(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水を抽出溶媒とする抽出により得られたバーベリー樹皮の抽出物を有効成分としてなるヒスタミンの遊離又は血小板凝集に起因するアレルギー疾患の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚化粧料に配合するのに適した抗アレルギー剤、活性酸素消去剤、およびこれら皮膚の炎症や老化症状の予防と改善に有効な成分を配合してなる皮膚化粧料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚のかぶれ、湿疹、アトピー症など、アレルギーによる皮膚の各種炎症は、体内におけるヒスタミン遊離、血小板凝集などのほか、スーパーオキサイド、一重項酸素、ヒドロキシラジカル等の活性酸素が原因となって発症する。
【０００３】
ヒスタミン遊離は、Ｉ型アレルギー反応に伴って肥満細胞内のヒスタミンが細胞外に遊離する現象で、遊離されたヒスタミンがアレルギー症状の起炎物質となる。このヒスタミンの遊離を阻害することによりアレルギー症の一部を抑制するのに有効な物質としては、トラニラスト、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、バイカレイン、塩酸プロメタジン等がある。しかしながら、これらの物質は必ずといってよいほど副作用があり、一般的な皮膚化粧料に配合するには安全性の点で問題があった。
【０００４】
血小板凝集はアラキドン酸カスケードのホスホリパーゼＡ２の活性化を招き、それによりロイコトリエンＢやプロスタグランジンＥ２等が放出されて起炎物質となる。
【０００５】
活性酸素は、体内で過剰に産生されたり分解酵素・ＳＯＤによる消去が不十分であったりして濃度が高くなると、アレルギー性炎症を生じさせるだけでなく、様々な組織障害の原因となる。皮膚は紫外線など環境因子の刺激を直接受けるため活性酸素が発生しやすい器官であるから、しばしば活性酸素濃度が上昇し、過酸化脂質が生成してシミ、ソバカス、小ジワ等を増やす。
【０００６】
そこで、上述の障害を回避するため、活性酸素の濃度が過大になるのを防ぐのに有効な活性酸素消去性物質を皮膚化粧料に配合すること、および、そのための活性酸素消去性物質を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされ、その結果、ウワミズザクラのプルヌソールＡ、ユーカリ等のエラグ酸、大麦、黒米、黒インゲン等の穀類のフラボノイド類、茶のカテキン、ゴマのセサミン類、セージ、ローズマリー等のハーブ類に含まれるカルノソールやロズマノール等の有効性が確認されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗アレルギー作用と活性酸素消去作用を有し皮膚化粧料構成成分としての適性も備えた物質を植物体から見いだし、抗アレルギー剤および活性酸素消去剤として提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、安全性の高い天然物系の抗アレルギー作用物質および活性酸素消去作用物質を配合することにより抗炎症作用および皮膚保護作用を強化した皮膚化粧料を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を解決することに成功した本発明は、水を抽出溶媒とする抽出によりバーベリー樹皮より得られる抽出物を有効成分とするヒスタミンの遊離又は血小板凝集に起因するアレルギー疾患の予防・治療剤を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
バーベリー（Ｍａｈｏｎｉａ  ｎｅｐａｌａｕｌｅｎｓｉｓ）は主に中央アジアの亜高山帯に生育するメギ科の植物であって、その樹皮は神経痛の治療に有効とされているが、その場合の有効成分や薬理作用の詳細は解明されていない。バーベリー樹皮に抗アレルギー作用や活性酸素消去作用を有する物質が含まれていることも、もちろん知られていなかった。
【００１１】
バーベリー樹皮に含まれていて抗アレルギー作用や活性酸素消去作用を示す物質は、水溶性であり、また多くの化粧料に配合しても安定であり、さらに経皮的に人体内によく吸収される性質のものである。しかも、皮膚に塗布しても皮膚を刺激したり炎症を起こさせたりすることがない。したがって、皮膚化粧料に配合してその有用作用を活用するのにきわめて好都合な性質を備えている。
【００１２】
バーベリー樹皮から上記有用作用を示す物質を抽出するには各種の親水性有機溶媒、水、またはこれらの混合物を使用することができるが、特に好ましい抽出溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等、炭素数１〜４の脂肪族アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；水；またはこれらの混合物である。
【００１３】
抽出条件および抽出に用いる装置は特に限定されないが、好適には重量比で５〜１５倍量の抽出溶媒にバーベリー樹皮の粉砕物を浸漬し、常温ないし１００℃程度の加熱下にゆるやかに撹拌しながら可溶性成分を溶出させる。濾過または遠心分離して得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、さらに乾燥すれば約３〜１０数％の収率で淡褐色の抽出物が得られるが、抗アレルギー剤または（および）活性酸素消去剤として利用するバーベリー樹皮抽出物は固形の抽出物である必要はなく、上記抽出液またはその濃縮液の状態のものであってもよい。また、その有用作用を損なわない限り、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理、液−液向流分配等の方法により精製してから用いてもよい。
【００１４】
製剤化する場合は、上述の抽出物またはその精製物を、必要に応じて任意の助剤と混合して、錠剤、散剤、液剤等、任意の剤形のものとする。
【００１５】
本発明による抗アレルギー剤および活性酸素消去剤を配合した皮膚化粧料を製造するのに特別の配慮は不要であって、化粧料製造に通常使用される原料を常法により処理して乳液、ローション、クリーム、ゼリー、パック等各種形態の化粧品を製造する工程の任意の段階でこれを添加すればよい。
【００１６】
皮膚化粧料に対する好適配合率は、皮膚化粧料の種類によっても異なるが、標準的なバーベリー樹皮抽出物としておおむね０．００１〜１０重量％（特に好ましくは０．０５〜２重量％）である。
【００１７】
添加対象となる皮膚化粧料の基本的な構成成分の選択が制限されることはなく、たとえばアボガド油、コメヌカ油、コメ胚芽油、ラノリン、蜜ロウ、スクワラン、ワセリン、流動パラフィン等の油性成分；グリセリン、１，３−ブチレングリコール、コラーゲン、ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、キトサン、キチン等の保湿剤；グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等の複合脂質；ＳＯＤ、カタラーゼ、β−カロチン、イチョウ葉抽出物、ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＥおよびその誘導体、オウゴン抽出物、クジン抽出物等の活性酸素消去作用物質；グアイアズレン、カマアズレンおよびその誘導体；グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびその塩、グリチルレチン酸誘導体、酸化亜鉛等の抗炎症剤；その他各種植物抽出物、増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、香料、酸化防止剤、水、アルコール等、皮膚化粧料製造に通常使用される成分を任意に使用することができる。
【００１８】
【実施例】
バーベリー樹皮抽出例
乾燥したバーベリー樹皮の粗砕物５００ｇを抽出溶媒３０００ｍｌに投入し、７０℃に加熱しながら２時間撹拌する。その後、濾過して得られた抽出液を減圧下に濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥して抽出物を得る。
抽出溶媒を種々変更して上記抽出を行なった場合の抽出物収率は表１のとおりであった。
【００１９】
【表１】
0004523087.tif 000002
【００２０】
試験例１
上記各抽出例で得られたバーベリー樹皮抽出物について、スーパーオキサイド消去作用、一重項酸素消去作用、およびＤＰＰＨ（ジフェニルピクリルヒドロラジカル）に対するラジカル消去作用を試験した。試験法は次のとおりである。
【００２１】
スーパーオキサイド消去作用（ＮＢＴ法）：３ｍＭキサンチン、０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＢＳＡ溶液および０．７５ｍＭ  ＮＢＴ  ０．１ｍｌを試験管にとり、これに試料溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃で１０分間放置する。次いでキサンチンオキシダーゼ溶液を加えて素早く撹拌し、２５℃で２０分間静置する。その後６ｍＭ塩化銅を加えて反応を停止させ、５６０ｎｍにおける吸光度を測定する。同様の操作と吸光度測定を、酵素溶液を添加せずに行う。さらに、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行い、次式によりスーパーオキサイド消去率を求める。
【００２２】
消去率（％）＝〔１−（Ｓｔ−Ｓｏ）／（Ｂｔ−Ｂｏ）〕×１００
但し
Ｓｔ：試料溶液添加，酵素溶液添加時の吸光度
Ｓｏ：試料溶液添加，酵素溶液無添加時の吸光度
Ｂｔ：試料溶液無添加，酵素溶液添加時の吸光度
Ｂｏ：試料溶液無添加，酵素溶液無添加時の吸光度
【００２３】
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記抑制率の測定を行い、活性酸素産生の抑制率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求める。
【００２４】
一重項酸素消去作用：透明ガラス瓶（１０ｍｌ容）中で２％赤血球懸濁液５ｍｌ、試料を所定濃度で含むｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍｌ、および光増感剤（１０ｍＭヘマトポルフィリン−２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液）０．０１ｍｌを混合する。得られた溶液をメリーゴーランド上、７．５Ｗハロゲンランプで３５分間均一に照射して１Ｏ２を発生させ、赤血球の溶血を生じさせる。この反応溶液１ｍｌを採取し、等張リン酸緩衝液２ｍｌを加えて混合後、４℃で３０００ｒｐｍ・５分間の遠心分離を行う。次いで上清を採取し、波長５４０ｎｍの吸光度を測定する。別に、赤血球を一部溶血させた上記反応溶液１ｍｌをとり、これに蒸留水２ｍｌを加えて完全に溶血させたものを対照液とし、同様に吸光度測定を行う。測定された吸光度より次式により一重項酸素消去率を求める。
一重項酸素消去率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
但し  Ａ：対照液の吸光度
Ｂ：反応溶液上清の吸光度
【００２５】
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、一重項酸素の消去率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求める。
【００２６】
ＤＰＰＨに対するラジカル消去作用：１．５×１０−４ＭＤＰＰＨメタノール溶液３ｍｌに試料溶液３ｍｌを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置する。その後、５２０ｎｍの吸光度を測定する。対照試験として、試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様に操作し、５２０ｎｍの吸光度を測定する。また、空試験として、メタノールに試料溶液３ｍｌを加えたのち直ちに５２０ｎｍの吸光度を測定する。測定された各吸光度より、次式によりラジカル消去率を算出する。
【００２７】
消去率（％）＝〔１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ〕×１００
但し
Ａ：対照試験の吸光度
Ｂ：試料溶液を添加した場合の吸光度
Ｃ：空試験の吸光度
【００２８】
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカルの消去率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求める。
【００２９】
試験結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
0004523087.tif 000003
0004523087.tif 000004
【００３１】
試験例２
前記抽出例１〜５による各抽出物について下記の方法によりヒスタミン遊離抑制作用を調べた（細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価する方法である。）。
【００３２】
試験法：２５ｍｌのフラスコに入れた１５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地にＲＢＬ−２Ｈ３細胞１．０×１０６個を播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で４日間培養する。その後トリプシン処理および遠心処理（１０００ｒｐｍ，２分間）を行なって細胞を沈殿物として得る。これを上記培地と同じ培地に４．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ懸濁させ、そこにマウスモノクロナール抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ（ＤＮＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ）を５μｌ添加し、濃度を０．５μｇ／ｍｌとする。得られた細胞浮遊液を９６穴プレートに８０μｌ播種し、５％ＣＯ２下３７℃で２４時間培養する。培養終了後、各穴中の培地を除去し、シリガリアン緩衝液で洗浄する。次に上記緩衝液３０μｌおよび試料溶液１０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートする。次にジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）１０μｌを加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートする。その後、氷冷下で上清液１０μｌを新たな９６穴プレートに移し替え、これに１ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド溶液１０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートする。反応終了後、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３・ＮａＨＣＯ３溶液２５０μｌを加え、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍにおける吸光度Ａを測定する。試料溶液を添加しない細胞浮遊液についても同様の処理と吸光度測定を行う（このとき測定される吸光度をＢとする）。また、細胞浮遊液のかわりに上記緩衝液を用いて同様の処理と吸光度測定を行う（このとき測定される吸光度をＣとする）。そして、次式によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を算出する。
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝〔１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）〕×１００
【００３３】
試料溶液の濃度を段階的に変更して上記方法により抑制率を測定し、抑制率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求める。
試験結果は表３のとおりであった。
【００３４】
【表３】
0004523087.tif 000005
抽出物 ５０％抑制濃度（ｐｐｍ）
抽出例１      ２０１．５
抽出例２      １９５．０
抽出例３      ２０５．５
抽出例４      １９８．５
抽出例５      ２００．５
【００３５】
試験例３
前記抽出例１〜５による各抽出物について、下記の方法で血小板凝集抑制作用を試験した。
【００３６】
試験法：日本種白色家兎の血液に７７ｍＭ  ＥＤＴＡを１／１０量添加し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を除く。上清を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿した血小板を採取する。得られた血小板を血小板洗浄液に浮遊させ、２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈殿した血小板を採取し、血小板数が３０万個／μｌになるように血小板浮遊液に浮遊させる。上述のようにして調製した洗浄血小板浮遊液２２３μｌに塩化カルシウム溶液１μｌを加え、３７℃に１分間保持する。そこに試料溶液１μｌを加えてさらに２分間同温度に保持した後、１分間撹拌する。次いでコラーゲン溶液を２５μｌ添加し、３７℃に１０分間保持した後、可視光線透過率Ａを測定して、血小板凝集状態の指標とする。別に、試料溶液を添加しないほかは上記と同様に操作して可視光線透過率Ｂを測定し、次式により血小板凝集抑制率を求める。
【００３７】
血小板凝集抑制率（％）＝〔（Ｂ−Ａ）／Ｂ〕×１００
試料溶液の濃度を段階的に変更して上記血小板凝集抑制率を測定し、抑制率が５０％になる濃度を内挿法により求める。
試験結果は表４のとおりであった。
【００３８】
【表４】
0004523087.tif 000006
抽出物 ５０％抑制濃度（ｐｐｍ）
抽出例１        ８０．５
抽出例２        ８７．５
抽出例３        ９５．０
抽出例４      １００．５
抽出例５        ９８．５
【００３９】
実施例１
抽出例１のバーベリー樹皮水抽出物を配合した下記組成の乳液を乳液製造の常法に従い製造した（「部」は重量部を意味する。以下の各例において同じ。）。
【００４０】
ステアリン酸                                  ２部
スクワラン                                    ２部
オリーブ油                                    ２部
セタノール                                    ７部
ホホバ油                                      ２部
ポリオキシエチレン（４０ＥＯ）硬化ひまし油    １部
グリセリン                                  １０部
バーベリー樹皮抽出物                          ３部
精製水                                    残部（全量を１００部とする）
【００４１】
実施例２
抽出例２によるバーベリー樹皮８０％エタノール抽出物を配合した下記組成の化粧水を、化粧水製造の常法により製造した。
【００４２】
グリセリン                                          ３部
１，３−ブチレングリコール                          ３部
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０ＥＯ）  ３部
パラオキシ安息香酸メチル                            ０．５部
クエン酸                                            ０．１部
クエン酸ソーダ                                      １部
香料                                                ０．０５部
バーベリー樹皮抽出物                                ３部
精製水                                    残部（全量を１００部とする）
【００４３】
実施例３
抽出例５によるバーベリー樹皮１，３−ブチレングリコール抽出物を配合した下記組成のクリームを、クリーム製造の常法により製造した。
【００４４】
流動パラフィン                                      ５部
サラシミツロウ                                      ４部
セタノール                                          ３部
スクワラン                                        １０部
ラノリン                                            ２部
ステアリン酸                                        １部
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０ＥＯ）  ３部
モノステアリン酸グリセリル                          ３部
１，３−ブチレングリコール                          ５部
パラオキシ安息香酸メチル                            ０．５部
香料                                                ０．０５部
バーベリー樹皮抽出物                                ３部
精製水                                    残部（全量を１００部とする）
【００４５】
試験例４
実施例２の乳液について、下記の塗布試験を行なった。
試験法：肌荒れ状態の女性１０名（年齢２９〜４８歳）からなる被験者群２群の一方に実施例２の乳液を、他方にはバーベリー樹皮抽出物を含まないほかは実施例２と同じ組成の比較例乳液を、それぞれ１日２回、朝夕に、３カ月間、顔面頬部に塗布させる。
【００４６】
使用開始前と使用３カ月後の肌の状態について各被験者に感想を述べさせた結果は表５，６のとおりで、バーベリー樹皮抽出物を含有させることにより乳液の使用効果が顕著に向上することが確認された。
【００４７】
【表４】
0004523087.tif 000007
【００４８】
【表５】
0004523087.tif 000008