(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物
【化６５】
0004542272.tif 000052
（式中、
Ｒ１は、下記式の一つの基であり、
【化６６】
0004542272.tif 000053
ここで、
Ｒ４は、−Ａ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、Ａ2、−ＮＨＲ１
を意味し、
Ｒ５は、−(ＣＨ2)lＣＯＯＡ、−(ＣＨ2)lＣＯＮＨ2、−(ＣＨ2)lＮＨ2または−(ＣＨ2)lＳＯ3Ｈ、
【化６７】
0004542272.tif 000054
を意味し、
Ｘは、下記式の一つの基であり、
【化６８】
0004542272.tif 000055
ここで、
Ｄは、(ＣＨ2)rを意味し、
Ｒ２は、−Ａ、−Ｅ−ＯＨ、−Ｅ−ＣＯＯＨまたは−Ｅ−ＣＯＮＨ2を意味し、
ここで、
Ｅは、直鎖状または分岐状のＣ1〜Ｃ10−アルキル鎖を意味し、
Ｒ３は、下記式の一つの基であり、
【化６９】
0004542272.tif 000056
ここで、
Ｒ６は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮＲ2、−ＣＨ2ＯＨまたは
【化７０】
0004542272.tif 000057
を意味し、
Ｒ７は、直鎖状または分岐状のＣ1〜Ｃ10−アルキル基を意味し、
Ｒは、ＨｅｔまたはＡｒを意味し、これらは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルオキシ、分岐状または非分岐状のＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、Ｃ5〜Ｃ10−シクロアルキル基、または−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、ＨｅｔまたはＡｒで置換されており、
ここで、
Ｈｅｔは、単環式または二環式の５〜１０員の芳香族または非芳香族の環を意味し、これは窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１個または２個の同一または異なるヘテロ原子を該環の構成員として含んでおり、この環は非置換であるか、または１個またはそれ以上のヒドロキシ基で置換されており、
Ａｒは、単環式または二環式の５〜１０員の芳香族環を意味し、これは非置換であるか、または１個またはそれ以上のヒドロキシ基で置換されており、
Ｚは、(ＣＨ2)mを意味し、
Ａは、ＨまたはＣ1〜Ｃ4−アルキルを意味し、
ｌ、ｍおよびｒは、０〜３の整数であり、
ｎおよびｋは、１〜２の整数であり、
ｑは、１〜３の整数である）、
その生理的に許容される塩を包含するその全ての立体異性体形態およびその全ての比の混合物。
【請求項２】
ｎが１である請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３】
基Ｘ中のＲがＨｅｔまたはＡｒを意味し、これらが場合により−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、ＨｅｔまたはＡｒで置換されている請求項１または２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４】
基Ｘ中のＲがＨｅｔを意味する請求項３に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５】
Ｈｅｔが
【化７１】
0004542272.tif 000058
を意味する請求項４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６】
Ｈｅｔが
【化７２】
0004542272.tif 000059
を意味する請求項４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項７】
Ｈｅｔが
【化７３】
0004542272.tif 000060
を意味する請求項４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項８】
Ｈｅｔが
【化７４】
0004542272.tif 000061
を意味する請求項４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項９】
Ｈｅｔが
【化７５】
0004542272.tif 000062
を意味する請求項４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１０】
基Ｘ中のＲがＡｒを意味し、これが場合により−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−ＡｒまたはＡｒで置換されている請求項３に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１１】
基Ｘ中のＲがＡｒを意味する請求項１０に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１２】
Ａｒが
【化７６】
0004542272.tif 000063
を意味する請求項１１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１３】
Ａｒが
【化７７】
0004542272.tif 000064
を意味する請求項１１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１４】
Ａｒが
【化７８】
0004542272.tif 000065
を意味する請求項１１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１５】
Ａｒが
【化７９】
0004542272.tif 000066
を意味する請求項１１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１６】
基Ｘ中のＲが
【化８０】
0004542272.tif 000067
を意味する請求項１０に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１７】
基Ｘ中のＲが
【化８１】
0004542272.tif 000068
を意味する請求項１０に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１８】
Ｘが下記式
【化８２】
0004542272.tif 000069
の基である請求項１〜１７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項１９】
Ｄが−(ＣＨ2)r−を意味し、ここで、ｒが０である請求項１８に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２０】
Ｄが−(ＣＨ2)r−を意味し、ここで、ｒが１である請求項１８に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が下記式
【化８３】
0004542272.tif 000070
の基である請求項１〜２０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２２】
Ｚが(ＣＨ2)mを意味し、ここで、ｍが０である請求項２１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２３】
Ｚが(ＣＨ2)mを意味し、ここで、ｍが１である請求項２１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２４】
Ｒ５が−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味する請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２５】
ＡがＨを意味する請求項２４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２６】
Ｒ５が−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＮＨ2を意味する請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２７】
ｌが０である請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２８】
Ｒ４が−ＮＨ2を意味する請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項２９】
Ｒ４が−Ａを意味する請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３０】
ＡがＨを意味する請求項２９に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３１】
Ｒ４が−ＮＨＲ１を意味する請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３２】
−ＮＨＲ１が
【化８４】
0004542272.tif 000071
を意味する請求項３１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３３】
−ＮＨＲ１のＲ５が
【化８５】
0004542272.tif 000072
を意味し、ｌが０である請求項３２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３４】
−ＮＨＲ１のＲ５が
【化８６】
0004542272.tif 000073
を意味し、ｌが０である請求項３２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３５】
−ＮＨＲ１のＲ５が(ＣＨ2)l−ＮＨ2を意味し、ｌが０である請求項３２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３６】
Ｒ１が下記式
【化８７】
0004542272.tif 000074
の基である請求項１〜２０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３７】
Ｚが−(ＣＨ2)m−を意味し、ここで、ｍが１である請求項３６に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３８】
Ｒ４が−ＮＨ2を意味する請求項３６または３７に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３９】
Ｒ５が−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味する請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４０】
ｌが０である請求項３９に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４１】
ＡがＨを意味する請求項３９または４０に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４２】
Ｒ１が下記式
【化８８】
0004542272.tif 000075
の基である請求項１〜２０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４３】
Ｒ５が−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味する請求項４２に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４４】
ｌが０であり、ＡがＨを意味する請求項４３に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４５】
Ｒ２がＡを意味する請求項１〜４４のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４６】
Ｒ２が−ＣＨ3を意味する請求項４５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４７】
Ｒ２が−Ｅ−ＣＯＯＨを意味する請求項１〜４４のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４８】
Ｒ２が−ＣＨ2−ＣＯＯＨを意味する請求項４７に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４９】
Ｒ２が−Ｅ−ＯＨを意味する請求項１〜４４のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５０】
Ｒ２が−ＣＨ2−ＯＨを意味する請求項４９に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５１】
Ｒ３が下記式
【化８９】
0004542272.tif 000076
の基である請求項１〜５０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５２】
ｋが２である請求項５１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５３】
Ｒ３が
【化９０】
0004542272.tif 000077
を意味する請求項１〜５０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５４】
Ｒ３が下記式
【化９１】
0004542272.tif 000078
の基である請求項１〜５０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５５】
Ｒ７が分岐状Ｃ1〜Ｃ10−アルキル基である請求項５４に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５６】
Ｒ７が−ＣＨ(ＣＨ3)2を意味する請求項５５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５７】
Ｒ７が−Ｃ(ＣＨ3)3を意味する請求項５５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５８】
Ｒ７が−ＣＨ(ＣＨ3)ＣＨ2−ＣＨ3を意味する請求項５５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５９】
Ｒ７が−ＣＨ2−ＣＨ(ＣＨ3)2を意味する請求項５５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６０】
Ｒ６が−Ｈを意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６１】
Ｒ６が−ＣＯＯＨを意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６２】
Ｒ６が−ＣＯＮＨ2を意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６３】
Ｒ６が−ＣＨ2ＯＨを意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６４】
Ｒ６が−ＣＯＮ(ＣＨ3)2を意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６５】
Ｒ６が
【化９２】
0004542272.tif 000079
を意味する請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６６】
ｑが２である請求項６５に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６７】
Ｒ３が下記式
【化９３】
0004542272.tif 000080
の基である請求項１〜５０のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６８】
Ｒ７が−ＣＨ(ＣＨ(ＣＨ3)2)2を意味する請求項６７に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６９】
Ｒ７が−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)3を意味する請求項６７に記載の式Ｉの化合物。
【請求項７０】
請求項１〜６９のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物および／またはその生理的に許容される塩を含有する医薬組成物。
【請求項７１】
医薬として使用するための請求項１〜６９のいずれか一項に記載の化合物および／またはその生理的に許容される塩。
【請求項７２】
増加したかまたは望ましくない基底膜の合成に関連する疾患の処置用医薬を製造するための、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の化合物および／またはその生理的に許容される塩の使用。
【請求項７３】
疾患が糖尿病の末期合併症である請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
疾患が基底膜またはその成分が増加する合成を伴う線維症である請求項７２に記載の使用。
【請求項７５】
疾患が肝臓の線維症である請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
疾患がアテローム性動脈硬化症である請求項７２に記載の使用。
【請求項７７】
疾患が癌である請求項７２に記載の使用。
【請求項７８】
疾患が糖尿病性網膜症である請求項７２に記載の使用。
【請求項７９】
疾患が水晶体後繊維増殖症である請求項７２に記載の使用。
【請求項８０】
疾患が強い炎症性成分に関連する請求項７２に記載の使用。
【請求項８１】
疾患が慢性関節リウマチである請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
疾患が変形性関節症である請求項８０に記載の使用。
【請求項８３】
疾患が脈管炎である請求項８０に記載の使用。
【請求項８４】
疾患が血管腫に関連する請求項７２に記載の使用。
【請求項８５】
疾患が乾せんである請求項７２に記載の使用。
【請求項８６】
請求項１〜７０のいずれかに記載の化合物を競合的阻害剤として使用する、ラミニンおよびニドゲンの相互作用を阻害する化合物の同定方法。
【請求項８７】
さらに、上記同定された化合物を製薬上許容される形態に処方することを含む請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
請求項８６に記載の方法、およびさらに、上記同定された化合物および／またはその生理的に許容される塩を製薬上許容される担体と混合することを含む、医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の目的は、ラミニンとニドゲン(nidogen) との間の相互作用（ラミニン／ニドゲン相互作用）の阻害剤として作用することができる低分子量ペプチド誘導体、その製造方法、それから製造された医薬組成物、ならびに医薬を製造するため、およびラミニン／ニドゲン相互作用の阻害剤を同定するためのその使用である。
【０００２】
ラミニン（８００kDaの糖タンパク質）およびニドゲン（１６０kDaの糖タンパク質）の会合は、基底膜の合成および安定化において決定的な生物分子機構と考えられている(Mayer, U.およびTimpl, R. (1994) in: Extracellular Matrix Assembly and Structure (P.D. Yurchenco, D. BirkおよびR.P. Mecham, Ed.) S. 389-416, Academic Press, Orlando, FL)。ニドゲンが、基底膜の全ての主要な構成成分、例えばγ１−含有ラミニンのイソ型（命名については：Burgeson, R.E.; Chiquet, M.; Deutzmann, R.; Ekblom, P.; Engel, J.; Kleinmann, H.; Martin, G.R.; Meneguzzi, G.; Paulsson M.; Sanes, J.; Timpl, R,; Tryggvasson, K.; Yamada, Y.; Yurchenco, P.D. (1994) Matrix Biology 14; 209-211 参照）、コラーゲンIV、ペルレカン(perlecan) およびフィブリン、ならびにこれら各々の会合構造物と三元複合体を形成する能力を有することは、独立したマクロ構造物を一緒に結合し、空間的に組織化し、かつ安定化するリンカーの機能を呈することを意味する (Fox, J.W.; Mayer, U.; Nischt, R.; Aumailley, M.; Reinhardt, D.; Wiedemann, H.; Mann, K.; Timpl, R.; Krieg, T.; Engel, J.; およびChu, M.-L. (1991) EMBO J. 10, 3137-3146)。
【０００３】
基底膜は細胞および組織の機能、組織構築、組織相互作用、細胞増殖、細胞転換、細胞転移のコントロールにおいて、および組織特異的遺伝子発現において重要な機能で寄与される高度に特殊化された細胞外構造物である (Adams, J.C.およびWatt, F.M. (1993) Development 117, 1183-1198)。ポリクローナル抗ラミニン抗体を用いた実験は、機能的基底膜の合成におけるラミニン／ニドゲン相互作用の中心的機能の明確な証拠を提供している。上記の抗体は、ラミニンＰ１で、または組み換え産生されたラミニンのニドゲン結合ドメイン（γ１ III ３−５）でウサギを免役することにより得られた。アフィニティークロマトグラフィーによりラミニンＰ１またはラミニンγ１ III ３−５マトリックス上に濃縮された抗体は、阻害アッセイにおいてラミニン／ニドゲン会合の完全な阻害を示した。しかしながら、これは、ニドゲンがラミニンに接近するのを、抗体（その結合領域がラミニンのニドゲン結合配列に隣接する位置にある）により立体的に遮断することに基づいている(Mayer, U.; Nischt, R.; Poeschl, E.; Mann, K.; Fukuda. K.; Gerl, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885)。
【０００４】
胚性器官培養物において、上記の抗体は尿細管の発達、肺胞の形成および胚性唾液腺の形態形成の双方を阻害した。これら三つのモデルは、新しい基底膜の妨げられない合成に依存する代表的な個体発生プログラムである (Ekblom, P.; Ekblom, M.; Fecker, L.; Klein G.; Zhang, H.-Y.; Kadoya, Y.; Chu, M.-L.; Mayer, U.; Timpl, R. (1994) Development 120; 2003-2014)。
【０００５】
ニドゲン結合にとって不可欠であるラミニンγ１鎖配列領域に対抗して指向された抗体は、同様にラミニン／ニドゲン会合を阻害することができる。しかしながらこの阻害は、この抗体がラミニン上の結合部位に対してニドゲンと直接に競合するので、上記の抗ラミニン抗体とは対照的に競合的である(WO 98／31709)。
【０００６】
ＩｇＭサブクラスのモノクローナル抗体（抗ラミニン P1 A6／2／4-DSM ACC2327; WO 98／31709 参照）は、ラミニン／ニドゲン相互作用をインビトロで３０nMのＩＣ５０で阻害する。この抗体は、上記のポリクローナル抗ラミニン抗体調製物のように、器官培養物において胚性唾液腺の形態形成を妨げる。このことは、ラミニン／ニドゲン相互作用の特異性、およびＬＥ−４モジュールおよびこの相互作用においてラミニンγ１ III ４ドメイン中の同定された配列領域の重要性を強調している。
【０００７】
ラミニンのニドゲン結合ドメインは明瞭に同定されており、その位置、配列およびその空間的構造（Ｘ線結晶構造およびＮＭＲ構造）に関して特性決定されている (Gerl. M; Mann, K.; Aumailley, M.; Timpl, R.; (1991) Eur. J. Biochem. 202; 167-174、Meyer, U.; Nischt R.; Poeschl. E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Gerl, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885. Baumgartner. R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Poeschl, E.; Huber, R.; Timpl, R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld, J.; Mayer, U.; Timpl, R.; Huber, R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657)。これは、ドメインγ１ III ４において、ラミニンのγ１鎖の短鎖アームの「ＬＥモジュール」（ラミニン型上皮成長因子様）中に位置している。「ＬＥモジュール」は、ＥＧＦに類似した４個のジスルフィド橋を持つ複合折り畳みパターンを有する５０〜６０アミノ酸の構造モチーフである (Bairoch, A.; (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310. Engel, J. (1989) FEBS Letters 251; 1-7)。
【０００８】
ニドゲンが相補的ラミニンドメインに結合する高い親和性は、マウスのＥＨＳ腫瘍からのラミニンＰ１、ヒト胎盤からのラミニン２およびラミニン４、およびショウジョウバエ属からのラミニンに関して検出されている。この種オーバーラッピング結合特異性の原因は、研究された種に関してγ１ III ４ドメインに存在する配列の同一性が著しく大きいことである。この同一性は、ドメイン全体を考慮した場合に、ヒトとマウスとの間で９７％、マウスとショウジョウバエ属との間で６１％であり、驚くべきことに、マウスとセノラブディティス・エレガンス (Ceanorhabditis elegans) との間では５１％である (Pikkarinen, T.; Kallunki, T.; Tryggvasson, K. (1987) J. Biol. Chem. 263; 6751-6758. Chi. H.-C.; Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264; 1543-1550. Wilson, R.ら(1994) Nature 368; 32-38. Poeschl, E.; Mayer, U.; Stetefeld, J.; Baumgartner, R.; Holak, T.A.; Huber, R.; Timpl, R. (1996) EMBO J. 15; 5154-5159)。
【０００９】
無傷の三次元構造に対するニドゲン結合の依存性のほかに、ドメインγ１ III ４のＳ−Ｓ安定化ループａおよびｃに位置する疑わしくない配列領域が同定されている。五つの必須アミノ酸が同定されており、四つはループａにおける７アミノ酸の区域中に、およびループｃにおけるチロシン側鎖中に位置していた (Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80)。γ１ III ４ドメインの適切な領域から誘導可能であり、特異的結合アッセイにおいてラミニン／ニドゲン結合を完全に阻害できる合成ペプチドは、J.W. Fox および R. Timpl により開示されている (US 5,493,008)。
【００１０】
ニドゲンのラミニン結合部位との高親和性結合は、実際の結合配列に隣接するループ（ループｃ）からのチロシンまたはヒスチジンとの相互作用を必要とすると考えられる。この芳香族相互作用は、ラミニンγ１ III ３−５の三次元構造に基づき＜５００nMのＩＣ５０範囲で阻害するための前提条件であり、そして米国特許第5,493,008号に記載された構造／機能関係の結果であると仮定された。しかしながら、ループｃがニドゲンと直接に相互作用するかどうか、またはそれがNIDPNAV配列領域の好適な空間的構造を安定化するのに貢献するかどうかは、明らかにされないままであった (Poeschl, E.; Fox. J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Poeschl, E.; Huber, R.; Timpl. R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668. Stetefeld, J.; Mayer, U.; Timpl, R.; Huber, R. (1996) J. Mol. Biol. 257; 644-657)。
【００１１】
ラミニン／ニドゲン相互作用は強い立体配座成分により影響を受ける (Mayer, U.; Nischt, R.; Poeschl, E.; Mann, K.; Fukuda, K.; Gerl, M.; Yamada, Y.; Timpl, R. (1993) EMBO J. 12; 1879-1885; Mann, K.; Deutzmann, R.; Timpl, R. (1988) Eur. J. Biochem. 178; 71-80)。ラミニンのニドゲン結合部位から誘導できる合成ペプチドは、ＬＥモジュール中に存在するようなジスルフィド結合パターンを形成することができないが、これらは阻害アッセイにおいて、無傷のラミニンＰ１またはラミニンγ１ III ３−５の活性よりも約４００〜１０,０００倍弱い活性を示す (Poeschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. J.W. FoxおよびR. Timpl; US 5,493,008)。この活性低下は、ペプチドが水溶液中で無数の異なる立体配座をとりうること、およびペプチドの数％のみが生物学的に活性な立体配座で存在するであろうことが知られているので、珍しいことではない。今日までに記載された最も活性なペプチド（２２nMのＩＣ５０）は約２７００Da（ＬＥモジュールの約５０％に相当する）の分子量を有する。これは無傷のＳ−Ｓループを含んでおり、多分このループが必須のNIDPNAV配列領域の構造を安定化する（Poeschl, E.; Fox, J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl, R, (1994) EMBO J. 13; 3471-3747. J.W. FoxおよびR. Timpl; US 5,493,008)。
【００１２】
配列NIDPNAV (Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val) の化学式は下記のとおりである：
【化３２】
0004542272.tif 000002
ラミニン／ニドゲン相互作用の阻害剤は、増加したかまたは望ましくない基底膜の合成に関連する疾患用医薬の製造のために適するはずである。
【００１３】
このような疾患は、例えば、基底膜の肥厚（特に腎臓、眼、脈管系で）を伴う糖尿病の全ての型の後期合併症、シヌソイドにおける連続基底膜の合成およびそれに起因する毛細管化を特徴とする肝線維症、特にアルコール性肝線維症、基底膜または基底膜成分の増加した合成を観察できる（腎臓、肺、皮膚）全ての線維症（慢性または医原性）、脂質代謝の調節制限（これは特に部分的に毛細管化した肝シヌソイドを通るリポタンパク質の損なわれた濾過により引き起こされることがある）を特徴とするアテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症で観察できる脈管系の病理的変化は、部分的には、血管における基底膜の組成および構造の変容に帰することができる）、血管形成が臨床像の劣化を来す疾患、例えば腫瘍増殖に血管新生を必要とする癌、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、強い炎症性成分による障害（例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎、脈管炎）、血管腫、乾せんおよびその他の多くの疾患である。
【００１４】
しかしながら、米国特許US 5,493,008に記載のものと同様なペプチドの医薬としての使用は、それらの立体配座的柔軟性、プロテアーゼに対するそれらの不安定性およびそれらの劣った生体利用性および薬力学のために、かなりの程度まで限定されている (Milner-White, E.J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10; 70-74. Verber, D.F.; Freidinger, R.M.; (1985) Trends Neurosci. 8; 392-396.  Hruby, V.J. (1994) in: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Hodges, R.S.; Smith, J.A.; Ed.) S. 3-17; ESCOM: Leiden, Netherlands)。
【００１５】
従って本願の目的は、ニドゲンのラミニン結合部位と特異的に相互作用することができ、ラミニンとニドゲンとの間の相互作用を低濃度で完全に阻害することができる低分子量ペプチド誘導体を見出すことであった。
【００１６】
それ故に本発明の目的は、式Ｉの化合物
【化３３】
0004542272.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、下記式の一つの基であり、
【化３４】
0004542272.tif 000004
ここで、
Ｒ４は、−Ａ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、Ａ2、−ＮＨＲ１、
【化３５】
0004542272.tif 000005
を意味し、
Ｒ５は、−(ＣＨ2)lＣＯＯＡ、−(ＣＨ2)lＣＯＮＨ2、−(ＣＨ2)lＮＨ2または−(ＣＨ2)lＳＯ3Ｈ、
【化３６】
0004542272.tif 000006
を意味し、
【００１７】
Ｘは、下記式の一つの基であり、
【化３７】
0004542272.tif 000007
ここで、
Ｙは、Ｏ、Ｓ、−Ｎ(Ａ)−ＣＯ−または−(ＣＨ2)r−を意味し、
Ｄは、(ＣＨ2)r、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、(ＣＨ2)r−Ｏ、(ＣＨ2)r−Ｓ、(ＣＨ2)r−ＮＨまたは(ＣＨ2)rＮＲを意味し、
Ｒ２は、−Ａ、−Ｅ−ＯＨ、−Ｅ−ＣＯＯＨまたは−Ｅ−ＣＯＮＨ2を意味し、
ここで、
Ｅは、直鎖状または分岐状のＣ1〜Ｃ10−アルキル鎖を意味し、これは非置換であるか、または−Ａ、−(ＣＨ2)m−ＯＨ、−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＡ2またはＣ5〜Ｃ10−シクロアルキル基で置換されており、または
Ｅは、Ｃ5〜Ｃ10−シクロアルキル基を意味し、これは非置換であるか、または−Ａ、−(ＣＨ2)m−ＯＨ、−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＡ2またはＣ5〜Ｃ10−シクロアルキル基で置換されており、
【００１８】
Ｒ３は、下記式の一つの基であり、
【化３８】
0004542272.tif 000008
ここで、
Ｒ６は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮＲ２、−ＣＨ2ＯＨまたは
【化３９】
0004542272.tif 000009
を意味し、
Ｒ７は、直鎖状または分岐状のＣ1〜Ｃ10−アルキル基を意味し、これは非置換であるか、または−Ａ、−(ＣＨ2)m−ＯＨ、−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＨ、−（ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＡ2またはＣ5〜Ｃ10−シクロアルキル基で置換されており、または
Ｒ７は、Ｃ5〜Ｃ10−シクロアルキル基を意味し、これは非置換であるか、または−Ａ、−(ＣＨ2)m−ＯＨ、−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＨ、−(ＣＨ2)m−Ｃ(Ｏ)ＮＡ2またはＣ5〜Ｃ10−シクロアルキル基で置換されており、
【００１９】
Ｒは、分岐状または非分岐状のＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、Ｃ5〜Ｃ10−シクロアルキル、ＨｅｔまたはＡｒを意味し、これらは場合により１個またはそれ以上のハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルオキシ、分岐状または非分岐状のＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ6−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ6−アルキニル、Ｃ5〜Ｃ10−シクロアルキル基、または−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、ＨｅｔまたはＡｒで置換されており、
ここで、
Ｈｅｔは、単環式または二環式の５〜１０員の芳香族または非芳香族の環を意味し、これは窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１個または２個の同一または異なるヘテロ原子を該環の構成員として含んでおり、この環は非置換であるか、または１個またはそれ以上のヒドロキシまたはカルボキシ基で置換されており、
Ａｒは、単環式または二環式の５〜１０員の芳香族環を意味し、これは非置換であるか、または１個またはそれ以上のヒドロキシまたはカルボキシ基で置換されており、
Ｚは、(ＣＨ2)m、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、Ｎ−Ｃ(Ｏ)−ＲまたはＮＳＯ2Ｒを意味し、
Ａは、ＨまたはＣ1〜Ｃ4−アルキルを意味し、
ｌ、ｍおよびｒは、０〜３の整数であり、
ｎおよびｋは、１〜２の整数であり、
ｐは、０〜１の整数であり、
ｑは、１〜３の整数である）、
その生理的に許容される塩を包含するその全ての立体異性体形態およびその全ての比の混合物。
【００２０】
生理的に許容される塩は、例えば無機および有機酸、例えば塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸またはｐ−トルエンスルホン酸の塩、または無機または有機塩基、例えばＮＨ4ＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ(ＯＨ)2、Ｍｇ(ＯＨ)2、ジエタノールアミンまたはエチレンジアミンの塩、またはアミノ酸、例えばアルギニン、リジン、リジル−リジンまたはグルタミン酸の塩である。
【００２１】
本発明の一つの好ましい実施形態は、ｎが１である式Ｉの化合物である。
もう一つの好ましい実施形態は、基Ｘ中のＲがＨｅｔまたはＡｒを意味し、これらが場合により−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｈｅｔ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、ＨｅｔまたはＡｒで置換されている式Ｉの化合物である。より好ましくは、基Ｘ中のＲはＨｅｔを意味する。例えば、Ｈｅｔは
【化４０】
0004542272.tif 000010
を意味する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態はまた、基Ｘ中のＲがＡｒを意味し、これが場合により−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ａｒ、−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−ＡｒまたはＡｒで置換されている式Ｉの化合物である。好ましくは、基Ｘ中のＲはＡｒを意味する。
【００２３】
例えば、Ａｒは
【化４１】
0004542272.tif 000011
を意味する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態はまた、基Ｘ中のＲが
【化４２】
0004542272.tif 000012
を意味する式Ｉの化合物である。
【００２５】
式Ｉの化合物において、Ｘは好ましくは下記式：
【化４３】
0004542272.tif 000013
の基である。
好ましくは、Ｙは−(ＣＨ2)rを意味し、ここで、ｒは好ましくは０または１であり、ｋは好ましくは１または２である。
【００２６】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｘが下記式
【化４４】
0004542272.tif 000014
の基である式Ｉの化合物であり、ここで、Ｄは好ましくは−(ＣＨ2)r−を意味し、ｒは０または１である。
【００２７】
また、本発明の好ましい実施形態は、Ｒ１が下記式
【化４５】
0004542272.tif 000015
の基である式Ｉの化合物であり、ここで、Ｚは好ましくは(ＣＨ2)mを意味し、ｍは０または１である。好ましくは、Ｒ５は−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味し、Ａは好ましくはＨを意味するか、またはＲ５は−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＮＨ2を意味し、ｌは０である。好ましくは、Ｒ４は−ＮＨ2または−Ａを意味し、ここで、Ａは好ましくはＨを意味するか、または好ましくは、Ｒ４は−ＮＨＲ１を意味し、ここで、−ＮＨＲ１は好ましくは
【化４６】
0004542272.tif 000016
を意味し、−ＮＨＲ１のＲ５は好ましくは
【化４７】
0004542272.tif 000017
を意味し、ｌは好ましくは０であるか、または−ＮＨＲ１のＲ５は好ましくは
【化４８】
0004542272.tif 000018
を意味し、ｌは好ましくは０であるか、または−ＮＨＲ１のＲ５は好ましくは(ＣＨ2)l−ＮＨ2を意味し、ｌは好ましくは０である。
【００２８】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ１が下記式
【化４９】
0004542272.tif 000019
の基を意味する式Ｉの化合物であり、ここで、Ｚは好ましくは−(ＣＨ2)m−を意味し、ｍは好ましくは１であり、Ｒ４は好ましくは−ＮＨ2を意味し、Ｒ５は好ましくは−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味し、ｌは好ましくは０であり、Ａは好ましくはＨを意味する。
【００２９】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ１が下記式
【化５０】
0004542272.tif 000020
の基を意味する式Ｉの化合物であり、ここで、Ｒ５は好ましくは−(ＣＨ2)l−ＣＯＯＡを意味し、ｌは好ましくは０であり、Ａは好ましくはＨを意味する。
【００３０】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ２がＡを意味し、Ａが好ましくは−ＣＨ3を意味するか、またはＲ２が−Ｅ−ＣＯＯＨ、好ましくは−ＣＨ2−ＣＯＯＨを意味するか、またはＲ２が−Ｅ−ＯＨ、好ましくは−ＣＨ2−ＯＨを意味する式Ｉの化合物である。
【００３１】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ３が下記式
【化５１】
0004542272.tif 000021
の基である式Ｉの化合物であり、ここで、ｋは好ましくは２である。
【００３２】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ３が下記式
【化５２】
0004542272.tif 000022
の基である式Ｉの化合物である。
【００３３】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ３が下記式
【化５３】
0004542272.tif 000023
の基である式Ｉの化合物であり、ここで、Ｒ７は好ましくは分岐状Ｃ1〜Ｃ10−アルキル基、好ましくは−ＣＨ(ＣＨ3)2、−Ｃ(ＣＨ3)3、−ＣＨ(ＣＨ3)ＣＨ2−ＣＨ3または−ＣＨ2−ＣＨ(ＣＨ3)2であり、Ｒ６は好ましくは−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＯＨ、−ＣＯＮ(ＣＨ3)2を意味するか、またはより好ましくは、Ｒ６は
【化５４】
0004542272.tif 000024
を意味し、ここで、ｑは好ましくは２である。
【００３４】
本発明のもう一つの好ましい実施形態は、Ｒ３が下記式
【化５５】
0004542272.tif 000025
の基である式Ｉの化合物であり、ここで、Ｒ７は好ましくは−ＣＨ(ＣＨ(ＣＨ3)2)2または−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)3である。
【００３５】
本発明に係る化合物は、ラミニン／ニドゲン相互作用をｎＭ濃度範囲で阻害できる、非天然の（すなわち自然界に存在しない）低分子量ペプチド誘導体である。驚くべきことに、見出されたこの低分子量構造物は、ニドゲンのラミニン結合部位に高親和力で結合することができ、これは実際の結合配列に隣接するループ（ループｃ）からのチロシンまたはヒスチジンを必要としない。
【００３６】
さらに全く驚くべきことに、本発明で記載する５５０〜８００Daの分子量を有する低分子量ペプチド誘導体は、約２７００Daの分子量（ＬＥモジュールの約５０％に相当する）を有し、かつ必須のNIDPNAV配列領域の構造をおそらく安定化する無傷のＳ−Ｓループを含む今日まで記載された最も活性な（２２nMのＩＣ５０）ペプチド（J.W. FoxおよびR. Timpl; US 5,493,008）と比較して、同じ大きさの順位の阻害を示す。
【００３７】
本発明の目的は、ニドゲン結合部位の構造／機能相関および刊行された三次元構造に基づいて、ペプチド誘導体を樹脂支持体上で特異的に合成することにより達成される。ペプチド合成のための構築ブロックを好適な基準により変化させて、広い構造的多様性および非天然構築ブロックの組み込みを確実にした。好適な感受性スクリーニングアッセイを用いて、得られたペプチド誘導体を支持体樹脂から切り離した後で、これらのペプチド誘導体を阻害活性について試験して比較した。
【００３８】
本発明に係る化合物は、基底膜の増加したかまたは望ましくない合成に関連する疾患の処置用医薬を製造するために使用することができる。
それ故に、本発明のペプチド誘導体および／またはその生理的に許容される塩の治療用途の可能な分野は、以下のものである：
１．基底膜（特に腎臓、眼、脈管系における）の肥厚を伴う糖尿病の全ての型の末期合併症。
２．シヌソイドにおける連続基底膜の合成およびそれに起因する毛細管化を特徴とする肝線維症、特にアルコール性肝線維症。
３．基底膜または基底膜成分の増加した合成を観察できる（腎臓、肺、皮膚）全ての線維症（慢性または医原性）。
【００３９】
４．脂質代謝の調節の制限（これは特に、部分的に毛細管化した肝シヌソイドを通るリポタンパク質の損なわれた濾過により生じることがある）を特徴とするアテローム性動脈硬化症。アテローム性動脈硬化症で観察できる脈管系の病理的変化は、部分的に、血管における基底膜の組成および構造の変異にも帰せられるであろう。
５．血管形成が臨床像の劣化の一因となる疾患、例えば血管新生が腫瘍増殖に必要である癌、糖尿病性網膜症、水晶体後繊維増殖症、強い炎症性成分による障害（例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎、脈管炎）、血管腫、乾せんおよびその他の多くの疾患。
【００４０】
従って、本発明に係る化合物および／またはその個々の生理的に許容される塩は、医薬としての使用に適している。それ故に、本発明のもう一つの目的は、少なくとも１種の本発明に係る化合物および／またはその生理的に許容される塩を含有する医薬組成物である。
【００４１】
本発明に係る式Ｉの化合物およびその生理的に許容される塩および誘導体は、本発明により、動物、好ましくは哺乳類、および特にヒトに、治療または予防のための医薬として投与することができる。これらは単独で、相互の混合物として、または経腸的または非経口的投与を可能にし、そして製薬上無害な慣用の賦形剤および／または添加剤に加えて、有効用量の、少なくとも１種の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体を活性成分として含有する医薬調製物として投与することができる。
【００４２】
これらの医薬は全身的または局所的に投与することができる。これらは例えば、ピル、錠剤、フィルムコーティング錠剤、糖衣錠、顆粒、硬質および軟質カプセル、粉末、溶液、シロップ、エマルジョン、懸濁液の形態または他の製薬形態で投与することができる。しかしながら投与は、例えば坐剤の形態で膣内または直腸内に、または例えば注射液または注入液、マイクロカプセルまたはロッドの形態で非経口的にまたは移植により、または例えば軟膏、溶液またはチンキの形態で局所的または経皮的に、または別の手段で例えば鼻スプレーまたはエアゾール混合物の形態でまたは吸入用乾燥粉末調製物として行うこともできる。溶液を非経口的に投与する場合、これらを例えば静脈内、筋肉内、皮下、動脈内または滑液嚢内に、または別の手段で、例えば湿潤エアゾールまたは乾燥粉末調製物の吸入により投与することができる。
【００４３】
本発明に係る医薬調製物は、本来公知の手段で製造され、式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体に加えて、製薬上不活性な無機および／または有機の賦形剤を使用することが可能である。ピル、錠剤、糖衣錠および硬質ゼラチンカプセルを製造するためには、例えば乳糖、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを使用することが可能である。軟質ゼラチンカプセルおよび坐剤の賦形剤は、例えば脂肪、ワックス、半固体および液体のポリオール、ポリエチレングリコール、天然油または硬化油などである。溶液、例えば注射液、またはエマルジョンまたはシロップを製造するために適する賦形剤は、例えば水、アルコール、グリセロール、ジオール、ポリオール、蔗糖、転化糖、ブドウ糖、植物油などである。マイクロカプセル、移植片またはロッドのために適する賦形剤は、例えばグリコール酸と乳酸との共重合体である。これらの医薬調製物は通常、約０.５〜９０重量％の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体を含有する。
【００４４】
活性化合物および賦形剤に加えて、医薬調製物はさらに助剤または添加剤、例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、着色剤、香味剤または香料、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、溶剤または可溶化剤、デポー効果を達成する手段、浸透圧変更用の塩、コーティング剤または抗酸化剤を含有することができる。これらの調製物は、２種またはそれ以上の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体を含有することもできる。さらに、これらは、少なくとも１種の式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体に加えて、１種またはそれ以上の他の治療的または予防的に活性な物質を含有することもできる。これらの医薬調製物は通常、投与当たり０.２〜５００mg、好ましくは１〜１００mgの式Ｉの活性化合物および／またはその生理的に許容される塩および誘導体を含有する。
【００４５】
式Ｉの化合物またはこれらを含有する医薬調製物をエアゾール、例えば鼻エアゾールとして、または湿潤エアゾールまたは乾燥粉末吸入により投与する場合、これは例えば、それぞれスプレー、アトマイザー、ポンプアトマイザー、吸入装置、秤量吸入器または乾燥粉末吸入器を用いて行うことができる。式Ｉの化合物をエアゾールとして投与するための医薬形態は、当業者に周知の方法で製造することができる。これらを製造するためには、慣用の添加剤、例えばベンジルアルコールまたは他の好適な保存剤、生体利用性を増大させる吸収向上剤、可溶化剤、分散剤など、および適切ならば慣用の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および／またはフルオロ炭化水素を用いた、例えば水、水−アルコール混合物または好適な食塩溶液中の式Ｉの化合物の溶液または分散液が適しているが、式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩の乾燥粉末調製物は、式Ｉの化合物および／またはその生理的に許容される塩および好適な水溶性添加剤、例えば糖または糖誘導体およびアミノ酸の水溶液を凍結乾燥するか、または好ましくは噴霧乾燥することにより得ることができる。
【００４６】
式Ｉの化合物を用いる場合の用量は広い範囲内で変動可能であり、慣例のとおり医師に公知のように、それぞれの各場合におけるそれぞれの条件に適合させるべきである。これは例えば、処置すべき疾患の性質および重さ、使用される化合物、または急性または慢性疾患状態を治療するのかまたは予防を行うのか、または式Ｉの化合物に加えて他の活性化合物を投与するかどうかに依存する。一般的に、経口投与の場合、約０.０１〜１００mg／kg、好ましくは０.１〜１０mg／kg、特に０.３〜２mg／kg（各場合、体重１kg当たり）の一日量が、成人において効果的な結果を達成するのに適切である。静脈内投与の場合、一日量は一般的に約０.０１〜５０mg／kg、好ましくは０.０１〜１０mg／kg体重である。比較的に大量を投与する場合は特に、一日量を数個の部分投与量、例えば２個、３個または４個の部分投与量に分割することができる。適切ならば、それぞれの行動に応じて、上記の一日量から上下に変えることが必要な場合がある。
【００４７】
さらに、本発明に係る式Ｉの化合物およびその生理的に許容される塩を、他の化合物、特に他の医薬活性化合物を製造するための中間体として使用することができ、これらは式Ｉの化合物から、例えば官能基のエステル化、還元、酸化または他の変換により、例えば基または官能基の変更または導入によって得ることができる。
【００４８】
こうして見出された本発明に係るペプチド誘導体は、一方では直接に治療剤として使用できるが、これらの誘導体は、基底膜の増加したかまたは望ましくない合成に関連する疾患を処置するための治療剤としての使用にも適する関連構造物の基礎を形成することもできる。
【００４９】
本発明のもう一つの目的は、本発明に係る化合物を競合的阻害剤として使用する、ラミニンとニドゲンとの相互作用を阻害する化合物の同定方法である。この方法は、さらに、同定された化合物を製薬上許容される形態に処方することを含むことができる。
【００５０】
本発明に係る化合物を競合的阻害剤として使用すること、およびさらに、同定された化合物および／またはその生理的に許容される塩を製薬上許容される担体と混合することを含む、ラミニンとニドゲンとの相互作用を阻害する化合物の同定方法を提供することも、本発明の目的である。
本発明に係る式Ｉの化合物の製造方法を提供することも、本発明の目的である。
【００５１】
本発明に係る式Ｉの化合物
【化５６】
0004542272.tif 000026
は、式IIの化合物
【化５７】
0004542272.tif 000027
と式IIIの化合物
【化５８】
0004542272.tif 000028
とのフラグメント縮合反応により製造される。これらの式中、Ｒ１、Ｘ、ｎ、Ｒ２およびＲ３は上記の意味を有し、式IIおよびIIIの化合物は上記で定義された官能基においてペプチド化学で公知の普通の保護基で保護されていてもよい（例えばHouben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 15／1および15／2巻, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974 参照）。好適な縮合方法は、当技術で周知である (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 15／1および15／2巻, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974)。好適な縮合剤または結合試薬は、例えばカルボニル−ジイミダゾール、カルボジイミド例えばジシクロヘキシル−カルボジイミドまたはジ−イソプロピル−カルボジイミド、またはＯ−（（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）−アミノ）−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラ−メチル−ウロニウム−テトラフルオロ−ボレート（ＴＯＴＵ）またはピロリン酸無水物（ＰＰＡ）である。縮合反応は標準的条件下で行われる。通例、ペプチド縮合中に、結合反応との関与が意図されないアミノ基を、結合が起きる条件とは異なる条件下で容易に除去される保護基で保護することが必要である。同じことは結合反応との関与が意図されないカルボキシ基にも当てはまり、カルボキシ基は結合反応中に、好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキルエステル、ベンジルエステルまたはtert−ブチルエステルとして保護される。アミノ基がアミノ基前駆体の形態、例えばニトロ基またはシアノ基の形態で存在する場合は、アミノ基の保護は必要でない。次いで、縮合反応に続く水和工程でアミノ基を形成する。縮合工程の後、保護基を公知の好適な方法で除去することができ、例えばベンジルオキシ−カルボニル基およびベンジル基をベンジルエステルにおける水和により除去することができ；tert−ブチル型の保護基は一般的に酸性条件下で切断され；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル残基は２級アミンにより除去される。
【００５２】
本発明に係る式Ｉの化合物の製造は、それぞれの成分、例えば天然、非天然のアミノ酸およびその誘導体を固相上で段階的に付加させることにより行ってもよく、これにより成分を種々の異なる配列で付加させることができる。
【００５３】
式Ｉの化合物を製造するために式ＩおよびIIの化合物をフラグメント縮合により直接に結合させるのではなく、例えば誘導体化により式Ｉの化合物に変えることのできる中間体を得るために、それぞれ好適なその前駆体を結合させることが有利な場合もある。
【００５４】
中間体（これから、縮合反応に続いて前駆体基をそれぞれの官能基に変えることにより、最終生成物を容易に得ることができる）を得るために、官能基を分子中に直接に導入するのではなく、それぞれの官能基の前駆体を分子に導入する上記の方法は、式Ｉの化合物の分子の異なる部分、例えば式Ｉの化合物の側鎖、Ｒ１−またはＲ１−Ｘ−にも、それぞれ当てはまる。
【００５５】
【実施例】
略語は下記の意味を有する：
物質および溶剤：
ＡｃＯＨ           酢酸
ａｑ               水性
ＢＳＡ             ウシ血清アルブミン
ＤＣＣ             Ｎ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ             ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ         Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ           ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ             Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ           ジメチルスルホキシド
Ｅｔ2Ｏ            ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ         エチルエタノエート（酢酸エチルエステル）
ＥｔＯＨ           エタノール
Fmoc-OSucc         Fmoc−Ｏ−コハク酸イミド
ＨＯＢＴ           １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＫＨＭＤＳ         カリウムヘキサメチルジシラジド
ｎ−Ｂｕｌｉ       ｎ−ブチル−リチウム
ＭｅＯＨ           メタノール
ＭＴＢＥ           メチルtert−ブチルエーテル
ＴＥＡ             トリエチルアミン
ＴＦＡ             トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ             テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ         テトラメチルエチレンジアミン
ＴＭＳＣｌ         トリメチルシリルクロライド
ＴＯＴＵ           Ｏ−((シアノ(エトキシカルボニル)メチレン)アミノ)−
Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオ
ロボレート
TrisＮ3            トリシリルアジド
【００５６】
化学基：
Ｍｅ        メチル          ＣＨ3−
Ｅｔ        エチル          ＣＨ3−ＣＨ2−
ｎＰｒ      ｎ−プロピル    ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2−
ｉＰｒ      イソプロピル    (ＣＨ3)2ＣＨ−
ｎＢｕ      ｎ−ブチル      ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−
ｉＢｕ      イソブチル      (ＣＨ3)2ＣＨＣＨ2−
ｔＢｕ      tert−ブチル    (ＣＨ3)3Ｃ−
Ｐｈ        フェニル        Ｃ6Ｈ5−
Ｆｍｏｃ    ９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｚ          ベンジルオキシカルボニル      Ｃ6Ｈ5−ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−
ＢＯＣ      tert−ブチルオキシカルボニル  (ＣＨ3)3Ｃ−Ｏ−ＣＯ−
【００５７】
１．ラミニン／ニドゲン相互作用の阻害剤のライブラリーのスクリーニング
ライブラリーを、前もって知られているヘプタペプチドNIDPNAVに関連する、より小さく、より効力があり、より代謝的に安定なペプチドを見出すために設計した (Poeschl, E.; Fox. J.W.; Block, D.; Mayer, U.; Timpl R. (1994) EMBO J. 13; 3741-3747. Poeschl, E.; Mayer, U.; Stetefeld, J.; Baumgartner, R.; Holak, T.A.; Huber, R.; Timpl, R. (1996) EMBO J. 15; 5154-5159. Baumgartner, R.; Czisch, M.; Mayer, U.; Poeschl, E.; Huber, R.; Timpl. R.; Holak, T.A. (1996) J. Mol. Biol. 257; 658-668)。ライブラリーを合成し、三つのサブライブラリー；５量体、６量体および７量体としてスクリーニングした。以下は５量体サブライブラリーのためのスクリーニング戦略の説明である。この方法は他の二つのサブライブラリーに使用する方法を代表しており、ただし、６量体は最初の工程においてウェル当たり約５０ビーズでスクリーニングし、７量体はウェル当たり約１００ビーズでスクリーニングした。
【００５８】
１.１ ５量体ライブラリーのスクリーニング
５量体ライブラリーは２,１６０の異なる化合物を含有していた。
１) 約８,８００個の個々のビーズを０.１％ＨＣｌに懸濁させ、七つのフィルター底９６ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり約１４ビーズで分配した。
２) ビーズを２００μlの脱イオン水で２回洗浄し、次いで５０μlの５００mM ＨＥＰＥＳ、pH７.０を加えた。ライブラリーに使用したリンカーはpHを７.０に高めると１アリコートの化合物を放出し、この切断工程を一夜進行させた。
３) プレートをＵ底フィルタープレートの上部に積み重ね、遠心した。ビーズから遊離した化合物の混合物を底プレートに集め、相当するビーズは元のフィルタープレートに残った。
【００５９】
４) ウェル当たり２５μlのＤＭＳＯをビーズに加え、残った遊離化合物をビーズから洗浄し、プレートを再び遠心して溶存する化合物をビーズから分離した。得られたストックは多分、３３３mM ＨＥＰＥＳ、３３％ＤＭＳＯ中の化合物当たり２７μMであった。
５) 化合物ストックをニドゲンと共に前ンキュベートし（１０μlの化合物ストック：９０μlのニドゲン溶液）、添付のプロトコールに記載されているようにアッセイを行い、化合物当たり２.７μMの最終スクリーニング濃度を得た。
６) ≧６２％の再現可能な阻害が起こった２５個のアッセイウェル中で、元のフィルタープレートからの相当するビーズを０.０５％ＨＣｌ、０.１％ Tween−２０に懸濁させ、５個の新しいフィルタープレートにウェル当たり１ビーズでピペットで加えた。同じリンカー上に親化合物を有する２個のコントロールビーズを、各プレートにコントロールとして加えた。
【００６０】
７) ビーズを２００μlの脱イオン水で２回洗浄し、次いで２５μlの５０mM ＮａＯＨを各ウェルに加えた。ライブラリーに使用したリンカーはpHを７.０から１０.０以上に高めると、第二の等モル量アリコートの化合物を放出した。この切断工程を３時間進行させた。
８) プレートをＵ底フィルタープレートの上部に積み重ね、遠心した。ビーズから遊離した化合物を底プレートに集め、相当するビーズは元のフィルタープレートに残った。
９) ５０mM ＨＣｌを加えた２０μlの５０mM ＨＥＰＥＳ（初期pH７.０）でビーズを洗浄し、溶液を下のプレート中に遠心し、最初の遊離物と一緒にした。
１０) ビーズを２５μlずつのＤＭＳＯで３回洗浄し、これを遠心する前にビーズで１０分間平衡化した。
【００６１】
１１) 得られた遊離物を１０分の１体積で工程＃５のようにアッセイした。
１２) コントロールビーズと同様またはそれより良好に阻害した溶液（約５０％阻害）をヒットと考えた。２３のヒットビーズを回収した。他の二つの潜在的ヒットウェルは、単一ウェルにおける付加的な弱い阻害剤により説明できた。
１３) ヒット溶液を質量スペクトル分析に供し、分子量を決定した。
１４) 相当する個々のヒットビーズをエドマン（Edman）分解に供してペプチド配列を決定した。
１５) 組み合わせたＭＳのデータおよびエドマン（Edman）データを分析してヒット化合物の構造を同定した。
【００６２】
構造およびその回復頻度を以下に示す。G-Hopa＝グリシンヒドロキシプロピルアミド、リンカーの残り。
【００６３】
【表１】
0004542272.tif 000029
【００６４】
１.２ 手順：ペプチドライブラリーの調製
ペプチドライブラリーを、スプリット／ミックス合成アプローチ (Lam, K. S., Salmon, S.E., Hersh, E.M., Hruby, V. J., Kazmierski, W. M., およびKnapp, R. J. (1991) Nature 354, 82; Furka, A., Sebestyen, F., Asgedom, M., およびDibo, G. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37, 487）により、標準的固相ペプチドFmoc化学 (Stewart, J. M.,およびYoung, J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Atherton, E., およびSheppard, R. C. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press Oxford）を用いて合成した。各樹脂ビーズを、各結合サイクルにおいて単一の活性化アミノ酸だけにさらした。それ故に、ライブラリー合成が完了したときに、各樹脂ビーズは一つのペプチド実体だけを発現する。全ての化合物を別々に試験することは不可能なので、我々は識別的に切断可能なリンカー、図１を介して、各樹脂ビーズ上に同じ構造物のコピーを二つずつ造った (Kocis, P., Krchnak, V.,およびLebl, M. (1993) Tetr. Lett. 34, 7251; Lebl, M., Krchnak, V., Salmon, S. E.,およびLam, K. S. (1994) A Companion to Methods in Enzymolog 6, 381)。次いで樹脂ビーズからのペプチドの遊離を、異なる切断機構を用いて連続的工程で行うことができる。ペプチドの最初の部分をヒドロキシプロピルアミドとして切断することは、pH７〜９の緩衝液中で行われる。ペプチドの第二の部分の遊離は、より高いpHを用いて達成される（スキーム１）。
【００６５】
ペプチドライブラリーにおいて、ポリエチレングリコール−グラフトポリスチレンビーズまたはTentaGel(R) S NH2 を用いた。実際に、水性条件下のペプチド合成およびスクリーニングに適合する任意の樹脂ビーズで充分である。
【００６６】
５量体、６量体および７量体のライブラリーを、一つの固定位置（Ｌ−アスパラギン）で調製した。Ｃ−末端上のグリシンヒドロキシプロピルアミドはリンカーの一部である：
H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH（2,160ペプチド）
H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH（25,920ペプチド）
H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH（311,040ペプチド）
X1：第一の無作為化に用いた  Ｎ−Fmoc−Ｌ−アミノ酸（９）：バリン、イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、β（２−ナフチル）アラニン、２−アゼチジンカルボン酸、プロリン、シクロヘキシルグリシン、フェニルグリシン。
X2：第二の無作為化に用いた  Ｎ−Fmoc−Ｌ−アミノ酸（４）：アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン酸。
X3＝X5＝X6：第三、第五および第六の無作為化に用いたＮ−Fmoc−Ｌ−アミノ酸（１２）：ピペコリン酸、β（２−ナフチル）アラニン、グルタミン酸、リジン、２−アゼチジンカルボン酸、スレオニン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、３,５−ジヨードチロシン、シトルリン、アルギニン。
X4：第四の無作為化に用いたＮ−Fmoc−Ｌ−アミノ酸（５）：アスパラギン酸、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、Ｏ−スルフェートチロシン、γ−カルボキシグルタミン酸。
【００６７】
樹脂（ＰＥＧ−ＰＳ・ＨＣｌ、Millipore(R)、２０ｇ、担持量０.５８ミリモル／ｇ、平均粒径２２０μm）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中で２時間膨潤させ、次いでジクロロメタン中の１０％Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンで中和した。樹脂をジクロロメタンおよびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。リンカー（図１、３当量）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１,３−ジイソプロピルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（各３当量）を用いて室温で１２時間結合させた。この反応をブロモフェノールブルー法で監視した (Krchnak, V., Vagner, J., Safar, P.,およびLebl, M. (1988) Collec. Czech. Cem. Commun. 53, 2542)。次いで結合の完了をニンヒドリン試験で決定した (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D.,およびCook, P. I. (1969) Anal. Biochem. 34, 595)。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した後、Fmoc保護基をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中の５０％ピペリジンで１５分間除去した。 次いで樹脂をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄し、遊離したフルベン−ピペリジン付加物の量をＵＶ分光測定法（３０２nm）で定量した。このようにしてライブラリー合成全体で定量した樹脂担持量（ミリモル／ｇ）の安定レベルを、質コントロール手段の一つとして役立てた。
【００６８】
樹脂を９等分した。次いで９個のFmoc保護アミノ酸（Ｘ１）を各樹脂アリコート中に別々に加え、上記の手順で２時間結合させた。次いで樹脂を、底にフリットを有する円筒状ガラス容器中にプールした。樹脂を混合するために乾燥窒素を通気した。Fmoc保護基を上記のように除去した。
【００６９】
樹脂を４等分した。次いで４個のFmoc保護アミノ酸（Ｘ２）を各樹脂アリコート中に別々に加え、同じ結合プロトコールを用いて結合させた。Fmoc保護基を除去し、樹脂担持量を決定した。次のサイクルにおいて、L-アスパラギンを上記の手順で結合させた。次いで樹脂を別の結合サイクルのためにアリコートに分割した。全ての無作為化工程が完了した後、Fmoc基を除去し、側鎖保護基をトリフルオロ酢酸（８２.５％）、アニソール（５％）、水（５％）、チオアニソール（５％）、エタンジチオール（２.５％）の混合物で２.５時間かけて切断した。次いで樹脂をトリフルオロ酢酸、ジクロロメタン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびメタノールで洗浄した。これらのライブラリーを４℃で乾燥状態で保存した。
【００７０】
ライブラリーの質を検証するために、無作為に選んだ幾つかのビーズをEdman分解および質量スペクトル分析技術による配列決定に供した。
【化５９】
0004542272.tif 000030
【００７１】
１.３ 結果（図２〜１２も参照）
【表２】
0004542272.tif 000031
【００７２】
【表３】
0004542272.tif 000032
【００７３】
【表４】
0004542272.tif 000033
【００７４】
【表５】
0004542272.tif 000034
【００７５】
【表６】
0004542272.tif 000035
【００７６】
【表７】
0004542272.tif 000036
【００７７】
【表８】
0004542272.tif 000037
【００７８】
【表９】
0004542272.tif 000038
【００７９】
【表１０】
0004542272.tif 000039
【００８０】
【表１１】
0004542272.tif 000040
【００８１】
【表１２】
0004542272.tif 000041
【００８２】
２. 大規模合成
２.１ Ｎ−Fmoc−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン（Ａ８）
概要：Ｎ−Fmoc−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン（Ａ８）を１０工程で製造した：
【化６０】
0004542272.tif 000042
【００８３】
２.１.１ トランス−３−（２′−ナフチル）−プロペン酸エチル（Ａ１）
エタノール５０mL中の２−ナフトアルデヒド（７.８ｇ，５０mmol）の撹拌溶液に、（カルボエトキシメチレン）トリフェニルホスホラン（１８.３ｇ，５２.５mmol）を加えた。僅かな発熱が認められた。この混合物を一夜撹拌する間に沈殿が生成した。反応混合物をＥｔ2Ｏ（５００mL）で希釈し、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4（２×１００mL）、飽和ＮａＨＣＯ3（１×１００mL）、水（１００mL）および塩水（１００mL）で洗浄した。有機画分を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧濃縮した。残留物をＳｉＯ2プラグに通し、９：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶離した。真空濃縮した後、ほぼ定量的収率の生成物を幾何異性体の８５：１５混合物（nmrでトランスが多い）として回収した。この材料をヘキサン／ＥｔＯＡｃ（富ヘキサン）から再結晶して目的生成物を異性体の９７：３混合物（nmr）として回収した。母液を濃縮し、上記と同様に再結晶してさらに２.９ｇの生成物を回収した（合計７.４ｇ，３３mmol，収率６５％）。NMR (CDCl3) δ 7.93(s, 1H), 7.88-7.83(c, 4H), 7.67(dd, 1H, J=1.6, 8.6Hz), 7.53-7.50(c, 2H), 6.55(d, 1H, J=16.0Hz), 4.30(q, 2H, J=7.1Hz), 1.42(t, 3H, J=7.1Hz)。
【００８４】
２.１.２ トランス−３−（２′−ナフチル）−プロペン酸（Ａ２）
ＴＨＦ（７５mL）中のエステルＡ１（４.２４ｇ，１８.８mmol）の溶液に、水（１９mL）中のＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（２.３６ｇ，５６.３mmol）を加えた。最初は不均質なこの混合物を一夜激しく撹拌すると均質になった。反応混合物を濃ＨＣｌで酸性化（pH約２）すると沈殿が生成した。この不均質混合物を分離ロートに移し、ＥｔＯＡｃ（３×１５０mL）で抽出した。一緒にした抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、真空濃縮して上記カルボン酸を白色固体（３.６６ｇ，収率９８％）として回収した。NMR (CDCl3) δ 7.97(d, 1H, J=15.7Hz), 7.90(d, 1H, J=15.3Hz), 7.90-7.83(c, 3H), 7.70(dd, 1H, J=1.6, 8.6Hz), 7.57-7.50(c, 2H), 6.58(d, 1H, J=16.0Hz)。
【００８５】
２.１.３ トランス−（４Ｓ）−３−（３′−（２″−ナフチル）−プロペノイル）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（Ａ３）
無水ＴＨＦ（７４mL）中のカルボン酸Ａ２（３.６６ｇ，１８.５mmol）およびトリエチルアミン（１.８７ｇ，２.５６mL，１８.５mmol）の溶液を−７８℃に冷却した。塩化ピバロイル（２.３５ｇ，２.４０mL，１９.４mmol）を２分間かけて加えると白色沈殿が生成した。１０分後、フラスコを０℃の浴中に１０分間入れ、その後フラスコを再び−７８℃に１.５時間冷却した。別のフラスコ中で、無水ＴＨＦ（７４mL）中のＬ−フェニルグリシノール（３.３１ｇ，２０.３mmol）から誘導したオキサゾリジノンを−７８℃に冷却した。n-BuLi溶液（ヘキサン中１.６Ｍ，１１.６mL，１８.５mmol）を加え、撹拌を約１時間続けると、ＴＨＦ／ヘキサン溶液から金属化オキサゾリジノンが沈殿した。この金属化オキサゾリジノンに上記の混合無水物をカニューレにより加え、反応混合物を０℃の浴中に入れた。１時間後、この浴を除去し、この混合物を室温に一夜温めた。５０mLの飽和ＮＨ4Ｃｌで反応を停止させた。ＴＨＦを減圧下で除去し、分離ロートに移した後、この混合物をＣＨ2Ｃｌ2（３×７５mL）で抽出した。一緒にした有機画分を１Ｍ ＮａＯＨ（２×５０mL）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶して白色固体（３.８７ｇ，１１.２mmol，収率６１％）を回収した。NMR (CDCl3) δ 8.05(d, 1H, J=15.7Hz), 7.94(d, 1H, J=15.4Hz), 7.87-7.81(c, 3H), 7.76(dd, 1H, J=1.5, 8.6Hz), 7.53-7.47(c, 2H), 7.41-7.34(c, 5H), 5.58(dd, 1H, J=8.7, 3.9Hz), 4.76(t, 1H, J=8.7Hz), 4.33(dd, 1H, J=8.8, 3.9Hz)。
【００８６】
２.１.４ （３′Ｒ４Ｓ）−３−（３′−（２″−ナフチル）−４′−ペンテノイル）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（Ａ４）
無水ＴＨＦ（９２mL）中のＣｕＩ（３.９６ｇ，２０.９mmol）およびＴＭＥＤＡ（２.６６ｇ，３.４６mL，２２.９mmol）の溶液に−７８℃で、ビニルマグネシウムブロマイド（ＴＨＦ中１.０Ｍ，２０.９mL，２０.９mmol）を加えた。この混合物を１５分間撹拌した。別のフラスコ中で、トリメチルシリルクロライド（５.６９ｇ，６.６４mL，５２.２mmol）を、無水ＴＨＦ（４２mL）中の不飽和イミドＡ３（３.８７ｇ，１１.３mmol）の溶液に加えた。このイミドが不溶性であるため、銅含有試薬を含むフラスコの隔壁を除去し、このスラリー化したイミドを一度に加え、少量のＴＨＦですばやくすすいだ。浴温度を−３０℃に高め、撹拌を１時間続けた。反応混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ：濃ＮＨ4ＯＨの３：２混合物２５０mL中に注いだ。相を分離し、水性画分をＥｔＯＡｃ（３×２００mL）で抽出した。一緒にした有機画分を飽和ＮＨ4Ｃｌ（１×１００mL）および水（１×１００mL）で順次に洗浄した。有機画分を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧濃縮した。残留物をＳｉＯ2のプラグに通し、４：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶離した。溶離物を真空濃縮して白色固体（３.６４ｇ，９.８１mmol，収率８７％）を回収した。NMR (CDCl3) δ 7.87-7.82(c, 3H), 7.72(s, 1H), 7.54-7.27(c, 8H), 6.11(ddd, 1H, J=6.7, 10.4, 17.0Hz), 5.34(dd, 1H, J=8.6, 3.5Hz), 5.10(d, 1H, J=8.2Hz), 5.08(d, 1H, J=17.2Hz), 4.56(t, 1H, J=8.8Hz), 4.26(dd, 1H, J=8.8, 3.5Hz), 4.16(ddd, 1H, J=8.1, 7.0, 6.9Hz), 3.68(dd, 1H, J=8.4, 16.5Hz), 3.50(dd, 1H, J=6.5, 16.5Hz)。
【００８７】
２.１.５ （２′Ｓ３′Ｒ４Ｓ）−３−（２′−アジド−３′−（２″−ナフチル）−４′−ペンテノイル）−４−フェニル−２−オキサゾリジノン（Ａ５）
カリウムヘキサメチルジシラジド（トルエン中０.５Ｍ，２５.５mL，１２.８mmol）を、無水ＴＨＦ（３４mL）に−７８℃で一度に加えた。イミドＡ４（３.６４ｇ，９.８１mmol）をＴＨＦ（３４mL）中にスラリー化し、カニューレにより加え、ＴＨＦ（２×１１mL）ですすいで移し終えた。３０分後、トリシラジド（４.４０ｇ，１４.２mmol）をＴＨＦ（３４mL）に溶解し、−７８℃に冷却し、カニューレにより加えた。３０分後、ＡｃＯＨ（１.４１ｇ，１.３４mL，２３.４mmol）を加えて反応を停止させた。この混合物を室温で一夜撹拌した。この混合物をＣＨ2Ｃｌ2（３００mL）と希塩水（１５０mL）との間に分配した。層を分離し、水相をＣＨ2Ｃｌ2（３×１５０mL）で抽出した。一緒にした有機画分を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して上記生成物（３.４１ｇ，８.２８mmol，収率８４％）を回収した。NMR (CDCl3) δ 7.85-7.82(c, 3H), 7.72(s, 1H), 7.53-7.47(c, 2H), 7.42(dd, 1H, J=1.7, 8.5Hz), 7.37-7.31(c, 3H), 7.18-7.15(c, 2H), 6.28(ddd, 1H, J=8.2, 10.2, 17.1Hz), 5.63(d, 1H, J=10.2Hz), 5.37(d, 1H, J=17.0Hz), 5.34(d, 1H, J=10.2Hz), 4.83(dd, 1H, J=3.0, 8.3Hz), 4.14(t, 1H, J=7.2Hz), 4.07(dd, 1H, J=9.3, 17.9Hz), 3.94(dd, 1H, J=3.0, 5.8Hz), 3.68(t, 1H, J=8.6Hz)。
【００８８】
２.１.６ （２Ｓ３Ｒ）−２−アジド−３−（２′−ナフチル）−４−ペンテン酸メチル（Ａ６）
ＴＨＦ（６２mL）中のイミドＡ５（３.４１ｇ，８.２８mmol）の溶液に、水（２１mL）、３５％Ｈ2Ｏ2（２.７mL）およびＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（６９５mg，１６.６mmol）を加えた。２時間後、Ｎａ2ＳＯ3（４.１７ｇ，３３.１mmol）を水（４１mL）中の溶液として加えた。この混合物を１５分間撹拌し、ＴＨＦを減圧下に除去した。この水溶液をＨＣｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（２×１５０mL）で抽出した。一緒にした抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧濃縮した。残留物をＳｉＯ2プラグカラムに通し、１：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶離し、濃縮した後、白色固体（これは多分カルボン酸とキラル助剤との混合物であった）を回収した。ヘキサン／ＥｔＯＡｃから再結晶してキラル助剤を針状晶として得た。母液を濃縮し、エステル化工程に進めた。この粗製カルボン酸を含有する残留物を無水ＭｅＯＨ（４６mL）に溶解し、０℃に冷却した。塩化チオニル（１.１８ｇ，７２５μL，９.９４mmol）を加え、１０分後にこの混合物を還流下に２時間加熱した。水（１.０mL）をこの混合物に加え、１０分間撹拌し、フラスコ内容物を減圧濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１５０mL）と塩水（１００mL）との間に分配した。層を分離し、有機画分を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１９：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製して、上記メチルエステル（１.５４ｇ，５.４８mmol，収率６６％）を回収した。NMR (CDCl3) δ 7.84-7.80(c, 3H), 7.71(s, 1H), 7.50-7.46(c, 2H), 7.39(dd, 1H, J=1.8, 8.5Hz), 6.23(ddd, 1H, J=8.3, 10.9, 17.6Hz), 5.30(d, 1H, J=9.9Hz), 5.28(d, 1H, J=17.7Hz), 4.22(d, 1H, J=7.5Hz), 4.06(t, 1H, J=7.9Hz)。
【００８９】
２.１.７ トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリンのメチルエステル（Ａ７）
ボラン−硫化メチル錯体（ＴＨＦ中２.０Ｍ，６.５７mL，１３.１mmol）を無水ＴＨＦ（２６ml）で希釈し、０℃に冷却した。シクロヘキセン（２.１６ｇ，２.６６mL，２６.３mmol）をシリンジにより注意深く加えた。３０分後、白色沈殿が生成した。撹拌を３時間続けた。フラスコ内容物を真空濃縮した。この試薬をＣＨ2Ｃｌ2（３６mL）中にスラリー化し、０℃に冷却した。ビニルアジドＡ６（１.２３ｇ，４.３８mmol）をＣＨ2Ｃｌ2（９mL）に溶解し、カニューレにより加えた。反応混合物は淡黄色になり、ガスの発生が明らかであった。この混合物を室温に一夜温めた。ＭｅＯＨ（２６mL）を加え、さらに１５分間撹拌した。この混合物を減圧濃縮した。残留物をＥｔ2Ｏ（２５mL）中に吸収させ、０.１Ｍ ＨＣｌ（５×２５mL）で抽出した。水性抽出液を飽和ＮａＨＣＯ3で塩基性化し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１００mL）で抽出した。有機抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、真空濃縮して、上記環化生成物を若干のジシクロヘキシルボラン由来の夾雑物と共に回収した（９７４mg，３.８２mmol，粗製物質の収率８７％）。NMR (CDCl3) δ 7.84-7.78(c, 3H), 7.71(s, 1H), 7.49-7.41(c, 3H), 3.91(d, 1H, J=6.9Hz), 3.69(s, 3H), 3.63(m, 1H), 3.48(dd, 1H, J=8.2, 15.4Hz), 3.27(d, 1H, J=7.8Hz), 3.25(d, 1H, J=7.8Hz), 2.33(m, 1H), 2.09(m, 1H)。
【００９０】
２.１.８ Ｎ−Fmoc−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン(Ａ８)
１２mlの６Ｎ ＨＣｌ中のメチルエステル（Ａ７）５１０mg（２mmol）を１００℃で１０時間加熱する。反応溶液を減圧濃縮し、固体残留物をアセトン１５ml中に懸濁させる。この懸濁液を２Ｎ Ｎａ2ＣＯ3溶液を用いてpH９〜１０に調節する。次いでFmoc−Ｏ−サクシンイミド７４２mg（２.２mmol）をゆっくりと加える。続いてpHを９〜１０に調節し、この混合物を室温で４時間撹拌した後、室温で一夜放置する。続いてpHを濃ＨＣｌを用いて２に調節し、この混合物を酢酸エチルと混合する。沈殿した生成物５６０mgを吸引濾別する。水相を酢酸エチルで３回抽出し、続いて塩化メチレンと混合する。これにより、さらに１８５mgの生成物を沈殿として得る。収量：７４５mg（８０.４％）。NMR (d6-DMSO) δ 7.95-7.80(c, 6H), 7.68(d, 1H, J=7.3Hz), 7.60(d, 1H, J=7.4Hz), 7.50-7.34(c, 6H), 7.25(m, 1H), 4.39-4.15(c, 4H), 3.70-3.48(c, 3H), 2.29(m, 1H), 2.14(m, 1H)。
【００９１】
２.２ Ｎ−サクシニル−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アラニニル−Ｌ−バリン−アミド（３４）
【化６１】
0004542272.tif 000043
【００９２】
２.２.１ Ｎ−Fmoｃ−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド（Ｂ１）
４６３.５mg（１mmol）のＮ−Fmoc−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン（Ａ８）、３３８mgのH-Asn-Ala-Val-NH2塩酸塩（ペプチド化学の慣用方法により製造した）および１３５mgのＨＯＢＴを２０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、０.１３mlのＮ−エチルモルホリンおよび２２０mgのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間、次いで室温で３時間撹拌し、続いて室温で一夜放置する。沈殿を吸引濾別し、この溶液を高真空下で濃縮する。残留物をペンタノールとＮａＨＣＯ3溶液との間に分配する。ペンタノール相をＫＨＳＯ4溶液およびＨ2Ｏ／ＮａＣｌ溶液で洗浄する。沈殿を吸引濾別し、ジエチルエーテルと共に完全に磨砕する。これにより、４７３mgの生成物を得る。ペンタノール相をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥し、濃縮する。残留物をジエチルエーテルと共に２回磨砕する。これにより、さらに２５７mgの生成物を得る。
収量：７３０mg（９７.７％）。
【００９３】
２.２.２ トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド（Ｂ２）
２４８mg（０.３３２mmol）のＮ−Fmoc−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミドＢ１を５mlのＤＭＦ中に取り入れる。０.３５ml（３.３２mmol）のジエチルアミンを加え、この混合物を室温で１５分間撹拌する。この混合物を透明化層に通して吸引濾別し、高真空下で濃縮する。固体残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：１４１mg（８１％）。
【００９４】
２.２.３  コハク酸メチルtert−ブチル（Ｂ３）
アルゴン中で、１３.２ｇ（１００mmol）のコハク酸モノメチルを５００mlの塩化メチレン中に懸濁させる。３０分の期間にわたり、１２.９ml（１５０mmol)の塩化オキサリルを滴下し、続いてこの混合物を室温で６時間撹拌する。約３.５時間後、透明な溶液が生成する。続いて３００mlのtert−ブタノールを滴下する。次いでこの混合物を室温で２１時間放置し、この透明溶液を濃縮する。残留物を酢酸エチルに溶解し、Ｈ2Ｏ、ＮａＨＣＯ3溶液およびＨ2Ｏで洗浄する。この溶液をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮する。
収量：２１.６ｇ（粗製の油様生成物）。
【００９５】
２.２.４ コハク酸モノ−tert−ブチル（Ｂ４）
９.４ｇ（５０mmol）のコハク酸メチルtert−ブチル（Ｂ３）を１１５mlの１,４−ジオキサンに溶解する。続いて１１０mlの０.５Ｎ ＮａＯＨを加える。この混合物を室温で放置すると、生成物が沈殿する。この混合物を室温で週末を通じて放置し、続いて濃縮する。この水溶液をジエチルエーテルを用いて抽出する。水相を０℃に冷却し、冷２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を用いてpH４に酸性化する。続いてこの混合物をジエチルエーテルを用いて５回抽出する。有機相を一緒にし、Ｈ2Ｏで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮する。
収量：５.６２ｇの油状物（６４.５％）。
【００９６】
２.２.５ Ｎ−tert−ブチル−サクシニル−トランス−３−（２′−ナフチル)−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド（Ｂ５)  ２６２mg（０.５mmol）のトランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド（Ｂ２）、８７.１mg（０.５mmol）のコハク酸モノ−tert−ブチル（Ｂ４）および６７.５mgのＨＯＢｔを５mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、１１０mgのＤＣＣを加え、この混合物を０℃で１時間、次いで室温で２時間撹拌し、室温で一夜放置する。沈殿を吸引濾別し、濾液を高真空下で濃縮する。残留物をＮａＨＣＯ3溶液と共に磨砕し、吸引濾別し、Ｈ2Ｏで洗浄し、デシケーター中で乾燥する。
収量：１６９mg（４９.６％）。
【００９７】
２.２.６ Ｎ−サクシニル−トランス−３−（２′−ナフチル）−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド（３４）
３１６mgのＮ−tert−ブチル−サクシニル−トランス−３−(２′−ナフチル)−Ｌ−プロリン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−アラニン−Ｌ−バリン−アミド(Ｂ５)を２mlの濃度９０％のトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で１時間放置する。続いてこの混合物を、透明化層を通して濾別し、濃縮する。残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。これにより、１５９mgの粗生成物を得る。精製のため、この物質をSephadex(R) LH20 上でブタノール／氷酢酸／水の混合物を用いてクロマトグラフィーで処理する。
収量：２７.５mg（９.５％）。
m／z：６２５.２９８９４９（Ｍ＋Ｈ）＋（高分解能質量スペクトル）。
【００９８】
化合物３４のＮＭＲデータ：
【化６２】
0004542272.tif 000044
【００９９】
【表１３】
0004542272.tif 000045
【０１００】
【表１４】
0004542272.tif 000046
【０１０１】
２.３ Ｎ−サクシニル−Ｌ−（２−ナフチル）アラニニル−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−セリニル−Ｌ−バリニル−グリシン−３−ヒドロキシプロピルアミド（２４）
【化６３】
0004542272.tif 000047
【０１０２】
２.３.１ ベンジルオキシカルボニル−グリシン−（３−プロパノール）アミド（Ｃ１）
６２７ｇ（３０mmol）のＧｌｙ−ＯＨ、２.４５mlの３−アミノ−１−プロパノールおよび４.０５ｇのＨＯＢｔを６０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、６.６ｇのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌し、室温で一夜放置する。沈殿を吸引濾別し、濾液を高真空下で濃縮する。残留物を酢酸エチルとＮａＨＣＯ3溶液との間に分配する。次いで有機相をＮａＨＣＯ3溶液およびＨ2Ｏ／ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥し、濃縮する。残留物をジエチルエーテルと共に磨砕する。
収率：７.０５ｇ（８８.２％）。
【０１０３】
２.３.２ ベンジルオキシカルボニル−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ２）
７ｇ（２６.２８mmol）のベンジルオキシカルボニル−グリシン−（３−プロパノール）アミド（Ｃ１）を６０mlのジオキサンに溶解する。低温（液体ＣＯ2)で、６mlのＨ2ＳＯ4をゆっくりと加える。続いて６０mlの縮合イソブチレンを加える。この混合物をオートクレーブ中で室温において約２０バールの窒素圧で３日間振とうする。次いでこの混合物をジエチルエーテルと混合し、２Ｎ Ｎａ2ＣＯ3溶液で３回抽出する。この水溶液をジエチルエーテルで洗浄する。有機相を一緒にし、水洗し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮する。
収量：７.９８ｇ（９４.２％）。
【０１０４】
２.３.３ グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ３）
７.９８ｇ（２４.７５mmol）のベンジルオキシカルボニル−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ２）を８０mlのＭｅＯＨに溶解し、Ｐｄ／炭素と混合し、自動タイトレーター上でメタノール性ＨＣｌおよびＨ2を用いて水素化する。続いて触媒を吸引濾別し、濾液を濃縮する。残留物を高真空下で乾燥する。
収量：４.７ｇ（８４.５％）。
【０１０５】
２.３.４ ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ４）
５.１３ｇ（２０.４３mmol）のベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−ＯＨ、４.５９ｇ（２０.４３mmol）のグリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ３）および２.７５ｇのＨＯＢｔを６０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、２.６５mlのＮ−エチルモルホリンおよび４.５ｇのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間、次いで室温で２時間撹拌する。この混合物を室温で一夜放置し、次いで高真空下で濃縮する。残留物を氷酢酸とＮａＨＣＯ3溶液との間に分配する。次いで氷酢酸層をＮａＨＣＯ3溶液、ＫＨＳＯ4溶液およびＨ2Ｏ／ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥し、濃縮する。固体残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：７.３２ｇ（８５％）。
【０１０６】
２.３.５ Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル)アミド塩酸塩（Ｃ５）
７.２９ｇ（１７.３mmol）のベンジルオキシカルボニル−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ４）を９０mlのＭｅＯＨに溶解し、Ｐｄ／炭素と混合し、自動タイトレーター上でメタノール性ＨＣｌを用いて水素化する。続いて触媒を吸引濾別し、濾液を濃縮する。残留物（無定形）を高真空下で乾燥し、ジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：５.２２ｇ（９３.２％）。
【０１０７】
２.３.６ ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ６）
５.４６ｇ（１８.５mmol）のＺ−Ser(But)OH、６ｇ（１８.５mmol）のＬ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ５）および２.５ｇのＨＯＢｔを６０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、２.４mlのＮ−エチルモルホリンおよび４.０７ｇのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌する。この混合物を室温で一夜放置し、次いで高真空下で濃縮する。固体残留物を氷酢酸とＮａＨＣＯ3溶液との間に分配する。氷酢酸相をＮａＨＣＯ3溶液、ＫＨＳＯ4溶液およびＨ2Ｏ／ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥し、濃縮する。残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：９.７４ｇ（９３.２％）。
【０１０８】
２.３.７ Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ７）
９.７４ｇ（１７.２５mmol）のベンジルオキシカルボニル−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ６）を約１００mlのＭｅＯＨに溶解し、Ｐｄ／炭素と混合し、自動タイトレーター上でメタノール性ＨＣｌを用いて水素化する。続いて触媒を吸引濾別し、濾液を濃縮する。残留物（無定形）を高真空下で乾燥し、続いてジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：８.０２ｇ（９９.６％）。
【０１０９】
２.３.８ ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ８）
４.５３ｇ（１７mmol）のＺ−Ａｓｎ−ＯＨ、７.９４ｇのＬ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ７）および２.３ｇのＨＯＢｔを６０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、２.２１mlのＮ−エチルモルホリンおよび３.７４ｇのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間および室温で３時間撹拌し、次いで高真空下で濃縮する。残留物をペンタノールとＮａＨＣＯ3溶液との間に分配する。ペンタノール相をＮａＨＣＯ3溶液、ＫＨＳＯ4溶液およびＨ2Ｏ／ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、吸引濾別し、高真空下で濃縮する。残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、冷却し、吸引濾別する。生成物をデシケーター中のＰ2Ｏ5上で乾燥する。
収量：１０.８ｇ（９３.６％）。
【０１１０】
２.３.９ Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル)−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ９)
１０.８ｇ（１５.９mmol）のベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ８）を約１６０mlの温ＭｅＯＨに溶解し、Ｐｄ／炭素と混合し、自動タイトレーター上でメタノール性ＨＣｌを用いて水素化する。続いて触媒を吸引濾別し、濾液を濃縮する。無定形残留物を高真空下で乾燥し、ジエチルエーテルと共に磨砕し、冷却し、吸引濾別する。
収量：８.９６ｇ（９７％）。
【０１１１】
２.３.１０ ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ１０）
５.２４ｇ（１５mmol）のベンジルオキシカルボニル−２−Ｎａｌ−ＯＨ、８.７２ｇ（１５mmol）のＬ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ９）および２.０４ｇのＨＯＢｔを６０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、１.９５mlのＮ−エチルモルホリンおよび３.３ｇのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間および室温で３時間撹拌する。次いでこの混合物を室温で一夜放置し、ＤＭＦで希釈し、僅かに加熱する。続いて沈殿を吸引濾別し、高真空下で濃縮する。残留物をＮａＨＣＯ3溶液と共に磨砕し、吸引濾別し、次いでＫＨＳＯ4溶液と共に磨砕し、吸引濾別し、Ｈ2Ｏと共に磨砕し、吸引濾別し、Ｈ2Ｏで洗浄し、デシケーター中のＰ2Ｏ5上で乾燥する。
収量：１３.２５ｇ（＞９９％）。
【０１１２】
２.３.１１ Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ１１）
８.８５ｇ（１０.１mmol）のベンジルオキシカルボニル−Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド（Ｃ１０）を２７０mlのＭｅＯＨに部分的に溶解し、Ｐｄ／炭素と混合し、自動タイトレーター上でメタノール性ＨＣｌを用いて水素化する。この懸濁液をＤＭＦで希釈する。約６時間後、この混合物を最初の体積の半分まで濃縮する。全ての物質が溶解する。この混合物を室温で一夜放置する。続いて触媒を吸引濾別し、濾液を同量のＭｅＯＨで希釈し、新たな触媒（Ｐｄ／炭素）と混合し、さらに自動タイトレーター上で水素化する。７時間後、この混合物を室温で一夜放置する。続いてこの混合物をさらに４時間水素化し、触媒を吸引濾別し、濾液を濃縮する。残留物（無定形）を高真空下で乾燥し、続いてジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。
収量：７.５６ｇ（９６.２％）。
【０１１３】
２.３.１２ Ｎ−tert−ブチル−サクシニル−Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノール）アミド（Ｃ１２）
５２３mg（３mmol）のＬ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン（tert−ブチルエステル）−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノールtert−ブチルエステル）アミド塩酸塩（Ｃ１１）、２.３３ｇのコハク酸モノ−tert−ブチル（Ｂ４）および４０５mgのＨＯＢｔを２０mlのＤＭＦに溶解する。０℃で、０.３９mlのＮ−エチルモルホリンおよび６６０mgのＤＣＣを加える。この混合物を０℃で１時間、室温で２時間撹拌し、次いで室温で一夜放置する。この混合物を高真空下で濃縮し、固体残留物をＮａＨＣＯ3溶液と共に磨砕し、吸引濾別する。続いて生成物をＫＨＳＯ4溶液と共に磨砕し、吸引濾別し、Ｈ2Ｏで洗浄し、デシケーター中のＰ2Ｏ5上で乾燥する。
収量：３.０４ｇ（粗生成物）。
【０１１４】
２.３.１３ Ｎ−サクシニル−Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノール）アミド（２４）
３ｇ（粗生成物）のＮ−tert−ブチル−サクシニル−Ｌ−２−ナフチルアラニン−Ｌ−アスパラギン−Ｌ−セリン−Ｌ−バリン−グリシン−（３−プロパノール）アミド（Ｃ１２）を３０mlの濃度９０％のトリフルオロ酢酸に溶解し、室温で１時間放置する。続いてこの混合物を濃縮し、残留物をジエチルエーテルと共に磨砕し、吸引濾別する。これにより、２.６ｇの粗生成物を得る。精製のため、２５０mgの粗生成物を温氷酢酸に溶解し、Sephadex LH20上でブタノール／氷酢酸／水の混合物を用いてクロマトグラフィーで処理する。
収量：１０３mg
m／z：７３０.３４１２４６（Ｍ＋Ｈ)+（高分解能質量スペクトル）。
【０１１５】
化合物２４のＮＭＲデータ：
【化６４】
0004542272.tif 000048
【０１１６】
【表１５】
0004542272.tif 000049
【０１１７】
【表１６】
0004542272.tif 000050
【０１１８】
３. ラミニン／ニドゲン相互作用の阻害および生物活性
明記しない限り、使用した化学薬品はMerck (Darmstadt)、Sigma (Munich）またはRiedel de Haeen (Seelze）から購入した。
ヒト胎盤からのラミニンＰ１、トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞からのヒトニドゲンおよびＨＥＫ−２９３細胞からのマウスラミニンγ１ III 3−5 の単離はWO 98／31709に記載されている。
【０１１９】
実施例３.１ 阻害アッセイ−見出されたペプチド誘導体によるラミニン／ニドゲン結合の阻害
３.１.１ ＨＴＳスクリーニングアッセイ（高感度アッセイ変法）時間−分解蛍光アッセイ試験管のコーティング
マイクロタイタープレート（例えばFluoroNunc(R)）を、ラミニンＰ１の０.１μg／ml溶液７５μl（０.１５９ｇのＮａ2ＣＯ3、０.２９３ｇのＮａＨＣＯ3、０.０２ｇのＮａＮ3／リットル中、pH９.２）で室温において１時間コーティングした。次いで溶液を捨て、遊離した結合部位を、０.５％ＢＳＡ（７.９ｇのＮａＣｌ、１.２ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０.３１ｇのＫＣｌ、０.２３ｇのＮａＨ2ＰＯ4、０.０４％Tween 20／リットル中、pH７.２）と共に室温で０.５時間インキュベートすることによりブロックした。ブロック反応は溶液のデカンテーションおよび２５０μlの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０.０４％Tween）での洗浄の後に完了した。
【０１２０】
逐次的阻害
コーティングと平行して、阻害剤または標準物と一緒にした８５〜１００μlの０.２５nMニドゲン溶液（組み換え的に製造したヒトニドゲン）の予備インキュベートを、別の反応容器中で行った（７.９ｇのＮａＣｌ、１.２ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０.３１ｇのＫＣｌ、０.２３ｇのＮａＨ2ＰＯ4、０.０４％Tween 20、０.５％ＢＳＡ／リットル中、pH７.２で室温において１時間）。
７５μlの予備インキュベート物（ニドゲン＋阻害剤または標準物）を上記マイクロタイタープレートのコーティングしたウェル中に移し、室温で１時間インキュベートした。これに続いて、ＰＢＳ／０.０４％Tweenで２回洗浄した。
【０１２１】
結合したニドゲンの検出を、ヒトニドゲンで免役したニワトリの卵の卵黄から得られた７５μlの特異的抗体調製物と共に（室温で）１時間インキュベートすることにより行った。ＩｇＹ画分をＰＢＳ／０.０４％Tween中の１：５００の希釈物中で使用した。ニドゲンおよび特異的に結合した抗体の複合体をＰＢＳ／０.０４％Tweenで２回洗浄した後、抗−ニワトリＩｇＹ−ビオチン（７５μlの１：２５００希釈物；Promega, Madison, WI 53711, 608−274−4330）の添加により検出した。この目的で、１時間のインキュベーション時間およびＰＢＳ／０.０４％Tweenでの２回の洗浄の後、ストレプトアビジン−ユーロピウムと共にインキュベートし(Wallac；室温で１時間）、ＰＢＳ／０.０４％Tweenで２回洗浄した。最後に、１００μlの強化溶液（Wallac）を加えて５分間振とうさせた後、Victorマルチラベルカウンターにおいてユーロピウムプロトコールを用いて、蛍光シグナルを測定することが可能であった。阻害剤を含む溶液中の結合したニドゲン量と阻害剤を添加しないニドゲン量との間の関係を調べた。
【０１２２】
３.１.２ ３日平衡アッセイ
選択された阻害剤をこのアッセイ変法において阻害活性について調査した。このアッセイは米国特許番号US 5,493,008に記載されている。
下記の表において、選択された物質のＩＣ５０値をＨＴＳスクリーニングアッセイの結果と比較する。この３日アッセイが僅かに低い測定値を与え、予想したように、スクリーニングアッセイよりも感度がよいことが明らかである。しかしながらこの比較から、本発明者等が開発したスクリーニングアッセイにより阻害構造を確実に同定できることも明らかである。
【０１２３】
【表１７】
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【０１２４】
実施例３.２（仮説的）
ペプチド誘導体の生物活性の試験
文献に詳細に記載されている幾つかのモデルを用いてペプチド誘導体の生物活性を試験することができる。
【０１２５】
幾つかの代表的なものを以下に挙げる：
胚性腎臓の培養物における細管の形成。
Grobstein, C.: (1956) Exp. Cell Res. 10:424-440
Ekblom, P. et al. (1994) Development 120: 2003-2014
胚性肺における分岐形態学。
Ekblom, P. et al. (1994) Development 120: 2003-2014
胚性唾液腺における分岐形態学。
Grobstein, C. (1953) J. Exp. Zool. 124: 383-413
Kadoya, Y. et al. (1997) Development 124: 683-691
【０１２６】
器官型皮膚培養物における基底膜アセンブリー。
Smola, H.; Stark, H.-J.; Thiekoetter, G.; Mirancea, N.; Krieg, T.; Fusenig, N.E. (1998) Exp. Cell Res. 239: 399-410
崩壊細胞からのヒドラの再構築。
Yang, Y.G.; Mayura, K.; Spainhour, C.B.; Edwards Jr., J.F.; Phillips, T.D.(1993) Toxicology 85: 179-198
上昇したグルコース濃度で培養した後のヒドラにおける基底膜の肥厚。
Zhang, X.; Huff, J.K.; Hudson, B.G.; Sarras Jr.; M.P. (1990) Diabetologia 33: 704-707
【０１２７】
Jain, R.K.らによるNature Medicine (1997) Vol. 3, No. 11の概説論文において要約された全ての種類の定量的血管形成アッセイ、例えば：
自発血管内皮肉腫からの細胞の移植によるマウスにおける血管腫の誘発。
O'Reilly, M.S.; Brem, M.S.; Folkman, J. (1995) J. Pediatr. Surg. 30: 2; 325-329
ラット大動脈の血清不含培養物における微小血管の増殖。
Nicosia, R.F.; Ottinetti, A. (1990) Lab. Invest Vol. 63, No. 1, 115-122
フィブリンゲル中に埋め込んだ後の微小担体上での内皮細胞の毛管形成。
Nehls, V.; Drenckhahn, D.(1995) Microvascular Research 50: 311-322
【図面の簡単な説明】
【図１】  用いたリンカーの化学構造を示す。
【図２】  化合物１〜４の化学構造を示す。
【図３】  化合物５〜８の化学構造を示す。
【図４】  化合物９〜１２の化学構造を示す。
【図５】  化合物１３〜１６の化学構造を示す。
【図６】  化合物１７〜２０の化学構造を示す。
【図７】  化合物２１〜２４の化学構造を示す。
【図８】  化合物２５〜２８の化学構造を示す。
【図９】  化合物２９〜３２の化学構造を示す。
【図１０】  化合物３３〜３６の化学構造を示す。
【図１１】  化合物３７〜４０の化学構造を示す。
【図１２】  化合物４１〜４３の化学構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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