(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはインドシアニングリーンであり；ＣＭはポリアスパラギン酸およびポリグアニル酸からなる群から選択される担体分子であり；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２】
ＣＭがポリアスパラギン酸である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＣＭがポリグアニル酸である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはインドシアニングリーンであり；ＣＭはポリアスパラギン酸およびポリグアニル酸からなる群から選択される担体分子であり；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートの診断的または治療的有効量を含む診断用または治療用組成物。
【請求項５】
該手順が光学的断層撮影イメージング手順、蛍光モニタリング手順、吸光度モニタリング手順および内視鏡試験手順からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
該手順が蛍光モニタリング手順である、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
ＣＭがポリアスパラギン酸である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ＣＭがポリグアニル酸である、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはインドシアニングリーンであり；ＣＭはポリアスパラギン酸およびポリグアニル酸からなる群から選択される担体分子であり；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する、ハプテンの血液持続性が変更された非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項１０】
ＣＭがポリアスパラギン酸である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
ＣＭがポリグアニル酸である、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはインドシアニングリーンであり；ＣＭはポリアスパラギン酸およびポリグアニル酸からなる群から選択される担体分子であり；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する、蛍光染料のインビトロおよびインビボ蛍光寿命が増加した非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを含む組成物。
【請求項１３】
ＣＭがポリアスパラギン酸である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
ＣＭがポリグアニル酸である、請求項１２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、非共有結合−担体−ハプテンバイオコンジュゲート、およびそれらを診断剤および治療薬を標的組織および臓器選択的に送達することに使用することに関する。とりわけ、本発明は、光学的断層撮影イメージング手順、蛍光モニタリング手順、吸光度モニタリング手順、または内視鏡試験手順を用いて、組織または臓器の構造および機能を決定する目的で、蛍光性の非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを特定部位へ選択的に送達することに関する。
【０００２】
従来技術の記載
非共有結合分子間力(例えば静電気的、水素結合、およびファンデルヴァールス相互作用)は、酵素触媒、薬物レセプター相互作用、抗原−抗体相互作用、ビオチン−アジピン相互作用、DNA二重らせん構造、食作用、植物および動物の色素沈着、および細胞輸送などの多くの生物学的プロセスにおいて、極めて重大な役割を果たす。例えば、花および植物で観察される様々な色は、天然の色素と植物細胞内で見られる炭水化物またはタンパク質の間の非共有結合的会合に帰せられる。
【０００３】
非共有結合力は、ハプテンまたは担体の物理化学的および／または生物学的性質を変えることができる。例えば、染料または色素分子とタンパク質または炭水化物との会合は、化学的または光化学安定性を変化させることができ、吸収／放出最大値の強度および／または波長、またはその両方を変化させることができる。単位相互作用ごとの相互作用力はかなり小さい(約４０kj／相互作用)が、２つの表面に沿った多くの相互作用の点の累積効果はかなり実体的となり、ハプテンと担体の間の強力な結合を導くことができる。このやり方は抗−DNA抗体の調製にうまく使用されている。DNAは、通常非免疫原性である、高度に荷電したアニオン性高分子である；しかし、高度に荷電したカチオン性メチル化ウシ血清アルブミン(MBSA)と複合化すると、DNAは免疫原性になる。従って、非共有結合DNA−MBSAバイオコンジュゲートは、DNAに対する免疫応答を引き出すほどに十分安定であった。
【０００４】
非特異的相互作用は生物学的過程でも重要な役割を果たす。例えば、ヒト血清アルブミンは非選択的様式で様々な分子に結合し、脈管構造から細胞へのこれらの分子の輸送を促進する。
【０００５】
従って、上記例から、非共有結合的に付着したバイオコンジュゲートは、単一ユニットとして生物学的に作用することは明らかである。上記特性に加えて、また担体分子は、化学的、光化学的、または放射線分解的分解からあるハプテンを保護し得る。本発明は、診断および治療用の新規なバイオコンジュゲートの設計における非共有結合的相互作用の概念の活用を意図する。
【０００６】
さらに、体液中の様々な種類の検出用の蛍光性染料および共有結合染料バイオコンジュゲートは、インビトロ免疫診断の分野でよく知られている。染料−免疫コンジュゲートは、放射能免疫アッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)手順を経た、体液中の様々な抗原、ホルモン、薬剤等の免疫組織学および免疫化学検出で、広く使用されている。蛍光性染料は蛍光顕微鏡検査で化学センサーとしても使用されている(J.P. Desvergne and A.W. Czarnik Chemosensors of Ion and Molecule Recognition, Kluver Academic, Boston, 1997; B.H. Satir, Ed., Noninvasive Techniques in Cell Biology, Wiley−Liss, New York 1990)。高度に蛍光性のポリエン染料であるインドシアニングリーンは、心搏出量のモニタリング、肝機能の評価、および腫瘍の断層撮影イメージングに使用されている(K. Licha et al., Synthesis and Characterization of Cyanine Dyes as Contrast Agents for Near−Infrared Imaging, SPIE, 1996, Vol. 2927, 192−197; X. Li et al., Tumor Localization Using Fluorescence of Indocyanine in Rat Models, SPIE, 1995, Vol. 2389, 789−798; B. Rieflce et al., In Vivo Characterization of Cyanine Dyes as Contrast Agents for Near−Infrared Imaging, SPIE, 1996, Vol. 2927, 199−208)。
【０００７】
従来のバイオコンジュゲート化学では、コンジュゲートは、薬剤、ホルモン、放射性医薬品薬剤、磁気共鳴映像試薬、化学療法薬、およびそれらの類似物などの様々なエフェクター分子の、生理活性担体に対する共有結合的付着によって調製される。このようなプロセスは、共有結合的付着に必要な適切な活性化ハプテンの複雑な合成に加えて、しばしば、２つの成分の使いにくい化学操作を含む。その上、得られた複合体の生理活性は、多くの場合、大きく減少するかまたは全く除去されるかの何れかである。
【０００８】
一般にポリエン染料、特にインドシアニングリーンは、それらの使用が近赤外(NIR)造影剤に限られるという、いくつかの不都合を有する。インドシアニングリーンは非常に短い血漿半減期を有し、肝臓によって急速に取りこまれる(D.K Meijer et al., Pharmacokinetics of Biliary Excretion in Man. VI. Indocyanine Green, Eur. J. Clin. Phannacol., 1988, Vol. 35, 295−303)；低い蛍光効率を有する、そして、蛍光の減量を伴う水性媒体中の分解を受ける。それゆえに、調製が簡単であり、十分安定であり診断または治療剤として有用である、新規なバイオコンジュゲートが必要とされている。
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、それゆえに、調製が簡単であり、診断的および治療的医療過程で有用な非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを提供することである。
本発明の他の目的は、診断的および治療的医療過程で使用されるまでの保管中安定であるバイオコンジュゲートを提供することである。
【００１０】
患者の診断または治療を行うための方法を提供することが本発明の他の目的である。
ハプテンの血液持続性(persistent)を変える方法の提供が本発明の別の目的である。
蛍光染料のインビトロおよびインビボ蛍光寿命の増加法の提供が本発明の別の目的である。
【００１１】
これらおよび他の目的が、式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはハプテン分子であり、その分子量は常にではないが一般的に１０００ダルトンより小さく、特異的機能を発揮し得る；ＣＭは担体分子であり、その分子量は常にではないが一般的に１０００ダルトンより小さく、ハプテンを特異的部位に輸送できる；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する、新規な構造的に異なった非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートの使用により達成される。
【００１２】
好ましくは、このバイオコンジュゲートは、蛍光染料ハプテンと、血清アルブミン、メチル化血清アルブミン、分子量２０００から２００００ダルトンのポリペプチド、および２０００から２００００ダルトンの範囲の分子量のポリサッカライド、２０００から１０００００ダルトンの範囲の分子量のポリヌクレオチド、シクロデキストリン、カリキサレンおよび界面活性剤からなる群から選択される担体分子から形成する。
【００１３】
最も好ましくは、このバイオコンジュゲートは、シアニン、インドシアニン、スクアライン、ポルフィリン、ローズベンガル、およびメチレンブルー染料からなる群から選択される蛍光染料ハプテン、およびメチル化血清アルブミン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、シクロデキストリン、イヌリン、ポリアデニル酸およびポリグアニル酸からなる群から選択される担体分子から形成される。
【００１４】
バイオコンジュゲートは、それらが使用前にインビトロで安定であり、使用中および後にビボで安定であるため、医療手順における診断および治療剤として有用である。ハプテンと担体の間の結合は、バイオコンジュゲートを安定化し、インビトロでの環境因子による分解を遅延させると理論化されている。また結合はインビボでのバイオコンジュゲートの遅い代謝をもたらし、したがって非結合ハプテンで予測されるよりも長い間体内に残る。
【００１５】
本発明の他の目的、利点および新規な性質は、以下の本発明の詳細な記載により明らかとなる。
【００１６】
図面の説明
図１は、インドシアニングリーン染料のラット血液クリアランス速度を示す。
図２は、イヌリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
図３は、MBSA−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
図４は、ガンマシクロデキストリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
図５は、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
図６(ａ)は、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および水溶液中の最初の調製物の時点でのインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
図６(ｂ)は、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製１日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
図６(ｃ)は、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製５日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
図６(ｄ)は、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製９日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
【００１７】
発明の詳細な記載
本発明は式：
ＨＭ−−−−−ＣＭ
(式中、ＨＭはハプテン分子であり、その分子量は常にではないが一般的に１０００ダルトンより小さく、特異的機能を発揮し得る；ＣＭは担体分子であり、その分子量は常にではないが一般的に１０００ダルトンより小さく、ハプテンを特異的部位に輸送できる；そして点線は担体分子とハプテン分子の間の非共有結合である)
を有する、新規な構造的に異なった非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを提供する。
【００１８】
ハプテンは小分子または高分子であり、ペプチド、炭水化物、および蛍光染料から選択される。ハプテンはホルモン、抗体、抗腫瘍剤、酵素、補酵素、ペプチド模倣物、糖模倣物、細胞接着性分子、放射性核種金属錯体、核磁気共鳴イメージング剤、Ｘ線不透明化剤、および音波発生剤(echogenic agent)のような分子であり得る。
【００１９】
好ましくは、ハプテンはその吸収および放出最大が２００−１２００ナノメートル(nm)範囲にある染料か、エネルギーを組織または細胞の中または外の他の成分に伝達できる光増感剤である。最も好ましくは、ハプテンは吸収および放出最大の範囲が４５０−９５０nmの範囲にある蛍光染料である。
【００２０】
担体はアルブミンおよびグロブリンのようなタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、リポタンパク質、界面活性剤、および他の天然または合成重合物質からなる群から選択される。
【００２１】
好ましくは、担体はアルブミンまたはメチル化アルブミン、抗体またはセレクチンのような糖タンパク質、イヌリンまたはレクチンのようなポリサッカライド、DNAまたはRNAのようなポリヌクレオチド、シクロデキストリンまたはカリキサレンのような包接化合物、およびトゥインのような界面活性剤からなる群から選択される高分子である。最も好ましくは、担体はポリサッカライド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドまたはシクロデキストリンである。
【００２２】
好ましい態様において、４５０−９５０nmの範囲の吸収および放出最大を有する蛍光染料ハプテンとポリサッカライド担体からなるバイオコンジュゲートが、染料とポリサッカライドの間の非共有結合的結合により保たれる。
【００２３】
他の好ましい態様において、染料バイオコンジュゲートは、染料とタンパク質の間の非共有結合的結合により保たれる４５０−９５０nmの範囲の吸収および放出最大を有する蛍光染料ハプテンとタンパク質からなる。
【００２４】
別の好ましい態様において、バイオコンジュゲートは、染料とポリペプチドの間の非共有結合的結合により保たれる４５０−９５０nmの範囲の吸収および放出最大を有する蛍光染料ハプテンとポリペプチドからなる。
【００２５】
本発明の染料分子は、意図する適用に依存して広く変化し得る。障害領域の診断的イメージングのために、近赤外(ＮＩＲ)領域、即ち７００−９００nmを吸収および放出する蛍光色素が望ましい。これはシアニン、インドシアニンまたはスクアラインを含むが、これらに限定されない。血液クリアランスのモニタリングまたは障害の内視鏡検査のために、４５０−９５０nm、好ましくは６００−９００nmの範囲を吸収および放出する色素が望ましい。
【００２６】
同様に、担体分子もまた広範囲に変わり得る。血液持続性薬剤のために、アルブミンまたはメチル化血清アルブミンが好ましい。腎臓機能測定のために、ポリサッカライドまたはアニオン性ポリペプチドが望ましい。障害の内視鏡検査のために、抗体および抗体フラグメントが好ましい。
【００２７】
本発明の非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートは、最適化学量的比率での二つの成分の単純な混合により有利には調製し、本混合物の有効量を薬学的に許容される製剤中に包含させて、個体に全身的にまたは調査する臓器または組織に局所的に投与できる。あるいは、バイオコンジュゲートを当分野で既知の方法により単離および貯蔵できる。本発明の新規バイオコンジュゲートは、広い臨床的使用を有し、これは腫瘍、炎症(無菌または細菌性両方)、および障害脈管構造の診断的造影；損傷部位のレーザーがガイドする内視鏡試験；および腫瘍または感染の化学療法および動的臓器機能評価を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の新規バイオコンジュゲートは、経腸、非経腸、または経口投与のための診断用または治療用組成物に製剤できる。これらの組成物は、有効量のバイオコンジュゲートを、意図される投与に適当な慣用の薬学的担体および賦形剤と共に含む。これらの組成物は、アスコルビン酸またはゲンチシン酸のような安定化剤も含み得る。例えば、非経腸用組成物は、有利には、約１μMから約１０μM濃度のバイオコンジュゲートの滅菌水溶液または懸濁液を含む。好ましい非経腸製剤は、１００μMから２mMのバイオコンジュゲートの濃度である。このような溶液はまた薬学的に許容される緩衝剤、および、所望により塩化ナトリウムのような電解質も含み得る。経腸投与用製剤は、当分野で既知のように広範囲に変わり得る。一般に、このような製剤は水溶液または懸濁液中に有効量のバイオコンジュゲートを含む液体である。このような経腸組成物は、所望により緩衝剤、界面活性剤、チキソトロピー剤等を含み得る。経口投与用組成物はまた香味剤およびその感覚刺激品質向上のための他の成分も含み得る。
【００２９】
診断組成物は、所望の診断または治療目標を達成するのに有効な量で投与する。このような投与量は、用いる具体的なバイオコンジュゲート、試験する臓器または組織、臨床過程で用いる装置に依存して広範囲に変わり得る。
【００３０】
本発明はまた、組織または臓器の構造および機能の測定を目的とした患者の診断または治療手順の実施法を提供する。本方法は、患者に本発明の非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを投与し、バイオコンジュゲートを組織または臓器の周りに局在化させ、光学的断層撮影イメージング手順、蛍光モニタリング手順、吸光度モニタリング手順および内視鏡試験手順、好ましくは、蛍光モニタリング手順のような診断または治療手順を患者に行うことを含む。
【００３１】
本発明はまた本発明の非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートの形成によるハプテンの血液持続性を変える方法を提供する。あるバイオコンジュゲートは、インビボでハプテン単独よりも安定であり、患者の血液からハプテン単独よりも遅い速度で除かれる。遅い血液クリアランス速度は、ハプテンが患者の血液システム中に延長された時間残るため、診断的および治療的医療過程のための長い時間を提供する。あるバイオコンジュゲートは、インビボでハプテン単独よりも不安定であり、患者の血液からハプテン単独よりも速い速度で除かれる。速い血液クリアランス速度は、ハプテンが患者の血液システム中に短い時間残るため、診断的および治療的医療過程のために短い時間を必要とする。これは、患者が過程を受け、回復するのが短い時間であることを意味し得る。
【００３２】
本発明はまた、本発明の非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートの形成による、蛍光染料のインビトロおよびインビボ蛍光寿命の延長法も提供する。バイオコンジュゲートは、蛍光染料単独と比較した場合よりも長い時間蛍光を発する能力を維持する。この長い蛍光寿命は、バイオコンジュゲートが長い時間棚に貯蔵され、次いで診断的および治療的医療過程に使用されることを可能にする。
【００３３】
本発明はまた蛍光染料単独よりも長いインビトロおよびインビボ蛍光寿命を有する蛍光染料バイオコンジュゲートを提供する。この長い蛍光寿命は、バイオコンジュゲートが長い時間棚に貯蔵され、次いで診断的および治療的医療過程に使用されることを可能にする。
【００３４】
以下の実施例は本明細書に記載する本発明の特異的態様を説明する。当業者には明白なように、種々の変化および修飾が可能であり、記載の本発明の範囲内で考慮される。
【００３５】
実験法
実施例１
インドシアニングリーン染料の血液クリアランス特性
【化１】
0004560209.tif 000002
インドシアニングリーン染料
【００３６】
インドシアニングリーン溶液(０.８mg／mL)の５００μL量を、Sprague-DawleyまたはFischerラットに側部尾静脈から注射した。染料バイオコンジュゲートの血液クリアランスを、レーザー蛍光装置(励起７８０nm；放出８３０nm)を使用して耳表面の毛細血管から放出される蛍光シグナルをモニターした。インドシアニングリーン血液クリアランスの時間定数(τ)は１３８秒である(図１)。
【００３７】
実施例２
イヌリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの調製および血液クリアランス特性
イヌリン(MW５０００、３０mg)の水溶液(５mL)をインドシアニングリーン(４mg)で処理し、全混合物を激しく約２分撹拌した。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度を、実施例１の記載と同じ方法を使用して測定した。このバイオコンジュゲートの時間定数(τ)は１３０秒である(図２)。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度は、インドシアニングリーンのものとほぼ同じである。
【００３８】
実施例３
MBSA−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの調製および血液クリアランス特性
メチル化ウシ血清アルブミン(MBSA)(MW７００００、２５mg)の水溶液(５mL)をインドシアニングリーン(４mg)で処理し、全混合物を激しく約５分撹拌した。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度を、実施例１の記載と同じ方法を使用して測定した。このバイオコンジュゲートの時間定数(τ)は２２４秒である(図３)。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度は、インドシアニングリーンのものより約２倍遅い。
【００３９】
実施例４
ガンマシクロデキストリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの調製および血液クリアランス特性
γ−シクロデキストリン(MW１１００、１１.２mg)の水溶液(５mL)をインドシアニングリーン(４mg)で処理し、全混合物を激しく１時間撹拌した。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度を、実施例１の記載と同じ方法を使用して測定した。このバイオコンジュゲートの時間定数(τ)は１４２秒である(図４)。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度は、インドシアニングリーンのものとほぼ同じである。
【００４０】
実施例５
ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの調製および血液クリアランス特性
ポリアスパラギン酸(MW６０００、８２mg)の水溶液(１０mL)をインドシアニングリーン(４mg)で処理し、全混合物を激しく約５分撹拌した。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度を、実施例１の記載と同じ方法を使用して測定した。このバイオコンジュゲートの時間定数(τ)は９１秒である(図５)。このバイオコンジュゲートの血液クリアランス速度は、インドシアニングリーンのものより速い。
【００４１】
実施例１−５に関して、データは、アルブミン、グロブリン、糖タンパク質、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、リポタンパク質、および界面活性剤のような種々の担体がインドシアニングリーン染料と相互作用し、非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートを形成し、ハプテンの血液持続性は、バイオコンジュゲートの形の場合に変化することを示す。
【００４２】
実施例６
数種のインドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの安定性および光物理学的特性
インドシアニングリーン(ICG)と、担体であるイヌリン、ポリ−ｄ,ｌ−アスパラギン酸、ポリグアニル酸、MBSA、およびγ−デキストリンの水溶液を調製し、環境温度で種々の時間間隔で蛍光強度をモニターした。表１および図６(ａ)、６(ｂ)、６(ｃ)および６(ｄ)はバイオコンジュゲートの安定性データを示す。
【００４３】
【表１】
0004560209.tif 000003
【００４４】
図６(ａ)、６(ｂ)、６(ｃ)および６(ｄ)に関して、データはポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料単独よりも、ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートにより安定性増加が達成されることを示す。表１に関して、データはある安定性増加がまたMBSAおよびポリグアニル酸を含むバイオコンジュゲートで見られることを示す。
【００４５】
実施例７
カルボキシフロログルシノール−スクアライン染料の調製
２,４,６−トリヒドロキシ安息香酸(３.４０ｇ、０.０２mol)およびスクアリックアシッド(１.１４ｇ、０.０１mol)の混合物の氷酢酸溶液(１５mL)を、４時間環流下加熱した。鮮紅色溶液を水(１００mL)に注ぎ、紫色染料を濾過して集め、大量の水で洗浄し、乾燥させた。染料を水(１００mL)に懸濁し、約１０分加熱して沸騰させ、熱いまま濾過し、乾燥させた。次いで、染料それ自体を更なる実験に使用した(A. Treibs and K. Jacob., Angew. Chem. Int. Ed. English, 1965, 4, 694)。
【００４６】
実施例８
カルボキシフロログルシノール−スクアライン染料バイオコンジュゲートの安定性および光物理学的特性
【化２】
0004560209.tif 000004
カルボキシフロログルシノールスクアライン染料
【００４７】
カルボキシフロログルシノール−スクアライン染料と、担体であるイヌリン、ポリ−ｌ−アルギニン、ポリ−ｄ,ｌ−アスパラギン酸およびγ−デキストリンの水溶液を調製し、環境温度で４８時間にわたり経時的に蛍光強度をモニターした(λex＝５１５、λem＝６１３)。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
0004560209.tif 000005
【００４９】
表２に関して、データはポリサッカライド、包接化合物、およびポリヌクレオチドのような種々の担体がカルボキシフロログルシノールスクアライン染料非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートと相互作用し、蛍光染料色素のインビトロおよびインビボ蛍光寿命は、バイオコンジュゲートの形の時増加することを示す。
【００５０】
実施例９
ベンゾチアゾリウム−スクアライン染料の調製
２−メチルベンゾチアゾール(２.９８ｇ、０.０２０mol)および臭化酢酸(２.９８ｇ、０.０２２mol)の混合物を、約１００℃で１５分加熱した。暗色の混合物をアセトン(１００mL)に注ぎ、ラベンダー色の固体を濾過して回収し、アセトンで洗浄し、乾燥させた。このベンゾチアゾリウム塩(１.３８ｇ、５mmol)およびスクアリックアシッド(０.２８ｇ、２.５mmol)の混合物のｎ−ブタノール／トルエン(１：１、１５mL)溶液を４時間、Dean-Stark条件下で加熱した。濃い青色溶液を水(１００mL)に注ぎ、青色染料を濾過して回収し、大量のアセトンで十分洗浄し、乾燥させた(S. Das et al., J. Phys. Chem., 1996, 100, 17310-17315)。
【００５１】
実施例１０
ベンゾチアゾリウム−スクアライン染料バイオコンジュゲートの安定性および光物理学的特性
【化３】
0004560209.tif 000006
ベンゾチアゾリウムスクアライン染料
【００５２】
ベンゾチアゾリウムスクアライン染料と、担体であるイヌリン、ポリアルギニン、ポリ−ｄ,ｌ−アスパラギン酸、ポリグアニル酸およびγ−デキストリンの水溶液を調製し、環境温度で４８時間にわたり経時的に蛍光強度をモニターした。結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
0004560209.tif 000007
【００５４】
表３に関して、データはポリサッカライド、包接化合物、およびポリヌクレオチドのような種々の担体がカルボキシフロログルシノールスクアライン染料非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートと相互作用し、蛍光染料色素のインビトロおよびインビボ蛍光寿命は、バイオコンジュゲートの形の時増加することを示す。
【００５５】
実施例１１
シアニンブルー染料複合体の調製
【化４】
0004560209.tif 000008
シアニンブルー染料
【００５６】
２−メチルベンゾチアゾール(２.９８ｇ、０.０２０mol)および臭化酢酸(２.９８ｇ、０.０２２mol)の混合物を、約１００℃で１５分加熱した。暗色の混合物をアセトン(１００mL)に注ぎ、ラベンダー色の固体を濾過して回収し、アセトンで洗浄し、乾燥させた。このベンゾチアゾリウム塩(１.４４ｇ、５mmol)およびマロンアルデヒドテトラメチルアセタール(０.４２ｇ、２.５mmol)の混合物のピリジン溶液を４時間、加熱環流した。濃い青色溶液をエーテル(５００mL)に注ぎ、青色染料を濾過して回収し、大量のエーテルで十分洗浄し、乾燥させた。
【００５７】
実施例１２
シアニンブルー染料複合体の安定性および光物理学的特性
シアニンブルー染料と、担体であるイヌリン、ポリアルギニン、ポリ−ｄ,ｌ−アスパラギン酸およびγ−デキストリンの水溶液を調製し、環境温度で２４時間にわたり経時的に蛍光強度をモニターした。結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
表４に関して、データはポリサッカライド、包接化合物、およびポリヌクレオチドのような種々の担体がシアニンブルー染料非共有結合担体−ハプテンバイオコンジュゲートと相互作用し、蛍光染料色素のインビトロおよびインビボ蛍光寿命は、バイオコンジュゲートの形の時増加することを示す。
【００６０】
本発明は、具体的な修飾に関して記載しているが、その詳細は限定するものとして見なしてはならず、種々の相同物、変化および修飾がその精神および範囲から逸脱することなく行い得ることは明らかであり、このような同等な態様はここに含まれるべきであることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  インドシアニングリーン染料のラット血液クリアランス速度を示す。
【図２】  イヌリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
【図３】  MBSA−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
【図４】  ガンマシクロデキストリン−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
【図５】  ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートのラット血液クリアランス速度を示す。
【図６（ａ）】  ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および水溶液中の最初の調製物の時点でのインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
【図６（ｂ）】  ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製一日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
【図６（ｃ）】  ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製五日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
【図６（ｄ）】  ポリアスパラギン酸−インドシアニングリーン染料バイオコンジュゲートの、および調製九日後のインドシアニングリーン単独のラット血液クリアランス速度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｃ）】
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【図６（ｄ）】
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