(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載の塩基配列の３’側非翻訳領域から第１８７４位より３’側で且つ第１８９９位〜第１９３５位のポリチミジン配列を含む配列を欠失させることを含む、組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡの製造方法、ここで、該組換えヒトＳＭＢＰは、配列番号：１に記載の塩基配列よりなるＤＮＡから発現するタンパク質よりも高い発現量で発現する。
【請求項２】
制限酵素Ksp632Iを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡが配列番号：１に記載の塩基配列における第１８７５位〜第２０７２位を欠失していることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡが配列番号：３に記載の塩基配列よりなる、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含有することを特徴とする、発現ベクターの製造方法。
（ａ）請求項１〜４いずれか記載の方法によりＤＮＡを作製する。
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを発現ベクターに挿入する。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含有することを特徴とする、形質転換細胞の製造方法。
（ａ）請求項１〜４いずれか記載の方法によりＤＮＡを作製する。
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを発現ベクターに挿入する。
（ｃ）前記（ｂ）の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。
（ｄ）前記（ｃ）の形質転換細胞を好適な条件下で培養する。
【請求項７】
請求項６記載の方法により形質転換細胞を得て、該形質転換細胞又はその細胞膜画分から組換えヒトＳＭＢＰを単離することを特徴とする、組換えヒトＳＭＢＰの製造方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法により形質転換細胞を得て、該形質転換細胞又はその細胞膜画分を用いることを特徴とする、ヒトＳＭＢＰアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、リガンド結合活性を示す組換えヒトＳＭ−１１０４４（（Ｌ））−ｔｈｒｅｏ−３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−Ｎ−［３−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｓｅｒｉｎｅ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）結合性レセプタータンパク質（以下、ＳＭＢＰと略記する）およびその用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、３’側非翻訳領域の塩基配列からポリチミジン配列を欠失させることにより、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞又はその細胞膜画分、あるいはこれら形質転換細胞又はその細胞膜画分から単離される組換えヒトＳＭＢＰ、さらにはこれら形質転換細胞、細胞膜画分、単離された組換えヒトＳＭＢＰを用いることを特徴とするヒトＳＭＢＰアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られるヒトＳＭＢＰアゴニストまたはアンタゴニストなどに関する。
背景技術
ＳＭ−１１０４４（（Ｌ）−ｔｈｒｅｏ−３−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−Ｎ−［３−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｓｅｒｉｎｅ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ  ａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）結合性レセプタータンパク質（ＳＭＢＰ）は、βアドレナリン作動性レセプターに対するアゴニストであるＳＭ−１１０４４、および、βアドレナリン作動性レセプターに対するアンタゴニストであるヨードシアノピンドロールが結合する新規なタンパク質として発見された（Ｓｕｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７））。該ＳＭＢＰは肺、回腸、結腸、好酸球膜に存在する膜タンパク質であり、ＳＭ−１１０４４のレセプターとして作用することが考えられている。すなわち、ＳＭ−１１０４４は腸における脱分極性の収縮反応を抑制的に調節する作用、および好酸球の遊走を抑制する作用を有することが知られているが、このようなＳＭ−１１０４４の機能は、ＳＭＢＰを介することにより発揮されると考えられている（Ｓｕｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７））。
近年、ヒトＳＭＢＰのｃＤＮＡがクローニングされたが（国際公開第９８／２６０６５号パンフレット）、ｃＤＮＡから翻訳された組換えタンパク質にＳＭ−１１０４４が結合するということは報告されていない。すなわち、リガンド結合活性の測定可能な程度にヒトＳＭＢＰを高発現させたという報告は未だなされておらず、ＳＭＢＰの具体的な利用方法については、確立されたものとは言えない状況にあった。
発明の開示
本発明は、リガンド結合活性を示す組換えヒトＳＭＢＰおよびその用途を提供することを目的とする。すなわち本発明は、３’側非翻訳領域の塩基配列からポリチミジン配列を欠失させることにより、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞又はその細胞膜画分、あるいはこれら形質転換細胞又はその細胞膜画分から単離される組換えヒトＳＭＢＰ、さらにはこれら形質転換細胞、細胞膜画分、単離された組換えヒトＳＭＢＰを用いることを特徴とするヒトＳＭＢＰアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られるヒトＳＭＢＰアゴニストまたはアンタゴニストなどを提供することを目的とする。
前述の如くＳＭＢＰは、腸における脱分極性の収縮反応を抑制的に調節する作用、および好酸球の遊走を抑制する作用を仲介するレセプターであると考えられている。従って、該ＳＭＢＰに対してアゴニスト活性を示す物質は、ＳＭＢＰに結合して前記作用を発揮することにより、例えば好酸球の浸潤を伴うような炎症性疾患、喘息、あるいは腸疾患などの治療剤となることが期待される。
本発明者は、このような治療剤の開発を念頭に置いて、当該ＳＭＢＰを用いてＳＭＢＰに結合性を示すリガンドを効率良くスクリーニングするスクリーニング系を構築することを考えた。しかし国際公開第９８／２６０６５号パンフレットによれば、抗ヒトＳＭＢＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより、組換えヒトＳＭＢＰのｃＤＮＡを導入したＣＯＳ細胞においてＳＭＢＰタンパク質が発現していることは記載されているが、ここで発現しているＳＭＢＰタンパク質はごく微量であり、結局、スクリーニング系を構築するのに充分な程ヒトＳＭＢＰを高発現させたという結果は、未だ報告されていない状況にあった。事実、本発明者が実際に国際出願（国際公開第９８／２６０６５号パンフレット）の出願人であるｖｅｔｉｇｅｎ社より該当するヒトＳＭＢＰ  ｃＤＮＡ断片（配列番号：１）を入手し、このｃＤＮＡをＣＯＳ−１細胞もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入してリガンドとの結合活性を測定したが、活性は認められなかった。このことから、１）ヒトＳＭＢＰ  ｃＤＮＡからタンパクへの翻訳が起こっていないか、あるいは２）翻訳が起こっていたとしても、リガンド結合活性を測定できる程には高発現していないことが考えられた。
本発明者は、ｃＤＮＡの構造に問題があるためタンパク質の発現が起こらない、あるいは起こりにくいのではないかと予想した。そこで配列番号：１に記載の塩基配列を再度検討したところ、３’側非翻訳領域中に３７個もの連続したポリチミジン配列が存在しており、このポリチミジン配列に対応するｍＲＮＡ上のポリウリジン配列が、ＳＭＢＰ  ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリアデニンテール（ｐｏｌｙ−Ａ）と結合して２次構造をとり、タンパクへの翻訳が制限されている可能性が考えられた。
以上の予想に基づき、配列番号：１に記載のヒトＳＭＢＰ  ｃＤＮＡの塩基配列の３’側非翻訳領域中に存在する当該ポリチミジン配列を欠失させた結果、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを高発現させることに初めて成功した。そして、このようにリガンド結合活性が測定可能となったことにより、ヒトに有効なＳＭＢＰアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングする系を確立することに初めて成功した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
（１）  ３’側非翻訳領域の塩基配列からポリチミジン配列を含む配列を欠失させることを特徴とする、組換えタンパク質の高発現方法、
（２）  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含有することを特徴とする、組換えヒトＳＭＢＰの高発現方法、
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の３’側非翻訳領域からポリチミジン配列を含む配列を欠失させたＤＮＡを作製する、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを発現ベクターに挿入する、
（ｃ）前記（ｂ）の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する、
（ｄ）前記（ｃ）の形質転換細胞を好適な条件下で培養する、
（３）  以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有する、組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位の位置よりも３’側において、ポリチミジン配列を含む配列が欠失している、
（ｆ）該ＤＮＡの翻訳産物である組換えヒトＳＭＢＰが、リガンド結合活性の測定可能な程度に高発現し得る、
（４）  配列番号：１に記載の塩基配列における第１８９９位〜第１９３５位の全部又は一部を含む配列が欠失していることを特徴とする、前記（３）記載のＤＮＡ、
（５）  配列番号：１に記載の塩基配列における第１８７５位〜第２０７２位の部分が欠失していることを特徴とする、前記（４）記載のＤＮＡ、
（６）  配列番号：３に記載の塩基配列よりなる、前記（５）記載のＤＮＡ、
（７）  前記（３）〜（６）いずれか記載のＤＮＡを保持する発現ベクター、
（８）  前記（１）又は（２）記載の高発現方法により得られる、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えタンパク質を高発現させた形質転換細胞、又はその細胞膜画分、
（９）  前記（２）記載の高発現方法により得られる、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞、又はその細胞膜画分、
（１０）  前記（７）記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより得られる、前記（９）記載の形質転換細胞、又はその細胞膜画分、
（１１）  前記（９）又は（１０）記載の形質転換細胞又はその細胞膜画分から組換えヒトＳＭＢＰを単離することを特徴とする、組換えヒトＳＭＢＰの製造方法、
（１２）  前記（１１）記載の製造方法により得られる組換えヒトＳＭＢＰ、
（１３）  前記（９）又は（１０）記載の形質転換細胞又はその細胞膜画分、あるいは前記（１２）記載の組換えヒトＳＭＢＰを用いることを特徴とする、ヒトＳＭＢＰアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、
（１４）  前記（１３）記載のスクリーニング方法を用いて得られるヒトＳＭＢＰアゴニスト又はアンタゴニスト、ならびに
（１５）  前記（１４）記載のアゴニストを含有することを特徴とする、好酸球の遊走抑制剤、または腸の緊張の弛緩剤、に関する。
本発明において、ヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡの３’側非翻訳領域中に存在するポリチミジン配列を欠失させることにより、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを高発現させることに成功した。これは、当該ポリチミジン配列に対応するｍＲＮＡ上のポリウリジン配列が、ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリアデニンテール（ｐｏｌｙ−Ａ）と結合して２次構造をとり、タンパクへの翻訳が制限されていたのが、該ポリチミジン配列の欠失に伴い、タンパクへの翻訳が正常に起こったことによるものと考えられる。
以上のようなヒトＳＭＢＰ−ＤＮＡの場合のみならず、３’側にポリチミジン配列を有する他の組換えタンパク質のＤＮＡにおいても、ポリチミジン配列を削除することにより、同様の効果が生じるものと考えられる。すなわち本発明においては、３’側非翻訳領域の塩基配列からポリチミジン配列を含む配列を欠失させることを特徴とする、組換えタンパク質全般における高発現方法、さらには該高発現方法により得られる組換えタンパク質を高発現させた形質転換細胞、及びその細胞膜をも提供するものである。
組換えヒトＳＭＢＰを例にして、前記高発現方法の具体的な工程について列挙すると以下のようになる。すなわち、
（ａ）配列番号：１に記載のヒトＳＭＢＰ−ＤＮＡの塩基配列の３’側非翻訳領域からポリチミジン配列を含む配列を欠失させたＤＮＡを作製し、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを発現ベクターに挿入し、
（ｃ）前記（ｂ）の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
（ｄ）前記（ｃ）の形質転換細胞を好適な条件下で培養する、
という工程よりなる、組換えヒトＳＭＢＰの高発現方法である。これら（ａ）〜（ｄ）の各工程の詳細については、後に詳述する。
本発明においてＤＮＡとは、組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡであって、配列番号：１に記載の塩基配列の３’側非翻訳領域中に存在するポリチミジン配列を欠失させたＤＮＡであれば、どのようなＤＮＡであっても良い。具体例としては、組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡであって、かつ、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位の位置よりも３’側においてポリチミジン配列を含む配列が欠失しており、その効果として（ｂ）該ＤＮＡの翻訳産物である組換えヒトＳＭＢＰがリガンド結合活性の測定可能な程度に高発現し得る、という特徴を有するものが挙げられる。
ここで「ヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡ」は、国際公開第９８／２６０６５号パンフレットに記載されているヒトＳＭＢＰの塩基配列の情報に基づき、該塩基配列の適当な部分をＰＣＲのプライマーあるいはハイブリダイゼーションのプローブとして用いることにより、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）などの基本書を参照）により容易にクローニングすることができる。またクローニングされた該ＤＮＡを基にして、置換、欠失、付加などの改変（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．１５章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を行うことも可能であり、このような改変ＳＭＢＰをコードするＤＮＡも、該ＤＮＡの発現産物である改変ＳＭＢＰがＳＭ−１１０４４等のリガンドとの結合活性を有するものである限り、本発明の組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡの範疇に含まれる。
このような組換えヒトＳＭＢＰをコードするＤＮＡのうち、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位の位置よりも３’側においてポリチミジン配列を含む配列が欠失しており、（ｂ）該ＤＮＡの翻訳産物である組換えヒトＳＭＢＰが、リガンド結合活性の測定可能な程度に高発現し得る、という特徴を有するものが、本発明のＤＮＡの具体例として挙げられる。
ここで配列番号：１に記載のヒトＳＭＢＰ−ＤＮＡの塩基配列の第１８７５位までの配列に関しては、該配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位までの配列、あるいはこの配列に対して前記の如き改変を施した配列であって、かつ該ＤＮＡの発現産物である組換えヒトＳＭＢＰが、ＳＭ−１１０４４等のリガンドとの結合活性を有するような配列であれば、本発明の範疇に含まれる。具体的には、配列番号：１の第１８７４位までの配列、配列番号：３の第１８２７位までの配列などが挙げられる。
配列番号：１に記載の塩基配列における第１８７５位の位置よりも３’側に関しては、ヒトＳＭＢＰのタンパク質の発現を抑制していると考えられる「ポリチミジン配列」を含む配列が欠失したものであれば、本発明の範疇に含まれる。該ポリチミジン配列を含む配列の欠失方法としては、ポリチミジン配列の前後に適当な制限酵素部位があればそれを利用した欠失方法が挙げられ、また、ＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））などの周知の技術を用いても欠失させることが可能である。
ここで「ポリチミジン配列」とは、連続したチミジンを含む配列であって、該配列の欠失により、その翻訳産物である組換えヒトＳＭＢＰが、リガンド結合活性の測定可能な程度に高発現し得るような配列を指す。
ここで、リガンド結合活性の測定方法の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７）に記載の方法が挙げられる。この方法は、リガンドとして１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌを用いることによってリガンドとの結合反応を測定し、このｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌの非特異的結合反応は１０−４ＭのＳＭ−１１０４４を用いて求め、この結合反応から非特異的結合反応を差し引くことでＳＭＢＰタンパク質のリガンド結合活性を求めるという原理に基づくものである（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７））。
具体的には、本発明のＤＮＡの候補となるＤＮＡを発現ベクターに挿入してヒトＳＭＢＰ発現ベクターを作製し、該ＳＭＢＰ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を作製し、該形質転換細胞またはその細胞膜画分などを、前記のリガンド結合活性の測定系に供する（これら発現ベクター、形質転換細胞およびその細胞膜画分については後に詳述する）。該リガンド結合活性の測定方法の例としては、前述したＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７）に記載の方法にほぼ準じ、また実施例６にも詳しく述べられている方法が挙げらる。すなわち、あらかじめグラスファイバー濾紙をウエルの底部に装着した９６穴マルチスクリーンプレート（ミリポア社製）を、あらかじめ０．３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水（６Ｎ−ＨＣｌでｐＨ７．４に再調整）を加えて処理し、トリス−塩酸緩衝生理食塩水で吸引洗浄する（前処理）。次に、１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）および前記細胞膜画分（５０μｇ膜タンパク質）を含む２００μｌトリス−塩酸緩衝生理食塩水を、３７℃で３０分間インキュベーションし、この反応液を上記９６穴マルチスクリーンプレートの各ウエルに添加して吸引し、膜画分をグラスファイバー濾紙上に捕捉し、さらに２００μｌの氷冷トリス−塩酸緩衝生理食塩水で吸引濾過洗浄する。その後、濾紙上にトラップされた膜画分に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを総結合量とする。［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌの非特異的結合量は、１０−４ＭのＳＭ−１１０４４（住友製薬（株）社製、特開昭６０−１３２９３５、特公平５−５０４９９に記載の方法に準じて合成できる）存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより求める。このようにして得られた総結合量から非特異的結合量を差し引いたものをＳＭＢＰへのリガンド結合量とすることができる。
以上のようなリガンド結合活性の測定系に、本発明のＤＮＡの候補となるＤＮＡを導入した形質転換細胞又はその細胞膜画分などを供することにより、本発明のＤＮＡを容易に選択することができる。なお、前記測定方法は当業者の常識の範囲において適宜変更を加えることも可能である。例えば［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌの代わりに［１２５Ｉ］もしくは［３Ｈ］でラベルしたＳＭ−１１０４４、ＢＲＬ−３５１３５Ａ（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ社）、ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ（Ｃｉｂａ  Ｇｅｉｇｙ社）などを用いることも可能である。
本発明のＤＮＡの具体例のうち、好適なものとしては、配列番号：１に記載の塩基配列の３’側非翻訳領域中の第１８９９位〜第１９３５位に存在しているポリチミジン配列の全部又は一部のポリチミジン配列を含む配列の欠失したＤＮＡが挙げられる。ここで「一部」の長さとしては、ＳＭＢＰ  ｍＲＮＡの３’末端に付加されるポリアデニンテール（ｐｏｌｙ−Ａ）と結合して２次構造をとり得る長さという観点から、３０塩基程度の長さが好ましい。ただし該ポリチミジン配列の欠失により、組換えヒトＳＭＢＰが、リガンド結合活性の測定可能な程度に高発現し得るものであれば、いかなる長さであっても良い。
本発明のＤＮＡのより好適なものとしては、配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位〜第２０７２位の欠失したものが挙げられ、さらに好ましくは、配列番号：３に記載の塩基配列よりなるヒトＳＭＢＰのＤＮＡが挙げられる。
以上のような本発明のＤＮＡを、常法により発現ベクターに組み込むことにより、本発明のＤＮＡを保持するＳＭＢＰ発現ベクターを得ることができる。
ここで、本発明のＤＮＡを組み込むための発現ベクターとしては、宿主となる細胞で効率良く発現するベクターであれば何でも良いが、好ましくは、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＥＦ誘導体（全てインビトロジェン社製）、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（クロンテック社製）、ｐＲＥＰ９誘導体（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
このようにして作製したＳＭＢＰ発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、該宿主細胞の染色体中に前記本発明の発現ベクターを安定に保持する形質転換細胞を作製することができる。ここで宿主細胞としては外来遺伝子を宿主染色体中に安定に組み込むことのできる細胞であれば何でも良く、哺乳動物細胞が好ましい。例としては、ＣＨＯ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）などが挙げられる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，４５６−４６７（１９７３））、ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカー（例えば前記ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を発現ベクターとして用いた場合はＺｅｏｃｉｎを選択マーカーとして使用）を含む通常の培地にて培養することにより、前記本発明の発現ベクターが宿主染色体中に安定に組み込まれた形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、リガンド結合活性の測定可能な程度に組換えヒトＳＭＢＰを細胞膜上に高発現させた、本発明の形質転換細胞を製造することができる。
ここで「好適な条件下」とは、その宿主細胞に適した培養用培地により、３７℃、５％ＣＯ２下で培養する条件を指し、例えばＣＨＯ細胞の場合は、１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２培地にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する条件などが挙げられる。
以上のようにして得られたヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞より、本発明の細胞膜画分を調製することができる。細胞膜画分の調製方法としては、例えば低張ホモジネートバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦもしくは１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ７．４）を添加し、４℃で３０分間程度静置して低張破壊した後、ピペッティングでホモジナイズし、４℃で５００００×ｇ、３０分間遠心分離することにより、細胞膜画分の沈殿物を得ることができる。そして、この沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理食塩水（トリス−塩酸緩衝液、１５４ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に懸濁することにより、本発明の細胞膜画分を得ることができる。
その他、例えばＦ．Ｐｉｅｔｒｉ−Ｒｏｕｘｅｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７，１１７４−１１７９（１９９７））らの方法などにより、本発明の細胞膜画分を得ることができる。
上記で得られた組換えヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞またはその細胞膜画分から、本発明の組換えヒトＳＭＢＰを単離することが可能である。すなわち、例えばＲ．Ｇ．Ｓｈｏｒｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，２７７８−２７８２（１９８２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１２３４１−１２３５０（１９８２））の方法により、本発明のヒトＳＭＢＰの粗抽出液を得ることができる。また、該粗抽出液からヒトＳＭＢＰを精製する方法としては、例えばＪ．Ｌ．Ｂｅｎｏｖｉｃら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３，４５１０−４５１８（１９８４））の方法が挙げられる。
本発明の組換えヒトＳＭＢＰの具体例としては、例えば配列番号：２又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列よりなるヒトＳＭＢＰなどの他に、これらのアミノ酸配列について置換、欠失、付加を行った改変ＳＭＢＰなども、ＳＭ−１１０４４等のリガンドとの結合活性を有するものである限り、本発明の組換えヒトＳＭＢＰの範疇に含まれる。
上記で得られた組換えヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞、その細胞膜画分、あるいは単離した組換えヒトＳＭＢＰのいずれかを用いることにより、ヒトＳＭＢＰに結合するアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
このうち、本発明のヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞の細胞膜画分を用いる場合は、例えば以下の方法によりスクリーニングを行うことができる。
すなわちまず、本発明の細胞膜画分（５０〜２００μｇ膜タンパク質）と、１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌとを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水を３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションし、この反応液を、先の「リガンド結合活性の測定方法」と同様の前処理を行った９６穴マルチスクリーンプレートの各ウエルに添加して吸引し、その後も先のリガンド結合活性の測定方法と同様の処理を行った後、濾紙上にトラップされた膜分画に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを結合量Ａとする。次に、常識範囲の濃度（１０−１２〜１０−４Ｍ）の被験化合物の存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより得られた結合量を結合量Ｂとする。また、前記被験化合物の代わりに１０−４ＭのＳＭ−１１０４４を用いて得られた結合量を結合量Ｃとする。そして、ＡからＢを差し引いた値が、ＡからＣを差し引いた値と同等の場合は１００％、半分の場合は５０％のＳＭＢＰ結合能が前記被験化合物にあるものと判定する。このようにして選択されたＳＭＢＰリガンドを、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１６，２０７−２１５（１９９２）、あるいはＡｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３７，２３３−２３７（１９９２）に記載のアッセイ法に供した場合に、ＳＭ−１１０４４と同等あるいはそれ以上に腸の収縮反応を抑制的に調節するか、あるいは好酸球の遊走を抑制する作用を有する場合はＳＭＢＰアゴニストと認定することができ、また、逆の作用を有する場合はＳＭＢＰアンタゴニストであると認定することができる。
また、本発明のヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞をそのままスクリーニングに用いる場合は、例えば以下の方法により行うことができる。
すなわちまず、本発明のヒトＳＭＢＰを高発現させた形質転換細胞を、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水（ギブコ）で洗浄し、１〜５ｍＭ  ＥＤＴＡ−ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水とともに室温でインキュベートして培養皿から剥離させる。遠心分離（４００ｘｇ，１０ｍｉｎ，４℃）し、上清を吸引除去し、０．２％ウシ血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水を加えてピペッティングにより懸濁する。５ｘ１０６個の細胞、１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ、０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水を３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションし、この反応液を、先の「リガンド結合活性の測定方法」と同様の前処理を行った９６穴マルチスクリーンプレートの各ウエルに添加して吸引し、その後も先のリガンド結合活性の測定方法と同様の処理を行った後、濾紙上にトラップされた膜分画に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを結合量Ａとする。次に、常識範囲の濃度（１０−１２〜１０−４Ｍ）の被験化合物の存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより得られた結合量を結合量Ｂとする。また、前記被験化合物の代わりに１０−４ＭのＳＭ−１１０４４を用いて得られた結合量を結合量Ｃとする。以下、上記と同様に判定する。
さらに、本発明の形質転換細胞または細胞膜画分より単離した組換えヒトＳＭＢＰをスクリーニングに用いる場合は、例えば以下の方法により行うことができる。
まず、適当な可溶化剤（β−Ｄ−オクチルグルコシドがのぞましい）で形質転換細胞又はその細胞膜画分を可溶化することにより単離したＳＭＢＰ標品と１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水２５０μｌを３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションし、氷冷したトリス−塩酸緩衝生理食塩水を２５０μｌ加えて反応を停止させる。以降４℃の条件下で、この反応液をトリス−塩酸緩衝生理食塩水で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム（ファルマシア社製）に適用し、トリス−塩酸緩衝生理食塩水で溶出する。このようにゲル濾過で分離されたＳＭＢＰ分画に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを結合量Ａとする。次に、常識範囲の濃度（１０−１２〜１０−４Ｍ）の被験化合物の存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより得られた結合量を結合量Ｂとする。また、前記被験化合物の代わりに１０−４ＭのＳＭ−１１０４４を用いて得られた結合量を結合量Ｃとする。以下、上記と同様に判定する。
なお、前記スクリーニング方法は、当業者の常識の範囲において適宜変更を加えることも可能である。
以上のようなスクリーニングにより得られたヒトＳＭＢＰのアゴニストは、好酸球の遊走抑制剤、または腸の緊張の弛緩剤として有用であり、より具体的には、好酸球の浸潤を伴うような炎症性疾患、喘息、あるいは腸疾患（たとえばアレルギー性胃腸症）の治療または予防剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られるアゴニストまたはアンタゴニストを上述の如き医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、経口的に投与する場合、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等で投与することができる。非経口的投与する場合は例えば、溶液、乳剤、懸濁液等の液剤を注射剤として投与すること、坐剤の型で直腸投与すること等ができる。このような投与剤型は通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤などと有効成分を配合することにより一般的方法に従って製造することができる。注射剤型で用いる場合には緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重等、及び投与形態等によって異なるが、経口投与する場合、有効成分は通常は成人に対し１日あたり約１〜約１０００ｍｇの範囲、好ましくは約１０〜約５００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。注射剤として投与する場合、有効成分は約０．１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約３〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡ  ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切断フラグメントの発現ベクターへの組み込み
国際公開第９８／２６０６５号パンフレットに記載のＳＭＢＰ−ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切断フラグメントを、該特許出願の出願人であるｖｅｔｉｇｅｎ社より入手した。このｃＤＮＡの塩基配列を、宝酒造（株）に依頼して常法により塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号：１に、また該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。該配列番号：１に記載の塩基配列は、前記国際公開第９８／２６０６５号パンフレットにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として開示された塩基配列を含み、かつ、さらに５’側および３’側の配列が付加されたものである。
次にこのｃＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで開裂した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（インビトロジェン社製）に組み込み、発現プラスミドＳＭＢＰ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を得た。得られたプラスミドＳＭＢＰ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を用いて大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡績株式会社製）を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で一夜培養し、形質転換体を得た。形質転換体から常法により調整したプラスミドをＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断し、ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡ（約２ｋｂ）が挿入されていることを確認した。またＡｐａＩで切断し、挿入方向を確認した。
実施例２
ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡフラグメントへのＫｏｚａｋ配列の結合と発現ベクターへの組み込み
ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡフラグメントのスタートコドンであるＡＴＧ（配列番号：１の第４９位〜第５１位）の周辺には、ｍＲＮＡを効率よく蛋白質へ翻訳させるのに必要と推察されるｋｏｚａｋの共通配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）（Ｍ．ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０８，２２９（１９８９））が存在していない。従ってタンパク質発現効率の上昇を目的として、以下のようにしてＳＭＢＰ−ｃＤＮＡフラグメントのスタートコドン周辺をＡＣＣＡＴＧＧに入れ換えた。
まず、２種類の異なるオリゴマーを７０℃で１０分間アニーリングすることで、Ｋｏｚａｋの共通配列を含み、かつＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ切断部位を有する以下のようなアダプターを作製した。
Ｋｏｚａｋ配列を含有するアダプター
５’−ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ−３’
３’−ＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  Ｇ−５’
このようにして得たアダプターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで開裂した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に組み込み、プラスミドＫｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を得た。得られたプラスミドＫｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で一夜培養し、形質転換体を得た。
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ間にはＢａｍＨＩ切断部位があるため、アダプターが挿入されていなければＢａｍＨＩで切断される。そこで、アダプター挿入の有無は、形質転換体から調整したプラスミドがＢａｍＨＩで切断されないことにより確認した。
次に、ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切断フラグメントをＮｏｔＩで切断して得られたＳＭＢＰ−ｃＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩで開裂した先のＫｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に組み込み、発現プラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を得た。得られたプラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で一夜培養し、形質転換体を得た。形質転換体から調整したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡ（約２ｋｂ）が挿入されていることを確認した。またＡｐａＩで切断し、挿入方向を確認した。
以上のようにして作製されたプラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）から翻訳されるＳＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第２位〜第４位の３つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が欠失している。
実施例３
発現プラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）からのポリチミジン配列の除去、および発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）への再組み込み
ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡのストップコドン（ＴＡＧ）の下流には、チミジンが３７個連続するポリチミジン配列（ｐｏｌｙ−Ｔ）が存在している（配列番号：１の塩基配列の第１８９９位〜１９３５位の部分）。本発明者らは、このｐｏｌｙ−ＴのｍＲＮＡ上の対応ｐｏｌｙ−Ｕが、ＳＭＢＰ−ｍＲＮＡの３’末に存在するポリアデニンテール（ｐｏｌｙ−Ａ）と結合して二次構造をとることによりｍ−ＲＮＡを不安定化するか、あるいは核膜を通りにくくしており、そのため蛋白質への翻訳が制限されているのではないかと考えた。そこで、以下の手順により配列番号：１に記載の塩基配列の第１８７５位以降を制限酵素Ｋｓｐ６３２Ｉで切断し、ｐｏｌｙ−Ｔ部分を含む１９８塩基部分を除去したＳＭＢＰ−ｃＤＮＡフラグメントを得、これを発現ベクターに組み込んだ。
すなわち、実施例２で作製した発現プラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）をＫｓｐ６３２Ｉで切断し、ｐｏｌｙ−Ｔを含む１９８塩基部分が除去されたＳＭＢＰ−ｃＤＮＡとｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）の一部が結合したフラグメント（約２．９ｋｂ）を分取した。さらにこのフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｓｐ６３２Ｉ切断フラグメント（約１．８ｋｂ）を分取した。このフラグメントの両末端をＴ４ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造株式会社製）で平滑化し、ＥｃｏＲＶで開裂した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）に組み込み、発現プラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅを得た。この発現プラスミドＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅの有するＳＭＢＰ−ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、またそのアミノ酸配列を配列番号：４に、それぞれ記載する。
この発現ベクターＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で一夜培養し、形質転換体を得た。形質転換体から調整したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切断し、ＳＭＢＰ−ｃＤＮＡ（約２ｋｂ）が挿入されていることを確認した。また、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｇｅＩで切断し、挿入方向を確認した。
実施例４
ヒトＳＭＢＰ発現プラスミドの動物細胞への導入
ＣＨＯ−ｋ１細胞を２×１０５細胞／ウエルとなるように６穴プレートに播き、１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＭ’ｓＦ−１２培地で２４時間培養し、この細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（コントロール）または実施例１〜３で得たヒトＳＭＢＰ蛋白質の発現プラスミドＳＭＢＰ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）またはＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅをそれぞれ遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いて導入した。導入５日後から、１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２培地で培養し、プラスミドを染色体に組み込んだ細胞を選択した。
実施例５
ヒトＳＭＢＰ蛋白質を含有するＣＨＯ細胞膜画分の調製
実施例４で得たヒトＳＭＢＰ蛋白質を含有するＣＨＯ細胞を、直径１０ｃｍの培養皿で付着培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷冷した低張ホモジネートバッファー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦもしくは１ｍＭＡＥＢＳＦ、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、４℃で３０分間静置して低張破壊した。ピペッティングでホモジナイズし、４℃で５００００×ｇ、３０分間遠心分離し、粗膜画分の沈殿物を得た。この沈殿物をトリス−塩酸緩衝生理食塩水（トリス−塩酸緩衝液、１５４ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に懸濁し、−８０℃で保存し、使用の都度、解凍して用いた。蛋白質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとしてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で測定した。
実施例６
ヒトＳＭＢＰタンパク質のリガンド結合活性の測定
ヒトＳＭＢＰタンパク質に対するリガンド結合反応は、リガンドとして１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いることによって測定し、このｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌの非特異的結合反応は１０−４ＭのＳＭ−１１０４４（住友製薬社製）を用いて求め、ＳＭＢＰタンパク質のリガンド結合活性は結合反応から非特異的結合反応を差し引くことで計算できることが、Ｓｕｇａｓａｗａら（Ｓｕｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７））によって報告されている。
従ってこの文献に準じてＳＭＢＰタンパク質のリガンド結合活性を測定した。さらに、結合実験の高速化をはかるため、アッセイは９６穴マイクロタイタープレートを用いた方法で行った。
まず、グラスファイバー濾紙をウエルの底部に装着した９６穴マルチスクリーンプレート（ミリポア社製）に、あらかじめ０．３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水（６Ｎ−ＨＣｌでｐＨ７．４に再調整）を加えて３０分以上処理し、トリス−塩酸緩衝生理食塩水で吸引洗浄した（前処理）。
次に、１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌおよび実施例５で調製した各粗膜画分（５０μｇ膜タンパク質）を含む２００μｌトリス−塩酸緩衝生理食塩水を、３７℃で３０分間インキュベーションし、この反応液を上記９６穴マルチスクリーンプレートの各ウエルに添加して吸引し、膜分画をグラスファイバー濾紙上に捕捉し、さらに２００μｌの氷冷トリス−塩酸緩衝生理食塩水で４回吸引濾過洗浄した。濾紙上にトラップされた膜分画に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを総結合量とした。ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌの非特異的結合量は、１０−４ＭのＳＭ−１１０４４存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより求めた。総結合量から非特異的結合量を差し引いたものをＳＭＢＰへのリガンド結合量（特異的結合量）とした。結果を図１に示す。
国際公開第９８／２６０６５号パンフレットに記載のＳＭＢＰ−ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミド（実施例１）を導入したＣＨＯ細胞（図中、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ）の膜画分、およびＫｏｚａｋ配列を挿入した発現プラスミド（実施例２）を導入したＣＨＯ細胞（図中、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ）の膜画分を用いた場合は、コントロール（図中、ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３．１）に比べて有意なリガンド結合活性を示さなかった。それに対し、Ｋｏｚａｋ配列を挿入し、かつｐｏｌｙ−Ｔ配列を除去した発現プラスミド（実施例３）を導入したＣＨＯ細胞（図中、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｏｌｙ  Ｔ  ｆｒｅｅ）の膜画分を用いた場合は、コントロールおよびｐｏｌｙ−Ｔ配列除去前のＣＨＯ−ＳＭＢＰ細胞に比べて有意なリガンド結合活性を示した。従って、ｐｏｌｙ−Ｔ配列を除去することにより、リガンド結合活性を示す程度にＳＭＢＰタンパク質が細胞膜上に発現してくることが明らかとなった。
実施例７
ヒトＳＭＢＰタンパク質のリガンドのスクリーニング
ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅを導入したＣＨＯ細胞の細胞膜画分（実施例５で作製）５０μｇ膜タンパク質と、１ｎＭの［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌとを含む２００μｌトリス−塩酸緩衝生理食塩水を３７℃、３０ｍｉｎインキュベーションし、この反応液を、実施例６と同じく前処理した９６穴マルチスクリーンプレートの各ウエルに添加して吸引し、その後も実施例６と同様の処理を行った後、濾紙上にトラップされた膜分画に結合した［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌ量をガンマーカウンターで測定し、これを結合量Ａとする。次に、常識範囲の濃度（１０−１２〜１０−４Ｍ）の被験化合物の存在下で上記インキュベーションを行い、その後同様の操作を行うことにより得られた結合量を結合量Ｂとする。また、前記被験化合物の代わりに１０−４ＭのＳＭ−１１０４４を用いて得られた結合量を結合量Ｃとする。そして、ＡからＢを差し引いた値が、ＡからＣを差し引いた値と同等の場合は１００％、半分の場合は５０％のＳＭＢＰ結合能が前記被験化合物にあるものと判定する。このようにして選択されたＳＭＢＰリガンドを、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２６７，２１２４４−２１２５２（１９９７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１６，２０７−２１５（１９９２）、あるいはＡｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３７，２３３−２３７（１９９２）に記載のアッセイ法に供することにより、腸の収縮反応を抑制的に調節するか否か、あるいは好酸球の遊走を抑制するか否かなどの、ＳＭＢＰアゴニスト活性を有するか否かを測定することができる。
産業上の利用の可能性
本発明のポリチミジン配列を除去したヒトＳＭＢＰ  ｃＤＮＡを保持する発現プラスミドにより形質転換された形質転換細胞は、リガンド結合活性の測定可能な程度にヒトＳＭＢＰを高発現することができる。従って、本発明の組換えヒトＳＭＢＰを含有する形質転換細胞、その細胞膜画分、あるいは該細胞またはその細胞膜画分から単離された組換えヒトＳＭＢＰを用いることにより、ヒトＳＭＢＰに結合するリガンドをスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、ヒトＳＭＢＰアゴニストまたはアンタゴニストを効率良くスクリーニングすることができる。ヒトＳＭＢＰに結合する化合物をスクリーニングする方法としては、ヒト組織を用いることも可能であるが、そのような方法ではヒト組織に存在するＳＭＢＰ以外のレセプター、例えばヒトβ１−、β２−もしくはβ３−アドレナリン作動性レセプター等に結合するリガンドとの区別が困難である。本発明のスクリーニング方法によれば、ヒトＳＭＢＰアゴニストまたはアンタゴニストを効率良く確実に選択することができるので、例えば、好酸球の浸潤を伴うような炎症性疾患の予防・治療剤、抗喘息剤、腸疾患治療剤などの医薬品を早期に開発することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＳＭＢＰ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）、あるいはＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ｐｏｌｙ−Ｔ  ｆｒｅｅを導入したＣＨＯ細胞（図中、それぞれＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３．１、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ、ＣＨＯ−ＳＭＢＰ−Ｋｏｚａｋ−ｐｏｌｙ  Ｔ  ｆｒｅｅと表示）の細胞膜を用いてリガンド結合活性を測定した結果を示すグラフであり、２回の実験の平均値±標準誤差を示している。図中、縦軸は、［１２５Ｉ］−ｉｏｄｏｃｙａｎｏｐｉｎｄｏｌｏｌのＳＭＢＰへの特異的結合量（ＣＰＭ）を示している。また図中、＊＊は、ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３．１との間に有意差あり（ｐ＜０．０１＞の結果を、＋は、ＣＨＯ−ＳＭＢＰとの間に有意差あり（ｐ＜０．０５）の結果を、Ｎ．Ｓ．は、ＣＨＯ−ｐｃＤＮＡ３．１もしくはＣＨＯ−ＳＭＢＰとの間に有意差なしの結果を、それぞれ示す。
【図１】
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