(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを含む浮腫治療用の医薬組成物であって、該ペプチドが、連続したアミノ酸配列ＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹおよびＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹからなる群より選択される医薬組成物。
【請求項２】
ペプチドが環化したものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＮＨ２−およびＣＯＯＨ−末端アミノ酸をシステインにより置換してこれらのシステイン間にジスルフィド結合を形成させることによりペプチドが環化されたものである請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
環状ペプチドが、環状ペプチドＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣおよびＣＧＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹＣからなる群より選択される請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
浮腫が肺浮腫である請求項１ないし４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載のペプチドの、浮腫治療用医薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の特定ドメイン由来のペプチドを効果的に用いて浮腫を治療することができるという知見に基づく。より詳細には、本発明は、肺浮腫を治療するための、ヒトＴＮＦ−αのＳｅｒ１００からＧｌｕ１１６までの領域に由来するペプチドの使用に関する。例えば、アミノ酸配列ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣを有する環状ペプチドは浮腫吸収の誘導において非常に有効であることが示される。
【０００２】
発明の背景
肺移植は末期肺疾患の患者の治療を成功させることが示されている。しかしながら、移植肺の再潅流後の肺浮腫は大きな臨床上の問題であり、現在これに対する有効な薬剤は存在しない。さらに、最近の証拠によれば、内皮が肺の血管拡張および血管収縮の間の動的相互作用において必須の役割を果たしており、虚血／再潅流および急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）に関連した肺の障害における主要標的であることが示されている。よって、しばしば肺浮腫が肺移植拒絶反応を引き起こし、移植に利用可能な肺が不足し続けているとすれば、肺浮腫を有効に予防または治療することが今すぐ必要である。
【０００３】
虚血および再潅流（Ｉ／Ｒ）の間に、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）のような炎症サイトカインの典型的な誘導が起こる。ＴＮＦは主として活性化マクロファージにより産生される多面作用性サイトカインであり、それは膜貫通分子として合成され、金属プロテイナーゼにより細胞表面から循環系中に放出されうる（Gearing et al., 1994）。ＴＮＦは少なくとも２つのタイプの膜結合受容体、ＴＮＦ受容体１（５５ｋＤａ）およびＴＮＦ受容体２（７５ｋＤａ）に結合することが示されており、それらの受容体は赤血球および未刺激Ｔリンパ球を除いて大部分の体細胞上に発現される。ＴＮＦを両刃の剣と考えることができる：実際に、ＴＮＦは過剰産生された場合、ＬＰＳ−により誘導される敗血症（Beutler et al., 1985）、脳性マラリア（Grau et al., 1987）のごとき種々の感染性疾患ならびにアフリカトリパノソーマ症（Lucas et al., 1993）の病理に関連していることが示された。対照的に、ＴＮＦは、マウスおよびラットにおける盲腸結さつおよびせん刺により誘発される腹膜炎に対する最も有効な防御剤の１つであること（Echtenacher et al., 1990, Alexander et al., 1991; Lucas et al., 1997）ならびにマウスにおけるニューモコッカス肺炎の間の宿主防御に関与していること（van der Poll et al., 1997）が示されている。そのうえ、ＴＮＦ受容体１欠損マウスはListeria monocytogenes感染（Rothe et al., 1993; Pfeiffer et al., 1993）およびMycobacterium tuberclosis感染（Flynn et al., 1995）ならびに真菌感染（Steinshamn et al., 1996）およびToxoplasma感染（Deckert-Schluter et al., 1998）に対してより感受性が高いことが示された。それゆえ、過剰産生または長期にわたる慢性的分泌の間におけるその損傷のもととなる効果とは別に、ＴＮＦは種々の病原体による感染に対する最も強力な防御剤の１つでもある。この点において、ＴＮＦ由来のペプチドは、疾病に対する治療薬としての使用が示唆されている（BoehmらのDE 3841759）。
【０００４】
２タイプの受容体（ＴＮＦ受容体１，５５ｋＤ、ＴＮＦ受容体２，７５ｋＤ）の活性化により媒介される体液過剰効果は別として、ＴＮＦは受容体とは無関係な活性を媒介することもできる。ＴＮＦの先端（tip）ドメインはそのベル形構造の頂上にあり、三量体分子の底部に存在する受容体部位とは場所的に異なっている（Lucas et al., 1994）。このドメインは、トリマンノースおよびジアセチルキトビオースのごとき特定のオリゴ糖に対するレクチン様アフィニティーを有する。トリパノソーマ類のリソソーム完全性を妨害することにより、おそらくはＴＮＦをリソソーム膜中に挿入することに関与しているｐＨ依存的効果により、ＴＮＦおよびＴＮＦの先端ペプチドはトリパノソーマ溶解活性を媒介しうる（Magez et al., 1997）。そのうえ、３つの重要アミノ酸（Ｔ（１０５）；Ｅ（１０７）；Ｅ（１１０））がＡにより置換されている先端ペプチドの変異種は、この活性を全く媒介することができない（Lucas et al., 1994）。マウスＴＮＦ（ｍＴＮＦ）の三重変異種Ｔ１０５Ａ−Ｅ１０７Ａ−Ｅ１１０Ａ（以下、三重変異ｍＴＮＦという）は、野生型ＴＮＦと比較するとトリパノソーマ溶解活性およびオリゴ糖に対するレクチン様アフィニティーを欠いている。三重変異ｍＴＮＦは、野生型ｍＴＮＦと比較すると、インビボにおいて全身毒性が有意に低下しているが、腹膜炎防御効果を維持している（Lucas et al., 1997）。
【０００５】
ＴＮＦの受容体とは無関係なもう１つの活性は、膜挿入およびナトリウムチャンネル形成能である（Baldwin et al., 1996）。実際に、他の研究者により、ＴＮＦが人工脂質二重層モデルにおいてＮａ＋チャンネルを形成するというｐＨ依存的活性が示されている。その理由は、おそらくＮａ＋チャンネル形成には三量体の「クラッキング（cracking）」が必要であり、これにより疎水性残基が膜に露出するからであろう（Kagan et al., 1992）。
【０００６】
最近の観察結果によれば、細菌感染５分前にラットの肺に抗ＴＮＦ中和抗体を滴下すると、肺胞液クリアランスの増加が抑制されることが示されており、そのことは肺胞内皮細胞中の細胞内ナトリウム含量の変化により引き起こされることが知られている。そのうえ、正常ラット中へのＴＮＦの滴下により、１時間で肺胞液クリアランスが４３％増加する（Rezaiguia et al., 1997）。この知見は、ＴＮＦを用いて肺胞液クリアランスを誘導できることを示すものであるが、野生型ＴＮＦはその全身毒性が高いので治療には使用できない。本発明は、驚くべきことに、浮腫の吸収に有効に使用でき、野生型ＴＮＦと比較して全身毒性が消失している選択された群のＴＮＦ由来ペプチドの使用に関する。
【０００７】
発明の目的
肺浮腫を有効に予防または治療することが今すぐ必要であることは明らかである。いくつかのデータは、ＴＮＦが浮腫の吸収に関与している可能性を示しているが、この多面機能的で潜在的に毒性のある分子を浮腫の治療に使用できないことは明らかである。
この点において、本発明は、ＴＮＦと同じ浮腫吸収誘導能を有する無毒の分子を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、浮腫の予防または治療に使用できるＴＮＦ由来の無毒ペプチドを提供することを目的とする。そのうえ本発明は、浮腫吸収を誘導するＴＮＦ由来のペプチドを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。本質的には、本発明は、Lucas et al., (1994)により記載されたＴＮＦ由来の殺トリパノソーマ性ペプチドおよびその変異体の新たな医学的使用を提供することを目的とする。
本発明のすべての目的は下記の具体例に合致すると考えられる。
【０００８】
発明の詳細な説明
本願発明はすでに公表された研究および係属中の特許出願に源を発するするものである。かかる研究は、例えば、科学論文、特許または係属中の特許出願からなる。上で引用した、あるいは以下に引用するこれらすべての刊行物および出願を、出典明示により本明細書に一体化させる。
【０００９】
本発明は、ヒトＴＮＦ−αのＳｅｒ１００からＧｌｕ１１６までの領域あるいはマウスＴＮＦ−αのＳｅｒ９９からＧｌｕ１１５までの領域に由来する７個ないし１７個、好ましくは１１個ないし１６個、より好ましくは１３個ないし１５個、最も好ましくは１４個の連続したアミノ酸の鎖を含むペプチドの、浮腫治療用医薬の製造のための使用に関する。より詳細には、本発明は、該１４個のアミノ酸の鎖が、Lucas et al (1994)により記載された連続したアミノ酸の配列ＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ（配列番号１）およびＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹ（配列番号２）からなる群より選択される上記ペプチドの使用に関する。これらの配列は、よく知られたアミノ酸の１文字表記による（３文字表記も時々使用する）。
【００１０】
用語「ペプチド」は、Lucas et al., (1994)により記載された、レクチン様アフィニティーを有するトリパノソーマ溶解性ＴＮＦドメイン由来のアミノ酸（ａａ）のポリマーをいう。そのうえ、該用語は、ヒトＴＮＦ−αのＳｅｒ１００からＧｌｕ１１６までの領域あるいはマウスＴＮＦ−αのＳｅｒ９９からＧｌｕ１１５までの領域に由来する７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の連続したアミノ酸のポリマーに関する。該ＴＮＦ領域は、Webb and Goeddel, eds. (1987)中の１７２頁、Pennica および Goeddel 著の部分の図５に示された領域もいう。しかしながら、ヒトＴＮＦ−αのＳｅｒ１００からＧｌｕ１１６までの領域がWebb and Goeddel, eds. (1987)中の１７２頁、Pennica および Goeddel 著の部分の図５に示されたヒトＴＮＦ−αのＳｅｒ９９からＧｌｕ１１６と同じであること、ならびにマウスＴＮＦ−αのＳｅｒ９９からＧｌｕ１１５までの領域がWebb and Goeddel, eds. (1987)中の１７２頁、Pennica および Goeddel 著の部分の図５に示されたマウスＴＮＦ−αのＳｅｒ９８からＧｌｕ１１５と同じであることが明らかなはずである。より詳細には、用語「ペプチド」は、該ＴＮＦ領域のヘキサマーＴＰＥＧＡＥ（配列番号３）を含むペプチド、あるいはLucas et al., (1994)により３個の重要アミノ酸であることが示された該ヘキサマーの対応アミノ酸Ｔ、ＥおよびＥを含むいずれかのペプチドについていう。本発明が該ＴＮＦ領域に由来するいずれのペプチドにも関するものであり、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、脂肪酸での修飾等のごときペプチドの翻訳後修飾体を排除するものではないことが明らかなはずである。例えば、本発明は、１個またはそれ以上のａａ（アミノ酸）アナログ（非天然ａａも含む）を含むペプチド、置換結合を有するペプチド、ペプチドの変異バージョンもしくは天然の配列変異体、システイン残基間のジスルフィド結合を含むペプチド、ならびに当該分野において知られた他の修飾体を包含する。本発明のペプチドは機能的にも定義され、すなわち、本発明は、浮腫の治療に使用できる、あるいは浮腫治療用医薬の製造に使用できるいずれのペプチドにも関する。本質的には、本発明は、Lucas et al., (1994)により定義されたトリパノソーマ溶解性ペプチドと同じまたは非常に類似の特徴を有する分子であって、当該分野において知られたいずれかの方法により得ることのできる分子に関する。
【００１１】
本発明のペプチドは、Houbenweyl (1974)およびAtherton & Shepard (1989)により記載されたような古典的化学合成のごとき当該分野で知られた方法により、あるいはManiatis et al., (1982)およびより詳細にはLucas et al., (1994)により記載されたような組み換えＤＮＡ手法を用いて製造することができる。
【００１２】
用語「浮腫」は、結合組織または漿液腔における（漿液性）液体の異常な過剰蓄積に関していう。詳細には、該用語は肺浮腫に関して用いる（実施例セクションも参照）。
【００１３】
さらにそのうえ、本発明は、環化された上記ペプチドの使用にも関する。より詳細には、本発明は、ＮＨ２−末端およびＣＯＯＨ−末端アミノ酸をシステインに置換してこれらのシステイン間にジスルフィド結合を形成させることにより環化された上記ペプチドの使用に関する。この点において、本発明は、Lucas et al., (1994)に記載された環化ペプチドＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ（配列番号４）およびＣＧＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹＣ（配列番号５）からなる群より選択される上記環化ペプチドの使用に関する。
【００１４】
最後に、本発明は、上記ペプチドを含む浮腫治療用医薬組成物に関する。用語「浮腫治療用医薬組成物」は、浮腫、特に肺浮腫を予防、改善または治療する、上で定義したペプチドを含有する組成物をいう。より詳細には、用語「浮腫治療用医薬組成物」または「浮腫治療用薬剤または医薬」（両用語は混用されうる）は、上記ペプチドおよび医薬上許容される担体もしくは賦形剤（両用語は混用されうる）を含む、浮腫を治療するための組成物をいう。当業者に知られた適当な担体または賦形剤はセイライン、Ringer溶液、ブドウ糖溶液、Hank溶液、不揮発性油、オレイン酸エチル、セイライン中５％ブドウ糖、等張性および化学的安定性を促進する物質、バッファーならびに保存料である。他の適当な担体は、それ自体組成物を与えられる個体に有害な抗体の産生を誘導しない担体を包含し、例えば、蛋白、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸およびアミノ酸コポリマーを包含する。「医薬」は、当業者の知識の範囲内のいずれかの適当な方法により投与できる。好ましい投与経路は非経口経路である。非経口投与の際には、本発明の医薬を単位用量注射可能形態、例えば上記の医薬上許容される賦形剤を伴った溶液、懸濁液またはエマルジョンとして処方する。しかしながら、用量および投与方法は個体によるであろう。一般的には、本発明のペプチドが１μｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０μｇ／ｋｇないし５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ないし２ｍｇ／ｋｇの用量で与えられるように医薬を投与する。好ましくは、ボーラスとして投与する。連続輸液を用いてもよい。そうする場合、５ないし２０μｇ／ｋｇ／分、より好ましくは７ないし１５μｇ／ｋｇ／分の用量で医薬を輸液する。
【００１５】
特に有利な具体例を示す実施例を参照して本発明を説明する。しかしながら、これらの具体例は典型であって、本発明を限定するものと解することはできない。
【００１６】
実施例
実施例１：
材料および方法
動物、細胞および試薬
オスのＣＢＡ／ＪまたはＣ５７ＢＬ／６マウス、ならびにH. Bluethmann, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerlandから提供されたＴＮＦ受容体を欠損したオスのＴＮＦＲ１／２０／０Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Bruce et al., 1996）を、８〜１０週齢にて使用した。協会の指針に従って動物の世話を行った。肺の微小血管内皮細胞をＣＢＡ／Ｊマウスから取り、記載されたようにして（Jackson et al., 1990）、精製ラット−抗−マウスＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体（B. Imhof, University of Genevaから贈与された）と共有結合した磁性ビーズ（Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Norway）を用いて特徴づけた。２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０％ ＦＣＳ、４０Ｕ／ｍｌヘパリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ内皮細胞成長補足物（Brunschwig Chemie, Basel, Switzerland）を含有するＤＭＥＭ中に微小血管肺内皮細胞を懸濁した。パッチクランプ（patch clamp）実験のために、０．２％ゼラチン（Sigma, Buchs, Switzerland）でプレコートした３５ｘ１０ｍｍのeasy grip ペトリ皿（Beckton Dickinson, Plymouth, UK）に細胞を撒いた。抗体および１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有する氷冷ＲＰＭＩ中に単離された内在腹腔内マクロファージを３５ｘ１０ｍｍのeasy grip ペトリ皿に４時間付着させ、その後、付着していない細胞を除去した。２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（すべてGibcoから得た）を含有するＲＰＭＩ １６４０中で細胞を増殖させた。パッチクランプ用に、単離２４時間後のマクロファージを用いた。
【００１７】
ＴＮＦおよびペプチド
記載されたようにして（Lucas et al., 1997）、E. coli由来の組み換えネズミＴＮＦ（以下、ＴＮＦという）およびE. coli由来の組み換え（Ｔ１０４Ａ−Ｅ１０６Ａ−Ｅ１０９Ａ）三重変異ＴＮＦ変異体（ｍｕｔＴＮＦ）を合成した。Ｆｍｏｃ−ａ−アミノ基保護（Fields et al., 1990）を用いてＴＮＦ由来のペプチドを合成し、Ｃ１８逆相高品質液体クロマトグラフィーカラムを用いて精製した。
下記のＴＮＦ由来ペプチドを合成した：
長い先端ペプチド９９−１１５（LTip）        GG-CGPKDTPEGAELKPWYC（配列番号６）
変異した先端ペプチド９９−１１５（mutTip）  GG-CGPKDAPAGAALKPWYC（配列番号７）
スクランブルされた先端ペプチド（scamblTip）  GG-CGTKPWELGPDEKPAYC（配列番号８）
短い先端ペプチド（STip）                      CTPEGAEC（配列番号９）
可能なかぎり元のＴＮＦコンホーメーションを理論的に保持させるように、Ｌｔｉｐ、ＭｕｔＴｉｐおよびＳｃａｍｂｌＴｉｐペプチドを環化させた。ＴＮＦ配列のＳｅｒ９９をＣｙｓにより置換し、Ｃｙｓ１００をＧｌｙにより置換して、ペプチド中のＣｙｓ９９とＣｙｓ１１５との間にジスルフィド結合を形成させることができた。ＳＴｉｐペプチドは環化できなかった。ペプチドをＮＨ２−ビオチン化した。
【００１８】
電気生理学
１４５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ−グルコースおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓからなるバッファー（ＮａＯＨで所望ｐＨとした）中で、ＴＮＦ、ｍｕｔＴＮＦおよび先端ペプチドで細胞を３０分間前処理した。次いで、ｐＨ７．３にした同じバッファーで細胞を洗浄し、タイト−シール、全−細胞記録法（tight-seal, whole-cell recording technique）を用いて実験を行った。１ｋＨｚでローパスフィルターをかけてAxopatch-200A増幅器を用いて電流を記録した。ＷＣＰプログラム（J. Dempster, Strathclyde Electrophysiology Software, Glasgow, UK）を用いてデジタル化およびオフライン分析を行った。パッチピペットをボロシリケートガラスから引き出し、炎で磨いて、１３０ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ｍＭ Ｄ−グルコース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含有する内部溶液（ＣｓＯＨでｐＨを７．３に合わせた）にてオープン抵抗３〜５ＭＷを有するようにした。直列抵抗を１０ＭＷ未満に保った。キャパシタンスおよび直列抵抗の補償を適用し、７０％にセットした。すべての実験を室温で行った。特記しないかぎり、結果を平均±標準偏差で示す。２群間にて観察された相違の有意さに関してpost-hoc Dunn-Bonferroni検定を用いて、電流および膜コンダクタンス値に関して変数分析を行った。０．０５のＰ値を有意とみなした。
【００１９】
トリプトファン蛍光
ＰＴＩスペクトル蛍光計を用いて蛍光測定を行った。励起波長は２９５ｎｍ、スリット幅は励起および発光それぞれにつき５ｎｍおよび２．５ｎｍであった。記録された各スペクトルに関して、バッファーブランクを差し引くことによりラマン散乱の寄与を除去した。すべてのバッファーは、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび所望ｐＨの２０ｍＭ Ｎ−［２−モルホリノ］エタン−スルホン酸（ＭＥＳ）バッファーを含んでいた。所望ｐＨにて試料を１時間３０分インキュベーションし、次いで、発光スペクトルを測定した。野生型および変異ＴＮＦ濃度は６μｇ／ｍｌであった。
【００２０】
リポソームの調製
すでに記載されているようにして（Vecsey-Semjen et al., 1996）逆相蒸発により大型の単ラメラリポソームを調製した。１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．４および１．５ｍｇ／ｍｌの６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ）を含有するバッファー中において、１００％卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）またはＥＰＣおよびＥＰＧ混合物（１：１ Ｗ／Ｗ）のいずれかからリポソームを調製した。
【００２１】
クロライド流出測定
サーモスタットセルホルダー（３７℃）を装備したＰＴＩスペクトル蛍光計を用いてすべての蛍光実験を行った。３５０ｎｍにおいて色素を励起し、４２２ｎｍにおいて発光を記録し、励起および発光の両方のバンド幅を５ｎｍにセットした。リポソームを希釈して、１００ｍＭ ＫＮＯ３および２０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．１または２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４を含有する溶液中最終濃度５０μｇ／ｍｌとした。野生型および変異ＴＮＦを添加して最終濃度３μｇ／ｍｌとした。
【００２２】
ＴＮＦおよびＴＮＦ先端ペプチドの前炎症活性
肺胞タイプＩＩ様上皮細胞Ａ５４９において、細胞間付着分子（ＩＣＡＭ）−１の表面アップレギュレーション誘導能を測定するバイオアッセイ（Pugin et al., 1996）を用いてＴＮＦおよびそれに由来するペプチドの前炎症活性を試験した。簡単に説明すると、Ａ５４９細胞をマイクロタイタープレートに集密状態として撒き、種々の濃度のＴＮＦ、ｍｕｔＴＮＦおよびペプチドとともに３７℃で１８時間インキュベーションした。第１の抗−ＩＣＡＭ−１抗体（R & D Systems, Abdington, UK）、第２のロバ−抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ抱合抗体（Jackson）、ｏ−フェニレンジアミン（Sigma）による発色、およびＨ２ＳＯ４による発色停止を用いる細胞上の直接ＥＬＩＳＡによりＩＣＡＭ−１の表面アップレギュレーションを検出した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）を４９０ｎｍにおいて読み、６２０ｎｍのＯ．Ｄ．の読みを差し引いた。
【００２３】
結果
実施例１．１：ネズミ細胞における膜コンダクタンスに対するＴＮＦの影響
我々は、ＴＮＦが一次ネズミ細胞における全細胞電流を変化させるかどうかを先ず調べた。内在腹腔内マクロファージおよび肺微小血管内皮細胞と１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦと３０分間のプレインキュベーションし、全細胞パッチクランプ手段により測定してＴＮＦに曝露されていない細胞と比較したところ、微小血管内皮細胞の場合には外へ向かう電流が有意に増加したが、内へ向かう電流はあまり増加しなかった（内皮細胞，図１Ａ；マクロファージ，図２）。プレインキュベーション時間の短縮（５分にまで）あるいはＴＮＦ用量の減少（１０ｎｇ／ｍｌにまで）は同様の結果を生じた（データ示さず）。この効果には酸性のインキュベーション条件が必要であった。なぜなら、ｐＨ７．３においてプレインキュベーションを行った場合にはこの効果が生じなかったからである（図１）。ＴＮＦにより誘導されるコンダクタンスは電圧非依存的であり、内皮細胞の場合には約０ｍＶの逆電位を示した。ＴＮＦにより誘導されるイオン電流の増加がＴＮＦ受容体依存的であるかどうかを調べるために、ＴＮＦ受容体−１および−２の両方を欠損するマウス（ＴＮＦＲ１／２０／０）から内在腹腔内マクロファージを単離し、全細胞パッチクランプアッセイにおいて試験した。ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体欠損細胞において電圧依存的な電流を誘導した（図２Ｂ）。この重要な実験は、哺乳動物においてＴＮＦにより誘導されたコンダクタンスがＴＮＦ受容体非依存的な様式で生じることを示した。これらの結果は、ＴＮＦにより誘導される電流が細胞タイプ特異的でないことも示す。
【００２４】
ＴＮＦのレクチン様ドメインは、その受容体ドメインとは空間的かつ機能的に異なっているので、次に我々は、哺乳動物細胞において観察されるＴＮＦのイオンチャンネル活性化効果に関与しているかどうかを調べた。それゆえ、ＴＮＦのレクチン様活性に必要な３個の重要な残基がアラニンにより置換されているＴＮＦ変異体（ｍｕｔＴＮＦ）の効果を、内皮細胞においてＴＮＦと比較した。図３に示すように、ｍｕｔＴＮＦは、１００倍用量（ＴＮＦ １０ｎｇ／ｍｌに対してｍｕｔＴＮＦ １μｇ／ｍｌ、データ示さず）においてさえもＴＮＦのコンダクタンス活性化効果を完全に欠いていた。対照的に、未変異（native）ＴＮＦ分子および変異ＴＮＦ分子は、Ａ５４９上皮細胞におけるＩＣＡＭ−１の誘導において同様の効力を示した（図４）。このことは、保存されたＴＮＦ受容体により媒介される活性にもかかわらず、ｍｕｔＴＮＦはイオン透過性を増加させることができないことを示す。ＴＮＦがナトリウムチャンネルのゲートを開くという仮定を検証するために、我々は、上皮ナトリウムチャンネルブロッカーであるアミロライドの存在下でさらなる実験を行った。ｐＨ６．０における前処理中に添加された１００μＭのアミロライドは、ＴＮＦにより誘導されるコンダクタンスの増加を抑制した（図３）。
【００２５】
実施例１．２：ＴＮＦの先端ドメインはその膜コンダクタンス増加効果を媒介する。
ＴＮＦの先端ドメインはそのイオン透過性活性化にとり重要であると思われるので、次に我々は、この領域を模したペプチドが生のＴＮＦの場合に観察されるように膜コンダクタンスを増加させるに十分であるかどうかを試験した。内皮細胞およびマクロファージを１７個のアミノ酸（ａａ）からなる環化した長い先端ペプチド（Ｌｔｉｐペプチド）（ＴＮＦのレクチン様ドメインを模倣する）で処理したところ、微小血管内皮細胞の場合には酸性ｐＨにおいて外へ向かう電流および内へ向かう電流が増加した。ＴＮＦとは対照的に、当該効果は中性ｐＨにおいて維持されたが、著しいものではなかった（図２Ａおよび４Ａ）。ＴＮＦと同様に、当該効果は１００μＭのアミロライドによりブロックされた（図４Ｂ）。変異した（Ｔ１０４Ａ−Ｅ１０６Ａ−Ｅ１０９Ａ）１７ａａの環化ペプチド（ｍｕｔＴｉｐペプチド）およびＬｔｉｐペプチドと同じアミノ酸をランダムな配列で含む１７ａａの環化ペプチド（ｓｃｒａｍｂｌＴｉｐペプチド）は、イオンチャンネル活性に関しては不活性であった（図４Ｂ）。これらの結果は、ＴＮＦの先端ドメインがその膜コンダクタンス増加活性を媒介することを示すものであり、残基Ｔ１０４、Ｅ１０６およびＥ１０９がこの効果に必須であることを確認するものであった。Ｌｔｉｐペプチドは、ＴＮＦＲ−１および−２受容体の両方を欠損した細胞においても活性があった（図２Ｂ）。しかしながら、３個の重要ａａを含む短い先端ヘキサペプチドは、微小血管内皮細胞において電圧依存的な電流を誘導せず（データ示さず）、このペプチドがイオンチャンネル効果を担持した構造を有するに至らないことが示唆された。重要なことに、Ａ５４９細胞においてＩＣＡＭ−１を誘導したペプチドはなく、それらがＴＮＦ受容体により媒介される活性を欠いていることが示された。
【００２６】
実施例１．３：生のＴＮＦおよび変異ＴＮＦは酸性ｐＨにおいて部分的変性を被る。
ＴＮＦがｐＨ依存的な様式で脂質と相互作用し、この膜相互作用が蛋白の部分的変性に関連していることがすでに示されている（Hlodan et al., 1994）（Baldwin et al., (1996)）。それゆえ、我々は、酸性ｐＨにおける肺ＭＶＥＣに対するｍｕｔＴＮＦの活性の欠如が、それが部分的変性して膜と相互作用できないためであるのかどうかを調べた。種々のｐＨ値におけるｍｕｔＴＮＦのコンホーメーションを分子固有のトリプトファン蛍光を測定することにより調べた。培地を酸性にすると蛍光強度が低下し、最大発光がｐＨ６にて３１８ｎｍであったのがｐＨ４．６にて３３９ｎｍに赤方変移した。これらの観察結果は、最初は埋もれていたトリプトファン残基が溶媒にさらされるようになったことを示した。しかしながら、６Ｍ ＧｕＨＣｌ中ではｍｕｔＴＮＦの赤方変移が起こったが、ｐＨ４．６におけるスペクトルは赤方変移しなかったので、蛋白は完全には変性していなかった。これらの結果は、ｍｕｔＴＮＦが酸性にて変性する可能性を示す。実際には、ｍｕｔＴＮＦの酸性での変性は野生型ＴＮＦの変性よりも迅速で、わずかに程度が大きかった。
【００２７】
実施例１．４：生のＴＮＦおよび変異ＴＮＦは両方とも酸性ｐＨにおいて膜と相互作用する。
次に我々は、クロライド感受性色素ＳＰＱを含有するリポソームからのクロライド漏出誘導能を調べることにより、ｍｕｔＴＮＦが酸性ｐＨにおいて膜と相互作用できるかどうかを調べた。１００％卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）を含有するリポソームを用いてこれらの実験を行った。生のＴＮＦはｐＨ６．１においてクロライド流出を誘導した。ｍｕｔＴＮＦはｐＨ６においてやはり変性していた。しかしながら、我々は、１００％ＥＰＧ小胞表面のｐＨがバルクｐＨよりもずっと低いこと、より詳細には、バルクｐＨが６である場合に表面ｐＨが４．３５であることをすでに示している。それゆえ、ｍｕｔＴＮＦはＥＰＧ小胞表面で部分的に変性した可能性がある。ＳＰＱ蛍光に対するｍｕｔＴＮＦの影響は野生型ＴＮＦよりもずっと顕著であり、酸性での変性が野生型ＴＮＦよりも迅速であることと合致していた。未変異ＴＮＦに関してすでに観察されたのと同様に（Baldwin et al., 1996）、ｍｕｔＴＮＦは中性ｐＨにおいては膜と相互作用しなかった。
【００２８】
クロライド流出がＴＮＦの膜結合または膜挿入によるものであるかどうかを調べるために、我々は、膜との相互作用により臭化脂質がＴＮＦおよびｍｕｔＴＮＦの固有蛍光を消失させることができるかどうかを調べた。臭化脂質は膜蛋白のトポロジーを調べること（Bolen et al., 1990）（Markello et al., 1985）ならびに小孔形成トキシンの膜相互作用を研究すること（Gonzalez-Manas et al., 1992）（Van der Goot et al., 1991）（Vecsey-Semjen et al., 1997）において有用である。ＴＮＦは２個のトリプトファン残基を含んでおり、１個は受容体結合ドメインの頂点に、もう１個はいわゆる先端ドメインの頂点に存在する。ＴＮＦ三量体の先端が脂質二重層に挿入される場合には、アシル鎖の９および１０の位置に結合した臭素を有するジオレオイルホスファチジルグリセロールを含有するリポソーム中への挿入によりＴｒｐ−１１３の蛍光は消失するはずである。実際、我々は、脂質頭部とアシル鎖との境界に存在するトリプトファンが臭素による消光に感受性を有することをすでに観察している。しかしながら、我々は、酸性ｐＨにおいてＴＮＦまたはｍｕｔＴＮＦのいずれを臭化脂質から形成された小胞中に添加した場合であっても、蛍光の消失を観察することができなかった。
【００２９】
上記観察結果は、酸性ｐＨにおいてｍｕｔＴＮＦが部分的に変性し、その後膜と相互作用しうることを示すものである。しかしながら、臭化脂質による消光が起こらないことは、分子の膜挿入によるのではなくむしろ部分的に変性したＴＮＦ分子の脂質二重層への結合により膜クロライド放出が起こることを示唆する。
【００３０】
次に我々は、ＴＮＦ先端ペプチドがＳＰＱ含有小胞からのクロライド流出を誘導できるかどうか、ならびに臭化脂質との相互作用によるトリプトファン消光を観察できるかどうかを調べた。１００％中性脂質、１００％酸性脂質またはそれらの１：１混合物のいずれかを含有するリポソームを使用した。いずれの脂質成分についても、３００μｇ／ｍｌまでのペプチド濃度の場合には、ＳＰＱ蛍光変化が観察できず、臭化脂質による消光も観察できなかったし、このことは４種のペプチドすべてに共通していた。これらの実験は、ＬＴｉｐならびに修飾先端ペプチドは膜と相互作用できないことを示唆するものであった。
【００３１】
実施例２：
単離肺潅流実験
DeCampos et al (1993)に記載されたようにして体重約３００ｇのメスのWhistarラットから肺を単離した。５００μｌの滅菌９％ＮａＣｌ、野生型ネズミＴＮＦ（１μｇ／肺）またはｍＴＮＦ先端ペプチド（上記Ｌｔｉｐ；１ｍｇ／肺）のいずれかを肺に鞘内注射した。次いで、同じラットから単離した血液で肺を潅流した。３０分後、２ｍｌの滅菌９％ ＮａＣｌ溶液を肺に鞘内注射したところ重量が約２ｇ増加した（図５）。その後、その重量測定を１５０分継続した（図５）。
【００３２】
対照肺（ＮａＣｌで前処理）の重量は経時的に減少しなかったが、対照的に、ｗｔＴＮＦまたは先端ペプチドのいずれかで処理された肺は、１５０分後には２５ないし５０％の有意な減少を示し（図５および６）、流体静力学的浮腫の存在の減少に対応していた。ＴＮＦ先端ペプチドの場合、２ｍｌのＮａＣｌ溶液の注入直後に重量低下が始まった（図５）。
これらの実験は、ｍＴＮＦの先端ペプチドは、野生型分子と同様に、浮腫吸収を導くことができることを示す。しかしながら、ｗｔ ｍＴＮＦとは対照的に、先端ペプチドはＴＮＦ受容体と相互作用せず、肺内皮および上皮細胞における接着分子の発現増加を導かない。それゆえ、先端ペプチドは、ｗｔ ｍＴＮＦと比較すると、より低い肺毒性しか誘導しない。
【００３３】
参考文献のリスト
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【図面の簡単な説明】
【図１】  （Ａ）ｗｔ ｍＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＮＥＳバッファーとともにｐＨ６および７．３において３０分プレインキュベーションされたネズミ肺微小血管内皮細胞における電流−電圧相関関係を示す。値は５個以上の細胞の平均値±標準偏差を示す（＊：Ｐが０．０５以下）。（Ｂ）ｐＨ６において培地（上）または１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ（下）で前処理された肺ＭＶＥＣの特徴的な電流トレースを示す。
【図２】  （Ａ）対照および（Ｂ）ＴＮＦＲ１／２０／０Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離された内在腹腔内マクロファージにおける電流−電圧相関関係を示す。細胞を培地、ｗｔ ｍＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＬｔｉｐペプチド（１００μｇ／ｍｌ）とともに３０分プレインキュベーションした。値は５個以上の細胞の平均値±標準偏差を示す（＊：Ｐが０．０５以下）。
【図３】  ｗｔ ｍＴＮＦにより誘導されるＭＶＥＣにおける膜コンダクタンス増加に対する、プレインキュベーション工程中３０分間添加されたアミロライド（１００μＭ）の影響を示す。肺ＭＶＥＣとともに３０分プレインキュベーションしてから、ｍＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびｗｔ ｍＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の影響を３つの同じ系にて比較した。値は５個以上の細胞の平均値±標準偏差を示す（＊：Ｐが０．０５以下）。
【図４】  （Ａ）ｐＨ６および７．３の場合のＣＢＡ肺ＭＶＥＣにおける対照に対するＬｔｉｐ（１００μｇ／ｍｌ）の影響を示す。（Ｂ）ｐＨ６においてＬｔｉｐペプチド、ｍｕｔ先端ペプチドおよびスクランブル先端ペプチドとＭＶＥＣとの３０分間プレインキュベーションの影響を比較したものである。Ｌｔｉｐペプチドにより誘導されるＭＶＥＣにおける膜コンダクタンス増加に対する、プレインキュベーション中に添加されたアミロライド（１００μＭ）の影響を示す。値は５個以上の細胞の平均値±標準偏差を示す（＊：Ｐが０．０５以下）。
【図５】  １５０分継続した単離肺潅流実験中における肺重量変化（グラム数で表示）に対するｍＴＮＦ先端ペプチド（１ｍｇ／肺）の影響を示す。
【図６】  １５０分間の単離肺潅流実験中の肺重量変化（３０分におけるベースライン肺重量に対する％）に対する、対照［白丸，ＮａＣｌ］と比較した場合の野生型ｍＴＮＦ（黒丸，１μｇ／肺）またはｍＴＮＦ先端ペプチド（黒三角，１μｇ／肺）の影響を示す。各シンボル［白丸、黒丸または黒三角］は１個の肺のものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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