(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の核酸配列のコーディング配列を含む、精製し単離した核酸組成物。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸配列を含む、精製し単離したタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸組成物から製造される組換えタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸組成物のコーディング配列を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含む、ママスタチンの核酸および／またはポリペプチドを検出するための癌診断キット。
【請求項６】
さらに抗−ママスタチン抗体を含む、請求項５に記載の診断キット。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項８】
配列番号：１の核酸配列または配列番号：２のアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項９】
乳房細胞癌腫の モニタリング方法であって、
配列番号：１の核酸配列または配列番号：２のアミノ酸配列の存在について患者の血液サンプルまたは組織サンプルを分析し、ついで
正常コントロールに比較してママスタチンの不在または低減を乳房細胞癌腫に相関させる
ことを含む方法。
【請求項１０】
ヒト乳房細胞のインビトロでの増殖を抑制するための配列番号：１の核酸配列からなる核酸または配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質の使用。
【請求項１１】
乳癌の治療用医薬組成物の製造のための請求項１に記載の組成物または請求項２または３に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、乳癌の診断および治療用組成物および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、乳癌の診断および治療に有用なタンパク質であるママスタチン（Mammastatin）をコードする核酸配列に関する。
【０００２】
（背景技術）
乳癌は米国単独で毎年４５,０００人の女性を死亡させる疾患である。年間１８０,０００件を超える乳癌の新症例が診断され、８人に１人の女性が乳癌になると推定されている。これらの数値は、乳癌が今日の女性が直面する最も危険な疾患のうちの１つであることを示している。癌の研究では、乳癌の原因を決定することができず、適当な癌療法または妨害法を見出さなかった。
【０００３】
乳癌と診断された女性は、外科的療法、ホルモン療法、化学療法および放射線療法により治療されるであろう。患者が転移性乳癌を患っているならば、脳、骨および肝臓などの離れた領域における癌を除去するために、放射線および多用量の化学療法が必要でなる。
【０００４】
乳癌の治療に利用可能な現在の療法は、有毒、危険、高価であり、その多くは特に、転移性乳癌の治療に無効である。下記の表はチャーチル・リビングストン（Churchill Livingston）、Clinical Oncology, 1995から抜粋したものであり、現在の治療方法および予期される生存率に関して利用可能であるデータをまとめている。
【０００５】
【表１】
0004441113.tif 000002
【０００６】
現在、リンパ節または遠位部位に転移した乳癌の長期治療に有効である療法は全くない。局所疾患は、癌全部を除去することができるなら、外科的手術によって有効に治療され得る。乳癌および転移性癌に由来する細胞の増殖を停止できる乳癌の有効な新規の治療法が即急に必要である。そのような療法は局所の乳癌の治療、転移性疾患の長期にわたる治療に有用であり、および腫瘍の外科的切除の後の追跡治療として有用である。他の応用には、初期治療としておよび防御的使用としての増殖インヒビターを含む。
【０００７】
乳房Ｘ線写真、身体検査、ＣＡＴ−スキャン、および超音波などの乳癌の検出方法は、乳癌の初期検出を有意に改善した。しかしながら、これらの方法を用いて、疑わしい腫瘍はさらに、該腫瘍が良性または悪性であるかを決定するための、および組織型および悪性の程度の決定を試みるための病理学的検査ために、外科的切除をしなければならない。この病理学的診断は、以後の治療プロトコールに何を使用するかを決定するために役立つ。
【０００８】
乳癌に関して、適当な乳癌腫瘍マーカーが利用できないので、これらの方法は一般的に決定的ではない。ＣＡ １５−３およびＣＡ ２７−２９などの利用可能なマーカーは転移の指標として使用されるが、しかしながらそれらは特異的ではない。例えば、新規のかつ特異的な乳癌マーカーを使用して、乳癌の有効かつ信頼できる診断が可能である診断手段および方法の必要性が多大である。さらに、乳癌の早期発見および早期診断用の信頼でき、かつ簡単な方法が顕著に必要とされている。好ましくは、そのような早期発見方法は、乳癌の初期段階で乳癌を同定し、進行した転移疾患による乳癌の進行を追跡し、ついで乳癌または進行した疾患の罹患傾向を診断するであろう。より好ましくは、該診断方法は、例えば血液などの体液などの分析によって組織生検なしに使用することができる。
【０００９】
ヒト乳房組織は月経の開始および各月経周期の間で、増殖活動の突発を被る。乳房組織および腫瘍へのエストロゲンの効果に関する研究は、エストロゲンが乳房組織の第１次増殖開始因子であることを示唆している。エストラジオール感受性増殖因子が特徴付けられた。さらに、本来ホルモンの影響を受けない乳房細胞増殖因子もまた記載される。
【００１０】
乳房組織増殖に刺激的影響を及ぼすことが示されている特異的な増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）αが挙げられる。他方、ＴＧＦ‐βは乳房組織の増殖を抑圧することを示している。
【００１１】
乳房細胞増殖の調節は乳癌の診断および治療に非常に重要である。乳房組織の新生物的増殖は、調べなければ、年間何千人もの女性の死因である調節不可能に増殖する悪性腫瘍に進行する。乳房細胞増殖を特異的に抑圧することができる増殖阻害因子は、乳癌の診断および治療において使用するため、機能的手段を提供する。
【００１２】
従って、特異的な乳房細胞増殖インヒビターを単離し、特徴付け、その核酸配列およびアミノ酸配列を同定し、ついで精製したタンパク質としてインヒビターを組換え的に発現させることは非常に有効である。該核酸配列および／または組換え的に製造したインヒビターを使用した診断および治療方法は乳癌の診断および治療において非常に利用性が高い。
【００１３】
（発明の要約）
特異的な乳房細胞増殖インヒビターであるママスタチンを正常ヒト乳房細胞から単離し、ついで特徴付けた。現在ママスタチンは正常乳房細胞により製造されるが乳癌細胞では製造されないことがわかっている。さらに、現在、血液中のママスタチンの減少または不在が乳癌の存在と相関することもわかっている。活性化ママスタチンの投与により乳癌細胞の増殖が妨害される。
【００１４】
ママスタチンをコードする核酸配列は、現在のところクローニングされ、シークエンシングされ、ついで宿主細胞中で組換え的に乳房細胞の増殖の活性インヒビターとして発現されている。単離し特徴付けられた核酸配列（配列番号：１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２）は乳癌の診断および治療において使用するための独特かつ特異的な手段を提供する。
【００１５】
本発明は乳房細胞増殖、特に乳癌細胞増殖の特異的なタンパク質インヒビターであるママスタチンをコードする単離し、精製した核酸配列を提供する。本発明はまた、ママスタチンの核酸配列、ママスタチンのアミノ酸配列および精製した乳房細胞増殖インヒビターを製造し、乳癌を診断および治療するためのママスタチン核酸またはアミノ酸配列を利用する方法、キットおよび組成物を含むプラスミドおよびベクターを含む。本発明組成物には、ママスタチン核酸配列およびそのＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーを含む。
本発明はママスタチンを投与することによって乳癌を治療する方法をさらに含む。
【００１６】
（好ましい態様の詳細な記載）
ママスタチン
ママスタチンは正常ヒト乳房上皮細胞によって製造され分泌されるタンパク質増殖インヒビターである。乳房細胞増殖インヒビターは正常ヒト乳房細胞の増殖によってならし培地中に存在する阻害性タンパク質活性として最初は記載された。阻害活性は正常ヒト乳房細胞からのならし培地中で同定されたが、ヒト乳癌細胞の増殖によってならし培地中では同定されなかった。阻害活性はバイオアッセイと約５３、４９および４４kDa（アービン（Ervin, Paul R.）、ミシガン大学博士論文、１９９５）の分子量を有する３つのタンパク質に存在する抗体の作成によって決定した。
【００１７】
現在、特異的な乳房細胞増殖インヒビターであるママスタチンが、４９kDa〜５３kDaへ分子量をリン酸化により増加させる４４kDaのタンパク質として発現することが決定された。リン酸化されていない４４kDaの形態（non-ph 44 kD form）は活性インヒビターではないが、リン酸化した４９kDaおよび５３kDaの形態は乳癌細胞の増殖を阻害する。活性５３および／または４９kDaリンタンパク質は正常ヒト乳房細胞によって発現されるが、一般的に乳癌細胞では製造されない。癌細胞の中にはリン酸化を欠如しており、不活性な４４kDaタンパク質を製造するものもある。
【００１８】
以下の表は正常なおよび癌性の細胞および組織中のママスタチンの発現および活性を示すデータをまとめたものである。
【表２】
0004441113.tif 000003
【００１９】
ヒト乳癌細胞での用量応答実験は、癌細胞増殖は１０ng/mlのママスタチンで５０〜７０％阻害され、２５〜５０ng/mlで完全に停止されることを示している。MDA-MB-435およびMDA-MB-231などの高度に転移性の細胞は増殖を停止させるために５０ng/mlを必要とする。イン・ビトロおよびイン・ビボ臨床データ実験は、該効果は可逆的であり、低濃度で癌細胞増殖を停止させるためには、インヒビターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしながら、５０ng/mlを超えた用量で、ママスタチンは細胞壊死などのような組織学によって示されるように、アポトーシスを誘発するようである。
【００２０】
ママスタチンは乳癌細胞増殖を阻害する天然に存在する増殖インヒビターであり、活性化ママスタチンを製造する腫瘍は全くないので、ママスタチン置換療法は乳癌治療のための治療法として理想的である。以下の例で提供された臨床データはママスタチン置換療法の有効性を証明する。
【００２１】
ママスタチンタンパク質をコードする核酸配列は、現在単離され、特徴付けられ、シークエンシングされ（配列番号：１）、全部で３つの（５３、４９、および４４kDa）分子量のタンパク質をコードすると決定されており、「ママスタチン（Mammastatin）」と名づけられた。３形態の分子量における差異はタンパク質のリン酸化の範囲が原因であると決定された。培養中のヒト正常乳房細胞（ＮＨＭＣ）によって製造されたママスタチンおよび組換え的に発現されたママスタチンはヒト乳癌細胞の増殖を阻害し、乳癌の治療における治療剤として有用である。
【００２２】
正常女性からのヒト血清および乳癌患者からのヒト血清の分析は、ママスタチンの減少した血液レベルは乳癌の進行と相関があることを示している。以下の実施例中に記載したようにこの活性インヒビターの存在のための血液血清のスクリーニングおよびモニタリングは特異的かつ有効な診断手段を提供する。
【００２３】
核酸配列
ママスタチンＤＮＡをコードする核酸（配列番号：１）およびそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号：２）を表１に示す。この配列は、以下の実施例でさらに詳しく記載するように、ヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーからのママスタチンｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンシングによって同定した。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビターは、以前にはアミノ酸分析を可能にするほど十分に単離されず、標準的技術によってタンパク質インヒビターをシークエンシングする初期の試みは失敗した。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成された抗体を使用するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの試みにより、活性のあるクローンを製造できなかった。これらの問題を克服するために、ママスタチンをコードする遺伝子を、ペプチドシークエンシングおよびヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーの縮重オリゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した。
【００２４】
ヒト正常乳房細胞によって製造された濃縮タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製したインヒビターに対して作成された抗−ママスタチン抗体を用いてアフィニティー精製された。精製したタンパク質画分を、トレーサーとして少量（１０5ｃｐｍ）の32Ｐ標識で補った。標識したトレーサータンパク質は、以下の実施例により詳しく記載するように32Ｐの存在下で増殖した細胞のならし培地から精製した。該タンパク質は臭化シアンで開裂し、ついで開裂した断片を32Ｐ標識したタンパク質のオートラジオグラフィー分析によってママスタチンとして同定した。開裂により製造された最も豊富な標識されたペプチドがシークエンシングされた。
【００２５】
独特のアミノ酸配列（配列番号：３および４）を有する選択された２つのタンパク質は、縮重オリゴヌクレオチドを製造するために使用される。ついで、縮重オリゴヌクレオチドを、ヒト正常乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。
【００２６】
標識されたpMammAである１つのクローンは、両方の選択されたペプチドからオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このクローンは、さらに特徴付けられ、抗−ママスタチン抗体によって認識された発現のタンパク質を発現することが示された。該クローンは、ノーザンブロット分析、イン・ビトロ転写および翻訳アッセイおよび増殖阻害アッセイによってママスタチンをコードすると査定された。ママスタチンｃＤＮＡインサート（pMammB）を含むpcDNA3クローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection) に寄託し、受託番号第９７５４１号を付与された。pMammB（配列番号：２）から発現した組換えタンパク質は、トランスフェクションした哺乳類細胞株のイムノブロットによって検出され、ついで乳癌細胞に対する増殖阻害活性を保有することを示した。ｃＤＮＡクローンを完全にシークエンシングし（実施例３参照）、BLAST DNAデータベースに対して唯一のものであるとわかった。
【００２７】
本発明の核酸配列（配列番号：１）はヒトママスタチンをコードし、それはヒト正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する機能を果たす。「ヒト」なる語は、タンパク質の源を制限することを意図しているわけでなく、またヒト細胞および組織にのみ与える阻害効果を制限することを意図しているわけではない。個体のママスタチンの核酸配列およびアミノ酸配列は幾分、タンパク質の構造または機能を変えずに変化するかもしれない。さらに、生化学の分野の当業者であれば、核酸配列またはアミノ酸配列の修飾が分子の構造および／または機能を変更せずに起こるかもしれないことを認識するであろう。例えば，該核酸配列は修飾され、ある特定の細胞宿主の最適な既知のコドンを用いて所望のアミノ酸配列の最適発現を可能にする。
本発明の核酸配列は乳癌の治療における治療法および診断方法において使用するため、高度に精製されたママスタチンの大容量を製造するのに有用である。
【００２８】
抗ママスタチン抗体：
いくつかの抗−ママスタチン抗体が製造され、特徴付けれられた。例えば、１９８９年１１月３０日に公開されたＰＣＴ出願公開公報ＷＯ８９／１１４９１号参照。これらの抗体は、クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成され、乳房細胞増殖にママスタチンタンパク質の阻害効果を与えるのを妨げることが示されている。
【００２９】
利用可能な抗−ママスタチン抗体は、ネオマーカーズ（Neomarkers）（フリーモント（Freemont）、カリフォルニア）より市販されて利用できる７Ｇ６および３Ｃ６および６Ｂ８を含む。６Ｂ８抗体を作成するハイブリドーマ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ１０１５２号）から入手可能である。これらの各抗体はママスタチンの全部で３つの分子量形態のものに結合し、ドットブロットおよびウエスタンブロットを含む免疫学的アッセイにおいて有用である。該７Ｇ６抗体は縮重したタンパク質サンプルのウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ分析に好ましい。該抗体３Ｇ６および６Ｂ８はＥＬＩＳＡアッセイ、例えば実施例に具体的に記載した条件下でのアッセイにおいて使用されるであろう。
【００３０】
さらなる抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に関して知られる標準的方法を用いて製造され得る。抗体製造のために使用した抗原はＮＨＭＣの培養または組換え的に発現されたママスタチンから得られるかもしれない。
【００３１】
診断方法
本発明はさらに、組織、細胞および液体を含む患者のサンプル中の活性ある阻害性ママスタチンを検出するためのイン・ビトロアッセイを提供する。乳癌および進行性転移性疾患は、患者のサンプル中のママスタチンタンパク質の存在および型とヒト正常乳房細胞または癌性乳房細胞のママスタチンタンパク質の存在および型との相関によって診断される。患者の血液または組織サンプルは、ママスタチンタンパク質、例えば豊富なママスタチンタンパク質および／またはママスタチンの分子量形態などに関して分析される。以下で議論するように、特に高分子量のママスタチンのリン酸化された形態であるママスタチンの存在または喪失は乳癌と相関があり、かつ進行した転移性の疾患の指標である。
【００３２】
ママスタチンの分析は、好ましくは、抗−ママスタチン抗体を用い、患者の血液サンプルのＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析を含むイムノアッセイにより行う。好ましくは、組換えママスタチンの標準は、信頼可能なインヒビターレベルの量に関する標準曲線を提供するように使用される。そのようなイムノアッセイは以下の実施例に示すドットブロットアッセイおよびウエスタンブロットアッセイによって例示される。本発明の別の好ましい態様において、腫瘍生検のような組織サンプルは免疫組織化学または患者の腫瘍細胞を培養することおよびママスタチンの発現のための培養物を試験することによって分析される。
【００３３】
特に好ましい態様において、乳癌の診断用アッセイには少なくとも２つの特異的な抗体を含む：抗−サイトケラチン抗体などの上皮組織のサンプルとして採取された乳房組織を同定するための抗体および抗−ママスタチン抗体である。例えば、イムノブロット形式を用いて，乳癌細胞を含むと疑われる組織をホモジナイズし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、膜にトランスファーし、抗−ケラチンおよび抗−ママスタチン抗体の両方で調べる。ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの適当なマーカーシステムにコンジュゲートさせたアイソタイプ特異的第２抗体を使用して、結合した抗体を検出する。ついで、結合した第１および第２抗体を含む膜を公知の比色または蛍光光度法技術を用いて発色させ、公知の方法によって定量する。
【００３４】
最も好ましい態様において、抗−ママスタチン抗体を用いて該サンプルをウエスタンブロットなどによりママスタチンのリン酸化に関して分析する。高分子量（５３／４９kDa）ママスタチンの減少または不在が乳癌の進行と相関がある。
【００３５】
組換え発現ベクターおよび形質転換した細胞
本発明の組換え発現ベクターは、精製ママスタチンタンパク質およびその部分の製造および増幅に、および診断法および治療法において使用されるママスタチンタンパク質およびその部分の簡易単離に有用である。
【００３６】
2.434kbママスタチンcDNA（配列番号：１）の全部またはその一部などの標的配列は、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞に関してはpＵＣ１８、pKC３３０、pBR３２２、ｐKK１７７−３、ｐＥＴ−３、ｐｃＤＮＡ３（イン・ビトロゲン（In Vitrogen））などの適当な核酸配列発現ベクターにクローニングされ、および昆虫細胞における発現にはpＡｃＤ３Ｘバキュロウイルス発現ベクター（ファーミンギン（PharMingin）、サン・ディエゴ、カリフォルニア）にクローニングされ、標準的な方法によって公知のシステムにクローニングされる。市販されており利用可能な発現ベクターは、標的配列が転写および翻訳調節領域へ作動可能に結合するようなベクターの部位へのクローニングのため提供する。
【００３７】
ついで、リン酸カルシウム法、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションなどの公知の方法を用いて適当な宿主細胞に発現ベクターが導入される。適当な宿主細胞には、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、High 5およびSF9昆虫細胞、バキュロウイルスおよび酵母細胞を挙げられる。他の宿主細胞には、大腸菌（E.coli）DH5αなどの大腸菌株、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）などの無毒性同遺伝子型サルモネラ種のアデニル酸シクラーゼを欠乏した欠失変異体およびcAMP受容体タンパク質、異種遺伝子内のサルモネラ変異体およびBio/Tech, 6: 693 (1988)に記載されるような他のサルモネラワクチン株を挙げられる。
【００３８】
好ましくは、該細胞宿主は真核細胞であり、適当な折り畳みおよびリン酸化した活性型インヒビターを製造するためのキナーゼ活性を持つタンパク質を発現することができる。宿主細胞は、ママスタチンをコードするｃＤＮＡでトランスフェクションすることによってスクリーニングされるであろう。形質転換した細胞によって製造されたタンパク質の分析は、例えば、イムノブロットにより、および以下の実施例に記載するように、例えばＭＣＦ７細胞増殖などの乳房細胞の増殖を阻害するためのタンパク質の能力によって潜在的に宿主細胞になり得るシステムをスクリーニングするのに使用することができる。
【００３９】
標的核酸配列で形質転換された宿主細胞をコロニーハイブリダイゼーションまたはママスタチンタンパク質に特異的な抗体との応答性を含む多様な方法によってスクリーニングする。形質転換した細胞は、pcＤＮＡ３または他のプラスミドまたはママスタチンをコードする核酸配列を含む他のベクターを運搬する適当な宿主細胞である。そのような１つのプラスミドはpMammAからの２.４kbBamHI-XhoIインサートを運搬するpcＤＮＡプラスミド（pMammＢ）であり、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９６年２月２２日に寄託し、受託番号第９７４５１号を付与されている（実施例５参照）。
【００４０】
特異的な標的DNA配列を含む発現ベクターは、ママスタチンタンパク質の全部または一部をタンパク質製造用細胞宿主に挿入することによるイン・ビトロ転写および翻訳よって製造するために使用される。発現ベクター系から製造されたタンパク質は正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する（実施例７参照）。例えば、該ベクターでトランスフェクションされたCos7宿主細胞などの真核細胞は、ならし培地中で、ママスタチンを発現および分泌する。ならし培地は正常および癌性の乳房細胞の増殖を阻害する（実施例８参照）。
【００４１】
アミノ酸配列
ママスタチンタンパク質（配列番号：２）は、核酸配列（配列番号：１）から推定される配列を有する約２４００アミノ酸残基のポリペプチドであり、表１に示す。クローニングされたママスタチン核酸配列（配列番号：１）から発現されるタンパク質は乳癌細胞（MCF-7)の増殖を阻害する。
【００４２】
組換えママスタチンタンパク質は、精製形態でかつ大量に有効に製造することができる。精製した組換えママスタチンは、患者のサンプル中でインヒビターの診断アッセイのための信頼できる標準として有用である。組換えママスタチンタンパク質はまた、乳癌細胞の増殖を阻害または妨害するための精製された治療剤として有用でもある。
【００４３】
治療的使用
治療的使用のためのママスタチンタンパク質は、無血清条件下または組換え手段によるＮＨＭＣ培養物から製造される。ママスタチンリンタンパク質は治療的に使用され、例えば乳癌の治療における乳房細胞の増殖を阻害する。好ましくは、ママスタチンは該タンパク質のリン酸化を達成するために高等真核細胞において製造される。組換えママスタチンタンパク質は宿主細胞または合成手段によって製造する。
【００４４】
機能的なママスタチンを公知の方法によって患者に投与し、リンタンパク質の投与に関しては好ましくは注入によって投与し、血流におけるインヒビターのレベルを増加し、乳房細胞とインヒビターの相互作用を高める。
該タンパク質は、リン酸化タンパク質治療剤の送達に関する当該技術分野において公知の方法によって患者に送達されてよい。概して、該インヒビターはデリバリービヒクルと混合し、注入によって投与される。
【００４５】
投与されるべきインヒビターの用量は当業者によって決定され、治療モダリティー（modality）の型および疾患の程度によって変化するであろう。ママスタチンは、１０ng／mlの濃度で乳癌細胞の約５０％を阻害し、イン・ビトロで約２０−２５ng／mlで増殖を停止し、有用な治療投与量範囲は１日用量約２.５μｇから約２５０μｇの投与である。好ましくは、約１２５μｇ／日の投与量である。投与の目的は、生理学的範囲からわずかに高い範囲（５０〜７５ng／ml）で最終的な身体用量となることである。インヒビターの高用量（>５０ng／ml）により、処理細胞の組織化学にみられるようにアポトーシスが誘発される。臨床的使用に関して、好ましい用量の範囲は、転移性疾患の初期治療のために約５００ng／mlであり、その後約５０ng／mlの維持用量となる。以下の実施例において報告された最初の臨床研究は、約５０ng／ml〜約７５０ng／mlの１日投与量がステージIVの乳癌患者における寛解を誘発するのに十分であることを示している。
【００４６】
活性化ママスタチンがリン酸化タンパク質であるため、患者の血液中でママスタチンの増殖阻害レベルを維持するためにインヒビターの複数の投与が必要であろうことが予期される。また、ママスタチンは一般的に細胞殺傷剤よりは細胞増殖抑制性剤として機能するので、該インヒビターの最大効果は、乳癌患者におけるインヒビターレベルの一定の維持を必要とすると予期される。
【００４７】
その好ましい使用において、ママスタチンは腫瘍の寛解を誘発するための（>５０ng／ml、好ましくは５０〜５００ng／ml）高用量で投与される。癌細胞増殖を妨害するためには、より低い維持用量（>５０ng／ml、好ましくは２０〜５０ng／ml）が使用される。
【００４８】
ステージIVの乳癌患者において投与されたママスタチンでの臨床経験は、有用な用量とは血液中のママスタチンの生理学的レベルを維持するものであることを示す。投与は、毎日が好ましく、しかし例えば、持続的な注入、徐放性補給（depot）、または２−３日ごとに１回の注入などによってもよい。逸話としての証拠は、持続的な投与はフィードバック阻害を誘発し、従って好ましい投与計画は約２５〜２８日間毎日ママスタチンを投与した後、２〜５日投与をやめることを示唆する。
【００４９】
診断的使用
ヒト組織および血清中の機能的なインヒビターの存在を検出するための本発明のアッセイは、乳癌の罹患の高い危険性を保有する集団のスクリーニング、乳癌発症の早期発見および治療期間中の患者のインヒビターレベルのモニターのため、乳癌患者のスクリーニングに有用である。例えば、患者の血液ママスタチンの分析は、正常のコントロールまたは該患者の以前のママスタチンのプロフィルに比較して、高分子量のリン酸化ママスタチンの量の減少を示すかもしれない。そのような変化は乳癌の危険の高まり、乳癌の早期発症、および転移性乳癌の進行と相関がある。リン酸化、活性化、４９／５３ｋDママスタチンに関する診断アッセイは、例えば、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによるか、または特異的な抗−ママスタチン抗体を用いる。例えば血清中などのスクリーニングは、例えば、ドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイによるのが好ましい。
【００５０】
最良の結果のため、患者のサンプルはサンプリングから短期間内で（１週間以内で）アッセイされるべきであり、４℃で保存されるか（１年以内）、または凍結させて長期保存すべきである。サンプルはアッセイの時期まで凍結させているのが最も好ましい。
【００５１】
アッセイキット
本発明の具体的な態様において、患者の液体および／または乳癌組織中のママスタチンの検出のためのアッセイキットが提供される。スクリーニングアッセイは、血清中のママスタチンを検出または定量するためのドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイが好ましい。そのようなスクリーニングキットには、抗−ママスタチン抗体およびコントロール抗体を含む場合もあり、および／またはママスタチンコントロールまたは標準を含む。第２のスクリーニングアッセイは乳房組織のママスタチンを分析する。該アッセイキットには必須試薬および該組織が乳房上皮であることを特異的に決定するための抗体、例えば抗−サイトケラチン抗体および特異的な抗−ママスタチン抗体と該組織を反応させるための手段を含む。市販されており利用可能な抗体混合物であるパン−ケラチン（pan-keratin）(シグマ(Sigma))は好ましい抗−サイトケラチン抗体である。
【００５２】
ママスタチンのネガティブアッセイは、乳癌腫瘍の存在または非上皮乳房組織によって引き起こされる。抗−サイトケラチン抗体の使用により、誤ったポジティブアッセイに対して警戒する。抗−ママスタチン抗体で染まらないか、または４４kDママスタチンのみを発現する乳房上皮細胞は形質転換細胞である。従って、例えば乳房組織から単離され、および抗−サイトケラチン抗体で陽性となるような乳房上皮しての組織を最初に同定し、ついで抗−ママスタチン抗体との第２の陽性反応を同定することによって擬陽性が避けられる。
【００５３】
乳癌細胞の約３０％が非リン酸化の不活性な４４kDママスタチンを発現することが実験により明らかだったので、分析の好ましい方法は、例えばウエスタン・ブロット分析などによって、５３／４９kDおよび４４kD形態の間で区別することである。
本発明はさらに以下の実施例を参照して定義される：
【００５４】
実施例１
ヒト乳房細胞ｃＤＮＡライブラリー
ｃＤＮＡライブラリーを整復乳房形成術（UM病院（UM Hospital））から得られるヒト乳房細胞から調製した。総ＲＮＡを塩化セシウム勾配により乳房細胞から単離した。総ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを単離した。使用された方法はガーナー（Garner I.）「アイソレーション・オブ・トータル・アンド・ポリ・Ａ＋ＲＮＡ・フロム・アニマル・セルズ（“Isolation of total and poly A+RNA from animal cells"）」、Methods Mol. Biol.（１９９４）２８：４１−７に記載されている。
【００５５】
単離されたｍＲＮＡの存在下での逆転写はｃＤＮＡを製造し、ついでEcoRIリンカーにライゲートされる。ｃＤＮＡをEcoRI切断T4DNAリガーゼ処理したラムダZapに挿入し、ついでショート（Short JM.）ら（１９８８）Nucleic Acids Research １６：７５８３に記載される方法に従って大腸菌XL1-blue中で増幅した。
【００５６】
実施例２
ママスタチンオリゴヌクレオチドの調製
実施例１で調製した正常ヒト乳房細胞ｃＤＮＡを、縮重オリゴヌクレオチドを用いてママスタチンをコードする核酸の存在に関してスクリーニングした。その縮重オリゴヌクレオチドは以下のようにして得る：
【００５７】
正常ヒト乳房細胞をミシガン大学病院形成外科より、または共同ヒト組織ネットワーク（Cooperative Human Tissue Network）より入手した。その組織をソウル（Soule）ら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に概して従い、コラゲナーゼ処理により還元した。
【００５８】
乳房細胞を４０μM CaCl2で調合したＤＭＥＭ／Ｆ１２低カルシウム培地中で、１７５cm2フラスコ中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、ついでソウルら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に従い、５％ＣＨＥＬＥＸ処理したウマ血清（シグマ）、０.１μg／mlのコレラ毒素（シグマ）、０.５μg／mlヒドロコルチゾン（シグマ）、１０ng／ml上皮増殖因子（ＥＧＦ、コラボラティブ・リサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード、マサチューセッツ）、１０μg／mlインシュリンおよび１μg／mlペニシリン／ストレプトマイシンを補給した。ウマ血清をCHELEXレジンで室温で3時間処理して血清カルシウムを除去した。
【００５９】
細胞溶解産物は、細胞をTBSですすぎ、テフロン製のスクレーパーでフラスコからこすりとることによって調製した。細胞を遠心分離によって回収し、８M 尿素、５０mMトリスpH7.5、０.５％β−メルカプトエタノール、０.５％TRITON X-１０００（溶解バッファー）で溶解させ、氷上で3分間超音波処理した。
【００６０】
該細胞溶解産物を溶解バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）陰イオン交換樹脂（シグマ）上で分画した。溶解産物を樹脂を充填したカラム（５０mlの使い捨て、バイオ・ラド（Bio Rad）上に負荷し、ついでカラムの容量の10倍量の溶解バッファーで洗浄した。物質は、重力の供給によってのみカラムから流出した。画分は、最初に、塩の存在下で溶出バッファー（８Ｍの尿素２５０mlおよび５０mMのトリスｐH７.５）を最初に含む閉鎖混合チャンバーに５ＭのNaClを含む溶出バッファーを持続的に重力の供給によって流して製造された塩勾配で溶出した。
【００６１】
溶出画分（２ml）をギブソン（Gibson）画分コレクターによって回収し、上記のように抗−ママスタチン抗体である７G6でドット・ブロットによって乳房細胞増殖インヒビターの存在に関して分析した。
【００６２】
陽性の画分を保存し、５０mMのNaClで溶解バッファーに透析し、再度同一のイオン交換カラム上で分離し、５０mMのNaClを含む溶出バッファー中のｐH勾配（ｐH8〜ｐH３）を持続的に減少させて溶出した（ｐH勾配をつくるために、pH３の緩衝尿素を持続的に最初のｐH８のバッファーに混合した。）。画分（２ml）を回収し、上記のように７G6抗体で分析した。
【００６３】
陽性の画分を再び保存し、ついで濾過遠心分離によってもともとの容積の１／１０のに濃縮した（アミコン・セントリプレップ（Amicon Centriprep）、１０kD切断）。濃縮した保存物を前もって染色した分子量標準（シグマ）とともに分取SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)によってサイズ画分した。
【００６４】
分子量４０〜６０kD間の分子中に含まれるタンパク質を０.５cmのストリップまたは画分でゲルから切り出した。各ゲルのストリップからのタンパク質の電気溶出を透析チューブ中でランニングバッファー（１９２ｍMのグリシン、２５mMのトリス（ｐH8.3）、0.1％SDS）１ml中にそのゲルストリップを置くことによって行った。そのチューブをサブマリン電気泳動装置中に設置し、終夜２５ボルトで電気溶出した。電流を２分間逆行させ、ランニングバッファー（現在は溶出したタンパク質を含む）を除去した。溶出したタンパク質の純度を、銀染色で分析SDS PAGEによって、またトウビン（Towbin）ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27：４９５〜５０１（１９８９）に記載されるような手法に従いチェックした。銀染色PAGEによって決定されるように少なくとも７０％純度の画分を貯蔵し、濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末形態とした。
【００６５】
貯蔵されたタンパク質を５００μlの７０％ギ酸中に凍結乾燥した粉末を溶解し、２０mg／mlの臭化シアン（シグマ）で室温で終夜（約２０時間）インキュベートすることによって、臭化シアンで開裂させた。使用した方法はフリーモント（Freemont）ら、Arch. Biochem. Biophys. ２２８：３４２−３５２（１９８６）中に記載されている。臭化シアン開裂タンパク質のサンプルを２回蒸留し、脱イオン化した水に透析し、再び濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末とした。
【００６６】
臭化シアン開裂は、もともとのタンパク質サンプルから複数のペプチドを産生し、分取１５％SDS PAGEおよび電気溶出によってPVDF膜上にトランスファーすることによって分離した。
【００６７】
乳房細胞溶解産物から得たタンパク質に加えて、タンパク質はまた正常ヒト乳房細胞ならし培地から単離される。正常細胞をリン酸欠如した８mlのDMEMでインキュベートし、２００μCi／mlの32P-オルトリン酸および１％の透析したウシ胎児血清を補った。細胞をならし培地を回収する前に、32P存在下で２４時間増殖させることができた。
【００６８】
回収したならし培地を１０ｋDの排除制限でアミコン濾過により５倍の濃度にまで濃縮した。濃縮した培地を濾膜上でPBSで１回漱ぎ、取り込まれていない過剰なリン酸を除去し、ついでさらにPBSで溶出したS-200SEPHACRYL（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラムによって画分した。フィルターとカラムの両者によりサンプルから未取り込み32Pの除去を可能にする。１mlの画分をカラムから回収し、シンチレーションカウンティングにより標識した画分を同定した。放射活性化区分を保存し、ついで銀染色およびオートラジオグラフィーをともなってSDSPAGEによって分析した。保存されたタンパク質を濃縮し、凍結乾燥して粉末とし、ついで臭化シアン開裂の前に上記のように精製した未標識タンパク質の多量と結合させた。標識したタンパク質の添加はリン酸化ママスタチンペプチドを含む臭化シアン開裂断片のトレースの便利な方法を提供する。開裂したペプチドを上記のように分取PAGE上で分離した。
【００６９】
放射活性タンパク質を臭化シアン開裂し、分離してPVDF膜にトランスファーし、X線フィルムに曝した後、２つの標識された約２０kDおよび２２kDのバンドが見ることができた。これら２つのペプチドを膜から切り出し、ウラー（Ullah Alt）らBiochem. Biophys. Res. Comm. ２０３：１８２−１８９（１９９４）に記載の方法を用いて、ユニバーシティ・オブ・ミシガン・バイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティー（University of Michigan Biomedical Research Core Facility）でエドマン法によってシークエンシングした。２つのペプチドの各々のアミノ酸配列をNIH「BLAST」サーバーを用いて公知のデータベースと比較した。その２つのペプチドは新規であることがわかった。
【００７０】
各配列の特に独特の部分を使用して縮重オリゴヌクレオチドを製造し、ジェララ（Jerala）、Biotechniques１３：５６４−５６７（１９９２）において記載される方法による標準的な第３の位置の縮重を用いた。２０kDペプチドから該配列「gly-gln-leu-glu-tyr-gln-asp-leu-arg」（配列番号：３）を使用した。：２２kDのペプチドから配列「tyr-glu-arg-asp-leu-lys-gly-arg-asp-pro-val-ala-ala」（配列番号：４）を使用してオリゴヌクレオチドの複数の種を製造した。縮重オリゴヌクレオチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
【表３】
0004441113.tif 000004
【００７２】
縮重オリゴヌクレオチドを32P−γATPおよびT4ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、ベテスダ（Bethesda）、メリーランド）で末端ラベルし、再度Ｔ４ＤＮＡキナーゼバッファー（６０mMのトリス（pH 7.8）、１０mM MgCl2、１５mM β−メルカプトエタノール）を１.５mg/mlで再度懸濁させた。ついでオリゴヌクレオチド（２５０μＭ）を０.３３μＭのＡＴＰ、２５μキナーゼバッファー中の５単位のキナーゼと３７℃で２時間インキュベートした。32P‐リン酸の取り込みをＴＣＡ沈殿（１５％ＴＣＡ、４℃、15分）によって決定した。典型的な取り込みは１０9cpm／mgＤＮＡであった。
【００７３】
実施例３
縮重オリゴヌクレオチドでの乳房細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
正常乳房細胞ｃＤＮＡインサートを含む実施例１で調製したファージに感染させた細菌を、トップアガー（感染細菌培養の１／１０希釈から７％NZYMトップアガーの６ml）プレート１５cmのNZCYM(１０ｇ、NZアミン（ベーリンガー・マンハイム）、５ｇのNaCl、５ｇの酵母抽出物、２ｇのMgSO4、１ｇのカザミノ酸）上にプレーティングした。プラーク含有プレートにファージの変性（denatureation）の前１５分間ニトロセルロース膜をかけた。ファージを０.５M NaOH、1.5M NaCl飽和したワットマンペーパー上で５分間のブロッティングフィルター（ＤＮＡサイドアップ）により変性させた。フィルターをH2Oですすぎ、１Ｍトリス（pH7.0）、１.５Ｍ NaCl中で５分間インキュベートした後、２０×SSCおよび２×SSCそれぞれ５分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、８０℃で1時間焼くか、または紫外線光線下放置してＤＮＡを固定した。燒結フィルターを１％ＳＤＳと２×SSC中で３０分間洗浄し、ついで５０％脱イオン化ホルムアミド、５×Denhart's溶液、１％ＳＤＳ、５×SSCおよび１００μg／ml変性サケ精子ＤＮＡで３７℃でプレハイブリダイズした。
【００７４】
フィルターを、熱変性した（９５℃で５分）標識縮重オリゴヌクレオチド１０7cpm／mlを加えた、実施例２で記載したようにして調製したプレハイブリダイゼーションバッファー中の標識縮重オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。フィルターを３７℃で３０分間２×SSCで洗浄した後、５０℃で３０分間２×SSCに１％SDSを加えた溶液中で３回洗浄した。フィルターを２×SSCで短くすすぎ、乾燥させて、ついで２４〜４８時間コダックＡＲ‐５フィルムに露光して陽性プラークを同定した。
【００７５】
陽性プラークを逆２００μl無菌ペプチドチップを用いて切り出したアガープラグから単離し、４℃で終夜ＳＭバッファー中に再懸濁した。第２および第３のプレート（１０cm）をＳＭバッファーを含むファージの１／１０,０００希釈で細菌に感染したＸＬ１−Ｂを用いてNZCYM(１mM MgSO4）中で作成した。プラークを上記のように８時間感染した細菌をインキュベートすることにより製造し、ついで標識した縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングする前にニトロセルロースにトランスファーした。スクリーニングは、本質的にはクロチェック（Kroczek, RA.）、J Chromatogr 618：１３３−４５（１９９３）に記載されるのと同様に、１０7cpm／mlの標識したＤＮＡおよび５０℃で３０分間２×SSCの最終的な洗浄ストリンジェンシーを用いて行われた。
さらなる分析に関して選択されたクローンは、両方の縮重オリゴヌクレオチドによって認識されるものであった。このクローンは「pMammA」と名づけられた。
【００７６】
実施例４
ママスタチンｃＤＮＡのシークエンシング
実施例３で得られた陽性クローンであるpMammAをミシガン大学のバイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティーで自動化シークエンサーを用いてシークエンシングし、ついでまた１５％ＤＮＡシークエンシングゲルを用いたジデオキシシークエンシングおよび35Ｓヌクレオチドを有する放射標識ＤＮＡ断片によってシークエンシングした。使用した方法はラスケン（Lasken RS）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：１３０１−５（１９８５）に記載されている。
【００７７】
自動化配列の認識された誤りの割合は約５％である。従って、寄託されたクローンをヌクレオチド配列の確認のために再度シークエンシングし、特に記載されるように、潜在的な過誤の疑いのある部分には注意した。
最初に得られた配列情報は、すべての読み取り枠において多くの停止コドン、およびとりわけＧＣリッチな領域中に明らかな誤りを含んでいた。最初のクローン（pMammA）を注意深く再シークエンシングした。得られた核酸配列は内部の停止コドンを含んでおらず、表１（配列番号：１）に示すとおりである。
【００７８】
実施例５
ママスタチンｃＤＮＡの発現ベクター中へのサブクローニング
ママスタチンｃＤＮＡ挿入物であるpMammAを発現ベクターｐｃＤＮＡ３（イン・ビトロゲン（In Vitrogen）にサブクローニングした。ママスタチンｃＤＮＡを実施例４に記載されたようにして入手したpMammAをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって単離した。制限酵素はプラスミドをママスタチンクローンインサートの末端で切断し、線形のプラスミド断片および線形挿入断片を作成した。消化したサンプルを電気泳動装置中に沈めた１.２％アガロースゲルのウェル中に静置し、５０Ｖの電流を２時間流した。電気泳動はＤＮＡ断片をサイズに基づいて分離し、大きなプラスミドＤＮＡ断片はゲル上で一層遅い移動速度を有する。２.４kbを含むアガロースゲルの一部を臭化エチジウム染色によって可視化し、ついでゲルを紫外線ボックスの上に置いて観察した。２.４kbママスタチン断片をゲルから切り出し、ついで透析チューブに置き、ついで該ＤＮＡをホウ酸トリスバッファーＴＢＥ（０.０８９Ｍホウ酸トリス、０.０８９Ｍホウ酸、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ）に電気溶出し、回収し、エタノール沈殿した。
【００７９】
pcＤＮＡ３プラスミドＤＮＡを修飾して、ライゲーション間にママスタチンｃＤＮＡ断片を受容するようにした。pcＤＮＡ３プラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化が完了した後、そのＤＮＡを子牛腸ホスファターゼの存在下で１時間インキュベートして５'リン酸を除去する。pcＤＮＡ３サンプルをついでフェノール抽出し、エタノール沈殿する。
【００８０】
pcＤＮＡ３およびママスタチン２.４kbｃＤＮＡ断片を一緒にライゲーションする。その２.４kbママスタチン断片および線形のpcＤＮＡ３プラスミドを３：１の割合でＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で混合した。ライゲーション反応は１時間インキュベートした後、４℃で終夜保存した。ライゲーション反応が完了した後、そのＤＮＡを使用して大腸菌コンピテント細胞を形質転換する。サブクローニングをアンピシリン選択コロニーからプラスミドＤＮＡを精製することによって確認した。そのプラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化したＤＮＡサンプルをアガロースゲル上に置き、ついで電気泳動で分離した。正しいサイズのママスタチンＤＮＡ断片を含むプラスミドをpＭammＢと命名し、ついでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection (ATCC)）に１９９６年２月２２日に寄託し、受領番号：ＡＴＣＣ９７４５１号が付与された。
【００８１】
実施例６
ママスタチンｃＤＮＡ配列からのトランスフェクションおよびタンパク質発現
Cos７細胞はママスタチンタンパク質と一緒に移動する免疫応答タンパク質を発現しない。pＭammＢおよびPCDNA３を使用してLIPOFECTINョ(BRL、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）、ベテスダ、（Bethesda)、メリーランド）を用いて、製造者により示唆されたプロトコールを利用してCos-7サル繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収前２日間増殖させた。トランスフェクションした細胞を標準プロトコールを用いて細胞をトリプシン処理することによってプレートから除去した（トリプシン２.５ml(０.２５％シグマ）を３７℃で５分間細胞のフラスコ内でインキュベートした。RPMI培地に１０％FBS（ウシ胎児血清）を補給したものの７.５mlアリコートを加えて細胞を遠心によって回収する）。細胞を血球測定計によって数え、１０7細胞／mlでSDS PAGEサンプルローディングバッファー中で溶解した。細胞溶解産物を８〜１５％のSDS-PAGE勾配ゲル（バイオラド）上で分離し、ついでトウビンらJ. Clin Chem Clin Biochem(1989年8月）27(8): 495-501中に記載される方法を用いてナイロン膜にトランスファーした。その膜を抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6でプロービングした。結合抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートＧＡＭ−ＩｇＭで検出し、ＥＣＬ（アマシャム）によって発色させた。
【００８２】
図１に示すように、pMammB（レーンＣ、Ｄ）でトランスフェクションしたＣｏｓ-７細胞はママスタチンタンパク質（レーンＡ）と同時に移動する免疫応答性のタンパク質を発現した。空のベクターＰＣＤＮＡ３単独でトランスフェクションしたCos-７細胞はイムノブロット実験を行った場合に免疫応答性のタンパク質を発現しなかった（レーンＢ）。
【００８３】
【表４】
0004441113.tif 000005
【００８４】
イムノブロット分析は、pMammBクローンがママスタチンのサイズおよび免疫学的特徴を有するタンパク質を合成することができるｃＤＮＡインサートを含むことを説明している。さらに、４４、４９および５３kDの免疫応答性のタンパク質が、pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞において発現された。これらのタンパク質は、以前に正常ヒト乳房細胞で同定したママスタチンタンパク質と同じ分子量で移動した。この免疫応答性タンパク質の群は、空のベクターpcＤＮＡ３でトランスフェクションしたCos-７細胞中では同定されなかった。
【００８５】
図１に示す特定のアッセイにおいて、ＮＨＭＣコントロールは異常に高量の４４ｋＤママスタチンを示す。これは４℃でＮＨＭＣ標準を長期間（>1年）貯蔵することによって製造された人工産物であり、時間をかけて高分子量の形態の分解が引き起こされたものである。より新鮮なＮＨＭＣサンプル（<１年）または凍結サンプルを用いたときは、４４kDタンパク質は常に高分子量形態より少ない。
【００８６】
実施例７
ＧＳＴ融合
ママスタチンクローンは同様にバキュロウイルス発現系にサブクローニングすることができる。pMammAインサートをファーミンゲン（Pharmingen(サン・ディエゴ、カリフォルニア））から市販されており入手可能であるpAcG3Xにサブクローニングした。このベクターにより、コーディング領域のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子上流の一部を有するＧＳＴとの融合タンパク質として、ママスタチンの製造が可能となる。
【００８７】
pMammAインサートをBamHI(5'）およびSmaI（３'）制限酵素認識部位、小さい非特異的領域およびママスタチン配列の一部を含むPCRの調製セットによって、サブクローニングした。３組のプライマー（各々、リーディング・フレームにおいてシフト）を調製した。プライマーはpMammAクローンにハイブリダイズし、およびpMammA鋳型ＤＮＡと典型的なＰＣＲ反応において、ｐAcG3X中のGST遺伝子のリーディング・フレームに挿入することができるpMammAＰＣＲ産物を増幅した。ついでそのベクターを使用してＨigh５（イン・ビトロゲン）宿主昆虫細胞をトランスフェクションしたところ、ＧＳＴ−ママスタチン融合タンパク質を発現するが、これはグルタチオン樹脂（グルタチオンアガロース、キアゲン（Qiagen)、チャッツワース（Chatsworth）、カリフォルニア）を用いて宿主昆虫細胞から容易に精製した。
【００８８】
pAcG3X（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）のBamHI、SmaI制限部位に挿入するためのＤＮＡを調製するため、プライマーのセットを３つのリーディングフレームを含むように、５'プライマーとしては、BamHI認識部位（GGATCC)、pMammA配列の一部およびｐBluescriptベクターからのいくつかの５'配列を含むように調製した。該３'プライマーも同一で、SmaI認識部位（GGGCCC)、pMammA配列の一部およびｐBluescriptのいくつかの配列を含むように調製した。
使用したプライマーのセットを以下の表に示す。
【００８９】
【表５】
0004441113.tif 000006
【００９０】
１つのプライマーのセットのみ（配列番号：６および８）が活性化阻害ママスタチンをコードすることができるクローンを製造した。その活性化クローンは、High５を形質転換するために使用する場合、形質転換した細胞中で免疫学的に反応性のママスタチンを製造した（図２参照）。
他の公知の真核生物発現系を同様にママスタチンタンパクを製造するために使用してよい。
【００９１】
実施例８
イン・ビトロ転写および翻訳によって製造したタンパク質による阻害アッセイ
pMammB、ママスタチンｃＤＮＡのイン・ビトロ転写をストラタジーンのExpress ＲＮＡ転写キットを用いて行ってママスタチンＲＮＡを製造した。製造されたＲＮＡをストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（Stratagene In Vitro Express translation kit）を用いてタンパク質に翻訳した。ママスタチンＲＮＡの翻訳から製造されたママスタチンタンパク質は、培養中で乳房細胞増殖を阻害することを示した。
【００９２】
MCF‐７細胞の培養を上記の翻訳アッセイにて製造したタンパク質産物で処理した。タンパク質産物（容積の５％、培養培地）を１ウェル当たり１mlの培地を含む１２ウェルプレート中の細胞に添加した。平行実験の培養を翻訳産物および抗−ママスタチン抗体３C6の両方で最終濃度３０μg／mlで処理した。
【００９３】
陰性コントロールとして、培養物をママスタチンｃＤＮＡの不在下でインキュベートしたストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（すなわちベクターとして採用）で翻訳したタンパク質産物で処理した。これらの溶解産物はママスタチンタンパク質を製造する適当な機構を持たない。
【００９４】
すべての培養物をタンパク質産物で処理した後に６日間増殖させ、各サンプルの細胞数をコールターカウンター（Coulter counter）を用いて計算した。各サンプルの細胞数を平均できるように各培養条件には３つのサンプルを用い、阻害％を網状赤血球溶解液で処理したコントロール細胞と比較することによって決定した。
図３に示すように、pMammBのタンパク質翻訳産物はMCF-7細胞増殖を阻害した。この阻害は、抗−ママスタチン抗体３C6の存在下で大きく低減されるかまたは阻止された。
【００９５】
実施例９
pMammBでトランスフェクションした増殖Cos−７細胞から得られたならし培地内に存在するタンパク質による乳房細胞の阻害
乳房細胞の増殖阻害実験を、実施例６に記載するように、pMammBでトランスフェクションしたCos−７細胞から入手したならし培地を用いて行った。ならし培地によって引き起こされる増殖阻害は、抗−ママスタチン抗体の添加によって阻害された。
【００９６】
MCF−７細胞を１０％非必須アミノ酸およびFBS(シグマ）を補ったMEM培地中で１０4細胞／mlにてプレーティングした。細胞を終夜付着させ、ついで、（１）空のベクターpcＤＮＡでトランスフェクションしたCos-７細胞（陰性コントロール）、（２）pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞（pMammB-Cos）、（３）ＭＨＭＣならし培地、または（４）ならし培地ではない培地のいずれかからのならし培地（３日間培養）の１０％の容量を補った。平行のＭＣＦ−７細胞の培養に３０μg／mlの３C６阻害抗体を補った。処理したMCF−７細胞を６日間増殖させて、ついで血球測定計によってカウントした。
【００９７】
ならし培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖を、コントロールの条件付けしていない培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖と比較することにより、細胞増殖の阻害を決定した。データを図４に示すが、pMammBで形質転換した細胞からのならし培地が正常なヒト乳房細胞のならし培地と同様に有効に乳癌細胞増殖を阻害したことを示している。この阻害は抗−ママスタチン抗体の存在下で阻止された。
【００９８】
実施例１０
３つの免疫学的に応答性の抗‐ママスタチンタンパク質
組織培養細胞中の全正常ヒト乳房細胞（NHMC)および乳癌部位を溶解し、細胞溶解タンパク質を、上記およびアービン（Ervin, Paul）１９９５、博士論文、ミシガン大学第２章に記載されるようにＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離した。溶解した細胞サンプルをミニ−プロテイン(Mini-Protean）II装置で１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２５μg／ サンプル）上で分離した。タンパク質をニトロセルロースへトランスファーし、抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6またはIgMコントロール抗体でプローブし、アルカリフォスファターゼコンジュゲート第二抗体であるヤギ抗−マウスIgMをNBT／BCIP基質系とともに利用して陽性の抗体の反応を比色分析により検出した。そのデータを図５に示す。
【００９９】
【表６】
0004441113.tif 000007
【０１００】
図５に示すように、正常のヒト乳房細胞は、抗−ママスタチンモノクローナル抗体によって強く認識される４９および５３kDにて移動する二重線のタンパク質、および第３の弱い免疫応答性の４４kDタンパク質を発現した。試験した４つの腫瘍細胞株は４４kDの免疫応答性タンパク質のみを発現するか（レーン１、４）または免疫応答性のタンパク質は全く発現されなかった（レーン２、３）。
【０１０１】
上記のデータは数年の期間をかけて４２名の異なる整腹乳房形成患者からの正常細胞で行った実験の代表例である。正常細胞および癌細胞株での４４kDタンパク質の発現は各調製物で強度が変化した。
【０１０２】
実施例１１
ママスタチンはリンタンパク質である
乳房細胞の細胞性のリン酸化タンパク質を、32P-オルトリン酸（２００μCi／ml）を正常乳房細胞の培養中に２４時間加えることにより32Pでラベリングした。ならし培地を３０kDの分子量制限のアミコン遠心により５倍に濃縮した。濃縮した培地を濾過膜上でPBSにて１回すすいで過剰な未導入リン酸を除去し、PBS溶出バッファーを用いたS-200 SEPHACRYL（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラム）によって分画した。イムノブロットを上記のように調製し、７G6抗体でプロービングした。
【０１０３】
放射線標識した５３kDママスタチンタンパク質を免疫沈降によってならし培地中で同定した。この分析はママスタチンが分泌リンタンパク質であることを示していた。分泌されたリンタンパク質は一般に知られていないので、細胞のブレフェルディン（Brefeldin）Ａ処理を利用して、ママスタチンが分泌あるいは細胞破砕または漏出によりならし培地中に存在するか否かを決定した。ブレフェルディンＡは真核細胞からのタンパク質の分泌を阻止する真菌性化合物である。ブレフェルディンＡは正常な小胞体およびゴルジ体の機能を阻害し、小胞形成を阻止する（アービン・ポール、１９９５、学位論文、第２５頁）。たいていの分泌タンパク質は膜結合小胞からエクソサイトーシスのプロセスによって細胞から遊離され、小胞形成の阻止は多くのタンパク質の分泌を阻止する。NHMCがブレフェルディンＡの存在下で増殖する場合、リン酸化ママスタチンはならし培地中で同定されない。
【０１０４】
ママスタチンタンパク質中でリン酸化されるアミノ酸残基を決定するため、放射性標識した５３kDタンパク質をホスホアミノ酸分析にかけた。MHMC細胞を32P−オルトリン酸と２４時間インキュベートした。ついで、細胞溶解産物を抗−ママスタチン抗体７G６で免疫沈降し、以下のように精製した。５３kDタンパク質をトリプシンで消化し、ついで、酸で加水分解した。２次元の薄層クロマトグラフィーを使用してママスタチンのリン酸化アミノ酸を分析した。32P−アミノ酸をホスホ−ser/thr/tyrコントロールと混合し、２D TLCプレート（２０cm）の起点に負荷した。サンプルを２次元で分離した：第１次元−ｐH１.９バッファー（５０mlギ酸、１５６ml氷酢酸／２０００ml（１７９４H2O)）、２０分＠１.５Ｋボルト；時計回りに回転；第２次元−ｐH３.５バッファー（１０mlピリジン、１００ml氷酢酸：１８９０ml H2O)）、１６分＠１.３Ｋボルト；時計回りに回転。
【０１０５】
TLCプレートをニンヒドリン染色し、フィルムに曝した。ホスホ−アミノ酸分析は、ニンヒドリン染色したホスホ−アミノ酸標準に対するオートラジオグラフィーと比較することにより、５３kDママスタチンタンパク質が３つのタイプのリン酸化アミノ酸残基を含むことを示した。
【０１０６】
トレオニン(Th)は最も豊富なリン酸化アミノ酸であり、ついでセリン（S)およびチロシン（Ty）が続き、これらは最も少ないリン酸化種である。しかしながら、リン酸化アミノ酸残基の相対的な豊富さは天然タンパク質のものを表すものではない。というのは、酸加水分解がホスホチロシン残基からリン酸を遊離させ得るからである。
【０１０７】
実施例１２
変化したリン酸化を有する１つのママスタチンタンパク質
タンパク質の細胞リン酸化はホスファターゼおよびキナーゼによって変調することができる。ママスタチンは、ママスタチンホスファターゼの異なる活性のために、正常および腫瘍細胞の溶解産物中で異なってリン酸化される。NHMC溶解産物中のママスタチンへ及ぼすホスファターゼの効果を調べた。
【０１０８】
NHMCを低カルシウム培地中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、TBS中にこそぎとることによって回収した。細胞をTBSで洗浄し、２mg／mlのｐH６.６の酢酸バッファーに０.５％のTritonX-100を加えて再懸濁した。５μg／mlのイェルシニアホスファターゼ（Yersinia phosphatase）（YOP)（スタッキー（Stuckey）ら、Nature 370: 571-5 (1994））または活性化部位を含むイェルシニアホスファターゼ変異体（MYOP）を使用して、３７℃で６時間、細胞溶解産物を消化した（YOPおよびMYOPはザ・ユニバーシティー・オブ・ミシガン、生化学研究室のディクソン（S. Jack Dixon）博士より入手）。図６に示すように、正常ヒト乳房細胞溶解産物のイェルシニアホスファターゼ（YOP）での消化は、抗−ママスタチンイムノブロットによって同定される５３kDママスタチンタンパク質が減少した量となる結果となった(レーンＡ)。対照的に、イェルシニアホスファターゼ変異体（MYOP、レーンＢ）での消化は５３kDのママスタチンタンパク質の同定を変化させなかった。これら結果は、イムノブロットによる５３kDママスタチンタンパク質の同定がママスタチンタンパク質のリン酸化の状態の都合のよい測定手段であることを示している。
【０１０９】
上記のようにイェルシニアホスファターゼ（YOP）の存在下でインキュベートしたならし培地を用いてMCF-7を処理した。以前の観察のように、NHMCならし培地はMCF-7細胞の増殖を阻害し、この阻害は抗−ママスタチン抗体によって阻止される。図７に示すように、YOPによるNHMCならし培地の処理はこの阻害活性を破棄させる。コントロールとして、ホスファターゼ活性を欠くYOP変異体（M.YOP）によるNHMCならし培地の処理を試験した。この変異体はNHMCならし培地の阻害活性に影響は全く及ぼさなかった。抗−ママスタチン抗体７G６を用いたならし培地の免疫沈降は阻害活性を除去した。
【０１１０】
TCA沈降は、YOPでのならし培地のインキュベートが約５０％の導入リン酸を除去することを示した。上記に示すように、YOPはまたNHMC溶解産物から５３kD種を除去した（図６）。
【０１１１】
実施例１３
癌性乳房細胞ではなく正常乳房細胞により製造されたリン酸化ママスタチン
正常かつ形質転換した乳房細胞を32Pオルトリン酸で標識した。ＭＣＦ−７細胞をＭＥＭ（セロックス（Cerox))（１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸およびインスリン（１０mg／l）を補って）中で増殖させた他は、癌腫細胞株をＡＴＣＣの示唆どおりに培地中で増殖させた。細胞タンパク質の32Pオルトリン酸標識を、２％の透析したFBSを含むリン酸不含DMEM(ICN)中で行った。細胞を２００μCi：／mlの32Ｐ−リン酸とともに３７℃で２４時間インキュベートした。４８時間後、ならし培地を細胞培養液から回収し、５倍に濃縮した。ならし培地をTBSで洗浄し、１０kDの分子量のカットオフのアミコン・フィルターで濃縮した。細胞層を、溶解バッファー、細胞溶解産物からの１.５ml／フラスコ（０.５％Triton X-100、デオキシコール酸としてで２.０１％SDS）およびならし培地中にこそぎとった（テフロン細胞スクレーパー使用）。
【０１１２】
ママスタチンタンパク質を、５倍濃縮培地または細胞溶解産物５００μlあたり５μgの７G6抗−ママスタチン抗体を加えることによって免疫沈降し、室温で１.５時間インキュベートした。ヤギ抗‐マウスIgM第２抗体（５μg／0.5ml）を加え、ついで混合物をさらに1時間インキュベートした。プロテインＧ ＰＬＵＳ/ＡアガロースＲスラリー（オンコジーン・サイエンス（Oncogene Science））を加え、ついで混合物を室温で1.5時間インキュベートして抗体複合体を固定した。
【０１１３】
複合体を溶解バッファーで６回洗浄し、各回の洗浄の後に３０００×ｇで遠心した。SES-PAGEローディングバッファー（５０μｌ）を加えた後、サンプルを１００℃で3分間加熱した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにトランスファーし、さらにコダックＸ−ＡＲフィルムに露光した。
【０１１４】
ＮＨＭＣタンパク質のリン酸標識および続く免疫沈降は、ＮＨＭＣ中の４９ｋＤおよび５３ｋＤリンタンパク質を同定した。癌腫細胞株では４９ｋＤおよび５３ｋＤリンタンパク質は認められなかった。癌腫細胞株ＭＨＣ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５は４４kDの免疫応答性タンパク質を発現したが、このタンパク質は32P−オルトリン酸で標識されなかった。
【０１１５】
本実験は、ママスタチンの分子量の増加とともにより多くのリン酸が取りこまれることを示す。形質転換細胞株でのママスタチンのリン酸化の欠如は、そのタンパク質の高分子量形態の欠如およびママスタチン阻害活性の欠如と相関している。
【０１１６】
実施例１４
ママスタチンキナーゼおよびホスファターゼ
正常細胞または癌腫細胞のフラスコを７５％のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞培養物をTBSで3回洗浄し、ついでテフロンスクレーパーを用いてTBS中にこそぎ入れた。細胞懸濁液を１０００ｇの遠心でペレット化し、ついで少量のTBS中に再懸濁した。各タイプの細胞のアリコートをタンパク質定量のため取り出した。ついで、タンパク質濃度を溶解バッファー（０.５％TritonX−１００および、各５μg／mlのアプロチニン、ロイペプチンおよびPMSFを加えたTBS）２mg／mlに等しくした。等質量の正常細胞タンパク質および腫瘍細胞タンパク質を混合し、３７℃で３時間インキュベートした。正常細胞および癌腫細胞溶解産物の平行混合を１０ｎＭオルトバナジン塩（Orthovandate(NaVO4))、ホスファターゼインヒビターの存在下で行った。ついで混合物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、７Ｇ６抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。そのデータを図８に示す。
【０１１７】
【表７】
0004441113.tif 000008
【０１１８】
図８に示すように癌細胞（ＺＲ−７５−１）（レーンＡ）はＮＨＭＣ(レーンＢ）に比較して、５３／４９kDママスタチンを産生しなかった。正常細胞タンパク質および癌細胞タンパク質をプロテイナーゼの存在下で混合すると活性な５３kDインヒビターの量が減少する（レーンD)。しかしながら、チロシン−ホスファターゼインヒビター（NaVO4)の存在下では、５３kD種は混合物中に保持されている(レーンC)。これらの結果は、癌腫細胞がママスタチンのリン酸化形態を排除しうるホスファターゼ活性を発現することを示している。
【０１１９】
正常細胞株および形質転換株でのママスタチンの発現はウエスタンブロット分析により定量的に測定できる。抗−ママスタチンモノクローナル抗体を用い、乳癌細胞および正常乳房上皮からの細胞との間で該タンパク質の発現に一貫した差異が存在するが示された。ママスタチンは、ヒトの正常な女性乳房組織中では抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6を用いたウエスタンブロット分析によって４４、４９および５３kD種として認められた。乳癌細胞では、４４kD種が首尾一貫することなく認められたが、４９または５３kDの免疫応答性形態は決して認められなかった。４９および５３kD形態が正常細胞中で同定される場合、それらはリン酸化されている。４４kD種はリン酸化されていない。従って、イムノブロット分析を用い、ママスタチンの４４および４９kD種、および５３kD種の発現を観察することによってママスタチンがリン酸化されているか否かを決定することができる。
【０１２０】
実施例１５
ヒト血清中でのママスタチンの同定
精製抗−ママスタチンモノクローナル抗体６B8および３C6を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)をママスタチンの検出のために確立した。
抗体６B8を用い、１０μg／mlまたは１００μl／ウェルの濃度で、室温で３時間または４℃で終夜、イムロン １（Immulon 1）９６ウェルマイクロタイタープレート（イムロン社）をコーティングした。プレートをTBS（１５０mM NaCl、１００ｍM トリスｐH7.4）中の２％BSA(シグマ）で３０分間ブロックし、ついで２％BSA溶液に５０％に希釈した精製したママスタチンまたはサンプル血清とともに３７℃で１.５時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを第二抗体を加える前に、３００μl／ウェルのTBSプラス0.1％TritonX-１００で５分間、３回洗浄した。
【０１２１】
第2抗体はビオチン化した３Ｃ６であった。抗体は、０.１ＭのNaHCO3中でビオチン、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（N-hydroxy succinimate ester）（シグマ）と室温で2時間または４℃で16時間インキュベートすることによってビオチン化する。抗体を使用の前または保存前に、１MのNaCl、５０mMのトリス（ｐH7.4）、０.０２％のアジ化物（NaN3、シグマ）に透析した。
【０１２２】
第二抗体はビオチン化した３Ｃ６であった。抗体のビオチン化は、ビオチン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマ）とともに０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3中で室温にて２時間および４℃にて１６時間インキュベートすることにより行った。抗体を使用前に１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７.４、０.０２％アジド（ＮａＮ3、シグマ）中に透析した。
【０１２３】
ビオチン化した抗−ママスタチン抗体を２％BSA／TBS溶液中にて１μg/mlおよび１００μl／ウェルにて添加し、３７℃で１.５時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを上記のようにTBSプラス0.1％Triton X-100で５分間で５回洗浄した。第二抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（サザン・バイオテクノロジー（Southern Biotechnology））で同定し、すべてのサンプルについて２％BSA/TBS中、１００μl／ウェルで１／１０００の希釈にて1時間インキュベートした。
【０１２４】
ELISAアッセイをＰＮＰＰ（パラニトロフェニルホスフェート、シグマ）をアルカリホスファターゼバッファー（１０mMジエタノールアミンｐH9.5（シグマ）、０.５０mM MgCl2（シグマ））中で１mg／mlにて用いて比色的に発色させた。マイクロタイタープレートを１５分および３０分間隔で４０５nmでＥＬＩＳＡリーダー上で読みとった。
【０１２５】
細胞溶解産物またはならし培地から単離したクロマトグラフィー精製したママスタチンを用い、低ナノグラム範囲でママスタチンのアッセイの感度を示すＥＬＩＳＡのための標準曲線を確立した（図９参照）。正常ヒト志願者血清中のママスタチンレベルの定量を、志願者から１ヶ月間、２日間隔で採取した血清サンプルで行った。このアッセイにより正常ヒト女性血清中のママスタチンレベルが検出可能であり、約１０〜５０μg/mlの間でで変化した（図１０）。
【０１２６】
ママスタチンレベルをまた、乳癌患者から採取した血清中でも測定した。ミシガン大学胸部ケアセンターで結節陰性（node negative）乳癌と診断された患者を、処理の全経過を通じて、血清中のママスタチン発現について検査した。そのデータを図１１に示し、以下にまとめた。血清サンプルを、サイトトキシン、アドリアマイシン、メトトレキセート、および５Fuを用いたホルモンサイクリング（hormonal cycling）組み合わせモダリティープロトコールの全処置期間と通じて乳癌患者から回収した。凝血後、血清を遠心により全血から分離し、使用まで−２０℃で保存した。０.５％NFDM中で５０％の濃度の血清１５０μlを用いたELISAアッセイを、酵素結合した「サンドイッチ」アッセイにて６B8および３C6抗−ママスタチン抗体を用いて２回行った。クロマトグラフィー精製したママスタチンで標準曲線を作成し、図９に示す曲線に匹敵するものとした。
ママスタチンの発現は患者によって変わり、処理の経過の間で変動した。ママスタチンレベルは、転移性疾患への進行とともに検出不能になることが一貫して観察された。
【０１２７】
乳癌と診断された患者は、正常患者血清中のレベルと比較して診断時の血清中に低レベルのママスタチンを有していた。ママスタチンレベルは、一般に、ホルモンサイクリング、アジュバント化学療法プロトコールで上昇した。ママスタチンレベルは、このプロトコールでも変動した。ママスタチンレベルは死直前の進行疾患を患う患者では検出できなかった。患者のデータを以下の表に示すように４つの群に分類した。
【０１２８】
I.  血清ママスタチンレベルが治療期間中上昇し続けた患者の群
II．  血清ママスタチンレベルが治療の最初は上昇したが、ついで検出不可能になった患者の群
III．  血清ママスタチンレベルが治療期間に上昇したが、ついで大きく変動した患者の群
IV．  低レベルの血清ママスタチンを有していたが治療で検出不可能になった患者の群。
【０１２９】
【表８】
0004441113.tif 000009
【０１３０】
実施例１６
ママスタチンのイン・ビボでの効力
CD-1Nu／Nuホモザイゴートの雌の６週齢マウス（チャールズ・リバー(Charles River））に徐放性ペレットによりエストロゲンを０.７２mg／ペレットにて、１７βエストラジオール（イノベーティブ・リサーチ（Innovative Rsearch）＃SE-121）の６０日間放出を用いて補給した。エストロゲンを補給したマウスに３×１０6MCF-7を６０％マトリゲル中に注入当たり１００μl、注射した。２回の注射を、わき腹当たり１回、投与した。腫瘍細胞増殖の７日後、ママスタチンを投与した。被験マウスに６週間の間、２日間隔で産生培地中のママスタチンの１、２、または５μgを与えた。コントロールのマウスにはBSAを投与するか、または腫瘍を注射せずにインヒビター単独を注射した。
【０１３１】
腫瘍の大きさを１週間ごとに最大直径の点で測定し、処理群ごとに平均した。その結果を図１３Ａ−１３Ｃに腫瘍の大きさを平均直径±標準偏差としてプロットして示した。
本動物実験を、MDA-２３１腫瘍細胞を用いて繰り返した。細胞をMCF-7細胞に関して上記で記載したように注射１回あたり２×１０6細胞で注射した。
【０１３２】
その結果を図１４Ａ〜１４Ｃに示す。
示された結果は期待されるほどではなかった。動物は尾静脈に注射を受けたので、必要な血中投与量より少ない結果となった。その後の腹腔内注射を用いた実験では一層有効な処理となった。５μg/マウスの用量およびそれより多い用量で腫瘍増殖が廃棄される。
【０１３３】
実施齢１７
ママスタチンのレトロウイルス発現
ママスタチンｃＤＮＡ（2.4キロベース（ｋｂ）のインサート）をレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを用いて３Ｔ３繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収し、溶解し、ついでその細胞溶解産物をウエスタンブロットで分析した。
図１２に示すように、ママスタチン運搬レトロウイルスにてトランスフェクションされた３Ｔ３細胞はリン酸化したママスタチンを発現した。
【０１３４】
実施齢１８
バキュロウイルスおよびCos７細胞におけるママスタチン発現
サル腎臓細胞であるCos−７をママスタチンをコードする核酸でトランスフェクションした。
【表９】
0004441113.tif 000010
【０１３５】
図１６に示すように、Ｃos−７細胞中の組換えママスタチン発現の誘発は、ママスタチン遺伝子pMammAおよびpMammBが真正のママスタチンをコードしていることを示していた。さらに、Ｃos−７細胞がタンパク質リン酸化を伴うママスタチンの異なる形態を発現するという観察は、ママスタチンがヒト乳房細胞以外の真核細胞にて製造される場合にリン酸化され活性であることを示唆している。安定したトランスフェクタントを選択して組換えママスタチンの永続的な合成を可能とした。
【０１３６】
実施例１９
培養中の正常ヒト乳上皮細胞によるママスタチンの産生
健常な乳房組織を、整腹乳房形成術から、無菌にて手術室から直接入手した。その組織をIII型コラゲナーゼ（ライフ・サイエンスィズ、ベテスダ、メリーランド）を１ｇ当たり４単位含む溶液中、ラミナーフローフード（Laminar Flow hood）中で滅菌状態で細かに切り刻んだ。この細かに切り刻んだ組織を終夜振盪水浴中で３７℃にてインキュベートしてコラゲナーゼ消化させた。
【０１３７】
コラゲナーゼ消化した乳房組織である、多様な細胞型および脂肪細胞中から放出された脂質を含む粘性液体を、遠心にかけて脂質、水性溶液、および他の細胞型を分離した。コラゲナーゼ消化した物質を卓上遠心機で１０００rpmにて室温で約５分間回転させた。脂肪細胞および遊離脂質は、遠心チューブの上部半分に分配され、吸引により抜き取り廃棄した。細胞ペレットの上に位置する水性上清もまた、吸引により抜き取り廃棄した。残りの細胞ペレットを哺乳動物増殖培地であるDMEM、ｐH７.４の滅菌溶液で洗浄した。洗浄は洗浄からの上清がもはや濁らなくなるまで（例えば、約４回の洗浄）続けた。その洗浄した細胞を増殖培地中に再浮遊させ、４０℃で３０分間重力によって沈降させた。赤血球は無核であり有核の上皮細胞よりも低密度であるため、この手順は、赤血球を含む上清を抜き取ることによって沈降した上皮細胞から赤血球を除去することができる。この沈降手順を細胞ペレットに赤色が残らなくなるまで、例えば約２回、繰り返した。残る細胞ペレットを、５％ウマ血清、１０μg/mlの上皮増殖因子、１００ng／mlのコレラ毒素、５００ng／mlのヒドロコルチゾン、１０μg/mlのインスリン、１００単位／mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、および１mM濃度の塩化カルシウムを含む富栄養DMEM／F12増殖培地中に再浮遊した。生理的濃度のカルシウムにより細胞接着および細胞培養中の増殖（outgrowth）が促進された。細胞浮遊液を５％ＣＯ2濃度で３７℃にて滅菌組織培養フラスコ中でインキュベートした。
【０１３８】
正常乳房組織の初期の培養は混合細胞集団を含む。脂肪細胞、ニューロンおよび血管組織は上記の遠心分画工程によって有意に減少させられる。結合組織細胞は有意な量で存在する。上皮細胞でない細胞を除去するために、分別接着法を用いた。繊維芽細胞、ニューロンおよび乳房組織における他の細胞型はすべて上皮細胞より一層速やかに組織培養プラスチックに接着する。さらに、これらの細胞型はすべて、組織培養プラスチックから上皮細胞よりも速やかにトリプシンによって除去される。乳房上皮細胞のための培養を富ませるために、単層を形成し始めた培養液（最初のプレーティングの５〜７日後）をトリプシン：EDTA溶液（２５０：１（モル比））で処理する。細胞の大多数は、３７℃でのインキュベーションで５分以内に除去された。残った接着細胞は９０％以上が上皮乳房細胞であった。これらの細胞を採り、上記の増殖培地に４０μMの塩化カルシウムとともに戻した。繊維芽細胞をトリプシン処理した培養フラスコから除去し、遠心により回収し、増殖培地に再浮遊させ、ついで組織培養プラスチックに３７℃で３０分間プレーティングした。接着した細胞は大部分が繊維芽細胞であった。接着しなかった細胞は有意に繊維芽細胞に富んでいた（５０〜８０％）。これら浮遊細胞を除去し、新鮮な組織培養フラスコ中で沈降させた。この工程を２回繰り返して、上皮細胞が優勢な細胞集団を得た。コレラ毒素は上皮細胞の増殖を促進させ繊維芽細胞の増殖は阻害するので、また繊維芽細胞は低減したカルシウムでは充分に増殖しないので、その培養物は、上記低カルシウム培地中で１週間以内に約１００％の上皮細胞となった。これらの正常ヒト乳房細胞（NHMC)の培養物は、培地中にママスタチンを産生した。
【０１３９】
NHMCを増殖させるために使用した栄養培地には５％のウマ血清が含まれており、これはヒト注射には適さない。ウマ血清タンパク質は精製してママスタチンタンパク質から排除するか、または該血清を欠く培地中で細胞を増殖させなければならない。正常細胞は、血清の不在下では７〜１０日間しか維持することができない。血清不含のママスタチンを有意な量で長期間にわたって製造するために、細胞を無血清培地および血清を含む培地で交代で増殖させた。
【０１４０】
NHMCを上記のように増殖培地中で完全なコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞は、細胞がフラスコの利用可能な表面を覆いつくしたとき、増殖するにつれて溶液中に伸び始めた。伸びつつある細胞を回収し、新しいフラスコに移した。コンフルエントに達したフラスコを滅菌食塩水で３回すすぎ、洗浄の間に５分間食塩水でインキュベートして血清タンパク質を除去した。ついで細胞に無血清の「産生培地」を与えたが、これは本質的に、血清、コレラ毒素およびヒドロコルチゾン欠く増殖培地であった。細胞を約４日（９６時間）産生培地で維持し、培地の回収および細胞の増殖培地への返還を少なくとも４日間行った。このようにして製造されたママスタチンの典型的なバッチサイズは、１〜２リットルであった。
【０１４１】
ママスタチンはまた、バイオリアクター、バイオフロー・３０００（Bioflow 3000）、ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（New Brunswick Scientific）中でも製造されている。この潅流リアクターでは、細胞は組織培養処理した線維細胞（fibracell）ディスクに接着した。細胞の接着したディスクを反応容器中のバスケット中で維持し、培地で潅流した。NHMCをリアクターに導入したとき、それらは線維細胞ディスクに集まり、培地の潅流によって栄養を与えられる。ならし培地をリアクターから回収し、冷凍した。
【０１４２】
実施例２０
ママスタチンのドット・ブロット血清アッセイ
２５歳の健康な女性から血清を入手し、乳癌患者（ステージIV）からの血清、該患者の診断されていないきょうだいからの血清、および該患者の母からの血清と比較した（その家族は乳癌の家系である）。これら血清サンプルをママスタチンの存在についてイムノアッセイで比較した。診断の日に採取した複数の乳癌患者からの血液サンプルもまたイムノアッセイで分析した。正常なヒト乳房細胞（NHMC)ならし培地を標準コントロールとして用いた。標準的なNHMCママスタチンは、クロマトグラフィー精製したママスタチンタンパク質標準を用いてドット・ブロットアッセイで決定されるように約５０ng／mlを含んでいた。
【０１４３】
個々の血液サンプルをバキュテーナー（vacutanier）チューブに回収し、全血から血清を分離した。血清サンプル（２５０または５００μl容量）を希釈なしに９６ウェル（S & S Dot-Blot manifold）を用いて吸引によってニトロセルロースに適用した。ならし培地を実施例１９のように調製した。ニトロセルロースフィルター上のサンプルをTBS中のTriton X-100で洗浄し、脱脂粉乳（TBS中に５％）でブロックし、５％の脱脂粉乳中の第１抗−ママスタチン抗体（７G6マウスIgM)１μg/mlとともに室温で１.５時間インキュベートした後、５％の脱脂粉乳中の第２抗体（アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスIgM)１μg/mlとともに室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ発色反応は、ニトロブルー−テトラゾリウムおよびBCIPを用いて進行させた。
【０１４４】
図１３に示すように、サンプル中のママスタチンの量を正常乳房細胞ならし培地から得た標準曲線に対して定量した。健康な女性から得た血清は暗く色付けたブロットによって示されるように、容易に検出可能な量のママスタチンを含んでいたのに対し、乳癌と診断された患者からの血清および診断されていない家族成員からの血清は、ほとんどまたは全くママスタチンを示さなかった。
【０１４５】
診断した日の乳癌患者から、乳癌患者の健康な家族から、および健康な女性および男性からさらなる血清を得た。血清を上記のように処理してママスタチンを分析した。ドット・ブロットは発色反応の強度を示すために「陰性または低い」または「陽性または高い」として評価した。データを以下の表に示す。
【０１４６】
【表１０】
0004441113.tif 000011
【０１４７】
実施例２１
ヒト乳癌患者の治療
化学療法に失敗したかまたは失敗しつつある乳癌再発したステージIVの乳癌患者２９名にママスタチンタンパク質を利用できるようにした。このタンパク質は上記実施例１９の記載と同様にして製造したものであり、３mlの注射容量にて所要用量で産生培地中にて提供された。患者は処方された計画に従って、このタンパク質を静脈内投与された。一般に、１日用量を注射した。選択された投与量は、患者の血流内で生理学的な量のママスタチン（例えば、健康な女性で５〜５０ng／ml)が提供されるものであった。各患者の投与量および頻度は以下の表に示すとおりである。
【０１４８】
【表１１】
0004441113.tif 000012
【０１４９】
【表１２】
0004441113.tif 000013
【０１５０】
２９名の患者のグループのうち、後期ステージの肝臓疾患を有していた６名は生存できなかった。これらの６名の患者はママスタチンを投与される前に肝機能不全の臨床的所見を呈し、本治療によっては助からなかった。１名の患者は肝臓機能不全に陥る前に黄疸が低減する徴候を示したが、これら６名の患者は全員、進行した肝臓癌を有する患者に共通する窒素毒素により死亡したと思われた。
【０１５１】
残りの患者のうち、２名はその疾患により死亡した。１名はママスタチン治療の２ヶ月後には疾患のない状態であったと思われた。この患者は治療から外され、２ヶ月以内に再発した。この患者はコントロール状態に戻ることはなく、肝臓の疾患で死亡した。第二の患者は治療の４ヶ月後に死亡したが、本治療に対する応答の徴候を示すことは決してなかった。これら後者の２名の患者ではママスタチンの投与量を１０倍に増加したが、これらの患者のいずれにおいても毒性の徴候は認められなかった。
【０１５２】
現在ママスタチン療法を受けている１９名の患者のうち、大多数は陽性の利益の徴候を示し、有害応答の徴候はみられない。これらの患者のうちの３名は、ママスタチンの利益を受けているのか否かは明らかでない。他の１６名の患者は、正常レベルまでの腫瘍マーカー（ＣＡ１５−３およびＣＡ２７−２９）レベルの低減、触診できる腫瘍の大きさの低減、ＭＲＩ走査で認められるような疾患の減退および痛みの低減を含む利益の明確な臨床的徴候を示している。これらの患者のうちの数人は、疾患が無くなったと考えられる段階まで改善を示す。しかしながら、これらの患者にタンパク質を３日〜５日の期間与えないと、疾患の徴候を全く示さない患者においてさえも、痛みの増大によって示されるように疾患の活性の再開という結果となることが一貫して観察されている。タンパク質療法を再生すると２〜４時間以内で増大した痛みの徴候が低減または除去される。
【０１５３】
血中のママスタチンレベルが長期の治療の後に衰退することもまた観察されており、負のフィードバックシステムを示唆している。この一定の血中レベルにおける衰退は、約２８日の期間、毎日ママスタチンを投与し、その後２〜３日タンパク質を投与しないことによってうまく回避できる。
【０１５４】
実施例２２
ヒト治療のための組換えママスタチン
組換えママスタチンを、Cos-7サル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細胞、およびＳｆ９昆虫細胞中を、ママスタチンｃＤＮＡ配列を含むプラスミドでトランスフェクションすることによってこれら細胞中で製造した。ママスタチンｃＤＮＡはこれら産生細胞株のゲノム中に安定に組み込まれ、増殖阻害活性と免疫応答性のタンパク質を分泌する。
【０１５５】
これらの細胞からママスタチンを製造し、ヒトに使用するために該タンパク質を単離するため、これら細胞株を無血清培地中で約４８〜７２時間増殖させる。培地を取り除き、タンパク質をならし培地から精製し、約０.１M〜約０.５Mから塩化ナトリウム濃度勾配を用い、約０.２Ｍでママスタチン画分を回収する、トリスバッファー（pH7.5）中でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ついで、タンパク質画分を生理食塩水に対して透析し、必要であれば透析し、ついで濾過滅菌する。
【０１５６】
別法において、ママスタチンをCos7またはSf9細胞中で融合タンパク質として産生させる。融合タンパク質はヒスチジンタグ（６つのヒスチジン残基）および第Ｘ因子プロテイナーゼ開裂部位を含む。ママスタチン発現細胞を好ましくは１％の血清含有培地中で培養し、ならし培地を回収し、ニッケルキレート樹脂に通す。His−融合タンパク質はカラムに付着し、５０mMトリス（pH7.5）、0.1M NaClで洗浄し、ついで１０単位／ｍｌの第Ｘ因子プロテイナーゼを含むトリス−ＮａＣｌでゆっくりと溶出する。これによりママスタチンはHis−融合から遊離される。ママスタチンを分子篩クロマトグラフィー、または上記のようにイオン交換クロマトグラフィーによって分離する。
上記明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全な記載を提供するものである。本発明の範囲から逸脱するこなく本発明の多くの態様を行うことが可能であるので、本発明は添付の特許請求の範囲に存在する。
【０１５７】
【表１３−１】
0004441113.tif 000014
【表１３−２】
0004441113.tif 000015
【表１３−３】
0004441113.tif 000016
【０１５８】
【図面の簡単な説明】
【図１】  真核細胞Cos-7細胞における組換えママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【図２】  昆虫細胞中のママスタチンの発現を示すイムノブロットである。
【図３】  イン・ビトロ転写および翻訳によって製造される組換えママスタチンによる乳房細胞増殖の阻害を示すイムノブロットである。
【図４】  ママスタチンｃDNAでトランスフェクションしたCos-7細胞のならし培地での処置により、ヒト乳癌細胞増殖における増殖阻害を示すグラフである。
【図５】  ヒト正常乳房細胞および癌性乳房細胞における５３、４９、および４４kDママスタチンの相対量を示すウエスタンブロットである。
【図６】  ママスタチンのホスファターゼ消化を示すイムノブロットである。
【図７】  ママスタチンの活性に及ぼすホスファターゼの影響を示すグラフである。
【図８】  ヒト正常乳房細胞および癌性乳房細胞からのママスタチンならびに正常細胞および癌性細胞の混合培養物中のママスタチンを示すウエスタンブロットである。
【図９】  ＥＬＩＳＡによって分析された正常ヒト血清中のママスタチンを示すグラフである。
【図１０】  ママスタチンのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図１１】  治療過程での乳癌患者におけるママスタチンレベルを示すグラフである。
【図１２】  レトロウイルスによって誘発されたママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【図１３】  ヌードマウスにおけるＭＣＦ７腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【図１４】  ヌードマウスにおける腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【図１５】  正常女性からの血液中のママスタチンと乳癌患者からの血液中のママスタチンの不在を示すドットブロットアッセイである。
【図１６】  組換えママスタチンを発現する乳房細胞のイムノブロットである。
【図１】
0004441113.tif 000017
【図２】
0004441113.tif 000018
【図３Ａ】
0004441113.tif 000019
【図３Ｂ】
0004441113.tif 000020
【図４】
0004441113.tif 000021
【図５】
0004441113.tif 000022
【図６】
0004441113.tif 000023
【図７】
0004441113.tif 000024
【図８】
0004441113.tif 000025
【図９】
0004441113.tif 000026
【図１０】
0004441113.tif 000027
【図１１】
0004441113.tif 000028
【図１２】
0004441113.tif 000029
【図１３Ａ】
0004441113.tif 000030
【図１３Ｂ】
0004441113.tif 000031
【図１３Ｃ】
0004441113.tif 000032
【図１４Ａ】
0004441113.tif 000033
【図１４Ｂ】
0004441113.tif 000034
【図１４Ｃ】
0004441113.tif 000035
【図１５】
0004441113.tif 000036
【図１６】
0004441113.tif 000037