(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮から胎児を摘出することなく、子宮内の哺乳類の発生中期〜後期の胎児の特定の部位に、外来遺伝子が組み込まれた哺乳類発現プラスミドベクターを、マイクロインジェクションにより子宮筋越しに注入し、次いで子宮外から前記特定の部位を含む領域を挟むように電極を固定して電圧パルスをかけることにより外来遺伝子を導入し、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることからなる、ヒトを除く遺伝子導入哺乳動物の製造方法。
【請求項２】
哺乳類発現プラスミドベクターが、導入された遺伝子の発現を検出又は同定することができる標識可能な配列を含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外来遺伝子が導入される部位が、脳室壁である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がマウスであり、その発生中期〜後期の胎児が胎生１１〜１９日の胎児である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により製造されたヒトを除く哺乳動物。
【請求項６】
哺乳動物が、マウスである請求項５に記載の哺乳動物。
【請求項７】
子宮から胎児を摘出することなく、子宮内のヒトを除く哺乳類の発生中期〜後期の胎児の特定の部位に、外来遺伝子が組み込まれた哺乳類発現プラスミドベクターを、マイクロインジェクションにより子宮筋越しに注入し、次いで子宮外から前記特定の部位を含む領域を挟むように電極を固定して電圧パルスをかけることにより、外来遺伝子を導入する方法。
【請求項８】
哺乳類発現プラスミドベクターが、導入された遺伝子の発現を検出又は同定することができる標識可能な配列を含んでいる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
外来遺伝子が導入される部位が、脳室壁である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が、マウスであり、その発生中期〜後期の胎児が胎生１１〜１９日の胎児である請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載の方法で外来遺伝子が導入されたヒトを除く哺乳類の胎児を、そのまま子宮内で発育させる方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法により子宮内で発育させている胎児又は出生後の子孫を測定又は解析して、導入した外来遺伝子の機能を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、子宮から胎児を摘出することなく子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入し、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることからなる遺伝子導入哺乳動物の製造方法、当該方法で製造される遺伝子導入哺乳動物に関する。
本発明は、胎児を子宮から取り出すことなく、発生中期〜後期の胎児の特定の部位に目的の外来遺伝子を簡便にかつ効率よく導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の発現の特異性や、遺伝子産物の生理作用の解明や、疾患モデルを作成するなどのために動物に外来遺伝子を導入する方法が開発されている。外来遺伝子を導入された動物としては、トランスジェニックマウスが有名である。トランスジェニックマウスは、通常はマイクロインジェクション法により、受精卵に外来遺伝子を導入して作成されている。また、ウイルスに外来遺伝子を組み込んで感染させることにより遺伝子を導入する方法も広く行われている。しかし、ウイルスを用いる方法は、ウイルスベクターを製作するに非常に多くの時間が必要であり、ウイルスの取扱いにも熟練を要する。操作者への感染の危険性などの問題もあった。このようなウイルスを用いる方法に代えて、電気穿孔法により胚に直接外来遺伝子を導入方法が、特にニワトリにおいて開発されてきた（Muramatsu, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 230, 376-380 (1997)など）。この電気穿孔法は、従来のウイルスを用いる方法に比べて簡便であり、多数の外来遺伝子の導入に利用されてきた。また、この電気穿孔法は、ＤＮＡがマイナスに帯電していることを利用して、導入した遺伝子を陽極の方向に移動させることができ、胚の目的とする特定の位置に外来遺伝子を導入することも可能であるという大きな利点を有している。さらに、この方法は物理的な現象に基づくものであることから、ほとんどどの細胞にも適用できるという適用の容易性も有している。
【０００３】
また、受精卵に外来遺伝子を導入した場合には、個体の全ての細胞に外来遺伝子が組み込まれ、個体の特定の部位に外来遺伝子を導入することはできなかった。例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）に特異的に外来遺伝子を導入し、ＣＮＳ細胞の分化、発生をみようとする場合には、中枢神経系が形成される初期の時期に、外来遺伝子を導入することが必要であるが、このような手法は上記のウイルスベクターをもちいる方法と、ニワトリにおける電気穿孔法以外に未だ開発されていない。また、受精卵に外来遺伝子を導入する際、ＣＮＳ特異的に発現するプロモーターを利用して、遺伝子そのものはＣＮＳ以外にも導入されるもののＣＮＳのみに目的遺伝子を発現させる方法も試みられているが、プロモーターの特異性の厳密さが問題となり、信頼性に欠ける。そこで、マウスの発生初期（胎生８〜９日等）の胎児を子宮外に取り出して直接ＣＮＳに遺伝子導入し、全胚培養によりその後の影響を解析する手法も報告されている（Akamatsu, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999; 96(17): 9885-9890）。この方法は、中枢神経系の発生初期の短時間の状況解析には有用ではあった。しかしながら、この方法では、全胚培養はせいぜい２日間程度しか続けることができないとか、培養はあくまでも人工的な環境であり、本来の子宮内での発生過程とは異なる可能性がある、などの限界があった。
【０００４】
このように、受精卵に外来遺伝子を導入した場合には、特定の器官での特定の遺伝子の役割を解析することはできない（外来遺伝子に特定の器官で発現するプロモーターをつないだ場合もあるが、この方法では信頼性を欠き実用性は低かった。）ので、発生期の特定の器官のみに目的の外来遺伝子を導入し、これを正常に発生、発育させるための技術開発が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発生期の特定の器官に目的の外来遺伝子を導入し、これを正常に発生、発育させるための最初の手法を提供するものである。即ち本発明は、受精卵から分化がはじまり、器官が発生してきた段階で、当該器官に特異的に目的の外来遺伝子を導入し、かつ外来遺伝子が導入された個体を正常に発生、発育させることができる方法を初めて提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、電気穿孔法を用いる外来遺伝子の新たな導入方法を検討してきたところ、哺乳類の発生中期〜後期の胎児の特定の器官に、ガラス毛細管を用いて目的の遺伝子を組み込んだ哺乳類発現プラスミドベクターを子宮筋越しに注入し、遺伝子を導入したい領域にピンセット型の電極をあて、適当な電圧パルスをかけることにより特定の部位に目的の外来遺伝子を導入することができ、当該外来遺伝子を導入された胎児が子宮内で正常に発育することを見出した。これは電気穿孔法により、子宮から胎児を摘出することなく特定の部位に目的の外来遺伝子を導入することができるということを初めて見出したものであり、また更に遺伝子が導入された胎児がそのまま子宮内で発生を続けることができるということを初めて見出したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入し、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることからなる遺伝子導入哺乳動物の製造方法、及び当該方法により製造された遺伝子導入哺乳動物に関する。
また、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく、子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入する方法、及び当該方法で外来遺伝子が導入された哺乳類の胎児を、そのまま子宮内で発育させる方法に関する。
さらに、本発明は、外来遺伝子が導入され子宮内で発育させている胎児又は出生後の子孫を測定又は解析して、導入した外来遺伝子の機能を分析する方法に関する。
【０００８】
本発明の方法は、脳内の神経細胞が発生過程でさかんに産生され移動する時期（マウスでは胎生１５日頃）において、子宮から胎児を摘出することなく電気穿孔法による遺伝子導入を行い、更にそのまま子宮内で発生を続けさせることを可能にする全く新しい方法である。本発明の方法により、現在脳への遺伝子導入法として一般的に使われているウィルスベクターを用いた方法よりもきわめて簡単に、任意の遺伝子をプラスミドの状態で生きた胎児の脳に導入し、その後の影響を正常の子宮内での発生を経た形（出産させ、そのまま育てることも可能）で観察することができることを可能とするものである。
【０００９】
つぎに本発明をより具体的に説明する。
本発明者らは、胎生１２．５〜１７日のマウスの胎児の脳室に子宮外から５〜１０μｇ／μｌの１〜２μｌのプラスミドベクターを注入した。そして、子宮の外側から直径５ｍｍの電極を用いて３０〜３５Ｖの電気パルスをあてた。このときの電気抵抗は、６００〜１０００ｍΩであった。
この結果、例えば、胎生１４日で処置を行った５８の胎児のうちから、４７匹の外来遺伝子が発現している子供が生まれた（出生率８１％）。これは非常によいバイアビリティー（viability）であり、遺伝子導入が効率よく行なわれたことを示している。
【００１０】
本発明者らは、この方法を種々のプラスミドベクターによりさらに検証した。まず最初に、ＣＭＶプロモーターの制御下で強化緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein(ＥＧＦＰ)）を発現するｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテック社製）を用いた。胎生１４日のマウスの胎児の脳にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入し、胎生１５日に固定したところ、脳室帯及び放射状線維（radial fibers）にＥＧＦＰの蛍光を観察することができた（図１Ａ参照）。特に、細胞体や線維のみならず、軟膜下の放射状線維の末端（エンドフィート）においても強い蛍光を観察することができた（図１Ｆ参照）。
電気穿孔法から２日後（電気穿孔法を行ったのが胎生１４日であるから、胎生１６日に固定した。）には、中間帯を移動する多数の神経芽細胞の蛍光像が観察された（図１Ｂ参照）。３日後には、皮室板内を活発に移動する神経芽細胞にも発現が観察された。皮質板とは、将来神経細胞が層状に配列して大脳皮質を形成する部分である。３日後の写真はここには記載してないが、同様のことは、ＣＭＶプロモーターによる修飾赤色蛍光蛋白質（modified red fluorescent protein(ＤｓＲｅｄ)）を発現するｐＤｓＲｅｄ−Ｎ１（クローンテック社製）を用いた実験によっても示された（図１Ｅ参照）。図１Ｅでは、赤色になっている細胞が、観察されたＤｓＲｅｄ陽性の細胞である。
この観察結果は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）やトリチウムチミジンの取り込み分析によって明らかにされてきた成長過程における神経芽細胞の移動の様式（Angevine, J. B., et al., Nature, 192, 766-768 (1961) ; Altman, J., et al., Exp. Neurol., 107, 36-47 (1990)など）に完全に対応しており、今回の電気穿孔法による遺伝子導入は、正常な発生過程を阻害しないことがわかった。
【００１１】
さらに、胎生１５日にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入し、生後３日目（（Ｐ）３）に固定したところ、これらの部分においてまだ蛍光陽性の神経芽細胞の移動を観察することができた（図２ａ参照）。しかし、移動する細胞の数はこの時期では劇的に減少することがわかった。
実験に用いたＥＧＦＰは、細胞の全体に分布するため、導入された細胞の全形状を明瞭に目視することができる（図２Ｃ参照）。同じ部位において、多数のＥＧＦＰ陽性の神経芽細胞が、脳辺縁帯のすぐ下に並んで観察された。観察された神経芽細胞は、移動を終えて、成熟神経細胞への分化が開始している。これらの神経芽細胞における最初のプロセスは、辺縁帯において一次樹状突起に対応する枝分かれ構造の形成であった（図２Ｄ〜Ｆ参照）。ＥＧＦＰの蛍光は、放射状線維の束にも観察された。ＥＧＦＰ蛍光のある放射状線維は、内側の皮質よりも外側の皮質においてより多く観察された。ＥＧＦＰの蛍光により、一部の放射状線維は、大脳基底核原基と新皮質の境界を外側に向かって走り、その後急激に方向を変えて辺縁帯にむかって走ることが観察された（図２Ａ〜Ｂ参照）。ＥＧＦＰは各放射状線維の末端部に至るまでその構造を明らかにした（図２Ｂ参照）。
胎生期にｐＥＧＦＰ−Ｎ１を導入した生後の脳において、ＥＧＦＰ陽性の成熟神経細胞はまったく見られなかった。さらに、胎生１５日目において遺伝子導入し、生後１１日目に固定した脳では、ＥＧＦＰ陽性の成熟神経細胞及び神経芽細胞は全く認められず、形態学的にグリアと考えられる少数の細胞のみが陽性であった（図３Ｋ参照）。この実験結果の解釈として、神経芽細胞が移動を終了して成熟神経細胞へと分化すると、ＣＭＶプロモーターが作動しなくなることが考えられた。現在、成熟神経細胞をラベルせずに移動神経芽細胞のみをラベルして可視化する手法は全く知られていないことから、ＣＭＶプロモーターを使用した本手法は、神経芽細胞の移動過程及び配置決定機構を解析する上で非常に有用であると考えられた。
【００１２】
次に、ＥＧＦＰ遺伝子がヒトＥＦ１αプロモーターで発現制御されるプラスミドであるｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを作成して実験をした。ｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰの発現パターンは、胎生期においてはｐＥＧＦＰ−Ｎ１のそれとほぼ同じであった。すなわち、胎生１４日目にｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを脳内に注入し、１〜３日後に固定した場合、標識された細胞群は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１の場合と同様なパターンで移動した（図１Ｃ〜Ｅ参照。Eにおいては、緑色の細胞がそれである）。しかしながら、生後においては、ｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰで得られた結果とｐＥＧＦＰ−Ｎ１のそれとはまったく異なるパターンであった。図３Ａ及びＦは、胎生１４日目にｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰを注入した、生後２１日目の脳から作成した、異なる２枚の切片のパターンを示している。生後２１日目においても、明確にＥＧＦＰの発現が観察された。ＮｅｕＮ−陽性の成熟神経細胞にＥＧＦＰの強い発現が見られた（図３Ｈ〜Ｊ参照）。標識されたニューロンは脳皮質における第２層／第３層に集まって配置していた（図３Ｅ参照）。これは、胎生１４日目に発生した神経芽細胞の運命についての報告と一致している。
【００１３】
皮質のより内側において標識されたニューロンは、より深い位置に観察された（図３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ参照）。この相違は、脳皮質の部位間の神経細胞発生の経過の違い、すなわち、外側の方が内側よりも発生が早いことを反映している。ＥＧＦＰの蛍光は、細胞体のみならずその樹状突起や軸索においても強く観察された。これらの細胞の頂部樹状突起は辺縁帯に向かって発達し、軸索は深層部で見事に分岐している様子が明確に目視できた。脳梁を通過している交連線維（図３Ａ、Ｂ、Ｆ）及び反対側の皮質における分岐（図３Ｇ）もまた明確に目視できた。ＥＧＦＰを発現するために、汎神経マーカーであるＴα１α−チューブリンのプロモーターを使用した場合にも、生後５日目において脳梁線維の同様なパターンを観察することができた（図３Ｌ参照）。
【００１４】
前記で説明してきた本発明の方法を要約すれば、妊娠母体（マウス）を麻酔して開腹する。子宮を露出させ、ガラス毛細管を用いて、目的の遺伝子を組み込んだ哺乳類発現プラスミドベクターを胎児の脳室へ子宮筋越しに注入する。遺伝子を導入したい領域を考慮してピンセット型の電極をあて、適当な電圧パルスをかけることにより遺伝子導入する。閉腹して、そのまま発生を継続させるということである。
このように本発明の新規な電気穿孔法は、マウスの胎児における細胞の運命、神経細胞の移動、位置決定及び軸索の伸長を決定するなどの発生中期または終期における遺伝子の機能及び発現を解析するために非常に有用なものである。このシステムの大きな利点は簡便なことである。複数の遺伝子を多数構築して生体内で簡単に実験を行うこともできる。さらにＥＧＦＰ発現プラスミドベクターを用いれば、おのおのの神経細胞の全形態及び線維連絡パターンを目視することができる。したがってこの方法は、突然変異マウスのフェノタイプの分析にも役立つ。そして、特定の遺伝子とＥＧＦＰの共発現ベクターを用いて、その遺伝子の過剰発現の結果生じる形態学的な変化を研究することもできる。この方法は、中期又は後期の神経発生における分子メカニズムの研究に非常に役立つものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子導入哺乳動物の製造方法は、第一に子宮から胎児を摘出することなく胎児に外来遺伝子を導入できることを特徴にするものであり、遺伝子が導入された胎児をそのまま子宮内で発生させることを第二の特徴とするものである。
本発明の哺乳類としては、ヒトを除く哺乳類動物であればラット、マウス、ハムスター、ウサギ、犬、猿などのいずれでもよいが、実験用としてはマウスやラットが好ましい。
本発明の外来遺伝子としては、発現又は機能を測定できるものであれば特に制限はなく、広範囲のものを使用することができる。これらの外来遺伝子は各種のプロモーターと併せて使用するのが好ましい。外来遺伝子を組み込むベクターとしては、発現ベクターであれば種々のものを使用することができる。これらのベクターには必要に応じて、マーカーやタグなどの標識を組み込むこともできる。外来遺伝子を哺乳類発現プラスミドベクターに組み込む方法は通常の方法により行うことができる。
【００１６】
本発明の電気穿孔法としては、通常の電気穿孔法の方法により行うことができる。好ましい例としては、マイクロインジェクションにより外来遺伝子を注入し、次いで電極を当てて注入された遺伝子を細胞に取り込ませる方法が挙げられる。
本発明の外来遺伝子を導入する器官としては、前述した例では脳であったが、脳に限定されるものではなく、脊髄、心臓、肝臓などの各種の器官に適用することができる。目的とする器官に応じて、また発生を観察すべき細胞に応じて導入場所を適宜設定することができる。例えば、脳などの中枢神経系の場合には、多くの場合脳室への注入が好ましいが、目的・部位によっては脳表側（髄膜側）から導入することも可能である。
【００１７】
本発明の方法を適用する胎児は、器官形成の初期段階が好ましいが、これに限定されるものではない。一般的には、発生中期〜後期の胎児が好ましいが、発生初期であってもよい。哺乳動物がマウスである場合には、胎生１１〜１９日の胎児である場合が好ましい。
【００１８】
本発明は、前記した本発明の方法により製造された哺乳動物を包含する。即ち、本発明の方法により外来遺伝子が導入された遺伝子導入動物を包含するものである。
【００１９】
また、本発明は、子宮から胎児を摘出することなく、子宮内の哺乳類の胎児の特定の部位に、電気穿孔法により外来遺伝子を導入する方法を提供するものでもある。本発明のこの方法は、前記した本発明の遺伝子導入動物の製造方法における遺伝子注入方法と同様に行うことができる。
前記した遺伝子導入哺乳動物の製造方法は、子宮内において動物を発育することを含有するものであるが、本発明のこの方法は遺伝子注入動物の出生を必要としない場合に適用されるものである。
したがって、本発明は、前記した本発明の方法により遺伝子が導入された胎児を子宮内で発育させる方法を包含するものである。
【００２０】
さらに、本発明は、前記した本発明の方法により外来遺伝子が導入された胎児を子宮内で発育させ、発育している胎児（出生後の子供を含む）を測定又は解析して、導入した外来遺伝子の機能を分析する方法を提供するものである。即ち、本発明のこの方法は、遺伝子が導入されて正常に子宮内で発育している状態において、外来遺伝子の機能を分析することが新規な方法を提供するものである。
本発明のこの方法により、現在脳への遺伝子導入法として一般的に使われているウィルスベクターを用いた手法よりもきわめて簡単に、任意の遺伝子をプラスミドの状態で生きた胎児の脳に導入し、その後の影響を正常の子宮内での発生を経た形（出産させ、そのまま育てることも可能）で観察することができる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  遺伝子の導入
妊娠ＩＣＲマウスは、ＳＬＣ社（静岡県）から購入した。
妊娠マウス手術法や胚の操作方法はすでに報告されている方法に準じて行った（Nakajima, K., Mikoshiba, K., Miyata, T., Kudo, C., and Ogawa, M. (1997) 94, 8196-8201）。
胎生１４日または１５日目に、妊娠マウスをペントバルビタールで深麻酔し、子宮を露出した。ＱＩＡＧＥＮプラスミドマキシキットで精製したプラスミドＤＮＡを、濃度５〜１０μｇ／μｌになるように１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。ファーストグリーン溶液（０．１％）をそのプラスミド溶液に１：１０の比になるように添加した。プラスミド溶液の約１〜２μｌ（胎生１２．５〜１３日に対して０．８μｌ、胎生１４日〜１５日に対して１．２μｌ、胎生１６日〜１７日に対して２μｌ）を、マイクロキャピラリーチューブ（ＧＤ−１；ナリシゲ社、東京）から作ったガラスマイクロピペットにより、側脳室に注入した。胎児を子宮外から挟むように、先端直径５ｍｍの電極板を有しているトゥイザーズ型電極（ＣＵＹ６５０−５；トキワ科学、福岡）を配置した。陽極と陰極で子宮外から胎児の頭部をはさむように固定する。その際、陽極側が、遺伝子を導入したい部位側になるようにする。電気パルス（胎生１２．５日〜１３日に対して３０Ｖ、胎生１４日に対して３２〜３５Ｖ、胎生１５日及びその後に対して３５Ｖ；５０ミリ秒）をエレクトロポーレイター（ＣＵＹ２１Ｅ；トキワ科学）により９５０ミリ秒の間隔で５回かけた。すべての胎児について導入が終了したら、子宮を腹腔内に戻し、閉腹して、胎児の正常な発生が続けられるようにした。
ＣＭＶプロモーターの下流にＥＧＦＰの遺伝子を結合させたｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテック）プラスミドの他に、異なるベクターとして、pDsRed1-N1（クローンテック）及びｐＥＦＢＯＳ−ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のEGFPの部分を切り出し、pEFBOSに組み換えたもの）を用いて同様な実験を行った。
【００２３】
実施例２  組織の調整及び観察
すべての動物は氷上又はペントバルビタールで麻酔し、胎生期又は生後の段階で、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。脳を摘出し、４％ＰＦＡで４℃で２〜１６時間さらに後固定した。ＰＢＳで１時間洗浄後、サンプルをＰＢＳ中の３０％ショ糖溶液に平衡化した。生後２１日の脳のサンプルは、ＯＣＴ化合物（サクラ社、東京）に包埋し、液体窒素で凍結した。冠状断の凍結切片（２０μｍ）をクリオスタット（ＣＭ１９００；ライカ社）で作成した。切片は、シランでコーティングされたガラススライド（マツナミ社、日本）に貼り付けた。０．０１％トライトンＸ−１００を含有するＰＢＳ（シグマ）（ＰＢＳＴ）中でＯＣＴ化合物を除いた後、パーマフロアー（イミュノン社；ピッツバーグ、ＰＡ）を用いてカバースリップをのせた。これを、蛍光顕微鏡で直接観察した。
ＭＡＰ２染色の場合には、切片は抗ＭＡＰ２抗体（１：１００、ケミコン社、テメキューラー、ＣＡ）で反応し、ついでＴＲＩＴＣラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０、カペルオーロラ社、ＯＨ）で免疫染色した。
【００２４】
一方、生後２１日目の脳は、クリオスタットの標本ディスク上で凍結し、５０μｍにスライスした。このスライスをＰＢＳ中にとり、抗ＮｅｕＮ抗体（１：１００、ケミコン社、テメキューラー、ＣＡ）及びＴＲＩＴＣラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０、キャペルオーロラ社、ＯＨ）を用いて免疫染色した。染色されたスライスをシランコーティングされたスライドにのせ、蛍光イメージをＣＣＤカメラ又は共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、発生途中の哺乳類の胎児の特定の器官を対象として外来遺伝子を導入することができる新規な方法を提供するものである。本発明の方法によれば、特定の神経細胞で遺伝子を発現させるためのプロモーターのスクリーニング、あるいは人工タンパク質のモデリング等において、いくつものプラスミドを生体内で発現させ、それを解析する作業を行う場合、それを短時間で行えるようになる。
ニワトリ胚で行われている電気穿孔法を、よりヒトに近い哺乳動物に対して行う。全胚培養において問題となる培養可能な胎児の発生段階の限界、正常発生を再現できる期間の限定を解消できる。また、ウィルスベクターやトランスジェニックマウスの作製に伴う操作の煩雑さや危険性、それにかかる時間、費用を解決できる。
また、本発明の方法は、遺伝子治療などにも応用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である（Eの赤色の細胞は、RFPの発現による蛍光を観察したものである）。
【図２】図２は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である。
【図３】図３は、マウスの中枢神経系に導入されたＥＧＦＰの発現による蛍光を観察した図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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