傷を経験していない個体で観察されるマーカーのレベルより高いマーカーレベルを指す。いくつかのマーカーでは、個体の血液中には、通常、マーカーはまったくまたは非常に低いレベルでしか存在しない可能性がある。本発明にしたがい解析されるマーカーの他のものでは、血液中には、通常、検出可能なレベルが存在する可能性がある。したがって、これらの用語は、個体に見られる正常レベルより有意に高いレベルを意図する。「有意に」という用語は、統計的有意性を意味し、そして一般的に正常より２標準偏差（ＳＤ）高い、またはより高い濃度のマーカーが存在することを意味する。いかなるものでもよい特定のマーカータンパク質に関する解析を行うアッセイ法は、目的の濃度範囲に渡り存在するマーカーレベルを検出することが可能であるため十分感度が高くなければならないし、そしてまた、非常に特異的でなければならない。
【００１９】
本方法にしたがい測定される４つの主なマーカーは、大脳事象中に細胞が損傷されるにつれ、特定の脳細胞により放出されるタンパク質である。これらのタンパク質は、天然型でもよいし、または例えばタンパク質分解的分解由来の酵素活性により生じる、タンパク質の免疫学的に検出可能な断片であってもよい。請求項を含め、本出願に言及される特異的な４つの主なマーカーは、免疫学的に検出することが可能な、タンパク質の断片を含むよう意図される。「免疫学的に検出可能」により、タンパク質断片が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗体により特異的に認識されるエピトープを含むことを意味する。
【００２０】
先に言及されるように、本発明の方法にしたがい解析されるマーカーは、細胞型特異的である。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、非常に塩基性のタンパク質であり、ミエリン鞘に局在し、そしてヒト脳におけるミエリンの総タンパク質の約３０％に相当する。該タンパク質は、１７０アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖として存在し、１．５  ｘ  １５０  ｎｍの寸法および約１８，５００ダルトンの分子量を持つ、棒状構造を有する。該タンパク質は、柔軟なタンパク質であり、αへリックスβコンホメーションを欠く、ランダムコイルで存在する。
【００２１】
血液およびＣＳＦ中のＭＢＰ濃度の増加は、虚血性脳卒中発症約４ないし５日後に最も明らかであり、一方、大脳出血の場合、増加はほぼ発症直後に最高である。さらに、ＴＩＡ患者は、ＭＢＰに関し正常値を有するが、脳梗塞および大脳内出血の患者は上昇値を有する。大脳事象を経験していないヒトの正常値は、０．００ないし約０．０１６  ｎｇ／ｍｌである。ＭＢＰは血清中で約１時間の半減期を有し、そして大脳出血の感度の高いマーカーである。
【００２２】
Ｓ１００タンパク質は、細胞質酸性カルシウム結合タンパク質であり、主に脳の灰白質、主にグリアおよびシュワン細胞に見られる。該タンパク質は、２つの免疫学的に異なるサブユニット、アルファ（ＭＷ＝１０，４００ダルトン）およびベータ（ＭＷ＝１０，５００ダルトン）からなる、いくつかのホモまたはヘテロ二量体アイソフォームで存在し、一方、Ｓ１００ａσはホモ二量体ααであり、主に横紋筋、心臓および腎臓に見られる。Ｓ１００ｂアイソフォームは、２１，０００ダルトンのホモ二量体ββである。該アイソフォームは高濃度でグリア細胞およびシュワン細胞に存在し、そしてしたがって組織特異的である。これは中枢神経系への急性損傷中、放出され、そして脳梗塞の感度の高いマーカーである。本発明の方法にしたがい、アッセイはＳ１００タンパク質のβサブユニットに特異的である。
【００２３】
Ｓ１００ｂアイソフォームは、中枢神経系への急性損傷中、放出される、特異的な脳マーカーである。該アイソフォームは腎臓により除去され、そしてヒト血清中で約２時間の半減期を有する。Ｓ１００血清レベルの反復測定は、神経学的損傷の経過をたどるのに有用である。さらに、ＣＳＦまたは血清中の上昇したＳ１００レベルの存在は、脳卒中症状と関連し、脳卒中の差別的診断に有用である可能性があり、そして脳梗塞の価値ある指標である可能性がある。
【００２４】
酵素エノラーゼ（ＥＣ  ４．２．１．１１）は、解糖経路中の２−ホスホグリセリン酸およびホスホエノールピルビン酸の相互変換を触媒する。該酵素は、各々別個の遺伝子の産物である３つのイソタンパク質で存在する。遺伝子座は、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２およびＥＮＯ３と称されている。ＥＮＯ１の遺伝子産物は、非ニューロン性エノラーゼ（ＮＮＥまたはα）であり、多様な哺乳動物組織に広く分布している。ＥＮＯ２の遺伝子産物は、筋肉特異的エノラーゼ（ＭＳＥまたはβ）であり、心臓または横紋筋に主に局在し、一方ＥＮＯ３遺伝子の産物は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥまたはγ）であり、ニューロンおよび神経内分泌細胞に主に見られる。天然酵素は、ホモまたはヘテロ二量体アイソフォームとして見られ、３つの免疫学的に異なるサブユニット、α、βおよびγで構成される。各サブユニットは、およそ３９，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２５】
αγおよびγγエノラーゼアイソフォームは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）と称されてきており、各々およそ８０，０００ダルトンの分子量を有する。ＣＳＦ中のＮＳＥ濃度が実験的巣状虚血後に増加し、そして損傷大脳組織からＣＳＦへのＮＳＥの放出は、梗塞の発生および大きさを反映することが示されてきている。ＮＳＥは約４８時間の血清半減期を有し、そしてそのピーク濃度は、大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後に起こることが示されてきている。ＣＳＦ中のＮＳＥレベルは、クモ膜下出血および急性脳梗塞を含む、急性および／またははなはだしい障害で上昇することが見出されてきている。
【００２６】
本発明にしたがい測定される第四のマーカータンパク質は、脳内皮細胞膜タンパク質である。脳の小血管を裏打ちする内皮細胞は、血液および脳実質の間の溶質の交換を緊密に制御するよう作用する、細胞表面受容体、輸送体および細胞内酵素の特有の発現を持つ。脳内皮膜タンパク質には：トロンボモジュリン（Ｔｍ）、血管内凝集の制御に関与する１０５，０００ダルトン表面糖タンパク質；グルコース輸送体（Ｇｌｕｃ  １）、二量体または四量体型で存在する可能性がある５５，０００ダルトン細胞表面膜貫通タンパク質；ニューロセリン／ＨＴ７、細胞質膜輸送タンパク質に組み込まれる４３，０００ダルトンタンパク質；ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、２２，０００および２５，０００ダルトンサブユニットで構成されるヘテロ二量体アイソフォームとして見られ、そしてグルタチオンからアミノ酸へのガンマグルタミル残基の輸送に関与するタンパク質；およびＰ−糖タンパク質、多剤耐性膜貫通タンパク質、が含まれる。方法の好ましい態様において、Ｔｍが測定される脳内皮膜タンパク質である。Ｔｍはラクナ（ｌａｃｕｎａｒ）梗塞の感度の高いマーカーである。
【００２７】
該方法にしたがって得られたデータは、脳卒中が起こっているか、そしてもし起こっていれば、脳卒中の種類、損傷の位置および損傷の広がりを示す。４つのマーカーすべてのレベルが陰性である、すなわち正常範囲内である場合、大脳損傷はない。脳内皮膜タンパク質、例えばＴｍのみが上昇しているまたは陽性である場合、すなわちレベルが少なくとも正常より２ＳＤ高い場合、脳卒中は、基底神経節および脳の深白質に存在するラクナ梗塞である。ＮＳＥレベルが陽性であり、そしてＳ１００および／またはＭＢＰレベルが陰性である（脳内皮膜タンパク質マーカーが陽性または陰性である）場合、患者はＴＩＡを患う。
【００２８】
別の好ましい態様にしたがい、本発明の方法にしたがい解析される３つの虚血マーカーの１つの特異的細胞型由来の第五のマーカーを測定し、脳卒中発症時間に関する情報を提供する。特に患者が意識がないかまたは老齢であり、そして信頼できる病歴が常に入手可能でない場合、脳卒中症状の発症は、常に既知ではないことを認識すべきである。脳卒中発症時間の指標は、異なる分子量を有する脳マーカーの異なる放出動力学に頼ることにより得ることが可能である。脳損傷に続く、脳マーカーの循環への放出時間は、マーカーの大きさに応じ、より小さいマーカーは事象のより早い時点で放出される傾向があり、より大きいマーカーは後に放出される傾向がある。図１は、本発明の方法にしたがい解析される２つのマーカータンパク質、すなわちＭＢＰおよびＳ１００の放出動力学を例示する。これらのデータは、冠状動脈バイパス手術を行った後、ブタの脳組織から収集した体液から得た。試料は、被験者がバイパス装置からはずされた０、３０、１２０、１８０および２４０分後に収集した。濃度値は、ゼロ時点での濃度であるベースライン値の倍数で表す。これらのデータにより、ＭＢＰ（ＭＷ＝１８，５００）の放出は、虚血事象後約１２０分で最大に達するようであり、一方、Ｓ１００（ＭＷ＝２１，０００）の放出は、約１８０分後に最大に達するようであることが示される。したがって、本発明の方法に利用される３つの虚血マーカーの１つの特異的細胞型由来のさらなるタンパク質マーカーを測定することにより、発症時間に関するデータを得ることが可能である。発症時間は、脳卒中の臨床的症状の開始時期と定義される。この好ましい態様において、第二のマーカータンパク質は、同一細胞型の最初のマーカーより大きい、すなわちより高分子量のマーカーである。
【００２９】
本発明にしたがって利用される３つの虚血マーカーおよび同一の特異的細胞型由来の多様な他の高分子量マーカーを表１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
本発明の特定の好ましい態様において、患者から異なる時点で採取された体液試料を解析する。典型的には、第一の体液試料は、脳卒中の症状の提示に際し、患者から採取し、そして本発明にしたがい解析する。続いて、提示後のある時点で、例えば提示約２時間後、第二の体液試料を採取し、そして本発明にしたがい解析する。ここで図２を参照すると、本発明にしたがって解析された４つのマーカータンパク質、例示態様ではＮＳＥ、Ｓ１００、ＭＢＰおよびＴｍから得たデータをどのように用い、患者を分類（ｔｒｉａｇｅ）することが可能であるかを例示するフローチャートが示される。該データを用い、脳卒中を診断し、脳卒中を排除し、血栓性および出血性脳卒中の間を区別し、血栓溶解治療に適した患者を同定し、そして脳卒中がどのように発展しているか決定することが可能である。
【００３２】
先に言及されたように、患者体液中の４つの特異的マーカーの各レベルは、１つの単一の試料から測定してもよいし、あるいは１つまたはそれ以上の個々のマーカーを１つの試料において測定し、そして少なくとも１つのマーカーを１つまたはそれ以上のさらなる試料において測定してもよい。「試料」により、１つの時点で得られる、血液またはＣＳＦなどの一定量の体液を意味する。さらに、以下に詳細に論じられるであろうように、すべてのマーカーを１つのアッセイ装置で、または各マーカーに関し別個のアッセイ装置を用いることにより、測定してもよく、この場合、同一体液試料のアリコットを用いてもよいし、または異なる体液試料を用いてもよい。解析は、試料が採取された後、ある短い時間枠で、例えば約３０分以内に行うべきであることが明らかであり、したがって、該データを用い、可能な限り迅速に治療を処方することが可能である。解析が単一の解析装置で行われるかまたは別個のこうした装置で行われるかに関わらず、単一試料に同時に存在する各マーカーレベルを用い、意味があるデータを提供することが可能であるように、４つのマーカー各々を同一の単一試料において測定することが好ましい。
【００３３】
一般的にいって、各マーカーの存在は、各マーカーに特異的な抗体を用い、そしてそれぞれの同族マーカーに対する各抗体の免疫特異的結合を検出し、測定する。商業的に入手可能なものを含め、いかなる適切なイムノアッセイ法を利用し、本発明にしたがって測定される特異的マーカーの各レベルを決定してもよい。既知のイムノアッセイ技術の詳しい議論は、当業者に既知であるため、ここでは必要ない。典型的な適切なイムノアッセイ技術には、サンドイッチ酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、均一アッセイ、不均一アッセイなどが含まれる。多様な既知のイムノアッセイ法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ７０，  ｐｐ．３０−７０および１６６−１９８（１９８０）に概説されている。直接および間接標識をイムノアッセイで用いてもよい。直接標識は、天然状態で、裸眼または光学フィルターの補助でおよび／または蛍光を促進する刺激、例えば紫外光の適用で、可視である実体と定義することが可能である。用いてもよい着色標識の例には、金属ゾル粒子、金ゾル粒子、色素ゾル粒子、染色ラテックス粒子、またはリポソーム被包色素が含まれる。他の直接標識には、放射性核種および蛍光または発光部分が含まれる。酵素などの間接標識もまた、本発明にしたがって用いてもよい。標識として使用可能な多様な酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびウレアーゼが知られる。イムノアッセイにおける酵素の詳細な議論には、Ｅｎｇｖａｌｌ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ７０，  ４１９−４３９（１９８０）を参照されたい。
【００３４】
本発明にしたがって使用するための好ましいイムノアッセイ法は、患者体液中のマーカータンパク質レベルを測定する、二重抗体技術である。本方法にしたがい、抗体の１つは「捕捉」抗体であり、そしてもう一方は「検出」抗体である。捕捉抗体は、当業に既知のいかなる種類であってもよい固体支持体、例えばマイクロタイタープレートウェル、ビーズ、試験管および多孔素材、例えばナイロン、ガラス繊維および他のポリマー素材上に固定される。本方法では、目的の特定のマーカータンパク質に対して作成された捕捉抗体、好ましくはモノクローナル抗体で被覆された、固体支持体、例えばマイクロタイタープレートウェルが、固相を構成する。希釈患者体液、例えば血清または血漿、典型的には約２５μｌ、標準およびコントロールを別個の固体支持体に添加し、そしてインキュベーションする。体液中にマーカータンパク質が存在する場合、該タンパク質に特異的な固定抗体に捕捉される。インキュベーションおよび洗浄後、抗マーカータンパク質検出抗体、例えばポリクローナルウサギ抗マーカータンパク質抗体を固体支持体に添加する。検出抗体は、捕捉抗体に結合しているマーカータンパク質に結合し、サンドイッチ構造を形成する。インキュベーションおよび洗浄後、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されている抗ＩｇＧ抗体、例えばポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を固体支持体に添加する。インキュベーションおよび洗浄後、酵素に対する基質を固体支持体に添加し、その後、インキュベーションし、そして酸溶液を添加し、酵素反応を停止する。
【００３５】
固定酵素の酵素活性の度合いは、固体支持体上の酸化酵素産物の光学密度を、適切な波長、例えばＨＲＰでは４５０  ｎｍで、測定することにより、決定される。該波長での吸光度は、体液試料中のマーカータンパク質の量に比例する。マーカータンパク質標準の組を用い、吸光度対マーカータンパク質濃度の標準曲線を用意する。本方法は、試験結果が４５ないし５０分間で提供されることが可能であり、そして該方法が各マーカーの目的の濃度範囲にわたり感受性が高く、そして非常に特異的であるため、好ましい。
【００３６】
マーカータンパク質を測定するのに用いるアッセイ法は、健康なヒトに見られる正常値から上昇レベル、すなわち正常を超え２ＳＤおよびそれ以上までの濃度範囲に渡り、各タンパク質を測定することが可能である十分な感度を示すべきである。もちろん、マーカータンパク質の正常値範囲は、健康なヒトの体液を解析することにより、見出すことが可能である。＋２ＳＤ＝０．０２  ｎｇ／ｍｌであるＳ１００ｂアイソフォームの場合、アッセイ範囲の上限は、好ましくは約５．０  ｎｇ／ｍｌである。＋２ＳＤ＝９．９  ｎｇ／ｍｌであるＮＳＥの場合、範囲の上限は、好ましくは約６０  ｎｇ／ｍｌである。０．０２  ｎｇ／ｍｌの上昇レベル切り捨て値を有するＭＢＰの場合、アッセイ範囲の上限は、好ましくは約５．０  ｎｇ／ｍｌであり、そして約７３  ｎｇ／ｍｌの上昇レベル切り捨て値を有するＴｍの場合、アッセイ範囲上限は、好ましくは約５００  ｎｇ／ｍｌである。
【００３７】
アッセイは、ＰＢ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃに対する米国特許４，９０６，４３９；  ５，０５１，２３７および５，１４７，６０９に記載されるものを含む、多様なアッセイ装置形式で行ってもよい。
【００３８】
本発明にしたがって用いられるアッセイ装置が、半定量的または定量的結果を提供するよう準備してもよい。「半定量的」という用語により、上昇マーカータンパク質値より高いレベル、およびその閾値より高くないレベルの間を区別する能力を意味する。
【００３９】
アッセイは、先に論じられたように、バッチ様式でアッセイを行うのに好ましい、マイクロタイタープレート形式を含む、多様な形式で行ってもよい。アッセイはまた、当業に周知であり、そしていくつかの異なる試料に対しアッセイを行うことが可能な自動化イムノアッセイ解析装置で行ってもよい。これらの自動化解析装置には、連続／ランダムアクセス型が含まれる。こうした系の例は、ＰＢ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．に対する米国特許５，２０７，９８７および５，５１８，６８８に記載される。商業的に入手可能な多様な自動化解析装置には、ＯＰＵＳ（登録商標）およびＯＰＵＳ  ＭＡＧＮＵＭ（登録商標）解析装置が含まれる。
【００４０】
本発明にしたがって用いてもよい別のアッセイ形式は、いかなる場所の医療地点でも行うことが可能な迅速な手動試験である。典型的には、こうした医療地点アッセイ装置は、閾値より高いまたは低い結果、すなわち先に記載されたような半定量的結果を提供するであろう。
【００４１】
本発明にしたがって用いられるアッセイ装置は、特定のマーカータンパク質に関する１つの単一のアッセイを行うよう、または単一の体液量から、対応する数の異なるマーカータンパク質に関し、複数のアッセイを行うよう、提供されてもよいことも認識すべきである。後者の種類の好ましいアッセイ装置は、本発明にしたがい測定される４つの主なマーカータンパク質、すなわちＳ１００ｂ、ＮＳＥ、ＭＢＰおよび脳内皮マーカータンパク質、例えばＴｍに関し、半定量的結果を提供することが可能であるものである。これらの装置は、典型的には、マーカータンパク質濃度が閾値レベル以上である場合、特定のマーカータンパク質に対する捕捉抗体が位置する場所で、異なる視覚的に検出可能な有色バンドを提供するように、適応している。本発明にしたがって利用することが可能なアッセイ種の詳細な議論と共に、多様なアッセイ形式および自動化解析装置に関しては、Ｊａｃｋｏｗｓｋｉに対する米国特許５，７４７，２７４を参照されたい。
【００４２】
本発明はここで、特定の好ましい態様に関し、さらに詳細に記載されるであろうが、これらは例示のみを意図し、そして本発明はそこに列挙される材料、方法などに限定されないことを理解すべきである。
【００４３】
【実施例】
２つの三次医療病院で前向き観察パイロット研究を行った。該研究は、急性虚血性脳卒中の臨床およびコンピューター連動断層撮影（ＣＴ）診断で入院した３３人の患者を評価した。脳卒中を提示する患者の平均年齢は、およそ６６歳（６６．４±１６．４）であり、年齢範囲は２７ないし９０歳であった。症状の発症および病院への提示の間の平均遅延は２２時間であり、１ないし７２時間の範囲であった。入院米国国立衛生研究所脳卒中スケールおよび退院修飾Ｒａｎｋｉｎスケールを記録した。血液試料は、１つの病院では第１日（提示時）、第３日、第５日および第７日に、そして第二の病院では第１日、第２日および第３日に得た。すべての血液試料を遠心分離し、そして血清のアリコットを凍結し、そしてＳ１００、ＮＳＥ、ＭＢＰおよびＴｍの解析まで−８０℃で貯蔵した。
【００４４】
コントロール被験者には、血液試料を用い、Ｓ１００およびＮＳＥの濃度に関し、参照値を決定した、１０３人の健康な血液ドナー（年齢範囲１８ないし７８歳；平均年齢５４．６±１５．２歳）、並びにＭＢＰおよびＴｍ濃度の参照測定のための試料を提供した、２４人の健康な血液ドナーが含まれた。
【００４５】
すべての参照値は、別に明記されない限り、平均＋２ＳＤとして報告する。血清中のＳ１００の参照値は０．００６７  ｎｇ／ｍｌであり、９８パーセンタイルは０．０２０  ｎｇ／ｍｌであった。上昇Ｓ１００値は、正常の９８パーセンタイル（０．０２  ｎｇ／ｍｌ）より高いいかなる濃度でもよいものとした（正常＋２ＳＤ＝０．０２  ｎｇ／ｍｌ）。
【００４６】
血清中のＮＳＥの参照値は、５．０３±２．４０  ｎｇ／ｍｌであった。上昇ＮＳＥ値は、正常を２ＳＤ超える値、９．８５  ｎｇ／ｍｌより高いいかなる濃度でもよい濃度であった。
【００４７】
血清中のＭＢＰの参照値は、０．０１６２±０．００１９  ｎｇ／ｍｌであった。上昇ＭＢＰ値は、正常を２ＳＤ超える値、０．０２  ｎｇ／ｍｌより高いいかなる濃度でもよい濃度であった。
【００４８】
血清中のＴｍの参照値は、５０．５２±１３．６２  ｎｇ／ｍｌであった。上昇Ｔｍ値は、正常を２ＳＤ超える値、７６．１４  ｎｇ／ｍｌより高いいかなる濃度でもよい濃度であった。
【００４９】
Ｓ１００およびＮＳＥのレベルは、それぞれ、Ｓｋｙｅ  ＰｈｒｍａＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、カナダ・ミシソーガより入手可能な、Ｅｘａｃｔ  Ｓ１００およびＥｘａｃｔ  ＮＳＥ  Ｅｌｉｓａアッセイキットを用いて解析した。Ｔｍレベルは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，，  ９  ｒｕｅ  ｄｅｓ  Ｆｒｅｒｅｓ  Ｃｈａｕｓｓｏｎ，  ９２６００  Ａｓｎｅｒｅｓ  Ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ，  Ｆｒａｎｃｅより入手可能なＥＬＩＳＡアッセイを用いて解析した。ＭＢＰ濃度レベルは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国テキサス州ウェブスターから入手可能なＥＬＩＳＡイムノアッセイを用いて解析した。
【００５０】
得られたデータを示す表において、「Ｄ１」は提示時、採取された第一の血液試料を得た第一の日を示す。試料収集のそれに続く日は、Ｄ２、Ｄ３などにより示される。マーカーの濃度値に関しては、＋２ＳＤは正常範囲以上である。「ＮＤ」は、いかなるデータも得られなかったことを示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
【表３】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
健康なコントロール被験者由来の血清試料中のＳ１００、ＮＳＥおよびＭＢＰレベルの解析は、これらのタンパク質レベルが年齢または性別に対し、いかなる関係も持たないことを示した。Ｔｍの場合、健康な男性由来の血清試料では、女性のものよりも、濃度がより高かった（それぞれ、５４．６２±１３．６２  ｎｇ／ｍｌ、正常＋２ＳＤ＝８１．８６  ｎｇ／ｍｌおよび４３．６３±１１．１８  ｎｇ／ｍｌ、正常＋２ＳＤ＝６８．７４  ｎｇ／ｍｌ）。
【００６１】
３３人の脳卒中患者のうち２６人が梗塞（７９％）であり、そしてこれらの５人がラクナ梗塞（１５％）であり、そして４人が出血性脳卒中（１２％）を有した。出血性脳卒中患者では、３人がクモ膜下出血を有し、そして１人が大脳内出血を有した。３人の患者（９％）は、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を有した。
【００６２】
提示時、Ｓ１００のレベルは、患者の４４％で上昇し、ＮＳＥレベルは５９％で上昇し、ＭＢＰレベルは４０％で上昇し、そしてＴｍレベルは５７％で上昇していた。
【００６３】
このデータは、本発明にしたがって４つのマーカータンパク質を測定することにより、いかなる１つでもよいマーカーが上昇していた場合、患者の９４％を提示時に同定することが可能であることを示す。２１人の非ラクナ梗塞のうち１９人（９０％）は提示に際し同定することが可能であった。残りの２人の患者は、症状発症後、それぞれ２２および７２時間後に病院に到着した。
【００６４】
図３−１０は、各々、研究の異なる患者から得たデータのグラフ例示である。濃度レベルは、参照値の倍数として示され、そして実際の測定濃度値を、各マーカータンパク質の定義参照値、すなわち２ＳＤ値で割ることにより、得た。
【００６５】
すべてのラクナ梗塞、出血性およびＴＩＡ患者は、１００％の正確さで提示時に同定された。５例すべてのラクナ梗塞は、提示時に上昇したＴｍレベルを有した。何人かの患者では、唯一の上昇マーカータンパク質がＴｍであった。ここで図３を参照すると、患者ＳＭ７に関しては、唯一の上昇マーカータンパク質がＴｍであり、ラクナ梗塞が示されることがわかる。
【００６６】
３人のＴＩＡ患者は上昇ＮＳＥレベル並びに正常範囲に留まる正常Ｓ１００およびＭＢＰレベルを有した。ＴｍはＴＩＡ患者の１人で上昇していた。ここで図４を参照すると、患者ＳＭ−２４に関しては、Ｔｍがわずかに上昇し、そしてＮＳＥが上昇し、ＴＩＡが示されることがわかる。患者はＴＩＡの診断を受け、退院した。ここで図５を参照すると、患者ＳＭ−３は、非常に上昇したレベルのＭＢＰおよびＳ１００と共に、上昇したレベルのＮＳＥおよびＴｍを有し、脳基底部に広がる損傷を持つ脳梗塞が示されることがわかる。
【００６７】
４人の出血性脳卒中患者では、３人のクモ膜下出血患者が、上昇したレベルのＳ１００およびＮＳＥ並びに正常レベルのＴｍを有した。大脳内出血性脳卒中の患者では、Ｓ１００およびＮＳＥのレベルが上昇し、そしてＭＢＰのレベルが約２５０倍上昇していた。図６は、患者ＳＪ−１６が提示時、２５０倍に増加したレベルのＭＢＰと共に、上昇したレベルのＳ１００およびＮＳＥを有し、そして大脳内出血を患っていたことを例示する。
【００６８】
図７は、患者ＳＪ−２が提示時、上昇したＭＢＰ、ＴｍおよびＳ１００を有し、そしてＭＢＰおよびＳ１００レベルが時間と共に上昇しつづけ、脳卒中と共に脳梗塞が時間に渡り増加していることを示す。提示時の最初のＣＡＴスキャンは陰性であり、そして数日後にはじめて陽性になった。
【００６９】
図８は、患者ＳＪ−１８が、ＴＩＡを提示し、これが脳卒中に発展したことを例示する。Ｔｍは正常範囲であり、大脳血管系が妥協していないことを示し、そしてしたがって、患者が血栓溶解のよい候補であったことを示す。
【００７０】
図９は、脳梗塞を提示し、そしてＴｍが正常範囲であった患者ＳＭ−８は、内皮血管系が妥協していないため、血栓溶解のよい候補であったことを示す。
図１０は、患者ＳＪ−１が脳梗塞を有し、そしてＴｍレベルが上昇していたため、血栓溶解剤を投与された場合、内皮血管系が妥協しているため、出血のリスクがあったことを例示する。
【００７１】
得られた第二の血清試料に関しては、Ｓ１００レベルは脳卒中患者の７３％で、ＮＳＥレベルは５４％で、ＭＢＰレベルは６４％で、そしてＴｍレベルは５５％で上昇していた。これらのデータは、本発明にしたがって、４つのマーカータンパク質を測定することにより、いかなるものでもよい１つのマーカーが上昇している場合、得られた第二の血清試料から、患者の９６％を同定することが可能であったことを示す。
【００７２】
該データは、続く血清試料のタンパク質マーカーレベルが、脳卒中が発展し、重症になるかまたはおさまるかに応じ、増加するかまたは減少したことを示す。
３３人の脳卒中患者の１８人（５４％）は、提示時にＣＡＴスキャンを受けた。４人の出血性脳卒中患者はすべて、提示時、ＣＡＴ陽性であった。１８人の患者のうち９人（５０％）は、提示時、正常ＣＡＴを有し、これは数日後、陽性になった。提示時に正常ＣＡＴを有したこれらの９人の患者のうち８人は、提示時に４つのタンパク質マーカーの１つまたはそれ以上のレベルが上昇していた。提示時にＣＡＴ陽性であった９人の患者もまたすべて、提示時に１つまたはそれ以上のタンパク質マーカーのレベルが上昇していた。
【００７３】
ピークＳ１００、ＮＳＥおよびＭＢＰレベルは、入院ＮＩＨＳＳスコア（ｐ＜０．０５）および退院修飾Ｒａｎｋｉｎスコア（ｐ＜０．０５）と有意に相関した（ピアソン）。
【００７４】
該データは、急性虚血性脳卒中患者において、Ｓ１００、ＮＳＥ、ＭＢＰおよびＴｍレベルを、容易にそして信頼可能に測定することが可能であり、そして本発明にしたがって、これらの４つのマーカータンパク質を測定することにより、いかなる１つでもよいマーカータンパク質が上昇していた場合、提示時に、急性虚血性脳卒中に関し、９４％の感度を達成することが可能であることを示す。さらに、発展している脳卒中の超急性期において、これらの４つのマーカータンパク質の１つまたはそれ以上のレベルの上昇は、ＣＡＴによるこうした損傷の検出前に、非可逆性組織損傷および脳浮腫に先行するようである。
【００７５】
本発明は、多様な好ましい態様に関し記載されてきているが、これを限定することを意図せず、むしろ当業者は、本発明の精神および付随する請求項の範囲内である、変動および修飾を行うことが可能であることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、大脳異常または状態の指標である２つのマーカータンパク質の時間（分）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図２】  図２は、本発明の態様にしたがい得られたデータを、大脳異常または状態の診断にどのように用いることが可能であるか例示するフローチャートである。
【図３】  図３は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図４】  図４は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図５】  図５は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図６】  図６は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図７】  図７は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図８】  図８は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図９】  図９は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図１０】  図１０は、本発明の態様にしたがい解析された４つのマーカータンパク質の時間（日）に渡る濃度のグラフ例示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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