(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染後に遊離されるウイルス粒子：
ａ）該粒子が、ウイルス性ＨＣＭＶグリコプロテイン類が内部に包埋される脂質膜によって囲にょうされること；
ｂ）該粒子が、ウイルス性ＤＮＡおよびカプシドのいずれをも含有しないこと；及び
ｃ）該粒子が、Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）の構成部分の一種以上及びｐｐ６５ではない一種以上のタンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タンパク質を含有すること。
【請求項２】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）を一種のＨＣＭＶグリコプロテインの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項３】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）をＨＣＭＶグリコプロテインｇＢの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項４】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）をＨＣＭＶグリコプロテインｇＨの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項５】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）をＨＣＭＶプロテインＩＥ１（ｐｐＵＬ１２３）の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項６】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）を一種のＨＣＭＶグリコプロテインの構成部分の一種以上及びＨＣＭＶプロテインＩＥ１（ｐｐＵＬ１２３）の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項７】
該Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ＵＬ８３）をＨＣＭＶ以外のヒト病原体の構成部分である一種のタンパク質の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項１において記載された粒子。
【請求項８】
ＨＣＭＶではない他種ヒト病原体が、ＨＩＶ−１，ＨＢＶ、ＨＣＶ及びインフルエンザから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７において記載された粒子。
【請求項９】
下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス感染後に遊離されるウイルス粒子：
ａ）該粒子が、ウイルス性ＨＣＭＶ−グリコプロテイン類を内部に包埋する脂質膜によって囲にょうされること；
ｂ）該粒子が、ウイルス性ＤＮＡおよびカプシドのいずれをも含有しないこと；及び
ｃ）該粒子が、他の異なるＨＣＭＶ株に由来した特定の一種のグリコプロテインの変異体である少なくとも二種のグリコプロテインの構成部分を含むこと。
【請求項１０】
該特定ＨＣＭＶグリコプロテインの二種の変異体のうちの一つが、ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株の変異体であり、また残りの変異体が、ＨＣＭＶ  Ａｄ１６９株の変異体であることを特徴とする、請求項９において記載された粒子。
【請求項１１】
該グリコプロテインが、ＨＣＭＶのｇＢタンパク質であることを特徴とする、請求項１０において記載された粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染後に遊離されるウイルス粒子及びかかる粒子のワクチンとしての使用法・用途に係る。
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、β―ヘルペスウイルスの一種であり、遍在的に存在する病原体の一つである。免疫適格性を有する人においては、ＨＣＭＶ感染症は、せいぜい中程度で且つ非特異的症状を呈するため、通常は認知されることはない。これとは逆に、例えばエイズ（ＡＩＤＳ）患者又は臓器被移植者など免疫抑制状態の患者などいくつかのリスク群においては、非経口感染を受けた場合、ＨＣＭＶ感染症は、重篤な症状を呈する。
【０００３】
【従来の技術】
ＨＣＭＶ感染症を治療するためにいくつかの化学療法剤が利用可能である。しかしながら、ＨＣＭＶ感染症に対する抗ウイルス化学療法剤の成功は、特にこれら医薬品の持つ毒性やまた治療期間が長期になった場合の抵抗性ウイルス変異株の出現によって限られたものとなっている。さらには、抗ウイルス性の高免疫度血清を予防目的又は治療目的に使用することは、有効性が限定されたものに過ぎないことが判っている。
【０００４】
ＨＣＭＶワクチン開発については過去長年にわたり多くの研究がなされてきた。即ち、所望の免疫を誘導するために弱毒化された生ワクチンについて多くの試みがなされているものの、この種のワクチンは、有効性が限定されたものにすぎないことが判明している。かかる理由としては、なかでも弱毒化ウイルスのヒト体内での生存可能性が限定されていることや抗原性が種特異的に変化することが挙げられる。生ワクチンの使用は、終生免疫誘導が不十分であること以外に、危険が多いものと見なすべきである；即ち、ＨＣＭＶ感染症における病原性機構に関する知識が欠如しておりまた免疫抑制後においてワクチン株再活性化の危険性があるため、生ワクチン使用は、臨床の現状においては少なくとも疑問が多いように思われる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このようないくつかのリスクを回避するために、種々の発現系で合成されたウイルスエンベロープ由来のタンパク質を幾つか含有するＨＣＭＶサブユニットワクチンを開発するべく、いくつかの研究方針が最近実行されている。このようなエンベロープタンパク質、特にグリコプロテインｇＢ及びｇＨは、ＨＣＭＶに対する中和抗体の必須の標的抗原である。中和抗体は、かかる感染症を防止する性能を有するものであり、ｇＢサブユニットワクチンによってかかる中和抗体を誘導せしめることは、実験動物においてもまた臨床試験においても可能であった。しかしながらヒトにおいては、このようにして誘導した抗体応答は、持続期間が短く、全ての症例において当該感染症を予防・防止するには適していないことが判明している。このことは、専らＨＣＭＶのｇＢにのみ依拠したサブユニットワクチンを広範に使用するうえで致命的な障害となるものである。逆にこのような抗体製剤の有効性が限定されることについて示唆されてきた理由としては、免疫応答における菌株特異的変動があること、充分な細胞性免疫応答が欠落していること及び使用する抗原について、そのエピト-プがいくつかの場合立体構造依存性であることが公知であるため、いくつか用いた抗原に構造的な制約があることが挙げられる。
【０００６】
従って、かかる経験に基けば、有効で且つ広範に使用可能なＨＣＭＶワクチンが満たすべき要件は、下記する通りである：即ち、
（１）菌株に重複的な態様でＨＣＭＶ感染症から防御する中和抗体を永続的に誘導すること。このためには、ＨＣＭＶに対する所謂“ヘルパー細胞応答”（ＣＤ４−陽性Ｔリンパ球）を有効に誘導させ、かくして抗体分泌性Ｂリンパ球の成熟を支援・助長することが必要である。
（２）ＨＣＭＶに対抗する細胞障害性Ｔ細胞の生成を誘導すること。この種のリンパ球は、既に発症したＨＣＭＶ感染症を終結させ且つ体内でのウイルスの感染拡大を限定するために極めて重要である。
（３）当該ワクチンによる副作用を最小限とすること。接種した生菌ウイルスは、これまでに知り得る限りでは免疫抑制後に潜伏期を樹立する能力を有しており、このことから誘発される可能性があるリスクを評価することは不可能である。従って目的とすべきことは、ワクチンとして非生菌性ウイルス抗原を調製することであるべきである。
【０００７】
ＨＣＭＶワクチンについて掲げた上記諸要件を満足するためには、当該ワクチンは、中和抗体を誘導させ且つヘルパー細胞（ＴHリンパ球）及び細胞障害性細胞（ＣＴＬ）を刺激するための適合した抗原を含有するものでなくてはならない。
【０００８】
中和抗体は、現在の技術知識水準に従えば、ＨＣＭＶ感染後において専らウイルスエンベロープタンパク質、特にグリコプロテインｇＢ及びｇＨに対して生成されるものである。
【０００９】
ＴHリンパ球は、主として該ウイルスの外被・被包タンパク質、特に所謂ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）に対して生成されるものであり、さらにはｐｐ６５は、ＨＣＭＶに対抗するＣＴＬを誘導するためには必須の抗原である。ｐｐ６５の提示は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して細胞によるデノボ(de novo)合成の後では常時生起するだけではない；つまり、所謂“外因性負荷（exogenous loading）”によってもＭＨＣＩ提示経路に導入されることが可能なのである。
【００１０】
前記した抗原は、ヒト線維芽細胞の初代培養物の感染過程においてＨＣＭＶにより合成され、培養培地内に遊離される欠陥ウイルス粒子の必須構成成分である。これらのデンスボディー（ＤＢ）は、電子顕微鏡下でも生存可能な構造物であって、そのタンパク質質量の９０％以上は、ｐｐ６５から構成される。これらは、ウイルス性グリコプロテインで修飾された細胞脂質膜が付与されていること及び当該細胞から放出されることの二点において、ウイルス粒子に比肩され得るものである。かかるウイルス性グリコプロテインは、このエンベロープでは天然の立体構造として存在する可能性が極めて高い。ＤＢは、ウイルス性ＤＮＡもまたウイルス性カプシドも一切含有していないため、非伝染性であり、細胞培養物の上澄み液から確立された方法によって大量に濃縮することが出来る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの目的は、ＨＣＭＶに対する有効で且つ広範に使用可能なワクチンを提供することである。
【００１２】
本発明は、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染後に遊離されるウイルス粒子について記述するものであり、かかる粒子は、ＨＣＭＶ感染症に対する予防又は治療目的のワクチンとして使用することが出来る。
【００１３】
本発明の該粒子は、脂質膜によって囲にょうされており、かかる脂質膜によって、当該粒子をいくつかの哺乳動物細胞に融合させて、かくしてその内容物が当該細胞の原形質内に侵入することが可能となるのである。当該粒子の膜は、ウイルス中和性抗体のための主要抗原を提示するウイルス性グリコプロテインを含有する。この粒子はまた、ウイルス性ＤＮＡもまたカプシドも双方を含有していないことを特徴とするものである。更には、ウイルス性Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）を含有しており、この抗原は、Ｔヘルパー細胞の生成を刺激すると共にＨＣＭＶに対抗する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するために必須の抗原となる。
【００１４】
かかる特質によって、特に中和性抗体と共に充分な細胞応答を誘導せしめる能力を有する複数の抗原を組合せて有することによって、当該粒子がＨＣＭＶワクチンとして適したものになるのである。
【００１５】
デンスボディーは、既に文献に記載されている（Gibson et al. Birth Defects:  Original Article Series 20, 1 (1984) 305-324; Virology 66 (975) 464-473）。このことに関連して、デンスボディーをワクチンとして使用する可能性が示唆されていたが、デンスボディーが現実に所望された効果を現出することを証明する実験は一切報告されたことはなかった。更には、デンスボディーが、抗原性効果を有することは既に示されている(Jahn et al., J. gen. Virol. 68 (1987) 1327-1337)。しかしながら、これらの実験は、誘導された免疫応答を特性化するものではなく、この事実が、ワクチンとしての適性に関する情報を一切推論できない理由となっている。
【００１６】
本発明の粒子が、高い抗原性を有し且つ中和抗体を生成させる能力を有するという事実は、実施例１及び２において示されるウイルス中和抗体の誘導は、長時間継続する（実施例３）のであって、このことは、成功するワクチンのためのもう一つの要件である。実施例１乃至３において実現された免疫応答は、免疫化をアジュバントを用いることなく実施しただけにそれだけ一層驚くべきことである。アジュバントと一緒に投与されたワクチンの副作用は、従ってここでは当てはまらない。本発明の粒子はまた、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するのである（実施例４及び５）。
【００１７】
最後に、ＤＢは、投与経路の如何に拘わらずＴｈ１型のＴヘルバー細胞応答を誘導するのである（実施例６）。
【００１８】
これらの実施例は、本発明の粒子がＨＣＭＶワクチンとして適していることを証明するものである。
【００１９】
また別の実施態様においては、一部分としてウイルス性Ｔ細胞抗原ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）の構成部分の一種以上又はそのタンパク質全体及び他の部分として一種以上の他種タンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タンパク質を含有する粒子について記載されている。
【００２０】
このことによって、当該粒子の有する抗原性を最適化することが可能となるのである。その理由は、このような融合タンパク質が粒子中において大量に存在するからである。更には、一分子中において細胞性と体液性の双方の免疫応答が発現することは、その抗原性を明白に増大させることが出来る、ということも既に公知となっている。ｐｐ６５の種々の部位及び他のタンパク質は、直接融合させることが出来るが、例えば関与するタンパク質のうちの一つのタンパク質の天然構成成分ではないリンカー配列を当該種々の部分の間に介在させることも可能である。この種の配列は、クローニングによって生成させることが出来るし又は当該抗原の諸特性に影響を及ぼすために慎重に導入することが出来る。しかしながら。かかる融合タンパク質は好ましくは、融合パートナーの構成成分ではない外来配列を一切含有しないのである。かかる実施態様においては、当該融合タンパク質は、ｐｐ６５の構成部分の一種以上と一種以上の他種タンパク質の構成部分の一種以上から構成される。
【００２１】
ｐｐ６５全体又はその一種以上の構成部分が、当該融合タンパク質に存在していてもよいことは、下記する全ての実施態様に対して当てはまる。“ｐｐ６５（から構成される）の融合タンパク質”なる表現は、本特許出願の目的のためにはｐｐ６５の全体に限定されるものと了解されるものとする。当該融合タンパク質中に存在する一種のタンパク質の“構成部分“又は”構成区分”とは、当該融合タンパク質が誘導される元のタンパク質のうちの少なくとも６、好ましくは少なくとも8、最も好ましくは少なくとも９、１５又は２０の連続したアミノ酸を含んで成る。
【００２２】
一つの好ましい実施態様は、ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）及びウイルス性グリコプロテインｇＢ又はｇＨの中和エピトープの一種以上との融合タンパク質を含んで成る。この種の粒子は、図７Ａにおいて示すように産生させることが出来る。かかる融合タンパク質は、抗原特異的取り込みを経由して、グリコプロテイン特異的Ｂ細胞内に進入し、このＢ細胞は次に、ＭＨＣクラスＩＩのコンテキストにおいてｐｐ６５及びｐｐ６５の双方のエピト-プを提示するのである。更には、この融合タンパク質のいくつかの部分をＭＨＣクラスＩＩのコンテキストにおいて抗原提示機能細胞（ＡＰＣ）を用いて提示させることも可能である。何れの場合においても、結果的にはｐｐ６５及びウイルス性グリコプロテインに対するＴHの応答を効率よく刺激することが出来る。これらのＴH 細胞は、ｐｐ６５及びウイルス性グリコプロテインのペプチドをＭＨＣクラスＩＩのコンテキストにおいて提示し、かくして中和抗体を相同的且つ異種的にも生成するグリコプロテイン特異的Ｂ細胞を刺激する能力を有している。その上、この種の粒子は、伝染性のビリオンと同様に細胞内に取り込まれることが可能であり、ｐｐ６５ペプチドをＭＨＣクラスＩ経路に外因的に負荷することによって導入することが出来る。このことによって、死滅ワクチンについては異常であるが、ＨＣＭＶに対するＣＴＬ応答刺激が実現される。
【００２３】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、ｐｐ６５及びＨＣＭＶの別のタンパク質であるプロテインＩＥ１（ｐｐＵＬ１２３）の構成部分の一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。このＩＥ１タンパク質の構成部分は、特別に存在するべきもので、ヒト体内で自然感染の過程で生成される細胞障害性Ｔ細胞の対象となる構成部分である。このＩＥ１タンパク質のペプチド類は、ｐｐ６５のペプチドとは異なるＭＨＣクラスＩ分子によって提示される場合もある。ＩＥ１由来の更なる“ＣＴＬエピトープ”が付加することによって、接種された被験者であって、異なるＭＨＣクラスＩ分子を提示する被験者が免疫化された場合、可能な限り広範な態様でＨＣＭＶに対抗するＣＴＬを産生する能力を有することが、確保されることになるはずである。
【００２４】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、ｐｐ６５とＨＣＭＶグリコプロテインの中和エピト-プの一種以上とＩＥ１のＣＴＬエピトープの一種以上とから構成される融合タンパク質を含有するのである。ｐｐ６５を中和エピトープとＣＴＬエピト-プとに融合させることによって、中和抗体とＣＴＬの双方を被験者の体内で可能な限り広範な態様で、即ちＭＨＣクラスＩパターンが異なる最大多数の人々の体内で生成させることが可能であることが確保されることになるはずである。
【００２５】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、ｐｐ６５及び他のヒト病原体のエピトープのとから構成される融合タンパク質を含有する。その他のヒト病原体の適当な構成成分とは、ヒト体内において生成される中和抗体が対抗する抗原である。単離した“中和抗原”を使用した場合と比較して、免疫応答（抗体応答）が顕著に増大することを期待することが、このような“中和抗原”をＴ細胞抗原ｐｐ６５に融合させることによって可能となるのである。ここで付言しておくべきかかる“中和抗原”の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡＧ領域由来）、Ｃ型肝炎ウイルス（例えばＥ２）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ，Ｅｎｖ領域由来）、インフルエンザウイルス（ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、核タンパク質）の表面タンパク質、又はその他のウイルス性病原体が挙げられる。さらに別の適当なヒト病原体としては、Haemophilus influenza、Bordetella pertussis、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria meningitidisなどが挙げられる。最後ながら、例えばプラスモディア（plasmodia、マラリア）などの真核性病原体由来の抗原もｐｐ６５に融合させることが可能である。
【００２６】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、ｐｐ６５及びその他の病原体であって、かかる病原体に自然感染した場合ヒト体内において産生されるＣＴＬが対抗する該病原体のタンパク質の構成成分の一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。かかるＣＴＬ抗原の例としては、ＨＩＶ−１、ＨＢＶ、ＨＣＶ又はインフルエンザウイルスのタンパク質の構成成分が挙げられる。このような手法の意図は、ヒト体内において異種病原体に対抗する保護性ＣＴＬを産生させる、ＤＢの独自の免疫原性特性を利用することである。
【００２７】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、ｐｐ６５、異種病原体の中和抗原の一種以上及び同一病原体のＣＴＬエピトープの一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。かかる融合は、接種した被験者が、かかる病原体に対抗する保護性抗体及びＣＴＬの双方を形成する能力を有することを確保することを意図するものである。
【００２８】
本発明は更には、異なるＨＣＭＶ株に由来する同一グリコプロテインの変異体である、少なくとも二種の異なるグリコプロテインを含有するウイルス粒子に係る。
【００２９】
一つの好ましい実施態様は、正確に二つの変異体、即ち一つはＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株に相当する変異体及び残りはＨＣＭＶ  Ａｄ１６９株に相当する変異体を含有する。この好ましい実施態様は、かかるＴｏｗｎｅ株及びＡｄ１６９株の双方のグリコプロテインｇＢを含有する。
【００３０】
これら二種のタンパク質は、感染細胞中の組換え型デンスボディーの膜内に同じ効率で組み込むことが出来る。かかる組換え型デンスボディーは、二つのプロトタイプＨＣＭＶ株に対する菌株重複型のみならず菌株特異的でもある中和免疫応答を誘導するのに適している。
【００３１】
最後に、本発明はまた、完璧に感染性ウイルス粒子を含まないウイルス粒子を調製する方法にも係る。予めＨＣＭＶで感染させておいたある細胞集団から粒子を調製する場合、感染性ウイルス粒子が、当該粒子の精製過程にまで持ち込まれるというリスクが生じるが、このようなことは、ワクチンにとって欠点の一つである。
【００３２】
本発明の方法はこのようなリスクを最小限にするものである。かかる目的のために、先ず最初に必須遺伝子にある欠失部を有するＨＣＭＶ株を生成させるのであるが、このことは、当該遺伝子の機能の欠失を意味する。大抵の場合においては、このことは、機能性遺伝子産物が存在しないことに依拠するのであるが、ある調節遺伝子配列の機能が、当該ＨＣＭＶが最早や生存しないように変化させることも可能である。このことは、例えば点変異、欠失、挿入又はその他の変異によってＨＣＭＶの核酸配列を変化させることによって生起させることが出来る。かかる欠陥ウイルスは、ＨＣＭＶにおいて予め欠失させておいた遺伝子を発現し且つビリオン組み立てのために使用可能な状態にある細胞においてのみ増殖することができる。初期線維芽細胞が現在のところ、ＨＣＭＶのインビトロ増殖のための唯一の許容可能とされるシステムであって、かかる細胞のトランスフェクションは、これまではレトロウイルスによる転移法を用いた場合にのみ可能であるに過ぎなかった。しかしながら、かかる細胞を用いてワクチンを製造しなければならない場合、このことは重大な欠点である。本発明の方法は、レトロウイルスによる遺伝子転移を行うことなく産生可能であるが、その内部でＨＣＭＶの増殖も可能であるような安定的にトランスフェクションさせた細胞を提供するものである。
【００３３】
一つの好ましい実施態様は、主要カプシドタンパク質遺伝子ＵＬ８６で安定的にトランスフェクションさせたヒト包皮線維芽細胞を含んで成る。かかるトランスフェクションは、好ましくは極めて高いトランスフェクション効率をもたらす脂質含有補助剤を用いて実施する。一つの好ましい実施態様において、ロッシュ  ダイアグノスティックス、マンハイム(Roche Diagnostics, Mannheim)から購入可能である“Ｆｕｇｅｎｅ試薬”をかかるトランスフェクションのために使用する。この実施態様は、実施例７において記載する。
【００３４】
主要カプシドタンパク質遺伝子ＵＬ８６を欠失させておいた欠陥ウイルスは、このような上記細胞中において増殖させることが出来る。“非相補性”の線維芽細胞をこのような欠陥ウイルスで感染させた場合、伝染性ウイルス粒子を一切含まないウイルス性ワクチン粒子をかかる繊維芽細胞から単離することが可能である。
【００３５】
本発明の当該粒子を感染のリスクを伴なうことなく産生させるもう一つの可能性は、ＨＣＭＶで感染させることなく当該粒子を細胞中に復元・再構成させることである。かかる目的のためには、当該粒子の構成成分をコードする遺伝子全てをこれらの細胞中において発現させねばならない。これらの遺伝子は、かかる目的のために当該細胞中に挿入させねばならない。
【００３６】
バクロウイルスで感染させた昆虫細胞がかかる目的のために好ましくは使用される。当該粒子のポリペプチド構成成分をコードする遺伝子をバクロウイルス発現ベクターにクローンする。組換えバクロウイルスの生成させた後、昆虫細胞、好ましくはＳｆ９細胞を種々のウイルスで同時・共感染させる。これらの遺伝子を昆虫細胞中で発現させ、得られたポリペプチドが結合して、所望とする粒子を得るのである。最後に、かかる粒子を当該昆虫細胞から遊離放出させる。このようなことは、ワクチンとして使用することが出来る非感染性粒子の産生させるためのひとつの可能性を表す。
【００３７】
又、別の可能性は、ＤＢを復元・再構成させるための構成成分をＨＣＭＶ主要ＩＥプロモーター／エンハンサー（ＭＩＥＰ）の制御下に組換えバクロウイルスにクローン化することである。組換えバクロウイルスは、例えば哺乳動物細胞などの高等真核細胞に感染する能力を有すること及び外来遺伝子は、例えばＭＩＥＰなどの強力な真核細胞プロモーターの制御下においてかかる細胞内において強力に発現させることとが明らかとなっている。このような手法の利点は、ＤＢの抗原性タンパク質の重度の修飾、例えば糖化などが、昆虫細胞中におけるよりも哺乳動物細胞中において一層自然な態様で生起する可能性があるということである。更には、既にワクチン製造のために承認済である多数の細胞系が存在している。
【００３８】
【実施例】
本発明をさらに下記する実施例において説明する。
【００３９】
実施例１
マウスの足に単回免疫した場合における天然ＤＢと破砕処理ＤＢとによる中和抗体の誘導
2匹のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（メス、９−１０週令）からなる群を２０μｇの精製ＤＢ又は２０μｇの破砕処理ＤＢの何れかをマウスの後足に注射することによって免疫処理した。血液を免疫後55日目に心臓窄刺によるサンプル採取し、細胞分画を凝集させて除去することによって血清を得た。
【００４０】
これらのマウス血清を所謂“中和アッセイ法”によってＨＣＭＶを中和する能力について検討したが、かかる検討は下記するプロトコールに従って行った：
−  これらの血清及び対照抗体１４−４ｂ（中和性）とＢ１Ｂ６（非中和性）を先ず最初は培地で１：３で予備稀釈し、次いで４８−ウエルプレート中で、各回１：２で十倍にまで段階稀釈した。
【００４１】
−  各稀釈液は２５０μｌずつ得られた。
【００４２】
−  各希釈液に２５０μｌ（同一容量）のＨＣＭＶウイルス培養株（１９９７年１２月１６日付けの、ＴＣＩＤ50が１０6.3／ｍｌであるＡｄ６９（１００μｌ＋１９．９ｍｌとして１：２００に予備稀釈したもの））を加えて、慎重に混合した。このウイルスは、解凍してから２０秒間“ボルテックス装置（Ｖｏｒｔｅｘ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）”で予め混合したものであった。
【００４３】
−  得られたウイルス／抗体混合物を３７℃にて4時間培養器中で培養した。
【００４４】
−  ３．５時間後、予めトリプシンで遊離させておいた人包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）を数え、６ｘ１０5細胞／ｍｌ（１．５ｘ１０4細胞／μｌに相当する）に調節した。
【００４５】
−  何れの場合にも９６―ウエルプレートチュでアッセイするべき各抗体毎又は抗血毎に清細胞懸濁液を２５μｌずつ４列に入れた。培養時間として４時間経過後に、適切なウイルス／抗体稀釈液を１００μｌずつ添加した。
【００４６】
−  更に３７℃においてＣＯ2培養器中で一晩培養した。
【００４７】
−  翌日、培養上澄み液を捨ててから、培養物を９６％エタノールで固定化し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、このマウスモノクローナル抗体ｐ６３−２７を第一の抗体として（各ウエルにつき５０μｌずつ）添加し、３７℃にて1時間培養した。
【００４８】
−  再度改めて洗浄した後、第二の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗マウスIｇＧ（Dako, Hamburug、ＰＢＳ中１：５００）を添加し、３７℃にて４５分間培養した。この培養に引き続き、ＰＢＳでもう一度洗浄しＡＥＣ染色を実施して特異的抗体反応を検出した。
【００４９】
−  かかる目的のために、１００μｌのAEC基質溶液を各ウエルに添加し、暗所で３７℃にて１０−２０分間培養した。次にこの反応は、PBSで停止させ、これらのウエルをPBSで数回洗浄した。染色された細胞核を同定し、伝送光線中で数えた。
【００５０】
試薬：
ＡＥＣ培養株溶液：４００ｍｇのＡＥＣ／１００ｍｌのジメチルホルムアミド（Sigma A-5754）
酢酸緩衝液：  ６．８ｇの酢酸ナトリウム／２．８８ｍｌの氷酢酸、１リットルの蒸留水当たり（ｐＨ４．９）
使用可能ＡＥＣ溶液：  酢酸緩衝液中にＡＥＣ培養株溶液を１：２０に稀釈し、次いで二度濾過する。発色反応の暫く前に１／１０００  ３０％強度のＨ2Ｏ2を添加する。
【００５１】
実施例２
マウスを三回腹腔内免疫化した場合における天然ＤＢによる中和抗体の誘導
抗体の誘導を別の免疫化スケジュールを用いることによって検討した。この目的のために、５匹の動物を三回（時間はそれぞれ、０、４週、９週）、何れの場合にも２０μｇの未処理ＤＢを用いて腹腔内免疫化した。これら動物のうち三匹について、採血を１２週において行い、また残りに二匹については３２週において行った。
【００５２】
得られたマウス血清を中和アッセイ法におきてＨＣＭＶを中和する能力について検討した。このために使用した方法は、実施例１に記載した通りであった。得られた結果を以下に示しが、その結果未処理ＤＢの２０μｇを三回投与した場合、足に単回投与した場合と比較して中和抗体の産生が有意に増大することが明らかとなった。中和に要した数値は、血清陽性ドナー由来のヒト血清について通常得られる力価に相当するものである。
【００５３】
実施例３
マウスを三回腹腔内免疫化した場合における天然ＤＢによる継続的中和抗体応答の誘導
Ｂａｌｂ／ｃＪマウスを実施例２に記載したスケジュールに従って天然ＤＢを用いて三回腹腔内免疫化した。第一回免疫化の後３２週に、血清を上記した方法で動物から採り、中和アッセイで検討を行った。その結果、中和抗体は、初回免疫化処理後は比較的長期間経過後でも高濃度で検出可能の状態に留まることが明らかとなった。このことは、ＤＢは、以前使用されていた死菌ＨＣＭＶワクチンとは異なり継続的な中和抗体応答を誘導する能力を有することを示す。
【００５４】
実施例４
天然ＤＢと破砕処理ＤＢとによる細胞障害性細胞の誘導
天然ＤＢと破砕処理ＤＢの投与が、実験動物体内において細胞障害性効果器細胞を活性化するのにどの程度適しているかを、本実験アプローチで試験してみた。抗ＣＤ３−媒介リディレクテッド(redirected)溶解方法をこの目的のために用いた。実験手法は下記する通りである。
【００５５】
予めＨＣＭＶの実験室株Ａｄ１６９で感染させておいたヒト包皮繊維芽の細胞培養上澄み液から、その細胞病原性効果が最大となる時点（感染後６―８日）で精製した。かかる目的のために、培地を採取し、ウイルス粒子をＳＷ２８ローターにおいて２４，０００ｒｐｍ（１０℃）で１時間遠心分離することによって沈降沈殿させた。この沈殿物を再度ＰＢＳ中に懸濁させ、酒石酸グリセリン勾配に層形成させた。超遠心分離を行った後、透過光中で可視となるデンスボディーに帰属せしめられるべきバンドを針と１ｍｌの注射器とを使って除去した。一つのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥでの純度について検討し、且つ当該調製標本中におけるＤＢの量を、Ｒａｙｔｅｓｔ社−ドイツーから販売されているＴｉｎａソフトウエアを使用してＢＳＡ標準と比較することによって色強度に基いて定量した。ＤＢの外膜がその免疫原性にどの程度関与しているかを解析するために、この調製標本の一部を試験するに際して、外膜を外被ーコア構造部から分離したが、粒子の粒状性質は保持するようにした。この目的のためには、ＤＢの当該部分を液体窒素中での冷凍とその後の解凍という繰り返しサイクル１０回に供した。次いで粒子をＢｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０；設定条件：稼働率、１０％、段階  ３―出力制御  ２．５）中で１０分間音波破砕処理し、このように処理した粒子の構造を電子顕微鏡で可視化し、その物理的性質をスクローズ勾配で解析した。
【００５６】
使用した実験動物は、９−１０週例の雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスであった。これらのマウスを何れの場合においても、試料をＰＢＳに溶解したものの５０μｌ容量を右後足に投与することによって免疫化した。各群６匹の動物から成る５群の動物を免疫化した。群１は、ＰＢＳ中の精製ネズミＣＭＶ（ＭＣＭＶ）２ｘ  １０5 ｐｆｕで免疫化し、群２は、それぞれ完全なデンスボディーの５０μｇ（ｐｐ６５の含量に標準化したクマシ―ゲル中の量）で免疫化し、また群３は、完全なデンスボディー２μｇで免疫化し、さらに群４は、機械的に損傷したデンスボディーの２０μｇ（プロトコールを参照のこと）で免疫化しまた群５は、ＰＢＳの５０μｌで免疫化した。８日目に、同側性および対側性膝かリンパ節を切除した。これらのリンパ節を金属篩に摩擦して通過させ次いで数回洗浄することによって、リンパ球を単離したが、リンパ節は群毎にプールした。細胞数を測定した後、コエレアのリンパ球は、ＩＬ−２含有培地で八日間の中間培養を行った（組換え型ＩＬ−２の１００Ｕ／Ｔ細胞培地の１ｍｌ）。ＭＥＭアルファをＴ細胞培地として使用したが、更に１０％のＦＣＳ、４ｍＭのＬ―グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．０００３５％  β―メルカプトエタノールを含有するものであった。１６日目に、リディレクテッド溶解を実施したが、これは、当初ｐ８１５肥満細胞種細胞（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−６４；生物：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｄ）をＣｒ−５１で標識化することによって行ったが、具体的には１ｘ１０6個の細胞を３０μｌのＦＣＳ中に再懸濁させ、次いで１００μＣｉのＣｒ−５０（重クローム酸ナトリウム）を用いて３７℃にて７５分間標識化することによって行った。これらの細胞をＰ８１５培地中で三回洗浄して、過剰のクロームを除去した（Ｐ８１５培地：ＲＰＭＩ，１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０００３５％  β―メルカプトエタノール）。この細胞集団の一部に抗ＣＤ３抗体を負荷した：即ち、このことは、５ｘ１０5個のＰ８１５細胞を５μｌの抗ＣＤ３抗体と共に室温で１５分間培養することによって行った（ハムスター抗マウスＣＤ３ε；Southern Biotechnology Associates Inc. Birmingham、AL；０．５ｍｇ/ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）。これらの細胞は二度洗浄した。
【００５７】
細胞毒性試験を９６ウエルマイクロタイタープレートで実施した。
【００５８】
即ち、種々異なる量のリンパ球を１００μｌ中に播種した。１００μｌ中で１０００個の標的細胞（Ｐ８１５又はＰ８１５／抗ＣＤ３）を各ウエルに添加した。最大限の溶解を決定するために、１００μｌの培地を効果器細胞の代わりに添加した。遠心分離（１００ｇ、４分間）を行った後、３７℃にて４時間培養を行った。遠心分離を繰り返し（４３０ｇ、４分間）１００μｌの上澄みを除去して、そのＣｒ−５１の放射能をガンマカウンターで測定した。それぞれの効果器細胞集団に対する溶解準位は、以下のようにして求める。
【００５９】
（測定したクローム遊離量―自然遊離量）ｘ１００／（最大遊離量―自然遊離量）
特異的再導向溶解は、対側リンパ節細胞に対して求めた溶解準位を減じれば求められる。
【００６０】
プロトコール：デンスボディーの機械的破砕
ＤＢは、液体窒素中での凍結と解凍を十回行い、次いでＢｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ中で１０分間音波破砕（ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０；設定条件：稼働率、１０％、段階  ３―出力制御  ２．５）することによって機械的に損傷させた。
【００６１】
実施例５
ＨＬＡ−Ａ２．ｋbトランスジェニックマウスを免疫した場合のｐｐ６５特異的ＣＴＬの誘導
天然ＤＢと破砕処理ＤＢの投与が、実験動物体内において細胞障害性効果器細胞を活性化するのにどの程度適しているかを、かかる実験で試験してみた。ヒトＨＬＡ−Ａ２分子（Ｃ５７／ＢＬ６−Ａ２．ｋb）に対してトランスジェニックであるＣ５７／ＢＬ６系の８−１０週令マウスからなる群を実施例４において記載したように２０μｇのＤＢ，２０μｇのＤＢ又は２０μｇの破砕処理ＤＢにアジュバントを添加することなくそれぞれＰＢＳに溶解したもので足底内免疫化に供した。膝かリンパ節の細胞を上記したように採取し、数えそして１００μＵ／ｍｌの組替え型ヒトインターロイキン２を添加したＴ細胞培地でインビトロにて８日間培養した。１６日目に、これら細胞集団中におけるＨＣＭＶ特異的細胞障害活性を測定した。クローム遊離試験に用いた標的細胞は、ヒトＴ２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９２）及びＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号  ＴＩＢ−１５２）であり、これらは、キメラＭＨＣ分子Ａ２．ｋb遺伝子を安定的に発現する細胞である。これらの細胞を実施例４において記載したようにＣｒ−５１で標識化し、次いで５ｘ１０5個の細胞からなる部分群に、一部は腫瘍抑制タンパク質ｐ５３由来のＨＬＡ−２が提示する公知のｐｐ６５ペプチド（アミノ酸  ４９５−５０３；Ｊｅｒｉｎｉ、Ｂｅｒｌｉｎにより合成して調製されたペプチド）でまた別には同じＨＬＡ−Ａ２が提示する当該しない対照ペプチド（アミノ酸１４９−１５７）とを負荷した。この目的のために、これらのペプチドは、１０-3の濃度でＰＢＳ中に溶解させ、次いで更に十進法により稀釈した。５ｘ１０5個の標的細胞からなる部分をペプチドと共に５００μｌの容量にて最終濃度として１０-5乃至１０-10Ｍで３７℃にて１時間培養した。未結合ペプチドをＴ細胞培地で洗浄した。これら二種類のＴ細胞系を負荷するための最適ペプチド濃度は、予備試験によってＪｕｒｋａｔ細胞に対しては１０-6ＭまたＴ２細胞に対しては１０-8Ｍと決定された。
【００６２】
クローム遊離試験は、効果器細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を減少させて実施した（図５）。即ち、該当しないペプチド（腫瘍抑制タンパク質ｐ５３由来のＨＬＡ−２が提示するペプチド）を標的細胞に負荷した後での平行実験で得られたクローム遊離値を、ｐｐ６５を負荷した標的細胞の特異的溶解を行った各ケースにおいて得られた数値から減じた。その結果、ＤＢによる免疫化によって、ｐｐ６５特異的（ＨＣＭＶ特異的）ＣＴＬが産生されることが明らかとなった。更に、２μｇのＤＢにより免疫化した動物の細胞は、Ｅ：Ｔ比を予め一定に設定した場合は２０μｇのＤＢで免疫化した動物の細胞よりもクローム遊離数値が若干高くなった。破砕処理した粒子で免疫化した動物の細胞は、矢張りｐｐ６５特異的溶解減少を示したのであるが、その細胞障害性効果器活性の一つの基準・目安であるクローム遊離は、特定のＥ：Ｔ比においては未処理ＤＢを投与した動物から得られた細胞よりも明らかに低くなった。特に、破砕処理した粒子で免疫化した動物から得られた細胞の細胞障害性活性の一つの基準・目安であるクローム遊離値を予め一定に設定した場合、かかるＥ：Ｔ比を実現するために必要な効果器細胞の相対的な数は、明らかに高くなった。これらの結果をまとめると、（Ｉ）“死滅抗原”であるＤＢで実験動物を免疫化することは、ＨＣＭＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞を産生させるために適していること、及び（ＩＩ）細胞性免疫応答の効率は、恐らく完全なエンベロープにより介在されるＤＢの細胞性取り込みに依存して異なること、この二点が明らかとなる。このような結果は、細胞内病原体に対するＣＴＬの効率的な産生が、通常は細胞内での相当する抗原のデノボ合成に依存することからして、例外的に注目するべきことであると言わねばならない。ＭＨＣクラスＩ複合体に対するウイルス特異的ペプチドの“外因性負荷”は、ＤＢによって介在されるのであり、例外的に極めて効率が良いとみなすことが出来、ＨＣＭＶのみならず例えばインフルエンザウイルスなど異種性病原体に対しても作用する保護的細胞障害性効果器の機能を生成させるのに適しているはずである。
【００６３】
実施例６
ＤＢによる免疫化をおこなうことによって、Ｔｈ１典型的Ｔヘルパー細胞応答が誘導されこと
体液性及び細胞性の終生免疫応答を誘導することは、Ｔヘルパーリンパ球を誘導することが可能であるか否か、及び如何なる態様にてこれを誘導することが出来るかに決定的に依存するのである。ウイルス性病原体に対して免疫化が行われると、Ｔｈ１典型的免疫応答を生成させることが特に望ましい。ＤＢによる免疫化がどの程度にまでかかる目的に適しているかを検討するために、二つの実験的アプローチを選択した。
【００６４】
第一の実験的アプローチにおいては、予めＤＢによる足底免疫化を受けた実験動物から得られたリンパ節細胞が、中間培養を行った場合にＴｈ１典型的リンホカイン類（この場合は、ガンマ（γ）―インターフェロン、即ちＩＦＮ―γ）又はＴｈ２典型的（この場合は、インターロイキンー５、即ちＩＬ−５）を合成し且つ遊離するか否かを試験した。それぞれ６匹のＢａｌｂ／ｃＪマウスから成る群を２μｇのＤＢ，２０μｇのＤＢ又は２０μｇの破砕処理ＤＢをそれぞれＰＢＳに溶解したもの又はＰＢＳ単独で足底内免疫化に供した。リンパ節細胞を実施例４において記載したように、免疫化して８日後に採取し、１０6細胞／ｍｌなる密度で、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５％ＦＣＳ、５ｘ１０-5の２―メルカプトエタノール、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを添加したＲＰＭＩ  １６０４０培地内に播種した。これらの細胞は、培養過程で２０μｇのＤＢ又は２０μｇの破砕処理ＤＢ、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ２）で提示されるペプチド（ｐｐ６５、４９５−５０３）又はＰＢＳによってこれらの抗原を培地に添加することによって再刺激した。最刺激の２４時間及び３６時間後に、細胞培養上澄み液を集め、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。培養細胞から得た上澄み液中のＩＦＮ―γ及びＩＬ−５の含有量を市販のＥＬＩＳＡテストキット（Ｅｎｇｏｇｅｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して測定した（図６）。測定値を標準化するために、同一テストキットにあわせて提供されている組換え型ＩＦＮ−γ及びＩＬ−５を細胞培養培地に溶解し、平行して分析した。
【００６５】
２０μｇ又は２μｇのＤＢで免疫化した動物から得られたリンパ球は、大量にＩＦＮ−γを分泌した。破砕処理した粒子で免疫化した動物由来の細胞は、明らかに分泌されるＩＦＮ−γが少なかった。ＩＬ−５は、どの混合物においても有意な量で測定されることはなかった。これらの結果から、デンスボディーによって動物を免疫化することが、Ｔｈ１典型的免疫応答を誘導するのに適していること及び逆にその誘導程度は、ＤＢ膜の完全さに依存して変わることが、明らかとなった。
【００６６】
Ｔｈ１典型的免疫応答又はＴｈ２典型的免疫応答は、特に投与形態に依存していることが判っているので、第二の実験的アプローチにおいては、マウスを２０μｇのＤＢを用いて４週間の間隔をおいて三回免疫化した。第一回目の注射から１２週間及び３２週間後に、これらの動物からエーテル麻酔下心臓穿刺によって全血を採血し、２７℃で２時間培養して凝集させ、４℃にて一晩貯蔵し、翌日１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。透明な血清上澄み液を取り除いて、狩猟のアリコートとしてー２０℃で貯蔵した。血清中におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブクラスのＨＣＭＶ特異的免疫グロブリン含量を測定した。Ｔｈ１典型的免疫応答の過程で、ＩｇＧ２ａクラスの抗体が優先的に生成されるが、これに対してＴｈ２典型的免疫応答では、ＩｇＧ１クラスの抗体が優勢となる。これらの実験動物から得られた血清を５６℃で３０分間不活性化させ、細胞外ＨＣＭＶ粒子の抗原をコートした市販のＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ，  Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）を用いて試験した。個の目的のために、試験血清の段階稀釈シリーズを調製し、ピペットでＥＬＩＳＡプレートのウエルに移し、３７℃にて２時間培養した。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２ｏで三回の洗浄工程を経た後、サブクラス特異的ＨＲＰ結合二次抗体をＰＢＳ／２％  Ｔｗｅｅｎ２０／３％ＦＣＳによる１：２０００なる稀釈率で添加し、湿潤雰囲気中３７℃にて１時間培養した。更に４つの洗浄工程を経た後、ＯＰＤ発色反応を行ったが、この反応は、１００μｌの０．５ＭＨ2ＳＯ4を添加することによって停止させた。４９２ｎｍの波長における吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【００６７】
種々の血清希釈液について得られた吸光度値を通過する回帰線を引き、ゼロ血清の吸光度の２．５倍に相当する数値を所謂“終点希釈率”として得た。ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａに対する終点希釈率の比から、一つのアリコートが得られるが、これは、免疫化プロトコールの如何に拘わらず常に０．３以下であった（図８）。ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比率が１以下であることは、Ｔｈ１典型的免疫応答を示すが、これに対してこの比率が１以上であることは、Ｔｈ２応答を示すので、個の実験から、ＤＢによる免疫化は、Ｔｈ１様のＴヘルパー細胞応答を誘導することが証明された。同様の結果が、ＤＢの足底投与による平行実験で得られた。このことから、投与の形態の如何に拘わらず、ＤＢによる免疫化によって、実験動物においてはＴｈ１典型的免疫応答が得られることが明らかとなった。
【００６８】
実施例７
一次ヒト線維芽細胞において異種遺伝子を発現させる方法及びかかる細胞においてＨＣＭＶの欠損突然変異株を補完すること
最少数のＰａｓｓａｇｅを有するヒト線維芽細胞を６ウエルプレートに播種したが、何れの場合にも１０5個の細胞を用いる。カバーガラスを対照目的のためにこれらのウエルのいくつかに用いる。
【００６９】
これらの細胞を３７℃のＣＯ2培養器中で一晩培養し、翌日トランスフェクションする。所望のトランスジーン(transgene)を例えば、ブラスチシジン（blasticidin）デアミナーゼ遺伝子を有するプラスミドｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitorogen）で発現させる。この遺伝子の発現によって、ブラスチジンＳなる物質に対する抵抗性が付与される。
【００７０】
又これに代わる別の可能性は、抗生物質ピューロマイシンに対する抵抗性を付与するベクターｐＲＧ２７３と共に別の発現プラスミドに所望のトランスジーンをトランスフェクションさせることである。このベクターは、ベクターｐＬＸＳＮ１６Ｅ６Ｅ７の誘導体であり、この抵抗性遺伝子以外にヒトパピローマウイルス１６の形質転換タンパク質Ｅ６及びＥ７を発現する。このことによって、関連細胞の増殖ポテンシャルをその形質転換によって増大させることが出来る。
【００７１】
このようなトランスフェクションは、ロッシュ  デイアグノステクス社（Rche Diagnostics）の“Fugene法”によって実施される。かかる目的のために、３μｌのＦｕｇｅｎｅ試薬を９７μｌのＦＣＳを含まない培地と混合し、室温で５分間培養する。ほぼ２μｇのトランスジーンプラスミドのＤＮＡ（ダブルトランスフェクションの場合は、５０ｎｇのｐＲＧ２７３をプラス）を加え、また室温で１５分間経過後に、９００μｌの血清含有培地を添加する。古い培地を取り除いた後で、この混合物を細胞に加える。トランスフェクションは、３乃至８時間の間行われる。この後、トランスフェクション混合物を除去し、培養用培地を加える。２日間培養した後、カバーガラスを２４ウエルプレートに移し、洗浄し、次いで９０％アセトンで固定化する。このトランスジーンの発現は、抗体を用いて間接的免疫蛍光顕微鏡でチェックする。
【００７２】
トランスフェクションさせる効率が充分である場合は、残存細胞をトリプシンで遊離させ、選択培地（例えば、３μｇ／ｍｌのブラスチシジン、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８など）に播種する。細胞コロニーがこの選択培地で形成された場合は、これらコロニーを単離し、更に選別条件下で更に培養する。細胞を次に選別条件下で膨張させ、当該トランスジーンの発現強度を例えばイミュノブロットでチェックする。当該発現が充分であれば、細胞をいくつかのアリコートに分別し、次に使用するまで液体窒素中で保存する。
【００７３】
実施例８
ｐｐ６５及び同種又は異種抗体との融合タンパク質を含有する組換え型ＤＢを産生させるための策定方針
組換え型ＤＢを産生させるための採用可能な一つの策定方針は、以下の通りである。
【００７４】
Ａｄ１６９菌株のゲノムＤＮＡ断片ＢａｍＨＩ−Ｒ（ｐＢａｍＨＩＲとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅにクローニングしたもの）からスタートして、先ずｐｐ６５遺伝子の３'部分の特異的ＳｒｆＩ切断部位にクローニングした異種核酸区分を含有するプラスミドクローンを幾つか産生させる。ｐｐ６５以外のＨＣＭＶタンパク質又は他の病原体のタンパク質の種々の抗原性部位をコードするＤＮＡ領域を、ＵＬ８３（ｐｐ６５）を有する連続オープンリーディングフレームが生じるようにクローニングする。これらの異種ＤＮＡ区分を基準として３'方向において、連続オープンリーディングフレームにおけると同様に、所謂グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子とネオマイシントランスフェラーゼとから成る融合遺伝子をクローニングすることも可能である。この遺伝子は、何れの場合にもファージＰ１のＣｒｅリコンビナ―ゼ認識部位（ＬｏｘＰ部位）によって選択されるべきである。これから得られるプラスミド構築物を図７に示す。
【００７５】
この組換え型プラスミドをヒト包皮線維芽細胞にトランスフェクションさせて、得られた細胞をＨＣＭＶＡｄ１６９株に重複感染させる。同種の組換えの結果、ｐｐ６５の代わりにそれぞれの融合遺伝子を含む組換え型ＨＣＭＶゲノム分子が得られる。Ｇ４１８を培養用培地に添加することによって、これら組換え型ＤＮＡ分子の複製と組換え型ウイルスの濃縮とを行うための選択がなされる。ＧＦＰの発現によって更には、サイトフルオロメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、組換え型ウイルスゲノムを含む細胞の正の選別を行うことが可能となるのである。組換え型ウイルスの効率的な濃縮とその後の単離とが、かくして確保されることになる。
【００７６】
かくして精製されたウイルスは、次に一時的に又は安定的にＣＲＥリコンビナ―ゼを発現する細胞系をパッセージさせる。このリコンビナーゼは、ＤＮＡ分子中の塩基対の短い配列（ｌｏｘＰ部位）を認識し、かかるｌｏｘＰ部位の間に位置するＤＮＡ区分を正確に切り取りする。この結果、選抜を行うために以前に使用し且つＧＦＰ−ＮｅｏをコードするＤＮＡ区分が欠失されることになる。ＧＦＰ陰性細胞をＦＡＣＳで選別した後、選別のためのｐｐ６５融合タンパク質を発現する純粋ウイルスを単離し且つ精製する。
【００７７】
その後は純粋ウイルス集団を使用してヒト線維芽細胞に感染させることが出来る。かかるウイルス感染過程においては、組換え型ＤＢが感染細胞において産生されるので、その後は勾配遠心分離によって細胞培養上澄み液から精製することが出来る。
【００７８】
例えば、下記するウイルスを産生させることが可能である（図７を参照）：
Ａ）ｐｐ６５及びＨＣＭＶのｇＢに由来する公知の中和領域とから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。この種の領域は、文献においてはＡＤ１及びＡＤ２と記述されてきた領域である。Towne laboratory株のｇＢに由来するＡＤ２に相同である領域は、ＴＷ２と記述されてきた領域である。
【００７９】
Ｂ）ｐｐ６５及びＨＣＭＶのＩＥ１タンパク質（ＩＥ１）のうちの公知ＣＴＬエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【００８０】
Ｃ）ｐｐ６５、ＨＣＭＶグリコプロテイン（ＮＡ）の公知の中和領域及び及びＨＣＭＶのＩＥ１タンパク質（ＩＥ１）のうちの公知ＣＴＬエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【００８１】
Ｄ）ｐｐ６５及び例えばインフルエンザＡウイルス（例えばＡＡ  １４７−１５５）の核タンパク質など、他の病原体の公知ＣＴＬエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【００８２】
Ｅ）ｐｐ６５、別の病原体の中和エピトープ（ＮＡ）及び他の病原体の公知ＣＴＬエピトープ（ＣＴＬ）とから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１で得られたデンスボディーで単回免疫化したマウスの血清中におけるＨＣＭＶ中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。実施例１において記載された染色方法によって４倍混合物中において陽性細胞核が最早や一切検出可能でない場合（破線）、中和を１００％と評価する。特定の血清稀釈倍率での中和度は、４倍混合物中での陽性細胞の数を抗体を含まない同一混合物中の陽性細胞の数を基準として比較することから得られる。
【図２】  実施例２で記載した天然デンスボディーをその都度Ｐ２０μｇ用いそれぞれ４週間隔てて三回腹腔内免疫化した場合のマウスの血清中におけるＨＣＭＶ中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。このアッセイは、図１において示すように評価した。点線は、１００％中和が生起した場合の血清力価を示す。“ゼロ血清”として用いたものは、ＨＣＭＶ粒子で免疫化しなかったマウスから得られた血清であった。
【図３】  実施例３で記載した天然デンスボディーをその都度Ｐ２０μｇを用いて三回腹腔内免疫化した場合（それぞれ４週間隔てて）中和抗体の持続を検出するための中和アッセイの結果を示す。評価は、図１に示すように行った。
【図４】  実施例４において記載したように、抗ＣＤ３εー媒介によりリディレクトした溶解によって破砕処理した天然デンスボディーでマウスを免疫化した場合の全細胞障害活性を解析した結果を示す。それぞれの場合において観察された溶解活性を標的細胞に対する作動細胞の比についてプロットしてある。
【図５】  実施例５において記載したように、破砕処理した天然デンスボディーで免疫化した場合のリンパ節細胞が示すＨＣＭＶ特異的細胞障害活性を解析した結果を示す。それぞれの場合において観察された溶解活性を放射性クロームの遊離放出度により測定し、標的細胞に対する効果器細胞の比（Ｅ：Ｚ比）についてプロットしてある。破線は参考として、現行レベルの溶解を達成するために必要な作動細胞の相対的数を示す。明らかなように、同一レベルの溶解を達成するためには、未処理ＤＢによって免疫化した動物由来の細胞の使用数は明らかに低くする必要があった。
【図６】  実施例６において記載したように、破砕処理した天然デンスボディーで免疫化した場合のリンパ節細胞によるリンホカイン放出・遊離に基いた、Ｔｈ免疫応答の本質を解析した結果を示す。遊離されたＩＦＮ−γの量を再刺激後の経過時間に対してプロットしてある。図Ａ）２０μｇのＤＢで免疫化、図Ｂ）２０μｇの破砕処理ＤＢ（ｄｒＤＢ）で免疫化、図Ｃ）２０μｇのＤＢで免疫化及び図Ｄ）ＰＢＳで免疫化（負の対照―ネガティブ  コントロール）。再刺激に用いた抗原は、図Ｄ）内のはめ込み部において示してある。ＩＬ−５分泌は、平行して測定した。ＩＬ−５の有意の分泌は、何れの場合においても検出不可能であった。
【図７】  同種及び異種抗原との融合タンパク質を含有する組換え型ＤＢを産生させるための手法を示すが、これは実施例８において記載する。
【図８】その都度２０μｇのＤＢを用いて４週間の間隔で腹腔内免疫化したｂａｌｂ／ｃＪマウスの血清中におけるＨＣＭＶ特異的抗体のＩｇＧサブクラスのプロフィールを示す。血清は、第一回目の注入後１２週間及び３２週間において採取し、実施例６において記載したように分析した。ＥＬＩＳＡでの吸収が、ゼロ血清の吸収の２．５倍に相当するアッセイ血清の終点稀釈率を示す。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２比をそれぞれの場合においてこれらの数値から算定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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