(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムタナーゼのムタン結合ドメインから選ばれるポリペプチドと、蛋白質分解酵素、リパーゼ、アミラーゼファミリー、ペクチン質分解酵素及び酸化還元酵素から選ばれる酵素とを結合させてなることを特徴とするキメラ酵素。
【請求項２】
酵素が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来する蛋白質分解酵素、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属もしくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来するアミラーゼ、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属もしくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来するリパーゼ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のペクチナーゼ、オイスターマッシュルーム由来のラッカーゼ、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ、又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースオキシダーゼである請求項１記載のキメラ酵素。
【請求項３】
ムタナーゼのムタン結合ドメインから選ばれるポリペプチドと、蛋白質分解酵素と、リパーゼとを結合させてなることを特徴とするキメラ酵素。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項記載のキメラ酵素を含む洗浄剤組成物。
【請求項５】
顔垢汚れ洗浄剤である請求項４記載の洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キメラ酵素及び洗浄剤組成物に関し、更に詳述すると、汚れ成分又は繊維成分に親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に親和性を有する酵素とを結合させてなる優れた洗浄効果をもたらすことのできるキメラ酵素及びこのキメラ酵素を含む洗浄剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
繊維織物製品には皮脂や蛋白質などの人体に由来する汚れだけでなく、食物や生活環境に由来する様々な汚れが付着し、これら汚れの除去を目的として、様々な洗浄剤組成物及び酵素が開発されている（上島孝之著、「産業用酵素」、丸善株式会社発行（１９９５））。
【０００３】
この場合、繊維織物製品への洗浄力を向上させるため、洗浄剤組成物中にプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼなどの酵素を配合することが広く行われている（上島孝之著、「産業用酵素」、丸善株式会社発行（１９９５））。更に洗浄力を向上させるため、比活性の高い酵素の開発や、洗浄剤組成物中の酵素の増量、汚れの構成成分に適した酵素の開発などが行われている。
【０００４】
しかしながら、繊維に固着している汚れやしみの除去は未だ充分なものではない。これは、洗浄中の酵素は洗浄液中に分散しているので、汚れに対して効率的に作用しにくく、酵素による洗浄力を向上させるためには汚れに配向する酵素濃度が低いのがその理由の一つである。
【０００５】
かかる課題の解決策の一つとして、セルラーゼのセルロース結合ドメインが保有する繊維に対する親和性を酵素に付与する方法が提案されている（ＵＳＰ６０１５７８３号公報）。
【０００６】
このセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤと略記する）は、そのアミノ酸配列の特徴から複数のファミリーが提唱されている（Ｐ．Ｔｏｍｍｅら、Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，１−８１（１９９５））。
【０００７】
洗浄剤へのＣＢＤの応用については、ＣＢＤファミリーＩ，ＩＩ，ＶＩのキメラ酵素に関してＵＳＰ６０１５７８３号公報に提案されているが、それらの洗浄力特性については明らかにされていない。また、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）のファミリーＩＩに分類されるセルラーゼのＣＢＤは、セルロース繊維を破壊することが報告されており（Ｎ．Ｄｉｎら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，１０９６−１０９８（１９９１））、繊維製品へダメージを与えることが懸念されるので、ＣＢＤファミリーＩＩは洗浄剤に用いるＣＢＤとしては適当なものではない。
【０００８】
また、上記ファミリー間のアミノ酸配列の特徴が異なることから、ＣＢＤのセルロースに対する結合特性がファミリーの種類により異なり、セルロースを含む製品の洗浄用に適するものと適しないものとが存在することが予想されるが、これまでに、１０タイプのＣＢＤファミリーＩ〜Ｘの洗浄剤への応用可能性を比較評価した事例は無く、セルロース繊維上の汚れの除去に適したＣＢＤについてはこれまで未知であった。
【０００９】
更に、獣毛繊維上の汚れの除去についても、酵素成分などに獣毛繊維に対する親和性を付与することができれば、より優れた洗浄効果が期待できる。
【００１０】
一方、従来から、生体に由来する汚れ（汗、皮脂、垢、血液、唾液、粘液等）、飲食物に由来する汚れ（果物、野菜、ソース、醤油、スパイス類、コーヒー、茶、澱粉質、肉汁、油等）、及び生活環境に由来する汚れ（草木、泥、塵、排気ガス、油類等）が繊維上に残留して、十分に洗浄できないという問題がある。そのため、汚れ除去効果を担う酵素に汚れ成分に対する親和性を付与することができれば、より優れた洗浄効果が期待できる。
【００１１】
以上の状況から、汚れやしみの除去に適したキメラ酵素を調製するために必要となる汚れ成分に対する親和性を有するポリペプチド、及び繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドを見出すことが強く望まれていた。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、汚れ成分又は繊維成分に親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に親和性を有する酵素とを結合させてなる優れた洗浄効果をもたらすことのできるキメラ酵素及びこのキメラ酵素を含む洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、セルロース繊維に対する親和性は、セルラーゼやキシラナーゼ等のＣＢＤを持つ酵素だけでなく、ムタナーゼ、アミラーゼやグルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴＦと略記する）等の本来セルロース繊維を基質としない酵素及びグルカン結合蛋白質なども有しており、これらもセルロース繊維に対する優れた結合力を有することを知見した。
【００１４】
また、ＣＢＤのファミリーＩ〜Ｘの中で利用できるポリサッカライド親和性ポリペプチドの例としては、繊維の破壊や洗浄時の親和性などの問題から、優れた洗浄力をもつキメラ酵素を構成するのに適したＣＢＤのタイプはファミリーＩ，ＩＩ，ＶＩ以外のファミリーＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘであることを知見した。
【００１５】
更に、獣毛由来の繊維に対する親和性の観点から鋭意検討を重ねた結果、獣毛由来の繊維に付着した汚れやしみに対して、蛋白質（特にケラチン）に対して親和性のあるポリペプチドを構成成分としたキメラ酵素が、優れた洗浄効果を有することを知見した。
【００１６】
一方、各種の汚れ成分に対する親和性の観点から、更に鋭意検討を重ねたところ、皮脂や蛋白質や澱粉などの多糖に対して親和性のあるポリペプチドを構成成分としたキメラ酵素が、繊維上の汚れやしみに対して優れた洗浄効果を有することを知見した。
【００１７】
そして、本発明者が、上記知見に基づき更に鋭意検討を進めた結果、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素とを結合させてなるキメラ酵素が、洗浄中において繊維成分又は汚れ成分に対して効果的に結合し得、汚れに配向する酵素濃度を高めることができ、今までにない高い洗浄力を有することを見出し、本発明をなすに至った。
【００１８】
即ち、本発明は、下記のキメラ酵素及び洗浄剤組成物を提供する。
［１］．ムタナーゼのムタン結合ドメインから選ばれるポリペプチドと、蛋白質分解酵素、リパーゼ、アミラーゼファミリー、ペクチン質分解酵素及び酸化還元酵素から選ばれる酵素とを結合させてなることを特徴とするキメラ酵素。
［２］．酵素が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来する蛋白質分解酵素、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属もしくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来するアミラーゼ、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属もしくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来するリパーゼ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のペクチナーゼ、オイスターマッシュルーム由来のラッカーゼ、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ、又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のグルコースオキシダーゼである［１］記載のキメラ酵素。
［３］．ムタナーゼのムタン結合ドメインから選ばれるポリペプチドと、蛋白質分解酵素と、リパーゼとを結合させてなることを特徴とするキメラ酵素。
［４］．［１］乃至［３］のいずれかに記載のキメラ酵素を含む洗浄剤組成物。
［５］．顔垢汚れ洗浄剤である［４］記載の洗浄剤組成物。
【００１９】
本発明によれば、繊維上の汚れやしみに対する酵素の作用性を画期的に向上させることができるキメラ酵素及びこのキメラ酵素を含む洗浄剤組成物が得られるものである。
【００２０】
なお、本発明において、「親和性」という言葉は、結合性、吸着性、相互作用性、吸脱着性、又は基質としての認識性を意味する。
【００２１】
即ち、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素とを結合させてなるキメラ酵素が、洗浄中において繊維成分又は汚れ成分に対して効果的に結合し得、また、汚れ成分に効率的に作用して繊維上の生体に由来する汚れ（汗、皮脂、垢、血液、唾液、粘液等）、飲食物に由来する汚れ（果物、野菜、ソース、醤油、スパイス類、コーヒー、茶、澱粉質、肉汁、油等）、及び生活環境に由来する汚れ（草木、泥、塵、排気ガス、油類等）に対して今までにない高い洗浄力を有するものである。
【００２２】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明のキメラ酵素は、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素とを結合させてなるものである。
【００２３】
ここで、上記汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドとしては、ポリサッカライドに対する親和性を有するポリペプチド、蛋白質に対する親和性を有するポリペプチド、脂質に対する親和性を有するポリペプチド及び澱粉質に対して親和性を有するポリペプチドから選ばれる１種又は２種以上であることが好ましい。なお、本発明で利用可能な汚れ成分又は繊維成分に親和性を有するポリペプチドは、その機能を有する酵素や蛋白質などのポリペプチド全体、汚れ成分又は繊維成分に親和性を有する部分を含んだポリペプチドの一部分、或いは前述のポリペプチドに対して化学修飾、糖鎖修飾、アミノ酸配列の変更や削除又は追加などの操作を行ったもの、及び合成ポリペプチドも含まれる。
【００２４】
上記ポリサッカライドに対する親和性を有するポリペプチド（ポリサッカライド親和性ポリペプチド）の具体的な例としては、ムタナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、キチナーゼ、セルロース結合蛋白質、キチン結合蛋白質、β−1，３−グルカン結合蛋白質、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、グルカン結合タンパク質、ポリサッカライド輸送蛋白質、ポリサッカライド生合成蛋白質、レクチン類などが挙げられる。
【００２５】
また、ポリサッカライドに対する親和性を有するポリペプチドの一部分を用いることも可能である。例えば、ムタナーゼのムタン結合ドメイン（ＭＢＤ）、アミラーゼの澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キチナーゼなどに含まれるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）のうち繊維の破壊や洗浄時の親和性などの問題から、ファミリーＩ，ＩＩ，ＶＩ以外のファミリーＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘに分類されるもの、セルロース結合蛋白質（ＣＢＰ）、β−グルコシダーゼの基質結合領域、グルコシルトランスフェラーゼのグルカン結合領域、レクチンの認識領域などを利用することもできる。
【００２６】
上記蛋白質に対する親和性を有するポリペプチド（蛋白質親和性ポリペプチド）の一例としては、ケラチンに対する親和性を有するポリペプチドが挙げられる。例えば、角化関連蛋白質、ケラチンの生合成や分解に関わる蛋白質や酵素、疎水性の強い蛋白質などが挙げられる。より具体的には、ケラチン分解酵素、トランスグルタミナーゼ、トリコヒアリンなどのアミノ酸配列上で蛋白質に親和性を有する領域を含んでなるポリペプチドの利用も可能である。
【００２７】
上記脂質に対する親和性を有するポリペプチド（脂質親和性ポリペプチド）の一例としては、脂質類の合成・運搬・代謝・分解などに関与する蛋白質や酵素などが挙げられる。より具体的には、脂肪酸合成酵素、トリアシルグリセロール合成酵素、脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、脂肪酸輸送蛋白質、アポリポ蛋白質、アルブミン、チロクロムＰ４５０、ホスホリパーゼ、リパーゼ、ジアシルグリセロールキナーゼ、脂肪酸結合蛋白質及びそのファミリー、又は各種の膜蛋白質の膜結合領域のアミノ酸配列上において、脂質結合に関与する領域の利用も可能である。更に、疎水性ペプチドの利用も可能である。
【００２８】
上記澱粉質に対する親和性を有するポリペプチドの例としては、前述のポリサッカライド親和性ポリペプチドと同じものが挙げられる。
【００２９】
なお、本発明で利用できる獣毛繊維に対する親和性を有するポリペプチドの例としては、上記ケラチンの生合成や分解に関わる蛋白質や酵素が挙げられる。
【００３０】
以下、本発明での好適なポリペプチドの由来の事例を示すが、本発明で利用できるポリペプチドは、下記の事例及びそれらの由来に限定されるものではない。
【００３１】
▲１▼ムタナーゼ及びムタナーゼのムタン結合ドメイン：
ムタナーゼの由来する属の一例としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、スピカリア（Ｓｐｉｃａｒｉａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、クロディウム（Ｃｈｌｏｄｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、バチルス・エスピー・ＲＭ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＲＭ１）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、ペニシリウム・フニキュロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ワートマニー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、ペニシリウム・ヴァーミキュラタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｔｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、スピカリア・ビオラセア（Ｓｐｉｃａｒｉａ  ｖｉｏｌａｃｅａ）、クラドスポリウム・レジーナ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｒｅｓｉｎａｅ）、クロディウム・ビリデ（Ｃｈｌｏｄｉｕｍ  ｖｉｒｉｄｅ）、ストレプトマイセス・ウェランシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｗｅｒｒａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・シャトレウシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）、バクテロイデス・オラリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｒａｌｉｓ）などが挙げられる。
【００３２】
▲２▼アミラーゼファミリー及びそれらの澱粉結合ドメイン：
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−１，４−グルカナーゼ及びシクログルカントランスフェラーゼの由来する属の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ホルモコニス（Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、コーティシウム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ）属、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、シュードモナス・サッカロフィア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・ステュツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・オーベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｈｂｅｎｓｉｓ）、バチルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモアナエロバクター・サーモスルフロゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ）、ホルモコニス・レジーナ（Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ  ｒｅｓｉｎａｅ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・アルビドフラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・ビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、サーモモノスポラ・クルバータ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ）、リゾパス・オリザ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フミコーラ・グリサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、コーティカム・ロルフシ（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ウーセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）などが挙げられ、更にはヒトや動物又は植物に由来するものも利用可能である。
【００３３】
▲３▼グルコシルトランスフェラーゼ類（ＧＴＦ−Ｓ、ＧＴＦ−Ｉ、ＧＴＦ−ＳＩ）及びそれらのグルカン結合領域：
ＧＴＦ類の由来する属の一例としては、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・クリセティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、リューコノストック・メセンテロイズ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などが挙げられる。
【００３４】
▲４▼グルカン結合蛋白質：
グルカン結合タンパク質の由来する属の一例として、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などが挙げられる。種の一例としては、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）などが挙げられる。
【００３５】
▲５▼β−１，３−グルカン結合蛋白質：
β−１，３−グルカン結合タンパク質の一例としては、ザリガニ類、エビ類、カニ類等の甲殻類や微生物由来のものなどが挙げられる。
【００３６】
▲６▼セルロース結合蛋白質：
セルロース結合タンパク質の由来する属の一例としては、ディスコステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メロイドギン（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ポルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属、フィブロバクター（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、ディスコステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、メロイドギン・インコグニータ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、ストレプトマイセス・レティキュリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｔｉｃｕｌｉ）、ストレプトマイセス・ハルステディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ビリドスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｓｐｏｒｕｓ）、ストレプトマイセス・オリバセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、クロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリディウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、フィブロバクター・スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ポルフィラ・パープレア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）などが挙げられる。その他、セルロース成長特異的タンパク質（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｇｒｏｗｔｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）も利用可能である。なお、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）属などに由来するものも一例に挙げられる。
【００３７】
▲７▼キチン結合蛋白質：
キチン結合タンパク質の由来する属の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・テンダ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｄａｅ）、ストレプトマイセス・レティキュリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｔｉｃｕｌｉ）、ストレプトマイセス・オリバセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、セラチア・マレッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などが挙げられる。
【００３８】
▲８▼β-グルコシダーゼ及びそれらの基質結合ドメイン：
β-グルコシダーゼの由来する属の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ファネロケート（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、シュードモナス・サッカロフィア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・ステュツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・オーベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｈｂｅｎｓｉｓ）、バチルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモアナエロバクター・サーモスルフロゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・アルビドフラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・ビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、サーモモノスポラ・クルバータ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、フミコーラ・グリサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ファネロケート・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）などが挙げられる。
【００３９】
▲９▼セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有する酵素（セルラーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−セロビオシダーゼ、β−グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キチナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼなど）及びそれらのＣＢＤ：
セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有する酵素としてセルラーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−セロビオシダーゼ、β−グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キチナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼの有する各種タイプのＣＢＤのうち、Ｉ，ＩＩ，ＶＩ以外のファミリーIII，ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，ＩＸ，Ｘに分類されるＣＢＤが好適であり、それらのＣＢＤを有する酵素又はそれらのポリペプチドの一部分も利用可能である。これらの中でも特に好ましいＣＢＤファミリーはファミリーＩＩＩ，ＩＶ，ＩＸである。
【００４０】
なお、以下に一例を挙げた属や種以外に由来するＣＢＤであっても、アミノ酸配列の類似性によりファミリーＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ，Ｘに分類されるＣＢＤであれば、利用することができる。
【００４１】
（ｉ）上記ファミリーＩＩＩのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クラドセラム（Ｃｌａｄｏｃｅｌｌｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クラドセラム・サッカロリティカム（Ｃｌａｄｏｃｅｌｌｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、クロストリディウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリディウム・セルロバンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリディウム・スタコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、クロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、エルヴィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）などが挙げられる。
【００４２】
（ｉｉ）上記ファミリーＩＶのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例としては、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、クロストリディウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ストレプトマイセス・レティキュリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｔｉｃｕｌｉ）、サーモモノスポラ・フコサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｃｏｓａ）などが挙げられる。
【００４３】
（ｉｉｉ）上記ファミリーＶのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例としては、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属などが挙げられ、種の一例としてはエルヴィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）などが挙げられる。
【００４４】
（ｉｖ）上記ファミリーＶＩＩのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例として、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属などが挙げられ、種の一例としてクロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）などが挙げられる。
【００４５】
（ｖ）上記ファミリーＶＩＩＩのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例として、ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属などが挙げられ、種の一例としてディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）などが挙げられる。
【００４６】
（ｖｉ）上記ファミリーＩＸのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例としては、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属などが挙げられる。更に種の一例としては、クロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ナポリターナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）などが挙げられる。
【００４７】
（ｖｉｉ）上記ファミリーＸのＣＢＤを持つ酵素が由来する属の一例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属などが挙げられ、種の一例としては、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）などが挙げられる。
【００４８】
なお、その他以下の属や種に由来する酵素の基質結合ドメイン又は酵素についても利用可能である。例えばクラディバチルス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ドウワニエラ（Ｄｏｏｈｗａｎｉｅｌｌａ）属、ジャンチノバクテリウム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エマリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの属に由来するキチナーゼ；クラディバチルス・セルロボランス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、ドウワニエラ・キチナシゲンス（Ｄｏｏｈｗａｎｉｅｌｌａ  ｃｈｉｔｉｎａｓｉｇｅｎｓ）、ジャンチノバクテリウム・リビダム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｖｉｄｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、エマリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの種に由来するキチナーゼなどが挙げられる。
【００４９】
なお、レクチン類についてもポリサッカライドに親和性を持つポリペプチドであれば利用可能である。
【００５０】
本発明の汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドの遺伝子は、一般的に行われている方法により取得することができる。例えば、微生物や植物や動物の染色体ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。この作製したｃＤＮＡライブラリーを含んだ微生物の形質転換体を作製して、それらのポリサッカライド、脂質又は蛋白質に対する親和性を評価することにより、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を持つクローンを見出すことができる。
【００５１】
この場合、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドに関するアミノ酸配列や遺伝子のデータベース情報などを基にして、放射性化合物（ＲＩ）や蛍光物質や酵素などでラベル化したオリゴヌクレオチドプローブを作製し、このプローブと相補的な遺伝子を持つクローンを見出すことにより、目的の遺伝子を取得することもできる。
【００５２】
他の方法としては、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドのＤＮＡ配列を含む染色体、ＲＮＡ、プラスミド、又はｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ等により目的のＤＮＡ領域を選択的に増幅して取得するか、適当な制限酵素を用いて切り出すことによっても、目的の遺伝子を取得することができる。
【００５３】
また別の方法としては、予め微生物などにより生産した「汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチド」を用いても良い。この場合、汚れ成分又は繊維成分に親和性を有するポリペプチドを蛋白質分解酵素などで限定分解して生じたポリペプチドを用いることもできる。更には、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が市販されている場合には、それを用いてキメラ酵素の遺伝子を構築しても構わない。
【００５４】
次に、本発明のキメラ酵素の洗浄又は漂白を担う領域の成分となる「汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素」としては、蛋白質分解酵素、リパーゼ、アミラーゼファミリー、ペクチン質分解酵素、及びペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ類（例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ））などの酸化還元酵素から選ばれる１種又は２種以上を用いることが好ましい。なお、対象となる汚れやしみの成分にあわせて、対象成分の分解や漂白に関わる酵素であれば、上記の酵素以外であっても利用することができる。
【００５５】
上記酵素ＤＮＡ又は酵素ポリペプチドの取得源については、動物、植物、カビやバクテリアなどの微生物に由来するものが適当である。また、ここで用いる酵素には、既知の酵素又は市販されている酵素を用いることもできる。更には、本発明で利用できる酵素には、化学修飾や遺伝子工学的な修飾を施した酵素も含まれる。
【００５６】
以下、本発明の好適な酵素の種類及び由来の事例を示すが、本発明で利用できる酵素は、下記の事例及びそれらの由来に限定されるものではない。
【００５７】
▲１▼蛋白質分解酵素：
本発明で用いる蛋白質分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．４）の種類や由来は限定されない。好適な蛋白質分解酵素の由来の例としては、微生物、動物、植物が挙げられるが、特に微生物（バクテリア又はカビ）由来のプロテアーゼが好ましい。各種のタイプのプロテアーゼが利用できるが、Ｅ．Ｃ．３．４．２１のセリンプロテアーゼが好適であり、中でも、アルカリプロテアーゼが好適である。好ましい酵素の一例としては、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属に由来するアルカリプロテアーゼが挙げられる。有用な酵素の一例としては、ズブチリシン、Ｙａ酵素（霜垣ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，２２５１−２２５８（１９９１））、などが挙げられる。
【００５８】
▲２▼アミラーゼファミリー：
本発明で利用できるアミラーゼの種類や由来は限定されない。Ｅ．Ｃ．３．２．１．１のα−アミラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２のβ−１，３−アミラーゼ、及びＥ．Ｃ．３．２．１．３のエキソ−α−１，４−グルコシダーゼ、エンド−α−１，４−グルコシダーゼが好ましく、特に微生物（バクテリア又はカビ）に由来するものが好ましい。有用なアミラーゼの一例としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾパス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００５９】
▲３▼リパーゼ：
本発明で利用できるリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）の種類や由来は限定されない。Ｅ．Ｃ．３．１．１３のトリアシルグリセロールリパーゼ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．１３のコレステロールエステラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．１．２３のモノアシルグリセロールリパーゼ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３４のリポプロティンリパーゼが好ましく、それら由来は限定されないが、特に微生物（バクテリア又はカビ）に由来するものが好ましい。有用なリパーゼの一例としては、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００６０】
▲４▼ペルオキシダーゼ：
本発明で利用できるペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１）の種類や由来は限定されないが、Ｅ．Ｃ．１．１１．７のペルオキシダーゼが好ましく、特に植物又は微生物（バクテリア、担子菌類、又はカビなど）に由来するものが好ましい。有用なペルオキシダーゼの一例としては、植物由来では、西洋わさび、大豆などに由来するもの、微生物由来では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００６１】
▲５▼ラッカーゼ：
本発明で利用できるラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）の種類や由来は限定されないが、植物又は微生物（バクテリア、カビ、又は担子菌類など）に由来するものが好ましい。有用なラッカーゼの一例としては、植物由来では、ウルシなどの樹木や野菜類に由来するもの、微生物由来では、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００６２】
▲６▼オキシダーゼ：
本発明で利用できるオキシダーゼの種類や由来は限定されない。Ｅ．Ｃ．１．１．３．４のグルコースオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．５のヘキソースオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．６のコレステロールオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．１０のピラノースオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．１３のアルコールオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．３．９のガラクトースオキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１０．３．１のカテコールオキシダーゼが好適である。これらの酵素は動物、植物、及び微生物から得ることができるが、微生物（バクテリア、カビ、又は担子菌類など）由来のものが好適である。有用なオキシダーゼの一例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００６３】
▲７▼ペクチン酸分解酵素：
本発明で利用できるペクチン酸分解酵素の種類や由来は限定されない。Ｅ．Ｃ．３．２．１５のペクチナーゼ、Ｅ．Ｃ．４．２．２．２のペクチン酸リアーゼが好適である。植物や微生物から得ることができるが、由来は限定されない。アルカリ領域で活性の高い酵素も好適に用いられる。好ましいペクチン酸分解酵素としては、微生物由来の酵素が挙げられ、一例としてバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属などに由来するものが挙げられる。
【００６４】
なお、その他の種類の酵素であっても、汚れ成分の分解に関わる酵素であれば利用することが可能である。
【００６５】
本発明の汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドを有するキメラ酵素は、遺伝子工学的な手法、又は化学的な架橋方法などによって得ることができる。
【００６６】
この場合、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと酵素との連結部分については、直接連結してもよいし、リンカーを介して連結することもできる。
【００６７】
本発明でいうリンカーとは、ポリサッカライドを分解する各種の酵素に良く見られるような、触媒活性領域と基質結合ドメインとの間をつなぐ領域として存在するペプチドである（Ｐ．Ｔｏｍｍｅら、Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，１−８１（１９９５））。目的に応じて各種のリンカーが利用でき、酵素や蛋白質に由来するリンカーやその誘導体、人工的に設計したポリペプチドなどを用いることができる。
【００６８】
リンカーの長さは０〜４００アミノ酸が適当であり、より好ましくは０〜１００アミノ酸である。また、リンカーの分解が懸念される場合には、プロテアーゼに感受性の低いアミノ酸配列のリンカーを用いたり、リンカーのアミノ酸配列をプロテアーゼが認識しにくく変更したり、リンカーを糖鎖により修飾することができる。また、酵素領域を離脱する目的でキメラ酵素を作製する場合は、リンカー部分にプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を挿入して、系中に存在するプロテアーゼ、又は後で添加したプロテアーゼなどにより、リンカーを分解させることも可能である。
【００６９】
また、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと酵素とのつなぎ方については、化学的な結合、イオン結合、ジスルフィド結合、疎水結合、水素結合、ｐＨ感受性の結合、又は金属イオンを媒介とした結合などを利用することもできる。
【００７０】
汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドは、それらを含む蛋白質や酵素の種類によって、ポリペプチド上の存在位置がＮ末端側、Ｃ末端側、内側のものがあり、様々である。しかしながら、キメラ酵素の作製においては、キメラ酵素のアミノ酸配列上において、ポリペプチド上の本来の存在位置に依存せず、Ｎ末端側、Ｃ末端側又は内側の任意の位置に組み込むことが可能である。
【００７１】
キメラ酵素の構成は、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドを複数、或いは汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素を複数組み合わせることも可能である。例えば、一つの汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドをキメラ酵素の内側に位置させて、その両側に同一又は異なる酵素を連結することも可能である。
【００７２】
また、リンカーを汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと酵素の連結部分に用いることも可能である。更に、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドに複数の酵素をつなぎ合わせた多機能キメラ酵素などの作製も可能であるし、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドを各種複数連結したキメラ酵素などの作製も可能である。
【００７３】
具体的には、遺伝子工学的手法により、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドの遺伝子配列と洗浄や漂白を担う酵素の遺伝子配列を融合することにより、キメラ酵素の遺伝子を得ることができる。また、キメラ酵素の遺伝子配列中にリンカー領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を融合しても良い。
【００７４】
更にもう一つの方法として、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列と洗浄や漂白を担う酵素のアミノ酸配列を、化学的な架橋結合、イオン結合、ジスルフィド結合、疎水結合、水素結合、ｐＨ感受性の結合、又は金属イオンを媒介とした結合などを利用して連結しても良い。この場合にもリンカー領域を含むことができる。
【００７５】
本発明の洗浄剤組成物は、上記のようにして得られる汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素とを結合させてなるキメラ酵素を含むものである。
【００７６】
この場合、洗浄剤組成物中のキメラ酵素の配合量は０．００１〜２０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量％である。
キメラ酵素の配合量が少なすぎると十分な洗浄力が得られない場合があり、一方、多すぎると配合量に見合った洗浄力が期待できない場合がある。
【００７７】
本発明の洗浄剤組成物には、キメラ酵素以外にも、一般に洗浄剤に使用される界面活性剤等の洗浄成分を併用することができる。
【００７８】
界面活性剤としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及び／又はアルキル硫酸塩を含有するものが好ましい。これらの具体例としては、平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩などが挙げられる。
【００７９】
本発明の洗浄剤組成物中に使用される界面活性剤の配合量は、一般的には５〜４０質量％、好ましくは１５〜４０質量％である。界面活性剤の配合量が少なすぎると洗浄力が不足する場合があり、一方、多すぎると洗剤製造性が悪化する場合があり、好ましくない。
【００８０】
上記界面活性剤としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及び／又はアルキル硫酸塩の含有物以外にも、必要に応じて、他の界面活性剤を配合することができる。具体的には、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、分子中に平均０．１５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するオレフィンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するα−スルホ脂肪酸メチルエステル塩、平均炭素数８〜２０高級脂肪酸塩等の他のアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有し、分子中に平均１〜２０モルのアルキレンオキサイドを付加したポリオキシアルキレンアルキルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加物等の非イオン性界面活性剤；その他べタイン型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、カチオン性界面活性剤などを含有してもよい。
【００８１】
その他、本発明の洗浄剤組成物には以下の成分を必要に応じて用いることができる。
１）アクリル酸とマレイン酸の共重合体
２）無機ビルダー
Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩、結晶性ケイ酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
３）２価金属イオン捕捉剤
アミノ酸誘導体（アミノ酸骨格としてグリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸から誘導される−ＣＯＯＸ基を分子内に３〜４個持つキレート剤であり、Ｘは水素、又はアルカリ金属塩、特にナトリウム塩が好ましい。具体的には、グリシン２酢酸塩、セリン２酢酸塩、アスパラギン酸２酢酸塩、グルタミン酸２酢酸塩、イミノジコハク酸塩、ヒドロキシイミノジコハク酸塩など）、オルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、ニトリル三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアクリル酸、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。
４）アルカリ剤及び無機塩
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
５）再汚染防止剤
ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
６）漂白剤、漂白活性化剤、蛍光剤等
漂白剤として過炭酸ソーダ、過ホウ酸ソーダ、硫酸ナトリウムや塩化ナトリウムの過酸化水素付加物などが挙げられ、漂白活性化剤としては、特開平８−１５７８７６号公報記載のものなど、また、増白剤として市販染料の他、香料、青味付剤なども必要に応じて配合することができる．
７）キャリーオーバー成分
原料の不純物は、性能等に悪影響を及ぼさない限り、含有することができる。
α−スルホ脂肪酸メチルエステル塩に含有されるメチル硫酸ナトリウム、メタンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸塩、アクリル酸とマレイン酸の共重合体（塩）に含有されるアクリル酸やマレイン酸のモノマー又はその塩、高級アルコールのエチレンオキサイド付加物に含有される高級アルコール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明によれば、汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドと汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有する酵素とを結合させてなるキメラ酵素及びこのキメラ酵素を含む洗浄剤組成物により、洗浄中において繊維成分又は汚れ成分に対して結合し得、汚れに配向する酵素濃度を高めることができ、今までにない高い洗浄力を有するものである。
【００８３】
【実施例】
以下、製造例、調製例、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって限定されるものではない。なお、製造例中の操作は特に断らない限り、「Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載されている方法に従い行った。
【００８４】
〔製造例１〕ムタナーゼのムタン結合ドメイン（以下、ＭＢＤと略記する）遺伝子の取得
ムタナーゼのＭＢＤ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
特開平１０−２０１４８３号公報に記載のプラスミドｐＲＭ１ＳＫを鋳型として、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー1，２（配列番号１及び２）を用いてＰＣＲを行った。
プライマー１：配列番号１
gccctaggac cgaatctcac
プライマー２：配列番号２
accctaggac cgtgatttgg
【００８５】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＭＢＤ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択して、ＭＢＤ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＭＢＤを得た。
【００８６】
〔製造例２〕  アミラーゼの澱粉結合ドメイン（以下、ＳＢＤと略記する）の取得
アミラーゼのＳＢＤ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学I、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【００８７】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号ＡＢ０２４５１９を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー３，４（配列番号３及び４）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー３：配列番号３
aagatttcct aggtgtaacc
プライマー４：配列番号４
ttacctagga cttgtatgag
【００８８】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＳＢＤ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＳＢＤ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＳＢＤを得た。
【００８９】
〔製造例３〕  セルロース結合蛋白質（以下、ＣＢＰと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＰ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりストレプトマイセス・ハルステディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｓｔｅｄｉｉ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【００９０】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｕ５１２２２を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー５，６（配列番号５及び６）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー５：配列番号５
atggcctagg caaaagactt g
プライマー６：配列番号６
ccgcctagga gattgttgc
【００９１】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＰ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＰ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＰを得た。
【００９２】
〔製造例４〕  ファミリーIに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−Ｉと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−Ｉ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」に記載の方法によりフミコーラ・グリサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【００９３】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ１７２５８を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー７，８（配列番号７及び８）を作製し、エクソン領域に存在するＣＢＤ−Ｉ領域をＰＣＲにより増幅した。
プライマー７：配列番号７
cggcaacaac ctaggcaacc
プライマー８：配列番号８
ttcctaggca ctgagagtac c
【００９４】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−Ｉ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−Ｉ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−Ｉを得た。
【００９５】
〔製造例５〕  ファミリーＩＩに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＩＩと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＩＩ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりセルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【００９６】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ１５８２４を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有するプライマー９，１０（配列番号９及び１０）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー９：配列番号９
atggaggccc taggcgcgag
プライマー１０：配列番号１０
tcagcctagg gtgcagggcg
【００９７】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＩＩ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−ＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＩＩを得た。
【００９８】
〔製造例６〕  ファミリーＩＩＩに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＩＩＩと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＩＩＩ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりバチルス・ロウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【００９９】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ７６５８８を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー１１，１２（配列番号１１及び１２）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー１１：配列番号１１
ttaccaccta ggtctgaaag
プライマー１２：配列番号１２
catctcctag ggtcgattcc
【０１００】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＩＩＩ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、プラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＩＩＩを得た。
【０１０１】
次に、ｐＵＣ１１８をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断したものに、ｐＴ７ＣＢＤ−ＩＩＩのＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ断片を連結し、プラスミドｐＵＣＣＢＤ−ＩＩＩを作製した。ＣＢＤ−ＩＩＩ遺伝子配列内部に存在するＰｓｔＩ部位をアミノ酸配列を変えずに消失させるために、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いて、ｐＵＣＣＢＤ−ＩＩＩを鋳型として下記ＰｓｔＩ消失プライマー１３（配列番号１３）を用い、ＣＢＤ−ＩＩＩ遺伝子内部のＰｓｔＩ部位を消失させたプラスミドｐＵＣＣＢＤ−ＩＩＩ−Ｅを作製した。
プライマー１３：配列番号１３
ttcatcgccg cagagctgtc
これにより、ＣＢＤ−ＩＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＵＣＣＢＤ−ＩＩＩ−Ｅを得た。
【０１０２】
〔製造例７〕  ファミリーＩＶに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＩＶと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＩＶ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりクロストリディウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０３】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ８７０１８を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー１４，１５（配列番号１４及び１５）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー１４：配列番号１４
catatgccct aggaacatat aac
プライマー１５：配列番号１５
tgcagatcct aggaagctgc
【０１０４】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＩＶ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−ＩＶ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＩＶを得た。
【０１０５】
〔製造例８〕  ファミリーＶに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−Ｖと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−Ｖ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりエルヴィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０６】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｙ００５４０を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー１６，１７（配列番号１６及び１７）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー１６：配列番号１６
ttgacgaacc taggacaacc
プライマー１７：配列番号１７
agggctgcaa tcctaggctg
【０１０７】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−Ｖ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−Ｖ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−Ｖを得た。
【０１０８】
〔製造例９〕  ファミリーＶＩに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＶＩと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＶＩ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりクロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０９】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ２２６２４を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー１８，１９（配列番号１８及び１９）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー１８：配列番号１８
ctccctaggt gactggatcg
プライマー１９：配列番号１９
tcacccctag gtgaggctc
【０１１０】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＶＩ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−ＶＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＶＩを得た。
【０１１１】
〔製造例１０〕  ファミリーＶＩＩに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＶＩＩと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＰ−ＶＩＩ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりクロストリディウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１１２】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ２２７５９を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー２０，２１（配列番号２０及び２１）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー２０：配列番号２０
ctcttatcct aggtgccggc
プライマー２１：配列番号２１
ccctaggtca tggtaagtcc
【０１１３】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＶＩＩ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−ＶＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＶＩＩを得た。
【０１１４】
〔製造例１１〕  ファミリーＶＩＩＩに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＶＩＩＩと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＶＩＩＩ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりディクティオステリウム・ディスコイディウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【０１１５】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｍ３３８６１を参考にして、オリゴヌクレオチドプローブを作製し、形質転換した大腸菌の中からＣｅｌＡ遺伝子を持つクローンｐＣｅｌＡを検出した。このｐＣｅｌＡをプラスミド鋳型として、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー２２，２３（配列番号２２及び２３）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー２２：配列番号２２
tgttcattcc taggaaatgc
プライマー２３：配列番号２３
agcgtatcct aggtttgaag
【０１１６】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、ＣＢＤ−ＶＩＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＶＩＩＩを得た。
【０１１７】
〔製造例１２〕  ファミリーＩＸに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−ＩＸと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−ＩＸ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法により、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１１８】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｚ４６２６４を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有する下記プライマー２４，２５（配列番号２４及び２５）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー２４：配列番号２４
ggtcctaggt ggagagatag
プライマー２５：配列番号２５
tgagcctagg gttaccgaac
【０１１９】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−ＩＸ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−ＩＸ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−ＩＸを得た。
【０１２０】
〔製造例１３〕  ファミリーＸに分類されるセルロース結合ドメイン（以下、ＣＢＤ−Ｘと略記する）の取得
セルロース結合蛋白質ＣＢＤ−Ｘ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法により、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１２１】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ１５４２９を参考にして、ＢｌｎＩ部位を有するプライマー２６，２７（配列番号２６及び２７）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー２６：配列番号２６
gcacacctag gaacttgcag
プライマー２７：配列番号２７
accctaggtt ggcattccag
【０１２２】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＣＢＤ−Ｘ遺伝子配列の５’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ部位が存在するクローンを選択し、ＣＢＤ−Ｘ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＣＢＤ−Ｘを得た。
【０１２３】
〔製造例１４〕  脂肪酸結合蛋白質（以下、ＦＡＢＰと略記する）遺伝子の取得
脂肪酸結合蛋白質ＦＡＢＰ遺伝子配列を以下のようにして取得した。
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）により、ヒト皮膚由来ケラチノサイトのｍＲＮＡを調製した。
【０１２４】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号ＭＮ００１４４４を参考にして、ＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー２８，２９（配列番号２８及び２９）を作製し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ)  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
プライマー２８：配列番号２８
ggacagccta ggctttgatg
プライマー２９：配列番号２９
catagatcct aggacaggtg
【０１２５】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＦＡＢＰのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＦＡＢＰ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＦＡＢＰを得た。
【０１２６】
〔製造例１５〕  ケラチナーゼ（以下、ＫＥＲと略記する）遺伝子の取得
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりバチルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１２７】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｓ７８１６０を参考にして、ＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー３０，３１（配列番号３０及び３１）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー３０：配列番号３０
taagcctagg agtgaaaacc
プライマー３１：配列番号３１
cggcacctag gacattgatc
【０１２８】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＫＥＲのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンｐＴ７ＫＥＲを選択した。
【０１２９】
次に、ｐＵＣ１１８をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断したものに、ｐＴ７ＫＥＲのＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ断片を連結し、プラスミドｐＵＣＫＥＲを作製した。ＫＥＲの活性中心のアミノ酸を変異して加水分解活性を消失させるために、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いて、ｐＵＣＫＥＲを鋳型として下記ＨＩＳ消失プライマー３２（配列番号３２）を用い、活性中心のヒスチジンをアラニンに変換したＫＥＲの遺伝子配列を持つプラスミドｐＵＣＫＥＲＡを作製した。
プライマー３２：配列番号３２
accattgccg ttccgttcaa tg
これにより、不活性ＫＥＲ遺伝子配列を含むプラスミドｐＵＣＫＥＲＡを得た。
【０１３０】
〔製造例１６〕  プロテアーゼ遺伝子の取得
アルカリプロテアーゼＹａ酵素（以下、ＡＬＰと略記する）（特開平４−１９７１８２号公報）を含む遺伝子配列を以下の方法により調製した。
【０１３１】
まず、特開平４−１９７１８２号公報記載のプラスミドｐＴＢＥ３ＥＳを鋳型として、ＥｃｏＲＩ部位を含む下記プライマー３３（配列番号３３）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー３４（配列番号３４）を用いてＰＣＲを行った。
プライマー３３：配列番号３３
gatgaggaat tcaggagaaa tgaag
プライマー３４：配列番号３４
atgtacgata cctagggaga aacgc
【０１３２】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＡＬＰのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＡＬＰ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＡＬＰを得た。
【０１３３】
〔製造例１７〕  アミラーゼ（以下、ＡＭＹと略記する）遺伝子の取得
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりバチルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１３４】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ６７１３３を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位を有する下記プライマー３５（配列番号３５）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー３６（配列番号３６）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー３５：配列番号３５
ggaattcaaa aggaggaaac atg
プライマー３６：配列番号３６
tcgcctaggt gaatgtcgac c
【０１３５】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＡＭＹのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＡＭＹ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＡＭＹを得た。
【０１３６】
〔製造例１８〕  リパーゼ（以下、ＬＩＰと略記する）の遺伝子の取得
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりバチルス・サーモカテヌロウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１３７】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ９５３０９を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位を有する下記プライマー３７（配列番号３７）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー３８（配列番号３８）を作製し、ＰＣＲを行った。
プライマー３７：配列番号３７
aagaattcgt tatgtgaggg
プライマー３８：配列番号３８
gcaaataaaa gcctaggata tc
【０１３８】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＬＩＰのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＬＩＰ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＬＩＰを得た。
【０１３９】
〔製造例１９〕  ペクチナーゼ（以下、ＰＥＣと略記する）遺伝子の取得
「生物化学実験講座２：核酸の化学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人発行」記載の方法によりシュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１４０】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｄ３２１２２を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位を有する下記プライマー３９（配列番号３９）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー４０（配列番号４０）を用いてＰＣＲを行った。
プライマー３９：配列番号３９
aactgaattc aatcaaggat c
プライマー４０：配列番号４０
tcctttccct aggacgtcc
【０１４１】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＰＥＣのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＰＥＣ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＰＥＣを得た。
【０１４２】
〔製造例２０〕  ラッカーゼ（以下、ＬＡＣと略記する）遺伝子の取得
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）により、オイスターマッシュルーム（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）のｍＲＮＡを調製した。
【０１４３】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｚ３４８２７を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位を有する下記プライマー４１（配列番号４１）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー４２（配列番号４２）を作製し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ(ＡＭＶ)  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
プライマー４１：配列番号４１
cagaattcgt atgtttccag g
プライマー４２：配列番号４２
taacctaggc cacctttgtc
【０１４４】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＬＡＣのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＬＡＣ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＬＡＣを得た。
【０１４５】
〔製造例２１〕  ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）遺伝子の取得
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）により、西洋わさび（Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）のｍＲＮＡを調製した。
【０１４６】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ５７５６４を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位とｐＫＫ２２３−３のリボソーム結合部位を有するように設計した下記プライマー４３（配列番号４３）及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー４４（配列番号４４）を作製し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
プライマー４３：配列番号４３
caaggaattc aggaaatgaa aacac
プライマー４４：配列番号４４
ctccattccc taggcttccc
【０１４７】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＰＯＤのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択し、ＰＯＤ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ７ＰＯＤを得た。
【０１４８】
〔製造例２２〕  オキシダーゼ遺伝子の取得
グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤと略記する）の取得方法を以下に記す。
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社製）により、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のｍＲＮＡを調製した。
【０１４９】
まず、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｊ０５２４２を参考にして、ＥｃｏＲＩ部位を有するように設計した下記プライマー４５（配列番号４５）、及びＢｌｎＩ部位を含む下記プライマー４６（配列番号４６）を作製し、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）  Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
プライマー４５：配列番号４５
cctcatctgg aattcatgca gactc
プライマー４６：配列番号４６
aatctcctag gatagcatcc
【０１５０】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＧＯＤのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択して、ｐＴ７ＧＯＤを得た。次に、ｐＵＣ１１８をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断したものに、ｐＴ７ＧＯＤのＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ断片を連結し、プラスミドｐＵＣＧＯＤを作製した。
【０１５１】
ＧＯＤ遺伝子配列内部に存在するＥｃｏＲＩ部位のアミノ酸配列を変えずに消失させるために、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎｖｉｔｏｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いて、ｐＵＣＧＯＤを鋳型として下記ＥｃｏＲＩ消失プライマー４７（配列番号４７）にて、ＧＯＤ遺伝子内部のＥｃｏＲＩ部位を消失させたプラスミドｐＵＣＧＯＤＥを作製した。
プライマー４７：配列番号４７
tgccaaattc cacgccaacg
【０１５２】
更に、ＧＯＤ遺伝子配列内部に存在するＰｓｔＩ部位もアミノ酸配列を変えずに消失させるために、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（宝酒造社製）用いて、ｐＵＣＧＯＤＥを鋳型として下記ＰｓｔＩ消失プライマー４８（配列番号４８）を用いて、ＧＯＤ遺伝子内部のＰｓｔＩ部位を消失させたプラスミドｐＵＣＧＯＤＥＰを作製した。
プライマー４８：配列番号４８
ctggtcctga aggttcaagc
これにより、ＧＯＤ遺伝子配列を含むプラスミドｐＵＣＧＯＤＥＰを得た。
【０１５３】
【表１】
0004557108.tif 000002
【０１５４】
【表２】
0004557108.tif 000003
【０１５５】
<キメラ酵素の調製方法>
表１に示した製造例１６〜２２に記載の方法又はこれらに準拠した方法で取得した各種の酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミド群（Ａ１〜Ａ１３）のＢｌｎＩ部位に、表２に示した製造例１〜１５に記載の方法又はこれらに準拠した方法で取得した汚れ成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミド群（Ｂ１〜Ｂ２５）のＢｌｎＩ消化断片（汚れの成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片）を組み込み、キメラ酵素ＤＮＡを調製した。
【０１５６】
具体的には、Ａ群のプラスミドをＢｌｎＩにて消化した後、アルカリフォスファターゼ処理して、Ｂ群のプラスミドのＢｌｎＩ断片（汚れの成分又は繊維成分に対する親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片）を連結した。その際、Ａ群に含まれる酵素のＤＮＡ配列により翻訳される蛋白質配列のＣ末端側にＢ群に含まれるポリペプチド遺伝子配列により翻訳される蛋白質配列のＮ末端側が連結される向きでＤＮＡ配列を連結した。更に必要に応じて、１〜１００アミノ酸配列のリンカーをコードする遺伝子配列をＡ群の遺伝子配列とＢ群の遺伝子配列の連結部分に挿入することができる。
【０１５７】
表３，４に示した各種のＡ群のＤＮＡ配列と各種のＢ群のＤＮＡ配列の組み合わせについて、前記の方法と同様な操作を行い、各種のキメラ酵素のＤＮＡ配列を構築した。また、Ａ群とＢ群とを組み合わせたキメラ酵素のＤＮＡ配列を含むプラスミドのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化断片を、ｐＫＫ２２３−３（アマシャム・ファルマシア社製）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位に挿入したプラスミドを作製し、このプラスミドによる形質転換体を一夜培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、更に４時間培養することにより、表３，４に示したキメラ酵素を得た。
【０１５８】
〔調製例１〕
表３のキメラ酵素Ｈ１の調製例を代表例として記載する。
製造例１６に記載のｐＴ７ＡＬＰをＢｌｎＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ処理したものに対して、製造例１記載のｐＴ７ＭＢＤのＢｌｎＩ断片を連結して、大腸菌を形質転換し、ＡＬＰ遺伝子配列に対してＭＢＤ遺伝子配列が順方向に連結されたクローンを選抜し、ｐＴ７ＡＬＰ−ＭＢＤを得た。
【０１５９】
また、このクローンに由来するキメラ酵素を大腸菌で発現するために、ｐＴ７ＡＬＰ−ＭＢＤをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにて消化し、その断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断したｐＫＫ２２３−３（アマシャム・ファルマシア社製）に連結した。このキメラ酵素の遺伝子配列を含むプラスミドｐＫＫ−ＡＬＰ−ＭＢＤで大腸菌ＪＭ１０５を形質転換して、その形質転換体を一夜培養した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して更に４時間培養することにより、ＡＬＰとＭＢＤから成るキメラ酵素Ｈ１を得た。
【０１６０】
〔調製例２〕  ３種類のポリペプチドを含むキメラ酵素
表５のキメラ酵素３Ｈ１の調製例を代表例として記載する。
キメラ酵素の調製例１に記載のｐＴ７ＡＬＰ−ＭＢＤのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位の断片をｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位を切断したものに連結し、ｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤを作製した。
【０１６１】
ＡＬＰとＭＢＤの連結部分のＢｌｎＩ部位を消失させるために、ＬＡ  ＰＣＲｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いて、ｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤを鋳型として下記ＢｌｎＩ消失プライマー４９（配列番号４９）を用いて、ＡＬＰとＭＢＤの連結部分のＢｌｎＩ部位を消失させたプラスミドｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤＢを作製した。
プライマー４９：配列番号４９
ttcggtccta gtgagaaacg
【０１６２】
一方、ＬＩＰの成熟体のＮ端側の遺伝子配列にＢｌｎＩ部位を作製するために、製造例１８に記載のｐＴ７ＬＩＰを鋳型として下記ＢｌｎＩ部位作製プライマー５０（配列番号５０）とＲ−２０ｍｅｒプライマー（ノバジェン社製）を用いて、ＰＣＲを行った。
プライマー５０：配列番号５０
tccctaggcg ccaatgatgc
【０１６３】
増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）にクローニングし、導入したＬＩＰのＤＮＡ配列の３’末端側にｐＴ７ＢｌｕｅのマルチクローニングサイトのＰｓｔＩ部位が存在するクローンを選択してｐＴ７ＬＩＰ２を得た。
【０１６４】
このｐＴ７ＬＩＰ２のＢｌｎＩ消化断片を、ｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤをＢｌｎＩ切断し、アルカリフォスファターゼ処理したものに連結して、ＡＬＰ−ＭＢＤ遺伝子配列に対してＬＩＰ遺伝子配列が順方向に連結されたクローンを選抜し、ＡＬＰ及びＭＢＤ及びＬＩＰの遺伝子が連結されたプラスミドｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤ−ＬＩＰを作製した。
【０１６５】
得られたｐＵＣＡＬＰ−ＭＢＤ−ＬＩＰをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにて消化し、その断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断したｐＫＫ２２３−３（アマシャム・ファルマシア社製）に連結した。
【０１６６】
このようにして作製したＡＬＰ−ＭＢＤ−ＬＩＰキメラ酵素の遺伝子配列を含むプラスミドｐＫＫ−ＡＬＰ−ＭＢＤ−ＬＩＰで大腸菌ＪＭ１０５を形質転換して、その形質転換体を一夜培養した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。更に、４時間培養することにより、ＭＢＤにＡＬＰとＬＩＰの２つの酵素を連結したキメラ酵素３Ｈ１を得た。
【０１６７】
【表３】
0004557108.tif 000004
【０１６８】
【表４】
0004557108.tif 000005
【０１６９】
【表５】
0004557108.tif 000006
【０１７０】
〔実施例１〜８、比較例１〜１６〕
表３〜５の各種キメラ酵素を、表６に示した組成１〜４の洗浄剤組成物に含まれるように調製し、これら洗浄剤組成物を用いて各種の洗浄力試験を下記方法に従って行った。結果を表７，８に示す。
【０１７１】
<洗浄力試験方法>
（１）顔垢汚れ試験
▲１▼顔垢汚れ布の作製方法
顔面の垢を均一に擦り付けた綿布（顔垢布）を分割して各試験汚染布とした。
▲２▼洗浄力試験
Ｕ．Ｓ．Ｔｅｓｔｉｎｇ社（米国）のＴｅｒｇ−０−ｔｏｍｅｔｅｒを使用し、これに上記汚垢布１０枚とメリヤス布を入れて浴比を３０倍に合わせ、上記洗剤溶液にて、３０℃、１２０ｒｐｍ、１０分間洗浄した。その後、すすぎ、乾燥工程終了後、反射率を測定し洗浄力を求めた。この場合、洗浄液は、洗浄剤濃度０．０６６％のもの９００ｍｌを用い、すすぎは９００ｍｌの水で３分間洗浄した。使用水は硬度３°ＤＨで、塩素濃度１ｐｐｍのものを用いた。
【０１７２】
（２）食品汚れ試験
▲１▼食品汚れ汚染布の作製方法
森永ミルクココア（森永製菓製）を牛乳に分散・溶解させた液に、綿布を浸漬し乾燥した後、ブラッシングして過剰に付着した汚れを脱落させた。この布を５ｃｍ×５ｃｍに裁断して試験布に供した。
▲２▼洗浄力試験
Ｕ．Ｓ．Ｔｅｓｔｉｎｇ社（米国）のＴｅｒｇ−０−ｔｏｍｅｔｅｒを使用し、これに試験布１０枚とメリヤス布を入れて浴比を３０倍にあわせ、１２０ｒｐｍで１０分間洗浄した。その後、すすぎ、乾燥工程終了後、反射率を測定し洗浄力を求めた。この場合、洗浄液は、洗浄剤濃度０．０６６％のもの９００ｍｌを用い、すすぎは９００ｍｌの水で３分間洗浄した。使用水は硬度３°ＤＨで、塩素濃度１ｐｐｍのものを用いた。
【０１７３】
（３）油汚れ試験
▲１▼油汚れ汚垢布の作製方法（泥／トリオレイン汚垢布）
結晶性鉱物であるカオリナイト、バーミキュライトなどを主成分とする粘土を２００℃で３０時間乾燥したものを無機汚垢として使用した。９００ｍｌの水に無機汚垢５０gを加えてポリトロンで分散させながらトリオレイン３０ｇを加えて安定な汚垢浴を作った。この汚垢浴中に１０ｃｍ×２０ｃｍの綿布を浸漬した後、ゴム製２本ロールで水を絞り、汚垢の付着量を均一化した。この汚垢布を１０５℃で３０分乾燥した後、汚垢布の両面を左右２５回づつラビングした。これを５ｃｍ×５ｃｍに裁断して泥／トリオレイン汚垢布を作製した。
▲２▼洗浄力試験
Ｕ．Ｓ．Ｔｅｓｔｉｎｇ社（米国）のＴｅｒｇ−０−ｔｏｍｅｔｅｒを使用し、これに上記汚垢布１０枚とメリヤス布を入れて浴比を３０倍に合わせ、３０℃で３０分間浸漬した後、１２０ｒｐｍ、１０分間洗浄した。その後、すすぎ、乾燥工程終了後、反射率を測定し洗浄力を求めた。この場合、洗浄液は、洗浄剤濃度０．０６６％のもの９００ｍｌを用い、すすぎは９００ｍｌの水で３分間洗浄した。使用水は硬度３°ＤＨで、塩素濃度１ｐｐｍのものを用いた。
【０１７４】
（４）評価方法
下記数式１で表されるクベルカムンク式により洗浄力（％）を求めた。なお、洗浄力の評価は、試験布１０枚の平均値で行った。
【０１７５】
【数１】
0004557108.tif 000007
【０１７６】
【表６】
0004557108.tif 000008
【０１７７】
表６中の略号の意味及び詳細は以下の通りである。なお、ＥＯｐはエチレンオキサイドの平均付加モル数を、また、ＰＯｐはプロピレンオキサイドの平均付加モル数を示す。
（１）アニオニン界面活性剤
α−ＳＦ：α-スルホ脂肪酸（Ｃ14〜Ｃ16）メチルエステルナトリウム
ＡＯＳ：Ｃ14〜Ｃ18α-オレフィンスルホン酸ナトリウム
ＡＥＳ：Ｃ12〜Ｃ18アルキルエーテル（ＥＯｐ＝３）硫酸ナトリウム
ＡＳ：Ｃ12〜Ｃ14硫酸ナトリウム
ＬＡＳ：Ｃ10〜Ｃ14直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
ＡＥ：Ｃ12アルコールエトキシレート（ＥＯｐ＝１２）
ＡＥＰ：Ｃ13アルコールのＥＯ，ＰＯ付加物（ＥＯｐ＝１２、ＰＯｐ＝３）
石けん：Ｃ12〜Ｃ18パーム油由来脂肪酸ナトリウム
コポリマー：アクリル酸とマレイン酸のモル比６０：４０、平均分子量５０，０００の共重合体のナトリウム塩、独国；ＢＡＳＦ社製、商品名ソカランＣＰ７
ゼオライト：４Ａ型ゼオライト（平均粒子径１．２μｍ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（平均分子量６０００）
蛍光剤：４．４−ビス（スルホスチリル）ビフェニル２ナトリウム／４．４−ビス｛（4−アニリノ−６−モノホリノ−１，３，５−トリアジン−２イル）アミノ｝スチルペン−２，２−ジスルホン２ナトリウム＝１／１の混合物（商品名チノパールＣＢＳ／商品名チノパールＡＭＳ）
酵素：プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼのそれぞれ１：１：１：１：０．５：０．５の割合の混合物
【０１７８】
【表７】
0004557108.tif 000009
【０１７９】
【表８】
0004557108.tif 000010
【０１８０】
〔実施例９〜３８、比較例１７〕
次に、表９〜１４に示した組成の洗浄剤組成物を調製し、上記と同様に食物汚れの洗浄力評価を行った。結果を表９〜１４に示す。
【０１８１】
【表９】
0004557108.tif 000011
【０１８２】
【表１０】
0004557108.tif 000012
【０１８３】
【表１１】
0004557108.tif 000013
【０１８４】
【表１２】
0004557108.tif 000014
【０１８５】
【表１３】
0004557108.tif 000015
【０１８６】
【表１４】
0004557108.tif 000016
【０１８７】
【配列表】
0004557108.tif 000017
0004557108.tif 000018
0004557108.tif 000019
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0004557108.tif 000022
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