(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を少なくとも1つの特性が変化するように誘導して凝集細胞を分離させる工程、及びその結果として生じる細胞集団の変化を検出する工程を含む、細胞試料中の凝集を検出する方法。
【請求項２】
凝集細胞を分離させるのに必要となる力を測定する工程を含む請求項1に記載の方法。
【請求項３】
特性の変化が細胞形状の変化である請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
試料細胞を変化にさらして細胞を球形に変化させることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記の変化がその中に細胞を懸濁させる液体の質量オスモル濃度の変化である請求項4に記載の方法。
【請求項６】
センサーを通る細胞を計数するようにしたセンサーに細胞試料のアリコットを通すことによって細胞集団内の変化を検出することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
質量オスモル濃度を連続的に変化させるようにした溶液に試料を連続的に送り込んで、連続した一連の細胞アリコットがセンサーに通されるようにする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
凝集を誘発するために、または少なくとも誘発するよう試みるために細胞試料を前処理する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞試料を全血源から得る、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞試料を別の源に由来する抗体で処理する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を血液型の判定を目的として処理する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を試料のクロスマッチ試験を目的として処理する請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
別の源に由来する抗体が全血、血しょうもしくは血清から製造される、またはそれらに由来する、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞試料を熱曝露によって前処理する、請求項8〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞試料を35℃ないし40℃の温度、好ましくは37℃に加温する、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞試料を試料の冷却によって前処理する、請求項8〜13のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
あらゆるタイプの血球は自然に凝集する場合があるが、これはしばしば重大な溶血性疾病の前触れとなる。それは非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性リンパ性白血病、癌、胸腺腫および卵巣腫瘍といった悪性腫瘍が潜んでいることを示唆する場合もある。
【０００２】
自然凝集が起こるのは、新生児溶血性疾患のような血液型不適合および不適合輸血の場合；発作性夜間ヘモグロビン尿症や低ガンマグロブリン血の場合；ある種の膠原病、たとえば播種状エリスマトーデス、リウマチ様関節炎、潰瘍性大腸炎および肝炎などの場合；ある種の感染症、たとえばウィルス性およびマイコプラズマ肺炎、サイトメガロウィルス、結核および感染性単球核症；およびL-ドーパなどのような薬物に対する反応の場合である。これらの疾病に血管内または血管外溶血が伴う場合の死亡率は10%以上であるため、赤血球凝集がわかれば早期診断と治療効果の監視に有益である。
【０００３】
通常、凝集の検出は凝集細胞の目視観察によって行われる。すでに自動細胞計数器が通常の諸々の手作業に取って代わっているが、それは手作業による検証を無用にするほど正確に凝集を検出しうるわけではない。それどころか、既存の自動細胞計数器は凝集細胞塊を1個の大きな細胞として誤って計算するため、不正確な平均細胞体積や細胞計数値を、またそうした不正確な計測値に由来する合成指数を生じてしまう。
【０００４】
市販の自動血球分析装置で表示される異常に高い平均赤血球体積（MCV）値または異常に高い平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）値は検査技師に凝集の存在という可能性に注意を促す。しかし、これらの指数は凝集の指標としては不適切である。というのはこれらの指数ははっきり限定されていないし、そのうえ凝集が高レベルまで上昇しなければ指数は正常限界を超えないからである。高MCHC値は赤血球の断片化、リンパ球増加症、高血糖症およびヘモグロビン血症によってもたらされるため、手作業による検査と再試験をまたなければ診断が下せない。
【０００５】
血液型判定やクロスマッチ試験を実施する通常の研究室では、試料の血液型を判定するために市販の血液型抗体1、2滴を純全血に（またはもっと一般的には正常食塩溶液に全血を5%懸濁させた懸濁液に）加える。懸濁液を室温で数分間、一般に2、3分間保つ。次いで懸濁液をベンチトップ遠心機に3000 rpmで30〜45秒かけてから、懸濁液を数秒間、静かに振る。次いで遠心管を目視検査して凝集血球の有無を調べ、低出力顕微鏡を使用して確認する。クロスマッチ試験は市販の抗体の代わりに受血者の血しょうを抗体として使用して、同じ要領で行い、凝集が存在しないことを確認する。
【０００６】
発明の要約
本発明によれば、細胞試料中の凝集を検出する方法は、細胞に少なくとも1つの特性を変化させて、凝集細胞を分離させるようにする工程とその結果として生じる細胞集団の変化を検出する工程とを含む。
好ましくは、特性の変化は細胞形状の変化とする。さらに好ましくは、試料細胞を環境の変化にさらして細胞を球形に変化させる。好ましい実施例において、環境の変化は細胞をその中に懸濁させる液体の質量オスモル濃度の、好ましくは水の添加による変化である。
【０００７】
好ましくは、細胞集団の変化は1以上の定量細胞試料を、センサーを通る細胞を計数するよう改造したセンサーに通すことによって検出する。もっと好ましくは、質量オスモル濃度を連続的に変化させるようにした溶液に試料を連続的に送り込んで、連続した一連の定量細胞がセンサーに通されるようにする。
【０００８】
好ましくはこの試験方法はさらに、凝集を誘発するために、または少なくとも誘発するよう試みるために細胞試料を前処理する工程を含む。本発明の好ましい一実施例において、抗原性が未知である源に由来する細胞試料を、それと別の源に由来する抗体と混合する。この抗体は全血、血しょうまたは一般に血清から製造しても、またはそれらに由来してもよい。さらにもう1つのステップにおいて、推定抗原−抗体混合物を異なる温度で試験して感熱凝集の有無を調べてもよい。これにより、既存の血液型判定およびミスマッチ試験法にとって代わりうる新しい試験方法が提供される。
【０００９】
本発明は、凝集細胞がどれだけ強く結合しあっているかを、凝集細胞を分離させるためにどれだけの力が要求されるかを測定することにより試験することもできる方法を用いて、凝集を測定する。この特性は補体系と相互作用する抗原次第である。赤血球の凝集は、相補的なGig抗体分子と結合する血球表面上の抗原結合部位の種類と数に規定される。凝集力は血球表面上の結合部位の近接性に規定される。全血試料を一般に1:10,000の懸濁液に導入し、血球をほぼ両凹の円盤から球へと変形させると、結合に使用される有効表面積が減少する。血球を球形にすると抗原結合部位の間隔が増し、結合が起こる平均距離も増す。
【００１０】
血球が球形になると、細胞間の結合に使用される表面積が減少するため結合力が弱まり分離を起こす。誘発圧力とその変化に伴う血球数（または血球数に関連する量）を記録することにより、凝集を検出、定量および監視することができる。この方法で試験すると、凝集している細胞が分離し、それによって細胞計数値が独特の形で増加する。さらにもう1つのステップにおいて、試料を機械的なかく拌にかける。これは、凝集能のある正常形状の細胞の凝集を促進する一方で球状細胞の分離を促進する傾向がある。
【００１１】
詳細な説明
本発明の方法は、出願人の以前の国際出願、すなわちWO 97/24601、WO97/24598およびWO97/24599に記載されている方法および装置と併用すると格別に有用であり、そこに記載されている試験方法の一般的な有用性をさらに高める。
【００１２】
好ましい方法は、細胞がセンサー開口部を通過する際に細胞数を計算することを含む。この装置は食塩水、細胞および希釈液を注入するための混合室を備えた構造にすることができるが、その場合には開口部を通過する細胞数はどの質量オスモル濃度でも一定となるようにする。混合室に2つの流れ（すなわち希釈液と細胞をあらかじめ導入してある食塩水懸濁液）だけを導く場合には、開口部を通過する細胞数を、浸透圧勾配と正比例する水準に固定する。液体に懸濁させた赤血球は周囲オスモル濃度の漸減にさらされ、またこの方法では一般に混合室に注入される血球流も漸減させるため、血球計数値の漸減が観察される。
【００１３】
国際出願WO97/24601に記載されている装置によって得られた正常者に関する結果は図1のとおりである。図1では、図2および3の場合と同様に、領域Aのグラフで赤血球計数値を示す。質量モル濃度と赤血球計数値の関係を表す（図1の領域Aに示すような）予定直線からの偏差が起こりうるのは、追加の粒子が出現する、または周囲の圧力変化によって刺激される場合に限られる。
【００１４】
後述するように、細胞が凝集すると、または凝集するよう仕向けられると、細胞計数値は低下する。次いで細胞が球形になると、各凝集塊が凝集力に反比例して分離しばらばらになるため、細胞計数値は上昇する。
ほとんどの細胞はPmaxとP0の区間内の圧力範囲で球形になる。Pmaxは細胞内への液体流入量が最大となる点であり、P0は均衡点である（領域Bを参照）。凝集塊が存在するとすれば、凝集塊は同区間内で分離し局所的に計数値を上昇させる。さらに、凝集が起きているかどうかはP0点からわかる。というのは細胞が凝集を起こしていればP0点は値が高くなるからである。
【００１５】
われわれの対応する国際出願（代理人参照番号G14201WO）は細胞断片の計測方法を開示している。細胞断片と分解した凝集細胞（DACs）はサイズ別に隔離することができる。断片は体積が10〜30 flときわめて小さいが、DACsのサイズは少なくともその3倍以上、一般に60〜110 flである。さらに、等張MCVは断片が存在する場合には正常であるかまたは減少するが凝集と共に増大する。正常範囲のMCVはきわめて大きいため、かなりの凝集を隠蔽する可能性がある。
【００１６】
試料の継時変化および機械的応力や超音波などのような応力の適用は、試料が凝集を起こしていれば原形を保った細胞の計数値を上昇させるし、試料が分解を起こしていれば原形を保った細胞の数を低下させる。周囲オスモル濃度が低下してP0を下回れば凝集塊をさらに分解する作用はもう及ぼさないが、細胞断片の度数はオスモル濃度に半比例して変化することが判明している。
【００１７】
図2は凝集血球をもつ患者に関する結果を示す。領域Aでは球形化に伴う血球計数値の急上昇が明示されており、また領域Bでは球形度指数（SI）の上昇が扁平血球として現れる。SIは表（領域D）からも見ることができる。SIは球形の場合が10であり、血球が扁平化するほどSIは上昇する。SI値は、図2（異常患者）では10.24であるが、図1（健全患者）では14.37である。
【００１８】
図2の領域Dは図1と比較すると、血球凝集塊のために赤血球度数分布の分散が大きくなっていることを示す。この度数分布を分析すると細胞が凝集を起こしているかどうかがわかる。第1に、標準偏差（SD）で測定した分布の幅、すなわち変動係数（cv）は凝集に伴って大きくなるからである。第2に、正規分布からの偏差はすべて計測可能であり、より扁平な形状の曲線を導くような中心からの偏りは負のとがりと呼び、凝集を示唆するからである。図1および2の領域Dを比較すると、異常患者では標準偏差が正常患者のほぼ2倍であり、とがりは負である。
【００１９】
領域Eは、オスモル濃度の上昇に対する細胞サイズ測定値の関係を示す度数分布である。応力が増すにつれて細胞は膨らみ始め、その結果として平均細胞サイズが漸増する。点P0で細胞サイズは増大不可能になり、さらに応力が増すと細胞は中身を排出して「幽霊細胞」となる。
【００２０】
一例として、この方法は（たとえば、血液型の判定を目的に現在使用されている任意の1以上の市販抗体を使用して、またはクロスマッチ試験用の抗体源として受血者の血しょうを使用して）水注射器に抗体を導入し最終的には混合室で、血液を懸濁させた食塩水と混ぜることによる凝集の誘発および検出による血液型と血球タイプの自動認識を目的とした装置へと具体化してもよい。抗体と血球表面上の抗原との相互作用またはその欠如によって引き起こされる凝集は、センサー開口部で計数により検出される。この試験方法は手作業による血液型判定とクロスマッチ試験を無用にする。
【００２１】
国際出願WO97/24601に記載されているその種の装置から生み出される結果を図3に示す。この例では、使用液体を装置内部で約37℃、すなわち体温まで加温して、通常の人体環境をシミュレートするようにした。凝集を認識可能にするものは、赤血球計数値の（通常はPmaxとPminの間における）上昇、負のとがりを示す度数分布（本例では、領域Eの“H”によって示される各試料採取時点で等張、球形、幽霊および「ユーザー」選択の各度数分布が用意される）、標準偏差または変動係数の増大によって計測される細胞集団の分布幅の増大、球形度指数の上昇、またゼロ浸透性（P0）を誘発する質量オスモル濃度の上昇である。
【００２２】
いかなる変化も、たとえ小さな変化（抗原を使用しない対照試験と比較したときに検出可能であるような変化）であっても、もっぱら抗体に帰させなければならない。この具体例では、第2の細胞集団が図3のB、E両領域に現れており、それもまた凝集を示唆している。
【００２３】
本発明は凝集の早期検出に、したがって溶血性疾患の早期診断とその後の治療に、特に有用であり、また背後に潜む病理を認識する可能性を強める。また、細胞の凝集力を、分離が実現される度合いとその難易度から定量することも可能である。非凝集細胞の濃度はわかっているので、等張計数値の減少はみな凝集を表す。細胞懸濁液が球形化勾配にさらされるので、原計数値は質量オスモル濃度の上昇に伴って、また凝集力に比例して、回復されることになろう。最後に、この方法は、血球に凝集を誘発させてからこの方法を使用して血球を試験することによる血液型と血球タイプの自動鑑定に道を開く。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、国際出願WO97/24601に詳しく記載してあるタイプの自動血球分析装置から得られた、正常な非凝集血球をもつ患者に関する分析結果のスクリーンダンプである。
【図２】  図2は凝集血球をもつ患者に関する分析結果の同種のスクリーンダンプである。
【図３】  図3は血液型判定試験で血液試料を抗体と混ぜた結果を示すもう1つのスクリーンダンプである。
【図１】
0004444513.tif 000002
【図２】
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【図３】
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