(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電性油中に微生物を懸濁させる工程、この懸濁液に電場をかける工程、及びかけた電場に応じて誘発される漏れ電流の強さの変化を測定する工程を含むことを特徴とする、電場をかけることによって微生物の生物学的活性の有無を決定する方法。
【請求項２】
前記微生物がゲロース培地上で採取されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物の懸濁液が、誘電性油と上記微生物とからなる混合物に超音波をかけることにより得られたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記誘電性油が鉱油もしくは有機油またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記誘電性油がシリコーンオイルであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
誘電性油中の微生物の懸濁液（３）を入れた、電極（２）を備えた容器、２つまたは複数の電極間に電場を発生する手段、誘発される漏れ電流を測定する手段及び記録する手段を備えていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法に従って微生物の生物学的活性の有無を決定する装置。
【請求項７】
懸濁液（３）を入れた容器が金属電極（２）を備えていることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
懸濁液（３）を入れた容器が、電極間空隙（７）を備えた１枚の絶縁板で構成されていることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
前記電極（２）間の電場を０〜２５０ボルト／ミリメートルで変化させることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれかに記載の方法によって、かけた電場に応じて誘発される漏れ電流の強さの変化を測定した後に、前記微生物を水性培地に移し計数することを特徴とする、電場をかけた後に生存できる微生物を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は微生物が生物学的活性を保有しているか、または保有していないかを決定することを可能にする方法に関する。
【０００２】
誘電性油中の微生物懸濁液に電場をかけることによって発生する漏れ電流の強さは、生物学的活性が存在するか、存在しないかを結論づけることができる。この方法は、それに微生物の回収しそして計数を行う段階を続けて行えば、電場をかけた後の微生物の生存可能性を決定するために利用することができる。
【０００３】
微生物の生物学的活性を簡単かつ迅速に決定することは、汚染の抑制、品質保証および臨床的分析のような多くの領域で必須である。研究および農産食品工業の分野においては、バクテリアおよび酵母のような微生物は、ますます利用されている手段である。用いられる様々な生化学的過程の有用性および効能は、かかる微生物の生存可能性に依存する。
【０００４】
この目的で標準的である技術は、特定の条件で寒天型の適当なゲロース培地中で試料を培養することからなる。採取した成分を有効に増殖させ、肉眼でまたは顕微鏡で観察し、続いて計数を行うことにより、生物学的活性の存在を結論づけることができる。この場合、もとのコロニーは生きていると認定される。逆な場合、コロニーの生物学的活性はないと結論される。
【０００５】
この方法は多くの不便をもたらし、特に、結果を得るまでに時間を要する。最も良い場合でも目に見えるコロニーが生成するのに１８時間が必要である。
【０００６】
このほか、ＥＰ特許０５４３０９０は、生物電気化学的セルの利用によるバクテリアの代謝活性の直接測定に基づく分析方法を提案している。生物電気化学的セル中で細菌の活性を測定するための方法および計測器に関するＥＰ０２２１６６３、生物電気化学的セルおよびその電極に関するＥＰ０２１９２４７、生物電気化学的媒介物質に関するＥＰ０２３８３２２および生物電気化学的セルに使用される改良された電極に関するＥＰ０３５２１３８には、生物電気化学的検出システムのいくつかの側面が記載されている。これらの方法の中には、装置の必須的な要素であるフィルター上でバクテリアを濃縮する、分析に先行する段階を含むものもあり、形状が特定的で、多孔質カーボンまたは高価な貴金属という特別な組成をもつ電極を使用するものもある。
【０００７】
これらの特許に記載されているシステムがどのようなものであれ、化学媒介物質の使用が必須である。かかる媒介物質は、１，４−ベンゾキノンのような有機化合物であって、媒体中に溶解されており、電極と微生物との間で電子を移動する役割を果たす。この媒介物質はバクテリアと接触すると、測定電極によって検出・測定される応答を生じる。測定されるこの応答は、媒介物質、その濃度およびその酸化の程度の関数として顕著に変化し、従って、結果の解釈および比較が困難になる。さらに、電子を媒介物質と交換する可能性のある、たまたままぎれこんだ物質や汚染物質成分が多くのアーティファクトの原因となる。最後に、媒介物質およびフィルターの存在は、研究対象である微生物を後で回収しようとするのが困難になるおそれがある。
【０００８】
生物電気化学的セルを使用する場合、微生物は水性媒体中で、より具体的には正確なイオン濃度とした緩衝液中で電場に置かれる。高周波数の交流型の電流は、交流電場を生じる。このような条件では、数秒間を越える時間にわたって、数ボルト以上の電圧をかけることはできない。直流を使用すると、コンデンサーの放電によって得られる電圧は常に遷移的であるかまたはパルス状であるという特徴を有する。電圧は、１秒以下の比較的短い時間にわたってしか数キロボルトという高い値に維持することはできない。このため、結果として不連続なまたは段階的な測定しかできない。
【０００９】
本発明の目的は、いろいろな種類の微生物に適応可能な、微生物の培養状態を迅速に知る方法を提供することにより上記した不都合を取り除くことである。
【００１０】
本発明は、上記した方法を簡便にかつ低費用で行えるように適合された装置を提供することをも目的とする。別な目的は、本発明の方法に従って電場をかけた後に、研究対象の微生物を回収することを可能にすることである。
【００１１】
これを行うために本発明は、誘電性油中に懸濁した微生物からなる誘電性媒体に電場をかける工程、およびその微生物が生存している時に特徴的な漏れ電流を測定する工程を含むことを特徴とする、微生物の生物学的活性の有無を電場をかけることにより知る方法を対象とする。
【００１２】
細胞懸濁液をつくるためには、予め微生物をゲロース培地の表面から採取し、次いで誘電性油中に導入する。誘電性油は、油の混合物または鉱油もしくは有機油、そして好ましくはシリコーンオイルとすることができる。微生物／誘電性油の混合物は超音波をかけることによってホモジェネート化することができる。
【００１３】
本発明の方法は、値が０から選定された最大値までの電場を誘電性懸濁液に逐次かけることからなる。電場をかけると、微生物と誘電性油とを含有する媒体中に漏れ電流が発生する。微生物が生存している場合、かけた電場に応ずる漏れ電流の強度の変化は特徴的であって、生物学的活性の存在を結論することができる。電場をかけた結果のストレスがどのようなものであるにせよ、研究対象の微生物の生存可能性を特徴づけるピークが出現する。反対に、微生物が死んでいる場合、かけた電場に応じて単調な強度変化が認められる。
【００１４】
本発明は、微生物の生物学的活性をの有無を決定する装置にも関し、これは、誘電性油中の微生物の懸濁液を入れる、電極を備えた容器、２つまたは複数の電極間に電場を発生する手段、誘発される漏れ電流を測定する手段および記録する手段を備えていることを特徴とする。微生物の懸濁液が導入される容器には金属電極が装備されている。
【００１５】
本発明の別な態様によれば、上記の懸濁液を入れる容器は電極間空隙を備えた１枚の絶縁板で構成されている。電極間の電流の電圧は１ミリメートルあたり０〜２５０ボルトであるのが好ましい。
【００１６】
本発明により電場をかけた後には、水性媒体中への移送工程、次いで計数を行う工程を続けることができる。本方法をこのように適用することは、電場で生き延びた微生物を選ぶのに簡単でまた有効な方法をなす。
【００１７】
本発明の特徴および利点は以下の例に関する詳細な説明（限定的なものではない）から明らかであろう。
【００１８】
例１
研究対象の微生物をゲロース培養培地から得る場合、微生物をスクレーパによって培地表面から採取し、シリコーンオイル系の誘電性油が１ｍｌ入ったＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロチューブ内に導入する。マイクロチューブ内に超音波をかける。均質な懸濁液を得るために、５秒間の休止相を２回から３回設けて、周波数２０ｋＨｚの２５Ｗの超音波を混合物に交番的に３０秒間かける。混入していることのある細胞の凝塊およびゲロースを、４０００回転／分での遠心分離によって４℃で３０秒間かけて除去する。次いで、均質な懸濁液を図１および２に示す容器の１つに導入する。電極２間の間隔は図１に示す容器の場合１．８ｍｍであり、また図２のものの場合３ｍｍである。１ｍｍあたり０ボルトから２５０ボルトに漸進的に変化する連続直流電圧を発電機によって供給し、懸濁液に漸進的に適用する。並行して、誘発される漏れ電流を電流計によって記録する。
【００１９】
電極２間に適用されるボルト表示の電場Ｖに応じて、マイクロアンペア表示の漏れ電流の強さｉの変化を示す曲線の軌跡によって、微生物が生きているか死んでいるかが直ちにそして簡単に決定できる。
【００２０】
微生物が死んでいる場合、図３に示されまた図１の装置によって得られた曲線の形は直線状である。対照的に、微生物が生きている場合、図４によって示されまた図１の装置によって得られる曲線の形は著しく異なる。漏れ電流は小さい電圧で突如増大し、約２２０ボルトの電圧で最大に達し、次いで突如また減少して３００ボルト程度の値以降安定化する。
【００２１】
例２
ゲロース培養培地からの研究用の微生物をスクレーパによって表面から採取し、シリコーンオイル系の誘電性油がそれぞれ１ｍｌ入っている２本のＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロチューブ内に導入する。実験用マイクロチューブおよび対照用マイクロチューブと称するこれらのマイクロチューブ内に超音波をかける。均質な懸濁液を得るために、５秒間の休止相を２回から３回設けて、周波数２０ｋＨｚの２５Ｗの超音波を混合物に交番的に３０秒間かける。混入していることのある細胞の凝塊およびゲロースを、４０００回転／分での遠心分離によって４℃で３０秒間かけて除去する。
【００２２】
実験用マイクロチューブ内に入っている均質な懸濁液を図１および２に示す容器の１つに導入した後、電場をかける。実施する研究の種類に従って、また研究対象である微生物に従って予め決定されている定性的および定量的な特性を有する電場を、所定の期間、懸濁液３の１つにかける。この媒地を実験用のＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロチューブ２中に移す。
【００２３】
次いで底部濃厚物を回収するために、上記２つのマイクロチューブを４℃で３０秒間１００００回転／分の遠心分離にかける。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロチューブを傾けてシリコーンオイルを抜き出す。ｐＨが７の０．０５Ｍの燐酸塩緩衝溶液１ｍｌを対照用マイクロチューブおよび実験用マイクロチューブ２内にいれ、そして各々の混合物を周波数２０ｋＨｚで２５Ｗの超音波を５秒間かけることによってホモジェネート化する。各々の懸濁液を、研究対象の微生物に適した培養培地が９ｍｌ入った、綿を詰めたチューブ内に注入する。
【００２４】
バクテリア細胞は、対照用および実験用の綿を詰めたチューブを１５０回転／分で３時間撹拌した後引き続いて蘇らされる。この第１の希釈物を各々のチューブから１ｍｌ採取し、各々の細胞懸濁液の光学的濃度を測定するために溶血チューブ内に移し入れる。０〜０．４の最終的な光学濃度を得るのに十分な、ｐＨが７の０．０５Ｍの燐酸塩緩衝液をこれら２つの採取物に添加する。対照物および被験物の光学濃度がわかれば、Ｔｈｏｍａ細胞計数を行うことによって得た標準曲線との比較によって、各々のチューブ内に存在する細胞の数が推定される。
【００２５】
各々のチューブに対して１０倍ごとの段階で希釈を行う。各々の希釈物について、ゲロース培地の入った３つのペトリ皿に０．１ｍｌの細胞懸濁液で接種する。３０℃でインキュベーションを７２時間実施した後、各々のペトリ皿上に形成されたコロニーの計数を行う。このようにして、実験用のチューブ内に存在する細胞の数と対照用のチューブ内に存在する細胞の数との比率を算出することにより電場をかけた後に生存する細胞の百分率を決定する。
【００２６】
例３
例１に記載のように操作する。
懸濁液３にかける電場の強さを、２５Ｖ／ｍｍの電圧を得るまで１５秒毎に段階的に５Ｖ／ｍｍずつ増大する。電圧の上昇の停止は、図６に矢印で示す。この電圧の上昇に必要な時間は１分１５秒である。次いで、１３分４５秒にわたって電圧をこの値に保持し、合計の実験時間を１５分間とする。並行して、誘発される漏れ電流を電流計で記録する。
【００２７】
電場の強さをもはや増大しなくしたとたん、漏れ電流の強さは最初１００秒間にわたって直線的に増加し、次いで転換点が訪れ、漏れ電流の強さが著しく増加し、３３０秒の時点で７０μＡ以上の最大値に達する。細胞懸濁液３に電場がかけられている残りの時間にわたって、漏れ電流の強さは２０μＡ近くの最終値まで減少する。この減少の規則性は強度の小さい２次的なピークの存在によって変化する。
【００２８】
例４
例１に記載のように操作する。
懸濁液３にかける電場の強さを、５０Ｖ／ｍｍの電圧を得るまで１５秒毎に段階的に５Ｖ／ｍｍづつ増大する。電圧の上昇の停止は、図７に矢印で示す。この電圧の上昇に必要な時間は２分３０秒である。次いで、１２分３０秒にわたって電圧をこの値に保持し、合計の実験時間を１５分間とする。並行して、誘発される漏れ電流を電流計で記録する。
【００２９】
最初の１分間にわたるゆるやかな増大期の後、漏れ電流の強さの急速な増加が始まる。電圧の増大を停止した後で突発する漏れ電流のピークの端緒が重要である。４分３０秒後に記録される漏れ電流の強さの最大値は３０６μＡである。細胞懸濁液３に電場がかけられている残りの時間にわたって、漏れ電流の強さは４７μＡに近い最終値まで減少する。この減少の規則性は強度の小さい２次的なピークの存在によって変化する。
【００３０】
例５
例１に記載のように操作する。
懸濁液３にかける電場の強さを、２５０Ｖ／ｍｍの電圧を得るまで１５秒毎に段階的に１０Ｖ／ｍｍづつ増大する。電圧の上昇の停止は、図８に矢印で示す。この電圧の上昇に必要な時間は６分１５秒である。次いで、８分４５秒にわたって電圧をこの値に保持し、合計の実験時間を１５分間とする。並行して、誘発される漏れ電流を電流計で記録する。
【００３１】
電圧を増大する最初の２分間にわたって、電場の強さが８０Ｖ／ｍｍに達するまで漏れ電流の強さは少しづつ増大する。次の１分間つまり９０Ｖ／ｍｍから１３０Ｖ／ｍｍに至るまで、漏れ電流の強さの極めて大きな増加が記録される。この期間が終了すると、漏れ電流の強さの値は９７．６Ｖ／ｍｍである。次いで、漏れ電流の強さは、電圧の適用停止まで指数的に減少して最終値の１５μＡに到達する。この減少の規則性は強度の小さい２次的なピークの存在によって変化する。
【００３２】
本発明に従う方法は１時間より短い期間でバクテリアの培養状態を知ることを可能にする。従って、本方法は、費用のかかる操作および視覚的に観察しまた栄養培地中に移植された成分を数える能力のある人員を不要にする。さらに、検査時間が短いため、汚染の進行は無視できる。従って、無菌の雰囲気であるいは厳格に滅菌された状態において作業する必要はない。
【００３３】
特異的な媒介物質を必要とせず慣用の電極を利用することによって正確な結果を低費用で得ることができるという他の利点もある。
【００３４】
本方法は、長期にわたって大きな強度で増大する電場をかけるという利点をも提供する。このように測定が連続的に実施されることによって、解釈の信頼性の高い首尾一貫した結果が得られる。
【００３５】
本発明は、電場をかけた後に生存する微生物を場合によっては後で用いるために回収することを可能にする利点も提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  電極２（それらの間に微生物の懸濁液３を入れる）を保持する被覆体４を含む容器１を示す。
【図２】  電極２を装備したペトリ皿５からなる容器の別な態様を示し、微生物の懸濁液は、電極間の空間７中にある小片上においてこれらの電極の間に入れられる。
【図３】  微生物が死んでいる場合の、かけた電場に応ずる漏れ電流の変動曲線を示す。
【図４】  微生物が生きている場合の、０Ｖ／ｍｍから２５０Ｖｍｍに至るまでかけた電場に応ずる漏れ電流の強さの変動曲線を示す。
【図５】  電場の強さを１５秒毎に階段的に２．５Ｖ／ｍｍづつ増大して矢印で示す最終的な電圧２５Ｖ／ｍｍを得、その後その値を維持した場合の、時間に対する漏れ電流の強さの変動曲線を示す。
【図６】  電場の強さを１５秒毎に階段的に５Ｖ／ｍｍづつ増大して矢印で示す最終的な電圧５０Ｖ／ｍｍを得、その後その値を維持した場合の、時間に対する漏れ電流の強さの変動曲線を示す。
【図７】  電場の強さを１５秒毎に階段的に１０Ｖ／ｍｍづつ増大して矢印で示す最終的な電圧２５０Ｖ／ｍｍを得、その後その値を維持した場合の、時間に対する漏れ電流の強さの変動曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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