(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性水素を持たない有機溶媒を用いてホスファチジルエタノールアミンとジカルボン酸無水物を反応させた後、ｐＨ３．５〜７．５の緩衝液と混合し、分層した後、有機溶媒層より有機溶媒を除去することを特徴とする式（１）で示されるホスファチジルエタノールアミン誘導体の製造方法。
【化１】
0004449147.tif 000003
(式中Ｒ1およびＲ2は脂肪族アシル基、Ｍ1およびＭ2は水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウム、ｎは１〜１４の整数を示す)
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミン誘導体を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リン脂質およびその誘導体は、水溶液に分散すると、リポソームと呼ばれる脂質二重層膜から成る閉鎖小胞体を形成する。この性質を利用し、医学、薬学および生化学の分野においては薬剤、酵素、遺伝子等をリポソーム内部に封入した運搬体等への展開が計られている。
このような目的で利用されるリン脂質には、高純度が要求される。高純度のリン脂質を製造するには、溶剤分別、カラム分画などの方法がとられている。
溶剤分別を用いたリン脂質の製造方法としては、例えば特開平９−７７７８２号公報に記載の方法が知られている。この方法はイカの皮から溶媒抽出した抽出物をヘキサンに溶解し、アセトンを添加してリン脂質を不溶物として沈殿、回収することにより得る方法である。また、特開平５−１３２４９０号公報にはリン脂質画分をクロロホルム・メタノール混液あるいはこれに水を加えた混液で抽出した後、アセトンで沈殿させ沈殿物をこれらの混液に再溶解させる操作を繰り返すことによって精製する方法が示されている。しかしながら、これらの溶剤分別を用いた方法では収率が悪く、また高純度のものが得られない。
【０００３】
カラム分画を用いたリン脂質の製造方法としては、例えば特開平４−６９３９０号公報に記載の方法が知られている。この方法は構造の異なるリン脂質を液体クロマトグラフィーにより分離するに際し、アミンを予め通液することにより前処理を行う脂質の分離方法である。また、特開平５−９７８７２号公報には混合リン脂質を、水または酢酸水溶液を含む、アルコールと非極性溶媒の混合溶媒に溶解し、高速液体クロマトグラフィーに供して、リン脂質を分離・精製する方法が示されている。しかしながら、これらの方法ではカラムクロマトグラフィーが必要とされ、カラムクロマトグラフィーを使用して精製を行うと純度が低く、また収率も低く、工業的に極めて不利である。
従来、ホスファチジルエタノールアミン誘導体の製造方法としては、例えば特表平７−５０１３１６号公報に記載の方法が知られている。この方法はホスファチジルエタノールアミンにジカルボン酸無水物を塩基性触媒下、室温で反応させたものを、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する方法である。しかしながら、この方法では、シリカゲルカラムからの溶出時にホスファチジルエタノールアミン誘導体が分解し、純度の低下および収率の低下が起こるなどの欠点があり、工業的には極めて不利である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以上の観点からなされたもので、ホスファチジルエタノールアミン誘導体を高純度で得ることができ、工業的スケールで容易に製造しうる方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる現状に鑑み簡易な操作で目的とするホスファチジルエタノールアミン誘導体を９７％以上の高純度で製造し得る方法を開発すべく鋭意研究を重ねるうち、有機溶媒に溶解しているホスファチジルエタノールアミンとジカルボン酸無水物との反応物に緩衝液を接触させ、緩衝液中に塩基性触媒を除去することにより純度９７％以上のホスファチジルエタノールアミン誘導体が９０％以上の収率で得られるという事実を見出した。本発明はかかる知見に基づき完成されたものである。
すなわち本発明は、活性水素を持たない有機溶媒を用いてホスファチジルエタノールアミンとジカルボン酸無水物を反応させた後、ｐＨ３．５〜７．５の緩衝液と混合し、分層した後、有機溶媒層より有機溶媒を除去することを特徴とする式（１）で示されるホスファチジルエタノールアミン誘導体の製造方法である。
【０００６】
【化２】
0004449147.tif 000002
【０００７】
(式中Ｒ1およびＲ2は脂肪族アシル基、Ｍ1およびＭ2は水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウム、ｎは１〜１４の整数を示す)
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＲ1およびＲ2で示されるホスファチジルエタノールアミンのアシル基は炭素数１２〜２２の飽和または不飽和アシル基であり、例えばラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ヘンエイコサン酸、ベヘン酸等の直鎖飽和カルボン酸、２−ラウロレイン酸、リンデル酸、トウハク酸、５−ラウロレイン酸、１１−ラウロレイン酸、ツズ酸、５−ミリストレイン酸、ミリストレイン酸、２−パルミトレイン酸、７−パルミトレイン酸、ｃｉｓ−９−パルミトレイン酸、ｔｒａｎｓ−９−パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、ペトロセエライジン酸、オレイン酸、エライジン酸、バセニン酸、ゴンドイン酸、ｔｒａｎｓ−ゴンドイン酸、エルシン酸、ブラシン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、リノレン酸、リノレンエライジン酸、プソイドエレオステアリン酸、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の直鎖不飽和カルボン酸由来のアシル基が挙げられ、好ましくはオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸である。
【０００９】
また、ホスファチジルエタノールアミンとして、天然由来の大豆ホスファチジルエタノールアミンまたは卵黄ホスファチジルエタノールアミン等も使用することができる。これらのホスファチジルエタノールアミンは、純度９０％以上、好ましくは９７％以上のものがよい。
【００１０】
また、本発明で用いられるジカルボン酸無水物は、炭素数３〜１６のものが好ましく、具体的にはマロン酸無水物、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物、ピメリン酸無水物、オクタンジオン酸、セバシン酸無水物、ドデカン二酸無水物、トリデカン二酸無水物、テトラデカン二酸無水物、ヘキサデカン二酸無水物等が挙げられ、好ましくはグルタル酸無水物、コハク酸無水物、アジピン酸無水物、セバシン酸無水物である。
使用するジカルボン酸無水物は市販品を用いてもよいし、ジシクロヘキシルカルボキシイミドなどの縮合剤を用いてジカルボン酸から合成してもよい。
ジカルボン酸無水物の添加量はホスファチジルエタノールアミンに対し、１〜３当量、好ましくは１〜１．８当量とするのが良い。１当量未満では、純度および収率が低下する。３当量を超過しても反応率および反応速度はほとんど変わらず、経済性が悪くなる。
【００１１】
本発明の方法を実施するに際しては、まず活性水素を持たない有機溶媒にホスファチジルエタノールアミンおよびジカルボン酸無水物を触媒存在下で混合する。用いられる有機溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロルメタン等のハロゲン溶媒、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素溶媒、ベンゼン、キシレン等の芳香族溶媒、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等のエーテル溶媒などが挙げられ、それらを単独で用いてもよいし、２種以上で組み合わせて用いてもよい。有機溶媒の使用量は、ホスファチジルエタノールアミンの５〜１００重量倍が好ましい。５重量倍未満では溶液の粘度が高くなり、１００重量倍を越えると生産効率が悪くなる可能性がある。
【００１２】
縮合反応に使用する触媒としては塩基性触媒が用いられ、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノ−ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノ−２−メチルピリジン、４−ピロリジノピロリジン等のピリジン誘導体、およびトリエチルアミン、トリブチルアミン等の第３アミン等が使用できるが、この中でトリエチルアミンおよびトリブチルアミンの使用が好ましい。触媒の添加量は原料に対し０．０１〜２０当量、好ましくは０．１〜２当量が良い。０．０１当量未満では反応率が低くなり、２０当量を超えても、反応率が高くならず、経済性が悪くなる。反応は０〜４０℃程度、好ましくは０〜１０℃の範囲で行うことができる。０℃未満では、反応速度が低下し、４０℃を超えると、ホスファチジルエタノールアミン誘導体の熱分解が起こるので好ましくない。
【００１３】
反応後、このようにして得られた反応液に緩衝液を添加して攪拌し、分層させる。
本発明で使用する緩衝液のｐＨは３．５〜７．５が好ましい。ｐＨ３．５未満または７．５を超えると、ホスファチジルエタノールアミン誘導体の分解が起こるので好ましくない。
また、本発明で使用する緩衝液中の金属塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムを含有するものであればよく、具体的にはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウム、その塩化物、水酸化物あるいはリン酸塩、酢酸塩およびその他の有機酸塩、硫酸塩、硝酸塩などいかなる形態の塩でも構わない。
本発明で使用する緩衝液で使用する水は金属イオンを含まない蒸留水が好ましい。
【００１４】
本発明で使用する緩衝液中の塩含量はホスファチジルエタノールアミンの０．３〜３倍モルが好ましい。０．３倍モル未満または３倍モルを越えると分層状態が悪くなり、有機溶媒層への抽出効率が悪くなるため、純度が低下し、収率が低下する。
このようにして緩衝液と混合し、分層した後、得られた有機溶媒層より有機溶媒を除去する。本発明で使用する有機溶媒の除去方法としては、エバポレーターを用いても、凍結乾燥および真空乾燥などの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。このようにしてホスファチジルエタノールアミン誘導体を得る。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば純度９７％以上のホスファチジルエタノールアミン誘導体を収率９０％以上で製造し得る。しかもその際の精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどの煩雑な操作が不要なため、工業的に極めて有利な方法である。本発明により得られるリン脂質誘導体は、高純度であるので、特に医薬品分野での利用に適している。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳しく説明する。なお、リン脂質の組成分析、純度測定は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣという）で行った。ＴＬＣはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ． Ｉｎｃ．）を用い、５重量％の試料２マイクロリットルをスポットし、クロロホルム：メタノール：蒸留水＝６５：２５：４（容量比）で展開し、無水硫酸銅１０ｇと８５％リン酸８ミリリットルを蒸留水で１００ミリリットルとしたものを噴霧後加熱する方法により行った。
【００１７】
実施例１
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−グルタリル）−エタノールアミンナトリウム塩；ＤＯＰＥ−グルタル酸ナトリウムの調製
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、純度９９．５％）１０ｇ、トリエチルアミン１．６ｇ（ＤＯＰＥに対して１．２当量）、クロロホルム２００ミリリットル（ＤＯＰＥの３０重量倍）に溶解し、グルタル酸無水物２．２ｇ（ＤＯＰＥに対して１．５当量）を加え、窒素雰囲気下、４℃で１時間反応したのち、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝６）７２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＯＰＥの２．７倍モル、０．５Ｍは０．５ｍｏｌ／ｌを示す）を加え、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取し、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝６）７２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＯＰＥの２．７倍モル）を加え、攪拌後、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取した。エバポレーターで溶媒留去し、注射用水に分散して、凍結乾燥し、乾燥物１１．６ｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度９９．７％、収率９７．８％であった。
【００１８】
実施例２
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−スクシニル）−エタノールアミンナトリウム塩；ＤＰＰＥ−コハク酸ナトリウムの調製
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ、純度９９．３％）９．３ｇ、トリエチルアミン１．５ｇ（ＤＰＰＥに対して１．１当量）、クロロホルム１８６ミリリットル（ＤＰＰＥの３０重量倍）に溶解し、コハク酸無水物１．９ｇ（ＤＰＰＥに対して１．４当量）を加え、窒素雰囲気下、４℃で１時間反応したのち、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）６７ミリリットルを加え、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取し、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）６７ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＰＰＥの１倍モル）を加え、攪拌後、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取した。エバポレーターで溶媒留去し、注射用水に分散して、凍結乾燥し、乾燥物１０．５ｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度９９．５％、収率９７．３％であった。
【００１９】
実施例３
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−アジピニル）−エタノールアミンナトリウム塩；ＤＳＰＥ−アジピン酸ナトリウムの調製
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ、純度９９．３％）１０．１ｇ、トリエチルアミン１．６ｇ（ＤＳＰＥに対して１．２当量）、クロロホルム２０１ミリリットル（ＤＳＰＥの３０重量倍）に溶解し、アジピン酸無水物２．５ｇ（ＤＳＰＥに対して１．４当量）を加え、窒素雰囲気下、４℃で１時間反応したのち、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）７２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＳＰＥの０．４倍モル）を加え、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取し、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）７２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＳＰＥの０．４倍モル）を加え、攪拌後、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取した。エバポレーターで溶媒留去し、注射用水に分散して、凍結乾燥し、乾燥物１１．７ｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度９９．３％、収率９６．５％であった。
【００２０】
実施例４
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−セバシニル）−エタノールアミンナトリウム塩；ＤＭＰＥ−セバシン酸ナトリウムの調製
ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ、純度９９．２％）８．５ｇ、トリエチルアミン１．４ｇ（ＤＭＰＥに対して１倍モル）、クロロホルム１７１ミリリットル（ＤＭＰＥの３０重量倍）に溶解し、セバシン酸無水物３．５ｇ（ＤＭＰＥに対して１．４当量）を加え、窒素雰囲気下、４℃で１時間反応したのち、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝７）６２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＭＰＥの２．９倍モル）を加え、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取し、０．５Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ＝７）６２ミリリットル（酢酸ナトリウムはＤＭＰＥの２．９倍モル）を加え、攪拌後、分液ロートに移し、１時間静置した。静置後、下層を分取した。エバポレーターで溶媒留去し、注射用水に分散して、凍結乾燥し、乾燥物１０．７ｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度９９．４％、収率９５．１％であった。
【００２１】
比較例１
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−スクシニル）−エタノールアミン；ＤＰＰＥ−コハク酸の調製
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ、純度９９．３％）３４６ｍｇ、コハク酸無水物１００ｍｇ（ＤＰＰＥの２当量）、トリエチルアミン０．１ミリリットル（ＤＰＰＥに対して１．４当量）をクロロホルム１０ミリリットル（ＤＰＰＥの４３３重量倍）に溶解し、窒素雰囲気下、室温で１６時間、窒素雰囲気下で攪拌した。攪拌後、エバポレーターで５ミリリットルになるまで溶媒留去した。これをクロロホルムで平衡化したシリカゲル６０カラム（２．５ｃｍ×４５ｃｍ）上に流し、クロロホルム５００ミリリットル、クロロホルム：メタノール（８５：１５）５００ミリリットルで溶出し、乾燥物２０３ｍｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度７９．６％、収率４９．９％であった。
【００２２】
比較例２
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−スクシニル）−エタノールアミン；ＤＳＰＥ−コハク酸の調製
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ、純度９９．３％）１００ｍｇ、コハク酸無水物１５ｍｇ（ＤＳＰＥに対して１．２当量）、ピリジン１０マイクロリットルをクロロホルム５ミリリットル（ＤＳＰＥの７５重量倍）に溶解し、窒素雰囲気下、室温で終夜、窒素雰囲気下で攪拌した。攪拌後、冷アセトンで沈殿させ、乾燥物９８ｍｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度８０．２％、収率８４．３％であった。
【００２３】
比較例３
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−スクシニル）−エタノールアミンナトリウム塩；ＤＯＰＥ−コハク酸ナトリウムの調製
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、純度９９．５％）２００．６ｍｇ、コハク酸無水物５４ｍｇ（ＤＯＰＥに対して２当量）をピリジン１０ミリリットルに溶解し、窒素雰囲気下、５５℃で２時間、窒素雰囲気下で攪拌した。攪拌後、エバポレーターで溶媒留去し、残留物をクロロホルム−メタノール−０．５８％塩化ナトリウム水溶液（１：２：０．８、容量比）の混合物に懸濁した。クロロホルム−０．５８％塩化ナトリウム水溶液（１：１、容量比）の混合物を添加後、生成物を分配により抽出した。下の層をクロロホルム−メタノール−０．５８％塩化ナトリウム水溶液（３：４８：４７、容量比）の混合物で３回洗浄した。エバポレーターで溶媒留去し、乾燥物１８４ｍｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度８２．５％、収率７８．８％であった。
【００２４】
比較例４
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｏ−（Ｎ−アジピニル）−エタノールアミン；ＤＯＰＥ−アジピン酸の調製
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、純度９９．５％）７４４ｍｇ、アジピン酸１７５ｍｇ（ＤＯＰＥに対して１．３当量）、ジシクロヘキシルカルボジイミド２６８ｍｇを酢酸エチル１０ミリリットルに溶解し、窒素雰囲気下、４５℃で４時間、窒素雰囲気下で攪拌した。攪拌後、エバポレーターで溶媒留去し、メタノールに再溶解した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを詰めたカラムに、この溶液を吸着させ、０．５Ｍ酢酸アンモニウムメタノール溶液で溶出し、乾燥物６２５ｍｇを得た。得られた乾燥物をＴＬＣで分析したところ、純度８２．４％、収率６９．９％であった。
【００２５】
比較例１および４でカラムを用いてホスファチジルエタノールアミン誘導体の精製を行ったが、実施例１〜４と比べて純度、収率ともに悪かった。比較例２ではアセトンを用いて溶剤分別による精製を行ったが、実施例１〜４と比べて純度、収率ともに悪かった。比較例３では塩化ナトリウムを含む混合溶媒による精製を行ったが、実施例１〜４と比べて純度、収率ともに悪かった。
以上の結果より、活性水素をもたない有機溶媒中でホスファチジルエタノールアミンとジカルボン酸無水物を反応させた後、ｐＨ３．５〜７．５の緩衝液と混合し、分層させた後、有機溶媒を除去することによって、９５％以上の収率で純度９９％以上のホスファチジルエタノールアミン誘導体を製造できる。