(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加／維持する方法において、
（ａ）初代間質細胞を含む間質細胞培養を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培養培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな３次元間質細胞培養を作り出す工程、および
（ｂ）上記未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を、前記コンフルエントな３次元間質細胞培養を含みかつ前記培養培地の前記連続流下にある前記固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、単離された未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を生体外で増加／維持する工程を含む方法。
【請求項２】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞が、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、共通のＨＬＡ抗原をもつ、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、同一種に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異種に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６細胞という密度にまで増殖している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも１０７細胞という密度にまで増殖している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも１０時間該バイオリアクターの中の流れが停止される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
繊維の孔が、全容量に対する割合にして４０％から９５％を構成し、孔の大きさが１０ミクロンから１００ミクロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
マトリックスが、直径または幅が０．５ミクロンから５０ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
マトリックスが、幅２ミクロンから２０ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも２：１であるリボン状繊維から構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
マトリックスが、全容量に対する割合が６０％から９５％の孔容量をもつ、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
マトリックスの厚さが５０〜１０００μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
マトリックスが円盤の形をしている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
マトリックスがポリ−Ｄ−リジンで被覆されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加／維持する方法において、
（ａ）初代間質細胞を含む間質細胞を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる３次元のネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな固定相３次元間質細胞培養を得る工程、
（ｂ）前記コンフルエントな固定相間質細胞培養から間質細胞馴化培地を分離して回収し、コンフルエントな間質細胞培養から馴化培地を得る工程、および
（ｃ）上記未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を、前記コンフルエントな間質細胞培養から得られた馴化培地の中で培養する工程を含む方法。
【請求項２２】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞が、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、共通のＨＬＡ抗原をもつ、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、同種に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異種に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６細胞という密度にまで増殖している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも１０７細胞という密度にまで増殖している、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
繊維の孔が、全容量に対する割合にして４０％から９５％を構成し、孔の大きさが１０ミクロンから１００ミクロンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
マトリックスが、直径または幅が０．５ミクロンから５０ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
マトリックスが、幅２ミクロンから２０ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも２：１であるリボン状繊維から構成されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
マトリックスが、全容量に対する割合が６０％から９５％の孔容量をもつ、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
マトリックスの厚さが５０〜１０００μｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
マトリックスが円盤の形をしている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
マトリックスがポリ−Ｄ−リジンで被覆されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加／維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、
（ａ）初代間質細胞を含む間質細胞を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる３次元のネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな固定相３次元間質細胞培養を得る工程、ただし、前記間質細胞培養は、前記担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６細胞という密度にまで増殖している、および
（ｂ）前記コンフルエントな固定相間質細胞培養から間質細胞馴化培地を分離して回収し、コンフルエントな間質細胞培養から馴化培地を作る工程、ただし、前記培地は、未分化の造血幹細胞培養を増加させて未分化の造血幹細胞の数を増大させる上で有用である、を含む方法。
【請求項４０】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６細胞という密度にまで増殖している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
間質細胞培養の間質細胞が、担体１立方センチメートルあたり少なくとも１０７細胞という密度にまで増殖している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
繊維の孔が、全容量に対する割合にして４０％から９５％を構成し、孔の大きさが１０ミクロンから１００ミクロンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
マトリックスが、直径または幅が０．５ミクロンから５０ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
マトリックスが、幅２ミクロンから２０ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも２：１であるリボン状繊維から構成されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
マトリックスが、全容量に対する割合が６０％から９５％の孔容量をもつ、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
マトリックスの厚さが５０〜１０００μｍである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
マトリックスが円盤の形をしている、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
マトリックスがポリ−Ｄ−リジンで被覆されている、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野および背景技術
本発明は、造血幹細胞を維持および増加するための方法および装置に関する。より詳しくは、本発明は、造血幹細胞を維持および／または増加、および／または、造血幹細胞を維持および／または増加させるための馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を作製するための３次元の間質細胞栓流バイオリアクター（ｐｌｕｇ  ｆｌｏｗ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に関する。
【０００２】
哺乳動物の造血系は、機能において、限定的な増殖能力しかない成熟細胞から旺盛な増殖能力、分化能力および自己複製能力をもつ多能性幹細胞までにわたる、不均一な細胞集団からなる（１〜３）。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、移植後の造血系再構成に専ら必要とされ、また、遺伝子治療の一次的な標的となる。幹細胞は、造血系維持に決定的な役割を果たしているにも拘わらず、造血組織における出現頻度が非常に低く、また、未分化の幹細胞を生体外で長時間にわたって維持または増加させにくいことは、肝心の臨床応用にこれらの細胞を用いる上での相変わらずの大きな欠点であるだけでなく、新規の幹細胞制御因子が現在まで利用できず、またそれらを必要としていることを反映している。
【０００３】
幹細胞が生体内で骨髄の中に離れたニッチをもち（４〜６）、それが、細胞−細胞間連絡または短距離の相互作用によって集団的にそれらの分化と自己複製をもたらす分子シグナルを提供することと密接に関連していると広く認められている（７）。これらのニッチは、「造血誘導微小環境」（ＨＩＭ）の一部であり、例えば、マクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞、および上皮細胞（８）などの骨髄間質細胞からなる。骨髄間質細胞は、細胞−細胞間連絡を促す細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および基底膜成分を提供することによってＨＩＭの機能的な完全性を維持する（９〜１１）。制御された造血細胞分化と増殖に必要なさまざまな可溶性または常在性のサイトカインも提供する（１２〜１４）。
【０００４】
上記の点から考えると、ヒトＨＳＣを長期間にわたって維持するための培養システムを開発するための努力が、主に、予め樹立された初代骨髄間質細胞の単層を使用することに集中したのは驚きではない。これらには、非照射ヒト初代骨髄間質細胞（Ｄｅｘｔｅｒ培養細胞、１５）または照射後初代骨髄間質細胞（１６〜１９）の長期培養、およびヒトまたはマウスの間質細胞株（１６、１９〜２４）が含まれ、外部からサイトカインを加えたものや加えなかったものがある。ＨＳＣの出力アッセイ法は、このような幹細胞を長時間（５〜７週間）培養した後、これらの細胞が骨髄細胞の後代（長時間培養開始細胞（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）；ＬＴＣ−ＩＣ）を産生するか、敷石状の形態をもつコロニー（敷石状領域形成細胞（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；  ＣＡＦＣ））を形成する能力に依存する（１６、１７）。しかし、ＬＴＣ−ＩＣアッセイ法およびＣＡＦＣアッセイ法が広範に使用されているにもかかわらず、これらのアッセイ法は、本当に再増殖した造血幹細胞（２５、２６）よりも非常に原始的な前駆細胞を検出することが次第に明らかになってきている。
【０００５】
最近開発されたヒト幹細胞アッセイ法は、ヒトの骨髄球系、リンパ球系、赤血球系、およびＣＤ３４＋の前駆細胞集団を生じさせる、非肥満−糖尿病（ＮＯＤ）／ＳＣＩＤマウス（２７）の骨髄細胞に存在するＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）を検出する（２８〜３０）。ＳＲＣは、専ら、ＣＤ３４＋３８−表面抗原（３１）を発現する造血細胞画分に見られ、ＣＢ（１／３×１０５細胞）におけるその頻度は、ＢＭ（１／９×１０５細胞）または動員されたＰＢ（１／６×１０６細胞）と比較すると高くなっている（３２）。つい最近の研究で、ＳＲＣは、ＣＤ３４＋／３８−／ＣＸＣＲ４＋細胞の亜集団の中に存在することが示された（３３）。ケモカイン間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、３４）の表面レセプターであるＣＸＣＲ４は、明らかに、ＮＯＤ／ＳＣＩＤの骨髄におけるヒト造血幹細胞のホーミングおよび移植に必須である（３３）。
【０００６】
間質細胞培養上でのヒトＨＳＣの長期間の維持／増加をめざした研究は、エンドポイント法として、主に、ＣＡＦＣ、ＬＴＣ−ＩＣまたはＣＤ３４＋３８−表現型に基づいていた（１６、１９〜２４）。間質細胞培養においてＳＲＣが維持／増加されたという稀少な報告も、長期間にわたる有意な支持を示せないでいる。例えば、同種異系のヒト骨髄間質は、長期間（７日間）のＳＲＣ維持を誘導し、その後急速に（６倍）活性が低下することが分かった（２６）。間質細胞層上の移植可能なヒト幹細胞の長期間にわたる維持／増加を支持できないのは、これらの細胞のインビトロ培養に関連するいくつかの要素によるものであろう。それらの一つには、骨髄の自然な３次元構造中における生体内増殖条件を反映していない間質細胞単層を使用することが含まれる。このような条件だと、最適で適切な支持的な微小環境を提供するという間質細胞の能力が失われると同時に、特異的なニッチに局在して、間質細胞およびその産物と物理的に相互作用するという幹細胞の能力も失われるであろう。実際、造血前駆細胞の生物活性に対する３次元（３Ｄ）構造の重要性に関する証拠は、ヒト造血細胞株を３Ｄコラーゲンマトリックス中の間質細胞上に播くと、この細胞の単層上に播いたときよりも優れた増殖を示すことから明らかである（３５）。より重要なのは、３Ｄのタンタル被覆多孔性生物素材が、細胞のみ、または骨髄間質細胞単層上で培養した場合に較べると、マカク類ＬＴＣＩＣまたはＣＤ３４＋３８−細胞の短期間の維持を促進することが最近分かったことである（３６）。しかしながら、間質細胞で被覆された３Ｄ担体の効果は、まだ調べられていない。
【０００７】
最近の研究によって、ヒトＣＢ  ＳＲＣ（３７）の２〜３週間の生存と維持（ただし、増加はなし）を支持するには、ヒト間質細胞よりもマウスＡＦＴ０２４細胞株の方が優れている。この細胞株では、膜結合タンパク質（２１、３８、３９）をコードする新規のＨＩＭ遺伝子がいくつか発現しているのが見られるが、それらが、幹細胞の生理に必須の役割をもつのかもしれない。これらまたはその他の遺伝子が、間質細胞の３Ｄ骨髄微小環境をより正確に模倣した条件下では、間質細胞によって発現され、それによって間質細胞が最適な生理学的機能活性をもつようになるという可能性はまだ結論づけられていない。
【０００８】
活発な研究によって、間質非接触培養（１９、２１、２２、４０、４１）または間質馴化培地（ＳＣＭ）（２１、４２〜４４）は、それだけで、またはサイトカインとともに、原始的な造血前駆細胞の生体外での維持または増加を支持することができることが分かった。また、ＳＣＭが、これらの細胞の回収効率および形質転換効率を向上させることも分かっている（４５、４６）。これらの知見は、再び、可溶性間質細胞因子重要性を強調しているが、それらのアッセイ法におけるＬＴＣ−ＩＣ、ＣＡＦＣ、またはＣＤ３４＋３８−のエンドポイントの使用は、移植可能なＨＳＣの維持／増加に対するＳＣＭの効果を反映させることができない。さらに、間質細胞の単層培養から得られたＳＣＭが、実際に、ヒトＨＳＣの生理現象に関与する間質細胞関連遺伝子産物のすべてを含んでいるか否かは分かっていない。
【０００９】
移植可能な造血幹細胞の生体外での増加を目的とする最近の努力は、サイトカイン添加懸濁培養の樹立に集中している（４７〜５３）。これらの研究は、本プロセスにおける主要関連サイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、および血小板産生因子（ＴＰＯ）のような早期作用因子の同定に役立ってきた。それにもかかわらず、さまざまな結果が得られていて、短期間での消失（４８、４９）、維持（５０〜５２）を示しているが、２〜４週間培養した後にＳＲＣが増加したという稀な例もある（４７、５３）。これらのサイトカインと間質細胞の、３Ｄ増殖条件下における、ＳＲＣの維持／増殖を支える相互作用能力については、まだ明らかにされていない。
【００１０】
このように、移植可能な造血幹細胞の生体外での増加および／または維持を行うための方法および装置で、上記の制約をもたず、先行技術に記載された結果と比較して優れた結果を示すものに対する需要が広く認められており、また、それらがあれば非常に有益であろう。
【００１１】
発明の概要
本発明を実施するにあたり、３Ｄ骨髄微小環境を正確に模倣し、間質細胞の増殖と長期間の維持を支持することのできる栓流バイオリアクター装置を開発した。間質細胞を、ポリエステル製不織繊維マトリックス（５４）でできた多孔性有機担体上に播き、比較的少量で細胞数が多くなるような増殖を可能にした。担体の構造と充填が、局所的濃度と間質細胞産物（例えば、ＥＣＭタンパク質、サイトカイン等、５５）の遊離だけでなく、酸素と栄養分の移転に主な影響を与える。さらに、この装置で培養された間質細胞の、直接的な細胞−細胞接触によって、移植可能なヒト造血幹細胞の維持／増加を促進する能力は、先行技術による方法よりも遙かに優れていることが測定されている。さらに、本システムで培養された馴化培地の、そこに含まれている新規の間質細胞関連幹細胞因子によって、移植可能なヒト造血幹細胞の維持／増加を促進する能力は、先行技術による方法よりも遙かに優れていることが測定されている。
【００１２】
本発明の態様の一つによって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する方法において、（ａ）未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および、（ｂ）上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に３次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、本方法は、さらに、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
【００１４】
本発明の別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する方法において、（ａ）未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および（ｂ）上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に３次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中で培養して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程を含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、（ａ）固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞培養を樹立して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程、および（ｂ）所望の間質細胞密度に達したら、該固定相栓流バイオリアクターから培地を回収して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する上で有用な間質細胞馴化培地を得る工程を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法において、（ａ）（ｉ）未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および（ｉｉ）上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に３次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程、および、（ｂ）工程（ａ）で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する工程を含む方法が提供される。
【００１７】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、本方法は、さらに、工程（ｂ）の前に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法において、（ａ）（ｉ）未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および（ｉｉ）上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に３次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターから得られた間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する工程を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によって、入り口と出口をもつ容器で、その中に生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含み、担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６個の間質細胞を支持しているシート状担体を含む容器を含むバイオリアクタープラグが提供される。
本発明のさらに別の態様によって、上記バイオリアクタープラグを含む栓流バイオリアクターが提供される。
【００２０】
後述する本発明の好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離される細胞である。
【００２１】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は共通のＨＬＡ抗原をもつ。
【００２２】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は単一個体に由来する。
【００２３】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異なった個体に由来する。
【００２４】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は同一種に由来する。
【００２５】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異種に由来する。
【００２６】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体１立方センチメートルあたり少なくとも５×１０６細胞という密度にまで増殖している。
【００２７】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体１立方センチメートルあたり少なくとも１０７細胞という密度にまで増殖している。
【００２８】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも１０時間該バイオリアクターの中の流れが停止される。
【００２９】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、繊維の孔は、全容量に対する割合にして４０％から９５％を構成し、孔の大きさが１０ミクロンから１００ミクロンである。
【００３０】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、直径または幅が０．５ミクロンから５０ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている。
【００３１】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、幅２ミクロンからであるリボン状繊維から構成されている。好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも２：１である。
【００３２】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、全容量に対する割合が６０％から９５％の孔容量をもつ。
【００３３】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスの高さは５０〜１０００μｍである。
【００３４】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスの材料は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される。
【００３５】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される。
【００３６】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスはポリ−Ｄ−リジンで被覆されている。
【００３７】
本発明は、未分化の造血幹細胞を増加／維持するためのより有効な手段を提供することによって、現在知られている構成の短所に対処することに成功している。
【００３８】
本発明に係る方法およびバイオリアクターを実施するには、手動、自動、またはそれらを併用して、選択された作業または工程を実施または完遂することが含まれるかもしれない。その上、本発明に係る方法およびバイオリアクターの好適な態様である実際の機器および装置によっては、選択された工程のいくつかは、ハードウエア、または何らかのファームウエアのオペレーティングシステム上のソフトウエア、またはそれらの併用によって実施することができるかもしれない。例えば、ハードウエアとして、選択された本発明の工程をチップまたは回路として行なうことができるかもしれない。ソフトウエアとして、選択された本発明の工程を、何らかの適当なオペレーティングシステムを用いてコンピュータが実行するソフトウエアによる複数の命令として実施することができる。いずれの場合にも、本発明に係る方法およびバイオリアクターの選択された工程は、複数の命令を実行するためのコンピュータ用プラットホームなどのデータプロセッサによって実行されるものとして説明することもできよう。
ここで、添付の図面を参照しながら、実施例のみによって本発明を説明する。以下では図面を説明しながら具体的に説明してゆくが、示された各図面は、具体例を示すことによって、本発明の好適な態様を具体的に検討する目的のためだけのものであり、最も有用、かつ容易に理解できると考える、発明の原理および概念的態様に関する記載を提供するために提示されたものであることをここで強調しておく。この点で、図面とともに説明を読めば、当業者は、発明のいくつかの形を実際に具体化する方法が明らかになるという程度に発明を基本的に理解する以上には、発明の構成の詳細を詳述する意図はない。
図面において、
図１は、本発明を実施するときに役立つよう、栓流バイオリアクター２０の例を図解したものである。１−培地貯蔵容器；２−気体混合用容器；３−気体濾過装置；４−注入ポイント；５−栓流バイオリアクター２０のプラグまたは容器；６−液流監視装置；６ａ−液流バルブ；７−馴化培地回収／分離用容器；８−培地交換用容器；９−蠕動ポンプ；１０−サンプリングポイント；１１−培地交換用容器；１２−Ｏ２モニター；１４−ステアリング装置；ＰＨ−ｐＨ測定針。
図２は、１４Ｆ１．１細胞によるＣＡＦＣ維持を示している。臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、限界稀釈して、照射済みの１４Ｆ１．１または初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。５週間後に敷石形成を測定した。結果は、２回の独立実験による平均値±ＳＤを表す。
図３は、１４Ｆ１．１細胞によるＬＴＣ−ＩＣ維持を示している。臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、限界稀釈して、照射済みの１４Ｆ１．１または初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。７週間後にミエロイドコロニー形成を測定した。ＦＬＴ３リガンド（３００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（３００ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を毎週培地を交換するときに添加した。結果は、２回の実験による平均値±ＳＤを表す。
図４は、１４Ｆ１．１および初代ヒト骨髄間質細胞上でのＣＤ３４＋３８−細胞の増加を示している。ＣＤ３４＋細胞を、１４Ｆ１．１または７０ＣＤ３４＋３８−における初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。サイトカインを毎週添加した。７〜２１日後に培養細胞をトリプシン処理した。ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３４＋ＣＤ３８−を測定した。結果は、２回の実験による平均値±ＳＤを表す。
図５ａ〜ｂは、１４Ｆ１．１間質細胞株を播いた担体の１０日後（図５ａ）または４０日後（図ｂ）の走査式電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。倍率：×１５０。
図６ａ〜ｂは、ＣＤ３４＋３８−の増加に対する３Ｄ対２Ｄの１４Ｆ１．１馴化培地の効果を示している。１４Ｆ１．１および初代ヒト骨髄間質細胞に由来する、さまざまな濃度の馴化培地存在下で、ＣＤ３４＋細胞を懸濁培地に播いた。ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数を測定した。結果は、２回の実験による平均値±ＳＤを表す。
図７は、間質細胞被覆担体上でのＣＤ３４＋３８−細胞の維持を示している。間質細胞被覆担体は、３Ｄ装置から取りだして、シリコン被覆した９６穴プレートに移し、１．５×１０４のＣＤ３４＋細胞を加えた。対照は、担体のみを含むものと、担体と同じ数の単層（２Ｄ）増殖させた１４Ｆ１．１細胞を含むものであった。一定の時点で細胞を回収して、ＦＡＣＳによって解析した。結果は、２回の独立実験による平均値±ＳＤを表す。
【００３９】
好適な実施態様の説明
本発明は、レシピエントへの移植に用いるか、以下でさらに詳述するような目的に使用することのできる造血幹細胞を増加／維持する方法およびバイオリアクターに関するものである。具体的には、本発明は、さまざまな応用に用いることのできる、造血幹細胞を維持および／または増加、および／または、造血幹細胞を維持および／または増加させるための馴化培地を作製するための３次元の間質細胞栓流バイオリアクターである。
【００４０】
本発明の原理と操作は、添付された図面および明細書を参照すれば、よりよく理解できよう。
【００４１】
少なくとも一つの本発明の実施態様を説明する前に、本発明は、その応用が、以下の説明で示されるか、図面に描かれた要素の詳しい構成および配置に限定されないことを理解されるべきである。本発明は、他の実施態様をとることができ、または、さまざまな方法で実施することができる。また、ここで使用する語句および用語は、説明のためのものであって、限定的なものではないことも理解されるべきである。
【００４２】
移植可能なヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を長期間生体外で維持または増加することを目的とする現在の方法は、今までのところ、限定的な成功しか収めていない。骨髄の微小環境を正確に模倣して、骨髄の間質細胞の増殖を支持し、長期間維持することができる新規の３次元（３Ｄ）栓流バイオリアクターをここで説明する。間質細胞を、ポリエステル製の不織繊維マトリックスでできた多孔性の担体に播くと、比較的少量で多数の細胞を増殖させることが可能になる。次の実施例の項で提示されている実例では、バイオリアクターにマウス１４Ｆ１．１間質細胞株を播くか、あるいは、初代ヒト骨髄間質細胞を播いた。細胞を播いてから４０日後までに、担体は、１００倍の細胞密度をもつようになった。さまざまなレベルのカラムで密度は同一であり、このことは、酸素と栄養分が均一に細胞まで移動したことを示している。ヒト臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋３８−細胞の長期間維持を支持するには、間質細胞によって馴化された、バイオリアクター内の培地（３Ｄ  ＳＣＭ）の方が、間質細胞の単層（２Ｄ）ＳＣＭよりも優れていた。また、３Ｄ  ＳＣＭは、ＳＣＩＤ／ＮＯＤ再増殖細胞（ＳＲＣ）を代表するＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋細胞の増加を支持することもできた。サイトカイン（ＦＬＴ３リガンドとＴＰＯ）存在下では、３Ｄ  ＳＣＭは、幹細胞の自己複製を促進し、分化を抑制したが、２Ｄ  ＳＣＭ＋サイトカインによって、これと反対の効果が誘導された。また、３次元の間質−幹細胞培養は、単層の間質細胞上で培養したときよりも優れたＣＤ３４＋３８−細胞維持を示した。これらの知見は、３Ｄ栓流バイオリアクターが、優れた間質細胞−幹細胞接触によって、そして、おそらく、既知および／または新規の幹細胞制御因子によって、ヒトＨＳＣを生体外で維持／増加するのに適した装置を提供することを示している。
【００４３】
ヒトＨＳＣは、移植および遺伝子治療にとって重要な標的である。ＨＳＣの頻度が非常に減少すること、および、最終分化がないときに、幹細胞の自己複製を誘導することができる増殖因子を今の所利用できないことが、相変わらず、このような方法を実施したり、ＨＳＣ「バンク」を大規模に準備する上での主な障害となっている。
【００４４】
未分化のヒトＨＳＣの長期間維持／増加をめざす現在の方法は、今までのところ、限定的にしか成功していない。サイトカイン添加懸濁培養を用いた最近の研究では、いくらかのＳＲＣ増加が示されたが、この処理過程は、初期造血前駆細胞の大量の増加もともなっていた（５３、６２）。このことは、幹細胞の分化がかなりの程度起こっていることを示すものである。理想的な装置は、例えば、、ＳＲＣが増加しても、ＬＴＣ−ＩＣは少ない数のままでいるようなものである。
【００４５】
造血細胞増加のために今ある装置は、灌流させた造血細胞の懸濁培養を単独で（米国特許第５，６４６，０４３号参照）、または間質細胞単層（米国特許第５，６０５，８２２号参照）上に播いて用いる。前者の装置では、関係する前駆細胞の膨大な産生が起こるが、後者では、単層の間質細胞−幹細胞相互作用という非生理学的な性質が問題となる。幹細胞を増加させるための別の装置では、間質細胞馴化培地の使用が記載されている（米国特許第４，５３６，１５１号、および第５，４３７，９９４号）。しかし、後者は、間質細胞単層から得られたものであり、本明細書において、３Ｄ  ＳＣＭと比較して幹細胞活性化能力が劣り、また異なっていると明示されている（実施例の項の表３を参照）。最近になって、間質細胞被覆ガラスビーズを用いた固定相バイオリアクターが記述されている（米国特許第５，９０６，９４０号）が、このビーズは、生理学的な３Ｄ構造を提供しておらず、本発明を実施したときに用いる担体と比較すると、間質細胞を１ｍｌあたり１０倍少ない数しか増殖させることができない。３Ｄ由来のＳＣＭ、または３Ｄ間質細胞培養が優れたＣＤ３４＋３８−細胞維持能力をもつという、ここで示された知見によって、単層間質細胞培養に対する３Ｄの利点が明確になる（図６と７参照）。３Ｄ  ＳＣＭの優れた効果は、既知のサイトカインまたは新規の幹細胞制御因子の量が上昇したためであろう。
【００４６】
３Ｄ  ＳＣＭとさまざまなサイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＴＰＯ等）を組み合わせたときのＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋（またはＳＲＣ）の維持／増加に対する効果を評価するための実験（表３）は、ＦＬＴ３リガンドおよびＴＰＯが存在するときには３Ｄ  ＳＣＭの有利な効果が示されたが、ＳＣＦでは示されなかった。これら知見は、幹細胞分化に対する３Ｄ  ＳＣＭの相対的な阻害効果によるものかもしれない。これらの知見は、３Ｄ条件下では、それ自体は活性が低いが、こうしたサイトカインと協働的に作用する新規の間質細胞関連因子が産生されたことを強く示している。ＣＤ３４＋の出力に加えて、ＬＴＣ−ＩＣおよび関連前駆細胞（ＧＭ−ＣＦＵ）出力値を使用することによって、幹細胞分化をテストできるようになる。
【００４７】
ここで説明するバイオリアクターは、３Ｄ間質細胞培養を連続的な流動装置と組み合わせた点でユニークである。連続的な培地の流動のない３Ｄ間質細胞−造血細胞システムについては最近の記述が見られる（米国特許第５，５４１，１０７号）が、本明細書で説明する知見（例えば、図７参照）によれば、連続的に流動させない場合には、単層と比較した場合の３Ｄ間質細胞培養の利点は減少することが明らかになっている。
【００４８】
ここで説明する３Ｄ栓流バイオリアクターは、間質細胞株、および初代骨髄間質細胞の長期増殖を支持することができる。バイオリアクターにおける間質細胞の使用は、優れた間質細胞−幹細胞の接触（ユニークな「ニッチ」、および細胞−細胞、細胞−ＥＣＭ相互作用による）を確保するために必須であるだけでなく、間質細胞による既知または新規の可溶性膜結合サイトカインの産生にも必須である。遺伝子工学的に作製されたサイトカイン産生変異株を用いることによって、間質細胞は、このようなバイオリアクターに適当なサイトカインを補充するのを容易にすることができる。
【００４９】
バイオリアクターの間質細胞は、バイオリアクターそのもの中でレトロウイルスパッケージング用細胞株となって、幹細胞の中に遺伝物質を効率よく導入することができるように改造することができる。また、バイオリアクターの中でさまざまな幹細胞を使用することによって、間質細胞に接着する能力が低いことで知られているＰｈ陽性幹細胞（６３）を排除するのに最も適した担体を選択できるかもしれない。初代間質細胞には、「自家性」の間質細胞−幹細胞バイオリアクターで、自家性の幹細胞または臍帯血幹細胞でさえも増加することができ、移植する前に間質細胞を除去する必要がないというバイオリアクターを樹立できるという利点がある。
【００５０】
バイオリアクターへの初回播種実験では、担体内でのＣＤ３４＋３８−細胞の収率はどちらかといえば低かったが、細胞を播いた後の培地の流速と、最初にバイオリアクターの中に播くＣＤ３４＋細胞の数は容易に最適化することができる。細胞を播いた後の早い時点（１〜４日後）でのＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋解析が、このような最適化には必須である。
【００５１】
先行技術の方法と明確に異なり、本発明のバイオリアクターは、骨髄の機械的な構造基盤を模倣するよう、間質細胞を接着させるために利用できる接着表面がかなり増加している増殖用マトリックスを使用する。例えば、０．５ｍｍの高さの増殖用マトリックスでは、増殖用マトリックスの基盤からの突起から計算すると、少なくとも５〜３０倍増加している。約５〜３０倍という、このような増加は、層単位あたりであり、積み重なっていようと、スペーサーなどによって離れていようと、このような層が複数用いられていれば、このような構造物の一枚あたりについて、５〜３０倍という係数が適用される。マトリックスが、好ましくは、不織繊維シートである、シートという形、または開孔発泡ポリマーのシートにして用いるときは好適な厚さは約５０〜１０００μｍ以上で、細胞の侵入、栄養分の侵入に適し、また、排出産物をシートから除去するのに適した孔が提供される。好適な実施態様によれば、孔の効果的な直径は１０μｍから１００μｍである。このようなシートは、さまざまな厚さの繊維から調製することができ、好ましい繊維の厚さまたは繊維の直径は約０．５μｍから２０μｍの範囲であり、さらにより好ましい繊維は、直径が約１０μｍから１５μｍの範囲である。
【００５２】
本発明の構造物は、寸法安定性と物理的強度を持たせるための多孔性支持シートまたはスクリーンによって支持されるか、さらによいのは、それに結合することができる。
【００５３】
また、このようなマトリックスシートは、切ったり、穴を開けたり、切り刻んだりして、約０．２ｍｍ２から約１０ｍｍ２までの突起領域をもち、同じ範囲の厚さ（約５０から１０００μｍ）をもつ粒子を提供することができる。
【００５４】
製造法に関する詳細については、本発明を実施したときに用いた増殖用マトリックスの使用および／または長所が、米国特許第５，１６８，０８５号と、特に、第５，２６６，４７６号に記載されており、これらは両方とも、ここにおいて参照として組み込まれる。
【００５５】
当業者には容易に理解できるように、本発明は、以下のような、しかし、これらには限定されない、さまざまな応用場面に用いることができる、増大した未分化造血幹細胞の集団を提供する：（ｉ）移植前に間質細胞−幹細胞を分離する必要のない、レシピエントの間質上でのヒト幹細胞（自家性または臍帯血由来）の増加、（ｉｉ）自家環境における、間質細胞−幹細胞相互作用によるＰｈ＋ＣＭＬ幹細胞の枯渇、（ｉｉｉ）バイオリアクター内にあるか、またはバイオリアクターから回収してからの自己複製幹細胞の中への遺伝子移入；（ｉｖ）未分化造血幹細胞を生体外で維持／増加させるための、懸濁培養または幹細胞バイオリアクターにおける、３Ｄ間質細胞馴化培地（ＳＣＭ）の生産；（ｖ）分化のない状態で幹細胞の自己複製を誘導する新規タンパク質、および、さらに別の生物学的機能をもつタンパク質の単離；（ｖｉ）新規の間質細胞関連幹細胞制御因子、および、さらに別の生物学的機能をもつ幹細胞遺伝子産物をクローニングするための３Ｄ幹細胞ＲＮＡの単離。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を得る。次に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を、図１に、その実例が参照用の番号とともに図示されている固定相栓流バイオリアクターの中に播くが、その中では、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの３次元の間質細胞培養が予め樹立されている。こうして、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化造血幹細胞または前駆細胞が増加／維持される。
【００５７】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「未分化の造血幹細胞」という語句は、まだ特定化されていない造血細胞を意味する。
【００５８】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「前駆細胞」という語句は、特定化されているが、未成熟の造血細胞を意味する。
【００５９】
未分化造血幹細胞も前駆細胞もＣＤ３４＋細胞である。したがって、「未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得ること」という語句、およびそれと同義の「未分化の造血幹細胞または前駆細胞が得られる」という語句は、どちらも、単離された未分化の造血幹細胞および／または前駆細胞、または、未分化の造血幹細胞および前駆細胞を含むＣＤ３４＋細胞の集団を取得することを意味する。
【００６０】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「増加させること」および「増加」という語は、実質的に分化のない細胞増殖、すなわち、細胞の増加に伴う分化なしに細胞集団が増加することを意味する。
【００６１】
ここで、「維持すること」および「維持」という語は、実質的に分化のない細胞の自己複製、すなわち、細胞の定常化に伴う分化のない実質的に定常的な細胞集団を意味する。
【００６２】
ここで、「分化」という語は、発生の過程で、相対的に一般的な種類から特異的な種類に変化することを意味する。さまざまな細胞系譜の細胞分化は、充分に記述されているプロセスであるから、ここでさらに記述する必要はない。
【００６３】
ここで、「生体外」という語は、生体から取り出された細胞で、生体の外部（例えば、試験管）で増殖される細胞を意味する。
【００６４】
増加後、例えば、そのとき増加した未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、蛍光活性化細胞選別、および親和性基質による親和分離法などであるが、これらに限定されない、さまざまな親和分離／標識技術によって単離することができる。このような単離法を実施するために使用できる親和性分子には、例えば、ＣＤ３４＋細胞に結合する抗ＣＤ３４抗体などがある。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持するもう一つの方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を得る。次に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を全成分または添加成分として間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養するが、この間質細胞馴化培地は、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの３次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターから得られるものであり、これによって、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化の造血幹細胞または前駆細胞が増加し／維持される。
【００６６】
本発明のさらに別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの間質細胞培養を樹立して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する。次に、所望の間質細胞密度すなわち、例えば、マトリックス１立方センチメートルあたり約５×１０６または１０７を超える密度に達したら、固定相栓流バイオリアクターから培地を回収すると、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する上で有用な間質細胞馴化培地が得られる。
【００６７】
本発明のさらに別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、上記の方法のいずれかによって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加／維持する。次に、最初の工程で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する。
【００６８】
図１に示すように、本発明のさらに別の態様によれば、容器５を含むバイオリアクタープラグで、典型的にはカラムの形をしており、入り口と出口をもち、また、その中に、生理学的に許容できる３次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含み、担体１立方センチメートルあたり、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの少なくとも５×１０６個、好ましくは、少なくとも１０７個の間質細胞を支持するシート状担体を含むものが提供される。
【００６９】
本発明のさらに別の態様によって、上記バイオリアクタープラグを含む栓流バイオリアクターが提供される。
【００７０】
この点に関して、担体が、理論的には、１立方センチメートルあたり５×１０７個の細胞を支持できることが理解されよう。十分な細胞が担体上に蓄積したところで、照射などの手段を用いて、さらなる細胞増殖を中断させて、担体によって支持される細胞の正確な数を調節する。
【００７１】
本発明に係る方法を実施する際に、このような細胞の供給源として用いられる未分化の造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、サイトカインにより動員された末梢血（例えば、白血球搬出によって回収されたもの）、および骨髄など、そのすべてが未分化の造血幹細胞または前駆細胞を含むことが知られている組織で、しかもこれらに限定されない組織から精製または単離することができる。このような分離を行なう方法は、当技術分野において公知であるが、もっともよく用いられるのは、フルオロフォアによる親和標識でまず細胞を標識してから回収する蛍光活性化細胞選別法である。
【００７２】
本発明の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、共通のＨＬＡ抗原をもつ。本発明の別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、単一個体に由来する。したがって、それをレシピエントに移植する場合には細胞を分離する必要はない。
【００７３】
本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、異なった個体に由来する。例えば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞の将来のレシピエントを間質細胞を提供するために用いることもできるが、このような細胞をレシピエントに提供するため、ＨＬＡ適合性によって選択されたドナーから未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞を得ることもできる。したがって、ここでも、移植前に細胞を分離する必要はない。
【００７４】
本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、同一種に由来する。しかし、本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、異種に由来する。
【００７５】
本発明の現在の好適な態様によれば、固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも１０時間バイオリアクターの中の流れが停止され、それによって、細胞を間質細胞で被覆されたマトリックスに固定することができる。
【００７６】
以下の記載では、本発明を実施する際に用いられる好適な担体に関する考察を行なう。
【００７７】
すなわち、実施態様の一つによれば、担体の繊維は、全容量に対する割合にして４０％から９５％が孔を形成し、孔の大きさは１０ミクロンから１００ミクロンである。別の態様によれば、担体を作るマトリックスは、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維でできており、繊維の直径または幅は０．５ミクロンから５０ミクロンである。さらに別の態様によれば、マトリックスは、幅２ミクロンからの幅をもつ繊維から形成されたリボンから構成される。さらなる態様によれば、繊維の厚さに対する幅の割合は少なくとも２：１である。さらに別の態様によれば、担体を作るマトリックスは、全容量に対する割合で６０％から９５％の孔容量をもつ。さらに別の態様によれば、マトリックスの高さは５０〜１０００μｍであるが、ただし、それらを積み重ねたものを用いることができる。さらに別の態様によれば、担体を作るマトリックスの材料は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される。さらに別の態様によれば、マトリックスは、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択された形である。さらに別の態様によれば、マトリックスはポリ−Ｄ−リジンで被覆されている。
【００７８】
本発明のさらに別の目的、利点、および新規の特徴は、以下の実施例を調べれば、当業者に明らかとなろうが、実施例は、制限を意図したものではない。さらに、上記で概略され、後述する請求の範囲の項で請求されている、本発明のさまざまな実施態様および態様はそれぞれ、以下の実施例で実験的に裏付けられていることが分かる。
【００７９】
実施例
ここで、以下の実施例を説明するが、これらは、上記の説明と合わせて、発明を非限定的な方法で具体的に示すものである。
【００８０】
一般的に、ここで用いられる命名法、および本発明において利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えＤＮＡによる技術などがある。このような技術は、文献中で詳細に説明されている。例えば、「分子クロニーング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第ＩからＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．編（１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、メリーランド州ボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）にあるジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クロニーングの実践的手引き（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」ニューヨークにあるジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）」、ニューヨークにあるサイエンティフックアメリカンブックス社（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ）；Ｂｉｒｒｅｎら、（編）「ゲノム解析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、第１〜４巻、ニューヨークにあるコールドスプリングハーバーラボラトリープレス社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号で開示されている方法；「細胞生物学：実験室ハンドブック（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第ＩからＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第ＩからＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（編）「基礎および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版）、コネティカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ）にあるアップルトンアンドラング社（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ）（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）「細胞免疫学の精選された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、ニューヨークにあるＷ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法が、特許文献および科学論文で広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，���７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号、第５，２８１，５２１号を参照；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｇａｉｔ，  Ｍ．Ｊ．  ら、（１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．編（１９８５）；「転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」、Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．編（１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．，編（１９８６）；「固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）」、ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８６）；「分子クロニーングの実践的手引き（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）および「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１〜３１７巻、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用への手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）にあるアカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク質精製と特徴付けの方法：実験コースマニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９６）を参照のこと。そして、これらはすべて、本明細書において完全に開示されているものとして、参照して本明細書に組み入れられる。その他の一般的な参考文献は、本書類全部にわたって提示されている。それらに含まれている情報はすべて、参照してここに組み込まれる。
【００８１】
材料と実験方法
バイオリアクター：  本発明の記載に従って使用されるバイオリアクターが、図１に記載の設計にしたがって構築された。ガラス用具は、テクニオン社（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ）（イスラエル）で設計製造され、シリコンチューブ（デガニア社（Ｄｅｇａｎｉａ）、イスラエル）で接続した。担体を、Ｃａ＋２とＭｇ＋２を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、イスラエル）の中で一晩回転させて、その後、ＰＢＳと遊離した残渣を除去した。各カラムに１０ｍｌのパックされた担体を入れた。バイオリアクターをＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇで満たし、出口をすべて密封し、この装置をオートクレーブした（１２０℃、３０分間）。容器［８］を通してＰＢＳを取り除いてから、３７℃の保温器の中で、１０％の熱で不活化したウシ胎児血清（ＦＣＳ；ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、イスラエル）、およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｎｙｓｔａｔｉｎ混合液（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５μｎ／ｍｌ；ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ））を含む３００ｍｌのダルベッコの高グルコース培地（ＤＭＥＭ；ギブコＢＲＬ社（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））で４８時間にわたってバイオリアクターを循環させた。循環している培地を、上記＋２ｍＭＬ−グルタミンを含む新鮮なＤＭＥＭ（ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ））と交換した。
【００８２】
幹細胞：  幹細胞株は、十分に湿度が高い５％ＣＯ２インキュベーターの中で、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭに入れて３７℃で維持した。細胞は、組織培養用フラスコ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ））の中で増殖させ、コンフルエントな状態になったところでトリプシン処理をして分割した。初代ヒト骨髄間質細胞培養は、開心術を受けている血液学的には正常なドナーの吸引胸骨髄から樹立した。簡単に説明すると、骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ギブコＢＲＬ社（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））で３倍に稀釈して、フィコール−ハイペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）にあるリボンズサイエンティフィック社（Ｒｉｂｂｏｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．））密度勾配遠心にかけた。骨髄の単核細胞（＜１．０７７ｇｒ／ｃｍ３）を回収して、ＨＢＳＳで３回洗浄してから、１２．５％ＦＣＳ、１２．５％ウマ血清（ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ））、１０−４Ｍのβ−メルカプトエタノール（メルク社（Ｍｅｒｋ））、および１０〜６ｍｏｌ／Ｌのハイドロコルトワゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｗａｓｏｎｅ）コハク酸ナトリウム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を添加したＤＭＥＭからなる長期培養用（ＬＴＣ）培地に再懸濁した。細胞を２５ｍｌの組織培養用フラスコ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ））に入れて、３７℃で３日間（５％ＣＯ２）インキュベートしてから、毎週培地を交換しながら３３℃（同様）でインキュベートした。個別のドナーからの間質細胞が各バイオリアクターに対して用いられた。３Ｄおよび単層を実験するために、初代間質細胞培養を１０日毎にトリプシン処理（０．２５％トリプシンおよびＥＤＴＡを含むパックス食塩水（Ｐｕｃｋ'ｓ  Ｓａｌｉｎｅ）；（ベイトハエメックインダストリー社（Ｂｅｉｔ  Ｈａ'Ｅｍｅｋ））して分割して、間質細胞を十分に増加させた。ＬＴＣ−ＩＣおよびＣＡＦＣ（下記参照）については、１３７Ｃｓ線源を用いて間質細胞を照射（１５００ｃＧｙ）してから、培養物をＬＴＣ培地中３３℃で維持した。
【００８３】
間質細胞の播種：  間質細胞株のコンフルエントな培養細胞、または５週目の初代骨髄間質細胞をトリプシン処理し、ＨＢＳＳで３回洗浄してから、バイオリアクター用培地に再懸濁し（上記参照）、細胞数を数えて、１０６細胞／ｍｌの細胞１０ｍｌを注射ポイント（［４］、図１）を通して、バイオリアクターのガラスカラムの中の担体１０ｍｌの上に播種した。播種直後から１６時間循環を停止して、細胞を担体上に定着させた。担体を取り出して、ＭＴＴ法（５６）で細胞数を数えることによって、バイオリアクター内での間質細胞の増殖を監視した。間質細胞細胞がコンフルエントになったら、さらに実験を続ける（ＳＣＭの調製、幹細胞の播種など）ために、培地をＬＴＣ培地と交換した。
【００８４】
間質細胞馴化培地（ＳＣＭ）の調製：  同等の細胞密度で、単層およびバイオリアクターの間質細胞に新鮮なＬＴＣ培養培地を補充した。細胞を一晩インキュベートした後ＳＣＭを回収した。このために、３Ｄ培養の培地の流れを１６時間停止して、循環を再開する前にカラムから直接取り出した。ＳＲＣの間質細胞産生に与えるＣＤ３４＋細胞の効果を解析するために、３Ｄ装置にＣＤ３４＋を播いた後さまざまな時間（２〜７日間）を置いて循環を停止し、上記したようにして、カラムから培地を回収した。ＳＣＭを回転させ（１０００×ｇ、１０分間）、濾過してから−２０℃に保存した。バイオリアクター中の無血清培地の中でも間質細胞を増殖させて、ＳＣＭを回収し、それによって、不確定の変数を除去した。
【００８５】
ＣＤ３４＋細胞の単離：  運搬中無菌状態で運ばれてきた臍帯血サンプルを、フィコール−ハイペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）上で分画して、浮遊性（＜１．０７７ｇｒ／ｃｍ３）の単核細胞を回収した。各ＣＢサンプルから得られた細胞をプールして、抗ＣＤ３４抗体とともにインキュベートし、ミディＭＡＣＳ（ミルテニルバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））によって単離した。
【００８６】
ＣＤ３４＋細胞の懸濁培養：  ０．５ｍｌの０〜１００％ＳＣＭに、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３リガンド、ＳＣＦまたはＴＰＯを単独で、または組み合わせて添加するか、または全く添加しないものを２４穴プレート（ＴＰＰ、スイス）に入れ、その中でＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（５×１０５／ウエル）をインキュベートした。対照は、ＬＴＣ培地にサイトカインを加えたものか加えないものであった。細胞は、空気中５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。培養培地は毎週交換した。播種前のさまざまな時点（１〜３週間）で細胞を回収し、ＣＤ３４＋／３８−／ＣＸＣＲ４＋をフローサイトメトリーによって数を数えて測定した。出力アッセイ法は、ＳＲＣ、ＣＡＦＣおよびＬＴＣ−ＩＣを含むこともある。
【００８７】
間質−幹細胞培養：  単離・プールしたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を同じくらいの数（約５×１０５）になるよう、単層上、または、コンフルエントな間質細胞と同じくらいの密度状態のバイオリアクターに播いた。バイオリアクターに添加するときには、間質細胞と接触できるよう、培地の流れを１６時間停止した後、１分間あたり０．１〜１．０ｍｌという速さで再開した。対照実験のため、培地交換をしないで、ＣＤ３４＋細胞を播いた間質細胞担体を取り出した。サイトカイン入りか、サイトカインなしのＬＴＣ培地中で同時培養を続けた。さまざまな時点（４週間後まで）で、非接着細胞を、単層の上清から、または循環している培養培地から容器（［８］、図１）を通して回収した。連続的にトリプシン処理を行ない、さらに、ＥＤＴＡを主成分とする解離用バッファー（ギブコＢＲＬ社）に曝した後、ゆっくりと細胞をピペッティングして、接着細胞を回収した。こうして得られた懸濁液の中に間質細胞が混じらないようにするため、細胞をＨＢＳＳ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、プラスチック製の培養皿（コーニング社）に入れて、３７℃で６０分間接着処理を行なった。循環する造血細胞と担体に単離された造血細胞を洗って、別々に、フローサイトメトリーによって、ＣＤ３４＋／３８−／ＣＸＣＲ４＋を数えて測定した。出力アッセイ法は、ＳＲＣ、ＣＡＦＣおよびＬＴＣ−ＩＣを含むこともある。
【００８８】
フローサイトメトリー：  飽和濃度のモノクローナル抗−ＣＤ３４＋ＰｅｒＣＰ抗体（ベクトン−ディキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））、抗−ＣＸＣＲ４−フルオロセインイソチオシアネート抗体（ＦＩＴＣ、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））、およびフィコエリトリン抗体（ＰＥ、ベクトン−ディキンソン社）とともに細胞を４℃で３０分間インキュベートした。５％熱不活性化ＦＣＳを含む氷冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄してから、ＦＡＣＳｓｃａｎ（ベクトン−ディキンソン社）上で３色フローサイトメトリーを行なうために再懸濁した。
【００８９】
ＬＴＣ−ＩＣアッセイ法およびＣＡＦＣアッセイ法：  以前の記載（１６、１７）にしたがって、単離したばかりのＣＤ３４＋細胞、間質細胞との同時培養か懸濁培養から単離した細胞を、ＬＴＣ−ＩＣとＣＡＦＣについて測定した。コンフルエントな初代骨髄間質細胞をトリプシン処理してから照射し（１５００ｃＧｙ）、９６穴プレート（コーニング社）０．１ｍｌの中に１．５×１０４／ウエルになるよう播いた。２４反復用ウエル／グループを樹立した。間質細胞の上をＣＤ３４＋細胞の連続稀釈（５００〜５細胞／ウエル）を含むＬＴＣ培地０．１ｍｌ、またはさまざまなアッセイから回収した細胞の連続稀釈液で覆った。培養液はそのまま、毎週半分の培地を交換しながら、３３℃で５週間インキュベートした。プレートを１０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、培養上清を取り除き、以前の記載（５７）にしたがって、メチルセルロース培養液、および骨髄前駆細胞アッセイを行うためのサイトカインをオーバーレイした。１４日後にコロニー数を数え、３７％の陰性培養になる被験細胞の濃度の逆数によって（１６）ＬＴＣ−ＩＣの頻度を決定した。ＣＡＦＣアッセイ法は、メチルセルロースおよびサイトカインをオーバーレイしない点を除いて、基本的には上記と同様に行なった。被験細胞懸濁液を連続稀釈して播いてから６週間後に、間質細胞層の下にある少なくとも５個の細胞（敷石領域）のうち少なくとも位相が濃い造血細胞クローンが一つあるウエルを判定した。
【００９０】
実験結果
本発明を実施する際に用いたバイオリアクター装置を図１に示す。これは、４本の平行栓流バイオリアクターユニット［５］を含んでいた。各バイオリアクターユニットには、ポリエステルの不織繊維マトリックス（５８）でできた１  ｇの多孔性担体が入っていた（直径４ｍｍ）。これらの担体は、比較的小さい容量で多数の細胞を増殖させることができる。担体の構造と詰め方が、酸素と栄養分の移動、また、局所的な濃度および遊離した間質細胞産物（例えば、ＥＣＭタンパク質、サイトカインなど、５９）に主要な影響を与える。バイオリアクターは、インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【００９１】
各バイオリアクターの流れを監視し［６］、バルブ［６ａ］によって調節した。各バイオリアクターは、サンプリングポイントと注入ポイント［４］をもっていて、間質細胞と造血細胞を連続的に播種できるようになっている。培養培地は、貯蔵容器［１］からｐＨ７．０で供給された［１３］。貯蔵容器には、カラムからの出口で５〜４０％の溶解酸素が維持できるよう、バイオリアクター内の細胞密度に応じて決まるさまざまなな空気／ＣＯ２／Ｏ２［２］の割合を含む濾過混合気体［３］を供給した。監視装置［１２］によって測定したところ、Ｏ２の割合は、バイオリアクターの出口の所で溶解しているＯ２レベルに適合していた。混合気体は、シリコンチューブを経由して貯蔵用容器に送られる。培養培地は、循環する非接着細胞を回収することのできる別の容器［７］を通って来る。培地の循環は、０．１〜３ｍｌ／分という速度で動く蠕動ポンプ［９］という手段によって得られた。バイオリアクターユニットは、さらに、サンプリングポイント［１０］と、１０〜５０ｍｌ／日の速度で連続的に培地を交換するための２つの容器［８、１１］を備えていた。４本平行になったバイオリアクターユニットを使用することによって、細胞の取り出し、走査式電子顕微鏡、組織学法、免疫組織化学法、ＲＮＡ抽出等の目的で、周期的に取り外すことが可能になっている。
【００９２】
実験の一つにおいて、マウス１４Ｆ１．１間質細胞株（２４、６０、６１）を含むバイオリアクター装置で、分化を開始したヒト骨髄前駆細胞の増殖を支持することが以前示されているバイオリアクター（２４）を確立した。この細胞株は、初代ヒト骨髄間質細胞だけでなく、ヒトＣＢ  ＣＡＦＣ（図２）、ＬＴＣ−ＩＣ（図３）、およびＣＤ３４＋３８−細胞（図４）も同様に支持することができる。また、これらの図に示された結果は、ＦＬＴ３リガンド＋ＴＰＯをこれらの培養細胞に添加したとき、ＬＴＣ−ＩＣには効果を与えなかったが、ＣＡＦＣおよびＣＤ３４＋３８−細胞の出力を有意に促進したことを示している。これに対して、ＳＣＦは、ＬＴＣ−ＩＣとＣＡＦＣの両方で減少を招いた。培養容量１０ｍｌあたり１．５×１０６個の細胞をバイオリアクターに播種すると、１４Ｆ１．１細胞が増殖して、担体上に広がった（図５）。播種後４０日目までに、担体の細胞密度は１００倍、すなわち、約１．５×１０６細胞／担体、１．５×１０７細胞／ｍｌという密度まで増加した（表１）。
【表１】
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【００９３】
さまざまなレベルのカラムで担体上の細胞密度は同じであったが、このことは、細胞への酸素と栄養分の移動が均一であったことを示している。これらの細胞について培養条件を最適化させると、培養培地（ダルベッコの高グルコース培地＋１０％ウシ胎児血清）、流速（１ｍｌ／分）、培地交換頻度（週に１回）、初回播種濃度（上記の通り）となった。コラーゲンまたはポリＬ−リジンによる担体被覆には、１４Ｆ１．１細胞の増殖率と最終濃度に有利な効果がないことが分かった。初代ヒト骨髄間質細胞による予備的知見（表１）は、１４Ｆ１．１と初代間質細胞が、それぞれ播種後１０日目と１４日目で同じ密度になることを明らかにした。
【００９４】
バイオリアクター内での間質細胞の機能活性を測定するために、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を播種した懸濁培養におけるＣＤ３４＋３８−細胞に対する、バイオリアクターカラム（３Ｄ  ＳＣＭ）から得られた間質細胞馴化培地（ＳＣＭ）の効果を判定した。活性を同じ濃度の間質細胞を含む単層培養（２Ｄ  ＳＣＭ）から得られたＳＣＭと比較した。図６に示したように、１４Ｆ１．１細胞からのＳＣＭは、初代骨髄間質細胞からのＳＣＭと同等またはそれ以上にヒトＣＢ  ＣＤ３４＋３８−細胞の維持を支持できることが分かった。１４Ｆ１．１  ＳＣＭの最大効果は、常に、初代骨髄ＳＣＭよりも低い濃度で見られた。さらに、３Ｄ  ＳＣＭは、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋３８−細胞の増加を支持する上で、どちらの細胞型の２Ｄ  ＳＣＭよりも優れていることが分かった。２Ｄと３Ｄ  ＳＣＭの間における活性の違いは、培養期間が長いほど（１４日対２１日）はっきりした。１４Ｆ１．１  ３Ｄ  ＳＣＭをヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞に加えても、培地のみを含む対照培養と較べると、ＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋細胞が維持される結果になった（表２）。
【表２】
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【００９５】
表３は、２Ｄ対３Ｄ  ＳＣＭを含むＣＤ３４＋懸濁培養における、サイトカインの効果を示している。この結果は、ＣＤ３４＋３８−、およびより重要なことには、ＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋（ＳＲＣ）サブセットの両方を維持する上で、３Ｄ  ＳＣＭが２Ｄ  ＳＣＭよりも優れていることを示している。
【表３】
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【００９６】
このことは、ＣＤ３４＋細胞を回収して検出したところ、２Ｄ  ＳＣＭの方が細胞分化に対する効果が強かったことと関連するのかもしれない。ＴＰＯ＋ＦＬＴ３リガンドは、２Ｄ  ＳＣＭ存在下ではＣＤ３４＋３８−／ＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋の収率を低下させたが、３Ｄ  ＳＣＭを添加した培地での収率を上昇させた。ＣＤ３４＋表面マーカーによって測定したところ、これもまた、３Ｄ装置における分化の程度が低いことに起因するのかもしれない。２Ｄ  ＳＣＭおよび３Ｄ  ＳＣＭの両培養において、ＳＣＦは、幹細胞分化の顕著な増加と、ＣＤ３４＋３８−／ＣＤ３４＋３８−ＣＸＣＲ４＋の収量の顕著な低下を引き起こした。
【００９７】
本発明者らのバイオリアクターにおける間質細胞と幹細胞の相互作用を測定するため、間質細胞（１４Ｆ１．１）で被覆した担体上でのＣＤ３４＋３８−細胞の維持／増加を最初に評価した。担体をバイオリアクターから取り出して、シリコン被覆した９６穴プレートに入れ、ＣＤ３４＋細胞を加えた。対照は、担体のみを含み、担体と同数の単層１４Ｆ１．１細胞を含んでいた。図７に示すように、ＣＤ３４＋３８−細胞の生存は、担体のみの存在下で促進され、３Ｄ構造物が、初期前駆細胞（３６）の生存／維持に有益な効果を与えることが確認された。間質細胞で被覆された担体は、ＣＤ３４＋３８−細胞の７日後の生存／維持を促進するときに、担体のみ、または単層１４Ｆ１．１細胞よりも優れていた。長期培養（１４日目）は、１４Ｆ１．１単層と１４Ｆ１．１被覆担体の両培養において、ＣＤ３４＋３８−数の増加をもたらした。
【００９８】
その後の実験では、非照射１４Ｆ１．１被覆担体の４本のカラムを含むバイオリアクター中の、３５０ｍｌの循環する培養培地に、６×１０６個のプールしたＣＢ  ＣＤ３４＋（３×１０５のＣＤ３４＋３８−）を播種した。１６時間培地の流れを停止させ、その後、正常な速さ（１ｍｌ／分）で培養を続けた。培養４日目に、回収した生細胞をＦＡＣＳ解析したところ、循環培地には、最初に播種したＣＤ３４＋３８−細胞の１０％が含まれていた。培養１８日目には、循環培地には、ＣＤ３４＋３８−細胞の０．４％が含まれていたが、担体に接着した細胞は、最初に播種したＣＤ３４＋３８−集団の３％を含んでいた。
【００９９】
本発明を具体的な実施態様とともに説明してきたが、多くの代替、改変、変更が可能であることは当業者にとって明らかなことである。したがって、本明細書に添付した請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれる限り、そのような代替、改変、変更も本発明に含まれるものである。本明細書で引用した刊行物のすべてを、全文、参照して組み込む。本願で引用または確認した参考文献を、それらの文献が、本発明の先行技術として利用できるものとして許可していると解してはならない。
【参考文献】
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0004523169.tif 000006
0004523169.tif 000007
0004523169.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明を実施するときに役立つよう、栓流バイオリアクター２０の例を図解したものである。
【図２】  １４Ｆ１．１細胞によるＣＡＦＣ維持を示している。
【図３】  １４Ｆ１．１細胞によるＬＴＣ−ＩＣ維持を示している。
【図４】  １４Ｆ１．１および初代ヒト骨髄間質細胞上でのＣＤ３４＋３８−細胞の増加を示している。
【図５】  １４Ｆ１．１間質細胞株を播いた担体の１０日後（図５ａ）または４０日後（図ｂ）の走査式電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図６】  ＣＤ３４＋３８−の増加に対する３Ｄ対２Ｄの１４Ｆ１．１馴化培地の効果を示している。
【図７】  間質細胞被覆担体上でのＣＤ３４＋３８−細胞の維持を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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