(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）からなるドキソルビシンのリポソーム用時調製用キット。
（Ａ）イ）ホスファチジルコリン、オレイン酸及びコレステロール硫酸ナトリウム、並びに、ロ）グリセリン、グリセリン及びエタノール、又はグリセリン及びエタノール及び水、のいずれかである溶媒であって、重量比で７０％以上がグリセリンである溶媒、を構成成分とする不活性ガス雰囲気下で容器内に密閉されたリン脂質組成物。
（Ｂ）ドキソルビシン。
（Ｃ）水性溶媒。
【請求項２】
ドキソルビシン１０ｍｇあたり、ホスファチジルコリンが８０−２００ｍｇであり、オレイン酸が５−１０ｍｇおよびコレステロール硫酸ナトリウムが１０−２０ｍｇである、請求項１記載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項３】
ドキソルビシン（Ｂ）が固体、あるいはグリセリン、グリセリン及びエタノール、又はグリセリン及びエタノール及び水、のいずれかである溶媒であって、重量比で７０％以上がグリセリンである溶媒で溶解された溶液である請求項１又は２記載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項４】
該水性溶媒（Ｃ）が０．９％塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、ブドウ糖リンゲル液、及びハルトマン液からなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリポソーム用時調製用キット。
【請求項５】
請求項１記載のリン脂質組成物（Ａ）にドキソルビシン（Ｂ）を混合してドキソルビシン（Ｂ）を溶解せしめ、ついで水性溶媒（Ｃ）と混合して得られたリポソーム組成物であって、１μｍ以上の粒子の比率が５重量％以下であり、リポソーム粒子の平均粒径が７０ｎｍ以下であり、ドキソルビシン（Ｂ）の９０重量％以上がリポソーム粒子に包含されていることを特徴とするリポソーム組成物。
【請求項６】
ホスファチジルコリン、オレイン酸及びコレステロール硫酸ナトリウムが、重量比で７０％以上がグリセリンであるグリセリンとエタノールとの混合液に溶解され、得られた溶解液が窒素雰囲気下で封入されたアンプルと、ドキソルビシンを収納したガラスバイアルと、生理食塩水を収納したガラスボトルとからなるドキソルビシンのリポソーム用時調製用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は調製方法が容易なカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関する。
また、本発明は平均粒子径が小さいリポソームを調製できるカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関する。
また、本発明は凝集物の少ないリポソームを調製できるカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関する。
また、本発明はカチオン性薬物の包含率が高いリポソームを調製できるリポソーム用時調製用キットに関する。
また、更に本発明は上述の、調製方法が容易で、リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、カチオン性薬物が効率良くリポソームに含有されるという特徴を同時に満足するカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットに関する。
また、本発明は調製方法が容易で、リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、ドキソルビシン（アドリアマイシン）が効率良くリポソームに含有されるという特徴を同時に満足するドキソルビシン（アドリアマイシン）のリポソーム用時調製用キットに関する。
【０００２】
さらにまた、本発明はリン脂質組成物（Ａ）にカチオン性薬物（Ｂ）を混合してカチオン薬物（Ｂ）を溶解せしめ、ついで該溶液を水性溶媒（Ｃ）と混合して得られたリポソーム組成物であって、９０重量％以上のリポソーム粒子の粒径が１００ｎｍ以下であり、リポソーム粒子の平均粒径が７０ｎｍ以下であり、該カチオン性薬物（Ｂ）の９０重量％以上がリポソーム粒子に包含されていることを特徴とするリポソーム組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
薬物のリポソーム組成物は薬物がリン脂質などからなる脂質二重膜に包含された微粒子状組成物である。単独に薬物を生体内に投与する時と比較して、分解酵素から薬物を保護して例えば血中半減期が延長したり、消化酵素から薬物を保護して消化管からの薬物が吸収可能となったりする特徴が認められてきた。また、微粒子として挙動することから肝臓、脾臓などの組織、マクロファージなどの細胞に選択的に取り込まれたり、癌組織、炎症部位などに高濃度に集積することも知られている。従って単独では副作用が強い薬物の副作用を低下させ薬効を最大限発揮させるための方法として知られている。このようなリポソームの特徴、製造方法などについては既に成書が多くある。（例えば、“ライフサイエンスにおけるリポソーム”（シュプリンガー・フェアラーク東京社刊、1994年）を参照されたい。）
【０００４】
一方、ドキソルビシンは制癌活性をもつ抗生物質として知られている。しかし、心臓に対する毒性が強く、優れた制癌活性を有するものの幅広い使用が制限されている。
この副作用を軽減するためにドキソルビシンをリポソーム組成物とし心臓組織へのドキソルビシンの分布を抑制することは古くから研究され、既に製品化されている。例えば、Sequus  Pharmaceuticals社（米国）からDoxilという商品名で販売されている。この製品においては20mgのドキソルビシンが10mlのリポソームサスペンションになっており通常250mlの5%グルコース水溶液で希釈して３０分かけて点滴静注される。
【０００５】
また、K.K.Chakrabortyらはリン脂質、アンホテリシンBを含むエタノールとトリス緩衝液の組成物を調製し、次いでその組成物にポリソルベート８０を含むトリス緩衝液を滴下してアンホテリシンBを含有するリポソームを用時に調製している。(Proc.Symposiumu on Natural Origin Substances in Drug Formulation, Beijing, 4/4 November, 1998の39-40頁）ここで開示された方法は本リポソームを用時に調製しているという点で本発明と同じであるが、粒径の小さいリポソームを製造するために生体にとって有害となる可能性のある合成界面活性剤のポリソルベート80を使用せざるを得ないのが欠点であり、本発明と異なるところである。
【０００６】
従来、用時調製用リポソームにはいくつかの方法が提案されてきた。
例えば、水性溶媒として提供されるリポソームに用時薬物をエタノールなどの溶媒に溶解した溶液として添加する方法がある。しかし、この方法ではリポソームを調製するのに例えばボルテックスミキサーでガラス壁に付着したリン脂質を水性溶媒中に強制的にリポソーム状粒子として分離分散させたり、リン脂質の分散液に超音波などのエネルギーを照射したり、リン脂質分散液を細孔のあいた膜を通過させたりする必要があり、本発明の要件の簡易なリポソーム製造法ではない。また、リポソームを水性溶媒に溶解・分散した状態で保存すると保存中にリン脂質の酸化がおきたり、リポソーム粒子の凝集が発生して巨大な二次粒子が生成するという欠点がある。また、水性溶媒に溶解・分散を避けるために、調製したリポソームを噴霧乾燥したり凍結乾燥して固体とし、用時に薬物と水性溶媒を添加する方法もあるが、本方法でも噴霧乾燥時あるいは凍結乾燥時に煩雑な操作を必要とし、本発明の要件の簡易なリポソーム製造法ではない。また、固体となったリポソームに水性溶媒を添加してリポソームを再生する際に粒子が凝集したままで一次粒子にまで復元しないことが認められ好ましくない。
【０００７】
従って、予めリポソームを調製しそれを液体あるいは固体状態で保存することは困難であり、何らかの手段で用時にリポソームを調製する方法が必須のこととなる。しかも調製時に格別の機器・器具を用いず簡潔な方法でリポソームを調製しかつ薬物を包含させることがのぞまれており、それを可能とする本発明の進歩性・有用性は高い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、リポソームには製造上あるいは製造後の品質などにいくつかの課題があることが認められている。
【０００９】
先ず、リポソームを調製するには通常エネルギーを要する。例えばボルテックスミキサーでガラス壁に付着したリン脂質を水性溶媒中に強制的にリポソーム状粒子として分離分散させたり、リン脂質の分散液に超音波などのエネルギーを照射したり、リン脂質分散液を細孔のあいた膜を通過させたりする方法が知られている。従ってこれらの方法は調製する際に機器・器具を必要としまた時間がかかる。また、リン脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解した後に該溶媒を蒸発させてガラス壁に付着させるが、この際概溶媒の残留量が問題となる。
【００１０】
また、リポソーム粒子が保存中に凝集して粒径が巨大な二次粒子を生成しやすい。リポソーム粒子の粒径は目的に応じて異なる範囲に調製されるが、静脈注射して使用する場合には血管に詰まることを避けるために１μｍ以上の巨大粒子があってはならない。通常、１μｍ以上の粒子がなく、かつ平均粒子径は０．１μｍ以下にすることが推奨されている。
【００１１】
また、薬物のリポソームへの包含率はリポソームの調製方法によって異なる。包含率が高ければ高いほど薬物をリポソーム組成物として期待する特性が見られることは当然である。従って高い包含率、具体的には100％に近い包含率が望まれる。
【００１２】
従って、上述の課題を解決したリポソーム製剤、特にこれらの課題を同時に解決した製剤、すなわち、調製方法が容易で、有害な有機溶媒を使用せず、リポソームの粒径が小さく、凝集物がなく、薬物が効率良くリポソームに含有されるという特徴を同時に満足する薬物のリポソーム組成物が望まれている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべく本発明者らは研究を開始したが、リポソームの組成、安定性、物性などはその中に包含される薬物によって大きく影響されることは公知である。そこで、本発明者らは上述の如く優れた制癌活性がありながら副作用のためにその使用が制限されているドキソルビシンに注目し、ドキソルビシンのように生体内の環境で正電荷をもつ薬物について鋭意研究した。
【００１４】
その結果、驚くべきことに、リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）を、リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）とともにグリセリンを含んでなる溶媒（３）に溶解し不活性ガス雰囲気下で容器内に密閉したリン脂質組成物（Ａ）をカチオン性薬物（Ｂ）に用時添加して更にこの溶液を静脈用注射に適した水性溶媒（Ｃ）に添加するだけで粒径が小さく、凝集物がなく、薬物が効率良く包含されたリポソームが調製されることを見出した。従って、リン脂質組成物（Ａ）、カチオン性薬物（Ｂ）、及び水性溶媒（Ｃ）はキットとして医療現場に提供される。
【００１５】
すなわち本発明は次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）からなるカチオン性薬物のリポソーム用時調製用キットを提供するものである。
（Ａ）リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）、リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）、及びグリセリンを含んでなる溶媒（３）を構成成分とする不活性ガス雰囲気下で容器内に密閉されたリン脂質組成物。
（Ｂ）カチオン性薬物。
（Ｃ）水性溶媒。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用されるリポソーム膜形成物質（１）としては通常電気的に中性のリン脂質の１種以上が好ましく、その例としてホスファチジルコリン（卵黄由来あるいは大豆由来）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、水添大豆レシチン、カルジオリピッド、ポリエチレングリコール化リン脂質類などが挙げられる。また、生成したリポソームの血中濃度を持続するためにポリエチレングリコール化されたリン脂質も使用される。ポリエチレングリコール化されたリン脂質としてはポリエチレングリコール化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール化卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール化１−パルミチル−２−オレイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール化水添大豆ホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。これらの中でもホスファチジルコリン（卵黄由来あるいは大豆由来）がドキソルビシンリポソームを調製するには望ましい。
【００１７】
本発明に使用されるリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）としては電気的に負に帯電した脂質あるいはリン脂質が好ましく、その例として、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸などの不飽和脂肪酸類、コレステロール硫酸ナトリウム、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロールなどが挙げられる。これらの中でもオレイン酸とコレステロール硫酸ナトリウムがドキソルビシンリポソームを調製するには望ましい。
【００１８】
本発明に使用されるグリセリンを含んでなる溶媒（３）はグリセリンを必須成分とする溶媒であり上記のリポソーム膜形成物質（１）とリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）とを溶解するものである。しかし、本発明においてグリセリンは単に上記２成分の溶媒ではなく、生成するリポソームの粒径を小さく保つという本発明にとって極めて重要な役割を果たしている。グリセリンに加えられる溶媒としてはエタノール、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール類などが挙げられるが、全体の７０重量％以上はグリセリンであることが好ましい。
【００１９】
本発明の、リン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）、リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）、及びグリセリンを含んでなる溶媒（３）を構成成分とするリン脂質組成物（Ａ）を保存容器内に密封する際に使用される不活性ガスとしては窒素、アルゴンなどが挙げられるが、中でも窒素が望ましい。
【００２０】
本発明に使用されるカチオン性薬物（Ｂ）としてはドキソルビシン、ビンクリスチン、ダウノルビシン及びこれらの薬学的に許容される塩などが挙げられるが、中でもドキソルビシンが好ましい。これらの薬物は固体状態でバイアル、アンプルなどに密封されてもよいし、安定性が良好であれば溶媒、好ましくはグリセリンを含んでなる溶媒（３）に溶解してもよい。また溶解が可能であれば上記のリン脂質組成物と併せて密封されてもよい。
【００２１】
本発明に使用される水性溶媒（Ｃ）としては通常輸液に使用されるものでよく例えば、0.9％塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、ブドウ糖リンゲル液、ハルトマン液などが挙げられ市販品をそのまま使用できる。
【００２２】
本発明に使用されるカチオン性薬物（Ｂ）の量はキット製品であることから１回の治療に使用される量が望ましいが、通常、使用量は適宜増減されることを考慮すると最小必要量を単位として提供されてもよい。ドキソルビシンの場合には通常1回10mgであるので10mgをガラスバイアル中に密封するのがよい。
【００２３】
本発明に使用されるリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）の量は、これがもつ負電荷の量がリポソーム内に包含されるカチオン性薬物（Ｂ）の正電荷よりも多くなるように使用される。ドキソルビシンの場合には負電荷をもつオレイン酸とコレステロール硫酸ナトリウムが使用されるが、オレイン酸はドキソルビシンと当量以上、コレステロール硫酸ナトリウムはドキソルビシンの当量の0.5倍量以上使用するとドキソルビシンのリポソームへの包含率が特に高くなることが知見されている。ドキソルビシンを10mg使用する場合にはオレイン酸は5-10mgを、コレステロール硫酸ナトリウムは10-20mgを使用するのが望ましい。
【００２４】
本発明に使用されるリポソーム膜形成物質の量はリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）の10倍量程度が望ましく、ドキソルビシンでは100-200mgが使用される。
【００２５】
本発明に使用されるグリセリンを含んでなる溶媒（３）の量は溶解されるリポソーム膜形成物質とリポソームゼータポテンシャル増加剤（２）の量に依存するが通常1-5mlの範囲で使用される。
【００２６】
また、本発明に使用される水性溶媒（Ｃ）の量は市販のガラス容器入り製品に収納されている量に依存するが、通常250-500mlが使用される。
【００２７】
本発明においては、例えばリン脂質から成るリポソーム膜形成物質（１）を、リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）とともにグリセリンを含んでなる溶媒（３）に溶解し不活性ガス雰囲気下で容器内に密閉したリン脂質組成物（Ａ）をカチオン性薬物（Ｂ）に用時添加して更にこの溶液を静脈用注射に適した水性溶媒（Ｃ）に添加することによりリポソームを調製することができる。
【００２８】
上記の添加という操作は液を適当な容器内で混合し必要に応じて軽く手で振トウするだけであり攪拌振動を与えるための機器・器具類は全く必要ではない。また、上記リン脂質組成物（Ａ）を調製するにもリポソーム膜形成物質（１）、リポソームゼータポテンシャル増加剤（２）を不活性ガス雰囲気下グリセリンを含んでなる溶媒（３）に溶解し密封する操作だけであり容易である。更に、カチオン性薬物（Ｂ）もバイアルなどに必要量を採取し必要であればグリセリンを含んでなる溶媒に溶解したり不活性ガスなどの雰囲気下密封するだけであり操作は容易である。また、上記リン脂質組成物（Ａ）ではリン脂質は無水状態かあるいは存在しても最少量の水に接触するのみであり安定性を損なう要因はほとんどない。
【００２９】
以下に、本発明を実施例で詳細に説明するがこれらによって限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
［実施例１］
卵黄由来ホスファチジルコリン（Sigma社製）80mg、オレイン酸（Sigma社製）5mg、コレステロール硫酸ナトリウム（Sigma社製）14mgをとり、グリセリン（和光純薬製）とエタノール（米山薬品製）の4:1（重量比）混液2.5gに溶解する。これを窒素雰囲気下でガラスバイアルに封入する（ａ）。一方、ドキソルビシン（Sigma社製）を10mgとり窒素雰囲気下にガラスバイアルに封入する（ｂ）。更に市販の生理食塩水250ml（扶桑薬品製）（ｃ）を用意し、以上３点でキットとする。用時は、先ず上記のリン脂質組成物溶液（ａ）をバイアルから取り、これをドキソルビシンが封入されているバイアル（ｂ）中に添加し、手で穏やかに攪拌してドキソルビシンを溶解する。溶解後できたドキソルビシン溶液を生理食塩水中（ｃ）に滴下し、手で穏やかに振トウしてドキソルビシンのリポソーム溶液とする。
得られたリポソーム溶液は赤色澄明であり、その他に下記の性質を示した。
（１）粒度分布
大塚電子製電気泳動光散乱光度計（ELS-800型）により測定した結果を示す。
平均径：54.5nm
1ミクロン以上の粒子の比率（重量基準）：５％以下
（２）ドキソルビシンのリポソーム包含率
ゲルろ過法によりリポソーム外に遊離しているドキソルビシンとリポソーム内に包含されているドキソルビシンを定量した結果、仕込みの10mgのドキソルビシンのうち9.85mgが包含されていりことが判明した。従ってリポソーム包含率は98.5%となる。
【００３１】
［実施例２−４、対照例１−２］
実施例１に準じて、リポソームゼータポテンシャル増加剤のオレイン酸（Sigma社製）5mg、コレステロール硫酸ナトリウム（Sigma社製）14mgの替わりに次の組成のものを用いて同様の操作でリポソームを製造し、ドキソルビシンのリポソーム包含率を比較した。
【００３２】
【表１】
0004444385.tif 000002
【００３３】
［実施例５−６、対照例３−４］
実施例１に準じてグリセリン（和光純薬製）とエタノール（米山薬品製）の4:1（重量比）混液2.5gのかわりに下記の組成の溶媒を使用して同様の操作でリポソームを製造しリポソームの性質を比較した。
【００３４】
【表２】
0004444385.tif 000003
【００３５】
［対照例５−６］
リポソーム製造法の違い
本発明で調製したリポソームと別の方法で調製したリポソームとの特性を比較した。すなわち、通常の方法としては、クロロホルムに溶解したリポソーム膜形成物質をビーカーにいれ溶媒を乾固した後ドキソルビシンの生理食塩水溶液を添加しボルテックスミキサーで振トウさせて製造した。（対照例５）
また、この方法でドキソルビシンを加えないで製造したリポソームを凍結乾燥して固体とし、これにドキソルビシンの生理食塩水を加えて製造したリポソームについても比較検討した。（対照例６）
【００３６】
【表３】
0004444385.tif 000004