(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子系統群の生体外非ランダム低ホモロジー・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法であって、
ａ）遺伝子系統群ライブラリから前記遺伝子系統群の相同ポリヌクレオチドの少なくとも二つからなる孤立鎖制限断片を得るが、前記相同ポリヌクレオチドのホモロジーが５０％よりも低いこと、
ｂ）前記断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上のテンプレートへハイブリダイズすることによって、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記テンプレートは、孤立鎖であり、前記テンプレートの少なくとも一つは、前記相同ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有し、且つ、該テンプレートの配列は、シャフリングまたはその他の人工的な処理から生じる合成のものであること、
ｃ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること、なお、前記処理は、順序に関係なく次のことからなり、
（ｉ）ニックをライゲートすること、そして
（ｉｉ）次のギャップを満たす技術の一つあるいは組合せを行うこと、
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと、そして
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと、そして、
前記組み換えポリヌクレオチドがステップ（ａ）〜（ｃ）の１サイクルの後に形成されることを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップが生体外で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記テンプレートが、最初は二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、テンプレート鎖を排除、分離、あるいは分解するよう、組み換えポリヌクレオチドの前記テンプレート鎖を処理することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
テンプレートがｍＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）において、補足あるいは代理断片が加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、相同ポリヌクレオチド上に多数の切断部位を持つ少なくとも一つの制限酵素で、あるいは複数の異なる制限酵素で、前記相同ポリヌクレオチドを断片化することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）における断片が、長さで少なくとも１５残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）が、別個のポリヌクレオチド・ライブラリから、断片の少なくとも二つの母集団を得ること、あるいは異なる制限酵素を用いて、同じポリヌクレオチド・ライブラリから、断片の少なくとも二つの別個の母集団を得ることからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）が、ＤＮアーゼＩでランダムに相同ポリヌクレオチドを断片化することからなり、前記相同ポリヌクレオチド、あるいはそれらから得た断片が、最初は二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における断片が、長さで少なくとも５０残基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）の断片が増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）の断片が、テンプレートの全長に沿って隣接する端部を持つ断片を生成するオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、相同ポリヌクレオチドを３以上の断片へ断片化することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）そして／あるいはステップ（ｃ）で使用のために、フラップ・エンドヌクレアーゼが加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
フラップ・エンドヌクレアーゼの濃度が２μｇ／ｍｌであり、ハイブリダイゼーションが１０℃の温度で起こり、そしてライゲーションが６５℃の温度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド・ライブラリが、天然の遺伝子から、連続的な方向定位の突然変異誘発によって、エラー・プローンＰＣＲによって、ランダムな化学的突然変異誘発によって、生体内でのランダムな突然変異誘発によって、あるいは同じ、または異なる種内の遺伝子系統群からの遺伝子を結合することによって生成されることで、前記ポリヌクレオチド・ライブラリ内に種々の配列がもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチド・ライブラリが合成配列からなる、またはステップ（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）において合成断片が加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
組み換えポリヌクレオチドが、重合酵素を使用せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
組み換えポリヌクレオチドが、交差あるいは鎖乗り換えを誘発せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
断片及び組み換えポリヌクレオチドが、サイズ分画せずに得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）が、単一のハイブリダイゼーション事象を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）が単一のハイブリダイゼーション事象を必要とし、ステップ（ｃ）が全くハイブリダイゼーション事象を必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
相同ポリヌクレオチドが、互いに２０から４５％相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
相同ポリヌクレオチドの少なくとも半分が、互いに２０から４５％だけ相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、生体外で組み換えポリヌクレオチドを翻訳し、そのタンパク質を発現させることからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択するステップ（ｄ）からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、ステップ（ｄ）の前に、しかし、テンプレート鎖を排除、分離、あるいは分解した後に、組み換え鎖から二本鎖の組み換えポリヌクレオチドを再生成し、そして前記二本鎖の組み換えポリヌクレオチドをクローンすることからなる、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して遺伝子組み換えに関し、特に、有向進化、分子的繁殖あるいはＤＮＡシャフリングとして知られる分野に関する。本発明は、基準配列に比較して、改良された特性を持つ新奇な配列を生成することを目的とする。生物体の外で行う場合、このプロセスは、生体外進化のための技術である。本発明は、さらに、この方法によって生成される配列、このような配列のライブラリ、このような配列を含むホスト及びベクターそれから変換したタンパク質に関し、本発明の方法をシミュレートするアレイに、また、方法を行うことが可能なアレイに関する。本発明は、さらに、方法の中間産物に、そして特定なタイプのポリヌクレオチド断片及び組織化テンプレートの反応混合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド配列の生体外組み換えを促進する種々の技術が知られている。最もよく知られる従来の技術には、重合に依存するセクシャルＰＣＲ（プライマーを加えない多数のサイクル）及び付着伸長（ＳｔＥＰ）を含むＤＮＡシャフリングがある。
【０００３】
典型的に、セクシャルＰＣＲを含むＤＮＡシャフリングでは、ＤＮアーゼＩがランダムにポリヌクレオチド配列を切断してオリゴヌクレオチド断片を形成し、断片が重合すなわちＰＣＲ延長を開始し、そして組み換えポリヌクレオチドが増幅される。各ハイブリダイゼーション・ステップにおいて、配列間の相同領域において交差が発生する（「鎖乗り換え」）。図１Ａは、この方法を概略的に表す。
【０００４】
ＳｔＥＰは、一対のイニシエータが存在する状態で、種々の突然変異を含む種々のポリヌクレオチド配列を混合することからなる。この混合物は、ハイブリダイゼーション及び重合ステップが単一の、非常に短期のステップに統合されるＰＣＲ反応にさらされる。これらの条件は、イニシエータをハイブリダイズすることを可能にするが、また重合を遅くするため、イニシエータは、変性後、ランダムに種々のポリヌクレオチド配列に再ハイブリダイズする断片だけを合成する時間を持つ。図１Ｂは、この方法を概略的に表す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
重合への過度の依存には欠点がある。このような方法は、重合の連続的な段階中にランダムに起こる組み換えの速度あるいは位置に対する制御を受けない。重合は、また、用いる条件及び重合酵素に依存して、望まない追加の突然変異、あるいは不十分な数の突然変異を生成することがある。後者は、長いギャップが、対向する鎖を完全に補足する残基で満たされる場合に起こる。さらに、十分なサイクルの後に、断片は、非常に長く成長して「メガイニシエータ」として知られるもの（６）になる。メガイニシエータは、特に開始ポリヌクレオチドが約１．５ｋｂを超えると、種々の問題を引き起こす。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、初期ポリヌクレオチドあるいは断片の重合、サイズ分画（大きさによる断片の分離）あるいは増幅に依存する必要がない。さらに、出願者は、望まないがそうではないと限定して述べる場合を除いて、本発明及び実施例には広範な利点があると信じている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
第一に、本発明は、組み換えの位置に対する制御を提供する。テンプレート上のハイブリダイゼーションは、組み換えが起こる位置の正確な制御を可能にする。例えば、目標タンパク質が、変化させないで維持することを望む活性部位を含む場合、本発明は、組み換えを、活性部位以外の領域に限定することができる。さらに、本発明は、隣接する配列セグメント間に高度な組み換えを達成することができる。本発明は、近くに横たわる配列を「結合している」として扱うよりもむしろ、それらをチャンクで移動して、近くに横たわる配列を分離することが可能である。したがって、ある意味で本発明は、また、遺伝子の多様性に対する高分解能、忠実度及び品質を達成する。実に、非ランダム的な断片化を用いる本発明の実施例は、残基が１５と短い断片でも用いることができる。
【０００８】
本発明は、また、特に（下記に定義する）ライゲーション・オンリー実施例以外の実施例においても、反応サイクルにつき、断片のさらに多くの組み換え及び組み込みを生じさせることが可能である。換言すれば、多量の多様な遺伝子を得ることができる。これは、より多くの全組み換え事象を刺激することによって、直接的に達成する。また、全体的な効率を向上させることによって間接的に達成する。特に、指向ライゲーションを用いることによって、全体的な効率を向上させることができる。指向ライゲーションを用いない場合、「ｎ」断片に切断された配列は、たとえいくつかの形態が有用であるとしても、非常に多種多様な、可能な形態へと再連合するであろう。本発明は、これに対して、所望の形態の直接的な達成を促進する。実に、本発明のいくつかの実施例では、僅かに単一反応サイクル後に組み換えポリヌクレオチドを得ることが可能である。
【０００９】
典型的に、本発明は、シャッフルされない親核クローン及び重複キメラの発生が比較的に少ないため、さらに効率が向上する。これらの不要な副産物を避けることによって、より多くの新奇なキメラに対して余地を提供する。従来の方法は、３０％から７０％の親核ＤＮＡからなる選別ライブラリを生成する。有向進化、分子種畜あるいは遺伝子シャフリングに関するすべての方法では、組み換えＤＮＡ分子の選別ライブラリが生成され、これらの分子を発現させてスクリーニングする。ライブラリは十万から数百万の組み換え分子を含むので、スクリーニングは、プロセスにおける、最も費用がかかり時間を消費する部分である。選別ライブラリから親核ＤＮＡを排除することで、この問題を緩和することができる。最終的な母集団が、新しい異なるポリヌクレオチドから構成されるため、本発明の好適実施例のように、テンプレートが過渡的であれば、親核ＤＮＡの除去は向上する。
【００１０】
本発明の方法の好適実施例、特に孤立鎖テンプレートあるいは断片を用いる実施例は、また、例えば、遺伝子系統群の遠縁のメンバーの、ホモロジーの低いシャフリングを促進する。すべてが、一つのポリヌクレオチドあるいは多数の相同ポリヌクレオチドの、センスあるいはアンチセンスな鎖のいずれかの、同じ鎖からのものであるため、相互に補完しない、特に一本鎖の配列の母集団を表すために、用語「孤立鎖」を用いる。例えば、孤立鎖断片は、相補的ではない、あるいは少なくとも、反応混合物内の他の断片を厳密に補足するものではないため、ハイブリダイゼーションは、相補的な断片によって形成されるであろう「野生型」配列に向かう傾向を持たない。このため、ハイブリダイゼーション温度を配列間のホモロジーの温度に調整して、最少組み換えサイクル数において、多様性を極大化し、適切な突然変異体を見いだすチャンスを大いに増加させることが可能である。（注記：本発明は、また、例えば、多量の一つの親核ポリヌクレオチドを用いて所望の傾向を達成するということを含んでもよい。）
【００１１】
さらに、本発明は、開始ＤＮＡライブラリの準備をほとんど必要とせず、イントロンを含んでもよい複合体、すなわちゲノムＤＮＡの瞬時の使用を可能にする。他のいくつかの方法は、シャフリングあるいは再集合させる断片を生成するために、時間がかかるｍＲＮＡの分離、そしてｃＤＮＡ配列の改造を必要とする。
【００１２】
本発明の利点及び実施例を、下記にさらに説明する。
【００１３】
発明の要約
【００１４】
本発明は概括的に遺伝子組み換えに関するが、本発明に関して、「組み換え」は、この用語が、二つの鎖が切り離されて相互に再び結合し、組み換え配列を形成するということを暗示する限りにおいて、幾分誤ったことばである。換言すれば、発明は、鎖乗り換えあるいは交差に依存しない。しかしながら、このことに注意して「組み換え」、そしてそれに関する用語を本文では用いる。
【００１５】
一つの実施例では、本発明の方法は、ポリヌクレオチドを非ランダム的にシャッフルするための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法からなる。
この方法は次のことを含む。
ａ）ポリヌクレオチド・ライブラリから直接あるいは間接的に、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片を得ること。
ｂ）前記断片を、少なくとも二つの断片が隣接的にハイブリダイズするまで、一つ以上の考案組織化テンプレートへハイブリダイズすることによって、少なくとも一つの部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成すること。なお、少なくとも一つの前記テンプレートは、前記相同ポリヌクレオチドと少なくとも一つのホモロジー領域を共有する。
ｃ）前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して、少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること。
この場合、前記処理は、順序に関係なく次のことを行う。
（ｉ）ニックをライゲートすること。そして
（ｉｉ）必要に応じて、次のギャップを満たす技術の一つ、あるいは組合せを行うこと。
隣接的にハイブリダイズする断片数を増加させるよう、前記断片を前記テンプレートへさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たすこと。
部分的にハイブリダイズした断片の張り出しフラップをトリムすることによって短いギャップを満たすこと。
そして重合を介して短いギャップを満たすこと。
【００１６】
上記実施例においては、必要に応じて、いずれのステップ、特にステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返してもよい。もう一つの実施例では、本発明の方法は、本発明の各ステップの、単に１回、１サイクルあるいは単一の操作後に、組み換えポリヌクレオチドを生成する。好適実施例では、方法は、さらに、所望の特性を持つ前記組み換えポリヌクレオチドの少なくとも一つを選択するステップ（ｄ）からなる。ステップは、生体外で（生物の外で）起こることがより好ましい。いくつかの好適実施例においては、方法は、とりわけ、非ランダム的な断片化、過渡テンプレート及び孤立鎖テンプレートあるいは断片を用いる。
【００１７】
択一的な実施例では、本発明は本質的に、上記ステップ（ｂ）及び（ｃ）からなる。このような場合、ステップ（ｂ）が「ステップ（ａ）」になり、また、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片をハイブリダイズすることを含む。
【００１８】
もう一つの択一的な実施例では、本発明は、生体外での遺伝子系統群の非ランダム低ホモロジー・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法からなる。ホモロジーが低いとみなすかどうかは、状況に応じて異なるが、５０％（例えば、４０から７０％あるいは２０から４５％）よりも低いホモロジーは、典型的に低いとみなす。もう一つの択一的な実施例では、親核ポリヌクレオチドは、二つの残基を超える長さで異なる。
【００１９】
さらにもう一つの択一的な実施例では、本発明は、ポリヌクレオチド対立遺伝単位の突然変異を含む領域の生体外非ランダム・シャフリングのための、テンプレート調整ライゲーション方向定位の方法からなる。この実施例は、さらに、対立遺伝単位間の突然変異を含む領域に対する制限部位の位置を定めること、それらの制限部位に対応する断片を得ることからなる。
【００２０】
本発明は、さらに、方法から生じる配列、そのライブラリ、それを含むホスト及びベクター、それから翻訳したタンパク質を含む。また、本発明の方法をシミュレートするコンピュータ・アルゴリズム等の論理名アレイ、あるいは本発明の方法が行われるバイオチップ等の物理的なアレイを含む。本発明は、さらに、方法の中間産物に、また、方法のいくつかの、あるいはすべてのステップを行うために用いることが可能な、ポリヌクレオチド断片と組織化テンプレートとの反応混合物に関する。
【００２１】
定義
【００２２】
本文で用いる「生体外」は、生物の体外の位置を指す。「相同」ポリヌクレオチドは、相互に、少なくとも一つの対応する残基位置において異なる。したがって、本文で用いる「相同」は、「部分的に異種である」と時々言及されるものをも含む。例えば、親核ポリヌクレオチド間におけるホモロジーは、２０％から９９．９９％までに及ぶが、３０から９０％が好ましく、４０から８０％がより好ましい。いくつかの実施例では、用語「相同」は、対応する残基位置において、例えば僅かに約２０から４５％だけが同一な配列を示すこともある。相同配列は、互いに、共通の祖先あるいは進化論的な起源を共有してもよいし、あるいはそうでなくともよい。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド配列」は、一本鎖の、孤立鎖の、または部分的に、あるいは完全に二本鎖の、ｍＲＮＡを含む核酸あるいはリボ核酸配列を指す。部分的に、あるいは完全に二本鎖である場合は、明示しない限り、各鎖が全く同一であっても、あるいは異種であってもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子あるいは遺伝子の一部であってもよい。「遺伝子」は、既知の、あるいは未知の生物学的機能あるいは活性に関連するポリヌクレオチド、またはその一部を指す。遺伝子は、核酸ソースからの抽出、化学合成、そして重合による合成を含み、異なる方法から得ることができる。「親核ポリヌクレオチド」及び「親核」は、交換可能な同義語であり、供与片を生じるように断片化させたポリヌクレオチドを指す。親核ポリヌクレオチドは、しばしば遺伝子から得られる。「組み換えポリヌクレオチド」、「突然変異ポリヌクレオチド」、「キメラ・ポリヌクレオチド」及び「キメラ」は、概して、方法によって生成されるポリヌクレオチドを指す。しかしながら、これらの用語は、初期ライブラリ内のキメラ・ポリヌクレオチド等の、他のキメラ・ポリヌクレオチドへ言及してもよい。「基準配列」は、所望の特性、あるいはそれに近い特性を持つ、しばしば遺伝子から得られるポリヌクレオチドを指し、他のポリヌクレオチドを生成する、あるいは評価するための目標あるいは基準として用いる。
【００２４】
「ポリヌクレオチド・ライブラリ」及び「ＤＮＡライブラリ」は、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドあるいは、それらの断片を含むポリヌクレオチドのグループ、プールあるいはバンクを指す。ポリヌクレオチド・ライブラリは、初期ライブラリあるいは選別ライブラリからなる。「初期ライブラリ」、「初期ポリヌクレオチド・ライブラリ」、「初期ＤＮＡライブラリ」、「親核ライブラリ」及び「開始ライブラリ」は、少なくとも二つの相同親核ポリヌクレオチド、あるいはそれらの断片を含むポリヌクレオチドの、あるいはそれらの断片のグループ、プールあるいはバンクを指す。初期ライブラリは、ゲノムＤＮＡすなわち複雑なＤＮＡからなり、イントロンを含んでもよい。また、事前のシャフリングによって生成される配列を含んでもよい。同様に、選別ライブラリ、または組み換えポリヌクレオチドあるいは断片からなる他の限られたライブラリは、初期ライブラリとして役立つかもしれないので、そのように呼ぶこともある。「選別ライブラリ」は、独創的なプロセス、あるいはもう一つの組み換えプロセスによって生成されるキメラを含むポリヌクレオチド・ライブラリを指す。
【００２５】
「残基」は、多数のヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドと言うよりも、むしろ個々のヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを指す。残基は、ポリヌクレオチドあるいは断片の一部でない遊離残基を指すことも、またはポリヌクレオチドあるいは断片の一部を形成する単一残基を指すこともある。
【００２６】
「供与片」及び「断片」は、概して、親核ポリヌクレオチドの断片化部分を指す。断片は、また、反応混合物に加えられる、そして／あるいは親核ポリヌクレオチドの断片化以外のソースから生じる、補足あるいは代用断片を指すこともある。断片の多くあるいはすべては、親核ポリヌクレオチドより短いはずであり、好適実施例においては、大部分あるいはすべての断片が、組織化テンプレートよりも短い。
【００２７】
本文で用いる「非ランダム」及び「制御」は、広く、本発明のテンプレートそして／あるいはライゲーション方向定位を介して達成する、例えば組み換えの割合あるいは位置に関する制御または予測可能性に言及する。非ランダム及び制御は、また、狭義的に、結果として生じる断片の大きさあるいは配列に関する制御を可能にする、あるいは予測可能性を提供するポリヌクレオチドの断片化技術を示す。例えば、ポリヌクレオチドを切断するために制限酵素を用いることで、断片の特性を制御することができる。（典型的にＤＮアーゼＩ消化による）ランダムな断片化を用いた場合でも、本発明を非ランダム的とみなしてもよいことに注意する。このような場合でも、本発明の組織化テンプレート、そして他の機能は、ある程度の制御を提供する。しかしながら、実施例においては、断片化は、非ランダム的である、すなわち制御されている。
【００２８】
「組織化テンプレート」、「考案テンプレート」及び「テンプレート」は、断片をアニールして、あるいはハイブリダイズして、部分的な、あるいは完全な二本鎖のポリヌクレオチドを形成する足場として用いるポリヌクレオチドを指す。好適実施例では、テンプレートは、供与片の大部分、あるいはすべてよりも長い。このような場合、遊離供与片が、相互に対するテンプレートであると考えることはできない。テンプレートは、基準配列、初期ライブラリ、選別ライブラリから、あるいは他のところから得てもよい。テンプレートは、初期ライブラリの親核ポリヌクレオチドからなる、あるいは得られるが、ポリヌクレオチドは、例えば、断片化しないでハイブリダイゼーション・ステップに陥ることで、偶発的にシャフリング・プロセスに入るならば、テンプレートとしては認められない。換言すれば、テンプレートは、完全にランダムでも、あるいは偶発的でもない。むしろ、少なくともある範囲に考案されたものである。テンプレートは、ヒトによる、あるいはヒトによって操作されるコンピュータによる、テンプレートとしての使用のため、目的に基づく計画、創案、調合、創造、誘導、そして／あるいは特定の、そして所望のポリヌクレオチド配列、または所望の配列を含む可能性が高いソースからの配列の選択を介して直接あるいは間接的に得られる。テンプレートは、シャフリングあるいは他の人工的な処理から生じる合成であっても、あるいは自然に存在するものであってもよい。「過渡テンプレート」は、それ自体が最終的な組み換えポリヌクレオチドに組み込まれることのないテンプレートを指す。この過渡性は、方法中に生成される、非最終的な組み換えポリヌクレオチドのテンプレート鎖の分離、あるいは崩壊から起こる。
【００２９】
用語「孤立鎖」は、すべてが一つのポリヌクレオチドあるいは多数の相同ポリヌクレオチドの、センスあるいはアンチセンスの、同じ鎖からのものであるため、相互に補完しない一本鎖の配列の母集団を表す。換言すれば、対向する相補的な鎖からの配列は存在せず、母集団は相互を補足する配列を含まない。例えば、孤立鎖断片の母集団は、親核ポリヌクレオチドの頂部鎖の断片からなり、孤立鎖テンプレートの母集団は、一つ以上の親核ポリヌクレオチドの底部鎖からなってもよい。
【００３０】
「ライゲーション」は、二つの残基間におけるリン酸ジエステル結合の生成を指す。
【００３１】
「ニック 」は、ポリヌクレオチドの同じ鎖にハイブリダイズした二つの残基間におけるリン酸ジエステル結合の欠如を指す。ニックは、ＤＮアーゼあるいは他の酵素によるリン酸ジエステル結合の欠如を、そして単純にライゲートされなかった隣接的にハイブリダイズされた断片間における結合の欠如をも含む。しかし、本文で用いるニックは、残基ギャップを含まない。
【００３２】
文中の「ギャップ」及び「残基ギャップ」は、部分的に二本鎖であるポリヌクレオチドの一つの鎖上に、一つ以上の残基の欠如があることを指す。本発明のいくつかの実施例では、短いギャップ（約１５から５０以下の残基）は、重合酵素、そして／あるいはフラップ・トリミングによって満たし、長いギャップは慣習的に重合酵素によって満たす。本発明においては、長いギャップは、ハイブリダイゼーションあるいはトリミングだけによって満たしてもよい。
【００３３】
「ハイブリダイゼーション」は、必要な変性及び再ハイブリダイゼーションのサイクルを含む場合を除き、一般的な意味を持つ。
【００３４】
「隣接断片」は、端部が、互いに対して平滑で、ギャップによってではなくニックによってのみ分離している、ハイブリダイズ断片を指す。
【００３５】
「ライゲーション・オンリー」は、ギャップを満たす重合酵素延長あるいはフラップ・トリミングを利用しない、すなわち必要としない本発明の実施例に言及する。ライゲーション・オンリー実施例においては、すべての断片が隣接的にハイブリダイズする。ライゲーション・オンリー実施例ではない実施例でも、ライゲーションが用いられることに注意して下さい。
【００３６】
「ライゲーション方向定位」及び「指向ライゲーション」は、概して、断片あるいは残基のライゲーションを、比較的に整った、あるいは比較的に予測可能な順序で可能にするテンプレート調整プロセスを表す、あるいは指す。本発明のすべての実施例は、ライゲーション方向定位による。例えば、ライゲーション・オンリー実施例であっても、ライゲーション方向定位である。
【００３７】
本発明の好適実施例の詳細な説明
【００３８】
本発明の一つの実施例は、非ランダム的にポリヌクレオチドをシャッフルするための、テンプレートによって調整した、ライゲーション方向定位の方法である。この方法は次のステップからなる。
ａ）ポリヌクレオチド・ライブラリから、少なくとも二つの相同ポリヌクレオチドの一本鎖断片を直接あるいは間接的に得ること。
ｂ）これらの断片を、少なくとも二つの断片が隣接してハイブリダイズされるまで、一つ以上の考案した組織化テンプレートにハイブリダイズすること。これによって、少なくとも一つの、部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを形成する。この場合、前記テンプレートの少なくとも一つが、前記相同ポリヌクレオチドと、少なくとも一つのホモロジー領域を共有する。
ｃ）この部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを処理して、少なくとも一つの組み換えポリヌクレオチドを形成すること。
この処理は、順番に関係なく、次のステップからなる。
（ｉ）ニックをライゲートすること。そして
（ｉｉ）必要な場合は、次のギャップを満たす技術のいずれかを、あるいはそれらを組合せて実行すること。
隣接的にハイブリダイズされた断片の数を増加させるために、前記テンプレートに前記断片をさらにハイブリダイズすることによってギャップを満たす。
部分的にハイブリダイズされた断片の張り出しているフラップをトリムすることによって短いギャップを満たす。
そして重合を介して短いギャップを満たす。
【００３９】
本発明の実施例は重合酵素を用いてもよいが、そのような実施例の場合、重合酵素は、長いギャップではなく、単に短いギャップ（例えば、１５から５０以下の残基）を満たすために用いる。好適実施例では、プロセスは重合酵素を用いない。ライゲーション・オンリー実施例においては、この方法は、ギャップを満たす技術を全く用いないで、その代わりに、しばしば多数のハイブリダイゼーション事象後に達成される、完全に隣接する断片のライゲーションに依存する。
【００４０】
部分的に二本鎖のポリヌクレオチドが十分な二本鎖になったら、（ｄ）一つあるいは複数の基準配列のものと比較して、有利な特性を選択することが好ましい。有利な特性としては、例えば、酵素の熱安定性あるいは、特定なｐＨあるいは塩度の下での活性を含んでもよい。多くの他の可能な用途として、このような酵素は、紡織繊維を糊抜きする、紙パルプを漂白する、乳製品に風味を付ける、あるいは新しい治療分子の合成を生物触媒するために用いてもよい。
【００４１】
プロセスは、また、選択の前後に、テンプレート鎖を崩壊させること、あるいは組み換え鎖から分離させることを含んでもよい。さらに、ステップ（ｄ）における選択の前に、組み換え配列を増幅すること、あるいはテンプレートから組み換え鎖を分離させた後に、組み換えポリヌクレオチド配列をクローンすることを含んでもよい。どのような増幅技術を用いてもよい。組み換え配列の端部にのみハイブリダイズすることが可能なイニシエータがあるため、ＰＣＲは、組み換え配列の選択増幅を可能にする。しかしながら、セクシャルＰＣＲでのシャフリングとは異なり、本発明は組み換え反応中の増幅を必要としない。
【００４２】
好適スクリーニング技術は、組み換えポリヌクレオチドの生体外転写、その後のｍＲＮＡの生体外翻訳を介する生体外発現を必要とする。この技術は、細胞の生理学的な問題、そして生体内発現クローニングに関連した欠点を排除する。さらに、この技術は、容易に自動化でき、多数の組み換え配列のスクリーニングを可能にする。
【００４３】
本発明の実施例は、実際、ステップを一度行うだけで、周回する必要はない（「非反復」）が、本発明は、また、いずれのステップの繰り返し、ステップ（ａ）、（ｂ）そして／あるいは（ｃ）の反復等を含む。例えば、プロセスは、多数のハイブリダイゼーション事象を必要としないかもしれないし、あるいは必要とするかもしれない。ステップ（ｂ）におけるハイブリダイゼーション、そしてステップ（ｃ）の追加のハイブリダイゼーションは、変性及び再ハイブリダイゼーションの必要なサイクルをカバーすることを意図している。必要ならば、単にステップ（ａ）によって生成された供与片に対してというよりもむしろ、ステップ（ｂ）そして／あるいは（ｃ）によって生成されるライゲートされた、そして／あるいはライゲートされていない断片に対して、ステップ（ｂ）そして／あるいは（ｃ）の一部分あるいは全部を反復してもよい。ライゲーション・オンリー実施例は、典型的に、多数の繰り返しが必要である。ステップの反復を含むことに加えて、本発明は、同時処理能力として本技術で既知であるところの、ステップの同時処理を可能にする実施例を含む。
【００４４】
好適実施例では、初期ライブラリ自体が本発明によって生成される。本発明のプロセスを繰り返すために、生体内あるいは生体外のスクリーンを、このライブラリを形成するために用いることができる。プロセスの第一の流れの後に選択した組み換え配列は、オプションとして、他の配列と混合する。
【００４５】
初期ライブラリは、また、本技術に熟練した者が知る方法、例えば、野生型遺伝子から始めることによって、突然変異誘発の連続的な段階を管理することによって、「エラーが起こり易い」ＰＣＲ（２）によって、ランダムな化学物質突然変異誘発によって、生体内でのランダムな突然変異誘発によって、または同じあるいは異なる種内の近いあるいは比較的に遠い系統群の遺伝子を結合することによっても生成することができる。初期ライブラリは、ランダムな局所的突然変異を生じる条件下における、連鎖重合反応から生じることが好ましい。本発明は、また、合成配列からなるものでもよい。
【００４６】
組織化テンプレート
【００４７】
ステップ（ｂ）あるいは（ｃ）の組織化テンプレートは、例えば、初期ライブラリからのポリヌクレオチド、あるいはそれから生成したポリヌクレオチドである。テンプレートは、合成であってよいし、シャフリングあるいは他の人工的な処理から生じるものでも、あるいは自然に存在するものでもよい。テンプレートは、一本鎖あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、実際のハイブリダイゼーションの前に、ステップ（ｂ）等で変性させなくてはならない。テンプレートがステップ（ｂ）で直接組み込まれる場合は、テンプレートは、変性させなくてはならないか、あるいは既に一本鎖の形態でなくてはならない。
【００４８】
好適実施例では孤立鎖テンプレートを用いる。より好ましい実施例では、孤立鎖テンプレートとして、一つの親核ポリヌクレオチドからの底部鎖と他の親核からの頂部鎖断片とを用いる。これは、それら自身の相補的な鎖への、配列の再アニーリングを防ぐ。孤立鎖ＤＮＡ分子を得るためには、ブルースクリプト（Bluescript）ファージミド、あるいはＭ１３ｍｐ１８等の糸状ファージの系統群のベクターを用いることができる。もう一つの方法は、５’でリン酸化したイニシエータ、そして他の非リン酸化イニシエータを用いるＰＣＲによって、二本鎖分子を生じさせることからなる。エキソヌクレアーゼによるラムダ・ファージの消化は、非リン酸化鎖をそのままにして、５’でリン酸化したＤＮＡの鎖を破壊する。孤立鎖分子を生成するもう一つの方法は、メタノール変性ＤＮＡテンプレートから開始する非対称ＰＣＲによって増幅することからなる。ＤｐｎＩによる消化は、メタノール変性鎖を破壊するが、増幅産物をそのままにするので、変性後に精製することが可能である。
【００４９】
好適実施例は、また、最終的な組み換えポリヌクレオチド内に組み込まれない、例えば、選別ライブラリに転送されるポリヌクレオチドの一部ではない過渡テンプレートを用いる。過渡性を授ける一つの技術は、組み換え鎖あるいはテンプレートにマーカーを用いる。例えば、テンプレートは、ハプテンによって標識し、例えば、担体に抗ハプテン抗体を定着させて、あるいはビオチン・ストレプトアビジン反応を開始させて分離してもよい。もう一つの技術は、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩによるテンプレートの分解を可能にする、メタノール変性ｄＡＴＰを用いるＰＣＲ増幅によって過渡テンプレートを合成することからなる。この場合、組み換え鎖は、メタノール変性ｄＡＴＰを含んではならない。過渡テンプレートは、また、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解を可能にする、ｄＵＴＰによるＰＣＲ増幅によって準備することができる。逆に、５’にフォスフォロチオエート変性グループを伴うオリゴヌクレオチドを用いる選択ＰＣＲで増幅することによって、組み換え鎖を保護することが可能である。したがって、エキソヌクレアーゼでの処理は、テンプレートの排他的な分解を可能にする。最も好ましい実施例においては、ｍＲＮＡ等のウラシルを含むテンプレートを用いることによって、過渡性を授ける。ｍＲＮＡは、結合のための高親和性を持ち、ｍＲＮＡ特定酵素で除くことができる。このようなｍＲＮＡテンプレートは、生体内あるいは生体外で準備することができる。より好ましい実施例では、ｍＲＮＡテンプレートの使用には、プロセスに、リガーゼに連結した少なくとも三つのプライマーを含めることを必要とする。
【００５０】
さらにもう一つの好適実施例では、テンプレートは、平滑末端の多分子ライゲーションの方向定位を可能にする。この実施例においては、テンプレートは、第一の断片の３’端部、そして親核ポリヌクレオチド内の第一の断片に隣接する第二の断片の５’端部を正確に補足する比較的に短い一本鎖あるいは二本鎖ポリヌクレオチドからなる。これは、テンプレート上の、これら二つの端部の隣接ハイブリダイゼーションを促進する。
【００５１】
さらに、実施例は、次のいずれかを、あるいはすべてを含む。テンプレート及び供与片は、異なるソースからのものである。テンプレートは反応混合物へ個別に加えられる。そして／あるいはテンプレートは、キメラ発生を増加させるため、特定な方法で修正される。
【００５２】
供与片
【００５３】
断片は、相同ポリヌクレオチド、関連遺伝子から、あるいは他の遺伝子から入れることができる。親核ＤＮＡは、特徴づける必要は全くないが、細胞、臨床試料あるいは環境から抽出することができる。ステップ（ａ）は、初期断片含有のライブラリからの、予め断片化した一本鎖あるいは二本鎖断片で始めること、そして／あるいは初期ライブラリからの一本鎖あるいは二本鎖親核ポリヌクレオチドを断片化するサブステップで始めることの両方を含む。ステップ（ａ）は、断片の別個のライブラリを結合すること、そして／あるいは別個の開始ライブラリからの親核ポリヌクレオチドを断片化することを含んでもよい。また、異なる制限酵素を用いる等の、異なる方法で同じライブラリからの親核ポリヌクレオチドを断片化することを含んでもよい。さらに、ステップ（ａ）は、一つの親核ポリヌクレオチドから、もう一つの親核ポリヌクレオチドよりも、多くの断片を用いることを含んでもよい。例えば、このプロセスを用いる実験者は、ポリヌクレオチドＹの断片あるいは部分よりも、ポリヌクレオチドＸの断片あるいは部分をより多く用いて、その結果を偏らせてもよい。
【００５４】
一つの実施例においては、種々の長さの補足一本鎖あるいは二本鎖断片を、ステップ（ｂ）あるいは（ｃ）で加える。これらの補足断片は、特に配列がステップ（ａ）断片の配列に相同である場合、ステップ（ａ）の断片のいくつかを置換することが可能である。このような補足断片は、例えば、一つ以上の直接的な突然変異を導入する可能性がある。また、合成配列からなるものであってもよい。
【００５５】
断片化は、断片化すべき配列の変性の前後に生じてもよい。断片化は、制御しても、あるいはランダムであってもよい。ランダムな場合は、ＤＮＡをランダムに切断するために、例えば、ＤＮアーゼＩによる消化、または超音波破砕等の、本技術の熟練者に既知である酵素あるいは機械的な手段を用いることができる。断片化を制御する場合は、組み換えの程度、速度、効率そして／あるいは位置の管理を促進する。好適実施例は、制限供与片を生じさせるために、制限酵素で親核ポリヌクレオチドを加水分解することを含む。制限酵素は、配列毎の生成断片数を制御することによって、組み換えの程度、速度及び効率に対する制御を提供する。例えば、多くの切断部位を持つ制限酵素を用いることによって、あるいはいくつかの異なる制限酵素を用いることによって、その数を増加させてもよい。配列毎の生成断片数が大きければ大きいほど、組み換え配列を形成するために再組成されなければならない断片数（ｎ）は大きくなる。ｎは３以上であることが好ましい。
【００５６】
断片端部の性質及び位置を制御することで、制限酵素は、さらに、程度及び速度に対してだけではなく、組み換えが起こる位置に対しても制御を提供する。例えば、基準配列あるいは組織化テンプレート内の領域に相同な親核配列領域内で切断が起こるように、断片化をデザインすることができる。
【００５７】
断片は、長さが約１５から５００残基であることが好ましい。断片化を非ランダム的に行う場合、断片は、長さが少なくとも１５残基であれば有利であるが、長さが約１５から４０残基であればより好ましい。語句「少なくとも１５残基」は、約１５残基と、使用最長ポリヌクレオチドの全長よりも１残基少ないものとの間を意味する。断片化をランダムに行う場合は、長さが少なくとも５０残基であることがより好ましい。語句「少なくとも５０の残基」は、約５０残基と、最長ポリヌクレオチドの全長よりも１残基少ないものとの間を意味する。
【００５８】
ステップ（ａ）における断片の少なくとも二つの端部は、隣接的にハイブリダイズされ、そしてライゲートされることが可能でなくてはならない。（ライゲーション・オンリー実施例では、ハイブリダイズして最終的な組み換え鎖を形成する断片のすべては、このような端部を持たなくてはならない。）好適実施例においては、本発明は、フラップ・トリミング酵素を用いて、さもなければ非生産的であろう断片をライゲート可能な端部にする。これらの酵素は、特定な方法で断片のハイブリダイズされていない端部を識別して分解あるいは切断し、同じテンプレート上の他のハイブリダイズされた断片を覆う。
【００５９】
望ましい酵素は、フラップ・エンドヌクレアーゼであり、それをステップ（ｃ）で、あるいはステップ（ｂ）のハイブリダイゼーション中に用いることができる。断片が最初に二本鎖にされる場合、本発明の実施例は、断片のハイブリダイズされない端部のような一本鎖配列を識別して分解する、特定なエキソヌクレアーゼを用いることからなる。このような一本鎖エキソヌクレアーゼあるいはフラップ・エンドヌクレアーゼは、例えば、テンプレートあるいは組み換え配列を分解する可能性のある、より一般的なエキソヌクレアーゼ活性を避ける濃度であることが好ましい（例えば、約１．８から２．２μｇ／ｍｌのフラップ・エンドヌクレアーゼ）。これらの酵素は、ステップ（ｃ）でライゲートすることが可能な断片端部数を増加させる。多くの張り出しフラップが生じる傾向があるため、断片をランダムに切断するのに特に有用である。低いハイブリダイゼーション温度そして／あるいは長いハイブリダイゼーション時間（例えば、２分）を持つこのような酵素の使用は、ホモロジーが低いポリヌクレオチド間の組み換えを促進する。例えば、ランダムな断片化を用いる好適実施例は、フラップ・エンドヌクレアーゼの使用、そしてステップ（ｂ）における広範囲なハイブリダイゼーション温度（例えば、５から６５℃）を含む。ステップ（ｂ）は、温度に関して、特にハイブリダイゼーション温度が高ライゲーション温度（例えば、約６０から７５℃）よりも低い場合、ステップ（ｃ）のライゲーションから切り離すことができる。最も好ましいのは、フラップ・エンドヌクレアーゼ濃度が約２μｇ／ｍｌであり、ハイブリダイゼーション温度が約１０℃であり、そしてライゲーション温度が約６５℃である。このようなトリミング酵素を用いる場合、リガーゼのように耐熱性で熱安定性があり、そして高温において活性であることが好ましい。
【００６０】
本発明の方法の追加のオプション機能
【００６１】
従来のシャフリング方法とは異なり、本発明の種々の実施例は、サーモサイクリング、例えば、セクシャルＰＣＲに必要な、繰り返しの加熱及び冷却を必要としない。種々の実施例においては、遺伝子長のポリヌクレオチドあるいは短いポリヌクレオチドを生じさせるために、プロセスを用いてもよい。種々の実施例は、厳密性が低い条件下でハイブリダイゼーションを起こしてもよい。種々の実施例は、テンプレートと、生成されるキメラ・ポリヌクレオチドとの比率が、約１である。種々の実施例はＤＮアーゼを全く用いない。種々の実施例においては、初期ライブラリは、単一遺伝子の変異体からなる。種々の実施例では、初期ライブラリは、人工的に誘発した点突然変異を持つポリヌクレオチドを含んでもよい。種々の実施例において、本発明は、全ゲノム・シャフリングのために用いてもよい。種々の実施例において、ステップは、生体外というよりもむしろ生体内で行われてもよい。最後に、例えば、ＰＣＲによって断片を増幅する場合、組織化テンプレートのすべてに沿って端部が隣接する断片を生成するよう開始配列をデザインすることができる。
【００６２】
例Ｉ
【００６３】
例Ｉの目的は、孤立鎖断片を用いて、カナマイシン抵抗遺伝子から組み換えポリヌクレオチドを生成することである。
【００６４】
第一に、ｐＡＣＹＣ１８４の抵抗遺伝子（１ｋｂ）を、孤立鎖ファージミドが遺伝子の非コード鎖を含むよう、Ｍ１３ｍｐ１８のポリリンカー内でクローンする。
【００６５】
平行して、遺伝子配列の各々の側のベクター配列Ｍ１３ｍｐ１８を補足する二つのイニシエータで、ＰＣＲ突然変異誘発（エラー・プローンＰＣＲ）により、この遺伝子を増幅する。非コード鎖に対するイニシエータはリン酸化されるが、コード鎖に対するイニシエータはリン酸化されない。ＰＣＲ突然変異誘発の産物をラムダエキソヌクレアーゼによって消化して、カナマイシン抵抗遺伝子の突然変異体のコード鎖ライブラリを生成する。
【００６６】
孤立鎖配列のこのライブラリは、制限酵素混合物、特にＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ及びＴａｑＩによって消化される。結果として生じる孤立鎖断片は、それから、孤立鎖ファージミドでハイブリダイズして熱安定性リガーゼでライゲートする。アガロース・ゲル上への析出中に小さな断片が観察されなくなるまで、このステップを数回繰り返す。その間、完全な抵抗遺伝子の孤立鎖に対応する縞模様が、ゲル上に見える「スメア」の主要な構成要素になる。
【００６７】
遺伝子の大きさに対応する縞模様を、ゲルから切り取って浄化する。それを、遺伝子の各側上におけるＭ１３ｍｐ１８配列の二つの相補的なオリゴヌクレオチド（４０マー）でハイブリダイズし、この部分的なデュプレックスを、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩによって消化し、それから、同じ酵素によって消化したＭ１３ｍｐ１８ベクター内でライゲートする。
【００６８】
それから、ライゲーション産物で変化させた細胞を、カナマイシンに対する抵抗が増加しているどうか選別する。
【００６９】
完全な遺伝子の二つのイニシエータでのＰＣＲと、この増幅の二本鎖産物のクローニングとによって、孤立鎖組み換え分子のクローニングをオプションとして行う。望まない突然変異を避けるために、この増幅は、Ｐｆｕタイプの重合酵素で、そして限られたサイクル数で行うべきである。
【００７０】
初期ストックよりもカナマイシンに対する抵抗力が著しく強いクローンのプラスミドを精製して、先に定めたリン酸化あるいは非リン酸化イニシエータ・カップルを用いる高忠実度条件下で、重合酵素ＰｆｕとのＰＣＲに使用する。これは、ラムダ・エキソヌクレアーゼでの処理、そして制限酵素での断片化の後、孤立鎖断片の第二世代を生じる。このステップに用いる酵素は、異なる混合物（例えば、ＢｓｔＮＩ、ＴａｑＩ及びＭｎｌＩ）であってもよい。
【００７１】
組み換え及び選択ステップは、カナマイシンに対する抵抗が実質的に増加するまで、数回繰り返す。
【００７２】
例ＩＩ
【００７３】
Ｉ．要約
【００７４】
開始ライブラリは、大腸菌（１）の ＰＢＰ１ｂ に対するコード、ｐｏｎＢの１０遺伝子突然変異体を含む。各突然変異体の配列は、非相同領域の３から１６ベースの長さだけ本来の遺伝子のものとは異なっていた。これは、本文内（８）に記述したレフェヴレ（Lefevre）氏らが説明する技術によって、五つの初期コドンの、５つのアラニン・コドンによる置換から生じたものである。
【００７５】
この置換は、二つのＰｓｔＩ酵素部位によって囲まれた制限酵素ＰｖｕＩＩの独特な部位を示すもので、突然変異体を消化プロフィールによって識別可能にした。図３は、各突然変異体に伴う突然変異（ＰｖｕＩＩ及びＰｓｔＩ）の、１０の領域の位置を表す。
【００７６】
突然変異体のＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を精製して、これを、ライブラリを形成するために等モル量で混合した。このライブラリのポリヌクレオチド配列を、制限断片のライブラリを生成するよう、制限酵素ＨｉｎｆＩ及びＢｓａＩで消化した。それから、熱安定性リガーゼが存在する状態で、異なる量の制限断片を、種々の量の野生型テンプレートと共に温置した。変性、ハイブリダイゼーション及びライゲーションの数サイクル後、反応混合物の少量を、突然変異遺伝子の５’及び３’端部に特定的な、そして野生型テンプレートの５’及び３’端部に非特定的な一対のプライマーでＰＣＲ増幅を行うために用いた。増幅産物をクローンし、これらのクローンを、消化プロフィールに関してＰｖｕＩＩあるいはＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて分析した。得たプロフィールは、突然変異体のどの断片が、他のものと再結合して遺伝子全体を形成することが可能であるかを示した。
【００７７】
ＩＩ．材料及び方法
【００７８】
Ａ．品種及びプラスミド
【００７９】
品種ＭＣ１０６１（Ｆ”ａｒａＤ１３９、△（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９６、ｇａｌＥ１５、ｇａｌＫ１６、△（ｌａｃ）Ｘ７４、ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）、ｍｃｒＡ  ｍｃｒＢ１、ｈｓｄＲ２（ｒｋ−ｍｋ＋））を大腸菌 K１２ から得る。
【００８０】
ベクターｐＡＲＡＰＯＮＢは、制限部位ＮｃｏＩとＮａｒＩとの間にトロンビン切断部位（９）を伴うｐｏｎＢ遺伝子が導入されたベクターｐＡＲＡ１３（３）から生じる。ベクターｐＥＴ２６ｂ＋は、スツディエール（Studier）氏 及びモッファット（Moffatt）氏（１０）によって開発され、ノバジェン社（NOVAGEN Corporation）が商業化したｐＥＴベクターの一つである。
【００８１】
Ｂ．オリゴヌクレオチド
【００８２】
オリゴヌクレオチドは、イソプリム社（ISOPRIM corporation）（トゥールーズ）が合成したものである。オリゴヌクレオチド配列を、下記の表Ｉに報告する。
【００８３】
【表Ｉ】
0004533584.tif 000002
【００８４】
Ｃ．試薬
【００８５】
下記の表ＩＩに引用した制限及び改修酵素は、供給業者の推薦に従って用いた。
【００８６】
【表ＩＩ】
0004533584.tif 000003
【００８７】
用いた緩衝液は、下記の表ＩＩＩに報告する。
【００８８】
【表ＩＩＩ】
0004533584.tif 000004
【００８９】
ＩＩＩ．テンプレートの準備
【００９０】
オリゴヌクレオチドＭ１及びＭ２をプライマーとして用い、ＰＣＲ反応ステップによって野生型ｐｏｎＢ遺伝子を増幅した（図４）。１０μｌの重合緩衝液、１０μｌのｄＮＴＰｓ２ｍＭ、各２０ピコモルのオリゴヌクレオチドＭ１及びＭ２、そして５ＵのＴａｑＤＮＡ重合酵素を含む最終量が１００μｌの混合物へ、野生型遺伝子（７）を持つ５０ｎｇのｐＰＯＮＢＰＢＲプラスミドを加えることによって、五つのＰＣＲ反応を準備した。これらの混合物を、次のプログラムに従ってパーキン・エルマー（Perkin-Elmer）９６００サーモサイクラーで温置した。（９４℃−２分）−（９４℃１５秒−６０℃３０秒−７２℃１分）ｘ２９サイクル−（７２℃−３分）。
【００９１】
５つのＰＣＲ産物を混合して、１％のＴＢＥアガロース・ゲル上に装填した。泳動とエチジウム臭化物でのゲルの染色の後、２６ｂｐ及び９０ｂｐの二つの断片によって囲まれたｐｏｎＢ遺伝子増幅産物に対応する、２６５１ｂｐの縞模様を、紫外線による透視法で視覚化した。それから、それをメスで切り剥がし、クイアジェン社のクイアクイック・システム（QUIAquick system, QIAGEN）で精製した。精製したすべてのＤＮＡを、１２０μｌの緩衝液Ｔで溶離した。このＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍにおけるその吸光度測定から、約１００ｎｇ／μｌであった。
【００９２】
ＩＶ．ライブラリの準備
【００９３】
Ａ．突然変異遺伝子の増幅
【００９４】
１０の突然変異体の遺伝子を、個別に、オリゴヌクレオチドＮ及びＥとのＰＣＲ反応によって増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは、各々、制限部位ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩを導入するため、これらの二つの部位で得られる産物のクローニングが可能となる。
【００９５】
１０μｌの重合緩衝液、１０μｌのｄＮＴＰｓ２mM、各々２０ピコモルのオリゴヌクレオチドＮ及びＥ、そして ５U のＴａｑＤＮＡ重合酵素を含む最終量で１００μｌの混合物へ、突然変異遺伝子を含む５０ｎｇのプラスミドを加えることによって、各ＰＣＲ反応を準備した。この混合物を、次のプログラムに従ってパーキン・エルマー９６００サーモサイクラーで温置した。（９４℃−２分）−（９４℃１５秒−６０℃３０秒−７２℃１分）ｘ２９サイクル−（７２℃−３分）。
【００９６】
最終量で３０μｌ内に３μｌの制限緩衝液Ａと５ＵのＰｖｕＩＩ酵素とを含む混合物内に、１時間３７℃で５μｌの各ＰＣＲ産物を温置することによって、遺伝子増幅の特殊性を、ＰｖｕＩＩエンドヌクレアーゼの制限プロフィールで実証した。その消化反応の１５μｌをＴＢＥ１％アガロース・ゲル上に装填した。泳動、そしてエチジウム臭化物での染色後、ゲルを紫外線にさらした。制限断片の視覚化は、各突然変異遺伝子の遺伝子増幅が特殊であることの確認を可能にした。
【００９７】
平行して、３μｌの各ＰＣＲ反応を、ＴＢＥ１％アガロース・ゲル上に装填した。泳動後、ゲルを上記のように処理した。各縞模様の輝度は、遺伝子増幅が同じ収量を持つことの査定を可能にした。
【００９８】
Ｂ．制限断片ライブラリの生成
【００９９】
５０μｌの各１０ＰＣＲを混合して、１％ＴＢＥアガロース・ゲル上に装填した。泳動とエチジウム臭化物での染色後、１０の突然変異遺伝子の増幅産物に対応する、２５７２ｂｐにおける縞模様をメスで採取して、クイアクイック・システム（QIAGEN）で精製した。精製したすべてのＤＮＡを、１２０μｌの緩衝液Ｔで溶離した。このＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍにおけるその吸光度から、約１００ｎｇ／μｌであった。
【０１００】
制限断片のライブラリを生成するために、１２μｌの制限緩衝液Ｂ、１．２μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、２５Ｕの酵素ＢｓａＩ、そして４μｌの水を含む混合物内で、１時間５０℃、１００μｌのこのＤＮＡを温置した。それから、２μｌの制限緩衝液Ｂ、２μｌＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、５０Ｕの酵素ＨｉｎｆＩ、そして１１．５μｌの水を混合物に加えて、それを３７℃で１時間温置した。その消化混合物をクイアクイック・コラム（QIAGEN）上で精製して、３０μｌの緩衝液Ｔで溶離した。１μｌの溶離物を１％ＴＢＥアガロース・ゲル上に装填し、その消化が完全であり、六つの制限断片が生成され、結果的に、５９０ｂｐ、５００ｂｐ、４７２ｂｐ、４３８ｂｐ、２９８ｂｐ及び２７４ｂｐの、六つの断片ライブラリが生成されたことを実証した。このＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍにおけるその吸光度から、約２５０ｎｇ／μｌであった。
【０１０１】
Ｖ．組み換えライゲーション反応（ＲＬＲ）
【０１０２】
熱安定性ＤＮＡリガーゼが存在する状態で、完全なテンプレートを持つ１０の突然変異体の遺伝子（すなわち、野生型ｐｏｎＢ遺伝子）から、制限断片ＨｉｎｆＩ−ＢｓａＩの所定量を温置することによってＲＬＲ反応を行った。下記の表ＩＶに、ＲＬＲのための混合物の組成を報告する。
【０１０３】
【表ＩＶ】
0004533584.tif 000005
【０１０４】
負の制御は、ＲＬＲ４の反応とまったく同じであるが、熱安定性ＤＮＡリガーゼを含まない。これらの異なる混合物を鉱油の滴で覆って、次のプログラムに従って２００μｌマイクロチューブ内でパーキン・エルマー９６００サーモサイクラーで温置した。（９４℃、５分）−（９４℃、１分−６５℃、４分）ｘ３５サイクル。
【０１０５】
それから、各ＲＬＲ反応の１０μｌを、１０μｌの重合緩衝液、１０μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、各々４０ピコモルのオリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２、そして５ＵのＴａｑＤＮＡ重合酵素を含む最終量が１００μｌのＰＣＲ反応混合物に加えた。この混合物を、次のプログラムに従ってパーキン・エルマー９６００サーモサイクラーで温置した。（９４℃、５分）−（９４℃、３０秒−４６℃、３０秒−７２℃、１分）ｘ２９サイクル−（７２℃、２分）。このＰＣＲ反応は、図４に示すように、オリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２がテンプレートとハイブリダイズすることができないため、テンプレートを増幅しないで、ＲＬＲ反応中に形成されたライゲーション産物の特定な増幅を可能にした。
【０１０６】
各ＲＬＲ反応の５μｌと、先のＰＣＲ反応の各々の１０μｌとを、１％ＴＢＥアガロース・ゲル上に装填した。エチジウム臭化物で染色後、図５に示すように、ゲルを紫外光にさらした。
【０１０７】
このゲルの分析は、負の制御と同様、ＲＬＲ４反応のみが、制限断片を可視のまま含むことを明らかにする（トラック４及び５）。
【０１０８】
負の制御（トラック１０）に対するＰＣＲ産物の欠如は、ＰＣＲ反応が特定である（完全なテンプレートの増幅が全くない）ことだけではなく、選択条件の下で不純ＰＣＲ産物を生成するために、混合物内に存在する制限断片をプライマーで置換することはできないということをも明示している。平行して、トラック６、７及び８内の約２５００ｂｐにおける独特な縞模様の存在は、ＲＬＲ産物が、ＲＬＲ１、２及び３反応のためのＰＣＲによって増幅できることを表している。したがって、これら三つのＲＬＲ反応は、六つのライブラリの制限断片から開始して、一つ以上の完全な遺伝子の再生を可能にした。
【０１０９】
ＶＩ．増幅産物の分析
【０１１０】
Ａ．クローニング
【０１１１】
ＲＬＲ１、２及び３反応のＰＣＲ増幅産物を、ウィザードＰＣＲプレプス・システム（プロメガ）で精製して、４５μｌの緩衝液Ｔ内で溶離した。６μｌの各精製ＰＣＲを、３μｌの制限緩衝液Ｃ、３μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、２０ＵのＥｃｏＲＩ酵素、１０ＵのＮｃｏＩ酵素、そして１５μｌの水を含む混合物内で、１時間３７℃で温置した。
【０１１２】
平行して、二つのベクター（ｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋）を、クローニングのために準備した。これらのベクターを３７℃で２時間、３μｌの制限緩衝液Ｃ、３μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、２０ＵのＥｃｏＲＩ酵素、１０ＵのＮｃｏＩ酵素、そして１９μｌの水を含む混合物内で、３μｇのプラスミドを温置することによって直線化した。
【０１１３】
直線化したベクターと、消化したＰＣＲとを、クイアクイック・システム（QUIAGEN）を用いて、ＴＢＥ１％アガロース・ゲル上で精製した。各ベクターあるいは各消化ＰＣＲを、３０μｌの緩衝液Ｔ中で溶離した。
【０１１４】
各ベクターで消化したＰＣＲの各々のライゲーションを、下記の表Ｖに説明する条件で行い、そして１６時間１６℃で温置した。
【０１１５】
【表Ｖ】
0004533584.tif 000006
【０１１６】
２００μｌの化学反応が可能なＭＣ１０６１細胞（４）を、熱ショック（５）によって１０μｌの各ライゲーションで変換し、これらの変換細胞を選択媒体上に広げた。
【０１１７】
ライゲーション制御ＴＬｐＡＲ及びＴＬｐＥＴの変換後、クローンは全く得られなかった。このことは、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクターｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋が、分子内ライゲーションを起こせないことを示している。
【０１１８】
Ｂ．ＰＣＲによるスクリーニング
【０１１９】
ベクターｐＡＲＡＰＯＮＢでのライゲーションの変換後に得られたクローンの第一のスクリーニングをＰＣＲによって行う。各ライゲーションＬｐＡＲ１、ＬｐＡＲ２及びＬｐＡＲ３から１４づつ４２のコロニーを個々に、５μｌの重合緩衝液、各々４０ピコモルのオリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２、５μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、そして５ＵのＴａｑＤＮＡ重合酵素を含む、最終量で５０μｌのＰＣＲ混合物内で再懸濁した。ＰＣＲ混合物へ、コロニーの代わりに５０ｎｇのプラスミドｐＢＲ３２２を加えることで、負の制御を得た。これら４３の試験管を、次のプログラムに従ってパーキン・エルマー９６００サーモサイクラーで温置した。（９４℃、５分）−（９４℃、３０秒−４６℃、３０秒−７２℃、１分）ｘ２９サイクル−（７２℃、２分）。それから、これらのＰＣＲ反応の各々５μｌを、２μｌの制限緩衝液Ａ、２μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、そして５Ｕの制限酵素ＰｖｕＩＩを含む最終量で２０μｌの混合物内で、１時間３７℃で温置した。
【０１２０】
これらの消化の各々１０μｌを、非消化ＰＣＲの５μｌの各々と並列にＴＢＥ１％アガロース・ゲル上に装填した（これによって、制限消化によって得た断片でのＰＣＲの非特異的な縞模様に関する混乱の発生を避けた）。泳動、そしてこのゲルのエチジウム臭化物での染色後、初期突然変異体のどの断片が、遺伝子全体を再構築するのに他のものと関連するのかを判定するために、酵素ＰｖｕＩＩによる消化から生じる縞模様を分析した。このスクリーニングは、一つの突然変異を伴う２７の遺伝子、二つの突然変異を伴う七つの遺伝子、そして突然変異をもはや伴わない八つの遺伝子の存在を明示する。
【０１２１】
Ｃ．プラスミドＤＮＡミニプレパレーションによるスクリーニング
【０１２２】
ベクターｐＥＴ２６ｂ＋でのライゲーションの変換から生じた２１のクローン（各ライゲーションから７つのクローン）から、プラスミドＤＮＡ（５）を抽出することによって第二のスクリーニングを行った。各クローンに対して得たプラスミドＤＮＡの５μｌを、１μｌの制限緩衝液Ｃ、６Ｕの酵素ＰｓｔＩ、３Ｕの酵素ＮｃｏＩ、そして６Ｕの酵素ＥｃｏＲＩを含む最終量で１０μｌの混合物内で、１時間３７℃で温置した。これらの消化の各々５μｌをＴＢＥ１％アガロース・ゲル上に装填した。泳動と、このゲルのエチジウム臭化物での染色後、初期突然変異体のどの断片が、遺伝子全体を再構築するのに他のものと関連したのかを判定するために、ＰｓｔＩ酵素による消化から生じた縞模様を分析した。このスクリーニングは、一つ突然変異を伴う１３の遺伝子、二つの突然変異を伴う五つの遺伝子、そして突然変異をもはや伴わない三つの遺伝子の存在を明示する。
【０１２３】
Ｄ．組み換えの統計的分析
【０１２４】
酵素ＨｉｎｆＩ及びＢｓａＩの切断部位に対する各突然変異の位置から判断して（図６参照）、ＲＬＲを介して初期遺伝子の突然変異０、１、２、３あるいは４個を伴う遺伝子を得る確率を計算することが可能である。
【０１２５】
ＲＬＲ反応が全くランダムであると仮定して、確率Ｐは次の通りである。
【０１２６】
【数１】
0004533584.tif 000007
0004533584.tif 000008
0004533584.tif 000009
0004533584.tif 000010
0004533584.tif 000011
【０１２７】
行った二つのスクリーニングは、下記の表ＶＩに報告するように、これらの統計上の予想に近い結果をもたらす。したがって、ＲＬＲ反応が準ランダムであることを示す。ゼロ突然変異を伴う遺伝子の損失によって、一つの突然変異を伴う遺伝子の割合が僅かに高いことが観察できる。この現象は、既に観察されているｐｏｎＢ遺伝子の弱い毒性に、また、非活性化突然変異を伴う遺伝子の選択を好むベクターｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋の軽い発現漏れに帰することができるだろう。
【０１２８】
【表ＩＶ】
0004533584.tif 000012
【０１２９】
例ＩＩＩ
【０１３０】
例ＩＩＩは、制御された消化を用いる本発明の実施例を表す。
【０１３１】
Ｉ．材料及び方法
【０１３２】
Ａ．菌種、ゲノム及びプラスミドＤＮＡ
【０１３３】
すべてのＤＮＡ操作に対して、標準技術及び処理を用いた。発現プラスミドｐＥＴ２６ｂ＋（Novagen）を繁殖するために、大腸菌ＭＣ１０６１ＤＥ３細胞を用いた。
【０１３４】
Ｂ．オリゴヌクレオチド
【０１３５】
ＰＣＲのためのすべての合成オリゴヌクレオチド・プライマーは、ＭＷＧバイオテク（MWG Biotech）が合成した。センス・プライマー５’ＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡ３’、そしてアンチセンス・プライマー５’ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＴＴＣ３’を、テルモトガ・ネアポリターナ・キシラナーゼＡ遺伝子を増幅してＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線部分）を導入するために用いた。ＮｄｅＩ部位は初期コドン（太字）を含んでいた。
【０１３６】
Ｃ．酵素
【０１３７】
制限酵素、ＤＮＡ重合酵素及び熱安定性リガーゼは、ネブ（NEB）及びエピセンター （EPICENTRE）から購入し、製造業者の勧めに従って用いた。
【０１３８】
Ｄ．ＤＮＡ増幅、クローニング及び発現
【０１３９】
ＰＣＲ増幅をＰＥ ９６００サーモサイクラーで行った。テルモトガ・ネアポリターナ・キシラナーゼＡアンプリコンを、プライマー特定制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＥＴ２６ｂ＋上の適合性のある部位内へライゲートさせて、大腸菌ＭＣ１０６１ＤＥ３へ変換した。このｐＥＴ２６ｂ＋ＸｙｎＡ発現ベクターを含むＭＣ１０６１ＤＥ３クローンを、カナマイシン（６０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ内で、３７℃で繁殖させた。
【０１４０】
Ｅ．生化学的な特徴
【０１４１】
ＸｙｎＡを発現する大腸菌に対して、直接的に熱不活性化実験を行った。４℃で５分間６０００ｇで遠心分離後、２００ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．６中で細胞を再懸濁した。再懸濁は、試料毎の細胞量を標準化するために、適当な量で行った。それから、異なる時間、適当な温度で１５０μｌの細胞を温置した。これらの細胞１００μｌを、２００ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．６での０．５％（ｗ／ｖ）キシラン１００μｌへ加え、１０分間８０℃で温置した。それから、２００μｌの３，５−ジニトロサリチル酸を加え、５分間沸騰させ、氷上で５分間冷却し、そして５分間１２０００ｇで遠心分離した。１５０μｌをμタイタープレート内へ移し、そして５４０ｎｍで ＯＤ を測定した。
【０１４２】
最適な温度の実験のため、２００ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．６での０．５％（ｗ／ｖ）キシラン１００μｌを、１００μｌの再懸濁細胞に加え、そして異なる温度で１０分間温置した。それから、２００μｌの３，５−ジニトロサリチル酸を加え、５分間沸騰させ、氷上で５分間冷却し、そして１２０００ｇで５分間遠心分離した。１５０μｌをμタイタープレート内へ移し、５４０ｎｍでＯＤを測定した。
【０１４３】
ＩＩ．結果
【０１４４】
Ａ．ＸｙｎＡの、熱安定性が低い突然変異体の生成
【０１４５】
ＸｙｎＡタンパク質の熱安定性が低い突然変異体を生成するため、図７に示すように、１％アガロース・ゲルを用いてＷＴ・ＸｙｎＡ遺伝子に対してエラー・プローンＰＣＲを行った。その産物をプライマー特定制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＥＴ２６ｂ＋上の適合性がある部位内へライゲートして、大腸菌ＭＣ１０６１ＤＥ３へ変換し、エラー・プローン・ライブラリを生成した。
【０１４６】
このエラー・プローン・ライブラリからの一つのクローン（突然変異体３３）は、ＷＴタンパク質に比べ、非常に低い熱安定性を持つようであった。最適な温度及び熱不活性化の判定を含む敏速な生化学的分析を行い、ＷＴのものと比較した。最適な温度に関して、突然変異体３３は、（９０℃を超える）ＷＴに比べ、７８℃前後が最適な温度であったが、８２℃で３０分間、あるいは９５℃で１分間定温放置した後の突然変異体３３からは、活性の残留が全く検出されなかった。そこで、図８から不活性化定数を計算した。８２℃における突然変異体３３の熱不活性化を、８２℃で０．１２０／分と推測した。これらの温度では、ＷＴタンパク質に対する熱不活性化の検出は、全くなかった、あるいは低かった。
【０１４７】
Ｂ．シャフリング実験
【０１４８】
それから、異なる熱安定性を持つ突然変異体を生成するために、Ｌシャフリング（商標）技術を用いて突然変異体３３及びＷＴ遺伝子を再結合した。異なる突然変異体が予期された。ＷＴ最適温度を持つ突然変異体、ＷＴよりも熱安定性が低い突然変異体、そして突然変異体３３の最適温度の場合よりも熱安定性が高い突然変異体。
【０１４９】
１）断片ライブラリ
【０１５０】
ＷＴ及び突然変異体３３のＰＣＲ増幅後、その産物を、ＨｉｎｃＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｈＩ、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶの、六つの制限酵素の混合物で消化し、八つの断片（１２０から７００ｐｂまで）を生成した。３％アガロース・ゲルを用いる、六つの制限エンドヌクレアーゼの混合物でのＰＣＲ産物の断片化、図９を参照。
【０１５１】
２）シャフリング実験
【０１５２】
ＲＬＲ（組み換えライゲーション反応）は、変性及びライゲーションあるいはハイブリダイゼーションのステップを数サイクル繰り返して、熱安定性リガーゼと共に、（図９に示す）標準化した断片、そしてテンプレートとしてのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ２６＋ＸｙｎＡを用いて行った。
【０１５３】
負の制御を、熱安定性リガーゼ（Ｂ）を含まずに同じ条件で行った。その結果を図１０、１％アガロース・ゲルを用いるＬシャフリング（商標）実験に示す。図１０は、熱安定性リガーゼがない場合、断片が組み換えに用いられないことを示す。それから、反応混合物にＤｐｎＩを加えることによって、テンプレートの選択的消化を行った。
【０１５４】
３）クローニング産物
【０１５５】
ＰＣＲ・Ｐｆｕ増幅（図１１、１％アガロース・ゲルを用いるＬシャフリング（商標）産物へのＰＣＲ・Ｐｆｕ）を、５’センス及び５’アンチセンス合成プライマーと上記プロトコルとを用いて、Ａ及びＢ（図９、負の制御）両方のＤｐｎＩ消化Ｌシャフリング（商標）産物に対して行った。クローニングのための多量の増幅Ｌシャフリング（商標）産物を得たにも拘わらず、テンプレート増幅は全く起こらなかった。したがって、Ｌシャフリング（商標）産物は、プライマー特定制限エンドヌクレアーゼで消化され、ｐＥＴ２６ｂ＋上の適合性がある部位内へライゲートされ、そして大腸菌ＭＣ１０６１ＤＥ３へ変換されてＬシャフリング（商標）・ライブラリを生成した。
【０１５６】
４）生化学的な特徴
【０１５７】
８２℃で３０分間定温放置後に残る活性に関して、Ｌシャフリング（商標）・ライブラリからいくつかのクローンを選択した。
【０１５８】
クローン２４、４１及び５６（図１２、９５℃における突然変異体の熱不活性化）は、突然変異体３３の最適温度を持ち、そしてクローン６はＷＴキシラナーゼの最適温度を持つ。これらの実験条件において、９５℃で１２０分間定温放置した後、ＷＴキシラナーゼは１００％の活性を維持した。対照的に突然変異体３３については、９５℃で１分間の後、活性の残留は全く検出されなかった。図１３は、二つの親核とは異なる特性を示したＬシャフリング（商標）・ライブラリからの四つの突然変異体を示す。
【０１５９】
例ＩＶ
【０１６０】
例ＩＶは、ランダムな消化を用いる本発明の実施例を表す。
【０１６１】
Ｉ．材料及び方法
【０１６２】
Ａ．菌種、ゲノム及びプラスミドＤＮＡ
【０１６３】
すべてのＤＮＡ操作に対して、標準技術及び処理を用いた。大腸菌ＭＣ１０６１ＤＥ３細胞を用いて、発現プラスミドｐＥＴ２６ｂ＋（Novagen）を繁殖した。
【０１６４】
Ｂ．オリゴヌクレオチド
【０１６５】
ＰＣＲのためのすべての合成オリゴヌクレオチド・プライマーは、ＭＷＧバイオテクが合成した。センス・プライマー５’ＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡ３’、そしてアンチセンス・プライマー５’ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＴＴＣ３’を用いて、テルモトガ・ネアポリターナ・キシラナーゼＡ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線部分）を導入した。センス・プライマー５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡ３’、そしてアンチセンス・プライマー５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧ３’を用いて、アシドバクテリア・カプスラーツム・キシラナーゼ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位（下線部分）を導入した。ＮｄｅＩ部位は初期コドン（太字）を含んでいた。
【０１６６】
Ｃ．酵素
【０１６７】
制限酵素、ＤＮＡ重合酵素及び熱安定性リガーゼは、ネブ及びエピセンターから購入し、製造業者の勧めに従って用いた。
【０１６８】
ＩＩ．結果
【０１６９】
テルモトガ・ネアポリターナ遺伝子（３．２ｋｂ）及びアシドバクテリア・カプスラーツム遺伝子（１．２ｋｂ）は再結合した。
【０１７０】
Ａ．断片ライブラリ
【０１７１】
テルモトガ・ネアポリターナとアシドバクテリア・カプスラーツム遺伝子上でＰＣＲ増幅を行ってから、ＤＮアーゼＩでの消化を行った。
【０１７２】
図１３、１％アガロース・ゲルを用いるテルモトガ・ネアポリターナ（Ａ）及びアシドバクテリア・カプスラーツム（Ｂ）遺伝子のＤＮアーゼＩ断片化を参照。
【０１７３】
Ｂ．シャフリング実験
【０１７４】
（図１３に示す）熱安定性リガーゼ及び熱安定性フラップで標準化した断片で、変性及びハイブリダイゼーションあるいはライゲーションを数サイクル繰り返して、ＲＬＲを行った。
【０１７５】
同じ条件の下で、ただし熱安定性リガーゼそして／あるいは熱安定性フラップがない状態で、負の制御を行った（Ａ、Ｂ及びＣ）。その結果を図１４、１％アガロース・ゲルを用いるＬシャフリング（商標）実験に示す。図１４は、熱安定性リガーゼ及び熱安定性フラップがない場合、断片が再結合しないことを示す。図１４において、Ａは、リガーゼ及びフラップ活性がない断片を表し、Ｂは、リガーゼのみを持つ断片を表し、Ｃは、フラップのみを持つ断片を表し、そしてＤは、シャフリング状態を表す。
【０１７６】
例Ｖ
【０１７７】
例Ｖは、例ＩＩＩの材料及び方法を用いたが、ステップ（ｂ）及び（ｃ）の異なるサイクル数で実験した。図１５Ａ、ｎサイクルのステップ（ｂ）及び（ｃ）を用いるＬシャフリング（商標）、そして図１５Ｂ、対応するＬシャフリング（商標）産物のＰＣＲ増幅を参照。図１５Ａ及びＢに示すように、組み換えポリヌクレオチドを得るためには、少なくとも一つのサイクル（ｎ＝１）が必要である。
【０１７８】
例ＶＩ
【０１７９】
例ＶＩは、例ＩＩＩの材料及び方法を用いたが、
次に示す七つの量の断片で実験した。
１：１ｘ
２：２ｘ
３：３ｘ
４：４ｘ
５：１１ｘ
６：１４ｘ
７：１７ｘ
【０１８０】
図１６、断片の増量を用いるＬシャフリング（商標）実験は、これらの７つの量に対する結果を示す。
【０１８１】
前述のプレゼンテーションは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の実施例を、添付図面を参照しながら詳細に説明したが、ここで説明した方法への変更が可能であることは、本技術の熟練者には明白である。本技術の熟練者は、これらの、そして他の種々の変更及び実施例を、本発明の範囲から外れることなく行うことが可能である。本発明の範囲は、従来の技術を考慮に入れて、請求項及びそれと同等のものに参照して判定されるべきである。
【０１８２】
（参照文献）
0004533584.tif 000013
0004533584.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
添付の図面を参照する。
【図１Ａ】従来のＤＮＡシャフリングを概略的に表す。
【図１Ｂ】従来のＳｔＥＰ（図１Ｂ）を概略的に表す。
【図２−１】本発明のプロセスの実施例、そしてその変形及び用途を概略的に表す。
【図２−２】本発明のプロセスの実施例、そしてその変形及び用途を概略的に表す。
【図２−３】本発明のプロセスの実施例、そしてその変形及び用途を概略的に表す。
【図３】ｐｏｎＢ遺伝子の各突然変異体による突然変異の１０領域（ＰｖｕＩＩ及びＰｓｔＩ）の位置を表す。
【図４】ｐｏｎＢ遺伝子配列に比較するために用いたプライマーの位置を表す。
【図５】アガロース・ゲル上における、ＲＬＲ反応のＲＬＲ及びＰＣＲ反応生成物の泳動を表す。
【図６】制限断片に比較した突然変異の位置を表す。
【図７】１％アガロース・ゲルを用いるＷＴ・ＸｙｎＡ遺伝子に対するＰＣＲの結果にエラーが起こり易いことを表す。
【図８】８２℃における、突然変異体３３の熱不活性化を表す。
【図９】３％アガロース・ゲルを用いる、六つの制限エンドヌクレアーゼによるＰＣＲ産物の断片化の結果を表す。
【図１０】１％アガロース・ゲルを用いる、Ｌシャフリング（商標）実験の結果を表す。
【図１１】１％アガロース・ゲルを用いて、Ｌシャフリング（商標）産物に対してＰＣＲ・Ｐｆｕを使用したときの結果を表す。
【図１２】９５℃における、突然変異体の熱不活性化を表す。
【図１３】１％アガロース・ゲルを用いる、 Thermotoga neapolitana （Ａ）及び Acidobacterium capsulatum （Ｂ）遺伝子のＤＮアーゼＩ断片化の結果を表す。
【図１４】１％アガロース・ゲルを用いる、Ｌシャフリング（商標）実験の結果を表す。
【図１５Ａ】ステップ（ｂ）及び（ｃ）をｎサイクル用いるＬシャフリング（商標）の結果を表す。
【図１５Ｂ】対応するＬシャフリング（商標）産物のＰＣＲ増幅を示す。
【図１６】断片の量を増加させた、Ｌシャフリング（商標）実験の結果を表す。
【図１Ａ】
0004533584.tif 000015
【図１Ｂ】
0004533584.tif 000016
【図２−１】
0004533584.tif 000017
【図２−２】
0004533584.tif 000018
【図２−３】
0004533584.tif 000019
【図３】
0004533584.tif 000020
【図４】
0004533584.tif 000021
【図５】
0004533584.tif 000022
【図６】
0004533584.tif 000023
【図７】
0004533584.tif 000024
【図８】
0004533584.tif 000025
【図９】
0004533584.tif 000026
【図１０】
0004533584.tif 000027
【図１１】
0004533584.tif 000028
【図１２】
0004533584.tif 000029
【図１３】
0004533584.tif 000030
【図１４】
0004533584.tif 000031
【図１５Ａ】
0004533584.tif 000032
【図１５Ｂ】
0004533584.tif 000033
【図１６】
0004533584.tif 000034