(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子を担う複製欠損性レトロウィルスウィルス粒子を生産する方法であって：
ウイルス生産能のある哺乳動物細胞の第１集団を：
（ｉ）レトロウイルスゲノム由来の、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする第１のレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列およびｅｎｖタンパク質をコードする第２のレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み、該ウイルスの５’ＬＴＲの天然エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠き、そして所定の哺乳動物細胞内で機能する外来エンハンサーおよび／またはプロモーターが、該ウイルスの５’ＬＴＲのＲ領域に結合される、少なくとも１つのレトロウイルスパッケージングプラスミド；および
（ｉｉ）哺乳動物細胞の第１集団において外来遺伝子を担う複製欠損性レトロウイルスウイルス粒子を生産するために外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクター、
で一時的に同時トランスフェクションすることを含んでなる上記方法。
【請求項２】
第１集団の哺乳動物細胞がヒト胚性腎細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト胚性腎細胞が２９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
レトロウイルスゲノムが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＨＩＶおよびテナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ウイルスからなる群から選ばれる白血病レトロウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
外来エンハンサーがヒトＣＭＶ即時型（immediate early）エンハンサーであり、プロモーターが天然ＭＭＬＶプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
外来エンハンサーおよびプロモーターがヒトＣＭＶ即時型エンハンサーおよびプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のヘルパー配列がエコトロピックＭＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードし、そして前記第２のヘルパー配列がゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック、１０Ａ１マウス白血病ウイルス、ＧＡＬＶ、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型のｅｎｖタンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選ばれるｅｎｖタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒト細胞において高力価の組換えレトロウイルスを生産するためのレトロウイルスパッケージングプラスミドであって、レトロウイルスゲノム由来の、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする第１のレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列およびｅｎｖタンパク質をコードする第２のレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み、該ウイルスの５’ＬＴＲの天然エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠き、そして所定の哺乳動物細胞内で機能する外来エンハンサーおよび／またはプロモーターが、該ウイルスの５’ＬＴＲのＲ領域に結合される、レトロウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項９】
前記レトロウイルスが白血病レトロウイルスである、請求項８に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１０】
前記白血病レトロウイルスゲノムが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＨＩＶおよびテナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）およびＨＩＶウイルスからなる群から選ばれる白血病レトロウイルスである、請求項９に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１１】
前記第１のヘルパー配列がエコトロピックＭＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードし、そして前記第２のヘルパー配列がゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック、１０Ａ１マウス白血病ウイルス、ＧＡＬＶ、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型のｅｎｖタンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選ばれるｅｎｖタンパク質をコードする、請求項８に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１２】
請求項８のレトロウイルスパッケージングプラスミドを含むトランスフェクションされた細胞。
【請求項１３】
２９３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）である、請求項１２に記載のトランスフェクションされた細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規なレトロウイルス構築物および哺乳動物細胞内での組換えレトロウイルスの一時的生産におけるその使用、ならびに哺乳動物細胞に効率よく形質導入を行うための該構築物の使用方法に関するものである。
発明の背景
レトロウイルスベクターはヒトの遺伝子治療において遺伝子を運搬するための重要な手段となっている（Miller, Nature 357:455-460（1992））。レトロウイルスベクターは初代培養において広範囲のげっ歯類、霊長類およびヒトの体細胞に単一コピーの非再配列遺伝子を送達できるため、この目的によく合致している。トリ（Ｅ）およびマウス（ψ）レトロウイルスのパッケージングシグナルをコードするレトロウイルス転写物内に存在する配列の同定とその後の欠失は、感染性ウイルス粒子の生産に必要なタンパク質をトランスで供給するためのパッケージング細胞系の開発を可能としたが、パッケージング細胞系がそれ自身のウイルスゲノムｍＲＮＡをパッケージすることをできなくしている（Watanabe and Temin, Molec. Cell. Biol. 3（12）:2241-2249（1983）; Mannら，Cell 33:153-159（1983）; およびEmbretson and Temin, J. Virol. 61（9）:2675-2683（1987））。レトロウイルスパッケージング系を構築する際に考慮すべき最も重要な点は、複製能のある組換えレトロウイルスを含まない高力価ベクター上清を生産することであり、複製能のあるレトロウイルスはげっ歯類（Cloydら，J. Exp. Med. 151, 542-552（1980））および霊長類（Donahueら，J. Exp. Med. 176, 1125-1135（1992））においてＴ細胞リンパ腫を形成することがわかっている。初期のマウスレトロウイルスパッケージング系は複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ：replication competent retrovirus）を形成する傾向が高く（Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353（1984）、また、ψ−ゲノムを同時パッケージする傾向も高かったが（Mannら，前掲，1983; Buttimore and Miller, Mol. Cell. Biol. 6（8）:2895-2902（1986））、ＲＣＲ形成能が著しく低下した第二世代のパッケージング系を構築するための２つの戦略が開発された。ＰＡ３１７によって具体化された１つの戦略は、第２鎖合成のための開始部位（３’ＬＴＲ）とψ部位が欠失された単一ゲノムパッケージング構築物を使用するものである（Miller and Buttimore, Molec. Cell. Biol. 6（8）:2895-2902（1986））。これらの改良は、パッケージングゲノムとウイルスベクター間の相同性を可能なかぎり排除して組換え体形成能を低下させるものであり、多くのベクター系とともにヘルパーフリーの高力価ウイルスの生産をもたらした（Miller and Rosman, BioTechniques 7（9）:980-990（1989））。２番目のアプローチは、パッケージング機能を２つのゲノム、すなわちｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物を発現するゲノムとｅｎｖ遺伝子産物を発現するゲノム、に分割するものであった（Bosselmanら，Molec. Cell. Biol. 7（5）:1797-1806（1987）; Markowitzら，J. Virol. 62（4）: 1120-1124（1988）; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）85: 6460-6464（1988））。このアプローチは、ψ−ゲノムを同時パッケージしてその後トランスファーする能力を排除するだけでなく、組換えを受けてＲＣＲを生産するに違いないパッケージング細胞内の３つのレトロウイルスゲノムの存在ゆえに組換え頻度を非常に減少させた。組換え体が生じる場合には、望まれない遺伝子産物内の変異（Danos and Mulligan, 前掲）または欠失（Bosselmanら，前掲; Markowitzら，前掲）が組換え体を非機能的にする。その上、両方のパッケージング機能構築物上の３’ＬＴＲの欠失は機能的な組換え体を形成する能力をさらに減ずる。２つのゲノムパッケージング系を形成する初期の試みは��力価の生産体クローンを生起させたが（Bosselmanら，前掲）、今では高力価の生産体クローンをもたらす生産体系が利用可能となっている（Danos and Mulligan, 前掲; Markowitzら，前掲）。
現在入手できるパッケージング系は、遺伝子治療で使用するためにヒト細胞に形質を導入するのに十分な力価の生産体クローンをもたらし、ヒトの臨床試験の開始へと導いた（Miller, 前掲）。しかし、こうしたパッケージング系は２つの面で不十分なものである。第一に、特定の用途に適するレトロウイルスベクターを設計するのに、数種のベクター構成を構築して試験することが必要となる。例えば、Belmontら，Molec. and Cell. Biol. 8（12）:5116-5125（1988）は、最高力価の生産体を生産しかつ最適な発現を与えることができるベクターを同定するために、１６種類のレトロウイルスベクターから安定した生産体系を構築した。試験したベクター構成の一部には次のものが含まれていた。すなわち、（１）ＬＴＲ駆動発現対内部プロモーター、（２）ウイルスまたは細胞の遺伝子から誘導される内部プロモーターの選択、および（３）構築物に選択マーカーが組み込まれたか否か、である。安定な生産体系を形成する必要がなく、迅速な高力価ウイルスの生産を可能とするパッケージング系は、いくつかの構築物から誘導される高力価生産体クローンの同定に要する約２か月を節約できるという点で非常に有利であろう。
第二に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比べて、高力価アンホトロピック（両栄養性）レトロウイルス生産体による哺乳動物体細胞の初代培養物の感染効率は相当に変動する。マウス筋芽細胞（Dhawanら，Science 254:1509-1512（1991））またはラット毛細管内皮細胞（Yaoら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8101-8105（1991））の形質導入効率はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のそれとほぼ等しいことがわかったが、イヌ肝細胞の形質導入効率（Armentanoら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145（1990））はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で見いだされた効率の２５％にすぎなかった。初代ヒト腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、末梢血リンパ球から単離されたヒトＣＤ４+およびＣＤ８+ Ｔ細胞、そして霊長類の長期再構成造血幹細胞はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比べて形質導入効率が低い極端な例である。精製したヒトＣＤ４+およびＣＤ８+ Ｔ細胞は、ある場合に、安定な生産体クローンからの上清を用いて６〜９％のレベルで感染することが報告されており（Moreckiら，Cancer Immunol. Immunother. 32:342-352（1991））、そして霊長類またはヒトの長期再構成造血幹細胞は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞での１０6個／ｍｌの力価の生産体により１％以下が感染したにすぎなかった（van Beusechemら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644（1992）; およびDonahueら，前掲）。もしもレトロウイルスベクターがｎｅｏR遺伝子を含むならば、形質導入細胞について高度に富化された集団はＧ４１８の存在下での選択により得ることができる。ところが、選択マーカーの発現は、造血幹細胞におけるin vivo長期遺伝子発現に対して有害な作用を及ぼすことが明らかとなった（Apperlyら，Blood 78:310-317（1991））。
初代培養のもとで哺乳動物細胞の著しく増大した形質導入を生じさせるアプローチは非常に望まれているものの、この要望は現在まだ満たされていない。
発明の概要
従って、本発明は、一時的トランスフェクションによるヒト細胞内での高力価組換えレトロウイルスの迅速な生産に必要とされるパッケージ可能なレトロウイルスベクター転写物とレトロウイルス遺伝子産物の両方の合成を支配する（それにより、安定な生産体系を形成することの必要性を排除する）新規なプラスミドベースの発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、レトロウイルス構築物を用いて形質導入を行うことが難しいと以前に報じられた哺乳動物細胞の効率のよい形質導入法を提供する。本発明はまた、ウイルス生産にトランスで必要とされるレトロウイルス遺伝子産物の合成を支配する本発明のプラスミドベースの発現ベクターが産生細胞のゲノムに安定に組み込まれた細胞系の構築について記述する。こうした安定にトランスフェクションされた系は組換えレトロウイルスを高力価で連続的に生産する安定な細胞系を作るために使用される。
レトロウイルス構築物は、複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージするために、そして複製能のあるヘルパーウイルスの生産なしに複製能のないレトロウイルスベクターを高力価でパッケージすることができるウイルス粒子タンパク質を生産するために必要とされる、ウイルス粒子タンパク質の全てをトランスでコードする複製能のないレトロウイルスゲノム由来の少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含んでなるパッケージングプラスミドである。該レトロウイルスＤＮＡ配列は該ウイルスの５’ＬＴＲの天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠いており、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲをどちらも欠失しているが、ウイルスの生産が望まれる細胞型において効率のよい転写を支配する外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位をコードしている。このレトロウイルスはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）のような白血病ウイルスである。外来エンハンサーおよびプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の即時型（ＩＥ：immediate early）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合されたＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーであり得る。レトロウイルスパッケージングプラスミドはプラスミドベースの発現ベクターによりコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むことができ、例えば、第１のヘルパー配列はエコトロピック（環境栄養性）ＭＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２のヘルパー配列はｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。宿主域を決定するｅｎｖ遺伝子は、ゼノトロピック（異種栄養性）、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック（多栄養性）（ミンクフォーカス形成）または１０Ａ１のマウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびII型のｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、前記のｅｎｖ遺伝子の１以上の組合せから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子、または前記のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通領域と所望の標的細胞上の特定の表面分子に対するモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子から誘導され得る。
本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミドの具体例は、pIK6.1MMSVampac、pIK6.1MCVampac、pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGである。
本発明は、所望の細胞型においてパッケージ可能なベクター転写物の効率のよい転写を可能とする修飾５’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを含むものである。さらに、本発明は、外来遺伝子をコードするレトロウイルス構築物を含むものである。
本発明の方法では、高力価の組換えレトロウイルスを含有する上清を得るために、パッケージングプラスミドおよびレトロウイルスベクターがウイルス生産能を有する哺乳動物細胞、例えば２９３細胞（ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, MD）のようなヒト胚性腎細胞、の第１の集団に一時的に同時トランスフェクションされる。本発明の他の方法では、その後、標的細胞に効率よく外来遺伝子を導入するために、この一時的にトランスフェクションされた第１の細胞集団が哺乳動物標的細胞（例えば、ヒトリンパ球）と共培養される。本発明はさらに、本発明の方法により作られた外来遺伝子を発現する標的細胞を含むものである。外来遺伝子はＣＤ４／ゼータまたは単一抗体鎖／ゼータＴ細胞受容体のようなキメラＴ細胞受容体でありうる。
【図面の簡単な説明】
図１は、レトロウイルスベクター転写物をパッケージするために必要なタンパク質の生産に使用する本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミド：pIK6.1MMSVampac、pIK6.1MCVampac、pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGの模式図を示す。
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、下記の実施例Ｉに記載するように、レトロウイルス構築物でトランスフェクトした２９３細胞のＦＡＣＳの結果を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、下記の実施例Ｉに記載するように、感染３Ｔ３ＤＮＡのサザンブロット分析で決定した形質導入効率を示す。
図４は、下記の実施例ＩＩに記載するように、最初にｐＲＴＤ２．２Ｆ３か、またはｐＲＴ２．２Ｆ１５のいずれかとpIK6.1MCVampacで２９３細胞を一時的にトランスフェクトし、次いで２９３細胞とＣＤ８+ Ｔ細胞を同時培養することによりＣＤ８+ Ｔ細胞に導入してＦＡＣＳで形質導入効率を分析した実験から得られたデータの棒グラフを示す。
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、下記の実施例IIIに記載するように、ＫＡＴパッケージング構築物で形質導入し、２９３細胞と同時培養した造血幹細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図６は、下記の実施例IIIに記載するように、ＣＤ３４+細胞とＫＡＴでトランスフェクトした２９３細胞との同時培養が高効率の形質導入を誘導するか否かをサザンブロット分析で試験する。
図７は、下記の実施例IIIに記載するように、ＫＡＴシステムで形質導入したＣＤ３４+細胞の形質導入効率と、安定なＰＡ３１７生産体と同時培養したときの形質導入効率とをサザンブロット分析で比較するものである。
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄおよび８Ｅは、下記の実施例ＩＶに記載するように、ｐＩＫＴベクターで２９３細胞をトランスフェクトし、同時培養した後の、ＫＡＴ  ｐＩＫＴレトロウイルスベクター構築物で形質導入したヒトＣＤ３４+造血前駆細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明の十分な理解のために、以下の記載を提供する。
本発明は、ウイルスベクターおよびパッケージング機能プラスミドのプラスミド複製の不在下に、効率のよい一時的トランスフェクションと発現が可能な哺乳動物細胞中にＫＡＴプラスミドを導入した後に、極めて安定レベルのレトロウイルスパッケージング機能とパッケージ可能なベクター転写物とが生産されるような、レトロウイルス粒子の生産のための新規な最適化された一時的発現プラスミド（「ＫＡＴ」と呼ぶ）を提供する。プラスミド複製の不在によって、高力価のウイルス粒子の生産が可能になる一方、組換えにより複製能のある（replication competent）レトロウイルスが生成する可能性を最小にする。ＫＡＴシステムの使用により、ＣＯＳ細胞へのパッケージング機能およびベクタープラスミドの同時トランスフェクションについて記載する文献（Landau and Litman, J. Virol. 66（8）:5110-5113, 1992）に比べて、１０〜３０倍の高いウイルス力価が得られる。あるいは、ＫＡＴパッケージング機能およびウイルスベクタープラスミドはＳＶ４０複製起点を含むので、ｔｓａ２０１（Heinzel et al., J. Virol. 62（10）:3738-3746, 1988）などのＳＶ４０  Ｔ抗原の発現によるＳＶ４０起点含有プラスミドの複製を可能にする細胞系にトランスフェクトできる。ＫＡＴシステムを使用すると、プラスミド複製の存在下でのウイルス力価は、複製不在下の力価よりも３〜１０倍高い。複製プラスミドを使用しても非複製プラスミドを使用してもＫＡＴシステムでは安定な生産体系を生成する必要なく高い力価の組換えレトロウイルスの上清を迅速に生産することができる。
本発明のレトロウイルス構築物は、従来法による形質導入では処理しにくい初代ヒト細胞などの哺乳動物細胞との同時培養による高効率の本発明の形質導入法にも使用できる。
本発明のプラスミドは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖなどのレトロウイルス粒子の生産にトランスで必要とされるレトロウイルスタンパク質を構成的に生産する安定な細胞系の構築にも使用できる。これらの安定なパッケージング構築物は、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンセターゼ、ＡＤＡなどの有力な選択マーカーとともにリン酸カルシウム法によるトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってヒト細胞系に導入し、次いで適当な薬剤中で選択してクローンを単離することができる。これによって、これらの細胞へのレトロウイルス構築物の導入後に高い力価の安定な生産体クローンを生産することができる。これらの細胞系は一時的にトランスフェクトされた生産体細胞という同じ性質をすべて有する。しかしながら、パッケージング機能とウイルスベクターの両方を安定に取り込むために、高力価のレトロウイルスを無期限に生産し続ける。
パッケージング機能を含むプラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードする第１のものと、ｅｎｖ遺伝子産物をコードする第２のものに分けられる。２つのウイルスゲノムを含むパッケージング系が文献（Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. 7（5）:1797-1806, 1987; Markowitz et al., J. Virol. 62（4）:1120-1124, 1988; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464, 1988）に記載されており、レトロウイルスベクターとパッケージング構築物との間の組換え後の複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）の生成の機会を有意に減少するので好ましい。本発明のプラスミドを使用すると、一時的システムの高効率の形質導入を生じるパッケージング系をもたらすが、安定なパッケージングシステムの付加的容易性と２ゲノムパッケージングシステムの安全性を伴う。本発明の新規なプラスミドは従来記載された２ゲノムパッケージング系に比較して有意な利点をもたらす。ｇａｇｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子をコードするＫＡＴプラスミドは、レトロウイルスゲノムからのタンパク質コーディング配列のみが存在するように構築された。本発明に記載するレトロウイルスベクターを用いると、レトロウイルスベクターとパッケージングゲノムとの間でその３’末端にオーバーラップが存在しない。この構造を、ベクター中のｇａｇ開始コドン（ＡＴＧ）の終始コドンによる置換と組み合わせたことによって、複製能のあるレトロウイルスの生成を完全に排除することができ、これは完全ウイルスゲノムが突然変異（Danos and Mulligan, Prc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:6460-6464, 1988）または欠失（Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. 7（5）:1797-1806, 1987; Markowitz et al., J. Virol. 62（4）:1120-1124, 1988）を含む従来のパッケージング系と比べて対照的である。これらの従来公知のパッケージング系はウイルスベクターの３’末端でパッケージング系とのオーバーラップを含み、ＲＣＲを生じる可能性がある。
ｇａｇｐｏｌプラスミドの導入に続いてｅｎｖ−含有プラスミドを段階的に導入することにより２ゲノムパッケージング系を構築する。ｅｎｖ遺伝子は細胞表面受容体の認識を担当する。５つの機能的かつ構造的に異なるｅｎｖ遺伝子がマウス白血病ウイルスに同定されており、遺伝子的に異なる受容体であることが示されている（Battini et al., J. of Virol. 66:1468-1475, 1992）。アンホトロピックｅｎｖ遺伝子を、エコトロピックＭＬＶ  ｇａｇｐｏｌを発現する細胞系に導入することによって、マウス白血病ウイルスベクターをもつヒト宿主域が可能となる（Danos and Mulligan, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:6460-646, 1988）。ゼノトロピックおよび１０Ａ１  ＭＬＶウイルスは、テナガザル白血病ウイルスやネコ白血病ウイルスと同様に、ヒト宿主域をもつ。これらのｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡクローンを用いて、１またはそれ以上のものをｇａｇｐｏｌ系に安定に導入してパッケージング系を作製し、この場合にはレトロウイルスベクターの導入後に生産されるレトロウイルスが複数の遺伝子的に異なる受容体を通して標的に入り得る。これによって明らかなウイルス力価の実質的増加が得られる。本発明のベクターはこれらのタイプの新規なパッケージング系を作製する可能性を提供する。
ベクター、トランスフェクト細胞および感染細胞を構築するために用いるほとんどの技術は当業界で公知であり、特定の条件や方法を記載する標準情報資料は当業者にはよく知られている。しかしながら、便宜のために、以下の記載を指針として提供する。
本発明のベクターの構築は、当業界で公知の標準のライゲーションおよび制限酵素技術を用いる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982）。単離プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは所望の形に切断、末端修復、または再ライゲーションする。
部位特異的ＤＮＡ切断は当業界で一般に理解されている条件下に適当な制限酵素（または酵素）で処理することによって行い、その詳細は市販の制限酵素の製造者によって特定されている（例えば、New England Biolabs、製品カタログ参照）。一般に、プラスミドまたはＤＮＡ配列約１μｇは、緩衝液約２０μｌ中で酵素約１ユニットで切断する。典型的には、ＤＮＡ基質の完全な消化を確保するために、過剰の制限酵素を使用する。約３７℃で１〜２時間のインキュベーション時間で十分であるが、各種の変更が可能である。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホルムで抽出し、場合によりその後エーテルで抽出してタンパク質を除去し、エタノール沈殿により水性画分から核酸を回収する。所望の場合には、切断断片のサイズ分画を標準法のポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行う。サイズ分画の一般的記載は、Methods of Enzymology 65:499-560, 1980に見られる。
制限酵素で切断した断片は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６ｍＭ  ＤＴＴおよび５〜１０μＭ  ｄＮＴＰ中、２０℃で、約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレノウ）で処理することにより平滑末端化できる。クレノウ断片は５’付着末端で修復するが、４種のｄＮＴＰが存在していても、突き出た３’一本鎖を５’側に順次切断していく。所望する場合には、付着末端の性質によって支持される範囲内で、ｄＮＴＰのうちの１種だけ、あるいは選択した複数のｄＮＴＰを供給することにより選択的修復を行うことができる。クレノウで処理した後、混合物をフェノース／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させる。適当な条件下でＳ１ヌクレアーゼまたはＢａｌ−３１で処理すると、すべての一本鎖部分の加水分解が生じる。
以下の標準条件および温度で１５〜５０μｌ容量中でライゲーションを行う：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０℃で４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション用）、あるいは１４℃で１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション用）。分子間「付着末端」ライゲーションは３３−１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５−１００ｍＭ全末端濃度）で通常行う。分子間平滑末端ライゲーション（通常１０〜３０倍モル過剰のリンカーを用いる）は１μＭの全末端濃度で行う。
ＫＡＴシステムのレトロウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドは以下のようにして調製した。
新規レトロウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドの作製
ＫＡＴ構築物は、複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージするために、そして複製能のあるヘルパーウイルスを生産することなく、高力価で複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージすることのできるウイルス粒子タンパク質を生産するために必要なすべてのウイルス粒子タンパク質をトランスでコードする、例えば白血病ウイルスゲノムなどの複製能のないレトロウイルスゲノム由来の少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなるＤＮＡパッケージングプラスミドを含む。ある態様では、レトロウイルスパッケージングＤＮＡ配列は、ウイルスのウイルス５’ＬＴＲの天然エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域をもたず、またヘルパーゲノムをパッケージする役割をもつプサイ機能配列ならびに３’ＬＴＲをもたないが、ウイルス生産が好ましいタイプの細胞中で効率のよい転写を支配する外来エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードし、そしてＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む。外来エンハンサーおよびプロモーターの転写開始部位は５’ＬＴＲの「Ｒ」領域の５’末端で白血病ウイルスゲノムと結合している。
レトロウイルスはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）でありうる。５’ＬＴＲのＲ領域と結合する外来エンハンサーおよびプロモーターは、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の即時型ＩＥ）エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターと結合したＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーでありうる。
すべてのプサイ（ψ）−パッケージングプラスミドはプラスミドｐＫＩ１．１の誘導体である。ｐＫＩ１．１はｐＭＦ２に４つの挿入物を連続して挿入することによって構築された哺乳動物発現ベクターであり、ｐＭＦ２はｐＳＫＩＩ（Staratagene, San Diego, CA）のＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位の欠失を伴って、ｐＳＫＩＩのＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位に合成ポリリンカー５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩ−ＢｇｌＩ−ＸｈｏＩ−３’を挿入することによって作製される。まず、ＳＶ４０Ｔ抗原ポリアデニル化部位を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片（ＳＶ４０のヌクレオチド２７７０〜２５３３、Reddy et al., Science 200:494-502, 1978）およびＳＶ４０複製起点を含むＮｈｅＩ−ＳａｌＩ断片（ＳＶ４０のヌクレオチド５７２５〜５５７８）をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位の間に３部分ライゲーションすることによって挿入して、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位を欠失させる。これらのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ−ＳａｌＩ断片は、それぞれオリゴヌクレオチドプライマー対３と４、および５と６（それぞれの末端にＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、およびＳａｌＩ部位を導入する）を用いて、ｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1:327-341, 1982）を鋳型とするＰＣＲによって合成する。第二に、ヒトα１グロビン遺伝子第２エクソンのスプライスアクセプターを含むＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ヌクレオチド＋１４３〜＋２５１）をＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入する。このＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片はオリゴヌクレオチドプライマー７と８（それぞれの末端にＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ部位を導入する）を用いて、ｐπＳＶαＨＰ（Treisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7428-7432, 1983）を鋳型とするＰＣＲによって合成する。第三に、合成ポリリンカー５’−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＮｃｏＩ−ＡｐａＩ−ＡａｔＩＩ−３’をＥｃｏＲＩとＡａｔＩＩ部位の間に挿入する。第四に、ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド−６７４〜−１９：Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985）およびＣＭＶ ＩＥ第１エクソン／スプライスドナーを含む化学合成ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片（ヌクレオチド−１９〜＋１７０）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩ部位の間に３部分ライゲーションによって挿入する。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片は、オリゴヌクレオチドプライマー９と１０（それぞれの末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩ部位を導入する）を用いて、ｐＣＤＭ８（Seed, Nature 329:840-842, 1987; Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369, 1987）を鋳型とするＰＣＲによって調製する。
0004409631.tif 000002
上述した−１９〜＋１７０をコードする化学合成ＳａｃＩ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド＋１〜＋６にあるＸｂａＩ部位をあらかじめ導入しておいた化学合成ＳａｃＩ／ＳＰｈＩオリゴヌクレオチドで置換することによって、ｐＩＫ１．１中のＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの転写開始部位にＸｂａＩ部位を導入し、ｐＩＫ６．１を得る。これによって、どのようなエンハンサー／プロモーターもＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩカセットとして挿入することが可能になり、所望の細胞型で目的の配列の最高発現レベルを指示するような適当なエンハンサーとプロモーターを挿入できる。マウス線維芽細胞ＮＩＨ  ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）またはＭ．ｄｕｎｎｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ２０１７）で最高発現レベルを達成するためには、２つのプライマー（１つはＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＵ３の５’側の２１ヌクレオチドをコードし、もう１つはＭＭＬＶ  Ｕ３領域の３’側の２１ヌクレオチドおよびＸｂａＩ部位をコードする）と、プラスミドｐＮ７（Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437, 1985）を鋳型として用いるＰＣＲによって、完全なＭＭＳＶ  Ｕ３領域を合成した。このＰＣＲ断片をｐＩＫ６．１のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位の間にクローン化してｐＩＫ６．１ＭＭＳＶを作製した。ヒト細胞で高レベルの発現を指示するために、ＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサー（Boshart et al., 前出）のＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ断片の単離、合成オリゴヌクレオチドＢｃｌＩリンカーの付加、およびプラスミドｐ△ＨＢ（Ｐ．Ｒｏｂｂｉｎｓ博士より、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ＰＡ）のＢａｍＨＩ部位への挿入によってｐＩＫ６．１ＭＣＶを構築した。このプラスミドをｐＭＣＶと命名した。ｐ△ＨＢは、３’ＬＴＲを含むウイルス配列を含むｐＺＩＰｎｅｏＳＶＸ（Cepko et al., 前出）のＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、かつＭＭＬＶ  Ｕ３のＳａｕ３ＡＩ−ＨｐａＩＩエンハンサー断片を除去したものである。ＭＭＬＶ  Ｕ３とＭＭＳＶ  Ｕ３との相同性のために、上述のＰＣＲプライマーを用いてｐＭＣＶのＵ３領域をコードするＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩリンカー断片を作製し、これをｐＩＫ６．１にクローン化してｐＩＫ６．１ＭＣＶを作製した。これらのプラスミドはｐＩＫ６．１と同様に、ｐＩＫポリリンカーの３’末端にあるＡｐａＩ部位とＳＶ４０ポリアデニル化部位にあるＨｐａＩ部位との間のＳＶ４０ポリアデニル化部位の１１２ヌクレオチドの欠失、およびＮｈｅＩリンカーによる置換によってさらに修飾して、pIK6.1Nhe、pIK6.1MMSV.NheおよびpIK6.1MCV.Nheを作製した。
ｐＭＯＶｐｓｉ−（Mann et al.,前出）のＵ３領域の一部、Ｒ、およびＵ５領域、ｇａｇ遺伝子および一部のｐｏｌ遺伝子をコードする３８１３塩基のＳａｃＩ／Ｓａｌ断片、ならびにｐＣＲＩＰａｍｇａｇ−２（Ｏ．Ｄａｎｏｓ博士より、パスツール研究所、パリ、フランス）由来のｐｏｌ／ｅｎｖをコードする４１４０塩基対のＳａｌＩ−ＮｈｅＩ断片を、pIK6.1MMSV.NheまたはpIK6.1MCV.NheのＳａｃＩとＮｈｅＩ部位の間にそれぞれ挿入することによって、pIK6.1MMSVampacおよびpIK6.1MCVampacを構築した。pCRIPamgag-2は、ｐＢＲ３２２プラスミド骨格をプラスミドｐＵＣ１９で置換したpCRIPamgagの誘導体である。得られるプラスミドはエコトロピックＭＭＬＶからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、ならびに４０７０ＡアンホトロピックＭＬＶ（Chattopadhyay et al., J. Virol. 39（3）:777-791, 1981）からのエンベロープ遺伝子をコードし、図１Ａに模式図で示してある。
pIK6.1MCVampacのエンベロープ遺伝子から３’側の非翻訳配列を除去するには、pIK6.1MCVampacを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド５’ＣＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣ３’と５’ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴＡＧ３’を用いてＰＣＲ反応を行った。得られる１４２塩基対のＰＣＲ産物をＣｌａＩとＮｈｅＩで切断した。この１００塩基対断片を切り出し、pIK6.1MCVampacの対応する１７２塩基対のＣｌａＩ−ＮｈｅＩ断片と置換してpIK6.1MCVampacUT△を得た。
pIK6.1amenvATGUT△は、pIK6.1amenvATG中の１７２塩基対のＣｌａＩ−ＮｈｅＩ断片を、pIK6.1MCVampacUT△からの１００塩基対のＣｌａＩ−ＮｈｅＩ断片で置換することによって構築した。pIK6.1MCVamenvATGUT△は、pIK6.1amenvATGUT△中のＣＭＶプロモーターおよびαグロビンスプライスアクセプターを含む９６１塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＫ６．１ＭＣＶからの対応する８９６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置換することによって構築した。
pIK6.1MCVgagpolATGは、pIK6.1gagpolATG中のＣＭＶプロモーターおよびαグロビンスプライスアクセプターを含む９６１塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＫ６．１ＭＣＶからの対応する８９６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置換することによって構築した。
pIK6.1MMSVampacおよびpIK6.1MCVampacと命名された本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランドにブダペスト条約に基づいて寄託され、以下の受託番号を与えられた：
0004409631.tif 000003
別の態様では、パッケージング機能は、例えば２つのヘルパー配列などの２つのプラスミドに基づく発現ベクターによってコードされ、ここでは第１ヘルパー配列がエコトロピックＭＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２ヘルパー配列がレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。宿主域を決定するＥｎｖ遺伝子は、ゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）または１０Ａ１マウス白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｇｐ１６０）のｅｎｖタンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）タイプＩおよびＩＩのｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子；上述のｅｎｖ遺伝子の１またはそれ以上の組み合わせから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子；または上述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通部分、および所望の標的細胞上の特定表面分子に対するモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子由来のものでありうる。
この態様のプラスミドの構築は以下のようにして実施する：ＭＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするpIK6.1gagpolATGは、まずｐＭＯＶｐｓｉ−をＳｃａＩで消化し、ＮｈｅＩ合成リンカーを付加し、ＡｆｌＩＩで再消化し、次いで５．２ｋｂのＡｆｌＩＩ／ＮｈｅＩ断片（ＭＭＬＶのヌクレオチド６４４〜５８６９）を単離することによって構築した。ＭＭＬＶのヌクレオチド６２１〜６４４（ｇａｇ遺伝子のＡＴＧからＡｆｌＩＩ）をコードする合成オリゴヌクレオチド（ただし、ヌクレオチド６２１におけるＡＴＧをＮｃｏＩ部位に変更してある）を、ＡｆｌＩＩ／ＮｃｏＩ断片とともに、ｐＩＫ６．１ＮｈｅのＮｃｏＩ部位ポリリンカーとＳＶ４０ポリアデニル化部位の５’末端にあるＮｈｅＩ部位との間にライゲートした。
ＭＬＶ４０７０Ａ  Ｅｎｖ遺伝子をコードするpIK6.1amenvATGは、pCRIPAMGAG-2（Danos and Mulligan, 前出）をＡｆｌ 111で消化し、ＮｈｅＩまたはＨｉｎＰ１で再消化し、０．３２５ｂｐのＨｉｎＰ１／Ａｆｌ 111断片（ＭＬＶ４０７０Ａ  Ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド３７〜３６５；Ott et al., J. Virol. 64（2）:757-766, 1990）および１．７ｋｂのＡｆｌ 111／ＮｈｅＩ断片（ＭＬＶ４０７０Ａ  Ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド３６５から）をそれぞれ、ｐＣＲＩＰＡＭＧＡＧ−２（Danos and Mulligan,前出）のＭＭＬＶ３’ＬＴＲのＮｈｅＩ部位に挿入することによって構築した。ＭＬＶ４０７０Ａ  Ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド３７〜４３（ｅｎｖ遺伝子のＡＴＧからＨｉｎＰ１）をコードする合成オリゴヌクレオチド（ただし、ヌクレオチド３７におけるＡＴＧはＮｃｏＩに変更してある）を、ＨｉｎＰ１／Ａｆｌ 111断片およびＡｆｌ 111／ＮｈｅＩ断片とともに、ｐＩＫ６．１Ｎｈｅのポリリンカー中のＮｃｏＩ部位とＳＶ４０ポリアデニル化部位の５’末端にあるＮｈｅＩ部位との間にライゲートした。これらのプラスミドを図１Ａに模式図で示してある。
pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGと命名された本発明の２つのゲノムレトロウイルスパッケージングプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランドにブダペスト条約に基づいて寄託され、以下の受託番号を与えられた：
0004409631.tif 000004
レトロウイルスベクター
１ゲノムおよび２ゲノムパッケージング構築物はいずれも、レトロウイルスが生産される細胞型中での効率のよい転写を指示する修飾５’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを利用する。本発明のレトロウイルスベクターは、ｐＺｅｎ（Johnson et al., The EMBO Journal 8（2）:441-448, 1989）、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶＸのｎｅｏ−改変体（Cepko et al., Cell 37:1053-1062, 1985）をモデルとしており、ここでは発現すべき遺伝子産物が通常はｎｅｏカセット（Cepko et al., 前出）で占められている位置でスプライスアクセプターの下流にクローン化される。さらに、ＭＭＬＶのＮａｒＩ部位（ヌクレオチド１０３８）までのウイルスｇａｇ配列を加えてパッケージングを改良し（Armentano et al., J. Virol. 61:11647-1650, 1987）、またｐＺＩＰｎｅｏＳＶＸのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片を除去した（Cepko et al., 前出）。ｐＩＫ１．１由来のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩポリリンカーをスプライスアクセプターの下流に挿入して、ｐＩＫプラスミド由来の挿入物をレトロウイルス構築物に転移させることができた。得られるプラスミドをｐＲＴＤ１．２と命名し、これは５’および３’ＭＭＬＶ  ＬＴＲの両方を含む。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶＸの５’ＬＴＲ  Ｕ３領域を、ｐＩＫＭＭＳＶのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片由来のＭＭＳＶ  Ｕ３で置換して、ｐＲＴＤ４．２を作製した。ｐＲＴＤ２．２では、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶＸの５’ＬＴＲのＵ３領域を、ＣＭＶ即時型エンハンサー／プロモーターをコードするｐＩＫ１．１由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片で置換し、これを、ＭＭＬＶ（Schinnick et al., Nature 293:543-548, 1989）のヌクレオチド＋１〜＋３２（ＫｐｎＩ）と結合したＨＣＭＶプロモーターのヌクレオチド１９（ＳａｃＩ）〜＋１をコードするオリゴヌクレオチドによってＭＭＬＶ  Ｒ領域と融合させた。ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧは、ｐＲＴＤ２．２の（７５０ｂｐ）ＳａｃＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を、ＬＸＮＳ（Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1989）の（７３６ｂｐ）ＳａｃＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片で置換することによって構築した。ｐＲＴＤ２．２ＳＳＡは、ｐＲＴＤ２．２の（１４４１ｂｐ）ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＬＸＮＳ（Millert and Rosman, 前出）の（１０５３ｂｐ）ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置換することによって構築した。ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧＥ−は、その５’末端にＡｐａＩ部位をあらかじめ付加しておいたｐＬＸＳＮ（GenBank Accession Bank, M28248）のヌクレオチド２８７８〜２９５５をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって構築した。これを用いてｐＲＴＤ２．２ＳＶＧのＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片を置換するが、これはポリリンカーの３’側のＤＮＡ配列および３’ＬＴＲ中のＮｈｅＩ部位の５’側のＤＮＡ配列を含む。本発明のこれらのレトロウイルスベクター構築物はｐＢＲ３２２骨格をもち、ｐＲＴＤ２．２、ｐＲＴＤ４．２、ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧ、ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧＥ−およびｐＲＴＤ２．２ＳＳＡを含む。
ＳＶ４０のＴ抗原を発現する細胞中でのプラスミド複製を可能にするために、ｐＲＴＤ２．２の５’と３’ＬＴＲの間の配列を上述のｐＩＫ１．１のＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩの間にクローン化し、これはＳＶ４０複製起点を含み、ベクターｐＩＫＴ２．２を得た。ｐＩＫＴ２．２ＳＶＧは、ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧのＨＣＭＶプロモーター中のＳａｃＩ部位によって５’末端を規定され、またｐＲＴＤ２．２ＳＶＧの３’ＬＴＲの７５０ｂｐ下流に位置するＥｃｏＲＩ部位によって３’末端を規定される断片を、ｐＩＫ１．１のＳａｃＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿入することによって構築した。pIKT2.2SVGE-F3は、pIKT2.2SVGF3の１８２塩基対のＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片を、上述のｐＲＴＤ２．２ＳＶＧＥ−Ｆ３由来の８０塩基対のＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片で置換することによって構築した。
ｐＲＴ４３．２Ｆ３は、３’ＬＴＲから約７５０塩基対下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩポリリンカーを、ＡｓｃＩ認識部位を含む合成オリゴヌクレオチドで置換することによってpIKT2.2SVGE-F3から誘導した。さらに、ウイルスｇａｇ配列の３’末端にあるＮｄｅＩ部位をオリゴヌクレオチド挿入によってあらかじめＸｈｏＩ部位に変更しておいた。ｐＲＴ４３．３ＰＧＫＦ３は、ｐＲＴ４３．２Ｆ３中の３’ＬＴＲをまず除去し、ＰｖｕＩＩからＸｂａＩまでの配列（ＭＭＬＶ、GenBank session#JO2255ヌクレオチド番号７９３８〜８１１５）を欠失させた３’ＬＴＲを挿入することによってｐＲＴ４３．２Ｆ３から誘導した。さらに、ＭＭＬＶスプライスアクセプター領域は、その５’末端にＸｈｏＩ部位と３’末端にＥｃｏＲＩ部位をもつポリリンカー中にクローン化したヒトホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター（GenBank session#M11958ヌクレオチド２〜５１６）で置換しておいた。
本発明のレトロウイルスベクターのある態様では、キメラ受容体構築物の発現のために本発明の方法を用いて哺乳動物標的細胞中に形質導入しようとする遺伝子をコードするＤＮＡが調製される。キメラ受容体構築物の構築を以下に記載する。
ＣＤ４／ＣＤ３ゼータおよび抗ＨＩＶ／ＣＤ３ゼータレトロウイルスベクター
ＫＡＴレトロウイルスベクターpRTD2.2F3、pRTD2.2SVGF3、pRTD2.2SSAF3、pRTD2.2SVGF3E-、pIKT2.2SVGF3は、ｐＩＫＦ３（上述した）のＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ消化、１．９ｋｂ断片の単離、次いでこの断片を、ベクターpRTD2.2、pRTD2.2SVG、pRTD2.2SSAF3、pRTD2.2SVGE-、pIKT2.2SVGのｐＩＫポリリンカー中のＥｃｏＲＩとＡｐａＩ部位の間にライゲートすることによって構築した。ＫＡＴレトロウイルスベクターpRTD2.2F15は、pIKF15neo（上述した）のＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ消化、２．２ｋｂ断片の単離、次いでこの断片をベクターｐＲＴＤ２．２のｐＩＫポリリンカー中のＥｃｏＲＩとＡｐａＩ部位の間にライゲートすることによって構築した。これらのベクターは、それぞれＣＤ４受容体の細胞質ドメイン（成熟ＣＤ４鎖のアミノ酸３７２〜３９５）およびＣＤ３−複合関連遺伝子ゼータ（ζ）の膜貫通ドメイン（成熟ζ鎖のアミノ酸３７２〜３９５）に融合したヒトＣＤ４（Ｆ３誘導体）の細胞外ドメインまたはＨＩＶ（Ｆ１５誘導体）のｇｐ４１に対する単鎖抗体を含むキメラ分子をコードする。ヒトＣＤ４受容体（Ｆ３という）の細胞外ドメイン（成熟ＣＤ４タンパク質のアミノ酸残基１〜３７１）、またはＨＩＶエンベロープタンパク質（Ｆ１５という）のｇｐ４１部分に特異的なヒト抗体（９８．６）由来のＨＩＶｇｐ４１に対する単鎖抗体のいずれかをコードするキメラ受容体カセットを、ＣＤ３ζ鎖と融合し、上述のｐＩＫ１．１のＥｃｏＲＩとＡｐａＩ部位の間にクローン化した。単鎖抗体では、Ｈ鎖およびＬ鎖のいずれの可変ドメインもペプチド鎖を介して共有結合して１分子上に抗原結合部位を作り出す。キメラ受容体構築を以下にさらに詳細に記載する。
ＣＤ４−ゼータキメラの構築
プラスミドｐＧＥＭ３ｚｅｔａは、ヒトζｃＤＮＡ（Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713, 1988）をもつ。プラスミドｐＢＳ．Ｌ３Ｔ４はヒトＣＤ４ｃＤＮＡ（Littman and Gettner, Nature 325:453-455, 1987）をもつ。細胞外（ＥＸＴ）ドメインの残基７からの全ヒトζ鎖コード配列を含むＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ制限断片（約０．６４ｋｂ）をｐＧＥＭ３ｚｅｔａから切り出し、Stratagene社（San Diego,CA）から入手したファージミドに基づくクローニングベクターであるpBluescript II SK（+）9pSKのポリリンカーのＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ制限部位にサブクローン化して、ｐＳＫ．ｚｅｔａを作製した。次いで、全ＣＤ４コード配列を含むＢａｍＨＩ制限ファージミド（約１．８ｋｂ）をｐＢＳ．Ｌ３Ｔ４から切り出し、ｐＳＫ．ｚｅｔａのＢａｍＨＩ部位にサブクローン化してｐＳＫ．ＣＤ４．ｚｅｔａを作製した。
ｐＳＫ．ＣＤ４．ｚｅｔａから一本鎖ＤＮＡを調製し（Stratagene pBluescript II プロトコル）、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発（Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500, 1982）の鋳型として用いて、以下に記載する所望の接合部をもつＣＤ４−ゼータキメラを作製した。ＣＤ４−ゼータ融合体１、２および３を次にサンガーのジデオキシヌクレオチド法（Sanger et al., Proc. Natl. Avad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977）で配列決定し、ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ制限断片として切り出し、発現ベクターｐＩＫ１．１またはｐＩＫ１．１．Ｎｅｏのポリリンカー中に同じ部位でクローン化した。
ＣＤ４の全コード領域を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限断片（約１．８ｋｂ）をｐＳＫ．ＣＤ．ｚｅｔａから切り出し、ｐＩＫ１．１またはｐＩＫ１．１．ＮｅｏポリリンカーのＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ部位の間にサブクローン化した。
プラスミドｐＵＣＲＮｅｏＧ（Hudziak et al., Cell 31:137-146, 1982）は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）３’ＬＴＲの転写制御下にネオマイシン遺伝子をもつ。ｐＵＣＲＮｅｏＧからＲＳＶ−ｎｅｏカセットをＨｉｎｃＩＩ制限断片（約２．３ｋｂ）として切り出し、ｐＩＫ．１．１の２つのＳｓｐＩ部位の間にサブクローン化してｐＩＫ．１．１．Ｎｅｏを作製した。
ＣＤ４−ゼータキメラ受容体Ｆ３は、それぞれＣＤ４およびゼータの細胞外（ＥＣ）および細胞質（ＣＹＴ）ドメインから構築した。この受容体の膜貫通（ＴＭ）ドメインはＣＤ４由来であった。Ｆ３は４つのＶドメインすべてを含むＣＤ４  ＥＸＴドメイン（成熟ＣＤ４タンパク質の残基１〜３７１）、ＣＤ４のＴＭドメイン（成熟ＣＤ４鎖の残基３７２〜３９５）、およびゼータのＣＹＴドメイン（成熟ゼータ鎖の残基３１〜１４２）をもつ。
単鎖抗体−ゼータキメラ受容体の作製
ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９８．６のＨ鎖をコードする発現ベクターの構築：
ヒトｍＡｂ９８．６（S. Zolla-Pazner, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:1624-1628, 1989）のＨ鎖の発現を導くために、プラスミドpIK.98.6-γFLを構築した。細胞系ＳＰ−１／９８．６（Zolla-Pazner, 前出）からオリゴ−ｄＴをプライマーとして用いて得た全ＲＮＡ５μｇの逆転写により全長ＩｇＧ１  Ｈ鎖ｃＤＮＡを作製し、次にオリゴヌクレオチドプライマー１７と２（下記参照）を用いるＰＣＲを行った。１．５ｋｂのＥｃｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＩＫ１．１のＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ部位の間にクローン化した。Ｈ鎖が所望のアロタイプであることを確認するために、ｃＤＮＡのＫａｓＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＩＫ１．Ｃγ１由来の０．９４ｋｂのＫａｓＩ−ＢｇｌＩＩ断片で置換した。ｐＩＫ．Ｃγ１は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Clontech, Inc. パロアルト、ＣＡ）由来のＤＮＡを基質として、そしてオリゴヌクレオチドプライマー２と１８（下記参照）を用いるＰＣＲによって得られるＩｇＧ１  Ｈ鎖の不変領域をコードするｃＤＮＡを、ｐＩＫ１．１のＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ部位の間に挿入することによって構築した。
ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９８．６のＬ鎖をコードする発現ベクターの構築：
ｍＡｂ９８．６のＬ鎖の発現を導くために、プラスミドpIK.98.6κFLを構築した。ｐｄＮ6（Pharmacia/LKB）をプライマーとして細胞系ＳＰ−１／９８．６から得た全ＲＮＡ５μｇの逆転写により全長ＩｇＧ１  Ｌ鎖ｃＤＮＡを作製し、次にプライマー１９と２０（下記参照）を用いるＰＣＲを行った。次に０．７８ｋｂの断片をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切り出し、ｐＩＫ１．１のＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ部位の間にクローン化した。
ｍＡｂ９８．６のＨ鎖およびＬ鎖由来のＳＡｂをコードする発現ベクターの構築：
ａ）ｐＩＫ９８．６−Ｋ／Ｌ／Ｈの構築：
一本鎖抗体（ＳＡｂ）形態のｍＡｂ９８．６の発現を引き出すため、ｐＩＫ．９８．６−Ｋ／Ｌ／Ｈを構築した。発現されたＳＡｂは、配列ＧＳＴＳＧＳＧＳＳＥＧＫＧを有する１４アミノ酸リンカー（L212, Betzykら，J. Biol. Chem.（1990）265:18615-18620）に融合した分泌リーダー（leader）配列および成熟９８．６ｍＡｂのＬ鎖可変（ＶL）部のアミノ酸１−１０７からなり、これを次に成熟９８．６ｍＡｂのＨ鎖可変（ＶH）部のアミノ酸１に融合させた。次に、分泌の向上を目的としてＩｇＧ１ Ｈ鎖定常部のＣＨ１ドメインを削除するために、これをアミノ酸１１３の位置でＩｇＧ１ Ｈ鎖定常部のアミノ酸２３４に融合させた。ｐＩＫ．９８．６−Ｋ／Ｌ／Ｈは３工程で構築された。
第一に、ｍＡｂ９８．６のＶH部のアミノ酸１１３をＩｇＧ１ Ｈ鎖のアミノ酸２３４に融合させるため、鋳型として一本鎖鋳型形態のｐＩＫ．９８．６−γＦＬを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチド２１（下記参照）を用いて、欠失突然変異誘発を実施した。プローブとしてオリゴヌクレオチド２２（下記参照）を用いて、正しく欠失したプラスミドを見いだした。このプラスミドをｐＩＫ．Ｈ／Ｆｃ−ｉｎｔと称する。アミノ酸１０７をリンカーペプチドのアミノ末端に融合させるため、ｐＩＫ．９８．６−κＦＬを基質として、またオリゴヌクレオチド２３および２４（下記参照）をプライマーとして用いて、ＰＣＲによりｍＡｂ９８．６Ｌ鎖のＶL部を作成した。これは、出来上がるタンパク質のアミノ酸配列を変更すること無くSal I部位をＶL配列の３’末端に位置させるために行なわれた。この断片はオリゴヌクレオチド２５および２６（下記参照）と共に、ｐＩＫ１．１のEco RI部位とBgl II部位の間に連結され、プラスミドｐＩＫ．Ｋ／Ｌ−ｉｎｔを作出した。
最後の工程で、ｐＩＫ．Ｋ／Ｌ−ｉｎｔの0.45kb断片をｐＩＫ．Ｈ／Ｆｃ−ｉｎｔのEco RI部位とKpn I部位の間でクローン化し、プラスミドｐＩＫ．Ｋ／Ｌ／Ｈ−ｉｎｔを作出した。このプラスミド由来の一本鎖ＤＮＡは鋳型として、またオリゴヌクレオチド27はプライマーとして（下記参照）、リンカーのカルボキシ末端アミノ酸をｍＡｂ９８．６のＶH部のアミノ酸１に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。プローブとしてオリゴヌクレオチド２８（下記参照）を用いて、正しく欠失したプラスミドを見いだした。出来上がったプラスミドはｐＩＫ．９８．６Ｋ／Ｌ／Ｈである。
ｂ）ｐＩＫ．ＣＤ４γ２の構築：
ヒトＩｇＧ２ Ｈ鎖定常部のアミノ酸２３４に融合した分泌リーダー配列および成熟ＣＤ４抗原の最初の１８０個のアミノ酸からなり、したがってヒンジドメインの一部とＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全部を含有する融合タンパク質の発現を引き出すため、プラスミドｐＩＫ．ＣＤ４γ２を構築した。これは、分泌の向上のためＩｇＧ２ Ｈ鎖のＣＨ１ドメインを欠失させている。ｐＩＫ．ＣＤ４γ２は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）由来のＤＮＡを基質として、またオリゴヌクレオチド３および４をプライマーとして用いて、ＰＣＲによりヒトＩｇＧ２ Ｈ鎖のＦｃ部分を含有する断片を作成することによって構築した。作成された0.75kbのNhe IからBgl II断片は、ｐＳＫＣＤ４ζ由来の0.6kbのEco RIからNhe I断片と共に、ｐＩＫ１．１のEco RI部位とBgl II部位の間に連結した。
ｃ）ｐＩＫ．Ｆ５の構築
すべてがヒト膜結合ＩｇＧ膜ヒンジドメイン（Tylerら，（1982）Proc. Natl. Acad. Sci. 79:2008-2012）を含有するＣＤ４／ＩｇＧ／ゼータ（ζ）融合タンパク質の幾つかの変形を発現させるため、プラスミドｐＩＫ．Ｆ５を構築した。発現されるべき各タンパク質はＣＤ４受容体のアミノ酸１−１８０を含有し、これらのアミノ酸の後にヒトＩｇＧ２ Ｈ鎖定常部のアミノ酸２３４−４４５が続き、その後にヒトＩｇＧ３の１８アミノ酸Ｍ１膜ヒンジドメインが続き（BensmanaおよびLefranc,（1990）Immunogenetics, 32:321-330）、その後に膜貫通ドメインが続き、その後にヒトζ鎖のアミノ酸３１−１４２が続いていた。ｐＩＫ．Ｆ７はＣＤ４の膜貫通ドメイン（アミノ酸３７２−３９５）を含有する。
このプラスミドを構築するための第一工程はヒトＩｇＧ３ Ｍ１エクソン（BensmanaおよびLefranc, 前出）のクローニングであった。これは、基質としてヒト細胞系W138を、またオリゴヌクレオチド7および８を用いて、PCRによりＭ１エクソンを含有する0.13kbのBam HIからBgl II断片を作成し、それをｐＩＫ．ＣＤ４γ２のBgl II部位にクローン化することにより実施した。得られたプラスミドをｐＩＫ．ＣＨ３／Ｍ１−ｉｎｔと称する。このプラスミド由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型として、またオリゴヌクレオチド９をプライマーとして、ヒトＩｇＧ２のアミノ酸４４５をＩｇＧ３膜ヒンジドメインの最初のアミノ酸に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。この融合は、膜結合ＩｇＧ分子におけるＣＨ３とＭ１の間の天然の連結部に見いだされる配列を作り出すように設計されている。プローブとしてオリゴヌクレオチド１０を用いて、正しく欠失したクローンを見いだした。得られたプラスミドをｐＩＫ．ＣＤ４γ２／Ｍ１と称する。
ｐＩＫ．ＣＤ４γ２／Ｍ１をBgl IIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端とし、次にNhe Iで切断した。出来上がった0.83kbの断片を、ｐＩＫ．Ｆ３由来の1.3kbのPvu IIからApa I断片と共に、ｐＩＫ．ＣＤ４γ２のNhe I部位とApa I部位の間に連結し、プラスミドｐＩＫ．Ｆ７−ｉｎｔを作出した。このプラスミド由来の一本鎖ＤＮＡを鋳型として、またオリゴヌクレオチド１５をプライマーとして、ＩｇＧ３Ｍ１膜ヒンジドメインの最後のアミノ酸をＣＤ４のアミノ酸３７２に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。プローブとしてオリゴヌクレオチド１６を用いて、正しく欠失したクローンを見いだした。得られたプラスミドはｐＩＫ．Ｆ７である。
プライマーおよびプローブとして使用される上記のオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
0004409631.tif 000005
ｐＩＫ．Ｆ１５ｎｅｏの構築：
ＩｇＧ１ Ｈ鎖のアミノ酸４４５で１８アミノ酸ＩｇＧ３ Ｍ１膜ヒンジドメインに連結し、これが次にＣＤ４膜貫通ドメイン（アミノ酸３７２−３９５）およびζ細胞質ドメイン（アミノ酸３１−１４２）に融合している、Ｋ／Ｌ／Ｈ  Ｓａｂ形態のｍＡｂ９８．６からなる融合タンパク質の発現を引き出すため、pIK.98.6-K/L/H由来の1.5kbのNsi I断片をpIK.F7neoの2つのNsi I部位の間に挿入することによりｐＩＫ．Ｆ１５ｎｅｏを構築し、正しい向きのクローンを選択した。
哺乳動物細胞におけるレトロウイルスの産生
一本鎖または二本鎖ゲノムＫＡＴパッケージングプラスミド（例えば、pIK6.1MMSVampac, pIK6.1MCVampac, またはpIK6.1amenvATGおよびpIK6.1gagpolATG, すべて上記）をＫＡＴレトロウイルス構築物（例えば、上記のpRTD2.2F3, pRTD2.2SVGF3, pRDT2.2SSAF3, pRTD2.2SVGF3E-, pIKT2.2SVGF3, pRTD2.2F15を含むが、これらだけに限定されない）と共に、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞にリン酸カルシウム同時トランスフェクション（Wiglerら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1373-1377（1979））等の標準的手段により導入する。ウイルスを産生することができ、かつ本発明のKAT構築物によってトランスフェクトされうる哺乳動物細胞は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、293細胞等のヒト胚性腎細胞、tsa201細胞、マウス3T3マウス繊維芽細胞、M.dunni繊維芽細胞、およびアフリカミドリザル腎（COS）細胞である。トランスフェクトした細胞を、ＦＡＣＳによりキメラ受容体の表面発現に関してアッセイし、ＤＮＡ構築物が上首尾に導入されたことを確認する。
トランスフェクションの４８時間後に上清を濾過する等の標準的技法を用いてウイルス上清を集める。8μg/mlポリブレン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）の存在下で、１０6個のNIH 3T3細胞を適切な量のウイルス上清を用いて感染させることにより、ウイルス力価を測定する。48時間後に、FACS分析およびサザンブロット法の両方により、3T3細胞の形質導入効率をアッセイする。
標的細胞への高効率形質導入
本発明の方法において、ＫＡＴでトランスフェクトした細胞を哺乳動物標的細胞と共培養（cocultivation）することにより、外来遺伝子を用いて哺乳動物細胞に高い効率で形質導入を行なうのに本発明のＫＡＴ構築物がさらに使用される。好ましい態様において、293細胞等の所望のウイルス産生細胞は適切なＫＡＴ構築物によりトランスフェクトされ、トランスフェクションの24時間後に、トランスフェクトされた293細胞は精製哺乳動物標的細胞（例えばCD8+ T細胞）と共に48時間共培養される。標準的方法を用いて標的細胞を集め、膨張させ、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞ソーター（FACS）分析およびサザンブロットＤＮＡ分析等の周知の方法により形質導入効率を試験する。形質導入効率は、FACSまたはサザンブロット分析により測定された、対照と比較した陽性形質導入細胞のパーセンテージと定義される。
ウイルスを産生するためにヒト293細胞中にトランスフェクトされるKAT構築物を用いると、以前に記述されたCOS一時的ウイルス産生系（LandauおよびLitman、前出）により産生されるウイルスに較べ、樹立細胞系（3T3等）の上清感染により測定されるウイルス力価において５〜５０倍の増加が得られる。さらに、造血幹細胞およびヒトT細胞等の主要なヒト細胞は、KATプラスミドによりトランスフェクトされた293細胞との共培養により、PA317（MillerおよびButtimore、前出）等の伝統的なパッケージング系よりも３〜２０倍大きいレベルで形質導入がなされる。
何ら特定の推論に束縛されることを望まないが、本発明の方法を用いて得られるヒト標的細胞への高効率の形質導入は、レトロウイルスによって感染させたヒト２９３細胞と標的細胞との細胞−細胞接触によって媒介されると考えられる。種々の標的細胞への高効率形質導入をもたらすヒト２９３細胞の成分は、２９３細胞によって合成されるタンパク質または脂質であろうと予想される。この系の活性成分を確認するため、公知の方法を用いて２９３細胞の膜タンパク質および脂質を精製し、種々の精製成分の能力を標的細胞への形質導入効果をもたらす能力に関して試験する。いったん活性成分が同定されると、その成分を組換えＤＮＡまたは化学的技法によって合成することができる。これらの合成された成分は、ウイルス粒子に組み込まれて、上清の形質導入効率を増強しうる。
適切な標的細胞は、任意の興味のある哺乳動物細胞であり、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、リンパ球、特に細胞毒性Ｔ細胞、ヒト造血幹細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋芽細胞、網膜上皮細胞、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ニューロン、ダリア細胞、神経節細胞、胚性幹細胞、および肝細胞である。
標的細胞に導入しうる遺伝子は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、リンパ球におけるシグナル伝達のためのキメラ受容体をコードする遺伝子、例えば1992年12月9日に出願された同時係属中の米国特許出願第988,194号（この開示は参照として全体をここに組み入れている）に記載のもの等；Ｇ−、Ｍ−およびＧＭ−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）および幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）等の増殖因子；インターロイキン等のリンホカイン；ＡＣＴＨ、ソマトメジン、インスリン、アンジオテンシン等のホルモン；および因子VIIIならびに因子IX等の凝固因子、多薬剤耐性薬剤（ＭＤＲ）遺伝子；ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）；グルコースセレブロシダーゼ；正常なβ−グロビン遺伝子およびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）である。
以下の実施例は、本発明を説明し、当業者が同じものを作成し、使用するのを助けるために提供される。これらの実施例は、開示の範囲または特許証によって与えられる保護を制限することを決して意図するものではない。
実施例Ｉ
高力価組換えウイルスの時的産生
細胞増殖、トランスフェクションおよび樹立細胞系の感染
２９３細胞と称されるヒト胚性腎細胞（ATCC CRL 1573, ATCC, Rockville, MD）をDMEM（JHR Biosciences, Lenexa, Kansas）、1g/Lグルコース、10% Donorウシ血清（Tissue Culture Biologics, Tulare, CA）で培養し、３日ごとに１：１０に分割した。３Ｔ３（ATCC CRL1573）細胞をDMEM（JHR Biosciences）、4.5g/Lグルコース、10% Donorウシ血清（Tissue Culture Biologics）で培養し、３日ごとに１：１０に分割した。ＣＯＳ（ATCC CRL1650）細胞をDME/F12（GIBCO, Grand Island, NY）、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologics, Tulare, CA）で培養し、３日ごとに１：１０に分割した。２９３ｓの誘導体であるｔｓａ２０１細胞はネオマイシン耐性遺伝子（Heinzelら，J. Virol. 62（10）:3738-3746（1988））を用いて同時トランスフェクトされたSV40 T抗原の温度感受性突然変異体を含む。この細胞をDME/F12（GIBCO）、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologics）で培養し、３日ごとに１：１０に分割した。２９３細胞およびｔｓａ２０１細胞をトランスフェクションの48時間前に、プレート10cmあたりそれぞれ1 x 106個および0.5 x 106個プレートした。ＣＯＳおよび３Ｔ３細胞をトランスフェクションの24時間前に、プレート10cmあたり0.5 x 106個プレートした。各プラスミドを10μg、単独または種々の組み合わせで、リン酸カルシウム共沈降（Wiglerら，前出）によりすべての細胞型に対しトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に培地を交換した。その24時間後に、ウイルス上清を集め、0.45μmのフィルターで濾過し、ドライアイス上で急速に凍結させた。３Ｔ３細胞を感染の24時間前に、プレート10cmあたり0.5 x 106個プレートした。感染は、ウイルス上清および8μg/mlのポリブレン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を含有する5mlの培地を用いて実施した。感染の24時間後に、培地をポリブレンを含まない培地に交換し、細胞をさらに24時間培養した。
一時的トランスフェクションの後、２９３細胞は高力価レトロウイルスを産生した。
ＫＡＴパッケージングプラスミドｐＩＫ６．１ＭＣＶａｍｐａｃまたはｐＩＫ６．１ａｍｅｎｖＡＴＧおよびｐＩＫ６．１ｇａｇｐｏｌＡＴＧ、およびＦ３またはＦ１５キメラ受容体をコードするレトロウイルスベクターｐＲＴＤ２．２Ｆ３、ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧＦ３、ｐＲＴＤ２．２ＳＳＡＦ３、ｐＲＴＤ２．２ＳＶＧＦ３Ｅ−、ｐＩＫＴ２．２ＳＶＧＦ３およびｐＲＴＤ２．２Ｆ１５を用いて同時トランスフェクションした後の、２９３細胞の組換えレトロウイルスを一時的に産生する能力についてアッセイした。アッセイは、トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を集め、マウス３Ｔ３細胞を感染させ、その48時間後にＦＡＣｓ分析を行うことにより実施した。
ＦＡＣＳ分析のため、感染させた３Ｔ３細胞をトリプシンの不在下で培養皿から除去し、40mM Tris, pH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA中でインキュベートした後、FACS分析用に処理する。細胞を2%（FCS）ウシ胎児血清（Hyclone）を加えたリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で１回洗浄し、次に適切なFITC-結合検出抗体と共に、PBSプラス2% FCSの存在下で、1mlあたり1 x 106個の密度で、30分間40℃でインキュベートする。細胞をPBSプラス2% FCSで３回洗浄し、最後に0.5ml PBSに再懸濁してフローサイトメトリーにより分析する。
FACS分析の結果を図２に示す。ｐＩＫ６．１ａｍｐａｃおよびｐＲＴＤ２．２Ｆ３によって同時トランスフェクトされた２９３細胞は、モック（対照）のトランスフェクトされた細胞（図２Ａ）に較べ、表面に高レベルのＦ３を発現する（図２Ｂ）。トランスフェクトされた２９３細胞から集めたウイルス上清で感染させた３Ｔ３細胞は、未感染および感染３Ｔ３細胞に対応する２つのはっきり分離したピークを示した（図２Ｄ）。これは、トランスフェクトされた２９３細胞（図２Ｂ）またはモックの感染３Ｔ３細胞（図２Ｃ）のＦＡＣＳプロフィールと比較すると、有意に異なっていた。
表１はＫＡＴパッケージングプラスミドおよびＫＡＴレトロウイルス構築物の同時トランスフェクションが、3T3感染およびFACS分析によりアッセイされる高力価ウイルス上清の産生をトランスフェクションの48時間後にもたらすことを示している。ｐＩＫ６．１ａｍｐａｃおよびｐＲＴＤ２．２Ｆ３の同時トランスフェクションは、感染時に最初に存在する106個の3T3細胞の50%に形質導入を行なうウイルス上清を生ずる。対照的に、LandauおよびLitman（LandauおよびLitman, 前出）によって記述されているCOS細胞における同時トランスフェクションによって産生されるウイルスは、KATプラスミドの293細胞への同時トランスフェクションによって達成される力価より10倍低い。ウイルス産生は、それぞれ２組の３Ｔ３感染を実施した４つのトランスフェクション実験において、高度に再現性を有する。対照的に、レトロウイルス構築物ｐＲＴＤ２．２Ｆ３単独でトランスフェクションを行うと、検出可能な３Ｔ３感染は観察されない。これは、ウイルス産生がパッケージング構築物およびレトロウイルスベクターの存在に依存することを示している。高力価ウイルス産生はまた、レトロウイルス構築物の存在にも依存する。ｐＩＫＦ３発現ベクター単独のトランスフェクション、またはｐＩＫＦ３発現ベクターおよびｐＩＫ６．１ＭＭＳＶａｍｐａｃの同時トランスフェクションは、３Ｔ３細胞に形質導入をすることができない上清を生ずる。
0004409631.tif 000006
高力価ウイルスは、pIK6.1amenvATG、pIK6.1gagpolATGおよびpRTD2.2F3（表１参照）の同時トランスフェクションによっても産生することができる。後者のプラスミドのトランスフェクション効率はpIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3のトランスフェクション効率とほぼ同等であったが、ウイルス産生は２〜２７％の率で減少した。同様な結果がLandauおよびLitman（LandauおよびLitman, 前出）によって記述されており、彼らは５倍の減少を観察した。１個または２個のゲノムパッケージングプラスミドを用いるＫＡＴ系の全効率はなお、ＣＯＳ細胞系について記述されている全効率の１０〜２０倍大きい。
ＫＡＴプラスミドによる２９３細胞のトランスフェクションの後に産生されたウイルス上清のＦＡＣＳ分析によって観察される３Ｔ３細胞への高い形質導入効率は、感染した３Ｔ３細胞由来の組み込まれたプロウイルスＤＮＡのサザンブロッティングによって確認された。感染および10μgのＤＮＡのEco RVによる消化の48時間後に、高分子量ＤＮＡを調製した。試料は0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動にかけ、Zetabindに移し、ゼータ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする605bpの断片で釣り上げた。トランスフェクトされたプラスミドpRTD2.2F3のEco RV消化は、4.2kbのバンドを生じた。MMLV 5’および3’LTRsを含有するプラスミドpRTD1.2F3のEco RV消化は、3.6kbの断片を生じた。ウイルス感染の後、3’LTRの組み込みおよび複製、ならびにEco RV消化は3.6kbの断片を生じるはずである。これが標的細胞における組み込まれたプロウイルスＤＮＡの存在の確認を可能とする。表２は、Eco RV消化およびゼータプローブへのハイブリダイゼーションを行なった後の、トランスフェクトされたプラスミドおよび組み込まれたプロウイルス由来の予想されるバンドの大きさを示す。
0004409631.tif 000007
感染3TSから調製された染色体DNAをEco RVで消化し、感染及び対照の細胞からの10μlの消化DNAを0.8%アガロースゲルで電気泳動を行ない、Zetabindに移し、ζ膜内外と細胞質ドメインをコードする605bp断片をプローブとして検出した。293細胞にpRTD2.2F3とpIKMCVampacをコトランスフェクトした後に得られた上清に感染させた3T3細胞から得られたDNAのみが3.6kb断片（図3A、レーン４及び５）を生じ、これはEco RV消化pRTD1.2F3プラスミドコントロールレーン（図3A、レーン11〜14）に見られる断片と同一であって、組込まれたプロウイルスを示している。走査デンシトメトリーによるサザンブロットの定量および３倍増加量において0.1〜3.0コピーを示すプラスミド標準物との比較（図3A、レーン11〜14）は、ウイルス上清1mlあたり0.5コピー／細胞の形質導入効率と一致した。この形質導入効率はFACS分析により観察された効率と同じであった。プローブは、擬似（mock）トランスフェクトさせた293細胞（レーン１）、pRTD2.2F3のみをトランスフェクトさせた293細胞（図3A、レーン２と３）、発現ベクターpIKF3のみをトランスフェクトさせた293細胞（図3A、レーン６と７）またはpIK6.1MCVampacおよびpIKF3を共にトランスフェクトさせた293細胞（図3A、レーン８と９）からのそれぞれの上清ととも感染させた3T3細胞のDNA中にバンドを検出せず、これもFACS分析に合致する。
３つのさらに別のレトロウイルス構築物［その内、２構築物はウイルス骨格が異なるpRTD2.2SSAF3（図3B、レーン４）、pRTD2.2SVGF3（図3B、レーン５）、pRTD2.2SVGE-F3（図3B、レーン６）であり、および１構築物はキメラ受容体挿入物が異なるpRTD2.2F15（図3B、レーン７と８）である］をpIK6.1MCVampacとともに293細胞にトランスフェクトし、その上清を用いて3T3細胞を感染させた後、FACS分析（表１）とサザンブロット（図3B）を行なった。予想されたように、すべてのF3構築物がFACS分析により類似の力価を示し（表１）、同様な強度でゼータプローブにハイブリダイズした。FACS分析（表１）とサザンブロットのデンシトメトリー分析により決定されたように、F15レトロウイルスは約50%高い力価を有していた。各ベクターを有する293中に作られたレトロウイルスは、感染すると、組込まれたプロウイルスに正しい大きさを与えた。したがって、5 KATレトロウイルス構築物のFACSとサザンブロットの結果は、高力価レトロウイルスを293細胞中に作ることができること、生産はレトロウイルス構築物およびパッケージング機能の両者のトランスフェクションに依存すること、並びに293細胞による高力価レトロウイルス上清の生産はレトロウイルス構築物の異常な再構成を導かないことを示している。
哺乳動物細胞系におけるウイルスの生産
KATプラスミドとともにトランスフェクトさせた後にウイルスを集めT3Tを感染させることにより、７種類のさらに別の細胞系を、レトロウイルスの生産能についてスクリーニングを行なった（表３）。
0004409631.tif 000008
CD4表面発現とウイルス生産は、pIK6.1MCVampacをpRTD2.2F3と共にトランスフェクトした後のL929とCHO D-には見られなかった。しかし、これらの細胞系はlac z遺伝子をコードするプラスミドを用いた条件下では高いトランスフェクションが可能であった。トランスフェクトされたHELA、143B、3T3およびCOSのFACS分析では、４細胞タイプのすべてについて、約50%のトランスフェクション効率を有する高い表面CD4発現が示された。しかし、これらの細胞間のウイルス生産は実質的に異なっていた。HELAと143B細胞はウイルスを全く生産しなかった一方で、3T3細胞は凍結上清1mlあたり3%の3T3の形質導入の可能なウイルスを生産した。COS細胞をKATプラスミドと共にトランスフェクションさせると、レトロウイルス構築物のDNA複製がなくてさえも、3T3細胞により作られたものよりも4.5倍高い力価を有するウイルスが生産された。これらの力価は、ウイルスベクター構築物のプラスミド複製がなくても、LandauおよびLitmanにより記載されたものよりも200倍高かった（上記のLandauおよびLitman）。このことは、多様な細胞のトランスフェクション後、プラスミド複製をすることなくレトロウイルスを生産するKAT構築物の能力が独自なものであることを示している。LandauおよびLitmanが観察したものよりもウイルスベクター構築物のプラスミド複製を用いることで100倍の増加を考慮するならば、KATパッケージング機能およびプラスミド複製を助けるレトロウイルスベクタープラスミドを、プラスミド複製を助ける宿主に導入することで、潜在的に力価をさらに10〜100倍増加させ、KATをトランスフェクトした細胞の実用性をさらに高めて、現在感染させることの困難な種類の細胞を感染させることができるであろう。
実施例II
ヒトＴ細胞の高効率形質導入
本実施例では、KATでトランスフェクトされた293細胞は、共に培養することで初代の、ヒト標的CD8+ T細胞を高効率で形質導入させることのできる本発明の方法を示す。
レトロウイルスベクターの構築とパッケージングプラスミド
KAT構築物は上記実施例Ｉに記載のように調製した。
末梢血液からのヒトCD8+ T細胞の単離と活性化
初代ヒトCD8+ T細胞を健康な供与者の末梢血液から以下のように精製した。末梢血液単核球（PBMC）をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した。PBMCをD-PBSE/CMF（1mM EDTAを含有し、CaとMgを含有しないPBS）で３回洗浄し、0.5%のヒトガンマグロブリンを含有する4mlのD-PBSE/CMFに5x107細胞で再懸濁し、室温で15分以上インキュベートした。インキュベーション後、CD8+ T細胞を陽性パンニングによりPBMC細胞懸濁物から精製した。具体的には、PBMC懸濁液を、ヒトCD8受容体に特異的な抗体で被覆した、予め洗浄されたT-25組織培養フラスコ（AIS CD8選択フラスコ（カリフォルニア州サンタクレアのApplied Immune Sciences））に１つのT-25フラスコあたり（4mlあたり）5x107細胞の密度で入れた。細胞を１時間室温でインキュベートし、非付着性細胞をピペットを用いてD-PBSE/CMFで静かにフラスコを３回洗って除去した。CD8+ T細胞をフラスコから遊離させ、同時に10ng/ml OKT3（ニュージャージ州ラリタンのOrtho Pharmaceuticals）と10% IL2（Pharmacia）を含有する10mlのＴ細胞培地（組成については下記参照）を添加して活性化した。細胞をこの培地で48時間インキュベートし、フラスコから細胞を集め、Ｔ細胞培地を用いて一回洗浄し、最後に新しいＴ細胞培地（10% IL2含有）に24ウェルプレート上で0.5〜1.0x106/mlの密度で再度懸濁した。
F3表面発現の検出に用いられるCD4に特異的な抗体、またはF15表面発現の検出に用いられるヒトFcに特異的な抗体のいずれかと交差反応してとどまった細胞（通常は２〜３％存在する）を除去するために、その高密度CD8+ T細胞集団をさらに一連の精製に供し、夾雑細胞を、陰性パンニングにより、抗CD4または抗ヒトFc抗体のいずれかを被覆した上記のようなAIS選択フラスコを用いて除去した。具体的には、前記高密度CD8+ T細胞集団を選択フラスコ中で１時間インキュベートし、次に非付着物（すなわち高度精製CD8+ T細胞）を除去した。次に細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地（10% IL2含有）中で24時間再生させた。このように調製されたCD8+ T細胞は95% CD8+およびCD3+よりも高く、0.5% CD4+またはFC+よりも低く、次にレトロウイルス形質導入のための標的として用いた。
共培養または上清感染によるレトロウイルスのCD8+ T細胞形質導入
293細胞を1x106細胞／６ウェルプレートで塗布し、次に48時間後に上記のように適当な構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、トランスフェクション培地を除去し、Ｔ細胞成長培地に換えた（組成に関しては下記参照）。
（ａ）共培養：  2〜4時間後、トランスフェクトされた293細胞を含有する１ウェルあたり、上記のように調製した0.5x106個の精製され、活性化したヒトCD8+ T細胞（通常は精製／活性化後４日または５日目）を添加し、ポリブレンを2μg/mlの最終濃度で添加した。最初のトランスフェクションで293細胞を塗布してから24時間後に、第二組の293細胞を上記のように塗布し、トランスフェクトした。最初の共培養から24時間後に、Ｔ細胞を最初の共培養物から取出し、第二の293トランスフェクションプレートに移して、同じ条件を用いて共培養をさらに24時間行なった。類似の条件を用いて、一時的にトランスフェクトされた3T3細胞または安定PA317生産細胞系40.39のいずれかと共に培養することによりCD8+ T細胞の形質導入を行なった（下記参照）。
（ｂ）上清感染：  上記のように調製した0.5x106個の精製され、活性化したヒトCD8+ T細胞（通常は精製／活性化後４日または５日目）を、上記の293一時的トランスフェクションシステムからか、または安定PA317生産細胞系40.39（下記参照）から得られた1mlのウイルス上清とともに、新しい1mlのＴ細胞培地（10% IL2と2μg/mlポリブレンを含有）中でインキュベートした。８時間のインキュベーション後、1.5mlの培地を各ウェルから除去し、1.0mlのウイルス上清とともに新しい0.5mlの新鮮Ｔ細胞培地（2μg/mlのポリブレンおよび10%のIL2を含有）と交換した。12時間のインキュベーション後、上記の２段階上清操作を繰り返した。
共培養と上清感染のために、CD8+ T細胞を新しいＴ細胞培地（10% IL2を含有）で24〜28時間再生させた。次に、形質導入効率の決定のために、細胞を、CD4（CD4-ζF3受容体に関して）またはFc（F15抗体-ζ受容体に関して）のいずれかの表面発現についてフローサイトメトリーによって分析した。トランスフェクトした293細胞と共に培養したＴ細胞を、293単層から懸濁物として静かに取り出した。共培養したＴ細胞と上清感染Ｔ細胞は両方ともに2%ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone）を含有するリン酸緩衝溶液（PBS）で一回洗浄した。次にＴ細胞を、2% FCSを含有するPBS存在下に1x106/mlの密度で30分間、40℃で適当なFITC複合検出抗体とともにインキュベートし、PBS（2% FCS含有）で３回洗浄し、最後に0.5ml PBSに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。
次に、形質導入したCD8+ T細胞集団をＴ細胞培地（10% FCS, Hyclone; RPMI1640, GellGro; 10mM Hepes緩衝液（Gibco）；1%ピルビン酸ナトリウム（Gibco）；1%非必須アミノ酸（Gibco）；2mMグルタミン（Gibco）；25μM 2-メルカプトエタノール（Sigma）および1%ステレプトマイシン／ペニシリン）中で維持した。Ｔ細胞を、7〜10日ごとに10ng/mlのOKT3の添加によるか、またはT-25組織培養フラスコ中で固定化OKT3に細胞を1〜2x107 CD8+ T細胞/10ml T細胞培地（10% IL2を含有）の密度でさらすことにより定期的に再刺激した。細胞を48時間インキュベートし、Ｔ細胞培地で１回洗浄し、新しい培地（10% IL2を含有）に0.5〜1.0x106/mlで再懸濁した。
CD8+ T細胞形質導入の分析
KATシステムを用いて一時的に作製したレトロウイルスによる初代ヒトCD8+ T細胞の形質導入効率は、アンホトロピック・パッケージング系PA317に由来する高力価の安定生産クローンから作られたレトロウイルスに匹敵した（上記のMillerおよびButtimore）。F3キメラ受容体を形質導入する安定な生産細胞クローン40.39を、pRTD4.2F3によるエコトロピックパッケージング系gpeのトランスフェクションにより単離し（上記のMarkowitz et al.）、トランスフェクションの48時間後に上清を集め、８マイクログラム／mlのポリブレンの存在下にPA317を感染させた（上記のMiller and Buttimore）。個々のクローンを限界希釈により得て、クローンの培地からウイルスmRNAを単離し、603bpゼータ鎖プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーションにより、ウイルス生産について50クローンを選抜した。最大のハイブリダイゼーションシグナルを示したクローンであるクローン40.39は、106個のNIH 3T3細胞を限界希釈感染させた後のフローサイトメトリーによりアッセイした。50μlの上清は17%の細胞を形質導入させ、これは340%または平均して3.4プロウイルスコピー／細胞／mlと等しい。初代ヒトCD8+ T細胞を40.39生産細胞と48時間の共培養した後の形質導入効率は1%〜3% CD4+（表４）であった。
この結果は、キメラ受容体F3及びF15をCD8+ T細胞に形質導入するために用いられた本発明のKAT一時的トランスフェクション及び共培養法後の形質導入効率に匹敵するものであった（図４）。CD8+ T細胞を、トランスフェクトさせた293細胞上で48時間共培養し、その後にＴ細胞を集め、14日間生育させ、上記のように形質導入効率のFACSによる分析を行なう４実験を行なった。F3構築物及びF15構築物の両方を用いたCD8細胞の形質導入効率は8%〜38%と変化し、かなりドナー依存的であるように思える。しかし、平均ではこの効率は、試験された高力価安定PA317クローンと共に培養することで得られた形質導入効率よりも8〜12倍高い。さらに、F15構築物は同様な効率で形質導入されるために（図４）、高い形質導入効率はF3構築物に特異なものではない。このデータから、CD8 T細胞は他のいかなる刊行された報告よりも少なくとも５倍以上、又は少なくともそれに等しい効率で形質導入することができること、および安定な生産体の作製が必要とされないことがわかる。
形質導入の３週間後、形質導入されたＴ細胞の上清を広範囲S+L-アッセイで調べたところ（Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437（1985））、複製能をもつレトロウイルスのないことが示された。
高効率形質導入は細胞-細胞接触により仲介される
KATプラスミドの一時的トランスフェクションおよびCD8+ T細胞との共培養後の高効率CD8 T細胞形質導入の機構を検討するために、以下のアプローチを用いるCD8+ T細胞の形質導入効率を比較した：  （1）高力価の安定PA317生産体系から得られた上清を用いる感染、（2）高力価の安定PA317生産体系との共培養、（3）pIK6.1MMSVampacおよびpRTD4.2F3によるNIH 3T3細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清を用いる感染、（4）pIK6.1MMSVampacおよびpRTD4.2F3による一時的なトランスフェクション後のNIH 3T3との48時間の共培養、（5）pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3による293細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清を用いる感染、および（6）pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3による一時的トランスフェクション後の293細胞との48時間の共培養（表４）。それぞれの一時的トランスフェクション実験のために、トランスフェクトされた細胞の二重プレートを用いて3T3細胞の上清感染用培地を集め、および二重プレートを用いてCD8 T細胞の共培養に用いた。同じアプローチを適当な生産体のために用いた。
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ウイルスが293細胞、3T3細胞および安定PA317生産体のどの細胞で作られたかにかかわらず、上清によるCD8+ T細胞の感染は1%であった（表４、実験1A、2Aおよび2C）。対照的に、pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3を共にトランスフェクトした293細胞と共にCD8 T細胞を培養することで、10%〜14%のCD8 T細胞形質導入がもたらされ（表４、実験1D、2D）、これらのプラスミドを293細胞にコトランスフェクションして作られた上清を含めたすべての上清による感染よりも10〜14倍高いものであった。これは、細胞-細胞接触がCD8+ T細胞の高効率形質導入を招くことを示すものである。さらに、KATトランスフェクションとその後の共培養の効率は、3T3細胞を用いる場合は安定PA317生産体と共培養したときの形質導入効果よりも１〜３倍高く（表４の1Bと2Bを1Cと比較されたい）、293細胞を用いる場合は5〜10倍高い。このデータから、293細胞は哺乳動物細胞の高効率形質導入を助ける独自な性質を有することが確認される。
これらの結果を本発明の特別な理論に限定することを欲するものではないが、これらの結果は、培養培地中への高力価ウイルス生産物は十分なＴ細胞形質導入のためには不十分であって、観察された高い効率の形質導入は293細胞とCD8+ T細胞との細胞-細胞接触により仲介され、10倍までの効率をもたらすことを示唆するものである。
本実施例に示す結果は、選択のない場合では、以前の結果と比較して著しく高い形質導入頻度で10〜40%のCD8+ T細胞がウイルスにより形質導入されることを示すものである。
実施例III
初代ヒト造血幹細胞の形質導入
本実施例では、初代ヒトCD34+骨髄幹細胞を形質導入するためのKAT構築物の利用と本発明の方法を記載する。
骨髄細胞の調製
ヒト骨髄を健康なボランティアから得た。それを最初にFicoll勾配を用いて（ニュージャージ州ピスカタウェイのPharmacia）、単核細胞画分に分画した。CD34+細胞をCellPro CEPTRATE LCTMアフィニティーカラム（ワシントン州ボーテルのCellPro）を用いる陽性選択を用いて単離する。精製後のFACS分析により約90%のCD34+細胞集団を得る。次にこの細胞集団を24ウェルプレートに5x105細胞/mlの密度でまき、Terry Fox Labs（カナダ、バンクーバー）から完全培地として提供されているMyeloid Long Term Culture Medium中に、100ng/mlヒト幹細胞因子（hSCF）（ミネソタ州ミネアポリスのR&D Systems）、50ng/ml hIL-3および10ng/ml hIL-6の存在下で48時間培養した。
CD34+骨髄幹細胞の形質導入
293細胞を形質導入の48時間前に1x106細胞/6ウェルプレートの密度で最初に塗布した後、pRTD2.2F3及びpIK6.1MCVampacをそれぞれ10μgトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクション培地を除去し、実施例IIに記載のように50ng/ml hIL-3、100ng/ml hSCFおよび10ng/ml hIL-6を含むＴ細胞増殖培地に換えた。２〜４時間後、トランスフェクトされた293細胞を、5x105個の精製CD34+細胞／ウェルとともに8μg/mlポリブレンの存在下に培養した。48時間後、細胞を293単層から集め、上記のように増殖因子を有するMyeloid Long Term Mediaに再度塗布した。部分的な細胞群減少により、培地に増殖因子を含む培地を毎日補給した。４日後、培地を補給し、G-CSFを2ng/mlおよびhSCFを20ng/ml加えて、顆粒球への分化を促進した。４〜６日後、細胞を、形質導入遺伝子及びCD15（顆粒球マーカー）からのヒトCD4の表面発現について分析した。さらに、DNAをサザンブロット分析のために調製した。
図５は、形質導入造血幹／始原細胞の顆粒球への生育と分化の14日後のFACS分析を示している。パネルＡは、図におけるすべての細胞集団の分析に用いられた前面または側面スキャッターゲートを示している。パネルＢには、イソタイプ対照抗体（FITCおよびPE）で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルＣには、ヒトCD4（形質導入遺伝子、ｙ軸）及びCD15（顆粒球分化マーカー、ｘ軸）に関して抗体で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルＤでは、KATパッケージングシステムを293細胞共培養と組合わせて用いて造血幹／始原細胞を形質導入した。一番上の右四分円をパネルＣ及びＤに関して比較すると、5〜6%の形質導入細胞がCD4タンパク質を発現したことがわかる。
形質導入効率のサザンブロット分析
造血幹／始原細胞がKATシステムを用いて作られたレトロウイルスに感染したかを決めるためにサザンブロット分析を行なった。染色体DNAを分化幹細胞から調製し、Eco RVで消化した。感染細胞（図６、レーン２）及び対照細胞（図６、レーン１）からの10μgのDNAならびにpRTD1.2F3の二倍体ゲノムあたり0.12、0.6、1.2および6.0コピーに相当するEco RV消化プラスミドDNA（図６、レーン４〜７）並びにpRTD2.2F3の二倍体ゲノムあたり５コピーに相当するEco RV消化プラスミドDNA（図６、レーン８）を0.8%アガロースゲル上で電気泳動し、Zetabindに移し、ゼータ膜内外及び細胞質ドメインをコードする605bp断片をプローブとして用いて検出した。トランスフェクトされたプラスミドpRTD2.2のEco RVによる消化は4.2kbバンド（図６、レーン８）を示す。MMLV 5’LTR及び3’LTRを含有するpRTD1.2のEco RV消化は3.6kb断片（図６、レーン４〜７）を示す。ウイルス感染、組込みおよび3’LTRの複製後にEco RVで消化すると、3.6kb断片を示すに違いない。感染を受けたCD34+細胞において、プローブは、プロウイルスに対応する適当な3.6kb断片とハイブリダイズした（図６、レーン７）。しかし、対照細胞はプロウイルスバンドがなく、プローブは内在性ゼータ遺伝子配列に対応するバンドにハイブリダイズした（図６、レーン８）。走査デンシメトリーを用いて形質導入効率を定量化したところ、感染を受けた細胞で１細胞あたりの平均プロウイルスコピー数は0.5（50%形質導入）であることがわかった。さらに、内在性バンドのデンシメトリーにより、等量のDNAが、感染または未感染の細胞に対応するレーンに載せられていたことが確認された。
第二の実験において、高力価PA317生産体クローンの形質導入効率はKATシステムにより作られたウイルスの形質導入効率を比較した。pIK6.1MCVampacとpRTD2.2F3との両方による293細胞の一時的トランスフェクション、CD34+細胞の単離、共培養、感染細胞の精製は既に記載のように行なった。実施例IIに記載のクローン40.39をCD34+細胞との共培養の開始の24時間前に5x105細胞／６ウェルプレートで塗布した。CD34+細胞の単離、共培養、感染細胞の精製は293細胞で記載したように行なった。形質導入効率は上記のようにEco RV消化DNAのサザンブロットにより分析し、それを図７に示す。KATプラスミドと共培養したCD34+細胞から単離されたDNAに存在するバンドは3.6kbバンドとハイブリダイズし（図７、レーン２）、Eco RV消化プラスミドDNAと大きさが等しく（図７、レーン４〜７）、組込まれたプロウイルスに対応していた。ハイブリダイズするバンドは擬似トランスフェクトされた293細胞（図７、レーン１）または40.39細胞（図７、レーン３）のいずれかと共培養されたCD34+細胞から単離されたDNAには存在しなかった。プラスミド標準物は１細胞あたり0.3〜10コピーの組込みプロウイルスの範囲にあった。したがって、PA317レーンにバンドのないことはKAT形質導入が少なくとも10倍効率的なことを示唆する。
形質導入された遺伝子の表面発現に関するFACS分析はわずかに5〜6%の形質導入効率のみを示しているが、サザン分析はそれよりも非常に高い形質導入効率（50〜100%）を示している。ヒトCD4タンパク質の発現レベルはFACS分析の検出レベル以下であると考えることができ、さもなければ遺伝子が存在していても十分に発現されていないとも考えられる。構築物に改変を行なって発現レベルを高めることができた。293細胞の共培養と組み合わせたKATパッケージングシステムによるヒト造血幹／始原細胞の形質導入の高い効率は、PA317等の在来のマウス繊維芽細胞パッケージングシステムを用いて得られる形質導入とは対照的である（図７）。PA317パッケージング系のデータによれば、マウス細胞を形質導入した場合に高力価ウイルスを作ることができるものの、ヒト骨髄幹／始原細胞の形質導入効率は不十分なことが示されている。
これらの結果は、高力価ウイルス上清の迅速な生産に加えて、KAT構築物を用いれば通常の方法では形質導入の難しい標的細胞（例えばヒトＴ細胞および造血細胞等）を形質導入することができることを示している。
実施例IV
pIKTレトロウイルスベクターによるヒト細胞での高力価ウイルスの生産及びヒトCD34+造血細胞の高効率形質導入
本実施例では、ヒト細胞系において高力価ウイルスを得るための本発明の新規なレトロウイルスベクターの使用、および初代ヒト造血幹細胞における高い効率の形質導入を得るための該ウイルスの使用を記載する。
上記のパッケージングベクターpIK6.1MCVampac UT△およびレトロウイルスベクターpIKT2.2SVGeF3を、上記のようにヒトtsa54細胞に一時的に（上記のように）コトランスフェクトした。tsa54細胞は293細胞からLarge SV40 T抗原のトランスフェクションにより得たものである（Heinzel et al., J. of Virol. 62（10）:3738-3746（1988））。pIKT2.2SVGe-F3は、プラスミド骨格が上記のようにSV40の複製開始点を含有している点でpRTD2.2F3とは異なる。この結果、SV40 t-抗原を有するtsa54細胞での高コピー数プラスミド複製がもたらされる。tsa54をトランスフェクトさせ、ウイルス上清を集め、これを用いて上記のように3T3細胞を感染させた。38% CD4陽性細胞/100μlの凍結ウイルス上清は7x106/mlに等しい。
pIKTベクターを用いて、上記のようにtsa54細胞にレトロウイルスを生産させ、そして共培養により初代ヒトCD34+骨髄幹細胞を形質導入した。以下の変更をした以外は上記実施例IIIに記載のように造血幹細胞を精製し、これをpIKT2.2SVGe-F3で形質導入した。tsa54細胞は5x105細胞／６ウェルプレートの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション培地を換えるのに用いた培地はIMDM + 10% FBS（ウシ胎児血清）であった。CD34+細胞をウイルス生産tsa54細胞との２日間の共培養後に集めて、増殖因子を有するMeloid Long Term Media中で培養した。8〜10日後、G-CSFを2ng/mlおよびhSCFを10ng/ml加えて分化を促進した。６〜８日後に細胞のヒトCD4の表面発現を調べた。
図８は、形質導入造血幹／始原細胞の顆粒球への生育と分化の18日後のFACS分析を示している。パネルＡは図におけるすべての細胞集団の分析に用いられた前面または側面スキャッターゲートを示している。パネルＢでは、イソタイプ対照抗体（FITCおよびPE）で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルＣでは、ヒトCD4（形質導入遺伝子、ｙ軸）及びCD15（顆粒球分化マーカー、ｘ軸）に関して抗体で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルＤでは、3T3プレート上の107 neor CFUクローン/mlと等しい力価を有するPA317クローン（78.81）を、安定ウイルス生産細胞として、造血幹細胞との共培養に用いた。パネルＥにおいて、KATパッケージングレトロウイルスベクターを293細胞共培養と組合わせて用いて造血幹／始原細胞を形質導入した。一番上の右四分円をパネルＣとＤおよびＣとＥとで比較すると、1.7%のPA317形質導入細胞がCD4タンパク質を発現したのに比べて、KAT構築物を用いて形質導入した場合は24%であることがわかる。
実施例Ｖ
単一ベクター293またはtsa54安定パッケージングクローンの生産
本実施例では単一ベクターパッケージングクローンの生産及び利用を記載する。ヒト293またはtsa54細胞をトランスフェクションの48時間前にDME（カンサス州レネキサのJRH Biosciences）、1g/lグルコース、10%ドナー子ウシ血清（カリフォルニア州ツラーレのTissue Culture Biologics）中で10cmプレート１枚あたり5x105で塗布した。10μgのMCVampac UT△および0.1μgのMC1 neo（Thomas and Capecchi Cell 51:503-512（1987））をリン酸カルシウム沈殿によりコトランスフェクトした（Wigler et al. Cell 16:777（1979））。クローンはベクターを共にエレクトロポレーションすることによっても効果的に作ることができた（Shigekawa and Dower Biotechniques 6（8）:742-751（1988））。トランスフェクションの18時間後に培地を変えた。24時間後、細胞を分け、1mg/ml G418（ニューヨーク州グランドアイスランドのGeneticin, GIBCO）を加えた培地中に、プレート上で1:10、1:20および1:50にしてそれぞれ二重で入れた。培地を14日間にわたって3日ごとに変えた。クローンを取って24ウェルプレートに入れ、密になるまで生育させた。培地をウェルから集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。細胞を10% DMSO（ミズリー州セントルイスのSigma Chemical社）を加えた培地に再度懸濁し、ドライアイスで凍結し、−70℃で保存した。上清は、放射能標識したチミジンのRNA鋳型への取込を測定する逆転写酵素のアッセイにより空のウイルス粒子の生産について検定した（Goff et al. J. of Virol. 38:239-2498（1981））。
オートラジオグラフィー後、最大の逆転写酵素シグナルを有するクローンを解凍、生育させ、一時的なトランスフェクション後のウィルス生産を調べた。トランスフェクションは10μgの43.3PGKF3を用いて既に記載のように行なった。培地はトランスフェクションの18時間後に換えた。24時間後にウイルス上清を集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。ウイルス上清を、感染の24時間前に10cmのプレート１枚あたり5x105で塗布された3T3細胞を用いて検定した。感染は上記のように行なった。次に細胞を集め、OKT4A抗CD4モノクローナル抗体（ニュージャージー州ラリタンのOrtho Diagnostic Systems社）で染色して上記のようにフローメトリーで分析した。クローンは多様な量のパッケージング機能を示した。最大の一時的力価を有するクローンを選択してさらに特徴付けを行なった（表５）。
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クローン90.74、107.75および107.18は長期間培養し、G418の存在または存在しない状態で経時的にパッケージングゲノムを維持する能力を調べた。細胞を３〜４日ごとに1:10〜1:20に分けた。継代1、6および12において、細胞を10μgの43.2で上記のようにトランスフェクトし、一時的ウイルス上清を上記のように3T3細胞感染により分析した。調べられた３クローンのうち、わずかに１クローン（90.74）が12継代にわたって変わらない力価を有しているように思われた（表６）。力価は、継続したG418選択に依存しないようにも思われた。クローン90.74は約107/mlに等しい一時的力価を有している。クローン90.74は、ブタペスト条約に基づいてメリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301のATCCに寄託されており、その同定は以下の通りである：
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上清は、PG4を用いるS+/L−アッセイによりRCRの生産についても調べられた。PG4細胞はMoloney肉腫ウイルスにより形質転換されたネコ脳由来の細胞である（ATCC CRL2032）。PG4細胞を能力を有するマウスレトロウイルスに感染させると、該細胞は顕微鏡的に区別することのできる認識できる病巣を作る（Haapala, et al. J. of Virol., 53（3）:827-833）。感染の24時間前にPG4細胞を5x106で10cmプレートにまいた。1mlの試験上清および4mlの培地（8μg/mlのポリブレンを含有）を用いて感染を行なった。培地は24時間後に替え、その後病巣が陽性対照プレート上に達するまで培地を２〜３日おきに交換した。調べたすべてのクローンは12継代にわたってRCRがないままであった。
予想されなかったことに、これらの結果は本発明のレトロウイルスベクターを用いて、安定にトランスフェクトされ、gag、polおよびenvのそれぞれのタンパク質を作る293由来細胞系が作られたことを示している。これらの細胞系によるウイルス生産は、パッケージング及びレトロウイルスベクターの一時的共同トランスフェクションから作られたものに等しかった。さらに驚くことに、薬剤選択がない場合に、これらの細胞系はgag、polおよびenvのそれぞれのタンパク質の生産を維持した。文献に記載のレトロウイルス構築物を用いる293起因レトロウイルス生産体を作ろうとするこれまでの試みはうまくいかなかった（Pear et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci.（USA）90:8392-8396（1993））。培養での長期継代後、これらのパッケージング細胞系は自発的には複製能をもつレトロウイルスを作らない。
実施例VI
二重ゲノム安定パッケージング細胞の生産
本実施例では293またはtsA54パッケージング細胞中の２ゲノムの構築及びと使用を記載する。最初にgap/polクローンをヒトtsa54細胞で作った。PBSの0.8mlあたり1x106個の細胞に対して15μgのnotI直鎖状gap/pol ATG（既に記載）、及び1μgのMC1 neoを用いてエレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーションは960μF及び260mV（上記のShigekawaおよびDower（1988））をジーンパルサー（カリフォルニア州リッチモンドのBio-Rad）を用いて行なった。すぐに細胞を10cmプレート上にまき、DME、1g/lグルコース、10%ドナー子ウシ血清中で48時間培養した。次に細胞を1.0mg/ml G418選択で、1:5、1:10、1:20および1:50に分けた。培地を３日ごとに替え、G418での12日間の選択後、クローンを集めて24ウェルプレートに移した。細胞が密になったら、培地を集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。クローンをトリプシン処理し、−70℃で凍結した。上清を解凍し、その逆転写酵素活性を分析した（上記のGoff et al.（1981））。最大のRT活性を示すクローンを生育させ、上記の5μgのpIK6.1MCVamenvATGUT△、及び上記の10μgのpRT43.2F3のリン酸カルシウムトランスフェクションによる一時的ウイルス生産を算出した。培地は18時間後に替え、さらに24時間後ウイルス上清を集め、濾過し、凍結し、3T3の感染による分析を行なった。一時的ウイルス力価は、pRT43.2F3でトランスフェクトさせた単一ゲノムパック系90.74の一時的ウイルス力価に匹敵し、pIK6.1MCVampacUT△とpRT43.2F3とによるtsA54細胞のコトランスフェクション後のウイルス力価のおよそ50%であった（表７）。
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C418選択を使用または使用しない長期安定性の研究から４種類の最も良いクローンを選択した。それらもRCRの生産に関してPG4細胞を用いて検定したが、RCR陰性であった。
クローン111.4をヒスチノール中で、記載されたように選択されたsv2his（Hartman and Mulligan, Proc. Nat’l. Acad. Sci.（USA）85:8047-8051（1988））およびpIK6.1MCVamenvATGUT△によってコトランスフェクトさせる。クローンを集め、ウイルス生産について上記のように一時的トランスフェクションによって特徴付ける。いくつかの高力価クローンの安定性とRCRを上記のように特性付ける。
パッケージング系はpIK6.1MCVamenvATGUT△中のアンホトロピックenv遺伝子を、上記の方法を用いて、他のレトロウイルスエンベロープ、例えばエコトロピック、ゼノトロピック、ポリトロピック、MLV、10A1、テナガザル白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルスＣ、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（HTLV）IおよびII並びにそれらの組合せに置き換えることによって作ることができる。
本明細書で挙げたすべての刊行物と特許出願は、個々の刊行物と特許出願が参照によって具体的にそして個々に組み入れられるように示されているが如く、ここに組み入れる。
本発明に関連する当業者には明らかなように、本発明は上記に具体的に記載された以外の形で、例えば他の種類の哺乳動物細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために、本発明の精神または必須の特徴から離れることなく具体化してもよい。したがって、上記の本発明の特別な実施態様は説明的なものとしてみなされるべきであって、限定的なものとみなされるべきものではない。本発明の範囲は、前記の実施例に限定されるというよりは添付の請求の範囲に記載されている通りである。
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アメリカンタイプカルチャー  コレクション
アメリカ合衆国  20852 メリーランド州、
ロックビル、パークローンドライブ12301
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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