(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、ＣｏおよびＦｅを、Ｃｏ／Ｆｅ比５〜１００で含有する微量金属要素の無機栄養塩包括担体上で馴化メタン菌を固定床バイオリアクターにより増殖させ、石炭ガスおよびバイオガスの少なくとも１種に水素を加えた混合ガスを資化させてメタンに改質させると同時に、菌体外生成物として発酵液中に存在するコバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミンとして回収することを特徴とするビタミンＢ12の生産方法。
【請求項２】
消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、ＣｏおよびＦｅを、Ｃｏ／Ｆｅ比５〜１００で含有する微量金属要素含有の限外濾過膜併用懸濁培養リアクターにより馴化メタン菌を増殖させ、限外濾過膜の透過液中に含まれる細胞外コバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミンとして回収し、石炭ガスおよびバイオガスの少なくとも１種に水素を加えた混合ガスを資化させるためにメタン菌を限外濾過膜から培養液中に戻して培養することを特徴とするビタミンＢ12の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ビタミンＢ12の生産方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
コバラミン、すなわちビタミンＢ12類縁体は化学合成が困難であり、バクテリアや放線菌から生合成され、酵母、カビ、植物、動物には生合成能力がないことが知られている。産業上はメタノールを基質とするプロピオン酸菌の菌体から抽出することが行われている。このようなビタミンＢ12は、薬品として利用されることが主であるが、近年では、食品の中に添加する機能性食品の開発や健康維持食品への需要が高まり、低コスト化が望まれている。
【０００３】
従来、プロピオン酸菌からのビタミンＢ12の生産はメタノールを基質とすること、ならびにこの菌の増殖は通性嫌気性菌であるためにきわめて遅く、またプロピオン酸を酢酸に変換するために、酢酸による増殖阻害が発生し、発酵液中の菌体密度が高くならず、菌体から抽出できるビタミンＢ12は１ｍｇ／Ｌ程度でその生産性は低い。そして、永久史郎ら（生物工学会誌、 76(6)、447-455 、1998）はメタノールを基質とするメタン菌の固定床バイオリアクターを用いて、メタン菌とプロピオン酸菌のビタミンＢ12の生産量との比較を行い、約１０倍の収量が得たが、主成分がコバラミンの型が少ないコリノイドであり、この場合にはメタノールとの分離法が複雑になりビタミンＢ12の回収率が上がらないこと、ビタミンＢ12の含有量が少ないので生産コストダウンに結びつかないという問題がある。
【０００４】
そこで、この出願の発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、ビタミンＢ12を高い含有量と回収率で効率的に生産することのできる新しい方法を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、ＣｏおよびＦｅを、Ｃｏ／Ｆｅ比５〜１００で含有する微量金属要素の無機栄養塩包括担体上で馴化メタン菌を固定床バイオリアクターにより増殖させ、石炭ガスおよびバイオガスの少なくとも１種に水素を加えた混合ガスを資化させてメタンに改質させると同時に、菌体外生成物として発酵液中に存在するコバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミンとして回収することを特徴とするビタミンＢ12の生産方法を提供する。
【０００６】
また、第２には、消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、ＣｏおよびＦｅを、Ｃｏ／Ｆｅ比５〜１００で含有する微量金属要素含有の限外濾過膜併用懸濁培養リアクターにより馴化メタン菌を増殖させ、限外濾過膜の透過液中に含まれる細胞外コバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミンとして回収し、石炭ガスおよびバイオガスの少なくとも１種に水素を加えた混合ガスを資化させるためにメタン菌を限外濾過膜から培養液中に戻して培養することを特徴とするビタミンＢ12の生産方法を提供する。
【０００９】
すなわち、この出願の発明は、発明者らが、微量要素・無機栄養塩包括担体（特願平９−１４０１８１、特開平１０−３２７８５０）の開発中にバイオガス中のＣＯ2 （約４０％）をＨ2 の添加によるＣＨ4 化（メタネーション）を試みた実験において、従来の報告でメタン生成菌以外の菌ではビタミンＢ12の大部分が菌体中に存在していると言うことであったが、メタネーション化（４Ｈ2 ＋ＣＯ2 →ＣＨ4 ＋２Ｈ2 Ｏ）の実験においては培養液中に存在するビタミンＢ12が全体量の７０％になる菌体外溶出が起こり、メタン菌体中には３０％しかないことがビタミンＢ12の物質収支の計算から判明したことと、中温メタン菌を水素と二酸化炭素の混合ガスを基質とする馴化培養で選択培養したメタン菌は発酵液中から高い濃度のコバラミン（ビタミンＢ12類縁体）をシアノコバラミンとして抽出可能であるとの知見を得たことを契機とし、またこれらを踏まえて完成されている。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１１】
まず、この出願の発明方法においては、基本的には、
１）消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、
２）馴化メタン菌を、微量金属要素の無機栄養塩包括担体上での固定床バイオリアクターにより増殖させ、
３）石炭ガス、バイオガスに水素を加えた混合ガスを資化させメタンに改質させると同時に、
４）菌体外生成物として発酵液中に存在するコバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミン、すなわちビタミンＢ12として回収する。
【００１２】
この方法では、たとえば、前記包括担体において、微量金属濃度を従来の１０〜１０００倍に高めることが有効である。
そして、また、限外ろ過膜を併設した膜複合型バイオリアクターにおける懸濁培養等においても微量金属塩濃度と栄養塩濃度を従来より、１０〜１０００倍高くすることが有効である。この限外ろ過膜併用縣濁培養については、この発明では、前記のように、消化汚泥から得た中温メタン菌をＨ2 ／ＣＯ2 を培地として馴化を行い、馴化メタン菌を微量金属要素含有の限外濾過膜併用懸濁培養リアクターにより増殖させ、限外濾過膜の透過液中に含まれる細胞外コバラミンをシアン化カリウムを用いてシアノコバラミンとして回収し、石炭ガスおよびバイオガスの少くとも１種に水素を加えた混合ガスを資化させるためにメタン菌を限外濾過膜から培養液中に戻して培養するビタミンＢ12の生産方法が提供されることになる。
【００１３】
以上のいずれの方法においても、この発明では、特にＣｏ／Ｆｅの比率を１０〜１００倍大きくする培地の部分的な改変によって、培養塩中のコバラミンの濃度を高めることができる。従って、この出願の発明はＣＯ2 やＣＯの多い石炭ガスやバイオガスの１００％ＣＨ4 化を図るメタネーションによる石炭ガスやバイオガス組成の改質を行うと同時にこの培養液からシアン化カリウムを用いてシアノコバラミン（ビタミンＢ12）化することにより、ビタミンＢ12の回収は従来の菌体からの回収法に比べ非常に簡素化され、ビタミンＢ12の濃度もプロピオン酸菌に比べ、５０〜１００倍となり、メタノール資化メタン菌（永井史郎：１９９６，生物工学会誌 74(6)， 447-455）からの回収の２−１０倍に達し、Ｖ．Ｂ12の製造コストを極めて低くできる。
【００１４】
次に添付図面に従い、この出願の発明についてさらに説明する。
図１は中温メタン菌を水素８０％、二酸化炭素２０％のガスを基質として液体状の標準合成培地を用いて十分馴化したメタン菌を、同じ中温（３５℃〜３６℃）で、栄養塩や微量金属塩を従来の１０〜１０００倍に高めた無機栄養塩包括担体（特願平９−１４０１８１、特開平１０−３２７８５０、微量要素・無機栄養塩類拡散型菌体培養担体）を用いて連続培養した時のメタン菌体密度の増加を示したものである。メタン菌体密度が２６ｇ−ｄｒｙ／Ｌの時ビタミンＢ12の濃度は１８５ｍｇ／Ｌに達した。これはプロピオン酸菌による方法の５０〜１００倍であった。
【００１５】
また、図２は、従来法の１０倍の微量金属濃度の合成培地に水素８０％二酸化炭素２０％を基質として吹き込み、懸濁培養液中の菌体内Ｖ．Ｂ12と菌対外のＶ．Ｂ12の割合を調べたところ、それぞれ３０％と７０％になっていることが判り、微量要素・栄養塩包括担体を用いる菌体外溶出ビタミンＢ12を分離する方が効率的生産が可能となると考えられる。
【００１６】
そして、図３は二酸化炭素濃度４０％〜６０％、水素濃度６０％の混合ガスを基質として微量要素・栄養塩包括担体中の微量元素のコバルトと鉄との比率をバラメータとしてバイオリアクタを運転し、シアノコバラミンの濃度を示したものである。コバラミンはビタミンＢ12の類縁体であり、コバルト要求性が高いことがわかる。
【００１７】
図４は、炭酸ガスバイオガスに水素を流加する方法としてバイオガスリアクターで多孔質セラミックス１をリアクター２の底部に置き、その下とリアクター２の最下部の液中に正極１０に相当する金属極（チタン、鉄）を置き、多孔質セラミックス１の真上の散気ノズル５の真上に白金又はチタン製の陰極４電極板を置き、電圧２０〜１００Ｖを印加する。これによって水素が陰極４の板に、酸素は正極１０の電極板上に発生するが酸素放出部９を設けてブロアＢ２により大気に拡散される。多孔質セラミックス１の間隙のサイズは発生した酸素の気泡の直径より１／２０〜１／１００に小さくしておき、ブロアによって常に大気圧より高い圧力にしておけば、電気分解により発生した酸素を多孔質セラミックス１を通してリアクター２内に侵入することはないので、バイオリアクター内の絶対嫌気性が保持できる。担体充填槽３は微量要素・包括担体を固定床になるようにリアクター２に組み込んである。この容積は有効容積の３０〜６０％として充填している。石炭ガスやバイオガスは１３の圧力検出制御器の指示によりバイオガス又は石炭ガス送入管８から入るが、電磁弁１１と１２の開操作によりＢ１のブロアの動作で循環し、二酸化炭素濃度が低下し、ＣＨ4 濃度が高くなると２０のガス濃度検出制御器の指示で電磁弁６が開になり、７のガスホルダーにメタンを送気する。バイオリアクター２内圧力が低下した段階で電磁弁６と１２が閉操作となり、バイオガス又は石炭ガス送入管８から新しくガスが供給される。
【００１８】
図５は、コバラミンを含む発酵液を１７の電気分解装置によって分解し、水素のみをバイオリアクター２に供給し、担体充填槽３の固定床に生息しているメタン菌によってメタネーションがなされ、バイオガス又は石炭ガス送入管８から供給される二酸化炭素が電気分解装置１７より供給する水素によってメタンとなる。バイオリアクター内のメタン濃度が上昇し、１００％に近くなったとき、２０のガス検出制御器で６のバルブを開き、７のガスホルダにメタンを送気する。バイオリアクター内の圧力が低下した段階で電磁弁６と１２が閉操作となり、１１の電磁弁の開操作により、バイオガス又は石炭ガス送入管８から新しくガスが供給される。このように図４、５は共にガスを基質とする場合には半連続操作になる。一方、液の方にはコバラミン濃度が上昇するので、１５又は１６のドレイン弁でこの濃度を調べながら、最大濃度に達した時に液を一定量引き抜き、この液からビタミンＢ12を回収する。液の引き抜きは８から新規なガスの供給のもとにドレイン弁１５、又は１６を使用して引き抜き、バイオリアクター２内に酸素の浸入がないような操作手順で行い、その後図４、５の培地用液供給ノズル２１よりポンプを用いて培地溶液を供給する。
【００１９】
これら図４および図５に例示した方法、装置は、この発明の第１ないし第４のいずれかの方法の実施において有用となる。
次にこの発明の実施例を説明する。
【００２０】
【実施例】
＜１＞従来法の１０倍の微量要素濃度のうち、そこに塩化コバルトの濃度を上昇させた回分式懸濁培養による実験でＣＯ2 ２０％、Ｈ2 ８０％の合成ガスを基質とした場合、培養液中のビタミンＢ12の濃度は４８時間後に２５．２ｍｇ／Ｌとなった。従来のプロピオン酸菌から得られたビタミンＢ12の濃度の文献値は０．５〜１ｍｇ／Ｌであったので、この発明の方法は、ビタミンＢ12の収量の高いことと、シアノコバラミンが菌体外に溶出して培養液中からの回収が容易であることを確認した。
＜２＞従来法の１０００倍の濃度をもつ溶液と微量要素・栄養包括固定担体に閉じ込めたものを５Ｌの容の固定床バイオリアクター充填し、ＣＯ2 ４０％、ＣＨ4 ６０％のバイオガス中に、培養液を電解法によって水素を連続供給し、バイオガスの改質連続運転を行い、９８−９９％のＣＨ4 に改質できた。また、同時に培養液中のビタミンＢ12の濃度は１８０ｍｇ／Ｌに達した。これはプロピオン酸菌による方法の５０−１００倍であり、生産速度も２５−５０倍であった。
【００２１】
以上より、実施例の具体的作用と特有の効果をまとめると次のとおりである。
１．微量金属塩を強化した培養液からビタミンＢ12を回収し、菌体そのものからビタミンＢ12を回収するものではないので高密度の菌体の維持が可能となり、菌体外生産物であるコバラミンを従来法よりはるかに超えて回収し、ビタミンＢ12の収率を高くすることができる。
【００２２】
２．水素の供給は当該バイオリアクター中の溶液そのものを電解法により供給できるので、バイオガスや石炭ガスの改質ならびに高エネルギー化が達成できる。
【００２３】
３．ビタミンＢ12の回収法はシアン化カリウムを用いることでシアノコバラミンとしての回収が単純化され、ビタミンＢ12の製造コストを更に低くすることができる。
【００２４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、高い回収率と、高い含有量で、従来に比べてはるかに効率的にビタミンＢ12の生産が可能とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メタン菌体密度の増加を例示した図である。
【図２】菌体内ビタミンＢ12と菌体外ビタミンＢ12の割合を例示した図である。
【図３】Ｃｏ／Ｆｅ比とシアノコバラミン密度との関係を例示した図である。
【図４】バイオリアクターの構成例を示した図である。
【図５】バイオリアクターの別の構成例を示した図である。
【符号の説明】
１  多孔質セラミックス
２  リアクター
３  担体充填槽
４  陰極
５  散気ノズル
６  電磁弁
７  ガスホルダー
８  バイオガス又は石炭ガス送入管
９  酸素放出部
１０  正極
１１  電磁弁
１２  電磁弁
１３  圧力検出制御器
１４  逆止弁
１５  ドレイン弁
１６  ドレイン弁
１７  電気分解装槽
１８  限外濾過膜ユニット
１９  圧力制御電磁弁
２０  ガス濃度検出制御器
２１  培地用液供給ノズル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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