(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性成分をミルク試料から分離する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）  ミルク試料を、残留物（以下「保持物」という。）と外因性成分を含む透過物とをそれぞれ形成するのに十分な多孔度の膜を横切る接線流濾過にかけ；
ｂ）  この透過物を捕獲用デバイスにかけて、実質的にその外因性成分を取り出し；
ｃ）  ステップｂ）におけるこの捕獲用デバイスからの流出物を保持物と合わせ；そして
ｄ）  ステップａ）からｃ）を、外因性成分が実質的に回収されるまで繰り返す、但し、外因性成分の回収率は７５％〜９０％である。
【請求項２】
ミルク試料を、ミルクの凝集を減じて、濾過膜の通過を改善するのに十分な量のキレート化剤と合わせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外因性成分がペプチド又は蛋白質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
蛋白質を、糖蛋白質、免疫グロブリン、ペプチド、ホルモン、酵素、血清蛋白質、乳蛋白質、細胞性蛋白質、可溶性レセプター及び産業用酵素よりなる群から選択する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
蛋白質を、エリスロポエチン、アルファ−１プロテイナーゼインヒビター、アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗トロンビンIII、キチナーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、因子VIII、因子IX、因子Ｘ、フィブリノーゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクタルブミン、プロインシュリン、可溶性ＣＤ４、可溶性ＣＤ４の成分及び複合体、組織プラスミノーゲンアクチベーター並びにこれらの変化物よりなる群から選択する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
接線流濾過に使用されるフィルターが、実質的にすべての脂肪、カゼインミセル、体細胞及び粒状物を保持物中に保持するのに十分な多孔度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
接線流濾過に使用されるフィルターが０．１〜１，０００ナノメートルの範囲の細孔寸法を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ミルク試料中に存在する細菌、マイコプラズマ、ウイルス、プリオン粒子及び他の汚染微生物が実質的に除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
キレート化剤を、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びシトレートよりなる群から選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
キレート化剤を、１〜５００ミリモルの終濃度範囲で加える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
キレート化剤がＥＤＴＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＤＴＡを、２０〜５０ミリモルの終濃度で加える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
捕獲用デバイスがクロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィー捕獲用デバイスがアフィニティークロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アフィニティークロマトグラフィー捕獲用デバイスを、ヘパリンカラム、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムよりなる群から選択する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフィー捕獲用デバイスが、イオン交換クロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ミルク試料を、トランスジェニック哺乳動物及びトランソミック哺乳動物よりなる群から選択する泌乳性非ヒト哺乳動物から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ミルク試料を、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット又はヒツジから得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
外因性成分を、閉ループ式連続抽出システムにおいてミルク試料から分離する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）  ミルク試料を、保持物と外因性成分を含む透過物とを形成するのに十分な多孔度の膜を横切る接線流濾過にかけ；
ｂ）  この透過物をクロマトグラフィー捕獲用デバイスにかけて、実質的に、外因性成分を取り出し；
ｃ）  ステップｂ）における捕獲手順からの流出液を保持物と合わせ；
そして
ｄ）  ステップａ）からｃ）を、外因性成分の回収率が７５％〜９０％となるまで繰り返す。
【請求項２０】
クロマトグラフィー捕獲用デバイスがアフィニティークロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー捕獲用デバイスがイオン交換クロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
この発明は、一般に、関心ある成分をミルクから精製する改良された方法に関係する。特に、それは、接線流濾過の利用により（好ましくは閉じたループの連続抽出システムにより）、脂肪、脂質又は粒状物質を除去する前処理なしで、生の全乳からペプチドを得る方法を提供する。
家畜のミルクは、多年にわたって、食品及び医薬産業のための蛋白質その他の産物の源として用いられてきており、これらの産物を単離するための様々な技術が知られている。ミルクは、主として水中の脂肪、ラクトース及び蛋白質よりなるコロイド状懸濁液である。反芻動物及び実験室用動物では、ミルクは、種に依って、１リットル当り平均３０〜１４０グラムの即ち約４〜１７重量％の蛋白質を含む。これらの蛋白質の大部分は、ミセルとして知られる超分子構造にてカルシウム及びホスフェートと複合体化しているカゼインである。乳蛋白質の他の主要なクラスは、主としてベータ−ラクトグロブリン及びアルファ−ラクトグロブリンよりなり、ラクトフェリン、免疫グロブリン及び血清アルブミンをも含むホエー蛋白質である。
乳蛋白質は、通常、組み合わされた工程により単離される。生乳は、先ず、脂肪を除去するために、例えば、スキミング、遠心分離、沈降（H.E.Swaisgood,Developments in Dairy Chemistry,I:Chemistry of Milk Protein,Applied Science Publishers,ニューヨーク、1982）、酸沈殿（米国特許第４，６４４，０５６）又はレンニン若しくはキモトリプシンを用いる酵素的凝固（Swaisgood,前出）により分画される。次に、主要な乳蛋白質を、澄んだ溶液又は大部分の沈殿に分画することができ、この沈殿から関心ある特定の蛋白質を容易に精製することができる。
乳蛋白質の単離における最近の改良でさえも、脂肪及び脂質を除去するための第１の工程及び、その後、濾過をして近いサイズの関心ある蛋白質の成分を回収することを必要とする。例えば、フランス国特許第２４８７６４２号は、排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーと組合せた膜限外濾過によるスキムミルク又はホエーからの乳蛋白質の単離を記載している。ホエーは、先ず、レンニン又は乳酸を用いる凝固によりカゼインを除去することにより生成される。米国特許第４，４８５，０４０号は、２つの逐次的限外濾過ステップによるホエーからのアルファ−ラクトグロブリン富化生成物（保持物中）の単離を記載している。米国特許第４，６４４，０５６号は、ｐＨ４．０〜５．５での酸沈殿、及び逐次的クロスフロー濾過（先ず、０．１〜１．２マイクロメートルの細孔寸法を有する膜にて生成物プールを清澄化し、次いで、それを５〜８０ｋｄの分離限界の膜にて濃縮する）によりミルク又は初乳から免疫グロブリンを精製する方法を提供している。
同様に、米国特許第４，８９７，４６５号は、ｐＨシフトを有する金属酸化物膜上での逐次的限外濾過による、血清、卵黄又はホエーからの蛋白質例えば免疫グロブリンの濃縮及び富化を教示している。濾過を、先ず、選択した蛋白質の等電点（ｐＩ）より低いｐＨで行なって蛋白質保持物から多量の夾雑物を除去し、次に、選択した蛋白質のｐＩより高いｐＨで行なって不純物を保持し且つ選択した蛋白質を透過物へ通過させる。異なる濾過濃縮方法が、欧州特許ＥＰ４６７４８２Ｂ１号により教示されており、そこでは、脱脂したスキムミルクをその乳蛋白質のｐＩより低いｐＨ３〜４まで下げてカゼイン及びホエー蛋白質の両者を可溶化する。次いで、連続する３ラウンドの限外濾過又は透析濾過（diafiltration）により蛋白質を濃縮して１５〜２０％の固形分（その９０％は蛋白質）を含む保持物を形成する。或は、英国特許出願第２１７９９４７号は、試料を濃縮するための限外濾過及びその後のほぼ中性のｐＨにおける弱いカチオン交換クロマトグラフィーによるホエーからのラクトフェリンの単離を開示している。純度の測定は、報告されていない。ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２２２５８において、蛋白質例えばラクトフェリンは、濃縮された塩の添加とその後のカチオン交換クロマトグラフィーにより高イオン強度に調節されたミルクから回収される。
これらの方法のすべてにおいて、ミルク又はその画分は、先ず、濾過膜又はクロマトグラフィー媒質を詰まらせる脂肪、脂質及び他の特定の物質を除去するために処理されている。こうして生成された初期の画分は、カゼイン、ホエー、又は全乳蛋白質よりなってよく、これから、次いで、関心ある蛋白質が単離される。しかしながら、これらの技術は、大きく且つ高価なバッチ及び／又は連続式の遠心分離機を必要とすること、沈殿中の捕捉による蛋白質の損失による低収率及び低いｐＨを必要とする沈殿方法による関心ある蛋白質の生物学的活性の損失を含む重大な不都合を与える。これらの制限は、非常に多量に存在して食料品例えばチーズの製造において商品として用いられる比較的安価な蛋白質については許容され得る。しかしながら、それらは、もし蛋白質が全乳蛋白質の小画分に相当し、高価な医薬品に相当し、又は生物学的活性を保持しなければならない酵素その他の治療上活性な蛋白質よりなるならば、重大な経済的阻害となる。
これらの条件のすべては、例えば、トランスジェニック動物のミルクからの医薬蛋白質の精製において得られるであろう。外因性蛋白質の発現レベルは、一般に、その蛋白質及び種に依って１リットル当り１グラム未満から１０グラム以上に及ぶ。例えば１億ドルの年間市場取引額を有する製品においては、各々の製品における１％の損失は、１００万ドルに相当する。
外因性蛋白質を、商業的に採算性のあるレベルで、トランスジェニック動物のミルクにおいて発現させる方法は、当分野で公知である。トランスジェニックの家畜のミルク中の蛋白質の広範囲の商業的生産は、現在、開発中である（A.,J.Clark等、Trends in Biotechnology,5:20-24,1987,A.J.Clark,Journal of Cellular Biochemistry,49:121-127,1992;W.Bawden等、Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,12:89-137,1994;N.S.Rudolph,Genetic Engineering News,15:8-9,1995）。外因性ペプチド特にヒトのペプチドを、ミルク中に比較的高濃度で大量に産生させることができ、それは、回復可能な源から容易に収穫される正常のプロセッシングを受けたペプチドの連続的な高レベルのアウトプットを与える。これらの高価な蛋白質の慣用の方法による精製は、上述の収率及び活性損失に対する主題である。例えば、A.J.Clark等は、トランスジェニック雌ヒツジから得られたミルク由来のカゼインの酸沈殿による約２．０〜２．５％の抗血友病因子ＩＸの回収（約９８％は、失われている）を報告した（A.J.Clark等、Biotechnology 7:487-492,1989）。J.Denman等は、組織プラスミノーゲンアクチベーターの長く作用する変異物の、トランスジェニックヤギ由来のミルクカゼインの酸沈殿による、約２５％の（即ち、７５％を失う）回収を報告した（J.Denman等、Biotechnology 9:839-843,1991）。
ＰＣＴ特許公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１９９３５は、生物学的に活性な蛋白質を全乳から、全乳蛋白質の可溶性を正に帯電した薬剤例えばアルギニン、イミダゾール又はビス−トリスにより安定化させることにより単離する方法を開示している。この処理は、清澄化された溶液を形成し、それから、蛋白質を、例えば膜を通しての濾過により単離することができるが、この処理をしなければ該膜は沈殿蛋白質により詰まってしまう。この添加剤の濃度は、１〜３モルのオーダーで高い。幾つかの場合には、特に高価な薬剤例えばアルギニンの大きな必要量を最小化することが好ましい（該剤は、如何なる場合にも、後続の精製ステップにおいて除去しなければならない）。この方法は又、乳脂肪を除去するための最初の遠心分離のステップをも必要とする。ここに開示したものは、可溶性の乳成分を単離するための当分野で公知の方法を超える改良である。本発明は、収率における損失を、大規模生産に適した効率的で費用効果的な方法において生物学的活性を保護する温和な条件を提供することにより減少させる。
発明の要約
本発明は、可溶性の乳成分例えばペプチドを、その生物学的に活性な形態で、全乳又はミルク画分から接線流濾過により単離する方法を提供する。以前の単離方法と違って、この発明の方法は、脂肪及びカゼインミセルを除去するための最初の全乳の分画を排除しており、それにより、この方法を単純にして回収率及び生物活性の高価な損失を回避する。この方法は、更に、夾雑物を除去して関心ある成分を精製する更なる精製ステップと組み合わせて用いることができる。
この発明により、全乳を接線流濾過に、好ましくは、可溶性の乳成分を含む透過物（濾液）と、脂肪、他のコロイド状物質、粒状物、ウイルス、マイコプラズマ、細菌及び体細胞を含む保持物を形成するのに十分な多孔度の限外濾過膜を横切るようにかける。この透過物を、可溶性乳成分を実質的に取り出す捕獲手順（capture procedure）にかけ、この捕獲手順（例えば、接線流濾過以外の捕獲手順）からの溶出液を元のミルク試料（保持物）と合わせる。この手順を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで反復し又は継続する。
この発明の別の具体例において、全乳を接線流濾過（好ましくは、限外濾過膜を横切るもの）にかけて、可溶性乳成分を含む透過物及び脂肪、他のコロイド物質、粒状物、ウイルス、マイコプラズマ、細菌及び体細胞を含む保持物を形成する。透過物を集め、この透過物を取り出す際に十分量の溶液を保持物に加えて一定容積を維持する。この手順を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで繰り返す。
適宜、この透過物を更に１つ以上の捕獲手順（例えば、接線流濾過以外の捕獲手順）により処理して、存在し得る任意の夾雑物を除去し、それにより、関心ある成分の精製標品を与えることができる。これらの更なる手順には、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、又は他の型の捕獲用クロマトグラフィー（これらは、当業者に周知である）が含まれ得る。
適宜、この手順を、透過物を直接捕獲用デバイスに導き且つ捕獲手順からの溶出物を直接保持物に導き戻す閉ループ式の連続抽出システムとして操作する。
適宜、全乳を、先ず、驚く程ミルクの凝集を抑えて限外濾過フィルターを横切る透過物流を改善するキレート化剤例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と合わせる。このミルクとキレート化剤との組合せを、上記のように、更なる工程なしで直接接線流濾過にかける。
この発明の他の面において、この手順を、全乳を接線流濾過（好ましくは、十分な多孔度の限外濾過膜を横切るもの）にかけて、可溶性乳成分を含む透過物（濾液）と、脂肪、他のコロイド状物質、粒状物、ウイルス、マイコプラズマ、細菌及び体細胞を含む保持物とを形成する閉ループ式の連続抽出システムとして操作する。この透過物を、次いで、捕獲用デバイス（接線流濾過以外のもの）例えば捕獲用クロマトグラフィー装置例えばイオン交換クロマトグラフィー装置又はアフィニティークロマトグラフィー装置例えばヘパリンアフィニティーカラム、プロテインＡアフィニティーカラム若しくはプロテインＧアフィニティーカラムに導き、そして、捕獲手順からの溶出物を元のミルク試料（保持物）に導き戻す。この手順を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで繰り返す。
従って、可溶性乳成分を全乳又はその画分から限外濾過膜を横切る接線流濾過によって単離するための効率的な方法を提供することは、本発明の目的である。
脂肪、カゼイン、ミセル、脂質及び粒状物を除去する（除去しないと微孔性フィルターを詰まらせる）ために濾過の前に全乳を最初に処理する必要性を排除することは、本発明の更なる目的である。可溶性乳成分の一部を捕らえてその収量を減じる沈殿又は遠心分離等の工程によって全乳を最初に処理する必要性を特異的に排除する方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
穏和な条件を用いて、特に有機溶媒及び極端なｐＨ及び温度を避け、それにより、可溶性乳成分の生物学的活性を保護する方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
大規模精製のための方法を効率化し且つ費用効果を良くする希釈又は容積拡張を伴わない一定の容積を維持する閉ループ式の連続抽出方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
更なる精製工程にかけて夾雑物を除去し（これらの工程の少なくとも１つは、閉ループ式連続抽出システムに含まれ得る）、それにより、精製された可溶性乳成分を生成することのできる接線流濾過透過物を提供することは、本発明の更なる目的である。
単一の逐次的工程において接線流濾過と可溶性乳成分分離のための捕獲手順とを組み合わせる方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
キレート化剤例えばＥＤＴＡを加えて限外濾過膜を横切る透過物の通過を改善して、濾過工程におけるミルクの凝集及び膜の目詰まりを減じるのを助ける方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
限外濾過及びクロマトグラフィー用媒質を、実質的に性能の変化なしで何回も浄化して再利用することのできる媒質から選択する方法を提供することは、本発明の更なる目的である。
【図面の簡単な説明】
図１は、接線流濾過及びヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを含む閉ループ式連続抽出システムにおける生物学的に活性なペプチドのミルクからの精製に用いられる典型的な装置の略図である。
図２は、接線流濾過による生物学的に活性なペプチドのミルクからの単離のために用いられる典型的な装置の略図である。
図３Ａ及び３Ｂは、種々のｐＨ値における全乳の濾過性に対するＥＤＴＡの効果を描いている。
図４は、種々のキレート化剤のミルクから単離された抗トロンビンの純度に対する効果を示す銀染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのエレクトロホログラムを描写している。
発明の詳細な説明
本発明は、ミルクから可溶性乳成分をその生物学的に活性な形態で単離するための方法を提供する。好ましくは、このミルクは、全乳である。可溶性乳成分は、家畜のミルク中に通常存在する成分、免疫化によりミルク中の存在が減少する特異的抗体等の成分、特定の食糧によりミルク中の存在が減じ若しくは増加する成分、又はトランスジェニック若しくはトランソミック動物中への遺伝子トランスファーにより導入された外因性成分の何れかであってよい。
この可溶性乳成分は、ペプチド特に蛋白質であってよい。この蛋白質は、例えば、糖蛋白質、免疫グロブリン、酵素、ペプチド又はホルモンであってよい。それは、起源において、ヒトであってもなくてもよい。それは、潜在的治療剤又は医薬例えばエリスロポエチン、アルファ−１プロテイナーゼインヒビターアルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗トロンビンIII、血液凝固因子の何れか（因子VIII、因子IX及び因子Ｘを含む）、キチナーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、フィブリノーゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリン、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質、プロインシュリン、可溶性ＣＤ４又はその成分若しくは複合体、ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター又はこれらの変異物であってよいが、これらに限定されない。
或いは、この乳成分を食糧の成分として用いて、例えば、パン（米国特許第５，１７８，８９４号）若しくは乳幼児調合乳（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９１／０８２１６）の栄養価を増大させ、又は酪農製品例えば凍らせた酪農デザートにこく、きめ若しくは安定性を加えることができる（米国特許第５，１７５，０１３号）。それは又、ある種の細胞例えば上皮細胞又は繊維芽細胞の無血清培養のための添加剤としても用いることができる（K.S.Steimer等、J.Cell Physiol.109:223-234,1981;K.S.Steimer及びM.Klagsbrun,J.Cell Biol.88:294-300,1981）。更に、それは、産業用酵素例えばプロテアーゼ、リパーゼ又はキチナーゼであってよい（ＰＣＴ公開Ｎｏ．９３／２５５６７）。
ミルクは、泌乳性哺乳動物例えば乳牛、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット又はヒツジから採取することができる。この哺乳動物は、普通の実験室用動物若しくは家畜、又はトランスジェニック動物若しくはトランソミック動物の何れかであってよい。ここで用いる場合、トランスジェニック又はトランソミック動物は、非ヒト動物をいう。トランスジェニック動物は、一般に、少なくとも１つの外来遺伝子のゲノムへの安定な取り込みの結果として異なる種に由来するペプチド又は他の特徴を発現する動物として規定される。かかるペプチドは、外因性ペプチドと呼ばれる。トランスジェニック哺乳動物のミルク中の外因性ペプチドの分泌は、蛋白質コード配列にミルク特異的蛋白質（例えば、カゼイン、ホエー酸性蛋白質又はラクトグロブリン）由来の調節配列を加えて含む融合又は組換え遺伝子構築物を受精卵又は胚へ導入するために当分野で公知の方法を用いることにより達成される。これらの融合構築物は、外因性蛋白質の発現を、その単離を商業的に可能にするだけ十分に高濃度で、主として又は専らミルクに向けることができる。
ミルクは又、少なくとも１つの外来遺伝子の特定の体組織への導入の結果として、異なる種に由来する蛋白質又は特徴を発現する動物であるトランソミック動物（トランソマチック動物とも呼ばれる）から採取することもできる。例えば、外因性蛋白質を、適当な遺伝子及び調節エレメントの乳上皮細胞への直接的な導入により、例えば乳腺で急速に分裂しているミオオピセリアル（myoopithelial）細胞を標的とするレトロウイルスベクターにより、ミルク中に生成することができる。継続する世代を通して子孫にトランスジーンを伝えるトランスジェニック動物と異なり、トランソミック動物は、外因性蛋白質をミルク中に生成する能力を伝えず、個体ごとに造らなければならない。それにもかかわらず、それらは、関心ある蛋白質その他の成分の起源たり得る。
通常は哺乳動物により生成されない外因性ペプチドは、異種性ペプチドとして知られている。家畜のミルク中に見出され得る異種性ペプチドの例には、ヒトの乳蛋白質例えばラクトフェリン、ヒト血清蛋白質例えば血液凝固因子及び産業用酵素例えばキチナーゼが含まれる。通常特定の哺乳動物により生成されるペプチドは、内因性ペプチドとして知られる。内因性の例は、内因性乳蛋白質をその濃度を増すことを目的として発現させ、又は通常血清中にのみ見出される蛋白質をミルク中に発現させるようにトランスジェニックとすることができる。例えばウシトランスフェリンは、通常、ミルク中に極微量で存在するが、発現を、ラクトフェリン遺伝子をアルファ−Ｓ１カゼイン遺伝子の制御下に有するトランスジェニック動物を生成することにより有意に増大させることができる（ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９３／２５５６７）。
異種性ペプチドは、トランスジェニック動物により通常作られる同じペプチド又は蛋白質の内因性型と共存することができる。異種及び同種型のペプチドは、通常、アミノ酸配列、三次若しくは四次構造、グリコシル化その他の翻訳後修飾の少なくとも１つにより異なっている。例えば、トランスジェニックヒツジにおける抗トロンビンIIIは、アミノ酸配列の違いにより区別することのできるヒト型及びヒツジ型の両方で存在し、この違いは、蛋白質の表面電荷、疎水性、金属結合親和性又はその他の親和性における差異を生じ得る。医薬又は治療薬等の用途のために、ヒトのペプチドは、意図したヒトレシピエントにより外来蛋白質として認識されにくいので好適である。非ヒト型ペプチドが哺乳動物のミルク中に存在すると、精製工程の一部として、それらを、外因性ヒト蛋白質から分離することが必要となり得る。
本発明は、自然に存在するものであっても誘導されたものであっても、内因性であっても外因性であっても、同種のものであっても異種のものであっても、ミルク中に存在し得る任意の関心ある成分を包含する。
ミルクは、本発明の方法により、生乳、低温殺菌乳又は凍結全乳の何れかの形態にて処理することができる。これは、ミルク中に存在し得て微孔性濾過膜又はクロマトグラフィー媒質を詰まらせ得る脂肪、カゼインミセル、脂質、体細胞及び他の粒状物を除去する最初の工程の必要性を排除する。典型的には、この最初の工程は、蛋白質画分の酸又はレンネットによる沈殿により行われ、又は脂肪及び脂質の遠心分離及びスキミングにより行われてスキムミルクを生成する。これらの方法のすべては、蛋白質を捕捉してそれらの回収を減じることが知られている。更に、沈殿法は、更なる処理のために沈殿した蛋白質を再溶解可能にして清透化する追加の工程を必要とする。大量の遠心分離は、大型の高価な装置を必要とし、この処理工程は、存在する遠心分離機を一層大きいものと置き換えるか、もっと多くの遠心分離機を追加してそれらの幾つかを同時運転するか、又は存在する遠心分離機によって逐次的に多数のバッチを処理し、それにより、全処理時間を延長することによってのみスケールアップすることができる。
更に、蛋白質沈殿に必要な低ｐＨは、幾らかの関心ある成分の生物学的活性を減じ又は破壊し得る。例えば、トロンビンインヒビターの抗トロンビンIIIは、約６．０未満のｐＨ値で不安定であり、３〜５のｐＨ値で完全に不活性化され、それは、カゼイン蛋白質の酸沈殿のために典型的に用いられる。
本発明において、捕捉及び酸不安定性による損失を、全乳の前分画を必要としない方法により排除する。この方法により、ミルクを、直接、微孔性膜を横切る濾過にかける。濾過の例には、デッドエンド濾過及び接線流濾過が含まれる。デッドエンド濾過において、濾過すべき溶液は、フィルター表面に対して垂直に流れる。接線流濾過において、濾過すべき溶液は、フィルターに平行に流れ、透過物は、それを横切って拡散する。この発明の方法において、濾過は、接線流濾過によるものである。
接線流濾過に使用するフィルターは、好ましくは、関心あるミルク成分を含む透過物及び脂肪、細胞、カゼインミセル及び粒状物を含む保持物を形成するのに十分なだけの多孔度を有する。一般に、乳脂肪球は、約１〜１０ミクロメートル未満の細孔寸法、体細胞は、約０．４５０ミクロメートルの細孔寸法、細菌は、約０．２００ミクロメートルの細孔寸法、カゼインミセルは、約０．０８〜０．２０ミクロメートルの細孔寸法、ウイルスは、約０．０５〜０．１ミクロメートルの細孔寸法、マイコプラズマは、０．１ミクロメートルの細孔寸法、そしてプリオンは、約０．３５ミクロメートルの細孔寸法を有する膜により保持され得る。ウイルスを除去するのに十分な膜は、脂肪球、体細胞、細菌及びカゼインミセルをも除去すると考えられる。約０．０５ミクロメートルの細孔寸法は、一般に、約５００ｋＤの分子量カットオフに対応する。
通常、限外濾過膜を横切る接線流濾過において、関心ある成分は、保持物中に濃縮される。例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ．４６７，４８２は、酸性化スキムミルクの限外濾過とその後の透析濾過及び第２の限外濾過による合わせた乳蛋白質の精製を開示している（それぞれの場合に、蛋白質を保持物中に保持する）。しかしながら、本発明に関して新規なものは、可溶性乳成分の透過物中への分離のための限外濾過膜の利用である。こうして形成された透過物は、関心ある成分を単離精製するための適宜の更なる処理に適した澄んだ溶液である。保持物は、乳状の外観を保持している。
適宜、ミルクを、最初に、穏和な条件下で、生乳が凝集すること及び濾過膜を詰まらせることを阻止するのに十分なそして膜を横切る透過物の通過を改善するのに十分な量にてキレート化剤と合わせる。ここで用いる場合、キレート化剤は、有機又は無機のカルシウム塩を可溶化することのできる任意の薬剤として定義される。好ましくは、このキレート化剤は、カルシウムをキレート化することができる。効果的にカルシウムをキレート化するキレート化剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）又はシトレートである。好ましくは、キレート化剤を加えて１〜５００ｍＭの終濃度とする。好ましくは、キレート化剤の終濃度は、約２０〜５０ｍＭのＥＤＴＡ又は５０〜２００ｍＭのシトレートである。最も好ましくは、キレート化剤の終濃度は、約２５ｍＭのＥＤＴＡである。
幾つかの状況において、シトレートは、捨てられる総量に依存して、ＥＤＴＡの処分が環境調節に対する問題であり得、それ故、一層高くつき得るので、一層強力なキレート化剤であるＥＤＴＡより好適である。ＥＧＴＡは、ＥＤＴＡより一層高いカルシウムに対する親和性定数を有し（R.M.C.Dawson,D.C.Elliott,W.H.Elliott及びK.M.Jones,Data for Biochemical Research,第三版、Clarendon Press,Oxford,1986）、この発明の方法において同等かそれ以上に有効であろう。
本発明の更なる利点は、凝結により詰まることのない膜が一層容易に浄化されて再利用されることである。例えば、それらは、適当な溶媒例えば酸、塩基及び／又はアルコールでその場で洗うことを繰り返すことにより同じ場所で浄化され得る。再利用の前に、これらの膜を適当な緩衝液で平衡化して極微量の溶媒をすべて除去する。大規模な精製に要する量では何万ドルもの費用がかかる濾過膜のリサイクルに従順な方法を提供することにより、この発明は、実質的に、処理コストを減じる。
この発明の好適具体例において、限外濾過膜を横切る接線流濾過を、単一の逐次的工程において、捕獲工程と組み合わせて、可溶性乳成分を透過物から除去する。最も好ましくは、接線流濾過を、閉ループ式の連続抽出システムにて実施する。ここで用いる場合、語句「閉ループ式の連続抽出システム」は、捕獲手順からの溶出物を元のミルク試料（保持物）と合わせるシステムをいう。好適具体例において、これは、元のミルク試料において一定の容積を維持し、そうして、新たな溶液をシステムに加える必要性を回避する。この透過物を捕獲用デバイスに導いて可溶性乳成分を単離する。ここで用いる場合、用語「捕獲用デバイス」は、関心ある可溶性乳成分を捕獲することのできる接線流フィルター以外のデバイスをいう。これらのデバイスには、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、又はその他の当業者に公知の捕獲用クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、この捕獲用デバイスは、クロマトグラフィーデバイス例えばアフィニティークロマトグラフィーデバイスである。アフィニティークロマトグラフィーデバイスの例には、ヘパリンアフィニティーカラム、プロテインＡアフィニティーカラム又はプロテインＧアフィニティーカラムが含まれるが、これらに限定されない。捕獲手順からの溶出物を、元のミルク試料（保持物）に導き戻す。好適具体例において、この処理は、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで行う（又は、この工程を繰り返し又は継続する）。この発明の方法を用いての回収率は、関心ある可溶性乳成分の少なくとも約７５％、８０％、９０％、又は９５％である。好ましくは、回収率は、約７５〜９０％の範囲に、一層好ましくは約７５〜９５％の範囲にある。この発明の方法を用いての関心ある可溶性乳成分の純度は、約８０％、８５％、９０％又は９５％である。好ましくは、この純度は、約９５％より高い。この方法を実施するために用いられる典型的な装置の略図を、図１に示す。
一定容積及び一定生成物通過を維持する条件下で、この回収プロセスは、指数関数的崩壊方程式によりモデル化することができ、この方程式を、以後、方程式１と呼ぶ：
Ｃｒ＝Ｃo×ｅ-（Vp×d/Vo）
式中、Ｃｒは、保持物中の所望の成分の濃度であり、
Ｃoは、所望の成分の出発濃度であり、
Ｖoは、出発容積であり、
Ｖｐは、全透過物容積であり、
ｄ＝は、通過係数（即ち、任意所定時間におけるＣｒ／Ｃo比）である。
例えば、この発明の方法を用いて、抗トロンビンIIIをトランスジェニックヤギ由来の全乳から単離することができる。この場合、ミルクを５００ｋＤのフィルターを横切る接線流濾過及びその後のヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラム上への捕獲ステップにより処理する。一定の流れを維持する条件下で、保持物中の抗トロンビンIIIの約４０％が、任意所定時間にこの膜を通過する：即ち、方程式１においてｄで示される通過係数は、０．４に等しい。方程式１は、７容の希釈されたミルクが透過物に及びヘパリンアフィニティーカラム上に通過した後には、元のミルク試料中の抗トロンビンIIIの９４％が回収され得るということを予言する。実際には、７試料通過後の回収率は、７５〜９０％である。
最も好ましくは、この捕獲用デバイスからの流出物を、インラインで、保持物を含有する元のミルク試料貯蔵器に導き戻す。実質的にすべての関心ある化合物を捕獲し、液体流からの液体を元のミルク試料貯蔵器に戻す。保持物中に残っている残留量の関心ある化合物を濾過／クロマトグラフィープロセスを続けることにより単離することができる。
別の具体例においては、透過物を貯蔵器に取り出し、十分量の緩衝溶液と置き換えてミルク試料貯蔵器中の一定容積を維持する。この別法を実施するのに用いられる典型的な装置の略図を、図２に示す。
通常、連続流濾過工程例えば限外濾過及び透析濾過は、透過物が除去されるのと同じ比率で水又は緩衝液を同時に加えることにより実施する。これは、試料及び廃溶液の全容積の並びにそれらを処理し保持するのに必要な容器の寸法の有意の増加を生じる。しかしながら、この発明の方法は、一定容積を維持する。好ましくは、ミルク溶液を、膜を詰まらせることなく効率的な濾過を与えることが可能な程度に濃縮して維持する。更に、種々の乳成分は、関心ある成分の選択的除去を除いて、平衡を保つ。有利には、ここに記載のプロセスは、出発試料、保持物及び透過物の容積、必要な緩衝液の容積、及び精製設備に配置すべき人員数を最小にする。従って、この発明は、従来の精製方法を超えるかなりの潜在的な費用の倹約を意味する。この発明の方法による接線流濾過により生成される透過物は、関心ある成分の部分精製された標品を含む。
本発明の更なる適用において、この透過物を、適宜、関心ある成分の精製標品を与えるために存在し得る１つ以上の更なるプロセスにより処理して、キレート化剤を他の汚染物質と共に除去することができる。第一の透過物は、関心ある成分と類似の、一層大きい又は一層小さい分子量の更なるペプチドを含んでよい。これらは、例えば、他の内因性乳蛋白質であっても、外因性蛋白質の同族型であってもよい。更なる精製のために適当な更なるプロセスの例には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、チオフィリッククロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー又は濾過プロセス例えば限外濾過が含まれる。アフィニティークロマトグラフィーは、関心ある成分に特異的に又は優先的に結合するリガンド例えば抗体、プロテインＡ又はプロテインＧ、又は抗トロンビンIIIの場合にはヘパリンを用いて行うことができる。
実施例１：生物学的に活性な抗トロンビンIIIのミルクからの単離
抗トロンビンIIIを発現しているトランスジェニックヤギからミルクを集めて、−３５℃にて凍結した。この凍結したミルクを８±３℃の冷蔵室で一晩かけて又は４０℃以下の水浴中で解凍が完了するまで断続的に手動で渦を起こして解凍した。約２３ｋｇの解凍したミルク試料を、同重量の５０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１８０ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ９．１）を含む８±３℃の溶液と合わせた。
希釈したミルクを供給タンク内に入れ、図１に図式表示した連続式抽出システムにおいて、接線流濾過により８±６℃で清澄化した。５００（ｋＤ）分子量カットオフの中空繊維膜カートリッジ（ＵＦＰ−５００−Ｅ；A/G Technology Corp.,マサチューセッツ、Needham在）を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１８０ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ６．８）を含む溶液で平衡化した。ミルクを、２つの３平行スタック中に配置した６つの０．７ｍ2カートリッジを通して、遠心ポンプにより確立された４５Ｌ／分以下の流量で循環させた。入口圧を、隔膜バルブにより、１５±２ポンド／平方インチ（psi）に調節した。透過物流量を、計量型ポンプにより調節して透過物の膜貫通圧力を０〜５psiに維持した。熱交換器（図１には示してない）を、管路中に、濾過カートリッジの直前に入れて溶液の温度を８℃近くに維持した。
抗トロンビンIIIを含む透過物を、誘導体化したヘパリンをリガンドとして含む平衡化されたアフィニティークロマトグラフィーカラムにインラインで直接ポンプで送った。ヘパリンハイパーＤ樹脂（BioSepra Inc.,マサチューセッツ、Marlborough在）をクロマトグラフィーカラムに詰めて総ベッドボリューム６．１±０．７Ｌとし、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（１８０ｍＭ  塩化ナトリウム中）、ｐＨ６．８、８±３℃で平衡化した。ヘパリンカラムからの流出物を直接供給タンクに戻した。今や濾過保持物及びヘパリンカラム溶出物と合わされたミルク試料を、希釈されたミルクの７容すべてが濾過カートリッジを通過するまで再循環させた。次いで、ヘパリンカラムを接線流濾過ユニットから分離して、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム及び４００ｍＭ  塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７．０）で洗った。抗トロンビンIIIは、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム及び２．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出された。カラム溶出液中の蛋白質を、２８０ナノメートルフィルターを取り付けたＵＶ吸光度検出器を用いて検出した。
接線流濾過及びヘパリンクロマトグラフィーの全プロセスは、約６〜８時間を要した。我々は、以前に、ここに記載した条件下で、この型の５００ｋＤの限外濾過用中空繊維カートリッジを横切る流れが４時間にわたって一定のままであることを示した。以前の実験は又、他の型の膜例えば０．１ミクロメートル、０．２ミクロメートル及び０．４５ミクロメートルのデュラポアメンブレンが、３０分間の試験濾過期間中に流れが有意に減じるので、ここに規定した条件下での接線流濾過に一層適さないことをも確立した。
定量的逆相クロマトグラフィーを用いて、出発ミルク試料中及び最終的ヘパリンカラム溶出物中の全抗トロンビンIII蛋白質を測定した。ＰＯＲＯＳ  Ｒ２／Ｈカラム（PerSeptive BioSystems,マサチューセッツ、Cambridge在、製品番号１−１１１４−１２）を、製造者の指示に従って用いた。水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）〜９９．９％アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡのカラム勾配を、２．０ｍＬ／分の流量で確立し、抗トロンビンIIIの標準溶液を用いて較正した。抗トロンビンIII含量を、直線的標準曲線から補間した。
抗トロンビンIIIの生物学的活性を、トロンビンの標準量により試料中の抗トロンビンIIIがＫａｂｉ基質Ｓ２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）の開裂を阻止する程度を測定するトロンビン阻害アッセイにより測定した。トロンビン及び抗トロンビンIIIに結合するヘパリンを各アッセイ試料に加えて抗トロンビンIII阻害活性を増大させた。ヘパリン及びトロンビンを、ミクロウェルプレート中で、プロセス試料のアリコート又は標準抗トロンビンIII溶液の希釈物の何れかとインキュベートした。１５分間３７℃でのインキュベーションの後に、氷酢酸で反応を停止して４０５ナノメートルで吸光度を測定した。抗トロンビンIII活性を直線的標準曲線から補間した。
この接線流濾過とヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの組合せは、一貫して、７５〜９０％の回収率及び９５％より高い純度を生じた。ロットＡＴ５０１の典型的な精製の実行の結果を表１に示す。２４Ｌの出発ミルク試料は、５５ｇの抗トロンビンIII（その４２ｇ（７５％）がヘパリンアフィニティーカラムから回収された）を含んだ。最終生成物プールは、７．８単位／ｍｇの比活性を有した（これは、血漿由来の抗トロンビンIIIの比活性に匹敵する）。
接線流濾過を単独で行って、インラインでヘパリンアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせなかったならば、透過物は、収集タンクに取り出され、一定容積を維持するために透過物の容積に等しい容積の緩衝液をミルク／保持物貯蔵器に加えたであろう。典型的装置を図２に示す。ロットＡＴ５０１の典型的な精製の実行のために、例えば、３３１Ｌの全透過物が集められ、等容積の緩衝液を系に加え戻す。
実施例２：全乳の濾過性に対するＥＤＴＡの効果
実施例１に記載したように凍結して解凍したヤギの全乳の２０ｍＬのアリコートを２０ｍＬの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ又は２０ｍＬの蒸留した脱イオン水と合わせ、濃ＨＣｌ又はＮａＯＨを用いて６〜１０の範囲に及ぶ種々のｐＨに調節した。各溶液を、蒸留した脱イオン水で２回より多く希釈して、１／１６及び１／３２（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終的なミルク希釈物とした。個々の試料を、３ｍＬ／分の流量で、無菌の０．２２ミクロメートルのMillex-GVフィルター（Millipore Corp.,マサチューセッツ、Bedford在）を通して、２０ＰＳＩＧの圧力が達成されるまでポンプで送った。透過物を予め重量を測定した小さい管に集めた。各濾過を二連で行った。管を重量測定して、全透過物をグラムで計算し、これを容積に変換した。対照を正確に同じ方法で処理した、但し、ＥＤＴＡを加えなかった。幾つかの場合には、透過物を、抗トロンビンIII活性について、実施例１に記載したようにトロンビン阻害アッセイによりアッセイした。
１０以下のｐＨで水のみで希釈したミルクは、１／３２の最終的希釈にてフィルターを容易に通過した（図３）。しかしながら、ＥＤＴＡの添加は、試験したすべてのｐＨ及び濃度において濾過性を増加させた。ＥＤＴＡは、試験した一層低い希釈において特に効果的であったが、これは、フルスケールの精製操作で一層小さい全処理容積に相当する。別々の実験において、ｐＨ８におけるＥＤＴＡ濃度の２倍増は、少なくとも、６．２５〜２５ｍＭ  ＥＤＴＡの範囲で濾過されたミルクの全重量の２倍増を生じた（データは示してない）。
実施例３：種々のキレート化剤の可溶性蛋白質のミルクからの単離に対する効果
トランスジェニックヤギ１５５−１０（抗トロンビンIIIを発現する）からのミルクを、実施例１に記載したように集め、凍結して解凍した。解凍したミルクの１６０ｍＬの試料を、ＥＤＴＡ又はシトレートをキレート化剤として含む同重量の緩衝液と合わせた。
シトレート緩衝液は、１６６ｍＭ  クエン酸ナトリウム及び１０ｍＭ  クエン酸（ｐＨ７．０）を含んだ。希釈されたミルクを、８±６℃で、図１に記載したごとき連続式抽出システムにおける接線流濾過により清澄化した（但し、一層小さい規模で）。５００ｋＤの分子量カットオフを有する中空繊維膜カートリッジ（UFP-500-E-4;A/G Technology Corp.,マサチューセッツ、Needham在）を、１１８ｍＭ  クエン酸ナトリウム及び７ｍＭ  クエン酸を含む溶液（ｐＨ７．０）で平衡化した。このミルクを０．０３２ｍ2のカートリッジを通して、２．５Ｌ／分で、蠕動ポンプにより再循環させた。入口圧を、管クランプにより１５±２ｐｓｉに調節した。第２の蠕動ポンプを用いて流量を１８ｍＬ／分に、圧力を２〜６ｐｓｉに維持した。
抗トロンビンIIIを含む透過物をインラインで、直接、平衡化したヘパリンハイパーＤ（BioSepra Inc.,マサチューセッツ、Marlborough在）アフィニティーカラムにポンプで送った。このカラムは７６ｍＬであり、１１８ｍＭ  クエン酸ナトリウム及び７ｍＭ  クエン酸（ｐＨ７．０）で、８±６℃で平衡化した。
この透過物を直接ヘパリンカラム上に通して、ヘパリンカラム溶出物を、閉ループ式連続抽出システム中の保持物貯蔵器に戻した。
１３容の希釈したミルクを濾過カートリッジを通過させた後に、ヘパリンカラムを接線流濾過ユニットから分離した。このヘパリンカラムを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム及び４００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む緩衝液で洗った。抗トロンビンIIIは、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム及び２．５Ｍ  塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７．０）でヘパリンカラムから溶出された。カラム溶出中の蛋白質を、２８０ナノメートルフィルターを取り付けたＵＶ吸光度検出器を用いて検出した。接線流濾過及びヘパリンクロマトグラフィーの全プロセスは、約６時間を要した。
キレート化剤としてのＥＤＴＡと合わせた全乳を、このスケールで、実施例１に記載した緩衝液及びカラム洗浄溶液を用いて同様に処理した。
精製した抗トロンビンIIIのアリコートを、１０〜２０％の勾配を有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Owl Scieentific,マサチューセッツ、Woburn在）上での電気泳動により分離して、蛋白質純度の定性的評価のための標準的方法に従って銀で染色した。図４は、ＥＤＴＡ及びシトレート試料からのヘパリンカラム溶出物（それぞれ、レーン３及び５）並びにＥＤＴＡ及びシトレートプロセスからの溶出蛋白質（それぞれ、レーン７及び９）を示している。分子量標準は、カリフォルニア、Hercules在、BioRad社より入手した（製品番号１６１−０３０４）。類似の精製レベルを、ＥＤＴＡ及びシトレートプロセスの両方から得た。定量的逆相クロマトグラフィーにより測定して、抗トロンビンIII活性の回収率は、ＥＤＴＡを用いて８１％、シトレートを用いて９０％であった。
実施例４：生物学的に活性なモノクローナル抗体のミルクからの単離
ＩｇＧモノクローナル抗体を発現するトランスジェニックヤギ３９５−９４から集めたミルクを、本質的に実施例１に記載したように、凍結し、解凍し、ＥＤＴＡと合わせて処理した。この試料を、５００キロダルトン（ｋＤ）の分子量カットオフの中空繊維（UFP-500-E-3A;A/G Technology Corp.,マサチューセッツ、Needham在）又は０．１ミクロンの中空繊維フィルター（モデルCFP-1-E-3A;A/G Technology Corp.,マサチューセッツ、Needham在）の何れかによる接線流濾過にかけた。両方の場合において、透過物を、直接、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラム（Pharmacia,ニュージャージー、Piscataway在）に導く。これらのカラムを、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化し、接線流濾過工程を完了した後に０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗って、０．１Ｍ  クエン酸（ｐＨ２．２）で溶出した。元のミルク試料中のＩｇＧの純度は、定量的逆相クロマトグラフィーにより測定して、約２１％であった。接線流濾過及びプロテインＧクロマトグラフィーの後に、ＩｇＧの純度は、０．１ミクロン濾過した物質については８２％であり、５００ｋＤ濾過した物質については９９％あった。
実施例５：アルファ−１プロテイナーゼインヒビターのミルクからの単離
ヒトのアルファ−１プロテイナーゼインヒビター（Ａ１ＰＩ）を発現するトランスジェニックヤギ（３９８−９４）から集めたミルクを、本質的に実施例１に記載したように、凍結し、解凍し、等容の２０ｍＭ  アルギニン（ｐＨ７．２）と合わせてＱ−セファロースＦＦクロマトグラフィーカラム（Pharmacia,ニュージャージー、Piscataway在）と連結した接線流濾過により処理した。希釈したミルクを、７５０キロダルトンの分子量カットオフの中空繊維フィルター（モデルUFP-750-E-3X2;A/G Technology Corp.,マサチューセッツ、Needham在）により、接線流濾過にかけた。その透過物を、直接、Ｑ−セファロースＦＦカラム（１．１ｃｍ×２４ｃｍ）上に導いた。このカラムを、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化した。接線流濾過／捕獲ステップが完了した後（２時間）、カラムを２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗い、次いで、Ａ１ＰＩをカラムから２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出させた。ミルク中のＡ１ＰＩの純度は、定量的逆相クロマトグラフィーにより測定して約４％であった。清澄化及びＱ−セファロースＦＦクロマトグラフィーのステップ（閉ループ式連続抽出モードにて実施）の後に、このトランスジェニックＡ１ＰＩの純度は、９１％であり、回収率は８９％であった。
実施例６：生物学的標品からのウイルスの除去
ウイルス除去の研究を、契約研究団体により、標準的試験手順に従って、この発明のプロセスにおいて行った。抗トロンビンIIIの全乳からの単離を、実施例１に記載したように行った。但し、このプロセスは、製造プロセススケールと同じベッド高さで一層狭い直径のカラムを用いることによりスケールダウンした。ヘパリンアフィニティーカラムにおける抗トロンビンIII蛋白質のカラムベッドボリュームに対する比率、線流量、緩衝液容積のカラム容積に対する比率、緩衝液の組成及び温度等の他のキーパラメーターは、変えなかった。
北米のヤギが感染し易いであろう４種類のウイルスを病原性ウイルスの範囲の代表として選択した。２種類のエンベロープを有するウイルス：レトロウイルス科の一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ含有ウイルスである異種栄養性のマウスレトロウイルス（ミンクＳ＋Ｌ−標的細胞にて試験）；及びヘルペスウイルス科の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルスである仮性狂犬病ウイルス（ＰＫ−１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ６４８９）にて試験）を試験した。２種類のエンベロープを有しないウイルス：ピコルナウイルス科のｓｓＲＮＡウイルスであるポリオウイルスセービン１型（ベロ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）にて試験）；及びアデノウイルス科のｄｓＤＮＡウイルスであるマウスアデノウイルス（ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞にて試験）を試験した。
これらのミルク試料に、各ウイルスの公知の接種物を別々に加えて、接線流濾過及びヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより処理した。ヘパリンカラムに載せる溶液にも又、別々に加えた。両カラムからの溶出液を、各標的細胞培養上で個々に試験した。接線流濾過カラムは、４種類すべてのウイルスについて、一貫して、優れたウイルス減少を与え、一層大きい仮性狂犬病ウイルス及び異種栄養性マウスレトロウイルスは、完全に除去された。このヘパリンアフィニティーカラムは、２〜４のログウイルス減少を与えた。結果は、表２にまとめてある。
表１．ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせた接線流濾過を用いる抗トロンビンIIIのトランスジェニックヤギのミルクからのこの発明の方法による単離。結果を、実施例１に記載したように、ロットＡＴ５０１の典型的単離について示す。抗トロンビンIII（ＡＴIII）活性を、トロンビン阻害アッセイにより測定し、キリユニット（ＫＵ）で表した；全ＡＴIII蛋白質を定量的逆相クロマトグラフィーにより測定した。
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表２．抗トロンビンIII単離プロセスによるウイルスの減少（各カラムに、別々にウイルス接種物を加えて、カラム溶出物を適当な標的培養細胞にて培養することにより測定）。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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