(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック綿植物体を生産する方法であって、下記の工程：
（ａ）綿葉柄移植片を取得する工程、
（ｂ）葉柄移植片を、外因性遺伝子および選択可能マーカー遺伝子を含むベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの培養液に接触させる工程、ここで、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは外因性遺伝子および選択可能マーカー遺伝子の綿葉柄移植片細胞ゲノムへの安定的輸送を行い得るものであり、
（ｃ）接触させた綿葉柄移植片を、カルス形成を誘導するための植物ホルモンを含有する培地上で培養する工程、ここで、植物ホルモンは、０．０５ｍｇ／ｌの濃度の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸および０．１ｍｇ／ｌの濃度のカイネチンの組合せであり、
（ｄ）外因性遺伝子を発現する形質転換カルスを選択する工程、
（ｅ）選択したカルスを、１０日以上２０日未満液体分化培地中で懸濁培養にて培養して、胚形成カルスの形成を誘導する工程、
（ｆ）胚形成カルスを半固体分化培地上で培養して胚様体の形成を誘導する工程、および、
（ｇ）胚様体を、窒素源として２００ｍｇ／ｌから１ｇ／ｌの濃度のアスパラギンおよび/または５００ｍｇ／ｌから２ｇ／ｌの濃度のグルタミンを含む培地上で発芽させて、若い形質転換綿植物体を得る工程、
を含む方法であって、
工程（ｂ）〜（ｇ）に用いられる培地は唯一の炭素源として１０ｇ／ｌから５０ｇ／ｌの濃度のグルコースを含み、
工程（ｂ）および（ｄ）〜（ｇ）に用いられる培地は植物ホルモンを含有せず、
工程（ｅ）および（ｆ）は、５．８から７．５のｐＨで行われる、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
綿葉柄移植片を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの培養液との接触前の期間に前培養する、請求項１の方法。
【請求項３】
グルコース濃度が３０ｇ／ｌである、請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ｇ）の培地中の窒素源が、３．８ｇ／ｌの濃度のＫＮＯ３をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
工程（ｇ）の培地中の窒素源が、５００ｍｇ／ｌの濃度のアスパラギンと１ｇ／ｌの濃度のグルタミンを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
工程（ｇ）の培地中の窒素源が、３．８ｇ／ｌの濃度のＫＮＯ３をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）の懸濁培養が１０日から１４日の期間を有する、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）の懸濁培養が１４日の期間を有する、請求項７の方法。
【請求項９】
工程（ｅ）および（ｆ）をｐＨ６．２〜７．０で行う、請求項１の方法。
【請求項１０】
工程（ｅ）および（ｆ）をｐＨ６．５で行う、請求項９の方法。
【請求項１１】
さらに以下の工程：
（ｈ）若い形質転換綿植物体を、炭素源として１０ｇ／ｌの濃度のグルコースおよび１０ｇ／ｌの濃度のスクロースを含む培地上で生育させ、土壌で生育可能な形質転換綿植物体を生産する工程、
を含み、工程（ｈ）で用いられる培地が植物ホルモンを含まないことを特徴とする、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、植物遺伝子工学の一般的分野に関する。特に、外因性遺伝的物質の綿への導入を綿葉柄の移植片のアグロバクテリア菌形質転換により行い、次いで体細胞胚の再生を行うことに関する。
【０００２】
（発明の背景）
綿は、最も利用価値が高く、かつ広域に育つ国際的換金性作物の１つである。その世界年間生産高は、アメリカドルの４５０億ドルに値する１億梱を超える。アジアは最大の綿生産地域であり、世界の綿生産地の上位５つの内４つの生産地がこの地域に位置する。綿は、主として織物産業を支えるだけでなく、雑草、病害、害虫の制御に関する化学製造工業にとっても、巨大かつ有利な市場を提供する。綿の分子的改良について多様な機会が存在し、この改良とは、収率と繊維品質の改良、および除草薬、昆虫、線虫および病害に耐性のある新規変種の創造を含む(Steward, 1991)。
【０００３】
綿の組織培養: １９３５年に、Ｓkovstedが、綿の最初の胚培養を報告した。Beasley (1971)が、受精した胚珠の珠孔末端からの派生物として、Murashige & Skoog (MS) 培地上で綿におけるカルス形成を報告した。体の胚発生は、G. klotzschianumの懸濁培養(Price & Smith, 1979)から達成された。１９８３年に、Davidonis & Hamiltonが、２年間の培養後、カルスから綿植物の効率的かつ反復可能な再生に初めて成功した(G. hirstutum L.)。それ以来、綿植物は、種々の移植片からの体細胞の胚発生により再生され(Zhang & Feng, 1992; Zhang, 1994)、例えば、次のものがある。子葉(Davidonis et al., 1987; Davidonis & Hamilton, 1983 ; Finer, 1988 ; Firoozabady et al., 1987)、胚軸(Cousins et al., 1991; Rangan & Zavala, 1984; Rangan & Rajasekaran, 1996; Trolinder & Goodin, 1988 ; Umbeck et al., 1987, 1989)、軸(Altman et al., 1990; Bajaj et al., 1989; Chen, et al. 1987; Finer & Smith, 1984)、短頂部(Bajaj et al., 1985; Gould et al., 1991; Turaev & Shamina, 1986)、未成熟胚 (Beasley, 1971; Stewart & Hsu, 1977,1978)、葉柄(Finer & Smith, 1984; Gawel et al., 1986; Gawel & Robacker, 1990)、葉 (Finer & Smith, 1984; Gawel & Robacker, 1986)、地下茎(Chen & Xia, 1991; Kuo et al., 1989)、カルス (E'iner & McMullen, 1990; Trolinder et al., 1991)およびプロトプラスト(Chen et al., 1989)。
【０００４】
綿の形質転換: アグロバクテリウムを介した綿の形質転換は、移植片として胚軸および子葉を用いて１０年前に初めて報告された(Firoozababy et al., 1987;Umbeck et al., 1987)。昆虫および除草剤に対する耐性遺伝子を含む幾つかの有用な遺伝子は、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、綿に導入された(Perlak et al., 1990 ; Trolinder et al., 1991; Chen et al., 1994)。移植片（例えば、胚軸、子葉、胚軸および子葉から生じたカルスおよび未成熟胚）は、アグロバクテリウムを介した形質転換および粒子衝突に用いられた(de Framond et al., 1983: Finer & McMullen, 1990; Firoozabady et al., 1987; Perlak et al., 1990; Rangan & Rajasekaran, 1996;Rajasekaran et al., 1996; Trolinder et al., 1991;Umbeck et al., 1987,1989,1992)。さらに、摘出した胚軸の分裂組織が、粒子衝突法による綿の形質転換にも使用された(Chlan et al., 1995; John, 1996; John & Keller, 1996; McCabe & Martinell, 1993)。Zhouら(1983)は、自家受粉の１日後、軸にある胎座中にＤＮＡを注入して綿を形質転換した。
【０００５】
しかし、形質転換比率は総じて低く、胚軸を移植片として使用した場合に、２０〜３０％の範囲であった(Firoozababy et al., 1987 ; Cousins et al., 1991; Rajasekaran et al., 1996)。８０％までの非常に高い形質転換効率が報告されているのは、子葉を移植片として使用し、オクトパイン合成酵素をコードするｏｃｔ遺伝子をレポーター遺伝子として使用した場合である(Firoozababy et al., 1987)。しかし、オクトパインは、A. tumefaciensによる感染によって確実には形質転換しない幾つかの植物種に見出されているので、形質転換用のマーカーとしてのオクトパインの確実性は疑問である (Wendt-Gailitelli and Dobrigkeit, 1973)。さらに、近年の報告で、子葉の形質転換効率は約２０〜３０％であることが示唆された(Cousins et al., 1991)。形質転換効率は粒子衝突法を使用した場合であっても低い(Keller et al., 1997)。形質転換に使用した移植片のタイプによる差異は、形質転換および再生効率に対して顕著な影響を与えるかもしれない。例えば、今までの報告では、疑陽性の形質転換体を減らすためには、子葉が胚軸よりも良好な移植片であった(Firoozabady et al., 1987)。
【０００６】
また、綿の形質転換は遺伝子型に非常に依存する(Trolinder, 1985a, 1986; Trolinder & Goodin, 1987, 1988a, 1988b ; Trolinder & Chen, 1989)。再生し得るかつ形質転換し得るいくつかの栽培変種、例えばGossypium hirsutum cv. Coker 312 and G. hirsutum Jin 7は別として、殆ど他の重要で鮮鋭な市販栽培変種、例えばG. hirsutum cv. D & P 5415 および G. hirsutum cv. Zhongmian 12は、上記方法では再生および形質転換ができない。高い効率の植物再生方法がないことは、綿へのアグロバクテリウムを介する形質転換の適用上最大の障害であると考えられている(Gawel et al., 1986; Firoozabady et al., 1987)。
【０００７】
（発明の要旨）
以前に公表されている方法に関連する課題を解決するために、移植片として葉柄を使用する効率的な形質転換法を、対応する改善培地とともに開発した。この方法は、胚軸および子葉を用いる方法に比していくつかの利点を提供する。すなわち、（１）移植片が得やすい、（２）形質転換効率が高い、（３）アグロバクテリア菌の汚染が非常に稀である、（４）再生の効率が高い、（５）形質転換から小植物体の再生までの時間が減少する。２つの植物変種、すなわち、Ｃｏｋｅｒ３１２およびＳｉ−Ｍｉａｎ３のこの方法による形質転換に成功し、マーカー形質転換遺伝子の強力な活性を示すＣｏｋｅｒ３１２からの３０以上の独立的形質転換遺伝子系を得た。この方法は他の綿変種に適用し得る。例えば、中国産のＪｉｎ７やＪｉ７１３、オーストラリア産のＳｉｏｋｒａ１−３、米国産のＴ２５やＣｏｋｅｒ２０１、Ｃｏｋｅｒ３１０に適用し得る。
【０００８】
（図面の簡単な説明）
図１は、レポーター遺伝子としてＧＦＰ、選択可能マーカーとしてＮＰＴ  II（ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ）遺伝子を含有するプラスミドｐＢＩ１２１ＧＦＰを示す。これを本発明方法により綿葉柄のアグロバクテリア菌仲介形質転換に使用する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
綿植物体の遺伝子形質転換についての効率的な方法を開示する。これは、エリート系を含み、移植片として綿の葉柄を用いる。葉柄移植片および一連の改善培地を使用することにより、以前に公表されている方法に比して、形質転換効率が顕著に高まり、形質転換から再生までの時間が短くなる。
【００１０】
本発明方法の使用においては、アグロバクテリア菌形質転換から形質転換小植物体の再生までの全過程は約６−７か月である。同じ過程を完了するのに、公表の胚軸および子葉法では通常７−９か月以上を要する（Cousins et al., 1991; Chen et al., 未報告）。さらに２か月を、小植物体が土に植えるのに適した大きさに成長するのに要する。
【００１１】
外因性遺伝子をアグロバクテリア菌に導入する技術によって、アグロバクテリア菌に曝された植物またはその組織に遺伝子が容易に移行される。このことは当技術分野で既知であり、本発明の部分を形成するものではない。アグロバクテリア菌のいわゆる「武装解除」株またはＴｉプラスミドを用いると好都合である。すなわち、この株またはプラスミドにおいては、野生型アグロバクテリア菌による根頭癌腫病を特徴とする腫瘍の形成を担う遺伝子が除去または不活性化されている。武装解除アグロバクテリア菌株の多くの例が文献に報告にされている（例えば、ｐＡＬ４４０４、ｐＥＨＡ１０１、ｐＥＨ１０５（Walkerpeach & Veltern, 1994)）。また、いわゆるバイナリー・ベクター系を用いると好都合である。この系は、Schilperoort et al., 1990, 1995 に記載されている。バイナリー・ベクター系は、植物体に導入されるべき外因性遺伝子を保有するプラスミドの大腸菌内操作を可能にし、ベクター構築過程の実行を容易にする。
【００１２】
同様に、ベクター構築は、植物体に導入しようとする外因性遺伝子を含有するキメラ遺伝子の構築を含み、当分野で既知の技術を用いて実施できるものであり、本発明の部分を形成しない。キメラ遺伝子は、発現を望む宿主中で活性を有するプロモーターを含有すべきである。例えば、形質転換過程の種々の段階で形質転換細胞の選択のための一連の選択可能マーカーをもつことが好都合である。細菌中で活性のプロモーターに連結した選択可能マーカー（例えば、カナマイシン、セフォタミン、ストレプトマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）が、マーカー（例えば、形質転換体）を含有する細菌の選択を可能とする。植物活性プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＮＰＴIIＮＯＳプロモーターなどのＴ−ＤＮＡプロモーターに連結した他の選択可能なマーカーが、形質転換植物細胞の選択を可能にする。植物細胞に導入しようとする外因性遺伝子は、コード配列に機能的に関連する植物活性プロモーターを含むべきであり、このプロモーターが形質転換植物における遺伝子の発現を駆動する。さらに、ＣａＭＶ３５Ｓなどの植物活性プロモーター、ＮＰIIＮＯＳプロモーターまたは多数の組織特異的プロモーターが当技術分野で既知であり、適当なプロモーターの選択は当技術分野の通常の範囲内にある。
【００１３】
本発明は、いかなる数の外因性遺伝子をも発現する形質転換植物をつくるのに使用でき、かかる遺伝子の選択により制限されない。所望の外因性遺伝子の選択は、研究者の目的に依存するものであり、本発明で使用できる多くの遺伝子が知られている（例えば、Bacillus thuringiensisトキシン遺伝子のファミリー、グリホサート耐性を付与するシキミ酸シンターゼ遺伝子などの殺草性耐性遺伝子：米国特許5,188,642、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸（２,４-Ｄ）に対する耐性を付与する２,４-Ｄモノオキシゲナーゼ遺伝子：Barley et al., Theoretical and Applied Genetics, vol. 82, pp. 645-49、米国特許5,741,684（Fabijanski et al.)
のアンチセンス遺伝子などの雄性不棯遺伝子、米国特許5,723,765 (Oliver et al.) に記載の精緻農作物保護系）。
【００１４】
綿の再生は、非常に変種依存性であると当分野で考えられている。綿変種のＣｏｋｅｒ系が比較的容易に形質転換するとされている。しかし、ＤＰ５４１２、Zhongmain１２などの変種は再生に関連する困難性がなお存する。この状況は G. barbadense などの２倍性種についても同じである。全植物の体性胚形成および再生は綿において高度に遺伝子型に依存性の過程であり、２つの別個の綿変種、すなわち米国産のＣｏｋｅｒ３１２ および中国産のＳｉ−Ｍｉａｎ３の形質転換および再生に本発明方法を用いて成功した。従って、本発明方法は種々の綿系の形質転換に広く適用できると考えられる。
【００１５】
本発明方法によりつくられる綿のゲノムにおける転換遺伝子の組込みを標準的サザンハイブリダイゼーション法で確認した。これは各形質転換系中の組込み転換遺伝子の複写数についての同定により行うことができる（参照、下記実施例６）。形質転換綿のＦ１生成を形質転換遺伝子の存在について試験でき、Ｆ１生成の転換遺伝子の遺伝型を解析して安定性と遺伝性を確認できる。
【００１６】
他の発表されているプロトコールに比べると、本発明の綿形質転換系は形質転換効率および生存率が高い。このことはいくつかの要因による。本発明において、葉柄を形質転換のための移植片として使用した。異なる型の綿移植片が植物体の形質転換および再生(Firoozabady et al., 1987)に対する顕著な作用を持ち得る 。葉柄からの体性胚形成の誘発はすでに発表されている。しかし、再生が成功していないか非常に低い（Finer and Smith, 1984; Gawel et al., 1986)。本発明では、下記に説明する改善培地を使用して再生効率を顕著に改善した。好ましい実施態様において、主要な脈管束組織の実質細胞中に富む柔らかい葉柄を、低濃度の２,４-Ｄおよびカイネチンを有するＭＭＳＩ培地（下記）で培養したときに、高品質のカルスを得た。
【００１７】
本発明では、懸濁培地における胚誘発の時間を以前の報告の３週間(Cousins et al., 1991)から１０−１４時間に短縮できる。懸濁培地処理時間の短縮が胚生成の高頻度誘発について重要であることがわかった。異常胚の生成を下げることも重要である。綿カルスを懸濁培地に長く保持しすぎるときに、再生に乏しい硝子体胚が高率でつくられるからである（Chen et al.、未公表）。
【００１８】
若い植物生育段階を除き種々の段階での最大細胞生育のために、グルコースを唯一の炭素源として使用した。培地中のグルコースの量は、約１０から葯５０ｇ／ｌ、好ましくは約３０ｇ／ｌであり得る。若い植物の生育段階では、グルコースおよびスクロースの各１０ｇ／ｌが炭素源として健全な小植物体の生育促進のために好ましい。
【００１９】
カルスの成長、胚形成、カルスの増殖について、ｐＨ領域は５.８−７.５、好ましくは６.２−７.０、最も好ましくは６.５である。ｐＨ７.０の培地が小植物体の健全な根成長に好ましい。
【００２０】
胚形成の効力の効果的なカルス開始・誘発にとって、カルス誘発選択培地での低濃度の２,４-Ｄおよびカイネチンが重要である。２,４-Ｄの量は０から約０.５ｍｇ／ｌ、好ましくは約０.０５ｍｇ／ｌであり得る。カイネチンの量は０.０から約１.０ｍｇ／ｌ、好ましくは約０.１ｍｇ／ｌであり得る。カルスの分化段階および胚様体の発芽段階において、植物ホルモンを培地に加えないときに最上の結果を得た。
【００２１】
胚様体の発芽および根の発育に特に役立つ窒素源として、アミノ酸のアスパラギンおよびクルタミンが無機アンモニア窒素よりも優れている。胚様体の発芽培地において、アスパラギンの量は約２００から約１０００ｍｇ／ｌ、好ましくは約５００ｍｇ／ｌであり得る。グルタミンの量は約５００から約２０００ｍｇ／ｌ、好ましくは約１０００ｍｇ／ｌであり得る。これらの最適化された窒素源で、非胚成長性カルスの成長が阻害され、一方、胚様体の発芽、成長、根発育が優先的に促進される。
【００２２】
綿形質転換の種々の段階において、アグロバクテリア菌との共培養を除き、植物組織およびカルスを、２５−３５℃、好ましくは２８℃に保持する。効果的な形質転換のために、共培養段階の温度は２８℃を越えるべきでない。光照射条件は、１日につき１６時間照射および８時間暗所が綿の形質転換および再生のすべての段階にとって好ましい。
【００２３】
以前に報告された形質転換および再生のプロトコール（Umbeck et al., 1987; Firoozabady et al., 1987, Cousins et al.) と異なり、本発明で使用する培地はいくつかの点で最適である。すなわち、（ａ）温室に植え替える前の若い植物の培養に使用する培地を除き、グルコースを唯一の炭素源として使用する；（ｂ）培地を高いｐＨ（６.５−７.０）に調整する；（ｃ）低濃度の２,４-Ｄ（０.０５ｍｇ／ｌ）およびカイネチン（０.１ｍｇ／ｌ）をカルス誘発段階でのみ使用し、他の段階ではホルモンを使用しない；（ｄ）胚様体の発芽用の培地においてアスパラギンおよびグルタミンを無機アンモニア窒素の代わりに使用する。これらの改変は、綿の胚様体成長および小植物発育の生理的必要事項に適合している。健全な胚様体発育、小植物体成長、特に根系発育がこれらの最適化培地に広く適合することがわかった。例えば、胚様体の発芽および根の発育に役立つ窒素源として、アスパラギンおよびグルタミンが無機アンモニア窒素よりも優れていることがわかった。窒素源としてアスパラギンおよびグルタミンを含有する好ましいＭＭＳ３培地において、非胚成長性カルスの成長が阻害され、一方、胚様体の発芽、成長、根発育が優先的に促進される。健全な根発育からして、本発明で得られた鉢植え形質転換綿植物の生存率は１００％である。報告されている胚軸および子葉法（Umbeck et al., 1987; Firoozabady et al., 1987)は、貧弱な根の発育が主な原因となって、鉢植え形質転換綿植物体の生存率が低い。
【００２４】
下記は実施例に使用される好ましい植物組織の培養基である。
(1) 若木生育培地 (リットル当り):
1/2 MS 塩基性塩混合物 (Sigma M5524)
0.9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム (Phytagel(商標)、Sigma)
pH 7.0
【００２５】
(2) 葉柄前培養基 (リットル当り):
MS 塩基性塩混合物
0.9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム (Phytagel(商標)、Sigma)
pH 7.0
【００２６】
(3) 共培養基 (リットル当り):
MS 塩基性塩混合物
10 mg チアミン-HCl
1 mg ピリドキシン-HC1
1 mg ニコチン酸
100 mg ミオイノシトール
0.05 mg 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸 (2,4-D)
0.1 mg カイネチン
30 g グルコース
0.9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム (Phytagel(商標)、Sigma)
pH 6.5
【００２７】
(4) MMS1-カルス誘発・選択培地 (リットル当り）:
共培養基
50 mg カナマイシン
500 mg セフォタキシム
【００２８】
(5) MMS2-分化培地 (リットル当り):
MS 塩基性塩混合物
10 mg チアミン-HCl
1 mg ピリドキシン-HCl
1 mg ニコチン酸
100 mg ミオイノシトール
1.9 g KN03
30 g グルコース
0.9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム (Phytagel(商標)、Sigma)
pH 6.5
【００２９】
(5) MMS3-胚様体発芽培地 (リットル当り):
3.8 g KNO3
440 mg CaCl2 H20
375 mg MgSO4・7H2O
170 mg KH2PO4
1 g グルタミン
500 mg アスパラギン
43 mg EDTA 第二鉄ナトリウム塩
MS ミクロ栄養素 (Murashige and Skoog, 1962)
10 mg チアミン-HCl
1 mg ピリドキシン-HCl
1 mg ニコチン酸
100 mg ミオイノシトール
30 g グルコース
0.9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム (Phytagel(商標)、Sigma)
pH 6.5
【００３０】
(7) 若い植物生育培地
S & H 培地ミクロおよびマクロ・エレメント(Strewart and Hsu, 1977)
10 mg チアミン-HC1
1 mg ピリドキシン-HCl
1 mg ニコチン酸
100 mg ミオイノシトール
10 g グルコース
10 g スクロース
0. 9 g MgCl2・6H20
2.0 g ゲランガム(Phytagel(商標)、Sigma)
pH 7.0
【００３１】
下記の実施例は、本発明を説明するためのもので、いかなる場合も発明の範囲を限定しない。この範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００３２】
実施例１．アグロバクテリア菌株およびプラスミド
A. tumefaciens 株ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１ＧＦＰ）を綿葉柄および若い茎の形質転換に使用した。ｐＢＩ１２１ＧＦＰの物理的マップを図１に示す。これは、ＧＦＰをレポーター遺伝子として、ＮＰＴII遺伝子（ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする）を選択可能なマーカーとして含有する。ＧＦＰおよびＮＰＴIIはそれぞれＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓプロモーターの制御下にある。ｐＢＩ１２１ＧＦＰの構築のために、ｐＧＦＰ２プラスミド（Dr. N. H. Chua, Rockefeller University, New York から）由来のＧＥＰ遺伝子の７２０ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｔＩ断片をプラスミドベクターｐＢＩ１２１（Clontech)の同じ部位中にクローン化して、ＧＵＳ遺伝子を置き換えた。ｐＢＩ１２１ＧＦＰを A. tumefaciens 株ＬＢＡ４４０４にエレクトロポレーションにより導入した。
【００３３】
実施例２．植物材料
米国産の高地綿変種Ｃｏｋｅｒ３１２および中国のShanxi綿研究所からのＳｉ−Ｍｉａｎを本実験に使用した。
柔らかい葉柄を低光条件で温室で生育させた８−１２週令の植物から採取した。葉柄を７０％エタノールで数秒表面滅菌し、２０％漂白液（Clorox Co. USA,１％塩素）で２０分間漂白した。滅菌水で５回ゆすいだ後に葉柄を３日間ＭＳ培地中で前培養した。
【００３４】
実施例３．植物の形質転換
A. tumefaciens 株ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１ＧＦＰ）の単一コロニーを液体ＬＢ培地中で５０ｍｇ／Ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンとともにインキュベートした。細菌を一夜２８℃で２００ｒｐｍのシェカー中で生育した。細菌培養基を液体ＭＳ培地でＯＤ６００＝０.３に稀釈した。
【００３５】
葉柄および若い茎を約２ｃｍのセグメントに切断した。セグメントを稀釈細菌懸濁液に５分間浸し、５０ｍｌの共培養培地に浸したフィルター紙を含有するプラスチックのプレート（１００ｘ２５ｍｍ）に移した。プレートをインキュベーターに２４℃で連続光の下に４８時間留置した。共培養した移植片をＭＭＳ１培地に移し、２８℃で一日につき１６時間照射（６０−９０、μＥｍ−２ｓ−１）および８時間暗所でインキュベートした。２−４週後にカルスが葉柄セグメントの切断端に形成し始めた。４−６週後にカナマイシン耐性カルスが現れた。カルスの数を数え、ＧＦＰ遺伝子の発現を調べた。
【００３６】
蛍光顕微鏡で見ると、非形質転換対照カルスは赤色を呈し、ＧＥＰ遺伝子を発現する形質転換カルスは明白な緑色蛍光を呈した。計１１３の可能性ある形質転換カルスについてＧＦＰ活性を調べたところ、ＧＦＰ遺伝子の形質転換頻度は３９.８％であった（表１）。綿変種Ｓｉ−Ｍｉａｎ３の葉柄を形質転換に用いたとき、試験した２６カルスのうち１１カルスがＧＦＰ陽性であり、形質転換頻度は４２.３％であった。
【００３７】
【表１】
0004463456.tif 000002
【００３８】
実施例４：体性胚形成および植物体再生の誘発
活発な成長およびＧＦＰの強い発現をもつカルスを選択し液体ＭＭＳ培地に移し、懸濁培養を２週間行った。砕けやすいクリーム色の粒状カルスを選別し、半固体の分化培地ＭＭＳ２に移した。約２か月後に多数の胚様体が生成した。細胞質性の密な胚形成構造が徐々に発達し、大きい配列が培地に１−２か月以内にできた。短時間の懸濁培養基処理が、胚形成誘導の高い頻度のためだけでなく高品質の胚様体の生産のためにも非常に重要である。ＧＦＰ遺伝子の発現について調べたところ、すべてＧＦＰ陽性であった。
【００３９】
強いＧＦＰ活性を有する胚様体および胚形成カルスをＭＭＳ３培地に移した。１−２か月後に、約１−２ｃｍの高さになり１−２の本葉と根のよい発達を有する小植物体を Young 植物生育培地に約１か月間移した。約１か月後に６−８の本葉を有し約１０−１５ｃｍの高さの若い植物を土に鉢植えし温室に入れた。全３０の鉢植えトランスジェニック植物体が生存し、ＧＦＰタンパク質の発現を示した。トランスジェニック小植物体を得るのに必要な全時間は７か月以下であり、約２か月さらに鉢から出して温室に入れて小植物体を観察した。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
実施例５．ＧＦＰタンパク質活性の検定
ＧＦＰタンパク質活性の発現についての検定に、Leica MZ FLIIT 蛍光立体顕微鏡を４８０／４０ｎＭ励起フィルターおよび５１０ηＭバリアーフィルターとともに用いた。
【００４２】
蛍光立体顕微鏡で、形質転換したカルス、胚様体、若い小植物体におけるＧＦＰ遺伝子の緑色蛍光は、非形質転換対照の赤色と容易に識別できる。例外は非形質転換の根であって、蛍光顕微鏡で薄暗い緑に見える。おそらく根に蓄積した発色性化学物質によるのであろう。しかし、ＧＦＰ活性を有する根は、ＧＦＰによる緑色蛍光が輝いており一層均一であったことから、同定できた。蛍光立体顕微鏡による青光下で、非形質転換の緑色植物組織は、葉や茎のクロロフィルに富んでおり、赤い蛍光がはっきりと見える。ＧＦＰ陽性緑色植物組織において、黄色の蛍光も観測された。赤と緑の蛍光が重なり合うからである。しかし、花弁および葯でのＧＦＰ遺伝子の発現は、植物の他の部分に比して少ない。
【００４３】
実施例６．トランスジェニック植物の解析
可能性ある形質転換系および非形質転換対照植物のゲノムＤＮＡを、Paterson et al.(1993)にしたがって精製した。キメラ性ＧＦＰ遺伝子のＴ−ＤＮＡとＮｏｓ−３’ターミネーターのｉｎｊ間左境界を切断するＥｃｏＲＩで消化した後（図１）、ＤＮＡを０.８％ＴＡＥアガロースゲルで単離し、製造業者の指示書にしたがってハイボンド−Ｎ膜に移した。ＤＮＡの膜への固定をＵＶ交差結合により行い、ＧＦＰ遺伝子のＤＩＧ標識コード領域にハイブリダイズした。ハイブリダイズしたプローブを、製造業者の指示書（Boehringer Mannheim)にしたがい、抗ＤＩＧ−ＡＰコンジュゲートで検定した。
【００４４】
１１の無作為に選択したトランスジェニック系および１の非形質転換対照植物からのゲノムＤＮＡサンプルについてのサザン・ハイブリダイゼーションに、ハイブリダイゼーション・プローブとしてＧＦＰ遺伝子のコード領域を使用した。データによると、１１系のうち７系がＴ−ＤＮＡ挿入の単一複写、３系が２複写、１系が６複写を有していた。Ｔ−ＤＮＡ挿入の単一複写を有するトランスジェニック系が高い％であることは、この形質転換プロトコールが遺伝子抑制および望ましくない挿入変異体の危険性をほとんど有さないことを示唆する。
【００４５】
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【図１】
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