(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニードルで吸引して保持した試料を溶離液により前記ニードルから分離カラムに押し流し成分毎に分離させて検出部にて検出し、前記試料の成分を分析する液体クロマトグラフ分析装置において、
前記溶離液を吸引、送液するポンプと、
前記ニードルと、前記分離カラムへと連通する注入ポートと、流路を切り替える流路切替手段と、送液の駆動源であるシリンジとを備え、前記ポンプの下流に接続されるとともに前記分離カラムの前である上流に接続されたオートサンプラと、
前記流路切替手段を含む前記オートサンプラを制御する制御手段とを有し、
前記シリンジの吸引作用により前記試料を前記ニードルに吸引させ、前記ニードルに連通するサンプルループと前記ニードルの中に前記試料を一時保持させ、
前記ニードルが前記注入ポートに移動後、前記流路切替手段が切り替わり、前記ポンプからの流路が前記ニードルの上流側に繋がり、前記ポンプから送液された前記溶離液が前記サンプルループと前記ニードルに流れ込み、該サンプルループと該ニードル内に保持されていた前記試料が前記流路切替手段を通らず、前記注入ポートを通って、前記分離カラムへと押し流されることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ分析装置において、
前記流路切替手段に流路切替時の圧力変動を低減させる流路抵抗調整手段を接続したことを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の液体クロマトグラフ分析装置において、
トラップカラム方式の液体クロマトグラフ分析装置を含むことを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
【請求項４】
請求項３記載の液体クロマトグラフ分析装置において、
トラップカラム切替手段を有し、
前記トラップカラム切替手段を介して接続されるトラップカラムが備わることを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
【請求項５】
試料を押し流す溶離液を送るポンプと、前記溶離液で押し流される前記試料の成分を分離する分離部と、該分離部で分離された前記試料の成分を検出する検出部とを備える液体クロマトグラフ分析装置の前記分離部の前である上流に接続され、送液されている溶離液中に試料が注入される試料導入装置において、
前記試料を吸引して保持するニードルと、前記分離部へと連通する注入ポートと、流路を切り替える流路切替手段と、前記試料を前記ニードルに吸引させるシリンジとを備え、
前記シリンジの吸引作用により前記試料を前記ニードルに吸引させ、前記ニードルに連通するサンプルループと前記ニードルの中に前記試料を一時保持させ、
前記ニードルが前記注入ポートに移動後、前記流路切替手段が切り替わり、前記ポンプからの流路が前記ニードルの上流側に繋がり、前記ポンプから送液された前記溶離液が前記サンプルループと前記ニードルに流れ込み、該サンプルループと該ニードル内に保持されていた前記試料が前記流路切替手段を通らず、前記注入ポートを通って、前記分離部へと押し流されることを特徴とする試料導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体クロマトグラフ分析装置及び液体クロマトグラフ装置用試料導入装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフ分析装置は、図１に示すように、送液部２により溶離液１は分離部４へと送液される。溶離液１、送液部２、分離部４、検出部５を含めて分析流路と云う。
【０００３】
この分析流路には、分離カラムを含む分離部４の前に試料注入部３が連通するように接続され、送液されている溶離液中に試料が注入され、分離部４中にて試料は成分毎に分離され、検出部５にて検出される。
【０００４】
一般的に、送液部２はポンプ、試料注入部３はオートサンプラ、分離部４は分離カラム、検出部５は検出器といったユニットにて液体クロマトグラフ分析装置のシステムが構成されている。
【０００５】
試料注入部３に用いられるオートサンプラの試料注入方式は、近年、ダイレクトインジェクションと呼ばれる方式が主流になっている。ダイレクトインジェクション方式を用いたオートサンプラでは、分析中はニードル内部が分析流路の一部となり、ポンプより溶離液が高圧力下で送液される。
【０００６】
ダイレクトインジェクション方式のオートサンプラで試料を注入する際は、まず、ニードルは高圧力下の分析流路から切り離され、オートサンプラ内の試料導入流路の一部となる。試料導入流路はオートサンプラ内の吸引吐出動作の駆動源であるシリンジに連通され、シリンジを引くことで、ニードルから試料を吸引する。試料吸引後、ニードルから吸引された試料を保持する試料導入流路は、溶離液が送液されてくるポンプからの分析流路と、分離カラムへ繋がる分析流路との間で連通されるように切り替えられ、試料導入流路に保持された試料が流路内に注入される。ダイレクトインジェクション方式のオートサンプラでは、この分析流路と試料導入流路の切替をバルブ（流路切替手段）にて行っており、ニードルの上流側と下流側の両流路ともバルブ（流路切替手段）を介しているのが通常である。
【０００７】
以下、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラの試料注入過程について、図２、図３を用いて説明する。
【０００８】
図２に、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラの、試料吐出時や、アイドリング状態の時の流路を示した。ポンプから送液されている溶離液は、バルブＡ１４を通り、ニードル１２を通る。注入ポート１３を通った後、再びバルブＡ１４を通り、分離カラムへと流れていく。
【０００９】
図３に、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラの、試料吸引時の流路を示した。試料の吸引動作を行う際は、バルブＡ１４が動作し、流路が切り替わる。この動作によって、ポンプから送液されている溶離液はニードル１２や注入ポート１３を介さず、分離カラムへと流れるようになる。分離カラムへ通じる流路から切り離されたニードル１２とサンプルループ２２は、オートサンプラ内の動液の駆動源であるシリンジ２０に接続され、ニードル１２がバイアルビン２３に挿入された後、シリンジ２０の駆動によって、ニードル１２とサンプルループ２２内に試料が吸引・保持される。
【００１０】
試料の吸引が終わると、ニードル１２は注入ポート１３へと接続される。そして、バルブＡ１４が再び切り替えられ、図２の流路へと戻る。それにより、サンプルループ２２、ニードル１２にポンプから送液される溶離液が流れ込み、ニードル１２とサンプルループ２２内部に保持されていた試料が注入ポート１３へと押し流される。試料は注入ポート１３、バルブＡ１４を通った後、分離カラムへと流れていく。
【００１１】
以上のように、ダイレクトインジェクション方式のオートサンプラにおいては、ニードルの上流側と下流側の両流路ともバルブを介している。このような例は、特許文献１、特許文献２などにおいても記載されている。
【００１２】
【特許文献１】特開２００７−１２１１９２号公報
【特許文献２】特開２００５−２６５８０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、試料注入部３に用いられるオートサンプラのうち、ダイレクトインジェクション方式によるオートサンプラでは、ニードルの上流および下流に分析流路と試料注入流路を切り替えるためのバルブを介する。
【００１４】
しかし、バルブを複数箇所も介在させると、デッドボリュームが増え、試料の成分分析を行う上で、分析の精度を落とすという課題を抱えることとなる。
【００１５】
デッドボリュームとは、液体クロマトグラフ分析装置内での試料導入から検出にいたる流れの中で、試料の分離に寄与せず、むしろ悪影響を及ぼす、無い方が望ましい空間のことを指す。
【００１６】
デッドボリュームによる悪影響としては２つ挙げられる。
【００１７】
１点目としては、デッドボリュームがあると、試料が溶離液中で拡散する、検出されるピークが広がってしまう。
【００１８】
よって、カラムの分離性能を測る指標である理論段数（Ｎ＝５．５４×ｔＲ２／Ｗ０．５ｈ２    ｔＲ：保持時間、Ｗ０．５ｈ：ピーク高さの中点におけるピーク幅）も低下する。
【００１９】
また、せっかく分離カラムで分離した化合物の各ゾーンも、デッドボリュームによる試料の拡散により、再び混じりあうこともありえる。
【００２０】
２点目としては、キャリーオーバーが多くなる、または起こしやすくなることが挙げられる。
【００２１】
キャリーオーバーとは、以前に分析した試料が、液体クロマトグラフ分析装置内部に残存し次の分析時に観察されることである。
【００２２】
残存する要因として、配管と部品との接続部分にできるバルブと配管との接続部にあるデッドボリューム（挿し込まれる配管の表面と、配管を受ける側の表面が完全には密着しておらず、その空隙部分がデッドボリュームとなる）に注入された試料が滞留し、滞留していた試料が、以降の分析の際に漏れ出すことが挙げられる。
【００２３】
これらの理由から、従来より、オートサンプラから分離カラム、分離カラムから検出器に至るまで分析流路に関して、いかにデッドボリュームを減らせるかが、分析精度向上を図る上で重要な要素となっている。
【００２４】
具体的には、従来では、オートサンプラから分離カラム、そして分離カラムから検出器に至る分析流路に用いる配管は、流速・圧力を鑑みた上で出来る限り細い配管を用い、また接液する部品は、接続面と接続面になるべく余分な空間ができないよう工夫されており、また接液する部品間にも余分な空間ができないよう、形状に工夫がされていることが多い。
【００２５】
しかし、配管内径を細くしたり、長さを短くしたり、部品形状の工夫によるデッドボリュームの低減には、限度がある。
【００２６】
本発明は、配管の長さや内径の工夫や、部品形状の工夫という従来の方法とは別の手段により、簡単な構成で、容易にキャリーオーバーの低減が実現できる液体クロマトグラフ分析装置、及び試料導入装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、溶離液を送る送液部、および分離部等を含む分析流路を備えるクロマトグラフ装置に、試料導入流路から試料を導入する試料導入装置において、試料の吸引を行う試料吸引手段と、分析流路と、ニードルを含む試料導入流路との分離、接続を切り替える流路切替手段と、試料吸引手段及び流路切替手段の動作を制御する制御手段を備え、ニードルの上流側には流路切替手段が連通配置され、ニードルの下流側は流路切替手段を介在せずして分離部に連通することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ニードルよりも下流側に流路切替手段を介さず、ニードルから分離カラムへと分析流路を繋ぐため、デッドボリュームを減らすことができる。デッドボリュームを減らせるため、分析流路に注入した試料の拡散程度をより減らすことができる。
【００２９】
また試料を分析流路に注入するニードルから下流側に流路切替手段を介さず、流路切替手段と配管との接続部がなくなることから、接続部に試料が残存することがないため、キャリーオーバーを減らすことができる。
【００３０】
また、本発明によれば、従来のダイレクトインジェクション方式のオートサンプラを大幅に改良することがないため、構成が簡単で容易に実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて添付図面を参照して説明する。
【００３２】
（第一の実施例）
図４は本発明を用いて、液体クロマトグラフ分析装置のシステムを構成した場合の一例を示した図である。
【００３３】
ポンプ７は溶離液１を吸引・送液するために溶離液１と配管で接続されており、ポンプ７の下流にはオートサンプラ８が接続されている。
【００３４】
オートサンプラ８は試料を吸引・吐出するためのニードル１２、分離カラムへと連通する注入ポート１３、流路を切り替えるバルブＡ１４（流路切替手段）、バルブＢ１５、オートサンプラ内の送液の駆動源であるシリンジ２０、試料を吸引する際に、図３に示したバイアルビン２３内の試料に浸漬され、外壁が試料によって汚染されたニードル１２を洗浄するための洗浄ポート１６などを備えている。
【００３５】
図３に示すようにニードル１２の先端が、試料が満たされたバイアルビン２３の中に挿入され、シリンジ２０の吸引作用により試料はニードル１２に吸われる。吸引された試料はニードル１２、と、ニードル１２に連通するサンプルループ２２の中に一時保持される。ニードル１２、サンプルループ２２を試料導入流路という。
【００３６】
ニードル１２が注入ポート１３に移動後、バルブＡ１４（流路切替手段）が切り替わり、図４に示すようにポンプからの流路がニードル１２、注入ポート１３に繋がる。これによって、ポンプから送液された溶離液がサンプルループ２２とニードル１２に流れ込み、サンプルループ２２とニードル１２内に保持されていた試料が、注入ポート１３を通って、分離カラム９へと押し流される。
背景技術の項でも述べたように、流路を切り替えるバルブＡ１４（流路切替手段）は、ニードルを含む試料導入流路と、分析流路との分離・接続を行う。バルブＡ１４（流路切替手段）が試料導入流路を分析流路から分離した時は、試料導入流路はシリンジ２０と連通し、シリンジ２０の吸引動作によって、試料の吸引を行う。試料の吸引動作を行う時以外は、バルブＡ１４は試料導入流路を分析流路に接続しており、試料導入流路は分析流路の一部となっている。
【００３７】
ニードル１２、シリンジ２０、オートサンプラ８等を含めて試料吸引手段と云う。
【００３８】
バルブＡ１４（流路切替手段）、バルブＢ１５、またオートサンプラ８は、制御手段（図示せず）に制御されて作動する。
【００３９】
バルブＡ１４（流路切替手段）の接続穴のうち、１つは密栓１８により栓がされ（接続穴が６穴ではなく、５穴の場合は、密栓は不要）、１つはドレイン管を兼ねた抵抗コイル１９が繋がっている。バルブＢ１５には洗浄液１７が通液する管が繋がっている。
【００４０】
ポンプ７からの分析流路はニードル１２の上流側でバルブＡ１４（流路切替手段）を通るが、ニードル１２より下流側ではバルブ（流路切替手段）を通らず、注入ポート１３を通った後、カラムオーブン１０内に収められた、分離カラム９に繋がる。分離カラム９の後は検出器１１が繋がり、検出器１１にはデータ処理部６が接続される。
【００４１】
ニードル７の下流側にはバルブ（流路切替手段）を介していない、この液体クロマトグラフ分析装置を用い、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した際のクロマトグラムを図５に、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いて、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した際のクロマトグラムを図５に示す。
【００４２】
測定ピークのシャープさを示す理論段数（クロマトグラム内では３番目に示されている数値）は、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いて測定した場合、３６７０である。これに対し、本発明の実施例の液体クロマトグラフ分析装置を用いたシステムによる測定結果では４５８７ある。本発明の実施例により、理論段数の低下防止を可能にしている。
【００４３】
また、図８は本発明の実施例の液体クロマトグラフ分析装置を用いて、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した後、６０％メタノールを注入し、キャリーオーバーを測定した際のクロマトグラムを図７に、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いて、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した後、６０％メタノールを注入し、キャリーオーバーを測定した際のクロマトグラムを図６に示した。
【００４４】
図５と図８から、一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いたときのキャリーオーバー値（％）が求められるが、キャリーオーバー値は０．００５０％である。
【００４５】
これに対し、図６と図８から、本発明の実施形態の液体クロマトグラフ分析装置を用いたときのキャリーオーバー値（％）が求められるが、キャリーオーバー値は０．００１７％である。これにより、本発明の実施例の液体クロマトグラフ分析装置を用いることにより、キャリーオーバーが低減できることがわかる。
【００４６】
また、簡単な構成で、容易にキャリーオーバーの低減の実現を可能にしている。
【００４７】
図９は、バルブＡ１４（流路切替手段）に流量抵抗調整機能付コイル２１を接続した他の実施形態を示す。流量抵抗を可変にすることで、流路切替時の圧力変動を低減させ、ベースラインをより安定させることができる。
（第二の実施例）
図１０は従来の第２の実施形態の概略構成図であり、特許第３８２３０９２号公報に記載されたナノフロー液体クロマトグラフ装置の構成例を示している。
【００４８】
これはトラップカラム方式の液体クロマトグラフ装置である。
【００４９】
グラジェントポンプ３１、ナノフローポンプ３２、ローディングポンプ３３の流量はそれぞれ数十〜数百μｌ／ｍｉｎ、数十〜数百ｎｌ／ｍｉｎ、数〜十数μｌ／ｍｉｎである。
【００５０】
１０方バルブ４１とインジェクションバルブ４４（トラップカラム切替手段）は１０ポート２ポジションの流路切替バルブであり、バックフラッシュバルブ４６とサンプラバルブ５１（流路切替手段）は６ポート２ポジションの流路切替バルブである。
【００５１】
試料４８はオートサンプラ３５内の計量デバイス（図示無し）によってニードル４９から吸引され、ニードル４９の先端と注入ポート５０間は液密性が保たれる構造となっている。５２、５３、５４、５５、５６は配管である。
【００５２】
ニードル４９から吸引された試料４８は、ローディンブポンプ３３によって配管５２〜５５および流路切替バルブ５１、４６、４４を介して、トラップカラム４５に保持される。グラジェントポンプ３１によって混合された溶離液３６、３７は、定期的に切り替えられる１０方バルブ４１によって、ループ４２および４３に交互に充填される。
【００５３】
ループ４２および４３に充填された溶離液３６、３７や水４０の一部が、ナノフローポンプ３２によってインジェクションバルブ４４のポート１へと送られることで、数十〜数百ｎｌ／ｍｉｎの流量でのナノフローグラジェント送液が実現される。
【００５４】
トラップカラム４５に保持された試料４８の脱塩が必要な場合は、バックフラッシュバルブ４６を切り替えてポート５・６間の流路を接続することで（図示無し）、溶離液３８、３９がトラップカラム４５へと送られる。
【００５５】
インジェクションバルブ４４が切り替えられ、ポート１・１０間およびポート６・７間の流路が接続されると（図示無し）、トラップカラム４５に保持されていた試料４８が、前述したナノフローグラジェント送液によって分離カラム４７へと溶出され、質量分析計３４によって検出される。
【００５６】
図１０の従来の液体クロマトグラフ装置のシステムに本発明の実施形態を適用した例を図１１に示す。
【００５７】
本実施形態によれば、オートサンプラ３５の注入ポート５０からインジェクションバルブ４４（トラップカラム切替手段）のポート８までを、配管５６によって直接接続することが可能となる。５７、５８、５９、６０、６１は密栓である。
【００５８】
従来使用していた配管を不要とすることで、注入ポート５０からトラップカラム４５までの流路（ローディング流路）のデッドボリュームを大幅に低減することが可能となり、試料４８の流路内での広がりの抑制や、トラップカラム４５へと試料４８を送り出す時間（ローディング時間）の短縮が図れる。
【００５９】
図１０および図１２の液体クロマトグラフ装置のシステム構成において、インジェクションバルブ４４（トラップカラム切替手段）のポート８への配管を直接、紫外吸光光度計に接続して、試料４８の流路内での広がりとローディング時間を評価した結果を図１３に示す。
【００６０】
ローディングポンプ３３の流量は１０μｌ／ｍｉｎ、紫外吸光光度計の検出波長は２１４ｎｍ、測定試料はアンジオテンシンとした。図１０の従来の液体クロマトグラフ装置のシステムで測定した試料バンド６２に対し、図１１の本発明の実施形態の液体クロマトグラフ装置のシステムで測定した試料バンド６３は、より高く幅も狭いことが分かる。
【００６１】
このことは、液体クロマトグラフとしての分離性能を改善させる上で、大きな利点となる。また、ローディング時間も大幅に短くなるため、分析時間の短縮にも貢献できる。
【００６２】
図１０および図１１の液体クロマトグラフ装置のシステム構成において、ヒト血清酵素消化物を用いてキャリーオーバーを評価した結果を図１３、図１４に示す。
【００６３】
図１３、図１４は質量分析計３４によるトータルイオンクロマトグラムであり、上段はサンプルを注入した際の測定結果、中段はブランク１回目の測定結果、下段はブランク１回目の測定結果を示している。
【００６４】
一例として、質量電荷比（ｍ／ｚ）８２５．７８の成分を抽出して、ブランク１回目のキャリーオーバーを算出した場合、従来システムでは３４．８％であった。これに対し、本発明の実施形態の液体クロマトグラフ装置のシステムでは３．９％と約一桁、キャリーオーバーを低減することができた。
【００６５】
このことは、従来はローディング流路にバックフラッシュバルブ４６を介在させていたため、とりわけ配管の接続部にサンプルが滞留し、大きなキャリーオーバーを引き起こす要因となっていたと考えられる。
【００６６】
本発明の実施形態を適用することで、従来の課題であったキャリーオーバーを大幅に改善することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】液体クロマトグラフ分析装置の一般的な構成と流路の一例を示した図である。
【図２】一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラの、試料導入流路から試料を吐出する際と、アイドリング時の流路の例を示した図である。
【図３】一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラの、試料導入流路へ試料を吸引する際の流路の例を示した図である。
【図４】本発明の実施形態に係わるもので、液体クロマトグラフ分析装置のシステムの一例を示した図である。
【図５】一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いて、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した際のクロマトグラムである。
【図６】本発明の実施形態に係わるもので、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した際のクロマトグラムである。
【図７】一般的なダイレクトインジェクション方式オートサンプラを用いて、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した後、６０％メタノールを注入し、キャリーオーバーを測定した際のクロマトグラムである。
【図８】本発明の実施形態に係わるもので、メチルパラベン（６００ｍｇ／Ｌ、６０％メタノールに溶解）を測定した後、６０％メタノールを注入し、キャリーオーバーを測定した際のクロマトグラムである。
【図９】本発明の実施形態に係わるもので、液体クロマトグラフ分析装置の別のシステムの一例を示した図である（流量抵抗調整可能手段が切替手段に接続される）。
【図１０】従来の第２の実施形態の液体クロマトグラフ分析装置の概略構成図である。
【図１１】本発明の第２の実施形態の液体クロマトグラフ分析装置の概略構成図である。
【図１２】従来および本発明の実施形態における流路内の試料バンドを評価した結果である。
【図１３】本発明の実施形態に係るトータルイオンクロマトグラムを示す図である。
【図１４】本発明の実施形態に係る他のトータルイオンクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００６８】
１…溶離液、２…送液部、３…試料注入部、４…分離部、５…検出部、６…データ処理部、７…ポンプ、８…オートサンプラ、９…分離カラム、１０…カラムオーブン、１１…検出器、１２…ニードル、１３…注入ポート、１４…バルブＡ、１５…バルブＢ、１６…洗浄ポート、１７…洗浄液、１８…密栓、１９…抵抗コイル、２０…シリンジ、２１…流量抵抗調整機能付コイル、２２…サンプルループ、２３…バイアルビン、３１…グラジェントポンプ、３２…ナノフローポンプ、３３…ローディングポンプ、３４…質量分析計、３５…オートサンプラ、３６、３７、３８、３９…溶離液、４０…水、４１…１０方バルブ、４２、４３…ループ（配管）、４４…インジェクションバルブ、４５…トラップカラム、４６…バックフラッシュバルブ、４７…分離カラム、４８…試料、４９…ニードル、５０…注入ポート、５１…サンプラバルブ、５２、５３、５４、５５、５６…配管、５７、５８、５９、６０、６１…密栓、６２、６３…試料バンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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