(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物であって、残基３８９および３９０で式Ｉの化合物を含むＡＴＩＩＩを含み、ここで：
式Ｉ：Ｄ−Ｅ
であって、
ここで、Ｄは、以下：グルタミン酸；フェニルアラニン；グリシン；およびプロリンからなる群より選択され；そして
Ｅは、以下：アラニン；フェニルアラニン；グリシン；およびプロリンからなる群より選択される、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項２】
請求項１に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物であって、以下：残基３８６〜３８８で式ＩＩ；および残基３９１で式ＩＩＩからなる群より選択される化合物をさらに含み、ここで：
式ＩＩ：Ａ−Ｂ−Ｃ
であって、
ここで、Ａは、以下：スレオニン；およびグルタミン酸からなる群より選択され、そして
Ｂは、以下：アラニン；グルタミン酸；およびグルタミンからなる群より選択され、そして
Ｃは、以下：ロイシン；バリン；グリシン；グルタミン酸およびスレオニンからなる群より選択され；ならびに
式ＩＩＩ：Ｆ
であって、
ここで、Ｆは、以下：アラニン；イソロイシン；セリン；グリシン；およびアスパラギンからなる群より選択される、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項３】
前記ＡＴＩＩＩが増強されたヘパリン親和性を有する、請求項２に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項４】
前記ＡＴＩＩＩが、グリコシル化部位に続く２残基の変異によって増強されたヘパリン親和性を有する、請求項３に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項５】
Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがアラニンである、請求項２に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項６】
Ａがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンである、請求項５に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項７】
Ａがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがバリンであり、かつＦがアラニンである、請求項５に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項８】
Ａがスレオニンであり、Ｂがアラニンであり、Ｃがロイシンであり、かつＦがイソロイシンである、請求項５に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項９】
Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがグリシンである、請求項２に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項１０】
Ａがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがロイシンであり、かつＦがアラニンである、請求項９に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項１１】
Ｄがフェニルアラニンであり、かつＥがフェニルアラニンである、請求項２に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項１２】
Ａがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンである、請求項１１に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項１３】
残基３８５〜３９３で以下：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；および配列番号１４；および配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ、またはその薬学的に受容可能な処方物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物をコードする核酸分子を含む、核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩアミノ酸分子をコードする、核酸分子。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物を含む、トロンビン活性化を阻害するための組成物。
【請求項１７】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項１８】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項２に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項１９】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項３に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２０】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項４に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２１】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項５に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２２】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項８に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２３】
トロンビン活性化の阻害を必要とする患者においてトロンビン活性化を阻害するための組成物であって、請求項１２に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２４】
第Ｘａ因子を阻害するための組成物であって、請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２５】
第Ｘａ因子の阻害を必要とする患者において第Ｘａ因子を阻害するための組成物であって、Ａがグルタミン酸でありＥがアラニンである場合を除く、請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２６】
トロンビンの阻害を必要とする患者においてトロンビンを阻害するための組成物であって、請求項８に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２７】
トロンビンの阻害を必要とする患者においてトロンビンを阻害するための組成物であって、請求項１２に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２８】
トロンビン活性化関連の病理学的症状の処置を必要とする患者においてこのような症状を処置するための組成物であって、請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の組成物であって、ここで、前記病理学的症状が以下：敗血症；外傷；急性呼吸窮迫症候群；再狭窄による再閉塞；血栓症、血栓塞栓症；発作；および再狭窄からなる群より選択される病理に起因する、組成物。
【請求項３０】
トロンビン活性化関連の病理学的症状の危険の減少を必要とする患者においてこのような危険を減少するための組成物であって、請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の組成物であって、ここで、前記危険が減少される前記トロンビン活性化関連の病理学的症状が以下：経皮的経管的冠状動脈形成における再閉塞および再狭窄；手術に関連する血栓症；虚血／再灌流障害；ならびに癌患者または手術患者における凝固異常からなる群より選択される、組成物。
【請求項３２】
前記手術患者に関連する凝固異常が心肺バイパスに関連する凝固異常である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
血栓症の危険の減少を必要とする患者において血栓症の危険を減少するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項３４】
再狭窄の危険の減少を必要とする患者において再狭窄の危険を減少するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項３５】
再閉塞の危険の減少を必要とする患者において再閉塞の危険を減少するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項３６】
凝固異常の危険の減少を必要とする患者において凝固異常の危険を減少するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項３７】
前記凝固異常の危険が心肺バイパスに関連する、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
敗血症の処置を必要とする患者において敗血症を処置するための組成物であって、以下：請求項１に記載の化合物；および請求項１に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項３９】
敗血症の処置を必要とする患者において敗血症を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４０】
外傷の処置を必要とする患者において外傷を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４１】
急性呼吸窮迫症候群の処置を必要とする患者において急性呼吸窮迫症候群を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４２】
虚血性発作の処置を必要とする患者において虚血性発作を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４３】
血栓症の処置を必要とする患者において血栓症を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４４】
再狭窄の処置を必要とする患者において再狭窄を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４５】
再閉塞の処置を必要とする患者において再閉塞を処置するための組成物であって、以下：請求項１３に記載の化合物；および請求項１３に記載の化合物をコードする核酸からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【請求項４６】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩを体液中に産生するための方法であって、以下：
請求項１に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を体液中で発現する非ヒトトランスジェニック動物を作製する工程であって、ここで、該ヒトアンチトロンビンＩＩＩが該非ヒトトランスジェニック動物により産生されて該体液中へ分泌される、工程；
該非ヒトトランスジェニック動物から体液を収集する工程であって、この体液が該ヒトアンチトロンビンＩＩＩを含む、工程；および
該収集された体液から該ヒトアンチトロンビンＩＩＩを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記体液が以下：乳汁または尿からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記体液が乳汁であり、そして前記非ヒト動物が以下：ヤギ；ヒツジ；およびウシからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ヒトアンチトロンビンＩＩＩをヤギの乳汁中に産生するための方法であって、以下：
請求項１に記載のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を乳房組織中で発現するトランスジェニックヤギを作製する工程であって、ここで、該ヒトアンチトロンビンＩＩＩが該トランスジェニックヤギにより産生されて該乳汁中へ分泌される、工程；
該トランスジェニックヤギから乳汁を収集する工程であって、この乳汁が該ヒトアンチトロンビンＩＩＩを含む、工程；および
該収集された乳汁から該ヒトアンチトロンビンＩＩＩを単離する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９８年５月１２日出願の、米国仮特許出願第６０／０８５，１９７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所からの助成金（助成金番号ＨＬ−５６９１４）に一部支援されており；米国政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、アンチトロンビン、ならびにアンチトロンビンにより影響される天然プロセスを変化させるのに有用な物質および方法の分野に関する。例えば、本発明は、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を提供し、このアンチトロンビンＩＩＩは、エラスターゼ不活化に対して驚異的な耐性を有し；ＩｇＧ活性化好中球による不活化に対する耐性を有し；抗トロンビン活性を保持し；そして／または驚異的な抗第Ｘａ因子活性を保持するかもしくは有する。これらのＡＴＩＩＩは、増強されたヘパリン親和性を有する糖形態として発現され得、これは、正常なヘパリン親和性を有するＡＴＩＩＩよりも効果的に血管壁を標的とする。従って、本発明は、組換えＤＮＡ技術、分子生物学ツール、および疾患処置に広く関する。
【０００４】
（発明の背景）
ＡＴＩＩＩは、凝固カスケード中の酵素（トロンビン（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤａｍｕｓ、（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８、６４９０〜６５０５）および第Ｘａ因子（Ｋｕｒａｃｈｉら、（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５、３７３〜３７７）を含む）の主なインヒビターである。凝固酵素の抑制されていない活性が原因で凝固能亢進を促進する、ＡＴＩＩＩにおける多くの固有の変異が同定されている（ｖａｎ  ＢｏｖｅｎおよびＬａｎｅ、（１９９７）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３４、１８８〜２０４に概説される）。ＡＴＩＩＩの後天性欠損もまた、止血に対するネガティブな影響を伴って生じ得、例えば、敗血症性汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の間に生じ得る（Ｂｉｃｋら、（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、７３、５７７〜５８３）；（ＢｕｌｌｅｒおよびＣａｔｅ、（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、８７、４４Ｓ〜４８Ｓ）；（ＤａｍｕｓおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、６、２７）；（Ｈｅｌｌｇｒｅｎら、（１９８４）Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ.、１０、２３〜２８）；（Ｌａｍｍｌｅら、（１９８４）Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ、８２、３９６〜４０４）；（Ｍａｍｍｅｎら、（１９８５）Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．、１１、３７３〜３８３）。対照的に、ＡＴＩＩＩによる血液凝固の過剰阻害に由来して生じる出血が、薬学的ヘパリンの存在下で生じ得る。この薬学的ヘパリンは、凝固能亢進性状態を処置および予防するために頻繁に使用される（Ｍａｎｔら、（１９７７）Ｌａｎｃｅｔ、１、１１３３〜１１３５）。
【０００５】
ＡＴＩＩＩは、４３２個のアミノ酸の、分子量５８，０００の、血漿糖タンパク質であり（Ｂｏｃｋら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０、８１１３〜８１２５）；（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、（１９７９）Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ（４３〜５４頁）：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）、これは、トロンビンおよび第Ｘａ因子を阻害するだけでなく、血液凝固の内因系においてこれらに先行するセリンプロテアーゼ（例えば、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９７７）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、３６、１０〜１８）および外因系においてこれらに先行するセリンプロテアーゼ（第ＶＩＩａ因子−ＴＦ）（Ｌａｗｓｏｎら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：７６７〜７７０）；（Ｒａｏら、（１９９３）Ｂｌｏｏｄ、８１：２６００〜２６０７）をも阻害する。第ＶＩＩａ因子−ＴＦは、凝固および血栓症において役割を有するのみならず、癌新脈管形成および転移においてもまた関係する（ＲｕｆおよびＭｕｅｌｌｅｒ、（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３：３７９〜８４）。ＡＴＩＩＩはまた、非凝固性の、トロンビン媒介性経路、例えば、トロンビン誘導性平滑筋細胞増殖（Ｈｅｄｉｎら、（１９９４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．、１４：２５４〜２６０）およびトロンビン媒介性好中球溢出（Ｏｓｔｒｏｖｓｋｙら、（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９６：２３０２〜２３１０）をもたらす。さらに、ＡＴＩＩＩは、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の内皮放出を促進する。このプロスタサイクリンは、白血球および血小板活性化を阻害し、そして血管拡張薬特性を有する（Ｕｃｈｉｂａら、（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２３：５８３〜５９０）。
【０００６】
ＡＴＩＩＩの標的酵素に対するＡＴＩＩＩの阻害活性は、ヘパリンにより（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤａｍｕｓ、（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８、６４９０〜６５０５）、および血管表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）により（Ｍａｒｃｕｍら、（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４５：Ｈ７２５〜７３３）劇的に増強される。アンチトロンビンのヘパリン結合特性は、ＡＴＩＩＩを、その標的酵素が生成される部位へと指向し、そしてこれらの表面に対するその活性を増強する。
【０００７】
アンチトロンビンは、肝臓において合成され、そして２つの異なるアイソフォームとして血液中に分泌される（ＰｅｔｅｒｓｏｎおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ、（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０、６１０〜６１５）。主な種（９０％）である、αーＡＴＩＩＩは、アスパラギン残基９６、１３５、１５５、および１９２に結合した４つの同一のＮ−グリコシド結合ポリサッカリド鎖を有する（Ｆｒａｎｚｅｎら、（１９８０）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５、５０９０〜５０９３）；（Ｍｉｚｕｏｃｈｉら、（１９８０）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２０３、４５８〜４６５）。少ない方のβ−ＡＴＩＩＩアイソフォーム（１０％）は、アスパラギン１３５でこのオリゴサッカリド側鎖を欠く（Ｂｒｅｎｎａｎら、（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２１９、４３１〜４３６）。β−糖形態は、ＮＸＳコンセンサス配列の効率の悪いグリコシル化が原因で、Ａｓｎ−１３５上の糖質を欠く（Ｐｉｃａｒｄら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、８４３３〜８４４０）。米国特許第５，６１８，７１３号および同第５，７００，６６３号は、１つ以上のグリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ  １３５、Ａｓｎ  １５５）での変異が、ヘパリン結合／ヘパリン活性化特性を増大させつつ、ＡＴＩＩＩのプロテアーゼ特異性を維持することを開示する。特に、これらの特許は、グリコシル化され得ない残基によるＮ−グリコシル化部位のアスパラギンの置換により改変されたＡＴＩＩＩを開示し、かつ請求する。米国特許第５，６１８，７１３号および同第５，７００，６６３号は、ヒト好中球エラスターゼに対する改善された耐性またはＮ−グリコシル化配列中の３番目の位置の変異に起因する増強されたヘパリン親和性を有する、本発明のＡＴＩＩＩを開示していない。
【０００８】
ヒト好中球エラスターゼは、ＡＴＩＩＩを切断し、そして不活化する（Ｊｏｃｈｕｍら、（１９８１）、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３６２、１０３〜１１２）。報告された好中球エラスターゼ切断部位は、Ｐ５−ＶａｌおよびＰ４−Ｉｌｅの後ろであった（ＣａｒｒｅｌｅおよびＯｗｅｎ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１７、７３０〜７３２）。さらに、Ｊｏｒｄａｎおよび同僚は、ＡＴＩＩＩのエラスターゼ不活化がヘパリン依存性であることを示した（Ｊｏｒｄａｎら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７、７７７〜７７９）。上昇したエラスターゼ（Ｎｕｉｊｅｎｓら、（１９９２）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１１９、１５９〜１６８）が、敗血症におけるＡＴＩＩＩの不活化（Ｓｅｉｔｚら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、３８、２３１〜２４０）および敗血症性ＤＩＣにおける減少したアンチトロンビンレベルの原因であると仮定されている（Ｂｉｃｋら、（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、７３、５７７〜５８３）；（Ｂｕｌｌｅｒおよびｔｅｎ  Ｃａｔｅ、（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８７、４４Ｓ〜４８Ｓ）；（ＤａｍｕｓおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９）Ｔｈｒｏｍｂ.Ｒｅｓ．、６、２７）；（Ｈｅｌｌｇｒｅｎら、（１９８４ａ）Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ.、１０、２３〜２８）；（Ｌａｍｍｌｅら、（１９８４）Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ、８２、３９６〜４０４）；（Ｍａｍｍｅｎら、（１９８５）Ｓｅｍｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．、１１、３７３〜３８３）。機能性ＡＴＩＩＩにおけるこの後天的減少は、活性型凝固プロテイナーゼを阻害し得ないことに起因してＤＩＣの進行に寄与し、最終的には、トロンビンの活性化、フィブリン形成および凝固因子消費をもたらす。
【０００９】
いくつかの動物およびヒトの研究は、ＡＴＩＩＩ濃縮物療法が、敗血症性汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に罹患している患者の致死率を減少させるのに有効であり得ることを示唆した。内毒素血症のラットモデルの使用（Ｅｍｅｒｓｏｎら、（１９８７）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、８７、２７Ｓ〜３３Ｓ）は、予防薬ＡＴＩＩＩ処置が、ＤＩＣにより悪化する敗血症に関連する止血の減少の予防を提供することを示した。ＡＴＩＩＩ処置はまた、ＤＩＣの存在がＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ誘導性敗血症ラットにおいて確立された後に投与された場合に、致死率を減少し、そして敗血症のパラメーターを安定にするのに有効であることが見出されている（ＤｉｃｋｎｅｉｔｅおよびＰａｑｕｅｓ、（１９９３）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、６９、９８〜１０２）。ＡＴＩＩＩ置換療法のヒトの研究もまた、有望な結果を示した。敗血症性ショックおよびＤＩＣの患者は、ＡＴＩＩＩ置換により、改善された生存、ならびに改善された血液学的特徴および改善された器官機能パラメーターを示した（Ｂｌａｕｈｕｔら、（１９８５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、３９、８１〜８９）；（Ｄｅｌｓｈａｍｍａｒら、（１９８９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２２５、２１〜２７）；（Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、（１９９３）Ｃｈｅｓｔ、１０４、８８２〜８８８）；（Ｈｅｌｌｇｒｅｎら、（１９８４ｂ）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、３５、４５９〜４６６）；（Ｊｏｃｈｕｍ、（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３２、１９〜３２）。種々の患者での試行の検討により、生存範囲７．６％〜２５％（組合せて、１９％）と比較して、ＡＴＩＩＩ置換を受けた患者の間で６４％〜９７％（組合せて、７６％）の範囲の生存率が示された（Ｖｉｎａｚｚｅｒ、（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、１、６２〜６５）。これらの研究は、敗血症性ＤＩＣの処置においてＡＴＩＩＩ濃縮物に対する有望な応答を示した。しかし、非常に大用量のＡＴＩＩＩが必要であった（９０〜１２０Ｕ／ｋｇ／日）（Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、（１９９３）Ｃｈｅｓｔ．、１０４、８８２〜８８８）；（Ｊｏｃｈｕｍ、（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３２、１９〜３２）。この知見は、好中球エラスターゼの上昇したレベルによる外因性ＡＴＩＩＩの連続した不活化と一致した。これらの観察は、敗血症性ＤＩＣの逆転が、好中球プロテイナーゼである、エラスターゼ、カテプシンＧおよびプロテイナーゼ−３に対して耐性であるように操作された、より低用量の組換えＡＴＩＩＩ改変体を使用して達成可能であり得ることを示唆した。
【００１０】
エラスターゼ切断部位を非切断可能残基で置換するという以前の試みは、減少したトロンビン結合阻害をもたらした。その著者らは、「これらの基準に最適の置換（Ｐ４およびＰ５［残基３８９および３９０］の両方でのＴｒｐの置換）の反復は、ＡＴに有意なＬＥ［好中球エラスターゼ］耐性を付与しないことを報告する。」Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、８８  Ｔｈｒｏｍｂｓｉｓ  Ｒｅｓ  １７１（１９９７）。これらの改変型ＡＴＩＩＩは、野生型ＡＴＩＩＩと比較して、商業的に生き残れないと考えられた。
【００１１】
他のグループは、残基３８４〜３９８の領域に改変を導入し、これらの領域を、低ヘパリン結合親和性を付与するように設計した。米国特許第５，４２０，２５２号は、野生型残基３８９および３９０を有する改変型ＡＴＩＩＩを記載している。この特許は、「ヒトＡＴＩＩＩアミノ酸配列であって、・・・この配列が・・・３８４〜３９８位で別のアミノ酸によって置換されたものを除く」と広範に記載している。本願のＡＴＩＩＩは、この特許において言及されなかった。
【００１２】
ＷＯ  ９１／００２９１はまた、改変されたアンチトロンビンＩＩＩ改変体を開示する。これは、改変されたＡＴＩＩＩであって、「アミノ酸３８４〜３９６を含む領域から少なくとも１つのアミノ酸が、メイゾトロンビン（ｍｅｉｚｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）の形成に関する第ＩＩ因子中の第Ｘａ因子切断部位周辺の対応するアミノ酸基により置換されている・・・」ＡＴＩＩＩを広く記載している。本願のＡＴＩＩＩは、この公開において言及さなかった。
【００１３】
上記の書類の引用は、前述のいずれもが先行技術であるという容認として意図されない。これらの書類の日時に関する全ての陳述または内容に関する全ての陳述は、本出願人に対して利用可能な情報の主観的特徴付けに基いており、そしてこれらの書類の日時または内容の正確さに関するいかなる容認をも構成しない。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、特に、残基３８９および３９０で式Ｉの化合物を含むＡＴＩＩＩを含むエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ、またはその薬学的に受容可能な処方物を提供する：
式Ｉ：Ｄ−Ｅ
ここで、Ｄは、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、およびプロリンからなる群より選択され、そして
Ｅは、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、およびプロリンからなる群より選択される。
【００１５】
好ましいのは、残基３８６から３８８で式ＩＩの化合物および残基３９１で式ＩＩＩの化合物をさらに含む、上記のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩである：
式ＩＩ：Ａ−Ｂ−Ｃ
ここでＡは、スレオニンおよびグルタミン酸からなる群より選択され、そして
ここでＢは、アラニン、グルタミン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、そして
ここでＣは、ロイシン、バリン、グリシン、グルタミン酸、およびスレオニンからなる群より選択され、ならびに
式ＩＩＩ：Ｆ
ここでＦは、アラニン、イソロイシン、セリン、グリシン、およびアスパラギンからなる群より選択される。
【００１６】
増強されたヘパリン親和性を有するこれらのＡＴＩＩＩが好ましく、ここで、このＡＴＩＩＩが、グリコシル化部位に続く２つの残基の変異によって、増強されたヘパリン親和性を有するものが特に好ましい。
【００１７】
特に、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがアラニンであるか、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがグリシンであるか、またはＤがフェニルアラニンであり、かつＥがフェニルアラニンである、上記のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩが好ましい。
【００１８】
Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがアラニンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンであるか、またはここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがバリンであり、かつＦがアラニンであるか、またはここでＡがスレオニンであり、Ｂがアラニンであり、Ｃがロイシンであり、かつＦがイソロイシンであるものが最も好ましい。
【００１９】
しかし、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがグリシンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがロイシンであり、かつＦがアラニンであるものもまた、好ましい。
【００２０】
しかし、Ｄがフェニルアラニンであり、かつＥがフェニルアラニンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンであるものもまた、最も好ましい。
【００２１】
また、残基３８６〜３９１で、以下：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；および配列番号１４；および配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ、またはその薬学的に受容可能な処方物も提供される。
【００２２】
本発明のＡＴＩＩＩをコードする核酸分子を含む核酸分子もまた、本発明によって提供される。特に、本発明のＡＴＩＩが、残基３８６〜３９１で、以下：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；および配列番号１４；および配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明のＡＴＩＩＩをコードする核酸が提供される。
【００２３】
方法もまた、本明細書中に提供される。特に、トロンビン活性化を阻害する方法が提供され、この方法は、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。１つの実施態様において、トロンビン活性化の阻害が必要な患者において、トロンビン活性化を阻害する方法が提供され、この方法は、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。好ましい方法は、好ましいＡＴＩＩＩおよび最も好ましいＡＴＩＩＩを利用する。
【００２４】
第Ｘａ因子の阻害を必要とする患者において、第Ｘａ因子を阻害する方法もまた提供され、この方法は、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。好ましい方法は、実施例に具体的に記載される第Ｘａ因子阻害活性を有するＡＴＩＩＩを利用する。
【００２５】
トロンビンの阻害を必要とする患者において、トロンビンを阻害する方法もまた提供され、この方法は、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。好ましい方法は、実施例に具体的に記載されるトロンビン阻害活性を有するＡＴＩＩＩを利用する。
【００２６】
本発明はまた、トロンビン活性化に関連する病理学的症状の危険性の処置の必要な患者において、トロンビン活性化に関連する病理学的症状の危険性を処置および／または減少する方法を提供し、この方法は、本明細書中に開示されるＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。特に、敗血症；外傷；急性呼吸窮迫症候群；血栓症；発作；および再狭窄に起因する病理学的症状を処置する方法が好ましい。さらに、トロンビン活性化に関連する病理学的症状が、経皮的経管的冠状動脈形成における再閉塞および再狭窄；手術に関連する血栓症；虚血／再灌流障害；ならびに癌患者または手術患者における凝固異常のような危険である上記の方法が、本明細書中に提供される。特に、手術患者における凝固異常が心肺バイパスまたは関節置換と関連するものである、この段落に記載される方法が好ましい。
【００２７】
また、血栓症、再狭窄、再閉塞、および凝固異常の危険の減少が必要な患者において、血栓症、再狭窄、再閉塞、および凝固異常の危険を減少する方法も提供され、この方法は、本明細書中の化合物、好ましくは最も好ましい化合物、またはそれらをコードする核酸を投与する工程を包含する。特に、凝固異常が、心肺バイパスまたは関節置換と関連するものである、この段落に記載される方法が好ましい。
【００２８】
また、敗血症、外傷、急性呼吸窮迫症候群、汎発性血管内凝固症候群、虚血性発作、血栓症、再狭窄および再閉塞の処置が必要な患者において、敗血症、外傷、急性呼吸窮迫症候群、汎発性血管内凝固症候群、虚血性発作、血栓症、再狭窄および再閉塞を処置する方法も提供され、この方法は、本明細書中の化合物、好ましくは最も好ましい化合物、またはそれらをコードする核酸を投与する工程を包含する。
【００２９】
最後に、本発明はまた、体液中でエラスターゼ耐性ヒトアンチトロンビンＩＩＩを産生するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：体液中で、本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製する工程であって、ここでヒトアンチトロンビンＩＩＩがトランスジェニック動物によって産生されて体液中に分泌される、工程；このトランスジェニック動物から体液を収集する工程であって、この体液が、ヒトアンチトロンビンＩＩＩを含む、工程；およびこの収集された体液からこのヒトアンチトロンビンＩＩＩを単離する工程。この体液が、乳汁または尿からなる群より選択される方法が好ましい。この体液が乳汁であり、かつこの動物が、ヤギ、ヒツジおよびウシからなる群より選択される方法がより好ましい。最も好ましいのは、ヤギ乳汁中にヒトアンチトロンビンＩＩＩを産生するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：乳房組織において、本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニックヤギを作製する工程であって、ここでこのヒトアンチトロンビンＩＩＩが、このトランスジェニックヤギによって産生される乳汁に分泌される工程；乳汁がこのヒトアンチトロンビンＩＩＩを含むトランスジェニックヤギから乳汁を収集する工程；およびこのヒトアンチトロンビンＩＩＩをこの収集した乳汁から単離する工程。
【００３０】
（定義）
「対立遺伝子改変体」は、指示対象配列と本質的に同じ遺伝子座（単数または複数）で生じるが、例えば、変異または組換えによって生じる天然の変動に起因して、類似するが同一ではない配列を有する全長遺伝子または全長遺伝子の部分配列をいうことを意味する。対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性に類似の活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、この遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）における変更を含み得る。
【００３１】
本明細書中で使用される「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方ならびにそれらのフラグメント（例えば、抗原またはハプテンを結合し得るＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）2フラグメント）を含む。
【００３２】
「残基（単数または複数）で」は、Ｂｏｃｋら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，８１１３−８１２５に記載されるような、天然に存在するＡＴＩＩＩについての番号付けシステムによって示される位置を意味する。
【００３３】
「ＡＴＩＩＩ標的酵素（単数または複数）」は、ＡＴＩＩＩによって阻害される任意の酵素を意味し、これには、内因性および外因性の凝固経路における酵素（例えば、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、ＴＦ−ＶＩＩａ）が含まれる。
【００３４】
「トロンビン」は、当該分野で認識される任意のトロンビン分子を意味し、これには、変異体または対立遺伝子改変体、あるいは発見される任意のそのような新たな分子が含まれる。
【００３５】
「アンチトロンビン関連応答」は、任意の体液性または細胞性免疫応答だけでなく、アンチトロンビンとの相互作用から生じる任意の生物学的応答も意味する。
【００３６】
「フラグメント」は、指示対象タンパク質または核酸分子の任意のサブセットをいうことを意味する。
【００３７】
「増強されたヘパリン親和性ＡＴＩＩＩ」は、血漿由来ＡＴＩＩＩ（αアイソフォーム）のＫｄ未満のＫｄでヘパリンを結合する能力を有する任意のＡＴＩＩＩを意味し、これには、例えば、５，６１８，７１３および５，７００，６６３に記載されるような改変型ＡＴＩＩＩ、野生型βＡＴＴに由来するもの、または１つ以上の残基（すなわち、１３５位のＡｓｎ）でのグリコシル化が二次変異（すなわち、セリン残基１３７のスレオニンまたはシステインを除く任意の他のアミノ酸での置換）によって妨げられているものを含む。
【００３８】
「タンパク質」は、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質などを含むアミノ酸を含む任意の化合物を意味する。
【００３９】
さらに、本発明の目的のために、用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、１つ以上のその実体をいう；例えば、「タンパク質」または「核酸分子」は、１つ以上のこれらの化合物または少なくとも１つの化合物をいう。このように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に使用され得ることにもまた注意されるべきである。さらに、「からなる群より選択される」化合物は、その以下の列挙（２つ以上の化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）を含む）における１つ以上の化合物をいう。本発明に従って、単離された、または生物学的に純粋な、タンパク質または核酸分子は、その天然の環境から取り出されている化合物である。このように、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、その化合物が精製されている程度を必ずしも反映はしない。本発明の単離された化合物は、その天然の供給源から得られ得るか、分子生物学技術を用いて生成され得るか、または化学合成によって生成され得る。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的のために、ＡＴＩＩＩ残基に対する数の特性は、当該分野で一般的に認識される番号付けの慣習に基づく。この慣習は、参照配列としてＢｏｃｋら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，８１１３−８１２５を利用し、そして残基の位置の記載は、結果の改変配列よりはむしろ、参照配列に基づく。アミノ酸（単数または複数）の欠失は通常、デルタ記号（Δ）によって指定される。挿入は通常、挿入の前のアミノ酸残基の数、次いでつづり指定によって指定される。例えば、残基３３６の後のトリペプチド配列の挿入は、３３６Ａ、３３６Ｂ、３３６Ｃと指定される。この慣習を変更することは、代表的でもなければ、この開示において意図されもしない。
【００４１】
さらに、「残基（単数または複数）Ｙで式Ｘの化合物」は、式Ｘの化合物が位置Ｙにあり、そして位置Ｙで任意の残基（単数または複数）を置換することを意味する。この化合物が、位置Ｙに以前に存在した任意の残基に付加することは意味しない；これに反して、この化合物は、位置Ｙに存在した任意の残基のかわり、またはその代理である。この定義において、「Ｘ」および「Ｙ」は変数として使用され、そして例えば、残基３８９および３９０で式Ｉの化合物」として、請求項において使用される。例えば、式Ｉの化合物は二量体であり、そして３８９および３９０に天然に存在する残基を置換する。
【００４２】
本発明は、特に、残基３８９および３９０で式Ｉの化合物を含むＡＴＩＩＩを含むエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ、またはその薬学的に受容可能な処方物を提供する：
式Ｉ：Ｄ−Ｅ
ここで、Ｄは、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、およびプロリンからなる群より選択され、そして
Ｅは、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、およびプロリンからなる群より選択される。
【００４３】
好ましいのは、残基３８６から３８８で式ＩＩの化合物および残基３９１で式ＩＩＩの化合物をさらに含む、上記のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩである：
式ＩＩ：Ａ−Ｂ−Ｃ
ここでＡは、スレオニンおよびグルタミン酸からなる群より選択され、そして
ここでＢは、アラニン、グルタミン酸、およびグルタミンからなる群より選択され、そして
ここでＣは、ロイシン、バリン、グリシン、グルタミン酸、およびスレオニンからなる群より選択され、ならびに
式ＩＩＩ：Ｆ
ここでＦは、アラニン、イソロイシン、セリン、グリシン、およびアスパラギンからなる群より選択される。
【００４４】
増強されたヘパリン親和性を有するこれらのＡＴＩＩＩが好ましく、ここで、このＡＴＩＩＩが、グリコシル化部位に続く２つの残基の変異によって、高いヘパリン親和性を有するものが特に好ましい。
【００４５】
特に、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがアラニンであるか、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがグリシンであるか、またはＤがフェニルアラニンであり、かつＥがフェニルアラニンである、上記のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩが好ましい。
【００４６】
Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがアラニンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンであるか、またはここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがバリンであり、かつＦがアラニンであるか、またはここでＡがスレオニンであり、Ｂがアラニンであり、Ｃがロイシンであり、かつＦイソロイシンであるものが最も好ましい。
【００４７】
しかし、Ｄがグルタミン酸であり、かつＥがグリシンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがロイシンであり、かつＦがアラニンであるものもまた、好ましい。
【００４８】
しかし、Ｄがフェニルアラニンであり、かつＥがフェニルアラニンであるものであって、そしてここでＡがスレオニンであり、Ｂがグルタミン酸であり、Ｃがグリシンであり、かつＦがセリンであるものもまた、最も好ましい。
【００４９】
また、残基３８６〜３９１で、以下：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；および配列番号１４；および配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ、またはその薬学的に受容可能な処方物も提供される。
【００５０】
本明細書中に開示されるタンパク質を含む組換え細胞もまた提供される。
【００５１】
本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質（ホモログを含む）は、エラスターゼによる切断に抵抗し、そしてＡＴＩＩＩ標的酵素を阻害するタンパク質の能力によって、簡単な様式で同定され得る。
【００５２】
エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質ホモログは、天然の対立遺伝子変異または天然の変異の結果であり得る。本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質ホモログはまた、当該分野で公知の技術を用いて産生され得、この技術としては、例えば、ランダム変異誘発または標的化変異誘発をもたらす古典的または組換え核酸技術を使用して、直接タンパク質を改変するかまたはそのタンパク質をコードする遺伝子を改変する技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質の１つの実施態様は、１つ以上の融合セグメントに接続されたエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質を含む融合タンパク質である。本発明とともに使用するために適切な融合セグメントとしては、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質のタンパク質安定性を増強し得、かつ／または（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる）エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質の精製を補助し得るセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば、増加した安定性を与える、タンパク質に増加した免疫原性を与える、そして／またはタンパク質の精製を簡素化する）を有する任意のサイズのドメインであり得る。融合タンパク質は、好ましくは、融合核酸分子で形質転換された組換え細胞を培養することによって産生され、この分子は、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ含有ドメインのカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれかに接続された融合セグメントを含むタンパク質をコードする。好ましい融合セグメントは、以下のドメインを含む：金属結合ドメイン（例えば、ポリヒスチジンセグメント）；イムノグロブリン結合ドメイン（例えば、プロテインＡ；プロテインＧ；Ｔ細胞；Ｂ細胞；Ｆｃレセプターまたは補体タンパク質抗体結合ドメイン）；糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）；「タグ」ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部、ストレップ（ｓｔｒｅｐ）タグペプチド、モノクローナル抗体のような、そのドメインに結合する化合物を使用して精製され得る他のドメイン）；ならびに／またはリンカーおよび酵素ドメイン（例えば、リンカーによってエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質に結合されるアルカリホスファターゼドメイン）。より好ましい融合セグメントとしては、以下が挙げられる：ポリヒスチジンセグメントのような金属結合ドメイン；マルトース結合ドメイン；ストレップタグペプチド；およびファージＴ７  Ｓ１０ペプチド。
【００５４】
本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子はまた、キメラ分子を含み得る。このキメラ分子は、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子、ならびにある様式でキメラ分子が表面に結合されることを可能にする第２の分子を含み、その様式は、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子が、表面に結合されないエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子と本質的に同じ様式でＡＴＩＩＩ標的酵素を阻害するような様式である。適切な第２の分子の例は、イムノグロブリン分子の一部または適切な結合パートナーを有する別のリガンドの一部を含み、このパートナーは、基質（例えば、ビオチンおよびアビジン）または金属結合タンパク質および金属（例えば、Ｈｉｓ）、または糖結合タンパク質および糖（例えば、マルトース）に固定され得る。
【００５５】
当該分野で公知の種々の手順は、天然に存在するＡＴＩＩＩまたは合成ＡＴＩＩＩを分子的に改変して、本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩを生成するために使用され得る。
【００５６】
本発明のＡＴＩＩＩをコードする核酸分子を含む核酸分子もまた、本発明によって提供される。特に、本発明のＡＴＩＩＩが、残基３８６〜３９１で、以下：配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；および配列番号１４；および配列番号１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む本発明のＡＴＩＩＩをコードする核酸が提供される。
【００５７】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む発現ベクターおよび組換え細胞を包含する。本発明の核酸化合物を使用して構築される融合タンパク質もまた提供される。
【００５８】
対立遺伝子改変体、縮重配列およびホモログは、特に上記の核酸に関して、本発明の範囲内に含まれる。対立遺伝子改変体は、当業者に周知であり、そして所定の二倍体の生物体内および／または生物体群の間で見出されると期待される。本発明はまた、実験操作（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅または部位特異的変異誘発の間に生成される改変体であるが、それらに限定されない）に起因する改変体を含む。特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにおいて実質的な量の重複性が存在することもまた周知である。従って、本発明はまた、同一アミノ酸の最終的な翻訳についてコードする代替コドンを含む核酸配列に関する。発現されるタンパク質の根本的な物理的特性を実質的に変更しない核酸配列または翻訳されたタンパク質のいずれかにおける変異もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンのバリンへの置換、リジンのアルギニンへの置換またはグルタミンのアスパラギンへの置換は、そのポリペプチドの機能性における変化をもたらし得ない。
【００５９】
本発明の特定のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ核酸分子の核酸配列を知ることにより、当業者は、例えば、（ａ）その核酸分子のコピーを作製し得、（ｂ）そのような核酸分子（例えば、全長遺伝子、全長コード領域、調節制御配列、短縮型コード領域を含む核酸分子）の少なくとも一部を含む核酸分子を入手し得、ならびに（ｃ）他の種由来のＡＴＩＩＩ核酸分子を入手し得る。そのような核酸分子は、本発明の抗体を用いて適切な発現ライブラリーをスクリーニングすること；本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる伝統的なクローニング技術によりＤＮＡの適切なライブラリーをスクリーニングすること；および、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて適切なライブラリーまたはＤＮＡをＰＣＲ増幅すること、を含む種々の方法において得られ得る。核酸分子をスクリーニングするためまたはそれを増幅するために好ましいライブラリーには、家畜（ウシ、ウマ、ブタ）および伴呂（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）動物（イヌおよびネコ）のｃＤＮＡライブラリー、ならびにゲノムＤＮＡライブラリーが含まれる。同様に、核酸分子をスクリーニングするためまたは増幅するために好ましいＤＮＡ供給源には、成体のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。遺伝子をクローニングおよび増幅するための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）に開示される。
【００６０】
本発明の１つの実施態様は、組換えベクターを含み、この組換えベクターは、核酸分子を宿主細胞中に送達し得る任意のベクターに挿入される、少なくとも１つの、本発明の単離された核酸分子を含む。そのようなベクターは、異種核酸配列、すなわち、本発明の核酸分子に隣接して天然には見出されず、そして好ましくはその核酸分子が由来する種以外の種由来である核酸配列を含む。このベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、原核生物または真核生物のいずれかであり得、そして代表的にはウイルスまたはプラスミドであり得る。組換えベクターは、本発明のＡＴＩＩＩ核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作において使用され得る。
【００６１】
組換えベクターの１つの型は、本明細書中で組換え分子といい、これは発現ベクターに作動可能に連結される、本発明の核酸分子を含む。句「作動可能に連結される（された）」とは、核酸分子が宿主細胞中に形質転換される場合、その分子が発現され得るような様式で、核酸分子を発現ベクターに挿入することをいう。本明細書中で使用される場合に、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し得、かつ特定の核酸分子の発現をもたらし得るＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、この発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製し得る。発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかであり得、そして代表的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本発明の組換え細胞（細菌細胞、真菌細胞、内部寄生生物細胞、昆虫細胞、他の動物細胞および植物細胞を含む）中で機能する（すなわち、遺伝子発現を指向する）任意のベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞中で、そしてより好ましくは本明細書中に開示される細胞型中で遺伝子発現を指向し得る。
【００６２】
特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞と適合しかつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列のような調節配列を含む。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列およびリプレッサー配列のような転写開始を制御する配列である。適切な転写制御配列は、本発明の少なくとも１つの組換え細胞において機能し得る任意の転写制御配列を含む。そのような種々の転写制御配列は当業者に公知である。好ましい転写制御配列は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞中で機能する配列（例えば、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージλ（例えば、λｐL、およびλｐRおよびそのようなプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α接合因子、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（例えば、シンドビスウイルスサブゲノムプロモーター）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ラクーンポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガウイルス（例えば、前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸および硝酸の転写制御配列、ならびに原核生物細胞または真核生物中で遺伝子発現を制御し得る他の配列であるが、それらに限定されない）を含む。さらなる適切な転写制御配列としては、組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導され得るプロモーター）が挙げられる。本発明の転写制御配列はまた、本来ヒトに関連する天然に存在する転写制御配列を含み得る。本発明はまた、本明細書中に記載される核酸分子を含む発現ベクターを含む。
【００６３】
組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、その核酸分子が転写される効率、生じた転写物が翻訳される効率、および翻訳後の修飾効率を操作することにより、形質転換された核酸分子の発現を改善し得る。本発明の核酸分子の発現を増大させるために有用な組換え技術としては、核酸分子を高コピー数のプラスミドに作動可能に連結すること、１つ以上の宿主細胞染色体への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定化配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガーノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン用法に対応するような本発明の核酸分子の改変、転写物を不安定にする配列の削除、ならびに発酵の間、組換え細胞増殖を組換え酵素生産から一時的に分離する制御シグナルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の発現される組換えタンパク質の活性は、そのようなタンパク質をコードする核酸分子の断片化、改変または誘導化により改善され得る。
【００６４】
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸で形質転換された組換え細胞を提供する。
【００６５】
核酸分子の細胞への形質転換は、核酸分子を細胞中に挿入し得る任意の方法によって達成され得る。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、吸着およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るか、または組織、器官または多細胞生物中で増殖し得る。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであり得るか、または発現する能力が保持される様式で、形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１つ以上の部位に組込まれ得る。
【００６６】
形質転換するのに適切な宿主細胞は、本発明の核酸分子で形質転換され得る任意の細胞を含む。宿主細胞は、非形質転換細胞か、または少なくとも１つの核酸分子（例えば、本発明の１つ以上のタンパク質および／または多価ワクチンの生成に有用な他のタンパク質をコードする核酸分子）ですでに形質転換された細胞のいずれかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明のＡＴＩＩＩを内因的に（すなわち、天然で）産生し得るか、または本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換させた後、そのようなタンパク質を産生し得るかのいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を産生し得る任意の細胞であり得、そして細菌細胞、真菌（酵母を含む）細胞、他の昆虫細胞、他の動物細胞および植物細胞を含む。好ましい宿主細胞としては、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、酵母細胞、寄生生物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、ＢＨＫ（ハムスター乳仔腎臓）細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、およびＶｅｒｏ細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２誘導体を含む）；およびバキュロウイルスを利用する昆虫細胞系である。
【００６７】
組換え細胞は、好ましくは、それぞれ、１つ以上の、本発明の核酸分子（これは、１つ以上の転写制御配列を含む発現ベクターに作動可能に連結される）を含む１つ以上の組換え分子で宿主細胞を形質転換することによって産生される。句「作動可能に連結される」とは、核酸分子が宿主細胞中に移入された場合に発現し得るような様式における核酸分子の発現ベクターへの挿入をいう。
【００６８】
本発明の組換え細胞は、本発明の少なくとも１つの任意の核酸分子で形質転換された任意の細胞を含む。細胞を形質転換するのに適切かつ好ましい核酸分子、ならびに適切かつ好ましい組換え分子は、本明細書中に開示される。
【００６９】
ＲＮＡのペプチドまたはタンパク質への翻訳は、例えば、ＡＴＩＩＩタンパク質の活性によってか、または抗ＡＴＩＩＩ抗体との免疫学的反応によって同定され得るＡＴＩＩＩタンパク質の少なくとも一部の生成を生じる。この方法において、ＡＴＩＩＩ産生細胞から単離されるｍＲＮＡのプールは、ＡＴＩＩＩタンパク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在について分析され得る。ＲＮＡプールのさらなる分画がなされて、非ＡＴＩＩＩ  ＲＮＡからＡＴＩＩＩ  ＲＮＡを精製し得る。この方法により産生されるペプチドまたはタンパク質は、ＡＴＩＩＩ  ｃＤＮＡの産生のためのプライマーを提供するために次いで使用されるアミノ酸配列を提供するために分析され得るか、または翻訳に使用されるＲＮＡは、ＡＴＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を提供し、そしてＡＴＩＩＩ  ｃＤＮＡの産生のためのプローブを生成するために分析され得る。これらの方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９中に見出され得る。
【００７０】
他の型のライブラリー、および他の細胞または細胞型から構築されるライブラリーは、ＡＴＩＩＩをコードするＤＮＡを単離するために有用であり得る。他の型のライブラリーは、他の哺乳動物または他の哺乳動物由来の細胞株に由来するｃＤＮＡライブラリー、およびゲノムＤＮＡライブラリーを含むが、これらに限定されない。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、標準的な技術により実行され得る。周知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（同書）中に見出され得る。
【００７１】
１つの実施態様において、本発明の単離されたタンパク質は、そのタンパク質を生成するのに有効な条件下でタンパク質を発現し得る細胞を培養し、そしてそのタンパク質を回収することによって生成される。培養するのに好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。有効な培養条件としては、タンパク質を生成し得る有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素の条件が挙げられるが、それらに限定されない。有効な培地とは、細胞が培養されて本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質を生成する任意の培地である。このような培地は、代表的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸供給源を有する水性培地、ならびに適切な塩、無機物、金属および他の栄養分（例えば、ビタミン）を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿中で培養され得る。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量にて実行され得る。このような培養条件は、当業者の専門知識内である。
【００７２】
産生のために使用されるベクターおよび宿主系に依存して、得られた本発明のタンパク質は、組換え細胞内にとどまるか：発酵培地中に分泌され得るか；２つの細胞膜間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間）に分泌され得るか；または細胞膜もしくはウイルス膜の外表面上に保持され得るのいずれかである。句「タンパク質の回収」、および同様の句は、タンパク質を含む発酵培地全体を収集することをいい、そして分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。本発明のタンパク質は、種々の標準的タンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーおよび差次的可溶化であるが、これらに限定されない）を用いて精製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋な」とは、治療用組成物または診断剤としてのタンパク質の有効な使用を可能にする純度をいう。例えば、動物の治療用組成物は、ほとんど不純物を示さないべきである。
【００７３】
さらに、組換えＡＴＩＩＩは、ＡＴＩＩＩに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはＡＴＩＩＩのポリペプチドフラグメントで作成された、免疫アフィニティーカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離され得る。
【００７４】
本発明はまた、本発明のＡＴＩＩＩタンパク質のエラスターゼ耐性部分またはそのマイムトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）（すなわち、抗ＡＴＩＩＩ抗体）に選択的に結合する単離された（すなわち、それらの天然の環境から取り出された）抗体を含む。本明細書中で使用されるように、用語、ＡＴＩＩＩタンパク質のエラスターゼ耐性部分に「選択的に結合する」とは、本発明の抗体が本発明の特定のタンパク質およびそのマイムトープに優先的に結合する能力をいう。結合は、当該分野において標準的な種々の方法（酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなどを含む；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）を参照のこと）を用いて測定され得る。抗エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ抗体は、好ましくは、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質に、そのタンパク質の活性を減少させるような方法で、選択的に結合する。これらの抗体は、さらなる物質（例えば、細胞因子または他の抗体フラグメント）と混合され得るか、または結合され得る。
【００７５】
本発明の単離された抗体は、体液（例えば、血清であるが、これに限定されない）中の抗体、または種々の程度で精製された抗体を含み得る。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。そのような抗体の機能的等価物（例えば、抗体フラグメントおよび遺伝的に操作された抗体（１つより多いエピトープに結合し得る単鎖抗体またはキメラ抗体を含む））もまた、本発明に含まれる。
【００７６】
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、（ａ）抗体を産生するために、有効量の本発明のタンパク質、ペプチドまたはそれらのマイムトープを動物に投与する工程、および（ｂ）抗体を回収する工程を包含する。別の方法において、本発明の抗体は、本明細書中上記で開示されたように、本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質を産生する技術を用いて、組換産生される。
【００７７】
本発明の組成物は、本発明の治療用化合物によってか、または治療用組成物中に含まれる核酸分子により発現されるタンパク質よって阻害され得る、少なくとも１つのＡＴＩＩＩ標的酵素を有する任意の動物に投与され得る。処置のための好ましい動物は、ヒトであるが、作業用および／または経済的食用動物である他の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌおよび他のペット）もまた、本発明の範囲内である。
【００７８】
本発明の治療用組成物は、処置される動物が寛容し得る賦形剤中に処方され得る。そのような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、および他の水性の生理学的に平衡化した塩溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド）もまた使用され得る。他の有用な処方物としては、増粘剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含む懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、少量の添加剤（例えば、等張性および化学的安定性を増大する物質）を含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられ、一方、保存剤の例としては、チメロサール、クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、液体の注射剤、または注射のための懸濁液もしくは溶液として適切な液体中に存在し得る固体のいずれかであり得る。従って、非液体処方物において、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などを含み得、これらには滅菌水または生理食塩水が投与の前に添加され得る。
【００７９】
本発明の化合物の投与は、皮下経路、皮内経路、静脈経路、鼻腔内経路、経口経路、経皮経路、筋肉内経路および他の非経口経路を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の種々の経路によってであり得る。
【００８０】
本発明の１つの実施態様において、治療用組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫応答を増大し得る薬剤である。本発明のタンパク質アジュバントは、タンパク質それ自体の形態においてか、またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子の形態で、本明細書中に記載される方法を用いて、送達され得る。
【００８１】
本発明の別の実施態様において、治療用組成物は、キャリアを含み得る。キャリアは、処置される動物における治療用組成物の半減期を増大させる化合物を含む。適切なキャリアとしては、ポリマー制御放出ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の別の実施態様は、本発明の組成物を動物中にゆっくりと放出し得る制御放出処方物である。本明細書中で使用されるように、制御放出処方物は、制御放出ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適切な制御放出ビヒクルには、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）および経皮送達系が含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の制御放出処方物は、動物への投与の際、インサイチュで固体またはゲルを形成する液体を含む。好ましい制御放出処方物は、生分解性（すなわち、生体浸食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ））である。
【００８３】
本発明の好ましい制御放出処方物は、動物におけるトロンビン活性化およびトロンビン媒介生物学的応答を減少させるための組成物の治療用量レベルを達成するのに十分な一定の速さで、本発明の組成物を動物の血液中に放出し得る。この治療用組成物は、好ましくは、約１日〜約１２ヶ月の範囲の期間にわたって放出され、そして２、３、４、５、６、７日〜３０日の間の期間にわたる放出を含む。
【００８４】
有効な様式において、本発明の治療用組成物を投与するための受容可能なプロトコルは、個体の用量サイズ、用量数、用量投与の頻度および投与の様式を含む。そのようなプロトコルの決定は、当業者によって達成され得る。適切な単回用量は、適切な期間にわたって１回以上投与する場合に、動物を疾患から防御（すなわち、予防または処置）し得る用量である。治療用組成物のさらなる投与の必要性は、患者の所定の状態に従って、当業者により決定され得る。
【００８５】
１つの実施態様に従って、本発明の核酸分子は、動物におけるエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質へのその核酸分子の発現が可能な様式で、動物に投与され得る。核酸分子は、以下を含むがそれらに限定されない種々の方法で動物に送達され得る：（ａ）裸の（すなわち、ウイルス被膜または細胞膜中にパッケージングされていない）核酸分子（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２４７、１４６５−１４６８中に教示されるような裸のＤＮＡ分子として）を投与すること、または（ｂ）組換えウイルスとしてかまたは組換え細胞としてパッケージングされた核酸分子を投与する（すなわち、核酸分子は、ウイルスビヒクルまたは細胞ビヒクルにより送達される）こと。
【００８６】
本発明の裸の核酸分子は、本発明の核酸分子を含み、そして好ましくは、本発明の組換え分子を含む。この組換え分子は、好ましくは、複製または他の方法での増幅について受容可能である。本発明の裸の核酸は、例えば、二シストロン性組換え分子の形態（例えば、１以上の内部リボソーム侵入部位を有する）の、１以上の本発明の核酸分子を含み得る。好ましい裸の核酸分子は、ウイルスゲノム（すなわち、ウイルスベクター）の少なくとも一部を含む。好ましいウイルスベクターは、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコナウイルス、およびレトロウイルスに基づくベクターを含む。ここで、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスまたはセムリキウイルス）、種特異的ヘルペスウイルスおよび種特異的ポックスウイルスに基づくベクターが、特に好ましい。任意の適切な転写制御配列が使用され得る。これらの配列としては、タンパク質産生に適切であるとして開示されている配列が挙げられる。特に好ましい転写制御配列としては、サイトメガロウイルス中初期配列（好ましくは、イントロンＡとともに用いられる）、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、および組織特異的な転写制御配列、ならびにウイルスベクターが使用される場合にはウイルスベクターに対して内因性である転写制御配列が挙げられる。「強力な」ポリ（Ａ）配列の取り込みもまた好ましい。
【００８７】
本発明の裸の核酸分子は、種々の方法によって投与され得る。適切な送達方法としては、例えば、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、皮内乱刺、粒子ボンバードメント、経口適用および経鼻適用が挙げられる。ここで、筋肉内注射、皮内注射、皮内乱刺および粒子ボンバードメントが好ましい。裸のＤＮＡ分子の好ましい単回用量は、当業者によって決定され得るように、投与経路および／または送達方法に依存して約１ナノグラム（ｎｇ）から約ｌミリグラム（ｍｇ）の範囲である。投与方法の例は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号（Ｂｒｕｎｅｒら、１９９３年４月２０日発行）、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／１９７９９号（１９９５年７月２７日公開、ＭｃＣａｂｅによる）、およびＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／０５８５３号（１９９５年３月２日公開、Ｃａｒｓｏｎらによる）に開示される。本発明の裸のＤＮＡ分子は、水性賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）中に、および／もしくはキャリア（例えば、脂質ベースのビヒクル）とともに含まれ得るか、またはこのＤＮＡ分子は、微粒子（例えば、金粒子）に結合され得る。
【００８８】
本発明の組換えウイルスは、ウイルス外被にパッケージングされ、そして投与後に動物において発現され得る本発明の組換え分子を含む。好ましくは、この組換え分子は、パッケージング欠損であり、かつ／または減弱化されたウイルスをコードする。多数の組換えウイルスが使用され得る。これらウイルスとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルスおよびレトロウイルスに基づくものが挙げられる。
【００８９】
動物に投与される場合、本発明の組換えウイルスは、レシピエント動物内の細胞に感染し、そしてその動物内のトロンビン活性化および／またはトロンビン活性化および／またはトロンビン媒介性生物学的応答を減少させ得る。例えば、本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ核酸分子を含む組換えウイルスは、その動物がトロンビン媒介性の生物学的応答を減少させるに充分な量のタンパク質の産生をもたらすプロトコルに従って投与される。投与プロトコルは、タンパク質ベースの組成物について本明細書に記載されるプロトコルに類似している。ここで、皮下、筋肉内、鼻内、および経口の投与経路が好ましい。
【００９０】
エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ  ＤＮＡまたはエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩタンパク質を含む薬学的に有用な組成物は、薬学的に受容可能なキャリアとの混合のような公知の方法に従うか、または化学誘導体を形成するようなさらなる化学的部分を伴う改変によって処方され得る。そのようなキャリア、改変および処方の方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。有効な投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を形成するために、そのような組成物は、有効量のタンパク質またはＤＮＡを含む。
【００９１】
本発明はまた、本明細書において提供される適切な局所的、経口、全身性および非経口の薬学的化合物の処方物を提供する目的を有する。これらの処方物は、広汎な種々の治療的投薬形態で、投与のための従来のビヒクル中にて投与され得る。例えば、この化合物は、錠剤、カプセル剤（各々は、時限放出および徐放の処方物を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤の形態での経口投与のため、または注射のために処方され得る。同様に、この化合物はまた、静脈内（ボーラスおよび注入を含む）、血管形成／カテーテル挿入の間、腹腔内、皮下的、閉塞を伴うかまたは伴わずに局所的、または筋肉内的に投与され得、これら全ては、薬学分野の当業者にとっては周知の形態を使用する。
【００９２】
エラスターゼ耐性のＡＴＩＩＩ分子は、緩衝液と合わされ得る。ここで、このエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子は、可溶化され、および／またはキャリアとともに存在する。適切な緩衝液およびキャリアは、当業者に公知である。適切な緩衝液の例としては、エラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩ分子がその標的酵素を阻害するように機能し得る任意の緩衝液が挙げられ、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝化生理食塩水）、ＴＥＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝化生理食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液およびＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ）が挙げられるがそれらに限定されない。キャリアの例としては、ポリマー性マトリクス、トキソイドおよび血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９３】
本発明の方法において、本明細書において詳細に記載される化合物は、活性成分を形成し得、そして代表的には、意図される投与形式に関して適切に選択された適切な薬学的希釈剤、賦形剤またはキャリア（本明細書において総称して、「キャリア」物質と称する）との混合物（すなわち、経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤など）において投与され、そして従来の薬学的実施と一致する。
【００９４】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与について、この活性薬物成分は、経口の非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わされ得る。さらに、所望されるか、または必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色料もまた、その混合物に取り込まれ得る。適切な結合剤としては、限定することなく、デンプン、ゼラチン、天然の糖（例えば、グルコース、βラクトース、コーン甘味料）、天然のゴムまたは合成ゴム（例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろうなどが挙げられる。これらの投薬形態において使用される滑沢剤としては、限定することなく、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定することなく、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。
【００９５】
液剤形態について、活性薬物成分は、適切に風味付けられた懸濁剤または分散剤（例えば、合成ゴムおよび天然ゴム（例えば、トラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなど）中で合わされ得る。使用され得る他の分散剤としては、グリセリンなどが挙げられる。非経口投与について、滅菌性の懸濁剤および液剤が所望される。一般に適切な保存料を含む等張性調製物は、静脈内投与が所望される場合に使用される。
【００９６】
活性薬物成分を含む局所調製物は、当該分野で周知の種々のキャリア物質（例えば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリシン、ビタミンＡの油、ビタミンＥの油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなど）と混合されて、例えば、アルコール液剤、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンジェル、スキンローションの処方物を形成し得る。本発明の化合物はまた、リポソーム送達系（例えば、小単層ベシクル、大単層ベシクルおよび多層ベシクル）の形態で投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン）から形成され得る。
【００９７】
本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーと合わされ得る。そのようなポリマーとしては、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するにおいて有用なクラスの生体分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋コポリマーまたは両親媒性ブロックコポリマー）と結合され得る。
【００９８】
従って、本明細書において、上記に記載の化合物、処方物、組成物およびプロトコルを利用する方法もまた提供される。特に、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する、トロンビン活性化を阻害する方法が提供される。１つの実施態様において、本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する、そのような阻害を必要とする患者におけるトロンビン活性化を阻害する方法が提供される。好ましい方法は、好ましいＡＴＩＩＩおよび最も好ましいＡＴＩＩＩを利用する。
【００９９】
本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する、第Ｘａ因子の阻害を必要とする患者において第Ｘａ因子を阻害する方法もまた提供される。好ましい方法は、実施例に具体的に記載されるような第Ｘａ因子阻害活性を有するＡＴＩＩＩを利用する。
【０１００】
本発明のＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する、トロンビンの阻害を必要とする患者においてトロンビンを阻害する方法もまた提供される。好ましい方法は、実施例に具体的に記載されるようなトロンビン阻害活性を有するＡＴＩＩＩを利用する。
【０１０１】
本発明はまた、トロンビン活性化に関連する病理的症状および／またはトロンビンが媒介する病理的症状の危険を、そのような処置を必要とする患者において処置および／または減少させる方法を提供する。この方法は、本発明が開示するＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する。特に、敗血症；外傷；急性呼吸窮迫症候群；血栓症；発作；および再狭窄に起因する病理的症状を処置する方法が好ましい。さらに、トロンビン活性化および／またはトロンビン媒介性関連病理症候群が危険である方法（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成における再閉塞および再狭窄；手術に関連する血栓症；虚血／再灌流障害；およびガンまたは手術患者における凝固異常）が本明細書において提供される。特に、このパラグラフにおいて記載されるような方法（ここで、手術患者に関連する凝固異常が心肺バイパスおよび関節置換に関連する異常である）が好ましい。
【０１０２】
血栓症、再狭窄、再閉塞、凝固異常の危険を、そのような減少を必要とする患者において減少させる方法もまた提供される。この方法は、本明細書の化合物、好ましくは、最も好ましい化合物もしくはそれをコードする核酸を投与する工程を包含する。特に、このパラグラフに記載される方法（ここで、凝固異常は、心配バイパスに関連する異常である）が好ましい。
【０１０３】
敗血症、外傷、急性呼吸窮迫症候群、汎発性血管内凝固症候群、虚血性発作、血栓症、再狭窄、および再閉塞を、そのような処置を必要とする患者において、処置する方法もまた提供される。この方法は、本明細書の化合物、好ましくは、最も好ましい化合物もしくはそれをコードする核酸を投与する工程を包含する。
【０１０４】
最後に、本発明はまた、エラスターゼ耐性のヒトアンチトロンビンＩＩＩを体液において産生するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を体液において発現するトランスジェニック動物を産生する工程であって、ここで、このヒトアンチトロンビンＩＩＩは、そのトランスジェニック動物によって産生される体液中に分泌される、工程；そのトランスジェニック動物から体液を収集する工程であって、この体液は、このヒトアンチトロンビンＩＩＩを含む、工程；ならびにこのヒトアンチトロンビンＩＩＩを、その収集した体液から単離する工程。好ましくは、この方法においては、その体液は乳汁または尿からなる群より選択される。その体液が乳汁であり、そしてその動物がヤギ、ヒツジおよびウシからなる群より選択される方法がより好ましい。最も好ましくは、ヒトアンチトロンビンＩＩＩをヤギの乳汁において産生するための方法であり、この方法は以下の工程を包含する：本発明のエラスターゼ耐性ＡＴＩＩＩをコードする導入遺伝子を乳腺組織において発現するトランスジェニックヤギを産生する工程であって、ここで、このヒトアンチトロンビンＩＩＩは、そのトランスジェニックヤギによって産生される乳汁中に分泌される、工程；そのトランスジェニックヤギから乳汁を収集する工程であって、ここで、その乳汁は、そのヒトアンチトロンビンＩＩＩを含む、工程；ならびにその収集された乳汁からそのヒトアンチトロンビンＩＩＩを単離する工程。本発明のこの局面は、米国特許第５，８４３，７０５号（この特許は、本明細書において参考としてその全体が援用される）に従って達成され得る。
【０１０５】
本発明はまた、試験化合物が本発明のＡＴＩＩＩ／トロンビンおよび／またはＡＴＩＩＩ相互作用を妨害する能力を同定する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：その試験化合物を、本発明のタンパク質と接触させる工程；およびその試験化合物とそのタンパク質が相互作用するか否かを決定する工程。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を例示するが、しかし、本発明を限定しない。この実施例は、当業者に公知と考えられる多数の分子生物学、微生物学、免疫学および生化学の技術を含むことに留意されたい。このような技術の開示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書および関連参考文献に見出され得る。
（実施例）
（実施例１：改変されたＡＴＩＩＩの調製およびアッセイにおいて使用される物質）
（プラスミド）
改変されたＡＴＩＩＩ配列を、ｐＢｌｕｅＢａｃバキュロウイルス発現構築物であるＢＢ．ＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａ（Ｅｒｓｄａｌ−Ｂａｄｊｕら、３１０  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３（１９９５））のアンチトロンビンＩＩＩ  ｃＤＮＡインサートから誘導した。ｐＵＣ１９中のＢＢ．ＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａの１５００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａ  ｃＤＮＡインサート（Ｂ１）を、ＰＣＲ変異誘発反応についてのテンプレートＤＮＡとして使用した。
【０１０７】
バキュロウイルス移入プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃ２は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、そしてこれを、グループＩ変異体の発現のために使用した。ｐＢｌｕｅＢａｃ２は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面体症ウイルス多面体プロモーター、複製起点、アンピシリン薬物耐性マーカー、およびＥＴＬ／βガラクトシダーゼ発現単位を含むことによって、組換えウイルスの同定を容易にする。さらに、ｐＢｌｕｅＢａｃ２は、多面体およびβガラクトシダーゼの転写単位に隣接し、そして移入プラスミドとバキュロウイルスゲノムとの間の相同組換えを促進するバキュロウイルスＤＮＡ配列を含む。グループＩ  ＡＴＩＩＩ配列を含むｐＢｌｕｅＢａｃ２移入プラスミド構築物を、Ｑｉａｇｅｎカラム上で精製し、その後、直鎖状にしたバキュロウイルスＤＮＡを用いてＳｆ９細胞を同時トランスフェクトした。
【０１０８】
ｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス移入プラスミドを、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａＣTM  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の一部として得、そしてこれをグループＩＩ変異体の発現のために使用した（表２を参照のこと）。ｐＦａｓｔＢａｃｌは、ゲンタマイシン耐性マーカーおよびバキュロウイルス多面体プロモーターがＴｎ７の左アームと右アームとの間に挿入されたものからなる発現カセットを含むｍｉｎｉ−Ｔｎ７トランスポゾンを有する。このｍｉｎｉ−Ｔｎ７は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂａｃ細胞に存在するヘルパープラスミド（ｐＭＯＮ７１２４）とともに、バキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ、ｂＭＯＮ１４２７２）に存在するｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７（これは、ＤＨｌ０Ｂａｃ細胞にも存在する）への組換え配列の挿入を容易にする。ｐＦａｓｔグループＩＩ移入プラスミドの「ミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）」ＤＮＡを、ＤＨｌ０Ｂａｃ  Ｅ．ｃｏｌｉのトランスフェクションのためにさらなる精製なしに使用した。
【０１０９】
（オリゴヌクレオチド）
変異誘発オリゴヌクレオチドを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬによってカスタム合成し、そして脱保護し、脱塩し、そして凍結乾燥した。これらのオリゴヌクレオチドを、使用前に滅菌した脱イオン水中で再構成した。合成オリゴヌクレオチド配列を、表２に列挙する。アミノ酸置換を特定することについてコドン変化を含むことに加えて、ほとんどの変異誘発オリゴヌクレオチド配列はまた、変異体サブクローン同定のために制限部位を導入した翻訳的にはサイレントな変化を組み込んだ。
【０１１０】
ＬＥＡＩ変異誘発プライマーは、ヌクレオチド１３２６−１２９２の間のＡＴＩＩＩの非コード鎖に対応する。Ｐ６−Ｐ３アミノ酸にてコード変化を特定することに加えて、ＬＥＡＩプライマーもまた、ＥａｇＩ部位を導入した。
【０１１１】
グループＩ変異誘発オリゴヌクレオチドは、ＡＴＩＩＩのコード鎖に対応し、そしてヌクレオチド１２９８にて始まって、ＡＴＩＩＩ  ｃＤＮＡの２４４ｂｐのＰｓｔＩ（１０５２）−ＲｓａＩ（１２９６）フラグメントに対する変異含有ＰＣＲフラグメントのインフレームな平滑末端の連結を可能にする（図１を参照のこと）。グループＩ  ＰＣＲ変異誘発反応のための下流プライマーは、ＮＥＢ＃１２３３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。これは、「汎用」Ｍ１３「逆向き配列決定」プライマーであり、これは、Ｂ１  ＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａ／ｐＵＣｌ９テンプレートについてのベクターのポリリンカーに対してハイブリダイズする。
【０１１２】
【表１】
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グループＩＩ変異誘発オリゴヌクレオチドはまた、ＡＴＩＩＩコード鎖に対応し、そしてこれを、ＰｉｃａｒｄおよびＢｏｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９６）によって記載されるような改変を伴って、Ｐｉｃａｒｄら、２２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５８７（１９９４）の３プライマーＰＣＲ変異誘発プロトコルにおいて「Ｍ」（変異誘発プライマー）として使用した。プライマーａｔ３．１２０１Ｆを、「Ｆ」順向きプライマーとして使用し、そしてＭ１３「逆向き配列決定プライマー」ＮＥＢ＃１２０１（これは、テンプレートベクターのポリリンカーにおける汎用配列に対応する）を、「Ｒ」逆向きプライマーとして使用した。
【０１１３】
プライマーａｔ３．１２０１Ｆはまた、ＰＣＲに由来する好中球耐性ＡＴＩＩＩ移入プラスミドの領域におけるＤＮＡ配列を確認するためのプライマーとしても用いた。
【０１１４】
（分子生物学的酵素）
制限エンドヌクレアーゼを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ），
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。Ｔ４  ＤＮＡキナーゼおよび仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ２．０を、ＵＳＢから入手した。
【０１１５】
（細胞および培地）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’細胞（ＥｎｄＡｌ、ｒｅｃＡｌ、ｈｓｄＲ１７、ｒ−ｋ、ｍ＋ｋ）、ｓｕｐＥ４４、λ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ、ｒｅｌＡｌ、ｆ８０  ｌａｃＺＤＭ１５Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）、ｄｅｏＲ＋、Ｆ’）を、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ２およびｐＦａｓｔのプラスミドおよびそれらのＡＴＩＩＩ含有誘導体を増幅するために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨｌＯＢａｃ細胞（これは、ヘルパープラスミドｐＭＯＮ７１２４およびバクミドｂＭＯＮ１４２７２を含む）を、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃTM  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）におけるグループＩＩ変異体についての組換えバクミドＤＮＡの転移のために使用した。
【０１１６】
Ｓｆ９  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（これは、もともとは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した）を、バキュロウイルス増幅および発現のための宿主細胞として使用した。このＳｆ９細胞を、無血清Ｓｆ  ９００  ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で維持した。Ｓｆ９細胞を１〜３×１０6／ｍＬの密度で含むエーレンマイヤフラスコを、２７℃で維持し、そして酸素化のために１６０ｒｐｍにて振盪した。生存度は、トリパンブルー排除によると９７％より多かった。トランスフェクション（すべての変異体）およびプラーク精製（グループＩ変異体）のために、Ｓｆ９細胞を、１０％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプレートした。これらの手順にもまた用いられたグレース培地およびＢｌｕｏ−Ｇａｌを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入した。グループＩ変異体について、グループＩ  ｐＢｌｕｅＢａｃ移入プラスミドの同時トランスフェクションのために使用した、直鎖状の野生型バキュロウイルスＤＮＡおよびカチオン性リポソーム試薬を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
（抗血清）
ヒツジ抗ヒトＡＴＩＩＩおよびアルカリホスファターゼ結合体化ロバ抗ヒツジＩｇをＴｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ Ｌｔｄ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から購入した。
【０１１７】
（電気泳動およびクロマトグラフィー）
「常用の（ｒｅｇｕｌａｒ）」ポリアクリルアミドストック（２９：１  アクリルアミド：ビス）をＡｍｒｅｓｃｏ（Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）から購入した。Ｌａｅｍｍｌｉゲルのための「デュラクリル（Ｄｕｒａｃｒｙｌ）」アクリルアミド（３７．５：１  アクリルアミド：ビス）をＥＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。ＤＮＡ配列決定のための「ロングレンジャー（Ｌｏｎｇｒａｎｇｅｒ）」アクリルアミドをＡＴ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から購入した。
【０１１８】
すべてのＬａｅｍｍｌｉ電気泳動をＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩ電気泳動セル（ＢｉｏＲａｄ）中の１０×１０ｃｍゲル上で実行した。タンパク質のバンドをＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて可視化した。ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ染色したゲルをＰｏｌａｒｏｉｄ  ６６７フィルムを用いて紫外透過照明上で写真撮影した。
【０１１９】
５ｍＬ  ＥｃｏｎｏｐａｋヘパリンカートリッジをＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを低圧のＥｃｏｎｏｓｙｓｔｅｍコントローラー（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実行した。
【０１２０】
（緩衝液）
ＰＥ：２０ｍＭ  リン酸、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＰＮＥ：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＰＮＥ−ＰＥＧ：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
ＳＤＳ非還元サンプル緩衝液：０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％  グリセロール、４％  ＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルー
ＳＤＳ還元サンプル緩衝液：０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％  グリセロール、５％  βメルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルー
ＴＢＥ：０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓホウ酸、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＴＢＳ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
ＴＢＳＴ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０
ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＴＧ−ＳＤＳ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  グリシン、０．１％ＳＤＳ
（色素形成性基質）
Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアナリドジヒドロクロリド）およびＳ−２７６５（Ｈ−ａ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアナリドジヒドロクロリド）をＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡおよびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡをＳｉｇｍａから購入した。
【０１２１】
（セリンプロテイナーゼおよびプロテイナーゼインヒビター）
ヒトα−トロンビン調製物は、Ｊｏｈｎ  Ｆｅｎｔｏｎ博士およびＷｉｌｌｉａｍ  Ｌａｗｓｏｎ博士（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ）の贈呈であった。ヒト第Ｘａ因子およびヒト血漿ＡＴＩＩＩをＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購入した。ヒト白血球エラスターゼおよびヒトカテプシンＧをＥｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．（Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）から購入した。
【０１２２】
（ヘパリンナトリウム）
ヘパリンナトリウムをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。このヘパリンは、ブタ腸粘膜に由来し、１３，５００〜１５，０００ダルトンの範囲であり、１ｍｇあたり１４０  ＵＳＰ（米国薬局方）ヘパリン単位を含む。
【０１２３】
（実施例２：改変されたＡＴＩＩＩを含む組換えバキュロウイルスの変異誘発および構築）
改変されたＡＴＩＩＩを、ヒトＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａをバックグラウンドにして生成した。鋳型ＤＮＡは、ｈ．ＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａ  ｃＤＮＡインサート（Ｅｒｓｄａｌ−Ｂａｄｊｕら、３１０  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３（１９９５）を含むｐＵＣ１９であるＢ１であった。
【０１２４】
（グループＩの変異体）
ＰＣＲ変異誘発。グループＩ変異体について、１００μＬの変異誘発反応物（６００μＬのＰＣＲ管中）は、以下を含んだ：４３．２ｆｍｏｌの鋳型ＤＮＡ（１２０ｎｇの４．２ｋｂプラスミド）、変異誘発（Ｍ）プライマーおよび下流（ＮＥＢ＃１２３３）プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ（１μＭ）、２．５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＸＴＰ（０．２ｍＭ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．７５、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ならびに０．１ｇ／Ｌ  ＢＳＡ。この酵素を、他の成分が完全に混合された後、最後に添加し、そして反応物に鉱油を重層した。ポリメラーゼ連鎖反応を、３０サイクルの増幅（９４℃、１分；４５℃、１分；７２℃、２分）、その後７２℃５分でプログラムされたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で実行し、そして分析まで４℃で保管した。
【０１２５】
サブクローニング。ｃＤＮＡ  ＡＴＩＩＩ配列の最終２２７ｂｐに対応する二本鎖ＤＮＡを含む、完了したＰＣＲ反応物を、ＢａｍＨＩ制限消化に供し、次いで３００ｎｇのｐＵＣ１８−Ｈｉｎｆサイズマーカーとともに、プレ泳動の５％非変性ポリアクリルアミドゲル（２９：１  アクリルアミド：ビス、１×ＴＢＥ、５０ｍＡ、底部へブロモフェノールブルー）上で電気泳動した。このゲルを臭化エチジウムで染色し、そしてバンドを紫外透過照明によって可視化した。予測された５’平滑末端〜３’−Ｂａｍ  ＨＩの２２７ｂｐのフラグメント（ヌクレオチド１２９８〜１５２５）が同定され、これをポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｓｐｅｃｔａｐｏｒ２透析バッグ（１２，０００〜１４，０００分子量カットオフ）に入れ、そして、５０ｍＡで氷上で０．１×ＴＢＥ中で一晩、電気溶出した。溶出液を採集し、そして遠心分離により粒子状のアクリルアミドを除去した。このＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、無水エタノールで沈殿させ、８０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１６μＬの滅菌脱イオン水中に再懸濁した。
【０１２６】
同時に、Ｂ１（ｈ．ａｔ３．Ｎ１３５Ａ／ｐＵＣ１９）をＰｓｔＩ、ＲｓａＩおよびＳｔｕＩで消化した。この消化物をプレ泳動５％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして２４４ｂｐのＰｓｔＩ−ＲｓａＩフラグメント（ヌクレオチド１０５３〜１２９７）を切り出した。このＰｓｔＩ−ＲｓａＩフラグメントを、電気溶出し、フェノール／クロロホルム抽出し、次いで滅菌脱イオン水に再懸濁した。さらにベクターをＰｓｔＩおよびＢａｍＩでの消化により、続いて、仔ウシアルカリホスファターゼでの脱リン酸化により調製した。
【０１２７】
ＡＴＩＩＩ  ｃＤＮＡの３’末端を含むプラスミドを以下の３つの部分の連結により得た（ｉ）ＰＣＲ変異誘発反応由来の５’平滑末端〜３’Ｂａｍ  ＨＩの２２７ｂｐフラグメント、（ｉｉ）Ｂ１のＰｓｔＩ〜ＲｓａＩフラグメント（ヌクレオチド１０５３〜１２９７）、および（ｉｉｉ）ｐＵＣ１９／Ｐｓｔ／ＢａｍＨＩ／ＣＡＰベクター。１０μＬの連結反応物は、１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを含み、そしてこれを４℃で一晩インキュベートした。さらに、以下のコントロール反応を実行した：（＋）インサート（−）リガーゼ、（−）インサート（＋）リガーゼ、および（−）インサート（−）リガーゼ。連結されたＤＮＡをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’細胞に形質転換し（以下の形質転換方法を参照のこと）、そして、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。それぞれの改変体について、最低４つのコロニーをマスタープレートに拾い採り、そしてこれを用いて、ミニプレップＤＮＡ（以下、ミニプレップＤＮＡ法を参照のこと）のための５ｍＬの培養物を接種した。
【０１２８】
変異誘発プライマーにより導入された部位について制限酵素での消化によりＢ１の親配列または変異体配列の存在についてミニプレップを迅速にスクリーニングした。次いで、変異体制限部位マーカーを含むプラスミドを、ＰＣＲ誘導ＲｓａＩをこえて停止コドン領域まで配列決定し、所望の変異の存在および計画されていない変異の非存在を確認した（以下のＤＮＡ配列決定法を参照のこと）。
【０１２９】
配列の確認後、ＡＴＩＩＩ  ｃＤＮＡの３’末端を含むＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ヌクレオチド１０５３〜１５２５）を調製し、そしてゲル精製した。さらに、Ｂ１由来のＡＴＩＩＩ．Ｎ１３５Ａ  ｃＤＮＡ配列の５’ＮｈｅＩ−ＰｓｔＩ部分をまた、調製してゲル精製した。５’フラグメントおよび３’フラグメントならびにｐＢｌｕｅＢａｃ２／ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＣＡＰベクターの３部分からなる連結物をコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’細胞に形質転換した。単一のコロニーを用いて培養物に接種し、そしてｐＢｌｕｅＢａｃ２移入プラスミドの高純度のＤＮＡをＱｉａｇｅｎ法により調製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡを滅菌水に再懸濁し、そして２６０ｎｍで濃度を決定した。それぞれの移入プラスミドについてのＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡを制限消化により再チエックし、次いで野生型直鎖状バキュロウイルスＤＮＡとともにＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。
【０１３０】
ｐＢｌｕｅＢａｃ２移入プラスミドおよび直鎖状バキュロウイルスＤＮＡの同時トランスフェクション。７０〜８０％コンフルエンシーのＳｆ９単層を、少なくとも３０分間、２×１０6のＳｆ９細胞を６０ｍｍのプレートに播種することにより準備した。１ｍＬの未補充Ｇｒａｃｅ培地を含むトランスフェクション混合物、１μｇの直鎖状ＡｃＭＮＰＶ  ＤＮＡおよび４μｇのＡＴＩＩＩ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ２移入プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ）を準備した。２０μＬの徹底的に混合されたＣａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、ＤＮＡ／Ｇｒａｃｅ培地溶液に添加し、激しくボルテックスし、次いで１５分間室温でインキュベートした。インキュベーションの間、この培地をＳｆ９プレートから吸引し、そして２ｍＬのＧｒａｃｅ培地で置換した。この細胞をトランスフェクション混合インキュベーション終了の２分以内まで静置した（約１０分）。Ｇｒａｃｅ培地を細胞から除去し、そして１ｍＬのトランスフェクション混合物を６０ｍｍのプレートに滴下した。このプレートを穏やかなロッキングプラットホーム上で４時間インキュベートした。ロッキングプラットホーム上での４時間後、１ｍＬの完全ＴＮＭ−ＦＨ培地をそれぞれの６０ｍｍプレートに添加し、そしてプレートを２７℃の加湿インキュベーターに移した。４８時間後、組換えバキュロウイルスおよび野生型バキュロウイルスの混合物を含む「１次溶解物」を回収した。
【０１３１】
グループＩ変異体を発現する組換えバキュロウイルスの単離。プラーク精製手順を用いて、１次溶解物で感染させたＳｆ９細胞から組換えバキュロウイルスを精製した。６０ｃｍのプレートに３０分間、２×１０6のＳｆ９細胞を播種した。この培地を吸引し、そして完全ＴＮＭ−ＦＨ培地中の１次溶解物の１０倍、１００倍および１０００倍希釈物の１ｍＬで置換した。このプレートを２７℃の加湿インキュベーターで２時間インキュベートし、次いでこの培地を吸引し、そして４ｍＬの完全Ｇｒａｃｅ培地で置換した。暖めた１０％  ＦＢＳおよび２％  Ｂｌｕｏ−Ｇａｌアガロースを、感染させたＳｆ９細胞単層上に注ぎ、そして固化させた。このプレートを滅菌の濡れたペーパータオルを備えたボックス中に配置して高湿度レベルに維持し、そして２７℃で４〜６日間インキュベートし、この間に青色プラークが出現した。単離した青色プラークを２１ゲージの注射針で拾い、そして０．５ｍＬ  ＴＮＭ−ＦＨ中に５×１０5のＳｆ９細胞を含有する２４ウェルプレートのウェルに移した。２４ウェルプレートを２７℃の加湿インキュベーター中でインキュベートし、そして感染後４〜６日で、２次溶解物ウイルスストックを含む培地を回収した。２次溶解物は、改変ＡＴＩＩＩ配列を保有するクローニングされた組換えバキュロウイルスを含んだ。２次溶解物において発現されたＡＴＩＩＩの存在を、ウエスタンブロッティングにより確認し、そしてこれらをさらなる研究のためにウイルスストックとして用いた。
【０１３２】
（グループＩＩの変異体）
ＰＣＲ変異誘発。グループＩＩ変異体について、ＰｉｃａｒｄおよびＢｏｃｋ（１９９６）に記載の改変を用いて、Ｐｉｃｈａｒｄら（１９９４）のプロトコールに従って、３−プライマーの変異誘発を行った。工程１：１００μＬの変異誘発反応物（６００μＬのＰＣＲ管中）は、以下を含んだ：４３．２ｆｍｏｌの鋳型ＤＮＡ（１２０ｎｇの４．２ｋｂプラスミド）、変異誘発（Ｍ）プライマーおよび下流（ＮＥＢ＃１２３３）プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌ（１μＭ）、２．５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＸＴＰ（０．２ｍＭ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．７５、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ならびに０．１ｇ／Ｌ  ＢＳＡ。この酵素を、他の成分が完全に混合された後、最後に添加し、そして反応物に鉱油を重層した。ポリメラーゼ連鎖反応を、３０サイクルの増幅（９４℃、１分；４５℃、１分；７２℃、２分）、その後７２℃５分でプログラムされたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で実行し、そして分析まで４℃で保管した。工程２：この工程を、水相に５００ｐｍｏｌの上流（１２０１Ｆ）プライマーを添加すること、および工程１に記載の増幅プログラムを実行することにより開始する。工程３：５００ｐｍｏｌの下流プライマー（ＮＥＢ＃１２３３）および、再度、工程１に記載した同じ増幅プログラムを用いる。
【０１３３】
ｐＦａｓｔ移入プラスミドのサブクローニングおよび構築。二本鎖ＤＮＡを含む、完了したＰＣＲ反応物を、ＮｓｉＩおよびＸｂａＩの制限消化に供し、次いで３００ｎｇのｐＵＣ１８−Ｈｉｎｆサイズマーカーとともに、プレ泳動の５％非変性ポリアクリルアミドゲル（２９：１  アクリルアミド：ビス、１×ＴＢＥ、５０ｍＡ、底部へブロモフェノールブルー）上で電気泳動した。このゲルを臭化エチジウムで染色し、そしてバンドを紫外透過照明によって可視化した。所望の３００ｂｐの５’−ＮｓｉＩ〜３’−ＸｂａＩフラグメントを同定し、ポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｓｐｅｃｔａｐｏｒ２透析バッグ（１２，０００〜１４，０００分子量でカットオフ）に入れ、そして、氷上で５０ｍＡで０．１×ＴＢＥ中で一晩、電気抽出した。溶出液を採集し、そして遠心分離により粒子状のアクリルアミドを除去した。このＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、無水エタノールで沈殿させ、８０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１６μＬの滅菌脱イオン水中に再懸濁した。
【０１３４】
ＰＣＲ変異誘発反応由来の３００ｂｐのＮｓｉ  Ｉ／ＸｂａＩフラグメントをｐＦａｓｔ*．Ｎ１３５Ａ／ＮｓｉＩ／ＸｂａＩ／ＣＡＰに連結した。１０μＬの連結反応物は、１単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを含み、そしてこれを４℃で一晩インキュベートした。さらに、以下のコントロール反応を実行した：（＋）インサート（−）リガーゼ、（−）インサート（＋）リガーゼ、および（−）インサート（−）リガーゼ。連結されたＤＮＡをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’細胞に形質転換し（以下の形質転換方法を参照のこと）、そして、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。それぞれの改変体について、最低４つの白色（インサート含有）コロニーをマスタープレートに拾い、そしてこれを用いて、ミニプレップＤＮＡ（以下、ミニプレップＤＮＡ法を参照のこと）のための５ｍＬの培養物を接種した。
【０１３５】
変異体のサブクローンの同定および配列の確認。変異誘発プライマーにより導入された部位について制限酵素での消化によりＢ１の親配列または変異体配列の存在についてミニプレップを迅速にスクリーニングした。次いで、変異体制限部位マーカーを含むプラスミドを、ＮｓｉＩをこえて停止コドン領域まで配列決定し、所望の変異の存在および計画されていない変異の非存在を確認した（以下、ＤＮＡ配列決定法を参照のこと）。
【０１３６】
バクミド（ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡの転移および単離。ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を氷上で融解し、そして１００μＬの細胞を１５ｍＬのポリプロピレンチューブに入れた。５μＬ（約１ｎｇ）のｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＴＩＩＩ移入プラスミドミニプレップＤＮＡを細胞に添加し、そして穏やかに混合した。混合物を３０分間氷上に置いた。混合物に４２℃で４５秒間熱ショックを与え、次いで２分間冷却した。９００μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を混合物に添加し、そしてこのサンプルを３７℃で４時間回転させた。細胞をＳ．Ｏ．Ｃ．培地中で１０倍、１００倍および１０００倍に階段希釈し、そしてそれぞれの希釈液１００μＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３００μｇ／ｍＬ  Ｂｌｕｏ−Ｇａｌおよび４０μｇ／ｍＬのＩＰＴＧを含有するＬｕｒｉａ寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で３６〜４８時間インキュベートした。
【０１３７】
白色コロニー（ポリヘドリン／ＡＴＩＩＩカセットのＴｎ７転移、および関連するｌａｃ  Ｚ  ａペプチド発現除去から生じる組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）を含む）を、拾い、そして新鮮なプレートにストリークして、白色の表現型を確認した。次いで、単一の白色コロニーを２ｍＬのＬＢ培地に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。１ｍＬの培養物を微量遠心管に移し、そして１分間回転させた。この上清を廃棄し、そしてペレットを０．３ｍＬの溶液Ｉ（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ）に再懸濁した。０．３ｍＬの溶液ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）を添加し、そしてこのサンプルを穏やかに混合し、その後５分間室温でインキュベーションした。０．３ｍＬの３Ｍ  ＫＡｃ、ｐＨ５．５の添加後、このサンプルを５〜１０分間氷上に置いた。次に、このサンプルを４℃で１０分間遠心分離（１２，０００×ｇ）し、そしてこの上清を０．８ｍＬの無水イソプロパノールを含む清浄な微量遠心管に移した。バクミドＤＮＡを管を数回反転させ、そしてこれを５〜１０分間氷上に置くことにより沈殿させた。このサンプルを１５分間微量遠心分離し、この上清を吸引し、そしてペレットに０．５ｍＬの７０％エタノールを添加した。この管を数回反転し、次いで５分間微量遠心分離した。この上清を吸引し、そしてこのペレットを風乾し、そして４０μＬのＴＥに再懸濁した。次いで、組換えバクミドＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクトし、一次ウイルスストックを作製した。
【０１３８】
Ｓｆ９細胞のトランスフェクションおよび一次ウイルスストックの回収。６ウェル組織培養皿の個々のウェルに１×１０6のＳｆ９細胞を播種し、そして２７℃の加湿インキュベーター中で少なくとも１時間インキュベートした。溶液Ａ（１００μＬのＳｆ−９００ＩＩ培地中の５μＬのミニプレップバクミドＤＮＡ）および溶液Ｂ（１００μＬのＳｆ−９００ＩＩ培地中の６μＬのＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））を一緒にし、穏やかに混ぜ、そして室温で４５分間インキュベートした。０．８ｍＬのＳｆ−９００ＩＩ培地をＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ−ＤＮＡ混合物に添加した。培地をＳｆ９細胞から吸引した。この細胞を２ｍＬのＳｆ−９００ＩＩ培地で洗浄し、次いで１ｍＬのＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ−ＤＮＡ混合物を細胞単層に適用した。この細胞を２７℃で５時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を吸引し、そして新鮮なＳｆ−９００ＩＩ培地で置換した。この細胞を２７℃でインキュベートし、そして一次溶解ウイルスストックをトランスフェクション後４８時間で回収した。
【０１３９】
（形質転換）
コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’細胞を−７０℃貯蔵から取り出し、そして氷上で融解した。５μＬの連結試薬または５ｎｇのｐＵＣ１８コントロールプラスミドを添加し、そしてサンプルを穏やかに混合し、その後氷上で１５分インキュベートした。次いでこの細胞に４５℃で９０秒間、熱ショックを与え、その後ウエットな氷上で１分間インキュベートした。５００μＬの滅菌ＬＢをそれぞれの管に添加し、そして管をフェリスホイール（Ｆｅｒｒｉｓ  ｗｈｅｅｌ）上に置き、そして３０〜６０分間３７℃で再増殖させ、その間に形質転換された細胞中の薬物耐性マーカーの表現型発現が生じた。３００μＬのそれぞれの実験的形質転換反応物および２０μＬのｐＵＣ１８コントロール形質転換物を、アンプシリンおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上に塗り広げた。プレートを反転し、そして３７℃で一晩インキュベートした。形質転換効率を、プレートされた容量と形質転換コントロールに添加されたＤＮＡの量との積で除算した、コロニー数５００μＬとの積として算出した。
【０１４０】
（ミニプレップＤＮＡ）
このプロトコールを用いて、制限酵素分析、配列決定、サブクローニングおよび形質転換のためのＤＮＡを作製した。適切なＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶａＦ’コロニーをマスタープレートに拾い採り、次いでこれを、５ｍＬのＬＢアンピシリンへの接種に用いた。この培養管をフェリスホイール上で３７℃で１晩回転させた。次の日、この細胞を、冷蔵Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心分離（６０００×ｇ）で、１０分間８０００ｒｐｍ（ＳＭ−２４ローター）でペレットにし、そしてこの上清を廃棄した。１００μＬの溶液Ｉ（５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０および２ｍｇ／ｍＬ  新鮮溶解リゾリーム）を細胞ペレットに添加し、次いでミニプレップ管をボルテックスし、そして５分間室温でインキュベートした。２００μＬの溶液ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）をそれぞれの管に添加し、そしてミニプレップ管のラックを前後に数回振盪し、その後室温で２分間インキュベートした。１５０μＬの溶液ＩＩＩ（３Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．８）をそれぞれの管に添加し、そしてミニプレップ管のラックを再度振盪し、その後少なくとも１０分間−２０℃に移した。ミニプレップ管を冷凍庫から取り出し、そして直ちに、Ｓｏｒｖａｌｌ−ＲＣ５Ｂ冷蔵遠心分離機で、４℃で１５分間２０，０００×ｇで回転させた（１５，０００ｒｐｍ，ＳＭ−２４ローター）。遠心分離後、この管をローター内で保冷し（サンプルが温まる際のＳＤＳの可溶化を防ぐため）、その後上清の４５０μＬを取り出し、そしてそれを４５０μＬの平衡化フェノールに添加した。ボルテックスした後、４５０μＬのクロロホルムを添加しそしてボルテックスした。次いで、この溶液を３分間微量遠心分離し、相を分離させた。４００μＬの上部水相を清浄な微量遠心管に移し、そして９００μＬの無水エタノールを添加した。数回反転することにより混合した後、この管を３分間微量遠心分離した。エタノールを注意深く吸引し、そして１００μＬの溶液ＩＶ（０．３Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ６．８）をペレットに添加した。激しくボルテックスした後、９００μＬの８０％エタノールを添加し、次いでこのサンプルを反転することにより混合し、そして３分間微量遠心分離した。エタノールを再度注意深く吸引し、そしてペレットをＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ）で乾燥した。乾燥したペレットを５０μＬのＲＮａｓｅ溶液（水中、２００μｇ／ｍＬ）に再懸濁した。この方法で調製した３μＬのミニプレップＤＮＡは、ゲルの１レーンに十分である、５００ｎｇ〜１μｇのプラスミドＤＮＡを含んだ。
【０１４１】
（ＤＮＡ配列決定）
ＬＥＡＩおよびグループＩ変異体ミニプレップＤＮＡを、改変したＳａｎｇｅｒプロトコル（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）を用いて配列決定した。ｐＢｌｕｅＢａｃ２移入プラスミドを用いて生成された改変体に対して行ったすべての配列決定は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ２．０およびＵＳＢ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキットからの試薬を用いて行われた。３５Ｓ−ｄＡＴＰを、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した。配列決定反応を、１μＬの線状にしたミニプレップＤＮＡ（約３００ｎｇの二本鎖プラスミドＤＮＡ）に対して行い、このＤＮＡを、９５℃にて３分間の加熱および氷上でのアニーリングによって、３．１２０１Ｆにて、０．５ピコモルのプライマーとともに変性させた。標識化反応は、１０μＬの鋳型−プライマー混合物、１μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、２μＬの１：５〜１：２０で希釈したｄＧＴＰ標識化混合物、０．５μＬの３５Ｓ−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、＞１０００ｍＣｉ／モル）、および２μＬの８倍希釈したＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ２．０（１３単位／ｍＬ）（最後に添加した）を含んだ。伸長反応物を、室温にて２〜４分間インキュベートし、次いで４つのアリコートに分け、これらのアリコートを、１μＭの最終濃度にまでｄｄＮＴＰを添加することによって終結させた。この配列決定反応物を、１．２×ＴＢＥ緩衝液および７Ｍ尿素を含む５％「Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ」アクリルアミドゲル上で分析した。電気泳動ランニング緩衝液は０．６×ＴＢＥであった。電気泳動後、このゲルをＢｉｏＲａｄゲル乾燥機を用いて３ＭＭ  Ｗｈａｔｍａｎ紙上で乾燥させた。この乾燥させたゲルを、−７０℃にて５〜７日間、Ｆｕｊｉ  ＲＸ  ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）に露光した。
【０１４２】
グループＩＩ変異体の配列決定を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、蛍光ＤＮＡ化学を使用するＡＢＩ  ３７３装置で行った。
【０１４３】
（ウェスタンブロッティング）
還元されたサンプルを、２００ボルトで７５分間、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩ電気泳動セル（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、１２％  ＳＤＳ−Ｄｕｒａｃｒｙｌ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。分離したタンパク質を、ＰｏｌｙＢｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｄｅｌ  ＳＢＤ−１０００，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写した。Ａｎｏｄｅ緩衝液番号１（０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ，２０％メタノール，ｐＨ１０．４）、Ａｎｏｄｅ緩衝液番号２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％メタノール、ｐＨ１０．４）、およびＣａｔｈｏｄｅ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，４０ｍＭ  ６−アミノヘキサン酸、２０％メタノール，ｐＨ９．４）からなる、低イオン強度の不連続緩衝液系を、タンパク質ブロッティングのために使用した。３−１／２”×２−１／４”のブロットを、１２５ｍＡにて２０分間転写した。膜を、ＴＢＳＴ中５％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で３０分間ブロックし、次いでヒツジ抗ヒトＡＴＩＩＩ  Ｉｇ（１：５０００、５％ＮＦＤＭを含むＴＢＳＴ中）とともに４℃にて一晩インキュベートした。各１０分のＴＢＳＴでの３回の洗浄後に、膜を、アルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヒツジＩｇ（１：３０００、５％ＮＦＤＭを含むＴＢＳＴ中）とともに室温にてインキュベートした。ＴＢＳでの激しい洗浄の後、このブロットを、１６ｍｇ／Ｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＸＰ）および３２ｍｇ／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を含む５０ｍＬアルカリホスファターゼ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９．５）を用いて、十分な染色が得られるまで発色させた。ブロットを、脱イオン水で洗浄し、そして風乾させた。
【０１４４】
（小規模バキュウロウイルスストック増幅）
新しいＳｆ−９００ＩＩ培地中の対数Ｓｆ９細胞（１〜２×１０6細胞／ｍＬ、＞９８％生存率）の１５０ｍＬ懸濁培養物に、２０μＬの２次溶解物を感染させた。感染させた培養物を、２７℃、１５０ｒｐｍにてインキュベートした。感染の３日後に、上清を回収した。ウシ胎仔血清を１０％まで添加し、ウイルスストックを安定化させた。次いで、これを、短期保存および長期保存のために、それぞれ４℃または−７０℃にて維持した。
【０１４５】
（組換えＡＴＩＩＩ改変体の大規模発現）
より大きな容量（０．８〜１．６Ｌ）の組換えＡＴＩＩＩを、Ｓｆ−９００ＩＩ培地中の対数Ｓｆ９細胞（１〜２×１０6細胞／ｍＬ、＞９８％生存率）のガラス三角フラスコに、０．５％（ｖ／ｖ）ウイルスストックを感染させることによって生成した。培養物を、２７℃、１５０ｒｐｍにて維持した。馴化培地を、感染の４日後に収集し、そしてアジ化ナトリウムを０．０２％（ｗ／ｖ）まで添加し、低速の遠心分離と、０．４５ミクロン酢酸セルロース膜（Ｚａｐ  Ｃａｐｓ，Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を通すことによって細胞および特定の物質を除去することにより、クロマトグラフィー用に調製した。
【０１４６】
（ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー）
培養培地の澄明化した上清を、０．４ｍＬ／分にて、２つのタンデム５ｍＬ  Ｅｃｏｎｏｐａｋヘパリンカートリッジを通して吸い上げた。カラムを、１５０ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、続いて０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。結合したタンパク質を、０．６から３．１ＭのＮａＣｌ勾配でカラムから溶出させた。１．５ｍＬの画分を、４．５ｍＬの１×ＰＥに回収した。画分のＮａＣｌ濃度を、１ｇ／ＬのＮａＣｌに対して較正した導電率メーターで決定した。この勾配画分中のＡＴＩＩＩの存在および純度を、１０％ポリアクリルアミドＬａｅｍｍｌｉゲルで分離したアリコートのＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ染色によって決定した。ピーク画分をプールし、そして透析した。
【０１４７】
（透析）
プールしたＡＴＩＩＩ画分をＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ２透析チューブ（１２，０００−１４，０００  ＭＷＣＯ）に配置し、そして４℃にて、少なくとも３０００倍容量のＰＮＥ緩衝液に対して透析した。次いで、透析したタンパク質を、製造業者の説明書の通りに、３０，０００  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５接線流濃縮機（ｔａｎｎｇｅｎｉｔａｌ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＴＤ、Ｂｉｎｂｒｏｏｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して濃縮した。濃縮機を、ＰＮＥ−ＰＥＧとともに予め回して、タンパク質の吸着を減少させた。次いで、濃縮した調製物を、５分間４℃にて微量遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）して粒子および凝集物を取り除き、そしてサンプルを０．５〜１．０ｍＬ容量にアリコートしそして−７０℃で保存した。
【０１４８】
（実施例３：改変ＡＴＩＩＩの分析）
（トロンビンおよびＸａ因子の２次反応速度定数の決定）
アンチトロンビンＩＩＩ改変体とトロンビンおよびＸａ因子の会合の連続（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）２次反応速度定数（κ）を、擬似第一条件下（インヒビターの濃度が、酵素濃度より非常に過剰である）で決定した。ＰＮＥ−ＰＥＧおよび５０μｇ／ｍＬのポリブレン（混入する全てのハプテンを中和するために）中の、異なる濃度（４５０ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ）のＡＴＩＩＩの４０μｌのアリコートを、低結合９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の４つ組のウェル中にプレロードした。プレートを２５℃で維持し、そして３０ｎＭヒトトロンビンまたは１５ｎＭヒトＸａ因子の２０μｌのアリコートを５分間隔で連続的に各々４つのウェルに添加した。１００μｌの１．５ｍＭ色素生産性の基質（トロンビンについてはＳ−２２３８；Ｘａ因子についてはＳ−２７６５）を添加することにより、最後のウェルに酵素を添加した後、反応を５分間クエンチした。Ｄｅｌｔａｓｏｆｔソフトウェアを備えたＭａｃｉｎｔｏｓｈ  ＳＥにより制御されたＢｉｏＴｅｋ  ＥＬＳ１１Ｘ反応速度プレートリーダー上で、残留酵素活性を測定した。色素生産性基質切断の開始速度を４０５ｎｍでモニターした。観察された擬似１次反応速度定数（κobs）を、ｌｎ（残留酵素活性）対酵素およびインヒビターを同時インキュベートした時間のプロットの負の傾きから算出した。プロットを、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを用いて作成した。κappは観察された擬似１次反応速度定数（κobs）をインヒビター濃度で、除算することにより算出した。
【０１４９】
（好中球プロテイナーゼに対するＡＴＩＩＩ改変体の感受性の決定）
好中球プロテイナーゼによる不活化に対するＡＴＩＩＩ改変体の感受性を、インヒビター切断の速度をモニターすることにより決定した。標準的な反応条件は、以下であった：ＰＮＥ−ＰＥＧ中、１μＭ  ＡＴＩＩＩ、１０ｎＭ  ＨＮＥまたは５０ｎＭカテプシンＧ、５０μｇ／ｍＬ非分画性ヘパリン。反応用量は、１５０μＬであった。プロテアーゼを最後に添加し、そして反応混合物を３７℃でインキュベートした。異なる時点で、１０μＬのアリコート（５００ｎｇのＡＴＩＩＩに対応する）を非還元ＳＤＳサンプル緩衝液中に副次試料として採り、そしてドライアイス／エタノール中ですばやく凍結させた。１２％Ｄｕｒａｃｒｙｌポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の前に、サンプルを煮沸した。写真に撮ったゲルをスキャンし、そして以前に記載したように濃度測定分析した。残留ネイティブ（未切断）ＡＴＩＩＩの割合を、反応時間に対してプロットし、改変体の半減期を決定した。
【０１５０】
（好中球の上清に対するＡＴＩＩＩおよび改変体の感受性）
好中球の上清は、Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｌｉｏｕ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）により調製していただいた。６０ｍＬの新鮮に採取したクエン酸塩加全血を、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で１：１に希釈した。３０ｍＬの希釈全血を、５０−ｍＬ円錐形ポリプロピレンチューブ中の２０ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に注意深く重層した。チューブを、３０分間、８５０×ｇで室温にて遠心分離した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを、バフィーコート層を乱さないように注意して、注意深く吸引しそして除去した。２０ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中の２．５％デキストランを、チューブに添加し、そして内容物を、数回チューブを反転することにより混合した。チューブを室温に２０分間置き、その間に赤血球が凝集し、そして沈降した。一番上の好中球を多く含む層を吸引し、そして赤血球細胞を捨てた。好中球を多く含む層を、新しい５０−ｍＬチューブ中でＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水を用いて５０ｍＬまで増量し、そして室温で１０分間４７５×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、そしてペレットを５０ｍＬの冷溶解（ｌｙｓｉｎｇ）溶液（１５０ｍＭ  ＫＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に再懸濁した。溶解溶液中に細胞を氷上で３〜５分間置き、次いで１０分間、４℃にて４７５×ｇで遠心分離した。上清を捨て、そして細胞を使い捨ての滅菌ピペットを使用して、新鮮なハンクス緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＨＢＳＳ）中に再懸濁した。それらを１回以上ＨＢＳＳで洗浄し、そして最後に３×１０7ＰＭＮ／ｍＬで再懸濁した。
【０１５１】
活性化表面を、直径１”の滅菌ポリスチレン培養ディッシュを使用して調製し、これを１ｍＬのＨＢＳＳ中の７５μｇのフィブロネクチン（ＦＮ）とともに１時間インキュベートした。ＨＢＳＳで３回リンスした後、プレートを、８００μＬの１：１６のヤギ抗ヒトＦＮＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１５０９、ｌｏｔ０９４Ｈ８８６８）または緩衝液とともに１時間インキュベートし、そしてＨＢＳＳで再び３回リンスした。上清を各ディッシュに、１ｍＬＨＢＳＳ中の２０〜３０×１０6ＰＭＮを添加することにより生成した。
【０１５２】
コントロールの好中球およびＩｇＧ刺激好中球からの上清を、色素生産性基質（ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ（ＡＡＰＶ）およびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（ＡＡＰＦ））を用いてアッセイした。上清の６０μｌのアリコートをマイクロプレートの４連ウェル中にロードした。好中球エラスターゼ（２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭおよび０．３２ｎＭ）およびカテプシンＧ（１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、および０．８ｎＭ）ならびに緩衝液のコントロールについての検量線を用いて、プレートをまたロードした。１００μＬの０．６６ｍＭ  ＡＡＰＶを各４連のセットの２つのウェルに添加し、そして１００μＬの０．６６ｍＭ  ＡＡＰＦを他の２つのウェルに添加した。基質の加水分解を４０５ｎｍで反応速度様式で測定した。各上清についてのプロテイナーゼ活性含量を精製プロテイナーゼ標準物より見積もった。好中球上清による不活化に対する改変体の耐性を、精製プロテイナーゼについて記載した標準反応条件を、精製プロテイナーゼの代わりに非希釈上清を用いて行なった。
【０１５３】
（実施例４：改変されたＡＴＩＩＩの特性）
改変されたアンチトロンビンＩＩＩの特性を、表３に要約する。好中球エラスターゼによる切断および不活化に対して感受性である血漿ＡＴＩＩＩと比較して、この改変体は、ＨＮＥに対する耐性の増大を示し、これは４倍〜８００倍より高い範囲で半減期の延長を伴った。改変されたＡＴＩＩＩの大半は、Ｘａ因子を阻害する能力を保持し、そしてこの群の中の５つについては、Ｘａ因子不活化の速度は、２倍より大きかった。改変されたＡＴＩＩＩの多くは、トロンビンを阻害する能力を保持する。いくつかの改変体を、好中球耐性およびカテプシンＧに対する耐性について試験した。ＩｇＧ活性化ヒト好中球の上清による不活化に対する耐性の程度、および活性化好中球の存在下における耐性の程度は、精製されたＨＮＥを用いるアッセイにおいて測定される耐性の程度と平行し、そしてＢｂ変異体の場合において獲得されるカテプシンＧ感受性とは独立であるように思われた。
【０１５４】
表３は、本明細書中に記載のプロトコールに従って行われた実験から得られた結果を記載する。
【０１５５】
【表２】
0004441116.tif 000003
表３に対する脚注。
【０１５６】
ａ．置換されたアミノ酸に下線を付す。
【０１５７】
ｂ．ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒの取り決め（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２７：１５７−１６２、１９６７）に従った、プロテイナーゼ基質およびインヒビターの切断しやすいＰ１−Ｐ１’結合に対してアミノ末端にある残基の番号付け。ヒトアンチトロンビンＩＩＩのＰ１残基は、アルギニン−３９３である。
【０１５８】
ｃ．特許請求の範囲の中の式において使用されるコード。Ａ＝残基３８６＝Ｐ８；Ｂ＝残基３８７＝Ｐ７；Ｃ＝残基３８８＝Ｐ６；Ｄ＝残基３８９＝Ｐ５；Ｅ＝残基３９０＝Ｐ４；Ｆ＝残基３９１＝Ｐ３。
【０１５９】
ｄ．好中球エラスターゼによる不活化の半減期。反応条件は、１μＭのＡＴＩＩＩ改変体、１０ｎＭの精製ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、５０μｇ／ｍＬの非分画性ヘパリン、２０ｍＭのＮａＰｉ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＥＤＴＡ、０．１％ポリエチレングリコール６０００、ｐＨ７．４、３７℃であった。種々の期間、ＨＮＥにＡＴＩＩＩ改変体を曝露した後、ネイティブのＡＴＩＩＩ分子および切断されたＡＴＩＩＩ分子を、非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ染色したゲルを撮影および走査し、そして残存ネイティブＡＴＩＩＩの百分率対インキュベーション時間のプロットから、半減期を決定した。Ｔ1/2を、平均±標準偏差として表す。
【０１６０】
ｅ．カテプシンＧによる不活化の半減期。反応条件は、１μＭのＡＴＩＩＩ改変体、５０ｎＭの精製カテプシンＧ、５０μｇ／ｍＬの非分画性ヘパリン、２０ｍＭのＮａＰｉ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００＿ＭのＥＤＴＡ、０．１％のポリエチレングリコール６０００、ｐＨ７．４、３７℃であった。種々の期間、カテプシンＧにＡＴＩＩＩ改変体を曝露した後、ネイティブのＡＴＩＩＩ分子および切断されたＡＴＩＩＩ分子を、非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ染色したゲルを撮影および走査し、そして残存ネイティブＡＴＩＩＩの百分率対インキュベーション時間のプロットから、半減期を決定した。Ｔ1/2を、平均±標準偏差として表す。
【０１６１】
ｆ．ＩｇＧ活性化ヒト好中球の上清による不活化の半減期。１μＭの組換えＡＴＩＩＩを、５０μｇ／ｍＬのヘパリンの存在下において、ＩｇＧで刺激された好中球由来の上清（約２ｎＭのエラスターゼ活性の等価物）に対して曝露した。反応を種々の時間で停止させ、そしてｄおよびｅに記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１６２】
ｇ．トロンビン阻害についての、見かけの二次速度定数。アッセイを、偽一次条件下で進め、そしてこれは、ＡＴＩＩＩ（３００ｎＭ、２００ｎＭ、または１００ｎＭ）、１０ｎＭのトロンビン、２０ｍＭのＮａＰｉ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＥＤＴＡ、０．１％のポリエチレングリコール６０００、５０μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐＨ７．４、２５℃）を含んだ。反応をクエンチし、そして残存酵素活性をＳ−２２３８で決定した。基質切断の初速度を、反応速度プレートリーダー（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で、４０５ｎｍにてモニターした。κobsを、ｌｎ（残存酵素活性）対酵素およびインヒビターの同時インキュベーションの時間のプロットの負の傾きから計算した。κapp＝κobs／［Ｉ］。値を、平均±標準偏差として表した。
【０１６３】
ｈ．Ｘａ因子阻害についての、見かけの二次速度定数。アッセイを、偽一次条件下で進め、そしてこれは、ＡＴＩＩＩ（３００ｎＭ、２００ｎＭ、または１００ｎＭ）、５ｎＭのＸａ因子、２０ｍＭのＮａＰｉ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＥＤＴＡ、０．１％のポリエチレングリコール６０００、５０μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐＨ７．４、２５℃）を含んだ。反応をクエンチし、そして残存酵素活性をＳ−２７６５で決定した。基質切断の初速度を、反応速度プレートリーダーで、４０５ｎｍにてモニターした。κobsを、ｌｎ（残存酵素活性）対酵素およびインヒビターの同時インキュベーションの時間のプロットの負の傾きから計算した。κapp＝κobs／［Ｉ］。
【０１６４】
ｉ．Ｒ−試験された最長の時点まで、切断に対して耐性（括弧中に示される）。
【０１６５】
ｊ．ＮＲ−反応せず。
【配列表】
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