(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0004542296.tif 000054
（式中、ｎは１より大きい整数であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂｎ−１およびＢｎは各々、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から独立して選択される化学官能基であり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々、第一リンカー基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎは各々、第二リンカー基であり、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃｎ−１およびＣｎはキラル炭素原子であり、そして［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲートである）
で表される化合物。
【請求項２】
前記第一−第二リンカー基：Ｙ１−Ｘ１、Ｙ２−Ｘ２、Ｙｎ−１−Ｘｎ−１およびＹｎ−Ｘｎが各々、単結合である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎ各々がアルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から独立して選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎが各々、メチレン基およびＣ−アルカノイル基からなる群から独立して選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記第二リンカー基：Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎが各々、メチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基、カルボニル基および単結合からなる群から独立して選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記キラル炭素のｍ％がＳ配置に存在し、ｍが９０−９５％、９６−９８％、９９％および９９％より大きい％からなる群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
［Ｋ］と［Ｉ］が各々、ポリエチレングリコール部分である請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
下記式：
【化２】
0004542296.tif 000055
で表される請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
下記式：
【化３】
0004542296.tif 000056
（式中、Ｂは、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される化学官能基であり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択され、
Ｙは第一リンカー基であり、
Ｘは第二リンカー基であり、
Ｃ＊はキラル炭素原子であり、
Ｚは第一保護基であり、そして
Ａは脱離基である）
で表される化合物。
【請求項１０】
前記第一−第二リンカー基：Ｙ−Ｘが単結合である請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記第一リンカー基：Ｙが、アルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記第一リンカー基：Ｙがメチレン基およびＣ−アルカノイル基からなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
前記第二リンカー基：Ｘがメチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基、カルボニル基および単結合からなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ヌクレオベースがアミノ基を含有していれば、前記アミノ基は第二保護基で保護される請求項９に記載の化合物。
【請求項１５】
前記保護基Ｚがジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基およびシリル基からなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１６】
前記脱離基Ａが、ハロゲン化物基、スルホネート基、アンモニウム誘導体、ＳＮ１またはＳＮ２の機構によって置換できるラジカル部分からなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
前記第二保護基が、メチルベンジルエーテル基、ベンズアミド基、イソブチルアミド基、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、および前記Ｚ保護基を開裂する試薬によって開裂されない酸性の反応活性基からなる群から選択される請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
下記式：
【化４】
0004542296.tif 000057
で表される請求項９に記載の化合物。
【請求項１９】
複数のキラル炭素原子を有するポリ（エーテル−チオエーテル）骨格を含んでなる化合物であって、前記ポリ（エーテル−チオエーテル）骨格が前記キラル炭素原子に個々に結合している複数のリガンドを有し、前記リガンドが、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される部分を含んでおり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択される化合物の製造方法であって、
（ａ）各々エーテル部分とチオエーテル部分を有するモノマーを獲得し、前記エーテル部分が少なくとも一つのエーテル結合を含有し、前記チオエーテル部分が少なくとも一つのチオエーテル結合を含有し、前記モノマーが各々、官能基が連結している少なくとも一つのキラル炭素原子をさらに含有し、前記官能基が天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択され、
（ｂ）前記モノマーの中の第一モノマーを固体支持体に結合させ、次いで
（ｃ）モノマーを予め定められた順序で前記第一モノマーに連続的に縮合させて、縮合モノマーのポリマーを得る、
ステップを含んでなる製造方法。
【請求項２０】
前記キラル炭素原子が、４〜６個の介入原子によって前記骨格内で互いに隔てられている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
二本鎖ポリヌクレオチドを請求項１に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が、配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドの一方のストランドに結合して他方のストランドを置換するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項２２】
一本鎖ポリヌクレオチドを請求項１に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が、配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドに結合するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項２３】
有効成分としての請求項１に記載の化合物、および少なくとも一種の医薬として有効な担体、結合剤、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤または界面活性剤を含有する医薬組成物。
【請求項２４】
下記式：
【化５】
0004542296.tif 000058
（式中、ｎは１より大きい整数であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂｎ−１およびＢｎは各々、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から独立して選択される化学官能基であり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々、第一リンカー基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎは各々、第二リンカー基であり、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃｎ−１およびＣｎはキラル炭素原子であり、そして
［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲートである）
で表される化合物。
【請求項２５】
前記第一−第二リンカー基：Ｙ１−Ｘ１、Ｙ２−Ｘ２、Ｙｎ−１−Ｘｎ−１およびＹｎ−Ｘｎが各々、単結合である請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎが各々、アルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から独立して選択される請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎが各々、メチレン基およびＣ−アルカノイル基からなる群から独立して選択される請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
前記第二リンカー基：Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎが各々、メチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基、カルボニル基および単結合からなる群から独立して選択される請求項２４に記載の化合物。
【請求項２９】
前記キラル炭素のｍ％がＳ配置に存在し、ｍが９０−９５％、９６−９８％、９９％および９９％より大きい％からなる群から選択される請求項２４に記載の化合物。
【請求項３０】
［Ｋ］と［Ｉ］が各々、ポリエチレングリコール部分である請求項２４に記載の化合物。
【請求項３１】
下記式：
【化６】
0004542296.tif 000059
で表される請求項２４に記載の化合物。
【請求項３２】
複数のキラル炭素原子を有するポリ（エーテル−スルホン）骨格を含んでなる化合物であって、前記ポリ（エーテル−スルホン）骨格が、前記キラル炭素原子に個々に結合している複数のリガンドを有し、前記リガンドが、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される部分を含んでおり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択される化合物の製造方法であって、
（ａ）各々エーテル部分とチオエーテル部分を有するモノマーを獲得し、前記エーテル部分が少なくとも一つのエーテル結合を含有し、前記チオエーテル部分が少なくとも一つのチオエーテル結合を含有し、前記モノマーが各々、官能基が連結している少なくとも一つのキラル炭素原子をさらに含有し、前記官能基が天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択され、
（ｂ）前記モノマーの中の第一モノマーを固体支持体に結合させ、
（ｃ）モノマーを予め定められた順序で前記第一モノマーに連続的に縮合させて縮合モノマーのポリマーを獲得し、次いで
（ｄ）スルフィド部分を酸化してスルホンにする、
ステップを含んでなる方法。
【請求項３３】
前記キラル炭素原子が、４〜６個の介入原子によって前記骨格内で互いに隔てられている請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
二本鎖ポリヌクレオチドを請求項２４に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドの一方のストランドに結合して、他方のストランドを置換するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項３５】
一本鎖ポリヌクレオチドを請求項２４に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドに結合するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項３６】
有効成分としての請求項２４に記載の化合物、および少なくとも一種の医薬として有効な担体、結合剤、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤または界面活性剤を含有する医薬組成物。
【請求項３７】
下記式：
【化７】
0004542296.tif 000060
（式中、ｎは１より大きい整数であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂｎ−１およびＢｎは各々、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から独立して選択される化学官能基であり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々、第一リンカー基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎは各々、第二リンカー基であり、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃｎ−１およびＣｎはキラル炭素原子であり、そして
［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲートである）
で表される化合物。
【請求項３８】
前記第一−第二リンカー基：Ｙ１−Ｘ１、Ｙ２−Ｘ２、Ｙｎ−１−Ｘｎ−１およびＹｎ−Ｘｎが各々、単結合である請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎが各々、アルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から独立して選択される請求項３７に記載の化合物。
【請求項４０】
前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎが各々、メチレン基およびＣ−アルカノイル基からなる群から独立して選択される請求項３７に記載の化合物。
【請求項４１】
前記第二リンカー基：Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎが各々、メチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基、カルボニル基および単結合からなる群から独立して選択される請求項３７に記載の化合物。
【請求項４２】
前記キラル炭素のｍ％がＳ配置に存在し、ｍが９０−９５％、９６−９８％、９９％および９９％より大きい％からなる群から選択される請求項３７に記載の化合物。
【請求項４３】
［Ｋ］および［Ｉ］が各々、ポリエチレングリコール部分である請求項３７に記載の化合物。
【請求項４４】
下記式：
【化８】
0004542296.tif 000061
で表される請求項３７に記載の化合物。
【請求項４５】
複数のキラル炭素原子を有するポリ（エーテル−スルホキシド）骨格を含んでなる化合物であって、前記ポリ（エーテル−スルホキシド）骨格が、前記キラル炭素原子に個々に結合している複数のリガンドを有し、前記リガンドが、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される部分を含んでおり、これらのヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基は、相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができ、ヌクレオベース結合基は、イノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシン、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤、ジオール基、トリオール基、ＤＮＡインターキレーター、および相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用でき、ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができるリガンドからなる群から選択される化合物の製造方法であって、
（ａ）各々エーテル部分とチオエーテル部分を有するモノマーを獲得し、前記エーテル部分が少なくとも一つのエーテル結合を含有し、前記チオエーテル部分が少なくとも一つのチオエーテル結合を含有し、前記モノマーが各々、官能基が連結している少なくとも一つのキラル炭素原子をさらに含有し、前記官能基が天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択され、
（ｂ）前記モノマーの中の第一モノマーを固体支持体に結合させ、
（ｃ）モノマーを予め定められた順序で前記第一モノマーに連続的に縮合させて縮合モノマーのポリマーを獲得し、次いで
（ｄ）スルフィド部分を酸化してスルホキシドにする、
ステップを含んでなる方法。
【請求項４６】
前記キラル炭素原子が、４〜６個の介入原子によって前記骨格内で互いに隔てられている請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
二本鎖ポリヌクレオチドを請求項３７に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドの一方のストランドに結合して、他方のストランドを置換するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項４８】
一本鎖ポリヌクレオチドを請求項３７に記載の化合物と接触させ、その結果、前記化合物が配列特異的方式で前記ポリヌクレオチドに結合するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成方法。
【請求項４９】
有効成分としての請求項３７に記載の化合物、および少なくとも一種の医薬として有効な担体、結合剤、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤または界面活性剤を含有する医薬組成物。
【請求項５０】
生物体内で遺伝子の発現を調節することに使用するために同定される請求項２３、３６および４９のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記化合物が、配列特異的方式で、前記遺伝子由来のＤＮＡまたはＲＮＡに結合する医薬組成物。
【請求項５１】
前記調節が、前記遺伝子の転写を阻害することを含んでいる請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記調節が、前記遺伝子の複製を阻害することを含んでいる請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記調節が、前記遺伝子の前記ＲＮＡの翻訳を阻害することを含んでいる請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
生物体内で望ましくないタンパク質が産生することに関連する症状を治療することに使用するために同定される請求項２３、３６および４９のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記化合物が前記タンパク質の産生を制御する遺伝子由来のＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に結合する医薬組成物。
【請求項５５】
生物体の細胞内でＤＮＡまたはＲＮＡの破壊を誘発することに使用するために同定される請求項２３、３６および４９のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記化合物が前記ＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に結合する医薬組成物。
【請求項５６】
細胞またはウイルスを殺すことに使用するために同定される請求項２３、３６および４９のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記化合物が、前記細胞もしくはウイルスのゲノムの一部またはそのゲノム由来のＲＮＡと特異的に結合する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、一般にヌクレオチド擬似体(nucleotide mimetics)とそのヌクレオチド擬似体由来の核酸擬似体、これら両擬似体の製造方法および前記核酸擬似体の生化学および医学での使用に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、(i)ポリ（エーテル−チオエーテル）、ポリ（エーテル−スルホキシド）またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格に基づいた非環式ヌクレオチドとも呼称される非環式ヌクレオチド擬似体；(ii)前記非環式ヌクレオチド擬似体の合成方法；(iii)非環式ポリヌクレオチド配列とも呼称される非環式ヌクレオチド擬似体配列；(iv)前記非環式ヌクレオチド擬似体配列の合成方法；および(v)前記非環式ヌクレオチド擬似体配列の、例えばアンチセンスの用途と方法におけるオリゴヌクレオチドとしての使用に関する。
【０００２】
従来の技術
アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド）は、その標的核酸に、ワトソン−クリック型塩基対またはフーグスティーン型塩基対およびアンチフーグスティーン型塩基対によって結合する。このことについては、ThuongとHeleneの研究報告「Sequence specific recognition and modification of double helical DNA by oligonucleotides」(Angev. Chem. Int. Ed. Engl.32巻 666頁 1993年）を参照されたい。ワトソン−クリック型塩基対によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの複素環式塩基は、標的の一本鎖核酸（ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）の複素環式塩基と水素結合を形成するが、一方、フーグスティーン型塩基対の場合、標的核酸の複素環式塩基は二本鎖ＤＮＡであり、そして第三のストランドが、フーグスティーン型塩基対とアンチフーグスティーン型塩基対によって、Ｂ型ＤＮＡ二重ラセンの主溝に収容されて三重ラセン構造を形成する。
【０００３】
ワトソン−クリック型塩基対とフーグスティーン型塩基対のモデルによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を制御しおよび核酸の必須機能を破壊する能力を有している。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、広範囲の疾患をやわらげるのに利用することができる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドを化学的に合成する有効な方法が発達しているので、これらの分子は、生化学や生物学の研究に広く使用されており、そして、注意深く工夫されたオリゴヌクレオチドを使用して、転写、転写物および／または翻訳のレベルを調節することによって遺伝子の発現を制御できるので医療に利用することができる。
【０００５】
１００個と長い塩基対（ｂｐ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、市販されている完全に自動化された合成器を使用する固相法でごく普通に合成される。しかし、オリゴリボヌクレオチドの化学合成はとても普通に行えるものではない。また、オリゴリボヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドよりはるかに不安定であり、この事実が、オリゴデオキシリボヌクレオチドの方が、例えば遺伝子治療または転写もしくは翻訳のレベルの調節を目的とする医学および生物学の研究に一層広く利用される理由になっている。
【０００６】
遺伝子の発現には、いくつかの十分に調節された明確なステップを含んでいる。遺伝子発現の第一の主要ステップは、アンチセンス（すなわち−）ＤＮＡストランドに相補的なＲＮＡ配列、すなわち換言すれば遺伝子を構成するＤＮＡセンス（すなわち＋）ストランドと同一の配列のＲＮＡ配列であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を含んでいる。真核生物の場合、転写は細胞核内で起こる。
【０００７】
遺伝子発現の第二の主要ステップは、タンパク質（例えば酵素、構造タンパク質、分泌タンパク質、遺伝子発現因子など）の翻訳を含んでいる。この翻訳のステップでは、ｍＲＮＡが、リボソームＲＮＡ複合体（リボソーム）およびアミノ酸活性化反応で合成された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）と相互に作用して、ｍＲＮＡ配列がコードするタンパク質の合成を誘導する。
【０００８】
転写を開始するには、遺伝子のコード配列の上流に位置するプロモーターＤＮＡ配列の、ＲＮＡ合成酵素すなわちＲＮＡポリメラーゼによる特異的認識が必要である。この認識が行われる前に、一つ以上のタンパク質転写因子のプロモーター配列との配列特異的結合が行われる。そのプロモーター配列に結合しているかまたは該プロモーター配列の近くに結合している追加のタンパク質が、転写を促進し、エンハンサーとして知られている。プロモーターに結合しているかまたは該プロモーターの近くに結合しているが、その結合がＲＮＡポリメラーゼの作用を阻害する他のタンパク質はリプレッサーとして知られている。
【０００９】
また、場合によっては、遺伝子発現が、相補的ｍＲＮＡ転写物を捕捉して、その機能性タンパク質への翻訳を阻害する内因性アンチセンスＲＮＡリプレッサーによって低下させられるという証拠もある。この点についてはGreenら、「The role of antisense RNA in gene regulation」、Ann. Rev. Biochem. 55巻 569頁 1986年を参照されたい。
【００１０】
このように遺伝子発現は一般に、転写因子とエンハンサーによって促進されそしてリプレッサーによって低下させられる。
【００１１】
しかし、多くの疾患状態では、遺伝子発現が損なわれる。各種の癌などの多数の症例では、種々の理由のため、特異的な内因性または外因性の（例えばウイルスなどの病原体の）の遺伝子の発現が促進される。さらに、寄生虫、細菌またはウイルスなどの病原体によって起こる感染症の場合、その疾患の進行は前記病原体遺伝子の発現によって左右され、またこの現象は、その患者に関する限り、外因性遺伝子の発現の促進と考えられる。
【００１２】
従来の薬物の大部分は、一つ以上の標的とする内因性または外因性のタンパク質、例えば酵素と相互に作用するかまたはこれらタンパク質を調節することによって機能する。しかし、このような薬物は、一般に、標的のタンパク質に対して特異的ではなく、他のタンパク質とも相互に作用する。したがって、標的のタンパク質を有効に調節するには、比較的多量の薬物を使用しなければならない。
【００１３】
薬物の一般的な一日当たりの投与量は、体重１ｋｇ当たり１０−５−１０−１ミリモルすなわち体重１００ｋｇのヒトに対して１０−３−１０ミリモルである。上記調節を、代わりに、ｍＲＮＡとの相互作用およびｍＲＮＡの不活性化によって行うことができれば、薬物の必要量を劇的に減らしかつ副作用を対応して減らすことができるであろう。このような相互作用を部位特異的にすることができればさらに減らすことができる。機能している遺伝子が連続的にｍＲＮＡを産生する場合、遺伝子の転写がその全体を阻止されると一層有利であろう。
【００１４】
このような場合、遺伝子発現が、転写レベルで阻止されるかまたは低下させられると有利であろう。
【００１５】
選択された予め定められた配列を有するオリゴヌクレオチドおよびその類似体を化学的に合成できると、遺伝子発現を低下させる手段が提供される。遺伝子の発現を調節する三種類の方法が考えられる。
【００１６】
転写の段階で、ストランドの置換もしくは三重ラセンの形成によってゲノムＤＮＡに結合するアンチセンスもしくはセンスのオリゴヌクレオチドもしくは類似体は、転写を妨げる。この点については、ThuongとHelene「Sequence specific recognition and modification of double helical DNA by oligonucleotides」、Angev. Chem. Int. Ed. Engl.32巻 666頁 1993年を参照されたい。
【００１７】
転写物の段階では、標的ｍＲＮＡ分子を捕捉するアンチセンスのオリゴヌクレオチドもしくは類似体が、細胞内ＲＮアーゼＨによるハイブリッドの酵素分解を起こす。この点については、Dashら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84巻 7896頁 1987年を参照されたい。この場合、標的ｍＲＮＡとハイブリッドを形成することによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ＲＮアーゼＨ酵素によって認識されて破壊される二重ラセンのハイブリッドを提供する。あるいは、かようなハイブリッドが形成することによって、正しいスプライシングが妨害される。この点については、Chiangら「Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two distinct mechanisms」、J. Biol. Chem. 266巻 18162頁 1991年を参照されたい。その結果、両方の場合、翻訳の準備ができた標的ｍＲＮＡの無傷の転写物の数が減るかまたはゼロになる。
【００１８】
翻訳の段階では、標的ｍＲＮＡ分子を捕捉するアンチセンスのオリゴヌクレオチドもしくは類似体は、立体障害によって、必須翻訳因子類（リボソーム類）が標的ｍＲＮＡに結合するのを妨げる。なお、この現象は、Patersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74巻 4370頁 1977年に記載されているように、このようなｍＲＮＡの翻訳をできないようにするハイブリッド形成の阻止として、当業技術界で知られている。
【００１９】
したがって、アンチセンス配列は、上記のように、それらの特異的な配列によって、内因性および／または外因性の遺伝子の発現を阻止できるので、アンチセンス法を新しい薬理学的手段として発展させる努力をしている科学者や薬理学者に大いに注目された。この点については、Cohen「Oligonucleotide therapeutics 」、Trends in Biotechnology 10巻 87頁 1992年を参照されたい。
【００２０】
例えば、いくつものアンチセンスオリゴヌクレオチドが、造血細胞の増殖（Szczylikら、「Selective inhibition of leukemia cell proliferation  by BCR-ABL antisense oligodeoxynucleotides」Science 253巻 562頁 1991年）、成長（Calabrettaら、「Normal and leukemic hematopoietic cell manifest differential sensitivity to inhibitory effects of c-myc antisense oligodeoxynucleotides：an in vitro study relevant to bone marrow purging 」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88巻 2351頁 1991年）、細胞周期のＳ期に入ること（Heikhilaら、「A c-myc antisense oligodeoxynucleotide inhibits entry into S phase but not progress from G(0)to G(1)」Nature 328巻 445頁 1987年）を阻止し、造血細胞の生存性を低下させ（Reedら、「Antisense mediated inhibition of BCL2 prooncogene expression and leukemic cell growth and survival：comparison of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides」、Cancer Res. 50巻 6565頁 1990年）そして受容体仲介の応答を妨げること（Burch and Mahan、「Oligodeoxynucleotides antisense to the interleukin I receptor mRNA block the effects of interleukin I in cultured murine and human fibroblasts and in mice」J. Clin. Invest. 88巻 1190頁 1991年）が報告されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの抗ウイルス剤としての使用について読者は、Agrawal、「Antisense oligonucleotides as antiviral agents 」、TIBTECH 10巻 152頁 1992年）を参照されたい。
【００２１】
遺伝子の発現を、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは類似体を使用して生体内で有効に阻害するには、そのオリゴヌクレオチドまたは類似体は以下の要件を満たさねばならない。すなわち(i)標的の配列に結合するのに十分な特異性；(ii)水溶性；(iii)細胞内ヌクレアーゼと細胞外ヌクレアーゼに対する安定性；(iv)細胞膜を透過する性能；および(v)生物体を治療するために使用する場合、毒性が低いことという要件を満たさねばならない。
【００２２】
未改質のオリゴヌクレオチドは、生体内での半減期が短くてその期間中に、ヌクレアーゼによって迅速に分解されるので、アンチセンス配列として使用することは実際的でない。さらに、未改質のオリゴヌクレオチドは、ｍｇ以上の量で製造することが困難である。さらに、このようなオリゴヌクレオチドは細胞膜透過性が悪い（Uhlmannら、Chem. Rev. 90巻 544頁 1990年参照）。
【００２３】
したがって、上記の要件をすべて満たすためには、オリゴヌクレオチド類似体を、適切な方式で考案する必要があることは明らかである。それ故、改質オリゴヌクレオチドの広範囲の研究が開始されている。
【００２４】
例えば三重ラセン形成による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の認識に付随して生じる問題点は、巧みな「スイッチバック」化学結合によって、小さくなり、その結果、一方のストランド上のポリプリンの配列が認識されそして、「スイッチバックを行う」ことによって、他方のストランド上のホモプリンの配列を認識することができる。また、人工塩基を使用することによって、良好なラセンが形成されて、イオン強度やｐＨに関する結合条件が改善される。
【００２５】
さらに、半減期と膜の透過性を改善するため、ポリヌクレオチドの骨格の多種類の変更が行われているがほとんど成功していない。
【００２６】
オリゴヌクレオチドは、塩基の部分、糖の部分またはホスフェートの部分を改質することができる。これらの改質には、メチルホスホネート類、モノチオホスフェエート類、ジチオホスフェート類、ホスホロアミデート類、リン酸エステル類；架橋ホスホロチオエート類；架橋ホスホロアミデート類；架橋メチレンホスホネート類；シロキサン架橋類、カーボネート架橋類、カルボキシメチルエステル架橋類、アセトアミド架橋類、カルバメート架橋類、チオエーテル架橋類、スルホキシ架橋類、スルホノ架橋類、各種「プラスチック」ＤＮＡ類、α−アノマー架橋類およびボラン誘導体とのデホスホヌクレオチド間類似体類（dephospho internucleotide analog）が使用される（さらなる詳細については、Cook 、「Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides - future opportunities」、Anti-Cancer Drug Design 6巻 585頁 1991年参照）。
【００２７】
国際特許願公開第ＷＯ  ８６／０５５１８号は、標的塩基配列を含有する一本鎖ポリヌクレオチドに結合するのに有効なポリマー組成物について広く特許を請求している。その組成物は、下記形態の非ホモポリマー分子すなわち実質的に立体規則性のポリマー分子を含有しているといわれている。
【化９】
0004542296.tif 000002
上記式中、
（ａ）Ｒ１−Ｒｎは、ワトソン／クリック型塩基対によって、標的配列中の対応する配列内塩基（in-sequence base）に結合するのに有効なプリン、プリン様、ピリミジンおよびピリミジン様の複素環類から選択される認識部分であり；
（ｂ）ｎはポリマー分子と標的配列間に形成されるワトソン／クリック型水素結合の合計数が少なくとも約１５になる数である；
（ｃ）Ｂ〜Ｂは、化学的に安定で実質的に非電荷の主としてアキラルの結合によって主として結合されている骨格部分であり；
（ｄ）上記骨格部分の長さは、環式構造を有している場合、５〜７個の原子の範囲の長さであり、そして、非環式構造を有している場合、４〜６個の原子の範囲内の長さであり；そして
（ｅ）上記骨格部分は認識部分を保持し、その認識部分は、この認識部分と、標的配列の対応する配列内塩基との間にワトソン−クリック型塩基対を形成できる位置にある。
【００２８】
国際特許願公開第ＷＯ  ８６／０５５１８号によれば、前記認識部分は各種の天然のヌクレオベース類（natural nucleobases）とヌクレオベース類似体であり、そしてその骨格部分は、フランまたはモルホリンのリングを含む環式骨格部分または下記形態の非環式骨格部分である。
【化１０】
0004542296.tif 000003
上記式中、Ｅは−ＣＯ−または−ＳＯ２−である。上記出願の明細書は、サブユニットの合成、骨格のカップリング反応およびポリマー組み立ての戦略について、一般的な説明を行っている。国際特許願公開第ＷＯ  ８６／０５５１８号は、特許請求されたポリマー組成物が、標的配列を捕捉できるので、診断や治療の用途に利用できることを示しているが、この出願には、特許請求がなされたポリマーの捕捉性能に関するデータが全く含まれていない。
【００２９】
国際特許願公開第ＷＯ  ８６／０５５１９号は、国際特許願公開第ＷＯ  ８６／０５５１８号に記載のポリマーを含んでいるが固体支持体に結合されている診断剤と診断システムを特許請求している。
【００３０】
国際特許願公開第ＷＯ  ８９／１２０６０号は、オリゴヌクレオチド類似体を合成するのに用いる各種ビルディングブロック、およびこのようなビルディングブロックを、特定の配列に結合することによって形成されるオリゴヌクレオチド類似体を特許請求している。上記ビルディングブロックは「剛性」であるか（すなわち環構造を含有しているか）または「可撓性」である（すなわち環構造を欠いている）。両方の場合、これらビルディングブロックは、ヒドロキシ基とメルカプト基を含有し、これらの基を通じて結合してオリゴヌクレオチド類似体を形成すると言える。これらオリゴヌクレオチド類似体の結合部分は、スルフィド（−Ｓ−）、スルホキシド（−ＳＯ−）およびスルホン（−ＳＯ２−）からなる群から選択される。しかし、この出願は、オリゴヌクレオチド類似体の標的オリゴヌクレオチドに対して特異的に結合することを支持するデータを全く提供していない。
【００３１】
Nielsenら、Science 254巻 1497頁 1991年および国際特許願公開第ＷＯ  ９２／２０７０２号には、選択された化学的ヌクレオベースまたは類似体が、連結されて、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ内に存在している場合と同様にコードキャラクターとして働くペプチド骨格を含む非環式オリゴヌクレオチドが記載されている。これらの新しい化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られているが、それらの天然の対応物より細胞内で安定であるのみならず、天然核酸が互いに粘着する（cling）場合より５０〜１００倍もしっかりと天然のＤＮＡとＲＮＡを捕捉する（ＰＮＡのヘテロハイブリッドのこの作用については、「Biotechnology research news Can DNA mimetics improve on the real thing?」、Science 262巻 1647頁 1993年参照）。
【００３２】
ＰＮＡオリゴマーは、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む４種の保護されたモノマーから、メリフィールドの固相ペプチド合成法によって合成することができる。水溶性を増大し、凝集するのを防ぐため、リシンアミド基をそのＣ末端に入れる。しかし、このＰＮＡ法には、いくつかの大きな欠点がある。第一の欠点は、ＰＮＡ分子は、少なくとも試験管培養では、細胞膜を透過せず、天然の短いＤＮＡおよびＲＮＡのセグメントの限定された程度の透過さえもしないということである。第二の欠点は、毒性によって起こる副作用である。ＰＮＡは、標的配列に非常に強く結合するので、それらの天然の対応物の特異性を欠いており、結局、標的配列のみならずＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の他のストランドにも結合して、細胞を予期しない方式で無能力にする。
【００３３】
Segevの米国特許第５９０８８４５号には、ポリエーテル骨格で構成された核酸擬似体が記載され、この擬似体はヌクレオベースまたはその類似体などのリカンドを複数有し、それらは相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡの配列とハイブリッドを形成することができる。さらに具体的に述べると、ヌクレオチド擬似体を合成するのに用いるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリエーテルに基づいた各種のビルディングブロックおよびこのようなビルディングブロックを所定の方式で結合することによって製造されるオリゴヌクレオチド擬似体、これら両者の合成方法、ならびにこれら両者の生化学および医療での使用が記載されている。米国特許第５９０８８４５号によれば、オリゴヌクレオチド擬似体は下記の任意形態(optional form)で表される。
【化１１】
0004542296.tif 000004
上記式中、ｎは１より大きい整数であり、Ｂ１−Ｂｎは各々独立して、化学的官能基であり、例えば限定されないが、天然に存在するヌクレオベース、ヌクレオベース結合基またはＤＮＡインターキレーター(interchelator)であり、Ｙ１−Ｙｎは各々第一リンカー基であり、Ｘ１−Ｘｎは各々第二リンカー基であり、Ｃ１−Ｃｎはキラル炭素原子であり、そして［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲート(exoconjugate)である。
【００３４】
米国特許第５９０８８４５号の明細書には、骨格連結反応に用いるサブユニットの合成およびポリマーアセンブリとその変形戦略について記載されているが、この特許には、その合成法自体の実行可能性について実験データが全くない。上記ポリエーテル核酸類の合成を試みたところ、合成収率が、効率的な大量生産を行うのに満足すべき収率より低いことが分かった。
【００３５】
これらの欠点のないオリゴヌクレオチド類似体であって、(i)合成法が容易であることと合成効率が立証されていることを特徴とし、そして上記ポリエーテル核酸に共通している特性、例えば(ii)標的配列に結合するのに十分な特異性、（iii）水溶性、(iv)細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼに対する安定性、(v)細胞膜を透過する性能、および(vi)生物体を治療するのに使用する場合の低い毒性、すなわちオリゴヌクレオチド類似体を、アンチセンス治療薬物として高度に適切なものにする特性をさらに特徴とするオリゴヌクレオチド類似体に対する要望があることは広く知られており、そしてこのようなオリゴヌクレオチド類似体を入手することは非常に有利である。
【００３６】
発明が解決しようとする課題
本発明の一つの目的は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよび／またはＲＮＡのストランドと結合して、これらストランドと安定なハイブリッドを形成する化合物を提供することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよび／またはＲＮＡのストランドに結合し、対応するＤＮＡには一層強く結合するがＰＮＡとの結合はあまり強くない化合物を提供することである。
【００３８】
本発明の他の目的は、天然に存在するヌクレオベースもしくは他のヌクレオベース結合部分、またはいくつかもしくは全ての塩基の代わりに化学的官能基で終わっているリンカーアームが、ポリ（エーテル−チオエーテル）、ポリ（エーテル−スルホキシド）もしくはポリ（エーテル−スルホン）の骨格に共有結している化合物を提供することである。
【００３９】
本発明のさらに他の目的は、生体内の条件下で、二本鎖ポリヌクレオチドの一方のストランドに結合して、他方のストランドを置換することができる、ＲＮＡまたはＰＮＡ以外の化合物を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、かような化合物を製造するのに適切なビルディングブロックの製造方法を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、かような化合物を、それらのビルディングブロックから製造する方法を提供することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、かような化合物を利用する治療方法および予防方法を提供することである。
【００４３】
本発明の追加の目的は以下にさらに述べる。
【００４４】
課題を解決するための手段
本発明の一側面によって、複数のキラル炭素原子を有するポリ（エーテル−チオエーテル）骨格を含有する化合物であって、そのポリ（エーテル−チオエーテル）骨格が、前記キラル炭素原子に個々に結合している複数のリガンドを有し、それらリガンドが天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される部分を含有している化合物が提供される。
【００４５】
本発明の他の側面によって、複数のキラル炭素原子を有するポリ（エーテル−スルホキシド）またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格を含有する化合物であって、そのポリ（エーテル−スルホキシド）またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格が、前記キラル炭素原子に個々に結合している複数のリガンドを有し、前記リガンドが天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択される部分を含有している化合物が提供される。
【００４６】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、単一もしくは複数の化学官能基で終わっている一つ以上のリンカーアームが、単一もしくは複数の天然に存在しているヌクレオベースおよび／または単一もしくは複数のヌクレオベース結合基の一つ以上を置換している。
【００４７】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、そのキラル炭素原子は、４〜６個の介入原子によって、骨格内で互いに隔てられている。
【００４８】
本発明の他の側面によって、下記式で表され化合物が提供される。
【化１２】
0004542296.tif 000005
上記式中、
ｎは１より大きい整数であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂｎ−１およびＢｎは各々、天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から独立して選択される化学的官能基であり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々、第一リンカー基であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎは各々、第二リンカー基であり、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃｎ−１およびＣｎはキラル炭素原子であり、そして
［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲートである。
【００４９】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、単一もしくは複数の化学的官能基で終わる一つ以上のリンカーアームが、前記天然に存在する単一もしくは複数のヌクレオベースおよび／またはヌクレオベース結合基の一つ以上を置換している。
【００５０】
下記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一−第二リンカー基：Ｙ１−Ｘ１、Ｙ２−Ｘ２、Ｙｎ−１−Ｘｎ−１およびＹｎ−Ｘｎは各々、単結合である。
【００５１】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々アルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から独立して選択される。
【００５２】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一リンカー基：Ｙ１、Ｙ２、Ｙｎ−１およびＹｎは各々、メチレン基、およびｋ個の炭素原子を有する一つのアルキルと一つのカルボニル部分（但しｋは２〜２０の整数である）を含有するＣ−アルカノイル基からなる群から独立して選択される。
【００５３】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第二リンカー基：Ｘ１、Ｘ２、Ｘｎ−１およびＸｎは各々、メチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体の基、カルボニル基および単結合からなる群から独立して選択される。
【００５４】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記キラル炭素のｍ％がＳ立体配置にあるかあるいはＲ立体配置にあり、ｍが９０−９５％、９６−９８％、９９％および９９％より大きい％からなる群から選択される。
【００５５】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、［Ｋ］と［Ｉ］は各々、ポリエチレングリコール部分である。
【００５６】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、化合物は下記式で表される。
【化１３】
0004542296.tif 000006
本発明のさらに別の側面によって下記式で表される化合物が提供される。
【化１４】
0004542296.tif 000007
上記式中、
Ｂは、天然に存在するヌクレオベース、ヌクレオベース結合基、およびリンカーアームを通じて結合された化学的官能基からなる群から選択される化学的官能基であり、
Ｙは第一リンカー基であり、
Ｘは第二リンカー基であり、
Ｃ＊はキラル炭素原子であり、
Ｚは第一保護基であり、そして
Ａは脱離基である。
【００５７】
下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一−第二リンカー基：Ｙ−Ｘは単結合である。
【００５８】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一リンカー基：Ｙは、アルキル基、ホスフェート基、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖、（Ｃ２−Ｃ４）置換アルキレン鎖および単結合からなる群から選択される。
【００５９】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第一リンカー基：Ｙはメチレン基およびＣ−アルカノイル基からなる群から選択される。
【００６０】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第二リンカー基：Ｘは、メチレン基、アルキル基、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基、カルボニル基および単結合からなる群から選択される。
【００６１】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、ヌクレオベースがアミノ基を含有していれば、そのアミノ基は第二保護基で保護される。
【００６２】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、Ｚ保護基は、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基およびシリル基からなる群から選択される。
【００６３】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、脱離基：Ａは、ハロゲン化物基、スルホネート基、アンモニウム誘導体、ＳＮ１またはＳＮ２の機構によって置換することができるラジカル部分からなる群から選択される。
【００６４】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、第二保護基は、メチルベンジルエーテル基、ベンズアミド基、イソブチルアミド基、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、およびＺ保護基を切断する試薬によって切断されない酸性の反応活性基からなる群から選択される。
【００６５】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、その化合物は下記式で表される。
【化１５】
0004542296.tif 000008
本発明のさらに他の側面によって、上記ポリマー化合物の製造方法が提供され、その製造方法は、（ａ）各々エーテル部分とチオエーテル部分を有するモノマーを獲得し、そのエーテル部分は少なくとも一つのエーテル結合を含有し、そのチオエーテル部分は少なくとも一つのチオエーテル結合を含有し、これらモノマーは各々、官能基が連結されている少なくとも一つのキラル炭素原子を含有し、その官能基は天然に存在するヌクレオベースおよびヌクレオベース結合基からなる群から選択され；（ｂ）前記モノマーの第一モノマーを固体支持体に連結し、次いで（ｃ）モノマーを、予め定められた順序で前記第一モノマーに連続して縮合させて、縮合モノマーのポリマーを獲得し次に任意に（ｄ）スルフィド部分を酸化してスルホキシドおよび／またはスルポンにするステップを含んでなる方法である。あるいは、モノマーは、Ｋおよび／またはＩの部分を通じて、各種の長さを有しかつそれ自体が固体支持体に連結されているポリエチレングリコール単位などのポリマー鎖に連結してもよい。上記ステップ（ｂ）と（ｃ）はかわりに、固体のポリマー支持体上ではなくて溶液内で行うことができることは分かるであろう。得られたポリマー生成物は、その後、当業技術界で周知のクロマトグラフィー法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＴＬＣなどによって精製することができる。
【００６６】
本発明の追加の側面によって、二本鎖ポリヌクレオチドを上記ポリマー化合物と接触させ、その結果、そのポリマー化合物が配列特異的方式で、上記ポリヌクレオチドの一方のストランドに結合して、他方のストランドを置換するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成法が提供される。
【００６７】
本発明のさらに追加の側面によって、一本鎖ポリヌクレオチドを上記ポリマー化合物と接触させ、その結果、その化合物が配列特異的方法で上記ポリヌクレオチドに結合するステップを含んでなる配列特異的ハイブリッド形成法が提供される。
【００６８】
本発明のさらに追加の側面によって、生物体の遺伝子の発現を調節する方法であって、前記生物体に上記ポリマー化合物を投与し、その結果、その化合物が、配列特異的方式で、該遺伝子由来のＤＮＡまたはＲＮＡに結合するステップを含んでなる方法が提供される。
【００６９】
本発明の下記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記調節には前記遺伝子の転写を阻害することが含まれている。
【００７０】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記調節には前記遺伝子のＲＮＡの複製を阻害することが含まれている。
【００７１】
上記好ましい実施態様のさらなる特徴によれば、前記調節には前記遺伝子のＲＮＡの翻訳を阻害することが含まれている。
【００７２】
本発明の別の側面によって、生物体内で望ましくないタンパク質が産生することに関連する症状を治療する方法であって、前記生物体を上記ポリマー化合物の有効量と接触させて、その化合物が、前記タンパク質の産生を制御する遺伝子由来のＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に結合するステップを含んでなる方法が提供される。
【００７３】
本発明のさらなる側面によって、生物体の細胞内のＤＮＡまたはＲＮＡの分解を誘発する方法であって、前記生物体に上記ポリマー化合物を投与して、その化合物が該ＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に結合するステップを含んでなる方法が提供される。
【００７４】
本発明のさらなる側面によって、細胞またはウイルスを殺す方法であって、前記細胞またはウイルスを上記ポリマー化合物と接触させて、その化合物が、前記細胞もしくはウイルスのゲノムの一部または該ウイルスもしくはウイルスのゲノム由来のＲＮＡに特異的に結合するステップを含んでなる方法が提供される。
【００７５】
本発明の別の側面によって、有効成分としての上記ポリマー成分と、少なくとも一種の医薬として有効な担体、結合剤、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤または界面活性剤を含有する医薬組成物が提供される。
【００７６】
本発明は、(i)その標的配列に結合するのに十分な特異性；(ii)水溶性；(iii)細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼに対する安定性；(iv)細胞膜を透過する性能；および(v)生物体を治療するのに使用するときの低い毒性、すなわち本発明のオリゴヌクレオチド類似体を、総合的に、アンチセンス治療薬物として高度に適切なものとし、かつとりわけ容易に合成できる特性を特徴とするオリゴヌクレオチド類似体を提供することによって、現在知られている立体配置の欠点をうまく克服するものである。
【００７７】
本発明を、単に例示として添付図面を参照して説明する。ここで詳細な図面について述べると、図示されている詳細は、例示としてかつ本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的とするものであり、そして本発明の原理と概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。このことについて、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の詳細な構造を示す試みはしていないが、図面について行った説明によって、当業技術者にとって、本発明のいくつもの形態を実施する方法が明らかになる。
【００７８】
図面の簡単な説明
図１ａは従来技術のＤＮＡおよび１ｂは本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸化合物上のヌクレオベースを隔てる１１個の原子を示す。
図２は隣りのＢ官能基との間に１１個の原子を有する、米国特許第５９０８８４５号に記載の従来技術のテトラチミン−ポリエーテル核酸化合物と天然のテトラ−アデニン−ｓｓＤＮＡとのハイブリッド形成を示す分子模型である。
図３は本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
図４は本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
図５は本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
図６は本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
図７は本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
図８は本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
図９は本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
図１０は本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
【００７９】
発明の実施の形態
本発明は、相補的なＤＮＡとＲＮＡの配列に結合するポリヌクレオチドでない化合物の発明であり、本発明の化合物としては、ポリ（エーテル−チオエーテル）、ポリ（エーテル−スルホキシド）および／またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格に共有結合した天然に存在するヌクレオベースまたは他のヌクレオベース結合部分（本願では、ヌクレオベース類似体とも呼んでいる）があり、これらの化合物は、オリゴヌクレオチド類似体として、例えばアンチセンスの用途と方法に使用できる。本発明のこれらオリゴヌクレオチド類似体には、前記従来技術の章で挙げたアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を選択するための六つの基準を最高に満たす新しい非環式生体高分子の骨格が含まれる。
【００８０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体の合成、構造、および作用モードは、添付図面と付随する説明を参照することによって、より良好に理解することができる。
【００８１】
ポリエーテルポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、公知の最高の生体適合性ポリマーであり、一連の有用な特性を有している。これらのポリマーは、有機媒体と水性媒体の両者に対する広範囲の溶解性(Mutterら、「The Peptides」Academic Press, 285 1979年）、毒性と免疫原性の欠如(Dreborgら、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6巻 315頁 1990年）、非生物分解性、および生きている生物体からの分泌が容易であること(Yamaokaら、J. Pharm. Sci. 83巻 601頁 1994年）を示している。
【００８２】
この２０年間に、ＰＥＧは、各種基体(substrate)の共有結合性修飾因子(covalent modifier)として広く使用され、出発基体と該ポリマーの両者の特性のいくつかを併有する接合体が製造された(Harris, J.M.著「Poly(ethylene glycol) Chemistry」1992年、米国ニューヨーク、Plenum Pressを参照）。対象の基体の一つ以上の特性を、変えて、特定の生物学的用途に対して適したものにすることが要望されて、この領域の圧倒的に多数の研究が促進された。ＰＥＧ接合体類とその用途の蓄積が増大したので、各種の生物学的認識の機構によって生体内でトリガーされる多くの望ましくない作用を、ＰＥＧによる共有結合性修飾によって最少限にすることができることが明らかになっている。
【００８３】
例えば、ＰＥＧ接合体を使用して、タンパク質の免疫原性と抗原性を減少させることができる（この点については、Davisらの米国特許第４１７９３３７号参照）。トロンボジェニシティー(Thrombogenicity)および細胞とタンパク質の粘着は、ＰＥＧがグラフトされた表面の場合減らすことができる（この点については、Merrill著「Poly(ethylene Glycol) Chemistry」199頁 1992年、米国ニューヨーク Plenum Press参照）。ＰＥＧによって伝達されるこれらの有益な特性は、血液接触(blood contact)を必要とするいずれの系にとっても非常に重要である。ＰＥＧの生体適合性に関するさらなる情報を得るため、読者は、Zalipski、「Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates」、Bioconjugate Chem. 6巻 150頁 1995年を参照されたい。しかし、現在までに知られているＰＥＧ接合体はエクソコンジュゲートであり、そのコンジュゲートされる部分はＰＥＧの末端ヒドロキシル基のうちの一つに接合されている（下記式Ｉ参照）。
【００８４】
ＰＥＧは、生体適合性であるため、核酸と相互に作用するヌクレオベース、ヌクレオベース類似体（すなわちヌクレオベース結合部分）および／または他の化学基［例えばＤＮＡインターキレーター（ＤＮＡ interchelator）］が共有結合されて、所望の特性を有するオリゴヌクレオチド類似体を、以下にさらに詳細に説明するように形成する、骨格の一部として、本発明の好ましい一実施態様によって使用される。
【００８５】
米国特許第５９０８８４５号に、例えば下記構造式のモノマーのビルディングブロックが記載されている。
【化１６】
0004542296.tif 000009
しかし、このモノマー化合物を利用する合成は、収率が望ましい収率より低くなる。この現象は、かさばった保護基（例えばジメトキシトリチル）およびポリエーテル骨格に連結されたヌクレオベースが原因の該化合物のキラル中心を囲む立体障害のために起こる。さらに、前記ヒドロキシル基の二次的性質によって、このヒドロキシル基が余り有効でない求核基になる。
【００８６】
したがって、本発明の教示によって、スルフヒドリル（−ＳＨ）基を、鎖組立てのための求核基として利用する新しいモノマー化合物が提供される。スルフヒドリル基は強力な求核基として知られており、ヒドロキシル基より高い効率で、各種の脱離基、例えばハロゲン化物基、トシレート基(tosylate)およびメシレート基(mesylate)を置換することによって、チオエーテル結合を形成することができる。したがって、本発明のモノマービルディングブロックは、例えば、下記構造式で表すことができる。
【化１７】
0004542296.tif 000010
したがってこの新規なビルディングブロックで組み立てられた鎖は、エーテル結合とチオエーテル結合を交互に有し、例えば下記のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸を生成する。
【化１８】
0004542296.tif 000011
この核酸は、以下により詳細に述べるように、酸化してポリ（エーテル−スルホキシド）核酸および／またはポリ（エーテル−スルホン）核酸にすることができ、これらの核酸は、以下に示すように、Ｍｇ＋＋イオンまたは他のカチオン、例えば限定されないがＫ＋、Ｎａ＋、Ｚｎ＋＋などと容易に相互作用を行う。
【化１９】
0004542296.tif 000012
したがって、広い意味で、本発明は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびＲＮＡのストランドを相補的に捕捉する新しいクラスの非環式骨格ＤＮＡ化合物を提供するものである。これらの化合物は、本願では、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸と呼ぶ。本発明のこれら化合物は、一般に(i)Ｃ−Ｃ、Ｃ−ＳおよびＣ−Ｏの結合のみからなる骨格、および(ii)化学的官能基（これらの基の少なくともいくつかは相補的方式でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡと適切な水素結合を形成することができる）を含有している。代表的な化学的官能基としては、５種類の天然に存在するＤＮＡとＲＮＡのヌクレオベースすなわちチミン、アデニン、シトシン、ウラシルもしくはグアニン、または修飾された塩基、例えば限定されないがイノシン、チオウラシル、ブロモチミン、アザグアニン類、アザアデニン類、５−メチルシトシンがあり、これらの官能基は一般に、ポリ（エーテル−チオエーテル）、ポリ（エーテル−スルホキシド）および／またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格に、一つ以上のリンカー基で形成された適切なリンカーアームを通じて連結されており、その結果、本発明の好ましい実施態様では、隣りの化学官能基が１１個の原子によって互いに隔てられており、米国特許第５９０８８４５号および未変性ＤＮＡ(native ＤＮＡ)のポリエーテル核酸に似ている。
【００８７】
本発明のチオ化−ＰＥＧ(thioated−ＰＥＧ）は下記式で表される。
【化２０】
0004542296.tif 000013
本発明の一実施態様で、本発明のチオ化ＰＥＧ核酸化合物は下記一般式で表される。
【化２１】
0004542296.tif 000014
上記式中、Ｂ１−Ｂｎは各々、化学官能基であり、Ｙ１−Ｙｎは各々第一リンカー基であり、Ｘ１−Ｘｎは各々第二リンカー基であり、Ｃ１−Ｃｎはキラル炭素原子であり、そして［Ｋ］と［Ｉ］は第一と第二のエクソコンジュゲートである。
【００８８】
本発明の好ましい実施態様によれば、化学官能基Ｂ１−Ｂｎは、予め決めて選択された順序で骨格に連結された配列を形成する天然に存在するヌクレオベースまたはヌクレオベース類似体である。これらヌクレオベースは、好ましくは、Ｙに、天然に見つけられた位置を通じて連結される。すなわちプリン類（例えばアデニンとグアニン）の場合は９位そしてピリミジン類（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）の場合は１位を通じて連結される。
【００８９】
さらに、各種の目的のために、化学官能基Ｂ１−Ｂｎのいくつかは、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、（Ｃ１−Ｃ３）アルカノイル基、芳香族基、複素環基、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、隣接ジオール基などのジオール基、トリオール基など）であってもよい。
【００９０】
二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの両者に対する結合を改善するため、いくつかのＢ１−Ｂｎ官能基は、ＤＮＡインターキレーター、例えば限定されないがアントラキノン基などであってもよい。
【００９１】
さらに、官能基Ｂ１−Ｂｎの一つ以上が、例えば発蛍光団、放射能標識、化学発光剤、酵素、基質、受容体、リガンド、ハプテン、抗体などのレポーター分子を含有していてもよく、これらを含有していると、その化合物は、ハイブリッド形成検定法における標識化プローブもしくは検出可能なプローブとして役立つ。
【００９２】
さらに、化学官能基：Ｂ１−Ｂｎの一つ以上が、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドと相互に作用できるリガンドであってもよく、該ストランドと共有結合してそのストランドを変化させることができる。適切なリガンドとしては、天然のヌクレオベース、またはアルキル化求電子基(alkylating electrophile)、例えば限定されないが、デオキシウリジンの５位の３−（ヨードアセトアミド）プロピルで修飾された類似ヌクレオベースがある。後者の場合、その修飾された化合物は、相補的標的核酸ストランドとの塩基対によって形成され、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡのストランド内に存在するグアニン残基の７位と共有架橋結合している。次に、上記架橋結合したグアニンの脱プリン反応と上記相補的ストランドのストランド切断が、生体内条件下で自然に起こる（この点について、読者は、Meyerら、「Efficient specific cross-linking and cleavage of DNA by stable synthetic complementary oligodeoxynucleotides」、J. Am. Chem. Soc. 111巻 8517頁 1989年を参照されたい）。
【００９３】
第一リンカー基：Ｙ１−Ｙｎは各々、第二級炭素原子、第三級炭素原子などのアルキル基またはホスフェート基でもよい。リンカー基：Ｙ１−Ｙｎは各々、好ましくはメチレン基またはＣ−アルカノイル基である。さらに、リンカー基Ｙ１−Ｙｎは各々、（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖またはＲ１Ｒ２で置換された（Ｃ２−Ｃ４）アルキレン鎖でもよい。場合によっては、Ｙは単に単結合であってもよい。
【００９４】
第二リンカー基：Ｘ１−Ｘｎは各々、メチレン基（またはＲ１Ｒ２のようなアルキル基で置換された炭素原子）、アミノ基、アミド基、硫黄原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ−アルカノイル基、ホスフェート誘導体基（例えば、メチルホスフェート基およびホスホアミデート基）または好ましくはカルボニル基でもよい。場合によっては、Ｘは単に単結合でよい。
図１ａ−１ｂを見ると、本発明の教示にしたがって、Ｘ基とＹ基はリンカーアームとして働いて、天然の核酸の場合と同様に、隣りの化学官能基Ｂとの間に間隔をとる好ましくは１１個の原子の存在を保証している。図１ａ−１ｂは、ＤＮＡストランド上（図１ａ）および本発明の好ましい実施態様のポリエーテル核酸ストランド上（図１ｂ）の、二つの隣りのヌクレオベース（Ｂ）を示す。Ｃ１−Ｃｎはキラル炭素原子である。これら原子のキラリティーは、Ｓ配置またはＲ配置を選択することができる。現在、Ｒ配置が好ましい。以下にさらに詳細に説明するように、本発明の化合物は段階的に構築され、各モノマーもしくはビルディングブロックが、増大するポリマーに順に付加される。したがって、所望のキラリティー（すなわちＲ配置またはＳ配置）を有するビルディングブロックを製造できれば、Ｓ配置とＲ配置のＣ１−Ｃｎキラル炭素を予め決めて混合してなる化合物を製造することができる。
【００９５】
さらに、本発明によれば、［Ｋ］と［Ｉ］は、第一と第二のエクソコンジュゲート、例えば限定されないが、各々一つ以上の繰返し単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または水素原子である。エクソコンジュゲート［Ｋ］と［Ｉ］は水溶性または水に不溶性のポリマーである。このようなコンジュゲートを使用して、該化合物が細胞膜を横切る性能を調節することができる。しかし、［Ｋ］と［Ｉ］の一方または両者は水素原子であってもよい。
【００９６】
本発明の好ましいチオ化ＰＥＧ核酸分子は下記一般式で表される。
【化２２】
0004542296.tif 000015
上記式中、Ｂ１−Ｂｎは各々、天然のヌクレオベースまたはヌクレオベース類似体などの化学官能基であり、そしてＰＥＧはポリエチレングリコールである。
【００９７】
現在、最も好ましい実施態様は、上記一般式で表され、式中、Ｂが天然のヌクレオベースすなわちチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）であり、ｎが４〜５０の範囲の整数であり、好ましくは８〜３０の範囲内で最も好ましくは１２〜２２の範囲内にある化合物である。
【００９８】
ここで図２を見ると、Segevの米国特許第５９０８８４５号の式IIIで表される従来技術のテトラチミジン−ポリエーテル核酸化合物と天然のアデニンテトラヌクレオチドとのハイブリッド形成を示す分子模型が、ハイブリッドの水素結合が最小エネルギーでハイブリッド形成に完全に適合していることを予報している。そして図中、Ｏは赤色、Ｃは黄色、Ｎは青色、Ｐは紫色で示し、形成された水素結合は破線で示し、これら水素結合は関連する原子を接続している。硫黄と酸素の両者は周期律表のVI族のカラムに隣接して位置していることが分かるであろう。実際に、多くの場合、分子の酸素原子が硫黄原子で置換可能であるが、チオ化類似体は酸素化された分子の特性のすべてまたはほとんどを維持している。上記従来技術の章でさらに詳しく述べたように、このことは、特にチオ化オリゴヌクレオチドに当てはまる。それ故に、本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類似体が、米国特許第５９０８８４５号に開示されているポリエーテル核酸類と同様に挙動し、そしてこの点については天然の核酸と同様であると予想される。
【００９９】
このことは、図３−１０に示す本発明の一本鎖および二本鎖のポリ（エーテル−チオエーテル）分子およびポリ（エーテル−スルホン）分子の分子模型（酸素原子は赤色、炭素原子は緑色、窒素原子は青色、硫黄原子は黄色、および水素原子は白色で示してある）によってさらに強調されている。
【０１００】
本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸は、溶液でまたは好ましくは固相で、標準のＤＮＡ合成法を使用して合成することができる。
【０１０１】
使用されるビルディングブロックは、特に設計されたキラルのＳもしくはＲのモノマーまたはその活性化型である。
【０１０２】
本発明のモノマーのビルディングブロックは下記一般式で表される。
【化２３】
0004542296.tif 000016
上記式中、Ｂ、ＹおよびＸは前記定義と同じであり、Ｚは適切な保護基であり、そしてＡは適切な脱離基である。
【０１０３】
特定のビルディングブロックが天然のヌクレオベースまたはヌクレオベース類似体であるＢを含有している場合、そのアミノ基は通常の保護基、例えば限定されないがメチルベンジルエーテル、ベンズアミド基、イソブチルアミド基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などで保護される。
【０１０４】
Ｚは、該モノマーの末端ヒドロキシル基を保護する保護基である。Ｚは当業技術界で知られている適切な保護基であればよく、例えば限定されないが、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基またはシリル基がある。Ｚはジメトキシトリチル基が好ましい。
【０１０５】
Ａは脱離基であり、例えばハロゲン化物基、スルホネート基例えばメタン−もしくはｐ−メチルフェニルスルホネート、アンモニウム誘導体、または周知のMitsunobu Reaction(Mitsunobu.O., Synthesis 1981年 1参照）を含むＳＮ１もしくはＳＮ２の機構によって置換できるラジカル部分である。
【０１０６】
本発明の好ましいモノマーのビルディングブロックは下記一般式で表される。
【化２４】
0004542296.tif 000017
上記式中、Ｂ、ＺおよびＡは前記定義と同じである。
【０１０７】
このモノマーは、制御された多孔質ガラス(controlled pore glass)または誘導体化ポリスチレンなどのポリマー支持体に逐次縮合され、これら支持体は、脱離基Ａに隣接する炭素原子と相互に作用して脱離基を脱離させるヒドロキシル、アミノ、チオール、リンなどの暴露された反応性化学基を有している。適当な塩基の付加は、（ａ）分子を活性化することによってポリマー支持体をモノマーと縮合させ、（ｂ）ポリマー支持体の未反応の反応性基をキャッピング(capping)して不活性化し、次いで（ｃ）Ｚ基を脱保護させて遊離のヒドロキシル基を暴露するサイクルによって実施する。これによって第一サイクルが完了する。その後のサイクルで、遊離ヒドロキシル基が、所望の性質のＢ基を有するその後のモノマーと縮合して、所望の配列のポリ（エーテル−チオエーテル）分子が得られる。最後のサイクルに続いて、ＰＥＧを、サイクリングに用いたのと類似の縮合法を使用して末端モノマーの遊離ヒドロキシル基に縮合させる。
【０１０８】
ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸を製造する場合は、上記方法で得られる生成物を、酸化剤で、好ましくは１．２当量のメタクロロ過安息香酸で酸化する。
【０１０９】
ポリ（エーテル−スルホン）核酸を製造する場合は、上記方法で得られた生成物を、別のより優れた酸化剤好ましくは４−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドで酸化する。
【０１１０】
ポリマー生成物のポリマー支持体からの脱離は、塩基性条件下、例えば水酸化アンモニウムまたは他の塩基の存在下、またはポリマー支持体への連結の性質に応じて他の適切な薬剤によって達成することができる。
【０１１１】
本発明の好ましい実施態様において、上記実施態様のいずれかによるポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸は、アルカリ金属のイオン例えば限定されないがＮａ＋、アルカリ土類金属のイオン例えば限定されないが、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋、または遷移金属のイオン例えば限定されないがＫ＋、Ｆｅ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋およびＣｒ＋＋と相互に作用して、ポリ（エーテル−チオエーテル）、ポリ（エーテル−スルホキシド）またはポリ（エーテル−スルホン）の骨格および／またはリンカー基の酸素原子または他の電気陰性部分と、配位結合または他の結合を形成することができる。このような配位結合は、本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸に、相補的一本鎖のＤＮＡもしくはＤＮＡと塩基対を作るのに高度に適切な立体配座をもたらすのに役立つ。
【０１１２】
本発明は、さらに、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の分子の、固相生化学での使用（W.H. Scouten編「Solid-Phase Biochemistry - Analytical and Synthetic Aspects 」1983年、米国ニューヨーク、John Wiley & Sons参照）、とりわけ固相のバイオシステム、特に相補的核酸の診断に利用する検出／定量またはアフィニティー精製に関するバイオアッセイまたは固相法での使用(P.D.G. Dean, W.S. JohnsonおよびF.A. Middle編「Affinity Chromatography - A Practical Approach」1986年、オックスフォード、IRL Press Ltd., B.D. HarnesおよびS.J. Higgins著「Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach」1987年、オックスフォード、IRL Press Ltd.参照）を目的としている。
【０１１３】
現在、このようなバイオアッセイまたは精製法を実施するための方法は、セルロース、多孔度を制御されたものを含むガラスビーズ類(Mizutaniら、J. Chromatogr. 356巻 202頁 1986年）、「Sepharose」、「Sephadex」、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロキシアルキルメタクリレートのゲル類、多孔質粒状アルミナ、多孔質セラミック類、ジオボンデッドシリカ(diobonded silica)またはナイロンもしくはニトロセルロース製のフィルターディスクのような相接する材料などの固体支持体に、物理的に吸着されるかまたは実質的に永久的な固定共有結合によって結合される「通常の」またはわずかに修飾されたオリゴヌクレオチドを、ほとんど排他的に利用する。一例は、ポリＡテールを含有するｍＲＮＡをアフィニティー分離するのに、セルロースビーズ上でのオリゴ−ｄＴの化学合成を利用する(L. GrossmannおよびK. Moldave編「Methods in Enzymology」1971年、ニューヨークおよびロンドンのAcademic Press, 21巻パート D 191頁のGilhamの報告）。
【０１１４】
上記の方法はすべて、本発明に関連して利用できる。しかしできれば、問題の分子の物理的吸着を超える共有結合が好ましい。というのは物理的吸着法は、固定化された分子のいくらかが、ハイブリッド形成中またはアフィニティ法中に洗い流される（脱着される）ことがあるという欠点をもっているからである。
【０１１５】
支持体材料の表面に吸着された種が、支持体がバイオアッセイ／精製法の過程で受ける各種の処理中に失われる程度の制御はほとんどなされていない。この問題のきびしさは、吸着された種と「遊離の」種との間の平衡が達成される速度に大きく左右される。特定の場合、許容可能な正確さおよび／または再現性で定量検定することが事実上不可能である。支持体を、体液、水性試薬もしくは洗浄媒体で処理している間に吸着された種が失われることは、比較的低い分子量の種の場合、最も著しいと一般に予想される。
【０１１６】
したがって、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の種は、相補的核酸に対する結合アフィニティが非常に高く（しかも配列特異的である）ため、上記固相法の場合有利であり、かつ二本鎖構造中に存在する核酸の追加の独特の配列特異的認識（および該核酸への強い結合）のために有利である。したがって、これらの核酸は、ハイブリッド形成検定法、例えば限定されないがブロットハイブリッド形成法（「サザーン」および「ノーザン」）、ドットブロットハイブリッド形成法、逆ブロットハイブリッド形成法、in situハイブリッド形成法、液相ハイブリッド形成法、クローン類（細菌／ファージなど）スクリーニング法などのハイブリッド形成検定法、およびハイブリッド形成を含む他の検定法、例えば限定されないがＰＣＲ法、配列決定法、プライマー伸長法などで、通常のオリゴヌクレオチド類を置換することができる。
また、これらの核酸は固体支持体に大量に負荷できるので、固相法の感度／容量をさらに増大することができる。さらに、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の固相生化学における使用に関する特定タイプの研究が、最近報告された「light-directed, spatially addressable, parallel chemical synthesis」法(Fodorら、Science 251巻 767頁 1991年)、すなわち、固相化学とホトリソグラフィーを組み合わせて、非常に多様であるが識別可能で永久的に固定化された化合物（例えばタンパク質）を何千種類も、実質的に同時に生成する方法を使用することによって、提案され、促進されまたは大きく加速されている。
【０１１７】
また、本発明はさらに、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸を治療および／または予防に使用することを目的としている。本発明の治療と予防の標的としては、限定されないが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、カンジダ・アルビカンス(candida albicans)、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびＲＡＳ癌遺伝子が考えられる。
【０１１８】
このようなターゲッティングの可能性のある用途としては、限定されないが、唇、眼および頸部の癌；性器いぼ；カポジ肉腫；尋常性ゆうぜい；皮膚および全身の真菌感染症；ＡＩＤＳ；肺炎；流行性感冒；単核症；免疫抑制されている患者の網膜炎と肺炎；眼、皮膚および全身の炎症；癌；心臓血管疾患；乾癬；喘息；心筋梗塞；心臓血管崩壊；腎臓疾患；胃腸疾患；骨関節炎；リウマチ様関節炎；敗血症性ショック；急性膵炎およびクローン病を治療する用途がある。
【０１１９】
本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸は、治療と予防に使用するため配合して医薬組成物にすることができ、この組成物は粘稠化剤、担体、緩衝剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤など（これらはすべて当業技術界では周知である）を含有している。また医薬組成物は、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸に加えて、一種以上の有効成分、例えば限定されないが抗炎症薬、抗菌薬などを含有していてもよい。
【０１２０】
この医薬組成物は、局所もしくは全身の治療を選択するかどうかおよび治療する領域に応じて一種以上の方式で投与できる。投与は、局所に（眼部、膣、直腸、鼻腔内）経口で、吸入でまたは非経口で（例えば静脈内点滴、または腹腔内、皮下もしくは筋肉内の注射による）行うことができる。
【０１２１】
局所投与用の配合物としては、限定されないがローション剤、軟膏、ゲル剤、クリーム剤、坐剤、滴剤、液剤、スプレー剤および粉末剤がある。通常の医薬担体；水性、粉末もしくは油状の基剤；粘稠化剤などが必要かまたは望ましい。コートされたコンドームも有用である。
【０１２２】
経口投与用組成物としては、粉末剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体による懸濁剤もしくは溶液剤、サシエ(sachet)、カプセル剤または錠剤がある。粘稠化剤、希釈剤、着香料、分散助剤、乳化剤または結合剤が望ましい。
【０１２３】
非経口投与用の配合物としては、限定されないが、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含有する滅菌水溶液剤がある。
【０１２４】
投与方法は、治療される症状の重傷度と反応性によって決まるが、一般に、数日間〜数ヶ月間続く治療過程で、または全治するまでもしくは疾病状態の減退が達成されるまで、１日当たり一回以上の投与である。当業技術者は、最適の投与量、投与法および反復率を容易に決めることができる。
【０１２５】
この種の治療は、単細胞の原核生物および真核生物から多細胞の真核生物までの範囲の各種生物体に対して実施できる。その遺伝、代謝または細胞の制御の基本的部分として、転写（ＤＮＡ−ＲＮＡ転写および逆転写を含む）、ＲＮＡ転写物またはＲＮＡ−タンパク質の翻訳を利用する生物体は、本発明による治療処置および／または予防処置を受けることができる。酵母、細菌、藻類、原生動物、全植物、すべての高等動物形態（温血動物を含む）などの多様な生物体を治療することができる。
【０１２６】
さらに、多細胞真核生物の各細胞は、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写とＲＮＡ−タンパク質の翻訳の両者を、その細胞活動の不可欠な部分としてもっているので治療することができる。
【０１２７】
さらに、真核細胞の多くのオルガネラ（例えばミトコンドリア、葉緑体および有色体）も、転写と翻訳の機構をもっている。したがって、単細胞、細胞集団またはオルガネラも、治療用または診断用のホスホロチオエート(phosphorothioate)のオリゴヌクレオチド類で処置することができる生物体の定義内に含まれる。用語「治療」は、本願で使用する場合、生物体を殺すことによって、または迷走性のもしくは有害な細胞の増殖または発現を制御することによる疾病状態の根絶を含むものとする。
【０１２８】
本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸は、既存のオリゴヌクレオチド類似体の技法を超える各種の利点を享受している。
【０１２９】
第一に、本発明の好ましい実施態様によれば、該ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の骨格は、水性溶媒および有機溶媒の両方に、高濃度で可溶性であることが知られているチオ化ＰＥＧまたはスルホン化ＰＥＧである。本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の、ポリ（エーテル−チオエーテル）骨格、ポリ（エーテル−スルホキシド）骨格またはポリ（エーテル−スルホン）骨格は一方では疎水性を有し、そして他方では水溶性を有している。ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸は、上記独特の特性によって、タンパク質核酸（ＰＮＡ）のように相補的配列と著しく強く相互に作用することがなく、しかも天然のＤＮＡストランドおよびＲＮＡストランドのように水性媒体中で高度に溶媒和されることがないので、これらの核酸と相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡの分子との間に、均衡ハイブリッド形成(balanced hybridization)を行うことができる。
【０１３０】
第二に、アンチセンス分子として使用するときのＰＮＡの主な欠点は、ＰＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドが高い融解温度（Ｔｍ）を特徴としていることである。例えばＰＮＡ−Ｔ１０−ｄＡ１０などの二重らせんのＴｍ値は７０℃より高く、一方、同等の天然二本鎖ＤＮＡ（ｄＴ１０−ｄＡ１０）のＴｍ値は、ほぼ１／３の約２４℃である。ＰＮＡ類は体温（例えば３７℃）で、相補的配列と強く結合するから、ＰＮＡは、それらの目的とする対応物に対する特異性を欠いているので、結局標的配列に結合するのみならず、他のＤＮＡ、ＲＮＡのストランドまたはタンパク質のストランドにさえも結合して、細胞を予知できない方式で無能力にする。ＰＮＡは、リシン残基が溶媒和されると、ミセルとして作用する。ＰＮＡは、水との混和性が劣っているが、その骨格の疎水性は、非極性の環境、例えば天然の相補的ＤＮＡの塩基を求める傾向がある。これらの疎水性相互作用は、高度に安定なＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する主な駆動力になっているので、このようなハイブリッドのＴｍ値は非常に高い。ＰＥＧなどのポリエーテル類の疎水性−親水性の特性を保持することによる、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の独特の溶解特性によって、Ｔｍ値が天然のＤＮＡよりわずかに高くなりしかもＰＮＡよりはるかに低くなり、この中間の値は、特異性のためには極めて重要である。
【０１３１】
第三に、ポリエーテルベースの化合物例えばシクロデキストリン類は、らせんを形成する傾向があり、そのらせんは、生理的条件下、溶液中で、水や金属イオンによって安定化される。ポリエーテルベースの化合物は、この特性によって、ヌクレオベースが相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡの分子と塩基対を作るのに非常に適切な非環式骨格になる。
【０１３２】
第四に、ＰＥＧは、非経口用途、局所塗布用途ならびに坐剤、鼻腔スプレー剤、食品および化粧品の成分として、ＦＤＡによって認可されている。ＰＥＧは、経口もしくは非経口で投与される場合、低毒性であり、大量の場合だけ有害反応がある(Smyth, H.F.ら、J.Am. Pharm. Assoc., 34巻 27頁 1955年参照）。ＰＥＧ−タンパク質接合体投与の経験を蓄積した証拠は、ＰＥＧ接合タンパク質の血漿半減期（循環時間）と生物学的利用率の両者が天然のタンパク質と比べて増大し、この増大によって効力が改善されることを示唆している。Ganserら(Blood 73巻 31頁 1989年)は、ＰＥＧで修飾したものを使用した場合、低投与量のとき副作用が少ないことを観察した。いくつものＰＥＧで修飾された酵素は毒性が低下することが観察されている(Fuertgesら、J. Contr. Release 11巻 139頁 1990年参照）。ＰＥＧの改善された薬物動態学的特性を利用する場合のもう一つの利点は、Pizzo, Adv. Drug. Del. Rev. 6巻 153頁 1991年に述べられているように、連続的な静脈注入の代わりに、ボーラス注入投与を行う選択肢である。本発明の好ましい実施態様で、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類はＰＥＧ骨格を含有しおよび／またはＰＥＧエクソコンジュゲートに接合されているので、上記諸利点を享受している。
【０１３３】
最後に、以下実施例の章で詳細に述べるように、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸またはポリ（エーテル−スルホン）核酸の合成は、既知のキラリティを有する一つのキラル中心を含有するモノマーまたはＲ／Ｓの例えばＲモノマーとＳモノマーのラセミ混合物を使用して行うことが好ましい。このモノマーは、先に述べたが、ポリ（エーテル−チオエーテル）骨格と、予め選択された望ましいヌクレオベースの配列とを有する適当なヌクレオチドを製造するのに必要な量を縮合させる。これらの縮合反応中、そのキラル中心はラセミ化されない。以下の実施例の章でさらに詳細に述べるように、前記モノマーを合成するには、純粋の形態のキラリティーで利用できるキラル出発物質が必要である。対照的に、Millerら(J. Am. Chem. Soc. 93巻 6657頁 1971年）は、そのホスフェート部分のヒドロキシル基がメチル基で置換されてメチルホスホネート結合になっている非イオン性オリゴヌクレオチド類似体を製造した。Millerが示しているように、各メチルホスホネート結合（ｐ）はＲまたはＳのキラル配置をもっていてもよい。したがって、例えば、ポリｄＴとハイブリッドを形成したｄＡｐＡ（Ｓ）（ｄＡ）１２はｄＡｐＡ（Ｒ）（ｄＡ）１２と比べてＴｍ値が４．４℃高い。この観察結果は、Ｒ配置中のメチル基がある種の特異的立体障害を提供するかもしれないということを示唆している。各合成ステップ毎に、Ｒ配置またはＳ配置に対して等しい機会があるのでＴｍが劇的に低下するから、オリゴヌクレオチド鎖中に、５個以上のメチルホスホネートを導入すると、一般に、Ｔｍ値が約２０℃低下する。合成の各ステップで形成されるジアステレオマー類を分離することは明らかに不可能である。ホスホチオエートオリゴヌクレオチド類の場合と同様に、ホスフェート部分のヒドロキシル基をスルフヒドリル基で置換する場合にも同じことが推量される。さらにこれらの物質は水に対して難溶性である。このファミリーの化合物の水性緩衝液への溶解性は、オリゴマーの大きさ、組成および恐らく配列にさえも左右される。グアニンの百分率が高いこと、またはさらに悪いことに相接するグアニン残基の集合体によって、このような化合物の溶解性が明確に低下する。例えば、ｄ（ＣｐＴ）８はミリモル濃度まで可溶性であるが、一方ｄ（ＡｐＧ）８は溶解性が０．１ｍＭ未満である。
【０１３４】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、当業技術者に対し、以下の実施例の試験によって明らかになるであろう。なおこれらの実験は本発明を限定するものではない。さらに先に述べられかつ本願の特許請求の範囲の項で請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例で実験的に支持されている。
【０１３５】
【実施例】
実施例１
本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸を合成するのに使用するＲ／Ｓモノマーの合成
式Ｑで表されるモノマーの製造：上記本発明の好ましい実施態様でモノマーを合成するのに用いる出発物質（そのリンカー基は両方ともメチレンである）はメチル４−ブロモクロトネートである。この合成経路によって、式Ｑで表される、キラル中心Ｃ＊のＲ／Ｓ異性体混合物が生成する。追加の連続合成ステップは下記のステップに基づいている。
【０１３６】
ブロミド置換反応によるメチル４−ヒドロキシクロトネート（化合物Ａ）の製造：水１９５ｍｌ中の酸化銀（１１．６ｇ、０．０５ｍｏｌ）の十分撹拌されている混合物に、メチル４−ブロモクロトネート（１７．９ｇ、０．１ｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、２５℃にて２４ｈｒ撹拌し、次に６０℃でさらに６ｈｒ加熱した。濾過を行った後、減圧下、水を蒸発させて、液体残留物を獲得し、これをさらに減圧下でさらに蒸留した。化合物Ａを、沸点が７７〜８０℃の透明な液体として得た（６ｇ、０．３ｍｍｏｌ、収率５１％）；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３．６５（ｓ、３Ｈ）、４．８（ｓ、３Ｈ）、６．０（ｍ、１Ｈ）、７．０（ｍ、１Ｈ）。
このプロセスを簡単に記載すると下記のとおりである。
【化２５】
0004542296.tif 000018
【０１３７】
メチル４（４，４′−ジメトキシトリチル）クロトネート（化合物Ｂ）の製造：メチル４−ヒドロキシクロトネート（化合物Ａ）（１１．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）の混合物を、乾燥ピリジンとともに共蒸発(co-evaporate)させ次いで乾燥ピリジン２００ｍｌに溶解した。得られた混合物を、氷水浴内で冷却し、乾燥ピリジン１００ｍｌに溶解したジメトキシトリチルクロリド(Aldrich) ４０．６ｇ（１２０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。得られた混合物を室温で１７ｈｒ保持した後、その混合物を蒸発乾固し、酢酸エチル５００ｍｌ／水５００ｍｌで抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液１００ｍｌで一回洗浄し、水で２回洗浄し次にブライン溶液で二回洗浄した。得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）、０．５％ピリジンを使用するカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物Ｂ（４０．２ｇ、９６％収率）はＲｆ＝０．８４で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．７０（ｍ、２Ｈ）、３．７７（ｓ、６Ｈ）、６．１（ｍ、１Ｈ）、６．８７．５５（ｍ、１３Ｈ）、７．０５（ｍ、１Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと次のとおりである。
【化２６】
0004542296.tif 000019
【０１３８】
メチル３−チオエタノール４−（４，４′ジメトキシトリチル）クロトネート（化合物Ｃ）の製造：メタノール５００ｍｌと炭酸カリウム２０ｇに化合物Ｂ（４１．８ｇ、１００ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、メルカプトエタノール(Aldrich、１５．６２ｇ、２００ｍｍｏｌ）をバルクで(in bulk)添加した。その反応混合物を室温で８ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発させ、次いで残留物を酢酸エチル５００ｍｌ／水５００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、ブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次に、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）、０．５％ピリジンを使用するカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＣのＲ／Ｓ混合物（４９ｇ、収率ほぼ１００％）はＲｆ＝０．２で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：［２．４２および２．９４］（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｔ、２Ｈ）、３．１４（ｍ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．６５（ｍ、３Ｈ）、３．７（ｓ、３Ｈ）、３．７９（ｓ、６Ｈ）、６．８１−７．４４（ｍ、１３Ｈ）。
このプロセスは簡単に示すと下記のとおりである。
【化２７】
0004542296.tif 000020
【０１３９】
メチル３−チオエチル（ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル）、４−（４，４′−ジメトキシトリチル）ブチレート（化合物Ｄ）の製造：ジクロロメタン１００ｍｌに溶解して得た化合物Ｃ（４．９６ｇ、１０ｍｍｏｌ）とイミダゾール(Aldrich、１．７ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロメタン５０ｍｌに溶解して得たｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．８ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で滴下して添加した。２ｈｒ撹拌した後、溶媒を蒸発させて乾固し、次に残留物を、酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次に、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＤのＲ／Ｓ混合物（５．８２ｇ、９５％収率）はＲｆ＝０．６２で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．５０（ｓ、６Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、［２．３８および２．８３］（ｍ、２Ｈ）、２．５９（ｍ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．１１−３．１５（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ）、３．６９（ｍ、２Ｈ）、３．７９（ｓ、６Ｈ）、６．８０−７．４４（ｍ、１３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化２８】
0004542296.tif 000021
【０１４０】
３−チオエチル（ｔ−ブチルメチルシリルエーテル）、４−（４，４′−ジメトキシトリチル）−１−ブタノール（化合物Ｅ）の製造：乾燥テトラヒドロフラン３００ｍｌに溶解して得た化合物Ｄ（６．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＬｉＢＨ４(Aldrich、０．５４４ｇ、２５ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。１０分後、反応混合物を１０分間、還流し、次にその還流溶液にメタノール（１０ｍｌ）を滴下して添加した。還流をさらに２ｈｒ続けた後、溶媒を蒸発させて乾固し、次に残留物を、酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いでヘキサン／酢酸エチル（２／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＥのＲ／Ｓ混合物（５．２３ｇ、収率９０％）はＲｆ＝０．３９で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０５（ｓ、６Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、［１．６９および２．０１］（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｔ、２Ｈ）、［２．９２および３．１５］（ｍ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．６９（ｔ、２Ｈ）、３．７８（ｓ、６Ｈ）、６．８０−７．４５（ｍ、１３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示せば下記のとおりである。
【化２９】
0004542296.tif 000022
【０１４１】
１−メシレート、３−チオエチル（ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル）、４−（４，４′−ジメトキシトリチル）−１−ブタン（化合物Ｆ）の製造：化合物Ｅ（５．８２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンとともに共蒸発させた。得られた油状物を、アルゴン雰囲気下、乾燥ピリジン２００ｍｌに溶解し、次に０℃まで冷却した。得られた溶液に、メタンスルホニルクロリド（９２８μｌ、１２ｍｍｏｌ）を添加し、その反応混合物を室温まで温めてさらに３ｈｒ撹拌し、その時点でエタノール（２ｍｌ）を添加した。続いてさらに１５分間撹拌し、溶媒を蒸発させて乾固し、残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いで、ヘキサン／酢酸エチル（１／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＦのＲ／Ｓ混合物（６．４１ｇ、収率９７％）はＲｆ＝０．８５で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０５（ｓ、６Ｈ）、０．９０（ｓ、９Ｈ）、［１．８１および２．０４］（ｍ、２Ｈ）、２．５５（ｔ、３Ｈ）、［２．９１および３．２０］（ｍ、２Ｈ）、３．０２（ｓ、３Ｈ）、３．３３（ｍ、１Ｈ）、３．６９（ｔ、２Ｈ）、３．７９（ｓ、６Ｈ）、４．３７（ｍ、２Ｈ）、６．８１−７．４６（ｍ、１３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３０】
0004542296.tif 000023
【０１４２】
化合物Ｆに対するヌクレオベースへの連結（化合物Ｇ）：乾燥ＤＭＦ２００ｍｌに溶解して得たチミン(Aldrich、１．２６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（４８０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）を、鉱油による６０％分散液としてバルクで添加した。その反応混合物を２ｈｒ撹拌したが、その時点で、そのスラリー溶液は透明になった。次に、乾燥ピリジン５０ｍｌに溶解して得た化合物Ｆ（６．６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液をバルクで添加した。その反応混合物を１１０℃で１８ｈｒ加熱し、溶媒を蒸発させて乾固し、次に残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次にブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いでヘキサン／酢酸エチル（１／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＧのＲ／Ｓ混合物（３．５ｇ、収率５０％）はＲｆ＝０．４４で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０５（ｓ、６Ｈ）、０．８８（ｓ、９Ｈ）、［１．６５および２．２５］（ｍ、２Ｈ）、１．８９（ｓ、３Ｈ）、２．５７（ｔ、２Ｈ）、［３．０８および３．８２］（ｍ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．６４（ｔ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、６Ｈ）、６．９６（ｓ、１Ｈ）、６．８０−７．４４（ｍ、１３Ｈ）、８．９０（ｓ、ブロード、１Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３１】
0004542296.tif 000024
【０１４３】
Ｎ−メチルベンジルエーテルによるチミンアミノ基の保護（化合物Ｈ）：化合物Ｇ（６．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリルに溶解して得た溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）(Aldrich、１．８２ｇ、１．５ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、注入によって添加し、次に、ベンジルクロロメチルエーテル（ＢＯＭ、Fluka、１．５６ｇ、１．４ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、注入によって添加した。その反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１８ｈｒ撹拌した。さらに２０％のＤＢＵとＢＯＭを添加し、得られた溶液を室温でさらに２ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発させて乾固し、次に残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗い、次にブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いで、ヘキサン／酢酸エチル（３／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＨのＲ／Ｓ混合物（７．３２ｇ、収率９１％）はＲｆ＝０．６４で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０５（ｓ、６Ｈ）、０．８８（ｓ、９Ｈ）、［１．６５および２．２５］（ｍ、２Ｈ）、１．８９（ｓ、３Ｈ）、２．５７（ｔ、２Ｈ）、［３．０８および３．８２］（ｍ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．６４（ｔ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、６Ｈ）、４．６８（ｓ、２Ｈ）、５．４８（ｓ、２Ｈ）、６．９０（ｓ、１Ｈ）、６．８０−７．４４（ｍ、１８Ｈ）。このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３２】
0004542296.tif 000025
【０１４４】
ベンゾエートによるチミンアミノ基の保護（化合物Ｈ１）、化合物Ｈの代替化合物：
３−Ｎ−ベンゾイルチミンの製造：この化合物を、Tetrahedron Letters 25巻 681頁 1984年に発表されたCruickshankらの方法によって製造する。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３３】
0004542296.tif 000026
【０１４５】
化合物Ｈ１の製造：乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）にＮ３−ベンゾイルチミン（２．３５ｇ、１０．２１ｍｍｏｌ）溶解して得た溶液をアルゴン雰囲気下で撹拌し、その溶液に、トリフェニルホスフィン（４．２９ｇ、１６．３７ｍｍｏｌ）とアルコール（４．５ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。１５分後に、アゾジカルボン酸ジエチル（２．８４ｇ、１６．３２ｍｍｏｌ、２．５７ｍｌ）を、３０分間かけてゆっくり添加した。得られた反応混合物を、アルミニウムフォイルで覆って、アルゴン雰囲気下、室温で２４ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発して乾固し次に残留物をＥｔＯＡｃ（３００ｍｌ）に溶解した。得られた有機層を５％ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍｌ）、水およびブラインで洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥した。その乾燥されたＥｔＯＡｃ抽出液を蒸発乾固してオレンジ色の油状物が得られ、これをヘキサン／酢酸エチル（２／１）および０．５％ピリジンを使用するカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物Ｈ１（５．２５ｇ、収率８５％）はＲｆ＝０．３８で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０５（ｓ、６Ｈ）、０．８８（ｓ、３Ｈ）、［１．７３および２．２５］（ｍ、２Ｈ）、１．９３（ｓ、３Ｈ）、２．５８（ｔ、３Ｈ）、［３．１８および３．８７］（ｍ、２Ｈ）、３．３３（ｍ、１Ｈ）、３．６５（ｔ、２Ｈ）、３．８０（ｓ、６Ｈ）、７．０８（ｓ、１Ｈ）、６．８−７．９２（ｍ、１８Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３４】
0004542296.tif 000027
【０１４６】
ヒドロキシルｔ−ブチルメチルシリル保護基の脱保護：テトラヒドロフラン１００ｍｌに化合物Ｈ（７．９７ｇ、１０ｍｍｏｌ）（または代替物の化合物Ｈ１）を溶解して得た溶液に、テトラブチルアンモニウムフルオリド水和物(Aldrich、３．１３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を添加し、次にその反応混合物を室温で１８ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発して乾固し、次に残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗い、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次に、ジクロロメタンに溶解したメタノールの１％溶液、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＩのＲ／Ｓ混合物（６．１０ｇ、収率８９％）はＲｆ＝０．３６で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：［１．７４および２．２５］（ｍ、２Ｈ）１．８７（ｓ、３Ｈ）、２．５７（ｔ、２Ｈ）、［３．２１および３．８７］（ｍ、２Ｈ）、３．３２（ｍ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、２Ｈ）、３．８７（ｓ、６Ｈ）、４．６８（ｓ、２Ｈ）、５．４８（ｓ、２Ｈ）、６．９０（ｓ、１Ｈ）、６．７９−７．４３（ｍ、１８Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３５】
0004542296.tif 000028
【０１４７】
代わりに、テトラブチルアンモニウムフルオリドを、化合物Ｈ１と、化合物Ｉを製造するために先に述べたのと同じ条件下で反応させた。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３６】
0004542296.tif 000029
【０１４８】
化合物Ｑの製造：乾燥ピリジン１００ｍｌに溶解して得た化合物Ｉ（６．９６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷水浴中で冷却し、この溶液に、メタンスルホニルクロリド(Aldrich、１．３６ｇ、０．９４ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、注入によって添加した。得られた反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、続いて室温でさらに２ｈｒ撹拌した。
【０１４９】
次に溶媒を蒸発させて乾固し、次いで残留物を、酢酸エチル２００ｍｌ／５％重炭酸ナトリウム溶液２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次いでブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いで、酢酸エチル／ヘキサン（１／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物ＱのＲ／Ｓ混合物（６．１０ｇ、収率８９％）はＲｆ＝０．２４で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：［１．７４および２．２５］（ｍ、２Ｈ）、１．８７（ｓ、３Ｈ）、２．５７（ｔ、２Ｈ）、［３．２１および３．８７］（ｍ、２Ｈ）、３．３２（ｍ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、２Ｈ）、３．８７（ｓ、６Ｈ）、４．６８（ｓ、２Ｈ）、５．４８（ｓ、２Ｈ）、６．９０（ｓ、１Ｈ）、６．７９−７．４３（ｍ、１８Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化３７】
0004542296.tif 000030
この方法は化合物Ｑ１の製造にも適用され、簡単に示すと以下のとおりである。
【化３８】
0004542296.tif 000031
【０１５０】
チミンが結合されているモノマー以外の、結合されているヌクレオベースが異なるモノマーを、上記合成法を使用して製造できることは分かるであろう。以下の実施例で例示されるように、これらヌクレオベースが異なるモノマーを使用して、所望の予め選択された配列のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸化合物を合成することができる。
【０１５１】
実施例２
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸を合成するのに使用する固体支持体の製造
ＣＰＧ−ＰＥＧポリマー（ポリマーＡ）の製造：本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類を固相合成するのに使用する好ましいポリマー支持体は、粒径が１２５〜１７７ミクロンで、例えばアルキルアミン鎖、例えばプロピルアミン、５００オングストローム(Pierce)によって誘導体化されている細孔が制御されたＣＰＧガラスである。乾燥ＤＭＦとトリエチルアミンの混合物（３３ｍｌ、１０：１）による前記ポリマー（１０ｇ）の懸濁液に、ＤＭＦ（２０ｍｌ）に無水コハク酸（４ｇ）を溶解して得た溶液を添加した。得られた反応混合物を室温で３ｈｒ撹拌し、次いで、その縮合反応が終結したことをニンヒドリン試験で監視した。得られた懸濁液を濾過し、得られた固体支持体を、まずメタノール（２回×１００ｍｌ）で洗い、続いて乾燥エーテル（１００ｍｌ）で洗浄した。乾燥した上記固体支持体に、１−ジメトキシトリチル−ヘキサエチレングリコール（後記実施例４でさらに説明する化合物１、４ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍｌ）と乾燥ピリジン（０．５ｍｌ）の混合物に溶解して得た溶液を添加し、続いて、さらに１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１．０３ｇ、８．２１ｍｍｏｌ、Aldrich）およびジメチルアミノピリジン（０．５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた不均一系の(heterogenic)混合物を室温で一夜撹拌し、得られたＰＥＧ−ＣＰＧアダクトを濾過し、まずメタノール（２回×５０ｍｌ）で洗浄し、次にジクロロメタン（２回×５０ｍｌ）で洗浄し、最後に乾燥エーテル（２回×５０ｍｌ）で乾燥した。ＰＥＧ−ＣＰＧアダクトの収率を、そのアダクトの一部分を秤取し、それを、ジクロロメタンによるトリクロロ酢酸２％溶液２ｍｌで１分間処理することによって、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）を脱保護して測定し（オレンジ色を４９５ｎｍにて分光光度法で監視した）、その結果、収率は９７％であった。
このプロセスを簡単に示せば下記反応式になる。
【化３９】
0004542296.tif 000032
【０１５２】
以後のプロセスに対しては、下記の略号を使用する。
【化４０】
0004542296.tif 000033
【０１５３】
実施例３
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類の合成（サイクル）
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類合成のサイクルには、三つのステップ：縮合、キャッピング(capping)および脱保護を含んでいる。
【０１５４】
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸ポリチミンの合成：
この実施例において、以下にさらに詳細に述べるように、Ｑ化合物またＱ１化合物を使用し、それ以外の点では同一の条件を利用して、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸ポリチミンを合成することができる。
【０１５５】
縮合：ポリマーＡ  １ｇの乾燥エチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）(Aldrich)による懸濁液中に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド(Aldrich)のＴＨＦによる１Ｍ溶液２ｍｌと、化合物Ｑまたは化合物Ｑ１  ０．５ｇのＴＨＦ  ２ｍｌによる溶液とを添加した。得られた懸濁液を室温で１ｈｒ撹拌した。得られたポリマーに結合した化合物Ｑまたは化合物Ｑ１を濾過し、次いでメタノール２５ｍｌで洗浄し、ジクロロメタン２５ｍｌずつで２回洗浄し、最後に２５ｍｌのエーテルで洗浄した。
【０１５６】
以後記載するプロセスに対しては下記の略号を使用する。
【化４１】
0004542296.tif 000034
【０１５７】
上記縮合工程（化合物Ｑの工程）を簡単に示すと次のとおりである。
【化４２】
0004542296.tif 000035
【０１５８】
キャッピング：先のステップで得たポリマー支持体に、無水酢酸／２，６−ルチジン／テトラヒドロフラン（１／１／８）１０ｍｌを添加することによって、未反応のポリマーヒドロキシ基のアセチル化を達成した。その懸濁液を５分間撹拌した。次に溶媒を減圧吸引によって除去し、次いで残留物をメタノール１０ｍｌで２回洗浄し、次にジクロロメタン１０ｍｌで２回洗浄した。
【０１５９】
ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）の脱保護：先の二つのステップのいずれかから得た乾燥ポリマーを、ジクロロメタンにトリクロロ酢酸を溶解して得た２％トリクロロ酢酸溶液５ｍｌで１分間処理し、生成するオレンジ色を分光光度法で監視し、次にそのポリマーをメタノール、ジクロロメタンで洗い、次いで乾燥エーテルで乾燥した。
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の脱保護工程を簡単に示すと下記のとおりである。
【化４３】
0004542296.tif 000036
【０１６０】
上記乾燥されたポリマーを、次に、乾燥ＤＭＥ中で、縮合の項目で先に述べたような方式で、第二の化合物Ｑのモノマーと縮合させた。上記第二縮合工程によってチミン−ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸二量体が得られるが、この工程を簡単に示すと次のとおりである。
【化４４】
0004542296.tif 000037
【０１６１】
このようなサイクルは、適当なセンス配列またはアンチセンス配列を形成するのに必要な回数だけ繰り返すことができ、各３段階サイクルにおいて、一つずつ追加のモノマーが連続して、成長中の鎖に、所望のｎサイクルまで付加される。
【０１６２】
この実施例のポリチミン−ポリ（エーテル−チオエーテル）−ＣＰＧ−ＰＥＧアダクトは一般に以下のように表される。
【化４５】
0004542296.tif 000038
【０１６３】
５′−ＯＨは、以下に述べるように、エクソコンジュゲートＰＥＧに最後に結合させるため露出したままである。
【０１６４】
実施例４
ＰＥＧ−エクソコンジュゲート類の製造
この実施例は、化合物（Ｔ−ＢＯＭ）ｎと化合物（Ｔ−Ｂｚ）ｎの両者に適用される。
【０１６５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、タンパク質などの他の基体に共有結合されると、その潜在的な用途を広げる方式でその特性を変える水溶性ポリマーである。ＰＥＧ−タンパク質接合体の薬理学的性能が、その未修飾タンパク質の対応物と比べると、改善されているので、この種のＰＥＧ接合体の治療薬としての開発が促進された。例えば、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症などの酵素欠損症は、天然の酵素による治療が、迅速なクリアランスおよび／または免疫反応のために、役に立たないことは分かっていたが今や同等のＰＥＧ−酵素類、例えばＰＥＧ−ＡＤＡで治療することができる。この新規の観察結果は、ＰＥＧ化（PEGylation）の技法の応用に新しい視野を開くことができる。
【０１６６】
最後のｎサイクルにおける第二ＰＥＧエクソコンジュゲートの縮合：
４，４′−ジメトキシトリチル−ヘキサエチレングリコール（化合物１）の製造：乾燥ピリジン２５０ｍｌにヘキサエチレングリコール（８．４６ｇ、３０ｍｍｏｌ）を溶解して得た溶液に、乾燥ピリジン５０ｍｌに４，４−ジメトキシトリチルクロリド（３．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を溶解して得た溶液を、室温で滴下して添加した。得られた溶液を室温でさらに５ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発させて乾固し、次いで残留物を、酢酸エチル２００ｍｌ／重炭酸ナトリウム５％溶液２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次にジクロロメタンによる５％メタノール溶液、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた４，４−ジメトキシトリチル−ヘキサエチレングリコール化合物（５．２３ｇ、収率８９％）はＲｆ＝０．２９で移動した。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化４６】
0004542296.tif 000039
【０１６７】
１−メタンスルホネート、６−（４，４−ジメトキシトリチル）−ヘキサエチレングリコール（化合物２）の製造：乾燥ピリジン１００ｍｌに化合物１（５．８４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を溶解して得た溶液に、アルゴン雰囲気下、メタンスルフィニルクロリド（１．３６ｇ、０．９４ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を注入によって添加した。その反応混合物を、一夜、室温で撹拌した。次に溶媒を蒸発させて乾固し、次いで残留物を、酢酸エチル２００ｍｌ／５％重炭酸ナトリウム溶液２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、ブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発し、次に、酢酸エチル／ヘキサン（４／１）、０．５％ピリジンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物２（６．１２ｇ、収率９２％）はＲｆ＝０．３１で移動した。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化４７】
0004542296.tif 000040
【０１６８】
化合物２を、上記実施例３に記載したようにして脱トリチル化した後、成長鎖の最後の塩基に縮合させた。
【０１６９】
ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸ポリチミン合成の、第二ＰＥＧ部分を付加した後の最終生成物は下記式で表される。
【化４８】
0004542296.tif 000041
【０１７０】
実施例５
ポリ（エーテル−スルホン）核酸の生成（任意に）：ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類に加えて、別のポリマーのポリ（エーテル−スルホン）核酸類を、追加のステップを加えてスルフィド部分を酸化してスルホンにすることによって製造することができる。ポリ（エーテル−チオエーテル）が結合されているポリマー支持体１ｇに対して、アセトン５ｍｌと水１ｍｌにＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（３０９ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、Aldrich）を溶解して得た溶液を添加した。この不均一系溶液に、０．１８モルＯｓＯ４水溶液４２μｌ（０．００７６ｍｍｏｌ、１ｍｏｌ、Aldrich）を添加した。得られた混合物を室温で１２ｈｒ撹拌し、続いて重亜硫酸ナトリウム飽和水溶液５ｍｌを添加してクエンチした。
【０１７１】
ポリマー支持体を濾過し、次に水（２０ｍｌ）、メタノール（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（２０ｍｌ）および最後にエーテル（２０ｍｌ）で洗浄した。その乾燥された残留物はここで、ジメトキシトリチル基を脱保護して５′−ＰＥＧ−エクソコンジュゲートを製造することができる状態にある。
この反応は簡単に示すと下記のとおりである。
【化４９】
0004542296.tif 000042
【０１７２】
この修飾を行うのは、３個の酸素原子を有するキレート金属カチオン(chelating metal cation)によって骨格の剛性を維持するためおよび分子の正電荷を増大することによって細胞の物質摂取を促進するためである。
【０１７３】
ポリ（エーテル−スルホキシド）核酸の生成（任意に）：ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸、およびポリ（エーテル−チオエーテル）核酸を酸化することによって誘導されるポリ（エーテル−スルホン）核酸に加えて、もう一つの酸化されたポリマーすなわちポリ（エーテル−スルホキシド）核酸が、ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸を酸化してスルホキシドにするステップを利用することによって製造することができる。
【０１７４】
ポリ（エーテル−チオエーテル）が連結されているポリマー支持体１ｇに、メタ−クロロ過安息香酸（１７２ｍｇ、１ｍｍｏｌ、Aldrich）をジクロロメタン５ｍｌに溶解して得た溶液を加えた。得られた混合物を室温で１２ｈｒ撹拌し、次いで重亜硫酸ナトリウム飽和水溶液５ｍｌを添加してクエンチした。
【０１７５】
ポリマー支持体を濾過し、次に水（２０ｍｌ）、メタノール（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（２０ｍｌ）および最後にエーテル（２０ｍｌ）で洗浄した。その乾燥された残留物は、ここで、ジメトキシトリチル基を脱保護して５′−ＰＥＧ−エクソコンジュゲートを製造することができる状態にある。
この反応を簡単に示すと下記のとおりである。
【化５０】
0004542296.tif 000043
【０１７６】
実施例６
脱保護と連結
サイクリング（縮合）が完了したとき、いくつかの一般的な脱保護ステップが下記のように実施される。
【０１７７】
塩基を含有するアミノ基の脱保護：化合物（Ｔ−ＢＯＭ）ｎ−ＰＥＧの脱保護は水素化反応で達成することができる。ポリマー支持体に連結されたポリ（エーテル−チオエーテル）核酸にテトラヒドロフラン１０ｍｌ、５％Ｐｄ／Ｃ  １００ｍｇを添加し、次いでＨ２（１気圧）を室温で２ｈｒ加えた。次にポリマー支持体を濾過し、次にメタノール（２回×３０ｍｌ）で洗浄し次いで乾燥エーテル（２回×３０ｍｌ）で洗浄した。
この工程を簡単に示すと下記のとおりである。
【化５１】
0004542296.tif 000044
【０１７８】
ポリ（エーテル−チオエーテル）の、固体支持体からの脱離：この実施例ではベンゾエート保護基も除去される。先のステップで得た乾燥ポリマー支持体を、濃水酸化アンモニウム液に、５５℃にて１６ｈｒさらし、遠心分離して、上澄み液を収集した。
【０１７９】
実施例７
本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸類を合成するのに使用するキラリティが純粋のモノマーの合成
式Ｅで表される立体特異性モノマーの製造：ポリ（エーテル−チオエーテル）核酸のＳ立体特異性異性体の製造は、本願に記載されている化合物Ｅを製造するのに用いる不斉出発物質（Ｓ）−（−）リンゴ酸ジメチルに基づいている。追加の連続合成ステップは次のとおりである。
【０１８０】
（Ｓ）−１，２，４−ブタントリオール（化合物Ｉ）の製造：（Ｓ）−（−）−リンゴ酸ジメチル(Aldrich、２５．９ｇ、１５９ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン１００ｍｌに溶解して得た溶液を、水素化リチウムアルミニウム（２１ｇ、５５３ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン１ｌに溶解して得た溶液に、アルゴン雰囲気下、滴下して加えた。得られた反応混合物を一夜還流し、続いて水（１６０ｍｌ）と１０％硫酸（１００ｍｌ）を添加した。生成した白色沈澱を濾過し、次に乾燥エタノール（４回×１３０ｍｌ）で洗浄した。生成した部分を含有して減圧下、蒸発させてほぼ乾固した。残留油状物に含有されている無機物質を、クロロホルム−エタノール混合物５６０ｍｌ（３：１ｖ／ｖ）および６７０ｍｌ（２：１ｖ／ｖ）を溶離液として用いる５０ｇシリカゲルのショートカラムクロマトグラフィーで除去した。溶媒を除去して、化合物Ｉを淡黄色油状物として得た（１２ｇ、収率６０％）。ＮＭＲ−（ピリジン）：２．１４（ｍ、２Ｈ）、３．９７（ｄｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１７（ｄｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、５．３８（ｍ、１Ｈ）、６．００（ヒドロキシル、３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５２】
0004542296.tif 000045
【０１８１】
（Ｓ）−１，２−Ｏ−イソプロピリデンブタン−１，２，４−トリオール（化合物II）の製造：（Ｓ）−１，２，４−ブタントリオール（９ｇ、８５．７ｍｍｏｌ）を、アセトン（５００ｍｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（４００ｍｇ）中で、室温にて１．５ｈｒ撹拌した。その反応混合物に重炭酸ナトリウム（２ｇ）を添加し、撹拌をさらに１０分間続けた。溶媒を蒸発させて乾固し、次に残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗い次にブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いでヘキサン／酢酸エチル（２／１）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。無色油状物（１１．６ｇ、収率９５％）として得られた化合物IIはＲｆ＝０．４７で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３６（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、３Ｈ）、１．８１（ｄｔ、Ｊ＝５．５、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．１０（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．５８（ｄｄ、Ｊ＝７、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、４．０７（ｄｄ、Ｊ＝６、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｍ、１Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５３】
0004542296.tif 000046
【０１８２】
（Ｓ）−４−Ｏ−アセテート−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−１，２，４−ブタントリオール（化合物III）の製造：乾燥ピリジン（１００ｍｌ）と無水酢酸（１００ｍｌ）に、化合物(II)（１４．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）を溶解して得た溶液を室温で３ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発させて乾固し、残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し、次いでブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いでヘキサン／酢酸エチル（１／２）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。化合物IIIが、無色油状物（１８．０ｇ、収率９５％）として得られ、Ｒｆ＝０．３５で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３５（ｓ、３Ｈ）、１．４１（ｓ、３Ｈ）、２．０２（ｍ、２Ｈ）、３．５９（ｄｄ、Ｊ＝７、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、４．２１（ｍ、２Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５４】
0004542296.tif 000047
【０１８３】
（Ｓ）−４−Ｏ−アセチル−１，２，４−ブタントリオール（化合物IV）の製造：化合物III（１８．８３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を、８０％酢酸水溶液（２００ｍｌ）に溶解し、室温で２１ｈｒ保持し、続いて５０℃でさらに４ｈｒ保持した。蒸発させ、続いてトルエン（２回×５０ｍｌ）と共蒸発させて化合物IV（１１．２ｇ、収率７５％）を単離した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．７６（ｍ、２Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）、３．４５（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｍ、１Ｈ）、３．７９（ｍ、１Ｈ）、４．２１（ｍ、２Ｈ）、４．７５（ｓ、ブロード、１Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５５】
0004542296.tif 000048
【０１８４】
（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−４−Ｏ−アセチル−１，２，４−ブタントリオール（化合物Ｖ）の製造：化合物IV（１４．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２回×５０ｍｌ）とともに共蒸発させて、残留油状物を乾燥ピリジン２００ｍｌに再び溶解した。得られた溶液を０℃まで冷却し、ジメトキシトリチルクロリド（３７．２３ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に溶解して得た溶液を、アルゴン雰囲気下、撹拌しながら滴下して添加した。得られた溶液を室温まで昇温させ、さらに１８ｈｒ撹拌した。溶媒を蒸発させて乾固し次いで、残留物を酢酸エチル２００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し次にブライン溶液で２回洗った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次いで、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物Ｖ（３８．２ｇ、収率８４．８％）はＲｆ＝０．２９で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．７１（ｍ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、３．１５（ｍ、２Ｈ）、３．７８（ｓ、６Ｈ）、４．１３（ｍ、２Ｈ）、６．７９−７．４５（ｍ、１３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと次のとおりである。
【化５６】
0004542296.tif 000049
【０１８５】
２−ブロモ−ｔｅｒｔブチル−ジメチルシリルエタノール（化合物VI）の製造：２−ブロモエタノール（１７．２７ｇ、１３８ｍｍｏｌ）とイミダゾール（２３．４８ｇ、３４５ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解して得た溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２５ｇ、１６５ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解して得た溶液を滴下して加えた。室温で２ｈｒ撹拌した後、溶媒を蒸発させて乾固し、次にその残留物を酢酸エチル４００ｍｌ／ＮａＨＣＯ３  ５％水溶液２００ｍｌで抽出し、水で２回洗浄し次いでブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次に、ヘキサン／酢酸エチル（１０／１）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物VI（２９．１５ｇ、収率８８．６％）はＲｆ＝０．５３で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０７（ｓ、６Ｈ）、０．８６（ｓ、９Ｈ）、３．３８（ｔ、２Ｈ）、３．８８（ｔ、３Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５７】
0004542296.tif 000050
【０１８６】
２−Ｓ−アセチル−ｔｅｒｔブチル−ジメチルシリルエタノール（化合物VII）の製造：乾燥ＤＭＦ  １５０ｍｌに化合物VI（２３．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を溶解して得た溶液に、チオ酢酸カリウム（１４．８２ｇ、１３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を１１０℃で４ｈｒ加熱した。溶媒を蒸発させて乾固し、次いでその残留物を酢酸エチル４００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、そしてヘキサン／酢酸エチル（１０／１）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた化合物VII（２２．８１ｇ、収率９７．４％）はＲｆ＝０．３８で移動した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：０．０３２（ｓ、６Ｈ）、０．８５（ｓ、９Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、２．９９（ｔ、２Ｈ）、３．６８（ｔ、２Ｈ）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化５８】
0004542296.tif 000051
【０１８７】
２−メルカプト−ｔｅｒｔブチル−ジメチルシリルエタノール（化合物VIII）の製造：化合物VII（２３．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）を２Ｎ  ＮａＯＨのメタノール溶液１００ｍｌと混合した。アルゴン雰囲気下、室温で２ｈｒ撹拌した後、その塩基性溶液を、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．０まで中和した。溶媒を蒸発させて乾固し、次いでその残留物を酢酸エチル４００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出し、次にブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、そして、さらに精製することなく次のステップに使用した。得られた化合物VIII（１８．５ｇ、収率９６．２％）をＴＬＣ［ヘキサン／酢酸エチル（２／１）］で分析したところＲｆ＝０．２２で移動した。
このプロセスを簡単に示すと次のとおりである。
【化５９】
0004542296.tif 000052
【０１８８】
（Ｒ）−化合物Ｅの製造：アゾジカルボン酸ジエチル(Aldrich、６．９６ｇ、４０ｍｍｏｌ）をトリフェニルホスフィン（１０．５０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に入れて０℃で３０分間充分に撹拌して得た溶液に添加して黄色を帯びたスラリー溶液を得た。化合物Ｖ（９．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）による溶液を、次に添加して、その反応混合物を０℃でさらに１０分間撹拌した。化合物VIII（７．６８ｇ、４０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を前記反応混合物に、１０分間かけて滴下して添加し、その混合物を０℃で１ｈｒ撹拌し、続いて室温で１ｈｒ撹拌した。得られた黄色の透明溶液を濃縮し、次に濃アンモニア水（１００ｍｌ）およびＴＨＦ（５０ｍｌ）で、室温にて２ｈｒ、加水分解を行った。溶媒を蒸発させて乾固し、次いでその残留物を酢酸エチル４００ｍｌ／水２００ｍｌで抽出しブライン溶液で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、次にヘキサン／酢酸エチル（１０／１）を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。生成した（Ｒ）−化合物Ｅを、（Ｒ／Ｓ）−化合物Ｅを製造するために先に述べたのと同じ条件を使ってシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた（Ｒ）−化合物Ｅ（９．３０ｇ、７９．８％収率）は、Ｒｆ値とＮＭＲスペクトルが、先に述べた（Ｒ／Ｓ）−化合物Ｅと同一である（実施例１参照）。
このプロセスを簡単に示すと下記のとおりである。
【化６０】
0004542296.tif 000053
【０１８９】
（Ｒ）−化合物Ｑを（Ｒ）−化合物Ｅから合成するステップは、化合物Ｅから化合物Ｑを合成するために実施例１で先に述べたのと同じである。
【０１９０】
本発明をその具体的な実施態様によって説明してきたが、多くの代替、変型および変更は当業技術者には明らかなことである。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入るかような代替、変型および変更すべてを含むものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  従来技術のＤＮＡおよび本発明のポリ（エーテル−チオエーテル）核酸化合物上のヌクレオベースを隔てる１１個の原子を示す。
【図２】  隣のＢ官能基との間に１１個の原子を有する、米国特許第５９０８８４５号に記載の従来技術のテトラチミン−ポリエーテル核酸化合物と天然のテトラ−アデニン−ｓｓＤＮＡとのハイブリッド形成を示す分子模型である。
【図３】  本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
【図４】  本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
【図５】  本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
【図６】  本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−チオエーテル）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
【図７】  本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
【図８】  本発明の、Ｓ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
【図９】  本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の一本鎖分子を示す分子模型である。
【図１０】  本発明の、Ｒ配置を有するポリ（エーテル−スルホン）核酸の二本鎖分子を示す分子模型であり、水素結合は破線で示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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