(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物Ｅ−３９６株(受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３)をＮＴＧ(N-methyl-N’-nitoro-N-nitrosoguanidine)で変異処理し、赤色の色調が濃いコロニーを選択し、培養液中のカロテノイド化合物を分析し、アスタキサンチンの生産性が向上した変異株を選択し、６日間以上培養することを特徴とする、カロテノイド化合物を３質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カロテノイド化合物を含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含有物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド化合物は長鎖のポリエン構造、多くは炭素数４０のテトラテルペノイドを持ち、黄、橙、赤ないし紫色を呈する色素群の総称であり、具体的にはβ−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、アドニルビン、アドニキサンチン等といった化合物をさす。これらの化合物は天然色素として飼料添加物、食品添加物、医薬品等として有用である。例えば、アスタキサンチンは養殖魚であるサケ、マス、マダイ等の体色改善剤のごとき飼料添加物として、また安全な天然食品添加物として産業上価値が高い。アドニキサンチンは工業的製造法が確立することによりアスタキサンチンと同様に飼料添加物、食品添加物、医薬品としての使用が期待される。カンタキサンチンは飼料添加物、食品添加物、化粧品等として使用され、ゼアキサンチンは飼料添加物、食品添加物として使用されている。さらにエキネノン、アドニルビンも飼料添加物、食品添加物等としての使用が期待される。これらカロテノイド化合物の製造方法としては、化学合成法、微生物による産生方法、天然物からの抽出法などが知られており、すでにアスタキサンチン、カンタキサンチンについては化学合成品が市販されている。微生物による産生方法は化学合成法に比較して、金属触媒、溶剤を用いず製造できることから安全性が高いことが利点である。一般的にカロテノイド化合物は酸素、光に不安定であるが、微生物が産生するカロテノイド化合物は微生物菌体の内部に蓄積されるため、細胞膜、細胞壁、その他の酸化防止剤によって安定的に保たれる。飼料添加物等として用いる場合、保存安定性が高いことは利点であり、微生物菌体そのものを用いることができれば大きな利点である。さらに、菌体内のカロテノイド化合物を抽出精製して用いるのであれば、安全性に問題のある塩素系溶媒などを用いる必要がある。以上よりカロテノイド化合物を含有する微生物よりなる微生物培養沈殿物を飼料添加物等に用いることは大きな利点を有する。その際、カロテノイド化合物を生産する微生物の細胞壁が強固である場合はそのままの菌体で供給しても吸収効率は極めて低く菌体を機械的に粉砕、あるいは化学薬品、酵素などで分解する必要がありコストの面で問題がある。しかも菌体を分解した状態ではカロテノイド化合物の安定性が低下する問題もある。さらに、微生物培養沈殿物中のカロテノイド化合物の含有量が低い場合、飼料を製造する際に、微生物培養沈殿物が多く必要とされ操作性がわるく運送コストも嵩む、飼料の栄養学的なバランスも崩すという問題もある。しかしながら、強固な細胞壁を持たないことから菌体内部に蓄積されるカロテノイド化合物が容易に利用され易い長所を有する微生物よりなり、さらにカロテノイド化合物を３質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含有物は見いだされていなかった。
【０００３】
カロテノイド化合物の中でもアスタキサンチンはサケ、マス、マダイ等の魚類、エビ、カニ等の甲殻類に含まれる赤色系の色素そのものであり、色調が美しい点で有用であり、上述のように飼料添加物、天然食品添加物として広く使用されている。アスタキサンチンを生産するとして知られている赤色酵母ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）は酵母であるために、細胞壁が強固であるという問題を有する。細菌によるアスタキサンチンの生産は以下のものが知られているがいずれも乾燥菌体重量当たりの含有量は低い。ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｎｏ．１０３株は乾燥菌体重量当たりわずか０．００３％のアスタキサンチンを生産するにすぎない（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２７，１９６９）。またパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｃｕｓｉｉＤＳＭ１１５７４株は乾燥菌体重量当たりわずか０．０２２％のアスタキサンチンを生産するにすぎない（ＷＯ  ９９／６５８６）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然色素として有用なカロテノイド化合物を高濃度含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含有物を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は、以下の手段を提供する。
１．  カロテノイド化合物を３質量％以上含有する微生物培養沈殿物よりなる飼料添加用色素含有物。
２．  カロテノイド化合物中の４０質量％以上がアスタキサンチンであることを特徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
【０００６】
３．  微生物培養沈殿物中の微生物の１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と実質的に相同であることを特徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
４．微生物培養沈殿物中の微生物がＥ−３９６株もしくはその変異株であることを特徴とする上記の飼料添加用色素含有物。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の飼料添加用色素含有物は微生物培養沈殿物よりなる。まず最初に、本発明の微生物培養沈殿物を説明する。本発明の微生物培養沈殿物とは、カロテノイド化合物を生産する微生物、主に菌体を培養してカロテノイド化合物を生産させ、その培養液を濾過、遠心分離機等により処理し、ある程度水分を除去したものを指す。カロテノイド化合物を生産する菌株の培養方法はカロテノイド化合物を生成する条件であればいずれの方法でもよいが、例えば、以下のような方法を採用できる。すなわち、培地としては生産菌が生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、および必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基等）を含むものを使用する。炭素源としてはグルコース、シュークロース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール等のアルコール類等が挙げられる。添加割合は炭素源の種類により異なるが、通常培地1L当たり1〜100g、好ましくは2〜50gである。窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なるが、通常培地1Lに対し0.1g〜10g、好ましくは1〜3gである。無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素ニナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なるが、通常培地1Lに対し0.001〜10gである。特殊な要求物質としてはビタミン類、核酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕、大豆油、オリーブ油、トウモロコシ油、アマニ油、等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は特殊な要求物質の種類により異なるが、通常、培地1Lに対し1g〜200g、好ましくは10〜100gである。培地のpHは2〜12、好ましくは6〜10に調整する。培養条件は15〜80℃、好ましくは20〜35℃の温度であり、通常1日〜20日間、好ましくは2〜8日間振とう培養あるいは通気撹拌培養を行う。
【０００８】
次に、以上の方法により得られた培養液から水分を除去する作業を行う。本発明の飼料添加用色素含有物を得るために、どの程度の水分除去が必要かは培養液の状態（色素含有量等）により異なるが、一般にまず濾過の作業を行いさらに水分の除去が必要であれば沈殿物の乾燥を行う。濾過の方法は、通常の濾過法、遠心分離法などにより行うことができる。得られた沈殿物は塩類、糖類などの培地成分が溶解した水および沈殿物を含むため、沈殿物中のカロテノイド化合物の含有量をさらに向上させるため、培養液から分離した沈殿物に水を加え懸濁した後、再度沈殿物を分離することも有効である。この工程により、水に溶解している培地成分等をある程度除去することができる。さらに沈殿物中のカロテノイド化合物の含有量を上げる必要がある場合には、沈殿物を乾燥して水分を除去する方法をとることが可能である。乾燥の方法としては、通常の噴霧乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。  以上の方法で得られた微生物培養沈殿物は飼料添加用色素含有物として良好に使用することができる。本発明の飼料添加用含有物はカロテノイド化合物の分解を防止する目的でＢＨＴ（ブチルハイドロキシトルエン）、エトキシキン、ビタミンＥなどの酸化防止剤を添加することも可能である。さらにこれらの表面をゼラチンなどで被覆しても良い。
【０００９】
次に本発明で使用される微生物について説明する。本発明で使用される微生物は、細菌、酵母等培養によりカロテノイド化合物を生産し、その培養沈殿物中に３質量％以上のカロテノイド化合物を含有できるものであれば特に限定されないが、培養中に微生物内に蓄積されたカロテノイド化合物を利用することを考え、細胞壁が薄く色素の有効な利用が可能である細菌を用いることが好ましい。特に、増殖速度の速さ、カロテノイド化合物の生産性から、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と実質的に相同であることが特に好ましい。
ここで言う実質的に相同とはＤＮＡの塩基配列決定の際のエラー頻度等を考慮し９８％以上の相同性であることを意味する。
【００１０】
上記配列と実質的に相同な配列を有する細菌は、培養により、菌体中にアスタキサンチン、アドニキサンチン、βーカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、βークリプトキサンチン、3ーヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビン等のカロテノイド化合物が混合物として蓄積する。菌体中に含まれるカロテノイド化合物の生成比率は、例えば、培養における好気条件を変えることにより、カロテノイド化合物の生成比率を変えることができる。一例として培養液中の溶存酸素濃度を高めることによりアドニキサンチンの生成比率を高めることができる。また、変異により、カロテノイド化合物の生成比率の変化した菌体を得ることも可能である。変異の方法としては、Ｘ線照射、紫外線照射等の物理的方法、化学変異剤、例えばＮＴＧ（N-methyl-N'-nitoro-N-nitrosoguanidineとＥＭＳ(ethylmethane sulfonate)等による変異処理のような化学的方法を用いた人為的変異処理等を用いることが可能である。
【００１１】
該細菌のうち、生成するカロテノイド化合物のうちの４０質量％以上がアスタキサンチンであるものとして、E-396株を挙げることができる。この株は、発明者らが新しく単離したものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成5年4月27日にFERM BP-4283として寄託された。この菌株の菌学的性質は、特開平7-79796号公報、特開平8-9964号公報、特開平9-308481号公報に記載されている通りである。また、この菌株の16SリボゾームRNAに対応するDNAの塩基配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００１２】
１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が本発明の特定の配列と実質的に相同である菌株が生産するアスタキサンチンは（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンでありその純度はほぼ１００％である。天然物であるザリガニ、ヘマトコッカス、サケ、マス、マダイに存在するアスタキサンチンは（３Ｓ，３’Ｓ）体の含有率が高いことが知られている。一方ファフィア・ロドチーマは（３Ｒ，３’Ｒ）体の含有率が多く天然に存在するアスタキサンチンとは反対の絶対配置を持つことが知られている。本発明の菌株が生産するアスタキサンチンは１００％の（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンであり天然において多数を占めるアスタキサンチンと同一の絶対配置を有することは産業上価値が高い。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕
第1表の組成からなる培地６mLを直径18mmの試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これにE-396株(FERM BP-4283)を1白金耳植菌し２８℃で２日間３５０rpmの往復振とう培養を行った。この培養液２mLを上と同組成の培地が１００mL入った５００mL容量の坂口フラスコ１本に植菌し２８℃、６日間100rpmの往復振とう培養を行った。培養液１００ｍＬから遠心分離により菌体（湿重量３．２g）を得た。この菌体にイオン交換水５０ｍＬを添加し十分懸濁した後、再度遠心分離機を行い菌体（湿重量３．１g）を得た。次いで菌体３．１ｇを凍結乾燥し菌体乾燥物１．１gを得た。乾燥菌体物中のカロテノイド含有量を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ第2表の組成であった。また菌体乾燥物中の水分含量は２．５％であった。
【００１４】
【表１】
0004463347.tif 000002
【００１５】
【表２】
0004463347.tif 000003
【００１６】
〔実施例２〕
E-396株(FERM BP-4283)をNTG(N-methyl-N'-nitoro-N-nitrosoguanidine)で変異処理し、赤色の色調が濃いコロニーを選択した。これらの株の培養液中のカロテノイド化合物を分析し、アスタキサンチンの生産量が向上した変異株を選択した。第1表の組成からなる培地５ｍＬを直径18mmの試験管に入れ121℃、15分間蒸気殺菌した。これに変異株を1白金耳植菌し30℃で2日間300rpmの往復振とう培養を行った。この培養液２mLを上と同組成の培地が100mL入った500mL容量の坂口フラスコに植菌し２９℃、２日間１２０rpmの往復振とう培養を行った。次にこの培養液８００ｍＬ分を表３の組成の培地が20L入った30L容量の発酵槽に植菌し２９℃、４００rpm、1.0vvmの好気培養を１５０時間行った。培養液18Lからシャープレス型遠心分離機により菌体（湿重量６００g）を得た。この菌体に水道水を２０L添加し十分懸濁した後、再度シャープレス型遠心分離機により菌体（湿重量５３０g）を得た。次いで菌体５３０gに水道水を１．５Ｌ添加し十分懸濁後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥し菌体乾燥物２００ｇを得た。運転条件は入口空気温度２１０℃、出口空気温度１０５℃、懸濁液供給速度３８mL/minで行った。乾燥菌体物中のカロテノイド含有を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ第４表の組成であった。また乾燥菌体物中の水分含量は３．１％であった。
【００１７】
【表３】
0004463347.tif 000004
【００１８】
【表４】
0004463347.tif 000005
【００１９】
【発明の効果】
本発明の飼料添加用色素含有物は、カロテノイドが微生物の細胞膜、細胞壁等の作用により安定化されているため、酸素や光などに対し耐性を示し、長期間安定的に保存することが可能である。
【００２０】
【配列表】
0004463347.tif 000006
0004463347.tif 000007