(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
（１）  ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を、≦１分子／μｍ2の表面密度で表面に固定化する工程；
（２）  個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程；
（３）  固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築する工程を有し、その際、
３ａ）  塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４種のヌクレオチドの少なくとも２種は完全に又は部分的に、異なる発光標識がなされており、
３ｂ）  発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分子検出器を用いて検出し、及び
３ｃ）  その都度、次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に先行する発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する、
ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。
【請求項２】
次の工程：
（１）  ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を、≦１分子／μｍ2の表面密度で
表面に固定化する工程；
（２）  個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程；
（３′）  固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの１種のヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１種のヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液を次々に添加することにより構築する工程を有し、その際、
３ａ′）  溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されており、
３ｂ）  発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分子検出器を用いて検出し、
３ｃ）  発光標識された１つのヌクレオチドの相補鎖中への組み込みを検出した後に組み込まれたヌクレオチドの発光信号を消去し、
３ｄ′）  次の溶液を添加する前にその都度洗浄する、
ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。
【請求項３】
工程（１）においてＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化するために、表面上に固定化されたヌクレオチド−オリゴマーを介してハイブリダイズさせることにより前記１本鎖を固定化する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
表面上の共有結合点の表面密度の調節により１本鎖の表面密度を調節する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
固定化すべき１本鎖又は固定化すべきオリゴマーの濃度により１本鎖の表面密度を調節する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（２）において固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束するために、
ａ）  発光標識されたヌクレオチド−オリゴマーを１本鎖とハイブリダイズさせ、
ｂ）  ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの位置をレーザー光線を用いた表面の走査により決定し、及び
ｃ）  ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの発光信号を引き続き消去する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（３ｂ）において発光標識された１つのヌクレオチドを１本鎖中に組み込むごとに、発光標識されたヌクレオチドの蛍光寿命によって検出する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（３ｂ）において発光標識された１つのヌクレオチドを１本鎖中に組み込むごとに、発光標識されたヌクレオチドの色によって検出する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（３ｂ）において単分子検出器は自己相関関数を有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程（３ｃ）において発光信号の消去を、ヌクレオチドの発光標識の脱離により行う、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
工程（３ｃ）において発光信号の消去を、ヌクレオチドの発光標識の光退色により行う、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程（３ｃ）において、次の塩基を組み込む前のその都度の発光信号の消去を、ポリメラーゼ活性、レーザー強度及びヌクレオチド濃度のパラメータの調整により行う、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法により構築されたＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を固定化されたＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖から温度を上昇させることにより脱離させ、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法を同じ１本鎖で繰り返す、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。
【請求項１４】
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法を、表面に固定化された他のＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖で繰り返す、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列決定法に関する。
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の塩基配列決定は、今日ではバイオテクノロジー、製剤工業、食品工業、医学診断及び他の応用分野において重要な分析技術に属している。生物のゲノムの解読は疾病の診断、治療及び予防並びに改変された特性を有する生物を産出するための遺伝型の意図的変更の可能性を開く。この潜在能力を利用するために、十分に迅速な配列決定法が必要である。
【０００３】
Sanger et al (Proceedings of the National Academy of Science, USA, 74, 5463-7; 1977)並びにMaxam 及び Gilbert (Proceedings of the National Academy of Science, USA, 74, 560-564; 1977)による古典的な配列決定法はなお今日の標準配列決定法の基礎であるが、２００個のヌクレオチドの配列決定のために１〜３日を必要とする。この方法は、約３・１０９個の塩基対を有するヒトゲノムを配列決定する課題のためには冗長すぎる。
【０００４】
配列決定法を加速するための最近の兆候は、個々のヌクレオチドの蛍光分光により検出する方法に集中している。米国特許第４９６２０３７号明細書は、塩基に対して特徴付けした蛍光色素分子が各塩基に共有結合している相補的核酸鎖を１本鎖に合成する配列決定法を開示している。この蛍光標識された核酸分子を粒子表面に結合させ、その際、個々の粒子は例えばマイクロインジェクションピペットを用いて液体流の形に保持される。エキソヌクレアーゼの使用により、次いで各蛍光標識された塩基は核酸鎖から次々に脱離され、液体流の形でレーザー光線の焦点に送られ、そこで励起後に塩基に対して特異的な蛍光を検出する。この配列決定法の速度は、理論的にはエキソヌクレアーゼの切断速度によってのみ制限されるので、１００〜１０００個の塩基／秒の配列決定速度から出発する。
【０００５】
米国特許第４９６２０３７号明細書に開示された方法の実施のための前提条件は、１つの核酸分子が１つの粒子に固定化されているだけである。しかしながら、１つの核酸分子を有する１つの粒子を作成することは技術的に著しく費用がかかり、実際の適用のためには適当ではないことが判明している。さらに、色素−標識されたヌクレオチドの脱離を行うことができるエキソヌクレアーゼの使用が必要である。このことがこの方法の発展を複雑化し、さらにこのために改変したエキソヌクレアーゼの使用が、一般に塩基配列決定の際の不正確性を高めている。
【０００６】
従って、本発明の課題は、例えば先行技術に記載された単一分子検出を用いた配列決定法の高速性に関する利点を利用するが、同時に上記した欠点を克服したＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列決定法を提供することであった。
【０００７】
前記課題の解決のために、本発明は、次の工程：
（１）  ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程；
（２）  個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束させる工程；
（３）  固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のための塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築する工程を有し、その際、
３ａ）  塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４種のヌクレオチドの少なくとも２種は完全に又は部分的に異なる発光標識がなされており、
３ｂ）  発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分子検出器を用いて検出し、及び
３ｃ）  その都度、次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に先行する発光標識されたヌクレオチドの発光信号を消去する、
ＤＮＡ又はＲＮＡの第１の塩基配列決定法を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、次の工程：
（１）  ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する工程；
（２）  個々の固定化された１本鎖上にレーザー光線を集束する工程；
（３′）  固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を、それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの１種のヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１種のヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液を次々に添加することにより構築する工程を有し、その際、
３ａ′）  溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されており、
３ｂ）  発光標識された１つのヌクレオチドを相補鎖中に組み込むごとに単分子検出器を用いて検出し、
３ｃ）  発光標識された１つのヌクレオチドの相補鎖中への組み込みを検出した後に組み込まれたヌクレオチドの発光信号を消去し、
３ｄ′）  次の溶液を添加する前にその都度洗浄する、
ＤＮＡ又はＲＮＡの第２の塩基配列決定法を提供する。
【０００９】
ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖の概念は、本発明の場合、ハイブリダイズしていないＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を表す。このような１本鎖は、遺伝子工学による方法を含めて生物から直接単離することにより、例えばこのような分子を制限酵素を用いて処理することにより得ることができる。オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡはこの１本鎖に含める。２本鎖から１本鎖を製造することは当業者にとって、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989から公知である。制限酵素を用いた処理は固定化の直前に実施することができ、これは多様な塩基配列を有する分子の固定化を行う。１本鎖は有利に５〜２０００個の塩基、特に有利に１００〜１０００個の塩基を有する。
【００１０】
本発明による方法の工程（１）ではＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化する。この表面は、後記する単一分子検出のために必要な光学的透明性を有する平坦な支持体の表面が有利である。ガラス支持体、特に石英ガラス支持体が特に有利である。有利な実施態様において、１本鎖を固定化する支持体の表面はLangmuir-Blodgettフィルムを設置することにより化学的に変性される。セルロース誘導体、特にトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣＣ）及びアミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）のLangmuir-Blodgettフィルムが特に有利である。
【００１１】
この１本鎖は吸着的に、共有結合を介して、同様に捕捉分子を介して表面に固定化される。捕捉分子は特にヌクレオチド−オリゴマーであり、このオリゴマーは表面に固定化されており、１本鎖はハイブリダイズにより結合することができる。表面上でのオリゴマーの固定化は、表面と化学的に反応性の基との共有結合により又は吸着により行われる。（ストレプト）アビジン−ビオチン−技術を用いた固定化が特に有利であり、この場合、オリゴマーはビオチンで誘導化されており、表面上に固定化された（ストレプト）アビジン−分子が結合している。（ストレプト）アビジン−分子の固定化は制限はない。有利な実施態様において、（ストレプト）アビジン−分子はセルロース誘導体のLangmuir-Blodgettフィルムを介して表面に固定化される。この表面をまず１〜８の単層（Monolagen）のアミノアルキルトリメチルシリルエーテルセルロース（ＡＴＭＳＣ）で、引き続き１〜８の単層のトリメチルシリルエーテルセルロースシンナメート（ＴＭＳＣＣ；Trimethylsilylethercellulosecinnammoat）で被覆するのが特に有利である。（ストレプト）アビジン−分子の共有結合のために次いでＴＭＳＣＣのシンナモイル基を酸化してアルデヒド基にする。さらに、本発明の場合、捕捉分子として５′−アミノ−変性オリゴヌクレオチドを使用するのが有利であり、このオリゴヌクレオチドはアルデヒド基、例えばLangmuir-Blodgettフィルム上に上記した種類の方法で得られるアルデヒド基に直接結合する。
【００１２】
さらに、工程（１）では、ＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖が≦１分子／μｍ２の表面密度で存在するようにＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖を表面に固定化するのが有利である。
【００１３】
この表面密度は有利に表面上の共有結合点の表面密度を調節することにより調節される。このための方法は、光架橋可能なLangmuir-Blodgettフィルム、例えば上記したＴＭＳＣＣフィルムを提供し、その上にＵＶ線を用いた照射時間に依存する反応性の基を表面上に生じさせる。次にこの反応性の基はＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖、ヌクレオチド−オリゴマー又は（ストレプト）アビジン分子の共有結合のために利用される。また固定化すべき１本鎖又は固定化すべきオリゴマーの溶液中の濃度により１本鎖の表面密度は調節される。この場合、この濃度は支持体の表面、並びに固定化すべき１本鎖もしくは固定化すべきオリゴマーの溶液の容量に依存する。
【００１４】
本発明による方法の工程（２）では、レーザー光線を１つの固定化された１本鎖上に集束させる。この場合、レーザー光線の選択は、ヌクレオチド塩基の使用された発光標識に依存し、この標識は後記する。工程（２）において固定化された１本鎖上にレーザー光線の集束について、有利に（ａ）発光標識したヌクレオチド−オリゴマーを１本鎖とハイブリダイズさせ、（ｂ）ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの位置をレーザー光線を用いる１本鎖が固定化されている表面の走査により決定し、（ｃ）ハイブリダイズしたヌクレオチド−オリゴマーの発光信号を引き続き消去するように進行する。工程（ａ）は１本鎖の固定化の前又は後で実施することができる。この場合、ヌクレオチド−オリゴマーの発光標識及びレーザー光線は、工程（ｂ）において発光標識が励起して発光するように選択される。工程（ｂ）でのレーザー光線を用いた表面の走査は、例えばレーザー操作顕微鏡において使用されているような慣用の走査装置又はスキャニング装置を用いて行うことができる。工程（ｃ）において発光標識の消去は、レーザ標識の脱離、特に光脱離により又は光退色により行うことができる。
【００１５】
第１の本発明による方法の工程（３）において、固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのヌクレオチドの混合物又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルのヌクレオチドの混合物及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液の添加により構築される。また、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有しない、例えばペプチド骨格を有する核酸（ペプチド核酸）のために、塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのポリマーの構築を実施することもできる。本発明の場合、塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの４種のヌクレオチドの少なくとも２種又は塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの４種のヌクレオチドの２種が完全に又は部分的に、異なる発光標識がなされている。全ての４種の塩基が異なる発光標識を有することが特に有利である。これは、相補鎖の単に簡単な構築の際に塩基配列を決定できる。４種の塩基の２種が異なる発光標識されている場合、完全な配列を得るために構築を５回繰り返さなければならず、この場合、各繰り返しの際に標識された塩基の多様な組合せが使用される。３種の異なる標識がなされた塩基を使用する場合、多様な組合せの標識された塩基を用いてそれぞれ３回繰り返さなければならない。
【００１６】
第２の本発明による方法の工程（３′）において、固定化され、集束された１本鎖のＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖は、それぞれ（ｉ）ＤＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンの１つのヌクレオチド又はＲＮＡ相補鎖の構築のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの１つのヌクレオチド及び（ｉｉ）ポリメラーゼを含有する溶液を相互に順番に添加することにより構築され、その際、溶液中に含まれるヌクレオチドは発光標識されている。ここでもまた、合成核酸、つまりホスフェート骨格を有さず、例えばペプチド骨格を有するような核酸（ペプチド核酸）のために塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンもしくは塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの塩基のポリマーの構築を実施することができる。第２の本発明による方法によると、相補鎖の構築は、それぞれのヌクレオチド溶液を相互に順番に添加することにより行われ、その際、その都度次の溶液を添加する前に洗浄しなければならない。ヌクレオチド溶液の添加後に組み込まれた信号の検出を単分子検出器を用いて行う場合、それにより測定された塩基の信号は分類することができる。例えばポリメラーゼ並びに塩基のアデニン、シトシン、グアニン及びチミンのそれぞれ１つのヌクレオチドを含有する溶液を固定化された１本鎖に添加し、かつ第２の溶液、つまりシトシン溶液の添加の際に単に単に信号を検出する場合、固定化された１本鎖の相応する塩基はグアニンである。それに対して、第２並びに第３の溶液の添加の際に信号が検出された場合、従ってグアニン−シトシンの配列順序が固定化された１本鎖状に見られる。相応する溶液の添加を繰り返すことにより、固定化された１本鎖の全体の配列が決定される。
【００１７】
溶液中に含まれるポリメラーゼは相補鎖の構築を触媒する。このポリメラーゼの選択は、ポリメラーゼが色素で標識されたヌクレオチドを有する相補鎖を構築できる限り制限はない。本発明により使用可能なポリメラーゼの例は、ネーティブＴ４−ポリメラーゼ、ネーティブＴ７−ポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ Ｉのクレノウ断片、Ｅｘｏ ＩＩＩ、Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ及びＴａｑ−ポリメラーゼである。
【００１８】
相補鎖中への発光標識されたヌクレオチドのポリメラーゼにより触媒された各組込みは、本発明の場合単分子検出器（Einzelmolekueldetektor）を用いて検出される。本発明により使用可能な単分子検出器は、所定の検出容量、レーザー光線の所定の波長及び出力及びヌクレオチドの所定の発光標識の場合に１つの発光標識されたヌクレオチド分子の検出が行える限り制限はない。単分子検出器の感度に関する要求はこの場合、検出容量の増加及びレーザー光線の出力の上昇と共に向上する。従って、検出容量を最小にし、レーザー光線を回折限度（beugungsbegrenzt）で集束させるのが特に有利である。
【００１９】
発光標識の励起の目的で、散乱光の発生を最小にするために、６００ｎｍ以上の波長を有するレーザー光線が有利である。本発明による方法のためにコストの理由からこの波長領域の半導体レーザが特に有利である。蛍光寿命の測定を介して検出を行う場合、本発明により使用されるレーザは変調、有利にパルス化される。
【００２０】
この発光標識は使用したレーザー光並びに使用した単分子検出器に適合させる。本発明の場合に蛍光体を発光標識として使用するのが有利である。蛍光体の適当な塩（つまり標識されたヌクレオチドごとの蛍光体）は、検出の種類に依存して選択される。この場合、色の検出（つまり放出される光子の波長）と蛍光体の蛍光寿命の検出との間では区別すべきである。蛍光寿命の検出のための色素セットの例は、S. Seeger et al., Ber Bunsenges. Physikal. Chem. 97, 1542-1548 (1993)並びにM. Sauer et al., J. Fluorescence 3, 131-139 (1993)に記載されており、色の検出のための色素セットの例は、L. M. Smith et al., Nature 312, 674-670 (1989)並びにJ. M: Prober et al., Science 238, 336-341 (1987)に記載されている。例えば、蛍光寿命の検出の場合、Sauer et al., J. Fluor. 5, 247-254, 1995に開示された色素ＪＡ２２、ＪＡ６６、ＪＡ５１−ＤＳ並びにシアニン染料Ｃｙ５（Amersham Pharmacia Biothech, Uppsala, Schweden）を使用することができ；色の検出の場合、色素ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を使用することができる。第１の本発明による方法において発光標識されたヌクレオチドは異なる発光体を用いて標識されているが、第２の本発明による方法において各ヌクレオチドに対して色素は同じであってもよく、それというのもヌクレオチドの区別はそれぞれの溶液の相違によって可能であるためである。簡単な励起及び検出の観点でこの手法が本発明の場合に有利である。
【００２１】
単分子検出器は、結像光学素子、光子の衝突の際に電気信号を発生させるユニット並びに電気信号の評価のためのソフトウェアを備えたコンピュータからなる。結像光学素子は有利に、電気信号を発生するユニット上に測定される光子をレーザー光線の焦点に対する共焦点の結像を可能にする。このユニットは有利にフォトダイオード、特に有利に単光子計数−アバランシュフォトダイオード（Einzelphotonenzaehl-Avalanche-Photodiode）である。また、光電子倍増管又は強化されたＣＣＤカメラを使用することもできる。本発明により使用可能な単分子検出器は、レーザーによる励起後の特定の時間後に初めて検出を開始（Gating）するように調節されているのが特に有利である。本発明により使用可能な単分子検出器はLoescher et al., Anal. Chem., 第７０巻, ３２０２−３２０５頁, 1998に記載されている。色の識別のために検出器は相応するフィルタを装備する。蛍光寿命の測定により識別するために、時間−相関−単光子計数モードで作業する検出器を使用するのが有利である。さらに、例えばSL Microtest GmbH, Jenaにより市販されている迅速な測定電子工学装置が必要である。
【００２２】
有利な実施態様において、単分子検出器は自己相関関数を有している。この自己相関関数は、自由拡散する分子の発光と固定化された核酸鎖の発光とを区別することができ、従って信号−雑音−割合を高めるために用いられる。
【００２３】
本発明の場合、組み込まれたヌクレオチドの検出された発光信号はその都度次の発光標識されたヌクレオチドの組み込みの前に消去される。この消去は発光標識の脱離により、特に光脱離により行うことができる。この消去は、例えばＷＯ９５／３１４２９に開示されたように、発光標識が感光性基を介して結合している場合に可能である。短いレーザーパルスは次に発光標識を脱離させる。脱離のためには一般に励起のためのレーザーの波長とは異なる波長が使用される。さらにヌクレオチドの発光標識の光退色により発光信号を消去するのが有利である。これは例えばレーザー強度を短期間高めることにより、つまり短いレーザーパルスにより達成される。
【００２４】
従って、発光信号を消去する速度は特にレーザーパルスの出力並びに検出とレーザーパルスとの間の時間に依存する。両方のパラメータは良好に制御可能である。組み込まれたヌクレオチドの発光信号をその都度次のヌクレオチドの組み込みの前に消去することを保障するために、これらのパラメータは相補鎖の構築速度に適合される。相補鎖の構築速度は、ポリメラーゼ活性に決定的に影響を及ぼす溶液の温度を調節することにより及びヌクレオチド濃度を調節することにより制御できる。
【００２５】
第１の本発明による方法においてヌクレオチドの全ては発光標識しない場合、相補鎖の１回の構築で固定化された１本鎖の塩基配列は第１の本発明による方法において十分な精度で決定できない。従って、完全な配列の決定のために構築を繰り返さなければならない。このことは本発明の場合同じ１本鎖に関して実施するのが有利である。このために、上記したように構築されたＤＮＡ相補鎖又はＲＮＡ相補鎖を固定化されたＤＮＡ１本鎖又はＲＮＡ１本鎖から温度上昇により脱離させ、上記方法の方法工程（３）を繰り返す。従って、本発明による方法は同一分子の配列決定を数回実施することができる。このことは発光標識されたヌクレオチドを使用する場合でも配列決定の精度を高めるために有利である。
【００２６】
また、本発明による方法は支持体上に固定化された他の１本鎖に関して繰り返すことができる。同じ塩基配列を有する１本鎖の場合、配列決定の高い精度が得られる。配列決定すべき核酸が固定化する前に制限酵素で処理されている場合、この処理により生じた１本鎖の多様な断片を漸次に決定することも可能である。制限酵素を用いた処理はこの場合固定化の直前に同じ反応容器中で行うことができる。
【００２７】
実施例
例１
１本鎖を徐々に結合させる場合に約４ｃｍ２のガラス表面に対して、１０-８ｍｏｌ／ｌのアミノ官能化されたオリゴヌクレオチド溶液１ｍｌをＰＢＳ緩衝液中で一晩中インキュベートし、次いで１本鎖の１ｍｌ溶液の添加によりハイブリダイズ緩衝液（１０-８ｍｏｌ／ｌ）中で１〜２時間５８℃〜２８℃に勾配する温度でハイブリダイズさせ、次いで色素標識されたオリゴヌクレオチド（１０-８ｍｏｌ／ｌ、１ｍｌハイブリダイズ緩衝液、２８℃〜４℃に勾配する温度）を２〜３時間対向ハイブリダイズさせた。約１分子複合体／１０μｍ２の密度が生じた。
【００２８】
例２
固定化の前のハイブリダイズ工程を実施する第２の工程において、１本鎖、アミノ官能化されたオリゴヌクレオチド及び色素標識されたオリゴヌクレオチドを一緒に緩衝液１ｍｌ中でそれぞれ１０-７ｍｏｌ／ｌの濃度で混合し、引き続きこの溶液を１０-１０ｍｏｌ／ｌに希釈し、固定化のために使用し、同様に約１分子複合体／１０μｍ２の密度が生じた。
【００２９】
例３
固定化された１本鎖に、色素Ｃｙ５（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden）で標識した１０-１１Ｍのモノヌクレオチド２μｌ及び７Ｐ−シークエナーゼ−ポリメラーゼ３．５ｕを添加した。このヌクレオチドの組み込みを４００μＷのレーザー出力及び２μｍの焦点直径で検出した。