(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(IA)もしくは(IB)：
【化１】
0004528131.tif 000066
［式中、
Arは、下記の置換基で置換されていてもよい2-ヒドロキシフェニル基であり；
R1 は、水素または下記の置換基で置換されていてもよいC1-C6アルキルであり；
R2 は、水素、下記の置換基で置換されていてもよいシクロアルキル、シクロアルケニル、C1-C6アルキル、C1-C6アルケニルもしくはC1-C6アルキニル；またはカルボキシ、カルボキサミドもしくはカルボキシエステル基であり；そして、
環Ａは、式(IIA)もしくは(IIB)：
【化２】
0004528131.tif 000067
（式中、ＸはCHまたはNを表し、Ｙは、CH、O、SまたはNHを表し、ここで(i)環炭素は下記の置換基で置換されていてもよく、そして／または(ii)環窒素は式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Qの基：
（ここで、Alk1、Alk2およびAlk3 は下記の置換基で置換されていてもよいC1-C3アルキルであり、
Cycは下記の置換基で置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基であり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｒおよびｓは、独立して0または1であり、
Zは、-O-、-S-、-(C=O)-、-SO2-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(=O)-、-NRASO2-または-NRA-（ここで、RAは水素またはC1-C6アルキルである）であり、そして
Qは、水素または下記の置換基で置換されていてもよい炭素環式基もしく複素環式基である）
で置換されていてもよい）
の環であり、
上記の置換基は、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル、メルカプト、メルカプト(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、フッ素および塩素を含むハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル(-CN)、オキソ、フェニル、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-CONHNH2、-CONHNHRA、-CONHNRARB、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARBおよび-NRACONRARB（ここで、RAおよびRBは独立して(C1-C6)アルキル基である）から独立して選択される置換基であり、４つまで置換され得る］
の化合物、またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Arは、5位が上記の置換基で置換されていてもよい2,4-ジヒドロキシフェニル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Arは、5位が塩素または臭素で置換されている2,4-ジヒドロキシフェニル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Arは、5位が上記の置換基で置換されていてもよいフェニルもしくはC1-C6アルキルで置換されている2,4-ジヒドロキシフェニル基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Arは、5位が上記の置換基でフェニル環が置換されていてもよいフェニルエチル基で置換されている2,4-ジヒドロキシフェニル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
R1およびR2が、独立して、水素、メチル、エチル、n- もしくはiso-プロピル、ヒドロキシエチルまたはベンジルである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
R1およびR2がそれぞれ水素である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
環Ａが、式(IIA)もしくは(IIB)：
【化３】
0004528131.tif 000068
（式中、ＸはCHまたはNを表し、ＹはCH、O、SまたはNHを表し、ここで(i)環炭素は前記の置換基で置換されていてもよく、そして／または(ii)環窒素は式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Qの基：
（ここで、Alk1、Alk2は前記の置換基で置換されていてもよいC1-C3アルキルであり、
p、rおよびsは、独立して0または1であり、
Zは、-O-、-S-、-(C=O)-、-SO2-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(=O)-、-NRASO2-または-NRA-（ここで、RAは水素またはC1-C6アルキルである）であり、
そして
Qは、水素または前記の置換基で置換されていてもよい炭素環式基もしくは複素環式基である）
で置換されていてもよい）
の環である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項９】
前記の置換基で置換されていてもよい環Ａが、式(IIA)（ここで、ＸはNであり、ＹはNHまたはCHである）である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
前記の置換基で置換されていてもよい環Ａが、式(IIA)であり、ＸがNであり、Ｙが-NRA-（ここで、RAは、式-(Alk1)-Q-の基（ここで、Alk1はC1-C3アルキレンであり、Qは前記の置換基で置換されていてもよいフェニル、ピリジル、フリル、チエニル、オキサジアゾリル、イミダゾリルもしくはモルホリニルである）である）である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１１】
RAが、前記の置換基で置換されていてもよいベンジル基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記の置換基で置換されていてもよい環Ａが、式(IIA)であり、ＸがNであり、Ｙが-NRA-（ここで、RAは、式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Qの基である）である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１３】
pが1であり、mが1であり、そしてCycがフェニレン基である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式(IC)もしくは(ID)：
【化４】
0004528131.tif 000069
（式中、Rは、水素、前記の置換基、またはそのフェニル環が前記の置換基で置換されていてもよいフェニルエチル基であり、R2、m、r、s、Alk3、ZおよびAlk2は、請求項１で定義されたとおりである）の化合物、またはそれらの塩、水和物もしくは溶媒和物。
【請求項１５】
R2が水素である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Rが塩素、臭素、またはそのフェニル環が前記の置換基で置換されていてもよいフェニルエチル基である、請求項１４または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
nが0であり、rが1であり、そしてZが-C(=O)NH-である、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１つに記載の化合物を、1以上の医薬的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HSP90阻害活性を有する置換ピラゾール、癌のようなHSP90活性の阻害に応答する疾病に関連した医薬での該化合物の使用、および該化合物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子シャペロンは、蛋白質の適切な折り畳みや立体構造を維持し、蛋白質の合成と分解のバランスの調節に非常に重要である。それらは、細胞増殖やアポトーシスのような多くの重要な細胞機能の調節に重要であることが示されている(JollyおよびMorimoto、2000; Smithら、1998; Smith、2001)。
【０００３】
熱ショック蛋白質(HSPs)
細胞が、熱ショック、アルコール、重金属および酸化ストレスを含む多くの環境ストレスに曝されると、熱ショック蛋白質(HSPs)として一般に知られている多くのシャペロンが、細胞に蓄積する。HSPsの誘導は、初期ストレス傷害から細胞を保護し、再生を高め、そしてストレス耐性状態の維持に導く。しかしながら、ある種のHSPsは、正常な、ストレスのない状態のもとで、重要な細胞蛋白質の増殖の一覧である、正確な折り畳み、分解、局在そして機能を調節することにより、主要な分子シャペロンの役割を果たすことも明らかとなっている。
【０００４】
細胞の発現、機能および局在の点で異なっている個々の遺伝子産物をもった多くのHSPs多重遺伝子族が存在する。それらは、分子量により、例えば、HSP70、HSP90およびHSP27のように分類される。
【０００５】
ヒトのいくつかの疾病は、蛋白質の間違った折り畳みの結果からもたらされ得る(Tytellら、2001に概説; Smithら、1998)。それゆえに、分子シャペロン機構を混乱させる治療の発展が有益であることを立証するかもしれない。ある容態（例えば、アルツハイマー病、プリオン病およびハンチントン病）において、間違って折り畳まれた蛋白質が、神経変性疾患をもたらす蛋白質凝集の原因となり得る。そのうえ、間違って折り畳まれた蛋白質は、野生型蛋白質の機能の損失をもたらし、細胞内で分子および生理的な機能の非調節に導き得る。
【０００６】
HSPsは癌にも関係している。例えば、腫瘍の進行段階に関係のあるHSPsによる分化発現の証拠がある(Martinら、2000; Conroyら、1996; Kawanishiら、1999; Jameelら、1992; Hoangら、2000; Lebeauら、1991)。種々の重大な腫瘍形成経路でのHSP90の関与、そして抗癌活性を有するある種の天然物が、この分子シャペロンを標的にしていることの発見の結果から、HSPの機能を阻害すれば、癌治療に役立つかもしれないとの魅力的で新しい概念が、展開されてきた。最初の分子シャペロン阻害剤が、現在、臨床試験中である。
【０００７】
HSP90
HSP90は、全細胞蛋白質の約1〜2％を構成しており、通常は、細胞中で、他の多くの蛋白質の一つと結合して２量体として存在している(例えば、Pratt、1997参照)。それは、細胞生存のために必須のものであり、二相のシャペロン機能を示す(Youngら、2001)。それは、種々の環境ストレス、例えば熱ショックによって本来の立体構造が変化させられた後に多くの蛋白質と相互作用すること、適切な蛋白質の折り畳みを保証すること、および非特異的な凝集を防ぐことによって、細胞のストレス応答において重要な役割を果たす(Smithら、1998)。さらに、最近の結果は、HSP90は、多分、突然変異蛋白質の不適当な折り畳みを修正することにより、突然変異の影響を緩和する役割も果たすことを示唆している(RutherfordおよびLindquist、1998)。
【０００８】
しかしながら、HSP90は、重要な調節の役割も有している。正常な生理的状態下、HSP90は、その小胞体ホモローグのGRP94と一緒に、細胞内でハウスキーピングの役割も果たしており、いくつかの重要なクライエント蛋白質の安定な立体構造および成熟（maturation）を維持する。これらは、３グループ：(a)ステロイドホルモン受容体、(b)Ser/Thrまたはチロシン・キナーゼ（例えば、ERBB2、RAF-1、CDK4およびLCK）および(c)例えば変種p53およびテロメラーゼhTERTの触媒サブユニット のような明らかに無関連の蛋白質の集団に細分化できる。これら全ての蛋白質は、細胞内の多くの生理学的および生化学的工程で、重要な調節の役割を果たしている。新規なHSP90クライエント蛋白質が、絶えず同定されている。
【０００９】
ヒトにおいて、多く貯蔵されているHSP90ファミリーは、４つの遺伝子、すなわち、サイトソルHSP90αおよびHSP90β同種体（isoform）（Hickeyら、1989）、小胞体中のGRP94（Argonら、1999）およびミトコンドリア基質中のHSP75/TRAP1（Feltsら、2000）からなる。それらのファミリー全ては、同じような作用形態を有するが、細胞内での局在により、異なったクライエント蛋白質と結合すると考えられる。例えば、ERBB2は、GRP94の特異的なクライエント蛋白質であることが知られており（Argonら、1999）、そしてタイプ1腫瘍壊死因子受容体（TNFR1）およびRBは両方ともTRAP1のクライエントであることが示されている（Songら、1995；Chenら、1996）。
【００１０】
HSP90は、クライエント蛋白質と調節蛋白質の間での一連の複合相互作用に関与している（Smithら、2001）。正確な分子についての詳細な解明は残っているが、最近数年間に行われた生化学的およびＸ-線結晶学的研究は、HSP90のシャペロン機能にますます詳細な洞察を与えた。
【００１１】
この問題に関する以前の議論に次いで、HSP90は、ATP加水分解に必須であるヌクレオチド結合ドメインの２量体の状態にあるATP-依存性分子シャペロンであり（Prodromouら、1997）、そして今度はこれがシャペロン機能に必須である（Prodromouら、2000a）ことが、今明らかになっている。ATPとの結合は、N末端ドメイン同士を、互いにより近づけて接触しやすい状態にし、そして「かすがい機構（clamp mechanism）」として知られている立体構造の切替えをもたらすドーナツ状の２量体構造の形成をもたらす（ProdromouおよびPearl、2000b）。
【００１２】
公知のHSP90阻害剤
最初に発見されたHSP90阻害剤のクラスは、ベンゾキノン アンサマイシン  クラスで、それは、ハービマイシンＡおよびゲルダナマイシンを含んでいる。それらにより、v-Src癌遺伝子で形質転換された繊維芽細胞の悪性の遺伝表現型が逆転することが示され（Ueharaら、1985）、次いで、in vitro（Schulteら、1998）そしてin vivoの動物モデル（Supkoら、1995）の両方で、強力な抗腫瘍活性を有することが示された。
【００１３】
免疫沈降およびアフィニティー・マトリックスの研究により、ゲルダナマイシンの主作用機構は、HSP90との結合であることが示された（Whitesellら、1994；SchulteおよびNeckers、1998）。さらに、Ｘ-線結晶学の研究から、ゲルダナマイシンは、ATPとの結合部位で競合し、HSP90の内因性のATPアーゼ（ATPase）活性を阻害することが示された（Prodromouら、1997；Panaretouら、1998）。そして次に、これがクライエント蛋白質をシャペロンする（chaperoning）ことのできる、成熟した多重結合のHSP90複合体の生成を妨げる。その結果、クライエント蛋白質は、ユビキチン・プロテアソーム経路を経る分解の標的にされる。17-アルキルアミノ、17-デメトキシゲルダナマイシン（17AAG）は、クライエント蛋白質を涸渇させるHSP90阻害作用ならびに培養細胞および異種移植モデルでの抗腫瘍活性は保持している（Schulteら、1998；Kellandら、1999）が、肝毒性はゲルダナマイシンよりも有意に弱い（Pageら、1997）。17AAGは、現在、フェーズI臨床試験で評価がなされている。
【００１４】
ラジシコールは、v-Srcおよびv-Ha-Rasにより形質転換された繊維芽細胞の悪性の遺伝表現型を逆転することが示された大環状抗生物質である（Kwonら、1992；Zhaoら、1995）。HSP90阻害により、多くのシグナル蛋白質を分解することが示された（Schulteら、1998）。Ｘ-線結晶学のデータにより、ラジシコールもまたHSP90のN末端ドメインに結合し、内因性ATPase活性を阻害することが確認された（Roeら、1998）。ラジシコールは、化合物が化学的に不安定なために、in vivoでは抗腫瘍活性が欠如している。
【００１５】
クマリン抗生物質は、HSP90のそれと相同性のあるATP結合部位でバクテリアのDNAジャイレースに結合することが知られている。クマリン、ノボビオシンは、HSP90のカルボキシ末端、すなわちN-末端で結合するベンゾキノン アンサマイシン類およびラジシコールが占める部位とは異なった部位で結合することが示された（Marcuら、2000b）。しかしながら、これでもHSP90機能を阻害し、HSP90でシャペンロンされる多くのシグナル蛋白質の分解をもたらした（Marcuら、2000a）。
ゲルダナマイシンは、ノボビオシンに次いで、HSP90を捕縛することができない。このことは、ＮおよびＣ末端ドメインの間に何らかの相互作用が存在しなければならなことを示しており、このことは、両方の部位が、HSP90シャペロンの性質にとって重要である点と矛盾がない。
【００１６】
プリンを基礎とするHSP90阻害剤であるPU3は、erb-B2を含むシグナル分子の分解をもたらし、そして乳癌細胞の細胞周期停止や分化を起こさせることが示されている（Chiosisら、2001）。
【００１７】
治療標的としてのHSP90
分子シャペロンHSP90が、腫瘍の遺伝表現型を誘導する際に非常に重要である多くのシグナル経路を調節することに関わっていること、およびある種の生理活性天然物が、HSP90への活性を経てそれらの効果を発揮することの発見により、現在、分子シャペロンHSP90が抗癌剤開発のための新規な標的として、評価されている（Neckersら、1999）。
【００１８】
ゲルダナマイシン、17AAGおよびラジシコールの最も重要な作用機作は、蛋白質のN-末端ドメインに存在しているATP結合部位でHSP90と結合することであり、そして、それがHSP90の内因性ATPase活性の阻害に導く（Prodromouら、1997；Stebbinsら、1997；Panaretouら、1998を参照）。
【００１９】
HSP90 ATPase活性の阻害は、コ−シャペロン（co-chaperones）の補充を妨害し、ユビキチン・プロテアソーム経路を経る分解のためにクライエント蛋白を標的とする、HSP90へテロ複合体型の形成を促進する（Neckersら、1999；Kellandら、1999を参照）。
【００２０】
HSP90阻害剤での処理は、癌において根本的に重要なプロセスである、細胞増殖、細胞周期調節およびアポトーシスに関与する重要な蛋白質の選択的な分解に導く。
【００２１】
HSP90機能の阻害により、根本的に重要であり、そして癌においては一般に非調節な状態にあるプロセスの、細胞増殖、細胞周期調節およびアポトーシスに関与する重要なシグナル蛋白質の選択的な分解を引き起こすことが示されている（Hosteinら、2001を参照）。臨床で使用するために、これを標的とする医薬の開発のための魅力的な根拠は、形質転換された遺伝表現型と関連する蛋白質を同時に涸渇することにより、強力な抗腫瘍効果が得られ、癌細胞対正常細胞に対して治療的利点が得られることである。HSP90阻害によるこれら下流の事象が、HSP90阻害剤が培養細胞および動物モデルで抗腫瘍活性を示す原因であると信じられている（例えば、Schulteら、1998；Kellandら、1999参照）。
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
本発明は、HSP90阻害剤であって、癌細胞増殖を阻害する置換ピラゾール化合物の新規なクラスを提供するものである。一つの環炭素原子における芳香族置換分および隣接する環炭素原子における非芳香族の炭素環もしくは複素環置換分が、本発明の化合物の基本的な特徴である。
【００２３】
発明の詳細な記述
本発明によれば、式（IA）もしくは（IB）：
【化１】
0004528131.tif 000002
（式中、
Ar は、アリール、アリール(C1-C6アルキル)、ヘテロアリールまたはヘテロアリール(C1-C6アルキル)基であり、それらのアリールまたはヘテロアリール部分は任意に置換されていてもよい；
R1 は、水素または任意に置換されていてもよいC1-C6アルキルであり；
R2 は、水素、任意に置換されていてもよいシクロアルキル、シクロアルケニル、C1-C6アルキル、C1-C6アルケニルもしくはC1-C6アルキニル；またはカルボキシ、カルボキサミドもしくはカルボキシエステル基であり；そして、
環Ａは、非芳香族の炭素環もしくは複素環であり、(i)環炭素は任意に置換されていてもよく、そして／または(ii)環窒素は式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Qの基：
（ここで、Alk1、Alk2およびAlk3 は任意に置換されていてもよいC1-C3アルキルであり、
Cycは任意に置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基であり、
m、n、p、rおよびsは、独立して0または1であり、
Zは、-O-、-S-、-(C=O)-、-SO2-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-NRA-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-SO2NRA-または-NRASO2-（ここで、RAは水素またはC1-C6アルキルである）であり、そして
Qは、水素または任意に置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基である）
で任意に置換されていてもよい）
の化合物、またはそれらの塩、Ｎ−オキサイド、水和物もしくは溶媒和物が提供される。
【００２４】
本発明の化合物の部分集合は、上で定義された式(IA)もしくは(IB)からなり、ここで、Arは任意に置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール基であり；そして、環Ａは非芳香族の炭素環もしくは複素環であり、(i)環炭素は任意に置換されていてもよく、そして／または(ii) 環窒素は式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Qの基：
（ここで、Alk1、Alk2は任意に置換されていてもよいC1-C3アルキルであり、
p、rおよびsは、独立して0または1であり、
Zは、-O-、-S-、-(C=O)-、-SO2-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-NRA-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-SO2NRA-または-NRASO2-（ここで、RAは水素またはC1-C6アルキルである）であり、そして
Qは、水素または任意に置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基である）
で任意に置換されていてもよい。
【００２５】
化合物IAおよびIBにおいてR1が水素のとき、化合物IAおよびIBは、同じ化合物の互変異性型である。
【００２６】
ここで用いられる、
「カルボキシ基」の語は、式-COOHの基であり、
「カルボキシエステル基」の語は、式-COORの基であり、ここでRはヒドロキシ化合物ROHから実際にまたは概念的に誘導される基であり、そして
「カルボキサミド基」の語は、式-CONRaRbの基であり、ここで-NRaRb は、アンモニアまたはアミンHNRaRbから実際にまたは概念的に誘導される一級または二級（環状を含む）アミノ基である。
【００２７】
ここで用いられる「（C1-C6）アルキル」の語は、１〜６の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチルおよびn-ヘキシルを含む。
【００２８】
ここで用いられる「（C2-C6）アルケニル」の語は、２〜６の炭素原子を有し、ＥまたはＺの立体配置の二重結合を少なくとも一つ含む、直鎖または分枝鎖アルケニル基を意味し、例えばエテニルおよびアリルを含む。
【００２９】
ここで用いられる「(C2-C6)アルキニル」の語は、２〜６の炭素原子を有し、少なくとも一つの三重結合を含む直鎖または分枝鎖アルキニル基を意味し、例えばエチニルおよびプロプ-2-イニルを含む。
【００３０】
ここで用いられる「シクロアルキル」の語は、３〜８の炭素原子を有する飽和炭素環式基を意味し、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを含む。
【００３１】
ここで用いられる「シクロアルケニル」の語は、少なくも一つの二重結合を含む３〜８の炭素原子を有する炭素環式基を意味し、例えばシクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルを含む。
【００３２】
ここで用いられる「アリール」の語は、１、２または３環の炭素環式芳香族基を意味する。そのような基の例は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルである。
【００３３】
ここで用いられる「炭素環式」の語は、環原子が全て炭素である環または環システムを意味し、単環式アリール、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基を含む。
【００３４】
ここで用いられる「ヘテロアリール」の語は、Ｓ、ＮおよびＯから選択される一つ以上の複素原子を含む１、２または３環式芳香族基を意味する。そのような基の例は、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イソキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、ベンゾトリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、インドリルおよびインダゾリルである。
【００３５】
ここで用いられる無条件の用語「複素環式」または「複素環系」は、上で定義された「ヘテロアリール」を含み、特に、Ｓ、ＮおよびＯから選択される一つ以上の複素原子を含む１、２または３環式の芳香族または非芳香族基を意味し、他の基または単環の炭素環式基と共有結合している一つ以上の複素原子を含む単環の芳香族または非芳香族基からなる群である。そのような基の例は、ピロリル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、モルホリニル、ベンゾフラニル、ピラニル、イソオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、マレイミドおよびスクシンイミド基である。
【００３６】
用語が使用されている文脈中で、別の方法で特定されていなければ、ここで用いられている「置換された」の語は、４つまでの置換基で置換されていることを意味し、その各々は独立して、例えば、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1-C6)アルキル、メルカプト、メルカプト(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、ハロ(フッ素および塩素を含む)、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル(-CN)、オキソ、フェニル、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-CONHNH2、-CONHNHRA、-CONHNRARB、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARBまたは-NRACONRARB（ここで、RAおよびRBは独立して(C1-C6)アルキル基である）である。
【００３７】
ここで用いられる「塩」の語は、塩基付加塩、酸付加塩および４級塩を含む。酸性である本発明の化合物は、例えばナトリウムおよびカリウムの水酸化物のようなアルカリ金属水酸化物；例えばカルシウム、バリウムおよびマグネシウムの水酸化物のようなアルカリ土類金属水酸化物のような塩基と、また例えばN-エチルピペリジン、ジベンジルアミンなどの有機塩基と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成することができる。
【００３８】
塩基性である化合物(I)は、例えば塩酸もしくは臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸などの無機酸、ならびに例えば酢酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、サリチル酸、クエン酸、メタンスルホン酸およびp-トルエンスルホン酸などの有機酸と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成することができる。
【００３９】
本発明のいくつかの化合物は、不斉炭素原子の存在により、一つ以上の顕在的または潜在的なキラル中心を有する。いくつかの不斉炭素原子の存在は、各々のキラル中心でのＲまたはＳ立体化学により、多くのジアステレオマーを生じる。本発明は、そのようなジアステレオマーおよびそれらの混合物の全てを含む。
【００４０】
本発明の化合物において：
Arは、好ましくは2-ヒドロキシフェニ基で、より好ましくは、例えば5位がさらに任意に置換されていてもよい2,4-ジヒドロキシフェニル基である。任意の置換基は、塩素または臭素、任意に置換されていてもよいフェニルまたはC1-C6アルキル、およびフェニル環が任意に置換されていてもよいフェニルエチルを含む。
【００４１】
R1およびR2の例としては、水素、メチル、エチル、n-もしくはiso-プロピル、またはヒドロキシエチルが挙げられる。R1の場合は水素が好ましく、R2の場合は水素またはメチルが好ましい。
【００４２】
環Ａは、例えば式 (IIA)もしくは(IIB) の環である：
【化２】
0004528131.tif 000003
（式中、ＸはCHまたはNを表し、ＹはCH、O、SまたはNHを表し、(i)環炭素は任意に置換されていてもよく、そして／または(ii)環窒素は式-(Alk1)p- (Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Qの基：
（ここで、Alk1、Alk2およびAlk3 は任意に置換されていてもよいC1-C3アルキルであり、
Cycは任意に置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基であり、
m、n、p、rおよびsは独立して0または1であり、
Zは-O-、-S-、-(C=O)-、-SO2-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(=O)-、-NRASO2-または-NRA-（ここで、RAは水素またはC1-C6アルキルである）であり、
そして
Qは水素または任意に置換されていてもよい炭素環式基または複素環式基である）で任意に置換されていてもよい）。
【００４３】
任意に置換されていてもよい環Ａが式(IIA)の環のとき、ＸはNが好ましく、ＹはNHまたはCHであり、そしてより好ましくは、ＸはNであり、Ｙは-NRA-であり、ここで、RAは式-(Alk1)-Qの基（ここで、Alk1はC1-C3アルキレン基である）である。そのような場合、例えばRAは任意に置換されていてもよいベンジル基であり、Qは任意に置換されていてもよいフェニル、ピリジル、フリル、チエニル、オキサジアゾリル、イミダゾリルまたはモルホリニルであり得る。
【００４４】
あるいは、任意に置換されていてもよい環Ａが式(IIA)の環であるとき、Ｘはであり、Ｙは-NRA-（ここで、RAは式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Qである）であり得る。そのような多くの場合の一つにおいて、pは1であり、およびmはそれぞれ1であり、Cycはフェニレン基である。
【００４５】
任意に置換されていてもよい環Ａが式(IIA)の環であり、ＸがNであり、Ｙが-NRA-である場合、置換基RAの特定の例は、実施例の化合物中に見出すことができる。
【００４６】
本発明の好ましい化合物のクラスは、式(IC)もしくは(ID)：
【化３】
0004528131.tif 000004
（式中、Rは水素、任意の置換基、またはフェニル環が任意に置換されていてもよいフェニルエチル基であり、R2、m、r、s、Alk3、ZおよびAlk2は上で定義したとおりである）
の化合物、またはそれらの塩、Ｎ−オキサイド、水和物もしくは溶媒和物からなる。
そのような化合物において、R2は水素であり、Rは例えば塩素、臭素、またはフェニル環が任意に置換されていてもよいフェニルエチル基であり、nは0であり、rは1であり、Zは-C(=O)NH-であり得る。
【００４７】
本発明の特定の化合物は、以下の実施例の化合物を含む。本発明の化合物は、以下の実施例で用いられた方法と同様の方法で製造され得る。
そして、それらは、一般的に、式(IIA)の化合物と式(IIB)の化合物：
【化４】
0004528131.tif 000005
とを反応させて式(IIC)の中間体化合物：
【化５】
0004528131.tif 000006
を生成し、次いでこれをヒドラジンH2N-NHR1と反応させて、二つのピラゾール化合物(IA)および(IB)の混合物を生成し、次いでこれらを分離することにより入手できる。
もちろん、上記の反応の間、Ar、環Ａおよび置換基R1およびR2中のいかなる潜在的な反応性基も保護し、次いで保護基を除去することが望ましい。
【００４８】
式(IIA)の化合物は、式(III)の化合物：
【化６】
0004528131.tif 000007
から環Ａのアニオンによる臭素の求核置換により製造される。
本発明のいくつかの化合物は、上記の一般的な方法によって作られる本発明の化合物を化学的に修飾することにより入手できる。
【００４９】
本発明の化合物はHSP90の阻害剤であり、したがって、HSP90活性の阻害に応答する疾病、例えば癌；Ｃ型肝炎(HCV)のようなウイルス病(Waxman、2002)；移植におけるような免疫抑制（Bijlmakers、2000およびYorgin、2000）；慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、I型糖尿病、狼瘡、乾癬および炎症性腸疾患のような抗炎症性疾患(Bucci、2000)；嚢胞性線維症(Fuller、2000)；血管形成関連疾患(Hur、2002およびKurebayashi、2001)；糖尿病性網膜症、血管腫、乾癬、子宮内膜症および腫瘍血管形成の治療に有用である。
【００５０】
本発明のHspP90阻害剤は、また、化学療法により誘発される毒性から正常細胞を保護し、そしてアポトーシスを起こさないようなっていることが根本的な要因である疾病に有用である。そのようなHsp90阻害剤は、細胞ストレスの誘導または熱ショック蛋白質応答によって引き起こされる疾病、例えば、心臓(Hutter、1996およびTrost、1998)および脳(Plumier、1997およびRajder、2000)のHsp70の上昇による低酸素−虚血傷害からの保護にも有用である。
Hsp90阻害剤は、蛋白質の間違った折り畳みまたは凝集が主な原因である疾病、例えば、スクラピー／クロイツフェルト‐ヤコブ病（ＣＪＤ）、ハンチントン病およびアルツハイマー病(Sittler、2001；Trazelt、1995およびWinklhofer、2001)にも用いることができる。
【００５１】
したがって、本発明は：
(i)上記の式(IA)もしくは(IB)の化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物、特にヒトのHSP90活性の阻害に応答する疾病または病態の治療方法；および
(ii)ヒトまたは動物の医薬、特にHSP90活性の阻害に応答する疾病または病態の治療に使用するための、上記の式(IA)もしくは(IB)の化合物；および
(iii) HSP90活性の阻害に応答する疾病または病態の管理（治療または予防を意味する）のための医薬の製造における上記の式(IA)もしくは(IB)の化合物の使用
も提供する。
【００５２】
特定の患者に対する特定の投与量レベルは、用いられる特定化合物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬の組合せ、治療を受ける特定の疾病の原因機序および重篤度を含む種々の要因に依存することが理解されるであろう。
一般的に、経口投与製剤の適切な投与量は、通常、1日当り１回、２回または３回で、0.1〜3000mgの範囲であるか、または点滴もしくは他の経路により投与される１日量に等しい量であろう。しかしながら、最適な投与量レベルおよび投与回数は、当分野で慣例の臨床試験によって決定されるであろう。
【００５３】
本発明に関する化合物は、それらの薬物動態の性質と合致した経路による投与を目的として製造される。経口投与可能な組成は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、経口用、局所用または無菌非経口用溶液もしくは懸濁液のような液もしくはゲル製剤の形態である。
経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、単位投与量を含む形態であり、それは慣用の賦形剤：例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントガムまたはポリビニル−ピロリドンのような結合剤；例えばラクトース、砂糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシンのような充填剤；例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、ポリエチレングリコールまたはシリカのような錠剤用滑沢剤；例えばバレイショデンプンのような崩壊剤、またはナトリウムラウリルスルフェートのような許容される湿潤剤を含んでいてもよい。錠剤は、普通の製薬の実務で周知の方法によりコーティングされてもよい。
【００５４】
経口液剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシルの形態であるか、または使用前に水もしくは他の適当な媒体で溶解する乾燥生成物の形態であってもよい。上記の液剤は、慣用の添加剤：例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、水素化された食用油脂のような懸濁剤；例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアラビアゴムのような乳化剤；例えばアーモンド油、ヤシ油、グリセリドのような油状エステル、ポリプロピレングリコールまたはエチルアルコールのような非水性媒体（食用油を含む）；例えばメチルもしくはプロピルp-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸のような保存剤、ならびに所望により慣用の芳香剤または着色剤を含んでいてもよい。
【００５５】
皮膚への局所適用のために、医薬はクリーム、ローションまたは軟膏にされ得る。そのような医薬のために使用されるクリームもしくは軟膏の製剤化は、例えば英国薬局方のような製剤学の標準的な教科書に記載されているような、当分野で周知慣用の製剤化である。
【００５６】
活性成分は、無菌媒体中、非経口的にも投与され得る。用いられる媒体および濃度により、医薬は媒体に懸濁させるか、または溶解させることができる。局所麻酔剤のような補助剤、保存剤および緩衝剤も媒体に溶解することができる。
【００５７】
以下の実施例は、本発明の特定の化合物の製造および活性を示している。
【実施例】
【００５８】
実施例１：4-[3-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル、および
実施例２：4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール
【化７】
0004528131.tif 000008
スキーム１：ピペラジノピラゾールの合成
【化８】
0004528131.tif 000009
【００５９】
工程１
1-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-エタノン
【化９】
0004528131.tif 000010
酢酸(17.5mL)を、ボロントリフルオライドエーテラート(200mL)中の4-クロロレゾルシノール(42.5g、0.293mmol)の懸濁液に、窒素雰囲気下、滴下した。反応混合物を90℃で3.5時間加熱し、次いで室温まで冷却した。冷却から約1時間後に、固体が生成した。混合物を10%w/v酢酸ナトリウム水溶液(700mL)中に注入した。この混合物を2.5時間激しく撹拌した。明るい褐色の固体が生成し、それをろ過し、水で洗浄し、一晩風乾して、1-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-エタノン(31.6g、58%)を得た。LCMS:[M-H]+ 185
【００６０】
工程２
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-エタノン
【化１０】
0004528131.tif 000011
ベンジルブロマイド(30mL)を、アセトニトリル(350mL)中の1-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-エタノン(20g、0.107mol)および炭酸カリウム(37g、2.5当量)の混合物に加えた。混合物を還流下に６時間加熱し、次いで冷却し、一晩撹拌した。混合物をろ過し、固体をジクロロメタン(3×100mL)で洗浄した。有機抽出液を合わせて、真空下に蒸発させ、淡黄色の固体を得、それをヘキサン(350mL)/酢酸エチル(15mL)の混液で粉砕し、ろ過して、オフホワイトの1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-エタノン(35.4g、90%)を得た。1H NMR(400MHz)は、この構造と一致した。
【００６１】
工程３
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-ブロモ-エタノン
【化１１】
0004528131.tif 000012
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド(7.5g、0.02mol)を、テトラヒドロフラン(100ml)中の1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-エタノン(7.09g、0.019mol)の撹拌溶液に滴下し、混合物を2時間撹拌した。混合物を水(100ml)とジエチルエーテル(2×50ml)の間で分配した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、ベージュ色の固体を得た。トルエン(100ml)から結晶化し、1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-ブロモ-エタノンを白色の固体(4.5g)として得た。
LC保持時間2.97分間、非イオン化  （実行時間3.75分間）
【００６２】
工程４
4-[2-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化１２】
0004528131.tif 000013
炭酸セシウム(2.95g、9mmol)を、ジメチルホルムアミド(20ml)中の1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-ブロモ-エタノン(4.4g、９mmol)およびピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(1.74g、9mmol)の撹拌溶液に、3分割して加えた。懸濁液を2時間撹拌し、次いで水(200ml)と酢酸エチル(3×50ml)の間で分配した。有機抽出液を合わせ、水(100ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、4-[2-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを黄色の油状物(4g)として得た。
LC保持時間2.53分間[M+H]+ 551.5  (実行時間3.75分間)
【００６３】
工程５
4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化１３】
0004528131.tif 000014
ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(4ml)中の4-[2-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-カルボン酸 tert-ブチルエステル(2g、3.6mmol)の溶液を、還流下に3時間加熱した。ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(15ml)をさらに加え、混合物を還流下に4時間加熱した。混合物を7つのマイクロウェーブ容器に分割した。エタノール(1ml)およびヒドラジン水和物(1ml)を、各マイクロウェーブ容器に加え、120℃で5分間加熱した。全容器の内容物を合わせ、水(50ml)とジクロロメタン(3×30ml)の間で分配した。有機相を合わせ、濃縮し、ヘキサン、次いでヘキサン：エーテル；4:1、次いで1:1、次いで1:2、次いで1:4で溶出するボンド溶出カートリッジ (20g)で精製し、4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを白色の固体(620mg)として得た。
LC保持時間2.98分間[M+H]+ 575.5  (実行時間3.75分間)
【００６４】
工程６
4-[3-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（実施例１）
酢酸エチル(15ml)中の4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(230mg、0.4mmol)の溶液を、10%パラジウム炭で1.5時間水素化した。懸濁液をセライトでろ過し、ジクロロメタン：エタノール(1:1)で洗浄した。ろ液を濃縮し、4-[3-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（実施例１）を白色の固体(72mg)として得た。
LC保持時間2.24分間[M+H]+ 395.3  （実行時間3.75分間）
【００６５】
工程７
4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール（実施例２）
方法Ａ
4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(25mg、0.06mmol)および濃塩酸(1ml)の混合物をマイクロウェーブ中、80℃で5分間加熱した。混合物を乾燥するまで蒸発させ、トルエンで共沸して、4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール(10mg)（実施例２）を得た。
LC保持時間1.37分間[M+H]+ 295.2  (実行時間3.75分間)
【００６６】
方法Ｂ
ボロントリクロライド(ジクロロメタン中1M溶液；8ml、8mmol)を、ジクロロメタン(15ml)中の4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(1.5g、2.6mmol)の溶液に0℃で滴下した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで重炭酸素ナトリウム飽和溶液で塩基性にした。懸濁液を真空下に濃縮し、残渣が乾燥するまでトルエンで共沸した。残渣をジクロロメタン：エタノール(1:1;15ml)で粉砕し、ろ過した。ろ液を、ジクロロメタン：エタノール：アンモニア、50:8:1、次いで20:8:1で溶出するボンド溶出カートリッジ(20g)で精製し、4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオールを淡黄色の固体(400mg)（実施例２）として得た。
LC保持時間1.37分間[M+H]+ 295.2  （実行時間3.75分間）
実施例１の化合物は、以下に記載のATPase評価で活性「B」を有し、実施例２の化合物は活性「A」を有していた。
【００６７】
次の表中の化合物は、対応するアミンを用いて、スキーム１に示したようにして製造し、HPLCを用いて精製した。「HSP90 IC50」の欄中の記載は、以下に記載したATPase評価で得られた結果である。
【表１】
0004528131.tif 000015
【００６８】
実施例５
4-クロロ-6-[4-(4-フラン-2-イルメチル-ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオール
【化１４】
0004528131.tif 000016
この化合物は、スキーム２に要約された経路によって合成された：
スキーム２：ピペラジンの還元的アミノ化
【化１５】
0004528131.tif 000017
トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(150mg、0.7mmol)を、4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール(43mg、0.146mmol)、フルフラルデヒド(0.025ml、0.3mmol)、酢酸(0.5ml)およびジクロロメタン(1ml)の混合物に、1回で加えた。窒素下で3時間撹拌を継続し、反応混合物を水(10ml)とジクロロメタン(3×10ml)の間で分配した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、ジクロロメタン：エタノール：アンモニア(100:8:1)で溶出するボンド溶出カートリッジ(5g)で精製して、4-クロロ-6-[4-(4-フラン-2-イルメチル-ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオールを白色の固体(10mg)として得た。
LC保持時間1.68時間[M+H]+ 375.3  （実行時間3.75分間）
実施例５の化合物は、以下に記載したATPase評価で活性「B」を有していた。
【００６９】
実施例６および７の化合物も、アセトアルデヒドおよび3-ピリジルアルデヒドをそれぞれ用いて、スキーム２により製造された。「HSP90 IC50」の欄中の記載は、以下に記載したATPase評価で得られた結果である。
【表２】
0004528131.tif 000018
【００７０】
実施例８
【化１６】
0004528131.tif 000019
実施例８の化合物は、次の二つのスキームに記載したようにして製造された：
スキーム３：ピペラジン酢酸エチルエステルの合成
【化１７】
0004528131.tif 000020
工程１
4-エトキシカルボニルメチル-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化１８】
0004528131.tif 000021
ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(2.62g、14mmol)、炭酸セシウム(5g、15mmol)およびブロモ酢酸エチル(1.56g、14mmol)を室温で1時間撹拌した。混合物を水(200ml)とジエチルエーテル(2×100ml)の間で分配した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、黄色の油状物を得、結晶化して、4-エトキシカルボニルメチル-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを淡黄色の固体(2.6g)として得た。
1H N.M.R (CDCl3) δ=1.24(3H, t, J=7.1Hz), 1.43(9H, s), 2.49(4H, t, J=5Hz), 3.20(2H, s), 3.44(4H, t, J=4.8Hz), 4.16(2H, q, J=7.1Hz).
【００７１】
工程２
ピペラジン-1-イル-酢酸エチルエステル
【化１９】
0004528131.tif 000022
90%トリフルオロ酢酸(5ml)中の4-エトキシカルボニルメチル-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの溶液を3時間撹拌した。混合物を重炭酸ナトリウム飽和溶液で塩基性にし、濃縮した。残渣を酢酸エチル(30ml)で粉砕し、ろ過した。ろ液を濃縮して、ピペラジン-1-イル-酢酸エチルエステルを黄色の油状物(約1.5g)として得た。
1H N.M.R (CDCl3) δ=1.18(3H, t, J=7.1Hz), 2.40(4H, t, J=4.1Hz), 2.70(4H, t, J=4.5Hz), 3.13(2H, s), 3.45(1H, br s), 4.01(2H, q, J=7.1Hz)
【００７２】
スキーム４：アシルヒドラジドの合成
【化２０】
0004528131.tif 000023
【００７３】
工程３
[4-[2-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸エチルエステル
【化２１】
0004528131.tif 000024
ピペラジン-1-イル-酢酸エチルエステルを用いて、スキーム１に記載したようにして製造した。
LC保持時間2.32分間[M+H]+ 537.5  （実行時間3.75分間）
【００７４】
工程４
[4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸エチルエステル
および
[4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸ヒドラジド
【化２２】
0004528131.tif 000025
ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(4ml)中の[4-[2-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸エチルエステル(1.5g、2.80mmol)の溶液を、マイクロウェーブ中、140℃で30分間加熱した。溶液を二つに分け、各々をヒドラジン水和物(0.1ml)およびエタノール(2ml)と混合し、マイクロウェーブ中、100℃で5分間加熱した。混合物を合わせ、濃縮し、ボンド溶出カートリッジで精製して、[4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸エチルエステル(230mg)、および[4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸ヒドラジド(150mg)を得た。
【００７５】
工程５
[4-[3-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸ヒドラジド（実施例８）
【化２３】
0004528131.tif 000026
実施例２の工程７の方法Ａと同様にして、[4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-イル]-酢酸ヒドラジドから製造した。
LC保持時間1.40分間[M+H]+ 367.3  (実行時間3.75分間)
実施例８の化合物はATPase評価で活性「B」を有していた。
【００７６】
実施例９
4-クロロ-6-[4-[4-(2-ヒドロキシ-エチル)-ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオール
スキーム５：ピペラジンのアルキル化
【化２４】
0004528131.tif 000027
4-クロロ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール(43mg、0.146mmol)、炭酸セシウム(48g、0.146mmol)、2-ブロモエタノール(0.025ml、0.35mmol)およびジメチルホルムアミド(1ml)の混合物を、室温で3日間撹拌した。混合物を乾燥するまで蒸発させ、ジクロロメタン：メタノール(49:1)でボンド溶出カートリッジ(5g)に注ぎ、次いでジクロロメタン、次いでジクロロメタン：エタノール：アンモニア(50:8:1、次いで20:8:1)で溶出して、4-クロロ-6-[4-[4-(2-ヒドロキシ-エチル)-ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオールを白色の固体(10mg)として得た。
LC保持時間1.36分間[M+H]+ 339.3  (実行時間3.75)
実施例９の化合物はATPase評価で活性「B」を有していた。
【００７７】
実施例10〜48は、適したアルキル化剤、アシル化剤またはスルホニル化剤を用いて、スキーム５に要約した方法によって製造した。「HSP90 IC50」の欄中の記載は、以下に記載したATPase評価で得られた結果であるか、またはアスタリスクで示されている場合は、以下に記載した蛍光偏光(FP)評価で得られた結果である。
【表３−１】
0004528131.tif 000028
【００７８】
【表３−２】
0004528131.tif 000029
【００７９】
【表３−３】
0004528131.tif 000030
【００８０】
【表３−４】
0004528131.tif 000031
【００８１】
【表３−５】
0004528131.tif 000032
【００８２】
【表３−６】
0004528131.tif 000033
【００８３】
【表３−７】
0004528131.tif 000034
【００８４】
【表３−８】
0004528131.tif 000035
【００８５】
実施例49
4-クロロ-6-(5-メチル-4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール
【化２５】
0004528131.tif 000036
工程１
4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化２６】
0004528131.tif 000037
【００８６】
パラトルエンスルホニルクロライド(180mg、0.95mmol)を、ジクロロメタン(10ml)およびピリジン(0.9mmol)中の4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(500mg、0.9mmol)の撹拌溶液に加えた。撹拌を18時間続け、次いで溶液を水(20ml)と酢酸エチル(2×20ml)との間で分配する。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮して黄色の油状物を得た。ヘキサン、次いでヘキサン:ジエチルエーテル、1:1、次いでジエチルエーテルで溶出するシリカ(20g)で精製し、4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(490mg、77%)を得た。
LC保持時間3.22分間[M]+ 729.6  (実行時間3.75分間)
【００８７】
工程２
4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-5-メチル-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化２７】
0004528131.tif 000038
窒素雰囲気下、n-ブチルリチウム(ヘキサン中1.6M；0.25ml、0.4mmol)を、テトラヒドロフラン(2ml)中の4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(240mg、0.33mmol)の溶液に、撹拌、冷却(-78℃)下に滴下した。混合物を-78℃で10分間撹拌し、次いでヨウ化メチル(40μL；0.64mmol)を加えた。反応混合物を室温まで暖め、次いで水(20ml)と酢酸エチル(2×20ml)との間で分配した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで真空下に濃縮し、ヘキサン、次いでヘキサン：ジエチルエーテル(1:1)、次いでジエチルエーテルで溶出するシリカカートリッジ(200mg)で精製して、4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-5-メチル-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(70mg；29%)を得た。
LC保持時間3.26分間[M]+ 743.6  (実行時間3.75分間)
最終生成物は、実施例１の方法Ｂを使って得られ、Hsp90 FP評価で活性「A」を有していた。
【００８８】
実施例50
4-クロロ-6-(5-ヒドロキシメチル-4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール
【化２８】
0004528131.tif 000039
工程１
4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-5-ヒドロキシメチル-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
【化２９】
0004528131.tif 000040
【００８９】
窒素雰囲気下、水素化リチウムアルミニウム(エーテル中１M、0.3ml、0.3mmol)の溶液を、無水ジエチルエーテル(2ml)中の4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-5-イソブトキシカルボニル-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(90mg、0.11mmol)[前記実施例中のリチオ化の化学反応を用いて製造された]の撹拌溶液に、室温で滴下した。懸濁液を2時間撹拌し、次いで水酸化ナトリウム溶液(1M、3滴)、次いでメタノール(0.5ml)を加えた。混合物を水(30ml)と酢酸エチル(2×20ml)の間で分配し、有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで真空下に濃縮して、4-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-クロロ-フェニル)-5-ヒドロキシメチル-1-(トルエン-4-スルホニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(58mg、88%)を得た。
LC保持時間2.87分間[M]+ 605.6  (実行時間3.75分間)
工程２
最終生成物は、実施例１の方法Ｂを用いて得られた。
この化合物は、Hsp90 FP評価で活性「A」を有していた。
【００９０】
実施例51
5-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-4-ピペラジン-1-イル-2H-ピラゾール-3-カルボン酸エチルアミド
【化３０】
0004528131.tif 000041
実施例52および53中のリチオ化の化学反応によるが、エチルイソシアネートでクエンチすることにより製造した。実施例54の化合物は、Hsp90 ATPase評価で活性「A」を有していた。
【００９１】
実施例52
3-(4-フルオロ-2-ヒドロキシフェニル)-4-(ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール
【化３１】
0004528131.tif 000042
試薬および条件：a. BnBr、K2CO3、DMF、rt、18時間；b. PhNMe3Br3、THF、rt、45分間；c. tBoc-ピペラジン、K2CO3、DMF、80%(2工程)；d. DMFDMA、μ-ウェーブ200℃、15分間；e. NH2NH2・H2O、EtOH、μ-ウェーブ、120℃、30分間、33%(2工程)；f. BCl3、DCM、30%
【００９２】
工程１
2'-(ベンジルオキシ)-4'-フルオロアセトフェノン
炭酸カリウム(4.02g、29.10mmol)を、DMF(15mL)中の4'-フルオロ-2'-ヒドロキシアセトフェノン(2.0mL、2.56g、16.60mmol)の溶液に加えた。ベンジルブロマイド(2.07mL、2.98g、17.50mmol)を、室温で5分間かけて滴下し、混合物を18時間撹拌した。混合物を塩酸(水中1.0M；200ml)に注入し、酢酸エチル(2×100mL)で抽出した。有機抽出液を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去した。ヘキサンで粉砕後に、純2'-(ベンジルオキシ)-4'-フルオロアセトフェノン(3.94g、97%)を白色の粉末として得た。Rf0.44（9:1ヘキサン：EtOAc）；
δH(CDCl3) 7.82(1H, dd, J=8.6および7.0Hz), 7.43-7.38(5H, m), 6.75-6.69(2H, m), 5.13(2H, s), 2.56(3H, d, J=3.2Hz);
LCMS保持時間2.68分間、M＋H+ 245.1
【００９３】
工程２
2'-(ベンジルオキシ)-2-ブロモ-4'-フルオロアセトフェノン
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド(1.55g、4.13mmol)を、THF(10mL)中の2'-(ベンジルオキシ)-4'-フロオロアセトフェノン(1.01g、4.13mmol)の溶液に加え、混合物を室温で45分間撹拌した。その間、次第に橙色溶液が退色し、白色の沈殿が生じた。Tlc分析(9:1 ヘキサン：EtOAc)が、反応の終了を示した。混合物を水(20mL)中に注入し、エーテル(2×50mL)で抽出した。エーテル抽出液を合わせ、乾燥（MgSO4で）し、溶媒を真空下に除去して、粗2'-(ベンジルオキシ)-2-ブロモ-4'-フルオロアセトフェノンを無色の油状物として得、これを精製することなく、次の工程に使用した。Rf0.47(9:1 ヘキサン：EtOAc);
δH(CDCl3) 7.89(1H, dd, J=9.4および6.9Hz), 7.45-7.40(5H, m), 6.77-6.74(2H, m), 5.15(2H, s), 4.47(2H, s);
LCMS保持時間2.75分間、M+H+ 323.3/325.3
【００９４】
工程３
2'-(ベンジルオキシ)-2-[4-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-4'-フルオロアセトフェノン
1-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン(808mg、4.34mmol)を、DMF中の2'-(ベンジルオキシ)-2-ブロモ-4'-フロオロアセトフェノン(4.13mmolと思われる)および炭酸カリウム(856mg、6.20mmol)の混合物に加え、室温で18時間撹拌した。溶媒を真空下に除去し、残渣を酢酸エチル(150mL)中に採取し、水(100mL)および塩水(100mL)で洗浄した。有機層を乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去した。粗生成物を、ヘキサン：EtOAc (9:1)、次いでヘキサン：EtOAc (1:1)で溶出するフラッシュクロマトグラフで精製して、純2'-(ベンジルオキシ)-2-[4-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-4'-フルオロアセトフェノン(1.42g、２工程で80%)を黄色の油状物として得た。Rf0.00(9:1 ヘキサン：EtOAc)、0.50(1:1 ヘキサン：EtOAc)；
δH(CDCl3) 7.89(1H, dd, J=9.3および6.9Hz), 7.48-7.44(5H, m), 6.81-6.77(2H, m), 5.17(2H, s), 3.79(2H, s), 3.51-3.47(4H, m), 2.44-2.41(4H, m), 1.50(9H, s);
LCMS保持時間2.10分間、M+H+ 429.4
【００９５】
工程４
3-[4-フルオロ-2-(ベンジルオキシ)フェニル]-4-[4-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール
ジメチルホルムアミドジエチルアセタール(1.5mL)中の2'-(ベンジルオキシ)-2-[4-(tert-ブトキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-4'-フルオロアセトフェノン(270mg、0.63mmol)の溶液を、密封されたマイクロウェーブ管の中で200℃で15分間加熱した。白色沈殿が生じた。混合物を真空下に乾燥するまで蒸発させて、粗4-[1-(2-ベンジルオキシ-4-フロオロ-ベンゾイル)-2-ジメチルアミノ-ビニル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルを得た。エタノール(2mL)およびヒドラジン水和物(2.0mL)を加え、混合物を密封されたマイクロウェーブ管の中で120℃で30分間加熱した。粗混合物を、乾燥プレパックドシリカカートリッジ上に充填し、一晩乾燥した。生成物をヘキサン：EtOAc（2:1）で溶出し、4-[3-(2-ベンジルオキシ-4-フロオロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(95mg、33%)を黄色のゴム状物質として得た。LCMS保持時間2.75分間、M+H+ 453.4
【００９６】
工程５
3-(4-フロオロ-2-ヒドロキシフェニル)-4-(ピペラジン-１-イル)-1H-ピラゾール
ボロントリクロライド(DCM中1.0M；0.829mL、0.829mmol)を、DCM(7.5mL)中の4-[3-(2-ベンジルオキシ-4-フロオロ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(75mg、0.166mmol)の溶液に加えた。褐色の沈殿が生じた。混合物を室温で1時間撹拌し、次いで重炭酸ナトリウム飽和水溶液(50mL)中に注入し、DCM(3×50mL)で抽出した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去した。生成物をプレパラティブHPLCで精製し、3-(4-フロオロ-2-ヒドロキシフェニル)-4-(ピペラジン-１-イル)-1H-ピラゾール(13mg、30%)をオフホワイトの固体として得た。
δH(MeOH-d4) 7.96(1H, br s), 7.72(1H, s), 6.71-6.64(2H,m), 3.36-3.33(4H, m), 3.31-3.10(4H, m), 2.65(1H, s);
LCMS保持時間1.46分間、M+H+ 263.2
この実施例52の化合物は、Hsp90 ATPase評価で活性「B」を有していた。
【００９７】
実施例53
3-[4-アセタミド-2-ヒドロキシフェニル]-4-(ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール
【化３２】
0004528131.tif 000043
試薬および条件：a. AcCl、pyr、DCM、96%；b. AlCl3、180℃、73%；c. BnBr、Cs2CO3、DMF、65%；d. PhNMe3Br3、THF、EE95%またはEE'100%；e. (EtO)2PH.Et3N、THF、＞100%(不純)；f. Cbz-ピペラジン、DMF、K2CO3、50%；g. DMFDMA、THF；h. 添加NH2NH2・xH2O、MeOH、98%；i. H2、Pd/C、MeOH、41%
【００９８】
工程１
3-アセタミドフェニルアセテート
ピリジン(46.32mL、45.30g、572mmol)を、DCM(200mL)中の3-アミノフェノール(25.0g、229mmol) 撹拌懸濁液に加え、混合物を0℃に冷却した。DCM(100mL)中の塩化アセチル(14.45mL、15.95g、203.21mmol)の溶液を、等圧滴下ロート(pressure-equalising dropping funnel)から2.5時間かけて混合物に滴下し(注意：発熱)、この混合物を0℃でさらに1時間撹拌した。混合物をHCl(水中1.0M；350mL)中に注入し、層分離した。水層をさらにDCM(150mL)で抽出し、有機層を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去した。粗生成物を40℃、150mbarで18時間さらに乾燥して、3-アセタミドフェニルアセテート(42.5g、96%)を白色の固体として得た。
δH(CDCl3) 7.38(1H, br s), 7.45(1H, t, J=2.0Hz), 7.23(1H, t, J=8.1Hz), 7.14-7.11(1H, m), 6.78-6.76(1H, m), 2.28(3H, s), 2.06(3H, s);
LCMS保持時間1.76分間、M+H+ 194.2
【００９９】
工程２
4'-アセタミド-2'-ヒドロキシアセトフェノン
3-アセタミドフェニルアセテート(10.47g、54.19mmol)を乳棒と乳鉢で微紛末になるまですりつぶし、次いで窒素供給に連結されたバブラーを装着した250mLの丸底フラスコ中でAlCl3(14.45g、108.40mmol)と混合した。混合物を溶融(75℃)し、次いで激しい反応(85℃)が起こるまで注意しながら加熱した（注意：気体の発生を伴う激しい発熱反応。備考：これらの工程が起こる温度は、いくらか変動する−示された温度は、観測された一番低いもので、最も高いものは、各工程で約30℃ほど高いものである）。混合物を室温まで冷却し、褐色の固体をスパーテルで粉状に粉砕した。次いで混合物を180℃で4.25時間加熱し、室温まで冷却した。固形物をスパーテルで粉砕し、氷-水(100mL)を加えた。混合物を一晩激しく撹拌し、純粋な生成物をろ取した。生成物を減圧(45℃、100mbar)で18時間乾燥し、N-(4-アセチル-3-ヒドロキシ-フェニル)-アセタミド(7.66g、73%)をオフホワイトの粉末として得た。
δH(DMSO-d6) 12.32(1H, s), 10.28(1H, s), 7.83(1H, d, J=8.8Hz), 7.35(1H, d, J=2.0Hz), 7.05(1H, dd, J=8.8, 2.0Hz), 2.56(3H, s), 2.70(3H, s);
LCMS保持時間1.87分間、M+H+ 194.2
【０１００】
工程３
N-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド
ベンジルブロマイド(4.84mL、6.97g、40.76mmol)を、DMF(175mL)中のN-(4-アセチル-3-ヒドロキシ-フェニル)-アセタミド(7.50g、38.82mmol)およびCs2CO3(25.30g、77.64mmol)の混合物に、室温で5分間かけて加えた。18時間撹拌後、溶媒を真空下に除去し、残渣を水(200mL)およびDCM(200mL)と一緒に、完全に溶解するまで激しく撹拌した。層分離を行い、水層をDCM(2×200mL)でさらに抽出した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去した。残渣をPhMe(150mL)中に採取し、乾燥するまで蒸発させると、結晶化した。混合物をPhMe(150mL)中に再懸濁し、活性炭(5g)と一緒に1時間還流した。熱溶液をろ過し、冷却させた。生成物をろ取して、N-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド(5.79g、53%)を無色の結晶として得た。
δH(CDCl3) 7.83(1H, m), 7.76(1H, d, J=8.5Hz), 7.58(1H, br s), 7.45-7.32(6H,  m), 6.74(1H, dd, J=8.5, 1.9Hz), 5.15(2H, s), 2.56(3H, s), 2.19(3H, s);
LCMS保持時間2.33分間、M+H+ 284.3
【０１０１】
工程４
N-[3-ベンジルオキシ-4-(2,2-ジブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド(102mg、0.272mmol)を、  THF(3.5mL)中のN-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド(53mg、0.124mmol)の溶液に加え、室温で2時間撹拌した。混合物を水(25mL)とEtOAc(25mL)の間で分配し、層分離し、有機層を乾燥(MgSO4で)した。溶媒を真空下に除去して、粗N-[3-ベンジルオキシ-4-(2,2-ジブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド(54mg、100%)を淡褐色の固体として得た。
δH(CDCl3) 7.92(1H, br s), 7.85(1H, d, J=8.5Hz), 7.55(1H, br s), 7.50- 7.35(5H, m), 7.09(1H, s), 6.78(1H, dd, J=8.5, 1.9Hz), 5.20(2H, s), 2.21(3H, s);
LCMS保持時間2.65分間、M+H+ 440.1/442.1/444.1
混合物を未精製のまま、次の工程で使用した。
【０１０２】
工程５
N-[3-ベンジルオキシ-4-(2-ブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド
方法Ａ
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド(241mg、0.641mmol)を、THF(16mL)中のN-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド(165mg、0.582mmol)の撹拌溶液に加え、室温で2時間撹拌した。反応混合物を水(50mL)中に注入し、エーテル(2×50mL)で抽出した。エーテル抽出液を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去して、粗N-[3-ベンジルオキシ-4-(2-ブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド(200mg、95%)をオフホワイトの固体として得た。
δH(CDCl3) 7.98(1H, br s), 7.92(1H, br s), 7.81(1H, d, J=8.5Hz), 7.49- 7.32(5H, m), 6.82(1H, dd, J=8.5, 1.9Hz), 5.16(2H, s), 4.50(2H, s), 2.20(3H, s);
LCMS保持時間2.52分間、M+H+ 362.2/364.2
粗生成物には、少量の出発物質および対応するジブロモ化合物が混入していたが、工程６で使用するには十分にきれいであった。
【０１０３】
方法Ｂ
THF(0.1mL)中のジエチルホスファイト(12.6μL、13.5mg、97.6μmol)およびトリエチルアミン(13.6μL、9.9mg、97.6μmol)の溶液を、THF(1.5mL)中のN-[3-ベンジルオキシ-4-(2,2-ジブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド(41mg、92.9μmol)の撹拌溶液に室温で加え、反応混合物を2時間撹拌した。混合物をEtOAc(20mL)中に注入し、水(20mL)および塩水(20mL)で洗浄した。有機層を乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去して、N-[3-ベンジルオキシ-4-(2-ブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド(40mg、＞100%)を得た。これには、ジエチルホスファイト由来の不純物が混入していることがNMRより分かった。この生成物は、さらに精製することなく、次の工程で正常に使用できた。全分析データは上に報告されたとおりであった。
【０１０４】
工程６
4'-アセタミド-2'-ベンジルオキシ-2-[4-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]アセトフェノン
1-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン(117μL、134mg、0.607mmol)を、DMF(5mL)中のN-[3-ベンジルオキシ-4-(2-ブロモ-アセチル)-フェニル]-アセタミド(200mg、0.552mmol)および炭酸カリウム(115mg、0.828mmol)の混合物に加え、室温で18時間撹拌した。溶媒を真空下に除去し、塩水(25mL)中に採取した。水溶液をDCM(3×25mL)で抽出し、有機層を合わせ、乾燥(MgSO4で)した。溶媒を真空下に除去し、生成物をプレパラティブHPLCで精製して、純4'-アセタミド-2'-ベンジルオキシ-2-[4-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]アセトフェノン(114mg、41%、50% rec.)をオフホワイトの固体として得た。
δH(CDCl3) 8.23(1H, br s), 7.81(1H, d, J=8.6Hz), 7.77-7.76(1H, m), 7.53- 7.51(2H, m), 7.42-7.28(8H, m), 7.08(1H, dd, J=8.6, 1.8Hz), 5.20(2H, s), 5.12(2H, s), 4.00(2H, s), 3.59-3.48(4H, m), 2.65-2.60(4H, m), 2.14(3H, s);
LCMS保持時間2.07分間、M+H+ 502.5  回収されたN-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド(35mg)を伴って。
【０１０５】
工程７
3-[4-アセトアミド-2-ベンジルオキシフェニル]-4-[4-(ベンジルオキシカルボニル)-ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール
乾燥THF(0.5mL)中の4'-アセタミド-2'-ベンジルオキシ-2-[4-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]アセトフェノン(68mg、135.6μmol)およびジメチルホルムアミドジメチルアセタール(90μL、81mg、677.9μmol)の溶液をマイクロウェーブ管中に密封し、120℃で65分間加熱した。THF(0.5mL)中のジメチルホルムアミドジメチルアセタール(90μL、81mg、677.9μmol)をさらに加え、管を再度120℃で40分間加熱した。
得られた粗4-[1-(4-アセチルアミノ-2-ベンジルオキシ-ベンゾイル)-2-ジメチルアミノ-ビニル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステルの溶液に、ヒドラジン水和物(0.75mL)およびMeOH(0.75mL)を加えて混合物を単相にし、この混合物を室温で3日間撹拌した。揮発性物質を真空下に除去し、残渣を50%飽和塩水(100mL)中に注入した。生成物をEtOAc(3×100mL)で抽出し、有機層を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、溶媒を真空下に除去して、粗3-[4-アセトアミド-2-ベンジルオキシフェニル]-4-[4-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール(70mg、98%)を黄色のゴム状物質として得た。
LCMS保持時間2.48分間、M+H+ 526.5
【０１０６】
工程８
3-[4-アセトアミド-2-ヒドロキシフェニル]-4-(ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール
MeOH(7mL)中の3-[4-アセトアミド-2-ベンジルオキシフェニル]-4-[4-(ベンジルオキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]-1H-ピラゾール(70mg、133.2μmol)の溶液を脱気(3×真空/窒素)し、パラジウム(炭素上10%；10mg、触媒)を加えた。反応混合物を再度脱気(3×真空/窒素)し、雰囲気を水素で置き換えた(3×真空/水素)。混合物を室温で18時間振盪した。触媒を少量のセライトパッドによりろ別し、さらにMeOH(15mL)で洗浄した。溶媒を真空下に除去し、粗生成物を得、これをプレパラティブHPLCで精製して、3-[4-アセトアミド-2-ヒドロキシフェニル]-4-(ピペラジン-1-イル)-1H-ピラゾール(16.3mg、41%)を白色の固体として得た。
δH(MeOH-d4) 8.47(1H, s), 7.80(1H, br s), 7.68(1H, s), 7.26(1H, s), 7.11(1H, dd, J=8.5, 2.1Hz), 3.34-3.29(4H, m), 3.11-3.07(4H, m), 2.12(3H, s);
LCMS保持時間1.26分間、M+H+ 302.3
この実施例53の化合物は、Hsp90 FP結合評価で活性「B」を有していた。
【０１０７】
実施例54
3-メチル-5-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-1H-インドール-6-オール
【化３３】
0004528131.tif 000044
工程１
N-(4-アセチル-3-ヒドロキシ-フェニル)-アセタミド
酢酸3-アセチルアミノ-フェニルエステル(5.0g、25.9mmol)をすりつぶして微粉末とし、次いで丸底フラスコ中でALCl3と混合した。窒素を勢いよく流した後、フラスコを95℃に加熱し、発煙反応が終了するまでこの温度を保った。反応混合物を室温まで冷却し、褐色固体を粉状に粉砕した。次いで反応混合物を180℃に再加熱した。4時間後、反応混合物を室温まで冷却し、粉砕して粉状にした。氷水(100ml)を加え、反応混合物を一晩撹拌した。生成物をろ過し、水で洗浄し、乾燥して、褐色の固体(2.57g、51.4%)を得た。
LC/MS：RT=1.864分間194(MH+)
【０１０８】
工程２
N-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド
N-(4-アセチル-3-ヒドロキシ-フェニル)-アセタミド(2.57g、13.3mmol)をDMF(60ml)中に懸濁し、次いでCs2CO3(8.70g、26.7mmol)およびベンジルブロマイド(1.7ml、14mmol)を順次加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下に除去し、油状の残渣をDCM/H2O(1:1)中で撹拌した。有機層を水で洗浄し、乾燥(Na2SO4で)し、ヘキサンからヘキサン/EtOAc(1:1)の勾配でのカラムクロマトグラフで精製して、ベンジルエステルをクリーム色の固体(1.25g、33%)として得た。
LC/MS：RT=2.307分間284(MH+)
【０１０９】
工程３
N-(4-アセチル-5-ベンジルオキシ-2-ブロモ-フェニル)-アセタミド
N-ブロモスクシンイミド(0.756g、4.27mmol)を、DMF(24ml)中のN-(4-アセチル-3-ベンジルオキシ-フェニル)-アセタミド(1.2g、4.24mmol)の溶液中に少しずつ加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥して、白色の固体(1.03g、67%)を得た。
LC/MS：RT=2.609時間362/364(MH+)
【０１１０】
工程４
N-(4-アセチル-5-ベンジルオキシ-2-ブロモ-フェニル)-N-アリル-アセタミド
窒素下に無水THF(20ml)中のN-(4-アセチル-5-ベンジルオキシ-2-ブロモ-フェニル)-アセタミド(1.03g、2.85mmol)の溶液を-78℃に冷却し、次いでLDA(2.1ml、2M溶液、4.3mmol)を滴下した。反応混合物を-78℃で1時間撹拌し続け、次いでアリルブロマイド(0.44ml、2.85mmol)でクエンチした。反応混合物を室温まで暖め、一晩撹拌を続けた。溶液をEtOAcと水の間で分配した。有機層を集め、水、塩水で洗浄し、次いで乾燥(MgSO4で)した。ヘキサン/EtOAc(1:1)でのカラムクロマトグラフで精製し、白色の固体(0.662g、58%)を得た。
LC/MS：RT=2.703分間402/404(MH+)
【０１１１】
工程５
1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-エタノン
MeCN(15ml)中のN-(4-アセチル-5-ベンジルオキシ-2-ブロモ-フェニル)-N-アリル-アセタミド(0.662g、1.65mmol)、P(o-トリル)3(0.028g、0.092mmol)およびトリエチルアミン(0.34ml、2.24mmol)の溶液を窒素で勢いよく流し、次いでPd(OAc)2(0.005g)を加えた。反応混合物を150℃で500秒間、マイクロウェーブで加熱した。粗混合物をEtOAcで希釈し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。ヘキサン/EtOAc(1:1)でのカラムクロマトグラフで精製し、クリーム色の固体(0.283g、54%)を得た。
LC/MS：RT=2.742分間322(MH+)、344(MNa+)、280（MH+-Ac）
【０１１２】
工程６
1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2,2-ジブロモ-エタノン
無水THF(6ml)中の1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-エタノン(0.283g、0.88mmol)の溶液にPhNMe3Br3(0.497g、2.3mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶液を水で希釈し、有機物をEt2Oで抽出し、MgSO4で乾燥して、粗生成物(0.420g、＞90%)を得た。
LC/MS：RT=2.900分間478/480(MH+)
【０１１３】
工程７
1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2-ブロモ-エタノン
粗生成物1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2,2-ジブロモ-エタノン(0.42g、0.88mmol)をTHF(4ml)中に懸濁し、次いでトリエチルアミン(0.12ml、0.89mmol)および(EtO)2P(O)H(0.137ml、0.88mmol)を加えた。室温で一晩撹拌後、反応混合物をEtOAcで希釈し、水、塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、粗生成物をヘキサン/EtOAc(1:1)でのカラムクロマトグラフで精製し、生成物(0.039g、11%)を得た。
LC/MS:RT=2.830分間400/402(MH+)
【０１１４】
工程８
4-[2-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル
化合物1-(1-アセチル-6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2-ブロモ-エタノン(0.039g、0.1mmol)、K2CO3(0.019g、0.14mmol)およびCbz-ピペラジン(0.026ml、0.1mmol)をDMF(2ml)中、室温で5時間撹拌した。溶媒を真空下に除去し、残渣をDCMに再溶解し、水、塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。ヘキサン/EtOAc(3:2)でのカラムクロマトグラフで精製して、生成物(0.008g、17%)を得た。
LC/MS：RT=2.236分間498(MH+)
【０１１５】
工程９
4-[1-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-カルボニル)-2-ジメチルアミノ-ビニル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル
DMFDMA(5ml)中の4-[2-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-2-オキソ-エチル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(0.661g、1.33mmol)の溶液を100℃で一晩加熱した。溶媒を真空下に除去し、粗生成物をヘキサン/EtOAc(1:1)でのカラムクロマトグラフで精製して、生成物(0.158g、22%)を得た。
LC/MS：RT=5.33分間553(MH+)
【０１１６】
工程10
4-[3-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル
EtOH中の4-[1-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-カルボニル)-2-ジメチルアミノ-ビニル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(0.158g、0.29mmol)およびヒドラジン(0.75ml、15.5mmol)の溶液を1時間還流した。その間に反応は終了していた。溶媒を真空下に除去し、生成物をヘキサン/EtOAc(1:1)でのカラムクロマトグラフで精製して、オフホワイトの固体(0.0445g、30%)を得た。
LC/MS：RT=2.713分間522(MH+)
【０１１７】
工程11
3-メチル-5-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-1H-インドール-6-オール
MeOH(2ml)中の4-[3-(6-ベンジルオキシ-3-メチル-1H-インドール-5-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペラジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(0.022g、0.042mmol)の溶液を排気して、窒素を勢いよく流した。この溶液に10%Pd/C(10mg)を加え、この懸濁液を排気して水素を勢いよく流した。反応混合物を水素雰囲気下に室温で一晩振盪した。反応混合物をセライトでろ過し、溶媒を真空下に除去した。最終生成物をHCl/Et2Oで塩化し、エーテルで粉砕して、淡褐色の固体(0.0046g、33%)を得た。
LC/MS：1.495分間298(MH+)
この実施例54の化合物は、Hsp90 FP結合評価で活性「B」を有していた。
【０１１８】
臭素で置換されたレゾルシノール環を有している以下の実施例55〜64の化合物は、スキーム１と同様にして、但し、実施例１の工程３の中間体のブロモ類似化合物を経て製造した。このブロモ中間体は、次のスキーム６により製造した。
スキーム６
【化３４】
0004528131.tif 000045
工程１
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-エタノン
【化３５】
0004528131.tif 000046
ベンジルブロマイド(35.6mL、0.3mol)をアセトニトリル(150mL)中の2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(15g、0.1mol)および炭酸カリウム(41.4g、0.3mol)    の懸濁液に加え、混合物を一晩撹拌した。乾燥するまで濃縮後、残渣をジクロロメタン(100mL)に再懸濁し、水(100mL)で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。ヘキサンで粉砕し、ろ過し、真空下に乾燥して、1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-エタノンを白色の粉末(26g)として得た。
LC保持時間2.83分間、[M+H]+ 333.3  (実行時間3.75分間)
【０１１９】
工程２
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-2-ブロモ-エタノン
【化３６】
0004528131.tif 000047
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド(5.6g、0.015mol)を、テトラヒドロフラン(50ml)中の1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-エタノン(5.0g、0.015mol)の撹拌溶液に少しずつ加え、混合物を2時間撹拌した。混合物を水(50ml)とジエチルエーテル(2×50ml)の間で分配した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-2-ブロモ-エタノンをベージュ色の固体として得、これをさらに精製することなく使用した。
LC保持時間2.89分間、[M+H]+ 411.2および413.2  (実行時間3.75分間)
【０１２０】
工程３
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-ブロモ-フェニル)-2-ブロモ-エタノン
【化３７】
0004528131.tif 000048
N-ブロモスクシンイミド(2.67g、0.015mol)を、ジメチルホルムアミド(50ml)中の粗1-(2,4-ビス-ベンジルオキシフェニル)-2-ブロモ-エタノン(約6.16g、0.015mol)の撹拌溶液に加え、混合物を18時間撹拌した。混合物を乾燥するまで濃縮し、ジクロロメタン(50mL)に溶解し、水(2×50ml)で洗浄した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-ブロモ-フェニル)-2-ブロモ-エタノンを白色の固体として得、これをさらに精製することなく使用した。
LC保持時間2.99分間、[M+Na]+ 511.2、513.2および515.2  (実行時間3.75分間)
【０１２１】
次の実施例の表において、「Hsp90 IC50」の欄中の記載は、以下に示したATPase評価で得られた結果である。
【表４−１】
0004528131.tif 000049
【０１２２】
【表４−２】
0004528131.tif 000050
【０１２３】
以下の実施例65〜76の化合物は、実施例55の化合物を中間体として用いて製造した。例えば、実施例70の化合物は、以下のようにして製造し、実施例65〜69および71〜76の化合物は、同様にして製造した。
工程１
スチリル中間体を生成するブロモ中間体のカップリング
n-ブタノール(1当量当り50mL)中の4-ブロモ-6-(4-ピペラジン-1-イル-1H-ピラゾール-3-イル)-ベンゼン-1,3-ジオール(実施例58)(1当量)、4-フルオロスチレン(3当量)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(3当量)の混合物を脱気(3×窒素/真空)した。ジクロロビス(トリ-o-トリルホスフィノ)パラジウム(II)(2モル%)を加え、混合物を15時間加熱還流した。混合物を、少量のシリカ栓でろ過し、シリカをジクロロメタンで洗浄した。
【０１２４】
工程２
フェネチル化合物への還元
酢酸ナトリウム(水中1.0M、3当量)の溶液を、1,2-DME中のアルケン(1当量)およびp-トルエンスルホニルヒドラジド(3当量)の還流溶液に2時間で滴下し、20時間還流を続けた。混合物を冷却し、水に注入し、ジクロロメタンで抽出した。抽出液を合わせ、乾燥(MgSO4で)し、真空下に濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフで精製した。
【表５−１】
0004528131.tif 000051
【０１２５】
【表５−２】
0004528131.tif 000052
【０１２６】
【表５−３】
0004528131.tif 000053
【０１２７】
【表５−４】
0004528131.tif 000054
【０１２８】
実施例77
4-ブロモ-6-[4-[4-(4-メタンスルホニル-ベンジルアミノ)-ピペリジン-1-イル]-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオール
【化３８】
0004528131.tif 000055
工程１
8-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-ブロモ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1,4-ジオキサ-8-アザ-スピロ[4.5]デカン
【化３９】
0004528131.tif 000056
1-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-ブロモ-フェニル)-2-ブロモ-エタノン(上記のスキーム６により製造)(15.56g、31.74mmol)をジメチルホルムアミド(20ml)中に溶解した。1,4-ジオキサ-8-アザ-スピロ[4.5]デカン(4.55g、31.74mmol)およびトリエチルアミン(4.42ml、31.74mmol)を加え、反応混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去した。残渣をジメチルホルムアミドジメチルアセタール(60ml、452mmol)中に採取し、110℃で16時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、真空下に濃縮して、褐色の油状物を得た。これをエタノール(100ml)およびヒドラジン水和物(23.8g、476mmol)中に溶解し、16時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、乾燥するまで蒸発させ、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフで精製した。生成物をエチルエーテル/ヘキサン(1:1)で溶出し、合わせた溶出画分を蒸発させ、残渣をジエチルエーテルで粉砕して、オフホワイトの固体(6.31g)を得た。
LC保持時間2.79分間[M+H]+ 576.4および578.4(臭素分裂パターン)  (実行時間3.75分間)
【０１２９】
工程２
1-[3-(5-ブロモ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペリジン-4-オン
【化４０】
0004528131.tif 000057
8-[3-(2,4-ビス-ベンジルオキシ-5-ブロモ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1,4-ジオキサ-8-アザ-スピロ[4.5]デカン(6.55g、11.4mmol)をジクロロメタン(70ml)中に溶解し、0℃に冷却した。ボロントリクロライド(ジクロロメタン中1M、57ml、57mmol)を滴下した。反応混合物を室温に暖め、30分間撹拌した。次いで0℃で水(50ml)でクエンチし、室温に暖め、3日間撹拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液でpH=7に中和し、淡褐色の沈殿物をろ取し、水で洗浄し、次いで真空オーブン中で乾燥した(2.25g)。
LC保持時間1.89分間[M+H]+ 352.4および354.2(臭素分裂パターン)  （実行時間3.75分間）
【０１３０】
工程３
4-ブロモ-6-[4-[4-(4-メタンスルホニル-ベンジルアミノ)-ピペリジン-1-イル]-1H-ピラゾール-3-イル]-ベンゼン-1,3-ジオール
【化４１】
0004528131.tif 000058
1-[3-(5-ブロモ-2,4-ジヒドロキシ-フェニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-ピペリジン-4-オン(0.1g、0.284mmol)をメタノール(3ml)中に溶解した。トリエチルアミン(0.044ml、0.312mmol)および4-メタンスルホニル-ベンジルアミン塩酸塩(0.069g、0.312mmol)を加え、反応混合物を室温で1時間撹拌した。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを加え、発泡が止まってから溶媒を真空下に除去した。残渣をシリカのフラッシュクロマトグラフで精製した。生成物をメタノール/ジクロロメタン(1:9)で溶出した。さらにHPLCによる精製を必要とした。白色の固体(0.036g)を得た。
LC保持時間1.68分間[M+H]+ 521.3および523.3(臭素分裂パターン)  (実行時間3.75分間)
【０１３１】
実施例78〜88の化合物は、実施例80の化合物と同様にして、適当なアミンの工程４中間体との工程５における反応により製造された。再度、「Hsp90 IC50」の欄中の記載は、以下に示したATPase分析で得られた結果である。
【表６−１】
0004528131.tif 000059
【０１３２】
【表６−２】
0004528131.tif 000060
【０１３３】
【表６−３】
0004528131.tif 000061
【０１３４】
【表６−４】
0004528131.tif 000062
【０１３５】
生物学的結果
Hsp90の内在性のATPase活性は、モデル系として酵母のHSP90を用いて測定され得る。無機ホスフェートの測定に対してマラカイトグリーンを用いる方法を基にした評価方法により、ここの実施例の化合物のHSP90阻害活性を試験した。
【０１３６】
マラカイトグリーンATPase分析
材料
化学薬品は市販品で最高純度のものであり、全ての水溶液はAR水を用いて調製される。無機ホスフェートの混入を最小限にする必要性から、分析に使用される溶液および装置に注意を払うべきである。ガラス製品およびpHメータは、2度蒸留された水または脱イオンされた水で使用前に洗浄され、可能な限りどんな場合でも、プラスチック製品を使用すべきである。全ての操作に対して手袋を着用した。
(1)グライナー384-ウェル(Greiner 781101)またはコスター384-ウェル平底ポリスチレンマルチウェルプレート（VWR）
(2)(a)100mM Tris-HCl、pH7.4 (b)150mM KCl (c)6mM MgCl2の分析緩衝液、室温で貯蔵
(3)0.0812%(w/v)マラカイトグリーン(M 9636、シグマアルドリッチ社、Poole、UK)、    室温で貯蔵
(4)沸騰水中2.32%(w/v)ポリビニルアルコールUSP(P 1097、シグマアルドリッチ社、Poole、UK) (コメント１参照)、冷却して室温で貯蔵
(5)6M塩酸中5.72%(w/v)モリブデン酸アンモニウム、室温で貯蔵
(6)34%(w/v)クエン酸ナトリウム、室温で貯蔵
(7)100mM ATP２ナトリウム塩、特別品質(47699、シグマアルドリッチ)、-20℃で貯蔵
(8)E.coliにより発現された酵母HSP90蛋白質、95%以上に精製し (例えば、Panaretou    ら、1998参照)、50μLに分割して-80℃で貯蔵
【０１３７】
方法
１．試験化合物をAR水中500μM に希釈 (DMSO濃度は2.5%である)。これらの化合物の2.5μlを直接、娘プレートから分析プレートへ移し、最終分析濃度を100μMにする。12ポイントのIC50値を得るために、1:2の連続希釈を行い100μMから97.6nMの範囲の分析濃度(2.5% DMSO)を作成し、各濃度の2.5μlを分析プレートへ移した。分析プレートの列１は、ネガティブコントールとして化合物を含まないものとする。化合物を含まないさらなる行を、バックグラウンドとしても使用する。
２． ATPの100mM貯蔵液を分析緩衝液で925μMに希釈して調製し、対照を含んだ各ウェルに、希釈されたATPの5μlずつを分割する（最終分析濃度370μM）。
３．緩衝液の5μlをバックグラウンドの行に加える。
４．分析緩衝液で酵素試料を1.05μMに希釈し、5μlずつ各化合物ウェルおよびネガティブコントロールの列に分割する。
５．ウェルの底に試薬を集め、プレートシールでプレートを覆い、37℃で一晩インキュベートする。
６．朝一番にマラカイトグリーン試薬を調製する。マラカイトグリーン溶液の２部、ポリビニルアルコール溶液の１部、モリブデン酸アンモニウム溶液の１部そしてAR水の２部を加える。
７．逆さまにして混合し、色が褐色から山吹色に変わるまで、約１時間放置する。
８．マラカイトグリーン試薬の40μlを各ウェルに加え、色が生じるように５分間放置する。
９．クエン酸ナトリウム試薬の5μlを各ウェルに加える（コメント２参照）。
１０．プレートシールで再度覆い、プレート振盪器で少なくとも15分間振盪する。
１１．適当なプレートリーダー（例えば、Victor、Perkin Elmer Life Sciences、Milton Keynes、UK）を使って620nmでの吸光度を測定する。これらの条件で、対照の吸光度は0.9〜1.4であり、バックグラウンドは0.2〜0.35であり、そして、信号対雑音比〜12を与える。これらの条件を用いて得られたデータから計算されたZ'因子は、0.6〜0.9の間である。
【０１３８】
コメント
(1)ポリビニルアルコールは沸騰水に溶け難く、２〜３時間の撹拌を必要とする。
(2)マラカイトグリーン試薬とクエン酸ナトリウムの添加時間の間隔は、ATPの非酵素的  加水分解を少なくするため、できるだけ短く保つべきである。一度クエン酸ナトリウム  が加えられれば、色は室温で4時間まで安定である。
(3)化合物は、Biomex FXロボット(Beckman Coulter)を用いて分析プレートに加えるこ  とができる。マルチドロップ384ディスペンサー(Thermo Labsystems、Basingstoke、UK)が、プレートへ試薬を加えるために都合よく使用できる。
(4)分析条件の時間、蛋白質および基質濃度は、信号対雑音格差を保持しながら、最小限の蛋白質濃度を達成するように最適化された。
(5)信号対雑音比(S/N)は次の式を用いて計算される。
【数１】
0004528131.tif 000063
(6)HSP90の比活性を決定するために、濃度範囲(0〜10μM)の無機ホスフェートが調製され、記載されているようにして620nmでの吸光度が測定される。比活性は、得られた検量線から計算される。
上記の分析で試験された化合物に対して、二つの活性範囲、すなわちA=＜50μM；B=＞50μMのうちの一つが割り当てられ、これらの割り当てが上に報告されている。
【０１３９】
蛍光偏光分析法
蛍光偏光[蛍光異方性としても知られている]は、溶液中の蛍光発光種の回転を測定する。この場合、分子が大きいほど、蛍光発光をより偏光させる。蛍光体が偏光で励起されるときに、発光もまた偏光される。分子サイズは蛍光発光の偏光に比例する。
【０１４０】
蛍光標識プローブ−RBT0045864-FAM−
【化４２】
0004528131.tif 000064
がHSP90[全長ヒト、全長酵母またはN-末端ドメインのHSP90]と結合し、その異方性[プローブ:蛋白質複合体の回転]が測定される。
試験化合物を分析プレートに加え、平衡状態にし、その異方性を再度測定する。異方性の変化は、化合物のHSP90との競合的な結合(それによりプローブが遊離する)に由来する。
【０１４１】
材料
試薬は市販品で最高純度のものであり、全ての水溶液はAR水を用いて調製される。
1)コスター 96-ウェル ブラック分析プレート#3915
2)(a)100mM Tris pH7.4； (b)20mM KCl； (c)6mM MgCl2の分析緩衝液、室温で保存
3)BSA(ウシ血清アルブミン)10mg/ml(New England Biolabs # B9001S)
4)100%DMSO中の20mMプローブ貯蔵濃度。暗所、RTで貯蔵。作業濃度はAR水で希釈し200nMであり、4℃で貯蔵。分析での最終濃度は80nM。
5)E.coliにより発現されたヒト全長HSP90蛋白質、95%以上に精製し (例えば、Panareto  uら、1998参照)、50μLに分割して-80℃で保存
【０１４２】
プロトコール
１）100μl 1×緩衝液をウェル11Aおよび12A(=FP BLNK)に加える。
２）分析混合物を調製−プローブが光感受性なので、全試薬はバケツに蓋をして氷上        で保存される。
【表７】
0004528131.tif 000065
３）全ての他のウェルに100μlの分析混合物を分割
４）プレートで覆い、平衡状態にするために暗所、室温で20分間放置
【０１４３】
化合物希釈プレート−1×3の一連の希釈
１）きれいな96-ウェルv底プレート−[#VWR007/008/257]のウェルB1〜H11に100%DM      SO 10μlを加える。
２）ウェルA1〜A11に100%DMSO 17.5μlを加える。
３）2.5μlのcpdをA1に加える。これはcpds 20mMと仮定して、2.5mM[50×]貯蔵cp      dを与える。
４）ウェルA2〜A10に対して繰り返す。列11および列12は対照。
５）列12を除いた行Aから行Bに5μlを移す。よく混合。
６）行Bから行Cへ5μlを移す。よく混合。
７）行Gまで繰り返す。
８）行Hには化合物を加えない−これが0行。
９）これにより50μM〜0.07μMの1×3の一連の希釈ができる。
10) ウェルB12に100μM標準化合物溶液20μlを調製する。
11) 最初のインキュベーション後、分析プレートをFusionTM a-FP plate reader(Packa  rd BioScience、Pangbourne、Berkshire、UK)で読み取る。
12) 最初の読み取り後、希釈された化合物の2μlを列1〜列10の各ウェルに加える。    列11[検量線を与える]において、B11〜H11にだけ化合物を加える。100mM標準cpdの2μl  をウェルB12からH12(陽性対照である)に加える。
13) Z'因子は0対照および陽性ウェルから計算される。それは典型的に0.7〜0.9の値を  与える。
上記の分析で試験された化合物に対して、二つの活性範囲、すなわちA=＜10μM；B=＞10μMのうちの一つが割り当てられ、これらの割り当てが上に報告されている。
【０１４４】
増殖阻害分析も、HSP90阻害剤候補の分析に使用された。
スルホロダミンＢ(SRB)分析による細胞毒性試験：50%阻止濃度(IC50)の計算
1日目
1)血球計数器により細胞数を決定する。
2)８チャンネルマルチピペッターを用いて、細胞懸濁液(3600細胞/ウェルまたは2×104細胞/ml)の160μlを96-ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加える。
3)CO2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。
【０１４５】
2日目
4)薬物の貯蔵溶液を調製し、各薬物の連続希釈を媒体中で行い、ウェル中に最終濃度のものを作成した。
5)マルチピペッターを用いて、薬物の40μl(5×最終濃度で)を四重のウェルに加える。  
6)対照ウェルは96ウェルプレートのいずれかの端であり、ここに媒体の40μlを加える。
7)CO2インキュベーター中で4日間(48時間)、プレートをインキュベートする。
【０１４６】
6日目
8)媒体を流しに捨て、プレートを10%氷冷トリクロロ酢酸(TCA)中にゆっくりと浸す。氷  上で約30分間放置する。
9)プレートを水道水浴に浸した後、それを捨てることによって、プレートを水道水で3回洗浄する。
10) インキュベーター中で乾燥する。
11) 1%酢酸中の0.4%SRBの100μlを各ウェルに加える(96ウェルプレートの最後の行(右側)を除いて、これは0%対照、すなわち無薬物、無染色である。一番目の行は、無薬物だが有染色の100%対照となる)。15分間放置する。
12) 結合しなかったSRB染色剤を1%酢酸で4回洗浄して洗い流す。
13) インキュベーター中でプレートを乾燥する。
14) 10mMのTrisベースの100μlを用いてSRBを可溶化し、プレートをプレート振盪器の上に5分間置く。
15) プレートリーダーを用いて540nmでの吸光度を決定する。四重のウェルの平均吸光度を計算し、対照の未処理のウェルに対する値のパーセントとして表す。
16) 対数薬物濃度に対する吸光度％をプロットし、IC50を決定する。
説明した方法により、実施例２の化合物は、SRB増殖阻止評価で「A」の範囲(<50μM)  のIC50を示した。
【０１４７】
参考文献
本発明、および本発明が属する技術分野の状況を、より十分に記載し、開示するために、多くの刊行物を上で引用している。これら参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々が、本明細書の中で完全に言及され、ここに組み込まれている。
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