(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水および1.5〜4.3重量％の微生物由来セルロースから本質的に成る、慢性創傷治療用の微生物由来セルロース性被覆材であって、その重量の20％〜200％の量の滲出液を滲出性慢性創傷から吸収し、かつ、その重量の75％を上回る量の湿気を慢性創傷の乾燥部分もしくは壊死部分に供与する、慢性創傷治療用の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項２】
創傷の形態に合わせて成形された、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項３】
カブトガニ血球抽出物（LAL）試験で陰性の結果（＜0.5EU／ml）を示し、従って非発熱性である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項４】
ウサギにおける一次刺激試験で陰性を示し、マウスL929細胞を用いた細胞傷害性試験で陰性を示し、モルモット感作試験に合格し、従って生体適合性である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項５】
慢性創傷が全層または部分層の慢性創傷である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項６】
慢性創傷が静脈性潰瘍である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項７】
慢性創傷が褥瘡である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項８】
慢性創傷が糖尿病性潰瘍である、請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材。
【請求項９】
水および1.5〜4.3重量％の微生物由来セルロースから本質的に成る慢性創傷治療用の微生物由来セルロース性被覆材であって、その重量の20％〜200％の量の滲出液を滲出性慢性創傷から吸収し、かつ、その重量の75％を上回る量の湿気を慢性創傷の乾燥部分もしくは壊死部分に供与する、慢性創傷治療用の微生物由来セルロース性被覆材を調製するための方法であって、アセトバクター・キリシナム（Acetobacter xylinum）を用いて微生物セルロース性菌膜を静的に産生させること、セルロースと水の比が1：100〜1：500の範囲にある菌膜を単離すること、および単離された菌膜を乾燥してセルロース含有量を1.5〜4.3重量％とすることを含む方法。
【請求項１０】
以下のものを含む慢性創傷治療用のキット：
a）水および1.5〜4.3重量％の微生物由来セルロースから本質的に成る微生物由来セルロース；
b）該微生物由来セルロースを含む防湿性包装；および
c）微生物由来セルロースを慢性創傷に対して適用するための指示書。
【請求項１１】
γ線照射によって滅菌された、請求項10記載のキット。
【請求項１２】
電子線滅菌によって滅菌された、請求項10記載のキット。
【請求項１３】
微生物由来セルロースを含む防湿性包装が、アルミニウム・プラスチックでコーティングしたヒートシール可能なシェブロンパウチ（chevron pouch）を含む、請求項10記載のキット。
【請求項１４】
請求項1記載の微生物由来セルロース性被覆材の製造のための、微生物由来セルロース薄膜の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、2002年4月26日に提出された出願第10／132,171号の一部継続出願である。この出願の開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、褥瘡、静脈性潰瘍および糖尿病性潰瘍を含む特定の種類の慢性創傷を治療するための、微生物由来セルロースを含む創傷被覆材に関する。
【０００３】
【従来の技術】
熱傷および擦過傷などの外科的および非外科的な傷害のある宿主を治療するために用いられる創傷被覆材の製造には、非常にさまざまな材料が用いられている。被覆材の範囲は単純なガーゼ型の被覆材からコラーゲン性被覆材などの動物由来の蛋白質型の被覆材まで多岐にわたり、個々の被覆材の組成は治療しようとする創傷の種類に応じて決まる。これらの被覆材のそれぞれには、用途の種類に応じた利点がある。例えば、ガーゼ型の被覆材は、単純な擦過傷および外科的切開創に対しては十分で経済性も高い。
【０００４】
これに対して、慢性創傷の場合には、ポリマーを主体とする被覆材の方がより有効であることが明らかになっている。定義上、慢性創傷は正常な修復過程が進行しなかった創傷であり、糖尿病、血管疾患、または循環障害などの基礎的障害の典型的な兆候である（例えば、非特許文献1）。このため、慢性創傷は基礎的障害に応じて褥瘡（衰弱性壊疽）、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍に広く分類することができる。基礎的障害に対処し、創傷治癒を促すために、原因に応じてさまざまな種類の創傷管理用の治療法および材料が用いられる。湿潤性の創傷環境を維持する能力を備えた先進的なポリマー材料は、これらの治癒困難な慢性創傷の治療においてガーゼより有効であることが示されている。
【０００５】
ポリマーを主体とする被覆材の範疇に含まれるさまざまな種類のポリマー材料が、皮膚障害の治療に用いられている。一般に、それらは主に2つの分類、すなわち合成ポリマー材料および天然物由来のポリマー材料に分けることができる。
【０００６】
合成材料には、ポリウレタン、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリビニルアルコール（PVA）、およびポリアクリロニトリル（PAN）が含まれる。保湿性および高吸液性などの特定の性質を備えた創傷被覆材を製造するために、これらの材料を他の合成ポリマーまたは天然ポリマーと組み合わせて用いてもよい。これらの性質はいずれもガーゼ型の被覆材には一般に認められないものであり、慢性創傷を感染から防ぎ、創傷における湿潤度のレベルを維持することによって治癒を促進する。従来の吸収性の三次元架橋ポリウレタン性ヒドロゲル創傷被覆材は、創傷部位の形状に沿い、創傷を湿潤状態に保つことによって治癒を促進している（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
また、従来の創傷被覆は、慢性創傷の創傷滲出液中の抗原、フリーラジカル、イオン、蛋白質、ペプチド、脂質、および遊離脂肪酸などの干渉性因子を除去するものもある（例えば、特許文献２参照）。これらの創傷被覆は、抗体、キレート剤、酵素阻害剤、酵素、酵素模倣物、ペプチド、およびその他の蛋白質などの「捕捉用分子」による化学的修飾がなされた、ポリウレタンまたは植物由来セルロースである。
【０００８】
同様に、コラーゲンおよびアルギン酸塩などの天然物由来のポリマーまたは生体高分子も、アルギン酸塩の吸収能力の高さまたはコラーゲンの生体適合性といったポリマーの望ましい特徴を利用した創傷被覆材として用いられている。これらの被覆材にはそれぞれ、創傷の種類およびそれが生じる滲出液の量に応じて固有の利点がある。しかし、これらの被覆材には不都合な点もあり、これには費用が比較的高いこと、創傷への付着、滲出液の吸収性が乏しいこと、および創傷部位に残留物が沈着することが含まれる。
【０００９】
親水コロイド性被覆材は創傷滲出液を吸収し、湿潤性の創傷-治癒環境をもたらすが、創傷部位に残存物が沈着するという望ましくない特徴もある。さらに、本明細書に記載の微生物由来セルロース性被覆材とは異なり、親水コロイド性被覆材には滲出液の乏しい乾燥した慢性創傷に対して必要となる湿潤付与性がない。また、親水コロイドは創傷床に付着することが知られており、除去する時に再び損傷が生じる恐れがある。親水コロイドは創傷床の内部で分解する傾向があり、創傷治癒過程を妨げる可能性がある。
【００１０】
これらに代わる材料として、微生物由来セルロースには創傷治癒の効果的な促進を可能とする固有の特徴があり、しかも現行の創傷被覆材に伴ういくつかの固有の不都合な点を伴わない。この点に関して、微生物由来セルロースは、疎水性が極めて高いこと、および湿分操作能力をもたらす特有の多層三次元層状構造といった、植物由来のセルロースとは異なる以下の物理的特性を有する。従来の微生物セルロースは親水性が高く、保水能力がそれ自体の重量の60〜700倍であるものもある（例えば、特許文献3参照）。微生物セルロースは優れた湿潤強度も示し、圧迫しても分解しない。さらに、層状の多層構造を有することから、微生物セルロースを加工して新規な液体操作能力を備えた薄膜を製造することもできる。すなわち、セルロースと液体の比率を調整することにより、加工された微生物セルロースは、薄膜と接触させる表面に応じて、液体を付与することもでき液体を吸収することもできる。
【００１１】
微生物セルロースには優れた特徴があるため、医療産業で用いることがこれまで検討されてきた。液体を充填した医用パッドにおける微生物由来セルロースの使用の可能性について開示しているものもある（例えば、特許文献４、５、および６参照）。これらの特許文献４〜６は、静的条件下で製造し、種々の液体および医薬品を充填した微生物セルロース性パッドの使用を対象としている。微生物セルロース性パッドに含めうるさまざまな種類の液体、ならびに出発物質となるセルロース材料を製造するための製造法および洗浄法が詳細に述べられている。これらの特許には、種々のパッドの製造法を詳細に説明した実施例も記載されており、その方法には、物理的特性、主として液体とセルロースの比率を調整して望ましい生成物を得るための一連の加圧および浸漬の工程が含まれる。これらの特許は一例として、熱傷に対する適用に理想的な冷却能力を付与することが可能な高水和パッド（液体-セルロース比が80対1）を例示している。特に特許文献６は、このような液体充填パッドを、創傷に対して長期にわたり湿潤性を付与しうる潰瘍被覆材として用いるための湿性被覆材として用いることを記載している。同じく特許文献６は、例として記載した湿性被覆材には、被覆材を飽和に満たない条件下で適用した場合に創傷部位から大量の液体を吸収するという別の能力もあることを記載している。しかし、特許文献４〜６で開示された創傷被覆材に関して、慢性創傷に対する湿潤性の供給源となる能力および液体吸収能の両方を備えた単一の被覆材は述べられていない。また、特許文献４〜６は、両方向性（dual）の液体操作能力を備えた被覆材を製造するために有効な液体-セルロース比も記載していない。
【００１２】
また、静的条件下で生成された脱水微生物セルロースを、人工皮膚移植片、分離膜、または人工皮革として使用しているものもある（例えば、特許文献７参照）。特許文献７は、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）によって形成される、引き伸ばされると脱水するセルロース薄膜の使用を詳述している。特許文献７はその発明品を創傷または損傷の治療用の人工皮膚として用いうる可能性を記載しているが、その材料を慢性創傷に用いうるという示唆はなされていない。さらに、特許文献７の乾燥薄膜には湿潤付与能力がなく、吸収能力もわずかに過ぎない。
【００１３】
また、静的方法の代わりに、攪拌タンク型バイオリアクター内で生産された原材料を用いて微生物セルロース薄膜を調製する方法を開示しているものもある（例えば、特許文献８参照）。この特許文献８はさらに、創傷被覆材として用いうる膜を製造するために、このようなセルロース材料を溶媒中に溶解して用いることを記載している。結果として得られる薄膜が乾燥した性質を持つため、このキャスト材料には湿潤付与能力がなく、液体吸収能力も乏しい。また、結果として得られるセルロース膜は、以前の記載の通り、静的条件下で成長した微生物セルロースのみに認められる三次元多層構造を有していない。
【００１４】
以上の特許文献１〜８は微生物セルロースを医療用途に用いうる可能性を認識しているが、先行技術は、効果的な創傷治癒、湿潤管理能力、および十分な生体適合性を示す創傷被覆材を開発する方法を提供できていない。このため、生体適合性の高い慢性創傷の治療用の微生物セルロースを含む、有効な創傷被覆材が望まれている。さらに、高い湿潤付与性および吸収能力を備えた創傷被覆材も、最適な創傷治癒を得るためには特に望ましい。本発明の被覆材が持つこの両方向性の湿潤操作能力により、慢性創傷の治癒のために必要な湿潤性の創傷環境を保つことが可能である。また、湿潤付与能力の高さは、乾燥した壊死組織を治療し、創傷閉鎖が可能となるために望ましい自己融解性創傷清拭を促進するためにも特に有用である。最終的に、肉芽形成を促進し上皮細胞の移動を可能することによって自己治癒を補助する本発明の創傷被覆材の能力は、本創傷被覆材に創傷閉鎖をもたらす明確な能力があることを示すものである。
【００１５】
このため、本発明者らは、吸収および付与という、この新規な液体操作能力を備えた創傷被覆材を開発した。この液体操作能力は、意図する目的に適したセルロース含有量を含むように微生物セルロースを加工することによる最終的な結果である。その結果得られる創傷被覆材は創傷表面が乾燥していれば液体を付与することができ、乾燥した壊死組織または痂皮で覆われた乾燥した慢性創傷に対して特に有用であることが明らかになった。同じくこの被覆材は、滲出性創傷床から液体を吸収することもできる。さらに、本発明に記載の微生物セルロース性創傷被覆材は、親水コロイド性被覆材とは異なり、創傷部位で分解して残留物を残すこともないと考えられる。微生物セルロース性被覆材を創傷から除去しても、これは創傷表面に付着しないため、組織に障害を与えない。
【００１６】
本発明は、事実上あらゆる形状またはサイズとして直接合成することができる、微生物セルロースのシートも想定している。発酵工程によって極めて薄く柔軟な形態が得られるが、これは著しく強度が高いにもかかわらず通気性および液体透過性がある。高圧蒸気滅菌またはγ線滅菌などの極端な環状条件にさらした場合でも、その形状は損なわれずに保たれると考えられる。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第6,238,691号明細書
【特許文献２】
米国特許第6,156,334号明細書
【特許文献３】
米国特許第4,942,128号明細書
【特許文献４】
米国特許第4,588,400号明細書
【特許文献５】
米国特許第4,655,758号明細書
【特許文献６】
米国特許第4,788,146号明細書
【特許文献７】
米国特許第4,912,049号明細書
【特許文献８】
米国特許第5,846,213号明細書
【非特許文献１】
Lazarus, G.S.ら、創傷の評価および治癒の評価に関する定義および指針（Definitions and Guidelines for Assessment of Wounds and Evaluation of Healing）、Arch. Dermatology、1994年、第130巻、p489〜p493
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1つの目的は、重量比にして1.5〜9％のセルロースを含む微生物由来セルロース性被覆材によって慢性創傷を治療するための方法を提供することである。1つの好ましい態様において、微生物由来セルロースは生体適合性かつ非発熱性である。
【００１９】
本発明のもう1つの目的は、最適な創傷治癒のために湿分を付与および吸収することができる慢性創傷の治療用の微生物セルロースを含む有効な創傷被覆材を提供することである。
【００２０】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示のみを目的として提供されるものであり、したがって本発明の精神および範囲に含まれるさまざまな変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになることを理解される必要がある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、全層または部分層の慢性創傷を微生物由来セルロースによって治療するための方法を提供する。本発明は、適切なセルロース-液体比を有し、最適な創傷治癒のための液体付与能力および吸収能力を備えた、生体適合性で非発熱性の微生物由来の創傷被覆材も提供する。親水コロイド、ヒドロゲル、アルギン酸塩、コラーゲン、またはガーゼ性の被覆材とは異なり、本明細書に記載の微生物由来セルロース性被覆材は、乾燥表面に液体を付与すること、または滲出性創傷から余分な液体を吸収することにより、最適な湿性治癒環境を提供することができる。
【００２２】
被覆材中に存在する微生物由来セルロースの含有量は、創傷被覆材の調製方法および最終的な用途に応じて変動しうる。本発明において、創傷被覆材中に存在する微生物由来セルロースの量は重量比にして約1.5％〜約9％であり、好ましくは約3％〜約7％、より好ましくは約4％〜約6％である。
【００２３】
本発明の創傷被覆材は湿潤付与のために用いることができる。一般に創傷被覆材は、その液体重量の約50％〜約90％を乾燥基質に付与することができる。このことは、乾燥壊死組織を呈する創傷を、液体を含む創傷被覆材の適用によって効果的に治療しうることを意味する。ほとんどの慢性創傷は通常、最初に表面を形成する際に、静脈不全などの基礎的障害に起因する死んだ（壊死）組織からなる乾燥した表面を形成する。特定の領域（通常は踵の周囲）に新鮮な血流が供給されないことにより、真皮および表皮が皮膚の下層で壊死し、最終的には潰瘍として表面を形成する。創傷被覆材のパッドに含まれる液体が乾燥した壊死性創傷に供給されることにより、慢性創傷の治癒にとって第一の必要条件である自己融解性創傷清拭が促進されうる。パッドに充填することができる液体材料には、水、等張食塩水、グリセリン、ポリエチレンオキシドなどの合成ポリマー、蛋白質、血小板由来増殖因子（PDGE）、および上皮増殖因子（EGF）を含む生体分子の水溶液、ならびにコラゲナーゼなどの酵素が含まれるがこれらに制限されない。
【００２４】
本発明の創傷被覆材を湿分吸収のために用いることもできる。一般に、本創傷被覆材はその重量の約20％〜約200％、好ましくは約35％〜約140％を吸収することができる。このことは、余分な液体を創傷から吸収すると考えられる本発明の創傷被覆材の適用により、滲出性の創傷を効果的に治療できることを意味する。一般に、静脈性潰瘍などの慢性創傷は治療過程の間に大量の液体を滲出する傾向がある。滲出時期は通常、壊死した真皮組織が占有していた空間を埋めるために創傷が肉芽組織の形成を開始する時点である。この時期に、本発明の被覆材は、滲出液を吸収するのと同時に上皮細胞が移動するための湿潤表面も保つことができる。上皮移動は創傷が最終的に閉鎖するために必須である。したがって、本発明の創傷被覆材は、湿分の吸収および付与の両方を行えるため、創傷治癒のための最適な条件を提供することができる。
【００２５】
本発明に係る方法においては、（１）慢性創傷を治療するための方法であって、非発熱性で生体適合性のある微生物由来セルロース性被覆材を創傷部位に対して適用することと、該被覆材を1日2回から週1回までの範囲で交換することとを含み、該微生物由来セルロース性被覆材が重量比にして約1.5％〜約9％のセルロースを含む方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る方法においては、（２）微生物由来セルロース性被覆材が重量比にして約3％〜約7％のセルロースを含む、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る方法においては、（３）微生物由来セルロース性被覆材が重量比にして約4％〜約6％のセルロースを含む、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る方法においては、（４）慢性創傷が全層または部分層の慢性創傷である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る方法においては、（５）慢性創傷が静脈性潰瘍である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る方法においては、（６）慢性創傷が褥瘡（pressure ulcer）である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る方法においては、（７）慢性創傷が糖尿病性潰瘍である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る方法においては、（８）微生物由来セルロース性被覆材が、カブトガニ血球抽出物（LAL）試験で陰性の結果（＜0.5EU／ml）を示し、従って非発熱性である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る方法においては、（９）微生物由来セルロース性被覆材が、ウサギにおける一次刺激試験で陰性を示し、マウスL929細胞を用いた細胞傷害性試験で陰性を示し、モルモット感作試験に合格し、従って生体適合性である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る方法においては、（１０）微生物由来セルロース性被覆材が、その液体重量の約50％〜約90％を付与し、その重量の約20％〜約200％を吸収する、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る被覆材においては、（１１）約1.5〜約9重量％のセルロースを含む、微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る被覆材においては、（１２）約3〜約7重量％のセルロースを含む、上記(11)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係る被覆材においては、（１３）約4〜約6重量％のセルロースを含む、上記(12)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る被覆材においては、（１４）創傷の形態に合わせて成形された、上記(11)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係る被覆材においては、（１５）カブトガニ血球抽出物（LAL）試験で陰性の結果（＜0.5EU／ml）を示し、従って非発熱性である、上記(11)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係る被覆材においては、（１６）ウサギにおける一次刺激試験で陰性を示し、マウスL929細胞を用いた細胞傷害性試験で陰性を示し、モルモット感作試験に合格し、従って生体適合性である、上記(11)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００４１】
また、本発明に係る被覆材においては、（１７）その液体重量の約50％〜約90％を乾燥基質に付与し、その重量の約20％〜約200％を吸収する、上記(11)記載の微生物由来セルロース性被覆材であることを特徴とする。
【００４２】
また、本発明に係る方法においては、（１８）微生物由来セルロース性被覆材を調製するための方法であって、アセトバクター・キリシナム（Acetobacter xylinum）を用いて微生物セルロース性菌膜を静的に産生させること、セルロースと水の比が約1：100〜約1：500の範囲にある菌膜を単離すること、および単離された菌膜を乾燥してセルロース含有量を1.5〜9重量％とすることを含む方法であることを特徴とする。
【００４３】
また、本発明に係るキットにおいては、（１９）以下のものを含むキットであることを特徴とする：
a）約1.5〜約9重量％のセルロースを含む微生物由来セルロース；
b）該微生物由来セルロースを含む防湿性包装；および
c）微生物由来セルロースを慢性創傷に対して適用するための指示書。
【００４４】
また、本発明に係るキットにおいては、（２０）微生物由来セルロースが約3〜約7％のセルロースを含む、上記(19)記載のキットであることを特徴とする。
【００４５】
また、本発明に係るキットにおいては、（２１）微生物由来セルロースが約4％〜約6％のセルロースを含む、上記(20)記載のキットであることを特徴とする。
【００４６】
また、本発明に係るキットにおいては、（２２）γ線照射によって滅菌された、上記(19)記載のキットであることを特徴とする。
【００４７】
また、本発明に係るキットにおいては、（２３）電子線滅菌によって滅菌された、上記(19)記載のキットであることを特徴とする。
【００４８】
また、本発明に係るキットにおいては、（２４）微生物由来セルロースを含む防湿性包装が、アルミニウム・プラスチックでコーティングしたヒートシール可能なシェブロンパウチ（chevron pouch）を含む、上記(19)記載のキットであることを特徴とする。
【００４９】
【発明の実施の形態】
1．手順を検討するための静的条件下における微生物セルロースの生産
本発明の微生物セルロースの調製に際しては、アセトバクター・キリシナム（Acetobacter xylinum）などの微生物を30℃、初期pH3〜6の液体栄養培地を含むバイオリアクター内で培養する。培地はスクロースまたは他の糖質をベースとする。好ましくは、効率的な薄膜生産は、当業者によって用いられている本来のシュラム・ヘストリン（Schramm & Hestrin）培地（1954）とは異なり、スクロースを炭素源とし、アンモニウム塩を窒素源とし、コーンスチープリカーを栄養源とした上で、所有権を有する微量元素補給剤と組み合わせて用いることによって行われる。この所有権を有する微量元素補給剤の量は以下の表の通りに定められる：
微量元素溶液
1リットル当たりの組成
EDTA四ナトリウム塩    570mg
FeSO４・7H２O            200mg
ZnSO４・7H２O             10mg
MnSO４・H２O              26mg
H３BO３                  30mg
CoCl３・6H２O             20mg
NiCl２・6H２O            3.2mg
(NH４)６Mo７O１４・4H２O     2.4mg
培地1リットル当たり、この溶液2mlを添加する。
【００５０】
蒸発がわずかで十分な酸素限定条件が得られるような、適したバイオリアクターを選択する。酸素限定条件は、セルロース薄膜の所望の含水量および厚さに応じて異なってよい。一般に酸素限定条件下では、酸素は気相液相界面に存在する気体全体の5％〜21％の量を占める。バイオリアクターは、気密カバーまたは限定した気体の透過性カバーを装着したプラスチック製容器から構成される。バイオリアクターの寸法は、生産されるセルロース薄膜の形状およびサイズに応じて、さまざまな形態（立方体または円筒形）でありうる。例えば、直径6インチの円筒からは直径6インチの被覆材が生産されると考えられ、これをそのまま用いることもでき、治療しようとする創傷に合わせて適用前に切断して用いることもできる。発酵培地中の酸素の量を制限することにより、アセトバクター菌は培地中の利用可能な炭素を、繁殖に用いる代わりにより多くのセルロースを産生するために利用し、それによりセルロースの全収率が高まると仮定された。
【００５１】
静的条件下における発酵過程を約7〜30日間にわたり進行させ、その間に培地中の細菌に、微生物を内部に含む完全なセルロース性菌膜を産生させる。単位面積当たりの特定のセルロース含有量に対応する所望の厚さに応じて、発酵を停止させ、菌膜をバイオリアクターから取り出す。続いて、菌膜に含まれる余分な培地を圧縮または遠心処理などの標準的な分離法によって除去した後に、菌膜の化学的洗浄、さらに加工処理を行うことにより、セルロース-液体比が約1：10〜約1：65である創傷被覆材が得られる。原材料となるセルロース性菌膜の糖：セルロース収率は約35％であり、文献値の10％よりも高い。この高い収率と安価な窒素源の組み合わせにより、原材料のセルロース薄膜の生産コストは、本来のシュラム・ヘストリン培地［1954、J. Gen. Micro、11：123〜1291］に従って生産されたセルロース薄膜と比べて40分の1に削減された。
【００５２】
2．加工処理および脱水の手順
セルロース薄膜が生産された後には、精製のために細胞をセルロース菌膜から除去する必要がある。フォンタナ（Fontana）ら（1990、Appl. Biochem. Biotech、24：253〜264）は細胞が非発熱性であると述べているが、未精製のセルロース菌膜は、カブトガニ血球抽出物（LAL）試験キットを用いた検討で、発熱性物質に関して陽性であった。この結果から、標準的な発熱性物質試験に合格し、微生物セルロース性創傷被覆材が非発熱性であると認定するために、本明細書で考察する化学処理によって細胞を除去することが必要となった。
【００５３】
未加工のセルロース薄膜を医療用等級の非発熱性創傷被覆材料に変えるために、セルロース菌膜に対して一連の化学的洗浄工程を行う。典型的な加工処理には、水酸化物溶液を重量比にして1〜20％の濃度で用いる。好ましくは、細胞を溶解するために、水酸化ナトリウムを3％以上の濃度で用い、最も好ましくは約3％〜約5％で用いる。さらに、本発明は、発熱性物質を含まない薄膜の脱色および滅菌が可能な過酸化水素による洗浄も提供する。薄膜を漂白するためには、重量比にして約0.05％〜約10％の濃度の過酸化物が有用である。用いる過酸化物の量は約0.1％〜約0.5％であることが好ましい。次亜塩素酸塩、次亜臭素酸塩、および過ホウ酸塩などのその他の漂白剤を用いてもよい。
【００５４】
未加工の発酵産物に対して、さまざまな曝露時間、濃度、および温度を用いる精製工程を行った。工程を最適化するために、1〜4時間の処理時間を30〜100℃の範囲の温度とともに検討した。異なる操作条件のそれぞれによって得られた薄膜を発熱性物質のレベルおよび物理的特性に関して検討した。続いて、経済的な理由から、最も短時間かつ最も低濃度の化学物質で非発熱産物が得られる工程条件を選択した。この工程を行う時間は約90℃で4時間でも可能であるが、好ましくは、行う時間は約60℃〜約80℃で約1〜2時間である。
【００５５】
加工処理後にセルロース性パッドに残る細胞片の量は、連邦規則集21 CFR 10.90に米国食品医薬品局（FDA）が定めているように、カブトガニ血球抽出物（LAL）試験によって測定してもよい。上記に概要を示した本洗浄工程により、非発熱性セルロースパッド（＜0.05EU／ml）が得られた。クラスIの医療用具における発熱性物質許容含有量は0.5EU／mlである（FDAのLAL試験指針）。LAL試験の工程は試験キットの製造者によって規定され、それに単に従うことにより、セルロース薄膜中の発熱性物質のレベルを得ることができる。
【００５６】
3．微生物セルロース性被覆材の物理的改変
創傷被覆材料に望まれる特徴には、湿潤環境を提供する能力が含まれるが、それだけでなく、同時に余分な滲出液を創傷から吸収する能力または創傷に湿分を付与する能力も含まれる。現在販売されているヒドロゲル創傷被覆材の製品の大まかな組成は90〜95％が水であり、5〜10％がポリマー材料である。しかし、これらの製品は十分な湿潤性を創傷に与えることができず、強度も不十分であることが特徴である。さらに、これらの被覆材は創傷部位に付着する傾向がある。この創傷付着性は、除去する際に創傷の再度の損傷を引き起こす。しかし、本発明の被覆材は、他の創傷被覆材には認められない層状の多層三次元構造を有するため、より優れた湿潤性および吸収性を示す。本セルロース性被覆材は、創傷部位の状態に応じて余分な液体を吸収したり湿分を付与したりすることにより、被覆材-創傷界面における湿潤レベルを調節する能力も示した。この湿潤性管理能力は慢性創傷における治癒の促進に役立つものであり、セルロース性創傷被覆材の新規な特徴である。
【００５７】
セルロース菌膜は一般に、初期組成は90％以上が水で0.2〜1％がセルロースである、またはセルロースと水の比が約1：100〜1：500である。最終的な創傷被覆材を得るために、この材料に対して一連の物理的処理を行う。飽和した微生物セルロース性パッドの含水量を98.5％〜0％の範囲に減らし、セルロースと水の比が約1：65から1：0（すなわち完全に乾燥した材料）である薄膜を得てもよい。これは機械によるプレス、遠心による水抜き、風乾、減圧乾燥、および凍結乾燥を含む、さまざまな乾燥法を用いて行える。
【００５８】
続いて、その結果得られた脱水パッドを水中に完全に浸漬することにより、吸収能力に関して試験した。その結果から、完全に乾燥した材料は、乾燥処理を加えていない材料に比べて水の再吸収能力が低いことが示されている。完全脱水パッドは24時間でパッド100cm２当たり最大30グラムの水を吸収したに過ぎなかったが、脱水していないパッドは同じ期間で60グラム／100cm２も吸収した。この点に関して、本発明の創傷被覆材におけるセルロースと水の比は約1：65〜1：10であり、より好ましくは約1：24〜約1：16である。これらの創傷被覆材は、湿潤環境をもたらす能力を示すことに加えて、最適な創傷治癒のために湿分を付与する、または滲出液を吸収するという両方向性の能力を有する。
【００５９】
4．製品の包装および滅菌
包装材料は、湿潤したセルロース性創傷被覆材が乾燥するのを防ぐために不透水性である上、滅菌工程に対して耐性である必要がある。例えば、アルミニウム・プラスチックでコーティングしたヒートシール可能なシェブロンパウチ（chevron pouch）により、十分な不透水性および保湿性が得られる。
【００６０】
医療用の創傷被覆材に対して最も多く用いられる2種類の滅菌手順であるγ線照射および電子線滅菌の両方について検討した。包装したセルロース性創傷被覆材に対して5〜50KGyの範囲のさまざまなレベルの放射線を照射した。続いて、各々の被覆材の無菌性を、米国薬局方（USP）による標準的な無菌性試験を用いて評価した。被覆材および包装材料の全体的外観および機械的完全性も検討した。無菌性試験の結果により、セルロース性創傷被覆材が5〜40KGyの放射線量に対して安定であり、製品の無菌性を確実に得るために必要な最小線量は15KGrayであることが示された。続いて、生体適合性試験、動物試験および臨床試験に用いる予定のセルロース性創傷被覆材の製品のすべてを、製品の無菌性が確実に得られるように30KGy（安全係数を2倍とした）で滅菌した。
【００６１】
【実施例】
実施例１．吸収／付与試験
さまざまな厚さのセルロース菌膜を産生させ、細胞片を除去するための加工処理を行った。菌膜を圧縮して1.9mmの均一な厚さとし、セルロース含有量が1.5％〜10％の範囲の一連の薄膜を得た。これらの薄膜が飽和表面から食塩水を吸収する能力、および乾燥表面に湿分を付与する能力を検討した。
【００６２】
均等な面積の秤量した試料を飽和スポンジの表面上に置いた。飽和を維持するためにスポンジの周囲に食塩水を注いだ。24時間後に吸収量を測定するために試料の重量を再び測定し、それを最初の試料重量に対する百分率としてプロットした。湿潤付与性を測定するために、均等な面積の秤量した試料を平滑な乾燥した皮革の表面上に置いた。皮革の重量は試料を添加する前に測定した。2時間後に試料を除去し、付与された湿分量を測定するために皮革の重量を再び測定した上で、同じく最初の試料重量に対する百分率としてプロットした。
【００６３】
吸収データおよび付与データの両方を、双方の特性に関して最適な含水量を決定するために1つのグラフにプロットした。このデータは図1に示されている。この図から、吸収能力および付与能力を得るための被覆材中のセルロースの比率は、理想的には3％〜6％の範囲であるべきことが見てとれる。また、この図は、吸収性または付与性のいずれかが増強された被覆材を、他方の特性を犠牲にすることによって製造しうることも示している。
【００６４】
微生物セルロース性創傷被覆材（Xcell）の付与能力が優れていることを示すために、市販されている従来のヒドロゲルに対して試験を行った。試験を行った製品は、クリアーサイト（Clearsite）（NDM）、ヌーゲル（Nugel）（Johnson & Johnson）、およびフレキシゲル（Flexigel）（Smith & Nephew）であった。これらの製品に対して上記のものと同じ手順を行い、図2に示したデータを得た。XCellに関して用いたデータは、セルロースを4.3％含む材料に関するものである。明らかに見てとれるように、XCell被覆材は初期重量の75％を上回る付与能を示し、付与能が9％〜31％の範囲であったいずれの競合製品よりも成績が優れていた。
【００６５】
付与性は創傷治癒にとって極めて重要であるが、創傷被覆材に付与および吸収の両方の能力があれば理想的と考えられる。吸収に関して先に記載した手順を、クリアーサイト（Clearsite）ヒドロゲル創傷被覆材の試験に用いた。これに関するデータを付与データおよびXCellデータとともに図3に示している。見てとれるように、いずれの試料も吸収能はほぼ同一であるが、XCell材料の湿分付与能力はヒドロゲルの6倍であった。
【００６６】
実施例２．生体適合性試験
滅菌したセルロース性創傷被覆材に対して以下の生体適合性試験を行った：1）モルモット感作、2）ウサギにおける一次刺激、および3）細胞障害性。感作試験では、製品の抽出物をモルモット6匹に注射した。8〜10週間の試験期間にわたり、モルモットの体温を測定して感作反応の有無を調べた。その結果、モルモットにおいて遅延型皮膚接触感作の所見は認められなかった。一次刺激試験はウサギを用いる2週間の試験とした。この試験では、セルロース性被覆材の抽出物を皮下注射し、皮膚に刺激反応がみられないかどうかを観察した。その結果、抽出物のウサギに対する皮下注射による有意な刺激反応および毒性の所見は認められなかった。セルロース性被覆材の抽出物の一次刺激指数は無視しうる程度であった。最後に、被覆材の哺乳動物細胞に対する細胞傷害性を、マウスL929培養細胞を用いて検討した。その結果、セルロース性被覆材の抽出物には細胞傷害性がなく、細胞増殖も阻害しないことが示された。本発明により調製されたセルロース性創傷被覆材はこれらの試験のすべてに首尾良く合格し、これにより、本製品が生体適合性であって安全である上、創傷治癒を抑制しないと考えられるとの確証が得られた。
【００６７】
実施例３．動物モデルにおける創傷治癒
動物による前臨床試験の目的は、ブタ動物モデルにおける微生物由来セルロース性創傷被覆材の創傷治癒性能を、親水コロイドおよびヒドロゲルなどの既存の創傷被覆材製品と比較することであった。
【００６８】
本試験は、実験動物管理公認協会（Association for Accreditation of Laboratory Animal Care）（AAALAC）に従ったマイアミ大学医学部皮膚科（Department of Dermatology of the University of Miami School of Medicine）のブタモデル実験プロトコールを用いて行った。
【００６９】
簡潔に述べると、本試験は病原体非感染ブタ2匹を用いて7日間にわたり行った。7mmの刃を装着した専用の電子式ケラトームにより、約140個の長方形の創傷（10×7×0.3mm）を各ブタの傍脊椎胸部領域に作成した。各創傷は15mmの非創傷皮膚を間に配置することによって互いに分離した。約35個の創傷を、セルロース、親水コロイド、ヒドロゲル、および被覆材非使用／大気曝露からなる創傷被覆材治療群のそれぞれに無作為に割り付けた。上皮移動の評価は適用から2日後に開始した。
【００７０】
要約すると、この結果、セルロース性創傷被覆材による部分層創傷の治癒は、親水コロイド被覆材と同程度であり、ヒドロゲル被覆材よりも優れることが示された。重要なこととして、創傷作成後の第4日の時点で、セルロース性創傷被覆材は創傷の70％を治癒させたが、これに対して、親水コロイド群、ヒドロゲル群、および大気曝露群の創傷ではそれぞれ50％、20％、および0％であった。第5日の時点までに、セルロース性被覆材および親水コロイド被覆材はいずれも試料とした創傷の100％を治癒させたが、ヒドロゲル群および大気曝露群の試料はそれぞれ70％および50％しか治癒しなかった。
【００７１】
実施例４．慢性創傷の治療における有効性に関するヒトでの臨床試験
ヒトでの臨床試験の目的は、さまざまな種類の慢性創傷の治療におけるセルロース性創傷被覆材の有効性を評価することであった。31件のさまざまな種類の慢性創傷を有する患者29例を試験の対象とした。施設内審査委員会（IRB）によって承認された試験プロトコールに示された試験対象患者基準を満たす患者に対して、セルロース性創傷被覆材による治療を行った。セルロース性創傷被覆材による治療は8週間または創傷が治癒するまで行った。創傷の観察は毎週行った。観察所見を記録した後、被覆材を変更した。創傷の状態およびサイズの両方を毎週の受診時に記録し、創傷が治癒した時点または治療を8週間行った時点で試験を終了した。
【００７２】
この臨床試験の結果は、セルロース性創傷被覆材の性能に基づく3つの顕著な所見に分類することができる。セルロース性創傷被覆材は深部褥瘡（pressure ulcer）における浸蝕性壊死の除去に際して強度を示した。セルロース性創傷被覆材の適用により、肉芽過形成組織の減少による周囲上皮レベルへの回復が、この障害を呈した2件の創傷で生じた。セルロース性創傷被覆材に対する最も興味深い3つ目の反応は、下肢静脈性潰瘍、特に全層組織に及ぶものを治療した際に観察された。その結果によれば、13件の下肢静脈性潰瘍（2件は部分層、11件は全層の創傷）のうち、7件（54％）は完全に治癒し、残り（46％）は8週間の試験期間中に改善を示した。
【００７３】
本発明の精神または範囲を逸脱することなく、本発明の方法および組成物にさまざまな修正および変更を行えることが当業者には明らかであると考えられる。したがって、添付する特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲に含まれる限り、本発明の修正物および変形物も本発明に包含されるものとする。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、褥瘡、静脈性潰瘍および糖尿病性潰瘍を含む特定の種類の慢性創傷を治療するための微生物由来セルロースを含む創傷被覆材が提供された。本創傷被覆材は乾燥基質に液体を付与することができ、さらに滲出性創傷を吸収することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  微生物セルロース性創傷被覆材の吸収能力および付与能力を、材料中に含まれるセルロースの比率と対比して示している。材料はすべて同一面積であり、厚さも同程度である。2つの曲線の交差領域は、両方の特性が最大となる理想的なセルロース含有率を示している。
【図２】  XCell微生物セルロース性創傷被覆材およびヒドロゲル創傷被覆材から乾燥表面に与えられた液体の量を示している。付与量は最初の試料重量に対する百分率として表現している。XCell創傷被覆材による付与はヒドロゲルのものよりも著しく優れている。
【図３】  XCell微生物セルロース性創傷被覆材の吸収能力および付与能力を、クリアーサイト（Clearsite）（NDM）ヒドロゲル創傷被覆材のものと比較している。吸収能は2つともほぼ同一であるが、XCell創傷被覆材の付与能力はヒドロゲルの6倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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