(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
調査溶液内で所定の対象配列のヌクレイン酸鎖を同定する方法であって、次のステップ、すなわち、
１）同定すべきヌクレイン酸鎖を、複数の同一の色素分子でマークされ、かつ対象配列の全体または実質的に全体に対して相補的であるアンチセンス鎖でハイブリッド化するステップ、
２）アンチセンス鎖がハイブリッド化されている、同定すべきヌクレイン酸鎖を判別することにより、対象配列を時間分解された蛍光分光法を用いて同定するステップ、
を有する、ヌクレイン酸鎖を同定する方法。
【請求項２】
前記ステップ１）において、同定すべきヌクレイン酸鎖とアンチセンス鎖（１７）間のハイブリッド化が、色素でマークされたヌクレイン酸または類似体構成要素を使用する場合に、同定すべきヌクレイン酸鎖を同定すべきヌクレイン酸鎖とアンチセンス鎖（１７）からなる２本鎖に重合化することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調査溶液内で所定の対象配列の少数の、好ましくは個別のヌクレイン酸の鎖を直接検出する方法に関するものである。
【０００２】
本発明はさらに、この方法を実施する装置並びにその際に使用される試験溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
一般に、既知の、部分的に既知の、かつ／または未知の配列のＤＮＡ／ＲＮＡ分子を証明できることが望まれている。それに関する用途例は、例えば発生進化的バイオテクノロジーの枠内での遺伝学上の調査、実験室実験の分析、あるいは特にウィスル診断学である。これらすべての用途例において最初から存在する調査溶液内に多くは所定の対象配列の少数のまたは全く個別のヌクレイン酸の鎖があって、それが調査溶液内で好ましくは定量的に検出される。
【０００４】
現在ではウィルス感染の証明は間接的な方法、すなわち取り付かれた宿主の免疫反応を介して行われる。テストは、これら間接的な方法に付随する一連の困難と結び付いている。それに数えられるのは遅延された免疫反応の長い潜伏期間、例えばエリザ・テストの時間のかかる分析、並びに偽陽性ないし偽陰性の免疫反応の可能性である。
【０００５】
従ってウィルスを極めて専門的に証明することのできる直接試験を行うことが望まれている。この直接証明の困難性は特に、大きな感度が要求されることにある。すなわち、ボーダーラインのケースにおいては、細胞抽出物内ないしは血清内で唯一のウィルス粒子を証明することができなくてはならない。その場合に証明すべきヌクレイン酸の鎖の濃度は１０マイナス１２乗から１０マイナス１８乗分子濃度の範囲にある。
【０００６】
数年前に開発された方法は、個別のあるいは少数のヌクレイン酸の鎖を、例えばゲル電気泳動などの従来の方法、温度勾配ゲル、配列決定の方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）方法またはマクサム・ギルバート法に従って接近し得る濃度水準まで高濃縮することにある。この高濃縮には、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）または証明すべきヌクレイン酸部分の固有の複製に基づく同様な方法が使用される。その場合に、短い１本鎖領域がプライマーとして供給される場合に、１本鎖を２本鎖に重合化するＤＮＡポリメラーゼの特性が利用される。その場合に増強すべき配列を有するヌクレイン酸の鎖に、増強すべき配列の端縁領域に基づく鎖固有の、すなわち両ＤＮＡ鎖の一方に対して相補的な２つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドが過剰に加えられる。
【０００７】
まず、この種の方法は非常に時間がかかり、この方法はＰＣＲ反応を実施することが必要であるだけでなく、その後他の分析を行って、調査溶液中に求める配列が存在することを少なくとも定性的に結論づけられるようにしなければならない。さらにここでは、求める配列の対応する部分に対して正確に相補的な、約１５−２０ヌクレオチドの長さを有する所定の短い鎖のヌクレイン酸配列が用意されることが必要である。この種の正確に相補的な短い鎖のヌクレイン酸部分を一般に「アンチセンス配列（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−Ｓｅｑｕｅｎｚ）」または「プライマー」とも称する。
【０００８】
時間がかかる他に、この方法においてはさらに、両端部において配列順序の少なくとも１つの短い部分がわかっており、それによって対応するプライマーを用意できるヌクレイン酸配列しか証明できないという欠点がある。証明すべきヌクレイン酸の鎖がＲＮＡ分子である場合には、これをまずさらにＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡコピーに書き換えてから、ＰＣＲ技術を使用することが可能になる。
【０００９】
場合によっては異なる処理ステップが多数あるので、この方法は多数の誤りの原因を有する。というのは個々のポリメラーゼは重合化の際にある確率でしか「正しい」相補的なヌクレオチドを組み込めないので、ここでも偽陽性と偽陰性のテスト結果がもたらされることを排除できない。
【００１０】
他の方法は、求める配列を直接視認できるようにすることであって、このことは当然のことながらまずその配列が他の配列から明らかに区別できなくてはならないことを意味している。個々の分子を同定して計数する新しく開発された方法が、ＷＯ９４／１６３１３に記載されている相関蛍光分光法であって、以下においてはＦＣＳと略称する。上述の公報には、測定体積内で証明すべき分子が他の分子から明白に区別されるかあるいは分離されて存在している限りにおいて、ＦＣＳを用いて０．１から１０ｆｌの範囲の極めて少量の測定体積内で色素でマーキングされた個々のＤＮＡ／ＲＮＡ分子を証明できることが記載されている。
【００１１】
すでに述べたＰＣＲ法においては２つのプライマー配列が必要であって、その一方はプラス鎖の鎖始端に対して相補的であって、他方はマイナス鎖の始端に対して相補的である。両プライマー配列の位置間の配列部分がその後濃縮される。それに対してＰＣＳ証明の場合には蛍光色素でマーキングされた１つの固有のプライマー配列しか必要とされない。そのプライマー配列が検出すべき（１本鎖の）ＲＮＡ配列または完全に溶融されたＤＮＡ配列の鎖に直接付加される。この形においてマークされたプライマーはその電荷特性においてもその移動度においても結合されていないプライマーから明白に区別され、それ以上濃縮しないでもＦＣＳ法によって直接検出することができる。
【００１２】
ＦＣＳの測定原理は、溶液の比較的少量の体積要素がレーザの強い励起光にさらされることによって、極めて薄い溶液内の蛍光団分子が測定されることに基づいている。この測定体積内に存在する、分子に対応する励起スペクトルがレーザによって励起される。この体積要素から放出される蛍光がその後光電子増倍管上に結像される。希釈された溶液である場合には、それぞれの体積要素内の分子の濃度が明らかに変動する。
【００１３】
一度体積要素内に拡散された分子は、固有の拡散速度に従って、該当する分子の固有の平均時間経つと再び体積要素から分離して、その後はもはや観察されない。
【００１４】
同一の一つの分子のルミネッセンスがその分子が測定体積内に滞留する平均的な滞留時間の間に多数回励起される場合には、この分子から多数の信号が検出される。従って希釈された溶液の場合には、一度測定体積内に拡散された分子が再び出て行く前に再度励起される確率は、新しく入ってくる分子の場合よりもずっと大きい。
【００１５】
上述のＷＯ９４／１６３１３には、この測定原理に基づいて希釈溶液内で個々の分子を検出することが可能であると記載されている。証明すべき分子がヌクレイン酸鎖である場合には、証明すべき分子の所定の部分配列に対して相補的なプライマーが付加され、その結合されない状態における拡散特性が対象分子に結合された状態から区別される。
【００１６】
関与する分子の拡散速度に関係する、現在では比較的長い測定時間を短縮するために、上述の文献には、測定体積内の証明すべき分子を濃縮することのできる種々の方法が記載されている。これらの方法は原理的に、結合されないプライマーとプライマー・ヌクレイン酸鎖複合体の電荷の違いを利用して、整流された電場において結合されないプライマーを複合体から分離し、あるいは異なる拡散速度を利用することに基づいている。
【００１７】
証明の特異性を向上させる他の方法は、異なるようにマークされた２つの異なるプライマーを使用することにある。異なるようにマークされたプライマーに基づく蛍光信号の時間的相関によって、電子的な信号処理の方法で非相関の、従って遊離されたプライマーの信号が効果的に抑圧される。
【００１８】
さらに、例えば４Ｈｚの低周波の交流電場によって帯電された分子が測定体積によって振動され、それによって分子がほぼ合焦されるので、測定体積内で単一の分子または少数の分子だけを定量的に検出することが可能になると記載されている。
【００１９】
上述の公報はＦＣＳの多数の使用方法を記載しているが、正確には装置と、光学系と種々の分子沈澱を扱っている。もちろん特に、ＦＣＳ装置を用いてプライマーを使用して個々のＤＮＡ／ＲＮＡ鎖を計数できることが記載されている。このＰＣＴ出願は物理的パラメータの測定にも大いに注目しており、そのために特に異なるようにマークされた配位子が使用されるが、しかしこれは測定信号の強度を改良するためではなく、特異性を向上させるために行われる。すなわち、例えば証明すべき分子の回転速度など他のパラメータを定めることができるようにするために、この種の異なるようにマークされたゾンデにおいてクロス相関技術が使用される。
【００２０】
一般的に、関与する分子の拡散速度にドリフト速度を重畳させるために、電気泳動法、毛細管、直流電場などを使用できることが記載されている。その場合にプライマーと対象分子は、それらが異なる電荷を有し、従って電場において異なるように移動するように選択することができる。
【００２１】
従ってＦＣＳ法はＰＣＲ法または類似の方法に比較して一連の利点を有する。まず、ＦＣＳ法は１本鎖のヌクレイン酸分子も２本鎖のそれにも直接使用することができる。多数の病原が１本鎖のＲＮＡウィルスであるので、これらはＦＣＳ法ではまずＤＮＡに複製する必要はなく、そのことが分析にかかる時間の中で前向きに評価される。さらにＦＣＳ法はより直接的であり、従って個々のヌクレイン酸を証明することができ、このヌクレイン酸はＰＣＲ法の場合にはまず複製しなければならず、そのことも同様にかかる時間の差をもたらす。
【００２２】
さらに濃縮プロセスがある物質によってじゃまされ、あるいは阻止されることがあるので、天然の試料についてはＰＣＲ法は必ずしも信頼できない。
【００２３】
しかしＰＣＲ法とまったく同様にＦＣＳ法も特異性に関しては障害が生じ易い。すなわちプライマー配列は例えば一部において、対象配列に偶然に類似している配列に対しても相補的になる場合がある。従って、結合の際に十分な特異性を得るために、１５から２０ヌクレオチドの長さのプライマー配列が選択される。しかしその場合には、部分的にのみ相補的な配列の融点が作業温度以下にあって、従って測定技術的に検出されないことが保証されなければならない。
【００２４】
ＰＣＲ法の場合には２つのプライマー配列が使用され、その場合に２つの配列が誤結合を有する確率はわずかである。しかしその代わりにここではプライマーはずっと高い濃度で使用しなければならない。というのはプライマーが反応によって消費されるからである。
【００２５】
それに対してＦＣＳ法の場合にはプライマー濃度は、証明すべきヌクレイン酸鎖への添加が測定時間内で行われる程度の高さでよい。
【００２６】
これらの条件がこれらの方法の使用をわずかな絶対量に厳しく制限する。
【特許文献１】ＷＯ９４／１６３１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
それに基づいて本発明の課題は、上述の欠点と困難を克服し、かつヌクレイン酸鎖を迅速かつ確実に直接証明することのできる冒頭で述べた種類の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明によればこの課題は、請求項１のステップを有する冒頭で述べた種類の方法によって解決される。
【００２９】
本発明の課題は、このようにして完全に解決される。すなわち、対象配列によって多数のプライマーをハイブリッド化することによって、付加されたプライマーを有する対象配列が測定体積内へ拡散し、それが記録される蛍光信号内で「閃光」として見られる場合に、例えばＦＣＳ技術において測定体積内でプライマーの局部的な濃度が著しく増大される。すなわち、本発明の発明者は、この種のプライマーの「カクテル」を利用できることを認識した。というのは、個々のヌクレイン酸鎖を証明する場合に、蛍光信号を増強することのみが重要となるからである。ほぼ「偶然に」プライマーが付加された配列は信号が極めてわずかであるので、公知のＦＣＳ法とは異なりもはや偽陽性表示されない。
【００３０】
プライマーと対象配列間のハイブリッド化の速度定数は一般に１０の６乗Ｍマイナス１乗Ｓマイナス１乗より低いので、プライマー濃度が１０のマイナス９乗Ｍですでに反応時間千秒を越える。対象配列自体がわずかな複製でしか、例えばマイクロリットル当り１つの鎖でしか存在しない場合には、直接の証明は不可能である。というのは上述の例においては結合されていないプライマーが例えば百万倍過剰に存在することになるからである。ＦＣＳ法に従って記録できるようにするためには、結合された蛍光マーカーは少なすぎて貢献できない。
【００３１】
しかしこの問題は本発明によれば、対象分子の種々の部位に対して相補的なプライマー配列のカクテルを用意することによって解決される。各プライマー配列の中央に、すべて同一の等しい、あるいはまた場合によっては種々の発蛍光団からなる蛍光マークを設けることができる。このカクテルは例えば約１０のマイナス９乗Ｍの濃度で提供され、これはフェムトリットル当り１分子を意味する。従ってレーザ光線の「光トラップ」が約０．２ｆｌの体積を有するＦＣＳ法においては、時間の約２０％における蛍光マークの存在に相当する「背景ノイズ」が記録されてしまう。対象分子が光または分子トラップ内に達すると、その対象分子が蛍光の突然の「輝き」をもたらす。というのは例えば２０から１００の蛍光マーカーが光トラップ内に同時に存在することになるからである。平均の強度のマークされた対象分子が完全に消えて行く間、この対象分子はＦＣＳの揺らぎ記録においてほぼ「照明弾」として現れる。
【００３２】
原理的にはこの考えを腫瘍細胞に使用して、迅速な直接の腫瘍証明を可能にすることもできる。ここでは、各腫瘍細胞が抗体に関する数千の抗体決定素を有するという事実を利用することができる。抗体を色素でマークすれば、抗体が結合されている腫瘍細胞は上述のＦＣＳ法では「閃光」として証明される。ここでも色素でマークされた抗体を腫瘍細胞に付加させることによって濃縮する効果が利用される。この考えに基づく腫瘍証明は、本発明による考えの他の利用例であって、色素でマークされた多数の異なるゾンデが、これらゾンデが多数結合することのできる目標対象に対して使用される。ゾンデの濃度を低く抑えて、観察される測定体積内でそのゾンデが、目標対象に平均して結合されたゾンデの数よりずっと少ない統計的確率で浮上するようにする場合には、結合されたゾンデを有する目標対象が測定体積内に進入した場合に、測定体積内のゾンデの濃縮を測定することができる。
【００３３】
またこの課題は、冒頭で述べた種類の方法において次のステップによって解決される。すなわち、１）証明すべきヌクレイン酸鎖の少なくともいくつかを、多数の色素分子でマークされ、対象配列全体またはほぼ全体に対して相補的であるそれぞれ長いアンチセンス鎖でハイブリッド化し、そして、２）対象配列を、アンチセンス鎖がハイブリッド化されている証明すべきヌクレイン酸鎖の少数、好ましくは１つを判別するように構成された光学分析装置を用いて同定する。
【００３４】
このことによっても本発明の課題は完全に解決される。蛍光信号の増大は、アンチセンス鎖を非常に多数の色素分子でマークすることによって行われるので、この種の２本鎖も同様に記録された蛍光信号において「閃光」として認識される。
【００３５】
証明すべきヌクレイン酸鎖とアンチセンス鎖間のハイブリッド化はまず、アンチセンス鎖が別に形成され、短いプライマーを調査溶液へ付加する方法の場合と同様に適当に温度処理することによって行うことができる。
【００３６】
あるいはまた、証明すべきヌクレイン酸鎖とアンチセンス鎖からなる色素でマークされた２本鎖を、証明すべきヌクレイン酸鎖を直接重合化することによって形成することも可能であって、その場合に色素でマークされたヌクレイン酸（または類似の）構成要素が使用される。好ましくはここではマークされたＵＴＰｓが使用される。このようにして得られた、極めて多数の色素分子でマークされた２本鎖が同様にマークされた自由な構成要素を背景として証明できない場合には、マークされた２本鎖を含む溶液を例えばＦＣＳ装置へ供給する前に、前段で適当な分離処理を行わなければならず、これについては後述する。
【００３７】
本発明による第１の方法の実施例においては、ステップａ）で対象配列の種々の、好ましくは重なり合わない部分に対して相補的なプライマー配列が形成され、その場合に種々のプライマー配列はヌクレイン酸（または類似の）構成要素の配列順序内で互いに区別される。
【００３８】
ここでは、対象配列に結合されるプライマー配列の数が非常に多いので、測定体積内でプライマー配列の高度の濃縮が行われ、それが偶然に通過する個々のプライマーによる偽陽性の測定結果に対するより大きい安全性を保証するという利点がある。
【００３９】
その場合に好ましくは、ステップａ）において、プライマー当り周波数長さ（配列長さ）が異なる、従ってヌクレイン酸（または類似の）構成要素の数の異なるプライマーが形成され、その場合にプライマーは１０から５０、好ましくは１５から２０構成要素の配列長さを有する。
【００４０】
プライマー長さが異なることによって、証明すべきヌクレイン酸の二次構造を効果的に計算に入れることができる。その場合に鎖の短いプライマーはヌクレイン酸鎖の１本鎖で存在する領域に対して使用され、長いプライマー配列は例えばまず適当な温度を選択することによって溶融しなければならない２本鎖で存在する領域に対して使用され、その場合にプライマーはその後二次構造の形成に対抗する。構成要素が比較的多数であることによって、この場合には長い鎖のプライマーと対象配列の対応する部分との結合が非常に大きく、それによってプライマーの結合が二次構造の新たな形成に優先する。１５から２０構成要素を有するプライマーはまず対象配列の相補的領域と十分に特異的な結合を行い、さらに偶然の非特異的な結合を許容しないことが明らかにされている。
【００４１】
ある実施形態においては、１０から２００、好ましくは２０から１００の異なる配列を有するプライマーが用意されると効果的である。
【００４２】
このようにして３００から２０００の相補的な構成要素が、ウィルスＲＮＡとして例えば４０００から１００００構成要素の配列長さを有する対象配列に付加されるので、この対象配列はこの種のハイブリッド化においては平均して最大数の付加すべきプライマーを収容する。その場合に好ましくは、対象分子とプライマーとからなるこの種の複合体が測定体積内へ移動すると、プライマーの極めて激しい濃縮と、それに伴って変動する蛍光信号の著しい増大がもたらされ、それが測定の確実性をさらに向上させる。
【００４３】
一般に、プライマーが例えばヌクレイン酸合成材を用いて直接的な合成によって形成されると効果的である。
【００４４】
ここで、種々のオリゴヌクレオチド（プライマー）を形成する絶対に確実な方法を説明しておいた方がよいと思われる。この方法は時間がかかるが、提供された「カクテル」の内部に場合によっては対象配列全体が存在することと、それに伴って対象配列が誤って表示されることを排除する。さらに重なり合うプライマー配列が防止され、それによって所望のマーキングが可能になる。もちろん対象配列は正確にわかっていなければならない。
【００４５】
あるいはまた、プライマーが色素分子でマークされたヌクレイン酸（あるいは類似の）構成要素が存在するところで対象配列の複製または転写によって形成されると効果的であって、その場合に複製または転写生成物は次に部分配列に切断されて、その後プライマーとして使用される。
【００４６】
この方法は、明らかに迅速に進行するという利点を有し、もちろんカクテルはこの方法の最初にまだ対象配列を含んでいるが、それは必ずしも正確にわかっている必要はない。従って、切断する際にどんな場合でも対象配列が分解され、それによって誤った表示が防止されることが保証されなければならない。複製または転写生成物のこの切断は、例えば生成物を砕く剪断力を行使する、機械的な方法で行うことができる。
【００４７】
あるいはまた、複写または転写生成物を所定の期間の間特異的および／または非特異的に切断するヌクレアーゼの作用にさらして、それによって生成物をプライマーに切断することができる。
【００４８】
その場合には、この切断を時間的に制御して、所望の平均長さを有するプライマーが発生するようにできる利点が得られる。
【００４９】
全体として、複写または転写生成物がポリメラーゼ連鎖反応技術、同様な方法を使用することによって、あるいは他の特異的なＲＮＡないしＤＮＡポリメラー
ゼを用いて形成されると効果的である。
【００５０】
この方法は良好に導入される方法であって、対象配列からプライマーを形成するために効果的に使用することができる。好ましくはここではプライマーは、その配列順序が部分的にしか、あるいは全く分かっていない対象配列に対して形成することができる。ただ、対象配列の端部が分かっていること、または分かっている配列部分がまったくわかならい対象配列に付くように合成され、それによってＰＣＲ方に必要なプライマーが用意できるようにすることだけが必要である。対象配列の２つのプライマー間にある領域の順序は必ずしもわかっている必要はなく、分析用のプライマーはいわば「自動的に」正しく発生されるので、例えば新しいウィルスを探すことができる。
【００５１】
さらに好ましくは、ＤＮＡ合成材を用いて短いＤＮＡ鎖が形成され、このＤＮＡ鎖は、このＤＮＡ鎖がその後例えばＴ７ポリメラーザによって転写されて、転写生成物がプライマーとして使用される場合には、対象配列の部分を有する。
【００５２】
この場合に好ましくは、公知の方法でＲＮＡプライマーを形成することができ、このプライマーはその後本発明によって証明すべきＲＮＡ対象配列に対してカクテルとして使用することができ、その場合にさらに対象配列の配列順序全体がわかっている必要はない。
【００５３】
一般に、プライマーとしてＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ配列が使用されると効果的である。
【００５４】
その場合には、ＤＮＡとＲＮＡ対象配列が証明できると効果的であって、その場合に、ペプチド類似の脊柱を有し、従って（ＲＮＡとＤＮＡのように）マイナスに帯電されていない、場合によってはプラスに帯電されたＰＮＡ配列を使用することによって、自由なプライマーと複合されたプライマーとを電気泳動で分離することが可能になる。プラスの残留グループの付着によってＰＮＡｓがプラスの帯電を有する場合があり、それが分離をさらに容易にする。
【００５５】
さらに好ましくは、ステップｂ）において、混合された溶液が、対象配列の三次及び二次構造が完全に溶融されるだけ高く、プライマーと対象配列との間の特異的な結合は溶融しないだけ十分に低く、さらにプライマーと対象配列間の非特異的な結合が溶融されるだけ十分に高い温度で温置される。
【００５６】
それによって好ましくはマーキングの際の重要な問題が解決される。すなわち、プライマー配列を付加するための速度定数は一般に１０の６乗Ｍマイナス１乗Ｓマイナス１乗より低いので、１０のマイナス９乗Ｍマイナス９乗のプライマー濃縮を使用する場合にすでに１０００秒より多い反応時間が発生する。しかしこの値は著しく温度に関係する。というのは対象配列の二次構造が溶融しないと、プライマー配列を付加できないからである。しかしまた、プライマー結合の融点より低い温度で作業しなければならず、その場合に非特異的な誤った付加を排除するためには温度はこの融点のすぐ下でなければならない。
【００５７】
すべてのことから、プライマーカクテルによる対象配列のマーキングは好ましくは、前述の融点を定量的に考慮した正確に決定された温度プロセスによってもたらされなければならないことが明らかになる。
【００５８】
ある実施形態においては、好ましくはそのためにプライマーは対象配列に比較して極めて過剰に使用され、その場合に温置が行われた後に、結合されていないプライマーをハイブリッド化された対象配列から分離することができる。
【００５９】
この場合に好ましくは、まずより高いプライマー濃度でハイブリッド化の飽和を行い、次に反応しなかったプライマーを分離することができる。
【００６０】
このことは特に、プライマーとしてプラスに帯電されたＰＮＡ配列が使用される場合に、簡単な電気泳動方法によって可能となる。
【００６１】
プライマーによってハイブリッド化された対象配列のステップｃ）における同定は、任意の時間分解された蛍光分光法を用いて行うことができ、この蛍光分光法は非常に少量の体積エレメント内で極めてわずかな蛍光信号を単独光子計数にいたるまで検出することができる。その場合に重要なことは、時間分解によって自由なプライマーに基づく信号を対象配列によっていわば濃縮されたプライマーに基づく信号から明確に区別できることである。
【００６２】
好ましくはこれは相関蛍光分光法を用いて行われ、この方法においては温置された溶液の極めてわずかな体積単位、好ましくは０．１から２０ｆｌがレーザの励起光にさらされ、励起光が測定体積内にあるプライマーを励起して蛍光光を放出させ、その場合に測定体積から放出された蛍光光は光電検出器を用いて測定され、かつ測定された放出の時間的な変化と関与する分子の相対的な拡散速度との相関が形成されるので、然るべく激しく希釈した場合には測定体積内で個々の分子が同定される。その場合に好ましくは、電場が使用され、それによってプライマーによってハイブリッド化された対象配列のドリフト速度が拡散速度を越えて増大される。
【００６３】
大きなＲＮＡまたはＤＮＡ分子は比較的低速で拡散するので、特殊な方法を用いて光トラップで濃縮しなければならない。通常の拡散の場合には、Ｍ１３ファージについて測定されたように、拡散係数が５×１０のマイナス８乗平方センチメートル／ｓであると仮定して、直径０．５μｍの光トラップへの対象配列の拡散にかかる平均時間は約１０のマイナス１０乗Ｃマイナス１乗であって、その場合にｃは対象配列のモル濃度である。ｃ＝１０のマイナス１５乗Ｍですでに、一日の拡散時間が得られる。
【００６４】
拡散時間の短縮は、光トラップの空間要素を拡大することによっても達成させるが、その場合には狭い限界がもたらされる。というのはノイズ背景が空間要素の半径の３乗で上昇するからである。
【００６５】
効果的な方法は、上述したように電場を用いてドリフト速度を増大させることであって、それによって効果的に測定時間を著しく短縮することができる。
【００６６】
その場合に好ましくは、結合されていないプライマーとプライマーによってハイブリッド化された対象配列との毛管電気泳動分離が行われ、その場合に毛管の０．０１ｍｍより小さい尖端開口部が測定体積の前に位置決めされて、毛管内で直流電場が発生され、その電場がプライマーでハイブリッド化され、マイナスに帯電された対象配列を測定体積の方向へ移動させる。
【００６７】
好ましくはここでは引き出された毛管、いわゆるネーエル毛管が使用され、これは例えばネーエルとサクマン（Ｅ．Ｎｅｈｅｒ、Ｂ．Ｓａｋｍａｎｎ）のサイエンティフィック・アメリカンの論文「Ｔｈｅ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」１９９２年３月、第４４ページから第５１ページに記載されている。冒頭で述べたＷＯ９４／１６３１３からは、この種の毛管において約１ｋＶ／ｃｍの場を発生させ、それによって約１ｍｍ／ｓの移動速度がもたらされることがすでに知られている。
【００６８】
毛管の代わりに４極子またはラジアルのイオントラップを使用することができ、その場合に後者が特に効果的である。後者は「点状の」尖端からなり（例えばネーエル毛管）、この尖端が例えば１ｃｍの直径を有する環状電極によって包囲されている。この場合には場は直流場であって、プラスに帯電された毛管の尖端が設けられる。マイナスに帯電された対象構造が非均質の場内で尖端で濃縮される。そこでは場内の移動による到着移送と拡散による搬出移送との間に均衡が存在する。低速で拡散する対象構造はその低分子のプライマーよりも１０の３乗倍まで強く濃縮される。
【００６９】
あるいはまた、好ましくはステップｃ）において高周波の非均質な交流電場が使用され、この電場が対象配列内に双極子モーメントを誘導し、その双極子モーメントが非均質の場内で双極子モーメントとして移動する。
【００７０】
この場合には好ましい方法で、毛管電気泳動分離またはラジアルイオントラップの主要な欠点が除去される。というのはマークされていないプライマーが一緒に濃縮されることが防止されるからである。
【００７１】
アイゲン（Ｍ．Ｅｉｇｅｎ）とシュヴァルツ（Ｇ．Ｓｃｈｗａｒｚ）の「電解質（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）」、ペルガモン  プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）１９６２年の論文「電場における緩和現象から決定される、溶液内の高分子電解質の構造と運動特性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｍｅｎａ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ）」には、小さい棒状の電解質と特にヌクレイン酸が、電場内でイオン雰囲気が高電荷イオンに対して移動することによってもたらされる電気的な分極率を有することが記載されている。特にＤＮＡの場合には、非常に大きな誘導双極子が得られ、この双極子は１０の３乗ボルト／ｃｍの場の強さにおいてすでに場内の完全な整合をもたらす。分極化の緩和時間はマイクロ秒であるので、高周波の交流電場を用いて約１０の５乗から１０の６乗Ｈｚで作業を行うことができる。整合はミリ秒から秒のうちに行われる。
【００７２】
換言すると、高周波の交流電場がヌクレイン酸内に強い双極子モーメントを誘導し、それをこのように供給されたヌクレイン酸を有する溶液の導電性の変化によって示すことができる。しかしこのことは、非均質の高周波の交流電場においてはヌクレイン酸はより場の強い方向へ移動することを意味し、本発明はそれを利用して、測定体積内でマークされた対象配列を濃縮するために用いている。というのは双極子は非均質な場においては場の強さが大きい方向へ移動するからであって、より強い場をそれが測定体積内に位置するように設けることができる。
【００７３】
そのために、ラジアルの電極装置が使用され、この電極装置は光トラップ内に配置された電極尖端と環状の相手側電極から形成される。
【実施例】
【００７４】
本発明の実施例を図面に示し、以下で詳細に説明する。
【００７５】
図１においてヌクレイン酸鎖が対象配列１０の形状で図示されており、対象配列には選択された個々の配列部分が符号ａ、ｂ及びｃで記載されている。
【００７６】
対象配列１０の他に、対象配列１０と共に温置溶液１５内に存在するプライマー１２、１３、１４の混合物１１が図示されている。
【００７７】
プライマーまたはオリゴヌクレオチド１２は部分ａに対して相補的な配列ａ’を有し、プライマー１３と１４は部分ｂないしｃに対して相補的な配列を有する。
【００７８】
プライマー１２、１３、１４はそれぞれ然るべく励起された場合に蛍光光を発する１つまたは多数の色素分子１６でマークされている。色素分子１６は図１ではクロスで象徴されている。
【００７９】
多数のプライマー１２、１３、１４の代わりに、多数の色素分子１６によってマークされ、かつ対象配列１０に対して相補的な、多かれ少なかれ全部揃ったアンチセンス鎖１７を使用し、あるいは対象配列１０を２本鎖に重合化することによって発生させることもできる。
【００８０】
溶液１５が、対象配列１０の二次構造が発生してもそれが完全に溶融される高さであるが、プライマー１２、１３、１４と対応する部分ａ、ｂ、ｃとの間の固有結合を溶融しないだけ十分に低い温度で温置された場合に、プライマー１２、１３、１４が対象配列１０に付加される。その場合に温置温度は、プライマー１２、１３、１４と対象配列１０との間の非固有の結合が再び溶融されるように、十分に高くなければならない。
【００８１】
このようにして得られた溶液１５内では１つの対象配列１０または少数の対象配列１０がそれぞれ多数のプライマー１２、１３、１４を有し、その場合にプライマーは１５から２０構成要素の対象長さを有し、全体で２０から１００の異なるプライマー１２、１３、１４が用意される。
【００８２】
プライマー１２、１３、１４は例えばヌクレイン酸合成材による直接的な合成によって形成することができ、その場合にＤＮＡ合成材を使用すると対象配列１０の部分ａ、ｂ、ｃを有する色素でマークされた短いＤＮＡ鎖が形成される。このＤＮＡ鎖はその後例えばＴ７ポリメラーゼで転写されて、転写生成物がプライマー１２、１３、１４として使用される。「カクテル」と称される混合物１１を形成するこの製造方法は、配列内で部分ａ、ｂ、ｃがわかっていることが前提となる。
【００８３】
それに対して配列内で部分的に、あるいはまったく分かっていないヌクレイン酸鎖１０を対象配列として使用しようとする場合には、プライマー１２、１３、１４は色素分子でマークされたヌクレイン酸構成要素の存在するところで対象配列を複製または転写することによって形成される。これは例えばポリメラーゼ連鎖反応技術、類似の方法を使用して、あるいは例えばＴ７ポリメラーゼなどのＤＮＡないしＲＮＡポリメラーゼ、逆の転写酵素などによって行われる。
【００８４】
複製または転写生成物はその後部分配列に切断され、その場合に生成物をプライマーに切断するために、機械的方法または固有および／または非固有に切断するヌクレアーゼが使用される。もちろんここでは、偽陽性の表示を防止するために、転写／複写の原型として最初に使用される対象配列のどれもが混合物１１内にもはや含まれていないことが保証されなければならない。
【００８５】
対象配列１０とプライマー１２、１３、１４としてＲＮＡ分子もＤＮＡ分子も使用することができる。さらに、プライマー１２、１３、１４として、正の電荷を有することが可能ないわゆるＰＮＡ分子を使用することができるので、結合されたプライマー１２、１３、１４を有する対象配列１０から電気泳動法で自由なプライマー１２、１３、１４が分離される。
【００８６】
アンチセンス鎖１７を使用する場合には、これを調査溶液に付加することができ、その後然るべき温度処理によって２本鎖形成が行われるように配慮される。あるいはまた、対象配列１０に色素でマークされたヌクレイン酸構成要素を付加して、ポリメラーゼを用いて対象配列１０を対象配列１０とアンチセンス鎖１７とからなる２本鎖に重合することも可能である。証明すべき対象配列１０に関する特異性は、対象配列１０にまず、対象配列１０の鎖始端と共に、後にポリメラーゼ用のプライマーとして用いられる２本鎖部分を形成する固有のオリゴヌクレオチドを付加しなければならないことによって得られる。このようにして種々の対象配列１０をポリメラーゼ用の異なるプライマーによって選択することができる。このようにして対象配列が多数の色素分子でマークされた２本鎖に重合される。
【００８７】
温置溶液１５の一部はその後、図２に概略図示され符号２０で示される光学分析装置へ供給され、この分析装置は１つまたは多数のプライマーがハイブリッド化されている証明すべきヌクレイン酸鎖のいくつか、好ましくは１つをハイブリッド化されていないプライマーを背景として判別するように構成されている。
【００８８】
図２に示される装置２０はＦＣＳ装置であって、例えば冒頭で述べたＷＯ９４／１６３１３から知られている。このＦＣＳ装置２１の構造と機能の詳細な説明は、この公報とそれに記載された引例を参照することができる。
【００８９】
簡単に説明すると、ＦＣＳ装置２１はレーザ２２を有し、このレーザはビームスプリッター２３並びに共焦のイメージ光学系２４を介して、０．１から１０ｆｌの範囲にある少量の測定体積２５を照射する。この測定体積２５は共焦の光学系２４を介して光電検出器２６上に結像され、光電検出器はこれ以上詳しく図示しないＦＣＳ分析用の評価電子装置と接続されている。
【００９０】
測定体積２５は、図２では概観性を考えて図示していない温置溶液１５の小部分を覆っている。
【００９１】
温置溶液１５が色素でマークされた上述の２本鎖を含む場合には、温置溶液１５を装置２０に供給する前に、場合によってはさらに色素でマークされた自由なヌクレイン酸構成要素を場合によっては電気泳動で分離しなければならない。２本鎖内に多数の色素分子が存在するので、測定体積２５内へ移動するこの種の２本鎖は閃光として現れ、従ってそのままで同定可能である。供給される、あるいは発生されるアンチセンス鎖１７は対象配列１０に固有に「合っている」だけなので、この種の閃光は、証明すべきヌクレイン酸鎖が実際に対象配列１０を有することを意味している。
【００９２】
プライマー１２、１３、１４でハイブリッド化された対象配列１０を拡散管理されるより速く測定体積２５内へ移動させるために、電気的な分子トラップ２７が設けられており、これは図示の実施例においては環状電極２８とネーエル毛管９を有し、その毛管の引き出された尖端が環状電極２８に対して中央に位置している。
【００９３】
環状電極２８とネーエル毛管２９の間に電圧が印加されると、測定体積２５内への対象配列１０のドリフトが行われる。プライマー１２、１３、１４と対象配列１０が異なる電気量を有する場合には、同時に電気泳動分離が得られる。
【００９４】
しかし図示の実施例においては電圧３０は交流電圧３１であって、環状電極２８とネーエル毛管２９との間に非均質の高周波の交流電場を発生させる。その場合にこの交流電場の周波数は、好ましくは数百ｋＨｚの範囲にある。
【００９５】
この交流電場によって特にＤＮＡにおいては非常に大きな誘導双極子モーメントが発生し、この双極子モーメントは１０マイナス３乗ボルト／ｃｍの場の強さにおいてすでに場内での完全な整合をもたらす。分極の緩和時間はマイクロ秒である。従って約１０の５乗から１０の６乗Ｈｚの高周波の交流場で作業をすることができ、その場合に整合はミリ秒から秒で行われる。この効果が、測定体積２５内でマークされた対象配列を濃縮するために利用される。
【００９６】
その場合に電気的な分子トラップ２７は測定体積２５内に配置されたネーエル
毛管２９の電極尖端を使用し、その場合に電極尖端は１μｍの直径を有する。それに対して環状の相手側電極２５は１ｃｍの直径を有する。
【００９７】
図２では概観を考慮して図示していない温置溶液１５が電極２９、２８間の空間を満たす。この空間内に電圧３０、３１が印加されると非均質のラジアル場が発生し、その場の強さは１／ｒに比例する。従って電極電圧が１０ボルトである場合には、ｒ＝１μｍの尖端で１０の５乗ボルト／ｃｍの場の強さが得られる。
【００９８】
対象配列１０内に誘導される双極子は、この非均質の場においては最高の場の強さの領域に、従って測定体積２５の領域に引き込まれる。
【００９９】
到達し得る双極子モーメントは長さの２乗に比例し、ＤＮＡの場合には等価長さが見積もられるので、マークされた長いヌクレイン酸鎖は応答するが鎖の短いプライマー配列は応答しない場の強さが選択される。高周波の交流場が印加されるので、例えばプロテイン分子などの大きな剛性の双極子も電気的トラップ２７に応答しない。
【０１００】
従ってこのようにして、カクテルを用いることによってマークされたプライマー配列１２、１３、１４を対象配列１０に付加して、この対象配列１０をハイブリッド化されたプライマー１２、１３、１４と共に装置２０の測定体積２５内へ移動させることができる。その場合にカクテルの使用によって測定された信号の強度が増大し、電気的な分子トラップ２７の使用によって必要な測定時間が著しく削減される。というのは拡散速度にドリフト速度が重畳されるからである。
【０１０１】
従って新しい方法と、新しい混合物１１並びに新しい装置２０によって、容認できる測定時間内に既知および／または未知の配列の個々のヌクレイン酸鎖を証明することが可能になる。
【０１０２】
後述するように、測定体積２５内に発生する熱効果は無視することができる：
導電性σと電場の強さＥにおいて散逸するエネルギは、長さｌで直径ｄの毛管が均質な場合には次のようになる。
【数１】
0004542182.tif 000002
【０１０３】
Ｑel＝σＥ2 ｌｄ2 π／４
その場合に電気的な熱等価は約０．２ｃａｌ／Ｗｓとなる。Ｑelを熱の消散によって液体から除去するためには、定常的な温度勾配ｄＴ／ｄｒが必要であって、その場合に媒体は次に示すように熱伝導度λを有すると仮定される。
【数２】
0004542182.tif 000003
【０１０４】
０．２σＥ2 ｌｄ2 π／４＝λｌｄπ・ｄＴ／ｄｒ
あるいは、
【数３】
0004542182.tif 000004
【０１０５】
ｄＴ／ｄｒ＝σＥ2 ・ｄ／λ・２０
水に関するλが１０のマイナス３乗ｃａｌ／（ｃｍ度秒）と仮定し、その場合にσ＜１０マイナス３乗シーメンスでＥ＝１０ボルト／ｃｍである代表的な例においては、毛管が０．１ｃｍの直径を有する場合には、０．５度／ｃｍより小さい温度勾配が得られる。従って、主要な熱停滞が水中で行われ、毛管壁では行われないと仮定して、血清を過度に希釈せずに直接調査することができる。
【０１０６】
同様なことがラジアルの分子トラップ２７についても観察される。ネーエル毛管２９の電極尖端の領域で場の強さは１０マイナス５乗ボルト／ｃｍであるので、μｍの領域では１０の５乗度／ｃｍの温度勾配が発生するが、これはマイクロメータの領域の１０度の過熱に相当する。
【０１０７】
最後に述べておきたいことは、何回も述べたＷＯ９４／１６３１３からすでに一般的な形で知られているように、２つまたは多数の蛍光色素を使用して、クロス相関を実施することによって、測定方法の感度をさらに上昇させることが可能であることである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】対象配列とプライマーとからなる温置溶液の簡略化した概略図である。
【図２】高周波、非均質の電気的交流場を使用する、寸法を無視して記載された電気的な分子沈澱装置を有する光学分析装置を簡略化して示す概略図である。
【符号の説明】
【０１０９】
１０    対象配列
１１    混合物
１２，１３，１４    プライマー
１５    温置溶液
１６    色素分子
１７    アンチセンス鎖
２１    ＦＣＳ装置
２２    レーザ
２３    ビームスプリッター
２４    イメージ光学系
２５    測定体積
２６    光電検出器
２７    分子トラップ
２８    環状電極
２９    ネーエル毛管
３０    電圧
３１    交流電圧
【図１】
0004542182.tif 000005
【図２】
0004542182.tif 000006