(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを生産できるアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子：
（ｉ）配列番号１に記載のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４；（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜１９５５からなる群より選択されるポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド、
（ｉｖ）（ａ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸３２〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、
（ｖ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下で、（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかの核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載の発現ベクターで形質転換されている組換え微生物。
【請求項４】
前記微生物が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａからなる群より選択される、請求項３記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記微生物が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ４０２５である、請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
（ａ）適切な培養培地中で請求項３記載の組換え微生物を培養し、そして（ｂ）前記培養培地からビタミンＣを回収および分離することを含む、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを生産する方法。
【請求項７】
（ａ）適切な培養培地中でＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＤＳＭ４０２５に属する微生物を培養し、ここで前記微生物中の配列番号２により示されるアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は破壊されており、そして（ｂ）前記培養培地から２−ＫＧＡを回収および分離することを含む、Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５から得られるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＮＤＨ）をコードする新規ＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、および前記発現ベクターを含む組換え微生物に関する。さらに、本発明は、組換えアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質を産生するプロセス、および、組換えアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質または前記発現ベクターを含む組換え微生物を使用することにより、Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）および／または２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＧＡ）を産生するプロセスに関する。
【０００２】
ビタミンＣはヒトにとって不可欠な栄養因子の１つであり、約６０年間の間、ライヒシュタインプロセスにより商業的に合成されてきた。家畜動物はビタミンＣを自身の体内で合成できるとしても、合成ビタミンＣはまた動物食餌中にも使用されている。ライヒシュタインプロセスは工業的ビタミンＣ産生において多くの有益な点を有するが、高いエネルギー消費量ならびにかなりの量の有機溶媒および無機溶媒の使用などの望ましくない問題を有する。それ故、過去数十年間かけて、酵素変換を使用してビタミンＣを製造するアプローチが数多く研究されており、このアプローチはより経済的かつ環境に優しいであろう。
【０００３】
本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離核酸分子に関する。
【０００４】
本明細書に使用したような「ＳＮＤＨ」はアルデヒドデヒドロゲナーゼを意味する。
【０００５】
本明細書に使用したような「核酸分子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み、特記しない限り、二本鎖核酸、一本鎖核酸、およびそのヌクレオシドを含む。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質ハイブリッド、ＲＮＡ−タンパク質ハイブリッド、およびＤＮＡ−タンパク質ハイブリッドなどのハイブリッドも含まれる。
【０００６】
本明細書に使用したような「変異」は、対象のヌクレオチド配列の１塩基対の変化、挿入、または欠失を意味する。
【０００７】
本明細書に使用したような「突然変異生成」は、変異がＤＮＡに生じるプロセスを意味する。「無作為」突然変異生成では、変異の正確な部位は予測不可能であり、微生物の染色体の何処でも起こり、突然変異は、照射または化学的処理などの要因により引き起こされる物理的傷害の結果としてもたらされる。
【０００８】
本明細書に使用したような「プロモーター」は、開始コドンの近くに位置する、遺伝子の５’領域として一般に記載されるＤＮＡ配列を意味する。隣接遺伝子（群）の転写は、プロモーター領域で開始する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して増加する。これに対し、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤により調節されない。
【０００９】
本明細書に使用したような「同一率」は、以下に例示したような配列解析プログラムにより、比較するヌクレオチドまたはアミノ酸配列における同一ヌクレオチドまたはアミノ酸と一致した、対象ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の比率を意味する。
【００１０】
本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜１９５５からなる群より選択されるポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離核酸分子を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸３２〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする単離核酸分子を提供することである。ＳＮＤＨ活性を有し、前記したアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸（群）の置換、欠失、挿入、または付加により前記したタンパク質から得られるタンパク質も含む。
【００１２】
本発明の別の態様としての機能的誘導体は、本発明のアミノ酸配列に基づいて、かかる配列の１つ以上のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失、および／または置換により定義され、このような誘導体は、当分野で既知のまたは本明細書で明記したアッセイにより測定したＳＮＤＨ活性を依然として有する。このような機能的誘導体は、当分野で既知の方法により本明細書に開示したようなＤＮＡ配列に基づいて、当分野で既知の化学的ペプチド合成により、または、組換え技術により作製できる。このような分子の活性を一般に変化させないタンパク質およびペプチド中のアミノ酸の交換は、当分野で既知である。
【００１３】
本発明の特定の実施形態において、対象の保存的置換は以下のように起こる：例として以下の置換、ＡｌａからＶａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、ＡｒｇからＬｙｓ／Ｇｌｎ／Ａｓｎ、ＡｓｎからＧｌｎ／Ｈｉｓ／Ｌｙｓ／Ａｒｇ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＰｒｏ／Ａｌａ、ＨｉｓからＡｓｎ／Ｇｌｎ／Ｌｙｓ／Ａｒｇ、ＩｌｅからＬｅｕ／Ｖａｌ／Ｍｅｔ／Ａｌａ／Ｐｈｅ／ｎｏｒＬｅｕ、ＬｙｓからＡｒｇ／Ｇｌｎ／Ａｓｎ、ＭｅｔからＬｅｕ／Ｐｈｅ／Ｉｌｅ、ＰｈｅからＬｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ａｌａ／Ｔｙｒ、ＰｒｏからＡｌａ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ／Ｐｈｅ、ＴｙｒからＴｒｐ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、およびＶａｌからＩｌｅ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｐｈｅ／Ａｌａ／ｎｏｒＬｅｕが妥当である。好ましい例として、ＡｌａからＶａｌ、ＡｒｇからＬｙｓ、ＡｓｎからＧｌｎ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＡｌａ、ＨｉｓからＡｒｇ、ＩｌｅからＬｅｕ、ＬｅｕからＩｌｅ、ＬｙｓからＡｒｇ、ＭｅｔからＬｅｕ、ＰｈｅからＬｅｕ、ＰｒｏからＡｌａ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ、ＴｙｒからＰｈｅ、およびＶａｌからＬｅｕが妥当である。このような置換により生物活性が変化した場合、より実質的な変化、前記した表示した例示的置換を導入し、産物をスクリーニングする。
【００１４】
さらに、本発明は、配列番号２として配列表に開示したようなＳＮＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、または、これらの配列、そのＤＮＡ配列またはその断片を含むもの、および、このような配列と標準的な条件下でハイブリダイズするが、正に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００１５】
従って、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供し、前記核酸分子の相補体は、前記したような核酸分子と標準的な条件下でハイブリダイズする。本発明の１つの態様は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供することであり、前記核酸分子は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ；（ii）（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜１９５５からなる群より選択されるポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ；および（iii）（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸３２〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子の相補鎖と標準的な条件下でハイブリダイズする。
【００１６】
ハイブリダイゼーションの「標準的条件」は、この脈絡では、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般に使用する条件、または好ましくはいわゆる当業者が使用するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を意味する。
【００１７】
従って、本明細書に使用したような「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列間に９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在した場合にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM  ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、および２％遮断剤（Roche Diagnostics GmbH）を含む溶液中で、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧラベリングシステムを使用することにより作製；Roche Diagnostics GmbH、68298 Mannheim、ドイツ）を使用して４２℃で一晩インキュベートし、その後、約６０℃で０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件である。
【００１８】
本発明はまた、前記したような核酸分子を含む組換えベクター、すなわち発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、適切な宿主細胞で機能するものである。本発明の核酸分子の発現に好ましいベクターは、ｐＱＥ、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＶＫ１００、およびＲＳＦ１０１０からなる群より選択されるベクターまたはその誘導体である。
【００１９】
本発明のヌクレオチド配列の発現に適切な宿主細胞は、細菌、酵母、および植物細胞からなる群より選択される組換え微生物である。好ましくは、微生物は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａからなる群より選択される。このような好ましい微生物の例はＥ．ｃｏｌｉである。より好ましい宿主細胞は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、最も好ましくはＧ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）に属し、これは１９８７年３月１７日、ブダペスト条約の条件下でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Braunschweig、ドイツに寄託された。
【００２０】
微生物「Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ」はまた、国際原核生物命名規約により定義されたような、同じ物理化学的特性を有するこのような種の同義語またはバソニム（basonyms）を含む。
【００２１】
従って、本発明は、前記したような発現ベクターで形質転換されるか、または、その染色体ＤＮＡに組み込まれた前記したような核酸分子を含む、組換え微生物に関する。
【００２２】
多種多様な宿主／ベクターの組合せを、本発明の二本鎖ヌクレオチド配列のクローニングに使用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉが好ましい宿主細胞であるので、Ｅ．ｃｏｌｉに通常使用される任意のベクターが本発明に有用である。このようなベクターには、Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質を発現できるｐＱＥベクター（QIAGEN K.K.、東京、日本）、ｐＵＣ１８およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア、米国）を含むｐＢＲ３２２またはその誘導体、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４およびその誘導体、および、ＲＫ２およびＲＳＦ１０１０などの広宿主域プラスミドから得られるベクターが含まれるがこれに限定されない。従って、本発明に使用する発現ベクターは、ｐＱＥ−プラスミド、ｐＵＣ−プラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、およびその誘導体プラスミド、および、ｐＶＫ１００およびＲＳＦ１０１０などの広宿主域プラスミドから得られる。
【００２３】
本明細書に使用したような「発現ベクター」は、適切な宿主への形質転換後に、クローニングベクター中にクローニングした遺伝子の発現を増強できるクローニングベクターを意味する。クローニングされた遺伝子は、プロモーター配列などの特定の制御配列の制御下（すなわちそれに作動可能に連結）に置かれる。プロモーター配列は構成性でも誘導性でもよい。
【００２４】
本明細書に使用したような「クローニングベクター」は、宿主細胞中で自律的に複製でき、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけられる、プラスミドもしくはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列を意味し、ここでの制限エンドヌクレアーゼ認識部位において、ベクターの本質的な生物学的機能が損なわれることなく決まった様式でこのようなＤＮＡ配列が切断され得、ここにＤＮＡ断片が導入されてその複製およびクローニングがなされ得る。クローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に使用するに適切なマーカーを含む。このようなマーカーは、例えば、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する。
【００２５】
本明細書に使用したような「組換えベクター」は、望ましいクローニングした遺伝子（群）を含む任意のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む。
【００２６】
本明細書に使用したような「発現」は、ポリペプチドが構造遺伝子から産生されるプロセスを意味する。このプロセスには、遺伝子からｍＲＮＡへの転写、および、このようなｍＲＮＡからポリペプチド（群）への翻訳が含まれる。
【００２７】
本明細書に使用したような「組換え微生物」は、発現ベクターまたはクローニングベクター上に望ましいクローニング遺伝子（群）を含む任意の原核細胞または真核細胞であり得る組換え宿主を含む。この用語はまた、前記微生物の染色体またはゲノムに望ましい遺伝子（群）を含むように遺伝子操作された原核細胞または真核細胞も含む。
【００２８】
本明細書に使用したような「宿主」は、複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターのレシピエントである任意の原核細胞または真核細胞を含む。「宿主」は、この用語が本明細書で使用されているように、その染色体またはゲノム上に望ましい遺伝子（群）を含むように公知の技術により遺伝子操作することのできる原核細胞または真核細胞も含む。かかる宿主の例は当業者には周知である。
【００２９】
組換えＤＮＡ、例えば組換えベクターを有する組換え微生物を作製するために、形質転換、形質導入、接合、または電気穿孔を含むがこれに限定されない種々の遺伝子導入法を使用できる。これらの方法は分子生物学の分野では公知である。慣用的な形質転換システムを、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａに使用できる。形質導入システムはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにも使用できる。接合システムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、およびＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒを含むグラム陽性およびグラム陰性細菌に広く使用できる。接合の例はＷＯ８９／０６，６８８号に開示されている。接合は、液体培地または固体表面上で起こり得る。ＳＮＤＨ産生のための適切なレシピエントの例には、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａの微生物が含まれる。接合用のレシピエントに、選択マーカー、例えばナリジクス酸またはリファンピシンに対する耐性を付加し得る。天然淘汰も使用でき、例えば、ポリミキシンＢに対する耐性は、多くのＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒに有用である。
【００３０】
本発明に有用である好ましいベクターは、広宿主域ベクター、例えばｐＶＫ１００およびその誘導体およびＲＳＦ１０１０のようなコスミドベクターである。ベクターのコピー数および安定性は、クローニングされた核酸分子の安定かつ効率的な発現のため、および、前記のクローニングした分子を有する宿主細胞の効率的な培養のために注意深く考慮すべきである。Ｔｎ５などの転位可能な要素を含む核酸分子を使用して、望ましいＤＮＡを、好ましい宿主に、特に染色体上に導入することもできる。好ましい宿主から単離した任意のＤＮＡを本発明のヌクレオチド配列と共に含む核酸分子も、本発明のヌクレオチド配列を、好ましい宿主細胞、特に染色体上に導入するのに有用である。このような核酸分子は、宿主細胞および核酸分子の性質を考慮しながら、当分野で公知である、例えば、形質転換、形質導入、接合、または電気穿孔などのいずれかの慣用的な方法を適用することにより、好ましい宿主に導入することができる。
【００３１】
本発明で提供されるＳＮＤＨ遺伝子を含むヌクレオチド配列を、当分野で公知の方法を用いて、前記した宿主細胞で作動可能なプロモーター、リボソーム結合部位、および転写ターミネーターなどの調節領域を含む適切なベクターに連結して、適切な発現ベクターを作製する。
【００３２】
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５から単離した望ましい遺伝子／ヌクレオチド配列を効率的に発現するために、種々のプロモーター、例えば遺伝子の元々のプロモーター、Ｔｎ５のカナマイシン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子のプロモーター、およびＥ．ｃｏｌｉ（ｌａｃ）のβ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−プロモーター、λファージのプロモーター、および、宿主細胞で機能的である任意のプロモーターを使用することができる。この目的では、宿主細胞は、細菌、酵母、および植物細胞からなる群より選択できる。好ましくは、宿主細胞は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する。
【００３３】
発現において、宿主細胞（これにコード配列を導入して本発明の組換え細胞を得る）で作動可能であるシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列（例えば、宿主細胞で作動可能である天然および合成配列を含むＡＧＧＡＧＧ）および転写ターミネーター（宿主細胞で作動可能である任意の天然および合成配列を含む逆方向反復構造）などの、他の調節要素を、前記のプロモーターと共に使用できる。
【００３４】
本発明のＳＮＤＨタンパク質のようにペリプラスム空間に位置するポリペプチドの発現では、通常１５〜５０アミノ酸残基を含み全体的に疎水性であるシグナルペプチドが好ましくは会合している。シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、望ましい宿主細胞で作動可能である任意の天然および合成配列から選択できる。配列番号２のアミノ酸残基１〜３１を含む推定シグナルペプチドはまた、本発明のＳＮＤＨ遺伝子により発現されるタンパク質にも見出された（配列番号４）。
【００３５】
特記しない限り、本明細書の精製ＳＮＤＨタンパク質をシークエンスすることにより決定された全てのアミノ酸配列は、自動アミノ酸シークエンサー（例えばモデル４７０Ａ、パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）を使用して決定した。
【００３６】
特記しない限り、本明細書のＤＮＡ分子をシークエンスすることにより決定された全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（例えばモデルＡＬＦエクスプレスＩＩ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を使用して決定し、本明細書で決定したＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、前記のように決定したＤＮＡ配列の翻訳により予測された。それ故、この自動アプローチにより決定された任意のＤＮＡ配列について当分野で既知であるように、本明細書で決定された任意のヌクレオチド配列はいくつかのエラーを含み得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、典型的には、シークエンスしたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当分野で公知のマニュアルＤＮＡシークエンス法を含む他のアプローチにより、より正確に決定することができる。これも当分野で既知であるように、実際の配列と比べて、決定されたヌクレオチド配列における１つの挿入または欠失により、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトが引き起こされ、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測アミノ酸配列は、このような挿入点または欠失点から始まって、シークエンスされたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるであろう。
【００３７】
本発明は、酵素（ＳＮＤＨ）をコードする単離核酸分子を提供する。単離核酸分子を操作するように設計された方法および技術は、当分野で公知である。核酸分子を、単離、精製およびクローニングする方法、ならびに、真核および原核宿主細胞の使用ならびにそこでの核酸およびタンパク質発現を記載した方法および技術は、当業者に既知である。
【００３８】
簡潔には、ＳＮＤＨ遺伝子、前記遺伝子を含むＤＮＡ分子、組換え発現ベクター、および本発明で使用する組換え微生物は、以下の工程により得ることができる：
（１）Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５から染色体ＤＮＡを単離し、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの適切な宿主細胞において染色体ＤＮＡを用いて遺伝子ライブラリーを作製し；
（２）コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、またはサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング、ウェスタンブロット解析または当分野で既知の他の技術により染色体ＤＮＡからＳＮＤＨ遺伝子をクローニングし；
（３）慣用的な方法により前記のようにして得られたＳＮＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列を決定して前記ＳＮＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ分子を選択し、ＳＮＤＨ遺伝子を効率的に発現できる組換え発現ベクターを作製し；
（４）宿主細胞にＤＮＡを導入する適切な方法、例えば形質転換、形質導入、接合および／または電気穿孔によりＳＮＤＨ遺伝子を有する組換え微生物を作製し、ここでの宿主細胞は、よって、本発明の組換え微生物となる。
【００３９】
本発明の前記態様に使用した物質および技術は、以下のように詳細に例示する。
【００４０】
全染色体ＤＮＡは、当分野で公知の手法により精製できる。望ましい遺伝子を、典型的には以下の例示的方法のいずれかにより、全染色体ＤＮＡから、プラスミドまたはファージベクターにクローニングできる：
（ｉ）部分的アミノ酸配列を、精製タンパク質またはそのペプチド断片から決定する。このような全タンパク質またはペプチド断片は、このような全タンパク質の単離により、または、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のゲルからのペプチダーゼ処理により調製できる。このようにして得られたタンパク質またはその断片を、アプライド・バイオシステムズ自動ガス相シークエンサー４７０Ａなどのタンパク質シークエンサーに適用する。アミノ酸配列を使用して、アプライド・バイオシステムズ自動ＤＮＡシークエンサー３８１ＡなどのＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを設計および調製できる。プローブは、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションを用いて、標的遺伝子を有する株の遺伝子ライブラリーから、標的遺伝子を有するクローンを単離するために使用できる。
（ii）または、遺伝子ライブラリーから標的タンパク質を発現するクローンを選択する目的で、標的タンパク質に対して調製した抗体を用いる免疫学的方法を適用できる。
（iii）標的遺伝子のＤＮＡ断片を、１セットのプライマー、すなわち、前記のように決定したアミノ酸配列に従って合成した２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法により、全染色体ＤＮＡから増幅できる。その後、標的全遺伝子を有するクローンを、プローブとして前記で得られたＰＣＲ産物を用いて、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションにより、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいて作製した遺伝子ライブラリーから単離できる。
【００４１】
当分野で既知の方法により本明細書に開示したＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーを使用することによりＰＣＲにより作製できるＤＮＡ配列もまた、本発明の目的である。
【００４２】
前記した抗体は、抗原としての、精製ＳＮＤＨタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるＨｉｓタグ化ＳＮＤＨなどの精製組換えＳＮＤＨタンパク質、またはそのペプチド断片を用いて調製できる。
【００４３】
一旦、望む遺伝子を有するクローンが得られると、標的遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ鎖終結法などの公知の方法により決定することができる。
【００４４】
本発明の遺伝子は、図２に示したような３１アミノ酸残基の推定シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜３１からなる配列番号４）と共に、５７８アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなる配列番号５）のＳＮＤＨ酵素をコードする。ヌクレオチド配列に関して、ＳＮＤＨ遺伝子のコード領域は、配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８７を包含し、推定シグナルペプチド（配列番号１のヌクレオチド２５８〜３５０）および終止コドン（配列番号１のヌクレオチド２０８５〜２０８７）のコード配列を含む。従って、終止コドンを含まないヌクレオチド配列は、配列番号１の２５８〜２０８４位のヌクレオチド配列であり、さらにシグナル配列を含まない場合にはヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４を包含する。
【００４５】
本発明に開示したような核酸分子は、２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣの産生のために組換え微生物において使用できる。Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａから選択される組換え微生物を、好気的条件下で適切な栄養を補充した水性培地中で培養し得る。培養は、４．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０のpHで実施し得る。培養期間は、使用するpH、温度および栄養培地により変更し、好ましくは１〜５日間である。培養を実施するに好ましい温度範囲は、約１３℃から約３６℃、好ましくは約１８℃から約３３℃である。培養培地が、同化可能な炭素源としてこのような栄養、例えば、グリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリトリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、およびスクロース、好ましくはＤ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、およびグリセロール；および、消化可能な窒素源、例えば有機物質、例えばペプトン、酵母抽出液、パン酵母、尿素、アミノ酸、およびコーンスティープリカーを含むことが通常必要である。種々の無機物質、例えば硝酸塩およびアンモニウム塩なども窒素源として使用し得る。さらに、培養培地は、通常、無機塩、例えば硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、および炭酸カルシウムを含む。培養は、ジャー発酵器、フラスコ、またはチューブなどの適切な装置中で実施する。組換え微生物は、前記のような核酸分子を含む発現ベクターで形質転換されているか、または、その染色体ＤＮＡに組み込まれた本発明の核酸分子を含む。
【００４６】
２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣの産生用の基質として使用する適切な糖化合物は、Ｌ−ソルボソンである。２−ＫＧＡおよびビタミンＣの代謝経路は、Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースを介してＬ−ソルボソンへと進行し、これはその後、２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣに変換される。従って、両方の産物の直接的な基質は、Ｌ−ソルボソンである。
【００４７】
従って、本発明の１つの態様は、（ａ）本発明で形質転換されているか、または、その染色体ＤＮＡに組み込まれた本発明の核酸分子を含む組換え微生物を、適切な培養培地中で増殖または培養し、（ｂ）前記の培養培地から２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣを回収および分離することを含む、Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡおよび／またはビタミンＣを産生するプロセスを提供することである。
【００４８】
１つの実施形態は、（ａ）適切な培養培地中で組換え微生物を繁殖し、ここで本発明の核酸分子は前記微生物に異種的に導入されており、（ｂ）前記培養培地からビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡを回収および分離することを含む、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣおよび／または２−ＫＧＡを産生するプロセスを提供することである。
【００４９】
本発明は、組換えＳＮＤＨを提供する。本発明により提供されるＳＮＤＨ遺伝子を、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５を含む宿主細胞に導入することにより、ＳＮＤＨ酵素の産生収率を向上することができる。また、本発明のＳＮＤＨ遺伝子を使用することにより、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＥｓｈｅｒｉｃｈｉａからなる群より選択される宿主細胞において、ＳＮＤＨタンパク質をより効率的に産生することができる。微生物は前記したように培養し得る。
【００５０】
培養後に微生物から組換えＳＮＤＨを単離および精製するための実施形態は、本明細書で以後に簡潔に記載している：細胞を、遠心分離またはろ過により液体培養ブロスから収集する。収集した細胞を、水、生理的食塩水、または適切なpHを有する緩衝溶液で洗浄する。洗浄した細胞を、緩衝溶液に懸濁し、ホモジナイザー、ソニケーター、もしくはフレンチプレスを用いて、または、リゾチームでの処理により破壊して、破壊細胞の溶液を得る。組換えＳＮＤＨを、破壊細胞の細胞非含有抽出液から、好ましくは微生物のサイトゾル画分から単離および精製する。組換えＳＮＤＨは、固相酵素反応のために固相担体上に固定できる。
【００５１】
本発明はさらに、（ａ）適切な培養培地中でＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＳＮ４０２５に属する微生物を培養し、ここで前記微生物中の配列番号２により示されるアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は破壊されており、（ｂ）前記培養培地から２−ＫＧＡを回収および分離することを含む、Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡを産生するプロセスに関する。破壊は、遺伝子中のどの場所でも起こり得、その結果、コードされている酵素は機能しない。
【００５２】
従って、（ａ）適切な培養培地中でＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＭＳ４０２５に属する微生物を繁殖することを含む、適切な糖化合物からＬ−ソルボソンを介して２−ＫＧＡを産生するプロセスを提供し、ここで前記微生物中のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は破壊されており、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド；（ii）（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜１９５５からなる群より選択されるポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド；および（iii）（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸３２〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されたポリヌクレオチドによりコードされている。得られた２−ＫＧＡは、前記培養培地からさらに回収され単離される。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、インビボならびにインビトロにおける、ＵＶ照射、または任意の変異試薬、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ＩＣＲ１７０、またはアクリジンオレンジなどによる化学的処理などの要因による古典的な変異誘発による、ＳＮＤＨ遺伝子の破壊のためのプロセスを提供する。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、インビボならびにインビトロにおける、トランスポゾン挿入またはＰＣＲによる部位特異的変異誘発などのＤＮＡ組換え技術により、ＳＮＤＨ遺伝子を破壊するプロセスを提供する。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、Ｌ−ソルボソン、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、およびＬ−ソルボースからなる群より選択される適切な基質、すなわち糖化合物からの発酵により、前記したような破壊物を使用して２−ＫＧＡを産生するプロセスを提供する。プロセスは、ジャー発酵器、フラスコ、またはチューブなどの適切な装置中で行なう。さらに、本発明は、バイオリアクターなどの適切な装置中で、適切な基質、例えばＬ−ソルボソン、Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボース、およびＤ−ソルビトールから、インキュベートにより、前記した破壊物の細胞非含有抽出液を使用して、２−ＫＧＡを産生するプロセスを提供する。
【００５６】
本発明は、組換えＳＮＤＨを提供する。さらに、（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド；（ii）（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜２０８４、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３５１〜１９５５からなる群より選択されるポリヌクレオチドに少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド；および（iii）（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸３２〜６０９からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸３２〜５６６からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を含む組換え微生物を培養し；ここで前記微生物は適切な培養培地中で培養し、（ｂ）前記アルデヒドデヒドロゲナーゼを前記培養培地から回収および分離することを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼの産生プロセスに関する。
【００５７】
実施例１：ＳＮＤＨのＮ末端からのアミノ酸シークエンス
ＳＮＤＨタンパク質のＮ末端７５kDaサブユニットの部分アミノ酸配列を決定した。７５kDaサブユニットからなる約１０μgのＳＤＳ処理精製ＳＮＤＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質バンドをＰＶＤＦメンブランにエレクトロブロットした。メンブラン上にブロットされたタンパク質を、消化緩衝液（１００mMリン酸カリウム緩衝液、５mMジチオトレイトール、１０mM  ＥＤＴＡ、pH８．０）に浸漬し、３０℃で２４時間、５．０４μgのピログルタメートアミノペプチダーゼ（シグマ、米国）と共にインキュベートした。インキュベート後、メンブランを脱イオン水で洗浄し、自動アミノ酸シークエンサー（ＡＢＩモデル４９０、パーキンエルマー社、コネチカット州、米国）を使用したＮ末端アミノ酸シークエンスにかけた。結果として、配列番号３で示したようなＮ末端アミノ酸配列の１４残基が得られた。
【００５８】
実施例２：ＰＣＲによる部分ＳＮＤＨ遺伝子のクローニング
部分ＳＮＤＨ遺伝子断片の増幅を、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の染色体ＤＮＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）ならびに縮重オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーのＰ１１（配列番号６）およびＰ１２（配列番号７）を用いてＰＣＲにより実施した。両方のプライマーが、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒコドン使用に偏りを有する縮重ＤＮＡ混合物であった。ＰＣＲは、熱安定ｔａｐポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＥｘＴａｐ（商標）、宝酒造株式会社、日本５２０−２１９３滋賀県大津瀬田３−４−１）を用いて、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００−Ｒ、ＰＥバイオシステムズ、８５０リンカーン・センター・ドライブ、フォスターシティ、ＣＡ９４４０４、米国）を使用して実施した。反応混合物（２５μl）は、２００μMのｄＮＴＰ、５０pmolの各プライマー（２４〜４８回縮重）、５ngの染色体ＤＮＡ、および業者から提供された緩衝液中の１．２５単位のＤＮＡポリメラーゼから構成されていた。反応は、９４℃で３０秒間の変性工程、３７℃で３０秒間のアニーリング工程、７０℃で１分間の合成工程を５サイクル、その後、９４℃で３０秒間の変性工程、５０℃で３０秒間のアニーリング工程、７０℃で１分間の合成工程を２５サイクルで実施した。結果として、４１bpのＤＮＡ断片が特異的に増幅され、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen、１６００ファラデイ・アベニュー・カールスバッド、カリフォルニア９２００８、米国）にクローニングし、組換えプラスミドｐＭＴＳＮ２を得た。成熟ＳＮＤＨタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列をコードするクローニングされた４１bpのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、ジデオキシ鎖終結法（F. Sangerら、Proc. Natl .Acad. Sci. USA、74、5463〜5467、1977）により確認した。
【００５９】
実施例３：ＳＮＤＨ遺伝子の完全クローニング
（１）Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５の遺伝子ライブラリーの作製
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＭＳ４０２５の染色体ＤＮＡを、４日間２７℃で、５％Ｄ−マンニトール、１．７５％コーンスティープリカー、５％パン酵母、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ＣａＣＯ３（実践用等級）、０．５％尿素、および２．０％寒天（pH７．０）を含むＭ寒天培地上で増殖させた細胞から調製した。染色体ＤＮＡ（４μg）を、２０μlの反応混合物中の４単位のＥｃｏＲＩで部分的に消化した。部分的に消化したＤＮＡ断片を含む試料の一部（８μl）を、１％アガロースゲルを使用して電気泳動により分離した。１５〜３５kbの範囲の断片を切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社、２８１５９アベニュー・スタンフォード、バレンシア、ＣＡ９１３５５、米国）を使用して化学的に融かして回収した。回収した目的のＤＮＡ断片を、Ｈ２Ｏ中に懸濁した。一方、２μgのコスミドベクターｐＶＫ１００を、ＥｃｏＲＩで完全に消化し、細菌アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉＣ７５）（宝酒造）での処理により５’末端を脱リン酸化した。処理したｐＶＫ１００（２２０ng）を、３６μlの反応混合物中において、ライゲーションキット（宝酒造）を使用して、１５〜３５kbのＥｃｏＲＩ断片（１μg）とライゲートした。エタノール沈降し適切な量のＴＥ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌpH８．０、１mM  ＥＤＴＡ）に溶かしておいたライゲートしたＤＮＡを、インビトロでのパッケージングに使用し（GigapackIII Gold Packaging Extract、Stratagene、１１０１１ノース・トーリー・パイン・ロード、ラ・ホーヤ、ＣＡ９２０３７、米国）、ゲノムライブラリーの宿主株であるＥ．ｃｏｌｉＶＣＳ２５７に感染させた。結果として、約２５kbの挿入ＤＮＡ断片を含む合計４００，０００〜６７０，０００個のクローンを得た。
【００６０】
（２）コロニーハイブリダイゼーションによるＳＮＤＨ遺伝子の完全クローニング
コロニーハイブリダイゼーション法により完全ＳＮＤＨ遺伝子を有するクローンを検出するための、前記したコスミドライブラリーのスクリーニングに使用するプローブを作製した。ＳＮＤＨのＮ末端アミノ酸配列をコードする４１bpＤＮＡ断片を増幅し、ＰＣＲ−ＤＩＧラベリング法（Roche Molecular Systems社、１１４５アトランティック・アベニュー、アラバマ、ＣＡ９４５０１、米国）により標識した。鋳型としてのプラスミドｐＭＴＳＮ２ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーＰ１３（配列番号８）およびＰ１４（配列番号９）を用いてのＰＣＲを、熱安定ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）、宝酒造株式会社）を用いて、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００−Ｒ、ＰＥバイオシステムズ）を使用して実施した。反応は、９４℃で３０秒間の変性工程、５５℃で３０秒間のアニーリング工程、７０℃で１分間の合成工程を２５サイクルで実施した。ＤＩＧ標識プローブを使用して、コロニーハイブリダイゼーションによるコスミドライブラリーのスクリーニング（約１０００クローン）および業者（Roche Molecular Systems Inc.、米国）により提供された方法に従っての化学ルミネセンス検出を実施した。結果として、３つの陽性クローンが単離され、その中の１つをｐＶＳＮ５と称し、これはｐＶＫ１００ベクター中に約２５kbの挿入断片ＤＮＡを有していた。これから、異なるサイズの２５kbＤＮＡ挿入断片をさらに、ｐＵＣ１８ベクター（図２）にサブクローニングした：（１）ＳＮＤＨ遺伝子の上流部分（Ｎ末端部分）を含む３．２kbのＥｃｏＲＩ断片によりｐＵＣＳＮ１９が得られ、（２）ＳＮＤＨ遺伝子の下流部分（Ｃ末端部分）を含む７．２kbＥｃｏＲＩ断片によりｐＵＣＳＮ５が得られ、（３）無傷または完全ＳＮＤＨ遺伝子を含む１．８kbＰｓｔＩ断片によりそれぞれｐＵＣＳＮＰ４およびｐＵＣＳＮＰ９が得られた。ｐＵＳＮＰ４およびｐＵＳＮＰ９における挿入断片は同じであるが逆の方向であることを注記する。
【００６１】
（３）ＳＮＤＨ遺伝子のヌクレオチドシークエンス
プラスミドｐＵＣＳＮ１９、ｐＵＣＳＮ５、およびｐＵＣＳＮＰ４を、ＳＮＤＨ遺伝子または遺伝子断片を含む領域のヌクレオチドシークエンスに使用した。決定されたヌクレオチド配列（３，４０８bpを有する配列番号１）により、ＳＮＤＨ遺伝子のＯＲＦ（１，８２７bp；配列番号１のヌクレオチド２５８〜２０８４）は、６０９アミノ酸残基（配列番号２）のポリペプチドをコードしていることが判明した。他のＯＰＦであるＯＲＦ−Ａは、図１に示したように、ＳＮＤＨ  ＯＲＦの下流に見られた。ＯＲＦ−Ａ（１，１０１bp；配列番号１のヌクレオチド２２１４〜３３１４）は３６７アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。
【００６２】
ＳＮＤＨ遺伝子のＯＲＦでは、シグナルペプチド様の配列（３１アミノ酸を有する配列番号４）が、（ｉ）多くの疎水性残基、（ii）Ｎ末端に近い正に荷電した残基、および（iii）シグナル配列の切断部位のためのＡｌａ−Ｘａａ−Ａｌａモチーフを含む、推定アミノ酸配列におそらく含まれている。ＳＮＤＨ遺伝子の推定リボソーム結合部位（シャインダルガーノ、ＳＤ、配列）は、開始コドンの６bp上流に位置していた（配列番号１のヌクレオチド位置２４７〜２５２のＡＧＧＡＧＡ）。さらに、ヘムｃ結合部位として定義されたモチーフ（Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ）は、配列番号２の位置５３０〜５３４に見出された。前記に示したような遺伝子解析から、ＳＮＤＨタンパク質はキノヘモタンパク質の１つであると考えられた。
【００６３】
ＧＣＧ（Genetics Computer Group、マディソン、ＷＩ、米国）のＦＡＳＴＡプログラムを使用したＳＮＤＨ遺伝子の相同性探索により、配列番号５のＡｒｇ２２７、Ａｓｎ２２８、Ｇｌｎ２３０、Ｇｌｙ２４６、およびＡｓｐ２５１が、Oubrieら［J.Mol.Biol.289: 319〜333(1999)］により記載のＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓＧＤＨ−Ｂタンパク質の推定活性部位におけるいくつかの高度に保存された残基に対応することが判明した。
【００６４】
実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳＮＤＨ遺伝子の発現
無傷の、すなわち完全なＳＮＤＨ遺伝子を有する８．０kbのＰｓｔＩ断片を含むプラスミドｐＵＣＳＮＰ４およびｐＵＣＳＮＰ９（図３）を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に形質転換し、ＳＮＤＨタンパク質の発現および活性を確認した。酵素活性として産生されるビタミンＣの量を、ＵＶ検出器（ＴＯＳＯＨ  ＵＶ８０００；Ｔｏｓｏｈ、日本）、デュアルポンプ（ＴＯＳＯＨ  ＣＣＰＥ；Ｔｏｓｏｈ）、積分器（島津Ｃ−Ｒ６Ａ；島津、日本）およびカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋポリアミン−ＩＩ；内径［ｉ．ｄ．］４．６mm×１５cm、ＹＭＣ、米国）から構成される高速液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ）により２６４nmの波長で測定した。
【００６５】
組換えＥ．ｃｏｌｉのサイトゾル画分を使用することによるＬ−ソルボソンからビタミンＣへの変換活性を試験した（表１）。細胞を、場合により１０μlのＰＱＱおよび１．０mMのＣａＣｌ２を補充したＬＢ培地中で培養した。サイトゾル画分を、５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）中での細胞非含有抽出液の超遠心分離（１００，０００×ｇ）４５分間）により調製した。反応混合物（１００μl）は、１２５μgの組換えＥ．ｃｏｌｉのサイトゾル画分、５０mMのＬ−ソルボソン、１．０mMのフェナジンメソスルフェート（ＰＭＳ）、場合に応じて、補因子として１．０μMのＰＱＱおよび１．０mMのＣａＣｌ２を添加したまたは添加しないものから構成された。酵素反応は、３０℃で３０分間実施した。１０μMのＰＱＱおよび１．０mMのＣａＣｌ２を含むＬＢ培地中で培養した細胞のホロ−ＳＮＤＨにより、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２の補因子を添加しない規定の反応条件下で、明確にビタミンＣが産生された。補因子の添加により、ｐＵＣＳＮＰ４およびｐＵＣＳＮＰ９で発現されたアポ−ＳＮＤＨは、ホロ酵素の活性とほぼ同じ活性を示した。
【００６６】
【表１】
0004528624.tif 000002
【００６７】
実施例５：Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓのＳＮＤＨ遺伝子破壊株の作製および培養
図４は、ＳＮＤＨ遺伝子標的化ベクター、ＧＯＭＴＲ１ＳＮ：：Ｋｍ（ＳＮＤＨ破壊物）の作製のスキームを示す。最初に、プラスミドｐＳＵＰＳＮを、プラスミドｐＵＣＳＮＰ４からのＳＮＤＨ遺伝子を含む８．０kbのＰｓｔＩ断片を、自殺ベクターｐＳＵＰ２０２とライゲートすることにより作製した（参照については、Simonet et., Abroad host range mobilization system for in vitro genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria、Biotechnology、1、784〜791、1983を参照のこと）。第二に、カナマイシン耐性遺伝子カセット（Ｋｍカセット）を、プラスミドｐＳＵＰＳＮにクローニングしたＳＮＤＨ遺伝子のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、プラスミドｐＳＵＰＳＮ：：Ｋｍ（ＫｍｒＴｃｒ）を得た。その後、プラスミドｐＳＵＰＳＮ：：Ｋｍを、リファンピシン（Rif）耐性で野生型Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５株から自発的に派生したＧＯＭＴＲ１に導入し、ＳＮＤＨ−ヌル変異体（ＫｍｒＲｉｆｒＴｃｓ）を得た。
【００６８】
ＧＯＭＴＲ１は、３０ｇ／ｌのトリプチカーゼソイブロス（ＢＢＬ；Becton Dickinson and Company、コッキーズビル、ＭＤ２１０３０、米国）および３ｇ／ｌの酵母抽出液（ディフコ；Becton Dickinson Microbiology Systems、Becton Dickinson and Company、スパークス、ＭＤ２１１５２、米国）と、１００μg／mlのリファンピシンからなる５０mlのＴブロスを含む２００mlのフラスコ中で３０℃で一晩培養した。Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）［D.H.Figurski、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、1648〜1652、1979］およびＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＵＰＳＮ：：Ｋｍ）を、５０μg／mlのカナマイシンを含む２mlのＬＢ培地を含む試験管中で３０℃で一晩培養した。ＧＯＭＴＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）、およびＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＳＵＰＳＮ：：Ｋｍ）の培養細胞を、遠心分離により別々に回収し、ＬＢ培地中の各細胞懸濁液を、それぞれ１０：１：１の比で混合した。その後、これらの細胞懸濁液を、同じ容量で混合し、Ｅ．ｃｏｌｉドナーからの自殺プラスミドの、レシピエントであるＧＯＭＴＲ１への接合導入のために、５．０％マンニトール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３、および２．０％寒天から構成される寒天培地上にのせた０．４５μｍニトロセルロースメンブラン（PROTRAN、Schleicher & SchuellGmbH、Postfach4、D-37582 Dassel、ドイツ）に混合物を蒔いた。２７℃で１日間培養した後、トランスコンジュガント（transconjugant）を含む細胞を懸濁し、Ｔブロスで適切に希釈し、１００μg／mlのリファンピシンおよび５０μg／mlのカナマイシンを含むスクリーニング寒天プレート上に蒔いた。最後に、Ｋｍカセットにより破壊されたＳＮＤＨ遺伝子を有するいくつかのトランスコンジュガント（ＫｍｒＲｉｆＴｃｓ）を得た。
【００６９】
ＧＯＭＴＲ１および破壊株ＧＯＭＴＲ１ＳＮ：：Ｋｍを、８．０％のＬ−ソルボース、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３、および２．０％寒天を含む寒天プレート上で２７℃で４日間増殖させた。白金棒でひとかきした細胞を、５００mlエーレンマイヤーフラスコ中の、４％のＤ−ソルビトール、０．４％酵母抽出液、０．０５％グリセロール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、０．１％尿素、および１．５％ＣａＣＯ３を含む５０mlの種培養培地（pH６．０）に接種し、３０℃で回転振とう機で１８０rpmで１日間培養した。このようにして調製した種培養液を、５００mlエーレンマイヤーフラスコ中の、１２．０％Ｌ−ソルボース、２．０％尿素、０．０５％グリセロール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０％コーンスティープリカー、０．４％酵母抽出液、および１．５％ＣａＣＯ３からなる５０mlの主培養培地への接種に使用した。培養は３０℃で１８０rpmで４日間行なった。活性アッセイは実施例４に記載のように実施した。酵素活性として産生される２−ＫＧＡの量は、ＵＶ検出器（ＴＯＳＯＨ  ＵＶ８０００；Ｔｏｓｏｈ）、デュアルポンプ（ＴＯＳＯＨ  ＣＣＰＥ；Ｔｏｓｏｈ）、積分器（島津Ｃ−Ｒ６Ａ；島津）およびカラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＰｒｏＣ１８、ＹＭＣ）で構成されるＨＰＬＣシステムにより３４０nmの波長で測定した。表２に示したように、ＳＮＤＨ遺伝子破壊株の２−ＫＧＡ産生効率は、親株のＧＯＭＴＲ１の効率より高かった。１モルのＬ−ソルボースあたりの２−ＫＧＡへの変換率の差は、約３％であった。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
実施例６：Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＭＳ４０２５のＳＮＤＨ遺伝子破壊株への、ＳＮＤＨ遺伝子を有するプラスミドの導入
広宿主域ベクターｐＶＫ１００を使用した数種類のＳＮＤＨ発現プラスミドを、図５に示したように作製した。このようなプラスミドは、以下のように記載したｐＶＫ１００のＨｉｎｄＩＩＩ部位において、異なる挿入断片ＤＮＡを有していた：ｐＶＳＮ１１７は、配列番号５のＧｌｙ５３５（配列番号２のアミノ酸残基５６６）で終結するポリペプチドをコードする不完全なＳＮＤＨ遺伝子、すなわち、僅か５５kDaのタンパク質を発現するＣ末端欠失ＳＮＤＨ遺伝子を含む、挿入断片ＤＮＡを有する。プラスミドｐＶＳＮ１０６およびｐＶＳＮ１１４は、それぞれ、完全なＳＮＤＨ遺伝子を含む挿入断片ＤＮＡを有していた。このようなプラスミドは、接合導入法によりＧＯＭＴＲ１ＳＮ：：Ｋｍ株に導入した。
【００７２】
図５に示したプラスミドを有するトランスコンジュガントを、１０．０％のＬ−ソルボース、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３、および２．０％寒天を含む寒天プレート上で２７℃で４日間増殖させた。酵素反応混合物は、組換えＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ株の細胞非含有抽出液８０μg、２５mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）、５０mMのＬ−ソルボソン、および０．０５mMのＰＭＳから構成された。酵素反応は、１，０００rpmで振とうしながら、３０℃で３０分間実施した。活性アッセイは、実施例４に従って実施した。結果を表３に示した。
【００７３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示した図である。ＳＮＤＨ遺伝子およびＯＲＦ−Ａ遺伝子の制限地図が示されており、ここでＯＲＦは、オープンリーディングフレームを意味し、シグナル配列は、ＳＮＤＨ遺伝子の推定シグナルペプチド配列を意味する。
【図２】コスミドｐＶＳＮ５にクローニングしたＳＮＤＨおよびＯＲＦ−Ａ遺伝子の制限地図、ならびに、ｐＵＣプラスミド、ｐＵＣＳＮＰ４、ｐＵＣＳＮＰ９、ｐＵＣＳＮ１９、およびｐＵＣＳＮ５への異なるサイズの挿入断片ＤＮＡのクローニングを示した図である。ｐＶＳＮ５の物理的地図において、灰色の矢印は、ＳＮＤＨ遺伝子を示す。
【図３】ｐＶＳＮ５からの無傷ＳＮＤＨ遺伝子を含む８．０kbのＰｓｔＩ断片を、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングする戦略を示し、その結果、ｐＵＣＳＮＰ４およびｐＵＣＳＮＰ９が得られる。ｐＵＣＳＮＰ４およびｐＵＣＳＮＰ９は、挿入断片の方向を除いては同一であることを注記する。
【図４】カナマイシンカセット（Ｋｍ）を用いて破壊したＳＮＤＨ遺伝子を有する自殺ベクタープラスミドを使用することによる、ＧＯＭＴＲ１ＳＮ：：Ｋｍ（ＳＮＤＨ破壊株）の作製を示した図である。対応する領域における、ベクタープラスミドと、親株であるＧＯＭＴＲ１の染色体ＤＮＡとの間の相同的組換えにより、破壊株が得られる。「Ｇ．Ｏ．」は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓを意味する。
【図５】ｐＶＳＮ１１７、ｐＶＳＮ１０６、およびｐＶＳＮ１１４の挿入断片ＤＮＡの物理的地図を示した図である。プラスミドｐＶＳＮ１１７は、Ｃ末端欠失ＳＮＤＨ遺伝子をコードする挿入断片ＤＮＡを有し（配列番号１のヌクレオチド２５８〜１９５５；すなわち、配列番号２のアミノ酸１〜５６６）、これは僅か５５kDaのタンパク質を発現する。プラスミドｐＶＳＮ１０６およびｐＶＳＮ１１４は、無傷ＳＮＤＨ遺伝子をコードする挿入断片ＤＮＡを有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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