(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）：
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205                 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の完全長アミノ酸配列（配列番号：３）：
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val
1               5                  10
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe
15                  20
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe
25                  30                  35
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40                  45
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50                  55                  60
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65                  70
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys
75                  80
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg
85                  90                  95
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln
100                 105
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu
110                 115                 120
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln
125                 130
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135                 140
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145                 150                 155
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160                 165
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp
170                 175                 180
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg
185
をコードする塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：２）：
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *
205                 210
である
ことを特徴とする請求項１に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の完全長アミノ酸配列（配列番号：３）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：４）：
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         36
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val
1               5                  10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         72
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe
15                  20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        108
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe
25                  30                  35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        144
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40                  45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        180
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50                  55                  60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        216
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65                  70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        252
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys
75                  80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        288
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg
85                  90                  95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        324
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln
100                 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        360
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu
110                 115                 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        396
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln
125                 130
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        432
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135                 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        468
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145                 150                 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        504
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160                 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        540
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp
170                 175                 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                570
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *
185
である
ことを特徴とする請求項２に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：５）：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC     48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          84
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA         120
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         156
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         192
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         228
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         264
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         300
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         336
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         372
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         408
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         444
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         480
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         516
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         552
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         588
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         624
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         660
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             681
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *
205                 210
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA  731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA  781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG  831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG                 867
を含むＤＮＡ分子である
ことを特徴とする請求項１に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の完全長アミノ酸配列（配列番号：２）をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：６）：
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA                            26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         62
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val
1               5                  10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         98
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe
15                  20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        134
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe
25                  30                  35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        170
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40                  45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        206
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50                  55                  60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        242
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65                  70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        278
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys
75                  80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        314
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg
85                  90                  95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        350
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln
100                 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        386
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu
110                 115                 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        422
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln
125                 130
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        458
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135                 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        494
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145                 150                 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        530
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160                 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        566
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp
170                 175                 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                596
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
185
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT 646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA 696
TGCAAATAAA AAAAACCTTA ACGGTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 746
AAAAAAA                                                753
を含むＤＮＡ分子である
ことを特徴とする請求項２に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：７）：
Met Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205                 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子。
【請求項８】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：８）：
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205                 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子。
【請求項９】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：７）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：９）：
ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
Met Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *
205                 210
である
ことを特徴とする請求項７に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子。
【請求項１０】
前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：８）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：１０）：
ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu Ile Cys
1               5                  10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15                  20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25                  30                  35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile
40                  45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn
50                  55                  60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65                  70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met
75                  80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85                  90                  95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala
100                 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp
110                 115                 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile
125                 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly
135                 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala
145                 150                 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160                 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170                 175                 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185                 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys
195                 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *
205                 210
である
ことを特徴とする請求項８に記載のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子。
【請求項１１】
哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とするルシフェラーゼ  タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、該哺乳動物細胞外へ分泌型ルシフェラーゼの形態で分泌生産されるリポーター・タンパク質として利用することを目的とする、該配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１０のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡの使用。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養可能なヒト由来細胞系である
ことを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明は、海洋プランクトンに由来する新規なルシフェラーゼの組換え発現に利用可能なコード遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼは、発光基質（ルシフェリン）を酵素的に酸化し、バイオルミネッセンスを発する酵素タンパク質であり、種々のバイオ・アッセイ系において、レポーター・タンパク質としての利用が従来から図られている。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において、該宿主細胞内で組換え発現させる目的で、幾つかのルシフェラーゼをコードする遺伝子が採取され、また、その組換え発現系も確立されている。具体的には、ルシフェラーゼの組換え発現系では、宿主細胞内において、異種のプロモーターの制御下、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の転写を行い、転写されたｍＲＮＡにより、ペプチド鎖に翻訳し、目的とするルシフェラーゼ・タンパク質が産生される。【０００３】
宿主細胞内で組換え発現されるルシフェラーゼ・タンパク質が、その細胞外へ分泌される、分泌型ルシフェラーゼを利用すると、培養されている宿主細胞をサンプリングすることなく、分泌された該レポーター・タンパク質を含む培地をサンプリングすることで、該レポーター・タンパク質の産生量を簡便にモニターすることが可能となる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において、経時的にレポーター・タンパク質の産生量変化を観測する際、分泌型ルシフェラーゼを利用すると、各時刻において、所定量の培地をサンプリングし、それに含まれる分泌型ルシフェラーゼの含有濃度をモニターする手法が利用可能となる。かかる用途に利用される、組換え発現可能な、分泌型ルシフェラーゼとして、甲殻類（Ｏｓｔｒａｃｏｄａ）に属するウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ：Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）由来のルシフェラーゼ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｅ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６，  ６５６７−６５７１  （１９８９））、十脚類（Ｄｅｃａｐｏｄａ）に属するヒオトシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｏｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ（Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４８１，  １９−２５  （２０００）；特開２００２−３２０４８２号公報）が報告されている。この二種の分泌型ルシフェラーゼに関して、動物細胞を宿主として、組換え発現させ、分泌生産を行ったことも報告されている。【０００４】
更に、その他の起源において発見された分泌型ルシフェラーゼとして、ともに、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０１５９９３）と、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ３６４１６４；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７９，  Ｎｏ．５  ｐｐ．３２１２-３２１７  （２００４））が報告されている。【０００５】
これらの分泌型ルシフェラーゼは、それぞれの生物に固有の発光基質（ルシフェリン）に作用して発光を起こしているが、種々のバイオ・アッセイ系を構築する上では、より汎用性に富む発光基質（ルシフェリン）に対しても、作用可能であることが望ましい。例えば、より汎用性に富む発光基質（ルシフェリン）として、下記のセレンテラジン：【０００６】
【化１】
0004463280.tif 000002
を利用する際、所望の発光を起こさせることが可能な分泌型ルシフェラーゼは、種々のバイオ・アッセイ系を構築する上で望ましいものである。例えば、甲殻類（Ｏｓｔｒａｃｏｄａ）に属するウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ：Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）由来のルシフェラーゼ、十脚類（Ｄｅｃａｐｏｄａ）に属するヒオトシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｏｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼは、前記セレンテラジンをその発光基質（ルシフェリン）として、利用可能であることが報告されている。
【発明の開示】
【０００７】
既に報告されているルシフェラーゼの幾つかは、
・セレンテラジンをその発光基質（ルシフェリン）として、利用可能である；
・例えば、哺乳動物細胞を宿主として、組換え発現させ、その宿主細胞外に分泌生産が可能である；
という種々のバイオ・アッセイ系を構築する上で、望ましい特性を有している。但し、その種類は、極く限られており、多様なバイオ・アッセイ系を構築する上では、利用可能な分泌型ルシフェラーゼの選択肢を、更に増やすことが望まれている。すなわち、前記の特性を満足する、新規な分泌型ルシフェラーゼを探索し、かかる新規な分泌型ルシフェラーゼの組換え発現に用いる、該分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子の提供が更に望まれている。
【０００８】
本発明は、かかる課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、
少なくとも、
・セレンテラジンをその発光基質（ルシフェリン）として、利用可能である；
・例えば、哺乳動物細胞を宿主として、組換え発現させ、その宿主細胞外に分泌生産が可能である；
という特性を有する、新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子を提供することにある。
【０００９】
本発明者らは、前記の課題を解決すべき、新規なルシフェラーゼの探索を進めた。その結果、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する海洋プランクトンの一種である、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａが、セレンテラジンをその発光基質（ルシフェリン）として、利用可能である、分泌型ルシフェラーゼを産生していることを見出した。そのＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来の分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子のクローニングを進めた結果、実際には、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａは、分泌型ルシフェラーゼを二種産生していることを発見した。このＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来の分泌型ルシフェラーゼ二種；Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２をコードする遺伝子をそれぞれクローニングし、ヒト由来の確立された細胞系統（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）において、組換え発現を行うと、実際に、二種のルシフェラーゼは、該宿主細胞外へ分泌されることを確認した。本発明者らは、これら一連の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の第一形態にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子は、
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）：
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  
205                 210 
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有するＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１１】
その際、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：２）：
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *  
205                 210  
であることが好ましい。例えば、該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：５）：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC     48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          84
Met Met Glu Ile Gln Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA         120
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         156
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         192
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         228
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         264
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         300
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         336
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         372
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         408
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         444
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         480
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         516
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         552
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         588
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         624
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         660
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             681
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *  
205                 210  
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA  731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA  781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG  831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG                 867
を有するＤＮＡ分子であることもできる。
【００１２】
加えて、本発明の第一形態は、下記のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子をも同時に提供する。
【００１３】
すなわち、本発明の第一形態にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子は、
・Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：７）：
Met Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  
205                 210  
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有するＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子；例えば、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：７）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：９）：
ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
2
Met Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *  
205                 210  
であることを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子、
あるいは、
・Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：８）：
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  
205                 210  
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有するＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子；例えば、  前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １変異体の完全長アミノ酸配列（配列番号：８）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：１０）：
ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC ATT TGC          36
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu Ile Cys  
1               5                  10          
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA          72
Phe Ala Leu Val Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys  
15                  20                  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         108
Asp Asp Ile Asp Ile Val Gly Val Glu Gly Lys Phe  
25                  30                  35      
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         144
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile  
40                  45              
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         180
Val Glu Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn  
50                  55                  60  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         216
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro  
65                  70          
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         252
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met  
75                  80                  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         288
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly  
85                  90                  95      
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         324
Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala  
100                 105              
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         360
Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp  
110                 115                 120  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         396
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile  
125                 130          
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         432
Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly  
135                 140                  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         468
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala  
145                 150                 155      
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         504
Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys  
160                 165              
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         540
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu  
170                 175                 180  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         576
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe  
185                 190          
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         612
Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys  
195                 200                  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *  
205                 210  
である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質変異体をコードする遺伝子、
を含んでいる。
【００１４】
一方、本発明の第一形態にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子は、
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２をコードする遺伝子であって、
該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の完全長アミノ酸配列（配列番号：３）：
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val  
1               5                  10          
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe  
15                  20                  
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe  
25                  30                  35      
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly  
40                  45              
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu  
50                  55                  60  
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys  
65                  70          
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys  
75                  80                  
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg  
85                  90                  95      
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln  
100                 105              
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu  
110                 115                 120  
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln  
125                 130          
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr  
135                 140                  
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys  
145                 150                 155      
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys  
160                 165              
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp  
170                 175                 180  
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg  
185                  
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有するＤＮＡ分子である
ことを特徴とするＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１５】
その際、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の完全長アミノ酸配列（配列番号：３）をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列（配列番号：４）：
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         36
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val  
1               5                  10          
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         72
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe  
15                  20                  
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        108
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe  
25                  30                  35      
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        144
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly  
40                  45              
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        180
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu  
50                  55                  60  
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        216
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys  
65                  70          
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        252
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys  
75                  80                  
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        288
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg  
85                  90                  95      
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        324
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln  
100                 105              
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        360
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu  
110                 115                 120  
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        396
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln  
125                 130          
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        432
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr  
135                 140                  
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        468
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys  
145                 150                 155      
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        504
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys  
160                 165              
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        540
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp  
170                 175                 180  
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                570
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg  *  
185                     
であることが好ましい。例えば、該遺伝子は、前記Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の完全長アミノ酸配列（配列番号：２）をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：６）：
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA                            26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         62
Met Gly Val Lys Leu Ile Phe Ala Val Val Cys Val  
1               5                  10          
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         98
Ala Ala Ala Gln Ala Ala Thr Ile Asn Glu Asn Phe  
15                  20                  
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        134
Glu Asp Ile Asp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Phe  
25                  30                  35      
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        170
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly  
40                  45              
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        206
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu  
50                  55                  60  
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        242
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys  
65                  70          
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        278
His Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys  
75                  80                  
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        314
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg  
85                  90                  95      
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        350
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gln  
100                 105              
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        386
Gly Gly Ile Gly Glu Glu Ile Val Asp Met Pro Glu  
110                 115                 120  
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        422
Ile Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gln  
125                 130          
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        458
Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr  
135                 140                  
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        494
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys  
145                 150                 155      
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        530
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys  
160                 165              
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        566
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Ser Gln Val Asp  
170                 175                 180  
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                596
Thr Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *  
185                    
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT 646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA 696
TGCAAATAAA AAAAACCTTA ACGGTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 746
AAAAAAA                                                753
を有するＤＮＡ分子であることもできる。
さらには、本発明は、上記の新規なルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子の用途の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子の用途の発明は、
哺乳動物細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とするルシフェラーゼ  タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、該哺乳動物細胞外へ分泌型ルシフェラーゼの形態で分泌生産されるリポーター・タンパク質として利用することを目的とする、該配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１０のいずれかに記載に記載の塩基配列を有するＤＮＡの使用である。特に好ましくは、前記哺乳動物細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養可能なヒト由来細胞系であることを特徴とするＤＮＡの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明にかかる新規なルシフェラーゼ  タンパク質の起源である海洋プランクトン、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａの外形を、紫外線照射下において、顕微鏡観察した結果を示す。
【図２】図２は、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質のコード遺伝子から組換え発現される、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の組換え発現タンパク質、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の組換え発現タンパク質の発光活性に対するｐＨ依存性を示し、各種バッファー液により調整されるｐＨにおいて、該ルシフェラーゼ  タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテラジンから発せられる青色発光（波長  ４８０ｎｍで測定した発光強度）を、各種バッファー液により調整されるｐＨ値に対して、プロットした結果を示す。
【図３】図３は、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質のコード遺伝子から組換え発現される、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の組換え発現タンパク質、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の組換え発現タンパク質の発光活性の発揮に対する金属陽イオンの必要性を示し、ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を、ｐＨ７．５において、アルカリ金属カチオン（Ｋ＋、Ｎａ＋）、アルカリ土類金属カチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）の存在下、該ルシフェラーゼ  タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテラジンから発せられる青色発光（波長  ４８０ｎｍで測定した発光強度）を対比した結果を示す。
【図４】図４は、発現ベクター；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐｃＤＮＡ３．２を導入した後、細胞損傷の回復処置を終えたＨｅＬａ細胞を、培地中で培養し、組換え発現を誘導した際、培地中に分泌される、成熟型のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １による発光活性の増加を示す。
【図５】図５は、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質と、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼまたはＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼとのアミノ酸配列の比較を示し、上段に、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １とＭｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとの対比、下段に、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １とＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼとの対比を、それぞれ示す。
【図６】図６は、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列、それをコードする塩基配列を対比して示し、両者間で同一の部分アミノ酸配列と、そのコード塩基配列に基づき、選択される、混合プライマー設計の基礎とした、４種の領域を併せて示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子を用いることにより、該ルシフェラーゼ  タンパク質を種々の宿主細胞内において、その天然の発光特性を有する、適正な立体構造を有するタンパク質として組換え発現可能である。また、該組換え発現された、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼは、その発光特性の発揮に必要な金属陽イオン、例えば、アルカリ金属カチオン（Ｋ＋、Ｎａ＋）、アルカリ土類金属カチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）の存在下において、分子状酸素を利用して発光基質のセレンテラジンを酸化し、極大波長λmax＝４８０ｎｍの青色発光を発することが可能である。特に、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を利用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において、該Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子を組換え発現させると、その完全長アミノ酸配列のＮ末部分に存在するシグナル・ペプチドを利用して、宿主の哺乳動物細胞外に分泌型ルシフェラーゼとして産生される利点を有する。すなわち、本発明のＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子を利用する、哺乳動物細胞の組換え発現系を構築することで、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質を宿主細胞外へと分泌されるリポーター・タンパク質として利用することが可能となる。
以下に、本発明のＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子と、それがコードする新規なルシフェラーゼ  タンパク質に関して、より詳しく説明する。【００１８】
まず、本発明にかかる新規な分泌型ルシフェラーゼ  タンパク質二種の起源である動物性プランクトンは、日本の近海で採取された海洋深層水中に見出された、甲殻類プランクトンである。その形態は、白色光照射下において、顕微鏡観察すると白色に見える、Ｗｈｉｔｅ  Ｃｏｐｅｐｏｄａ（赤色の橈脚類）の一種であり、一方、紫外線照射下、顕微鏡観察すると、図１に示す外観を示す。更には、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）を発光基質とするルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンであり、特には、該プランクトン体表の外骨格（甲皮）に存在する殻腺から、その体外へと分泌される、体外分泌型ルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンであることを発見した。【００１９】
該体外分泌型ルシフェラーゼの産生能を有するＷｈｉｔｅ  Ｃｏｐｅｐｏｄａについて、詳細な分類学上の同定を行い、Ｍｅｔａｚｏａ（動物界）、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ（節足動物門）、Ｃｒｕｓｔａｃｅａ（甲殻亜門）、Ｍａｘｉｌｌｏｐｏｄａ（アゴアシ綱）、Ｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ亜綱）、Ｎｅｏｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ下網）、Ｇｙｍｎｏｐｌｅａ（前脚類）、Ｃａｌａｎｏｉｄａ（カラヌス目）、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）、Ｍｅｔｒｉｄｉａ（メトリディア属）に属する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ（メトリディア  パシフィカ）であると結論された。【００２０】
次いで、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子クローニングに先立ち、そのクローニング過程に利用する混合プライマーの設計を行った。【００２１】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａは、体外分泌型ルシフェラーゼを産生することが、確認されたので、同じく、Ｍｅｔｒｉｄｉａ（メトリディア属）に属する海洋プランクトンにおいて報告されている、既知の体外分泌型ルシフェラーゼを検索したところ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ３６４１６４；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７９，  Ｎｏ．５  ｐｐ．３２１２-３２１７  （２００４））が見出された。さらに、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼの報告例を検索したところ、Ｇａｕｓｓｉａ属に属する、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０１５９９３）と、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ属に属する、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｓｐ．  ＣＳＧ−２００１由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０１５９９３）が見出された。【００２２】
検索されたＭｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼ三種のアミノ酸配列間における対比を行ったが、三種の間において、高度に保存されている「共通的配列」は見出されなかった。次に、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼと他の二種のアミノ酸配列間で、個々に対比を行ったところ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼとの間において、相同性の高い領域が存在することを見出した。【００２３】
この結果は、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼが、進化的に同じ起源を有する可能性を示唆している。Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼが、前記二種のルシフェラーゼと、進化的に同じ起源を有するか否かは、確認できないものの、その可能性を仮定して、少なくとも、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ産物を与えることが可能な混合プライマーの設計を試みた。【００２４】
図６に示すように、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列間で、相互にアラインした際、アミノ酸残基数８以上にわたり、同一の部分アミノ酸配列を有する領域を探索すると、合計４箇所が見出された。この４箇所の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を参照し、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡを鋳型として、それぞれ対応するＰＣＲ増幅産物が一種ずつ得られるように、上流側混合プライマー二種と、下流側混合プライマー二種を設計する。すなわち、各混合プライマーは、ｃＤＮＡの塩基配列上、その設計の基礎となる領域とはハイブリッダイズ可能であるが、それ以外の領域にミスフィット・ハイブリッダイズした際、その混合プライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長が困難であるように、各混合プライマーの塩基配列を選択した。【００２５】
具体的には、以下に示す、上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二種の塩基配列を選択した。【００２６】
上流側混合プライマー
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ１  （２６  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−GGC TGC ACY AGG GGA TGY CTK ATM TC−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｋ＝Ｇ，Ｔ；Ｍ＝Ａ，Ｃ）
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ２  （２３  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−GCT ATT GTT GAY ATY CCY GAR AT−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｒ＝Ｇ，Ａ）
下流側混合プライマー
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ２  （２６  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−TC AAG TTG WTC AAT RAA YTG YTC CAT−３’
（Ｗ＝Ａ，Ｔ；Ｒ＝Ｇ，Ａ；Ｙ＝Ｔ，Ｃ）
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ１  （２３  ｍｅｒ：１２種の混合プライマー）
５’−AC ATT GGC AAG ACC YTT VAG RCA−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｖ＝Ａ，Ｇ，Ｃ；Ｒ＝Ｇ，Ａ）
後述するＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クローニング工程においては、ｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡを鋳型として、前記上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二種とを組み合わせた、計４種のＰＣＲ用プライマー対についてＰＣＲ反応を行った際、全てのプライマー対に対して、ＰＣＲ増幅産物を与えるものを選択した。すなわち、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの遺伝子と、少なくとも、４箇所において、極めて高い相同的な塩基配列を有する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のタンパク質をコードする遺伝子を選択した。さらに、改めて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、クローニングを進めた結果、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの遺伝子と、少なくとも、４箇所において、極めて高い相同的な塩基配列を有する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のタンパク質をコードする遺伝子として、二種が選択された。その二種の遺伝子は、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ二種をコードしていること、また、動物細胞中において、それら遺伝子から組換え発現されるタンパク質二種は、ともに、分泌型ルシフェラーゼであることを検証した。【００２７】
具体的には、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子として、下記の二種がクローニングされた。【００２８】
Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC     48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          84
M   M   E   I   Q   V   L   F   A   L   I   C  
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA         120
F   A   L   V   Q   A   N   P   T   E   N   K  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         156
D   D   I   D   I   V   G   V   E   G   K   F  
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         192
G   T   T   D   L   E   T   D   L   F   T   I  
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         228
V   E   D   M   N   V   I   S   R   D   T   N  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         264
L   A   N   S   D   A   D   R   G   K   M   P  
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         300
G   K   K   L   P   L   E   V   L   I   E   M  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         336
E   A   N   A   R   K   A   G   C   T   R   G  
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         372
C   L   I   C   L   S   K   I   K   C   T   A  
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         408
K   M   K   V   Y   I   P   G   R   C   H   D  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         444
Y   G   G   D   K   K   T   G   Q   A   G   I  
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         480
V   G   A   I   V  D   I   P   E   I   S   G  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         516
F   K   E   L   G   P   M   E   Q   F   I   A  
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         552
Q   V   D   L   C   A   D   C   T   T   G   C  
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         588
L   K   G   L   A   N   V   K   C   S   A   L  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         624
L   K   K   W   L   P   D   R   C   A   S   F  
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         660
A   D   K   I   Q   S   E   V   D   N   I   K  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             681
G   L   A   G   D   R   *  
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA  731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA  781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG  831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG                 867
Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列：
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA                            26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         62
M   G   V   K   L   I   F   A   V   V   C   V  
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         98
A   A   A   Q   A   A   T   I   N   E   N   F  
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        134
E   D   I   D   L   V   A   I   G   G   S   F  
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        170
A   L   D   V   D   A   N   R   G   G   H   G  
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        206
G   H   P   G   K   K   M   P   K   E   V   L  
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        242
V   E   M   E   A   N   A   K   R   A   G   C  
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        278
H   R   G   C   L   I   C   L   S   H   I   K  
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        314
C   T   K   K   M   K   K   F   I   P   G   R  
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        350
C   H   S   Y   E   G   D   K   D   S   A   Q  
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        386
G   G   I   G   E   E   I   V   D   M   P   E  
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        422
I   P   G   F   K   D   K   E   P   M   D   Q  
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        458
F   I   A   Q   V   D   L   C   V   D   C   T  
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        494
T   G   C   L   K   G   L   A   N   V   H   C  
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        530
S   D   L   L   K   K   W   L   P   S   R   C  
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        566
K   T   F   A   S   K   I   Q   S   Q   V   D  
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                596
T   I   K   G   L   A   G   D   R   *  
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT 646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA 696
TGCAAATAAA AAAAACCTTA ACGGTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 746
AAAAAAA                                                753
上に示す塩基配列中には、一次選択に利用した、上流側混合プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ２、下流側混合プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ２とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ１がそれぞれハイブリッドする部位が、下線により示されている。
本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質二種；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １とｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２と、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼとの間で、その遺伝子上にコードされている完全長のアミノ酸配列を対比すると、図５に示される通り、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １とＭｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼ、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２とＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの間で、同一性を示すアミノ酸残基、相同的なアミノ酸残基を含めると、相当に高い相同性が見出されている。特には、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の６５番目のＡｓｐ以降とＭｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来ルシフェラーゼの７４番目のＡｓｐ以降、また、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の    番目のＡｓｐ以降とＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来ルシフェラーゼの４０番目のＡｓｐ以降は、極めて高い相同性を示している。すなわち、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ二種は、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼと同種の起源を有するが、進化に伴い、部分的にアミノ酸配列の相違を有する二系統のルシフェラーゼが、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ中では、共存的に発現されていることが推定される。加えて、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の２２番目のＧｌｕよりＮ末側とＭｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来ルシフェラーゼの２１番目のＧｌｕよりＮ末側、また、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の２３番目のＡｓｎよりＮ末側とＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来ルシフェラーゼの２３番目のＡｓｎよりＮ末側は、高い相同性を示している。このＮ末端側は、分泌に際して、利用されるシグナル・ペプチドを含む領域であり、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来ルシフェラーゼにおいては、ＶＱＡ−ＫＳにシグナルペプチダーゼによる切断部位が推定されており、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １においては、対応する部位は、ＶＱＡ−ＮＰであり、また、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来ルシフェラーゼにおいては、ＡＥＡ−ＫＰ、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １においては、ＡＱＡ−ＡＴが相当する可能性がある。相同性を考慮すると、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ二種も、哺乳動物細胞内において、組換え発現した際、疎水性アミノ酸に富むＮ末端のシグナル・ペプチドを利用することで、高い効率で宿主細胞外へ分泌されている。
なお、本発明にかかるＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質二種；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １とｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、プラスミド・ベクター：ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ中のマルチ・クローニング・サイト中に挿入した組換え発現用ベクター二種について、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の組換え発現用ベクター：ｐＭｐＬｕｃ１−１０は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１７９として、また、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の組換え発現用ベクター：ｐＭｐＬｕｃ２−７は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１７８として、それぞれ、国際寄託（平成１６年１２月６日付け）がなされている。
本発明にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼを、レポーター・タンパク質として、哺乳動物細胞内で組換え発現する際には、甲殻類（Ｏｓｔｒａｃｏｄａ）に属するウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ：Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）由来のルシフェラーゼや、十脚類（Ｄｅｃａｐｏｄａ）に属するヒオトシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｏｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼに適用された発現系を利用し、そのコード領域を置換する手法が利用可能である。また、哺乳動物細胞以外に、従来のルシフェラーゼの組換え発現が可能な、バクテリア、酵母、真菌、昆虫細胞などの宿主において、同様にＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼを組換え発現することが可能である。これら組換え発現に利用する際、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼをコードする遺伝子は、必要に応じて、宿主において使用頻度の高いコドンへと変換した上で発現ベクターに挿入することが好ましい。勿論、コドン変換に伴い、その遺伝子によりコードされるアミノ酸配列自体には、変異が導入されない。発現ベクターへの挿入に際し、予めコドン変換された、コード遺伝子は、両端の非コード領域において制限酵素消化し、断片化する。この制限酵素消化を行う際、適当な制限酵素サイトが存在しない場合には、部位特異的変異導入法によって、非コード領域の塩基配列に変異導入して、所望の制限酵素サイトを導入することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。
（甲殻類プランクトン由来の新規なルシフェラーゼの採取）
本発明者らは、日本の近海から採取される、多数種の動物性プランクトンの内から、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）を発光基質とするルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンを探索した。特には、該プランクトン体表の外骨格（甲皮）に存在する殻腺から、その体外へと分泌される、体外分泌型ルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンを探索した。【００３０】
その探索過程において、日本海、富山湾沖合い約２，６００ｍ、水深３２１ｍ（海面下３２１ｍ、海底面上約５ｍ）で採取された海洋深層水中に存在する動物性プランクトン多数種を詳細に調査したところ、白色光照射下において顕微鏡観察すると、白色に見えるＣｏｐｅｐｏｄａ（橈脚類）の一種が、紫外線照射下、顕微鏡観察すると、図１に示す外観を示し、その殻腺から体外へと分泌される、体外分泌型ルシフェラーゼを産生することを見出した。該体外分泌型ルシフェラーゼの産生能を有するＣｏｐｅｐｏｄａについて、詳細な分類学上の同定を行い、Ｍｅｔａｚｏａ（動物界）、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ（節足動物門）、Ｃｒｕｓｔａｃｅａ（甲殻亜門）、Ｍａｘｉｌｌｏｐｏｄａ（アゴアシ綱）、Ｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ亜綱）、Ｎｅｏｃｏｐｅｐｏｄａ（カイアシ下網）、Ｇｙｍｎｏｐｌｅａ（前脚類）、Ｃａｌａｎｏｉｄａ（カラヌス目）、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）、Ｍｅｔｒｉｄｉａ（メトリディア属）に属する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ（メトリディア  パシフィカ）であると結論された。
（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子クローニング用の混合プライマーの設計）
Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子クローニングに先立ち、そのクローニング過程に利用する混合プライマーの設計を行う。【００３１】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａは、体外分泌型ルシフェラーゼを産生することが、確認されたので、同じく、Ｍｅｔｒｉｄｉａ（メトリディア属）に属する海洋プランクトンにおいて報告されている、既知の体外分泌型ルシフェラーゼを検索したところ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ３６４１６４；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７９，  Ｎｏ．５  ｐｐ．３２１２-３２１７  （２００４））が見出された。さらに、Ｍｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼの報告例を検索したところ、Ｇａｕｓｓｉａ属に属する、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０１５９９３）と、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ属に属する、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｓｐ．  ＣＳＧ−２００１由来のルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＹ０１５９９３）が見出された。【００３２】
検索されたＭｅｔｒｉｄｉｎｉｄａｅ（メトリディニダエ科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼ三種のアミノ酸配列間における対比を行ったが、三種の間において、高度に保存されている「共通的配列」は見出されなかった。次に、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼと他の二種のアミノ酸配列間で、個々に対比を行ったところ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼとの間において、相同性の高い領域が存在することを見出した。【００３３】
この結果は、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼが、進化的に同じ起源を有する可能性を示唆している。Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼが、前記二種のルシフェラーゼと、進化的に同じ起源を有するか否かは、確認できないものの、その可能性を仮定して、少なくとも、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ産物を与えることが可能な混合プライマーの設計を試みた。【００３４】
図６に示すように、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列間で、相互にアラインした際、アミノ酸残基数８以上にわたり、同一の部分アミノ酸配列を有する領域を探索すると、合計４箇所が見出された。この４箇所の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を参照し、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡを鋳型として、それぞれ対応するＰＣＲ増幅産物が一種ずつ得られるように、上流側混合プライマー二種と、下流側混合プライマー二種を設計する。すなわち、各混合プライマーは、ｃＤＮＡの塩基配列上、その設計の基礎となる領域とはハイブリッダイズ可能であるが、それ以外の領域にミスフィット・ハイブリッダイズした際、その混合プライマーの３’末端からＤＮＡ鎖の伸長が困難であるように、各混合プライマーの塩基配列を選択した。【００３５】
具体的には、以下に示す、上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二種の塩基配列を選択した。【００３６】
上流側混合プライマー
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ１  （２６  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−GGC TGC ACY AGG GGA TGY CTK ATM TC−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｋ＝Ｇ，Ｔ；Ｍ＝Ａ，Ｃ）
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ２  （２３  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−GCT ATT GTT GAY ATY CCY GAR AT−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｒ＝Ｇ，Ａ）
下流側混合プライマー
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ２  （２６  ｍｅｒ：１６種の混合プライマー）
５’−TC AAG TTG WTC AAT RAA YTG YTC CAT−３’
（Ｗ＝Ａ，Ｔ；Ｒ＝Ｇ，Ａ；Ｙ＝Ｔ，Ｃ）
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ１  （２３  ｍｅｒ：１２種の混合プライマー）
５’−AC ATT GGC AAG ACC YTT VAG RCA−３’
（Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｖ＝Ａ，Ｇ，Ｃ；Ｒ＝Ｇ，Ａ）
下記のＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クローニング工程においては、ｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡを鋳型として、前記上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二種とを組み合わせた、計４種のＰＣＲ用プライマー対についてＰＣＲ反応を行った際、全てのプライマー対に対して、ＰＣＲ増幅産物を与えるものを選択する。すなわち、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ由来のルシフェラーゼとＧａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来のルシフェラーゼの遺伝子と、少なくとも、４箇所において、極めて高い相同的な塩基配列を有する、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のタンパク質をコードする遺伝子を選択する。
（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クローニング）
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの採取
サンプリングされた海洋水より、回収されたＣｏｐｅｐｏｄａ（Ｍ.  ｐａｃｉｆｉｃａ）の４００個体について、水きりした後、合計４ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬中に懸濁し、−８０℃で凍結、保存する。【００３７】
凍結保存したＣｏｐｅｐｏｄａ個体を室温で解凍し、この懸濁液を、１５ｍＬ容テフロン製ホモジナイザー用容器に移し、１０度破砕機にかけ、外殻ならびに体内細胞の破砕を行う。次いで、５ｍＬ容シリンジと２２Ｇ注射針とを利用し、１０回、圧送して、前記細胞破砕物を該注射針内を通過させる処理を施し、細胞破砕物の均一化を行う。【００３８】
得られた均一破砕物を１５ｍＬ容ファルコン・チューブに移し、ＴＲＩＺＯＬ試薬４ｍＬ当たり、０．８ｍＬのクロロフォルムを加えて、１５秒間よくシェイクする。その後、室温で、２〜３分間静置して、相分離を行う。更に、２〜８℃において、１５分間、遠心（１２，０００×ｇ）する。上清（水相）約４ｍＬを、別の１５ｍＬ容ファルコン・チューブに回収する。【００３９】
回収される水相に対して、ＴＲＩＺＯＬ試薬４ｍＬ当たり、２ｍＬのイソプロパノールを添加し、よく混合する。室温で、１０分間保持して、アルコール沈澱を行う。その後、２〜８℃において、１０分間、遠心（１２，０００×ｇ）する。上清を除去し、ペレット（アルコール沈澱画分）を回収する。【００４０】
ペレット（アルコール沈澱画分）に対して、ＴＲＩＺＯＬ試薬４ｍＬ当たり、７５％エタノール４ｍＬを加え、ヴォルテックスにかけ、分散・混合する。分散・混合液を、２〜８℃において、１０分間、遠心（１１，０００ｒｐｍ）する。上清を除き、ペレット（アルコール沈澱画分）を回収する。この洗浄を二度繰り返す。【００４１】
洗浄後、該ＲＮＡ沈澱ペレットを、３７℃に、１０分間放置して、残留する溶媒を蒸散させ、乾燥する。乾燥済みＲＮＡ沈澱ペレットに、ＲＮａｓｅの混入のない水２１０μＬを加えて、１０〜２０分間静置して、再溶解し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料液を調製する。【００４２】
調製されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料液２１０μＬから、一部溶解液（５μＬ）を採取して、波長２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍの吸光度ＯＤ２６０、ＯＤ２８０、ＯＤ３２０（バックグラウンド吸収）を測定する。その結果に基づき、定法に従って、吸光度ＯＤ２６０からＲＮＡ含有濃度を算定する。【００４３】
表１に、得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ試料に関する、ＲＮＡ含有濃度の評価結果を示す。【００４４】
【表１】
0004463280.tif 000003
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製
上で調製した、精製済みのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液（ＲＮＡ含有濃度０．８７２μｇ／μＬ）２０５μＬから、含まれているｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を市販の精製キット；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜ＳＵＰＥＲ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いて分離、精製する。【００４５】
前記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液２００μＬに、同キットに添付のバイブリダイゼーション・バッファー：２×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬを加え、合計４００μＬの液を均一化する。このＲＮＡ溶液に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０の分散液２０μＬを添加し、よく混合する。チューブ中の液を７０℃に加熱し、３分間保持し、引き続き、室温で１０分間放冷して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のｐｏｌｙ（Ａ）末端と、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０のＯｌｉｇｏ−ｄＴプローブ部とのバイブリダイゼーションを行う。５分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を沈澱画分として分離する。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０とバイブリダイゼーションしていないＲＮＡ成分を含む、上清を除去する。【００４６】
沈澱画分を、同キットに添付の洗浄用バッファー３５０μＬ中に分散し、遠心カラム用チューブに移す。３０秒間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、上清を除去する。さらに、同量の洗浄用バッファーを用いて、同じ洗浄操作を行う。【００４７】
二度の洗浄を終えた、沈澱画分に、予め７０℃に加熱した、同キットに添付のＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  ５０μＬを加えて、この混合物を別の遠心カラム用チューブに移す。３０秒間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０のプローブ上から遊離されたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む上清を回収する。沈澱画分に、再度、予め７０℃に加熱した、ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  ５０μＬを加えて、プローブ上からの遊離操作を行い、上清を回収する。回収された上清を合わせ、合計１００μＬの精製済みｍＲＮＡを含む溶液とする。【００４８】
この精製済みｍＲＮＡを含む溶液に、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  １０μＬと、１００％イソプロパノール  １００μＬを添加し、よく混合する。その後、−２０℃、１０分間放置し、含有されるｍＲＮＡをアルコール沈澱させる。３０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）して、析出したｍＲＮＡを沈澱画分に集め、上清を除去する。更に、析出したｍＲＮＡの沈澱画分に、７５％エタノール１ｍＬを加え、よく混合する。５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）して、析出したｍＲＮＡの沈澱画分を分離し、上清を除去する。得られる精製済みのｍＲＮＡ析出物は、ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ（水溶液）  １１μＬ中に再溶解する。【００４９】
精製済みのｍＲＮＡ試料溶液１１μＬから、一部評価用サンプル（０．５μＬ）を取り、ＲＮＡ含有濃度を評価した。表２に、得られた精製済みｍＲＮＡ試料に関する、ＲＮＡ含有濃度の評価結果を示す。【００５０】
【表２】
0004463280.tif 000004
ｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成
市販のｃＤＮＡ合成キットを用いて、精製済みｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応を利用して、ｃＤＮＡを合成する。【００５１】
先ず、下記表３に組成を示す、精製済みのｍＲＮＡ試料溶液と、同キット添付の５’ＣＤＳ（ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）  ｐｒｉｍｅｒ、ＳＭＡＲＴ  ＩＩ  ｏｌｉｇｏを含有する、５’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／５’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）、ならびに、精製済みのｍＲＮＡ試料溶液と、同キット添付の３’ＣＤＳ（ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）  ｐｒｉｍｅｒを含有する、３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）を予め調製する。【００５２】
【表３】
0004463280.tif 000005
各成分を混合し、６５℃に５分間保持した後、得られる混合液を１分間、氷冷する。前記加熱により、混合液中含有されるｍＲＮＡは、いずれも一本鎖ＲＮＡ分子に変換される。【００５３】
なお、前記３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ（３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ）の塩基配列は、
３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ（５７ｍｅｒ）
５’−AAGCAGTGGT AACAACGCAG AGTACTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTVN−３’
（なお、前記配列中、Ｖ：Ａ，Ｇ，Ｃ、  Ｎ：Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ  を意味する）
であり、ｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）末端とｄＴ３０部分において、ハイブリダイズする。
５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ合成、ならびに３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ合成は、予め調製される５’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／５’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）、または、３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）を利用し、下記表４に組成を示す逆転写反応液を調製して行う。【００５４】
【表４】
0004463280.tif 000006
ｃＤＮＡ合成は、同キット添付の逆転写酵素：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III  を利用し、同反応液を、５０℃で、１時間インキュベーションし、その後、７０℃で、１５分間インキュベーションすることにより、鋳型のｍＲＮＡ鎖とハイブリダイズしている、プライマーからＤＮＡ鎖の伸長反応を行う。反応終了後、合成されたｃＤＮＡを含む反応液は、−２０℃で保存する。
ＲＴ−ＰＣＲ反応による、ｃＤＮＡ断片の取得
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡを鋳型として、調製される３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡから、下記表５に示す４組のプライマー対を利用して、ＰＣＲ増幅産物を調製する。【００５５】
【表５】
0004463280.tif 000007
反応液組成と、ＰＣＲ増幅反応の条件を、表６に示す。【００５６】
【表６】
0004463280.tif 000008
各２０μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、５μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。各プライマー対を使用した際、確認されたＰＣＲ増幅産物の塩基数を表７に示す。【００５７】
【表７】
0004463280.tif 000009
以上の結果から、  Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡ中に、Ｍ．  ｌｏｎｇａ、Ｇ．  ｐｒｉｎｃｅｐ由来のルシフェラーゼと類似する部分アミノ酸配列をコードする部分的な塩基配列を有するものが存在していることが確認される。
３’ＲＡＣＥ反応産物、ならびに５’ＲＡＣＥ反応産物の取得
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき調製される、３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ、ならびに５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、下記表８に示す各２組のプライマー対を利用して、それぞれ、３’ＲＡＣＥ反応産物、ならびに５’ＲＡＣＥ反応産物を調製する。【００５８】
【表８】
0004463280.tif 000010
反応液組成と、ＰＣＲ増幅反応の条件を、表９に示す。【００５９】
【表９】
0004463280.tif 000011
各２０μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、５μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。各プライマー対を使用した際、確認された増幅産物の塩基数を表１０に示す。【００６０】
【表１０】
0004463280.tif 000012
３’ＲＡＣＥ反応産物、ならびに５’ＲＡＣＥ反応産物を鋳型とするＮｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物の取得
３’ＲＡＣＥ反応産物、ならびに５’ＲＡＣＥ反応産物を鋳型として、下記表１１に示す各プライマー対を利用して、それぞれ、Ｎｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物を調製する。【００６１】
【表１１】
0004463280.tif 000013
反応液組成と、ＰＣＲ増幅反応の条件を、表１２に示す。【００６２】
【表１２】
0004463280.tif 000014
各２０μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、５μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。
前記３’ＲＡＣＥ反応産物を鋳型として、調製されるＮｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物を一旦、クローニング・ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ中に挿入し、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミド・ベクターの宿主大腸菌へ導入は、以下の手順で実施した。
宿主大腸菌に利用する、ＴＯＰ１０株は、凍結保存されているＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌを、氷温で解凍する。ｃＤＮＡ挿入プラスミド・ベクター溶液  ３μＬを、解凍された宿主大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ懸濁液  ５０μＬに加える。次いで、氷上で１０分間保持した後、４２℃、３０秒加温し、再び、氷上に戻す。ベクター注入処理後、宿主大腸菌を懸濁した液  ５３μＬに、ＳＯＣ培地  １００μＬを加えて、３７℃、１０分間振盪培養する。【００６３】
その後、培養液に含まれる形質転換株を、クローニング・ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯに由来する選択マーカーを利用して、選択する。選択される形質転換株中から、ｃＤＮＡ挿入プラスミド・ベクターを保持するものを選択する。
選別クローン中に導入されているプラスミド・ベクターの複製、精製
選別された４つのクローンから、以下の手順で、導入されているプラスミド・ベクターの複製、精製を行う。【００６４】
宿主大腸菌  ＴＯＰ１０株を用いて、ｃＤＮＡを導入した系において、選別された４つのコロニー（クローン）を、それぞれ１０ｍＬの培地  ＬＢ／Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ中に懸濁し、３７℃、１６時間培養を行った。培養液を、１０分間、遠心（５０００×ｇ）して、細胞を分取した。【００６５】
分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット：ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を利用して、プラスミドを分離、精製する。分取した細胞に、同精製キットに添付のＰ１液  ０．２５ｍＬを添加し、ヴォルテックスにかけて、よく分散させる。この細胞分散液に、添付のＰ２液  ０．２５ｍＬを添加し、混和する。室温（２０℃）に、５分間静置する。次いで、添付のＮ３液  ０．３５ｍＬを添加し、混和する。溶菌処理後、１５分間、４℃で遠心（１１，０００ｒｐｍ）し、プラスミドＤＮＡを可溶性画分（上清）を分離、回収する。【００６６】
プラスミドＤＮＡを含む可溶性画分（上清）を、同精製キットのＱＩＡｐｒｅｐカラムにかける。４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、液層を除去する。バッファーＰＢ  ０．５ｍＬを加えて、洗浄し、引き続き、バッファーＰＥ  ０．７５ｍＬを加えて、洗浄する。最終的に、１分間、４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、洗浄液を除去する。精製キットのＱＩＡｐｒｅｐに吸着されている、プラスミドは、バッファーＥＢ  ３０μＬにより、溶出させ、回収する。この精製済みプラスミドを含む液  ３０μＬのうち、１μＬをとり、蒸留水  ９９μＬを加えて、１００倍希釈液とする。【００６７】
表１３に、各クローンについて、精製済みプラスミドを含む液中に含まれるＤＮＡ濃度を評価した結果を示す。【００６８】
【表１３】
0004463280.tif 000015
選別クローン中のｃＤＮＡ断片（Ｎｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物）の塩基配列解析
前記４種のクローンが保持しているプラスミド・ベクター中に挿入されている、ｃＤＮＡ部分（Ｎｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物）について、以下の手順に従って、その塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。【００６９】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を２５０ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、クローニング・ベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯに由来する部位に対する二種プライマー；Ｍ１３  ｓｅｎｓｅ  Ｍ４，Ｍ１３  ＲＶをシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されているｃＤＮＡを含む領域から調製する。表１４に、用いたＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００７０】
【表１４】
0004463280.tif 000016
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍＬ容チューブに移す。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍＬ容チューブに予め用意する。この１．５ｍＬ容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させる。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスする。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散する。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。９５℃、２分間加熱し、一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷する。一旦、ヴォルテックスにかけた後、再度遠心して、伸長された一本鎖ＤＮＡを含む液を集める。その後、解析用試料ＤＡＮ断片（伸長された一本鎖ＤＮＡ）は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行う。【００７１】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、挿入されているｃＤＮＡ断片（Ｎｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物）の塩基配列を決定する。
３’ＲＡＣＥ反応産物を鋳型として調製される、前記Ｎｅｓｔｅｄ・ＰＣＲ産物の解析された塩基配列に基づき、下記の塩基配列を有する二種の下流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ３，Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ４を設計した。【００７２】
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ３：（３０ｍｅｒ）
５’−AACGATCTCCAGCCAAGCCCTTGATGTTGT−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ４：（３０ｍｅｒ）
５’−TCAGCGCAAAGATCAACTTGAGCAATGAAC−３’
５’ＲＡＣＥ反応産物の再取得
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき、３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ、ならびに５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを再度調製した上で、５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、前記二種の下流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ３，Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ４を利用して、新たに５’ＲＡＣＥ反応産物を調製する。
まず、上記のｔｏｔａｌ  ＲＮＡの採取、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製の手順に従って、別途、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａの９００個体から、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、精製済みｍＲＮＡ試料を調製する。採取されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ならびに、精製済みｍＲＮＡ試料中に含有されるＲＮＡ量を定量した結果を、表１５に示す。【００７３】
【表１５】
0004463280.tif 000017
次いで、上記のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成の手順に従って、前記精製済みｍＲＮＡ試料から、含有される精製済みｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応を利用して、ｃＤＮＡを合成する。
下記表１６に組成を示す、５’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／５’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）、ならびに、３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）を予め調製する。【００７４】
【表１６】
0004463280.tif 000018
各成分を混合し、６５℃に５分間保持した後、得られる混合液を１分間、氷冷する。前記加熱により、混合液中含有されるｍＲＮＡは、いずれも一本鎖ＲＮＡ分子に変換される。
５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ合成、ならびに３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ合成は、予め調製される５’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／５’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）、または、３’ＣＤＳ  ｐｒｉｍｅｒ添加ｍＲＮＡ溶液（ＲＮＡ／３’−Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）を利用し、下記表１７に組成を示す逆転写反応液を調製して行う。【００７５】
【表１７】
0004463280.tif 000019
ｃＤＮＡ合成は、同キット添付の逆転写酵素：Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  III  を利用し、同反応液を、５０℃で、１時間インキュベーションし、さらに、７０℃で、１５分間インキュベーションする処理を行って、鋳型のｍＲＮＡ鎖とハイブリダイズしている、プライマーからＤＮＡ鎖の伸長反応を行う。反応終了後、合成されたｃＤＮＡを含む反応液は、−２０℃で保存する。
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき、新たに調製される５’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、下記表１８に示す各２組のプライマー対を利用して、それぞれ、５’ＲＡＣＥ反応産物を調製する。【００７６】
【表１８】
0004463280.tif 000020
反応液組成と、ＰＣＲ増幅反応の条件を、表１９に示す。【００７７】
【表１９】
0004463280.tif 000021
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、５μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。各プライマー対を使用した際、確認された増幅産物の塩基数を表２０に示す。【００７８】
【表２０】
0004463280.tif 000022
前記５’ＲＡＣＥ反応産物を一旦、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入し、得られるベクターをＣｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミド・ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上で述べた手順に準じて実施した。
その後、培養液に含まれる形質転換株は、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに由来する選択マーカー（薬剤耐性遺伝子）を利用して、薬剤添加培地上で選択する。選択される形質転換株中から、コロニーＰＣＲ法を利用して、ｃＤＮＡ挿入プラスミド・ベクターを保持するものを選択する。
コロニーＰＣＲ法による、ｃＤＮＡ挿入プラスミド・ベクター保持クローンの選別
コロニーＰＣＲ法を利用して、各コロニーを形成する形質転換株中から採取される、プラスミド・ベクター中におけるｃＤＮＡ断片挿入の有無を以下の手順で確認する。
ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲは、
フォワード・プライマーとして、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ１（ｍｉｘｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）、リバース・プライマーとして、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ２（ｍｉｘｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）を利用して、市販のＤＮＡ合成酵素：ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、クローン中に含まれるベクターＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行う。その際、上述するように、プライマー対；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＵＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ  ＬＰ２によるＰＣＲ産物として、１５９ｂｐのＤＮＡ断片が与えるクローンを選択する。表２１に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００７９】
【表２１】
0004463280.tif 000023
シャーレ上のコロニーから、無作為に４８個のコロニーを選択し、各コロニーの菌体を７０μＬの水（ＤＤＷ）に懸濁した。この菌体懸濁液を９５℃、５分間処理した。この菌体から回収されたベクターを含む液を、反応液において、コロニー溶液として利用した。
ＰＣＲ反応の終了後、増幅産物を含む反応液１０μＬから、３μＬを採取して、２％ゲル上で泳動して、ｃＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物の有無、そのサイズ範囲を調べる。無作為に選択した４８個のコロニー中、一次スクリーングにおいて、Ｎｏ．４−７、１０、１８、２２、２４、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３６、３８の１６個のコロニーにおいて、予定される１８９ｂｐのＰＣＲ増幅産物が見出された。【００８０】
引き続き、一次スクリーングで選別された１６個のコロニーについて、下記表２２に示す条件でｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲを行い、二次スクリーングを行う。【００８１】
【表２２】
0004463280.tif 000024
ＰＣＲ反応の終了後、増幅産物を含む反応液１０μＬから、３μＬを採取して、２％ゲル上で泳動して、ｃＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物の有無、そのサイズ範囲を調べる。一次スクリーングにおいて選別された１６個のコロニー中、Ｎｏ．４、５、７、１０、２７、２９、３１、３３の８個のコロニーにおいて、当該クローニング・サイトにｃＤＮＡ断片が挿入されたもの相当するサイズのＰＣＲ増幅産物が明確に見出された。
選別クローンが保持する５’ＲＡＣＥ反応産物が挿入されているプラスミド・ベクターの複製、精製
選別された８つのクローンから、以下の手順で、５’ＲＡＣＥ反応産物が挿入されているプラスミド・ベクターの複製、精製を行う。【００８２】
選別された８つのコロニー（クローン）を、それぞれ１０ｍＬの培地  ＬＢ／Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｉｎ中に懸濁し、３７℃、１５．６時間培養を行った。培養液を、１０分間、遠心（５０００×ｇ）して、細胞を分取した。【００８３】
分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット：ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を利用して、プラスミドを分離、精製する。分取した細胞に、同精製キットに添付のＰ１液  ０．２５ｍＬを添加し、ヴォルテックスにかけて、よく分散させる。この細胞分散液に、添付のＰ２液  ０．２５ｍＬを添加し、混和する。室温（２０℃）に、５分間静置する。次いで、添付のＮ３液  ０．３５ｍＬを添加し、混和する。破菌処理後、１５分間、４℃で遠心（１１，０００ｒｐｍ）し、プラスミドＤＮＡを可溶性画分（上清）を分離、回収する。【００８４】
プラスミドＤＮＡを含む可溶性画分（上清）を、同精製キットのＱＩＡｐｒｅｐカラムにかける。４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、液層を除去する。バッファーＰＢ  ０．５ｍＬを加えて、洗浄し、引き続き、バッファーＰＥ  ０．７５ｍＬを加えて、洗浄する。最終的に、１分間、４℃で遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、洗浄液を除去する。精製キットのＱＩＡｐｒｅｐに吸着されている、プラスミドは、バッファーＥＢ  ３０μＬにより、溶出させ、回収する。この精製済みプラスミドを含む液  ３０μＬのうち、１μＬをとり、蒸留水  ９９μＬを加えて、１００倍希釈液とする。【００８５】
表２３に、各クローンについて、精製済みプラスミドを含む液中に含まれるＤＮＡ濃度を評価した結果を示す。【００８６】
【表２３】
0004463280.tif 000025
選別クローン中のｃＤＮＡ断片（５’ＲＡＣＥ反応産物）の塩基配列解析
前記８種のクローンが保持しているプラスミド・ベクター中に挿入されている、ｃＤＮＡ部分（５’ＲＡＣＥ反応産物）について、以下の手順により、塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。【００８７】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を２５０ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに由来する部位に対する二種プライマー；Ｍ１３  ｓｅｎｓｅ  Ｍ４，Ｍ１３  ＲＶをシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されているｃＤＮＡを含む領域から調製する。表２４に、用いたＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００８８】
【表２４】
0004463280.tif 000026
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍＬ容チューブに移す。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍＬ容チューブに予め用意する。この１．５ｍＬ容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させる。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスする。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散する。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。９５℃、２分間加熱し、伸長された一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷する。一旦、ヴォルテックスにかけた後、再度遠心して、一本鎖ＤＮＡを含む液を集める。その後、解析用試料ＤＡＮ断片（伸長された一本鎖ＤＮＡ）は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行う。【００８９】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、挿入されているｃＤＮＡ断片（５’ＲＡＣＥ反応産物）の塩基配列を決定する。
８種のクローンについて、決定された５’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列を相互に比較したところ、そのＯＲＦ部分にコードされるＮ末側アミノ酸配列が相違する二種の５’ＲＡＣＥ反応産物が見出された。二種の５’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列に基づき、それぞれ５’−側の非翻訳領域部分から、下記の三種の上流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ２、およびＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１を設計した。
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１：（３９  ｍｅｒ）
５’−GGAGACAACTGGATCCAAAAGGAAAGGAGCTAAATCTAC−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ２：（２９  ｍｅｒ）
５’−AAAAGGAAAGGAGCTAAATCTACAGTCTA−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１：（３７  ｍｅｒ）
５’-GAGTCCAAACTGAAAGGTACTCAAAAATGGGAGTCAA−３’
３’ＲＡＣＥ反応産物の再取得
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき再度調製された、３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、前記三種の上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ２、およびＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１を利用して、それぞれの上流側プライマーから核酸鎖の伸長がなされた、３’ＲＡＣＥ反応産物を新たに調製する。
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき、新たに調製される３’  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、下記表２５に示す各２組のプライマー対を利用して、それぞれ、３’ＲＡＣＥ反応産物を調製する。【００９０】
【表２５】
0004463280.tif 000027
反応液組成と、ＰＣＲ増幅反応の条件を、表２６に示す。【００９１】
【表２６】
0004463280.tif 000028
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、５μＬの反応液を採取し、１％アガロース・ゲル上で泳動し、ＰＣＲ増幅産物（３’ＲＡＣＥ反応産物）の分子量を確認する。
再取得される３’ＲＡＣＥ反応産物を一旦、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中に挿入し、得られるベクターをＣｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。再取得される３’ＲＡＣＥ反応産物がサブ・クローニングされているプラスミド・ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上記５’ＲＡＣＥ反応産物をサブ・クローニングした形質転換株の作製手順に準じて、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌを利用して実施した。
選別クローン中のｃＤＮＡ断片（３’ＲＡＣＥ反応産物）の塩基配列解析
選別された各クローンが保持しているプラスミド・ベクター中に挿入されている、再取得される３’ＲＡＣＥ反応産物を含む部分を鋳型として、以下の手順で塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。【００９２】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を７０〜１００ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに由来する部位に対する二種プライマー；Ｍ１３  ｓｅｎｓｅ  Ｍ４，Ｍ１３  ＲＶのうち、Ｍ１３  ＲＶのみをシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されている３’ＲＡＣＥ反応産物を含む領域から調製する。表２７に、用いたＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【００９３】
【表２７】
0004463280.tif 000029
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍＬ容チューブに移す。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍＬ容チューブに予め用意する。この１．５ｍＬ容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させる。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスする。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散する。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。９５℃、２分間加熱し、一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷する。一旦、ヴォルテックスにかけた後、再度遠心して、伸長された一本鎖ＤＮＡを含む液を集める。その後、解析用試料ＤＡＮ断片（伸長された一本鎖ＤＮＡ）は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行う。
各１０コロニーの形質転換株を選択し、前記三種の上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ２、およびＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１を利用して、それぞれの上流側プライマーから核酸鎖の伸長がなされた、３’ＲＡＣＥ反応産物について、新たに解析された塩基配列を比較する。一つのクローン：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ１−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  Ｎｏ．１０中に保持されている、上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１から伸長される３’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列は、下記のものであることが判明した。
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’ＲＡＣＥ  Ｎｏ．１０  塩基配列
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC     48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC          84
M   M   E   I   Q   V   L   F   A   L   I   C  
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA         120
F   A   L   V   Q   A   N   P   T   E   N   K  
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT         156
D   D   I   D   I   V   G   V   E   G   K   F  
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC         192
G   T   T   D   L   E   T   D   L   F   T   I  
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT         228
V   E   D   M   N   V   I   S   R   D   T   N  
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT         264
L   A   N   S   D   A   D   R   G   K   M   P  
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG         300
G   K   K   L   P   L   E   V   L   I   E   M  
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA         336
E   A   N   A   R   K   A   G   C   T   R   G  
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA         372
C   L   I   C   L   S   K   I   K   C   T   A  
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT         408
K   M   K   V   Y   I   P   G   R   C   H   D  
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA         444
Y   G   G   D   K   K   T   G   Q   A   G   I  
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA         480
V   G   A   I   V   D   I   P   E   I   S   G  
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT         516
F   K   E   L   G   P   M   E   Q   F   I   A  
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC         552
Q   V   D   L   C   A   D   C   T   T   G   C  
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC         588
L   K   G   L   A   N   V   K   C   S   A   L  
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT         624
L   K   K   W   L   P   D   R   C   A   S   F  
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG         660
A   D   K   I   Q   S   E   V   D   N   I   K  
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA                             681
G   L   A   G   D   R   *  
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA  731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA  781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG  831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG                 867
一つのクローン：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ１−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  Ｎｏ．７中に保持されている、上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１から伸長される３’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列は、下記のものであることが判明した。
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’ＲＡＣＥ  Ｎｏ．７  塩基配列
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA                            26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT         62
M   G   V   K   L   I   F   A   V   V   C   V  
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT         98
A   A   A   Q   A   A   T   I   N   E   N   F  
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT        134
E   D   I   D   L   V   A   I   G   G   S   F  
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT        170
A   L   D   V   D   A   N   R   G   G   H   G  
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT        206
G   H   P   G   K   K   M   P   K   E   V   L  
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC        242
V   E   M   E   A   N   A   K   R   A   G   C  
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG        278
H   R   G   C   L   I   C   L   S   H   I   K  
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA        314
C   T   K   K   M   K   K   F   I   P   G   R  
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG        350
C   H   S   Y   E   G   D   K   D   S   A   Q  
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA        386
G   G   I   G   E   E   I   V   D   M   P   E  
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA        422
I   P   G   F   K   D   K   E   P   M   D   Q  
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA        458
F   I   A   Q   V   D   L   C   V   D   C   T  
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC        494
T   G   C   L   K   G   L   A   N   V   H   C  
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC        530
S   D   L   L   K   K   W   L   P   S   R   C  
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT        566
K   T   F   A   S   K   I   Q   S   Q   V   D  
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA                596
T   I   K   G   L   A   G   D   R   *  
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT 646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA 696
TGCAAATAAA AAAAACCTTA ACGGTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 746
AAAAAAA                                                753
これら二種の塩基配列を対比すると、前者は、２１０アミノ酸残基をコードするＯＲＦを含み、後者は、１８９アミノ酸残基をコードするＯＲＦを含んでいる。前者の遺伝子によりコードされているタンパク質を、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １と、後者の遺伝子によりコードされているタンパク質を、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２と命名する。
このＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １をコードする塩基配列部分から、下記の下流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１Ｂ  ＬＰ１を設計した。
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１Ｂ  ＬＰ１：（３７  ｍｅｒ）
５’−ACTGTTGACTAGATTGGTGTCTCTACTGATGACATTC−３’
該Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１Ｂ  ＬＰ１は、ＯＲＦ中の下記の部分に相補的な塩基配列である。
G AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT CTA GTC AAC ACT
N   V   I   S   R   D   T   N   L   A   N   S 
加えて、上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’−ＵＰ１から伸長される３’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列中、３’末端側非翻訳領域の塩基配列に基づき、下記二種の下流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’−ＬＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’−ＬＰ２を設計した。また、上流側プライマー：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ５’−ＵＰ１から伸長される３’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列中、３’末端側非翻訳領域の塩基配列に基づき、下記二種の下流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’−ＬＰ１とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’−ＬＰ２を設計した。
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’−ＬＰ１：（２７ｍｅｒ）
５’−GGATTACATAGAATATATTTATAGGAA−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’−ＬＰ２：（２９ｍｅｒ）
５’−CATGATCCAGTTATCTCTTGTTCTGTTCT−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’−ＬＰ１：（２８ｍｅｒ）
５’−ATTTTTACATAGTTATGGTTTAATACGA−３’
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’−ＬＰ２：（２９ｍｅｒ）
５’−TAACATCATTGGGCTAAAGTATCATCATC−３’
５’ＲＡＣＥ反応産物の再取得
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のｍＲＮＡに基づき、前記下流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１Ｂ  ＬＰ１を利用し、該下流側プライマーから核酸鎖の伸長がなされた、５’ＲＡＣＥ反応産物を新たに調製する。【００９４】
再取得される５’ＲＡＣＥ反応産物を一旦、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中に挿入し、ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。サブ・クローニングされている５’ＲＡＣＥ反応産物部分を利用して、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の遺伝子の５’未翻訳領域に相当する部分の塩基配列を再度解析する。【００９５】
すなわち、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ由来の選択マーカーを利用して、選別された形質転換株について、下流側プライマー；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１Ｂ  ＬＰ１の３’末端から、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の遺伝子の５’未翻訳領域へと、核酸鎖の伸長がなされた５’ＲＡＣＥ反応産物を含む、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ５’ＲＡＣＥ  ＬＰ１Ｂ−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯのサブクローン群が保持する５’ＲＡＣＥ反応産物の塩基配列を解析し、その５’未翻訳領域、ならびにＯＲＦのＮ末部分をコードする部分の塩基配列の再確認を行う。【００９６】
選別された各クローンが保持しているプラスミド・ベクター中に挿入されている、再取得される５’ＲＡＣＥ反応産物を含む部分を鋳型として、以下の手順で塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。【００９７】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を７０〜１００ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、クローニング・ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに由来する部位に対する二種プライマー；Ｍ１３  ｓｅｎｓｅ  Ｍ４，Ｍ１３  ＲＶのうち、Ｍ１３  ｓｅｎｓｅ  Ｍ４のみをシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されている５’ＲＡＣＥ反応産物を含む領域から調製する。【００９８】
同時に、上で選択される３’ＲＡＣＥ反応産物を保持する、サブクローン群：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ１−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  Ｎｏ．１、４、５、６、７、９、１０、ならびに、サブクローン群：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ２−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  Ｎｏ．２、３、４、５、６、７、８、９、１０についても、その５’未翻訳領域、ならびにＯＲＦのＮ末部分をコードする部分の塩基配列を解析する。【００９９】
表２８に、用いたシークエンス用プライマー、ＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【０１００】
【表２８】
0004463280.tif 000030
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍＬ容チューブに移す。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍＬ容チューブに予め用意する。この１．５ｍＬ容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させる。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスする。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散する。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。９５℃、２分間加熱し、一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷する。一旦、ヴォルテックスにかけた後、再遠心して、伸長された一本鎖ＤＮＡを含む液を集める。その後、解析用試料ＤＡＮ断片（伸長された一本鎖ＤＮＡ）は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行う。
各サブクローンにおける、５’未翻訳領域、ならびにＯＲＦのＮ末部分をコードする部分の塩基配列の解析結果に基づき、ＯＲＦの５’末端に位置する開始コドン（ＡＴＧ）から、３’末端の終止コドン（ＴＧＡ）までの、翻訳領域のＰＣＲ増幅用の上流側プライマー、下流側プライマーを以下のように設計した。その際、これらの上流側プライマー、下流側プライマー対を利用して作製されるＰＣＲ増幅は、発現用ベクターｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯへ組み込みが可能な形態とする。【０１０１】
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １のコード配列（ＯＲＦ）増幅用
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−４  ｐＥＴ−ＵＰ：（３４ｍｅｒ）
CACC ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC
M   M   E   I   K   V   L   F   A   L  
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−９  ｐＥＴ−ＵＰ：（３４ｍｅｒ）
CACC ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC
M   M   E   V   K   V   V   F   A   L  
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０  ｐＥＴ−ＵＰ：（３４ｍｅｒ）
CACC ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC 
M   M   E   I   Q   V   L   F   A   L  
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ｐＥＴ−ＬＰ：（２９ｍｅｒ）
TCA ACG ATC TCC AGC CAA GCC CTT GAT GT
下記のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １におけるＣ末部分のコード配列と相補的は塩基配列である。
AC ATC AAG GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 
I   K   G   L    A   G   D   R   *  
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２のコード配列（ＯＲＦ）増幅用
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ｐＥＴ−ＵＰ：（３０ｍｅｒ）
CACC ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GT 
M   G   V   K   L   I   F   A    
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ｐＥＴ−ＬＰ：（２８ｍｅｒ）
TCA ACG ATC TCC AGC TAA GCC CTT GAT G
下記のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２におけるＣ末部分のコード配列と相補的は塩基配列である。
C ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 
I   K   G   L   A   G   D   R   *  
（Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現）
プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ中へのＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質遺伝子の挿入
先ず、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １のコード配列を内在する、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ１−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔのプラスミド・ベクターを保持する単離クローン、あるいは、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １のコード配列を内在する、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ３’ＲＡＣＥ  ＵＰ１−ＵＰＭ／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔのプラスミド・ベクターを保持する単離クローンより回収したベクターを鋳型として、上記ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーを利用し、以下の条件でＰＣＲ増幅産物を調製する。表２９に、鋳型とＰＣＲ用プライマー対の組み合わせ、ＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【０１０２】
【表２９】
0004463280.tif 000031
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製は、以下の手順で行った。【０１０３】
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、合計３回の反応液を合わせ、２μＬの反応液を採取し、１．６％アガロース・ゲル上で泳動し、目的分子量のＰＣＲ増幅産物を確認する。【０１０４】
次いで、反応液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ  製）で濃縮する。反応液１容（７３μＬ）当たり、バッファーＰＢ  ５容を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移した。３０秒間遠心し、ＤＮＡを吸着させたカラムを分離し、上清を除去する。ＤＮＡを吸着させたカラムをバッファーＰＥ  ０．７ｍＬで洗浄し、さらに１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）して、カラムを分離し、バッファーＰＥを完全に除去する。その後、カラムに溶出バッファーＥＢ  １０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。この溶出処理後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、カラムから溶出されたＤＮＡを含む上清を、１．５ｍＬ容ｅｐｐｅｎチューブに回収する。【０１０５】
回収されたＤＮＡ溶液に、１０×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  液  ２μＬを添加した後、１．０％  ＴＡＥ  アガロース・ゲル上、各レーン  ＤＮＡ溶液  １２μＬを泳動した。目的分子量のバンドをゲルから切り出す。１．５ｍＬ容ｅｐｐｅｎチューブ中に、ゲル切片を入れ、ＤＮＡを回収する。【０１０６】
精製済み二本鎖ＤＮＡを、市販のプラスミドｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）中に挿入し、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ  タンパク質の遺伝子（コード配列部分）をベクター中にクローニングする。構築されたベクターを用いて、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミド・ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上で説明した手順に従って、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌを利用して実施した。
コロニーＰＣＲ法による、ルシフェラーゼ  タンパク質の遺伝子（コード配列部分）挿入プラスミド・ベクター保持クローンの選別
コロニーＰＣＲ法を利用して、各コロニーを形成する形質転換株中から採取される、プラスミド・ベクター中におけるｃＤＮＡ断片挿入の有無を以下の手順で確認する。
ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲは、
フォワード・プライマーとして、プラスミドｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯに由来するＴ７  プライマー、リバース・プライマーとして、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１  ｐＥＴ−ＬＰまたはＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２  ｐＥＴ−ＬＰを利用して、市販のＤＮＡ合成酵素：ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、クローン中に含まれるベクターＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行う。その際、使用するプライマー対によるＰＣＲ産物として、下記する分子量のＤＮＡ断片を与えるクローンを選択する。表３０に、用いたＰＣＲ反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【０１０７】
【表３０】
0004463280.tif 000032
シャーレ上のコロニーから、無作為にコロニーを選択し、各コロニーの菌体を７０μＬの水（ＤＤＷ）に懸濁した。この菌体懸濁液を９５℃、５分間処理した。この菌体から回収されたベクターを含む液を、反応液において、コロニー溶液として利用した。【０１０８】
ＰＣＲ反応の終了後、増幅産物を含む反応液１０μＬから、３μＬを採取して、２％ゲル上で泳動して、ｃＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物の有無、そのサイズ範囲を調べる。【０１０９】
ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲ法を利用するスクリーングにおいて、一次選別されたコロニー中、
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−４／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．２，３
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−９／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．２
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．３，５
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−６／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．１
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．４，６
Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−８／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０：Ｎｏ．２，５
のコロニーにおいて、予定されるＰＣＲ増幅産物が明確に見出された。
選別された各クローンが保持しているプラスミド・ベクター中に挿入されている、ルシフィラーゼ  タンパク質の遺伝子を含む部分を鋳型として、以下の手順で塩基配列解析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。【０１１０】
選別クローンから回収、精製したプラスミド・ベクターを含む液について、そのＤＮＡ濃度を７０〜１００ｎｇ／μＬとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークエンス用ＤＮＡ試料調製キット：ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより、この精製済みプラスミド・ベクターを鋳型として、塩基配列解析用の試料を、クローニング・ベクターｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯに由来する部位に対する二種プライマー；Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒ，Ｔ７  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒをシークエンス・プライマーとして利用し、プラスミド・ベクター中に挿入されているｃＤＮＡを含む領域から調製する。【０１１１】
表３１に、用いたシークエンス用プライマー、ＤＮＡ鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。【０１１２】
【表３１】
0004463280.tif 000033
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の０．５ｍＬ容チューブに移す。試料溶液  ５μＬ当たり、３Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液  ０．５μＬ、９５％エタノール  １２．５μＬの比率で混合した液を、別途、１．５ｍＬ容チューブに予め用意する。この１．５ｍＬ容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷下に、１０分間静置し、含まれるＤＮＡ断片をエタノール沈澱（析出）させる。２０分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出したＤＮＡ断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、１２５μＬの７０％エタノールを加え、析出ＤＮＡ断片をリンスする。再び、５分間、遠心（１４，０００ｒｐｍ）し、析出ＤＮＡ断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出ＤＮＡ断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料ＤＡＮ断片は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）中に再分散する。ヴォルテックスにかけて、混合した後、遠心して液を集める。９５℃、２分間加熱し、一本鎖ＤＮＡに分離し、氷冷する。一旦、ヴォルテックスにかけた後、再遠心して、伸長された一本鎖ＤＮＡを含む液を集める。その後、解析用試料ＤＡＮ断片は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、塩基配列解析を行う。【０１１３】
塩基配列解析の結果、前記の選別された各クローンでは、上記ＰＣＲ用ファワード・プライマーとリバース・プライマーを利用し、調製されるＰＣＲ増幅産物が、プラスミドｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯのクローニング・サイト中に挿入されていることが確認される。
なお、使用された上流側プライマーの塩基配列の違いに伴い、ＰＣＲ増幅産物中のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １のコード配列は、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−４／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−９／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０に保持される配列と、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０に保持される配列とは、そのＮ末領域に相当する部分に相違を有する。すなわち、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−４／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−９／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０に保持される配列と、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０に保持される配列とは、互いに、Ｎ末領域に相当する部分にアミノ酸置換を有する変異体タンパク質のコード配列となっている。
（Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体の発光特性）
選別された二種のクローン；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０について、ベクターｐＥＴ１０１−ＴＯＰＯ由来のプロモーターから、ＩＰＴＧを用いて、挿入された遺伝子の発現を誘導し、４時間経過した時点で培養菌体を回収する。菌体破砕後、遠心（１５，０００ｒｐｍ；１８，８００×ｇ）により分離した、可溶性画分（細胞質成分）ならびに不溶性画分（膜成分）にそれぞれ含まれるタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その結果、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）中に、目的とするルシフェラーゼ  タンパク質に相当する新たなバンドが見出される。【０１１４】
形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）に対して、１００ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、ｐＨ７．５において、発光基質のセレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）を加えたところ、極大波長λmax＝４８０ｎｍの青色発光が観測される。すなわち、宿主大腸菌内において、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の遺伝子、ならびにＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の遺伝子から、それぞれルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体が産生されていることが確認される。また、その発光活性の発揮には、Ｃａ等の二価の金属陽イオンが必要であることが示唆される。
（Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体の発光特性のｐＨ依存性）
選別された二種のクローン；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０について、前述するルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を含有する、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）を用いて、各ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体の発光特性のｐＨに対する依存性を評価する。【０１１５】
５０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下、ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を含有する液のｐＨを種々に変化させ、その酵素活性に伴い、発光基質のセレンテラジンから発せられる。【０１１６】
図２には、本発明にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を、下記の各種バッファー液により調整されるｐＨにおいて、該ルシフェラーゼ  タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテラジンから発せられる青色発光（波長  ４８０ｎｍで測定した発光強度）を、各種バッファー液により調整されるｐＨ値に対して、プロットした結果を示す。少なくとも、ｐＨ  ６．５〜９．０の範囲においては、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の組換え発現体は、所望の水準の発光特性を示すことが確認される。
ｐＨ調整用バッファー液：
pH5.0   Acetate
pH5.5   Acetate
pH6.0   Phosphate
pH7.0   HEPES
pH8.0   Tris-HCl
pH8.5   Tris-HCl
pH8.9   Tris-HCl
pH10.0  Carbonate
（Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体の発光特性発揮に対する金属陽イオンの必要性）
選別された二種のクローン；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０とＷｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１／ＴＯＰ１０について、前述するルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を含有する、形質転換大腸菌の可溶性画分（細胞質成分）を用いて、各ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体の発光特性発揮に対する、金属陽イオンの必要性を評価する。【０１１７】
図３には、本発明にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現体を、ｐＨ７．５において、アルカリ金属カチオン（Ｋ＋、Ｎａ＋）、アルカリ土類金属カチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）の存在下、該ルシフェラーゼ  タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテラジンから発せられる青色発光（波長  ４８０ｎｍで測定した発光強度）を対比した結果を示す。少なくとも、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の組換え発現体は、所望の水準の発光特性を発揮する上では、アルカリ金属カチオン（Ｋ＋、Ｎａ＋）、アルカリ土類金属カチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）が、５０ｍＭ程度存在することが必要であることが確認される。
（Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のヒト細胞内における組換え発現）
プラスミドｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ中へのＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １の遺伝子、あるいは、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２の遺伝子の挿入
上述する大腸菌中における組換え発現に利用する、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の発現ベクター：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１の作製手順に準じて、ＰＣＲ法で調整される、精製済み二本鎖ＤＮＡを、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製）のクローニング・サイト中に挿入し、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のヒト細胞内発現用発現ベクターを作製する。【０１１８】
なお、かかるヒト細胞内発現用発現ベクター中に挿入されている二本鎖ＤＮＡ断片は、前記発現ベクター：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１中に挿入されているコード遺伝子と同じ塩基配列を有し、ヒトにおけるコドン選択に適合するようなコドン変換は施されていない。すなわち、上記発現ベクター：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１中に挿入される二本鎖ＤＮＡ断片と同じものである。一旦作製される発現ベクター；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐｃＤＮＡ３．２、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐｃＤＮＡ３．２は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＴＯＰ１０株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミド・ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上で説明した手順に従って、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌを利用して実施した。【０１１９】
ｃｏｌｏｎｙ  ＲＣＲ法を利用するスクリーングによって、前記発現ベクター：Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐＥＴ１０１、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐＥＴ１０１中に挿入されているコード遺伝子と同じ塩基配列を有するｃＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択する。また、実際に塩基配列解析を行い、その挿入部の塩基配列の確認を行う。【０１２０】
該選択されたクローン株の培養により、作製されたプラスミドの回収、精製は、市販のプラスミド精製キット；ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  製）を用いて行う。
Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のヒト細胞内発現用発現ベクターのＨｅＬａ細胞への導入
精製済みの、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のヒト細胞内発現用発現ベクターを、ＨｅＬａ細胞中に、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ  製）を利用して導入する。宿主のＨｅＬａ細胞は、血清添加培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１００μｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を用いて、１００ｍｍ  Ｄｉｓｈ上で、７０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態まで培養されたものを利用する。その際、発現ベクター・プラスミド溶液（ＤＮＡ含有量：１μｇ／μＬ）６．０μＬに、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ５０．０μＬを加え、この混合液を１０秒間攪拌後、複合体形成のため室温で１０分間インキュベーションし、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ処理に使用する。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ処理後、ＨｅＬａ細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃に保持し、２４〜４８時間インキュベーションする。この間に、処置に伴う細胞損傷の回復と、培養細胞内において、導入された遺伝子の発現を行う。【０１２１】
この発現ベクターを導入されたＨｅＬａ細胞内における、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質の組換え発現を誘導したところ、培養細胞中で発現されるルシフェラーゼ  タンパク質は、細胞外に分泌され、培地中に分泌型のルシフェラーゼ  タンパク質として蓄積されることが観測された。すなわち、ヒト由来のＨｅＬａ細胞内においても、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のコード遺伝子に基づき、完全長のアミノ酸配列を有するプレ・タンパク質型組換え体へと翻訳がなされる。その後、そのＮ末に存在するシグナル・ペプチド部を利用して、細胞外へ成熟型タンパク質として、分泌されることを明確に示している。【０１２２】
図４は、発現ベクター；Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ１−１０／ｐｃＤＮＡ３．２、Ｗｈｉｔｅ  ｌｕｃ２−７／ｐｃＤＮＡ３．２をそれぞれ導入した後、細胞損傷の回復処置を終えたＨｅＬａ細胞を、培地中で培養し、組換え発現を誘導した際、培地中に分泌される、成熟型のＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １による発光活性の増加、ならびに、Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ２による発光活性の増加を示す。培養中、組換え発現を誘導した状態で、２４時間経過した時点と、４８時間経過した時点とで、培地中におけるルシフェラーゼ  タンパク質による発光活性と、培養細胞内に残余するルシフェラーゼ  タンパク質による発光活性とを比較している。培地中におけるルシフェラーゼ  タンパク質による発光活性が、培養時間の経過とともに、格段に増加していることが確認される。【０１２３】
従って、該Ｍ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来ルシフェラーゼ  タンパク質のコード遺伝子は、ヒト細胞におけるコドン選択に適合させるコドン変換を施さなくとも、十分に、各種のヒト由来の細胞系を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能であり、かつ、発現後、細胞外へと分泌されるリポーター・タンパク質のコード遺伝子として利用することが可能であることが検証される。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明にかかるＭ．  ｐａｃｉｆｉｃａ由来の二種のルシフェラーゼ  タンパク質をコードする遺伝子は、いずれも、哺乳動物細胞を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系において、該宿主細胞内で発現可能であり、かつ、かかる遺伝子から発現後、組換え発現型ルシフェラーゼ  タンパク質は、宿主細胞外へと分泌されるリポーター・タンパク質として利用することが可能である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【配列表】
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