(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（II）
【化１】
0004392812.tif 000005
で表されるラセミ体N−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルに、該エステル体の不斉加水分解反応を触媒するシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＭＲ−２０６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８４６）若しくはエセリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８３５）、又はその処理物を作用させることを含む、光学活性N−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明で得られる新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体は、光学活性医農薬合成中間体として様々な用途が期待される有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、類縁化合物である光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸の製造方法としてはラセミ体４−アミノ−２−メチル酪酸をフタルイミド化した後、キニンを用いて優先晶析する方法が公知である。（Ａｄａｍｓ  Ｒ．，Ｆｌｅｓ  Ｄ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８１，４９４６−４９５１（１９５９））しかしながら、精製には再結晶を繰り返す煩雑な操作が必要であり、回収率は１７〜２２％程度と低く、光学純度も明らかではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体及びその製造方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、ラセミ体Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸エステルに微生物、その処理物、または酵素を作用させることにより該エステルを不斉加水分解し、光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体が得られることを見いだし、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、一般式、
【化３】
0004392812.tif 000002
（式中、Ｘはアルコキシカルボニル基、Ｒは水素原子または炭素数１から６の直鎖ま若しくは分岐状のアルキル基、＊は不斉炭素を示す。）
で表される新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体である。
【０００６】
また、本発明は、一般式、
【化４】
0004392812.tif 000003
（式中、Ｘはアルコキシカルボニル基、Ｒは炭素数１から６の直鎖若しくは分岐状のアルキル基を示す。）
で表されるラセミ体エステルに該エステルの不斉加水分解反応を触媒する、微生物、その処理物、または酵素を作用させることを特徴とする上記新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体の製造方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）においてＸで表されるアルコキシカルボニル基としては、通常、アミノ基の保護に用いるものであり、酵素反応を阻害しないものであれば、特に制限無く使用可能である。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基及びベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０００８】
上記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）においてＲで表されるアルキル基としては,炭素数１から６の直鎖または分岐状のアルキル基であり、酵素反応の基質となるものであればよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基及びシクロヘキシル基等が挙げられる。
【０００９】
上記一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸エステルは、任意の方法で製造可能である。例えば、青酸とメタクリル酸メチルより３−シアノイソ酪酸メチルを得た後(特開平８−２９１１５７号公報参照)、アルカリ加水分解で３−シアノイソ酪酸を得る。得られた３−シアノイソ酪酸を適当な溶媒中で、例えば、パラジウム−カーボンなどの触媒存在下、中圧で接触還元を行えば４−アミノ−２−メチル酪酸が得られる。得られた４−アミノ−２−メチル酪酸を適当な溶媒中でアミノ基を保護し、常法に従いエステル化反応を行えば、酵素反応の基質であるラセミ体エステルが得られる。アミノ基の保護には、例えば、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート等を用いることもできる。エステル化は適当なアルコール、脱水剤と反応させればよい。
【００１０】
本発明に使用する微生物、その処理物、または酵素は、一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体エステルを不斉加水分解し、一般式（Ｉ）で表される光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体を与えるものであれば特に制限はない。微生物、植物又は動物由来の市販加水分解酵素（エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等）、各種保存菌株の微生物培養菌体及び自然界より新たに単離された微生物等が使用可能である。
【００１１】
不斉加水分解酵素を生産する微生物として、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エセリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物が挙げられる。バチルス属に属する微生物としては、バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  リケニフォルマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ）、バチルス  ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ）、アスペルギルス属に属する微生物としては、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  ソーユ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス  サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）、リゾプス属に属する微生物としては、リゾプス  ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス  デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）、ムコール属に属する微生物としては、ムコール  ジャポニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール  ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、フミコーラ属に属する微生物としては、フミコーラ  ラニュギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、具体的にはシュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＭＲ−２０６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８４６）、エセリキア属に属する微生物としてはエセリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、具体的にはエセリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８３５）等が挙げられる。尚、エセリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８３５）は、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＭＲ−２０６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８４６）由来のエステラーゼ遺伝子で形質転換された株である。
【００１２】
また、本発明に使用するエステル不斉加水分解酵素としては、市販の酵素を使用することも可能である。例えば、ＮＯＶＯ社製のアルカラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、リポラーゼ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ属由来）及びフラボザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来）、天野製薬社製のリパーゼＰＳ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ由来）、リパーゼＭ−１０（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来）、ニューラーゼＦ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属由来）及びリパーゼＡＹ（Ｃａｎｄｉｄａ属由来）、シグマ社製のリパーゼＶＩＩ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来）及びリパーゼＸＸＩＩＩ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）等が挙げられる。動物由来の酵素としては、シグマ社製のリパーゼＩＩ（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａ由来）、ブタやウシの膵臓由来のパンクレアチン、トリプシン及びＰＰＬ等が挙げられる。
【００１３】
本発明で使用する微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものを用いる。炭素源としては、例えばグルコース、シュクロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸等の有機酸類あるいはその塩、エタノール、グリセロール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、廃糖蜜、アミノ酸等の天然窒素源の他、各種無機・有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて使用される。微生物の加水分解能を向上させるため、培地に少量のエステルを加えることも有効である。培養は微生物が生育可能である温度、ｐＨで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行えばよい。例えば、ｐＨ４〜１０、温度２０〜５０℃の範囲で数時間〜数十時間培養する。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行っても良い。
【００１４】
本発明においては、培養して得られる培養液そのままか、あるいは培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる微生物菌体、もしくはその処理物を用いることもできる。処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、無細胞抽出物、無細胞抽出物からゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の分離操作により得られた粗酵素または精製酵素等が挙げられる。また、微生物菌体または酵素は、架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定化したり、イオン交換樹脂、珪藻土などの固体担体に物理的あるいは化学的に固定化して用いることができる。
【００１５】
本発明において一般式（ＩＩ）で表されるラセミ体エステルの不斉加水分解反応は、次のようにして行うことができる。すなわち、反応媒体に酵素反応基質であるラセミ体エステルを添加し、溶解または懸濁し、触媒となる微生物、その処理物、または酵素を加える。反応媒体としては、例えば、イオン交換水、緩衝液等が用いられる。反応液中の基質濃度は、０．１〜７０重量％の間で特に制限はないが、基質の溶解度、変換効率などを考慮すると５〜５０重量％で行うの好ましい。また、基質の溶解性を向上させるため、例えば、メタノール、エタノールなどの低級アルコールを系内に添加することも可能である。反応温度は酵素の至適温度と基質の安定性を考慮して、通常５〜７０℃、好ましくは１０〜５０℃で行えばよい。反応液のｐＨは、通常４．０〜１０．０であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。反応が進行するに従い、生成したカルボン酸によりｐＨが低下するので適当な中和剤を添加し、最適ｐＨを維持することが望ましい。
【００１６】
反応終了液より生成物の分離精製は、次のようにして行うことができる。中性付近で一般的な有機溶媒、例えば、酢酸エチル、ヘキサン、トルエン、ジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルムなどを用いて抽出操作を行い、未反応の基質を分離することができる。また、抽出残液に硫酸や塩酸等の強酸を加え、ｐＨを２．０程度に調整し、上記と同様の一般的な抽出操作を行うことにより、酵素反応生成物である光学活性Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸を抽出分離することができる。
【００１７】
本発明で得られる光学活性Ｎ−置換４−アミノ−２−メチル酪酸およびその対掌体エステルは、そのまま使用可能であるが、目的に応じて任意の手法で容易に脱保護が可能である。
【００１８】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものでは無い。
【００１９】
【実施例】
参考例１
ラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸エステルの製造：
特開平８−２９１１５７号、実施例１の方法で得られた３−シアノイソ酪酸メチル１００ｇを５００ｍｌの３Ｎ  ＮａＯＨに滴下し室温で一晩攪拌した。反応終了液に硫酸を滴下し、ｐＨを２．０に調整し、１／３量の酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機相を減圧濃縮し、８１．５ｇの３−シアノイソ酪酸を得た。得られた３−シアノイソ酪酸３８ｇを３５０ｍｌの酢酸に溶解し、１０％パラジウム−カーボンを５ｇ添加し、オートクレーブに仕込み、４０℃、水素圧１２kg/ｃｍ２で接触還元を行った。ほぼ理論量の水素が吸収された時点（約４時間後）で反応を終了し、触媒を濾別し、酢酸を減圧留去した。油状残分にイソプロパノールを添加し、冷却し、析出した結晶を回収し、３２．０ｇの白色パウダーを得た。ＮＭＲで構造を確認したところ、４−アミノ−２−メチル酪酸と確認された。
【００２０】
４−アミノ−２−メチル酪酸１０ｇを５０ｍｌの４Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、氷冷下クロロギ酸メチル９ｇを滴下した後、室温で数時間攪拌した。反応終了後、硫酸でｐＨを酸性とし、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、１２．３ｇのＮ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸を得た。これを常法によりエステル化し、１１．６ｇのラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルを得た。
【００２１】
実施例１
光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ２−メチル酪酸及びその対掌体エステルの製造：
エセリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＲ−２１０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８３５）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５０ｍｌに植菌し、３７℃、２０時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離により集菌し、イオン交換水で洗浄した後、全量を５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液に参考例１で得られたラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル５ｇを加え、３０℃にて２０時間反応させた。この間、反応液のｐＨは１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応のＮ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルを３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、２．０１ｇの残分を得た。このサンプルの物性値及び１Ｈ−ＮＭＲチャート（図１）を以下に示した。次いで抽出残水相のｐＨを希硫酸で２．０に調整し、酵素反応生成物である光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸を３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、１．７８ｇの残分を得た。このサンプルの物性値及び１Ｈ−ＮＭＲチャート（図２）を以下に示した。
【００２２】
（＋）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル＞  ＤＭＳＯ、内部標準ＴＭＳ（第１図）
ｄＨ  １．０７２〜１．０９７  （３Ｈ，ｄ，−ＣＨ３）
ｄＨ  １．４５９〜１．４９５  （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２）
ｄＨ  １．６９０〜１．７４６  （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２）
ｄＨ  ２．４３３〜２．４８９  （１Ｈ，ｑ，−ＣＨ）
ｄＨ  ２．９５３〜３．０１８  （２Ｈ，ｄｄ，−ＣＨ２）
ｄＨ  ３．５１７、３．６００  （６Ｈ，ｓ，−ＣＨ３）
ｄＨ  ７．０７２              （１Ｈ，ｓ，−ＮＨ）
＜比旋光度＞
［α］Ｄ２６＝＋２７．４８（ｃ＝２．２２、ＭｅＯＨ）
＜光学純度＞
９９．８％ｅ．ｅ．  （カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ，  移動相；ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１）
【００２３】
（−）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル＞  ＤＭＳＯ、内部標準ＴＭＳ（第２図）
ｄＨ  １．０６１〜１．０８６  （３Ｈ，ｄ，−ＣＨ３）
ｄＨ  １．４０２〜１．５０４  （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２）
ｄＨ  １．６７５〜１．７７８  （１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２）
ｄＨ  ２．３１２〜２．３８９  （１Ｈ，ｑ，−ＣＨ）
ｄＨ  ２．９７１〜３．０４５  （２Ｈ，ｄｄ，−ＣＨ２）
ｄＨ  ３．５２４              （３Ｈ，ｓ，−ＣＨ３）
ｄＨ  ７．０５０              （１Ｈ，ｓ，−ＮＨ）
ｄＨ  １２．０                （１Ｈ，ｂｒ，−ＯＨ）
＜比旋光度＞
［α］Ｄ２６＝−１５．０７  （ｃ＝３．４５、ＭｅＯＨ）
＜光学純度＞
９６．８％ｅ．ｅ．  （カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ，  移動相；ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１）
【００２４】
実施例２〜７
光学活性Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸及びその対掌体エステルの製造：
１ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に参考例１で得られたラセミ体Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチル１０ｍｌを加え、市販の酵素（液体の場合は５ｍｌ、粉末の場合は５ｍｇ）を加え、３０℃にて２０時間反応させた。得られた残存エステル及び酸画分の分析結果を表１に示した。なお、括弧内の（＋，−）は、サンプルの旋光性を示した。
【００２５】
【表１】
0004392812.tif 000004
【００２６】
【発明の効果】
新規光学活性４−アミノ−２−メチル酪酸誘導体は、医農薬合成中間体として有用であり、また本方法により高純度の光学活性体が製造可能である。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】  （＋）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸メチルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図２】  （−）−Ｎ−メトキシカルボニル−４−アミノ−２−メチル酪酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。
【図１】
0004392812.tif 000006
【図２】
0004392812.tif 000007