(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン(IFN)欠損細胞系に感染して、その中で複製する能力がある、全NS1コード配列を欠失している（delNS1）ウイルスゲノムを含む、遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項２】
異種配列をさらにコードしている、請求項１記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項３】
異種配列がウイルス抗原をコードする、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項４】
異種配列が腫瘍抗原をコードする、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項５】
異種配列が細菌または寄生虫に由来する、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項６】
異種配列が免疫グロブリン遺伝子またはその一部である、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項７】
異種配列が、ヒト免疫不全ウイルスgp120、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヘルペスウイルスの糖タンパク質またはポリオウイルスのVP1をコードする、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項８】
異種配列が、Plasmodium yoeliiのマラリアエピトープ(ME１)をコードする、請求項２記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルス。
【請求項９】
適当な医薬製剤中に、請求項１〜８のいずれか１項記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
鼻腔内送達用に製剤化されている、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下送達用に製剤化されている、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
適当な医薬製剤中に、請求項１〜８のいずれか１項記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルスを含有するワクチン。
【請求項１３】
鼻腔内送達用に製剤化されている、請求項１２記載のワクチン。
【請求項１４】
経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内または皮下送達用に製剤化されている、請求項１２記載のワクチン。
【請求項１５】
被験体に免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項９〜１１のいずれか１項記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１６】
被験体にワクチン接種するための医薬の製造における、請求項１２〜１４のいずれか１項記載のワクチンの使用。
【請求項１７】
被験体が動物である、請求項１５または１６記載の使用。
【請求項１８】
被験体がヒトである、請求項１５または１６記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の遺伝子工学的に作製された弱毒Ａ型インフルエンザウイルスを含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願に記載されている研究は、一部、米国立衛生研究所からの助成による支援を受けたものであり、政府は本発明における一定の権利をもつことがある。
【０００２】
1.  緒言
本発明は、非コード領域またはウイルスの非構造(NS)遺伝子のコード配列を改変することにより遺伝子工学的に作製された弱毒ウイルスに関する。特に、本発明はインターフェロンおよびその関連経路を誘導する遺伝子工学的に作製された生存能のある弱毒インフルエンザウイルスに関する。本発明はさらに、腫瘍特異的抗原を含む、広範な病原菌および/または抗原に対する弱毒ウイルスおよびウイルスベクターの使用に関する。本発明はまた、遺伝子操作されたインフルエンザウイルスを同定するための宿主制限に基づく選択系に関する。特に本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスを同定する選択系に関する。
【０００３】
2.  発明の背景
2.1  弱毒ウイルス
不活化ウイルスワクチンは、例えば、熱やホルマリン処理によってウイルス性病原菌を「殺す」ことにより製造されるため、これを複製することは不可能である。不活化ワクチンは持続的な免疫を与えず、従って保護も制限されるため、不活化ワクチンの用途は限られていた。ウイルスワクチンを作製する代替法として、生存能のある弱毒ウイルスワクチンの使用がある。弱毒ウイルスは複製可能ではあるが病原性はなく、従ってより持続性のある免疫を与えると共に保護力もより大きい。しかしながら、弱毒ウイルスを作製する常法には、その多くが温度感受性である宿主域突然変異体の偶発的な単離が含まれる。例えば、前記ウイルスは人為的な宿主によって継代され、免疫性はあるが未だ病原性ではない子ウイルスが選択されている。
【０００４】
特異的突然変異は意図的にウイルスゲノムへ遺伝子操作することができるため、理論上組換えDNA技術および遺伝子工学技術は弱毒ウイルスの作製にとって優れた方法となる。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子改変は知られておらず、また予測できるものでもない。一般に、ウイルスワクチンを遺伝子工学的に操作するための組換えDNA技術を利用しようとする試みは、ほとんどの場合、ワクチニアウイルスやバキュロウイルスのような組換えウイルスベクターで発現される、免疫応答に関与する病原菌のタンパク質サブユニットのみを含むサブユニットワクチンの作製に関するものであった。さらに最近では、天然または公知の宿主域突然変異体において発見された弱毒ウイルスを模倣したヘルペスウイルス欠失突然変異体やポリオウイルスを作製する試みに組換えDNA技術が利用されるようになった。ごく最近に至るまで、マイナス鎖RNAウイルスはまったく部位特異的遺伝子操作になじまず、従ってその遺伝子工学的な操作は不可能であった。
【０００５】
2.2  インフルエンザウイルス
エンベロープをもち、マイナス極性ゲノムである1本鎖RNAを含むウイルスファミリーは非セグメント(分節)ゲノムをもつグループ(パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae))または、セグメントゲノムをもつグループ(オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)およびアレナウイルス科(Arenaviridae))に分類される。以下詳細に説明する本発明の実施例に使用されたオルトミクソウイルス科には、A型、B型およびC型のインフルエンザウイルスのみが含まれる。
【０００６】
インフルエンザウイルス粒子は1本鎖RNAゲノムを含む内部のリボ核タンパク質コア(らせん状のヌクレオキャプシド)、およびマトリックスタンパク質(M)によって内部が覆われた外側の核タンパク質エンベロープとからなる。インフルエンザAのセグメントゲノムは、10個のポリペプチドをコードする線状のマイナス極性1本鎖RNAの8分子(インフルエンザC型は7分子)からなり、該ポリペプチドには、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質(PB2、PB1およびPA)およびヌクレオキャプシドを形成する核タンパク質(NP)；マトリックスタンパク質(M1、M2)；リポタンパク質エンベロープから出る2個の表面糖タンパク質；赤血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)；ならびにその機能が知られていない非構造タンパク質(NS1およびNS2)が含まれる。ゲノムの転写および複製は、核内で起こり、形質膜での出芽を通してアセンブリーが生じる。ウイルスは混合感染中に遺伝子を再構成する(reassort)ことができる。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、HAを介して細胞膜糖タンパク質および糖脂質中のシアリルオリゴ糖に吸着する。ウイルス粒子のエンドサイトーシスに続いて、膜融合を助ける細胞エンドソーム内でHA分子のコンホメーション変化が生じて脱外皮を誘導する。ヌクレオキャプシドが核のほうへ移動すると、そこで感染に必須の最初の事象としてウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ユニークなメカニズムによって転写される。該メカニズムにおいては、エンドヌクレアーゼが細胞性異種mRNAから、キャップをもつ5'末端を切断すし、この5'末端がウイルス転写酵素によってウイルスRNAテンプレートを転写するためのプライマーとして働く。転写物はそのテンプレートの末端から15〜22塩基の部位で終了するが、そこではオリゴ(U)配列がポリ(A)鎖をテンプレート非依存的に付加するシグナルとして作用する。そうして作製された8個のウイルスmRNA分子のうち6個は、HA、NA、NPを表すタンパク質ならびにウイルスポリメラーゼタンパク質PB2、PB1およびPAへ直接翻訳されるモノシストロン性メッセージである。他の転写物2個はスプライシングを受け、それぞれ2個のmRNAとなるが、これは異なるリーディングフレームで翻訳されてM1、M2、NS1およびNS2を産生する。換言すれば、8個のウイルスmRNAが10個のタンパク質をコードするのであり、8個は構造タンパク質であり、2個は非構造タンパク質である。インフルエンザウイルスの遺伝子およびそのタンパク質産物を下記表Iにまとめて示す。
【０００８】
0004441595.tif 000002
【０００９】
インフルエンザA型のゲノムはマイナス極性をもつ1本鎖RNAのセグメント8個をもっており、これらは9個の構造タンパク質および1個の非構造タンパク質をコードする。非構造タンパク質NS1はインフルエンザウイルスに感染した細胞に豊富に見られるが、ウイルス粒子では検出されていない。NS1は感染初期の核およびウイルスサイクル後期の細胞原形質にも見出されるリンタンパク質である(King et al., 1975, Virology 64: 378)。NS遺伝子に損傷をもつ温度感受性(ts)インフルエンザ突然変異体の研究によれば、NS1タンパク質は、ウイルスが宿主細胞の遺伝子発現を阻害でき、かつウイルスタンパク質合成を促進できるメカニズムの転写レギュレーターであり転写後レギュレーターでもあることが示唆される。転写後プロセシングを制御するその他多くのタンパク質と同じように、NS1タンパク質は特定のRNA配列および構造と相互作用する。NS1タンパク質は、vRNA、ポリA、U6 SNRNA、ウイルスmRNAおよびds RNAについて5'未翻訳領域を含む、異なるRNA種に結合することが報告されている(Qiu et al., 1995, Rna 1: 304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68: 2425)。感染細胞におけるcDNAからのNS1タンパク質発現は、いくつかの効果、すなわち、mRNAの核-細胞質輸送の阻害、mRNAスプライシング前の阻害、宿主mRNAポリアデニル化の阻害およびウイルスmRNAの翻訳促進と関連している(Fortes, et al., 1994, Embo J. 13: 704, Enami, K. et al., 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu, Y. et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433)。
【００１０】
3.  発明の概要
本発明は、インターフェロンおよび関連する応答を誘導する、遺伝子工学的に作製された生存能のある弱毒ウイルスに関する。好ましい態様によれば、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを含む、遺伝子工学的に作製された生存能のある弱毒ウイルスに関する。本発明はまた、弱毒表現型およびインターフェロン誘導性表現型をもつよう遺伝子工学的に作製されたセグメントおよび非セグメントウイルスの両方に関する。上記の表現型は、細胞のインターフェロン応答を妨害するウイルス遺伝子産物を標的とすることにより達成される。本発明の弱毒ウイルスは、ウイルス遺伝子の転写および/または複製を制御するNS遺伝子セグメントの非コード領域をダウンレギュレートするように改変することによって、遺伝子工学的に作製することができる。非セグメントウイルスの場合、ウイルス遺伝子のダウンレギュレーションによって、複製中に作製された感染ウイルス粒子の数を減少させることができ、その結果ウイルスは弱毒化された特性を示す。第2の方法はNSコード領域の遺伝子工学的改変を含むため、発現されたウイルスタンパク質はアミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失または置換によって改変され、弱毒キメラウイルスが産生する。この方法は、多くの異なるウイルスに適用することができ、マイナス鎖RNAウイルスの遺伝子工学的作製に有利に用いられる。その際NS遺伝子産物は、インターフェロンが媒介するウイルスタンパク質の翻訳阻害を制御する役割を果たす。
【００１１】
本発明はさらに、ウイルス感染を阻害するワクチンおよび方法に関する。本発明の弱毒ウイルスはウイルス感染から保護するために使用することもできる。本明細書の実施例に提示の証拠に示すとおり、本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウイルスに感染する前に投与すると抗ウイルス活性を示し、従って本発明の弱毒ウイルスには予防的な効用がある。
【００１２】
本発明はまた、遺伝子操作されたインフルエンザウイルスを同定するための宿主制限に基づく選択系に関する。本発明の選択系は、より具体的には、改変されたNS遺伝子セグメントを含む遺伝子操作されたインフルエンザウイルスの同定に関する。
【００１３】
本発明の一部は、出願人の驚くべき発見に基づくものである。その発見とは、NS1遺伝子を欠失した遺伝子工学的に作製されたインフルエンザA型ウイルスが2型IFNを産生しない細胞系では増殖できるが、インフルエンザウイルスに対する2つの常用基質である、マディン-ダービー(Mardin-Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞および孵化鶏卵の尿膜では検知不可能であるというものである。出願人はまた、ヒト細胞が、野生型ウイルスではなく、NS1遺伝子を欠失する遺伝子工学的に作製されたインフルエンザA型ウイルスに感染すると、IFN誘導性プロモーターの制御下で高レベルの遺伝子発現が誘導されることも見出した。以上の結果は、従来NS1欠失表現型のウイルスをスクリーニングすることが不可能であった、NS1突然変異を含むインフルエンザウイルスの効率的な選択系を初めて可能にするものである。
【００１４】
本発明の弱毒ウイルスは、生存能のあるウイルスワクチン製剤化において安全に有利に使用することができる。本明細書において用いられる場合、「弱毒」ウイルスなる語は感染性ではあるが病原性ではないウイルス、あるいは、病原性であってもなくてもよいが各複製ラウンド中に欠陥粒子を産生するかまたは複製中に対応する野生型ウイルスよりも少ない子ウイルス粒子を産生する感染性ウイルスをいう。欠陥粒子または減少数の子ウイルス粒子を産生するよう遺伝子操作されている病原性ウイルスは、そのウイルスがたとえ病気を引き起こすことができても、ワクチン接種個体で得られるウイルス力価が無症状レベルの感染しか示さないいう意味において、「弱毒」性である。
【００１５】
4.  図面の簡単な説明
（下記参照）。
【００１６】
5.  発明の説明
本発明は、遺伝子工学によって作成された弱毒ウイルスおよびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有する弱毒生ウイルスの作成に関わる。組換えDNA技法を用いて、ウイルスゲノムの１または２以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を起すことが可能で、その結果、１または２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションを生じる。あるいはまた、組換えDNA技術を用いて以下のような突然変異を起すことができる。すなわち、この突然変異は、ウイルスゲノムのコード領域へのアミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失、または置換を含むが、それらに限定されない。結果として、作成されたウイルスは改変型またはキメラ型ウイルスタンパク質を発現する。
【００１７】
さらに、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスを同定するための新規選択法に関する。本発明の選択方法は、1つには、野生型インフルエンザウイルスの宿主制限、およびNS遺伝子セグメントに改変を有するインフルエンザウイルスがINF欠損細胞に感染し増殖する能力を有することに基づく。
【００１８】
本発明はまた、1つには、NS1遺伝子セグメントに欠失を有する遺伝子工学的に作成されたA型インフルエンザウイルスは、INFを生産できない細胞系においては増殖可能であるが、インフルエンザウイルスの二つの従来から一般的な宿主であるMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞および孵化鶏卵の尿膜においては検出できないという、本発明者らによる驚くべき発見に基づく。さらにNS1の欠失を含む遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、ヒト細胞においてIFN応答を誘発することが、本発明者らにより明らかになった。また、本発明者らは、NS1の欠失を含む遺伝子工学的に作成されたインフルエンザウイルスが、野生型マウスでは病原性を示さないが、INFのシグナル伝達が不十分な動物においては、複製して疾病を引き起こす能力を有することを見出した。
【００１９】
さらに本発明は、広範なウイルスおよび／または抗原（腫瘍特異抗原を含む）に対するワクチンとして、本発明の弱毒ウイルスを使用することに関する。免疫応答を受けるヒトまたは動物に弱毒生ウイルス製剤を導入するために、多数の方法を用いることができる。この方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。望ましい実施形態において、本発明の弱毒ウイルスは鼻腔内ワクチンとして送達されるように製剤化される。
【００２０】
5.1.  インターフェロン応答を誘導する弱毒ウイルス
本発明は、遺伝子工学によって作成された、特定の遺伝子に改変、突然変異、置換、または欠失を有する(-)鎖RNAウイルスに関するが、ここにおいて、上記の遺伝子産物は細胞のインターフェロン応答をウイルスが回避する原因となる。したがって、本発明は、セグメントに分かれている、あるいは分かれていないに関わらず、細胞のINF応答のダウンレギュレーションを引き起こす遺伝子に突然変異を有する、遺伝子工学によって作成されたRNAウイルスに関する。遺伝子工学によって作成された本発明の弱毒ウイルスは、野生型ウイルスが細胞のインターフェロンによる応答を阻害するのに対して、インターフェロンを誘発する表現型を示す。
【００２１】
望ましい態様において、本発明は、改変型NS遺伝子セグメントを有する弱毒インフルエンザウイルス、およびこのような改変型インフルエンザウイルスを同定する方法に関する。また、本発明は、1つには、NS1改変型ウイルスがベロ細胞のようなINF欠損細胞では増殖可能であるが、その複製能力はMDCK細胞および孵化鶏卵では甚だしく損なわれたという発見に基づくものである。このような増殖欠損の原因がNS遺伝子以外のRNAセグメントにおける変化にあるという可能性も考えられる。こうした可能性を除外するために、delNS1ウイルスの中に、遺伝子工学的に作成した野生型NS遺伝子をレスキューすることによってウイルスを「修復」した。こうして得られたトランスフェクタントウイルスはMDCK細胞および卵において、野生型並に増殖したので、このことから、NS1遺伝子の欠失がdelNS1ウイルスの表現形質を決定することが明らかになった。
【００２２】
NS改変型ウイルスは、INF発現が欠損したベロ細胞においては複製能を有するので、このことから組織培養や卵でNS改変型ウイルスの増殖が変化した原因がINFが媒介する作用であることは明らかである。以下の証拠がINFが媒介する作用の役割を支持する：(a)ウイルスタンパク質の発現レベルが、delNS1ウイルスに感染したベロ細胞およびINFαR-/-細胞では同様であるが、MDSK細胞では著しく減少する。INFαR-/-細胞およびベロ細胞はいずれも抗ウイルス性のINF応答の誘導が欠損していること、ただしこうした欠損の原因となる遺伝子の欠失は上記二つの細胞系で異なることを念頭に置く必要がある。(b)野生型ウイルスではなくてNS改変ウイルスによる感染が、293細胞においてINF刺激レポーター遺伝子のトランス活性化を誘導した。(c)最後に、delNS1ウイルスはINFシグナル伝達を欠損したマウス、すなわちSTAT1-/-動物において複製し疾病を引き起こすことができたが、野生型マウスにおいては病原性を示さなかった。
【００２３】
Ｉ型INFの重要性は、多くのウイルスが宿主によるINF応答をうち消すアンタゴニストを発現するという事実によって明示される。例としては、アデノウイルスのVA RNA、エプスタイン−バールウイルスがコードする構造低分子RNA、ワクシニアウイルスのK3LおよびB3L遺伝子産物、グループCロタウイルスのNSP3遺伝子産物、およびレオウイルスσ３タンパク質などがある。これらのウイルス産物のうちのいくつかが、A型インフルエンザウイルスのNS1タンパク質と同様に、二本鎖RNAに結合してPKR（二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ）の活性化を妨げることができることは興味深い。したがって、大半のウイルスがこれを回避するために複雑なメカニズムを発達させてきた反応である、INF媒介性応答を増強することによって、いずれかの抗ウイルス治療を補うために、本発明の弱毒ウイルスを利用することができる。
【００２４】
本発明の弱毒インフルエンザウイルスを用いて、ウイルス抗原および腫瘍抗原を包む異種配列を発現させることができる。したがって、さまざまな抗原エピトープ（すなわち、さまざまな病原体のいずれかに対する防御的免疫応答を誘導するエピトープ） を発現させるために、この弱毒ウイルスを利用することができ、または中和抗体に結合する抗原を、キメラ型ウイルスによって、あるいはその一部として発現させることができる。本発明の弱毒ウイルスは、それがINF媒介性応答を誘導し宿主に対して病原性を示さないとすると、抗原エピトープを導入するためのすぐれた担体である。
【００２５】
本発明に従って、A型インフルエンザウイルスのNS遺伝子の遺伝子操作を、新規抗原および／またはポリペプチドを発現するウイルスワクチンベクターの生産の助力とし得る。NS RNAセグメントは８つのウイルスRNAの中でもっとも短いので、NS RNAは他のウイルスRNAよりも長い異種配列の挿入に耐えられる。さらに、NS RNAセグメントは感染した細胞内で高レベルのタンパク質合成を指令するが、このことはそのセグメントが異種抗原の挿入のために理想的なセグメントであることを示唆する。しかしながら、本発明に従って、インフルエンザの８つのセグメントは、いずれも異種配列の挿入のために使用することができる。
【００２６】
当業者に公知の方法を用いて、たとえば3'-インフルエンザウイルス末端の相補的配列、または3'-および5'-インフルエンザウイルス末端の両方に相補的な配列等、ウイルスのポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補的配列に隣接する異種遺伝子コード配列を構築することができる。バクテリオファージT7, T3またはSp6ポリメラーゼ等のようなDNA依存性RNAポリメラーゼによって、上記のようなハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子をクローニングし、転写することができ、それによって、ウイルスポリメラーゼの識別および活性を可能にする適当なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型を作成することができる。
【００２７】
上記のようなハイブリッド分子を構築するための方法の一つは、インフルエンザウイルスゲノムセグメントの相補的DNAへの異種コード配列の挿入であり、それによって異種配列はウイルスポリメラーゼ活性のために必要とされるウイルス配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーター（以下の文ではウイルスポリメラーゼ結合部位と称する）、に隣接する。また別の方法では、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、たとえばウイルスゲノムセグメントの3'-または両末端の相補的配列を異種コード配列に結合して、ハイブリッド分子を構築することができる。異種遺伝子または異種遺伝子セグメントの標的配列内での配置は、その標的配列内の適当な制限酵素切断部位の存在によって予め指定された。しかしながら、分子生物学の最近の進歩によって、こうした問題は大幅に軽減されるようになった。部位特異的突然変異誘発を用いることによって、制限酵素切断部位は容易にどこにでも配置することができる（たとえば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82 ; 488 によって記載された方法を参照のこと）。以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の変法によって、配列（すなわち制限酵素切断部位）の特異的な挿入が可能となり、ハイブリッド分子を容易に構築することができる。また、クローニングの必要なしに組換え鋳型を調製するために、PCR反応を利用することができると考えられる。たとえば、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター（たとえば、バクテリオファージT3, T7またはSp6）を含有する二本鎖DNA分子、および異種遺伝子およびインフルエンザウイルスポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調製するために、PCR反応を利用することができると考えられる。さらに、RNA鋳型をこうした組換えDNAから直接転写することができる。さらに別の実施形態において、組換えRNA鋳型は、異種遺伝子およびウイルスポリメラーゼ結合部位の負の極性を条件として指定して、RNAリガーゼを用いてRNAを結合することによって調製することができる。ウイルスポリメラーゼ活性のために必要な配列の要件、および本発明に従って使用される構築物を以下の分節で説明する。
【００２８】
5.2.  弱毒ウイルスの生産
本発明は、遺伝子工学によって作成された弱毒ウイルス、およびその生産に関する。より詳細には、本発明は、結果としてINF非依存性およびINF誘導性表現型となるように改変された弱毒インフルエンザウイルスに関する。下記の節では、本発明に従って弱毒表現型を生産するために利用できる様々な方法を説明する。ウイルスゲノムの１または２以上の非コード領域内に部位特異的突然変異を遺伝子工学的に操作するために組換えDNA技法を利用することができ、その結果１または２以上のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションがおこる。また、アミノ酸残基またはエピトープの挿入、欠失、または置換を包含するがそれらに限定されない突然変異を、ウイルスゲノムのコード領域に作り出すために、組換えDNA技法を利用することができ、その結果、改変型またはキメラ型ウイルスタンパク質が遺伝子工学的に作成されたウイルスによって発現される。この発明は、ひとつには、セグメントウイルスにおけるウイルス遺伝子のダウンレギュレーションの結果として、複製を繰り返すごとに不完全な粒子が産生されることとなり、その結果ウイルスは弱まった特性を示すという発見に基づく。非セグメントウイルスでは、ウイルス遺伝子のダウンレギュレーションの結果、野生型ウイルスによって産生されるより数少ないウイルス粒子が産生される。上記のウイルスタンパク質変化は、詳細には理解されていない理由によって弱毒化をもたらす。
【００２９】
多くの方法を用いて、免疫応答を誘導するために弱毒生ウイルスをヒトまたは動物に導入することができる；このような方法は、経口、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻腔内の経路を包含するが、それらに限定されない。自然の感染経路でキメラ型ウイルスワクチンを導入することが望ましい。
【００３０】
本発明に従って、安全な生ウイルスワクチンとしての使用に適した弱毒株を作成するためにあらゆるウイルスを遺伝子工学的に作り出すことができる。ここにおいて、このウイルスは下記の表１に記載の科に属するウイルスを包含するが限定されない。
【００３１】
【表１】
0004441595.tif 000003
【００３２】
当業者に公知の組換えDNA技術を用いて、容易に、DNAウイルス（例としては、ワクシニア、アデノウイルス、バキュロウイルス）および(+)鎖RNAウイルス（例、ポリオウイルス）を遺伝子工学的に作成することができる（たとえば、米国特許第4,769,330号、Paoletti；米国特許第4,215,051号、Smith；Racanielloら、1981, Science 214: 916-919参照）。しかしながら、ウイルスRNAは感染性でないため、最近まで、(-)鎖RNAウイルス（例、インフルエンザ）に部位特異的遺伝子操作を行なうことは困難であった。ところが、「逆遺伝学(reverse genetics)」と称される最近の技術の進歩により、組換え(-)鎖RNAウイルスを遺伝子工学的に作成し生産することが可能となっている。
【００３３】
逆遺伝学技術とは、ウイルスポリメラーゼによるウイルスRNAの識別に必須であり、成熟ビリオンを生成するために必要なパッケージングシグナルに欠かせない、(-)鎖ウイルスの非コード領域を含有する、合成組換えウイルスRNAの調製を含むものである。組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、in vitroで精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いて再構成されて、細胞のトランスフェクションに利用できる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。合成RNAのin vitroでの転写に際してウイルスポリメラーゼタンパク質が存在するならば、より効率の良いトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPを感染性のウイルス粒子内にレスキューすることができる。上記の技法は1992年11月24日に交付された米国特許第5,166,057号、およびEnami & Palese, 1991, J. Virol. 65 : 2711-2713に記述され、これらはいずれも、その全体が引用によって本文に編入される。さらに、NS遺伝子の軸部分に挿入、欠失、および突然変異を有するA型インフルエンザウイルスは、変化して、宿主域突然変異体として作用する。
【００３４】
5.2.1.  ウイルス遺伝子のダウンレギュレーション
本発明によれば、ウイルスの非コード調節領域を改変して、細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子をダウンレギュレートする、例えば、そのmRNAの転写を低下および／またはvRNA（ウイルスRNA）の複製を低下させることにより、IFN誘導性表現型を有する弱毒ウイルスを生成することができる。
【００３５】
この手法は、あらゆるウイルスに適用可能であるが、特に、セグメントゲノムを有するウイルス、すなわち、ゲノムがビリオンにパッケージングされたセグメントに分かれているウイルスを作製するのに有利である。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス（オルトミクソウイルス）のセグメントゲノムは、10のポリペプチドをコードする線状(-)センスssRNAの８つの分子から構成されており、これらには、次のものが含まれる：ヌクレオキャプシドを形成する、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1およびPA）および核タンパク質（NP）；エンベロープから突出した２つの表面糖タンパク質、すなわち、赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）；ならびに、機能が未知の非構造タンパク質（NS1およびNS2）。各セグメントの末端は、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠であり、かつ成熟ウイルス粒子の生成に必要なシグナルをパッケージングするのに必須の非コード領域を含む。この末端の配列は、8つのすべてのセグメント間で高度に保存されている。別の例として、レオウイルスのセグメントゲノムは、６〜10の主構造ポリペプチド、転写酵素およびその他の酵素をコードする線状dsRNAの10〜12のセグメントから成る。
【００３６】
上記の手法は、非セグメントRNAウイルスにも同様に適用可能であり、この場合、細胞IFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子の転写をダウンレギュレートすることにより、そのmRNAおよびコードされた遺伝子産物の生成が低下し、その結果、インターフェロン誘導性表現型がもたらされる。
【００３７】
効率または強度を低下させる非コード調節領域のあらゆる改変を、本発明に従って実施することができる。例えば、ウイルスプロモーターの強度は、ステム構造の改変により低下させることができる。弱毒表現型を達成するためには、細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルス遺伝子のシスエレメントに突然変異を起こすことによって、該遺伝子の転写および複写に著しい作用を及ぼすことが可能である。
【００３８】
Ａ型インフルエンザウイルスが、どのようにして、その８つのRNAゲノムセグメントをパッケージングするかは、依然として、関心を集める疑問のままである。これまで、インフルエンザウイルスRNAのパッケージングについては、２つの異なる機構が提示されている。１つは、８つのRNAが選択的にパッケージングされるとするものであり、他方は、ウイルスRNAがランダムにパッケージングされるとするものである（Compansら、1970，In The Biology Of Large RNA Viruses、Barry & Marry、Eds.、 pp. 87-108、Academic Press、N.Y.；Lamb & Choppin、1983、Ann. Rev. Biochem. 467-506；Smith & Hay、1982、Virology 118： 96-108）．現在、ランダムパッケージング機構を支持する証拠が多く集まっている。ランダムパッケージング論は、インフルエンザウイルスの、物理的粒子に対する感染性粒子の比が低いという事実に由来するものである。１ビリオンにつき、平均11のRNAがパッケージングされるとすると、予想される比は、in vivoでみいだされたものと適合する（Enamiら、1991、Virology 185：291-298）。また、この仮説は、2つの異なるウイルスに由来する同じセグメントの２つのコピーを含む再構築ウイルスの知見によっても支持されている（Scholtissek、1978、Virology 89：506-516）。さらに、この理論は、感染性となるために、９つのRNAを必要とするＡ型インフルエンザウイルスを記載したさらに最近の報告（Enamiら、1991、Virology 185：291-298）からも支持されている。
【００３９】
要約すると、弱毒表現型は、NS遺伝子セグメントのシスエレメントを標的として、該遺伝子セグメントをダウンレギュレートさせることにより、達成することができる。このウイルスのタンパク質は、野生型ウイルスと比較して、変わっていないため、弱毒化は、非効率的なシス作用シグナルの結果であるに違いない。この弱毒化の原理は、セグメントゲノムを有する他のウイルスにも同様に適用することができる。例えば、ロタウイルス遺伝子もしくはその他のセグメントdsRNAウイルスの遺伝子(Ronerら, 1990, Virology 179: 845-852)の非コード配列に修飾を導入しても、これらウイルスの病原性を改変することができるだろう。
【００４０】
5.2.2.  ウイルスタンパク質の改変
弱毒ウイルスを作製する別の方法は、改変の導入を伴うが、かかる改変は、細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与する１つ以上のウイルスタンパク質への、１つ以上のアミノ酸残基および／またはエピトープの挿入、欠失もしくは置換を含むが、これらに限定されるわけではない。これは、対応するウイルス遺伝子配列への適切な改変を実施することにより容易に達成することができる。細胞のIFN媒介応答のダウンレギュレーションに関与するウイルスタンパク質の活性を改変することにより、ウイルスの複製を改変もしくは低下させるあらゆる変化は、本発明に従って達成することが可能である。
【００４１】
例えば、宿主細胞受容体へのウイルスの結合とそれに続く感染を妨害するが、完全に排除するわけではない改変を、プロセッシングに関与するウイルスの表面抗原またはウイルスプロテアアーゼに施し、弱毒株を生成することができる。この実施形態によれば、ウイルスの表面抗原を改変することにより、宿主細胞受容体に対するウイルス抗原の結合親和性を妨害する、もしくは低下させる１つ以上のアミノ酸またはエピトープの挿入、置換または欠失を含むようにすることができる。この手法は、弱毒化された特性も示す、外来エピトープを発現するキメラ型ウイルスを生成できるというもう１つの利点をもたらす。このようなウイルスは、組換え生ワクチンとして使用するための理想的な候補である。例えば、本発明のキメラ型ウイルスに作製することができる異種遺伝子配列は、限定するものではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）；ポリオウイルスのVP1；ならびに、細菌や寄生虫等の非ウイルス病原体の抗原決定基を含むが、ここに挙げた例はわずかにすぎない。
【００４２】
この点に関して、インフルエンザは、外来エピトープを作製する理想的な系である。というのは、キメラ型ウイルスを構築するための何千種ものインフルエンザウイルス変異体から選択できることが、ワクシニア等の他のウイルスベクターを使用した場合に発生する宿主耐性もしくは免疫寛容の問題を回避するからである。さらに、インフルエンザは、活発な分泌および細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激することから、インフルエンザバックグラウンドに外来エピトープを提示することにより、分泌免疫および細胞性免疫をもたらすことも可能である。例えば、インフルエンザのHAタンパク質に、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を施すことにより、弱毒株を生成することができる。この場合、HAのＢ領域またはＥ領域への改変を用いてもよい。この手法に従い、Plasmodium yoelii（NEDSYVPSAEQI）マラリアのエピトープ(ME１)をインフルエンザの赤血球凝集素の抗原部位Ｅに導入した。得られたキメラ型ウイルスは、マウスで検定した場合、野生型ウイルスより500〜1,000倍低いLD50（致死量50）を有する。別の実施形態では、1型ポリオウイルスの主抗原決定基、すなわち、1型ポリオウイルスのVP1のBCループ（PASTTNKDKL；配列番号５）をインフルエンザHAタンパク質のＢ領域に導入した。このキメラ型ウイルスも弱毒化されている。
【００４３】
別の実施形態では、ウイルスタンパク質のプロセッシングに必要なウイルスプロテアーゼの改変を施すことにより、弱毒化を行うことができる。酵素活性に作用し、プロセッシングにおけるこの酵素の効率を低下させる改変は、ウイルスの感染力、パッケージング、および／または放出に影響を及ぼして、弱毒ウイルスを生成することになる。例えば、インフルエンザのNSタンパク質に対する改変を施すことにより、NS酵素活性を低下させ、複製中に放出された子孫ウイルスの数および／または感染力を減少させることができる。
【００４４】
別の実施形態では、ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の転写に関与するウイルス酵素、例えば、ウイルスポリメラーゼ、レプリカーゼ、ヘリカーゼ等を改変して、該酵素の効率または活性を低下させることが可能である。このような酵素の活性の低下によって、子孫ゲノムおよび／またはウイルス転写産物が少なくなり、その結果、複製中に生成される感染性粒子の数が減少する。
【００４５】
上記ウイルス酵素のいずれかに施される改変には、分子の活性部位のアミノ酸配列の挿入、欠失および置換が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、酵素の結合部位を改変して、基質に対するその結合親和性を低下させることができる。その結果、上記酵素の特異性および／または効率が低下する。例えば、すべてのポリメラーゼタンパク質には、温度感受性の高い突然変異が存在することから、好適な標的は、ウイルスポリメラーゼ複合体である。従って、このような温度感受性に関連したアミノ酸位置に導入された改変をウイルスポリメラーゼ遺伝子に施し、弱毒株を生成することができる。
【００４６】
5.3.  宿主制限に基づく選択系
本発明は、遺伝子工学的に操作されたインフルエンザウイルスを同定するための宿主制限に基づく選択系に関する。さらに具体的には、本発明の選択系は、改変型NS遺伝子セグメントを含む遺伝子工学的に操作されたインフルエンザウイルスの同定に関する。本発明の選択系によって、遺伝子工学的に作製されたインフルエンザウイルスのスクリーニングから、改変型NS遺伝子セグメントを有するウイルスを同定することが可能となる。
【００４７】
本発明の選択系は、NS1遺伝子の欠失した、遺伝子工学的に作製されたＡ型インフルエンザウイルスが、IFN生産欠損細胞系において増殖できるのに、同じ細胞系が、野生型インフルエンザウイルスの感染および増殖を支持しないという本発明者らの発見に部分的に基づくものである。このNS1欠失ウイルスは、インフルエンザウイルス用の通常の培養基では、感染および増殖することができなかった。従って、本発明は、改変型NS1遺伝子を含む遺伝子工学的に作製されたインフルエンザウイルスを同定するための、非常に単純かつ容易なスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
5.4.  キメラ型ウイルスを用いたワクチン製剤
実質的にあらゆる異種遺伝子配列は、ワクチンに用いる本発明のキメラ型ウイルスへと構築することが可能である。好ましくは、多種の病原体、または、中和抗体と結合する抗原のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープを、キメラ型ウイルスによって、もしくはその一部として発現させることができる。例えば、ワクチンに用いる本発明のキメラ型ウイルスに構築することができる異種遺伝子配列としては、限定するものではないが、gp120等のヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）;ポリオウイルスのVP1；細菌および寄生虫等の非ウイルス病原体の抗原決定基などが含まれるが、ここに挙げた例はわずかにすぎない。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全部または一部を発現させることができる。例えば、このようなエピトープを擬態する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のキメラ型ウイルスに構築することができる。
【００４９】
組換えウイルス生ワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンのいずれを製剤化することもできる。宿主内での増殖は、自然感染で発生するものと同様の種類および大きさの刺激を持続させ、従って、実質的な長期持続性免疫を賦与することから、生ワクチンが好ましいと思われる。このような組換えウイルス生ワクチン製剤の調製は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿嚢でのウイルスの増殖と、それに続く精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
【００５０】
これに関して、ワクチンを目的として、遺伝子工学的に作製されたインフルエンザウイルス（ベクター）を使用するためには、これらの株が、弱毒性を有する必要があると考えられる。ヒトに使用するためのこのウイルス生ワクチン候補は、低温適応性であるか、温度感受性であるか、あるいは、トリウイルス由来の数個（６）の遺伝子を誘導するように継代される（passaged）かのいずれかであり、これにより、弱毒化がもたらされる。適切な突然変異（例えば、欠失）を、トランスフェクションに使用する鋳型に導入することにより、弱毒性を有する新規のウイルスを作製することができる。例えば、温度感受性または低温適応と関連する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異に起こすことができる。これらの突然変異は、低温または温度感受性突然変異体に関連した点突然変異よりも安定しており、復帰頻度は極めて低い。
【００５１】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラ型ウイルスを構築することもできる。このようなウイルスは、宿主中で、１ラウンドのみ、もしくは２、３ラウンドの複製しか経ない。例えば、複製を再開するためには、HAの切断が必要である。従って、HA切断部位の改変によって、ヒト宿主ではなく、適切な細胞系で複製するウイルスが生成されると考えられる。ワクチンとして用いた場合には、組換えウイルスは、1回の複製サイクルを経て、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主ではそれ以上進展しないため、疾病を引き起こさない。1つ以上の必須インフルエンザウイルス遺伝子を欠失する組換えウイルスは、次に続くラウンドの複製を経ることができない。このような欠陥ウイルスは、特定の遺伝子を欠失した再構築RNPを、該遺伝子を永久的に発現する細胞系に共トランスフェクションすることにより、生成することができる。必須遺伝子を欠失したウイルスは、これらの細胞系で複製されるが、ヒト宿主に投与する場合には、1ラウンドの複製を完了することができない。このような調製物は、−上記の不稔サイクルにおいて−免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳する。あるいは、さらに多量の菌株を投与して、これらの調製物が不活性化（死滅）ウイルスワクチンとして役立つようにすることも可能である。不活性化ワクチンについては、異種遺伝子産物をウイルス成分として発現させ、該遺伝子産物がビリオンに随伴するようにするのが好ましい。このような調製物の利点は、これらが、天然のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの製造に用いられるホルマリンもしくはその他の薬剤での処理による不活性化を被らないことである。
【００５２】
本発明のこの側面に関する別の実施形態では、キメラ型ウイルスを「死滅させる」従来の方法を用いて、不活性化ワクチン製剤を調製することができる。不活性化ワクチンは、それらの感染力が破壊されているという意味で、「死んで」いる。理想的には、ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響を及ぼすことなく、破壊されている。不活性化ワクチンを調製するためには、キメラ型ウイルスを細胞培養物もしくはニワトリ胚の尿嚢中で増殖させ、ゾーン超遠心分離により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンで不活性化した後、プールする。こうして得られたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
【００５３】
不活性化ウイルスは、免疫応答を増強するのに適したアジュバントを用いて製剤化することができる。このようなアジュバントとしては、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン等の界面活性物質；ペプチド；油性エマルション；ならびにBCGやCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
多くの方法を用いて、上に記載したワクチン製剤を導入することができる。これらの方法には、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、ならびに鼻腔内経路が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ワクチンを設計しようとする病原体の自然感染経路を介して、キメラ型ウイルスワクチン製剤を導入するのが望ましい。キメラ型ウイルス生ワクチン製剤を使用する場合には、インフルエンザウイルス感染の自然経路を介して、該製剤を導入するのが好ましい。インフルエンザウイルスが活発な分泌および細胞性免疫応答を誘導する能力を有利に利用することができる。例えば、キメラ型インフルエンザウイルスによる気道の感染は、例えば、泌尿生殖器系において強い分泌免疫応答を誘導するが、これには特定の病原体に対する防御が付随する。
【００５５】
６．材料および方法
以下の第７節から第11節では、下記の材料および方法を使用した。
【００５６】
ウイルスおよび細胞：  インフルエンザA/PR/8/34（PR8）ウイルスを10日齢の孵化鶏卵中に37℃で増殖させた。低温適応型株Ａ/Leningrad/134/47/57由来のNSセグメントと、PR8ウイルス由来の残りの遺伝子を含む再構築ウイルスである、Ａ型インフルエンザウイルス25A-1（Egorovら、1994、Vopr. Virusol. 39：201-205；Shawら、1996、in Options for the control of IFNluenza III, eds. Brown, Hampson Webster（Elsevier Science）pp.433-436）を、ベロ細胞中に34℃で増殖させる。この25A-1ウイルスは、哺乳動物細胞において温度感受性（ts）であり、delNS1トランスフェクタントウイルスのレスキュー（rescue）用のヘルパーウイルスとして使用した。１μg／mlのトリプシン（Difco Laboratories、Detroit、Michigan）を含む最少必須培地（MEM）中のベロ細胞およびMDCK細胞をインフルエンザウイルスの増殖のために用いた。ベロ細胞はまた、delNS1ウイルスの選択、プラーク精製および力価測定にも用いた。MDCK細胞、293細胞、ならびに、IFNαR-/-マウスの14〜16日齢の胚に由来するマウス胚繊維芽細胞（MEF）を、10％熱不活性化ウシ胎児血清を含むDMEM（ダルベッコの最少必須培地）に維持した。不死化したIFNαR-/-繊維芽細胞は、連続継代により、MEFから誘導したものである（Todaroら、1963、J. Cell. Biol. 17；299-313）。ベロ細胞をAIM-V培地中で増殖させた（Life Technologies, Grand Island, NY）。
【００５７】
マウス：  以前に記載されたもの（Durbinら、1996、Cell 84：443-450）と同様に、STAT1の標的欠失についてホモ接合のC57BL/6マウスを作製した。IFNαR-/-マウスもすでに記載されている（Hwangら、1995、Proc. Natl. Aced. Sci. USA 92：11284-11288）。特定の病原体のないC57BL/6およびBALB/c（野生型）マウスをTaconic Farmsから購入した。
【００５８】
動物の感染：  生後６〜12週間の雌のマウスをインフルエンザウイルスの感染に用いた。delNS1ウイルスの５ｘ104プラーク形成単位（pfu）を含む50μlのMEMを用いて、エーテル麻酔下の野生型マウスとSTAT1-/-マウスに、鼻腔内（i.n.）接種を実施した。動物を毎日監視し、極端な状態（extremis）を観測した場合には、処分した。すべての手順は、実験動物の保護および使用に関するNIH指針に従った。
【００５９】
プラスミド：  pT3delNS1を次のように作製した。まず、プライマー5'-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTG-3'（配列番号１）および5'-GACATACTGCTGAGGATGTC-3' （配列番号２）（CODON Genetic Systems、 Weiden,、Austria）を用いる逆PCR（Ochmanら、1988、Genetics 120：621-623）で、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびBpuAI制限部位が両端に隣接するPR8ウイルスの完全NS遺伝子を含むpPUC19-T3/NS PRR8を増幅した。このようにして得られたNS1遺伝子を欠失したcDNAをリン酸化し、クレノウ処理し、自己連結した後、大腸菌株TG1中で増殖させた。精製後得られた構築物をpT3de1NS1と名づけ、配列決定により確認した。PR8ウイルスのNP、PB1、PB2、およびPAタンパク質の発現用のプラスミド（pHMG- NP、pHMG- PB1、pHMG- PB2、およびpHMG- PA）については、すでに記載されている（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）。インフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイルスのNS遺伝子のコード領域に由来するRT-PCR産物内の、pPOLI-CAT-RT（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）のCATオープンリーディングフレームを置換することにより、pPOLI-NS-RBを調製した。このプラスミドは、切断型ヒトポリメラーゼＩプロモーターの制御下でWSNウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントを発現する。pHISG54-1-CAT（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220：395-402）は、ISG-54K遺伝子のIFNα刺激プロモーターの転写制御下で、CATレポーター遺伝子をコードする。
【００６０】
トランスフェクタントウイルスの作製：  delNS1ウイルスの作製は、リボ核タンパク質（RNP）トランスフェクションにより実施した（Luytijesら、1989、Cell 59：1107-1113）。RPNは、インフルエンザ25A-1ウイルスの精製された核タンパク質およびポリメラーゼの存在下で、BpuAIで線状化されたpT3delNS1からのT3RNAポリメラーゼ転写により形成される（Enamiら、1991、J. Virol 65：2711-2713）。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスを感染させたベロ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で18時間インキュベートし、次に、上清をベロ細胞中で40℃で2回継代させた後、寒天オーバーレイ培地で被覆したベロ細胞において37℃で3回プラーク精製した．単離したdelNS1ウイルスをRT-PCRによって分析した。尚、このRT-PCRは、プライマー：5'-GGCCTCTAGATAATACGACTC−ACTATAAGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3'（NS遺伝子の3'非コード末端での位置１〜21に相補的；配列番号３）および5'-GATCGCCTTCTATTAGTAGAAA-CAAGGGTGTTTTTATTAAATAAGCTG-3'（ NS遺伝子の５'非コード末端の最後の38ヌクレオチドを含む；配列番号４）を用いている。NS/WSNトランスフェクタントウイルスを次のように作製した。35mm皿中のベロ細胞を、以前の記載（Pleschkaら、1996、J. Virol.. 70：4188-4192）と同様に、プラスミド：pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PAおよびpPOLI-NS-RBでトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、細胞に５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを感染させ、37℃でさらに2日間インキュベートした。細胞の上清をMDCK細胞中で1回、さらに、孵化鶏卵中で2回継代させた。トランスフェクタントウイルスを卵の希釈を制限することによりクローン化した。精製されたNS/WSNトランスフェクタントウイルスからのゲノムRNAを、以前の記載（Zhengら、1996、Virology 217：242-251）と同様に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００６１】
感染細胞におけるウイルスタンパク質合成の分析：  35mm皿中の細胞単層に、２ｘ104pfuのdellNS1ウイルスを感染させた。感染後に時間をおいて、表示した時間について、L-[35S]システインおよびL-[35S]メチオニンで、細胞を標識した。標識した細胞を、150mM NaCl、５mM EDTA、１mM PMSF、10％グリセロール、１％トリトンX-100、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する10mM トリスHCｌ（ｐH 7.4）中で溶解させた。ウサギのポリクロナール抗インフルエンザウイルス血清を用いて、タンパク質を免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を、SDS-10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析した。
【００６２】
CATトランスフェクション：  35-mm皿中の293細胞単層を、DOTAPリポフェクション試薬（Boehringer Mannheim）を用いて、製造者の指示に従って、１μgのpHISG54-1-CATでトランスフェクションした後、37℃でインキュベートした。トランスフェクションから1日後の細胞に、指示された感染多重度（MOI）で、delNS1ウイルスまたはPR8ウイルスを感染させた。対照として、細胞を擬似感染させるか、あるいは、50μgのポリ（I-C）でトランスフェクションさせた。37℃でさらに1日放置した後、細胞抽出物を調製し、記載されている（Percyら、1994、J. Virol. 68：4486-4492）ように、CAT活性について検定した。
【００６３】
７．実施例：NS1遺伝子を欠失したトランスフェクタントインフルエンザウイルスdelNS1の作製
Ａ型インフルエンザウイルスのNS特異的ウイルスRNAセグメントは、NS1およびNEP（核輸出タンパク質）タンパク質の両方をコードする。スプライシングされていないNS特異的mRNAは、NS1タンパク質に翻訳されるが、スプライシングされたRNAはNEPの合成を命令する。インフルエンザPR8ウイルスからの突然変異NS遺伝子を発現するプラスミドpT3delNS1を構築した。この突然変異RNAセグメントは、NS1特異的オープンリーディングフレーム（PR8 NS遺伝子のヌクレオチド位置57〜528（Baezら、1980、Nucleic Acids Res. 8：5845-5858））の欠失を含み、従って、これは、NEPだけをコードする（図1）。ts 25A-1ヘルパーウイルスを用いたdelNS1遺伝子のRNPトランスフェクションによって、子孫ウイルスが得られたが、この子孫ウイルスは、ベロ細胞において40℃で増殖することができた。レスキューされたウイルスのNS遺伝子のRT-PCRによる増幅で、上記ヘルパーウイルスのNS遺伝子の、トランスフェクションされたdelNS1遺伝子に由来するNS遺伝子による置換を確認した（図２）。
【００６４】
８．実施例：組織培養および卵におけるdelNS1ウイルスの増殖特性
delNS1ウイルスおよび野生型PR8ウイルスの増殖特性を、ベロ細胞、MDCK細胞、ならびに10日齢の孵化鶏卵において比較した。約106個のベロ細胞またはMDCK細胞を含む細胞単層に、約0.0005のMOIで、delNS1ウイルスまたはPR8ウイルスを感染させた。１μg／mlのトリプシンを含むMEMを用いて、37℃で4日間インキュベートした後、上清を赤血球凝集反応アッセイに使用した。これ以外に、10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に、104pfuのdelNS1またはPR8ウイルスを注入し、37℃で3日間インキュベートした後、尿膜腔液中の赤血球凝集反応力価を測定した。表２に示すように、野生型PR8ウイルスの128の力価と比較して、delNS1ウイルスは、16の力価までベロ細胞中で増殖することができた。しかし、delNS1ウイルス複製は、MDCK細胞および鶏卵では甚だしく損なわれた（これらのサンプルでは、赤血球凝集反応力価は測定不可能であった）。
【００６５】
表２
0004441595.tif 000004
1：力価は、赤血球凝集反応活性を有する最大希釈度を示す。
【００６６】
2：野生型Ａ型インフルエンザ/PR/8/34ウイルス
【００６７】
8.1.  delNS1の増殖特性は、NS1遺伝子の欠失に依る
MDCK細胞および鶏卵におけるdelNS1ウイルスのウイルス増殖欠損が、NS1遺伝子の欠失によるものであって、delNS1およびPR8ウイルスの他のRNAセグメントに存在し得る相違によるものではないことを証明するために、野生型NS遺伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしてdelNS1ウイルスを用いた。トランスフェクションは、インフルエンザA/WSN/34ウイルスの野生型NS遺伝子用の、プラスミドに基づく発現系を用いる「材料および方法」（Pleschkaら、1996、J. Virol. 70：4188-4192）に記載されている通りに実施した。トランスフェクタントNS/WSNウイルスの選択は、MDCK細胞および鶏卵中における連続的継代により実施した。NS/WSNウイルス由来の精製ウイルスRNAのSDS-PAGE分析により、そのNS RNAセグメントの野生型の長さを確認した。WSNウイルス由来のNS RNAセグメントと、delNS1（PR8）ウイルス由来の残存セグメントを含むトランスフェクタントNS/WSNウイルスは、MDCK細胞および10日齢の孵化鶏卵中の野生型PR8ウイルスと同じ力価まで増殖することができた。
【００６８】
8.2.  delNS1ウイルス感染MDCKおよびベロ細胞におけるウイルスタンパク質発現レベル
delNS1ウイルス複製MDCK細胞の欠損が、ウイルスタンパク質の発現レベルの減少と相関するかどうかを調べるために、［35S］標識実験を実施した。MDCKまたはベロ細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、表示された時間について、L-［35S］システインおよびL-［35S］メチオニンで標識した。標識の後、ウイルスタンパク質を細胞抽出物から免疫沈降させ、PAGEにより分離した（図3）。35Sシグナルの数量化から、感染したMDCK細胞によって、約20倍少ないウイルスタンパク質が合成されたことがわかった。
【００６９】
8.3.  delNS1ウイルス感染ベロ細胞およびIFNαR-/-細胞は、ウイルスタンパク質の発現レベルが類似している
delNS1ウイルス複製およびウイルスタンパク質発現の支持に関する、ベロ細胞およびMDCK細胞間の相違の理由は、ベロ細胞にIFNを合成する能力がないことに関すると思われる（Desmyterら、1968、J. Virol. 2：955-961；Moscaら、1986、Mol. Cell. Biol. 6：2279-2283；Diazら、1988、Proc. NeH、Acad. Sci. USA 85：52595263）。この仮説を試験するために、IFNに応答することができないマウス細胞株で、ウイルスタンパク質発現のパターンを調べた。IFNαRノックアウト細胞に、MOI：0.02でdelNS1ウイルスを感染させ、前述と同様に標識した。対照として、delNS1ウイルス感染ベロ細胞を、感染後８〜10時間後に、同時に標識した。ウイルスタンパク質の発現レベルは、両細胞株で類似しており（図4）、delNS1ウイルスが、IFN欠損系において複製できることを示していた。ここで、IFNαR -/-細胞におけるdelNS1ウイルスの多サイクル複製の調査ができなかったことに留意されたい。これは、これらの細胞が、ウイルスの赤血球凝集素活性化およびウイルス感染力に必要なトリプシンの存在下ですぐに死んでしまうためである。
【００７０】
９．実施例：デルタNS1ウイルスは、インターフェロン応答の潜在的誘導物質である
トランスフェクタントdelNS1ウイルスの感染による、IFN調節プロモーターからの転写の刺激。delNS1ウイルスにおけるNS1遺伝子の欠失により、感染細胞に増強されたIFN応答が起こるかどうかを調べるために、pHISG54-1-CATを用いて、トランスフェクション実験を実施した。このプラスミドは、ISG-54K遺伝子のIFNα刺激プロモーターの前端にCATレポーター遺伝子を含む（Bluyssenら、1994、Eur. J. Biochem. 220：395-402）。293細胞をpHISG54-1-CATでトランスフェクションし、「材料および方法」で記載したように、表示したMOIで、delNS1ウイルスまたは野生型PR8を感染させた。感染細胞抽出物のCAT活性を、感染していない細胞の抽出物のそれと比較した。陽性対照として、IFN調節プロモーターからの転写を、ポリ（I-C）で刺激した。図5に示すように、野生型ウイルスではなく、delNS1ウイルスによるMOI：0.05の感染は、約6倍のレポーター遺伝子発現の刺激を誘導した。従って、NS1遺伝子を欠失したトランスフェクタントウイルスは、293感染細胞におけるIFN応答を阻害する能力が欠損していた。
【００７１】
10．実施例：デルタNS1ウイルスの病原性
トランスフェクタントdelNS1ウイルスは、STAT1-/-マウスにおいて病原性である。delNS1ウイルスの、野生型マウスおよびIFN応答が欠失したマウスにおいて、複製して疾病を誘発する能力を調べた。この目的のために、５ｘ104pfuのdelNS1ウイルスを用いて、3匹のC57BL/6変異マウスに鼻腔内(i.n.)感染させた。これらのマウスは、IFNシグナル化に必要なトランスアクチベーターであるSTAT1の標的欠失について、ホモ接合である（Durbinら、1996、Cell 84：443-450；Merezら、1996、Cell 84：431-442）。また、３〜4匹の野生型C57BL/6およびBALB/cマウスにもdelNS1ウイルスを接種した。感染した-STAT-/-マウスは、感染から３日後にはぐったりとしてきた。感染から7日までには、3匹の感染した-STAT-/-マウスすべてが死んだ（表３）。delNS1ウイルスを、瀕死の-STAT-/-マウスの肺から回収したが、これは、このウイルスが、これらの動物において複製していたことを示している。しかし、野生型の感染マウスは、delNS1ウイルスの感染にもかかわらず、何の疾病症状を現すこともなく、すべて生存した（表３）。
【００７２】
表３
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1：エーテル麻酔下のマウスに、５ｘ104pfu のdelNS1ウイルスを鼻腔内接種した。
【００７３】
11．実施例：delNS1ウイルスの前接種はインフルエンザの複製を阻害する
delNS1ウイルスの前接種が、野生型インフルエンザの感染もしくは複製に抑制効果を及ぼすかどうかを調べるために、次の実験を実施した。
【００７４】
この実験では、10日齢の孵化鶏卵に、20,000 pfu のdelNS1ウイルスを接種するか、あるいは、尿膜腔にPBSを接種した。37℃での8時間のインキュベーション後、さらに、これら鶏卵に、103pfuのH1N1Ａ型インフルエンザ/WSN/33（WSN）；H1N1Ａ型インフルエンザ/PR/8ウイルス（PR8）、H3N2Ａ型インフルエンザ/X-31ウイルス（X-31）、Ｂ型インフルエンザ/Lee/40ウイルス（B-Lee）またはSendaiウイルスを感染させた後、37℃で40時間さらにインキュベートした。ただし、B-Lee感染細胞は、35℃でインキュベートした。図６に示すように、delNS1ウイルスで処理した鶏卵のウイルス感染は、非処理の細胞と比較して、検出不可能なレベルとなっている。従って、delNS1ウイルスの抗ウイルス活性、ならびに、抗ウイルス治療薬および予防薬としてのその可能性が示されている。
【００７５】
本発明は、本発明の個々の態様を説明するためだけに記載した具体的実施形態によってその範囲が限定されることはなく、また、機能的に同等のあらゆる構築物またはウイルスが、本発明の範囲に含まれる。実際、ここに示し、説明したもの以外にも、本発明の多様な変更が、以上の説明および添付の図面から、当業者には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の請求の範囲に含まれるものとする。
【００７６】
ここに、様々な参照文献を引用したが、その開示内容の全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、(A)野生型インフルエンザA/PR/9/34ウイルス(WT NS)および(B)トランスフェクタントdelNS1インフルエンザウイルスのNS遺伝子とNS特異的mRNAの概略図である。ゲノムRNAセグメントは黒い四角でふちどった白いボックスとして表す。後方の四角部分は遺伝子の非コード領域を示す。NS特異的mRNAも示す。mRNA末端の細い線は非翻訳領域を示す。mRNAの5'キャップ構造(黒丸)およびポリ(A)テールが示されている。NS1タンパク質のオープンリーディングフレームは灰色のボックスとして示す。特異的NEP (核輸出タンパク質;Nuclear Export Protein)オープンリーディングフレームは斜線つきボックスで示す。野生型NS遺伝子に由来するNEP mRNAは、V型ラインで示すように、NS1 mRNAのスプライシング産物である。
【図２】  図2は、delNS1トランスフェクタントウイルスのNS RNAセグメントのRT-PCR分析を示す。精製インフルエンザA/PR/8/33ウイルス(wt)またはdelNS1ウイルス(delNS1)由来のNSウイルスRNAを、第6節に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写-PCRの組み合わせにより増幅した。PCR産物を2%アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウムにより染色した。サイズマーカーの位置を右側に示す。
【図３】  図3は、delNS1ウイルスに感染した(A)ベロ細胞および(B)MDCK細胞のタンパク質発現を示す。細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において[32S]標識を行い、ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイルスに対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物はSDS-PAGEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(HA)、核タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M1)を矢印で示す。分子サイズマーカーは左側に示す。
【図４】  図4は、delNS1ウイルス感染IFNαR-/-細胞におけるタンパク質発現を示す。細胞は細胞をMOI 0.02でdelNS1ウイルスに感染させ、指示時点において[32S]標識を行った。対照として、感染の8〜10時間後の同じ実験においてdelNS1ウイルス感染ベロ細胞を標識した。ウイルスタンパク質の全体量を、インフルエンザウイルスに対するポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物はSDS-PAGEにより分析した。主な構造ウイルスタンパク質である、赤血球凝集素(HA)、核タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)およびマトリックスタンパク質(M1)を矢印で示す。分子サイズマーカーは左側に示した。
【図５】  図5は、delNS1ウイルス感染によるIFN刺激プロモーターからの転写誘導を示す。I型IFN刺激プロモーターの制御下、レポーター遺伝子CATをコードするプラスミドpHISGS4-1-CATで239細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、細胞をdsRNA 50μgでトランスフェクトするか、または指定の各MOIでdelNS1ウイルスかもしくは野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルス(wt)に感染させた。感染後1日たってから細胞抽出液でCAT活性を測定した。異なる処理後のCAT活性刺激を示す。
【図６】  図6は、delNS1ウイルスによる孵化卵での抗ウイルス応答の誘導を示す。10日齢の孵化鶏卵に、20,000プラーク形成単位のdelNS1ウイルスまたはPBS(未処置)を接種した。37℃で8時間インキュベートした後、該鶏卵に再びH1N1インフルエンザA/WSN/33ウイルス(WSN)、H1N1インフルエンザA/PR/8ウイルス(PR8)、H3N2インフルエンザA/X-31ウイルス(X-31)、インフルエンザB/Lee/40ウイルス(B-Lee)またはセンダイウイルス(Sendai)を103 pfu感染させた。B-Lee感染卵は35℃でさらに40時間インキュベートした。他の卵はすべて37℃でさらに40時間インキュベートした。血球凝集反応アッセイにより尿液に存在するウイルスを滴定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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