(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子と、
（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基と
を含み、前記抗原または前記抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質であり、
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に少なくとも一つの非ペプチド共有結合により結合しているワクチン組成物。
【請求項２】
前記ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ウイルス粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルス様粒子がＲＮＡ−ファージＱβの組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージｆｒまたはＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原または抗原決定基がＩＬ−５のタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＬ−５のタンパク質が、
（ａ）配列番号２３３のアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号２３４のアミノ酸配列
を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原または抗原決定基がＩＬ−１３のタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＬ−１３のタンパク質が、
（ａ）配列番号２３０のアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号２３１のアミノ酸配列
を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原または抗原決定基がエオタキシンのタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記エオタキシンのタンパク質が、
（ａ）配列番号２４２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２４３のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号２４４のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウイルス様粒子が少なくとも１つの第１の付着部位を含み、且つ
前記抗原または抗原決定基が、
（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び
（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択された少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含み、
前記第２の付着部位は第１の付着部位に会合することが可能であり、前記抗原又は抗原決定基と前記ウイルス粒子は前記会合を介して相互作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗原または抗原決定基がＩＬ−５のタンパク質であり、前記少なくとも第２の付着部位を備えた前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）配列番号３３５のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３３６のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号３３７のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原または抗原決定基がＩＬ−１３のタンパク質であり、前記少なくとも第２の付着部位を備えた前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）配列番号３３０のアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号３３１のアミノ酸配列
を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質の少なくとも１つの抗原性部位を含むＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の付着部位がリジン残基であり、前記第２の付着部位がシステイン残基である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
（ａ）請求項１に記載の組成物、および
（ｂ）許容可能な医薬品担体
を含む医薬品組成物。
【請求項１８】
更にアジュバンドを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
（ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子を提供し、
（ｂ）ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質である少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供し、及び
（ｃ）前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に少なくとも１つの非ペプチド共有結合により結合できるように、前記ウイルス様粒子と前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを組み合わせること
を含む、請求項１に記載の組成物を生成する方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物を含む、アレルギー性好酸球疾患を治療するための医薬。
【請求項２１】
（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位をそれぞれ備えた少なくとも１つの第１のコア粒子および少なくとも１つの第２のコア粒子であって、 前記少なくとも１つの第１のコア粒子及び／又は少なくとも１つの第２のコア粒子がＲＮＡファージのウィルス様粒子であるもの、および
（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位をそれぞれ備えた少なくとも１つの第１の抗原または抗原決定基および少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基
とを含む組成物であって、
前記少なくとも１つの第１の抗原または抗原決定基および前記少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質から選択され、前記第２の付着部位が、
（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び
（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択され、
前記第２の付着部位が前記第１の付着部位に会合可能であり、前記少なくとも１つの第１および前記少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基と、前記少なくとも１つの第１および前記少なくとも１つの第２のコア粒子とが前記会合を介して相互に作用して規則正しい反復性抗原アレイを形成する、ワクチン組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの第１のコア粒子と前記少なくとも１つの第２のコア粒子が同じ組換えウイルス様粒子であり、前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージの組換えタンパク質を含み、及び前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＲＮＡファージＱβの組換えタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含むか、あるいは前記コートタンパク質から本質的になるか、あるいは前記コートタンパク質からなる、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学、および医学の分野に関する。本発明は、規則的で繰り返し並べられた抗原または抗原決定基のアレイ、特にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを含むアレイを構成する組成物を提供する。より具体的には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、及び／又はエオタキシンの少なくとも１種のタンパク質またはペプチドとを含む組成物を提供する。また本発明は、結合体と規則的な反復アレイをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を予防しまたは治療しかつ免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こす治療用ワクチン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）として有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
喘息、鼻炎、鼻ポリープ、好酸球性症候群、およびアトピー性皮膚炎を含めたいくつかのアレルギー性疾患は、明らかな好酸球浸潤を特徴とする顕著な炎症成分を有する。
【０００３】
これらの疾患で最も医学的に重要なグループであるアトピー性喘息は、臨床的には偶発的な空気流の閉塞、気道の炎症、および非特異的なアレルゲンに対する気管支の過剰反応を特徴とした、気道の慢性炎症性疾患であることがわかっている。気道閉塞および反応亢進の程度は、しばしば気道の炎症レベルと関連がある。このような臨床上の特徴は、喘息の重症度を示している（Ｋａｙ，Ａ．Ｂ．、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８７：８９３；Ｄｅ  Ｍｏｎｃｈｙ，Ｊ．Ｇ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９８５、１３１：３７３；Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｒ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９８９、１３９：８０６；Ａｚｚａｗｉ，Ｍ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９９０、１４２：１４０７；Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９９２、１４５：１４６９；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９９２、１４６：３７４；Ｂｒｏｉｄｅ，Ｄ．Ｈ．他、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８８：６３７；Ｗａｒｌａｗ，Ａ．Ｊ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９８８、１３７：６２）。細胞浸潤は、疾患の進行に関連し、病原および病理の主な要因である気道の炎症を示す。喘息における炎症性浸潤は複雑であるが、現在ではこの障害の臨床的な発現および病原において、Ｔｈ２プロフィル（Ｔｈ２細胞）のサイトカイン発現を伴うＣＤ４＋Ｔｈリンパ球が極めて重要な役割を果たすことが広く認識されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９３、９２：３９７；Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．他、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８８：９３５）。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、−５、−９、−１０、−１３などのある範囲のサイトカインを放出して気道のアレルギー性炎症を整えることにより、疾患の進行および気道過敏症（ＡＨＲ）を調節する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９２、３２６：２９８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９３、９２：３１３；Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．他、Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ、１９９２、１４６：１０９；Ｄｒａｚｅｎ，Ｊ．Ｍ．他、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９９６、１８３：１）。Ｔｈ２細胞と同様に、肺の中の好酸球およびその炎症産物のレベルは疾患の重症度に関連し、気道におけるこの白血球の蓄積は、遅発相喘息性反応中の気管支機能不全の中心的な特徴である（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｊ．他、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９０、３２３：１０３３）。Ｔｈ２細胞はアレルギー性応答の数多くの面を整えるが、ＩＬ−５の分泌によって好酸球増加症を抑制する際のその役割は、喘息での主要な炎症誘発性経路であると考えられる。
【０００４】
インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、喘息患者で高レベルで発現する炎症誘発性サイトカインである。さらにＩＬ−５は、アトピー性疾患の病原に主として関与するサイトカインである。これは特に、アトピー性疾患における組織損傷の主な原因である好酸球の産生、活性化、および局在化を制御する。さらにＩＬ−５は、好酸球系列に著しく特異的な、誘発性Ｔ細胞由来のサイトカインである。ＩＬ−５は転写レベルで制御され、遺伝子を調節することは、喘息や湿疹、鼻炎などの好酸球依存型アレルギー性障害の治療の将来有望な目標である。
【０００５】
好酸球が喘息におけるアレルギー反応の重要な成分であるという、数多くの証拠がある。ＩＬ−５は好酸球の産生に独自に関与するものであり、ＩＬ−１３などの様々なその他のサイトカインの場合、エオタキシンなどのケモカインおよびその他のファクターが、その活性化、局在化、および生存を制御する。したがってＩＬ−５は、新しい抗喘息薬の重要な薬物標的になっている（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、９４（３）：２５３；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２００２、８（４）：１６２）。
【０００６】
ヒトタンパク質とマウスタンパク質との相同性は７１％である（サイトカインハンドブック（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｈａｎｄ  ｂｏｏｋ）。ＩＬ−５のアミノ酸配列は、マウスインターロイキン３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、およびマウスインターフェロンγタンパク質の短いストレッチ領域を除き、その他のサイトカインのアミノ酸配列との相同性が著しいものではない。ヒトとマウス両方のタンパク質配列に関して予想される分子質量は、１３．１ｋＤａである。生物学的に活性なＩＬ−５は、モノマーを頭−尾構造に向ける高度に保存されたシステイン残基（４４〜８６’および８６〜４４’）が共有結合した、ジスルフィド結合ホモダイマーである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９１１〜９２０、１９９０）。野生型モノマーＩＬ−５は生物学的に不活性であるが、挿入性の突然変異誘発によって、機能性ＩＬ−５モノマーが設計製作されている（Ｄｉｃｋａｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ  ７４：５３５〜４６、１９９６）。ヒトＩＬ−５の結晶構造の分析によれば、新規な２つのドメイン構造が示され、各ドメインでは２つの鎖の関与が必要であり、サイトカインの折畳みに対する高い類似性がＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン３、およびインターロイキン４に見られることが実証された（Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｍ．Ｖ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３６３：１７２〜１７６）。ＩＬ−５のＣ末端領域は、ＩＬ−５レセプターとの結合および生物活性に重要であるようにみえる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１５（５）：４９１〜９、１９９６）。ＩＬ−５とそのレセプターとの結合は、らせんＡが主にレセプターのαサブユニットの結合に関与する、らせんＡとＤが重複する領域で生じると考えられる（Ｇｒａｂｅｒ、Ｐ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５７６２〜１５７６９、１９９５）。天然のヒトＩＬ−５には、２つの潜在的なグリコシル化部位があり、マウスＩＬ−５には３つの部位がある。ヒトＩＬ−５は、Ｔｈｒ３でＮグリコシル化しかつＯグリコシル化している。真核系内で発現した組換えＩＬ−５は、差次的なグリコシル化が原因で、４５〜６０ｋＤａという広範囲にわたる分子質量を示す。脱グリコシル化したＩＬ−５と原核細胞内で発現したＩＬ−５は、完全な生体活性を維持する（Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ａ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：１３４５〜１３５２、１９９０）。
【０００７】
薬物送達への経路は、一般に、ＩＬ−５産生の阻害剤のスクリーニング、リガンド拮抗剤、レセプターの発現およびレセプターの活性化の制御に基づく。特にＩＬ−５の作用の阻害は、喘息および好酸球に関連するその他の疾患に対する治療方法を提供することができる。免疫療法は、ＩＬ−５レベルおよび喘息などの好酸球に関連した疾患状態を制御するための、もう１つの非常に魅力ある手法である。
【０００８】
現在、喘息の症状を予防する最も一般的な治療は、吸入用コルチコステロイドを使用することである。一般にこれらの薬剤を使用することは、非常に安全で安価である。しかしこれらの薬剤は、全身に免疫抑制作用を引き起こすことによって機能し、したがってこれらの薬剤を長期使用することにより、高血圧や骨粗鬆症、白内障の発症を含めた副作用が生じる。コルチコステロイドは毎日摂取しなければならず、そのためこれらの薬品を首尾良く使用するうえで、患者のコンプライアンスが別の問題になる。さらに、コルチコステロイドを使用しても治りにくく、別の療法の使用を必要とする喘息患者がいる。ＩＬ−５を対象とした免疫治療薬を使用して、好酸球を選択的に標的とすることにより、多面的作用を伴う全身性免疫抑制剤を使用することの副作用を克服することができる。
【０００９】
喘息などの疾患の将来可能な治療には、受動免疫化、したがってＩＬ−５に特異的なモノクローナル抗体の使用を含めることができる。喘息患者の好酸球を減少させることを目標とした、ＩＬ−５に対するヒト化モノクローナル抗体による臨床試験が進行中である。特に、様々な種のＩＬ−５に対して活性なヒト化モノクローナル抗体であるＳＣＨ５５７００（エスリズマブ（ｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）を使用した臨床試験［Ｅｇａｎ，Ｒ．Ｗ．他、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、１９９９、４９：７７９］と、ヒトおよび霊長類のインターロイキン５に特異的なヒト化抗体であるＳＢ２４０５６３（メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）を使用した臨床試験［Ｈａｒｔ，Ｔ．Ｋ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１９９８、１５７：Ａ７４４；Ｚｉａ−Ａｍｉｒｈｏｓｓｅｉｎｉ，Ｐ．他、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、１９９９、２９１：１０６０］が報告されている。どちらのモノクローナル抗体も、第１相試験で許容可能な安全プロフィルであることが実証され、その結果好酸球の数が減少したが、気道の機能亢進の低下は観察されなかった。好酸球によって喘息患者の気道に生じる有害な作用は、組織の再建を伴う慢性的現象と考えられる。この意味で抗ＩＬ−５療法の効き目を試験するように設計された研究を評価する必要があり、開発中である。
【００１０】
しかしｍＡｂによる治療には、いくつかの欠点が伴う。モノクローナル抗体は、毎月または隔月に摂取しなければならない高価な治療薬である。注射用薬物の投与のために医療機関を繰り返し訪れなければならないことから生じる患者の非コンプライアンスの問題は、重要な問題である。さらに、患者と治療用抗体とのアロタイプが様々であることから、モノクローナル抗体療法が結局効果のないものになる可能性がある。ｍＡｂが高用量であり免疫形成が複雑であることも、受動免疫化の効果を低下させる可能性がある。ワクチン接種を活発に行う試みにより、これらの合併症が抑制される。
【００１１】
慢性の喘息または実証された好酸球増加症に伴うその他の疾患またはＩＬ−５に関連するその他の状態に対する治療薬を提供する別の手法が、ＷＯ９７／４５４４８に記載されている。その中で、天然または変異形態のＩＬ５によって引き起こされた異常な作用を改善し、軽減し、またはその他の方法で低減させる際に「ＩＬ５の活性に拮抗可能な変性または変種形態のＩＬ５分子」を使用することが提案されている。拮抗作用は、低親和性のＩＬ５Ｒ鎖に結合するが高親和性のレセプターには結合しない変種形態のＩＬ５の結果であることが報告されている。このように作用することによって、変種はＩＬ５と競合し、ＩＬ５の生理的作用をもたらすことなくそのレセプターと結合しようとする。
【００１２】
エオタキシンは、好酸球、好塩基球、およびＴｈ２細胞上に存在する、ケモカインレセプター３に特異的なケモカインである。しかしエオタキシンは、好酸球に対する特異性が高い（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。好酸球の遊走は、エオタキシン１ノックアウトマウスで７０％低減するが、依然として好酸球を発生させることができる（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７８５〜９０（１９９７））。ＩＬ−５は、好酸球が骨髄から血液に遊走する原因と考えられ、エオタキシンは、組織内での局所的な遊走の原因と考えられる（Ｈｕｍｂｌｅ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６０１〜１２（１９９７））。したがって、ＩＬ−５の他にエオタキシンを標的とすることによって、好酸球の減少に向けた免疫療法を強化することができる。
【００１３】
ヒトゲノムは、３０％が相同な３個のエオタキシン遺伝子、エオタキシン１〜３を含有する。今日まで、２個の遺伝子、エオタキシン１およびエオタキシン２がマウスでわかっている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。これらは３８％が相同である。マウスエオタキシン２は、ヒトエオタキシン２に対して５９％が相同である。マウスでは、エオタキシン１が、胃腸管に偏在して発現するようであり、一方エオタキシン２は、空腸に優先的に発現するようである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。エオタキシン１は、気管支肺胞液中に存在する（Ｔｅｉｘｅｉｒａ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１６５７〜６６（１９９７））。ヒトエオタキシン１の配列は配列番号２４２で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応する）、ヒトエオタキシン２の配列は配列番号２４３で示され（ａａ１〜２６がシグナルペプチドに対応し）、ヒトエオタキシン３の配列は配列番号２４４で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応し）、マウスエオタキシン１の配列は配列番号２４５で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応し）、マウスエオタキシン２の配列は配列番号２４６で示される（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応する）。
【００１４】
エオタキシンのモノマーは、その質量が８．３ｋＤａであり、広範囲にわたる条件全体を通してダイマーエオタキシンと平衡状態を保つ。推定されるＫｄは３７℃で１．３ｍＭであるが、モノマーが主な形態である（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。エオタキシンの構造は、ＮＭＲ分光測定によって明らかにした。そのレセプターＣＣＲ３に対する結合部位はＮ末端にあり、第１のシステインの前にある領域が非常に重要である（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９、１９９８）。エオタキシンに結合したケモカインレセプターから得られたペプチドが、この発見を裏付けた。エオタキシンは、２つのジスルフィド架橋を形成する４つのシステインを持ち、化学的に合成することができる（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３０：３１２８〜３１３５、１９９１）。エオタキシン１は、Ｔｈｒ７１上で様々にＯグリコシル化する（Ｎｏｓｏ，Ｎ．他、Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：１１４〜１２２）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質ゾルでのエオタキシン１の発現についても記述されている（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。封入体としてのＥ．ｃｏｌｉでの発現とその後に続くリフォールディング（Ｍａｙｅｒ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３９：８３８２〜９５（２０００））、および昆虫細胞の発現（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１〜６（１９９７））が、エオタキシン２に関して報告されている。
【００１５】
インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、生物学的に活性なモノマーＴｈ２サイトカインとして分泌される。成熟した形態のＩＬ−１３は、ヒトの場合は１１２個のアミノ酸を含み、マウスの場合は１１１個のアミノ酸を含む。計算されたタンパク質の分子質量は約１２．４ｋＤａである。ＩＬ−１３は、Ｎ結合グリコシル化することができ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｋ．Ａ．他、Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｆａｃｔ  Ｂｏｏｋ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ＩＬ−１３は、Ｔｈ２細胞、マスト細胞、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞によって産生される（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ  Ｆ、２０００  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  Ｊｕｌ；２２（７）：６４６〜５６）。機能的ＩＬ−１３レセプターは、インターロイキン４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒ  α鎖）と、２つのＩＬ−１３レセプターα結合タンパク質の一方とからなるヘテロダイマーである（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ  Ｆ、２０００  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  Ｊｕｌ；２２（７）：６４６〜５６）。
【００１６】
ＩＬ１３は、喘息の病状にかなりの役割を果たす。ＩＬ１３は、この疾患の中心的な特徴に関与することが示されている。これは、アレルゲン誘発性気道過敏症（ＡＨＲ）および粘液産生に直接作用し、好酸球増加症に関与する（Ｋｕｐｅｒｍａｎ  Ｄ．Ａ．、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、印刷前の電子版）。マウスにおけるＩＬ−１３の選択的中和により、喘息の表現型が著しく弱められた。さらに、ＩＬ−１３を投与すると、喘息様の表現型が非感作Ｔ細胞欠失マウスまたは未処置のマウスに与えられた（Ｇｒｕｎｉｇ  Ｇ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２６１〜３、Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２５８〜６１）。ＩＬ−１３の標的欠失がなされたマウスは、アレルゲン誘発性ＡＨＲを発症させることができず、粘液産生が著しく低下したことが示された（Ｗａｌｔｅｒ，Ｄ．Ｍ．他、２００１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７（８）：４６６８〜７５）。ＩＬ−１３は、マウス喘息モデルでは好酸球増加症にも影響を及ぼすので（Ｇｒｕｎｉｇ  Ｇ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２６１〜３）、ＩＬ−１３は、好酸球増加症に関連したより多くのアレルギー性疾患に関与する可能性があり、したがってその活性を中和することによって、患者に将来有望な治療を提供することができる。
【００１７】
さらに、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３レセプターのアップレギュレーションが多くの腫瘍型に見られた（例えば、今日まで試験が行われているすべてのＨｏｄｇｋｉｎリンパ腫疾患細胞系）。したがってＩＬ−１３に対する免疫化は、ＩＬ−１３を過発現する腫瘍患者の治療方法を提供することができる。
【００１８】
ワクチン接種の効率を改善する１つの方法は、加えられる抗原の反復度を高めることである。単離されたタンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けによりまたはＴ細胞の助けなしで、いかなるアジュバントも存在しない状態で、即座にかつ効率的に免疫応答を引き起こす（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：１５：２３５〜２７０（１９９１））。ウイルスはしばしばごく少ないタンパク質からなるが、単離された成分よりも非常に強い免疫応答を引き起こすことができる。Ｂ細胞応答では、ウイルスの免疫原性に関する１つの極めて重要なファクターが、表面エピトープの反復性および順序正しさであることがわかっている。多くのウイルスは、エピトープに特異的な免疫グロブリンをＢ細胞に効率的に架橋するエピトープの規則正しいアレイを示す、準結晶質表面を示す（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：５５３〜５５８（１９９６））。この免疫グロブリンのＢ細胞への架橋は、細胞周期の進行およびＩｇＭ抗体の産生を直接誘発させる強力な活性化シグナルである。さらに、そのようなトリガーＢ細胞はＴヘルパー細胞を活性化することができ、それによってＢ細胞内でＩｇＭからＩｇＧ抗体産生への切換えを誘発させ、長命Ｂ細胞記憶を生成する−すなわちこれがすべてのワクチン接種の目標である（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウイルス構造は、自己免疫疾患での抗抗体の生成にも関係し、病原に対する自然な応答の一部としても関係する（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）参照）。したがって高度に組織化されたウイルス表面に存在する抗体は、強力な抗抗体応答を引き起こすことができる。
【００１９】
しかし上述のように、免疫系は通常、自己由来の構造に対する抗体を産生することができない。低濃度で存在する可溶性抗原の場合、これはＴｈ細胞レベルでの寛容に起因する。これらの条件下、Ｔヘルプを送達することができる担体に自己抗原を連結することによって、寛容性が破壊される可能性がある。高濃度で存在する可溶性タンパク質または低濃度の膜タンパク質では、ＢおよびＴｈ細胞が寛容になり得る。しかしＢ細胞寛容は可逆的であり（アネルギー）、高度に組織化された手法で外来の担体に連結した抗原の投与によって破壊される可能性がある（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。
【発明の開示】
【００２０】
本発明者等はついに、固有の反復性組織を有する構造のコア粒子、すなわち本明細書では特にウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびＶＬＰのサブユニットにそれぞれ結合して高度に規則的で反復性の結合体になった、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンに特異的な抗体を誘発させるための潜在的な免疫原になることを見出した。さらにこれらの自動反応性抗体は、喘息のマウスモデルにおける好酸球増加症を阻害する。したがって本発明は、規則的で反復性の、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子とのアレイ、特にＶＬＰと、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの結合体およびアレイをそれぞれ基にした、アレルギー性好酸球疾患を治療するための治療手段を提供する。この療法は、ワクチン接種した動物で抗ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシン抗体の高い力価を引き出すことができ、喘息のマウスモデルで好酸球増加症を阻害することができる。
【００２１】
したがって本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位は前記第１の付着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。本発明での使用に適するコア粒子の好ましい実施形態は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、細菌線毛またはべん毛、あるいは本発明による規則正しい反復性抗原アレイを形成することが可能な固有の繰返し構造を有する任意のその他のコア粒子である。
【００２２】
より詳細には、本発明は、規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイを含む組成物、したがって本明細書では特にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとの結合体を含む組成物を提供する。より詳細には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドとを含む、組成物を提供する。また本発明は、結合体と、規則的で反復性のアレイとをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また、好酸球成分によるアレルギー性疾患を予防しまたは治療し、免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こすための治療用ワクチンとしても有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的な免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。
【００２３】
本発明では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合し、典型的な場合は方向が示された手法で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの規則正しい反復性抗原アレイが得られる。さらに、コア粒子およびＶＬＰの高度に反復的かつ組織化された構造はそれぞれ、高度に規則的で反復的に、ＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの表示を媒介し、それが高度に組織化され反復的な抗原アレイにつながる。さらに、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合により、それぞれＴヘルパー細胞エピトープが得られるが、これは、コア粒子とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシのタンパク質またはペプチドのアレイ、さらにはＶＬＰとＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドのアレイでそれぞれ免疫化した宿主に対して、コア粒子およびＶＬＰが外来のものだからである。これらのアレイは、高度に組織化された構造であり、寸法であり、またアレイ表面に抗原が繰り返し存在する点で、従来技術の結合体とは異なる。
【００２４】
本発明の一態様では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質あるいはＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドの適正な折畳みに適合した安定な発現宿主に発現し、あるいは合成され、一方コア粒子およびＶＬＰはそれぞれ、コア粒子およびＶＬＰの折畳みおよび組織体にそれぞれ適した発現宿主で発現し、精製される。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、化学的に合成することができる。次いで、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシアレイのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンアレイのタンパクまたはペプチドを組織化（ａｓｓｅｍｂｌｅ）する。
【００２５】
別の態様で、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、（ａ）請求項１または請求項２２に記載の組成物と、（ｂ）許容可能な医薬品担体とを含む医薬品組成物を提供する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、前記ウイルス様粒子に結合する。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子を提供する工程と、（ｂ）少なくとも１つの抗原、あるいはＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを提供する工程と、（ｃ）前記ウイルス様粒子と前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基を結合して、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に結合するようにする工程とを含む、請求項１に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子を提供する工程と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供する工程であって、前記抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位が、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位が、前記第１の付着部位に会合可能なものである工程と、（ｃ）前記コア粒子と、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを結合する工程であって、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とが前記会合によって相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する工程とを含む、請求項２２に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む、免疫化の方法を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療する薬品を製造するための、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物の使用を提供する。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患、好ましくは喘息を治療しまたは予防する薬品を調製するための、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物の使用を提供する。さらに別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患、特に喘息を治療しまたは予防するための組成物、ワクチン、薬物、または薬品を製造するために、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物を単独でまたは他の薬剤と併せて使用することを提供する。
【００３３】
さらに本発明は、特に、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるのに適したワクチン組成物を提供する。本発明はさらに、動物、特に雌ウシ、ヒツジ、ウシ、ならびにヒトにおける、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるための、免疫化およびワクチン接種の方法をそれぞれ提供する。本発明の組成物は、予防的にまたは治療的に使用することができる。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物、すなわち本明細書で使用する「自己抗原」によって引き起こされまたは悪化する、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を、予防しかつ／または軽減させる方法を提供する。関係する実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされまたは悪化する好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させる抗体の産生をもたらす免疫応答を、動物および個体においてそれぞれ誘発させる方法を提供する。
【００３５】
当業者に理解されるように、本発明の組成物を動物またはヒトに投与する場合、その組成物は、塩、緩衝液、アジュバント、またはこの組成物の効能を改善するのに望ましいその他の物質を含有する組成物でよい。医薬品組成物の調製に適した物質の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０））を含めた非常に数多くの出典に示されている。
【００３６】
本発明の組成物は、その投与が受容者個人によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能」といえる。さらに本発明の組成物は、「治療上有効な量」（すなわち、所望の生理学的効果をもたらす量）で投与される。
【００３７】
本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法で投与することができるが、通常は注射、輸液、吸入、経口投与、またはその他の適切な物理的方法によって投与される。あるいは組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下から投与することができる。投与される組成物の成分には、滅菌水溶液（例えば生理食塩水）、または滅菌非水性溶液または懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯法を使用して、皮膚の浸透を増すことができ、抗原吸収を高めることができる。
【００３８】
本発明のその他の実施形態は、当技術分野で知られている事項、下記の本発明の図面および記述、特許請求の範囲に照らし、当業者に明らかにされよう。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
他に特に示さない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明を実施しまたは試験するにあたり、本明細書に記述するものと同様のまたは均等な任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料について以下に記述する。
【００４０】
１．定義
好酸球成分によるアレルギー性疾患：本明細書で使用される好酸球成分によるアレルギー性疾患という用語は、循環血液または体組織および体液中の好酸球の数が増加する、疾患の状態または条件を指す。好酸球が増加して、疾患状態に直接または間接的な影響が生じる疾患には、喘息、枯草熱、鼻炎、鼻ポリープ、特発性好酸球増多症、アトピー性皮膚炎、皮膚病および発疹、レフラー症候群などの肺疾患、慢性好酸球肺炎、チャウグ−シトラウス症候群、および原因不明の過好酸性症候群が含まれる。当業者なら、好酸球成分によるアレルギー性疾患を理解することができる。
【００４１】
アミノ酸リンカー：本明細書で使用されるように、本明細書内の「アミノ酸リンカー」は、単なる「リンカー」という用語も同様に、抗原または抗原決定基を第２の付着部位に会合させ、またはより好ましくは第２の付着部位をすでに含みまたは含有し、典型的な場合は、必ずしも必要ではないが、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含みまたは含有する。しかし本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態であったとしても、そのようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示唆するものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、天然に生ずるアミノ酸または当技術分野で知られている非天然のアミノ酸、全Ｌ型または全Ｄ型、あるいはこれらの混合物からなることが好ましい。しかし、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明に包含される。そのような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしアミノ酸リンカーの他、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含んで任意のアミノ酸に欠けるリンカーも、本発明の範囲内に包含すべきである。抗原または抗原決定基あるいは任意選択の第２の付着部位とアミノ酸リンカーとの会合は、少なくとも１つの共有結合によることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によることがより好ましい。
【００４２】
動物：本明細書で使用する「動物」という用語は、例えばヒト、ヒツジ、オオシカ、シカ、ミンク、哺乳類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ、ニワトリ、爬虫類、魚、昆虫、およびクモを含むものとする。
【００４３】
抗体：本明細書で使用する「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することが可能な分子を指す。この用語は、抗体全体と、その抗原結合断片であって、１本鎖抗体を含めたものを含むものとする。抗体は、ヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬまたはＶＨドメインを含んだ断片を含むがこれらに限定するものではないことが、最も好ましい。抗体は、トリおよび哺乳類を含めた任意の動物由来のものから形成することができる。抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入された動物から単離した抗体、および内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含み、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるものである。
【００４４】
抗原：本明細書で使用する「抗原」という用語は、抗体に、あるいはＭＨＣ分子によって提示される場合にはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合可能な分子を指す。本明細書で使用する「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原はさらに、免疫系によって認識することができ、かつ／または体液性免疫応答及び／又は細胞免疫応答を引き起こして、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらすことができる。しかしこれは、少なくともある特定の場合には、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有しまたは結合し、アジュバントに与えられることを必要とする。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上述の特定の反応は、抗原が、典型的な場合には非常に選択的な手法で、好ましくはその対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって引き起こされる可能性のある数多くのその他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことを示すものとする。本明細書で使用する抗体は、いくつかの個別の抗原の混合物でもよい。
【００４５】
抗原決定基：本明細書で使用する「抗原決定基」という用語は、ＢまたはＴリンパ球によって特異的に認識される抗原のタンパク質を指すものとする。抗原決定基に応答するＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は、細胞及び／又は体液性免疫の媒介に極めて重要なエフェクター機能の増大および確立によって、抗原決定基に応答する。
【００４６】
会合：本明細書で使用する「会合」という用語は、第１および第２の付着部位に適用されるように、少なくとも１つの非ペプチド結合によることが好ましい第１および第２の付着部位の結合を指す。会合の性質は、共有結合、イオン結合、疎水結合、極性結合、またはこれらの任意の組合せでよく、この会合の性質は共有結合であることが好ましい。
【００４７】
第１の付着部位：本明細書で使用する「第１の付着部位」という文言は、抗原または抗原決定基上に位置する第２の付着部位が会合し得る、非天然または天然由来の要素を指す。第１の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。第１の付着部位は、典型的な場合かつ好ましくは、好ましくはウイルス様粒子などのコア粒子の表面に位置する。複数の第１の付着部位は、コアおよびウイルス様粒子の表面にそれぞれ存在し、典型的な場合は繰返し構成体内にある。
【００４８】
第２の付着部位：本明細書で使用する「第２の付着部位」という文言は、コア粒子およびウイルス様粒子の表面にそれぞれ位置付けられた第１の付着部位が会合し得る、抗原または抗原決定基に会合する要素を指す。抗原または抗原決定基の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。少なくとも１つの第２の付着部位は、抗原または抗原決定基上に存在する。したがって「少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基」という用語は、抗原または抗原構造であって、少なくとも抗原または抗原決定基と第２の付着部位を含むものを指す。しかし特に、非天然由来の第２の付着部位、すなわち抗原または抗原決定基内に自然に生じないものに関しては、これらの抗原または抗原構造が、「アミノ酸リンカー」を含む。
【００４９】
結合：本明細書で使用する「結合」という用語は、例えば化学的な連結による共有結合、または例えばイオン的相互作用や疎水的相互作用、水素結合などの非供給結合などの、結合または結着を指す。共有結合は、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などでよい。「結合」という用語は、「連結」や「融合」、「結着」などの用語よりも広く、これらを含むものである。
【００５０】
コートタンパク質：本明細書で使用する「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのカプシド組織体内に組み込むことが可能なバクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかし、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を指す場合は、「ＣＰ」という用語を使用する。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を「Ｑβ  ＣＰ」と呼び、一方バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は、「Ｑβ  ＣＰ」ならびにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのカプシドは、主にＱβ  ＣＰからなり、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。同様にＶＬＰ  Ｑβコートタンパク質は、主にＱβ  ＣＰを含有し、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。
【００５１】
コア粒子：本明細書で使用する「コア粒子」という用語は、固有の反復性組織を有する硬質構造を指す。本明細書で使用するコア粒子は、合成プロセスの生成物または生物学的プロセスの産物でよい。
【００５２】
連結：本明細書で使用する「連結」という用語は、共有結合または強力な非共有相互作用による結着を指し、典型的な場合かつ好ましくは、共有結合による結着を指す。本発明では、生物学的に活性な物質を連結させるために当業者によって通常使用される任意の方法を、使用することができる。
【００５３】
有効な量：本明細書で使用する「有効な量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。組成物の有効な量は、この選択された結果を実現する量であると考えられ、そのような量は、当業者により日常的な業務として決定することができる。例えば、免疫系障害を治療するのに有効な量とは、免疫系の活性化を引き起こし、それよって、抗原に曝されたときに抗原特異的免疫応答を誘発させるのに必要な量である。この用語は、「十分な量」とも同義である。
【００５４】
任意の特定の適用例での有効な量は、治療する疾患や状態、投与される特定の組成物、被験者のサイズ、及び／又は疾患または状態の重症度などのファクターに応じて様々に変えることができる。当業者なら、必要以上の実験を行うことなく、本発明の特定の組成物の有効な量を経験的に決定することができる。
【００５５】
エオタキシンタンパク質：本明細書で使用する「エオタキシンタンパク質」という用語は、エオタキシン遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。エオタキシンタンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ引き起こすことができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって引き起こすことができ、明らかに本発明の範囲内に包含されるべきである。エオタキシンが差次的にグリコシル化した形、ならびにタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によってさらに変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「エオタキシンタンパク質」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないエオタキシンタンパク質変種も包含すべきである。
【００５６】
エオタキシンペプチド：本明細書で使用する「エオタキシンペプチド」という用語は、エオタキシンタンパク質の一部であり、もとのエオタキシンタンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちエオタキシンタンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するエオタキシンタンパク質の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するエオタキシンの一部である、任意のペプチドと広く定義される。
【００５７】
「エオタキシンペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記エオタキシンペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、エオタキシンタンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。エオタキシペプチドは、例えばエオタキシンペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはエオタキシンペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、エオタキシンペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。エオタキシンペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をエオタキシンペプチドに付加することができる。あるいはエオタキシンペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するエオタキシンペプチドという用語は、好ましくはエオタキシンの３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなエオタキシンペプチドは、必ずしもエオタキシンの連続アミノ酸配列から得るものではなく、エオタキシンからの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するエオタキシンタンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。
【００５８】
エピトープ：本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて、抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの連続または不連続な部分を指す。エピトープは、抗体によって、またはＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞レセプターを介してＴ細胞によって認識される。本明細書で使用する「免疫原性エピトープ」は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定されるように、動物の抗体応答を引き出しまたはＴ細胞応答を誘発させるポリペプチドの一部と定義される（例えばＧｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）参照）。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定されるように、抗体がその抗原を免疫特異的に結合させることができるタンパク質の一部と定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するものであるが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外するものではない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープでもよく、その場合、ＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞に免疫特異的に結合することができる。
【００５９】
エピトープは、空間構造内に３個のアミノ酸を含むことができるが、これはこのエピトープに独特なものである。一般にエピトープは、少なくとも約５個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には少なくとも約８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。エピトープが有機分子である場合、ニトロフェニル程度に小さくなる。
【００６０】
融合：本明細書で使用する「融合」という用語は、コードヌクレオチド配列のフレーム内の組合せによる、１つのポリペプチド鎖での異なる由来のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」という用語は、末端の一方への付加の他、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内への異なる由来の配列の挿入を明らかに包含する。
【００６１】
免疫応答：本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化または増殖に繋がる体液免疫応答及び／又は細胞免疫応答を指す。しかし、ある場合には、この免疫応答の強度が低くなる可能性があり、本発明による少なくとも１つの物質を使用した場合にしか検出することができなくなる。「免疫原性」は、生きている生物の免疫系を刺激するのに使用される薬剤を指し、したがって免疫系の１つまたは複数の機能が増大し、免疫原性薬剤へと向かう。「免疫原性ポリペプチド」は、アジュバントの存在下でまたは存在しない状態で、単独であってもまたは担体に結合した状態であっても細胞及び／又は体液免疫応答を引き出すポリペプチドである。抗原提示細胞は、活性化できることが好ましい。
【００６２】
免疫応答を「高める」物質とは、その物質を添加せずに測定した同じ免疫応答と比べた場合、その物質を添加することによって多少なりとも大きくなりまたは強くなりまたは偏向した免疫応答が観察される物質を指す。例えば細胞障害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば免疫化中にその物質を使用してまたは使用せずに得られたサンプルで、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定することができる。この物質がない場合のＣＴＬ溶解活性に比べてＣＴＬ溶解活性が高められた物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分な量と言える。好ましい実施形態では、免疫応答が少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上、高められる。分泌されたサイトカインの量またはタイプは変えてもよい。あるいは、誘発された抗体またはそのサブクラスの量を変えることができる。
【００６３】
免疫化：本明細書で使用する、「免疫化する」または「免疫化」という用語あるいはこれに関連する用語は、標的抗原またはエピトープに対して実質的な免疫応答を引き起こす能力を与えることを指す（抗体及び／又は細胞免疫性であってエフェクターＣＴＬなど）。これらの用語は、完全な免疫性をもたらすことを必要とせず、むしろベースラインよりも実質的に大きい免疫応答を生成することを指す。例えば哺乳類は、本発明の方法を適用した後に標的抗原に対する細胞及び／又は体液免疫応答が生じた場合、標的抗原に対して免疫化されたと考えられる。
【００６４】
天然由来：本明細書で使用する「天然由来」という用語は、その全体または一部が合成ではなく、自然に存在しまたは産生されることを意味する。
【００６５】
非天然：本明細書で使用されるこの用語は、一般に、天然からのものではないことを意味し、より具体的にはこの用語は、人の手によるものであることを意味する。
【００６６】
非天然由来：本明細書で使用する「非天然由来」という用語は、一般に、合成したものまたは天然からのものではないことを意味し、より具体的には、この用語は人の手によるものであることを意味する。
【００６７】
規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ：本明細書で使用する「規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ」いう用語は、一般に、抗原または抗原決定基の反復パターンを指し、典型的な場合かつ好ましくは、コア粒子およびウイルス様粒子に対してそれぞれ抗原または抗原決定基が均一な空間配置であることを特徴とする。本発明の一実施形態で、反復パターンは幾何学的パターンでよい。適切な規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイの典型的かつ好ましい例は、厳密に繰り返される準結晶の配列の抗原または抗原決定基を所有するものであり、好ましくは１〜３０ナノメートルの間隔があり、好ましくは５〜１５ナノメートルの間隔があるものである。
【００６８】
線毛（ｐｉｌｉ）：本明細書で使用する「線毛」（単数形は「ｐｉｌｕｓ」）は、規則的で反復性のパターンに組織化されたタンパク質モノマー（例えばピリンモノマー）からなる細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに線毛は、細菌細胞と宿主細胞表面レセプターとの結着や、細胞間での遺伝子交換、および細胞−細胞認識などのプロセスに関与する構造である。線毛の例には、１型線毛、Ｐ線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ線毛、および９８７Ｐ線毛が含まれる。線毛の追加の例を、以下に示す。
【００６９】
線毛様構造：本明細書で使用する「線毛様構造」という文言は、線毛の構造およびタンパク質モノマーからなる構造と同様の特徴を有する構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然の線毛と同一の規則的で反復性のアレイを形成しない修飾ピリンタンパク質を発現する細菌細胞によって形成された構造である。
【００７０】
ポリペプチド：本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）によって線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがってペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化なども指すものとする。組換えまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。化学合成を含めた任意の手法で生成してもよい。
【００７１】
ＩＬ−５タンパク質：本明細書で使用する「ＩＬ−５タンパク質」という用語は、ＩＬ−５遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。ＩＬ−５タンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ誘発させることができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって誘発させることができ、本発明の範囲内に明らかに含まれるべきである。ＩＬ−５が差次的にグリコシル化した形、ならびにＩＬ−５がタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によって別の変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「ＩＬ−５」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないＩＬ−５タンパク質変種も包含すべきである。
【００７２】
ＩＬ−５ペプチド：本明細書で使用する「ＩＬ−５ペプチド」という用語は、ＩＬ−５タンパク質の一部であり、もとのＩＬ−５タンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちＩＬ−５タンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するＩＬ−５の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するＩＬ−５の一部である、任意のペプチドと広く定義される。
【００７３】
「ＩＬ−５ペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記ＩＬ５ペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、ＩＬ−５タンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。ＩＬ−５ペプチドは、例えばＩＬ−５ペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはＩＬ−５ペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、ＩＬ−５ペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。ＩＬ−５ペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をＩＬ−５ペプチドに付加することができる。あるいはＩＬ−５ペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するＩＬ−５ペプチドという用語は、好ましくはＩＬ−５の３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなＩＬ５ペプチドは、必ずしもＩＬ５の連続アミノ酸配列から得る必要はなく、ＩＬ５からの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するＩＬ５タンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。
【００７４】
ＩＬ−１３タンパク質：本明細書で使用する「ＩＬ−１３タンパク質」という用語は、ＩＬ−１３遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。ＩＬ−１３タンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ誘発させることができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって誘発させることができ、本発明の範囲内に明らかに含まれるべきである。ＩＬ−１３が差次的にグリコシル化した形、ならびにＩＬ−１３がタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によって別の変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「ＩＬ−１３」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないＩＬ−１３タンパク質変種も包含すべきである。
【００７５】
ＩＬ−１３ペプチド：本明細書で使用する「ＩＬ−１３ペプチド」という用語は、ＩＬ−１３タンパク質の一部であり、もとのＩＬ−１３タンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちＩＬ−１３タンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するＩＬ−１３の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するＩＬ−１３の一部である、任意のペプチドと広く定義される。
【００７６】
「ＩＬ−１３ペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記ＩＬ−１３ペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、ＩＬ−１３タンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。ＩＬ−１３ペプチドは、例えばＩＬ−１３ペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはＩＬ−１３ペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、ＩＬ−１３ペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。ＩＬ−１３ペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をＩＬ−１３ペプチドに付加することができる。あるいはＩＬ−１３ペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するＩＬ−１３ペプチドという用語は、好ましくはＩＬ−１３の３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなＩＬ−１３ペプチドは、必ずしもＩＬ−１３の連続アミノ酸配列から得る必要はなく、ＩＬ−１３からの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するＩＬ−１３タンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。
【００７７】
残基：本明細書で使用する「残基」という用語は、ポリペプチドの主鎖または側鎖における特定のアミノ酸を意味するものとする。
【００７８】
自己抗原：本明細書で使用する「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質を指し、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質またはＲＮＡにより生成された生成物は、自己と定義される。さらに、２個またはいくつかの自己分子の組合せから得られ、あるいは自己分子の一部であるタンパク質と、上述の相同性の高い２個の自己分子（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質は、自己と見なしてもよい。
【００７９】
治療：本明細書で使用する「治療」、「治療する」、「治療した」、または「治療している」という用語は、予防及び／又は療法を指す。例えば感染症に対して使用する場合、この用語は、病原体で感染に対する被験者の耐性を増大させ、すなわち言い換えれば被験者が病原体に感染しまたは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療を指し、同様に、被験者が感染した後にその感染と闘うための治療、例えば感染を軽減しまたはなくし、あるいは悪化するのを防止する治療を指す。好酸球成分によるアレルギー性疾患に対して使用する場合、「治療」という用語は、とりわけかつ好ましくは、アレルギー性好酸球疾患に伴うアレルギー性炎症成分を阻害しまたは減少させる予防的治療または療法を指す。
【００８０】
ワクチン：本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含有しかつ動物に投与可能な形態の製剤を指す。典型的な場合、ワクチンは、本発明の組成物を懸濁させまたは溶解させた、従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物を都合よく使用して、状態を予防し、改善し、またはその他の方法で治療することができる。宿主に導入することにより、ワクチンは、抗体及び／又はサイトカインの産生、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、およびまたはその他の細胞応答も含むがこれらに限定することのない免疫応答を引き起こすことができる。
【００８１】
任意選択で、本発明のワクチンはさらに、本発明の化合物に対して少量または多量の割合で存在可能なアジュバントを含む。本明細書で使用する「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、または本発明のワクチンと組み合わせたときに免疫応答をさらに高めるデポー剤を宿主内で生成することが可能な物質を指す。様々なアジュバントを使用することができる。例として、完全および不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、および変性ムラミールジペプチドが含まれる。
【００８２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する「ウイルス様粒子」は、ウイルス粒子に似ている構造を指す。さらに本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべてまたは一部、特にウイルスゲノムの複製的で感染性の成分が欠けているので、非複製的であり非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムとは異なる核酸を含有してよい。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウイルスカプシドなどのウイルスカプシドである。本明細書で同義として使用される「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。典型的な場合かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットは、固有の反復性組織を備えた構造を有するウイルスカプシドおよびカプシドにそれぞれ組織化され、前記構造は、典型的な場合、球状または管状である。例えばＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのカプシドは、対称な正二重面体の球形である。本明細書で使用する「カプシド様構造」という用語は、上記定義した意味でカプシドの形態に似ているが、典型的な対称組織体から逸脱すると共に十分な程度の規則性と反復性を維持する、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。
【００８３】
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用する「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造に似ており、非複製的で非感染性であり、さらに少なくともバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子に欠けているウイルス様粒子、典型的な場合はウイルスの宿主への結着またはウイルスの宿主への進入の原因となるタンパク質をコードする遺伝子にも欠けているウイルス様粒子を指す。しかしこの定義は、前述の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがってバクテリオファージの非複製的で非感染性のウイルス様粒子が得られる、バクテリオファージのウイルス様粒子も包含すべきである。
【００８４】
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０個のサブユニットの自己組織化から形成され、任意選択で宿主ＲＮＡを含有するカプシド構造は、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。特定の例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰがＱβ  ＣＰサブユニットのみから組織化され（例えば抑制によってより長いＡ１タンパク質のすべての発現を除外するＴＡＡ停止コドンを含有したＱβ  ＣＰ遺伝子の発現によって生成、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））、または追加としてカプシド組織体中にＡ１タンパク質サブユニットを含有してよい。
【００８５】
ウイルス粒子：本明細書で使用する「ウイルス粒子」という用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルスのタイプでは、タンパク質カプシドで取り囲まれたゲノムを含み、その他のタイプでは、追加の構造（例えば外被や末端部など）を含む。
【００８６】
１つ：この開示で「１つ」という用語を使用する場合は、他に特に指示しない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。
【００８７】
当業者に明らかにされるように、本発明のある特定の実施形態は、クローニングやポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核細胞および真核細胞での組換えタンパク質の発現などの、組換え核酸技術の使用を含む。そのような方法は当業者に周知であり、出版された実験方法マニュアルに都合よく見出すことができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた基本的な実験室技法（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））、および抗体をベースにした技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「タンパク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、タンパク質精製の原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））も、文献に十分に記載されており、そのすべてを参照により本明細書に援用する。
【００８８】
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示される発明は、動物の、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含み、あるいはこれらからなり、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位は前記第１の付着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。より詳細には、本発明の組成物は、ウイルス様粒子と少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含みあるいはこれらからなり、抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、規則的で反復性の抗原ＶＬＰアレイが形成されるようにウイルス様粒子に結合する。さらに本発明によれば、とりわけ好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療しかつ／または予防的に阻止するために、そのような組成物を医者が都合よく構成することが可能である。
【００８９】
一実施形態では、コア粒子には、ウイルス、細菌線毛、細菌性ピリンから形成された構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、またはこれらの組換え形態が含まれる。規則的で反復性の被覆及び／又はコアタンパク質構造を有する当技術分野で知られている任意のウイルスが、本発明のコア粒子として選択することができ、適切なウイルスの例には、シンドビスおよびその他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例えばヒトライノウイルス、アイチウイルス）、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばトゴトウイルス、バトケンウイルス、家禽ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例えばポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、トリポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、およびヒトパピローマウイルスが含まれ、好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７である（例えばＢａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．およびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：５５３〜５５８（１９９６）の表１参照）。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、ウイルスの遺伝子工学を利用して、規則的で反復性のウイルス外被タンパク質と、選択された異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基、または反応性アミノ酸残基を含む第１の付着部位との融合を生成する。本発明の組成物を構成するには、当技術分野で知られるその他の遺伝子操作を含めることができ、例えば遺伝子の変異により組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましい。さらに本発明で使用されるウイルスは、化学的または物理的不活性が原因となって、または示されるように複製適格ゲノムが欠けていることから、複製不可能である。第１の付着部位に融合するよう選択されたウイルスタンパク質は、組織化された繰返し構造を有するべきである。そのような組織化繰返し構造は、ウイルスの表面に、間隔が５〜３０ナノメートル、好ましくは５〜１５ｎｍの準結晶質組織を含む。このタイプの融合タンパク質の生成によって、ウイルス表面に、複数の規則的で反復性の第１の付着部位が得られ、天然のウイルスタンパク質の通常の組織化を反映することになる。当業者に理解されるように、第１の付着部位は、任意の適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然または合成ポリマー、二次代謝産物、またはこれらの組合せでよく、あるいはこれらの一部でよく、すなわちこれらは抗原または抗原決定基に特異的に結着するよう役立てることができ、それによって規則正しい反復性抗原アレイが得られる。
【００９１】
本発明の別の実施形態で、コア粒子は組換えアルファウイルスであり、より詳細には組換えシンビスウイルスである。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で、ＤＮＡの中間体なしで、そのゲノムＲＮＡ全体を複製するプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルス科のいくつかのメンバー、シンドビス（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３：１１８８〜１１９１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１８〜２２（１９９３））、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．＆  Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６〜１３６１（１９９１））、およびその他のもの（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：１８９〜２０４（１９８９））は、様々な異なるタンパク質に関するウイルスベースの発現ベクターとして（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５〜５００（１９９４））、さらにワクチン開発の候補物質として使用することを目的に、かなりの注目を集めている。最近、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためにアルファウイルスを使用することを対象としたいくつかの特許が発行されている（米国特許第５，７６６，６０２号；第５，７９２，４６２号；第５，７３９，０２６号；第５，７８９，２４５号、および第５，８１４，４８２号参照）。本発明のアルファウイルスコア粒子の構成体は、参照により本明細書に援用する前述の論文に記載されている、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている手段によって行うことができる。
【００９２】
抗原または抗原決定基結着用のウイルスベースのコア粒子を生成するには、様々な異なる組換え宿主細胞を利用することができる。例えばアルファウイルスは、広い宿主範囲を有することが知られており、シンドビスウイルスは、培養した哺乳動物、爬虫類、両性類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３５：３３５（１９７７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．、ＴＨＥ  ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）、第５８３〜６２１頁）。したがって本発明の実施に際して数多くの組換え宿主細胞を使用することができる。ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が、異種タンパク質の生成に特に適しているが、その理由は、これらの細胞がヒト細胞と同様の手法で異種タンパク質をグリコシル化することができ（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．他、糖鎖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）４：２２７（１９９４））、選択することができ（Ｚａｎｇ，Ｍ．他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３８９（１９９５））、または遺伝子工学によって合成することができ（Ｒｅｎｎｅｒ，Ｗ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４：４７６（１９９５）；Ｌｅｅ，Ｋ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、それによって血清を含まない培地ならびに懸濁液中で成長させることができるからである。
【００９３】
宿主細胞内へのポリヌクレオチドベクターの導入は、標準的な実験室マニュアルに記載されている方法により行うことができ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、第９章；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、第１６章参照）、電気穿孔法やＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入、陽イオン脂質媒介型トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、および感染などの方法が含まれる。宿主細胞に外因性ＤＮＡ配列を導入する方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．他の米国特許第５，５８０，８５９号で論じられている。
【００９４】
宿主細胞に感染させるには、パッケージのＲＮＡ配列を使用することもできる。このようなパッケージＲＮＡ配列は、培地に添加することによって宿主細胞に導入することができる。例えば非感染性のアルファウイルス粒子の調製について、「シンドビス発現系（Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）」バージョンＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ７５０−１）を含めたいくつかの出典に記載されている。
【００９５】
ウイルスベースのコア粒子を生成するために組換え宿主細胞として哺乳動物細胞を使用する場合、この細胞は一般に、組織培養によって増殖させることになる。培養によって細胞を増殖させる方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．、動物細胞の培養（ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）参照）。
【００９６】
本発明のコア粒子としての使用に適しているＲＮＡウイルスの別の例には、下記のものが含まれるが、これらに限定するものではない：すなわちオルトレオウイルス属（哺乳動物とトリレトロウイルスの両方の複数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、オイゲナンギーウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス）を含むレオウイルス科；エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＧ型肝炎ウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルスムリス（ｍｕｒｉｓ）、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも１１３のサブタイプを含むヒトライノウイルス；その他のライノウイルス）、アプトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含むピコルナウイルス科；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス、およびノーウォークウイルスを含むカリシウイルス科；アルファウイルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含むトガウイルス科；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミアン−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フランダース−ハートパークウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、フィッシュラブドウイルス、およびフィロウイルス（マーブルグウイルスおよびエボラウイルス）を含むラブドウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、およびラッサウイルスを含むアレナウイルス科；伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸炎コロナウイルス、およびネコ伝染性腸炎ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバーである。
【００９７】
コア粒子として使用することができる例示的なＤＮＡウイルスには下記のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、オルソポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア、牛痘、バッファロー痘ウイルス、家兎痘、エクトロメリア）、レポリポックスウイルス属（粘液腫、線維腫）、アビポックスウイルス属（鶏痘、その他のトリポックスウイルス）、カプリポップスウイルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウイルス属（豚痘）、パラポックスウイルス（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含むポックスウイルス科；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス２および３型、魚のリンホシスチウイルス）；αヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１および２型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３型、仮性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ角結膜炎ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス）、βヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、ブタ、サル、およびげっ歯類のサイトメガロウイルス）を含むヘルペスウイルス科；γヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス、ヘルペスｓａｉｍｉｒｉ、ヘルペスウイルスａｔｅｌｅｓ、ヘルペスウイルスｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）；マストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと、分類されていないもの）、サルアデノウイルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、ウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、および多くのその他の種のアデノウイルス、アビアデノウイルス属（トリアデノウイルス）を含むアデノウイルス科；非培養性アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、その他の種の様々な病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サル空胞剤（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞剤（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、およびリンパ増殖性パピローマウイルスなどのその他の霊長類のポリオーマウイルス）を含むパポウイルス科；アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）を含むパルボウイルス科である。最後に、ＤＮＡウイルスには、慢性伝染性神経障害剤（ＣＨＩＮＡウイルス）などのウイルスを含めることができる。
【００９８】
その他の実施形態では、細菌性ピリン、細菌性ピリンの小部分、あるいは細菌性ピリンまたはその小部分を含有する融合タンパク質を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。ピリンタンパク質の例には、大腸菌、インフルエンザ菌、ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌、カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、シュードモナス−スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、および緑膿菌によって生成されたピリンが含まれる。本発明と共に使用するのに適したピリンタンパク質のアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＪ０００６３６（配列番号１）、ＡＪ１３２３６４（配列番号２）、ＡＦ２２９６４６（配列番号３）、ＡＦ０５１８１４（配列番号４）、ＡＦ０５１８１５（配列番号５）、およびＸ００９８１（配列番号６）に記載されたものが含まれ、その開示の全体を参照により本明細書に援用する。
【００９９】
細菌性ピリンタンパク質は、一般に、タンパク質を細菌性ペリプラズムへと移出する前に、Ｎ末端リーダー配列が除去されるようにプロセッシングされる。さらに当業者に理解されるように、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、一般に、天然に存在するリーダー配列を持たない。
【０１００】
本発明での使用に適するピリンタンパク質の１つの特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰピリンである（ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＦ２３７４８２（配列番号７））。本発明と共に使用するのに適した１型Ｅ．ｃｏｌｉピリンの例は、ＧｅｎＢａｎｋレポートＰ０４１２８に記載されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するピリンであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋレポートＭ２７６０３に記載されたヌクレオチド配列（配列番号９）を有する核酸でコードされたものである。これらＧｅｎＢａｎｋレポートの開示全体を、参照により本明細書に援用する。同様に、一般に上記タンパク質の成熟形態を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。
【０１０１】
本発明を実施する際、使用に適する細菌性ピリンまたはピリン小部分は、一般に規則正しい反復性抗原アレイが形成されるよう会合することができる。
【０１０２】
ピリンおよび線毛様構造を生体外で調製する方法は、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２８９０〜１２８９５（１９９６）は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｐ線毛サブユニットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成体について述べている。さらにＥｓｈｄａｔ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８：３０８〜３１４（１９８１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛の解離および線毛の再構成体に適した方法について述べている。簡単に言えば、これらの方法は以下の通りである。すなわち線毛を、飽和塩酸グアニジン中、３７℃でインキュベートすることによって解離させる。次いでピリンタンパク質をクロマトグラフィーで精製し、その後、５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーを形成する。Ｅｓｈｄａｔ他は、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーが再会合して線毛を形成することも見出した。
【０１０３】
さらに、例えば従来の遺伝子工学およびタンパク質変性方法を使用して、抗原または抗原決定基が第２の付着部位を介して結合される第１の付着部位が含まれるように、ピリンタンパク質を変性させることができる。あるいは抗原または抗原決定基は、第２の付着部位を介して、これらのタンパク質中に自然に存在するアミノ酸残基に直接結合することができる。次いでこれらの変性ピリンタンパク質を、本発明のワクチン組成物に使用することができる。
【０１０４】
本発明の組成物およびワクシン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、ＨＢｃＡｇに関して本明細書で述べた場合と同様の手法で変性させることができる。例えばシステインおよびリジン残基は、欠失させることができ、または他のアミノ酸残基で置換することができ、第１の付着部位をこれらのタンパク質に付加することができる。さらにピリンタンパク質を、変性した形で発現させることができ、または発現後に化学的に変性させることができる。同様に、無傷の線毛を細菌から収集し、次いで化学的に変性させることができる。
【０１０５】
別の実施形態では、線毛または線毛様構造を細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）から収集し、これを使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を形成する。組成物およびワクチン組成物の調製に適した線毛の一例は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するピリンモノマーから形成された、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛である。
【０１０６】
細菌線毛を収集する方法のいくつかは、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：６２３〜６３２（１９９８））は、Ｅ．ｃｏｌｉからＰ線毛を収集するための線毛精製方法について述べている。この方法によれば、線毛は、Ｐ線毛プラスミドを含有する過度に線毛化したＥ．ｃｏｌｉから剪断され、溶解およびＭｇＣｌ２（１．０Ｍ）沈殿のサイクルによって精製される。
【０１０７】
収集した後、線毛または線毛様構造を様々な方法で変性させることができる。例えば第１の付着部位は、第２の付着部位を介して抗原または抗原決定基を結着させることができる線毛に付加することができる。言い換えれば、細菌線毛または線毛様構造を収集して変性させることにより、規則正しい反復性抗原アレイを得ることができる。
【０１０８】
抗原または抗原決定基は、線毛または線毛様構造内に存在する、天然に生ずるシステイン残基またはリジン残基に結合することができる。そのような場合、天然に生ずるアミノ酸残基が高度に配列され繰り返されることにより、抗原または抗原決定基と線毛または線毛様構造とが連結するようになる。例えば線毛または線毛様構造は、異種２官能性架橋剤を使用して、抗原または抗原決定基の第２の付着部位に結合することができる。
【０１０９】
生物体によって自然に合成される構造（例えば線毛）を使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を調製する場合、所望の特徴を有する構造が生成されるように、これらの生物体を遺伝子工学を使用して合成することがしばしば有利になる。例えばＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を使用する場合、この線毛が収集されるＥ．ｃｏｌｉは、特定の特徴を備えた構造が生成されるように、変性させることができる。ピリンタンパク質の可能な変性例には、１つまたは複数のリジン残基の挿入、１つまたは複数の天然に存在するリジン残基の欠失または置換、１つまたは複数の天然に存在するシステイン残基の欠失または置換が含まれる（例えば、配列番号８の位置４４および８４のシステイン残基）。
【０１１０】
さらに、追加の変性をピリン遺伝子に行うことができ、その結果、リジン残基以外の第１の付着部位を含有する発現生成物が得られる（例えばＦＯＳまたはＪＵＮドメイン）。当然ながら一般に、適切な第１の付着部位は、本発明のワクチン組成物での使用に適する線毛または線毛様構造をピリンタンパク質が形成するのを妨げないものに限定される。
【０１１１】
細菌細胞内に自然に存在するピリン遺伝子は、生体内で変性させることができ（例えば同種組換えによって）、または特定の特徴を備えたピリン遺伝子を、これらの細胞に挿入することができる。例えばピリン遺伝子は、複製可能なクローニングベクターまたは細菌染色体に挿入されるベクターの成分として、細菌細胞に導入することができる。挿入されたピリン遺伝子は、発現調節制御配列（例えばｌａｃオペレーター）に結合してもよい。
【０１１２】
ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される線毛または線毛様構造は、単一タイプのピリンサブユニットからなる。同一サブユニットからなる線毛または線毛様構造は、高度に配列されかつ繰り返された抗原アレイを提示する構造を形成することが予想されるので、一般的に使用される。
【０１１３】
しかし本発明の組成物は、異質なピリンサブユニットから形成された線毛または線毛様構造を含んだ組成物およびワクチンも含む。これらの線毛または線毛様構造を形成するピリンサブユニットは、細菌細胞内に自然に存在する遺伝子から発現させることができ、または細菌細胞に導入することができる。天然に存在するピリン遺伝子と導入した遺伝子は共に、線毛または線毛様構造を形成する細胞内で発現し、その結果、一般にこれらのピリンタンパク質の混合物から形成された構造になる。さらに、２個以上のピリン遺伝子が細菌細胞内で発現した場合、各ピリン遺伝子の相対的な発現は典型的な場合、線毛または線毛様構造における異なるピリンサブユニットの比を決定するファクターになる。
【０１１４】
混合型ピリンサブユニットの特定の組成物を有する線毛または線毛様構造が望まれる場合、ピリン遺伝子の少なくとも１つの発現は、異種誘発性プロモーターによって調節することができる。他の遺伝要素と同様にそのようなプロモーターを使用して、細菌細胞内で産生される異なるピリンサブユニットの相対的な量を調節することができ、したがって線毛または線毛様構造の組成を調節することができる。
【０１１５】
さらに、抗原または抗原決定基は、ペプチド結合ではない結合によって細菌線毛または線毛様構造に結合することができ、本発明の組成物に使用される線毛または線毛様構造を産生する細菌細胞を遺伝子工学により合成して、抗原または抗原決定基と融合するピリンタンパク質を生成することができる。線毛または線毛様構造を形成するそのような融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物で使用するのに適している。
【０１１６】
本願におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子に似ているが病原体ではない構造を指す。一般にウイルス様粒子はウイルスゲノムに欠けており、したがって非感染性である。またウイルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することもでき、容易に精製することもできる。
【０１１７】
好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。当業者なら、組換えＤＮＡ技術と一般に公開されているウイルスコード配列とを使用して、ＶＬＰを生成することができる。例えばウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、ウイルスプロモーターの調節制御の下、市販のバキュロウイルスベクターを使用するバキュロウイルス発現ベクターにおける発現を目的として設計製作することができるが、この場合、配列の適切な変更によってコード配列と調節配列との機能的連鎖が可能になる。ウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、例えば細菌発現ベクターでの発現を目的として設計製作することもできる。
【０１１８】
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウイルス（Ｗａｒｎｅｓ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および米国特許第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１３：１６０３〜１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒファージ、ＧＡファージ、およびＱβファージが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
当業者に容易に明らかにされるように、本発明のＶＬＰは、いかなる特定の形態にも限定するものではない。粒子は、化学的に合成することができ、あるいは自然のまたは非自然の生物学的プロセスを経て合成することができる。例として、このタイプの実施形態は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。
【０１２０】
より特定の実施形態では、ＶＬＰは、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、口蹄疫ウイルスの組換えポリペプチド、はしかウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えポリペプチド（例えばＨＢｃＡｇ）、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、フロックハウスウイルスの組換えポリペプチド、ヒトパピローマウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組換えポリペプチド、Ｔｙの組換えポリペプチド、ｆｒファージの組換えポリペプチド、ＧＡファージの組換えポリペプチド、およびＱβファージの組換えポリペプチドから選択された、組換えポリペプチドまたはその断片を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ウイルス様粒子はさらに、そのようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、ならびにそのようなポリペプチドの変種を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ポリペプチドの変種は、例えばこれに対応する野生型との同一性が、アミノ酸レベルで少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％である。
【０１２１】
好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、およびｌ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択されることが好ましい。
【０１２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子が、ＲＮＡバクテリオファージＱβまたはＲＮＡバクテリオファージｆｒの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１２３】
本発明の別の好ましい実施形態で、組換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１２４】
したがって、ＶＬＰのカプシドを形成するＲＮＡファージコートタンパク質、あるいはカプシドまたはＶＬＰへの自己組織体に適合したバクテリオファージコートタンパク質の断片は、本発明のさらに好ましい実施形態である。例えばバクテリオファージＱβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えによって発現することができる。さらにそのような発現の後、これらのタンパク質は自然発生的にカプシドを形成する。さらにこれらのカプシドは、固有の繰返し編成を持つ構造を形成する。
【０１２５】
本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ  ＣＰを指す。配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ  Ａ１タンパク質を指す。）、バクテリオファージＲ１７（配列番号１２；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３０３７４、ＳＰ  ＣＰを指す。配列番号１６；受入番号、ＳＰ  Ａｌタンパク質を指す。）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号２２）などの、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質、あるいはそのＣ末端から１００、１５０、または１８０のアミノ酸を失ったＣ末端切断型を、Ｑβコートタンパク質のカプシド組織体に組み込むことができる。一般に、カプシド組織体におけるＱβ  ＣＰに対するＱβ  Ａ１タンパク質のパーセンテージは、カプシドの形成を確実にするために、限定されている。
【０１２６】
Ｑβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した場合、カプシドに自己組織化することも見出されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．他、遺伝子（ＧＥＮＥ）１３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ、Ｔ＝３の、準対称的な正二十面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造も解析された。カプシドは、コートタンパク質の１８０のコピーを含有するが、これらのコピーは、ジスルフィド架橋によって共有５量体または６量体に結合しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコートタンパク質のカプシドは極めて安定した状態になる。しかし、組換えＱβコートタンパク質から作製されたＶＬＰのカプシドは、ジスルフィド結合を介してカプシド内の他のサブユニットに結合していないかまたは不完全に結合しているサブユニットを含有する可能性がある。したがって組換えＱβカプシドを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに導入することによって、モノマーＱβコートタンパク質に対応するバンドならびにＱβコートタンパク質の６量体または５量体に対応するバンドが目に見えるようになる。不完全なジスルフィド結合サブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、２量体、３量体、または４量体のバンドとしても現れる。Ｑβカプシドタンパク質は、有機溶媒および編成剤に対しても異常な耐性を示す。意外なことに本発明者等は、ＤＭＳＯおよびアセトニトリルの濃度が３０％程度でありグアニジン濃度が１Ｍ程度であると、カプシドの安定性に影響が生じないことを観察した。Ｑβコートタンパク質のカプシドの安定性が高いことは、本発明による哺乳類およびヒトの免疫化およびワクチン接種で使用する場合に、特に有利な特徴である。
【０１２７】
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現後、Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンは、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）に記載されているＮ末端Ｅｄｍａｎ配列決定によって本発明者等が観察したように、通常は除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコートタンパク質から構成されたＶＬＰ、あるいはＮ末端メチオニンが切断されまたは存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
【０１２８】
別のＲＮＡファージコートタンパク質も、細菌宿主内で発現した後に自己組織化することが示されている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ２８７：４５２〜４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージカプシドは、コートタンパク質の他に、いわゆる読抜けタンパク質Ａ１および成熟タンパク質Ａ２を含有する。Ａ１はＵＧＡ停止コドンで抑制によって生成され、その長さは３２９ａａである。本発明で使用されるファージＱβ組換えコートタンパク質のカプシドは、Ａ２溶解タンパク質に欠けており、宿主からのＲＮＡを含有する。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクル中に翻訳抑制因子として働くレプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位のステムループと相互に作用する。この相互作用の配列および構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８：７１〜７６（１９８９）；Ｌｉｍ，Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。ステムループおよびＲＮＡは一般に、ウイルス組織体に関与することが知られている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））。
【０１２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質、好ましくは上述のＲＮＡファージの変異コートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換によって少なくとも１つのリジン残基を除去することにより、または置換によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させ、あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失により、または挿入によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させた。
【０１３０】
別の好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、あるいは配列番号１０と配列番号１１のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物、あるいは配列番号１１の変異体を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。
【０１３１】
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子はＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、変異Ｑβコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換による少なくとも１つのリジン残基の除去によって、または置換による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失によって、または挿入による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。
【０１３２】
Ｑβタンパク質のカプシド表面には４個のリジン残基が露出する。露出したリジン残基に代わってアルギニンが配置されたＱβ変異体も、本発明で使用することができる。したがって本発明を実施する際には、下記のＱβコートタンパク質変異体および変異Ｑβ  ＶＬＰを使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ  １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、「Ｑβ−２５１」（配列番号２６）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。したがって本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列、ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列、ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列、ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列、およびｅ）配列番号２７のアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、変異Ｑβコートタンパク質の組換えタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。上述のＱβコートタンパク質、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびカプシドの構成体、発現、および精製のそれぞれは、２００２年１月１８日に本願の譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に開示されている。特に本明細書では、上述の出願の実施例１８を参照する。
【０１３３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、Ｑβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１つと対応するＡ１タンパク質との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１３４】
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１３５】
ＡＰ２０５ゲノムは、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼ、および関連するファージに存在しない２つのオープンリーディングフレームからなり；溶解遺伝子およびオープンリーディングフレームは、成熟遺伝子の翻訳で役割を果たす（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．、他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号９４）から発現することができるが、これはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含むものである。あるいはＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流でｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。いずれの手法も、その全体を参照により援用する２００２年７月１６日に本願譲受人によって出願された「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ）」という名称の同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、タンパク質を発現させ、カプシドを形成する。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから得られたベクターであり、これらのベクターでクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御される（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３〜５８（配列番号７９）は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開示コドンのすぐ上流に、以下の配列の推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつ開始コドンの上流に、シャイン−ダルガーノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、下線はシャイン−ダルガーノ配列）。
【０１３６】
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１３７】
したがって本発明のこの好ましい実施形態は、カプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、組換えによって発現させ、または自然源から調製する。細菌内で生成されたＡＰ２０５コートタンパク質は、電子顕微鏡（ＥＭ）および免疫拡散法によって明らかにされるように、自発的にカプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号８０）によって形成されたカプシドおよびＡＰ２０５  ＲＮＡファージのコートタンパク質によって形成されたカプシドの構造的特性は、ＥＭで見た場合にほとんど見分けがつかない。ＡＰ２０５  ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／又は抗原決定基に結合して、繰り返し向きが定められた抗原及び／又は抗原決定基を示すワクチン構成体を生成することができる。そのように示された抗原に対して高い力価が引き出され、結合した抗原及び／又は抗原決定基は抗体分子と相互に作用し易く、免疫原性であることが示される。
【０１３８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１３９】
本発明を実施する際、アミノ酸５でプロリンがトレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号８１）を含む、組織体−ＡＰ２０５  ＶＬＰのコンピテント変異形態を使用してもよく、さらに好ましい本発明の実施形態になる。これらのＶＬＰ、自然源から得られたＡＰ２０５  ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウイルス粒子を抗原に結合して、本発明による抗原の規則的で反復性のアレイを生成することができる。
【０１４０】
ＡＰ２０５  Ｐ５−Ｔ変異コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号８２）から発現することができるが、これはｐＱｂ１８５から直接誘導されたものであり、またＱβコートタンパク質遺伝子の代わりに変異ＡＰ２０５被覆タンパク質遺伝子を含有するものである。ＡＰ２０５コートタンパク質の発現用ベクターは、ＡＰ２０５コートタンパク質の発現を目的としてＥ．ｃｏｌｉに形質移入される。
【０１４１】
ＶＬＰへの自己組織体に繋がるコートタンパク質および変異コートタンパク質をそれぞれ発現させるための方法は、「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１６日に本願譲受人により出願された、同時係属の米国仮特許出願に記載されており、その全体を参照により援用する。適切なＥ．ｃｏｌｉ株には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ８０２、ＪＭ１０９、ＲＲ１が含まれるが、これらに限定されない。適切なベクターおよび株およびそれらの組合せは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、コートタンパク質および変異コートタンパク質の発現をそれぞれ試験することにより確認でき、また、カプシドの形成および組織体は、任意選択でまずゲルろ過によりカプシドを精製し、その後、免疫拡散アッセイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ試験）または電子顕微鏡でそれらを試験することによって、確認できる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ、Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））。
【０１４２】
ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現したＡＰ２０５コートタンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉの細胞質内でのプロセッシングが原因で、初期メチオンニンアミノ酸に欠けている可能性がある。ＡＰ２０５  ＶＬＰの切断形態、非切断形態、またはその混合物は、本発明のさらに好ましい実施形態である。
【０１４３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１４４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質または組換え変異コートタンパク質の断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
【０１４５】
ＶＬＰおよびカプシドにそれぞれ組織化可能な組換えＡＰ２０５コートタンパク質断片も、本発明の実施に有用である。これらの断片は、コートタンパク質および変異コートタンパク質それぞれの内部またはその末端における欠失によって生成することができる。コートタンパク質および変異コートタンパク質の配列への挿入、あるいはコートタンパク質および変異コートタンパク質の配列との抗原配列の融合、およびＶＬＰへの組織体との適合性は、本発明の別の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質および粒子がそれぞれ得られる。コートタンパク質配列への挿入、欠失、および融合の結果と、これらがＶＬＰへの組織体に適合するか否かは、電子顕微鏡によって決定することができる。
【０１４６】
上述のＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片、およびキメラコートタンパク質によって形成された粒子は、その全体を参照により援用する「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１６日に本願譲受人により出願された同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、沈殿による分画工程と、例えばセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラム、およびこれらの組合せを使用したゲルろ過による精製工程との組合せにより、純粋な形で単離することができる。ウイルス様粒子を単離するためのその他の方法が当技術分野で知られており、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離するのに使用することができる。例えば、その全体を本明細書に参照により援用する米国特許第４，９１８，１６６号には、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離するために超遠心分離を使用することが記載されている。
【０１４７】
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５４（１９９６））。そのような情報を使用して、表面が露出した残基を同定することができ、したがってＲＮＡファージコートタンパク質は、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を挿入または置換することによって挿入できるように、変性させることができる。その結果、バクテリオファージコートタンパク質が変性した形のものも、本発明で使用することができる。したがって、本発明の組成物を調製するにあたり、カプシドまたはカプシド様構造（例えばバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、およびバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）を形成するタンパク質の変種も使用することができる。
【０１４８】
上記で論じた変種タンパク質の配列は、これに対応する野生型の配列とは異なるが、これらの変種タンパク質は一般に、カプシドまたはカプシド様構造を形成する能力を維持することになる。したがって本発明はさらに、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質の変種をさらに含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含み、同様に、そのような組成物およびワクチン組成物のそれぞれと、そのような組成物の調製に使用される個々のタンパク質サブユニットと、これらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する方法も含む。したがって本発明の範囲内には、カプシドまたはカプシド様構造を形成しかつカプシドまたはカプシド様構造を会合し形成する能力を維持する野生型タンパク質の変種形態が含まれる。
【０１４９】
その結果、本発明はさらに、規則的なアレイを形成して固有の繰返し構造をそれぞれ有する、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
【０１５０】
本発明の範囲内には、本発明の組成物を調製するのに使用されるタンパク質をコードする核酸分子がさらに含まれる。
【０１５１】
その他の実施形態では、本発明はさらに、配列番号１０〜２７で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。
【０１５２】
本発明での使用に適するタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造あるいはＶＬＰを形成するタンパク質のＣ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
【０１５３】
本発明での使用に適する別のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質のＮ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＮ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
【０１５４】
本発明での使用に適する追加のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するＮ末端およびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端およびＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
【０１５５】
本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。
【０１５６】
したがって本発明は、カプシドまたはＶＬＰを形成するタンパク質から調製された組成物およびワクチン組成物と、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰまたはカプシドからこれらの組成物を調製する方法と、これらのタンパク質サブユニットおよびこれらのサブユニットをコードする核酸分子を調製する方法と、本発明のこれらの組成物を使用して、個体にワクチン接種しかつ／または個体に免疫応答を誘発させる方法を含む。
【０１５７】
前述のように、本発明は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。１つのさらに好ましい実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇの断片からなる。別の実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇタンパク質の断片からなるが、これはいくつかの遊離システイン残基を排除しまたはその数が減少するように変性させたものである。Ｚｈｏｕ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたＨＢｃＡｇがカプシドを会合し形成する能力を維持することを実証した。したがって本発明の組成物での使用に適するＶＬＰは、天然に存在するシステイン残基の１つまたは複数が欠失しまたは別のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換された変性ＨＢｃＡｇまたはその断片を含んだものを含む。
【０１５８】
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質をプロセッシングされることによって生成されたタンパク質である。ＨＢｃＡｇのいくつかのアイソタイプが同定され、それらのアミノ酸配列は、当業者が容易に入手可能である。ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、ＨＢｃＡｇをプロセッシングされた形のもの（すなわちＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を除去したＨＢｃＡｇ）を使用して調製される。
【０１５９】
さらに、プロセッシングが行われない条件下でＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にＨＢｃＡｇは、「プロセッシングされた」形で発現させる。例えば、細胞質に向けてタンパク質を発現させるＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にこれらのタンパク質は、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現することになる。
【０１６０】
本発明で使用することができるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えばＷＯ００／３２２２７、本明細書では特に実施例１７〜１９および２１〜２４と、ＷＯ  ０１／８５２０８、本明細書では特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１、および４１と、２００２年１月１８日に本願譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２に開示されている。後者の出願では、特に実施例２３、２４、３１、および５１に記載されている。３つの文書のすべてを参照により本明細書に明らかに援用する。
【０１６１】
また本発明は、１つまたは複数の追加のシステイン残基を欠失させまたは置換するように変性したＨＢｃＡｇ変種も含む。遊離システイン残基がいくつかの化学副反応に関与し得ることが、当技術分野で知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、あるいは例えば他の物質と共に併用療法で注入されまたは形成された化学物質または代謝産物との反応、あるいはＵＶ光に曝露することによるヌクレオチドとの直接酸化および反応が含まれる。毒性付加物は、ＨＢｃＡｇが核酸に結合する傾向が強い点を特に考慮して、このように生成される。したがって毒性付加物は、それぞれが個々に低濃度で存在するが一緒になると毒性レベルに達する複数の種の間に分布する。
【０１６２】
上記事項に鑑み、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたワクチン組成物にＨＢｃＡｇを使用することの１つの利点とは、抗原または抗原決定基が結着したときに毒性種が結合可能な部位が、数のうえでは減少しまたはすべてなくなることである。
【０１６３】
本発明の実施に際して使用に適した天然に生ずるＨＢｃＡｇ変種の数が確認されている。例えばＹｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号２８の位置９７に対応した位置のイソロイシン残基をロイシン残基またはフェニルアラニン残基で置換した変種について述べている。いくつかのＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列が、いくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体変種と同様にＧｅｎＢａｎｋレポートＡＡＦ１２１２４０（配列番号２９）、ＡＦ１２１２３９（配列番号３０）、Ｘ８５２９７（配列番号３１）、Ｘ０２４９６（配列番号３２）、Ｘ８５３０５（配列番号３３）、Ｘ８５３０３（配列番号３４）、ＡＦ１５１７３５（配列番号３５）、Ｘ８５２５９（配列番号３６）、Ｘ８５２８６（配列番号３７）、Ｘ８５２６０（配列番号３８）、Ｘ８５３１７（配列番号３９）、Ｘ８５２９８（配列番号４０）、ＡＦ０４３５９３（配列番号４１）、Ｍ２０７０６（配列番号４２）、Ｘ８５２９５（配列番号４３）、Ｘ８０９２５（配列番号４４）、Ｘ８５２８４（配列番号４５）、Ｘ８５２７５（配列番号４６）、Ｘ７２７０２（配列番号４７）、Ｘ８５２９１（配列番号４８）、Ｘ６５２５８（配列番号４９）、Ｘ８５３０２（配列番号５０）、Ｍ３２１３８（配列番号５１）、Ｘ８５２９３（配列番号５２）、Ｘ８５３１５（配列番号５３）、Ｕ９５５５１（配列番号５４）、Ｘ８５２５６（配列番号５５）、Ｘ８５３１６（配列番号５６）、Ｘ８５２９６（配列番号５７）、ＡＢ０３３５５９（配列番号５８）、Ｘ５９７９５（配列番号５９）、Ｘ８５２９９（配列番号６０）、Ｘ８５３０７（配列番号６１）、Ｘ６５２５７（配列番号６２）、Ｘ８５３１１（配列番号６３）、Ｘ８５３０１（配列番号６４）、Ｘ８５３１４（配列番号６５）、Ｘ８５２８７（配列番号６６）、Ｘ８５２７２（配列番号６７）、Ｘ８５３１９（配列番号６８）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６９）、Ｘ８５２８５（配列番号７０）、ＡＢ０１０２８９（配列番号７１）、ＡＦ１２１２４２（配列番号７２）、Ｍ９０５２０（配列番号７３）、Ｐ０３１５３（配列番号７４）、ＡＦ１１０９９９（配列番号７５）、およびＭ９５５８９（配列番号７６）に開示されており、そのそれぞれの開示を参照により本明細書に援用する。これらのＨＢｃＡｇ変種は、配列番号７７における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２、および１８３に位置付けられたアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めたいくつかの位置で、アミノ酸配列が異なっている。本発明の組成物での使用に適する他のＨＢｃＡｇ変種、および本明細書の開示に従ってさらに変性し得るものが、ＷＯ  ００／１９８３３３、ＷＯ  ００／１７７１５８、およびＷＯ  ００／２１４４７８に記載されている。
【０１６４】
上述のように、一般にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわちリーダー配列にかけたもの）が、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される。本発明は、ワクチン組成物、ならびに上述の変種ＨＢｃＡｇを用いるこれらの組成物の使用方法を含む。
【０１６５】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記野生型アミノ酸配列の１つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの既知のコンピュータプログラムを従来通り使用して決定することができる。例えば特定の配列が参照アミノ酸配列と９５％同一であるか否かを決定するのに、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが完全長の参照アミノ酸配列全体にわたって計算されるように、かつ参照配列のアミノ酸残基の総数の５％までが相同なギャップが可能になるように設定する。
【０１６６】
配列番号２９〜７２および７３〜７７に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変種および前駆体は、互いに相対的に類似している。したがって、配列番号７７の特定の位置に対応する位置に位置付けられたＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸残基を言う場合は、配列番号７７で示されるアミノ酸配列のその位置に存在するアミノ酸残基を指す。ＨＢｃＡｇ変種同士の相同性は、哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルスのほとんどの部分で十分に高く、そのため当業者は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列の両方について検討しかつ「対応する」アミノ酸残基を特定することがほとんど困難ではない。さらに、ウッドチャックに感染するウイルスから得られたＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号７３に示されるＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと十分に相同であり、配列番号７７のアミノ酸残基１５５と１５６の間の配列番号６４に３アミノ酸残基挿入断片が存在することが容易に明らかにされる。
【０１６７】
また本発明は、トリに感染するＢ型肝炎ウイスルのＨＢｃＡｇ変種を含んだワクチン組成物、ならびにこれらのＨＢｃＡｇ変種の断片を含んだワクチン組成物も含む。これらのＨＢｃＡｇ変種では、これらのポリペプチドに自然に存在するシステイン残基の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を、別のアミノ酸残基で置換しまたは欠失させ、その後、本発明のワクチン組成物に含めることができる。
【０１６８】
上記で論じたように、遊離システイン残基をなくすことによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合できる部位の数を減少させ、また、同じかまたは隣接するＨＢｃＡｇ分子のリジンおよびシステイン残基の架橋が生じ得る位置をなくす。したがって本発明の別の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の１つまたは複数のシステイン残基を欠失させ、または別のアミノ酸残基で置換した。
【０１６９】
その他の実施形態で、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、Ｃ末端領域（例えば配列番号７７のアミノ酸残基１４５〜１８５または１５０〜１８５）を除去したＨＢｃＡｇを含有することになる。そのため、本発明を実施する際の使用に適した追加の変性ＨＢｃＡｇは、Ｃ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇを含む。
【０１７０】
本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、Ｎ末端切断型変異体も含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去された変性ＨＢｃＡｇを含む。
【０１７１】
本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、ＮおよびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、および１７アミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去された、ＨＢｃＡｇを含む。
【０１７２】
本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
【０１７３】
本発明のある特定の実施形態では、ＨＢｃＡｇポリペプチドにリジン残基を導入して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＨＢｃＡｇのＶＬＰとの結合を媒介するようにする。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、配列番号７７のアミノ酸１〜１４４、または１〜１４９、１〜１８５を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇを使用して調製するが、これは、位置７９および８０に対応するアミノ酸がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有するペプチドで置換されるように変性させたものである（配列番号７８）。さらに好ましい実施形態では、配列番号７７の位置４８および１０７のシステイン残基をセリンに変異させる。本発明はさらに、配列番号２９〜７４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含んだ組成物を含むが、これは上述のアミノ酸の変化があるものである。本発明の範囲内には、カプシドまたはＶＬＰを形成するように会合すること可能でありかつ上述のアミノ酸変化を有する、追加のＨＢｃＡＧ変種がさらに含まれる。したがって本発明はさらに、野生型アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドと、適切な場合にはＮ末端リーダー配列を除去するようプロセッシングされて上述の変化によって変性されるこれらタンパク質のプロセッシングされた形とを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
【０１７４】
本発明の組成物またはワクチン組成物は、種々のＨＢｃＡｇの混合物を含んでよい。したがってこれらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇからなる。例えば、「野生型」ＨＢｃＡｇと、１つまたは複数のアミノ酸残基が変化した（例えば欠失し、挿入され、または置換された）変性ＨＢｃＡｇとを含む、ワクチン組成物を調製することができる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、抗原がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである、高度に規則正しい反復性抗原アレイを提示するものである。本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの共有結合によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが前記コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ結合する。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドは、少なくとも１つの共有結合によってコア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ結合し、前記共有結合は非ペプチド結合であって、コア粒子とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの規則的で反復性のアレイと、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとのアレイまたは結合体をそれぞれもたらすものであることが好ましい。このＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとのアレイおよび結合体のそれぞれは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つであり通常は複数のタンパク質またはペプチドが向きの定められた状態でＶＬＰに結合するので、典型的な場合かつ好ましくは反復性で規則性の構造を有する。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの１０、２０、４０、８０、１２０を超えるタンパク質またはペプチドがＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットに結合することが好ましい。反復性で規則性のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドアレイおよび結合体の形成はそれぞれ、下記の事項で明らかにされるように、配列され向きが定められ、かつ画定されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとの結合および結着によって、確実になされる。さらに、ＶＬＰの典型的な固有の高度に繰り返され編成された構造は、高度に編成され繰り返されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドアレイおよび結合がそれぞれ得られるように、高度に順序付けられ繰り返される手法で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを表示することに寄与することが有利である。
【０１７５】
したがって、好ましい本発明の結合体およびアレイのそれぞれは、高度に編成された構造、寸法であること、およびアレイ表面の抗原の反復性が、従来技術の結合体とは異なる。さらに本発明の好ましい実施形態によれば、発現宿主内で粒子と抗原の両方を発現させることが可能になり、抗原、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドの適正な折畳みと、ＶＬＰの適正な折畳みおよび組織体が保証される。
【０１７６】
本発明は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合する方法を開示する。示すように、本発明の一態様では、化学的架橋によって、典型的な場合かつ好ましくは異種２官能性架橋剤を使用することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをそれぞれコア粒子およびＶＬＰに結合させる。いくつかの異種１官能性架橋剤は、当技術分野で知られている。好ましい実施形態で、異種２官能性架橋剤は、好ましい第１の付着部位、すなわちコア粒子およびＶＬＰまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットそれぞれのリジン残基の側鎖アミノ基とそれぞれ反応することができる官能基と、好ましい第２の付着部位、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に天然に存在し、還元による反応に供され、または設計製作され、任意選択で還元による反応にも供される、システイン残基と反応することができる別の官能基を含有する。この手順の第１の工程は、典型的な場合は誘導体化と呼ばれ、コア粒子またはＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化コア粒子または活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、ゲルろ過や透析などの通常の方法を使用して、未反応の架橋剤を除去する。第３の工程では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを活性化担体と反応させるが、この工程は典型的な場合、連結工程と呼ばれる。未反応のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、例えば透析によって、第４の工程で任意選択で除去することができる。いくつかの異種２官能性架橋剤が当技術分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡと、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）から入手可能であって一方の官能基がアミノ基に対して反応性があり他方の官能基がシステイン残基に対して反応性があるその他の架橋剤が含まれる。上述の架橋剤はすべて、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明の実施に適した別のクラスの架橋剤は、連結によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子またはＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することを特徴とする。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤によるコア粒子およびＶＬＰそれぞれの誘導化の程度は、各反応相手の濃度や、１つの試薬が他の試薬よりも過剰であること、ｐＨ、温度、およびイオン強度などの実験条件を変えることによって影響を受ける可能性がある。連結の程度、すなわちコア粒子およびＶＬＰそれぞれのサブユニット当たりのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量は、ワクチンの要件に一致するよう上述の実験条件を変化させることによって調節することができる。��Ｌ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの溶解度によって、各サブユニットに連結し得るＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量に制限が課される可能性があり、得られるワクチンが不溶性である場合は、サブユニット当たりのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量を減少させることが有利である。
【０１７７】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させる特に好ましい方法は、コア粒子およびＶＬＰの表面のリジン残基をそれぞれ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上のシステイン残基と結合させることである。したがって本発明の好ましい実施形態では、第１の付着部位がリジン残基であり、第２の付着部位がシステイン残基である。いくつかの実施形態では、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに結合させるため、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対し、第２の付着部位としてまたはその一部として、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーを設計製作することが必要になる。あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド内への挿入または変異によって、システインを導入することができる。あるいはシステイン残基またはチオール基を、化学的な連結によって導入することができる。
【０１７８】
アミノ酸リンカーの選択は、抗原および自己抗原のそれぞれの性質に応じてなされ、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの性質、ｐＩや電荷分布、グリコシル化などのその生化学的特性に応じてなされる。一般に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの好ましい実施形態は、（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ末端γ１リンカー、（ｃ）Ｎ末端γ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー、（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５であるもの、（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２であるもの、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）Ｃ末端γ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端γ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５であるもの、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、およびｏ＝０〜８であるものからなる群から選択される。
【０１７９】
アミノ酸リンカーのさらに好ましい例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであって、すべてが第２の付着部位としてシステイン残基をさらに含有し、さらに任意選択でグリシン残基を含有するものである。典型的な場合、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端γ３；ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ；Ｃ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧ；Ｃ末端グリシン−リジンリンカー：ＧＧＫＫＧＣ；Ｎ末端グリシン−リジンリンカー：ＣＧＫＫＧＧである。
【０１８０】
本発明のさらに好ましい実施形態では、特に抗原がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである場合、ペプチドのＣ末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ、またはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化の略である）リンカーあるいはそのＮ末端のＣＧＧは、アミノ酸リンカーとして好ましい。一般にグリシン残基は、連結反応におけるバルク状アミノ酸の可能性ある立体障害が回避されるように、バルク状アミノ酸と第２の付着部位として使用されるシステインとの間に挿入される。
【０１８１】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に存在するシステイン残基は、活性化ＶＬＰ上の異種２官能性架橋剤と反応するように、その還元状態になければならず、すなわち遊離システインまたは遊離スルフィドリル基を有するシステイン残基が利用可能でなければならない。結合部位として機能するシステイン残基が酸化された形のものである場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合は、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールとのこのジスルフィド架橋の還元が必要とされる。
【０１８２】
上述の好ましい方法による異種２官能性架橋剤を使用することによる、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合のそれぞれは、向きが定められた手法によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの連結をそれぞれ可能にする。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとをそれぞれ結合するその他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させる方法が含まれる。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、またはイミノチオタンとの反応によって最初にチオール化してもよい。次いでＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、必要に応じて脱保護を行った後、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに以下のように連結することができる。過剰なチオール化試薬を分離した後、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、システイン反応性部分を含む異種２官能性架橋剤で事前に活性化させたコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させ、したがって少なくとも１つまたはいくつかの官能基がシステイン残基に対して反応性があることが示されるが、これは上述のように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのチオール化タンパク質またはペプチドが反応することが可能なものである。任意選択で、少量の還元剤を反応混合物に含める。別の方法では、グルタルアルデヒドやＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）などの同種２官能性架橋剤、あるいは、コア粒子およびＶＬＰそれぞれのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性を有する官能基を備えたその他の知られている同種２官能性架橋剤を使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結着する。
【０１８３】
別の実施形態では、グリコシル化したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に存在する炭水化物部分を変性させ、その後コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させることによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに結合する。一実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのグリコシル化タンパク質またはペプチドを、炭水化物部分の緩慢な酸化反応で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドを得る。このように活性化したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを過剰な過ヨウ素酸ナトリウムから分離し、さらにコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させるが、この場合、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に記載されているように、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのリジン残基を、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上の事前形成されたアルデヒド官能基と反応させる。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドの自己重合は、前述の文献に記載されているように、ｐＨを調節することによって制御することができる。形成されたシッフ塩基は、好ましくはシアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元し、その後ゲルろ過または透析によって除去する。あるいは、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのカルボキシル基でＥＤＣと反応させ、さらにアジピン酸ジヒドラジドなどのジヒドラジドと反応させて、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチド上に存在する１つまたは複数のアルデヒド官能基と反応することが可能なヒドラジド部分を得る。このように形成されたヒドラゾンは、シアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元することができる。あるいは、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドをシステアミンと反応させて、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドにシステイン基を導入する。コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに対するＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに適した追加の架橋方法および架橋剤、ならびに連結反応の実施と化学架橋剤および化学架橋手順の使用に関する指針は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に見出すことができる。
【０１８４】
ＶＬＰをＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに結合するその他の方法には、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれをビオチニル化し、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをストレプタビジン融合タンパク質として発現させる方法、あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとの両方を、例えはＷＯ  ００／２３９５５に記載されているようにビオチニル化する方法が含まれる。この場合、自由な結合部位を、次の工程で添加されるコア粒子およびＶＬＰのそれぞれの結合にそのまま利用することができるように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとストレプタビジンとの比を調節することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをまずストレプタビジンまたはアビジンに結合させる。あるいは、すべての成分を「ワンポット（ｏｎｅ  ｐｏｔ）」反応で混合することができる。その他のリガンド−レセプター対は、可溶形態にあるレセプターおよびリガンドを利用可能であり、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと架橋可能であり、あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとを結合させるための結合剤として使用することができる。あるいは、リガンドまたはレセプターをＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと融合させ、それによって、このレセプターまたはリガンドにそれぞれ化学結合しまたは融合しているコア粒子およびＶＬＰのそれぞれへの結合を仲介することができる。融合は、挿入または置換によって行ってもよい。
【０１８５】
既に述べたように、本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。
【０１８６】
１つまたはいくつかの抗原分子、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、立体的に可能な場合、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基によって、カプシドまたはＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの１つのサブユニットに結着することができる。したがってＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの特定の特徴とは、サブユニット当たりいくつかの抗原に連結できることである。このため、稠密な抗原アレイを生成することが可能になる。
【０１８７】
本発明の好ましい実施形態で、少なくともＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれとの結合および結着は、それぞれ、ウイルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と、抗原または抗原決定基の少なくとも１つの第２の付着部位との相互作用および会合による。
【０１８８】
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、その表面に、定められた数のリジン残基を示し、３個のリジン残基がカプシドの内部に向かってＲＮＡと相互に作用し、他の４個のリジン残基がカプシドの外部に露出しているという、定められたトポロジーを持つ。これらの定められた性質は、リジン残基がＲＮＡを相互に作用する粒子の内部よりも粒子の外部に抗原が結着するのに都合良い。その他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面に定められた数のリジン残基を有し、これらのリジン残基は定められたトポロジーを持つ。
【０１８９】
本発明の別の実施形態で、第１の付着部位はリジン残基であり、かつ／または第２の付着部位はスルフィドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施形態では、第１の付着部位がリジン残基であり、第２の付着部位がシステイン残基である。
【０１９０】
本発明の非常に好ましい実施形態で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に天然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基を介して、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰリジン残基、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに結合する。
【０１９１】
ＲＮＡファージから得られたＶＬＰの別の利点は、細菌内でのその発現収量が高いことであり、手ごろなコストで大量の物質の生成が可能になる。
【０１９２】
述べたように、本発明の結合体およびアレイはそれぞれ、高度に編成された構造、寸法である点と、アレイ表面の抗原の反復性に関して、従来技術の結合体とは異なる。さらに、ＶＬＰを担体として使用することによって、抗原密度が様々な頑丈な抗原アレイおよび結合体がそれぞれ形成される。特にＲＮＡファージのＶＬＰを使用することによって、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを使用することによって、非常に高いエピトープ密度を実現することが可能になる。エピトープ密度の高いＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ組成物の調製は、本願の教示を使用して行うことができる。
【０１９３】
本明細書で定義する第２の付着部位は、抗原または抗原決定基に自然に存在するかまたは自然に存在しないものでよい。抗原または抗原決定上に、適切な天然の第２の付着部位が存在しない場合は、天然のものではない付着部位を抗原に対して設計製作しなければならない。
【０１９４】
上述のように、４個のリジン残基がＱβコートタンパク質のＶＬＰ表面に露出している。典型的な場合、これらの残基は、架橋剤分子との反応によって誘導化される。露出したリジン残基のすべてが抗原に連結し得るとは限らない場合、誘導化工程の後に、架橋剤分子がεアミノ基に結着した状態で、架橋剤と反応したリジン残基が残る。これは、ＶＬＰの溶解性および安定性に有害な、１つまたはいくつかの正電荷の消失に繋がる。以下に開示するＱβコートタンパク質変異体と同様に、アルギニン残基は架橋剤と反応しないので、リジン残基のいくつかをアルギニンに代えることによって、本発明者等は正電荷が過剰に消失するのを防止する。さらに、リジン残基をアルギニンに代えることにより、抗原との反応に利用部位が少なくなるので、より明確に定められた抗原アレイを得ることができる。
【０１９５】
したがって、本願で開示する以下のＱβコートタンパク質変異体および変異体Ｑβ  ＶＬＰでは、露出したリジン残基をアルギニンに代えた：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、およびＱβ−２５９（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。これらの構造体をクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製して、ペプチドおよびタンパク質抗原との連結に使用した。Ｑβ−２５１；（配列番号２６）も構成し、Ｑβ−２５１コートタンパク質のＶＬＰをどのように発現させ、精製し、かつ連結させるかについての指針は、本願全体を通して見出すことができる。
【０１９６】
他の実施形態では、本発明者等は、密度がさらに高い抗原アレイを得るのに適した、１つの追加のリジン残基を有するＱβ変異体コートタンパク質を開示する。この変異Ｑβコートタンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ  １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）をクローニングし、タンパク質を発現させ、カプシドまたはＶＬＰを単離して精製したが、追加のリジン残基の導入が、サブユニットとカプシドまたはＶＬＰとの自己組織体に適合することを示した。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと結合体のそれぞれは、Ｑβコートタンパク質変異体のＶＬＰを使用して調製することができる。抗原とＶＬＰ、特にＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰとを結着させる特に好ましい方法は、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ表面に存在するリジン残基と、抗原、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に自然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基とを結合することである。システイン残基を第２の付着部位として有効なものにするため、スルフィドリル基を連結に利用しなければならない。したがって、システイン残基を還元状態にしなければならず、すなわち遊離したシステインまたは遊離したスルフィドリル基を持つシステイン残基を利用可能にしなければならない。第２の付着部位として機能するシステイン残基が酸化形態にある場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合には、このジスルフィド架橋を、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールで還元することが必要である。還元剤の濃度、および抗原よりも過剰な還元剤のモル数は、各抗原ごとに調節しなければならない。１０μＭ程度またはそれ以下に低い濃度から始まり最高で１０〜２０ｍＭまたは必要に応じてそれ以上の濃度に至る還元剤の滴定範囲を試験し、抗原と担体との連結について評価する。２００２年１月１８日に本願譲受人により出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に記載されるように、還元剤が低濃度であることは連結反応に適合することであるが、濃度がより高くなると、当業者に知られるようにこの連結反応が阻害され、その場合は還元剤を透析またはゲルろ過によって除去しなければならない。透析または平衡緩衝液のｐＨは７未満であり、好ましくは６である。ｐＨの低い緩衝液と抗原の活性または安定性との適合性について試験をしなければならない。
【０１９７】
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤またはその他の反応条件を選択することによって調節できる。例えば架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳやＳＭＰＨでは、典型的な場合、高いエピトープ密度に達することが可能である。誘導化は、還元剤の濃度を高くすることによって、良い影響が得られ、反応条件の操作を行うことによって、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに連結する抗原の数を制御することができる。
【０１９８】
非天然の第２の付着部位を設計する前に、そこに融合し挿入されまたは一般に設計製作される位置を選択しなければならない。第２の付着部位の位置の選択は、例として、抗原の結晶構造に基づくものでよい。そのような抗原の結晶構造は、分子のＣまたはＮ末端の利用可能性（例えば溶媒に対するその接触可能性から決定される）に関する情報、またはシステイン残基など、第２の付着部位としての使用に適する残基の溶媒への曝露に関する情報を提供することができる。Ｆａｂ断片の場合のように、露出したジスルフィド架橋は、一般に緩慢な還元によって単一システイン残基に変換可能であるので、第２の付着部位の源であってもよい。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの免疫原性に影響を及ぼさない緩慢な還元条件が選択される。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用を阻害する目的である場合、自然のリガンドとの相互作用の部位に対して抗体が生成されるように、第２の付着部位が付加されることになる。したがって第２の付着部位の位置は、第２の付着部位またはこれを含有する任意のアミノ酸リンカーからの立体障害が回避されるように、選択されることになる。他の実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとが相互に作用する部位とは別の部位を対象とした抗体応答が望まれる。そのような実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用の部位に対する抗体の生成が妨げられるように、第２の付着部位を選択することができる。
【０１９９】
第２の付着部位の位置を選択する際のその他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補因子の存在、抗原の変性が自己抗原の機能または自己抗原を認識する抗体の生成に適合する抗原構造および配列内の部位を開示する実験的証拠の利用可能性が含まれる。
【０２００】
ほとんどの好ましい実施形態で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、コア粒子およびＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットとのそれぞれにある第１の付着部位と会合可能な単一の第２の付着部位または単一の反応性付着部位を含む。このため、少なくとも１つであるが典型的な場合は複数であり、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個を超える抗原とコア粒子およびＶＬＰそれぞれとの画定されかつ均一な結合および会合のそれぞれが確実になる。したがって、抗原上に単一の第２の付着部位または単一の反応性付着部位を設けることによって、単一および均一なタイプの結合および会合のそれぞれが確実になり、その結果、非常に高度に規則的で反復性のアレイが得られる。例えば、結合および会合のそれぞれが、リジン（第１の付着部位として）およびシステイン（第２の付着部位として）の相互作用を介して行われる場合、本発明のこの好ましい実施形態によれば、このシステイン残基が抗原上に天然のものとして存在するかまたは非天然のものとして存在するかに関わらず、抗原当たりただ１つのシステイン残基と、ＶＬＰおよびコア粒子の第１の付着部位との結合および会合のそれぞれが確実になる。
【０２０１】
いくつかの実施形態で、抗原上に第２の付着部位を設計製作することは、本発明の開示による第２の付着部位として適切なアミノ酸を含有するアミノ酸リンカーの融合を必要とする。したがって本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの共有結合によって、アミノ酸リンカーを抗原または抗原決定基に結合する。アミノ酸リンカーは、第２の付着部位を含み、あるいはこれからなることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、スルフィドリル基またはシステイン残基を含む。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーがシステインである。アミノ酸リンカーを選択するいくつかの基準、ならびに本発明によるアミノ酸リンカーのさらに好ましい実施形態については既に述べた。
【０２０２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ融合させる。上述のように、ＶＬＰは、典型的な場合、ＶＬＰに組織化する少なくとも１つのサブユニットからなる。したがって、本発明のさらに好ましい実施形態でも同様に、抗原または抗原決定基、好ましくは少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ウイルス様粒子またはＶＬＰに組込み可能なタンパク質の少なくとも１つのサブユニットに融合させて、キメラのＶＬＰサブユニットとＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を生成する。
【０２０３】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合は、ＶＬＰサブユニット配列への挿入によって行うことができ、あるいは、ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端あるいはＶＬＰに組込み可能なタンパク質との融合によって、行うことができる。以下、タンパク質またはペプチドとＶＬＰサブユニットとの融合を指す場合、サブユニット配列の両端への融合またはサブユニット配列内部へのペプチドの内部挿入が包含される。
【０２０４】
融合は、サブユニット配列の一部が欠失したＶＬＰサブユニットの変種にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を挿入することによって行ってもよく、これは切断型変異体とも呼ばれるものである。切断型変異体は、ＮまたはＣ末端を有し、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部に内部欠失を有する。例えば、アミノ酸残基７９〜８１の欠失を伴うような特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇは、内部欠失を有する切断型変異体である。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと、切断型変異体ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端との融合も、本発明の実施形態になる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合は、置換によって行ってもよく、例えば特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇでは、アミノ酸７９〜８１を外来のエピトープに代える。したがって以下に述べる融合は、ＶＬＰサブユニットの配列にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を挿入することによって、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部をＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列で置換することによって、あるいは欠失、置換、または挿入の組合せによって行うことができる。
【０２０５】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのキメラタンパク質またはペプチドのサブユニットは、一般に、ＶＬＰに自己組織化することが可能である。そのサブユニットに融合したエピトープを示すＶＬＰも、本明細書ではキメラＶＬＰと呼ぶ。示されるように、ウイルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含み、あるいはこれからなる。本発明の別の実施形態で、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわちそこに抗原が融合していないＶＬＰサブユニットとの混合物であり、いわゆるモザイク粒子と呼ばれる。これは、ＶＬＰの形成およびＶＬＰへの組織体を確実にするのに有利である。これらの実施形態で、キメラＶＬＰサブユニットの割合は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％、またはそれ以上でよい。
【０２０６】
ペプチドの配列の両端またはＶＬＰのサブユニットの配列の両端に融合されるエピトープには、フランキングアミノ酸残基を付加することができ、またはそのようなペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列に内部挿入することができる。グリシンおよびセリン残基は、融合するＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに付加されるフランキング配列に使用するのに特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基は追加の柔軟性をもたらし、それによって、外来の配列をＶＬＰサブユニットの配列に融合する際に不安定な影響が出る可能性を減じることができる。
【０２０７】
本発明の特定の実施形態で、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））またはいわゆる主免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）、ＷＯ  ０１／９８３３３）、本発明の好ましい実施形態である。ＭＩＲ内の欠失を伴う天然に生ずるＨＢｃＡｇの変種も記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）、その全体を参照により明確に援用する）、ＮまたはＣ末端への融合、ならびにｗｔＨＢｃＡｇと比較した場合の欠失部位に対応するＭＩＲの位置での挿入は、本発明の別の実施形態である。Ｃ末端への融合についても記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者なら、古典的な分子生物学的技法を使用して融合タンパク質をどのように構成すべきかという方向性を容易に見出すであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈｏ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、７７：５１（１９８９））。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用な、ベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実施する際に使用することができる。また本発明者等は、例として（実施例６）、キメラ自己組織化ＨＢｃＡｇをもたらすＨＢｃＡｇのＭＩＲへのエピトープの挿入についても述べている。自己組織体の効率およびＨＢｃＡｇのＭＩＲに挿入するエピトープのディスプレイを最適化するための重要なファクターは、挿入部位の選択、ならびに挿入によってＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ４２１’６３５；米国第６，２３１，８６４号）であり、言い換えればＨＢｃＡｇからのアミノ酸類を新しいエピトープで置換しなければならない。例えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１を、外来のエピトープで置換することが記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；米国第６，２３１，８６４号）。ＨＢｃＡｇは、カプシド組織体には重要ではなく核酸に結合可能な長いアルギニン末端部（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（��００１））を含有する（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン末端部を含みまたは含まないＨＢｃＡｇは、いずれも本発明の実施形態である。
【０２０８】
本発明のさらに好ましい実施形態で、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主なコートタンパク質は、細菌内、特にＥ．ｃｏｌｉ内での発現によって自発的にＶＬＰに組織化する。本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ  ＣＰを指すもの、および配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ  Ａ１タンパク質を指すもの）やバクテリオファージｆｒ（配列番号４；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）などのＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。
【０２０９】
より好ましい実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを、Ｑβコートタンパク質に融合させる。切断型のＱβのＡ１タンパク質のＣ末端にエピトープを融合させ、またはＡ１タンパク質内にエピトープを挿入した融合タンパク質構成体が、記述されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンで抑制することによって生成し、Ｎ末端メチオニンの切断を考慮した場合、その長さは３２９ａａまたは３２８ａａである。アラニン（Ｑβ  ＣＰ遺伝子によってコードされた第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は、通常Ｅ．ｃｏｌｉで起こり、Ｑβコートタンパク質ＣＰのＮ末端ではそれが起こる。ＵＧＡアンバーコドンのＡ１遺伝子３’の部分は、長さが１９５アミノ酸であるＣＰ伸長部をコードする。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを挿入することも、本発明の実施形態になる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端切断型のＱβ  Ａ１タンパク質のＣ末端で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを融合することも、本発明のさらに好ましい実施形態になる。例えばＫｏｚｌｏｖｓｋａ他は（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））、位置１９で切断されたＱβ  ＣＰ伸長部のＣ末端でエピトープが融合した、Ｑβ  Ａ１タンパク質融合について述べている。
【０２１０】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記述されるように、融合エピトープを示す粒子の組織体は、典型的な場合、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体と、ｗｔＣＰとの両方を存在させて、モザイク粒子を形成する必要がある。しかし、ウイルス様粒子、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰであって、そこに融合した少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを有するＶＬＰサブユニットのみからなるものを含む実施形態も、本発明の範囲内である。
【０２１１】
モザイク粒子の生成は、いくつかの方法で行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇ、３９：９〜１５（１９９６）は、２つの方法について述べており、これらはいずれも本発明を実施する際に使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上での融合エピトープの効率的な提示が、クローニングされたＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドを収容したＥ．ｃｏｌｉ株のＣＰとＣＰ伸長部との間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ  Ａ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって仲介され、ＵＧＡコドンがＴｒｐに翻訳される（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ  Ｂ．Ｋ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３４：３３〜４０（１９９３）））。別の手法では、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡに変更し、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製源は第１のプラスミドに適合するものである（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｋ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されているように、ＣＰと、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を、２シストロン的手法でコードし、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに動作可能に結合する。
【０２１２】
別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ｆｒ  ＣＰのアミノ酸２と３（切断ＣＰの付番、すなわちＮ末端メチオニンが切断される）の間に挿入し、したがってＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとｆｒ  ＣＰ融合タンパク質になる。ＶＬＰに自己組織化するｆｒ  ＣＰ融合タンパク質を構成し発現するためのベクターおよび発現系であって、本発明の実施に有用なものが、記載されている（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を、アミノ酸２の後の、ｆｒ  ＣＰの欠失変種、すなわちｆｒ  ＣＰの残基３および４が欠失している部分に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。
【０２１３】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ末端隆起βヘアピンへのエピトープの融合と、その後の、ＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上での融合エピトープの提示についても記述されており（ＷＯ９２／１３０８１）、ＭＳ−２  ＲＮＡファージのコートタンパク質への挿入または置換によるＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合も、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１４】
本発明の別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、パピローマウイルスのカプシドタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１に融合する。バキュロウイルス／昆虫細胞系内でＢＰＶ−１融合タンパク質を構成し発現させるためのベクターおよび発現系について、記述されている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１  Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６を、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドで置換することによって、ＢＰＶ−１  Ｌ１と、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質が得られるが、これは本発明の好ましい実施形態である。バキュロウイルスベクターでのクローニング、およびバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞での発現について記述されており、本発明を実施する際に使用することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの融合タンパク質またはペプチドを示す組織化粒子の精製は、ゲルろ過やショ糖勾配超遠心分離などのいくつかの方法で行うことができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。
【０２１５】
本発明の別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、Ｔｙ  ＶＬＰに組込み可能なＴｙタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ＴＹＡ遺伝子でコードしたｐ１またはカプシドタンパク質に融合する（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．、酵母（Ｙｅａｓｔ）、１６：７８５〜７９５（２０００））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３、および４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離し、一方、レトロトランスポゾンＴｆ１は、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂａｅ）から単離した（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．およびＳａｎｄｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｂ．、「Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、第１９３頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は、コピア種の植物および動物要素に関係し、一方Ｔｙ３は、植物および動物のレトロウイルスに関係するジプシー科のレトロトランスポゾンに属する。Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｇａｇまたはカプシドタンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質の長さが４４０アミノ酸である。Ｐ１は、位置４０８でのＶＬＰの成熟中に切断され、その結果、ＶＬＰの本質的な成分であるｐ２タンパク質が得られる。
【０２１６】
ｐ１との融合タンパク質と、酵母内で前記融合タンパク質を発現させるためのベクターが記述されている（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。したがって例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをｐ１に融合することができる（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。ｐＭＡ５６２０ベクターへの外来エピトープをコードする配列のクローニングによって、外来エピトープのＮ末端にＣ末端が融合したＴｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質が発現する。同様に、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドのＮ末端融合、あるいはｐ１配列への内部挿入、あるいはｐ１配列の一部の置換も、本発明の範囲内に含まれるものとする。特に、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０〜３１と、６７〜６８と、１１３〜１１４と、１３２〜１３３との間のＴｙ配列に、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを挿入することも（ＥＰ０６７７１１１）、本発明の好ましい実施形態になる。
【０２１７】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合に適する別のＶＬＰは、例えば、レトロウイルス様粒子（ＷＯ９６３０５２３）、ＨＩＶ２  Ｇａｇ（Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｃ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３５３〜３６４（１９９９））、ササゲモザイクウイルス（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３８７〜３９２（１９９９））、パルボウイルスＶＰ２  ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ，Ｐ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３：８９〜９９（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国第４，７２２，８４０号、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）である。
【０２１８】
本発明の実施に適するキメラＶＬＰの例として、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：１（１９９６）に記載されているものもある。本発明での使用が企図されるＶＬＰのその他の例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスのウイルス様粒子も作製され、これらＶＬＰのキメラＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
【０２１９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである。
【０２２０】
本発明のさらに好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基はＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの変種であり、例えばアミノ酸の置換、ペプチドの挿入、または多形性を含むものである。既に述べたように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの変種を含む組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、本発明の範囲に含まれる。
【０２２１】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、原核または真核発現系でＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンｃＤＮＡを発現させることによって生成することができる。これに関する様々な例が文献に記載されており、おそらくは変性後に使用して、任意の所望の種の任意のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを発現することができる。ＩＬ−５のタンパク質またはペプチドをどのように生成するかについてもＷＯ９００／６５０５８に開示されており、その関連事項も記載されている。
【０２２２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである。そのようなＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドまたはその断片は、標準的な分子生物学的技法を使用して生成することができ、すなわち問題となっている断片をコードするヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅し、ＧＳＴタグやＭＢＰタグ、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、または抗体の定常部（Ｆｃ領域）などのポリペプチドタグに、融合体としてクローニングする。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシン断片とタグとの間にプロテアーゼ切断部位を導入することによって、対応するプロテアーゼを用いた消化による精製の後、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドをタグから分離することができる。別の手法では、当業者に知られている標準的なペプチド合成反応を使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成することができる。別の手法では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの完全長タンパク質のプロテアーゼ消化または化学的切断によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドを生成することができるが、これらの方法はどちらも当業者に周知である。
【０２２３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基はさらに、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の付着部位からなる群から選択された少なくとも１つの第２の付着部位を含む。ウイルス様粒子との結合のためにＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをどのように変性させるかに関する指針は、本願全体を通して示されている。好ましい第２の付着部位は、誘導化ＶＬＰと結合するシステイン残基を含み、その例が、上記事項と実施例１２および１３に記載されている。
【０２２４】
本発明者等は、ＩＬ−５の３次元構造モデルの分析を行って、本発明によるＶＬＰ上の第１の付着部位に連結可能になるよう選択された第２の結着部（ＮＨ２末端）の接触可能性について決定した。Ｎ末端は、追加のシステイン残基と共にアミノ酸リンカーを含む第２の付着部位を結着するのに好ましい。しかし、第２の付着部位としてシステイン残基を含有し、ＩＬ−５構成体のＣ末端で融合するアミノ酸リンカーも、本発明のさらに好ましい実施形態になる。システイン残基融合Ｌを含有するＮ末端アミノ酸リンカーを持つヒトＩＬ−５構成体は、本発明の非常に好ましい実施形態である。
【０２２５】
当業者なら、同様の手順を使用して、ＶＬＰの第１の付着部位との連結が最適化されるように、ＩＬ−１３およびエオタキシン上の付着部位の接触可能性をモデル化することができる。
【０２２６】
マウスＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド構成体が開示されており、好ましいヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド断片構成体も生成することができる。さらに好ましい構成体は、すべてのヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンタンパク質、ヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである。好ましくはＶＬＰに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを含む本発明の組成物を使用した、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対する免疫化は、好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を治療しまたは予防する方法を提供することができる。
【０２２７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質の少なくとも１つの抗原部位を含む。当業者なら、対応するペプチドおよびアミノ酸配列のそれぞれをどのように識別するか理解している。
【０２２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、モノクローナル抗体を中和することによって定められるような（Ｄｉｃｋａｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（３）：１０３０〜７  １９９６）、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの非隣接または隣接ペプチドが含まれる。
【０２２９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、レセプターの相互作用に関与しかつＩＬ−５のＣＯＯ−末端からなどのレセプターとの相互作用に重要であることが予想される、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの非隣接または隣接ペプチドが含まれる。
【０２３０】
本発明での使用に適するその他のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、Ｔ細胞または抗体応答を誘発するその固有の性質によって実験的に決定することができる。これは一般に、免疫学的に適切な製剤において選択されたペプチドで個別に実験動物を免疫化し、当業者に知られている方法を使用してＴ細胞およびＢ細胞、すなわち抗体応答を測定することによって実現される。抗原がタンパク質またはペプチドである場合、この領域は、連続アミノ酸配列によって形成することができる。あるいは、不連続アミノ酸配列によって抗体エピトープを形成することができ、その場合、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの３次元折畳みの後、空間的に互いに近付いてエピトープを形成するような状態で、アミノ酸が配列する。問題となっている連続ペプチド断片は、上述の免疫化実験によって識別することができる。
【０２３１】
本発明での使用に適するさらに好ましいＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、既存のまたは将来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して識別することができ、これに関する手順は当業者に知られている。
【０２３２】
本発明での使用に適するその他のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに特異的な抗体で、ファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって識別することができ、これは当業者に周知の方法である。
【０２３３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基は、任意の動物から単離したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質、ならびに任意の動物の、任意のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの抗原ペプチドである。当業者なら、これらの単離されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドからどのようにペプチドを生成するかを理解している。
【０２３４】
本発明の別の好ましい実施形態では、抗原決定基がインターロインキン１３（ＩＬ−１３）である。ＩＬ−１３は、活性化Ｔリンパ球によって分泌され、単球、マクロファージ、およびＢ細胞に影響を及ぼすサイトカインである。前駆体ヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列を配列番号２３０で示し、プロセッシングされたヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列を配列番号２３１で示す。前駆体タンパク質の最初の２０のアミノ酸はシグナルペプチドに対応し、プロセッシングされたタンパク質は存在しない。マウス配列も記載されており、プロセッシングされたアミノ酸配列を配列番号２３２に示す（Ｂｒｏｗｎ  Ｋ．Ｄ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６７９〜６８７（１９８９））。発現宿主に応じて、ＩＬ−１３構成体は、例えば真核宿主での発現および分泌では前駆体タンパク質の配列を含むことになり、あるいは例えばＥ．ｃｏｌｉでの細胞質発現では、成熟タンパク質からなる。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現では、ＩＬ−１３のシグナルペプチドを細菌シグナルペプチドに代える。
【０２３５】
ＩＬ−１３は、最近になってアレルギー性気道応答（喘息）に結び付けられたＴヘルパー２由来サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５など）である。ＩＬ−１３およびＩＬ−１３レセプターのアップレギュレーションは、多くの腫瘍型（例えばホジキンリンパ腫）に見出されている。インターロイキン１３は、ホジキン細胞およびリード−ステンベルグ細胞の増殖によって分泌され、これらの細胞の増殖を刺激する（Ｋａｐｐ  Ｕ他、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８９：１９３９〜４６（１９９９））。したがってＩＬ−１３に対する免疫化は、とりわけ喘息やホジキンリンパ腫などの上述の状態を治療する方法を提供する。
【０２３６】
組成物は、遊離システイン残基を含有して成熟ＩＬ−１３配列のＮまたはＣ末端に融合するアミノ酸リンカーを含み、それによってタンパク質内に第２の付着部位を導入することが好ましい。さらに好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーは、ＩＬ−１３のＮＭＲ構造により自由に接触可能であるので、成熟形態のＩＬ−１３のＮ末端に付加する（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ，Ｅ．Ｚ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：２３１（２００１））。さらに好ましい実施形態でも、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーを、プロセッシング済みのタンパク質の配列に対応する配列のＮ末端に融合し、またはシグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端で挿入する。さらに好ましい実施形態では、遊離システイン残基を含有するアミノ酸リンカーを、タンパク質のＣ末端に付加する。
【０２３７】
ＩＬ−１３は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させることができ（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ  Ｅ．Ｚ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０：１８６〜９５（２０００））、またはＮＳ−０細胞（真核細胞系）で発現させることができる（Ｃａｎｎｏｎ−Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｓ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：２３９〜４８（１９９８））。実施例８は、細菌内での、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーに融合したマウスＩＬ−１３−Ｆの、クローニンング、構成体の発現、および精製について示している。また、エオタキシン−ＶＬＰワクチンの生成および試験についても述べている。ヒトＩＬ−１３構成体は、実施例８の教示により生成することができ、融合タンパク質の発現と、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼのそれぞれによる切断の後に、タンパク質であるヒトＣ−ＩＬ−１３（配列番号３３０）およびヒトＣ−ＩＬ−１３−Ｓ（配列番号３３１）が得られる。このように生成されたタンパク質は、ＶＰＬおよび線毛に連結することができ、本発明の好ましい実施形態が得られる。
【０２３８】
本発明のさらに別の実施形態では、抗原決定基がインターロイキン５（ＩＬ−５）である。ＩＬ−５は、好酸球形成に関する系統特異的サイトカインであり、喘息などの、好酸球数の増加に関連する疾患において重要な役割を果たす。前駆体およびプロセッシング済みのヒトＩＬ−５の配列を、配列番号２３３および配列番号２３４にそれぞれ示し、プロセッシングされたマウスアミノ酸配列を配列番号２３５で示す。
【０２３９】
ＩＬ−５の生物学的機能は、いくつかの研究で示されており（Ｃｏｆｆｍａｎ  Ｒ．Ｌ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５：３０８〜１０（１９８９）；Ｋｏｐｆ他、免疫性（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）４：１５〜２４（１９９６））、これらは、好酸球により媒介される疾患において、ＩＬ−５の機能を阻害するという有益な作用を示している。したがってＩＬ−５の動作の阻害は、喘息および好酸球に関連するその他の疾患に対する治療法を提供する。
【０２４０】
ＩＬ−５は、ジスルフィド架橋によって共有結合するダイマーを形成する。ＩＬ−５の２つのモノマーがペプチドリンカーによって結合される１本鎖（ｓｃ）構成体が報告されている。
【０２４１】
本発明の好ましい実施形態で、遊離システインを含有するペプチドリンカーは、プロセッシング済み形態のＩＬ−５の配列のＮ末端に付加される。遊離システインを含有するリンカーの付加は、好ましくはプロセッシング済み形態のｓｃＩＬ−５の配列のＮ末端でなされることも考えられる。さらに好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーが、プロセッシング済みタンパク質の配列に対応した配列のＮ末端に融合され、シグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端に挿入される。
【０２４２】
さらに好ましい実施形態でも、遊離システインを含有するリンカーが、ＩＬ−５の配列のＣ末端に融合し、またはｓｃＩＬ−５配列のＣ末端に融合する。
【０２４３】
ＩＬ−５に関するいくつかの発現系が記載されており、本発明の組成物の調製に使用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉを使用する細菌発現系が、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他により述べられている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７０：３５７〜６１（１９９０））。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質内でＩＬ−５が発現する場合、ＩＬ−５構成体にはシグナルペプチドが欠けている。本発明の組成物を作成するためにＩＬ−５構成体を生成する際、昆虫細胞を使用してもよい（Ｐｉｅｒｒｏｔ  Ｃ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５３：７５６〜６０（１９９８））。同様に、バキュロウイルス発現系（ｓｆ９細胞；Ｉｎｇｌｅｙ  Ｅ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：６２３〜９（１９９１）、およびＢｒｏｗｎ  Ｐ．Ｍ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：６３〜７１（１９９５））を使用することもできる。最後に、哺乳動物発現系も報告されており（ＣＨＯ細胞）、本発明のこれらの組成物を調製するのに使用することができる（Ｋｏｄａｍａ  Ｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）１１０：６９３〜７０１（１９９１））。
【０２４４】
バキュロウイルス発現系（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：３３２Ｓ（１９９３）；Ｋｕｎｉｍｏｔｏ  ＤＹ他、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）３：２２４〜３０（１９９１））およびＣＨＯ細胞を使用する哺乳動物細胞発現系（Ｋｏｄａｍａ  Ｓ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：４１９〜２７（１９９２））も、マウスＩＬ−５に関するものが記載されている。
【０２４５】
実施例７および１０は、ＶＬＰおよび線毛と連結するためのシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーに対してＩＬ−５配列がそのＮ末端で融合しているマウスＩＬ−５構成体の、実験的喘息のマウスモデルにおける、発現、精製、ＶＬＰとの連結、免疫化、及び試験について述べている。ヒト構成体は、実施例７および１０の教示により生成することができ、ＶＬＰおよび線毛との連結に適したタンパク質であるヒトＣ−ＩＬ−５−Ｅ（配列番号３３５）、ヒトＣ−ＩＬ−５−Ｆ（配列番号３３６）、およびヒトＣ−ＩＬ−５−Ｓ（配列番号３３７）が得られ、本発明の好ましい実施形態になる。
【０２４６】
別の特定の実施形態では、抗原決定基はエオタキシンである。エオタキシンは、好酸球、好塩基球、およびＴｈ２細胞上に存在する、ケモカインレセプター３に特異的なケモカインである。しかしエオタキシンは、好酸球に非常に特異的であるようにみえる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。好酸球の遊走は、エオタキシン１ノックアウトマウスで７０％低下するが、依然として好酸球が発生する可能性がある（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７８５〜９０（１９９７））。ＩＬ−５は、骨髄から血液に好酸球が遊走する原因であり、エオタキシンは、組織内での局所的遊走の原因であるようにみえる（Ｈｕｍｂｌｅｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６０１〜１２（１９９７））。
【０２４７】
したがって好ましい実施形態では、本発明の組成物は、第２の付着部位としてシステイン残基を含有し、かつ好ましくはエオタキシン配列のＣ末端に融合するアミノ酸リンカーを含む。その他の好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーは、プロセッシングされたタンパク質の配列に対応した配列のＮ末端に融合し、またはシグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端に挿入される。これらの特定の構成体をコードする遺伝子は、適切な発現ベクターでクローニングする。
【０２４８】
実施例９および１１は、マウスエオタキシン構成体のクローニングおよび発現について述べており、この場合エオタキシン配列は、そのＣ末端が、ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するアミノ酸残基に融合している。ヒト構成体は、実施例９の教示により生成することができ、ＶＬＰおよび線毛との連結に適したタンパク質が得られ、本発明の好ましい実施形態になる。エオタキシンは、化学的に合成することができる（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３０：３１２８〜３１３５（１９９１））。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現も、細胞質でのエオタキシン１に関して記載されている（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。封入体としてのＥ．ｃｏｌｉでの発現とその後の折畳み（Ｍａｙｅｒ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３９：８３８２〜９５（２０００））、および昆虫細胞の発現（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１〜６（１９９７））が、エオタキシン２に関して述べられており、さらにこれを使用して、本発明の特定の実施形態とすることができる。
【０２４９】
当業者なら、本明細書に記載する方法および適用例に対するその他の適切な変更例および適応例が、容易に明らかになり、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく変更を加えかつ適応可能であることが理解されよう。本発明について詳細に述べてきたが、本発明は、本発明の単なる例示を目的とするものであり本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されよう。
【実施例１】
【０２５０】
変異Ｑβコートタンパク質の構成体および発現、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰまたはカプシドの精製
プラスミドの構成体および変異コートタンパク質のクローニング
ｐＱβ―２４０の構成体
プラスミドｐＱβ１０（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，ＴＭ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜１３７）を、ｐＱβ−２４０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１３→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣ−３’、および
５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣ−３’
に設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
【０２５１】
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２３）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
【０２５２】
ｐＱβ−２４３の構成体：
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２４３の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ａｓｎ１０→Ｌｙｓを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
【０２５３】
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４３を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳＤ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２４）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＫＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
【０２５４】
ｐＱβ−２５０の構成体：
プラスミドｐＱβ２４０を、ｐＱβ−２５０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。変異ＰＣＲ断片を合成するために、上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
【０２５５】
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２５）：
ＡＲＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
【０２５６】
ｐＱβ−２５１の構成体
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２５１の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１６→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
【０２５７】
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５１を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。この構成体でコードされた、得られたアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。
【０２５８】
ｐＱβ−２５９の構成体
プラスミドｐＱβ−２５１を、ｐＱβ−２５９の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を、変異ＰＣＲ断片の合成に使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
【０２５９】
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５９を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２７）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
【０２６０】
ＱβおよびＱβ変異体を発現し精製するための一般的手順
発現
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地５ｍｌを、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換したクローンと共にインキュベートした。接種培養物を、振盪せずに、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された接種材料を、引き続き２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する新鮮なＬＢ培地１００〜３００ｍｌに入れて１：１００に希釈し、振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。得られた第２の接種材料を、フラスコ内で、１％カザミノ酸および０．２％グルコースを含有するＭ９培地に入れ、１：５０に希釈し、これを振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。
【０２６１】
精製
精製手順用の溶液および緩衝液
１．Ｌｙｓｉｓ緩衝液ＬＢ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０
５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．１％、トリトンＸ１００、および新たに調製したＰＭＳＦを、濃度ｍｌ当たり５マイクログラム含む。
リゾチームおよびＤＮＡｓｅなし。
２．ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
３．緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８
５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
４．ＰＥＧ
ポリエチレングリコール６０００の４０％（ｗ／ｖ）ＮＥＴ溶液。
【０２６２】
破壊および溶解
凍結細胞を、ＬＢに２ｍｌ／ｇ細胞で再懸濁した。溶液を氷上で冷却するために１分の間隔を空けて、混合物を１５分間２２ｋＨで５回超音波処理した。次いでＪａｎｅｃｋｉ  Ｋ６０ローターを使用して、溶解産物を１時間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。下記の遠心分離工程は、他に特に示さない限り、すべて同じローターを使用して行った。上清を４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢで２回洗浄した。遠心分離後、溶解産物の上清と洗浄画分を溜めた。
【０２６３】
分画
飽和硫酸アンモニウム溶液を１滴ずつ、撹拌しながら、上述の溜めた溶解産物に添加した。ＳＡＳの体積を、全体積の５分の１になるように調節して、飽和度が２０％になるようにした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離した。得られた上清を溜め、ＳＡＳを１滴ずつ添加して、飽和度４０％にした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液に溶解した。
【０２６４】
クロマトグラフィー
ＮＥＴ緩衝液に再度溶解したカプシドまたはＶＬＰタンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。クロマトグラフィー中、３つのピークが溶出された。最初の１つは主に、膜および膜断片を含有し、回収しなかった。カプシドは２番目のピークに含有され、３番目のピークはその他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質を含有していた。
【０２６５】
ピーク画分を溜め、ＮａＣｌ濃度を調節して、その最終濃度を０．６５Ｍにした。溜めたピーク画分の２分の１に相当する体積のＰＥＧ溶液を、撹拌しながら１滴ずつ添加した。溶液を、撹拌せずに一晩放置した。１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、カプシドタンパク質を沈降させた。次いでこれを、最小体積のＮＥＴに溶解し、再びセファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。ピーク画分を溜め、飽和度６０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離してＮＥＴ緩衝液に再度溶解した後、カプシドタンパク質をセファロースＣＬ−６Ｂカラムに導入して、再びクロマトグラフィーを行った。
【０２６６】
透析および乾燥
上記得られたピーク画分を溜め、滅菌水に対して広範にわたり透析し、凍結乾燥して貯蔵した。
【０２６７】
発現および精製  Ｑβ−２４０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ  １０９、プラスミドｐＱβ−２４０で形質転換された）をＬＢに再懸濁し、１５分間、５回超音波処理し、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上清を、さらにプロセッシングされるまで４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢ  ９ｍｌで２回洗浄し、最後に、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素９ｍｌで洗浄した。すべての上清を溜め、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。溜めたピーク画分を、硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離した。次いで再溶解したタンパク質をセファロース２Ｂカラムでさらに精製し、最後にセファロース６Ｂカラムで精製した。最後にカプシドのピークを、水に対して広範にわたり透析し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質とカプシドとの組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
【０２６８】
発現および精製  Ｑβ−２４３
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１）をＬＢに再懸濁し、一般的手順で述べたように処理した。セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、タンパク質を、連続した２回のゲルろ過工程により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製した。ピーク画分を溜め、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
【０２６９】
発現および精製  Ｑβ−２５０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５０で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、上述のように処理した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムでゲルろ過により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
【０２７０】
発現および精製  Ｑβ−２５９
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５９で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、超音波処理した。細胞破壊片をＬＢ  １０ｍｌで１回洗浄し、２回目は、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素１０ｍｌで洗浄した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、２回のゲルろ過クロマトグラフィー工程により精製した。タンパク質を、上述のように透析し凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
【実施例２】
【０２７１】
リジン残基を含有するペプチドの、ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）ｃ／ｅ１エピトープへの挿入
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面の先端領域に位置付けた。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構成体）で遺伝的に置き換えた。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有するが、これは、ＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。
【０２７２】
配列番号７８で示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ  ＤＮＡを、ＰＣＲで生成した。ＨＢｃＡｇ断片（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）をコードする２つの断片をＰＣＲにより別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用されるプライマーも、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）断片は、プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、２つのＰＣＲ生成物の両端で相補的ＤＮＡ配列を導入し、したがって２つのＰＣＲ生成物の融合が後続の組織体ＰＣＲで可能になった。組織化された断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０２７３】
ＰＣＲでは、各オリゴ１００ｐｍｏｌと鋳型ＤＮＡ  ５０ｎｇを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４の５０ｍｌ反応混合物中で使用した。両方の反応で、温度サイクルは以下のように実施した：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクル。
プライマー配列：
ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）：
（５’−ＣＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ−３’）；
ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）：
（５’−ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧ−３’）
【０２７４】
ＰＣＲによる２つのＰＣＲ断片の融合では、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）１００ｐｍｏｌを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する５０ｍｌ反応混合物に溶かした２つの精製済みＰＣＲ断片１００ｎｇと共に使用した。ＰＣＲサイクル条件は：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクルであった。組織化したＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液に入れて１９時間消化した。消化されたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターにライゲートして、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ生成物のベクターへの挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析および挿入物のＤＮＡ配列決定によって分析した。
【実施例３】
【０２７５】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ８０２またはＪＭ１０９を、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。一晩培養した細菌１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピリシンＬＢ培地１００ｍｌに接種した。この培養物を、６００ｎｍでＯＤが約０．８に達するまで、３７度で４時間成長増殖させた。ＩＰＴＧを添加することにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘発を行って、最終濃度を１ｍＭにした。誘発後、細菌をさらに、３７℃で４時間振盪した。細菌を、５０００×ｇで１５分間遠心分離することにより収集した。ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを解凍し、２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）が補われた細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を室温で３０分間インキュベートし、超音波によって破壊した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたは対照プラスミドを収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、ＩＰＴＧでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現を誘発させた。ＩＰＴＧを添加する前に、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを持つ細菌培養物と、対照プラスミドを持つ培養物からサンプルを取り出した。ＩＰＴＧを添加してから４時間後、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含有する培養物と対照培養物からサンプルを再び取り出した。タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした後、クーマシー染色を行った。
【０２７６】
次いで不溶性細胞破壊片を除去するため、溶解産物を、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、米国から購入）を使用して、上清とペレットをウェスタンブロット法によって分析したが、かなりの量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることが示された。簡単に、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現するＥ．ｃｏｌｉと対照細胞からの溶解産物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）とペレット（＝不溶性画分）を分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等体積にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でウェスタンブロット法を行った。
【０２７７】
４ｍｌの６５％ショ糖溶液上に３ｍｌの１５％ショ糖溶液があり、その次に細菌溶解産物４ｍｌがある、ショ糖ステップ勾配を使用したステップ勾配遠心分離に、清浄にした細胞溶解産物を使用した。サンプルを、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、勾配最上部から１ｍｌ画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、クーマシー染色を行った。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質は、クーマシー染色によって検出した。
【０２７８】
１５％と６５％のショ糖の間ではＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が濃縮され、カプシド粒子を形成することが示された。細菌タンパク質のほとんどは、ショ糖を含まない勾配上層で維持され、したがってＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子のステップ勾配遠心分離により、粒子が濃縮されかつ部分的に精製された。
【０２７９】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの大規模な発現および精製は、以下のように行った。１００ｍｌ  ＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンに単コロニーを接種し、培養物を３７℃で一晩増殖させることによって、一晩培養物を調製した。翌日、予備培養物２５ｍｌを、８００ｍｌのＬＢアンピシリン培地で希釈し、その培養物を増殖させて光学密度ＯＤ６００を０．６〜０．８にした。次いで１ｍＭのＩＰＴＧで培養を誘発させ、さらに４時間増殖させた。細胞を、本質的に上述のように収集し溶解した。
【０２８０】
次いでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを、まず清浄にした細胞溶解産物から硫酸アンモニウム（３０％飽和）でタンパク質を沈殿させ、次いで再溶解したペレットをゲルろ過カラム（セファクリルＳ−４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入することによって、精製した。溜まった画分を硫酸アンモニウムで再び沈殿させ、ペレットを再溶解して同じゲルろ過カラムに２回目の導入を行った。最後に、画分を溜め、濃縮し、その濃度をブラッドフォード試験を使用して評価した（ＢｉｏＲａｄ）。
【実施例４】
【０２８１】
遊離システイン残基に欠けており挿入したリジン残基を含有する、ＨＢｃＡｇの構成体
配列番号７７の４８および１０７に対応する位置でシステイン残基に欠けておりかつ挿入されたリジン残基を含有する、本明細書ではＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔと呼ぶ肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、以下の方法を使用して構成した。
【０２８２】
以下のＰＣＲプライマーの組合せを用い、実施例２で述べたように調製したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ遺伝子の３つの断片を最初に別々に増幅することによって、２つの変異体を導入した。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ遺伝子を調製した。
【０２８３】
簡単に言うと、下記のプライマーを使用して断片１を調製した。
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
プライマー２：４８ａｓ
ＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣ
【０２８４】
以下のプライマーを使用して、断片２を調製した。
プライマー３：４８ｓ
ＧＳＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣ
プライマー４：１０７ａｓ
ＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＣ
【０２８５】
以下のプライマーを使用して断片３を調製した。
プライマー５：ＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧ
プライマー６：１０７ｓ
ＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧ
【０２８６】
次いで断片１および２をＰＣＲプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）および１０７ａｓと組み合わせて、断片４を得た。次いで断片４および断片３をプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓと組み合わせて、完全長の遺伝子を生成した。次いで完全長の遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化してｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの発現および精製は、実施例３で述べたように行った。
【実施例５】
【０２８７】
ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓの構成体
実施例２で述べたように、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）１−１８５を変性させた。ｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙで遺伝的に置き換えた（ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ構成体）。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有し、これをＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ遺伝子を調製した。
【０２８８】
実施例２で述べたように、ｐＥｃｏ６３からのＨＢｃＡｇ遺伝子の２つ別個の断片を増幅し、その後これら２つの断片をＰＣＲにより融合してＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を挿入し、それによって完全長の遺伝子を組織化した。以下のＰＣＲプライマーの組合せを使用した。
【０２８９】
断片１：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）（実施例２参照）
断片２：
プライマー３：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー４：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩＩ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ
組織体：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩＩ
【０２９０】
次いで組織化した完全長遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化し、ｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。
【実施例６】
【０２９１】
ＨｂｃＡｇのＭＩＲ領域でのペプチドエピトープの融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９よび８０を、配列ＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧのエピトープＣεＨ３で置換した。ＣεＨ３配列は、ヒトＩｇＥのＨ鎖の第３定常ドメインの配列から得られる。組織体ＰＣＲ法を使用して、エピトープをＨＢｃＡｇ１−１８５配列に挿入した。最初のＰＣＲ工程では、ＡＴＣＣクローンｐＥｃｏ６３由来のＨＢｃＡｇ１−１８５遺伝子であってプライマーＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＥｃｏＲＩ  ｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ｒｅｖで増幅したものを、２つの個別の反応で鋳型として使用して、ＣεＨ３配列をコードする配列要素を含有した２つの断片を増幅した。次いでこれら２つの断片を、第２のＰＣＲ工程で、組織体ＰＣＲ反応により組織化した。
【０２９２】
第１のＰＣＲ工程でのプライマーの組合せ：ＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ｒｅｖを持つＣεＨ３ｆｗｄ、およびＣεＨ３ｒｅｖを持つＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＥｃｏＲＩ  ｆｗｄ。組織体ＰＣＲ反応では、まず第１のＰＣＲ工程で単離した２つの断片を、３回のＰＣＲサイクル中は外部プライマーなしで組織化し、その後、次の２５回のサイクルでは外部プライマーを反応混合物に添加した。外部プライマー：ＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＥｃｏＲＩ  ｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ｒｅｖ。
【０２９３】
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のため、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、ＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３．３にクローニングした（実施例２参照）。キメラＶＬＰをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、実施例２で述べたように精製した。ＨＢｃＡｇ１−１８５−ＣεＨ３がゲルろ過から溶出した溶出体積は、融合タンパク質とキメラＶＬＰとの組織体を示していた。
プライマー配列：
ＣεＨ３ｆｗｄ：
５’ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ３’
Ｖ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｗ  Ｓ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ａ８０  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｌ  Ｖ  Ｖ８６
ＣεＨ３ｒｅｖ：
５’ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ３’
Ｄ７８  Ｅ  Ｌ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｖ７２
ＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＥｃｏＲＩ  ｆｗｄ：
５’ＣＣＧｇａａｔｔｃＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
ＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ：
５’ＣＧＣＧＴＣＣＣａａｇｃｔｔＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ
【実施例７】
【０２９４】
システイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたＩＬ−５のクローニング、発現、および精製。好酸球成分によるアレルギー性喘息の実験モデルにおける、ＶＬＰとの連結、免疫化、および効能の実証
Ａ．マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５のクローニングおよび、Ｅ．ｃｏｌｉでの封入体としての発現
以下の２つのプライマーを使用して、ＰＣＲによりＡＴＣＣクローン（ｐｍＩＬ５−４Ｇ；ＡＴＣＣ番号：３７５６２）からＩＬ−５を増幅した：Ｓｐｅｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ１（配列番号３４０）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒ（配列番号３４２）。このＰＣＲの産物を、プライマーＳｐｅＮｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ２（配列番号３４１）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒを用いた第２のＰＣＲでの鋳型として使用した。挿入物を、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。この挿入物を、事前にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＥＴベクター誘導体（ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクター）にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＯＤＥＣ３−８にＩＬ５をクローニングすることによって生成された構成体は、そのＮ末端から、ヘキサヒスチジンタグ（精製を促進させる）、エンテロキナーゼ切断部位、システイン残基を含有するγ３誘導アミノ酸リンカー（Ｎ末端がアミノ酸ＡＬＶに、Ｃ末端がＡＳに隣接する）、および成熟形態のＩＬ−５タンパク質をコードするＤＮＡを含む。クローニング手順の中実度を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２９５】
上記ＩＬ−５を含有する構成体を、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５．２とし（ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５とも呼ぶ）、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１−ＤＥ３に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えタンパク質を、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と呼ぶ。
【０２９６】
ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を収容するクローンＢＬ２１−ＤＥ３細胞を、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ  ５ｍｌ中で一晩増殖させた。この培養物の一定量２．０ｍｌを、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌの富栄養培地（ＴＢ）で希釈した。培養物を、光学密度ＯＤ６００ｎｍで０．７〜１．０になるまで増殖させ、１．０Ｍのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）保存液を０．１ｍｌ添加することにより、４時間にわたり発現を誘導した。組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を不溶形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に位置付けた．Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の発現は、以下のように確認した。誘導後４時間経てから培養サンプル１０ｍｌを取り、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００（ｐＨ８．０）からなる０．５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。この懸濁液に、リゾチーム（４０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加し、４℃で３０分間経た後、２分間超音波処理した。ベンゾナーゼの一定量１．０ｍｌと、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の一定量１００μｌとを添加し、室温で３０分間インキュベートした。１３０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットをＳＤＳ導入緩衝液１００μｌ中で、９８℃で５分間加熱した。次いで一定量１０μｌを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、ＩＬ−５の質量に対応する１７ｋＤａのタンパク質のバンドが示された。対照として、ＩＰＴＧが存在しない状態でｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を含有するＢＬ２１−ＤＥ２細胞を増殖させ、上述のように不溶性細胞画分から抽出物を調製した。
【０２９７】
Ｂ．マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の精製および折畳み
ワクチン生成に十分な量の純粋なＩＬ−５を得るために、ＢＬ２１−ＤＥ３細胞でクローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５からＩＬ−５を大規模に発現させた。培養物を一晩増殖させ、１．０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する体積１００ｍｌまたは１ＬのＴＢ培地で希釈した。合計３リットルの培養物をこのように調製し、ＯＤ６００ｎｍが０．７になるまで３７℃で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを添加することにより、最終濃度１．０ｍＭを得た。４時間のインキュベーションの後、１００００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞を収集した。ペレットを収集した後、ＰＢＳ（５．０ｍｌ／ｇ湿潤重量）に再懸濁し、１００００×ｇで１５分間遠心分離した。洗浄したペレットを、次に使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【０２９８】
細菌ペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用してＰＢＳ（２．０ｍｌ／ｇ細胞  湿潤重量）に再懸濁した。この懸濁液にリゾチーム（０．８ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。懸濁液を、氷上で１分間、３回にわたり超音波処理し、次いでベンゾナーゼおよびＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）を添加して、室温で３０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００を添加して最終濃度１％（ｗ／ｖ）にし、その混合物を、３０分間室温で静かに撹拌した。溶液を、２００００×ｇで２０分間遠心分離し（ＳＳ３４チューブ）、上清を捨てた。封入体を収容したペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して洗浄緩衝液（２Ｍ尿素および１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）に懸濁し（５．０ｍｌ／ｇ湿潤重量）、５分間撹拌した。溶液を２００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを洗浄し、上述のようにさらに２回遠心分離した。トリトンＸ−１００が存在しない状態で、洗浄緩衝液で封入体の最後の洗浄を行った。
【０２９９】
ペレットの封入体中に存在するＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を、変性緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６．０Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ８．０）に溶解し（５．０ｍｌ／ｇ細胞  湿潤重量）、２５℃で１時間、静かに撹拌した。懸濁液を２００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合した（ＱＩＡｇｅｎ、可溶化緩衝液と平衡）。４℃で３時間、静かに撹拌した後、スラリーをガラスカラム（Ｃ１０／１０）に注ぎ、樹脂を、１００ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ６．３）で洗浄した。さらに１５ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ５．９）を用いて洗浄工程を実行した。マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、２０ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ４．５）を加えることによって樹脂から溶出した。精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３００】
Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を含有する溶出工程からの画分を溜め、１０ｋＤａのカットオフ膜を使用して、８．０Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液に対して４℃で透析した。透析の後、以下の式を使用して、タンパク質濃度を分光測光により決定した：タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×Ａ２８０ｎｍ）−（０．７６×Ａ２６０ｎｍ）。タンパク質の濃度を、透析緩衝液で希釈して０．２ｍｇ／ｍｌにした。次いで溶液を、２．０Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）を含むリフォールディング緩衝液１に対し、３．５ｋＤａ膜で２４時間にわたり４℃で透析し、さらに５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）を含む別のリフォールディング緩衝液２に対して２４時間透析した。最後にタンパク質をＰＢＳ  ｐＨ８．０に対して４℃で２４時間透析し、次いで３０分間１００００×ｇで遠心分離した。上清のタンパク質含量を、ブラッドフォードアッセイにより評価した。
【０３０１】
Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５をさらに精製するために、Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いた陰イオン交換を行った。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、遠心分離フィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａカットオフ）を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．４に対して１４時間透析した。溶液をＨｉｔｒａｐ  Ｑカラムに導入し、５０ｍＭリン酸ｐＨ８．４緩衝液で洗浄した。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を加えることによって、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５をカラムから溶出した。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、１００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムから溶出した。精製の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、濃度をブラッドフォードアッセイで測定した。タンパク質の４次構造を、非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０３０２】
Ｃ．ワクチン生成：Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のＱβへの連結
様々な条件を調査して、連結反応の効率を最適化した。この手法には、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５への還元剤（ＴＣＥＰ）の添加、連結反応におけるＱβモノマーとＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のモル比の変化が含まれ、これを表１にまとめる。効能を調査するためのワクチンは、以下の方法で生成した。精製したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５（４０μＭ）を、ｐＨ８．０のＰＢＳに溶かした等モル量のＴＣＥＰで１時間還元した。還元したＩＬ−５（８０μＭ）を、全体積が７００μｌのＳＭＰＨで誘導化した４０μＭ  Ｑβと共に、２２℃で４時間インキュベートした。反応生成物を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してｐＨ８．０のＰＢＳに対して１２時間透析した。連結反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗Ｈｉｓおよび抗Ｑβ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。タンパク質濃度をブラッドフォードで測定した。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析によって、連結効率［すなわちモルＱβ−ＩＬ５／モルＱβモノマー（合計）］を評価した。
【０３０３】
0004533626.tif 000002
【０３０４】
Ｄ．ワクチンを評価するためのＥＬＩＳＡ
マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のＱβへの連結は、図４に示す「４重」ＥＬＩＳＡを使用して評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり１ｍｇ／Ｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ  １００ｕｌで一晩被覆した。プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、次いでＰＢＳＴに溶かした２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウサギからのポリクローナル抗Ｑβ血清（１：５０００に希釈）を添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、様々な量のＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５または対照を添加し（図５）、２５℃で１時間インキュベートした。２つの異なる３次抗体をアッセイに使用した。すなわちラット抗マウスＩＬ５（ＴＲＦＫ４）またはラット抗マウスＩＬ５（ＴＲＦＫ５）であり、いずれも中和モノクローナル抗体である。すべては濃度１μｇ／ｍｌで使用した。検出抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合され、これは３次抗体の特定のＦｃ断片に特異的であった。サンドイッチアッセイでの結合は、化学発光法（ＥＣＬ）により４５０ｎｍで測定した。
【０３０５】
Ｆ．ＩＬ−５活性のアッセイ
マウスＩＬ−５に応答してＢ細胞リンパ腫系ＢＣＬ１が増殖する能力を用いて、リフォールディング組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５の生物活性をチェックした（Ｈａｒｒｉｍａｎ  Ｇ．Ｒ．（１９９１）免疫学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６．５．１〜６．５．５、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）。Ｑβに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の増殖活性についても評価した。対照として組換えマウスＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用した。様々な形態の組換えＩＬ−５を、ウェル当たり２×１０４ＢＣＬ１細胞を有する平底９６ウェルプレートでインキュベートし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。３Ｈチミジン１μＣｉ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ、スイス）を各ウェルに添加し、このプレートをさらに６時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、液体シンチレーションカウンターでβ放出をカウントすることによってチミジンの組込みを決定した。
【０３０６】
Ｇ．免疫化プロトコル
マウスＩＬ−５に対する自己反応性抗体を生成するために、４匹のＢａｌｂＣマウスに対して第０日目と第１４日目に、ＰＢＳ  ２００μｌに溶かしたＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５ワクチン２５μｇを皮下注射した。陰性対照として役立てるため、５匹のマウスを第０日目と第１４日目に、６．４μｇのＱβと１６μｇのＩＬ５の単純混合物で、すなわち非共有結合した（Ｑβ＋Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５）をＰＢＳに溶かしたもので免疫化した。免疫化の前と、免疫化プロトコルの第２１日目に、マウスから出血させた。血清をＥＬＩＳＡで分析した。
【０３０７】
Ｈ．血清分析
ＥＬＩＳＡ。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、精製したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５（３μｇ／ｍｌ）５０μｌで、４℃で１４時間被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに溶かした２％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。５倍希釈した血清を、２％ＢＳＡ、０．１％ＦＣＳをＰＳＢに溶かしたものに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを引き続きＰＢＳで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧをＨＲＰに結合させたもの（希釈１：１０００）と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの展開溶液（０．０６６Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍ  クエン酸、０．０３２％  Ｈ２Ｏ２、０．４％  １，２−フェニレンジアミン２塩酸塩）を添加した。室温で２分間反応させた後、ＥＬＩＳＡをウェル当たり５０μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍで測定した。
【０３０８】
Ｑβ−ＩＬ５で免疫化したマウスの血清によるウェスタンブロット染色。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５、Ｑβ、および対照をＳＤＳ＿ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜上に電気ブロットした。膜を、ＰＢＳに溶かした５％（ｗ／ｖ）粉乳で１時間ブロックし、次いで、ＰＢＳに溶かした１％（ｗ／ｖ）粉乳１０ｍｌ中に、ワクチン接種したマウスからの第２１日目の血清を溶かしたもの２０μｌと共にインキュベートした。膜をＰＢＳで１５分間洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に１：１０００の希釈率で結合させたものを含有するＰＢＳに溶かした１％（ｗ／ｖ）粉乳１０ｍｌと共に、１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ中で１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で現像して、写真フィルムに露光した。
【０３０９】
Ｉ．好酸球増加症モデル
アレルギー性気道炎症の実験喘息モデルを使用して、好酸球増加症に対するワクチン接種の効果について評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たり４匹）を、上述のＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５で免疫化した。ワクチン接種プログラムの第２３日目に、マウスに対し、Ａｌｕｍｎ（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ）に溶かした５０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を腹膜内注射した。免疫化されていない４匹のマウスの第３のグループにも注射をした。１０日が経過した後（すなわち第３３日目）、マウスは４日間にわたり毎日、ＰＢＳに溶かしたＯＶＡ  １００μｇの鼻内投与を受けた。最後の投与から２４時間後、マウスを屠殺して、肺をＰＢＳで洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）に含有される細胞をＭａｉｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、カウントした（Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ  Ａ他、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ、２００１年６月；３１（６）：９３４〜４２）。
【０３１０】
結果および考察
発現。ＢＬ２１−ＤＥ２細胞での構成体ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５の発現について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１）。クーマシーブルー染色したゲルは、１７ｋＤａタンパク質のＩＰＴＧ誘導型発現が、ＩＬ−５の質量に対応するものであることを実証した。対照として、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を含有するＢＬ２１−ＤＥ２細胞を、ＩＰＴＧが存在しない状態で増殖させ、抽出物を、上述のように不溶性細胞画分から調製した。予想通り、これらの条件下では、１７ｋＤａの誘導はなかった。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、不溶性封入体画分に局在化した。
【０３１１】
抽出、精製、およびリフォールディング。不溶性Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、６Ｍ塩酸グアニジンを用い、洗浄剤で洗浄した封入体から抽出した。溶解したタンパク質を、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２）。組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、この手順によって非常に濃縮されたことがわかった。変性したタンパク質を、上述のように尿素中でのリフォールディング手順にかけ、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。これらの工程では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されたように、可溶性で高純度のＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５が得られ（図５、レーン１）、回収率２３％、収量６．９ｍｇであった。
【０３１２】
生物学的に活性な未処理のＩＬ−５はジスルフィド結合ホモダイマーであるので、精製された組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５がダイマーを形成する能力について、非還元条件下で実施されるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図３）。３７ｋＤａの分子質量により判断されるように、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、未処理の４次構造が保存されている状態を示す性質からダイマーであることが実証された。
【０３１３】
組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の生物活性を、マウスＢ細胞系の増殖を刺激する能力を決定することによって評価した（図４）。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の存在下で培養されたＢＣＬ１細胞は、培地単独またはその他のタンパク質に比べて増殖速度が高められたことを示した。さらに、増殖が高まったことは、市販のマウスＩＬ−５で観察された場合に類似している。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５が、おそらくはその同族のレセプターとの相互作用によってＢ細胞の増殖を刺激することができ、またダイマー構造の形態をとることができることは、いずれも、組換えタンパク質が未処理の構造形態をとることを示している。
【０３１４】
ワクチンの生成および分析。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５とウイルス様粒子Ｑβとの共有化学結合を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。この連結反応のクーマシーブルー染色ゲルは、分子量が、Ｑβに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５に関して予測されるものに相当するバンドが現れることを実証した（図５）。さらにウェスタンブロット分析によれば、抗Ｈｉｓ抗体または抗Ｑβ抗体で染色した場合にこれらのバンドが共存することが示された（図６）。連結効率［すなわちモルＱβ−ＩＬ５／モルＱβモノマー（総量）］は、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析によって評価し、４０．６％であった。
【０３１５】
Ｑβに共有架橋したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５がＢ細胞増殖を刺激することができる能力は、前述のように評価した。図５は、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５によって、無関係のサイトカインに連結したＱβよりも増殖を高めることができることを示す。
【０３１６】
Ｑβに連結したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の構造について、４重ＥＬＩＳＡを使用してさらに分析した（図７ａ）。図７ｂは、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５がＩＬ−５中和モノクローナル抗体ＴＲＦＫ４およびＴＲＦＫ５によって認識されることを実証している。反応を、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５ではなくＱβと共に行った場合、シグナルは検出されなかった。モノクローナル抗体ＴＲＦＫ４は、ＩＬ−５内の中和エピトープを認識する。ＩＬ−５特異的モノクローナル抗体が、共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を認識できることは、中和エピトープがワクチン製剤中に保存されることを示している。
【０３１７】
血清の分析。マウスの免疫前血清と、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種したマウスの第２１日目の血清を回収し、ＥＬＩＳＡで分析した（図８）。その結果は、自己抗原ＩＬ−５に対する免疫寛容が、アジュバントのない状態で、かつマウス（４／４）にワクチン接種した後にのみ、克服されたことを示している。最大半減力価は、１：２０００〜１：６０００の範囲になるように計算した。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と混合したＱβを受け取った対照グループでは、有意な抗ＩＬ−５力価が検出されなかった。しかし５匹のうち３匹のマウスでは、低抗体力価＜１：５０がもたらされた。Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種したマウスからの免疫血清を、ウェスタンブロット分析によってさらに試験した。すべての場合において、免疫血清はマウスＩＬ−５を特異的に認識した。
【０３１８】
実験的喘息の動物モデルでのワクチン効率。Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５によるワクチン接種が好酸球増加症に及ぼす影響について、喘息の重要な病態を模倣するアレルギー性気道炎症のマウスモデルで評価した。この実験では、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５のワクチン接種により生成された抗ＩＬ５抗体が、内因性ＩＬ−５のｉｎ  ｖｉｖｏ動作をダウンレギュレーションする能力について試験した。対照実験では、ＯＶＡ感作および投与の前に、マウスにＰＢＳを接種した。この場合、多数の好酸球がＢＡＬでカウントされた。カウントされた細胞２００個当たりの好酸球の平均の数は、９６±１４Ｓ．Ｄ．であった。これとは対照的に、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５をワクチン接種した４匹のマウスからのＢＡＬ好酸球の平均値は、細胞２００個当たり２７．５＋１１Ｓ．Ｄ．であることがカウントされた。これは７１．４％の減少であり、高度に配列された免疫アレイとして提示されるＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５による免疫化で生成された自己抗体が、内因性標的分子を認識し、それによって喘息の実験モデルで好酸球増加症をダウンレギュレートすることの証拠である。
【実施例８】
【０３１９】
ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸リンカーを備えるマウスｍＩＬ−１３の、分子のクローニング、発現、リフォールディング、および精製。マウスインターロイキン１３とＶＬＰおよび線毛との連結
Ａ．原核発現のためのＩＬ−１３のクローニング
ＩＬ−１３をクローニングするためのＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲでｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化脾細胞から単離したが、これは以下のようにして得られたものである。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓細胞から単離し、事前に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で被覆した６ウェルプレートでＩＭＤＭ（＋５％ＦＣＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ４）中で３日間インキュベートした。これらの細胞からのＲＮＡを使用して、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（ＱｉａｇｅｎワンステップＰＣＲキット）により、ＩＬ１３をコードするｃＤＮＡを増幅した。プライマーＸｈｏＩＬ１３−ＲはＲＮＡの逆転写に使用し、プライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）は、ＩＬ１３ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＭＯＤベクターに、増幅したＩＬ１３ｃＤＮＡをライゲートした（ベクターｐＭＯＤＢ１−ＩＬ１３を与える）。得られたｃＤＮＡ配列の同一性を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。
【０３２０】
同じプライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）を使用して、ｐＭｏｄＢ１−ＩＬ１３プラスミドからＩＬ−１３ｃＤＮＡを増幅し、ｐＭＯＤＧＳＴ−ＥＫ−Ｃｌベクターにライゲートし、それによってプラスミドｐＭｏｄＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌを得た。このプラスミドのｃＤＮＡ配列を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。エンテロキナーゼ切断部位に融合したグルタチオンＳトランスフェラーゼと、それに続くＣ末端リンカー１を備えたＩＬ−１３配列に対するコード配列を含むｃＤＮＡを、プラスミドｐＭｏｄＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌを鋳型として使用して、プライマーＧＳＴ−ＢａｍＨＩ  ｓｓおよびＣｌ−ＢｓｍＢＩ／ＸｈｏＩを用いたＰＣＲにより増幅した。このｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＭｏｄＢ−Ｎ１ベクターにライゲートした。得られたプラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、エンテロキナーゼ切断部位、ＩＬ−１３、システイン含有リンカー、およびポリヒスジジンタグからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ）をコードする。この融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの同一性を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。
オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＳＴ−ＢａｍＨＩ  ｓｓ：
５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧ−３’
Ｃｌ−ＢｓｍＢＩ／ＸｈｏＩ  ａｓ：
５’−ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡ−３’
【０３２１】
Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＬ−１３の発現
プラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓを、細菌宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。２％グルコース（事前培養物）を含有するＬＢ培地で回収した９０分後、０．２％グルコースおよび１００μｇアンピシリン／ｌを含有する２５０ｍｌのＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地に、２５０μｌの事前培養物を接種し、振盪プラットフォーム上で一晩３７℃でインキュベートした。翌朝、種培養物を、１００μｇアンピシリン／ｌを含有する７５０ｍｌの事前に温めたＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地で希釈し、振盪プラットフォーム上でさらに９０分間、ＯＤ６００が４．５に達するまで１２５ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。１０００ｍｌの培養物を、１００μｇアンピシリン／ｌを含有する５００ｍｌのＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地で希釈し、２４℃のインキュベータに移し、プラットフォームを振盪させながら３０分間、ＯＤ６００が３．７５に達するまでインキュベートした。ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質の発現は、０．７５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。４時間後、遠心分離によって細菌を収集し、超音波処理で破壊した。
【０３２２】
Ｃ．変性条件下での、封入体からのＩＬ−１３の精製
溶解後、封入体を低速遠心分離（１００００ｇ、６０分、４℃）により沈降させた。上清を回収し、再び同じ条件下で遠心分離した。ペレットを粗製封入体画分として保持した。封入体を、以下の洗浄緩衝液、すなわち５０ｍＭ  トリスＨＣＬ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２Ｍ尿素、２％トリトンＸ−１００、および１０Ｕベンゾナーゼ／ｍｌで４回洗浄した。封入体を遠心分離によって回収し、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、および６Ｍ  グアニジン−ＨＣ  ｐＨ８．０を含有する変性緩衝液に再懸濁した。封入体を、１０Ｕベンゾナーゼ／ｍｌの存在下で超音波処理し、室温で２時間、回転ホイール上でインキュベートした。遠心分離後、上清を保持し、ペレットを再び変性緩衝液に再懸濁し、上述のように処理した。上清を溜め、変性緩衝液で平衡にしたＮｉ２＋アガロースカラムに導入した。結合したタンパク質を、ｐＨ６．３およびｐＨ４．５の変性緩衝液を用いて２段階で溶出した。一定量の画分を、アミドブラック染色し、ＴＣＡ沈降後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１０）。
【０３２３】
Ｄ．ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓのリフォールディング
溶出したタンパク質にβメルカプトエタノールを添加して、最終濃度１０ｍＭにし、８．０Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１０ｍＭ  βメルカプトエタノール（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液２リットルに対し、１０ｋＤａのカットオフ膜を使用して４℃で一晩透析した。透析後、タンパク質濃度を決定し、そのタンパク質の濃度を透析緩衝液で希釈して０．２ｍｇ／ｍｌにした。この溶液を、２．０Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  還元グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化グルタチオン、０．５Ｍ  アルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）に対し、４℃で２４時間透析した。翌日このリフォールディング緩衝液１を、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ  還元グルタチオン、０．２５ｍＭ  酸化グルタチオン、０．２５Ｍ  アルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液２（ｐＨ８．５）に対して交換し、さらに２４時間、４℃で透析した。最後にこの溶液を、２０ｍＭ  エタノールアミン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液３（ｐＨ９．０）に対して４℃で透析した。リフォールディング緩衝液３を２時間後に一度交換し、透析をさらに１４時間続行した。透析物を、４℃で１５分間、２００００ｇで遠心分離した。上清を保持し、タンパク質を、５ｋＤａ分子量カットオフ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた「バイオマックス遠心分離フィルタ装置」で遠心分離することにより濃縮して、最終的なタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌにした。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＧＳＴ、マウスＩＬ−１３、およびＨｉｓタグに対するそれぞれの単一特異性抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【０３２４】
Ｅ．エンテロキナーゼによるＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質の切断
ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質を、１×エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１％Ｔｗｅｅｎ−２０）と、１２．５ｕｇの融合タンパク質当たり１Ｕのエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）と共に、４℃で２４時間インキュベートする。
【０３２５】
Ｆ．ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓの精製
エンテロキナーゼによる処理の後、切断されたＧＳＴを、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、およびアフィニティークロマトグラフィーの組合せによって分離する。ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を濃縮して、最終的なタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌにする。
【０３２６】
Ｇ．連結反応のためのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質の調製
ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を連結するのに最適な条件を決定するため、タンパク質を、様々な濃度（０μＭ〜５００μＭ）の還元試薬（ＤＴＴまたはＴＣＥＰ）を用いた緩慢な還元条件下でプロセッシングされる。還元ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を、誘導化したＶＬＰおよび線毛との効率的な連結に関して試験する。
【０３２７】
Ｈ．ＩＬ−１３−Ｃｌ−ＨｉｓとＱβカプシドとの連結
１２０μＭのＱβカプシドを溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）などの異種２官能性架橋剤と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析した誘導体化Ｑβ反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と混合する。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化Ｑβカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。
【０３２８】
ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓとｆｒカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのｆｒカプシドを溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したｆｒカプシドタンパク質反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化ｆｒカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。
【０３２９】
ＩＬ−１３−Ｃｌ−ＨｉｓとＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドを溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。
【０３３０】
ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と線毛の結合
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓに１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を加えた溶液（ｐＨ７．４）を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、室温のロッキングシェーカー上で６０分間反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で脱塩する。カラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化したＥ．ｃｏｌｉの１型線毛よりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。
【０３３１】
Ｑβカプシドタンパク質に連結されたＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓによるマウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントを添加することなく、ＶＬＰに連結されたＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓをワクチン接種する。各サンプルの全タンパク質２５μｇをＰＢＳ中に希釈して２００ｕｌにし、第０日目と第１４日目に皮下注射する（両腹側部に１００μｌ）。第３１日目に、マウスを、眼窩後方から出血させ、その血清を、ＩＬ−１３特異的ＥＬＩＳＡを使用して分析する。
【実施例９】
【０３３２】
ｃｙｓ含有アミノ酸リンカー配列によるエオタキシンのクローニング、発現、精製、および連結
マウスエオタキシンを、そのＣ末端で融合しているアミノ酸リンカーＣ１により組換え発現させた。このリンカーは、ＶＬＰに連結するための１つのシステインを含有していた。
【０３３３】
ｐｍＥｏ−ＣｌおよびｐｍＨｉｓＥｏ−Ｃｌの構成体
アニールされたオリゴプライマーＭＣＳ−１ＦおよびプライマーＭＣＳ−１Ｒで当初の配列をＮｄｅＩ部位からＸｈｏＩ部位に置き換えることによって、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＭＣＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＣに変えた（アニーリングは、１５ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８緩衝液で）。得られたプラスミドをｐＭｏｄ００とし、これはそのＭＣＳにＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を有するものであった。アニールされたＢａｍｈｉｓ６−ＥＫ−Ｎｈｅ−ＦとＢａｍｈｉｓ６−ＥＫＮｈｅ−Ｒのオリゴ対と、アニールされた１Ｆ−Ｃ−グリシン−リンカーと１Ｒ−Ｃ−グリシン−リンカーのオリゴ対を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＭｏｄ００プラスミドに一緒にライゲートしてｐＭｏｄＥＣ１を得たが、これはＮ末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位、および１つのシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸グリシンリンカーを有するものであった。以下のプライマーを使用して、すなわちｍエオタキシン−Ｆ、Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆ、およびｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒを使用して、マウスエオタキシンを、ＰＣＲによってＡＴＣＣクローン（ＡＴＣＣ番号３１４８３９４）から増幅した。ｍエオタキシン−Ｆは、内部ＮｄｅＩ部位を有し、Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆは、内部ＮｈｅＩ部位を有し、ｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒは内部ＸｈｏＩ部位を有していた。プライマー対ｍエオタキシン−Ｆとｍエオタキシン−Ｘｈｏ−ＲからのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＭｏｄＥＣ１にライゲートした。得られたプラスミドをｐｍＥｏ−Ｃ１としたが、これは、エオタキシンと、そのＣ末端にリンカーを含有するシステインとからなる融合タンパク質をコードするものである。プライマー対Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆとｍエオタキシン−Ｘｈｏ−ＲからのＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＭｏｄＥＣ１にライゲートした。得られたプラスミドをｐＨｉｓｍＥｏ−Ｃ１としたが、これは、Ｎ末端Ｈｉｓタグと、その後に続くエンテロキナーゼ切断部位、エオタキシン、およびシステインリンカーからなる融合タンパク質をコードするものである。
【０３３４】
ＰＣＲ反応では、各オリゴ１５ｐｍｏｌと鋳型ＤＮＡ１ｎｇを、５０μｌの反応混合物（２単位のＰＦＸポリメラーゼ、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ、および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中で使用した。温度サイクルは下記の通りであった：９４℃  ２分間、その後、９４℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、６８℃（３０秒）を３０サイクル、その後、６８℃  ２分間。その他すべての工程は、標準的な分子生物学的プロトコルによって実施した。
オリゴヌクレオチドの配列：
ｍエオタキシン−Ｆ：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ３’
Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆ：５’ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ３’
ｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒ：５’ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴ３’
【０３３５】
ｐｍＥｏ−Ｃｌの発現
コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、プラスミドｐｍＥｏ−Ｃｌで形質転換した。アンピシリン（Ａｍｐ）含有寒天平板からの単一コロニーを液体培養（１５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１００ｕｇ／ｍｌ  Ａｍｐ、０．５％グルコースを含むＳＢ）で拡張し、３０℃で一晩、２２０ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。次いでＳＢ（１５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１００ｕｇ／ｍｌ  Ａｍｐ）１ｌに、一晩培養したものを１：５０ｖ／ｖ接種し、１５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃でＯＤ６００＝１．７になるまで増殖させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧで発現を誘導した。９時間誘導した後、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を収集した。細胞ペレットを、０．８ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加えた溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．２５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁し、超音波処理し、ベンゾナーゼで処理した。４８０００ＲＣＦで２０分間遠心分離した後、上清を１６％ＰＡＧＥゲル上で分離させ、マウスエオタキシンの発現を、ウェスタンブロット法で抗マウスエオタキシン抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）により確認した（図１２）。これは、予測される分子量８．８ＫＤで実験したときのエオタキシン−Ｃｌの発現を明らかに示していた。
【０３３６】
マウスエオタキシン−ＣｌとマウスＨｉｓ−エオタキシン−Ｃｌのタンパク質配列を、ｃＤＮＡ配列から翻訳した。
マウスエオタキシン−Ｃｌ：
ＭＨＰＧＳＩＰＴＳＣＣＦＩＭＴＳＫＫＩＰＮＴＬＬＫＳＹＫＲＩＴＮＮＲＣＴＬＫＡＩＶＦＫＴＲＬＧＫＥＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＡＴＫＨＬＤＱＫＬＱＴＰＫＰＬＲＧＧＧＧＧＣＧ
マウスＨｉｓ−エオタキシン−Ｃｌ：
ＭＤＰＨＨＨＨＨＨＧＳＧＤＤＤＤＫＡＬＡＨＰＧＳＩＰＴＳＣＣＦＩＭＴＳＫＫＩＰＮＴＬＬＫＳＹＫＲＩＴＮＮＲＣＴＬＫＡＩＶＦＫＴＲＬＧＫＥＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＡＴＫＨＬＤＱＫＬＱＴＰＫＰＬＲＧＧＧＧＧＣＧ
【０３３７】
マウスエオタキシン−ＣｌとＱβカプシドタンパク質の連結
６ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした１．４８ｍｌの溶液を、２５℃で、ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）（ＤＭＳＯに溶解した１００ｍＭ保存溶液から）１４．８μｌと６０分間反応させる。その後、この反応溶液を、２ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して４℃で３時間にわたり、２回透析する。３．６ｍｇ／ｍｌのマウスエオタキシン−Ｃｌタンパク質を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に溶かした１．３ｍｌの溶液を、２５℃で、ＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｈ２Ｏに溶解した３６ｍＭ保存溶液から）９．６μｌと１時間反応させる。次いで誘導化し透析されたＱβ  １３０μｌを、還元エオタキシン−Ｃｌ  １２９μｌを２４１μｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶かしたものと、２５℃で一晩反応させる。抗Ｑβおよび抗エオタキシン抗体によるウェスタンブロット分析は、エオタキシンとＱβとが共有結合したことを示している。
【０３３８】
Ｂ．Ｑβカプシドタンパク質に連結したマウスエオタキシン−Ｃｌによるマウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントを添加することなく、Ｑβカプシドタンパク質に連結したマウスエオタキシン−Ｃｌをワクチン接種する。各サンプルのすべてのタンパク質２５μｇをＰＢＳに希釈して２００ｕｌとし、第０日目と第１４日目に皮下注射する（両腹側部に１００μｌ）。第３１日目にマウスの眼窩後方から出血させ、その血清を、エオタキシン特異的ＥＬＩＳＡを使用して分析する。
【０３３９】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥｌＩＳＡプレートを、濃度５μｇ／ｍｌでマウスエオタキシン−Ｃｌで被覆する。このプレートをブロックし、次いで連続希釈したマウス血清と共にインキュベートする。結合した抗体を、酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出する。対照として、同じマウスからの免疫前血清も試験する。
【実施例１０】
【０３４０】
ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたインターロイキン５（ＩＬ−５）のクローニングおよび発現
Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ中の封入体として発現させるためのＩＬ−５のクローニング
以下の２つのプライマー、すなわちＳｐｅｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ１（配列番号３４０）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒ（配列番号３４２）を使用したＰＣＲによって、ＡＴＣＣクローン（ｐｍＩＬ５−４Ｇ；ＡＴＣＣ番号：３７５６２）からＩＬ−５を増幅した。このＰＣＲ産物を、プライマーＳｐｅＮｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ２（配列番号３４１）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒによる第２のＰＣＲ用鋳型として使用した。挿入物を、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。この挿入物を、事前にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化した（脱リン酸化していない）ｐＥＴベクター誘導体（ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクター）にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクターへのクローニングによって生成されたＩＬ５構成体は、そのＮ末端にヘキサヒスチジンタグを含有し、その後にエンテロキナーゼ部位、システイン残基を含有するＮ末端γ３アミノ酸リンカーが続き、そのＣ末端側には配列ＡＳが隣接し、Ｎ末端側には配列ＡＬＶが隣接し、成熟形態のＩＬ５遺伝子となる。エンテロキナーゼを用いた切断によって遊離したタンパク質を、「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｅ」（配列番号３３２）と呼ぶ。得られたクローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５．２（ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５とも呼ぶ）のプラスミドＤＮＡは、その配列がＤＮＡ配列決定によって確認されたものであり、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１に形質転換した。
【０３４１】
クローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５／ＢＬ２１を、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養物２ｍｌを、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌの富栄養培地（ＴＢ）で希釈した。培養は、培養によって光学密度がＯＤ６００＝０．７に達したときに、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１Ｍ溶液０．１ｍｌを添加することによって誘導した。２時間ごとに、サンプル１０ｍｌを採取した。これらのサンプルを、４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００（ｐＨ８）を含有する０．５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。リゾチーム（４０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加してチューブを４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２分間超音波処理した。５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液１００μｌとベンゾナーゼ１ｍｌを添加した。次いで細胞を、室温で３０分間インキュベートし、１３０００×ｇで１５分間遠心分離した。
【０３４２】
上清を捨て、ペレットを、ＳＤＳ導入緩衝液１００μｌ中、９８℃で５分間沸騰させた。導入緩衝液中のサンプル１０μｌを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１７Ａ）。図１７Ａのゲルは、ＩＬ−５構成体の発現を明確に示している。図１７Ａのゲルに導入されたサンプルは、下記の通りであった。
レーンＭ：マーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ着色マーカー）
レーン１：誘導前の１ｍｌ培養の細胞抽出物
レーン２：誘導後４時間の１ｍｌ培養の細胞抽出物
【０３４３】
Ｂ．哺乳動物細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）中で発現させるためのＩＬ−５のクローニング
ａ）ＩＬ−５は、そのＮ末端でシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーに融合し、そのＣ末端でＦｃ断片に融合する。
（Ａ）（ＡＴＣＣクローン３７５６２）で述べた鋳型を、以下の構成体のクローニングに使用した。プラスミドｐＭＯＤＢ１−ＩＬ５（ｐＥＴ誘導体）をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化して、システインを含有するＮ末端アミノ酸リンカーに融合したＩＬ５をコードする小断片を得た。この断片を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで事前に消化されたベクターｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ＊（ΔＸｈｏ）にライゲートした。ライゲーションをＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１に電気穿孔し、得られたクローンｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ５−Ｆｃ．２のプラスミドＤＮＡであって、その配列がＤＮＡ配列決定によって確認されたものを使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を形質移入した。このプラスミドによってコードされた、得られたＩＬ−５構成体は、ＩＬ−５成熟配列のＮ末端に融合したアミノ酸配列ＡＤＰＧＣＧＧＧＧＧＬＡを有していた。この配列は、システインを含有するアミノ酸リンカー配列ＧＣＧＧＧＧＧを含み、これはクローニング手順中に導入された追加のアミノ酸に隣接している。第Ｘａ因子による融合タンパク質の切断によって遊離したＩＬ−５タンパク質を、以下「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｆ」（配列番号３３３）と呼ぶ。
【０３４４】
ピューロマイシンに形質移入し選択した後、培養上清を、抗Ｈｉｓ（マウス）および抗マウスＩｇＧ抗体であってホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したものを使用して、ウェスタンブロットによって分析した（図１７Ｂ）。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧ抗体も、Ｆｃ融合タンパク質を検出する。タンパク質の精製は、プロテインＡ樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。図１７Ｂの結果は、ＩＬ−５構成体の発現を明瞭に示している。
【０３４５】
図１７Ｂのウェスタンブロットに導入されたサンプルは、下記の通りであった。レーン１：ＩＬ５−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元条件下で行った。レーン２：ＩＬ１３−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元条件下で行った。レーン３：ＩＬ５−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元条件下で行った。
【０３４６】
Ｂ．ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）でクローニングされたＩＬ−５と、そのＮ末端で融合しているシステイン残基を含有するアミノ酸リンカー
ＩＬ−５（ＡＴＣＣ３７５６２）を、プライマーＮｈｅ−ｌｉｎｋ１−ＩＬ１３−ＦおよびＩＬ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒで増幅した。ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した後、挿入物を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで事前に消化されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＥＫにライゲートした。得られたプラスミドｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ５を配列決定し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに使用した。このプラスミドによってコードされた、得られたＩＬ−５構成体は、ＩＬ−５成熟配列のＮ末端で融合しているアミノ酸配列ＬＡＣＧＧＧＧＧを有していた。この配列は、システイン残基を含有するアミノ酸リンカー配列ＡＣＧＧＧＧＧを含み、これはクローニング手順中に導入された追加のアミノ酸に隣接している。エンテロキナーゼを用いた切断によって遊離したタンパク質を、以下「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ」（配列番号３３４）と呼ぶ。得られたタンパク質の精製は、グルタチオンアフィニティー樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０３４７】
Ｃ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−ＳとＱβカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのＱβカプシドタンパク質を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したＱβ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  Ｑβカプシドタンパク質、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０３４８】
Ｄ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓとｆｒカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのｆｒカプシドタンパク質を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したｆｒ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  ｆｒカプシドタンパク質、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０３４９】
Ｅ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液とＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドを、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０３５０】
Ｆ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓと線毛の連結
１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと６０分間、室温でロッキングシェーカー上で反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  線毛、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【実施例１１】
【０３５１】
ＶＬＰおよび線毛に対するＩＬ−１３のクローニング、発現、および精製
Ａ．ＶＬＰおよび線毛と連結するためのシステイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたインターロイキン（ＩＬ−１３）のクローニングおよび発現
ａ）Ｆｃ融合タンパク質として哺乳動物細胞中で発現させるためのマウスＩＬ−１３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のクローニング
ＩＬ−１３のクローニング用ＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化脾細胞からＲＴ−ＰＣＲにより単離したが、この細胞は、以下のようにして得られた。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓細胞から単離し、事前に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で被覆された６ウェルプレートのＩＭＤＭ（＋５％ＦＣＳ＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ４）中で３日間インキュベートしたものである。これらの細胞からのＲＮＡを使用して、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（ＱｉａｇｅｎワンステップＰＣＲキット）によりＩＬ１３を増幅した。プライマーＸｈｏＩＬ１３−ＲはＲＮＡの逆転写に使用し、プライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）はＩＬ１３ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。増幅したＩＬ１３ｃＤＮＡを、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＭＯＤベクターにライゲートした（ベクターｐＭＯＤＢ１−ＩＬ１３を得る）。ｐＭＯＤＢ１−Ｉｌ１３は、消化されたＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩであり、ＩＬ１３を含有する断片を、事前にＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ＊（Δｘｈｏ）ベクターに、すなわちＦｃ配列の終わりのＸｈｏＩ部位が除去されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ＊の類似体にライゲートした。このライゲーションから得られたプラスミド（ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ１３−Ｆｃ）を配列決定し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに使用した。このプラスミドでコードされた、得られたＩＬ１３構成体は、ＩＬ１３成熟配列のＮ末端で融合しているアミノ酸配列ＡＤＰＧＣＧＧＧＧＧＬＡを有していた。この配列は、クローニング手順中に導入された追加のアミノ酸が隣接しているアミノ酸リンカー配列ＧＣＧＧＧＧＧを含む。ＩＬ１３−Ｆｃは、ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ１３−Ｆｃが形質移入された細胞の上清から、プロテインＡ樹脂で精製することができる。発現の結果を図１７Ｂに示す（サンプルの詳細については実施例１０参照）。そのＮ末端で前述のアミノ酸配列に融合している成熟ＩＬ−１３は、第Ｘａ因子による融合タンパク質の切断によって遊離し、その結果、以下「マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ」と呼ばれかつ配列番号３２８を有するタンパク質が得られる。図１７Ｂの結果は、ＩＬ−１３構成体の発現を明確に示している。
【０３５２】
ｂ）そのＮ末端で融合しているＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）を備えた、哺乳動物細胞中で発現させるためのマウスＩＬ−１３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のクローニング
Ｎ末端ＧＳＴを持つＩＬ−１３のクローニングに使用されるｃＤＮＡは、上記（ａ）のＴＨ２活性化Ｔ細胞のｃＤＮＡ由来のものである。ＩＬ−１３は、プライマーＮｈｅｌｉｎｋ１ＩＬ１３−ＦおよびＩＬ１３ＳｔｏｐＸｈｏＮｏｔ−Ｒを使用して、このｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、事前にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＥＫベクターにライゲートした。ライゲーション（ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ１３）から単離可能なプラスミドを使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を形質移入した。このプラスミドでコードされた、得られたＩＬ１３構成体は、ＩＬ−１３成熟配列のＮ末端に融合したアミノ酸配列ＬＡＣＧＧＧＧＧを有していた。この配列は、クローニング手順中に導入された追加のアミノ酸が隣接しているアミノ酸リンカー配列ＡＣＧＧＧＧＧを含む。ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ１３が形質移入された細胞の培養上清は、融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＬ１３を含有しており、これは、標準のプロトコルに従ってグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。そのＮ末端で前述のアミノ酸配列に融合する成熟ＩＬ−１３は、エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断によって遊離し、その結果、以下「マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ」と呼ばれかつ配列番号３２９の配列を有するタンパク質が得られる。
【０３５３】
Ｂ．マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＳとＱβカプシドタンパク質との連結
１２０μＭのＱβカプシドを溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＱβ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  Ｑβカプシドタンパク質、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３５４】
Ｃ．マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ、マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓとｆｒカプシドタンパク質との連結
１２０μＭのｆｒカプシドタンパク質を溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したｆｒ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  ｆｒカプシドタンパク質、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３５５】
Ｄ．マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液とＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔとの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔカプシドを溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３５６】
Ｅ．マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と線毛の連結
１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を溶かした２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、室温のロッキングシェーカー上で６０分間反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ  線毛、６０μＭ  マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３５７】
明確な理解のため、例としていくらか詳細に本発明について十分に述べてきたが、当業者なら、本発明またはその任意の特定の実施形態に影響を及ぼすことなく、条件、配合物、およびその他のパラメータの広くかつ均等な範囲内で本発明を修正しまたは変更を加えることによって同様の事項を実施することができ、またそのような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが、明らかであろう。
【０３５８】
本明細書で述べたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものであり、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが参照により援用されるよう具体的にかつ個々に示されるかのように同様の程度まで参照により本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の発現を示す図である。ＩＰＴＧと共にまたは無しで、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５／ＢＬ２１−ＤＥ３を培養した後に得られた不溶性細胞画分からの抽出物を、上述のように調製した。等量の抽出物を、１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に導入し、電気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。レーンＭはサイズマーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ、染色前マーカー）、レーン１は非誘発（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ）培養からの抽出物、レーン２は、ＩＰＴＧで４時間誘発させた（ｉｎｄｕｃｅｄ）培養からの抽出物。
【図２】Ｎｉ−ＮＴＡによるＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。様々な段階の精製から得られたサンプルを１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、還元条件下で実行した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。Ｍ：マーカー、１：可溶性封入体、２：フロースルー（非結合物質）、３：洗浄１  ｐＨ６．５、４：洗浄２  ｐＨ６．５、５：洗浄３  ｐＨ５．９、６〜８：溶出液ｐＨ４．５、９：純粋な組換えマウスＩＬ−５。
【図３】組換えマウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。一定分量５μｇの精製済みマウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、ジチオスレイトールの存在下（左から第２レーン目）、または存在しない状態で（左から第３レーン目）、１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に分離した。ゲルを、タンパク質に関してクーマシーブルーＲ−２５０で染色した。レーンＭはサイズマーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ、染色前マーカー）を含む。
【図４】Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５がＢＣＬ１細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。下記の物質の存在下、すなわちマウスＩＬ−５（３０ｎｇ／ｍｌ）  Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５（３０ｎｇ／ｍｌ）；Ｑβ（２００ｎｇ／ｍｌ）；Ｑβ−無関係のサイトカインと化学的に架橋したもの（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５（１０５ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＢＣＬ１細胞を３Ｈ−チミジンと共にインキュベートした。希釈していない出発濃度を括弧内に示し、この示される出発濃度から５倍に連続希釈した。３Ｈ−チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウントによって決定した。
【図５】クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる連結反応の分析を示す図である。レーンＭ：染色前分子量マーカー、レーン１：精製済みＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５、レーン２：化学架橋剤ＳＭＰＨで誘導化した後のＱβ、レーン３：連結反応、レーン４：透析後の連結反応。連結反応における種々の分子種の名称を図の右側に示す。
【図６】ウェスタンブロット法による連結反応の分析を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：精製済みＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５、レーン２：化学架橋剤ＳＭＰＨによって誘導化した後のＱβ、レーン３：連結反応。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を検出するための一次抗体は、後にＨＲＰに結合する抗ラット抗体と共にインキュベートする、ラット抗Ｈｉｓ抗体であった。Ｑβに対してウサギポリクローナル抗血清で染色することによって、Ｑβを検出し、その後、ＨＲＰ結合抗ラビット抗体により検出した。同一のブロットは、図示のように染色された。
【図７】４段階のＥＬＩＳＡを示す図である。Ａ．捕捉ＥＬＩＳＡの概略図。アッセイの様々な成分は、１：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、２：ウサギ抗Ｑβポリクローナル抗血清、３：Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５、Ｑβ、またはＰＢＳ、４：抗ＩＬ５モノクローナルＡｂ、ＴＲＦＫ４または５、５：抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ。Ｂ．４段階ＥＬＩＳＡの結果。モノクローナル抗体を中和して、規則的抗体アレイに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と相互に作用させることができる能力を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【図８】ＩＬ−５に対する血清のＥＬＩＳＡを示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５で被覆し、免疫前のマウス、またはＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種し（４匹）またはＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５と混合したＱβでワクチン接種して（５匹）２１日過ぎた後のマウスから採取した血清と共にインキュベートした。血清の出発希釈率は１：５０であり、５倍希釈を行った。ＩＬ−５特異的抗体の結合を、ＨＲＰに結合した抗マウスＩｇＧおよび色素生成基質で検出した。
【図９】ＢＬ２１での組換えＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ発現の誘導を示す図である。１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色。導入量は、示される細菌溶解産物の０．１  ＯＤ６００に相当する。ＩＬ−１３−融合タンパク質の発現を０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４時間後にサンプルを分析した。対応するプラスミド（ｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ）で形質転換されかつＩＰＴＧで誘導された細菌には、ＩＬ−１３−融合タンパク質の強力な発現があることに留意されたい（矢印参照）。
【図１０】変性下でのＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓの精製を示す図である。１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色。導入量は、示される画分の５μｌに相当する。ＩＬ−１３−融合タンパク質を封入体から得て、グアンジン−ＨＣｌ変性緩衝液に溶解し、Ｎｉ２＋アガロースカラムに導入し、同じ緩衝液で平衡状態にした。結合したタンパク質を、異なるｐＨで２段階で溶出した。図は、ｐＨ４．５の第２の緩衝液で溶出された、図示される画分（＃５〜＃３０）の、ＴＣＡ沈殿による一定分量の分析を示す。Ｃ末端Ｈｉｓタグにより、ＩＬ−１３融合タンパク質がＮｉ２＋アガロースカラムに効率的に結合し、ｐＨを下げることによって溶出されたことに留意されたい。
【図１１】リフォールディング後の可溶性ＩＬ−１３融合タンパク質の分析を示す図である。ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ融合タンパク質を、セクション１８Ｄで述べるようにリフォールディングした。リフォールディング反応が終了した後、一定分量のタンパク質溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後クーマシー染色（Ａ）またはウェスタンブロット（Ｂ）を行った。示される一次抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（α−ＩＬ１３、ＡＦ−４１３−ＮＡ）から、Ｑｉａｇｅｎ（α−ＰｅｎｔａＨｉｓ、３４６６０）およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（α−ＧＳＴ、２４−４５７７）によって、それぞれ購入した。抗体は、製造業者の取扱い説明書に従った濃度で使用した。
【図１２】マウスエオタキシンＣ１の発現を示す図である。１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の９時間後、ｐｍＥｏ−Ｃ１で形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の細胞溶解産物からの上清について、１６％ＰＡＧＥゲル上で実験し、ニトロセルロース膜にブロットして、ヤギ抗マウスエオタキシン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）と反応させた。レーン１：染色前タンパク質マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、レーン２：１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の９時間後、ｐｍＥｏ−Ｃ１で形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の細胞溶解産物の上清、レーン３：染色前タンパク質マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、レーン４：抗マウスエオタキシン抗体でプローブした、レーン２と同じ溶解産物のウェスタンブロット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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