(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液中でのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション方法であって、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程を含み、
前記ハイブリダイゼーション反応が、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応であり、
ターゲット遺伝子を捕捉するためのキャプチャープローブが反応機材に結合しており、該キャプチャープローブが前記部分的に形成された反応温度領域に存在することを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブが、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブであることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【化１】
0004482557.tif 000018
【化２】
0004482557.tif 000019
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）
【請求項３】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブが、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブの塩基配列が、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項７】
前記ｎ≧２であり、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブが、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第１の系から第ｋ番目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブであることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項９】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブが、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第１の系から第ｋ番目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブであることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡからなる群から選択された少なくとも１種のヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項項記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１２】
前記標識物質が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素又は発光系酵素であることを特徴とする請求項１１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１３】
互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用して、遺伝子を検出するための反応機材におけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるシグナル増幅方法であって、該自己集合反応が請求項１〜９のいずれか１項記載のハイブリダイゼーション方法を用いて行われることを特徴とするシグナル増幅方法。
【請求項１４】
前記反応機材が、マイクロプレート、ＤＮＡマイクロアレイ又は磁性体粒子であることを特徴とする請求項１３記載のシグナル増幅方法。
【請求項１５】
前記ターゲット遺伝子が一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４記載のシグナル増幅方法。
【請求項１６】
前記ターゲット遺伝子が二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４記載のシグナル増幅方法。
【請求項１７】
前記ターゲット遺伝子がＳＮＰｓ（一塩基多形）を含むことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１８】
前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１９】
前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と前記オリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシストプローブを用いることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチド・プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡからなる群から選択された少なくとも１種のヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つが、標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１３〜２０のいずか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項２２】
前記標識物質が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素又は発光系酵素であることを特徴とする請求項２１記載のシグナル増幅方法。
【請求項２３】
前記ターゲット遺伝子に結合した自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項２４】
前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項２３記載のシグナル増幅方法。
【請求項２５】
前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１３〜２０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項２６】
請求項１３〜２５のいずれか１項記載のシグナル増幅方法を用いたターゲット遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション反応において、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブリダイゼーション反応を行い、効果的にハイブリッドを形成させるようにしたハイブリダイゼーション方法、該ハイブリダイゼーション方法を用いた遺伝子の検出方法、並びに該ハイブリダイゼーション方法を用いて、ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（非特許文献１等参照。本明細書において、ＤＮＡチップとＤＮＡマイクロアレイを総称してＤＮＡマイクロアレイと称する。）、マイクロプレート、及び磁性体粒子等の遺伝子を検出するための反応機材に結合しているターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができるようにしたシグナル増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を検出するための反応機材（以下、反応プラットフォームと称する。）として、マイクロプレート、ＤＮＡマイクロアレイ、磁性体粒子等は、安価で反応温度を均一に制御し易く、かつ特殊な機器を必要としないために、発色系酵素や発光系酵素を用いた遺伝子診断キットが多く市販されている。
【０００３】
現在、これらの反応プラットフォームの温度制御は一般的な恒温槽と呼ばれる機器で行われている。特に遺伝子の検出においては、目的とする遺伝子、又はＰＣＲ法等により増幅された遺伝子に酵素等を標識し、一般的な生化学反応として恒温槽による均一な反応温度を用いている。
【０００４】
一方、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の形成方法）を提案した（特許文献１〜４）。図１〜図３は特許文献１記載の方法の概略説明図である。例えば、特許文献１記載の方法は、図１に示したように３個所の領域から構成される１対のオリゴヌクレオチド・プローブ１８（HoneyComb Probe、以下、ＨＣＰと称する。）を用いる方法であり、第１ＨＣＰ（Ｘ領域，Ｙ領域及びＺ領域）と第２ＨＣＰ（Ｚ’領域，Ｙ’領域及びＸ’領域）の各々の３個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領域の塩基配列を工夫したものである（図２）。この工夫により、複数の１対のＨＣＰを反応させた場合、図９に示されるように反応温度に依存して互いにハイブリダイズしてプローブの自己集合体２０（図９の矢印）を形成させることができる（図３）。本明細書において、これらオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応（Probe alternation link self-assembly reaction）による集合体の形成法を、ＰＡＬＳＡＲ法と称する。
【０００５】
また、本発明者らは、ＰＡＬＳＡＲ法を利用することにより、ターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができることを見出した（特許文献５）。図４に、ＰＡＬＳＡＲ法を利用したマイクロプレートにおけるシグナル増幅方法の一例を示す。図４（ａ）に示した如く、マイクロプレート１０等の反応機材にターゲット遺伝子１２のキャプチャープローブ１４（捕捉用プローブ）を結合させ、次に図４（ｂ）に示した如く、ターゲット遺伝子１２を捕捉した後、図４（ｃ）に示した如く、ＨＣＰとターゲット遺伝子に相補的な領域を持つオリゴヌクレオチドＤＮＡ１６（特許文献５のジョイント・プローブ。本発明において、検出するターゲット遺伝子と相補的な配列、及び自己集合体を形成する核酸（プローブ）と相補的な配列の両方を有するプローブをアシストプローブと称する。）を加え、更に、図４（ｅ）に示した如く、複数対のＨＣＰ１８を加えて、自己集合反応により自己集合体２０を形成させ、シグナルを増幅させることができるものである。
【特許文献１】
特許第３２６７５７６号公報
【特許文献２】
特許第３３１０６６２号公報
【特許文献３】
国際公開第０２／３１１９２号公報
【特許文献４】
特開２００２−３５５０８１号公報
【特許文献５】
国際公開第０３／０２９４４１号公報
【特許文献６】
国際公開第９２／２０７０２号公報
【非特許文献１】
Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips:an array of possibilities.Nat Biotechnol.16,27-31,1998.
【非特許文献２】
Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630.,
【非特許文献３】
Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253.,
【非特許文献４】
Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.
【非特許文献５】
H.C.Birnboim,J.Doly,Nucleic Acids Res.,7,1513(1979)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らが鋭意研究を行った結果、均一な反応温度によるＰＡＬＳＡＲ法は反応溶液中では均一に自己集合体が形成するために、均一な反応温度を用いたシグナル増幅による遺伝子の検出では、固相に結合しているターゲット遺伝子上でのＨＣＰの自己集合体形成反応よりも、ターゲット遺伝子上以外の反応溶液中でのＨＣＰの自己集合体の形成反応が優先されてしまうことが明らかとなった。
図５は均一な反応温度を用いたＰＡＬＳＡＲ法によるシグナル増幅の一例を示す概略説明図であり、（ａ）は均一な反応温度による自己集合体の形成、（ｂ）は自己集合体の形成反応を行った後、洗浄し、洗浄後のターゲット遺伝子に結合した自己集合体をそれぞれ示す。図５に示した如く、ターゲット遺伝子上で形成された自己集合体により十分なシグナル増幅効果が得られるものの、ターゲット遺伝子上以外の反応溶液中で形成された自己集合体は、その後の洗浄により除去されてしまう為、実際の自己集合体の総形成量に比べてシグナル増幅が減少することが判明した。
【０００７】
本発明は、効率的なハイブリダイゼーション反応を可能とするハイブリダイゼーション方法、該ハイブリダイゼーション方法を用いた、高感度なターゲット遺伝子の検出方法、並びにターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上せしめるシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記問題を解決するために、ターゲット遺伝子上でのＨＣＰの自己集合体形成効率を高めるべく、鋭意研究を重ねた結果、反応溶液中に部分的に反応温度領域を設定することにより、ターゲット遺伝子上でのＨＣＰの自己集合体形成効率を著しく高めることができることを見出し、またさらに、ＨＣＰの自己集合体反応のみならず一般的なハイブリダイゼーション反応においても、反応溶液中に部分的に反応温度領域を設定することにより、ターゲット遺伝子上でのハイブリッド形成効率を著しく高めることができることを見出し、本発明に到達したものである。
【０００９】
即ち、本発明のハイブリダイゼーション方法は、反応溶液中でのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション方法であって、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成し、当該反応温度領域においてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程を含み、前記ハイブリダイゼーション反応が、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応であり、ターゲット遺伝子を捕捉するためのキャプチャープローブが反応機材に結合しており、該キャプチャープローブが前記部分的に形成された反応温度領域に存在することを特徴とする。
【００１０】
本発明において、前記ハイブリダイゼーション反応としては、特に限定されないが、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を含むことがより好適である。
【００１１】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第１の例として、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第１プローブと、５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所以上の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブが挙げられる（特許文献１及び２）。
【００１２】
【化１】
0004482557.tif 000002
【化２】
0004482557.tif 000003
（前記化学式（１）及び（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）
【００１３】
図１〜図３は３箇所の核酸領域からなる第１プローブ（第１ＨＣＰ）と第２プローブ（第２ＨＣＰ）とからなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（一対のＨＣＰ）を用いた自己集合反応の例を示した概略説明図である。図１〜図３に示した如く、前記化学式（１）及び（２）の構造を有する一対のオリゴヌクレオチド・プローブ１８の複数対を用いて（図１）、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより（図２）、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体（ポリマー）２０が形成される（図３）。
【００１４】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第２の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、該架橋プローブの塩基配列が、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列である複数のオリゴヌクレオチド・プローブが挙げられる（特許文献４）。
【００１５】
該オリゴヌクレオチド・プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応が挙げられる。前記プローブのハイブリダイゼーションは、ダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせて、各系のダイマー（ダイマープローブ）を形成させた後、該ダイマーと架橋プローブをハイブリダイゼーションさせて、自己集合体を形成させることが好ましい。
【００１６】
上記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第２の例において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマー形成用プローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。
ｎ＝１の場合の１例として、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１７】
ｎ＝１の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１８】
上記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第２の例において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１９】
ｎ≧２の場合の別の例として、前記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００２０】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第２の例を用いた自己集合反応を具体的に説明する。例えば、ｎ＝１の場合、一対のダイマー形成用プローブを用いて形成された下記化学式（３）の構造を有するダイマープローブと、下記化学式（４）の構造を有する一対の架橋プローブ又は下記化学式（５）の構造を有する一対の架橋プローブとを用いて、これらプローブをハイブリダイゼーションさせることにより、下記化学式（６）の構造を有する自己集合体が形成される。
【００２１】
【化３】
0004482557.tif 000004
【００２２】
【化４】
0004482557.tif 000005
【００２３】
【化５】
0004482557.tif 000006
【００２４】
（式（３）〜式（５）において、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’及びＦとＦ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）
【００２５】
【化６】
0004482557.tif 000007
【００２６】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第３の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第１番目の系から第ｋ番目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブが挙げられる（特許文献３）。
【００２７】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第４の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを含む系を第１番目の系から第ｋ番目（ｋ≧２）の系まで順番に複数個形成し、
（ａ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｂ）第（ｋ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第ｋ番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
（ｃ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
（ｄ）最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ互いに相補的な塩基配列とした構造を有する、第１番目の系から第ｋ番目の系まで形成される複数対のダイマー形成用プローブが挙げられる（特許文献３）。
【００２８】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第３及び第４の例において、第１番目の系から第ｋ番目の系までの複数対のダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応が挙げられる。ダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーションは、各系毎にダイマー形成用プローブをハイブリダイゼーションさせて、それぞれダイマー（ダイマープローブ）を形成させた後、各系のダイマープローブをハイブリダイゼーションさせて、自己集合体を形成させることが好ましい。
【００２９】
前記複数種のオリゴヌクレオチド・プローブの第３又は第４の例を用いた自己集合反応を具体的に説明する。例えば、ｋ＝２の場合、一対のダイマー形成用プローブを用いて形成された下記化学式（７）の構造を有するダイマープローブと、一対のダイマー形成用プローブを用いて形成された下記化学式（８）の構造を有するダイマープローブ又は一対のダイマー形成用プローブを用いて形成された下記化学式（９）の構造を有するダイマープローブとを用いて、これらプローブをハイブリダイゼーションさせることにより、下記化学式（１０）の構造を有する自己集合体が形成される。
【００３０】
【化７】
0004482557.tif 000008
【００３１】
【化８】
0004482557.tif 000009
【００３２】
【化９】
0004482557.tif 000010
【００３３】
（式（７）〜式（９）において、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’及びＦとＦ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域である。）
【００３４】
【化１０】
0004482557.tif 000011
【００３５】
本発明のシグナル増幅方法は、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用して、遺伝子を検出するための反応機材におけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるシグナル増幅方法であって、該自己集合反応が前記本発明のハイブリダイゼーション方法を用いて行われることを特徴とする。
【００３６】
前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つアシストプローブを用いることが好ましい。また、前記自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも１つを、ターゲット遺伝子と相補的な配列が含まれるように構成してもよい。
【００３７】
本発明のシグナル増幅方法は、形成された自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子の高感度な検出を可能とするものである。自己集合体を検出する方法としては、特に限定はないが、例えば、前記自己集合反応に使用するオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つを、あらかじめ標識物質で標識し、標識物質を検出することにより自己集合体を検出することが好ましい。前記標識物質は特に限定されず、公知の標識物質を広く使用することができる。例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素又は発光系酵素等が挙げられる。
【００３８】
また、上記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。
【００３９】
さらにまた、上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。蛍光物質としては、２本鎖の塩基対の中に挿入する性質を持った蛍光物質が好ましい。
【００４０】
本発明のターゲット遺伝子の検出方法の第１の態様は、前記本発明のシグナル増幅方法を用いてターゲット遺伝子を検出することを特徴とする。
【００４１】
本発明のターゲット遺伝子の検出方法の第２の態様は、反応溶液中でのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応を利用して、遺伝子を検出するターゲット遺伝子の検出方法であって、該ハイブリダイゼーション反応が前記本発明のハイブリダイゼーション方法を用いて行われるハイブリダイゼーション反応を含むことを特徴とする。
前記ハイブリダイゼーション反応に用いるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを、前記ターゲット遺伝子の一部に相補的な配列を有するように構成することが好ましい。
【００４２】
本発明において、前記遺伝子を検出するための反応機材は特に限定されず、遺伝子検出の為の種々の反応機材に適用可能であるが、特に、マイクロプレート、ＤＮＡマイクロアレイ、及び磁性体粒子等に好適に用いられる。
【００４３】
本発明において、前記ターゲット遺伝子として、一本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。また、上記ターゲット遺伝子としてＳＮＰｓ（一塩基多形）を含んでいる遺伝子を用いることができる。
【００４４】
本発明において、前記ハイブリダイゼーション反応に使用するオリゴヌクレオチドを、あらかじめ標識物質で標識し、標識物質を検出することによりターゲット遺伝子を検出することが好ましい。前記標識物質は特に限定されず、公知の標識物質を広く使用することができる。例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、発色系酵素又は発光系酵素等が挙げられる。
【００４５】
上記オリゴヌクレオチドは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、特許文献６）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、非特許文献２〜４）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００４６】
上記オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００４７】
本発明において使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０2〜１０15本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。
【００４８】
本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、簡便にターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上することができる。また、本発明によればハイブリダイゼーション反応におけるハイブリッド形成効率を向上させることができる。更に本発明によれば、検出に用いられる自己集合体の形成を増大させ、シグナル増幅を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】一対のＨＣＰを示す概略説明図である。
【図２】一対のＨＣＰの結合態様を示す概略説明図である。
【図３】複数対のＨＣＰにより形成された自己集合体を示す概略説明図である。
【図４】ＰＡＬＳＡＲ法を利用したマイクロプレートにおけるシグナル増幅法の一例を示す概略説明図である。
【図５】均一な反応温度を用いたＰＡＬＳＡＲ法によるシグナル増幅方法の一例を示す概略説明図である。
【図６】マイクロプレートを用いた部分的な反応温度領域を用いたターゲット遺伝子の検出方法の一例を示す概略説明図である。
【図７】本発明の部分的な反応温度領域を用いたシグナル増幅によるターゲット遺伝子の検出方法の一例を示す概略説明図である。
【図８】本発明の部分的な反応温度領域を用いたシグナル増幅による遺伝子の検出方法の他の例を示す概略説明図である。
【図９】実験例１の結果を示す写真である。
【図１０】実験例２の結果を示す写真である。
【図１１】実施例１の工程図を示す概略説明図である。
【図１２】実施例２の工程図を示す概略説明図である。
【図１３】実施例３の工程図を示す概略説明図である。
【図１４】  参考例１の工程図を示す概略説明図である。
【図１５】参考例１及び比較例４の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５１】
１０：マイクロプレート、１２：ターゲット遺伝子、１４：キャプチャープローブ、１５：標識物質、１６：アシストプローブ、１７：一対のＨＣＰの一方、１８：一対のＨＣＰ、２０：自己集合体、２２：ホットプレート、２４：冷却手段、５０：アシストプローブ−１、５１：アシストプローブ−２、５２：ターゲット遺伝子、５３：プローブＡ、５４：キャプチャープローブ−１、５５：アシストプローブ−３、５６：キャプチャープローブ−２、５７：プローブＢ、５８：キャプチャープローブ−３、５９：プローブＣ、６０：ターゲット遺伝子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００５３】
熱の伝わり方には、熱伝導（分子の衝突）、対流（物質の移動）、及び放射（電磁波）の３種類がある。本発明のハイブリダイゼーション方法は、この熱の伝わり方を利用してマイクロプレート等の検出プラットフォーム内の反応溶液の温度を不均一とし、反応溶液内に反応温度領域を部分的に作製することにある。
この部分的な反応温度領域の設定を、ハイブリダイゼーション反応を利用した遺伝子検出に適用することが可能であり、特に図４や図８に示したＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅による遺伝子検出に適用することが好ましい。本発明においては、ターゲット遺伝子の固定部位付近、例えば、検出用プラットフォームの底部等、に部分的に反応温度領域を形成し、該検出用プラットフォームの底部でのハイブリダイゼーション反応を優先的に行うことにより、遺伝子検出を高感度に検出することが可能である。
【００５４】
以下、ハイブリダイゼーション反応における部分的な反応温度領域の形成の例を具体的に説明する。
本発明は、反応溶液の一部のみをハイブリダイゼーションに適した温度とすることにより、その局所でのみハイブリダイゼーション反応が効率的に進み、ハイブリダイゼーションを用いたターゲット遺伝子の検出を感度良く行うことができることを示したものである。局所のみを反応温度としてハイブリダイゼーション反応を行うものであれば、本発明に含まれるものであるが、好ましくは、反応溶液中に高温の領域及び低温の領域を設けて、反応溶液中に温度勾配を生じさせ、局所のみが反応温度となるようにすることが望ましく、更に好ましくは、高温の領域を加熱により、低温の領域を冷却により生じさせることが好ましい。また、ハイブリダイゼーション反応が進まないように、反応溶液は予め冷却しておくことが好ましい。
【００５５】
具体的には、図６に概略説明図を示したマイクロプレートを用いた部分的な反応温度領域を用いたハイブリダイゼーション方法の例が挙げられる。以下、反応プラットフォームとしてマイクロプレートを用いた場合を例に、本発明のターゲット遺伝子の検出方法を具体的に説明する。なお、他のプラットフォームもマイクロプレートと同様に適用されるものである。
まず、ターゲット遺伝子を捕捉したマイクロプレート１０に、ハイブリダイゼーション反応に使用するオリゴヌクレオチドを加えた後、マイクロプレート１０全体を例えば４℃に冷却する［図６（ａ）］。冷却後、図６（ｂ）に示した如く、マイクロプレート１０を、行われるハイブリダイゼーション反応に適した温度に調整済みのホットプレート２２等の加熱手段の上に乗せ、その上から冷却手段２４（例えば、保冷剤（−２０℃）、又はそれに類する冷却プレート、例えば、冷却したアルミブロック等）を被せてハイブリダイゼーション反応を行う［図６（ｃ）］。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応は、上記加熱手段及び冷却手段を備えた機器を用いて、反応溶液を加熱及び冷却して行うことが好ましく、上記加熱手段及び冷却手段は温度を制御できることが好ましい。マイクロプレートでハイブリダイゼーション反応を行う場合は、上記加熱手段及び冷却手段ともに平面でマイクロプレートと接触する構造であることが更に好ましく、特に底面は加熱及び冷却の両方できることが好ましい。
【００５７】
ハイブリダイゼーション反応として自己集合反応を行う例について更に具体的に説明する。図７は、マイクロプレートに部分的な反応温度領域を設定したシグナル増幅による遺伝子の検出方法の一例を示す概略説明図であり、図４におけるステップ（ｅ）−（ｆ）の自己集合反応を本発明のハイブリダイゼーション方法を用いて行った例である。
前述した図４（ｅ）に示したようにターゲット遺伝子を捕捉したマイクロプレート１０に自己集合反応に用いられる複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを加えた後、冷却する。冷却後、図７（ａ）に示したように、自己集合反応に最適な温度をターゲット遺伝子に近い階層Ｗ（マイクロプレートの底部）に設定することにより、その部位でのみハイブリダイゼーション反応が行われる。図７（ｂ）に示したように、反応時間の経過とともにマイクロプレートの底部から上部へ向けて自己集合反応に最適な温度に到達するために、洗浄後は図７（ｃ）に示したようにターゲット遺伝子にのみ大きな自己集合体が結合して、遺伝子を高感度に検出できる。
【００５８】
図８は、マイクロプレートに部分的な反応温度領域を設定したシグナル増幅による遺伝子の検出方法の他の例を示す概略説明図である。図８は、一対のＨＣＰを用いたシグナル増幅であり、一対のＨＣＰの一方の一領域が、ターゲット遺伝子に相補的な領域である一対のＨＣＰを用いた例を示す。ＰＡＬＳＡＲ法によれば、図８（ａ）に示したように、検出用プラットフォーム（マイクロプレート１０やＤＮＡマイクロアレイ等）の底部に遺伝子を捕捉するためのキャプチャープローブ１４を結合させておき、図８（ｂ）〜図８（ｄ）のような手順でターゲット遺伝子１２（例えば、E.coli-16SrRNA等）を捕捉し、該ターゲット遺伝子１２にターゲット遺伝子に相補的な領域を有するＨＣＰ１７を加えて［図８（ｂ）］、該ターゲット遺伝子１２とＨＣＰ１７を結合させ［図８（ｃ）］、図８（ｄ）に示した如く、複数対のＨＣＰ１８を加えて、自己集合反応により自己集合体２０を形成させ、シグナルを増幅させることができる。
【００５９】
本発明においては、このステップ（ｄ）−（ｅ）の自己集合反応において、ターゲット遺伝子の存在する検出用プラットフォームの底部に部分的に反応温度領域を形成させ、該検出用プラットフォームの底部での自己集合反応を優先的に行うことにより、ターゲット遺伝子上での自己集合体形成効率を著しく高めることができ［図８（ｅ）］、遺伝子検出を高感度に検出することができる。なお、図８においては、自己集合反応に用いる一対のＨＣＰの一方を標識物質で予め標識しておき、標識物質を検出することにより自己集合体を検出し、それによりターゲット遺伝子を検出する例を示したが、自己集合体の検出方法は特に限定されないものである。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【００６１】
（実験例１及び２）
一対のプローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応温度・時間の違いによる自己集合体の形成。
〈各溶液の調製方法〉
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
以下の試薬を調製し、ハイブリダイゼーション溶液として使用した。
ハイブリダイゼーション溶液−１
［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］
【００６２】
（２）ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の調製
前記ハイブリダイゼーション溶液−１に下記一対のプローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を２ｐｍｏｌ／μＬになるように溶解し、これをハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液とした。
ＨＣＰ−１の塩基配列（配列番号１）
5’-Ｘ領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC）・Ｙ領域（CTGCTACAGTGAACACCATC）・Ｚ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC）-3'
ＨＣＰ−２の塩基配列（配列番号２）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
DIG-5’-Ｘ’領域（GATGCAAGACACGAGACATG）・Ｙ’領域（GATGGTGTTCACTGTAGCAG）・Ｚ’領域（GACTGGTCTATGTCGAGAAC）-3’
【００６３】
〈反応及び検出方法〉
前記ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を０．２ｍＬマイクロチューブに２０μＬずつ１２８本に分注し、この１／２ずつを各々「実験例１：分注後のチューブを９４℃で３０秒加熱」、又は「実験例２：分注後のチューブをいったん氷上で冷却」した後、各反応温度（３７．０、３９．６、４１．４、４３．８、４６．４、４８．７、５０．５、５３．０、５５．０、５７．１、５８．７、６０．６、６２．８、６４．６、６６．０又は６８．０℃）で３０分、１時間、又は３時間反応させ、氷上で急冷させた。これらを０．５％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００６４】
図９は実験例１の結果を示す写真であり、図１０は実験例２の結果を示す写真である。図９及び図１０において、（ａ）は各反応温度で３０分間反応、（ｂ）は各反応温度で１時間反応、（ｃ）は各反応温度で３時間反応させたの場合の結果である。また、図９及び図１０において、各レーンのサンプルの温度条件は、下記の通りである。
Ｍ：サイズマーカー、１：３７．０℃，２：３９．６℃，３：４１．４℃，４：４３．８℃，５：４６．４℃，６：４８．７℃，７：５０．５℃，８：５３．０℃，９：５５．０℃，１０：５７．１℃，１１：５８．７℃，１２：６０．６℃，１３：６２．８℃，１４：６４．６℃，１５：６６．０℃，１６：６８．０℃。
【００６５】
図９に示した如く、９４℃の熱変性を行った実験例１においては、いずれの反応時間においても５５℃以上でアガロースゲルのウェルに留まる大きさの自己集合体の形成が確認された（図中の矢印）。一方、図１０に示した如く、熱変性を行わなかった実験例２においては、５５℃以上では実験例１と同様に自己集合体の形成が確認されたが、５５℃未満ではＨＣＰの非特異的な凝集とみられるスメアなバンドが確認され、反応時間を延長しても同じ傾向がみられた。よって、本実験例で用いたハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の条件における一対のプローブ（ＨＣＰ−１及び２）の自己集合体形成の至適反応温度は５５℃付近であった。
【００６６】
（実施例１〜３及び比較例１〜３）
部分的な反応温度領域を用いたハイブリダイゼーション反応によるターゲット遺伝子の検出感度の測定
実施例１〜３は、ＨＣＰを用いたハイブリダイゼーション反応において、均一な反応溶液を用いた場合を対照（比較例１〜３）とし、反応溶液中に部分的な反応温度領域を作成した場合の効果を確認したものである。以下、部分的な反応温度領域を作成し反応させる条件を「Ｃ／Ｈ」、対照である均一な反応温度において反応させる条件を「Ｈ／Ｈ」とそれぞれ称する。
【００６７】
また、ＨＣＰを用いた反応を行う場合に、一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いて自己集合反応を行う場合を「２ＨＣＰ」、ＨＣＰのうち一本鎖のみ（ＨＣＰ−１又はＨＣＰ−２）を用いてハイブリダイゼーション反応を行う場合を「１ＨＣＰ」と記載する。
【００６８】
〈各溶液の調製〉
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
以下の試薬を調製し、ハイブリダイゼーション溶液として下記実施例１〜３及び比較例１〜３で使用した。
ハイブリダイゼーション溶液−１：
［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）］
ハイブリダイゼーション溶液−２：
［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］
ハイブリダイゼーション溶液−３：
［4XSSC、0.2%SDS、１％Blocking reagent（Roche製）、5％PEG20000］
【００６９】
（２）溶菌液の調製
トリプチックソイアガーで１８時間培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を生理食塩水に懸濁させたものを培養菌原液とした。これを生理食塩水で所定の菌数に希釈し、アルカリ−ＳＤＳ法（非特許文献５）に従って溶菌させたものを下記実施例１〜３及び比較例１〜３に用いるターゲットｒＲＮＡを含有する溶菌液とした。菌数については、培養菌原液の希釈系列を作成して、トリプチックソイアガーで培養して得られた生菌数から所定の菌数を算出した。
【００７０】
（実施例１及び比較例１）
「Ｃ／Ｈ」及び「Ｈ／Ｈ」条件におけるターゲット遺伝子の検出感度及びターゲット遺伝子上の自己集合体の形成効率への効果を比較した。実施例１の概略説明図を図１１に示す。
【００７１】
〈各溶液の調製方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに下記アシストプローブ−１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ、下記アシストプローブ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ、下記プローブＡ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−２を７０μＬ加え、ミキサーでよく混和して９４℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しプローブ混液とした。
前記ハイブリダイゼーション溶液−２を３．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブに前記プローブ混液を加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲットｒＲＮＡとキャプチャープローブのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液（各プローブの終濃度０．２５ｐｍｏｌ／μＬ）とした。
【００７２】
アシストプローブ−１（図１１の符号５０）の塩基配列（配列番号３）
5'-Ｔ1領域（TAGCTAATGCAGCGCGGATCC）・Ｓ領域（GAGAAAGTTCATAGATATAC）・Ｘ領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC）・Ｙ領域（CTGCTACAGTGAACACCATC）・Ｚ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC）-3'
アシストプローブ−２（図１１の符号５１）の塩基配列（配列番号４）
5'-Ｘ領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC）・Ｙ領域（CTGCTACAGTGAACACCATC）・Ｚ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC）・Ｓ’領域（GTATATCTATGAACTTTCTC）・Ｔ2領域（ATCTATAAGTGACAGCAAGAC）-3'
プローブＡ（図１１の符号５３）の塩基配列（配列番号５）
5’-Ｋ1領域（CGACGACGACGACGACGACG）・Ｔ3領域（GCGGTTCAAAATATTATCCGG）-3’
【００７３】
（２）第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに、前記実験例１記載のＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）及びＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を各３０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−１を４０μＬ加え、ミキサーでよく混和して９４℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しＨＣＰ混液とした。
このＨＣＰ混液を、前記ハイブリダイゼーション溶液−１を１．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブへ加え、ミキサーでよく混和し第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液（各プローブの終濃度１．５ｐｍｏｌ／μＬ）とし、実施例１−１及び比較例１−１で用いた。
また、実施例１−２及び比較例１−２で用いる第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液として、ＨＣＰ−１のかわりに滅菌蒸留水を３０μＬ使用し、同様に溶液を調製した。
【００７４】
〈マイクロプレートの調製〉
黄色ブドウ球菌のｒＲＮＡに相補的な配列を有する下記キャプチャープローブ−１をストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実施例１、実施例３、比較例１及び比較例３で使用した。
キャプチャープローブ−１（図１１の符号５４）の塩基配列（配列番号６）
5’-Ｔ4領域（CGTCTTTCACTTTTGAACCAT）・Ｋ1’領域（CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG）-3’-Amino link
【００７５】
〈反応及び検出方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション
２．０ｍＬマイクロチューブに前記調製した溶菌液（菌濃度：１×１０5ＣＦＵ／ｍＬ）を８００μＬ、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液を８００μＬ加え、ミキサーでよく混和し、４５℃で１時間反応させた。図１１の（ａ）及び（ｂ）はこの反応工程の概略説明図である。また、対照として、溶菌液の代わりに生理食塩水を用いて同様に反応を行った。
この反応液を前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、更に４５℃で１時間反応させた。図１１の（ｃ）及び（ｄ）はこの反応工程の概略説明図である。
前記反応後、９６ウェルマイクロプレートを洗浄液（50mM- Tris, 0.3M-NaCl,0.01％-TritonX-100,pH7.6）で洗浄した。
【００７６】
（２）第２ハイブリダイゼーション（ＨＣＰによる自己集合体又はハイブリッド形成反応）
前記洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。
【００７７】
実施例１、即ち実施例１−１及び実施例１−２では、前記マイクロプレートのストリップウェルのうち半分を使用し、「Ｃ／Ｈ」条件により反応させた。実施例１における「Ｃ／Ｈ」条件は下記の通りである。
ストリップウェルを４℃の保冷庫で３０分間冷却した後、冷却したストリップウェルをアルミブロック恒温槽（クールスタット、アナテック製）のマイクロプレート用アルミブロック（重さ：８２８ｇ、幅１２．１ｃｍ、直径８．２ｃｍ、高さ４．２ｃｍ）上に設置し、マイクロプレートの上に冷却手段（ストラタクーラーの蓋、STRATAGENE製）を載せ、恒温槽を４５℃又は５５℃に設定して１時間反応させた。
【００７８】
比較例１、即ち比較例１−１及び比較例１−２では、前記ストリップウェルの残りを使用し、「Ｈ／Ｈ」条件により反応させた。比較例１における「Ｈ／Ｈ」条件は下記の通りである。
ストリップウェルを室温で３０分間放置した後、４５℃又は５５℃に設定したインキュベーターで１時間反応させた。
【００７９】
（３）検出
マイクロプレートウェルを洗浄後、50mM-Tris(pH7.6)に溶解したPOD標識抗ジゴキシゲニン（60mU/mL)を５０μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、０．２M酢酸緩衝液(pH5.0)、0.06%TMB及び0.04％Ｈ2O2を含む発色液を５０μＬ加え、暗所で１５分間放置し、６５５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の結果を表１及び表２に示す。
【００８０】
【表１】
0004482557.tif 000012
【００８１】
【表２】
0004482557.tif 000013
【００８２】
表１及び表２に示したように、１ＨＣＰ、２ＨＣＰのいずれにおいてもＣ／Ｈ条件下の実施例１の測定値はＨ／Ｈ条件下の比較例１の測定値よりも高く、Ｃ／Ｈ条件を用いることによりターゲット遺伝子上で効率的にハイブリダイゼーション反応が行われていた。
また、Ｃ／Ｈ条件下の実施例１においては、１ＨＣＰを用いた実施例１−２よりも２ＨＣＰを用いた実施例１−１の測定値が高く、一方、Ｈ／Ｈ条件下の比較例１においては、１ＨＣＰを用いた比較例１−２と比較して２ＨＣＰを用いた比較例１−２の測定値は同等かそれ以下であった。この結果より、溶液中の反応温度を段階的に作成したＣ／Ｈの方が均一な反応温度のＨ／Ｈよりもターゲット遺伝子上でＨＣＰによる自己集合体が形成されていることが確認された。
【００８３】
（実施例２及び比較例２）
Ｃ／Ｈにおける段階的な反応温度の作成について、ＨＣＰによるハイブリッド形成又は自己集合体形成の反応液量をかえて確認した。実施例２の概略説明図を図１２に示す。
【００８４】
〈各溶液の調製方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに下記アシストプローブ−３（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を２０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−２を８０μＬ加え、ミキサーでよく混和して９４℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しプローブ液とした。
アシストプローブ−３（図１２の符号５５）の塩基配列（配列番号７）
5'-Ｘ領域（CATGTCTCGTGTCTTGCATC）・Ｙ領域（CTGCTACAGTGAACACCATC）・Ｚ領域（GTTCTCGACATAGACCAGTC）・Ｔ2領域（ATCTATAAGTGACAGCAAGAC）-3'
【００８５】
ハイブリダイゼーション溶液−２を７．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブに前記プローブ液を加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲットｒＲＮＡとキャプチャープローブのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液（プローブの終濃度：０．２５ｐｍｏｌ／μＬ）とした。
【００８６】
（２）第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに、実験例１記載のＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）及びＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を各３２μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−１を３６μＬ加え、ミキサーでよく混和して９４℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しＨＣＰ混液としたものを３本用意した。
このＨＣＰ混液を、ハイブリダイゼーション溶液−１を１．５ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブ３本へ各々加え、ミキサーでよく混和し、第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液（各終濃度  ２ｐｍｏｌ／μＬ）とした。
また、実施例２−２及び比較例２−２で用いる第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液として、ＨＣＰ−１のかわりに滅菌蒸留水を３２μＬ使用し、同様に溶液を調製した。
【００８７】
〈マイクロプレートの調製〉
黄色ブドウ球菌のｒＲＮＡに相補的な配列を有する下記キャプチャープローブ−２をストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、実施例２及び比較例２で使用した。
キャプチャープローブ−２（図１２の符号５６）の塩基配列（配列番号８）
5’-Ｔ4領域（CGTCTTTCACTTTTGAACCAT）-3’- Amino link
【００８８】
〈反応及び検出方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに前記調製した溶菌液（菌濃度：１×１０5ＣＦＵ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬ、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液を５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、４５℃で１時間反応させた。図１２はこの反応工程の概略説明図である。また、対照として、溶菌液の代わりに生理食塩水を用いて同様に反応を行った。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
【００８９】
（２）第２ハイブリダイゼーション（ＨＣＰによる自己集合体又はハイブリッド形成反応）
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を５０μＬ又は１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。
実施例２、即ち実施例２−１及び実施例２−２では、前記マイクロプレートのストリップウェルのうち半分を「Ｃ／Ｈ」条件により５０℃又は５５℃で１時間反応させた。なお、「Ｃ／Ｈ」条件は冷却手段として保冷剤を用い且つ恒温槽の設定温度を変更した以外は実施例１と同様に行った。
【００９０】
比較例２、即ち比較例２−１及び比較例２−２では、前記ストリップウェルの残りを「Ｈ／Ｈ」条件により５０℃又は５５℃で１時間反応させた。なお、「Ｈ／Ｈ」条件はインキュベーターの代わりにマイクロプレートヒーター（ＤＩＧＥＮＥ製）を用い且つ設定温度を変更した以外は比較例１と同様に行った。
【００９１】
（３）検出
実施例１と同様の方法により吸光度を測定した。結果を表３及び表４に示す。なお、表３及び表４中に示した各吸光度の数値は、測定された数値から溶菌液の代わりに生理食塩水を用いた対照実験の測定数値を差し引いた数値である。
【００９２】
【表３】
0004482557.tif 000014
【００９３】
【表４】
0004482557.tif 000015
【００９４】
表３及び表４に示したように、Ｃ／Ｈ条件下の実施例２においては、１ＨＣＰを用いた実施例２−２よりも２ＨＣＰを用いた実施例２−１の測定値が高く、Ｈ／Ｈ条件下の比較例２における２ＨＣＰを用いた比較例２−１と比較しても高い測定値であった。また、１ＨＣＰについて、Ｃ／Ｈ条件下の実施例２−２では反応液量を５０μＬから１００μＬへ増やすと測定値が高くなるが、Ｈ／Ｈ条件下の比較例２−２では反応液量をかえても差がみられなかった。これらの結果より、Ｃ／Ｈにおいて溶液中の反応温度がより段階的に作成され、ターゲット遺伝子上でＨＣＰによる自己集合体が形成され易くなると同時に、ＰＡＬＳＡＲ法ではない通常の一本鎖のハイブリダイゼーションの効率も高くなることが確認された。
【００９５】
（実施例３及び比較例３）
部分的な反応温度領域を適用する第２ハイブリダイゼーションの反応液量をかえて、一本鎖のプローブのハイブリダイゼーション効率及びＨＣＰによる自己集合体の形成効率への効果を確認した。実施例３の概略説明図を図１３に示す。
【００９６】
〈各溶液の調製〉
（１）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−１の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに実施例１記載のアシストプローブ−１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）及びアシストプローブ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を各１０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−２を８０μＬ加え、ミキサーでよく混和して８０℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しプローブ混液とした。
このプローブ混液を、冷却したハイブリダイゼーション溶液−２を３．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブに加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲットｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−１（各プローブの終濃度：０．２５ｐｍｏｌ／μＬ）とした。
【００９７】
（２）第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−２の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに実施例１記載のプローブＡ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−２を９０μＬ加え、ミキサーでよく混和して８０℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しプローブ混液とした。
このプローブ混液を、冷却したハイブリダイゼーション溶液−２を１．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブに加え、ミキサーでよく混和し、これをターゲットｒＲＮＡとキャプチャープローブのハイブリダイゼーションに使用する第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−２（プローブの終濃度：０．２５ｐｍｏｌ／μＬ）とした。
【００９８】
（３）第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液の調製
０．２ｍＬマイクロチューブに、実験例１記載のＨＣＰ−１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）及びＨＣＰ−２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を各４０μＬ、ハイブリダイゼーション溶液−１を２０μＬ加え、ミキサーでよく混和して８０℃で３０秒加熱した後、直ちに氷冷しＨＣＰ混液とした。
このＨＣＰ混液を、ハイブリダイゼーション溶液−１を１．９ｍＬ分注した１５ｍＬコニカルチューブへ加え、ミキサーでよく混和し第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液（各プローブの終濃度：２ｐｍｏｌ／μＬ）とし、実施例３−１及び比較例３−１で用いた。
また、実施例３−２及び比較例３−２で用いる第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液として、ＨＣＰ−１のかわりに滅菌蒸留水を４０μＬ使用し、同様に溶液を調製した。
【００９９】
〈反応及び検出方法〉
（１）第１ハイブリダイゼーション
実施例１記載のストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートに、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−２を５０μＬ加え、プレートシーラーでしっかりとシールし、４５℃で１時間反応させた。図１３の（ｃ）及び（ｄ）はこの反応工程の概略説明図である。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
【０１００】
同時に、１．５ｍＬマイクロチューブに、前述した方法により５×１０4ＣＦＵ／ｍＬに調製された溶菌液又は生理食塩水（対照）を５００μＬ、第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−１を５００μＬ加え、ミキサーでよく混和し、４５℃で１時間反応させた。図１３の（ａ）及び（ｂ）はこの反応工程の概略説明図である。
この反応液を前記第１ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−２による反応後のマイクロプレートに１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールし、更に４５℃で１時間反応させた。図１３の（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）はこの反応工程の概略説明図である。
反応後、プレートウォッシャーを用いて洗浄液で洗浄した。
【０１０１】
（２）第２ハイブリダイゼーション（ＨＣＰによる自己集合体又はハイブリッド形成反応）
前記洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ第２ハイブリダイゼーション・ＨＣＰ溶液を５０μＬ又は１００μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。
【０１０２】
実施例３、即ち実施例３−１及び実施例３−２では、前記マイクロプレートのストリップウェルのうち半分を使用し、「Ｃ／Ｈ」条件により反応させた。実施例３における「Ｃ／Ｈ」条件は下記の通りである。
ストリップウェルを４℃の保冷庫で３０分間冷却した後、冷却したストリップウェルをマイクロプレートヒーター（ＤＩＧＥＮＥ製）に設置し、マイクロプレートの上に予め４℃の保冷庫で冷却したアルミブロックを載せ、その上に冷却手段（ストラタクーラーの蓋、STRATAGENE製）を載せ、マイクロプレートヒーターを５５℃に設定して１時間反応させた。
【０１０３】
比較例３、即ち比較例３−１及び比較例３−２では、前記ストリップウェルの残りを「Ｈ／Ｈ」条件により５５℃で１時間反応させた。なお、「Ｈ／Ｈ」条件は設定温度を変更した以外は比較例２と同様に行った。
なお、実施例３及び比較例３では、ストリップウェルとの密着性を高める為、反応前にいずれのブロック上にもミネラルオイルを滴下しておいた。
【０１０４】
（３）検出
実施例１と同様の方法により吸光度を測定した。結果を表５に示す。なお、表５中に示した各吸光度の数値は、測定された数値から溶菌液の代わりに生理食塩水を用いた対照実験の測定数値を差し引いた数値である。
【０１０５】
【表５】
0004482557.tif 000016
【０１０６】
表５に示したように、１ＨＣＰ、２ＨＣＰのいずれにおいても、Ｃ／Ｈの方がＨ／Ｈよりも測定値が高く、反応液量を５０μＬから１００μＬへ増やすと、通常のハイブリダイゼーションである１ＨＣＰについて特にＣ／Ｈの測定値が高くなった。これらの結果より、Ｃ／Ｈにおいて溶液中の反応温度がより段階的に作成され、ターゲット遺伝子上でＨＣＰによる自己集合体が形成され易くなると同時に、ＰＡＬＳＡＲ法ではない通常の一本鎖のハイブリダイゼーションの効率も高くなることが確認された。
【０１０７】
（参考例１及び比較例４）
参考例１は、標識オリゴヌクレオチドＤＮＡを用いて、均一な反応温度溶液を対照（比較例４）とし、反応溶液中に部分的な反応温度領域を作成した場合のターゲット遺伝子の検出効率を比較した。
【０１０８】
〈各溶液の調製方法〉
（１）ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ａの調製
ハイブリダイゼーション溶液−２［4XSSC、0.2%SDS、1%Blocking reagent（Roche製）、２０％ホルムアミド、Salmon sperm DNA(10μg/mL)］に下記プローブＢを０．０２５ｐｍｏｌ／μＬになるように溶解し、これをハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ａとした。
プローブＢ（図１４の符号５７）の塩基配列（配列番号９）
5’-Ｋ1領域（CGACGACGACGACGACGACG）・Ｔ5領域（AAATCGACAGCGTTTACAGCG）-3'
【０１０９】
（２）ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ｂの調製
前記ハイブリダイゼーション溶液−２に５'末端がＤＩＧラベルされた下記プローブＣを０．０２５ｐｍｏｌ／μＬになるように溶解し、これをハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ｂとした。
プローブＣ（図１４の符号５９）の塩基配列（配列番号１０）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
DIG-5'-Ｔ6領域（TTATCACGTTAGCTACGGGCGC）-3'
【０１１０】
（３）溶菌液の調製
チョコレート寒天培地で１８時間培養したインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を生理食塩水に懸濁させたものを培養菌原液とした。これを菌濃度１×１０7ＣＦＵ／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、アルカリ−ＳＤＳ法（非特許文献５）に従って溶菌させ、これを溶菌液とした。菌数については、培養菌原液の希釈系列を作成して、チョコレート寒天培地で培養して得られた生菌数から所定の菌数を算出した。なお、溶菌液のかわりに生理食塩水を用いて同様に反応させたものを対照とした。
【０１１１】
〈マイクロプレートの調製〉
インフルエンザ菌のｒＲＮＡに相補的な配列を有する下記キャプチャープローブ−３を各々ストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレート上に固定し、参考例１及び比較例４で用いた。
キャプチャープローブ−３（図１４の符号５８）の塩基配列（配列番号１１）
5’-Ｔ７領域（CAGAGTTAAACCCCAACCCCC）・Ｋ１’領域（CGTCGTCGTCGTCGTCGTCG）-3’-Amino link
【０１１２】
〈反応及び検出方法〉
（１）ハイブリダイゼーション反応
前記調製したストリップウェルタイプの９６ウェルマイクロプレートにハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ａを５０μＬ分注し、マイクロプレートを４５℃に設定した条件下で１時間反応させた。図１４（ａ）はこの反応工程の概略説明図である。
反応後、洗浄液（50mM- Tris, 0.3M-NaCl,0.01％-TritonX-100,pH7.6）で洗浄した。
【０１１３】
洗浄後、洗浄液をよくきった９６ウェルマイクロプレートへ前記調製した溶菌液を５０μＬ、ハイブリダイゼーション・プローブ溶液−Ｂを５０μＬずつ分注し、プレートシーラーでしっかりとシールした。なお菌数は４×１０５ＣＦＵ／wellであった。
参考例１は、前記マイクロプレートの下部を４５℃、上部を電気的に２０℃に制御した条件下で１時間反応させた。図１４（ｂ）はこの反応工程の概略説明図である。反応後、洗浄液で洗浄した。
一方、比較例４はマイクロプレートを４５℃に設定した条件で同様の反応及び洗浄を行った。
【０１１４】
（２）検出
マイクロプレートウェルを洗浄後、50mM-Tris(pH7.6)に溶解したPOD標識抗ジゴキシゲニン（60mU/mL)を５０μＬ加え、３７℃のインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄後、０．２M酢酸緩衝液(pH5.0)、0.06%TMB及び0.04％Ｈ2O2を含む発色液を５０μＬ加え、暗所で１５分間放置し、６５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を表６及び図１５に示す。
【０１１５】
【表６】
0004482557.tif 000017
【０１１６】
表６及び図１５に示した如く、下部を４５℃、上部を電気的に２０℃に制御した参考例１は、比較例４よりも測定値が高く、感度が向上した。この結果より、ＨＣＰの自己集合反応によるシグナル増幅においてのみならず、標識オリゴＤＮＡを用いた場合の検出においても感度が向上していることが確認できた。
【図１】
0004482557.tif 000020
【図２】
0004482557.tif 000021
【図３】
0004482557.tif 000022
【図４】
0004482557.tif 000023
【図５】
0004482557.tif 000024
【図６】
0004482557.tif 000025
【図８】
0004482557.tif 000026
【図１５】
0004482557.tif 000027
【図７】
0004482557.tif 000028
【図９】
0004482557.tif 000029
【図１０】
0004482557.tif 000030
【図１１】
0004482557.tif 000031
【図１２】
0004482557.tif 000032
【図１３】
0004482557.tif 000033
【図１４】
0004482557.tif 000034
【配列表】
0004482557000001.app