(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子と、該磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したハイブリッドタンパク質とからなり、該ハイブリッドタンパク質が本来的に該有機膜に結合して生成する後記の配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質の膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該ｍｐｓタンパク質の膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖と、少なくとも一種の他のタンパク質とが融合により結合してなるハイブリッドタンパク質である、タンパク質結合磁気微粒子。
【請求項２】
前記少なくとも一種の他のタンパク質が生理活性を有するものである、請求項１に記載のタンパク質結合磁気微粒子。
【請求項３】
前記の生理活性を有するタンパク質が、免疫関連タンパク質、結合能を有するタンパク質、又は酵素である、請求項２に記載の磁気微粒子。
【請求項４】
前記ｍｐｓタンパク質の膜外露出部分に由来するアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１〜７２アミノ酸残基の少なくとも一部および第２３５〜３１７アミノ酸残基の少なくとも一部のいずれか一方または両方である請求項１〜３のいずれか１項に記載の磁気微粒子。
【請求項５】
磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子と、該磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したハイブリッドタンパク質とからなり、
該ハイブリッドタンパク質が、本来的に該有機膜に結合して生成し膜結合部分と該膜結合部分の両端に位置する膜外露出部分とからなる膜タンパク質の該膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖と、結合性タンパク質と、標識タンパク質とが融合により結合してなるハイブリッドタンパク質であり、
該結合性タンパク質と該標識タンパク質とが、該結合性タンパク質が前記ポリペプチド鎖の一末端に融合により結合し、該標識タンパク質が該ポリペプチド鎖の他末端に融合により結合した状態、または、該標識タンパク質が該ポリペプチド鎖の一末端に融合し、この融合したタンパク質に直列に残る他方の結合性タンパク質が融合した状態で、前記ポリペプチド鎖に結合しており、
前記膜結合部分と膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質由来のものまたは配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するｍａｇＡタンパク質由来のものである、
タンパク質結合磁気微粒子。
【請求項６】
前記膜結合部分と膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質由来のものであり、
前記膜外露出部分に由来するアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１〜７２アミノ酸残基の少なくとも一部および第２３５〜３１７アミノ酸残基の少なくとも一部のいずれか一方または両方である請求項５に記載の磁気微粒子。
【請求項７】
前記膜結合部分と膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するｍａｇＡタンパク質由来のものであり、
前記膜外露出部分に由来するアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列の第１〜６アミノ酸残基の少なくとも一部および第３８１〜４３４アミノ酸残基の少なくとも一部のいずれか一方または両方である請求項５に記載の磁気微粒子。
【請求項８】
磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子と、該磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したハイブリッドタンパク質とからなり、
該ハイブリッドタンパク質が、本来的に該有機膜に結合して生成し膜結合部分と該膜結合部分の両端に位置する膜外露出部分とからなる膜タンパク質の該膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖と、少なくとも一種の他のタンパク質とが融合してなるハイブリッドタンパク質である、
タンパク質結合磁気微粒子の製造方法であって、
（a）磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合して生成する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質のアミノ酸配列中の前記有機膜への結合部分をコードするＤＮＡ配列からなる遺伝子断片または該ＤＮＡ配列と該アミノ酸配列中の前記有機膜外に露出する部分に由来するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とからなる遺伝子断片と、（b）該遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二以上のタンパク質をコードする一又は二以上のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、該一又は二以上のタンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからなる製造方法。
【請求項９】
前記有機膜外に露出する部分に由来するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、配列番号３で表される塩基配列の第１〜２１６塩基の少なくとも一部および第７０３〜９５１塩基の少なくとも一部のいずれか一方または両方である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
（a）磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合して生成する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質のアミノ酸配列中の前記有機膜への結合部分をコードするＤＮＡ配列からなる遺伝子断片または該ＤＮＡ配列と該アミノ酸配列中の前記有機膜外に露出する部分に由来するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とからなる遺伝子断片と、（b）該遺伝子断片の一方又は両方の末端に融合された、一又は二以上のタンパク質をコードする一又は二以上のＤＮＡ配列と、からなる融合ＤＮＡ配列を含有する組換えプラスミド。
【請求項１１】
前記有機膜外に露出する部分に由来するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、配列番号３で表される塩基配列の第１〜２１６塩基の少なくとも一部および第７０３〜９５１塩基の少なくとも一部のいずれか一方または両方である請求項１０に記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
宿主磁性細菌ＡＭＢ−１に請求項１０または１１に記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換磁性細菌。
【請求項１３】
試料中の標的物質を測定する方法であって、（A）前記標的物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁気微粒子を前記試料に加え、これにより前記標的物質が試料に存在する場合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して磁気微粒子が凝集するようにし；
（B）次に、凝集後の前記標識タンパク質に基づく信号を測定し；
（C）（B）で得られた信号強度を、標準試料から得られる信号強度と比較することにより、試料中の標的物質を検定する；
ことを含む、標的物質の測定方法において、
前記結合性タンパク質が、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成し膜結合部分と該膜結合部分の両端に位置する膜外露出部分とからなる膜タンパク質の該膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖の一末端に融合により結合し、前記標識タンパク質が該ポリペプチド鎖の他末端に融合により結合したものであり、前記の有機膜に結合して生成するタンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するｍａｇＡタンパク質又は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質の膜結合部分により該有機膜に結合しているものであることを特徴とする、
標的物質の測定方法。
【請求項１４】
試料中の標的物質を測定する方法であって、（A）前記標的物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁気微粒子を前記試料に加え、これにより前記標的物質が試料に存在する場合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して磁気微粒子が凝集するようにし；
（B）次に、凝集後の前記標識タンパク質に基づく信号を測定し；
（C）（B）で得られた信号強度を、標準試料から得られる信号強度と比較することにより、試料中の標的物質を検定する；
ことを含む、標的物質の測定方法において、
前記標識タンパク質が、磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成し膜結合部分と該膜結合部分の両端に位置する膜外露出部分とからなる膜タンパク質の該膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖の一末端に融合し、この融合したタンパク質に直列に残る他方の結合性タンパク質が融合しているものであり、前記の有機膜に結合して生成するタンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するｍａｇＡタンパク質又は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質の膜結合部分により該有機膜に結合しているものであることを特徴とする、
標的物質の測定方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記の結合性タンパク質及び標識タンパク質の少なくとも一方が、前記ポリペプチド鎖に融合により結合している別のタンパク質に融合により結合していることを特徴とする方法。
【請求項１６】
試料中の標的物質を測定する方法であって、（A）前記標的物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁気微粒子を前記試料に加え、これにより前記標的物質が試料に存在する場合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して磁気微粒子が凝集するようにし；
（B）次に、凝集後の前記標識タンパク質に基づく信号を測定し；
（C）（B）で得られた信号強度を、標準試料から得られる信号強度と比較することにより、試料中の標的物質を検定する；
ことを含む、標的物質の測定方法において、
磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成し膜結合部分と該膜結合部分の両端に位置する膜外露出部分とからなる膜タンパク質の該膜結合部分からなるポリペプチド鎖または該膜結合部分と該膜外露出部分に由来するアミノ酸配列とからなるポリペプチド鎖の一末端にプロテインＡが融合し、該プロテインＡに結合性タンパク質である抗ＩｇＧ抗体が結合し、該ポリペプチド鎖の他末端に標識タンパク質が融合しており、前記の有機膜に結合して生成するタンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するｍａｇＡタンパク質又は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するｍｐｓタンパク質の膜結合部分により該有機膜に結合しているものであることを特徴とする、
標的物質の測定方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、標的物質が抗原、抗体、リガンドとしてタンパク質に特異的に結合しうる物質、多糖類・複合糖類、及びビオチンから選ばれ、結合性タンパク質が該標的物質に対応して抗体、抗原として作用するタンパク質、上記のリガンドと結合するタンパク質、プロテインＡ、レクチン及びアビジン類から選ばれる方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記標識タンパク質が蛍光性タンパク質、蛍光色素結合タンパク質又は酵素である方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記酵素が発光関連酵素、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、又は制限酵素である方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、前記の発光関連酵素が、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ又はグルコース−６−リン酸脱水素酵素である方法。
【請求項２１】
磁性細菌ＡＭＢ−１の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で生成する、後記の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、単離、精製されたｍｐｓタンパク質。
【請求項２２】
請求項２１に記載のｍｐｓタンパク質をコードするｍｐｓ構造遺伝子。
【請求項２３】
請求項２２に記載のｍｐｓ遺伝子であって、配列表に記載の配列番号３で示されるＤＮＡ配列からなる、単離、精製されたｍｐｓ構造遺伝子。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、タンパク質結合磁気微粒子及びその製造方法、並びにそれらに関連した新規なタンパク質、遺伝子等、並びに該タンパク質結合磁気微粒子を用いる標的物質の測定方法等に関する。
背景技術
磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等の生理活性を有するタンパク質は、磁気的手段で誘導することができるため、従来困難であった局所的な位置への誘導が可能であり、磁気により集めたり、分離したりすることができるため、医療や発酵の分野を初めとする各種産業において利用が期待されている。
従来、磁気微粒子への生理活性物質の固定化は特公平６−１２９９４に示されるように磁性細菌より磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化することが行われていた。また、酵素処理により、磁性細菌から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固定化を行う方法も知られている。また、ＳＰＤＰを用いる化学的結合法により生理活性物質を磁気微粒子に固定化する方法も知られている（特開平５−２０９８８４）。
さらに、これらの方法で化学的に生理活性物質を固定化した磁気微粒子を用いて抗原抗体反応を行なわせる、抗原又は抗体の測定方法が提案されている（特開平４−２８５８５７、同５−２０９８８４、特開平５−９９９２６）。
上述の酵素、抗体等のタンパク質を磁気微粒子への固定化は化学的に行うものであるため、固定化処理に長時間を要する、固定化処理によりタンパク質の生理活性が低下する、得られる固定化タンパク質の固定化量にロット間バラツキが大きくかつ活性のバラツキも大きい、固定化に用いられるタンパク質は一般に高価であるので固定化タンパク質は高コストにならざるを得ない、等の問題があった。
また、上述の標識抗体を磁気微粒子に結合して用いる方法は、抗体にあらかじめ標識化合物を化学的に結合させたり、物理的に吸着させておく必要がある。このために、抗体の活性が低下したり、処理による損失が生じたりする問題があった。さらには、磁気微粒子への標識化合物の固定化量や結合の仕方が変化し、これが測定データのバラツキの原因になる恐れがあるほか、高コストになる等の問題があった。
そこで、本発明の課題は、化学的な方法で酵素や抗体あるいは標識化合物を磁気微粒子に固定化する従来技術の欠点を解決し、高い検出感度が得られる標的物質の測定方法、及びそれに使用する磁気微粒子を提供することにある。
発明の開示
有用タンパク質結合磁気微粒子
本発明は、第一に、磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子と、該磁気微粒子を被覆する有機膜に結合したハイブリッドタンパク質とからなり、該ハイブリッドタンパク質が本来的に該有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含むポリペプチド鎖と、少なくとも一種の他の有用タンパク質とが生物学的に結合してなるハイブリッドタンパク質である、有用タンパク質結合磁気微粒子を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Kyte-doolittle法による解析で得られたｍｐｓタンパク質のアミノ酸配列の親水性領域−疎水性領域の分布を示す図である。
第２図は、プラスミドｐＵＭ５Ａの作製を説明し、該プラスミドの制限酵素切断部位地図である。
第３図は、例１で調製したプラスミドｐＫＬＣ及びｐＫＳＬの調製方法の説明図である。
第４図は、プラスミドｐＫＬＣの制限酵素切断部位地図である。
第５図は、例２で調製したプラスミドｐＫＳＧの調製方法の説明図である。
第６図は、プラスミドｐＫＬＣの制限酵素切断部位地図である。
第７図は、例３で調製したプラスミドｐＫＳＡの調製方法の説明図である。
第８図は、プラスミドｐＫＳＡの制限酵素切断部位地図である。
第９図は、例４で調製したプラスミドｐＮＥＬＳの調製方法の説明図である。
第１０図は、プラスミドｐＮＥＬＳの制限酵素切断部位地図である。
第１１図は、例５で調製したプラスミドｐＮＥＬＳＣの調製方法の説明図である。
第１２図は、プラスミドｐＮＥＬＳＣの制限酵素切断部位地図である。
第１３図は、例６で調製したプラスミドｐＮＰＡＭＬの調製方法の説明図である。
第１４図は、例７で調製したプラスミドｐＫＺＭＰＬの調製方法の説明図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される磁気微粒子は磁性細菌の菌体内に生産される、粒径約５０〜１５０ｎｍのマグネタイトからなる微粒子である。利用することができる磁性細菌としては、例えばMagnetospirillum種の微生物（例：菌株AMB-1（FERM BP-5458），MS-1（IFO 15272，ATCC 31632，DSM 3856）SR-1（IFO 15272 DSM 6361）、及びDesulfovibrio種の微生物（例：菌株RS-1（FERM P-13283））が挙げられる。
これらの磁性細菌の菌体中に生産される磁気微粒子はリン脂質を主成分とする有機膜で被覆されている。該有機膜には種々の膜タンパク質が結合している。本発明に用いられる膜タンパク質は、有機膜に比較的強固に結合しつつその一部が膜の外に露出しているものが好ましく、特に両末端が外に露出していることが好ましい。膜タンパク質の膜結合部分は有用タンパク質の有機膜への固定手段として利用される。露出部分は有用タンパク質をその膜タンパク質に結合させるのに利用される。
この有用タンパク質のポリペプチド鎖への結合は生物学的結合により行われる。ここで、「生物学的結合」とは二種のタンパク質が融合された状態でポリペプチドとして一体化している場合のほか、抗原抗体反応による結合、リガンド・リセプター反応による結合等が挙げられる。
結合形態としては、例えば次の場合が挙げられる。これらは、固定手段として使用される膜タンパク質の種類等により選べばよい。
（a）一種の有用タンパク質が膜結合部分含有ポリペプチド鎖の一方の末端に生物学的に結合される形式。
（b）二種の有用タンパク質が膜結合部分含有ポリペプチド鎖の異なる末端にそれぞれ結合される形式。
（c）二種の有用タンパク質のうちの第一の有用タンパク質が膜結合部分含有ポリペプチド鎖の一末端に生物学的に結合しており、その結合したタンパク質の他末端に第二の有用タンパク質が直列に結合している形式。二種の有用タンパク質の結合順序は、用いられるタンパク質の種類等により適切な順序を選べばよい。
上の（a）〜（c）のいずれの場合も、タンパク質同士の結合は、直接的な生物学的結合の形でもよいし、第三のタンパク質が介在して生物学的結合により橋渡し結合する形式でもよい。
さらに、（b）、（c）の形式の組み合わさった形式で三以上の有用タンパク質が結合されてもよい。
なお、上記において「膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含むポリペプチド鎖」は、膜結合部分に対応するアミノ酸配列のみでもよいし、その外側に該膜タンパク質に由来するアミノ酸配列を有していてもよい。
有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法
上記の有用タンパク質結合磁気微粒子は形質転換磁性細菌を用いて製造することができる。
即ち、本発明は、第二に、上記の有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法として、本来的に有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部分をコードする遺伝子断片と該有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との融合ＤＮＡ配列を含む組換えプラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、該有用タンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることからなる、有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法を提供する。
磁性細菌の上記組換えプラスミドによる形質転換は公知の方法により行うことができる。宿主として用いる磁性細菌としては、上で例示のものが挙げられる。
こうして得られた形質転換された磁性細菌を適切な条件下で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク質が膜結合性タンパク質の膜結合部分を含むポリペプチド鎖と融合した状態で生成する。該融合タンパク質はその磁気微粒子を被覆している有機膜に結合した状態にある。
また、該有用タンパク質結合磁気微粒子は、培養により増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることができる。
本発明において有用タンパク質の固定手段として利用される膜タンパク質の起源（ソース）となる磁性細菌と、前記組換えプラスミドの宿主となる磁性細菌とは同一種でも異なる種類でもよい。
一般に、磁性細菌の菌体内に磁気微粒子を被覆する有機膜に強固に結合して、好ましくはその一部が有機膜外に露出した状態で生成する膜タンパク質はいずれも本発明によるタンパク質結合磁気微粒子の製造方法に利用することができる。このような膜タンパク質の少なくとも膜結合部分をコードする遺伝子が判りさえすれば、公知の手法に従ってこの遺伝子断片と所望の一又は二以上の有用タンパク質をコードする一又は二以上のDNA配列とを含む融合DNA配列を含む組換えプラスミドを作製し、該組換えプラスミドで適当な磁性細菌を形質転換し、得られた形質転換磁性細菌を培養することにより、該形質転換磁性細菌の菌体内に前記有用タンパク質が結合した磁気微粒子が産生される。
本発明にこのようにして利用される膜タンパク質の代表的な例として、本発明者らは磁性細菌ＡＭＢ−１（FERM BP-5458）の生産するｍｐｓタンパク質とｍａｇＡタンパク質を見出した。
〔磁性細菌ＡＭＢ−１の寄託に関する情報〕
寄託機関
名称：  工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Techonology）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
寄託日    １９９２年１１月１２日
受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４５８
以下、これらのタンパク質、及びそれらをコードする遺伝子を例に具体的に説明する。
［ｍｐｓタンパク質の利用］
ｍｐｓタンパク質は後記の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列（対応する構造遺伝子の塩基配列とともに示す）からなる、単離、生成されたタンパク質である。
このタンパク質は次のようにして単離、精製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠心集菌後フレンチプレスにより細胞を破砕した。この破砕物から細胞膜分画を分離し、さらにサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子分画を分離し精製した。次に１％Tryton 10mMトリス緩衝液中で２時間撹拌し、磁気微粒子と有機膜を分離した。このように処理した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、泳動パターンを細胞膜上に存在するタンパク質と比較したところ、細胞膜には存在しない有機膜上に特異的なスポットが三つ確認された。これら三つの有機膜上のタンパク質の内、最も含有量の多いタンパク質をｍｐｓタンパク質と命名した。このｍｐｓタンパク質のバンドの位置は、後述のｍｐｓ構造遺伝子からコードされるタンパク質として導かれたものの分子量34.49kDaのところに当たることが確認された。
このｍｐｓタンパク質のアミノ酸配列の親水性領域−疎水性領域の分布をKyte-doolittle法により解析した結果を第１図に示す。この結果より、中央のＮ−末端から第７３〜２３４アミノ酸残基の範囲（第１図において領域Ａ）が比較的疎水性が高く有機膜への結合に寄与しており、Ｎ末端側の第１〜第７２アミノ酸残基の範囲及びＣ末端側の第２３５〜第３１７アミノ酸残基の範囲が比較的親水性が高く有機膜の外に概ね露出している。中央の第７３〜２３４アミノ酸残基の範囲が膜結合部分である。
ｍｐｓ構造遺伝子：
上記のｍｐｓタンパク質はｍｐｓ構造遺伝子によりコードされる。
該ｍｐｓ構造遺伝子は後述の配列表に記載の配列番号２で示される塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなる。
該ｍｐｓ構造遺伝子として、配列表の配列番号３で示されるものが磁性細菌ＡＭＢ−１から、次のようにして単離、精製された。
上述のようにして分離されたｍｐｓタンパク質についてエドマン分解法によりアミノ酸シーケンスを行ない、Ｎ−末端アミノ酸配列を決定した。Ｎ−末端アミノ酸配列からプライマーを作製し、ＰＣＲ法により有機膜にのみ存在するｍｐｓタンパク質の、Ｎ−末端部分をコードしている遺伝子断片をクローニングした。この遺伝子断片を基に、ジーンウォーキングによりその周辺の約２ｋｂのｓｐｈＩ断片をクローニングした。この遺伝子断片のシークエンスを行ない解析した結果、９５４ｋｂのｍｐｓ構造遺伝子配列を決定し、その遺伝子配列から前記のアミノ酸配列を導いた。
該ｍｐｓ構造遺伝子の配列の上流側約７００ヌクレオチドの範囲内にプロモーターが存在する。プロモーターとしては他の公知のものを使用することもできる。
該ｍｐｓ構造遺伝子中の、膜結合部分をコードするＤＮＡ配列は、前記配列番号２及び配列番号３で示された塩基配列中の２１７〜７０２の範囲である。前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法には、少なくともこの範囲のＤＮＡ配列を含む遺伝子断片（該遺伝子断片を前述の膜タンパク質中の膜結合部分を含むポリペプチド鎖に対応するものであり、以下、「膜結合部遺伝子断片」という）が所望の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との融合に用いられる。このとき、膜結合部遺伝子断片は膜結合部分をコードするＤＮＡ配列のみから構成されてもよいし、その３’末端側又は５’末端側に元々ｍｐｓ構造遺伝子に存在するＤＮＡ配列が含まれてもよい。元々ｍｐｓ構造遺伝子に含まれているＤＮＡ配列の一部又は全部がそのまま存在してもよい。むしろ、比較的親水性が高く有機膜の外側に露出する部分をコードするＤＮＡ配列が存在すると、結合した状態で生成する有用タンパク質が有機膜外に露出した形で発現するので有利である。即ち、第１図における領域Ａの外側にＢ１の領域（第１塩基〜第２１６塩基の範囲）の少なくとも一部及び／又はＢ２の領域（第７０３塩基〜第９５１塩基の範囲）の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列、より具体的には例えば、第１図におけるＣ１の領域（第１５４塩基〜第２１６塩基の範囲）及び／又は領域Ｃ２（第７０３塩基〜第７６８塩基の範囲）をコードするＤＮＡ配列が存在することが好ましい。
該膜結合部遺伝子断片は前記の膜タンパク質の膜結合部分をコードする遺伝子を必須の要素として含み、これのみで構成されていてもよいが、上述のようにその３’末端側及び／又は５’末端側に元々ｍｐｓ構造遺伝子に存在する塩基配列が存在してもよい。この膜結合部遺伝子断片は、有用タンパク質の有機膜への固定手段である膜結合部分を発現する重要な役割を演じる。
［ｍａｇＡタンパク質の利用］
ｍａｇＡタンパク質のアミノ酸配列は、後記の配列表の配列番号４に示す（対応するｍａｇＡ遺伝子の塩基配列とともに表示）通りであり、Ｎ末端から第１〜第６アミノ酸残基の範囲が親水性領域であり、それに続く第７〜第３８０アミノ酸残基の範囲が疎水性領域であり、続く第３８１〜４３４アミノ酸残基の範囲が第二の親水性領域である。中央の長い疎水性領域が膜結合部分であり、両端の親水性領域は膜から露出した状態にある。詳細には、疎水性領域は短い親水性部分を約４箇所含んでおり、これらの部分は膜から一部露出しているものと推定される。ｍａｇＡタンパク質の疎水性領域が該タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合させ、両端の親水性領域は有機膜から露出する。この疎水性領域がｍａｇＡタンパク質の有機膜への膜結合部分である。
ｍａｇＡタンパク質は次のようにして単離、精製された。磁性細菌ＡＭＢ−１を定常期まで培養し、遠心集菌後フレンチプレスにより細胞を破砕した。この破砕物からサマリウムコバルト磁石で磁気微粒子を抽出し、精製した。次に１％Tryton 10mMトリス緩衝液中で２時間撹拌し、磁気微粒子と膜を分離した。このように処理した抽出物についてタンパク電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったところ、後述するｍａｇＡ構造遺伝子からコードされるタンパク質の分子量として既知である、46.8kDaのところにバンドが確認された。
本発明者らは、このｍａｇＡタンパク質をコードする遺伝子（ｍａｇＡ構造遺伝子という）が、後述の配列表に記載の配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ配列からなることを見出した。該ｍａｇＡ遺伝子の配列の上流にはプロモーター配列が隣接している（J．Biochem．118，23-27（1995））。ｍａｇＡタンパク質は一般的には配列番号６の塩基配列で表されるＤＮＡ配列でコードされる。
上記の配列番号５で表されるｍａｇＡ遺伝子は、磁性細菌ＡＭＢ−１から次のようにして見いだされ、単離、精製された。
磁性細菌ＡＭＢ−１に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を持った転移性の遺伝子であるトランスポゾンＴｎ５を導入することでゲノムに部位非特異的にミューテーションを生じさせ、磁気微粒子精製機能を欠損したミュータントを作製した。次に、薬剤耐性因子（Ｋｍ）を指標に磁気応答しない菌体を分離し、このミュータントからゲノムを抽出した。EcoRIで切断後、サザンハイブリダイゼーションでトランスポゾンＴｎ５とのハイブリッドの形成を指標にｍａｇＡ遺伝子を含む遺伝子断片を単離し、ｐＵＣ１９にクローニングすることで精製を行った。ここで作製したプラスミドｐＵＭ５Ａを第２図に示す。遺伝子解析の結果、ｍａｇＡ遺伝子１．３ｋｂを見出した。
該ｍａｇＡ構造遺伝子中の、膜結合部分をコードするＤＮＡ配列は、前記配列番号４で示された塩基配列中の１９〜１１４０の範囲である。前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の製造方法には、少なくともこの範囲のＤＮＡ配列を含む遺伝子断片（膜結合部遺伝子断片）が所望の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との融合に用いられる。この場合も、該膜結合部遺伝子断片にはｍａｇＡタンパク質の膜結合部分をコードする遺伝子のみから構成されてもよいし、親水性領域の一部又は全部を含んでもよい。膜結合部遺伝子断片は膜結合部分をコードする遺伝子を含み、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との融合部に生成するＤＮＡ配列がアミノ酸合成に適したものとなる限り制限されない。前記結合部分をコードするＤＮＡ配列に近接する形で有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列が導入されてもよいし、疎水性領域をコードするＤＮＡ配列と有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列との間に前記親水性領域をコードするＤＮＡ配列が部分的に存在してもよい。特に５’末端側の親水性領域は短いので、これらは全て存在していてもよい。目的とする有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入する部位として機能的な５’末端側の制限酵素切断部位としては、ｍａｇＡ遺伝子内に導入したＳｃａＩ切断部位があり、３’末端側の制限酵素切断部位としてはＳｐｈＩ切断部位、ＤｒａＩＩＩ切断部位がある。ＳｐｈＩ切断部位とＤｒａＩＩＩ切断部位はｍａｇＡ遺伝子の疎水性領域から僅かに下流側に寄った親水性領域内に存在するので、好都合な部位の一つである。
［融合ＤＮＡ配列］
（a）ｍｐｓタンパク質やｍａｇＡタンパク質のような膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含むポリペプチド鎖をコードする膜結合部遺伝子断片と、（b）一又は二以上の所望の有用タンパク質との融合ＤＮＡ配列を調製する。
一種又は二種以上の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列は膜結合部遺伝子断片の３’末端側及び５’末端側のいずれか一方に融合されてもよいし、両方に融合されてもよい。両方に融合される場合には、３’末端に導入されるＤＮＡ配列と５’末端に導入されるＤＮＡ配列とは同一のタンパク質をコードするものでもよいし、異なるタンパク質をコードするものでもよい。両方に融合する利点は、次のような場合に得られる。
１）両末端に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、磁気微粒子への該タンパク質の固定化量を向上させることができる。
２）５’末端と３’末端に２つの連続する複合酵素系又は酵素と補酵素再生酵素などのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、酵素系の反応を迅速に進めることができる。
３）５’末端と３’末端にサブユニットを形成するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を導入することで、このサブユニットを迅速にかつ完全に形成させることができる。
また、二種以上のタンパク質をコードする二種以上のＤＮＡ配列を５’末端と３’末端のいずれか一方に順次直列式に融合させてもよい。
融合される、別のタンパク質をコードする遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
［組み換えプラスミド］
本発明の有用タンパク質結合磁気微粒子を産生する形質転換磁性細菌は、上記の融合ＤＮＡ配列を含有する組み換えプラスミドで形質転換されたものである。
該組み換えプラスミドは、前記の融合ＤＮＡ配列を公知の方法により適当なベクタープラスミドに導入することにより得られる。
組み換えプラスミドの調製に用いるベクターとしては、例えば、ｐＲＫ４１５の系統、ｐＫＴ２３０の系統のものを用いることができる。選択したベクターに遺伝子を組み込む。ベクターに最も効率よく、また遺伝子が目的の向きに並ぶように、遺伝子を組み込む順、用いる制限酵素を決定する。遺伝子を導入する手順が決定したなら、制限酵素によってＤＮＡを切断し、電気泳動を行うことにより導入する目的遺伝子断片を分離する。その後、リガーゼを用いてライゲーションを行いＤＮＡを連結する。遺伝子断片の連結部分が合わない場合は末端部分を平滑化処理し、ライゲーションを行う。制限酵素、リガーゼ、末端平滑化用の酵素などは全て市販のものを用いて行うことができる。最後に目的のプラスミドができているかどうか制限酵素の切断パターンを確認する。
［形質転換磁性細菌］
磁性細菌の上記プラスミドによる形質転換は公知の方法により行うことができる。宿主として用いる磁性細菌は、用いられる膜タンパク質のソースである磁性細菌と同一種でも異なる種類のものでもよい。同一種であることが好ましい。使用することができる磁性細菌としては、ＡＭＢ−１が代表的であるが、これに限らず、例えば、Magnetospirillum種の微生物（例：菌株AMB-1（FERM BP-5458），MS-1（IFO 15272，ATCC 31632，DSM 3856）SR-1（IFO 15272 DSM 6361）、及びDesulfovibrio種の微生物（例：菌株RS-1（微工研菌寄13283））が挙げられる。
こうして得られた磁性細菌を適切な条件下で培養することにより菌体内に目的とする有用タンパク質を有する磁気微粒子が生成する。具体的には、目的とするタンパク質は、膜結合部遺伝子断片によりコードされるポリペプチド鎖と融合した状態で、その磁気微粒子を被覆している有機膜に結合した状態で生成する。こうして生成した有用タンパク質結合磁気微粒子は、増殖した磁性細菌の菌体を通常の方法によって破砕又は溶解したのち磁気を利用して容易に集めることができる。
また、上記の有用タンパク質の製造方法は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方法によっては純粋な形で得ることが困難であるときには、該タンパク質の製造方法として有用である。この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られるが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、精製することができる。
本発明において、膜タンパク質の膜結合部分と融合される有用なタンパク質をコードする遺伝子も、それにより発現されるタンパク質も特に限定されない。医療、発酵を利用する産業等の目的に使用される場合には何らかの機能、例えば、生理活性を有するタンパク質が用いられる。しかし、これに限定されるものではなく、通常の方法では分離、取得が困難であるタンパク質の製造に本発明を利用することができる。即ち、このようなタンパク質を融合タンパク質の形で磁気微粒子上に生成させ、磁気的に容易に分離し集めることができる。
有用タンパク質の内、機能性タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関連タンパク質、レクチン、アビジン等の結合能を有するタンパク質、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵素類が挙げられる。
また、上記の有用タンパク質の製造方法は、そのタンパク質が機能性を有しない有用タンパク質である場合であっても、そのタンパク質が従来の製造方法によっては純粋な形で得ることが困難であるときには、該タンパク質の製造方法として有用である。この場合有用タンパク質は磁気微粒子に結合した状態で得られるが、上記の方法で磁石等を用いる磁気的方法で容易に他の細胞成分から分離、精製することができる。
結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合した磁気微粒子
本発明は前記の有用タンパク質結合磁気微粒子の一態様として、有用タンパク質として結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合した磁気微粒子、及びこれを利用する標的物質の測定方法を提供する。
即ち、本発明によれば、結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁気微粒子において、前記の結合性タンパク質と標識タンパク質とが、磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含むポリペプチド鎖に、相互に近接した状態で、生物学的結合により結合していることを特徴とする、磁気微粒子が提供される。
標的物質の測定方法
また、本発明によれば、（A）試料中の標的物質を測定するために、
前記標的物質に特異的に結合する結合性タンパク質と標識タンパク質とが結合された磁気微粒子を前記試料に加え、これにより前記標的物質が試料に存在する場合にはこれと前記結合性タンパク質とが反応して磁気微粒子が凝集するようにし；
（B）次に、凝集後の前記標識タンパク質に基づく信号を測定し；
（C）（B）で得られた信号強度を、標準試料から得られる信号強度と比較することにより、試料中の標的物質を検定する；
ことを含む、標的物質の測定方法において、
前記の結合性タンパク質と標識タンパク質とが、磁性細菌の菌体内に生成する磁気微粒子を被覆している有機膜に結合して生成する膜タンパク質の少なくとも膜結合部分を含むポリペプチド鎖に、相互に近接した状態で、生物学的結合により結合したものであることを特徴とする、
標的物質の測定方法が提供される。
上記の方法においては、試料中の標的物質の量に応じて凝集が起こる結果、磁気微粒子に結合した標識タンパク質の機能が主として物理的（立体的）障害を受けて低下する。そのために、磁気微粒子の凝集量、ひいては標的物質の反応量に応じて標識タンパク質からの検出信号、例えば標識タンパク質が発光関連酵素である場合には発光量が低下する。これを光学的測定方法等により測定することで標的物質を検出しあるいは定量することができる。凝集反応は、反応後に例えば交番磁界を加えることで容易に促進することができる。
［機能性タンパク質が結合した磁気微粒子］
具体的には、結合性タンパク質と標識タンパク質の結合形態としては、例えば次の場合が挙げられる。これらは、固定手段として使用される膜タンパク質の種類等により選べばよい。
（a）結合性タンパク質と標識タンパク質とがそれぞれポリペプチド鎖の異なる末端に結合される形式。このとき、結合性タンパク質や標識タンパク質という機能性タンパク質の結合は、該ポリペプチド鎖に直接融合する形でもよいし、第三のタンパク質がポリペプチド鎖の末端部に融合し、そして該第三のタンパク質に機能性タンパク質が生物学的結合により結合する形でもよい。
（b）結合性タンパク質と標識タンパク質のいずれか一方の機能性タンパク質が前記ポリペプチド鎖の一末端に融合しており、その融合した機能性タンパク質の他末端に他方の機能性タンパク質が直列に融合している形式。結合性タンパク質と標識タンパク質の結合順序は、用いられるタンパク質の種類等により適切な順序を選べばよい。
上の（a）、（b）いずれの場合でも、有機膜への結合部分を含むポリペプチド鎖と機能性タンパク質等との融合タンパク質を得る必要があるが、それは対応する融合ＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドを調製し、これで形質転換された磁性細菌を培養することにより、前記融合ＤＮＡ配列を発現させ、所要の機能性タンパク質を含む融合タンパク質を、磁気微粒子を被覆する有機膜に結合した状態で該菌体内に生成させることができ、上記の方法に用いる磁気微粒子が得られる。
上記の磁気微粒子において、結合性タンパク質と標的タンパク質とが前記ポリペプチド鎖に「相互に近接した状態で」結合している、とは、相互の間に他のペプチドが存在しないか、あるいは１〜１０００個のペプチドしか存在しないことを意味する。このとき、立体障害などにより相互のタンパク質の活性が低下しないこと、および結合性タンパク質に結合する第三のタンパク質の活性が低下しないことが必要である。
［標的物質］
上記の方法により測定することができる標的物質は、それに特異的に結合する能力を有する結合性タンパク質が存在しさえずればいずれでもよい。特異的な結合の方式は限定されず、例えば抗原抗体反応、リガンド・リセプター結合反応等が挙げられる。
したがって、上記の方法により測定することができる標的物質としては、例えば、抗原、抗体、リガンドとしてタンパク質に結合しうる物質（酵素に結合する基質、補酵素、調節因子；リセプターと結合するレクチン、ホルモン、神経伝達物質など）、プロテインＡと抗体のいずれか一方、レクチンと結合する多糖類・複合糖類、アビジン、ストレプトアビジン等のアビジン類と結合するビオチン等が挙げられる。抗体、動植物細胞、細菌、ウイルス等様々なものが抗原として機能しうることは周知であり、本発明の測定方法の対象となる。
［結合性タンパク質］
磁気微粒子に結合される結合性タンパク質は標的である試料中の標的物質と特異的に結合し得るタンパク質である。
結合性タンパク質は、上記の標的物資に対応して選択される。該結合性タンパク質としては、例えば、抗体、抗原として作用するタンパク質、上記のリガンドと結合するタンパク質、プロテインＡと抗体の残る他方、その他の免疫関連タンパク質、レクチン、アビジン等が挙げられる。
［標識タンパク質］
上記の方法において、検出用信号を発生する機能タンパクである標識タンパク質としては、例えば、グリーンフルオレセンスプロテイン等の蛍光性タンパク、蛍光色素結合タンパク、あるいはルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などの生物発光もしくは化学発光に関与する発光関連酵素等の光学的測定手段で測定可能なもの；補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の活性を別途測定する酵素類が挙げられる。前者が直接に光学的手段を用いて測定できる点で好ましい。
実施例
例１
Ｉ．組み換えプラスミドの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ製）を磁性細菌内で発現させ、該遺伝子でコードされる発光タンパク質を磁気微粒子を被覆する有機膜上に生成させるため、ｍｐｓ−ｌｕｃ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＳＬを第３図に示す方法で作製した。
ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄＤ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７０：１９１−１９７）を用いた。ｐＲＫ４１５をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断したｌｕｃ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。更にプラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流端に存在するＢａｍＨＩで切断した。
次に、ｍｐｓ構造遺伝子とその上流に位置するプロモータ部位を含むＤＮＡ配列の５’末端部と相補的な配列を有しさらにＢａｍＨＩ切断部位をデザインしたＦ−プライマーと、該ＤＮＡ配列の３’末端部と相補的な配列を有しさらにＢａｍＨＩ切断部位をデザインした配列を有するＲ−プライマーとを用いて、ＰＣＲにより増幅し、両端にＢａｍＨＩ切断部位を付加した結合性ＤＮＡ配列を作製した。増幅した結合性ＤＮＡ配列をプラスミドｐＫＬＣと接続し、プラスミドｐＫＳＬを作製した。ｐＫＳＬの制限酵素切断部位地図を第４図に示す。こうしてｍｐｓ構造遺伝子の読み枠とずれることなくｌｕｃ遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。
II．接合伝達体の作製
次に、Ｉで得られた組み換えプラスミドをE．coli S17-1にエレクトロポレーションにより導入したのち、接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたE．coli S17-1はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＳｍ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離した。さらに懸濁液を５，０００Ｇ、１５分遠心分離することで細胞膜成分を分離し、１００，０００Ｇ、１．５時間超遠心する事で細胞質を分離した。
磁気微粒子、細胞膜及び細胞質の各分画のルシフェーラーゼ活性をピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定することで行い、導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現及び発現量を測定した。結果を表１に示す。
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表１に示すように、大腸菌ではほとんど発現しないが細胞質分画の発光量が高く、水溶性タンパク質であることを示している。磁性細菌では細胞質分画、細胞膜分画、磁気微粒子分画の各分画で発光が確認されたが、磁気微粒子分画が最も発光量が高く、磁気微粒子表面でのタンパク質の発現効率が高いことが示された。即ち、水溶性ではあるが膜結合性タンパク質であるｍｐｓ融合タンパク質が磁気微粒子分画で最も多く発現しており、磁気微粒子を被覆する有機膜上でのｌｕｃタンパク質の生産及び分離が示された。
例２
抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原認識部位をコードした遺伝子（ｉｇｇ遺伝子、ファルマシア社）を該遺伝子でコードされる抗体タンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍｐｓ−ｉｇｇ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＳＧを第５図に示す方法で作製した。
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断し平滑末端化しｉｇｇ遺伝子を組み込み、プラスミドｐＫＧＣを作製した。
次に、ｍｐｓ構造遺伝子及びその上流に位置するプロモータ部位を含む遺伝子断片と相補的な配列を有しさらにＢａｍＨＩ切断部位をデザインしたＤＮＡ配列を有するＦ−プライマーとＲ−プライマーとを用いてＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩ切断部位を両端に付加した結合性ＤＮＡ配列を作製した。増幅した結合性ＤＮＡ配列をプラスミドｐＫＧＣと接続し、プラスミドｐＫＳＧを作製した。ｐＫＳＧの制限酵素切断部位地図を第６図に示す。こうしてｍｐｓの読み訳とずれることなくｉｇｇ遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。
このプラスミドを例１と同様にして接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養し、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子を用いて、ウサギＩｇＧを抗原としたイムノアッセイを行った。イムノアッセイはアルカリフォスファスターゼ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として用いたサンドイッチ法を用い、検出はアルカリフォスファスターゼと、ＡＭＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）との反応による発光をルミノメーターで測定した。この結果、抗原を検出することが可能であった。この実験により、接合伝達体の磁気微粒子に抗体がｍｐｓ融合タンパク質として結合することによって、抗体固定化操作なしに抗原検出システムに用いることが可能な磁気微粒子を生産することができた。
例３
プロテインＡ遺伝子（ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｇｅｎｅ、ファルマシア社製ｐＥＺＺ１８より分離）を該遺伝子でコードされるタンパク質を磁気微粒子を被覆するリン脂質を主成分とする有機膜上に生成させるため、ｍｐｓ−プロテインＡ融合遺伝子を結合したプラスミドｐＫＳＡを第７図に示す方法で作製した。
即ち、ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５をＥｃｏＲＩで切断した。別途、両端にＥｃｏＲＩ切断部位をデザインしたプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した、ＥｃｏＲＩ切断部位を付加してプロテインＡ遺伝子作り、これを上記のＥｃｏＲＩで切断したｐＲＫ４１５に組み込み、プラスミドｐＫＡＣを作製した。
次に、ｍｐｓ構造遺伝子とその上流に位置するプロモータ部位を含む遺伝子断片と相補的な配列を有しさらにＢａｍＨＩ切断部位をデザインしたＤＮＡ配列を有するＦ−プライマーとＲ−プライマーとを用いてＰＣＲにより増幅し、ＢａｍＨＩ切断部位を両端に付加した結合性ＤＮＡ配列を作製した。増幅した結合性ＤＮＡ配列をプラスミドｐＫＡＣと接続し、プラスミドｐＫＳＡを作製した。ｐＫＳＡの制限酵素切断部位地図を第８図に示す。こうしてｍｐｓの読み訳とずれることなくプロテインＡ遺伝子は翻訳され融合タンパク質を生産することが出来る。
このプラスミドを接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＳｍ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離し、こうして磁気微粒子上にプロテインＡが発現した磁気微粒子を得た。
この磁気微粒子に対し、プロテインＡのＩｇＧとの結合能に注目し、抗杉花粉、抗小麦、抗卵ＩｇＧと混合した。混合した粒子は洗浄し、抗体固定化量を測定したところ、従来用いられてきた特開平５−２０９８８４号公報に記載のＳＰＤＰを用いる化学結合法と同程度の固定化が可能であることが示された。また、同公報に記載の実施例１と同様に、抗原検出実験を行った結果３種の抗原はどれも検出可能であった。このよにプロテインＡ−ｍｐｓ融合タンパク質を用いて様々なＩｇＧを磁気微粒子表面に簡便に結合させることが可能であり、従来の化学結合に劣らない抗原検出が可能であることが示された。
例４
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）をｍｐｓ構造遺伝子の５’末端側に導入し、ｌｕｃ−ｍｐｓ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＳを第９図に示す方法で作製した。
（１）ベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５を用いた。ｐＲＫ４１５のＮｃｏＩ切断部位とＥｃｏＮＩ切断部位をそれぞれ平滑末端化処理により欠損っせ、プラスミドｐＲＫ４１５ＮＥを作製した。ｐＲＫ４１５ＮＥをＳａｃＩで切断し、ｍｐｓプロモーターｌｕｃ融合遺伝子を組み込んだプラスミドｐＮＥＰＬを作製した。
（２）次に、ＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用いＰＣＲによりＳｃａＩ切断部位を付加してｍｐｓ遺伝子断片を増幅した。増幅したｍｐｓ遺伝子断片のＳｃａＩ切断部位を平滑末端化し、ＥｃｏＮＩで切断後平滑末端化したプラスミドｐＮＥＰＬと接続し、プラスミドｐＮＥＬＳを作製した。ｐＮＥＬＳの制限酵素切断部位地図を第１０図に示す。
（３）このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁気微粒子を磁石を用いて回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定した。結果を表２に示す。
0004441797.tif 000003
次に、磁気微粒子上におけるｍｐｓタンパク質のＣ末端及びＮ末端の露出方向を確認するために、ｍｐｓ構造遺伝子の３’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐＫＳＬを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子と、ｍｐｓ構造遺伝子の５’末端にｌｕｃ遺伝子を結合したプラスミドｐＮＥＬＳを保持する接合伝達体由来の磁気微粒子において、抗ルシフェラーゼＩｇＧ及びアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧを用いてイムノアッセイを行った。検出はアルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）との反応による発光をルミノメーターで測定した。結果を表３に示す。
0004441797.tif 000004
この実験により、ｍｐｓタンパク質のＮ末端及びＣ末端は磁気微粒子を被覆する有機膜の外側に露出していることが明らかとなった。従って機能性タンパク質の性質に応じてｍｐｓタンパク質のＮ末端に融合した融合タンパク質として生成させるかＣ末端に融合した融合タンパク質として生成させるかを選択することができる。
例５
蛍ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を磁気微粒子上に同時発現させるため、ｌｕｃ−ｍｐｓ−ｃａｔ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＥＬＳＣを第１１図に示す方法で作製した。
ｃａｔ遺伝子に該遺伝子のＳＤ配列を削除しＳｐｈＩ切断部位をデザインしたプライマーを用い、ＰＣＲによりＳｐｈＩ切断部位を付加してｃａｔ遺伝子断片を増幅した。増幅したｃａｔ遺伝子断片のＳｐｈＩ切断部位を平滑末端化した。これを、例４で調製したｐＮＥＬＳをＮｕｒＩで切断した後平滑末端化したものと接続し、プラスミドｐＮＥＬＳＣを作製した。ｐＮＥＬＳＣの制限酵素切断部位地図を第１２図に示す。このプラスミドを接合伝達によって野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体を作製した。接合伝達体を培養して増殖させ、細胞を回収、破砕を行い、磁石で磁気微粒子を回収した。この磁気微粒子のルシフェラーゼ活性を、ピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで発光量を測定したところｐＮＥＬＭと同等のルシフェラーゼ活性を示した。
次に、この磁気微粒子上のＣＡＴアッセイを行った結果、ＣＡＴ活性が検出された。ＣＡＴアッセイは、クロラムフェニコールアセチルランスフェラーゼとクロラムフェニコールとの反応によるクロラムフェニコールアセチル化体を薄層クロマトグラフィーにより検出することで行った。この結果、ｍｐｓ構造遺伝子タンパク質の両末端に接続したそれぞれのタンパク質は、該タンパク質を単独で接続したときと同等の活性を示した。この実験より、ｍｐｓ構造遺伝子タンパク質の両末端に機能の異なるタンパク質をコードする遺伝子を接続した融合遺伝子を構築することで、磁気微粒子上に同時発現することが可能になり、これより多数の機能を有する磁気微粒子を生産することができた。
例６
Ｉ．組み換えプラスミドの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ製）をｍａｇＡ遺伝子の３’末端側に導入し、プロテインＡ遺伝子を（ｐｒｏｔｅｉｎＡ遺伝子、ファルマシア製）をｍａｇＡ遺伝子の５’末端側に導入したプロテインＡ−ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＰＡＭＬを第１３図に示す方法で作製した。
最終的なベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７０：１９１−１９７）を用いた。
（１）ＢａｍＨＩ切断部位とＮｕｒＩ断部位をデザインしたプライマーを用いＰＣＲによりＢａｍＨＩ切断部位とＮｕｒＩを付加したｍａｇＡ遺伝子断片を増幅したのち平滑末端化処理した。平滑末端化処理したｍａｇＡ遺伝子断片をＢａｍＨＩで切断後、平滑末端化処理したプラスミドｐＥＺＺ１８に組込み、プラスミドｐＥＺＺＭを作製した。
（２）次に、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断後、平滑末端化処理したｌｕｃ遺伝子をＳｐｈＩで切断し、平滑末端化処理したプラスミドｐＥＺＺＭ組込み、プロテインＡ−ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＥＺＭＬを作製した。更に、ＨｐａＩとＳｃａＩ切断部位をデザインしたプライマーを用いＰＣＲによりＨｐａＩとＳｃａＩ切断部位を付加したプロテインＡ−ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列増幅した。
（３）次に、プラスミドｐＲＫ４１５のＮｃｏＩ切断部位を欠損させたプラスミドｐＲＫ４１５ＮをＥｃｏＲＩで切断後、平滑末端化処理し、ＰＣＲにより増幅したプロテインＡ−ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を組込みプラスミドｐＮＡＭＬを作製した。
（４）次に、プラスミドｐＮＡＭＬをＳｃａＩで切断し、プラスミドｐＵＭ５ＡをＫｐｎＩとＮｃｏＩで切断し、平滑末端化処理を行ったｍａｇＡ遺伝子のプロモーター配列を組込んだ。こうしてｍａｇＡ遺伝子のプロモーター配列とプロテインＡ−ｍａｇＡ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮＰＡＭＬを作製した。
II．接合伝達体の作製
次に、Ｉで得られた組み換えプラスミドを接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたE．coli S17-1はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＳｍ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離し、こうして磁気微粒子上に蛍ルシフェラーゼ及びプロテインＡが同時に発現した磁気微粒子を得た。
次に、分離した磁気微粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁し、抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、磁気微粒子上のプロテインＡと結合させた。余剰の抗体は磁気微粒子をＳｍ−Ｃｏ磁石を用いて磁気的に回収し再びＰＢＳに懸濁する事を繰り返す事で洗浄し、プロテインＡに抗体が結合した磁気微粒子を得た。
次に、抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させた蛍ルシフェラーゼ及びプロテインＡを同時に発現させた磁気微粒子（プロテインＡ発現抗体結合磁気微粒子）の懸濁液（ＰＢＳ）に抗原としてヒトＩｇＧを添加し抗原抗体反応を行った。抗原抗体反応は交番磁界を印加することで磁気微粒子を磁気的に撹拌することで行った（特開平２−２８１１４２）。従来より用いられてきたグルタルアルデヒドを用いる化学結合法（特広平６−１２９９４）でプロテインＡ及びルシフェラーゼを固定化し、プロテインＡに抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させた磁気微粒子（プロテインＡ固定化抗体結合磁気微粒子）と抗ヒトＩｇＧ抗体とルシフェラーゼを固定化した磁気微粒子（抗体結合磁気微粒子）を比較として用い、抗原抗体反応によって生じた凝集により磁気微粒子上のルシフェラーゼの発光量の変化を測定した結果を表１に示す。発光量はピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで測定し、稀釈した抗原を測定する事で、最高検出感度を比較した。
0004441797.tif 000005
表４に示すようにプロテインＡ発現抗体結合磁気微粒子が最も検出感度が高かった。これは化学的な固定化法と比べ、遺伝子組み換えによりタンパク質を発現させた場合は磁気微粒子への結合部位が遺伝的に制御され活性の低下が無いためである。また、遺伝的に制御する事でプロテインＡとルシフェラーゼを近接した位置に結合できるため、抗原結合によりルシフェラーゼの発光を効果的に阻害できる。これに対し、化学的な固定化では固定化処理に活性部位を用いてしまったり、結合したタンパク質の状態によっては立体阻害を起こし結合部位が表面に出ない場合がある。従って、固定化量の制御及び同時に二種類のタンパク質を安定に固定化することは困難である。
例７
Ｉ．組み換えプラスミドの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ遺伝子、東洋インキ製）をｍｐｓ遺伝子の３’末端側に導入し、プロテインＡ遺伝子を（ｐｒｏｔｅｉｎＡ遺伝子、ファルマシア製）をｍｐｓ遺伝子の５’末端側に導入したプロテインＡ−ｍｐｓ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＫＺＭＰＬを第１４図に示す方法で作製した。
最終的なベクターには磁性細菌ＡＭＢ−１に接合伝達による遺伝子導入が可能であり、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＲＫ４１５（Ｎ．Ｔ．Ｎｅｅｎ，Ｓ．Ｔａｍａｋｉ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｔｒａｌｌｉｎｇｅｒ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７０：１９１−１９７）を用いた。
（１）プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ切断部位を欠損させたｐＵＣ１８ＥにＢａｍＨＩ切断部位をデザインしたプライマーを用いＰＣＲによりＢａｍＨＩ切断部位を付加してプロモータ配列を含むｍｐｓ遺伝子断片を増幅した。増幅したｍｐｓ遺伝子断片をＢａｍＨＩ切断部位で切断したプラスミドｐＵＣ１８Ｅと接続し、プラスミドｐＵＣＥＭＰＳを作製した。
（２）次に、ＰＣＲにより増幅したプロテインＡ遺伝子をＴＡクローニングをしたプラスミドより、ＥｃｏＲＩで切り出した。切り出したプロテインＡ遺伝子断片をＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＵＣＥＭＰＳと接続し、プラスミドｐＵＣＥＺＭＰを作製した。
（３）次に、プラスミドｐＲＫ４１５をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断したｌｕｃ遺伝子を組込み、プラスミドｐＫＬＣを作製した。更にプラスミドｐＫＬＣをｌｕｃ遺伝子の上流部に存在するＢａｍＨＩで切断した。
（４）プラスミドｐＵＣＥＺＭＰをＢａｍＨＩで切断し、プロテインＡ−ｍｐｓ融合ＤＮＡ配列を切り出し、ＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＫＬＣに接続し、プロテインＡ−ｍｐｓ−ｌｕｃ融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＫＺＭＰＬを作製した。
II．接合伝達体の作製
次に、Ｉで得られた組み換えプラスミドを接合伝達により野生株ＡＭＢ−１に導入し、接合伝達体の作製を行った。接合伝達における供与菌体として用いたE．coli S17-1はｔｒａ遺伝子を有しているため、接合伝達を行う際、ヘルパープラスミドなしで接合伝達が可能である。接合伝達にはＭＳＧＭ培地で培養した対数期中期から後期の磁性細菌約８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを用い、供与菌体は前日にプラスミドを導入し発生したコロニーをかき取って１０９から１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁して用いた。１：５０（磁性細菌：大腸菌）で菌を混合し、寒天プレート上にスポットし、メイティングを行った。６時間後スポットをメスで切り取り５ｍｌ程度のＭＳＧＭ培地を用い菌体を回収した。この懸濁液をテトラサイクリン２．５μｇ／ｍｌを添加したＭＳＧＭ培地に植菌した。２５℃で培養し、増殖した細胞を接合伝達体とした。この際、大腸菌はＭＳＧＭ培地では増殖しない。
次に接合伝達後ＭＳＧＭ培地で培養した磁性細菌より磁気微粒子の分離を行った。磁性細菌を遠心分離により集菌後１０ｍＭトリスバッファーで２回洗浄後、菌体濃度０．１ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌ／ｍｌを超えない濃度で懸濁し、出力１２０Ｗ、３０秒間５回の超音波破砕を行った。細胞破砕懸濁液を容器内で氷冷しながらＳｍ−Ｃｏ磁石を容器外壁面に当てて３０分処理し、磁気微粒子を懸濁液中から分離し、こうして磁気微粒子上に蛍ルシフェラーゼ及びプロテインＡが同時に発現した磁気微粒子を得た。
次に、分離した磁気微粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁し、抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、磁気微粒子上のプロテインＡと結合させた。余剰の抗体は磁気微粒子をＳｍ−Ｃｏ磁石を用いて磁気的に回収し再びＰＢＳに懸濁する事を繰り返す事で洗浄し、プロテインＡに抗体が結合した磁気微粒子を得た。
次に、抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させた蛍ルシフェラーゼ及びプロテインＡを同時に発現させた磁気微粒子（プロテインＡ発現抗体結合磁気微粒子）の懸濁液（ＰＢＳ）に抗原としてヒトＩｇＧを添加し抗原抗体反応を行った。抗原抗体反応は交番磁界を印加することで磁気微粒子を磁気的に撹拌することで行った（特開平２−２８１１４２）。従来より用いられてきたグルタルアルデヒドを用いる化学結合法（特公平６−１２９９４）でプロテインＡ及びルシフェラーゼを固定化し、プロテインＡに抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させた磁気微粒子（プロテインＡ固定化抗体結合磁気微粒子）と抗ヒトＩｇＧ抗体とルシフェラーゼを固定化した磁気微粒子（抗体結合磁気微粒子）を比較として用い、抗原抗体反応によって生じた凝集により磁気微粒子上のルシフェラーゼの発光量の変化を測定した結果を表１に示す。発光量はピッカジーン発光キット（東洋インキ製）を用いルミノメーターで測定し、稀釈した抗原を測定する事で、最高検出感度を比較した。
0004441797.tif 000006
表５に示すようにプロテインＡ発現抗体結合磁気微粒子が最も検出感度が高かった。これは化学的な固定化法と比べ、遺伝子組み換えによりタンパク質を発現させた場合は磁気微粒子への結合部位が遺伝的に制御され活性の低下が無いためである。また、遺伝的に制御する事でプロテインＡとルシフェラーゼを近接した位置に結合できるため、抗原結合によりルシフェラーゼの発光を効果的に阻害できる。これに対し、化学的な固定化では固定化処理に活性部位を用いてしまったり、結合したタンパク質の状態によっては立体阻害を起こし結合部位が表面に出ない場合がある。従って、固定化量の制御及び同時に二種類のタンパク質を安定に固定化することは困難である。
〔発明の利点〕
本発明によれば、固定化等の処理を行う必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得ることができる。有用タンパク質が機能性タンパク質である場合には、磁気微粒子に固定化された機能性タンパク質を磁気的に制御することができるので、所要の局所へ効率的にその機能を発揮させることができる。
また、所要のタンパク質をコードする遺伝子をプラスミドベクターに導入し、得られた組換えプラスミドで磁性細菌を形質転換することでどのようなタンパク質も磁気微粒子上に生成させることができる。
高価な酵素、抗体等のタンパク質を用意する必要はなく、同じ菌株を維持し培養するだけで所要のタンパク質結合磁気微粒子を半永久的に製造することができ、製造ロット間のタンパク質含有量や活性にバラツキがなく、しかも低コスト化のメリットも大きい。しかも、こうして得られる磁気微粒子は、常に同一活性を有するタンパク質を同一の量で含有するものである。
さらに、タンパク質を磁気微粒子上に生産するため目的とするタンパク質を磁気的に短時間で分離回収でき、効率的な分離精製が出来る。
本発明の標的物質測定方法によれば、微量な標的物質と磁気微粒子上の結合性タンパク質との反応を例えば交番磁場によって加速して磁気微粒子を凝集させ、かつ第二のタンパク質に基づく蛍光あるいは発光光量の変化を測定することによって容易に標的物質を測定することができる。また、本発明に用いる磁気微粒子は、固定化等の処理を行う必要がなく、機能性タンパク質はすべて生物学的結合により磁気微粒子に結合されるので固定化に伴う活性の低下はおこらない。しかも固定化の反応性が均一であり、低コストである。また、遺伝的にタンパク質の発現位置を制御できるため結合性タンパク質と標識タンパク質とを近接して結合することが可能であることは検出感度を著しく向上させる。従って、例えばプロテインＡを介在タンパク質として発現させた後、これに抗体を結合し、抗原抗体反応に用いた場合、抗原の結合により近接したルシフェラーゼの発光を容易に立体阻害出来るために非常に高感度な測定が可能となる。
産業上の利用可能性
本発明は、例えば、次のような利用可能性を有する。
1）酵素結合担体
一般に部位特異的に働くことが理想であると考えられる酵素はすべて磁気微粒子表面で発現させる価値がある。例えば、生化学反応において反応系の中で局所的にある酵素反応を行いたい場合にはこの酵素を発現させた磁気微粒子は有用である。また、ある酵素系の疾患においては器官に特異的にその酵素を投与したい場合磁気微粒子表面に発現させた酵素を磁気的に誘導することによって、治療することが可能である。
2）DNAキャリア
DNAやRNAとの結合能を持つタンパク質、例えばリプレッサーなどのタンパク質の遺伝子を結合性ＤＮＡ配列と融合し、本発明により磁気微粒子に固定すると、この磁気微粒子を遺伝子の輸送を行うキャリアとして用いることが可能である。リプレッサーなどのタンパク質はある特定の物質の存在下で結合力を失う特性がある。これを利用して、遺伝子の輸送を行うことができる。リプレッサータンパク質の例としてはＬａｃＩが挙げられる。ＬａｃＩとはラクトース分解酵素の遺伝子発現を制御するタンパク質で、プロモーターの下流域に結合することによって、遺伝子の転写を抑制するリプレッサーである。このＬａｃＩはラクトースや、ＩＰＴＧなどの化学物質と結合することによって、ＤＮＡとの結合能を失う。つまり、分解する基質が存在するときに発現する仕組みになっているのである。また、ＬａｃＩが結合する特定のＤＮＡドメインがある。ＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子はＬａｃＩが結合することができる。
例えば、このＬａｃＩを磁気微粒子表面で発現させることによって、ＬａｃＩがＤＮＡドメインを組み込んだ遺伝子と結合する。一方、ＬａｃＩは、ＩＰＴＧという物質によってＤＮＡとの結合能を失う。これを用いてある特定の場所からＤＮＡを磁気輸送し、ＩＰＴＧの添加によってＤＮＡを遊離させることができる。こうして、遺伝子を所要の場所へ輸送することができる。
したがって、本発明の磁気微粒子は、遺伝子治療における遺伝子移送担体などに応用することが考えられる。例えば、目的遺伝子の相補鎖からできるアンチセンスＲＮＡを発現させることによって、その目的の遺伝子の発現をＲＮＡハイブリッドの形成によって抑えるという治療法が現在盛んに研究されているが、そのアンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを運ぶ手段として用いることができる。
また、さらに、金属結合性のタンパク質を磁気微粒子表面に発現させ、これを金属の回収、または、検出に用いることができる。回収、検出は磁気回収によって行うことができる。
3）タンパク質生産システム
一般に分離精製が困難であると言われるタンパク質は、磁気微粒子上にｍｐｓタンパク質との融合タンパク質として発現させることで、分離精製が容易になる。即ち、磁気微粒子表面で発現させたタンパク質は、最後に磁気により容易に回収できるからである。磁性細菌から得られる磁気微粒子の単分散性の高さを考えると、タンパク質によっては、磁気微粒子に固定化された状態で使用可能なものも多く存在すると考えられる。例えばアルコール発酵用の酵素などは磁気微粒子と結合したままの状態でも酵素の活性さえあれば十分に使用可能であると考えられる。
4）診断試薬
ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を発現させた磁気微粒子に同時に抗体を発現させるか、またはプロテインＡを発現させ、抗体を結合させた磁気微粒子は免疫測定用の試薬としての利用が可能である。磁気微粒子を担体とすることで外部磁界により撹拌することができ、抗原抗体反応を促進することができる。抗原抗体反応による凝集によりリポーター遺伝子が立体的に阻害されルシフェラーゼでは発光阻害がおきる。凝集度により発光阻害効果が異なるので抗原の定量が可能となる。
5）抗原物質など標的物質の定量
有用タンパク質として結合性タンパク質と標識タンパク質とを結合させた磁気微粒子、及びこれを用いる前記の測定方法によれば、ルシフェラーゼ等の発光性機能タンパク質（発光関連酵素）を結合させた磁気微粒子に、同時に抗体を発現させるか、又はプロテインＡを発現させ、抗体を結合させた磁気微粒子を免疫測定用の試薬として利用する。すなわち、磁気微粒子を担体とすることで外部磁界により攪拌することができ、抗原抗体反応を促進することができる。また、抗原抗体反応による凝集により発光性機能タンパク質が立体的に阻害され、ルシフェラーゼでは発光阻害がおきる。凝集度により発光阻害効果が異なるので抗原の定量が可能となる。
以下に示す配列表に示された塩基配列は、左から右へ５’末端から３’末端の方向である。また、各文字は次の塩基を表す。
Ａ：アデニン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｔ：チミン
Ｙ：Ｔ／ＵまたはＣ
Ｈ：ＡまたはＣ
Ｎ：ＡまたはＧまたはＣまたはＴ／Ｕ
Ｒ：ＧまたはＡ
配列表
配列番号：１
配列の長さ：317
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0004441797.tif 000007
0004441797.tif 000008
0004441797.tif 000009
配列番号：２
配列の長さ：1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：Yes
アンチセンス：No
配列：
0004441797.tif 000010
配列番号：３
配列の長さ：1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：No
アンチセンス：
起源：
生物名：マグネトスピルラム属（Magnetospirullum）
株名：AMB-1（FERM BP-5458）
配列：
0004441797.tif 000011
配列番号：４
配列の長さ：434
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
0004441797.tif 000012
0004441797.tif 000013
0004441797.tif 000014
0004441797.tif 000015
0004441797.tif 000016
配列番号：５
配列の長さ：1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
ハイポセティカル配列：NO
アンチセンス：No
起源：
生物名：マグネトスピルラム属（Magnetospirullum）
株名：AMB-1（FERM BP-5458）
配列：
0004441797.tif 000017
配列番号：６
配列の長さ：1302
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
0004441797.tif 000018
【図１】
0004441797.tif 000019
【図２】
0004441797.tif 000020
【図３】
0004441797.tif 000021
【図４】
0004441797.tif 000022
【図５】
0004441797.tif 000023
【図６】
0004441797.tif 000024
【図７】
0004441797.tif 000025
【図８】
0004441797.tif 000026
【図９】
0004441797.tif 000027
【図１０】
0004441797.tif 000028
【図１１】
0004441797.tif 000029
【図１２】
0004441797.tif 000030
【図１３】
0004441797.tif 000031
【図１４】
0004441797.tif 000032