(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料組成物を、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号７および配列ＩＤ番号９の配列からなるプライマーからなる群より選択される第一のプライマーおよび配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１０の配列からなるプライマーからなる群より選択される第二のプライマーが存在する核酸増幅反応に付して、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属の細菌の２３ＳｒＤＮＡ／ｒＲＮＡのＨｅｌｉｘ５４の少なくとも一部を含む核酸領域を増幅する工程；
（ｂ）工程（ａ）の増幅産物またはその一部を含む組成物を、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列およびそれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群より選択される１つ以上のプローブとハイブリダイズさせる工程；および
（ｃ）ハイブリダイゼーションの度合いを測定する工程；
を含むことを特徴とするマイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属の細菌を検出および／または同定する方法。
【請求項２】
核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記配列：
配列ＩＤ番号１／配列ＩＤ番号２（プライマーペア１）、
配列ＩＤ番号３／配列ＩＤ番号４（プライマーペア２）、
配列ＩＤ番号５／配列ＩＤ番号６（プライマーペア３）、
配列ＩＤ番号７／配列ＩＤ番号８（プライマーペア４）および
配列ＩＤ番号９／配列ＩＤ番号１０（プライマーペア５）
を有するプライマーペアのいずれかが核酸増幅反応中に存在することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのプローブまたは１つのプライマーが標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標識が、蛍光標識、ビオチンおよびジゴキシゲニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
プライマーのうち少なくとも１つが標識を有することを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
１つ以上のプローブが固体相上に固定され、次に該固体相を工程（ａ）の増幅産物またはその一部を含む組成物と接触させることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つのプローブが固体相上に固定されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
配列ＩＤ番号１１〜４２の配列または対応する相補的な配列からなるプローブが、固体相上に各プローブが間隔をあけた領域で固定されていることを特徴とする請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
プローブのうち少なくとも１つが標識を有することを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項１１】
増幅産物またはその一部が固体相上に固定され、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列およびそれに相補的な配列からなるプローブからなる群より選択される少なくとも１つのプローブを含む組成物と接触させることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、マイコバクテウム属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属の細菌の２３ＳｒＤＮＡ／ｒＲＮＡのＨｅｌｉｘ５４の少なくとも一部を含む核酸領域を増幅し、これらの細菌を検出及び／または同定するためのキット。
（ａ）第１のプライマーが配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号７および配列ＩＤ番号９の配列からなるプライマーからなる群より選択され、第２のプライマーが配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１０の配列からなるプライマーからなる群より選択されるプライマーペアを少なくとも一つ
（ｂ）配列ＩＤ番号１１〜４２の配列およびそれに相補的な配列からなる群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ
【請求項１３】
配列ＩＤ番号１／配列ＩＤ番号２（プライマーペア１）、
配列ＩＤ番号３／配列ＩＤ番号４（プライマーペア２）、
配列ＩＤ番号５／配列ＩＤ番号６（プライマーペア３）、
配列ＩＤ番号７／配列ＩＤ番号８（プライマーペア４）および
配列ＩＤ番号９／配列ＩＤ番号１０（プライマーペア５）
であるプライマーペアのいずれかを含むことを特徴とする請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号１〜１０の配列からなるオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる１つ以上のオリゴヌクレオチドからなる、マイコバクテウム属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、ロドコッカス属、及びツカムレラ属の細菌の２３ＳｒＤＮＡ／ｒＲＮＡのＨｅｌｉｘ５４の少なくとも一部を含む核酸領域を増幅し、これらの細菌を検出及び／または同定するための核酸増幅反応用のプライマー。
【請求項１５】
（ａ）の増幅産物またはその一部を含む組成物を、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列からなるオリゴヌクレオチドからなる各プローブとハイブリダイズさせる請求項３記載の方法。
【請求項１６】
（ｂ）が、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列からなるオリゴヌクレオチドからなる各プローブを含むものである請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物診断の分野、特に、マイコバクテリアのようにＧＣ含量の高いグラム陽性菌の臨床診断における検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリアの検出とそれらの正確な同定は、臨床診断において非常に重要な役割を果たした。それゆえ、細菌感染症においては、適切な治療を施すことができるようそれぞれの病原体が可及的すみやかに同定されるべきである。
【０００３】
こうした状況において、グラム陽性菌、特にマイコバクテリアが重要な役割を果たす。現在のところ、これまでに臨床物質から発見され識別されてきた１００種類を越えるマイコバクテリアが知られている。マイコバクテリウム・チュバーキュロウセス  コンプレックス（M. tuberculosis complex）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)のような病原性マイコバクテリア種がここでは特に重要である。
【０００４】
通常の医学的診断や食品分析では、従来バクテリアは選択培地およびその後の生化学的特性の調査によって同定されてきた。しかしながら、それでは正確な種類を同定出来ないことが頻繁であった。更に、これらの調査は非常に時間がかかり、より詳しい調査のためには純粋な培養菌が存在しなければならない。特に、非常に複雑で多様なバクテリア群で生育条件が困難なものについては、従来の培養菌判別法によるアクセスが難しく、および／またはそれらの生育の遅さのため大幅に診断が遅れることになる。
【０００５】
近年、バクテリア検出のために、核酸をベースとする方法がますます導入されている。該方法は、例えば、種に特異的なプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことを含む。検出は、通常ゲル電気泳動またはマイクロタイター皿に固定されたプローブにより行われる。しかし、このような技術は、可能性のある多数の病原性微生物の中から１つまたはそれ以上を検出するのには適していない。この問題に対する１つのアプローチは、異なる種に特異的な増幅プライマーおよび対応するプローブ、および／または微生物群の塩基断片に相補的なプライマーペアの混合物を含む増幅反応混合物である。種特異性はプローブの構造によって確認される。
【０００６】
スペーサー構造を含むリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が、すでにバクテリア特異的核酸の増幅のための標的配列として用いられている。診断で最もよく用いられている標的配列は１６Ｓ ｒＲＮＡである。それは妥当なデータベースにおいて最も代表的な配列である。しかしながら、その相対的に保持された形質のため、種に特異的な配列構造が常に見つかるとは限らない。対照的に１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡスペーサー領域は多くの種で非常に可変的であり、バクテリアを同定するのに良く適している。それはまた構造情報の内容に関して１６Ｓ ｒＲＮＡよりも優れている。しかしながら、これらの標的領域はまた、多種のマイコバクテリア間での判別においては限られた適性しか有さない。なぜならそれらの配列の可変性が高すぎるため、該標的領域に対するプローブへの感度が低下するからである
【０００７】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８１巻、１１４〜１１８頁（１９９１年）（Liesackら）には、マイコバクテリウム・レプラ（Mycobacterium leprae）２３Ｓと５Ｓ ＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、およびバクテリア検出用の種々の標的配列が明らかにされている。特にマイコバクテリウム・レプラ検出用のＨｅｌｉｘ ５４領域のプローブが明らかにされている。これは、しかしながら、Ｈｅｌｉｘ ５４標的領域に基づいて、非常に多くの異なる種類のマイコバクテリア等の高ＧＣ含量グラム陽性菌間で、識別が可能であるとの結論を導けるものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＣ含量の高いグラム陽性菌を検出および／または同定するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本方法によれば、最初に核酸増幅反応が行われ、次にその増幅産物またはその一部分を含む組成物を１つ以上のプローブとハイブリダイズさせる。最後に、ハイブリダイゼーションの度合いが測定される。
【００１０】
核酸増幅反応として種々の反応が利用されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることが好適である。様々なデザインのＰＣＲ技術が当業者に知られており、例えばＤＮＡ分析のためのポリメラーゼ連鎖反応による標的増幅(Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction)、Ｍｕｌｌｉｓ、Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｒｉｓ）４８（８）巻、５７９〜５８２頁（１９９０年）を参照されたい。適用されうる更なる増幅技術は、ＮＡＳＢＡ法（nucleic acid strand-based amplification）、ＴＭＡ法(transcriptase mediated amplification)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、Ｑ−β複製酵素増幅（β−Ｑ複製酵素）および一本鎖置換増幅法（single strand displacement amplification：ＳＤＡ）である。ＮＡＳＢＡ法および他の転写をベースとした増幅法が、医学的微生物学のレビュー（Reviews in Medical Microbiology）、１０（４）巻、１８５〜１９６頁（１９９９年）（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｆｏｘ）の中で検討されている。
【００１１】
核酸増幅反応は、試料組成物を用いて行われる。該試料組成物は、バクテリア、特にＧＣ含量の高いグラム陽性菌を含んでいると思われるいかなる組成物であってもよい。それは例えば気管分泌物、創傷塗沫、血液等の主要な材料、または予め液体培地または固体培地で生育させた微生物の菌株であってもよい。
【００１２】
本発明によれば、核酸増幅反応中に存在するプライマーペアは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号７、または配列ＩＤ番号９のいずれかの配列を有する第一のプライマーおよび配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号８、または配列ＩＤ番号１０のいずれかの配列を有する第二のプライマーである。個々のプライマーの配列を図１に示す。
好ましい態様では、下記の配列：
配列ＩＤ番号１／配列ＩＤ番号２（プライマーペア１）、
配列ＩＤ番号３／配列ＩＤ番号４（プライマーペア２）、
配列ＩＤ番号５／配列ＩＤ番号６（プライマーペア３）、
配列ＩＤ番号７／配列ＩＤ番号８（プライマーペア４）および
配列ＩＤ番号９／配列ＩＤ番号１０（プライマーペア５）
を有するプライマーペアのいずれかが核酸増幅反応中に存在する。
【００１３】
該プライマーペアのいずれもが、ＧＣ含量の高いグラム陽性菌の２３Ｓ ｒＤＮＡ／ｒＲＮＡのＨｅｌｉｘ ５４の少なくとも一部を含む核酸領域を増幅するために使用することができる。該プライマーは、異なる組み合わせで、すべてのＧ＋Ｃ−ｒｉｃｈなグラム陽性菌のＨｅｌｉｘ ５４領域を増幅してもよい。特にプライマー配列ＩＤ番号８（図１）は、適切な反応条件下でＧ＋Ｃ−ｒｉｃｈなグラム陽性菌の核酸のみに特異的に結合することができる。プライマー配列ＩＤ番号３（図１）と配列ＩＤ番号２（図１）または配列ＩＤ番号４（図１）との組み合わせは、非常に特異的にマイコバクテリウム・ケロナエ  コンプレックス（M. chelonae complex）、マイコバクテリウム・カンサシイ（M. kansasii）、マイコバクテリウム・マルモエンセ（M. malmoense）、マイコバクテリウム・チュバーキュロウセス  コンプレックス（M. tuberculosis complex）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（M. scrophulaceum）およびマイコバクテリウム・インタージェクタム（M. interjectum）を増幅する。
【００１４】
当業者は、本発明の教示を出発点とすれば、本発明のプライマーから僅かにそれるがそれでも機能するプライマーが設計可能であることを十分に理解する。それゆえ、配列ＩＤ番号１〜１０の配列を有する本発明のプライマーと対照して、５’および／または３’末端で少なくとも１つ、２つまたは３つのヌクレオチドにより伸長または切断されるプライマーもまた考えられる。特に、プライマーの５’末端での伸長または切断により、本発明により使用しうる機能的なプライマーを更に提供することが出来る。同様に、プライマーの個々またはいくつかのヌクレオチドは、該プライマーの特異性および該プライマーの溶融温度があまり変わらない限り、他のヌクレオチドで置き換えられることが考えられる。通常のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴ以外に、イノシン等の修飾されたヌクレオチドもまた適用されてもよいことは、当業者には明白である。本発明の教示により、請求項に記載の対象事項を始めとするこのような修飾が可能となる。
【００１５】
本発明では、増幅産物またはその一部を含む組成物を、１つ以上のプローブとハイブリダイズさせる。プローブは、配列ＩＤ番号１１〜４２またはそれに相補的な配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドである。図２Ａおよび図２Ｂに個々のプローブの配列を示す。またプローブを僅かに修飾することも、僅かながら機能性が損なわれるが考えられる。本発明のプローブは、５’末端および／または３’末端で少数のヌクレオチド、好ましくは３つ以下のヌクレオチド、より好ましくは２つ以下のヌクレオチド、最も好ましくは１つのヌクレオチドにより伸長および／または切断されてもよい。標的配列に対するハイブリダイゼーションがまだ可能である限り、本発明によるプローブの配列中の１つまたはいくつかのヌクレオチドを異なるヌクレオチドと置き換えることが同様に可能である。これは、修飾においては修飾されたプローブの溶融温度と元のプローブの溶融温度にあまり差がないという事実を含む。溶融温度は次式により計算される。
【００１６】
溶融温度＝（Ｇ／Ｃ塩基ペアの数）・４℃＋
＋（Ａ／Ｔ塩基ペアの数）・２℃
【００１７】
原則的に、単一の特異的プローブとのハイブリダイゼーションによりバクテリアの種類を判断することができる。しかしながら、増幅産物またはその一部を含んでいる組成物を、１つ以上のプローブとハイブリダイズさせることもまた可能である。これは本方法の有意性を高める。配列ＩＤ番号１１〜４２の配列（またはそれらの相補的な配列）を有する全てのプローブとハイブリダイゼーションを行う場合に、最も正確に述べることが可能である。この場合、正確なプロファイルが得られ、バクテリアの種類を高い確率で判断することが出来る。従って、例えば、プローブ配列ＩＤ番号２３（図２Ａ）は、バクテリアM．intracellulare、M．scrophulaceumおよびM．interjectum由来の核酸とハイブリダイズする。しかしながら、M．intracellulareはプローブ配列ＩＤ番号２４（図２Ａ）により、M．scrophulaceumおよびM．interjectumから除かれるかもしれない。プローブ配列ＩＤ番号２５（図２Ａ）は、マイコバクテリウム・セラタム（M．celatum）、M．chelonae complex、マイコバクテリウム・ゴードナエ（M．gordonae）、M．kansasii、M．malmoense、M．tuberculosis  complex、M．scrophulaceumおよびM．interjectumおよび他のマイコバクテリア種由来の核酸とハイブリダイズするが、われわれの知る限りでは、マイコバクテリア属の種とのみハイブリダイズする。現在知られているところによれば、プローブ配列ＩＤ番号２５は、配列ＩＤ番号２３（図２Ａ）と共に、M．scrophulaceumおよびM．interjectumをすべての他のマイコバクテリアから除く。これは同様にプローブ配列ＩＤ番号２４にもあてはまる。
【００１８】
ハイブリダイゼーションは通常、増幅産物またはその一部を含む組成物またはプローブのいずれかを固体相に固定し、それぞれの他のハイブリダイゼーションのパートナーと接触させる方法で行われる。使用可能な固体相は、多岐にわたる素材、例えばナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、シリカ質素材である。固体相としてマイクロタイター皿を使用することも可能である。
【００１９】
通常、少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーが標識される。非常に多様な標識が可能であり、例えば、蛍光染料、ビオチンまたはジゴキシゲニンが挙げられる。一般的な標識は、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、シアニン染料等である。標識は通常オリゴヌクレオチドに共有結合している。蛍光標識は直接検出することができるが、ビオチンおよびジゴキシゲニン標識は、培養後、適当な結合分子で検出することができる。例えばビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドは、例えばパーオキシターゼまたはアルカリフォスフォターゼ等の酵素と結合したストレプトアビジンを含む溶液と接触させ、色素を生成させるかまたは化学ルミネセンスを作る基質に変えることによって検出される。この種類の方法は当業者にとって自体公知である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の実施態様の一つとして、使用されるプライマーの少なくとも１つが標識される。反応中に存在する多数のプライマーが標識されるのが好ましい。標識されたプライマーが使用される場合、プローブは通常標識されない。本方法の態様では、プローブは固体相上に固定され、次に増幅産物またはその一部を含む組成物と接触させる。この方法は固体相上に１つ以上のプローブを固定することができる点で好都合である。少なくとも２つのプローブ、より好ましくは少なくとも５つのプローブ、更により好ましくは少なくとも１０のプローブ、最も好ましくは配列ＩＤ番号１１〜４２のプローブまたは対応する相補的な配列を有するプローブを固体相上に固定するのが好適である。増幅産物またはその一部を上記のように調製した固定化プローブを有する固体相とともに培養すると、一度のハイブリダイゼーション工程によって、増幅産物とすべての固定化されたプローブとのハイブリダイゼーションに関する情報を得ることができる。従って、該固体相は固体相上に固定されたプローブのマイクロアレイが好適である。このような“ＤＮＡチップ”により、多数の異なるオリゴヌクレオチドを小さな領域に固定することができる。ＤＮＡチップに適した固体相は、ガラス等のようにシリカを含む材質からなることが好ましい。この態様では、プライマー標識は蛍光標識が好ましい。ＤＮＡチップは、増幅産物と培養後、スキャニング装置によって迅速に分析しうる。そのような装置は当業者では公知である。チップ技術の概要は、分子診断のための小型化技術（Miniaturization technologies for
molecular diagnostics）、ＭｃＧｌｅｎｎｅｎ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４７（３）巻、３９３〜４０２頁（２００１年）を参照できる。
【００２１】
他の実施態様では、プローブの少なくとも１つが標識を有している。この場合、増幅産物またはその一部を含む組成物は通常固体相の上に固定され、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列およびその相補的配列を有するプローブからなる群より選択される少なくとも１つのプローブを含む組成物と接触させられる。この態様でもまた、１つ以上のプローブとハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。この目的のため、増幅産物が固定された多数の固体相を用意することが可能である。しかしながら、少量の増幅産物を、固体相上の間隔をあけた複数の領域に固定することもまた可能である。次に、いずれの場合にもこれらの様々なスポットを異なるプローブと接触させる（ハイブリダイゼーション）。
【００２２】
ハイブリダイゼーション方法の手順は、当業者には自体公知である。したがって、ハイブリダイゼーションのパートナーを含んでいる可能性のある溶液と共に培養した後、通常固体相は非特異的に結合した核酸分子を除去するためストリンジェントな条件下に置かれる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング(Molecular Cloning)、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Cold Spring Harbor Laboratory（１９８９年）に記載されているように、従来の方法によりナイロン上で行うか、従来の方法によりナイロンまたはニトロセルロース膜上で行うことができる。それに述べられている原理は、当業者によって更なる実施態様に転用することができる。
【００２３】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションの程度はハイブリダイゼーション後に測定される。これは通常、固体相に結合している標識の量を測定することによって行われる。この種類の検出反応および検出方法は当業者にとって自体公知である。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、配列ＩＤ番号１〜４２の配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドである。本発明は同様に、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列のいずれかに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００２５】
本発明はまた、そのようなオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む組成物に関する。該組成物は、好ましくは配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号７および配列ＩＤ番号９の配列を有するプライマーからなる群より選択される第１のプライマーおよび配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１０の配列を有するプライマーからなる群より選択される第２のプライマーからなるプライマーペアを含む。より好ましくは、組成物は下記配列：
配列ＩＤ番号１／配列ＩＤ番号２（プライマーペア１）、
配列ＩＤ番号３／配列ＩＤ番号４（プライマーペア２）、
配列ＩＤ番号５／配列ＩＤ番号６（プライマーペア３）、
配列ＩＤ番号７／配列ＩＤ番号８（プライマーペア４）および
配列ＩＤ番号９／配列ＩＤ番号１０（プライマーペア５）
を有するプライマーペアのいずれかを含む。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列またはそれに相補的な配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが固定されている固体相である。多数のオリゴヌクレオチドが固定される場合、該オリゴヌクレオチドは固体相上で互いに間隔をあけて離れている。好ましい態様では、配列ＩＤ番号１１〜４２の配列またはそれに相補的な配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドが固体相上に固定される。該固体相は好ましくはＤＮＡチップとして設計される。
【００２７】
本発明は更に、ＧＣ含量の高いグラム陽性菌、特にマイコバクテリアを検出および／または同定するためのキットに関し、そのキットは本発明のオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む。詳しい態様として、前述のキットは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号７および配列ＩＤ番号９の配列を有するプライマーからなる群より選択される第１のプライマーおよび配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１０の配列を有するプライマーからなる群より選択される第２のプライマーをからなるプライマーペア、および配列ＩＤ番号１１〜４２の配列またはそれに相補的な配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む。より好ましくは、該キットは下記配列：
配列ＩＤ番号１／配列ＩＤ番号２（プライマーペア１）、
配列ＩＤ番号３／配列ＩＤ番号４（プライマーペア２）、
配列ＩＤ番号５／配列ＩＤ番号６（プライマーペア３）、
配列ＩＤ番号７／配列ＩＤ番号８（プライマーペア４）および
配列ＩＤ番号９／配列ＩＤ番号１０（プライマーペア５）
を有するプライマーペアを少なくとも１つを含む。
【００２８】
本発明における組成物、固体相およびキットの好ましい態様は、本発明の方法におけるそれらと一致する。
【００２９】
最後に、本発明は、特にＧＣ含量の高いグラム陽性菌を検出および／または同定するための、核酸増幅反応におけるプライマーとしての配列ＩＤ番号１〜１０の配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００３０】
本発明はまた、特にＧＣ含量の高いグラム陽性菌を検出および／または同定するための、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしての配列ＩＤ番号１１〜４２の配列またはそれに相補的な配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００３１】
ここに記載されている２３Ｓ ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡプローブと、それらをＧＣ含量の高いグラム陽性菌の系統発生分岐細菌を認識および判別するために適用させることは、臨床微生物学にとって非常に重要である。通常前記の種は形態学的または生化学的方法で判別可能であるが、非常に困難であり、および／またはそれらの生育が遅いため同定に相当な遅れが生じる。
保存性の非翻訳領域(conservative flanking region)は、この遺伝子領域を１セットのプライマー（一般的な増幅プライマー）を用いる核酸増幅に利用できるようにする。これによりチップ技術が使用可能となる。
【実施例】
【００３２】
下記の実施例は本発明をより詳細に説明するためのものである。
【００３３】
実施例１
ＤＮＡ／ＲＮＡの単離：
細菌の核酸は、固体栄養培地、液体培地または主要材料のいずれかより、適切な調製を行った後に得られた。
表１：  実施例１で検討された細菌の種類
【表１】
0004441259.tif 000002
【００３４】
この目的のため、細菌物質を滅菌接種用ループを用いて固体培地から取り出し、３００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に懸濁した。液体培地から１ｍｌを採取し、卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄した後、３００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。主要材料はアセチルシステインで液状にし、ＮａＯＨ／ＳＤＳで“除染”した。このようにして得られた細胞懸濁液をサーモミキサー（エッペンドルフ社、ハンブルグ、ドイツ）中で９５℃で１５分間培養し、超音波バス（バンデリン社）中で１５分間音波粉砕し、卓上遠心機で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。各ケースで、増幅反応には５μｌの上澄み液を使用した。
【００３５】
増幅：
すべてのプライマーは市販の合成品（Interactiva社、ウルム、ドイツ）であった。ＰＣＲ混合物は１×Ｔａｑ緩衝液（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）、１μＭの各プライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ（ロシュ社）、および１ＵのＨｏｔｓｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）を含有した。ＰＣＲ増幅は、サーモサイクラーＰＥ９６００（ＡＢＩ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）上で、９５℃で１５分間、９５℃で３０秒間および６０℃で２分間を１０サイクル、および９５℃で１０秒間、５５℃で５０秒間および７０℃で３０秒間を２０サイクル行った。
【００３６】
ニュークリセンス増幅キット（NucliSens amplification kit）（オルガノンテクニカ社、ボクステル、オランダ）を、ＮＡＳＢＡ法を用いたＲＮＡ増幅のため、製造元の使用説明書に基づいて使用した。
【００３７】
１．  増幅混合物の調製：緩衝液に溶解させた“試薬希釈(reagent dilution)”に“試薬領域(reagent sphere)”を溶解させた溶液（反応に必要な酵素を含む）８μｌ、ＫＣｌ液（最終濃度７０ｍＭ）５μｌ、およびプライマー液（最終濃度０．５μＭ）２μｌ；  
２．  ５μｌのＲＮＡ液を加え、４１℃の水浴中で６０分間培養
【００３８】
ＤＮＡ／ＲＮＡアンプリコンを、臭化エチジウムで着色された寒天ゲルを用いるかまたはハイブリダイゼーションによって検出した。
【００３９】
プローブハイブリダイゼーションによるアンプリコンの検出：
すべてのプローブは、ストレプトアビジンと結合したレポーター酵素によって目的とする配列／プローブのハイブリッドを検出できるよう、５’末端でビオチン標識された。用いられたプローブはオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号１１〜２７である（図２Ａ参照）。
【００４０】
吸取紙（Blotting Papier GB002、Schleicher & Schull社、ダッセル、ドイツ)およびナイロン膜（Biodyne A、ポール・コーポレーション、ポーツマス、イギリス）をブロッティング装置（Minifold Schleicher & Schull社、ダッセル、ドイツ）のサイズに切り、１０×ＳＳＣに浸漬した。最初に２５０μｌの変性液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ； １．５Ｍ  ＮａＣｌ）を組み立てた装置の口から注入し、ピペットを使ってアンプリコン２０μｌを加えた。真空状態にして液体を完全に吸い上げた。続いて１０×ＳＳＣ緩衝液ですすいだ。膜が完全に乾燥した後、ＵＶクロスリンカー（UV-Stratalinker 2400、Stratagene社、ラ・ホーヤ、アメリカ合衆国）内で１２００ジュール／ｃｍ2で固定し、蒸留水で洗浄後、乾燥した。
【００４１】
すべてのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブン（Hybaid Mini Oven MkII、MWG-Biotech社、エーバースベルク、ドイツ）のガラス管内で５０℃で行われた。ＤＮＡ／ＲＮＡアンプリコンでコーティングされた膜を乾燥した状態で巻き上げ、ガラス管に入れた。次に膜を予め暖めておいたハイブリダイゼーション緩衝液とともに、５分間絶えず回転させながら培養した。２ｐｍｏｌのビオチン標識されたプローブを加えた後、１時間ハイブリダイゼーション反応を行った。結合していないかまたは部分的にのみ結合したプローブを、ストリンジェント緩衝液(stringent buffer)とともに５０℃で３０分間培養することにより除去した。その間、予め暖めておいたストリンジェント緩衝液を１度交換した。その後ブロッキング試薬を加え、さらに３７℃で１５分間培養した。ハイブリッドは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて比色分析を行うかまたは化学蛍光基質（Lumi-Phos 530、Cellmark Diagnostics社、アビンドン、イギリス）をスプレーしてオートラジオグラフィーを行い、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体によって検出した。この目的のため、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体を加え、３７℃で３０分間培養した。続いて膜を基質緩衝液によって１５分間ずつ２回洗浄した。次に膜を取り出し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ試薬をその上にスプレーし、Ｘ線フィルムの露光を２時間行った。あるいは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを含む基質緩衝液を加えて発光させた。
【００４２】
使用した溶液
１０×ＳＳＣ溶液（標準クエン酸含有生理食塩水）：
１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウム；
ハイブリダイゼーション緩衝液：
７％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）；
ストリンジェント洗浄液（ストリンジェント緩衝液）：
３Ｍ ＴＭＣＬ（塩化テトラメチルアンモニウム）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、
２ｍＭ ＥＴＤＡ、０．１％ ＳＤＳ；
膜の結合部位を飽和させる溶液：
５ｇ／ｌ ブロッキング試薬（ロシュ社）のｐＨ７．５ マレイン酸緩衝液（水５００ｍｌ中、ＮａＣｌ ４．１３ｇおよびマレイン酸５．５３ｇ、ｐＨは５Ｍ ＮａＯＨで７．５に調整）溶液；
基質緩衝液：
２７４ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ７．５）、６８．６ｍＭ クエン酸三ナトリウム（Ｎａ3 ｃｉｔｒａｔｅ）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２７．４ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；
ＢＣＩＰ：
５０ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニルホスフェート、トルイジニウム(toluidinium)塩の１００％ ジメチルホルムアミド溶液；
ＮＢＴ：
７５ｍｇ／ｍｌ ニトロブルーテトラゾリウム塩の７０％ ジメチルホルムアミド溶液
【００４３】
オートラジオグラムをデンシトメトリーにより評価した。使用した１００％基準値は、プローブ配列の由来元である種のアンプリコンドット(amplicondot)であった。膜上のドットとして常に平行して実行するコントロール群は、核酸溶液の代わりに水が添加された試料および１００ｎｇの単離したヒトＤＮＡを含む試料であった。
【００４４】
表２：実施例１の結果。デンシトメトリー評価でのパーセントを表にした。種に相同のプローブの値は１００％とした。ここで用いられたプローブは重複する特性を有していてもよい。
【表２】
0004441259.tif 000003
【００４５】
ここで述べられた方法は、主要材料（例えば気管分泌物、創傷塗沫、血液等）、または細菌の液体培地または固体培地のいずれかから、対応する細菌を同定および判別するために用いられてもよい。本来無菌でない物質の場合、付随する酸耐性でない細菌叢（flora）は、予め通常の汚染除去法によって除去されねばならない。これは培養菌の作製や主要材料の調製の両方に当てはまる。
【００４６】
実施例２
実施例１による方法を用いて、ＧＣ含量の高いグラム陽性菌を含む更なる試料が検討された。検討された細菌の種類は以下の通りである。
【００４７】
表３：  実施例２で検討された細菌の種類
【表３】
0004441259.tif 000004
【００４８】
使用したプローブは配列ＩＤ番号２８〜４２の配列を有するオリゴヌクレオチドである。（図２Ｂ参照）
評価は実施例１で述べたのと同様に実施した。結果は表４にまとめられている。
【００４９】
表４：  実施例２の結果      
デンシトメトリーによる評価での比率を表にした。上記の種に相同するプローブの値を１００％とした。ここで用いられたプローブは、重複する特性を有していてもよい。
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、配列ＩＤ番号１〜１０の配列を有するプライマーの核酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、配列ＩＤ番号１１〜２７の配列を有するプローブのリスト、および各ケースに関する標的微生物を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、配列ＩＤ番号２８〜４２の配列を有するプローブの配列、および各ケースに関する標的微生物を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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