(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）によって表される繰り返し単位を含み、
【化１】
0004560036.tif 000011
Xは、C(O)OR1, C(O)SR1, C(O)NR1R2,及びVZからなる群より選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、炭素数１から１０のアルキル、及び炭素数６から１０のアリールからなる群より選択され、Vは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ１−、−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、および−Ｓ−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択される易動性リンカー基であり、Zは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（リシン）、PAMAMデンドリマー、オクタアミン・デンドリマー、及びヘキサデカアミン・デンドリマーからなる群より選択され、
Yは、-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, 及び -(CH2)3-NHC(O)-(CH2)6-C(O)NH-(CH2)3-からなる群より選択される、ポリマー。
【請求項２】
Zがポリ（エチレンイミン）である請求項１のポリマー。
【請求項３】
前記ポリ（エチレンイミン）が、２００から１００,０００ダルトンの範囲の分子量を有する請求項２のポリマー。
【請求項４】
Zがポリ（リシン）である請求項１のポリマー。
【請求項５】
前記ポリ（リシン）が、２００から５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する請求項４のポリマー。
【請求項６】
XがVZである請求項１のポリマー。
【請求項７】
Vが-C(O)NH-である請求項６のポリマー。
【請求項８】
式（II）によって表される繰り返し単位を更に含み、
【化２】
0004560036.tif 000012
Wは、真核細胞への遺伝子トランスフェクションの効率を高めることができる官能基、および細胞表面上で特異的な受容体を認識することができる官能基からなる群より選択される、請求項１のポリマー。
【請求項９】
Wが、真核細胞への遺伝子トランスフェクションの効率を高めることができる官能基、および細胞表面上で特異的な受容体を認識することができる官能基からなる群より選択される、請求項８のポリマー。
【請求項１０】
Wが、脂質、コレステロール、トランスフェリン、抗体、抗体フラグメント、ガラクトース、マンノース、リポタンパク質、リソソーム栄養剤（lysosomotrophic agent）、及び融合誘導因子（fusogenic agent）からなる群より選択される請求項８のポリマー。
【請求項１１】
XがVZであり、ZがWに結合するか、第2のエンハンサー及び第2のターゲッティング受容体からなる群より選択される物質に結合する請求項８のポリマー。
【請求項１２】
式（III）によって表されるジオールと、式（IV）によって表されるジビニルエーテルとを反応させることを含み、
【化３】
0004560036.tif 000013
X及びYは、請求項１に記載のものと同義である、請求項１のポリマーを製造する方法。
【請求項１３】
式H2NZによって表される化合物と、式（V）の繰り返し単位を含むポリマーとを反応させることを含み、
【化４】
0004560036.tif 000014
Zは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（リシン）、PAMAMデンドリマー、オクタアミン・デンドリマー、及びヘキサデカアミン・デンドリマーからなる群より選択され、
Yは、-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, 及び -(CH2)3-NHC(O)-(CH2)6-C(O)NH-(CH2)3-からなる群より選択される、請求項７のポリマーを製造する方法。
【請求項１４】
請求項６のポリマーとポリヌクレオチドとを含む複合体。
【請求項１５】
請求項６のポリマーとポリヌクレオチドとを混合することを含む、請求項１４の複合体を調製する方法。
【請求項１６】
前記混合が、請求項６のポリマーを含む溶液を、ポリヌクレオチドを含む第二の溶液に加えることによって行なわれる請求項１５の方法。
【請求項１７】
請求項６のポリマーにおけるVが-C(O)NH-である請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞を請求項１４の複合体と接触させることを含む、細胞をトランスフェクションする方法。
【請求項１９】
請求項６のポリマーにおけるVが-C(O)NH-である請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項６のポリマーにおけるZがポリ（エチレンイミン）である請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセタール繰り返し単位を含む生分解性ポリマーに関し、特に、酸に反応する生分解性ポリアセタール、その製造方法、及びそれをポリヌクレオチド・デリバリー用途に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫原性が低い、比較的大きなスケールでの製造に順応できる、生物学的な特性範囲を提供するために容易に変更することができるといった好ましい特性を持つ非ウイルス性ドラッグ・デリバリー・システムが求められている。Mulligan, R. C., “遺伝子治療の基礎科学（The basic science of gene therapy）” Science 260, 926-932 (1993); 及びLuo, D. & Saltzman, W. M. “合成DNAデリバリーシステム（Synthetic DNA delivery systems）” Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000)を参照。しかし、ポリ（リシン）やポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような非分解性カチオンポリマーは、かなりの細胞毒性を有している。Choksakulnimitr, S., Masuda, S., Tokuda, H., Takakura, Y. 及びHashida, M., “異なる細胞培養システムにおける高分子のインビトロ細胞毒性（In Vitro cytotoxicity of  macromolecules in different cell culture systems）” J. Control Release 34, 233-241 (1995); Brazeau, G. A., Attia, S., Poxon, S. & Hughes, J. A., “非ウイルス性遺伝子治療で使用されるカチオン高分子のインビトロ筋毒性（In Vitro Myotoxicity of Selected cationic macromolecules used in non-viral gene therapy）” Pharm. Res. 15, 680-684 (1998); 及びAhn, C.-H., Chae, S. Y., Bae, Y. H. & Kim, S. W. “プラスミドＤＮＡデリバリー用生分解性ポリ（エチレンイミン）” J. Control. Release 80, 273-282 (2002)を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞毒性を下げるために、分解性カチオンポリマーを開発する様々な努力がなされている。Ahn, C.-H., Chae, S. Y., Bae, Y. H. 及びKim, S. W., “プラスミドＤＮＡデリバリー用生分解性ポリ（エチレンイミン）” J. Control. Release 80, 273-282 (2002); Lynn, D. M. A., D. G.; Putman, D.; Langer, R., “合成トランスフェクションベクターの加速された発見: 平行合成及び分解性ポリマー・ライブラリーのスクリーニング（Accelerated Discovery of Synthetic Transfection Vectors: Parallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library）” J. Am. Chem. Soc. 123 (2001); Lim, Y. ほか, “生分解性ポリエステル, 非毒性遺伝子キャリアーとしてのポリ[α-(4-アミノブチル)-l-グリコール酸]（Biodegradable Polyester, Poly[α-(4-Aminobutyl)-l-Glycolic Acid]）” Pharmaceutical Research 17, 811-816 (2000); Lim, Y., Kim, S., Suh, H. 及びPark, J.-S., “高効率かつ非毒性の遺伝子デリバリーキャリアーとしての、生分解性かつエンドソーム分裂性のカチオン網状高分子（Biodegradable, Endosome Disruptive, and Cationic Network-type Polymer as a High Efficient and Non-toxic Gene Delivery Carrier）” Bioconjugate Chem. 13, 952-957 (2002); Lim, Y. K., S.; Lee, Y.; Lee, W.; Yang, T.; Lee, M.; Suh, H.; Park, J., “カチオン性高分岐型ポリ(アミノエステル): カチオン表面を有するＤＮＡ濃縮分子の新クラス、生分解性３次元構造、及びその内部の第三級アミン基（Cationic Hyperbranched Poly(amino ester):A Novel Class of DNA Condensing Molecule with Cationic Surface, Biodegradable Three Dimensional Structure, and Tertiary Amine Groups in the Interior,）” J. Am. Chem. Soc. 123, 2460-2461 (2001); 及びTuominen, J. ほか, “制御された堆肥化条件下の乳酸ベースポリマーの生分解及び環境毒性学的影響の評価（Biodegradation of Lactic Acid based Polymers under Controlled Composting Conditions and Evaluation of the Ecotoxicological Impact）” Biomacromolecules 3, 445-455 (2002)を参照。しかし、生理的な条件下、これらのカチオンポリマーは、塩基触媒による加水分解を通じての分解に影響され易い。
【０００４】
アセタール結合を含む、酸に反応するポリマーが報告されている。Tomlison, R. ほか, “ｐＨ依存分解を示すペンダント鎖機能化ポリアセタール：新規ポリマー治療の開発のためのプラットフォーム（Pendent Chain Functionalized Polyasetals that Display pH-Dependent Degradation: A Platform for the Development of Novel Polymer Therapeutics）” Macromolecules 35, 473-480 (2002); 及びMurthy, N., Thng, Y. X., Schuck, S., Xu, M. C. 及びFrechet, J. M. J., “蛋白質のカプセル化及び放出のための新戦略: 酸に変化し易いアセタール・クロスリンカーを有するヒドロゲル及びミクロゲル（A Novel Strategy for Encapsulation and Release of Proteins: Hydrogels and Microgels with Acid-Labile Acetal Cross-Linkers）” J. Am. Chem. Soc. 124, 12398-12399 (2002)を参照。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
好ましい態様では、式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマーが提供される。
【化５】
0004560036.tif 000002
ここで、Xは、C(O)OR1, C(O)SR1, C(O)NR1R2, 及びVZからなる群より選択され、R1及びR2はそれぞれ独立に、水素、炭素数１から１０のアルキル、及び炭素数６から１０のアリールからなる群より選択され、Vは、易動性リンカー基であり、Zは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（リシン）、PAMAMデンドリマー、オクタアミン・デンドリマー、及びヘキサデカアミン・デンドリマーからなる群より選択され、Yは、-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, 及び-(CH2)3-NHC(O)-(CH2)6-C(O)NH-(CH2)3-からなる群より選択される。
【０００６】
別の好ましい態様では、式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマーは、更に、式(II)によって表される繰り返し単位を含む。
【化６】
0004560036.tif 000003
ここで、Wは、エンハンサー及びターゲッティング受容体からなる群より選択される。
【０００７】
別の好ましい態様として、式（III）によって表されるジオールと、式（IV）によって表されるジビニルエーテルとを反応させる、式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマーを製造する方法が提供される。
【化７】
0004560036.tif 000004
ここで、X及びYは、上述したのと同義である。
【０００８】
別の好ましい態様として、式H2NZ によって表される化合物と、式(V)の繰り返し単位を含むポリマーとを反応させる、XがVZである式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマーを製造する方法が提供される。
【化８】
0004560036.tif 000005
ここで、Zは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（リシン）、PAMAMデンドリマー、オクタアミン・デンドリマー、及びヘキサデカアミン・デンドリマーからなる群より選択され、ここで、Yは、-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, 及び -(CH2)3-NHC(O)-(CH2)6-C(O)NH-(CH2)3-からなる群より選択される。
【０００９】
別の好ましい態様として、(a) XがVZである式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマー、及び(b)ポリヌクレオチドを含む複合体が提供される。別の好ましい態様として、(a) XがVZである式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマー、及び(b)ポリヌクレオチドを混合する、複合体を製造する方法が提供される。
【００１０】
別の好ましい態様として、細胞と複合体とを接触させることを含む、細胞をトランスフェクションする方法が提供される。前記複合体は、(a) XがVZである式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリマー、及び(b)ポリヌクレオチドを含む。
これら及び別の実施態様は、以下で詳細に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
好ましい実施形態は、ポリアセタール、ポリアセタールの製造方法、ポリアセタール及びポリヌクレオチドを含む複合体、そのような複合体の製造方法、及びそのような複合体を使用して細胞をトランスフェクションする方法に関する。
【００１２】
ポリアセタールは、アセタール（-O-CHR-O-）繰り返し単位を含むポリマーである。好ましいポリアセタールは、式（I）によって表される繰り返し単位を含む。
【化９】
0004560036.tif 000006
【００１３】
式（I）において、Xは、好ましくはC(O)OR1, C(O)SR1, C(O)NR1R2,及びVZからなる群より選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、炭素数１から１０のアルキル、及び炭素数６から１０のアリールからなる群より選択され、Vは、リンカー基である。本明細書において、「リンカー基」は、ある化学基と別の基とを結合する二機能性の化学基である。リンカー基は、アミドのような単一の二機能性化学基を含むことができ、あるいは、アミド−アミド、アミド−アルキル、アルキル−アミド、アミン−アミド、又はチオエーテル−アミドのような２つの化学基を含んでもよい。好ましいリンカー基の例として、-C(O)NH-, -C(O)NH-R1-C(O)NH-, -C(O)NH-R1-, -R1-C(O)NH-, -NH-R1-C(O)NH-, -S-R1-C(O)NHが挙げられ、R1は、水素、炭素数１から１０のアルキル、及び炭素数６から１０のアリールからなる群より選択される。
【００１４】
式(I)において、Zは、好ましくは、ポリ（エチレンイミン）（PEI）、ポリ（プロピレンイミン）（PPI）、ポリ（リシン）、ポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマー、オクタアミン・デンドリマー、及びヘキサデカアミン・デンドリマーからなる群より選択される。PEI及びPPIが使用される場合、好ましくは、約２００から約１００,０００ダントルの分子量を有する。ポリ（リシン）が使用される場合、好ましくは約２００から約５０,０００ダルトンの分子量を有する。式(I)では、Yは、好ましくは、-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-, 及び-(CH2)3-NHC(O)-(CH2)6-C(O)NH-(CH2)3-からなる群より選択される。
【００１５】
ポリアセタールはコポリマーであってもよく、従って、式(I)によって表される２以上の異なる繰り返し単位及び/又は他の繰り返し単位を含んでいてもよい。ここで使用される「式(I)のポリアセタール」あるいは「式(I)のポリマー」は、式(I)の繰り返し単位を本質的に含むホモポリマーおよび上述のコポリマーを含む。好ましい態様では、ポリアセタールは、式(II)の繰り返し単位を含む。
【化１０】
0004560036.tif 000007
【００１６】
式(II)では、Wは、好ましくは、エンハンサー及びターゲッティング受容体からなる群より選択される。本明細書で、「エンハンサー」とは、真核細胞への遺伝子トランスフェクションの効率を高めることができる官能基であり、「ターゲッティング受容体」とは、細胞表面上で特定の受容体を認識することができる官能基である。上述の定義は、相互に排他的ではなく、よって、Ｗは、エンハンサー及びターゲッティング受容体の両者であってもよい。好ましくは、Wは、脂質、コレステロール、トランスフェリン、抗体、抗体フラグメント、ガラクトース、マンノース、リポ蛋白質、リソソーム栄養剤（lysosomotrophic agent）、及び融合誘導因子（fusogenic agent）からなる群より選択される。ここで使用される「式(II)のポリアセタール」あるいは「式(II)のポリマー」は、式(II)の繰り返し単位を本質的に含むホモポリマーおよび式(II)の繰り返し単位を含むコポリマーを含む。好ましいポリアセタールは、式(I)の繰り返し単位及び式(II)の繰り返し単位を含む。
【００１７】
エンハンサー及び/又はターゲッティング受容体は、様々な方法でポリアセタールに付加されてもよい。例えば、式(II)で表されるようなポリアセタールに共有結合する方法、式(I)のＺにエンハンサー及び/又はターゲッティング受容体を結合させる方法、あるいはその両方の方法が挙げられる。例えば、好ましい態様において、ポリアセタールは、式(I)の繰り返し単位及び式(II)の繰り返し単位を含み、式(I)のＸはＶＺである。式(II)のＺ基は、Ｗに結合してもよく（この場合、Ｗによって表されるエンハンサー及び/又はターゲッティング受容体は、Ｚへの結合及び式IIによって表される繰り返し単位への共有結合付加を通して、少なくとも２箇所でポリアセタールに付加される)、及び/又は式(II)のＺ基は、第二のエンハンサー及び/又は第二のターゲッティング受容体に結合されてもよい。こうして、２以上のエンハンサー及び/又はターゲッティング受容体が１つのポリアセタールに付加されてもよい。
【００１８】
様々な方法を使用してポリアセタールを製造してもよい。好ましい方法は、式(III)によって表されるジオールと、式(IV)によって表されるジビニルエーテルとを反応させることを含む。
【化１１】
0004560036.tif 000008
【００１９】
式(III)及び(IV)において、X及びYは、上述したものと同義である。重合反応は、好ましくは、ｐ−トルエンスルホン酸(pTSA)のような酸触媒の存在下、テトラヒドロフランのような極性非プロトン性溶媒中で、式(III)によって表されるジオールと、式(IV)によって表されるジビニルエーテルとを混合することによって行なわれる。任意に、前記混合物は、１以上の他のジオール及び/又はジビニルエーテルを含んでもよい。好ましくは、前記混合物中のジビニルエーテルに対するジオールのモル比率は、およそ１対１である。但し、その正確な比率は、得られるポリマーの分子量を調節するために変更されてもよい。より高い分子量は、一般的にその比率を１対１に近くすると達成される。より低い分子量は、ジオールあるいはジビニルエーテルのいずれかをやや過剰に使用することによって達成してもよく、及び/又は単官能アルコール及び/又はビニルエーテルの少量を加えることによって達成してもよい。好ましくは、得られるポリアセタール(例えば、式(1)及び/又は(2)によって表される繰り返し単位を含むポリマーあるいはコポリマー)の分子量は、約1,000ダルトン以上であり、より好ましくは約1,000から約250,000ダルトンの範囲である。
【００２０】
式(I)によって表される繰り返し単位は２つの属を含む。１つは、Xが、C(O)OR1, C(O)SR1, 及びC(O)NR1R2からなる群より選択され、もう１つは、XがVZである。Xが、C(O)OR1, C(O)SR1,及びC(O)NR1R2からなる群より選択されるポリアセタールは、XがVZであるポリアセタールを製造するのに有用である。例えば、XがVZであり、Vが-C(O)NH-である式(I)によって表される繰り返し単位を含むポリアセタールは、好ましくは、式H2NZ によって表される化合物と、式(V)で表される、XがC(O)OR1である式(I)の繰り返し単位を含むポリアセタールとを反応させることによって製造される。
【化１２】
0004560036.tif 000009
【００２１】
式(V)において、R1及びYは、上述したのと同義である。式H2NZ によって表される化合物において、Zは、上述したのと同義である。式H2NZ によって表される化合物と式(V)のポリアセタールとの反応は、好ましくは、ジメチルホルムアミドのような極性溶媒中で行なわれる。式(V)のポリアセタールは、上述のジオールとジビニルエーテルの重合で説明した一般的な条件の下、Xが-C(O)OR1である式(III)のジオールと式(IV)のジビニルエーテルとの反応によって調製されてもよい。ここで使用される「式(V)のポリアセタール」あるいは「式(V)のポリマー」とは、本質的に式(V)の繰り返し単位のみからなるホモポリマーだけでなく、式(V)の繰り返し単位を含むコポリマーをも含む。
【００２２】
XがVZである式(I)のポリアセタールは、DNAやRNAのようなポリヌクレオチドと複合体を形成するということがわかった。従って、別の態様として、式(I)のポリアセタール及びポリヌクレオチドを含む複合体が提供される。ここで、式(I)のポリアセタールのXはVZであり、V及びZは、上述したのと同義である。好ましくは、Vは-C(O)NH-である。そのような複合体は、好ましくは、式(I)のポリアセタール(ここでXはVZである)及びポリヌクレオチドを混合することによって形成される。好ましくは、ポリアセタールを含む溶液をポリヌクレオチドを含む第二の溶液に添加することによって混合が行なわれる。図１に示されるように、複合体形成は、アガロースゲル電気泳動上のポリヌクレオチド−ポリアセタール・バンドの遅延を調べることによって検証してもよい。
【００２３】
式(I)のポリアセタール(ここでXはVZである)及びポリヌクレオチドを含む複合体は、細胞をトランスフェクションするのに有用であることがわかった。トランスフェクションは、好ましくは、細胞を複合体と接触させることによって行なわれる。以下の実施例は、図２に示されるように、ヒト胚腎臓細胞（「２９３細胞」）のトランスフェクションのためのポリアセタール−ＤＮＡ複合体の使用を示している。式(I)のポリマー(ここでXはVZである)及びポリヌクレオチドを含む好ましい複合体は、比較的毒性がないということがわかった。以下の実施例は、3-[4,5 ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)法を用いて評価した哺乳類細胞におけるポリアセタール−ＤＮＡ複合体の細胞毒性を明らかにしている(図６参照)。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例で使用された細胞株及び培地は、以下のように調製した。ヒト胚腎臓細胞（「２９３細胞」）を、１０％（ｖ/ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ），１００Ｕ/mlのペニシリン及び１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させ、３７℃、７．５％の二酸化炭素を含む１００％の湿度雰囲気で培養した。
【００２５】
以下の実施例で使用されたＧＦＰプラスミドは、以下のように調製した。プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰは、クロンテックから購入した。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡの発現は、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターによって制御し、その転写産物は、遺伝子発現エンハンサーであるニワトリβ−グロブリン・イントロンによって安定化させた。そのプラスミドベクターｐＣＭＶ−lucを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を哺乳類発現ベクターの同じバックボーンをもつｐＣＭＶ−０でクローニングすることによって構築した。ＤＨ５α大腸菌の中にそのプラスミドを展開し、Qiagenプラスミドマックスプレパレーションキットを用いて、その製造指示に従って精製した。精製されたプラスミドＤＮＡの量と質は、２６０及び２８０ｎｍで分光光度的測定および０．８％アガロースゲル電気泳動によって評価した。精製したプラスミドＤＮＡを、無菌の蒸留脱イオン水に再懸濁し、凍結した。精製されたプラスミドＤＮＡを、以下「ＧＦＰプラスミド」と言うことがある。細胞内の緑色蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡（オリンパス、フィルター５２０ｎｍ）で観察した。細胞は、１０倍対物レンズを使用して撮影した。トランスフェクトした培養物中のＧＦＰシグナルを有する細胞のパーセントは、３箇所の計数から決定した。
【００２６】
ジビニルエーテル4は、アジピン塩酸塩及びアミノプロピル・エーテルから調製した。ジオール5は、相当するカルボン酸のエステル化によって調製した。ポリアセタールの合成に用いた薬品及び試薬の全ては、アルドリッチケミカル社から購入した。
【００２７】
実施例１−４
ポリアセタール6-9は、図７に示される反応スキームに従って調製した。ポリアセタール7の合成を以下に解説する。ジ（エチレングリコール）ジビニルエーテル2（１．３９ｇ、８．７６mmol）及びビス−（２−ヒドロキシメチル）メチルプロピオン酸塩5（１．３０ｇ、８．７６mmol）を、室温でモレキュラーシーブ（１．０ｇ）と共にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍＬ）中に混ぜ、２０分間撹拌した。トルエンスルホン酸一水和物の触媒量を加え、４日間撹拌を続けた。その反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（１ｍＬ、５％水溶液）あるいはトリエチルアミン（１ｍＬ）で急冷した。水（１０ｍＬ）を加え、有機層をエチルアセテート（３×１０ｍＬ）で抽出した。その抽出物を混ぜ合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過して、ロータリーエバポレーターで濃縮した。その残渣を高真空下で乾燥し、オイルとしてポリアセタール7（２．６５ｇ、８．６５mmol、９８％）を得た。
【００２８】
実施例５−１１
ポリアセタール10-16を、図８に示される反応スキームに従って調製した。ポリアセタール10の合成を以下に解説する。ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ１８００）（３０ｇ、１６．７mmol）に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）中のポリアセタール7（０．５ｇ、１．６３mmol）溶液を加えた。更にＤＭＦ（１０ｍＬ）を加え、その混合物を４日間撹拌した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）を加え、沈殿を形成した。その沈殿をろ過し、ＴＨＦで洗浄し、その後高真空下で乾燥してポリアセタール10（２．２ｇ）を得た。
【００２９】
実施例１２
エンハンサーと結合したポリアセタール−ポリ（エチレンイミン）を以下のように調製した。
【化１３】
0004560036.tif 000010
【００３０】
ポリアセタール10（０．５５ｇ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５０ｍＬ）をガラスびん内で混ぜ合わせた。コレステリルクロロギ酸塩（１．０ｇ）及びトリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、その混合物を２０分間撹拌し、ろ過し、不溶性の残渣を取り除き、ジクロロメタン（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた固形残渣を高真空下で乾燥し、ポリアセタール17の１．３ｇを得た。ＧＦＰアッセイ（図５）によって示されるように、ポリアセタール17は、ポリ（エチレンイミン）制御より、２９３細胞のトランスフェクション試薬として効率がよいことがわかった。
【００３１】
実施例１３−２４
１２個のポリアセタール10サンプルを室温で、溶液（ｐＨ７．４、ｐＨ６．０及びｐＨ５．０）中で３時間、６時間、１２時間及び２４時間かけて分解した。これらの溶液を上述のＧＦＰアッセイ用２９３細胞のトランスフェクションに用いた。図３は、ポリアセタールがｐＨ７．４（例えば、生理的血液のｐＨ）でとても安定であったことを示している。図４は、ポリアセタールが２４時間以内にｐＨ５．０又は６．０（例えば、細胞内エンドソーム−リソソームのｐＨ）でほぼ完全に加水分解したことを示している。
【００３２】
実施例２５
ポリヌクレオチド−ポリアセタール複合体の遅延：  １０μｌＤＭＥＭ（血清及び抗生物質なし）中の様々な量のポリアセタール10及び12を、１０μｌＤＭＥＭ（血清及び抗生物質なし）中の０．２μｇＧＦＰプラスミドに、ボルテックスしながら滴下して加えた。得られた複合体を電気泳動前に１５分間室温に置いた。充填色素５μｌを各サンプルに加え、各サンプル１５μｌをウェル（well）ごとに充填した。その複合体を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．４の０．０４Ｍトリス−酢酸緩衝剤を用いて０．３％アガロースゲルで、１００Ｖ３０分間で電気泳動して分析した。その複合体は、ＵＶ照明によって可視化された。そのポリアセタールと複合体を形成したポリヌクレオチド（プラスミドＤＮＡ）はアガロースゲル中で遅延され、より大きな遅延は、図１に示されるように、ポリアセタールとポリヌクレオチドとの間のより強い結合を示している。
【００３３】
実施例２６
ポリアセタール10及び17を使用した生体外（イン  ビトロ）トランスフェクションを以下のように実行した。永久２９３細胞を、２４ウェルの組織培養プレート（２×１０５細胞/ウェル）に入れて、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭの中で一晩培養した。各ウェルに、ポリアセタール溶液（それぞれポリアセタールの異なる用量を含む）の３０μｌを、０．６μｇのプラスミドＤＮＡ、例えばｐＣＭＶ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡ又はｐＣＭＶ−lucを含む３０μｌＤＮＡ溶液に、ボルテックスしながら滴下して加えた。ボルテックスしながら滴下して加えることは、大変好ましいということがわかった。なぜなら、トランスフェクションの結果は、混合条件に依存するということがわかったからである。その混合されたＤＮＡとポリアセタール溶液は、室温で１５分間培養し、ＤＮＡ−ポリアセタール複合体を形成した。それから、ＤＮＡ−ポリアセタール複合体の６０μｌを、各ウェルに加え、細胞を２４時間培養した（３７℃、７．５％二酸化炭素）。その培養後、ＧＦＰシグナル及びショウジョウバエ  ルシフェラーゼ活性を以下に記載のようにして検出した。市販のトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（Ｌ２０００）を、製造会社によって提供されるプロトコールに従ってポジティブコントロールとして使用した。
【００３４】
実施例２７
ルシフェラーゼ活性を、製造会社の指示（ルシフェラーゼアッセイシステム、プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国）に従って、化学発光アッセイを使用して測定した。実施例２６で記述したトランスフェクションから約２４時間後に、その細胞をＰＢＳで２度洗浄し、その後、室温で１５分間、溶解緩衝液（１％TritonＸ−１００，１００ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭジチオトレイトール、１０％グリセロール、及び２ｍＭ EDTA ｐＨ７．８）で溶解した。それから、１０μｌの細胞溶解物を、照度計中、室温で、注入器を用いて５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混ぜ合わせた。発光を１０秒間３度測定し、ＲＬＵｓ（相対光単位）として表した。相対光単位（ＲＬＵ）を、各サンプルの蛋白質含有量で標準化し、ＢＳＡ蛋白質アッセイ（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）によって決定した。すべての実験は３度行なった。ポリアセタール10及びＬ２０００（ポジティブ制御）を使用して、ｐＣＭＶ−lucを用いた２９３細胞のトランスフェクションによって得られた結果を図２に示す。これらの結果は、これらポリアセタールのトランスフェクション効率が、最近知られている最も商業的に利用されているトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００）を用いて達成されたものに匹敵するということを示している。
【００３５】
実施例２８
哺乳類細胞におけるポリアセタール10、12及び15の細胞毒性を、3-[4,5- ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)法を用いて評価した。この方法では、９６ウェルのプレートに２９３細胞 (4×104 細胞/ウェル)を入れ、その細胞を２４時間培養した。実施例２６で記述したように調製した様々な量のポリアセタール−ＤＮＡ複合体を、３時間の間、その細胞に添加した。その培地を、その後に取り除き、新鮮な培地を加えた。更に４８時間培養した後、その培地を取り除き、１０μｌのＭＴＴ溶液（５．０ｍｇ/ｍｌ）を各ウェルに添加し、３時間培養した。それからその培地を取り除き、２００μｌのＤＭＳＯを加えホルマザン結晶を溶解した。その溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。細胞生存率を次の等式を用いて計算した。生存率（％）＝{サンプルの吸光度（５７０ｎｍ）/コントロールの吸光度（５７０ｎｍ）}×１００。すべての実験は３度行なった。図６に示される結果から、ポリアセタールは、リポフェクタミンより細胞に対する毒性が低かったことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ポリアセタールポリマー及びＤＮＡ分子マーカーを使用したヌクレオチド遅延アッセイの写真の複写を表す。前記アッセイは、コントロールＣ（ポリアセタールなし）及び分子マーカーＭと比較して、ポリヌクレオチドに対するポリアセタールの様々な割合（１６：１、８：１、４：１、及び２：１、重量/重量）で、ポリアセタール10と12とがポリヌクレオチドと複合体を形成したことを示している。
【図２】図２は、ポリアセタール10と市販のトランスフェクション試薬L2000（リポフェクタミン２０００、ポジティブコントロール）を使用して、プラスミドＤＮＡを有するヒト胚腎臓細胞（「２９３細胞」）のトランスフェクションについて蛋白質ｍｇあたりの相対光ユニット（ＲＬＵ）をプロットした棒グラフを示している。
【図３】図３は、ポリアセタール10と市販のカチオン性ポリマーであるポリ（エチレンイミン）−１８００（分子量１８００ダルトン、ネガティブコントロール）を使用して、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）シグナルの写真の複写を示す。その結果は、ポリアセタール10が、ポリ（エチレンイミン）−１８００より高いトランスフェクション効率を有することを示している。
【図４】図４は、24時間後と48時間後のｐＨ５．０とｐＨ６．０緩衝液での酸分解によって得られた２９３細胞用ＧＦＰシグナルの写真の複写を示す。その結果は、ポリアセタール10が、24時間以内にｐＨ５．０あるいはｐＨ６．０でほぼ完全に加水分解されたことを示している。
【図５】図５は、ポリアセタール17とポリ（エチレンイミン）−１８００（ネガティブ制御）を使用した２９３細胞用ＧＦＰシグナルの写真の複写を示す。その結果は、ポリアセタール17が、ポリ（エチレンイミン）−１８００（ネガティブ制御）より高いトランスフェクション効率を有することを示している。
【図６】図６は、２９３細胞の細胞生存能力（％）をプロットした棒グラフを示す。ポリアセタール15、12及び10は、このアッセイでは細胞毒性を示さない。
【図７】図７は、ポリアセタール6-9の合成のための好ましい反応スキームを示す。
【図８】図８は、ポリアセタール10-16の合成のための好ましい反応スキームを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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