(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない酵母ＲＮＡを用い、ＮＡＳＢＡ法によりＲＮＡ増幅をおこなうようにしたことを特徴とする、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法に関し、特に、特定の塩基配列を有する標的核酸を高感度および高精度に測定できる改良方法を提案するものである。
【０００２】
【従来の技術】
特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたその核酸量を測定するために、従来これまでに、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ノーザンブロット法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｒｉｂ−ｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）などの種々の方法が提案され、用いられてきた。しかし、これら方法は、感度の低さ、操作の煩雑さおよび定量の正確さなどの点で不十分であるという問題があった。そこで、これら問題点を解決するため、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡ−ＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ法などの様々な核酸増幅法が開発されている。特に、ＰＣＲ法などは、最近、種々の変形法が編み出され、急速な進歩を遂げている。
また一方、近年、標的核酸の検出の容易化を図るべく検出機器の開発もいろいろと進み、核酸の増輻系を用いずに標的核酸を検出するマイクロアレーやＤＮＡチップと呼ばれる技術などが開発されてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら標的核酸量の測定系を用いても、標的核酸量の測定の精密度は、なお低い状態にある。この問題を解決するために、試薬性能の向上や実験工程の改良など、種々の対策が進められてきたが、低い精密度の原因は末だに解明されておらず、低い精密度に対する根本的な解決策は、今のところ見出されていないのが現状である。
したがって、従来、特定の塩基配列を有する標的核酸を高感度および高精度に測定できる方法の開発が求められていた。
【０００４】
本発明は、上述した従来の事情を考慮してなされたものであって、その課題とするところは、特定の塩基配列を有する標的核酸の量を、直接または増幅系を用いて測定するにあたって、より高感度、より高精度およびより広領域の測定を可能にする有用な改良方法を提供することにある。
また、本発明の他の課題は、特定の塩基配列を有する標的核酸の高感度、高精度および広領域の測定に適している、該標的核酸およびそれに対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液を提供することにある。
本発明のその他の課題は、特許請求の範囲を含む明細書の記載を参照することにより、理解される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の技術的課題を解決するべく鋭意研究した結果、特定の塩基配列を有する標的核酸およびこの標的核酸に対する内部標準物質（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸等）の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、その特定の塩基配列を有する標的核酸およひ標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸（例えばＤＮＡ重合体、ＲＮＡ重合体など）を添加し、そしてその共存系の下で、公知の核酸増幅法例えばＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法などを利用して特定の塩基配列を有する標的核酸量の測定を行なうと、従来よりも著しく、より高感度、より高精度およびより広領域の測定が可能になることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
したがって、本発明は、より明確には、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を添加することを特徴とする、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法に関する。
また、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸が添加されている、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液の、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するための使用に関する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に添加して使用される、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法に関する。従って、本発明は、従来これまでに開発された、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出方法全般に、例えばサザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ノーザンブロット法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）およびＤＮＡチップアーレーなどに適用されうる。また、本発明は、従来これまでに開発された、特定の塩基配列を有する標的核酸の測定（増幅）方法全般に、例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、自己配列複製法（３ＳＲ）、逆転写−ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）、Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅系、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、およびＴＭＡ法などに適用されうる。
本発明者は、本発明は特に、ＮＡＳＢＡ法、逆転写−ＰＣＲ法、を利用して特定の塩基配列を有する標的核酸の測定を行なう場合に有効、有用である点を確認している。ＮＡＳＢＡ法による場合、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーの他、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、そして核酸の原料となるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが用いられる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有する逆転写酵素を使用すると、１種類の酵素で逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとを兼用できる。好ましい濃度範囲はそれぞれ、逆転写酵素は０．０１〜１００Ｕ／μＬ、ＲＮａｓｅＨは０．０００１〜０．１Ｕ／μＬ、ＲＮＡポリメラーゼは０．１〜１００Ｕ／μＬ、そして両ヌクレオチドは０．１〜１００ｍＭである。ＮＡＳＢＡ法は、基本的に、これら成分および標的核酸を含む反応液を４１℃前後の最適反応温度にて、通常８０分〜１００分間インキュベートするだけでよく、大変簡便である。
なお、ＮＡＳＢＡによる測定は、日本臨床検査自動化学会会誌Ｖｏｌ．２０に掲載されたハイブリダイゼーション装置等を用いて行なうことができる。
【０００８】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質（例えばｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸）の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対するｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸等の内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸、つまりその検出または増幅反応に直接関わるプライマー、プローブまたはヌクレオチド以外の核酸を添加し、そして、その併存系において、上述の知られた検出・測定法に従い、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出・測定を行なうものである。
本発明において使用される‘特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸’とは、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応を妨げないだけでなく、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応におそらく間接的に関与し（その関与の詳細な機構は現在のところ不明である。）、それらの反応を鋭敏に進行させまたは急速に増大させるような核酸を指し、例えば標的核酸の種類にも依るが、そのような性質を持ったＤＮＡ重合体とかＲＮＡ重合体などが該当する。特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接関わるプライマー、プローブまたはヌクレオチドなどは、上記の核酸に該当しない。‘直接には関らない核酸’としては、例えば、標的核酸が白血病遺伝子ＷＴ１  ＲＮＡであって、内部標準物質としてＷＴ１  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡを用いるとき、本実施例で示すような酵母ＲＮＡが該当しかつ好適である。
本発明における‘特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸’は、通常もしくは好ましくは１ｎｇ／μＬ以上の濃度で使用される。
したがって、本発明の主題は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に添加し、この併存系で行なうところの特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法に関する。
また、本発明の他の主題は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸が添加されている、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液を使用することに関する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために利用される、上記の特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を主題とする。
【０００９】
【実施例】
以下、本発明の最良の実施形態と思われる実施例を説明することにより、本発明をより明確なものにする。
【００１０】
実施例１
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＮＡＳＢＡ法を用いたＷＴ１  ＲＮＡの測定
１）ＷＴ１  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ（ＷＴ）の合成
ＮＡＳＢＡ増幅領域を含む白血病遺伝子ＷＴ１  ｃＤＮＡの一部をｐＳＰ６４（ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだプラスミド（ｐＷＴ６２８）を用いて合成ＷＴ１  ｓｔａｎｄ−ａｒｄ  ＲＮＡ（ＷＴ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。即ち、プラスミドｐＷＴ６２８を制限酵素処理してｃＤＮＡの３’末端で切断して  ｌｉｎｅａｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔとし、その後、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  ｋｉｔｓを用いてＲＮＡを合成した。プラスミド精製・ＲＮＡ合成は適当な回数（２〜３回）繰返され、得られたＲＮＡは変性ゲル電気泳動で転写産物長を確認し、これとともに合成ＲＮＡのコピー数は２６０ｎｍの吸光度から算出した。
２）ＷＴ１  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡ（ＱＡ）の合成
増幅領域内の捕捉プローブ部分において結合配列だけがｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡと異なるＲＮＡ合成用プラスミド（ｐＷＴ６２８ＱＡ）を作製した。  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡの合成は、ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡの合成方法に従って行なった。合成ＲＮＡのコピー数は２６０ｎｍの吸光度から算出した。
３）合成ＲＮＡの希釈
合成ＲＮＡは、１０２コピー／５μＬまで０．１μｇ／μＬの酵母ＲＮＡ溶液（実施例）またはｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  （比較例）によって希釈した。
４）ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＮＡＳＢＡ
４０μＬのＮＡＳＢＡ反応系に１０２コピーのｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡと１０４コピーのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡを加え増幅反応をＮＡＳＢＡで行なった。
増幅産物の測定を、ＤＮＡプロブ自動測定システムにてＷＴ１／ＱＡ各捕捉用マイクロプレート並びに検出プレートを用いて行ない、各シグナルの対数比（ｌｏｇ（ＷＴ／ＱＡ））を取り、回帰式から発現量（コピー／μｇ）を算出した。
５）結果
試験の結果を以下の表１に示す。同表に示された測定精度の値よりわかるように、酵母ＲＮＡを添加したＷＴ１合成ＲＮＡの希釈液をＮＡＳＢＡ増幅に用いた場合は、酵母ＲＮＡを添加していないＷＴ１合成ＲＮＡの希釈液をＮＡＳＢＡ増幅に用いた場合と比較して、格段により高い精度でＷＴ１  ＲＮＡの測定を行ないうる。
【００１１】
実施例２
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＮＡＳＢＡ法を用いたＭＤＲＩ  ＲＮＡの測定
１）ＭＤＲ１  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ（ＭＤＲ）の合成
ＮＡＳＢＡ増幅領域を含むＭＤＲ１  ｃＤＮＡの一部をｐＳＰ６５（ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだプラスミド（ｐＭＤＲ９４）を用いて合成ＭＤＲ１  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ（ＭＤＲ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。即ち、プラスミドｐＭＤＲ９４を制限酵素処理してｃＤＮＡの３  末端で切断してｌｉｎｅａｒｆｒａｇｍｅｎｔとし、その後、ＭＥ−ＧＡ  ｓｃｒｉｐｔ  ｋｉｔｓを用いてＲＮＡを合成した。プラスミド精製・ＲＮＡ合成は適当な回数（２〜３回）繰返され、得られたＲＮＡは変性ゲル電気泳動で転写産物長を確認し、これとともに合成ＲＮＡのコピー数は２６０ｎｍの吸光度から算出した。
２）ＭＤＲ１  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡ（ＱＡ）の合成
増幅領域内の捕捉プローブ部分において結合配列だけがｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡと異なるＲＮＡ合成用プラスミド（ｐＭＤＲ９４ＱＡ）を作製した。ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡの合成は、ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡの合成方法に従って行なった。合成ＲＮＡのコピー数は２６０ｎｍの吸光度から算出した。
３）合成ＲＮＡの希釈
合成ＲＮＡは、１０２コピー／５μＬまで０．１μｇ／μＬの酵母ＲＮＡ溶液（実施例）またはｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（比較例）によって希釈した。
４）ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＮＡＳＢＡ
４０μＬのＮＡＳＢＡ反応系に、１０２コピーまたは１０４コピーのｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡと１０２コピーまたは１０４コピーのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡを加え、増幅反応をＮＡＳＢＡで行なった。増幅産物の測定を、ＤＮＡ自動分析装置ＭａｒｋＩ（東洋紡株式会社製）にてＭＤＲ１／ＱＡ各捕捉用マイクロプレート並びに検出プレートを用いて行ない、各シグナルの対数比（ｌｏｇ（ＭＤＲ／ＱＡ））を取り、回帰式から発現量（コピー／μｇ）を算出した。
５）結果
試験の結果を以下の表２に示す。同表に示された測定精度の値よりわかるように、酵母ＲＮＡを添加したＭＤＲ１合成ＲＮＡの希釈液をＮＡＳＢＡ増幅に用いた場合は、酵母ＲＮＡを添加していないＭＤＲ１合成ＲＮＡの希釈液をＮＡＳＢＡ増幅に用いた場合と比較して、格段により高い精度でＭＤＲ１  ＲＮＡの測定を行ないうる。
【００１２】
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【００１３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸の量を、直接または増幅系を用いて測定するにあたって、より高感度、より高精度およびより広領域の測定を可能になるという効果が得られる。
また、本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸の高感度、高精度および広領域の測定に適している、該標的核酸およびそれに対する内部標準物質の液体検体が提供される。