(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液を用いず、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させ、酵素反応により生成するグリシンおよびアンモニアを回収するグリシンの製造法であって、上記微生物としてロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９（ＦＥＲＭＢＰ−５２１９）を用いることを特徴とするグリシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリシンの微生物学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、ホルムアルデヒド、青酸およびアンモニアの反応で得られるグリシノニトリルを微生物の作用による加水分解反応に付し、生成するグリシンとアンモニアを水溶液から回収することを含むグリシンの微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは、食品添加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造するため利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、青酸およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアルカリで加水分解し、グリシンソーダとアンモニアに変換した後、硫酸等の酸で中和して製造されている。この時、アンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用いる欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため、廃棄物が多く環境負荷が大きい欠点があった。さらに、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似しているため、グリシンを精製回収するためには、晶析操作を複数回繰り返したり、母液を循環する等の煩雑な操作が必要であった（特開昭５１−３４１１３号）。
【０００３】
一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分解してグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−１５１２０号においては、ブレビバクテリウムＲ３１２株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１号においては、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリン酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法は、実施例によると、グリシンを得るためには、グリシン重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため、緩衝液が用いられる点に問題があった。すなわち、多量の菌体を用いるため、培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、また、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため、緩衝液の廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はアンモニア塩となり、アンモニアの回収を妨げる問題もある。ロドコッカス属、アルスロバクター属、カセオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバクテイリア属またはストレプトマイセス属の微生物を用いる特開平３−２８０８８９号においては、菌体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良されているが、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さらに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。
【０００４】
このように、従来の微生物を用いたグリシノニトリルからグリシンを生産する方法は、菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が低く、培地や菌体を多量に浪費する欠点に加え、反応液のｐＨを調整するために用いた緩衝液の廃棄が避けられない欠点、さらに、緩衝液がアンモニアの回収を妨げる問題があり、工業的に実施できるものではなかった。また、従来の微生物を用いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を用いグリシノニトリルからグリシンを生産するに当たり、菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が高く、培地や菌体を多量には廃棄せず、反応液のｐＨを調整するために緩衝液を用いず、グリシンとアンモニアを定量的に、かつ容易に回収できる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニアを定量的に、かつ容易に回収できる反応系を構築すべく、適した微生物を探索した。その結果、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下でグリシンとアンモニウムが生成し、反応液のｐＨが１０を越えても反応が進行する微生物を見い出すことができ、本微生物の培養条件、反応条件と反応方法等の研究を鋭意行った結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させることを特徴とするグリシンの製造法であり、また、本発明は、ｐＨを調整しない閉鎖的反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させ、酵素反応により生成するグリシンおよびアンモニアを回収することを特徴とするグリシンの製造法である。
本発明に使用する微生物としては、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus ）属に属する微生物が適していることが新たに発見されたが、これに限定されるものではない。
【０００８】
本発明に適した微生物として選択されたロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９株は、１９９３年１１月２日に工業技術院微生物工業技術研究所に原寄託され、１９９５年９月１日に国際寄託に移管されＦＥＲＭ  ＢＰ−５２１９の受託番号を付与されており、微生物学的性質は以下に示すとおりである。
（ａ）形状、成育状況
１．細胞の形                      桿状
２．細胞の多形性の有無              有
３．運動性の有無                    無
４．胞子の有無                      無
５．グラム染色性                  陽性
６．肉汁寒天平板培養における      生育良好・オフホワイト・不明・
コロニーの状態                滑らか・凸状・光沢有
【０００９】
（ｂ）生理学的性質
１．カタラーゼ                      ＋
２．オキシダーゼ                    −
３．ＯＦテスト                    実施せず
４．細胞壁ジアミノ酸              meso−ジアミノミメリン酸
【００１０】
（ｃ）その他生理学的性質
１．硝酸塩の還元                    ＋
２．ピラジンアミダーゼ              ＋
３．システインアリルアミダーゼ      −
４．バリンアリルアミダーゼ          ＋
５．ピロリドニルアリルアミダーゼ    −
６．アルカリフォスフォダーゼ        ＋
７．β−グルクロニダーゼ            −
８．β−ガラクトシダーゼ            −
９．α−グルコシダーゼ              ＋
１０．ウレアーゼ                      −
１１．ゼラチン分解                    −
１２．溶血性                          −
１３．アデニン分解                    ＋
１４．チロシン分解                    −
１５．５％ＮａＣｌ存在下での生育    生育する
１６．リボースからの酸生成            ＋
【００１１】
（ｄ）各単一炭素源での生育
１．イノシトール                    −
２．マルトース                      −
３．マンニトール                    −
４．ラムノース                      −
５．ソルビトール                    −
６．ｍ−ヒドロキシ安息香酸          ＋
７．アジピン酸ナトリウム            −
８．クエン酸ナトリウム              −
９．グルタル酸ナトリウム            ＋
１０．Ｌ−チロシン                    −
１１．グリセロール                    −
１２．トレハロース                    −
１３．アセトアミド                    −
１４．Ｄ−ガラクトース                −
菌株の同定に際しては、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティク・バイオテリオロジー（Bergy's Manual of Determinative Bacteriolog ）第２巻（１９８６）およびザ・プロカリオート（The Prokaryotes ）第２版（１９９２）に従って分類した。
【００１２】
次に、本発明の一般的実施態様について説明する。
本発明に使用される微生物の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としては、アンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われる。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導剤を加えてもよい。例えば、ラクタム化合物（γ−ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニトリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
【００１３】
本発明の微生物は、そのまま工業使用できるが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもできる。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、公知の方法で行うことができる。
【００１４】
本発明において用いるグリシノニトリルは、公知の方法で合成することができる。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニアから得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュトレッカー法として総称されている。
【００１５】
本発明においては、上述の方法で分離した菌体および菌体処理物は、ｐＨを調整しない密閉反応条件下でグリシノニトリル水溶液に懸濁することで、速やかに加水分解反応が進行し、グリシンとアンモニアに転換することができる。すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物を例えば０．０１〜５重量％、およびグリシノニトリルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しない水性懸濁液を、生成するアンモニアが放散しないように密閉容器に仕込み、温度として例えば０〜５０℃の条件を用いて、反応時間を例えば１〜２４時間反応させればよい。この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。
【００１６】
かくして、グリシンは、ほぼ１００％のモル収率でグリシンとアンモニアに転換し、グリシンアンモニウム塩の高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。もし、グリシンアミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性を持つ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能である。グリシンアンモニウム塩の高濃度反応液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法にて回収できる、また、アンモニアは一部の水と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、この実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
（１）グリシノニトリルの合成
ホルマリンに等量の青酸をを作用させて、一旦生成したグリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を添加し、３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。
【００１８】
（２）菌体の培養
ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
グリセリン                  １．０重量％
肉エキス                    １．０
ペプトン                    １．０
食塩                        ０．１
ε−カプロラクタム          ０．３
リン酸第一カリウム          ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩    ０．０２
塩化アンモニウム            ０．１
硫酸第二鉄・７水塩          ０．００３
塩化マンガン・４水塩        ０．００２
塩化コバルト・６水塩        ０．００２
ｐＨ                      ７．５
【００１９】
(2) 培養条件
３０℃／１日
(3) グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として６２ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始した。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを追加添加し、反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行った。
【００２０】
得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は９７ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は９．７ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３０ｇは遠心濾過し、菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２５ｇであった。
【００２１】
【比較例１】
実施例１と同様の培養操作を菌体として、ロドコッカス・マリスＢＰ−４７９−９の代わりにグリシンの合成活性が知られるAlcaligenes  faecalis （ＡＴＣＣ８７５０）を用い、ε−カプロラクタムの代わりにアセトニトリルを用いて行った。得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄後、密閉した１００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として５０ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始した。反応開始２時間後、ｐＨは８．５になっていた。
【００２２】
この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが残り、グリシンは仕込量の１６％生成していた。そこで、反応時間をさらに２時間延長して行ったが、グリシン量は変化しなかった。このことから、密閉反応器では生成したアンモニアが蓄積し、ｐＨが上昇すると、アセトニトリルで培養したAlcaligenes  faecalis 等の通常の菌体の場合、ニトリルの加水分解活性が著しく阻害されることが示唆された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のグリシンの微生物学的製造方法を用いれば、ｐＨを調整しない密閉反応条件下で、ホルムアルデヒド、青酸およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルを、ｐＨ１０以上で加水分解活性を持つ微生物、好ましくはロドコッカス（Rhodococcus ）属に属する微生物の作用により加水分解反応に付し、生成するグリシンのアンモニウム水溶液からグリシンとアンモニアを別々に回収することで、アルカリ、酸、緩衝液を多量に消費や廃棄をせず、生成したグリシンやアンモニアを反応条件下で消費することなく、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性でグリシンを製造することができる。
【００２４】
一般には、加水分解活性のある菌体を用いて、ｐＨを調整せずグリシノニトリルを加水分しても、再現性良く加水分解は起こらない。また、ｐＨ調整のため、酸、アルカリ、緩衝液を用いると、それらを多量に消費、廃棄する必要があり、かつ、生成するアンモニア、グリシンの回収が煩雑となる。よって、高いｐＨでも活性があり、ｐＨが大きく変化しても活性が維持される菌体を用いることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性でグリシンを製造することができると同時に、アルカリ、酸、緩衝液を用いないことで、こうした塩類の廃棄をなくし、グリシンやアンモニアを定量的に、かつ容易に分離することができた。