(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）と（２）の第１のRNA部分と第２のRNA部分が、UU配列を介して切断可能に連結し、生体内で（１）と（２）の第１のRNA部分と第２のRNA部分に切断され得るキメラRNA分子であって、ウイルスを抑制するキメラRNA分子：
（１）ウイルスRNAを標的配列としウイルスを抑制し得るsi RNAを形成し得る少なくとも１つのshRNA（ショートヘアピンRNA）部分もしくはmiRNA部分である第１のRNA部分；
（２）ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウイルスを抑制し得る少なくとも１つのデコイRNA部分である第２のRNA部分。
【請求項２】
標的とするウイルスRNAの変異及び欠損を遅延させ、かつウイルスを抑制するキメラRNA分子である、請求項１記載のキメラRNA分子。
【請求項３】
ウイルスがHIV-1、HIV-2、HCV、ガンおよびインフルエンザウイルスからなる群から選択される請求項１又は２に記載のキメラRNA分子。
【請求項４】
shRNA部分またはmiRNA部分がHIV-1のgag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、またはLTR領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする、HIV-1を抑制する請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラRNA分子。
【請求項５】
デコイRNA部分が、HIV-1のTAR領域と相同な配列を有しTatタンパク質と結合し得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラRNA分子。
【請求項６】
下記の２次構造を有する請求項５記載のキメラRNA分子。
0004536112.tif 000011
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラRNA分子の鋳型DNAを含み該キメラRNAを発現するベクター。
【請求項８】
ウイルスベクターである請求項７記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラRNA分子を含み、生体内で各RNA部分に切断されるウイルス感染症およびガンの予防または治療剤。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のベクターを含むウイルス感染症の予防または治療剤であって、生体内で各RNA部分が生成するウイルス感染症の予防または治療剤。
【請求項１１】
ウイルスの変異に基づくウイルスのRNAi耐性を阻止することができる請求項９または１０に記載のウイルス感染症またはガンの予防もしくは治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ、デコイＲＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡを利用したウイルス感染の抑制、ウイルス感染症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は種々の遺伝子機能を阻害するための強力なツールであることがわかっている（Ｃｏｇｏｎｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  Ｉｎｔ  Ｊ  １９９４，６５：２０５−２０９２−１４；Ｂａｕｃｏｍｂｅ，Ｄ．Ｃ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９６，３２：７９−８８；Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １９９８，９５：１０１７−１０２６；Ｎｇｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８，９５：１４６８７−１４６９２；Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５，１３９５９−１３９６４；Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９９９，２１４：２１１−２１４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ａｌｖａｒａｄｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，９６，５０４９−５０５４；Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０７：３１９−３２０；Ｗｉａｎｎｙ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００，２，７０−７５；Ｃｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００，９７，４９８５−４９９０；Ｙａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  ＣｅｌｌＢｉｏｌ  ２０００，２１，７８０７−７８１６；Ｓｖｏｂｏｄａ，Ｐ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｐ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒ．Ｍ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ＲＮＡｉｎｔｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．２０００，１２７，４１４７−４１５６）。ＲＮＡｉの使用は分化型の培養細胞にも拡がっている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１，４９４−４９８；Ｒｏｓｅｌ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００３，３１（１５），４４１７−４４２５）。ＲＮＡｉはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）により引き起こされる（Ｌｉｄａｒｄｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０７，２９７−３０７（２００１）；Ｓｉｊｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０７，４６５−４７６（２００１））。ＲＮＡｉが関与する機構のステップには５つのステップがあることがわかっている。最初のステップでは、ｄｓＲＮＡ（３０ｂｐより大きい）がダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素により切断されて１９〜２３ヌクレオチドのフラグメントを生成する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４０９，３６３−６；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００１，１５，２６５４−９；Ｋｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１，２９３，２２６９−７１）。これらの短い２重鎖ｓｉＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’オーバーハングという機能に不可欠な特殊な特性を有している（Ｅｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００１，１５，１８８−２００）。その結果、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼがこれらの短い２重鎖を認識しｓｉＲＮＡ２重鎖を２つの１重鎖ＲＮＡにすると推測されている（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００１，１０７，３０９−２１）。次いで、１重鎖の一つはＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる高分子タンパク質複合体（Ｅｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００１，１５，１８８−２００）に取り込まれ、ＲＩＳＣ中のいまだ同定されていないエンドヌクレアーゼ活性を有するコンポーネントによる相同的なＲＮＡ配列の切断を導くガイドとして働く（Ｅｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００１，１５，１８８−２００；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４０４，２９３−６）。最後に、ＲＩＳＣは切断されたＲＮＡから離れ再び切断を触媒するために再利用される。このＲＩＳＣの役割はサイレンシング効果にとって不可欠である。ＤＮＡ鋳型により発現されたｓｉＲＮＡも外来的に遺伝子導入されたｓｉＲＮＡと同じくらい効率的に遺伝子発現を抑制することが示されている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６，５５０−３；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１６，９４８−５８；Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２，２０，５０５−８；ＺｅｎｇＹ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２００２，９，１３２７−３３）。ＲＮＡｉは培養細胞において、いくつかの異なる病原性ウイルスの複製を効果的に抑制する。（非特許文献１から５を参照）。これらのウイルスとしては灰白髄炎ウイルス（Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）およびＨＩＶが挙げられる。ＨＩＶに関する報告において、特異的なｍＲＮＡが標的となりｓｉＲＮＡによるサイレンシングが達成されている。標的ＲＮＡとしては、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆならびに小さい制御性タンパク質であるＴａｔおよびＲｅｖが挙げられる。これらの報告はＲＮＡｉがウイルスＲＮＡだけではなく、ウイルス感染サイクルのインテグレーション段階の前後でゲノムＲＮＡをも効率的に標的とし得ることを示した（Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１，１，３４−４６：  Ｇｉｔｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１８，４３０−４３４：  Ｃｏｂｕｒｎ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００２，７６，９２２５−３１：  Ｊａｃｑｕｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２００２，４１８，４３５−８：  Ｎｏｖｉｎａ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００２，８，６８１−６）。動物モデルおよびヒトへの実際の応用において、ｓｉＲＮＡを効率的にデリバリーするために、レトロウイルス（Ｂｒｕ��ｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００２，２，２４３−７）、アデノウイルス（Ｘｉａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，２０，１００６−１０）およびレンチウイルス（Ｑｉｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３．１００，１８３−８）ベースの遺伝子治療用ベクターが構築され、種々の細胞や組織において、安定に実質的にｓｉＲＮＡを発現することができた。しかしながら、最近長期間の培養においてｓｉＲＮＡにより誘導される変異による耐性ウイルス株の出現が報告されている（Ａｔｚｅ  Ｔ．Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｖｉｏｌ．７８：２６０１−２６０５（２００４）：  Ｄａｎｉｅｌ  Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｖｉｏｌ．７７：１１５３１−１１５３５（２００３））。この現象は、ＨＩＶ−１治療応用へのｓｉＲＮＡの使用を踏みとどまらせると思われる。
一方、ウイルス増殖の抑制のために、デコイ型核酸医薬分子を用いることが研究されている。デコイは、その一例として、ウイルスゲノム上の転写因子結合部位と同じ配列を含む短い核酸であり、体内に投与すると転写因子がゲノムに結合することを阻害して遺伝子の働きを抑える。ウイルスの転写因子に対するデコイにより体内でのウイルス増殖を抑えることが可能である。例えば、ＨＩＶのＴａｔ転写増殖因子と結合するデコイ  ＲＮＡ（Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ５，３７１−３８８（２０００））やＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを抑制するデコイ  ＲＮＡ（Ｋ．Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７，３６８５−３６９４（２０００））等について報告されている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＮＡｉ医薬、デコイＲＮＡ医薬等のＲＮＡ医薬の少なくとも１つの医薬としての作用を発揮し得る複数の機能的ＲＮＡ部分を含むキメラＲＮＡならびに該キメラＲＮＡを含む医薬の提供を目的とする。
本発明者は、ＨＩＶ−１の遺伝子の変異により、ＨＩＶ−１ＲＮＡを標的としたｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−１の複製抑制効果が失われる現象について検討を行った。ｓｉＲＮＡ適用後、ＨＩＶ−１ＲＮＡに変異が生じ、ｓｉＲＮＡがＨＩＶ−１ＲＮＡを認識できなくなり、時間が経過するとｓｉＲＮＡによりＨＩＶ−１ＲＮＡを切断できなくなるものの、ＨＩＶ−１ＲＮＡに変異が生じる前には、ＨＩＶ−１の複製をかなり抑制し、ある程度のＨＩＶ−１複製抑制効果を発揮していることに鑑み、ＨＩＶ−１ＲＮＡに変異が生じた場合にも、変異の生じていない他のＲＮＡ領域を標的にしてＨＩＶ−１ＲＮＡの複製を抑制することにより、長期間にわたってＨＩＶ−１の複製を抑制し得ることを見出した。すなわち、従来から種々ＨＩＶ−１の遺伝子を標的した種々のＨＩＶ−１感染治療法が研究されていたが、それらがすべて一箇所の標的配列をターゲットとして、該標的配列を攻撃する１種類の分子を用いていたのに対して、複数の標的配列をターゲットとして、複数の攻撃分子を用いることにより、ＨＩＶ−１に変異が生じても、確実にＨＩＶ−１の増殖を抑制し得ることを見出した。
本発明者は、一例として、キメラＲＮＡ部分として発現される分割可能なＨＩＶ−１ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡとデコイＴＡＲ  ＲＮＡをコードする第二世代のアンチＨＩＶ  ｓｈＲＮＡが著しくＨＩＶ−１複製抑制効果を有することを見出した。デコイＴＡＲ  ＲＮＡは競合的にＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質と相互作用（タンパク質−ＲＮＡ相互作用）し、ＨＩＶ−１転写の５’ＬＴＲプロモーターからのトランス活性化現象のダウンレギュレートを引き起こし、相補的な阻害因子（ＣＩＦ）として働く。一方、ＨＩＶ−１ｖｉｆ−ｓｈＲＮＡは安定に遺伝子導入されたＪｕｒｋａｔ細胞中で発現され、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＨＩＶ−１起源の遺伝子の転写後阻害に働く。標的ウイルスの遺伝子型分析により、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡとデコイＴＡＲのキメラＲＮＡならびにｓｈＲＮＡ単独を発現する遺伝子導入Ｊｕｒｋａｔ細胞中で、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡのｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ標的部位において変異が生じていることがわかった。しかも、該変異は時間とともに多くなっていき、次々にウイルス変異株が生じていた。一方、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡのデコイＲＮＡ標的部位においては変異は生じていなかった。興味深いことに、ｓｉＲＮＡが関与する変異による耐性の獲得は対照ｖｉｆｓｈＲＮＡ単独およびランダムｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ変異デコイＴＡＲキメラＲＮＡ（ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡＲａｎ−ｍＴＡＲ）を発現する培養中でのみ観察された。２重ＨＩＶ−１アンチジーン分子を複合させて発現させ、細胞中で単一ＲＮＡ分子に分割させ、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用およびタンパク質−ＲＮＡ相互作用の両方を利用する新しいストラテジーはＨＩＶ−１遺伝子治療に有用である。
すなわち、本発明の態様は、以下のとおりである。
［１］  ウイルスＲＮＡを標的配列としウイルスを抑制し得るｓｉＲＮＡを形成し得る少なくとも１つのｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）部分もしくはｍｉＲＮＡ部分を含み、さらにウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウイルスを抑制し得る少なくとも１つのデコイＲＮＡ部分、ウイルスのライフサイクルに関与する遺伝子にハイブリダイズしウイルスを抑制し得る少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ部分、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのリボザイムからなるＲＮＡ部分、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分ならびにウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡ部分を含み、２つ以上の上記ＲＮＡ部分が切断可能に連結したキメラＲＮＡ分子。
［２］  ウイルスＲＮＡを標的配列としウイルスを抑制し得るｓｉＲＮＡを形成し得る少なくとも１つのｓｈＲＮＡ部分もしくはｍｉＲＮＡ部分ならびにウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウイルスを抑制し得る少なくとも１つのデコイＲＮＡ部分が切断可能に連結したキメラＲＮＡ分子。
［３］  ｓｈＲＮＡ部分またはｍｉＲＮＡ部分と他のＲＮＡ部分との間にＵＵ配列が存在する［１］または［２］のキメラＲＮＡ分子。
［４］  ウイルスがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ガンおよびインフルエンザウイルスからなる群から選択される［１］〜［３］のいずれかのキメラＲＮＡ分子。
［５］  ｓｈＲＮＡ部分、ｍｉＲＮＡ部分、アンチセンスＲＮＡ部分、リボザイムからなるＲＮＡ部分、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分またはＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分がＨＩＶ−１のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはＬＴＲ領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする、ＨＩＶ−１を抑制する［１］のキメラＲＮＡ分子。
［６］  ｓｈＲＮＡ部分またはｍｉＲＮＡ部分がＨＩＶ−１のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはＬＴＲ領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする、ＨＩＶ−１を抑制する［２］のキメラＲＮＡ分子。
［７］  デコイＲＮＡ部分が、ＨＩＶ−１のＴＡＲ領域と相同な配列を有しＴａｔタンパク質と結合し得る、［５］または［６］のキメラＲＮＡ分子。
［８］  下記の２次構造を有する［７］のキメラＲＮＡ分子。
0004536112.tif 000002
［９］  ［１］〜［８］のいずれかのキメラＲＮＡ分子の鋳型ＤＮＡを含みキメラＲＮＡを発現するベクター。
［１０］  ウイルスベクターである［９］のベクター。
［１１］  ［１］〜［８］のいずれかのキメラＲＮＡ分子を含み、生体内で各ＲＮＡ部分に切断されるウイルス感染症およびガンの予防または治療剤。
［１２］  ［９］または［１０］のベクターを含むウイルス感染症の予防または治療剤であって、生体内で各ＲＮＡ部分が生成するウイルス感染症の予防または治療剤。
［１３］  ウイルスの変異に基づくウイルスのＲＮＡｉ耐性を阻止することができる［１１］または［１２］のウイルス感染症およびガンの予防または治療剤。
［１４］  ウイルスＲＮＡを標的配列としウイルスを抑制し得るｓｉＲＮＡを形成し得る少なくとも１つのｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡならびにウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウイルスを抑制し得る少なくとも１つのデコイＲＮＡを含むウイルス感染症の予防または治療剤。
［１５］  ウイルスＲＮＡを標的配列としウイルスを抑制し得るｓｉＲＮＡを形成し得るｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡがＨＩＶ−１のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはＬＴＲ領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする［１４］のウイルス感染症の予防または治療剤。
［１６］  デコイＲＮＡ部分が、ＨＩＶ−１のＴＡＲ領域と相同な配列を有しＴａｔタンパク質と結合し得る、［１４］または［１５］のウイルス感染症の予防または治療剤。
［１７］  ウイルスの変異に基づくウイルスのＲＮＡｉ耐性を阻止することができる［１５］または「１６］のウイルス感染症およびガンの予防または治療剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０５１６０２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、第二世代ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築を示す図である。
図１Ｂは、レンチウイルスベースのベクターの構築を示す図である。
図２Ａは、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェアにより分析されたｖｉｆ−ＴＡＲキメラＲＮＡの２次ＲＮＡ構造を示す図であり、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡの３’末端とＴＡＲ  ＲＮＡの５’末端の間にＵＵ単一鎖切断部位がある。
図２Ｂは、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す写真である。
図２Ｃは、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞中の発現ベクターｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す写真である。
図２Ｄは、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞中に存在するダイサーを示す写真である。
図２Ｅは、キメラＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの切断を示す図である。
図２Ｆは、キメラＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断を示す写真である。
図３Ａは、ＨＩＶ−１抗ウイルス効果を示す図である。
図３Ｂは、ＨＩＶ−１レポーター遺伝子発現のダウンモジュレーションを示す写真である。
図３Ｃは、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲによるＪｕｒｋａｔにおけるＨＩＶ−１複製の長期抑制を示す図である。
図３Ｄは、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲによるＲＢＭＣｓにおけるＨＩＶ−１複製の長期抑制を示す図である。
図３Ｅは、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲによるＨ９細胞におけるＨＩＶ−１複製の長期抑制を示す図である。
図３Ｆは、Ｊｕｒｋａｔ細胞における遺伝子型分析の結果を示す図である。
図３Ｇは、ＰＢＭＣｓにおける遺伝子型分析の結果を示す図である。
図４は、本発明のキメラＲＮＡのＨＩＶ−１への作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のキメラＲＮＡは、少なくとも２つの機能的ＲＮＡ部分を含み、ＲＮＡ部分はＲＮＡｉ機構を介したＲＮＡｉ医薬としての作用、デコイ機構を介したデコイ型核酸（ＲＮＡ）医薬としての作用、アンチセンスＲＮＡ医薬としての作用、リボザイムＲＮＡ医薬としての作用、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ医薬としての作用およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ医薬としての作用の少なくとも１つの医薬としての作用を発揮する。好ましくは、２つ以上のＲＮＡ部分のうちの一つのＲＮＡ部分はＲＮＡｉ機構を介したＲＮＡｉ医薬としての作用を発揮し、他のＲＮＡ部分はデコイ機構を介したデコイ型核酸（ＲＮＡ）医薬、アンチセンスＲＮＡ医薬、リボザイムＲＮＡｉ医薬、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ医薬およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ医薬の少なくとも１つの医薬としての作用を発揮する。
本発明のキメラＲＮＡは、ウイルスの抑制に用いることができる。ここで、ウイルスの抑制とはウイルスの複製、増殖を抑制し、ウイルスが生存できなくすることをいう。ウイルス感染症の治療のために、従来からウイルス複製を抑制するために、ウイルスの複製機構に関与する遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸やリボザイムを用いることが研究されていた。しかしながら、ＨＩＶ等のＲＮＡウイルスにおいて、ウイルス遺伝子に高頻度で変異が生じ得る。従って、ウイルスの変異により、特定の遺伝子配列を標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸やリボザイムのウイルス抑制効果が消失してしまう。例えば、ＨＩＶ−１のｖｉｆ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを投与した場合、数週間でＨＩＶ−１遺伝子に変異が生じ、徐々に変異が増大し、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果は減少していく。本発明のキメラＲＮＡは、ウイルスを抑制するために攻撃するウイルスのライフサイクルに関与した遺伝子に変異が生じたとしても、変異していない遺伝子を同時に攻撃することにより、ウイルスが攻撃からエスケープするのを阻止し、効率よく確実にウイルスを抑制することができる。ここでウイルスのライフサイクルに関与した遺伝子とは、ウイルスが複製あるいは増殖するのに必要な遺伝子をいい、ウイルスの構造遺伝子、アクセサリー遺伝子、転写調節因子をコードする遺伝子等が含まれる。なお、本発明において、ウイルスのｓｉＲＮＡ標的配列に変異が生じてｓｉＲＮＡの攻撃を逃れることをｓｉＲＮＡ耐性を獲得するといい、アンチセンス核酸標的配列に変異が生じてアンチセンス核酸の攻撃を逃れることをアンチセンス核酸耐性を獲得する変異という。他の核酸医薬に対しても同様である。本発明のキメラＲＮＡは、ウイルスに変異が生じたとしても、ウイルスの核酸医薬に対する耐性獲得を阻止することができる。
本発明のキメラＲＮＡによる複製を抑制するウイルスは限定されずＤＮＡウイルスもＲＮＡウイルスも対象となり得るが、変異により核酸医薬に対する耐性を獲得する１本鎖ＲＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス等のＲＮＡウイルスが望ましい。このようなウイルスとして、レトロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、テトラウイルス科、ノダウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、フィロウイルス科、ラプドウイルス科、パラミクソウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科等の各科に属するウイルスが挙げられる。具体的には、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ヒトスプマウイルス、風疹ウイルス、シンドビスウイルス、黄熱ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ラッサウイルス、ＳＡＲＳウイルス、コロナウイルス、ムンプスウイルス、ＲＳウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、テング熱ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス等が挙げられる。
また、本発明のキメラＲＮＡは、ウイルスを抑制することによりウイルス感染が原因となるがんの予防、治療にも用いることができる。ウイルス感染が原因となるがんとして、以下のがんが例示できる。子宮頸がん（ヒトパピローマウイルス１６型、１８型（ＨＰＶ−１６，１８））、バーキットリンパ腫（ＥＢウイルス（ＥＢＶ））、成人Ｔ細胞白血病（ヒトＴリンパ球好性ウイルス）、肝がん（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、カポジ肉腫（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））。
このような作用を発揮するために本発明のキメラＲＮＡは、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）部分もしくはｍｉＲＮＡ部分、少なくとも１つのデコイＲＮＡ部分、少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ部分、少なくとも１つのリボザイムからなるＲＮＡ部分、少なくとも１つのｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分および少なくとも１つのＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡ部分を含む。好ましくは、本発明のキメラＲＮＡは、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）部分もしくはｍｉＲＮＡ部分を含み、さらに少なくとも１つのデコイＲＮＡ部分、少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ部分、少なくとも１つのリボザイムからなるＲＮＡ部分、少なくとも１つのｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分および少なくとも１つのＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡ部分を含む。本発明において、キメラＲＮＡが２種類のＲＮＡ部分からなる場合、デュアルタイプＲＮＡと呼ぶこともあり、３種類以上のＲＮＡ部分からなる場合、マルチタイプＲＮＡと呼ぶことがある。また、本発明のキメラＲＡＮを含む医薬をキメラＲＮＡ医薬またはデュアルタイプＲＮＡ医薬という。本発明において、ＲＮＡ部分は、ウイルスの複製に関与する遺伝子と実質的に同一な配列またはウイルス複製に関与する遺伝子との相補性が高くハイブリダイズし得る配列を有するＲＮＡをいう。キメラＲＮＡは、特定の配列を有し、ＲＮＡｉ医薬、デコイ医薬、アンチセンスＲＮＡ医薬、リボザイム医薬、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳまたはＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ医薬としての機能を発揮するＲＮＡ配列の少なくとも２つのＲＮＡ配列が連結した構造を有する。連結したＲＮＡ配列は異なるＲＮＡ配列であるが、連結したＲＮＡ配列の医薬としての機能の組合せは、任意の組合せでよく、例えば連結するＲＮＡ部分が２種類の場合は、ＲＮＡｉとＲＮＡｉ、デコイＲＮＡとデコイＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡ、リボザイムとリボザイム、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳとｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ、ＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ、ＲＮＡｉとデコイＲＮＡ、ＲＮＡｉとアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉとリボザイム、ＲＮＡｉとｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ、ＲＮＡｉとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ、デコイＲＮＡとアンチセンスＲＮＡ、デコイＲＮＡとリボザイム、デコイＲＮＡとｔＲＮａｓｅＺＬ−ＥＧＳ、デコイＲＮＡとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ、アンチセンスＲＮＡとリボザイム、アンチセンスＲＮＡとｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ、アンチセンスＲＮＡとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ、リボザイムとｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ、リボザイムとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳおよびｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳとＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳが挙げられる。また、３種類以上のＲＮＡ配列が連結していてもよく、３種類のＲＮＡ配列が連結する場合、上記のＲＮＡ医薬を発揮するＲＮＡ部分の任意の組合せでよい。好ましくは、ＲＮＡｉ医薬としての作用を発揮するＲＮＡ部分が必ず含まれている。本発明のキメラＲＮＡに含まれるｓｈＲＮＡ部分もしくはｍ���ＲＮＡ部分、デコイＲＮＡ部分、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムからなるＲＮＡ部分、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分は、生体内で酵素等の切断手段により切断し得る。従って、本発明のキメラＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ部分もしくはｍｉＲＮＡ部分、デコイＲＮＡ部分、アンチセンスＲＮＡ部分、リボザイムからなるＲＮＡ部分、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分および／またはＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分が切断可能に連結されたキメラＲＮＡである。ＲＮＡｉと他のＲＮＡ部分、特にＲＮＡｉとデコイＲＮＡの組合せが好ましい。これは、ＲＮＡｉ機構によりウイルスを抑制しようとした場合、ウイルスに変異が生じ、ウイルスがＲＮＡｉ耐性を獲得してしまうからである。デコイＲＮＡ機構は、ウイルスの変異によっても効果を失わないので、最初にＲＮＡｉ機構で、多くのウイルスを攻撃し、次いで変異が生じても、デコイＲＮＡ機構により変異の生じたウイルスをさらに攻撃できるように上記組合せが好ましい。
ＲＮＡｉ医薬とは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）により特定の配列を有する標的ｍＲＮＡを切断し、そのｍＲＮＡに対応する遺伝子の発現を抑制し得る医薬である。ＲＮＡｉにおいては、特定の標的ｍＲＮＡと実質的に同一な配列を有するセンス鎖と該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）がガイドＲＮＡとしてターゲット配列を認識し、ターゲットｍＲＮＡを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。ｓｉＲＮＡは細胞内または生体内でダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によりプロセッシングを受けて２重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）より形成される。従って、本発明のキメラＲＮＡは、特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形成し得るキメラＲＮＡである。特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを生成し得るキメラＲＮＡのｓｉＲＮＡを形成し得る部分はショートヘアピン構造を有しているＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡは、２本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有する。２本鎖構造は、１本のＲＮＡ鎖中にセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される。ショートヘアピンＲＮＡは、細胞内または生体内でプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡが産生される。５’側には、三リン酸（ｐｐｐ）が結合していてもよい。また、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＵＵが挙げられる。なお、本発明において、オーバーハングとは、ｓｈＲＮＡの一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。２本鎖部分は、ＲＮＡ干渉によりノックダウンしようとする標的遺伝子の配列またはノンコーディング領域に含まれる特定の標的配列にハイブリダイズし得る配列を有するＲＮＡ鎖（センス鎖）および該配列に相補的なＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が相補的に結合した構造を有する。
本発明のｓｈＲＮＡにおいて、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端がループ（ヘアピンループ配列）を介して連結されている。ヘアピンループ配列は限定されないが、５〜１２塩基からなるＵＵで始まる配列、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号１９）が挙げられる。そのほかのループ配列としては、Ｌｅｅ  ＮＳ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５００−５０５、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１６，９４８−９５８、Ｓｕｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，５５１５−５５２０、Ｐａｕｌ  ＣＰ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５０５−５０８、ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７等に記載の配列からなるループを採用することができる。
本発明のキメラＲＮＡのｓｈＲＮＡ部分の標的配列はウイルスの複製に関与する遺伝子の一部配列である。本発明のｓｈＲＮＡの標的遺伝子またはノンコーディング領域の特定の標的配列の塩基数は、限定されず、１５〜５００塩基の範囲で選択される。好ましくは１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５もしくは１５〜３０塩基、さらに好ましくは２０〜３５塩基、さらに好ましくは１９〜３０塩基、特に好ましくは１９〜２９塩基もしくは２８塩基である。標的遺伝子またはノンコーディング領域中の標的配列は、例えば標的遺伝子により適宜発現抑制効果の大きい部分を選択すればよい。本発明のｓｈＲＮＡと標的配列は、同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、本発明のｓｈＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよいが、ミスマッチにより遺伝子抑制効果は減少する。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のｓｈＲＮＡを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｈＲＮＡを試薬としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件あるいは高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２〜１６時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。また、本発明のｓｈＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列は、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８もしくは９９％以上の配列相同性を有する。
本発明のキメラＲＮＡのｓｈＲＮＡ部分が標的とするウイルス遺伝子は、ウイルスの複製に関連する遺伝子ならば限定されず、該遺伝子の一部配列を標的とすることができる。例えば、ＨＩＶ−１ウイルスの場合、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）、５’非翻訳領域、スプライス供与−受容部位、プライマー結合部位、３’非翻訳領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕまたはｖｐｘ領域よりなる群から選択される。これらの領域の配列の一部をセンス鎖としてｓｈＲＮＡを設計すればよい。これらの配列は公知であり、公知の配列情報から適宜一部配列を選択すればよい。また、ＨＣＶウイルスの場合、構造蛋白質（コア蛋白質；Ｃ、外被蛋白質；Ｅ１、Ｅ２）ならびに非構造蛋白質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）の各領域の配列の一部をセンス鎖としてｓｈＲＮＡを設計すればよい。これらの配列は公知であり、公知の配列情報から適宜一部配列を選択すればよい。
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）とは、１８〜２５塩基の１本鎖ＲＮＡであり、７０塩基前後の２本鎖ＲＮＡ領域を含むｍｉＲＮＡ前駆体からダイサーによってプロセシングされる。ｍｉＲＮＡもｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡｉにより標的配列を含む遺伝子の発現を抑制する。本発明のキメラＲＮＡにおいてｍｉＲＮＡは、１８〜２５塩基の１本鎖ＲＮＡとして含まれていてもよく、また７０塩基前後の２本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ前駆体）として含まれていてもよい。本発明のおいては、いずれの場合もｍｉＲＮＡ部分という。キメラＲＮＡに７０塩基前後の２本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ前駆体）として含まれている場合、ダイサーにより１８〜２５塩基の１本鎖ＲＮＡが生じ標的配列を含む遺伝子の発現を抑制する。ｍｉＲＮＡ部分が含む標的配列は、ｓｉＲＮＡの場合と同様である。
デコイ核酸型（ＲＮＡ）医薬（おとり型核酸医薬）とは、目的の標的遺伝子と結合し目的の遺伝子の発現を阻止し得る医薬である。例えば、目的の転写調節因子と結合し遺伝子の転写を阻害し得る。本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分は、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合し、該遺伝子の発現を阻害する。ここで、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質とはウイルスの転写調節因子タンパク質やウイルスの複製や増殖に必要な酵素等が挙げられる。
例えば、本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分は、転写調節因子が認識結合する領域と類似の１次構造および２次構造を有する。例えば、ＨＩＶ−１遺伝子の発現は、細胞性因子と、ＨＩＶ−１のＬＴＲに特定の調節要素を有するウイルスのトランス活性化因子タンパク質Ｔａｔとの相互作用によって調節される。ＨＩＶ−１の調節タンパク質Ｔａｔは、トランス活性化応答領域（ＴＡＲ）と呼ばれる、５９ヌクレオチドＬＴＲ領域の調節要素の１つと結合する。ＴＡＲは安定したヘアピン構造を形成し、Ｔａｔの結合を可能とする。また、ＨＩＶ−１にはＴａｔのほかに、ＲｅｖやＮｅｆが転写調節因子として作用し、Ｒｅｖタンパク質はＰＲＥ領域に結合する。Ｒｅｖのデコイについては、例えばＤｉｎｇ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００２  Ｆｅｂ  ０１；７：ａ１５−２８、Ｋｏｈｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｊｕｌ  １；９４（１）：３６８−７１、Ａｋｋｉｎａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２３（３Ａ）：１９９７−２００５に詳述されており、これらの文献に基づいて設計することができる。この場合、本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分は、ＴＡＲ領域またはＰＲＥ領域と類似の立体構造を有しており、従って１次および２次構造も類似している。具体的には、ＴＡＲ領域の配列またはＰＲＥ領域の配列と実質的に同一、すなわち相同な配列を有しているＲＮＡである。すなわち、本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分とＴＡＲ領域またはＰＲＥ領域とがハイブリダイズする限り１または複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、生体内の条件である。本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分とＴＡＲ領域またはＰＲＥ領域の配列は、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８もしくは９９％以上の配列相同性を有する。また、本発明のキメラＲＮＡ部分は、ループ−ステム構造を有していることが望ましく、ループ−ステム構造とは、一本鎖のＲＮＡがループとステムを形成した構造をいう。ＴＡＲ領域に類似した構造を有する本発明のデコイＲＮＡ部分の配列として、ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＵＣ  ＵＧＡ  ＧＣＣ  ＵＧＧ  ＧＡＧ  ＣＵＣ  ＵＣＵ  ＧＧＣ  ＵＵＣ  ＣＵＵ  ＵＵＵ  ＧＡＡ  ＵＵＣ  Ｇ（配列番号１）が挙げられ、該配列に対して１個から数個のミスマッチがあるＲＮＡもＴａｔタンパク質と結合する限り用いることができる。
また、ＨＣＶの複製を抑制する場合の本発明のキメラＲＮＡのデコイＲＮＡ部分として、ＮＳ３プロテアーゼやＮＳ３ヘリカーゼに結合するＲＮＡが挙げられる。例えば、特開２００２−３４５４７５号公開公報を参考に設計することができる。
本発明のデコイＲＮＡ部分は、特定のタンパク質に結合し得るＲＮＡであり、アプタマーＲＮＡ部分ともいう。
アンチセンス医薬とは、目的の標的遺伝子に相補的でありハイブリダイズする配列を持つＤＮＡまたはＲＮＡであり、その遺伝子の発現を抑止する医薬である。本発明キメラＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ部分は、目的の標的遺伝子の標的配列との相補的な配列であり、ウイルスの複製に関与する遺伝子の領域の配列に相補的な配列である。アンチセンスＲＮＡ部分は、ウイルス複製に関与する遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合し、翻訳を阻害し、遺伝子の発現を抑制する。例えば、ＨＩＶ−１ウイルスの場合、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）、５’非翻訳領域、スプライス供与−受容部位、プライマー結合部位、３’非翻訳領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕまたはｖｐｘ領域よりなる群から選択される。これらの領域の配列の一部に相補的なアンチセンスＲＮＡを設計すればよい。また、ＨＣＶウイルスの場合、構造蛋白質（コア蛋白質；Ｃ、外被蛋白質；Ｅ１、Ｅ２）ならびに非構造蛋白質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）の各領域の配列の一部に相補的なアンチセンスＲＮＡを設計すればよい。該ＲＮＡは、長さが１０から４００ヌクレオチドであり、好ましくは長さが２５０以下のヌクレオチド、さらに好ましくは長さが１００以下のヌクレオチド、さらに好ましくは長さが５０以下のヌクレオチド、特に好ましくは長さが１２〜２８の間のヌクレオチドである。アンチセンスＲＮＡ部位は適宜ループ構造を有していてもよい。
リボザイムとは、核酸を切断する活性を有するＲＮＡをいう。リボザイムとしてはハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、ヒトデルタ型肝炎ウイル由来のリボザイム等があり、本発明においてはいずれのリボザイムからなるＲＮＡ部分をキメラＲＮＡに含ませることができる。リボザイムも標的配列を有しており、公知の方法によりリボザイムＲＮＡ部分を設計することができる。リボザイムからなるＲＮＡ部分（リボザイムＲＮＡ部分）は、ウイルス複製に関与する遺伝子のｍＲＮＡを認識し切断し、遺伝子の発現を抑制する。例えば、ＨＩＶ−１ウイルスの場合、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）、５’非翻訳領域、スプライス供与−受容部位、プライマー結合部位、３’非翻訳領域、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーセ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕまたはｖｐｘ領域よりなる群から選択される。
ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳおよびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳとは、リボザイムと同様に核酸を切断する活性を有するＲＮＡをいい、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１  ２３５−２４３やＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４（２００４）４９４１−４９４４等の記載に基づいて設計できる。ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳおよびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳもリボザイムと同様に、ウイルス複製に関与する遺伝子のｍＲＮＡを認識し切断し、遺伝子の発現を抑制する。
本発明において、ＲＮＡｉ医薬、デコイ型医薬、アンチセンス医薬、リボザイム医薬、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ医薬、ＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ医薬いずれも、遺伝子の発現を抑制することから、これらの医薬をアンチジーン医薬と呼ぶことがある。すなわち、本発明のキメラＲＮＡは複数のアンチジーンを含みアンチジーン医薬として作用し得る。また、従来にない遺伝子医薬であることから、第二世代アンチジーン医薬と呼ぶこともある。
本発明のキメラＲＮＡにおいて、上記ｓｈＲＮＡ部分もしくはｍｉＲＮＡ部分、デコイＲＮＡ部分、アンチセンスＲＮＡ部分、リボザイムからなるＲＮＡ部分、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分は、連結した形態で化学合成や、プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。この際、ＤＮＡ配列には、適宜ターミネーター等を含ませる。ターミネーター配列として例えば、ＴＴＴＴＴ配列等を用いればよい。プロモーターとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する場合、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられ、ベクターに本発明のキメラＲＮＡのテンプレートＤＮＡを遺伝子導入し、該ベクターを生体内に投与して生体内でキメラＲＮＡを合成する場合、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩ系プロモーターやｔＲＮＡプロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、ｐＢＡｓｉベクター、ｐＳＵＰＥＲベクター等を用いればよく、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。ベクターへの本発明のキメラＲＮＡの発現可能な状態での組み込みは、公知の方法で行うことができる。本発明のキメラＲＮＡがｓｈＲＮＡ部分を含む場合、ｓｈＲＮＡ部分と他のＲＮＡ部分とは、生体内のダイサーの作用により切断される。ダイサーに認識され切断される配列はｓｈＲＮＡ部分の３’オーバーハング部位に存在するＵＵであり、従ってｓｈＲＮＡ部分と他のＲＮＡ部分の間にＵＵ配列を含ませればよい。この結果、ベクターから各ＲＮＡ部分を含むキメラＲＮＡが１分子として発現され、生体内のダイサー等の切断手段により書く部分に切断され、ｓｈＲＮＡ部分またはｍｉＲＮＡ部分からは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが形成され、デコイＲＮＡ部分からはデコイＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ部分からはアンチセンスＲＮＡが、リボザイムからなるＲＮＡ部分からはリボザイムが、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分からはｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳが、ＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分からはＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳが生じ、それぞれの機能を発揮する。
本発明のキメラＲＮＡは、遺伝子抑制のための医薬として用いることができ、特にウイルスの複製を抑制することから、ウイルス抑制剤、ウイルス感染症の予防、治療薬、ウイルス感染が原因となるがんの予防、治療薬として用いることができる。
本発明のキメラＲＮＡの導入方法としては、被験体が細胞や組織の場合、細胞や組織と同時に培養することにより導入することができる。その他、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。被験体が動物個体の場合、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することができる。また、特定の部位に投与する場合、ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位にデリバリーしてもよい。ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があり、投与しようとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。ドラッグデリバリーシステムとしては、例えば、キャリアとしてリポソーム、エマルジョン、ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。投与は、医薬的に許容され得る希釈剤またはキャリアと混合して行うことが望ましい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。導入するキメラＲＮＡの量は、予防、治療しようとする疾患の種類、重篤度、被検体の年齢、体重等により適宜決定することができるが、疾患部の細胞１個当たり少なくとも、１コピーのキメラＲＮＡが導入されるような量が好ましい。キメラＲＮＡを投与する場合、ＲＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇ程度を１日１回から数回投与すればよい。また、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる場合、ベクターＤＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇ程度を投与すればよく、１日１回から数回投与すればよい。
例えば、本発明のキメラＲＮＡがｓｈＲＮＡ部分もしくはｍｉＲＮＡ部分とデコイＲＮＡ部分からなる場合、キメラＲＮＡまたはキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを投与した場合、生体内でｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとデコイＲＮＡが生成する。投与当初は、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡがウイルス遺伝子の発現を抑制し、ウイルスの複製を抑制する。しかしながら、投与から数週間でウイルス遺伝子のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ標的配列に変異が生じ、時間と共に変異が増加し、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡが標的配列を認識できなくなり、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡの効果はなくなる。この場合でも、デコイＲＮＡは、ウイルスの変異と関係なく、ウイルスの転写調節因子と結合することにより、ウイルスの複製を抑制することができるので、ｓｉＲＮＡが効果を失った後でも、デコイＲＮＡの作用によりウイルスの複製を抑制することができる。
また、本発明のｓｈＲＮＡ部分もしくはｍｉＲＮＡ部分とデコイＲＮＡ部分からなるキメラＲＮＡまたはキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを投与した場合、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを単独で投与した場合に、ウイルスの変異速度が遅くなる減少が観察される。すなわち、本発明のキメラＲＮＡまたはキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを投与した場合、ウイルスの変異速度を遅くできるという効果もある。
さらに、本発明のキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを投与した場合、細胞の核内でキメラＲＮＡが生成されたのち、エクスポーチンの作用で細胞質に輸送され、細胞質で良好に機能を発揮するという効果もある。
本発明は上記キメラＲＮＡを被験体に投与し、被験体内でのウイルス複製を抑制し、ウイルス感染症を予防する方法または治療する方法をも包含する。さらに、本発明は上記キメラＲＮＡのウイルス複製抑制剤、ウイルス感染症予防剤またはウイルス感染症治療剤の製造への使用をも包含する。
図２Ａに本発明のキメラＲＮＡの一例を示す。図２Ａに示す例は、ＨＩＶ−１複製を抑制するＲＮＡｉ医薬としての作用およびデコイＲＮＡとしての作用を有するｓｈＲＮＡ部分およびデコイＲＮＡ部分からなるキメラＲＮＡである。配列番号２に配列を示す。ｓｈＲＮＡ部分は、ＨＩＶ−１のｖｉｆ遺伝子の発現を抑制し、デコイＲＮＡ部分は、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質に結合し、ＴＡＲ領域の転写を抑制する。ＨＩＶ−１において、ｖｉｆ遺伝子部分は、変異が起こりやすく、ｖｉｆ遺伝子を標的遺伝子としたＲＮＡｉ医薬単独では、経時的に効果を失う。しかしながら、本発明のキメラ医薬は、デコイＲＮＡをも含むので、ｖｉｆ遺伝子に変異が生じ、ｓｈＲＮＡ部分がｖｉｆ遺伝子の発現を抑制できなくなった後でも、ＴＡＲ領域の転写を抑制することにより、ＨＩＶ−１の複製を抑制しえる。従って、長期間にわたって、ＨＩＶ−１の複製を抑制し得るので、効率的かつ確実なＨＩＶ−１感染の予防または治療薬として用いることができる。本発明のキメラＲＮＡは、キメラＲＮＡとして化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写系を用いて製造し、予防または治療を必要とする被験体に投与して芋よいし、レンチウイルス等のウイルスベクターにキメラＲＮＡを発現しえるように鋳型ＤＮＡを導入し、該ベクターを被験体に投与してもよい。後者のようにベクターを用いた場合、被験体体内で長期間にわたって本発明のキメラＲＮＡが合成されるので、ＨＩＶ−１複製抑制の効果が持続する。図４に本発明の図２ＡのキメラＲＮＡがどのようにしてＨＩＶ−１複製を抑制するかを示す。
また、図２の配列を有するキメラＲＮＡとハイブリダイズする限り１または数個、すなわち、１〜３個、２個もしくは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、生体内の条件である。本発明のキメラＲＮＡは図２のキメラＲＮＡと９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８もしくは９９％以上の配列相同性を有するＲＮＡも含まれる。
さらに、本発明は、ＲＮＡｉ医薬として作用するｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとデコイＲＮＡ医薬として作用するデコイＲＮＡを別々に含む医薬組成物をも包含する。該医薬組成物において、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとデコイＲＮＡは連結してキメラＲＮＡを形成しておらず、それぞれ単独で存在する。該医薬組成物はウイルス複製抑制剤、ウイルス感染症予防剤またはウイルス感染症治療剤として用いることができる。さらに、本発明は上記のｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとデコイＲＮＡを被験体に同時にまたは前後して投与することを含む被験体内でのウイルス複製を抑制し、ウイルス感染症を予防する方法または治療する方法をも包含する。この場合、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを先に投与して、デコイＲＮＡを数日から数週間後に投与してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本実施例においては、各実験は以下に記載の方法で行った。
細胞培養
ＨｅＬａ  ＣＤ４＋、２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ９およびＭＴ−４細胞は１０％（ｖ／ｖ）熱非動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）またはＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）からなる完全培地で培養した。すべての培養は３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。
人末梢血リンパ球（ＰＢＭＣｓ）
血液分離用試験管、リューコセップ（ファルコン社）にＦａｉｃｏｌを入れ鮮血をＦａｉｃｏｌ：鮮血＝１：３になるようにする。１５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、赤血球と白血球を分離した。白血球の部分を５０ｍｌ遠心管に移し倍量のＰＢＳを入れ１５００ｒｐｍで５分遠心分離した。この操作をもう一度繰り返し、１．０Ｘ１０６／ｍｌになるように１０％ＲＰＭＩを加えた。最後に、１μｍｏｌ／ｍｌになるようにＰＨＡを加えて２〜３日培養し幼若化させた。
Ｕ６発現プラスミドおよびレンチウイルスベースのベクターの構築
発現プラスミドは公知の方法により構築した。２つの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして化学的に合成したヘアピンｓｉＲＮＡ配列を等モル量で混合し、９５℃で５分間加熱処理し、アニーリングバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ／１００ｍＭ  Ｎａｃｌ）中で徐々に冷却した。得られた２重鎖をエタノール沈殿し、Ｕ６プロモーター（ＬｅｅＮ．ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，２０，５００−５）上流のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位に連結し、以下のベクターを作製した。
Ｕ６−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲベクター：ＨＩＶ−１  ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡとデコイＴＡＲの両方を、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を含むｄｓＲＮＡセンス配列（５’−ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡＧＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧ−３’、配列番号３）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  Ａ  ＡＡ  Ａ  ＡＧ  ＧＡＡ  Ｇ  ＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＡＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’、配列番号４）としてコードしている。
Ｕ６−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡベクター：ＨＩＶ−１ｖｉｆセンスフラグメント配列（５’−ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ−３’、配列番号５）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’、配列番号６）をコードしている。
Ｕ６−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−Ｒａｎ  ＲＮＡベクター：ランダムｖｉｆセンス配列（５’−ＣＧＧ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ−３’、配列番号７）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  Ｔ−３’、配列番号８）をコードしている。
Ｕ６−ＴＡＲ  ＲＮＡベクター：ＨＩＶ−１  ＴＡＲセンス配列（５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  Ｇ−３’、配列番号９）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣ−３’、配列番号１０）をコードしている。
Ｕ６−ｍＴＡＲ３１−３４  ＲＮＡベクター：変異ＴＡＲループセンス配列（５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  Ｇ−３’、配列番号１１）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣ−３’、配列番号１２）をコードしている。
Ｕ６−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−Ｒａｎ−ｍＴＡＲベクター：ランダムｖｉｆおよび変異ＴＡＲセンス配列（５’−ＣＧＧ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡ  Ｔ  ＴＣＧ−３’、配列番号１３）およびアンチセンス配列（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ−３’、配列番号１４）をコードしている。
レンチウイルスベクターは以下のようにして構築した。Ｕ６プロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位およびインサートフラグメントの下流のＥｃｏＲＩクローニング部位を消化し、レンチウイルスベクター（ＣＳ−ＣＤＦ−ＣＧ−ＰＲＥ）のＥｃｏ  ＲＩ部位にクローニングし、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ、ＣＳ−ＴＡＲ、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ、ＣＳ−ｖｉｆ  Ｒａｎ−ＭＴＡＲおよびコントロールトランスファーベクターを構築した。
ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析
ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞（５×１０５細胞）を６０ｍｍディッシュに播いた。２４時間後、培地を抗生物質を含まない新鮮な培地に交換し、製造者のプロトコールに従い、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにより最適化されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて３μｇのベクターＤＮＡでトランスフェクトした。７２時間後、ベクターでトランスフェクトした細胞およびトランスフェクトしていないＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞からのトータルＲＮＡをトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて抽出した。次にＲＮＡ  ＰＣＲ  ｈｉｇｈ−ｐｌｕｓｋｉｔ（東洋紡社製）を使用し、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞内因性のダイサーの存在を検出するためにダイサーの上流プライマー（ヌクレオチド１−２４、フォワードプライマーＦ−（５’−ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＴＣＣ−３’、配列番号１５））および下流（ヌクレオチド４３５−４５９、リバースプライマーＲ−（５’−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ−３’、配列番号１６））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。内部コントロールとして、ヒトコントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡをＧＡＤＰＨ−Ｆ（ヌクレオチド２３０−２５４）および下流のＧＡＤＰＨ−Ｒ（ヌクレオチド４２２−４６６）プライマーを用いて増幅した。すべての抽出ＲＮＡ産物をＲＮａｓｅを含まない２μｇのＤＮａｓｅ  Ｉを用いて３７℃で３０分間処理した。この際、ＤＮＡのコンタミンをチェックするために抽出ｖｉｆ−ＴＡＲ  ＲＮＡを用いたｎｏｎ−ＲＴ−ＰＣＲも行った。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を分画し、２％アガロースゲルを用いた電気泳動により分析した。
ノーザンブロット分析
一過性でトランスフェクトしたＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞５×１０５細胞から２４時間後にトータルＲＮＡを抽出し、１レーンにつき３０μｇのＲＮＡを２０％のポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動の後、ＲＮＡのバンドをＨｙｂｏｎｄ−ＮＴＭナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写した。Ｖｉｆ−ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてバンドを検出した。ハイブリダイゼーションは３７℃で行い、２×ＳＳＰＥを用い得３９℃で洗浄し、次いでオートトラジオグラフィーに曝す前に１×ＳＳＰＥを用いて４１℃で一度洗浄した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのダイサー切断アッセイ
ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  ＴＯＰＯ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ  プロモーターから転写した精製ｖｉｆ−ＴＡＲ  ｄｓＲＮＡ（６０μｇ）を、製造業者のプロトコール（ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｄｉｃｅｒ  ＲＮＡｉキット・マニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従って切断した（反応容積３００μｌ）。すなわち、ダイシング反応物を３７℃で２０時間インキュベートし、得られたダイシング産物を２０％のポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）上で分析した。Ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲキメラＲＮＡ基質が本当に細胞中で切断されるかを確認するために、ＨｅＬａＣＤ４＋細胞を３μｇのベクターＤＮＡでトランスフェクトし、トータルＲＮＡをトリゾール試薬を用いてトランスフェクト２４時間後に抽出した。対照として、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＤＮＡをＴ７ポリメラーゼを用いてＲＮＡに転写した。トランスフェクトしたものとＴ７で転写したＲＮＡの両方を２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で分画しＨｙｂｏｎｄ−ＮＴＭナイロン膜に転写しノーザンブロット分析を行った。
細胞中での標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションおよびＨＩＶ−１の複製の抑制
２μｇのベクターＤＮＡおよび０．２μｇのＨＩＶ−１  ｐＮＬＥと共に同時トランスフェクトしたＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を７２時間培養した後に、トリゾール試薬を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ＨＩＶ−１  ｖｉｆ  ウイルスｍＲＮＡおよびＴＡＲ  ｍＲＮＡの検出が可能なプライマーセットを用いてＲＮＡ含量を調べた。回収した細胞を含まない培養上清中のＨＩＶ−１ｇａｇ  ２４抗原産生レベルを、完全自動化ＥＬＩＳＡシステム（ＣＬＥＩＡ社）により測定した（Ｌｅｅ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，２０，５００−５．）。
ＨＩＶ−１複製の用量依存的な抑制
ＨＩＶ−１複製の抑制についての用量依存性範囲を決定するために、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞３×１０５細胞を０．１、１および３μｇのベクターＤＮＡとＨＩＶ  １ｐＮＬＥのＤＮＡ  ０．２μｇで同時トランスフェクトした。細胞を含まない培養上清を回収し、ウイルス複製のインデックスとして細胞外のＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４抗原産生レベルを測定した。
２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウム沈殿トランスフェクション
レンチウイルスベクターを製造するために、１５μｇのトランスファーベクターカセットＤＮＡ、ｇａｇ−ｐｏｌ（１５μｇ）をコードするヘルパー構築物ならびにｔａｔ、ｒｅｖおよびＶＳＶ−Ｇそれぞれ５μｇとともにリン酸カルシウム沈殿トランスフェクト法で２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトした（Ａｎｎｅ−Ｌｙｓｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０，（１４）：６５−６９）。トランスフェクト後７２時間で、培養上清を回収し、０．４５μｍフィルタディスクによりろ過し、オーバーナイトでの６，０００ｇの超遠心により１００倍に濃縮した。得られたウィルスペレットを、無血清無抗生物質ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、用時まで−８０℃で保存した。ウイルス力価を決定するために、５×１０５細胞の２９３Ｔ細胞に調製したウイルスストックを用いて遺伝子導入し、７２時間の培養の後でフローサイトメーター分析によりＧＦＰ陽性細胞をカウントした（Ａｎｎｅ−Ｌｙｓｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，６５−６９（２００２））。
Ｊｕｒｋａｔ細胞の遺伝子導入
Ｊｕｒｋａｔ細胞に遺伝子導入するため、３×１０５細胞を１５ｍＬの遠心チューブに１ｍＬの培養用培地とともに、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよび対照レンチウイルスベクター２０ＭＯＩおよび８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で播いた。８００ｇで１時間遠心した後に、細胞を２４ウェル培養プレートに移し、２４時後、ウイルス感染の前に培養用培地を換えた。
ＨＩＶ−１によるチャレンジおよび長期の培養アッセイ
遺伝子導入の２４時間後、１×１０６のＪｕｒｋａｔ細胞を０．０１ＭＯＩのＨＩＶ−１ＮＬ４−３で感染させた。オーバーナイトでインキュベートした後に、細胞を３回無血清培地を用いて洗浄し、Ｒ１０（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で培養した。同じインターバルで培養体積の半量を回収し、同体積の培養用培地で交換した。回収した培養物を遠心し、細胞を含まない培地をＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４抗原分析に用い、細胞ペレットは細胞生存率試験、ＧＦＰ発現およびＲＮＡ抽出に用いた。
ＨＩＶ  １ＮＬ４−３のＶｉｆ  ＲＮＡ標的領域の遺伝子配列分析
ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞を含まない培養上清からウイルスＲＮＡを単離した。５μＬのウイルスＲＮＡを、Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐ逆転写酵素（クローンテック社製）、それぞれ１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、１×第１鎖バッファー（クローンテック社製）、２００ｎｇのランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と１０ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と混合し、逆転写酵素反応に用いた。逆転写は４２℃で１時間行い、次いで、７０℃で１５分間逆転写酵素の熱不活化を行った。次に、２μｌのｃＤＮＡを１×Ｑｉａｇｅｎ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌのセンスプライマーｖｉｆ  Ｆ：（５’−ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＡＴ−３’、配列番号１７）およびアンチセンスプライマーｖｉｆＲ：（５’−ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ−３’、配列番号１８）、１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を含むＰＣＲ混合物４８μｌに添加した。ＰＣＲは、グラジェントＰＣＲサーマル・サイクラー（ＡＳＴＥＣ社製）を用い９５℃１分間、９５℃１５秒間３５サイクル、５８℃３０秒間、および７２℃３０秒間、および７２℃５分間の条件で行なった。ＰＣＲ産物を分画し、１％のｓｅａｋｅｍゲル上で分析し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。ヌクレオチドサイクルシクエンスは、Ｄｙｅ標識した化合物を用いて行った。
本実施例によって、以下の結果が得られた。
Ｕ６プラスミドとＣＳレンチウイルスベクターについてベクター設計、標的部位および構造を図１ＡおよびＢに示す。図１Ａは、第二世代ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築を示す図であり、ＨＩＶ−１ゲノムを示すとともにｔａｔタンパク質に対するデコイＴＡＲ  ＲＮＡ標的およびｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ標的位置を表す５’ＬＴＲを拡大して示す。図１Ｂは、ヒトＵ６プロモーターで転写されるｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよびターミネーターシグナル配列を有する対照発現カセットを示す図である。レンチウイルスベースの発現カセットはＵ６プロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位およびＵ６ベクターからのターミネーター配列の下流のＥｃｏＲＩクローニング部位を消化することにより作られ、次いでＣＳ−ＣＤＦ−ＣＧ−ＰＲＥ発現カセット中のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされレンチウイルスベクターが作られる。全ての構築物は標準的な分子生物学的技術によって製造し、配列はヌクレオチドシークエンシングにより決定した。Ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  キメラ分子のＲＮＡ二次構造をＧＥＮＥＴＹＸソフトウェアを用いて分析し（図２Ａ）、製造業者のプロトコールに従って、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞（５×１０５）中でのＵ６  ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよび対照ｍＲＮＡの発現を測定した。すなわち、３μＬのＤＮＡを４７μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、ＤＮＡ複合体形成を最適化した。ＨＩＶ−１アンチジーンｍＲＮＡの発現がＨＩＶ−１遺伝子ｍＲＮＡの分解または細胞のタンパク質相互作用に不可欠なので、ＨＩＶ−１アンチジーンｍＲＮＡの発現のトランスフェクト効率を高めた。ｖｉｆ−ＴＡＲ  ｍＲＮＡもＰＣＲにより検出し、ノーザンブロット分析により細胞内局在を決定し（図２Ｂ）、すべてのベクターの発現の完全なプロファイルを得た（図２Ｃ）。図２Ｂは、第２世代ＨＩＶ−１ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ（ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  キメラ  ＲＮＡ）の細胞内局在を示す。細胞はｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ構築物でトランスフェクトされた。核および細胞質ＲＮＡから抽出されたトランスフェクト２４時間後のＲＴ−ＰＣＲ産物はキメラＲＮＡがおそらくトランスポート因子であるエクスポーチンの助けにより核よりも細胞質に局在していることを示している。図２Ｃは、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞中の発現ベクターｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。細胞は種々のベクター構築物でトランスフェクトされ、細胞におけるｍＲＮＡ発現効率が調べられた。
ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  分子は核よりも細胞質中に強く局在していた。これにより、生物学的機能をどこで発揮するかを決定することができる。
ＲＮＡｉ機構は細胞中のダイサーと呼ばれる内因性のＲＮＡａｓｅ  ＩＩＩ様酵素の活性に強く関連しているので、トランスフェクトしたＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞における内因性のダイサーの発現を特異的なダイサープライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより調べた。すなわち、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡにプロセシングされ、細胞中でＲＮＡｉ効果とデコイＲＮＡ  ＴＡＲ効果の両方を発揮するかどうかの証拠を確立するために行った。興味深いことに、ダイサーの高いレベルの発現が細胞中で観察された（図２Ｄ）。図２ＤはＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞中に存在するダイサーを示す。細胞中のトータル  ＲＮＡはＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞から回収され、特異的ダイサー検出プライマーを用いて増幅された。これは一過性にトランスフェクトされた細胞および感染した安定な発現細胞の両方のウイルスに対して効くデュアルタイプの抗ＨＩＶ−１効果の原因となる。
ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞においてＵ６  ｖｉｆ−ＴＡＲ  ｍＲＮＡ分子のダイサーによる切断を確認するために、Ｕ６  ｖｉｆ−ＴＡＲ  ＤＮＡをトランスフェクトするか、あるいは内部対照サンプルとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼにより転写し、トランスフェクト２４時間後に、得られた切断産物を２０％ポリアクリルアミドゲル上で分画しノーザンブロット分析を行った。その結果、分子がｖｉｆ  ｓｉＲＮＡおよびデコイ  ＴＡＲ  ＲＮＡコンポーネントに切断されることがわかった（図２Ｅ）。図２Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの切断を示す。キメラＲＮＡの細胞内プロセッシングを確認するためのＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞のトランスフェクション７２時間後に抽出されたｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。各レーンは以下を示している。
レーン１：エンドヌクレアーゼおよびダイサー効果の非存在下においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼに転写されたｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＤＮＡ  Ｉ、レーン２および３：ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞中で発現されたｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよびＴＡＲ  ＲＮＡを示す。ヒト対照遺伝子Ｇ３ＰＤＨを同時にインプットＲＮＡの標準化のために流した。レーン２におけるｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよびＴＡＲ  ＲＮＡバンドの両方の検出は細胞におけるキメラＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの切断を示している。レーン３のＴＡＲ  ＲＮＡは、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ基質の切断されたＴＡＲ  ＲＮＡコンポーネントの移動をチェックするための対照である。
レーン１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写された対照合成オリゴヌクレオチドであり、内在性ダイサーは非存在である。レーン２は、内在性ダイサーを発現するトランスフェクト細胞からトランスフェクト２４時間後に抽出されたｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ基質を示す。残りの切断されていないｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ｍＲＮＡと同時にＴＡＲ  ＲＮＡコンポーネントを検出した。これは、細胞内でのｉｎ  ｖｉｖｏの切断を示し。レーン３はｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  キメラ  ＲＮＡの切断されたＴＡＲ  ＲＮＡ  コンポーネントのための内部対照マーカーとしてのトランスフェクトしたＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞から抽出した発現されたＴＡＲ  ｍＲＮＡを示している。ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ分子の高い切断アフィニティーのさらなる証拠として、基質を転写しヒトリコンビナントダイサーを含むダイサー反応混合液に添加し室温で２０時間インキュベートし、ノーザンブロット分析を行った。その結果、ダイサーとｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲの複合体において、ダイサーで切断されていないｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ産物に対して９０％より多く切断されたことを示している（図２Ｆ）。図２Ｆはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断を示す。ヒトリコンビナントダイサーで室温で２０時間以上処理されたＴ７−ＲＮＡポリメラーゼで転写されたｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲのノーザンブロット分析を示す。各レーンは以下の通りである。レーン１：ダイサーおよびサンプルのない反応混合物（陰性対照）、レーン２：ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＲＮＡを含むがダイサーを含まない反応混合物、レーン３：ダイサーおよびｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  ＲＮＡを含む反応混合物。従って、２つの別々のｍＲＮＡ分子（ｖｉｆ  ｓｉＲＮＡ  ｍＲＮＡおよびＴＡＲ  ｍＲＮＡ）がＲＮＡｉおよびデコイＴＡＲ  ＲＮＡ経路を通してデュアル抗ＨＩＶ−１効果を発揮し、細胞におけるＨＩＶ複製（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａ；．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１，４９４−４９８；Ｒｏｓｅｌ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２００３，３１（１５），４４１７−４４２５）の抑制効果を増強したことが予測される。
ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ分子の可能性と抑制効果を調べるために、ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞を種々の量のベクターＤＮＡ（０．１、１．０、３．０μｇ）で同時トランスフェクトした。その結果、ＨＩＶ−１複製効果が用量依存性を示すことがわかった。３μｇ濃度のＤＮＡで９０％を超える抑制効果を示した（データは、３つの独立実験の上清の測定値±ＳＤで表す）。興味深いことに、抑制の結果はＨＩＶ−１  ｖｉｆ  ｍＲＮＡのダウンモジュレーションの程度と相関していた（図３Ａ）。図３ＡはＨＩＶ−１抗ウイルス効果を示す。ＨｅＬａ  ＣＤ４＋細胞はＵ６−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ  Ｒａｎｄｏｍ、デコイ  ＴＡＲ、デコイ  Ｍ−ＴＡＲおよびコントロールＵ６ベクターの種々のＤＮＡ濃度（０．１、１．０、および３．０μｇ）で、０．２μｇのＨＩＶ−１ｐＮＬＥとともに同時トランスフェクトされた。培養上清はトランスフェクト７２時間後に回収されＨＩＶ−１ｐ２４アッセイを自動ＥＬＩＳＡシステムを用いて行った。同時トランスフェクト細胞からのＨＩＶ−１ｍＲＮＡ分析によりウイルスｍＲＮＡ発現のダウンレギュレーションが示された。さらに、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ  キメラ  ＲＮＡ、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡおよびデコイ  ＴＡＲ  ＲＮＡを示すパネルに示されるように、ＨＩＶ−１  ｐＮＬＥ、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ  ＲａｎおよびＭ−ＴＡＲを示すパネルと比較してＨＩＶ−１レポーター遺伝子発現（ＥＧＦＰ）の有意の減少が認められた（図３Ｂ）。図３Ｂは、ＨＩＶ−１レポーター遺伝子発現の抑制を示す。細胞への同時トランスフェクト７２時間後に細胞を顕微鏡スライドに移し、ＥＧＦＰ発現を調べた。パネルはｖｉｆ−ＴＡＲ、ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡおよびＴＡＲ  デコイに介在されたＨＩＶ−１  レポーター遺伝子の抑制を示す。パネルはｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ  ｒａｎｄｏｍおよび変異ＴＡＲがＨＩＶ−１ｐＮＬＥを示すパネルに比べて同じレベルの発現を維持していることを示す。
ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ構築物の潜在的な抑制能力と安定性をさらに調べるために、レンチウイルスベクターを作製し、キメラ  ＲＮＡ（ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ）、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ、ＣＳ−ＴＡＲおよび対照発現カセットのデリバリーを高めた。ＨＩＶ−１アンチジーンを安定に発現する遺伝子導入Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ９細胞およびＰＢＭＣｓに対してＨＩＶ−１  ＮＬ４−３による感染を行い８週間以上培養した。サンプリングした細胞を含まない培養上清のＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４抗原分析を行い、ＨＩＶ−１複製の抑制を評価し（ウイルス複製アッセイにおけるｇａｇ  ｐ２４抗原の変化として測定した）、ＨＩＶ−１複製に対するアンチジーンの抗ＨＩＶ−１効果の評価を行った。その結果、感染した遺伝子導入細胞において第２世代抗ＨＩＶ分子の抑制効果が安定に長期化されたことがわかった（図３Ｃ、ＤおよびＥ）。図３Ｃ、ＤおよびＥはＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲによるＨＩＶ−１複製の長期抑制を示す。遺伝子導入Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ９細胞およびＰＢＭＣｓはＨＩＶ−１ＮＬ４−３の感染下で、９週間以上培養された。ＨＩＶ−１ｐ２４量の著しい減少がｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ発現細胞で認められた。ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡのＨＩＶ−１  ｐ２４抗原産生レベルはＪｕｒｋａｔ細胞では４週目から徐々に増加し、対照ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ  Ｒａｎ−Ｍ−ＴＡＲと同一レベルまで達した（図３Ｃ）。ＰＢＭＣｓでは２週目から徐々に増加し、対照ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびｖｉｆ  ｓｈＲＮＡＲａｎ−Ｍ−ＴＡＲと同一レベルまで達した（図３Ｄ）。さらに、Ｈ９細胞では３週目から徐々に増加し、対照ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３およびｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ  Ｒａｎ−Ｍ−ＴＡＲと同一レベルまで達した（図３Ｅ）。
ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡを発現する培養物におけるウイルスの変異と欠損を調べるために、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３の感染細胞（ＪｕｒｋａｔおよびＰＢＭＣｓ）にＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲまたはＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡを感染させた細胞から２８、３５および４８日目にウイルスＲＮＡを単離し、ｖｉｆ−ｓｈＲＮＡおよびＴＡＲ標的部位によっておこるＨＩＶ−１ＮＬ４−３のｖｉｆおよびＴａｔ遺伝子における変異及び欠損を分析した。配列決定により、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲおよびＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ（単独）の両方において、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ標的部位における変異および欠損が認められた。しかしながら、ＨＩＶ−１  ウイルスＲＮＡのＴａｔ標的領域には変異および欠損は認められなかった。ＣＳ−ｖｉｆ−ｓｈＲＮＡは、ＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲを発現する培養物での変異および欠損速度が遅いのに対して変異および欠損速度が速い（図３ＦおよびＧ）。図３ＦおよびＧは、それぞれＪｕｒｋａｔ細胞およびＰＢＭＣｓにおける遺伝子の分析の結果を示す。ウイルスＲＮＡをＣＳ−ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡおよびＣＳ  ｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲ培養上清から抽出し、Ｊｕｒｋａｔ細胞では２、３、４、５および６週とｓｉＲＮＡによる変異について配列分析した。一方、ＰＢＭＣｓでは２、３、４、５、６および８週とｓｉＲＮＡ仲介変異および欠損について配列分析した。ＨＩＶ−１ＮＬ４−３のｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ標的部位における変異および欠損をｖｉｆ  ｓｈＲＮＡまたはｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲのいずれかを発現しているすべての培養細胞において検出した。ＴＡＲ−ＲＮＡとｔａｔタンパク質の間のタンパク質−ＲＮＡ相互作用はｖｉｆ  ｓｈＲＮＡ−ＴＡＲの培養細胞で観察されるＲＮＡｉ耐性の制御に重要である。Ｔａｔタンパク質とＴＡＲ  ＲＮＡ特異的相互作用（タンパク質−ＲＮＡ相互作用）は長期アッセイで観察されるＲＮＡｉ耐性株下での高い抗ウイルス活性を補助するためのｓｉＲＮＡとの併合遺伝子治療戦略に重要である。
すなわち、本実施例において、細胞において切断され得る単独のＲＮＡ分子を通して発現されるデュアルまたはマルチＨＩＶ−１アンチジーンの発現は長期間にわたってＨＩＶ−１複製の抑制効率を増強させることができる。従って、ＨＩＶ−１デコイ  ＴＡＲ  ＲＮＡの競合的相互作用的役割は、ＨＩＶ−１複製に対するｖｉｆ  ｓｉＲＮＡの抑制効果を高め（９８％を超えて）、９週間といった長期間にわたるＨＩＶ−１感染細胞でｖｉｆ  ｓｈＲＮＡによる変異体および欠損の出現が起こっても、デコイ  ＴＡＲ  ＲＮＡが引き続いてＨＩＶ−１の産生を阻止する。従って、デュアルまたはマルチＨＩＶ−１アンチジーンを発現させる新しい戦略的方法はＨＩＶ／ＡＩＤＳの予防および治療に適用することのできる有望なＨＩＶ−１遺伝子治療となり得る。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本発明のキメラ  ＲＮＡは、遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを形成し得るｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）部分もしくはｍｉＲＮＡ部分とデコイとして作用し遺伝子転写因子の作用を抑制するデコイ  ＲＮＡ部分、遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ部分、リボザイムからなるＲＮＡ部分、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳからなるＲＮＡ部分の少なくとも１つのＲＮＡ部分を含み、ＲＮＡｉ医薬とデコイ型核酸（ＲＮＡ）医薬、アンチセンスＲＮＡ医薬、リボザイム医薬、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬ−ＥＧＳ医薬およびＲＮａｓｅ  Ｐ−ＥＧＳ医薬の少なくとも１つの医薬としての作用を発揮する。本発明のキメラ  ＲＮＡは、変異を生じＲＮＡｉ耐性を獲得し得るウイルスの複製防止等のウイルス抑制に効果的であり、ウイルス感染症の予防または治療薬として用いることができる。ＲＮＡｉ医薬がウイルスの変異により効果を失ったとしても、他の作用を発揮する核酸医薬の効果または他の標的配列を指向する同一の作用を発揮する核酸医薬の効果により変異が生じたウイルスを抑制することにより、効率的かつ確実にウイルスを抑制することが可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００７】
配列番号１から８：合成
［配列表］
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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