(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性バラス化ｐＨ指示薬を提供する親水性高分子量物質に化学的に結合したｐＨ指示薬を含む、成長中の微生物用の培地を含む、微生物を検出して計数するための、成長中の微生物用の培地が水和した成長維持用栄養物ゲルを形成しうる培地。
【請求項２】
前記ｐＨ指示薬が、モノアゾ色素；ポリアゾ色素；アミノ−、ヒドロキシ−、およびアミノヒドロキシ−アリールメタン（ジ−およびトリ−アリールメタン）；変性フェノールフタレイン；変性スルホンフタレイン；アントロキノン類；キサンテン類；多環式芳香族；およびナフトフルオレセインからなる群から選択されるｐＨ指示薬である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記ｐＨ指示薬が、２−（２，４−ジニトロフェニルアゾ）−６−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホニル−オキシ−エチルスルホニル）アミド］−ｌ−ナフトール−３−スルホン酸を含む、請求項１に記載の培地。
【請求項４】
前記ｐＨ指示薬が、カルボキシフェノールレッドを含む、請求項１に記載の培地。
【請求項５】
前記親水性高分子量物質が、セルロース、変性セルロース、ポリビニルアルコール、デキストラン類、アミノ変性デキストラン、変性グアーガム、グアーガム類、キサンテンガム、およびローカストビーンガムからなる群から選択される、請求項１に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、サンプル中の微生物を検出して計数するための培地、装置および方法に関し、特に、バラス化ｐＨ指示薬を使用した、装置および方法に関する。
【０００２】
ｐＨ指示薬を使用して微生物の成長を検出する方法は、知られてから久しい。微生物の存在は、通常、指示薬と、成長中の微生物によって産生される酸との反応によって生じる、成長中の微生物コロニーを取り巻く帯域におけるｐＨ指示薬の目に見える色または蛍光の変化によって検出される。
【０００３】
ｐＨ指示薬を使用するときの共通の問題は、成長中の微生物が酸を産生し続けるにつれて、有色指示薬帯域または蛍光性指示薬帯域はサイズが増大し、周囲の隣接コロニーの指示薬帯域と合流してオーバーラップし始めることである。一般に１８〜２４時間のインキュベーション期間後、近隣の指示薬帯域は、一般に、一緒になって拡散し、その結果、個々のコロニーに対応する個々の指示薬帯域を区別して計数することが困難になる。
【０００４】
非常に高い濃度でｐＨ指示薬を使用することによって、細菌の成長に悪影響を及ぼさずに、培地中の腸内細菌を検出する時間が短縮されることが最近明らかにされた。しかし、検出時間が短縮されても、コロニーが多数であるため、インキュベーション期間中に、指示薬帯域はサイズが増大し、一緒になって拡散するため、観察者は、酸を産生するコロニーと、酸を産生しないコロニーとを区別できない。
【０００５】
ｐＨ指示薬を選択するときの別の潜在的な問題は、優れた指示特性および／またはスペクトル特性を示す幾つかの指示薬は、微生物学的成長に有毒であるということである。
【０００６】
ｐＨ指示薬を使用するとき、指示薬帯域の広がりを限定する、従来技術の欠陥を克服する培地が、当技術分野で必要性である。特に、ｐＨ指示薬を使用するとき、指示薬帯域の広がりを抑制する、培地、装置およびその使用方法が必要である。
【０００７】
本発明の一態様において、培地は、成長中の微生物に適した培地、および少なくとも１つのバラス化ｐＨ指示薬を含む。培地は、標的微生物用の成長栄養分を有するか、あるいは、使用するための成長栄養分を加えてもよい。培地は、冷水可溶性粉末であると好ましい。潜在的に、通常は微生物学的成長に有毒な幾つかの指示薬を含め、様々なｐＨ指示薬を本発明で使用することができる。指示薬としては、モノアゾ色素；ポリアゾ色素；ジアリールメタンおよびトリ−アリールメタンを含む、アミノアリールメタン、ヒドロキシアリールメタン、およびアミノヒドロキシアリールメタン；変性フェノールフタレイン；変性スルホンフタレイン；アントロキノン類；キサンテン類；多環芳香族化合物；およびナフトフルオレセイン類などがある。好ましいバラスとしては、セルロース；変性セルロース；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；デキストラン類；アミノ変性デキストラン類；グアーガム；変性グアーガム；キサンテンガム；ローカストビーンガム；およびその他のポリ炭水化物ガムからなる群から選択される高分子量などがある。
【０００８】
本発明の別の態様において、微生物を検出し且つ／または計数するための装置は、上述の培地を含む。好ましい装置は、自立した防水基材、任意のフォームスペーサー、およびカバーを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の態様において、サンプル中の微生物を検出して計数する方法は、微生物を含むと考えられるサンプルを、バラス化ｐＨ指示薬を含む培地に加えるステップと、培地の存在下で微生物を成長させるステップと、培地中のバラス化ｐＨ指示薬の色または蛍光の変化を検出するステップとを含む。
【００１０】
本発明は、有色指示薬帯域または蛍光性指示薬帯域が培地全体に広がるのを抑制することによって、従来技術の欠陥を克服する。有色指示薬帯域または蛍光性指示薬帯域の抑制は、ｐＨ指示薬をバラスに結合させることによって達成される。意外なことに、これらのバラス化ｐＨ指示薬は、培地中でのコロニーの酸産生能に悪影響を及ぼさずに、培地中の指示薬帯域の広がりを抑制する。結果として、近隣の指示薬帯域の合併が減少するか排除され、長時間インキュベートした後でも、個々の指示薬帯域の識別を向上させることが可能である。
【００１１】
本発明は、通常であれば、微生物学的成長に有毒と考えられるｐＨ指示薬の使用を可能にすることができる培地、装置および方法も提供する。ｐＨ指示薬をバラス化することによって、指示薬は、微生物に対して毒性を示さない可能性がある。
【００１２】
本発明は、サンプル中の微生物を検出して計数するために使用することが可能な培地、装置および方法を提供する。様々な製品および方法を使用してサンプル中の微生物を検出して計数することができるが、本発明の培地、装置および方法は、バラス化ｐＨ指示薬を使用することによって、微生物のこのような検出および計数を大いに簡素化する。本培地、装置、および方法は、結果の迅速な判定を可能にするばかりでなく、長時間インキュベートした後でも不連続の指示薬帯域を維持する。
【００１３】
さらに、本発明は、所望のスペクトル特性およびｐＨ指示特性を有するが微生物に有毒な、ｐＨ指示薬の使用を可能にすることができる。これらの指示薬をバラス化することにより、指示薬が微生物細胞に入るのを防止し、その結果、活性または細胞死を減少させることによって、このような毒性を低下または排除することができる。
【００１４】
本発明の場合、「バラス」（ｂａｌｌａｓｔ）は、ｐＨ指示薬に化学結合するが、ｐＨ指示薬の機能を実質的に損なわない高分子量物質を意味する。「バラス化ｐＨ指示薬」は、バラスが化学結合したｐＨ指示薬を意味する。「バラス化する」ことは、バラスをｐＨ指示薬に結合させることを意味する。「指示薬帯域」は、一般に、成長中の微生物コロニーを取り囲む円形領域を意味し、コロニーにより産生される酸とｐＨ指示薬の反応ため、周囲の培地と異なる色または蛍光を有する。培地全体にわたる指示薬の拡散または広がりを制限するほど、生じる「指示薬帯域」は小さい。従って、指示薬帯域は、一般に、外観が培地の残部と視覚的に異なる。
【００１５】
本発明は、バラス化ｐＨ指示薬を含む培地を含む。様々な培地が、本発明で使用するのに適する。本培地は、標的微生物に応じて、様々な栄養分を含むか、あるいは栄養分が添加されている。代表的な培地は、炭水化物等の炭素源、アミノ酸またはタンパク質加水分解物等の窒素源、および微量栄養素を含む。培地は、少なくとも１種のゲル化剤も含んでもよい。好ましい培地は、米国特許第５，２３２，８３８号に記載されているような、冷水可溶性粉末である。
【００１６】
本発明のバラスは、高分子量物質であることが好ましい。これらの物質は、ｐＨ指示薬に結合することができる。バラスは、親水性であり、高分子量を有し、且つ少なくとも１つの反応性官能基、たとえば、ｐＨ指示薬に化学結合するヒドロキシル基、カルボキシル基、またはアミノ基を有することが好ましい。バラスの分子量は、約５，０００より大きいことが好ましく、分子量は、約４０，０００より大きいことがさらに好ましい。本発明で有用な適当なバラスとしては、セルロース、変性セルロース；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、デキストラン類、アミノ変性デキストラン類、変性グアーガム、グアーガム類、キサンテンガム類、ローカストビーンガムなどがあり、ポリビニルアルコールおよび変性デキストラン類は、ｐＨ指示薬と反応しやすいため、好ましい。さらに、これらのバラスを含むバラス化ｐＨ指示薬は、様々な培地に組込むことが比較的容易である。
【００１７】
様々なｐＨ指示薬を本発明で使用することが可能である。適当な指示薬は、培地の酸レベルが変化するにつれて、色を変えるかあるいは蛍光を変える。微生物コロニーが成長すると、コロニーは酸を産生し、これがｐＨ指示薬と反応して、培地の残部と異なる色または蛍光である指示薬帯域を、コロニー周囲に生じる。たとえば、指示薬カルボキシフェノールレッドを使用して、一般に、酸レベルが上昇すると黄色に変化する、赤色の培地を作る。色を変えるバラス化ｐＨ指示薬に加えて、蛍光が変化するバラス化ｐＨ指示薬も、本発明の培地、装置、および方法で、使用することが可能である。かかるバラス化ｐＨ指示薬の場合、指示薬帯域は高レベルの酸の存在下で蛍光を発するが、高レベルの酸と接していない培地は蛍光を発しない。
【００１８】
本発明で有用な適当なｐＨ指示薬または酸−塩基指示薬としては、一般に、モノアゾ色素；ポリアゾ色素；アミノ−、ヒドロキシ−、およびアミノヒドロキシ−アリールメタン（ジアリールメタンおよびトリアリールメタン）；変性フェノールフタレインおよびスルホンフタレイン；アントロキノン類；キサンテン類；多環式芳香族；およびナフトフルオレセインとして分類される指示薬などがある。好ましいｐＨ指示薬としては、変性フェノールフタレインおよびスルホンフタレイン、ナフトフルオレセイン類、およびモノアゾ色素類などがある。列挙した部類の代表的な色素としては、カルボキシフェノールレッドおよびアミノフェノールレッド（両者とも、変性スルホンフタレインである）；メチルレッド、エチルレッドおよび２−（２，４−ジニトロフェニルアゾ）−６−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホニル−オキシ−エチルスルホニル）アミド］−１−ナフトール−３−スルホン酸（「ＤＮＳＡ」）（全て、モノアゾ色素である）；およびカルボキシＳＮＡＲＦＴＭおよびカルボキシＳＮＡＦＬＴＭ（両者とも、ナフトフルオレセインである）などがある。ＤＮＳＡ指示薬は、米国特許第４，０２９，５９８号（Ｎｅｉｓｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．）に記載の通りに調製することができ、カルボキシＳＮＡＲＦＴＭおよびカルボキシＳＮＡＦＬＴＭは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手できる。特に好ましい色素は、カルボキシフェノールレッド、カルボキシクロロフェノールレッド、アミノフェノールレッド、アミノクロロフェノールレッド、カルボキシＳＮＡＲＦＴＭ、カルボキシＳＮＡＦＬＴＭ、およびＤＮＳＡである。方法は、適当な官能基を後続の高分子量へのバラス共有結合に利用できるように、指示薬色素を適切に変性することで知られる。たとえば、公開された欧州特許出願第０５１９１９８Ａ２号（Ｒｏｂｏｔｔｉ）には、様々なフタレイン型ｐＨ指示薬色素のこのような変性方法が開示されている。
【００１９】
一般に、所望の微生物に望ましいｐＨ範囲で色または蛍光を変化させ、指示薬の酸−塩基反応化学に関与しない１個以上の反応基を有する任意のｐＨ指示薬を使用して、指示薬を高分子量バラスに結合することが可能である。ｐＨ指示薬は、指示薬のｐＫａを実質的に不利に変化させずに、バラスに共有結合することが好ましい。
【００２０】
本発明の特に好ましいｐＨ指示薬とバラスとの組合せとしては、反応および培地への組込みが容易なため、ポリビニルアルコールに結合したＤＮＳＡ指示薬、およびおよそ４０，０００以上の分子量のアミノ変性デキストランに結合したカルボキシフェノールレッドなどが挙げられる。
【００２１】
ｐＨ指示薬をバラスに結合する助剤として、カップリング剤を使用してもよい。たとえば、カップリング剤ＥＤＣ［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩］およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物）は、カルボキシフェノールレッドのカルボキシル基を、アミノ変性デキストランのアミノ基に共有結合するのを助けることができる。このようなカップリング剤の使用は、Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈによる“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２，ｐｐ．４２０−４２１に記載されている。
【００２２】
本発明のバラス化ｐＨ指示薬は、指示薬帯域を培地全体にわたって制限または限定する。指示薬帯域の広がりを抑制することにより、一緒になって拡散する可能性が低く、従って、互いに容易に区別することができる、小さいまたはより不連続の指示薬帯域を生じる。指示薬帯域の広がりが少ないことは、成長中の微生物コロニーの、より簡単で且つより正確な検出および計数につながる。比較的多数の酸産生コロニーが存在する場合、指示薬帯域の広がりは特に問題である。バラス化ｐＨ指示薬は、混合サンプル中の酸産生コロニーと酸を産生しないコロニーとをより正確に区別するのにも有用な可能性がある。
【００２３】
本発明のバラス化ｐＨ指示薬は、成長中の微生物コロニーに対するｐＨ指示薬の毒性を低下または排除することもできる。この毒性低下は、バラス化ｐＨ指示薬が、微生物細胞内に浸透できないことに起因する。ｐＨ指示薬は、幾つかの理由で、たとえば、サイズや電荷等のため、細胞膜を横切ることができないと考えられる。このように、ｐＨ指示薬を分子にバラス化することにより、ｐＨ指示薬が微生物細胞に入って、細胞活性の低下または細胞死を引き起こすのを防止することが可能である。
【００２４】
多くの装置が本発明での使用に適する。上述の培地を組込み、微生物の検出および／または計数に使用することができる任意の装置を使用することができる。図１に、本発明の好ましい装置を図解する。図１に関連して、薄膜培養装置について記述する。薄膜培養装置は、米国特許第４，５６５，３８３号、第５，０８９，４１３号および第５，２３２，８３８号に既に記載されている。
【００２５】
引き続き図１を参照して、薄膜培養装置１０は、自立した、実質的に防水性の基材１２を有する母材を含む。基材１２は、実質的に水を吸収しない、ポリエステル、ポリプロピレン、またはポリスチレン等の防水性材料で作られた比較的堅い材料であることが好ましい。その他の適当な防水性材料としては、防水性ポリエチレン塗料を含む紙等の物質等がある。
【００２６】
基材１２の表面を、培地１４の層で被覆し、次いで、これを乾燥させて、基材１２上に乾燥培地を提供する。あるいは、粉末として使用することが可能な培地を保持するのに役立つ接着剤（表示せず）の層を基材１２上に塗布してもよい。接着剤は、塗布された基材を通して、基材の表面上で成長中の細菌コロニーを見ることができるように、水和したときに十分に透明であることが好ましい。接着剤は、培地を接着剤中に完全に包埋せずに、基材を実質的に一様に乾燥培地で被覆することができる厚さで基材上に塗布される。
【００２７】
本発明の液体培地を乾燥形態でまたは乾燥粉末として使用するのであれば、試薬、栄養物、ガムおよびバラス化ｐＨ指示薬を液体として基材に加え、次いで、乾燥させる。本発明の培地は、液体中の水が本質的に全部蒸発するまで、液体培地を約１００℃の炉内で加熱することによって、容易に乾燥させることができる。しかし、水が蒸発した後、培地を加熱すると、培地が分解し始める可能性がある。
【００２８】
フォーム内に開口部を有する任意のフォームスペーサー１６を、基材１２の培地被覆面に接着させる。基材１２の外縁を実質的に覆うフォームスペーサーは、サンプルが接種される領域を画定し、サンプルを基材から予防するのに役立つ。代替実施形態では、装置はフォーム層を含まなくてもよく、サンプルの量は、培地のみの成分によって、基材上に収容される。
【００２９】
カバー２０をフォームスペーサー１６の上面の一辺に接着させてもよい。図１は、基材上に存在する細菌コロニーの計数を容易にするために、透明のフィルムまたはシート材料で作製されることが好ましいカバーシート２０を示す。さらに、カバーシート２０は、成分が汚染および劣化するリスクを回避するために、細菌および水蒸気を通さないことが好ましい。カバーシート２０として使用するのに好ましい材料は、二軸延伸ポリプロピレンである。カバーシートは、補足的なガムおよび塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）等の第２の指示薬で任意に被覆されている。
【００３０】
本発明の方法では、サンプルを上述の培地に加える。好ましい実施形態では、サンプルを、本発明の培地を含む、図１に図解されている装置等の装置に加える。接種材料を、基材１２全体に広げることができ、カバーを基材１２上に置くことができる。接種材料を広げる方法は、接種材料をカバーに沿って移動させて広げるための加重道具の使用を含む。乾燥培地の場合、接種材料が基材１２と接触して基材１２上に広がるにつれて、培地は水和して成長維持用栄養物ゲルを形成する。次いで接種された装置を予め決定された時間インキュベートし、その後、基材上で成長中のコロニーまたは微生物の数を計数することができる。
【００３１】
バラス化ｐＨ指示薬を含む培地を薄膜装置上に使用することについて上述したが、当業者は、バラス化ｐＨ指示薬を含む培地を、当技術分野で周知の他の培養装置で使用できることが分かるであろう。たとえば、この培地を、ブロスとして使用して、懸濁液中で細菌を成長させるのに使用してもよく、あるいは、この培地を使用して、寒天プレート上で細菌を成長させてもよい。
【００３２】
実施例
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。特に指示がなければ、全ての部およびパーセンテージは重量基準である。
【００３３】
実施例１
バラス化ｐＨ指示薬の調製
（ＤＮＳＡ指示薬−ポリビニルアルコール）
ポリビニルアルコール（１００ｇ、分子量３１，０００〜５０，０００、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を、約８０℃にて攪拌することにより、脱イオン水（８００ｍｌ）に溶解した。別のビーカー内で、ＤＮＳＡｐＨ指示薬［２−（２，４−ジニトロフェニルアゾ）−６−（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホニル−オキシ−エチルスルホニル）アミド）−ｌ−ナフトール−３−スルホン酸］（２ｇ、３．１ミリモル、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、米国特許第４，０２９，５９８号に記載）およびＮａ２ＣＯ３（３２ｇ、３００ミリモル、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を、室温で攪拌することにより、脱イオン水（１５０ｍｌ）に溶解した。３２％ＮａＯＨ水溶液（２０ｍｌ）をポリビニルアルコール溶液に加え、マグネティック攪拌用プレート上で攪拌することによって混合した。次いで、このＤＮＳＡ溶液を、２ｍｌアリコートで加え、アリコートとポリビニルアルコール溶液との完全な混合を待った。この溶液を室温で６時間攪拌した。得られたＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールを、プロペラ式オーバーヘッドスターブレードで激しく攪拌しながら、反応混合物２５０ｍｌをメタノール２リットルに滴加することによって、４つのバッチ内で沈澱させた。この混合物を、８０メッシュのワイヤースクリーン上に注ぐことにより、沈澱したポリマーを単離した。次いで、もはや青色が溶出しなくなるまで、この沈澱物をメタノール（１回の洗浄当たりおよそ５００ｍｌ）で３回洗浄した。メタノール洗浄に続いて、エーテル（１回の洗浄当たりおよそ５００ｍｌ）で３回洗浄した。次いで、洗浄したポリマーを、大きい蓋のないホイルパン（ｆｏｉｌ  ｐａｎ）内で一晩風乾した。
【００３４】
次いで、乾燥したポリマーを、約８０℃で攪拌することによって脱イオン水（８００ｍｌ）に溶解し、上記の通りに、再度沈澱させ、洗浄した。洗浄したポリマーを一晩風乾し、続いて室温にて真空下で乾燥させた。回収されたＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールバラス化ｐＨ指示薬の質量は８０ｇであった。
【００３５】
比較用に、溶剤としての５０％（ｖ／ｖ）エタノール中で反応を実行したこと以外は正確に同じ方式で、ＤＮＳＡ−エタノールのサンプルを調製した。
【００３６】
実施例２
ポリビニルアルコールに結合されるＤＮＳＡ指示薬の量
この実施例の目的は、実施例１で調製したＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールバラス化ｐＨ指示薬に結合したＤＮＳＡ指示薬の量を決定することであった。
【００３７】
０．ｌＭ  ＮａＯＨ水溶液でのＤＮＳＡ  ｐＨ指示薬の吸光係数は、最高吸光度の波長である５８９ナノメートル（ｎｍ）にて２３，２２０リットル／ｍｏｌであると、分光光度法で決定された。
【００３８】
この吸光係数を使用して、ＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液中のＤＮＳＡ指示薬の量を決定した。溶液中の遊離ＤＮＳＡと溶液中のバラス化した  ＤＮＳＡの可視スペクトルは全く同じであり、そこで、結合したＤＮＳＡの吸光係数は、溶液中のＤＮＳＡと同じであるという仮説を立てた。バラス化した  ＤＮＳＡの溶液の５８９ｎｍにおける吸光度を、既知濃度のＤＮＳＡの溶液と比較することによって、ポリビニルアルコールに結合したＤＮＳＡの量は、ポリビニルアルコールｇ当たりおよそ５ｍｇのＤＮＳＡであると決定された。従って、理論上、上記手順で使用されるポリビニルアルコール１００ｇにつき、ＤＮＳＡ  ５００ｍｇがポリビニルアルコールに結合される。
【００３９】
実施例３
ＤＮＳＡ指示薬−ポリビニルアルコールを含む、薄膜乾燥培養装置の作製
実施例１で調製したＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールバラス化ｐＨ指示薬（６ｇ）を、８０〜９０℃にて３０分間攪拌することにより、脱イオン水（１００ｍｌ）に溶解した。生じた暗青色溶液を室温まで冷却し、次いで、栄養分および胆汁塩を加えて、ＥＢ培地（ＥＢ培地は、指示薬色素を含まず、ラクトースの代わりに使用された５％グルコースを含む、Ｄｉｆｃｏ  ＶＲＢＡと同じである；１９８４年Ｄｉｆｃｏ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩのｐ．１０５３参照）を作った。次いで、この混合物を５０℃に温め、Ｍ１５０グアーガム（１ｇ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ，Ｋｒｅｕｚｌｉｎｇｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を加えた。このようにして得られた温かい粘性混合物を、７ミルのポリエステル基質フィルム（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上に２０ミルの厚さで塗布し、次いで、約１４３℃にて２０分間、乾燥させた。次いで、グアーガムを塗布したポリプロピレンカバーシートおよび米国特許第５，７２３，３０８号の実施例１に記載のＳｔｙｒｏｆｏａｍスペーサーで、ＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールバラス化ｐＨ指示薬を含む薄膜培養装置を構築した。等モル量のＤＮＳＡ指示薬のみまたはＤＮＳＡ−エタノール指示薬（実施例１から）のいずれかを、ＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールバラス化ｐＨ指示薬の代わりに使用したこと以外は同じ方式で、比較用装置を作製した。ＤＮＳＡ指示薬および実施例２に記載のその付加物に対して同じ吸光係数を仮定し、５８９ｎｍの波長における光学濃度測定によって、これらの指示薬の相対量を決定した。
【００４０】
実施例４
細菌成長の検出
米国特許第５，７２３，３０８号の実施例１に記載の手順に従って、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌ４９（ＡＴＣＣ５５５３５）およびＣ１（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）の両者を、実施例３に記載の薄膜培養装置上で、３７℃にて２４時間成長させた。結果として生じた有色帯域の直径を測定し、ＤＮＳＡ−ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）バラス化ｐＨ指示薬を含む装置で得られた結果を、遊離ＤＮＳＡ指示薬またはＤＮＳＡ−エタノール指示薬のいずれかを含む装置で得られた結果と比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ  １４９およびＣ１細菌種は、非常に低い酸産生（Ｃ１）から非常に高い酸産生（Ｅ．ｃｏｌｉ  １４９）までの全範囲の酸産生細菌を含むため、これらを選択した。
【００４１】
結果を表１に示す。これらの結果から、ｐＫａ変化およびＤＮＳＡｐＨ指示薬のバラス化の変化に原因があると考えられる有色帯域直径の差がわかる。従って、遊離ＤＮＳＡ指示薬（ｐＫａ＝７．６）装置からＤＮＳＡ−エタノール（ｐＫａ＝６．９）装置に変えることによって、有色帯域直径が有意に減少した。ＤＮＳＡ−エタノール（ｐＫａ＝６．９）装置からＤＮＳＡ−ポリビニルアルコール（ｐＫａ＝６．９）装置に変えることによって、有色帯域直径はさらに有意に減少した。後者の結果は、エタノール等の低分子量化合物を使用するのに対して、ポリビニルアルコール等の高分子量バラスを使用することによる、有色帯域直径を減少させる効果を明らかに示すものである。ＤＮＳＡ−ポリビニルアルコールを含む薄膜培養装置を使用すると、有色帯域直径が減少し、インキュベーション期間中に一緒になって拡散する可能性が低くなると考えられるため、成長中の細菌からの有色帯域を検出するのに役立つことが、結果から示唆される。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
実施例５
バラス化ｐＨ指示薬の作製
（アミノ変性デキストランに結合したカルボキシフェノールレッドｐＨ指示薬）  下記の手順を使用して、カルボキシフェノールレッドｐＨ指示薬を、様々な分子量のアミノ変性デキストランに共有結合させた。
【００４４】
アミノ変性デキストラン（０．５ｇ、ＭＷ＝１０，０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、攪拌することによって、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に懸濁した。カルボキシフェノールレッド（ＣＰＲ、Ｃｕｒｔｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ）指示薬（１２０ｍｇ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解し、続いて、カップリング剤ＥＤＣ［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩］（１７８ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物）（８１ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えた。次いで、指示薬／ＥＤＣ／ＨＯＢｔ上澄溶液をデキストラン溶液に加え、この反応混合物を３日間攪拌した。次いで、真空フラスコ上にブフナーロートを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ  ＃４フィルター紙で、生じたスラリーを濾過した。次いで、生じた固形残渣を、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）４ｍｌに溶解した。未溶解物質を沈澱させ、透き通った上澄液体を、６〜８０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析バッグに移した。蒸留水４リットルに対して２４時間（水を４回変えて）透析した後、透析バッグをガラス皿に載せ、デキストラン−ＣＰＲ複合物の溶液の体積が少なくとも５０％減少するまで、固体フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ＭＷ＝４０，０００、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で４〜６時間覆った。この溶液を、使用まで４℃にて保存した。アミノ変性デキストランが４０，０００の分子量を有していたこと以外は、上記の通りにＣＰＲ−デキストラン（ＭＷ＝４０Ｋ）バラス化ｐＨ指示薬を作製した。
【００４５】
実施例６
ＣＰＲ−デキストラン指示薬を含む薄膜培養装置の作製
実施例５に記載の通りに作製したそれぞれのＣＰＲ−デキストランバラス化ｐＨ指示薬中に存在するＣＰＲ発色団の量を、実施例２に記載の方法に似た方式で、分光光度法で５６０ｎｍの波長にて測定した。ＣＰＲ−デキストラン指示薬の水溶液を実施例３に記載のＥＢ培地と個々に混合し、０．２ｍｇのＣＰＲ／ｍｌを含む培地を作った。次いで、このようにして得られた培地を使用して、実施例３に記載の薄膜培養装置を作製した。等モル量のＣＰＲ指示薬のみをＣＰＲ−デキストラン（ＭＷ＝１０Ｋまたは４０Ｋ）バラス化ｐＨ指示薬の代わりに使用したこと以外は同じ方式で、比較用装置を作製した。
【００４６】
実施例７
細菌成長の検出
Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌ４９（ＡＴＣＣ５５５３５）およびＣ１（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）の両者を、実施例６に記載の薄膜培養装置上で、３７℃にて２４時間成長させた。生じた有色帯域の直径を測定し、ＣＰＲ−デキストランバラス化ｐＨ指示薬を含む装置で得られた結果を、遊離ＣＰＲ指示薬を含む装置の結果と比較した。装置上のできる限り多くのコロニーについて、有色帯域直径を測定した。フォームダム（ｆｏａｍ  ｄａｍ）の縁の非常に近くで成長しているコロニー、または別のコロニーから２ｍｍ未満離れているコロニーは、測定しなかった。明確な有色帯域を計数することができた容易さに関する目視検査も書き留めた。
【００４７】
結果を表２に示す。強酸産生菌Ｅ．ｃｏｌｉ  １４９を用いたテストでは、結果は、ＣＰＲ  ｐＨ指示薬をアミノ変性デキストランでバラス化することにより、有色帯域直径がより小さくなる傾向を示し、データから、帯域直径を減少させる効果は、より大きい分子量のデキストランで大きいことがわかる。弱酸産生菌Ｃ１用いたテストでは、有色帯域の直径は有意に異ならなかった。しかし、融合した帯域に関して、ＣＰＲ−デキストラン（ＭＷ＝４０Ｋ）指示薬装置の細菌コロニーは、遊離ＣＰＲ指示薬装置上の細菌コロニーよりはっきりした縁を有し、読取り易いという、目視観測が行われた。
【００４８】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、バラス化ｐＨ指示薬を含む本発明の培地を含む薄膜培養プレート装置の図解である。
【図１】
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