(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｈ’）
（ａ’）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び（ｉｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる３成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｂ’）液相から３成分の固相複合体を分離し、
（ｃ’）分離された３成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｄ’）この３成分の固相複合体に（ｉｖ）標識化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｅ’）液相から４成分の固相複合体を分離し、
（ｆ’）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物（ｉｖ）を除去し、
（ｇ’）洗浄された標識された４成分の複合体の検出／測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
（ｉ’）
（ｉ’ａ）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、（ｉｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び（ｉｖ）標識化合物からなる４成分の固相複合体との混合物を準備して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｉｂ’）液相から４成分の固相複合体を分離し、
（ｉｃ’）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｉｄ’）洗浄された標識された４成分の複合体の検出／測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
（ｊ’）
工程（ｈ’）及び工程（ｉ’）で得られた測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項２】
（ｈ）
（ａ）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる３成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｂ）液相から３成分の固相複合体を分離し、
（ｃ）分離された３成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｄ）洗浄された３成分の固相複合体に、（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｅ）液相から４成分の固相複合体を分離し、
（ｆ）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物（ｉｖ）を除去し、
（ｇ）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出／測定すること、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
（ｉ）
（ｉａ）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる４成分の固相複合体との混合物を準備して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｉｂ）液相から４成分の固相複合体を分離し、
（ｉｃ）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｉｄ）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体含量を定量する工程、および
（ｊ）
工程（ｈ）及び工程（ｉ）で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項３】
（ｈ”）
（ａ”）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる３成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｂ”）液相から３成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｃ”）分離された３成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合の化合物を除去し、
（ｄ”）洗浄された３成分の固相複合体に、（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｅ”）液相から４成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｆ”）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物（ｉｖ）を除去し、
（ｇ”）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出／測定すること、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
（ｉ”）
（ｉａ”）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる４成分の固相複合体との混合物を準備して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｉｂ”）液相から４成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｉｃ”）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｉｄ”）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体含量を定量する工程、および
（ｊ”）
工程（ｈ”）及び工程（ｉ”）で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項４】
（ｘ’）
（ｏ’）液相と、（ｉ）試料の抗体及び（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる２成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｐ’）液相から２成分の固相複合体を分離し、
（ｑ’）分離された２成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｒ’）洗浄された２成分の固相複合体に（ｉｉｉ）標識されていないかまたは標識されている抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、３成分の固相複合体を形成し、
（ｓ’）任意に、この３成分の固相複合体に（ｉｖ）標識化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｔ’）溶液からステップ（ｒ’）または（ｓ’）で得られた３成分または４成分の固相複合体をそれぞれ分離し、
（ｕ’）分離された多成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｖ’）洗浄された標識された多成分の複合体の検出／測定を行うこと、
を含む方法を用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
（ｙ’）
（ｙａ’）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び（ｉｉｉ）標識されたあるいは（ｉｖ）標識化合物に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる３成分の固相複合体との混合物を準備して、多成分の固相複合体を形成し、
（ｙｂ’）液相から多成分の固相複合体を分離し、
（ｙｃ’）分離された多成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｙｄ’）洗浄された標識された多成分の複合体の検出／測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
（ｚ’）
工程（ｘ’）及び工程（ｙ’）で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項５】
（ｘ）
（ｏ）液相と、（ｉ）試料の抗体及び（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる２成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｐ）液相から２成分の固相複合体を分離し、
（ｑ）分離された２成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｒ）洗浄された２成分の固相複合体に、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、３成分の固相複合体を形成し、
（ｓ）この３成分の固相複合体に（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｔ）この溶液から４成分の固相複合体を分離し、
（ｕ）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合の化合物（ｉｖ）を除去し、
（ｖ）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出／測定することを含む方法、
を用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
（ｙ’）
（ｙａ）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる４成分の固相複合体との混合物を準備して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｙｂ）液相から４成分の固相複合体を分離し、
（ｙｃ）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｙｄ）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
（ｚ）
工程（ｘ）及び工程（ｙ）で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項６】
（ｘ”）
（ｏ”）液相と、（ｉ）試料の抗体及び（ｉｉ）固体常磁性体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる２成分の固相複合体との混合物を準備し、
（ｐ”）液相から２成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｑ”）分離された２成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｒ”）洗浄された２成分の固相複合体に、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、３成分の固相複合体を形成し、
（ｓ”）この３成分の固相複合体に（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｔ”）この溶液から４成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｕ”）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物（ｉｖ）を除去し、
（ｖ”）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出／測定することを含む方法、
を用いて液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
（ｙ”）
（ｙａ”）液相と、（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、（ｉｉｉ）ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる４成分の固相複合体との混合物を準備して、４成分の固相複合体を形成し、
（ｙｂ”）液相から４成分の固相複合体を磁気的に分離し、
（ｙｃ”）分離された４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（ｙｄ”）洗浄された４成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定することを含むアッセイ、
を用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
（ｚ”）
工程（ｘ”）及び工程（ｙ”）で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び／または予測の指標とする方法。
【請求項７】
成分（ｉ）と（ｉｉ）を混合し、次に、成分（ｉｉｉ）を添加し、添加する場合には、最後に成分（ｉｖ）を添加することにより、ステップ（ｉａ’）、（ｉａ）、（ｉａ”）、（ｙａ’）、（ｙａ）または（ｙａ”）がそれぞれ行われる請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項８】
成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を混合し、次に、添加する場合には、成分（ｉｖ）を添加することにより、ステップ（ｉａ’）、（ｉａ）、（ｉａ”）、（ｙａ’）、（ｙａ）または（ｙａ”）がそれぞれ行われる１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｊ’）、（ｊ）、（ｊ”）、（ｚ’）、（ｚ）または（ｚ”）の比較が、２つの上記ステップにおいて得られる測定値の比を計算することにより行われる請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１０】
治療期間のスタートの時点及び治療期間の間の多数のポイントにおいて、ステップ（ｊ’）、（ｊ）、（ｊ”）、（ｚ’）、（ｚ）または（ｚ”）の比較が行われ、そしてまた、観察されるかもしれないいかなる一時的な変化も治療の効果を評価及び／または予測するための基礎として使用される請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１１】
１）試料の抗体と、試料抗体のＦａｂ領域に特異的である、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドとの間の反応を、試料の他の構成成分の存在下で行って測定値１を得るイムノアッセイを使用して、被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
２）試料の抗体と、抗原、抗体またはハプテンの形の試料抗体のＦａｂ領域に特異的であるリガンドとの間の反応を、試料の他の構成成分の不在下で行って測定値２を得るイムノアッセイを使用して、被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、および
３）測定値１及び測定値２の相互関係付けを行って妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用する工程、
を含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。
【請求項１２】
Ａ）
（Ａａ）（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体キャリアに結合している、試料抗体のＦｃ領域に特異的な抗体、及び（ｉｉｉ）試料抗体のＦａｂに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドを混合して、３成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ａｂ）３成分の複合体を（ｉｖ）標識化合物と接触させて、４成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ａｃ）４成分の固相を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ａｄ）洗浄された標識された４成分の複合体の検出／測定を行って、測定値Ａを得ることを含むアッセイプロトコルＡを用いて被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
Ｂ）
（Ｂａ）（ｉ）試料の抗体及び（ｉｉ）固体キャリアに結合している、試料抗体のＦｃ領域に特異的な反応物抗体を混合して、２成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ｂｂ）２成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ｂｃ）洗浄された２成分の固相複合体を、（ｉｉｉ）試料抗体のＦａｂに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド及び（ｉｖ）標識化合物と接触させて、４成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ｂｄ）４成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ｂｅ）洗浄された標識された４成分の複合体の検出／測定を行って、測定値Ｂを得ることを含むアッセイプロトコルＢを用いて上記試料中の上記抗体の含量を定量する工程、および
（Ｅ）
測定値Ａ及びＢの相互関係付けを行って、妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用する工程を含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。
【請求項１３】
ステップＡａの３成分の固相複合体と液相の上記混合物に上記（ｉｖ）標識化合物を添加することにより、ステップＡｂが行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップＡａで得られた３成分の固相複合体を洗浄して非複合体結合の化合物を除去し、そして引き続き、洗浄された３成分の複合体に上記（ｉｖ）標識化合物を添加することにより、ステップＡｂが行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記（ｉｉｉ）リガンドと上記（ｉｖ）標識化合物を２成分の複合体と同時にインキュベートすることによりステップＢｄが行われる、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
上記（ｉｉｉ）リガンドを２成分の複合体に添加して、３成分の複合体を形成し、次にそれを洗浄して非複合体結合（ｉｉｉ）リガンドを除去し、次に上記（ｉｖ）標識化合物を添加して４成分の複合体を形成する、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標識化合物が発光性標識、化学発光性標識、酵素標識、放射性標識、蛍光性標識または吸光性標識である請求項１１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
（ｉｉｉ）リガンドがビオチニル化されている請求項１１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記（ｉｖ）標識化合物がアビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの機能的誘導体に共有結合した化学発光化合物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ）
（Ｃａ）（ｉ）試料の抗体、（ｉｉ）固体キャリアに結合している、試料抗体のＦｃ領域に特異的な抗体及び（ｉｉｉ）試料抗体のＦａｂに特異的である、抗原、抗体またはハプテンの形の標識されたリガンドを混合して、３成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ｃｂ）３成分の固相を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ｃｃ）洗浄された標識された３成分の複合体の検出／測定を行って、測定値Ｃを得ることを含むアッセイプロトコルＣを用いて被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
Ｄ）
（Ｄａ）（ｉ）試料の抗体及び（ｉｉ）固体キャリアに結合している、試料抗体のＦｃ領域に特異的な反応物抗体を混合して、２成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ｄｂ）２成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ｄｃ）洗浄された２成分の固相複合体を、（ｉｉｉ）試料抗体のＦａｂに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形の標識されたリガンドと接触させて、３成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
（Ｄｄ）３成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
（Ｄｅ）洗浄された標識された３成分の複合体の検出／測定を行って、測定値Ｄを得ることを含むアッセイプロトコルＤを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
（Ｅ）
測定値Ｃ及び測定値Ｄの相互関係付けを行って妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用するステップを含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。
【請求項２１】
標識されたリガンドが放射性原子により標識されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
評価対象の被験者がアレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療または特異的アレルギーワクチン注射（ＳＡＶ）治療を受けている請求項１１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
キャリアが粒子である請求項１２から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
キャリアが常磁性粒子である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料抗体が特異的ＩｇＥである請求項１１から２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は液体試料中において特異的抗体を検出する方法に関する。
【０００２】
従来技術
ＷＯ  ９４／１１７３４には、化学発光標識とビオチン結合リガンドを用いる抗体に対する２部位のイムノアッセイが記述されており、上記方法は、（ａ）液体試料と、リガンド抗原、ビオチンまたはその官能性誘導体に結合されている抗体またはハプテン、常磁性粒子に結合されている検出対象の抗体に特異的な抗体及びアビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に結合されている化学発光を持つアクリジニウム化合物とを混合して、固相複合体を形成し、（ｂ）液相から固相を磁気的に分離し、（ｃ）存在する場合、分離された固相中で化学発光反応を開始し、そして、（ｄ）試料中の上記抗体の存在を示す、化学発光相の存在について分離された固相を分析するステップを含んでなる。
【０００３】
従来技術の方法は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのサブクラスの群から選ばれる特異的免疫グロブリン等の体液中の特異的免疫グロブリンの濃度を測定するのに特に好適である。
【０００４】
従来技術の方法は、また、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのサブクラス等のクラスまたはサブクラスにおける免疫グロブリンの全含量の検出及び定量にも好適である。
【０００５】
従来技術の方法の好ましい実施形態において、固相複合体の形成は２ステップで、すなわち、試料と、ビオチンを結合したリガンド抗原、抗体またはハプテン及び常磁性粒子に結合されている抗体とを混合して、第１の固相複合体を形成させる第１のステップ、及び第１の固相複合体に化学発光を持つアクリジニウム化合物を添加して、第２の固相複合体を形成させる第２のステップで行われる。
【０００６】
しかしながら、従来技術の方法の実際的な使用により、この方法のある用途においては、他の型の免疫グロブリン及び／または測定対象以外の他の型の免疫活性血清成分による干渉が起こり、得られる結果の誤差に至るという事実が明らかになった。
【０００７】
「特異的ＩｇＥに対する捕捉アッセイ、Ｖ．  Ｏｌｉｖｉｅｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｍｕｕｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉ５７（１９９３）６５−７２」という論文には、溶液中でモノクローナル抗ヒトＩｇＥ（マイクロタイタープレートの穴にコートされた）とビオチニル化アレルゲンを用いてアレルギー患者の血清中の特異的ＩｇＥを測定するアッセイが開示されている。一度のインキューベーションにおいて、ＩｇＥは、Ｆｃフラグメントにより固相に結合し、ビオチニル化アレルゲンは、特異的ＩｇＥのＦａｂ領域と反応する。第２のステップにおいては、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体が添加されて、固相に固定されたビオチン量を明らかにする。この論文は、高レベルの非特異的ＩｇＥと、アレルゲン特異的ＩｇＧによる干渉を研究する。このアッセイは、アレルゲン特異的ＩｇＧにより影響を受けないことがわかった。
【０００８】
ＷＯ９８／１６８２９には、抗免疫グロブリンがマイクロタイタープレートの穴と結合し、次に洗浄されるアッセイが開示されている。次に、試験血清を穴に添加して、試験試料中の全標的免疫グロブリンをすべて捕捉する。次に、生物学的流体試料を吸引し、マイクロタイタープレートを洗浄する。マイクロタイタープレート上の捕捉抗体をビオチニル化アレルゲンに曝露し、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ共役体を添加し、再度プレートを洗浄する。標準的な抗生物質治療によるＨ．Ｐｙｌｏｒｉ感染治療に及ぼす影響をモニターするために、従来技術のアッセイが使用されうる。
【０００９】
発明の要約
本発明の第１の目的は、固体粒子に結合したＦｃ特異的な抗体とＦａｂ特異的なリガンドに標的抗体を複合化させ、試験試料の他の成分からの干渉という上記に説明した欠点に悩まされないタイプの方法を提供することである。
【００１０】
この第１の目的は本発明の方法により達成され、その第１の態様は請求項１から６に定義される。本発明の本質的な新しい特徴は、リガンドの添加に先立ち、反応物抗体を持つ粒子と試料抗体からなる中間の固相複合体を分離、洗浄する追加のシーケンスを行うことである。
【００１１】
本発明の方法は、このような分離と洗浄の追加のシーケンスを導入することにより、液体試料から潜在的に干渉性の過剰な材料並びに潜在的に干渉性の過剰な成分（ｉｉ）をこの方法から除去し、それにより以降のステップにおける上記の因子の干渉のリスクが無くされるという認識に基づく。驚くべきことに、このような分離と洗浄の追加のシーケンスは、異るタイプの免疫活性血清成分の間の干渉の技術的問題を実質的に低減し、ある場合には無くすることがわかった。
【００１２】
得られる干渉の低減は多くの技術的利点を含む。特に、困難で、予測できない比の抗体混合物を有する問題の血清を更に正確に測定することが可能になる。更に、抗体を誤って陽性に同定することが回避される。また、干渉の低減により、従来技術の方法によるよりも広い抗体濃度範囲で更に正確な測定が可能になる。
【００１３】
本発明の第２の目的は、特異的アレルギーワクチン注射（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＡＶ）の効果を評価及び／または予測することが可能な方法を提供することである。
【００１４】
この第２の目的は、請求項７から１２に定義される、本発明の第２の態様により得られる。この態様によれば、異るタイプの免疫活性血清成分、例えば抗体の間の干渉のレベル、性質及び一時的な発現は、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するパラメーターとして使用される。このように、驚くべきことに、上記パラメーターは、人の免疫状態並びに選ばれた治療スキームへの応答について貴重な情報を保持することがわかった。
【００１５】
本発明の第３の目的は、対象の免疫状態を評価する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の第３の目的は、請求項２０から３１に定義される、本発明の第３の態様により得られる。この態様によれば、異るタイプの免疫活性血清成分、例えば抗体の間の干渉のレベル、性質及び一時的な発現は、対象の免疫状態を評価するパラメーターとして、特にアレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療または特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び／または予測するパラメーターとして使用される。このように、驚くべきことに、上記パラメーターは人の免疫状態並びに選ばれた治療スキームへの応答についての貴重な情報を保持することがわかった。
【００１７】
本発明の第４の目的は、対象のアレルギー治療の効果を評価する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の第４の目的は、請求項３２から３５に定義される、本発明の第４の態様により得られる。本発明のこの態様は、サブアッセイ１、Ａ及びＣ（それぞれ、請求項２０、２１及び２９を参照のこと）により得られる測定、すなわち、試料中の干渉性因子の存在下で行う測定は、アレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療及び特異的アレルギーワクチン注射治療（ＳＡＶ）の効果を評価するのに特に有用であるという認識に基づく。このように、この方法により得られる測定は、インビボ条件に相当する条件下で得られ、それゆえ、治療効果を評価するための更に生理学的で臨床的関連測定である。
【００１９】
本発明の第１の態様
本発明の第１の態様の好ましい実施形態は、ステップ（ｒ’）、（ｒ）または（ｒ”）の成分（ｉｉｉ）及びステップ（ｓ’）、（ｓ）または（ｓ”）の成分（ｉｖ）をそれぞれ一つの操作で添加することを特徴とする。
【００２０】
本発明の第１の態様の第１の別な実施形態は、ステップ（ｓ’）、（ｓ）または（ｓ”）にかけるのに先立ち、ステップ（ｒ’）、（ｒ）または（ｒ”）において形成される３成分固相複合体をそれぞれ洗浄して、非複合体結合化合物を除去することを特徴とする。
【００２１】
本発明の第２の態様
以前、特異的免疫療法または減感作として知られていた特異的アレルギーワクチン注射（ＳＡＶ）は、この世紀の初頭以来、タイプ１ＩｇＥ仲介のアレルギー疾患の治療に使用されてきた。
【００２２】
ＳＡＶにより得られる全般的な利益は、ａ）アレルギー症状及び薬の消費の減少、ｂ）目、鼻及び肺中のアレルゲンに対する耐性の改善及びｃ）皮膚の反応性の低下（早期及び後期反応）である。
【００２３】
ＳＡＶにより得られる改善の背後にある基本的な機構は未知であるが、最近数十年で行われた多数のＳＡＶの研究から、次の多数の共通した特徴を抽出することができる：１）全ＩｇＥの量は治療期間の間変化しない、２）アレルゲン特異的ＩｇＥの量は、用量を上げる（ｕｐｄｏｓｉｎｇ）時、過渡的に増加し、次に低下して、初期（前治療）レベルに戻る、３）ＩｇＥのエピトープ特異性及び親和性は、変化しないままである、４）アレルゲン特異的ＩｇＧ、特にＩｇＧ４はＳＡＶ時急激に上昇する、５）新しいＴｈ０／１応答は見掛け上開始する、６）Ｔｈ２応答は変化しないように見える。ＳＡＶにより誘導される効果と特異的ＩｇＧの発現の間に相関はない。
【００２４】
ＳＡＶは、治療期間の間成熟する新しい免疫応答を誘導する（Ｔｈ０／１細胞が補強され、アレルゲン特異的ＩｇＸ（ＸはＡ１、Ａ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、ＭまたはＤであってよい）が開始する）。新しい免疫応答のＩｇＸの親和性（または量／親和性）が成熟したのに従い、ＩｇＸはアレルゲンに対してＩｇＥと効率的に競合し、肥満細胞及び好塩基球の表面上の受容体を結合したＩｇＥの架橋により特徴付けられるアレルギー応答に基づく「正常な」Ｔｈ２を阻害する。それゆえ、臨床的な症状は徐々に低減される。
【００２５】
本発明は、競合化合物（ＩｇＧ及び／または任意の他の干渉物質）の存在下及び不在下で特異的ＩｇＥの量を測定すると、個別患者における免疫応答の競合能力の目安が計算され、この目安が適当な効果パラメーターと相関するという仮説に基づく。
【００２６】
従来技術の「定量的な」ＩｇＥアッセイは大多数、競合化合物の不在下でＩｇＥを測定する。本発明は、任意（血清起源の）の競合化合物の存在下及び不在下でのＩｇＥの測定を記述する。このように、請求項１から６（図２ａからｃを参照）に定義される方法は、競合化合物の不在下でＩｇＥを測定し、一方、請求項７から１２のステップ（ｉ’）、（ｉ）、（ｉ”）、（ｙ’）、（ｙ）及び（ｙ”）に定義される方法は、それぞれ競合化合物の存在下でＩｇＥを測定する。
【００２７】
本発明の方法の作用モードは、次のように説明されると考えられる。ＳＡＶがアレルゲンの結合に対してＩｇＥと競合する応答を誘導するならば、上述の２つの方法により定量されるＩｇＥを比較することにより、治療の効果を測定することが可能であるはずである。２つの方法が同じ結果を生むならば、干渉物質は誘導されていず、効果はない。更に、後者の方法（競合化合物の存在下）の測定が前者の方法（競合化合物の不在下）の測定よりも低いならば、競合応答が組み込まれており、治療の効果がある。
【００２８】
本発明の第２の態様（請求項７から１２）として、この方法において２つのサブアッセイが使用される。それぞれ他の試料構成成分の不在下（サブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）、（ｈ”）、（ｘ’）、（ｘ）及び（ｘ”））及び存在下（サブアッセイ（ｉ’）、（ｉ）、（ｉ”）、（ｙ’）、（ｙ）及び（ｙ”））で、試料抗体とアレルゲンの間の反応を行うサブアッセイである。
【００２９】
サブアッセイ（ｈ）及び（ｈ”）においては、化学発光性標識はアクリジニウム化合物である。
【００３０】
サブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）の好ましい実施形態は、ステップ（ａ’）、（ａ）または（ａ”）において、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を一つの操作で混合することを特徴とする（図３ｂ）。
【００３１】
サブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）の第１の別の実施形態は、ステップ（ａ’）、（ａ）または（ａ”）において、成分（ｉ）及び（ｉｉ）を第１の操作で混合し、成分（ｉｉｉ）を第２の操作で混合することを特徴とする（図３ｃ）。
【００３２】
第２の別のサブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）は、ステップ（ａ’）、（ａ）または（ａ”）において、成分（ｉ）及び（ｉｉｉ）を第１の操作で混合し、成分（ｉｉ）を第２の操作で混合することを特徴とする（図３ａ）。
【００３３】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態は、成分（ｉ）と（ｉｉ）を混合し、次に、成分（ｉｉｉ）を添加し、最後に、添加する場合には、成分（ｉｖ）を添加することにより、ステップ（ｉａ’）、（ｉａ）、（ｉａ”）、（ｙａ’）、（ｙａ）または（ｙａ”）を行うことを特徴とする。
【００３４】
本発明の第２の態様のもう一つの好ましい実施形態は、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を混合し、次に、最後に、添加する場合には、成分（ｉｖ）を添加することにより、ステップ（ｉａ’）、（ｉａ）、（ｉａ”）、（ｙａ’）、（ｙａ）または（ｙａ”）を行うことを特徴とする。
【００３５】
更なる好ましい実施形態は、上記２つのステップの測定の比を計算することにより、ステップ（ｊ’）、（ｊ）、（ｊ”）、（ｚ’）、（ｚ）または（ｚ”）の比較を行うことを特徴とする。あるいは、比較は、２つの測定の間の差を計算することにより行われる。
【００３６】
本発明の次の更なる実施形態は、上記２つのステップの測定の比を計算することにより、治療期間のスタートの時点及び治療期間の間の多数のポイントにおいて、ステップ（ｊ’）、（ｊ）、（ｊ”）、（ｚ’）、（ｚ）または（ｚ”）の比較を行うこと、また、治療の効果を評価及び／または予測するための基礎として、観察されうるいいかなる一時的な変化も使用することを特徴とする。
【００３７】
本発明の第３の態様
本発明の第３の態様は、第２の態様と同じ認識及び仮説に基づくが、その差異は、第３の態様がいかなる特定のイムノアッセイ法にも限定されないことである。また、第３の態様によれば、すべてのタイプのアレルギー治療の効果を予測するためにこのアッセイが使用されうる。
【００３８】
２つの測定の間の比または差を計算することにより、得られた２つの測定の相互関係付けが行われる。
【００３９】
「アレルギー治療」という用語は、アレルギーのいかなる治療も意味する。「アレルギーワクチン注射治療」という用語は、アレルギーのいかなるワクチン注射治療も意味する。「特異的アレルギーワクチン注射治療（ＳＡＶ）」という用語は上述されている。
【００４０】
定義
本発明においては、「試料の抗体」及び「試料抗体」という表現は、特異的免疫グロブリン、好ましくはクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのサブクラスの特異的免疫グロブリンを意味する。一般に、上記抗体は、免疫グロブリンと抗原、抗体またはハプテン、例えば酵素阻害剤及び受容体の形のリガンドの間の相互作用を特異的に干渉することが可能ないかなる血清または血漿成分であってよい。
【００４１】
「液体試料」という用語は、溶液、エマルジョン、分散剤及び懸濁剤を含む、いかなる液体あるいは液化試料も意味する。試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液及び生物体内で排泄、分泌あるいは輸送される任意の他の流体等の生物学的流体であってよい。
【００４２】
「抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド」という表現は、いかなる免疫的に活性な物質であってもよい。「抗原」は、アレルゲン、例えば木、草、雑草などからの花粉、かびアレルゲン、コナダニ（ダニ）及び猫、犬、馬、牛及び鳥からのアレルゲン、刺す昆虫のアレルゲン、昆虫に起源する吸い込まれたアレルゲン、及び食物アレルゲンであってよい。「抗体」は組み替え型及びフラグメント化抗体を含む、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体であってよい。「ハプテン」は、炭水化物部分またはそのフラグメント、酵素阻害剤または薬剤、例えばペニシリンまたはその誘導体であってよい。
【００４３】
「標識されたリガンド」という表現は、標識された原子または部分、例えば放射性原子標識を含むいかなるリガンドも意味する。
【００４４】
「標識化合物」という表現は、発光性標識、化学発光性標識、酵素標識、放射性標識、蛍光性標識、及び吸光性標識を含むイムノアッセイに慣用されるいかなる好適な標識系も意味する。
【００４５】
「キャリア」という用語は、イムノアッセイに使用されるいかなる固体支持体も意味し、それは、例えば、マイクロタイタープレート、粒子、管、ポリマー材料のスポンジ（マトリックス）である。
【００４６】
「固体粒子」という用語は、液体中に懸濁することができる、いかなる粒状物質も意味し、それは例えば、ガラスビーズ、金属、例えば鉄粒子、ポリマー材料の粒子である。
【００４７】
液相からの固相複合体の分離は、使用される固体粒子のタイプに依り、磁気分離、濾過、沈降、遠心分離、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーにより行われる。
【００４８】
「常磁性固体粒子」という用語は、液体媒体中に分散あるいは懸濁される、いかなる常磁性粒子も意味し、それは、例えば、米国、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，により販売されている「ビオマグ（Ｂｉｏｍａｇ）」粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）、及びノルウエー、Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．により販売されている「ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）」粒子（ポリマーで被覆された酸化鉄粒子）である。
【００４９】
「反応物抗体」という用語は、組換え型及びフラグメント化抗体を含む、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体を含んでなる試料抗体と反応することが可能ないかなる抗体または他の生物特異的試剤も意味し、それは、例えば、モノクローナル抗体、スエーデン、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢにより供給されている「プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）」または米国セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ」により供給されている「プロテインＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）」を含む。
【００５０】
化学発光化合物は、好ましくはＮ−ヒドロキシ−スクシニミドジメチルアクリジニウムエステル（ＮＨＳ−ＤＭＡＥ）等のアクリジニウム化合物である。アビジン／ストレプトアビジン及びＤＭＡＥは、Ｗｅｅｋｓら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２９，１４７４−１４７９（１９８３）の方法にしたがって結合される。本発明における使用に好適な化学発光化合物の他の例は、ルミノール、ルシゲニン及びロフィンである。
【００５１】
次に、図に関して本発明を更に詳細に説明する。
【００５２】
図面の簡単な説明
図１ａからｂは、ＷＯ９４／１１７３４に開示されている従来技術のアッセイの２つの実施形態（従来技術の方法Ａ及びＢ）の図表示である。
【００５３】
図２ａからｃは、請求項７から９（サブの方法）に定義される方法における使用に好適な３つの好ましいアッセイの図表示である。
【００５４】
図３ａからｃは、本発明の第１の態様による３つの好ましいアッセイの図表示である。
【００５５】
図４から６は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブの方法１による特異的ＩｇＥの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【００５６】
図７は、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブ方法１による干渉性抗体の含量の関数としての相対的な化学発光レベルを示す。
【００５７】
図８から１２は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【００５８】
図１３から１４は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による０、６及び１２ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【００５９】
図１５は、方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の比を示す。
【００６０】
図１６から１８は、有効、無効及び疑問の３つの臨床効果群に対する０、６及び１２ケ月の時点での相対的なＩｇＥレベルを示す。
【００６１】
図１９は、種々のＳＡＶ治療用量に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【００６２】
図２０は、それぞれ臨床効果のある患者と臨床効果のない患者に対して、方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた平均応答の時間の関数としての比を示す。
【００６３】
図２１は、臨床効果のある個別患者に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【００６４】
図２２は、臨床効果のない個別の患者に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【００６５】
図１ａは、ＷＯ９４／１１７３４に開示されているアッセイの一つの実施形態の原理を示す。このアッセイにおいては、試料（ｉ）中の検出対象の抗体（特異性ＩｇＥ）を常磁性粒子に結合した反応物抗体と混合して、２成分の複合体を形成し、インキュベートし、次に、ビオチニル化されたアレルゲン（ｉｉｉ）を添加して３成分の複合体を形成し、インキュベートして、次に、それに、アビジン／ストレプトアビジン（ｉｖ）に結合した化学発光性アクリジニウム化合物を添加して４成分の複合体を形成し、洗浄して、次に、洗浄した複合体の化学発光を測定する。
【００６６】
図１ｂは、従来技術のアッセイのもう一つの実施形態を示す。そこでは、成分（ｉ）及び（ｉｉｉ）を混合して２成分の複合体を形成し、また、次に成分（ｉｉ）及び（ｉｖ）を添加し、得られる混合物をインキュベートして４成分の複合体を形成し、洗浄し、化学発光の測定にかける。
【００６７】
図１ａ及び１ｂのアッセイにおいては、交差反応性ＩｇＥ抗体及びアレルゲン特異的非ＩｇＥ抗体を含む、試料のすべての構成成分は、以降の反応中に存在して、４成分の複合体の形成につながる。
【００６８】
図２ａは、本発明の第２の態様の好ましい実施形態（請求項２）を示す。そこでは、成分（ｉ）及び（ｉｉ）を混合し、インキュベートして２成分の複合体を形成し、洗浄する。次に、それに成分（ｉｉｉ）を添加して３成分の複合体を形成し、その後、成分（ｉｖ）を添加して４成分の複合体を形成し、洗浄して、化学発光の測定にかける。
【００６９】
図２ｂは、本発明の第２の態様のもう一つの好ましい実施形態（請求項５）を示す。これは、成分（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を一つの操作で添加することを除いて、図２ａに示したものに対応する。
【００７０】
図２ｃは、本発明の第２の態様の更なる好ましい実施形態（請求項６）を示す。これは、成分（ｉｖ）の添加の前に、形成された３成分の複合体を洗浄ステップにかけることを除いて、図２ａに示したものに対応する
図２ａ、２ｂ及び２ｃのアッセイにおいては、交差反応性ＩｇＥ抗体及びアレルゲン特異的非ＩｇＥ抗体を含む、試料のすべての構成成分を、成分（ｉｉ）との反応の後除去する。それゆえ、以降の反応中には不在であって、４成分の複合体の形成につながる。
【００７１】
図３ａは、請求項７から９のサブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）の好ましい実施形態を示す。そこでは、成分（ｉ）及び（ｉｉｉ）を第１の操作で混合して、２成分の複合体を形成し、次に、それに成分（ｉｉ）を第２の操作で添加して、得られる混合物をインキュベートして３成分の複合体を形成し、成分（ｉｖ）を添加する前に洗浄して、化学発光の測定にかける。
【００７２】
図３ｂは、請求項７から９のサブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）のもう一つの好ましい実施形態を示す。そこでは、成分（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を一つの操作で混合して３成分の複合体を形成し、洗浄し、その後に、成分（ｉｖ）を添加して４成分の複合体を形成し、化学発光の測定にかける。
【００７３】
図３ｃは、請求項７から９のサブアッセイ（ｈ’）、（ｈ）及び（ｈ”）の更なる好ましい実施形態を示す。そこでは、成分（ｉ）及び（ｉｉ）を混合して、２成分の複合体を形成し、それに成分（ｉｉｉ）を添加して３成分の複合体を形成し、それを洗浄して、その後、成分（ｉｖ）を添加して４成分の複合体を形成し、これも洗浄して、化学発光の測定にかける。
【００７４】
図３ａ、３ｂ及び３ｃのアッセイにおいては、交差反応性ＩｇＥ抗体及びアレルゲン特異的非ＩｇＥ抗体を含む、試料のすべての構成成分を、成分（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）との反応の後除去する。それゆえ、以降の反応中には不在であって、４成分の複合体の形成につながる。
【００７５】
次に、本発明は実施例を参照して更に詳細に説明される。
【００７６】
試薬の調製
ビオチニル化ヤケヒョウヒダニ
ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）抽出物（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を３０：１のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳ、クロンテック社製、米国）をジメチルホルムアミド（メルク社製）に溶解し、最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとする。Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳのこの溶液５５．４μｌを、２．４４ｍｇ／ｍｌのヤケヒョウヒダニ１ｍｌを含有するｐＨ８．５、０．１ＭのＮａＨＣＯ３に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーにおいて２５℃で１５分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はＰＤ１０−カラム（ファルマシア社製）のサイズ排除クロマトグラフィーによって非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化ヤケヒョウヒダニを０．１％ヒト血清アルブミン（シグマ社製）と０．０９％ＮａＮ３（メルク社製）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。
【００７７】
ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータ
アルテルナリアアルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）抽出物（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を３０：１のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳ、クロンテック社製、米国）をジメチルホルムアミド（メルク社製）に解し、最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとする。Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳのこの溶液３８．６μｌを、１．７ｍｇ／ｍｌのアルテルナリアアルテルナータ１ｍｌを含有するｐＨ８．５、０．１ＭのＮａＨＣＯ３に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーで２５℃、１５分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はＰＤ１０−カラム（ファルマシア社製）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータを０．１％ヒト血清アルブミン（シグマ社製）と０．０９％ＮａＮ３（メルク社製）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。
【００７８】
ビオチニル化シラカンバ（シダレカンバ）
シラカンバ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）花粉抽出物（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を１０：１のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳ、クロンテック社製、米国）をジメチルホルムアミド（メルク社製）に溶解し、最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとする。Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳのこの溶液３３．５μｌを、４．４ｍｇ／ｍｌのシラカンバ１ｍｌを含有するｐＨ８．５、０．１ＭのＮａＨＣＯ３に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーで２５℃、１５分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はＰＤ１０−カラム（ファルマシア社製）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化シラカンバを０．１％ヒト血清アルブミン（シグマ社製）と０．０９％ＮａＮ３（メルク社製）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。
【００７９】
ストレプトアビジンアクリジニウムエステル標識の調製
ウィークス（Ｗｅｅｋｓ）らの変法を用いて、ストレプトアビジン（ベーリンガーマンハイム社製）をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ｛２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル−１０−（３−スルフォプロピル）−アクリジニウム−９−カルボン酸塩｝でコンジュゲートする（参照文献１）。
【００８０】
ストレプトアビジン−アクリジニウムエステル標識（ライト試薬）の調製：
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（カイロンダイアグノスティクス社製、マサチューセッツ州、米国）をジメチルホルムアミド（メルク社製）に溶解し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとする。この溶液０．５ｍｌを５．８８ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンを含むｐＨ８．５、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液の１．７ｍｌに加える。その試薬を２５℃で３０分間攪拌しながらインキュベートする。インキュベーション後に２０ｍｇ／ｍｌの６−アミノ−ｎ−ヘキサン酸（シグマ社製）０．４ｍｌを加える。非結合ＤＭＡＥを除去するため、溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製、ウプサラ市、スウェーデン）に充填する。コンジュゲート化ストレプトアビジンをｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で溶離し、コンジュゲート化ストレプトアビジンを含んでいる画分を収集する。コンジュゲート化ストレプトアビジンを０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（シグマ社製）と１％Ｔｗｅｅｎ２０（メルク社製）と０．０９％ＮａＮ３を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で最終濃度まで希釈する。
【００８１】
常磁性粒子への抗体の不動化：
６．５ｇの常磁性粒子（カイロンダイアグノスティクス社製、マサチューセッツ州、米国）を磁気分離を用いてｐＨ５．５、０．０１Ｍのアセテート緩衝液６５０ｍｌで３回洗浄する。粒子を６．２５％グルタルアルデヒド（メルク社製）とｐＨ５．５の０．０１Ｍアセテート緩衝液中で２５℃で、３時間活性化する。粒子をｐＨ５．５のアセテート緩衝液６５０ｍｌで６回洗浄する。粒子をＩｇＥのＦｃ領域に対して特異的なモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（バイオインベントインターナショナルＡＢ社製、スウェーデン）１６２５ｍｇと２５℃、１６時間結合させる。粒子をｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液６５０ｍｌで２回洗浄する。過剰な活性群の阻止をｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液に溶解したヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）１０８３ｍｇで２５℃で、２０時間行なう。粒子をｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液６５０ｍｌで洗浄し、次いで１ＭのＮａＣｌ溶液（メルク社製）６５０ｍｌで３回洗浄する。粒子をｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄し、次いでｐＨ７．４の０．１％ヒト血清アルブミン、リン酸緩衝液６５０ｍｌ（シグマ社製）で洗浄する。粒子を３２５ｍｌで再懸濁し、５０℃で１６時間加熱処理する。粒子をｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液６５０ｍｌと０．１％ヒト血清アルブミン中で４回洗浄する。粒子をｐＨ７．４の０．１％ヒト血清アルブミン、０．０１Ｍリン酸緩衝液６５０ｍｌ中で３日目と５日目に緩衝液を交換しながら、３７℃で７日間加熱処理する。粒子を０．１％ヒト血清アルブミン（シグマ社製）と０．０９％ＮａＮ３を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で最終濃度まで希釈する。
【００８２】
アッセイ用洗浄緩衝液
アッセイ用洗浄緩衝液はｐＨ７．４の２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液と、１００ｍＭの塩化カリウム溶液と、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と、０．０９％ＮａＮ３から成る。試薬は全てメルク社製である。
【００８３】
実施例１
特異抗体の測定（特異的ＩｇＥ）
シラカンバ（シダレカンバ）アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ抗体の測定をそれぞれの方法で定められた検量希釈において上記に詳述した試薬を用いて三つの異なる方法で行った。三方法は先行技術方法Ｂ（図１ｂ）と、この発明に関する方法１（図２ａ、請求項２）およびこの発明に関する副法１（図３ａ）である。
【００８４】
先行技術方法Ｂ
この方法は参照文献２に記載されるチバコーニング社製ＡＣＳ：１８０ベンチトップ型免疫分析機で行なう。分析機は通常２回のインキュベーション時間を提供するため４０秒周期のソフトウェアを特別に備えている。試料５０μｌと１：１５００希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン５０μｌを試料プローブによってキュベットに分注する。インキュベーション１２分後にキュベットが試薬プローブＲ２に達すると、１：２０希釈した常磁性粒子１００μｌと１：１００００希釈したライト試薬２００μｌが同時に分注されて、キュベットはトラックを降りる。磁石および洗浄位置には、さらに１２分４０秒のインキュベーション後に到達する。脱イオン水７５０μｌで洗浄を２回行なう。洗浄サイクル完了後、０．５ｇ／ｌＨ２Ｏ２を３００μｌ含有する０．１ＭのＨＮＯ３で常磁性粒子を再懸濁する。キュベットはルミノメータチャンバーに入り、光電子倍増管の正面で２５ｍＭのＮａＯＨ溶液３００μｌが加えられ、放出される光の光子を測定、定性し、相対的光単位（ＲＬＵ）として表す。ＲＬＵの量は試料中のＩｇＥの量に比例する。試料分注から最初の結果が出るまでの時間は３０分であり、４０秒毎に新しい結果が続く。結果はＲＬＵ実測値／ＲＬＵバックグラウンドとして表し、ここでＲＬＵバックグラウンドはＩｇＥを欠いた化学発光反応とした。
【００８５】
方法１
この方法は参照文献２に記載されるチバコーニング社製ＡＣＳ：１８０ベンチトップ型免疫分析機の改良型で行なう。試料２５μｌを試料プローブでキュベットに分注し、その後直ちに１：２０希釈した常磁性粒子１００μｌを固定されたプローブで分注する。８分のインキュベーション後、常磁性粒子を磁気的に分離し１ｍｌの洗浄緩衝液で１回洗浄する。常磁性粒子を１００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、１：１５００希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン５０μｌをキュベットに加える。１０分のインキュベーション後、１：１５００希釈したライト試薬１００μｌを固定されたプローブで分注し、さらに８分のインキュベーション後、常磁性粒子を磁気的に分離し、１ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄サイクル完了後、０．５ｇ／ｌＨ２Ｏ２を３００μｌ含有する０．１ＭのＨＮＯ３に常磁性粒子を再懸濁する。キュベットはルミノメータチャンバーに入り、光電子倍増管の正面で２５ｍＭのＮａＯＨ溶液３００μｌが加えられ、放出される光の光子を測定、定量し、相対的光単位（ＲＬＵ）として表す。ＲＬＵの量は試料中のＩｇＥの量に比例する。結果はＲＬＵ実測値／ＲＬＵバックグラウンドとして表し、ここでＲＬＵバックグラウンドはＩｇＥを欠いた化学発光反応とした。
【００８６】
副法１
この方法は５ｍｌポリスチレン試験管（サーステッド社製）で手動で行なう。試料２５μｌを１：５０希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン５０μｌと混合する。３７℃で１２分インキュベーション後、１：２０希釈した常磁性粒子１００μｌを加え、常磁性粒子を磁気的に分離する前に混合物を３７℃で５分３０秒間インキュベートし、マジックライトマルチチューブウォッシャー（Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  Ｍｕｌｔｉｔｕｂｅ  Ｗａｓｈｅｒ）（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を用いて洗浄緩衝液３ｍｌで１回洗浄する。常磁性粒子を１：１００００希釈したライト試薬２００μｌで再懸濁し、常磁性粒子を磁気的に分離する前に３７℃で７分３０秒間インキュベートし、マジックライトマルチチューブウォッシャー（Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  Ｍｕｌｔｉｔｕｂｅ  Ｗａｓｈｅｒ）（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を用いて洗浄緩衝液３ｍｌで２回洗浄する。常磁性粒子を１００μｌの脱イオン水に再懸濁し、まず０．５ｇ／ｌＨ２Ｏ２を３００μｌ含有する０．１ＭのＨＮＯ３を、次いで２５ｍＭのＮａＯＨ溶液３００μｌを加えて、化学発光反応をマジックライトアナライザーＩＩ（Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  ＡｎａｌｙｚｅｒＩＩ）（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）で測定する。放出される光の光子を測定、定量し、相対的光単位（ＲＬＵ）として表す。ＲＬＵの量は試料中のＩｇＥの量に比例する。結果はＲＬＵ実測値／ＲＬＵバックグラウンドとして表し、ここでＲＬＵバックグラウンドはＩｇＥを欠いた化学発光反応とした。
【００８７】
バーチ花粉感受性患者５人の血清プールを１４０ＳＵ／ｍｌから１．１ＳＵ／ｍｌまで８試料を与えるため２倍連続希釈した。これら８試料を陰性試料（バックグラウンド）とバーチ花粉感受性患者からの８試料と共に上述した三つの方法で同時に測定した。それぞれ図４、５および６を参照のこと。測定した全ての試料は三つの方法全てを用いて陽性として検出可能であると結論付けられる。
【００８８】
実施例２
他のクラス（ＩｇＧ）由来の特異的抗体との干渉
シラカンバ（シダレカンバ）アレルゲンに対する特異的ＩｇＥの測定を匹敵する特異的抗体の変化量の存在において、実施例１に記載したような異なる三つの方法で行った。より具体的には、バーチ花粉感受性患者５人の血清プールを異なる力価のウサギポリクロナール抗シラカンバ抗体（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）を含むＩｇＥ陰性血清と１：５の割合で混合した。対照はウサギ抗体を含まなかった。
【００８９】
図７に示された結果を対照に対する試料中のウサギ抗体で得られた応答として計算した％回収として表す。応答はシグナル／バックグラウンドで与えられる。１００％未満の回収は拮抗する抗体の付加により応答が減少するが、１００％より上の回収は拮抗する抗体の付加により応答が増大することを示す。
【００９０】
方法１は同時の方法よりも他のクラス由来の拮抗する抗体による干渉が少ないと結論付けられる。拮抗する抗体の添加が副法１において有意の陽性干渉で、特に高い量の干渉している抗体を伴う結果となるのに対し、方法１においては干渉は完全に除かれているように思われる。
【００９１】
実施例３
特異的アレルギーワクチン（ＳＡＶ）を接種している患者からの試料との希釈曲線
ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータアレルゲンをビオチニル化シラカンバアレルゲンの代わりに用いることを以外は、アルテルナリアアルテルナータ（カビ）アレルゲンに対する特異的ＩｇＥの測定を実施例１に記載の先行技術方法Ｂおよび方法１で行なった。ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータアレルゲンの検量希釈は先行技術方法および方法１の双方において１：４００であった。
【００９２】
特異的アレルギーワクチン（ＳＡＶ）を接種した患者４人からの血清をそれぞれ異なる二つの方法での測定に先立ち、４つの試料を与えるため２倍連続希釈した。参照試料として、アルテルナリアアルテルナータ感受性患者５人の血清プールを用いた。
【００９３】
図８から１２はＳＡＶ患者４人の試料と参照試料に関する結果を示す。図８から１２に示される結果は予想される応答に対して異なる希釈血清で得られた応答である。％回収は（希釈力価）×（観察された応答）／（希釈されない試料の応答）の形で計算される。応答はシグナル／バックグラウンドで与えられる。１００％以下の回収は希釈した血清の応答が予想したよりも低いことを示すが、１００％よりも高い回収は予想したよりも高いことを示す。それゆえに１００％よりも高い回収は希釈していない試料で得られた応答が真の値よりも低く評価されていることを示す。
【００９４】
図８から１２からは、ＳＡＶ試料については先行技術方法は希釈されないＳＡＶ試料の真の値を低く評価するものの、方法１ではより一層正確な評価結果となるようである。ＳＡＶを条件としない患者血清プールについてはどちらの方法も申し分無くより一層正確な値を与える。
【００９５】
洗浄ステップを２回含む方法１は、ＳＡＶを条件とする患者からの血清試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥの量を先行技術方法Ｂよりもさらに一層信頼のおける評価ができると結論付けられる。
【００９６】
実施例４
家ぼこりダニＳＡＶ間の免疫応答のモニター観察
ビオチン化ベツラ・ヴェルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）アレルゲンの代わりにビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）アレルゲンを用いる以外は、実施例１に記載するように従来の方法Ｂおよび方法１によりデルマトファゴイデス・プテロニシヌス（家ぼこりダニ）アレルゲンに対する特異的ＩｇＥの測定を実施した。従来の方法Ｂおよび方法１の両方においてビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲンの使用希釈率は１：２５０であった。
【００９７】
臨床試験に参加している患者から血清試料を入手した。３０人の全患者にプラセボ（Ｎ＝１４）またはデルマトファゴイデス・プテロニシヌスおよびデルマトファゴイデス・ファリーナ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）アレルゲン（アルタード、ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）の１：１の混合物を含むＳＡＶ（Ｎ＝１６）のいずれかを投与した。処置前（ｔ＝０）、処置の６か月後（ｔ＝６）および処置の１２か月後（ｔ＝１２）に試料を採り、全試料を２種の異なる方法により分析した。結果を相対的応答＝（シグナル−バックグラウンド）／（シグナルｈｉｇｈ−バックグラウンド）（ここでシグナルｈｉｇｈとは検出すべき特異的抗体の含量が高い血清プールのシグナルである）として求めた。これらの結果を図１３から１４に示す。従来の方法Ｂおよび方法１で得られた結果の比率をとることによりさらに一連のデータを得た。これらの結果を図１５に示す。
【００９８】
結論
血清特異的ＩｇＥを測定するために用いたいずれの方法（従来の方法Ｂまたは方法１）でもＳＡＶ間の活性およびプラセボ処置群を判別することができなかった（図１３から１４）。しかしながら、驚くべきことに従来の方法および本発明の方法で得られた結果の比率（比率＝ＩｇＥ（従来の方法Ｂ）ｔ／ＩｇＥ（方法１）ｔ）によりＳＡＶ開始後６および１２か月で活性およびプラセボ処置群が判別される。さらに、ほぼ１個の比率の切り捨て値は、個々の患者がプラセボまたは活性処置群に属することが予測し得るほどであり（図１７、ｔ＝１２）、すなわちこれはＳＡＶ効果パラメーターである。
【００９９】
統計：
ノンパラメトリック検定［マーン−ホイットニー・Ｕ−テスト（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔ）］により統計学的分析を実施した。０．０５未満の推計学的な両側確率は有意であると考えられた。ＮＳとは有意でないことを意味し、そうでない場合は実際の確率を図に記載している。
【０１００】
実施例５
家ぼこりダニＳＡＶ間の免疫応答のモニター観察
前記の試薬を各方法で規定する使用希釈率で用いて２種の異なる方法によりデルマトファゴイデス・プテロニシヌス（家ぼこりダニ）アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ抗体の測定を実施した。用いた二つの方法は、従来の方法Ａ（図１ａ）および本発明による方法１（図２ａ、請求項２）である。
【０１０１】
従来の方法Ａ
この方法は参照文献に記載されているチバ・コーニングＡＣＳ：１８０ベンチトップ・イムノアッセイ・アナライザーの改良版で実施した。試料プローブにより３．２５μｌの試料をキュベットに分注し、その後即座に固定したプローブで１：２０に希釈した常磁性体粒子１００μｌを分注した。８時間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、洗浄はしない。常磁性体粒子を１００μｌの洗浄バッファー中に再懸濁し、１：２５０に希釈したビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲン５０μｌをキュベットに加えた。１０分間のインキュベーションの後、固定プローブで１：５０００に希釈したライト（ｌｉｔｅ）試薬１００μｌを分注し、８分間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、１ｍｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄サイクルが完了した後、常磁性体粒子を０．１Ｍ  ＨＮＯ３中０．５ｇ／ｌ  Ｈ２Ｏ２３００μｌに再懸濁する。キュベットをルミノメーター・チャンバーに入れ、光電子増倍管の正面で２５ｍＭ  ＮａＯＨ溶液３００μｌを加え、放出される光の光量子を測定し、定量して相対的光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ：ＲＬＵ）として表した。ＲＬＵの量は試料中のＩｇＥの量に比例する。結果をＲＬＵ実験値／ＲＬＵバックグラウンド（ここでＲＬＵバックグラウンドはＩｇＥ不在下の化学発光反応である）として表した。
【０１０２】
方法１
この方法は参照文献に記載されているチバ・コーニングＡＣＳ：１８０ベンチトップ・イムノアッセイ・アナライザーの改良版で実施した。試料プローブにより２．２５μｌの試料をキュベットに分注し、その後即座に固定したプローブで１：２０に希釈した常磁性体粒子１００μｌを分注した。８時間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、１ｍｌの洗浄バッファーで１回洗浄した。常磁性体粒子を１００μｌの洗浄バッファー中に再懸濁し、１：２５０に希釈したビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲン５０μｌをキュベットに加えた。１０分間のインキュベーションの後、固定プローブで１：５０００に希釈したライト（ｌｉｔｅ）試薬１００μｌを分注し、８分間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、１ｍｌの洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄サイクルが完了した後、常磁性体粒子を０．１Ｍ  ＨＮＯ３中０．５ｇ／ｌ  Ｈ２Ｏ２３００μｌに再懸濁する。キュベットをルミノメーター・チャンバーに入れ、光電子増倍管の正面で２５ｍＭ  ＮａＯＨ溶液３００μｌを加え、放出される光の光量子を測定し、定量して相対的光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ：ＲＬＵ）として表した。ＲＬＵの量は試料中のＩｇＥの量に比例する。結果をＲＬＵ実験値／ＲＬＵバックグラウンド（ここでＲＬＵバックグラウンドはＩｇＥ不在下の化学発光反応である）として表した。
【０１０３】
本試験には２８人の患者が参加した。１３人の患者にはなんら処置を施さず、７人の患者には投与量レベル１００のＳＡＶ処置を施し、８人の患者には投与量レベル３００のＳＡＶ処置を施した。ＳＡＶ処置では最初の２１週間の投与量増量期間中は毎週デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（家ぼこりダニ）アレルゲンの投与量を皮下注射により患者に投与し、続いて２年間１００または３００ＳＱユニットの投与量を６から８週間毎に投与した。
【０１０４】
この研究では皮膚プリック試験（ｓｋｉｎ  ｐｒｉｃｋ  ｔｅｓｔ：ＳＰＴ）および気管支刺激試験（ｂｒｏｎｃｉａｌ  ｐｒｏｂａｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ：ＢＰＴ）に基づく効果パラメーターを用いる。ここで用いた臨床効果パラメーターは以下の通りにして得られた：相対皮膚指数（ＳＩ（時間＝ｘ）−ＳＩ（時間＝０））を用いて患者を２群に集めた（有効＝皮膚感受性の低下、および無効＝皮膚感受性に変化無し）。同様に相対刺激試験（ｌｏｇＢＰＴ（時間＝ｘ）−ｌｏｇＢＰＴ（時間＝０））を用いて患者を２群に集めた（有効＝気管支感受性の低下、および無効＝気管支感受性に変化無し）。二つの測定値を一つの臨床効果パラメーターにまとめた：臨床的有効＝両測定で有効、臨床的無効＝両測定で無効および臨床効果に疑いあり＝一方の測定では有効であるが他方の測定では無効である。
【０１０５】
図１６から１８は臨床効果による３群、「有効」、「無効」および「疑いあり」に関して時間０（ＬＴ Ｓ０ ０）、６（ＬＴ Ｓ６ ０）、１２（ＬＴ Ｓ１２ ０）および２４（ＬＴ Ｓ２４ ０）か月での相対的ＩｇＥレベルを示している。時間＝０は処置前の値である。ｎｎ ｉｉｉの様式の曲線の表示は患者認識番号（ｎｎ）および処置の形式（ｉｉｉ）を意味し、ここでｉｉｉ＝０は処置していないこと、ならびにｉｉｉ＝１００またはｉｉｉ＝３００は各々投与量レベル１００および３００で処置したことを意味する。０．１４における直線は任意の切り捨て値である。相対的ＩｇＥ値は以下のとおり定義する：
ｌｏｇ（応答（方法１）／応答（従来の方法Ａ））ｔ＝ｘ−
ｌｏｇ（応答（方法１）／応答（従来の方法Ａ））ｔ＝０
ここでｔ＝時間、ｘ＝０、６、１２または２４か月であり、応答＝シグナル／バックグラウンドである。
【０１０６】
図１６から明らかであるように、臨床効果を示した全ての患者で方法１の応答が従来の方法Ａの応答より高く、このことはアレルゲンと効果的に反応できる非ＩｇＥ競合抗体応答が始まっていることを意味する。図１７から臨床上無効の群の患者には競合抗体応答が進行しているものはいないようである。最終的には、図１８から臨床上疑わしい群の１人の患者で皮膚プリック試験でのみ検出される陽性の競合抗体応答が進行しているようである。対照群（ｎｎ  ０）で競合抗体応答が上昇しているかのように判断された患者はいなかったので、この試験により処置および未処置患者が判別される。
【０１０７】
結論
血清試料中競合物質の存在および不在時に測定した、すなわち各々方法１および従来の方法Ａにより測定したＩｇＥの比率によりＳＡＶの効果が予測されると考えられる。さらに、インビトロで測定した効果は処置スケジュールの初期に観察できる。恐らく競合物質は非ＩｇＥ抗体であろうが、アレルゲンと特異的に反応するいかなる血清物質も同様に挙動するものと考えられる。
【０１０８】
実施例６
ビオチン化Ｄｅｒ  ｐ：
Ｄｅｒ  ｐ１はリシル残基を１個のみおよびＮＨ２末端アミノ酸を含有し、これらはビオチン化に利用できる。「通常の」標識試薬（これらはＮＨ２基を標的とする）を用いて粗Ｄｅｒ  ｐ抽出物をビオチン化した場合、得られた標識Ｄｅｒ  ｐ抽出物はＤｅｒ  ｐ２およびその他のアレルゲンに対して偏向性のある感受性を有する傾向がある。
【０１０９】
よりバランスのとれたＤｅｒ  ｐ試薬は以下のようにして得ることができる：粗Ｄｅｒ  ｐ抽出物を記載のとおりビオチン化し、チロシンおよびヒスチジン残基を誘導できるビオチン試薬を用いて標識したビオチン化Ｄｅｒ  ｐ１調製物を加えた。得られた混合物を以下の検定に用いた。
【０１１０】
Ｄｅｒ  ｐ１のビオチン化：
製造指示書に従って、安定な前駆体ｐ−アミノベンゾイル・ビオシチン（ピアース、米国）から調製したｐ−ジアゾベンゾイル・ビオシチンを用いてＤｅｒ  ｐ１（ＡＬＫ−アベロウ  Ａ／Ｓ、ホーショルム、デンマーク）をビオチン化した。得られたｐ−ジアゾベンゾイル・ビオシチン溶液は理論上の濃度１．８２ｍｇ／ｍｌ（３．３８ｍＭと等価）であり、ｐ−アミノベンゾイル・ビオシチンからｐ−ジアゾベンゾイル・ビオシチンに１００％の効率で変換したと考えられる。３４３μｌのｐ−ジアゾベンゾイル・ビオシチン溶液を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中１．７４ｍｇ／ｍｌ  Ｄｅｒ  ｐ１  １ｍｌに加えることにより、Ｄｅｒ  ｐ１はモル比１７：１でビオチン化され、Ｄｅｒ  ｐ１の分子量は２５ｋＤａと考えられる。この方法のその後の工程はビオトキシン−ＸＸ−ＮＨＳエステルを用いるビオチン化に関して前記したとおりである。
【０１１１】
器具
アドゥヴィア・ケンタウロス・アナライザー（バイエル・ディアグノースティックス）を用いて試料を分析した。二つのプロトコルを用いて各試料中のＤｅｒ  ｐ特異的ＩｇＥの量を決定した：二工程法（Ｔ）ではビオチン化したアレルゲンを加える前に干渉物質（例えば非ＩｇＥ抗体）を除去する洗浄を行い、同時性プロトコル（Ｓ）ではビオチン化アレルゲンを加えるときに干渉物質（例えば非ＩｇＥ抗体）が存在していてもよい。方法Ｔおよび方法Ｓはアレルゲンが前記のとおりビオチン化されていること以外は実施例５に記載の方法１および従来の方法Ａに相当する。
【０１１２】
材料および方法
ビオチン化Ｄｅｒ  ｐ１の１：２５０希釈物を作り、この試薬を前記のとおりに調製し希釈した通常のＤｅｒ  ｐ試薬と１：４で混合してビオチン化アレルゲン試薬を作った。
【０１１３】
Ｄｅｒ  ｐを含むＳＡＶを投与されたＤｅｒ  ｐアレルギー患者からＳＡＶ開始後０、０．５、１、２、３、６、９、１２、１８および２４か月に血清試料（Ｎ＝４８）を採取した。患者を４つの処置群：対照（Ｎ＝１５）、用量１０（Ｎ＝１２）、用量１００（Ｎ＝９）および用量３００（Ｎ＝１１）に振り分け、Ｄｅｒ  ｐアルタードで２４か月間示した用量で処置した。
【０１１４】
ＳＡＶの期間の前後で臨床パラメーターＳＰＴ（皮膚プリック試験：Ｓｋｉｎ  Ｐｒｉｃｋ  Ｔｅｓｔ）、ＢＰＴ（気管支刺激試験：Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）およびＣＰＴ（角膜刺激試験：Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）を測定し、臨床パラメーターを分析した群から効果の測定法を構築した。２または３個のパラメーターが陽性である場合ＳＡＶは有効と判断され、１または０個のパラメーターが陽性である場合無効と判断された。
【０１１５】
二つのプロトコル（ＴおよびＳ）に従って血清試料中のＩｇＥを測定し、ＬＮ（Ｔｉ／Ｓｉ）−ＬＮ（Ｔ０／Ｓ０）（ここでｉは時間（＞０＜＝２４）であり、０はパラメーター値である）に従って基底値補正したインビトロ効果パラメーターを算出した。
【０１１６】
結果
ＬＮ（Ｔｉ／Ｓｉ）−ＬＮ（Ｔ０／Ｓ０）および投与量間で明らかな用量依存的応答の関係があり（図１９；効果パラメーターの用量依存的応答）、これはパラメーターが用量依存的に患者の免疫学的変化を測定していることを示している。図２０（平均効果パラメーター）は臨床効果が認められたおよび認められなかった患者に関してインビトロ効果パラメーターとして得られた値の平均値を表しており、図２１（有効：個々の患者）および図２２（無効：個々の患者）では個々の患者に関してインビトロパラメーターが示されている。臨床的に効果的な進展をみた全ての患者において６から２４か月の時間で対照群の域を超えてインビトロパラメーターが上昇していることが示されており、これらの全ての患者は活性なＤｅｒ  ｐＳＡＶの投与を受けていた。明らかな臨床効果が認められなかった４人の患者（１４％）はインビトロ効果パラメーターによる効果はあると判断される。
【０１１７】
結論
インビトロ効果パラメーターは患者の状態の臨床評価とよく相関すると考えられ、インビトロパラメーターはＳＡＶ６か月後のＳＡＶの結果を予測しており、一方臨床効果は通常１２または２４か月後に明らかになる。
【０１１８】
参照文献
１）  Ｉａｎ  Ｗｅｅｋｓ、Ｉｒａｊ  Ｂｅｈｅｓｈｔｉ、Ｆｒａｎｋ  ＭｃＣａｐｒａ、Ａｎｔｈｏｎｅｙ  Ｋ．ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＪ．Ｓｔｕａｒｔ  Ｗｏｏｄｈｅａｄ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８３、２９：１４７４−１４７９（１９８３）。
【０１１９】
２）  Ｊ．Ｂｏｌａｎｄ、Ｇ．Ｃａｒｅｙ、Ｅ．ＫｒｏｄｅｌおよびＭ．Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０、３６：１５９８−１６０２。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】ＷＯ９４／１１７３４に開示されている従来技術のアッセイの２つの実施形態（従来技術の方法Ａ及びＢ）の図表示である。
【図１ｂ】ＷＯ９４／１１７３４に開示されている従来技術のアッセイの２つの実施形態（従来技術の方法Ａ及びＢ）の図表示である。
【図２ａ】請求項７から９（サブの方法）に定義される方法における使用に好適な３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図２ｂ】請求項７から９（サブの方法）に定義される方法における使用に好適な３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図２ｃ】請求項７から９（サブの方法）に定義される方法における使用に好適な３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図３ａ】本発明の第１の態様による３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図３ｂ】本発明の第１の態様による３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図３ｃ】本発明の第１の態様による３つの好ましいアッセイの図表示である。
【図４】図４は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブの方法１による特異的ＩｇＥの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図５】図５は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブの方法１による特異的ＩｇＥの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図６】図６は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブの方法１による特異的ＩｇＥの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図７】図７は、従来技術の方法Ｂ、本発明の方法１及び本発明のサブ方法１による干渉性抗体の含量の関数としての相対的な化学発光レベルを示す。
【図８】図８は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図９】図９は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図１０】図１０は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図１１】図１１は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図１２】図１２は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの４つの試料及び一つの参照試料（図１２）についての従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図１３】図１３は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による０、６及び１２ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【図１４】図１４は、それぞれ、従来技術の方法Ｂ及び本発明の方法１による０、６及び１２ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【図１５】図１５は、方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の比を示す。
【図１６】図１６は、有効、無効及び疑問の３つの臨床効果群に対する０、６及び１２ケ月の時点での相対的なＩｇＥレベルを示す。
【図１７】図１７は、有効、無効及び疑問の３つの臨床効果群に対する０、６及び１２ケ月の時点での相対的なＩｇＥレベルを示す。
【図１８】図１８は、有効、無効及び疑問の３つの臨床効果群に対する０、６及び１２ケ月の時点での相対的なＩｇＥレベルを示す。
【図１９】図１９は、種々のＳＡＶ治療用量に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【図２０】図２０は、それぞれ臨床効果のある患者と臨床効果のない患者に対して、方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた平均応答の時間の関数としての比を示す。
【図２１】図２１は、臨床効果のある個別患者に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【図２２】図２２は、臨床効果のない個別の患者に対する方法１により得られた応答に対する従来技術の方法Ｂにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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