(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14,045から15,804、ヌクレオチド14,760から15,804、ヌクレオチド14,760から16,575、またはヌクレオチド14,045から16,575、あるいは(b) (a)に定義された配列に高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列を含む少なくとも1つのエンハンサーエレメント、異種ポリペプチドをコードする配列並びにプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドであって、上記異種ポリペプチドの発現が、PSM遺伝子のエンハンサーエレメント及びプロモーターによって制御される、組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記プロモーターが、上記異種ポリペプチドをコードする配列の上流に位置し、上記配列に機能的に結合している、請求項1記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
上記プロモーターが、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、前立腺において活性なプロモーター、または血管内皮細胞において活性なプロモーターより成る群から選択される、請求項1または2記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
上記前立腺において活性なプロモーターが、プロバシンプロモーター、PSMプロモーター、及びPSAプロモーターより成る群から選択される、請求項3記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
上記前立腺において活性なプロモーターが、PSMプロモーターである、請求項4記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から14930を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項1から5のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から15091を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項1から5のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項８】
二つ以上のエンハンサーエレメントを含む、請求項1から7のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項９】
(a)配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14,045から15,804、ヌクレオチド14,760から15,804、ヌクレオチド14,760から16,575、またはヌクレオチド14,045から16,575、あるいは(b) (a)に定義された配列に高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列を含む少なくとも1つのエンハンサーエレメント、プロモーター、並びに異種ポリペプチドのコード配列が挿入される挿入部位（上記挿入部位は、上記プロモーターに隣接して下流に存在する）を含む、組換え発現カセットであって、上記異種ポリペプチドの発現が、PSM遺伝子のエンハンサーエレメント及びプロモーターによって制御される、組換え発現カセット。
【請求項１０】
上記エンハンサーエレメントが、上記プロモーターに隣接して配置される、請求項9記載の組換え発現カセット。
【請求項１１】
上記エンハンサーエレメントが、上記プロモーターの上流に存在する、請求項9または10記載の組換え発現カセット。
【請求項１２】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から14930を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項9から11のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項１３】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から15091を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項9から11のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項１４】
二つ以上のエンハンサーエレメントを含む、請求項9から13のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項１５】
二つ以上のエンハンサーエレメントを含むダイマーまたは高級マルチマーを含む、請求項9から14のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項１６】
上記プロモーターが、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、前立腺において活性なプロモーター、または血管内皮細胞において活性なプロモーターより成る群から選択される、請求項9から15のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項１７】
上記前立腺において活性なプロモーターが、プロバシンプロモーター、PSMプロモーター、及びPSAプロモーターより成る群から選択される、請求項16記載の組換え発現カセット。
【請求項１８】
上記前立腺において活性なプロモーターが、PSMプロモーターである、請求項17記載の組換え発現カセット。
【請求項１９】
上記コード配列の下流に位置し、上記配列に機能的に結合した、または上記挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルを、上記発現カセットがさらに含む、請求項9から18のいずれか一項記載の組換え発現カセット。
【請求項２０】
上記ポリアデニル化シグナルが、SV40ポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項19記載の組換え発現カセット。
【請求項２１】
選択マーカーをコードする遺伝子をさらに含む、請求項1から8のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
上記ベクターが、ヒトアデノウイルスタイプ５またはヒツジアデノウイルスである、請求項21記載のベクター。
【請求項２３】
(a)配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14,045から15,804、ヌクレオチド14,760から15,804、ヌクレオチド14,760から16,575、またはヌクレオチド14,045から16,575、あるいは(b) (a)に定義された配列に高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列を含む少なくとも1つのエンハンサーエレメント、プロモーター、及びコード配列を含み、上記エンハンサーエレメントとプロモーターが、上記コード配列の発現に向けられた組換え発現カセットを、細胞内に導入することを含む、in vitroにおける、細胞内でのコード配列の発現に向けた方法。
【請求項２４】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から14930を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
上記エンハンサーエレメントが、配列番号2に示されたPSM遺伝子のヌクレオチド14760から15091を含む配列、または高い厳密性の下で上記配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
上記プロモーターが、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、前立腺において活性なプロモーター、または血管内皮細胞において活性なプロモーターより成る群から選択される、請求項23から25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
上記前立腺において活性なプロモーターが、プロバシンプロモーター、PSMプロモーター、及びPSAプロモーターより成る群から選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
上記前立腺において活性なプロモーターが、PSMプロモーターである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
上記細胞が、前立腺細胞、膀胱細胞、乳房細胞、または血管内皮細胞より成る群から選択される、請求項23から28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
上記細胞が、血管内皮細胞である、請求項23から29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
ガンの治療のための、医薬の製造における、請求項9から20のいずれか一項記載の組換え発現カセットの使用。
【請求項３２】
上記ガンが、前立腺ガン、膀胱ガン、及び乳ガンより成る群から選択される、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
上記ガンが、乳ガンである、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
上記ガンが、前立腺ガンである、請求項32記載の使用。
【請求項３５】
上記コード配列が、酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)をコードする、請求項31から34のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、前立腺特異的遺伝子から由来する新規な調節エレメントを含む構築物に関する。本発明はまた、これらの構築物の使用を含む診断方法及び治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織特異的及び／またはホルモン調節遺伝子発現をコントロールするＤＮＡ領域の単離と特徴付けは、特異的な細胞タイプに制限された特定の遺伝子の発現による発達プロセスの理解に対して重要となっている。プロモーター領域は、転写の開始部位のすぐ上流及びしばしばオーバーラップして見出され、転写の開始及び基底レベルに対して重要である。エンハンサーは、遺伝子の上流若しくは下流のいずれかまたはイントロン内で、転写開始部位からいくらか離れて存在し、しばしば高レベルの組織特異的またはホルモン調節発現を与える調節領域である；ある場合、その機能は、特定のプロモーターに特異的である。プロモーターとエンハンサーの両者の機能は、特異的なＤＮＡ配列に結合する特定のタンパク質、転写因子によって介在される。単独で、または他の転写因子と組み合わせて、それらは転写開始部位に対してＲＮＡポリメラーゼを含むコア転写マシネリーを活性化し、その活性を刺激するように機能する。単離されたプロモーターとエンハンサー配列は、細胞内の他の遺伝子の発現または組織特異的な態様に向けて、例えば遺伝子治療において使用することができ、特異的に遺伝子発現を調節する試薬の開発のための標的を提供することもできる。
【０００３】
前立腺において発現される数多くの遺伝子のプロモーター及び調節領域が、トランスフェクション法を使用して、またはその後トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現によって研究されている。我々は以前に、前立腺発現遺伝子、プロバシン（Ｐｂ）とリラキシン遺伝子のプロモーターと、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）遺伝子のプロモーター及びエンハンサーによって向けられる、細胞タイプの発現特異性を比較した(1)。前立腺特異的なものとして同定された遺伝子のほとんどはアンドロゲン誘導性であり、それらの機能のこの特徴点は詳細に研究されている。かくして、誘導性の発現及び／またはアンドロゲンレセプターの結合のためのアンドロゲン応答エレメントの重要性は、ＰＳＡ(2,3)、ヒト腺カリクレイン（ＫＬＫ２）(4)、ラット前立腺ステロイド結合タンパク質（ＰＳＢＰ）(5,6)、プロバシンＰｂ(7,8)、及び前立腺酸性ホスファターゼ遺伝子(9)において特徴付けされており、並びにラットＰＳＢＰ Ｃ３(1)遺伝子(10)及びラット２０ＫＤａａアンドロゲン調節タンパク質(11)のイントロン中の調節エレメントにおいて特徴付けされている。
【０００４】
分析されたコアプロモーター領域の中では、プロバシン遺伝子のプロモーターのみが、実質的な前立腺特異的な発現を与える(1,15)。アンドロゲン応答性とは区別されるように、本質的に前立腺特異的な発現を与えることに関与するエレメントは十分に特徴付けされていないが、ＰＳＢＰ Ｃ３遺伝子プロモーターと第一イントロンの領域に結合する組織特異的因子が同定されている(9,12)。隣接配列の４ｋｂ上流と２ｋｂ下流に存在するＰＳＢＰ Ｃ(3)についての遺伝子は、組織特異的にトランスジェニックマウスにおいて適切なホルモンコントロールの下で発現される(13)。ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するためのＰＳＢＰ Ｃ３(1)から５ｋｂ上流の領域の使用は、前立腺腫瘍を誘導するが、発現は高度には制限されず、他の異常も一般的であった(14)。トランスジェニックマウスを使用する研究は、プロバシンとＰＳＢＰ Ｃ(3)遺伝子の領域が、前立腺特異性を与え得ることを確立している。
【０００５】
ＰＳＡ及びプロバシン調節領域は、前立腺発現遺伝子の中で二つの最も研究されているものである。ラットプロバシン遺伝子上流の４３０ｂｐ領域は、トランスフェクション実験(1)及びトランスジェニック動物(15,16)におけるレポーター遺伝子についての発現の前立腺特異性を与えることができることを確立している；ＳＶ４０ Ｔ抗原の発現を標的化するために使用する場合、前立腺腫瘍は特異性を形成する(17,18)。この発現は、完全に特異的なわけではないが、特異性はヒヨコリゾチーム遺伝子由来のＭＡＲ（マトリックス結合領域）を含むことによって顕著に改良される(15)。４３０ｂｐプロモーター領域は、アンドロゲン誘導に強力に応答性であり、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）を結合するアンドロゲン応答エレメントが特徴付けされている(4,6,7,16)。
【０００６】
ＰＳＡ上流領域（６３０ｂｐまで）はまた、強力なアンドロゲン応答プロモーターとして機能し、アンドロゲン応答エレメントもまた特徴付けされている(2,3)。しかしながらこの領域は、カルチャーにおける細胞タイプ特異的発現(1)またはトランスジェニックマウスにおける組織特異的な発現(19)に向けるのには不十分である。トランスジェニックマウスにおいて活性化Ｈａ−ｒａｓガン原遺伝子を発現するための６３０ｂｐヒトＰＳＡプロモーター領域の使用は、唾液腺腫瘍の形成を導き、前立腺腫瘍の形成は導かない(19)。Pang等は、前立腺ガン患者から単離した同等なプロモーター領域が、印刷された配列と比較して７カ所のミューテーションを含み、前立腺ガン細胞系ＬＮＣａＰ中で高度に活性であることを報告している(20,21)。より最近、ＰＳＡ遺伝子の転写開始部位の４から５ｋｂ上流の領域で、エンハンサー領域が同定されている(20,21)。このＰＳＡエンハンサーは、アンドロゲン誘導性エンハンサーとして機能し、ＰＳＡプロモーターと組み合わせて顕著な細胞タイプ特異性を示すことが示されている(1,20,21)。
【０００７】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、アンドロゲンによって誘導されない発現を有する、同定されたいくつかの前立腺特異的タンパク質の一つである。ＰＳＭＡは最初に、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ５によって結合される抗原として同定された(25)。上記抗原は、前立腺ガン細胞系ＬＮＣａＰの膜分画に対して生産され、正常な前立腺組織、並びに原発性及び転移性前立腺ガン組織に対して特異的に結合することが示された。この抗体は後に、この膜結合タンパク質の内部エピトープに結合することが見出された(26,27)。その後、上記タンパク質の細胞外ドメインに対して標的化された他のモノクローナル抗体が単離されている(28,29)。
【０００８】
ＰＳＭＡをコードするｃＤＮＡがクローン化され、その配列が決定されている(30)。ＰＳＭＡは、ＩＩ型必須膜タンパク質であり、ＬＮＣａＰのような細胞を発現する細胞の細胞膜と会合している(30)。膜アンカードメインを欠き、細胞質に位置することが示されているＰＳＭＡのスプライス変異体（Ｐｓｍ’）もまた同定されている(31)。Ｐｓｍ’に対するＰＳＭＡの比は、正常な前立腺または良性の過形成と比較して、前立腺ガンにおいて増大していることが報告されている(31)。ＰＳＭＡは二つの関連する酵素活性を有することが示されており、それはポリγ-グルタマート化フォレートに対するカルボキシペプチダーゼ（フォレートヒドロラーゼ）(32)として、及び酸性ニューロペプチドN-アセチルアスパルチルグルタマートに対するペプチダーゼとして(33)機能する。この後者の活性は、ＰＳＭＡまたは脳における関連タンパク質の発現と一致する。
【０００９】
ＰＳＭＡ発現の特異性は、タンパク質及びＲＮＡレベルの両者で研究されている。前立腺における発現の主要な部位に加えて、免疫組織化学的な研究により、十二指腸刷子縁／小腸、腎臓の近位細管の一部、及び大腸の希細胞において、ＰＳＭＡ発現が同定されている(34.35)。全ての他の正常組織の研究は、７Ｅ１１−Ｃ５抗体で染色され、ＰＳＭＡの外部ドメインに対する抗体では染色されない横紋筋を除いて、発現に対して陰性である(28)。
【００１０】
７Ｅ１１−Ｃ５及び外部ドメイン抗体の両者は、広範囲のヒト腫瘍タイプの腫瘍血管系と反応することが見出されており、そのことは、ＰＳＭＡ発現の特異的な誘導を示す。ＰＳＭＡ発現は、いずれの正常血管系においても同定されていない。
【００１１】
ＲＮＡ発現は、タンパク質発現データとほぼ並行的であることが見出されている。ＰＮアーゼ保護分析により、前立腺、唾液腺、及び脳、並びに場合により小腸においてＰＳＭＡ ｍＲＮＡが同定された(37)。脳におけるＰＳＭＡ ＲＮＡの同定は、ラット脳由来の密接に関連するｃＤＮＡのクローニングと一致する(33)。しかしながら、免疫組織化学的分析では、ヒト脳組織において抗原と反応性のＰＳＭＡは同定されていない。
【００１２】
ＰＳＭＡ発現は、アンドロゲンの存在下でダウンレギュレーションされていることが示されており、発現は一般的に、後期前立腺ガン、及びアンドロゲン枯渇または削除治療を受けている患者において上昇する(37,38)。ＰＳＭＡの発現はまた、数多くの増殖因子によって調節されていることが見出されている；ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦは、発現をアップレギュレーションされているのに対し、ＴＮＦ−αは発現を減少する(39)。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
前立腺細胞におけるＰＭＳＡの制限された高レベルの発現、及び広範囲の腫瘍の血管系における発現の誘導は、ＰＭＳＡを前立腺及び他の腫瘍タイプの標的化のための理想的なものとする。ＰＳＭＡ遺伝子を包含するゲノムクローンが単離されており、その配列及びエキソン／イントロン構造が決定されている(40)。その発現を制御する調節領域は、遺伝子治療的ガン治療における使用が見出されており、標的細胞タイプにおける制限されたまたは高レベルの発現を可能にするであろう。上記調節領域はまた、標的細胞タイプにおける遺伝子発現を妨げる試薬の開発のための標的を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＰＳＭ遺伝子中の新規な調節エレメントを同定した。上記調節エレメントは、ＰＳＭ遺伝子のイントロン３に位置するエンハンサーである。これは本出願人の知見によると、アンドロゲン独立性の前立腺特異的遺伝子から由来するエンハンサーの初めての報告である。
【００１５】
ここで使用される場合、ＰＳＭ遺伝子は、O'Keefe等, 1998 (40) (Genbank登録番号AF007544)に記載されたＰＳＭゲノム配列を指し、この文献の全内容は、参考としてここに取り込まれる。
【００１６】
従って、第一の特徴点として、本発明は、ＰＳＭ遺伝子のイントロン３から由来する少なくとも一つの調節エレメントと、異種ポリペプチドをコードする配列とを含む、組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
用語、「異種ポリペプチド」は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ポリペプチド以外のポリペプチドを意味する。
【００１８】
好ましい実施態様として、上記組換えＤＮＡ分子はさらにプロモーターを含む。好ましくは上記プロモーターは、上記ポリペプチドをコードする配列から上流に位置し、上記配列と機能的に結合する。
【００１９】
第二の特徴点として、本発明は、ＰＳＭ遺伝子のイントロン３から由来する少なくとも一つの調節エレメント、プロモーター、及び挿入部位とを含む組換え発現カセットを提供し、上記挿入部位内にコード配列が機能的に挿入され、上記挿入部位が上記プロモーターに隣接してその下流に位置する。
【００２０】
調節エレメントは、本発明の組換えＤＮＡ分子または発現カセット内のいずれかの場所で、いずれかの配向で位置してもよい。例えば、上記調節エレメントは、コード配列の下流（例えば３’末端またはポリアデニル化シグナルの下流）またはコード配列中に位置するイントロン内に位置してもよい。好ましい実施態様として、上記調節エレメントは、プロモーターの上流である。
【００２１】
本発明の文脈内で、上記調節エレメントがエンハンサーエレメントであることが好ましい。好ましくは上記エンハンサーエレメントは、ＰＳＭ遺伝子のイントロン３またはその一部を含む。
【００２２】
好ましい実施態様として、上記エンハンサーエレメントは以下のものを含む：(a)ＰＳＭ遺伝子のヌクレオチド14,045から15,804、ヌクレオチド14,760から15,804、ヌクレオチド14,760から16,575、若しくはヌクレオチド14,045から16,575を含む配列；または
(b)パラグラフ(a)に定義された配列に対して高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列。
【００２３】
一つの好ましい実施態様として、上記エンハンサーエレメントは、図１１に示されたヌクレオチド14760から14930、またはそれらと高い厳密性の下でハイブリダイズする配列を含む。
【００２４】
別の好ましい実施態様として、上記エンハンサーエレメントは、図１１に示されたヌクレオチド14760から15091、またはそれらと高い厳密性の下でハイブリダイズする配列を含む。
【００２５】
さらに好ましい実施態様として、本発明の組換えＤＮＡ分子または発現カセットは、ＰＳＭ遺伝子のイントロン３から由来する二つ以上の調節エレメントを含む。一つの好ましい実施態様として、上記組換えＤＮＡ分子または発現カセットは、ＰＳＭＡ遺伝子のイントロン３から由来する調節エレメントのダイマーまたは高級マルチマーを含む。
【００２６】
いずれかの適切なプロモーターが、本発明の文脈において使用できることは、当業者に予測されるであろう。好ましいプロモーターとしては、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、プロバシン、ＰＳＭ及びＰＳＡのような前立腺において活性なプロモーター、または血管内皮細胞において活性なプロモーターが制限されることなく含まれる。
【００２７】
好ましい実施態様として、本発明の組換えＤＮＡ分子及び発現カセットはさらに、上記ポリペプチドをコードする配列から下流に位置し機能的に結合した、または上記挿入部位から下流に位置するポリアデニル化シグナルを含む。好ましくは上記ポリアデニル化シグナルは、米国特許第5122458号に記載されたＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルであり、上記文献の全内容は、参考としてここに取り込まれる。
【００２８】
第三の特徴点として、本発明は、第一の特徴点の組換えＤＮＡ分子、または第二の特徴点の発現カセットを含むベクターを提供する。
【００２９】
一つの好ましい実施態様として、上記ベクターは、選択マーカーを含む。上記ベクターはさらに、複製のためのオリジンを含む。
【００３０】
上記ベクターが、ヒトアデノウイルスタイプ５またはヒツジアデノウイルスであることが実際は好ましい。
【００３１】
第四の特徴点として、本発明は、エンハンサー活性を有し、以下のものを含む単離された核酸分子を提供する：
(a)図１１に示されたヌクレオチド14760から14930を含む配列、または
(b)パラグラフ(a)に定義された配列と高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列。
【００３２】
第四の特徴点の好ましい実施態様として、上記単離されたヌクレオチド分子は以下のものを含む：
(a)図１１に示されたヌクレオチド14760から15091を含む配列、または
(b)パラグラフ(a)に定義された配列と高い厳密性の下でハイブリダイズする核酸配列。
【００３３】
第四の特徴点のさらに好ましい実施態様として、単離されたヌクレオチド分子は、７．５ｋｂ未満である。
【００３４】
第五の特徴点として、本発明は、ＰＳＭＡ遺伝子のイントロン３から由来する少なくとも一つの調節エレメント、プロモーター、及びコード配列を含む組換え発現カセットを細胞内に導入することを含む、細胞内での興味あるコード配列の発現に向けた方法を提供し、ここで上記調節エレメント及びプロモーターは、コード配列の発現に向ける。
【００３５】
第五の特徴点の好ましい実施態様として、上記細胞は、前立腺細胞、膀胱細胞、乳房細胞、または血管内皮細胞である。
【００３６】
第六の特徴点として、本発明は、ＰＳＭＡ遺伝子のイントロン３から由来する少なくとも一つの調節エレメント、プロモーター、及びコード配列を含む組換え発現カセットを患者に投与することを含む、ガンの治療のための方法を提供し、ここで上記調節エレメント及びプロモーターは、コード配列の発現に向ける。
【００３７】
第六の特徴点の好ましい実施態様として、コード配列は、毒素、ウイルス複製に関与するタンパク質、またはプロドラッグを毒性薬剤に変換する酵素をコードする。例えば、上記コード配列は、プロドラッグフルダラビン及び6-メチルプリン2-デオキシリボシド（６ＭＰＤＲ）をその毒性誘導体に変換する、酵素プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードしてもよい。
【００３８】
本発明の構築物は、血管内皮細胞におけるタンパク質の発現にとって有用であるため、ガンのタイプの範囲が、本発明の第六の特徴点の文脈内で治療されてもよい。適切なガンのタイプの例として、腎細胞ガン腫、移行性細胞ガン腫、大腸腺ガン、神経内分泌ガン腫、悪性メラノーマ、膵管ガン腫、乳ガン腫、縦隔ガン腫、非小細胞肺ガン腫、精巣胚ガン腫、及びグリア芽細胞腫多型が含まれる。しかしながら、第六の特徴点の好ましい実施態様として、上記ガンは、前立腺、膀胱、または乳ガンから選択される。
【００３９】
【発明の実施の形態】
当業者に予測されるように、本発明は、アンドロゲンの存在下及び不存在下の両者で活性である、前立腺において特異的に発現する遺伝子から得られた新規な調節エレメントを提供する。それ故、これらの調節エレメントは、前立腺細胞における高レベルの遺伝子発現のために使用されてもよい。一つ異常の調節エレメントと、プロバシン及びＰＳＡプロモーターとの組み合わせは、強力な前立腺特異性を有する高レベルの発現を提供する構築物の例である。
【００４０】
本発明の調節エレメントはまた、腫瘍新血管形成及び腎細胞を含む、他の細胞のタイプの制限された範囲での発現に向けて有用であってもよい。
【００４１】
本発明の調節エレメントは、遺伝子治療における前立腺細胞または腫瘍新血管形成または腎細胞に対する遺伝子の特異的発現を標的化するために使用されてもよい。
【００４２】
本発明の調節エレメントはまた、前立腺疾患のトランスジェニック動物モデルの形成における遺伝子の特異的発現を標的化するために使用されてもよい。
【００４３】
本発明の調節エレメントはまた、前立腺細胞における遺伝子発現の調節に関与する他の遺伝的エレメントを同定するために使用されてもよい。
【００４４】
本発明の調節エレメントはまた、前立腺遺伝子発現を妨げる試薬を同定するための、または前立腺遺伝子発現の調節に関与するタンパク質及び他の因子を同定するためのアッセイにおいて使用されてもよい。
【００４５】
ここで使用される用語、「高い厳密性」は、以下の条件を指す：
(i)ハイブリダイゼーションの後の洗浄のために、低イオン強度と高温を使用すること、例えば50℃で0.1×SSC及び0.1%(w/v)SDS；
(ii)ハイブリダイゼーションの間で、ハイブリダイゼーション温度が、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの二本鎖への分解温度より２５℃以下低い温度であるような条件を使用すること、例えば６５℃で1.5×SSPE、10%(w/v)ポリエチレングリコール6000、7%(w/v)SDS、0.25mg/mlの断片化ニシン精子ＤＮＡ；または(iii)例えば７０℃で0.5Mリン酸ナトリウム,pH7.2、5mM EDTA、7%(w/v)SDS及び0.5%(w/v)BLOTTO；または
(iv)ハイブリダイゼーションの間で、ホルムアミドのような変性剤を使用すること、例えば４２℃で5×SSCで50%(v/v)ホルムアミド、50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)及び5×デンハルト溶液；または
(v)例えば４２℃で50%(v/v)ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%(w/v)ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)及び10%硫酸デキストラン。
【００４６】
この明細書を通して、用語、「含む」または「含む」、「含んでいる」といったその変異形は、述べられたエレメント、数字若しくは工程、またはエレメント、数字若しくは工程の群を含むように解されるが、いずれかの他のエレメント、数字若しくは工程、またはエレメント、数字若しくは工程の群を排除するものとは解されない。
【００４７】
本発明の性質をより明白に理解するために、本発明の好ましい形態が、以下の非制限的な実施例及び図面を参考にして記載されるであろう。
【００４８】
【実施例】
実施例１：PSMA遺伝子エンハンサー配列の単離
PSMA遺伝子の転写開始部位の上流及びそれを包含する領域の分析により、1kb領域が前立腺細胞系LNCaP中のレポーター遺伝子の発現に向けられることが示されている(40)。この発現は、SV40エンハンサー／プロモーターによって向けられるものと比較した場合、前立腺細胞に特異的であることを示す。LNCaP中での発現は、SV40エンハンサー／プロモーターによって向けられるものの約７５％であった。別の広く発現するプロモーターと比較して、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーターは、SV40エンハンサー／プロモーターがLNCaP細胞内でRSVの<1%という非常に弱くのみ活性であることを示している（未印刷データ）。我々は、PSMA転写開始部位に対する5'配列の11kbまでを包含する領域をクローン化し、増大するレポーター遺伝子発現を提供する能力について試験した；増大する活性は、1kbプロモーター領域に対して検出されなかった。
【００４９】
PSMA遺伝子の1kb近接プロモーター領域によって向けられた転写を促進する能力について、DNA断片のスクリーニングを可能にするストラテジーが開発された。1kbプロモーターは、図１に示されるようにプラスミドベクターpPSMentrap内のグリーン蛍光タンパク質(GFP)遺伝子の前方にクローン化された。プロモーターの上流に、候補断片のクローニングのための部位を含むポリリンカー領域が挿入された。
【００５０】
pPSMentarpは、以下のエレメントを含む；酵素KpnI、HindIII、SalI、MfeI、NsiI、BglI、NheI及びSpeIのための制限部位を含むポリリンカー、PSMA配列(Genbank登録番号AF007544(配列番号2))の1386塩基から2560塩基（XbaI部位）に亘るPSMAプロモーター領域、pC1ベクター(Promega)に含まれるキメライントロン、GFP遺伝子、ウイシ成長ホルモン遺伝子由来の3'末端ポリアデニル化シグナル、及びpC1ベクター由来のプラスミド骨格（アンピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンを含む）。
【００５１】
DNA配列のライブラリーを、PSMA遺伝子の5'半分と上記遺伝子の上流隣接配列を含むバクテリオファージP1コスミドP1-683を切断することによって調製した(40)。コスミドDNAを、一定範囲の部分的切断産物を生産するAATT部位で切断する酵素Tsp509Iで、各種の時間で切断した。これらをアガロースゲル電気泳動によって分離し、1から2kbのサイズ範囲で断片を記録し、pPSMentrapベクターのMfeI部位内にクローン化した。約600の個々のクローンのライブラリーを拾った。クローンを49の12プールに分け、Qiagenカラムとプロトコールを使用して個々のプールからDNAを調製した。各プールから得たDNA(2.5mg)を、以前に記載したように3.5cmの皿中のLNCaP細胞内にトランスフェクトした(1)。48から72時間後、細胞カルチャーをUV蛍光顕微鏡の下で調べ、蛍光化細胞を同定した。ポジティブプールを、7×7のマトリックス内に広げ、各整列及び各欄で7のクローンからDNA調製物を作製した。トランスフェクションを繰り返して、ポジティブサブプールを同定した。ポジティブ整列及び欄の交差地点のクローンを個々にさらにスクリーニングし、GFPの発現を確認した。最も強いシグナルを与える３種のクローン、#1、#3及び#4をさらなる分析のため取得した。
【００５２】
実施例２：エンハンサー断片の位置と配列分析
上記クローン由来の挿入物を、pBluescriptSK+ (pBKSEn3及びpBKSEn4)内に再クローン化し、それらの末端の配列を決定した。全てのクローンは、図２に示されるようにPSMA遺伝子の第三のイントロンから開始することが見出された。クローン#3及び#4の両末端の位置を、示されたように同定した。クローン#3及び#4中の挿入物は、図３に示されるようにpPSMentrapベクター中のPSMプロモーターに対して反対の向きで並んでいた。上記クローンは、1044bpの共通のオーバーラップ配列を所有し、全部で2,530bpに亘った。一方の末端がクローン#4の末端の6bp上流である、同じ領域から由来する第三のクローン#1もまた、クローン#3と#4渡橋痛の領域内に含まれるSpeI及びHinDIIIを含んだ。しかしながら、それはクローニングに際していくつかの再生列を受け、さらに研究はしなかった。
【００５３】
実施例３：PSMAエンハンサー領域の機能
PSMAエンハンサー領域の活性を、PSMプロモーターの上流にPSMA遺伝子挿入物を有するクローンでトランスフェクトされた細胞の蛍光強度の視覚的観察によって、最初に同定した。これらの予備的実験において、上記エンハンサー（クローン#4）は、膀胱細胞系BL13において機能しないようであることに注意した（示さず）。プロモーターとエンハンサー機能の定量的測定を提供するために、PSM 1kbプロモーターと組み合わせたエンハンサー#3と#4（以下ではEn3及びEn4と称する）を、二つの異なる遺伝子発現レポーター系内に再クローン化した。
【００５４】
実施例４：pCAT3SATシステムにおいてアッセイされる発現
pCAT3SATベクターは、トランスフェクション効率のためのCAT発現を標準化するために、RSVプロモーターの制御の下に、プロモーター活性を測定するための修飾細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子と、レファレンスレポーター遺伝子、セリンアセチルトランスフェラーゼを含む。BamHI内のSalI/BamHI断片として、pCATSATプラスミド(1)からセリンアセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子をクローニングすることによって、それを調製した。SalIは、pCAT3ベクター(Promega)を切断する。PSMエンハンサー断片4(En4)の存在下または不存在下でPSMプロモーターを含む構築物pPSM1k-C3S及びpEn4PSM1k-C3Sを、CAT遺伝子の上流のポリリンカー中のXhoI及びPstI部位で切断されたpCAT3SAT内に、pPSMentrapベクター由来のSalI/PstI断片としてのPSMエンハンサー／プロモーター断片をクローニングすることによって調製した（図４）。RSVプロモーターを含むコントロール構築物、pRSV-C3Sもまた、pCAT3SATのNheI部位内に、pCATSAT(1)由来のNaeIからScaI断片の平滑末端ライゲーションによって調製した（図４）。細胞系を異なる構築物でトランスフェクションし、CAT及びSAT活性を記載されたように48時間後に測定した(1)。標準化発現データは、図５に示される。
【００５５】
LNCaP細胞において、En4断片が1kb PSMプロモーターの上流に存在する場合、約50倍の発現の増大（RSVプロモーターの活性の0.33%から15.7%）が検出された。この発現は、PSMAを発現するLNCaP細胞の高レベルの特異性を示した。別の前立腺細胞系、PC3は、エンハンサーの存在下または不存在下のそれぞれで、PSMプロモーターからの非常に低レベルの発現を示した。バックグランド以上の発現は、３種の非前立腺細胞系(MCF-7、乳ガン系、ヒト胚腎細胞(HEK293)及び肝細胞系(HepG2))について検出されなかった。低い及び可変的な発現は、LNCaP細胞においてみられた活性の約10%を示すエンハンサー／プロモーター構築物を有する第二の乳ガン細胞系T47-D2において検出された。
【００５６】
実施例５：ルシフェラーゼpGL3システムにおいてアッセイされる発現
CATアッセイシステムにおけるPSM １ｋｂプロモーターの低い活性のため、プロモーターとエンハンサー配列を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むpGL3ベクター(Promega)内にクローン化した。上記クローンの構築物は、図６に示される。pPSM1k-GL3及びpEn4PSM1k-GL3を、pPSM1k-C3S及びpEn4PSM1k-C3S由来のKpnIからXbaI断片を、それぞれKpnI及びNheIで切断したpGL3内にクローニングすることによって調製した。pEn3PSM1k-GL3を、KpnI及びNheIで切断したpEn4PSM1k-GL3内に、pEn3PSMentrapのKpnIからNheIエンハンサー断片をクローニングすることによって調製した。活性をアッセイするために、各pGL3構築物の混合物と参考プラスミドpRSVCAT(1)を、以前に示されたように標準的な方法で各種の細胞系内にトランスフェクトした(1)。DNA濃度を、エチジウムブロマイド染色ゲルのイメージ分析により測定し、マスターミックスを1μgのpRSVCATに対して1.5μgのpGL3構築物の比で調製した。同じマスターミックスを、全ての細胞系内へのトランスフェクションのために使用した。細胞を標準的方法を使用して2.5μgのDNAミックスでトランスフェクトし、発現を48時間後にアッセイした。抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を、Luciferase Assay System (Promega)を使用して測定した。CAT活性を、上述のように測定した。ルシフェラーゼ発現レベルを、pRSVCATレファレンスプラスミドに対して標準化し、標準化された活性を、pRSV-GL3/pRSVCATのものの割合として表した（図７）。
【００５７】
LNCaP細胞において、PSM 1kプロモーター由来の発現は、En3とEn4エンハンサー配列の両者によって強力に増大し（約260倍）、pEn3PSM1kとpEn4PSM1kによって表される発現レベルは、PSVプロモーターのレベルの15及び15.7%であった。非PSMA発現前立腺細胞系PC3において、低レベルの増大（En3とEn4のそれぞれ3.7及び5.2倍）が検出され、その一方で他の非発現前立腺系、DU145においてはエンハンサーの機能は存在しなかった。試験された非前立腺細胞系の範囲、HepG2肝細胞、MRC5原発性肺線維芽腫、BL13膀胱ガン腫、及びヒト胚腎HEK293細胞について、PSMAエンハンサー／プロモーターまたはプロモーター単独の構築物について活性は必須に検出されなかった。かくして活性は、一つの非発現前立腺細胞系PC-3における部分的エンハンサー機能を有する、発現前立腺細胞系LNCaPに対して非常に特異的である。
【００５８】
実施例６：エンハンサーエレメントの特徴付け
エンハンサー活性を提供するのに必要な配列の度合いを測定するために、クローンEn3及びEn4によって包含される全ての配列を複む構築物、並びに両者のクローンに存在するオーバーラップする領域を含む構築物を調製した（図６参照）。pEn3+4PSM1k-GL3を、KpnIとNdeIで切断されたpEN4PSM1k-GL3内にpBKSEn3由来のKpnIからNdeI制限断片をクローニングすることによって調製した。クローンpOverlapen3/4を、pBleuscriptSK+内にpEn3PSMentrap由来ｓのSalIからHinDIII断片をクローン化し、その後中間体ベクターのHinDIII部位内にpEn4PSMentrap由来のHindIII断片をクローン化し、それが正確な向きで存在するかを確認することによって調製した。オーバーラップするエンハンサー断片を、KpnIとEcoRIで切断したpPSM1k-GL3内のPSM 1kbプロモーターの前方にKpnIからEcoRI断片としてクローン化した。PSMプロモーターに対して反対の向きでオーバーラップする領域を有する構築物を、pEn3PSMentrap由来ｓのHinDIII断片が引き続くpBleuscriptSK+内に、pEn4PSMentrap由来のSalIからHinDIII断片の最初のクローニングと、KpnIからEcoRI断片としてのPSMプロモーターの前方のオーバーラップ領域のクローニングにより、同様に調製した。
【００５９】
これらの構築物の有効性を、LNCaP細胞内へのトランスフェクション（上述の通り）によって、PSM1kプロモーター単独及びEn4/PSM1kプロモーターの有効性と比較した。オーバーラップ領域のそれぞれの向きを含むクローンは、En4配列を含むクローンと同様のレベルの発現を生じた。しかしながら、エンハンサー3及び4によって包含される全領域を含む構築物は、顕著により強い発現を与えた。発現のレベルは、PSVプロモーターのレベルの約半分であった。
【００６０】
実施例７：他のプロモーターに対するPSMAエンハンサー機能
上記エンハンサーの特性を、PSA及びプロバシンという前立腺細胞において主に活性なプロモーター、並びにヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)の非組織特異的プロモーターという他のプロモーターに結合することによってさらに評価した。これらのプロモーター領域の構造は、図８に示されている。PSA及びプロバシン構築物について、エンハンサー領域En4を、それぞれXbaI切断プラスミドpPSA630CATSAT及びpPb430CATSAT内に、pEn4PSM1k-C3Sプラスミド由来のNheI断片としてクローン化した（プロバシン構築物についてはXbaIで部分的に切断した）。pPSA630CATSAT及びpPb430CATSATは、以前に記載されている(1)。プラスミドpTKCATSAT.1を、SalI切断ベクターpCATSAT.1内に、SalIからXhoI断片として-101から+59塩基のTKプロモーター領域をクローニングすることによって調製した(1)[pCATSAT.1は、RSVプロモーターの上流に位置するSalI、PstI及びXhoI部位が、XhoI及び部分的SalI切断と再ライゲーションにより除去または破壊されたpCATSAT(1)の誘導体である]。pEn4TKCATSATを、SalIで切断され、BamHIで部分的に切断されたpTKCATSAT.1内に、pEn4SMentrap由来のSalIからBglIIのエンハンサー含有断片をクローニングすることによって調製した。
【００６１】
６種のプラスミドを、数多くの細胞系内にトランスフェクトし、CAT及びSATレポーター遺伝子発現を記載されたように測定した(1)。発現レベルを、記載されたようにpRSVCAT及びpRSVSATの標準混合物のトランスフェクションによって測定されたPSVプロモーターのレベルに対して標準化した。その結果が図９ａ及びｂに示されている。
【００６２】
LNCaP細胞において、PSA、プロバシン及びTKプロモーターの強力な増大が検出され、プロバシンのものが最も強力であった。全てのエンハンサー構築物についての発現のレベルは、RSVプロモーターのものの２から３倍であった。エンハンサーの存在下で全てのプロモーターは同レベルの発現を達成したので、示された「倍の増大」はおそらく、異なるプロモーター由来の非増大発現のレベルの差異を反映するであろう。
【００６３】
PSMAを発現しないPC3前立腺細胞において、異なるプロモーターに対して５から１６倍である、大きく減少した増大が検出された。これは、エンハンサーをＰＳＭプロモーター自体と結合した場合に見られる結果と同様である。かくして、PC3細胞は、転写を活性化するために、他の細胞は欠いているPSMエンハンサーと相互作用できるいくつかの因子を含むかまたは、LNCaP細胞で見られるような完全なエンハンサー機能を可能にするのに十分なレベルを有さないようである。
【００６４】
非前立腺細胞系について、HepG2肝細胞またはBL13膀胱細胞では、増大は検出されなかった。増大は胚腎HEK293細胞で見られた。低レベルの増大(1.4,1.5倍)が、PSA及びTKプロモーターに対してみられる一方で、プロバシンプロモーターについては９倍の増大が存在した。そのホモローガスなPSMプロモーターのEn4によっては、HEK293細胞において増大は見られなかった（図７）。近接する腎小管は、低レベルのPSMA発現の部位であるため、HEK293細胞で見られた発現は、生物学的に重要であると思われる。
【００６５】
実施例８：PSMエンハンサー機能はアンドロゲンを必要としない
二つの非常にアンドロゲン誘導性プロモーター、プロバシン及びPSA遺伝子のプロモーターと、一つの構成的プロモーター、TKに結合した場合の、PSMエンハンサー(En4)の活性に対するアンドロゲンの必要性を研究した。LNCaP細胞を、アンドロゲンを除去するため木炭で引っかかれた培地を使用して、プラスミド構築物でトランスフェクトした。細胞をアンドロゲンフリー培地で維持し、または0.28nMで加えた非代謝性アンドロゲン類似体R1881の存在下でインキュベートした(1)。全てのプロモーターについて、アンドロゲンが培地中に存在するか否かに関わらず、強力な発現の増大が見られた。しかしながら、PSMエンハンサーを含む３種の構築物の全てについて、発現のレベルは実際にアンドロゲンの添加で減少した。このことは、エンハンサーが、内因性PSMA遺伝子の観察されるアンドロゲン抑制を介在する配列を含むことを示唆した。
【００６６】
実施例９：エンハンサー機能に必要とされる配列
どの配列領域がエンハンサー機能に必須であるかを測定するために、PSME領域由来の異なる断片がpPSM1k-GL3プラスミド中のPSMプロモーターの前方に配置された、一連の構築物を調製した。各構築物に含まれる配列は、以下の表に示されている。プロモーターに対するエンハンサー配列の向きは、F（正方向、pEn4PSM1k-GL3について）またはR（負方向、pEn3PSM1k-GL3について）のそれぞれとして示される。これらの構築物の活性を、pRSVCATコントロールプラスミドと共にLNCaP細胞内へのトランスフェクトに引き続きアッセイした。トランスフェクションの４８時間後に抽出物を調製しアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、共トランスフェクトpRSVCATプラスミドの活性を使用して標準化され、pRSV-GL3の活性に対して表された（以下の表）。
【００６７】
【表１】
0004528446.tif 000002
【００６８】
これらのデータは、ほとんどのエンハンサー活性が、14760から15091塩基を包含する331bp領域内に含まれることを示す。この領域は、En3とEn4クローン、及びそれらの間で共有される約1kb領域に対して同様な活性（RSVの活性の26%）を示す。331bp領域の左側半分または全部のそれぞれの1kbオーバーラップ領域の欠失（構築物pEnO1/722SmaIPSM1k-GL3及びpEnO1/886NdeIPSM1k-GL3）はエンハンサー活性を失い、この領域が活性に必須であることが示される。331bp領域の右側半分の欠失は、14760から14930塩基を包含する170bpのみを残し、活性の顕著な減少を導く。
【００６９】
かくして14760から14930塩基は、PSME活性に必須であるが、14760から15091に亘る配列は、より強いエンハンサー活性を提供する。上記領域の配列は、図１１に示される。
【００７０】
実施例１０：PSMEコアエンハンサー領域は細胞タイプ特異性を維持する
PSMEの331bpコア領域が、細胞タイプ特異性を維持するかどうかを測定するために、エンハンサー機能を提供するPSMEの331bpコア領域(14760から15091塩基)に対して実験を実施した。プラスミドpRSM1k-GL3、pEn02/331SmaIPSM1k-GL3及びpRSV-GL3の活性を、数多くの細胞系内へのトランスフェクションの後にアッセイした（以下の表）。プラスミドを内部コントロールpRSVCATプラスミドと共トランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後に抽出物を調製してアッセイした。ルシフェラーゼ活性をpRSVCATプラスミドの活性を使用して標準化し、pRSV-GL3の活性に対して表した。
【００７１】
【表２】
0004528446.tif 000003
【００７２】
より長いエンハンサー断片に対するように、部分的エンハンサー活性は、PSMAを発現しないPC-3前立腺ガン細胞系において見られた。他の非PSMA発現前立腺細胞系DU145では、基底のプロモーター活性の増大は検出されなかった。同様に、331bp PSMEコア領域は、非前立腺細胞系において機能的ではない。かくしてコア領域は、PSMEの特異性を維持する。
【００７３】
実施例１１：タンデムエンハンサー配列はより大きい活性を提供する
PSMエンハンサー断片の存在下または不存在下でプロバシンプロモーターを、pGL3ベクター中のルシフェラーゼレポーター遺伝子の前方にサブクローン化した一連の構築物を調製した。上記構築物の構造は、以下に示される。430bpプロバシンプロモーター断片は以前に記載され(1)、pPB-CSプラスミドから再クローン化された（図８参照）。pPPb-GL3は、1kbオーバーラップエンハンサー領域を含む(14760から15704塩基)。pP1Pb-GL3及びpP2PPb-GL3は、331bpエンハンサー領域の一つまたは二つのコピーをそれぞれ含む(14760から15091塩基)。全てのエンハンサー配列は、正の向きで存在する。
【００７４】
【表３】
0004528446.tif 000004
【００７５】
構築物を、LNCaP、HEK293またはMCF-7細胞内に、RSVCATコントロールプラスミドと共にトランスフェクトし、48時間インキュベーションした後に調製された細胞抽出物における発現を測定した。トランスフェクションはアンドロゲン枯渇培地で実施され、共トランスフェクトRSVCAT内部コントロールを使用してルシフェラーゼ活性が解析された。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
LNCaP細胞における最大の発現は、二重エンハンサー構築物で観察され、単一コピーのエンハンサーを有する構築物の２から３倍大きい。発現の特異性は、これらのトランスフェクション実験で主に維持されているが、pP2Pb-GL3構築物はMCF-7細胞で上昇したレベルの発現を示す。
【００７８】
実施例１２：ウイルス骨格におけるエンハンサー機能
プロバシンプロモーターと組み合わせたPSMEの特性（その活性及び特異性及びアンドロゲンレベルに対する制限された応答性）は特に、遺伝治療応用における前立腺特異的遺伝子発現に向けて適している。
【００７９】
プロドラッグフルダラビンまたは6-メチルプリン2-デオキシリボシド(6MPDR)と組み合わせた大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)遺伝子は、酵素プロドラッグ治療を輸送するするために使用できる(41)。PNP遺伝子が、430bpプロバシンプロモーターに隣接した1kb PSME領域（負の向きで14760から15804塩基）のコントロールの下に配置された発現カセットを、pGEM11プラスミド内に調製した。この構築物(pPPP（Psm/プロバシン/PNPのため))のマップが以下に示される。pGEM11中の上記カセットを、部分的に配列決定し、その構造を確認した。
【表５】
0004528446.tif 000006
【００８０】
上記発現カセットを、ApaIとNotI（NotIについては部分的切断）で切断することによってサブクローン化し、ApaI/NotI切断ヒツジアデノウイルス(OAV)ベクター内に挿入した(42)。上記発現カセットは、OAVプラスミド中で二つの別の部位に挿入された。一つの単離物を、ApaIとNotI（部位１）で切断されたOAV200内にクローン化することによって調製し、クローンpOAV223を得た。別の単離物pOAV623においては、上記カセットはpOAV600の別の部位（部位３）にクローン化された(42)。プラスミドDNAを記載されたようにGSL503細胞内にトランスフェクトし(43)、ウイルスOAV223と623を回収した。
【００８１】
OAV223、OAV623、並びにPNP遺伝子がそれぞれRSV及びCMVプロモーターのコントロールの下に配置されたことを除いてOAV223と同等である二つの他のウイルスOAV220とOAV222を使用して、図１２に示された各種の細胞系に感染させた。細胞を、103opu/細胞の感染の多様性で各種のウイルスで感染させ、４日後にPNP発現を測定した(44)。各細胞タイプについて、最も強力に発現するウイルスからのPNP発現が、アッセイの直線範囲にはいるように、一定量の溶解物を使用した。かくして、PNP活性の全体量は細胞系の間で比較できないが、発現の比は比較できる。
【００８２】
図１２に示されたデータは、ウイルス骨格とOAV感染の下で、遺伝子発現の強力は特異性が維持されることを示す。最も高い活性はOAV623で見られ、ついでOAV223であり、LNCaP及びLN3前立腺ガン細胞におけるRSVプロモーターの活性よりも高かった。全ての非前立腺細胞系において、RSVプロモーター(OAV220)は最も高い発現を提供する。非前立腺細胞と比較した前立腺細胞に対するRSVプロモーターに対するPSME/Pbの差別的な特異性は、HEK293及びMCF-7に対する約１５倍の発現から、MRC-5に対する２００倍の発現までの範囲である。かくして、いくつかの細胞タイプにおいて、特異性はOAV感染について減少するが、未だ実質的に存在する。以下の実施例において、ヒトアデノウイルスタイプ５によって実施された場合、PSMプロモーター自体と組み合わせたPSMEの細胞特性の維持もまた示される。
【００８３】
実施例１３：ヒト臍動脈細胞におけるエンハンサー機能
PSMAは、広範囲の腫瘍タイプの真剣関係性において発現されるが、正常の血管形成では発現されないことが示されている。我々は逆転写酵素PCRを使用して、PSMAがヒト臍動脈(HUAEC)から由来する内皮細胞において発現されることを測定した（データ示さず）。腫瘍血管形成においてアップレギュレーションされる他の遺伝子もまた、HUAEC及び関連するヒト臍静脈細胞(HUVEC)、例えば内分泌系でも発現される(45)。それ故、PSM調節配列の機能をこれらの細胞で調べた。PSM 1kbプロモーターと結びついたPSMEの活性を、En4挿入物を有するpPSMentrap由来の発現カセットが挿入された、複製欠失アデノウイルス、ヒトアデノウイルスタイプ５を使用して評価した。ウイルスAd525は、PSM 1kbプロモーターに結合したPSME En4配列の転写制御の下でウシ成長ホルモン3'ポリアデニル化配列を有するGFP遺伝子を有する。GFP遺伝子が偏在する活性EF-1プロモーターの制御の下に存在するコントロールウイルスAd526もまた使用した。
【００８４】
HUAEC及びHUVECは、臍動脈から分離され、組織カルチャーがチキンではなくウシフィブロネクチンでコートされていることを除いて、Underwood及びBean(46)に記載されたように培養された。HUAC、HUVEC、LNCaP及びコントロールヒト胚線維芽細胞MRC-5は、フィブロネクチンコート化顕微鏡スライドチェンバー中に、チェンバー当たり４×１０4細胞で配置された。数日後に、それらはAd525またはAd526のそれぞれの、チェンバー当たり５×１０8光学粒子単位で感染された。GFP遺伝子の発現を、コントロールAd526ウイルスについて感染の３日後、PSME由来Ad525について６日後に蛍光顕微鏡によってモニターした。
【００８５】
コントロールウイルス(EIF、OAV526)由来の発現は、全ての細胞タイプで強力であった。En4PSMGFPウイルスについては、明らかな発現がHUAEC及びLNCaP細胞で見られ、弱い発現がHUVECで見られたが、MRC-5細胞では発現は検出できなかった。かくして、PSMEとPSMプロモーターの組み合わせは、内因性PSM遺伝子を発現するこれらの動脈細胞において遺伝子発現を特異的に発揮でき、腫瘍血管形成に対する発現に向けて有用であることがわかった。
【００８６】
数多くの変形及び／または変更が、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく、特異的な実施態様において示された本発明になすことができることは、当業者に明白であろう。それ故本実施態様は、説明のためにあらゆる観点で考慮されるべきであり、制限的なものではない。
【００８７】
【参考文献】
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0004528446.tif 000009
0004528446.tif 000010
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、pPSMentrapベクターを表す図である。上記ベクターの重要な特徴が示される：独特な制限部位であるマルチクローニング部位(MCS)、その下流にPSM 1kプロモーター領域(PSK1k)、pCIベクター(Promega)から由来するリーダー配列とイントロン(intron)、グリーン蛍光タンパク質遺伝子(GFP)、及びウシ成長ホルモン遺伝子(bGHpA)から由来する3'配列。有用な制限酵素部位の選択が示される；独特の制限酵素部位は太字で示される。
【図２】 図２は、クローン化PSMエンハンサー断片の位置を示す図である。マップは、PSM遺伝子のイントロン３内のクローン化エンハンサー断片の位置を示す。塩基番号(Genbank登録番号AF007544(配列番号2))が、イントロン３の境界と、クローン化断片の末端について示されている。イントロン内の制限部位SmaI(Sm)、HinDIII(H)及びSpeI(Sp)の位置が示されている。矢印は、pPSMentrapベクター内のクローン化配列の向きを示す（図３参照）。エンハンサークローン#1の右側末端は、このクローンの末端が再整列を受けているため点の箱で示される；SmaI、HinDIII、及びSpeI部位は、全ての３種のクローン化領域で存在する。
【図３】 図３は、pPSMentrap中のプロモーター及びエンハンサー挿入物を示す図である。pPSMentrap中のPSM 1kbプロモーター領域と隣接する制限部位の位置が上部の線に示される。プロモーター配列の右側に対して、リーダー配列とキメライントロンとGFPレポーター遺伝子が存在する。その下には、En3及びEn4挿入物を含むクローンのマップが示されている。上記配列は反対向きで存在する（HinDIIIとSpeI部位の順番に注意）。制限部位は以下のものの略称である：B2 BglII E EcoRI H HinDIII K KpenI M MfeI N NsiI Nh NheI P PstI S SalI Sp SpeI X XbaI
【図４】 図４は、pCAT3SAT中のプロモーター及びエンハンサー挿入物を示す図である。マップは、PSM 1kbプロモーター、PSM En4、及びRSVプロモーター、ならびにそれらの隣接制限酵素部位の位置を示す。プロモーター配列の右側に対して、リーダー配列とキメライントロンとPromega pCAT3 Basicベクターに存在するCATレポーター遺伝子が存在する。制限酵素部位は以下のものの略称である：B2 BglII Bz BstZI E EcoRI H HinDIII K KpenI M MfeI Ml MluI N NsiI Nh NheI P PstI S SalI Sc SacI Sm SmaI Sp SpeI X XbaI Xh XhoI
【図５】 図５は、PSM Enhancer4/PSM1kプロモーターによって向けられる相対的CAT発現を示す図である。細胞系内へのpPSM1k-C3SまたはpEn4PSK1k-C3Sのトランスフェクションに引き続き、示された標準化された発現レベルが、各構築物について測定され、pRSV-C3Sプラスミドのトランスフェクションから測定されたものに対して表される。
【図６】 図６は、pGL3中のプロモーター及びエンハンサー挿入物を示す図である。マップは、pGL3ベクター中に調製されたことなる構築物における、PSM 1kbプロモーター（影の箱）、PSMエンハンサー断片（黒い箱）及びPSVプロモーター（斜線の箱）の位置と隣接する制限酵素部位を示す。示された領域の右側に対して、pGL3ベクターのリーダー及びキメライントロン及びルシフェラーゼレポーター遺伝子が存在する。PEN4PSM1k-GL3及びpEn3PSm1k-GL3は、それぞれ図２に示されたエンハンサークローン#4と#3の配列を含む。pEn3+4PSM1k-GL3は、14,045から16,575塩基を包含するPSMエンハンサー配列を含む（図２参照）。POverlap3,4aPSM1k-GL3及びPOverlap3,4bPSM1k-GL3は、14,760から15,804塩基から由来するエンハンサー配列を含み、a及びb構築物は、HinDIII及びSpeI部位の位置によって示されるように反対の向きでエンハンサー配列を含む。制限酵素部位は以下のものの略称である：A ApoI B2 BglII Bz BstZI E EcoRI Eo EcoO109I H HinDIII K KpenI M MfeI Ml MluI N NsiI Nh NheI Nt NotI P PstI RV EcoRVS SalI Sc SacI Sc2 SacII Sm SmaI Sp SpeI X XbaI Xh XhoI
【図７】 図７は、pGL3ベクター中のPSMエンハンサー／プロモーター構築物の相対的発現を示す図である。ルシフェラーゼレポータープラスミド(1.5μg)と標準化プラスミドpRSV-CAT(1μg)の混合物を、示された異なる細胞系中にトランスフェクトした。標準化ルシフェラーゼ発現を測定し、異なるプラスミドの活性は、pRSV-GL3からの標準化発現に対して表される。棒グラフの上部の数字は、PSMプロモーター単独の構築物、pPSM1k-GL3からの発現と比較した活性の相対的増大を示す。
【図８】 図８は、他のプロモーターを有するPSMエンハンサー構築物を表す図である。マップは、PSMエンハンサー配列(En4、黒色の箱)、PSA（斜線の箱）、プロバシン（縦線の箱）及びチミジンキナーゼ（横線の箱）遺伝子由来のプロモーターの位置と隣接する制限酵素部位を示す。プロモーターの右側に対して、pCATSATベクターのCATレポーター遺伝子が存在する。制限部位は以下のものの略称である：B BamHI B2 BglII E EcoRI H HinDIII N NsiI P PstI S SalI Sm SmaI Sp SpeI X XbaI
【図９ａ】 図９ａは、前立腺細胞系における、PSM En4による異種プロモーターの相対的増大を示す図である。異なるプロモーター及びエンハンサー構築物を、前立腺細胞系内にトランスフェクトし、SAT発現に対して標準化されたCATレポーター遺伝子発現を測定した。活性は、pRSV-CATの標準化発現のパーセンテージとして表される。棒グラフの上部の数字は、それぞれのプロモーター単独の構築物由来の発現と比較した活性の相対的増大を示す。*は、比を測定できないほど発現レベルが低いことを示す。
【図９ｂ】 図９ｂは、非前立腺細胞系における、PSM En4による異種プロモーターの相対的増大を示す図である。異なるプロモーター及びエンハンサー構築物を、非前立腺細胞系内にトランスフェクトし、SAT発現に対して標準化されたCATレポーター遺伝子発現を測定した。活性は、pRSV-CATの標準化発現のパーセンテージとして表される。棒グラフの上部の数字は、それぞれのプロモーター単独の構築物由来の発現と比較した活性の相対的増大を示す。*は、比を測定できないほど発現レベルが低いことを示す。
【図１０】 図１０は、PSM En4による異種プロモーターの増大に対するアンドロゲンの効果を示す図である。グラフの下部に示される異なるエンハンサー／プロモーターの組み合わせを含むプラスミドを、アンドロゲンを除去するために炭で引っかかれた培地、または非代謝性アンドロゲン類似体R1881が0.28nMで加えられた同等な培地に維持されたLNCaP細胞内にトランスフェクトした。アンドロゲンの存在または不存在は、グラフの下部の(-または+)で示される。活性を測定し、図９に記載されたように表される。
【図１１】 図１１は、PSMEの331塩基類のコア領域の配列を示す図である（配列番号１）。
【図１２】 図１２は、ウイルス構築物OAV223、並びにOAV623(PSME及びプロバシンプロモーター)、OAV220(PSME及びRSVプロモーター)、及びOAV222(PSME及びCMVプロモーター)における、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)遺伝子発現の特異性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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