(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
母乳から調製した試料溶液にＮＡＤＰＨ、ＤＴＮＢおよびグルタチオンリダクターゼを添加して、吸光度を測定することにより該母乳中のグルタチオン量を定量する方法において、母乳を搾乳後ただちに過塩素酸を添加して該母乳中の酵素を失活させた後に、測定に供することを特徴とする母乳中のグルタチオン定量法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、試料溶液の希釈を、アルブミン溶液を除タンパク処理した溶液を用いて行うことを特徴とする母乳中のグルタチオン定量法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法により母乳中のグルタチオンを定量し、０．３〜１８μｇ／ｍｌの濃度となる量のグルタチオンを配合したことを特徴とする乳幼児用栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタチオンを配合した乳幼児用栄養組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
母乳は乳幼児に対しては最も理想的な栄養源であると考えられており、近年、技術の向上により、この究極的な目標である母乳に近づけた組成物が提案されている。しかしながら、母乳中には種々のホルモン、増殖因子、酵素阻害物質等の生理活性物質が含まれており、一方、牛乳を原料として製造される栄養組成物は、その成分・組成には種間差があるといわれているとともに、精製する過程で牛乳由来の生理活性物質は大部分が分解、あるいは除去されるため、これら生理活性物質はほとんど含まれていない。
生理活性物資の一つであるグルタチオンは、免疫賦活作用、抗酸化作用等をはじめとする様々な生理活性作用を有し、更に、乳幼児の腸整作用、脳の発育にも影響を与えているといわれている。
このグルタチオンの母乳中の存在については、例えば、臨床栄養６４巻７７９頁（昭和５９年）には、平均値として分娩５日目までが２３７ｎｍｏｌ／ｍｌ、６〜２５日は１２３ｎｍｏｌ／ｍｌ、２５日以降は１００ｎｍｏｌ／ｍｌ前後であったことが、また、Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｐ．  ２０００  ４６  １１１には、分娩４週間未満では平均２５２．５μｍｏｌ／ｌ、４週間以上では平均１６３．９μｍｏｌ／ｌであったことが、それぞれ報告されている。
しかしながら、これら報告のグルタチオンの分析はいずれもオルトフタルアルデヒドを用いる蛍光法によるものであり、アミン、チオールと反応するためグルタチオンの微量定量法としてはほとんど用いられていない方法であることから、これらの数値が、実際にグルタチオンが母乳中に存在すること、かつその存在量を表したものとは言い難い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現代社会において、全ての乳幼児を母乳だけで育てることは難しく、栄養組成物が必要とされている。しかしながら、母乳中の生理活性成分やその機能については、一部は明らかにされつつあるものの未だ不明な点が多い。
本発明は、母乳中に存在する生理活性成分を乳幼児用栄養組成物に配合することで、成分組成及び機能を母乳に近づけた乳児用栄養組成物を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討の結果、母乳を搾乳後ただちに過塩素酸を添加して該母乳中の酵素を失活させた後にグルタチオンリダクターゼを用いることにより母乳中のグルタチオンを定量できること、試料溶液の希釈をアルブミン溶液を除タンパク処理した溶液を用いて行えばよいこと、母乳中にグルタチオンが存在すること、グルタチオンを配合した組成物が安定であることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
（１）母乳から調製した試料溶液にＮＡＤＰＨ、ＤＴＮＢおよびグルタチオンリダクターゼを添加して、吸光度を測定することにより該母乳中のグルタチオン量を定量する方法において、母乳を搾乳後ただちに過塩素酸を添加して該母乳中の酵素を失活させた後に、測定に供することを特徴とする母乳中のグルタチオン定量法、
（２）上記（１）記載の方法において、試料溶液の希釈を、アルブミン溶液を除タンパク処理した溶液を用いて行うことを特徴とする母乳中のグルタチオン定量法、
（３）上記（１）または（２）に記載の方法により母乳中のグルタチオンを定量し、０．３〜１８μｇ／ｍｌの濃度となる量のグルタチオンを配合したことを特徴とする乳幼児用栄養組成物、を提供するものである。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の栄養組成物は、特に乳幼児として調整された調整乳、蛋白質分解乳、フォローアップミルク、特殊栄養調整乳あるいは幼児用として調整された離乳食や食品であって、これらの乾燥粉末化されたものも好適である。また、栄養組成物の形態としては、固形状、液状、粉体状あるいはゲル状等のいずれでもよい。
【０００６】
本発明の栄養組成物に配合されるグルタチオンはグルタミン酸、システイン及びグリシンの三つのアミノ酸からなる公知のペプチドであり、本発明者らが母乳中に存在することを初めて見いだしたものである。グルタチオンの配合量は栄養組成物より異なるが、栄養組成物の固形分１００ｇに対して０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．３〜５０ｍｇ添加される。特に乳児の育児用ミルクとして使用する場合は、グルタチオン濃度として母乳組成と同程度の０．３〜１８μｇ／ｍｌ（１〜６０ｎｍｏｌ／ｍｌ）、好ましくは０．６〜１２μｇ／ｍｌ（２〜４０ｎｍｏｌ／ｍｌ）の濃度で使用することが望ましい。
グルタチオンの配合方法は任意であるが、例えば液体調整乳を製造する場合は原料を滅菌して調整した溶液にグルタチオンあるいはその溶液を添加、混合する方法、調整粉乳を製造する場合は、調製粉乳と混合する方法、が簡便であり好ましい。
【０００７】
本発明の栄養組成物は、蛋白質、糖質、脂質、ビタミン類及びミネラル類を主成分として、これらにグルタチオンが配合されるが、その他、乳幼児用栄養組成物に配合が可能な成分を加えてもよい。
これら成分は公知のものが用いられ、その配合も公知の範囲で十分である。
【０００８】
従来、母乳中のグルタチオンに関しては報告はあるものの、いずれも母乳の処理について何ら検討が行われておらず、かつ、測定はアミン、チオール類と反応するオルトフタルアルデヒドを用いた蛍光法によるものであり、グルタチオンに特異的な定量法とはいえず、その存在あるいは存在量として十分に確認されたものとはいえなかった。この間の事情について、例えば、Ｊ．ＮＵＴＲＩＴＩＯＮ１９９８  １２８  ２１２５Ｓ  （ＬＳＲＯ  Ｒｅｐｏｒｔ）には、人乳のグルタチオン含量についてはデータが見いだせないことが記載されている。
本発明者らは、母乳の処理について検討を行うと共に、グルタチオンの定量法としてグルタチオンに特異的な酵素であるグルタチオンリダクターゼを使用することにより、母乳中のグルタチオンの存在を確認し、その量を測定できることを見いだしたものであり、その測定値が従来報告された数値と大きく異なっていることも上記の観点を裏付けるものである。
【０００９】
【実施例】
以下実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
実験例１  母乳中のグルタチオンの定量
搾乳したての母乳０．５ｍｌを分取し、直ちに０．６Ｎ  ＨＣｌＯ４ −０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液１．０ｍｌを添加した。試験管ミキサーにて混合した後、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を１．０ｍｌ分取し、これに２Ｍ  ＫＨＣＯ３ ０．５ｍｌを添加・混合した後、氷水中に２０分間放置した。放置後、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、その上清１．０ｍｌをとり、アルブミン処理液（アルブミン溶液を母乳と同様に除タンパク処理をした溶液）で希釈し、定量用サンプルとした。
定量は、サンプル１．０ｍｌ、ＧＲ反応用試薬（リン酸カリウム緩衝液、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ３ 、ＮＡＤＰＨ、ＥＤＴＡ、ＤＴＮＢの混合液）１．０ｍｌ、蒸留水１．０ｍｌを石英セルに入れ、これにＧＲ（グルタチオンレダクターゼ）１０μｌを添加し、泡立たないように撹拌した後、レートアッセイ法により波長４１２ｎｍ、３分間、室温で定量した。
検量線は、アルブミン溶液を用い上記と同様な手順で処理を行い作成した。
本定量法の概要を図１に示す。
本方法のポイントの一つは母乳の処理にある。すなわち、母乳搾乳後ただちに過塩素酸を添加し母乳中の酵素類を失活させること、及び母乳の希釈をアルブミン処理液で行う（水で希釈すると相当に高い測定値を与える場合がある。）こと、により、母乳中のグルタチオン量を定量することができる。
【００１０】
実験例２  グルタチオンの添加回収試験
搾乳したての母乳を氷冷し、５分後に最終濃度がそれぞれ２．０１μｇ／ｍｌ、４．０２μｇ／ｍｌ、６．０３μｇ／ｍｌとなるようにグルタチオンを添加した後、過塩素酸を添加し、以下、実験例１記載の方法に準じてグルタチオン量を測定した。グルタチオン量は、グルタチオン無添加の母乳測定値をブランクとしてそれぞれの添加区の測定値から差し引くことにより求めた。
結果を図２に示す。
図２より、相関係数が０．９８３５と非常に高い相関関係を示し、本定量法が十分なものであることが分かる。
【００１１】
実験例３  母乳中のグルタチオンの安定性
母乳に最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるようにグルタチオンを添加し、氷冷保存し、０、１０、２０、４０、６０分後にサンプリングし過塩素酸を添加し、以下、実験例１記載の方法に準じてグルタチオン量を測定した。
結果を図３に示す。
図３から、母乳中において、グルタチオンは速やかに消失し、１０分後には１／３程度に、１時間後にはほとんど残存していないことが分かる。
【００１２】
実験例４  血漿中のグルタチオン濃度の測定
成人女性２２名（２４〜５９才）及び妊婦３０名（２０〜４０才）について血漿中のグルタチオン量を測定した。
すなわち、採血後直ちに遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、２分間）を行い血漿を分離し、その血漿について、実験例１記載の方法に準じてグルタチオン量を測定した。
成人女性の結果を図４に、妊婦の結果を図５に示す。
図４及び図５から、妊婦のほうが、血漿中のグルタチオン濃度が若干低いことが分かる。
【００１３】
実験例５  母乳中のグルタチオンの定量
初乳段階（産褥日数０〜１２日）５５名及び常乳域（産褥日数２６日以降）４３名の母乳中のグルタチオン量を、実験例１記載の方法に準じて測定した（サンプル総数２１６検体）。
結果を図６に示す。
図６から、母乳中のグルタチオンの最高濃度は１４．３μｇ／ｍｌ（４７．６ｎｍｏｌ／ｍｌ）、最低濃度は０．７５μｇ／ｍｌ（２．５３ｎｍｏｌ／ｍｌ）で、全てのサンプルについてグルタチオンが見いだされたこと、平均濃度としては産褥日数が１〜８日では４．１μｇ／ｍｌ（１３．５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、３０〜３５日では５．２μｇ／ｍｌ（１７．４ｎｍｏｌ／ｍｌ）であることが分かる。
【００１４】
実施例１
人工ミルク粉末（和光堂（株）、フォローアップミルク「ぐんぐん」、配合割合：乳成分６３．９％、調整脂肪１７．８％、デキストリン１８．３％、栄養成分（１００ｇ当たり）：エネルギー４７６ｋｃａｌ、脂質２０．０ｇ、糖質５９．９ｇ、ナトリウム２００ｍｇ）１４ｇをとり、約４０℃のお湯１００ｍｌを加え混合した後、グルタチオンを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように添加混合し、本発明の乳幼児用栄養組成物を作製した。
本組成物中のグルタチオンの安定性を以下の方法で試験した。
すなわち、本組成物を室温で保存し、０、５、１０、２０、３０、４０、６０分経過ごとにボルテックスミキサーにて撹拌し、実験例１記載の方法に準じてグルタチオン量を測定した。
結果を図７に示す。
図７より、本組成物中のグルタチオンは十分に安定であることが分かる。
【００１５】
【発明の効果】
以上説明してきた通り、本発明によると、グルタチオンを配合した、成分組成を母乳に近づけた乳児用栄養組成物が提供され、乳幼児の免疫賦活作用、抗酸化作用、腸整作用、脳の発育等の機能が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】グルタチオンリダクターゼを用いたグルタチオン定量法の概要図である。
【図２】フレッシュな母乳に対する添加回収試験の結果を表した図である。
【図３】母乳中のグルタチオンの保存安定性を表した図である。
【図４】成人女性の血漿中のグルタチオン濃度を表した図である。
【図５】妊婦の血漿中のグルタチオン濃度を表した図である。
【図６】産褥日数と母乳中のグルタチオン濃度との関係を表した図である。
【図７】本発明の乳幼児用栄養組成物中のグルタチオンの安定性を表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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