(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞汚染物を実質的に含まない失活Ａ型肝炎ウイルスの製法であって、以下のステップ：
ａ）Ａ型肝炎ウイルスを培養し、そしてＡ型肝炎調製物を収獲し、
ｂ）上記Ａ型肝炎調製物をプロテアーゼで処理し、その後、
ｃ）無傷のウイルスを、プロテアーゼ消化タンパク質から分離し、
ｄ）上記無傷のウイルス調製物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして
ｅ）上記ウイルスを失活させる、
を含む前記製法。但し、前記製法は、DNase 又はRNase による酵素処理を含まない。
【請求項２】
前記Ａ型肝炎ウイルスがＨＭ−１７５株由来である、請求項１に記載の製法。
【請求項３】
前記プロテアーゼがトリプシン、プロナーゼ、パパイン又はペプシンである、請求項１又は２に記載の製法。
【請求項４】
前記ステップｃ）が、パーミエーション（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ）クロマトグラフィー・ステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５】
前記失活Ａ型肝炎ウイルス調製物調製物が、宿主細胞汚染物を実質的に含まない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項６】
前記調製物が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥをスキャンすることにより検出することができる１０％未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項５に記載の製法。
【請求項７】
前記調製物が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥをスキャンすることにより検出することができる８％未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項５に記載の製法。
【請求項８】
前記調製物が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥをスキャンすることにより検出することができる５％未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項５に記載の製法。
【請求項９】
以下のステップ：
ｆ）前記失活Ａ型肝炎ウイルスの調製物を、医薬として許容される担体及びアジュバントと混合して、Ａ型肝炎ワクチンを製造する、
をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１０】
前記アジュバントが、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体を含む、請求項９に記載の製法。
【請求項１１】
前記アジュバントが、ＱＳ２１をさらに含む、請求項１０に記載の製法。
【請求項１２】
前記アジュバントが、油／水エマルジョン及びトコフェロールをさらに含む、請求項１１に記載の製法。
【請求項１３】
前記失活Ａ型肝炎ウイルスの調製物を、Ｂ型肝炎抗原と混合する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規ワクチン製剤、それらの製法、及び医療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、有効な免疫刺激剤、好ましくは、例えば、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体で補強された改良Ａ型肝炎ワクチンに関する。本発明は、上記Ａ型肝炎ワクチンが１成分であるところの併合ワクチンにも関する。
【０００２】
Ａ型肝炎ワクチンは知られている。例えば、Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからのワクチンＨａｖｒｉｘ（商標）が、Ａ型肝炎の感染を防ぐために使用されることができ、そしてまた、アジュバントとして水酸化アルミニウムと配合される。このワクチンは、Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．の手順に従って製造される。それは、ホルモール（ホルムアルデヒド）で失活されたＨＭ−１７５Ａ型肝炎ウイルスの減弱株を含む；Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．〔Ｐｒｏｇ  Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１９９０，ｖｏｌ３７；−ｐ７２−９５〕を参照のこと。
【０００３】
上記Ａ型肝炎とＢ型肝炎抗原の併合物であるワクチンＴｗｉｎｒｉｘ（商標）は、Ａ型肝炎とＢ型肝炎に対して同時に保護するために使用されることができる。上記Ａ型肝炎抗原とサルモネラ・チフィムリアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の精製Ｖｉ多糖の併合物であるワクチンＨｅｐａｔｙｒｉｘ（商標）は、肝炎と腸チフスに対して同時に保護するために使用されることができる。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ９３／１９７８０（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ｓ．ａ．）は、とりわけ、３Ｄ−ＭＰＬで補強されたＡ型肝炎ワクチンを開示している。
ヨーロッパ特許第０３３９６６７号（Ｃｈｅｍｏ  Ｓｅｒｏ）は、Ａ型肝炎抗原とＢ型肝炎抗原を併合して、併合ワクチンを製造するという一般概念について記載している。その明細書には、使用されるアジュバントは決定的でなく：それは、望ましい程度までこの免疫活性を高めることができるだけでなければならず、そしていかなる副効果をも生じさせないと述べられている。アルミニウム・ゲル、特に、水酸化アルミニウム・ゲルとリン酸アルミニウム・ゲルが使用されうると述べられている。
【０００５】
今般、Ａ型肝炎ワクチンのための失活ウイルスを製造及び精製する伝統的な方法が、Ａ型肝炎ウイルスがその中で成長するところの宿主細胞からの汚染物の少量の残渣を残すことができるということが発見された。このような宿主細胞汚染物は、特にそれらがヒト起源であり、天然において２倍体であり、そして低レベルであるときは、そのワクチンがアルミニウム塩で補強されるときには心配ない。しかしながら、そのワクチンが強い免疫刺激剤で補強されるとき、ワクチン接種を受けた人が、その宿主汚染物に対して、有害な免疫応答を引き起こすことができる理論的な可能性が存在する。
【０００６】
従って、上記宿主細胞タンパク質の微量成分の実質的に全てを除去する、製法の必要性が在る。
従って、本発明の１の局面においては、宿主細胞汚染物を実質的に含まない、失活Ａ型肝炎ウイルスの製法であって：
ａ）Ａ型肝炎ウイルスを培養し、そしてＡ型肝炎調製物を収獲し；
ｂ）上記Ａ型肝炎調製物をプロテアーゼで処理し；そしてその後、
ｃ）プロテアーゼ消化材料から無傷のウイルスを分離し；
ｄ）上記ウイルスを失活させる、
を含む前記製法が提供される。
【０００７】
驚くべきことに、上記プロテアーゼ消化処理は、上記Ａ型肝炎ウイルスに悪影響を及ぼさないが、上記Ａ型肝炎調製物から宿主細胞汚染物の分解及び分離を容易にする。
好ましくは、上記Ａ型肝炎ウイルスは、ＨＭ−１７５株由来である。
宿主細胞汚染物を実質的に含まないとは、銀染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥをスキャンすることにより、１０％未満の、好ましくは、８％未満の、より好ましくは、５％未満の宿主細胞タンパク質が検出されることができるということを意味する。より重要には、そしてスロット・ドット・ハイブリダイゼーションにより測定されるとき、上記ワクチン中のＨＡＶの１投与量は、好ましくは、１０ng未満の宿主細胞タンパク質を含有する。
【０００８】
好ましくは、使用されるプロテアーゼは、トリプシンである。使用されることができる他のプロテアーゼは、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、及びペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）を含む。
上記プロテアーゼ処理は、好ましくは、約２時間、室温より高い温度で、例えば、約３７℃で、行われる。
【０００９】
上記プロテアーゼ及び消化成分からの無傷のウイルスの分離は、さまざまな好適な方法により、例えば、パーミエーション（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ）クロマトグラフィーにより達成されることができる。
あるいは、上記プロテアーゼ及び消化された成分は、サイズに基づき分離するいずれかの分離方法、例えば、限外濾過により、分離されることができる。
【００１０】
次に、上記生成物は、他の汚染物を除去するための他のステップによりさらに精製されることができる。例えば、上記生成物は、上記生成物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、核酸残渣を除去することにより、さらに精製されることができる。
本発明に係る方法のプロテアーゼ消化ステップは、２つの効果に因りＡ型肝炎調製物の精製を改良することができる。第１に、上記プロテアーゼは、それらが、上記プロテアーゼ処理に続くクロマトグラフィー分離ステップにおいてより容易に分離するように、汚染性宿主タンパク質を消化する。第２に、汚染性宿主タンパク質の消化は、上記イオン交換ステップにおいて、未消化の宿主タンパク質と他の方法で会合されるであろう他の汚染性材料、特に核酸のよりよい分離を許容する。これらの観察された効果は、いかなる方法においても本発明を必ずしも限定しないと理解されよう。
【００１１】
本発明の他の局面においては、先に定義したような、汚染性宿主タンパク質を実質的に含まない、失活Ａ型肝炎ウイルスが提供される。
次に失活Ａ型肝炎ウイルスはワクチンに配合されることができる。
従って、本発明は、さらなる局面において、宿主細胞汚染物を実質的に含まない失活Ａ型肝炎ウイルスを含むＡ型肝炎ウイルスを提供する。
【００１２】
このようなワクチンは、有利には、好適なアジュバントを含む。好適なアジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムのゲル又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であることも、又はアシル化チロシン、又はアシル化糖、カチオン又はアニオン誘導体化多糖、又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であることもできる。有利には、高く精製されたＡ型肝炎ウイルスは、強いアジュバント系と配合されることができる。従って、本発明の配合物においては、上記アジュバント組成物が、Ｔｈ１性状を含む免疫応答を誘発することが望ましい。
【００１３】
一般的な意味においては、Ｔｈ１−型応答は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−４，ＩＬ−５、及びＩＬ−１０の産生を特徴とするＴｈ２−型応答とは異なり、ＩＦＮ−γの産生を特徴とする。体液性応答のアイソタイプ特性は、Ｔｈ１又はＴｈ２−型応答のためのマーカーとして、使用されることもできる。マウスにおいては、Ｔｈ１−型応答は、しばしば、ＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の産生に関係し、一方、ＩｇＧ１は、Ｔｈ２−型応答のマーカーである。この状況は、ヒトにおいては明らかではないが、データは、ＩｇＧ１とＩｇＧ４がそれぞれＴｈ１−とＴｈ２−型応答のマーカーであることができるであろうということを示唆している。
【００１４】
好適なアジュバント系は、例えば、モノホスホリル・リピドＡ、好ましくは、３−０−脱アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の併合物を含み、そして好ましくは、アルミニウム塩とともに配合される。
強化系は、モノホスホリル・リピドＡとサポニン誘導体の併合物、好ましくは、ＷＯ９４／００１５３中に開示されたような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの併合物、又はＱＳ２１がＷＯ９６／３３７３９中に開示されたようなコレステロールでクエンチされているところのより反応原性の低い組成物を含む。
【００１５】
油／水エマルジョン中に、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ、及びｄ，ｌ−アルファ−トコフェロールを含む特に強力なアジュバントが、ＷＯ９５／１７２１０中に記載されている。
包含されることができる他の知られたアジュバントは、例えば、ＷＯ９６／０２５５５中に開示されたような、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
【００１６】
従って、本発明の好ましい態様においては、モノホスホリル・リピドＡ又はその誘導体により補強された、本発明に係るウイルスを含むワクチンが提供される。
好ましくは、上記ワクチンは、さらに、サポニン、より好ましくは、ＱＳ２１を含む。
【００１７】
好ましくは、上記配合物は、さらに、油／水エマルジョン及びｄ，ｌ−アルファ−トコフェロールを含む。
本発明は、医薬として許容される賦形剤又は担体、例えば、３Ｄ−ＭＰＬと、本発明に係る精製ウイルスを混合することを含む、ワクチン配合物の製法をも提供する。
【００１８】
本発明の精製ウイルスは、有利には、それが、Ａ型肝炎感染に加えて他の疾患の予防又は治療において有効であるように、他の抗原と併合されることができる。好ましい併合は、Ｂ型肝炎抗原を含む併合を含む。
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢS Ａｇ）の調製は、よく文書化されている。例えば、Ｈａｒｆｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ５４，ｐａｇｅ  １２５（１９８３），Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，ｐａｇｅ４７９（１９８７），ＥＰ−Ａ−０２２６８４６，ＥＰ−Ａ−０２９９１０８、及びその文献中の引用文献を参照のこと。
【００１９】
本明細書中に使用するとき、表現“Ｂ型肝炎表面抗原”又は“ＨＢS Ａｇ”は、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を提示するいずれかのＨＢS Ａｇ抗原又はその断片を含む。ＨＢS Ａｇ  Ｓ抗原の２２６アミノ酸配列（Ｔｉｏｌｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１７，４８９（１９８５）及びこの文献中の引用文献を参照のこと）に加えて、本明細書中に記載するＨＢS Ａｇは、所望により、上記文献及びＥＰ−Ａ−０２７８９４０中に記載されたようなプレ−Ｓ配列の全部又は一部を含む。特に、ＨＢS Ａｇは、ａｄ血清型のＢ型肝炎ウイルス上のオープン・リーディング・フレームに対して、ＨＢS ＡｇのＬ−タンパク質の残基１２〜５２、その後の残基１３３−１４５、その後の残基１７５−４００を含むアミノ酸を含むポリペプチド（このポリペプチドをＬ* という；ＥＰ０４１４３７４を参照のこと。）を含むことができる。本発明の範囲内のＨＢS Ａｇは、ＥＰ０１９８４７４（Ｅｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ）中に記載されたプレＳ１−プレＳ２ポリペプチド又はそのアナログ、例えば、ＥＰ０３０４５７８（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ）中に記載されたものをも含む。
【００２０】
本明細書中に記載するとき、ＨＢS Ａｇは、突然変異体、例えば、ＷＯ９１／１４７０３又はＥＰ０５１１８５５Ａ１中に記載された“逸脱（ｅｓｃａｐｅ）空然変異体”、特に、１４５位においてグリシンからアルギニンへのアミノ酸置換が存在するところのＨＢS Ａｇをもいう。
通常、上記ＨＢS Ａｇは粒子形態になるであろう。この粒子は、例えば、Ｓタンパク質だけを含むことができるし、又は複合粒子、例えば、（Ｌ* ，Ｓ）｛ここで、Ｌ* は先に定義したものと同じであり、そしてＳはＨＢS ＡｇのＳ−プロテインを表す。｝であることができる。上記粒子は、有利には、それが酵母内で発現されるところの形態である。
【００２１】
本発明は、さらなる局面において、医学療法における使用のために、特に、肝炎ウイルス感染の治療又は予防における使用のために、本明細書中に記載するようなワクチン配合物を提供する。好ましい局面においては、本発明に係るワクチンは、進行性の肝炎感染、より特にそれを患うヒトにおけるＡ型肝炎及び／又はＢ型肝炎感染のために有用である治療用ワクチンである。
【００２２】
得られた驚くべき有効な結果に照らして、さらに好ましい局面においては、本発明は、Ａ型肝炎及び／又はＢ型肝炎感染の治療又は予防のためのワクチン製剤を提供する。
有利には、本発明の肝炎ワクチン製剤は、それが１以上の他のバクテリア、ウイルス又は真菌（ｆｕｎｇａｌ）感染の治療又は予防において有効であるように、他の抗原を含む。
【００２３】
従って、本発明に係る肝炎ワクチン配合物は、好ましくは、以下の疾患：
ジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ）（Ｈｉｂ）、及びポリオ、の中の１以上に対して保護を与えるために、本分野において知られた非肝炎抗原から選ばれることができる少なくとも１の他の成分を含む。
【００２４】
好ましくは、本発明に係るワクチンは、先に定義したようなＨＢS Ａｇを含む。
上記併合ワクチンにおける使用のために好適な成分は、既に商業的に入手でき、そして詳細は、世界保健機構から得られることができる。例えば、ポリオ成分は、Ｓａｌｋ失活ポリオ・ワクチン（ＩＰＶ）であることができる。百日咳ワクチン成分は、全細胞又は無細胞製品を含むことができる。
【００２５】
有利には、本発明に係る肝炎又は併合ワクチンは、小児ワクチン又は青年期ワクチンである。
青年用途のための好ましい本発明に係る併合ワクチンは、以下の疾患：
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）、ヒト・Ｈイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇａｎｄｉｉ）、の中の１以上に対し保護を提供することが、本分野において知られている抗原から選ばれる１以上の成分を含む。
【００２６】
上記ワクチン投与量中の各抗原の量は、典型的なワクチン接種を受けた者において有意な有害副作用を伴わずに免疫保護応答を誘導する量として選ばれる。このような量は、どの特異的免疫原が使用されるかということに依存して変化するであろう。一般に、各投与は、Ａ型肝炎のために投与当り０．１〜１．０μｇのタンパク質、最も好ましくは、０．０６〜０．２２０μｇタンパク質／投与を含むであろうと予想される。Ａ型肝炎以外の抗原、例えば、ＨＢS Ａｇ、ＨＳＶ、等のためには、投与当りのタンパク質の量は、より高く、例えば、約２０μｇ／投与までであることができる。特別なワクチンのための１以上の免疫原のそれぞれの最適量は、被験体（患者  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）における抗体力価及び／又は他の応答の観察を含む標準的な試験により確められることができる。最初のワクチン接種後、被験体は、約４週間以内にブーストを受容することができる。
【００２７】
本発明のさらなる局面においては、肝炎感染の予防又は治療において有効なワクチンの製法であって、本明細書中に定義するような肝炎抗原をＭＰＬ又はその誘導体と混合することを含む、前記製法が提供される。
上記方法を用いて、１以上の追加の成分が、好ましくは、失活Ａ型肝炎ワクチンと混合されて、併合ワクチンが提供される。
【００２８】
以下の実施例は、本発明とその利点を説明する。
実施例
実施例１
ａ）精製ステップ
本実施例中に与える一連のステップを、本発明に係る方法に従うが、常に、トリプシン又は他のプロテアーゼ消化ステップを含んで、異なる組合せにおいて、行うことができる。
【００２９】
培養及び収獲
Ａ型肝炎ウイルスＨＭ１７５を、ＭＲＣ５細胞（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．前掲）上で培養し、そしてそのウイルスを、上記細胞層の洗浄後に収獲して、成長培地中で使用した血清を除去する。凍結／解凍後、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０（商標））を添加して、上記細胞死骸から上記ウイルスを抽出する。細胞死骸を、０．２２μｍ膜を通した濾過により、除去する。濾液をさらに限外濾過にかける。得られた濃縮物は、最終的に、１〜２時間、５〜１０，０００xgにおける遠心分離により清澄化されることができる。
【００３０】
トリプシン処理
上記ＨＡＶウイルスを含有する濃縮物を、ブタの膵臓から抽出した精製トリプシンで処理する。使用したトリプシンを２回結晶化し、そして使用前に凍結を保った。トリプシンの添加前、上記濃縮物を、一定の撹拌の下、３７℃で前もって温める。次に、トリプシンを、濃縮物１ml当り４４０IUの比で添加し、そしてその混合物を、３７℃で、最短で２時間（最長で２．５時間）緩やかに撹拌する。
【００３１】
濃縮
トリプシン処理の後、上記産物を、その容量を減少させるために限外濾過装置上で周囲温度で直ちに処理することができる。使用した膜は３０，０００ダルトンの名目カット−オフをもつ再生セルロースであり、そして膜１cm2 当り最大８mlまでのトリプシン処理産物を、０．２〜０．６バールの間の経膜圧で処理して、８〜１２の目の濃縮率を達成する。
【００３２】
パーミエーション・クロマトグラフィー
このステップの目的は、無傷のＨＡＶウイルスからタンパク質を分離することである。トリプシン処理後にパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップが行れるとき、条件は、残存トリプシンをも除去するように適合されなければならない。使用された分離ゲルは、Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢＦＦである。
【００３３】
上記ウイルスは、（カラムの全容量に近い）より大きな保持容量を用いて溶出されるより小さなタンパク質断片よりも、より小さな保持容量で、溶出される。
クロマトグラフィー・パラメーターは以下のようである：
クロマトグラフィー材：（Ｐｈａｒｍａｃｉａからの）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢＦＦ
インジェクト容量：ゲル容量の１〜５％
溶出速度：５〜１０cm／時間
温度：１０〜１６℃
画分のプール：標的１００ngプロット／７２０Ｅｌｉｓａ単位（＋／−１０％）
イオン交換
この精製ステップの目的は、（ＭＲＣ５細胞に起源をもつ）ＤＮＡ含量を低下させることである。このステップを、バッチ原理に従って走らせる。
【００３４】
先のクロマトグラフィ・ステップからのプールを、０．３Ｍ  ＮａＣｌに調整し、そして次に室温で１時間（最長１．５時間）緩かに撹拌しながらイオン交換樹脂と混合する。
ＤＮＡ固定の後、上記ゲルを濾過により除去する。次に、固定されていないＨＡＶウイルス懸濁液を、そのＮａＣｌ濃度を１５０mMに調整するように希釈する。あるいは、このイオン交換精製ステップは、カラム・クロマトグラフィーにより行われることもできる。
【００３５】
最終的に精製された産物を、０．２２μｍフィルター上で滅菌濾過する。クロマトグラフィー・パラメーターは以下のようなものである：
供給：上記プールの容量に対して３％のゲル（容量／容量）
温度：周囲
失活を、Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．中に記載されたように行う。但し、２５０μｇ／mlのホルモールを使用する。
【００３６】
ホルムアルデヒド低下
上記失活の終わり後４８時間以内に、そのホルムアルデヒド含量を低下させ、そしてアルミニウム塩（好ましくは、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）上に事前吸着させるために、上記産物をダイアフィルトレートし、そして濃縮する。
【００３７】
使用前に、完全限外濾過装置を、少なくとも３０分間、０．１Ｎ  ＮａＯＨを用いて除菌する。次に、この装置を、ダイアフィルトレーション・バッファーで十分に濯ぎ、そしてその膜を、アミノ酸含有バッファー（Ｔｒａｖａｓｏｌ）で被覆する。最終的に、この装置を、ダイアフィルトレーション・バッファーで濯ぐ。
【００３８】
ダイアフィルトレーション及び濃縮の後、最終生成物を０．２２μｍフィルター上で滅菌濾過する。
ｂ）精製スキーム
上記の精製ステップを、純粋な生成物が経済的なやり方で得られるような方法で、併合した。２つのこのような精製スキームを、スキーム１に示す。この両者が類似の生成物を作り出す。スキーム１に示すようなステップの１の形態（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）においては、上記ステップを実施例１ａ中に記載する順番で行い、そして他の形態においては、上記トリプシン・ステップを、上記限外濾過ステップと第１のパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップの間で行った。これは、第２のパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップが省略されることができるということを意味する。
実施例２−特徴付け
精製された産物のサンプルを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド、スタッキング・ゲル中１％ＳＤＳ、４０〜５０ボルトで１５時間の移動）により分析した。このゲルを、ＡｇＮＯ3 で染色し、そしてその色を、１０〜２０分間、発色させ、そして伝統的なＨＡＶプロセス（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）と比較した。
【００３９】
図２と図３から分かるように、上記産物をプロテアーゼ処理に供することにより、高分子量汚染物のほとんどが除去される。
実施例３−ＨＡＶワクチン配合物
３．１  ＨＡＶ−アルミニウム（ａｌｕｍ）３Ｄ−ＭＰＬ
実施例１のＨＡＶ粒子を、まず、水酸化アルミニウム（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）に吸着させ、その後、遊離の３Ｄ−ＭＰＬを添加する。０．５ml投与量７２０ＥＬＵのＡ型肝炎ウイルス粒子／０．０２５mgＡｌ3+イオン、及び５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ。
３．２  ＨＡＶ＋ＨｂS Ａｇ配合物
以下の配合物を作った：
【００４０】
【化１】
0004523164.tif 000002
【００４１】
群１において、個々の抗原を、ＨＡ，０．４７５mg  Ａ１３＋イオン（ＡｌＰＯ4 Ｓｕｐｅｒ  ｆｏｓ型）について、アルミニウム塩０．０２５mg  Ａｌ3+イオン（Ａｌ（ＯＨ)3Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）に吸着させた。群２と５においては、５０μｇ／投与の遊離３Ｄ−ＭＰＬを、肝炎Ｓ抗原に添加し、それに上記の吸着されたＡ型肝炎成分を添加した。群３と４においては、３Ｄ−ＭＰＬを、別々に上記アルミニウム塩に吸着させ、そして次に上記３つの吸着された成分を互いに混合せた。
実施例４−免疫原性実験
Ｂａｌｂ／Ｃマウス
１０匹のマウスからなる群を、ＨＡＶ／ＨＢS 配合物（１／１０ＨＤ）で２週間間隔で３回筋中、免疫感作させた。ＨｂS に対する抗体応答を、IIに後（ｐｏｓｔII）１４日目に、そしてIII の後１４日目に、ＥＬＩＳＡによりモニターした。抗−ＨＢS 応答のアイソタイプ特性を、IIの後１４日目に分析した。ＨＡＶに対する抗体応答をIII の後１４日目にモニターした。
【００４２】
ＮＭＲＩマウス
１０匹のマウスからなる群を、ＨＡＶ／ＨＢS 配合物（１／２ＨＤ）で１回腹腔内に免疫感作させた。ＨｂS とＨＡＶに対する抗体応答を、注射後２８日目にＥＬＩＳＡによりモニターした。
【００４３】
【表１】
0004523164.tif 000003
【００４４】
ＨＡＶマウス血清学
抗−Ａ型肝炎ウイルス抗原（ＨＡＶ）抗体の定量を、ＢｅｈｒｉｎｇからのＥｎｚｙｇｎｏｓｔキット（ｒｅｆ：ＯＱＥＣ１１）を用いて行った。このアッセイは、競合テスト原理に基づくＥＬＩＳＡであり、１ステップで走らせられ、そして最初に、ヒト血清学のために開発された。
【００４５】
マウス血清（１／１０から出発する４希釈）、（８０ mIU／mlから出発する８希釈）、及び対照の２倍希釈を、抗−ＨＡＶ陰性ヒト血清中で行った。テスト／対照サンプル（２５μｌ）、ＨＡＶ抗原溶液（５０μｌ）、及びペルオキシダーゼと結合した抗−ＨＡＶマウス・モノクローナル（コンジュゲート・バッファー中で行われた１／４１希釈の５０μｌ）の混合物を、３７℃で２時間、ＨＡＶプレ−コートされたマイクロプレート上でインキュベートした。次に、このプレートを洗浄し、そしてＴＭＢの溶液（１００μｌ）で３０分間インキュベートした。この反応を、Ｈ2 ＳＯ4 ０．５Ｎで停止させ、そして４５０／６２０nmで読んだ。
【００４６】
抗−ＨＡＶ抗体力価を、（４つのパラメーターの等式を用いて）ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏにより上記文献から計算し、そして mIU／mlで表す。
結果
上記結果を図１に示す。
図１の中、結果は、ＭＰＬを含有する配合物が、アルミニウム塩群単独よりも、有意に高い、Ａ型肝炎成分に対する抗体応答を誘発するということを表す。同様に、図１ｂ中に示す結果は、ＭＰＬ含有配合物が、ＨｂS Ａｇに対する高い抗体力価を誘発することを表す。
実施例５−臨床試験
ＨＡＶ／ＨＢS(ＨＡＢ）配合物を、健康な被験体に投与した。
【００４７】
抗−ＨＡＶ抗体の血清力価を、ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍからのＥｎｚｙｍｕｎテスト）により計測し、そして抗−ＨＢS 抗体の血清力価を、テスト・キットＡＵＳＡＢ−Ａｂｂｏｔｔを用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により計測した。抗−ＨＡＶ抗体についての上記アッセイのカット−オフは３３ mIU／mlであり、そして抗−ＨＢS 抗体についての上記アッセイのカット−オフは１ mIU／mlであった。
【００４８】
３３ mIU／mlの抗−ＨＡＶ抗体力価をもつ被験体を、抗−ＨＡＶ抗体について血清陽性であると考えた。１ mIU／mlの抗−ＨＢS 抗体力価をもつ被験体を、抗−ＨＢS 抗体について血清陽性であると考えた。抗−ＨＢS についての血清保護率を、１０ mIU／mlの抗−ＨＢS 力価をもつ被験体の割合として定義した。
【００４９】
【表２】
0004523164.tif 000004
結果：
ＨＡＢ／ＭＰＬが健康な被験体に投与されるところの上記フェーズＩ臨床試験においては、免疫応答の際に免疫刺激剤として働くＭＰＬの顕著な効果が存在する。
【００５０】
ＭＰＬは、抗−ＨＡＶ動態に対して明らかな効果をもつ。それは、６．５ヶ月目及び７ヶ月目（すなわち、最後のワクチン投与後、それぞれ、１４と３０日後）に観察される顕著な既往反応をもつ、より速く、かつ、強い免疫応答を誘発する。
この試験の制限内で、上記候補ＨＡＢ／ＭＰＬワクチンは、ひじょうに良好な安全性及び反応原性特性を示したと結論することができる。１８〜４０歳の健康な成人の試験群における２投与からなるワクチン接種の全経過の後、それはひじょうに免疫原性であった。両Ａ型肝炎抗原とＢ型肝炎抗原に対する強いプライミング及びより速い免疫応答が存在した。
【００５１】
【表３】
0004523164.tif 000005
【００５２】
【表４】
0004523164.tif 000006
【００５３】
【表５】
0004523164.tif 000007
【００５４】
【表６】
0004523164.tif 000008
【図１ａ】
0004523164.tif 000009
【図１ｂ】
0004523164.tif 000010
【図２】
0004523164.tif 000011
【図３】
0004523164.tif 000012