(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中のソルビトールを選択的に測定するための試薬として、少なくともソルビトールキナーゼ、ATP、ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、NADH、チオNADおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含有してなるソルビトール測定用試薬であって、
以下の要件を備えている第１試薬と、第１試薬に含まれない上記の成分を含む第２試薬を含むことを特徴とする前記試薬。
（１）少なくともＡＴＰ及び６−ホスホフルクトキナーゼを含む
（２）ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを同時に含まない
（３）ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとチオＮＡＤを同時に含まない
【請求項２】
６−ホスホフルクトキナーゼが１〜５００ｕ／ｍｌの６−ホスホフルクトキナーゼである、請求項１に記載のソルビトール測定用試薬。
【請求項３】
第１試薬にさらに、ホスホヘキソースイソメラーゼを含有してなる請求項1又は２に記載のソルビトール測定用試薬。
【請求項４】
ホスホヘキソースイソメラーゼが１〜５００ｕ／ｍｌのホスホヘキソースイソメラーゼである、請求項３に記載のソルビトール測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床生化学検査、食品検査等の分野におけるソルビトールの高感度定量用組成物に関する。さらに詳しくは、少なくとも試料中にソルビトールと混在するフルクトースおよび／またはグルコースの影響を受けないソルビトールの高感度定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ソルビトールはポリオールのうちの代表的なものであり、生体中ではグルコースからアルドース還元酵素により生成される。糖尿病において高血糖状態が続き、細胞内におけるソルビトール産生が進むと、ソルビトールは細胞外に微量しか拡散しないために細胞内に過剰蓄積し、蓄積されたソルビトールにより神経細胞等への種々の障害をきたすことが知られている（堀田ら、ホルモンと臨床、３５，３０９〜３１３、１９８７）。したがって、ソルビトールを正確に定量することは、糖尿病性合併症を把握する上で重要である。
【０００３】
ソルビトールは特に水晶体、神経、赤血球などに存在していることから、各臓器におけるソルビトールの測定が試みられているが、例えば、赤血球中のソルビトールの濃度は、全血に換算した場合、多いと言われる糖尿病患者においてさえ１０μｍｏｌ／Ｌから５０μｍｏｌ／Ｌ程度と低濃度であることが知られている（Ｊ．Ｍａｌｏｎｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２９、８６１〜８６４、１９８０）。
【０００４】
ソルビトールの測定法としては、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、ソルビトールデヒドロゲナーゼを用いて補酵素ＮＡＤが還元型に変化する量を吸光度あるいは蛍光強度により測定する方法、あるいは２種類の補酵素、例えば、還元型ＮＡＤと酸化型チオＮＡＤを用いたサイクリング法、もしくはソルビトールオキシダーゼを用いた酵素法などが知られているが、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法は試料の前処理等、操作が煩雑である。ソルビトールデヒドロゲナーゼは安定性に問題があり、ソルビトールオキシダーゼはソルビトールの酸化に酸素が必須となるために反応液中の溶存酸素濃度が不足し、正確な測定ができない場合も予想された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中のソルビトールを高感度に、他の成分の影響を受けにくい、さらに安定なソルビトール測定試薬の開発を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者らが以前に発明した保存安定性に優れた２種類の酵素、すなわち、ソルビトールキナーゼ（特開平８−１０３２７０号）とソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（特開平８−１０３２６８号）とＡＴＰ、還元型ＮＡＤおよび酸化型チオＮＡＤを組成分とした試薬を調製することにより、下記反応式で表わされるサイクリング反応を形成せしめ、蓄積されてくる還元型チオＮＡＤを測定することで、ソルビトールを高感度に測定できることを発見した。
【０００７】
【化１】
0004392472.tif 000002
【０００８】
また、試料として血液成分を測定しようとした場合、サイクリング反応で生成されてくるフルクトース−６−リン酸が血液成分にはすでに存在するためにブランクをはくことになり、正確な測定ができない（生化学ハンドブック、東京化学同人社、１５５５ページ）。そこで、本発明者らは、サイクリング反応を開始する前に、６−ホスホフルクトキナーゼを用いてフルクトース−６−リン酸をフルクトース−１，６−２リン酸に変化せしめることにより、影響を激減できることを発見した。
【０００９】
さらに、試料として血液成分を測定しようとした場合、血液成分として存在するグルコース−６−リン酸は、血液成分中に存在するホスホヘキソースイソメラーゼによって除々にフルクトース−６−リン酸に変換されるためにブランクをはくことになり、正確なソルビトールの測定が困難であった。そこで、本発明者らは、サイクリング反応を開始する前に、ホスホヘキソースイソメラーゼを過剰に用いてグルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換せしめた後に、さらに６−ホスホフルクトキナーゼを用いてフルクトース−１，６−２リン酸に変化せしめることにより、影響を解除できることを発見し、本発明をなすに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、試料中のソルビトールを測定するための組成物として、少なくともソルビトールキナーゼ、ＡＴＰ、ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨおよびチオＮＡＤを含有してなるソルビトール測定用組成物である。また、本発明は、試料中のソルビトールを選択的に測定する組成物として、上記組成物に６−ホスホフルクトキナーゼ、あるいはさらにホスホヘキソースイソメラーゼを含有してなるソルビトール測定用組成物である。
【００１１】
以下、本発明の構成および好ましい形態について、さらに詳しく説明する。
本発明においては、少なくとも２種類の酵素を使用する。まず、リン酸供与体としてＡＴＰを利用し、ソルビトールの６位の水酸基をリン酸化するソルビトールキナーゼにより、ソルビトールからソルビトール−６−リン酸を産生する反応を触媒する。この時用いられるソルビトールキナーゼは、上記反応を触媒する酵素であればどれでも使用できるが、その具体例としては、特開平８−１０３２７０号記載のエルビニア属由来の酵素が挙げられる。酵素量は５〜１０００ｕ／ｍＬ、好ましくは２００ｕ／ｍＬ付近で使用すればよい。
【００１２】
次いで、ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、還元型ＮＡＤおよび酸化型チオＮＡＤを用いてサイクリング反応を行わしめ、産生されてくる還元型チオＮＡＤを４００ｎｍ付近の吸光度の増加、あるいは減少してくる還元型ＮＡＤを３４０ｎｍ付近の吸光度の減少を測定することにより高感度に測定する。このときソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼはサイクリング反応を十分に触媒する酵素であればどれでも使用できるが、その具体例としては、特開平８−１０３２６８号記載のコマモナス属由来の酵素が挙げられる。酵素量は０．１〜１００ｕ／ｍＬ、好ましくは３ｕ／ｍＬ付近で使用すればよい。還元型ＮＡＤの使用量は０．０５〜５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ付近、酸化型チオＮＡＤの使用量は０．０５〜１００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ付近で使用すればよい。
【００１３】
また、共存物質の影響を回避するための成分としての６−ホスホフルクトキナーゼとホスホヘキソースイソメラーゼは、酵素本来の活性を有する酵素であればどれでも使用することができ、市販の酵素を使用すればよく、６−ホスホフルクトキナーゼはユニチカ社製のバチルス由来の酵素を用いることができ、酵素量は１〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは５０ｕ／ｍＬ付近で使用すればよい。ホスホヘキソースイソメラーゼはユニチカ社製のバチルス由来の酵素を用いることができ、酵素量は１〜５００ｕ／ｍＬ、好ましくは５０ｕ／ｍＬ付近で使用すればよい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例を述べるが、本発明は、これらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
サイクリング反応を用いたソルビトールの測定
〈反応液〉
０．１    Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０１  Ｍ      ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
０．０１  Ｍ      塩化マグネシウム
２００ｕ／ｍＬ    ソルビトールキナーゼ（エルビニア属由来、旭化成工業社製）
３．０ｕ／ｍＬ    ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（コマモナス属由来、旭化成工業社製）
０．０２  Ｍ      酸化型チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
１．０  ｍＭ      還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
０．００５％      トリトンＸ−１００
〈操作〉
上記反応液１．０ｍＬをキュベットにとり、３７℃にて２０、４０、６０μＭに調整したソルビトール溶液３３μＬを添加し、反応を開始させた。反応はそれぞれ４分目には平衡状態に達した。平衡状態にあった６分目と７分目の４０５ｎｍの吸光度差を求めた。その結果を第１図に示した。第１図から明らかなように、ソルビトールに対する吸光度変化量は、チオＮＡＤ／ＮＡＤＨを補酵素とするサイクリング反応において良好な直線を示した。
【００１５】
【実施例２】
サイクリング反応
〈反応液１〉
０．０５  Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０１  Ｍ      ＡＴＰ（オリエンタル酵母社製）
０．０１  Ｍ      塩化マグネシウム
２００ｕ／ｍＬ    ソルビトールキナーゼ（エルビニア属由来、旭化成工業社製）
０．０１  ％      トリトン  Ｘ−１００
〈反応液２〉
０．１    Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０４  Ｍ      酸化型チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
２．０  ｍＭ      還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）
６．０ｕ／ｍＬ    ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（コマモナス属、旭化成工業社製）
０．０３  Ｍ      ＥＤＴＡ・２Ｎａ
〈操作〉
上記反応液１を０．５ｍＬキュベットにとり、２０、４０、６０、８０，１００μＭに調整したソルビトール溶液３３μＬを添加し、３７℃にて反応を開始させた。５分後、反応液２を０．５ｍＬ混合し、３７℃で第２反応を開始させた。反応開始後の２分目と５分目の４０５ｎｍにおける吸光度差から、１分間当たりの吸光度変化を求めた。その結果を図２に示した。図２から明らかなように、ソルビトールに対する吸光度変化量は、チオＮＡＤ／ＮＡＤＨを補酵素とするサイクリング反応において良好な直線を示した。
【００１６】
【実施例３】
溶血サンプルの調製方法
〈操作〉
実験的に溶血サンプルを調製するために、ヘパリン採血したヒト血液３ｍＬをヘパリン加生理食塩水７ｍＬに混和した後、ソニケイションにより便宜的に可溶化した。可溶化液を１００，０００Ｇ、６０分間の遠心分離を行い、上清を溶血サンプルとして得た。
【００１７】
【実施例４】
溶血サンプルの測定
〈操作〉
実施例２の反応液１からソルビトールキナーゼを除いた反応液を調製し、実施例３の溶血サンプル３３μＬを添加し、３７℃にて反応を開始させた。５分後、１０分後、１５分後、２０分後と５分間隔で反応液２を０．５ｍＬ混合し、３７℃で第２反応を開始させた。反応開始後の２分目と５分目の４０５ｎｍにおける吸光度差から、１分間当たりの吸光度変化を求めた。その結果を図３に示した。図３から明らかなように、ソルビトールキナーゼが含有されていないのにチオＮＡＤ／ＮＡＤＨを補酵素とするサイクリング反応が起こっていることが明らかであり、血液成分として含有されるフルクトース−６−リン酸がサイクリング反応を引き起こしていることが明らかとなつた。さらには、５分間隔のインターバルで吸光度が徐々に増加していることから、フルクトース−６−リン酸を産生する反応が起きていることが明らかとなった。
【００１８】
【実施例５】
溶血サンプル中に存在するフルクトース−６−リン酸の消去反応
〈反応液３〉
０．０５  Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０１  Ｍ      ＡＴＰ
０．０１  Ｍ      塩化マグネシウム
０．０１  ％      トリトン  Ｘ−１００
５０ｕ／ｍＬ    ６−ホスホフルクトキナーゼ（ユニチカ社製製）
〈反応液２〉
０．１    Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０４  Ｍ      酸化型チオＮＡＤ
２．０  ｍＭ      還元型ＮＡＤ
６．０ｕ／ｍＬ    ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
０．０３  Ｍ      ＥＤＴＡ・２Ｎａ
〈操作〉
反応液３に溶血サンプル３３μＬを添加し、３７℃にて反応を開始させた。５分後、１０分後、１５分後、２０分後と５分間隔で反応液２を０．５ｍＬ混合し、３７℃で第２反応を開始させた。反応開始後の２分目と５分目の４０５ｎｍにおける吸光度差から、１分間当たりの吸光度変化を求めた。その結果を図４に示した。図４からチオＮＡＤ／ＮＡＤＨを補酵素とするサイクリング反応が低減していることが明らかとなり、血液成分として含有されていたフルクトース−６−リン酸が消去されたことが明らかとなった。しかし、５分間隔のインターバルで吸光度が相変わらず徐々に増加していることから、フルクトース−６−リン酸を産生する反応が起きていることが明らかとなった。
【００１９】
【実施例６】
溶血サンプル中に存在するフルクトース−６−リン酸産生反応の除去
〈反応液４〉
０．０５  Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０１  Ｍ      ＡＴＰ
０．０１  Ｍ      塩化マグネシウム
０．０１  ％      トリトン  Ｘ−１００
５０ｕ／ｍＬ    ６−ホスホフルクトキナーゼ
５０ｕ／ｍＬ    ホスホヘキソースイソメラーゼ（ユニチカ社製）
〈反応液２〉
０．１    Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０４  Ｍ      酸化型チオＮＡＤ
２．０  ｍＭ      還元型ＮＡＤ
６．０ｕ／ｍＬ    ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
０．０３  Ｍ      ＥＤＴＡ・２Ｎａ
〈操作〉
反応液４に溶血サンプル３３μＬを添加し、３７℃にて反応を開始させた。５分後、１０分後、１５分後、２０分後と５分間隔で反応液２を０．５ｍＬ混合し、３７℃で第２反応を開始させた。反応開始後の２分目と５分目の４０５ｎｍにおける吸光度差から、１分間当たりの吸光度変化を求めた。その結果を図５に示した。図５からチオＮＡＤ／ＮＡＤＨを補酵素とするサイクリング反応が激減していることが明らかとなり、血液成分として含有されていたフルクトース−６−リン酸が消去されたことが明らかとなった。また、５分間隔のインターバルで吸光度増加がないことから、フルクトース−６−リン酸を産生する反応がなくなっていることが明らかとなった。
【００２０】
【実施例７】
溶血サンプルの測定
〈反応液５〉
０．０５  Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０１  Ｍ      ＡＴＰ
０．０１  Ｍ      塩化マグネシウム
２００ｕ／ｍＬ    ソルビトールキナーゼ
０．０１  ％      トリトン  Ｘ−１００
５０ｕ／ｍＬ    ６−ホスホフルクトキナーゼ
５０ｕ／ｍＬ    ホスホヘキソースイソメラーゼ
〈反応液２〉
０．１    Ｍ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
０．０４  Ｍ      酸化型チオＮＡＤ
２．０  ｍＭ      還元型ＮＡＤ
６．０ｕ／ｍＬ    ソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
０．０３  Ｍ      ＥＤＴＡ・２Ｎａ
〈操作〉
反応液５に溶血サンプル３３μＬを添加し、３７℃にて反応を開始させた。５分後、反応液２を０．５ｍＬ混合し、３７℃で第２反応を開始させた。反応開始後の２分目と５分目の４０５ｎｍにおける吸光度差から、１分間当たりの吸光度変化を求めた。その結果を図６に示した。この結果から、本発明であるソルビトールキナーゼおよびソルビトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた高感度なソルビトール測定試薬中に、６−ホスホフルクトキナーゼとホスホヘキソースイソメラーゼを添加することで、少なくとも血液成分の影響を激減できることが明らかとなった。
【００２１】
【発明の効果】
前述のように、本発明は、酵素サイクリング反応を用いたソルビトールの高感度な反応試薬を提供し、さらには、血液成分の影響を解除した高性能な反応試薬を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図２】実施例２において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図３】実施例４において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図４】実施例５において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図５】実施例６において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図６】実施例７において求めた吸光度変化を示す図表である。
【図１】
0004392472.tif 000003
【図２】
0004392472.tif 000004
【図３】
0004392472.tif 000005
【図４】
0004392472.tif 000006
【図５】
0004392472.tif 000007
【図６】
0004392472.tif 000008