(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号６のコード領域；および
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと少なくとも９０％同一であるＤＮＡ配列を含み、ここでＩＬ−１８結合における補因子であるポリペプチドをコードしているＤＮＡ、
からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
ポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４】
ポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸残基の番号ｘ1ないし３５６、ここでｘ1はアミノ酸残基の番号１または１５であるアミノ酸配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで該核酸はＩＬ−１８結合における補因子をコードする、前記単離核酸分子。
【請求項５】
配列番号７のアミノ酸残基の番号ｘ1ないし３５６、ここでｘ1はアミノ酸残基の番号１または１５であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号７の配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドはＩＬ−１８結合における補因子である、前記ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）配列番号６のコード領域；および
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと少なくとも９０％同一であるＤＮＡ配列を含み、ここでＩＬ−１８結合における補因子であるポリペプチドをコードしているＤＮＡ、
からなる群より選択されるＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸残基の番号ｘ1ないし３５６、ここでｘ1はアミノ酸残基の番号１または１５である配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで該ポリペプチドはＩＬ−１８結合における補因子である、前記ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号７のアミノ酸残基の番号ｘ1ないし３５６、ここでｘ1はアミノ酸残基の番号１または１５であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項９のポリペプチドおよびＩｇのＦｃ領域を含む、融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項２のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターで形質転換されている宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することを含む、ポリペプチドを調製するための方法。
【請求項１４】
請求項１２の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０のポリペプチドに免疫反応性である抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、精製されそして単離されているＡＣＰＬポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに由来する断片化ペプチド、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量マーカーとしての使用、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの、ペプチド断片化に関するコントロールとしての使用、並びにこれらの試薬を含むキットに関する。本発明はさらに、ＩＬ−１８刺激に反応する細胞情報伝達、および細胞情報伝達におけるＡＣＰＬポリペプチドの関与に基づく誘導性タンパク質発現系の研究における、ＡＣＰＬポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードする核酸、およびこれらのポリペプチドに対し生成された抗体の使用に関する。
【０００２】
関連技術の説明
ＩＬ−１  Ｉ型受容体（ＩＬ−１Ｒ）は、ＩＬ−１の生物学的影響を仲介する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに起因すると考えられる活性には、炎症性サイトカインの誘導、並びにプロスタグランジン、メタロプロテイナーゼ、接着分子、急性期タンパク質、造血、発熱、骨吸収、およびＴｈ２細胞増殖および分化を含む、他の炎症性反応の誘導が含まれる。
【０００３】
ＩＬ−１は、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性の炎症性疾患と関連付けられてきている。ＩＬ−１が骨粗鬆症で役割を果たしている証拠が増えつつある。これらの働きはすべて、Ｉ型ＩＬ−１Ｒの細胞質部分の情報伝達機能により開始される。ＩＬ−１ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１受容体に結合し、それによりＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの接近を遮断するが、それ自体いかなる生物学的反応も引き出さないことによりＩＬ−１の活性を阻害する。
【０００４】
ＩＬ−１８はＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）であり、そしてＩＬ−１Ｒに相同な受容体、ＩＬ−１受容体関連タンパク質１（ＩＬ−１ＲｒｐＩ）（Ｐａｒｎｅｔら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７１：３９６７，  １９９６およびＴｏｒｉｇｏｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７２：２５７３７，  １９９７を参照されたい）を介しその働きを仲介する可能性がある。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞増殖および分化の刺激因子として作用し、そしてＴｈ１細胞からのインターフェロン産生の強力な誘導因子である。ＩＬ−１８はＮＫ細胞殺傷活性を亢進し、そして敗血症性ショック、肝臓破壊、および糖尿病に関連付けられてきている。さらに、ＩＬ−１８は、マウスで免疫学的に仲介されるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す（Ｍｉｃａｌｌｅｆら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４３：３６１，  １９９７）。
【０００５】
タンパク質の発見および同定は、現代分子生物学および生化学の最先端である。
【０００６】
試料タンパク質の一次構造、または配列の同定は、実験の困難な過程が成就した結果である。未知の試料タンパク質を同定するため、研究者は、当業者に知られる多様な技術を用い、未知の試料タンパク質の既知のペプチドへの比較に頼ることが可能である。例えば、タンパク質は、電気泳動、沈降、クロマトグラフィー、および質量分析などの技術を用い、日常的に解析される。
【０００７】
未知のタンパク質試料を既知の分子量と比較することにより、未知のタンパク質試料の見かけの分子量を決定することが可能になる（Ｔ．Ｄ．  ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．  Ｍａｄｉｇａｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  第６版，  １９９１））。タンパク質分子量標準は、未知のタンパク質試料の分子量概算を援助するため、商業的に入手可能である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．カタログ：１３０−１３１，  １９９５；Ｊ．Ｌ．  Ｈａｒｔｌｅｙ、米国特許第５，４４９，７５８号）。しかし、分子量標準は、見かけの分子量の正確な概算を可能にするには、未知の試料タンパク質に十分近い大きさに相当しない可能性がある。
【０００８】
化学的または酵素的手段により断片化にさらされるタンパク質の場合、分子量概算における困難の度合いが増す（Ａ．Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０６−１０８（Ｗｏｒｔｈ  Ｂｏｏｋｓ，  第２版，  １９８１））。化学的断片化は、メチオニン残基のカルボキシル側のペプチド結合切断を導く臭化シアンなどの化学薬品とタンパク質をインキュベーションすることにより、達成することが可能である（Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．  １１：２３８−２５５，  １９６７）。タンパク質の酵素的断片化は、多数のアミノ酸残基で切断するプロテアーゼとタンパク質をインキュベーションすることにより、達成することが可能である（Ｄ．Ｗ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：１１０２−１１０６，  １９７７）。タンパク質の酵素的断片化はまた、リジン残基のカルボキシル側のペプチド結合切断を導くアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ（Ｆ．  ＳａｋｉｙａｍａおよびＡ．  Ｎａｋａｔａ、米国特許第５，２４８，５９９号；Ｔ．  Ｍａｓａｋｉら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ６６０：４４−５０，  １９８１；Ｔ．  Ｍａｓａｋｉら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ６６０：５１−５５，  １９８１）などのプロテアーゼとタンパク質をインキュベーションすることにより、達成することも可能である。断片化ペプチドの分子量は、広い範囲の分子量に及ぶ可能性があり、そして該ペプチドは非常に多い可能性がある。断片化の度合いの変動もまた、達成することが可能である（Ｄ．Ｗ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：１１０２−１１０６，  １９７７）。
【０００９】
特定のアミノ酸構成要素に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質内の切断部位の特有の配置を生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特定の断片化は、特有の「ペプチドフィンガープリント」を生じる（Ｄ．Ｗ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：１１０２−１１０６，  １９７７；Ｍ．  Ｂｒｏｗｎら，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５０：３０９−３１６，  １９８０）。その結果、特定の部位での切断は、既定のタンパク質の、正確な分子量のペプチドへの、再現可能な断片化を生じる。さらに、これらのペプチドは、該ペプチドの等電点ｐＨを決定する特有の電荷特性を持つ。これらの特有の特性は、多様な電気泳動および他の技術を用い、利用することが可能である（Ｔ．Ｄ．  ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．  Ｍａｄｉｇａｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  第６版，  １９９１））。
【００１０】
未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られたならば、この未知のタンパク質の同定を援助するため、既知のタンパク質のデータベースに比較してもよい（Ｗ．Ｊ．  Ｈｅｎｚｅｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５０１１−５０１５，  １９９３；Ｂ．  Ｔｈｉｅｄｅら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，  １７：５８８−５９９，  １９９６）。多様なコンピューターソフトウェアプログラム、例えばＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、こうした比較を容易にするため、インターネットを介し、当業者に利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤および指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログラムは、試料タンパク質の同定の解明を補助するため、これらの分子量をタンパク質データベースと比較する。正確な同定には、断片化ペプチドの数およびこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。したがって、断片化ペプチドの数およびこれらのペプチドの正確な分子量の決定の正確さが増せば、未知のタンパク質の同定における成功は高まるはずである。
【００１１】
タンパク質の断片化はさらに、アミノ酸組成解析およびタンパク質配列決定のための断片の産生（Ｐ．  Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：１００３５−１００３８，  １９８７；Ｃ．  Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９８８，  ９：８３０−８３８，  １９８８）、特に「遮断（ｂｌｏｃｋｅｄ）」Ｎ−末端を持つタンパク質からの断片の産生に使用される。さらに、タンパク質の断片化は、質量分析のためのペプチドの調製（Ｗ．  Ｊ．  Ｈｅｎｚｅｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５０１１−５０１５，  １９９３；Ｂ．  Ｔｈｉｅｄｅら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，  １７：５８８−５９９，  １９９６）、免疫感作、アフィニティー選択（Ｒ．  Ａ．  Ｂｒｏｗｎ、米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾部位（例えばリン酸化）の決定、活性生物学的化合物の生成（Ｔ．  Ｄ．  ＢｒｏｃｋおよびＭ．  Ｔ．  Ｍａｄｉｇａｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ３００−３０１（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  第６版，  １９９１））、および相同タンパク質の識別（Ｍ．  Ｂｒｏｗｎら，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５０：３０９−３１６，  １９８０）に用いてもよい。
【００１２】
タンパク質研究並びにタンパク質構造および特性の解明における関心が続いているため、当該分野には、ペプチド断片化研究および分子量測定に用いるのに適切なポリペプチドに対する必要性が存在する。
【００１３】
発明の概要
本発明は、配列番号１、配列番号３のＤＮＡ配列、配列番号６のコード領域を含む単離核酸分子、並びに配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を含む。本発明はまた、これらの配列に相補的な核酸分子も含む。こうしたものとして、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列および配列番号６のコード領域並びに配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を含む、二本鎖核酸分子を含む。一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡおよびＤＮＡ  ＡＣＰＬ核酸分子が本発明に含まれる。これらの分子を用い、本発明に含まれるＡＣＰＬの一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡおよびＤＮＡ変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を検出することが可能である。二本鎖ＤＮＡプローブにより、核酸分子のどちらかの鎖に同等な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）核酸分子を検出することが可能になる。配列番号１または配列番号６のＤＮＡ配列、あるいは配列番号２または配列番号７のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を含む、変性二本鎖ＤＮＡに、６０℃、０．５  Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を伴う、５０％ホルムアミドおよび６  Ｘ  ＳＳＣ、４２℃における中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子が、本発明に含まれる。
【００１４】
本発明はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により配列番号１または配列番号６から得られる単離核酸分子を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、限定されるわけではないが、部位特異的突然変異誘発、無作為突然変異誘発、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成を含む、当業に知られる多くの技術を含むであろう。本発明はまた、遺伝暗号の結果として、配列番号１および配列番号６から縮重している単離核酸分子；ヒトＡＣＰＬ  ＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核酸分子、またはＡＣＰＬ  ＤＮＡの種相同体も含む。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指示する組換えベクターおよびこれらのベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞も含む。
【００１５】
本発明はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるような、およそ７０  ｋＤの分子量を有する単離ポリペプチドおよび非糖鎖付加型の単離ポリペプチドを含む、これらの核酸分子にコードされる単離ポリペプチドも含む。これらのポリペプチドに結合する単離ポリクローナルまたはモノクローナル抗体が本発明に含まれる。本発明はさらに、宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして培地からポリペプチドを回収することを含む、ＡＣＰＬポリペプチド産生のための方法を含む。特に、細菌、酵母、植物、および動物細胞におけるＡＣＰＬポリペプチドの発現が、本発明に含まれる。
【００１６】
さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを利用し、ＡＣＰＬポリペプチド対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子またはＡＣＰＬ結合タンパク質に関連する活性の潜在的な阻害剤をスクリーニングするアッセイ、およびＡＣＰＬポリペプチド対構造分子または結合タンパク質により仲介される疾患の治療のための治療剤として、ＡＣＰＬポリペプチドを用いる方法が、本発明に含まれる。さらにＡＣＰＬポリペプチドを、その阻害剤の設計に用いる方法もまた、本発明の側面である。
【００１７】
本発明はさらに、化学的または酵素的処理により、ＡＣＰＬポリペプチドから産生される断片化ペプチドを含む。さらに、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびその断片化ペプチドの型であって、化学的または酵素的手段による断片化に必要な部位が少なくとも1つ突然変異している前記型も、本発明の側面である。
【００１８】
本発明はまた、電気泳動を用い、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびその断片化ペプチドを視覚化するための方法も含む。本発明はさらに、タンパク質または断片化タンパク質試料の分子量概算を可能にする分子量マーカーとして、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびその断片化ペプチドを用いるための方法を含む。本発明はさらに、試料タンパク質の等電点の決定を援助するマーカーとして、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドを用いるための方法を含む。本発明はまた、タンパク質試料の断片化の程度を確かめるためのコントロールとして、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドを用いるための方法も含む。
【００１９】
本発明にさらに含まれるのは、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカー、その断片化ペプチド、および化学的または酵素的手段による断片化に必要な部位が少なくとも1つ突然変異しているＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーを利用し、試料タンパク質の分子量決定を援助するキットである。
【００２０】
やはり本発明に含まれるのは、ＡＣＰＬ依存誘導に基づく誘導性タンパク質発現系に関連する過程である。こうした系には、限定されるわけではないが、ＩＬ−１８刺激に反応するＮＦκＢ仲介情報伝達およびＩＬ−１８刺激に反応するＡｐ−１仲介情報伝達のＡＣＰＬ依存誘導が含まれる。本発明にさらに含まれるのは、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８のＩＬ−１８誘導に対する反応に関連する過程である。
【００２１】
発明の詳細な説明
マウスおよびヒトＡＣＰＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡが単離されそして配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６に開示される。ＡＣＰＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡのこの発見により、ＡＣＰＬポリペプチドおよびＡＣＰＬポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターの構築；発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞の構築；単離されそして精製されているタンパク質としての、生物学的に活性があるＡＣＰＬポリペプチドおよびＡＣＰＬ分子量マーカーの構築；並びにＡＣＰＬポリペプチドに免疫反応性である抗体の調製が可能になる。
【００２２】
ＡＣＰＬヌクレオチドおよびポリペプチドは以下のように得られた。マウス胸腺由来のＥＳＴ配列ＡＡ２０３９８６のＩＭＡＧＥクローンを得てそして配列決定した。本配列情報を用い、マウスＴ細胞（ＥＬ４）由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そしてＡＣＰＬ  ＤＮＡの全長ネズミクローンを単離し、そして配列決定した。該ＡＣＰＬ配列は、全読み枠に渡る少なくとも３つの別個の単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）由来の配列を代表する。マウスＡＣＰＬ  ＤＮＡのコード領域配列は、配列番号１に示す。配列番号１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に示す。配列番号１にコードされるマウスＡＣＰＬは、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号２のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号２の残基１−３５６）；２４アミノ酸の膜貫通領域（配列番号２の残基３５７−３８０）およびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号２の残基３８１−６１４）を含む。
【００２３】
本クローンの配列は、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーの配列と類似性を示し、それによりマウスＡＣＰＬ  ＤＮＡ（配列番号１）が、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーである受容体（配列番号２）をコードすることが示される。
【００２４】
ヒトＮＫ細胞ライブラリー由来のクローン、ＱＱ１３５２は、マウスＡＣＰＬ  ＤＮＡのヒト相同体として同定された。クローンＱＱ１３５２は、一部スプライシングされたｍＲＮＡクローンに相当し、そして本配列の一部は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託番号Ｂ６４４０３にて寄託された、ＢＡＣ由来のゲノムＤＮＡクローン内に見られるエクソンの配列と同一である。さらに、本配列（配列番号５のヌクレオチド１７９−２４４）は、ヒトＩ型ＩＬ−１Ｒのエクソン７の位に対応し、そしてＡＣＰＬポリペプチドが炎症性反応の仲介に関与していることが示される。
【００２５】
ＱＱ１３５２クローンにコードされるアミノ酸配列を、マウスＡＣＰＬポリペプチド配列と比較した。マウスＡＣＰＬポリペプチド配列と、ヌクレオチド５２２から始まる、ＱＱ１３５２の３つの異なる読み枠での翻訳物との最適合（ｂｅｓｔｆｉｔ）比較を行った。これらの並列から、配列の位に応じ、３つの読み枠すべてで、マウスおよびヒト配列間の有意な相同性につながる、少なくとも２つのフレームシフトがあることが明らかであり、ＱＱ１３５２がヒトＡＣＰＬの一部を含むことが立証された。
【００２６】
全長ヒトＡＣＰＬを得るため、ヒトｃＤＮＡクローン、ＱＱ１３５２を用い、ＰＢＬ、ＰＢＴおよびＮＫ  ｃＤＮＡライブラリーからクローンを探査（ｐｒｏｂｅ）した。プローブとして用いたクローンＱＱ１３５２の領域は、ネズミＡＣＰＬヌクレオチド１１９６から１７５３に相同であった。全長クローンは、これらのライブラリーのいずれからも得られなかったため、ベクター固定（ｖｅｃｔｏｒ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＰＣＲを各ライブラリーで行い、読み枠の５’末端を得た。ヒトＡＣＰＬの全長ＤＮＡ配列は、配列番号６に開示する。配列番号６にコードされるアミノ酸配列は、配列番号７に示す。配列番号６にコードされるＡＣＰＬは、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号７のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号７の残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（配列番号７の残基３５７−３８１）およびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号７の残基３８２−５９９）を含む。
【００２７】
ＡＣＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の同時発現は、ＩＬ−１８で刺激された細胞においてＮＦκＢ活性の劇的な亢進を生じる。対照的に、ＡＣＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の発現はＩＬ−１８反応性を生じない。したがって、ＡＣＰＬはＩＬ−１８反応を仲介するのに役割を果たし、そしてＩＬ−１８受容体複合体の構成要素である可能性がある。さらに、ＩＬ−１８の受容体を、ＩＬ−１８が誘導する炎症性反応の阻害剤として用いることが可能である。したがって、本発明の態様は、細胞外部分を含む。
【００２８】
本発明の好ましいＤＮＡおよびアミノ酸態様には、配列番号１および配列番号６のコード領域、並びにそれぞれ配列番号２および配列番号７に示される、配列番号１および配列番号６にコードされるアミノ酸が含まれる。さらなる好ましい態様は、ＡＣＰＬアミノ酸配列のドメインおよび該ドメインをコードするヌクレオチド配列である。配列番号７に関しては、該ドメインは：１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号７のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号７の残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（配列番号７の残基３５７−３８１）およびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号７の残基３８２−５９９）を含む。配列番号２に関しては、本発明のＡＣＰＬアミノ酸配列ドメインは：１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号２のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号２の残基１−３５６）；２４アミノ酸の膜貫通領域（配列番号２の残基３５７−３８０）およびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号２の残基３８１−６１４）を含む。
【００２９】
本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの構築；該発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞の構築；および単離されそして精製されている生物学的に活性があるポリペプチドおよびその断片の構築が可能になる。さらに、開示される核酸、およびその断片またはオリゴヌクレオチドの発見により、ＩＬ−１と相同性を有するタンパク質をコードする核酸を同定し、そしてＩＬ−１８仲介反応において役割を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしてそれらを使用することが可能になる。さらに、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、ヒト染色体２ｑ上のＤＮＡをマッピングし、そしてヒト染色体第２ｑ番に関連する特定の疾患、症候群または他のヒト異常に関連する遺伝子を同定するのに使用を見出す。以下の表は、いくつかのこうした疾患、症候群、または異常を確認する。
【００３０】
【表１】
0004409763.tif 000002
【００３１】
0004409763.tif 000003
【００３２】
本発明の核酸により、ＡＣＰＬ遺伝子にコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、該核酸由来の一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が可能になる。本発明のポリペプチドおよび可溶性断片（例えば配列番号２および配列番号７の細胞外ドメイン並びにその活性断片）を用い、ＩＬ−１８仲介反応を阻害し、そしてＡＣＰＬ依存誘導に基づく誘導性タンパク質発現系に関連する過程を研究してもよい。こうした系には、限定されるわけではないが、ＩＬ−１８刺激に反応するＮＦκＢ仲介情報伝達およびＩＬ−１８刺激に反応するＡｐ−１仲介情報伝達のＡＣＰＬ依存誘導が含まれる。同様にこうした過程には、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８のＩＬ−１８誘導に対する反応に関連するものが含まれる。
【００３３】
本発明のポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、さらに、分子量マーカーとしての使用、ペプチド断片化のコントロール試薬としての使用、そしてこれらの試薬を含むキットの構成要素としての使用を見出す。さらに、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片は、抗体の生成に有用である。こうして生成される抗体は、本発明に含まれ、そして治療剤として、および本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片を精製するための方法において、有用である。
【００３４】
核酸
１つの態様において、本発明は内因性成分の汚染がない、特定の単離ヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」は、別個の断片の形の、またはより大きな核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、実質的に純粋な型で、そして標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に略述されているものなど）によるその構成要素ヌクレオチド配列の同定、操作、および回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１度単離されているＤＮＡまたはＲＮＡから由来している。好ましくは、こうした配列は、真核遺伝子に典型的に存在する、内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されない読み枠の形で提供されおよび/または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がコード領域の操作または発現に干渉しない、読み枠の５’または３’に存在していてもよい。
【００３５】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡと共に、そのＲＮＡ相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も含む。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号６、または適切なその断片をプローブとして用い、慣用技術により単離してもよい。
【００３６】
本発明のＤＮＡ分子は、全長遺伝子と共にポリヌクレオチドおよびその断片を含む。全長遺伝子は、Ｎ−末端シグナルペプチドを含んでもよい。他の態様は、可溶性型をコードする、例えばシグナルペプチドを含むまたは含まない、該タンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む。
【００３７】
本発明の核酸は、好ましくは、ヒト供給源から由来するが、本発明は、非ヒト種由来のものもまた含む。
【００３８】
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号１、配列番号３および配列番号６に示されるものと異なり、そしてなお配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は、沈黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３９】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列であって：（ａ）配列番号１、配列番号３および配列番号６のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２および配列番号７のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そしてＡＣＰＬ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）非常にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に定義されるＤＮＡに対し遺伝暗号の結果として縮重しており、そして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡより選択される、前記単離ＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドが本発明に含まれる。
【００４０】
本明細書において、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．１．１０１−１０４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５  Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の前洗浄溶液、および約４２℃での、約５０％ホルムアミド、６  Ｘ  ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５  Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２  Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。
【００４１】
本発明の態様としてやはり含まれるのは、以下に記載されるような、不活性化Ｎ−糖鎖付加部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミノ酸置換を含む、ポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００４２】
別の態様において、本発明の核酸分子はまた、天然配列に少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列も含む。やはり意図されるのは、核酸分子が、天然配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一である配列を含む、態様である。
【００４３】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７，  １９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，  １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００４４】
本発明はまた、ポリペプチドの産生に有用な単離核酸も提供する。こうしたポリペプチドは、いくつかの慣用技術のいずれにより調製してもよい。ＡＣＰＬポリペプチド、または望ましいその断片をコードするＤＮＡ配列を、該ポリペプチドまたは断片を産生するための発現ベクター内にサブクローンしてもよい。ＤＮＡ配列は、好都合に、適切なリーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合させる。あるいは、既知の技術を用い、望ましい断片を化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離してもよい。必要であれば、望ましい点まで５’または３’末端を再構築したオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化により生成されたＤＮＡ断片に連結してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドはさらに、望ましいコード配列、およびコード配列のＮ−末端の開始コドン（ＡＴＧ）位の上流に、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含んでもよい。
【００４５】
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、望ましいタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離しそして増幅するのに使用してもよい。ＤＮＡ断片の望ましい末端を定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。該オリゴヌクレオチドはさらに、発現ベクターへの増幅ＤＮＡ断片の挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含んでもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｗｕら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，サンディエゴ（１９８９）；ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００４６】
ポリペプチドおよびその断片
本発明は、ポリペプチドおよび多様な型のその断片を含み、天然発生である、または組換えＤＮＡ技術を伴う方法などの多様な技術を通じ産生されるものを含む。こうした型には、限定されるわけではないが、誘導体、変異体、およびオリゴマーと共に、融合タンパク質またはその断片が含まれる。
【００４７】
当業者は、上述のＡＣＰＬポリペプチドドメイン（例えば細胞外ドメイン、シグナルペプチド、膜貫通領域および細胞質ドメイン）の境界はおよそのものであり、そして膜貫通領域およびシグナルペプチド（本目的のため利用可能であるコンピュータープログラムを用いることにより予測することが可能である）境界は上述のものと異なる可能性があることを認識するであろう。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、膜に結合していても、または分泌されそしてしたがって可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能である。一般的に、可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離などにより、望ましいポリペプチドを発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を培地から分離し、そして望ましいポリペプチドの存在に関し培地（上清）をアッセイすることにより、同定する（そして非可溶性膜結合対応物と区別する）ことが可能である。培地中にポリペプチドが存在することにより、該ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって該タンパク質の可溶性型であることが示される。
【００４９】
１つの態様において、可溶性ポリペプチドおよびその断片は、細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むが、細胞膜へのポリペプチドの保持を生じるであろう膜貫通領域を欠く。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生細胞から分泌される限り、細胞質ドメイン、またはその一部を含んでもよい。可溶性ポリペプチドのさらなる例は、細胞質ドメインおよび膜貫通領域だけでなく、上述のスペーサー領域のすべてまたは一部も欠いているものである。
【００５０】
一般的に、可溶性型の使用は特定の適用に有益である。可溶性ポリペプチドは宿主細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与に、より適している。さらに、可溶性ポリペプチドは、ＡＣＰＬ結合タンパク質に関連する活性を阻害するのに有用である可能性がある。
【００５１】
本発明はまた、ＡＣＰＬポリペプチド、および望ましい生物学的活性を保持するその断片（例えば細胞外ドメイン）も提供する。特定の態様は、ＡＣＰＬ結合タンパク質または結合パートナーに結合する能力を保持するポリペプチド断片に関する。こうした断片は、上述のように可溶性ポリペプチドであってもよい。別の態様において、ポリペプチドおよび断片は、好都合に、上述のようなＩＬ−１受容体ファミリーに保存される領域を含む。
【００５２】
本明細書にやはり提供されるのは、配列番号２または配列番号７の配列の隣接アミノ酸を少なくとも２０、または少なくとも３０含むポリペプチド断片である。細胞質ドメイン由来の断片は、情報伝達研究において、そして生物学的情報の伝達に関連する細胞過程の制御において、使用を見出す。ポリペプチド断片はまた、抗体を産生する際の免疫原として使用してもよい。
【００５３】
変異体
天然発生変異体と共に、ポリペプチドおよび断片由来変異体が本明細書に提供される。
【００５４】
変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示してもよい。やはり意図されるのは、ポリペプチドまたは断片が、好ましいポリペプチドまたはその断片に、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、態様である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３，  １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５，  １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。
【００５５】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタンパク質分解切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が生物学的に活性があるタンパク質を生じる可能性があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型などがある。タンパク質分解に起因すると考えられる変動には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現に際しての、該タンパク質からの１つまたはそれ以上の末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去によるＮ−またはＣ−末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違を遺伝的多型性（該タンパク質を産生する個体の間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク質もまた、本発明に意図される。
【００５６】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、他の化学部分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体を形成することにより、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の、官能基上に、化学部分を連結することにより、調製してもよい。以下により詳細に記載されるような、結合している診断用剤（検出可能）または治療剤を含む結合体が本発明に意図される。
【００５７】
他の誘導体には、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体として組換え培養において合成されることによる、該ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体が含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと関連し、以下に論じられる。さらに、融合タンパク質は精製および同定を容易にするため添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリＨｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ  ９２５９号下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）に結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００５８】
本明細書に提供される変異体ポリペプチドの中に、天然の生物学的活性を保持する天然ポリペプチドの変異体または実質的なその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）がある。１つの例は、天然型と本質的に同一の結合親和性でその結合タンパク質または結合パートナーに結合する変異体である。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして以下に示されるように、簡便な方法により測定することが可能である。
【００５９】
変異体には、実質的に天然型と相同であるが、1つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較して、アミノ酸残基の１ないし１０の欠失、挿入または置換を含むポリペプチドが含まれる。
【００６０】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。
【００６１】
同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性があるポリペプチドをコードする変異体が含まれる。
【００６２】
本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現されたポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付加パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）での本発明のポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用的な方法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除去してもよい。一般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよい。
【００６３】
これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは末端または内部の残基または配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築物が、本発明に含まれる。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−糖鎖付加部位を修飾し、糖鎖付加を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ−糖鎖付加部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで置換してもよい。タンパク質のＮ−糖鎖付加部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。
【００６４】
変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるようにし、フォールディングまたは再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを妨げてもよい。
【００６５】
他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢進させるため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の発生を除去するため、残基を欠失、付加、または置換することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的なそして好ましいアプローチを代表する。
【００６６】
オリゴマー
本発明に含まれるのは、ＡＣＰＬポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパク質である。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。上述のように、好ましいポリペプチドは可溶性であり、そしてしたがってこれらのオリゴマーは可溶性ポリペプチドを含んでもよい。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価、三価などの結合部位を提供する。
【００６７】
本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介し結合している多数のポリペプチドを含むオリゴマーに関する。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドが、結合するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチドに含まれる。
【００６８】
免疫グロブリンに基づくオリゴマー
１つの代替物として、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用い、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定の異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，  １９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｓｕｐｐｌ．４，  １０．１９．１−１０．１９．１１，  １９９２）に記載されている。
【００６９】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合させることにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され、二価分子を生じる。
【００７０】
本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたはすべてを含む抗体のＦｃ領域から構成される天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型ポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むこうしたポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。好ましいポリペプチドはヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含む。
【００７１】
ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９３／１０１５１号（本明細書に援用される）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒンジ領域から天然Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１，  １９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。本突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ  ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。
【００７２】
Ｆｃ部分を含む上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。
【００７３】
他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関し置換してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＡＣＰＬ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。あるいは、ＡＣＰＬまたはＡＣＰＬの可溶性断片、例えば細胞外領域、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１の可溶性断片、例えば細胞外領域が、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関し置換されるように、融合タンパク質を調製してもよい。
【００７４】
ペプチドリンカーに基づくオリゴマー
あるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまたは含まない多数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの中に、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーにより分離された、２ないし４つの可溶性ＡＣＰＬポリペプチドを含む。同様に、上述のように、融合タンパク質は、２つのＡＣＰＬポリペプチドまたは断片および２つのＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたは断片を含んでもよい。
【００７５】
ロイシンジッパー
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）、そして以来、多様な異なるタンパク質で見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中に、二量体化または三量体化する天然発生ペプチドおよびその誘導体がある。
【００７６】
ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成ドメインとも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復が含まれ、しばしば４つまたは５つのロイシン残基が、他のアミノ酸に点在する。ジッパードメインの例には、酵母転写因子ＧＣＮ４およびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；  Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，  １９８９）がある。２つの核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎもまた、ネズミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物同様、ジッパードメインを示す（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含む（Ｏ'Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５；６４６，  １９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，  １９８９）。ジッパードメインは、これらのタンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必要である。
【００７７】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５４７，  １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３９４，  １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：７０３，  １９９０）。これらの融合体形成性ウイルスタンパク質のジッパードメインは、該タンパク質の膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメインが、該融合体形成性タンパク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されてきている。融合体形成性ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓｐｒｕｃｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８８：３５２３，  １９９１）。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリゴマー化に役割を果たしているとも報告されてきている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：２３０，  １９９３）。
【００７８】
ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ'Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９，  １９９１）。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃｒｉｃｋにより１９５３年に提唱されたような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ６：６８９）により、よく特徴付けられている。ジッパードメインにより形成された二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：２９３；  １９７５）の表記にしたがい、（ａｂｃｄｅｆｇ）nと表される、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ジッパードメインから形成される平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされる。
【００７９】
ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し、そしてオリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．  ３８：２２９，  １９９１）。Ｌｏｖｅｊｏｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８，  １９９３）は最近、らせんが上−上−下に走る、三重鎖αらせん束合成を報告した。彼らの研究により、疎水性安定化エネルギーが、らせん単量体からのコイルドコイルの形成のための主要な原動力を提供していることが裏付けられた。これらの研究はまた、静電相互作用がコイルドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示している。ロイシンジッパーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１，  ２６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９３）に見られる。
【００８０】
可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９４／１０３０８号に記載されると共に、本明細書に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，  １９９４）に記載される肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパードメインも一例である。修飾ロイシンジッパーに融合している異種性タンパク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：２６７−２７８，  １９９４）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合している可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形成される可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。
【００８１】
特定のロイシンジッパー部分は、優先的に三量体を形成する。１つの例は、本明細書に完全に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，  １９９４）および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、上述の肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。本肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒを含む。
【００８２】
三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇを含むペプチドである。１つの別の態様において、Ｎ−末端Ａｓｐ残基が添加され；別の態様では、該ペプチドはＮ−末端Ａｒｇ残基が欠けている。
【００８３】
オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もまた、使用してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述のアミノ酸配列に示される１つまたは２つのＮ−末端またはＣ−末端残基を欠くペプチドが含まれる。ロイシンジッパーは、天然発生ロイシンジッパーから、例えばオリゴマー化を促進するペプチドの能力が保持されるように、天然アミノ酸配列の保存的置換を介し、得てもよい。
【００８４】
天然発生三量体タンパク質由来の他のペプチドを、三量体ＡＣＰＬを含むオリゴマーＡＣＰＬを調製するのに使用してもよい。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドを使用してもよい。特定の態様において、ロイシンジッパー部分のロイシン残基を、イソロイシン残基により置換してもよい。イソロイシンを含むこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと呼んでもよいが、本明細書において「ロイシンジッパー」という用語に含まれる。
【００８５】
ポリペプチドおよびその断片の産生
本発明のポリペプチドおよび断片の単離および精製は、いかなる適切な技術により達成してもよく、限定されるわけではないが以下を含む：
発現系
本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング用および発現ベクターと共に、該組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを用い、該ＤＮＡにコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製してもよい。ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換されている宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、その後培養から発現ポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現ポリペプチドを精製するための方法は使用する宿主細胞の種類、および該ポリペプチドが膜に結合しているかまたは宿主細胞から分泌される可溶性型かなどの要因にしたがい、多様であろうことを認識するであろう。
【００８６】
いかなる適切な発現系を使用してもよい。ベクターは、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されている、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。
【００８７】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞からの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。
【００８８】
当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位は、コンピュータープログラムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞の種類などの要因にしたがい、多様である可能性があることも認識するであろう。タンパク質調製は、１つ以上の部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ−末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含んでもよい。
【００８９】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核細胞が含まれる。宿主細胞としての使用には、哺乳動物または昆虫細胞が一般的に好ましい。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主に適したクローニング用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ニューヨーク州エルセビア（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、ポリペプチドを産生するのに使用してもよい。
【００９０】
原核発現系
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。
【００９１】
原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）など、商業的に入手可能なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。
【００９２】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，  １９７８；  およびＧｏｅｄｄｅｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，  １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７，  １９８０；  およびＥＰ−Ａ−３６７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．４１２，  １９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な、λＰLプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ  ３７０９２に常住）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ  ５３０８２に常住）が含まれる。
【００９３】
酵母系
あるいは、ポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞において発現されてもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ，  ＥＰＡ−７３，６５７にさらに記載されている。他の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２）に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターは、大腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、構築してもよい。
【００９４】
酵母α−因子リーダー配列を使用し、ポリペプチドを直接分泌させてもよい。α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２およびＢｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が当業者に知られる。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたはそれ以上の制限部位を含むよう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融合するのを容易にするであろう。
【００９５】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒｐ+形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００９６】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例は、８０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【００９７】
哺乳動物または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＡＣＰＬポリペプチドを発現するのに使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。
【００９８】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  １９９０，  ｐｐ．１５−６９）。商業的に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さらなるプロトコルを用い、細胞をトランスフェクションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，  １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版．  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）におけるもののような、慣用的な方法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションしてもよい。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当業に知られる方法を用い、行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１，  １９９０は、いくつかの選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などを記載する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であってもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，  １９８０）。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、そしてプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させてもよい。発現ベクターに組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい。
【００９９】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９９０）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡るおよそ２５０  ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた用いてもよい。
【０１００】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさらなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ｐｐ．５２９−５３４およびＰＣＴ出願第ＷＯ  ９７／２５４２０号）並びにアデノウイルス２由来の三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３４７５−１３４９１，  １９８２）などの要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：２９５−３００，  １９９３；Ｒａｍｅｓｈら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：２６９７−２７００，  １９９６）。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９９０）。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１５０−１６１，  １９９７に記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ｐｐ．５２９−５３４に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【０１０１】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら，  Ｃｅｌｌ  ５９：３３５−３４８，  １９８９に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示されるように構築してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ  ９１／１８９８２に記載されている。さらに別の代替物として、ベクターは、レトロウイルス由来であってもよい。
【０１０２】
さらなる有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１もまた用いてもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）疎水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）により発現される組換えタンパク質のＮ−末端に融合させることを中心とする。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞でタンパク質を発現させるために用いる、別の特殊化ベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリアデニル化部位と共に含む、二シストロン性配列により特徴付けられる。
【０１０３】
使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然シグナルペプチドを異種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されるべき宿主細胞の種類などの要因に依存する可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能する異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【０１０４】
単離および精製
本発明はまた、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片を単離しそして精製する方法も含む。
【０１０５】
本発明に含まれる「単離」ポリペプチドまたはその断片は、天然に見られる可能性がある環境と同一でない環境にあるＡＣＰＬポリペプチドまたは断片である。本発明に含まれる「精製」ポリペプチドまたはその断片は、例えば上述のような組換え発現系の精製産物のように、または天然発生細胞および／または組織などの非組換え供給源からの精製産物のように、他のタンパク質またはポリペプチドとの結合を本質的に含まない。
【０１０６】
１つの好ましい態様において、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発明のポリペプチドまたは断片の、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を補助する別のポリペプチドへの融合を用い、達成してもよい。こうした融合パートナーは、上述のようなポリ−Ｈｉｓまたは他の抗原性同定ペプチドと共に先に記載されるＦｃ部分を含んでもよい。
【０１０７】
いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られるように、組換えポリペプチドまたは断片を精製するための方法は、使用する宿主細胞の種類および組換えポリペプチドまたは断片が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、多様であろう。
【０１０８】
一般的に、組換えＡＣＰＬポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合、宿主細胞から、あるいは可溶性でありそして分泌される場合、培地または上清から単離してもよく、その後１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階が続く。これらの段階を達成する特定の方法については、培地をまず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側鎖を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使用される他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシング段階を使用してもよい。あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を使用してもよい。適切なマトリックスは、樹脂に結合しているフェニルまたはオクチル部分であってもよい。さらに、組換えタンパク質に選択的に結合するマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用してもよい。使用されるこうした樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キレートカラムである。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、側鎖メチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、さらにポリペプチドを精製してもよい。多様な組み合わせの前記の精製段階のいくつかまたはすべてが周知であり、そして単離されそして精製されている組換えタンパク質を提供するのに使用してもよい。
【０１０９】
ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質、例えばＡＣＰＬポリペプチドまたはその断片に対し生成されたモノクローナル抗体などを含むアフィニティーカラムを利用し、発現されたポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これらの精製ＡＣＰＬポリペプチドは、慣用的技術を用い、例えば、高塩溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に透析することによって、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他の構成要素を変化させることによって、あるいは親和性部分の天然発生基質、例えば本発明由来のポリペプチドを用い、競合的に除去することによって、アフィニティーカラムから除去してもよい。
【０１１０】
本発明の本側面において、ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質、例えば本発明の抗ポリペプチド抗体またはＡＣＰＬポリペプチドと相互作用する可能性がある他のタンパク質を、その表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定し、分離し、または精製するのに適したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の支持体などの固相支持体に結合させてもよい。固相接触表面へのＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質の結合は、いかなる手段により達成してもよく、例えば磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合タンパク質で被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、上にこうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。ＡＣＰＬポリペプチドを表面上に有する細胞が固定ポリペプチド結合タンパク質に結合し、そしてその後非結合細胞を洗い流す。本親和性結合法は、溶液からこうしたポリペプチド発現細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用である。固相から陽性に選択された細胞を遊離させる方法は当業に知られ、そして例えば酵素の使用を含む。こうした酵素は好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう、指示される。
【０１１１】
あるいは、ＡＣＰＬポリペプチド発現細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず、ビオチン化ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションしてもよい。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの強い親和性が、ポリペプチド結合細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用は当業に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。非結合成分を除去するためのの洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用い行う。
【０１１２】
望ましい純度は、タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検出不能であるように精製される。当業者は、異なる糖鎖付加、異なる翻訳後プロセシング、およびそれらに匹敵するもののため、該ポリペプチドに対応する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。タンパク質バンドは銀染色、クーマシーブルー染色により、または（タンパク質が放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーにより、視覚化してもよい。
【０１１３】
アッセイ
本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）を、慣用的な結合アッセイなど、いかなる適切なアッセイにおいて、結合能に関し試験してもよい。例として、ポリペプチドを検出可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素、およびそれらに匹敵するもの）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、適切なＡＣＰＬ結合タンパク質、例えば抗ＡＣＰＬ抗体を発現している細胞と接触させる。細胞をその後、洗浄し、非結合標識ポリペプチドを除去し、そして細胞に結合している標識の存在を、標識の性質にしたがい選択される適切な技術により、決定してもよい。
【０１１４】
結合アッセイ法の１つの例は以下の通りである。ＡＣＰＬ結合タンパク質ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。１０  ｃｍ2プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を該組換え発現ベクターでトランスフェクションする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターからドライブされるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であった。
【０１１５】
トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をその後、２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞（約４  ｘ  １０4細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０  ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５  ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２  ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７．２を含むＲＰＭＩ  １６４０）である。該細胞をその後、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質と、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞をその後、洗浄し、そして結合培地中で、125Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、トリプシン処理を介し細胞を遊離させる。
【０１１６】
上記のマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用い、放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、125Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合タンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイすると共に、Ｆｃ融合タンパク質および２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。
【０１１７】
細胞結合125Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）はＭｉｃｒｏｖａｘコンピューター上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。
【０１１８】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、ＡＣＰＬ変異体の生物学的活性は、該変異体が、ＡＣＰＬ結合タンパク質への結合に関し、天然タンパク質と競合する能力をアッセイすることにより、決定してもよい。
【０１１９】
競合結合アッセイは、慣用的方法論により行ってもよい。競合結合アッセイに使用してもよい試薬には、放射標識ＡＣＰＬ、およびＡＣＰＬ結合タンパク質（内因性または組換え）を細胞表面に発現している損なわれていない細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性ＡＣＰＬ断片を用い、細胞表面ＡＣＰＬ結合タンパク質への結合に関し、可溶性ＡＣＰＬ変異体と競合させてもよい。損なわれていない細胞の代わりに、（固相上の）プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ部分との相互作用を通じ固相に結合している可溶性ＡＣＰＬ可溶性タンパク質／Ｆｃ融合タンパク質で代用してもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１２０】
別の種類の競合結合アッセイは、放射標識可溶性ＡＣＰＬ結合タンパク質、例えばＡＣＰＬ結合タンパク質／Ｆｃ融合タンパク質、およびＡＣＰＬを発現する損なわれていない細胞を利用する。定性的結果は、競合オートラジオグラフプレート結合アッセイにより得てもよく、一方、定量的結果を生成するのにＳｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）を利用してもよい。
【０１２１】
ＡＣＰＬ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用
上述のように、ポリペプチドを発現するのに用いられるほか、ＤＮＡを含む本発明の核酸およびそのオリゴヌクレオチドを以下に用いてもよい：
ヒト染色体第２ｑ番を同定するため
ヒト染色体第２ｑ番上の遺伝子をマッピングするため
ヒト染色体第２ｑ番と関連する、特定の疾患、症候群、または他の異常に関連する遺伝子を同定するため；
一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＡＣＰＬ遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を阻害するため；
個体において不全遺伝子を検出するのを補助するため；および
遺伝子治療のため。
【０１２２】
プローブ
本発明の核酸の使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含む。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含む。
【０１２３】
配列番号１、配列番号３および配列番号４および配列番号６の、他の哺乳動物種由来の相同体が本明細書に意図されるため、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６のＤＮＡ配列に基づくプローブを用い、慣用的な種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーション技術を用い、他の哺乳動物種由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１２４】
遺伝暗号の知識を、上に示されるアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。
【０１２５】
染色体マッピング
配列番号１、配列番号３、および配列番号６の核酸のすべてまたは一部は、オリゴヌクレオチドを含め、当業者により、周知の技術を用いる、ヒト２ｑ、並びにＩＬ−１受容体ＩおよびＩＩ、ＳＴ２およびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む、ＩＬ−１ＲファミリーメンバーのＤＮＡを含む、特定のその遺伝子座を同定するのに用いてもよい。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ）マッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの、多様な周知の技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することを含む。
【０１２６】
例えば、染色体は放射ハイブリダイゼーションによりマッピングしてもよい。第一に、９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）。目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、インターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データをスコア化し、そして放射ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた割り当ておよび配置が提供される。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関し、さらなる情報を提供する：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【０１２７】
関連する疾患の同定
下に示すように、配列番号６のＤＮＡは染色体２ｑにマッピングされている。該領域は、限定されるわけではないが、上記の表１に同定されるものを含む特定の疾患に関連している。したがって、当業者は、周知の技術を用い、染色体２ｑにマッピングされる遺伝子に関連する異常を解析するのに、配列番号６の核酸またはその断片を用いてもよい。これにより本マーカーが再配置または欠失されている状態を識別することが可能になる。さらに、配列番号６のヌクレオチドまたはその断片は、未知の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして用いてもよい。
【０１２８】
本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに、該ＤＮＡを用いてもよい。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示される天然ヌクレオチド配列と、本遺伝子に不全を宿すると疑われるヒト由来の遺伝子のものとを比較することにより、検出してもよい。
【０１２９】
センス−アンチセンス
核酸の他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号６のＤＮＡの断片を含む。こうした断片は一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオチドを含む。既定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９，  １９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，  １９８８）に記載されている。
【０１３０】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、ＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡ分解の亢進、スプライシングの阻害、転写または翻訳の未成熟な終結、あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つにより、タンパク質発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、タンパク質の発現を遮断してもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル骨格（または、ＷＯ  ９１／０６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてこのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。こうした耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可能である）が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。
【０１３１】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ（Ｌ−リジン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合するオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾してもよい。
【０１３２】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、ＣａＰＯ4仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、いかなる遺伝子トランスファー法により、あるいはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。
【０１３３】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ  ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。
【０１３４】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離される。
【０１３５】
ポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用
使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：
タンパク質の精製およびその活性の測定
搬送剤
治療および研究用試薬
分子量および等電点電気泳動マーカー
ペプチド断片化のコントロール
未知のタンパク質の同定
抗体の調製。
【０１３６】
精製試薬
本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬として使用を見出す。例えば、ＡＣＰＬポリペプチドを固体支持体成分に結合させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーによりＡＣＰＬ結合タンパク質を精製するのに用いてもよい。特定の態様において、ポリペプチド（ＡＣＰＬ結合タンパク質に結合することが可能な、本明細書に記載されるいかなる型でもよい）を、慣用的方法により固体支持体に結合させる。１つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含む、クロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、ポリペプチド／Ｆｃタンパク質（上述のようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じ、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに結合させる。
【０１３７】
該ポリペプチドはまた、細胞表面上にＡＣＰＬ結合タンパク質を発現する細胞を精製する、または同定するのに使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球体をポリペプチドで被覆し、そして磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。ＡＣＰＬ結合タンパク質発現細胞を含む細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上にＡＣＰＬ結合タンパク質を発現する細胞が固定ポリペプチドに結合し、そしてその後非結合細胞を洗い流す。
【０１３８】
あるいは、ポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、その後、結合タンパク質発現に関し試験すべき細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、非結合標識成分を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。
【０１３９】
さらに別の代替物において、ＡＣＰＬ結合タンパク質細胞を含むと疑われる細胞混合物をビオチン化ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを装填したカラムに通過させ、これによりビオチンのアビジンに対する高い親和性が、望ましい細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズを用いる方法が知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９，  １９８６を参照されたい）。非結合成分を除去するための洗浄、および結合細胞の遊離は、慣用法を用い行う。
【０１４０】
活性測定
ポリペプチドはまた、その結合親和性に関しＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を測定するのにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件下でのタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品質保証」研究を行うものにより、使用してもよい。例えば、ポリペプチドを結合親和性研究に使用し、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生されたＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を測定してもよい。該タンパク質はまた、ＡＣＰＬ結合タンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然変異など）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも用いてもよい。修飾ＡＣＰＬ結合タンパク質の結合親和性を、非修飾ＡＣＰＬ結合タンパク質のものと比較し、ＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。したがって、例えばＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を、調査研究において用いる前に確認することが可能である。
【０１４１】
搬送剤
該ポリペプチドはまた、結合する剤を、ＡＣＰＬ結合タンパク質を発現している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリペプチドを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または治療剤をこうした細胞に（または細胞表面上にＡＣＰＬ結合タンパク質を発現することが見出されている他の細胞種に）搬送してもよい。
【０１４２】
ポリペプチドに結合させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および治療剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素、およびそれらに匹敵するものが、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、123Ｉ、131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、および76Ｂｒがある。治療使用に適した放射性核種には、131Ｉ、211Ａｔ、77Ｂｒ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、109Ｐｄ、64Ｃｕ、および67Ｃｕがある。
【０１４３】
こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ポリペプチドに結合させてもよい。ポリペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよい。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に結合させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴ってもよい。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を、例えば適切な二官能性キレート剤を用いることにより、受容体に結合させてもよい。
【０１４４】
ポリペプチドおよび適切な診断用剤または治療剤を含む（好ましくは共有結合している）結合体をこのように調製する。該結合体を投与し、またはそうでなければ特定の適用に適した量で使用してもよい。
【０１４５】
治療剤
本発明のポリペプチドを、ＡＣＰＬ、またはＩＬポリペプチドを含む、いかなる結合パートナーの不全、過剰または不十分な量により（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに用いてもよい。単離されそして精製されているＡＣＰＬポリペプチドまたはその断片はまた、それ自体ＩＬ−１およびＴＮＦ情報伝達を阻害する治療剤として有用である可能性もある。ＡＣＰＬのこうした治療的使用は、周知の手段による、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片を細胞内環境へ指示することによる、その投与を伴う可能性がある。こうした手段の１つは、該タンパク質をリポソームに入れる、または該タンパク質を特定の細胞種に標的化されているモノクローナル抗体にカップリングさせることによる。
【０１４６】
ポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、ＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を阻害するのにも使用してもよい。例えば、ＡＣＰＬ精製ポリペプチドまたはその可溶性断片を用い、内因性細胞表面ＡＣＰＬ結合パートナーへのＡＣＰＬ結合タンパク質の結合を阻害してもよい。こうして、内因性受容体への結合パートナーの結合から生じる生物学的影響を阻害する。
【０１４７】
さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを哺乳動物に投与し、ＡＣＰＬ結合パートナーが仲介する障害を治療してもよい。こうした結合パートナー仲介障害には、該結合パートナーにより（直接または間接的に）引き起こされるあるいは悪化される異常が含まれる。
【０１４８】
本発明の組成物は、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチド、例えば天然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性がある断片を含んでもよい。特定の態様において、該組成物は、可溶性ポリペプチド、または可溶性ＡＣＰＬポリペプチドを含むオリゴマー、例えば結合パートナーに結合するＡＣＰＬの細胞外ドメインまたは生物学的に活性があるその断片を含む。
【０１４９】
本発明のＡＣＰＬポリペプチドまたはその断片の有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）などの他の構成要素と組み合わせて含む組成物が、本明細書に提供される。ポリペプチドを、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい処方してもよい。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。
【０１５０】
さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化している、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどのポリマー化合物に取り込まれている、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよい。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響するであろうし、そしてしたがって意図される適用にしたがい、選択される。
【０１５１】
本発明の組成物は、例えば局所、非経口、または吸入によるなど、いかなる適切な方式で、投与してもよい。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内、細胞内または筋内経路による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位での局所化投与も含まれる。移植物からの持続放出もまた、意図される。当業者は、適切な投薬量が、治療すべき障害の性質、患者の体重、年齢および全身状態、並びに投与経路などの要因に応じ、多様であろうことを認識するであろう。予備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そしてヒト投与のための投薬量の見積もりを、当業に認められる実施にしたがい、行う。
【０１５２】
生理学的に許容しうる処方中の核酸を含む組成物もまた、意図される。ＤＮＡは、例えば注射のため処方してもよい。
【０１５３】
研究用剤
本発明のポリペプチドの別の使用は、異なる細胞種上のＡＣＰＬ結合パートナー／ＡＣＰＬ相互作用を阻害することから生じる生物学的影響を研究するための研究ツールとしてである。ポリペプチドはまた、ＡＣＰＬ結合パートナーまたはＡＣＰＬあるいはそれらの相互作用を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに使用してもよい。
【０１５４】
ＡＣＰＬポリペプチド、およびＡＣＰＬポリペプチドに対する抗体を、多様な研究プロトコルにおける試薬として用いてもよい。こうした研究プロトコルの実例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に提供される。例えば、これらの試薬は、ＲＮＡまたはタンパク質の細胞特異的または組織特異的発現のマーカーとして利用することが可能である。同様にこれらの試薬を用い、ＡＣＰＬ  ＲＮＡまたはポリペプチドの恒常的または一過的発現を調べてもよい。ＡＣＰＬ  ＤＮＡを用い、ＡＣＰＬ  ＤＮＡの染色体位置を決定し、そして本染色体位置に関連して遺伝子をマッピングしてもよい。ＡＣＰＬ  ＤＮＡはまた、遺伝的フィンガープリンティングなどの技術の使用を通じ、遺伝的不均一性および遺伝形質を調べると共に、遺伝的障害に関連する危険性を同定するのに用いてもよい。ＡＣＰＬ  ＤＮＡはさらに、ＡＣＰＬ  ＤＮＡに関連するさらなる遺伝子を同定するのに、そして配列比較に基づく、進化系統樹を確立するのに用いてもよい。ＡＣＰＬ  ＤＮＡおよびポリペプチドを用い、サザンブロッティングおよびイムノブロッティングなどの陽性スクリーニング法を通じ、そしてサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）などの陰性スクリーニング法を通じ、ＡＣＰＬ  ＤＮＡまたはポリペプチドに相同な遺伝子またはタンパク質を選択してもよい。
【０１５５】
ＡＣＰＬポリペプチドはまた、（ａ）ＡＣＰＬポリペプチドが制御するいかなるタンパク質も同定する、そして（ｂ）ＡＣＰＬポリペプチドが相互作用する可能性がある他のタンパク質を同定する試薬としても用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドは、組換えタンパク質をアフィニティーマトリックスにカップリングさせることにより、またはＡＣＰＬポリペプチドを２−ハイブリッド系のおとり（ｂａｉｔ）として用いることにより、用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片を、ＩＬ−１Ｒファミリーの受容体により用いられる情報伝達経路の研究における試薬として、そしてＩＬ−１８およびＩＬ−１ファミリーの他のリガンドの可能性があるものによる情報伝達を遮断するのに用いてもよい。
【０１５６】
本発明の別の態様は、細胞情報伝達を研究するＡＣＰＬの使用に関する。ＡＣＰＬポリペプチドは、細胞情報伝達を含む免疫反応において役割を果たす。こうしたものとして、ＡＣＰＬの発現および／または活性の改変は、多くの細胞過程に激しい影響を有する可能性がある。クローン化されたＡＣＰＬの発現、ＡＣＰＬの機能的に不活性である突然変異体を用い、特定のタンパク質が特定の情報伝達事象仲介において果たす役割を同定してもよい。
【０１５７】
細胞情報伝達は、しばしば、分子活性化カスケードを伴い、該カスケード中、受容体が、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することにより、リガンド−受容体仲介シグナルを伝播する。これらの基質は、それ自体キナーゼであってもよく、該基質がリン酸化後活性化されてもよい。あるいは、該基質は、リン酸化後、タンパク質−タンパク質相互作用を通じ、下流情報伝達を容易にするアダプター分子であってもよい。基質分子の性質に関係なく、発現されたＡＣＰＬの機能的に活性である型は、酵母２−ハイブリッドアッセイなどのアッセイに用い、ＡＣＰＬ結合パートナーにより、どの基質が認識されそして活性化されるか同定してもよい。このように、これらの新規ＡＣＰＬは、情報伝達経路に関与する新規分子を同定する試薬として用いてもよい。
【０１５８】
さらに、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片は、ＩＬ−１８情報伝達を遮断する試薬として、ＩＬ−１８情報伝達経路の研究に、試薬として用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドがＮＦκＢ情報伝達に役割を果たしているという発見により、ＮＦκＢ情報伝達の、特にＩＬ−１８によるＮＦκＢ情報伝達の誘導に関する研究にＡＣＰＬポリペプチドを使用することが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドおよびＮＦκＢ情報伝達におけるその役割の発見により、細胞情報伝達におけるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＩＬ−１８の役割を解明する研究プロトコルにおける試薬として使用することが可能になる。
【０１５９】
ＩＬ−１８は多くのさらなる情報伝達反応を誘導する。こうした情報伝達反応の中に、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８の誘導がある。したがって、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片は、ＩＬ−１８が誘導する、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８の情報伝達反応の研究における試薬として用いてもよい。
【０１６０】
ＡＣＰＬポリペプチドがＩＬ−１８に反応し特定のタンパク質産生を刺激するという発見により、誘導性タンパク質発現系の生成が可能になる。１つの態様において、目的のタンパク質の発現を仲介する３つのＮＦκＢ部位を含むベクター内に、該タンパク質をコードする遺伝子を配置してもよい。当業者は、発現が望ましい細胞の種類に応じ、ＮＦκＢ発現に連結した（ｌｉｎｋｅｄ）発現を達成するのに、多くの異なるベクターを用いてもよいことを認識する。例として、ＮＦκＢ連結発現ベクター４０μｇ並びにネズミＡＰＣＬポリペプチドおよびネズミＩＬ−１Ｒ−Ｒｐ１をコードする発現ベクター２０μｇで、９６０μＦおよび３２０Ｖで、１０7のＳ４９．１細胞を０．７  ｍｌ中でエレクトロポレーションによりトランスフェクションしてもよい。細胞を２日間培養してもよく、そしてその後、４０  ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激してもよい。ＩＬ−１８添加は、ＮＦκＢ連結遺伝子発現を３００倍誘導することが可能である。ＡＣＰＬポリペプチドおよびＩＬ−１８刺激を用い、タンパク質発現誘導を達成するのに、多くの異なるアプローチを用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１６１】
ＮＦκＢ連結タンパク質の産生が制御されているため、細胞内の本タンパク質のレベルは、ＩＬ−１８の刺激にしたがい、調節することが可能である。ルシフェラーゼなどのマーカー遺伝子の使用により、ＩＬ−１８刺激ＮＦκＢ情報伝達の阻害因子および制御因子の解明が可能になる。さらに、タンパク質発現のレベルおよびタイミングの調節により、当業者が、目的のタンパク質の一時的な影響および累積的な影響両方を調べることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドに対する抗体はさらに、これらの実験におけるＩＬ−１８刺激ＮＦκＢ情報伝達を阻害するのに用いてもよく、ＮＦκＢ情報伝達に伴われる段階のより詳細な解析が可能になる。
【０１６２】
本発明にしたがった精製ＡＣＰＬポリペプチドは、ＡＣＰＬポリペプチドの阻害剤の発見を容易にするであろう。精製ＡＣＰＬポリペプチドを、その潜在的な阻害剤をスクリーニングするのに使用することは重要であり、そして汚染物質との干渉性反応の可能性を除くまたは減少させる可能性がある。
【０１６３】
さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチド−阻害剤の構造に基づく設計のため、用いてもよい。こうした構造に基づく設計は「合理的薬剤設計」としても知られる。ＡＣＰＬポリペプチドを、例えば、すべて周知の方法である、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴または相同性モデリングにより、三次元的に解析してもよい。分子モデリングソフトウェア系におけるＡＣＰＬポリペプチド構造情報を、阻害剤設計および阻害剤−ＡＣＰＬポリペプチド相互作用を補助するのに使用することもまた、本発明に含まれる。こうしたコンピューター補助モデリングおよび薬剤設計は、化学的コンホメーション解析、分子の静電位、タンパク質フォールディングなどの情報を利用することが可能である。例えば、メタロプロテアーゼのクラス特異的阻害剤の設計の大部分は、触媒性亜鉛原子をキレートするまたは該原子に結合する試みに重点を置いてきている。合成阻害剤は、通常、陰性荷電部分を含むよう設計され、該部分に、特定のプロテアーゼの特異性ポケットに適合するよう設計された、一連の他の基が結合している。本発明の特定の方法は、ＡＣＰＬポリペプチドの三次元構造を、基質の結合部位である可能性がある部位に関し解析し、予測される反応性部位を含む新規分子を合成し、そして新規分子を上述のようにアッセイすることを含む。
【０１６４】
分子量、等電点マーカー
本発明はさらに、ゲル電気泳動により試料タンパク質の見かけの分子量を概算する分子量マーカーとしてＡＣＰＬポリペプチドを利用する方法を含む。本発明にしたがい、単離されそして精製されているマウスＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、糖鎖付加がなければ、およそ７０，０４８ダルトンの分子量を有する。ＡＣＰＬポリペプチドは、試料タンパク質と共に、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ．  Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５，  １９７０）により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。マウスＡＣＰＬの特有のアミノ酸配列（配列番号２）は、およそ７０，０４８ダルトンの分子量を特定する。したがって、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、７０，０４８ダルトンに近い見かけの分子量を有する試料タンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。本ポリペプチド分子量マーカーの使用により、７０，０４８ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。同様に、ヒトＡＣＰＬポリペプチド（配列番号７）を、試料タンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして用いてもよい。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを用いた試料タンパク質の分子量測定に、多くの異なる技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１６５】
本発明の別の好ましい態様は、ＡＣＰＬポリペプチドの化学的断片化により生成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの、ゲル電気泳動により試料タンパク質の見かけの分子量を概算するための分子量マーカーとしての使用である。単離されそして精製されているＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチド内のメチオニン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーの断片化を生じる慣用的条件下で、臭化シアンで処理してもよい（Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．  １１：２３８−２５５，  １９６７）。ＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列により、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーの臭化シアンでの断片化は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。例えば、ヒトおよびマウスＡＣＰＬポリペプチドは、各々、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成するであろう。これらの分子量マーカーの大きさは、利用可能なコンピュータープログラムを用い、予測することが可能である。メチオニン残基の分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）が各ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分子量を決定する。
【０１６６】
マウスＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの処理により生成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組は、大きさが少なくとも１０アミノ酸の１０の断片化ペプチドを含む。配列番号２のアミノ酸２−８７にコードされるペプチドは、およそ９，７２４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸８８−１０５にコードされるペプチドは、およそ２，０２０ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１１１−１３６にコードされるペプチドは、およそ３，０９４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１３７−１８８にコードされるペプチドは、およそ５，５０２ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１８９−２０７にコードされるペプチドは、およそ２，３５４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２０８−２９９にコードされるペプチドは、およそ１０，６１７ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３００−３６９にコードされるペプチドは、およそ８，２９３ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３７０−５５８にコードされるペプチドは、およそ２１，５５９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５６８−５９３にコードされるペプチドは、およそ２，９６３ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５９４−６１４にコードされるペプチドは、およそ２，３４３ダルトンの分子量を有する。
【０１６７】
したがって、マウスＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの化学的処理による切断は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。これらのＡＣＰＬ断片化ペプチドの特有でそして既知のアミノ酸配列により、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの分子量決定が可能になる。この特定の場合、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およそ９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；および２，３４３ダルトンの分子量を有する。
【０１６８】
ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質と共に、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。マウスＡＣＰＬの特有のアミノ酸配列は、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーに関し、およそ９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；および２，３４３ダルトンの分子量を特定する。したがって、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダルトンに近い見かけの分子量を有する試料タンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。その結果、これらの断片化ペプチド分子量マーカーの使用により、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。もちろん、ヒトＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列（配列番号１３）を同様に用い、ヒトＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成してもよい。断片の大きさは、利用可能なコンピュータープログラムを用い、容易に決定することが可能である。
【０１６９】
さらなる態様において、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドを同時にしかし別個に、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチド内のメチオニン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドの断片化を生じる慣用的条件下で、臭化シアンで処理してもよい。上述のように、ＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの切断により生成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およそ９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；および２，３４３ダルトンの分子量を有する。
【０１７０】
ＡＣＰＬポリペプチドおよび試料タンパク質両方由来の断片化ペプチドを、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上の断片化ペプチドは、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質由来の断片化タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。上に論じられるように、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。その結果、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの使用により、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドの断片化の度合いをさらに、試料タンパク質の完全な断片化が期待される条件を決定するコントロールとして用いる。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに多くの化学薬品を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１７１】
別の態様において、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を、特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断する酵素を用い、ＡＣＰＬポリペプチドから生成してもよい。ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列の特有の性質により、異なるアミノ酸残基での切断は、断片化ペプチド分子量マーカーの異なる組を生成するであろう。
【０１７２】
単離されそして精製されているＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチド内のリジン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、ＡＣＰＬポリペプチドの断片化を生じる慣用的条件下で、アクロモバクター・プロテアーゼＩで処理してもよい（Ｔ．  Ｍａｓａｋｉら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ６６０：４４−５０，  １９８１；Ｔ．  Ｍａｓａｋｉら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ６６０：５１−５５，  １９８１）。ＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列により、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーのアクロモバクター・プロテアーゼＩでの断片化は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。リジン残基の分布が各ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分子量を決定する。
【０１７３】
マウスＡＣＰＬポリペプチドのアクロモバクター・プロテアーゼＩでの処理により生成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組は、大きさが少なくとも１０アミノ酸の２０の断片化ペプチドを含む。ＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアン処理での１０の断片化ペプチドの生成に比べ、ＡＣＰＬポリペプチドの本酵素処理での２０の断片化ペプチドの生成は、断片化ペプチド分子量マーカーの大きさが、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに利用する断片化処理に応じ、多様であろうことを、明らかに例示する。これらの断片の大きさおよび数は、共に、ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列により決定される。その結果、断片化ペプチドの数もまた、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに利用する断片化処理に応じ、多様であろう。さらに、ヒトＡＣＰＬポリペプチド（配列番号７）の断片化は、該ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列に決定される、断片化ペプチドの特有の組を生じるであろう。
【０１７４】
配列番号２のアミノ酸１−１６にコードされるペプチドは、およそ１，８９７ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１７−２８にコードされるペプチドは、およそ１，２３６ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３０−５５にコードされるペプチドは、およそ３，１００ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５６−７１にコードされるペプチドは、およそ１，７２１ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸７９−１４１にコードされるペプチドは、およそ７，２８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１４８−１９２にコードされるペプチドは、およそ４，８９３ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２０３−２３８にコードされるペプチドは、およそ４，１２３ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２５０−２６６にコードされるペプチドは、およそ１，８６６ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２６７−２８３にコードされるペプチドは、およそ１，９８９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２９２−３０５にコードされるペプチドは、およそ１，７５７ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３１３−３３３にコードされるペプチドは、およそ２，６０１ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３３４−３５３にコードされるペプチドは、およそ２，３２４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３５５−３９５にコードされるペプチドは、およそ４，７６５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸４０６−４７１にコードされるペプチドは、およそ７，３３９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸４７３−５０７にコードされるペプチドは、およそ３，８８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５１３−５２７にコードされるペプチドは、およそ１，７８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５２９−５３９にコードされるペプチドは、およそ１，２８２ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５４３−５６１にコードされるペプチドは、およそ２，３２９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５６２−５７６にコードされるペプチドは、およそ１，８５５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５９６−６１２にコードされるペプチドは、およそ１，８５８ダルトンの分子量を有する。
【０１７５】
したがって、マウスＡＣＰＬポリペプチドのアクロモバクター・プロテアーゼＩでの酵素的処理による切断は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。これらの断片化ペプチドの特有でそして既知のアミノ酸配列により、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの分子量決定が可能になる。この特定の場合、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およそ１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；および１，８５８ダルトンの分子量を有する。
【０１７６】
再び、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質と共に、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。これらの断片化ペプチド分子量マーカーの使用により、１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。もちろん、ヒトＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列（配列番号１３）を同様に用い、断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成してもよい。断片の大きさは、利用可能なコンピュータープログラムを用い、容易に決定することが可能である。
【０１７７】
別の態様において、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドを同時にしかし別個に、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチド内のリジン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドの断片化を生じる慣用的条件下で、アクロモバクター・プロテアーゼＩで処理してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーおよび試料タンパク質由来の断片化ペプチドを、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離する。ゲル上の断片化ペプチドは、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの使用により、１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドの断片化の度合いをさらに、試料タンパク質の完全な断片化が期待される条件を決定するコントロールとして用いる。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに多くの酵素を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１７８】
別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を生成してもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩ  Ｃｏｒｐ．、モンタナ州ハミルトン）の存在下で、単離されそして生成されているＡＣＰＬポリペプチドまたはＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列に基づくペプチド１０μｇを、３週間間隔で２回、腹腔内注射してもよい。その後、慣用的ドットブロット技術または抗体捕捉（ＡＢＣ）によりマウス血清をアッセイし、どの動物のものを融合させるのが最適か決定する。３週間後、マウスに、無菌ＰＢＳ中に懸濁されているＡＣＰＬポリペプチドまたはペプチド３μｇを静脈内追加投与する。３日後、マウスを屠殺し、そして確立されたプロトコルにしたがい、Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と脾臓細胞を融合させる。簡潔には、Ａｇ８．６５３細胞を血清不含培地で数回洗浄し、そして骨髄腫細胞１に対し脾臓細胞３の割合で、マウス脾臓細胞に融合させる。融合剤は、５０％  ＰＥＧ：１０％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）である。融合物を、ＨＡＴ補足ＤＭＥＭ培地を含む２０の９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔き、そして８日間増殖させる。生じたハイブリドーマから上清を集め、そしてまずヤギ抗マウスＩｇで被覆されている９６ウェルプレートに６０分間添加する。洗浄後、125Ｉ−ＡＣＰＬポリペプチドまたはペプチドを各ウェルに添加し、室温で６０分間インキュベーションし、そして４回洗浄する。陽性ウェルは続いて、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  Ｓフィルムを用いた−７０℃でのオートラジオグラフィーにより、検出することが可能である。陽性クローンをバルク培養で増殖させてもよく、そして続いて上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製する。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドおよび断片化ペプチドに対する抗体を生成するのに多くの技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１７９】
別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドに対し生成された抗体を、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーと組み合わせて用い、試料タンパク質の見かけの分子量および等電点を決定するこれらの分子量マーカーの使用における正確さを亢進してもよい。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーを、モル過剰の試料タンパク質と混合し、そして混合物を、慣用的手段による２次元電気泳動により、分離してもよい。ポリペプチドを、慣用的手段により、ニトロセルロースなどの適切なタンパク質結合膜に移してもよい。
【０１８０】
膜上のポリペプチドは、試料タンパク質および分子量マーカー間の区別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技術を用い、視覚化してもよい。本検出は、試料タンパク質の検出を生じない慣用的な条件下で行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まない可能性があるため、すべてのＡＣＰＬポリペプチド断片に対する抗体を生成することは不可能である可能性があることが理解される。さらに、本アッセイにおいて、すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；しかしながら、ＡＣＰＬポリペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に決定することが可能である。
【０１８１】
試料タンパク質を、慣用的染色法を用い、視覚化する。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片ペプチド分子量マーカーに対する試料タンパク質のモル過剰は、慣用的な染色法が、主に試料タンパク質を検出する程度である。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法により、これらのマーカーがほとんどまたはまったく検出されない程度である。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーに対する試料タンパク質の好ましいモル過剰は、２および１００，０００倍の間である。より好ましくは、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーに対する試料タンパク質の好ましいモル過剰は、１０および１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の間である。
【０１８２】
ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーを、試料タンパク質の見かけの分子量および等電点の概算において、分子量および等電点マーカーとして用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーのものに近い見かけの分子量および等電点を有する試料タンパク質の見かけの分子量および等電点概算のための分子量および等電点マーカーとして、特によく働く。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーおよび試料タンパク質を、同一の条件下で同時に分離する能力により、試料タンパク質の見かけの分子量および等電点測定の正確さを増加させることが可能になる。これは、方法の性質が、いかなるマーカーも試料タンパク質と同時に分離されることを指令する、二次元電気泳動などの技術に特有の目的である。
【０１８３】
別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーを、切断剤で試料タンパク質を処理することにより得られる断片化ペプチドの見かけの分子量および等電点の概算において、分子量および等電点マーカーとして用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いた、試料タンパク質およびその断片化ペプチドの分子量および等電点測定に、多くの技術を用いることができ、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１８４】
本発明に含まれるＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、該マーカーが発現される宿主細胞に応じ、多様な分子量を有する可能性がある。多様な細胞種におけるＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびペプチド断片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これらのマーカーの分子量の変動を生じる可能性がある。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーの大きさは、該ポリペプチドの細胞外部分由来のＡＣＰＬポリペプチド断片で最も雑多である可能性がある。一貫した分子量マーカーは、完全に膜貫通および細胞質領域由来のポリペプチドを用いること、Ｎ−グリカナーゼで前処理し、糖鎖付加を除くこと、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが可能である。
【０１８５】
本発明のポリペプチドは、化学的および酵素的手段により、より小さいペプチドへの断片化にさらされてもよく、そしてこうして産生されるペプチド断片を、他のタンパク質またはポリペプチドの解析に用いてもよい。例えば、こうしたペプチド断片を、ペプチド分子量マーカーとして、ペプチド等電点マーカーとして、またはペプチド断片化の度合いの解析において、用いてもよい。したがって、本発明はまた、これらのポリペプチドまたはペプチド断片と共に、未知のタンパク質の見かけの分子量および等電点決定を補助するキット並びに未知のタンパク質の断片化の度合いを評価するキットも含む。
【０１８６】
もちろん、本発明のペプチドおよびポリペプチドの断片はまた、当業に周知の慣用的な組換え法および合成法により産生してもよい。組換え法に関し、本発明に含まれるポリペプチドおよびペプチド断片は、これらが発現される宿主細胞に応じ、多様な分子量を有する可能性がある。多様な細胞種における本発明のポリペプチドおよびペプチド断片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これらの片（ｐｉｅｃｅ）の分子量の変動を生じる可能性がある。これらの片の大きさは、該ポリペプチドの細胞外部分由来のポリペプチド断片で最も雑多である可能性がある。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、完全に膜貫通および細胞質領域由来のポリペプチドを用いること、Ｎ−グリカナーゼで前処理し、糖鎖付加を除くこと、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが可能である。
【０１８７】
これらのポリペプチドの分子量はまた、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端両方に、さらなるペプチド配列を融合させることにより、変化させてもよい。本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合を用い、これらのポリペプチドの発現を亢進し、または該タンパク質の精製を補助してもよい。さらに、本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合は、酵素的または化学的処理により生成されるポリペプチドの断片化ペプチドを、通常すべてではないがいくつか、改変するであろう。もちろん、分子生物学の日常的でそして既知の技術を用い、本発明のポリペプチドに、突然変異を導入してもよい。例えば、特定の酵素によるタンパク質分解切断部位または特定の化学的に誘導される断片化法による切断部位を除去するように、突然変異を設計してもよい。該部位の除去は、特定の酵素または化学的方法での断片化に際し、本発明のポリペプチドのペプチドフィンガープリントを改変するであろう。
【０１８８】
ポリペプチドおよび生じた断片化ペプチドは、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー、および質量分析を含む方法により解析し、それらの分子量を決定してもよい。各片の特有のアミノ酸配列が分子量を特定するため、これらの片はその後、未知のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の分子量決定を補助するこうした解析技術を用い、分子量マーカーとして利用することが可能である。本発明の分子量マーカーは、同様の見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働き、そしてその結果、タンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。
【０１８９】
本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカーは、好ましくは大きさが少なくとも１０アミノ酸である。より好ましくは、これらの断片化ペプチド分子量マーカーは、大きさが１０および１００アミノ酸の間である。さらにより好ましいのは、大きさが１０および５０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーであり、そして特に大きさが１０および３５アミノ酸の間のものである。最も好ましいのは、大きさが１０および２０アミノ酸の間の断片化ペプチド分子量マーカーである。
【０１９０】
分子量測定法の中に、沈降、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、および質量分析がある。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ．  Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５，  １９７０）である。慣用的には、該方法は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンを用いる。マーカーおよび試料を、同一の条件下で同時に分解する能力により、正確さを増加させることが可能になる。もちろん、本発明のポリペプチドを用いた未知のタンパク質の分子量測定には、多くの異なる技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１９１】
各非糖鎖付加ポリペプチドまたはその断片は、その特有のアミノ酸配列により本質的に決定されるｐＩを有する（このｐＩは、当業者により、現在利用可能なｐＩ値を予測するよう設計されたいかなるコンピュータープログラムを用い概算しても、いかなる周知のアミノ酸ｐＫａ表を用い計算しても、または実験により測定してもよい）。したがって、これらのポリペプチドおよびその断片は、等電点電気泳動などの技術を用い、未知のタンパク質、ポリペプチド、または断片化ペプチドの等電点測定を補助する、特定のマーカーとして利用することが可能である。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーのものと近い見かけの等電点を有する未知のタンパク質の見かけの等電点概算に、特によく働く。
【０１９２】
等電点電気泳動技術は、さらに、ゲル電気泳動などの他の技術と組み合わせ、分子量および電荷に基づき、タンパク質を同時に分離してもよい。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を、同一の条件下で同時に分離する能力により、未知のタンパク質の見かけの等電点測定の正確さを増加させることが可能になる。これは、方法の性質が、いかなるマーカーも未知のタンパク質と同時に分離されることを指令する、二次元電気泳動（Ｔ．Ｄ．  ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ．  Ｍａｄｉｇａｎ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  第６版，  １９９１））などの技術に特有の目的である。さらに、こうした方法を用い、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質または断片化ペプチドの等電点および分子量両方の測定を補助することが可能である。
【０１９３】
ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質および分子量マーカー間の区別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。１つの態様において、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技術を用い、視覚化してもよい。本検出は、未知のタンパク質の検出を生じない慣用的な条件下で行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まない可能性があるため、本発明のすべてのポリペプチド断片に対する抗体を生成することは不可能である可能性があることが理解される。さらに、本アッセイにおいて、すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；が、本発明のポリペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に決定することが可能である。
【０１９４】
未知のタンパク質もまた、慣用的染色法を用い、視覚化する。本発明のポリペプチドまたは断片ペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰は、慣用的な染色法が、主に未知のタンパク質を検出する程度である。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法により、これらのマーカーがほとんどまたはまったく検出されない程度である。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰は、２および１００，０００倍の間である。より好ましくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰は、１０および１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の間である。
【０１９５】
もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いた未知のタンパク質、ポリペプチド、およびその断片化ペプチドの分子量および等電点の測定および検出に、多くの技術を用いてもよく、そしてこれらの態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１９６】
別の態様において、例えば断片化反応の時間または温度を改変することによる、本発明のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性断片化（Ｄ．Ｗ．  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：１１０２−１１０６，  １９７７）の解析は、未知のタンパク質の切断の度合いのコントロールとして用いてもよい。例えば、同量のポリペプチドおよび未知のタンパク質の、同一の条件下での切断により、断片化の度合いの直接比較が可能になる。ポリペプチドの完全な断片化を生じる条件はまた、未知のタンパク質の完全な断片化をも生じる可能性がある。
【０１９７】
最後に、本発明に含まれるキットに関しては、こうしたキットの構成要素は、多様である可能性があるが、典型的には、ポリペプチドおよび断片化ペプチド分子量マーカーを含む。また、こうしたキットは、断片化に必要な部位が除去されているポリペプチドを含んでもよい。さらに、キットは、ポリペプチドおよび未知のタンパク質の化学的または酵素的切断による、特異的切断のための試薬を含んでもよい。キットはさらに、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して向けられる抗体を含んでもよい。
【０１９８】
未知のタンパク質の同定
上述のように、ポリペプチドまたはペプチドフィンガープリントを、既知のタンパク質のデータベースに入力しまたは該データベースと比較し、質量分析を用いた未知のタンパク質の同定を補助してもよい（Ｗ．Ｊ．  Ｈｅｎｚｅｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５０１１−５０１５，  １９９３；Ｄ．  Ｆｅｎｙｏら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：９９８−１００５，  １９９８）。これらの比較を容易にする多様なコンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ  Ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、インターネットを介し利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤および指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログラムは、未知のタンパク質の同定の決定を補助するため、観察された分子量を配列データベース由来の予測されるペプチド分子量と比較する。
【０１９９】
さらに、タンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用い、ポリペプチドまたはペプチド消化物を配列決定し、そして生じた配列をデータベースに対し検索してもよい（Ｊ．Ｋ．  Ｅｎｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．  ５：９７６−９８９（１９９４）；Ｍ．  ＭａｎｎおよびＭ．  Ｗｉｌｍ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ．  ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．  １１：１０６７−１０７５（１９９７））。本方法に用いてもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ  ９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、並びに上述のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄなど、インターネット上に存在する。
【０２００】
したがって、遺伝子配列並びにその予測されるタンパク質配列およびペプチド断片を配列データベースに添加することにより、質量分析を用いた未知のタンパク質の同定を補助することが可能である。
【０２０１】
抗体
本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介し、該ポリペプチドに特異的に結合する。したがって、上述のようなポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用してもよい。より詳細には、ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。
【０２０２】
これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分から構成されるが、コンホメーション性または断続的エピトープは、タンパク質フォールディングに際し、ごく接近するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｊｒ．およびＰ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に数多い；が、タンパク質のコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｊｒ．およびＰ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。エピトープは、当業に知られるいかなる手段により同定してもよい。
【０２０３】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの材料から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として用いてもよい。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの当業に周知の技術を用い、あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい。
【０２０４】
本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出される可能性がある抗体に関しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により調製することが可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ．  Ｋｅｎｎｅｔら（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８０）；  およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【０２０５】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術により産生しそして同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫感作し；免疫感作された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術により回収してもよい。
【０２０６】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術により調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，  １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，  １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，  １９８９）、およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，  Ｍａｙ，  １９９３）に記載されるものが含まれる。導入遺伝子的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および５，５４５，８０６号並びにそれらから優先権を請求する関連特許に見ることが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。
【０２０７】
慣用的技術により産生されてもよい、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片が含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【０２０８】
１つの態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のタンパク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリーニング法が周知であり、そして例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィーを伴ってもよい。
【０２０９】
抗体の使用
本発明の抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいて用いてもよい。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断片を精製するのに使用してもよい。
【０２１０】
さらに、本発明のポリペプチドの、その結合パートナーへの結合を遮断することが可能な抗体を用い、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい。こうした遮断抗体は、結合パートナーを発現している特定の細胞へのＡＣＰＬの結合を阻害する能力に関し、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用い、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、ＡＣＰＬ結合パートナーの標的細胞への結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて同定してもよい。抗体は、結合パートナー仲介活性を阻害する能力に関しアッセイしてもよい。
【０２１１】
こうした抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用し、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与し、抗体を生成した実体により仲介される生物学的活性を阻害してもよい。このように、ＡＣＰＬ結合パートナーと細胞表面結合パートナー受容体との相互作用により、（直接または間接的に）引き起こされるまたは悪化される障害を治療してもよい。治療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした治療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【０２１２】
抗体は、アゴニスト性（すなわちリガンド模倣性）特性に関しスクリーニングしてもよい。こうした抗体は、細胞表面結合パートナーへの結合に際し、ＡＣＰＬ結合パートナーが細胞表面ＡＣＰＬに結合する際に誘導される生物学的影響と同様の生物学的影響（例えば生物学的情報の伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を用い、ＩＬ−１８仲介活性を誘導してもよい。
【０２１３】
ＡＣＰＬに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含む組成物が、本明細書に提供される。こうした組成物の適切な構成要素は、ＡＣＰＬタンパク質を含む組成物に関し、上述された通りである。
【０２１４】
やはり本明細書に提供されるのは、抗体に結合している検出可能（例えば診断用剤）または治療剤を含む結合体である。こうした剤の例は、上に示される。該結合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用を見出す。
【０２１５】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示するため提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書は、本明細書に引用される参考文献の教える内容を考慮に入れると最も完全に理解され、該参考文献は本明細書に援用される。本明細書中の態様および以下の実施例は、本発明の態様を例示するため提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。当業者は、多くの他の態様が、請求される発明に含まれることを認識する。以下の実施例において、記載されるすべての方法は、他に特定されない限り、慣用的である。
【０２１６】
【実施例】
実施例１：マウス核酸の単離
発現配列標識タグデータベースを検索し、ＩＭＡＧＥクローン６４０６１５（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＡ２０３０９７号）がＩＬ−１ＲＡｃＰに対し相同性を有することを発見することにより、マウスＡＣＰＬ  ｃＤＮＡを単離した。ＩＭＡＧＥクローン６４０６１５を得て、ランダムプライム化により32Ｐで標識し、そしてＥＬ４６．１（マウス胸腺細胞）ｃＤＮＡライブラリーを探査する（ｐｒｏｂｅ）のに用いた。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で、４２℃で行った。ＥＬ４６．１ｃＤＮＡクローンにより全長読み枠を定めた後、ＰＣＲ増幅を用い、７Ｂ９（マウスＴ細胞）およびＬＤＡ１１（マウス骨髄ストローマ性）ｃＤＮＡライブラリー由来の別個の単離体を得ることにより、該読み枠を確認した。プライマーは、マウスＡＣＰＬヌクレオチド配列の（＋１ないし＋３である開始ＡＴＧに対し）ヌクレオチド−１５ないし＋１３およびヌクレオチド１８９２ないし１９１６に対応した。
【０２１７】
実施例２：ヒトＡＣＰＬ核酸配列の単離
ＮＫ細胞ライブラリーの無作為配列決定により得られたＱＱ１３５２と称されるヒトｃＤＮＡクローンは、実施例１に記載されるように単離されたネズミＡＣＰＬに対し高い度合いの相同性を有することが見出された。該クローンをプローブとして用い、末梢血リンパ球、末梢血Ｔ細胞、およびＮＫ  ｃＤＮＡライブラリーからヒトＡＣＰＬクローンを単離した。プローブとして用いたクローンＱＱ１３５２の領域は、マウスＡＣＰＬヌクレオチド１１９６−１１７５３に対し相同であった。全長クローンは、いずれのライブラリーからも得られず、そのため、各ライブラリーでベクター固定ＰＣＲを行い、読み枠（配列番号６）の５’末端を得た。
【０２１８】
実施例３：染色体マップ位の決定
ヒトＡＣＰＬの染色体マップ位は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｇ３放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用い、放射ハイブリッドマッピングにより決定した。プライマーは、ＩＬ−１Ｒに対する相同性に関して選択した。標準的ＰＣＲ条件下で、４０サイクル、増幅を行った。
【０２１９】
結果により、ヒトＡＣＰＬは、染色体２上に配置され、１２．７２の確率スコア対数で、ＡＦＭ３１６ｔｇ５に最も近く連鎖した。これは、染色体２の、ＩＬ−１Ｒ  Ｉ型、ＩＬ−１Ｒ  ＩＩ型、ＩＬ−１Ｒ−ｒｐ１、およびＴ１／ＳＴ２がマッピングされているのと同じ領域である。
【０２２０】
実施例４：ノーザンブロット解析
ヒト多数組織ブロットをＣＬＯＮＴＥＣＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．より購入し、そして該ブロットは、正常ヒト脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血リンパ球由来のｍＲＮＡ  ２μｇを含んだ。該ブロットを、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、３２Ｐ標識アンチセンスヒトＡＣＰＬリボプローブと、６３℃で一晩ハイブリダイズさせ、そしてその後、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄した。曝露後、標準化のため、β−アクチンに対するランダムプライム標識化プローブで、該ブロットを再ハイブリダイズした。
【０２２１】
結果により、ヒトＡＣＰＬは末梢血リンパ球および脾臓で強く発現されていることが立証された。ヒトＡＣＰＬは、より低い度合いで、結腸で発現している。結果によりさらに、ヒトＡＣＰＬは前立腺および小腸ｍＲＮＡで弱く発現していることが立証された。主なｍＲＮＡ産物は、およそ３．８キロ塩基であり、およそ２．６および８．０キロ塩基の弱いバンドが見られた。発現はまた、ノーザン解析により、肺ｍＲＮＡでも検出された。
【０２２２】
実施例５：ＡＣＰＬポリペプチドおよびＡＣＰＬ：ＦＣ融合体の発現
マウスおよびヒトＡＣＰＬポリペプチドを発現させるため、全長マウスおよびヒトＡＣＰＬヌクレオチド配列を、ＰＣＲにより生成し、そしてｐＤＣ３０２の変異体であるｐＤＣ３０４にクローン化した。ヒトＡＣＰＬ：Ｆｃ融合タンパク質を発現させるため、Ｂａｕｍら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１（１９９４）に記載されるように、ヒトＡＣＰＬ発現ベクターの細胞外部分（アミノ酸１−３５６）をヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結し、そして生成した。
【０２２３】
実施例６：ＣＯＳおよびＳ４９細胞におけるＡＣＰＬポリペプチドを通じたＮＦκＢの誘導
マウスＡＣＰＬポリペプチド（配列番号２）がＩＬ−１８情報伝達に関与する受容体であるか決定するため、ＡＣＰＬポリペプチドをＣＯＳ細胞およびＳ４９．１細胞で過剰発現し、そしてＮＦκＢ活性化に対するＩＬ−１８刺激の影響を評価した。１２ウェル形式で、ＣＯＳ−７細胞をＤＥＡＥ／デキストラン法によりトランスフェクションした。受容体をコードする発現ベクター総量２００ｎｇ、およびルシフェラーゼ発現を仲介する３つのＮＦκＢ部位を含むＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミド８００ｎｇで、各ウェルをトランスフェクションした。およそ１０7のＳ４９．１細胞を、ＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミド４０μｇ、および受容体をコードする発現ベクター総量２０μｇで、０．７  ｍｌ中で、エレクトロポレーションにより、トランスフェクションした。エレクトロポレーションは、９６０μＦおよび３２０Ｖで行った。
【０２２４】
細胞を２日間インキュベーションし、そしてその後４０ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で４時間刺激した。細胞を洗浄し、溶解し、そして製造者の指示にしたがい、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、ルシフェラーゼ活性に関しアッセイした。
【０２２５】
ベクターのみ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードする発現ベクターのみ、またはＡＣＰＬポリペプチドをコードする発現ベクターのみでトランスフェクションした細胞は、ＩＬ−１８刺激に反応性ではなかった。さらに、受容体をコードする発現ベクターを単独で、あるいはＩＬ−１Ｒ  Ｉ型またはＩＬ−１ＲＡｃＰをコードする発現ベクターと組み合わせてトランスフェクションした場合、ＩＬ−１情報伝達においてＡＣＰＬのいかなる機能も検出されなかった。しかし、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡＣＰＬポリペプチドをコードする発現ベクターで共トランスフェクションした細胞にＩＬ−１８を添加すると、ＣＯＳ細胞において１０倍、そしてＳ４９細胞において３００倍、ＮＦκＢ連結遺伝子の発現が誘導された。ＮＦκＢ活性のこの劇的な刺激は、ＡＣＰＬポリペプチドが、ＩＬ−１Ｒｒｐ１と共同作用するＩＬ−１８受容体の構成要素であり、ＩＬ−１８刺激に反応してＮＦκＢ情報伝達を誘導することを示す。
【０２２６】
実施例７：ＪＮＫ活性の活性化
ＪＮＫ活性の誘導は、ＩＬ−１経路の下流情報伝達事象である。上述のＮＦκＢ誘導実験と同様、ＡＣＰＬのみで、またはＩＬ−１Ｒｒｐ１と組み合わせて、ＩＬ−１８によるＪＮＫ活性の誘導を仲介することが可能であるか調べた。ＪＮＫ活性の活性化はＢｉｒｄら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１８３６−３１８４４，  １９９４に記載されるように評価した。トランスフェクション２日後、ＣＯＳ７細胞をＩＬ−１８で１５分間刺激し、溶解し、そして２つの抗ＪＮＫ抗体（ｃ−１７およびＦＬ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔａｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）の組み合わせで免疫沈降した。キナーゼ緩衝液中で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）および［γ−32］ＡＴＰを添加することにより、この免疫複合体を活性に関しアッセイした。反応を室温で３０分間進め、その後Ｌａｅｍｍｌｉ装填緩衝液を添加し反応を停止し、そして産物を４−２０％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、染色し、乾燥し、そしてＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ上で解析した。
【０２２７】
ＮＦκＢの活性化に関し得られた結果同様、ＪＮＫ活性は、ＩＬ−１Ｒ−Ｒｐ１およびＡＣＰＬが共発現された際のみ、ＣＯＳ７細胞においてＩＬ−１８により誘導された。
【配列表】
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