(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫外光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイおよび分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに紫外光を照射し、タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。
【請求項２】
紫外光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイ、紫外光照射手段、光検出手段を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、紫外光照射手段によりタンパク質アレイに紫外光を照射し、光検出手段によりタンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
さらに、データ処理手段を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
タンパク質がタンパク質アレイの１スポット当たり0.01μg/mm2以上の密度で固定化されている請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
タンパク質がタンパク質アレイの１スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
高密度で整列固定化したタンパク質が、式  NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y  [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
紫外光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
紫外光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
紫外光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて紫外光を照射し、タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。
【請求項１５】
紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質がタンパク質アレイの１スポット当たり0.0１μg/mm2以上の密度で固定化されている請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質がタンパク質アレイの１スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
高密度で整列固定化したタンパク質が、式  NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y  [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
紫外光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
紫外光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイ上のタンパク質ならびに該タンパク質と他のタンパク質および／またはタンパク質以外の化合物の相互作用を、タンパク質の紫外、可視または赤外光域での吸収を分光光度計を用いて測定することにより検出・解析するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子にコードされている未知のタンパク質の機能を探り、また多数個のタンパク質の複雑な相互作用を一度に解析する手段としてタンパク質アレイ（タンパク質チップ）は新たな可能性を提供する技術である。タンパク質アレイはタンパク質やペプチドを基板上に並べたものであり、種々のタンパク質アレイについて報告されている（特許文献１および２参照）。タンパク質アレイ技術において、適当な基板上にタンパク質を固定化し、該固定化タンパク質に他のタンパク質等を相互作用させ、相互作用したアレイ上のスポットを検出していた。【０００３】
アレイ上のスポットの検出方法としては、蛍光色素等でラベルした固定化タンパク質と相互作用し得る化合物を用い、アレイ上に存在する蛍光色素から発せられる蛍光を測定していた。しかし、この方法においてはラベル標品を調製する必要があり、またタンパク質をラベルすることにより、タンパク質の活性が低下することがあるという問題点もあった。さらに、蛍光測定機器等でアレイを測定できる機器はそれほど普及しておらず、さらにタンパク質の相互作用をリアルタイムで解析することはできなかた。【０００４】
この問題点を解決するために、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance; SPR)イメージング法を利用して検出する方法が開発されている（非特許文献１および２参照）。この方法は、タンパク質アレイ上に偏光光束を照射し、その反射光をSPR像として得て、SPR像の反射光強度を解析することにより、アレイ上に固定化されたタンパク質を検出する方法である。該方法はラベルを必要とせず、リアルタイムで検出することができるという利点があった。しかしながら、SPRイメージング法によっても、固定化したタンパク質と低分子物質との相互作用の解析に用いることはできず、該方法はダイナミックレンジが狭いという問題もあった。さらに、SPRイメージングに用いる機器は、極めて高価であり、検出システムの構築は容易ではないという問題点もあった。【０００５】
また、タンパク質アレイに水晶発振子を組込んで、検出する方法も報告されている（非特許文献３参照）が、この方法も上記SPRイメージング法を利用した方法と同様な問題点があった。【０００６】
さらに、顕微フーリエ変換赤外分光法（顕微FT-IR）を利用して、検出する方法も報告されている（特許文献３参照）が、測定機器が高価であり、必ずしも定量には適していなかった。【０００７】
【特許文献１】特表2002-520618号公報
【特許文献２】特表2002-502038号公報
【特許文献３】特開2004-45390号公報
【非特許文献１】Nelson, B. P. et al., Anal Chem. 71(18)3928-3934(1999)
【非特許文献２】Brockman, J.M. et al., Annu. Rev. Phys. Chem, 51, 41-63 (2000)）
【非特許文献３】Y. Okahata, et al. J. Am, Chem. Soc., 114, 8299-8300 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、従来用いられていたタンパク質アレイおよびタンパク質アレイを用いた検出・解析システムの上記問題点を解決すべく、アレイ基板上にタンパク質を配向制御して高密度で固定化し、紫外光、可視光または赤外光を固定化タンパク質に照射し、タンパク質に吸収されなかった光を測定することにより、基板上のタンパク質を検出し、さらに基板上のタンパク質と他のタンパク質および／またはタンパク質以外の化合物との相互作用を解析する方法および装置の提供、ならびに該システムに適合したタンパク質アレイの提供を目的とする。特に、アレイ基板として紫外光透過性の基板を用い、タンパク質が固定化された基板に紫外光を照射することにより、タンパク質により吸収されなかった紫外光を測定し、基板上のタンパク質を検出し、さらに基板上のタンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物、特にタンパク質と相互作用し得る低分子化合物との相互作用を解析する方法および装置の提供、ならびに該システムに適合したタンパク質アレイの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、従来技術の問題点に鑑み、蛍光色素等によるタンパク質のラベリングの必要がなく、なおかつ安価で入手可能な機器を利用したタンパク質アレイを用いたタンパク質とタンパク質および／または他の物質との相互作用の検出・解析システムを開発すべく鋭意検討を行った。【００１０】
従来法においては、微小量の検出に対応すべく、アレイ基板上へタンパク質をフェムトモル(f moles)オーダーからピコモル(p moles)オーダーで固定化しており、微小量のタンパク質を検出するために、蛍光色素等でラベリングを行ったり、SPRのような特別な機器を要するシステムを用いていることに着目した。本発明者は先に、アレイ基板上にタンパク質を配向制御させて高密度で固定化する方法を完成させており（特許第2517861号公報、特許第2990271号公報、特許第3047029号、特開2003-344396号公報等）、この方法によれば従来より１オーダーから、２オーダー上回るnmole/cm2 オーダーで基板上にタンパク質を固定化することができる。本発明者は、この高密度でタンパク質を固定化したタンパク質アレイを用いることにより、蛍光色素でラベリングしたり、高価な機器を用いることなく、一般に普及しており比較的安価で入手できる分光光度計を用いて、アレイ上のタンパク質をタンパク質の光学的活性を測定することにより測定し得ることを見出した。すなわち、基板上にタンパク質が高密度で大量に固定化されているので、該固定化タンパク質にタンパク質または固定化タンパク質と相互作用する物質が吸収する波長の光を照射することにより、照射した光がアレイ上のタンパク質またはタンパク質と相互作用する物質に吸収される。そして、吸収されずに透過した光の強度を測定することにより、固定化タンパク質またはタンパク質と相互作用する物質による吸収を測定することができ、アレイ基板上のタンパク質またはタンパク質と相互作用する物質を光学的活性を利用して直接測定し得ることを見出した。特に、タンパク質は紫外光を吸収するが、石英ガラス等の紫外光透過性の基板を用いることにより、タンパク質に吸収されなかった紫外光をタンパク質が固定化されたアレイ基板を通る透過光として測定することができた。ここで、アレイ上に固定化された各タンパク質スポットにおける光透過を一度に測定するためには、CCD等の２次元光検出器の使用が望まれるが、紫外光を検出し得る２次元光検出器は、極めて高価であり、容易にシステムを構築することはできなかった。そこで、本発明者らは、タンパク質を固定化した基板を透過した紫外光を、蛍光ガラス等の紫外-可視光変換デバイスを用いて可視光に変換することにより、安価で入手し得るCCDを用いることをできるようにし、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
[１]  光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイおよび分光光度計を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、分光光度計を用いて前記タンパク質アレイに光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１２】
[２]  光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイ、光照射手段、光検出手段を含む、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステムであって、光照射手段によりタンパク質アレイに光を照射し、光検出手段によりタンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／またはタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１３】
[３]  さらに、データ処理手段を含む、[２]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１４】
[４]  タンパク質がタンパク質アレイの１スポット当たり0.01μg/mm2以上の密度で固定化されている[１]〜[３]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１５】
[５]  タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている[１]〜[３]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１６】
[６]  高密度で整列固定化したタンパク質が、式  NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y  [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、[１]〜[５]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１７】
[７]  光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、[１]〜[６]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１８】
[８]  光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、[１]〜[７]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００１９】
[９]  タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性基板である[１]〜[８]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２０】
[１０]  紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である[９]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２１】
[１１]  タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を検出する[９]または[１０]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２２】
[１２]  紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである[１１]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２３】
[１３]  タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、[１]〜[１２]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２４】
[１４]  タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、[１]〜[１２]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２５】
[１５]  光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、[１]〜[１２]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析するシステム。【００２６】
[１６]  光透過性基板上にタンパク質を高密度で整列固定化したタンパク質アレイに分光光度計を用いて光を照射し、タンパク質アレイを透過した光を測定することによりアレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定し、タンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００２７】
[１７]  タンパク質がタンパク質アレイの１スポット当たり0.0１μg/mm2以上の密度で固定化されている[１６]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００２８】
[１８]  タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている[１６]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００２９】
[１９]  高密度で整列固定化したタンパク質が、式  NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y  [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表し、Yは基板を表す]で示される、[１６]〜[１８]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３０】
[２０]  光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された、[１６]〜[１９]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３１】
[２１]  光検出手段がCCDまたはフォトダイオードアレイである、[１６]〜[２０]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３２】
[２２]  タンパク質アレイに照射される光が紫外光であり、光透過性基板が紫外光透過性基板である[１６]〜[２１]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３３】
[２３]  紫外光透過性基板が石英ガラス製基板である[２２]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３４】
[２４]  タンパク質アレイを透過した紫外光を紫外-可視光変換デバイスに照射し、紫外光から可視光に変換された光を検出する[２２]または[２３]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３５】
[２５]  紫外-可視光変換デバイスが蛍光ガラスである[２４]のタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３６】
[２６]  タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と検体を接触させ、接触前後におけるタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、固定化タンパク質と相互作用する検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出する、[１６]〜[２５]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３７】
[２７]  タンパク質アレイ上に固定化されたタンパク質と他のタンパク質または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を接触させ、接触前後にわたってタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物による光の吸収を測定することにより、タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、[１６]〜[２５]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３８】
[２８]  光透過性基板が、内部に流路が形成されたフローチャンネルセルまたはマイクロチップであり、該流路内にタンパク質が固定化されており、検体を該流路を通すことにより、固定化タンパク質と検体中のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物との相互作用を解析する、[１６]〜[２５]のいずれかのタンパク質アレイ上のタンパク質および／または固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物を検出・解析する方法。【００３９】
[２９]  式  NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y  [式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列を表す]で示されるタンパク質が高密度で整列固定化したタンパク質アレイであって、Yで表される固定化基板が光透過性ガラス製であるタンパク質アレイ。【００４０】
[３０]  光透過性ガラスが紫外光透過性ガラスである[２９]のタンパク質アレイ。【００４１】
[３１]  紫外光透過性ガラスが石英ガラスである[３０]のタンパク質アレイ。【００４２】
[３２]  タンパク質がタンパク質アレイの１スポット当たり0.0１μg/mm2以上の密度で固定化されている[２９]〜[３１]のいずれかのタンパク質アレイ。【００４３】
[３３]  タンパク質がタンパク質アレイの1スポットにおける吸光度が0.001以上となる密度で固定されている[２９]〜[３１]のいずれかのタンパク質アレイ。【００４４】
[３４]  光透過性ガラスの表面にキャストされた一級アミンを含む担体とタンパク質のアミノ酸配列のC末端のカルボキシ基が共有結合してタンパク質が整列固定化された[２９]〜[３３]のいずれかのタンパク質アレイ。
【発明の効果】
【００４５】
本発明において用いるタンパク質アレイは、光透過性の基板上にタンパク質を配向制御して高密度で固定化してあるため、光を照射して基板を透過した光を測定することにより、タンパク質による光の吸収を求めることができ、光の吸収からタンパク質アレイ上のタンパク質の量を測定することができる。このため、従来法のように、蛍光色素等でラベルした化合物等を検出に用いる必要がなく、基板上のタンパク質の量をタンパク質の光学活性を測定することにより直接測定することができる。さらに、本発明は、紫外光、可視光、赤外光を測定するため、広く普及している分光光度計を用いて容易にタンパク質アレイ上のタンパク質量を測定することができる。特に、タンパク質の定量手段として広く行われている、紫外光吸収を用いてタンパク質アレイ上のタンパク質を正確に測定することができる。さらに、光検出手段としてCCD等の２次元光検出手段を用いることにより、タンパク質アレイ上の各スポットのタンパク質を一度に迅速に測定することができる。また、紫外光を透過し得る基板と紫外光を可視光に転換しえる蛍光ガラス等の紫外-可視変換デバイスを用いることにより、容易に安価で入手できるデジタルカメラ用のCCDを使用することができ、システム構築にかかる費用も少なくてすむ。【００４６】
また、タンパク質と他のタンパク質もしくはタンパク質以外の化合物との結合等の相互作用をアレイ上のタンパク質の吸光の変化あるいはタンパク質以外の化合物の吸光を測定することにより解析することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のシステムを示す図である。
【図２】フローシステムの概要を示す図である。図１のタンパク質固定化光透過性基板３の位置に装着される。
【図３】緑色蛍光タンパク質を固定化したアレイ用基材を自然光下で撮影した図である。
【図４】実施例で用いた観測系の光学系統図（光路）を示す図である。
【図５】分光光度計AVIV ATF104を用いた場合の光学系統図を示す図である。
【図６】タンパク質固定化基板と蛍光ガラスを組み合せたものを示す図である。
【図７】DHFR固定化スライドガラスと蛍光ガラスを組合せ、280nmの波長の紫外光を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を撮像した図である。図７右図は、各スポットに用いられたタンパク質量を示している。
【図８】0.5μ〜4μg/スポットでDHFRを固定化したスライドガラスと蛍光ガラスを組合せ、280nmの波長の紫外光を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を高解像度CDDで撮像した図である。図８右図は、各スポットに用いられたタンパク質量を示している。
【図９】280nmから310nmまでの波長範囲で5nmおきに紫外線を照射して測定した各スポットにおける吸光度すなわち、吸収スペクトルを示す。図中×、▲、○及び●は、それぞれ0.5、1、2および4μg/スポットでの平均値(各々4スポット)を示す。また、各点には、それぞれエラーバーを示している。比較のために、各々、0.7μM(図中１の曲線で示すスペクトル)、1.3μM(図中２の曲線で示すスペクトル)、2.5μM(図中３の曲線で示すスペクトル)、および4.4μMのAS-DHFRが示す溶液中でのスペクトルを示している。
【符号の説明】
【００４８】
１  分光光度計
２  光学系（光照射手段）
３  タンパク質固定化光透過性基板
４  紫外-可視光変換デバイス
５  CCDカメラ（光検出手段）
６  ビデオキャプチャボード
７  データ処理手段
８  レンズまたはスリット
９  通信手段
１０  アレイ基板
１１  固定化したタンパク質
１２  カバー
１３  流入口
１４  排出口
１５  合成石英ガラス。
１６  マトリックス
１７  蛍光ガラス
１８  スポット
１９  光断面
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明のタンパク質アレイ用検出および解析システムは高密度でタンパク質を固定化した基板を用い、該基板上のタンパク質に光（紫外光、可視光または赤外光）を照射し、基板上のタンパク質の吸収を直接測定することにより、タンパク質を検出・解析する。また、本発明のシステムにおいては、上記基板として紫外光を透過し得る基板を用い、タンパク質の紫外光の吸収を利用してタンパク質を検出・解析する。ここで、「検出・解析」とは、タンパク質の定性、定量、タンパク質とタンパク質またはタンパク質以外の化合物との相互作用の測定、固定化タンパク質の吸光度変化によるタンパク質-リガンド相互作用の測定、タンパク質自体の構造変化のモニタリング、固定化タンパク質と相互作用するタンパク質以外の化合物の定性、定量等をいう。【００５０】
本発明において、タンパク質は、ペプチド、ポリペプチドも含まれる。また、アレイ上のタンパク質を検出する際の「アレイ上のタンパク質」とは、アレイ上にNH基を介して結合した固定化タンパク質だけではなく、固定化タンパク質との相互作用により結合した他のタンパク質も含む。また、「アレイ上のタンパク質の検出・解析」とは、アレイ上の固定化したタンパク質および該固定化タンパク質と相互作用した他のタンパク質の検出・解析ばかりでなく、アレイ上に固定化したタンパク質がタンパク質以外の化合物、例えば低分子化合物と相互作用し、該相互作用によりタンパク質の構造等の変化により吸光が変化した場合に、吸光の変化を測定することにより、前記タンパク質の構造変化等を検出・解析することも含む。さらに、「アレイ上のタンパク質と相互作用した他の化合物の検出・解析」とは、アレイ上に固定化されたタンパク質と相互作用するタンパク質以外の他の化合物の検出・解析をいい、特定の波長の光に吸収を有する化合物をその波長の光を利用して測定することをいう。【００５１】
本発明のタンパク質アレイ用検出および解析システムの構成を図１に示す。システムは、光照射手段（光学系）２を含むシステム制御部、CCDデジタルカメラ等の光検出手段５や必要ならばビデオキャプチャボード等のビデオデータ処理手段６等を含む測定部およびデータ処理部７、タンパク質を高密度で固定化した光を透過し得る基板３から構成される。また測定部には紫外-可視光変換デバイス４を含んでいてもよい。さらに光学系２から基板３への光路上には、レンズまたはスリット８を含んでいてもよい。また、データ処理手段はRS232C等の通信手段９により、システム制御部の作動を制御することができる。なお、該システムにおいて、光照射手段および光検出手段を含む、光を発生させ、分光させ、タンパク質アレイに照射し、透過光を測定する部分は、分光光度計１であり、本発明は、タンパク質を高密度で固定化した光を透過し得る基板上のタンパク質を分光光度計を利用して検出するシステムでもある。ここで、分光光度計とは、赤外、可視、紫外部のスペクトルを測定するための装置であり、本発明においては、望ましくは紫外部のスペクトルが測定される。従って、本発明では、広く普及している紫外可視分光光度計を用いることができる。【００５２】
本発明において、基板上に固定化されたタンパク質に光を照射し固定化タンパク質の吸光を直接測定するため、基板は光透過性である必要がある。「光透過性」とは、紫外光、可視光または赤外光を透過する性質、すなわちこれらの光を吸収しない性質をいう。このためには、基板は透明なものを用いることが望ましく、透明ガラス（石英ガラス、パイレックスガラス等）、透明プラスチック等を用いればよい。また、紫外光を用いて測定する場合は、基板は紫外光を透過する必要がある。紫外光を透過する基板として、紫外光透過ガラス等の分光光度計に使用される紫外光測定用セル（キュベット）と同一素材でできたガラス基板を用いればよい。紫外光を透過し得る基板として、合成石英ガラスや溶融石英ガラス等の石英ガラスでできたスライドガラスを用いればよく、合成石英ガラス（例えば、信越化学工業社製）が好ましい。また、本発明において、基板に固定化したタンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の他の化合物との相互作用を液中で測定するフローシステムも構築することができ、そのフローシステムの概要は、図２で示される。タンパク質１１を固定化したガラス基板（アレイ基板１０）を、適当なスペーサーを用いて、カバーするガラス基材（カバー１２）ではさみ、片方のスペーサーに溶液の入り口を（流入口１３）、反対側のスペーサー部分に、溶液の出口部分（排出口１４）を作り、外部より溶液を流すことが出来るようにすることにより、フローシステムを簡便に作製することができる。該フローシステムは、図１に示す装置のタンパク質固定化光透過性基板３の位置に装着される。フローシステムは、フローチャンネルセルやガラス基板上にミクロンオーダーの高精度の流路を形成したマイクロチップ等を用いて、流路内のガラス上にタンパク質を固定化することによっても構築できる。マイクロチップを用いる場合、流路を形成した流路基板とカバープレートを作製し、カバープレートの流路と接する部分にタンパク質を固定化した後に、流路基板とカバープレートを接合してマイクロチップを作製すればよい。また、Epigem社のFluenceマイクロ流路ツールキット等の市販のものを用いることもできる。【００５３】
本発明においては、タンパク質を蛍光色素等のプローブやレポーターで標識することなく直接基板上のタンパク質の吸光を測定するため、基板上にタンパク質を高密度で固定化する必要がある。高密度で固定化するとは、基板の単位面積あたりに固定化されたタンパク質分子の数が大きくなるように固定化することをいう。固定化量は限定されないが、基板上に固定化された１種類のタンパク質当たり、すなわち面積１cm2のスポット当たり、0.5nmole以上、好ましくは1nmole以上、さらに好ましくは5nmole以上であるか、あるいは0.01μg/mm2以上、0.05μg/mm2以上、0.1μg/mm2以上、0.25μg/mm2以上であるか0.5μg/mm2以上、好ましくは１μg/mm2以上である。１スポット当りの固定化量がこれ以下では、分光光度計を用いて直接光の吸収を測定することは困難である。また、固定化密度はタンパク質アレイ上の光の吸収の程度によっても、特定することができ、固定化されたタンパク質のスポットにおける吸光度が0.0005以上、0.001以上、0.002以上、0.003以上、0.004以上、0.005以上、0.006以上、0.007以上、0.008以上、0.009以上または0.01以上となる密度、または固定化されたタンパク質に他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物が結合したときの吸光度変化が0.0005以上、0.001以上、0.002以上、0.003以上、0.004以上、0.005以上、0.006以上、0.007以上、0.008以上、0.009以上または0.01以上になる密度が望ましい。タンパク質を固定化したスポットの面積は、限定されないが、0.1mm2程度から十数mm2、例えば１mm2から10mm2程度である。ここで、固定化されたタンパク質のスポットにおける吸光度の求め方は、後述する。【００５４】
タンパク質を高密度で基板上に固定化するためには、タンパク質を基板上に配向制御して固定化することが望ましい。配向制御したタンパク質の固定化とは、タンパク質をタンパク質のペプチド鎖の一端で基板上に固定化することをいい、例えばペプチド鎖のカルボキシ末端またはアミノ末端で固定化する。配向制御してタンパク質を固定化する方法として、例えば特許第2517861号公報、特許第2990271号公報、特許第3047029号、特開2003-344396号公報に記載の方法が挙げられる。【００５５】
例えば、式 NH2-R1-COOHで表されるタンパク質のカルボキシ末端側に、システイン残基をカルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入して改変タンパク質を調製したのち、これをそのカルボキシ末端のシステイン残基におけるメルカプト基を介して固定化基板に結合させることができる。この場合、NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y（R1およびR2は任意のアミノ酸配列を示し、Yは一級アミンを官能基として有する固定化基板を示す。）で示される固定化タンパク質を得ることができる。【００５６】
タンパク質の固定化は、例えば、以下のようにして行うことができる。【００５７】
式(1) NH2-R1-CONH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH で示されるスルフヒドリル基を有するタンパク質を式(2)NH2-Yで示される固定化基板上に中性から弱アルカリ条件下（pH7〜10）に整列化することにより、タンパク質R1がNH2-R1-CONH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH(-)--(+)-NH2-Yの式（(-)--(+)はイオン結合で吸着結合している状態を表す）により基板上に吸着したタンパク質アレイが得られる。さらに、この式で表される吸着したタンパク質をシアノ化試薬で処理することにより、NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Yの式で示されるタンパク質R1が共有結合により基板上に整列固定化されたタンパク質アレイを得ることができる。上記式中、R1およびR2は任意のアミノ酸配列、R3は中性付近で強く負に荷電し、且つ式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHの等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。R2は、式 NH2-R1-COOHで示される固定化しようとするタンパク質と基板との間のリンカーペプチドとなる。R2は任意でありそのアミノ酸の種類、数ともに限られないが、例えばGly-Gly-Gly-Gly等を用いることができる。R3としては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。タンパク質の等電点は、構成するアミノ酸の種類と数に依存する。例えば、リジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の総数を超える数のアスパラギン酸やグルタミン酸が必要である。タンパク質の等電点の計算は、当業者であれば容易に計算により推定できる。好ましくは、上記式(1)で示される物質の等電点を４から５の間の値になるように、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列をデザインすればよい。そのような配列のうち好適な配列としてアラニル-ポリアスパラギン酸をあげることができる。なぜならば、シアノシステインの次のアミノ酸をアラニンにすることにより、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応が生じやすいことと、アミノ酸側鎖の中でアスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるからである。吸着反応を行う溶液としては、上記静電相互作用を保証し、且つ、式（1）で示されるタンパク質が溶解し得る溶媒で且つpHを調整できる溶媒であればいかなる溶液も利用可能である。リン酸緩衝液、硼酸緩衝液などの種々の緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類の他、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキサイドなどが利用可能である。反応温度は、室温で高い反応効率が得られるが、用いる溶媒が凍結もしくは沸騰しない範囲、及び上記式(1)で示されるタンパク質が変性の結果凝集しない温度範囲であれば問題なく用いることができる。シアノ化反応は、シアノ化試薬を用いて行うことができる。シアノ化試薬としては、通常、２-ニトロ-５-チオシアノ安息香酸(2-nitro-5-thiocyanobennzoic acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry, 13,1-11 (1974)参照)または、１−シアノ-４-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロ硼酸(1-cyano-4dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))などを用いる方法が簡便である。NTCBおよびCDAPは市販のものをそのまま用いることができる。NTCBを用いたシアノ化は、pH7〜9の間で効率よく行うことができ、且つ遊離するチオニトロ安息香酸の412nmの吸光度の増加（分子吸光係数=13,600M-1cm-1）で反応効率を調べることができる。また、SH基のシアノ化は文献(J.Wood & Catsipoolas, J.Biol.Chem. 233, 2887(1963)参照)の記載の方法に従っても行うことができる。シアノ化試薬によるシアノ化は、固定化基板上に式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHで示されるタンパク質を吸着固定化した後に行っても、吸着固定化と同時に行ってもよい。後者の場合、上記式(1)で示されるタンパク質とシアノ化試薬を同時に固定化基板上に適用すればよい。シアノ化処理は、基板のタンパク質が吸着した表面にシアノ化剤を添加すれば行える。また、タンパク質が吸着した基板ごとシアノ化剤中に浸漬する等の手段によってシアノ化することもできる。また、上述の整列化手段によりタンパク質を吸着した後、同様の整列化手段を用いて基板上のタンパク質が吸着した部分にシアノ化試薬を適用してもよい。例えば、ピンを用いてタンパク質を一定のドットパターンで基板上に吸着整列化した後に、ピンを用いてタンパク質の代わりにシアノ化試薬溶液をタンパク質に重ねるようにしてスポットすれば、シアノ化反応が起こりタンパク質が固定化される。また、固定化基板に式(1) NH2-R1-CONH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHで示されるタンパク質と、シアノ化試薬を同時に適用してもよい。【００５８】
本発明のタンパク質の固定化には、スポッター（アレイ機）を用いることができる。スポッターとは、コンピュータの制御下で高性能モーターによりタンパク質試料をスポットするためのピンのピン先あるいは基板をXYZ軸方向に作動させ、マイクロタイタープレート等のタンパク質試料を含む容器から基板表面にタンパク質試料を運ぶ装置である。スポッターとしては、市販のものを用いることができる。市販のスポッターとして、例えば、日立ソフトウェアエンジニアリング社のSPBIO2000、宝酒造社のGMS417Arrayer、日本レーザ電子社のGene Tip Stamping、PerkinElmer社のピエゾ方式バイオチップ・スポッティングシステム等がある。【００５９】
さらに、本発明のタンパク質の固定化に、インクジェットプリンティング技術を利用して、タンパク質アレイを作製することができる。本発明のタンパク質の固定化工程中、式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHで示されるタンパク質をインクジェットプリンティング技術によりNH2-Yで示されるアミノ基を導入した適当な基板に吸着固定化し、次いで該タンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基をシアノ化し、シアノシステイン残基に変換させることにより、式 NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Yで示される固定化タンパク質を有するタンパク質アレイを作製することができる。【００６０】
プリンティングに用いるインクジェットプリンタには、インクの射出方法の違いにより、電圧を加えることにより変形する素子（ピエゾ素子）を用いてその変形によりヘッド内のインク収納スペースを減少させ、この圧力によりインクを吐出するピエゾ方式のものと、ノズル中のヒータを加熱することにより泡を生成し、この泡によりインクを押し出すサーマルインクジェット方式のものがあるが、本発明の固定化にはいずれの方式のプリンタも用いることができる。但し、タンパク質の熱による変性を考慮すると、ピエゾ方式のプリンタが好ましい。インクジェットプリンタとしては、市販のプリンタを用いることができ、例えば、市販のEPSON社のPMシリーズやCanon社のPIXUSシリーズのインクジェットプリンタが挙げられる。【００６１】
プリンタのインクカートリッジに上記式(1)で示されるタンパク質溶液を充填し、プリンタに設置すればよい。プリンタのプリンティングパターンは描画ソフト等の適当なソフトウェアを利用すれば自由に設定でき、線状に固定化するラインパターンを採用しても、一定面積上に任意の数のドット（スポット）として固定化するドットパターンを採用してもよい。また、この際１回に吐出されるタンパク質溶液の量も自由に設定できる。例えば、ラインパターンを採用する場合、幅数十μmから数mmのライン状に固定化すればよい。
吐出量、吐出速度を適宜設定すればこの範囲で任意の幅のラインパターンで固定化することができる。また、ドットパターンを採用する場合、ドット一つに対して１滴分のタンパク質溶液を吐出して直径数μmから数mmの円状のドットとしてタンパク質を固定化することもできるし、プリンティング時のパターニングを調整し、一辺が数μmから数mmの矩形状にドットを形成させることもできる。この際も、所望のドットパターンによりタンパク質溶液の吐出量や吐出速度を適宜設定すればよい。なお、１ドットあるいは１ライン上に固定化するタンパク質の量は上記のとおりであり、この際の、固定化に用いるタンパク質溶液の濃度は1mM〜１M程度が望ましく、固定化するタンパク質溶液の量は、0.1μl〜100μl程度が望ましいが、限定されず固定化しようとするタンパク質量に応じて、タンパク質溶液の濃度および固定化するタンパク質溶液の量を適宜変更することができる。【００６２】
１つの基板上に固定化されるタンパク質の種類数またはスポット数は、少なくとも１であり、好ましくは５以上、さらに好ましくは10以上、さらに好ましくは50以上、特に好ましくは100以上である。【００６３】
上記のように、タンパク質を基板上に固定化する際、基板上にアミノ基を導入し、該アミノ基とタンパク質のペプチドのカルボキシ末端を結合させる。基板上にアミノ基を導入するためには、例えば、基板上にアミノ基を有する一級アミンのポリマーからできたマトリックスを結合させる必要がある。一級アミンのポリマーとして、例えばポリアミン、アリルアミン、ポリリジン等が挙げられる。これらの一級アミンのポリマーを適当な担体と混合し、基板上にキャストし、基板上で膜を形成させればよい。担体としては、例えばハイドロゲルを用いることができる。「ハイドロゲル」とは、高分子からなる架橋ないし網目構造と、該構造中に支持ないし保持された（分散液体たる）水とを少なくとも含むゲルをいう。ハイドロゲルを与えるべき水溶性または親水性高分子化合物としては、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリＮ−ビニルアセトアミド、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。また、アミノ−セルロファイン（生化学工業で販売）、AF-アミノトヨパール（TOSOHで販売）、EAH-セファローズ４Ｂ及びリジン-セファローズ４Ｂ（アマシャムファルマシアで販売）、アフィゲル102（バイオラッドで販売）、ポラス２０NH（ベーリンガーマンハイムで販売）などの一級アミノ基を有する市販の担体を用いてもよい。この際、一級アミンのポリマーとポリアクリルアミド等の担体との結合には、担体を重合させる必要があり、例えば、紫外線照射処理が有効である。【００６４】
マトリックスとガラス等の基板との結合は、例えばシランカップリング剤を用いればよい、シランカップリング剤は、ガラス表面とポリアクリルアミド等のマトリックスの両方と共有結合を形成し得る物質であり、無機物質と有機物質を結合させることができる。シランカップリング剤は一般的にR-Si-X3の構造をもつ化合物であり、Xはメトキシ基(-OCH3)などのアルコキシ基で、これを加水分解することによりシラノール基(Si-OH)になる。このシラノール基が基板表面に存在するシラノール基と水素結合や脱水縮合などの反応を起こして、安定なシロキサン結合(Si-O-Si)を形成して基板表面に疎水性のR-の被膜を形成する。一方R-はマトリックスと結合可能な有機官能グループ(たとえばH2C=C(CH3)C(=O)O-(CH2)3-など)である。シランカップリング剤として、市販のもの、例えば、Amersham社のバインドシラン(Bind-silane; 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilane)等を用いることができる。【００６５】
基板上に固定化したタンパク質に光を照射してタンパク質による光の吸収を測定する。この際、好ましくは紫外線透過性基板上に固定化したタンパク質に紫外光を照射してタンパク質による紫外光の吸収を測定する。光照射手段としては、分光器を用いればよい。分光器としては、光学フィルターを用いた分光器、分散型分光器、フーリエ変換型分光器のいずれも用いることができる。照射光として紫外光を用いる場合は、分散型分光器が望ましい。用いる光は紫外光、可視光、赤外光いずれも用いることができる。紫外光を用いる場合の波長は、200〜310nmであり、タンパク質を測定する場合はタンパク質が吸収する280nm、224〜236nmまたは205nm付近の波長の紫外光が望ましい。タンパク質以外の化合物を測定する場合は、その化合物の特有の吸収波長の光を用いればよい。また、照射する光の波長は一定の波長に固定してもよいし、波長を固定した上で複数の波長で測定してもよい。また、波長を変化させてもよい。波長を変化させて測定することにより、タンパク質アレイ上のタンパク質または該タンパク質と相互作用したタンパク質以外の化合物の吸収スペクトルを測定することができる。例えば、市販の分光光度計を用いて、分光光度計のセルを装着するセル室に本発明のタンパク質を固定化した基板を装着して測定することができる。タンパク質を固定化した面は、光照射手段側に向けても反対側の光検出手段側に向けてもよい。また、光照射手段から、基板に光を照射する光路上には、レンズやスリットを設けて光路の幅等を調整し、基板の必要な部分に光が照射するようにすることができる。【００６６】
また、CCD等の２次元の光検出器を用いる場合、基板上にスポットされた固定化タンパク質全体に光を照射することにより、個々のスポットにおける透過光を一度に測定することができるが、一次元の光検出器を用いる場合は、基板上の特定のスポットのみに光が照射するように光の照射手段を移動させ、すべてのスポットに光を照射すればよい。この場合、光照射部分の移動と同時に光検出器も移動させる。【００６７】
光をタンパク質を固定化した基板に照射すると光が固定化したタンパク質、固定化タンパク質に結合したタンパク質および／または固定化タンパク質に結合したタンパク質以外の化合物に吸収される。本発明においては、吸収されずに基板を透過した光を測定する。透過した光の測定は、光検出手段を用いる。光検出手段は、光強度を電気信号として出力する手段であり、内部光電効果型光検出器および外部光電効果型光検出器のいずれも用いることができる。内部光電効果型光検出器は、光による半導体中の電荷分離を利用する検出器であり、電荷分離により生じた担体による電気伝導度の変化を検出する光導電型検出器と電位差を検出す光起電力型検出器がある。光導電型検出器として電荷結合素子（charge coupled device、CCD）、フォトダイオード(PD)、フォトダイオードアレイ(PDA)がある。外部光電効果型光検出器は、入射光子によって光電面から電子を真空中に放出させ、その電子を直接あるいは増幅した後に検出する光電管や光電子増倍管（フォトマル、photomultiplier）がある。【００６８】
本発明の装置において、これらのいずれの光検出手段を用いることができるが、マルチチャンネル検出器であるPDAやCCDが望ましく、２次元のマルチチャンネル検出器であるCCDがさらに望ましい。また、PDA、CCDにマイクロチャンネルプレートによる電子増倍機能を付与したIPDAやICCDを用いることもできる。本発明において、IPDA、ICCDはそれぞれPDA、CCDに包含される。【００６９】
照射光として紫外光を用いて、透過紫外光を測定する場合、CCDは紫外光に対応している必要がある。紫外光対応のCCDとして、例えば、テキサスインスツルメンツ社製のTC253SPD-30/TC253SPD-B0、TC285SPD-30/TC285SPD-B0等のIMPACTRONTMCCD素子やホリバジョバンイボン社製のCCD素子を用いることができる。またこれらの素子を利用した市販のCCDカメラを用いてもよい。例えば、テキサスインスツルメンツ社製のMC681SPD、MC285SPD-LOBO等のIMPACTROMTMCCDデジタルカメラ等がある。しかしながら紫外光対応のCCDは、非常に高価であるという問題がある。入手容易な市販のCCDデジタルカメラに使用されている紫外光に対応していないCCDを用いる場合は、非線形光学材料である紫外-可視光変換デバイスを用いればよい。紫外-可視光変換デバイスとは紫外光を可視光に変換するデバイスであり、例えば蛍光ガラス等の波長変換ガラス、蛍光顔料等の蛍光材料、銀塩感剤や非銀塩感剤等の感剤が挙げられる。この中でも蛍光ガラスが望ましく蛍光ガラスはガラスに蛍光活性イオンとなる希土類イオンを含有させたものであり、200〜400nmの紫外光を照射することにより、400nm以上の可視光に変換する。蛍光ガラスとして、例えば住田光学ガラス社製のルミラス-G9、ルミラス-R7、ルミラス-B等があり、それぞれ200〜400nmの紫外光を照射することにより、540nmの緑色の蛍光、610nmの赤色の蛍光、410nmの青色の蛍光を発する。蛍光ガラスは、本発明の装置において、タンパク質を固定化した紫外光透過性の基板と光検出手段の間に設置すればよい。また、蛍光顔料や感剤は、ガラス板に塗布して、該ガラス板をタンパク質を固定化した紫外光透過性の基板と光検出手段の間に設置してもよく、またタンパク質を固定化した紫外光透過性の基板の反対側に塗布してもよい。後者の場合、タンパク質を固定化した面に紫外光を照射する。【００７０】
上記のように、タンパク質を固定化した紫外光透過性の基板に紫外光を照射し、固定化タンパク質に吸収されない紫外光または紫外光から変換された可視光を光検出手段で検出する。【００７１】
光検出手段から、画像データまたはビデオデータとして信号が出力され、解析手段で該信号を処理し、基板上のタンパク質の吸光を測定する。画像データの種類は限定されず、例えば画像データをBMP画像として得て、処理することができる。画像データまたはビデオデータを処理する際、基板上の各スポットの光強度を求める。処理データは例えば、各スポットにおいて、吸収の違いにより色分けして表示することも、基板上の２次元座標に対応して、吸光度を高さで表示する３次元座標で表示することもできる。【００７２】
ビデオデータは、CCDを有するビデオカメラでタンパク質を固定化した基板を撮像することにより得られる。ビデオデータを得ることにより、基板上のタンパク質の吸収をリアルタイムで解析することができる。リアルタイムでビデオデータを処理するには、ビデオキャプチャボードおよび市販のソフトウェアを用いることができ、例えばDirect X（Windows社製）を用いて処理すればよい。【００７３】
この際、基板上のタンパク質を固定化していない部位を透過した光の強度とタンパク質を固定化した部位を透過した光の強度を測定し、タンパク質を固定化していない部分を透過した光を吸収されていない100％透過光として、タンパク質を固定化した部位を透過した光の透過率を計算する。光検出手段により得られたデータはピクセルとして構成されており、タンパク質を固定化していない任意の部位について複数のピクセルについての光強度に関するデータを得て平均し(I0)、さらにタンパク質を固定化したそれぞれの部位（スポットまたはドット）についても複数のピクセルについて光強度に関するデータを得て平均し、各スポットの光の透過率を求めることができる(I)。吸光度は-log(I / I0)により求めることができる。この際、あらかじめ固定化密度、あるいは１スポット中のタンパク質量のわかっている標準タンパク質について、固定化密度と吸光度の関係を求めておくことにより、測定しようとする固定化タンパク質の固定化密度を求めることができる。例えば、密度Dの標準タンパク質の吸光度がAsであり、密度未知の被験タンパク質の吸光度がAtである場合、被験タンパク質の密度は、式D×（At/As）により求めることができる。この際、基板上に密度既知の標準タンパク質をコントロールスポットとして固定化しておいてもよい。【００７４】
光照射手段からタンパク質を固定化した基板に照射する紫外光は一定の波長に固定化した紫外光でもよいし、1nmから数十nmの間隔で波長スキャンを行ってもよい。【００７５】
固定化したタンパク質と該タンパク質と相互作用する他のタンパク質または低分子化合物等のタンパク質以外の化合物とを接触反応させ、基板上のスポットにおける光の吸収を測定することができる。例えば、固定化タンパク質とそのタンパク質と結合するリガンドタンパク質との相互作用を検出・解析することができる。また、固定化タンパク質とタンパク質以外のリガンドとの相互作用を検出・解析することができる。例えば、抗体または抗原を一定密度で固定化し、該抗体または抗原と特異的に結合する抗原または抗体と反応させた後に、基板上のタンパク質の吸収を測定することにより、固定化した抗原または抗体と結合した抗体または抗原の量を測定することができる。この場合、固定化タンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物を接触反応させる前後にタンパク質アレイ上の吸光を測定した場合、接触前の測定値は固定化タンパク質のみの吸光を反映し、接触後の測定値は固定化タンパク質と他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物が相互作用した複合体を反映する。従って、接触前後の吸光の差をとることにより、固定化タンパク質と相互作用した他のタンパク質またはタンパク質以外の化合物の量を決定することができる。基板上に固定化したタンパク質の吸収をあらかじめ求めておき、他のタンパク質を相互作用させた後に、再度吸収を測定し、相互作用前後の吸収の変化を求めることにより、固定化タンパク質が相互作用したことおよび相互作用した他のタンパク質の量を測定することができる。この際、固定化タンパク質と相互作用したタンパク質化合物に特有の吸収波長の光を用いることにより、固定化タンパク質と相互作用した化合物のみを測定することができる。また、基板としてフローセルまたは液体の流路を有するマイクロチップを用いフローシステムを構築することにより、接触の前後にわたって接触中のタンパク質アレイ上の吸光の変化をリアルタイムで測定することができ、相互作用を経時的にモニタすることができる。【００７６】
また、固定化したタンパク質と低分子リガンドとの測定においても、リガンド結合に伴うアロマティックなアミノ酸側鎖の吸収に由来する紫外部の吸収変化を利用することが出来る。例えば、紫外部に吸収が無いリガンドの濃度を変化させ、リガンド結合に伴う紫外部の特定波長の吸光度変化もしくは紫外部の吸収スペクトル変化を測定することにより、リガンド結合の強さの指標である結合定数を求めることが出来る。また、多くのタンパク質は可視部に吸収を持たない場合が多いことから、可視部に吸収を持つリガンドに関しては、可視部の特定波長の吸光度変化もしくは可視部の吸収スペクトル変化を測定することにより、対象リガンドに関する結合もしくはその結合の強さを表す結合定数を求めることが出来る。
【実施例】
【００７７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７８】
本実施例においては、石英ガラスの表面に、アミノ基を有するポリマーを含むポリアクリルアミドゲルの薄板を形成させることにより、タンパク質アレイ用基材を作製した。この基材は、可視光線及び紫外線の波長領域の光をほとんど吸収しない（透明である）ので、ゲル内に存在しているタンパク質の光学的活性を直接検出できる。即ち、特別な標識操作を行うことなく、固定化されたタンパク質、及びそれと相互作用するタンパク質を光学的手法により検出・解析することが可能である。【００７９】
本実施例では、緑色蛍光タンパク質（配列番号１）及び、ジヒドロ葉酸還元酵素（配列番号４）をこのタンパク質アレイ用基材に固定化した。緑色蛍光タンパク質は自然光の下で緑色を呈し容易に肉眼で確認できるので、固定化操作の過程をモニターするために用いた。一方、ジヒドロ葉酸還元酵素は、一般のタンパク質と同様に280nm近辺の紫外線を吸収する性質を持っているので、固定化した後、アレイ上でその光学的活性を検出するためのテスト用のタンパク質として用いた。【００８０】
以下、タンパク質アレイ用基材の作製過程〔１〕、固定化用緑色蛍光タンパク質の調製〔２〕、固定化用ジヒドロ葉酸還元酵素の調製〔３〕、タンパク質のアレイ用基材への吸着整列化〔４〕、吸着させたタンパク質の固定化〔５〕、アレイに固定化したタンパク質の光学的活性の測定〔６〕、について具体的に記述する。【００８１】
〔１〕タンパク質アレイ用基材の作製
アレイ用基材の作製においては、先ずバインドシランを石英ガラス（7.7cm×2.6cm×1mmのスライドガラスのサイズに加工したもの、VIOSIL-SG2AS；信越化学工業社より購入）の表面に導入し、その後、アミノ基を有するポリマー（分子量30,000〜70,000のポリLリジン；シグマ社より購入）を含むポリアクリルアミドゲルの薄板（2.4cm×5.0cm×約50μm）を形成させた。【００８２】
バインドシラン（アマシャム社より購入）は、石英スライドガラスとポリアクリルアミド分子の両方と共有結合を形成する性質を持つものであり、両者を強固に結合させるために用いたが、具体的には以下のようにしてバインドシランを石英スライドガラスの表面に導入した。8mlのエタノール、0.2mlの酢酸、1.8mlの純水、10μlのバインドシランを混ぜた溶液を作製し、ドラフトの中でこれを0.5ml石英スライドガラス上に滴下し、キムワイプを用いてガラスの表面全体に塗り広げ1.5時間乾燥させた。【００８３】
このようにしてバインドシランを導入した石英スライドガラスの表面に以下のようにしてポリアクリルアミドゲルの薄板を形成させた。先ず、アクリルアミドとメチレンビスアクリルアミドの37.5：1の混合物（バイオラッド社より購入）を純水に溶かして12.5%のポリアクリルアミド溶液を作製した。この溶液にポリLリジン（分子量30,000〜70,000のポリLリジン；シグマ社より購入）及び純水を加え、最終的にポリアクリルアミドの濃度が10%、ポリLリジンの濃度が0.5%である溶液を1ml氷上で調製した。次に、ポリアクリルアミドのゲル化（固化）試薬であるTEMED（バイオラッド社より購入）を1μl、10%の過硫酸アンモニウム溶液（ナカライ社より購入）を7.5μl加え、よく混ぜた後、この溶液0.3mlを、バインドシランを導入した石英スライドガラス上に滴下した。その後直ちに、その上からギャップカバーガラス（松浪ガラス社より購入）を気泡が入らないように被せた。以上の操作においては、不本意なゲル化が進行しないようにするため、溶液の調製は氷上で行い、操作はできるだけ素早く行う必要がある。この後、室温で一晩静置し、ポリアクリルアミドをゲル化させた。ゲル化が完了した後、トランスイルミネーター(UVP社より購入)を用いて紫外線（360nm)を5分間照射し、石英スライドガラス全体をシャーレの中の純水に浸して30分間攪拌し、シャーレから取り出し、ピンセットを用いてギャップカバーガラスを取り外した。その後、再びシャーレの中の純水に浸し一晩攪拌した後、さらに純水で2回水洗し、数時間風乾させた。【００８４】
〔２〕  固定化用緑色蛍光タンパク質の調製
緑色蛍光タンパク質（GFP）（配列番号１）のカルボキシ末端に固定化用の配列として、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号２）なる配列を付加し、式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHに該当する固定化用タンパク質（配列番号３）を作製し、固定化反応の条件等を検討した。【００８５】
配列番号２をコードするDNA配列に、遺伝子発現に必要なリボゾーム結合配列及びベクター組み込みに必要な制限酵素切断部位を加えたDNA配列を合成し、発現ベクターpUC18のEcoRIとHindIII部位に組み込み、組み換えプラスミドを作製した。これを大腸菌株JM109株に導入し、以下に述べるようにして、発現させた後、分離精製した。【００８６】
固定化用緑色蛍光タンパク質を発現する組み換え大腸菌を、２リッターの培地（10gの塩化ナトリウム、10gの酵母エキス、16gのトリプトン、280mgのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、37℃で一晩培養した後、培養液を20分間低速遠心（毎分5000回転）することにより、湿重量約５ｇの菌体を得た。これを、30mlの1mMエチレンジアミン4酢酸（EDTA）を含む10mM燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、フレンチプレス装置を用いて菌体を破砕することにより無細胞抽出液を得た。その後、ストレプトマイシン硫酸処理、硫安分画処理、DEAEトヨパールクロマトグラフィー（東ソー株式会社より購入）による精製処理、SuperQトヨパールクロマトグラフィー（東ソー株式会社より購入）による精製処理を施すことにより、均一になるまでタンパク質を精製し、約60mgの均一な固定化用緑色蛍光タンパク質を得た。固定化用緑色蛍光タンパク質の濃度は、緑色蛍光タンパク質の分子吸光係数=22,000M−1cm−1を用いて、280nmの吸光度より決定した。なお、当業者であれば配列番号１で示される緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が入手できれば、配列番号３で示される固定化用緑色蛍光タンパク質を容易に作製できる。【００８７】
〔３〕  固定化用ジヒドロ葉酸還元酵素の調製
ジヒドロ葉酸還元酵素の変異酵素(AS-DHFRと略す) （配列番号４）のカルボキシ末端に固定化用の配列として、Gly-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号２）なる配列を付加し、式(1) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHに該当する固定化用タンパク質（配列番号５）を作製し、タンパク質の紫外線領域における光学的活性をアレイ上で検出に用いた。【００８８】
配列番号５をコードするDNA配列に、遺伝子発現に必要なリボゾーム結合配列及びベクター組み込みに必要な制限酵素切断部位を加えたDNA配列を合成し、発現ベクターpUC18のEcoRIとHindIII部位に組み込み、組み換えプラスミドを作製した。これを大腸菌株JM109株に導入し、以下に述べるようにして、発現させた後、分離精製した。【００８９】
固定化用AS-DHFRを発現する組み換え大腸菌を、２リッターの培地（10gの塩化ナトリウム、10gの酵母エキス、16gのトリプトン、280mgのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、37℃で一晩培養した後、培養液を20分間低速遠心（毎分5000回転）することにより、湿重量約５ｇの菌体を得た。これを、30mlの1mMエチレンジアミン4酢酸（EDTA）を含む10mM燐酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、フレンチプレス装置を用いて菌体を破砕することにより無細胞抽出液を得た。その後、ストレプトマイシン硫酸処理、硫安分画処理、メソトレキセートアフィニティクロマトグラフィー（シグマ社より購入）による精製処理、DEAEトヨパールクロマトグラフィー（東ソー株式会社より購入）による精製処理を施すことにより、均一になるまでタンパク質を精製し、約70mgの均一な固定化用AS-DHFRを得た。固定化用AS-DHFRの濃度は、AS-DHFRの分子吸光係数=31,100M−1cm−1を用いて、280nmの吸光度より決定した。なお、当業者であれば配列番号４で示されるタンパク質をコードする遺伝子が入手できれば、配列番号５で示される固定化用AS-DHFRを容易に作製できる。【００９０】
〔４〕タンパク質のアレイ用基材への吸着整列化
上記〔１〕において作製したアレイ用基材に、固定化用緑色蛍光タンパク質もしくは固定化用AS-DHFRを以下のように吸着整列化させた。先端の開口部の半径が約0.5mmのマイクロロード用のピペット用チップ（QSP社より購入）を、容量が10μlのマイクロインジェクション用のシリンジ（ハミルトン社より購入）に装着し、これを、ナリシゲ社より購入した油圧式のコントローラに装着し、マイクロマニピュレータとして用い、上下、左右、前後の３方向に、そのホルダーを移動させることで、タンパク質のスポット用装置とした。この装置を用いることで、タンパク質のスッポッティングを、位置に関しては0.5mmの単位で、溶液量に関しては0.1μlの単位でコントロールすることが可能であった。【００９１】
緑色蛍光タンパク質の基板へのスポッティングは、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/mlの5種類の濃度の固定化用緑色蛍光タンパク質溶液を準備し、薄いタンパク質溶液から順番に0.2μlずつアレイ用基材にスポットしていった。2.5mg/mlのタンパク質溶液を0.2μlずつアレイ基板の左端に縦一列に3カ所、互いに5mmずつ離してスポットし、次にこの4mm右隣に、5mg/mlのタンパク質溶液を0.2μlずつ縦一列に3カ所、互いに5mmずつ離してスポットした。以下同様に、10mg/ml、20mg/ml、40mg/mlの濃度のタンパク質溶液を0.2μlずつスポットした。このことにより、0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μgの緑色蛍光タンパク質が3カ所ずつにスポットされたことになる。スポットした直後は、タンパク質溶液はゲルの表面上に直径約1mmの液滴を形成したが、その後速やかにゲルの中に吸収されていった。スポット完了後、アレイ基材ごと10mM燐酸緩衝液（pH7.0）に浸してスポットの状況を観察したところ、0.5μg、1μg、2μgのタンパク質を用いた場合は、スポットの拡散は認められなかったが、4μg、8μgのタンパク質を用いた場合は、蛍光タンパク質が緩衝液の中に徐々に散逸していくのが観察された。結果的に、2μg以上のタンパク質をスポットしても、2μgのタンパク質をスポットした場合と同程度タンパク質のみが基板中に吸着されることが観察された。このことは、スポットの大きさが直径約1mmであることから考えて、吸着可能な蛍光タンパク質の面密度の上限が約2.5μg/mm2であることを示している。なお、以下の〔５〕に示す固定化反応を施す前に、１ＭのKClで十分洗うと、このように吸着させた緑色蛍光タンパク質はゲル薄板から離脱した。【００９２】
固定化用AS-DHFRに関しても、これと同様に、アレイ用基材への吸着を行った。【００９３】
〔５〕  固定化反応
上記〔４〕において、固定化用緑色蛍光タンパク質または固定化用AS-DHFRを吸着させた基板に、5mMの2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸(NTCB)を含む10mM燐酸緩衝液（pH7.0）を1mlを用いて、基板全体をこの溶液で浸らせた状態で、室温で4時間放置し、タンパク質のシアノ化反応を行わせた。その後、10mM燐酸緩衝液（pH7.0）で十分洗い、過剰な試薬等を除去した後、基板を10mM硼酸緩衝液（pH9.5）に浸し、室温で24時間穏やかに攪拌させることにより固定化反応を行った。固定化反応が終了した後、スライドガラスごとシャーレの中の1MKClを含む10mM燐酸緩衝液（pH7.0）に浸し、24時間穏やかに攪拌することにより、未反応タンパク質及び副反応生成物を除去した。その結果を図３に示す。これは、緑色蛍光タンパク質を固定化したアレイ用基材を自然光下で撮影したものであるが、固定化されたタンパク質が示す蛍光強度から、本実施例で作製した基板を用いた場合、固定化可能な蛍光タンパク質の面密度の上限は、おおよそ2μg/mm2であると推測された。【００９４】
〔６〕  固定化されたタンパク質の光学的活性の測定
固定化されたタンパク質の光学的活性を測定した。
測定に用いた機器装置は以下のとおりである。
光照射用の光源として島津UV-1200またはAVIV-ATG14を用いた。前者はスリット幅の調整はできず、また出力が約30W(0.3mA×100V)と比較的低いことを特徴とする。後者は、Xenonランプ（450W）を採用しておりスリット幅を調整することができる。これらの、光源の回折格子からの光をセルホルダー手前に置いたUV専用ミラーで外側に光路を移して観測系を構築した。図４に島津UV-1200の観測系の光学系統図（光路）を示す。図４の行光学系統図中、回折格子が光学系にあるため、波長は装置制御側で設定する。【００９５】
図５に上記AVIV ATF104を用いた場合の光学系統図を示す。図中、装置左に光源が設置され、光は矢印のように移動する。１の部分にミラー１、２の部分に基板ホルダー（セルホルダー）、３の部分にミラー２を設置し、４の部分にCCDカメラを設置した。CCDカメラは、Logicool社のLogicool Qcam QV-700Nを用いた。CCDの解像度は30万画素であった。CCD素子のゲイン調整等は、CCDカメラに附属のアプリケーションを用いて行った。図中３の部分のミラーからCCDカメラまでの焦点距離は18cm以上とした。上記基板ホルダーに装着するタンパク質固定化基板は、上記〔１〕から〔５〕のように合成石英ガラス製の基板ガラス上の20mm×20mmの範囲にφ１〜2mmでDHFRをスポットして固定化した。スポット当りのタンパク質量は、10、15および20μgであった。紫外-可視変換デバイスとして、住田光学ガラス社製のルミラスBを用いた。AS-DHFRを固定化したガラス基板の模式図を図６に示す。図６に示すようにAS-DHFR固定化ガラス基板と蛍光ガラスを組合せた。スポットの直径は１〜２mm、光の当たる光断面の大きさは20mm×20mm、スポット間の距離は4mm未満であった。各スポットの固定化タンパク質量は、図7右に示すように、右の列からそれぞれ、10、15および20μg/スポットであった。280nmの波長の紫外光を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を撮像した。撮像条件は、シャッタースピードが1/30、ゲインはmax、画像サイズは320×240であった。図7左に撮像した画像を示す。【００９６】
図７に示すように、DHFRを固定化したスポットの部分は、固定化したDHFRにより紫外光が吸収され、紫外光の透過光が弱く、蛍光ガラスから蛍光が発せられないので、スポットの部分のみ光っていない。なお、上記条件においては固定化密度が高すぎたため、吸収が大きすぎ吸光度測定に飽和がおきていた。【００９７】
より大きい固定化密度での測定を行うため、より解像度の高いCCDを用いて同様の検討を行った。CCDカメラはニコン社のCoolpix4300を用いた。撮像条件は、シャッタースピード1/4であり、同カメラの接写機能を用い、４cmの距離で撮像した。この際、焦点はマニュアルフォーカスにて合わせた。画像サイズは640×480であった。照射光の波長は280nmであった。上と同様に、合成石英ガラス上に上記と同様にDHFRをスポットし、蛍光ガラスと組合せ、280nmの波長の紫外光を照射した。図８右に示すように、右の列からそれぞれ、0.5、1、2および4μgをスポットしたものを調製した。図8左にその撮像画像を示す。【００９８】
このタンパク質基板を用いて、280nmから310nmまでの波長範囲で5nmおきに紫外線を照射し、蛍光ガラスから照射される蛍光を測定し、吸光度は、スポットしていない基板上の部分における蛍光ガラスからの発光強度をI0とし、スポットした部分の蛍光ガラスからの発光強度をIとして、log(I0/I)で求めた。それぞれの濃度での4つのスポットから得られる吸光度を平均し、その平均値とエラーバーを照射した紫外線の波長に対してプロットした結果を図９に示す。280nmの吸光度より、0.5、1、2および4μgをスポットした各ポイントでのタンパク質の線密度は、AS-DHFRの分子吸光係数より、それぞれ、0.6nmoles/cm2、1.5nmoles/cm2、2.8nmoles/cm2、および4.7nmoles/cm2と見積もられた。また、各波長での吸光度の値を、AS-DHFRの溶液中でのスペクトルにフィティングすることにより、それぞれ、0.7μM(図中１の曲線で示すスペクトル)、1.3μM(図中２の曲線で示すスペクトル)、2.5μM(図中３の曲線で示すスペクトル)、および4.4μM(図中４の曲線で示すスペクトル)が得られた。この図に示されるように、本発明の測定により、固定化されたタンパク質の吸収スペクトルが溶液中のそれと非常によく一致することが示された。また、固定化に要したタンパク質量に比例して、スペクトル強度が増加することが示され、固定化したタンパク質の定量化を行うことが出来ることが示された。また、この値を用いると、0.5、1、2および4μgのAS-DHFR用いてスポットし固定化されたタンパク質の密度は、AS-DHFRの分子量を18000として計算することにより、それぞれ、0.11μg/mm2、0.27μg/mm2、0.50μg/mm2、および0.85μg/mm2と見積もることが出来、スポット面積としては、約４から５mm2と見積もることが出来た。【００９９】
今回用いた分光光度計の精度から荒く見積もることにより、上記シグナル強度の約1/10までは精度よく測定できることから、本発明のタンパク質アレイシステムにおいては、固定化されたタンパク質の密度として、0.01μg/mm2に十分対応できることが考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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