(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テリマグランジンＩ及び／又はコリラジンとβ−ラクタム系抗生物質とを含有せしめてなる抗菌剤。
【請求項２】
β−ラクタム系抗生物質がオキサシリン、ベンジルペニシリン、アンピシリン、セフメタゾール及びイミペネムである請求項１記載の抗菌剤。
【請求項３】
メチシリン耐性ブドウ球菌に対して抗菌作用を示す請求項１又は２記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌作用の増強方法に関し、詳しくは、テリマグランジンＩ（ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎ  Ｉ）骨格を有する化合物及び／又はコリラジン（ｃｏｒｉｌａｇｉｎ）骨格を有する化合物を抗生物質と併用することを特徴とする抗菌作用の増強方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗生物質は感染症などの治療に有効な化学療法剤として従来より広く使用されている。しかしながら、抗生物質は、医療現場等における濫用により、種類によってはその抗生物質に対する耐性菌の出現を招く場合があり、斯かる耐性菌に関連する問題が近年発生しはじめている。例えば、β−ラクタム系抗生物質をはじめとする諸種の抗生物質に対する多剤耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、以下、「ＭＲＳＡ」と略記する。）が院内感染により患者に致命的な結果をもたらしたとの報告例もある。ＭＲＳＡを含め、抗生物質に対する耐性を獲得した病原菌は、ヒト以外の動物、鳥類、爬虫類、魚類などにも感染し伝搬する場合があり、抗生物質耐性菌の問題は医療現場にとどまらず、大きな社会問題に発展しつつある。
【０００３】
このような、抗生物質に対する耐性菌に対しては、現在のところその抗生物質とは作用機作の異なる別の抗生物質で対処するのが一般的である。例えば、ＭＲＳＡに対しては、一般に、ＭＲＳＡにより耐性が獲得された抗生物質とは作用機作の異なるバンコマイシン等の抗生物質を適用することにより対処されている。このような対処方法は、その初期の段階では耐性菌の殺菌ないしは静菌に奏効するものの、連用すると、その別の抗生物質に対する新たな耐性菌の出現を招く場合がある。また、バンコマイシン等の抗生物質はヒトに対して副作用を示す場合もある。このように、抗生物質に対する耐性菌に関する問題は未だ根本的には解決されていないというのが現状である。この問題を解決する方策のひとつとしては、抗生物質が、その抗生物質に対する耐性菌に対しても効果を示すようにその抗菌作用を増強することが考えられるけれども、そのような抗菌作用の増強のための、十分に有効といえる方法は現在のところ確立されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、抗生物質の抗菌作用を増強する方法とその用途を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、抗生物質の抗菌作用の増強能を有する物質を求めて植物を中心とする諸種の材料を広く検索した。その結果、バラの花弁及びウワウルシの葉の抽出物は抗生物質と併用した場合、その抗菌作用を顕著に増強するという全く独自の知見を得た。引き続き本発明者らは、該増強作用を示したこれらの抽出物を分画して、該増強作用の本体の単離と同定を試みた。その結果、バラの花弁の抽出物より該増強作用の本体のひとつとしてテリマグランジンＩ骨格を有する化合物を、ウワウルシの葉の抽出物より該増強作用の本体としてコリラジン骨格を有する化合物を同定した。
【０００６】
斯くして単離・同定された化合物は、いずれも抗生物質と併用したときその抗菌作用を顕著に増強し、とりわけ、ＭＲＳＡに対するβ−ラクタム系抗生物質の抗菌作用を顕著に増強することが確認された。この発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
すなわち、この発明は、テリマグランジンＩ骨格を有する化合物及び／又はコリラジン骨格を有する化合物を抗生物質と併用することを特徴とする抗菌作用の増強方法ならびに、テリマグランジンＩ骨格を有する化合物及び／又はコリラジン骨格を有する化合物と抗生物質とを含有せしめてなる抗菌剤により上記の課題を解決するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明はテリマグランジンＩ骨格を有する化合物及び／又はコリラジン骨格を有する化合物を抗生物質と併用することを特徴とする抗菌作用の増強方法に関するものである。この発明で用いるテリマグランジンＩ骨格を有する化合物の具体例としては化１で表されるテリマグランジンＩが、また、この発明で用いるコリラジン骨格を有する化合物の具体例としては化２で表されるコリラジンがそれぞれ挙げられる。
【０００９】
【化１】
0004542644.tif 000002
【００１０】
【化２】
0004542644.tif 000003
【００１１】
この発明でいうテリマグランジンＩ骨格を有する化合物及びコリラジン骨格を有する化合物とは、上記に例示されるテリマグランジンＩ及びコリラジンそれぞれの誘導体であって、β−ラクタム系抗生物質などの抗生物質の抗菌作用の増強能を有する化合物全般を意味する。上記に例示される以外のこの発明で用い得る化合物としては、例えば、化１又は化２における水酸基の１個又は２個以上が、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシル基、アリール基などの置換基で置換された誘導体を挙げることができる。個々のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などが、また、個々のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基などが挙げられる。個々のアリール基としては、例えば、フェニル基、ジフェニル基及びターフェニル基などが挙げられる。
【００１２】
以上のような、この発明で用いるテリマグランジンＩ骨格を有する化合物及びコリラジン骨格を有する化合物（以下、これらの化合物から選ばれる１種又は２種以上を単に「当該化合物」ということがある。）は、調製方法が種々知られている場合があるので、慣用の方法により調製されるこれらの化合物はいずれも有利にこの発明で用いることができる。したがってこの発明の実施において、当該化合物はその給源や調製方法により限定されず、例えば、植物体など天然の給源から得られたものであっても、化学合成などにより人為的に得られたものであってもよい。また、この発明の実施において、当該化合物は精製された実質的に単一の形態で用いても、また、後述する当該化合物による抗菌作用の増強効果を実質的に消失させない範囲で他の成分との混合物としての形態で用いてもよい。医療分野、食品分野、化粧品分野など、ヒトに適用する場合には、天然の給源から比較的高純度に精製された当該化合物を用いるのが望ましい。テリマグランジンＩ骨格を有する化合物はバラの花弁をはじめとするバラの植物体に、また、コリラジン骨格を有する化合物はウワウルシの葉をはじめとするウワウルシの植物体に比較的多く含有されるので、これらの給源から精製された当該化合物は医療、食品、化粧品などの諸分野でのこの発明の実施に有利である。
【００１３】
天然の給源から当該化合物を調製するには、配糖体を含む天然のポリフェノール類の分離・精製に用いられる通常の手段が適宜採用される。斯かる通常の手段としては、例えば、抽出、濃縮、濾過、分液、分別沈澱、結晶化、分蜜、真空乾燥、凍結乾燥、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどが挙げられる。以上のような慣用の方法から選ばれる適宜の方法で当該化合物の給源の抽出物を分画して生成する画分を、後述する抗菌作用の増強効果の判定方法に供して所期の性質を示した画分を選択・合一し、合一した画分を、必要に応じて、さらに適宜の方法により分画し、生成する画分を前記と同様に選択・合一する操作を繰り返せば、所望のレベルにまで精製された当該化合物を得ることができる。斯くして得られる当該化合物は、さらに必要に応じて、適宜の他の成分と混合するなどして組成物の形態に調製して使用することもでき、本発明による抗菌作用の増強方法の実施分野や実施の対象となる微生物の種類に応じて、適宜の精製度・形態の当該化合物の調製物を用いればよい。
【００１４】
斯くして調製される当該化合物は、単独では、医療分野で通常用いられる慣用の抗生物質の抗菌作用と比較すると通常明らかに弱い抗菌作用しか示さない。当該化合物の種類や精製度、対象とする微生物の種類などにもよるが、当該化合物の抗菌作用を最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」という。）で表すと、通常、１００μｇ／ｍｌ程度ないしはそれ以上である。当該化合物は単独ではこのように弱い抗菌作用しか示さないけれども、抗生物質と併用したとき、その抗生物質の抗菌作用を顕著に増強する能力を有している。
【００１５】
この発明による抗菌作用の増強方法で用いる抗生物質は、当該化合物の併用によりその抗菌作用が増強されるものであればいずれでもよい。一般に抗生物質とは、原核細胞及び真核細胞を含む微生物のいずれか１種以上に対する殺菌作用又は静菌作用を示す物質と定義される。この発明においては、このように定義される抗生物質のうち、テリマグランジンＩやコリラジンなどの当該化合物の併用によりその抗菌作用が増強されるものであれば、それらから適宜選ばれる１種又は２種以上はいずれも用いることができ、化学構造や抗菌作用の作用機作、さらには、対象となる微生物の種類により限定されるものではない。抗菌作用の増強の効果は、対象とする抗生物質に応じて選ばれる慣用の抗菌作用の測定系に当該化合物を添加して抗菌作用を調べることにより確認することができる。すなわち、斯かる測定系で抗生物質を当該化合物と併用して求められた抗菌作用の測定値が、同じ測定系でその抗生物質及び当該化合物をそれぞれ単独で用いた場合の抗菌作用の加算値を上回った場合、換言すれば、抗生物質と当該化合物の併用により相乗的に高まった抗菌作用が確認された場合、当該化合物の併用によりその抗生物質の抗菌作用が増強されたと判定される。以上述べた、この発明で用い得る抗生物質（以下、その１種又は２種以上を単に「当該抗生物質」ということがある。）の具体例としては、例えば、オキサシリン、ベンジルペニシリン、アンピシリン、セフメタゾール及びイミペネムをはじめとするβ−ラクタム系抗生物質や、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンをはじめとするテトラサイクリン系抗生物質などが挙げられる。この発明による抗菌作用の増強方法は、β−ラクタム系抗生物質との併用によるときとりわけ著効を発揮する。
【００１６】
この発明による抗菌作用の増強方法は、当該化合物及び／又は当該抗生物質が単独で抗菌作用を発揮する微生物に対して、抗菌作用の増強効果を示す場合もあるが、当該抗生物質が単独では顕著な抗菌作用を示さない微生物に適用するととりわけ顕著な効果を発揮する。したがって、本発明による方法は、従来の抗生物質では対処し得なかった微生物の殺菌ないしは静菌に極めて有効である。当該抗生物質が単独では顕著な抗菌作用を示さない微生物としては、例えば、当該抗生物質に対する耐性を獲得した微生物の変異株が挙げられ、より詳細には、当該抗生物質に対する耐性を獲得した、スタフィロコッカス属又はストレプトコッカス属のグラム陽性菌の変異株や、バクテロイデス属、フコバクテリウム属、シュードモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラティア属、シトロバクター属又はアシネトバクター属のグラム陰性細菌の変異株が挙げられる。これらのうち、当該抗生物質のひとつであるβ−ラクタム系抗生物質をはじめとする諸種の抗生物質に対する多剤耐性を獲得したＭＲＳＡ（スタフィロコッカス属）に対し、この発明による抗菌作用の増強方法はとりわけ著効を発揮する。
【００１７】
この発明でいう、当該化合物を当該抗生物質と併用するとは、当該抗生物質を、上記で述べた微生物による汚染・感染が懸念されるか又は確認された対象物に適用する際に、その適用前、適用後及び／又は適用と同時にその対象物に当該化合物を適用することを意味する。いずれの時期の適用によっても所期の効果が得られるけれども、より望ましくは、当該抗生物質の適用前又は適用と同時に適用される。ここでいう適用とは、当該抗生物質及び／又は当該化合物を、必要に応じて適宜の他の成分、例えば、溶解剤、希釈剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤などから選ばれる１種又は２種以上との組成物としての形態で、対象物に投与、接種、塗布、添加、噴霧、含浸などすることを意味する。この発明による抗菌作用の増強方法を実施し得る分野としては、例えば、医療分野、畜産分野、水産分野、食品分野、化粧品分野、衛生用品分野、日用品分野、建材分野、情報伝達機器分野などが挙げられ、この発明による方法は、これらの分野における上記で述べた微生物による汚染・感染の予防、処置及び／又は治療に奏効する。当該抗生物質及び当該化合物を併用する際の用量・割合は、上記で述べた、抗菌作用の増強効果の確認方法により求められる、対象微生物に対して有効な両者の濃度と、適用の対象物の種類を勘案して選択される。通常は、当該化合物及び当該抗生物質がそれぞれ単独では抗菌作用を発揮し得ない用量であっても、両者を併用することにより所期の抗菌作用が得られる。使用する当該化合物ならびに当該抗生物質の種類や実施の分野にもよるけれども、例えば、上記のような微生物による感染症に罹患した患者に適用する医療分野においては、患者の症状に応じて、成人患者１人に対して、当該抗生物質を、固形物重量換算で、１日当たり通常１ｍｇ以上、望ましくは１０ｍｇ以上、より望ましくは１００ｍｇ以上の用量を１回又は２回以上に分けて、連日または隔日の頻度で、患部に応じて選択される経口、経皮、皮内、皮下、筋肉内、静脈内などのいずれかの経路で適用し、その際に、当該化合物を、当該抗生物質の１回当たりの適用量に対して固形物重量比で等量以上、望ましくは２倍量以上、より望ましくは５倍量以上に相当する量を、当該抗生物質の適用経路に準じて適用して併用すればよい。また、ヒトを含む生体以外の、例えば、医療関連機器等の諸物品に適用する場合には、該物品の使用前、使用中及び／又は使用後に、通常０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、望ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ以上、より望ましくは１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の溶液に調製した当該抗生物質を該物品に噴霧、塗布、含浸するなどして適用し、その際に、当該抗生物質の濃度に対して通常等濃度以上、望ましくは２倍以上、より望ましくは５倍以上の濃度の溶液に調製した当該化合物を該物品に同様に適用して併用すればよい。
【００１８】
この発明は、上記で述べた当該化合物と当該抗生物質とを含有せしめてなる抗菌剤を提供するものでもある。この発明の抗菌剤は、当該化合物及び当該抗生物質がそれぞれ単独では達成し得ない、増強された抗菌作用を発揮するので、上記で述べた、この発明による方法を実施し得る諸分野において有利に用いることができる。この発明の抗菌剤は、それぞれの使用分野において増強された抗菌作用が発揮されるものであればよく、特定の組成や形態に限定されるものではない。使用分野にもよるが、この発明の抗菌剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形状に調製され、当該抗生物質を０．００１乃至２０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０１乃至１０％（ｗ／ｗ）含有するとともに、当該化合物を０．００１乃至８０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０１乃至５０％（ｗ／ｗ）含有する。
【００１９】
この発明の抗菌剤は、実質的に当該化合物及び当該抗生物質のみからなる組成のものはもとより、これら以外の、個々の使用分野で許容される、例えば、担体、賦形剤、溶解剤、希釈剤、緩衝剤、安定剤、静菌剤、着香剤、着色剤などとの組成物としての形態をも包含する。担体ないしは賦形剤としては、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、重炭酸ナトリウム、グリセリンなどが挙げられる。安定剤としては、より具体的には、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質が挙げられる。静菌剤としては、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類や、酢酸、乳酸、安息香酸などの有機酸類が挙げられる。この発明の抗菌剤は、以上のような成分を配合してなる組成物を、使用分野に応じて、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤、軟膏、ローション、スプレー、天花粉などの形態に適宜成形して得ることができる。
【００２０】
以下、実験に基づいて本発明をより詳しく説明する。
【００２１】
【実験１】
〈テリマグランジンＩ骨格を有する化合物の併用による抗菌作用の増強〉
【００２２】
【実験１−１】
〈テリマグランジンＩの精製〉
バラの花弁乾燥物約２００ｇに約４ｌの７０％アセトン／水混液を加えて磨砕して抽出し、濾過して不溶物を除き、溶液部をエバポレーターで濃縮した。この濃縮物に約４００ｍｌのジエチルエーテルを加え分液ロートで抽出し水層を回収した。この水層に約１．５ｌの酢酸エチルを加えてさらに抽出し、酢酸エチル層を回収し、この層を減圧濃縮したところ、酢酸エチル抽出物が固形分として１０．２１ｇ得られた。この酢酸エチル抽出物を適量の蒸留水に溶解した後、『ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０ゲル』（三菱化学株式会社製造）を充填したガラスカラム（内径４．８ｃｍ、長さ５０ｃｍ）に負荷してゲルに吸着させた後、下記表１に示す、２０％から１００％まで段階的にメタノール濃度を高めたメタノール／水混液を順次カラムに通液し、カラムからのそれぞれの溶出物を分画採取した。採取したそれぞれの画分を常法により減圧濃縮した後、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリン（シグマ社販売）の抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を以下のように調べた。先ず、試験株として、岡山大学付属病院で単離されたＭＲＳＡの４株（ＯＭ４８１株、ＯＭ５０５株、ＯＭ５８４株、ＯＭ６２３株）それぞれを３２℃で好気的にミュラー・ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地、以下「ＭＨ培地」と略記する。）（和光純薬販売）で増殖させた。試験培地として、最終固形分濃度５０μｇ／ｍｌの上記のいずれかの画分と、１，０２４μｇ／ｍｌ以下の順次段階希釈したいずれかの濃度のオキサシリンとを含むＭＨ培地を調製した。また、別の試験培地として、上記のいずれの画分も含まず、同様に段階希釈したオキサシリンのみを含むＭＨ培地も調製した。これらの試験培地に、先に準備した試験株のいずれかを細胞密度１０6乃至１０7個／ｍｌとなるように加え、３２℃で好気的に２４時間保持した。それぞれの試験培地を生理食塩水で適宜希釈した後、ニュートリエント寒天培地（和光純薬販売）上に塗布し、３２℃で２４時間保持した。寒天培地上に形成したコロニーを肉眼で計測し、オキサシリンの最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
0004542644.tif 000004
【００２４】
表１に示すとおり、４０％メタノール／水混液による溶出画分を併用したときオキサシリンは最も低濃度でＭＲＳＡの発育を阻止した。このことから、この画分がオキサシリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用を増強する物質を主として含有すると考えられた。
【００２５】
上記の４０％メタノール／水混液による溶出画分の一部（固形分として９９７ｍｇ）を、『Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ  ４０ゲル』（東ソー株式会社販売）を充填したガラスカラム（内径２．２ｃｍ、長さ５２ｃｍ）を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供して分画した。各画分を、オキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの併用の影響について上記と同様にして試験し、オキサシリンのＭＩＣを顕著に低下させた画分を合一し、凍結乾燥して、精製された成分を固形分重量として３６４ｍｇ得た。得られた精製成分を、上記と同様にして試験した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
0004542644.tif 000005
【００２７】
表２に示すとおり、バラの花弁抽出物から上記の方法で精製された成分の併用によりオキサシリンによるＭＲＳＡに対するＭＩＣは著しく低下した。より詳細には、この精製成分は最終濃度５０μｇ／ｍｌでオキサシリンと併用すると、ＭＩＣを１／５００程度あるいはそれ以下に低下させた。このことから、この精製成分が抗菌作用の増強能を有していると判断された。
【００２８】
常法にしたがって、重水素化アセトン中で、周波数５００ＭＨｚで、上記で得た精製成分の1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（以下、「1Ｈ−ＮＭＲ」と略記する。）を調べたところ、図１に示すスペクトルが得られた。この結果観察された化学シフトならびに水素原子の帰属を表３に示す。
【００２９】
【表３】
0004542644.tif 000006
【００３０】
上記の結果に基づいて、本実験により得た精製成分をテリマグランジンＩ（ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎ  Ｉ）、別名、ｃｙｃｌｉｃ ４，６−（４，４’，５，５’，６，６’−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙ［１，１'−ｂｉｐｈｅｎｙｌ］−２，２'ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）２，３−ｂｉｓ（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ），（Ｓ）−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅと同定した。本化合物の構造は化１に示している。通常の高速液体クロマトグラフィーにより調べたところ、本実験で精製したテリマグランジンＩの純度は約９０％であった。
【００３１】
【実験１−２】
〈テリマグランジンＩの併用によるオキサシリンの抗菌作用の増強〉
オキサシリンの抗菌作用を増強するテリマグランジンＩによる効果を確認するため以下の実験を行った。テリマグランジンＩは、実験１−１の方法で精製して調製した。試験株として、ＭＲＳＡの単離株ＯＭ５８４株を３２℃で好気的にＭＨ培地で増殖させた。試験培地として、ＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンを含むＭＨ培地、５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩを含むＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンと５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩとを含むＭＨ培地を調製した。これらの試験培地に、先に準備した試験株を細胞密度約１×１０7個／ｍｌとなるように加え、３２℃で好気的に２０時間保持した。それぞれの試験培地を生理食塩水で適宜希釈し、ニュートリエント寒天培地（和光純薬販売）に塗布し、３２℃で２４時間保持した。寒天培地上に形成されたコロニーを肉眼で計測し、計測値より、試験培地中で２０時間保持した時点における試験株の生菌数を求めた。結果を図２に示す。なお、本図において、白抜き丸（○）はＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、黒塗り丸（●）はオキサシリン（２μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、白抜き三角（△）はテリマグランジンI（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、黒塗り三角（▲）はオキサシリン（２μｇ／ｍｌ）とテリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）との両者を含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化をそれぞれ示している。また、本図における縦軸は、コロニーの計測数に基づく生菌数（コロニー・フォーミング・ユニット、図３においては「ｃｆｕ」と表示した。）の対数値（底１０）を示している。
【００３２】
図２に示すとおり、ＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンのみを含むＭＨ培地、及び、５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩのみを含むＭＨ培地では、いずれも培養２０時間後、試験株は１００倍以上の生菌数にまで増殖したのに対して、２μｇ／ｍｌのオキサシリンと５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩとを含むＭＨ培地中では、試験株は増殖せず死滅してゆき、２０時間後で約１／１００の生菌数となった。これらの結果は、オキサシリンとテリマグランジンＩは併用により相乗的に増強された抗菌作用を発揮し、テリマグランジンＩには抗生物質の抗菌作用を顕著に増強する作用があることを意味している。したがって、それぞれ単独ではＭＲＳＡの増殖を阻止できない程度の濃度のオキサシリンとテリマグランジンＩであっても、これらを併用すると、ＭＲＳＡの増殖を顕著に阻止し、さらに、死滅させることができる。
【００３３】
【実験１−３】
〈抗菌作用の増強に有効なテリマグランジンＩの濃度〉
抗生物質オキサシリンの抗菌作用の増強に奏効するテリマグランジンＩの有効な濃度を検討するために、種々の濃度のテリマグランジンＩ存在下でのオキサシリンの抗菌作用を実験１−１の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００３４】
【表４】
0004542644.tif 000007
【００３５】
表４に示すとおり、いずれの試験株においても、併用するテリマグランジンＩの濃度が２５μｇ／ｍｌ以上の場合は、オキサシリン単独の系と比較して、ＭＩＣが顕著に低下し、ＭＲＳＡに対する抗菌作用が増強されることが判明した。これらの結果は、抗生物質オキサシリンと併用する場合、ＭＲＳＡの抗菌作用を発揮するのに有効なテリマグランジンＩの濃度は、最終濃度として約２５μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは４０μｇ／ｍｌ以上であり、テリマグランジンＩの濃度が５０μｇ／ｍｌ以上では特に好ましいことが判明した。これらの結果は、このような濃度となるようにテリマグランジンＩを併用すると、ＭＲＳＡに対する抗生物質の使用濃度あるいは使用量を低減させることができることを意味している。
【００３６】
【実験１−４】
〈テリマグランジンＩの併用による種々の抗生物質の抗菌作用の増強〉
本発明のテリマグランジンＩによる各種の抗生物質の抗菌作用の増強効果を実験１−１の方法に準じて調べた。抗生物質として、β−ラクタム系抗生物質である、オキサシリン、ベンジルペニシリン（米国、シグマ社販売）、アンピシリン（和光純薬販売）、セフメタゾール（米国、シグマ社販売）、イミペネム（萬有製薬販売）を用いた。試験株として、ＭＲＳＡの単離株であるＯＭ４８１株、ＯＭ５０５株、ＯＭ５８４株、ＯＭ６２３株と、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌１株（ＡＴＣＣ  ２１０２７）を用いた。結果を表５に示す。なお、本表中の「単独」とは抗生物質を単独で適用した場合を、「併用」とは最終濃度４０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩと抗生物質とを併用して適用した場合をそれぞれ意味する。
【００３７】
【表５】
0004542644.tif 000008
【００３８】
表５に示すとおり、いずれの抗生物質においても、抗生物質を単独で適用した場合と比較すると、抗生物質とテリマグランジンＩとの併用によって抗生物質のＭＩＣは顕著に低下した。このことから、テリマグランジンＩには、広くβ−ラクタム系の抗生物質の抗菌作用を増強する能力があることが判明した。なお、表５における、オキサシリン及びベンジルペニシリンを用いた実験結果に示されるとおり、テリマグランジンＩは、ＭＲＳＡに対する場合ほど顕著ではないものの、ＭＲＳＡ以外の微生物に対する抗生物質の抗菌作用をも増強することも判明した。また、データは割愛するけれども、同様の実験により、テリマグランジンＩは、テトラサイクリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用をも顕著に増強することが確認された。
【００３９】
【実験２】
〈コリラジン骨格を有する化合物の併用による抗菌作用の増強〉
４００ｍｌのウワウルシ葉抽出液『日本薬局方  ウワウルシ流エキス』（司生堂製薬株式会社販売）をエバポレーターで濃縮・乾固して、約８．１ｇの固形物を得た。この固形物を適量の蒸留水に溶解させた後、『Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ４０Ｃゲル』（東ソー株式会社販売）を充填したガラスカラム（内径２．２ｃｍ、長さ５２ｃｍ）に負荷した後、水、２０％メタノール／水混液、６０％メタノール／水混液、メタノール、７０％アセトン／水混液を順次カラムに通液し、カラムからのそれぞれの溶出物を分画採取した。採取したそれぞれの画分を常法により減圧濃縮した後、その一部を用いて、実験１−１に準じて、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を調べた。その結果、６０％メタノール／水混液による溶出画分を併用したときオキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣは顕著に低下した。
【００４０】
上記の６０％メタノール／水混液による溶出画分を、常法にしたがって、『ＭＣＩ  ＣＨＰ２０Ｐゲル』（三菱化学株式会社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに続いて調製用高速液体クロマトグラフィーに供して分画し、実験１−１に準じて、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を調べた。これらの画分のうち、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣをとりわけ顕著に低下させた画分を採取し、凍結乾燥して、精製された成分を固形分重量として３６４ｍｇ得た。上記の方法に準じて、この精製成分を最終濃度８μｇ／ｍｌ及び１６μｇ／ｍｌで併用したときの、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣを調べた。結果を表６に示す。
【００４１】
【表６】
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【００４２】
表６に示すとおり、ウワウルシの葉抽出物から上記の方法で精製された成分の併用によりオキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣは著しく低下した。より詳細には、この精製成分は最終濃度１６μｇ／ｍｌでオキサシリンと併用すると、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣを１／５０程度あるいはそれ以下に低下させることが判明した。なお、上記の方法に準じて、本実験による精製成分の単独でのＭＲＳＡの単離株４株に対するＭＩＣを調べたところ、いずれの株に対しても１２８μｇ／ｍｌ程度であった。以上の結果は、オキサシリンの抗菌作用は上記の精製成分と併用したとき相乗的に増強され、本実験による精製成分に抗生物質の抗菌作用の顕著な増強作用があることを意味している。
【００４３】
実験１−１に準じて、重水素化アセトン中で、周波数５００ＭＨｚで、上記で得た精製成分の1Ｈ−ＮＭＲを調べたところ、図３に示すスペクトルが得られた。この結果観察された化学シフトならびに水素原子の帰属を表７に示す。
【００４４】
【表７】
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【００４５】
上記の結果に基づいて、本実験により得た精製成分をコリラジン（ｃｏｒｉｌａｇｉｎ）、別名、ｃｙｃｌｉｃ ３，６−（４，４’，５，５’，６，６’−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙ［１，１'−ｂｉｐｈｅｎｙｌ］−２，２'ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）１−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ），β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅと同定した。本化合物の構造は化２に示している。通常の高速液体クロマトグラフィーにより調べたところ、本実験で精製したコリラジンの純度は約９８％であった。
【００４６】
なお、データは割愛するけれども、上記と同様の実験により、本実験で精製・同定されたコリラジンは、テトラサイクリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用をも顕著に増強することが確認された。
【００４７】
【実験３】
〈急性毒性試験〉
常法にしたがって、８週齢のマウスに実験１及び実験２の方法で精製したテリマグランジンＩ及びコリラジンのいずれかを、経皮、経口又は腹腔内の経路で投与し急性毒性を調べた。その結果、いずれの投与経路においても、調べた最大の投与量である１００ｍｇ／ｋｇマウス体重においても死亡例は見られなかった。
この結果は、この発明で用いる化合物のヒトを含む生体への適用が安全であることを裏付けている。
【００４８】
以下、実施例を示してこの発明を説明するが、この発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００４９】
【実施例１】
〈錠剤〉
下記の処方にしたがって、（１）、（４）及び（５）の成分と（２）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）の成分及び（２）の成分の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。
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【００５０】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による口腔内における感染症を治療・予防するための舌下錠として、また、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による消化器系における感染症を治療・予防するための内服用錠剤などとして有利に利用できる。
【００５１】
【実施例２】
〈錠剤〉
下記の処方にしたがって、（１）、（４）及び（５）の成分と（２）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）の成分及び（２）の成分の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。
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【００５２】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による口腔内における感染症を治療・予防するための舌下錠として、また、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による消化器系における感染症を治療・予防するための内服用錠剤などとして有利に利用できる。
【００５３】
【実施例３】
〈軟膏〉
下記の処方にしたがって、（１）、（２）、（５）及び（６）の成分と（３）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（４）の成分及び（３）の成分の残量を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す軟膏を得た。
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【００５４】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物に対する抗菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給作用も発揮することから、治癒期間が短縮され、創面をきれいに治癒することのできる軟膏として有用である。また、本品は、切り傷、火傷、口内炎など外傷治療の促進に利用することができる。更に、本品をソフトカプセルなどに充填、成形すれば、ＭＲＳＡをはじめとする微生物による直腸内、膣内などにおける感染症の治療・予防のための坐薬としても有利に利用できる。
【００５５】
【実施例４】
〈軟膏〉
下記の処方にしたがって、（１）、（２）、（５）及び（６）の成分と（３）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（４）の成分及び（３）の成分の残量を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す軟膏を得た。
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【００５６】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物に対する抗菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給作用も発揮することから、治癒期間が短縮され、創面をきれいに治癒することのできる軟膏として有用である。また、本品は、切り傷、火傷、口内炎など外傷治療の促進に利用することができる。更に、本品をソフトカプセルなどに充填、成形すれば、ＭＲＳＡをはじめとする微生物による直腸内、膣内などにおける感染症の治療・予防のための坐薬としても有利に利用できる。
【００５７】
【実施例５】
〈抗菌スプレー〉
イソプロパノール  ６８重量部に、精製水  ２６重量部、実験１の方法で得たテリマグランジンＩ  ０．９重量部、実験２の方法で得たコリラジン  ０．９重量部、オキサシリン  ０．２重量部、安息香酸４重量部をそれぞれ加え、常法により分散させて原液を得た。その後、常法にしたがって、１００ｍｌ容スプレー容器に、この原液４０ｍｌと噴射剤としての液化炭酸ガス６０ｍｌをそれぞれ充填して抗菌スプレーを得た。
【００５８】
幅広い抗菌スペクトルを有し、かつ、オキサシリンの抗菌作用が増強された本品は、ＭＲＳＡを含む微生物による汚染・感染を予防、治療又は処置するための抗菌スプレーとして、医療分野、畜産分野、水産分野、食品分野、化粧品分野をはじめとする諸種の分野で有利に利用できる。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、抗生物質を適用する際にテリマグランジンＩ及び／又はコリラジンを併用するとその抗生物質の抗菌作用が顕著に増強されるという全く独自の知見に基づき完成されたものである。この発明による抗菌作用の増強方法は、微生物の殺菌及び／又は静菌に著効を発揮し、とりわけ、現在までのところ根本的な対処方法が確立されていなかったＭＲＳＡの殺菌及び／又は静菌に著効を発揮する。この発明による方法ならびに抗菌剤は、ＭＲＳＡを含む微生物による汚染・感染が懸念される諸種の分野において、その予防、治療及び／又は処置に有効である。
【００６０】
斯くも顕著な効果を奏するこの発明は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】  バラの花弁より抽出・精製したテリマグランジンＩの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を示す図である。
【図２】  ＭＲＳＡに対するオキサシリンとテリマグランジンＩによる抗菌作用の発現における相乗効果を示す図である。
【図３】  ウワウルシの葉より抽出・精製したコリラジンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を示す図である。
【符号の説明】
○    ＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
●    オキサシリン（２μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
△    テリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
▲    オキサシリン（２μｇ／ｍｌ）とテリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）との両者を含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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