(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＣＦ２−７Ｆ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６５）の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＭＦ２−３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６４）の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】
哺乳動物の虫歯の予防または処置のための抗齲蝕生産物の製造方法であって、
ａ．ラクトバチルス・ロイテリの菌株を選択しおよび培養し、
ｂ．前記ラクトバチルス・ロイテリの菌株の、ストレプトコッカス・ムタンスに対する阻止活性および口のムチンへの粘着能力を評価し、ここで、前記菌株のストレプトコッカス・ムタンスに対する良好な阻止活性および口のムチンへの良好な結合を示すことの両方の能力が生産物に使用するラクトバチルス・ロイテリの菌株を決定するものであり、そして、
ｃ．段階ｂ．で選択したラクトバチルス・ロイテリの少なくとも１つの菌株の細胞を含む生産物を調整すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項４】
ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６５およびラクトバチルス・ロイテリ菌株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６４からなる群から選ばれるラクトバチルス・ロイテリの少なくとも１つの菌株の細胞を含んでなる、虫歯細菌の増殖を阻止するための生産物であって、前記菌株が口のムチンに対する良好な結合との組み合わせで虫歯菌に対する阻止活性を有する、上記生産物。
【請求項５】
生産物が食用生産物である、請求項４に記載の生産物。
【請求項６】
食用生産物が、ヨーグルト、ゼリー、プディング、チューインガム、キャンディー、チョコレート、ビスケット、クッキー、チーズ、ジュースおよびティーからなる群から選ばれる、請求項５に記載の生産物。
【請求項７】
食用生産物が乳含有生産物である、請求項５に記載の生産物。
【請求項８】
食用生産物がヨーグルトである、請求項７に記載の生産物。
【請求項９】
生産物が歯科処置用生産物である、請求項４に記載の生産物。
【請求項１０】
生産物がマウスウォッシュである、請求項９に記載の生産物。
【請求項１１】
少なくとも１つの菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６５およびラクトバチルス・ロイテリ菌株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４９６４からなる群から選ばれ、前記菌株が口のムチンに対する良好な結合との組み合わせで虫歯菌に対する阻止活性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
生産物が食用生産物である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
食用生産物が、ヨーグルト、ゼリー、プディング、チューインガム、キャンディー、チョコレート、ビスケット、クッキー、チーズ、ジュースおよびティーからなる群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
食用生産物が乳含有生産物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
食用生産物がヨーグルトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生産物が歯科処置用生産物である、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
生産物がマウスウォッシュである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非病原性抗齲蝕（以下、抗う食ということもある）原性菌株のスクリーニング方法の使用、ならびに口の細菌、例えばストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）および他の虫歯を惹起する病原体によって惹起される虫歯の処置および予防のためのそのような菌株を使用する生産物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび他の動物の口腔は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の多数の異なる種を含む、多くの異なる細菌の種を含有する。虫歯は細菌によって惹起される疾病である。１８９０年に、Ｍｉｌｌｅｒは「化学的−寄生的理論（Ｃｈｅｍｉｃｏ−ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｔｈｅｏｒｙ）」において、虫歯は消化性の炭水化物から酸を生成し、これが歯のヒドロキシヘパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐａｔｉｔｅ）を溶解する口の細菌によって惹起されるという仮説を提唱した。後に、例えば、主としてムタンス連鎖球菌群の正常な口の細菌叢が関与し、かつまた乳酸桿菌群も関与することがノトバイオティック・ラットにおいて確認された。口腔内に常在するこれらの「酸生成」菌種は、虫歯の存在および発生に関係している（非特許文献１）。全ヒト分離株の９０％において見いだされるストレプトコッカス・ムタンスとともに、群ムタンス連鎖球菌内には７細菌種（血清型ｃ，ｅ，ｆ）が存在する（非特許文献２）。虫歯の発生が歯垢中のＳ．ムタンスの比較的高い割合を必要とするという多くの証拠がある。これらの細菌は歯の表面によく粘着し、糖から他の細菌類よりも多量の酸を産生し、酸環境において他の細菌よりも良好に生存することができ、そしてスクロースから細胞外多糖を生産する。プラーク中のＳ．ムタンスの割合が高い（２〜１０％の範囲において）場合、患者は虫歯に対して高いリスクにある。割合が低い（０．１％未満）場合、患者は低いリスクにある。それらは他の細菌よりも酸許容性であるので、プラーク中の酸条件はムタンス連鎖球菌の生存と増殖にとって好ましい。２つの他の細菌類もまた象牙質を通して虫歯の進行に関係している。これらはラクトバチルスの数種、およびアクチノミセス・ビスコサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）である。これらの細菌はまた非常に酸生成性であり、そして酸条件において良好に生存する。虫歯におけるラクトバチルスの関与は確立されている（非特許文献３）。事実、異なる選択培地または他の技術を用いる、ムタンス連鎖球菌数の算定に加えて唾液中の乳酸桿菌数の算定は、「虫歯試験」として、かつ虫歯に対して高いリスクにある群を同定する試みのために長年使用されてきた。かくして、あるものはヒトの歯垢から分離されたラクトバチルス菌株は、高度にう食原性であり得る（非特許文献４）。
【０００３】
細菌にとって虫歯の形成において主要な病原体であることは、それがいくつかの必要な特徴（非特許文献２）：歯の表面における粘着とコロニー形成能；歯の限られた表面での大きな菌数における蓄積能；食物中に見いだされる炭水化物からの迅速な酸生成能；および歯垢における低いｐＨの下での酸生成の継続能の組み合わせを有することが要求される。  食物スクロースはプラークの濃厚さと化学的性質をともに変化させる。ムタンス連鎖球菌および若干の他のプラーク細菌は、スクロースの二糖結合の単糖成分（グルコースおよびフルクトース）とエネルギーを使用して細胞外多糖を組み立てる。これらは実質的にプラークの濃厚さを増大し、そしてまたその細胞外空間の化学的性質を液体からゲルへと変える。ゲルは若干のイオンの運動を制限する。濃厚なゲル状プラークは唾液の緩衝作用から保護された歯の表面に対する酸環境の発達を可能にする。スクロースと接触したことのないプラークは、より希薄であり、より良好な緩衝作用を有している。したがって、高い割合のスクロースを含む食事は虫歯のリスクを増大する。より濃厚なプラークは歯の咬合窩と裂溝に、そして口腔衛生の乏しい患者では歯肉の縁に発生する。
【０００４】
疾病の性質についてこの概念があれば、虫歯の予防および処置が、例えば、細菌のための基質を低減するという手段としての食事変換をとおして、Ｓ．ムタンスの影響を阻害して歯の表面構造を補強するか、またはＳ．ムタンス菌の数を低減することを要することは明らかである。かくして、試みられた処置は：局所的クロロヘキシジンおよび局所的フッ化物のような薬剤を使用して微生物叢を変化させる努力；食事変換や、Ｓ．ムタンスによつ代謝がより難しい甘味剤、例えば、ソルビトール、アスパルタン、キシリトールへの置換によって、食物スクロースの量を低減すること；食事の選択によって飲食の頻度を減少させること；特に歯磨き時の毎日の適用によってフッ化物を付加すること；および激しい咀嚼時の機械的刺激を用いて流出を増進するか、流出を低下させる薬物を交換するか、または流出を増進する薬物を使用することによって、唾液の流出を増加することを含む。
【０００５】
種々のアプローチが虫歯を予防するために評価された、例えば、１つの組成物はストレプトコッカス・ムタンスに特異的なバクテリオファージによって産生される溶菌酵素を使用する（特許文献１）。また、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ）の１菌株が、有害な連鎖球菌を中和するようその表面に抗体を生産させるために遺伝子工学により改変された（非特許文献５）が、遺伝的に改変された生物によるこのアプローチは未知の安全性承認局面に面している。
【０００６】
さらに、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１菌株（菌株ＧＧ）が、一般にストレプトコッカス・サブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｂｒｉｎｕｓ）およびムタンス連鎖球菌を低減する共生方法として奨励された（非特許文献６）。さらなる研究は、乳発酵におけるスターターとしてのこの菌株の使用が、乳中に存在しているヒトのう食原性細菌に対する抗体の力価に影響しないことを示した（非特許文献７）。Ｌ．ラムノサスＧＧは、発酵特性と分離源を含む多くの点でＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）とは異なる。歯垢の形成に対して阻害活性を有することが見い出された他の微生物は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｖ２０およびラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）１３７０を含む（特許文献２）。Ｓ．ムタンスを阻止するために、他の研究がいわゆる「競合的排除」概念を用いて実施された。例えば、Ｌ．ロイテリ菌株ＡＴＣＣ５５７３０はＳ．ムタンスを阻止することが見い出された（非特許文献８）。ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の１菌株（ＬＳ１）（Ｆｒｅｎｔｅ  Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎによる）を含有する、ＬＳ１と呼ばれる日本で市販されている錠剤生産物はＳ．ムタンスを阻止することで特許請求されている。
【０００７】
ラクトバチルス・ロイテリを含む、広範なラクトバチルス種の菌株が共生的発酵において使用された。ラクトバチルス・ロイテリは、動物の胃腸管の天然に存在する常在菌の１種であり、日常的には腸管内に、そして場合によっては、ヒトを含む健康な動物の産道、乳房内の乳および口中に見い出される。それは抗菌活性をもつことが知られている。参照、例えば、特許文献３，４，５，６および７。Ｌ．ロイテリ細胞がグリセロールの存在で嫌気的条件下で増殖される場合、それらはロイテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）（β−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド）として既知の抗微生物物質を生産する。
【０００８】
伝統的な有機酸以外の他の抗微生物物質、例えば「ロイテリシクリン（Ｒｅｕｔｅｒｉｃｙｃｌｉｎ）」（非特許文献９）および「ＰＣＡ（ピログルタミン酸）」（非特許文献１０）もまた報告されている。Ｌ．ロイテリを含む乳酸桿菌もまた、栄養物の局部的競合と他の代謝的相互作用を通して他の生物、例えばＳ．ムタンスを阻止する能力を有することがよく知られている。免疫調節および抗炎症活性もまたＬ．ロイテリに関係している。Ｌ．ロイテリのムチン結合タンパク質が単離され、報告されている。参照、例えば、特許文献８。
【０００９】
ラクトバチルス菌株は、種々の細胞系および宿主粘液に粘着することが報告されている。このことは共生活性にとって重要であると推測されており、そしてそのような相互作用の莫大な列が前世紀中に発見された病原菌における毒性因子の概念から誘導される（非特許文献１１）。
【００１０】
Ｌ．ロイテリによる効果的な抗菌活性の可能性が知られており、Ｌ．ロイテリのある種の結合特性、例えばムチン結合が既知であり、そしてＬ．ロイテリ菌株ＡＴＣＣ５５７３０およびラクトバチルスＧＧ  ＡＴＣＣ５３１０３のＳ．ムタンス阻止効果もまた既知であるが、両阻止効果と結合活性の結果として、口腔内のストレプトコッカス・ムタンスの数とそれによる虫歯を低減する能力において実質的な差異が乳酸桿菌の菌株間に存在することも、あるいはそのような菌株が選択できることも、従来知られていなかった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、口のムチンおよび歯垢への良好な結合と組み合わせた抗微生物活性を通して、口中のＳ．ムタンスの数を低減し、それによって虫歯を予防、緩和または処置する能力について選択されたラクトバチルスのより良好な菌株を提供することである。本発明のさらなる目的は、ヒトへの投与のためのＳ．ムタンスが関与する虫歯の予防または処置のための薬剤を含む、該菌株を含有する生産物を提供することである。
【００１２】
他の目的および利点は、次に示す開示および付随する請求項から一層完全に明らかになるであろう。
【特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉらの米国特許第６，３９９，０９８号
【特許文献２】Ｏｈ，米国特許第６，０３６，９５２号
【特許文献３】米国特許第５，４３９，６７８号
【特許文献４】米国特許第５，４５８，８７５号
【特許文献５】米国特許第５，５３４，２５３号
【特許文献６】米国特許第５，８３７，２３８号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，２８９号
【特許文献８】米国特許第６，１００，３８８号
【非特許文献１】Ｌｏｃｓｃｈｅ  ＷＪ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ  Ｒｅｖ．，１９８６：５０：３５３−３８０）
【非特許文献２】Ｌｉｎｄｅｒ  Ｌ．，Ｏｒａｌ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉ  １９９６，ＩＳＢＮ  ９１−７２０５−０３７−３．
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  １０５：７７−８５，２００１）
【非特許文献４】Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．６０：９１９−９２６，１９８１．
【非特許文献５】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｌ．，Ｊｕｌｙ  ２００２  ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献６】Ｎａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ．３５：４１２−４２０，２００１．
【非特許文献７】Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：９−１５，２００２．
【非特許文献８】Ｎｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｊｕｌｙ  １１，２００２．
【非特許文献９】Ｈ  ｌｔｚｅｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ３９，２７６６−２７６８，２０００．
【非特許文献１０】Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｍａｒｃｈ  ２０００．
【非特許文献１１】Ｋｌｅｍｍ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｍｂｒｉ，Ｍ．Ａ．（２０００）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０，２７−３５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明はここに、口のムチンおよび歯垢への良好な結合と組み合わせた阻止活性を通して哺乳動物の口中のストレプトコッカス・ムタンスの数を低減し、それによって虫歯を予防、緩和または処置する能力について選択されたラクトバチルスの菌株、ヒトへの投与のための虫歯の処置または予防用の薬剤を含む、該菌株から得られる生産物、ならびにこれらの生産物を製造する方法を含む。
【００１４】
本発明の他の目的および特徴は、次に示す開示および付随する請求項から一層完全に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、口のムチンおよび歯垢への良好な結合と合わせて、ストレプトコッカス・ムタンスに対する良好な抗微生物活性をともに有するラクトバチルスの少なくとも１種の選択された菌株の細胞を含んでなる、虫歯細菌の増殖と活性を阻止し、それによって虫歯を予防、緩和または処置するための生産物を提供する。そのような菌株は、Ｌ．ロイテリＣＦ２−７Ｆ（２００３年１月２９日にＡＴＴＣに寄託され、指定された時にここに含まれる番号）およびＬ．ロイテリＭＦ２−３（２００３年１月２９日にＡＴＴＣ寄託され、指定された時にここに含まれる番号）。
【００１６】
口腔中のストレプトコッカス・ムタンスの数を低減する能力に加えて、本発明におけるラクトバチルス株選択のための他の基準は、宿主のムチンに粘着する菌株の能力である。事実、乳酸桿菌は粘膜表面およびその成分への粘着をすることが分かっている。粘液への乳酸桿菌の粘着に関する研究は、多くの菌株がイン・ビトロにおいて粘液物質に結合する能力を明らかに欠くことを示した。これらの非結合菌（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｅｒ）の多くが粘膜表面から単離されたので、増殖の環境が細菌の粘着性に影響することが推測できる。
【００１７】
ここで使用された選択方法では、粘着特性は、細菌の増殖培地中にムチンを含有させて腸の環境を部分的に模倣することによって試験された。かくして、実施例において議論されるように、本発明の選択方法は、１）ラクトバチルス菌株によるＳ．ムタンスの阻止効果の評価；および２）ラクトバチルスによるムチン結合効果の評価を含む。
【００１８】
本発明の生産物は、虫歯の予防または処置として口中に置くため、または栄養もしくは息（ｂｒｅａｔｈ）の目的のためのすべての生産物、例えば、食用生産物、歯科処置用生産物、例えばマウスウォッシュ、または他の特殊な健康用生産物、チューイングガム、等々であってもよい。特に本発明における使用にかなう食用生産物は、乳含有生産物、例えばヨーグルト、およびまたジュース、飲料などを含む。本発明において使用できる歯科処置用生産物は、練り歯磨き、液体歯磨き、マウスウォッシュ、抗口臭生産物などを含む。
【００１９】
本発明の生産物の効力のために必要な選ばれたラクトバチルス細胞の濃度は、食物の種類および摂取される食物の量（または非食用の歯科処置用生産物の口中の使用時間）に依存するが、通常、生産物１グラム当たり約１０６〜１０７ＣＦＵ（コロニー生成単位）またはそれ以上を有することが好ましい。約１０１０〜１０１１ＣＦＵまでの量が可能であり、生産物の感覚受容特性（その風味もしくは香り）に悪い影響を与えることなく効力を増大するために使用できる。生産物がヨーグルトもしくは他の乳酸発酵生産物である場合、この生産物を製造するために使用される乳酸発酵菌株は、好ましくは、この特定の目的のための標準的な培養物であり、そして本発明の抗う食原性細菌は、先に議論されたようにヨーグルト１ｍｌ当たり約１０６〜１０７ＣＦＵまたはそれ以上のレベルにおいて生産物の発酵前後のいずれに添加されてもよい。
【００２０】
好ましくは、本発明の生産物は、選ばれたラクトバチルス菌株を阻止または殺菌するか、またはその抗う食原性活性を妨害する他の抗菌成分を少なくとも１つも含有しない。
【００２１】
ラクトバチルスの菌株は、その種類の生産物の製剤化のための当該技術分野において既知の手段によって成分中に混合されるか、または生産物に混練されるか、またはコーティングされる添加物であってもよい。本発明の選ばれた食物もしくは他の生産物の製造が加熱段階を要する場合、ラクトバチルス菌株は加熱後に添加されなければならない。既に選ばれたラクトバチルス細胞が生産物中に存在する場合は、長時間６０〜７０℃またはそれ以上に生産物を加熱することは好ましくない。
【００２２】
本発明の特徴は、次の実施例を引用することによってより明瞭に理解できるが、これは本発明を限定するものと考えてはならない。
【実施例１】
【００２３】
菌株の選択方法
本発明により使用されるラクトバチルス菌株の選択は次の２段階方式において実施することができる：
ａ）ラクトバチルス菌株によるＳ．ムタンスの阻止効果の評価
阻止効果を測定するために使用する菌株の１例はスタフィロコッカス・ムタンス、ＡＴＣＣ２５１７５（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡから得られる）である。分離株は、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）を補足したトリプティカーゼ大豆ブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）（ＴＳＢＹ）において増殖される。細胞は対数増殖期に１０００ｘｇでの遠心分離によって収穫し、ＰＢＳにより２回洗浄し、そして同じバッファーに再懸濁する。細胞懸濁液を低度の超音波装置にかけて細菌の凝集塊を分散させる。
【００２４】
試験ラクトバチルス菌株を脳・心臓浸出液ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させ、対数増殖期に１０００ｘｇでの遠心分離によって収穫し、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ６．８）により２回洗浄し、そして同じバッファーに再懸濁する。
【００２５】
細菌懸濁液の光学濃度を１ｃｍ光路の１．０ｍｌキュベットにおいて測定し、そして懸濁液を最終濃度１．０ｘ１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌに調節する。
【００２６】
阻止アッセイは次のように実施される：Ｓ．ムタンスの懸濁液とラクトバチルスの懸濁液を無菌遠心チューブ中で１００−０，７５−２５，５０−５０および２５−７５の比で混合し（総容量１００μｌ）、１０ｍｌまでＢＨＩブロスを添加し、１０秒間回転混合し、そして弱い振盪をしながら３７℃で９０分間インキュベートする。対照として、Ｓ．ムタンスの懸濁液を対照チューブ（ラクトバチルス不含）中で等容量のＰＢＳと混合する。その後、各懸濁液を１０００ｘｇでの遠心分離によって洗浄し、ＰＢＳにより２回洗浄し、そしてＭＳ寒天プレートに塗布してＳ．ムタンスのＣＦＵカウントを決定する。Ｓ．ムタンスの生存％は次の式から得られる。
【００２７】
【数１】
0004486957.tif 000002
【００２８】
アッセイは最小３並列のサンプルにより実施すべきである。得られたすべての数字データは統計学的に解析すべきである。
【００２９】
ｂ）ラクトバチルスによるムチン結合効果の評価
ブタの胃からのムチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を濃度０．１ｍｇ／ｍｌにおいてｐＨ９．７の炭酸バッファーに懸濁する。この溶液２００μｌをミクロタイターウェル中にピペットで採取し、３７℃で約３時間、コーティングのために放置する。ウェルを２００μｌＰＢＳ１％Ｔｗｅｅｎ２０の添加によって室温で１時間ブロックし、そしてＰＢＳ０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。ラクトバチルスの評価菌株を、イン・ビボの増殖条件を模倣して０．０１％ブタ・胃ムチン（Ｓｉｇｍａ，Ｍ１７７８）を補足したＭＲＳブロスにおいて３７℃で一夜増殖させ、次いでＰＢＳＴで洗浄し、再懸濁する。細菌細胞の光学濃度（ＯＤ）をＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６５０分光光度計で６００ｎｍにおいて測定し、ＯＤ０．５に調節する。１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、４℃で一夜インキュベートする。ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、そして結合を倒立顕微鏡により検査する。バッファーを注ぎ出し、ウェルを乾燥した後、ＯＤ４０５をＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて測定する。結合の結果を０〜３のスケールでスコアするが、ここで０は結合なしであり、３はムチンに対する強い結合である。
【００３０】
Ｓ．ムタンスの阻止ならびにムチンへの結合の両方で最良の結果を示すラクトバチルス菌株を、このアッセイにより選択する。
【実施例２】
【００３１】
菌株の選択
１．Ｌ．ロイテリＳＤ２１１２（ＡＴＣＣ５５７３０）
２．Ｌ．ロイテリＤＳＭ２００１６（ＤＳＭ２００１６）
３．Ｌ．ロイテリＭＭ２−３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９）
４．Ｌ．ロイテリＣＦ２−７Ｆ（指定された時にここに含まれるＡＴＴＣ番号）
５．Ｌ．ロイテリＭＦ２−３（指定された時にここに含まれるＡＴＴＣ番号）
６．Ｌ．ロイテリＭＦ１４−Ｃ（Ｂｉｏｇａｉａ  ＡＢ，Ｒａｌｅｉｇｈ  ＮＣ，
ＵＳＡのカルチャー・コレクション）
７．Ｌ．ロイテリＭＦ５２−１Ｆ（Ｂｉｏｇａｉａ  ＡＢ，Ｒａｌｅｉｇｈ  ＮＣ，
ＵＳＡのカルチャー・コレクション）
８．Ｌ．サリバリウスＬＳ１（Ｆｒｅｎｔｅ  Ｌｔｄ．ＪａｐａｎによるＬＳ１錠剤
から分離）
９．Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）
この研究においては、前記ラクトバチルス菌株を、本発明にしたがってＳ．ムタンスの阻止およびムチンへの粘着という選択基準を用いて評価するために選ぶ。実施例１に記述した方法を使用する。もっとも適当な菌株であるとして選択された菌株は、ラクトバチルス菌株細胞のＳ．ムタンス阻止効果およびムチンへの粘着の組み合わせに基づいている。
【００３２】
【表１】
0004486957.tif 000003
【実施例３】
【００３３】
選ばれたラクトバチルス菌株の効力の確認
実施例２のリストにしたがって添加した評価ラクトバチルス株を用いて発酵させた乳（試験ヨーグルト）、およびプラセボ発酵乳（プラセボ・ヨーグルト）のムタンス連鎖球菌の口中保菌（ｃａｒｒｉａｇｅ）に及ぼす効果を検討する。試験ヨーグルトは次のとおりである：
−試験ヨーグルト１．、Ｌ．ロイテリＳＤ２１１２含有
−試験ヨーグルト２．、Ｌ．ロイテリＤＳＭ２００１６含有
−試験ヨーグルト３．、Ｌ．ロイテリＭＭ２−３含有
−試験ヨーグルト４．、Ｌ．ロイテリＣＦ２−７Ｆ含有
−試験ヨーグルト５．、Ｌ．ロイテリＭＦ２−３含有
−試験ヨーグルト６．、Ｌ．ロイテリＭＦ１４−Ｃ含有
−試験ヨーグルト７．、Ｌ．ロイテリＭＦ５２−１Ｆ含有
−試験ヨーグルト８．、Ｌ．サリバリウスＬＳ１含有
−試験ヨーグルト９．、Ｌ．ラムノサスＧＧ含有
−試験ヨーグルト１０．プラセボ、以下参照
２００人の健康な女性被験者（年齢；２０±２才）を１０群に分ける。全被験者はいかなる活性なう食病巣、歯肉炎もしくは歯根膜疾患のいずれの症候も有してはならない。第１群の被験者は、２週間の間、毎日昼食時（１２：００〜１３：００）にプラセボ・ヨーグルト１カップ（９５ｇ）を食し、次いでその後の２週間の間昼食時に試験ヨーグルトＮｏ．１の１カップを食す。第２群の被験者は、２週間の間、毎日昼食時（１２：００〜１３：００）にプラセボ・ヨーグルト１カップ（９５ｇ）を食し、次いでその後の２週間の間１日の昼食時に試験ヨーグルトＮｏ．２の１カップを食し、そしてすべて９試験群については第１群と同じようにする。試験群Ｎｏ．１０は両期間プラセボ・ヨーグルトを食する。各種ヨーグルトの摂食前後に、ムタンス連鎖球菌の口中保菌レベルを次のように決定する。未刺激での総唾液約５ｍｌを１５：００〜１６：００に氷上の容器中に収集する。次いで、ムタンス連鎖球菌の口中保菌を慣用の生存菌数によって決定する。プラセボ・ヨーグルトは、発酵乳製品において広く用いられるＬ．ブルガリスとＳ．サーモフィルスからなり、このプラセボ・ヨーグルトを８０℃で１０分間加熱して微生物を殺菌し、試験ヨーグルトＮｏ．１０として調製さる。被験者および研究者は共に、研究中どのヨーグルトがどの試験微生物を含有していたかを知らない。ラクトバチルスもしくは他の製薬学的乳酸菌を含有する他の生産物の使用は、本介入前１週間および介入中は禁止される。データは統計学的に解析される。
【００３４】
【表２】
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【実施例４】
【００３５】
選ばれた菌株を含有する生産物の製造
この実施例では、Ｌ．ロイテリＣＦ２−７Ｆ（指定された場合付加されるＡＴＴＣ番号）が、標準的ヨーグルトに菌株を添加するために、Ｓ．ムタンス阻止とムチン結合に関して上記方法を用いて選択された。Ｌ．ロイテリ菌株を、酪農産業においてラクトバチルスを増殖させる標準的方法を用いて、増殖させ、凍結乾燥した。次いでこの培養物を伝統的なヨーグルト培養物を用いて前以て発酵した乳に、１０７ＣＦＵ／ヨーグルト１ｇのレベルにおいて添加し、そしてこのヨーグルトを虫歯を予防する方法としてヒトによって使用した。
【００３６】
ある代表的な実施態様がここに記述されたが、当業者は、改変が本発明の精神または範囲を逸脱することなく作成できることを容易に認識できる。
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１．ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＣＦ２−７Ｆ（与えられるＡＴＣＣ番号）の生物学的に純粋な培養物。
２．ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＭＦ２−３（与えられるＡＴＣＣ番号）の生物学的に純粋な培養物。
３．口のムチンへの良好な結合と組み合わせた阻止活性の選択アッセイを用いて、哺乳動物の虫歯の予防または処置のために口中のストレプトコッカス・ムタンスの数を低減する能力について選択されたラクトバチルスの生物学的に純粋な培養物。
４．口のムチンへの良好な結合と組み合わせて齲蝕原性細菌に対する阻止活性を有するよう選択されたラクトバチルス・ロイテリの少なくとも１菌株の細胞を含んでなる、虫歯細菌の増殖を阻止するための生産物。
５．少なくとも１つの菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＣＦ２−７Ｆ（与えられるＡＴＣＣ番号）およびラクトバチルス・ロイテリ菌株ＭＦ２−３（与えられるＡＴＣＣ番号）からなる群から選ばれる、４．に記載の生産物。
６．生産物が食用生産物である、４．に記載の生産物。
７．食用生産物が、ヨーグルト、ゼリー、プディング、チューインガム、キャンディー、チョコレート、ビスケット、クッキー、チーズ、ジュースおよびティーからなる群から選ばれる、６．に記載の生産物。
８．食用生産物が乳含有生産物である、６．に記載の生産物。
９．食用生産物がヨーグルトである、８．に記載の生産物。
１０．生産物が歯科処置用生産物である、４．に記載の生産物。
１１．生産物がマウスウォッシュである、１０．に記載の生産物。
１２．口のムチンへの良好な結合と組み合わせて齲蝕原性細菌に対する阻止活性を有するよう選択されたラクトバチルス・ロイテリの少なくとも１菌株の細胞を生産物に添加することを含んでなる、抗う食原性生産物を製造する方法。
１３．少なくとも１つの菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ菌株ＣＦ２−７Ｆ（与えられるＡＴＣＣ番号）およびラクトバチルス・ロイテリ菌株ＭＦ２−３（与えられるＡＴＣＣ番号）からなる群から選ばれる、１２．に記載の方法。
１４．生産物が食用生産物である、１２．に記載の方法。
１５．食用生産物が、ヨーグルト、ゼリー、プディング、チューインガム、キャンディー、チョコレート、ビスケット、クッキー、チーズ、ジュースおよびティーからなる群から選ばれる、１４．に記載の方法。
１６．食用生産物が乳含有生産物である、１４．に記載の方法。
１７．食用生産物がヨーグルトである、１６．に記載の方法。
１８．生産物が歯科処置用生産物である、１２．に記載の生産物。
１９．生産物がマウスウォッシュである、１８．に記載の生産物。
【００３７】
【表３】
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