(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が野生株と比べて増強され、さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が野生株と比べて増強されたコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミンの製造法であって、グルタミンシンテターゼ活性の増強が、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、もしくは前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子のプロモーターを改変すること、またはアデニリル化による活性調節が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細菌に保持させること、もしくは前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下したことにより細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節が解除されたことによるものであり、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子のプロモーターを改変することによるものである、Ｌ−グルタミンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌のＬ−グルタミン生産菌およびＬ−グルタミンの製造法に関する。Ｌ−グルタミンは、調味料、肝機能促進薬、アミノ酸輸液、および総合アミノ酸製剤などの成分として、産業上有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するには、微生物の育種改良法が多用されてきた。すなわち、野生株そのもののＬ−アミノ酸生産の生産能は極めて低い場合が多いので、突然変異により栄養要求性、アナログ耐性、もしくは代謝調節変異を付与したり、又はこれらを組み合わせる方法が知られている。上述の方法によれば、それなりの収量でＬ−グルタミンは得られるが、工業的に安価にＬ−グルタミンを製造する為には、さらに発酵収率を向上させることが不可欠である。
【０００３】
また、Ｌ−グルタミン発酵においては、Ｌ−グルタミン酸が副生するという問題がある。この問題を解決する方法が、例えば特開平3-232497号公報に提案されている。この方法によれば、ある程度Ｌ−グルタミン酸の生成を抑えることができるが、依然としてＬ−グルタミン酸の副生があると同時に、Ｌ−グルタミンの収量が不十分である。
【０００４】
上記のようなＬ−グルタミン生産菌の改良においては、変異処理剤などで宿主菌を処理し、ランダムに変異が入った菌からＬ−グルタミンの生産性が向上した株を選択する方策が用いられていたため、大きな労力と困難を伴っていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌のＬ−グルタミンの生産性向上、及びグルタミン酸の副生の抑制に至る特性を見出し、当該特性を有する菌株を用いたＬ−グルタミンの製造法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞中のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌の菌株が、該活性が野生株並である菌株に比べて、Ｌ−グルタミン生産能において優れていると同時に、Ｌ−グルタミン酸の副生が大幅に抑制できることを見出した。また、グルタミンシンテターゼ活性とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を同時に増強させることにより、Ｌ−グルタミンの生産速度が向上することを見出した。さらに、新規なグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子、及びグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００７】
（１）Ｌ−グルタミン生産能を有し、かつ細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌。
（２）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである(1）記載の細菌。
（３）グルタミンシンテターゼ活性の増強が、細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節が解除されたことによるものである(1)記載の細菌。
（４）細胞内のグルタミンシンテターゼのアデニリル化による活性調節の解除が、アデニリル化による活性調節が解除されたグルタミンシンテターゼを前記細菌に保持させること、前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性が低下したこと、又は前記細菌細胞内のPIIたんぱく質活性が低下したことのいずれか一つ又は２以上によるものである(3)記載の細菌。
（５）さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強された(1)〜(4)のいずれかに記載の細菌。
（６）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによるものである(5)記載の細菌。
【０００８】
（７）（１）〜（６）いずれか一項に記載の細菌を培地に接種し、該培地中に生成蓄積したＬ−グルタミンを採取することを特徴とするＬ−グルタミンの製造法。
【０００９】
（８）下記（Ａ）または（Ｂ）に示すたんぱく質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するたんぱく質。
（Ｂ）配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質。
（９）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである(8)記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５９〜１９９６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６５９〜１９９６からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質をコードするＤＮＡ。
（１０）下記（Ｃ）または（Ｄ）に示すたんぱく質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するたんぱく質
（Ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質。
（１１）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである(10)記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２００６〜５２００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２００６〜５２００からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
（１）本発明のコリネ型細菌
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００１２】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
【００１３】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
【００１４】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM  BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１５】
本発明において、「Ｌ−グルタミン生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培地中にＬ−グルタミンを蓄積する能力をいう。このＬ−グルタミン生産能は、コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１６】
育種によってＬ−グルタミン生産能を付与または増強するには、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法（特開平3-232497）、プリンアナログ耐性および／またはメチオニンスルホキサイド耐性を付与する方法（特開昭61-202694）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭56-151495）、グルタミン酸を含有するペプチドに耐性を付与する方法（特開平2-186994）などが挙げられる。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
【００１７】
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573(FERM P-5492) 特開昭56-151495公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205) 特開平2-186994公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-5493) 特開昭56-151495公報参照
【００１８】
「細胞内のグルタミンシンテターゼ（以下、「GS」ともいう）活性が増強された」とは、細胞当たりのGS活性が野生型のコリネ型細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのGS分子の数が増加した場合や、GS分子当たりのGS活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のコリネ型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067である。細胞内のGS活性が増強された結果、培地中のＬ−グルタミン蓄積量が上昇するという効果や、Ｌ−グルタミン酸の副生が減少するという効果がある。
【００１９】
コリネ型細菌細胞内のGS活性の増強は、GSをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、GSをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−グルタミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−グルタミン生産能を付与してもよい。
【００２０】
GS遺伝子は、コリネ型細菌由来の遺伝子およびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。このうち、発現の容易さの観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００２１】
コリネ型細菌のGSをコードする遺伝子として、既にglnAが明らかにされている(FEMS Microbiology Letters 81-88, (154) 1997)ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号４および５に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、GS遺伝子を取得することができる。他の微生物のGSをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
【００２２】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２３】
一方、アミノ酸生合成系に関与する酵素にはアイソザイムが存在することが多い。本発明者らは、前述のglnA遺伝子の塩基配列との相同性を利用して、コリネ型細菌のGSのアイソザイムをコードする遺伝子の単離およびクローン化に成功した。この遺伝子を「glnA2」とする。その取得工程は後述する。glnA2も、glnAと同様に、コリネ型細菌のGS活性の増強に利用することができる。
【００２４】
PCR法により増幅されたGS遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００２５】
コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
pAM330   特開昭58-67699号公報参照
pHM1519  特開昭58-77895号公報参照
pSFK6    特開2000-262288号公報参照
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００２６】
このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
0004560998.tif 000002
【００２７】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２８】
GS遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、GS遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００２９】
上記のように調製した組換えDNAをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００３０】
GS遺伝子のコピー数を高めることは、GS遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体DNA上にGS遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、GS遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３１】
GS活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のGS遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、GS遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりGS遺伝子の発現が強化され、GS活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、GS遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３２】
発現調節配列の置換は、例えば後述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモーター配列を置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代わりにpHSC4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うことができる。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００３３】
GS活性の増強は、上記のようなGS遺伝子の発現量を増強する以外に、細胞内のGSのアデニリル化による活性調節が解除されることによっても達成される。GSは、そのアミノ酸配列中のチロシン残基をアデニリル化されることにより不活性型に変化する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 642-649, (58) 1967）（J. Biol. Chem., 3769-3771, (243) 1968)。したがって、このGSのアデニリル化を解除することによって、細胞内のGS活性を増強することができる。ここで、アデニリル化の解除とは、アデニリル化が実質的に完全に解除されることに加えて、細胞内のGS活性が増強されるようにアデニリル化が低減されることを含む。
【００３４】
GSのアデニリル化は、一般にアデニリルトランスフェラーゼによって行われる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1703-1710, (58) 1967）。コリネ型細菌においては、Genebank accession Y13221の配列に示されるglnA遺伝子産物の405位のチロシン残基がアデニリル化されることが示唆されている（FEMS Microbiology Letters, 303-310,(173)1999）。このチロシン残基を他のアミノ酸残基に置換するようにglnA遺伝子に変異を導入することによってGSのアデニリル化による不活性化を解除できる。
【００３５】
また、細胞内のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ（ATase）の活性を低下させることによっても、GSのアデニリル化による不活性化を解除できる。コリネ型細菌のアデニリルトランスフェラーゼは未知であったが、本発明者らは、コリネ型細菌のアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glnEの単離に成功した。その工程については後述する。
【００３６】
コリネ型細菌の細胞内のATase活性を低下させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ATase活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。また、ATase活性が低下したコリネ型細菌は、変異処理の他に、ATaseをコードする遺伝子（glnE）の部分配列を欠失し、正常に機能するATaseを産生しないように改変したglnE遺伝子（欠失型glnE）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型glnEと染色体上のglnEとの間で組換えを起こさせることにより、染色体上のglnEを破壊することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００３７】
欠失型glnEを、宿主染色体上のglnEと置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００３８】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するglnE配列との組換えを起こし、染色体glnEと欠失型glnEとの融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なglnEが優性であるので、形質転換株は正常なATaseを発現する。
【００３９】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型glnEのみを残すために、２個のglnEの組換えにより１コピーのglnEを、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なglnEが染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型glnEが切り出される場合と、反対に欠失型glnEが染色体ＤＮＡ上に残され、正常なglnEが切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のglnEは、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型glnEが残った株を選択することによって、glnEが破壊された株を取得することができる。
【００４０】
また、細胞内のPIIたんぱく質の活性を低下させることによっても、GSのアデニリル化による不活性化を解除できる。ATaseによるGSのアデニリル化にはPIIたんぱく質も関与することが知られている。PIIたんぱく質とは、GS活性を調節するためのシグナル伝達たんぱく質であり、ウリジリルトランスフェラーゼ(UTase)によるウリジリル化を受けることが知られている。ウリジリル化されたPIIたんぱく質は、ATaseによるGSの脱アデニリル化を促進し、脱ウリジリル化されたPIIたんぱく質はATaseによるGSのアデニリル化を促進する。
【００４１】
UTaseの欠損株においてはGSが高度にアデニリル化されることが報告されている（J. Bacteriology, 569-577, (134) 1978）。過剰にアデニリル化されるこの表現形は、PIIたんぱく質の変異によって抑制される（J.Bacteriology, 816-822,(164)1985）。すなわちPIIたんぱく質の活性低下によっても、GSのアデニリル化による不活性化を解除できる。PIIたんぱく質の活性低下とは、ATaseによるアデニリル化を促進する機能が低下することをいう。コリネ型細菌のPIIたんぱく質をコードするglnB遺伝子は既に単離されており、その欠失によりGSのアデニリル化による抑制が解除されることが示唆されている（FEMS Microbiology Letters, 303-310, (173) 1999）。
【００４２】
コリネ型細菌のPIIたんぱく質の活性を低下させるためには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、PIIたんぱく質の活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。また、PIIたんぱく質の活性が低下したコリネ型細菌は、変異処理の他に、PIIたんぱく質をコードする遺伝子glnBの部分配列を欠失し、正常に機能するPIIたんぱく質を産生しないように改変したglnB遺伝子（欠失型glnB遺伝子）を含むDNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型glnBと染色体上のglnBとの間で組換えを起こさせることにより、染色体上のglnBを破壊することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立されており、直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００４３】
欠失型glnBを宿主染色体上のglnBと置換するためには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と変異型glnEとクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換体が得られる。
【００４４】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するglnB配列との組換えを起こし、染色体glnBと欠失型glnBとの融合遺伝子２個が組換えDNAの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体上に挿入されている。したがって、この状態では正常なglnBが優性であるので、形質転換体は正常なglnBを発現する。
【００４５】
次に、染色体DNA上に欠失型glnBのみを残すために、２個のglnBの組換えにより１コピーのglnBを、ベクター部分（温度感受性複製起点および薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体DNAから脱落させる。その際、正常なglnBが染色体上に残され、欠失型glnBが切り出される場合と、反対に欠失型glnBが染色体DNA上に残され、正常なglnBが切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に安定に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のglnBは、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型glnEが残った株を選択することによって、glnBが破壊された株を取得することができる。
【００４６】
GSのアデニリル化の解除は、上記のアデニリル化を受けないようなGSの変異、ATaseの活性低下、及びPIIたんぱく質の活性低下から選ばれる２つ、又は３つの手段を組み合わせることよっても、達成することができる。
【００４７】
GS活性の増強は、上述のようなATaseによるGSのアデニリル化の解除によっても可能であるが、前述のGS遺伝子のコピー数を高める手段や、発現調節配列の改変をする手段と組み合わせて行ってもよい。
【００４８】
本発明のコリネ型細菌を用いてＬ−グルタミンを効率よく生産するには、GS活性と同時にグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）活性が高められた菌株を用いるのが好ましい。
【００４９】
「細胞内のGDH活性が増強された」とは、細胞当たりのGDH活性が野生型のコリネ型細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのGDH分子の数が増加した場合や、GDH分子当たりのGDH活性が上昇した場合などが該当する。
また、比較対象となる野生型のコリネ型細菌とは、例えばブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067である。細胞内のGDH活性が増強された結果、Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の培養時間が短縮されるという効果がある。
【００５０】
コリネ型細菌細胞内のGDH活性の増強は、GDHをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、GDHをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをＬ−グルタミン生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。また、野生型のコリネ型細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−グルタミン生産能を付与してもよい。
【００５１】
GDHをコードする遺伝子は、コリネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。発現容易の観点からは、コリネ型細菌由来の遺伝子を用いることが好ましい。
【００５２】
コリネ型細菌のGDHをコードする遺伝子（gdh遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（Molecular Microbiology (1992) 6 (3), 317-326）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号12及び13に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、gdh遺伝子を取得することができる。コリネ型細菌等の他の微生物のGDHをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
gdhのコリネ型細菌への導入は、前記のGS遺伝子と同様にして行うことができる。
【００５３】
また、本発明のコリネ型細菌は、GSおよびGDH以外のＬ−グルタミン生合成を触媒する酵素の活性が増強されていてもよい。例えばグルタミン生合成を触媒する酵素としては、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ等がある。
【００５４】
さらに、Ｌ−グルタミンの生合成経路から分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。このような反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒロゲナーゼ、グルタミン酸シンターゼ等が挙げられる。
【００５５】
（２）本発明の微生物を用いたＬ−グルタミンの生産
上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にＬ−グルタミンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−グルタミンを採取することにより、Ｌ−グルタミンを効率よく製造することができ、かつ、Ｌ−グルタミン酸の副生を抑制することができる。
【００５６】
本発明のコリネ型細菌を用いてＬ−グルタミンを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００５７】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００５８】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００５９】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００６０】
無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
【００６１】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミンを採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【００６２】
（３）本発明のグルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA（glnA2遺伝子）および、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA（glnE遺伝子）
【００６３】
本発明の第一のＤＮＡは、GSをコードする遺伝子である。また、本発明の第二のＤＮＡは、ATaseをコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、公知のglnA遺伝子の部分断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライリブラリーから取得することもできる。公知のglnA遺伝子の部分断片は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１８および１９に示すプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅することによって取得される。
【００６４】
本発明のＤＮＡの取得、及び、前記のGS活性及びGDH活性の増強に際して、ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)に記載されている。
【００６５】
上記プライマーの塩基配列は、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムのglnA遺伝子（GenBank ACCESSION Y13221）の塩基配列に基づいて設計されたものであり、これらのプライマーを用いれば、glnA遺伝子（GenBank ACCESSION Y13221）の塩基番号1921〜2282に相当する領域を含むＤＮＡ断片が得られる。
【００６６】
上記のようにして得られる本発明のglnA2を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。また、glnA2がコードするグルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質のアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００６７】
また、前記のＤＮＡ断片中には、glnA2遺伝子のＯＲＦのすぐ下流に別のＯＲＦが見出された。既知の配列との相同性比較の結果、当該ＯＲＦはグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質（ATase）をコードする遺伝子（glnE）であると予想された。ATase活性を有するたんぱく質のアミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
【００６８】
本発明のglnA2又はglnEを含むＤＮＡ断片は、本発明によりその塩基配列が明らかになったので、同塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたPCR法により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００６９】
本発明の第一のＤＮＡは、コードされるたんぱく質のグルタミンシンテターゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタミンシンテターゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱく質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から９０個、好ましくは、２から５０個、より好ましくは２から２０個である。
【００７０】
本発明の第二のＤＮＡは、コードされるたんぱく質のグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のたんぱく質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３５０個、好ましくは、２から５０個、より好ましくは２から２０個である。グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性を損なう場合においても、相同組換えを起こす限り本発明に含まれる。
【００７１】
上記のようなGS又はATaseと実質的に同一のたんぱく質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、glnA2又はglnEの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００７２】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、グルタミンシンテターゼ、または、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼと実質的に同一のたんぱく質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するグルタミンシンテターゼ、もしくは、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号659〜1996または2066〜5200からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミンシンテターゼ活性を有するたんぱく質をコードするDNA、または、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を有するたんぱく質をコードするＤＮＡを単離することによっても、GS又はATaseと実質的に同一のたんぱく質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００７３】
プローブとして、配列番号１の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。
そのようなプローブは、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００７４】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグルタミンシンテターゼ活性、または、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性を、例えばグルタミンシンテターゼ活性についてはMethods in Enzymology, Vol.XVIIA, 910-915, ACADEMIC PRESS (1970)記載の方法で、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼ活性についてはMethods in Enzymology Vol.XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970)記載の方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別することができる。活性が低下あるいは欠失したグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡも本発明においては利用可能である。
【００７５】
GSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列と、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつGS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、ATaseと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号３に示すアミノ酸配列と、好ましくは65%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上の相同性を有し、かつATase活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７７】
【実施例１】
GS遺伝子増幅株の評価
（１）コリネ型細菌のglnA遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム・グルタミカムのglnA配列は既に明らかにされている(FEMS Microbiology Letters 81-88,(154) 1997)。報告されている塩基配列に基づいて、配列表配列番号４および５に示すプライマーを合成し、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを鋳型にしてPCR法によりglnA断片を増幅した。
【００７８】
ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAの調製は、Bacterial Genome DNA Purification Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用いて行った。また、PCR反応は、Pyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を用い、変性94℃ 30秒、会合55℃ 15秒、伸長72℃ 2分の条件で30サイクル行った。
【００７９】
生成したPCR産物を常法により精製後、制限酵素SalIで切断し、SalIで切断したpMW219（ニッポンジーン）とライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、IPTG 10μg/ml, X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むＬ培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。
【００８０】
形質転換体からアルカリ法によりプラスミドを調製した後、ベクターにglnA遺伝子が挿入されているプラスミドをpMW219GSと名付けた。
【００８１】
（２）glnAとコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドの構築
さらに、glnA遺伝子とコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを構築するために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号公報参照）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キット（宝酒造）を用い平滑末端化した後、KpnIリンカー（宝酒造）を用いてpMW219GSのKpnI部位に挿入した。本プラスミドをpGSと名付けた。
【００８２】
（３）コリネ型細菌へのpGSの導入と培養評価
Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418（FERM BP-2205：特開平2-186994号公報参照）を電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラスミドpGSで形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体AJ12418/pGSを用いてＬ−グルタミン生産のための培養を以下のように行った。
【００８３】
25μg/mlのカナマイシンを含むCM2Bプレート培地にて培養して得たAJ12418/pGS株の菌体を、グルコース100ｇ、(NH4)2SO4 60g、KH2PO4 2.5g、MgSO4・7H2O 0.4g、FeSO4・7H2O 0.01g、VB1-HCl 350μg、ビオチン4μg、大豆加水分解物200mg、CaCO3 50gを純水1Lに含む培地（NaOHでpH6.8に調整されている）に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるまでしんとう培養した。
【００８４】
培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはCAPCELL PAK C18（資生堂）を用い、サンプルは0.095％リン酸、3.3mMヘプタンスルホン酸、5%アセトニトリルを蒸留水１Ｌに含む溶離液で溶出し、210nMの吸光度の変化によりＬ−グルタミン蓄積量を分析した。このときの結果を表１に示した。
【００８５】
【表１】
0004560998.tif 000003
【００８６】
pGS導入株ではＬ−グルタミン（L-Gln）の蓄積が顕著に向上し、またＬ−グルタミン酸（L-Glu）の副生が大幅に抑制された。これらの結果から、Ｌ−グルタミンの生産において、GSの増強が収量の向上に有効であることが示された。なお、GSの酵素活性のデータは、実施例２の表２に示した。
【００８７】
【実施例２】
GSアデニリル化部位改変株の評価
（１）アデニリル化部位改変プラスミドの構築
コリネ型細菌のglnA遺伝子産物のアデニリル化部位は、既に明らかにされている（FEMS Microbiology Letters, 303-310,(173)1999）。そこで、アデニリル化部位が改変されたglnA遺伝子で、染色体上のglnA遺伝子とを置換することにより、アデニリル化部位改変株の取得を行った。具体的な方法を以下に記す。
【００８８】
まずブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号６と７の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnA遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、glnA遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号８と９の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列表配列番号７と８にはミスマッチが導入されているので、これらの増幅産物の末端には変異が導入される。次に、変異が導入されたglnA遺伝子断片を得るために、上記glnA N末側およびC末側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列表配列番号１０と１１の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、アデニリル化部位に変異導入されたglnA遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後、HincIIで消化し、pHSG299（宝酒造）のHincII部位に挿入した。このプラスミドをpGSAと名付けた。
【００８９】
（２）アデニリル化部位改変株の構築と培養評価
上述のpGSAは、コリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。
【００９０】
Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418を電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）により高濃度のプラスミドpGSAを用いて形質転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を得た。次にこれらの形質転換体を継代培養し、カナマイシン感受性となった株を取得した。さらに、カナマイシン感受性株のglnA遺伝子の配列を決定し、その配列中のアデニリル化部位がpGSA由来のglnAのその領域と置換されたものをQA-1と名付けた。AJ12418、AJ12418/pGS、QA-1株を用いて、Ｌ−グルタミン生産のための培養を実施例１（３）記載の方法と同様にして行った。その結果を表２に示した。
【００９１】
【表２】
0004560998.tif 000004
【００９２】
QA-1株ではAJ12418に比べ、Ｌ−グルタミン蓄積の向上が認められた。
これらの株のGS活性について測定した結果についても、表２に示した。GS活性は、Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.70, No.3, 182-184, 1990に記載の方法を参考とし、イミダゾール-HCl(pH7.0)100mM, NH4Cl 0.1mM, MnCl2 1mM, ホスホエノールピルビン酸1mM, NADH 0.3mM, ラクテートデヒドロゲナーゼ10U, ピルビン酸キナーゼ25U, ATP 1mM, MSG 10mMを含む溶液に、粗酵素液を加え、30℃における340nMの吸光度変化を測定することによって測定した。ブランクの測定には、上記反応液よりMSGを除いたものを用いた。粗酵素液は、上記の培養液より遠心分離により菌体を分離し、イミダゾール-HCl(pH7.0)100mMで洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去することにより、調製した。粗酵素液のたんぱく質濃度は、牛血清アルブミンを標準試料として、Protein Assay（Bio-Rad）を用いて定量した。
【００９３】
【実施例３】
GDH遺伝子増幅株の評価
（１）gdh増幅株の構築と培養評価
コリネ型細菌のgdh遺伝子がクローニングされたプラスミドpGDHの構築は、以下のように行った。まずブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAを抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１２と１３の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行った。得られたDNA断片を平滑末端化し、これをpHSG399（宝酒造）のSmaI部位に挿入した。このプラスミドをpHSG399GDHと名付けた。
【００９４】
次に、pHSG399GDHのSalI部位に、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984))由来の複製起点を導入した。具体的には、前述のpHK4を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を平滑末端化した後、SalIリンカー（宝酒造）を用いてpHSG399GDHのSalI部位に挿入した。本プラスミドをpGDHと名付けた。
【００９５】
Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418株をpGDHで形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体AJ12418/pGDHを用いて、Ｌ−グルタミン生産のための培養を実施例１記載の方法で行った。その結果を表３に示した。GDH増強株ではＬ−グルタミンの収量が減少し、Ｌ−グルタミン酸の副生が増加したが、培養時間は大幅に短縮された。
【００９６】
【表３】
0004560998.tif 000005
【００９７】
【実施例４】
GSおよびGDHを同時に増強した株の構築と評価
（１）gdhプロモーター改変プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを抽出し、これを鋳型として、配列表配列番号１４と１５の合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行った。得られたDNA断片を制限酵素StuI、PvuIIで切断し、これをpHSG399のSmaI部位に挿入した。このプラスミドを制限酵素SacIで処理することによりgdhプロモーターおよびgdh遺伝子の部分断片を含むDNA断片を取得し、pKF19k（宝酒造）のSacI部位に挿入した。このプラスミドをpKF19GDHと名付けた。
【００９８】
プロモーター領域への変異の導入には、Mutan-Super Express Km（宝酒造）を用いた。pkF19GDHを鋳型として、Mutan-super Express Km添付のセレクションプライマーと変異導入用のプライマーとして配列表配列番号１６又は１７の5'末端リン酸化合成DNAを添加して、LA-PCRを行った。反応産物はエタノール沈殿により精製した後、これを用いてエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造）を形質転換し、形質転換体を得た。
【００９９】
形質転換体よりプラスミドを抽出し、gdhプロモーター領域の配列を決定した。このうち、表４に示す配列を有していたものを、pKF19GDH1, pKF19GDH4と命名した。gdhプロモーター配列をpKF19GDH1型に置換することにより、GDH活性は野生型のプロモーターを有するgdhに比べ約３倍、pKF19GDH4型に置換することによりGDH活性は約５倍に向上させることができると予想される（国際公開WO00/18935参照）。
【０１００】
これらのプラスミドを制限酵素SacIで切断し、gdhプロモーターおよびgdh遺伝子の部分断片を含むDNA断片を取得し、pSFKT2（特開2000-262288号公報参照）のSacI部位に挿入した。これらのプラスミドを、それぞれpSFKTGDH1、pSFKTGDH4と名付けた。pSFKT2は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株由来のプラスミドpAM330の誘導体であり、コリネ型細菌中での自律複製が温度感受性となっているプラスミドである。
【０１０１】
【表４】
0004560998.tif 000006
【０１０２】
（２）gdhプロモーター変異の染色体への導入
染色体上のgdhプロモーター配列への変異の導入は、以下のようにして行った。まず、QA-1株を電気パルス法によりプラスミドpSFKTGDH1、pSFKTGDH4で形質転換し、それぞれ形質転換体を得た。なお、形質転換後の培養は25℃で行った。次に、これらの形質転換体を34℃で培養し、34℃においてカナマイシン耐性を示す株を選択した。上記プラスミドは34℃では自律複製できないために、相同組換えにより、染色体にこれらのプラスミドが組み込まれたもののみが、カナマイシン耐性を示す。さらに、これらのプラスミドが染色体上に組み込まれた株をカナマイシン非存在下で培養し、カナマイシン感受性となった株を選択し、そのうち染色体上のgdhプロモーター領域にpSFKTGDH1, pSFKTGDH4と同じ変異が導入された株をぞれぞれQB-1、QB-4と命名した。
【０１０３】
（３）gdh遺伝子増幅株の構築とGDH活性の測定
Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムQA-1株を、実施例３（２）記載のプラスミドpGDHで形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体QA-1/pGDHを用いてＬ−グルタミン生産のための培養を実施例１記載の方法で行った。また、GDH活性についてはMol. Microbiology, 317-326(6) 1992を参考とし、Tris-HCl(pH7.5)100mM, NH4Cl 20mM, α-ケトグルタル酸10mM, NADPH 0.25mMを含む溶液に粗酵素液を加え、340nMにおける吸光度の変化を測定することによって測定した。粗酵素液は、上記の培養液より遠心分離により菌体を分離し、Tris-HCl(pH7.5)100mMで洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去することにより調製した。粗酵素液のたん白質濃度は牛血清アルブミンを標準試料として、Protein Assay（Bio-Rad）を用いて定量した。その結果を表５に示した。
【０１０４】
Ｌ−グルタミンの収量においては、GDHプロモーター改変株QB-1、QB-4が高い収量を示した。また、QA-1/pGDH株も、AJ12418株よりも高い収量を示した。培養時間は、QA-1/pGDH株が最も短かった。Ｌ−グルタミン酸の副生は、QB-1、QB-4株が大幅に改善された。これらの結果から、GSとGDHを同時に強化することが、Ｌ−グルタミンの収量の向上および培養時間短縮に有効であることが示された。
【０１０５】
【表５】
0004560998.tif 000007
【０１０６】
【実施例５】
GSのアイソザイムをコードする遺伝子の取得
コリネバクテリウム・グルタミカムのglnAを取得したことを報告した論文（FEMS Microbiol. Letter, 154 (1997) 81-88）には、ΔglnA破壊株がグルタミン要求となり、GS活性が失われることを記載されている一方、サザンブロッテイングの結果、アイソザイムの存在を示唆するデータも報告されている。また、「アミノ酸発酵：学会出版センター、232頁〜235頁」には、コリネバクテリウム・グルタミカムには２種類のGSがあることが記載されている。そこで第２のGSアイソザイムをコードする遺伝子の取得を試みた。
（１）プローブの調製
GSのアイソザイムをコードする遺伝子（glnA2）は、コロニーハイブリダイゼーションにより取得した。まず、配列表配列番号１８および１９に示すプライマーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、glnA遺伝子部分断片を取得した。このDNA断片をDIG-ハイプライムDNAラベリング＆デテクションスターターキットI（ベーリンガー・マンハイム）を用いて標識し、プローブとした。
【０１０７】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵素Sau3AIにより部分分解して、得られたＤＮＡ断片をpHSG299のベクターのBamHI部位に挿入し大腸菌JM109株を形質転換した。得られた形質転換体を、Hybond-N+（アマシャムファルマシアバイオテク）にトランスファーし、変性、中和後、DIG-ハイプライムDNAラベリング＆デテクションスターターキットIにしたがって、実施例５（１）で調製したプローブとハイブリダイズさせた。このとき、強くハイブリダイズする形質転換体と弱くハイブリダイズする形質転換体が認められた。これらの形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、挿入断片の塩基配列を決定したところ、既知のコリネ型細菌のグルタミンシンテターゼと高い相同性を示す遺伝子を含むクローンが取得できた。後者の挿入断片の全塩基配列を配列表配列番号１に示した。
【０１０８】
オープン・リーディング・フレームを推定し、その塩基配列より推定される産物のアミノ酸配列を配列表配列番号２と３に示した。これらのアミノ酸配列おのおのについて既知の配列と相同性比較を行った。用いたデータベースはGenbankである。その結果、いずれのオープン・リーディング・フレームにコードされるアミノ酸配列も、コリネ型細菌の新規なたんぱく質であることが明らかとなった。
塩基配列及びアミノ酸配列は、Genetyx-Mac computer program（ソフトウェア開発、東京）により解析した。相同性解析は、LipmanとPearson (Science, 227, 1435-1441, 1985)の方法にしたがって行った。
【０１０９】
配列表配列番号２に示したアミノ酸配列は、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムのGS（FEMS Microbiology Letters 81-88,(154) 1997）、マイコバクテリウム・ツバクロシスのGS（GenBank ACCESION Z70692）およびストレプトマイセス・セリカラーのGS(GenBank ACCESSION AL136500)と、それぞれ  34.6%、65.6％、60%の相同性を示し（表６）、コリネ型細菌のGSのアイソザイムであることが判明した。
【０１１０】
一方、配列表配列番号３の配列は、既に報告されているマイコバクテリウム・ツバクロシスのATase(GenBank ACCESION Z70692)およびストレプトマイセス・セリカラーのATase(GenBank ACCESSION Y17736)と、それぞれ51.9％、33.4%の相同性を示し（表７）、コリネ型細菌のATaseであることが判明した。したがって、配列番号１に示す塩基配列のうち、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームはglnA2であり、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームはglnEであることが判明した。
【０１１１】
【表６】
0004560998.tif 000008
【０１１２】
【表７】
0004560998.tif 000009
【０１１３】
【実施例６】
ATase欠損株によるＬ−グルタミンの生産
上記実施例５でATaseをコードする遺伝子glnEが明らかにされたので、Ｌ−グルタミン生産菌AJ12418よりglnE欠損株を構築した。具体的方法を以下に示す。
まず、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067株の染色体DNAを鋳型として、配列番号２３と２４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部分断片を得た。生成したPCR産物を常法により精製後、平滑末端化し、pHSG299（宝酒造）のHincII部位に挿入した。このプラスミドをpGLNEと名付けた。次に、このプラスミド上のglnE遺伝子の一部領域を欠失させる為、pGLNEをHincIIで消化した後、セルフライゲーションを行い、得られたプラスミドをpΔGLNEと名付けた。このプラスミドは、配列表配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号2341番目から4650番目までを含んでいるが、3343番目のHincII認識部位から3659番目のHincII認識部位までの約300bpを欠失している。
【０１１４】
上述のpΔGLNEは、コリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まない為、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが、本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた形が形質転換体として出現する。
【０１１５】
Ｌ−グルタミン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418を電気パルス法により、高濃度のプラスミドpΔGLNEを用いて形質転換し、カナマイシン耐性を指標として形質転換体を取得した。次にこれらの形質転換体を継代培養し、カナマイシン感受性となった株を取得した。取得したカナマイシン感受性株より染色体DNAを抽出し、これを鋳型として配列番号２３と２４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、glnE遺伝子の部分断片を得た。PCR産物をHincIIで消化し、約300bpの断片が生じないものをglnE遺伝子破壊株とした。この株をQA-Tと名付けた。AJ12418及びQA-Tを用いて、Ｌ−グルタミン生産の為の培養を実施例１（３）記載の方法と同様にして行った。その結果を表８に示した。
【０１１６】
QA-T株ではAJ12418株に比べ、L-グルタミン蓄積の向上が認められた。
これらの株のGS活性について測定した結果についても表８に示した。
QA-T株ではAJ12418株に比べ、GS活性が向上していることが確認された。
【０１１７】
【表８】
0004560998.tif 000010
【０１１８】
〔配列表の説明〕
配列番号１：glnA2およびglnE塩基配列
配列番号２：glnA2アミノ酸配列
配列番号３：glnEアミノ酸配列
配列番号４：glnA増幅用プライマーN
配列番号５：glnA増幅用プライマーC
配列番号６：glnA 1stPCRプライマーNN
配列番号７：glnA 1stPCRプライマーNC
配列番号８：glnA 1stPCRプライマーCN
配列番号９：glnA 1stPCRプライマーCC
配列番号１０：glnA 2ndPCRプライマーN
配列番号１１：glnA 2ndPCRプライマーC
配列番号１２：gdh増幅用プライマーN
配列番号１３：gdh増幅用プライマーC
配列番号１４：gdh増幅用プライマーN２
配列番号１５：gdh増幅用プライマーC2
配列番号１６：gdhプロモーター変異プライマーM１
配列番号１７：gdhプロモーター変異プライマーM4
配列番号１８：glnAプローブ調製用プライマーN
配列番号１９：glnAプローブ調製用プライマーC
配列番号２０：野生型gdhプロモーター配列
配列番号２１：変異型gdhプロモーター配列
配列番号２２：変異型gdhプロモーター配列
配列番号２３：glnE破壊用プライマーN
配列番号２４：glnE破壊用プライマーC
【０１１９】
【発明の効果】
本発明によれば、コリネ型細菌を用いた発酵法によるＬ−グルタミンの製造において、Ｌ−グルタミン酸の副生を抑制でき、Ｌ−グルタミンの生産効率を向上させることができる。また、本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のＬ−グルタミン生産菌の育種に利用することができる。
【０１２０】
【配列表】
0004560998.tif 000011
【０１２１】
0004560998.tif 000012
0004560998.tif 000013
0004560998.tif 000014
0004560998.tif 000015
0004560998.tif 000016
0004560998.tif 000017
0004560998.tif 000018
0004560998.tif 000019
0004560998.tif 000020
0004560998.tif 000021
0004560998.tif 000022
【０１２２】
0004560998.tif 000023
0004560998.tif 000024
0004560998.tif 000025
【０１２３】
0004560998.tif 000026
0004560998.tif 000027
0004560998.tif 000028
0004560998.tif 000029
0004560998.tif 000030
【０１２４】
0004560998.tif 000031
【０１２５】
0004560998.tif 000032
【０１２６】
0004560998.tif 000033
【０１２７】
0004560998.tif 000034
【０１２８】
0004560998.tif 000035
【０１２９】
0004560998.tif 000036
【０１３０】
0004560998.tif 000037
【０１３１】
0004560998.tif 000038
【０１３２】
0004560998.tif 000039
【０１３３】
0004560998.tif 000040
【０１３４】
0004560998.tif 000041
【０１３５】
0004560998.tif 000042
【０１３６】
0004560998.tif 000043
【０１３７】
0004560998.tif 000044
【０１３８】
0004560998.tif 000045
【０１３９】
0004560998.tif 000046
【０１４０】
0004560998.tif 000047
【０１４１】
0004560998.tif 000048
【０１４２】
0004560998.tif 000049
【０１４３】
0004560998.tif 000050
【０１４４】
0004560998.tif 000051