(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体をｐＨ３．５以下の酸性条件で処理してなるヒトパルボウィルスＢ１９抗原の免疫測定方法
【請求項２】
抗ヒトパルボウィルスＢ１９抗体を用いる請求項１記載の免疫測定方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は検体をｐＨ３．５以下の酸性条件で処理してなるヒトパルボウィルスＢ１９抗原の免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトパルボウイルスＢ１９は、小児おける伝染性紅斑（りんご病）の原因ウイルスとして知られ、このウイルスは成人には重篤な症状を引き起こすことが少ないといわれてきた。しかしながら、近年免疫不全患者における慢性骨髄不全、多発性関節炎の原因となること、妊婦が感染すると胎児水腫、流産を引き起こすことが報告された（臨床検査；３９，８０５−８１０（１９９５））。従来、ヒトパルボウイルスＢ１９の測定には、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原を抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体によって免疫測定する方法（J. Clin. Microbiol., １９９７（３５），１５７５）、ｐＨ５．５の緩衝液中でウイルスレセプターを固定した赤血球の凝集を測定する方法（receptor−mediated  hemagglutination（ＲＨＡ），Vox  Sang，７６，１４−２１（１９９７）,ＥＰ特許公開６９０９９０号参照）、ウイルス遺伝子をPCR法により増幅する方法（Lancet，343,798（1994））等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体を用いた免疫測定法及びＲＨＡは、測定感度が低く微量のヒトパルボウイルスB１９抗原の測定を行うことができず、また、ＰＣＲ法によりヒトパルボウイルスＢ１９遺伝子を増幅して測定する方法は高感度な測定法であるものの、測定するウイルスの精製や増幅時の不純物質の混入防止を必要とし、簡便且つ多量試料を測定する手段ではなかった。そこで、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原を簡便且つ感度よく測定し、検体へのヒトパルボウイルスＢ１９の感染を判定する方法が求められていた。
本発明の目的は、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原の新たな測定方法を提供することである。
【０００４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、ヒトパルボウイルスＢ１９を含むと思われる検体をｐＨ３．５以下の酸性条件下で処理した後、ヒトパルボウィルスＢ１９抗原を測定する方法を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明を実施するにはヒトパルボウイルスＢ１９を含むと思われる検体溶液を、ｐＨ３．５以下の酸性の条件で処理を行う。この酸性条件はｐＨ３．５以下であればよく、測定に悪影響を与えないような条件であれば、強酸性条件であってもよい。酸処理は例えば０℃〜５０℃、通常室温付近で実施することができる。処理時間は１０秒〜１０分間程度行うことができるが、ｐＨ又は処理温度によって処理時間を調節することが好ましい。本発明の検体としては、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原を含むと予想される試料、例えば血清、血漿、輸血用の血液などの血液由来の試料、血漿分画製剤等を挙げることができる。検体はまず緩衝液に溶解後、例えば塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸等の酸を単独又は混同して加え、前期ｐＨに調節することができる。
【０００６】
この酸で処理した溶液は、免疫測定にあたってアルカリ性溶液で所望のｐＨに中和した後、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原の測定に用いることができる。ヒトパルボウイルスＢ１９抗原の測定は、抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体を用いて実施することができ、例えばサンドイッチ法、競合法等の免疫測定法を挙げることができる。この測定に用いる抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体は、周知の抗体作製法に従い製造されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。また、抗体としては、抗体のＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等の抗体フラグメントも用いることができる。
【０００７】
また、サンドイッチ法、競合法等に用いる固相としては、周知のマイクロプレート、ガラス、ポリスチレン等のビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子等の各種粒子を挙げることができる。また、抗体への標識としては、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等の標識物質を用いることができる。前記固相又は前記標識物質と抗体とをそれぞれ結合させるには、周知の吸着法や化学結合法等によって行うことができる。
【０００８】
前記方法に従い製造された抗体結合固相と標識抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体は、前記の酸で処理された検体と混合して、固相に結合した標識物質によるシグナルを測定することによりヒトパルボウイルスＢ１９抗原を検出し、検体中のヒトパルボウイルスＢ１９の有無を判定することができる。標識物質が酵素である場合には、周知の発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いて標識酵素活性の測定を行うことができる。
【０００９】
【実施例】
以下、参考例及び実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
参考例１  リコンビナントＶＰ２抗原の調製
パルボウイルスの主要構成蛋白質であるＶＰ２の発現は以下のようにして行った。即ち、クローニングしておいたＶＰ２全長ＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ・ＢａｍＨＩで切断し、クレノーで処理した後、これを制限酵素部位ＳｍａＩで切断したｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＡｃＹＭ１）に組み込んだ。このｐｌａｓｍｉｄをリポフェクチン法により、Ｂａｃｕｌｏ  Ｇｏｌｄ  ｌｉｎｉａｒｉｚｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ社製）と共に、夜盗蛾由来の昆虫細胞Ｓｆ９細胞に導入した。導入細胞を数日培養後、培養上清のウイルスを回収した。さらにこのウイルスを純化するために、限外希釈法を用いてウイルスのクローニングを行った。組換えタンパク（ＶＰ２）は、夜盗蛾由来の昆虫細胞Ｓｆ２１細胞にこの純化した組換えウイルスを感染させ、培養５日後の昆虫細胞から回収した。
【００１１】
昆虫細胞からのＶＰ２の精製は、以下のように行った。即ち、昆虫細胞を遠心回収後、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０  ５％グリセリン  １Ｍ塩化ナトリウム  ２０ｍＭ２−メルカプトンエタノール  ２ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウム溶液にて超音波破砕を行い遠心分離後、沈殿を回収した。沈殿物を０．１％トライトンＸ１００、１％オクチルチオガラクトピラノシドで各々３回洗浄し、洗浄リコンビナントＶｐ２を回収した。事前の平板ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｍｏｄｅｌ  ４９１Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の分離ゲル濃度を１０％と決め、円柱状分離ゲルの作製を行った。洗浄リコンビナントＶｐ２をＳＤＳ濃度２％としたサンプルバッファー２ｍｌに溶解後、泳動を行い、円柱状のゲル先端より溶出するＶｐ２を回収した。回収したＶｐ２をセントリプレップ（アミコン社製）を用いて濃縮し精製品とした。
【００１２】
参考例２  ヒトパルボウイルスＢ１９の精製
精製は緩衝液Ａ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を用いて実施した。ウイルスの検出はＫＵ８１２Ｅｐ６細胞を用いた感染価測定法（Miyagawa；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；８３（１９９９）４５−５５）及びB１９ｍAｂを用いウエスタンブロットにより測定した。ヒトパルボウイルスＢ１９陽性血漿（ウイルス感染価１０6ＴＣＩＤ50 ／ｍｌ）をクロマトグラフィー処理してウイルスを分離した。このクロマトグラフィーによりヒトパルボウイルスＢ１９の粒子サイズより推定される溶出位置に単一ピークとして溶出され、ウイルス感染価も確認された。
【００１３】
参考例３  抗ＶＰ−２モノクローナル抗体の確立
抗ＶＰ−２モノクローナル抗体は、参考例１で示したリコンビナントＶＰ−２又は参考例２で示した精製パルボウイルスをマウスに免疫し、その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより作製した。すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスをフロイント完全アジュバントでエマルジョン化したリコンビナントＶＰ−２又は精製パルボウイルスを２５〜１００μｇ／マウスで初回免疫を行い、２週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原 ２５〜１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。抗体価のチェックは、リコンビナントＶＰ−２でコートし９６Ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートを用いた固相ＥＬＩＳＡで行った。抗体価の上昇が認められたマウスにＦｒｅｅのリコンビナントＶＰ−２、或いは精製パルボウイルス ２５〜１００μｇを静脈内投与し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調製した。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞(P3U1)と脾細胞を１：２〜１：５の比率で混合し、ＰＥＧ（ベーリンガー社製）を用い細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６Ｗｅｌｌ培養プレートに分注し３７℃、ＣＯ2インキュベーターで培養した。
【００１４】
スクリーニングは上記に示した固相ＥＬＩＳＡで行った。すなわち、参考例１で示したリコンビナントＶＰ−２抗原を９６Ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（ファルマシア社製）に１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／Ｗｅｌｌ分注し、４℃一晩放置することにより吸着させた。１％スキムミルクでブロッキングした後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５０μｌを加え、３７℃１時間反応させた。同様に洗浄Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＣＯ社製）を加え、さらに３７℃１時間反応させた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒで４ 回洗浄後、基質（２，２‘−アジノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６’−スルホン酸；ＡＢＴＳ）を加え発色の見られるＷｅｌｌを選択した。このようにして抗ＶＰ−２抗体2種を選択した。リコンビナントＶＰ−２免疫マウスからＶＰ２−３１２、精製パルボウイルス免疫マウスからＰｒｖ３３４を確立した。
【００１５】
参考例４  ｒＶＰ−２測定サンドイッチＥＬＩＳＡの確立
リコンビナントＶＰ−２を抗原としてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは以下のように行った。すなわち、ＮＵＮＣ社製ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＢ） にＰｒｖ３３４抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ７．４で希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌづつ入れ、４℃一晩放置しＣｏａｔした。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ７．４を２００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃、５時間放置しＭａｓｋｉｎｇを行った。洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ７．４）で３回洗浄後、リコンビナントＶＰ−２を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２ｎ希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃、１時間反応させた。特異性を確認するため、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原とは異なる抗原を免疫原として作製したモノクローナル抗体３DG−４７２を同様Ｃｏａｔしたプレートに抗原を入れ、３７℃、１時間反応させた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ＶＰ２−３１２抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃、１時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、基質（ｐ−ニトロフェノールリン酸；ＰＮＰＰ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ室温で１５分放置後、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。図１に示すように、本固相抗体と標識抗体の組合せで、パルボウイルスの構成蛋白質であるリコンビナントＶＰ−２が特異的に測定できることが確認された。
【００１６】
実施例１  血清の測定と酸処理
血清の測定は、未処理と各ｐＨで処理した血清について比較した。ＥＬＩＳＡは参考例４と同様に行った。すなわち、ＮＵＮＣ社製ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＢ） にＰｒｖ３３４抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ７．４で希釈し、１ｗｅｌｌに１００μｌづつ入れ、４ ℃一晩放置しＣｏａｔした。次に１％ＢＳＡ−ＰＢＳ７．４を２００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃、５時間放置しＭａｓｋｉｎｇを行った。洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ７．４）で３回洗浄後、パルボウイルス陽性（ＰＣＲ）血清と、対照として陰性血清の測定を行った。
【００１７】
各ｐＨ条件（ｐＨ１．５、２．０、２．５、３．５、４．５，５．５及び７．４）で処理を行ったものと、処理を行わなかったもの（ｐＨ７．４；従来法）について（計８種）、１００μｌ／ｗｅｌｌで３７℃、１時間反応させた。血清の酸処理は、例えばｐＨ２．０は０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．０で、ｐＨ５．０は０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．０で、未処理は０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４で血清を１０倍希釈し行った。酸性条件で処理をした血清は少量の２Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５で速やかに中和した。ＥＬＩＳＡサンプルとしては、これを更に１．０％ＢＳＡ−ＰＢＳ７．４で２倍に希釈したものを用いた。洗浄緩衝液で３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ＶＰ２−３１２抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、３７℃、１時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、基質PNPPを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え室温で１５分放置後、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図２に示す。
【００１８】
【発明の効果】
本発明では、検体を酸処理することにより検体中に含まれるヒトパウボウイルスＢ１９抗原を簡便に測定することができる。本発明によって、従来法では測定ができなかった微量のヒトパルボウイルスＢ１９抗原の測定が可能となり、殊に輸血による感染の防止に多大な貢献をする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＬＩＳＡ法による抗体の特異性を測定した結果を示す図である。対照として用いたモノクローナル抗体３DG−４７２は、ヒトパルボウイルスＢ１９抗原と異なる免疫原から作製した抗体である。
【図２】  各ｐＨ条件でパルボウイルス陽性血清又は陰性血清を処理した後、ＥＬＩＳＡ法によってヒトパルボウイルスＢ１９抗原を測定した結果を示す図である。＊は処理を行わない従来法の測定結果を示す。
【図１】
0004449171.tif 000002
【図２】
0004449171.tif 000003