(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼにおいてＣ末端から２５個のアミノ酸残基を欠失させたＤＮＡリガーゼ変異体。
【請求項２】
請求項１記載の変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項４】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５８０を有するプラスミド。
【請求項５】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９３を有するプラスミド。
【請求項６】
請求項１記載の変異体を用いることを特徴とするＬＣＲ法。
【請求項７】
請求項１記載の変異体を含むＬＣＲ用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡリガーゼ変異体に関する。詳細には、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分を一部または全部削除することにより得られる、ＤＮＡ結合能を向上させたＤＮＡリガーゼ変異体、それをコードするＤＮＡ、ならびにかかる変異体の用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ基と５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。近年、新しい遺伝子増幅技術として、Ligase Chain Reaction（ＬＣＲ）法が開発され、用いられている。ＬＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＬＣＲ法の効率を上げるためにさらなる耐熱性リガーゼが検索され、市販もされている。ごく最近になって、超好熱性古細菌由来のＤＮＡリガーゼが見出された（非特許文献１参照）。しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡリガーゼはＤＮＡに対する結合能が極めて低い。一方、ＤＮＡとの結合能の高い酵素としてファージ由来のＤＮＡリガーゼが知られているが、耐熱性に乏しいためＬＣＲ法には不向きである。結局、十分な反応速度で効率よくＬＣＲ法を実行しうる、耐熱性、ＤＮＡ結合能および反応性の優れたＤＮＡリガーゼは見つかっていない。
【非特許文献１】独立行政法人産業技術総合研究所ホームページのプレス・リリース（２００３年）「世界最高の熱安定性を示す遺伝子診断用酵素（ＤＮＡリガーゼ）の開発に成功」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決すべき課題は、ＤＮＡとの結合性が向上したＤＮＡリガーゼ、特に、耐熱性を有し、かつＤＮＡとの結合性が向上したＤＮＡリガーゼを得ることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分が酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制されていること、ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分の一部または全部削除することにより、ＤＮＡとの結合性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分を一部または全部削除することにより得られるＤＮＡリガーゼ変異体；
（２）ＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックス部分およびそのＮ末端側に隣接する０個、あるいは１個〜５個のアミノ酸を欠失させた（１）記載の変異体；
（３）ＤＮＡリガーゼが好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来である（１）または（２）記載の変異体；
（４）ＤＮＡリガーゼがピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来である（３）記載の変異体；
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の変異体をコードするＤＮＡ；
（６）（５）記載のＤＮＡを組み込んだベクター；
（７）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５８０を有するプラスミド；
（８）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９３を有するプラスミド；
（９）（１）〜（４）のいずれかに記載の変異体を用いることを特徴とするＬＣＲ法；
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の変異体を含むＬＣＲ用キット
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ネイティブな状態よりもＤＮＡ結合能および反応性に優れたＤＮＡリガーゼ変異体が得られ、好熱性の生物に由来する酵素を用いた場合には、結合能および反応性ならびに耐熱性が優れたＤＮＡリガーゼ変異体が得られる。さらに、それらをコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡリガーゼを用いるＬＣＲ法およびそのためのキットが提供される。したがって、より特異的かつ迅速なＬＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。また本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を用いると、選択性の高い系での遺伝子操作を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第１の態様は、Ｃ末端ヘリックス部分が一部または全部削除されたＤＮＡリガーゼ変異体を提供するものである。「ヘリックス部分」とは、酵素のヘリックスを構成する連続したアミノ酸をいう。ＤＮＡリガーゼはＣ末端にヘリックス部分を有するものが多い。Ｃ末端にヘリックス部分を有するＤＮＡリガーゼの例としては、ヒト、酵母、細菌由来のものが挙げられる。Ｃ末端にあるヘリックス部分は酵素の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、酵素の柔軟性を抑制しており、そのことによりＤＮＡとの結合能が抑制され、反応性が乏しくなっている。そこで、Ｃ末端のヘリックス部分の一部または全部を削除することにより、酵素のＤＮＡ結合能および反応性を向上させることができる。
【０００８】
本発明に用いるＤＮＡリガーゼはＣ末端にヘリックス部分を有するものであればよく、その起源はいずれのものであってもよい。ＬＣＲ法の効率および特異性を向上させること等を考慮すると、反応性および耐熱性がいずれも向上したＤＮＡリガーゼを用いることが好ましい。したがって、本発明により変異体を得るＤＮＡリガーゼとしては、例えば好熱性の生物に由来するＤＮＡリガーゼが好ましい。このような耐熱性リガーゼのＣ末端にあるヘリックス部分を一部または全部削除することにより、ＤＮＡ結合能および反応性ならびに耐熱性が優れたＤＮＡリガーゼ変異体を得ることができる。特に好ましいＤＮＡリガーゼとしては好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）由来のものが挙げられ、超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来のＤＮＡリガーゼが最も好ましい。最も好ましいＤＮＡリガーゼの例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＤＮＡリガーゼが挙げられる。
【０００９】
ＤＮＡリガーゼのＣ末端にあるヘリックス部分は部分的に削除してもよく、あるいは全体を削除してもよい。削除は酵素のＣ末端から一定数の連続したアミノ酸を欠失させることにより行うのが一般的である。Ｃ末端のヘリックス部分の削除は当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくは部位特異的突然変異法を用いて行う。例えば、ストップコドンを挿入することによりストップコドン以下によりコードされるＣ末端アミノ酸配列を欠失させることができる。なお、本明細書において、例えば、ＤＮＡリガーゼのＣ末端から２５個のアミノ酸を欠失させた変異体を「ΔＣ２５」と表すことがある。Ｃ末端から削除されるアミノ酸の数が少なすぎると（Ｃ末端ヘリックス部分の削除が不十分であると）、分子の柔軟性が十分に得られず、酵素のＤＮＡ結合能および反応性の向上が不十分となる。Ｃ末端から削除されるアミノ酸数が多すぎると（Ｃ末端ヘリックス部分のＮ末端に隣接するアミノ酸を削除しすぎると）、分子の柔軟性は増加するが、酵素自体が不安定となり、耐熱性も低下する。ヘリックス部分のＮ末端側のアミノ酸を０個ないし数個残すように、酵素のＣ末端からアミノ酸を削除してもよく、あるいはヘリックス部分全体およびそのＮ末端側に続くアミノ酸を０個ないし数個削除するように、酵素のＣ末端からアミノ酸を削除してもよい。ここで、数個とは１個ないし９個を意味する。好ましくは、Ｃ末端ヘリックス部分とともに、そのＮ末端側に隣接する二次構造を構成しない部分のアミノ酸を削除する。二次構造を含まない部分のアミノ酸の削除であれば、酵素の好ましいコンホーメーションが保持されると考えられる。例えば、ヘリックス部分全体およびそのＮ末端側に続くアミノ酸を０個、あるいは１個ないし５個削除してもよい。
【００１０】
本発明は、さらなる態様において、上記ＤＮＡリガーゼ変異体をコードするＤＮＡ、およびかかるＤＮＡを組み込んだベクターを提供する。本発明のＤＮＡリガーゼ変異体をコードするＤＮＡをベクターに組み込んで、これを宿主に導入することにより、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を製造することができる。当業者は、組み込まれるＤＮＡや宿主に応じて種々のベクターを選択することができる。細菌由来のＤＮＡリガーゼ変異体のＤＮＡであれば細菌プラスミドに組み込んでもよい。細菌プラスミドとしては大腸菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等）や枯草菌プラスミド（例えば、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等）が典型的に用いられる。また当業者は、蛋白の生産性を向上させるために、適切なプロモーター（例えば、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、アクチンプロモーター）やエンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー）を選択し、公知の方法によりベクター中の適切な位置に組み込むことができる。このようなＤＮＡリガーゼ変異体を発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤＣ２５およびｐＥＴ２１ｄ−ＰｆｕＬｉｇＤＣ２２が挙げられ、これらを用いて、耐熱性ならびにＤＮＡとの結合能および反応性が優れたＤＮＡリガーゼ変異体を製造することができる。
【００１１】
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を用いることを特徴とするＬＣＲ法、および本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を含むＬＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体、特に耐熱性に優れたものはＬＣＲ法に用いることにより威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡとの結合能および反応性が優れた本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を用いれば、より特異的かつ迅速なＬＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。かかるＬＣＲ法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を含む。通常は、キットの取扱説明書を添付する。
【００１２】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００１３】
Ｃ末端ヘリックス除去ＤＮＡリガーゼ変異体の調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨより入手し、文献（ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)，第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸，（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅ Ａを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００１４】
（２）ｌｉｇ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｌｉｇ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅するためのプライマーを設計した。１ｓｔ ＰＣＲに用いるプライマーとして５’−ＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：９）、５’−ＴＣＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号：１０）を合成した。また、２ｎｄ ＰＣＲに用いるプライマーとしてそれぞれの１ｓｔプライマーの内側にアニ−リングするように５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣ−３（配列番号：１１）、５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号：１２）を作成した。ｌｉｇ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＢａｍＨＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄ ＰＣＲを行ない、その産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターから切り出したｌｉｇ遺伝子をｐＥＴ２１ｄベクター（EMD Bioscience社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを得た。この発現系構築のために、開始コドン部位にＮｃｏＩ配列を導入したために、配列番号：１に示す２番目のコドンａｇｇがｇｇｔに変わり、得られる翻訳産物の２番目のアミノ酸は本来ＡｒｇであるところがＧｌｙになっている（配列番号：３および４参照）。
このプラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇを鋳型としてＣ末端の２２、および２５残基を欠失したミュータント（ΔＣ２２、ΔＣ２５）を作製するべく、当該残基（Ｃ末端より２２、および２５残基目）にストップコドンを導入する方法をとる事とした。ΔＣ２２作製用プライマーセット５’−ＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号：１３）、５’−ＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧ（配列番号：１４）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行なうＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。ΔＣ２５に関しては同作製用プライマーセット５’−ＧＡＴＡＡＡＧＧＡＣＣＡＴＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＡＴＡ−３’（配列番号：１５）、５’−ＴＡＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号：１６）を用いて同じ手法で目的の遺伝子を増幅した。
【００１５】
（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来Ｎａｔｉｖｅリガーゼ、およびＣ末端ヘリックス除去変異体リガーゼ（ΔＣ２２、ΔＣ２５）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（ネイティブ）リガーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、Ｃ末端ヘリックス除去変異体リガーゼ（ΔＣ２２、ΔＣ２５）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤＣ２２およびｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇＤＣ２５（それぞれ、Ｃ末端より２２残基目、２５残基目にストップコドンが導入されている）になるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、生成することができた。
プラスミドｐＥＴ２１ｄ−ｌｉｇをコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１  コドンプラスＲＩＬにトランスフォームして、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４−０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この画分を更に陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ，５ｍｌ；アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて分離操作を行い、素通り画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０，アマシャムファルマシアバイオテック社）を用いて、流速２ｍｌ／分で分離操作を行い、１００分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度である事、および、ネイティブ蛋白質に比してＣ末端欠失分だけ分子量が低い事、を確認する事ができた。このように、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体を容易に得られることがわかった。
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。なお、ピロコッカス・フリオサスのＤＮＡリガーゼのＣ末端ヘリックスは配列番号：２のアミノ酸５４０（Ａｓｐ）から５６１（Ｓｅｒ）までにより構成されている。実施例１で得られたネイティブなＤＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：３に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。実施例１で得られた変異体ΔＣ２５をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。実施例１で得られた変異体ΔＣ２２をコードするヌクレオチド配列を配列番号：７に、それによりコードされる蛋白のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
なお、本発明で得られた変異体ΔＣ２５をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＥＴ２１ｄ−ＬｉｇＤＣ２５を独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、２００５年７月１日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５８０を付与された。また、本発明で得られた変異体ΔＣ２２をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＥＴ２１ｄ−ＬｉｇＤＣ２２を独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託し、２００５年７月１４日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９３を付与された。
【実施例２】
【００１６】
Ｃ末端ヘリックス除去ＤＮＡリガーゼ変異体のＤＮＡとの結合能
（４）ネイティブなリガーゼ、および実施例１で得られたＣ末端ヘリックス除去変異体ＤＮＡリガーゼ（ΔＣ２５）と、５’リン酸化ニック入りＤＮＡ（５’−ｐｈｏｓｐｈｏ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ）との相互作用のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行って、基質ＤＮＡリガーゼ変異体との結合能を調べた。
５’位がリン酸化された一本鎖ＤＮＡを用いて、リガーゼとの結合能測定をおこなった。ＤＮＡ配列は５’Ｐ−ＴＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＴＡＴＡＴＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＴＡ−３’（配列番号：１７）である。下線部は安定なヘアピン構造をとる事が知られており、（ヌクレイック・アシッド・リサーチ，第２２巻、２２１７−２２２１ページ）一本鎖で安定なニック入り基質になると考えられた。ＤＮＡは緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解し、サーマルサイクラーをもちいて９８℃、５分間加熱後、室温まで徐冷した。この溶液をゲル濾過カラムに通して、上記一本鎖ＤＮＡのみからなるサイズの基質を分離して、以降の分析に用いた。さらにこの基質ＤＮＡは当該サイズの二本鎖ＤＮＡと並べてネイティブ電気泳動を行い、一本鎖由来のニック入り基質が形成されている事を再度確認した。
この基質ＤＮＡをリガーゼと緩衝液内（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％（ｖ／ｖ），１ｍＭ ＭｇＣｌ２）で、モル比１．２：１．０（各濃度は約１ｎｍ）で混合した。２５℃、５分間静置後、限外濾過器を遠心して１０μｌまで濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った。ゲル濾過分析はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを装着したＳＭＡＲＴ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。カラムを通過した溶液については、波長２６０ｎｍ，および２８０ｎｍの吸光度を連続的に監視し、吸光度がピークを呈した分画についてはその組成を明らかにするため電気泳動を行った（図１）。
ネイティブなリガーゼを用いた結果を図１のパネル（ａ）、（ｂ）に示す。パネル（ａ）は混合直後の試料のゲル濾過クロマトグラム、パネル（ｂ）は２５°Ｃ、５分間静置後の試料のゲル濾過クロマトグラムである。ＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）を用いた結果を図１のパネル（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）に示す。パネル（ｃ）は混合直後の試料のゲル濾過クロマトグラム、パネル（ｄ）は２５°Ｃ、５分間静置後の試料のゲル濾過クロマトグラムである。パネル（ｂ）とパネル（ｄ）を比較すると、パネル（ｄ）において、高分子側に大きなピークが見られ、２６０ｎｍの吸光度と２８０ｎｍの吸光度が重なり合っていた。このことは、ＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）が基質ＤＮＡを取り込んだこと、すなわち基質ＤＮＡと結合したことを示す。ピーク中の蛋白を調べるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても、ピーク中央部（２と表示）を試料としたレーン２に特に濃い蛋白バンドが示された。一方、パネル（ｂ）においては対応する高分子側のピークは極めて小さく、ネイティブなリガーゼと基質ＤＮＡと結合とがほとんど結合しなかったことが示される。このパネル（ｄ）の高分子側のピークの中央部（２と表示）を分取し、ＡＴＰ（１００μｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で１０分反応させた反応液を同じカラムにかけて得られたクロマログラムを図１のパネル（ｅ）に示す。各ピークの主要成分を同パネル中に記載した。酵素と結合していたＤＮＡが解離したことが示され、反応の進行が示された。
【実施例３】
【００１７】
本発明のＤＮＡリガーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡリガーゼは、ネイティブ、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性タンパク質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体はネイティブに遜色のない耐熱性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明により、ＤＮＡと結合との結合能および反応性、さらには耐熱性が改善されたＤＮＡリガーゼ変異体が得られるので、本発明は、生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、無処理（ネイティブ）ＤＮＡリガーゼと基質ＤＮＡとの結合能、本発明のＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）と基質ＤＮＡとの結合能、ならびに本発明のＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）と基質ＤＮＡとの反応を調べた結果を示す図である。図中、Ｐｆｕはピロコッカス・フリオサスを表す。ネイティブなリガーゼを用いた結果を図１のパネル（ａ）、（ｂ）に示す。パネル（ａ）は混合直後の試料のゲル濾過クロマトグラム、パネル（ｂ）は２５°Ｃ、５分間静置後の試料のゲル濾過クロマトグラムである。パネル（ｂ）に示すピークを分取（１から５までの部分）し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白の分析を行った結果も同パネル中に示す。ＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）を用いた結果を図１のパネル（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）に示す。パネル（ｃ）は混合直後の試料のゲル濾過クロマトグラム、パネル（ｄ）は２５°Ｃ、５分間静置後の試料のゲル濾過クロマトグラムである。パネル（ｄ）に示すピークを分取（１から５までの部分）し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白の分析を行った結果も同パネル中に示す。さらに、このピークの中央部（２と表示）を分取し、ＡＴＰ（１００μｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で１０分反応させた反応液を同じゲル濾過カラムにかけて得られたクロマログラムを図１のパネル（ｅ）に示す。
【００２０】
配列表フリーテキスト
配列番号：１はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：２はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列である。
配列番号：３は実施例１で得られたネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４は実施例１で得られたネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列である。
配列番号：５は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）のアミノ酸配列である。
配列番号：７は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２２）をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：８は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２２）のアミノ酸配列である。
配列番号：９はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを増幅するための１ｓｔＰＣＲ用プライマーである。
配列番号：１０はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを増幅するための１ｓｔＰＣＲ用プライマーである。
配列番号：１１はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを増幅するための２ｎｄＰＣＲ用プライマーである。
配列番号：１２はネイティブなPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを増幅するための２ｎｄＰＣＲ用プライマーである。
配列番号：１３はPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２２）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号：１４はPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２２）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号：１５はPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号：１６はPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼ変異体（ΔＣ２５）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号：１７はPyrococcus furiosusのＤＮＡリガーゼおよびその変異体の基質のヌクレオチド配列である。
【図１】
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【配列表】
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