(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量し、健常者における当該ＤＮＡの発現量と比較することを特徴とする慢性関節リウマチの検出法。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量し、健常者における当該ＤＮＡの発現量と比較することを特徴とする慢性関節リウマチの検出法。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した２０〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量し、健常者における当該ＤＮＡの発現量と比較することを特徴とする慢性関節リウマチの検出法。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１〜３いずれか１項に記載の検出法。
【請求項５】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、およびこれらＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを含む慢性関節リウマチの診断薬。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した２０〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む慢性関節リウマチの診断薬。
【請求項７】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を用いる、慢性関節リウマチの検出法。
【請求項８】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体を含有する、慢性関節リウマチ診断薬。
【請求項９】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する細胞と被験化合物とを接触させ、該ポリペプチドを認識する抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を増加させる化合物のスクリーニング法。
【請求項１０】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞と被験化合物とを接触させ、ノーザンハイブリダイゼーション法またはポリメラーゼ・チェイン・リアクション法を用い、該ＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする、該ＤＮＡの発現を増加させる化合物のスクリーニング法。
【請求項１１】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、慢性関節リウマチ関連ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は慢性関節リウマチの新規な判定法、診断薬、予防薬および治療薬に関する。
背景技術
慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと略記することもある）は関節滑膜の病変を主座とする慢性炎症性疾患である〔検査と技術，１１，４０２（１９８３）〕。ＲＡの発症メカニズムは未だ明確ではなく、遺伝的素因と外的因子（環境因子）が原因となって発症すると考えられている。
ＲＡの病変部（関節滑膜組織）には、ＣＤ４陽性、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞の浸潤が認められるため、ある特定の自己抗原を認識するメモリーＴ細胞が発症に関与しているケースもあると考えられている。
ＲＡ疾患の感受性遺伝子としてＨＬＡ−ＤＲＢ１アレルが同定されており、該遺伝子のような、遺伝的要因もＲＡの発症に関与していると考えられている。
外的要因としてはウイルスの感染が考えられている。該ウイルスとしてはＨＴＬＶ−１、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（以下、ＥＢＶと略記することがある）、パルボウイルスＢ１９、ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ２、ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ９、肝炎ウイルス（Ｇ型、Ｃ型）などのウイルスが考えられている。
これらウイルスのなかでもＥＢＶをトリガーとする報告が多数なされており、ＥＢＶの関節滑膜細胞への感染、ならびに滑膜細胞の活性化が、ＲＡの病因の一つとの可能性が示唆されている〔Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，７３９（１９９７）〕。
現在のＲＡの診断法は症状に基づいたものであり、発症メカニズムに基づいた診断法は確立されていない。
症状に基づいたＲＡの診断には、アメリカリウマチ学会（ＡＲＡ）により作成された、以下の７項目の診断基準からなる診断法が使用されている〔Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、別冊、４５ページ（１９８７）〕。
▲１▼少なくとも１時間以上持続する朝の関節のこわばり（６週間以上）
▲２▼３個以上の関節の腫脹（６週間以上）
▲３▼手（ＷＲＩＳＴ）、中手指関節（ＭＣＰ）、近位指関節（ＰＩＰ）の腫脹（６週間以上）
▲４▼対称性関節腫脹
▲５▼手、指のＸ線像の変化
▲６▼皮下結節（リウマチ結節）
▲７▼リウマトイド因子（ＲＦ）の存在
これら７項目のうち少なくとも４項目の病変が認められれば、ＲＡであると診断される。
リウマチ性疾患を診断するために実際に行われている臨床検査として、赤血球数、赤沈、生化学的パラメーターの測定等の一般検査、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、ＲＦ等の免疫血清学的検査、病理組織学的検査、Ｘ線検査等がある。
また臨床学的なＲＡの活動性を評価する判定基準としてランズバリー指数がよく用いられている。ランズバリー指数は、朝の関節のこわばり時間、関節点数、握力、および赤沈値等の項目から算定表を参考にして指数を算出するが、合計の指数が高いほどＲＡの活動性が高いと判定されている。
しかし、上記診断法は発症メカニズムに基づいた診断法ではないため、どのような治療をすべきかの情報を得ることができない。また、長期の診断期間を必要とするという問題点がある。
上記基準のうち、ＲＦの検出は、ＲＡの診断に際して不可欠となっており、ＲＡ以外の関節症状（関節痛、関節炎等）を有する疾患との鑑別にも利用されている。しかし、実際には健常人でもＲＦ陽性の人が数〜１０％程度存在し、一方リウマチと診断された人でもＲＦの陽性率は４０〜９０％で、臨床的感度もそれほど高いものではない〔検査と技術，１６，１４４２（１９８８）〕。またＲＦに関しては、臨床的特異性も良くないことが知られている。リウマチ近縁疾患やＲＡ以外の膠原病諸疾患（シェーグレン症候群、アジュバント病、膠原病等）でも、２０〜４０％の陽性率でＲＦが検出される。また、肝疾患（特に肝硬変症、慢性肝炎）や心疾患（特に心筋梗塞発作後、亜急性細菌性心内炎）でも３０〜５０％の高い陽性率を示す。このようにＲＦの検出によるＲＡの診断は、その臨床的感度および臨床的特異性ともに臨床の現場では有用性が低いことが広く認識されている。
ＲＦに代わるＲＡ診断法として、ＲＡ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖鎖についての構造異常を利用した方法がいくつか提案されている（特開平３−７３８５７、特開平５−８７８１４、特開平３−４８７００）。本方法は、ＥＢＶの感染を発症メカニズムとするＲＡを診断する方法とは区別される診断法であり、別の発症メカニズムに基づくＲＡの診断法である可能性はあるが、この診断法には擬陽性の判定が存在するという問題点がある。
現在のＲＡの治療法は主に症状に基づいた対象療法であり、発症メカニズムに基づいた治療法ではない。
現在ＲＡの治療の中心となっているのが、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、免疫調整剤、ステロイド剤等を用いた治療である。
ＮＳＡＴＤはＲＡ患者の朝の関節のこわばり、関節痛を軽減し、炎症症状を一時的に抑制するが、関節破壊、変形の進行を抑制する効果はなく、赤沈、ＣＲＰ等の関節炎の指標を改善しない。すなわちＮＳＡＩＤには基本的には抗リウマチ作用はない。
ステロイド剤は、各種の炎症性疾患における諸症状を顕著に改善するが、投与が長期化すると耐性化がおき、消化器障害、皮膚障害、腎炎等の、ときには重篤である副作用が存在することが知られている。
最近、注目されているのが抗リウマチ作用を有するとされる疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）であり、注射金製剤あるいは内服金製剤であるオーラノフィン、メトトレキセート（ＭＴＸ）、サラゾピリン、ブシラミン等がある。しかしながら、ＤＭＡＲＤもその有効率は６０％未満であり、遅効性の上、連続投与により効果がなくなり、重篤な副作用が高頻度にみられる。
より効果的に炎症をコントロールする薬剤として、近年免疫抑制剤が使用されつつあるが、骨髄抑制等の重篤な副作用が存在する。
以上のことから、より効果が優れ、副作用等の問題がない新しい作用機序の抗リウマチ薬の出現が強く望まれている。
ＲＡの発症メカニズムが明らかになれば、発症メカニズムに基づいた診断、予防、および副作用のない根治的な治療が可能になる。
ＲＡの患者人口は多く、該患者のＱｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）の向上の面からも、発症原因の解明、発症原因に基づくＲＡの診断法および治療法が強く望まれている。しかし上述のように、ＲＡの病因は未だ明らかではなく、病因に基づく診断、治療法も確立されてはいない。
発明の開示
本発明の課題は、ＲＡ発症の原因解明、発症原因に基づくＲＡの判定法、診断薬、予防薬および治療薬を提供することにある。
本発明者らは、ＲＡ患者の白血球において発現量が低下している遺伝子を見いだし、該遺伝子を特定することにより本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡの発現量を定量することを特徴とする慢性関節リウマチの判定法。
本明細書において、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体とは、個人差に基づく遺伝子の多型が原因で生じる該ポリペプチドの変異体であり、具体的には配列番号１記載のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。以下、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体を含めＲＡ関連ポリペプチドと略すこともある。
（２）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することを特徴とする慢性関節リウマチの判定法。
（３）  ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０残基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法により、ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することを特徴とする慢性関節リウマチの判定法。
（４）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（１）〜（３）いずれか１つに記載の判定法。
（５）  ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、およびこれらＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを含む慢性関節リウマチの診断薬。
（６）  ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０残基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む慢性関節リウマチの診断薬。
（７）  ＲＡ関連ポリペプチドを認識する抗体を用いる、慢性関節リウマチの判定法。
（８）  上記（７）の抗体を含有する、慢性関節リウマチ診断薬。
（９）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む慢性関節リウマチの予防薬または治療薬。
（１０）  ＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列の１０３〜４８６番目の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（９）の予防薬または治療薬。
（１１）  ＲＡ関連ポリペプチドを発現する細胞と被験化合物とを接触させ、上記（７）の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を増加させる化合物のスクリーニング法。
（１２）  ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞と被験化合物とを接触させ、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用い、該ＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする、該ＤＮＡの発現を増加させる化合物のスクリーニング法。
（１３）  配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子中に存在するプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被験化合物とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物の含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を増加させる化合物のスクリーニング法。
（１４）  レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、上記（１３）のスクリーニング法。
（１５）  上記（１１）〜（１４）いずれか１つに記載のスクリーニング法で得られる化合物を含む慢性関節リウマチの予防薬または治療薬。
配列番号２記載の塩基配列は、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（以下、ＸＬＰと略す）およびＩｇＡ腎症との関連が示唆されている公知のＳＡＰ遺伝子〔Ｎａｔｕｒｅ，３９５，４６２（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０，１２９（１９９８）、ＷＯ９８−２４８９９〕の有する塩基配列と同一であることが判明した。ＳＡＰ遺伝子がＲＡに関与することは本発明において初めて明らかにされた。
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡ（以下、ＲＡ関連ＤＮＡと略すこともある）の発現量を定量することによる慢性関節リウマチ（ＲＡ）の判定法
ＤＮＡ発現の定量方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング  第２版と略す）〕、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６−５１（１９９７）〕等をあげることができる。
特に、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）〕、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法は定量性に優れ、ＲＡの診断に利用することができる。
例えば、ＲＡ関連ＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、または該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行い、ＲＡ関連ＤＮＡの発現量を定量し、健常者と比較することによりＲＡを判定することができる。
該判定方法として、例えば、以下の方法をあげることができる。
被検者の白血球細胞由来全ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）またはｍＲＮＡ（１〜５μｇ）を、変性溶液〔５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、２．２ｍｏｌ／Ｌホルムアルデヒド、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕（ＰＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ〕中、６５℃で５分間加熱し、変性させ、２．２ｍｏｌ／Ｌホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動する。
電気泳動後、ゲル中のＲＮＡをニトロセルロースフィルター（Ｏｐｔｉｍａｌ  ＢＡ−Ｓ８５；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）上にブロッティングし、減圧下８０℃で１時間加熱し固定化する。
該フィルターをハイブリダイゼーション溶液〔５×ＳＳＰＥ（７５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）〕中に浸漬しプレハイブリダイゼーションを行う。
プレパイブリダイゼーション後、該溶液にプローブを添加し、６５℃でハイブリダイゼーションを行う。
プローブとしては、例えばＲＡ関連ＤＮＡ断片（１００〜２２７６塩基）をマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて３２Ｐで標識したものを使用できる。
ハイブリダイゼーション後のフィルターを、以下の順で洗浄する。
（１）０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、室温で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
（２）０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、５０〜７０℃で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
（３）５０〜７０℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸ナトリウム）溶液中、５０〜７０℃で１５分間洗浄する。これを数回繰り返す。
フィルター洗浄後、イメージングプレートを用いてオートラジオグラフィーを行い、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）でＲＡ関連ＤＮＡの発現を検出・定量することができる。
また、例えば、ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡに特異的な１組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、被検者の白血球細胞由来全ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはこれらＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片を検出・定量し、健常者と比較することによりＲＡを判定することができる。
上記オリゴヌクレオチドとしては、ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により得られる、あるいは該全ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により合成された、該ＤＮＡの一部の配列を有する、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドをあげることができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号２で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には、配列番号３〜７に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等をあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
増幅させる塩基配列部分としては、ＲＡ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡのいかなる塩基配列領域でもよいが、塩基配列の長さが５０ｂｐから２ｋｂｐであり、反復配列あるいはＧＣ（グアニン・シトシン）塩基に富む配列を含まない塩基配列領域が好ましい。
また、該方法を用い、翻訳領域を増幅させることにより、翻訳領域における変異の有無を調べることができる。
白血球細胞としては、軟膜（Ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）または分離・取得した各種白血球細胞を用いることができる。
軟膜は、被検者の末梢血を３，０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離し、血漿と赤血球画分の中間層にあたる画分を分取することにより、取得することができる。
各白血球細胞としては、多形核白血球、単球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞等をあげることができる。
多形核白血球および単核球は、被検者の末梢血より、ナイコメッド・ファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）社製のキットであるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭを用いることにより、分離・取得することができる。
取得した単核球より、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）等に記載の方法により、単球およびリンパ球を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，９，１５３（１９７７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，２７３（１９７６）、Ｎｙｃｏｍｅｄ社の血球細胞の単離法に関するマニュアル等に記載の方法により、Ｔ細胞やＢ細胞を分離・取得することができる。
Ｔ細胞はナイロンウール法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，，３，６４５（１９７３）〕を用いて取得することもできる。また、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージにそれぞれ特異的な抗体を結合した磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ）を用いて、各細胞を分離・取得することができる。
白血球細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）〕等をあげることができる。
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング  第２版）等をあげることができる。
また、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ・アイソレーション・キット〔Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ファルマシア社製）等のキットを用いてｍＲＮＡを調製することもできる。
一本鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから、一本鎖ｃＤＮＡ合成キットＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ社製）を用いて、合成することができる。合成は、キットに添付のマニュアルに従って行うことができる。
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識する抗体
配列番号２記載の塩基配列は、ＷＯ９８−２４８９９「ＩｇＡ腎症関連遺伝子」の配列番号６記載の塩基配列と同じものであり、該公開特許公報に該塩基配列を有するＤＮＡのコードするポリペプチドを認識する抗体の取得方法が詳述されている。従って、該方法に準じて、本発明に利用可能な抗体を取得することができる。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体を認識する抗体を用いた慢性関節リウマチ（ＲＡ）の判定法
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体を認識する抗体を用いて、白血球細胞における該ポリペプチドの発現を免疫学的に検出または定量することにより、ＲＡの判定をすることができる。
免疫学的に検出する方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等をあげることができる。
免疫学的に定量する方法としては、液相中でＲＡ関連ポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識したＲＡ関連ポリペプチドと該ポリペプチドを認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
（４）慢性関節リウマチ（ＲＡ）の診断薬
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡの塩基配列中の連続した１００〜２２７６塩基と同じ配列を有するＤＮＡ、上記ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０残基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および上記オリゴヌクレオチドの修飾体であるオリゴヌクレオチド修飾体から選ばれるＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含有してなるＲＡ判定用試薬は、ＲＡの診断薬として、例えば（１）に記載の判定方法に使用することができる。
また、（２）に記載の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体を認識する抗体を含有してなる試薬は、ＲＡ診断薬として、例えば（３）に記載の判定方法に使用することができる。
（５）慢性関節リウマチ（ＲＡ）の予防薬および治療薬、または該薬剤の探索法への配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの利用
ＲＡ患者の白血球細胞においては、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量が減少することから、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量あるいは該ポリペプチドの発現量を増加させることにより、ＲＡの予防または治療が可能である。
白血球細胞において配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を増加させる方法としては、白血球細胞または骨髄幹細胞に、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを導入する方法がある。白血球細胞または骨髄幹細胞にＤＮＡを導入する方法としては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ＨＩＶウイルス、他のレンチウイルスなどのウイルスベクターを用いる方法、あるいは非ウイルス性のベクターを用いる方法があり、該方法を用いて遺伝子治療を行うことができる〔Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３０，３３５−３４７（１９９８）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８０，３５−４７，（１９９８）、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６，６９６−７００（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１５，１１４９５−１１３９９（１９９６）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１３，１０６−１１３（１９９５）〕。白血球細胞または骨髄幹細胞にＤＮＡを導入する方法としては、他にＭａｍｍａｌｉａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓを用いる方法もある〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８，３５１−３５９（１９９８）〕。
また、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進する活性を有する化合物は、該ポリペプチドの発現量を増加させることが可能である。上記活性を有する化合物は、以下の（ａ）〜（ｃ）に示すスクリーニング法によって取得可能である。
（ａ）ＲＡ関連ポリペプチドを発現する細胞を、被験化合物の存在下で、２時間から１週間培養した後、細胞中の該ポリペプチド量を、上記（２）の抗体を用いて測定し、該ポリペプチド量を増加させる活性を有する化合物を選択・取得する。
ＲＡ関連ポリペプチドを発現する細胞としては、ＷＯ９８−２４８９９「ＩｇＡ腎症関連遺伝子」の配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡを発現する該文献に記載の細胞、または該文献に記載の方法に準じて取得される細胞等をあげることができる。該細胞の培養も、ＷＯ９８−２４８９９に記載の方法に準じて行うことができる。
抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）ＲＡ関連ポリペプチドを発現する細胞を、被験化合物の存在下、２時間から１週間培養後、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を、上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等の方法を用いて測定し、該発現量を増加させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｃ）常法に従い、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子中に存在するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを作製し、動物細胞に導入して形質転換体を取得する。該形質転換体を被験化合物の存在下２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所  制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定し、該発現量を増加させる活性を有する化合物を選択・取得する。該化合物はＲＡ関連ポリペプチドの発現量を増加させることができる。
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターは、公知の方法〔東京大学医科学研究所  制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕により取得することが可能である。また、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター配列を含むと思われる配列は既に知られている〔ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＥＭＢＬ  ＡＬ０２３６５７〕ため、該配列を利用し、化学合成することにより取得することもできる。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子等をあげることができる。
（６）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する慢性関節リウマチ（ＲＡ）の予防薬または治療薬
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２に記載の塩基配列の１０３〜４８６番目の塩基配列を有するＤＮＡをレトロウィルス、アデノウィルス等のウィルスベクターやその他遺伝子治療用のベクターに組み込んだ遺伝子治療用ベクターを遺伝子治療薬または予防薬として用いるには、該遺伝子治療用ベクターと遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法をあげることができる。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソンポリペプチドに特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
（−）鎖ＲＮＡウイルスであるセンダイウイルスをベースにしたウイルスベクターも開発されており（特願平９−５１７２１３、特願平９−５１７２１４）、遺伝子治療を目的として配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだセンダイウイルスベクターを作製することができる。
また、非ウイルス遺伝子移入法によっても目的とする治療部位にＤＮＡを輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５，（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）〕あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）〕等をあげることができる。  リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている〔Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３，３９９−４１０（１９９２）〕。ＤＮＡを目的とする治療部位に直接ターゲッティングするには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−ポリペプチドコンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
（７）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの転写効率または発現を増加させる化合物を含有するＲＡの予防薬または治療薬
化合物またはその塩を上記の予防薬または治療薬、すなわち医薬組成物として使用する場合、常法に従って製剤化することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＧＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  慢性関節リウマチ患者および健常人の白血球細胞からの全ＲＮＡの取得
専門の医師による総合的診察に基づき、ＲＡと診断された患者１２名および健常人８名より各々２０ｍｌ採血した。１，０００単位／ｍｌのヘパリンを５００μｌ添加し、凝固を抑制後、遠心チューブに移し、室温で３，３００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、白血球画分として軟膜を取得した。
取得した軟膜から、ＡＧＰＣ法〔実験医学，９，１９３７，（１９９１）〕またはＲＮＡ回収用キット（ＲＮＡｅａｓｙ：ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを取得した。
コントロールとして、全身性エリテマトーデス（以下、ＳＬＥと略す）の患者７名、微少変化ネフローゼ（以下、ＭＣＮＳと略す）の患者５名、巣状糸球体硬化症（以下、ＦＧＳと略す）の患者１名、慢性腎症（以下ＣＧＮと略す）の患者３名、膜性腎症（以下、ＭＮと略す）の患者６名およびメサンギウム増殖性腎炎（以下、ＭＰＧＮと略す）の患者３名の白血球細胞からも、同様にして全ＲＮＡの取得を行った。
また、ＲＡ患者４例、シェーグレン症候群患者４例および健常人５例よりＴ細胞を分取し、上記と同様にして全ＲＮＡを取得した。Ｔ細胞の取得は以下のように行った。ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて血液２０ｍｌから単核球画分を取得し、次いでＤｙｎａｌ社製の磁気ビーズ〔Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｐａｎ−Ｔ（ＣＤ２）〕を用いて、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｈａｎｄｂｏｏｋに記載の方法に準拠してＴ細胞を取得した。
実施例２  一本鎖ｃＤＮＡの合成
実施例１で取得した全ＲＮＡ２μｇからＢＲＬ社製のキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し（反応液２１μｌ）、３９９μｌの蒸留水を添加後、以下のＰＣＲの鋳型として用いた。
実施例３  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いたＲＡ関連ＤＮＡの発現量の測定
Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６−５１（１９９７）〕を用いて、ＲＡ関連ＤＮＡの定量を、下記の方法で行った。また、どの細胞でも同程度発現していると考えられるヒト・グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ３ＰＤＨあるいはＧＡＰＤＨと略す）遺伝子の転写産物の定量も同時に行い、ＲＡ関連ＤＮＡの発現量をＧ３ＰＤＨの発現量で割って補正を行った。
Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ７７００）を用い、インストラクションマニュアルに記載の方法に準拠して行った。
（１）定量用スタンダードの調製
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）に、配列番号２記載のＤＮＡ（クローン名ＰＨＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１−２８−１；ＷＯ９８−２４８９９）を組み込んだプラスミド（ＷＯ９８−２４８９９）より、ＰＨＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１−２８−１部分を切り出す制限酵素で完全に切断し、直鎖状ＤＮＡを取得した。
該ＤＮＡを、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌ含む水で段階的に希釈し、ＲＡ関連ＤＮＡ転写物定量用のスタンダードＤＮＡとして用いた。
ｐＵＣ１１９にＧ３ＰＤＨｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＵＣ１１９−Ｇ３ＰＤＨを造成した。
ｐＵＣ１１９−Ｇ３ＰＤＨをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素で切断し、直鎖状ＤＮＡを取得した。該ＤＮＡを、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌ含む水で段階的に希釈し、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子転写産物定量用のスタンダードＤＮＡとして用いた。
（２）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いたＲＡ関連ＤＮＡの発現量の定量
実施例２で調製した白血球細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。
ＲＡ関連ＤＮＡの発現量を定量するためのＰＣＲ用プライマーとしては、配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを使用した。
Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲには、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入したＴａｑＭａｎプローブを用いた。該プローブは、配列番号５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端をそれぞれフルオレッセイン系の蛍光色素である６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（レポーター色素）およびローダミン系の蛍光色素である６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（クエンチャー色素）で標識したものである。
ＰＣＲに用いる反応液５０μｌの組成は、１Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、商品番号４３０４４４７を使用）、フォワードプライマー（最終濃度２００ｎｍｏｌ／Ｌ）、リバースプライマー（最終濃度２００ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＴａｑＭａｎプローブ（最終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、鋳型（スタンダードＤＮＡまたは白血球由来一本鎖ｃＤＮＡ）１０μｌである。
サーマルサイクラーを、５０℃で２分間、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で３０秒間、６２℃で１分３０秒間の反応を１サイクルとして５０サイクル行う条件に設定し、ＰＣＲを行った。
ＲＡ関連ＤＮＡ転写物定量用のスタンダードＤＮＡを用いて検量線を作成し、各一本鎖ｃＤＮＡ中のＲＡ関連遺伝子の発現量を定量した（第１〜４表）。
Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量も同様に、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子転写産物定量用のスタンダードＤＮＡを用いて検量線を作成し、定量した（第１〜４表）。プライマー及びＴａｑＭａｎプローブにはＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、商品番号４０２８６９）を用いた。
ＲＡ関連ＤＮＡ転写物の発現量をＧ３ＰＤＨ遺伝子転写物の発現量で割り、ＲＡ関連遺伝子の相対発現量を求めた。
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ＲＡ患者は、健常者と比較し、相対的にＲＡ関連ＤＮＡの相対発現量が少なく、非常に少ない患者（ＲＡ２、ＲＡ８、ＲＡ９）も存在することが判明した。
ＲＡ患者、健常者、ＳＬＥ患者におけるＲＡ関連ＤＮＡの相対発現量の平均値を用いた比較結果を第１図に示した。
ＲＡ患者において、明らかに平均発現量の低いことがわかる。
また、実施例２で調製したＴ細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、上記と同様にしてＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。
健常人５例、ＲＡ患者４例およびシェーグレン症候群患者４例のＴ細胞におけるＲＡ関連ＤＮＡの発現量を測定した結果、ＲＡ関連ＤＮＡ（ＲＡ−ＲＤ）のＧ３ＰＤＨに対する相対発現量（ＲＡ−ＲＤ／Ｇ３ＰＤＨ）の平均は、健常人で０．０７７９±０．０１、ＲＡ患者で０．０１９８±０．０１２４、シェーグレン症候群患者で０．０３８９±０．０１５９となり、ＲＡ患者では健常人やシェーグレン症候群患者に比べて有意に低いことが判明した。
以上の結果より、ＲＡ関連ＤＮＡ発現量を調べることにより、ＲＡの発症の予測、判定が可能と考えられる。ＲＡ患者においてＲＡ関連ＤＮＡの発現量が低下していることより、ＲＡ関連ＤＮＡの発現量を増加させることにより、ＲＡの予防や治療が可能と考えられる。
実施例４  ＲＡ患者白血球由来ＲＡ関連ＤＮＡの塩基配列解析
ＲＡ患者白血球由来のＲＡ関連ＤＮＡについて変異が存在するかどうか解析を行った。
実施例２で調製したＲＡ患者の白血球細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型、配列番号６および配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲを行うことにより、ＲＡ患者のＲＡ関連ＤＮＡを増幅した。
即ち、５μｌの白血球一本鎖ｃＤＮＡに、蒸留水７．４μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造社製）２μｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ  １．６μｌ、ＤＭＳＯ  １μｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ  ＲＡ関連ＤＮＡ特異的フォワードプライマー（配列番号６）１μｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ  ＲＡ関連ＤＮＡ特異的リバースプライマー（配列番号７）１μｌ、１単位／μｌに希釈したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）１μｌを添加し反応液を調製した。
該反応液を用い、９４℃で３分間加熱し、氷中で５分間冷却した後、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の反応工程を１サイクルとして３０サイクル行う条件で、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、ダイレクトシークエンス法〔実験医学（増刊），１２，６０（１９９４）〕を用いて、上記ＲＡ関連ＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、パーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
第２表で示したＲＡ患者の中から、ＲＡ５、ＲＡ７、ＲＡ１０、ＲＡ１１の４名について、ＲＡ関連ＤＮＡの塩基配列を決定した。
これら４名のＲＡ患者いずれにも、翻訳領域における変異は認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＲＡ患者の白血球において発現量が低下しているＲＡ関連ＤＮＡまたは該ＤＮＡのコードするポリペプチドの発現量の低下を検出することに基づくＲＡの判定法、ＲＡ関連蛋白質の発現を上昇させることを特徴とするＲＡの予防法および治療剤、およびＲＡ関連ＤＮＡまたはＲＡ関連ポリペプチドの発現を増加させる化合物のスクリーニング法を提供することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いて、慢性関節リュウマチ患者１２名、全身性エリテマトーデス患者７名および健常人８名の、白血球におけるＲＡ関連ＤＮＡ（ＲＡ−ＲＤ）の発現量の各々の平均を比較した結果を示した。誤差範囲はｐ＝０．０１で示した。
【図１】
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