(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｄ免疫グロブリンを含み、ウイルス及びプリオンを含まないヒト血漿画分を製造する方法であって、
（ａ）アルコール中でヒトの血漿を分画し；
（ｂ）生じるコーン（Cohn）の沈殿IIを再懸濁し;
（ｃ）再懸濁した当該コーン（Cohn）の沈殿IIを、非イオン性界面活性剤を含む150mM±20％の高イオン強度緩衝液と混合し；
（ｄ）上記（ｃ）で得られた混合物に、30 nmより小なるカットオフ定格を有するナノフィルターによりナノろ過を施し；そして
（ｅ）上記（ｄ）で得られた画分をプリオン検出分析法にかけて、プリオンを含まないことを確認する、
工程を含む事を特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記アルコールがメタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液が150mM NaCl-グリシン緩衝液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤が非イオン性ポリオキシエチレン洗剤である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記非イオン性ポリオキシエチレン洗剤がポリソルベート-80である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カットオフ定格が12nmである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノろ過が、10,000Kから60,000Kのカットオフ定格を有する２番目のナノフィルターの使用を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記カットオフ定格が50,000Kである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プリオンを含まない抗Ｄ抗体を製造する方法であって、
（ａ）分画したヒトの血漿からのコーン（Cohn）の沈殿IIを再懸濁し；
（ｂ）前記再懸濁した沈殿IIを150mM±20％の高イオン強度緩衝剤及び非イオン性界面活性剤からなる処理剤と混合し；
（ｃ）上記（ｂ）で得られた混合物に、30 nmより小なるカットオフ定格を有するナノフィルターによりナノろ過を施し；そして
（ｄ）上記（ｃ）で得られた画分をプリオン検出分析法にかけて、プリオンを含まないことを確認する、
工程を含む事を特徴とする製造方法。
【請求項１０】
前記高イオン強度緩衝液が150mM NaClグリシン緩衝液を含み、そして前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート80を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記カットオフ定格が12nmである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノろ過が、10,000Kから60,000Kであるカットオフ定格を有する２番目のナノフィルターの使用を含む、請求項９〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カットオフ定格が50,000Kである請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン濃度を濃厚にし、および50,000Kのカットオフ定格を有するナノフィルターを用いて、前記処理助剤を50mMの低イオン強度緩衝液と交換する追加工程(ｄ)を含む請求項９〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記低イオン強度緩衝液が50mM NaClグリシン緩衝液である請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
プリオンを含まない免疫グロブリンを製造する方法であって、
（ａ）血漿から免疫グロブリンを単離し；
（ｂ）単離した免疫グロブリンを緩衝液に再懸濁し；
（ｃ）再懸濁した単離物を150mM±20％の高イオン強度緩衝剤及び非イオン性界面活性剤からなる処理助剤と混合し；
（ｄ）上記（ｃ）で得られた混合物に、30 nmより小なるカットオフ定格を有するナノフィルターによりナノろ過を施し；そして
（ｅ）上記（ｄ）で得られた画分をプリオン検出分析法にかけて、プリオンを含まないことを確認する、
工程を含む事を特徴とする製造方法。
【請求項１７】
前記単離工程（ａ）が、回分式もしくはイオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーもしくはCohnプロセスからなる群から選ばれる請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、精製、プリオンおよびウイルスの減少、あるいはプリオンおよびウイルスの除去処理にさいして、小さな細孔の排除フィルターを通じて大きなタンパク質性物質を回収することである。ガンマグロブリンのような大きな生体分子からサイズ排除により、プリオンおよびウイルスを除去する事は、製薬および診断薬用に必要とされる、望ましい小細孔径を有するサイズ排除フィルターを、大きな球状タンパク質を効率的に通すのが困難なため、通常出来ない。本発明の処理方法を使用し、タンパク質性分子からプリオンおよびウイルス粒子を除去する事により、本質的にそのような粒子を含まない製品を得られる。
【０００２】
発明の背景
精製、ウイルスの減少、あるいはウイルス除去処理時の小細孔排除フィルターによる大きなタンパク質性物質の回収は、製薬および診断薬業界において重大な問題である（Roberts, P., Vox Sang, 1995;69:82-83を参照）。ガンマグロブリン（単クロ-ン性または多クロ-ン性）のような大型の生体分子からプリオンまたはウイルスをサイズ排除により除去するのは、大型球状タンパク質を細孔径12 - 15 nm のサイズ排除フィルターを効率的に通すのが困難なため出来ない。問題は、小さな、外皮膜に覆われていないウイルスを、高分子量の製品から除去しようとする時に、特に明白である。この工程をさらに複雑にするのは、回収すべき免疫グロブリンのようなタンパク質性の物質が、フィルターを殆どまたは全く通過しない、2量体および3量体を生じる事である。
【０００３】
膜の細孔径が小さいほど、プリオンまたはウイルス粒子を保持する膜効率はより高くなる。しかしながら、細孔径が小さくなればなるほど、膜がプリオンまたはウイルスを除去された製品を自由に通過させる能力も益々減少する。すべてのウイルス減少技術について、各応用法の夫々の製品および夫々のウイルスに対して、各自の利点を評価しなければならない。小さな、外皮膜に覆われていないウイルスの除去が必要とされる場合には、最も小さな細孔径（35 nm以下、および好ましくは 12 - 30 nmの間）のウイルスフィルターの使用が多分必須であるが、これは高分子量の製品または2量体および3量体を生ずる製品では不可能かもしれない。
【０００４】
上述したRobertsの参照文献に問題点が概述されており、公称カットオフ値70および160 kD、ならびに15、35、40、50および 70 nmのフィルターが小ウイルスを除去するのに有効であろうが、一方、免疫グロブリン（IgG、150 kD）およびファクターVIII（350 kD）のようなより大きな分子量の製品は、より大きな細孔径のフィルターのみを通過できることが議論されている。
本発明の方法は、免疫グロブリンの製剤調製におけるろ過工程、ならびにプリオンおよびウイルスの除去を含む。
【０００５】
新生児溶血性疾患の予防のため、母親にヒト由来のRho(D)免疫グロブリンを注射する。そのような製品は、権利譲受人から発売されている、RhoGAM（商標）であって、それは、免疫の無いRho(D)陰性な母親が、赤血球に存在し、またRho(D)陽性の嬰児から”受取った”Rho(D)抗原に反応するのを予防する。かくして、母親による抗Rho(D)の産出を予防することにより、この母親から生まれるRho(D)陽性の嬰児を新生児溶血性疾患から守る。
【０００６】
この成功している製品は現在Cohnアルコール分画タイプのプロセスで製造されているが、数人の研究者が、血漿に対する大きな需要を減らし、経済的により有利な製品を得るために、同様な物質を製造するための代替法を試みてきた。このような研究的努力が下記文献に報告されている：すなわち、Hoppeらの “Prevention of Rh Immunization Modified Production of IgG Anti-Rh For Intravenous Application by Ion Exchanged Chromatography”、Vox Sang, 25:308-316(1973)、 およびFriesenらの“Column Ion-Exchange Preparation and Characterization of an Rh Immune Globulin for Intravenous Use”,  Journal of Applied Biochemistry, 3, 164-  175  (1981)である。
【０００７】
ドイツのHoppeおよびカナダのFriesenの両者共、リン酸塩緩衝液を溶出剤としてDEAE-Sephadexクロマトグラフィーカラムを使用した。Hoppeの抗D含有血漿は、少なくとも6ヶ月間HB Agの試験室試験を合格した志願者から得られたもので、血漿はその間貯蔵された。かくして、Hoppeは第一に比較的安全で、感染していない血漿を採用した。しかしながら、B型肝炎表面抗原に対するDEAE-Sephadexの有効性を確認するための追加試験は行なわなかった。Hoppeの関心はしかし凝集した物質の除去、および比較的高い抗体濃度を有し、断片化されていない、免疫電気泳動的に純粋なIgGの分離に向けられた。
【０００８】
Friesenの文献は、カナダで使用するための静注用Rh IgGの開発のためのHoppe法の変更について報告している。Hoppe がしたように、Friesenは陽性反応を示すドナーを除くために、HB AG用 Rh血漿の各単位を試験した。Friesenはイリノイ州北シカゴのAbbott Laboratories社製の放射線免疫検定法キット（Ausria I Kit）を使用した。この試験法は依然として最も敏感なものの一つとみなされており、後述する本発明の開発においても使用された。臨床試験で、DEAE-Sephadex樹脂/リン酸塩緩衝液の組合せを用いて製造した物質が、Rh免疫化の予防に有効で安全である事が示されたと、Friesenが報告した。
【０００９】
彼はしかしながら、血漿サンプルからB型肝炎表面抗原を除去するために、DEAE-Sephadex/リン酸塩緩衝液の組合せの有効性を測定するための追加的な試験については何も報告しなかった。これは、ドナーの血漿サンプルをスクリーニングするのに用いられる放射線免疫検定法試験では、依然として感染するかもしれない2または3桁低いHg Ag粒子の濃度を検出出来ないので、少なくとも米国政府の観点からは、特に重要である。米国政府が固体相方法論による試薬での注射用免疫グロブリンの製造を許可する事に著しくより制限的なのは、まさにこのような方法で製造された試薬の潜在的な感染可能性を懸念しているためである。
【００１０】
RhoGAM（商標）Rho(D) Immune Globulin (Human)は抗体を媒介とする免疫抑制を達成するために、特定の抗体を予防的に使用した最初の成功例であった。RhoGAM（商標）は1用量当たり300マイクログラムの抗D活性のドースで抗Rho(D)を含むIgG免疫グロブリン溶液である。RhoGAM（商標）は、免疫のない、Rho(D)陰性の妊婦に彼女のRho(D)陽性の胎児が将来病気になるのを予防するために適切な時期に与えられる。この病気は新生児溶血性疾患、またはより特定的に、Rh胎児赤芽球症と呼ばれる。
【００１１】
より小用量の抗Rho(D)、すなわちMICRhoGAM（商標）Rho(D) Immune Globulin (Human) Micro-Dose （50マイクログラムの抗 Rho(D)）も、流産および妊娠12週またはそれ以前に早産をした女性の治療用として、権利譲受人から販売されている。全用量の投与を受けた受療者では15 ml迄のRho(D)陽性の赤血球が守られるが、より小用量では2.5 ml迄のRho(D)陽性の赤血球が守られる。RhoGAM（商標）は妊娠26―28週の誕生前予防薬として使われる。他の適応症には、妊娠中の如何なる時期での切迫流産、流産または妊娠13週もしくはそれ以上での妊娠の終了、腹部外傷もしくは遺伝子検査用羊水穿刺、繊毛膜サンプリング(CVS)ならびに経皮臍帯血サンプリング(PUBS)が含まれる。
【００１２】
FDAおよび生物製剤局により使用を許可されている大概の免疫グロブリン注射剤は、1940年代にハーバードの E. Cohen博士により開発されたアルコ-ル分画法により製造された。この方法は、Cohnらにより J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)  に叙述されており、ここに参照文献とされている。伝染性肝炎、HIV、ならびに可能な限り最も感度の高い試験で測定された他の血液中病原菌に対して陰性な血漿を、注意深く選択するこの方法は、非常に長期間使用されてきたので、米国政府はこの手法によって調製されたもののみを安全であるとする立場をとっている。この手法により製造された製品が正に安全であるということは、この製品の数百万人の受療者が感染していない、と言う事実により容易に実証されうる。
【００１３】
ヒトの血清からガンマグロブリンを分離する幾つかの伝統的な方法が下記文献に明白に記されている。Baumstarkらの “A Preparative Method for The Separation of 7S Gamma Globulin From Human Serum”, Archives of Biochem- istry and Biophysics, 108, 514-522 (1964)、 および  A. Webb, “A 30-Minute Preparative Method For Isolation Of IgG From Human Serum”, Vox Sang, 23:279-290 (1972) で、両著ともここに参照文献として引用している。
【００１４】
両論文とも、数多くの他の汚染タンパク質を含む血清からの種々のガンマグロブリン種の分離および選択により多く関係しているが、両者共、原料血清サンプルから汚染タンパク質および汚染物質を除去したと言明している。両者共、リン酸塩緩衝液を溶出剤として用いてDEAE-Sephadexカラムクロマトグラフィー剤を使用している。両研究者共、汚染タンパク質の除去に関する限りある程度の成功を収めたが、安全な注射剤を得るために汚染肝炎ウイルス粒子を除去する問題については述べていない。
【００１５】
血液が新しい変形クロイツフェルド・ヤコブ病を引き起こす潜在力に関わる理論的リスクを極小にするために、血漿の出所に対する制限、ならびに血液および血液成分の白血球減損を含む工程が、採用されてきた(Turner ML et al., Blood Reviews 1998; 12: 255-268; Prowse CV et al., Br. J. Heamatology 1999; 106: 240-247)。血漿分画業界も、血漿の処理がプリオンスパイク物質の除去に有する効果を理解するために、数多くの研究を行った(lee, DC, J. Virological Methods 2000; 84:77-89; Foster PR, Vox Sang 2000; 78:86-95)。
【００１６】
これらの、および他の研究の成果が最近業界により再検討され、プリオンの除去に関して幾つかの結論が得られた。その中には以下のものがある：如何なる方法も良く確立された除去方法として、例外なしに認める事は出来ないこと；主要工程段階の研究で、異種の物質および菌株を使用することが、スパイク物質の性質に対するそれらの依存性を調べるために、賢明であること；ならびに、TSEの除去の程度は厳密なプロセス条件に依存するので、潜在的に効果的な除去方法は特定の製造プロセスの研究により確認することが重要であること。
【００１７】
本発明の目的は、注射用の、プリオンおよびウイルスを除いた、純粋な免疫グロブリンを供給することである。そのような本質的に純粋な製品が本発名の処理方法を用いて製造される。
本発明のさらなる目的は、時間的、面積的、ならびにタンパク質の収率に対する要求に対し合理的な、免疫グロブリンを精製するための、製造プロセスを与えるものである。
【００１８】
本発明で使用されるろ過は、フィルターの平均細孔径に対するウイルスの寸法の関係に依存するふるいー保持率作用によって達成される。その効率は、温度、イオン強度、ウイルス力価チャレンジ、圧力、pH、表面張力、および他の変数といったろ過条件に影響されない。本発明の洗剤およびイオン強度の条件は、IgG粒子がフィルターを通過する能力には影響するが、ウイルス除去には影響しない。権利譲受人のために行われた研究で、使用された緩衝液成分が、ウイルスの不活性化およびウイルス外皮膜の除去に関して、ウイルス粒子に与える影響は僅かであることが示された。
【００１９】
発明の要旨
本発明の方法は、たとえば免疫グロブリンのような本質的に純粋な大きな球状のタンパク質をもたらす。本発明で使われている“本質的に純粋な”と言う術語は、本質的にウイルスおよびプリオンを含まない事を意味する。該免疫グロブリンは、単クローン性または多クロ-ン性免疫グロブリン、たとえば単クローン性または多クロ-ン性抗D免疫グロブリン、より詳細には、RhoGAM（商標）またはMICRhoGAM（商標）かも知れない。
【００２０】
本発明の免疫グロブリンの処方は、重量約4.0 %から6.0%の免疫グロブリン、約24から36 ppmの Thimerosol、および約80から200 ppm のポリソルベート 80を含む。より詳細には、本発明の免疫グロブリンの処方は約5.0重量%の免疫グロブリン、約33 ppmの Thimerosol、ならびに約100 ppm のポリソルベート80を含む。
【００２１】
本発明は大きな球状タンパク質の本質的に純粋な処方を製造する方法を考えるものであり、(a)  アルコール中でヒトの血漿を分画し；(b)  生成沈殿IIを再懸濁し；(c)  再懸濁した沈殿物IIと医薬品添加物を含む高イオン強度の緩衝液を混合し；(d)  免疫グロブリンにナノろ過を施す工程を含むものである。アルコールはメタノールかもしれない。高イオン強度の緩衝液は、150mM NaCl-グリシンでありうる。医薬品添加物は非イオン性のポリオキシエチレン洗剤、たとえばポリソルベート-80である。
【００２２】
ナノろ過は、約30 nmより小なる、好ましくは約 12 nmのカットオフ定格を有する1番目のナノフィルターの使用を含む。ろ過はさらに、約10,000Kから約60,000Kの、好ましくは約50,000Kのカットオフ定格を有する2番目のナノフィルターの使用を含むものであって、これは、メタノールを除去し、タンパク質を濃縮し、および緩衝液を製品の安定に最も良いそれと交換する。そのような緩衝液は、たとえば低イオン強度の緩衝液、たとえば50mM  NaClグリシン緩衝液である。
【００２３】
本質的に純粋な抗D抗原を製造するためのプロセスは以下の工程を含んでいる：
(a)  分画したヒトの血漿からの沈殿IIを再懸濁し；
(b)  再懸濁した沈殿IIを処理助剤と混合し；ならびに
(c)  免疫グロブリンにナノろ過を施す。
処理助剤は高イオン強度緩衝液および非イオン性医薬品添加物を含むものであり；ここで高イオン強度緩衝液は150mM NaClグリシン緩衝液を含み、非イオン性医薬品添加物はポリソルベート80を含むものである。
本発明の方法はまた、(d)  約50,000Kのカットオフ定格を有するナノフィルターを用いて免疫グロブリン濃度を濃厚にする工程を含むかもしれない。この工程ではまた高イオン強度緩衝液を低イオン強度緩衝液、たとえば50mM NaCl、と交換する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、大きな生物分子のプリオンおよび/またはウイルスの減少またはプリオンおよび/またはウイルス除去の際の処理助剤として、高い（ほぼ生理学的範囲近傍の）イオン強度緩衝液および非イオン性医薬品添加物の組合せを用いる。本発明によれば、免疫グロブリンのような球状タンパク質分子に対して、目に見える程の収率低下および免疫グロブリンのサブクラス、凝集レベル、あるいは安定性に重要な変化を生ずることなく、小細孔径のサイズ排除ナノフィルターを使用出来る。
【００２５】
高イオン強度緩衝液および医薬品添加物は処理助剤としてのみ使われ、処理後にナノろ過により減少する事が出来る。本発明の方法は、本質的にプリオンおよび/またはウイルスを含まない製品を製造する。本発明の方法(サイズ排除)により除かれたウイルスは、あらゆる可能な種類のウイルスが、すなわち外皮膜のある（たとえば、HIV、B型肝炎ウイルス）および外皮膜のない（たとえば、A型肝炎ウイルス、パルボウイルスB19）ウイルスの両者共が、製品から除かれることを保証する。本発明の方法により除かれるプリオンは、あらゆる可能な種類のプリオンを含むものであり、たとえば、伝染性海綿状脳症 (“TSE”)を含み、さらに狂牛病(“BSE”)、ならびにPrPSCおよび新変形クロイツフェルド・ヤコブ病を含むスクレーピーを含むものである。
【００２６】
本発明の処理助剤の利点は、(1) 処理助剤が平衡をタンパク質の2量体、3量体、ならびに凝集物の生成からずらす方向に移動させ、製品をより高いタンパク質濃度で処理可能とするので、処理時間が大幅に短縮し、かつ付随的に収率が向上する、(2)  より小細孔径の膜を使用できるので、より小さな、外皮膜のないウイルスのプリオンおよびウイルスの除去をより確実にする、(3)  膜を通して処理された免疫グロブリンはIgGサブクラスまたは安定性に変化を生じない、ならびに、(4)  処理設備およびそれゆえ製造床面積を、フィルター面積当たり最も高い製品収率を得るように最適化できる。
【００２７】
本発明の方法に従って処理される大きな分子は、アルブミン、免疫グロブリン（たとえばIgG）およびその断片、ファクターVIII、IX、およびXIのような血液凝固因子、成長ホルモン、アポリポタンパク質、酵素（たとえばストレプトキナーゼ）、自然発生または遺伝子操作をしたものであろうと上記の全て、のような大きな球状タンパク質を含む。
【００２８】
本発明の本質的に純粋な、プリオンおよびウイルスの無い免疫グロブリン製品の製造に使用されるナノろ過ユニットの細孔径は、約30 nm未満、最も好ましくは約 15 nm未満である。しかしながら、タンパク質性の溶液から外皮膜の無いウイルスを減少し,または除去するに充分なフィルターカットオフ定格を有する如何なる膜も、本発明の処理方法に採用できる。たとえば、Viresorb-180（マサチューセッツ州ベドフォードのMillipore社製）ユニットが使用されるかもしれないが、そのようなユニットは約180 KDの分子量すなわち約 12 nmより小さい分子量細孔径定格を有する。本発明の方法はまた、血液分画製品同様、小さな組替えタンパク質、サイトカイン、ならびにリンホカイン製品のろ過に現在使われている70 KDナノフィルターの細孔径使用を考慮する。
【００２９】
プリオンおよびウイルスの除去のためのナノろ過処理助剤として、非イオン性医薬品添加物を使用する事は、新規である。本発明の非イオン性医薬品添加物は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンポリマー(PluronicsTM)、多糖類、タンパク質、ポリ（エチレンオキサイド）、ならびにアクリルアミドポリマ-およびその誘導体またはその塩類を含む。ポリ（エチレンオキサイド）はポリエチレングリコールを含むと理解される。本発明に有用であるビニルポリマーは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンならびにポリビニルアルコールからなる群から選択されるかもしれない。
【００３０】
本発明に有用である多糖類はセルロースまたはセルロース誘導体、グリコサミノグリカン、寒天、ぺクチン、アルギン酸、デキストラン、デンプン、ならびにチトサンからなる群から選択されるかも知れない。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン、ならびに関連分子からなる群から選択されるかもしれない。本発明に有用であるタンパク質は、ゼラチンおよびフィブロネクチンからなる群から選択されるかもしれない。上記表示の物質の幾つかはナノフィルターを通過しないかもしれないが、それらがリテンテート側にあることが、本発明の目的を達成するために充分であるかもしれない。
【００３１】
セルロース誘導体は、アルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、たとえばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースならびにヒドロキシプロピルセルロースを含むかもしれない。
本発明において考えられている球状タンパク質のナノろ過で最も好ましいものは、イオン性洗剤、ポリオキシエチレンまたは糖類先端基を有する非イオン性洗剤、リソホリピド、ならびに胆汁塩およびその組合せである。とりわけ好ましいのは、非イオン性ポリオキシエチレン洗剤、たとえばポリソルベート、Pluronics、Brij、Sterox-AJ、TritonsならびにTweensである。最も好ましいものは、ポリソルベート80である。
【００３２】
本発明の非イオン性医薬品添加物は、最初に処理法でタンパク質溶液中に、約0.015 g/Lから約 0.024 g/Lの範囲で、最も好ましくは約0.02 g/Lすなわち 20ppmで存在するかもしれない。処理中のそのような医薬品添加物濃度は、ウイルスの除去に影響しないことが測定された。特に好ましい非イオン性医薬品添加物はポリソルベート80であり、これは最も好ましくは処理中、処理のために0.002%すなわち 20ppmの濃度で使用される。これは、ポリソルベート80に対する臨界ミセル濃度またはその範囲内である。
【００３３】
本発明の他の医薬品添加物に対する濃度の決定に際して、その医薬品添加物に対して臨界ミセル濃度に関する知識への手引きが必要かもしれない。このパラグラフに引用された医薬品添加物の量は抗D免疫グロブリンに特定的であるが、前記量は他のIgG処方、たとえば免疫血清グロブリン（ヒトおよび馬）およびB型肝炎免疫グロブリン、に応用出来るだろうと考えられる。製品中の最終的な医薬品添加物濃度は、約0.1 - 0.2% w/v迄、より好ましくは約 80 - 200ppm、最も好ましくは、ポリソルベート 80の場合で、約100ppmかもしれない。一般的には、最終製品中に存在する医薬品添加物の量は、ほぼ同用量で投与される全てのIgG分子に対して、おおよそ同じである。医薬品添加物使用のさらなる利点は、ろ過処理中の消泡助剤としてである。
【００３４】
本発明で用いられるヒトの血漿は、上記に参照した如くCohnらの方法（Cohnプロセス）において、バッチもしくはカラム交換クロマトグラフィー、または親和力クロマトグラフィーで得られる。
【００３５】
本発明のプロセスで、（Cohnらのプロセスからの）沈殿IIの物質は約4.6 - 5.0 mg/ml（約0.5%）に希釈され、後に限外ろ過により10Xに濃縮されねばならないが、医薬品添加物の初期濃度を低くすることが重要である；上述した範囲の医薬品添加物濃度、および好ましくは約0.002%は、プロセスに悪影響を与えない。そのような悪影響は、たとえば外皮膜のあるウイルスで、ウイルスの外皮膜からの解離およびウイルス粒子のろ液への通過でありうる。水泡性口内炎ウイルス、すなわち弾丸状で、外皮膜があり、RNAを含有するウイルスを用いた、権利譲受人のための研究で、本発明で用いられた医薬品添加物濃度（処理で5X後、100ppmすなわち 0.01%）では、認識出来るようなウイルスの活性化は生じなかった事が示された。
【００３６】
本発明の処理で使用されたタンパク質濃度は重量で約0.1%から約1%の範囲にある。タンパク質物質が単量体または単クローン性であるときには、約1%までの濃度が使用出来る。本発明で使用された沈殿IIの免疫グロブリンに対しては、処理に使われたタンパク質の初期濃度は約4.6 - 5.0 mg/ml（約 0.46 - 0.5%）である。
【００３７】
Cohnは、参照文献としてその内容を本特許に引用している、彼の米国特許No. 2,390,074で、ガンマグロブリンを調製する血液分画法を開示している。Cohn法により調製されるガンマグロブリンは、19 S グロブリン、プラスミノーゲンならびに脂質である。このガンマグロブリンは、はしかおよび破傷風のような病気に対する予防薬として大いに適しているが、19 S グロブリン、プラスミノーゲンならびに脂質の存在は不必要な汚染物質であり、胎児の赤血球上のRh因子に対する免疫化予防の効果を減少するかもしれない。
【００３８】
本発明のバリデーション可能なプロセスで製造された、本質的に純粋な抗Rhグロブリンは、アルブミン、プラスミノーゲン、アルファ、ベータ、およびガンマグロブリン、ならびに種々の脂質を含むヒトの血漿から調製される。特定的に、本発明の抗Rhグロブリンはガンマグロブリンである。
抗Rhグロブリンを得るためのヒトの血漿の分画は、Pollackらに与えられた米国特許No.3,449,314の方法に従って行われ、その特許の教えは本特許に文献として入れられている。付随の図1のフローシートで、ヒトの血漿を分画する能力は、血漿の種々の成分の溶解性に依存する。分画の各段階で、画分の分離および抗Rhグロブリンに不要な成分の最終的な除去は、pH、温度、沈殿剤濃度ならびにシステムのイオン強度の厳密な制御により決定される。
【００３９】
アセトンおよびアルコール類のような低い比誘電率の種々の有機溶媒がタンパク質を沈殿するので、血漿の分画に使用されてきた。本発明の方法で用いられた有機溶媒は、種々のアルコール類およびアセトン、好ましくはメタノールを含む。メタノールは、他の有機溶媒より比較的毒性が低くかつ取り扱いの安全性が高い（たとえば、爆発危険性）ので好ましい。
分画中のタンパク質の変性を予防するために、沈殿は低温で行われる。タンパク質の溶解度は温度に依存するので、分画の各段階に対し選ばれる温度は、変性予防のために、望まれる分離の可能な最低温度でなければならない。
【００４０】
図1のフローシートで、分画はヒトの全血漿から始める。血漿を約1℃に冷却し、ついで上澄み液から冷たい不溶な沈殿を分離するために遠心分離する。上澄み液はさらに分画されて、沈殿Iおよび上澄み液Iを生じる。おもにフィブリノーゲンからなる沈殿物Iは廃棄される。上澄み液Iはさらに分画され上澄み液II+IIIおよび沈殿II+IIIを生じる。上澄み液II+IIIは、廃棄されるが、ベータグロブリンおよび脂質を含む。沈殿II+IIIは、おもにベータおよびガンマグロブリンならびにイソ凝集素からなるが、またプロトロンビン、プラスミノーゲン、コレステロールならびに他の脂質を含む。沈殿II+IIIは、さらなる分画で上澄み液II+III Wおよび沈殿II+IIIWを生じる。ベータグロブリン、コレステロールならびに他の脂質は、廃棄される上澄み液II+III W中に主として除かれる。
【００４１】
沈殿物II+III Wは、主としてガンマグロブリン、イソ凝集素、プラスミノーゲンおよびプロトロンビンならびにベータグロブリン、コレステロールおよび他の脂質からなる。さらなる分画により、沈殿II+III Wは上澄み液 III + 沈殿物IIIを生ずる。廃棄される沈殿IIIはイソ凝集素、プラスミノーゲンおよびプロトロンビンを含む。上澄み液 IIIは、主としてガンマグロブリンおよび少量のフィブリノーゲンおよび脂質を含む。分画の最終段階は、殆んど完全に19 S グロブリン、プラスミノーゲンおよび脂質を含まない、本質的に純粋なガンマ G グロブリンである沈殿IIを生じる。本発明のプロセスで調製された沈殿IIは抗Rhガンマグロブリンである。
【００４２】
本発明の好ましい方法で、再懸濁のための免疫グロブリン出発物質は、変更したCohnプロセスからの沈殿IIぺーストである。もしタンパク質が本発明で考えられているような医薬品添加物の存在下で凍結乾燥されるなら、凍結乾燥された沈殿IIぺーストが使用されるかもしれない。
【００４３】
本発明の沈殿IIぺーストを再懸濁するために用いられる希釈液は、注射用水、U.S.P. (“W.F.I.”)、通常の生理食塩水、U.S.P.、あるいは一連の適切な、安定なpHを与える利点のある、緩衝液のいずれかから選択される製剤的に許容できる希釈剤を含む。適切な緩衝液は、pH約6.4で、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、およびグリシン緩衝液からなる群から選択されるものである。好ましくは最初の希釈液は、後に最初の限外ろ過前に高イオン強度の緩衝液中に希釈される、ぺーストの3重量倍のW.F.I.である。ここに考えられている高イオン強度の緩衝液もまた、最初の希釈液として適している。好ましくは150mM +/- 20%のイオン強度が用いられ、好ましくは150mM +/- 20%のNaClグリシン緩衝液で、pH 6.4である。
【００４４】
本発明の免疫グロブリン処理とろ過のさい、高イオン強度の緩衝液が処理助剤として免疫グロブリンの2量体および3量体の生成を減らすための処理剤として好んで用いられ、より完全にフィルターを通過させる。適切な高イオン強度の希釈液は再懸濁用希釈液として上記に再引用されたものであるが、比較的より高いイオン強度で、かつpH が約6.4のものである。好ましくはそのような処理助剤は、最も好ましい約150mM +/- 20%濃度のイオン強度で存在する、これはほぼ生理学的イオン強度である。本発明の最も好ましい具体例で、高イオン強度処理助剤は、150mM NaCl-グリシン緩衝液で、pH 6.4である。
【００４５】
本発明の本質的にプリオンおよびウイルスの無い免疫グロブリンの処理において、非イオン性医薬品添加物を、プロセスのろ過工程の開始時に高イオン強度緩衝液と都合よく混合出来る。ポリソルベート 80を含む高イオン強度緩衝液の調製のための例2Aおよび3Aが、この点につき参照できる。本発明の処理助剤は、もしポリソルベート 80の濃度が増加すれば、イオン強度量が減少するように、相互に関連して調整できる。
【００４６】
保存剤が、本発明の処理方法で製造される製剤製品に用いらるかもしれない。好ましい保存剤は、Thimerosolおよびアジ化ナトリウムのような製剤的に許容できる保存剤であり、前者は26 -36 ppmで、本発明では 33 ppm (0.003%)で用いられるかもしれない。しかしながら、本発明の免疫グロブリン処方、および特に1回使用の非経口投与として設計されている、RhoGAM（商標）およびMICRhoGAM（商標）の処方においては、保存剤の使用は不必要である。
【００４７】
たとえば2番目の小細孔径ナノろ過フィルター、たとえば、約10,000Kから 60,000K迄のカットオフのフィルター、たとえば、Biomax-50（カットオフ50,000K）フィルター（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）を用いた本発明のタンパク質濃縮および有機溶媒除去の段階において、高イオン強度緩衝液は、任意に比較的低イオン強度のたとえば50 mM緩衝液、と交換されるかもしれない。このタンパク質濃縮工程は、ナノろ過処理をしたタンパク質製品を濃縮するのに役立ち、同時に多少の医薬品添加剤および有機溶媒を除去する。
【００４８】
Viresolve-180膜システムを使用してのろ過中、透過膜圧は、好ましくは約0ないし約 3.0 psiの範囲、最も好ましくは約1.5 psiより低い。ろ過係数は好ましくは約60%より大きいだろう。
本発明の処理は室温で行われる。冷却下での処理では、そのような温度（たとえば、16-17℃）で粘度が通常増加するので、一般的にはろ過時間が長引く。処理中の製品温度は約0℃から約45℃の少し上迄でありうるが、より好ましくは約15℃-30℃、最も好ましくは約20℃-25℃である。
【００４９】
ここで用いられる下記の術語は、以下に示すような意味を有する：
十字流流速：  膜表面を横切る供給液の流速(mL/min)
パーミエート: 膜を通過する精製製品
リテンテート: 膜により保持される物質
流束:         パーミエート流速/面積
変換：        パーミエート流速/十字流流速
ろ過係数：    パーミエートのタンパク質含量/リテンテートのタンパク質含量
【００５０】
本発明の1具体例で、および図2〜図4に関して、ナノろ過により本質的に純粋な（プリオンおよびウイルスを除去した）免疫グロブリン、たとえばRhoGAM（商標）を得るための製造規模での処理は下記の如く進める：
Rho(D)免疫グロブリンは、Cohn精製法  (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 68, pages 459-475)  を用いて“沈殿IIペースト”段階に精製される、ここでエタノールはメタノールで置換され、2-8℃に冷やされた注射用水(WFI),U.S.P.に再懸濁される。W.F.I.の容積は下式で計算される：
沈殿IIの重量(kg) X 3 L/kg ＝ W.F.I.の必要容積  (L)
沈殿IIペースト各1 kgは3 LのW.F.I.に再懸濁される。
【００５１】
混合物は貯留タンクで3-8時間渦巻き攪拌（泡立てずに）され  ー  製品(1)、以後の使用まで4℃で蓄えられる。スチ-ム  イン  プレース(SIP)処理を、ウイルス除去システムで行う。これには、ウイルス除去フィルターホルダー(2)にViresolve CIP/SIPモジュ-ル(マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社)の装着、および限外ろ過フィルターホルダー(3)にPellicon CIP/SIPモジュ-ル(マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製)を装着してある。CIP/SIP処理をシステムおよび50mM NaCl−グリシン緩衝液貯蔵タンク(4)でも行った。
【００５２】
クリーン  イン  プレース(CIP)法は、装置部品を分解せずに処理装置を洗浄する方法である。装置の要件として、全ての配管はステンレススチールであり、適切なピッチおよび配置であり、ならびにガスケットは最小数であることを含む。CIPの目的は、手動での洗浄およびロット間の交差汚染を除くことである。この方法はバリデーション出来る。洗浄の要素には、時間、温度、化学的および機械的パラメーターが含まれる。処理後に残る残渣の種類により、CIP処理に使用すべきクリ-ナーが決められる。製薬業界の通常の技術を有する人はCIPの処理および要件に精通している。
【００５３】
SIP処理プロセス後、おおよそ40 L容積の再懸濁した沈殿IIに対して、Viresolve-180Rモジュ-ル、20束(2)をViresolve CIP/SIPモジュ-ル(2)の代わりに設置する。（10 - 16 L の最終製品容積に対して10束のViresolve-180Rフィルターを、および >16-40 L に対して20束を用いる）。4個のBiomax-50カセット（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）を, Pellicon CIP/SIPモジュ-ル(3)の代わりに設置する。10-16 L容積の再懸濁した沈殿IIに対して2個のBiomax-50カセットを、 >16-40 Lの容積に対して4個のカセットを使う。Viresolve-180Rモジュ-ルを塩素で滅菌し、ついでジエチルフェニレンジアミン(DPD)法による塩素の測定値が0.3 ppm以下になる迄リンスする。
【００５４】
圧力保持試験を、滅菌済みモジュ-ル(2)で行う。モジュ-ルは最低10 psiの圧力に耐え、かつ要求される5分間の試験期間中の圧力低下が1 psi以下を示さねばならない。
Biomax-50の膜(3)はWFI, U.S.P.でフラッシュ洗浄する。塩化ベンザルコニウム (Roccal)の測定は、最後の透過洗浄サンプルで行われ、塩化ベンザルコニウム 含量は10 ppm以下であらねばならない。
拡散試験は、Biomax-50のカセットで行われ、解放速度は下記の様に計算される：
【００５５】
【数１】
0004523222.tif 000002
【００５６】
解放速度は18 cc/分/カセット以下であらねばならない。
Viresolve-180フィルター(2)を用い,ウイルス除去限外ろ過を50mM NaCl  グリシン緩衝液で行う。ウイルス除去循環タンク(T-1)(5)に、50mM NaCl  グリシン緩衝液を入れる。供給量は、最大250 L、最小130 Lである。
緩衝液はT-1 (5)に再循環し、緩衝液パーミエートをオフラインのタンクに集める。
ウイルス除去再循環タンク(T-1)(5)には、タンクおよび膜をフラッシュ洗浄するために、最小60 Lの150mM NaCl-グリシン緩衝液を入れる。
沈殿IIの再懸濁は、下記の様に行う。沈殿IIは、泡を生ずることなく渦巻きを生じる速度で、完全に懸濁する迄15-30分間、混合する。屈折率によるタンパク質パーセント(mg/mlタンパク質)の測定は、携帯プロトメーターを使い沈殿IIの再懸濁液について行う。5.0 mg/mlタンパク質濃度を得るために必要な希釈沈殿IIの最終容積は、下式を用いて計算される：
【００５７】
【数２】
0004523222.tif 000003
【００５８】
150mM NaCl-グリシン緩衝液の必要容積は下式を用いて計算される：
【００５９】
【数３】
0004523222.tif 000004
【００６０】
緩衝液を希釈された沈殿IIに加え、泡を生ずることなく渦巻きを生成するに十分な速度で、最小30分間攪拌する。混合物は以後の処理まで最長2.5時間、15-30℃で蓄えられる。
希釈した沈殿IIのバッチを、限外ろ過のためにウイルス除去再循環タンク(T-1)(5)に供給する。TMP設定点は約3.0にされる。しかしながら、設定点は高くしても良いが、もし約12に達すると、膜が分極するかもしれないので、その時にはリテンテートで（パーミエートを減らすことにより）膜を洗う。Viresolveのレベル設定点は、下記の様に計算される：
【００６１】
【数４】
0004523222.tif 000005
【００６２】
もし上記計算の結果が50未満なら、50をViresolveのレベル設定点として入力する。全容積の1/3は、最も近い整数のLにまるめられる。
限外ろ過濃縮の終点は以下の様に計算される：
【００６３】
【数５】
0004523222.tif 000006
【００６４】
もし上記結果が20未満なら、20を濃縮終点として入力する。限外ろ過のダイアろ過終点は以下で計算される：
濃縮終点  −  3  ＝  ダイアろ過終点
ダイアフィルター全設定点は次の様に計算される：
濃縮終点  Ｘ  5.5  ＝  ダイアフィルター全設定点  (L)
【００６５】
限外ろ過/濃縮プロセスを始めるために、Viresolve-180の供給液ポンプ(P1) (7)の速度を、20束のフィルターサイズに対しては75% - 83%に、10束に対しては37% - 42%にする。TMPの制御を行う；TMPはパーミエートポンプ(P2)の速度で制御する；もし膜貫通圧力が3.0になれば、ポンプを遅くする。Viresolve パーミエートポンプ(P2) (8)の速度は、18%迄、または10 束のフィルターの時は9%迄ゆっくりと上げる。一旦P2を上げたら、リテンテート圧力(PT3)を5.0 psi以上に維持する。一旦TMP圧力が平衡に達したら、ポンプの速度範囲を10束のフィルターに対しては9%から11%、20束のフィルターに対しては18%から23%に設定する。
【００６６】
TMP圧力は制御しない；しかしながら、それは好ましくは比較的低く、たとえば約3.0 psiより低い、さもないと膜が分極するかもしれない。もしTMPがもっと高く、たとえば12 psi位になると、リテンテートが膜を洗えるようにパーミエートが止められるかもしれない。UVメーター(UV1) (9)は下限4.0 A.U.および上限7.7 A.U.の間であるべきである。パーミエート流速(FT1)は、下限0.81 リッター/分 (LPM)および上限0.98 LPMの間であり、10束のフィルターでは0.40 LPM−0.49 LPMの間である。処理温度は約15 - 30℃に維持される。これらの条件は、ウイルス除去/限外ろ過プロセスを通じて監視される。UVメーター(UV1) (9)は下限6.4 A.U.および上限7.7 A.U.の間である。ろ過係数は約75%以上であるべきである。
【００６７】
T-2 (6)の容積がほぼ75-100 Lに達したら、Pelliconシステム(3)を組み立て、混合を始める。UF供給液ポンプ(P5) (10)を始動し/吐出量をあげる、そしてUFパーミエートの流速をポンプの速度で制御する。UF供給液圧力(PT4)およびUFリテンテート圧力(PT5)を以下のように維持する：
UF供給液圧力:   < 30 psi
UFリテンテート圧力:   < 10 psi
供給液圧力とリテンテート圧力との差圧は20 psi以下に維持される。
供給液圧力 (psi) ― リテンテート圧力 (psi)  ＝  差圧 (psi)
希釈沈殿II供給タンクT-1(5)の容積レベルは(重量で)監視され、T-1のロードセルがこれに応答する。
【００６８】
定容ダイアろ過をT-1 (5)で行う。この定容ダイアろ過は、システムおよびViresolve-180膜を通して残留タンパク質を洗うために使われ、それにより収率を上げる。3X 150mM NaCl-グリシン緩衝液をダイアろ過する；一定量の緩衝液を加え、それと同速度で緩衝液をViresolve-180パーミエートを通して除去する。ダイアろ過工程の終了後、T-1 (5) およびViresolve-180モジュ-ル(2)を上述の如く、塩素プロセスを使い、滞留したウイルスを全て確実に不活性化するように、滅菌する。
【００６９】
T-2  (6)中のバルクを、ウイルスを除いた50mM NaCl-グリシン緩衝液を用いて、T-2  (6)中で定容ダイアろ過により濃縮する。この工程はバルク製品を濃縮し、高イオン強度緩衝液濃縮物を低イオン強度緩衝液濃縮物と交換し、Cohnプロセスからのメタノ-ルおよび約半量のポリソルベート80を除く。ダイアろ過プロセスが終了したら、T-2  (6)内のレベルをリッターで記録する。T-2  (6)からサンプルを取り、UFパーミエートサンプルのデジタル比電動度測定を行う。結果は、4.95 - 5.67 X 10-3 mhos/cmの範囲に入らねばならない。この要件が最初の試験で満たされない場合には、試験結果がこの要件範囲に入るまで、定容ダイアろ過を続けねばならない。
【００７０】
5.5X ダイアろ過後のT-2レベルは、再懸濁沈殿IIの容積の95%以下であるべきである。もしT-2レベルが再懸濁沈殿IIの容積の95%を越えていたら、T-2容積が容積レベル要件の上限に合うまで、バルクの濃縮を続ける。容積レベルが満たされたときに、UFパーミエートを停止し（11）かつバルクを再循環で混合し、10.5 mlサンプルを無菌的に採取する(12)。タンパク質パーセントの測定を、サンプルの0.5 mlアリコートについて、携帯プロトメーターを使って屈折率で行う。もしタンパク質濃度が少なくとも5.5%でない時は、その最小値になるまで、サンプルをさらに濃縮しなければならない。バルクを中間容器に移し、バルク重量を下記の式を使って重力的に計算する：
【００７１】
満たされた中間容器の重量  (kg) ―  中間容器風袋の重量  (kg)
＝  T-2内のバルク製品重量  (kg)
バルクの調整は、下記の式を用いて、最終バルク容積を得るために加えるべき50mM NaCl-グリシン緩衝液容積を決定して行う事が出来る：
【００７２】
【数６】
0004523222.tif 000007
【００７３】
残ったサンプルのアリコートで初期pHの測定を行う。先ずアリコートを0.9% NaClで1:10に希釈する、ついで、0.5N HCLまたは0.5N NaOHで1:100に希釈し、6.3 - 6.4のpHに滴定する。
もし調整が必要ならば、バルクのpHを調整するのに必要な無希釈の0.5N 試薬の量を下式で計算する：
【００７４】
【数７】
0004523222.tif 000008
【００７５】
Viresolve-180フィルターモジュールの完全性試験を、一般に認められた方法に従って行う。完全性試験の値は1.2以上でなければならない、そしてモジュールを上述の如く塩素で滅菌してから、リンスしなければならない。
上述の式を用いて計算した0.5Nの無希釈の試薬、および、もし望まれるなら、100X  thimerosol溶液をバルクに加える。もし望まれるなら、加えるべきthimerosol溶液の必要量は、次の様に計算できる：
【００７６】
【数８】
0004523222.tif 000009
【００７７】
バルクはT-2にポンプで戻し、必要最終容積に達した後10-60分間 T-2で混合を続ける、そしてバルク製品の10.5mlのアリコートをpHの測定のために無菌的に除く。pHは6.3-6.4でなければならない。もしpHが上述の範囲外なら、アリコートを希釈し、以前のように許容pHに滴定しなければならない、そして無希釈の0.5Nの試薬の必要量を計算し、上述の如く、攪拌しながらバルクに戻さねばならぬ。タンパク質パーセントは、上述の如く、携帯プロトメーターを用いて屈折率により測定する。もしタンパク質濃度が、許容できる5.0%以上なら、バルクを次工程に送ってもよい。もしタンパク質濃度が許容パーセンテージ以下なら、バルク製品を不合格とする。
【００７８】
バルクは任意で、ろ過プロセス中に15 psiを越えない圧力で、0.2u Optisealフィルター(13)でろ過し、ついで微生物学的、血清学的に試験する。
WFIおよび蒸気を用いて、クリーン  イン  プレース操作を、ウイルス除去システムで行う（上述のCIP操作）。
製品の受け入れ規格を表1に示す。
【００７９】
【表１】
0004523222.tif 000010
【００８０】
伝染性スクレーピーに関連した原繊維の寸法は、断面直径で6 nmおよび長さで1000 nm迄であり、ここで使用される定格の小細孔排除膜は(12-18 nm)なので、製品流、たとえば限外ろ過済みのRhoGAM（商標）からのプリオンの除去で、米国特許No. 6,096,872の方法がプリオンの汚染を除去するのに好都合に使用出来る。
サンプルのプリオン汚染を測定する既知の分析法が、本発明に従って製品のろ過後のプリオンを試験するのに好都合に用いられる。
【００８１】
そのようなプリオン検出分析法には、ELISAおよびウエスタンブロット分析法等がある。たとえば、ELISA分析法はBioRad社、Aventis社、およびCaprion社 から容易に入手出来、またウエスタンブロット分析法には、Prionics社 およびQ-One社から容易に入手出来る。さらに、ここで用いられたBioReliance社のプリオン検知ウエスタンブロット分析法も入手可能である。
【００８２】
本発明における調製物投与の様式は、この化合物が送達される生物の場所および/または細胞を決定するかもしれない。本発明の化合物は単独でも投与できるが、一般的には意図する投与の道筋および標準的な製薬の習慣により選ばれた製剤的キャリアーまたは希釈剤と混合して投与される。調剤は、非経口的に、たとえば、動脈内にまたは静脈内に注射されるかもしれない。調剤はまた経口、皮下、あるいは筋肉内に送達されるかもしれない。非経口投与では、調剤はたとえば、液を等張にするための他の溶質、たとえば充分な塩類またはグルコースを含む無菌の、水溶液の形態で使用できる。
【００８３】
経口投与のための、発明の成分は、錠剤、カプセル、トローチ剤、粉末、シロップ、エリキシル剤、水溶液および懸濁液ならびにその他同様のものの形態で使用出来る。錠剤の場合には、使用されるキャリアーは、乳糖、クエン酸ナトリウム、ならびにリン酸塩を含む。デンプンのような種々の崩壊剤およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤が錠剤に通常用いられる。カプセル形での投与では、有用な希釈剤は乳糖および高分子量ポリエチレングリコールである。経口用として水溶液が必要とされる時に、ある種の甘味剤および/または着香料が添加出来る。
【００８４】
本発明の本質的に純粋な免疫グロブリンは、人間を含む哺乳動物のような患者に投与されるかもしれない。苦難の治療のための投与で、処方医または獣医は、人間または動物の患者に適切な用量を最終的に決めるだろう、そしてこの用量は体重、年齢、ならびに個人の兆候の性質および激しさ同様、個人の反応により変わると期待される。
【００８５】
本発明の本質的に純粋な抗D免疫グロブリンの場合に、1投与当たりの用量は、RhoGAM（商標）に対して約300ug およびMICRhoGAM（商標）に対して約50ugからである。そのいずれも、上述におよびそれぞれの製品文献で議論される指針に応じおよび目的のために投与される。上述した各製品は、治療医により決定されるべき全用量に対して、複数回投与出来る。
以下の例は例証のみの目的で提示され、本発明の範囲を限定するものとみなさるべきではない。
【００８６】
例
例1．
以下の如く行われる限外ろ過による、ウイルスを除去したRhoGAM（商標）の製造。
変更したCohn精製法（上述で参照した）を用いて“沈殿IIペースト”の段階に精製したRho(D)免疫グロブリン3.250 KGを5℃に冷却した9.750 Lの注射用水(WFI),U.S.P.に再懸濁した。混合物を4時間（泡を生ぜずに）渦巻き攪拌し、以後の使用迄4℃で貯蔵した。再懸濁したPPT IIの重量は3.250 Kgであった。
【００８７】
SIP操作後、容積約13.0Lの再懸濁した沈殿IIのためにViresolve-180Rモジュ-ル（Millipore社製）（10束）を設置した。2組のBiomax-50カセットをPellicon CIP/SIPモジュールの代わりに設置した。Viresolve-180Rモジュ-ルを塩素で滅菌し、リンスした。Biomax-50膜をWFI,U.S.P.でフラッシュ洗浄した。塩化ベンザルコニウム (Roccal)の測定を、最後に透過したフラッシュサンプルで行った；塩化ベンザルコニウム 含量は6 ppmであった。拡散試験をBiomax-50カセットについて行った；放出速度を上述の如く計算した；放出された全容積は5分間で2mlであり、実際の放出速度は0.4cc/分であった。
【００８８】
Viresolve-180を用いたウイルス除去限外ろ過を190.0 Lの 50mM NaCl-グリシン緩衝液で行った。ウイルス除去再循環タンク(T-1)に100 Lの 50mM NaCl-グリシン緩衝液を供給した。緩衝液はT-1に再循環され、同時に緩衝液パーミエートを予め滅菌した50mM NaCl-グリシン緩衝液貯留タンクに集めた。集められた透過緩衝液の容積は21.7℃で123.3 Lであり、収集は50分で終了した。ウイルスを除去した緩衝液は約25℃の室温で貯蔵された。
【００８９】
150mM NaCl-グリシン緩衝液（例２参照）のフラッシュを、ウイルス除去再循環タンク(T-1)に緩衝液供給タンクを取り付けて行った。T-1にフラッシュ用の150mM NaCl-グリシン緩衝液を60 L供給した。
沈殿IIの再懸濁を以下の様に行った。沈殿II (3250 g)を、泡を生ぜずに渦を生じる速度で20分間、完全に懸濁するまで混合した。屈折率法によるタンパク質パーセント（mg/mlタンパク質）測定を、携帯プロトメーターを用いて沈殿II再懸濁液で行い、49 mg/ml（約5.0%タンパク質）を得た。
【００９０】
希釈沈殿IIの必要容積を5.0 mg/mlのタンパク質濃度を得るために計算した。
【数９】
0004523222.tif 000011
【００９１】
20 ppm のポリソルベート80 （例  1A参照）を含む150mM NaCl-グリシン緩衝液の必要容積を下式を用いて計算した：
【数１０】
0004523222.tif 000012
【００９２】
114.4 Lの緩衝液を13 Lの希釈沈殿物IIに加え、泡を生ぜずに渦を生ずるに充分な速度で45分間攪拌した。
ウイルス除去再循環タンクに100.0Lの希釈沈殿IIを加えた。ウイルス除去再循環タンク（ポンプ  No.1）を、使用されている10束のViresolve-180モジュール用に40%の供給ポンプ速度で開始した。ウイルス除去パーミエートのポンプ流速(ポンプNo.2)を、初期の膜貫通圧(TMP)を1.6 psi未満に維持するために、10束モジュールに対し0.450LPM(10.0%)に上げた。実際の圧力は1.6 psiに維持された。製品ポンプ速度（ポンプNo.3）をレベルを制御する様に調節した。TMPは, ウイルス除去再循環タンクのリテンテート側のタンパク質濃度を監視することにより、プロセスを通じて3.0 psi以下に維持した。インラインのUVモニターを使用し、タンパク質含量4.5 - 5.5 mg/mlに対応する吸光度6.4 - 7.7の間に維持した。
【００９３】
ウイルス除去タンクから約75 Lのパーミエートを限外ろ過タンク(UF)に供給し、限外ろ過供給液ポンプ(ポンプNo.5)を10.0%で開始した。UFパーミエート流速がウイルス除去パーミエートの流速と同じになる迄、ポンプ速度を早めた（30%迄）。UFパーミエート流速は0.4 LPM、VCパーミエート流速は0.460 LPMであった。UFタンクの一定容積を75.3 Lに維持した。UF供給液圧は5.4 psi、UF透過圧は0.2 psi、ならびにUF リテンテート圧は0.3 psiであった。
【００９４】
タンクが15 - 20 Lになった時、定容ダイアろ過をT-1で行った。ダイアろ過は150mM NaCl-グリシン緩衝液で最低3回の緩衝液交換を維持した（全容積約60 L）。ダイアろ過が終了した時に、ウイルス除去タンクのポンプとミキサーを止めた。VC再循環タンクの定容積を16.2  Lに維持した。交換された全緩衝液容積は49Lであった。ウイルス除去ダイアろ過は、UF供給液ポンプを始動した時から約4時間で終了した。
【００９５】
T-2内のバルクを再循環し、それにより、50 mM NaCl-グリシン緩衝液のウイルス除去ロット(ポリソルベート80を含まない)を用いて、T-2内で定容ダイアろ過を行い、濃縮した。バルクをそれにより再懸濁沈殿IIのほぼ初期の出発容積迄濃縮した。パーミエートバルブを全開し、UF供給液ポンプ速度を65%とした；供給液圧力を30 psi未満に維持し、圧力差はリテンテートループに背圧をかけて14-17 psiに維持した。UF定量カラムを20 Lに維持し、全部で110 Lの緩衝液を交換した。UF透過サンプルのデジタル比伝導度測定を行うために、T-2からサンプルをとった。結果は5.29 X 10-3 mhos/cmであった。一旦、容積レベルが満たされたら、UFパーミエートを止め、バルクを再循環で混合し、10.5 mlのサンプルを無菌的に採取した。タンパク質パーセントの測定を、携帯プロトメーターを用いてサンプルの0.5 mlアリコートの屈折率で行った。タンパク質濃度は4.8%であった。
【００９６】
5%タンパク質含量を達成するためのバルクの必要最終容量は、下式で計算される：
【数１１】
0004523222.tif 000013
【００９７】
バルクを、要求タンパク質濃度5%にするために、最終容積11.424迄さらに濃縮した。
初期pHの測定を残ったサンプルアリコートで行った。まずアリコートを0.9% NaClで1:10に希釈し、0.5N HCl または0.5N NaOHで1:100に希釈して、pH 6.3 - 6.4に滴定した。PHは6.58であった。
pHを調整するために、0.9% NaClに0.5N HClをいれた滴定剤1.8 mLを加えた。最終pHは6.31であった。もし調整が必要な場合、バルクのpHを調整するに必要な無希釈の0.5N試薬の容積は下式で計算される：
【００９８】
必要最終容積  (L) Ｘ  必要な1:100滴定剤容積  (ml)
＝  無希釈の0.5N試薬の容積  (ml)
すなわち、この場合；
11.424 L X 1.8 ml ＝  20.536 ml  無希釈の0.5N試薬
Viresolve-180フィルターモジュールの完全性試験を、一般に認められている方法に従って行った。完全性試験値は1.2以上でなければならない、そしてモジュールを上述のように滅菌し、リンスしなければならない。
【００９９】
100X Thimerosol溶液の必要容積を計算した：
【数１２】
0004523222.tif 000014
【０１００】
定常的にバルクを混合しながら、99.7 ml の100X Thimerosolを加えた。
バルクは、0.70 Lのウイルスを除去した50 mM NaCl-グリシン緩衝液を用い、計算で得た必要最終容積に調整し、10分間混合した。
バルク製品の10.5 mlアリコートをpH測定のために、無菌的に採取した。pHは6.3-6.4でなければならない。実際のpHは6.54であった。pHが上述の範囲外にあったので、アリコ-トを希釈し以前のように許容出来るpHに滴定した。そして上述の如く、無希釈の0.5Nの試薬の必要量を計算し、混合しながらバルクに加え戻さねばならない。
【０１０１】
【数１３】
0004523222.tif 000015
【０１０２】
6.35 の最終pHに達するための滴定剤の容積は1.7 mLであった。
最終のタンパク質製品は、下記の如く受け入れ規格に合った：
タンパク質  ＝  5.0%
pH ＝  6.3
ポリソルベート80は2回の試験(A319)で、104.6 および106.7で平均は105.7であった。
メタノ-ル含量は、ガスクロマトグラムによる測定で、32.4 ppmであった。
【０１０３】
例1A．
例1に用いた150mM NaCl-グリシン緩衝液を、下述のように調製した：
調製すべき緩衝液の適正量は、下式で計算した：
【０１０４】
【数１４】
0004523222.tif 000016
【０１０５】
必要物質の量を決定し、較正済みの、発熱物質を除去した容器に秤りこんだ：
【表２】
0004523222.tif 000017
【０１０６】
ポリソルベート秤量容器を総量約2リッターの注射用水、U.S.P.で数回リンスし、各すすぎアリコートをバッチに加えた。全量で10 Lを加えた。下記の物質の量を決定した：
【０１０７】
【表３】
0004523222.tif 000018
【０１０８】
混合物を注射用水、U.S.P.で容積迄希釈し、最終量を60分間混合した。pHを測定した；必要条件は6.3-6.5であったが、実測pHは6.46であった。もし要件が満たされない時は、必要pHに達する迄、1.0N HClまたは 1.0N NaOHを加えることが必要である；添加毎に、溶液を15-30分間混合し、pH測定を確認すべきである。
デジタル比伝導度測定を行った；25℃での要件は、14.15から15.59 X 10-3 mhos/cmである。結果は15.38 X 10-3 mhos/cmであった。もし要件が満たされなかった時は、調整した試薬を廃棄し、新たに試薬を調製する必要がある。
ポリソルベート80 の測定を行った；試験サンプルは15から 25 ppmの  ポリソルベート80を含まねばならない。濃度は22.8 ppmであった。
【０１０９】
例2．
限外ろ過によりウイルスを除去したRhoGAM（商標）の製造を、下記の変更をして例2の様に進めた：
変更したCohn精製法を用いて“沈殿IIペースト”段階に精製したRho(D)免疫グロブリン6.802 Kgを、4℃に冷却した20.406 Lの注射用水(WFI), U.S.P.に再懸濁した。混合物を4時間（泡を生ぜずに）渦巻き攪拌し、以後の使用迄4℃で貯蔵した。
【０１１０】
SIP処理後、約27.208Lの再懸濁した沈殿物IIのために、Viresolve-180Rモジュール（Millipore社製）（20束）を設置した。2組のBiomax-50のカセットを、Pellicon CIP/SIPモジュールの代わりに設置した。Viresolve-180Rモジュールを、上述の如く塩素で滅菌し,リンスした。Biomax-50膜をWFI,U.S.P.でフラッシュ洗浄した。塩化ベンザルコニウム (Roccal)の測定を最後の透過フラッシュサンプルで行った；塩化ベンザルコニウム含量は8 ppmであった。拡散テストをBiomax-50のカセットについて行った；放出速度を上述の如く計算した；放出した全容積は5分間で22 ccであり、実際の放出速度は4.4 cc/分であった。
【０１１１】
Viresolve-180Rを用いて、245 Lの50mM  NaCl-グリシン緩衝液のウイルス除去限外ろ過を行った。ウイルス除去再循環タンク(T-1)に245 Lの50mM  NaCl-グリシン緩衝液を供給した。緩衝液をT-1に再循環し、同時に緩衝液パーミエートを予め滅菌した50mM NaCl-グリシン緩衝液貯蔵タンクにオフラインで集めた。集められた透過緩衝液の容積は213 Lであった。ウイルス除去緩衝液は、約63-78Fの室温で貯蔵した。
【０１１２】
緩衝液供給タンクをウイルス除去再循環タンク(T-1)に接続して、150mM  NaCl-グリシン緩衝液(調整法は例2Aを参照)によるフラッシュを行った。フラッシュするために60 Lの150mM  NaCl-グリシン緩衝液をT-1に供給した。沈殿IIの再懸濁を下記の如く行った。沈殿II(6.802 Kg)を泡を生ぜずに渦を生ずる速度で、完全に懸濁するまで、55分間混合した。沈殿II再懸濁物の、屈折率によるタンパク質パーセント(mg/mlタンパク質)の測定を携帯プロトメーターにより行い、59 mg/mlをえた。
【０１１３】
5.0 mg/mlのタンパク質濃度をうるために必要な希釈した沈殿IIの量を計算した：
【数１５】
0004523222.tif 000019
【０１１４】
緩衝液(293.846 L)を27.208 Lの希釈沈殿IIに加え、泡を生ぜずに渦を生ずるに十分な速度で30分間、混合した。
107 Lの希釈沈殿IIをウイルス除去再循環タンクに供給した。  20束のViresolve-180Rモジュールの使用に対し、ウイルス除去再循環タンク(ポンプNo.1)を80%の供給液ポンプ速度で開始した。ウイルス除去パーミエートポンプの流速(ポンプNo.2)を、20束のモジュールに対し1.6 psi未満の初期膜貫通圧(TMP)を維持するために、0.91 LPM(20%)にした。維持された実際の圧力は1.2 psiであった。製品ポンプ速度(ポンプNo.3)をレベル制御速度に調整した。ウイルス除去再循環タンクのリテンテート側のタンパク質濃度を監視することにより、プロセスを通じてTMPを3.0 psi未満に維持した。インラインUVモニターで観測し、タンパク質含量4.5 - 5.5 mg/mlに対応する6.4-7.7の吸光度単位の範囲に維持した。
【０１１５】
ウイルス除去タンクからの約75 Lのパーミエートを限外ろ過タンク(UF)に供給した後、限外ろ過供給液ポンプ（ポンプNo.5）を10%で開始した。UFパーミエート流速がウイルス除去パーミエートの流速に等しくなるまで、ポンプ速度を上げる（25%まで）、ついで容積を維持するために25%に合わせる。UFパーミエート流速は0.91 LPMでVCパーミエートの流速は0.91 LPMであった。UFタンクの一定容積を152 Lに維持した。UF供給液圧は4.0 psi、UFパーミエート圧は 0.1 psi、およびUF リテンテート圧は 0.7 psiであった。
【０１１６】
T-1タンクに約15-20 L満たして、定容ダイアろ過を行った。ダイアろ過は、150mM  NaClグリシン緩衝液を最低3回、緩衝液交換（全容積約60L）をして行った。ダイアろ過が終了した時に、ウイルス除去タンクポンプとミキサーを止めた。VC  再循環タンクを、15 Lの一定容積に維持した。緩衝液の全交換容積は45 Lであった。
【０１１７】
T-2のバルクを再循環し、それにより、50mM  NaCl-グリシン緩衝液のウイルス除去ロットで、T-2で定容ダイアろ過により濃縮した。それによりバルクを再懸濁沈殿IIのほぼ元々の初期容積まで濃縮した。パーミエートバルブを全開にし、UF供給液ポンプ速度を70%にした；供給液圧力を30 psi未満に維持し、リテンテートループに背圧をかけることにより、圧力差を14-17 psi に維持した。UFの定容カラムを22 Lに維持し、交換された全緩衝液容積は121.2 Lであった。UFパーミエートサンプルでデジタル比伝導度の測定を行うため、T-2からサンプルをとった。結果は5.47 X 10-3 mhos/cmであった。容積レベルが満たされると、UFパーミエートを閉じ、バルクを再循環で混合し、10.5 mlのサンプルを無菌的に採取した。タンパク質パーセントの測定を、携帯プロトメーターを用いてサンプルの0.5 mlアリコートの屈折率で行った。タンパク質濃度は7.9%であった。
【０１１８】
T-2からのバルクを中間バルク容器に移動し、全容器を秤量した（総重量）。バルクをT-2に戻し、空の中間バルク容器を秤量した：
【数１６】
0004523222.tif 000020
【０１１９】
初期pHの測定を残ったサンプルアリコートで行った、まずアリコートを0.9%のNaClで1:10に希釈し、0.5 N HCL または  0.5 N NaOHの1:100の希釈液でpH 6.3-6.4に滴定した。  pH は6.55であった。
pHを調整するために、0.9% NaClに0.5N HClを入れた滴定剤1.35 mlを加えた、最終のpHは6.35であった。もし調整が必要なら、バルクのpHを調整するのに必要な無希釈の0.5N試薬の量を以下の如く計算する：
【０１２０】
【数１７】
0004523222.tif 000021
【０１２１】
Viresolve-180フィルターモジュールの完全性試験を、一般に認められた方法に従って行った。完全性試験値は1.2以上でなければならない、そしてモジュールは上述の如く塩素で滅菌し、リンスしなければならない。
100X  Thimerosol溶液の必要量を計算した：
【０１２２】
【数１８】
0004523222.tif 000022
【０１２３】
バルクを絶えず混合しながら、341 mlの100X  Thimerosolを加えた。バルクを、ウイルス除去した 50mM NaCl-グリシン緩衝液0.801 Lを用いて、計算値の必要最終容積迄調整し、10分間混合した。
バルク製品のアリコート10.5 mlを、pH測定のために無菌的に採取した。pHは、6.3-6.4でなければならない。実際のpHは、2回の読みで6.38および6.345であった。
【０１２４】
最終タンパク質製品は、以下の様に受け入れ規格に合格した：
タンパク質  ＝  5.3%
pH          ＝  上述
ガスクロマトグラムで測定したメタノール含量  ＝  53.9  ppm
ポリソルベート 80 ＝101.7 ppm,102.2 ppm(2回試験)；平均値は101.9 ppm。
【０１２５】
例2A．
例2に用いた150mM NaCl-グリシン緩衝液を、以下の様に調製した：
調製すべき緩衝液の適正量を以下の様に計算した：
【０１２６】
【数１９】
0004523222.tif 000023
必要な物質量を決定し、較正済みの、発熱物質を除いた容器に測りこんだ：
【０１２７】
【表４】
0004523222.tif 000024
【０１２８】
ポリソルベート秤量容器を全部で約2リッターの注射用水、U.S.P.で数回リンスし、リンスアリコートはバッチに加えた、そして全量を604.16 Lに調整した。下記の物質の量を決定した：
【０１２９】
【表５】
0004523222.tif 000025
【０１３０】
混合物を注射用水、U.S.P.で容積迄希釈し、最終量を60 分間混合した。pHを測定した；要件は6.3 - 6.5であった。pHは6.38であった。もし要件が満たされなければ、要件pHに達する迄1.0N HCl または 1.0N NaOHを加えることが必要であり；そのたびに液を15-30分間混合し、pH測定を確認すべきである。
デジタル比伝導度測定を行った；25℃での要件は、14.15から15.59 X 10-3 mhos/cmである。結果は15.18 X 10-3 mhos/cmであった。もし要件に合わなかった時には、試薬を廃棄して新しく調製する必要がある。
ポリソルベート80の測定を行った；試験サンプルは15から24 ppm ポリソルベートを含まねばならない。濃度は19.5 ppmであった。
【０１３１】
比較例
ポリソルベート 80  対  ポリソルベート 80の無いとき
比較例1A．ポリソルベート 80を含むとき
沈殿IIペースト(10g)を30 mlのWFIに懸濁した。この再懸濁ペースト(40 ml)を100 ppm(0.1 g/L) のポリソルベート80を含む 360 mlの150mM NaCl-グリシン緩衝液（10Xに希釈）と混合し、全容積を400 mlとした。Millipore Multiplexポンピングプラットフォーム(1/3 ft2モジュール)を通してパーミエート流を21.8 ml/分で流した、このとき流束は0.06 ml/分/cm2であった。39分間流した後で、ろ過係数は80%より大きく、膜貫通圧が1.3 psi未満を保った。ポリソルベート80を含む高イオン強度緩衝液系を使う事で、IgG多クローン性抗D物質の自由な通過を保証できた。
【０１３２】
比較例1B．ポリソルベート 80を含まないとき
沈殿IIペースト(10g)を30 mlのWFIに懸濁した。この再懸濁ペースト(40 ml)を、ポリソルベート80を含まない360 mlの 150mM NaCl-グリシン緩衝液（10Xに希釈）と混合し、全容積を400 mlとした。Millipore Multiplexポンピングプラットフォーム(1/3ft2モジュール)を通したパーミエート流を21.8 ml/分で流した、このとき流束は0.06 ml/分/cm2であった。39分間流した後で、ろ過係数が急速におおよそ60%に減少し、膜貫通圧は6.1 psiであった。IgG多クローン性抗D物質の自由な通過を、ポリソルベート80を含む高イオン強度緩衝液系を使う事で保証できた。
この比較研究の結果は、高イオン強度緩衝液系にポリソルベート80の存在が必要であることを示している。
【０１３３】
比較例2．
低イオン強度対高イオン強度緩衝液
比較例2A．低イオン強度緩衝液
沈殿IIペースト(1.35g)を4.5 mlのWFIに懸濁した。この再懸濁ペースト(5.0 ml)を0.1 g/Lのポリソルベート80を含む 45 mlの50mM NaCl-グリシン緩衝液と混合し全容積を50 mlとした。パーミエートを、Viresolve-180 Small Area Module (SAM, 10 cm2)（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）を通して、十字流流速15.6 ml/分で流した、このとき流束は0.64 ml/分/cm2であった。28分間流した後、ろ過係数が急速にほぼ31%に減少した。
【０１３４】
比較例2B．高イオン強度緩衝液
比較例2Aからの100 ppm (0.01%)のポリソルベート80を含む50mM NaCl-グリシン緩衝液に、0.29 g のNaClを加えて、150mM NaCl-グリシン緩衝液としたものに、再懸濁した沈殿IIペースト(46.0 ml)を用いた。Viresolve-180 Small Area Module (SAM, 10 cm2)（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）を通したパーミエート流を15.6 ml/分で流した、このとき流束は0.64 mL/分/cm2であった。40分間流した後のろ過係数は86%であった。
比較例2Aおよび2Bに開示した低イオン強度対高イオン強度緩衝液系の比較研究の結果は、処理中の緩衝液系のイオン強度がViresolve膜を通してのタンパク質の通過点に対し測定可能かつ重大な影響を与えることを示している。
【０１３５】
比較例3．
WFI、低イオン強度緩衝液に溶解した凍結乾燥沈殿IIペースト製品
要旨
ヒトIgG製品を、この分子に対する膜の成績特性を測定するために、Viresolve/180 1/3 ft2モジュールで試験した。2種類の実験を行った；流束変動および容積減少である。最初の試験で、タンパク質のろ過を流束の関数として測定して、基本的な膜のデータをとった。流束変動からのデータをプロセス運転をまねるための容積減少実験のために使った。注射用水(WFI)中の製品に対する流束変動中にタンパク質の通過は見られなかった。それ以後の実験では、（0.01%のポリソルベート-80を含む）グリシン緩衝液中の製品を使用した。タンパク質の質量回収率は、83.3%の容積増加をしたこの溶液を用いて、89.1%であった。
【０１３６】
目的
これらの実験は、Viresolve/180 モジュールを通して処理した時の、ろ過係数および製品のタンパク質質量回収を評価するために行った。これらの実験で得たデータをシステムの操作条件決定のために使用した。
【０１３７】
実験
最初の実験は、WFIに溶解した製品を使い4℃の低温室で行った。全てのそれ以後の実験を、1/3 ft2  Viresolve/180モジュールを用い室温で行った。全ての全タンパク質濃度は、280 nmでの光学濃度(O.D.)を読んで測定した。全てのサンプルを希釈し、製品緩衝液を対照として読んだ。
【０１３８】
流束変動
1)  Viresolve/180 #0010（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）のロット#K2EM0536を用いて、図５に示した如くシステムを組み立てた。
2)  おおよそ1%のタンパク質濃度で、WFI中で凍結乾燥された500 mLの沈殿IIの凍結乾燥粉末を、1000 mL容量の供給バッグにポンプで入れた。製品のサンプルを取って、初期のタンパク質濃度を測定した。バッグを系につなぎ、配管から空気を除くために呼び水をした。
3)  製品を十字流流速500 mL/分で30分間再循環した。（パーミエートポンプは停止。）
【０１３９】
4)  重大なタンパク質吸着が起こったか否かを測定するために、1 mLのサンプルを緩衝液孔からとった(R0)。注：別途記載のない限り、全ての採取サンプルは1 mLであった。
5)  パーミエートは、流速1.09 mL/分(J=0.003 mL/分/cm2)で流し始めた。パーミエート流量は308MC/Aポンプヘッドを有するWatson Marlow 503U ポンプで制御した。製品を35分間供給液ループに戻して再循環した。
6)  35分間再循環した後、緩衝液(R1)サンプルおよびパーミエート(P1)サンプルを1点づつとった。この時点で、プロセスを低温室から常温室に移した。再循環は同じ流速で30分間続けた。
【０１４０】
7)  室温での30分間の再循環後、緩衝液(R2)サンプルおよびパーミエート(P2)サンプルを1点づつとった。
8)  十字流流速を約600 mL/minに上げ、15分間再循環した。緩衝液(R3)サンプルおよびパーミエート(P3)サンプルを1点づつとった。
9)  製品を製品緩衝液で0.5%に希釈した。十字流流速およびパーミエート流速を一定に保った。20分間再循環後、緩衝液(R4)サンプルおよびパーミエート(P4)サンプルを1点づつとった。
10) さらに2種類のパーミエート流束速度を試験した。0.005 mL/分/cm2 (1.82 mL/分)および0.01 mL/分/cm2 (3.63 mL/分)である。夫々最低30分間再循環した。
【０１４１】
流束変動および容積減少の組合せ
2番目の実験はグリシン緩衝液に溶解したヒトIgGで行った。
1)  Viresolve/180 #0009（マサチュ-セッツ州ベドフォードのMillipore社製）のロット#K2EM0536を用いて、図６に示した如くシステムを組み立てた。
2)  おおよそ0.1%タンパク質濃度で、990mLの製品を、1L容量の供給バッグにポンプで入れた。1 mLの製品サンプルを取って、実際のタンパク質濃度を測定した。注：別途記載のない限り、全ての採取サンプルは1 mLであった。バッグをシステムにつなぎ、配管から空気を除くために呼び水をした。
【０１４２】
3)  製品を十字流流速50 mL/分で30分間再循環した。（パーミエートポンプは停止。）パーミエート流量は501RLポンプヘッドのついたWatson Marlow 503U ポンプで制御した。再循環後、タンパク質吸着を試験するため、サンプル(R0)をとった。
4)  パーミエート流束の4速度、0.003、0.005、0.030、ならびに0.050 mL/分/cm2で試験した。製品を各流束速度で30分間再循環させた。十字流流量を0.050 mL/分/cm2の流束速度に対して、600 mL/分に上げた。30分後、緩衝液サンプルおよびパーミエートサンプルを1点づつとった。
5)  実験の流束変動の部分が終了後、パーミエートポンプを止めた。システムを図６の様に再配置した。最初のサンプルを15 mL採取した。
【０１４３】
6)  製品を0.05 mL/分/cm2  (18.2 mL/分)の流束で処理した。注：流束の測定値は0.043 mL/分/cm2 (15.7 mL/分)であった。
7)  100、250ならびに500 mLの製品処理後、緩衝液サンプルおよびパーミエートサンプルを採取した。
8)  645 mLのIgG液を処理した後で、製品緩衝液のダイアろ過（パーミエート流速で）を始めた。このダイアろ過は、Viresolv/180モジュールを通して、全量で500 mLを処理するまで続けた。745、895、1145 mLが処理された時に、緩衝液およびパーミエートのサンプルを採取した。
【０１４４】
9)  残りの液を、容積減少モードでシステムのホールドアップ容積迄処理した。緩衝液サンプルおよびパーミエートサンプルを、全処理容積1245および1475 mLでとった。
10)  最後のダイアろ過工程は、ホールドアップ容積迄濃縮された製品を回収するために行った。ダイアろ過は、50 mL容積で、全部で4回続けた。各ダイアろ過の容積を別々に集めた。
11)  プールされたバルクパーミエートのサンプル、および夫々プールされたダイアろ過容積からのサンプルを集めた。最後の緩衝液サンプルも、実験終了時に供給バッグ内に残っている製品の濃度を測定するために採取した。
【０１４５】
結果
流束変動
最初の流束変動実験中に、製品の通過は観測されなかった。製品溶解度を改善するための努力で、プロセスを室温においた（最初は4℃）。製品通過の増加は見られなかった。タンパク質通過を誘導する他の方法には、十字流を上げる、製品を希釈する、ならびにタンパク質通過を強制するためにパーミエート流束速度を上げることを含む。ろ過係数は、全ての試験条件で零のままであった。
最初の製品サンプルをWFIに懸濁した。溶液は靄がかかったように見え、疑った如く溶解度の問題があった。追加の製品はグリシン緩衝液に溶解した；この溶液は残りの試験で使用した。
【０１４６】
流束変動および容積減少の組合せ
表6に、グリシン緩衝液に懸濁したIgGで行った流束変動実験の結果を示した。表は、約0.1%の全タンパク質濃度の製品で集めたデータを表示する。表で、製品の濃度値を吸光度単位(AU)で表す。希釈因子はこの値の計算に入っている。
初期濃度：  1.68 AU
RO 濃度：   1.81 AU
【０１４７】
【表６】
0004523222.tif 000026
【０１４８】
グリシン緩衝液中のIgGに対するろ過係数対流束曲線を図７にプロットした。
容積減少実験からの製品濃度データ(AU)を次に示す。
初期プロセス容積：           963 mL
初期濃度：                   -0.1% (1.80 AU) 全タンパク質
十字流速度：                 600 mL/分
流束測定値：                 0.043 mL/分/cm2  （流速：15.7 mL/分）
バルク1パーミエート容積：    645 mL
プロセスダイアろ過容積：     500 mL
バルク2パーミエート容積：    330 mL
表7に、容積減少実験でえられたタンパク質濃度およびろ過係数データを示した。表に吸光度単位(AU)でのタンパク質濃度値を示した。希釈因子は、この値の計算に入っている。
【０１４９】
【表７】
0004523222.tif 000027
表8に、容積減少実験の各段階で得られた全タンパク質濃度を示す。希釈因子は、この値の計算に入っている。
【０１５０】
【表８】
0004523222.tif 000028
*ダイアろ過プラス最終容積減少
容積減少実験に対するろ過係数対ろ過容積曲線を図８にプロットする。
考察
【０１５１】
【数２０】
0004523222.tif 000029
【０１５２】
【表９】
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【０１５３】
ダイアろ過はタンパク質質量回収率をあげるが、製品容積の増加および製品希釈を生ずる。各ダイアろ過工程に対する容積増加率は次の通りである：
プロセスダイアろ過 :     55.7%容積増加
1回の最終ダイアろ過:     61.3%容積増加
2回の最終ダイアろ過:     67.6%容積増加
3回の最終ダイアろ過:     72.8%容積増加
4回の最終ダイアろ過:     83.3%容積増加
【０１５４】
実験で得られたタンパク質ふるい分けのデータに基づいて、以下の情報を学んだ：
1)  Viresolve/180へのタンパク質の吸着は無視出来るようである。
2)  WFIに懸濁した製品溶液にみられる靄およびこの溶液ではタンパク質通過は無かったという事実から、この製品とWFIとに安定性の問題がある事を示唆している。Viresolve膜を通してのタンパク質の通過は、グリシン緩衝液に懸濁したタンパク質で達成された。
3)  処理中に膜の上流側でタンパク質が濃縮されるにつれ、ろ過係数が着実に下がる。
4)  プロセス終了時の低いろ過係数(〜25%)は、著しいタンパク質分極が膜表面で起きていることを示唆している。
【０１５５】
結論
Viresolve/180を使い、2種類の緩衝液  −  WFIおよびグリシン懸濁液  −に懸濁したヒトIgG製品を用いてのフィージビリティー研究を行った。WFIに懸濁した製品ではタンパク質の通過は見られなかった。出発溶液にかすかな靄が見られ、タンパク質が溶液中に完全には溶解していない事を示唆した。これは直ちに膜を分極し、膜がタンパク質を通すのを妨げるだろう。流束変動の結果は、これが正に起った事を示唆している；すなわち膜を詰まらせた未溶解のタンパク質が、タンパク質の通過を妨げた。
グリシン緩衝液に製品を含む溶液の清澄度には著しい差があった；すなわちこの溶液は靄がかかっていなかった。この溶液での流束変動で得たろ過係数は試験した全ての流束速度(0.003から0.5 mL/分/cm2)に対してほぼ50%であった。グリシン緩衝液中の製品濃度は約0.1%(全タンパク質)であった。
0.1%溶液を容積減少実験に用いた。製品回収率は、83.3%の容積増加で、89.1%であった。処理中の膜の上流側でのタンパク質濃度を制限する努力で、インプロセスダイアろ過工程を用いた。最終ダイアろ過工程の使用により、システム内の滞留液液中のタンパク質を回収した。
【０１５６】
ろ過係数は、プロセス中に最初のろ過係数57.8%から最後のろ過係数26.9%まで、着実に低下した。これは、処理中に相当量のタンパク質層が、膜上に蓄積する事を示唆している。プロセス途中のダイアろ過はろ過係数の低下を遅くしたが、上昇させたり、一定に保ったりはしなかった。最終ダイアろ過工程により、滞留液および膜表面からタンパク質を幾分回収した。これら最終ろ過液のタンパク質濃度は初期出発溶液の約25から50%であった；すなわちこれは、ダイアろ過の新しい緩衝液による洗いで、膜のタンパク質分極層が徐々に除かれることを示している。ダイアろ過中に膜から製品がより多く剥がれる事が望ましい、これにより製品の希釈およびプロセス時間が減少する。最終ダイアろ過を延長すればより多くのタンパク質が回収されるだろうが、製品希釈が大きくなるだろう。
【０１５７】
試験された製品は、溶液中に5-12%の2量体を含んでいた。これらの2量体は活性タンパク質からなる。2量体の存在は膜表面でのタンパク質分極を疑いも無く起こし、2量体は、もしそのままなら、上流に捕まっているだろう。
比較例は、凍結乾燥した出発物質および低イオン強度緩衝液を用いた条件では、ろ過係数が低くなる事を示した、すなわち非常に希釈された条件下でも、タンパク質の膜通過効率が50%未満である事を示した。例1および2の最適化され、バリデーション可能なプロセスで得られたと同じ時間でこの物質を処理するには、より大きなろ過面積を有する装置が必要となろう。
【０１５８】
例4．
沈殿IIの調製および溶解
本特許の例1の方法および物質は、以下の変更をして実施された：
実規模の、変更されたCohn-Oncley分画からの抗Dを含む沈殿IIペーストを、処理の1時間前まで  -70℃で貯蔵した。このペーストを3倍容のWFIに溶解した。この溶解ペーストを限外ろ過中に10倍量の150 mM NaCl-グリシン緩衝液と混合した。この物質をスクレーピー脳ホモジネートの導入前に0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。
【０１５９】
スクレーピー脳ホモジネート
スクレーピー脳ホモジネート(10%)を、263Kハムスター適合エージェントで感染したハムスターからの脳を用いて調製した。1%のリゾレシチンを0.1%の最終濃度に加える前に、ホモジネートを遠心分離機で20分間澄ませた。溶液が半透明から澄むまでを目安にして、脳ホモジネートを音波処理した。音波処理の時間は、溶液が清澄になるのを目安にして約3分間であった。処理したホモジネートを、Millex 0.45.0.22/0.1ミクロンフィルターで連続的にろ過した。図９を参照。ホモジネートを沈殿IIに1:300の容積比で加え、限外ろ過工程の開始直前に無菌フィルターを通して最終的にろ過した。
【０１６０】
限外ろ過
1/3ft2 Viresolve モジュールをステンレススチールの集合管アッセンブリーに置いた。膜を横切る、および通過する物質の流れは、上述で開示した如く蠕動ポンプで制御した；パーミエートおよびリテンテート物質のタンパク質濃度を、ろ過係数および最終収率を記録するために、プロセスを通してA280で監視した。膜貫通圧を監視し、上記に開示に従いパーミエート流の速度およびタンパク質濃度により制御した。膜に導入されるタンパク質の膜単位面積当たりの負荷は、膜の除去能力に挑戦するための努力の小規模化を通じて1/10に減らされた。
ウエスタンブロット
【０１６１】
資料調製
ウエスタンブロット分析は、PrPcをPrPscと区別するために使われるプロテイナーゼK消化段階で始まる。プロテイナーゼK処理後、サンプルを4℃で1時間、20,000 X gで遠心分離した。ペレットを、電気泳動前に10分間95℃で熱した2 X  SDSに再懸濁した(Lee, D.C et al., J. Virological Methods, 2000; 84:77-89)。
【０１６２】
分析
移動およびブロッキング後、膜を3F4単クローン抗体中でインキュベートした。洗浄後、膜を、2次のアルカリ性ホスファターゼー接合抗マウスIgG抗体に暴露した。次にブロットをCDP-StarプラスNitroBlockに浸し、ついでKodak XAR-2フィルムに露出した。試験の有効性は、33 kDaマークでのバンディングを示す陽性な対照により決められた。他のバンディングも、それらが33 kDaのバンドよりも小さく、かつ強くない限り許容出来る。0.5 log10の希釈で行った、スクレーピー脳ホモジネートの典型的なウエスタンブロットを図10に示す。
【０１６３】
Viresolve 180限外ろ過により、パーミエート中のPrPsc濃度を検出限界以下に除去出来た（図11）。リテンテート中のプリオン物質の回収は、使用されたスパイク量に依存する変数である。スクレーピー脳ホモジネートは、最大の0.22ミクロンを含む全てのフィルター細孔率でろ過困難であった。音波処理をしなかった、リゾレシチン処理脳ホモジネートを0.1ミクロンフィルターを通してろ過した時に、力価は0.5 log以上に減少した。音波処理により、PrPscは定量的にフィルターを通過出来た。
【０１６４】
音波処理により、処理中にホモジネートの力価を減ずることなく、ろ過性が上がることが、繰返し示されている。最悪の条件下、すなわち、タンパク質の低い負荷、処理後の緩衝液洗浄、ならびに非凝集状態のPrPsc、でチャレンジした時でさえ、本発明の限外ろ過法がスクレーピーエージェントを顕著に除去する事が、示されていると結論づけられる。
【０１６５】
例5．
溶液が半透明から澄む迄最長約30分間、スクレーピー脳ホモジネートをカップホーン超音波処理器で音波処理する事を除けば、例4の物質および方法を踏襲した。図９を参照。
本発明を、特定の好ましい具体例に関して詳細に叙述した。発明の範囲および精神から外れることなく、変更および修正が出来る事が、理解されるであろう。全ての引用した発明、発明出願、ならびに非発明開示の全内容が、参照文献によりここに明確に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は抗Rhグロブリンを得るためにヒトの血漿を分画するプロセスを示すフローシートである。
【図２】図２は、図３及び図４と共に、本発明のプリオンおよびウイルス除去プロセスに使用されたVIRESOLVE（商標）180 SYSTEM 限外ろ過システムを示す模式図である。図２、図３、ならびに図４では、製品貯蔵タンクを1、ウイルス除去フィルターホルダーを2、限外ろ過フィルターホルダーを3、50mM NaCl グリシン緩衝液貯蔵タンクを4、T-1循環タンクを5、T-2 UF循環タンクを6、P1 Viresolve 180 供給ポンプを7、Viresolve 180  パーミエートポンプを8、UVメーターを9、UF供給液ポンプを10、UFパーミエートを11、サンプル孔を12、ならびに製品回収およびインライン滅菌ろ過を13と指定する。
【図３】図３は、図２及び図４と共に、本発明のプリオンおよびウイルス除去プロセスに使用されたVIRESOLVE（商標）180 SYSTEM 限外ろ過システムを示す模式図である。図２、図３、ならびに図４では、製品貯蔵タンクを1、ウイルス除去フィルターホルダーを2、限外ろ過フィルターホルダーを3、50mM NaCl グリシン緩衝液貯蔵タンクを4、T-1循環タンクを5、T-2 UF循環タンクを6、P1 Viresolve 180 供給ポンプを7、Viresolve 180  パーミエートポンプを8、UVメーターを9、UF供給液ポンプを10、UFパーミエートを11、サンプル孔を12、ならびに製品回収およびインライン滅菌ろ過を13と指定する。
【図４】図４は、図２及び図３と共に、本発明のプリオンおよびウイルス除去プロセスに使用されたVIRESOLVE（商標）180 SYSTEM 限外ろ過システムを示す模式図である。図２、図３、ならびに図４では、製品貯蔵タンクを1、ウイルス除去フィルターホルダーを2、限外ろ過フィルターホルダーを3、50mM NaCl グリシン緩衝液貯蔵タンクを4、T-1循環タンクを5、T-2 UF循環タンクを6、P1 Viresolve 180 供給ポンプを7、Viresolve 180  パーミエートポンプを8、UVメーターを9、UF供給液ポンプを10、UFパーミエートを11、サンプル孔を12、ならびに製品回収およびインライン滅菌ろ過を13と指定する。
【図５】図５は、低イオン強度緩衝液およびポリソルベート80を含む比較例3のために組み立てられたViresolve-180システムの模式図である。
【図６】図６は、比較例3の流束変動部分の結論後、再配置されたViresolve 180システムの模式図である。
【図７】図７は、比較例3の流束変動実験で、低イオン強度緩衝液中の免疫グロブリンGに対するろ過係数対流束を描写したグラフである。
【図８】図８は、比較例3の容積減少実験で、低イオン強度緩衝液中の免疫グロブリンＧに対するろ過係数対ろ過容積を描写したグラフである。
【図９】図９は、ハムスターの脳ホモジネート(HBH)が0.1ミクロンのフィルターを通過する時のろ過特性を描写したグラフである。
【図１０】図10は、例4で議論されたような限外ろ過リテンテートおよび脳ホモジネートストックのウエスタンブロットである。
【図１１】図11は、PrPRES スパイク RhoGAM（商標）の限外ろ過の前および後におけるウエスタンブロット分析の結果を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0004523222.tif 000039
【図１０】
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【図１１】
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