(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：７または配列番号：１２の核酸配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：８または配列番号：１３の配列を含むアミノ酸配列をコードする、あるいはそのようなアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子；
（ｃ）遺伝子コード結果として（ａ）に定義されたＤＮＡと縮重されるＤＮＡ；および
（ｄ）（ａ）の断片
から成る群より選択される単離された核酸分子であって、ここにおいてヒト包皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｒｅｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）及びヒト  ウムべリカル静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｅｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）においてＩＫＢα及びｐ３８ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのリン酸化を活性化するポリペプチドをコードする、前記核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号：７または配列番号：１２の核酸配列を含むＤＮＡ；および
（ｂ）配列番号：８または配列番号：１３の配列を含むアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子
から成る群より選択される単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１又は２の核酸分子の発現を指示する組換え体ベクター。
【請求項４】
請求項１又は２の核酸分子によりコードされている単離されたポリペプチド。
【請求項５】
非グリコシル化形の請求項４の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項４のポリペプチドへ結合する抗体。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号：８または配列番号：１３のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：８または配列番号：１３に示されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたＩＬ−１エプシロンポリペプチドであって、ここにおいてヒト包皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｒｅｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）及びヒト  ウムべリカル静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｅｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）においてＩＫＢα及びｐ３８ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのリン酸化を活性化するポリペプチドである、上記単離されたＩＬ−１エプシロンポリペプチド。
【請求項１０】
請求項３のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞。
【請求項１１】
発現を促進させる条件下で請求項１０の宿主細胞を培養し、そして培養培地からポリペプチドを回収することを含む、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞から成る群より選択される請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
ここに請求されている本出願は１９９８年８月２１日、１９９８年８月３１日および１９９８年９月１１日に出願された各々米国仮出願Ｓ．Ｎ．６０／０９７，４１３、Ｓ．Ｎ．６０／０９８，５９５およびＳ．Ｎ．６０／０９９，９７４の利益を請求する。これらの出願の全開示はあてにでき、本明細書において援用される。
【０００２】
背景技術
発明の分野
本発明は、精製され、そして単離された新規ヒトＩＬ−１エプシロンポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドの組換え体型の産生のための方法、これらのポリペプチドに対して作成された抗体、これらのポリペプチドから誘導された断片化ペプチド、細胞性および免疫反応におけるおよび分子量マーカーとしてのそのようなポリペプチドおよび断片化ペプチドの使用、ペプチド断片化の対照としてのそのようなポリペプチドおよび断片化ペプチドの使用、並びにこれらの試薬を含んでいるキットに関している。
【０００３】
関連分野の記載
インターロイキン−１（ＩＬ−１）はサイトカインの大きな群のメンバーであり、その主たる機能は免疫および炎症性応答を仲介することである。五つのＩＬ−１ファミリーメンバーが知られており、それらにはＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−１デルタ（ＩＬ−１δ、ＰＣＴ  ＵＳ／９９／００５１４に開示されているような）およびＩＬ−１８（以前はＩＧＩＦおよびある時はＩＬ−１ガンマとして知られていた）が含まれる。マクロファージにより分泌されるＩＬ−１は、実際は大部分のＩＬ−βおよび若干のＩＬ−１αの混合物である（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。最初はシグナル配列を欠いた３３ｋＤ前駆体として産生されるＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、さらにタンパク質分解的切断により処理され、各々約１７ｋＤの分泌活性型を産生する。加えて、ＩＬ−１αの３３ｋＤ前駆体もまた活性である。ＩＬ−１の両型は染色体２上に位置している二つの異なった遺伝子の産物である。二つの型はお互いに３０パーセント未満の相同性であるが、両方とも同一のレセプターに結合し、同様の活性を持っている。
【０００４】
ＩＬ−１の生物学的不活性型であるＩＬ−１ｒａはＩＬ−１と構造的に相同であり、同一のレセプターに結合する。加えて、ＩＬ−１ｒａはシグナル配列とともに産生されるため細胞外領域への効果的な分泌が可能であり、そこでＩＬ−１と競合的に競争する（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【０００５】
ＩＬ−１ファミリーリガンドは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである二つのＩＬ−１レセプターへ結合する。ＩＬ−１レセプターには８０ｋＤａタイプＩレセプター（ＩＬ−１ＲＩ）および６８ｋＤａタイプＩＩレセプター（ＩＬ−１ＲＩＩ）が含まれる。このリガンドはまた、ＩＬ−１ＲＩＩの可溶性タンパク質分解性断片（ｓＩＬ−１ＲＩ）へも結合する（Ｃｏｌｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１（５１２０）：４７２−７５，１９９３）。
【０００６】
ＩＬ−１の主たる供給源は活性化マクロファージまたは単核食細胞である。ＩＬ−１を産生する他の細胞としては、上皮および内皮細胞が挙げられる（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。マクロファージからのＩＬ−１の分泌は、マクロファージがグラム陰性菌に出会った後および消化した後に起こる。そのような細菌はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）分子（内毒素としても知られている）を細菌細胞壁に含んでいる。ＬＰＳ分子はマクロファージが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＬ−１を産生するのを刺激する活性成分である。この場合、ＩＬ−１はＬＰＳおよびＴＮＦ産生に応答して産生される。低濃度において、ＬＰＳはマクロファージを刺激し、そしてＢ細胞および微生物感染を除去するのに必要とされるその他の宿主応答を活性化する；しかしながら高濃度では、ＬＰＳは重度の組織損傷、ショックおよび死さえも引き起こすことができる。
【０００７】
ＩＬ−１の生物学的機能としては血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、局所性組織破壊および発熱が含まれる（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。低レベルにおいて、ＩＬ−１はマクロファージおよび血管内皮細胞を刺激してＩＬ−６を産生し、血管内皮細胞表面上の分子を上方調節して白血球付着を増加させ、そして単核食細胞および他の細胞を刺激することにより炎症性白血球を活性化するある種のケモカインが産生されて間接的に炎症性白血球を活性化する。これらのＩＬ−１機能は低レベルの微生物感染の間では決定的である。しかしながら、微生物感染が拡大すると、ＩＬ−１は熱を誘発し、単核食細胞を刺激してＩＬ−１およびＩＬ−６を産生し、肝細胞からの血清タンパク質の産生を増加させ、そして凝固系を活性化することにより全身的に作用する。ＩＬ−１は腫瘍の出血性壊死または骨髄幹細胞分裂の抑制を起こさないことも知られている。それにも関わらず、ＩＬ−１は高濃度ではヒトに対して致死的である。
【０００８】
ＩＬ−１の重要な機能があるとすれば、ＩＬ−１リガンドファミリーの追加のメンバーがが技術分野において必要とされる。加えて、タンパク質研究および免疫系において引き続いて示されている興味からみて、ヒトＩＬ−１エプシロンおよびそのレセプターのような新規タンパク質の発見、同定および役割が現代分子生物学および生化学の興味の中心である。知識は増大しているにもかかわらず、細胞性および免疫応答に関与するタンパク質の正体および機能を明らかにすることが未だに必要とされている。
【０００９】
本発明のさらに別の側面において、未知の試料タンパク質の一時構造、または配列の同定は最も困難な実験過程である。未知のタンパク質試料を同定するために、当業者は既知の種々の技術を使用して既知のタンパク質と未知のタンパク質試料との比較に頼ることができる。例えば、タンパク質は電気泳動、沈降、クロマトグラフィーおよび質量分析法のような技術を用いて日常的に分析される。
【００１０】
既知の分子量のポリペプチドと未知のタンパク質試料の比較は未知タンパク質試料の見掛けの分子量の決定を可能にする（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））。タンパク質分子量標準品は未知のタンパク質試料の分子量の算定を助けるために市販品として入手可能である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１，１９９５；Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｔｌｅｙ，米国特許第５，４４９，７５８号）。しかしながら、分子量標準品は見掛けの分子量の正確な算定を可能にするほど未知の試料タンパク質のサイズに十分密接して対応してはいないかもしれない。分子量の算定における困難は、化学的または酵素的手段により断片化されたタンパク質の場合に一層ひどくなる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０６−１０８（Ｗｏｒｔｈ  Ｂｏｏｋｓ，第２版，１９８１））。
【００１１】
その特異的アミノ酸構成に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質内の切断部位に関する独特の位置づけを生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特異的断片化は独特の”ペプチドフィンガープリント”を生じる（Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：１１０２−１１０６，１９７７；Ｍ．Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５０：３０９−３１６，１９８０）。その結果、特異的部位での切断は与えられたタンパク質の正確な分子量のペプチドへの再現可能な断片化を生じる。さらに、これらのペプチドは、ペプチドの等電的ｐＨを決定する独特の荷電特性を持っている。これらの独特の特性は、種々の電気泳動的および他の技術を使用して利用できる（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））。
【００１２】
未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られた場合、未知のタンパク質の同定を助けるためにそれを既知のタンパク質のデータベースと比較できる（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５０１１−５０１５，１９９３；Ｂ．Ｔｈｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，１７：５８８−５９９，１９９６）。ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）のような種々のコンピューターソフトウェァープログラムがそのような比較を当業者が容易に行うためにインターネットを通してアクセス可能である。これらのプログラムは示された許容誤差内で、切断試薬および断片化ペプチド分子量を使用者が特定することを可能にする。プログラムは試料タンパク質の同一性の評価を助けるために、これらの分子量をタンパク質データベースと比較する。断片化ペプチドの数に関する正確な情報およびこれらのペプチドの正確な分子量が正確な同定に必要とされる。従って、断片化ペプチドの数およびこれらのペプチドの正確な分子量の決定における正確さを増加させることが、未知のタンパク質同定の成功率を高める。
【００１３】
タンパク質の断片化はさらにアミノ酸組成分析およびタンパク質配列決定のための断片生成、特に、”ブロックされた”Ｎ末端を持つタンパク質からの断片の生成に用いられる（Ｐ．Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１００３５−１００３８，１９８７；Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９８８，９：８３０−８３８，１９８８）。加えて、タンパク質の断片化は質量分析のための（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５０１１−５０１５，１９９３；Ｂ．Ｔｈｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，１７：５８８−５９９，１９９６）、免疫化のための、アフィニティー選択のための（Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾部位決定のための（例えば、リン酸化）、活性な生物学的化合物作成のための（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ３００−３０１（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，第６版，１９９１））、および相同的タンパク質の識別のための（Ｍ．Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５０：３０９−３１６，１９８０）ペプチド調製に使用できる。
【００１４】
それ故、ペプチド断片化研究での使用、分子量測定での使用、およびタンデム質量分析を使用したタンパク質配列決定での使用に適したＩＬ−１ポリペプチドが本分野で必要とされている。
【００１５】
発明の概要
本発明は単離されたヒトＩＬ−１エプシロン核酸およびこれらの核酸によりコードされているポリペプチドを提供することにより、本分野におけるこれらの要求を満たすことの助けになっている。具体的には、本発明は配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２のＤＮＡ配列を含む単離されたヒトＩＬ−１エプシロン核酸分子および配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１３のアミノ酸配列をコードする単離されたヒトＩＬ−１エプシロン核酸分子、ならびにこれらの配列に相補的な核酸分子を包含している。一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子、ならびに配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２に関連する変性した二本鎖ＤＮＡへハイブリダイズする核酸分子が本発明に包含されている。配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２からインビトロ突然変異誘発により誘導された単離された核酸分子、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２からの縮重である単離された核酸分子、本発明のヒトＤＮＡの対立変異体である単離された核酸分子、並びに本発明のＤＮＡと種相同体である単離された核酸分子もまた包含されている。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指示する組換え体ベクター、およびこれらのベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も包含している。加えて、本発明は染色体、ヒト遺伝子地図を同定するための、および免疫系を研究するためのアッセイにおいて前記の核酸を使用する方法も包含している。
【００１６】
本発明はまた、これらの核酸分子によりコードされている単離されたポリペプチド、これらの核酸分子によりコードされている合成ポリペプチド、これらのポリペプチドのペプチドおよび断片も包含している。これらのポリペプチドに結合する単離されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体もまた本発明に包含されている。本発明はさらに、発現を促進する条件下で宿主細胞を培養し、培養培地からポリペプチドを回収することを含む、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドを産生するための方法も包含している。特に、細菌、酵母、植物、昆虫および動物細胞中でのＩＬ−１エプシロンポリペプチドの発現が本発明に包含されている。
【００１７】
一般に、本発明のポリペプチドは免疫調節、細胞増殖、細胞死および炎症応答のような細胞過程を研究するために使用できる。加えて、ＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片は、ＩＬ−１様リガンドおよびＩＬ−１様レセプターに関連するタンパク質を同定するために使用できる。
【００１８】
加えて、ポリペプチド対応構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子に会合する活性の潜在的阻害剤をスクリーニングするためにＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片を利用するアッセイ、並びにＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド対応構造分子により仲介される疾患処置のための治療薬としてＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片を使用する方法が本発明に包含されている。さらに、その阻害剤の設計にＩＬ−１エプシロンリガンドポリペプチド、関連ＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよびそれらの断片を使用する方法も本発明の一つの側面である。
【００１９】
本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質試料の分子量の算定を可能にする分子量マーカーとしてこれらのポリペプチドおよびそれらの断片化ペプチドを使用する方法、ならびに、電気泳動を使用する本発明の分子量マーカーを可視化する方法も含んでいる。本発明はさらに、試料タンパク質の等電点を決定するためのマーカーとして、ならびにタンパク質試料の断片化の程度を確立するために対照として本発明のポリペプチドおよびそれらの断片化ペプチドを使用する方法も包含している。
【００２０】
これらの決定を助けるためのキットもまた本発明に包含されている。
発明の詳細な説明
インターロイキン（ＩＬ−１）レセプターは、その多くが免疫系細胞（特にリンパ球）の応答を仲介するサイトカインレセプターの大きなＩｇスーパーファミリーのメンバーである。最近、これらのレセプターへ結合するリガンドファミリーのメンバーが加速されたペースで発見されている。既知のＩＬ−１リガンド数の増加は主として遺伝子クローニングおよび配列決定技術の出現によるものである。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列が、他の既知のＩＬ−１リガンドと相同性を共有しているとしたらＩＬ−１リガンドを意味すると考えられる。
【００２１】
マウスＩＬ−１エプシロンは既知のＩＬ−１遺伝子、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１δ（ＰＣＴ  ＵＳ／９９／００５１４に開示されている）およびＩＬ−１ｒａ、およびより最近にはＩＬ−１８（以前のある時にはＩＬ−１ガンマとして知られていた）の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）である。マウスＩＬ−１エプシロンは最初はＥＳＴデータベースを検索し、マウスＩＬ−１エプシロンに対応するＥＳＴを発見することにより同定された（承認番号ＡＡ０３０３２４）。”長型”のための全読み取り枠がこのＥＳＴに含まれている。
【００２２】
マウスＩＬ−１エプシロン（長型）ＤＮＡ配列
ＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡ  ＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴ  ＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡ  ＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡ  ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣ  ＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣ  ＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡ  ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴ  ＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧ  ＡＡＣＡＴＡＡＴＧＧ  ＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡ  ＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡ  ＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧ  ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴ  ＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＴＧＧＴＡ  ＣＡＡＣＣＴＣＴＡＣ  ＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴ  ＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣ  ＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴ  ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ  ＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧ  ＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣ  ＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧ  ＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣ  ＴＧＧＧＧＧＡＡＡＴ  ＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴ  ＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡ  ＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴ  ＡＣＡＴＴＡＡ（配列番号：１）
マウスＩＬ−１エプシロン（長型）アミノ酸配列
ＭＦＲＩＬＶＶＶＣＧ  ＳＣＲＴＩＳＳＬＱＳ  ＱＧＫＳＫＱＦＱＥＧ  ＮＩＭＥＭＹＮＫＫＥ  ＰＶＫＡＳＬＦＹＨＫ  ＫＳＧＴＴＳＴＦＥＳ  ＡＡＦＰＧＷＦＩＡＶ  ＣＳＫＧＳＣＰＬＩＬ  ＴＱＥＬＧＥＩＦＩＴ  ＤＦＥＭＩＶＶＨ＊（配列番号：２）
ＩＬ−１遺伝子と相同性を示しているが、最初に同定されたＥＳＴはＩＬ−１様分子の３分の２のＣ末端をコードしているようである点でマウスＩＬ−１エプシロンは通常ではない。加えて、ＩＬ−１エプシロン発現の研究の間に、同一のＮ末端であるが異なったＣ末端を持つタンパク質をコードする二つの（もしくはスプライスされた）型のｍＲＮＡが存在することが明らかになった。これら二つのタンパク質のより長い方は、最初のＥＳＴによりコードされているものであった。より短いものは（しばしば”アイソフォーム”と称される）典型的ＩＬ−１ファミリー分子の約３分の１の長さである。
マウスＩＬ−１エプシロン（短型）ＤＮＡ配列
ＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡ  ＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴ  ＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡ  ＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡ  ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣ  ＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣ  ＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡ  ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴ  ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＣＴＴＧＣＴ  ＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡ  ＴＡＴＣＴＧＧＡＣＡ  ＣＴＣＴＴＧＡＧＡＣ  ＧＡＡＣＡＧＧＧＧＧ  ＧＡＴＣＣＣＡＣＧＴ  ＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴ  ＧＣＡＡＡＧＧＣＣＧ  ＡＴＧＡ（配列番号：３）
マウスＩＬ−１エプシロン（短型）アミノ酸配列
ＭＦＲＩＬＶＶＶＣＧ  ＳＣＲＴＩＳＳＬＱＳ  ＱＧＫＳＫＱＦＱＳＬ  ＬＰＣＳＨＡＮＩＷＴ  ＬＬＲＲＴＧＧＩＰＲ  ＴＷＥＣＫＧＲ＊（配列番号：４）
同一起源のＲＮＡ転写体で、異なってスプライスされた転写体によりコードされているこれら二つのタンパク質（長および短型）は非共有結合的に会合し、”全”ＩＬ−１様分子を形成するであろう。
【００２３】
いずれにしても、マウス長型および短型ＩＬ−１エプシロンのための混合されたｃＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトＩＬ−１エプシロンがヒトゲノムライブラリーのスクリーニングにより同定された。ヒトゲノムライブラリーから得られたクローンの配列決定から読み取り枠を含んでいるＤＮＡの一続きが明らかにされた（同一領域にマウスＩＬ−１エプシロンと高度に相同なタンパク質の一部をコードしている）。読み取り枠はエキソンであるようである（コード領域の最も３’側のエキソン）。このエキソンの５’末端でのスプライス受容部位は、マウスＩＬ−１エプシロンの対応するエキソンのスプライス受容部位と同一の位置に存在する。
【００２４】
ヒトＩＬ−１エプシロンに対応するこのエキソンのＤＮＡおよびアミノ酸配列が、各々配列番号：５および配列番号：６に示されている。
ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡのヌクレオチド配列：
ＧＡＡＡＡＧＧＡＴＡ  ＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴ  ＧＴＡＣＡＡＣＣＡＡ  ＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧ  ＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴ  ＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣ  ＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡ  ＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡ  ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣ  ＧＡＧＴＣＴＧＴＧＧ  ＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧ  ＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣ  ＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴ  ＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧ  ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣ  ＡＴＣＣＴＴＡＣＣＣ  ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧ  ＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣ  ＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴ  ＴＴＧＧＧＴＴＡＡＣ  ＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴ  ＴＡＡ（配列番号：５）
核酸配列によりコードされている好適なポリペプチドが以下に示されている：
ヒトＩＬ−１エプシロンのアミノ酸配列：
適切な読み取り枠の翻訳（５’３’）：
ＥＫＤＩＭＤＬＹＮＱ  ＰＥＰＶＫＳＦＬＦＹ  ＨＳＱＳＧＲＮＳＴＦ  ＥＳＶＡＦＰＧＷＦＩ  ＡＶＳＳＥＧＧＣＰＬ  ＩＬＴＱＥＬＧＫＡＮ  ＴＴＤＦＧＬＴＭＬＦ＊（配列番号：６）
完全長ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡ配列が実施例１に説明したように単離された。完全長ヒトＩＬ−１エプシロンのＤＮＡおよびアミノ酸配列が各々配列番号：７および配列番号：８に示されている。
ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧ  ＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴ  ＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴ  ＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡ  ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡ  ＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴ  ＣＧＧＧＴＧＴＧＧＧ  ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡ  ＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣ  ＡＴＡＧＣＡＧＴＣＣ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＣＣＧＴＡＴＧＴＣＴ  ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ  ＴＴＧＣＣＴＴＡＡＴ  ＣＴＣＡＴＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡ  ＣＣＣＴＴＧＡＧＡＡ  ＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧ  ＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴ  ＧＡＡＴＧＧＡＣＴＣ  ＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣ  ＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣ  ＴＡＡＡＧＴＣＧＧＧ  ＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡ  ＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴ  ＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧ  ＧＡＴＡＴＡＡＴＧＧ  ＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡ  ＣＣＡＡＣＣＣＧＡＧ  ＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴ  ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ  ＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣ  ＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣ  ＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴ  ＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ  ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴ  ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ  ＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧ  ＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣ  ＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴ  ＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣ  ＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣ  ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ  ＧＡＣＴＴＴＧＧＧＴ  ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴ  ＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：７）
ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長アミノ酸配列：
適切な読み取り枠の翻訳（５’から３’）：
ＭＥＫＡＬＫＩＤＴＰ  ＱＱＧＳＩＱＤＩＮＨ  ＲＶＷＶＬＱＤＱＴＬ  ＩＡＶＰＲＫＤＲＭＳ  ＰＶＴＩＡＬＩＳＣＲ  ＨＶＥＴＬＥＫＤＲＧ  ＮＰＩＹＬＧＬＮＧＬ  ＮＬＣＬＭＣＡＫＶＧ  ＤＱＰＴＬＱＬＫＥＫ  ＤＩＭＤＬＹＮＱＰＥ  ＰＶＫＳＦＬＦＹＨＳ  ＱＳＧＲＮＳＴＦＥＳ  ＶＡＦＰＧＷＦＩＡＶ  ＳＳＥＧＧＣＰＬＩＬ  ＴＱＥＬＧＫＡＮＴＴ  ＤＦＧＬＴＭＬＦ＊（配列番号：８）
加えて、単一ヌクレオチド多型がヒトＩＬ−１エプシロン遺伝子で同定された。特に、多型はヌクレオチド３５位でのアデノシンからグアノシンへの置換が含まれていた。この多型ＩＬ−１エプシロン遺伝子によりコードされているポリペプチドはグルタミン残基ではなく１２位にアルギニン残基を持っている。この単一ヌクレオチド多型を含んでいるヒトＩＬ−１エプシロン遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号：１２に示されており、この多型遺伝子に対応する完全長アミノ酸配列は配列番号：１３に示されている。
多型ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列：
ＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧ  ＣＡＴＴＧＡＡＡＡＴ  ＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴ  ＣＡＧＣＧＧＧＧＧＡ  ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡ  ＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴ  ＣＧＧＧＴＧＴＧＧＧ  ＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡ  ＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣ  ＡＴＡＧＣＡＧＴＣＣ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＣＣＧＴＡＴＧＴＣＴ  ＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡ  ＴＴＧＣＣＴＴＡＡＴ  ＣＴＣＡＴＧＣＣＧＡ  ＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡ  ＣＣＣＴＴＧＡＧＡＡ  ＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧ  ＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴ  ＧＡＡＴＧＧＡＣＴＣ  ＡＡＴＣＴＣＴＧＣＣ  ＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣ  ＴＡＡＡＧＴＣＧＧＧ  ＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡ  ＣＡＣＴＧＣＡＧＣＴ  ＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧ  ＧＡＴＡＴＡＡＴＧＧ  ＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡ  ＣＣＡＡＣＣＣＧＡＧ  ＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴ  ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ  ＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣ  ＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣ  ＣＴＴＣＧＡＧＴＣＴ  ＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣ  ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴ  ＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ  ＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧ  ＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣ  ＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴ  ＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣ  ＴＧＧＧＧＡＡＡＧＣ  ＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴ  ＧＡＣＴＴＴＧＧＧＴ  ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴ  ＧＴＴＴＴＡＡ（配列番号：１２）
ヒトＩＬ−１エプシロンの完全長アミノ酸配列：
適切な読み取り枠の翻訳（５’から３’）：
ＭＥＫＡＬＫＩＤＴＰ  ＱＲＧＳＩＱＤＩＮＨ  ＲＶＷＶＬＱＤＱＴＬ  ＩＡＶＰＲＫＤＲＭＳ  ＰＶＴＩＡＬＩＳＣＲ  ＨＶＥＴＬＥＫＤＲＧ  ＮＰＩＹＬＧＬＮＧＬ  ＮＬＣＬＭＣＡＫＶＧ  ＤＱＰＴＬＱＬＫＥＫ  ＤＩＭＤＬＹＮＱＰＥ  ＰＶＫＳＦＬＦＹＨＳ  ＱＳＧＲＮＳＴＦＥＳ  ＶＡＦＰＧＷＦＩＡＶ  ＳＳＥＧＧＣＰＬＩＬ  ＴＱＥＬＧＫＡＮＴＴ  ＤＦＧＬＴＭＬＦ＊（配列番号：１３）
ＩＬ−１エプシロンをコードするこのＤＮＡの発見は、本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる発現ベクター；発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞；生物学的に活性なヒトＩＬ−１エプシロンポリペプチドおよび単離され精製されたタンパク質としての分子量マーカー；並びに本発明のポリペプチドと免疫反応的な抗体の構築を可能にした。
【００２５】
核酸分子
特定の態様において、本発明はある種の単離されたヌクレオチド配列に関している。”ヌクレオチド配列”とは、少なくとも一度は実質的に純粋な形で単離され（即ち、外因性物質の夾雑がない）、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているような方法）によるその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収が可能な質または濃度での、ＤＮＡまたはＲＮＡから誘導された、別々の断片の形でのまたは大きな核酸構築物の成分としてのポリヌクレオチド分子を意味している。そのような配列は好適には、真核生物遺伝子に典型的に存在している内部非翻訳配列またはイントロンにより中断されていない読み取り枠の型で提供および／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は読み取り枠の５’または３’側に存在してもよいが、そこでもそれらはコード領域の操作または発現を妨害しない。
【００２６】
本発明の特に好適なヌクレオチド配列は上に示したような配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２である。本発明はさらに配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２から誘導される単離された断片およびオリゴヌクレオチドも包含している。本発明の範囲内の核酸配列には中程度のまたは高度のストリンジェンシー条件下、本明細書に開示されている天然のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そして本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。これらの単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ配列はまた、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードする完全長ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、中程度のストリンジェンシーとは、当業者には既知であるように、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に定義されているように、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のニトロセルロースフィルターの前洗浄溶液、５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、４２℃でのハイブリダイゼーション条件（またはスターク溶液のような他の類似のハイブリダイゼーション溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃で）、および約６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件の使用を含んでいる。高ストリンジェンシー条件は、前記のハイブリダイゼーション条件および６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄で定義される。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度を、プローブの長さのような因子に従い、必要に応じて調節できることを認識するであろう。
【００２８】
既知の遺伝子コード縮重から、一つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードでき、ＤＮＡ配列は配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２に示された配列を変更でき、それでも各々配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のアミノ酸配列を持っているポリペプチドをコードしているようにできる。そのような変異体ＤＮＡは沈黙突然変異から生じるか（例えば、ＰＣＲ増幅の間に起こる）、または天然配列の計画的突然変異誘発の産物であろう。
【００２９】
それ故、本発明は（ａ）天然の哺乳動物遺伝子のコード領域に由来するＤＮＡ；（ｂ）配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｃ）配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）中程度のストリンジェンシー条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で定義されたＤＮＡについての遺伝子コードの結果として縮重し、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、から選択される、本発明のポリペプチドをコードする同等な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）単離されたＤＮＡ配列を提供する。もちろん、そのような同等なＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドは本発明に含まれる。
【００３０】
配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のＤＮＡ配列と同等なＤＮＡは中程度のストリンジェンシー条件下、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする二本鎖天然ＤＮＡ配列へハイブリダイズするであろう。そのようなＤＮＡによりコードされているポリペプチドの例には、以下に説明するような不活性化Ｎ−グリコシル化部位、不活性化プロテアーゼプロッセッシング部位または保存的アミノ酸置換を含んでいるポリペプチド断片およびポリペプチドが含まれるが、それらに制限されるわけではない。ＤＮＡが配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１２のＤＮＡの相補体にハイブリダイズするであろう、他の哺乳動物に由来するＤＮＡによりコードされているポリペプチドもまた包含される。
【００３１】
発現
本発明のポリペプチドをコードしている核酸配列はよく知られている方法を使用して組換え発現ベクター内へ挿入できる。発現ベクターは哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するもののような、適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能なように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）本発明のＤＮＡ配列を含んでいる。調節配列の例には転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、転写および翻訳の開始および終止を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が本発明のＤＮＡ配列に機能的に関係している場合、ヌクレオチド配列は”機能可能なように連結”されている。従って、もしプロモーターヌクレオチド配列が本発明のＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に機能可能なように連結されている。所望の宿主細胞で複製する能力は通常複製起点により与えられ、および、形質転換体が同定される選択遺伝子を付加的に発現ベクター内へ取り込ませることができる。
【００３２】
加えて、本発明のポリペプチドには天然には付随されていない適したシグナルペプチドをコードしている配列を発現ベクター内へ取り込ませることができる。例えば、ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳されるように、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡ配列を本発明のヌクレオチド配列の読み枠内へ融合できる。意図する宿主細胞中で機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からポリペプチドが分泌されるとポリペプチドから切断できる。
【００３３】
本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高等な真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用するために適したクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８５）、に記載されている。本明細書に開示したＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用して、本発明のポリペプチドを産生させるのに細胞を含まない翻訳系もまた用いることができるであろう。
【００３４】
原核生物系
原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物体が含まれる。形質転換に適した原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびバシラス、シュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコッカス属内の種々の他の種が含まれる。大腸菌のような原核生物宿主細胞において、本発明のポリペプチドは、原核生物宿主細胞での組換え体ポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むことができる。Ｎ末端Ｍｅｔは発現された組換え体ポリペプチドから切断できる。
【００３５】
原核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターはまた、一般に一つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子も含んでいる。表現型選択可能マーカー遺伝子とは、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは自己栄養要求性を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用である発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販品として入手可能なプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、従って、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を使用して発現ベクターを構築するには、適切なプロモーターおよび本発明のＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２ベクター内へ挿入される。他の市販品として入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。他の市販品として入手可能なベクターには、タンパク質の発現のために特別に設計されたものが挙げられる；これらには、マルトース結合タンパク質に融合されたタンパク質の発現に使用されるｐＭＡＬ−ｐ２およびｐＭＡＬ−ｃ２ベクターが含まれる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）。
【００３６】
組換え体原核生物宿主細胞発現ベクターに通常使用されるプロモーター配列にはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，１９８２）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系はファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性レプレッサー配列を用いている。λＰLプロモーターの誘導体を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ  ３７０９２）に存在する）およびｐＰＬｃ２８  （大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ  ５３０８２）に存在する）が含まれる。
【００３７】
本発明のＤＮＡは通常の細菌発現ベクターの多クローニング部位内へイン−フレームでクローン化できる。理想的には、誘導剤の添加が研究者が選択した時期での組換え体タンパク質の高レベル産生を導くように、ベクターはクローニング部位上流の誘導可能プロモーターを含んでいる。いくつかのタンパク質については、プロモーターおよび初期の遺伝子の間に（ヘキサヒスチジンのような）融合パートナーをコードしているコドンを取り込ませることにより、発現レベルを押し上げることができる。
【００３８】
組換え体タンパク質の発現では、前もって決定されている光学密度に到達するまで増殖培地中で細菌細胞を増殖させる。続いて、組換え体タンパク質が例えば、ｌａｃオペレーター／プロモーターを含んでいるプラスミドからのタンパク質発現を活性化するＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加により誘導される。インキュベーション後（典型的には１−４時間）、細胞を遠心分離（例えば、４℃、５，０００ｘＧで２０分）によりペレット化して採取する。
【００３９】
発現されたタンパク質の回収のため、ペレット化細胞を１０容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁し、フレンチプレスを２または３回通過させる。ほとんどの高度に発現された組換え体タンパク質は封入体として知られている不溶性凝集体を形成する。封入体は４℃、５，０００ｘＧで２０分遠心分離してペレット化することにより可溶性タンパク質を除去して精製できる。封入体ペレットは５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１％トリトンＸ−１００で洗浄し、次に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／８Ｍ尿素／０．１Ｍ  ＤＴＴに溶解させた。溶解できない物質を遠心分離により除去する（２０℃、１０，０００ｘＧで２０分）。ほとんどの場合、問題とするタンパク質は得られた透明化上清中にもっとも豊富なタンパク質であろう。このタンパク質は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭ  ＣａＣｌ2／５ｍＭ  Ｚｎ（ＯＡｃ）2／１ｍＭ  ＧＳＳＧ／０．１ｍＭ  ＧＳＨに対して透析することにより活性なコンホメーションへ”再折り畳み”される。再折り畳み後、イオン交換またはゲル濾過のような種々のクロマトグラフィー法により精製を実施できる。いくつかのプロトコールでは最初の精製は再折り畳み前に実施されるであろう。例えば、ヘキサヒスチジン−タグ付け融合タンパク質は、固定化ニッケル上で部分的に精製されるであろう。
【００４０】
前記の精製および再折り畳み法は、タンパク質が封入体から最もよく回収されることを仮定しているが、当業者は多くの組換え体タンパク質は細胞溶解液の可溶性分画から最もよく精製されることを認識するであろう。これらの場合、再折り畳みはしばしば必要とされず、標準クロマトグラフィー法による精製が直接的に実施されるであろう。
【００４１】
酵母系
本発明のポリペプチドはあるいは、酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス属から（例えば、Ｓ．セレビジエ）、中で発現できる。ピキア、Ｋ．ラクチスまたはクルイベロミセスのような酵母の他の属もまた用いることができる。酵母ベクターはしばしば２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含んでいるであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、中でも、メタロチオネイン、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）のためのプロモーターが含まれる。酵母発現で使用するための他の適したベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７またはＦｌｅｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０７：２８５−１９５（１９９１）；およびｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５−１３９（１９９０）にさらに記載されている。別の代替物はＲｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）およびＢｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，１９８２）に記載されているグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌中での選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）を前記の酵母ベクター内へ挿入することにより構築できる。
【００４２】
酵母α因子リーダー配列が本発明のポリペプチドの分泌を指示させるために用いることができる。α因子リーダー配列はしばしばプロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ３０：９３３，１９８２；Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５３３０，１９８４；米国特許第４，５４６，０８２号；およびＥＰ  ３２４，２７４を参照されたい。酵母宿主からの組換え体ポリペプチドの分泌を容易にするための適した他のリーダー配列は当業者には既知である。リーダー配列は一つまたはそれ以上の制限部位を含ませるためにその３’末端近傍を修飾できる。このことは構造遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にするであろう。
【００４３】
酵母形質転換プロトコールは当業者には既知である。そのようなプロトコールの一つがＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９，１９７８、に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコールは選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択しており、ここで選択培地は０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルから成っている。
【００４４】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含んでいるベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は”リッチ”培地中で発現を誘導するために増殖できる。リッチ培地の例は８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した、１％酵母抽出物、２％ペプトンおよび１％グルコースから成るものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制はグルコースが培地から使い尽くされた場合に起こる。
【００４５】
哺乳動物および昆虫系
あるいは、本発明の組換えポリペプチドを発現させるために哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いることができる。昆虫細胞における異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）、により概説されている。哺乳動物起源の確立された細胞株もまた使用できる。適した哺乳動物宿主細胞株にはサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、並びに、ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１，１９９１）により記載されているアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）から誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）が含まれる。
【００４６】
哺乳動物細胞内へＤＮＡを導入するための確立された方法が報告されている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９）。細胞をトランスフェクトするためにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓのような市販品として入手可能な試薬を使用する別の方法が使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８７）。加えて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、に記載されているような慣用の方法を使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクトするためにエレクトロポレーションが使用できる。安定な形質転換体の選択は例えば、細胞毒性薬剤への耐性のような、本分野では既知の方法を使用して実行できる。Ｋａｕｆｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５ｌｌ，１９９０、はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性のようないくつかの選択スキームを記載している。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であろう（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，１９８０）。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを発現しているプラスミドが株ＤＸ−Ｂ１１内へ導入でき、プラスミドを含んでいる細胞のみが適切な選択培地中で増殖できる。発現ベクター内へ取り込ませることができる選択可能マーカーの別の例には、Ｇ４１８およびヒグロマイシンＢのような抗生物質に対して耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。ベクターを含んでいる細胞はこれらの化合物への耐性に基づいて選択できる。
【００４７】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列はウイルスゲノムから切り出すことができる。普通に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位が哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列発現のための他の遺伝子要素を提供するために使用できる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方ともウイルスゲノムからウイルス複製起点も含むことができる断片として容易に得ることができるので特に有用である（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，１９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）。ＳＶ４０ウイルス由来複製起点中に位置しているＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にわたる約２５０ｂｐ配列が含まれていれば、より短いまたはより長いＳＶ４０断片もまた使用できる。
【００４８】
哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示されている別の制御配列には、ＣＨＯ細胞から誘導された発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４）およびアデノウイルス２からの三分割リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５−１３４９１，１９８２）が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列はジシストロンｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする（Ｏｈ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：２９５−３００，１９９３；Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：２６９７−２７００，１９９６）。選択可能マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の遺伝子に続くジシストロンｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクト可能性および異種ｃＤＮＡの発現を改良することが示されている（Ｋａｕｆｒｎａｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）。ジシストロンｍＲＮＡを用いる発現ベクターの例は、Ｍｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１５０−１６１，１９９７、により記載されているｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，ｐｐ．５２９−５３４、により記載されているｐ２Ａ５Ｉである。
【００４９】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：３３５−３４８，１９８９、に記載されている。哺乳動物宿主細胞で使用するための他の発現ベクターはＯｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）により開示されているように構築できる。Ｃ１２７マウス乳腺上皮細胞での哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系はＣｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によりおおむね記載されているように構築できる。Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，１９８４、により説明されている有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。別の有用な哺乳動物発現ベクターはＥＰ−Ａ−０３６７５６６、および１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１，４１５号（本明細書において援用される）に記載されている。ベクターはレトロウイルスから誘導できる。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているＩＬ−７のためのシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されているＩＬ−２レセプターのためのシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されているＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているタイプＩ  ＩＬ−１レセプターシグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されているタイプＩＩ  ＩＬ−１レセプターシグナルペプチドのような異種シグナル配列が付加できる。
【００５０】
別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧが使用できる。ＦＬＡＧ技術は低分子量（１ｋＤ）、親水性、ＦＬＡＧマーカーペプチドのｐＦＬＡＧ−１TM発現ベクター（１）（ＩＢＩ  Ｋｏｄａｋから入手した）により発現される組換え体タンパク質のＮ末端への融合を中心に行われる。
【００５１】
本発明のポリペプチド
前に示したように、本発明はまた単離されおよび精製されたポリペプチドも含んでいる。本明細書で使用される場合、本発明の”ポリペプチド”とは配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１３のアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに、そのようなアミノ酸配列と高い程度の類似性（少なくとも９０％の相同性）を持っているタンパク質（およびそれらのタンパク質は生物学的に活性である）をさらに包含するポリペプチド類を意味している。加えて、本発明のポリペプチドは配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２のヌクレオチドの遺伝子産物を意味している。
【００５２】
単離および精製
本明細書で使用される場合、用語”単離および精製された”とは本発明のポリペプチドまたは断片が、例えば、組換え体宿主細胞培養の精製生成物として、または、非組換え体源からの精製された生成物として、本質的に他のタンパク質またはポリペプチドが会合していないことを意味している。本明細書で使用される場合、用語”実質的に精製された”とは、本発明のポリペプチドまたは断片を含む混合物が、他のタンパク質またはポリペプチドと本質的に会合していないが、特異的抗体を使用して除去できる既知のタンパク質が存在することを指しており、そして実質的に精製されたポリペプチドまたはその断片は分子量マーカーとして使用できる。用語”精製された”とは本発明のポリペプチドの”単離および精製された”型または本発明のポリペプチドの”実質的に精製された”型のどちらか一方を指している（両方ともここに説明されている）。
【００５３】
本発明に従って単離および精製されたポリペプチドは、前記のように組換え体発現系により産生できるか、または、天然に存在する細胞から精製できる。
一つの好適な態様において、組換え体ＩＬ−１エプシロンポリペプチドの発現は、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードする配列と、本発明のポリペプチドの精製を助けるための別のポリペプチドをコードする配列との融合を利用して達成できる。そのような融合の例は、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードしている配列とＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．のｐＭＡＬ−ｃ２ベクターのｍａｌＥ遺伝子産物をコードする配列への融合である。そのような融合は、融合タンパク質のアフィニティー精製、ならびに、精製後の本発明のポリペプチドからの融合タンパク質のマルトース結合タンパク質部分の分離を可能にしている。
【００５４】
ＩＬ−１エプシロンポリペプチドをコードするＤＮＡのｐＭＡＬ−ｃ２ベクター内への挿入は、既知の分子生物学技術を使用した種々の方法により達成できる。挿入の好適な構築では、本発明のポリペプチドのカルボキシ終端コドンに隣接している終止コドンが含まれている。加えて、挿入の好適な構築は、本発明のポリペプチドのアミノ末端の、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクター中のファクターＸａ切断部位カルボキシ末端への直接的な融合を生じている。ＤＮＡ断片は、本発明のＤＮＡを鋳型として、および二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより発生できる。オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、慣用の方法により単離できるＤＮＡの平滑末端化断片を生成する。このＰＣＲ生成物は慣用の手段を使用してｐＭＡＬ−ｐ２と結合できる（制限エンドヌクレアーゼＸｍｎＩで切断して）。陽性クローンは通常の手段により同定できる。融合タンパク質の発現の誘導および精製は使用説明書に従っておよび前に示したように実施できる。この構築は、使用説明書どおりの単純なプロテアーゼ処理を利用する融合マルトース結合タンパク質からの本発明のポリペプチドの正確な分離を容易にする。この様式により、精製されたＩＬ−１エプシロンポリペプチドを得ることができる。さらに、そのような構築ベクターはさらなる融合タンパク質を作成させるため、既知の分子生物学的技術を使用して容易に修飾できる。もちろん、前に示したように、多くの異なったベクターおよび技術が本発明のポリペプチドの発現および精製に使用できること、そしてこの態様は本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。
【００５５】
細菌培養で産生された組換え体タンパク質は、常法（凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含んでいる）による宿主細胞の初期破壊、遠心分離、もし不溶性ポリペプチドならば細胞ペレットからの、またはもし可溶性ポリペプチドならば上清液からの抽出、続いての１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程により通常単離される。当業者には既知であるように、組換え体タンパク質を精製する方法は、用いられた宿主細胞の型、および組換え体タンパク質が培養培地中へ分泌されるかどうかの様な因子に従って変化するであろう。例えば、組換え体タンパク質を分泌する発現系が用いられた場合、培養培地は最初に、市販品として入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット、を使用して濃縮できる。濃縮工程に続き、濃縮液はゲル濾過媒質のような精製マトリックスが応用できる。あるいは、陰イオン交換樹脂が使用できる、例えば、ぶら下がった（ｐｅｎｄａｎｔ）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つマトリックスまたは基質。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製で普通に用いられる他の型であろう。もしくは、陽イオン交換工程が使用できる。適した陽イオン交換物にはスルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでいる種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適である。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒質（例えば、ぶら下がったメチルまたは他の脂肪族基を持っているシリカゲル）を用いた１回またはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣが、ポリペプチドをさらに精製するために使用できる。いくつかのまたは全部の前記精製工程（種々に組み合わされた）はよく知られており、単離および精製された組換え体タンパク質を提供するために使用できる。
【００５６】
本発明のポリペプチドに対して作成したモノクローナル抗体のような本発明のポリペプチド−結合タンパク質を含むアフィニティーカラムを利用して、発現ポリペプチドをアフィニティー精製することも可能である。これらのポリペプチドは通常の技術を使用して（例えば、高塩溶出液中に溶出し、次に使用するために低塩緩衝液で透析するかまたは、利用されたアフィニティーマトリックスに依存してｐＨまたは他の成分を変えることにより）アフィニティーカラムから除去することができる。
【００５７】
本発明のこの側面において、本発明の抗ポリペプチド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用するであろう他のタンパク質のようなポリペプチド結合タンパク質は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、あるいは本発明のポリペプチドをその表面に発現する細胞の同定、分離または精製に適した類似の基質のような固相支持体に結合できる。本発明のポリペプチド−結合タンパク質の固相接触表面への付着は任意の手段（例えば、磁性マイクロスフェアはこれらのポリペプチド−結合タンパク質で被覆でき、磁場によりインキュベーション容器に保つことができる）により達成できる。細胞混合物の懸濁液を、その表面にそのようなポリペプチド−結合タンパク質を持つ固相と接触させる。表面に本発明のポリペプチドを持っている細胞は固定されたポリペプチド−結合タンパク質に結合され、非結合細胞は洗い流す。このアフィニティー結合法は、溶液からそのようなポリペプチド発現細胞を精製、スクリーニングまたは分離するために有用である。固相から陽性で選択された細胞を放出させる方法は本分野で知られており、例えば、酵素の使用を含んでいる。そのような酵素は好適には細胞に対して無毒および非傷害性であり、好適には細胞表面結合相手を切断するように方向付けられている。
【００５８】
あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含んでいると思われる細胞の混合物を最初に、本発明のビオチニル化ポリペプチド結合タンパク質とインキュベートしてもよい。インキュベーション期間は本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも１時間持続される。得られた混合物は次にアビジン被覆ビーズを詰めたカラムを通過させると、アビジンに対するビオチンの高親和性によりポリペプチド結合細胞のビーズへの結合が起こる。アビジン被覆ビーズの使用は本分野で既知である。Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。非結合物質の洗浄および結合細胞の放出は、常法を使用して実施される。
【００５９】
上に説明した方法において、適したポリペプチド結合タンパク質は抗ポリペプチド抗体および、本発明のポリペプチドへ高親和性で結合できる他のタンパク質である。好適なポリペプチド結合タンパク質は抗ポリペプチドモノクローナル抗体である。
【００６０】
好適な態様において、形質転換された酵母宿主細胞は、精製を簡単にするため、分泌されるポリペプチドとして本発明のポリペプチド発現するように用いられる。酵母宿主細胞発酵により分泌された組換え体ポリペプチドはＵｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）（精製のため２回の連続した逆相ＨＰＬＣ工程の使用が示されている）により記載されている方法と類似の方法で精製できる。
【００６１】
変異体
本発明はまた本発明のポリペプチドの変異体を含んでいる。本明細書においてポリペプチド”変異体”とは本発明の天然のポリペプチドと実質的に相同的であるが、一つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、本発明の天然のポリペプチド（ヒト、マウスまたは他の哺乳動物種）とは異なったアミノ酸配列を持つポリペプチドを意味している。変異体アミノ酸配列は好適には少なくとも８０％が天然のポリペプチドアミノ酸配列と同一である。ポリペプチドまたは断片が好適なポリペプチドまたはその断片と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含んでいる態様も企図される。パーセント同一性は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）により記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定できる。ＧＡＰプログラムはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）により改訂された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用している。ＧＡＰプログラムの好適なデフォルトパラメーターには以下の項の値が含まれる：（１）ヌクレオチドの単項比較マトリックス（同一には１および非同一には０の値を含んでいる）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９により記載されているようなＧｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の重り付き比較マトリックス；（２）各々の不一致に対して３．０のペナルティーおよび各々の不一致における各々のシンボルに対して追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端不一致にはペナルティーなし。
【００６２】
変異体は保存的に置換された配列を含むことができ、定められたアミノ酸残基が類似の物理化学的特性を持っている残基で置換されることを意味している。保存的置換の例には一つの脂肪族残基の別のＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａのような他の残基での置換、または一つの極性残基の別のもう一つのものによる置換（ＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間のような）が含まれる。他のそのような保存的置換、例えば類似の疎水特性を持っている全領域の置換、がよく知られている。天然に存在する変異体もまた本発明に含まれている。そのような変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング、ＩＬ−１エプシロンポリペプチドのタンパク質分解的切断、または異なった対立遺伝子からの転写／翻訳により生じたタンパク質である。タンパク質分解に帰すことができる変異体には、例えば、異なった型の宿主細胞での発現によるＮまたはＣ末端の相違、本発明のポリペプチドからの一つまたはそれ以上のアミノ酸のタンパク質分解的除去（一般に、１−５の末端アミノ酸）によるものが含まれる。
【００６３】
オリゴマー
本発明のポリペプチドは、共有結合で連結されたまたは非共有結合的に連結されたダイマーまたはトライマーのようなオリゴマーとしても存在できる。オリゴマーは、異なったポリペプチド上のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により連結できる。
【００６４】
本発明の一つの態様において、ポリペプチドダイマーは本発明のポリペプチドを抗体（例えば，ＩｇＧ１）のＦｃ領域へ、これらのポリペプチドの生物学的活性を妨害しないような様式で融合することにより作り出せる。Ｆｃ領域は好適には本発明の可溶性ポリペプチドのＣ末端へ融合されて、Ｆｃ融合またはＦｃポリペプチドを形成する。本明細書で使用される場合、用語”Ｆｃ融合タンパク質”または”Ｆｃポリペプチド”とは天然型およびムテイン型、ならびに二量化を促進するヒンジ領域含む短縮型Ｆｃポリペプチドを含んでいる。前記のＦｃポリペプチドを作製する方法の例は、米国特許第５，４２６，０４８および５，７８３，６７２号（両方とも本明細書において援用される）に開示されている。
【００６５】
抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）へ融合された異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの一般製法は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，１９９０）（本明細書において援用される）に記載されている。本発明のポリペプチド：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合物は、適した発現ベクター内へ挿入される。ポリペプチド：Ｆｃ融合タンパク質はよりふさわしい抗体分子を組み立てることを可能にし、それにより鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、本発明の２価ポリペプチドが得られる。もし融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方を持つように形成されたら、４つもの数のポリペプチド細胞外領域を持つポリペプチドオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、ペプチドリンカーで２つの可溶性ポリペプチドドメインを連結できる。
【００６６】
変更法
上述のように、本発明は、単離され、かつ精製されたポリペプチド、並びに、その組換え及び非組換え断片を提供する。天然のポリペプチドの変異体及び誘導体は、天然のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得られる。天然のアミノ酸配列の変換は多数の慣用法のいずれによっても遂行され得る。天然配列の断片にライゲーション可能にする制限部位が近接する、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異は特定の部位に導入され得る。ライゲーションに続いて、結果として生じた再構築配列は、所期のアミノ酸挿入、置換、もしくは欠失を有する類似体をコードする。
【００６７】
或いは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発法が、予め決定されたコドンが置換、欠失、もしくは挿入によって変換され得る変換遺伝子を提供するのに使用され得る。上記の変換を作成する例示的な方法が、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１），Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８，１９８５），Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；並びに、米国特許  第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号によって開示され、これらはすべて参考文献として援用される。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、グリコシル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）群、脂質、リン酸、アセチル基及び同様のもののような、他の化学成分と共有結合体もしくは凝集体を形成することによって、ポリペプチド誘導体を創るように修飾されることも可能である。本発明のポリペプチドの共有結合誘導体は、本発明のポリペプチドもしくはその細胞外ドメインの、ポリペプチドアミノ酸側鎖上のあるいはＮ末端またはＣ末端の官能基に化学成分を連結させることによって提供され得る。本発明の範囲内で、ポリペプチドの他の誘導体は、これらのポリペプチドもしくはペプチド断片と他のタンパク質もしくはポリペプチドとの共有結合体または凝集体、例えばＮ末端もしくはＣ末端融合のような組換え培養中の合成による結合体、を含む。例えば、結合体は、本発明のポリペプチドのＮ末端に、シグナルもしくはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセスのα因子リーダー）を含み得る。シグナルもしくはリーダーペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、合成部位から細胞膜もしくは細胞壁の内または外への結合体の転移を指示する。
【００６９】
ポリペプチド結合体は、本発明のポリペプチドの精製及び同定を容易にするために加えられるペプチドを含むこともできる。このようなペプチドは、例えば、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、または、米国特許庁第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４，１９８８に
記載された抗原同定ペプチドを含む。
【００７０】
本発明は、更に、天然型のグリコシル化を伴うもしくは伴わない、本発明のポリペプチドを含む。酵母または哺乳類の発現系（例えば、ＣＯＳ−１もしくはＣＯＳ−７細胞）に発現されたポリペプチドは、発現系の選択によって、分子量及びグリコシル化の型が天然ポリペプチドと同様あるいは有意に異なることもあり得る。大腸菌のような細菌発現系では、本発明のポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。グリコシル基は、慣用法で、特にグリコペプチダーゼを使用して除去され得る。一般に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰量のグリコペプチダーゼ（ベーリンガー  マンハイム）でインキュベートされ得る。
【００７１】
同様に、アミノ酸残基もしくは配列の様々な付加または置換、あるいは、末端もしくは内部の残基または配列の欠失をコードする、同等のＤＮＡ構成物が、本発明に含まれる。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−グリコシル化部位は、グリコシル化を妨げる様に修飾され、哺乳類及び酵母の発現系において、還元された炭水化物類似体の発現を可能にし得る。真核細胞のポリペプチドのＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙで特徴付けられ、Ｘは、Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸であり、Ｙは、ＳｅｒもしくはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列への適切な置換、付加、もしくは欠失は、Ａｓｎ側鎖に炭水化物残基の付着するのを妨げる結果となるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸に変換されるように選ばれる、１つのヌクレオチドの変換は、Ｎ−グリコシル化部位を不活化するのに十分である。タンパク質のＮ−グリコシル化部位を不活化する既知の手法は、米国特許庁第５，０７１，９７２号及びＥＰ第２７６，８４６号に記載された手法を含み、本明細書に参考文献として援用される。
【００７２】
他の例では、生物学的活性に重要ではないＣｙｓ残基をコードする配列が、Ｃｙｓ残基を欠失する、または、他のアミノ酸で変換するように、変換され、再生における誤った分子内ジスルフィド橋の形成を妨げることが可能である。他の同等物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系で発現を増強するように、近接したニ塩基アミノ酸残基を修飾することによって提供される。ＥＰ第２１２，９１４号は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活化するために部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＬｙｓ−Ａｒｇ対を変換するように、かつ、これらの近接する塩基残基の発生を除去するように、残基を欠失、付加、あるいは置換することによって、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、不活化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対は、比較的にＫＥＸ２分解をあまり受けやすくないので、Ａｒｇ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活化するのに保守的な好ましい方法を代表する。
【００７３】
断片とその使用
本発明の更に別の側面では、本発明のポリペプチドは、化学的及び酵素的方法によって、ペプチドに断片化され得る。このように産生された断片は分子量マーカーおよび等電点マーカーを含む、様々な目的に使用され得る。ポリペプチドとペプチド断片は、断片化の程度の解析にも使用され得る。そのため、本発明は、これらのポリペプチド及びペプチド断片、並びに、試料タンパク質の明らかな分子量及び等電点の決定を助けるキットおよび試料タンパク質の断片化の程度を評価するキットも含む。
【００７４】
断片化のすべての方法が本発明に含まれるけれども、化学的断片化が好ましい態様であり、特異的分解がメチオニン残基に起こるような、中性もしくは酸性条件下で分解するために臭化シアンの使用を含む（Ｅ．Ｇｒｏｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．  １１：２３８−２５５，１９６７）。これは、さらに、システイン残基を不応性の種類へ変換するカルボキシメチレーションの工程のような、付加的工程を含み得る。
【００７５】
酵素的断片化は、もう一つの好ましい態様であり、慣用的条件下で、Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉ，Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ａｓｐ−Ｎ，もしくは、Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｌｙｓ−Ｃのようなプロテアーゼの使用を含み、結果として特異的なアミノ酸残基での分解に至る。Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅは、本発明のポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る。Ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅは、これらのポリペプチド内に存在するアルギニン残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る。Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉは、ポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る（Ｓａｋｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｎａｋａｔ，米国特許庁第５，２４８，５９９号；Ｔ．Ｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６６０：４４−５０，１９８１；Ｔ．Ｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６６０：５１−５５，１９８１）。トリプシンは、本発明のポリペプチド内に存在するアルギニンおよびリジンのカルボキシル側で特異的に分解し得る。酵素的断片化は、多数のアミノ酸残基で分解するプロテアーゼを用いても起こり得る。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８  プロテアーゼは、ポリペプチド内に存在するアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る（Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：１１０２−１１０６，１９７７）。Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ａｓｐ−Ｎは、ポリペプチド内に存在するアスパラギン残基のアミノ側で特異的に分解し得る。Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｌｙｓ−Ｃは、本発明のポリペプチド内に存在するリジン残基のカルボキシル側で特異的に分解し得る。他の酵素的及び化学的処理は、これらのポリペプチドを特異的ペプチドの特有のセットへ特異的に断片化するのに同様に使用され得る。
【００７６】
当然、本発明のペプチド及びポリペプチド断片は当該技術分野で良く知られている慣用的組換え法及び合成法によっても産生され得る。組換え法に関しては、本発明に含まれるポリペプチド及びペプチド断片は、それらが発現される宿主細胞次第で様々な分子量を有し得る。様々な細胞型における、本発明のポリペプチド及びペプチド断片のグリコシル化は、修飾の程度に応じて、結果として様々な分子量の小片に成り得る。これらの小片のサイズは、ポリペプチドの細胞外部分に由来するポリペプチド断片で最も不均一であり得る。一定したポリペプチド及びペプチド断片は、膜貫通部及び細胞質部分にもっぱら由来するポリペプチドを使用すること、グリコシル化を除去するためにＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅで前処理すること、あるいは、細菌宿主にポリペプチドを発現させることによって得られうる。
【００７７】
これらのポリペプチドの分子量は、本発明のポリペプチドのアミノ及びカルボキシル末端の双方に付加的ペプチド配列を融合させることによって様々に成り得る。本発明のポリペプチドのアミノ及びカルボキシル末端に付加的ペプチド配列を融合させることは、これらのポリペプチドの発現を増強させるために、あるいは、タンパク質の精製を助けるために使用され得る。更に、本発明のポリペプチドのアミノ及びカルボキシル末端に付加的ペプチド配列を融合することは、酵素的もしくは化学的処理によって生じたポリペプチドの断片化ペプチドのいくつかを、たいてい全部ではないが、変えるであろう。当然、、突然変異は、日常的なかつ既知の分子生物学的技術を使用して、本発明のポリペプチドに導入され得る。例えば、突然変異は、特異的酵素によるタンパク質融解分解部位あるいは特異的化学的断片化誘発法による分解部位を除去するように、設計され得る。この部位を除去することは、特異的酵素的もしくは化学的手法を用いた断片化における本発明のポリペプチドのペプチドフィンガープリントを変えるだろう。
【００７８】
それぞれの小片の特有なアミノ酸配列は分子量を明示するので、これらの小片は、その後は、試料タンパク質、ポリペプチドもしくはその断片の分子量の決定を助けるための解析技術を用いて、分子量マーカーとして役立ち得る。本発明の分子量マーカーは、類似した明白な分子量を有する試料タンパク質の明白な分子量の推定のための分子量マーカーとしてとりわけ良く役立ち、結果として、タンパク質の明白な分子量の決定に正確さを増すことが可能である。
【００７９】
本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合に、それらのマーカーは、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸サイズである。より好ましくは、これらの断片化ペプチド分子量マーカーは１０から１００アミノ酸サイズまでの間である。さらに好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０から５０アミノ酸サイズまでの間であり、特に好ましくは、１０から３５アミノ酸サイズまでの間である。最も好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０から２０アミノ酸サイズまでの間である。
【００８０】
分子量を決定する方法には、沈降法、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー、及び、マススペクトロメトリーがある。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法である（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５，１９７０）．慣用的に、その方法は、ドデシル硫酸ナトリウムを含むゲルの２つの分かれたレーンを使用し、アクリルアミドの濃度は６から２０％の間である。同一の条件下で、マーカーと試料を同時に溶解する能力は、正確さを増すことを可能とする。多くの異なる技術が、本発明のポリペプチドを使用して試料タンパク質の分子量を決定するために使用され得ること、及び、この態様が決して本発明の範囲を限定することはないことは、当然、理解される。
【００８１】
さらに、本発明のポリペプチド及び断片化されたペプチドは、特有の荷電の特徴を有していて、それゆえ、等電位焦点法のような技術を使用して、試料タンパク質、ポリペプチドもしくは断片化ペプチドの等電点を決定するのを助ける特異的マーカーとして役立ち得る。これらのポリペプチドもしくは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペプチドもしくは断片化ペプチドマーカーの等電点に近接した明白な等電点を有する試料タンパク質の明白な等電点の推定に、特に良く役立つ。
【００８２】
等電位焦点法技術は、タンパク質を、分子量と荷電とに基いて同時に分ける、ゲル電気泳動法のような、他の技術と更に結び付けられ得る。同一条件下で、これらのポリペプチドもしくは断片化ペプチドマーカー及び試料タンパク質を同時に溶解する能力は、試料タンパク質の明白な等電点の決定に正確さを増すことを可能とする。これは、２次元電気泳動（Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｍａｄｉｇａｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，６ｔｈ  ｅｄ．１９９１））のような技術において特に興味深く、この技術においては、手法の本質は、いかなるマーカーも試料タンパク質と同時に溶解されるべきであることを要求する。さらに、このような方法を用いて、これらのポリペプチド及びそれの断片化ペプチドは、試料タンパク質もしくはその断片化ペプチドの等電点及び分子量の双方の決定を助けることが可能である。
【００８３】
ポリペプチド及び断片化ペプチドは、試料タンパク質及び分子量マーカーの間の区別を可能とする２つの異なる方法を使用して可視化され得る。１つの態様においては、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して産生された抗体を使用して、慣用的なイムノブロッチング法を使用して可視化され得る。この検出は、試料タンパク質の検出に結果として至らない慣用的条件下で行なわれる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まない可能性があるので、本発明のすべてのポリペプチド断片に対する抗体を産生するのは可能ではないかもしれないことは理解される。さらに、必ずしもすべての抗体がこのアッセイでうまく動くとは限らないであろうことも理解される。しかしながら、本発明のポリペプチド及び断片に結合できる抗体は、慣用的技術を使用して容易に決定され得る。
【００８４】
試料タンパク質も、慣用的染色手法を使用することによって可視化される。本発明のポリペプチドもしくは断片ペプチド分子量マーカーに対してモル過剰量の試料タンパク質は、慣用的染色手法によって有力に検出されるようなものである。これらのポリペプチドもしくは断片化ペプチド分子量マーカーのレベルは、慣用的染色法によって、ほとんどまたは全く検出不可能のような程度である。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する好ましいモル過剰量の試料タンパク質は、２倍から１０００００倍の間である。より好ましくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する好ましいモル過剰量の試料タンパク質は、１０倍から１００００倍の間であり、特に好ましくは、１００倍から１０００倍の間である。
【００８５】
これらのポリペプチド分子量マーカー及びそれのペプチド断片を使用して、試料タンパク質、ポリペプチド及びそれの断片化ペプチドの分子量および等電点を決定並びに検出するために、多数の技術が使用されること、また、これらの態様は本発明の範囲を決して限定するものではないことは、当然理解される。
【００８６】
もう１つの態様においては、断片化反応の時間もしくは温度を変えることによるような、本発明のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性の断片化の解析（Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：１１０２−１１０６，１９７７）が、試料タンパク質の分解の程度の対照として使用され得る。例えば、同一条件下で同量のポリペプチドと試料タンパク質の分解を行なうと、断片化の程度を直接比較することが可能となる。ポリペプチドの完全な断片化を結果として生じる条件は、試料タンパク質の完全な断片化も生じ得る。
【００８７】
本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドの分子量マーカーとしての特定の使用に関しては、本発明の好ましいポリペプチドの、臭化シアンを用いた断片化が、グリコシル化の存在しない状態で、約６９３３、６２５及び２３８ダルトンの分子量を有する断片化ペプチド分子量マーカーの特有のセットを生ずる。開始メチオニン存在下では、１４９ダルトンの追加断片が生ずる。臭化シアンによる配列番号８の分解は、１４９．２，２６０．３，２０１７．４，３９５４．６，４４４２．１、及び６９３２．７の分子量を有する断片を生ずる。臭化シアンによる配列番号１３の分解は、１４９．２，２６０．３，２０１７．４，３９５４．６，４４７０．１、及び６９３２．７の分子量を有する断片を生ずる。メチオニン残基の配置は、各ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定し、各ペプチドの特有のアミノ酸組成は、その分子量を決定する。
【００８８】
さらに、本発明の好ましい単離かつ精製されたポリペプチド（配列番号６、配列番号８、及び配列番号１３）は、グリコシル化の存在しない状態で、順に、約７８１０（ポジション１にメチオニンの付加後は７９４１ダルトン）、１７６８４、及び１７７１２ダルトンの、算定分子量を有する。既知のＩＬ−１ポリペプチドの実測分子量は、１７、２５、３１、３３、及び３５キロダルトンを含むので、これらの決定に使用する一定範囲の分子量を提供する。
【００８９】
タンパク質がそのまま（ｉｎｔａｃｔ）使用されると、これらのポリペプチド分子量マーカーの使用は、７８１０，１７６８４、もしくは１７７１２ダルトンに近接する明白な分子量を有するタンパク質の明白な分子量の決定に正確さを増すことが可能である。断片が使用される場合は、断片の分子量の範囲にわたる分子量の決定に正確さを増す。
【００９０】
最後に、本発明に含まれるキットに関しては、このようなキットの構成要素は様々であり得るが、典型的には、ポリペプチド及び断片化ペプチド分子量マーカーを含む。また、このようなキットは、断片化に必要な部位が除去されたポリペプチドを含み得る。さらに、キットは、ポリペプチド及び試料タンパク質の化学的もしくは酵素的分解による特異的分解のための試薬を含み得る。キットは、さらに、本発明のポリペプチドもしくはその断片に対して方向付けられた抗体を含み得る。
【００９１】
センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の更に別の態様においては、標的ｍＲＮＡ配列に結合できる（２重構造を形成する）または２本鎖ＤＮＡらせんの配列に結合できる（３重らせんを形成する）、一本鎖核酸配列（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）から成るアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドが、本発明によって作成され得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ｃＤＮＡコード領域の断片を含む（配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号１２）。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０ヌクレオチドまでを含む。与えられたタンパク質のｃＤＮＡ配列に基いて、アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドを創ることができることは、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８  及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８，１９８８に開示されている。
【００９２】
標的核酸配列へのアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重構造の分解促進、転写もしくは翻訳の早期終結、または他の方法を含む幾つかの方法の一つによって、翻訳（ＲＮＡ）もしくは転写（ＤＮＡ）をブロックする複合体の形成を生ずる。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの発現をブロックするために使用され得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（あるいはＷＯ９１／０６６２９に開示されているような他の糖連結）を有するオリゴヌクレオチドを含み、このような糖連結はそこにおいて内因性ヌクレア−ゼに抵抗性である。抵抗性糖連結を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定している（すなわち、酵素分解に抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合可能な配列特異性は保持している。センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１０４４８に開示されたような有機成分、および、ポリ−（Ｌ−リジン）のような、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増す他の成分に、共有結合するオリゴヌクレオチドを含む。さらには、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾するために、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドに、エリプチシンのような介在試薬、及び、アルキル化剤または金属複合体を付着し得る。
【００９３】
アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ4−媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスのような遺伝子導入ベクターの使用による方法を含む、いずれの遺伝子導入法によっても、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。アンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適切なレトロウィルスベクターへアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドを挿入した後、挿入配列を含むレトロウィルスベクターと細胞をｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることによって、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適切なレトロウィルスベクターは、マウスのレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ，Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）、またはＤＣＴ５Ａ，ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと呼ばれるダブルコピーベクター（ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＵＳ９０／０２６５６参照）を含むが、これに限定されない。
【００９４】
あるいは、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に開示されるような、リガンド結合分子との結合体の形成によっても標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る。適切なリガンド結合分子は、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、もしくは細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含むがこれに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、その相当分子もしくは受容体に結合するというリガンド結合分子の能力とは実質上干渉せず、あるいは、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型の細胞への進入をブロックしない。
【００９５】
更に別の態様では、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に開示されるようなオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で解離される。
【００９６】
染色体マッピング
さらに別の態様においては、配列番号５、配列番号７もしくは配列番号１２のすべてまたは一部分を表すオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ファミリーメンバー、例えば、ＩＬ−１エプシロンのＤＮＡを含む、ヒト２番染色体及びその特異的部位を同定する良く知られている技術を使用して、当業者によって使用され得る。下記のように、配列番号５、配列番号７、及び、配列番号１２は、２番染色体の長腕（２ｑ）に、放射線ハイブリッドマッピングによって、マッピングされた。その領域は、非限定的に、緑内症、外胚葉異形成、インスリン依存性糖尿病、ｗｒｉｎｋｌｙ皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンフォーマ、喘息、及び、脛筋ジストロフィーを含む特定の疾患に関与する。このように、配列番号５、配列番号７、配列番号１２もしくはこれらの配列の断片は、２番染色体に関する上記疾患及び他の異常を研究するために良く知られている技術を使用して、当業者によって使用され得る。これは、このマーカーが再構成されるまたは欠失される条件を区別することを可能にするであろう。さらに、配列番号５、配列番号７、配列番号１２、もしくは、その断片は、部位未知の他のヒト遺伝子をマッピングするための部位マーカーとして使用され得る。
【００９７】
治療的及び研究的使用
本発明の別の態様は、ＩＬ−１エプシロンの治療的使用に関する。ＩＬ−１リガンドは、感染防御並びに免疫及び炎症反応促進に中心的役割を果たし、細胞内シグナル伝達、活性化血管内皮細胞及びリンパ球、炎症性サイトカインの誘導、急性期タンパク質、造血、発熱、骨吸収、プロスタグランジン、メタロプロテイネ−ス、及び接着分子を含む。既知のＩＬ−１ファミリーメンバーの数の持続的増加に伴って、適切な分類体系は、機能（活性化及び調節性）並びにポリペプチド構造を比較することに基くものである。このように、ＩＬ−１エプシロンは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１８のように、上記の機能の多くに含まれるようである。更に、ＩＬ−１エプシロンは、炎症反応促進に含まれるようであり、それゆえ、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、及び乾癬のような炎症性及び／または自己免疫性疾患の原因並びに維持に不可欠に含まれている可能性がある。このため、ＩＬ−１エプシロンのようなＩＬ−１ファミリーメンバーの発現及び／または活性化の変更は、シグナル伝達の変化に基く細胞特異的反応、増殖、及び炎症反応の、活性化あるいは阻害、を含むがこれに限定されない、多くの細胞作用に十分な効果を有する可能性がある。
【００９８】
したがって、ＩＬ−１エプシロンは、感染を防御するような、並びに、免疫及び炎症反応が不適切もしくは不応性の個体において、免疫及び炎症反応を生じさせるような、治療的使用を有する。例えば、ＩＬ−１エプシロンは、免疫系が抑制されている個体の免疫系を刺激するのに使用され得る。同様に、ＩＬ−１エプシロンは炎症反応を促進するようであり、炎症性及び／または自己免疫性疾患の原因並びに維持に含まれるので、ＩＬ−１エプシロンのアンタゴニストは、炎症性及び／または自己免疫性疾患の阻止あるいは治療に有用である。
【００９９】
ＩＬ−１媒介細胞シグナリングは、しばしば分子活性化カスケードを含み、その間、受容体は、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することによって、リガンドー受容体媒介シグナルを伝達し、結果として転写因子ＮＦκＢ並びにプロテインキナーゼＪｕｎ  Ｎ末端キナーゼ及びｐ３８マップキナーゼの活性化を生じる。これらの基質は、それら自身が、リン酸化に伴って活性化されるキナーゼであり得る。或いは、それらはリン酸化に伴ってタンパク質−タンパク質相互作用を通して下流のシグナリングを容易にするアダプター分子であり得る。
【０１００】
ＩＬ−１エプシロンは、アンタゴニストとして作用し、免疫及び炎症反応に阻害効果を有する可能性がある。例えば、ＩＬ−１エプシロンは、単離されかつ精製されたＩＬ−１ｒａの機能のような機能を有する可能性がある。本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチドもしくはその断片は、シグナルを阻害し並びに炎症性及び／または自己免疫性疾患を治療する治療薬として有用であり得る。しかしながら、下記実施例ＩＩＩに示されたデータに与えられたように、例えばＩＬ−１αもしくはＩＬ―１８のように、ＩＬ−１エプシロンはよりアゴニストであるようである。上記のように、このようなアゴニストは、自身の免疫系が不適切に反応する個人の免疫及び炎症反応を促進するのに有用である。ＩＬ−１エプシロン活性に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ）目的で、ＩＬ−１エプシロンの阻害剤が、当該技術分野で知られている技術を使用して、企図されもしくは設計されることが可能である。ＩＬ−１エプシロン阻害剤を含む、本発明のポリペプチドは、タンパク質を経静脈的に投与することによる、または、特定の細胞型を標的としたモノクローナル抗体に結合させることによる、ような良く知られた方法によって、細胞外環境に導入され、それによって、シグナリングに影響を与え得る。
【０１０１】
治療薬として使用される場合、本発明のポリペプチドは、既知の方法によって医薬組成物に処方され得る。ポリペプチドは、単一の活性物質としてもしくは他の既知の活性物質と共に、医薬的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，酢酸塩、リン酸塩）、防腐剤（例えば、チメロサ―ル、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、溶解剤、補強剤及び／または担体と混ぜ合わせて結合され得る。適切な担体及びそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。更に、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体をつくったり、ポリ酢酸、グリコール酸、ヒドロゲル等のような多量体化合物に組み入れられたり、あるいは、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層膜胞、赤血球陰影または球状芽球に組み入れられたりした、ポリペプチドを含み得る。このような組成物は、本発明のポリペプチドの物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出割合、及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス率に影響を与えるであろう。
【０１０２】
組成物の容量は、当業者によって容易に決定され得る。投与量及び投与回数は、実験的に決定可能であり、治療される病気並びに治療される患者の年齢及び体格も考慮に入れるだろう。
【０１０３】
治療は、経静脈的、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、鞘内、筋肉内、皮下、局所的には、扁桃、鼻腔内、腟内、及び経口的投与を含む、当業者に良く知られたいずれの方法による組成物の投与も含む。組成物は、特定の場所に筋肉内もしくは皮下注射することによるように、局所的に与えられることも可能である。
【０１０４】
さらに、本発明のポリペプチドに対するＤＮＡ，ポリペプチド及び抗体は、様々な研究プロトコールにおける試薬として使用され得る。このような研究プロトコールのサンプルは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．  Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示される。例えば、これらの試薬は、ＲＮＡもしくはタンパク質の、細胞特異的または組織特異的発現のマーカーとして役立ち得る。同様に、これらの試薬は、ＲＮＡもしくはポリペプチドの構成的及び一時的発現を調べるのに使用され得る。上記のように、このＤＮＡは、ＤＮＡの染色体上の位置を決定するため、及び、この染色体上の位置に関して遺伝子をマッピングするために使用され得る。このＤＮＡは、遺伝子疾患に関するリスクを同定するために、並びに、遺伝子フィンガープリンテイングのような技術を使用して遺伝子の不均一性及び遺伝性を調べるためにも使用され得る。このＤＮＡは、更に、この遺伝子に関連する付加的遺伝子を同定するために、及び、配列の比較に基く進化の系図を確立するために使用され得る。このＤＮＡ及びポリペプチドは、サザンブロッテイング及びイムノブロッテイングのような陽性スクリーニング手法、並びに、サブトラクションのような陰性スクリーニング手法を通して、このＤＮＡもしくはポリペプチドに相同な遺伝子もしくはタンパク質を選択するために使用され得る。
【０１０５】
さらに、ＩＬ−１エプシロンは、リガンドであるため、少なくとも一つのタンパク質、すなわち、その受容体との、タンパク質―タンパク質相互作用に参加する。そのため、本発明のポリペプチド及び断片は、（ａ）ポリペプチドが制御するタンパク質、及び、（ｂ）それが相互作用する可能性のあるタンパク質を同定するための試薬として使用され得る。それゆえ、ＩＬ−１エプシロンリガンドもしくはＩＬ−１エプシロンリガンドの成分を含むポリペプチドは、親和性マトリックスに再構成タンパク質を結合することによって、または、十分確立された分子生物学的技術に従って酵母２−ハイブリッド系でそれらを“えさ”として使用することによって、本発明のポリペプチドと直接相互作用するタンパク質を同定するために使用され得る。更に、本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチド及び断片は、ＩＬ−１受容体及び／またはＩＬ−１エプシロン受容体をの発見をめざす研究に使用を見出す。例えば、ＩＬ−１エプシロンポリペプチド及び、ＩＬ−１エプシロンポリペプチド断片は、受容体発現細胞を同定する結合研究に使用され得る。適切な結合研究は当該技術分野で知られており、当業者の知識内で十分である。同様に、本発明のＩＬ−１エプシロンポリペプチド及びポリペプチド断片は、発現クローニング技術を使用して、受容体のクローニングに更なる使用を見出す。
【０１０６】
ポリペプチド及びその断片は、ＩＬ−１及びＩＬ−１Ｒ相同体もしくはファミリーメンバーによって使用されるシグナル経路の研究及び／またはそれらのシグナル経路のブロッキングに、試薬として使用され得る。このような新しいＩＬ−１受容体相同体は、シグナル伝達経路に含まれる新しい分子を同定し、細胞及び組織発現を特徴づけ、発生、免疫、及び炎症反応におけるそれらの役割を理解し、並びに、制御分子及び生理学的に適切なタンパク質基質を同定するために、試薬として特異的に使用され得る。
【０１０７】
或いは、本発明のポリペプチドは、ポリ―ＨｉｓもしくはＦＬＡＧのような標識とともに発現に先立って設計され、その後、発現され、それぞれ、ニッケルキレートクロマトグラフィーもしくはレジンに結合した抗ＦＬＡＧ抗体を使用して精製され得る。一度レジンに結合すると、本発明のポリペプチドは、良く確立した技術を使用して、二価性クロスリンキング試薬を使用して共有結合的に付着され得るレジンに共有結合したポリペプチドは、その後、本発明のポリペプチドの親和性を通して、細胞溶解産物もしくは細胞上清から分子を（様々な試薬の処理を経て）精製するのに使用され得る。
【０１０８】
抗体
本発明の治療及び研究面の範囲内で、本発明のポリペプチド及びそのアミノ酸配列に基づいたペプチドは、そのポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するのに使用され得る。“抗体”という言葉は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）2，及びＦａｂ断片のような、その断片、並びに、あらゆる組換え産生結合パートナーを含むこととなっている。抗体は、もしそれらが本発明のポリペプチドと約１０7Ｍ-1より大きい又は同等のＫａで結合するならば、特異的に結合していると定義される。結合パートナーもしくは抗体の親和性は慣用技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）によって記載された方法を使用して容易に決定され得る。
【０１０９】
ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、もしくはラットのように様々なものから、当該技術分野においてよく知られている手法を使用して、容易に産生され得る。一般的には、本発明の精製ポリペプチド、もしくは、適切に結合がなされた、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基くペプチドは、典型的には、非経口的注入によって宿主動物に投与される。これらのポリペプチドの免疫原性はアジュバント、例えば、Ｆｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全アジュバントの使用によって増強され得る。追加免疫に続いて、血清の少量のサンプルが収集され、ポリペプチドに対する反応性がテストされる。このような決定に有用な様々なアッセイの例は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されているもの、並びに、向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡ），ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイのような手法を含む。米国特許第４，３７６，１１０号及び４，４８６，５３０号参照。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、良く知られている手法を使用して容易に作製され得る。例えば、米国特許庁第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号、及び、第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１９８０に記載された手法参照。簡単に述べると、Ｂａｌｂ／ｃマウスのような宿主動物は、本発明の単離及び精製ポリペプチドもしくは結合ポリペプチドを、任意にアジュバントの存在下で、少なくとも一度、好ましくは約３週間間隔で少なくとも２度腹腔内注入される。本発明の単離精製ポリペプチド１０μｇもしくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基くペプチドが、ＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩＣｏｒｐ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）の存在下に注入される。その後、どの動物が最高レベルの抗体を産生するのか、及び、どれの脾臓細胞が融合の最高の候補であるのかを決定するために、慣用的ドットブロット法もしくは抗体捕捉法（ＡＢＣ）によって、マウス血清がアッセイをされる。ほぼ２−３週間後、マウスは、無菌的ＰＢＳに浮遊された３μｇのようなポリペプチドもしくは結合ポリペプチドの静脈内追加免疫を与えられる。マウスは後に殺されて、脾臓細胞が、確立されたプロトコールに従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）のような、商業的に利用可能なミエローマ細胞と融合される。簡単に述べると、ミエローマ細胞は、媒質の中で数回洗われ、一つのミエローマ細胞に約３個の脾臓細胞の割合で、マウスの脾臓細胞に融合される。融合試薬は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），もしくは、より好ましくは、５０％ＰＥＧ：１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）のような当該技術分野において使用されるいかなる適切な試薬でも可能である。融合体は、ＨＡＴ補足ＤＭＥＭミデイウムのような、適切なミデイウムを含む、例えば２０個の９６穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に平板培養され、８日間増殖させられる。生じたハイブリドーマからの上清が収集され、例えば、最初にヤギ抗マウスＩｇでコートされた９６穴プレートに６０分間加えられる。洗浄に続いて、本発明の１２５Ｉ―ポリペプチドもしくはペプチドは、それぞれのウェルに加えられ、室温で６０分間インキュベートされ、４回洗われた。陽性のウェルはその後Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  Ｓ  ｆｉｌｍを使用して−７０℃でオートラジオグラフィ−を行なうような、慣用法で検出され得る。陽性クローンは、巨大培地で増殖し得て、上清がその後Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通すような方法で精製される。多くの技術が、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドに対する抗体の産生に使用され得ること、及び、この態様が本発明の範囲を決して限定することはないことは、当然理解される。
【０１１１】
本発明のモノクローナル抗体は、本明細書に参考文献として援用される、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｒａｂｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３：１−９（１９９０）に記載されるような別の技術を使用しても産生され得る。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変部位を組み入れる組換えＤＮＡ技術を使用して、構成され得る。このような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：３９４（１９８９）に記載されている。
【０１１２】
他の型の“抗体”は、当該技術分野の知識の状態に関連して、本明細書に提供された情報を使用して産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合できるヒト抗体の要素を含むように設計された抗体も、本発明の範囲に含まれる。
【０１１３】
一度単離かつ精製されると、本発明のポリペプチドに対する抗体は、確立されたアッセイプロトコールを使用して、資料中のポリペプチドの存在を検出するのに使用され得る。更に、本発明の抗体は、治療的にあるいは研究目的で、ポリペプチドに結合してその活性をｉｎ  ｖｉｖｏ  もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するように使用され得る。
【０１１４】
本発明のポリペプチドと免疫反応性のある抗体、及び、特に、これらのポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、本発明によって今や使用可能になる。このような抗体は、ポリペプチド活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するために、及び、資料中の本発明のポリペプチドの存在を検出するために有用であり得る。
【０１１５】
別の態様においては、本発明のポリペプチド及び断片化ペプチドに対して生成される抗体は、試料タンパク質の明白な分子量及び等電点を決定するためにこれらの分子量マーカーの使用において正確さを増すように、本発明のポリペプチドもしくは断片化ペプチド分子量マーカーと共同して使用され得る。本発明のポリペプチドもしくは断片化ペプチド分子量マーカーは、モル過剰量の試料タンパク質と混合され、混合物は慣用的方法によって２次元電気泳動によって分解され得る。ポリペプチドは、慣用法によって、ニトロセルロースのような適切なタンパク質結合膜にトランスファーされ、本発明の抗体によって検出され得る。
【０１１６】
薬剤の発見
本発明による精製ポリペプチドは、、このようなポリペプチドの阻害剤の発見を容易にするであろう。本発明の精製ポリペプチドの、その潜在的阻害剤のスクリーニングにおける使用は重要であり、不純物との干渉反応の可能性を消失もしくは減少させ得る。
【０１１７】
更に、本発明のポリペプチドは、ポリペプチド阻害剤の、構造に基く設計に使用され得る。このような構造に基く設計は、“合理的薬剤設計”としても知られている。ポリペプチドは、例えば、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴もしくは相同性モデリングのような、いずれも良く知られた方法によって、３次元的に解析され得る。阻害剤の設計及び阻害剤―ポリペプチド相互作用を助けるために、ポリペプチドの構造の情報を分子モデリングソフトウェアシステムに使用することも、本発明の範囲に含まれる。このようなコンピューター援助モデリング及び薬剤設計は、化学構造解析、分子の静電位、タンパク質折りたたみ構造等のような情報を使用し得る。例えば、メタロプロテイネ−スのクラス特異的阻害剤の設計の多くは、触媒亜鉛原子をキレートするあるいは結合する試みに集中した。合成阻害剤は、特定のプロテアーゼの特異的ポケットに合うように設計された一連の他の群に付着するように、負に荷電された成分を含むようにたいてい設計されている。本発明の特別な方法は、基質の想定される結合部位として本発明のポリペプチドの３次元構造を解析し、予想される反応部位を組み込んだ新しい分子を合成し、及び、上記の新しい分子をアッセイすることを含む。
【０１１８】
下記の実施例は、本発明のより十分な理解を促進するために提供される。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例Ｉ
新しいヒトＩＬ−１リガンドの単離及び同定
我々は、マウスＩＬ−１エプシロンの全コード配列に相当する32Ｐ−標識１本鎖ＤＮＡプローブの混合物を使用して、ヒトゲノムファージライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃９４６２０５）をスクリーニングした。低ストリンジェンシーの洗浄（低ストリンジェンシーの洗浄というのは、０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，室温、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐ．１０．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９６）で定義されている）の後、強度のハイブリダイゼーションシグナルを有する陽性クローンが同定された。このクローン由来でサザン解析に供されたＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローンされシークエンスされた５．５ｋｂＳａｌＩ−Ａｓｐ７１８制限断片を同定した。ＵＷＧＣＧコンピュータープログラム“ベストフィット”を使用した５．５ｋｂ断片の相同性解析は、クローン内の２１２ｂｐ領域が、マウスＩＬ−１エプシロンの３プライムエクソンにヌクレオチドレベルで７４％類似していることを見出した。図３に示したように、この２１２ｂｐ配列は、マウスＩＬ−１エプシロンの３プライムエクソンに６６％の類似性（６４％の同一性）を有する７０アミノ酸のオープンリーディングフレームを含む。
【０１１９】
ヒトＩＬ−１エプシロン部位周囲のゲノム配列は、製造者の指示書に従ってＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから利用可）を使用して５‘方向に更に５ｋｂ広げられた。この上流領域の配列の解析は、更に３つの推定上のエクソンを明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲが、４つの異なるヒト組織（胸腺、扁桃、並びに細胞株ＨＬ−６０及びＴＨＰ−１）由来のＲＮＡに、これらのエクソンの発現及び単一のＩＬ−１エプシロンｃＤＮＡへのそれらの連結を確認するために使用された。更に、ｃＤＮＡクローンが、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｒｒａｙ  Ｉから得られ、これも３つの３’の大部分のエクソンの結合を示した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｒｒａｙ  ＩからのｃＤＮＡクローンは、オープンリーディングフレームの５’末端には広がらない特別なクローンであった。全長ヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡ配列は、配列番号７及び配列番号１２に開示される。配列番号７及び配列番号１２によってコードされるポリペプチドは、順に、配列番号８及び配列番号１３に開示される。図４に示すように、配列番号８及び配列番号１３のアミノ酸５１−１５９はマウスＩＬ−１エプシロン（長型）と５３％の類似性（４９％の同一性）を共有する。
【０１２０】
実施例ＩＩ
放射性ハイブリッドマッピングによるヒトＩＬ−１エプシロンの染色体マッピング
ＰＣＲは、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ９３  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ−ＳＴＳ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）を使用して実施された。プライマーは、推定上ヒトＩＬ−１エプシロン３プライムエクソンの中にあるもので、かつ、ヒトゲノムＤＮＡからの１９５ｂｐ産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないものが使用された。ＰＣＲの結果は、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）上  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｓｉｔｅに提示されたデータベクターに変換された。データは、計算され、放射線ハイブリッドマップ上の既知のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ  Ｓｉｔｅ（ＳＴＳ）に関係のある染色体割り当て及び配置が提供された。その結果によると、ヒトＩＬ−１エプシロンは２番染色体上の、ＳＴＳ  Ｄ２Ｓ１２１から１１．５４ｃＲ及びマーカーＣＨＬＣ．ＧＡＡＴ１１Ｃ０３から４．３ｃＲの部位にある。下記のｗｅｂ  ｓｉｔｅは、放射線ハイブリッドマッピングについて更なる情報を提供する：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ−ＳＴＳ−ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ．
実施例ＩＩＩ
ヒトＩＬ−１エプシロンによるヒト細胞におけるシグナリング分子の活性化
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び他の炎症性サイトカインによって活性化されるのと同様の、ストレス反応に含まれるシグナリング分子の幾つかを、ＩＬ−１エプシロンが活性化できるのか否かを決定するために遂行されたテストと結果を、以下に述べる。
【０１２１】
ヒトＩＬ−１エプシロンは、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの数日後、馴化培地（一時的に発現されたＩＬ−１エプシロンを含む）が収穫された。テスト細胞は、この馴化培地、もしくは、替わりに、空の発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの馴化培地でインキュベートされた。インキュベーションして約１０分後、細胞抽出物がテスト細胞から作製されて、活性化されたシグナル分子の存在が、ＩＫＢα（Ｓｅｒ３２でリン酸化）、ｐ３８ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ１８０及びＴｈｒ１８２でリン酸化）、及びＳｔｒｅｓｓ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５でリン酸化）のリン酸化型に特異的な抗体の使用によってアッセイされた（抗体は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから得られた）。これらのシグナル伝達分子は、ＵＶ照射、エンドトキシン、及びＩＬ−１βを含む炎症性サイトカインのような刺激に対する広範囲の細胞反応に含まれることが知られている。対照馴化培地に比較して、ＩＬ−１エプシロンを含む馴化培地は、Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｒｅｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ及びＨｕｍａｎ  Ｕｍｂｅｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３０）を含む多数のヒト細胞株においてＩＫＢα及びｐ３８ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅのリン酸化を活性化した。非ホジキンリンホーマ細胞株Ｋ２９９において、ヒトＩＬ−１エプシロンは、ＪＮＫ／ＳＡＰＫリン酸化を特異的に活性化した。これらの結果はＩＬ−１エプシロンが、ストレス反応シグナリング経路に含まれることを示す。
【０１２２】
実施例ＩＶ
ヒトＩＬ−１エプシロンの組織分布
ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡの組織分布は、１本鎖ｃＤＮＡ鋳型のパネルからＰＣＲ増幅を使用して調べられた。具体的には、エクソン２に前向きプライマー、及び、エクソン４に後向きプライマーを使用して、共同して、ＩＬ−１エプシロンの４５０塩基対断片を増幅させて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌをスクリーニングした。ＰＣＲ反応は、６０℃のアニーリング温度で３５サイクル施行された。ＰＣＲ産物は、エチジウムブロマイドを使用してアガロースゲル上に検出された。
【０１２３】
ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡは、脾臓、リンパ節、胸腺、扁桃、及び白血球組織に検出された。ヒトＩＬ−１エプシロンｍＲＮＡの最高レベルを有する組織は、扁桃である。
【０１２４】
実施例Ｖ
ヒトＩＬ−１エプシロンによるヒト細胞におけるＩＣＡＭ−１レベルの活性化
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び他の炎症性サイトカインによって活性化されるのと同様の、ストレス反応に含まれる細胞表面分子の幾つかを、ＩＬ−１エプシロンが活性化できるのか否かを決定するために遂行されたテスト及び結果を、以下に記載する。
【０１２５】
ヒトＩＬ−１エプシロンがＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション数日後、馴化培地（一時的に発現したＩＬ−１エプシロンを含む）が収穫された。ヒト包皮ファイブロブラスト（ＨＦＦ）細胞は、新鮮０．５％血清含有培地で１：１に希釈されたこの馴化培地で、あるいは、替わりに、新鮮０．５％血清含有培地で１：１に希釈された、空の発現ベクターでトランスフェクトされた対照ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地で、３７℃１８時間インキュベートされた。
【０１２６】
ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地を用いた処理に続いて、ＨＦＦ細胞は、ＰＢＳで２回洗われ、ｖｅｒｓｅｎｅ（非トリプシン試薬）で組織培養容器から除去された。細胞表面ＩＣＡＭ−１レベルは、氷上で１時間、抗ＣＤ５４−ＰＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色して測定され、引き続き、洗浄され、ＦＡＣＳに基いて検出された。
【０１２７】
対照ＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地でインキュベートされたＨＦＦ細胞は、未処理細胞に比して、ＩＣＡＭレベルにわずかな上昇を示した。一方、ＩＬ−１エプシロンを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞由来の馴化培地で処理されたＨＦＦ細胞は、細胞表面ＩＣＡＭ−１レベルにおいて２倍の上昇を示した。ＩＬ−１エプシロン処理ＨＦＦ細胞上に見られたＩＣＡＭ−１染色のレベルは、精製ＩＬ−１βによって同細胞上に誘発されたものと同等であった。
【０１２８】
本明細書は、本明細書に参考文献として援用されている、本明細書に引用された参考文献の教示を考慮すると、非常に良く理解される。本明細書の中の態様は、本発明の態様の実例を提供するものであって、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が、請求された本発明に含まれることを認識している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明のヒトＩＬ−１エプシロンＤＮＡのヌクレオチド配列、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２である。
【図２】  図２は、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：１２のヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列、各々、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１３、である。
【図３】  図３は、ヒトＩＬ−１エプシロンおよびマウスＩＬ−１エプシロン（長型）の３’エキソン間のアミノ酸相同性を示している。
【図４】  図４は、ヒトＩＬ−１エプシロン（アミノ酸５１−１５９）およびマウスＩＬ−１エプシロン（長型）間のアミノ酸相同性を示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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