(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を調節し得る分子をスクリーニングする手段としての、Grb7タンパク質ファミリーのタンパク質のPIRドメインからなるフラグメントの使用。
【請求項２】
フラグメントが配列SEQ ID NO:１、２、５、６、９、10、13、14、17、18、21、22、25及び26からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ａ)  Grb7タンパク質ファミリーのタンパク質のPIRドメインからなるフラグメントの活性化したインシュリンレセプターへの結合を可能にする条件下で、該レセプターを該フラグメント及び試験すべき分子と接触させ、
ｂ)  チロシンキナーゼ基質を加え、
ｃ)  チロシンキナーゼ活性を測定し、かつ
ｄ)  該活性化インシュリンレセプターと該フラグメントからなる対照と比較することによって、チロシンキナーゼ活性の調節を決定する
ことからなることを特徴とする、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を調節し得る分子のインビトロ検出方法。
【請求項４】
フラグメントが、SEQ ID NO:１、２、５、６、９、10、13、14、17、18、21、22、25及び26からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Grb7タンパク質ファミリーのタンパク質のPIRドメインからなるフラグメントのインシュリンレセプターとの相互作用を調節し得る分子の予備選択が、
１)  該フラグメントを固相支持体に固定化し、
２)  試験すべき分子を該フラグメントと接触させ、次いで
３)  標識しかつ予め活性化したインシュリンレセプターを該フラグメントに結合させる条件下で、該レセプターとインキュベートし、
４)  該支持体に保持されていない該標識レセプターを分離し、
５)  該フラグメントと該活性化インシュリンレセプターとの間に形成される可能性がある複合体を検出し、かつ
６)  該フラグメントと該インシュリンレセプターからなる対照との比較により、該分子の作用を決定すること
によって、工程ａ)の前に行われることを特徴とする請求項３又は請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、インシュリンに関与する疾患の治療用分子をスクリーニングする手段としてのGrb14タンパク質及び同種アダプタータンパク質(Grb7タンパク質ファミリー)の使用に関する。
【０００２】
エネルギー代謝の調節に重要なホルモンであるインシュリンは、身体において血中グルコースを低下させる唯一のホルモンである。それはグルコースの輸送及び末梢組織(骨格筋及び脂肪組織)によるその使用を刺激し、肝臓によるグルコースの内因産生を阻害する。
インシュリンは、細胞の原形質膜で発現されるレセプターを介して作用する。このレセプターは、触媒活性を有する細胞内ドメインの存在によって特徴付けられる、チロシンキナーゼ活性を有するレセプターファミリーの一部である。リガンドの結合は、レセプターの二量体化、チロシンキナーゼドメインの活性化及びレセプターのサイトゾル成分に存在する特異的なチロシン残基のリン酸化(自己リン酸化及びトランスホスホリレーション)を誘発する(Ullrich. A. ら、(1990) Cell, 61, 203-212)。
【０００３】
インシュリンレセプターは、天然に二量体化した形態で存在するという特殊性がある。細胞外αサブユニットへのインシュリンの結合は、コンフォメーションの改変を誘発し、それにより、レセプターのβサブユニットで保持されるキナーゼドメインの活性化を生じ、レセプターの完全な活性化に必要とされる自己リン酸化を生じる。こうして活性化されるインシュリンレセプターは、インシュリンシグナルエフェクターとして用いられる細胞内タンパク質をリン酸化する。
具体的には、細胞内へのシグナル導入は、チロシンキナーゼ活性でレセプターを刺激した後、タンパク質-タンパク質の相互作用カスケードを利用し、それにより分子アダプターが優先的な役割を果たしている代謝作用又は分裂促進作用を生じる。それらのタンパク質相互作用ドメインを介して、アダプターは、シグナル経路を構成している継続的なエフェクターを補充することができる。
【０００４】
インシュリンレセプターとその細胞内エフェクターとの種々の中継のうち、十分に特徴付けられた大部分のアダプタータンパク質には、IRS-1、IRS-2(インシュリンレセプター基質-1 及び 2)ならびにShc (Src 及びコラーゲン同種タンパク質) (White M.F.ら、(1994) J. Biol. Chem., 269, 1-4; Waters S.B.,ら、(1996) Trends Cell Biol., 6, 1-4)がある。それらはインシュリン感受性の組織に非特異的であり、また他のチロシンキナーゼレセプターの活性化後とサイトカインレセプター又はGタンパク質結合レセプターの活性化後の双方にリン酸化される(Bonfini L.ら、 (1996) Trends Biochem. Sci., 21, 257-261; Souza S.C. ら、(1994) J. Biol. Chem., 269, 30085-30088; Argetsinger L.S.ら、(1995) J. Biol. Chem., 270, 14685-14692; Platanias L.C.ら、(1996) J. Biol. Chem., 271, 278-282; Velloso L.A.ら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12490-12495; Kowalski-Chauvel A.ら、(1996) J. Biol. Chem., 271, 26536-26361)。
【０００５】
したがって、例えばShcタンパク質は活性化したインシュリンレセプターに結合し、次いでリン酸化されて、そのSH2ドメインを介してShc のホスホチロシン残基に結合するGrb2アダプターを補充し、 SH3ドメインを介してヌクレオチド交換体Sos (それ自体でRasを活性化する)に結合する(Schlessinger, J. (1993), Trends Bioch. Sci., 18, 273-275)。
最近、インシュリンシグナル導入に特異的に関与し得る新規なアダプタータンパク質が、ダブル-ハイブリッドシステム、特にヒトとマウスのGrb10 タンパク質の種々のイソ型を用いてインシュリンレセプターとの相互作用によってクローンされている(Liu F.ら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10287-10291; O'Neill T.J.ら、(1996) J. Biol. Chem., 271, 22506-22513; Frantz J.D.ら、(1997) J. Biol. Chem., 272, 2659-2667)。
【０００６】
さらにより最近、発明者らは、ダブル-ハイブリッドシステムを用いるインシュリンレセプターとの相互作用によって、ラットのrGrb14及び rGrb7タンパク質をクローンしている(Kasus-jacobiら、(1998) J. Biol. Chem., 273, 26026-26035)。
mGrb10、hGrb10、hGrb14及びrGrb14タンパク質は同じファミリーのアダプタータンパク質に属し、その最初の公知のメンバーが EGF、Ret及びPDGFに対するレセプターに結合する Grb7 タンパク質である(Margolis B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8894-8898)。以降、このファミリーのタンパク質をGrb7タンパク質ファミリーと命名する。
活性化したインシュリンレセプターとの相互作用によりクローンされるこれらのタンパク質は、インシュリンシグナル導入において重要な役割を果たしていると思われる。
【０００７】
こうして、発明者らは、rGrb14タンパク質の発現がインシュリンに対する組織の感受性と極めて十分に相関していること、CHO-IR細胞(ヒト由来のインシュリンレセプターを高レベルで発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞)でのその過剰発現が、インシュリンレセプターの自己リン酸化を変えずにIRS-1の活性化を低下させてインシュリンの作用を阻害していることを示した(Kasus-Jacobiら、(1998)上記)。
Grb7ファミリーのアダプタータンパク質は、連続する3つのドメイン：
-  アミノ-終末端に近い、PPと命名されるプロリン-リッチ配列、
-  PH (プレクストリン(Pleckstrin)ホモロジー) と命名される中心ドメイン、及び
-  ホスホチロシンを含む配列と相互作用することが知られている、カルボキシ終末端のSH2と命名されたドメイン(Srcホモロジー2)(Ooi J.ら、(1995) Oncogene, 10, 1621-1630; Margolis B. (1992) 上記; Daly R.J. (1996)上記)
によって特徴付けられる。
【０００８】
他のタンパク質ですでに研究されているこれらのドメインに加えて、発明者らは、タンパク質340〜437残基に相当するPIR(リン酸化インシュリンレセプター相互作用領域)と命名された、rGrb14タンパク質における新規なドメインを明らかにし; Grb7、Grb10及びGrb14タンパク質の比較により、発明者らは、rGrb14 タンパク質の365〜470アミノ酸に相当する43アミノ酸配列がこれらのタンパク質ファミリーをとおして高度に保存されており(Kasus-Jacobiら、(1998)上記)、インシュリンレセプターに対するこれらのタンパク質の付着において特異的な役割を果たしているはずであることを示している。
PIRドメインは、近年hGrb10タンパク質で立証されている(He W.ら、(1998) J. Biol. Chem., 273, 6860-6867) BPSドメイン(PHとSH2のあいだ)に相同であり(Kasus-Jacobiら、(1998)上記)、Grb14 タンパク質のアミノ酸358-434に相当している。
【０００９】
活性化されたインシュリンレセプターとGrb7タンパク質ファミリーとの会合は、2つのドメインPIR及びSH2を伴う。研究中のGrbタンパク質によって、2つのドメイン個々の役割は幾分重要である。具体的には、それは本質的にインシュリンレセプターへのGrb14の結合の原因となるPIRであり(Kasus-Jacobiら、(1998)上記)、一方PIR 及びSH2はGrb10とレセプターとの相互作用に関与している(He ら、(1998)上記)。
幾つかのチームが、インシュリンレセプターのリン酸化及びグルコースの輸送ならびに肥満患者もしくは糖尿病患者でのある種の酵素の活性化におけるインシュリンの作用の修飾に欠点があることを示している(Arner, P.ら、J. N. (1987), Diabetologia, 30, 437-440; Caro, J. F.ら、(1987), J. Clin. Invest., 79, 1330-1337; Mandarino, L.J. (1989), Diab. Metab. Rev., 5, 475-486)。
【００１０】
インシュリンレセプター遺伝子の突然変異は、種々の機序を介して、レセプターのチロシンキナーゼ活性の低下をもたらし、その結果、インシュリン耐性の状態の発現及び肥満ならびに非インシュリン依存性糖尿病(DNID)のような病状の設定に寄与している可能性がある(Taylor, S.I. (1992), Diabetes, 41, 1473-1490)。
インシュリン耐性の状態では、インシュリンの内因性分泌がもはや不十分である場合に、高血糖症が発症し、インシュリン治療に頼って炭水化物のホメオスタシスを維持する必要がある。糖尿病が10年間進行した後には、深刻な合併症が症例の30％でみられる。これらの合併症は、制御困難な血糖症に派生し、種々の極めて深刻な臨床上の係わり合い(腎疾患、壊死及び肢(lower limbs)の切断、失明)を有しており、これにより患者の生存の見込みを短くする。
【００１１】
チロシンキナーゼ活性の標準化は、これが乱れている場合に、直接この酵素に作用する分子を用いるか(Levitzkiら、(1995), Science 267, 1782-1788)、又は間接的にアダプタータンパク質とチロシンキナーゼとの相互作用を阻害する(Pendergastら、(1993), Cell, 75, 175-185)ことによることが考えられ得る。
ここに、発明者らは、驚くべきことに、単独又はSH2フラグメントと組みあわさった(PIR-SH2)、Grb7タンパク質のタンパク質ファミリーのPIRドメイン(Grb14, Grb10 and Grb7)の活性化したインシュリンレセプターに対する結合は、該レセプターのチロシンキナーゼ活性を阻害することを示した。
【００１２】
この発明の対象は、インシュリンに関与する疾患の治療用分子をスクリーニングする手段としての、Grb7タンパク質のタンパク質ファミリーのPIRドメイン又はPIR-SH2ドメインからなるフラグメントの使用である。
この使用の有利な具体例によれば、このフラグメントは、配列：それぞれがrGrb14、hGrb14、mGrb10、hGrb10、rGrb7、hGrb7 及びmGrb7タンパク質のPIRフラグメント(365-407残基及び353-436残基)とPIR-SH2 フラグメント(365-538残基と353-538残基)に相当するSEQ ID NO: 1-28からなる群から選択される。
この発明の目的のために、タンパク質フラグメントの残基の番号付けを、アラインメントの後のrGrb14タンパク質の配列を基準として示す。
【００１３】
興味深いことに、発明者らは、Grb14タンパク質の阻害作用が精製されたGST-PIR及びGST-PRI+SH2融合タンパク質によって再現されることを見出した。これらのタンパク質は、rGrb14のPIRドメイン又はPIR+SH2ドメインとのGSTの融合によって得られる。他方、この阻害作用は、 rGrb14のSH2ドメインとのGST融合によって得られるGST-SH2融合タンパク質を用いては認められない。
予期しなかったことに、発明者らは、PIRドメインのみが全タンパク質のそれに等価な活性を有し、一方PIR+SH2ドメインはPIRが単独で発現されるよりもかなり大きな阻害作用を有することを示している。具体的には、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の全体的な阻害は、GST-PIRタンパク質0.3μgが加えられると生じるが、GST-PIR+SH2についてはわずか0.03μgが必要である。したがって、SH2ドメインはそれ自体で阻害活性を有しないが、他方、それはPIRの作用を著しく増加するものと考えられる。
【００１４】
比較可能な方法において、発明者らは、Grb10のPIR及びPIR+SHドメインがインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に阻害作用を有することを示している。Grb10のSH2ドメインは、それ自体では阻害作用を有しないが、PIRによって誘発される阻害を強く増す。
さらに、発明者らは、インシュリンレセプターは、Grb10及びGrb7よりもGrb14の阻害作用により感受性であり、その作用は、全タンパク質とPIRドメイン又はPIR-SH2ドメインとの双方を用いて得られることを示している。
したがって、Grb14、Grb10 及びGrb7タンパク質のPIR及びPIR-SH2ドメインは、分子アダプターに対して完全に新規な機能であるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に関する内因性阻害剤のようにふるまう。実際、インシュリンレセプターと細胞エフェクターとの中間体であるアダプタータンパク質IRS-1、IRS-2又はShcとは異なり、 Grb7ファミリーのタンパク質の該ドメインは、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に直接作用する。
【００１５】
この結果、Grb14タンパク質ならびに同種のアダプタータンパク質(Grb7ファミリータンパク質)のPIR及びPIR-SH2ドメインは医薬品の潜在的な標的となっている。
具体的には、このタンパク質のドメインの相互作用を増強又は抑制し得る化合物は、インシュリンレセプターのキナーゼタンパク質の活性修飾に関連する生物の疾患を予防又は治療し得る。
【００１６】
したがって、この結果、この発明は、
a)   Grb7タンパク質ファミリーのタンパク質のPIRドメイン又はPIR-SH2ドメインからなるフラグメントの活性化したインシュリンレセプターへの結合を可能にする条件下で、該レセプターを該フラグメントと試験される分子とに接触させ、
b)  チロシンキナーゼ基質を加え、
c)  チロシンキナーゼ活性を測定し、かつ
d)  活性化インシュリンレセプターと該フラグメントからなる対照と比較することによって、チロシンキナーゼ活性の調節(阻害又は刺激)を測定する
ことからなることを特徴とする、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を刺激又は阻害(調節)し得る分子を検出する方法にも関連している。
この発明によれば、フラグメントは、配列SEQ ID NO: 1〜28からなる群から選択することが好ましい。
【００１７】
この方法の有利な具体例によれば、上記工程a)の前の、Grb7タンパク質のタンパク質ファミリーの PIRドメイン又はPIR-SH2ドメインからなるフラグメントのインシュリンレセプターとの相互作用を刺激もしくは阻害(調節)し得る分子の予備選択は、
1)  フラグメントを固体の支持体に固定化し、
2)  試験すべき分子をフラグメントと接触させ、次いで
3)  レセプターをフラグメントに結合させる条件下で、標識し、予め活性化したインシュリンレセプターをインキュベートし、
4)  支持体に保持されていない標識レセプターを分離し、
5)  フラグメントと活性化インシュリンレセプターとのあいだに形成される可能性がある複合体を検出し、かつ
6)  フラグメントとインシュリンレセプターからなる対照との比較により、分子の作用(フラグメント-レセプター相互作用の阻害又は刺激)を測定することによって行われる。
【００１８】
フラグメントを固体支持体に固定化するために、フラグメントは、例えばGSTのようなタンパク質との融合物として発現されてもよい。
レセプターは、例えば放射活性分子で標識されていてもよく、又はGFP (緑蛍光タンパク質)のような蛍光タンパク質に融合していてもよい。
レセプターが蛍光又は放射活性分子で標識されている場合、フラグメントと該レセプターとの相互作用は、固体支持体に保持されている蛍光又は放射活性を測定して検出される。
【００１９】
また、この発明の対象は、インシュリンに関与する疾患、特に糖尿病及び肥満の治療に用いることができる医薬品を製造するための、Grb7 タンパク質のタンパク質ファミリーのPIRドメインもしくはPIR-SH2ドメインからなるフラグメントに結合でき、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を阻害できる分子の使用である。
この使用の有利な具体例によれば、分子は、この発明による方法を用いて得られる。
【００２０】
こうして選択される化合物は、インシュリンに関与する疾患、例えば糖尿病及び肥満又は卵巣症候群(Legro, R.S.ら、(1998), Rec. Progr. Hormone Res., 53, 217-255)もしくは症候群X (Komers, R.ら、(1998), Physiol. Res., 47, 215-225)のようなインシュリン耐性によって特徴づけられる他の病状の予防又は治療に使用できる可能性がある。
上記の記載に加えて、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付図面にも言及する以下の記載から明らかになるであろう他の変更をも含む。
【００２１】
-  図１は、Grb タンパク質のタンパク質ファミリーのアラインメントを示す。ドメインのアミノ酸の同一性の割合は、rGrb14の同種のドメインに対して示す。 PP: プロリン残基のリッチなモチーフ、SH3ドメインを含むタンパク質の結合部位; PH:プレクストリンホモロジードメイン、リン脂質又はタンパク質と会合; PIR リン酸化したインシュリンレセプター相互作用領域; SH2: ホスホチロシン残基と相互作用しうるドメイン。
-  図２は、Grbタンパク質のタンパク質ファミリーのPIRドメイン配列: rGrb14、hGrb14、hGrb10 及び hGrb7のアラインメントを示す。アミノ酸の番号付けは、rGrb14タンパク質の配列を基準にして示す。保存アミノ酸は、星印で示す。Grbタンパク質の365-407残基に相当する保存されたドメインは、グレーで示す。
【００２２】
-  図３は、Grbタンパク質のファミリータンパク質のPIR-SH2ドメインの配列: rGrb14、hGrb10 及び hGrb7を示す。rGrb14 (SEQ ID NO: 4)、hGrb10 (SEQ ID NO: 16)及びhGrb7 (SEQ ID NO: 24)の完全なPIR-SH2ドメイン配列(残基353-538)を示す。rGrb14 (SEQ ID NO: 3)、hGrb10 (SEQ ID NO: 15)及びhGrb7 (SEQ ID NO: 23)のPIR-SH2ドメインのフラグメント405-538の配列に下線を付す。
-  図４は、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対する Grbタンパク質の作用; (●) GST-rGrb14; (▲) GST-mGrb10; (■) GST-rGrb7を示す。結果は、タンパク質を加えずに得られた値の％として示す。実験数 = 4。GST-rGrb14 タンパク質の作用と比較したGST-mGrb10及びGT-rGrb7タンパク質の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【００２３】
-  図５は、rGrb14タンパク質: (●) GST-rGrb14; (▲) rGrb14のGST-PIR ;
0004560215.tif 000002
rGrb14のGST-SH2; (■) rGrb14のGST-PIR+SH2; (◇) rGrb14のGST-PIR+SH2 R464Kによるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果を、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 5。全体的なGST-rGrb14タンパク質の作用と比較した種々のrGrb14構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
-  図６は、mGrb10の種々のドメイン: (●) GST-mGrb10; (▲) mGrb10のGST-PIR;
0004560215.tif 000003
mGrb10のGST-SH2; (■) mGrb10のGST-PIR+SH2; (◇) mGrb10のGST-PIR+SH2 R547Kによるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果は、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 4。全体的なGST-mGrb10タンパク質の作用と比較した種々のmGrb10構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【００２４】
-  図７は、rGrb7の種々のドメイン: (●) GST-rGb7; (▲) rGrb7のGST-PIR;
0004560215.tif 000004
rGrb7のGST-SH2; (■) rGrb7のGST-PIR+SH2によるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果を、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 2。全体的なGST-rGrb7タンパク質の作用と比較した種々のrGrb7構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【００２５】
実施例1: インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性におけるrGrb14、mGrb10 及びrGrb7タンパク質の作用の比較
1.  方法:
弱い胚芽レクチン(weak germ lectin)カラムに細胞溶解物を通過させ、0.3M N-アセチルグルコサミンを用いて保持される糖タンパク質を溶出して、CHO-IR細胞からインシュリンレセプターを部分的に精製する。こうして精製したインシュリンレセプターを室温で1時間インシュリンの存在下(0又は10-7 M)でインキュベートする。次に20μM ATP、MnCl2 及びMgCl2イオン及び[γ-32P] ATPを含む緩衝液を加え、GSTとの融合物として発現される精製Grbタンパク質の量を増すにつれて、レセプターが自己リン酸化できるようにする。30分後、合成基質15μg、ポリGlu-Tyr (4:1)を加える。レセプターのチロシンキナーゼ活性を、30分ポリ Glu-Tyr に放射活性を導入して測定する。
【００２６】
2.  結果:
結果を図４に示す。
GST-rGrb14及びGST-mGrb10融合タンパク質の添加は、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の用量-依存阻害を誘発し、最も高い濃度により酵素の全体的な阻害を可能にする。比較によれば、GST-rGrb7タンパク質は、最大わずか40％の阻害を可能にする。GST-mGrb10の作用に関する用量-応答曲線は、GST-rGrb14の作用の曲線に対して右にシフトする。レセプターのチロシンキナーゼ活性の50％阻害は、それぞれ0.04μgのGST-rGrb14及び0.13μgのGST-mGrb10を用いる場合に得られる。したがって、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性は、mGrb10の作用よりもrGrb14の阻害作用により感受性である。
これらの結果は、Grbタンパク質がインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対して阻害活性を有し、rGrb14タンパク質がもっとも大きな阻害作用を有していることを示している。
【００２７】
実施例2: インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対するrGrb14の種々のドメインの阻害作用
1.  方法:
インシュリンレセプターは、実施例１に記載するように部分的に精製する。rGrb14の種々のドメイン(rGrb14、PIR、SH2、PIR+SH2、PIR+SH2 R464K)は、GSTとの融合物として産生し、精製する。インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対するこれらのタンパク質の阻害作用は、実施例１に記載するように分析する。
2.  結果:
結果を図５に示す。
PIRドメインは、全体的なrGrb14タンパク質の作用に匹敵する阻害作用を発揮するが、SH2ドメインはそのような作用を有しない(PIR+SH2領域を欠失したタンパク質と同様、結果示さず)。しかし、PIR+SH2ドメインは PIR単独又はタンパク質全体よりも極めて大きい阻害作用を有する(最大阻害作用は、タンパク質0.03μgを加えて生じる)。この増強は、PIR+SH2 R464KドメインがPIR単独と同じ作用を有するので、SH2ドメインを不活化する保存されているFLVRESモチーフのアルギニン464残基を突然変異することによって抑制される。
これらの結果は、インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対するrGrb14の阻害作用は、PIRの存在に起因していることを示している。SH2ドメイン単独では作用を有しないが、それはPIR作用を増強する。
【００２８】
実施例3: インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対するmGrb10の種々のドメインの阻害作用
1.  方法:
方法は、実施例２に記載するものと同一である。
2.  結果:
結果を図６に示す。
PIRドメインは、全タンパク質によって奏される作用に匹敵する阻害作用を発揮する。SH2ドメイン単独では阻害作用を有しないが、それは PIRによって発揮される阻害を増強する(PIR+SH2の用量-応答曲線は左にシフトする)。SHドメインのFLLRDSモチーフのアルギニン残基を突然変異することによって、PIR+SH2ドメインの増強作用が阻害される(PIR+SH2 R547K突然変異)。
これらの結果は、rGrb14のPIR又はPIR-SH2ドメインが、 mGrb10のPIR又はPIR-SH2ドメインよりも大きな阻害作用を有することを示している。
【００２９】
実施例4: インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対するrGrb7の種々のドメインの阻害作用
1.  方法:
方法は、実施例２に記載するものと同一である。
2.  結果:
結果を図７に示す。
PIRドメインは、全タンパク質によって奏されるのに匹敵する阻害作用を発揮する。SH2ドメイン単独では阻害作用を有しないが、それはPIRによって奏される阻害を増強する(PIR+SH2の用量-応答曲線が左にシフトする)。rGrb7のPIR及びPIR-SH2ドメインは、rGrb14及びmGrb10タンパク質のPIR ならびにPIR-SH2ドメインの作用に比較して阻害作用が低い。
上記から明らかであるように、この発明は、より詳細に記載したに過ぎないその実施方法、製造及び応用に全く限定されない。逆に、この発明は、この発明の骨子又は範囲から逸脱しないで、当業者に成し得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Grb タンパク質のタンパク質ファミリーのアラインメントを示す。ドメインのアミノ酸の同一性の割合は、rGrb14の同種のドメインに対して示す。 PP: プロリン残基のリッチなモチーフ、SH3ドメインを含むタンパク質の結合部位; PH:プレクストリンホモロジードメイン、リン脂質又はタンパク質と会合; PIR リン酸化したインシュリンレセプター相互作用領域; SH2: ホスホチロシン残基と相互作用しうるドメイン。
【図２】  Grbタンパク質のタンパク質ファミリーのPIRドメイン配列: rGrb14、hGrb14、hGrb10 及び hGrb7のアラインメントを示す。アミノ酸の番号付けは、rGrb14タンパク質の配列を基準にして示す。保存アミノ酸は、星印で示す。Grbタンパク質の365-407残基に相当する保存されたドメインは、グレーで示す。
【図３】  Grbタンパク質のファミリータンパク質のPIR-SH2ドメインの配列: rGrb14、hGrb10 及び hGrb7を示す。rGrb14 (SEQ ID NO: 4)、hGrb10 (SEQ ID NO: 16)及びhGrb7 (SEQ ID NO: 24)の完全なPIR-SH2ドメイン配列(残基353-538)を示す。rGrb14 (SEQ ID NO: 3)、hGrb10 (SEQ ID NO: 15)及びhGrb7 (SEQ ID NO: 23)のPIR-SH2ドメインのフラグメント405-538の配列に下線を付す。
【図４】  インシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性に対する Grbタンパク質の作用; (●) GST-rGrb14; (▲) GST-mGrb10; (■) GST-rGrb7を示す。結果は、タンパク質を加えずに得られた値の％として示す。実験数 = 4。GST-rGrb14 タンパク質の作用と比較したGST-mGrb10及びGT-rGrb7タンパク質の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【図５】  rGrb14タンパク質: (●) GST-rGrb14; (▲) rGrb14のGST-PIR ;
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rGrb14のGST-SH2; (■) rGrb14のGST-PIR+SH2; (◇) rGrb14のGST-PIR+SH2 R464Kによるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果を、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 5。全体的なGST-rGrb14タンパク質の作用と比較した種々のrGrb14構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【図６】  mGrb10の種々のドメイン: (●) GST-mGrb10; (▲) mGrb10のGST-PIR;
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mGrb10のGST-SH2; (■) mGrb10のGST-PIR+SH2; (◇) mGrb10のGST-PIR+SH2 R547Kによるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果は、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 4。全体的なGST-mGrb10タンパク質の作用と比較した種々のmGrb10構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【図７】  rGrb7の種々のドメイン: (●) GST-rGb7; (▲) rGrb7のGST-PIR;
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rGrb7のGST-SH2; (■) rGrb7のGST-PIR+SH2によるインシュリンレセプターのチロシンキナーゼ活性の阻害を示す。結果を、タンパク質を加えないで得られた値の割合として示す。実験数 = 2。全体的なGST-rGrb7タンパク質の作用と比較した種々のrGrb7構築物の作用は、p＜0.05に*、p＜0.01 について**及びp＜0.001ついて*** で示される統計的に有意な差を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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