(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトシン５位のメチル化修飾とシトシンからチミンへの突然変異を識別する方法であって、以下の工程を含み：
a)  第一ゲノムＤＮＡ試料を準備する工程、
b)  前記第一ゲノムＤＮＡ試料と同一のゲノム試料である第二ゲノムＤＮＡ試料を準備する工程、
c)  前記第一ゲノムＤＮＡ試料はメチルトランスフェラーゼで処理せず、前記第二ゲノムＤＮＡ試料は、未処理の前記第二ゲノム試料の非メチル化シトシンが全てメチル化されるように、メチルトランスフェラーゼで処理する工程、
d)  第一ゲノムＤＮＡ試料と工程c)でメチルトランスフェラーゼ処理した第二ゲノムＤＮＡ試料を、亜硫酸塩又は重亜硫酸塩でそれぞれ化学処理することにより、メチル化シトシンは変換せずに、全ての非メチル化シトシンを変換する工程、
e)  工程d)で産生された第一及び第二ゲノムＤＮＡ試料中のシトシン位置を同一の分析方法により決定する工程、
f)  工程e)で決定した第一及び第二ゲノムＤＮＡ試料中のシトシン位置を標準的な遺伝子データベースから得られる標準ＤＮＡ配列と比較することにより、シトシンの５位のメチル化修飾とシトシンからチミンへの突然変異を識別する工程、
g)  ゲノムＤＮＡ中のシトシンからチミンへの単一ヌクレオチド多型（SNPs）又は点突然変異を検出する工程、
ここで該標準ＤＮＡ配列の対応するシトシン位置と比較して、（１）第一ゲノムＤＮＡ試料中の塩基がチミンとして第二ゲノムＤＮＡ試料中の塩基がシトシンとして検出される場合には非メチル化シトシン、（２）第一及び第二ゲノムＤＮＡ試料中の塩基がいずれもシトシンとして検出される場合にはメチル化シトシン、（３）第一及び第二ゲノムＤＮＡ試料中の塩基がいずれもチミンとして検出される場合にはシトシンからチミンへの単一ヌクレオチド多型（SNPs）又は点突然変異、として識別する方法。
【請求項２】
第一又は第二ゲノムＤＮＡ試料又はこれらの一部を、前記シトシン位置を決定する前に、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処理されたゲノムＤＮＡの１０以上の異なる断片が、一つの増幅バッチで作られることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子制御に重要ないわゆる共通配列又はそれに類する配列を含み、主として制御配列またはコード配列に結合するプライマーをゲノムＤＮＡ試料の増幅に用いることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
シトシンを5'-CpG-3'特異的な配列において検出することを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
増幅において検出可能に標識されたヌクレオチド構成単位又はオリゴヌクレオチドを組み込むことによって、一又はそれ以上の検出可能に標識されたＤＮＡを備えることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
標識を蛍光又は化学発光により検出することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シトシンを含む配列に特異的なオリゴマーでハイブリダイズすることによってシトシンが検出され、該オリゴマーが一又はそれ以上の固体表面に一定の配置で固定されている、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列特異的なシトシンの検出に関し、少なくとも１つの該配列に相補的なオリゴマーが固体表面に固定され、該オリゴマーは検出されるべきシトシンに相補的なグアニンを含み、及び他のオリゴマーが、検出されるシトシン位置で請求項１の工程d)による化学反応によって変換される非メチル化シトシンの塩基と相補的な塩基を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シトシン位置を検出するために、固体表面に固定されたオリゴマーが、プラス鎖又はマイナス鎖の両方のメチル化又は非メチル化位置に特異的に結合すること、及び／又は増幅によりそれぞれに生成される相補鎖に特異的にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
さらにオリゴマーが固体表面に固定されており、該オリゴマーがチミンを含む配列に特異的に結合し、及び／又は該オリゴマーが、シトシンと、請求項１の工程d)による化学処理で生成されるプラス鎖、マイナス鎖の塩基もしくは増幅により相補鎖を生成する鎖を検出する、請求項８〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
未処理のゲノム試料における、メチル化、非メチル化、又は変異位置に特異的な信号が、固体表面の種々の位置のオリゴマーによって検出されることを特徴とする、請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
メチル化の絶対度及び／又はホモ接合もしくはヘテロ接合の状態が、検出された信号の比較により決定されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
両試料の増幅断片が、固体表面に固定され、固体表面上において検出可能な標識を備える配列特異的なオリゴマーでハイブリダイズされることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリダイズした配列特異的オリゴマーの分析を、MALDIを含む質量分析によって行なうことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ハイブリダイズした配列特異的オリゴマーの分析を、化学発光の蛍光によって行なうことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
鋳型中のシトシン塩基に到達することにより特異的にポリメラーゼ反応が停止され、生成される断片長が測定される、ポリメラーゼ反応によって生成されたシトシンを検出することを特徴とする、請求項１〜７又は１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴマーがプライマー依存性ポリメラーゼ反応の開始に利用され、異なる配列が固体表面の異なる部位に固定されており、ポリメラーゼ反応が当該固体表面上で行われることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴマーがプライマー依存性ポリメラーゼ反応の開始に利用され、該オリゴマーが化学反応又は光によって固体表面から取り除かれることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
シトシンの位置で又は対応する相補鎖のグアニン位置でのポリメラーゼ反応の終結に、蛍光、化学発光又は抗体の結合を含む化学修飾により検出可能なヌクレオチド構成単位を使用することを特徴とする、請求項１７〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
シトシン位置又は対応する相補鎖のグアニン位置でのポリメラーゼ反応の終結に関し、生成されたフラグメントの長さをゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動で測定することにより検出することを特徴とする、請求項１７〜２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
生成断片長の測定に関し、MALDIを含む質量分析により行うことを特徴とする、請求項１７〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
標準ＤＮＡ配列が、ヒトゲノムプロジェクトのデータベースに由来することを特徴とする、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、シトシンからチミンへの突然変異体の５-位置メチル化変性体とシトシン塩基の識別方法およびゲノムＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）または点突然変異の検出方法に関する。
【０００２】
近年、分子生物学的方法が発達するにともない、遺伝子それ自身、ＲＮＡ内の遺伝子の翻訳、およびそれにより生じる蛋白質などが、詳しく研究されている。個体が発達する間に、どの遺伝子が発現されているか、特定の細胞や組織のある遺伝子がどう活性化され、あるいは抑制されているかは、遺伝子あるいはゲノムのメチル化の程度や特性と相関している。この意味で、病因となる状態は、個々の遺伝子あるいはゲノムのメチル化様式の変化に反映されているという仮説は説得力を持っている。
【０００３】
本発明では、特に突然変異とシトシンのメチル化を互いに区別することができるゲノムＤＮＡ試料のメチル化状態を検出する方法が記載されている。この方法は、点突然変異および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の発見にも利用することができる。
【０００４】
5-メチルシトシンは有核細胞のDNAの中で、共有結合で修飾された塩基としては最も多数存在する。例えば、転写の制御、ゲノム・インプリンティングや腫瘍発症に関与している。それゆえ遺伝情報の現状としての5-メチルシトシンの把握には、多大の関心が寄せられている。しかしながら、5-メチルシトシンの位置はシーケンシング（配列解析）によっては同定できず、5-メチルシトシンはハイブリダイゼーションではシトシンと同じ結果をもたらす。従って、どのシトシンが5-メチルシトシンとなっているかという発生機構的な情報はPCR増幅では完全に見落としてしまう。
【０００５】
ゲノム塩基であるシトシンを５'-メチルシトシンに修飾すると、今日まで最も重要で且つ最もよく研究されている発生機構的パラメータが得られる。細胞と個体の包括的な遺伝子型を究明する方法は現在でもあるが、大規模に発生機構型の情報をつくり、且つ評価する比較可能な方法はない。
【０００６】
シトシンの５-メチル体を配列コンテクストにおいて測定する方法には、原理的に異なる３つの方法がある。
【０００７】
第１の方法は"メチル化"に敏感な制限エンドヌクレアーゼ(RE)を用いる方法である。REsは特定のＤＮＡ配列において、４〜８個の塩基長からなるカットをＤＮＡに持ち込むという特徴がある。そのようなカットの位置は、ゲル電気泳動，膜への移動およびハイブリッド形成により検出することができる。メチル化感受性とは、認識配列の中の特定の塩基が非メチル化により失われ、それによりカットが生じ得ることを意味している。制限断片とゲル電気泳動によるバンドパターンは、ＤＮＡのメチル化パターンによっても変わる。ただし、REsの認識配列の中にあるメチル化できる最小CpGは、この方法では研究することができない。
【０００８】
この方法の感度は極端に低い（Bird, A.P. とSouthern, E.M.,J.Mol. Biol. 118, 27-47）。この方法とPCRを結びつけた一つの変形態様は、認識配列の両側に存在する２つのプライマーを介して一つの断片のみによって行われる増幅で、認識配列をメチル化した場合に存在する。感度はこの場合理論的には標的配列のただ一つの分子まで向上する。ただし、高い費用をかければ、個々の位置のみを研究することができる（Shemer, R.ら，PNAS 93, 6371-6376）。さらに、認識配列の中のメチル化できる位置は１つのREであるとも仮定されている。
【０００９】
第２の変形態様は、ＤＮＡ全体の化学的部分開裂と、見本によるMaxam-Gilbert配列反応，そのようにして発生した末端へのアダプターの連結反応，種属に関するプライマーを用いた増幅およびゲル電気泳動による分離に基づく方法である。この方法を用いると、塩基対1000個未満のサイズの限定された領域について研究することができる。ただし、この方法は複雑で且つ信頼性も低いので、もはや実際には使われていない（Ward, C. ら，J. Biol. Chem. 265, 3030-3033）。
【００１０】
ＤＮＡの５-メチルシトシンを調べるために、その間に最もよく使われ且つ比較的新しい方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特異的反応に基づく方法であり、シトシンは塩基対特性がチミジンに対応しているウラシル中で引き続きアルカリ性加水分解により転化される。一方、５-メチルシトシンはこの条件下では修飾されない。したがって、本来のＤＮＡは転化されるので、本来そのハイブリダイズ特性によりシトシンとは区別できないメチルシトシンは、今や唯一の残留シトシンとして“普通の”分子生物学的方法により、たとえば、増幅やハイブリダイズまたは配列決定により検出することができる。これらすべての方法は、今や完全に利用できる塩基対に基づいている。感度に関する周知技術のレベルは、研究対象のＤＮＡをアガロース・マトリックスに閉じこめ、ＤＮＡの拡散と復元（重亜硫酸塩は個々の鎖のＤＮＡとのみ反応する）を阻害し、すべての沈殿および精製ステップを迅速な透析により置き換える方法により規定できる（Olek, A.ら，Nucl. Acids Res. 24, 5064-5066）。この方法を用いると、個々の細胞について研究し、この方法の可能性について具体的に説明することができる。ただし、これまでは塩基対長さ約3000個までの個々の領域について調べられたが、メチル化による数千個の細胞に関する包括的な研究は不可能である。また、この方法では試料の量が少ない非常に小さなフラグメントについては信頼できる分析はできない。マトリックスにより拡散の防止が計られているにもかかわらず、このフラグメントは失われた状態になるからである。
【００１１】
５-メチルシトシンを検出する方法には、さらに、次のような文献：すなわち、Rein, T.，DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic. Acids Res. 26, 2255 (1998)がある。
【００１２】
重亜硫酸塩法の研究には、これまではごくわずかに（たとえば、 Zeschnigk, M. ら，Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98 ; Kubota, T. ら，Nat. Genet. 16, 16-17）使われただけである。しかし、周知の遺伝子の短くて特異的な断片は重亜硫酸塩処理により増幅され、完全な配列決定（Olek, A. と Walter, J. Nat. Genet. 17, 275-276）または“プライマー拡張反応”（Gonzalgo, M.L. と Jones, P.A., Nucl. Acids. Res. 25, 2529-2531）または酵素断片（Xiong, Z. と Laird, P.W.， Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534）により個々のシトシンの位置が検出されるようになった。さらに、ハイブリダイズによる検出も知られている（Olekら，WO99 28498）。
【００１３】
さらに、個々の遺伝子においてメチル化の検出に重亜硫酸塩法を適用する研究に取り組んでいる文献もある：Xiong, Z. と Laird, P.W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532；Gonzalgo, M.L. と Jones, P.A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529；Grigg, S. と Clark, S.(1994), Bioessays 16, 431；Zeschnik, M. ら，(1997), Human Molecular Genetics, 6, 387；Teil, R. ら，(1994), Nucl. Acids Res. 22, 695；Martin, V. ら，(1995), Gene 157, 261；WO 97/46705, WO 95/15373およびWO 97/45560。
【００１４】
プロモーター間の共通点は、TATAボックスまたはGCボックスの存在だけでなく、転写ファクターについてこれらが結合部位を持ち且つ結合部位の間隔でこれが互いに存在することにある。特定のタンパク質の存在している結合部位はそのタンパク質における配列と完全には一致していないが、結果としては少なくとも４個の塩基が保存され、これらの塩基が“ゆらぎ”の挿入により、すなわち、それぞれ種々の塩基が存在する位置で延ばすことができる。さらに、これらの結合部位は特定の間隔で存在する。
【００１５】
オリゴマー配列の合成における現在の技術水準についての概観は、1999年１月に、Nature Geneticsの別冊（Nature Genetics増補，Vol. 21，1999年１月）、並びにこの文献の中で引用されている文献に掲載されている。
【００１６】
レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF)が開発され、生体分子の分析効率が非常に高い（Karas, M. と Hillenkamp, F. 1988, 分子量が10.000ドルトンを超えているタンパク質のレーザー脱着イオン化，Anal. Chem. 60: 2299-2301）。分析対象が脱離を起こすマトリックスの中に混和される。短いレーザー・パルスによってマトリックスは気化し、分析対象分子は気体相へと蒸散する。マトリックス分子の衝突によって分析対象物がイオン化する。加えられた電圧によってイオンは加速され、無電場の管へと送りこまれる。異なる質量に基づいて、イオンは異なった加速度を受ける。より小さなイオンは、より大きなイオンよりも早く検出部に到達する。
【００１７】
固定されたＤＮＡ配列を走査する場合、種々の蛍光標識プローブが使われる。蛍光標識に特に適しているのは、それぞれのプローブの5'OHに単にCy3およびCy5の両色素を取り付ける方法である。ハイブリダイズされたプローブの蛍光の検出は、たとえば、共焦点顕微鏡により行われる。Cy3およびCy5両色素は商業的に入手できる。
【００１８】
特定の配列コンテクストにおいてシトシン塩基をメチル化しているメチラーゼは、一般に知られており、且つ一部は商業的に入手できる。たとえば、Sss1メチラーゼは、配列コンテクストCpGにおいてシトシンをメチル化する（たとえば、Renbaum, P.ら，(1990)，Nucleic Acids Res.18, 1145参照）。New England Biolabsでは、Alul，BamH1およびHaeIIIなどの他のメチラーゼと同様に入手できる。
【００１９】
周知の技術の場合と同様に、重亜硫酸塩処理，増幅およびそれに続く配列決定またはハイブリダイズだけでは、メチル化されたシトシンの位置を確実に検出することはできない。当該位置でシトシンの代わりにチミンが検出された場合は、引き合いに出された比較配列に対する突然変異およびゲノムＤＮＡ試料においてメチル化されないシトシンが問題であり、このシトシンはまずウラシル中で重亜硫酸塩処理、そして増幅の際に配列コンテクストにおいてチミンに転化される。本発明の課題はこの問題を解決することである。
【００２０】
この課題は、シトシン塩基の５-位置メチル化変性体とシトシンからチミンへの突然変異体とを識別し、且つ単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰｓ)またはゲノムＤＮＡ中の点突然変異体を検出する方法を創り出すことにより解決され、この方法ではａ）ゲノムＤＮＡ試料を亜硫酸塩または重亜硫酸塩またはこの種のその他の化学物質で処理し、塩基の５-位置がメチル化されていないすべてのシトシン塩基を変性して、塩基対特性に従って種々の塩基を形成し、一方、５-位置にメチル化されたシトシンはそのまま残り、ｂ）同じゲノムＤＮＡ試料のアリコートはａ）による化学処理の前にSss1またはその他のメチルトランスフェラーゼを用いて定量的にメチル化し、ｃ）そのようにして処理した２つのＤＮＡ試料をシトシンが存在する場合と同じ分析方法により調べ、ｄ）得られたシトシン位置を標準ＤＮＡ配列と比較対照する。
【００２１】
本発明は、同じ試料のメチル化したアリコートを同じように処理し、得られた配列情報を標準ＤＮＡの配列と比較対照し、突然変異とシトシンメチル化の間の識別を可能にすることによってもこの課題を解決することができる。その上、この方法の枠内で新しい突然変異と多型、特にC-T突然変異を見つけることもできる。
【００２２】
本発明で好適な方法は、２つの異なる方法で処理した試料からの個々のシトシンの位置を標準配列と比較対照し；特定の位置でシトシンを検出できないかどうか；およびこの結果はゲノムＤＮＡのシトシンがメチル化されずに存在しているか、または突然変異または多型により変性されて存在し、したがってゲノムＤＮＡには存在しないことに基づいているかどうかを究明する方法である。
【００２３】
さらに、発明に適った方法には、塩基を検出する前に両ＤＮＡ試料またはこれらのＤＮＡ試料の一部を、循環プロセス、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応またはこれに匹敵するプロセスを用いてシトシンを増幅することを特徴とする方法がある。
【００２４】
その際、増幅プロセスでは、処理されたゲノムＤＮＡの１０種類以上のフラグメントをつくるのが好ましい。
【００２５】
さらに、ゲノムＤＮＡ試料の増幅には、遺伝子制御にとって重要ないわゆる共通配列またはそのような配列を含むプライマーを用い、そしてこのような配列を主として制御配列またはコード配列に結合するのが好ましい。
【００２６】
特に本発明では、特異的コンテクスト5'-CpG-3' にあるシトシンを検出することが好ましい。
【００２７】
さらに、検出可能な標識を備えたヌクレオチド構成単位，オリゴヌクレオチドの組み込みによりＤＮＡを増幅する場合、全部で一つか複数の検出可能な標識を備えていることが好ましい。
【００２８】
標識の検出を蛍光または化学発光により行うことが特に好ましい。
【００２９】
さらに、本発明の方法では、“配列コンテクスト-シトシン-配列コンテクスト”にとって特異的なオリゴマーを用いてハイブリダイズしたシトシンを検出することが好ましい。なお、このオリゴマーは限定された配列において一つ以上の表面に固定されている。
【００３０】
この場合、その配列特異的コンテクストにおいて検出され得る各シトシンについて少なくとも一つの配列コンテクストに相補的なオリゴマーを表面に固定し、このオリゴマーには検出され得るシトシンに対して相補的なグアニンが含まれていることが好ましく；および検出され得るシトシンの部位に塩基が含まれており、この塩基に対して相補的である別のオリゴマーでは、化学的処理により非メチル化シトシンが転化されることが好ましい。
【００３１】
さらにこの場合、検出され得るシトシン位置にそのようなオリゴマーが固定され、オリゴマーはそれぞれメチル化された位置とメチル化されていない位置においてプラスとマイナスの両鎖に特異的に結合するか、および/またはそれぞれ増幅により生成した相補的な鎖において特異的にハイブリダイズされることが好ましい。
【００３２】
さらにこの場合、別のオリゴマーが表面に固定され、オリゴマーそれぞれが“配列コンテクスト-チミン-配列コンテクスト”配列に特異的に結合しているか、および/またはオリゴマーのシトシン、および化学的処理によりプラスとマイナスの両鎖において生成した塩基、および生成した相補的鎖を増幅してできたそれぞれの鎖を検出することが好ましい。
【００３３】
さらに、本発明では、表面の点におけるオリゴマーからの信号を検出することが好ましい。この信号はオリジナルのゲノム試料においてメチル化，または非メチル化または突然変異化された試料に対して特異的である。
【００３４】
その際、検出された信号を比較することにより、メチル化の絶対度および/またはホモもしくはヘテロ両接合体を求めることが望ましい。
【００３５】
さらに、本発明に好適な方法は、両試料の増幅されたフラグメントをそれぞれ表面に固定し、検出可能な標識を備えた配列特異的オリゴマーをこの表面でハイブリダイズする方法である。
【００３６】
ハイブリダイズされた配列特異的オリゴマーの分析を、質量分析法、好適にはMALDI質量分光計により行うのが好ましい。
【００３７】
さらに、ハイブリダイズされた配列特異的オリゴマーの分析を蛍光または化学発光により行うのが好ましい。
【００３８】
本発明の方法の特に好適な変形態様では、配列コンテクストのシトシンの検出が、鋳型にシトシン塩基が到達した際に特異的に停止されるポリメラーゼ反応、および生成したフラグメントの長さ測定により行われる。
【００３９】
この場合、プライマー依存性のポリメラーゼ反応の開始に使われるオリゴマーが、それぞれ表面上の様々な場所に様々な配列を固定し、この表面でポリメラーゼ反応が行われることは特に好ましい。
【００４０】
その際さらに、プライマー依存性のポリメラーゼ反応の開始に使われるオリゴマーが、化学反応か光りにより表面から剥離されることは好ましい。
【００４１】
さらに本発明では、ポリメラーゼ反応を終結するためにシトシンまたは向かい側の鎖のグアニンの位置にあるヌクレオチド構成単位を用いることが好ましい。なお、ヌクレオチド構成単位は、化学的修飾を経て、たとえば、蛍光，化学発光または抗体の結合による検出を可能にする。
【００４２】
その他、シトシンまたは向かい側の鎖のグアニンの位置における終結の検出は、ゲル電気泳動、特にキャピラリー電気泳動による生成フラグメントの長さ測定を介して行うことが好ましい。
【００４３】
その際さらに、生成フラグメントの長さ測定を質量分光分析法，好適にはMALDI質量分光計で行うことが好ましい。
【００４４】
さらに、本発明の方法は、標準ＤＮＡ配列がデータバンク、すなわち、ヒトゲノム・プロジェクトに由来しているという特徴がある。
【００４５】
本発明のもう一つの主題は、標準ＤＮＡ，および/または重亜硫酸塩反応および/または増幅を行うための化学物質と助剤および/またはメチルトランスフェラーゼ、および/または本発明の方法を実施するための説明書を含むキットである。
【００４６】
ここに記載されたゲノムＤＮＡの５-メチルシトシンの位置と点突然変異および/または多形性の識別に用いる方法は、点突然変異および/または多型の発見や検出にも使える。図１には、任意の配列１を例にしてこの方法の概要を示している。
【００４７】
本発明の方法を実施するために次のようなステップが行われる。すなわち、ゲノムＤＮＡ試料は、５-位置をメチル化されていないシトシン塩基がすべて変えられ、塩基対特性に従って種々の塩基が生成し、一方、５-位置をメチル化されているシトシンはそのまま変わらないように、化学的に処理される。このステップでは、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，ジ亜硫酸塩）による処理と引き続いてアルカリ性加水分解が行われるのが好ましい。これらの処理によりウラシル中の非メチル化シトシン塩基が転化し、その塩基対特性は、当該位置が増幅によっても失われるチミンに対応している。
【００４８】
第２のステップでは、同じゲノムＤＮＡ試料のアリコートは、上述の化学処理の前に、Sss1またはその他のメチルトランスフェラーゼを用いてメチル化される。このメチル化により、ＤＮＡ試料の配列コンテクストCGのすべてのシトシン塩基またはその他のメチルトランスフェラーゼによりＤＮＡ試料のすべてのシトシン塩基が５-メチルシトシンに転化され、したがって、化学処理ではもはやチミンへの転化は起きない。この方法の特に好ましい変形態様では、両ＤＮＡ試料は前述の前処理ステップの後に増幅され、この増幅はPCRにより行われるのが好ましい。
【００４９】
この方法の第３ステップでは、処理済みの両ＤＮＡ試料について、同じ分析方法によりシトシンの存在を調べる。得られたシトシンの位置は標準ＤＮＡ配列と比較対照される。この標準ＤＮＡ配列は任意に選択することができるが、調べる試料と同一であってはならない。標準配列は、たとえば、現在ヒトゲノム・プロジェクトの枠内でできているものや既に存在するものなど、データバンクに由来するものが好ましい。標準ＤＮＡとの比較対照により、試料中の所定の位置についてそれぞれ検出されたシトシン塩基は次のような結果に導かれる。すなわち、メチル化された試料でも、また非メチル化された試料でも、シトシンが検出されれば、これらのシトシンはメチル化されたゲノムＤＮＡに存在する。メチル化された試料でのみシトシンが検出され、非メチル化試料ではチミンが検出されれば、ゲノムＤＮＡには非メチル化シトシンが存在する。一方、両試料でチミンが検出されるが、標準配列の同じ位置にシトシンが存在すれば、C-T点突然変異か“単一ヌクレオチド多型”(SNP)が存在する。
【００５０】
この方法の好適な変形態様では、第２のステップで増幅が行われるので、増幅プロセスでは10個以上の様々なフラグメントが生じる。この増幅は好適にはプライマーを用いて行うことができる。なお、プライマーは遺伝子制御に重要ないわゆる共通配列またはそのような配列を含み、且つ主として制御配列またはコード配列に結合している。この増幅では、生成物は検出可能な標識を備えたヌクレオチド構成単位またはオリゴヌクレオチド(たとえば、プライマー)を組み込み、全体として一つ以上の検出可能な標識を備えるのが好ましく、その場合、標識の検出は蛍光または化学発光により行うのが特に好ましい。
【００５１】
シトシンの位置の調査は、この方法の特に好適な変形態様では、シトシンはもっぱら特異的コンテクストである5'-CpG-3' において検出されるように行われる。これは、“配列コンテクスト-シトシン-配列コンテクスト”に特異的なオリゴマーを用いたハイブリダイズを介したシトシンの検出により好適に行うことができる。なお、このオリゴマーは限定された配列において一つ以上の表面に固定されている。この方法の特に好適な変形態様では、その配列特異的コンテクストにおいて検出し得るシトシンの各々について、配列コンテクストに相補的な少なくとも一つのオリゴマーが表面に固定され、そのオリゴマーには検出し得るシトシンに対して相補的なグアニンおよび別のオリゴマーが含まれ、別のオリゴマーは検出し得るシトシンの部位に塩基が含まれ、このシトシンはこの塩基に相補的で、ここでは非メチル化シトシンが化学処理により転化されている。この方法の特に好適な変形態様では、重亜硫酸塩処理が行われた場合チミンに相補的な塩基であるアデニンが重要である。
【００５２】
この方法の特に好適な別の変形態様では、検出され得るシトシンの位置について下記のようなオリゴマーが表面に固定される。すなわち、このオリゴマーは、メチル化および非メチル化の両シトシンの位置それぞれに、プラスとマイナスの両鎖に特異的に結合するか、および/または増幅によりそれぞれ生成する相補的な鎖に特異的にハイブリダイズするオリゴマーである。
【００５３】
この方法の特に好適な別の変形態様では、下記のようなオリゴマーが表面に固定される。すなわち、このオリゴマーは、“配列コンテクスト-チミン-配列コンテクスト”配列にそれぞれ特異的に結合するか、および/またはオリゴマーのシトシンおよび化学処理により生成したプラスとマイナスの両鎖の塩基および増幅により生成した相補的な鎖を生成する鎖を検出するオリゴマーである。
【００５４】
この方法の特に好適な別の変形態様では、オリゴマーが固定されている表面の点において信号が検出される。この信号は最初のゲノム試料においてメチル化または非メチル化または突然変異試料に特異的である。この方法の好適な変形態様では、検出された信号は定量的であるから、メチル化の絶対的度合いおよび/またはホモもしくはヘテロ両接合体を求めることができる。
【００５５】
この方法の別の好適な変形態様では、メチル化および非メチル化両試料の増幅されたフラグメントは、それぞれ表面に固定され、そして検出可能な標識を備えた配列特異的オリゴマーがこの表面で両試料においてハイブリダイズされる。この方法の特に好適な変形態様では、ハイブリダイズされた配列特異的オリゴマーは、質量分析法，好適にはMALDI質量分光法により検出される。この方法の別の特に好適な変形態様では、ハイブリダイズされた配列特異的オリゴマーの分析は、その蛍光または化学発光により行われる。
【００５６】
この方法の別の好適な変形態様では、配列コンテクストのシトシンの検出は、シトシン塩基が鋳型に到達すると特異的に停止されるポリメラーゼ反応および、生成したフラグメントの長さ測定により行われる。その際、プライマー依存性ポリメラーゼ反応の開始に利用されるオリゴマーは、好適にはそれぞれ様々な配列を表面の様々な場所に固定し、そしてポリメラーゼ反応は好適にはこの表面で行うことができる。この方法の特に好適な変形態様では、プライマー依存性ポリメラーゼ反応の開始に利用されるオリゴマーは、化学反応または光により表面から剥離させることができる。シトシンまたは向かいの鎖のグアニンの位置におけるポリメラーゼ反応を終結させるために、好適にはヌクレオチド構成単位が使われる。この構成単位は、化学的修飾を経て、たとえば、蛍光，化学発光または抗体の結合により検出することも可能である。シトシンまたは向かいの鎖のグアニンの位置における終結の検出は、ゲル電気泳動，特に毛細管電気泳動による生成フラグメントの長さ測定により行うこともできる。この方法の別の好適な変形態様では、生成フラグメントの長さ測定は、質量分光分析により，および好適にはMALDI質量分光計で行われる。
【００５７】
この方法を実施する場合はキットを使用することができる。キットには、標準ＤＮＡ，重亜硫酸塩反応および/または増幅および/またはメチルトランスフェラーゼを実施する化学薬品および助剤，および/またはこの方法を実施するための説明書が含まれている。
【００５８】
本発明の方法を添付図面を用いて説明する。
図１では、シトシンのチミンへの点突然変異が、重亜硫酸塩処理と増幅したＤＮＡでも、メチル化する前に重亜硫酸塩処理と増幅したＤＮＡでも、チミンとして検出される。メチル化されたシトシンは両方の場合にシトシンとして検出され、一方、非メチル化シトシンはメチル化されていない試料でのみＴとして、メチル化された試料ではＣとして検出される。
【００５９】
次の例により本発明の内容を説明する：
実施例：
実施例として次のＤＮＡ配列を用いる。この配列には、潜在的にメチル化されたCGジヌクレオチドまたはTG（C-SNP）の後に点突然変異CGが含まれている：
部分Ｉ）はデータバンクにおける遺伝子バンクから得られた、位置117606から位置118388までのアクセッション番号AL031228を有するゲノム配列である。
【００６０】
【化１】
0004528475.tif 000002
【００６１】
この配列にあるC/Tは、アクセッション番号AL031228を有する配列において位置117606に存在するC-SNPの特徴を明らかにしている。
【００６２】
メチル化され、且つ重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの配列Ａ）を下に示す。
【００６３】
【化２】
0004528475.tif 000003
【００６４】
非メチル化され、且つ重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの配列Ｂ）を下に示す。
【００６５】
【化３】
0004528475.tif 000004
【００６６】
832 bp(位置1から832まで)の長さを有する増幅されたフラグメント１には、557の位置にC-SNPがあり、783 bp(位置303から1085まで)の長さを有する増幅されたフラグメント２には、255の位置にC-SNPがある。フラグメント１では太字印刷したプライマーがあり、フラグメント２ではプライマーは太字印刷され、且つ下線が引かれている。
【００６７】
ゲノムＤＮＡは制限酵素Mss1（Fermentas）を用いて切断され、続いて酵素Sss1（CpGメチラーゼ，BioLabs）を用いてメチル化される。重亜硫酸塩反応は本来周知の方法で行われる。引き続き行われるポリメラーゼ反応では、遺伝子COL11A2が染色体6p21において増幅される。この増幅は、普通のPCRプロトコルによりプライマー対
【００６８】
【化４】
0004528475.tif 000005
【００６９】
またはプライマー対
【００７０】
【化５】
0004528475.tif 000006
【００７１】
を用いて行われる。この場合、それぞれのプライマー対の両方またはただ一つのプライマーがCy5を用いて標識される。
【００７２】
PCR配合物（20μＬ）：
１μＬのＤＮＡ（10 ng），それぞれ２μＬ(4x25mM)のdNTPs，0.2μＬ(1ユニット)のTaq(Hot Star Taq[登録商標], Qiagen)，２μＬのPCRバッファー(10x, Qiagen)，それぞれ１μＬのCy5マーキング・プライマー(6.25 pmoL/μＬ)。それによりＡ）に示す２つのＤＮＡフラグメントが増幅された。
【００７３】
ゲノムＤＮＡは制限酵素Mss1（Fermentas）を用いて切断される。重亜硫酸塩反応は本来周知の方法で行われる。引き続き行われるポリメターゼ反応では、遺伝子COL11A2が染色体6p21において増幅される。この増幅は、普通のPCRプロトコルによりプライマー対
【００７４】
【化６】
0004528475.tif 000007
【００７５】
またはプライマー対
【００７６】
【化７】
0004528475.tif 000008
【００７７】
を用いて行われる。この場合、それぞれのプライマー対の両方またはただ一つのプライマーがCy5を用いて標識される。
【００７８】
PCR配合物（20μＬ）：
１μＬのＤＮＡ(10 ng)，それぞれ２μＬ(4x25mM)のdNTPs，0.2μＬ(1ユニット)のTaq(Hot Star Taq[登録商標], Qiagen)，２μＬのPCRバッファー(10x, Qiagen)，それぞれ１μＬのCy5標識・プライマー(6.25 pmoL/μＬ)。それによりＢ）に示す２つのＤＮＡフラグメントが増幅された。
【００７９】
Ｉ）に示すCGまたはTGジヌクレオチドの分析では、配列TTTAAGGGCGTGTGGTATおよびTTTAAGGGTGTGTGGTATを含むオリゴヌクレオチドがガラス表面に固定された。別の実験では、非メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡから増幅されたＤＮＡフラグメント１およびメチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡから増幅されたＤＮＡフラグメント１および/または非メチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡから増幅されたＤＮＡフラグメント２およびメチル化重亜硫酸塩処理ＤＮＡから増幅されたＤＮＡフラグメント２を有するガラスキャリアが本来周知の方法でハイブリダイズされた。この方法は完全に自動化されている。
【００８０】
ゲノム配列CTGGTGGGTTTAAGGGC/TGTGTGGTATCTCから出発して、CGジヌクレオチドにおいてメチル化状態または点突然変異を検出できるハイブリダイズの結果について次のようなことが考えられる：
非メチル化ＤＮＡ（重亜硫酸塩処理）
ケース １）CTGGTGGGTTTAAGGGCGTGTGGTATCTC メチル化Ｃ
ケース ２）TTGGTGGGTTTAAGGGTGTGTGGTATTTT 非メチル化Ｃ
ケース ３）TTGGTGGGTTTAAGGGTGTGTGGTATTTT 点突然変異/SNP
メチル化ＤＮＡ（重亜硫酸塩処理）
ケース １）CTGGTGGGTTTAAGGGCGTGTGGTATCTC メチル化Ｃ
ケース ２）TTGGTGGGTTTAAGGGCGTGTGGTATTTT 非メチル化Ｃ
ケース ３）TTGGTGGGTTTAAGGGTGTGTGGTATTTT 点突然変異/SNP
【００８１】
ケース１：ゲノム配列にはメチル化されたシトシンが存在し、非メチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡおよびメチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡではシトシンが検出される。
【００８２】
ケース２：ゲノム配列には非メチル化されたシトシンが存在し、非メチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡではチミンが検出され、そしてメチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡではシトシンが検出される。
【００８３】
ケース３：ゲノム配列には点突然変異（C-SNP）が存在し、非メチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡおよびメチル化重亜硫酸塩処理されたＤＮＡではチミンが検出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１では、シトシンのチミンへの点突然変異が、重亜硫酸塩処理と増幅したＤＮＡでも、メチル化する前に重亜硫酸塩処理と増幅したＤＮＡでも、チミンとして検出される。メチル化されたシトシンは両方の場合にシトシンとして検出され、一方、非メチル化シトシンはメチル化されていない試料でのみＴとして、メチル化された試料ではＣとして検出される。
【図１】
0004528475.tif 000009