(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ITDを有する変異FLT3（FLT3/ITD）の発現によってＩＬ３非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、ＩＬ３非存在下において培養する工程、
（ｃ）該細胞の増殖を検出する工程、および
（ｄ）該細胞の増殖を抑制する化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項２】
腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）FLT3/ITDの発現によってＩＬ３非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、ＩＬ３非存在下において培養する工程、
（ｃ）該細胞におけるFLT3/ITDのリン酸化を検出する工程、および
（ｄ）該細胞におけるFLT3/ITDのリン酸化を抑制する化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項３】
腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）FLT3/ITDの発現によってＧ−ＣＳＦによる分化誘導能が抑制された動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対して、Ｇ−ＣＳＦの存在下、被検試料を接触させて培養する工程、
（ｃ）該細胞の分化誘導能を検出する工程、および
（ｄ）該細胞の分化を促進する化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項４】
腫瘍が造血器腫瘍である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
造血器腫瘍が急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
動物細胞が血球系細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
FLT3/ITDの発現によってＩＬ３非依存的増殖を示す動物細胞が、FLT3/ITDを発現するようにFLT3/ITDの遺伝子が導入されたFDC-P1細胞、32D細胞またはBaF3細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
FLT3/ITDの発現によってＧ−ＣＳＦによる分化誘導能が抑制された動物細胞が、FLT3/ITDを発現するようにFLT3/ITDの遺伝子が導入された32D細胞である、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腫瘍、特に造血器腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法に関する。より詳しくは、血球系細胞等の動物細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
ＦＬＴ３は、ＫＩＴ、ＦＭＳ、およびＰＤＧＦＲなどと共に、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のクラスＩＩＩに属するタンパク質で、造血系に関与していると考えられている（Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９：３８０−３８５，Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６４１−１６５０，Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６５：１１４３−１１５２，Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８２：１１１０−１１１９）。構造的には、ＲＴＫは５個のイムノグロブリン様ドメインからなる細胞外領域と、１つの膜近傍領域（ＪＭドメイン）、キナーゼ挿入ドメイン（ＫＩドメイン）に挟まれた２つのチロシンキナーゼドメイン（ＴＫ１およびＴＫ２）、および、Ｃ末端ドメインを有する。ＦＬＴ３は、脳、胎盤、肝臓に加え、造血幹細胞において強く発現している（Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１６４１−１６５０，Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓら，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６５：１１４３−１１５２，Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８２：１１１０−１１１９，Ｌ．Ｓ．Ｒｕｓｔｅｎ，１９９６，８７：１３１７−１３２５）。ＦＬＴ３のリガンド（ＦＬ）は骨髄のストローマ細胞から発現され、膜結合型と可溶型が存在し、単独あるいは他のサイトカインと共働して幹細胞を刺激する（Ｃ．Ｈａｎｎｕｍら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６４３−６４８，Ｈ．Ｊ．ＭｃＫｅｎｎａら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８６：３４１３−３４２０，Ｆ．Ｈｉｒａｙａｍａ，１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８５：１７６２−１７６８，Ｍ．Ｌｉｓｏｖｓｋｙら，１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：１０１２−１０１８）。従って、ＦＬとＦＬＴ３によるリガンド−受容体の相互作用は、造血系において重要な機能を果たしていると考えられる。
一方、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）や急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者の試料では、ほとんどの場合ＦＬＴ３の高発現が観察され、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でもＦＬＴ３の高発現が見られる。また、ＦＬの刺激により、ＡＬＬ細胞よりもＡＭＬ細胞の増殖が顕著に高まることが知られている（Ｗ．Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８６：４１０５−４１１４，Ａ．Ｓｔａｃｃｈｉｎｉら，１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：１５８４−１５９１，Ｍ．Ｌｉｓｏｖｓｋｙら，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８８：３９８７−３９９７，Ｆ．Ｂｉｒｇら，１９９２，Ｂｌｏｏｄ  ８０：２５８４−２５９３，Ｕ．Ｄｅｈｍｅｌら，１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：２６１−２７０）。このことから、ＦＬＴ３は、骨髄系の細胞に特異的な機能を有している可能性が考えられている。また、幾つかの白血病−リンパ腫細胞株では、ＦＬＴ３とＦＬの両方が発現しており（Ｎ．ＤａＳｉｌｖａら，１９９４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８：８８５−８８８，Ｇ．Ｍｅｉｅｒｈｏｆｆ，１９９５，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ９：１３６８−１３７２）、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）または傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）の機構が示唆されている（Ｈ．Ｇ．Ｄｒｅｘｌｅｒ，１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：５８８−５９９）。
近年、癌におけるサイトカイン受容体の変異が注目されている。今日までに、ヒトの白血病で、ｃ−ｆｍｓやｃ−ｋｉｔの変異が報告されている（Ｂ．ＬｏｗｅｎｂｅｒｇおよびＩ．Ｐ．Ｔｏｕｗ，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２８１−２９２）。変異ｃ−ｆｍｓをトランスフェクトしたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞はリガンド非依存的なトランスフォーメーションを起こす（Ｍ．Ｒｏｕｓｓｅｌら，１９８８，Ｃｅｌｌ  ５５：９７９−９８８）が、ほとんどの白血病患者の細胞で、ｆｍｓのリガンドであるＭ−ＣＳＦは、増殖を僅かしか上昇させないことから、ＦＭＳの変異の重要性はまだよくわかっていない（Ｂ．ＬｏｗｅｎｂｅｒｇおよびＩ．Ｐ．Ｔｏｕｗ，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２８１−２９２）。また、ＫＩＴとそのリガンドであるＳＣＦは白血病細胞や幹細胞を増殖させる（Ｂ．ＬｏｗｅｎｂｅｒｇおよびＩ．Ｐ．Ｔｏｕｗ，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８１：２８１−２９２，Ｏ．Ｗｉｔｔｅ，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６３：５−６）。しかしながら、マスト細胞白血病細胞株にはｃ−ｋｉｔ遺伝子の変異が見つかっている（Ｔ．Ｔｓｕｊｉｍｕｒａら，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８３：２６１９−２６２６，Ｈ．Ｋｉｔａｙａｍａ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ８８：９９５−１００４，Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｕｒａら，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：２７３−２８３）ものの、臨床試料では未だ十分確認されていない。
最近、ＡＭＬ患者の中に、ＦＬＴ３の体細胞変異が発見された（Ｍ．Ｎａｋａｏら，１９９６，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：１９１１−１９１８）。これらの変異体は、ＦＬＴ３遺伝子のＪＭドメインをコードしている領域が直列に重複（ＩＴＤ；ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）していた。重複配列は、主にエクソン１１／１２およびイントロン１１を含んでおり、その長さは試料によって様々であったが、それらは読み枠がインフレームであり、蛋白に翻訳可能で長いＪＭドメインを有している点が共通していた。
ＦＬＴ３変異は、ＡＭＬ患者の約２０％、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者の約３％に見られ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）やリンパ性造血器腫瘍の患者には見られない（Ｓ．Ｙｏｋｏｔａら，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１６０５−１６０９）。ＡＭＬの患者において、ＩＴＤを有する変異ＦＬＴ３遺伝子（以後ＦＬＴ３／ＩＴＤと記す）が、本発明者らの知見によれば、診断時には見られなくて、再発時に見られる例があることから、ＦＬＴ３／ＩＴＤが白血病の進行と関わっていることが示唆される。しかしながら、白血病の進行におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの機能についてはいまだ何ら報告されていない。
発明の開示
本発明は、白血病などの造血器腫瘍におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を解明し、ＦＬＴ３／ＩＴＤの機能の抑制を指標とした、造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、血球系細胞株におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの機能の検討を行い、該細胞株において、ＦＬＴ３／ＩＴＤのチロシン残基が恒常的にリン酸化されていること、および、ＦＬＴ３／ＩＴＤを導入した血球系細胞が、ＩＬ３非依存的な増殖を示すこと、更に、同系マウスに接種することにより、腫瘍が形成されることを見出した。これら事実は、ＦＬＴ３／ＩＴＤのチロシン残基のリン酸化を介する、ＦＬＴ３／ＩＴＤからの増殖シグナルにより、ＩＬ３非依存的な細胞増殖が引き起こされ、これが特に急性骨髄性白血病などの造血器腫瘍の進行に関係していることを示唆した。このため、本発明者らはＦＬＴ３／ＩＴＤの機能の抑制を指標として造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。
本発明は、特に、血球系細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を抑制を指標とした、造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
（１）  腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、サイトカイン非存在下において培養する工程、
（ｃ）該細胞の増殖を検出する工程、および
（ｄ）該細胞の増殖を抑制する化合物を選択する工程、
を含む方法、
（２）  腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、サイトカイン非存在下において培養する工程、
（ｃ）該細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤのリン酸化を検出する工程、および
（ｄ）該細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤのリン酸化を抑制する化合物を選択する工程、
を含む方法、
（３）  腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞を非ヒト哺乳類動物に接種して腫瘍を形成させる工程、
（ｃ）該細胞を接種する前あるいは接種後に被検試料を該非ヒト哺乳類動物に投与し、腫瘍の形成を検出する工程、および
（ｄ）該非ヒト哺乳類動物の腫瘍の形成を抑制する化合物を選択する工程、
を含む方法、
（４）  腫瘍に対する医薬品候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によって分化誘導能が抑制された動物細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対して被検試料を接触させて培養する工程、
（ｃ）該細胞の分化誘導能を検出する工程、および
（ｄ）該細胞の分化を促進する化合物を選択する工程、
を含む方法、
（５）  腫瘍が造血器腫瘍である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）  造血器腫瘍が急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群である、（５）に記載の方法、
（７）  サイトカインがＩＬ３である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（８）  動物細胞が血球系細胞である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（９）  血球系細胞がＦＤＣ−Ｐ１細胞、３２Ｄ細胞またはＢａＦ３細胞である、（８）に記載の方法、
（１０）  動物細胞が３２Ｄ細胞である、（４）記載の方法、
（１１）  （１）から（１０）のいずれかに記載の方法により単離しうる、腫瘍に対する医薬品候補化合物、に関する。
実施例に示したように、ＦＬＴ３／ＩＴＤを導入した幼若顆粒球系細胞株ＦＤＣ−Ｐ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２１０３）において、ＦＬＴ３／ＩＴＤのチロシン残基のリン酸化が検出された（実施例３）。また、親細胞のＦＤＣ−Ｐ１はＩＬ３依存性であるのに対して、ＦＬＴ３／ＩＴＤを導入したＦＤＣ−Ｐ１はＩＬ３非依存的な増殖を示すことが判明した（実施例４）。これら事実は、ＦＬＴ３の直列重複（ＩＴＤ）変異が、血球系細胞の腫瘍化に機能的に関わっていることを初めて明らかにするものである。本発明者らは、上記したＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を阻害することによって、細胞の異常増殖を抑制し、白血病等の造血器腫瘍を含む腫瘍の治療を行うことが可能であることを見出した。
従って、本発明の造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法の一つの態様は、ＦＬＴ３／ＩＴＤを発現させた血球系細胞等の動物細胞の増殖の抑制を指標とする方法である。この方法は、具体的には、（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、サイトカイン非存在下において培養する工程、（ｃ）該細胞の増殖を検出する工程、および（ｄ）該細胞の増殖を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
また、本発明の造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法の他の一つの態様は、血球系細胞等におけるＦＬＴ３／ＩＴＤのチロシン残基のリン酸化の抑制を指標とする方法である。この方法は、具体的には、（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に対し被検試料を接触させ、サイトカイン非存在下において培養する工程、（ｃ）該細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤのリン酸化を検出する工程、および（ｄ）該細胞におけるＦＬＴ３／ＩＴＤのリン酸化を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
さらに、本発明の造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＦＬＴ３／ＩＴＤを発現させた血球系細胞等の動物細胞による腫瘍の形成の抑制を指標とする方法である。この方法は、具体的には、（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってサイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞を非ヒト哺乳類動物に接種して腫瘍を形成させる工程、（ｃ）該細胞を接種する前あるいは接種後に被検試料を該非ヒト哺乳類動物に投与し、腫瘍の形成を検出する工程、および（ｄ）該非ヒト哺乳類動物の腫瘍の形成を抑制する化合物を選択する工程、を含む。
また、本発明の造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法の他の一つの態様は、ＦＬＴ３／ＩＴＤを発現させた血球系細胞等の動物細胞の分化誘導能、即ち該細胞の分化を促進する作用を指標とする方法である。この方法は、具体的には、（ａ）ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によって分化誘導能が抑制された動物細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に対して被検試料を接触させて培養する工程、（ｃ）該細胞の分化誘導能を検出する工程、および（ｄ）該細胞の分化を促進する化合物を選択する工程、を含む。細胞の分化を促進する化合物としては、単独で該細胞の分化を促進するものであっても、細胞の分化を促進することが知られている既知のサイトカインと協調して促進するものであってもよい。
本発明においてスクリーニングされる医薬品候補化合物の対象とする腫瘍としては、ＦＬＴ３の直列重複（ＩＴＤ）変異に起因する腫瘍であれば特に制限はなく、中でも造血器腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病や骨髄異形成症候群が挙げられ、特に、急性骨髄性白血病が対象疾患として好適である。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、オリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに制限されない。
スクリーニングに利用する細胞としては、ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によって、サイトカイン非依存的増殖を示す動物細胞または分化誘導能が抑制された動物細胞であれば制限はないが、血球系細胞（造血幹細胞を含む）が好適である。例えば、ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現によってＩＬ３非依存的な増殖を示すＦＤＣ−Ｐ１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１２１０３）、３２Ｄ細胞（理研細胞バンク：ＲＣＢ１１４５）、Ｂａ／Ｆ３細胞（理研細胞バンク：ＲＣＢ０８０５）、ＤＡ−３細胞（理研細胞バンク：ＲＣＢ１１４４）等が挙げられる。特に、ＦＤＣ−Ｐ１細胞、３２Ｄ細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞が好適である。細胞内でのＦＬＴ３／ＩＴＤの発現は、当業者に公知の遺伝子操作技術により行うことができる。細胞内で発現させるＦＬＴ３／ＩＴＤとしては、サイトカイン非依存的に血球系細胞の増殖を誘導しうるものであればよく、例えば、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を有するＦＬＴ３／ＩＴＤを用いることができる。また、文献（Ｓ．Ｙｏｋｏｔａら，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１６０５−１６０９、Ｈ．Ｋｉｙｏｉら，１９９７，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１４４７−１４５２）に記載のＦＬＴ３／ＩＴＤ配列を用いることもできる。その他、造血器腫瘍の患者から新たに得られるＦＬＴ３／ＩＴＤを用いることもできる。また、ＦＬＴ３／ＩＴＤは、人工的に合成したものであっても、細胞由来のものであってもよい。
細胞への被検試料の接触は、被検試料の種類に応じて、被検試料の細胞培養培地への添加や被検試料の細胞内への導入などの方法で行うことができる。
以下▲１▼から▲４▼に具体的なスクリーニング方法の一例を示すが、本発明の方法はこれに制限されない。
▲１▼  正常ＦＬＴ３またはＦＬＴ３／ＩＴＤを市販のネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含む発現ベクターに組み込み、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（バイオラド）等を用いてＦＤＣ−Ｐ１細胞や３２Ｄ細胞等へ導入する。ＦＬＴ３／ＩＴＤ導入細胞を選択後、５×１０４個程度の細胞を２４ｗｅｌｌプレート上に播き、被検試料存在下または非存在下で３７℃、ＣＯ２インキュベータ中にて培養し、２〜３日後に生細胞数をトリパンブルーまたはＭＴＴアッセイ等により計測し、細胞の増殖を抑制する化合物を選択することができる。
▲２▼  正常ＦＬＴ３またはＦＬＴ３／ＩＴＤを市販のネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含む発現ベクターに組み込み、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（バイオラド）等を用いてＦＤＣ−Ｐ１組胞や３２Ｄ細胞等へ導入する。ＦＬＴ３／ＩＴＤ導入細胞を選択後、１×１０６個程度の細胞を１０ｃｍプレート上に播き、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを加え、被検試料存在下または非存在下で３７℃、ＣＯ２インキュベータ中にて培養する。その後、細胞抽出物を調製し、抗ＦＬＴ３抗体および抗リン酸化チロシン抗体で免疫沈降後、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーでＦＬＴ３／ＩＴＤ中の放射性同位元素を検出することで、ＦＬＴ３のチロシンリン酸化を抑制する化合物を選択することができる。
▲３▼  ＦＬＴ３／ＩＴＤを上記▲１▼のようにして導入して形質転換したＦＤＣ−Ｐ１細胞を２×１０７個程度、ＦＤＣ−Ｐ１細胞が樹立されたマウスＤＢＡ２（ストレイン）の皮下に接種したところ、接種後、該マウスは約２週間で腫瘍を形成した。形成された腫瘍にＦＬＴ３／ＩＴＤのＤＮＡおよび蛋白質がそれぞれ発現していることを確認した（図３Ａ及びＢ）。その際、特に放射線照射などの処理を施さなくとも腫瘍が形成された。すなわち、ＦＬＴ３／ＩＴＤで形質転換した血球系細胞等を、該細胞と同系のマウスなどの非ヒト哺乳類動物に接種するとＦＬＴ３／ＩＴＤによる腫瘍が形成される。したがって、この非ヒト哺乳類動物に、形質転換した血球系細胞等を接種する前、あるいは、接種後に被検試料を経皮、経静脈または経口的に投与し、腫瘍の形成あるいは消長を調べることによって腫瘍の増殖を抑制する化合物を選択することができる。
▲４▼  また、本発明者らは、例えば３２Ｄ細胞は、ＩＬ３依存性細胞でありＧ−ＣＳＦの存在下で分化が誘導されるが、ＦＬＴ３／ＩＴＤを導入するとＧ−ＣＳＦによる上記分化誘導が抑制されることを見出している。したがって、正常ＦＬＴ３またはＦＬＴ３／ＩＴＤを上記▲１▼のようにして導入して形質転換した血球系細胞等を５×１０４個程度２４ｗｅｌｌプレートにまき、被検試料を添加して経時的にサイトスピン標本を作成し、メイギムザ染色、ペルオキシダーゼ染色、エステラーゼ染色またはアルカリフォスファターゼ染色などにより、分化誘導能を調べるか、あるいは、フローサイトメトリーにてＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３３などの発現を調べることにより分化誘導能を調べることにより、分化誘導能を促進する化合物を選択することができる。
なお、細胞増殖を指標としたスクリーニング系においては、非選択的細胞毒性物質の影響を除外するため、親細胞をＩＬ３存在下で培養し、被検化合物を加え、ＩＬ３依存性増殖に対する被検化合物の影響を同時に調べることが好ましい。
本発明におけるスクリーニングにより単離される化合物としては、種々の作用点を有するものが考えられる。例えば、ＦＬＴ３／ＩＴＤに直接作用してその機能を阻害するもの、ＦＬＴ３／ＩＴＤまたはリン酸化ＦＬＴ３／ＩＴＤに結合する分子（例えば、ＳＨＣ、Ｇｒｂ２、Ｃｂ１、ＰＩ３Ｋ、ＲＡＳ−ＧＡＰ、ＰＬＣ−γなどのアダプタータンパク質など）に作用して間接的にＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を阻害するもの、ＦＬＴ３／ＩＴＤから細胞増殖に至るまでのシグナル伝達に関与するタンパク質群に作用するもの、ＦＬＴ３／ＩＴＤのリン酸化を行うタンパク質に作用してその機能を阻害するもの、ＦＬＴ３／ＩＴＤからそのリン酸化に至るまでのシグナル伝達に関与するタンパク質群に作用するもの、恒常的にリン酸化しているＦＬＴ３／ＩＴＤを脱リン酸化するものが含まれる。
これら化合物は、ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現が関与する上記造血器腫瘍等の治療薬の候補になる。スクリーニングされる化合物の中で、ＦＬＴ３／ＩＴＤの機能を特異的に阻害し、正常ＦＬＴ３の機能は阻害しない化合物は、ＦＬＴ３／ＩＴＤに起因する上記疾患の特異的な治療薬となるため好ましい。
本発明のスクリーニング法により単離される化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本発明において、「ＦＬＴ３」と表記したときは、特に断らない限り、正常ＦＬＴ３だけでなく、ＦＬＴ３／ＩＴＤを含む変異ＦＬＴ３をも意味する。また、「ＦＬＴ３異常」とは、変異ＦＬＴ３の発現に加え、正常ＦＬＴ３の高発現などのあらゆるＦＬＴ３の異常を意味する。
［実施例１］  白血病細胞のＦＬＴ３／ＩＴＤの検出
白血病細胞から、高分子ＤＮＡを単離し、ＦＬＴ３タンパク質のＪＭ領域を含むＤＮＡ断片を文献（Ｈ．Ｋｉｙｏｉ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１４４７−１４５２，１９９７）記載の方法を用いてＰＣＲにて増幅した。正常なサイズと異なるバンドをアガロースゲルから切り出し、Ｑｉａｅｘ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）で精製した後、メーカーの説明書に従ってｐＭＯＳＢｌｕｅ  Ｔベクター（アマシャム社）へクローニングした。組換えコロニー１０種類をＬＢ培地で培養し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社）で調製し、塩基配列をシークエンスにより確認した。ＦＬＴ３  ｍＲＮＡの発現は文献（Ｈ．Ｋｉｙｏｉ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１：１４４７−１４５２，１９９７）記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲにて確認した。正常なサイズを示さないバンドを上記の方法でクローン化し、シークエンスにより配列を確認した。
その結果判明した、種々の造血器腫瘍におけるＦＬＴ３／ＩＴＤの出現頻度（ＦＬＴ３／ＩＴＤの見られた症例数／検索症例数）を表１にまとめた。
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ＦＬＴ３／ＩＴＤは造血器腫瘍の中でもＡＭＬに特異的に見られることが確認され、その割合はＡＭＬの約２０％と効率であった。また、ＭＤＳにも見られたが、その割合は約３％と低かった。
［実施例２］  ＦＬＴ３／ＩＴＤ発現プラスミドの血球系細胞への導入
白血病由来細胞よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、これを鋳型として、変異ＦＬＴ３  ｃＤＮＡのタンデムリピート領域を含むＭｕｎＩ−ＥｃｏＲＶ断片をＲＴ−ＰＣＲにて増幅した。プライマーにはＭｕｎＩ−Ｆプライマー（配列番号：１１／５’−ＣＡＡＣＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴ−３’）およびＥｃＲＶ−Ｒプライマー（配列番号：１２／５’−ＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＧ−３’）を用いた。増幅した断片はＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶ（ベーリンガーマンハイム山之内社）により切断し、アガロースゲルで分離後、前述の方法で精製した。正常ＦＬＴ３  ｃＤＮＡの全長（Ｏ．Ｒｏｓｎｅｔら，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  ８２：１１１０−１１１９；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ６４７８５）を有する発現ベクターｐＣＤＨＦ３（Ｏｌｉｖｉｅｒ  Ｒｏｓｎｅｔ博士より供与）をＭｕｎＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、精製したＦＬＴ３／ＩＴＤ遺伝子断片を挿入した。４種のＦＬＴ３／ＩＴＤ（Ｍｔ１、Ｍｔ２、Ｍｔ３およびＭｔ４）を用いた。Ｍｔ１〜Ｍｔ４の変異領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３、５および７に示し、そのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２、４、６および８に示した。Ｍｔ１からＭｔ４の発現ベクターを使用して、血球系細胞へのトランスフェクションを行った。
得られたＦＬＴ３／ＩＴＤ発現プラスミドは、血球系細胞へ以下のように導入した。すなわち、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（バイオラド社）を用い、ｐＢａｂｅ−ｎｅｏベクター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３５８７−３５９６，１９９０）と１０：１の割合でコトランスフェクト（３００  Ｖｏｌｔｓ，９６０  μＦ）し、８００ｎｇ／ｍｌのネオマイシンで選択を行い、クローニング後、ＦＡＣＳおよびウェスタンブロットにてＦＬＴ３の発現を確認してトランスフェクトしたクローンを樹立した。
ＦＬＴ３／ＩＴＤ遺伝子を導入する細胞としては、幼若顆粒球系のＦＤＣ−Ｐ１細胞を用いた。
［実施例３］  トランスフェクタントのＦＬＴ３分子チロシンリン酸化
（１）１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社）にてトランスフェクタントを培養し、２×１０７個の細胞を１０００ｒｐｍ５分にて回収し、ＰＢＳにて洗浄後、細胞ペレットをリシスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，５０ｍＭ  ＮａＦ，１０ｍｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０ｍｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，５０ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ））に溶解、４℃、１時間後、１５０００ｒｐｍ３０分間遠心し、上清にウサギ抗ヒトＦＬＴ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加え、４℃２時間回転撹拌し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｐｌｕｓ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を加え４℃２時間回転撹拌後、リシスバッファーにて３回洗浄し、サンプルローディングバッファー（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１０％  ２−メルカプトエタノール，４％  ＳＤＳ）に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ミリポア社）に転写し、抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）にて反応後、ＥＣＬシステム（アマシャム社）にてバンドを検出した。同じ膜をストリッピングバッファー（１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，２％  ＳＤＳ，６２．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）にて７０℃３０分インキュベートした後、ウサギ抗ヒトＦＬＴ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて再度反応させ、ＦＬＴ３蛋白の確認を行った。
ＦＤＣ−Ｐ１細胞の結果を図１に示す。図１に示されるように、ＦＤＣ−Ｐ１細胞に導入されたいずれのＦＬＴ３／ＩＴＤも、チロシン残基がリン酸化されており、ＦＬＴ３／ＩＴＤは恒常的にＦＬＴ３／ＩＴＤのチロシン残基をリン酸化するシグナルが活性化されていることが判明した。また、正常ＦＬＴ３タンパク質は、ＦＬ非存在下ではリン酸化されていなかった。
また、３２Ｄ細胞において、ＦＤＣ−Ｐ１細胞の場合と同様の結果が得られた。
［実施例４］  ＦＬＴ３／ＩＴＤ導入細胞の増殖特性
正常ＦＬＴ３（ｗｔ）またはＦＬＴ３／ＩＴＤ（Ｍｔ１からＭｔ４）を導入した５×１０４個のＦＤＣ−Ｐ１細胞を２４ウェルプレート上に、次の４種の培地下で３７℃、ＣＯ２インキュベータ中にて培養し、トリパンブルーで染色し、生細胞数を２４時間毎４日間計数し、各細胞の増殖能を測定した。
培養条件は、
１．１０％ＦＣＳＲＰＭＩ１６４０のみ                        （図２左上）
２．１０％ＦＣＳＲＰＭＩ１６４０＋１ｎｇ／ｍｌ  マウスＩＬ３（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）          （図２右上）
３．１０％ＦＣＳＲＰＭＩ１６４０＋５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦＬ（Ｐｕｒｏｔｅｃｈ社）          （図２左下）
４．１０％ＦＣＳＲＰＭＩ１６４０＋１ｎｇ／ｍｌ  マウスＩＬ３＋５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦＬ    （図２右下）
の４条件で行った。その結果を図２に示す。図に示されたように、正常ＦＬＴ３導入細胞は、ＩＬ３非存在下では増殖できず、ＦＬＴ３のリガンドであるＦＬを加えた場合でも、ＩＬ３依存性は変化しなかった。また、ＩＬ３およびＦＬの相乗効果も認められなかった。それに対して、ＦＬＴ３／ＩＴＤ導入細胞は、ＩＬ３を加えない場合でも、ＩＬ３存在下と同等の増殖を示し、その増殖速度は、正常ＦＬＴ３導入細胞にＩＬ３を加えた場合よりも有意に高かった。また、ＩＬ３および／またはＦＬによる増殖促進作用、相乗効果は認められなかった。
これらのデータから、ＦＬＴ３／ＩＴＤは幼若顆粒球細胞において細胞内の増殖シグナル経路を活性化し、サイトカイン非依存的な増殖を引き起こすことが判明した。
また、３２Ｄ細胞において、ＦＤＣ−Ｐ１細胞の場合と同様の結果が得られた。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＦＬＴ３／ＩＴＤの機能の抑制を指標とした、造血器腫瘍等に対する医薬品候補化合物のスクリーニング方法が提供された。本発明の方法により単離される化合物は、造血器腫瘍、特に急性骨髄性白血病における、ＦＬＴ３／ＩＴＤの発現に起因する血球系細胞等の異常な増殖を抑制する効果が期待されるため、これら疾患に対する治療薬開発への利用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、正常ＦＬＴ３およびＦＬＴ３／ＩＴＤを導入したＦＤＣ−Ｐ１細胞の、ＦＬＴ３タンパク質のチロシン残基のリン酸化を示す図である。細胞抽出物をＦＬＴ３抗体で免疫沈降（ＩＰ：ＦＬＴ３）し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、抗リン酸化チロシン抗体でウエスタンブロットを行った（上段；ＩＢ：ｐＴｙｒ）。さらに、同じ膜を抗ＦＬＴ３抗体でウエスタンブロットを行った（下段；ＩＢ：ＦＬＴ３）。レーン１：Ｍｔ１、レーン２：Ｍｔ２、レーン３：Ｍｔ３、レーン４：Ｍｔ４。
図２は、正常ＦＬＴ３および４種のＦＬＴ３／ＩＴＤを導入したＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖特性を示す図である。各細胞を、ＩＬ３およびＦＬの非存在下（左上；ＩＬ３（−）／ＦＬ（−））、ＩＬ３（１ｎｇ／ｍｌ）存在下（右上；ＩＬ３（１ｎｇ／ｍｌ）／ＦＬ（−））、ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）存在下（左下；ＩＬ３（−）／ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ））、またはＩＬ３およびＦＬ存在下（右下；ＩＬ３１ｎｇ／ｍｌ）／ＦＬ（５０ｎｇ／ｍｌ））の条件で培養した。
図３は、ＦＬＴ３／ＩＴＤを導入したＦＤＣ−Ｐ１細胞をマウスＤＢＡ２の皮下に接種して形成された腫瘍にＦＬＴ３／ＩＴＤのＤＮＡおよび蛋白質が発現していることを示す図である。ＡはＤＮＡをＰＣＲで増幅後電気泳動し、腫瘍にＦＬＴ３／ＩＴＤのＤＮＡが存在していることを示している。Ｂは抗ＦＬＴ３抗体を用いた全細胞抽出物のウェスタンブロットであり、腫瘍にＦＬＴ３／ＩＴＤの蛋白質が存在していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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