(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカイン阻害性ペプチドであって、
（１）下記アミノ酸配列（Ｉ）：
Glu-Ile-Cys-X4-Asp-Pro-X7-Gln-Lys-Trp-X11-Gln
（上記配列中、X4はAla又はLeuであり、X7はSer又はLysであり、そしてX11はVal又はIleである）
で表されるアミノ酸配列；或いは
（２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｎ−末端側の少なくとも６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｃ−末端側の少なくとも６個のアミノ酸を含むアミノ酸配列；
を含んでなり、15個以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
【請求項２】
ケモカイン阻害性ペプチドであって、
（１）LRD−Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln  （Ｄ−アミノ酸で構成される逆転配列直鎖状ペプチド）；
（２）CFL−Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-Cys  （Ｌ−アミノ酸で構成され、２個のCys間にジスルフィド結合を有する環状ペプチド）；
（３）CRD−Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-Cys  （Ｄ−アミノ酸で構成され、２個のCys間にジスルフィド結合を有する逆転配列環状ペプチド）；
（４）CRD−Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-Cys  （Ｄ−アミノ酸で構成され、２個のCys間にジスルフィド結合を有する逆転配列環状ペプチド）；及び
（５）CRD−Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-Cys  （Ｄ−アミノ酸で構成され、２個のCys間にジスルフィド結合を有する逆転配列環状ペプチド）；
からなる群から選択されるペプチド。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列：
Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln（配列番号１）；
Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln（配列番号７）；
Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro（配列番号８）；
Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln（配列番号９）；
Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln（配列番号10）；
Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Ser-Gln-Lys-Trp-Val-Gln（配列番号11）；
Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Ser-Glu-Glu-Trp-Val-Gln（配列番号12）；
Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln（配列番号13）；
Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln（配列番号14）；及び
Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln（配列Ａ）；
からなる群から選択されるアミノ酸配列から成るケモカイン阻害性ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含んでなるケモカイン阻害剤。
【請求項５】
CRD−Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-Cys  （Ｄ−アミノ酸で構成され、２個のCys間にジスルフィド結合を有する逆転配列環状ペプチド）を含んで成る医薬組成物。
【請求項６】
ケモカインが誘発する活性に関連する徴候を予防または阻止するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
２種以上のケモカインの活性を阻止するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
哺乳類のケモカイン関連炎症応答を増大しまたは高めるための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗ウイルス剤である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
レンチウイルスの感染または複製を防止または阻害する治療のための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
レンチウイルスがHIVである請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
自己免疫疾患を予防または治療するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
喘息を予防または治療するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
TNF-αの増大に関連する徴候を予防または阻止するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アレルギーを予防または治療するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
皮膚炎症の予防または治療のための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
内毒素血症の予防または治療のための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
マクロファージの抑制のための、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
マクロファージ／単球漸増は、広範囲の疾患、例えば自己免疫疾患、慢性肉芽腫症、アレルギー性疾患、感染性疾患、骨粗鬆症および冠動脈疾患の罹患率および死亡率においてある役割を演じる。例えば、アテローム性動脈硬化症では、脂質病変形成中の早期に、循環単球は初期プラークの上に載っている活性化内皮に接着する。適切な条件下では、単球は次に発育中の内膜に移動する。内膜では、マクロファージがリポタンパク質を蓄積して、プロテアーゼ阻害剤に対して余分のプロテアーゼを排出する。リポタンパク質が酸化されると、それらはマクロファージに対して有毒となり、これがマクロファージ死を引き起こして、不安定な壊死性細胞外脂質プールの増大を生じる。余分のプロテアーゼは、細胞外マトリックスの損失および繊維状プラークの不安定化を引き起こす。プラーク不安定性は、心筋梗塞の急性原因である。
【０００２】
単球およびその他の型の炎症細胞の漸増に必要な多数の分子が同定されている。これらの分子は、単球漸増の抑制のための標的を代表するものである。ある種類のこのような分子は、単球のための接着分子、例えば受容体である。別の種類の分子としては、炎症媒介物質、例えばTNF-αおよび関連分子、インターロイキン、例えばIL-1β、およびケモカイン、例えば単球化学誘引物質プロテイン−１（MCP-1 ）が挙げられる。その結果、ケモカインの活性を調節する作用物質は、広範囲の疾患を予防および治療するのに有用であると思われる。例えば、Rollins 等（米国特許第5,459,128 号）は一般的に、内因性MCP-1 の単球化学誘引物質活性を抑制するMCP-1 の類似体を開示する。
【０００３】
内因性MCP-1 を抑制するために有効な類似体は、MCP-1 の２８−チロシン、２４−アルギニン、３−アスパラギン酸でおよび／または残基２〜８間のアミノ酸で修飾される類似体として開示されている。特に、Rollins 等は、「MCP-1 が１つ又はそれ以上の以下の方法で修飾される場合に活性抑制の好結果が認められる：ａ）２８−チロシンがアスパラギン酸に置換される、ｂ）２４−アルギニンがフェニルアラニンに置換される、ｃ）３−アスパラギン酸がアラニンに置換されるおよび／またはｄ）２〜８個のアミノ酸配列が欠失される」と述べている（１列目４９−５４行）。MCP-1 のアミノ酸２〜８の欠失（「MCP-（△２〜８）」）は、不活性なポリペプチドを生じ、即ちMCP-1 （△２〜８）は化学誘引物質でない（２列目２２−２３行）。Rollins 等に開示された唯一の有効なMCP-1 阻害剤が、MCP-1 （△２〜８）である。
【０００４】
MCP-1 （△２〜８）は優勢な陰性作用を示し、即ちそれは生物学的作用を発揮できない野生型MCP-1 との異種二量体を形成することを、近年の研究は示唆している（Zhang et al., J. Biol. Chem., 269, 15918（1994）; Zhang et al., Mol. Cell. Biol., 15, 4851（1995））。したがって、MCP-1 （△２〜８）は古典的受容体拮抗物質の特性を示さない。さらに、MCP-1 （△２〜８）は、望ましくない薬力学的特性を有する大型ポリペプチドであるので、in vivo でのMCP-1 活性の抑制のために広範に有用であるとは思えない。さらに、MCP-1 （△２〜８）がその他のケモカイン関連炎症の優勢陰性阻害剤として活性であるか否かは分からない。
【０００５】
したがって、ケモカイン誘導性マクロファージおよび／または単球漸増を抑制または増強する、そして望ましい薬力学的特性を有する作用物質を同定する必要がある。さらに、その他の種類の細胞、例えばリンパ球のケモカイン誘導性活性を抑制または増強する作用物質を同定する必要がある。さらに、汎選択的ケモカイン阻害剤である作用物質を同定する必要がある。
【０００６】
発明の要約
本発明は、単離および精製ケモカインペプチド、ケモカインペプチド変異体、ケモカイン類似体またはその誘導体を包含する治療薬を提供する。好ましくは、本発明の治療薬は一つより多いケモカインの活性を抑制するが、しかしその薬剤はすべてのケモカインの活性を同程度に抑制するわけではない。あるいは、本発明の好ましい治療薬は、他のケモカインより重度にあるケモカインの活性を特異的に抑制する。本発明のさらに別の好ましい治療薬はケモカインの活性を模倣し、例えばそれは作動薬として作用する。したがって、ケモカイン拮抗薬および作動薬である治療薬は、本発明の範囲内である。本発明のさらに好ましい治療薬は、ケモカインの活性を抑制または模倣しないが、しかしケモカインに対する受容体と結合するかまたはそれに接近する薬剤であり、即ちそれは中性作用物質である。
【０００７】
本発明の好ましい実施態様は、単離および精製ＣＣケモカインペプチド３、例えば成熟MCP-1 （“ペプチド３［MCP-1 ］”）、その変異体、類似体または誘導体の約残基４６〜約残基６７に対応するMCP-1 由来のペプチドである。ケモカインペプチド３、その変異体、類似体または誘導体はケモカイン受容体拮抗薬であるが、しかしこれらの治療薬は異なるメカニズムにより、例えばアラキドン酸経路を抑制すること（例えばロイコトリエン、トロンボキサンまたはプロスタグランジン合成または安定性の抑制）により、またはTGF-βレベルを上げることにより、または１つより多いメカニズムによって、それらの作用を発揮し得る。
【０００８】
本発明の好ましいペプチド３は、式（Ｉ）：
[[(X2)-(X3)-C-(X)-(X7)-P ]a - [(X4)-(Z)-(X5)-W-(X1)-(X6) ]b ] c
（式中、Ｘ2 はＥ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、ＩまたはＭであり、Ｘ3 はＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ノルロイシンまたはＬであり、ＸはＡ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、ノルロイシンまたはＩであり、Ｘ4 はＫ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｑ、ＮまたはＴであり、ＺはＱ、Ｋ、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ノルロイシンまたはＬであり、Ｘ7 はＤまたはＰであり、Ｘ5 はＫ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｔ、ＨまたはＮであり、Ｘ1 はＶ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ａ、ノルロイシンまたはＩであり、Ｘ6 はＱ、Ｎ、ＫまたはＲであり、ａは０〜６であり、ｂは０〜６であり、そしてｃは１〜６であるが、但しａおよびｂがともに０ではあり得ない）
の化合物である。Ｘ、ＹまたはＺでない式（Ｉ）〜（III ）中の文字は、図１３に示すようなペプチジル残基を表す。
【０００９】
本発明のさらに好ましいペプチド３は、式（Ｉ）：
[[(X2)-(X3)-C-(X)-D-P]a - [(X4)-(Z)-(X5)-W-(X1)-(X6) ]b ] c
（式中、Ｘ2 はＥ、ＱまたはＭであり、Ｘ3 はＩ、ＶまたはＬであり、ＸはＡ、ＬまたはＩであり、Ｘ4 はＫ、ＳまたはＴであり、ＺはＱ、Ｋ、ＥまたはＬであり、Ｘ5 はＫ、Ｅ、Ｒ、ＳまたはＴであり、Ｘ1 はＶまたはＩであり、Ｘ6 はＱまたはＲであり、ａは０〜６であり、ｂは０〜６であり、そしてｃは１〜６であるが、但しａおよびｂがともに０ではあり得ない）
の化合物である。
【００１０】
本発明のさらに別の好ましいペプチド３は、式（II）：
[[(X4)-(Z)-(X5)]a - [W-(X1)-(X6) ]b ] c
（式中、Ｘ4 はＫ、ＳまたはＴであり、ＺはＱ、Ｋ、ＥまたはＬであり、Ｘ5 はＫ、Ｅ、Ｒ、ＳまたはＴであり、Ｘ1 はＶまたはＩであり、Ｘ6 はＱまたはＲであり、ａは０〜６であり、ｂは０〜６であり、そしてｃは１〜６であるが、但しａおよびｂがともに０ではあり得ない）
の化合物である。
【００１１】
本発明の別の好ましいペプチド３は、式（II）：
[[(X4)-(Z)-(X5)]a - [W-(X1)-(X6) ]b ] c
（式中、Ｘ4 はＫ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｑ、ＮまたはＴであり、ＺはＱ、Ｋ、Ｅ、Ｎ、Ｒ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ノルロイシンまたはＬであり、Ｘ5 はＫ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｔ、Ｈ、またはＮであり、Ｘ1 はＶ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ａ、ノルロイシンまたはＩであり、Ｘ6 はＱ、Ｎ、ＫまたはＲであり、ａは０〜６であり、ｂは０〜６であり、そしてｃは１〜６であるが、但しａおよびｂがともに０ではあり得ない）
の化合物である。
【００１２】
本発明のさらに好ましいペプチド３は、式（Ｘ）：
(X8)-(X)-D-(X2)-(X4)-(Z)-(X5)-W-(X1)-Q-(X7)
（式中、ＸはＡ、Ｌ、ＶまたはＩであり、Ｘ2 はＰ、ＧまたはＬであり、Ｘ4 はＫ、Ｔ、ＲまたはＮであり、ＺはＱ、Ｋ、ＡまたはＬであり、Ｘ5 はＫ、Ｅ、Ｒ、ＱまたはＰであり、Ｘ1 はＶ、Ｌ、Ａ、Ｍ、ＦまたはＩであり、Ｘ8 およびＸ7 は別々にＣであるかまたは存在しない）
の化合物である。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様は、単離および精製ＣＣケモカインペプチド３、例えば配列番号：１（“ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］”）または配列番号：７（“ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］”）に対応するMCP-1 由来のペプチド、その断片、変異体、類似体または誘導体である。以下に記載するように、ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１）およびペプチド３（3-12）［MCP-1 ］（配列番号：７）は、生物学的利用可能な汎ケモカイン阻害剤であり、望ましい薬物動態を有する。本発明の別の好ましいＣＣケモカインペプチド３は、ペプチド３［MPI1α］、さらに好ましくは配列番号：４２に対応するアミノ酸配列を有するペプチド３（1-12）［MPI1α］、その変異体、類似体、断片または誘導体である。
【００１４】
本発明のさらに好ましい実施態様は、ＣＣケモカインペプチド３、例えばペプチド３（1-12）［MCP-4 ］（例えば配列番号：６５）、ペプチド３（1-12）［MCP-3 ］（例えば配列番号：６６）、ペプチド３（1-12）［MCP-2 ］（例えば配列番号：６７）、ペプチド３（1-12）［エトタキシン］（例えば配列番号：６８）、ペプチド３（1-12）［MCP1α］（例えば配列番号：４２）、ペプチド３（1-12）［MCP1β］（例えば配列番号：４３）、ペプチド３（1-12）［RANTES］（例えば配列番号：４４）またはその断片である。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施態様としては、CXC ケモカインペプチド３、その変異体、類似体または誘導体が挙げられる。本発明の好ましいCXC ペプチド３は、式（III ）：
[[(X2)-(X3)-C-L-(X)-(X7) ]a - [(X4)-(Z)-(X5)-(X8)-(X1)-(X6)]b ] c
（式中、Ｘ2 はＥまたはＫであり、Ｘ3 はＩ、Ａ、ＲまたはＬであり、ＸはＤまたはＮであり、Ｘ7 はＱ、ＰまたはＬであり、Ｘ4 はＥ、Ｋ、Ｄ、ＡまたはＱであり、ＺはＡ、Ｒ、ＳまたはＥであり、Ｘ5 はＰ、ＮまたはＫであり、Ｘ8 はＦ、Ｗ、Ｒ、Ｉ、Ｍ、ＬまたはＡであり、Ｘ1 はＬ、Ｖ、ＹまたはＩであり、Ｘ6 はＫまたはＱであり、ａは０〜６であり、ｂは０〜６であり、そしてｃは１〜６であるが、但しａおよびｂがともに０ではあり得ない）
の化合物である。
【００１６】
本発明のさらに好ましい実施態様は、CXC ケモカインペプチド３、例えばペプチド３（1-12）［IL8 ］（例えば配列番号：４０）、ペプチド３（1-12）［SDF-1 ］（例えば配列番号：３８）、ペプチド３（1-12）［ENA-78］（例えば配列番号：４１）、ペプチド３（1-12）［ GROα］（例えば配列番号：７２）、ペプチド３（1-12）［ GROβ］（例えば配列番号：７３）、ペプチド３（1-12）［ GROγ］（例えば配列番号：７４）またはその断片である。
本発明のさらに別の好ましい実施態様は、CX2C、CX3CまたはＣケモカインペプチド３、その変異体、類似体または誘導体である。
【００１７】
好ましくは、ケモカインペプチド３、その変異体、類似体または誘導体はアラキドン酸経路を抑制し、例えばトロンボキサン、プロスタグランジン、ロイコトリエンまたはそれらの任意の組合せの合成、安定性または結合を抑制する。
【００１８】
本発明のその他の化合物としては、式（VIII）：
【化７】
0004523151.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒは（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル（ここでアリール、ヘテロアリールおよびベンジルオキシカルボニルのフェニル環は任意に１つ又はそれ以上（例えば１、２、３または４）のハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 〜Ｃ6 ）アルカノイルオキシまたは（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシカルボニルで置換され得る）であり；
【００２０】
Ｒ’は（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、アリールオキシまたはＮＲa Ｒb （ここで、Ｒa およびＲb は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、アリール、ベンジルまたはフェネチルであるか、またはＲa およびＲb はそれらが結合される窒素と一緒になって５〜６員複素環式環（例えばピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ）を形成し；
各Ｒ”は別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである）
の化合物、あるいは製薬上許容可能なその塩が挙げられる。好ましくは、Ｒはベンジルオキシカルボニルであり、Ｒ’はジメチルアミノまたはジエチルアミノであり、あるいはＲはベンジルオキシカルボニルであって、そしてＲ’はベンジルオキシである。
【００２１】
本発明のその他の化合物としては、式（IX）：
【化８】
0004523151.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｒは（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル（ここでアリール、ヘテロアリールおよびベンジルオキシカルボニルのフェニル環は任意に１つ又はそれ以上（例えば１、２、３または４）のハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 〜Ｃ6 ）アルカノイルオキシまたは（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシカルボニルで置換され得る）であり；
【００２３】
Ｒ’は（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、アリールオキシまたはＮＲa Ｒb （ここで、Ｒa およびＲb は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、アリール、ベンジルまたはフェネチルであるか、またはＲa およびＲb はそれらが結合される窒素と一緒になって５〜６員複素環式環（例えばピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ）を形成し；
各Ｒ”は別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである）
の化合物、あるいは製薬上許容可能なその塩が挙げられる。好ましくは、Ｒはベンジルオキシカルボニルであり、Ｒ’はジメチルアミノまたはジエチルアミノであり、あるいはＲはベンジルオキシカルボニルであって、そしてＲ’はベンジルオキシである。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施態様としては、少なくともトリペプチドであるケモカインペプチド３、その変異体またはその誘導体が挙げられる。本発明の好ましい実施態様は、MCP-1 トリペプチドKQK （即ち、ペプチド３（9-12）［MCP-1 ］）であり、これはMCP-1 を特異的に抑制するがしかし MIPα、IL8 およびSDF1α、ケモカイン誘導性活性を抑制しない。本発明のその他の好ましい実施態様としては、IL-8、MIP1α、SDF1，ネズミMCP-1 、MCP-2 、MCP-3 およびMIP1βを特異的に抑制する単離および精製ケモカイントリペプチド、例えばそれぞれKEN 、SEE 、KLK 、KKE 、KER 、TQK およびSES が挙げられる。本発明のさらに好ましい実施態様は、１つより多いケモカインの活性を抑制するケモカインペプチド３トリペプチド、例えばWVQ またはWIQ である。好ましくは、本発明のトリペプチドはRFK ではない。
【００２５】
本発明のさらに別の実施態様は、アミノ酸配列KXK （ここで、Ｘはアミノ酸であり、好ましくは２０の天然アミノ酸のうちの１つである）を含むペプチドであって、そのペプチドはケモカイン拮抗薬で、TGF-β（TGF-β１、TGF-β２、TGF-β３またはそれらの組合せ）を活性化するペプチド、またはそれらの組合せである。好ましくは、ペプチドはTGF-β１の活性化を増大する。アミノ酸配列KXK を含むペプチドは長さが約１５未満のアミノ酸残基、好ましくは約１０アミノ酸残基、さらに好ましくは約８アミノ酸残基である。好ましくは、ペプチドはKKFKまたはRKPKではない。本発明のさらなる実施態様は、塩基性アミノ酸残基とその後のフェニルアラニン、その後の別の塩基性残基を含むペプチドであるが、この場合、ペプチドはRFK でなく、KRFKでなく、あるいはRFK またはKRFKを含有しない。
【００２６】
本発明の別の好ましいペプチドは、式（VII ）：
(X1)-(Y)-(K)-(X2)-K-(X3)
（式中、Ｘ2 はＶ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｒ、Ｃ、Ｈ、Ｍ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＹまたはＩであり、Ｙは存在しないかあるいはＲまたはＫでないアミノ酸であり、そしてＸ1 およびＸ3 は別々に０〜２０アミノ酸残基であるかまたは存在しない）
の化合物である。好ましくは、Ｘ2 はＦ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＹまたはＩである。さらに好ましくはＸ2 はＦ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＹまたはＩであり、そしてＹ、Ｘ1 およびＸ3 は存在しない。
【００２７】
本発明の方法に有用な本発明のペプチドを同定するために、異なる種からのケモカインの配列比較が実行される。その場合、ヒト受容体に対する非ヒトケモカインの交差反応性が査定される。好ましいケモカインは、対応するヒトケモカインとの最小配列相同性を有するが、しかしヒト受容体との結合によりさらに交差反応する種からのものである。高度の配列類似性または同一性を有する領域を用いて本発明のペプチドを調製する。例えば、拮抗薬、作動薬または中性特性を有するTGF-βのペプチドを同定するために、ヒトTGF-βのアミノ酸配列をアフリカツメガエルXenopus の配列と比較した。
【００２８】
本発明により同定されるペプチドとしては、LYIDFRQDLGWKW （“T1”；配列番号：111)；HEPKGYHANFC （“T2”；配列番号：112)；VYYVGRK （“T3”；配列番号：113)およびKVEQLSNMVVKSC （“T4”；配列番号：114)が挙げられる。１８μＭのED50を有するTHP-1 細胞のTGF-β受容体に結合されるビオチニル化Ｔ１は、受容体中性作用物質である（即ち作動薬でも拮抗薬でもない）。３０μＭのED50を有するTHP-1 細胞のTGF-β受容体に結合されるビオチニル化Ｔ２は、弱受容体拮抗薬である。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施態様は、単離および精製ＣＣケモカインペプチド２、例えば配列番号：３に対応するペプチド（“ペプチド２（1-15）［MCP-1 ］”）、配列番号：５に対応するペプチド（“ペプチド２（1-14）［MCP1α］”）、その断片、変異体、類似体または誘導体である。ケモカインペプチド２、その変異体、類似体または誘導体はケモカイン受容体作動薬であるが、しかしこれらの治療薬は異なるメカニズムにより、または１つより多いメカニズムによりそれらの作用を発揮し得るよう意図される。ケモカインペプチド２、その変異体、類似体または誘導体はケモカイン受容体拮抗薬であるとも考えられる。好ましくは、ペプチド２の変異体、類似体または誘導体は、元のまたは野生型のアミノ酸配列を有する対応するペプチド２に対してダッフィー抗原結合低減を示し、そして好ましくは受容体結合特性の増強を示す。
【００３０】
その他の好ましいＣＣケモカインペプチド２としては、ペプチド２（1-14）［MIP1β］（例えば配列番号：６０）、ペプチド２（1-15）［RANTES］（例えば配列番号：６１）、ペプチド２（1-15）［MCP-2 ］（例えば配列番号：６２）、ペプチド２（1-15）［MCP-3 ］（例えば配列番号：６３）、ペプチド２（1-15）［MCP-4 ］（例えば配列番号：６４）、ペプチド２（1-15）［エトタキシン］（例えば配列番号：７５）またはその断片が挙げられる。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施態様としては、CXC ケモカインペプチド２、その変異体、類似体または誘導体が挙げられる。好ましいＣＣケモカインペプチド２としては、ペプチド２（1-15）［IL8 ］（例えば配列番号：６）、ペプチド２（1-15）［SDF1］（例えば配列番号：４）、ペプチド２（1-15）［ENA78 ］（例えば配列番号：５９）、ペプチド２（1-15）［ GROα］（例えば配列番号：６９）、ペプチド２（1-15）［ GROβ］（例えば配列番号：７０）、ペプチド２（1-15）［ GROγ］（例えば配列番号：７１）またはその断片が挙げられる。
本発明のさらに別の好ましい実施態様は、CX2C、CX3CまたはＣケモカインペプチド２、その変異体、類似体または誘導体である。
【００３２】
その他の好ましいペプチド２としては、TSSKC （ペプチド２（1-5)［MIP-1 ］；配列番号：102)；DYFETSSQC （ペプチド２（1-9)［MIP1α］；配列番号：103)；CSKPGV（ペプチド２（9-14）［MIP1α］；配列番号：104)；HLKILNTPNCALQIV （ペプチド２（1-5)［MIP-1 α］；配列番号：105)；SYRRITSSK （ペプチド２（1-5)［MCP-1 ］；配列番号：106)；CPKEAV（ペプチド２（10-15)［MCP-1 ］；配列番号：107)；SYRRI （ペプチド２（1-5)［MCP-1 ］；配列番号：108)およびCSYRRITSSKSPKEAVC （配列番号：110)；ならびに配列VGPKSCQSSTEFYD（ペプチド２（1-14）［MIP1α］の残基1-14に対応する。
【００３３】
ロアーケースの文字は、本明細書中では、Ｄ異性体を示すために、ならびにCRD およびLRD における文字“Ｄ”を示すために用いられる）のＤ異性体を有するペプチド；vaekpcksstirryに対応するペプチド；およびvgpkscqsstefydの変異体ペプチド２（位置１０のセリンのＤ異性体を含むLRD ペプチド２（1-14）［MIP1α］）、ならびにペプチドのアミノおよびカルボキシ末端のシステインのＤ異性体（LRD-Cys0Ser10Cys16ペプチド２（1-15）［MCP-1 ］と呼ばれる。ここで、Ｌ＝線状、Ｆ＝前方、Ｄ＝Ｄ異性体）が挙げられる。
【００３４】
本発明のさらに好ましいペプチド２は、式（XII ）：
C-(X)-Y-(X2)-(X4)-(Z)-T-(X5)-(X6)-(X1)-C-(X8)-(X7)-(X9)-(X10)-V-C
（式中、ＸはＳまたはＤであり、Ｘ2 はＲ、Ｋ、ＦまたはＹであり、Ｘ4 はＲ、ＥまたはＦであり、ＺはＴまたはペプチド結合であり、Ｘ5 はＳまたはＮであり、Ｘ6 はＳまたはＩであり、Ｘ1 はＫ、Ｒ、ＱまたはＬであり、Ｘ8 はＰまたはＳであり、Ｘ7 はＫ、ＲまたはＱであり、Ｘ9 はＥまたはＰであり、そしてＸ10はＡまたはＧである）の化合物である。
【００３５】
単離および精製ケモカインペプチド変異体またはその誘導体も提供される。ケモカインペプチド変異体は、対応する元のケモカインのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、しかし 100％未満の連続アミノ酸配列相同性または同一性を有し、例えばSer7ペプチド３（1-12）［MCP1］（配列番号：１１）はMCP-1 の対応するアミノ酸配列、即ち配列番号：１を有するペプチドに対して 100％未満の連続相同性を有する。好ましいペプチド３変異体は、Leu4Ile11 ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］である。
【００３６】
本発明は、ケモカインペプチドおよびペプチド変異体の誘導体も提供する。好ましい誘導体は、本発明のケモカインペプチド、その変異体または類似体の環状逆配列Ｄ異性体(CRD）誘導体である。例えば、ペプチド２のLRD 誘導体、CRD-Cys0Ser10Cys16ペプチド２［MCP-1 ］およびCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］は、以下に記載するように本発明の方法の実施に特に有用である本発明の化合物である。
ケモカインのある種の類似体も提供される。特に、ケモカインペプチド２、ケモカインペプチド３またはその変異体の類似体が意図される。ケモカインペプチド３の好ましい類似体は、WIQ の類似体である。したがって、本発明の好ましいケモカイン類似体としては、式（IV）：
【００３７】
【化９】
0004523151.tif 000004
【００３８】
（式中、Ｒ1 はアリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキルヘテロアリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クマリール、クマリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クロマニルまたはクロマニル（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキルであって、この場合、任意のアリールまたはヘテロアリール基、あるいは任意のクマリールまたはクマリール基のベンズ環は、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 〜Ｃ6 ）アルカノイルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、C(=O) NRg R h 、NRi R j から成る群から選択される１、２または３つの置換基で任意に置換され得る；
【００３９】
Ｒ2 は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Ra ) (Rb ）であり；
Ｒ3 は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Rc ) (Rd ）であり；
Ｙはオキソまたはチオキソであり；
【００４０】
Ｚは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシまたはＮ（Ｒe ）（Ｒf ）であり；そして
Ｒa 〜Ｒj は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであるか、あるいはＲa およびＲb 、Ｒc およびＲd 、Ｒe およびＲf 、Ｒg およびＲh 、またはＲi およびＲj はそれらが結合される窒素と一緒に、ピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノから選択される環を形成する）
の化合物、またはその製薬上許容可能な塩が挙げられる。
【００４１】
式（IV）の化合物の好ましい実施態様としては、Ｒ1 がアリール、ヘテロアリール、クマリールまたはクロマニルである式（IV）の化合物が挙げられる。好ましくは、アリールはフェニルであり、ヘテロアリールはインドリルまたはピリジニルである。式（IV）の化合物の別の好ましい実施態様としては、Ｒ2 がN (Ra ) (Rb ）であり、そしてＲ3 がN (Rc ) (Rd ）である式（IV）の化合物が挙げられる。式（IV）の化合物のさらに別の好ましい実施態様としては、Ｚが（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルである式（IV）の化合物が挙げられる。
さらに好ましい化合物は、Ｒ1 がインドリルであり、Ｒ2 がN (Ra ) (Rb ）であり、Ｒ3 がN (Rc ) (Rd ）であり、ＹがＳであり、Ｚが水素であり、そし    てＲa 、Ｒb 、Ｒc およびＲd が各々メチルである式（IV）の化合物が挙げられる。
【００４２】
ケモカインペプチド３の別の好ましい類似体は、KXK の類似体である。したがって、本発明は、式（Ｖ）：
【化１０】
0004523151.tif 000005
【００４３】
（式中、Ｒ4 はNRk R l であり、
Ｒ5 はNRm R n であり、
Ｒ6 はNRo R p であり、
Ｒ7 は天然または非天然アミノ酸の側鎖であるか、あるいは-(CH2)2 C(=O) NRq R r であり、
Ｒ8 は水素、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、NRs R t 、アミノ酸のアミノ末端、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドのＮ末端残基であり、
【００４４】
Ｒk 、Ｒl 、Ｒo およびＲp は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、
Ｒm およびＲn は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェニル、ベンジル、フェネチル、アミノ酸のＣ−末端残基、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、
【００４５】
Ｒq およびＲr は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、
Ｒs およびＲt は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである）
の化合物、あるいはその製薬上許容可能な塩を含む。
【００４６】
好ましくは、Ｒk 、Ｒl 、Ｒo およびＲp は各々水素であり、Ｒm およびＲn は各々別々に水素、アセチル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、プロポキシ、ブトキシ、tert−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、あるいはアミノ酸のＣ−末端残基または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、そしてＲq およびＲr は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルまたは（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキルである。
好ましくは、Ｒ7 は-(CH2)2 C(=O) NRq R r である。
【００４７】
好ましくは、Ｒ7 はメチル、３−グアニジノプロピル、アミノカルボニルメチル、カルボキシメチル、メルカプトメチル、（２−カルボキシ−２−アミノエチル）ジチオメチル、２−カルボキシエチル、２−（アミノカルボニル）エチル、水素、５−イマダゾイルメチル、４−アミノ−３−ヒドロキシプロピル、２−ブチル、２−メチルプロプ−１−イル、４−アミノブチル、２−（メチルチオ）エチル、ベンジル、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、３−インドリルメチル、４−ヒドロキシベンジルまたはイソプロピルである。
さらに好ましくは、Ｒ7 は水素、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル、メチル、２−ヒドロキシメチルまたはメルカプトメチルである。
【００４８】
式（Ｖ）の好ましい化合物としては、KGK 、KFK 、KYK 、KAK 、KSK 、KCK またはKQK の類似体が挙げられる。例えば、KQK の類似体としては、式（Ｖ）：
【化１１】
0004523151.tif 000006
【００４９】
（式中、Ｒ4 はNRk R l であり、
Ｒ5 はNRm R n であり、
Ｒ6 はNRo R p であり、
Ｒ7 はNRq R r であり、
Ｒ8 は水素、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、NRs R t 、アミノ酸のアミノ末端、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドのＮ末端残基であり、
【００５０】
Ｒk 、Ｒl 、Ｒo およびＲp は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、
Ｒm およびＲn は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェニル、ベンジル、フェネチル、アミノ酸のＣ−末端残基、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、
【００５１】
Ｒq およびＲr は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、
Ｒs およびＲt は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである）
の化合物、あるいはその製薬上許容可能な塩が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、Ｒk 、Ｒl 、Ｒo およびＲp は各々水素であり、Ｒm およびＲn は各々別々に水素、アセチル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、プロポキシ、ブトキシ、tert−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、あるいはアミノ酸のＣ−末端残基または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、そしてＲq およびＲr は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルまたは（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキルである。
【００５３】
ケモカインペプチド３の別の好ましい類似体は、WVQ の類似体である（図８参照）。したがって、本発明は、式（VI）：
【化１２】
0004523151.tif 000007
【００５４】
（式中、Ｒ10はNRi R j であり、
Ｒ11はアリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クマリール、クマリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クロマニルまたはクロマニル（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキルであって、この場合、任意のアリールまたはヘテロアリール基、あるいは任意のクマリールまたはクマリール基のベンズ環は、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 〜Ｃ6 ）アルカノイルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、C(=O) NRg R h 、NRe R f から成る群から選択される１、２または３つの置換基で任意に置換され得る；
【００５５】
Ｒ12は（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキルであり；
Ｒ13は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、ヒドロキシまたはN (Ra ) (Rb ）であり；
Ｒ14は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Rc ) (Rd ）であり；
【００５６】
Ｙはオキソまたはチオキソであり；
Ｒa 〜Ｒj は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであるか、あるいはＲa およびＲb 、Ｒc およびＲd 、Ｒe およびＲf 、Ｒg およびＲh 、またはＲi およびＲj はそれらが結合される窒素と一緒に、ピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノから選択される環を形成する）
の化合物、あるいはその製薬上許容可能な塩を提供する。
【００５７】
好ましくは、Ｒ10はアミノであり、Ｒ11は２−ベンズイミダゾリルであり、Ｒ12は（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキルであり、Ｒ13はヒドロキシであり、そしてＲ14はアミノである。
本発明の治療薬には、任意に活性およびラセミ形態で単離され得るキラル中心を有する化合物が含まれる、と考えられる。
【００５８】
ケモカインの少なくとも一部をコードする、即ち本明細書中に記載したようなケモカインペプチドまたはその変異体、例えばケモカイン３ペプチド、その変異体または誘導体、あるいはケモカインペプチド２、その変異体または誘導体をコードする予備選定核酸セグメントを包含する単離および精製核酸分子、例えばDNA 分子も提供される。例えば、本発明は、すべてのまたは一部のメッセンジャーRNA （“標的”mRNA）、即ち内因性または“元の”ケモカインmRNAと実質的に同一であるRNA 分子をコードする予備選定DNA セグメントを包含する発現カセットを提供する。
【００５９】
発現カセット中の予備選定DNA セグメントは、プロモーターと操作可能的に連結される。本明細書中で用いる場合、配列で「実質的に同一」とは、２つの核酸配列が互いに少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、さらに好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９８％の連続ヌクレオチド配列同一性を有することを意味する。好ましくは、予備選定DNA セグメントは、ハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、対応する元のケモカインをコードする核酸分子とハイブリダイズする。
【００６０】
本発明は、宿主細胞中で発現カセットから発現される場合にケモカイン発現を変え得るケモカインをコードするDNA セグメントの「アンチセンス」mRNA転写体を提供する単離および精製DNA 分子も提供する。本明細書中で用いる場合、「アンチセンス」という用語は、ケモカインをコードするRNA 分子の少なくとも一部の逆補体である核酸の配列を意味する。好ましくは、本発明のアンチセンス配列は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をコードするDNA セグメントと実質的に相補的である。本明細書中で用いる場合、「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が互いに相補的な少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、さらに好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９８％の連続ヌクレオチド配列を有することを意味する。
【００６１】
実質的に相補的なRNA 分子は、mRNAの翻訳の低減または抑制を引き起こすようにケモカインをコードするmRNAとの十分な配列相補性を有するものである。アンチセンス配列およびmRNAにより形成される二重螺旋はmRNAの翻訳を抑制し、ならびにRNA 分解を促進するが、しかしアンチセンス配列はその他のメカニズムにより、またはメカニズムの組合せによりそれらの作用を発揮し得る、と考えられる。好ましくは、予備選定アンチセンスDNA セグメントはハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、対応するケモカイン遺伝子を包含する核酸分子とハイブリダイズする。
【００６２】
ケモカインセンスまたはアンチセンス核酸のex vivo またはin vivo での細胞中への導入は、ケモカインの発現を制御するこ糖尿病向けられる分子遺伝学をベースにした療法をもたらし得る。したがって、導入された核酸は、ケモカイン関連適応症を有する患者における遺伝子の発現を矯正または補足するのに有用であり得る。例えば、ケモカイン受容体作動薬である本発明のペプチドをコードする発現ベクターの投与はケモカインシグナリングを増大し、したがってケモカインレベルの低減を特徴とする疾患に有効である。同様に、アンチセンスケモカイン配列を包含する発現ベクターの投与は、ケモカイン発現の増大に関連した疾患を予防または治療するのに有用であり得る。例えば、肺に導入されるアンチセンスペプチド３（1-12）［MCP-1 ］を含有する発現ベクターは、喘息を予防または治療するのに有効であり得る。
【００６３】
本発明の治療薬を包含する製剤組成物、送達系およびキットも提供される。
本発明は、ケモカイン関連適応症の治療方法も提供する。例えば、方法は、ケモカイン誘導性活性に関連した適応症の予防または抑制方法を提供する。本方法は、適応症に苦しんでいるかまたはその危険性のある哺乳類に、前記の活性を防止または抑制するのに有効な量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その断片、その変異体、その誘導体、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを哺乳類に投与することを包含する。好ましくは、ペプチドはIL-8ペプチド、NAP-2 ペプチドまたはPF4 ペプチドではない。
【００６４】
好ましくは投与は、１つより多いケモカインの活性を抑制するのに有効である（即ち、ペプチドは汎選択的阻害剤である）。好ましい汎ケモカイン阻害剤は、WVQ 、WIQ 、Leu4Ile11 ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］、Leu4Ile11 ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］およびCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）である。これらの作用物質は、適応症、例えば多発性硬化症、喘息、乾癬、アレルギー、慢性関節リウマチ、臓器移植拒絶および自己免疫疾患を治療するのに有用である。これらの適応症を治療または抑制するのに有用な好ましいケモカインペプチドとしては、MCP-1 、MCP-2 、MCP-3 、MCP-4 、RANTES、MIP1α、ENA78 、MIG 、 GROβ、エトタキシン、IP10、 MIPβおよびSDF-1 からのペプチド２および／またはペプチド３が挙げられる。
【００６５】
本発明は、ケモカイン誘導性活性に関連した適応症に苦しんでいるかまたはその危険性のある哺乳類の治療方法であって、式（IV）：
【化１３】
0004523151.tif 000008
【００６６】
（式中、Ｒ1 はアリール、ヘテロアリール、クマリールまたはクロマニルであり；Ｒ2 はN (Ra ) (Rb ）であり；Ｒ3 はN (Rc ) (Rd ）であり；Ｙはオキソまたはチオキソであり；Ｚは（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキルであり；Ｒa 〜Ｒd は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであるか、あるいはＲa およびＲb またはＲc およびＲd はそれらが結合される窒素と一緒に、ピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノ環を形成する）
の有効量の化合物またはその製薬上許容可能な塩を哺乳類に投与することを包含する方法も提供する。
【００６７】
ケモカイン誘導性活性に関連した適応症に苦しんでいるかまたはその危険性のある哺乳類の治療方法であって、式（Ｖ）：
【化１４】
0004523151.tif 000009
【００６８】
（式中、Ｒ4 はNRk R l であり；Ｒ5 はNRm R n であり；Ｒ6 はNRo R p であり；Ｒ7 は天然または非天然アミノ酸の側鎖であるか、あるいは-(CH2)2 C(=O) NRq R r であり；Ｒ8 は水素、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、NRs R t 、アミノ酸のアミノ末端、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドのＮ末端残基であり；Ｒk 、Ｒl 、Ｒo およびＲp は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり；
【００６９】
Ｒm およびＲn は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェニル、ベンジル、フェネチル、アミノ酸のＣ−末端残基、または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり；Ｒq およびＲr は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり；Ｒs およびＲt は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである）
の有効量の化合物またはその製薬上許容可能な塩を哺乳類に投与することを包含する方法も提供される。
【００７０】
ケモカイン誘導性活性に関連した適応症に苦しんでいるかまたはその危険性のある哺乳類の治療方法であって、式（VI）：
【化１５】
0004523151.tif 000010
【００７１】
（式中、Ｒ10はNRi R j であり；
Ｒ11はアリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クマリール、クマリール（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキル、クロマニルまたはクロマニル（Ｃ1 〜Ｃ3 ）アルキルであって、この場合、任意のアリールまたはヘテロアリール基、あるいは任意のクマリールまたはクマリール基のベンズ環は、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 〜Ｃ6 ）アルカノイルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、C(=O) NRg R h 、NRe R f から成る群から選択される１、２または３つの置換基で任意に置換され得る；
【００７２】
Ｒ12は（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキルであり；
Ｒ13は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシ、ヒドロキシまたはN (Ra ) (Rb ）であり；
Ｒ14は（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 〜Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 〜Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Rc ) (Rd ）であり；
【００７３】
Ｙはオキソまたはチオキソであり；
Ｒa 〜Ｒj は各々別々に水素、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 〜Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであるか、あるいはＲa およびＲb 、Ｒc およびＲd 、Ｒe およびＲf 、Ｒg およびＲh 、またはＲi およびＲj はそれらが結合される窒素と一緒に、ピロリジノ、ピペリジノまたはモルホリノから選択される環を形成する）
の有効量の化合物またはその製薬上許容可能な塩を哺乳類に投与することを包含する方法も提供される。
【００７４】
本発明はさらに、哺乳類におけるケモカイン関連炎症反応を増大、増加または増強するための方法であって、前記の反応を増大、増加または増強するのに有効な量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。
【００７５】
さらに、ペプチド３、その変異体および誘導体はTh2 反応を低減し、Th1 反応を増大し得るので、これらの化合物は、Th2 反応の低減およびTh1 反応の増大が必要とされる特定の疾患を治療または予防するのに特に有用であり得る。ケモカイン関連炎症反応を増大、増加または増強するために用いられる作用物質はYNFTNRKISVQRLASYRRITSSK でないのが好ましい。これらの治療薬は、例えば、しばしば不十分な免疫応答に関連がある細胞内病原体または寄生体に対する炎症反応を増大するのに有用である。したがって、これらの作用物質は、結核およびマラリアを治療または予防するのに有用であり得る。したがって、本発明は、寄生生物感染を予防または治療するための療法も提供する。
【００７６】
本発明は、好塩基性細胞または肥満細胞からのヒスタミン放出と関連する適応症を予防または抑制する方法も提供する。方法は、適応症の危険があるかまたはそれに苦しむ哺乳類に有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを投与することを包含する。
【００７７】
単球、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞または好酸球漸増、あるいはＢ細胞またはＴ細胞活性化または増殖に関連した適応症を予防または抑制する方法も提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを投与することを包含する。例えば、ケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体は、自己免疫または肉芽腫性適応症を予防または治療するのに有用であり得る。
【００７８】
さらに、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せをこのような治療が必要な場合に哺乳類に投与することを包含する脈管性適応症を予防または治療するための治療方法であって、適応症が冠動脈疾患、心筋梗塞、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症または脈管炎である方法が提供される。本発明のこの実施態様に好ましいケモカインペプチドとしては、MCP-1 、RANTES、 GROα、MIP1α、IP10、MCP-4 およびMIP1βのケモカインペプチドが挙げられる。
【００７９】
本発明は、自己免疫疾患を予防または治療するための方法も提供する。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを前記の治療が必要な場合に哺乳類に投与することを包含する。自己免疫疾患を予防または治療するために有用なペプチド３の好ましい変異体は、Leu4Ile11 ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１４）またはWVQ を有するペプチド３である。多発性硬化症を予防または治療するのに用いるための好ましいケモカインペプチド３としては、SEE およびペプチド３（1-14）［MIP1α］（配列番号：４２）が挙げられる。その他の好ましいペプチドは、RANTESのケモカインペプチドである。
【００８０】
予備選定生理学的部位でのマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはその他の造血細胞、例えば好中球、好酸球または肥満細胞のケモカイン誘導性活性を調節するための方法も提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを包含する投与形態であって、標的部分と共有的にまたは非共有的に連結される投与形態を投与することを包含する。標的部分は、予備選定生理学的部位で細胞構成成分と結合する。
【００８１】
さらに、本発明の作用物質は、そのいくつかが汎ケモカイン阻害剤というよりむしろ選択的ケモカイン阻害剤であるので、標的部分たり得るとも考えられる。例えば、本発明の作用物質、例えばペプチド２は、赤血球系白血病、赤血球系骨髄症、真性赤血球増加症またはその他の赤血球系形成異常といった疾患の治療のための赤血球への同位元素またはその他の細胞傷害性分子の標的化送達に有用であり得る。同様に、特定の種類の細胞を特異的に標的にする本発明の作用物質は、診断に有用であり得る。したがって、これらの作用物質は、放射能標識され得る（Chianelli et al., Nucl. Med. Comm., 18, 437 （1997））か、または任意のその他の検出可能なシグナル、例えば診断的画像形成（例えばMRI およびCAT)に有用なものを慢性関節リウマチおよび真性糖尿病（Ｉ型）のような疾患の炎症の造像部位に標識され得る。
【００８２】
免疫応答を増加するための治療方法も提供される。方法は、免疫原性部分ならびに有効量のケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを包含する哺乳類に投与することを包含するが、この場合、その量は免疫原性部分に対する哺乳類の免疫応答を増加するのに有効である。
【００８３】
したがって、本発明は、免疫原性部分ならびに有効量のケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを包含するワクチンも提供する。本明細書中で用いる場合、「免疫原性部分」とは、動物に、好ましくは哺乳類に導入された場合に、組成物または化合物に対する動物による体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こす単離または精製組成物または化合物（例えば、精製ウイルス製剤、あるいは元のまたは組換え体ウイルスまたは細菌抗原）を意味する。
【００８４】
免疫原性部分がペプチド２、その変異体または誘導体に結合される修飾ワクチンも提供される。ペプチド２は、修飾ワクチンの赤血球プールとの結合を増大し、ケモカインのダッフィー結合を遮断し、したがって循環中のワクチンの滞留時間を延長し、そしてケモカイン誘導性活性を低減し、このいずれかが抗体応答増加をもたらす。修飾ワクチンは非修飾免疫原に用いられるのと同一経路（例えば、静脈内、筋肉内または経口的）で送達されると考えられる。
【００８５】
本発明は、喘息を予防または抑制するための方法も提供する。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せをこのような治療が必要な場合に哺乳類に投与することを包含する。実施例１２で後述するように、本発明のペプチドは、卵白アルブミンに曝露されたマウスの肺における細胞性炎症およびIgE 応答を抑制した。好ましくは、本発明のこの実施態様では、治療薬は上部および／または下部気道に投与される。本発明のこの実施態様に有用な好ましいペプチドは、RANTES、MCP-1 およびMIP1αのケモカインペプチドである。
【００８６】
さらに、ウイルス性の、例えばポックスウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、Herpesvirus samiri）、サイトメガロウイルス(CMV）またはレンチウイルスの感染または複製を予防または抑制するための治療方法が提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せをこのような治療が必要な場合に哺乳類に投与することを包含する。
【００８７】
好ましくは、治療薬は、HIV を予防するために用いられる。さらに好ましくは、作用物質は、抗ウイルス剤、例えば、HIV  AZTのための、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤またはそれらの組合せの投与前、投与中、投与後に投与される。ケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物の組合せは、本発明の抗ウイルス的方法および組成物に有用であり得る。ウイルス感染を予防または抑制するために有用な好ましいケモカインペプチドは、IP10、MIP1α、MIP1β、SDF-1 、IL-8、 GROα、RANTESおよびMCP-1 からのものである。
【００８８】
低骨無機質密度を予防または治療するための治療方法も提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せをこのような治療が必要な場合に哺乳類に投与することを包含する。低無機質骨密度を予防または治療するためのペプチド３の変異体の好ましい誘導体は、CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］である。低無機質骨密度を予防または治療するのに有用な配列番号：１の好ましい断片は、KQK である。
【００８９】
治療的有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを脊椎動物に投与することを包含する前記の脊椎動物における腫瘍増殖を抑制する方法も提供される。好ましくは、方法は腫瘍部位でのマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはその他の免疫細胞関連活性を増大または増強する。本発明のこの実施態様に用いるための好ましいペプチドは、MCP-1 ペプチドである。
【００９０】
さらに、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを哺乳類に投与することを包含する哺乳類における慢性関節リウマチを予防または治療するための方法が提供される。本発明のこの実施態様に関しては、好ましいペプチドはMCP-1 、MIP1α、MIP1β、 GROαおよびENA78 ペプチドである。
【００９１】
臓器移植拒絶を予防または治療するための方法も提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを投与することを包含する。
【００９２】
さらに、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを哺乳類に投与することを包含する哺乳類における乾癬を予防または治療するための方法が提供される。乾癬を予防または治療するための好ましいペプチドは、MCP-1 、RANTES、MIP1α、MIG 、IP10、 GROβ、 GROαまたはMCP-3 のペプチドである。乾癬を予防または治療するための好ましい誘導体は、ペプチド３のCRD-誘導体である。
【００９３】
創傷治癒を増強するための方法も提供される。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを投与することを包含する。
【００９４】
さらに、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを哺乳類に投与することを包含する哺乳類におけるアレルギーを予防または治療するための方法が提供される。アレルギーを予防または治療するための好ましいペプチドとしては、RANTES、MIP1α、MCP-1 、MCP-2 、MCP-3 、MCP-4 、エオタキシンまたはMIP1βのペプチドが挙げられる。
【００９５】
本発明のさらに別の実施態様は、TNF-αの上昇に関連した適応症を予防または抑制するための方法である。方法は、有効量のケモカインペプチド３、ケモカインペプチド２、その変異体、その誘導体、式（IV）の化合物、式（Ｖ）の化合物、式（VI）の化合物、式（VII ）の化合物、式（VIII）の化合物、式（IX）の化合物、式（Ｘ）の化合物、式（XI）の化合物、式（XII ）の化合物、またはそれらの組合せを投与することを包含する。
本発明は、本発明の核酸分子がケモカイン誘導性活性に関連した適応症に苦しんでいるかまたはその危険のある哺乳類に投与される方法も提供する。
【００９６】
本発明は、それにより望ましい製剤の薬物動態が調節され得る方法も提供する。特に、循環から正常に迅速に清掃される作用物質は、赤血球上のダッフィー抗原に対する親和性を有する本発明のペプチドの付加により、より長く保持され得る。この方法は、その他の生物学的に活性な、製薬上有用なペプチド、ならびにより大きいポリペプチドまたはタンパク質の薬物動態を修飾するために特に適し得る。例えば、ダッフィー結合ペプチド（例えばペプチド２［MCP-1 ］）は、共有的にまたは非共有的に、組換え体比と成長ホルモン(HGH）またはインスリンのような分子と結合または連結され、そして蓄積注射により投与され得る。
【００９７】
赤血球に修飾HGH を分配することにより、HGH は、より長い半減期および血漿濃度の低迅速変化を伴う非常に適切な薬物動態を有する。別の例では、本発明のペプチドと結合したインスリンは、疾患が有意に進行した高インスリン耐性II型糖尿病患者のための治療として特に有用であり得る。その他の小分子は、活性分子の、およびダッフィー結合分子の意図された機能を保存する方法でダッフィー結合分子に結合され得る、とも考えられる。組換え体タンパク質およびペプチドとの結合のためには、ダッフィー結合ペプチドが好ましい。小分子薬剤との結合のためには、ダッフィー結合ペプチドの類似体（例えば同配体）が好ましい。
【００９８】
本発明の詳細な説明
定義
「ケモカイン」とは、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、平滑筋細胞、例えば脈管平滑筋細胞等に作用する（それらの移動、増殖または脱顆粒、あるいはTh1 およびTh2 サブタイプへのＴ細胞発達の免疫調節に影響を及ぼすことにより）前炎症シグナル分子の一族を指す。好ましいケモカインは、霊長類起源、例えばヒトのものであるが、しかし本発明はその他の哺乳類のケモカイン、例えばウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコまたは齧歯類起源のもの、ならびにウイルス的コード化ケモカインを含む。
【００９９】
ケモカインの例としては、MCP-1 （配列番号：１６）、MCP-2 （配列番号：１７）、MCP-3 （配列番号：１８）、MIG （配列番号：４５）、MIP1α（配列番号：１９）、MIP1β（配列番号：２０）、RANTES（配列番号：２１）、PF4 （配列番号：４６）、I-309 （配列番号：４７）、HCC-1 （配列番号：４８）、エトタキシン（配列番号：２５）、C10 （配列番号：４９）、CCR-2 （配列番号：５０）、ENA-78（配列番号：５２）、 GROα（配列番号：２４）、 GROβ（配列番号：５３）、IL-8（配列番号：２３）、IP-10 （配列番号：５４）、SDF1α（配列番号：２２）、SDF1β（配列番号：５６）、 GROα（配列番号：５７）、MIP3α、TCA-3 、CTAPIII 、MARC/FYK、β−トロンボグロブリン、GCP-2 、PBP 、HC14、MDC 、TECK、PARC、６Ｃカイン、フラクタリン、DC-CK1、LIX 、TARC、LARC、MIG 、Ckβ８、CCF18/MRP-2 、CCIII 、CKα2 、H1305 、Dvic-1、MGSA、Ckβ4 、DGWCC 、TCA4、デンドロカイン（WO97/29192参照）、CC2/HCC1、CC3 およびMIP1τ、ならびにウイルス的コード化ケモカイン、例えばvMIP-I、vMIP-II およびvMIP-III（Kledal et al., Science, 277, 1656 （1997）参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
「CXC 」または「α」ケモカインとしては、IL-8、PF4 、IP10、NAP-2 、 GROα、 GROβ、 GROγ、SDF1、MIP2、MGSA、γIP、CTAPIII 、β−トロンボグロブリン、MIG 、PBP 、NAP-2 およびENA78 が挙げられるが、これらに限定されない。「ＣＣ」または「β」ケモカインとしては、MCP-1 、MCP-2 、MCP-3 、MCP-4 、MCP-5 、RANTES、エトタキシン、LARC、TARC、C10 、MIP1α、MIP1β、I309、HCC-1 、CKβ8 、CCF18/MRP-2 、MIP1τが挙げられるが、これらに限定されない。第三の型のケモカインは、「Ｃ」ケモカイン、例えばリンフォタクチンである。第四の型のケモカインは、「CX3C」ケモカイン、例えばフラクタリンまたはニューロタクチンである（Rollins et al., Blood, 90, 404（1997））。第五の型のケモカインCX2Cケモカインとしては、CCIII が挙げられる。
【０１０１】
「ペプチド３」とはケモカインに由来するペプチドを指すが、これはケモカインのカルボキシ末端半分に一般的に位置し、当業界で周知の方法により確定されるように、少なくとも対応する元のケモカインの活性を抑制する。ペプチド３は、３０以下、好ましくは約３〜約２５、さらに好ましくは約３〜約１５、さらに好ましくは約３〜約１１のペプチジル残基を包含するが、これは対応する元のケモカイン、好ましくは哺乳類ケモカイン、例えば霊長類ケモカイン、例えばヒトケモカイン、あるいはウイルス的コード化ケモカインのアミノ酸配列との 100％連続アミノ酸配列相同性または同一性を有する。
【０１０２】
例えば、少なくともMCP-1 の活性を抑制するMCP-1 の好ましいペプチド３は、ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］、例えば配列番号：１に対応するアミノ酸配列、あるいはその断片または誘導体を有するペプチドである。本発明の別の好ましい実施態様は、ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］、例えば配列番号：７に対応するアミノ酸配列、あるいはその断片または誘導体を有するペプチドである。好ましくは、本発明のケモカインペプチド３は、IL-8、PF-4またはNAP-2 のペプチドを含まない。
【０１０３】
ケモカインアミノ酸配列の列、例えば表１に示したような列は、ケモカイン中のペプチド３配列の位置を同定するための一般的方法を提供する。一般に、非MCP-1 ケモカイン中のペプチド３は、成熟ヒトMCP-1 の約残基４６〜約残基６７に対応する。さらに、ペプチド３は、ケモカイン活性を抑制するアミノ酸配列以外の部分、例えばもとのケモカイン（即ち融合タンパク質）中には存在しないアミノ酸残基、核酸分子または標的部分、例えば抗体またはその断片、あるいはビオチンを、これらの部分がペプチド３の生物学的活性を実質的に低減しない限りは、包含し得ると考えられる。活性の実質的低減は、約９９％より多い活性の低減を意味する。
【０１０４】
「ペプチド２」とはケモカインに由来するペプチドを指すが、これは一般的にケモカインのアミノ末端三分の二に位置し、元の成熟ケモカインのアミノ末端約２０〜約２４アミノ酸残基を含まない。
一般にペプチド２はケモカイン作動薬であるが、しかしペプチド２は作動薬活性も拮抗薬活性も有さない（即ち「中性」）か、あるいはペプチドが少なくとも１つのケモカイン受容体と特異的に結合する限りは、ケモカイン拮抗薬であり得る。
【０１０５】
ペプチド２は、３０以下、好ましくは約３〜約２５、さらに好ましくは約１０〜約２５、さらに好ましくは約１０〜約１８のペプチジル残基を包含するが、これは対応する元のケモカインのアミノ酸配列との 100％連続アミノ酸配列相同性または同一性を有する。例えば、MCP-1 の好ましいペプチド２は、ペプチド２（1-15）［MCP-1 ］、例えば配列番号：３に対応するアミノ酸配列、あるいはその断片または誘導体を有するペプチドである。さらに好ましいペプチド２は、少なくとも１つのＤ異性体を包含するペプチド２である。好ましくは、本発明のケモカインペプチド２は、ペプチド２［PF4 ］、ペプチド２［IL-8］、ペプチド２［NAP-2 ］またはYNFTNRKISVQRLASYRRITSSK でない。
【０１０６】
ケモカインアミノ酸配列の列、例えば表１に示したような列は、その他のケモカイン中のペプチド２配列の位置を同定するための一般的方法を提供する。一般に、非MCP-1 ケモカイン中のペプチド２は、成熟ヒトMCP-1 の約残基２７〜約残基４５に対応する。ペプチド２は、ケモカイン活性を模倣するか、増強するかまたは影響を及ぼさない（即ち中性）アミノ酸配列以外の部分、例えばもとのケモカイン中には存在しないアミノ酸残基、核酸分子または標的部分、例えばペプチド３に関して前記したものを、これらの部分がペプチド２の生物学的活性を実質的に変えない限りは、包含し得ると考えられる。活性の実質的変化とは、約９９％より多い変化を意味する。
【０１０７】
さらに好ましくは、本発明のペプチド、変異体、類似体または誘導体は、少なくとも１つのケモカイン受容体に対する親和性の増大、例えば約１μＭ〜約１nM、さらに好ましくは約１nM〜約１pMの増大を、そしてさらに好ましくは対応する元の（「野生型」）配列を有するペプチドに対する、あるいは対応する元のケモカインに対するダッフィー結合低減を示す。しかしながら、ある集団は、ダッフィー−である個体を有し、例えばあるパーセンテージのアフリカ系アメリカ人はダッフィー−である。したがって、これらの集団を治療するのに有用な作用物質は、対応する元のケモカインと等しいかまたはそれより大きいダッフィー結合親和性を有し得る。
【０１０８】
本明細書において使用するとき、用語「単離されたおよび／または精製された」は、本発明の治療剤がin vivo 物質に関連しないように、それはin vitroの製造、単離および／または精製を意味する。こうして、「単離された核酸分子」に関すると、それはゲノム、cDNA、または合成由来のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合わせを包含し、「単離された核酸分子」は（１）「単離された核酸分子」が自然に見出されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部分に関連せず、（２）自然に連鎖されないポリヌクレオチドに作用可能に連鎖されているか、あるいは（３）より大きい配列の一部分として天然に存在しない。単離された核酸分子は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマーの形態、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれらの型の修飾された形態を意味する。
【０１０９】
この用語はDNA の一本鎖または二本鎖の形態を包含する。本明細書において言及する用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する、および天然に存在しないオリゴヌクレオチドの連鎖により一緒に結合された、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは200 塩基またはそれより短い長さのポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは10〜60塩基の長さ、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19または20〜40塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは通常一本鎖、例えば、プローブであるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、変異型の構築において使用するために、二本鎖であることができる。
【０１１０】
本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドであることができる。本明細書において言及する用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及する用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾されたまたは置換された糖基およびその他を有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及する用語「オリゴヌクレオチドの連鎖」は、オリゴヌクレオチドの連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート、およびその他を包含する。オリゴヌクレオチドは、所望ならば、検出のための標識を含むことができる。
【０１１１】
用語「単離されたポリペプチド」は、cDNAまたは組換えtRNAによりコードされるポリペプチドを意味するか、あるいは合成由来であり、またはそれらのいくつかの組換えであり、この単離されたポリペプチドは（１）自然に見出されるタンパク質に関連せず、（２）同一源からの他のタンパク質を含まず、例えば、ヒトタンパク質を含まず、（３）異なる種からの細胞により発現されるか、あるいは（４）天然に存在しない。
【０１１２】
用語「配列の相同性」は、２つの核酸配列の間の塩基の合致の比率または２つのアミノ酸配列の間のアミノ酸の合致の比率を意味する。配列の相同性は百分率として、例えば、５０％として表すとき、百分率はいくつかの他の配列と比較されるケモカインからの配列の長さにわたる合致の比率を表す。ギャップ（２つの配列のいずれかにおける）は合致を最大とするために許容される；１５塩基またはそれより短いギャップ長さを通常使用され、６塩基またはそれより短いギャップ長さは好ましく、２塩基またはそれより短いギャップ長さは最も好ましい。
【０１１３】
オリゴヌクレオチドをプローブまたは処理剤として使用するとき、ターゲット核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列の相同性は一般に２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の合致のうちの１７ターゲット塩基の合致（８５％）以上である；好ましくは１０の可能な塩基対の合致のうちの９の合致（９０％）以上であり、より好ましくは２０の可能な塩基対の合致のうちの１９の合致（９５％）以上である。
【０１１４】
用語「選択的ハイブリダイゼーションする」は、検出可能に、特異的に結合することを意味する。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびフラグメントは、非特異的核酸に対する検出可能な結合の感知可能な量を最小とするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に、核酸鎖に選択的にハイブリダイゼーションする。高いストリンジェンシイ条件を使用して、この分野において知られおりかつ本明細書において論ずる、選択的なハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメントと、問題の天然および合成のとの間の核酸配列の相同性は少なくとも６５％、いっそう典型的には好ましくは増加する相同性は少なくとも約７０％、約９０％、約９５％、約９８％、そして 100％である。
【０１１５】
２つのアミノ酸配列の間の部分的または完全な同一性が存在する場合、それらの配列は相同性である。例えば、２つの配列が最大の合致で整列されるとき、８５％の相同性はアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大とするとき、ギャップ（合致する２つの配列のいずれかにおける）は許される；５またはそれより短い長さは好ましく、２またはそれより短い長さはより好ましい。
【０１１６】
あるいは、また、好ましくは、突然変異のデータマトリックスおよび６またはそれより大きいギャップペナルティーを用いるプログラムALIGN を使用して、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸の長さのそれらから誘導されたポリペプチド配列）が５より大きい整列スコア（標準偏差の単位において）を有する場合、この用語を本明細書において使用するとき、それらは相同性である。下記の文献を参照のこと：Dayhoff, M.O. Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, Vol.5, National Research Foundation, pp.101-110、およびこれに対するSupplement 2, pp.1-10 。２つの配列またはそれらの一部分は、ALIGN プログラムを使用して最適に整列したとき、それらのアミノ酸が５０％またはそれより高い同一性を有する場合、より好ましくは相同性である。
【０１１７】
用語「に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分に対して相同性である（すなわち、同一であり、厳格に進化的に関係しない）ことを意味するか、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチドに同一であることを意味するために使用される。対比的に、用語「に対して相補的」は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分に対して相同性であることを意味するために使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「TATAC 」は参照配列「TATAC 」に対応し、そして参照配列「GTATA 」に対して相補的である。
【０１１８】
２またはそれ以上のポリヌクレオチドの間の配列の関係を記載するために、下記の用語を使用する：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列の同一性」、「配列の同一性の百分率」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列の比較の基準として使用される規定された配列である；参照配列は、例えば、全長のcDNAのセグメントとして、より大きい配列のサブセットであることができるか、あるいは配列のリストに記載する遺伝子配列は完全なcDNAまたは遺伝子配列からなることができる。
【０１１９】
一般に、参照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、頻繁に少なくとも２５ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２つのポリヌクレオチドは各々（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分）からなることができ、そして（２）２つのポリヌクレオチドの間で発散する配列をさらに含むことができ、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドを「比較ウィンドウ」にわたって比較して配列の類似性の局所的領域を同定しかつ比較することによって実施される。
【０１２０】
「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用するとき、少なくとも２０の隣接ヌクレオチドの概念的セグメントを意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適な整列のために参照配列（これは付加または欠失を含まない）に比較して、２０％またはそれより少ない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【０１２１】
比較ウィンドウの最適な整列のために配列の最適な整列は下記の方法により実施することができる：Smith およびWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2 : 482の局所的相同性のアルゴリズム、Needleman およびWunsh (1970) J. Mol. Biol. 48 : 443 の相同性の整列のアルゴリズム、Pearson およびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85 : 2444 の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（GAP, BESTFIT, FASTA 、およびTFASTA, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. 、ウイスコンシン州マディソン）、または検査。そして、種々の方法により発生した最良の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたる相同性の最高の百分率を生ずる）を選択する。
【０１２２】
用語「配列の同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドの基準で）ことを意味する。用語「配列の同一性の百分率」は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドの基準で）ことを意味する。用語「配列の同一性の百分率」は次のようにして計算される：比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が双方の配列の中に存在して合致した位置の数を生ずる位置の数を決定し、合致した位置を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で割り、そして結果に100 を掛けて配列の同一性の百分率を得る。
【０１２３】
本明細書において使用するとき、用語「実質的な同一性」はポリヌクレオチド配列の特性を意味し、ここでポリヌクレオチドは、少なくとも２０のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁に少なくとも２０〜５０のヌクレオチドのウィンドウにわたって参照配列に比較して、少なくとも８５％の配列の同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列の同一性、より通常少なくとも９９％の配列の同一性を有する配列からなり、ここで配列の同一性の百分率は、比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０％またはそれより少ない欠失または付加を含むことができるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって、計算される。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、ヒトMCP-1 のセグメントであることができる。
【０１２４】
用語「実質的な同一性」は、ポリペプチドに適用するとき、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップ重量を使用してプログラムGAP またはBESTFIT により、最適に整列したとき、少なくとも約８０％の配列の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列の同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％の配列の同一性を共有することを意味する。
【０１２５】
本明細書において使用するとき、用語「標識」または「標識化」は、例えば、マークしたアビジン（例えば、光学的または比色方法により検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの放射性アミノ酸の組込みまたは結合による、検出可能なマーカーの組込みを意味する。種々のポリペプチドの標識化法はこの分野において知られており、そして使用することができる。
【０１２６】
ポリペプチドのための標識の例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：放射性同位元素（例えば、 3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、 125Ｏ、 131Ｉ）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド、リン）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次リポーターにより認識される前もって決定したポリペプチドのエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。ある態様において、標識化を種々の長さのスペーサーアームにより結合させて潜在的立体的障害を減少させる。
【０１２７】
本明細書において使用するとき、「実質的に純粋な」は、目的の種が存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、それが組成物中の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味し、好ましくは実質的に精製された画分は、目的の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物の中に存在するすべての高分子種の約８０％より多く、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％、そして約９９％より多くを構成するであろう。最も好ましくは、目的の種は本質的に均質に精製され（汚染する種は慣用の検出法により組成物の中に検出することができない）ここで組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
【０１２８】
ペプチド３またはペプチド２の単離された「ケモカインペプチド変異型」は、対応する天然のケモカインのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％であるが、 100％より低い、隣接アミノ酸配列の相同性または同一性を有する、３０より多い、好ましくは約３〜約２５、より好ましくは約３〜約１８、なおより好ましくは約３〜約１１のペプチジル残基からなるペプチドであり、例えば、Ser7ペプチド３（1-12）［MCP1］（配列番号：11）は、MCP-1 、すなわち、ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１）の対応するアミノ酸配列に対して、 100％より低い相同性を有する。本発明の変異型は、対応する天然のケモカインの中に存在しないアミノ酸残基、および対応する天然のケモカインに関して内部の欠失を含むことができる。ケモカインペプチドの変異型は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を有するペプチドを包含する。
【０１２９】
化学的修飾、例えば、エステル化、アミド化，還元、保護およびその他を受ける、ケモカインのペプチドまたはペプチド変異型は、ケモカイン「誘導体」と呼ばれる。例えば、in vivo のペプチドの安定性および生物学的利用性を改良することが知られている修飾は、例えば、１またはそれ以上のジサルファイド結合を通す、ペプチドの環化である。好ましい修飾は、本発明のペプチドの環状逆方向配列誘導体(CRD）の合成である。ペプチドの逆方向（すなわち、Ｃ末端→Ｎ末端）配列を用い、すべてのＤ型アミノ酸を使用して、線状ペプチドを合成する。
【０１３０】
必要に応じて、追加のシステイン残基をＮおよびＣ末端に付加し（ペプチド配列がＮおよびＣ末端のcys 残基を既にもたない場合）、これにより酸化的環化を可能とする。しかしながら、用語「CRD 」は、他のメカニズム、例えば、ペプチジル結合、およびその他を介する、環化を包含する。本発明の好ましい誘導体は、CRD-Cys0Cys13Leu4Ile11ペプチド３［MCP-1 ］またはCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］である。
【０１３１】
また、用語「誘導体」の範囲内に、線状逆方向Ｄ(LRD）および環化前方向Ｌ(CFL）誘導体が包含される。LRD 誘導体はペプチドの逆方向（すなわち、Ｃ末端→Ｎ末端）配列であり、すべてはＤ型アミノ酸であるが、環化されていない。CFL 誘導体はペプチドの前方向（すなわち、Ｎ末端→Ｃ末端）配列であり、すべてはＬ型アミノ酸であるが、追加のＮおよびＣ末端のcys 残基（ペプチド配列はＮまたはＣ末端の位置のいずれかの位置においてcys 残基を既にもたない場合）を有し、次いで酸化的環化、またはオールタネイト法により環化を有する。本発明の他の誘導体は、分枝鎖状ペプチド、環状、分枝鎖状および分枝鎖状および環状ペプチドを包含する。
【０１３２】
「ケモカインアナローグ」は、ケモカイン誘導活性を模擬または阻害するか、あるいはケモカインレセプターにまたはその付近に結合するが、ケモカイン活性を模擬または阻害しない（中性）成分を意味し、ここでケモカイン誘導活性を模擬または阻害するか、あるいはレセプターにまたはその付近に結合するが、中性である成分の一部分はペプチドではなく、そしてアナローグの活性部分は核酸分子ではない。本明細書において使用するとき、用語「模擬」は成分が天然のケモカインにより誘導される活性を誘導するが、アナローグによる誘導は天然のケモカインによる活性の誘導と同一の大きさである必要ではない。
【０１３３】
また、本発明のケモカインのペプチド、それらの変異型、アナローグおよび誘導体は、ケモカイン活性を阻害または模擬するか、あるいはシグナリングを引き出すか、あるいは阻害しないでケモカインレセプターにまたはその付近に結合する部分以外の成分、例えば、ペプチドまたはポリペプチドの分子、例えば、抗体またはそのフラグメントまたは融合タンパク質、核酸分子、糖、脂肪、検出可能なシグナル分子、例えば、放射性同位元素、例えば、ガンマエミッタまたは音波エミッタ、小さい化学物質、金属、合成ポリマー、例えば、ポリアクチドおよびポリグリコリド、界面活性剤およびグリコスアミノグリカンからなることができることが考えられ、これらはケモカイン誘導活性を模擬または阻害するペプチド、変異型、アナローグまたは誘導体の部分に共有結合または連鎖されていることが好ましく、ただし他の部分はペプチド、変異型、アナローグまたは誘導体の生物学的活性を変更してはならない。
【０１３４】
本発明の好ましいケモカインアナローグは、式（IV）の化合物、またはその薬学上許容される塩である：
【化１６】
0004523151.tif 000011
【０１３５】
式中、
Ｒ1 はアリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、クマリル、クマリル（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキル、クロマニルまたはクロマニル（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキルであり、ここでアリールまたはヘテロアリール基、またはクマリルまたはクロマニル基は必要に応じてハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルカノイル、（Ｃ2 −Ｃ6 ）アルカノイルオキシ、-C(=O)（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシ、C(=O) NRg R h 、NRi R j から成る群より選択される１、２または３つの置換基で置換することができ、
【０１３６】
Ｒ2 は（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Ra ) (Rb ）であり、
Ｒ3 は（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ8 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Rc ) (Rd ）であり、
【０１３７】
Ｙはオキシまたはチオオキソであり、
Ｚは（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシまたはN (Re ) (Rf ）であり、そして
Ｒa 〜Ｒj の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジル、またはフェネチルであるか、あるいはＲa およびＲb 、Ｒc およびＲd 、Ｒe およびＲf 、Ｒg およびＲh 、またはＲi およびＲj はそれらが結合する窒素原子と一緒になってピロリジノ、ピペリジノ、またはモルホリノから選択される環を形成する。
【０１３８】
式（IV）の化合物の好ましい態様は、Ｒ1 がアリール、ヘテロアリール、クマリル、またはクロマニルである、式（IV）の化合物を包含する。好ましくは、アリールはフェニルであり、そしてヘテロアリールはインドリルまたはピリジニルである。式（IV）の化合物の他の好ましい態様は、Ｒ2 がN (Ra ) (Rb ）であり、そしてＲ3 がN (Rc ) (Rd ）である、式（IV）の化合物である。式（IV）の化合物は、Ｚが（Ｃ1 −Ｃ10）アルキルである、式（IV）の化合物を包含する。
【０１３９】
他の好ましい化合物は、Ｒ1 がインドリルであり、Ｒ2 がN (Ra ) (Rb ）であり、Ｒ3 がN (Rc ) (Rd ）であり、ＹがＳであり、Ｚが水素であり、そしてＲa 、Ｒb 、Ｒc 、およびＲd の各々がメチルである、式（IV）の化合物である。
なお式（IV）の他の好ましい化合物は、Ｒ1 が２−ベンズイミダゾリルであり、Ｒ2 がN (Ra ) (Rb ）であり、Ｒ3 がN (Rc ) (Rd ）であり、Ｙがオキソであり、そしてＺがN (Rc ) (Rf ）である化合物またはその薬学上許容される塩である。式（IV）の他の好ましい化合物は、Ｒ1 が２−ベンズイミダゾリルであり、Ｒ2 がN (Me)2 であり、Ｒ3 がN (Me)2 である、化合物またはその薬学上許容される塩である。
【０１４０】
本発明の他の好ましいケモカインアナローグは、式（Ｖ）の化合物またはその薬学上許容される塩である：
【化１７】
0004523151.tif 000012
【０１４１】
式中、
Ｒ4 はNRk R l であり、
Ｒ5 はNRm R n であり、
Ｒ6 はNRo R p であり、
Ｒ7 はNrq R r であり、
Ｒ8 は水素、ヒドロキシ、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシ、NRs R t 、アミノ酸のアミノ末端の残基または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドのＮ末端の残基であり、
【０１４２】
Ｒk 、Ｒl 、Ｒo 、およびＲp の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルカノイル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、Ｒm およびＲn の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシ、（Ｃ1 −Ｃ10）アルカノイル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェニル、ベンジル、フェネチル、アミノ酸のカルボキシ末端の残基または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、
【０１４３】
Ｒq およびＲr の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルであり、
Ｒs およびＲl の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキル、フェニル、ベンジルまたはフェネチルである。
【０１４４】
好ましくはＲk 、Ｒl 、Ｒo 、およびＲp の各々は水素であり、Ｒm およびＲn の各々は独立して水素、アセチル、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキル、プロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、アミノ酸のＣ末端の残基または２〜約２５アミノ酸残基のペプチドであり、そしてＲq およびＲr の各々は独立して水素、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキル、または（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキルである。
【０１４５】
本発明のそれ以上の好ましいケモカインアナローグは、式（VI）の化合物である：
【化１８】
0004523151.tif 000013
【０１４６】
本明細書において使用するとき、ハロはフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードである。用語アルキルおよびアルコキシは、直鎖状および分枝鎖状の双方の基を表すが、個々の基、例えば、「プロピル」に対する言及は直鎖状の基のみを包含し、分枝鎖状の異性体、例えば、「イソプロピル」は特に言及される。アリールはフェニル基または少なくとも１つの環が芳香族である、約９〜１０個の環原子を有するオルト−融合二環式炭素環式基を表す。
【０１４７】
ヘテロアリールは、炭素および各々が非ペルオキシド酸素、硫黄、およびN (R4)（ここでＲ4 は存在しないか、あるいは水素、（Ｃ1 −Ｃ4 ）アルキル、フェニルまたはベンジルである）から成る群より選択される１〜４個のヘテロ原子から成る５〜６つの環原子を含有する一環式芳香族環の環炭素を介して結合した基、ならびにそれらから誘導された約８〜１０個の環原子のオルト−融合二環式複素環、特にベンズ誘導またはプロピレン、トリメチレン、またはテトラメチレンのジラジカルをそれに融合させることによって誘導されたものの基を包含する。
【０１４８】
当業者は認識するように、キラル中心を有するペプチドである、本発明の化合物を包含する式（IV）、（Ｖ）、または（VI）の化合物は、光学的に活性な形態およびラセミ体の形態で存在し、単離することができる。例えば、本発明の化合物はＤまたはＬ型、またはそれらの混合物のα−アミノ酸残基からなる。ある化合物は多形性を示すことができる。本発明は本発明の化合物のラセミ体、光学的に活性な、多形性、または立体異性体の形態、またはそれらの混合物を包含し、これらは本明細書に記載する有用な性質を有することを理解すべきである。
【０１４９】
光学的に活性な形態を製造することは、この分野においてよく知られている（例えば、結晶化技術によりラセミ体の形態の分割、光学的に活性な出発物質からの合成、キラル合成、またはキラル静止相を使用するクロマトグラフィーの分離による）。また、本明細書に記載する標準的試験を使用するか、あるいはこの分野においてよく知られている他の試験を使用して、ケモカイン誘導活性を阻害または増強する化合物の能力を決定することは、この分野においてよく知られている。
基、置換基、および範囲について本明細書において列挙する特定の、好ましい値は例示のためであり、そしてそれらは他の定義した値または基および置換基について定義した範囲内の他の値を排除しない。
【０１５０】
詳しくは、（Ｃ1 −Ｃ10）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、またはデシルであることができ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、またはヘキシルであることができ、（Ｃ1 −Ｃ3 ）アルキルは、メチル、エチル、またはプロピルであることができ、（Ｃ3 −Ｃ6 ）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルであることができ、（Ｃ1 −Ｃ10）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、またはデシルオキシであることができ、
【０１５１】
（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ、またはヘキソキシであることができ、（Ｃ1 −Ｃ10）アルカノイルは、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、またはデカノイルであることができ、（Ｃ1 −Ｃ6 ）アルカノイルは、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、またはヘキサノイルであることができ、（Ｃ2 −Ｃ6 ）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、またはヘキサノイルオキシであることができ、アリールはフェニル、インデニル、またはナフチルであることができ、そしてヘテロアリールは、フリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル（またはそのＮ−オキシド）、チエニル、ベンズイミダゾリル（またはそのＮ−オキシド）、ピリミジニル（またはそのＮ−オキシド）、インドリル、またはキノリル（またはそのＮ−オキシド）であることができる。
【０１５２】
好ましくは、本発明の治療剤は生物学的に活性である。ケモカインのペプチド、ペプチド変異型、そのアナローグまたは誘導体の生物学的活性はこの分野において知られている方法により測定することができ、それらの方法のいくつかは後述される。例えば、本発明の範囲内に入る生物学的に活性なペプチド３［MCP-1 ］変異型は、対応する天然のペプチド配列、例えば、ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１）、または天然のケモカイン、例えば、MCP-1 （配列番号：16）の活性の少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％を有する。
【０１５３】
こうして、本発明の範囲内に入るペプチド３変異型、例えば、Leu4Ile11 ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］は、 100μＭにおいてペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１）の最大の活性の少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％である阻害についてのED50を有する。
【０１５４】
同様に、例えば、本発明の範囲内に入るペプチド２［MCP-1 ］、その変異型、アナローグまたは誘導体は、 100μＭにおいて配列番号：３の最大の活性の少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％であるケモカイン様活性についてのED50を有する。あるいは、本発明の範囲内に入るペプチド、その変異型、アナローグまたは誘導体は、同一レセプターについてのペプチド２（1-15）［MCP-1 ］（配列番号：３）のアフィニティーの少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％であるアソシエーション定数を有する細胞に結合する。
【０１５５】
本明細書において使用するとき、「ケモカイン誘導活性」は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ケモカインレセプターに対するケモカイン、本発明の治療剤または他の成分、例えば、ウイルスのタンパク質の結合、または活性が変更されるようにレセプターに対して密接に物理的に近接する治療剤または他の成分の結合により引き出される活性。ケモカインレセプターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：CCR1、CCR2a 、CCR2b 、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、IL8R1 、IL8R2 、CC-CKR1 、CC-CKR2 、CC-CKR3 、CXCR1 、CXCR2 、CXCR3 、CX3CR およびCXCR4 。ケモチドレセプターは、細胞の移動、細胞の活性化、ウイルスまたは寄生生物のエントリー、前炎症性化合物の放出、およびその他においてある役割を演ずる。
【０１５６】
本明細書において使用するとき、「ケモカイン誘導活性に関連する誘導」は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アテローム性動脈硬化症および局所的または全身的脈管炎の他の形態、疾患、例えば、心筋梗塞、卒中およびアテローム性動脈硬化症に対して二次的である急性虚血；高血圧症；再灌流損傷（Kumar et al., Circulation 95 : 693 (1997) ）；大動脈性動脈瘤；静脈移植片形成不全；血管形成；高コレステロール血症；鬱血性心不全；川崎病；特に血管形成術を受けている患者における、狭窄または再狭窄；
【０１５７】
病理学的に低い骨ミネラル密度、例えば、オステオポローシス（Posner et al., Bone 21 : 321 (1997) ）；潰瘍性大腸炎；慢性閉塞性肺疾患；ヒト免疫不全ウイルス(HIV）、１または２以上のケモカインレセプターの同様なメカニズムを有する他のレンチウイルスまたはレトロウイルスによる感染、または他のウイルス、例えば、サイトメガロウイルスによる感染（Sozzani et al., J. Leukoc. Biol. 62, 30 (1997)）、またはウイルス性腹膜炎を生ずるウイルスの感染；器官の移植、例えば、急性移植片の拒絶反応、異系移植片の拒絶反応および移植片／宿主疾患；移植脈管療法；
【０１５８】
マラリアおよびマラリア原虫に関係する寄生体による感染の他の結果；ぜん息；アレルギー性疾患、例えば、アトピー（IgE 仲介成分）、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、アレルギー性気管支肺性アスペルギルス症（IgE 仲介）、および  過敏性肺炎（高いIgG および反応性Ｔ細胞）（鳩飼育家病、農夫肺疾患、加湿肺疾患、麦芽労働者肺疾患）、アレルギー、例えば、哺乳動物、例えば、家畜、例えば、イヌおよびネコにおけるノミアレルギー性皮膚炎、カの刺傷または他の昆虫の刺創のアレルギー、ツタウルシ、毒オーク、毒漆、または他の皮膚アレルギー；嚢胞性線維症；
【０１５９】
溶血性尿毒症症候群（Van Setten et al., Pediatr. Res. 43, 759 (1998) ）；下記のものを包含するが、これらに限定されない自己免疫疾患、糖尿病Ｉ型、クローン病、多発性硬化症、関節炎、慢性関節リウマチ（Ogata et al., J. Pathol. 182 : 106 (1997) ; Gong et al., J. Exp. Med. 186, 131 (1997) ）、全身性エリテマトーデス、自己免疫（橋本）甲状腺炎、自己免疫肝疾患、例えば、肝炎および原発性胆汁性肝硬変、甲状腺機能亢進症（グレーブス病；甲状腺中毒症）、インスリン耐性糖尿病、自己免疫副腎機能不全（アジソン病）、自己免疫卵巣炎、自己免疫睾丸炎、自己免疫溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿素症、ベーチェット病、自己免疫血小板減少症、自己免疫好中球減少症、悪性貧血、真性赤血球性貧血、自己免疫凝固障害、重症筋無力症、自己免疫多発性神経炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、天疱瘡および他の球疾患、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー症候群、心臓切開後症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、および強皮症；
【０１６０】
眼の疾患、例えば、ブドウ膜炎および盲性ヘルペス間質性角膜炎；肝疾患；エーリヒオシス（erhlichiosis）またはライム関節炎を包含するライム病；異常な造血；例えば、常染色体優勢多発性腎疾患、糖尿病性ニューロパシイ、IgA ニューロパシイ、腸線維形成、または狼瘡のための腎炎；ならびに局所的または全身的、例えば、過敏性または炎症性腸症候群から生ずる不適切な炎症（Mazzucchelli et al., J. Pathol. 178, 201 (1996) ）、乾癬（Gillitzer, Arch. Dermtol. Res. 284, 26 (1992) ; Yu et al., Lab. Investig. 71, 226 (1994)）、遅延型過敏症、アルツハイマー病、慢性肺炎症、例えば、肺胞炎および肺性肉芽腫、歯肉炎または歯根膜疾患、および歯肉由来の病変に関連する骨性炎症（Volejnikova et al., Am. J. Pathol. 150, 1711 (1997) ）、
【０１６１】
過敏症肺疾患、例えば、過敏症肺炎（Sugiyama et al., Eur. Respir. J. 8, 1084 (1995) ）、および好塩基球からのヒスタミン放出に関係する炎症（Dvorak et al., J. Allerg. Clin. Immunol. 98, 355 (1996) ）、例えば、枯草熱、マスト細胞からのヒスタミンの放出（Galli et al., Ciba Foundation Symposium 147, 53 (1989)）、またはマスト細胞の腫瘍、１型の過敏性反応（アナフィラキシー、皮膚アレルギー、じんま診、アレルギー性鼻炎、およびアレルギー性胃腸炎）；糸球体腎炎（Gesualdo et al., Kdney International 51, 155 (1997) ）；腹腔透析に関連する炎症（Sach et al., Nephrol. Dial. Transplant 12, 315 (1997) ）；および膵臓炎。
【０１６２】
本発明の範囲内に入る他の適用は下記のものを包含するが、これらに限定されない：新形成、例えば、組織細胞腫、グリオーム、肉腫、骨肉腫、骨腫（Zheng et al., J. Cellular Biochem. 70, 121 (1998) ）、黒色腫、カポージ肉腫、小細胞肺癌、および卵巣癌ならびに化学療法に関連する骨髄抑制および粘膜炎；例えば、円板外科手術後の、脳および脊髄の外傷（Ghirnikar et al., J. Neurosci. Res. 46, 727 (1996) ; Berman et al., J. Immunol. 156, 3017 (1996)；通風；例えば、ヒト、畜牛、ブタおよびその他のための、肺の疾患、または肺の損傷（Lukcas et al., Adv. Immunol. 62, 257 (1996) ；
【０１６３】
卒中；レフラー症候群；慢性好酸球性肺炎；肺性線維症；創傷の治癒；細菌感染、例えば、細菌性腹膜炎または髄膜炎；肉芽腫性疾患、例えば、マイコバクテリウム症、ニューモシスト症、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、アスペルスギルス症、肉芽腫性腸炎、カンジダ症、異物性肉芽腫および腹膜炎、肺性肉芽腫症、ウェーゲナー肉芽腫症（Del Papa et al., Arthritis Rheum. 39, 758 (1996)）、癩病、梅毒、ネコ引っ掻き病、住血吸虫症（Jacobs et al., Am. J. Pathol. 150, 2033 (1977)）、珪肺症、サルコイドーシス（Iida et al., Thorax 52, 431 (1997) ; Car et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 149, 655 (1994) ）およびベリリウム症；
【０１６４】
致死性内毒素血症（Zisman et al., J. Clin. Invest. 99, 2832 (1997) ）；および弱い炎症性反応、例えば、寄生体感染において起こる反応、例えば、リーシュマニア症（Moll, Biol. Abs. 104, 21765 (1997)）、トリパノソーマ、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）またはヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の感染、蠕虫の感染、例えば、線虫（線形動物）；（鞭虫症、蟯虫症、回虫症、鉤虫、糞線虫症、旋毛虫症、住血糸状虫症）；
【０１６５】
吸虫症（異常流出）（住血吸虫症、肝ジストマ症）、条虫（cestode ）（条虫（tape worms）（エキノコックス症、無鉤虫症、嚢虫症）；内臓、内臓幼虫移行症（例えば、トキソカラ属（Toxocara) ）、好酸球性胃腸炎（例えば、アニサキ（Anisaki ）種、フォカネマ（Phocanema)種）、皮膚幼虫移行症（アンキロストマ・ブラジリエンセ（Ancylostoma braziliense ）、アンキロストマ・カニヌム（Ancylostoma caninum ）、または真菌の感染。
【０１６６】
さらに、弱い炎症反応に関連する適応症を予防または治療するために、本発明の因子、すなわち、ペプチド２、その変異型、アナローグおよび誘導体をワクチンのアジュバントとして使用することができる。
本発明のペプチドは、また急性呼吸窮迫症候群、およびステロイドが日常的に使用されている疾患（例えば、再発性ベヘーアズ（Beheers ）大腸炎およびぜん息）において、避妊薬として、または流産を誘発するために有用であることがある。
【０１６７】
また、腫瘍壊死因子(TNFα）、例えば、慢性関節リウマチまたは内毒素腫に関連する適応症、または TNFαのレベルの増加に関連する適応症が本発明の範囲内に含まれる。これらの適応症は下記のものを包含するが、これらに限定されない：エンドトキシンショック；膠原病；熱病、および流行性感冒様症候群；急性間質性肺炎；敗血性および非敗血性ショック；急性呼吸窮迫症候群；血栓塞栓性症状；骨吸収；関節炎；急性移植片対宿主の疾患；脳性マラリア；結核または癌の悪液質；肺の損傷；および特発性線維症。
【０１６８】
Ｉ．本発明の範囲内に入る治療剤の同定
本発明の実施において有用な薬剤は、ケモカイン誘導活性、例えば、単球またはマクロファージの漸増を阻害または減少する（例えば、ケモカインレセプターのアンタゴニスト）か、あるいは増加、増強または増大する（例えば、ケモカインレセプターのアゴニスト）薬剤を包含する。これらの薬剤は、in vitroおよびin vivo のアッセイにより同定することができる。本発明の範囲内に入る薬剤のすべてがin vitroおよびin vivo においてケモカイン誘導活性を阻害または増強することができるわけではないことは認識されている。
【０１６９】
本発明の治療剤は、直接的レセプター結合性アゴニストおよび／またはアンタゴニストであることができるか、あるいは異なるメカニズム、例えば、アンチセンス核酸とケモカインmRNAとの二本鎖の形成によるか、あるいは２以上のメカニズムにより、ケモカイン誘導活性を変更するように、作用することができる。
【０１７０】
Ａ．ペプチド、変異型、誘導体およびアナローグ
１．in vitro化学走性
ある因子がケモカイン誘導活性、例えば、マクロファージの漸増を阻害するかどうかを決定するために、変化する量の因子を既知の化学誘引物質の存在において細胞と混合する。例えば、ある範囲の既知の濃度の因子、例えば、ケモカインのペプチドを、トランス−ウェルのプレートの上部の区画の個々のウェル中で、定められた数（例えば、１０4 〜１０6 ）とインキュベートする。ケモカイン（例えば、MCP-1 、MIP1α、IL8 または SDF-1α）は、トランス−ウェル移動アッセイにおいてTHP-1 細胞の有意な移動を引き起こすことが知られている濃度において、下部の区画の中に入れる（第１図）。
【０１７１】
次いで細胞を３７℃において移動を可能とするために十分な時間、例えば、４時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞をピペットでフィルターの上部から取出し、２０μｌの簡単なPBS 中の２０mMのEDTAを各上部のウェルに添加し、４℃において２０分間インキュベートする。おだやかな流れを使用して培地でフィルターを注意してフラッシュし、取出す。THP-1 細胞（２９μｌ中の）の２倍の希釈系列から成る標準曲線を作成して、移動した細胞の数を正確に定量する。
【０１７２】
移動した細胞を３μｌのMTT ストック色素溶液で染色し、ここで色素溶液は各ウェルに直接添加し（フェノールレッドを含まないRPMI-1640 中の５mg／ml、Sigma Chemical Co.) 、３７℃において４時間インキュベートする。培地を注意して各ウェルから吸引し、変換した色素を２０μｌのDMSOにより可溶化する。ELISA プレートリーダーにより 595nmの波長において、変換した色素の吸収を測定する。次いで、各ウェル中の移動した細胞の数を標準曲線の内挿により決定する（また、Imai et al., J. Biol. Chem. 272, 15036 (1997) 、参照）。
【０１７３】
細胞を計数するために適当な任意の方法、例えば、血球計を使用する計数、細胞とMTT とのインキュベーション（上を参照）、またはFACS解析を使用することができる。また、TGF-βまたは他のケモカイン化学誘引物質（例えば、 IL1βまたは TNFα）を使用して、陰性の対照のアッセイを実施する。因子が細胞障害性であるがどうかを評価するために、同一濃度の因子をTHP-1 細胞とインキュベートする。１）移動を阻害するレベルにおいて細胞障害性ではない、２）陰性の対照が誘導した移動の阻害において有効であり、そして３）ケモカインが誘導するTHP-1 の移動を減少または阻害する因子は、本発明の範囲内に入る因子である。
【０１７４】
また、ヒト好中球、好酸球、マスト細胞、好塩基球、血小板、リンパ球または単球を使用して走化アッセイにおいて、因子をスクリーニングする。単球について、１mlの 3.8％のクエン酸ナトリウムを含有する管に９mlの新鮮な血液を移し、室温において１５分間放置する。５mlのこの抗凝固化血液を 3.5mlのポリモーフプレプ（PolymophprepR ）（オスロ州ナイコウムドファーマ）上に注意して層状化し、製造業者の使用説明書に従い 500ｇにおいて３５分間遠心する。
【０１７５】
試料／培地の界面における上部のバンドは単球を含有する。単球をガラス製ピペットで注意して取出し、等しい体積（５ml）に再構成する。細胞を PBS＋１０％のウシ胎児血清で洗浄し、 400ｇにおいて１０分間遠心する。細胞の計数前に、洗浄工程を３回反復する。細胞を RPMI-1640＋１０％のウシ胎児血清(FCS）中で１×１０7 細胞／mlに再懸濁させる。単球を５％ CO2の加湿雰囲気中で３７℃において培養する。
【０１７６】
第２日に、細胞を計数し、回転し、ゲイ(Gey）均衡塩溶液＋１mg／mlのウシ血清アルブミン(BSA）中に１×１０7 細胞／mlに再構成する。単球、好中球または好酸球について５〜８μｍのポリカーボネートフィルター、あるいはリンパ球について３μｍのフィルターを装備する４８または９６ウェルの使い捨て化学走性チャンバー中で、化学走性を誘導する（Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25, 64 (1995) ; Loetscher et al., J. Exp. Med. 184, 569 (1996) ; Weber et al., J. Immunol., 4166 (1995)) (PVP free, Chemo TX, Neuroprobe Incv. 、マリイランド州キャビンジョン）。
【０１７７】
２９μｌの化学誘引物質または対照を各ウェルの下部の区画に添加する。フレーム付きフィルターをフィルターのフレームの角の孔と整列させ、ウェルの上に配置する。ゲイ均衡塩溶液＋１mg／mlのBSA 中の 2.5×１０5 の単球を上部の区画に添加する。因子をミリ(Milli）Ｑ水中に溶解し、次いでゲイ均衡塩溶液中で連続的に希釈する。ほとんどの場合において、連続希釈した因子を化学走性チャンバーの上部の区画に添加する。チャンバーを５％ CO2の加湿雰囲気中の３７℃において 1.5時間インキュベートする。
【０１７８】
２．酵素の放出
単球からのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの放出を使用して、治療剤がケモカイン関連活性を阻害するかどうかを決定する。 0.3mlの前加温した培地（136mM のNaCl，4.8mM のKCl, 1.2mMのKH2PO4，１mMの CaCl2，２０mMのHepes, pH7.4, ５mMのＤ−グルコース、および１mg／mlの無脂肪酸BSA)中の 1.2×１０6 単球の試料をサイトカラシンＢ(2.7mg／ml）で２分間処理し、次いで治療剤の存在または非存在下にケモカインで刺激する。氷上で冷却することによって反応を停止させ、遠心し、上清中の酵素活性を測定する（Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25, 64 (1995)）。
【０１７９】
好中球からのエラスターゼの放出をまた使用して、治療剤がケモカイン関連活性を阻害するかどうかを決定する（Perei et al., J. Exp. Med., 1547 (1988) ; Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 269, 16075 (1994) ）。
【０１８０】
３．無細胞質ゾルCa2+濃度（［Ca2+］i ）の変化
フラ（Fura）−２(0.1nmol／１０5 細胞）を負荷した単球、好酸球、好中球およびリンパ球を治療剤の存在または非存在下にケモカインで刺激し、そして［Ca2+］i 関係蛍光の変化を記録する（Von Tschanner et al., Nature 324, 369 (1986)）。例えば、単球中の細胞質ゾルCa2+濃度を測定するために、単球を３７℃においてHEPES 緩衝化生理食塩水（145mM のNaCl，５mMの KCl，１mMの MgCl2，１０mMのHEPES 、および１０mMのグルコース）(pH7.4，３７℃、１％のアルブミン(w/v）および１mMのCaCl2 を補充した）中で３０最小 0.5μＭのフラ−2/AMとインキュベートする。
【０１８１】
フラ−２を負荷した後、細胞を 300×ｇで５分間遠心し、次いで添加したアルブミンを含有しない緩衝液の中に 1.5×１０6 細胞／mlの細胞密度に再懸濁させ、使用するまで室温に保持する。このプロトコールにおいて、約 100μＭの細胞質ゾルフラ−２濃度が生ずる。 PBS＋ 0.1％のアルブミン(w/v）（滅菌濾過した）中のケモカインの連続希釈物を細胞懸濁液のアリコート(0.7ml）に添加する。単一の励起の、単一の放射(500nm）の波長のパーキンエルマー（Perkin Elmer) LS5 蛍光測定装置で、単球のフラ−２蛍光を３７℃において測定する。340nm の単一の励起波長において測定した蛍光の変化から、［Ca2+］i を計算する。
【０１８２】
対応する非形質転換細胞において発現されない、分子的にクローニングされたケモカインレセプターで安定に形質転換される細胞において、本質的に前述したように［Ca2+］i を測定する。フラ−2/AMを負荷した後、細胞（１×１０6 ／ml）を氷冷培地（118mM のNaCl, 4.6mM の KCl，２５mMのNaHCO3，１mMのKH2PO4，１１mMのグルコース、５０mMの HEPES，１mMの MgCl2，１mMのCaCl2, 0.1およびゼラチン（pH7.4)）の中に保持する。細胞懸濁液のアリコート（２ml）を３mlのプラスチッククベット中で３７℃に５分間前加温し、そして磁気撹拌機を装備し、３７℃に温度制御したフルオロメーター（Johnson Foudation Biomedical Group）で蛍光を測定する。励起を 340nmに設定し、そして放射を 510nmに設定する。前述したように、［Ca2+］i を計算する。
【０１８３】
カルシウムの応答の交差脱感作を単球において研究するために、ケモカインを２分の間隔で順次に添加し、［Ca2+］i の遷移を記録する。これらの型の研究において使用した濃度は各ケモカインについて変化し、そして［Ca2+］i 移動化についての最大の応答を誘導することが知られているレベルに設定する（下記の文献を参照のこと：Forssmann et al., FEBS Lett., 408, 211 (1997) ; Sozzani et al., J. Leukoc. Biol., 57, 788 (1995) ; Berkhout et al., J. Biol. Chem., 272, 16404 (1997) ）。
【０１８４】
４．ケモカインの結合および結合の変位
一般に、寒冷競合因子の非存在において結合した標識化因子の量−寒冷競合因子の存在において結合した標識化因子の量として、特異的結合を計算する。変化する量の寒冷競合因子の存在における特異的結合の量を使用して、因子についてのアソシエーション定数を決定し、ならびに、例えば、スキャッチャード分析を使用して、細胞上の因子のための結合部位の数を決定することができる。放射能標識化（例えば、ヨウ素化）によるか、あるいは適当な生化学的標識（例えば、ビオチン）を使用するか、あるいは光活性化可能な架橋基の付加により、因子を標識化することができる。
【０１８５】
100μＭより低いアソシエーション定数を有し（すなわち、 100μＭのアソシエーション定数を有する因子よりも強く結合し）かつケモカインレセプターを発現する少なくとも１つの細胞型当たり、少なくとも約2,500 、好ましくは少なくとも約10,000、より好ましくは25,000より大きい結合部位を有する因子は、本発明の範囲内に入る。THP-1 細胞は少なくとも約5000MCP-1 レセプター／細胞を有する。
【０１８６】
例えば、重炭酸塩を含まず、 0.2％のウシ血清アルブミンおよび 0.1％のアジドを含有するRPMI 1640 の中に単球を懸濁させた。９６ウェルのプレート中で 0.2ml（例えば、 PBS＋ 0.5％のFCS)の最終体積で増加する濃度の非標識化ケモカイン（MCP-1 、MCP-3 、MCP-4 、RANTESまたは MIP-1α）の存在または非存在下に、放射能標識化ケモカインペプチドを１〜２×１０6 細胞、例えば、THP-1 細胞と３７℃において１５分間インキュベートする。
【０１８７】
インキュベーション後、 0.5mlの氷冷洗浄緩衝液（２０mMのTris、 0.5ＭのNaCl，pH7.4)を添加し、そしてブランダール（Brandall）細胞収集器を使用して、細胞をポリエチレンイミン処理ワットマン(Whatman）GF/Cフィルター上に収集する。フィルターを４mlの冷洗浄緩衝液で洗浄し、そしてフィルターに結合した放射能をガンマカウンターで計数する。
【０１８８】
競合研究のために、曲線適合プログラム（GraFit, Erithacus Software、ロンドン）に従い、４パラメーターの論理計算、cpm 結合＝cpm 最大（１＋（［Ｌ］／IC50) s ）＋cpm 非特異的を使用して、IC50を計算する。ここでcpm 最大は競合因子の非存在における結合を表し、［Ｌ］は競合因子の濃度であり、cpm 非特異的は非特異的結合であり、そしてｓは勾配のファクターである。cpm 結合は「無細胞」の対照について補正されている。Ｋｄおよび結合の特異的結合の容量を得るために、相同変位の実験からのデータをグラフィット（GraFit）ベスト適合プログラムを使用して単一部位のリガンド結合方程式の中に適合させる。
【０１８９】
分子的にクローニングされたケモカインレセプターで安定に形質転換された細胞へのケモカインの結合を本質的に前述したように実施するが、ただし放射能標識化因子を非標識化ケモカインで希釈する。細胞を放射能標識化因子＋または−非標識化ケモカインと３７℃において３０分間インキュベートする（下記の文献を参照のこと：Imai et al., supra ; Sozzani et al. (1995), supra ; Berkhout et al., supra ; WO97/22698)。
【０１９０】
５．ケモカインのダッフィ抗原レセプター（DARC）への結合
この分野において知られている任意の方法、例えば、赤血球に対する放射能標識化MCP-1 の結合を阻害する治療因子の能力により、DARCに対する治療因子のアフィニティーを測定することができる（実施例３参照）。ケモカインレセプターに結合するよりも低いアソシエーション定数でDARCに結合し（すなわち、＜１のDARC選択性）かつ 100μＭより低い、好ましくは１０μＭより低い、より好ましくは１μＭより低いアソシエーション定数を有するDARCに結合する治療因子は、本発明の方法の特定の態様において有用である。対照的に、DARCに結合しないか、あるいはケモカインレセプターに対するそれらのアフィニティーより大きいアフィニティー（すなわち、＞１の選択性の比）を有するDARCに結合しない治療因子は、本発明の方法の他の態様において有用である。
【０１９１】
６．ケモカインの共マイトジェン活性の阻害
多数のケモカインは低い濃度のFCS と共マイトジェン性である、例えば、５０ng／mlの MCP-1＋ 0.5％のFCS は平滑筋細胞のためのマイトジェンである。因子の存在および非存在において適当な細胞（例えば、平滑筋細胞）に対して任意の既知のケモカイン＋低い濃度（＜５％）のFCS により誘導されるDNA の合成を測定するこの分野においてよく知られているアッセイは、このような阻害活性について因子をスクリーニングするために使用することができる。Porreca et al., J. Vasci. Res., 34, 58 (1997) （その開示は引用することによって本明細書の一部とされる）参照。
【０１９２】
７．抗レンチウイルス活性
特定のケモカインレセプターの発現の結果としてレンチウイルスの感染に対して感受性である細胞系統を製造するために、そうでなければケモカインレセプターを発現しない細胞系統、例えば、HeLa-MAGI (KimptonおよびEmerman, J. Virol., 66 : 3026 (1992)）またはU373-MAGI (Harrington およびGeballe, J. Virol., 67 : 5939 (1993)）細胞の中に、レトロウイルスの感染により、分子的にクローニングされたケモカインレセプターを導入する。細胞表面上のケモカインレセプターの発現は、抗体を使用する生きている細胞の免疫染色により証明される。レセプターをコードするRNA の発現は、RT-PCRにより証明される。HeLa-MAGI およびU373-MAGI は、レンチウイルスの感染後に発現する。感染した細胞をX-gal とインキュベートすると、これらの細胞の中に青色の染色が沈着する。
【０１９３】
記載されているように（Kimpton およびEmerman, supra）３０μｇ／mlのDEAE−デキストランの存在下に 300μｌのウイルスの１０倍の連続希釈物を使用して１２ウェルのプレート中で、ケモカインレセプターで安定に形質転換された細胞系統を因子の存在または非存在下にHIV で感染させる。製造業者により提供される標準を使用して、ウイルスのストックをELISA または p24gag （Coulter Immunology）または p27gag （Coulter Immunology）により、それぞれ、HIV-1 およびHIV-2/SIV について正規化する。
【０１９４】
感染後２日に、細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ活性についてX-gal で染色する。細胞を３７℃で５０〜120 分間染色する。感染力価は青色細胞の数／ウェル×ウイルスの希釈であり、そして１mlに対して正規化する。
ある因子がレンチウイルスの感染および／または複製を阻害するかどうかを決定する他の方法については、Cocchi et al., Science 270, 1811 (1995) 、およびWO97/22698を参照のこと。
【０１９５】
８．因子
本発明の因子がケモカインレセプターのアゴニストであるかどうかを決定するために、変化する量の標識化された、例えば、ビオチニル化された形態の因子を、レセプターを発現する細胞、例えば、MCP-1 、MIP1α、 SDF-1αおよびIL8 のレセプターを発現するTHP-1 細胞と混合するがJurkat細胞はSDF-1 の機能的レセプターを発現する。次いで細胞に対する標識化因子のアフィニティーを測定する。合理的アフィニティーでレセプターに結合しかつシグナリングを誘導することによってレセプターと相互作用する因子は、本発明の範囲内に入る。レセプターにまたはその付近に結合するが、レセプターを引き出さない因子は、用語「アゴニスト」または「アンタゴニスト」に包含されないが、また、本発明の範囲内に入り、そして「中性の」因子と命名される。
【０１９６】
また、アゴニスト活性を有する因子はトランスウェル移動アッセイにより同定することができ、ここで細胞を因子の非存在下に上部の区画（第１図参照）の中に入れ、そして因子、例えば、ペプチド２［MCP-1 ］を変化する濃度で下部の区画の中にケモカインの代わりに入れる。１またはそれ以上の因子がアゴニスト活性を有する場合、不活性の対照、例えば、因子または培地の単独を含有するウェルにおけるよりも１またはそれ以上の因子を含有するウェルの中に、アッセイの終わりにおいて、より多い細胞が下部の区画の中に見出される。好ましくは、トランスウェル移動アッセイにおいてアゴニスト活性を有する因子は、また、一次ヒト細胞、例えば、単球の移動を刺激する。
【０１９７】
そのうえ、THP-1 細胞またはJurkat細胞の表面に対するHIVgp120、特にgp120 のＶ３ループの結合を変位する能力について因子をスクリーニングすることによって、弱いアゴニストまたは中性のアゴニスト（レセプターに結合するが、天然のケモカインの結合およびその引き続くシグナリングを阻害せず、またシグナリングをそれら自体誘導しない因子）を同定することができる。ウイルスのレセプターに結合するために十分な量において、種々の濃度の１またはそれ以上の因子の存在および非存在下に、細胞を標識化（例えば、放射能ヨウ素化）組換えgp120 タンパク質とインキュベートする。gp120 の結合を減少または壊滅させる因子は、本発明の範囲内のアゴニストまたは中性のアゴニストである。
【０１９８】
９．in vivo
本発明の因子が本発明の因子が炎症反応を阻害または増強するかどうかを決定する迅速な方法は、本発明の因子のの存在または非存在下に動物の皮膚の中に選択したケモカインを注射することである。ある時間が経過した後、動物を殺し、ケモカインおよび因子に対する暴露した動物における炎症性細胞の数を、ケモカイン単独に対して暴露した動物における炎症性細胞の数と、例えば、対照の動物に関する、定量的免疫蛍光により、比較する。
【０１９９】
Ｂ．本発明の核酸分子
１．本発明の核酸分子源
ケモカインのペプチド、その変異型または核酸補体をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列源は、cDNAをこの分野において知られている方法により誘導することができる、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の源からの全体のまたはポリＡ+ RNA を包含する。本発明の他のDNA 源は、真核細胞源に由来するゲノムライブラリーを包含する。本発明のDNA 分子は、例えば、約100 、好ましくは約７５、より好ましくは約５０、なおより好ましくは約４０ヌクレオチドの長さのヌクレオチドを合成するか、あるいは特定のケモカインをコードするDNA セグメントの部分をサブクローニングすることによって、in vitroで製造することができる。
【０２００】
２．ケモカインをコードする遺伝子の単離
ケモカインをコードする核酸分子は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989）に記載されているように、標準的方法を使用して同定し、単離することができる。例えば、逆転写酵素 PCR (RT-PCR）を使用して、ケモカインcDNAを単離し、クローニングすることができる。オリゴ−ｄＴを逆転写酵素反応においてプライマーとして使用して、問題のRNA 配列を含有する単離されたRNA 、例えば、ヒト組織から単離された全体のRNA から、第１鎖cDNAを製造することができる。RNA はこの分野において知られている方法により、例えば、TRIZOLTM試薬（GIBCO-BRL/Life Technologies 、マリイランド州ガイサースバーグ）を使用して単離することができる。次いで、生ずる第１鎖cDNAをPCR 反応において増幅する。
【０２０１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR 」は、核酸、RNA および／またはDNA の前もって選択したフラグメントの増幅を米国特許第4,683,195 号に記載されているように増幅する手順または技術を意味する。一般に、問題の領域の末端からまたはそれを越えた配列の情報を使用して、少なくとも７〜８ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドのプライマーを設計する。これらのプライマーは、増幅すべき鋳型の反対の鎖に対して配列が同一であるか、あるいは類似するであろう。
【０２０２】
PCR を使用して、特定のRNA 配列、全体のゲノムDNA からの特定のDNA 、および全体の細胞のRNA 、バクテリオファージまたはプラスミドの配列、およびその他から転写されたcDNAを増幅することができる。一般に、下記の文献を参照のこと：Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 263 (1987) ; Erlich 、編、PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)。こうして、PCR に基づくクローニングアプローチは、関係する遺伝子またはポリペプチド配列の整列から推定された保存された配列に頼る。
【０２０３】
例えば、他の真核ケモカインの配列の比較により、プライマーを発生させるために同定され、比較されたポリペプチドまたはヌクレオチド配列の高度に保存された領域に対応して、プライマーは作られる。ケモカインをコードするDNA の、アンチセンス鎖にアニールすることが予測される１つのプライマーを製造し、そしてセンス鎖にアニールすることが予測される他のプライマーを製造する。
各PCR 反応の生成物をアガロースゲルにより分離し、そしてすべての首尾一貫して増幅生成物をゲル精製し、適当なベクター、例えば、既知のプラスミドベクターの中に直接クローニングする。生ずるプラスミドを制限酵素に暴露し、二本鎖プラスミドDNA のジデオキシ配列決定する。
【０２０４】
ケモカインをコードするcDNAを同定し、単離し、クローニングする他のアプローチは、cDNAライブラリーをスクリーニングすることである。ケモカインに関係すると考えられる遺伝子の間に高度に保存される配列を有するプローブ、例えば、異なる種からの特定のケモカインの相同体でプロービングするか、あるいはケモカインを特異的に認識する抗体に対する結合についてプラークをスクリーニングすることによって、ケモカインをコードするcDNAのすべてまたは一部分をコードするDNA フラグメントについてのスクリーニングを達成することができる。ケモカインに関係する配列を有するプローブに結合するか、あるいはケモカインに対する抗体と免疫反応性であるDNA フラグメントを適当なベクターの中にサブクローニングし、配列決定し、および／またはケモカインののすべてまたは一部分をコードする他のcDNAを同定するプローブとして使用することができる。
【０２０５】
本明細書において使用するとき、「単離しおよび／または精製する」は、その天然の細胞の環境から、および細胞の他の成分、例えば、核酸またはポリペプチドとのアソシエーションから、DNA またはポリペプチド分子をin vitroで単離し、それを配列決定し、複製し、および／または発現させることができるようにすることを意味する。
【０２０６】
例えば、「単離されたケモカイン核酸」は、ケモカインの少なくとも一部分をコードする９より大きい、好ましくは３６、より好ましくは４５またはそれ多い、連続的ヌクレオチド塩基を含有するRNA またはDNA 、またはそれらの変異型、あるいはそれらに対して相補的なRNA またはDNA であり、ここで相補的なRNA またはDNA は、それぞれ、ケモカインをコードするRNA またはDNA に対して相補的であるか、あるいはハイブリダイゼーションし、そして、この分野において、例えば、Sambrook et al. supra において、よく知られている方法により定義して、ストリンジェント条件下に安定に結合して止まる。こうして、RNA またはDNA は、天然のRNA またはDNA 源の中で通常アソシエートしている少なくとも１つの汚染する核酸を含有せず、好ましくは他の哺乳動物のRNA またはDNA を実質的に含まないことにおいて、「単離されている」。
【０２０７】
用語「通常アソシエートしている少なくとも１つの汚染する核酸を含有せず」は、核酸が源または天然の細胞の中に再導入されるが、異なる染色体位置に存在するか、あるいはそうでなければ源の細胞の中に通常見出されない天然および合成のによりフランクされている場合を包含する。単離されたケモカイン核酸の例は、ヒトMCP-1 をコードし、配列番号：16を有するMCP-1 ポリペプチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列の同一性を共有するRNA またはDNA である。
【０２０８】
本明細書において使用するとき、用語「組換え核酸」または「前もって選択した核酸」、例えば、「組換えDNA 配列またはセグメント」または「前もって選択したDNA 配列またはセグメント」は、任意の適当な組織源から誘導されるか、あるいは単離され、その配列が天然に存在しないか、あるいは外因的DNA で形質転換されなかったゲノムの中に位置されるように位置決定されていない天然に存在する配列に対応するように、引き続いてin vitroで化学的に変更することができる核酸、例えば、DNA を意味する。
【０２０９】
源から「誘導される」前もって選択したDNA の例は、所定の生物内で有用なフラグメントとして同定され、次いで本質的に純粋な形態で化学的に合成されるDNA 配列である。源から「単離された」このようなDNA の例は、それが本発明において使用するために、遺伝子操作の方法により、さらに操作、例えば、修飾することができるように、化学的手段により、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用により、前記源から切除または取出される、有用なDNA 配列であろう。
【０２１０】
こうして、制限消化からのDNA の所定のフラグメントの回収または単離は、電気泳動によるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上の消化物の分離、既知の分子量のマーカーDNA フラグメントの移動度に対するその移動度の比較による問題のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含有するゲル切片の取出し、およびDNA からのゲルの分離を使用することができる。Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981) 、およびGoeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980)、参照。したがって、「前もって選択したDNA 」は、完全に合成のDNA 配列、半合成のDNA 配列、生物学的源から単離されたDNA 配列、およびRNA から誘導されたDNA 配列、ならびにそれらの混合物を包含する。
本明細書において使用するとき、RNA 分子に関する「誘導された」は、RNA 分子が特定のDNA 分子に対して同一である相補的配列を有することを意味する。
【０２１１】
３．本発明の核酸分子の変異型
ケモカインペプチドのアミノ酸配列の変異型をコードする核酸分子は、この分野において知られている方法により製造される。これらの方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：天然の源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列の変異型の場合において）、あるいはケモカインペプチドの以前に製造された変異型または非変異型のバージョンのオリゴヌクレオチド仲介（または部位特異的）突然変異誘発、PCR 突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発。
【０２１２】
オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は、ケモカインペプチドのアミノ酸置換変異型を製造する好ましい方法である。この技術は、Adelman et al., DNA, 2, 183 (1983)に記載されているように、この分野においてよく知られている。簡単に述べると、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをDNA 鋳型にハイブリダイゼーションさせることによって、ケモカインDNA を変更し、ここで鋳型はケモカインの非変更または天然のDNA 配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖の形態である。ハイブリダイゼーション後、DNA ポリメラーゼを使用して鋳型の全体の第２の相補的鎖を合成し、こうして鋳型はオリゴヌクレオチドのプライマーを組込んでおり、そしてケモカインDNA 中の選択した変更をコードするであろう。
【０２１３】
一般に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードする１またはそれ以上のヌクレオチドのいずれかの末端上の鋳型に対して完全に相補的である、１２〜１５ヌクレオチドを有するであろう。これにより、オリゴヌクレオチドは一本鎖のDNA 鋳型の分子に適切にハイブリダイゼーションするであろう。オリゴヌクレオチドは、この分野において知られている技術、例えば、Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 5765 (1978) に記載されている技術により容易に合成される。
【０２１４】
バクテリオファージM13 ベクター（商業的に入手可能なM13mp18 およびM13mp19 ベクターは適当である）から誘導されるベクター、あるいはVierra et al., Methods Enzymol., 153, 3 (1987)に記載されている一本鎖ファージの複製起点を含有するベクターにより、DNA 鋳型を発生させることができる。こうして、突然変異させるべきDNA をこれらのベクターの１つの中に挿入して、一本鎖の鋳型を発生させる。一本鎖の鋳型の製造は、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989)の節4.21〜4.41に記載されている。
【０２１５】
あるいは、一本鎖DNA 鋳型は、標準的技術に従い二本鎖プラスミド（または他の）DNA を変性することによって発生させることができる。
天然のDNA 配列を変更する（例えば、アミノ酸配列の変異型を発生させる）ために、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件下に一本鎖の鋳型にハイブリダイゼーションさせる。次いで合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して、DNA 重合酵素、通常DNA ポリメラーゼのクレノーフラグメントを付加して、鋳型の相補的鎖を合成する。
【０２１６】
こうして、DNA の一方の鎖がケモカインの突然変異した形態をコードし、かつ他方の鎖（もとの鋳型）がケモカインの天然の、非変更の配列をコードするように、ヘテロ二本鎖の分子を形成する。次いでこのヘテロ二本鎖の分子を適当な宿主細胞、通常原核生物、例えば、大腸菌（E.coli) JM101 の中に形質転換する。細胞が成長した後、細胞をアガロースプレート上にプレートし、そして３２−リン酸塩で放射能標識化したオリゴヌクレオチドのプライマーを使用してスクリーニングして、突然変異したDNA を含有する細菌のコロニーを同定する。次いで突然変異した領域を取出し、ペプチドまたはポリペプチドの産生のために適当なベクター、一般に典型的には適当な宿主の形質転換に使用される型の発現ベクターの中に配置する。
【０２１７】
プラスミドの双方の鎖が１またはそれ以上の突然変異を含有する、ホモ二本鎖分子がつくられるように、直ぐ上に記載した方法を修飾することができる。それらの修飾は次の通りである：一本鎖のオリゴヌクレオチドを前述した一本鎖の鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、すなわち、デオキシリボアデノシン（dATP）、デオキシリボグアノシン（dGTP）およびデオキシリボチミジン（dTTP）の混合物をdCTP-(αS)と呼ぶ修飾されたチオデオキシリボシトシン（これはAmersham Corporationから入手することができる）と組合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にDNA ポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基を除外して鋳型と同一のDNA の鎖が発生する。さらに、DNA のこの新しい鎖はdCTPの代わりにdCTP-(αS)を含有し、これはそれを制限エンドヌクレアーゼの消化から保護する働きをする。
【０２１８】
二本鎖のヘテロ二本鎖の鋳型鎖を適当な制限酵素でニックした後、突然変異化すべき１またはそれ以上の部位を含有する領域を過ぎたところで、鋳型鎖をExoIIIヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼで消化することができる。次いで反応を停止させて、部分的にのみ一本鎖である分子を残す。次いですべての４つのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、ATP 、およびDNA リガーゼの存在下にDNA ポリメラーゼを使用して、完全な二本鎖DNA ホモ二本鎖を形成する。次いでこのホモ二本鎖分子を適当な宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli) JM101 の中に形質転換することができる。
【０２１９】
例えば、本発明の好ましい態様は、配列番号：１を有するペプチド３（1-12）［MCP-1 ］をコードする前もって選択したDNA セグメントからなる、単離されかつ精製されたDNA 分子であり、ここでDNA セグメントは、「サイレント」であるヌクレオチド置換を有する、配列番号：76、または配列番号：76の変異型からなる（第１２図参照）。すなわち、サイレントヌクレオチド置換がコドンの中に存在するとき、置換を含まないコドンによりコードされるのと同一のアミノ酸が、ヌクレオチド置換を有するコドンによりコードされる。例えば、バリンはコドンGTT 、GTC 、GTA およびGTG によりコードされる。
【０２２０】
成熟ポリペプチド中の第１０のコドン（配列番号：79中のGTC)における配列番号：79の変異型は、GTC のGTT 、GTA またはGTG による置換を包含する。配列番号：１を有するペプチド３（1-12）［MCP-1 ］をコードすることができる配列番号：76中の他の「サイレント」ヌクレオチド置換は、第１２図およびSambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1989) 中の付録Ｄ中のページＤ１を参照することによって確認することができる。この分野においてよく知られている方法により、ヌクレオチド置換をDNA セグメントの中に導入することができる。
【０２２１】
例えば、Sambrook et al., supra、参照。同様に、他の哺乳動物、好ましくはヒトのケモカインをコードする核酸分子は同様な方法において修飾することができる。こうして、例えば、MCP-2 （配列番号：80）、MCP-3 （配列番号：81）、MCP-4 （配列番号：100)、MIP1α（配列番号：82）、MIP1β（配列番号：83）、RANTES（配列番号：84）、SDF1α（配列番号：85）、IL8 （配列番号：86）、 GROα（配列番号：87）、エオタキシン（配列番号：88）、MIG （配列番号：89）、PF-4（配列番号：90）、I309（配列番号：91）、HCC-1 （配列番号：92）、C10 （配列番号：93）、CCR-2 （配列番号：94）、ENA-78（配列番号：95）、
【０２２２】
GROβ（配列番号：96）、IP10（配列番号：97）、SDF1β（配列番号：98）、 GROα（配列番号：99）、MIP3α、TCA-3 、CTAPIII 、MARC/FYK、β−トロンブグロブリン、GCP-2 、PBP 、HC14、MDC 、TECK、PARC、6Ckine、フラクタリン（Fractaline) 、DC-CK1、LIX 、TARC、LARC、MIG 、Ckβ8 、CCF18/MRP-2 、CCIII 、CKα2 、H1305 、Dvic-1、DGWCC 、TCA4、デンドカイン、CC2/HCC1、CC3 、およびMIP1τの少なくとも一部分、ならびにウイルス的にコードされたケモカイン、例えば、vMIP-I、vMIP-II およびvMIP-III、またはそれらに対する補体をコードする核酸分子を修飾して、サイレントヌクレオチド置換を有する本発明の核酸分子を生成させるか、あるいはアミノ酸置換を生ずるヌクレオチド置換を有する核酸分子をさせることができる（下記のペプチド変異型参照）。
【０２２３】
Ｃ．in vivo 研究
特定の因子が本発明の方法の実施において有用であるかどうかをさらに決定するために、動物モデルをヒト疾患について同定する。また、ヒトの疾患のためのトランスジェニック動物のモデルを使用して、本発明の方法において有用な因子を同定することができる。例えば、ヒトアテローム性動脈硬化症に関連するケモカイン誘導マクロファージのリクルートメントのモデルは下記のものを包含するが、これらに限定されない：アポリタンパク質Ｅ（アポＥ）遺伝子のホモ接合欠失を有するマウス、ヒトアポＢを過度に発現するマウスおよびワタナベ遺伝性高脂血症のウサギ。
【０２２４】
自己免疫疾患のモデルは、DBA/1 マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎およびミエリン塩基性タンパク質誘導実験自己免疫脳脊髄炎を包含する。オステオポローシスのモデルは、卵巣摘出した雌ラット、ヘパリンまたはグルココルチコイドで処置したマウス、サル、ラット、ならびにラットにおける懸濁液誘導オステオポローシスを包含する。HIV 感染のモデルは、SIV 、SIV 分離株、HIV またはHIV 分離株を有するサル、HIV またはHIV 分離株を有するSCID-Hu マウス、またはHIV またはHIV 分離株を有するウサギの感染を包含する。レンチウイルス感染の他の動物モデルは、FIV で感染したネコ、EIAVで感染したウマ、およびCAEVで感染したヤギ（これはまた関節炎の動物モデルである）を包含する。
【０２２５】
本発明の因子の効能は、炎症の程度、または影響を受けた組織のマクロファージ浸潤の程度の測定により評価することができる。マクロファージ浸潤は、マクロファージを特異的に検出する抗体（例えば、mac-1 抗血清）で組織切片を染色することによって検出することができる。疾患の炎症または他の症候は、当業者によく知られている技術を使用して、適当な臨床的パラメーターを測定することによって検出することができる。
【０２２６】
例えば、アポＥノックアウトマウスを因子、例えば、CRD-leu4ile11 ペプチド３で、例えば、腹腔内注射により、１２週間処置するが、対照の同腹子の配偶体に既知の生物学的活性をもたない適当な対照ペプチドを与える。１２週の終わりにおいて、動物を殺し、mac-1 抗血清を使用する定量的免疫組織化学により血管壁の中へのマクロファージのリクルートメントの減少を測定しかつPaigen，Arteriosclerosis, 10, 316 (1990)に従うオイルレッドＯ染色を使用して組織化学により脈管の病変の形成の程度の減少を測定することによって、因子の作用を評価する。
【０２２７】
アポ（ａ）トランスジェニックマウスは、脂質に富んだ食事を与えるとき、病変を発生する。対照的に、C57B16同系繁殖マウスは、アポ（ａ）トランスジェニックマウスにおけるそれらに対して同様な大きさおよび程度の脂質の病変を発生するが、これらの病変は浸潤性マクロファージに富んでいる。アポ（ａ）マウス、C57B16マウス、およびマクロファージで脂質の病変を発生させるマウスの６つの他の系統を、前炎症性メディエイタ、例えば、TNF-α、MCP-1 、 MIP-1α、 IL1β、ICAM-1、VCAM-1、およびＰ−セレクチンのレベルについて定量的免疫蛍光によりスクリーニングした。
【０２２８】
TNF-α、 MIP-1α、 IL1β、ICAM-1、VCAM-1およびＰ−セレクチンのすべては、アポ（ａ）マウスの病変およびC57B16の病変において同一レベルで発現された。こうして、これらの前炎症性メディエイタは浸潤に対して必要であることがあるが、それらは単独では十分ではない。顕著な対照において、MCP-1 はアポ（ａ）マウスの病変において完全に存在しないが、マクロファージに富んだ病変を有する、すべての他のマウスの系統から病変において高いレベルで発現される。
【０２２９】
SM−α−アクチン（平滑筋細胞；IA4 抗体）、マクロファージ（Mac-1 抗体）およびMCP-1 に対して特異的な抗体で三重染色した病変を有する血管壁の切断の共焦点顕微鏡解析において、MCP-1 はマクロファージにより独占的に発現されないことが示された。すなわち、平滑筋細胞およびマクロファージの双方はMCP-1 を発現した。こうして、MCP-1 はアテローム性動脈硬化症のアポ（ａ）マウスにおいて欠けている「炎症性メディエイタ」であろう。
【０２３０】
これらの結果が示唆するように、アポ（ａ）マウスの病変におけるMCP-1 の欠如はマクロファージの非存在の結果ではなく、その代わりに単球の浸潤の欠如の原因に寄与する。そのうえ、これらの結果はケモカインMCP-1 がアテローム性動脈硬化症の血管系の炎症においてある役割を演ずる証拠を提供する。こうして、MCP-1 はこのケモカインのリクルートメントをブロックするアナローグの基礎を提供することができる。
【０２３１】
MCP-1 以外のケモカインは、また、アテローム性動脈硬化症のマクロファージのリクルートメント、炎症および病原性、および不適切な増殖に関連する他の疾患に関係することがある。例えば、MIP1αは多発性硬化症における不適切な炎症に関係づけられた。こうして、MIP1αからのペプチド２および３に対して類似する配列は、多発性硬化症を治療または予防するために特に有用であることがある。
【０２３２】
したがって、特定のケモカインが特定の疾患に関係づけられるとき、その特定のケモカインからの配列はその疾患の治療または予防するために特に有用である。本発明の範囲内に入る好ましい因子は、２以上のケモカイン、好ましくはすべてのケモカインのシグナリングのインヒビターである。こうして、特定の疾患のプロセスに関連するもの他のケモカインからの配列を有する、ケモカインペプチドのアナローグを製造することが好ましいであろう。特定の疾患を治療する特定の因子の選択は、生物学的利用能、毒性、DARCの結合または他の同様な基準に基づくことができる。
【０２３３】
他のモデルは下記の文献に報告されているものを包含するが、これらに限定されない：肺の損傷について、Lukacs, Adv. Immunol., pp.257-304, Academic Press (1996)；腎炎について、Lloyd et al., J. Leukoc. Biol., 185, 1371 (1997)およびTam et al., Kid. Int., 49, 715 (1996) ；骨について、Volejnikova, Am. J. Pathol., 150, 1711 (1997) ；脳について、Ghinikar et al., J. Neurosci. Res., 46, 727 (1996)およびRansoholf et al., J. Leukoc. Biol., 62, 645 (1997)；マラリアについて、Kaul et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 58, 240 (1995) ；腹膜炎について、Ajeubar et al., J. Leukoc. Biol., 63, 108 (1998)；全身性エリテマトーデスについて、Furukawa et al., Lupus, 6, 193 (1997) ；
【０２３４】
移植片について、Suzuki et al., J. Heart & Lung Transpl., 16, 1141 (1967), Abbott et al., Arch. Surg., 89, 645 (1964), Corry et al., Transpl., 16, 343 (1973), Dworkin et al., J. Heart Lung Transpl., 10, 591 (1991), Laden et al., Arch. Path., 93, 240 (1972) およびMitchell et al., Transpl., 49, 835 (1990) ；創傷の治癒について、米国特許第5,661,132 号；自己免疫について、Burhardt et al., Rheum. Int., 17, 91 (1997) ；炎症性腸疾患について、Elson et al., Gastroenter., 109, 1344 (1998)；心臓血管系疾患について、Haye et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol., 18, 397 (1998) およびWang et al., Arterio. Thromb., 11, 1166 (1991)；
【０２３５】
肺の中への好酸球の浸潤について、Wegner et al., Science, 247, 456 (1990) ；慢性関節リウマチについて、Brahn, Ciinorth and Rel. Res., 265, 42 (1991), Wooley, Curr. Op. Rheum., 3, 407 (1991)およびGay et al., Curr. Op. Rheum., 7, 199 (1995) 、SCID−ヒト滑液モデル；乾癬について、Beamer et al., Blood, 86, 3220 (1998); Nakaguma, Int. J. Exp. Path., 76, 65 (1998); Nanney et al., J. Invest. Dermat., 106, 1169 (1996); Nickoff et al., AJP., 146, 580 (1995); Sundberg et al., Pathobiol., 65, 271 (1997) 、およびWolf et al., Int. J. Dermat., 30, 448 (1998)；および
【０２３６】
アレルギーについて、Conti et al., Blood, 89, 4120 (1997), Gonzal et al., JCI, 98, 2332 (1996), Teiyeira et al., JCI, 100, 1657 (1997), Ceri et al., Allergy, 52, 739 (1997), Freed, Eur. Res. J., 8, 1770 (1998), Griffiths-Johnson et al., Meth. Enzy., 288, 241 (1991), Herz et al., New Horizons in Allergy Immunoth., 25-32 Plenum Press, 1996、およびKane, Eur. Resp. J., 7, 555 (1991)。
【０２３７】
II．本発明の範囲内に入る因子の製造
Ａ．核酸分子
１．キメラ発現カセット
本発明における形質転換の発現カセットを製造するために、組換えまたは前もって選択したDNA 配列またはセグメントは環状または線状、二本鎖または一本鎖であることができる。ケモカインをコードするmRNA配列に対して実質的に相補的であるRNA 配列をコードする、前もって選択したDNA 配列は、典型的には、カセットの中に反対の向き（すなわち、５’→３’よりむしろ３’→５’）の中にクローニングした「センス」DNA 配列である。
【０２３８】
一般に、前もって選択したDNA 配列またはセグメントは、生ずる細胞系統の中に存在する前もって選択したDNA の発現を促進する制御配列によりフランクされたコーディング領域をまた含有する、キメラDNA 、例えば、プラスミドDNA の形態である。
本明細書において使用するとき、「キメラ」は、少なくとも２つの異なる種からなるベクター、あるいは種の「天然の」または野生型において存在しない方法において、連鎖またはアソシエートした、同一の種からのDNA からなるベクターを意味する。
【０２３９】
ケモカイン、またはその一部分の転写単位として働く、前もって選択したDNA 配列を別として、前もって選択したDNA の一部分は非転写であり、調節的または構造的機能を提供することができる。例えば、前もって選択したDNA はそれ自体哺乳動物細胞において活性であるプロモーターからなるか、あるいは形質転換ターゲットであるゲノムの中に既に存在するプロモーターを利用することができる。このようなプロモーターは、CMV プロモーター、ならびにSV40後期プロモーターおよびレトロウイルスLTR （長い末端の反復因子）を包含するが、当業者によく知られている多数の他のプロモーター因子を本発明の実施において使用することができる。
【０２４０】
宿主細胞において機能的な他の因子、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列およびその他は、また、前もって選択したDNA の一部分であることができる。このような因子はDNA の機能について必要であるか、あるいは必要でないことがあるが、mRNAの転写、安定性またはその他に影響を与えることによって、DNA の発現を改良することができる。必要に応じて、このような因子をDNA の中に含めて、細胞においてDNA を形質転換する最適な性能を得ることができる。
【０２４１】
「制御配列」は、特定の宿主生物中の作用可能に連鎖された配列の発現に必要なDNA を意味すると定義された。原核細胞に適当な制御配列は、例えば、プロモーター、および必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０２４２】
「作用可能に連鎖された」は、核酸が他の核酸配列と機能的関係に配置されていることを意味すると定義される。例えば、前配列または分泌リーダーのためのDNA は、それがペプチドまたはポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ペプチドまたはポリペプチドのためのDNA に作用可能に連鎖されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作用可能に連鎖されている；あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置決定されている場合、コーディング配列に作用可能に連鎖されている。
【０２４３】
一般に、「作用可能に連鎖された」は、連鎖されているDNA 配列が隣接していることを意味し、そして、分泌リーダーの場合において、隣接しておりかつ読み取り相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接である必要はない。連鎖は好都合な制限部位における結合により達成される。このような部位が存在する場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは普通の実施に従い使用される。
【０２４４】
細胞の中に導入すべき前もって選択したDNA は、一般に、形質転換しようとする細胞の集団からの形質転換された細胞の同定および選択を促進するために、選択可能なマーカーの遺伝子またはリポーターの遺伝子または双方をさらに含有するであろう。あるいは、選択可能なマーカーをDNA の別々の片上に担持させ、共形質転換手順において使用することができる。選択可能なマーカーおよびリポーターの双方の遺伝子を適当な調節配列でフランクさせて、宿主細胞における発現を可能とすることができる。有用な選択可能なマーカーはこの分野においてよく知られており、そして、例えば、抗生物質および除草剤耐性遺伝子、例えば、neo 、hpt 、dhfr、bar 、aroA、dapAおよびその他を包含する。また、Lundquist et al.（米国特許第5,848,956 号）の表１に列挙されている遺伝子を参照のこと。
【０２４５】
潜在的に形質転換された細胞を同定しそして調節配列の機能を評価するために、リポーターを使用する。容易にアッセイできるタンパク質をコードするリポーター遺伝子はこの分野においてよく知られている。一般に、リポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織の中に存在しないか、あるいはそれらにより発現されず、かついくつかの容易に検出できる性質、例えば、酵素活性により発現が現われるタンパク質をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、大腸菌 (E.coli）のTn9 からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat）、大腸菌（E.coli）のuidA遺伝子座のβ−グルコシダーゼ遺伝子(gus）、およびホタルPhotinus pyralisからのルシフェラーゼ遺伝子を包含する。リポーター遺伝子の発現は、DNA がレシピエント細胞の中に導入された後、適当な時間にアッセイされる。
【０２４６】
ターゲット細胞を形質転換できる組換えDNA を構築する一般的方法は当業者によく知られており、そして構築の同一の組成物および方法を利用して、本発明において有用なDNA を産生することができる。例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（第２版、1989）は、適当な構築方法を提供する。
【０２４７】
２．宿主細胞の中への形質転換
特定の細胞の中への導入に有用な任意の手順、例えば、物理的または生物学的方法により、ケモカインまたはその補体をコードするDNA からなる発現ベクターでトランスフェクトすることによって、組換えDNA を宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫の細胞の中に容易に導入して、そのゲノムの中に組込まれた組換えDNA を有する形質転換された細胞を産生し、こうして本発明のDNA 分子、配列、またはセグメントを宿主細胞により発現させる。
【０２４８】
前もって選択したDNA を宿主細胞の中に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈澱法、リポフェクション、粒子の衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびその他を包含する。問題のDNA を宿主細胞の中に導入する生物学的方法は、DNA およびRNA のウイルスベクターの使用を包含する。物理的方法の主要な利点は、それらの方法がウイルスの病理的またはオンコジーンのプロセスに関連しないことである。
【０２４９】
しかしながら、それらは正確さが低く、多数のコピーの挿入、ランダムな組込み、外来および内因的遺伝子配列の崩壊、および予測不可能な発現をしばしば生ずる。哺乳動物の遺伝子療法のために、単一のコピー遺伝子を宿主ゲノムの中に正確に挿入する効率よい手段を使用することが望ましい。ウイルスのベクター、特にレトロウイルスのベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒトの細胞の中に挿入する、最も広く使用されている方法となった。他のウイルスのベクターを、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス、およびその他から誘導することができる。
【０２５０】
本明細書において使用するとき、用語「細胞系統」または「宿主細胞」は、細胞のよく特性決定された均質な、生物学的に純粋な集団である。これらの細胞は、新形成的であるか、あるいはこの分野において知られている方法によりin vitroで「永久分裂能化された」真核細胞、ならびに一次細胞、または原核細胞であることができる。細胞系統または宿主細胞は好ましくは哺乳動物由来であるが、非哺乳動物由来の細胞系統または宿主細胞、例えば、植物、昆虫、酵母、菌類または細菌の源を使用することができる。一般に、前もって選択したDNA 配列は、宿主細胞のゲノムの中に存在するが、発現されないか、あるいは高度に発現されないか、あるいは、また、過度に発現されないDNA 配列に関係する。
【０２５１】
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」は、少なくとも１つの前もって選択したDNA 配列の存在により変更または増強されたゲノムを有する、宿主細胞または細胞系統を包含するために本明細書において使用し、前記DNA は、また、遺伝子操作の分野において「異種DNA 」、「組換えDNA 」、「外因的DNA 」、「遺伝子操作された」、「非天然の」または「外来DNA 」と呼び、ここで前記DNA は遺伝子操作により単離され、宿主細胞または細胞系統のゲノムの中に導入される。
【０２５２】
典型的には、本発明の宿主細胞は、プラスミドの発現ベクター、ウイルスの発現ベクターにおいてDNA 配列のトランスフェクトにより、あるいは単離された線状DNA 配列として、産生される。好ましくは、トランスフェクトされたDNA は染色体的に組込まれた組換えDNA 配列であり、ケモカインまたはその補体からなり、宿主細胞は有意なレベルのオートロガスまたは「天然の」ケモカインを発現するか、あるいは発現することができない。
【０２５３】
宿主細胞中の前もって選択したDNA 配列の存在を確証するために、種々のアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、この分野においてよく知られている「分子生物学的」、例えば、サザンブロッティングおよびノザンブロッティング、RT-PCRおよびPCR ；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のケモカインの存在または非存在の検出、例えば、免疫学的手段（ELISA およびウェスタンブロット）によるか、あるいは本発明の範囲内に入る因子を同定する前述のアッセイによる；を包含する。
【０２５４】
導入された前もって選択したDNA セグメントから産生されたRNA を検出および定量するために、RT-PCRを使用することができる。このPCR の適用において、まず酵素、例えば、逆転写酵素を使用して、RNA をDNA に転写し、次いで慣用のPCR 技術を使用してDNA を増幅することが必要である。大部分の場合において、PCR 技術は、有用であるが、RNA 産物の統合みを証明しないであろう。RNA 産物の特質についてのそれ以上の情報は、ノザンブロッティングにより得ることができる。この技術はRNA 種の存在を証明し、そしてそのRNA の統合についての情報を与える。RNA 種の存在は、また、ドットまたはスロットブロットノザンハイブリダイゼーションを使用して決定することができる。これらの技術はノザンブロッティングの変法であり、そしてRNA 種のの存在または非存在を証明する過ぎない。
【０２５５】
サザンブロッティングおよびPCR を使用して問題の前もって選択したDNA セグメントを検出することができるが、それらは前もって選択したDNA セグメントが発現されるかどうかに関する情報を提供しない。導入された前もって選択したDNA 配列のペプチド産物を特別に同定するか、あるいは宿主細胞における導入された前もって選択したDNA セグメントの発現により発生した表現型を評価することによって、発現を評価することができる。
【０２５６】
Ｂ．ペプチド、ペプチド変異型およびそれらの誘導体
本発明の単離された、精製されたケモカインペプチド、ペプチド変異型またはそれらの誘導体は、例えば、固相ペプチド合成法によるか、あるいは組換えDNA アプローチ（上を参照）により、in vitroで合成することができる。固相ペプチド合成法は確立され、広く使用されている方法であり、下記の文献に記載されている：Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco (1969) ; Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963) ; Meienhofer, ″Hormonal Proteins and Peptide ″C.H.Li編、Vol.2 (Academic Press, 1973), pp.48-267 ; BavaayおよびMerrifield, ″The Peptides″, E. GrossおよびF. Meienhofer 編、Vol.2 (Academic Press, 1980), pp.3-285；およびClark-Lewis et al., Meth. Enzymol., 287 : 233 (1997)。
【０２５７】
それらのペプチドは下記の方法によりさらに精製することができる：イムノアフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上の分画；エタノール沈降；逆相HPLC；シリカまたはアニオン交換樹脂、例えば、DEAE上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈降；例えば、セファデックス（Sephadex）G-75を使用する、ゲル濾過；またはリガンドアフィニティークロマトグラフィー。
【０２５８】
所定のケモカインペプチドのいったん単離され、特性決定された誘導体、例えば、化学的誘導された誘導体は容易に製造することができる。例えば、本発明のケモカインペプチドのアミドまたはケモカインペプチドの変異型は、また、カルボン酸基または前駆体をアミドに変換する分野においてよく知られている技術により製造することができる。Ｃ末端のカルボキシル基においてアミドを形成する好ましい方法は、適当なアミンで固体の支持体からペプチドを切断するか、あるいはアルコールの存在下に切断し、次いで所望のアミンでアミノ分解することである。
【０２５９】
本発明のペプチドまたはペプチド変異型のカルボキシル基の塩は、通常の方法で、ペプチドを１またはそれ以上の当量の所望の塩基、例えば、金属の水酸化物の塩基、例えば、水酸化ナトリウム；金属の炭酸塩または重炭酸塩の塩基、例えば、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム；またはアミン塩基、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、およびその他と接触させることによって製造することができる。
【０２６０】
ケモカインペプチドまたはペプチド変異型のアミノ基のＮ−アシル誘導体は、最終縮合のためにＮ−アシル保護されたアミノ酸を利用するか、あるいは保護されたまたは非保護のペプチドをアシル化することによって製造することができる。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、遊離のヒドロキシペプチドまたはペプチド樹脂をアシル化することによって製造することができる。いずれのアシル化も標準的アシル化剤、例えば、アシルハロゲン化物、無水物、アシルイミダゾール、およびその他を使用して実施することができる。Ｎ−およびＯ−アシル化の双方は、必要に応じて、一緒に実施することができる。
【０２６１】
ホルミル−メチオニン、ピログルタミンおよびトリメチル−アラニンは、ペプチドまたはペプチド変異型のＮ末端の残基において置換することができる。他のアミノ末端の変性は、アミノオキシペンタンを包含する（Simmons, et al., Science, 276, 276 (1997) 参照）。
【０２６２】
さらに、ケモカインペプチド変異型を生ずるように、ケモカインペプチドのアミノ酸配列を修飾することができる。修飾はペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基の他のアミノ酸残基による置換、Ｌ型よりむしろＤ型を利用する置換を包含する、ならびに他のよく知られているアミノ酸アナローグ、例えば、天然に見出されされないアミノ酸、例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他を包含する。
【０２６３】
これらのアナローグは、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシ；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシルアミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイル−フェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様なアミノ酸およびイミノ酸およびｔ−ブチルグリシンを包含する。
【０２６４】
ペプチド変異型が生物学的に活性であるかぎり、ペプチドの１またはそれ以上の残基を変更することができる。例えば、ペプチド３［MCP-1 ］変異型、例えば、Ser7ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］について、変異型は対応する非変異型のペプチド、例えば、配列番号：１を有するペプチドの生物学的活性の少なくとも約１０％を有することが好ましい。
【０２６５】
保存的アミノ酸置換は好ましい−すなわち、例えば、酸性アミノ酸としてアスパラギン−グルタミン；塩基性アミノ酸としてリジン／アルギニン／ヒスチジン；疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン、メチオニン／バリン、アラニン／バリン；親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン／スレオニン。保存的アミノ酸置換は、また、側鎖に基づく基形成を包含する。
【０２６６】
例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基はセリンおよびスレオニンである；アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸の基はアスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有する基はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基はリジン、アルギニン、およびヒスチジンである；そして硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸の基はシステインおよびメチオニンである。
【０２６７】
例えば、ロイシンのイソロイシンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、スレオニンのセリンによる置換、あるいはアミノ酸の構造的に関係するアミノ酸による同様な置換は生ずる変異型のポリペプチドの性質に対して主要な効果をもたないことを期待することは合理的である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドを生ずるかどうかは、ペプチド変異型の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは本明細書において詳細に説明される。
【０２６８】
保存的置換を典型的な置換の題目の下に第１３図に示す。より好ましい置換を好ましい置換の題目の下に示す。置換が導入された後、変異型を生物学的活性についてスクリーニングする。
本発明の範囲内に入るアミノ酸の置換は、一般に、（ａ）置換の区域におけるペプチドの主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、の維持に対するそれらの効果が有意に異ならない置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、普通の側鎖の性質に基づくグループに分割される：
【０２６９】
（１）  疎水性：ノリロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）  中性の親水性：システイン、セリン、スレオニン；
（３）  酸性：アスパラギン、グルタミン；
（４）  塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン；
（５）  鎖の向きに影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；および
（６）  芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０２７０】
本発明は、また、非保存的置換を有するペプチド変異型に関する。非保存的置換は、前述のクラスの１つのメンバーを他のメンバーによる交換を伴う。
ペプチドまたは変異型ペプチドの酸付加塩あるいはペプチドまたは変異型ペプチドのアミノ残基の酸付加塩は、ペプチドまたはアミノを１または２以上の当量の所望の無機酸または有機酸、例えば、塩酸と接触させることによって製造することができる。ペプチドのカルボキシル基のエステルは、また、この分野において知られている通常の方法により製造することができる。
【０２７１】
そのうえ、本発明の因子、例えば、ケモカインペプチドは、それらのin vivo の安定性、例えば、それらの半減期または生物学的利用能を増加する方法において修飾される。修飾された因子は「誘導体」と命名される。このような誘導体を製造する方法はこの分野においてよく知られている。ペプチドを安定化する１つの方法は、環化されたペプチドである誘導体を製造することである（下記の文献を参照のこと：EPA471,453号（アミド結合）、例えば、リジン側鎖とアスパラギン酸側鎖との間のアミド結合；EPA467,701号（ジサルファイド結合）；EPA467,699号（チオエーテル結合））。
【０２７２】
in vivo の安定性を増加することができる他の修飾は、Jameson, et al., Nature, 368, 744 (1994)）；米国特許第4,992,463 号；米国特許第5,596,078 号および米国特許第5,091,396 号に開示されている。本発明の好ましい態様は、ペプチドのＮおよび／またはＣ末端に１または２以上のシステイン残基を付加することによって環化されたケモカインペプチドまたは変異型、ならびにＤ型アミノ酸の逆向き配列（例えば、Ｃ末端→Ｎ末端に読む）を有するように構築されたペプチドである。本発明のより好ましい態様は、環化されかつＤ型アミノ酸の逆向き配列を有するように構築されたペプチド、例えば、CRD 誘導である。
【０２７３】
Ｃ．ケモカインアナローグ
ケモカインアナローグは、対応するペプチドの性質に類似する性質を有する。それらのアナローグは「ペプチド模倣物」または「ピペチド模倣物」（Fauchere, J. (1986) Adv. Dru Res., 15 : 29 ; VegerおよびFreidinger (1985) TINS p.392；およびEvans et al. (1987) J. Med. Chem., 30 : 1229、これらは引用することによって本明細書の一部とされる）と呼ぶことができ、そしてコンピューター化された分子のモデル化の助けにより開発することができる。
【０２７４】
これらのアナローグは、この分野において知られており、そして下記の参考文献にさらに記載されている方法により、-CH2NH- 、-CH2S-、-CH2-CH2- 、-CH=CH- （シスおよびトランス）、-CH=Cf- （トランス）、-COCH2- 、-CH(OH)CH2- 、および-CH2SO- から成る群より選択される結合と必要に応じて置換された１または２以上のペプチド結合を有する構造を包含する：
【０２７５】
Spatola, A.F.,″Chemistry およびBiochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins ″, B. Weinstein編、Marcel Dekker, New York, P.267 (1983) ; Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol.1, Issue 3,″Peptides Backbone Modifications ″(general review) ; Morley, J.S., Trends Pharm. Sci. (1980) pp.463-468 (general review) ; Hudson, D., et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1979) 14 : 177-185 （-CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A.F., et al., Life Sci. (1986) 38 : 1243-1249 (-CH2-S) ; Hann, M.M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-，シスおよびトランス）；
【０２７６】
Almquist, R.G., et al., J. Med. Chem. (1980) 23 : 1392-1398 (-COCH2-) ; Jennings-White, C., et al., Tetrahedron Lett. (1982) 23 : 2533 (-COCH2-) ; Szelke, M., et al. 、欧州特許出願EP45665 (1982) CA ; 97 : 39405 (1982) (-CH(OH)CH2-) ; Holladay, M.W., et al., Tetrahedron Lett. (1983) 24 : 4401-4404 (-C(OH)CH2-)；およびHruby, V.J., Life Sci. (1982) 31 : 189-199 (-CH2S-) ；それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２７７】
特に好ましい非ペプチド結合は-CH2NH- である。このようなアナローグは、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、効力、効能、およびその他）、変更された特異性（例えば、広いスペクトルの生物学的活性）、減少した抗原性を有し、そして経済的に製造することができる。
【０２７８】
アナローグの標識は、通常、定量的構造−活性のデータおよび／または分子のモデル化により予測されるアナローグ上の１またはそれ以上の非妨害性位置への１またはそれ以上の標識の、直接的またはスペーサーを通す、共有結合を包含する。このような非妨害性位置は、一般に、アナローグが結合して療法的効果を産生する１またはそれ以上の高分子との直接接触を形成しない位置である。コンセンサス配列の１またはそれ以上のアミノ酸を同一型のＤ−アミノ酸でシステム的に置換（例えば、Ｌ−の代わりにＤ−リジン）して、より安定なペプチドを発生させることができる。
【０２７９】
Ｉ．ケモカイントリペプチドのイソエステル（式（IV）の化合物）
式（IV）の化合物（ここでZ=CH3 ；R=インドリル；Y=O ；かつX=CH3 ）は、N-t-BOC-NinBOC-L- トリプトファン-OH およびシクロヘキセノンから製造することができる。例えば、２−シクロヘキセン−１−オン（Ardrich C10,281-4 ）をトリメチルシリルクロライド（Ardrich 38,652-9）の存在下にリチウムジメチルクプレートと反応させて（反応１）エノラート中間体を捕捉する。反応において使用する前に、この分野においてよく知られている方法により、リチウムジメチルクプレートをメチルリチウムおよび銅（Ｉ）塩から２：１の化学量論において製造する（例えば、House, et al., J. Org. Chem., 40, 1460 (1975) ）。
【０２８０】
有機クプレートによりα−β不飽和ケトンの付加は、例えば、House, et al., J. Org. Chem., 31, 3128 (1966) に記載されている。同様に、トリメチルシリルクロライドによりエノラートの捕捉は、House, et al., J. Org. Chem., 36, 2361 (1971) に記載されている。次いで捕捉されたエノラートを、例えば、Rubottonの方法（J. Org. Chem., 44, 1731 (1979)）に従い、アセトキシ−銀およびテトラブチルアンモニウムフルオライドの存在下に分子のヨウ素の添加により、α−ヨード誘導体に分割して、式（IV）のトランス二置換シクロヘキサノンを生成する。
【０２８１】
【化１９】
0004523151.tif 000014
【０２８２】
式（IV）のヨウ化物を第二級アルコールに変換し、そして、例えば、無水酢酸でエステルを生成して、式（VIIb）の化合物を生成する。
【化２０】
0004523151.tif 000015
【０２８３】
この分野においてよく知られている手順を使用して、前述のトリメチルシリルエーテルエノラートをα−ヒドロキシケトンに変換し、次いでエステルを生成することによって、式（VIIb）の化合物をまた製造することができる。
式（VIIb）の化合物を標準的条件下に、例えば、ビニルマグネシウムブロミドでアルキル化し、脱水して（例えば、分子状ヨウ素および熱の存在下に）式（VIII）のジエンを生成する：
【０２８４】
【化２１】
0004523151.tif 000016
【０２８５】
式（VIII）のジエンとエチルアクリレート（Ardrich E970-6）との間のディールス−アルダー反応は、式IXの立体特異的、位置特異的生成物を与える。例えば、環化反応は、Green, et al., Adv. Pest Control Res., 3, 129 (1960)）に本質的に記載されているように、式（VIII）の化合物およびエチルアクリレートを混合することによって実施することができる。
【０２８６】
【化２２】
0004523151.tif 000017
【０２８７】
式（IX）の化合物中の二重結合を酸化的に切り放すと、式（Ｘ）の二酸が生成する。このような酸化的切り放しは、オゾン分解または酸性クロメートを使用する酸化により好都合に実施することができる。例えば、酸中のCrO3を使用して、Eschenmoser & Winter, Science, 196, 1410 (1977) に本質的に記載されているように、式（Ｘ）の化合物を製造することができる。
【０２８８】
【化２３】
0004523151.tif 000018
二酸をPOCl5 で活性化し、引き続いてジメチルアミンと反応させると、式（XI）のジアミドが生成する。
【０２８９】
【化２４】
0004523151.tif 000019
式（XI）の化合物のアセトキシ基を加水分解し、次いでメシレート（または他の適当な離脱基）を形成し、そしてTHF 中のヨウ化ナトリウムを添加すると、式（XIb ）の化合物が生成する。
【０２９０】
【化２５】
0004523151.tif 000020
式（XI）の化合物および式（XII ）の化合物を、LygoおよびRudd、Tetrahedron Lett., 36, 3577 (1995)に本質的に記載されているように、乾燥DMF 中で無水炭酸カリウムの存在下に反応させ、例えば、SmI2を使用して、スルホンを除去すると、Ｒ2 およびＲ3 がNMe2である、式（IV）の化合物が生成する。
【０２９１】
【化２６】
0004523151.tif 000021
保護されたトリプトファン（例えば、N-α-tBOC- Nin tBOC-L-トリプトファン-OH ；ノバビオケム04-12-0201）からフェニルメチルスルホンから誘導化されたジアニオンとの反応により、式（XII ）の中間体を好都合に製造することができる。
【０２９２】
【化２７】
0004523151.tif 000022
Ar=N-tBOC インドリル
式（IV）の化合物の好ましい合成は次の通りである：
【０２９３】
【化２８】
0004523151.tif 000023
【０２９４】
チオケトン誘導体（Ｙ＝Ｓ）は付加反応の挿入により合成することができ、ここで保護されたトリプトファンのβ−ケトスルホン誘導体をチオケトン誘導体に変換する。例えば、ジチオール、例えば、１，２−エタンジチオールとの反応により、チオアセタールが生成し、これをH2S の存在において無水条件下に加水分解してチオケトンを生成することができる。また、［２，４−ビス（４−メトキシ−フェニル）−１，３−ジチア−２，４−ジフォス−フェタン−２，４−ジサルファイド］（ロウウェッセン試薬）を使用して、変換を実施することができる。チオケトン誘導を式（XI）の化合物と反応させると、Ｙ＝Ｓである式（Ｉ）の化合物が生成する。
【０２９５】
【化２９】
0004523151.tif 000024
【０２９６】
インドリル以外のアリール置換基は、適当なアミノ酸の適当な保護されたβ−ケトスルホン誘導体の製造を必要とする。アミノ酸が容易に入手可能であるとき、反応は適当なtBOCまたはFmoc保護されたアミノ酸（それぞれ、フェニルアラリンおよびチロシン）（例えば、Novabiochem から）を使用して実施することができる。アミノ酸が容易に入手可能できないとき（例えば、Ｒ＝クマリル）、非標準的アミノ酸の合成についてこの分野においてよく確立された方法により適当なアミノ酸をまず製造しなくてはならない（例えば、YuanおよびHruby, Tetrahedron Lett., 38, 3853 (1997) 参照）。
【０２９７】
下に示すように、式（Ｖ）の化合物を式１３のエステルから好都合に製造することができる。リチウムジイソプロピルアミドで脱保護し、次いでブロミド１４でアルキル化すると、式１５の化合物が生成する。このエステルを、例えば、水素化ジイソブチルアルミニウムで選択的に還元すると、式１６のアルデヒドが生成し、これをPPh3＝CF2 を使用するウィッティッヒ反応によりジフルオロアルケンに変換することができる（Hayasi, et al., Chemistry Letters, 1980, pp.935-938)。
【０２９８】
アルデヒド１８は、Visweswariah, et al., Synthesis, 1982, pp.309-310 に記載されている手順に類似する手順を使用して、フェニルトリメチルアンモニウムトリブロミドで処理し、次いで標準的条件下にアセタールを形成することによって、ブロミド１９に変換に変換することができる。ｎ−ブチルリチウムで処理し、次いでジフルオライド１７と反応させて、式２０の化合物を生成することによって、ブロミドを対応するアルキルリチウムに変換する（Chemistry Letters, 1980, pp.935-940)。
【０２９９】
酸性条件下に脱保護すると、アルデヒド２１が生成し、これをPPh3＝CF2 と反応させてトリフルオライド２２が得られる。ブロミド２３から誘導されたアルキルリチウムで２２を引き続いて処理すると、式（Ｖ）の化合物が生成する。当業者は理解するように、種々の他の既知の保護基を前述の手順において利用することができ、そしてある種の保護基は基Ｒ4 〜Ｒ8 の構造に依存して他の保護基に依存して好ましいことがある。
【０３００】
【化３０】
0004523151.tif 000025
他の有用なケモカインアナローグは前述の方法により同定することができる。特に、経口的に生物学的利用性でありかつ安定であるケモカインアナローグ、およびケモカイン活性の効力があるインヒビターは好ましい。
【０３０１】
Ｄ．治療因子のターゲッティング
ケモカインペプチド、それらの変異型、アナローグまたは誘導体は、細胞の成分に特異的に結合する成分、例えば、抗体またはそのフラグメント、レクチン、トランスフェリン（肝臓のターゲッティングのために）および小さい分子の薬剤に結合させて、療法上の複合体を形成することによって、特定の治療部位にターゲッティングすることができる。
【０３０２】
本発明の治療因子のターゲッティングは、特定の解剖学的位置における治療因子の濃度を増加させることができる。そのうえ、結合性成分への本発明の治療因子の結合は、治療因子のin vivo サザンブロットを増加することができる。例えば、CD4 レセプターに結合する抗CD4 模倣物を本発明の治療因子に結合させて、治療複合体を生成することができ、その一部分はHIV コレセプターに結合する。これは特定の細胞型に対して治療因子をターゲッティングする能力を増強することができる。
【０３０３】
新形成について、抗腫瘍抗体、例えば、NR-LU-10（抗癌腫）、NR-ML-5 （抗黒色腫）、または抗CD45（抗リンパ腫）は治療因子を特定の型の腫瘍に局在化するために有用であることがある。感染症について、病原体特異的エピトープ、例えば、Ab17.41 (Cryptosporidium parvum)を認識する抗を使用することができる。慢性関節リウマチを治療するために関節にターゲッティングするために、抗滑膜またはコンドロイチン硫酸（例えば、カタログNo.C8035, Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）抗体を本発明の治療因子に結合させることができる。ぜん息または肺炎を治療または予防するために、気管支上皮に対する抗体は本発明の方法において使用するための免疫複合体を製造するために有用であろう。
【０３０４】
本発明の治療因子を特定の部位または細胞型にターゲッティングするとき有用な他の抗体は、下記に対して特異的な抗体を包含する：血管またはリンパに（例えば、Ulex europaeus-Iレクチン、カタログNo.U4754, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、血液凝固物または血小板（例えば、カタログNo.F9902、F4639 、F2506 、F8512 、Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、Ｔ細胞（例えば、カタログNo.C7048 (CD3) ; C1805 (CD4) ; C7173 (CD5)；およびC7298 (CD7), Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）、脳（例えば、カタログNo.S2644およびS2407, Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）、腫瘍（例えば、カタログNo.C2331, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、上皮細胞（例えば、カタログNo.E6011およびC1041, Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）、線維芽細胞（例えば、カタログNo.F4771およびV4630, Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）、
【０３０５】
マクロファージ（例えば、カタログNo.M1919, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、胃管腔（例えば、カタログNo.M5293, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、好中球（例えば、カタログNo.N1890およびN1765, Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）、腱（例えば、カタログNo.E4013, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、皮膚（例えば、カタログNo.K4252, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）、哺乳動物の組織または上皮（例えば、カタログNo.C6930, Sigma Chemical Co.ミゾリー州セントルイス）および骨格筋（例えば、カタログNo.D8281およびD1033, Sigma Chemical Co. ミゾリー州セントルイス）。
【０３０６】
悪性またはウイルス感染細胞をターゲッティングするために有用な免疫複合体を製造するために、悪性またはウイルス感染細胞上の表面抗原に対して特異性を有する抗体またはそのフラグメントを本発明の治療因子に結合させる。好ましくは、ケモカインペプチドまたはその変異型をペプチド結合を介して抗体の重鎖のカルボキシ末端領域、例えば、CH3 に結合させる。免疫複合体は遺伝子工学技術により、すなわち、キメラ免疫複合体をコードする核酸構築物を形成することによって製造することができる。
【０３０７】
好ましくは、免疫複合体をコードする遺伝子構築物は、５’→３’の向きに、重鎖の可変領域をコードするDNA セグメント、重鎖の定常領域をコードするDNA セグメント、およびケモカインペプチド、ペプチド変異型、またはそれらの反復をコードするDNA セグメントを含む。融合遺伝子を、それが発現される、適当なレシピエント細胞のトランスフェクションのための発現ベクターの中に挿入する。ハイブリッド鎖を軽鎖（または重鎖）の対応物と組合わせて、単価または２価の免疫複合体を形成することができる。
【０３０８】
複合体の重鎖の定常領域は、５つのイソ型の任意のものから選択される：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミュー。重鎖または種々のサブクラス｜例えば、IgG サブクラス１〜４）を使用することができる。軽鎖はカッパまたはラムダの定常鎖を有することができる。これらの免疫グロブリン領域のDNA 配列はこの分野においてよく知られている（例えば、Gillies et al., J. Immunol. Meth., 125, 191 (1989)参照）。
【０３０９】
好ましい態様において、可変領域はターゲット抗原（疾患を有する細胞、例えば、癌細胞またはウイルス感染細胞に関連する抗原）に対して特異的な抗体から誘導され、そして定常領域はCH1 、CH2 およびCH3 ドメインを包含する。ケモカインペプチドまたは変異型をコードする遺伝子は、例えば、適当なリンカー、例えば、(Gly4-Ser)3 をコードするDNA により、定常領域をコードする遺伝子の３’末端に対してインフレームで、直接的にまたは遺伝子間領域を介して結合される。
【０３１０】
ある態様において、遺伝子間領域はタンパク質分解的切断部位をコードするヌクレオチド配列からなることができる。この部位は、免疫グロブリンとケモカインペプチドまたは変異型との間で介在し、ターゲット部位においてケモカインペプチドまたは変異型をタンパク質分解に放出するように設計することができる。例えば、プラスミンまたはチロシンはプロテアーゼに対してアクセス可能である部位においてリジンおよびアルギニン残基の後に切断することはよく知られている。それらが攻撃する、多数の他の部位特異的エンドヌクレアーゼはよく知られている。
【０３１１】
核酸構築物は、キメラ免疫グロブリン鎖の発現を調節するために、可変領域をコードする遺伝子のためのエンハンサーおよびプロモーターを含むことができる。例えば、可変領域をコードする遺伝子は、リーダーペプチド、軽鎖のためのＶＪ遺伝子（結合（Ｊ）セグメントを有する機能的に再配列された可変（Ｖ）領域）または重鎖のためのVDJ 遺伝子、およびこれらの遺伝子のための内因的プロモーターおよびエンハンサーからなるDNA フラグメントとして得ることができる。あるいは、可変領域をコードする遺伝子は内因的調節因子を別として得ることができ、そしてこれらの因子を提供する発現ベクターにおいて使用することができる。
【０３１２】
可変領域の遺伝子は、所望の抗体を産生する細胞から、標準的DNA クローニング手順により得ることができる。特定の機能的に再配列された可変領域についてゲノムライブラリーをスクリーニングすることは、適当なDNA プローブ、例えば、Ｊ領域DNA 配列および下流配列を含有するDNA セグメントを使用して達成することができる。次いで、クローニングされた遺伝子をDNA 配列決定し、そして配列を全長の、適切にスプライスされたmRNAの対応する配列と比較することによって、正しいクローンの同定および確証は達成される。
【０３１３】
適当な可変領域をコードする遺伝子は、一般に、Ｉｇ産生リンパ系細胞から得ることができる。例えば、腫瘍関連抗原またはウイルス抗原に対して特異的なＩｇを産生するハイブリドーマ細胞系統は、標準的体細胞のハイブリダイゼーション技術により産生することができる。これらのＩｇ産生細胞系統は、機能的に再配列された形態の可変領域源を提供する。ネズミ系は所望の特異性の広範な種類のＩｇの産生に適しているので、可変領域の遺伝子は典型的にはネズミ由来である。
【０３１４】
機能的に再配列された可変領域の遺伝子を含有するDNA フラグメントを、所望の定常領域（またはその一部分）をコードする遺伝子を含有するDNA フラグメントに結合させる。Ｉｇ定常領域（重鎖および軽鎖）は、標準的遺伝子クローニング技術により、抗体産生細胞から得ることができる。２クラスのヒト軽鎖および５クラスのヒト重鎖の遺伝子はクローニングされ、こうして、ヒト由来の定常領域はこれらのクローンから容易に入手可能である。
【０３１５】
ハイブリッドIgH 鎖をコードする融合遺伝子は、レシピエント細胞の中への組込みのための発現ベクターに組立てるか、あるいはそれらの中に挿入される。プラスミドベクターの中への遺伝子構築物の導入は、標準的遺伝子スプライス手順により達成することができる。
完全な免疫グロブリンを発現させかつ同時に組立てることができるように、キメラIgH 鎖を同一細胞において共発現させることができる。この目的のために、重鎖および軽鎖の構築物を同一または別々のベクターの中に入れることができる。
【０３１６】
レシピエント細胞系統は一般にリンパ系細胞である。好ましいレシピエント細胞は骨髄腫（またはハイブリドーマ）である。骨髄腫を合成し、組立て、そしてトランスフェクトされた遺伝子によりコードされる免疫グロブリンを分泌させることができ、そしてそれらはポリペプチドをグリコシル化することができる。特に好ましいレシピエント細胞は、通常内因性免疫グロブリンを産生しない、Sp2/0 骨髄腫である。トランスフェクトされるとき、細胞はトランスフェクトされた遺伝子構築物によりコードされるＩｇのみ産生するであろう。トランスフェクトされた骨髄腫は培養またはマウスの腹膜において成長させることができ、ここで分泌された免疫複合体を腹水から回収することができる。他のリンパ系細胞、例えば、Ｂリンパ球をレシピエント細胞として使用することができる。
【０３１７】
キメラＩｇ鎖をコードする核酸構築物を含有するベクターでリンパ系細胞をトランスフェクトする、いくつかの方法が存在する。リンパ系細胞の中にベクターを導入する好ましい方法は、スフェロブラスト融合による（Gillies et al., Biotechnol., 7, 798-804 (1989)参照）。別の方法はエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈澱法を包含する。
免疫複合体を産生する他の有用な方法は、適当なin vivo またはin vitro系における構築物をコードするRNA 配列の製造およびその翻訳を包含する。
【０３１８】
組換え免疫グロブリンを精製する方法はこの分野においてよく知られている。例えば、抗体を精製するよく知られている方法は、プロテインＡは抗体のＦｃ領域に結合する傾向を有するので、プロテインＡの精製を包含する。次いで精製された免疫複合体の抗原結合活性を、この分野においてよく知られている方法、例えば、Gillies et al., J. Immunol. Metho., 125, 191 (1989) に記載されている方法により測定することができる。例えば、直接的結合または競合アッセイフォーマットにおいて抗原被覆プレートを使用して、免疫複合体の活性を測定することができる。
【０３１９】
特に、ヒト化抗体を製造し、次いで抗原に結合するそれらの能力をアッセイすることは好ましい。抗原に結合するヒト化抗体の能力を測定する方法は、抗原−抗体のアフィニティーをアッセイする多数の方法の任意の方法により達成することができる。例えば、ネズミ抗体NR-LU-13は、多数の癌腫上で発現された、ほぼ４０キロダルトンの糖タンパク質に結合する。この抗原はVarki et al., Cancer Res., 44, 681 (1984) ; Okabe et al., Cancer Res., 44, 5273 (1989)において特性決定された。こうして、NR-LU-13抗原に結合するヒト化抗体の能力を試験することは日常的である。そのうえ、この抗原のエピトープに結合する抗体の能力を評価する方法は知られている。
【０３２０】
ヒト化抗体（またはそれらのフラグメント）は、療法上の目的のための方法において有用な道具である。療法上の目的のin vivo 投与のためにヒト化抗体または抗体複合体を使用する基準を決定するとき、一般的に到達可能なターゲッティング比は高いこと、および腫瘍に送出される治療因子の絶対投与量は有意な腫瘍の応答を引き出すために十分であることが望ましい。ヒト化抗体を利用する方法は、例えば、米国特許第4,877,868 号、米国特許第5,175,343 号、米国特許第5,213,787 号、米国特許第5,120,526 号および米国特許第5,202,169 号の中に見出される。
【０３２１】
血管平滑筋細胞（VSMC）をターゲッティングするために、血管平滑筋細胞の細胞膜に関連する、VSMC結合性タンパク質、例えば、ポリペプチドまたは炭水化物、プロテオグリカンおよびその他を使用して療法上の複合体を製造することができる。好ましい態様において、結合性成分の例は、血管平滑筋細胞および周細胞により合成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）であり、そして約250kD の見掛けの分子量を有するCSPGの離散部分（本明細書においてエピトープと命名する）は特に好ましい。250kD のターゲットは、より大きい400kD のプロテオグリカン複合体の成分であるＮ−結合糖タンパク質である。
【０３２２】
本発明の１つの現在好ましい態様において、血管平滑筋結合性タンパク質は、血管平滑筋CSPGターゲット分子中のエピトープに結合するNR-AN-01モノクローナル抗体（NR-ML-05の継代培養物）により提供される。NR-ML-05と表示するモノクローナル抗体は、黒色腫細胞により合成される250kD のCSPGに結合すると報告されている（Morgan et al. 、米国特許第4,897,255 号）。平滑筋細胞および周細胞は、また、250kD のCSPGならびに他のCSPGを合成すると報告されている。平滑筋細胞に結合するNR-ML-05は開示された（Fritzb  erg et al.、米国特許第4,879,225 号）。
【０３２３】
継代培養物NR-ML-05No.85-41-4I-A2、freeze #A2106 は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection) 米国マリイランド州ロックビレ）に受託され、そして受け入れ番号HB-9350 を与えられた。NR-ML-05は、本明細書に開示するサブクローンNR-AN-01の親であり、それと構造的にかつ機能的に同等である。認識されるように、NR-AN-01は、400kD のCSPGターゲットに特異的に関連する血管平滑筋結合性タンパク質のちょうど１つの例であり、そしてこのターゲットに関連する他の結合性タンパク質およびこのターゲット中の他のエピトープは、また、本発明の療法上の複合体および方法において有用である。
【０３２４】
認識されるように、本発明者らは、また、本発明の療法上の複合体における血管平滑筋結合性タンパク質として、ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」ネズミ抗体の実用をもくろむ。例えば、ヒト定常ドメイン領域およびＦｃ領域をコードするヌクレオチド配列でネズミＦｖ領域（すなわち、抗原結合部位を含有する）をコードするヌクレオチド配列を遺伝的に組換えることによって、ネズミモノクローナル抗体を「キメラ化」することができる（例えば、欧州特許出願No.0,411,893A2に開示されている方法に類似する方法において）。
【０３２５】
ヒト化血管平滑筋結合性相手は、宿主レシピエントにおける抗体またはポリペプチドの免疫学的に反応性を減少するという利点を有し、これによりin vivo 半減期を増加しかつ悪い免疫反応の可能性を減少させるとき有用である。また、N. Lonberg et al.(米国特許第5,625,126 号；米国特許第5,545,806 号；および米国特許第5,569,825 号）；およびSurani et al.(米国特許第5,545,807 号）参照。
【０３２６】
本発明の癌治療の態様のために有用な結合性ペプチドは、癌細胞およびその他の細胞膜および細胞質のエピトープに関連するものを包含する。これらの結合性ペプチドは、それぞれ、無傷の細胞の表面膜および崩壊した細胞の内部のエピトープに局在化し、そして同化のための治療因子をターゲット細胞の中に送出す。必要な腫瘍細胞型に局在化する、最小のペプチド、模倣物の有機化合物およびヒトまたはヒト化抗体は、また、本発明の結合性ペプチドとして有用である。このような結合性ペプチドは、既知の技術に従い、同定し、構築し、または単離することができる。本発明のこれらの態様の好ましい結合性ペプチドは、少なくとも約１０-6Ｍのアソシエーション定数を有するターゲットエピトープに結合する。
【０３２７】
抗体−ペプチド複合体の製造に有用な方法はこの分野においてよく知られている。例えば、米国特許第5,650,150 号（その開示は引用することによって本明細書の一部とされる）参照。共有結合または非共有結合を介してターゲッティング成分に治療因子を結合させる、代表的な「カップリング」法は、治療因子中の反応性基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、アミド、またはスルフヒドリル基）と、ターゲット成分中の他の反応性基（同様な特質の）との間で反応して結合を形成する、化学的架橋性化合物およびヘテロ二官能性架橋性化合物（すなわち、「リンカー」）を包含する。
【０３２８】
この結合は、例えば、ペプチド結合、ジサルファイド結合、アミド結合、チオエーテル結合、およびその他であることができる。１つの例示的例において、モノクローナル抗体と薬剤との複合体は、MorganおよびFoon (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer : Preclinical Models and Investigation, Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol.2, Kluwer Academic Publishers、マサチュセッツ州ヒンガム）およびUhr (J. of Immunol., 133 : j-vii, 1984) により要約されている。
【０３２９】
複合体が放射性核種の細胞増殖抑制因子を含有する、他の例示的例において、米国特許第4,897,255 号（Fritzberg et al.、引用することによって本明細書の一部とされる）には、有用であるカップリング法が記載されている。１つの態様において、療法上の複合体はケモカインペプチドまたは変異型に共有結合でカップリングされた血管平滑筋結合性タンパク質を含有する。この場合において、連鎖の共有結合は血管平滑筋結合性タンパク質およびケモカインペプチドまたは変異型の１またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基の間で形成することができる。
【０３３０】
本発明の好ましい態様において、抗体複合体は前ターゲッティング法において使用される。本質的に、このような前ターゲッティング法は、従来の癌診断または療法に比較して、ターゲッティング比の改良およびターゲット細胞部位への絶対投与量の増加により特徴づけられる。前ターゲッティング法の一般的説明は、米国特許第4,863,713 号、米国特許第5,578,287 号、および米国特許第5,630,996 号の中に見出すことができる。典型的には前ターゲッティングアプローチは下記に要約される。
【０３３１】
前ターゲッティング法は２つの一般的型を有する：３工程の前ターゲッティング法および２工程の前ターゲッティング法。３工程の前ターゲッティングプロトコールはターゲッティング成分−リガンド複合体の投与を含み、この複合体はターゲットに局在化させ、循環において希釈することができる。次いで、抗リガンドを投与し、この抗リガンドはターゲッティング成分−リガンド複合体に結合し、非結合のターゲッティング成分−リガンド複合体を血液からクリアーし、かつターゲット部位においてターゲッティング成分−リガンド複合体に結合する。こうして、抗リガンドはターゲット部位に結合しないターゲッティング成分−リガンド複合体をクリアーし、かつターゲット部位に結合してターゲッティング成分−抗リガンド複合体を形成することによって、二重の機能を満足する。最後に、急速な体全体のクリアランスを示す治療因子−リガンド複合体を投与する。
【０３３２】
循環中の治療因子−リガンド複合体はターゲット部位に結合したターゲッティング成分リガンド：抗リガンド複合体に密接に近接するようになり、複合体の抗リガンド部分は循環する治療因子−リガンド複合体のリガンド部分に結合し、こうしてターゲット部位においてターゲッティング成分リガンド：抗リガンド：リガンド−治療因子「サンドイッチ」を産生する。さらに、非結合の治療因子は急速にクリアーするリガンド（ゆっくりクリアーするターゲッティング成分、例えば、抗体または抗体フラグメントよりむしろ）に結合するので、この技術は活性因子に対する非ターゲットの暴露を減少させる。
【０３３３】
あるいは、２工程の前ターゲッティング法は、前述の同定された抗リガンドを投与する工程を排除する。これらの「２工程の」手順はターゲッティング成分−リガンドまたはターゲッティング成分−抗リガンドの投与、次いでリガンド／抗リガンドの対の反対のメンバーに複合化する治療因子の投与を特徴とする。
２工程の前ターゲッティング法における任意の工程として、クリアランス機能を提供するように特別に設計されたリガンドまたは抗リガンドを投与して、循環するターゲッティング成分−リガンドまたはターゲッティング成分−抗リガンドのクリアランスを促進する。こうして、２工程の前ターゲッティングアプローチにおいて、直接的に、あるいはターゲッティング成分−抗リガンドまたはターゲッティング成分−リガンド複合体に結合した、前に投与したターゲット細胞を通して、クリアー因子はターゲット細胞の集団に結合するようにならない。
【０３３４】
前ターゲッティング法におけるターゲッティング成分は、規定されたターゲット細胞の集団、例えば、腫瘍細胞に結合する。これに関して好ましいターゲッティング成分は抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、例えば、ヒトモノクローナル抗体、または「ヒト化」ネズミまたはキメラ抗体である。ヒト化抗体のいくつかの例は、CHO 産生、宿主、例えば、植物（例えば、トウモロコシ、大豆、タバコ、およびその他）、昆虫、哺乳動物、酵母、および細菌において産生された抗体を包含する。ヒト化抗体は、抗体NR-LU-13により結合された抗原に結合する抗体であることができる。好ましくは、ヒト化抗体は、Ｎ−結合グリコシル化または免疫原性または毒性を減少するために、発現後の修飾された、そのＮ−結合グリコシル化をもたないであろう。
【０３３５】
ターゲッティングプロトコールにおいて使用するために適当なリガンド／抗リガンド対は、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、ハプテンおよびエピトープ／抗体、それらのフラグメントまたはアナローグ、例えば、模倣物、レクチン／炭水化物、亜鉛フィンガータンパク質／dsDNA フラグメント、酵素インヒビター／酵素；およびそれらのアナローグおよび誘導体を包含する。好ましいリガンドおよび抗リガンドは、少なくとも約ＫA ≧１０9 ／ＭまたはＫD ≦１０-9Ｍのアフィニティーで互いに結合する。
【０３３６】
一般に、このような前ターゲッティング法はクリアランス機能を提供する抗リガンドの投与を含むことが好ましい。クリアランスは、血液中を循環する複合体の架橋および／または凝集に多分寄与し、これはレシピエントのPES （細網上皮系）による複合体／凝集物のクリアランスに導く。次いで型の抗リガンドのクリアランスは好ましくは多価の分子により達成される。しかしながら、その自身上のPES によりクリアーされるために十分な大きさの１価の分子を使用することもできるであろう。
【０３３７】
あるいは、ヘキソース残基、例えば、ガラクトース残基またはマンノース残基を付加して、肝臓を介して抗リガンド、抗リガンド複合体またはヒト化抗体をクリアーするようにすることによって、レセプターをベースとするメカニズム、例えば、アシュウェル(Ashwell）レセプターまたは他のレセプターを利用することができる。このようなクリアランスのメカニズムは、前述のRES 複合体／凝集物のクリアランスメカニズムよりも、クリアランス因子の原子価に依存する程度が低い。
【０３３８】
例えば、ターゲッティング成分−リガンドまたはターゲッティング成分−抗リガンドがクリアランスを提供するように誘導化されている（すなわち、ヘキソース残基の付加）場合、クリアランス因子は不必要であろう。好ましいクリアランス因子は、米国特許第5,624,896 号および米国特許第5,616,690 号；ならびにPCT 出願公開WO95/15978号に開示されている。
【０３３９】
当業者は、本明細書における教示および本明細書において言及する出願に基づいて、有効な療法上の有効投与量および治療のプロトコールを容易に決定することができる。これは、なかでも、因子、例えば、特定の選択した治療因子、送出の経路、１またはそれ以上のターゲット部位の型、問題のターゲット部位に対するターゲッティング成分のアフィニティー、正常組織とのターゲッティング成分の交差反応性、患者の症状、治療を単独でまたは他の治療と組合わせて実施するかどうかに依存するであろう。
【０３４０】
例えば、前ターゲッティング戦略におけるヒト化抗体−アビジンまたはストレプトアビジン複合体の場合において、適当な投与量は約１０〜約2500mg、より好ましくは約５０〜抗体1500mg、最も好ましくは約 100〜抗体800mg の範囲である。リガンド−治療因子複合体の投与量は、一般に、約 0.001〜約１０mg、より好ましくは約 0.1〜２mgの範囲である。
【０３４１】
一般に、このような前ターゲッティング法はクリアランス因子の投与を含む。クリアランス因子の投与量は、前に投与した複合体を循環から実質的にクリアーするために十分な量である、すなわち、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは 100％に近い値または 100％である。一般に、クリアランス因子はヒト化抗体−ストレプトアビジン複合体の投与の数日後、好ましくは約１〜５日後、より好ましくは少なくとも約１〜２日後である。一般に、クリアランス因子をいつ投与するかの決定は、ターゲットの吸収およびターゲッティング成分複合体の内因的クリアランスに依存する。
【０３４２】
特に好ましいクリアランス因子は、アシュウェルレセプター仲介クリアランスを提供する因子、例えば、ガラクトシル化タンパク質、例えば、ガラクトシル化ビオチニル化ヒト血清アルブミン(HSA）およびガラクトースおよびビオチンを含有する小さい分子のクリアランス因子である。HSA をベースとするクリアランス因子の場合において、クリアランス因子の典型的な投与量は約 100〜1000mg、より好ましくは約 200〜500mg の範囲であろう。クリアランス因子を投与する場合、リガンド−治療因子複合体は好ましくは約２〜１２時間後に投与される。
複合体は既知の投与法により投与することができる。既知の投与法は、なかでも、例えば、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、鼻内投与を包含する。静脈内投与は一般に好ましい。
【０３４３】
III ．本発明の因子により治療に従う適応症
本発明の因子は、ケモカイン誘導活性に関連する適応症、例えば、異常なまたは病理学的炎症プロセスに悩む哺乳動物を治療し、哺乳動物においてそれの危険を抑制し、あるいは哺乳動物においてその危険を増大するために有用である。ケモカインは、生理学的または病理学的の双方の、広い範囲の炎症プロセスに参加する。
【０３４４】
こうして、広い特異的なケモカインインヒビターは、広い範囲の炎症性疾患の治療または予防に有用である。そのうえ、合理的にデザインされたケモカインインヒビター、すなわち、種々のケモカインに対して比較的特異性のインヒビターは、広いスペクトルのケモカインインヒビターの慢性的療法に関連する副作用を減少または抑制する。こうして、これらのインヒビターは特定の疾患を治療し、これにより無関係の生理学的プロセスの崩壊から生ずる副作用を最小とするように設計することができる。
【０３４５】
アテローム性動脈硬化症  アテローム性動脈硬化症の発生は、平滑筋細胞、内皮細胞および炎症性細胞、および、特に、単球由来の組織のマクロファージ、Ｂ細胞またはＴ細胞を包含する複雑なプロセスである。いったん内皮細胞が活性化されると、それらは炎症性細胞の管外遊出に重要な付着分子を発現する。例えば、 TGFβ1 ノックアウト（−／−）マウスにおいて、このサイトカインの非存在は内皮細胞の活性化を生じた。
【０３４６】
活性化された内皮細胞は、なかでも、接着分子、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびICAM-1を発現し、これらは引き続いて白血球の管外遊出に参加する。効力がある前炎症性サイトカインは、また、初期の血管病変の部位において発現された。TFN-α、IL-1、ならびにいくつかのケモカイン、例えば、IL-8およびMCP-1 は、アテローム性動脈硬化症の病変において増加したレベルで検出された。前述の結果が示すように、ケモカインモノ(Mono)Ｑは特にアテローム性動脈硬化症の血管の情報においてある役割を演ずる。
【０３４７】
血管病変の急性安定性は、全体のプラークの負荷よりも心筋梗塞の短期、例えば、数年、の危険のいっそう重要な決定因子であることは現在よく受け入れられいる。マクロファージの浸潤の程度は、多分比較的プラーク安定性の主要な決定因子である。
【０３４８】
少なくとも２つの因子はプラーク安定性に寄与する：マクロファージはそれらのインヒビターを超える過剰のマトリックス分解性酵素（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ）を分泌し、マクロファージに富んだ肩および繊維質キャップ領域における細胞外マトリックス(ECM）の低下を生ずる、不安定なまたは破壊したプラークの共通の特徴；および多分脂質の毒性の酸化性代謝物に応答して、マクロファージ由来のフォーム細胞は壊死性となり、脂質が充填した細胞外プールを生じ、これはさらに局所的壁の構成を不安定化する。
【０３４９】
ケモカインの作用のインヒビター、特にMCP-1 のインヒビターは、プラークの安定性を改良し、こうして、全体のアテローム性動脈硬化症のプラークの負荷を必然的に減少させないで、心筋梗塞の危険を急速に減少させる。特に、本発明の因子は脂質の病変の形成および／または病変の病変の進行を減少し、ならびにプラークの安定性を増加させる（Boring et al., Nature, 394, 894 (1998)) 。
【０３５０】
こうして、本発明の因子、例えば、ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：１）、KQK ペプチド７［7-12］（配列番号：９）、ならびに変異型、例えば、Leu4Ile11 ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］（配列番号：14）、またはそれらの誘導体は、不安定な狭心症、アテローム性動脈硬化症、ならびに局所的または全身的血管炎により特徴づけられる他の疾患、ならびに血管壁の情報に対して二次的に起こる症状および疾患、例えば、心筋梗塞の治療および／または予防に有用であろう。
そのうえ、本発明の因子は、また、脂質低下因子、例えば、スタチン、またはTGF-β増加因子と組み合わせにおいて有用である（例えば、WO96/40098、その開示は引用することによって本明細書の一部とされる、参照）。
【０３５１】
骨粗鬆症．しばしば骨粗鬆症に分類される低骨密度は、骨芽細胞による骨マトリックスの蓄積と、それに続く破骨細胞による吸収とが非平衡となる結果生ずる。これら２つの動的プロセス間のバランスが骨密度を決定している。骨密度を上げる一つの方策は、骨に対するエストロゲン作用を模擬するラロキシフェンの様なタモキシフェン類縁体を使用し、骨芽細胞の分化を促進（骨マトリックス蓄積の増加）し、破骨細胞の動員を抑制する（吸収低下）ことである。別の方策は、破骨細胞が骨に動員されるメカニズムを直接阻害し、骨吸収を低下させることである。血漿及び尿中の骨マトリックス分解産物（コラーゲンのN-末端およびC-末端テロペプチド、ならびにピリジニウム架橋の様な）の測定から、骨粗鬆症では骨吸収が増加していることが確認されており、従って破骨細胞の活動阻害は効果的な治療方針であることが証明されたと考えられる。
【０３５２】
局所的に誘導される骨芽細胞とは異なり、破骨細胞は単核細胞分画を循環し、おそらく単核細胞と同一である前駆細胞として持続的に骨に動員される。一度動員されると、前駆細胞は骨芽細胞に分化し、その後アポトーシスで死滅するまでマトリックスを吸収する。即ち、骨組織の破骨細胞の数（及び、従って破骨細胞の活動度）は、破骨細胞の動員プロセスを変調することで迅速に制御することができる。
【０３５３】
現在、数多くの一連の証拠より、単核細胞の骨への動員がアテローム発生中に起こる血管壁への病的な単核細胞動員と分子的に平行していることが示唆されている。具体的には、ケモカインMCP-1 が両プロセスに関わっている。即ち、MCP-1 阻害剤は単核細胞の動員減少に作用し、その結果破骨細胞の動員を低下し、そして／又は破骨細胞に分化する細胞の数を減らし、例えば年単位ではなく週単位で迅速に骨密度を増加する。
【０３５４】
この骨密度を増加する治療薬の能力は、骨密度が更に減少することを阻止するが骨密度の上昇はもたらさない既存治療薬とは対照的である。従って、ペプチド３、即ちペプチド3(7-12) ［MCP-1 ］およびその変種（即ちLeu4Ile11 ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］、ならびにその誘導体（即ち、CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12) ［MCP-1 ］）は低骨密度の阻害または予防に有用であろう。具体的には、CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12) ［MCP-1 ］の様なCCケモカインに特異性を有する誘導体は、骨粗鬆症の治療に好適薬である。
【０３５５】
HIV 感染及びAIDS． HIV分離株による細胞の増殖性感染にはCD4 レセプターに加え、さらに別の細胞表面分子（コレセプターと命名された）が必要とされる。HIV 分離株は、単核細胞／マクロファージ（M-トロピック株）、又はヘルパーＴリンパ細胞（T-トロピック株）に感染可能かにより２種類のサブタイプに分けられる。ケモカインリガンドを用いた実験は、ケモカインレセプターがHIV コレセプターとして機能すること：MIP1α及びRANTESがM-トロピック株の単核球感染を阻害し（しかしT-トロピック株によるT-細胞感染は阻害しない）、一方SDF-1 はT 細胞感染を阻害する（しかし、単核細胞は阻害しない）ことを示唆した。さらに分子解析より、MIP1α/RANTES レセプターCCR-5 は単核細胞上のHIV コレセプターであるのに対しSDF-1 レセプターCXCR-4（又はLESTR 及びフシンとも呼ばれる）はT-細胞上のコレセプターであることが確認されている。
【０３５６】
初期感染では、非シンシチウム形成ウイルスであり、病毒性がなく、そしてＴ−細胞を消耗しないM-トロピックウイルスが優性である。後期になると、ヘルパーT 細胞を消耗し、獲得免疫不全症（AIDS）を誘導するより毒性の強い、シンシチウム形成T-トロピック株への転換傾向の選択が起こる。効率は低いものの、ビリオンは別のケモカインレセプターとして利用できる。即ち、HIV を阻害する有効薬剤を提供するには、薬剤は１種類以上のレセプターへのウイルス結合を阻害することが好ましく、即ち薬剤はケモカインレセプターに対する広範な特異性を持たなければならない。
【０３５７】
遺伝的研究から、HIV 感染に対する個々に必須な免疫を提供するCCR5に突然変異を同定した。このCCR5△32と命名された変異の結果、切断されたmRNAが生ずる。切断CCR-5 は発現しても細胞表面上に検出可能なCCR-5 を生まない。現在のところHIV 感染に関する血清陽性のホモ接合体変異１例に関する１報告のみであるが、該欠損のホモ接合体人はたとえ極めて多量のウイルス攻撃に曝さても、HIV 感染に対し完全に耐性であると報告されている。即ち、これらの観察は、CCR-5 レセプターの効果的遮断は感染を効果的に防止することを示している。さらに、CCR-5 △32ホモ接合体はHIV 耐性以外に検出可能な表現形を有していないことから。CCR-5 が伝達するケモカインシグナルは正常生理状態では重要な役割を有していない。
【０３５８】
従って、ペプチド３の様なケモカインレセプターの阻害剤、その変種、類縁体または誘導体は広い特異性を持つことから、HIV 感染を阻害するだろう。以下記すように（実施例５）、ペプチド3 ［MCP-1 ］はHIV 結合及び、ジュルカット（Jurkat）細胞及びマクロファージの感染を阻害した。HIV 感染及び／または複製の予防、又は阻害に好適な薬剤はCRD-Cys13Leu4Ileペプチド3(3-12) ［MCP-1 ］である。具体的には、ペプチド３、その変種、類縁体あるいは誘導体、例えばCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はHIV のM-トロピック株の感染の阻害に特に有用であろう。
【０３５９】
ペプチド２はＴ細胞及びマクロファージ内でのHIV の複製を阻害することから、ペプチド２、その変種、類縁体、あるいは誘導体はまたHIV 感染及び／又は複製の予防又は阻害にも有用であろう。好適な治療薬は対応するケモカイン、又は天然あるいは野生型配列を有するペプチドに関しダッフィ結合を低下し、コレセプター親和性を増加する（少なくともおよそnMの範囲で）（実施例５参照）。好ましくは、ペプチド２、その変種、類縁体あるいは誘導体、例えばLRD 誘導体はHIV のT-トロピック株の阻害に有用である。
即ち、ペプチド３、その変種、類縁体または誘導体とペプチド２、その変種、類縁体または誘導体の組合せは、HIV 感染の予防、または治療に特に有用であろう。
【０３６０】
即ち、これら薬剤は、単独または組合せ、あるいは他の抗ウイルス治療と組合せて利用した場合に、HIV 血清陽性例、及び血清陽性患者のAIDSへの進行の両方の治療、ならびに防止に有用である。組み合わせて利用する場合、感染者は抗ウイルス剤（逆転者酵素阻害剤とウイルスプロテアーゼ阻害剤のカクテルの様な）で前処理され、続いて一般的なケモカイン阻害剤、好ましくはペプチド３、ペプチド２、それらの変種または誘導体、より好ましくはペプチド２［MIP1α］、その類縁体または誘導体の投与を受けることが好ましい。
【０３６１】
さらに、ウイルスの複製によって他の治療法（プロテアーゼ阻害剤または逆転写阻害剤の様な）に対する耐性が惹起されることから、ウイルスの感染能を低下させる薬剤はこれら既存治療法の成功率を劇的に増加するだろう。特に、逆転写酵素またはウイルスプロテアーゼの様な、現在成功している全ての治療法の標的とは異なり、ケモカインアゴニスト及び／又はアンタゴニストは、ウイルス自身ではなく、むしろ感受性細胞を標的とする。ウイルスは急速に変異し、ウイルス標的薬剤に対する耐性株を生じるが細胞はそれほど容易に変異せず、又変異への選択圧が小さいかまたは無い。
【０３６２】
ケモカインコレセプターの利用を迂回せねばならない場合にHIV ウイルスが起こさねばならない変異の範囲は、逆転写酵素阻害剤に対する逆転写酵素耐性を生じるために必要な変異に比べ遙かに広範囲であると考えられる。即ち、ケモカイン類縁体の投与は、単独、またはウイルス標的治療との組合せのいずれでも有効であると考えられる。さらに、ケモカイン阻害剤はin vivo に於ける副作用が少なく、即ち生理学的インパクトが限局されており、従ってin vivo で使用した場合に良好な治療指数を有するだろう。
【０３６３】
マラリア．  マラリアは原虫属の細胞内寄生虫により引き起こされる。この寄生虫の主要標的細胞は赤血球であり、その感染メカニズムには原虫表面蛋白並びに少なくとも一般原虫種、P.vivax に対するケモカイン（DARC）のディフィ抗原レセプターが含まれる。研究より、赤血球表面に正常にDARCが提示されることが原虫の進入に必要であることが示されている。従って、DARC機能阻害剤は有用な抗マラリア薬となるだろう。
【０３６４】
即ち、ペプチド３、又は好ましくはSer7Glu8Glu9ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］の様な高親和性DARC結合を示す誘導体、もしくはより好ましくは抗親和性DARC欠等を示し、且つケモカイン活性を阻害しないペプチド2 ［MCP-1 ］、ペプチド2 ［MGSA］またはペプチド2 ［IL-8］の様なペプチドが、マラリアの予防と治療に有効な本発明の範囲の薬剤の例である。ペプチド２，ペプチド２変種、及び誘導体は前炎症性作用物質である。即ち、これらの作用物質は炎症反応、特に寄生虫の感染、例えば細胞内感染の様な持続性感染にしばしば付随する弱い炎症反応の促進に有用である。
【０３６５】
乾癬．乾癬はMCP-1 及び単核細胞の動員に関連する炎症性疾患である。本発明の治療薬、例えばペプチド３の局所適用は、この薬物提供法が生物学的利用能を低下させることから、乾癬の予防または治療に好適である。局所性に投与される本発明の治療薬の誘導体、例えばCRD ペプチドは、その非誘導型薬剤に比べ高い生物学的有効能を有するだろう。
【０３６６】
自己免疫疾患．多発性硬化症、クローン病、リューマチ関節や全身性エリテマトーテスの様な自己免疫疾患は、免疫系の不適当な活性化が特徴であり、自己反応性白血球により引き起こされる。最初に自己抗原の不適切な認識を誘導するファクターは不明であるが、その後の傷害発生、死亡に続く組織破壊の基礎となる持続性炎症には多くの前炎症性サイトカインが関与している。これら炎症性サイトカインのうち、TNF-α及びケモカイン（特にMIP-1 α）が関与する。
【０３６７】
例えば、ヒトの多発性硬化症と共通な幾つかの特徴を持つT-細胞介在型自己免疫疾患のモデルである、実験的自己免疫性脳脊髄炎に於いてはMIP-1 α発現の上昇が検出される。自己免疫疾患の動物モデルではケモカインレベルを下げる抗体治療が有効であることが示されているが、この方法は短期間ケモカインレベルを低下させるに過ぎず、ヒトの治療には有効ではないと考えられる。逆にケモカインシグナル伝達の一般的アンタゴニストは、広範囲の不適当な炎症を抑制する。即ち、ペプチド３、その誘導体及び変種は、もとよりこれに限定されるものではないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リューマチ関節炎および全身性エリテマトーテスを含む自己免疫疾患の予防及び／または治療に有用であろう。
【０３６８】
さらに、様々な自己免疫疾患には多様なケモカイン発現のパターンが伴い、従って各自己免疫疾患は異なるペプチド３の誘導体、又は変種を必要とするだろう。例えば、MIP1αは多発性硬化症に於いて重要な役割を果たすだろう。MIP1αはCCケモカインである。即ち、ON発明のCC- 選択薬剤の投与は多発性硬化症の治療に利用できる（例えばLeu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］又はSer7Glu8Glu9ペプチド３（1-12）［MCP-1 ］）。
【０３６９】
創傷治癒．創傷が起こると、創傷の治癒には各種細胞の動員及び増殖、マトリックスの生産、免疫サーベイランスの増加を含む複雑なプロセスが起こる。胎児では（免疫サーベイランスの増加が必要とされない）、この創傷治癒のプロセスは正常組織構造の完全回復につながる（例えば切開創傷後に正常皮膚構造が回復する）。成人ではこれと明確に異なり、切開創傷は清浄皮膚構造を回復しない創傷治癒プロセスを取る。マトリックスは過剰に生産され、不適当な空間構造を作る。その結果瘢痕ができる。火傷のような重症の創傷を受けた子供の様な場合には、瘢痕は常の多量のマトリックスの蓄積を伴う過形成であり、極めて醜悪となることがある。
【０３７０】
成人では、創傷後感染のリスクは高い。白血球、特に好中球は創傷部位に迅速に動員されるが、単核球／マクロファージは創傷数日後に出現し、迅速に肉芽性組織を形成する。抗体を用いた研究から、IL-8の様なCXC ケモカインが創傷部位への好中球誘引に於いて需要な役割を果たしていること、及びIL-8産生阻害が好中球の蓄積と、その後の瘢痕形成を軽減することが示唆されている。CCケモカインを阻止する実験からも、これらが創傷部位へのマクロファージの誘引に機能していること、そしてこれら細胞が創傷の質を代償にしても迅速治癒を促進していることが示されている。従って、CXC またはCCケモカイン、あるいはその両方を阻害すると、創傷に誘導される炎症反応が減少し、それに続いて迅速な治癒と皮膚構造の良好な回復のバランスが促進されるだろう。
【０３７１】
瘢痕形成を防止または低下し、及び／又は創傷治癒を促進するための、本発明の好適実施態様は、創傷部位のケモカイン作用を阻害する本発明の治療薬の局所適用である。即ち、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］、CRD-Leu4-Ile11ペプチド3 ［MCP-1 ］またはWVQ 、あるいはその組み合わせの様な広域スペクトラムケモカイン阻害剤が投与されるだろう。あるいは、KEN の様なIL-8の選択的阻害剤、股はKQK の様なMCP-1 の選択的阻害剤、ならびにその組み合わせが投与されるだろう。
【０３７２】
さらに、広域スペクトラム阻害剤及び選択的阻害剤の組み合わせも投与されるだろう。この様にして、創傷により誘導される炎症プロセスの各種成分は希望通りにコントロールされ、皮膚構造の回復そ促進しながら創傷をよりゆっくりと治癒（感染から保護された状態、例えば抗生物質併用）することが可能になるだろう。創傷治癒を治療、または促進する薬剤の効果の決定方法については米国特許第5,202,118 号を参照。
【０３７３】
高血圧．高血圧はアテローム性動脈硬化症のリスクファクターである。本発明の薬剤が高血圧の阻害、または治療に有用でるか決定するために、ウサギモデルを使用した。ニュージーランド白ウサギにアテローム形成食を３週間与え、プラークを形成させた。各ウサギ群の半数には本発明の薬剤を投与した。ウサギの１群には、下行胸部大動脈の中央部周辺にダルコンバンドを巻き付けて動脈狭窄を創造した（狭窄群）。他のウサギ群には狭窄を伴わないバンド処理を行った。ウサギのさらに別の群は未処理のコントロールとした。
【０３７４】
血管内皮細胞表面への単核細胞の結合は、バンド近位部および遠位部の標準的な動脈断片についてエピ蛍光顕微鏡により決定した。免疫組織学は以下の抗体を用いて実施した：VCAM-1、RAM11 、CD11b 及び第VIII因子。薬剤投与を受けないウサギでは、狭窄近位動脈の高血圧域では、内膜肥厚化及びマクロファージの蓄積を伴う単核細胞の付着およびVCAM-1の発現が増加した。薬剤処理されたウサギでは、単核細胞の接着及び、内皮細胞でのVCMA-1の発現、内膜肥厚及びマクロファージの蓄積は非薬剤処理群に比べて減少した。
【０３７５】
結核：Mycobacterium tuberculosisの感染は、宿主組織（この場合は肺）からの病原菌排除の試みに単核細胞／マクロファージが関与するが、しかし免疫反応がしばしば不十分となる疾患の１例である。その結果、抗体を使用した場合でも体からの全病原菌の排除に失敗し、その結果M.tuberculosisの感染が有症候性または無症候性に持続する。
【０３７６】
即ち、結核の様な病気については、既存の免疫反応を増強し標的組織に対しさらに単核細胞を動員する薬剤による治療を行うべきである。全身性の炎症を惹起する薬剤は、全身性の炎症が副作用（例えば吐き気、高熱、昏睡等）を有することから有効ではない。従って、DARCに対し高い親和性で結合する薬剤は、これら薬剤が既存の免疫反応を増強しながら全身性の炎症は起こさないことから有用であろう。
【０３７７】
通常DARCは、局所的なケモカイン産生を抑制し、炎症反応範囲の限定に作用するため、DARCの能力を減少または阻止する薬剤は所望の反応を増強する。従って、本発明の実施態様の一つはDARC結合薬、例えばペプチド2 ［MCP-1 ］を肺に局所性に投与し、あるいは全身性に投与し、ケモカインのDARC抑制を低下または阻害することである。局所的なケモカインレベルの上昇は単核細胞の動員を増強し、またその結果組織マクロファージ数が増加してM.tuberculosisの排除を助け、そして慢性感染を軽減あるいは予防するだろう。
【０３７８】
本発明の薬剤は単独、またはより好ましくは抗生物質あるいはM.tuberculisisの増殖を阻害するこが、単独使用時には慢性感染を予防できず、あるいは無効にできないことが判明しているその他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
既存の免疫反応を増強するペプチド2 ［MCP-1 ］の様な薬剤はその他の慢性の、あるいは寄生虫の感染症、例えばリーシュマニア、トリパノゾーマ、らい病等のの軽減、又は排除にも有用であろう。
【０３７９】
好塩基球介在病．喘息は、過敏性の気道と、様々なタイプの細胞と炎症性メディエイターの流入の結果生ずる慢性炎症を特徴とする疾患である。喘息に於ける全炎症性メディエイターの相互作用及び原因作用は完全には解明されていない。MCP-1 は、単核細胞動員、好塩基球動員、リンパ細胞動員、単核細胞活性化、あるいは好塩基球又は定住マスト細胞からのヒスタミン放出により引き起こされるような様々なエフェクター機能を通し、その役割を果たしている（Bischoffら、J.Exp.Med.,175(5) 、1271（1992））。
【０３８０】
これらプロセスの阻害は、疾患の重傷度を低下させるだろう。喘息の様なアレルギー性疾患は、単核細胞／マクロファージ、リンパ細胞及びマスト細胞および好塩基球からのヒスタミン放出を含む炎症性メディエイターの複雑な相互作用を通し表現される。
喘息に伴う症状の治療、または阻害を目的とした本発明治療薬の好適投与形態は吸引である。赤血球は気道には通常存在しないため、他の投与形態に比べ気道への投与に関しては治療薬のDARC特異性の重要性は低い。
【０３８１】
内毒素中毒．内毒素中毒は、グラム陰性細菌細胞壁の主要成分であるLPS によりしばしば引き起こされる急性の全身疾患である。LPS は前炎症性サイトカインの放出を促す。内毒素中毒ではMCP-1 及びMCP-2 が出現し、標的臓器への白血球の動員によりその作用を表す。LPS を作用させたマウスへの組み換え体マウスMCP-1 の投与は、内毒素致死作用よりマウスを保護した（Zismanら、J.Clin.Invest.,99.2832(1997)）。従って、本発明の実施態様での使用にとって好適なペプチドはMCP-1 及びMCP-2 ペプチドである。
【０３８２】
心筋梗塞／急性虚血．心筋梗塞は、アテローム性血栓プラークの破壊に伴う血栓が原因となることが多い、心臓血管の急性閉塞の結果である。一定期間の虚血、および再還流時に起こる傷害により近傍心筋が損傷され、その結果として心不全が起こる。再還流損傷は、酸素フリーラジカルの増加と炎症性メディエイターを伴う。還流中MCP-1 はアップレギュレーションされ、そして重要な炎症メディエイターである（Kumar ら、Circulation 、90,1427 （1994）；Kumer ら、Circulation,95.693（1997））。MCP-1 及びその結果としての炎症挿入の阻害は、回復期の心筋損傷を減らし、心不全の発生頻度を下げるだろう。
【０３８３】
リューマチ性関節炎．リューマチ性関節炎は、原発性の関節だけでなく、皮膚、血管、心臓、肺及び筋肉を含む多発的−全身性炎症疾患である。リューマチ性関節炎の特徴的病理には、関節内へのマクロファージ及びリンパ細胞より成る非化膿性細胞浸潤の蓄積が含まれる。未変性MCP-1 およびMCP-1 のアンタゴニスト（未変性MCP-1 の残基9-76）の能力は、慢性関節炎のMRP-Ipr モデルにより評価されている。未変性MCP-1 ではなく、アンタゴニストMCP-1 （9-76）による治療はこのモデルでの症状および慢性関節炎の組織学を緩和する（Gongら、J.Exp.Med.,186,131(1997 ）；Plater-Zyberk ら.,Immunol.Lett.,57.117（1997）；Wilder,Clin,Rheumat.,10,259 （1996））。即ち、ペプチド３、その変種、類縁体および誘導体は、リューマチ性関節炎の治療、または予防に特に有用である。
【０３８４】
避妊．CXCR4 ケモカインレセプターに関するノックアウトマウスは、胚性致死を有する。本発明の薬剤は、CXCR4 レセプター（実施例５参照）およびその他のケモカインレセプターを阻害することが判明している。即ち、本発明の薬剤は堕胎の誘導または避妊の提供に有用であろう。CXCR4 レセプターの阻害は従来の避妊法に替わる方法を提供でき、性交後にも利用できるだろう。
【０３８５】
IV. 発明薬剤の投与量、処方および投与経路
その塩を含む式（Ｉ）−（Ｖ）の化合物を含む本発明の治療薬は血清レベルが約0.01M ないし約100nM になる様に投与されるのが好ましく、さらに好ましくは治療薬約0.01pMないし約5nM であり、よりさらに好ましくは約0.1pM ないし約2nM である。これらレベルを達成するには、薬剤は少なくとも体重当たり約0.01ないし約100mg/kg、より好ましくは約0.1 ないし約50mg/kg 、さらに好ましくは約0.1 ないし約30mg/kg で投与される。投与量は、年齢、病気、目的が予防か治療か、および薬剤が生物学的利用能およびin vivo 安定性について修飾されているかを含む様々な因子により異なる。
【０３８６】
センスまたはアンチセンス核酸分子の投与は、核酸分子を含む発現カセットで形質転換された細胞を導入し（例えばWO93/02556参照）、または核酸分子を投与し（例えばｍFelgner ら、米国特許第5,580,859 号、Pardoll ら、Immunity.3,165(1995)；Stevenson ら、Immunol.Rev.,145,211(1995)；Molling,J.Mol.Med.,75,242(1997) ；Donnellyら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,772,40(1995)；Yangら、Mol.Med.Today,2.476(1996) ；Abdallahら、Biol.Cell.85,1(1995)参照）。核酸の製剤処方、投与量および投与経路は、例えば上記Felnger ら、に一般的に開示されている。
【０３８７】
投与される治療薬の量は選択され、特定の適用を治療する。例えば、マラリアの治療には高用量のペプチド２、その変種または誘導体が投与されるが、一方HIV 感染の予防または阻害にはより少ない用量のペプチド、その変種、あるいは誘導体が有用である。本発明の治療薬はまた予防目的の慢性使用、特に全身投与により使用できる。
本発明による治療薬の投与は、例えば患者の生理学的状態により、あるいは投与目的が治療か又は予防か、及びその他当業者公知にファクターに依存し、連続的または間欠的に行われる。本発明の薬剤の投与は選択された期間必ず持続されるか、あるいは一定の間隔をあけて投与される。
【０３８８】
場合によっては持続的放出を目的とし、以下論ずる様な本発明の治療薬を含む１またはそれ以上の好適投与形態を製剤化し、経口または直腸、頬、膣及び舌下、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸内、肺内及び鼻内経路を含む多様な経路より投与することができる。製剤は、適当な場合には、痛序うの分割単位の投与形状にもでき、製薬業者公知の方法の何れかにより調整することができる。この様な方法には、治療薬を液性担体、固形マトリックス、半固形担体、細分された固形担体またはその組合せと結合せしめる工程、さらに必要に応じて所望するデリバリーシステムに製品を導入または成形する工程を含む。
【０３８９】
本発明の治療薬を経口投与用に調整する場合には、これらを薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、製剤又は単位投与形態を形成することが好ましい。この様な製剤中の相活性成分は、製剤重量の約0.1 ないし99.9％を構成する。”薬学的に許容される”とは、担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩が製剤の他成分と適合していること、及びその受容者に対し有害でないことを意味している。経口投与用の活性成分の例は、粉末または顆粒；水性懸濁液または乳剤；又はチューインガムからの性成分摂取用合成樹脂の様なアチーバブルベースである。活性成分はボーラス、舐剤または軟膏でもよい。
【０３９０】
膣投与に好適な製剤の例としては、活性成分に加えて、当業者により適当であることが知られている担体の様なものを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、軟膏、灌注剤、潤滑剤、泡剤またはスプレーがある。直腸投与に好適な製剤は座薬である。
本発明の治療成分を含む医薬製剤は、当業者公知の方法および容易に入手可能な成分より調整することができる。例えば、製剤は一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、懸濁液、粉末等に成形できる。
【０３９１】
これら製剤に好適な賦形剤、希釈剤及び担体の例には、澱粉、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体の様な充填剤および増量剤、カルボキシメチルセルロース、HPMC及びその他セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニル- ピロリドンの様な結合剤、グリセロールの様な湿潤剤；炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムの様な崩壊剤、パラフィンの様な溶解遅延剤；４級アンモニウム化合物の様な吸収加速剤；セチルアルコール、グリセロールモノステアリン酸の様な表面活性剤；カオリンおよびベントナイトの様な吸収担体；ならびにタルク、カルシウム、マグネシウムステアリン酸、および固形ぽりえちるグリコールの様な光沢剤を含む。
【０３９２】
例えば、本発明の製剤を含む錠剤、またはカプレットは炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、及び炭酸マグネシウムの様な緩衝剤を含むことができる。カプレットおよび錠剤はさらにセルロース、α化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マグネシウムステアリン酸、微結晶セルロール、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、ミネラルオイル、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛等の不活性添加物も含むことができる。
【０３９３】
本発明の薬剤を含む硬または軟ゼラチンカプセルは、ゼラチン、微結晶セイルロース、ラウリルリン酸ナトリウム、澱粉、タルク及び二酸化チタン等の様な不活性成分、およびポリエチレングリコール（PEGs）や植物油の様な液体賦形剤を含むことができる。さらに本発明の薬剤の腸溶剤コーティングカプセル又は錠剤は、胃に於いては分解に耐性であり、十二指腸のより中性からアルカリ性の環境の中で溶解する様に設計される。
【０３９４】
本発明の治療成分はまた、通常の経口投与用エリキシル剤または液、又は例えば筋肉内、皮下あるいは静脈内経路の様な非腸管投与に適した液体として処方できる。
本発明の治療成分の医薬製剤は水性または無水液あるいは分散剤の形状、あるいは乳剤または懸濁剤の形状にもできる。
【０３９５】
即ち、治療成分は非腸管投与（例えば一回注射あるいは連続注入の様な注射による）用に処方でき、そしてアンプル、充填済み注射器、少量注入容器、あるいは保存剤入り複数回投与容器の単位投与形状にできる。活性成分は、油性もしくは水性の賦形剤懸濁液、溶液又は乳剤の様な形状をとることができ、又懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤の様な処方成分を含むことができる。あるいは活性成分は、滅菌された発熱物質を含まない水の様な好適な賦形剤で調剤される為の、滅菌固形物を無菌的に分離し、あるいは液体を凍結乾燥することにより得られる粉末形状である。
【０３９６】
この様な製剤は、当業者公知の薬学的に許容される賦形剤と添加物を含むことができる。例えば、水に加え、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、”ドワノール（Dowanol ）”の名称で市販されているグリコールエーテル、ポリグリコール及びポリエチレングリコール、C1-C4 アルキルエステル短鎖酸、好ましくはエチルあるいはイソプロピル乳酸、”ミグリオール（Miglyol ）”の名称で市販されている脂肪酸トリグリセリド、イソプロピルミリステアリン酸、動物油、鉱物油、植物油およびポリシリコキサンの様な溶媒より選択され、生理学的観点より受け入れ可能である１またはそれ以上の有機溶媒を利用し、液を調整することもできる。
【０３９７】
本発明による組成体はまたセルロース及び／又はセルロース誘導体の様な濃縮剤を含むこともできる。これらはまたキサンタン、ガラナ又はカルボゴム、又はアラビアゴムの様なゴム類、またはポリエチレングリコール、ベントン類及びモントモリロン石等を含むことができる。
必要に応じて、酸化防止剤、表面活性剤、その他の保存剤、フィルム形成剤、角質溶解剤またはコメド溶解剤、香料および着色剤より選択される添加物を加えることもできる。さらに、所望される状態またはその他の状況によりその他の活性添加物を加えられる。
【０３９８】
酸化防止剤としては、例えばt-ブチルヒドロキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、及びα- トコフェロール、ならびにその誘導体が挙げられる。主に局所適用用に調整された生薬はクリーム、ミルク、ゲル、分散剤または微乳剤、濃縮または希釈されたローション、軟膏パッド、軟膏あるいはスティックの形状を取るが、あるいはスプレーもしくは泡の形状のエアゾール製剤、あるいは石鹸の形状を取る。
【０３９９】
更に、試薬は持続放出投与形態等の製剤にも好適である。製剤は、これらが活性成分だけを、または好ましくは腸管または気道の特定部分、可能な限り時間をかけて放出する用に構成できる。コーティング、エンベロープ、保護マトリックスは、例えばポリラクチド- グリコレートの様な高分子物質、リポゾーム、微乳剤、微粒子、ナノ粒子またはワックスより作るられる。これらコーティング、エンベロープ及び保護マトリックスは、ステント、カテーテル、腹膜透析チューブ等の留置用具のコーティングに有用である。
【０４００】
本発明の治療薬剤は経皮投与用パッチにより供与することができる。治療薬剤の経皮供与に好適なパッチの例については、米国特許第5,560,922 号を参照。経皮供与用パッチは、裏層とその中に治療製剤が分散または溶解している高分子マトリックス、ならびに１またはそれ以上の皮膚透過促進剤を含むことができる。裏層は治療製剤に対し不透過性である好適物質より作ることができる。裏層はマトリックス層の保護カバーとして機能すると同時に支持機能も提供する。
【０４０１】
裏層は高分子マトリックスと実質的に同一サイズの層、または高分子マトリックス端を越えて広がり、さらに裏層の余分な面積が付着のためのベースとなる様に外側に広がる形で作製することができる。あるいは、高分子マトリックスは、ポリアクリレート又はアクリレート／酢酸ビニルコポリマーの様な接着性高分子を含むことができ、またはこれらより処方される。長期間適用については、微小孔及び／または呼吸可能な裏層ラミネートを使用し、皮膚の脱水または浸解を最小にすることが望まれる。
【０４０２】
裏層作製に好適な材料の例は、高密度あるいは低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、塩化ポリビニル、ポリ（エチレンフタレート）の様なポリエステル、これら好適ポリマーフィルムの金属製フォイル、金属製フォイルラミネート等である。好ましくは裏層に使用する材料は、例えばアルミニウムフォイルの様な金属製フォイルを有するこれら高分子フィルムの金属フォイルラミネートである。これらラミネートでは、ラミネートの高分子フィルムは通常接着高分子マトリックスと接触している。
裏層は所望の保護および支持機能を提供するに適当な厚みを持つことができる。好適な圧差は約10から約200 ミクロンである。
【０４０３】
一般に生物学的に許容される接着性高分子層形成に用いられるこれら高分子は治療薬剤が制御された速度で通過できる成形体、薄壁またはコーティングを形成できるものである。好適高分子は生物学的、及び薬学的に適合的であり、無アレルギー性であり、また装置が接触する体液または組織に不溶性で且つ適合的である。皮膚の湿気によるマトリックスの解離または浸食は治療薬剤の放出速度、及び取り外しの利便のための空間に投与単位を残す能力に影響することから、可溶性高分子の使用は避けなければならない。
【０４０４】
接着性ポリマー層の製造材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチレンアクリレートコポリマー、エチレン／酢酸ピリミジンニルコポリマー、シリコンエラストマー、特記医療用ポリジメチルシキコキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリ塩素化エチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋型ポリメタクリレートポリマー（ハイドロゲル）、ポリ塩化ポニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；
【０４０５】
シリコンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカフボネートコポリマー、ポリシロキサンポリエチレンオキサイドコポリマー、ポリシロキサン−ポリエメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えば、ポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）等；セルロースポリマー、例えばメチル又はエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオオロエチレン等が含まれる。
【０４０６】
好ましくは、生物学的に許容される接着性ポリマーマトリックスは、室温以下のガラス転移温度を持つポリマーより選択される。必ずしも必要ではないが、ポリマーは室温にて結晶性を有する。ポリマー内に治療薬剤を分散させた後にマトリックスを架橋する部位を提供する架橋モノマー性単位、あるいは部位をこれらポリマーに取り込むことができる。ポリアクリレートポリマー用の既知架橋モノマーには、ブチレンジアクリレート及びジメタクリレートの様なポリオールのポリメタクリックエステル、トリメチルオールプロパントリメタクリレート等が含まれる。これら部位を提供する他のモノマーには、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレアート等が含まれる。
【０４０７】
好ましくは、可塑剤及び／又は湿潤剤は接着性ポリマーマトリックス内に分散される。この目的には、一般に水溶性ポリオールが好適である。製剤中への湿潤剤の取り込みは、投与単位に皮膚表面上の湿気を吸収させ、それにより皮膚刺激の減少ならびにデリバリーシステムの接着層からの脱落防止を助ける。
経皮的デリバリーシステムから放出される治療薬剤は、皮膚の各層を通過できなければならない。治療薬剤の通過速度を上げるためには、経皮的薬物デリバリーシステムは特に分子の通過に対する最も強い抵抗性を提供している皮膚最外層、角質層の透過性を上げなければならない。治療薬剤の経皮的デリバリーのためのパッチの製造は当業者公知である。
【０４０８】
吸入による上部（鼻）または下部気道への投与に関しては、本発明の治療薬剤は注入器、噴霧器または加圧パック、あるいはエアゾールスプレーを送出するその他通常の方法により容易に送出される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の公的なガスの様な好適な発射剤を含むだろう。加圧されたエアゾールの場合、投与単位は一定量を送出するためのバルブを提供することで決定されるだろう。
【０４０９】
あるいは、吸入又は通気による投与の場合、組成体は乾燥粉末、例えば治療薬剤とラクトースまたは澱粉の様な好適な基礎パウダーの粉末混合物の形を取ることができる。粉末組成体は、例えばカプセル又はカートリッジの様な投与単位形状内；あるいは粉末が吸入器、通気装置または計量投与吸入器の助けをかりて投与される様なゼラチンまたはブリスターパック内に存在する。
鼻内投与の場合は、治療薬剤は点鼻薬、液体スプレー、例えばプラスチック製ボトル噴霧器又は計量投与量吸入器により投与できるだろう。噴霧器の例はミストメーター（Mistometer）(Wintrop）及びメディハーラー（Mdeihaler) (Riker)である。
【０４１０】
本発明の治療薬剤の局所送出は、病気箇所又はその近傍に薬剤を投与する各種技術によっても行うことができる。部位特異的あるいは標的型局所送出技術の例は利用可能な技術の例示であり、もとよりこれに限定されるものではない。例には注入または留置カテーテルの様な局所送出用カテーテル、例えば注入カテーテル、シャントおよびステント、又はその他の植え込み可能な用具、部位特異的キャリアー、直接注入、又は直接適用が含まれる。
【０４１１】
局所塗布投与の場合、治療薬剤は当業者公知の如く目標部位への直接適用に適した形に製剤化される。該目的に適する一般的形態には、創傷包帯剤、コーティング絆創膏あるいはその他のポリマーカバー剤、軟膏、クリーム、ローション、パスタ、ゲル、スプレー及び噴霧、ならびに歯磨き粉、口濯ぎ剤、またはその他の好適形状、例えばコーティングコンドームが含まれる。軟膏及びクリームは、例えば水性または油性の基材に好適な濃縮剤及び／又はゲル剤を加えて製剤化される。ローションは水性または油性基材により製剤化され、一般には１またはそれ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、濃縮剤、あるいは着色剤も含む。活性成分はまたイオン導入、例えば米国特許第4,140,122 号；第4,383,529 号；又は4,051,842 号に開示されている方法によっても送出できる。典型的な製剤中に存在する本発明の治療薬剤の重量％は様々な要因に依存するが、一般的には製剤全重量の0.01％ないし95％であり、典型的には重量の0.1-25％である。
【０４１２】
必要な場合には、例えば特定の疎水性ポリマーマトリックス、例えば天然ゲル、合成ポリマーゲル又はその混合体を含むものと組み合わせて、上記製剤を使用活性成分の持続的放出に適合させることができる。
点眼剤または点鼻剤の様な滴剤は、１またはそれ以上の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤も含む水性又は非水性基材より処方できる。液体スプレーは加圧されたパックより容易に送出される。滴剤は単純な点眼器−キャップ付きボトル、又は液体内容物を滴下送出に適合したプラスチック製ボトル、特に成形密封容器により送出できる。
【０４１３】
治療薬剤はさらに口腔内、あるいは咽頭内への局所投与用に製剤化される。例えば、活性成分は芳香基材をさらに含み、通常ショ糖およびアカシア又はトラガントを含むトローチ剤；ゼラチン及びグリセリンの様な不活性基材、またはショ糖及びアカシア中に組成体を含む香錠剤；本発明の組成体を好適液体担体中に含む口腔洗浄剤；及び例えば本発明の組成体を含む歯磨き剤またはゲルの様なパスタ及びゲルに処方される。
本発明記載の製剤及び組成体は、抗菌剤または保存剤の様なその他成分も含むことができる。さらに、活性成分は他の治療薬剤、例えば経口避妊薬、気管支拡張剤、抗ウイルス剤、ステロイド等と組み合わせ使用することもできる。
【０４１４】
持続放出型投与形態
本発明の持続型放出投与形態は、その内に分散された治療薬剤を有する微粒子及び／又はナノ粒子を含むだろう。本発明の本観点の治療投与形態は、持続型放出に好適ないかなる形状でもよい。好適な持続放出治療投与形状は、以下の特性を１またはそれ以上の有する：
【０４１５】
−微粒子（例えば、直径約0.5 マイクロメーターないし約100 マイクロメーターであり、より好ましくは約0.5 ないし約２マイクロメーターであり、又は直径が約0.01マイクロメーターないし約200 マイクロメーターであり、好ましくは約0.5 ないし約50マイクロメーターであり、より好ましくは約２ないし約15マイクロメーターである）あるいはナノ粒子（例えば直径約1.0 ナノメーターないし約1000ナノメーター、より好ましくは約50ないし約250 ナノメーターであり、又は直径約0.01ナノメーターないし約1000ナノメーターであり、好ましくは約50ナノメーターないし約200 ナノメーターである）、流動型粉末構造；
【０４１６】
−好ましくは約0.5 ないし約180 日間、好ましくは約１−３日ないし約150 日間、あるいは約３ないし約180 日間、より好ましくは約10日ないし約21日間の期間で生体分解される生体分解性構造；または約0.5 ないし約180 日間、より好ましくは約30日ないし約120 日間、あるいは約３ないし約180 日間、より好ましくは約10日ないし約21日間の期間治療薬剤が拡散できる非生物分解構造；
−標的組織及び、生体適合型生体分解産物の発生を含む投与形態が投与される局所の生理学的環境への生体適合性；
【０４１７】
−その内にある治療薬剤の安定製と再現的分散を促進し、好ましくは治療薬剤−ポリマーマトリックスを形成せしめ、活性治療薬剤の放出が以下の経路の一つまたは両方で起こる；(1) 投与形態からの治療薬剤の拡散（治療薬剤が、投与形態の寸法を規定している成形ポリマーまたはポリマー混合体内に可溶化されている場合）；又は(2) 治療薬剤が投与形態生体分分解物として放出される場合；及び／又は
【０４１８】
−標的投与形態に関し、好ましくは投与形態結合に対して約１ないし10,000結合蛋白／ペプチドを結合させる能力、より好ましくは粒子表面積150 平方オングストローム当たりに最大約１ペプチドを投与形態結合に結合させる能力。投与形態結合へ結合する蛋白／ペプチドの総数は使用する粒子サイズに依存する。結合蛋白又はペプチドは、本発明記載の共有結合サンドイッチまたは非共有結合様式を通じて治療投与形態の粒子に結合できる。
【０４１９】
ナノ粒子の持続放出投与形態は好ましくは生体分解性であり、場合により血管平滑筋細胞に結合し、一次的にはエンドサイトーシスによりこれら細胞に侵入する。ナノ粒子の生体分解は、前ライソゾームベシクル及びライソゾーム中経時的に起こる（例えば30ないし120 日；または10ないし21日）。本発明の好適でより大きな微粒子投与形態は、貪食反応により細胞に取り込まれるより小さな微粒子数が極僅かでしかない細胞に対し、持続的取り込み用に治療薬物を放出する。
【０４２０】
当業者は、標的細胞が本発明の投与形態を同化し、代謝する正確なメカニズムがこれら細胞の形態、生理及び代謝プロセスに依存していることを認識するだろう。持続放出治療薬剤形態の大きさも、細胞同化のモードに関し重要である。例えば、より小さなナノ粒子は細胞間の空間流に乗って流れ、注入組織内を貫通できる。より大きな微粒子は、注入された組織内の空間に捕捉されやすく、従って治療薬剤にとり有益である。
【０４２１】
好適な本発明による持続放出投薬形態は、生物分解型微粒子またはナノ粒子を含む。より好ましくは、生物分解性微粒子またはナノ粒子はランダムに、非酵素的、加水分解的に切断され生体分解し治療薬物を放出し、それにより粒子構造内に小孔を形成するマトリックスを含むポリマーより形成される。
αハイドロキシカルボン酸および関連ラクトンの縮合に由来するポリマーは、本発明の使用に好適である。特に好適な成分は温度可塑性ポリエステル（例えばポリラクチドまたはポリグリコリド）またはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の様なラクチドとグリコリド成分のコポリマーの混合体より形成される。例示構造であるランダムポリ（DL- ラクチド−コ−グリコリド）を以下に示すが、式中ｘ及びｙは所望する微粒子またはナノ粒子の特性を得るために当業者により操作される。
【０４２２】
【化３１】
0004523151.tif 000026
本発明の粒子投与形態の形成に好適な物質にはポリオルトエステル及びポリアセタール（Polymer Letters,18:293(1980)およびポリオルトカルボン酸（米国特許第4,093,709 号）等が含まれる。
【０４２３】
本発明のマトリックス粒子を含む好適な乳酸／グリコール酸ポリマーは、例えばCowsarら、”ステロイド制御放出用ポリ（ラクタイド−コ−グリコリド）マイクロカプセル（Poly（Lactide-C0-Glycolide）Mirocapsules for Controlled Release of Streroids）"Methods Enzymology, 112:101-116,1985(steroid entrapment in mirocparitcles); Eldridge ら、”毒素中和抗体のレベルを上げるブドウ球菌腸毒素Ｂトキソイド用アジュバントとしての生物分解性および生体適合性ポリ（DL- ラクタイド−コ−グリコリド）マイクロスフェアー（Biodegradable and Biocomptible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)Microspheres as an Adjuvant for Staphulococcal Endterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies," Infection and Immunity. 59:2978-2986,1991(toxoid entrapment) ；
【０４２４】
Cohen ら、”ポリ（乳酸／グリコール酸）マイクロスフェアーを基本とする蛋白制御送出システム（Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid)Microspheres" PharmaceuticalResearch,8(6):713-720,1991(enzyme entrapment) ；Sanders ら、”ポリ（DL- ラクタイド−コ−グリコリド）マイクロスフェアーからの黄体形成ホルモン- 放出ホルモン類縁体の制御放出（Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Go-Clycolide)Microspheres,"J.Pharmaceutical Science,73(9):1294-1297,1984(peptide entrapment) に記載の工程に見られる、改良型溶媒抽出工程を含む乳剤を基本とした工程により調整される。
【０４２５】
一般に、本発明の粒子投与形態を形成するための方法は、ポリマーをハロゲン化炭化水素溶媒に溶解し、その中に治療薬剤液（水性が好ましい）を分散し、さらにハロゲン化炭化水素溶媒に対し溶媒として作用するがポリマーに対しては溶媒として作用しない追加剤を加えることを含む。ポリマー−ハロゲン化炭化水素溶媒より溶媒を含む治療薬物の滴としてポリマーが沈殿し、治療薬物を捕捉する。好ましくは、治療薬物は本質的に均一に本発明の持続放出投与形態内に分散している。粒子形成に続き、これらは洗浄され、有機溶媒により硬化される。室温、真空下での乾燥前に、水洗浄及び水性非イオン性界面活性剤洗浄段階を経る。
【０４２６】
生体適合性目的に関しては、粒子マトリクッス内に分散した治療薬剤により特徴付けられる粒子投与形態は包装、保管または投与前に滅菌される。滅菌は、滅菌を目的とした通常の方法の何れかにより実施できる。例えば粒子を、その照射に対し暴露することが治療薬物−ポリマーマトリックス中に分散する治療薬物の構造又は機能、あるいはそれに結合する蛋白／ペプチドに対し有害作用を及ぼさないガンマ線に照射する。治療薬物または結合蛋白／ペプチドに有害な影響が及ぶ場合には、粒子投与形態は滅菌条件下に製造することもできる。
【０４２７】
本発明の粒子投与形態からの治療薬物の放出は、拡散および粒子マトリックスの浸食の両方の結果として起こり得る。生体分解率は直接治療薬物の放出の動態に影響する。生体分解速度は、持続放出投与形態の組成または構造を変えることで制御できる。例えば、Ticeらの" 生体分解制御放出非腸管システム（Biodegradable Contolled-Release Parenteral Systems",Pharmaceutical Technology,pp.26-35,1984 記載の如くにして；Kentら”水溶性活性ポリペプチドのマイクロカプセル化（Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides"米国特許第4,675,189 号に差の如くクエン酸及び炭酸ナトリウムの様なポリマー加水分解速度を変更する作用物質を加えて；
【０４２８】
作用能が異なり結果として該コア負荷量が変化する共通治療薬物ファミリーから適当なアナログを慎重に選択し、分解速度をその中に加えられた治療薬物量に逆比例するようにラクタイド／グリコリドポリマー内の治療薬物負荷量を変更し；またBeckら”ポリ(DL-ラクタイド−コ−グリコリド）／ノルエチステロンマイクロカプセル：注射可能な生体分解経口避妊薬（Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules:An Injectable Biodegradable Contraceptive,"Biol.Reprod.,28:186-195,1983記述の如くの粒子サイズの変更させて、等により本発明の好適投与形態中のラクチド／グリコリド比を変更することができる。生体分解速度を制御する前記方法のいずれもが的オリックス含有ポリマーの内因性粘度に影響し、それによりその水和率が変化する。
【０４２９】
好適なラクタイド／グリコラリド構造はほ乳類の生理的環境に適合している。また、これら好適持続放出投与形態は、その生体分解によりほ乳類の天然代謝産物である乳酸及びグリコール酸を形成するという利点も有している。
場合により、粒子投与形態への蛋白質／ペプチドの結合に求められる官能基が粒子マトリックス内、又は表面に加えられ、非分解性又は生体分解性ポリマー単位と結合する。この目的に有用な官能基には、カルボキシル基、アミノ基、スルフィドリル基等のペプチドと反応する基が含まれる。好適結合即新成分には、マトリックスを含む好適（ラクタイド−グリコリド）ポリマー等の末端カルボキシル基が含まれる。
【０４３０】
本発明の治療薬物を使用して特定の免疫源、例えばHaemophilis influenza b 型（Hib ）莢膜ポリサッカライド（ポリリボシルリビトールリン酸、PRP ）に対する免疫反応を増強するに、薬物を免疫源に標識することができるだろう。即ち、例えばペプチド(1-15)［MCP-1 ］をアジピン酸ジヒドラジド由来の６炭素スペーサー分子を通じPRP に共有結合し（Gordon、特許第83/4939 、南アフリカ、1984）、Eskolaら、Lancet, １．1184（1985）記載と同様にして投与する。ワクチンを調整を目的とした核酸の使用は、例えば上記Felgner ら、および上記Steevensonらに記載されている。
【０４３１】
本発明のワクチンは、免疫源をコードする核酸を有する細胞、またはウイルス、及び本発明のペプチド又はその変種ペプチド、または場合により融合蛋白としての補体も含む。
ワクチンの原理および実際に関する一般的な記述についてはAda 、Fundamental Immunology, ２nded., Raven Press Ltd.,NY.,pp.985-1030(1989) を見よ。
【０４３２】
Ｖ．生理学的液体中の本発明ペプチドの検出
血液及び尿中のペプチド３の分析は、半透過性表面（SPS ）HPLCカラム（出入り制限媒体）上で実施した。血清またはその他の蛋白含有サンプルはSPS カラムに直接注入できる（例えばカラムサイズ4.6mm ×250mm のSPS-C18 ；遊走相：A:0.1%TFA 水溶液、B;0.1%TFA アセトニトリル液；0-5 分−5%B,5-30分−60%B、30-40 分−5%B 検出器；215nm ）。カラムの外相は内面への巨大分子到達を阻止する半透過性表面を形成する。
【０４３３】
ペプチド３のPBS 標準液（1.5 μg/mlないし1000μg/mlの範囲）を注入し、標準曲線を作成した。血清及び尿20μl を注入し、ペプチド３ピーク下面積を得た。次に、標準曲線より濃度を計算した。この方法は、少なくとも生理学的液体サンプル中にある約20μg/mlのペプチドを検出できる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に記載するが、本発明はもとよりこれに限定されない。
【０４３４】
実施例１．汎ケモカインペプチド阻害剤の同定と特徴
様々な種に由来するMCP-1 配列のアラインメントを基に、検討した全ての種に保存されるMCP-1 中３領域を同定した。ヒト及びマウスMCP-1 配列間の配列相同性が最大である３種類の精製ペプチド（＞95％純度）（12-15mers ）を調整した（表１）。これらペプチドはhMCP-1によるTHP-1 遊走を阻害する能力についてスクリーニングした。同様に、Xenopus laevis TGF- ベータ１及びTGF-ベータ３、並びにヒトTGF-ベータ１及びTGF-ベータ３の配列を比較し、完全に相同な３領域（各10mer ）を特定した。これらペプチドは”ベタチド（betatides ）”と命名した。
【０４３５】
本アッセイでは、THP-1 細胞を10% 胎児ウシ血清＋20μM2- メルカプトエタノールを加えてRPMI-1640 中に4 ×105 細胞／mlの密度に維持した。走化性は5 μM ポリカーボネートフィルター付き96ウエル型使い捨て走化性チャンバー内で誘導した（PVP フリー、ChemoTX 、Neuroprobe Inc., Cabin John ）。化学誘引物質29μl （組み換え体ヒトケモカイン；50ng/ml 、即ち5.9nM ）またはコントロール（100ng/ml TGFβ）を各ウエルの下部コンパートメントに加えた。成形フィルターをフィルターフレーム端の穴にそって並べ、ウエルの上に置いた。25μl のRPMI-1640 培養培地中の５×104 THP-1 細胞を上部コンパートメントに加えた。ペプチドをMIlliQ水に溶解し、続いて培地中に連続希釈した。多くの場合、連続希釈したペプチドを走化性チャンバーの上部コンパートメントに加えた。チャンバーを5%CO2 の湿潤環境下、37℃で４時間反応させた。
【０４３６】
反応後、細胞をピペットでフィルター上部より注意しながら取り出し、20μl の20mMEDTAのPBS 液を各上部ウエルに加え、混合液を20分、４℃にて反応させた。緩い流れを利用して、フィルターを注意深く培地でフラッシュし、取り出す。遊走したTHP-1 細胞の数を正確に定量するための標準曲線を調整する。曲線はTHP-1 細胞の２倍希釈系列に基づく（最大標準物質は29μl 中100,000 細胞）。ウエル毎の遊走細胞、及び標準体の細胞は、各ウエルに３μl のMTT 保存液を直接加え、染色し（フェノールレッドを含まない5mg/mlのRPMI1640液、Sigma Chemical Co.),37℃、４時間培養した。各ウエルより培地を注意しながら吸い取り、変換色素を20μl のDMSOに溶解した。変換色素の吸光度を、ELISA プレートリーダーを用い波長595nm で測定した。標準曲線より各ウエル内の遊走細胞数を決定した。
【０４３７】
ペプチド１［MCP-1 ］（表１；配列番号：２参照）、遊走アッセイでは即ちヒトMCP-1 のN-末端ペプチドは弱い活性のみを示した（ED50＞100 μM ；100 μM での10% 阻害、p=0.27）。ペプチド２［MCP-1 ］（表１；配列番号：３参照）もまたケモカイン誘導遊走の弱い阻害剤であった（ED50＞100 μM ；100 μM での19% 阻害、p=0.09）。即ち、強力なアゴニスト、即ちMCP-1 、配列番号３を有するペプチド2 ［MCP-1 ］存在する場合、弱いアゴニストはそのレセプターよりMCP-1 を置換した。しかし、強力なアゴニスト、例えばMCP-1 が存在しない場合、弱いアゴニスト特性を持つペプチド2 ［MCP-1 ］、即ちペプチド2 ［MCP-1 ］は走化性を刺激した。驚くべき事に、ペプチド2(1-15）［SDF1α］は強力な汎ケモカインアンタゴニスト特性を有していた。
【０４３８】
逆に、ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（表１；配列番号１）はMCP-1 に誘導されるTHP-1 遊走の極めて効果的な阻害剤であり、50％阻害投与量（ED50）は8 ±1 μM （n=4 ）であった。典型的な反応曲線を図２に示す。50μM 以上の濃度では、配列番号１を有するペプチド3(1-12）［MCP-1 ］はMCP-1 誘導THP-1 遊走の全てを無効にした。
【０４３９】
【表１】
0004523151.tif 000027
【０４４０】
ペプチドがMCP-1 レセプターアンタゴニストであるか決定するために、ペプチドをケモカインと共に下部コンパートメントに導入した（上記実験の上部コンパートメントに細胞を入れたのとは逆；トランスウエルTHP-1 遊走アッセイ。この様な条件では、配列番号２を有するペプチド1 ［MCP-1 ］は、細胞と共に培養した場合にはMCP-1 誘導のケモカイン遊走のより効果的な阻害剤であり、ペプチドI ［MCP-1 ］（配列番号２）を細胞と共に培養した場合に10％阻害であった100 μM でのMCP-1 誘導細胞遊走を48％を阻害した。この結果、ペプチド1 ［MCP-1 ］（配列番号２）およびその誘導体が、MCP-1 ダイマーを破壊し、不活性モノマーを形成して作用することを示す公表報告と一致する。
【０４４１】
従ってペプチド1 ［MCP-1 ］（配列番号２）はMCP-1 機能の典型的レセプターレベルのアゴニストではない。これとは好対照に、配列番号１を有するペプチド3(1-12）［MCP-1 ］は、細胞ではなくケモカインと反応した場合の効果は極めて低い（＞99％阻害に対して、100 μM で17% 阻害）ことから、配列番号１を有するペプチドはレセプターを直接拮抗しMCP-1 誘導遊走を阻害することが示唆される。この観察を確認するため、ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）のN-末端ビオチン化誘導体の結合親和性を決定した。この誘導体は、Ka約10μM でTHP-1 細胞の表面に結合した。
【０４４２】
ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）はまた、レセプターの他の組み合わせにより伝達されるMCP-1 のその他の機能も阻害する。MCP-1 は培養平滑筋細胞に対して、0.5 ％胎児ウシ血清と共に弱いコマイトーゲンであると報告されている。100 μM ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）は培養平滑筋細胞のMCP-1 のコマイトーゲン作用を完全に無効し、ペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）はMCP-1 レセプターアンタゴニストであるという仮説にも一致する。ペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）は、様々なタイプの細胞のMCP-1 に対する各種反応を阻害することから、ペプチド3 はMCP-1 に対し反応し、結合し及びシグナル伝達することができる全てのケモカインレセプターの一般的アンタゴニストであることが示唆されている。
【０４４３】
ペプチド3 阻害のレセプターの特異性を研究するために、MCP-1 レセプター以外の様々なレセプターを通しシグナルされるケモカインにより誘導されるTHP-1 遊走のペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）による阻害ついてED50を決定した。代表的ケモカインはβ- ケモカイン（"CC"）、MIP-1 α及び２種類のα- ケモカイン（"CXC" ）、IL-8及びSDF-1 αを含む。さらに、ケモカインレセプターに対するペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）の特異性を決定するために、ケモカインファミリーと関係しないTGF-βを遊走誘導剤として、さらに同定済みの無関係なレセプターを通じたシグナル伝達による生物活性を惹起する薬剤として選択した。
【０４４４】
ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）は、４種類の全ての選択されたケモカインに対しTHP-1 遊走誘導反応を、MIP-1 α≧MCP-1 ＞SDF1α＞IL-8の順に阻害した（表２参照）。逆に、ペプチド1 ［MCP-1 ］（配列番号２）またはペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］（配列番号３）は、これらケモカインのいずれに対する反応についても、100 μM でも遊走を20％以上阻害しなかった（表2 ）。
【０４４５】
【表２】
0004523151.tif 000028
【０４４６】
ａ  少なくとも３回測定の平均±SEM
ｂ  ペプチド１は、下部コンパートメントに加えた時のみ顕著な阻害を起こした。
n.s.＝統計有意な阻害なし（p ＞0.05）
さらに、配列番号１を有するペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（ならびにペプチド1 ［MCP-1 ］（配列番号２）及びペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３））は、100 μM であってもTGF-βにより誘導されるHP-1遊走を大きく阻害しなかった。まとめると、これらの結果はペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）はケモカインシグナル伝達の一般的及び特異的阻害剤であることを示している。
【０４４７】
ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）はCXC ケモカインに比べCCケモカインに対する選択が低いにもかかわらず、100 μM でさえペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）は試験したケモカインファミリーのケモカインのいずれかにより誘導される遊走の99％以上を阻害する（表２）。即ち、MCP-1 は複数の関連レセプターを通じシグナルを伝達するが、ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）はMCP-1 により惹起される走化性及び突然変異性シグナル伝達経路に関与する全てのレセプターを遮断する。
【０４４８】
ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）は初代ヒト単核細胞に比べTHP-1 に対しより効果的である可能性を除外するために、新たに３名の供血者から調整した末梢血単核細胞のケモカイン誘導遊走に及ぼすペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）の作用を試験した。THP-1 細胞の結果同様に、ペプチド3 （1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）の100 μM は４種類全てのケモカインにより誘導される遊走の全て、又はほとんど全て（＞95％）を阻害し、TGF-β誘導遊走に影響しなかったが、ペプチド1 ［MCP-1 ］（配列番号２）またはペプチド2(1-15）［MCP-1 （配列番号３）は阻害しなかった。
【０４４９】
即ち、ペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）は、広範囲の標的細胞（平滑筋細胞、THP-1 、ジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞、始原ヒト単核細胞）に作用する前炎症性ケモカインの広範な阻害剤である。THP-1 細胞に比べ、MCP-1 により誘導される始原ヒト単核細胞の遊走に対するペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）の阻害（20％）は統計有意であった（表２）。
【０４５０】
実施例２．ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］及びペプチド2 ［MCP-1 ］の断片およ び変種の特徴
ペプチド３の断片が生物学的活性および選択性を持つかを決定するために、２種類の6merの長さの”半ペプチド”を分析した（表３）：ペプチド3 （1-6)［MCP-1 ］に対応するEICADP（配列番号８）、及びペプチド3 （7-12）［MCP-1 ］に対応するKQKWVQ（配列番号９）。ペプチド3(7-12) ［MCP-1 ］（配列番号８）はCCケモカインシグナル伝達阻害剤としてはペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）と同程度の強さであったが、CXC ケモカインの阻害剤としてはより強力であった（表４）。逆に、ペプチド3(1-6 ）［MCP-1 ］（配列番号８）はペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に比べ阻害剤としては極めて弱いものであった。
【０４５１】
【表３】
0004523151.tif 000029
【０４５２】
【表４】
0004523151.tif 000030
【０４５３】
ペプチド3(7-12) ［MCP-1 ］（配列番号９）は、実質滴に選択的を示さず、試験した全てのケモカインによる遊走を7-9 μM の範囲のED50で阻害した。ペプチド3(1-6 ）［MCP-1 ］（配列番号８）は、ペプチド3(1-12）[MCP-1] （配列番号１）に比べてCCケモカインの阻害に関する効果は極めて低いが（ED50約30μM ）、CXC ケモカインの阻害効果については若干低い程度である。選択比率はMCP-1 及びMIP1αに関する平均ED50をIL-8及びSDF1αの平均ED50で除したものと定義されている。
【０４５４】
選択比率が１より大きいことは、CXC ケモカインに比べCCケモカインの阻害がより大きいことを示している；選択比率が１より小さいことはCCケモカインに比べCXC ケモカインの阻害が大きいことを意味している；また選択比率が１であることは、両ケモカインファミリーが同程度に阻害されることを意味する。従って、全体としてはケモカインシグナル伝達の阻害は極めて弱いものの、ペプチド3(1-6)［MCP-1 ］（配列番号８）はCXC ケモカインに対し２倍の選択性を示した。即ちペプチド3(1-6)［MCP-1 ］（配列番号８）はCXC ケモカインの好適阻害剤であり、選択比率は0.7 であるのに対しペプチド3(7-12) ［MCP-1 ］（配列番号９）は両ケモカインに対し好適な阻害剤であり、その選択比率は1.1 である。ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）の選択比率は1.5 である。
【０４５５】
ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］（配列番号７）はペプチド3 （1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に極めて似た特性を持っていた。この結果より、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）配列中、MPC-1 以外のケモカインに於いて保存されていない位置１及び２のグルタミン酸（Ｅ）及びイソロイシン（Ｉ）はレセプター結合にとって重要でないことが示唆された。全てのヒトケモカインのペプチド３領域の配列アラインメントは、αまたはβサブファミリーに関わらず殆ど全てのケモカインに共通の保存モチーフが存在することを示唆している（表３）。このモチーフはCx1DPx2X3X4Wx5Q である。
【０４５６】
さらに、可変位置ｘ1 からＸ5 のアミノ酸には、これら位置のアミノ酸の性質がレセプター結合の選択性決定に於いて役割を果たしていることを示唆するアミノ酸パターンが存在している。例えば、CCケモカインファミリーの場合、位置ｘ１は通常アラニン（Ａ）で占められているが、CXC ケモカインの場合にはSDF1を除き（SDF-1 ではイソロイシン（Ｉ））この位置はロイシン（Ｌ）が占めている。
【０４５７】
この仮説を検証するために、Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号10）の選択性をペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）と比較した。Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号10）は、α含有ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に比べCXC ケモカインの阻害剤として約４倍強力でありながら、CCケモカイン阻害能力も低下しなかった（表４）。即ち、Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号10）は若干のCXC 選択性（選択比率0.37）を示し、そしてトリペプチドを除く試験した全ての誘導体の中で最もCXC 選択的であった（以下参照）。
【０４５８】
上記位置ｘ1 について記した様に、位置ｘ5 については３種類のアミノ酸のみが出現した（表１）。多くのケモカインはCXC ケモカインIL-8及びMIP の様に位置ｘ5 にバリン（Ｖ）を持つ。これに対し、SDF-1 及びIP10はこの位置にイソロイシン（Ｉ）を持ち、他方、ENA78 はこの位置にロイシン（Ｌ）を持つ。結果は、Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号13）には若干のCXC 選択性を有し、一方Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号10）は顕著な選択性を示さなかった（選択比率0.9 ）が、驚くべき事にIL-8については最も高い選択性を示し（この位置にバリンを持つ）、SDF-1 についてはそれを示さなかった。この類縁体はトリペプチドを除き最も選択的なIL-8シグナル伝達阻害剤であり、即ち本類体は他のケモカインに比べて約３倍高いIL-8選択性を有していた。
【０４５９】
Leu4及びIle11 置換を同時に持つ類縁体のCXC ケモカイン阻害剤としての特性せは、それぞれの単一変異体Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１0 ）または]Ile11ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号13）に比べ大きくはなかった（表６）。しかし、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）は、CCケモカイン阻害剤としてはペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）または単一変異体Leu4ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１0 ）またはIle11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号13）にくらべ約５倍強力であった。従って、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）は一般のケモカイン阻害剤よりも強力であり、平均ED50はペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）が10μM であったのに対し2.3 μM であった。
【０４６０】
さらに予想外にも、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）は、最も穏当なペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）の選択性を保存し、その選択比率は2.0 であった。従って驚くべき事にLeu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）は、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）がヒトMCP-1 の認識配列を有しているにも関わらず、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に比べMCP-1 シグナル伝達の阻害剤として約５倍強力であった。さらに、Leu4Ile11 ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］（配列Ａ）は、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）同様、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）の高親和性ペプチド類縁体であった。
【０４６１】
ｘ２からｘ４の位置に関しては、今日までに報告された全てのケモカインがこの３アミノ酸域内に少なくとも１個の荷電アミノ酸を持っている（表１）。多くのケモカインがｘ2 及びｘ4 を占める２個の塩基性残基を有する（例えば、MCP-1 ではKQK 、MCP-2 ではKER 及びSDF-1 ではKLK ）が、その他２個の酸性残基を持つものもある（例えばMIP1a のSEE 、MIPIβのSES 、RANTESのSES ）。最近（Nature Med.,3.367(1997))  ケモカインレセプターの細胞外ループ内の荷電がリガンド特異性の重要な決定因子であることが示唆され、例えばSDF-1 に結合するCXCR4 はマイナスに荷電しているが、一方MIP1α、MIP1β及びRANTESに結合するCCR5はプラスに荷電している。即ち、ｘ2 −ｘ4 はレセプター特異性に重要な役割を果たしている。
【０４６２】
この仮説を検証するため、幾つかの変種を調整した：Ser7ペプチド（3-12) ［MCP-1 ］（配列番号11）はMCP-1 、MCP-2 、エオタキシン、IL-8及びSDF-1 中に存在するプラスに荷電したＫ残基を、MIP-1 α、MIP1β及びRANTES中に存在するヒドロキシル化されたＳ残基に置換する。しかし、この変更は選択性を大きく変えなかった。具体的には、この変化はMCP-1 シグナル伝達の阻害能を低下させず、あるいはMIP1αのシグナル伝達の阻害能を増加しなかった（表４）。
【０４６３】
検出された唯一の変化は、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）の中度のCC選択性からSer7ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号11）変種の中度のCXC 選択性（選択比率0.5 ）への軽微なシフトであった。変種の中では、MCP-1 配列の認識配列のペプチドからMIP α配列の認識配列のペプチドに変換したSer7Glu8Glu9ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号12）では、他の全てのケモカインに対してMIPaに関する選択比率は約３倍にしか過ぎないにも関わらず、よりMIP1α選択的となった。
【０４６４】
100 μM の濃度に於いても、いずれのペプチド3(1-12）［MCP-1 ］変種もTGF-βに誘導されるTHP-1 細胞の遊走阻害剤として検出可能な活性を持っていなかった（表４）。即ち、これら変種は全てケモカイン誘導シグナル伝達の高度に選択的な阻害剤であった。ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］の中のアミノ酸残基が上記ケモカイン配列中に認められる他のアミノ酸域のいずれかに変わり、観察される一般的ケモカイン阻害能力を低下させる置換は無かった。しかし、特定の変化は顕著な選択性のシフトを起こした。
【０４６５】
例えば、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）のCC選択性は、位置4(x1) をＡからＬへ変異させることにより、又は位置11(x5)をＶからＩへ変異させることによりCXC 選択性に転換できる。具体的には、２種類の変種はある１種のケモカインに対する選択性が、その他すべてのケモカインの平均ED50に対し３倍以上高くなり、即ちIle11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号13）は、IL8 阻害について弱い全般的な選択性を有し、Ser7Glu8Glu9ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号12）はMIP1αに対する弱い全般的選択性を有する。
【０４６６】
まとめると、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］変種はそれぞれのED50とケモカインのαファミリーまたはβファミリーに対する選択性に若干の違いはあるものの、それらは全てペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に似ていた。表６の結果は、ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）及びペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）変種がMCP-1 、MIP1α、IL8 及びSDF1αケモカインにより誘導される遊走を同程度に阻害することを示している。CCケモカインに対する若干の嗜好性を示すエプチドまたはペプチド変種がある一方で、他はCXC ケモカインに対し若干の嗜好性を示すものの、CC- 特異性が２倍を越えるものはなかった。ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）、ペプチド3(1-6 ）［MCP-1 ］（配列番号８）及びペプチド3(7-12）［MCP-1 ］（配列番号９）もまた有意なCC又はCXC 選択性は示さなかった。
【０４６７】
実施例３．機能的アゴニストであるケモカイン配列の同定と特徴
ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）がTHP-1 遊走アッセイでMCP-1 活性を阻害しないという上記の結果は、ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）がMCP-1 レセプターと結合するがMCP-1 結合およびシグナル伝達は阻害しない、又はアゴニストとしてMCP-1 の結合を阻止するがMCP-1 様シグナルは伝達しないという可能性を排除するものではない。
【０４６８】
ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）がケモカインレセプターに結合する否かを検証するために、THP-1 細胞をペプチドのビオチン化誘体と混合した。ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）は妥当な親和性（kD=1.9μM ）でTHP-1 細胞と結合することが判明し、ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）はケモカインのシグナル伝達を阻害することなく、ケモカインレセプターと相互作用できることが示唆された（中和結合剤）。
【０４６９】
ケモカイン間で比較的保存された領域であるペプチド３とは異なり、ケモカインのペプチド２領域内には配列類似性が極めて低い部分も存在する。即ち、ペプチド２、その誘導体または変種はよりケモカイン特異的作用を持つだろう。この仮説を検証するために、２種類の細胞、即ちTHP-1 細胞とジャーケット細胞に対するビオンチン化ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）の結合を比較した。
【０４７０】
THP-1 細胞はMCP-1 、MIP1α、SDF-1 α及びIL-8に対するレセプターを発現しているのに対し、ジャーカット細胞はSDF-1 に対する機能的レセプターのみを発現している。ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）はHTP-1 細胞（1.9 μM ）と同様のkD（3 μM ）でジャーカット細胞と結合する。この観察は、驚くべき事にペプチド2(1-15）［MCP-1 ］はSDF-1 相当域に対しほとんど相同性を有していないにも関わらず、ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）が極めて多様なケモカインレセプターと結合できることを示している。
【０４７１】
遊走アッセイの中で各種濃度のペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）をTHP-1 細胞と反応させ、ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）の機能的アゴニストの特性を調べた。ペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）は、弱いアゴニスト活性（ED50約10μM で遊走を促進）を持ち、最大遊走は100 μM であったが、その強さはMCP-1 により誘導されるものの約10％であった。
【０４７２】
即ち、高濃度（＞20μM ）の場合にはペプチド2(1-15）［MCP-1 ］（配列番号３）、その変種または誘導体はMCP-1 アゴニスト活性を必要とする適用に有用であろう（例えば、高いマクロファージ活性が所望される寄生虫感染の治療）。さらに、低濃度（＞1 μM で＜20μM ）では、ペプチド２、ペプチド２変種または誘導体は、ケモカインレセプターに対する非MCP-1 蛋白結合に影響する天然結合作用物質として有用であろう。例えば、ペプチド２、その誘導体又は変種は、所望のケモカインシグナル伝達を阻害することなく、ケモカインレセプターへのHIV の結合を予防し、または阻害するのに有用であろう。
【０４７３】
実施例４．In Vivo 応用を目的とした発明の治療薬の同定、調整及び特徴付け
Ａ．誘導体
ペプチドは一般に化学的、または酵素的加水分解に感受性である。具体的には、ペプチドは通常胃の中の酸性および蛋白分解環境に於いて安定でないために、経口投与できない。即ち、化学的または酵素的加水分解により、ペプチドのin vivo の半減期は極めて短くなる。加水分解に対する作用物質の感受性の半減期を伸ばすために、in vivo 活性薬剤を経口投与可能な誘導体を生じる様式に修飾し、薬物動態を改善し、その投与によりケモカイン活性を阻害する血中濃度を達成できるだろう。
【０４７４】
例えば、環式逆転-D（CRD ）ペプチドが調整できる。CRD ペプチドは、逆の立体異性体（L-アミノ酸の代わりにD-アミノ酸）を利用してペプチドの逆配列を合成（C 末端からN 末端へ）することで調整できる。次に得られたペプチドをN-及びC-末端システイン残基を介して環状化する。これら誘導体は非CRD ペプチドに極めて類似した原子の立体配置を有しながら、酵素による加水分解の対象にはならない。in vivo に於ける半減期を伸ばしたその他の誘導体には、チエニルまたはピリジル誘導体がある（例えば、米国特許第4,992,463 号；米国特許第5,091,396 号を参照）。
【０４７５】
例えば、ペプチド３誘導体を調整するには、ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］をJameson らに従い（Nature、368,744(1994))修飾し、CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］を得る（図４）。上記記載のin vitroアッセイに於いてペプチド3(3-12）［MCP-1 ］（配列番号１）に極めて良く似た特性を示すCRD-Cys13Leu84Ile11 ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］は酸性加水分解（pH2.0 、２時間、37℃で分解＜10％）及び酵素分解（５単位トリプシン、２時間、37℃）に対し安定である。CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はまたin vivo に於ける加水分解に対しても耐性であり、治療上有用な血漿濃度を得ることができる（250 μl 生理食塩水中1mg のCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］の単回腹腔内投与24時間後で＞10μM ）。
【０４７６】
Leu4Ile11 ペプチド3 の環式逆転D (CRD）、直鎖状逆転-D（LRD)、環式前方L (CFL）及び直鎖式前方L (LFL）（即ち、ペプチドの標準型）誘導体を調整し、そのMCP-1 阻害活性をTHP-1 トランスウエルアッセイで決定した。結果は以下の通りである、
【０４７７】
【表５】
0004523151.tif 000031
【０４７８】
これらの結果より、以外にも環状化及び逆転-D誘導化は独立に活性を改善することが示された。この改善はCRD 誘導体中相加的であった。即ち、環状化はペプチドの立体構造を拘束することで親和性を改善した。しかし逆転-D誘導かがこれほど有益であることは予想外であったが、おそらく分子の安定性の向上によるものであろう。
【０４７９】
CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はMCP-1 誘導THP-1 遊走の極めて強力な阻害剤であることが判明した（ED50約1nM ）。親のLeu4Ile11 ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］（配列番号14）に比べ上昇した能力は、in vitroに於いてさえ安定性が向上を反映した結果であり、またペプチドの立体構造安定性の増加を反映したものであろう。さらに、この化合物はシグナル伝達レセプターと、天然の完全長MCP-1 と同じ親和性で結合するが、シグナルは発しない。
【０４８０】
CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］が培養中のコンカナバリンＡまたは破傷風菌毒素に対するＴまたはＢ細胞の増殖を阻害するか、又は増強するか決定するために、CFSE-FITC 細胞標識によりCD4T細胞およびＢ細胞の増殖を調べた。50ngのCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はCD4T細胞のConA増殖を50％阻害し、5ng のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はCD4T細胞のConA増殖を＜3%までに減少させた。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］は破傷風菌毒素に対するＢ細胞の増殖には影響しなかった。
【０４８１】
コンピューターモデリングを使い、特定のアミノ酸の置換がペプチド誘導体CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］の立体構造に影響するか否か決定した。ペプチド配列をHyperChem5.0（HyperCube ）に入力した。アンバーフォースフィールド（Amber force Field)パラメーターとポラック−リビエール（Polak-Ribiere ）アルゴニズムを用いて最少エネルギー立体構造を探した。初期モデルを分子動態シュミレーション（300 °K 、2n秒）および手動による側鎖回転を用い操作し、さらに見かけ上最少総エネルギー立体構造が得られるまで幾何学的至適化を行った。収束基準は＜0.01Kcal/molオングストロームとした。この方法を用いて、エネルギー約213.4kcal/mol で立体構造を得た。
【０４８２】
摂動に対するモデルペプチドの感受性を試験するために、全てのＤペプチドの最少立体構造から主発して、ジスルフィド結合を形成している末端のシステインを除いた各残基を個別にＤからＬに変異させ、幾何学的に再度至適化した。この様な摂動について、各変異体をまず幾何学的至適化ルーチンに通し、続いて分子動態シュミレーションを行い、そして別の幾何学的至適化に進む。得られた変異ペプチドを全てのがＤ型であるものとジスルフィド結合と隣接原子を重ねて比較し、ペプチド主鎖の違いを目で確認した。
【０４８３】
全体の立体構造は２，３，４，８，９及び10お位置のキラリティーの変化に対しては不感受性であったが、５，６及び７の位置のキラリティーの変化には感受性であった。一般に主鎖の立体構造変化が顕著な場合には、側鎖の変化はマイナーである予想される。変異体のエネルギーは-187.9から-226.1Kcal/molまで様々であったが、エネルギー変化（出発立体構造は-213,4）は立体構造の変化と相関しなかった。
【０４８４】
さらに、側鎖のカルボキシル基をＤ- アラニルアミドに変換して、位置９のアスパラギン酸の修飾の影響を調べた。修飾されたペプチドの最少エネルギー立体構造をキラル変異体の場合と同じルーチンを用い、同じ最少エネルギー立体構造から出発して探した。残基９の側鎖のカルボキシルにＤ- アラニンを縮合すると、ペプチドの立体構造内に大きな変化が起こる。このことはCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］に比べD-ala ペプチドでは生物活性が大きく消失することを示したin vitroに於ける単核細胞遊走データと一致する。
【０４８５】
L-Leu に代わりD-Leu が付いたCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］であるL-Leu-CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はペプチド主鎖の立体構造にはほとんど変化を生じないはずである。In vitroでのL-Leu-誘導体による遊走試験は、それが機能活性を良く保持していることを示した。即ち、発明の生物学的に活性な分子の立体構造を保持した特定アミノ酸置換体の選択には、分子モデリングが利用できるだろう。
以下のD-アミノ酸からL-アミノ酸への変化は、モデリングにより調べた限りにおいてペプチド主鎖の構造に大きな影響を及ぼさない。
【０４８６】
【表６】
0004523151.tif 000032
【０４８７】
以下のD-アミノ酸からL-アミノ酸への変化は、モデリングにより調べた限りにおいてペプチド主鎖の構造に大きな影響を及ぼす。
【表７】
0004523151.tif 000033
【０４８８】
Ｂ．DARC結合
生物学的利用度に関して、治療薬物の非特異的結合についてさらに検討した。赤血球はケモカイン関連ダッフィ抗原レセプター（DARC）と呼ばれる、シグナル伝達欠損ケモカインレセプターまたは結合蛋白を持っている。これはシグナルを発しないが、ケモカインに対し高い親和性を持ち（10nM）血中のケモカイン清掃の役割を果たしている。
【０４８９】
不幸にも、DARCに対し高い親和性を持つケモカインレセプターアンタゴニストはいずれも赤血球上にある極めて多量の結合部位により捕捉されるため、他の組織に於ける増殖性ケモカインシグナル伝達の阻害に利用できない。In vivo での利用の場合には、DARCに結合しないペプチドは糸球体濾過の最初の通過時に速やかに排除されるため、本発明の薬剤はDARCに対し若干の親和性を持つことが好ましい。即ち、好適な薬剤は100nM ないし1mM 、より好ましくは１μM ないし100 μM の範囲、よりさらに好ましくは10ないし100 μM の範囲でDARC（親和定数）と結合する。
【０４９０】
DARCとケモカインとの相互作用の親和性は高い（5-10nM結合定数）が、動的には該相互作用は極端に速いオン・オフ速度により特徴付けられる。即ち、標識されたケモカインと反応させると、DARC結合部位は飽和するが、結合した標識の多くは未標識体を除くと数分以内に消失する（３分以内に＞90％）。結果として、離脱速度が速すぎるために結合標識量の測定は不可能または不正確となるため、ビオチン化ペプチドの直接結合をアッセイし、DARCへのペプチド結合を直接測定することは困難である。
【０４９１】
この困難を克服するために、DARCを発現している赤血球と 125I 標識MCP-1 を各種濃度のペプチド存在下に反応させ、ペプチド3(1-12)[MCP-1]（配列番号１）及びペプチド2(1-15）[MCP-1] （配列番号３）とDARCとの結合定数Kaを求めた。結合が平衡に達したの後（37℃、30分）、５分間ショ糖勾配中に遠心分離し細胞を未結合標識体から分離した。続いてガンマカウンティンブシンチグラフィーを使い、細胞の結合カウントを決定した。
【０４９２】
ペプチドが全く存在しない場合、ヒト赤血球への125I- 標識MCP-1 の結合定数は5.45nMであったが、この値はこれまでの報告と一致した。さらにスキャチャード（Scatchard ）分析により、DARCの既知特性に一致して、細胞当たり500-1000コピーの１種類の高親和結合部位の存在が確認された。即ち、各種濃度のペプチド存在下の本アッセイにより赤血球への125I-MCP-1結合が決定されたことにより、DARCに対する結合定数を正確に算出することが可能になった。
【０４９３】
DARCの特異性比率についても決定した。DARC特異性比率は、DARCについて算定された結合定数を生物学的活性に関するED50で除したものとして定義される。DARC特異性比率が１より大きいことは、ペプチドとDARCとの結合が弱く、ケモカインシグナル伝達の変調に関してアンタゴニスト又はアゴニストとして生物学的に利用できることを示している。DARC特異性比率が約１であるということは、ペプチドがDARCおよびTHP-1 シグナル伝達レセプターに同等の親和性で結合することを示している。即ち、修飾せずにin vivo でこれらペプチドを生物学的活性濃度（ケモカイン阻害剤として）にすることは困難である。DARC特異性比率が１以下であることは、DARCに対する親和性の方がケモカインシグナル伝達レセプターに対する親和性よりもはるかに高いことを示している。
【０４９４】
ペプチド１［MCP-1 ］（配列番号２）（ケモカインレセプターには結合しないが、優性ネガティブな様式で機能する）はDARCへの結合を示さない（推定Kd＞100 μM ）。これとは好対照に、弱アゴニストであるペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］（配列番号３）はDARCに対し高い親和性結合を示した。ペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］（配列番号３）のTHP-1 細胞上のケモカインレセプターに対する結合定数は、競合結合分析から2 μM と算出された。
【０４９５】
しかし、このペプチドのDARCに対する親和性は、赤血球を使用し同様に競合結合分析により測定すると500nM より小さかった。即ちペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］（配列番号３）はTHP-1 細胞ケモカインレセプターに結合するが、レセプターを介したシグナル伝達は阻害せず、又DARCにより強く結合する（DARC選択比率＝0.1-0.2 ）。即ち、ペプチド２はマラリアの治療または予防に好適な治療薬である（DARC阻害作用は必要であるが、ケモカインシグナル伝達は変調しない）。
【０４９６】
DARCレセプターに対し非常に強い親和性を持つペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］（配列番号３）の様なペプチドは、in vivo においても強い生物学的アゴニスト活性を持っているだろう（in vitroでは極めて弱い、または中性のアゴニストであっても）。さらに、ペプチド２、その変種及び誘導体は、in vivo に於いては強い前炎症性であり、あるいはケモカイン結合機能を発揮しDARCを阻止することで既存炎症を強く増悪化するだろう。
【０４９７】
DARCが血液循環よりケモカインを除く排水口として機能するなら、ケモカイン濃度はペプチド２の存在により顕著に増加するだろう。ケモカインが血液循環中に放出される条件下（例えば炎症中）では、ペプチド２は炎症を増悪化し、ペプチドが内状態に比べ炎症を長引かせ、あるいは炎症反応の質的特質を変化させるだろう。この様な理由より、DARC特異性比率が低いペプチドは、免疫機能の改善が求められる状態の治療、または病的な不適切な炎症反応を特徴とする状態の治療に有用である。
【０４９８】
既にMIP1- αはDARCと顕著な結合を示さない唯一のケモカインであることが示されている。ペプチド2(1-9)［MCP-1 ］は約50μM のダッフィ親和性を持つが、一方ペプチド2(1-15) ［MCP1α］（配列番号５）はMIP1- αレセプターの強力な結合作用物質である。即ち、ペプチド2(1-15) ［MCP1α］（配列番号５）はDARCに結合しないが（結合定数＞50μM ）、THP-1 細胞上のケモカインレセプターと強く結合する（結合定数＝100-900nM ；結合部位の数は約150,000/細胞）。さらに、この作用物質はMCP-1 、MIP1α、IL-8又はSDF1αにより誘導されるTHP-1 細胞の遊走を阻害する。即ち、後者作用物質はin vivo に於ける、DARCに極めて選択的な天然ケモカインレセプター結合作用物質として特に有用であろう。
【０４９９】
ペプチド3(1-12) ［MCP-1 ］（配列番号１）もDRACに結合するが、ケモカインレセプターへの結合時と同じ親和性でDNRCに結合する（低μＭ濃度域）。Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）は本質的にはDARC結合能を持たないが、MCP1誘導遊走を１μM 付近の濃度で阻害する。即ち、Leu4Ile11 ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号14）の様なペプチド３の誘導体は、in vivo でアンタゴニスト特性を示す。
【０５００】
ペプチド3 ［MCP-1 ］の短断片（例えばペプチド3(7-12）［MCP-1 ］（配列番号９）は、漸次的に高いDARC特異性比率を示す（例えばペプチド3(7-12）［MCP-1 ］（配列番号９）の約3.0 対ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）の1.0 ）ことから、ケモカインシグナル伝達レセプターの特異性が望まれる場合には、一般には完全長のペプチドよりもケモカインアンタゴニストまたはアゴニスト活性を完全に保持したより短いペプチド断片の方が好ましい。
【０５０１】
ペプチド3(1-12）［MCP-1 ］（配列番号１）（DARC特異性比率＝1.00）はin vivo では汎ケモカイン阻害剤としては有用ではないと思われるが、一方Leu4Ile11 ペプチド3 ［MCP-1 ］（配列番号14）（DARC特異性比率＝37.83 ）またはCRD-CYS13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］の様な、DARCには弱く結合するだけだが（結合定数＝90μM ）、THP-1 細胞上のケモカインレセプターには極めて強く結合する（結合定数＝100-500nM ；結合部位数約150,000 ／細胞）その誘導体は、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、及び自己免疫疾患、HIV 感染（ケモカインシグナル伝達レセプター結合機能）の治療又は予防に関する好適な実施態様である。さらに、CRD-CYS13Leu4Ile11ペプチド3(3-12）［MCP-1 ］はMCP-1 、MIP1α、IL-8及びSDFIにより誘導されるTHP-1 細胞遊走を、極めて近いED50S で阻害する。
【０５０２】
CRD-ペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］はLFL 誘導体に比べると、機能的能力は高く、ダッフィ結合活性活性は低い。LRD ペプチド2(1-15) ［MCP-1 ］のダッフィ結合は約100 倍低い（25μM 対LEL100μM ）。
生物学的に利用可能な作用物質を調整する別の方法はケモカインの非ペプチド性類縁体を調整するものである。本発明の好適な非ペプチド性類縁体にはWIQ 、即ち式中のZ ＝CH3 ；Y=O ；X=CH3 ；及びAr= インドリルである式（IV) の化合物である。この化合物はDARCには結合しない（結合定数＝＞30μM ）が、THP-1 細胞のケモカインレセプターには極めて強く結合する（結合定数＝100nM-１μM ；結合部位数は約150,000 ／細胞）。この作用物質はMCP-1 、MIP1α、IL-8及びSDFIにより誘導されるTHP-1 細胞遊走を、極めて近いED50S で阻害する。
【０５０３】
【表８】
0004523151.tif 000034
【０５０４】
脚注：
ａ  ”CC- 特異性”はSDF1及びIL8 に対する平均阻害ED50を、MCP-1 及びMIP1α    に対する平均ED50で除したもの。
ｂ  ”ダッフィ選択性”は、赤血球に対する結合Ka算定値を、各ケモカイン（ペ    プチド２は除く：以下脚注参照）に対する平均阻害ED50で除したもの。
ｃ  ”平均ED50”とは、各ケモカイン（ペプチド２を除く；以下脚注参照）によ    り誘導されるTHP-1 遊走阻害の平均阻害ED50。
ｄ  ペプチド２ファミリーに関しては、”平均ED50”はTHP-1 細胞に対する結合    について算定されたKaである。
ｅ  ペプチド２ファミリーに関しては、”ダッフィ選択性”は赤血球への結合に    関するkaをTHP-1 細胞に対する結合に関するkaで除して計算される。
ｆ  印の付いたトリペプチド誘導体については、ペプチドは４種類の例示ケモカ    インの中の１種類について極めて特異的である。この場合、ED50はそのケモ    カインの阻害について示した。高いn.d.= 測定せず
【０５０５】
略語
CRD=環式逆転-D誘導体
LRD ＝直鎖式逆転-D誘導体
CFL=直鎖L-型ペプチドの環式誘導体
LFL=標準、直鎖L-型ペプチド［NB; 特記無き限りペプチドは全てLFL ］
イタリックのアミノ酸はD-型アミノ酸、その他は全てL-型。
−＝２個のシステインが連結した環式であることを示す。
【０５０６】
実施例５．本発明の薬剤の抗−HIV 活性
HIV が細胞と結合して感染するのを、本発明の薬剤が阻害することを実証するため、ヒトＴ細胞由来のジャーカット細胞を、（ｉ）阻害剤なし；または（ii）不活性な対照のペプチドとしてのペプチドＣ（表５）、（iii ） 100μＭのペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（配列番号：１）もしくは（iv） 100ng／mgのSDF-1 （すべてのCXCR-4受容体に結合して遮断するはずである）の存在下、感染性Ｔ−刺激HIV 分離株（intections T-tropic HIV isolate)とともにインキュベートした。３週間培養した後、ウイルスの複製を、培地の逆転写酵素検定法によって評価した。ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（配列番号：１）が、ジャーカット細胞のHIV 感染の有効な阻害剤であることが見出された（図３）。
【０５０７】
ペプチド２（1-15）〔MCP1〕（配列番号：３）はジャーカット細胞とTHP-1 細胞の表面のケモカイン受容体と結合するが、ケモカイン類による産生シグナリング（productive signaling) を阻害しないので、ペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕（配列番号：３）は、細胞侵入（cell entry）のためにHIV が利用するエピトープと結合して阻害するが、シグナリングのためMCP-1 が利用するエピトープとは結合して阻害することはないという可能性がある。この仮説をテストするため、先に述べたのと同じHIV 感染検定法を利用して、ペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕（配列番号：３）がジャーカット細胞のHIV 感染を阻害するかどうかを試験した。ウイルスの侵入を防止する場合、 100μＭでペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕（配列番号：３）は、ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（配列番号：１）より有効であり、SDF1αと同等に有効であった。
【０５０８】
ペプチド２誘導体（図１０）は、ペプチド３誘導体より優れた、ジャーカットＴ細胞のHIV 感染（CXCR4 が仲介する事象）の阻害剤であるが、驚くべきことには、ペプチド３は、THP-1 細胞の感染（CCR-5 が仲介する事象）のより優れた阻害剤である。したがって、ペプチド２とペプチド３の組合せは、抗HIV 治療に、例えばＭ刺激分離株（M-tropic isolate) およびＴ刺激分離株の両者による増殖性感染を阻害するのに特に有用である。
【０５０９】
さらに、LRD ペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕は、CCR5/CXCR4に対する親和定数が 100nM以下であり、そしてダフィ結合性（Duffy binding)がLFL ペプチド２〔MCP-1 〕に比べて１／10であるので、LRD 誘導体は、それらのIFL 対応物より効力が高いかもしれない（LFL の場合の 100μＭに対して25μＭ）。
【０５１０】
HIV を阻害する現在の治療法は、ウイルスに集中している。例えば、逆転写酵素の阻害剤またウイルスプロテアーゼの阻害剤がある。これらの治療法は限られた期間しか有効でない。それぞれの場合、ウイルスは迅速に複製を行っているので効力は低下し、そして、阻害剤に対して耐性の変異体を残す選択がある。組合わせ治療法は、一層有効であるが、感染した個体からウイルスを一掃することにはならないようである。
【０５１１】
結局、薬物カクテルを回避する変異ウイルスが生じ、今や薬物耐性の個体中に病勢の悪化が再び起こっている。したがって、コレセプター（co-receptor)の阻害に基づいた戦略は、ウイルスタンパク質ではなくて宿主タンパク質を標的としており、阻害されたコレセプターを克服するには、ウイルスは一層広い範囲の変異を行う必要があるから効力が増大するかもしれない。実際に、CCR-5 Δ32接合体の感染に対し耐性があることは、少なくともウイルス集団が小さい場合、ウイルスは、別のコレセプターを使用することに容易に適応できないことを示している。
【０５１２】
ペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕のSer10 変異体（SYRRITSSKSPKEAV)またはそのLRD Cys0Ser10Cys16誘導体（cvaekpsksstirrysc)またはCRD 誘導体を利用することが好ましい。SYRRITSSKSPKEAV のDARC結合性（DARC binding) は２０μＭ〜100 μＭの範囲内であり、そして抗HIV 薬剤として１〜100nM の範囲内の活性である。
【０５１３】
実施例６．感染力についての迅速な選別法
HIV の感染力の生体外で現在行われている検定法は、時間がかかりかつ再現性に乏しい。例えば、感染力は、放射能標識をつけたＲＴ基質を用いて、ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）活性を生成させることによって監視することが多い。実験室に適応させたHIV 株を用いて、ジャーカットヒトＴ細胞系などの高度に許容性の細胞系（high permissive line) に感染させても、あいにく、ＲＴの生成量は低い。その結果、感染させた細胞は２週間以上培養して、ＲＴの生成量が測定できるように十分な感染を起こさせる必要がある。
【０５１４】
この検定法は、時間がかかる上に、その外にいくつもの欠点がある。最も重大なのは、この検定法は、ＲＴ活性が検出可能になるよう十分にウイルス力価を増大させるため、複数回の二次感染に依存していることである。そのため、一次感染のわずかの差が拡大され、そして、一次感染の頻度（primary infection frequency)が低いので、同一に処理されたウェル間の推計学的差は有意になる。したがって、この検定法は、各分析毎に多数の繰返しウェルを必要とし、２４回もの多数の繰返し試験が日常的に行われている。
【０５１５】
例えば、典型的な検定を行う場合、９６ウェルプレート中の２４ウェルずつのジャーカット細胞のグループに、HIV ウイルスのストックの繰返し区分を感染させ、その一グループは、ケモカインのコレセプター阻害剤としてのペプチド２で処理し、別のグループは SDF-1α（CXCR-4の天然リガンド）で処理し、そして第三グループは未処理のままにしておく。３週間後、これらの細胞を収穫してＲＴ活性を測定した。未処理ウェルの変動係数は３７％であった。したがって、ペプチド２はＲＴ活性を７５％阻害したが、これは、ウェル毎の変動が大きいのでｐ＝0.02でしか有意でなかった。このため、選別の目的を達成するため多数回の繰返しを行う必要があり、その検定法が面倒になる。
【０５１６】
別の方法は、HIV タンパク質を、例えば免疫蛍光顕微鏡法によって、直接可視化する方法である。あいにく、最も高度に発現されるHIV タンパク質（例えばp24gag) でも、細胞にはかなり低いレベルで存在している。したがって、感染後、早い段階で直接検出することは困難でかつ誤差を生じやすい。したがって、以下の方法を利用して、免疫蛍光の感度を高めて、HIV に感染した細胞の数を、感染後、２４〜２７hrの間に正確に測定できた。さらに、この方法のシグナル／ノイズ比によって、画像分析ソフトウェアを用いて、感染細胞を自動的に計数できる。
【０５１７】
THP-1 細胞の場合、これらの細胞は、PMA とヒドロコルチゾンを使用して、複数ウェルのスライドガラス（例えば１６ウェルチャンバーのスライドガラス；Nunc) に付着させる。次にこれら細胞を前記チャンバースライドガラスにて、各種の試験薬剤の存在下、ウイルスに暴露する。ジャーカット細胞などの非付着性細胞の場合、感染は、例えば、ＲＴ検定法の場合のように９６ウェル培養プレートで実施するが、分析する前に、これらの細胞を、製造業者の説明にしたがって、シロプシン（cyrospin) 装置を用いてスライドガラスに付着させる。スライドガラス上の前記感染細胞を、感染後、２４hr〜７２hrの間例えば、これらスライドガラスを氷冷アセトン中に９０秒間浸漬することによって固定する。
【０５１８】
定量免疫蛍光法に適合可能な他の固定法も利用できる（定量免疫蛍光法の考察については、J. Histochem. Cytochem., 44 巻1043頁1997年参照）。固定に続いて、前記細胞に対するタンパク質の非特異的結合を、例えば、脂肪酸を含有していないウシ血清アルブミンを３％  ｗ／ｖ含有するリン酸緩衝食塩水（３％ FAF-BSA含有PBS)中で、室温にて３０分間インキュベートすることによって遮断する。あるいは、他の遮断溶液（例えば、５％スクロース、５％ Tween-20 含有のPBS)も使用できる。
【０５１９】
次に、前記遮断されたセクションを、例えばp24gagに対して特異的な抗血清を用いて、HIV タンパク質について染色する。スライドガラスを、３％ FAF-BSA含有PBS 中、適切な濃度（通常、１〜100 μｇ／mlの範囲内の特異的IgG)の抗血清とともにインキュベートする。他のHIV 抗原に対する抗体も使用できるが、p24gagなどの比較的高度に発現される抗原が好ましい。
【０５２０】
このインキュベーションは、少なくとも１６時間続けねばならない。伝統的免疫蛍光法は、第一抗体とのインキュベーション期間が一般に１〜２時間であるが、これより長い時間インキュベートすると、バックグランドが増大することなく、シグナルが増大する（J. Histochem. Cytochem. 44巻1043頁1997年）。このインキュベーションは、シグナル／ノイズ比に対し有害な効果なしで３６時間まで続けてもよい。次に未結合の抗体を洗って除く。一般にこの洗浄は、PBS 中で３分間ずつ３回、行うが、他の洗浄方式も利用できる（洗浄法の比較については、J. Histochem. Cytochem. 44巻1043頁1997年参照）。次に、適当な発蛍光団で標識した、第二抗体を通常、使用して、未結合の第一抗体を検出する。
【０５２１】
しかし、第一抗体は、抗原からはずれるのを防ぐため、前記セクションに後固定する（post-fix) 。この処理は、例えば、前記スライドガラスを、新しく調製した４％パラホルムアルデヒド含有PBS 中で、室温にて１０分間インキュベートすることによって達成することができる。さらに、例えばPBS 中で３分間ずつ３回洗浄した後、前記スライドガラスを、適当な発蛍光団を結合させた第一抗体の種に対して特異的な第二抗体（例えば、抗ウサギ−IgG FITC接合体、１〜100 μｇ／ml）に暴露する。
【０５２２】
このインキュベーションを行う場合には、非特異的な核染料（nuclear stain)を含有させるべきである。例えば、Hocscht 33342 （１〜100 ng／ml）またはヨウ化プロピジウム（１〜100 ng／ml）を使用できる。その培養は、最も短くても約４時間であり、好ましくは少なくとも８時間であり、そしてシグナル／ノイズ比に対して有害な効果なしで２４時間まで行うことができる。次に、スライドガラスを、例えば、３回、３分間ずつPBS で洗浄して未結合の第二抗体を除去し、次いでCitifluor AF1 などの適切なマウンティングメディアム（mounting medium)にマウントする。マウンティングの後、分析を行う前に、少なくとも約１８時間で約７２hr未満、スライドガラスを暗箱中に静置する。
【０５２３】
分析は、選択された第二抗体の発蛍光団（例えば、FITC）の蛍光の検査と別個に選択された非特異的な核染色（例えば、Hoescht 33342)を行えるように、エピフルオレッセンス（epifluorescence)を視覚化することができかつ適当なフィルターセットを有する適切な顕微鏡を使って、手作業で行うことができる。各視野中の細胞の数を、非特異的核染料を視覚化するためフィルターを使用して核を計数することによって求める。次に、同じ視野内のHIV に感染した細胞の数を、第二抗体に結合した発蛍光団を視覚化するためフィルターセットをスイッチすることによって求める。それぞれの場合、細胞の数は手作業の計数によって求めることができる。
【０５２４】
あるいは、画像分析ソフトウェア（例えば、OpenLap software, Improvision 、英国）を用いて、各画像に一定のしきい値を適用し、そのしきい値を超える別の物体の数を計数することができる。スライドガラス上の細胞の密度によっては、必要に応じて、画像分析の分野で標準的なデアグロメレーションのアルゴリズム（deagglomeration algorithm)を適用できる。一定の組合せの照明条件が画像捕促（image acquisition)中に使用され、かつ一定のしきい値が適用されれば、HIV の染色された細胞の画分は、主観的な考察によることなく、迅速かつ正確に測定することができる。
【０５２５】
図１１は、ペプチド２（1-15）〔MCP-1 〕およびペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕による、HIV 感染の阻害の結果を示す。この方法の変動係数は５％より小さく、再現性に優れている。ケモカイン受容体のペプチド阻害剤が存在していない場合、THP-1 細胞の約６％がHIV に感染した。 100μＭのペプチド２の存在下で、感染は、感染率は２５±３％減少した。ウイルス感染の統計的に有意な減少は、統計的な有意性を立証するため、単一ウェル内の複数の視野を用いて行う単一ウェルの試験で示すことができる。陽性の試験結果は繰返しウェルを分析することによって確認することができ、そして投与量応答曲線を作製することができる。
【０５２６】
選択されたHIV 抗原の発現が低いか、または、検出が感染後、非常に早い（感染してから約１４時間後）場合、この方法の感度はさらに高めることができる。第二抗体をインキュベートした後、さらに、後固定ステップ（例えば４％パラホルムアルデヒド含有PBS 中で室温にて１０分間）を適用し、次に、そのスライドガラスを、第一抗体と同じ種の非免疫性の免疫グロブリン画分（すなわち非免疫性のウサギ血清）とともにインキュベートする。このインキュベーションは、室温で１〜２時間でよい。
【０５２７】
その後、先に使用したのと同じ第一抗体とともに第二のインキュベーションを実施する。この場合、非特異的な核染料（例えばHoescht 33342)を、第二抗体だけを含有する第二インキュベーションに加える。すべてのインキュベーションは、適当な洗浄方式（例えば、室温にて、PBS 中で３分間ずつ３回洗浄）によって分離するはずである。これらの変化によって、HIV 抗原の検出の感度がさらに５倍増大して、感染を早く検出できる。
【０５２８】
実施例７．トリペプチドの調製と特性決定
本発明の治療薬剤
ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕のフラグメントが生物活性を有していたかどうかを確認するため、ペプチド３のフラグメントを調製した。ペプチド３（10-12)〔MCP-1 〕すなわちWVQ は、試験されたすべてのケモカインの強力な阻害剤であることが見出された（表６）。10〜12位のアミノ酸残基(WVQ) は、他の多数のケモカイン類、例えば、MCP-3 、MIP1α、MIP1β、RANTES、EOTAXIN およびIL8 に保存されているが、SDF1は配列WIQ を有している。
【０５２９】
WVQ は、試験された４種の代表的なケモカインすべてを阻害したが、ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（配列番号：１）とは異なり、MCP-1 以外のすべてのケモカインの一層強力な阻害剤であった（ED50＝約１μＭ）。したがって、これらトリペプチドWVQ とWIQ およびこれらトリペプチドに基づいた非ペプチド類似体はパンスペシフィック（pan-specific) ケモカイン阻害剤である。さらに、WVQ は、ダッフィ選択度（Duffy selectivity)が優れている（すなわち選択度１０）ことが見出された。
【０５３０】
ペプチド３（7-9)〔MCP-1 〕すなわちKQK はDARCと結合しないが（会合定数≧５０μＭ）、THP-1 細胞のケモカイン受容体に強く結合する（会合定数＝500nM-1 μＭ；結合部位の数は約15,000／細胞である）。この薬剤は、MCP-1 によって誘発されるTHP-1 細胞のマイグレーション(migration) を阻害したが、MIP1α、IL-8またはSDF1αによって誘発されるマイグレーションを阻害しなかった。したがって、KQK （ED50＝２〜５μＭ）が、MCP-1 の特異的阻害剤であることが見出された。すなわちKQK は、 100μＭでも、MIP1α、SDF1αまたはIL8 が誘発する活性に対して効果がなかった。
【０５３１】
４種のトリペプチドとランダム配列のジペプチド（RGD, GGR, TTT, APQおよびVE）も試験した。これらペプチドはいずれも、前記ケモカイン類のいずれかによって誘発されるマイグレーションを有意には阻害しなかった。したがって、トリペプチドのKQK は、MCP-1 の活性を特異的に阻害し、そのMCP-1 に対する特異性は、他のすべての被検ケモカインに対する特異性より100 倍を超えることを示した。
【０５３２】
ケモカインの配列内に保存システイン残基が配列されていることに基づいて、MIP1α、SDF1αおよびIL8 に対する、KQK のトリペプチド等価体を、ケモカインが誘発するTHP-1 のマイグレーションの阻害について試験した。各場合について、そのトリペプチドは、その同系のケモカイン類に対して高度に特異的であった（各場合、100 倍を超える特異性であった）。例えば、SEE すなわちMIP-αに対して同系のペプチドは、MCP-αに対する選択度が、他のケモカイン類に対する選択度の100 倍を超えることを示した。
【０５３３】
さらに、KLK はSDF1に対して特異的で強力な阻害剤であり、そしてKEN はIL-8に対して特異的でかつ強力な阻害剤であった。いずれの場合も、上記トリペプチドは、 100μＭでも、同系でないケモカイン類によって誘発されるマイグレーションを有意には阻害しなかった。同類置換がなされているトリペプチドは、元のトリペプチドと同じ特異性をもっていると予想できる。さらに、その外のケモカイン類に対応するトリペプチドは、その同系のケモカイン類に対して特異的であろう。
【０５３４】
【表９】
0004523151.tif 000035
【０５３５】
示された各ペプチド（WVQ を除く）について、数字は、その化学誘引物質が誘発するマイグレーションの、 100μＭ濃度のそのトリペプチドによる阻害率を示す（平均値±範囲：二つの試験）。ダッシュ印は、マイグレーションが統計的に有意に減少しないことを示す（化学誘引物質とトリペプチドのすべての組合わせについて試験された）。トリペプチドのWVQ は、すべての被検化学誘引物質に応答するマイグレーションを阻害した。そしてそのトリペプチドの場合に示した数字は、阻害についてのED50（少なくとも二回の測定の平均値）である。提示されたどのトリペプチドも、 100μＭの濃度で、TGF-β1 が誘発するマイグレーションを阻害しなかったことに留意すべきである。肉太の数値は、そのペプチドを誘導する化学誘引物質によって誘発されるマイグレーションの、各ペプチドによる阻害率を示す。すなわち、KQK はMCP-1 などから誘導される。
【０５３６】
a DARCに結合するKQK の親和定数は１５μＭである。
b MCP-1 が誘発するマイグレーションを阻害するKQK のED50は７μＭである。
c DARCに結合するWVQ の親和定数は２μＭである。
【０５３７】
実施例８．生体内の薬動学と毒性
3H-D-alaペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（3H-D-alaをAsp に結合させた）を、IVまたはSQの注射(bolus) としてマウスに投与したところ、１時間以内に、ピーク血清濃度に到達した。この放射能標識ペプチドは、主として腎臓を通じて迅速に（約４hrで）排泄された。生物分布(biodistribution) のデータは、主な標的器官が腎臓であり、血液、肝臓および腸に検出された量ははるかに少なかったことを示した。
【０５３８】
対照的に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、循環中、２４時間以上、検出された。これは恐らくダッフィ結合性の結果であろう。3H-alaペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（DARC結合性がなく、迅速に除去される）とCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕（ダッフィ結合性が弱くかつ血清半減期が優れている）を直接比較すると、本発明のペプチド類は、他の医薬の半減期を増大するのに特に有用であることを示している。
【０５３９】
改変LD50法を使用して、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕について、マウスの静脈内LD50値を求めた。そのLD50は、 569mg／kgをマウスにIV投与して11.4mgであった。この値は、ヒトのIV投与量３９ｇと同等である。この量は、喘息モデルまたは内毒素血症モデルに見られる有効投与量の１０倍を超えている（下記諸実施例参照）。１１mgを腹腔内投与したところ死にいたらなかった。組織学的に見て、毒性は、腎臓とリンパ組織に限定されていた。
【０５４０】
致死量において、リンパ球のアポトーシスが脾臓と腸関連リンパ組織に見られた。律速毒性は腎臓に対する毒性であった。急性尿細管壊死が投与量に依存して増大した。これは、腎臓によって非常に迅速に排泄される（初回通過）小分子量のペプチドの非常に大量の静脈注射(569mg／kg）が原因であることはまず間違いない。これは、挫傷または大量の溶血の後、ミオグロビンまたはヘモグロビンが大量に放出される、患者に見られる変化に非常に類似している。致死量において、急性尿細管壊死と軽症のリンパ系細胞死の組織学的証拠が見られた。
【０５４１】
急性ラット毒性試験のインライフ相（in-life phase)を用いたところ、１０mgIVまでの投与量で、試験薬剤の投与に関連する、臨床で検出可能な変化は全く見られなかった。ラットに、７日間繰返し投与する毒性試験で、処置した動物に臨床徴候は全く観察されなかった。
【０５４２】
実施例９．ラットの皮膚炎症モデルへの本発明の薬剤の使用
リポ多糖(LPS) およびMCP-1 が誘発するラットの皮膚炎症を予防する本発明の薬剤の効力を評価するため、３種の投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与した。500ng MCP-1 または100ng MCP-1 と、内毒素なしのリン酸緩衝食塩水の媒体（陰性の対照として）および細菌のリポ多糖（LPS ; 陽性対照として）とともに、皮内注射（腹部）することによって炎症応答を誘発させた。各物質を、異なる部位に注射した。
【０５４３】
動物から得た試験結果を、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置した動物とPBS(希釈剤の対照）で処置した動物と比較した。アゴニストを皮内投与する３０分前に、これらの動物に、パンケモカイン阻害剤のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を、静脈内初回投与（3.30または300mg)を行い、次に皮下（背中）にデポ投与（depo dose)  (0.1，１または１０mg）を行った（例えば、図１７参照）。動物を注射してから２０〜２４hr後に殺した。血清と尿を収集した。アゴニストを注射した皮内部位を収集し、二分して、炎症応答の程度を、組織病理学と定量免疫蛍光法（固定し冷凍して）によって評価した〔例えば、MCP-1 を注射した後、皮膚内の単球／マクロファージの数を、抗−CD14（Serotec から入手できるMCA342、クローンED2)を３μｇ／mlの濃度で一夜４℃で使用して測定した。
【０５４４】
第二抗体は、室温にて６hrで２８μｇ／mlのラット抗マウスFITC（Jackson Immuno Research から入手できる415-096-100)であった。その上に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕の毒性を、組織学的分析を行うため、１０％の中性緩衝ホルマリン液中に入れた以下の組織の試料すなわち肺臓、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、心臓およびアンタゴニスト（試験薬剤）の注射部位の組織の試料と収集して評価した。
【０５４５】
一般的な試験の結果を図９と１０に示す。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕による全身治療によって、MCP-1 が誘発する単球／マクロファージの漸増が完全に停止した（ｐ＝0.009)。このことは、この薬剤によって生体外でみられる、MCP-1 誘発マイグレーションの強力な阻害と一致している。さらに、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕によって、PBS だけを投与された部位および未処置の皮膚の常在組織の単球／マクロファージの数が減少した。このことは、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で一回処置してから２４hr後に、単球／マクロファージの漸増が全身にわたって抑制されることと一致している。対照的に、D-ala ペプチド３（1-12）〔MCP-1 〕は生体内で効果がなかった（ｐ＝0.754)が、これは、この薬剤がマイグレーションの検定の際に生体外で活性を欠いていることと一致している。
【０５４６】
注射された細菌LPS に応答して漸増する単球／マクロファージの数がかなり減少する（＞８０％）こともみとめられた。LPS は投与量が 500ngでも、MCP-1 より強力なマクロファージ漸増の誘発剤であった。以前の研究は、LPS が仲介するマクロファージの蓄積は、TNF-αに対する抗体を中和すると、LPS が誘発する炎症を著しく減少させるので、TNF-α（非ケモカイン化学誘引物質）に大きく依存していることを示唆した。しかし、内毒素血症（実施例１０）において、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、LPS が誘発する、血漿中TNF-αの増大を著しく減少させたが、このことは、ケモカイン類がTNF-αの誘発に役割を演じているかもしれず、そしてケモカインのシグナリングとTNF-αのシグナリングの両方は、LPS が誘発する炎症を最大にするのに必要であるかもしれないことを示唆している。
【０５４７】
MCP-1 は、単球／マクロファージの化学誘引物質としてかなり特異的であるが、LPS を皮膚注射すると、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球を含む広範囲の白血球の漸増を誘発する。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕がこの白血球のサブポピュレーション(subpopulation) の漸増に作用するかどうかを確認するため、ラットのＢ細胞に対して特異的な抗体（Serotec から入手できるMCA 1432) を、１０μｇ／mlの濃度で一夜４℃で使用した。第二抗体は抗マウスFITC（上記のJackson Immuno Research から入手できる415-096-100)であった。
【０５４８】
単球／マクロファージについて、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、LPS 注射部位に対するＢ細胞の漸増を実質的に阻害した（図１０）。したがって、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕およびその外のペプチド３の誘導体、類似体および変異体の抗炎症作用は、マクロファージの蓄積を減らすかまたは阻害することに限定されることなく、他の白血球サブセットの漸増も阻害する。
【０５４９】
実施例１０．マウスの内毒素血症モデルに対する本発明の薬剤の使用
マウスの内毒素血症のモデルを使用して、生体内で迅速に機能するサイトカイン活性について、ペプチドを選別する。雌のCD-1マウスに 583μｇのLPS をi.p.注射（腹部）して、TNF-α，IFN-γ，IL-4およびMCP-1 のタンパク質ならびにmRNAのレベルを測定する。LPS を投与する３０分前に、これら動物に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕の三種の投与量のうちの一種を、静脈内の初回投与および皮下注射投与（背中）として投与した。
【０５５０】
LPS の投与ありおよびなしでPBS で処置した動物が、陽性および陰性の対照であった。２時間後に、動物を安楽死させて、血清を収集した。血清を細胞のペレットから分離して、サイトカインのレベルをELISA 分析するまで凍結した。肺臓と肝臓の試料を、mRNAの分析と組織病理学的試験を行うために収集した。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、投与量に依存して血清中のTNF-αが減少することを示した。IL-4，IFN-γおよびMCP-1 の血清レベルとmRNAレベルも測定する。
【０５５１】
実施例１１．マウスの喘息モデルに対する本発明の薬剤の使用
CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕の投与量を増やすと、肺臓内の細胞数と細胞のタイプが変化するかどうかを確認するため、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を、マウスに、静脈内に、静脈内と気管内に、または気管内のみに注射した。注射をしてから２０〜２４hr後にマウスを殺した。肺臓を収集して細胞を分離し、続いて、その細胞を、表面染色によつて、CD3, CD4, CD8, B220 およびMac-1 について、計数して特性を決定した。
【０５５２】
肺臓から単離された細胞の全数は、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を少量投与されたすべての群(0.3μｇIVまたは１０μｇIV) がPBS で処置されたマウスに比べて多かった。高投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置したマウスの肺臓から単離した細胞の全数は、PBS で処置した対照と比べて有意差はなかった。
【０５５３】
高投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、FACS分析によれば、すべての投与経路によって、PBS 処置の対照と比べて、CD3, CD4およびB220の細胞の比率を有意に低下させた。対照的に、低投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置した群のCD3, CD4またはB220の細胞の比率は、すべての投与経路によって、有意差はなかった。
【０５５４】
別の試験で、二種の増大投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕が、肺の炎症性浸潤を減らし、IgE 抗体が増大するのを阻害し、そしてオボアルブミンと気管内にチャレンジされたマウスの肺臓と血液中の特殊な炎症細胞の比率を変化させる性質を評価した（Gonzalo ら、J. Clin. Invest., 98巻2332頁1996年；Gonzalo ら、J. Exp. Med., 188 巻 157頁1998年参照）。
【０５５５】
オボアルブミン 0.1mgを含有する 200μｌ PBS（対照希釈剤）を腹腔内に投与することによって、マウスを感作した（表７６）。感作を行ってから８日目に、パンケモカイン阻害剤のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を、マウスに、静脈内初回投与量(0.3μｇまたは３０μｇ）と皮下のデポ投与量（１０μｇまたは１mg）で投与した。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与してから３０分後、マウスの気管内に、１％のオボアルブミンまたはPBS(対照希釈剤）をチャレンジした。
【０５５６】
感作を行ってから２１日目に、パンケモカイン阻害剤のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を、第二の静脈内初回投与量(0.3μｇまたは３０μｇ）と皮下投与量（１０μｇまたは１mg）でマウスに投与した。CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与してから３０分後に、マウスの気管内に、２％オボアルブミンまたはPBS(対照希釈剤）をチャレンジした。２１日目にオボアルブミンのチャレンジを行ってから３hr後にマウスを殺した。肺臓を収集して、組織病理学的試験を行い、かつ細胞を単離して全細胞の計数とFACS分析を行った。PBL を収集してFACS分析を行った。血清を収集してIgE レベルを測定した。
【０５５７】
FACS分析を行ったところ、２種の投与量(0.3μｇIV／１０μｇ皮下または３０μｇIV／１mg皮下）のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置したマウスの肺のCD3, CD4, B220およびMac-1 の細胞の比率が、OVA をチャレンジされる前にPBS を投与されたマウスに比べて、有意に低かった。CD8 細胞の比率はすべての群で類似していた。その上に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置されたマウスの肺から単離した細胞の全数は、PBS で処置したマウスと類似していたが、OVA とPBS で処置したマウスより有意に低かった。
【０５５８】
このことは、この薬剤が、炎症細胞の肺臓内へのトラフィッキング(trafficking) を変化させたことを示唆している。二種の投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置したマウスは、OVA で処置したマウス（陽性対照）およびPBS で処置したマウス（対照希釈剤）と比べて、血液中のCD3 とCD4 の細胞の比率が有意に高く、かつ血液中のB220の比率が有意に低かった。前記高投与量で処置したマウスは、他のすべての群に比べて、PBL コンパートメントにおけるMac-1 細胞が少なかった。
【０５５９】
高投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置したマウスはすべて、PBS だけで処置したマウスと同様に、肺の炎症性浸潤が組織学的に、最小乃至全く存在しなかった。低投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与されたマウスも、PBS とOVA で処置されたマウスと比べて、最小の炎症を示した。OVA による感作に対して予想される応答である好酸球が、PBS OVA 群（陽性対照）にのみ、まれに見られた。
IgE のレベルは、PBS とOVA で処置されたマウスが、他のすべての群に比べて有意に高かった。IgE は、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置されたすべての群のマウスに、バックグランドを超えて検出できなかった。
【０５６０】
第三の試験によって、三種の増大投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕が、肺の炎症性浸潤を減らし、IgE 抗体が増大するのを阻害し、そしてオボアルブミンを気管内にチャレンジされたマウスの肺臓の特殊な炎症細胞の比率を変化させる性質を評価した。0.1mg のオボアルブミンまたはPBS(対照希釈剤）をマウスの気管内に投与して感作した。感作を行ってから８日目、マウスに、（10.3μｇ， 103μｇまたは1.03mg) のパンケモカイン阻害剤のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を皮下に投与した。
【０５６１】
CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与してから３０分後に、マウスの気管内に、１％オボアルブミンまたはPBS(対照希釈剤）をチャレンジした。感作を行った後、１５日目、１８日目および２１日目に、マウスに対し、パンケモカイン阻害剤のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を皮下投与量（10.3μｇまたは 103μｇまたは1.03mg）で投与した。２１日目に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕を投与してから３０分後、マウスに、２％のオボアルブミンをチャレンジした。肺を収集して、組織病理学的試験を行いかつ細胞を単離して、全細胞を計数しFACS分析を行った。血清を集めて、IgE, IL-4 およびIFN-γのレベルを測定した。
【０５６２】
FACS分析を行ったところ、各種の投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置したすべてのマウスの肺のMac-1 細胞の比率が、OVA のチャレンジを行う前にPBS だけを投与されたマウスと比較して有意に低かった。高投与量または中位の投与量のCRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置されたマウスはすべて、ペプチドで処置されずにOVA をチャレンジされたマウス（陽性対照）に比べて、組織学的に、肺の炎症性浸潤が少なかった。PBS だけで処置したマウスは、肺の炎症は最小乃至ゼロであった。OVA をチャレンジされたマウスはすべては、肺に好酸球をもっていた。PBS のみで処置したマウス（陰性の対照）と同様に、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕で処置されたマウスのIgE のレベルは、PBS とOVA で処置されたマウス（陽性の対照）と比べて、有意に低かった。
【０５６３】
したがって、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕がIVと皮下、または皮下のみで送達されると、抗原に暴露された後のリンパ球の肺の中へのトランフィッキングが変化した。さらに具体的に述べると、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕は、肺臓の細胞炎症、IgE 応答およびIL-4の血清濃度を減少させた。これらのことは喘息と強く関連している。IgE 応答はTh2T細胞応答に依存しており、後者の応答はIL-4とIL-5を産生する。したがって、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕が、OVA をチャレンジされたときにIgE を減らす効果を有しているという観察結果は、CRD-Leu4Ile11Cys13ペプチド３（3-12）〔MCP-1 〕がIL-4とIL-5も減らすことができることを強く示している。
【０５６４】
実施例１２．好ましいトリペプチドとその類似体
本発明の好ましいトリペプチドとしては、KXK ペプチド（Ｘは２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１種である）。例えばKQK およびKLK 、ならびにKXK で表されるペプチドがある。下記のように、KXK ペプチドは、二つの別個の機構によって抗炎症性である。いくつかのKXK ペプチドはTGF-β活性化剤であり、残りはケモカインのアンタゴニストであり、そしてサブセットが両方にある（表１０参照）。
【０５６５】
【表１０】
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【０５６６】
KXK トリペプチドがTGF-βを活性化するかどうかを試験するため、直接ELISA 型の検定法を使用できる。CHO 細胞中に産生された組換えヒト潜伏TGF-β1 (R & D System)を、被検活性化剤とともにインキュベートした。例えば、200ng の潜伏TGF-β1 (latent TGF-β1)（２０μｇ／ml）を、最終濃度が 100nMの被検ペプチドとともに、３７℃で９０分間インキュベートした。
【０５６７】
インキュベーションの後、そのTGF-βを、活性型であって潜伏型でないTGF-β1 だけに結合するII型TGF-β受容体(R2X) の組換え細胞外ドメインとともにインキュベートする（Clin. Chim. Acta, 235 巻11頁1995年）。例えば、５０μｌの 100mM炭酸ナトリウム中で、精製R2X １μｇによって、４℃にて２hr、Maxisorp ELISAプレートのウェルをコートし、次いで非特異的タンパク質の結合は、５％スクロースと５％ Tween 20 を含有するTris緩衝食塩水とともに室温にて１hrインキュベートすることによって遮断した。
【０５６８】
次に、上記TGF-βの試料を、振盪しながら、前記コートされ遮断されたウェルとともに、室温で２hrインキュベートした。ウェルを、各インキュベーションの間で、0.05％のTween-20を含有するTris緩衝食塩水を用いて迅速に３回洗浄する。潜伏TGF-β1 は、被検ペプチドとともにインキュベートされて活性化されたならば、R2X によって捕獲されるが、残りの潜伏TGF-β1 は洗い流される。捕獲された活性TGF-β1 を、例えばペルオキシダーゼを接合されたポリクローナル抗TGF-β抗体などの適切な検出薬剤とともにインキュベートすることによって検出する。
【０５６９】
例えば、それらのウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたBDA19 にわとり抗TGF-β1 抗体 200μｌとともに、振盪させながら室温で９０分間インキュベートする。次いで、結合したペルオキシダーゼを、適切な色素産生基質（例えば、K-BLUE TMB基質の溶液）を用いて検出する。生成した活性TGF-βの量は、既知量の活性TGF-β1 (R & D Systems) を用いて作成した標準曲線に内挿することによって評価する。
【０５７０】
ケモカインアンタゴニストの活性は、前記THP-1 トランスウェルマイグレーション検定法（THP-1 transwell migration assay)を使って測定することができる。この検定法で、ペプチドは細胞とともにトップコンパートメント（top compartment)でインキュベートされるが、一方、ケモカインは化学誘引物質としてローワーコンパートメント（lower compartment)で使用される。４種類のケモカイン類：IL-8, SDF-1 α，MCP-1 およびMIP1αを試験した。
【０５７１】
表８に示すプラス印は、そのペプチドが、これら４種の化学誘引物質のケモカインの少なくとも１種によって誘発されるマイグレーションの阻害剤として活性であったことを示す。プラス印の数は、各検定における各ペプチドの活性を定性的に示している。マイナス印は、その検定法で検出可能な活性がないことを示し、n.d.は、与えられたペプチドの活性を、この検定法で評価しようという試みが今日まで全くなされていないことを示す。
【０５７２】
KFK はRFK と同等に活性であった。しかし、以前の報告と著しく対照的に、KXK シリーズの他のメンバーもTGF-β活性化剤として活性であった。例えば、KYK はKFK より活性が大であった。したがって、リシンをアルギニンで置換すると、TGF-βを活性化する２位のアミノ酸の範囲が増大する。
KLK とKIK は、これら薬剤が二重作用を有する抗炎症分子であるから特に興味深い。これらのトリペプチド類は、 SDF-1α受容体CXCR4 の特異的アンタゴニストであり、またTGF-βを活性化する。したがって、KLK, KIKおよびそれらの類似体と誘導体は、広範囲の炎症障害の予防と治療に用いる特に有用な医薬になるであろう。
【０５７３】
例えば急性の移植体拒絶反応に関連する移植体好酸球増多症の場合、パンケモカイン阻害剤または好酸球漸増の選択的阻害剤（例えばKKK またはその類似体）は特に有利である。かような薬剤は、単独で、またはプレドニゾロンなどのステロイド数（急性拒絶反応のエピソードを抑制するため、現在使用されている）の通常の投与量より低い投与量と組み合わせて使用できる。急性の拒絶反応中に用いられる最大投与量のプレドニゾロン（または他のステロイド類）を使用すると重篤な副作用が伴うので、ステロイド類を投与する必要性を減らすかまたは除く薬剤を使用することは特に有用である。
【０５７４】
KXK ペプチドの類似体、例えばKQK の類似体も考えられる。式Ｖで表され、置換基としてＲ７を有する化合物の中央の連鎖は、一般的な置換基Ｒ（Ｒはあらゆるアミノ酸由来の側鎖である）で置換される。これらの類似体〔例えば、式（VI) で表される化合物である一般クラスのフッ化アルケン類〕は、TGF-βの活性化および／またはケモカインのシグナリングを阻害することが望ましい広範囲の疾患を治療するのに有用である。このクラスの分子の適当なメンバーを選択することによって、その分子の望ましい特性を設計製作することができる。したがって、KYK 類似体を選べば、ケモカインの阻害なしでTGF-βが強く活性化されるが、KLK の類似体は両方の特性を有している。KQK の類似体は、１種以上のケモカイン受容体に対する阻害作用を有しているがTGF-βを活性化しない。
【０５７５】
したがってKYK およびその類似体と誘導体を、選択して、TGF-βの増加作用が特に有利な疾患、例えばアテローム性動脈硬化症または骨粗しょう症に使用することができる。対照的に、KQK の類似体は、ケモカインの阻害は望ましいが、TGF-βの増加作用は有利でない場合、例えばHIV 感染症を治療する場合に選択できる。
KXK ペプチド類とその等配電子体（isos ter) は、低い骨無機質密度を治療するのに有用であり、この場合、TGF-βの増大とMCP-1 の選択的阻害は、特に相乗効果を引き起こすようである。
【０５７６】
KXK クラスの誘導体または類似体は、単独で、または炎症障害もしくは本明細書に記載されているような他の疾患もしくは徴候を治療する他の治療法と組み合わせて使用できる。例えば、KYK の誘導体または類似体は、炎症性症状の治療に用いるステロイド類と組み合わせて使用することができ、ステロイド類の通常の投与量より少ない投与量を利用することが可能になり、ステロイドの長期間の使用に伴う副作用が低下する。
また、１位と３位におけるアミノ酸の保存的置換（conservative substitution)は、これら分子の活性に影響しないと考えられる。したがって、リシン側鎖〔ペプチド中または（VI）などの類似体中の〕の一方または両方を、アルギニル側鎖またはオルニチニル側鎖によって置換される。
【０５７７】
引用したすべての刊行物、特許および特許願は、本明細書に援用するものである。上記明細書において、本発明を、その特定の好ましい実施態様について説明し、多くの詳細事項を例示を目的として述べてきたが、本発明は、追加の実施態様を実施することができ、かつ本明細書に記載した詳細事項のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱することなくかなり変更することができることは、当業技術者にとって明らかなことである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、経−ウエル移動検定の略図である。ほとんどの実験において、ペプチド（波腺）は約50,000個の細胞（Ｏ）とともに上部ウエルに付加される。上部および下部ウエルは、孔サイズ５μｍまたは８μｍのPVP 無含有膜（‐‐‐‐）により分離される。ケモカイン（●）は、下部ウエルに付加される。４時間後、膜を通って移動した細胞の数を測定する（下部ウエル中のＯ）。
【図２】  図２は、MCP-1 誘導性THP-1 細胞移動のペプチド３（配列番号：１）抑制に関する用量−反応曲線を示す。
【図３】  図３は、Ｔ向性HIV をJurkat細胞に注射後２１日目に培地中に認められた逆転写酵素活性を示す。ペプチドは０日目のHIV 単離物の細胞への注射の１時間前に付加された。全長ケモカイン SDF-1αを陽性対照として用いた。
【図４】  図４は、ジスルフィド結合により環化されるCRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］の構造を示す。主鎖α炭素は、Ｄ形態のアミノ酸が存在することを示すＣD で示される。
【図５】  図５は、本発明の治療薬のケモカイン受容体との結合による細胞移動の抑制の略図である。 CR C ＝本発明の治療薬。ケモカイン受容体は中黒矩形として示される。
【図６】  図６は、本発明の作用物質によるHIV 侵入の抑制の略図を示す。
【図７】  図７は、ペプチド３（CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］＝NR58−3.14.3）による動物モデルにおける炎症（Ａ）および内毒血症（Ｂ）の用量依存性抑制を示す。
【図８】  図８は、ペプチドWVQ の好ましい類似体を示す。
【図９】  図９は、本発明のペプチドの存在下または非存在下でのラットにおけるLPS 投与の部位でのマクロファージのｌ数のグラフを示す。
【図１０】  図１０は、本発明のペプチドの存在下または非存在下でのラットにおけるLPS 投与の部位でのＢ細胞のｌ数のグラフを示す。
【図１１】  図１１は、定量的免疫蛍光(QIF）検定を用いたペプチド２またはペプチド３の存在下でのHIV 感染THP-1 細胞の分画のグラフを示す。
【図１２】  図１２は、種々のアミノ酸に関するコドンを示す。
【図１３】  図１３は、アミノ酸置換の例を示す。
【図１４】  図１４は、本発明の治療薬の例を示す。
【図１５】  図１５は、選定ペプチド２化合物に関するTHP-1 移動のダッフィー結合親和性および抑制を示す。 LFL＝線状前方Ｌ異性体； LRD＝線状逆Ｄ異性体； CRD＝環状逆Ｄ異性体； CFL＝環状前方Ｌ異性体。
【図１６】  図１６は、本発明の選定ペプチドに関する結合およびED50データを要約する。
【図１７】  図１７は、ラット皮膚炎症モデルにおける作用物質（CRD-Cys13Leu4Ile11ペプチド３（3-12）［MCP-1 ］＝NR58−3.14.3）を試験するためのプロトコールの例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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