(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）由来のセルラーゼ、トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ及びフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼより選択される２種以上のセルラーゼからなることを特徴とする反芻動物の飼料用酵素剤。
【請求項２】
請求項１記載の酵素剤を添加した飼料を牛に投与することにより、牛の発育を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、反芻動物の飼料用酵素剤に関し、詳しくは起源の異なる２種以上のセルラーゼを含有することを特徴とする反芻動物の飼料用酵素剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
配合飼料の栄養成分を家畜に有効に利用させることを目的として、飼料中にセルラーゼを添加することが行われている。セルラーゼは、微生物起源のものが用いられており、これまでにトリコデルマ属微生物、アスペルギルス属微生物、アクレモニウム属微生物、フミコーラ属微生物などに由来するセルラーゼが知られている。
アクレモニウム属微生物に由来するセルラーゼを添加した家畜用飼料は、特許第２９４８４７１号明細書に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、セルラーゼは、その起源などによって、天然セルロースに対する分解力が異なる上に、セルロースを完全にグルコースまで分解することができないものや、セロビオース、セロオリゴ糖等を多量に生成するもの等があり、飼料に配合するにあたって、様々な問題点があった。
また、反芻動物は飼料中に含まれる繊維を消化、利用できるという特性を有しているが、繊維の消化率はデンプンよりもはるかに低く、主要な繊維消化の場であるルーメンにおいても、繊維消化の速度は遅く、特に配合飼料（濃厚飼料等）の多給によりルーメン内のｐＨが低下した場合は、繊維の消化速度は著しく低下することが知られている[Hino T. et al., Animal Science and Technology, 64: 1070-1078 (1993)、Hino T. et al., The Journal of General Applied Microbiology, 39: 35-45 (1999)]。
そのため、ルーメン内のｐＨが低下した場合は、牛などの反芻動物の生育速度は大幅に低下し、その改善が求められていた。
【０００４】
そこで、本発明者らは、牛によって代表される反芻動物に投与する飼料について検討を重ねた結果、起源の異なる複数種のセルラーゼを組み合わせて添加することにより、飼料中の栄養成分の有効利用が促進されること、特に牛による不溶性食物繊維等の繊維の消化率が改善されることを見出し、本発明に到達した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）由来のセルラーゼ、トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ及びフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼより選択される２種以上のセルラーゼからなることを特徴とする反芻動物の飼料用酵素剤である。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載の酵素剤を添加した飼料を牛に投与することにより、牛の発育を改善する方法に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるセルラーゼは、繊維を分解する作用を有する酵素を意味し、繊維素を分解する狭義のセルラーゼの他、飼料成分として用いられる大麦、小麦などに含まれる多糖類などに作用するキシラナーゼ、β−グルカナーゼ、ペントサナーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等の酵素を含む混合酵素剤も包含される。本発明の酵素剤に用いるセルラーゼは、微生物に由来するものであればよく、例えばアクレモニウム属微生物由来のセルラーゼ、トリコデルマ属微生物由来のセルラーゼ、フミコーラ属微生物由来のセルラーゼ、アスペルギルス属微生物由来のセルラーゼ等があり、これらの中から選択される２種以上のものを用いる。
【０００７】
具体的には、アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）由来のセルラーゼ、トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ（Agric. Biol. Chem., 55 (7), 1817-1822 (1991)) 、トリコデルマ・レーゼイ由来のセルラーゼ（J. Bacteriol., 139(39)，761-769 (1979)) 、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼ（商品名：バイオフィードプラス、ノボノルディスク社製、至適ｐＨは約６）、フミコーラ・グリセア由来のセルラーゼ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(2), 245-250 (1997))、アスペルギルス・ニガー由来のセルラーゼ（Biochem. J., 165(1), 33-41 (1977) 、Mol. Gen. Genet., 194, 494 (1984))、スペルギルス・オリゼー由来のセルラーゼ（Can. J. Microbiol., 20(3), 413-416 (1974))などがある。
【０００８】
アクレモニウム属微生物由来のセルラーゼは、例えば特公昭６０−４３９５４号公報に記載された方法に従い、上記アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）を用いて製造することができる。この酵素は、結晶性セルロースに対する分解力が強く、β−グルコシダーゼ活性もトリコデルマ属微生物由来の酵素よりも著しく強いため、セルロースを殆ど完全にグルコースにまで分解することができる。
一方、トリコデルマ属微生物由来のセルラーゼ、例えば商品名（メイセラーゼ、明治製菓（株）製）は、トリコデルマ・ビリデを培養して得られる酵素で、酵素力試験において、１ｇ中に１５００繊維崩壊力単位以上を含んでいる。
フミコーラ属微生物由来のセルラーゼ、例えば商品名（バイオフィードプラス、ノボノルディスク社製）は、フミコーラ・インソレンスを液体培養することにより得られ、セルロースの他、大麦や小麦に含まれるアラビノキシランやβ−グルカン等を分解することができる。
また、アスペルギルス属微生物由来のセルラーゼとしては、前記したように、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ニガー由来のセルラーゼがある。
【０００９】
前記したように、反芻動物は、飼料中の繊維を消化・利用するという特性を有しているが、繊維の消化率は、デンプンよりもはるかに低い。実際に、ルーメンにおける繊維の消化速度は遅く、特に濃厚飼料等の多給によって、ｐＨが低下した場合は、繊維の消化速度は著しく低下する。
そこで、本発明者らは反芻動物による繊維の消化を促進させるため、飼料へのセルラーゼの添加条件について検討を重ねた。
【００１０】
反芻動物、例えば牛のルーメン内のｐＨは通常５．０〜６．０であるが、濃厚飼料で飼育されている牛のルーメン液のｐＨは大幅に低下していることが分かった。
したがって、飼料に添加するセルラーゼは、至適ｐＨが比較的低いものを用いれば、ルーメン内での活性に影響を受け難いものと考えられる。それ故、酵素剤として用いるセルラーゼの組み合わせの中には、必ず至適ｐＨの低い酵素を含有させることが必要である。また、反芻動物用飼料として主に粗飼料あるいは濃厚飼料を多量投与する場合は、該飼料に添加する酵素の種類や量を多くすることが有効であり、３種類以上のセルラーゼを組み合わせると、不溶性食物繊維（ＮＤＦ）の消化率を高めることができる。
【００１１】
飼料に添加する際のセルラーゼの形態については特に制限はなく、例えば粉末状で用いるのが一般的であるが、賦形剤と混ぜて用いてもよい。この場合の賦形剤としては、小麦粉、コーンミール、大豆粉、澱粉、澱粉の部分分解物、グルコース、米ぬか、ふすまなどがあり、これらを単独で、もしくは数種を組み合わせて用いることができる。その他、液剤なども用いられる。
【００１２】
飼料へのセルラーゼの添加量は、反芻動物の種類、年齢や飼料の種類などを考慮して適宜決定すればよい。例えば牛の場合、通常乾物飼料１Ｋｇに対して０．１〜５０ｇ、好ましくは０．５〜５ｇである。過剰に添加しても相応する効果が得られず、弊害が起きる場合がある。
また、セルラーゼを添加した飼料の投与期間についても制限はなく、飼養期間の全期間を通じて投与することもできる。
なお、市販のセルラーゼの中には、飼料添加物として認可されたものもあり、その一部はサイレージ生産における初期発酵を促進するために利用されている。
したがって、適量のセルラーゼを飼料に添加すれば、牛などの反芻動物に対する安全性に問題はない。なお、一部の市販セルラーゼは、前記したように、キシラナーゼ、ペントサナーゼ、ペクチナーゼ等の繊維成分を分解する作用のある酵素を含んでおり、本発明に用いるセルラーゼとして好ましい。
【００１３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
ヤギから二重ガーゼを用いて採取したルーメン液（混合ルーメン微生物）５０ｍｌと１００ｍＭ  リン酸カリ緩衝液（ｐＨ7.０）１５０ｍｌを５００ｍｌ容丸底フラスコに入れた。次いで、飼料として、ミキサーで細かく砕いたパニカム青草（５ｇ）、チモシー乾草（３ｇ）及び市販の肉用牛配合飼料（５ｇ）のいずれか１種を加えた後、３９℃で４８時間嫌気的に（ＣＯ2 気相下）振盪培養した。なお、配合飼料（濃厚飼料）の成分組成（％）は、大麦  ５1.６％、トウモロコシ  8.６％、一般麸  １7.２％、増産麸  １7.２％、大豆油粕  3.０％、炭酸カルシウム  0.９％、食塩  0.３％、ビタミンＡＤ  0.１％である。
【００１４】
培養中、飼料は２４時間後に同量を追加し、６時間毎に培地のｐＨを5.５〜6.０あるいは6.５〜7.０の範囲内となるように調整した。発生したメタンガスをガスバッグに捕集した。また、培養は３連で実施した。
セルラーゼは、１日２回飼料と混ぜて添加した。セルラーゼとして、アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）を用いて製造したもの（商品名：アクレモザイム、明治製菓（株）製、繊維糖化力試験法による酵素力価は６６４０単位／ｇ、至適ｐＨは５前後）（酵素Ａ）、トリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ（商品名：メイセラーゼ、明治製菓（株）製、繊維糖化力試験法による酵素力価は２１４７単位／ｇ、至適ｐＨは５前後）（酵素Ｂ）及びフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼ（商品名：バイオフィードプラスＣＴ、ノボノルディスク社製、至適ｐＨは６前後、本酵素の活性はキシラナーゼ  ８００ＦＸＵ／ｇ、ペントサナーゼ  ２５００ＰＴＵ／ｇ、β−グルカナーゼ  ７５ＦＢＧ／ｇ、エンドβ−グルカナーゼ  １２０ＥＧＵ／ｇである）（酵素Ｃ）を単独で、もしくは２種以上を組み合わせて使用した。酵素の１回の添加量は、単独添加の場合は、酵素Ａ及びＢについては0.２ｇ、酵素Ｃは1.５ｇとした。２種の酵素を併用したときは、それぞれ１／２量とし、３種を併用したときは、それぞれ１／３量とした。
【００１５】
繊維糖化力試験法による酵素力価は、カルボキシメチルセルロースナトリウムにセルラーゼが作用するときに、加水分解に伴って増加する還元力により、飼料添加物中のセルラーゼ量を測定して求められるものである。その単位は、繊維糖化力単位で示され、セルラーゼがカルボキシメチルセルロースナトリウムに３７℃で作用するとき、反応初期の１分間の１μｍｏｌのブドウ糖に相当する還元力の増加をもたらす酵素量を１単位という。
【００１６】
培養を開始してから４８時間後に、測定に必要な量のサンプル液を取り出し、飼料中の不溶性食物繊維（ＮＤＦ）の消化率、揮発性脂肪酸濃度及び発生メタンガス量を測定した。すなわち、ＮＤＦの消化率測定には５ｍｌ、揮発性脂肪酸濃度及び発生メタンガス量の測定には１ｍｌを採取した。ＮＤＦの測定は、Van Soest PJ, Wien PH., Journal of Association Officials of Animal Chemistry, 50; 50-55, 1967 に記載の方法より行い、揮発性脂肪酸濃度及びメタンガス量の測定は、Hino T., The Japanese Journal of Zootechnical Science 53; 171, 1981 に記載の方法により行った。これらの結果を第１〜２表に示す。
また、飼料の種類と生成還元糖との関係を第３表に、ルーメン微生物による各種酵素のカルボキシメチルセルラーゼ(CMCase)活性への影響を第４表に示した。
【００１７】
【表１】
第１表  不溶性食物繊維の消化率への酵素の影響
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【００１８】
第１表から明らかなように、ｐＨ5.５〜6.０ではルーメン微生物だけでは、殆ど繊維を消化できないが、セルラーゼの添加によりＮＤＦの消化率は著しく向上する。消化率の向上は、２種以上の酵素を用いることにより、一層顕著である。
これは、各酵素慓品に含まれる酵素の種類と特性が異なり、互いに補い合うための相乗効果であると考えられる。また、ｐＨ6.５〜7.０の場合も、セルラーゼの添加によりＮＤＦの消化率が向上することが認められ、２種以上を添加したときに特に顕著である。ｐＨとの関係では、低ｐＨのときにセルラーゼの添加効果が著しく、低ｐＨ時での繊維消化の低下を補う効果が認められた。
この例では、ヤギのルーメン液を用いたが、牛のルーメン液を使用した場合も同様の結果が得られることを確認している。
【００１９】
【表２】
第２表  発酵生産物量への酵素の影響
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【００２０】
表中の*1のVFA は揮発性脂肪酸を、*2は培養終期１２時間のメタンガス生成量を示す。
【００２１】
表から明らかなように、セルラーゼの添加により繊維の分解が進み、揮発性脂肪酸とメタンガスの生成量が増加する。
【００２２】
【表３】
第３表  ｐＨ5.８での酵素による食物繊維の消化
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* 還元糖生成量は、３９℃で５時間培養後に測定した。
【００２３】
第３表に示したように、セルラーゼ無添加では飼料中の食物繊維は消化されないが、酵素の添加により改善され、２種以上を組み合わせて添加すると、改善効果が顕著となる。
【００２４】
【表４】
第４表  ルーメン微生物による各種酵素の CMCase 活性への影響
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【００２５】
表中の*1はルーメン液１００ｍｌあたり２００ｍｇの酵素量を、＊2 はセルラーゼを添加してから所定時間後の活性を示し、０時間を１００とした相対値である。
【００２６】
第４表は、酵素のCMCase活性はルーメン微生物のプロテアーゼによる分解の程度に差があり、酵素Ｂの場合はプロテアーゼによる分解が大きいことを示している。
【００２７】
実施例２
この例では、in vivo 消化試験を行った。被検牛を１区３頭の２区に分け、各牛には実施例１で用いたものと同じ組成の配合飼料を5.５ｋｇ／日とチモシー乾草0.５ｋｇ／日を朝夕２回に分けて給餌し、水と固形塩類は自由摂取させた。
試験区の牛には、所定のセルラーゼを配合飼料に混合し、朝夕２回与えた。その投与量は、酵素Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ１０ｇ／日、２０ｇ／日及び１００ｇ／日とした。５日間の予備飼育の後、６日間の本試験を行い、全糞採取法により不溶性食物繊維（ＮＤＦ）の消化率を測定した。結果を第５表に示す。
【００２８】
また、in situ 消化試験として、５ｇのチモシー乾草粉末又はセルロース粉末（商品名：fibrous long、Sigma Chemical Co. USA製) を詰めたナイロンバッグ（三紳工業（株）製）各２袋／頭をルーメンフィステルから懸垂し、本試験最後の２日間における消化率を測定した。なお、２袋の平均値を牛１頭の測定値とした。結果を第５表に示す。なお、ＮＤＦとセルロースの測定方法は実施例１と同じである。
【００２９】
【表５】
第５表 in vivo又はin situ での各種酵素の NDFとセルロースの消化率への影響
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【００３０】
*1は全消化管における消化率、*2はルーメン内に試験最後の２日間懸垂したナイロンバッグ中の消化率、*3はチモシー乾草中のNDF 、*4は粉末セルロースを示す。
【００３１】
第５表から、in vivo 試験では、全消化管における繊維の消化率は低いが、酵素を添加することによって、ＮＤＦの消化率が顕著に増加することが分かる。これは、いずれの牛でもルーメン内のｐＨが5.０〜6.０の範囲であったため、大きな効果が奏されたものと思われる。in situ ナイロンバッグ法でも同様の結果が得られていることから、投与したセルラーゼがルーメン内で作用したことは明らかである。
なお、主要なルーメン微生物はｐＨ6.０以下では増殖しないのに、酵素無添加区において一部のＮＤＦが分解された理由として、本試験においては、普通のルーメン微生物以外の一過性の低ｐＨ耐性セルロース分解菌が存在していたものと考えられる。
【００３２】
実施例３
実施例２では濃厚飼料多給区での試験を行ったが、この例では粗飼料多給区におけるセルラーゼのＮＤＦ消化率への影響を調べた。試験方法は、実施例２と基本的に同じである。
１区５頭の３区を設け、各牛に実施例１で用いたものと同じ組成の配合飼料を４ｋｇ／日とチモシー乾草１ｋｇ／日及びオーツ乾草１ｋｇ／日を給餌した。試験区には、セルラーゼとして酵素Ａ、Ｂをそれぞれ２０ｇ／日、１２０ｇ／日投与した区と、酵素Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ１５ｇ／日、１００ｇ／日及び２００ｇ／日投与した区を設けた。結果を第６表に示す。
【００３３】
【表６】
第６表  ＮＤＦの消化率への酵素の影響
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【００３４】
表に示したように、セルラーゼ無添加でもＮＤＦ消化率が高かったため、セルラーゼの添加効果が十分に現れなかったものと認められる。さらに、繊維の摂取量に比べてセルラーゼの添加量が相対的に少なかったことも原因と考えられる。しかし、酵素ＡとＢを増量した場合には、有意な効果が認められた。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、起源の異なる２種以上のセルラーゼを添加した反芻動物用飼料が提供される。この飼料を牛などの反芻動物に投与することによって、繊維消化率を改善することができる。これに伴い、牛などの発育改善が期待される。