(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドを含む血管新生を阻害するための組成物であって、該単離されたポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸３９〜１７４；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１または数個の置換、欠失もしくは付加を有し、かつ、新脈管形成阻害活性を有する（ａ）に定義されるポリペプチドの誘導ポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、分泌シグナルに融合されている、請求項１に記載の単離された組成物。
【請求項３】
制御されていない新脈管形成により媒介される疾患およびプロセスの処置または改善のための組成物であって、該組成物は、
以下の単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸３９〜１７４；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１または数個の置換、欠失もしくは付加を有し、かつ、新脈管形成阻害活性を有する（ａ）に定義されるポリペプチドの誘導ポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、
組成物。
【請求項４】
ガンを処置するための組成物であって、該組成物は、
以下の単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸３９〜１７４；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１または数個の置換、欠失もしくは付加を有し、かつ、新脈管形成阻害活性を有する（ａ）に定義されるポリペプチドの誘導ポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ヒトまたは動物は、非常に特定の制限された状況において、正常な生理的な条件下で、組織または器官内への新たな血管の生成である新脈管形成を受ける。例えば、新脈管形成は、通常、創傷治療、ならびに胚発生および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。用語、「内皮」とは、漿液腔、リンパ管、および血管を裏打ちする平坦な内皮細胞の薄い層を意味する。用語「抗新脈管形成性」または「新脈管形成阻害活性」とは、一般に新脈管形成を阻害する分子の能力を意味する。
【０００２】
制御された新脈管形成および制御されていない新脈管形成の両方は、類似の様式で進行すると考えられる。内皮細胞および血管周囲細胞は、基底膜により囲まれ、毛細血管を形成する。新脈管形成は、内皮細胞および白血球によって放出された酵素による基底膜の侵食で始まる。次いで、血管の管腔を裏打ちする内皮細胞は、基底膜を通って突出する。新脈管形成刺激剤は、内皮細胞が侵食された基底膜を介して移動するのを誘導する。移動する細胞は、親の血管から「出芽」を形成し、ここで内皮細胞は、有糸分裂および増殖を受ける。内皮出芽は互いに合さって、毛細管ループを形成し、新しい血管を作る。
【０００３】
制御されていない持続性の新脈管形成は、内皮細胞による多数の疾患状態、腫瘍転移、および異常増殖において起こり、これらの状態において見られる病的損傷を支持する。制御されていない新脈管形成が存在する多種な病的疾患状態は、新脈管形成依存性または新脈管形成関連疾患と同じに分類されてきた。
【０００４】
腫瘍増殖の間、内皮細胞の増殖は、間質内に侵入し、ガン細胞のような新脈管形成刺激の源に向かって移動し、血管周囲細胞および間質細胞と相互作用し、そして腫瘍組織を循環に結合する毛細血管をついに形成する（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：２７〜３１）。新脈管形成を制御する、疑いもなく高度に複雑な機構は、まだ理解されていないが、このプロセスの開始または終結が、新脈管形成のポジティブな制御因子とネガティブな制御因子との間のバランスの結果が明らかになりつつある。腫瘍組織においてしばしば顕著に上方制御される多数の新脈管形成因子は、ＦＧＦ−１（Ｇ．Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３８５）、ＦＧＦ−２（Ｌ．Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２５７）のような線維芽細胞増殖因子ファミリーのいくつかのメンバー、および血管内皮細胞増殖因子ファミリー（ＶＥＧＦ）のいくつかのメンバー（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６）、ならびにこれらの増殖因子のレセプター（Ｌ．Ｗ．ＢｕｒｒｕｓおよびＢ．Ｂ．Ｏｌｗｉｎ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８６４７；Ｓ．Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍら（１９９１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ４：１９７；Ｂ．ｔｅｒｍａｎら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７：１５７９；Ｃ．ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：９８９）を含み、記載されている。本明細書中の前出および以下に記載されたすべての文書を、それらへの参考によってその全体を援用する。
【０００５】
新脈管形成のいくつかのインヒビターはまた、トロンボスポンジン（Ｄ．Ｊ．Ｇｏｏｄら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６６２４）、アンジオスタチン（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７９：３１５）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｉｎ）（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７）および血小板第４因子（Ｅ．Ｍａｉｏｎｅら（１９９））Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：７７）を含み、報告されている。正常な新脈管形成は、必要とされる場合は迅速に活性化され、そしてもはや必要とされない場合は迅速に終結されるが、一方、病的な新脈管形成は一旦開始されると、しばしば長期化し、そして停止することが困難であることが明白である。これは、正常な新脈管形成プロセスにおいて機能するネガティブな調節機構が、病的な新脈管形成プロセスにおいて失なわれているかまたは抑圧されていることを示唆する。多数の前駆体からの新脈管形成インヒビターを放出するタンパク質分解活性が、プラスミノーゲン由来のアンジオスタチンのタンパク質分解活性およびコラーゲンＸＶＩＩＩ由来のエンドスタチンのタンパク質分解活性により示されたように、新脈管形成の下方制御を部分的に解明し得ることが示唆された（Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７）。多数の公知の新脈管形成レギュレーターは、多面発現性であり、そして他の細胞型、ならびにレギュレーターを産生する細胞型にたいして作用し得るが、内皮細胞は、新脈管形成プロセスを抑制するか、または成熟脈管構造の静止を維持するオートクライン因子を産生し得ることが考えられる。新脈管形成のこのようなオートクラインレギュレーター以前に記載されていない。本出願において、内皮細胞により特に発現される、血管内皮細胞増殖インヒビター（ＶＥＧＩ）と呼ばれる新脈管形成の新規のオートクラインネガティブレギュレーターが記載される。
【０００６】
本出願に記載されたタンパク質が、ＴＮＦ−γとして、１９９４年１１月７日に出願されたＥＰ９５９０３５２１．３に最初に記載されたにもかかわらず、そのタンパク質の新脈管形成阻害機能は、その中に開示されていない。そのタンパク質は、３０，０００の発現配列タグ（ＥＳＴ）が作製された種々の内皮細胞由来のＲＮＡを用いる８つのｃＤＮＡライブラリーを構築することにより見出された。内皮細胞の独特のＥＳＴは、公知のタンパク質ファミリー、特にサイトカインへの配列相同性に関してさらに同定された。ＥＳＴの１つの群の推定されたアミノ酸配列は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のコンセンサスアミノ酸配列を含んでいた。全長のｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞ライブラリーを、最初のクローンの１つから放射性標識プローブを用いスクリーニングした。いくつかのポジティブなクローンを単離し、そして配列決定した。最長のｃＤＮＡクローンは、１７４アミノ酸のオープンリーディングフレームならびに３’末端および５’末端の両方の長い非翻訳領域をコードする４．５キロベースのインサートを含んでいた。予想された開始コドンの上流のインフレームな停止コドンは、翻訳が、さらに上流で開始され得ないことを示した。新しいタンパク質は、ヒトＴＮＦα、ＴＮＦβ、およびＦａｓリガンドと２０〜３０％の配列相同性を示した。予想されたオープンリーディングフレームと一致した分子量２２ｋＤを有するタンパク質を、インビトロでの転写および翻訳実験において、テンプレートとしてｃＤＮＡクローンを用いて作製した。そのタンパク質の疎水性分析は、１２アミノ酸の疎水性領域の直後に１４の非疎水性アミノ酸のＮ末端セグメントを予想した。これは、ＴＮＦ（Ｂ．Ｂ．ＡｇｇａｒｗａｌおよびＫ．Ｎａｔａｒａｊａｎ（１９９６）Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｗｓ．７：９３）に類似のＩＩ型膜貫通タンパク質の構造と一致している。
【０００７】
種々の系統の２２の異なった型の培養細胞からの全ＲＮＡ調製物の最近のノザン分析は、このタンパク質に関する転写物が、内皮細胞の２つの株（継代初期のＨＵＶＥ細胞およびヒト静脈内皮細胞）においてのみ検出され得ることを示した。ｍＲＮＡは、継代後期のヒト静脈内皮細胞において観察されず、そしてまたヒト動脈細胞においても見られなかった。はっきりと対照的に、ＴＮＦファミリーのメンバーは、免疫細胞においてほとんど発現する（Ｂ．Ｂ．ＡｇｇａｒｗａｌおよびＫ．Ｎａｔａｒａｊａｎ（１９９６）、前出）。例えば、ＴＮＦαは、マクロファージ、単球、好中球、およびＴ細胞によって産生されるが、ＴＮＦβは、マイトジェン刺激Ｔリンパ球および白血球により優先的に産生される。同様に、Ｆａｓおよび他のＴＮＦファミリーのメンバー（ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、および４−１ＢＢ）に対するリガンドは、免疫系の細胞型の全てに発現される。複数の組織のノザンブロットを用いて、ＶＥＧＩ転写物は、胎盤、肺、腎臓、骨格筋、脳、肝臓、胸腺、精巣、卵巣、および末梢血リンパ球において発現されることが見出された。
【０００８】
本発明は、このタンパク質の新規の機能を同定し、そして記載する。上述のこのタンパク質の短縮型は、内皮細胞増殖を阻害することが見出された。従って、このタンパク質は、血管内皮細胞増殖インヒビター（ＶＥＧＩ）と命名された。推定の細胞外ドメインと対応する残基３９〜１７４からなるＶＥＧＩの短縮型を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現し、単離し、そして種々の細胞アッセイにおいて調べた。ＶＥＧＩの短縮型は、内皮細胞の増殖を特異的に阻害すること、インビトロでのモデルにおける毛細管様管の形成を阻害すること、およびメス無胸腺症ヌードマウスの乳房パッドにおいて、ヒト乳ガン異種移植片の増殖を阻害することが見出された。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一般に内皮細胞の増殖のインヒビターおよび特に新脈管形成のインヒビター、ならびに使用方法に関する。ＶＥＧＩの完全なヌクレオチド配列を、配列番号１、配列番号８、配列番号２６に示し、そしてコードされたアミノ酸配列を配列番号２、配列番号９、および配列番号２７にそれぞれ示す。推定の細胞外ドメインに対応する残基３９〜１７４（配列番号３）からなるタンパク質の短縮型は、内皮細胞の増殖を特異的に阻害することが見出された。ＶＥＧＩは、インビトロでの新脈管形成モデルにおいて、毛細血管様管の形成を阻害することが見出された。最終的に、ＶＥＧＩは、無胸腺症ヌードマウスにおける異種移植腫瘍の増殖を阻害することが見出された。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、新脈管形成インヒビターを提供し、このインヒビターは、薬学的に受容可能な希釈剤中で、薬学的に受容可能な量で、ＶＥＧＩポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、またはＶＥＧＩの改変された型を含む。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、新脈管形成の促進因子を提供し、この促進因子は、薬学的に受容可能な希釈剤中で、薬学的に受容可能な量で、ＶＥＧＩ機能を低減するかまたは排除する抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴニスト、リボザイム、薬物または薬剤を含む。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、新脈管形成を阻害するために十分な投薬量で、実質的に精製されたＶＥＧＩポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、またはＶＥＧＩの改変型を含む組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含む、新脈管形成を阻害するための方法を提供する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩ機能を低減するかまたは排除する、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴニスト、リボザイム、薬物または薬剤を含む組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含む、新脈管形成を加速するための方法を提供する。
【００１４】
なお別の実施態様において、本発明は、試料中で、ＶＥＧＩポリペプチドの存在または不在を検出する工程を含む生理学的な新脈管形成を診断するための方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（ｉ）病的な新脈管形成を有する疑いのある個体由来の試料を本発明のＶＥＧＩポリペプチドに特異的である抗体と接触させる工程；および
（ｉｉ）ＶＥＧＩと抗体との間で形成された複合体の存在または不在を検出する工程。
【００１５】
なお別の実施態様において、本発明は、試料中で、ＶＥＧＩポリヌクレオチド（好ましくはＲＮＡ）の存在または不在を検出する工程を含む生理学的な新脈管形成を診断するための方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（ｉ）病的な新脈管形成を有する疑いのある個体由来の試料をＶＥＧＩポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）を特異的に結合するオリゴヌクレオチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）ＶＥＧＩポリヌクレオチドとそれに特異的なオリゴヌクレオチドとの間で形成された二重鎖の存在または不在を検出する工程。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を用い病的な新脈管形成の診断のための方法を提供し、ここで、この方法は、ＶＥＧＩの領域を特異的に増幅する、配列番号１、配列番号８、および配列番号２６に示すＶＥＧＩのヌクレオチド配列を用いてプライマーを設計する工程を含む。プライマーは、ＶＥＧＩ  ＤＮＡまたはＶＥＧＩ  ＲＮＡを増幅するために使用し得、後者はＲＮＡの逆転写により相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にＲＮＡを変換した後である。ＰＣＲアッセイを、当該分野で公知の方法を用いて作成され得る標準に対して増幅産物を比較することにより定量的にし得る。
【００１７】
なお別の実施態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイにより、試料中のＶＥＧＩ  ＲＮＡまたはＤＮＡの存在または不在をアッセイする工程を含む、試料中のＶＥＧＩポリヌクレオチドの検出のための方法を提供する。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してうやうやしく結合する抗体、ＶＥＧＩ  ＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および／またはＶＥＧＩ  ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー、ならびに試料中のＶＥＧＩの存在を検出することにおける使用に適切な補助試薬を含む、診断または予後判定用キットを提供する。ＶＥＧＩが、膜タンパク質として機能し得るので、膜結合ＶＥＧＩの天然に存在する可溶型は、そのアンタゴニストとして機能し得、そしてその可溶型を検出するための方法は、本発明の別の実施態様に含まれる。
【００１９】
なお別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩの発現または機能の減少または増加を生じる、ＶＥＧＩポリヌクレオチドにおける変異の存在を検出する工程を含む、診断アッセイを提供する。このようなアッセイは、いくつか挙げてみると、ハイブリダイゼーションアッセイ、制限地図多型アッセイ、および遺伝子配列決定を含む。
【００２０】
なお別の実施態様において、本発明は、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、末梢血管拡張症、強皮性乾癬症、化膿性肉芽腫、心筋層新脈管形成、悪疫新生血管形成、冠状側副枝、虚血性四肢新脈管形成、角膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖症、関節炎、および糖尿病新生血管形成を含むがこれに限定されない、新脈管形成により媒介される疾患およびプロセスの処置または改善のための治療方法および組成物を提供し、ここで、新脈管形成は、制御されていないか、または過剰であり、そして阻害を必要とし、この方法は、新脈管形成が阻害されるように、本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドの有効量をこのような処置を必要とする個体に提供する工程を含む。
【００２１】
なお別の実施態様において、本発明は、新脈管形成が所望される、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、月経、および胎盤形成のような疾患の処置または改善のための治療方法および組成物を提供し、この方法は、薬学的に受容可能な希釈剤中で、薬学的に受容可能な量で、本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドアンタゴニスト、ＶＥＧＩポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはＶＥＧＩの機能を低減するかまたは排除する抗ＶＥＧＩ抗体、薬剤または薬物をこのような処置を必要とする個体に投与する工程を含む。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、本発明の実質的に精製されたＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むガン増殖のリプレッサーまたはインヒビターの組成物を提供する。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、試料中の本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの存在または不在を検出することによる、ガンの検出および予後判定のための方法、またはＶＥＧＩの発現もしくは機能を改変するＶＥＧＩポリヌクレオチドにおける変異の検出方法を提供する。
【００２４】
なお別の実施態様において、本発明は、可能性のある薬物または薬剤がＶＥＧＩ発現を上方制御する能力があるかどうか試験することにより、新脈管形成の阻害活性について可能性のある薬剤または薬物を試験するための方法を提供する。ＶＥＧＩは、他の新脈管形成インヒビターと同様に、細胞膜からこのタンパク質を放出するプロテアーゼによっておそらく活性化されるので、プロテアーゼ、ならびに金属イオンのようなこのような活性化を促進する他の薬剤は、ＶＥＧＩの発現を増加するための薬剤として有用である。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、可能性のある薬剤または薬物が、ＶＥＧＩの発現を上方制御することにより、新脈管形成を阻害する能力があるかどうか試験することにより、可能性のある抗腫瘍薬剤または薬物を試験するための方法を提供する。
【００２６】
まだ別の実施態様において、本発明は、可能性のある薬剤または薬物が、ＶＥＧＩの機能（例えば、新脈管形成の阻害）をブロックし得るかどうか試験することにより、新脈管形成を促進する、このような活性化に可能性のある薬剤または薬物を試験するための方法を提供する。この場合、上述したようなＶＥＧＩを活性化するプロテアーゼの阻害、または必要とされる薬剤もしくは金属イオンのようなこのような活性化を促進する薬剤の阻害は、ＶＥＧＩを下方制御するために使用され得、それによって、新脈管形成を上方制御し得る。
【００２７】
（詳細な説明）
本発明のタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が、ＴＮＦγとしてＥＰ９５９０３５２１．３に記載されたにもかかわらず、この分子の新規の抗新脈管形成活性および新規の内細胞阻害活性は、開示されなかった。
【００２８】
従って、１つの実施態様において、本発明は、血管内皮細胞の増殖を阻害するＶＥＧＩポリヌクレオチドおよびポリペプチドに、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを投与することによって新脈管形成により媒介されるかまたはそれに関連する疾患およびプロセスを処置するための方法に関する。本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、血清、尿および腹水を含むがこれに限定されない体液から単離され得るか、または化学的および生物学的方法（例えば、細胞培養、組換え遺伝子発現）により合成され得る。組換え技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてのＤＮＡ供給源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素／ＰＣＲを用いてのＲＮＡ供給源からの遺伝子増幅を含む。ＶＥＧＩは、非血管化腫瘍または血管化腫瘍のような組織内への血管の増殖を阻害する。本発明は、分子量約２２ｋＤを有するタンパク質、および短縮または翻訳後修飾（例えば、内因性増殖因子の新脈管形成活性を克服する能力のあるタンパク質のグリコシル化形態）を含むがこれに限定されない、そのタンパク質の任意のその改変型を含む。ＶＥＧＩに関するヌクレオチド配列を、配列番号１、配列番号８、および配列番号２６に示し、そしてＶＥＧＩに関するアミノ酸配列を、配列番号２、配列番号９、および配列番号２７にそれぞれ示す。ＶＥＧＩの活性形態は、配列番号２に示されるタンパク質のアミノ酸３９〜１７４にわたる。ＶＥＧＩの天然形態は、決定されていない。生物学的に活性な形態が、二量体、三量体、または多量体であり得ることが可能である。本発明はまた、新脈管形成の阻害を生じる、本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドに含まれる配列および特定のエピトープまたはドメインの任意の対立遺伝子のバリエーションに関する。これらの配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような抗ＶＥＧＩ薬剤を設計するため、またはＶＥＧＩ機能を阻害する抗体を作製するために使用され得、このような配列または薬剤は、新脈管形成関連疾患の改善または予防に有用である。
【００２９】
ヒトＶＥＧＩの配列が、示され、そして記述されているにもかかわらず、ヒトＶＥＧＩが、ウシおよびマウスの内皮細胞の増殖を阻害する能力があるので、ＶＥＧＩは、種の間でよく保存されていることが理解される。他の種由来のＶＥＧＩ配列は、本出願に開示された配列および機能の情報を用いてクローン化され得る。従って、ヒト以外の種由来のＶＥＧＩポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、本出願に含まれる。
【００３０】
さらに、本発明は、クローン化されたｃＤＮＡ（ＨＵＶＥ０９１）を配列決定することにより決定された、図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ（配列番号９）に示すアミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のＶＥＧＩポリペプチドは、ヒトＶＥＧＩ（配列番号１０）、ＶＥＧＩβ（配列番号１１）、ヒトリンホトキシンβ（配列番号１２）およびＦＡＳリガンド（配列番号１３）との配列相同性を共有する。本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、新脈管形成の阻害、抗腫瘍サイトカイン様分子として、骨および軟骨においてパンヌスを浸潤することと関連した新脈管形成および／または内皮細胞増殖の阻害による関節炎の処置として、ＮＦ−κＢおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）のインデューサーとして、細胞接着のインデューサーとして、およびアポトーシスのインデューサーとしてを含むがこれに限定されない。配列番号８に示されるヌクレオチド配列は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９に、１９９４年１０月２６日に寄託され、そして受託番号７５９２７を与えられたｃＤＮＡクローン（ＨＵＶＥ０９１）を配列決定することにより得られた。寄託されたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれる。
【００３１】
本発明はまた、クローン化ｃＤＮＡ（ＨＥＭＣＺ５６）を配列決定することにより決定された、図６Ａおよび６Ｂ（配列番号２７）に示されるアミノ酸配列を有する、ＶＥＧＩβポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）を含む単離された核酸分子を提供する。ＶＥＧＩβポリペプチドは、本明細書に開示されたＶＥＧＩポリペプチドのスプライス改変体である。配列番号２６に示されるヌクレオチド配列は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に、１９９８年７月９日に寄託され、そして受託番号２０３０５５を与えられたｃＤＮＡクローン（ＨＥＭＣＺ５６）を配列決定することにより得られた。寄託されたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれる。
【００３２】
（核酸分子）
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、デオキシリボヌクレオチドの配列を、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応配列を意図する。ここで、特定のデオキシリボヌクレオチド配列のチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置き換える。
【００３３】
本明細書中で提供される情報（例えば、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃにおけるヌクレオチド配列（配列番号８）、または図６Ａおよび６Ｂにおけるヌクレオチド配列（配列番号２６））を用いて、ＶＥＧＩまたはＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードする本発明の核酸分子（すなわちポリペプチド）は、例えば開始物質としてｍＲＮＡを用いるｃＤＮＡクローニングのための手順のような標準クローニングおよびスクリーニングの手順を用いて入手され得る。例えば、ＶＥＧＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＶＥＧＩを発現する任意の細胞または組織供給源（例えば、ヒト腎臓およびヒト臍静脈内皮細胞）から慣用的に入手され得る。本発明の例として、図５Ａ，５Ｂおよび５Ｃ（配列番号８）に記載の核酸分子は、ヒト臍静脈内皮細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。ＶＥＧＩに対応するｃＤＮＡクローン（クローン  ＨＵＶＥ０９１）は、１７４アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。そのアミノ酸残基の最初の約２７アミノ酸残基は、推定リーダー配列であり、結果として成熟タンパク質は１４７アミノ酸を含む。このタンパク質は、１１１アミノ酸長にわたって、３８％同一性および５８％類似性で、ウサギＴＮＦ−α（Ｉｔｏ，Ｈ．ら，ＤＮＡ  ５：１５７−１６５（１９８６）；ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号Ｍ１２８４６；配列番号１４）に対してＣ末端で最も高い程度の相同性を示す。ＴＮＦファミリーのメンバーの全体に渡って保存された配列はまた、ＶＥＧＩでも保存されている。
【００３４】
さらに、ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導されたそして休止の内皮細胞、臍静脈、扁桃腺、ならびにいくつかの他の細胞および組織型から慣用的に入手され得る。本発明の例として、図６Ａおよび６Ｂにおいて記載される核酸分子（配列番号２６）は、誘導された内皮細胞由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。ＶＥＧＩ−β（ＨＥＭＣＺ５６）に対応するｃＤＮＡクローンは、２５１アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このアミノ酸残基の最初の約３５アミノ酸残基は、推定の細胞内ドメインであり、そして３６〜６１アミノ酸は、推定の膜貫通ドメインであり、そして６２〜２５１アミノ酸残基は、推定の細胞外ドメインである。
【００３５】
細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを構成するアミノ酸残基は、コンピューター分析により推定された。従って、当業者が理解するように、これらのドメインを構成するアミノ酸残基は、それぞれのドメインを規定するために用いられる判定基準に依存してわずかに（例えば、約１〜約１５アミノ酸残基）変化し得る。
【００３６】
本発明の１つの局面に従って、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。この核酸は、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（配列番号９）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするか、または１９９４年１０月２６日にＡＴＣＣ受託番号７５９２７として寄託されたＨＵＶＥＯ９１と命名されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００３７】
さらに、本発明の別の局面に従って、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。この核酸は、図６Ａおよび６Ｂの推定アミノ酸配列（配列番号：２７）を有する成熟ポリペプチドをコードするか、または１９９８年７月９日にＡＴＣＣ受託番号２０３０５５として寄託されたＨＥＭＣＺ５６と命名されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００３８】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、そのネイティブな環境から取り出された分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）のさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子（ポリヌクレオチド）には、本発明のＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子またはポリヌクレオチドには、合成的に生成されたような分子がさらに挙げられる。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。このＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡは、二本鎖または単鎖であり得、そして一本鎖の場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【００４０】
本発明の単離された核酸分子としては、配列番号８に開示され、そして成熟ＶＥＧＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２６で示されたポリヌクレオチド配列（成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードする）、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７として寄託された寄託クローン（ＨＵＶＥ０９１）に含まれたポリヌクレオチド配列（成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードする）、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５として寄託された寄託クローン（ＨＥＭＣＺ５６）に含まれたポリヌクレオチド配列（成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードする）、ならびに上記の配列と異なるが、遺伝コードの縮重により配列番号１、配列番号８、および配列番号２６のＤＮＡ、または寄託されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列が挙げられる。もちろん、遺伝子コードは当該分野において周知である。従って、このような縮重改変体を生成することは当業者にとって慣用的である。
【００４１】
本発明は、ＶＥＧＩポリペプチドタンパク質の成熟型をコードする核酸分子を提供する。完全なＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列は、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（配列番号９）ならびに配列番号２に示されるような、リーダー配列および成熟タンパク質を含む。シグナル仮説に従えば、粗面小胞体を隔てた成長タンパク質鎖の輸送が一旦開始すれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、完全なポリペプチドから切断され、分泌されたタンパク質の「成熟」形態を産生する、シグナルまたは分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞、および昆虫の細胞でさえ、同様の特異性で、分泌タンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合は、分泌タンパク質の切断は、完全に均一ではなく、これはタンパク質の２つ以上の成熟した種を生じる。さらに、分泌タンパク質の切断特異性が完全なタンパク質の最初の構造によって究極的に決定されること、すなわち切断特異性がポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長く公知である。従って、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号７５９２７中のｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩポリペプチド」とは、寄託されたクローンのヒトＤＮＡ配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、下記のＣＯＳ細胞）中の発現により産生されたＶＥＧＩポリペプチドの成熟型を意味する。
【００４２】
図６Ａおよび６Ｂの成熟ポリペプチドをコードする（配列番号２６）、または寄託されたｃＤＮＡ（ＨＥＭＣＺ５６）によってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下が挙げられるがこれに限られない：成熟ポリペプチドについてのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、ならびにさらなるコード配列（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または膜貫通配列またはプロタンパク質配列）；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の非コード配列５’および／もしくは３’）。
【００４３】
本発明はまた、ポリヌクレオチドを含む。ここで成熟ポリペプチドに対するコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド配列に対する同じリーディングフレームに融合され得る（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送の制御のために分泌配列として機能するリーダー配列）。リーダー配列を有するポリペプチドは、プロタンパク質であり、そして宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し、ポリペプチドの成熟形態を形成し得る。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質でさらに５’アミノ酸残基を付加されたプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性形態である。一旦、プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
【００４４】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質をコードするか、またはプロ配列を有するタンパク質をコードするか、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とインフレームで融合されたコード配列を有し得る。このマーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するために、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されたヘキサ−ヒスチジンタグであり得るか、または例えば、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が用いられる場合、マーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。このＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００４６】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００４７】
本発明はさらに、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃならびに６Ａおよび６Ｂの推定アミノ酸配列（配列番号２、配列番号９、および配列番号２７）を有するポリヌクレオチドのフラグメント（すなわち、部分）、アナログ、および誘導体をコードする、本明細書上記のポリヌクレオチドの改変体、ならびに寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドに関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異、またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００４８】
従って、本発明には、配列番号２および配列番号９で示されるのと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１のｃＤＮＡによりコードされた成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの改変体が挙げられる。この改変体は、図１ＡおよびＢのポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログ、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１のｃＤＮＡによりコードされたポリペプチドをコードする。このようなヌクレオチド改変体には、欠失改変体、置換改変体、および付加改変体もしくは挿入改変体が挙げられる。
【００４９】
さらに、本発明には、配列番号２７に示される成熟ポリペプチド、または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリペプチドの改変体（この改変体は、配列番号２０３０５５のポリペプチド、または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６のｃＤＮＡによりコードされたポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする）が挙げられる。このようなヌクレオチド改変体には、欠失改変体、置換改変体、および付加改変体もしくは挿入改変体が挙げられる。
【００５０】
本明細書上記で示すように、このポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号８に示されるコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１のコード配列のであるコード配列を有し得る。あるいは、このポリヌクレオチドは、配列番号２６に示されるコード配列遺伝子変異、または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６のコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異であるコード配列を有し得る。当該分野で公知のように、対立遺伝子変異は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の代替形態であり、これはコードされたポリペプチドの機能を実質的に変えない。
【００５１】
本発明はさらに、本明細書中で記載された単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡ（ＨＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）のヌクレオチド配列、または図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（配列番号１および配列番号８）ならびに図６Ａおよび６Ｂ（配列番号２６）に示されたヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメント、またはそれらに対する相補鎖は、少なくとも１５ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００または５００ヌクレオチド長のフラグメントを意図する。これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーを含むがこれに限定されない多くの用途を有する。当然のことながら、５０〜１５００ヌクレオチド長の、より大きいフラグメントもまた、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６のヌクレオチド配列、配列番号８に開示されたヌクレオチド配列、または配列番号２７に開示されたヌクレオチド配列の、全てでなくとも、ほとんどに対応するフラグメントと同様に、本発明に従って有用である。少なくとも２０ヌクレオチド長のフラグメントは、例えば、寄託されたｃＤＮＡクローン（ＨＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）のヌクレオチド配列、配列番号１、配列番号８および配列番号２６に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントを意図する。
【００５２】
特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、機能的な活性を示すポリペプチドをコードする。「機能的な活性」を示すポリペプチドとは、完全長または成熟ＶＥＧＩポリペプチドに関連する１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性には、生物学的活性（（例えば、血管形成の阻害、内皮細胞増殖の阻害、細胞接着の誘導、抗原性［抗ＶＥＧＩおよび／または抗ＶＥＧＩβ抗体と結合（またはＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドと結合について競合）する能力］、免疫原性（ＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドと結合する抗体を産生する能力）、他のＶＥＧＩポリペプチドとのポリマーを形成する能力、およびＶＥＧＩポリペプチドのレセプターまたはリガンド（例えば、ＤＲ３）に結合する能力が挙げられるがこれに限定されない。
【００５３】
本発明はまた、以下の関連ｃＤＮＡクローンにより決定された配列番号８の長いフラグメントに関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：ＨＵＶＥＯ９１（配列番号１５）、ＨＭＰＡＰ０５（配列番号１６）、ＨＳＸＣＡ４４（配列番号１７）、ＨＥＭＦＧ６６（配列番号：１８）、およびＨＥＬＡＭ９３（配列番号１９）。
【００５４】
本発明はまた、以下の関連ｃＤＮＡクローンにより決定された配列番号２６の長いフラグメントに関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：ＨＵＶＥＯ９１Ｐ０１（配列番号２８）、ＨＭＰＴＩ２４Ｒ（配列番号２９）、ＨＥＬＡＭ９３Ｒ（配列番号３０）、およびＨＥＭＦＧ６６Ｒ（配列番号：３１）。
【００５５】
特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、好ましくは上記列挙したｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除き、ヌクレオチド残基１〜２４４２由来の配列番号８の、少なくとも３０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる。本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例には、配列番号１、またはそれらに対する相補的なポリヌクレオチド鎖、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１中に含まれるｃＤＮＡの以下のヌクレオチドを含むフラグメントが挙げられる：
【００５６】
【化１】
0004441112.tif 000002
さらなる特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、好ましくは上記列挙したｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除き、配列番号２６のヌクレオチド残基１〜１１１６うちの、少なくとも３０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様は、配列番号２の残基−１〜１４７（すなわち、−１〜１４７）、１〜１４７（すなわち、＋１〜１４７）、２〜１４７、３〜１４７、４〜１４７、５〜１４７、６〜１４７、７〜１４７、８〜１４７、９〜１４７、１０〜１４７、１１〜１４７、１２〜１４７および１３〜１４７のアミノ酸配列を含む、あるいはそのアミノ酸配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００５８】
本発明のＶＥＧＩ−βポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例には、配列番号１、またはそれらに対する相補的なポリヌクレオチド鎖、または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６中に含まれるｃＤＮＡの以下のヌクレオチドを含むフラグメントが挙げられる：
【００５９】
【化２】
0004441112.tif 000003
【００６０】
【化３】
0004441112.tif 000004
本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、以下のドメインのうちの１つ以上をコードする核酸分子も含む：
配列番号２のＶＥＧＩ潜在的アスパラギン結合グリコシル化部位Ｎ−２９からＮ−３２（Ｎ−２９、Ｙ−３０、Ｔ−３１、Ｎ−３２）、およびＮ−１２５からＤ−１２８（Ｎ−１２５、Ｖ−１２６、Ｓ−１２７、Ｄ−１２８）；
潜在的プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位Ｔ−３２からＫ−３４まで（Ｔ−３２、Ｎ−３３、Ｋ−３４）、およびＴ−５０からＲ−５２まで（Ｔ−５０、Ｆ−５１、Ｒ−５２）；潜在的カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位Ｓ−８３からＥ−８６（Ｓ−８３、Ｙ−８４、Ｐ−８５、Ｅ−８６）；
Ｓ−９６からＥ−９９（Ｓ−９６、Ｖ−９７、Ｃ−９８、Ｅ−９９）；
Ｓ−１１５からＥ−１１８（Ｓ−１１５、Ｌ−１１６、Ｑ−１１７、Ｅ−１１８）；
Ｓ−１３０からＤ−１３３（Ｓ−１３０、Ｌ−１３１、Ｖ−１３２、Ｄ−１３３）；
およびＴ−１３５からＤ−１３８まで（Ｔ−１３５、Ｋ−１３６、Ｅ−１３７、Ｄ−１３８）；
ならびに潜在的ミリスチル化部位Ｇ−２０からＫ−２５（Ｇ−２０、Ｌ−２１、Ａ−２２、Ｆ−２３，Ｔ−２４，Ｋ−２５）およびＧ−１１１からＬ−１１６（Ｇ−１１１、Ａ−１１２、Ｍ−１１３、Ｆ−１１４、Ｓ−１１５、Ｌ−１１６）。
【００６１】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドの中には、ＶＥＧＩの構造的または機能的な属性をコードすることにより特徴づけられたポリヌクレオチドが存在する。このようなポリヌクレオチドは、ＶＥＧＩのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原性指数領域（すなわち、各々が、１．５以上の抗原性指数を有する、３つ以上の連続アミノ酸残基の抗原性領域を有する）を含むアミノ酸残基をコードする。いくつかの好ましい領域は、図７に示される図であり、これは、認定されたコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて、配列番号９に示されたアミノ酸配列の分析により同定された前記の型の領域を含むがこれに限定されない。このような好ましい領域には以下が挙げられる；Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ−親水性領域、および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ−α両親媒性領域、およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ−可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ−表面形成領域、および高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域。
【００６２】
ＶＥＧＩについての上記の様式においてＶＥＧＩ−βを示すデータは、配列番号２７に開示されたアミノ酸配列を用いて容易に調製され得る。従って、上記列挙したＶＥＧＩの上記列挙した構造または機能の属性それぞれ（すなわち、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ−親水性領域、および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ−α両親媒性領域、およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ−可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ−表面形成領域、および高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域など）は、ＶＥＧＩおよびＶＥＧＩ−βに同等に当てはまる。
【００６３】
これらの点に関していくつかの好ましい領域は、図７に示されるが、図７に示されたデータの表の表示を用いることによってまた、示されるかまたは同定され得る。図７を作成するために用いたＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（元来のデフォルトパラメーターを並べる）は、そのような表の形式で表７にデータを容易に示す。図７におけるデータの表形式が用いられ、好ましい領域の特定の境界線を容易に決定し得る。
【００６４】
図７に並べられた上記の好ましい領域には、配列番号２、配列番号９、および配列番号２７に示されたアミノ酸配列の分析により同定された前記の型の領域が挙げられるが、これに限られない。図７に示されるように、このような好ましい領域には、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ−α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ−親水性領域、および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ−α両親媒性領域、およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ−可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ−表面形成領域、および高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。
【００６５】
この点に関して、高度に好ましいフラグメントの中には、いくつかの構造的特徴、例えば、いくつか（例えば１、２、３、または４）の上記の特徴を組み合わせたＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βの領域を含むフラグメントがある。
【００６６】
本発明のさらに好ましい核酸フラグメントには、ＶＥＧＩポリペプチドの１つ以上のエピトープ保有部位をコードする核酸分子が挙げられる。特に、本発明のこのような核酸フラグメントには、以下をコードする核酸分子が挙げられる：配列番号９の約Ｔｈｒ−２４から約Ａｓｎ−３２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｉｌｅ−３７から約Ｉｌｅ−４５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｍｅｔ−５４から約Ａｒｇ−６２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｇｌｎ−６３から約Ａｓｐ−７１のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｇｌｕ−５７から約Ｇｌｙ−６５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｖａｌ−８０から約Ｔｈｒ−８８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ｌｅｕ−１１６から約Ｖａｌ−１２４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９の約Ａｓｐ−１３３から約Ｐｈｅ−１４１のアミノ酸残基を含むポリペプチド。このようなポリペプチドフラグメントは、上記、図７において示されるように、Ｊａｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ−抗原性指数の分析によりＶＥＧＩポリペプチドの抗原性エピトープを保有することが決定された。ＶＥＧＩの他のこのようなエピトープ保有部分位を決定するための方法を、以下に詳細に記載する。
【００６７】
ＶＥＧＩ−βタンパク質の抗原エピトープを保有するポリペプチドフラグメントは、図７に示されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ−抗原性指数の上記の分析を用いて当業者によって容易に決定され得る。ＶＥＧＩ−βの他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法を、以下に詳細に記載する。
【００６８】
本発明の別の実施態様は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書中で記載された、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローン、ＡＴＣＣ受託２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローン、ＶＥＧＩポリヌクレオチドフラグメント）のポリヌクレオチド配列の部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、続いて約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を意図する。ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは３０〜７０ｎｔ、もしくは８０〜１５０ｎｔ、または全長にハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上に議論したように、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である。もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号１、配列番号８または配列番号２６に示されるＶＥＧＩ  ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ））のみに、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体（例えば、実際には、オリゴｄＴをプライマーとして用いて生成された任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００６９】
好ましい実施態様では、本明細書中で開示される参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号８および／もしくは配列番号２６に開示されたポリヌクレオチド配列、または寄託物に含まれるｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドとして、実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００７０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＶＥＧＩポリペプチドの部分、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の対立遺伝子変異体のように天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的な形態のうちの１つを意図する（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。天然には生じない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。
【００７１】
このような改変体は、本明細書中で記載されたポリヌクレオチド配列（フラグメントを含む）のヌクレオチド置換、欠失または付加により生成した改変体を含む。この置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方で変化され得る。コード領域での変化は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これはＶＥＧＩポリペプチドまたはその部分の特性および活性を変化しない。このことに関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。
【００７２】
本発明のさらなる実施態様は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに少なくとも７０％または少なくとも８０％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一である、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む単離され核酸分子に関する：（ａ）配列番号２または９の全アミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号９の−２７位〜１４７位）；（ｂ）配列番号２または９の全アミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠失するＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号９の−２６位〜１４７位）；（ｃ）配列番号９の１位〜１４７位として示される、配列番号９のアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号９の１位〜１４７位として示される、配列番号２または９のアミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる全アミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる全アミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠失する、ＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）本明細書中で記載されたポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；および（ｊ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。本発明のポリペプチドはまた、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）に記載の配列に、少なくとも８０％同一な、より好ましくは少なくとも９０％同一な、そしてさらにより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の配列に少なくとも９０％類似の、そしてより好ましくは少なくとも９５％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに少なくとも７０％または少なくとも８０％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一である、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する：（ａ）配列番号２７の全アミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２７の１位〜２５１位）；（ｂ）配列番号２７の全アミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠失するＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２７の２位〜２５１位）；（ｃ）配列番号２７の６２位〜２５１位として示される、配列番号２７のアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号２７の１位〜３５位として示される、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号２７の６２位〜２５１位で示される、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされる全アミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされる全アミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠失する、ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＩ−βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｋ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）のいずれか１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。本発明のポリペプチドはまた、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）に記載の配列に、少なくとも８０％同一な、より好ましくは少なくとも９０％同一な、そしてさらにより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の配列に少なくとも９０％類似性、そしてより好ましくは少なくとも９５％類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７４】
本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列がＶＥＧＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり、５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多くのヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照（問い合わせ）配列は、配列番号１、配列番号８および配列番号２６で開示された全ヌクレオチド配列、または本明細書中で記載される任意のフラグメントであり得る。
【００７５】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば配列番号８、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性の高いセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が本発明による参照配列に、例えば９５％同一であるか否かを決定する場合、当然のことながらパラメーターは、同一性の百分率が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【００７６】
特定の実施態様において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と被検配列との間の同一性（全体的配列アラインメントともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定される。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて用いられる好ましいパラメーターは以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または被験ヌクレオチド配列の長さ（いずれか短い方）。本実施態様に従って、被験配列が、内部の欠失のためではなく、５’または３’欠失のために問い合わせ配列より短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを計算するとき、被験配列の５’および３’切断を計算しない事実を考慮する結果になるように、手動補正を行う。問い合わせ配列と比べて５’または３’末端で切断された被験配列に関しては、同一性パーセントは、被験配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基数（これは、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして、マッチせず／整列しない）を計算することにより補正される。ヌクレオチドがマッチする／整列するかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、このパーセンテージを、特定のパラメーターを用いた上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された、同一性パーセントから差し引き、同一性パーセント最終スコアに達する。この補正スコアが、この実施態様の目的のために用いるものである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントに示されるように、被験配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみ（これは問い合わせ配列とマッチせず／整列しない）を、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算する。例えば、９０塩基の被験配列を、同一性パーセント決定のために１００塩基の問い合わせ配列に整列させる。欠失は被験配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端で最初の１０塩基のマッチング／アラインメントを示さない。１０の非対合塩基は、配列の１０％（５’末端および３’末端でのマッチしない塩基数／問い合わせ配列における総塩基数）を示し、そのためＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算した同一性パーセントスコアから１０％を差し引く。残りの９０塩基が完全にマッチした場合、最終の同一性パーセントは９０％になる。別の実施例では、９０塩基の被験配列を、１００塩基の問い合わせ配列と比較する。この場合、欠失は、内部の欠失であり、そのため問い合わせ配列とマッチ／整列しない塩基は被験配列の５’または３’にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性パーセントは、手動では補正されない。もう一度、問い合わせ配列とマッチ／整列しない被験配列の５’および３’塩基のみを手動で補正する。この実施態様の目的のために他の���動の補正は行わない。
【００７７】
さらなる実施態様では、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％同一性、好ましくは少なくとも９０％同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチド、およびそのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも３０塩基そして好ましくは少なくとも５０塩基を有する）、ならびにこのようなポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに関する。
【００７８】
さらなる実施態様では、本発明は、配列番号２７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％同一性、好ましくは少なくとも９０％同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチド、およびそのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも３０塩基そして好ましくは少なくとも５０塩基を有する）、ならびにこのようなポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに関する。
【００７９】
本出願は、配列番号１、配列番号８、配列番号２６に示されるポリヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンの核酸配列またはそのフラグメントと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関し、それらがＶＥＧＩ機能活性を有するポリペプチドをコードするか否かとは無関係である。しかし、本発明の核酸分子がＶＥＧＩ機能活性を有するポリペプチドをコードすることは好ましい。「ＶＥＧＩ機能活性を有するポリペプチド」とは、本発明のＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドの活性に対して同様の活性を示すが、必ずしも同一である必要はないポリペプチド（完全長タンパク質、または好ましくは成熟タンパク質）を意図する（この活性は、特定のイムノアッセイおよび／または生物学的アッセイで測定される）。例えば、ＶＥＧＩ活性は、実施例６に詳細に記載されたようにＡＢＡＥ細胞の培養において、または実施例１０に記載されたように絨毛尿膜（ＣＡＭ）において、キャピラリー様管構造形態のＦＧＦ−２誘導化形態を阻害するためのＶＥＧＩの相対的な能力を決定することにより、ならびに、他の実施例および当該分野で記載されたいくつかのさらなる方法において測定され得る。
【００８０】
もちろん、遺伝コードの縮重により、当業者は寄託したｃＤＮＡの核酸配列、もしくは配列番号１、配列番号８、配列番号２６に開示される核酸配列、またはそのフラグメントと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「ＶＥＧＩ活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコードするので、多くの場合において、このことは上記のアッセイを実施しない場合でさえも当業者に明らかである。縮重改変体でないこのような核酸分子については、妥当な数のものがまたＶＥＧＩ活性を有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさらに認識される。これは、タンパク質の機能に顕著に影響する可能性が低いかまたはその可能性のないアミノ酸置換（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者は十分に知っているからである。例えば、表現型がサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは、Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、その中で著者らは、タンパク質が、驚くべきことにアミノ酸置換に寛容であることを示す。
【００８１】
本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換だが、５０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、４０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは３０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、２０以下の保存的アミノ酸置換、１０〜２０の保存的アミノ酸置換、５〜１０の保存的アミノ酸置換、１〜５の保存的アミノ酸置換、３〜５の保存的アミノ酸置換、または１〜３の保存的アミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を有するＶＥＧＩポリペプチド（例えば、本明細書で記載されたＶＥＧＩポリペプチドフラグメント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。もちろん、絶えず増大している優先度の順序で、多くとも１０，９，８，７，６，５，４，３，２または１の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するようにＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることがポリヌクレオチドにとっては高度に好ましい。
【００８２】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベクターで遺伝子操作されたか、そうでなければ、本発明のポリペプチドを産生するように操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００８３】
宿主細胞は、本発明のベクターを用いて遺伝子操作（形質導入されているか、または形質転換されているか、またはトランスフェクトされている）されている。このベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。このベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはＶＥＧＩ遺伝子を増幅することに関して適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞で以前から使用されている条件であり、そして当業者に明らかである。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、例えば、このポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するために、種々の発現ベクターのうちいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ、および合成ＤＮＡの配列を含む（例えば、ＳＶ４０；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られたベクターの誘導体；ワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、および仮性狂犬病ウイルスのようなウイルスＤＮＡ）。しかし、任意の他のベクターは、宿主において複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。
【００８５】
適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般的に、このＤＮＡ配列は、適切な制限酵素部位へ、当該分野で公知の手順によって挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の技術範囲内であるとみなされる。
【００８６】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指向するために、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合される。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が言及され得る：ＬＴＲもしくはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃもしくはｔｒｐ、ファージλＰプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞中で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター、またはそれらのウイルスプロモーター。発現ベクターはまた、転写開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。
【００８７】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換した宿主細胞についての表現型形質を提供するように、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおいては、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を含む。
【００８８】
本明細書中上記に記載されるように、適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを使用して、適切な宿主を形質転換して、この宿主にタンパク質を発現させ得る。
【００８９】
適切な宿主の代表的な例として、以下に言及するものが存在する：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞、アデノウイルス、植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の技術範囲内であるとみなされる。
【００９０】
より詳細には、本発明はまた組換え構築物を含み、この組換え構築物は、上記の広範に記載される１つ以上の配列を含む。構築物としては、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターが含まれ、このベクターには、本発明の配列が正方向または逆方向で挿入される。この実施態様の好ましい局面において、この構築物は、調節配列（例えば、配列に作動可能に結合されたプロモーターを含む）をさらに含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして市販されている。以下のベクターは、実施例によって提供される。細菌ベクター：ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ受託番号第２０９３１１号；およびその誘導体）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物ベクター：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターは、宿主中で複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。
【００９１】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特に称された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰプロモーター、Ｐプロモーター、およびｔｒｐプロモーターが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期のＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当該分野の技術レベル内である。
【００９２】
さらなる実施態様において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。
この宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）もしくは下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または他の宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによってもたらされ得る。（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００９３】
本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に哺乳動物起源）の初代、二代、および不死化宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は、内因性遺伝物質（例えば、ＶＥＧＩコード配列）を欠失または置換するように、および／または本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドと作動可能に結合されている遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作され、そしてこの本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチドと作動可能に結合されている遺伝物質は、内因性ＶＥＧＩポリヌクレオチドを活性化するか、改変するか、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術を使用して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因性ＶＥＧＩポリヌクレオチド配列を相同組換えによって、作動可能に結合する（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８月４日に公開された国際公開ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと、これらの各々の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００９４】
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生する従来の様式で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機によって合成的に生成され得る。
【００９５】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または適切なプロモーターの制御下にある他の細胞で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を生成するために使用され得る。原核生物宿主および真核生物宿主での使用のために適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００９６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加される。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は、ほぼ１０〜３００ｂｐであり、その転写を増加させるためにプロモーターに対して作用する。例としては、１００〜２７０ｂｐの複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００９７】
一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流構造配列の転写を指向する高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターとしては、とりわけ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような糖分解酵素をコードするオペロン、ａ因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および終結配列、好ましくは、細胞周辺腔または細胞外の培地へ、翻訳されたタンパク質の分泌を指向し得るリーダー配列とともに、適切な相で組み立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特性（例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００９８】
細菌を使用するために有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターとともに作動可能なリーディング相で適切な翻訳開始シグナルおよび終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。このベクターは、１つ以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確実にする複製起点を含み、所望であれば、宿主内の増幅を提供する。形質転換のために適切な原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種が挙げられるが、他の種もまた、選択の問題として使用され得る。
【００９９】
代表的であるが限定ではない例として、細菌についての使用のために有用な発現ベクターは、市販されるプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このプラスミドは、周知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む。このような市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わせられる。
【０１００】
適切な宿主株を形質転換して、適切な細胞密度に増殖させた後、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導され、そして細胞は適切な期間にわたって培養される。細胞は、代表的には、遠心分離によって回収され、物理的または化学的手段によって破壊され、そして得られた粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。
【０１０１】
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、いずれかの便利な方法（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）によって破壊され得、そしてこのような方法は、当業者に周知である。
【０１０２】
種々の哺乳動物細胞培養系がまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得る。哺乳動物発現系の例としては、サル腎臓線維芽細胞ＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１））に記載される）、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列もまた含む。ＳＶ４０スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、必要とされる、転写されない遺伝子エレメントを提供し得る。
【０１０３】
ＶＥＧＩポリペプチドが組換え細胞培養物から回収され得、そして以下を含む方法によって精製され得る：硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。タンパク質再折りたたみ工程は、必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完全にすることにおいて使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が採取的な精製工程のために使用され得る。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物であってもよいし、化学的に合成された産物であってもよく、原核生物細胞宿主または真核生物細胞宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の培養細胞）から組換え技術によって生成されてもよい。組換え生成手順で使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【０１０５】
少なくとも１５のＶＥＧＩ発現構築物が、本明細書中で本発明者らによって生成されて、いくつかの系でいくつかのサイズのＶＥＧＩポリペプチドの生成を容易にする。これらのうち、４つは、全長ＶＥＧＩポリペプチドをコードするものを構築した。全長構築物は、以下である：（ｉ）ｐＱＥ９ＴＮＦｇ−２７／１４７、（ｉｉ）ｐＱＥ７０ＴＮＦｇ、（ｉｉｉ）ｐＣ１ＴＮＦｇおよびｐｃＤＮＡ３ＴＮＦｇ。列挙した第１の発現構築物（ｐＱＥ９ＴＮＦｇ−２７／１４７）の場合では、この構築物を使用して、実施例１に従って、Ｎ末端６ヒスチジンアミノ酸タグを有する全長ＶＥＧＩポリペプチドを生成した。ヒスチジンタグを欠いた全長ＶＥＧＩポリペプチドは、実施例１で行われるように、本質的にｐＱＥ７０ＴＮＦｇ構築物を使用して、細菌で発現された。さらに、ヒスチジンタグを欠いた全長ＶＥＧＩポリペプチドは、ｐＣ１ＴＮＦｇまたはｐｃＤＮＡ３ＴＮＦｇ構築物のいずれかを使用して、実施例３に記載のように、哺乳動物細胞で生成した。さらに、成熟ＶＥＧＩポリペプチドが生成され、そしてｐｃＤＮＡ３／ＩＬ６ＴＮＦｇ−１／１４９と称された構築物に由来するインターロイキン（ＩＬ）−６シグナルペプチドの指示下で哺乳動物細胞から分泌される。
【０１０６】
残りのＶＥＧＩ発現構築物を使用して、細菌系、バキュロウイルス系、および哺乳動物系から種々のＶＥＧＩ変異体を発現した。４つのＮ末端欠失変異体が、ｐＱＥ６０細菌発現ベクターを使用して生成された。これらのＮ末端欠失変異体構築物は、以下である：（ｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ−３／１４７（可能性のある、成熟ＶＥＧＩポリペプチドを表す；この構築物によって発現されたポリペプチドは、配列番号２７のＶＥＧＩ−βのアミノ酸残基１０７〜２５１と同一である）、（ｉｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ１２／１４７（配列番号９のアミノ酸残基１２〜１４７および配列番号２７のアミノ酸残基１１６〜２５１を表す）、（ｉｉｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ２２／１４７（配列番号２７のアミノ酸残基２２〜１４７およびアミノ酸残基１２６〜２５１を表す）、ならびに（ｉｖ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ２８／１４７（配列番号２７のアミノ酸残基２８〜１４７およびアミノ酸残基１３２〜２５１を表す）。これらの発現構築物の各々を使用して、細菌系でＶＥＧＩポリペプチドを生成し得る。これは、それぞれ、全長ＶＥＧＩポリペプチドに関して、２５、３９，４９、および５５アミノ酸のＮ末端欠失、または全長ＶＥＧＩ−βポリペプチドに関して、それぞれ、１０６、１１５、１２５および１３１アミノ酸のＮ末端欠失を示す。
【０１０７】
さらなるＮ末端欠失変異体の細菌構築物が生成される。ｐＨＥ４  ＶＥＧＩ  Ｔ３０−Ｌ１７４と称される構築物は、細菌発現ベクターｐＨＥ４を使用して生成され、配列番号９のアミノ酸残基スレオニン３〜ロイシン１４７として開示される、ＶＥＧＩ配列のアミノ酸残基スレオニン３０〜ロイシン１７４を発現した。これは、配列番号２７の残基スレオニン１０７〜ロイシン２５１として、ＶＥＧＩ−β配列のスレオニン１０７〜ロイシン２５１に正確に対応する。さらなる、生成された細菌発現構築物は、ｐＱＥ９、ＶＥＧＩ．ｈｉｓ．Ｔ２８−Ｌ１７４、ｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ２８−Ｌ１７４、ｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ５１−Ｌ１７４、およびｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ５８−Ｌ１７４を含む。これらの構築物は、ｐＱＥ９またはｐＨＥ４細菌発現ベクターのいずれかに基づく。構築物の命名は、発現ベクター、遺伝子名、および構築物によって発現されるアミノ酸残基を示す（例えば、ｐＱＥ９．ＶＥＧＩ．Ｔ２８−Ｌ１７４は、ｐＱＥ９細菌発現ベクターが使用されて、ＶＥＧＩのアミノ酸スレオニン（Ｔ）−２８からロイシン（Ｌ）−１７４を発現することを示す）。
【０１０８】
ＶＥＧＩ発現構築物が生成され、この構築物を使用して、哺乳動物系から分泌された成熟ＶＥＧＩポリペプチドを生成する。この構築物は、ｐＣ１／ＩＬ６ＴＮＦｇ−３／１４７と称される。これは、成熟ＶＥＧＩ配列に融合した、ヒトＩＬ−６遺伝子に由来するシグナルペプチドをコードする。同様の構築物が生成され、この構築物は、ｐＣ４哺乳動物発現ベクターの状況で、ＶＥＧＩのアミノ酸１２〜１４９（配列番号９；すなわち、ＥＧＩ−β（配列番号２７）のアミノ酸１１６〜２５１）のアミノ末端に融合したＣＫ−ｂ８シグナルペプチド（９５年６月２３日に出願された公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９０５８に開示されるＣＫ−ｂ８配列のアミノ酸−２１〜−１）を含む。この構築物は、ｐＣ４／ＣＫ−ｂ８ＴＮＦｇ１２／１４７と称された。この構築物の改変体が生成され、この構築物を使用して、ＶＥＧＩカルボキシ末端でヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合したＶＥＧＩのアミノ酸１２〜１４７を発現する。この融合タンパク質はまた、ＣＫ−β８シグナルペプチドの指示下で分泌され、そしてｐＣ４／ＣＫ−β８ＴＮＦｇ１２／１４７／Ｆｃと称される。融合分子のヒトＦｃ部分の配列は、配列番号２５に示される。当業者に公知の他の配列が使用され得る。
【０１０９】
ＶＥＧＩのアミノ酸−３〜１４７（配列番号９；これは、ＶＥＧＩ−β（配列番号２７）のアミノ酸残基１０２〜２５１に対応する）は、ｐＡ２ＧＰＴＮＦｇ−３／１４７と称される構築物を使用することによって、バキュロウイルス系で発現され得、そして分泌され得る。この発現構築物は、バキュロウイルスＧＰシグナルペプチドにそのアミノ末端で融合した、成熟ＶＥＧＩコード配列をコードする。
【０１１０】
２つのレトロウイルスＶＥＧＩ発現構築物もまた生成される。これらのうちの第１のものは、ｐＧ１ＳａｍＥＮ／ＴＮＦｇ−３／１４９と称された。この発現構築物を使用して、全長ＶＥＧＩポリペプチドを哺乳動物系から生成し得る。関連構築物である、ｐＧ１ＳａｍＥＮ／ＣＫ−β８ＴＮＦｇ１２／１４９が生成され、この構築物を使用して、ＣＫ−β８シグナルペプチドの指示下で哺乳動物系から成熟ＶＥＧＩポリペプチドを生成し得、かつ分泌し得る。
【０１１１】
本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対して、少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、そしてなおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡにコードされたポリペプチド、または配列番号９のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性、そしてなおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドを含み、そして少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分もまた含む。
【０１１２】
上記の組換えまたは融合タンパク質を生成する方法は、当該分野で公知であり（一般的なクローニング方法については、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）またはＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編（１９８５））を参照のこと）、そしてこの方法は、ＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターで安定に形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含し、このＤＮＡフラグメントは、このＤＮＡフラグメントが発現され、そして組換えタンパク質または融合タンパク質が生成されるような条件下で、本発明のポリペプチドをコードする。さらに、タンパク質またはポリヌクレオチドは、機能を増加するか、または細胞での位置を特異化する他のタンパク質またはポリペプチドに（例えば、実施例１〜３に示される分泌配列として）融合され得る。組換えタンパク質または融合タンパク質は、当該分野で公知の方法により単離され得る。形質転換された細胞を使用して、ＶＥＧＩ機能を阻害または活性化する薬物または薬剤（例えば、ＶＥＧＩポリペプチドの発現をダウンレギュレートするか、もしくは改変するか、または新脈管形成阻害する能力に影響を及ぼすＶＥＧＩポリヌクレオチドと相互作用し得る宿主タンパク質または化学的に誘導された薬剤もしくは薬物）の有効性を分析する。抗ＶＥＧＩまたは抗新脈管形成薬物もしくは薬剤の有効性を試験する方法は、例えば、ＶＥＧＩの内皮細胞増殖阻害活性のブロックであり得る。すなわち、このような抗ＶＥＧＩ薬剤の存在は、内皮細胞増殖を阻害する、能力が減少されたＶＥＧＩを導こ得る。結果として、より多くのＶＥＧＩが、抗ＶＥＧＩ薬剤の非存在下で観察される匹敵する阻害を達成するために必要とされる。一方、抗新脈管形成薬剤の存在は、ＶＥＧＩが内皮細胞増殖を阻害する能力を増強し得るかまたは相乗作用し得る。結論として、より低い濃度のＶＥＧＩが、薬物の非存在下で観察された同様の阻害を達成するために必要とされる。
【０１１３】
（ポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、単離されたＶＥＧＩポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号９の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡであるＨＵＶＥＯ９１によってコードされたアミノ酸配列、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体を有する。
【０１１４】
本発明はまた、ＶＥＧＩ−βポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号２７の推定アミノ酸配列を有するか、または  寄託されたｃＤＮＡであるＨＥＭＣＺ５６にコードされたアミノ酸配列、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を有する。
【０１１５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、均質性を完全にするために（例えば、＞９９％純粋）ほぼ完全な範囲内（例えば、＞９０％純粋）の点まで精製される。用語「単離された（る）」とは、物質がその元来の環境（例えば、この物質が天然に存在する場合にはその天然の環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生存動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、その天然の系に同時に存在する物質のいくつかまたは全てから分離されていれば、この同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。「単離されたポリペプチド」として意味されるものはまた、組換え宿主細胞から部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、ＶＥＧＩポリペプチドの組換え産生バージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８））に記載の一工程方法によって実質的に精製され得る。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてなおこのようなベクターまたは組成物は、その天然の環境の一部ではないという点で単離されている。本発明に従う単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、天然または合成により生成されたこのような分子もまた含む。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本発明のＶＥＧＩ抗体を使用して天然または組換え供給源から精製され得る。この方法は、タンパク質精製の分野では周知である。
【０１１６】
配列番号２、配列番号９、または配列番号２７のポリペプチド、および寄託されたｃＤＮＡによってコードされるようなポリペプチドをいう場合、用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」とは、ＶＥＧＩ機能的活性を保持している（すなわち、配列番号２、配列番号９、または配列番号２７に開示されるか、および／または寄託されたクローン（ＨＹＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）のうちの１つまたは両方によってコードされた、全長および／または成熟ＶＥＧＩポリペプチドと関連する、１つ以上の機能的活性を示す）ポリペプチドを意味する。１つの例として、このようなフラグメント、誘導体、またはアナログは、所望の免疫原性または抗原性を有し、例えば、イムノアッセイで、免疫するために、ＶＥＧＩ活性の阻害のためなどに使用され得る。従って、本発明の特定の実施態様は、ＶＥＧＩフラグメントに関し、このフラグメントは、配列番号２、配列番号９、配列番号２７、および／または寄託されたクローン（ＨＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）のうちの１つまたは両方にコードされるＶＥＧＩポリペプチド配列と特異的に結合する抗体によって結合され得る。
【０１１７】
別の例として、ＶＥＧＩ生物学的活性を有するＶＥＧＩフラグメント、誘導体またはアナログ（例えば、成熟ＶＥＧＩポリペプチドまたはＶＥＧＩ−βポリペプチドの細胞外ドメイン）が提供される。目的のＶＥＧＩ特性（例えば、細胞増殖の阻害、腫瘍阻害、新脈管形成の阻害、脈管形成ならびに／または骨および軟骨中のパンヌスを侵襲することと関連した内皮細胞増殖の阻害による抗関節炎、ＮＦ−κβおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）、細胞接着のインデューサー、ならびにアポトーシスのインデューサー）を保持するか、あるいは欠如するＶＥＧＩフラグメント、誘導体、およびアナログは、それぞれ、このような特性およびその生理学的相関特性のインデューサーまたはインヒビターとして使用され得る。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは、膜貫通領域ならびに細胞内および細胞外領域を有する膜結合型レセプターとして存在するか、またはそれらは、膜貫通ドメインが欠如している可溶性形態で存在し得る。ＶＥＧＩのこのような形態の一例は、配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−βポリペプチド配列であり、この配列は、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、および細胞外ドメインを含む。
【０１１９】
ＶＥＧＩポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能の有意な効果を伴わずに変化され得ることが認識される。配列のこのような差異が熟慮される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを記憶しておくべきである。したがって、本発明はさらに、実質的なＶＥＧＩポリペプチド活性を示すか、本明細書中に開示されるポリペプチドフラグメントのようなＶＥＧＩの領域を含む、ＶＥＧＩポリペプチドの改変体を含む。このような改変体は、活性にほとんど効果を有さないように、当該分野で公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスが提供され、ここで、著者らは、アミノ酸配列の変更に対する寛容性を研究するために、主に２つのアプローチがあることを示す（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）。第１の方法は、進化のプロセスに依存し、ここで、変異は、自然淘汰によって受け入れられるか、または拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングした遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を誘導し、そして機能性を維持する配列を選択またはスクリーニングして同定する。著者らが述べるように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容性であることを明らかにした。著者らは、タンパク質の特定の部位においてどのアミノ酸変化が許容され得る可能性があるかをさらに示す。例えば、最も埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、その一方で、一般的に、表面側鎖のわずかな特性が保存される。他のこのような表現型がサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅよび共同研究者（前出）およびそこで引用された参考文献に記載される。代表的には、保存的置換としてみられるものは、以下の、ある残基から別の残基への置換である：脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中での置換、ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの中での交換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であるＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基であるＬｙｓとＡｒｇの交換、および芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒの中での置換。
【０１２０】
従って、配列番号９もしくは配列番号２７のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの、フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されたもの（そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであってもなくてもよい）、（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟形態のＶＥＧＩポリペプチドが、このポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列、あるいはこのポリペプチドまたはプロタンパク質配列の上記の形態の精製に利用される配列が、上記の形態のポリペプチドに融合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示からの当業者の範囲内であると見なされる。
【０１２１】
従って、本発明のＶＥＧＩは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を、自然変異またはヒトの操作のいずれかで含みうる、示されるように、好ましくは、変化は、マイナーな性質である（例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換）（表１を参照のこと）。
【０１２２】
【表１】
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本発明の実施態様は、本明細書中に記載されるＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列を含むが、本明細書中に記載のＶＥＧＩポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換であるが、５０を超えない保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは、４０を超えない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは、３０を超えない保存的アミノ酸置換、そしてさらになおより好ましくは、２０を超えない保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドに関する。当然のことながら、増え続けている優先度の順に、ＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドが非常に好ましい。この配列は、少なくとも１つ、しかし、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１を超えない保存的アミノ酸置換を含む。
【０１２３】
さらに詳細な実施態様において、配列番号２、配列番号９、および配列番号２７のアミノ酸配列、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチド配列、および／または本明細書中に記載の任意のポリペプチドフラグメント（例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン）のアミノ酸配列における置換、付加、または欠失の数は、７５，７０，６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または１５０〜５０、１００〜５０、５０〜２０、３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０、１０〜１、５〜１０、１〜５、１〜３または１〜２である。
【０１２４】
ＶＥＧＩポリペプチドの特性を改善または改変するために、タンパク質工学もまた使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、新規の変異タンパク質またはムテイン（単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または融合タンパク質）を作製し得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、高収率で精製され得、そしてその対応する天然のポリペプチドよりも、少なくとも特定の精製および保存条件下で、より良好な溶解度を示す。
【０１２５】
従って、本発明はまた、ＶＥＧＩポリペプチドを生成するように、１つ以上のアミノ酸残基を欠失したか、付加したか、または置換したＶＥＧＩ誘導体およびアナログを含み、この誘導体およびアナログは、選択された宿主細胞中での発現、スケールアップなどにより良好に適合される。例えば、ジスルフィド架橋を取り除くためにシステイン残基が欠失されてい得るか、または別の残基で置換されてい得る；Ｎ結合型グリコシル化部位は、例えば、均質な産物の発現を達成するために改変され得るか、または除去され得る。均質な産物の発現は、Ｎ結合部位を高グリコシル化することが公知である酵母宿主から、より容易に回収および精製される。この目的のために、本発明のＶＥＧＩポリペプチドの、任意の１つ以上のグリコシル化認識配列上の１位または３位のうちの１つまたは両方での種々のアミノ酸置換、および／またはこのような認識配列の任意の１つ以上の第２の位置でのアミノ酸欠失は、改変されたトリペプチド配列でのＶＥＧＩポリペプチドのグリコシル化を妨げる（例えば、Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ５（６）：１１９３−１１９７を参照のこと）。
【０１２６】
機能に不可欠である、本発明のＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）））によって同定され得る。後者の手順は、分子中のあらゆる残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子は、レセプター結合またはインビトロ増殖活性のような生物学的活性について試験される。
【０１２７】
特に目的のものは、荷電アミノ酸の他の荷電性アミノ酸または中性アミノ酸での置換であり、この置換は、より少ない凝集のようなより高度に所望され得る改善された特徴を有するタンパク質を生成し得る。凝集は、活性を減少させるだけでなく、薬学的処方物を調製するときに問題であり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１２８】
ＶＥＧＩは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ＶＥＧＩの生物学的活性を完全に除去するよりはむしろそれを調節するために、好ましくは、付加、置換、または欠失が、保存されたＴＮＦ様ドメイン中の（すなわち、配列番号９の１７位−１４７位、または配列番号２７の１２１位−２５１位で、より好ましくは、ＶＥＧＩ関連ポリペプチドファミリーの全てのメンバーで保存されていないこの領域内の残基中で）アミノ酸をコードする配列中に作製される。本発明の形成部分はまた、上記のＶＥＧＩ改変体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０１２９】
ＶＥＧＩポリペプチドのいくつかのアミノ酸は、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーの公知のメンバーにまたがって高度に保存される。チロシン−１５（配列番号９での番号づけとして）、ロイシン−３５、グリシン−４１、チロシン−４３、チロシン−４６、グルタミン−４８、ロイシン−９０、ロイシン−１１６、グリシン−１１９、アスパラギン酸−１２０、フェニルアラニン−１４１、フェニルアラニン−１４２、およびロイシン−１４７のような残基でＶＥＧＩ中に特定の変異を作製することによって、生物学的活性に対する注目すべき効果が観察されるようである。これらの同一のアミノ酸残基は、当然のことながら、配列番号２７に示されたＶＥＧＩ−βの対応する位置で存在する。
【０１３０】
本発明はまた、上記に記載のＶＥＧＩポリペプチドのフラグメントを含む。本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２および配列番号９に含まれるアミノ酸配列、寄託されたクローン（ＨＵＶＥＯ９１）に含まれるｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号８、および／もしくは配列番号２６に開示された寄託されたクローン中に含まれるヌクレオチド配列もしくはそれに対する相補鎖に（例えば、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１３１】
ポリペプチドフラグメントは、「自由な状態」であり得るか、またはこのフラグメントが一部または領域、最も好ましくは、単一の連続する領域として形成するより大きなポリペプチド内に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号９およびまたは配列番号２７の以下のおよそのアミノ酸残基を含むか、あるいはそれからなるか、またはそれらに由来するフラグメントを含む：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８３，８４〜１００，１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６０〜１６７、１６１〜１７４、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２５１。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸長であり得る。この状況において、「ほぼ、約、およそ」とは、特に記載された範囲、どちらかの極端または両方の極端でいくつかのアミノ酸だけ（すなわち、５、４、３、２または１）、より大きいかまたはより小さい範囲を含む。
【０１３２】
他の実施態様において、本発明のフラグメントまたはポリペプチド（すなわち本明細書中に記載されるフラグメントまたはポリペプチド）は、２５０、２２５、２００、１８５、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９０、８０、７５、６０、５０、４０、３０または２５アミノ酸残基長より大きくはない。
【０１３３】
さらに好ましい実施態様は、ＶＥＧＩの成熟ドメイン（配列番号９の１〜１４７のアミノ酸残基）、ＶＥＧＩ−βの細胞内ドメイン（配列番号２７の１〜３５のアミノ酸残基）、ＶＥＧＩ−βの膜貫通ドメイン（配列番号２７の３６〜６１のアミノ酸残基）、および／またはＶＥＧＩ−βの細胞外ドメイン（配列番号２７の６２〜２５１のアミノ酸残基）を含むか、またはそれらからなるポリペプチドフラグメントを含む。
【０１３４】
特定の実施態様において、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号９のアミノ酸残基ロイシン−３５〜バリン４９、トリプトファン−１０４〜ロイシン−１１６、グリシン−１１９〜セリン−１２７、リジン−１３９〜ロイシン−１４７を含むか、あるいはそれらからなる。これらのドメインは、ＶＥＧＩファミリーメンバーポリペプチドの比較によって同定される高い同一性の領域である。
【０１３５】
本発明の特に好ましいフラグメントのなかで、フラグメントは、ＶＥＧＩの構造的または機能的寄与によって特徴づけられる。このようなフラグメントは、ＶＥＧＩのα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原性指標領域（すなわち、Ｊｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメーターを使用して同定されるように、１．５以上の抗原性指標を有するアミノ酸残基からなるポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残基を含む。特定の好ましい領域は、図７に開示され、そして図５Ａ、５Ｂ、５Ｃならびに配列番号２および配列番号９に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される前述の型の領域を含むが、これらに限定されない。このような好ましい領域としては、以下が挙げられる：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ推定α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ推定α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｅ推定親水性および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆのコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用して推定されるような、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指数領域。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１３６】
さらに、本発明のアナログは、活性な成熟ポリペプチドを生成するようにプロタンパク質部分の切断によって活性化され得るプロタンパク質を含む。
【０１３７】
別の実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むか、あるいはそれからなるＶＥＧＩポリペプチド（例えば、フラグメント）を提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を惹起するタンパク質の部分として定義される。それに対して、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般的に、抗原性エピトープの数より少ない（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【０１３８】
抗原エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドの選択に関して（すなわち、これは、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）、タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドが部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘導し得ることは、当該分野で周知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ．Ｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。タンパク質反応性の血清を誘発し得るペプチドはタンパク質の一次配列において度々示され、簡単な化学的な規則のセットによって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優勢な領域（すなわち、免疫原性エピトープ）に対しても、またはアミノ末端もしくはカルボキシル末端に対しても限定されない。従って、本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用であり、これは本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）を参照のこと）。
【０１３９】
本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７つの配列を好ましくは含み、さらに好ましくは少なくとも９つ、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の間の配列を好ましくは含む。ＶＥＧＩ特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの限定しない例には、以下が挙げられる：配列番号９で約Ｔｈｒ−２４〜約Ａｓｎ−３２までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｉｌｅ−３７〜約Ｉｌｅ−４５までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｍｅｔ−５４〜約Ａｒｇ−６２までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｇｌｎ−６３〜約Ａｓｐ−７１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｇｌｕ−５７〜約Ｇｌｙ−６５までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｖａｌ−８０〜約Ｔｈｒ−８８までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号９で約Ｌｅｕ−１１６〜約Ｖａｌ−１２４までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号９で約Ａｓｐ−１３３〜約Ｐｈｅ−１４１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図７で示したように、ジェイムソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）抗原インデックスの分析によってＶＥＧＩポリペプチドの抗原エピトープを有することが決定されている。
【０１４０】
当業者は、デフォルトパラメーターを使用し、そして上記のような高い抗原インデックスを有する領域を選択するＶＥＧＩ−βポリペプチド配列（配列番号２７）のＤＮＡ*ＳＴＡＲ分析を通じて調製されたデータを使用することによってＶＥＧＩ−βについての抗原領域を容易に決定し得る。
【０１４１】
エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段によって調製される（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎら、米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）を参照のこと）。
【０１４２】
本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野において周知の方法に従って抗体を誘導することを含むがこれらに限定されない用途を有する（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、上記；Ｗｉｌｓｏｎら、上記；Ｃｈｏｗ、Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ、Ｆ．Ｊら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。本発明の免疫原性エピトープ含有ペプチド（すなわち、全タンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質のこれらの部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、上記を参照のこと）。なおさらに、Ｇｅｙｓｅｎに対して発行された米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に対して相補的なエピトープの位相幾何学的な等価物（すなわち、「ミモトープ」である単量体（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。さらに一般には、Ｇｅｙｓｅｎに対して発行された米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定レセプターのリガンド結合部位（例えば、ＤＲ３）に対して相補的なリガンドの局所特異的な等価物である単量体配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび同僚に対して発行されたペルアルキル化されたオリゴペプチド混合物に関する米国特許第５，４８０，９７１号は、直鎖状Ｃ１〜Ｃ７アルキルをペルアルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子と優先的に結合するペルアルキル化オリゴヌクレオチドの配列を決定するためのこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用に関する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ含有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１４３】
当業者が理解するように、本発明のＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドおよび上記のそのエピトープ含有フラグメントをイムノグロブリン（ＩｇＧ）の不変部（ドメイン）の一部と組み合わせ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増加を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の不変領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質に関して示されている（ＥＰＡ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド連結二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＶＥＧＩポリペプチドまたはタンパク質フラグメント単独より他の分子を結合および中和することにおいてより有効であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。１つの例として、１つのこのようなＶＥＧＩ−Ｆｃ融合物が、上記のように本明細書中で産生されている。
【０１４４】
本発明のＶＥＧＩポリペプチドのフラグメント（すなわち、部分）は、全長ポリペプチドを産生するための中間体を含むが、これらに限定されない使用を有する。
【０１４５】
膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは天然の形態（単数または複数）の分泌タンパク質を含む多くのタンパク質に関して、１以上のアミノ酸が生物学的機能の実質的な損失なくＮ末端またはＣ末端から欠失し得ることが当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎおよび同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７Ｎ末アミノ酸残基を失っている場合でさえ、へパリン結合活性を有していた修飾されたＫＧＦタンパク質を報告した。さらに、数人の研究者は、ＴＮＦ−αムテインを報告し、これは、２、４または７個のＮ末端アミノ酸が除去されて、天然に存在するＴＮＦ−αポリペプチドと比較した場合、機能的活性において２〜３倍の増加を示した。（Ｃｒｅａｓｅｙ、Ａ．Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：１４５−１４９（１９８７）；Ｓｉｄｈｕ，Ｒ．Ｓ．およびＢｏｌｌｏｎ、Ａ．Ｐ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１５６９−１５７６（１９８９）；Ｋａｍｉｊｏ，Ｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０：８２０−８２７（１９８９））。さらに、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他のＶＥＧＩの機能的活性は依然として保持され得る。
【０１４６】
現在の場合、本発明のタンパク質はＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号９の３５位のロイシン残基までのＮ末端アミノ酸の欠失（これは、配列番号２７の１３４位のロイシン残基と正確に対応する）は、多くの型の造血および内皮細胞の増殖および分化の調節のようないくつかの生物学的活性を保持し得る。配列番号９におけるロイシン−３６残基（配列番号２７におけるロイシン−１３５に対応する）を含むＮ末端欠失をさらに有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは予期されない。なぜならば、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおけるこの残基は、生物学的活性のために必要とされる保存ドメインの始まりであることが公知であるからである。
【０１４７】
しかし、全長ＶＥＧＩポリペプチドのＮ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がこのペプチドの１以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、ポリペプチドの全長または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または抗体と結合するための短縮ポリペプチドの能力は、全長または成熟ポリペプチドの大部分の残基より少ない残基がＮ末端から除去される場合、一般に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書に記載された慣用的な方法、そしてさもなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定し得る。
【０１４８】
従って、本発明は、配列番号９に開示されるＶＥＧＩのアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号３５のロイシン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。特に、本発明は、配列番号９の残基ｎ1−１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ1は、−２７〜３５までの範囲の整数であり、そして３５は、多くの型の造血および内皮細胞の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＶＥＧＩポリペプチド（配列番号９に示す）のＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１４９】
特定の実施態様において、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号９の
【０１５０】
【化４】
0004441112.tif 000006
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
【０１５１】
従って、本発明はさらに、配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−βのアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号１３４のロイシン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２７の残基ｎ2−２５１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ2は、１〜１３４までの範囲の整数であり、そして１３５は、ＶＥＧＩ−βポリペプチドの多くの型の造血および内皮細胞活性の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＶＥＧＩ−βポリペプチド（配列番号２７に示す）のＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１５２】
特定の実施態様において、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２７の
【０１５３】
【化５】
0004441112.tif 000007
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１５４】
上述のように、ポリペプチドのＮ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がこのポリペプチドの１以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、ポリペプチドの全長または成熟した形態を認識する抗体を誘導および／または抗体と結合する短縮されたＶＥＧＩムテインの能力は、全長または成熟ポリペプチドの大部分の残基より少ない残基がＮ末端から除去される場合、一般に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載の慣用的な方法、そしてさもなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定し得る。多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有するＶＥＧＩムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原活性を保持し得るようである。実際、６つほどのＶＥＧＩアミノ酸残基からなるペプチドがしばしば免疫応答を誘起し得る。
【０１５５】
従って、本発明はさらに、配列番号９において開示されるＶＥＧＩの推定された成熟アミノ酸配列のアミノ末端から配列番号９の位置番号１４２のフェニルアラニン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号９の残基ｎ3−１４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ3は、１〜１６９までの範囲の整数であり、そして１７０は、ＶＥＧＩポリペプチドの免疫原活性に少なくとも必要と考えられる完全なＶＥＧＩポリペプチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１５６】
より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃにおいて示されるＶＥＧＩアミノ酸配列は配列番号９における配列と同じである。しかし、番号付けスキームは、２つの間で異なる；この場合の上記アミノ酸残基の番号付けは図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃのそれを反映する）に示されるＶＥＧＩ配列の
【０１５７】
【化６】
0004441112.tif 000008
【０１５８】
【化７】
0004441112.tif 000009
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１５９】
従って、本発明はさらに、配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−βの推定された成熟アミノ酸配列のアミノ末端から位置番号２４６のフェニルアラニン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２７の残基ｎ4−２５１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ4は、２〜２４６までの範囲の整数であり、そして２４７は、ＶＥＧＩ−βタンパク質の免疫原活性に少なくとも必要と考えられる完全なＶＥＧＩ−βポリペプチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１６０】
より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−β配列の
【０１６１】
【化８】
0004441112.tif 000010
【０１６２】
【化９】
0004441112.tif 000011
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって含まれる。
【０１６３】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が知られている。例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端からの８〜１０アミノ酸残基の欠失によって１０倍までの高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。さらに、数人の研究者は、生物学的に不活性なＴＮＦ−αムテインを報告しており、これにおいて、２つほどのアミノ酸がＣ末端から除去されていた（Ｃａｒｌｉｎｏ、Ｊ．Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９５８−９６１（１９８７）；Ｃｒｅａｓｅｙ、Ａ．Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：１４５−１４９（１９８７）；Ｓｉｄｈｕ、Ｒ．Ｓ．およびＢｏｌｌｏｎ、Ａ．Ｐ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１５６９−１５７６（１９８９）；Ｇａｓｅ、Ｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７１：３６８−３７１（１９９０）。
【０１６４】
この場合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号９の１４６位のロイシン（これは配列番号２７の２５０位のロイシンに対応する）までのＣ末端アミノ酸の欠失は、多くの型の造血および内皮細胞の増殖および分化の調節のようないくつかの生物学的活性を保持し得る。配列番号９（または配列番号２７の２５０位のロイシン残基）の１４６位のロイシン残基を含むＣ末端欠失をさらに有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待され得ない。なぜならば、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおけるこの残基は生物学的活性に必要な保存ドメインのはじめであることが公知であるからである。
【０１６５】
しかし、タンパク質のＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がこのタンパク質の１以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的な活性は依然として保持され得る。従って、タンパク質の完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または抗体と結合する短縮されたタンパク質の能力は一般に、完全または成熟タンパク質の大部分の残基より少ない残基がＣ末端から除去された場合、保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書に記載の慣用的な方法およびさもなければ当該分野で既知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
【０１６６】
さらなる実施態様において、本発明は配列番号９に示されるＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から配列番号９の１４６位のロイシン残基までで除去される１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。特に、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列の残基−２７〜ｍ1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍ1は、１４６〜１４７までの範囲の任意の整数であり、そして残基１４６は、ＶＥＧＩ−βポリペプチドによる多くの型の造血および内皮細胞の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＶＥＧＩポリペプチド（配列番号９に示される）のＣ末端からの最初の残基の位置である。
【０１６７】
さらに詳細には、本発明は、配列番号９の残基−２７〜１４６および−２７〜１４７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１６８】
本発明はまた、配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−βのアミノ酸配列のカルボキシ末端から配列番号２７の２５０位のロイシン残基までで除去される１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２７におけるアミノ酸配列の残基１〜ｍ2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍ2は、２５０〜２５１までの範囲の任意の整数であり、そして残基２４９は、多くの型の造血および内皮細胞の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＶＥＧＩ−βポリペプチド（配列番号２７に示される）のＣ末端からの最初の残基の位置である。
【０１６９】
さらに詳細には、本発明は、配列番号２７の残基１〜２５０および１〜２５１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１７０】
本発明はまた、ＶＥＧＩ−αのアミノ末端とカルボキシル末端の両方から欠失された１以上のアミノ酸を含むか、あるいは１以上のアミノ酸からなるポリヌクレオチドフラグメントを提供し、これは配列番号９の残基ｎ1〜ｍ1を有すると一般的に記載され得る。ここでｎおよびｍは上記のような整数である。本発明はさらに、ＶＥＧＩ−βのアミノ末端およびカルボキシル末端両方から欠失した１以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これは、配列番号２７の残基ｎ2〜ｍ2を有すると一般に記載され得る。ここでｎ2およびｍ2は上記のような整数である。
【０１７１】
上述のように、ポリペプチドのＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がこのペプチドの１以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、全長または成熟のポリペプチドを認識する抗体を誘導および／または抗体と結合する短縮されたＶＥＧＩムテインの能力は、一般に、完全または成熟ポリペプチドの大部分の残基より少ない残基がＣ末端から除去される場合、保持される。全長ポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載の慣用的な方法およびさもなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するＶＥＧＩムテインがいくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際、６つほどのＶＥＧＩアミノ酸残基から構成するペプチドは免疫応答をしばしば誘起し得る。
【０１７２】
従って、本発明はさらに、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに（または配列番号９に）示されるＶＥＧＩのアミノ酸配列のカルボキシ末端から図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃにおける位置番号６（または配列番号９における−２２）のセリン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号９の残基１〜ｍ3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ3は、６〜１７４までの範囲の整数であり、そして６は、ＶＥＧＩ−αの免疫原性活性に少なくとも必要と考えられる完全なＶＥＧＩポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位置である。
【０１７３】
さらに詳細に、本発明は以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１７４】
【化１０】
0004441112.tif 000012
【０１７５】
【化１１】
0004441112.tif 000013
および図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃで示されるＶＥＧＩ配列の配列Ｍ−１〜Ｓ−６（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃで示されるＶＥＧＩアミノ酸配列は、配列番号９における配列と同一である。しかし、番号付けスキームはこの２つの間で異なる；この場合において上のアミノ酸残基の番号付けは図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃのそれを反映する）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１７６】
本発明はまた、ＶＥＧＩポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失した１以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これは一般配列番号９の残基ｎ3〜ｍ3を有するとして記載され得、ここでｎ3およびｍ3は、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。
【０１７７】
本発明はさらに、配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−βのアミノ酸配列のカルボキシ末端から位置番号６のグリシン残基までで欠失した１以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２７の残基１〜ｍ4のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ4は、６〜２５０までの範囲の整数であり、そして６は、ＶＥＧＩ−βタンパク質の免疫原性活性に少なくとも必要と考えられる完全なＶＥＧＩ−βポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位置である。
【０１７８】
さらに詳細には、本発明は以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下の残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１７９】
【化１２】
0004441112.tif 000014
【０１８０】
【化１３】
0004441112.tif 000015
および配列番号２７に示されるＶＥＧＩ−β配列の配列のＭ−１〜Ｇ−６。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１８１】
本発明はまた、ＶＥＧＩ−βポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端両方から欠失した１以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、これは、配列番号２７の残基ｎ4〜ｍ4を有するとして一般に記載され得、ここでｎ4とｍ4は、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる。
【０１８２】
本発明のさらなる実施態様は、一般式ｍ×〜ｎ×によって記載されるアミノ酸を含むか、またはアミノ酸からなるポリペプチドフラグメントに関し、ここで、ｍおよびｎは、これらの記号について上記で特定したアミノ酸残基の任意の１つにそれぞれ対応し、そしてＸは、任意の整数を示す。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１８３】
本発明の特定の実施態様は、ＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なＶＥＧＩアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関し、ここでこの部分は、ＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの１〜約６２アミノ酸、あるいはＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から、または上記のアミノ末端およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせからの約１つのアミノ酸を除外する。上記の欠失変異体ポリペプチド形態のすべてをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１８４】
他の実施態様において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なＶＥＧＩ−βアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関し、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの１〜約１３４のアミノ酸を除外し、あるいは、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの多くのアミノ酸（ここでこの数は１〜１３４の任意の整数から選択される）、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端、もしくは上記のアミノ末端およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせから約１つのアミノ酸を除外する。上記のポリペプチドのすべてをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって含まれる。
【０１８５】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＶＥＧＩポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号９に示された完全なアミノ酸配列を有する全長ＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号９の−２７〜１４７位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号９に示される完全なアミノ酸配列を有する全長ＶＥＧＩポリヌクレオチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号９の−２６〜１４７位）；（ｃ）配列番号９において位置１〜１４７のアミノ酸配列を有する推定された成熟ＶＥＧＩポリペプチドのアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローン、ＨＵＶＥＯ９１によってコードされる完全なアミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列；および（ｆ）ＡＴＣＣ寄託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローン、ＨＵＶＥＯ９１によってコードされる推定の成熟ＶＥＧＩポリペプチドの完全なアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に記載のように、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載の配列に対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、およびさらにより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはそのフラグメントを含む。
【０１８６】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＶＥＧＩポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２７において示される完全なアミノ酸配列を有する全長ＶＥＧＩ−βポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２７の１〜２５１位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニン（すなわち、配列番号２７の２〜２５１位）を除く、配列番号２７に示される完全なアミノ酸配列を有する全長ＶＥＧＩ−βポリペプチドのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号２７における６２〜２５１位のアミノ酸配列を有する推定された成熟ＶＥＧＩ−βポリペプチドのアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローン、ＨＥＭＣＺ５６によってコードされる完全なアミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローン、ＨＥＭＣＺ５６によってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列；および（ｆ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローン、ＨＥＭＣＺ５６によってコードされる推定の成熟ＶＥＧＩポリペプチドの完全なアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に記載のように、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載の配列と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、およびさらにより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはそのフラグメントを含む。特定の実施態様において、これらのポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸である。
【０１８７】
例えば、ＶＥＧＩポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペプチド配列がＶＥＧＩポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、このポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列におけるアミノ酸残基の５％までが欠失または別のアミノ酸残基と置換され得るか、あるいは参照配列における全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端部分またはこれらの末端部分の間でどこにでも生じ得、参照配列において残基中で個々にか、または参照配列内の１以上の連続した群においてかのいずれかで分散される。
【０１８８】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ（配列番号９）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントに、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、例えば、特定の配列が、本発明に従う参照配列に９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメーターは、当然のこととして、同一性パーセントが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基中の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【０１８９】
特定の実施態様において、参照（問合わせ）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性は（これはまた、グローバル配列アラインメントともいわれる）、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０、Ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。この実施態様に従って、内部の欠失でなくＮ−またはＣ−末端欠失によって、対象配列が問合わせ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバル同一性パーセントが計算される場合に、手動の訂正がなされて、対象配列のＮ−およびＣ−末端の切断を考慮しないという事実を考慮に入れる結果を作成する。Ｎ−末端およびＣ−末端において切断されている対象配列について、問合わせ配列と比較して、同一性パーセントは、対応する対象残基とマッチ／アラインされない、対象配列のＮ−およびＣ−末端である問合わせ配列の残基の数を、問合わせ配列の全塩基数のパーセントとして計算することによって訂正され得る。１つの残基がマッチ／アラインされるかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは同一性パーセントから差し引かれ、特定化されたパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算され、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントスコアは、この実施態様の目的のために使用されるものである。対象配列のＮ−およびＣ−末端への配列（これは問合わせ配列にマッチ／アラインされていない）のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列のＮ−およびＣ−末端の最も遠い外側の問合わせ残基位置のみである。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の問合わせ配列とアラインされる。対象配列のＮ−末端に欠失が存在し、それゆえにＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ−末端で最初の１０残基のマッチング／アラインメントを示さない。１０の不対残基は、配列の１０％（マッチしないＮ−およびＣ−末端の残基数／問合わせ配列中の残基の総数）を示し、ゆえに１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全にマッチする場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列は１００残基の問合わせ配列と比較される。今回は、欠失は内部の欠失であり、ゆえに対象配列のＮ−またはＣ−末端において問合わせ配列とマッチ／アラインしない残基は存在しない。この場合においては、ＦＡＳＴＤＢによっ��計算される同一性パーセントは手動で訂正されない。再度述べると、問合わせ配列とマッチ／アラインしない対象配列のＮ−およびＣ−末端の外側の残基位置のみが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示されるように、手動で訂正されるものである。他の手動の訂正は、本実施態様の目的のためにはなされない。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、配列番号９のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号９のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有するポリペプチド、およびより好ましくは、配列番号９のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、およびなおより好ましくは、配列番号９のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてまた、そのようなポリペプチドの部分も含み、このようなポリペプチドの部分は、一般的に少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。
【０１９１】
本発明のポリペプチドはまた、配列番号２７のポリペプチド（特にポリペプチドの細胞外ドメイン）、ならびに配列番号２７のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有するポリペプチド、およびより好ましくは、配列番号２７のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、およびなおより好ましくは、配列番号２７のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして、そのようなポリペプチドの部分もまた含み、このようなポリペプチドの部分は、一般的に少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。
【０１９２】
本発明のさらなるポリペプチドは、本明細書に記載されるこれらのポリペプチドに対して、少なくとも７０％の類似性、少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、本明細書に開示されるポリペプチドに対して、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む。特定の実施態様において、このようなポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。
【０１９３】
当該分野で公知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換の、第２のポリペプチドの配列に対する比較によって決定される。２つのポリペプチドの「類似性％」は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）および類似性の決定のためにデフォルト設定を使用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生成される類似性スコアを意図する。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所ホモロジーアルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９，１９８１）を使用して、最も良好な、２つの配列間の類似性のセグメントを見いだす。
【０１９４】
本明細書中で使用される場合、配列番号２、配列番号９、および配列番号２７のアミノ酸配列に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、その配列またはその部分中にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、ここでその部分は少なくとも２〜５アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、ならびになおより好ましくは少なくとも１１〜１５アミノ酸からなり、あるいは、この配列は、この配列中にコードされるポリペプチドを用いて、免疫学的に同定可能である。
【０１９５】
本発明はまた、融合タンパク質を含み、この全長ＶＥＧＩポリペプチドまたはフラグメント、改変体、誘導体、もしくはそのアナログが関連性のないタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は、本明細書で開示されるＶＥＧＩヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に基づいて慣用的に設計され得る。例えば、当業者が理解するように、本明細書に記載されるＶＥＧＩおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドならびにそのフラグメント（エピトープ保有フラグメントを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域の部分と組み合わされ得、キメラ（融合）ポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期の増大を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示された（ＥＰ  Ａ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分のためにジスルフィド連結した二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＶＥＧＩタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子を結合させることおよび中和させることにおいてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８〜３９６４（１９９５））。例として、上記のように本明細書においてこのようなＶＥＧＩ−Ｆｃ融合物が産生される。本発明に含まれるさらなるＶＥＧＩ融合タンパク質の例は、細胞表面に提示される融合タンパク質；またはマーカー機能を提供する、酵素との融合物、蛍光性タンパク質、もしくは発光性タンパク質を可能にする任意のアミノ酸配列に対するＶＥＧＩポリペプチド配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
【０１９６】
（機能的活性）
ＶＥＧＩポリペプチド、ならびにそのフラグメント、種々の誘導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法でアッセイされ得る。
【０１９７】
例えば、抗ＶＥＧＩ抗体への結合について全長ＶＥＧＩポリペプチドと結合するか、または競合するその能力についてアッセイする１つの実施態様において、当該分野で公知の種々のイムノアッセイが使用され得、これには、ラジオイムノアッセイのような技術を使用する競合的および非競合的アッセイ系、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどを含むが、これらに限定されない。１つの実施態様において、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施態様において、一次抗体は、二次抗体または一次抗体に対する試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施態様において、二次抗体は標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【０１９８】
ＴＮＦ−リガンドが同定される別の実施態様において、結合は、例えば、当該分野で周知の手段によってアッセイされ得る。別の実施態様において、ＶＥＧＩのその基質との結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【０１９９】
さらに、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、実施例５〜８および１０）およびさもなくば当該分野で公知のアッセイは、ＶＥＧＩポリペプチドならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの、ＶＥＧＩ関連生物学的活性を誘発する（例えば、インビトロまたはインビボにおける、細胞増殖、新脈管形成、および細胞接着を阻害、あるいは促進する）能力を測定するために慣用的に適用され得る。
【０２００】
他の方法は当業者に公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【０２０１】
（抗体）
１つ以上のＶＥＧＩのエピトープもしくはＶＥＧＩの保存された改変体のエピトープ、またはＶＥＧＩのポリペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体もまた、本発明に含まれる。従って、そのポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞は、それに対する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物、抗イデオタイプ抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントもまた含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。
【０２０２】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接的な注入によって得られ得るか、または動物（好ましくは非ヒト動物）へのポリペプチドの投与によって得られ得る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合する。この様式で、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえ、全体のネイティブポリペプチドを結合する抗体を生成するために使用され得る。このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からのポリペプチドの単離を含むがこれに限定されない使用および生物学的サンプルにおけるＶＥＧＩの検出についての使用を有し、そして診断的または予後の技術の一部として使用され得、それによって患者はＶＥＧＩの異常な量について試験され得る。そのような抗体はまた、ＶＥＧＩ生物学的活性の阻害の方法においてもまた使用され得る。
【０２０３】
抗体の産生のために、種々の宿主動物がＶＥＧＩポリペプチド（例えば、ポリペプチドの機能的ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）に対応するもの）の注入によって免疫化され得る。このような宿主動物には、ウサギ、マウス、およびラットなどが含まれ得るがこれらに限定されない。宿主の種に依存して種々のアジュバントが免疫応答を増大するために使用され得、これらには、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェロール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の異種集団である。
【０２０４】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養中の継続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術によって得られ得る。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；および米国特許第４，３７６，１１０号）のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０（１９８３））、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁（１９８５））が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンのクラスの抗体であり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボにおいて培養され得る。インビボにおける高力価のｍＡｂの産生は、これを現在好ましい産生方法にする。
【０２０５】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４（１９８５））が使用され得る。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するような、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
【０２０６】
ヒトにおける抗ＶＥＧＩのインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築物を使用して産生し得る。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野で公知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５））。
【０２０７】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載した技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４５４６（１９８９））が、ＶＥＧＩポリペプチドに対する単鎖抗体を産生するために適応され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、単一のポリペプチドを生じる。
【０２０８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９））、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
【０２０９】
ＶＥＧＩポリペプチドに対する抗体は、次には、当業者に周知の技術を使用して、ＯｂＲを「模倣する」抗イデオタイプ抗体を産生するために利用され得る（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７〜４４４；（１９８９）ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９〜２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、ＶＥＧＩ細胞外ドメインに結合し、競合的にリガンドのＶＥＤＩへの結合を阻害する抗体は、ＶＥＧＩ細胞外ドメインを「模倣する」（従って、ＶＥＧＩリガンドに結合し、そしてＶＥＧＩリガンドを中和する）抗イデオタイプを産生するために使用され得る。このような中和抗イデオタイプまたはこのような抗イデオタイプのＦａｂフラグメントは、治療療法においてＶＥＧＩリガンドを中和するために使用され得る。
【０２１０】
従って、上記に開示したように、標準的な方法論を使用する当業者は、本発明のＶＥＧＩタンパク質（またはポリペプチド）に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を惹起させ得る。抗体産生の材料および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第４章、１９８６を参照のこと）。さらに、このポリペプチドはその抗原性を増大させる他のタンパク質またはポリペプチドに融合させ得、それによって高力価の抗体を産生する。このようなタンパク質またはポリペプチドの例は、任意のアジュバントまたはキャリア（例えば、水酸化アルミニウム）を含む。これらの抗体は、受動的な抗体治療において使用され得、ここでＶＥＧＩに特異的に結合する抗体は、生殖、発生、創傷治癒、および組織修復などのような、新脈管形成依存的なプロセスを調節するために利用され得る。
【０２１１】
（免疫および循環系関連および他の医学的障害）
別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩの有効量を前記患者に投与することによる、動物またはヒト患者の新脈管形成関連疾患の徴候を減少させる方法に関する。新脈管形成は腫瘍の生存に必要であるので、新脈管形成の阻害または逆転は腫瘍を減少または抹殺させ得る。ＶＥＧＩを有する患者が提供された場合、投与される薬剤の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的医学的状態、以前の病歴などのような因子に依存して変化する。一般的に、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲の上記の化合物の投薬量を有するレシピエントを提供することが所望されるが、より低いまたはより高い投薬量が投与され得る。本発明の方法は、単回投与、および、同時にまたは延長された時間の間にわたってのいずれかで与えられる、多回投与を意図する。
【０２１２】
ＶＥＧＩポリヌクレオチドは、配列番号１に記載される本発明のＶＥＧＩポリヌクレオチド、またはその部分、あるいはその対立遺伝子型を含む、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスまたはレトロウイルス）を使用することによって提供され得る。その使用されるベクターは、好ましくは、そのポリヌクレオチドが転写および翻訳され、そしてＶＥＧＩポリペプチドが産生されるように細胞にＶＥＧＩポリヌクレオチドを供給し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡとして、リポソームにカプセル化されたＤＮＡとして、またはウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含むプロテオリポソーム中に包括されたＤＮＡとして投与され得る（Ｋａｎｏｄａ，Ｙ．ら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５）。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、キャリアとともに注入され得る。キャリアは、サイトカイン（例えば、インターロイキン２）またはポリリジン糖タンパク質キャリアのようなタンパク質であり得る。このようなキャリアタンパク質およびベクターならびにこれを使用する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ａｓｃａｄｉ  Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１、３５２：８１５を参照のこと）。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、小さい金のビーズにコートされ得、そしてこのビーズは、皮膚に、例えば遺伝子銃を用いて導入され得る（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３、２５９：１７４５）。
【０２１３】
あるいは、本発明のＶＥＧＩポリペプチドは、当該分野で公知の処方方法を使用して、薬学的に受容可能な処方物中に提供され得る。これらの処方物は、標準的な経路で投与され得る。一般的には、局所的、経皮的、腹腔内、経口、直腸の、または非経口的（例えば、静脈内、皮下、または筋肉内）経路による組み合わせが投与され得る。さらに、本発明のＶＥＧＩポリペプチドは、ＶＥＧＩポリペプチドがゆっくりと全身に放出されるように、薬物送達が所望されるか、または移植される場所の近傍に移植される生分解ポリマー中に組み込まれ得る。生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えば、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６（１９９１）に詳細に記載される。
【０２１４】
ＶＥＧＩポリペプチド処方物は、経口、直腸、眼（硝子体内または眼房を含む）、鼻、局所的（口腔内および舌下を含む）、膣、または非経口的（皮下、腹腔内、および硬膜外を含む）投与に適する処方物を含む。ＶＥＧＩポリペプチド処方物は、単位用量形態で便利に提供され得、そして従来的な薬学的技術によって調製され得る。このような技術には、関連する活性成分および薬学的キャリア（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）を会合させる工程を含む。一般的には、その処方物は、活性成分を、液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアあるいはその両方と、均一にかつ密接に会合させることによって調製され、次いで、必要である場合、生成物を鋭くする。
【０２１５】
非経口的な投与に適切な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、および意図したレシピエントの血液との等張性を処方物に与える溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射溶液；および懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。処方物は、単位用量または多用量の容器（例えば、密封されたアンプルおよびバイアル）において存在し得、そして使用の直前に滅菌液体キャリアー（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。処方箋に応じて調合する注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０２１６】
好ましい単位投薬量の処方物は、毎日の用量または単位、毎日の用量未満（本明細書の上記に記載した）、または投与される成分のその適切な画分を含む処方物である。特に、上記に記載した成分に加えて、本発明の処方物は、問題の処方物の型と関連する当該分野における従来の他の薬剤を含み得ることが理解されるであろう。
【０２１７】
別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩポリヌクレオチド、ＶＥＧＩポリペプチドまたはそのアナログの有効量、あるいは病理学的な新脈管形成の症状を減少するような内在性もしくは外来性のＶＥＧＩポリヌクレオチド、または内在性もしくは外来性のＶＥＧＩポリペプチドの発現を誘導し得る薬剤を患者に投与することにより、患者における制御されていない病理学的な新脈管形成の症状を減少する方法に関する。意図される疾患は、血管腫、毛細管拡張症乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、心筋新脈管形成、悪疫新生血管形成、冠状側副枝、虚血性四肢新脈管形成、角膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖、関節炎、糖尿病新生血管形成を含むが、これらに限定されない。本明細書で記載された疾患および疾患状態は、いかなる種類のガンまたは腫瘍を含まない。
【０２１８】
特定の実施態様において、本発明のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドは、血小板第４因子、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６ｋＤａフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８ｋＤａのフラグメント）、ｂＦＧＦ可溶性レセプター、トランスフォーミング成長因子β、インターフェロンα、および胎盤プロフェリン関連タンパク質であり得るが、これらに限定されない、新脈管形成を負に制御する他の分子の治療的な有効量と組み合わせられる。
【０２１９】
本発明のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドで処置され得る新生血管形成と関連した眼の障害は、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の目の炎症性疾患および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連した疾患を含むが、これらに限定されない。（例えば、Ｗａｌｔｍａｎらの総説、１９７８、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７４０〜７１０およびＧａｒｔｎｅｒら、１９７８、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２を参照のこと）
別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩポリヌクレオチドの転写を減少すること、ＶＥＧＩポリペプチドをコードするＲＮＡの量を減少することによるか（例えば、ＶＥＧＩ特異的リボザイムまたはＶＥＧＩ  ＲＮＡに対し特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによる）、あるいは上記に記載したＶＥＧＩポリペプチドをプロセスし得るおよび／または活性化し得るプロテアーゼの阻害によりＶＥＧＩポリペプチドの産生を阻害することによるか（Ｋａｙａｇａｋｉら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１７７７〜１７８３；Ｂｌａｃｋら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２９〜７３３）、あるいはＶＥＧＩポリペプチドの活性化を可能にするまたは促進する薬剤および／または金属イオンをブロックすることまたは除去することによるか、あるいはＶＥＧＩレセプターをブロックすることによりＶＥＧＩポリペプチド機能を直接阻害することによるか、あるいはＶＥＧＩポリペプチドを認識し、そして結合する抗体を使用することによるか、あるいはＶＥＧＩポリペプチドの機能を阻害するためのアンタゴニストを使用することにより、ＶＥＧＩポリペプチド機能を減少し得る薬剤の有効量を、患者に投与することにより、患者における新脈管形成を促進するための方法に関する。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの操作および送達は、当該分野で公知であり（Ｕｓｍａｎ  Ｎ．ら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：５２７〜５３３ならびにＨｏおよびＰａｒｋｉｎｓｏｎ（１９９７）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：１８７〜２０２を参照のこと）、例えば、脂質と混合することによるか、あるいはウイルスベクターまたはプラスミドベクターを使用することにより哺乳動物細胞に送達し得る。意図された疾患および状態は、黄斑変性、創傷治療、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、月経、および胎盤形成を含むがこれらに限定されない。
【０２２０】
（さらなる実施態様）
さらなる実施態様において、本発明は、脈管形成関連疾患の診断および予後の目的のために、試料中のＶＥＧＩポリペプチドの存在を検出するための方法に関する。当該分野で周知の標準的な方法論を用い、診断的アッセイは、表面（すなわち固体支持体）（例えば、マイクロタイトレーションプレートまたは膜（例えば、ニトロセルロース膜））上を、ＶＥＧＩポリペプチドに対して特異的な抗体でコートし、そして脈管形成関連疾患を有すると疑われた人から得られた血清、組織、あるいは他の生物学的または化学的試料とコートされた表面を接触することにより構築され得る。試料中のＶＥＧＩポリペプチドとそれに特異的な抗体との間に形成された生じる複合体の存在は、当該分野において通常の公知の任意の方法（例えば、蛍光抗体分光法または比色法）により検出され得る。この検出方法は、例えば、ガンの診断または予後のために使用され得る。
【０２２１】
別の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩポリペプチドに対する特異的な抗体、および当該分野で周知であり、そして血清、組織、または他の試料中のＶＥＧＩポリペプチドの存在を検出することにおいて使用するために適切である補助的な薬剤を含む診断用キットに関する。意図された組織試料は、サルまたはヒト、あるいは他の動物から得られ得る。
【０２２２】
別の実施態様において、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、ＶＥＧＩポリヌクレオチドの存在または不在を検出することにおいて使用するためのＲＮＡ、ＤＮＡ、または他のヌクレオチド配列に関する。配列番号１、配列番号８、または配列番号２６に示された本発明のＤＮＡ配列は、ＰＣＲの場合においてＶＥＧＩポリヌクレオチド配列に対してか、あるいはＶＥＧＩポリヌクレオチドの存在、不在を検出すること、または標準との比較によりＶＥＧＩポリヌクレオチド量を定量することの目的のためにＶＥＧＩポリペプチドをコードするＲＮＡの逆転写から生成されたＶＥＧＩ  ｃＤＮＡに対して特異的に結合するプライマーを設計するために使用され得る。プライマーは、７〜４０ヌクレオチドの任意の長さの範囲であり得、好ましくは１０〜１５ヌクレオチドで、最も好ましくは１８〜２５ヌクレオチドであり得る。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応のために必要な試薬およびコントロールは、当該分野において周知である。次に、増幅された産物は、ＶＥＧＩポリヌクレオチド配列の存在または不在を例えば、ゲル濾過により、ハイブリダイゼーションの用いるかまたは用いらずに、放射性化学および免疫化学技術により分析され得る。この方法は、少量の試料のみが、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを実行するためのテンプレートＤＮＡの十分な量を生成するために必要とされるので有利である。
【０２２３】
他の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＩポリヌクレオチドに対する特異的なＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲプライマー、および当該分野で周知であり、そしてＶＥＧＩポリヌクレオチドの存在または不在を検出すること、あるいはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを用いて試料中のＶＥＧＩポリペプチドをコードするＲＮＡの量を定量することにおいて使用するために適切である補助的な薬剤を含む診断用キットに関する。意図される試料は、ヒトまたは他の哺乳動物から獲得され得る。
【０２２４】
ＶＥＧＩは、ヒト臍静脈内皮細胞、誘導された内皮細胞、マクロファージ、および黒質組織において発現される。多数の免疫および循環系に関連した障害のために、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現の実質的に改変された（増加されたまたは減少された）レベルは、「標準」のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現レベル、すなわち、免疫系および循環器系障害を有さない個体由来の免疫系組織および循環器系組織、または体液におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現レベルと比較して、このような障害を有する個体から採取された免疫系組織および循環器系組織、あるいは他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）において検出され得る。従って、本発明は、免疫および循環器系障害の診断中に有用である診断方法を提供する。これは、個体由来の免疫および循環器系組織、あるいは他の細胞または体液におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、そして標準のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現レベルと測定された遺伝子発現レベルを比較する工程を含み、これによって、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少は、免疫および循環器系障害の指標である。
【０２２５】
従って、本発明は、免疫および循環器系障害の診断中に有用である診断方法を提供する。これは、個体由来の免疫および循環器系組織、あるいは他の細胞または体液におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、そして標準のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現レベルと測定された遺伝子発現レベルを比較する工程を含み、これによって、標準と比較された遺伝子発現レベルの増加または減少は、免疫および循環器系障害の指標である。
【０２２６】
免疫および循環器系における障害の診断が、従来の方法に従ってすでに成されている場合には、本発明は、予後の指標として有用であり、これによって、抑制されたＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレベルで、この遺伝子を発現する患者と比較して、より悪い治療結果を経験する。
【０２２７】
「ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」ことにより、第１の生物学的試料において直接的にか（例えば、絶対的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを決定することまたは推定することによる）、または相対的に（例えば、第２の生物学的試料におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することによる）、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドのレベル、あるいはＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを定性的にまたは定量的に測定することまたは推定することを意図する。好ましくは、第１の生物学的試料におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを測定するかまたは推定し、そして障害を有さない個体から得られた第２の生物学的試料から取られたか、または免疫系および循環器系の障害を有さない個体の集団からのレベルを平均することにより決定された標準のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較する。当該分野で理解されるように、一旦標準のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが既知となると、それは、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０２２８】
「生物学的試料」によって、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む個体、体液、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られた任意の生物学的試料を意図する。示されたように、生物学的試料は、遊離のＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、免疫および循環器系組織、および完全または成熟ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチド、もしくはＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβレセプターを発現することを見出された他の組織供給源を含む。哺乳動物由来の組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的試料が、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検は好ましい供給源である。
【０２２９】
総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜１５９（１９８７））に記載の一工程グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法のような任意の適切な技術を用いて、生物学的試料から単離され得る。次ぎに、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０２３０】
生物学的試料におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルをアッセイすることは、抗体に基いた技術を用いて行ない得る。例えば、組織におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６〜９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７〜３０９６（１９８７））を用いて研究され得る。ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチド遺伝子の発現を検出するために有用な抗体に基く他の方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイを含む。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素ラベル、およびヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ）のような放射性同位体、およびフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、およびビオチンを含む。
【０２３１】
個体から得られた生物学的試料におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドはまた、画像処理によってインビボで検出され得る。ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドのインビボでの画像処理のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なそれらを含む。Ｘ線撮影のために、適切な標識は、検出可能な放射線を放射するが、被験体に明白には有害でないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、ジュウテリウムのような検出可能な特徴的なスピンを有するマーカーを含み、関連するハイブリドーマのために栄養を標識することにより抗体内に取り込まれ得る。
【０２３２】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透性物質、または核磁性共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像処理部分で標識されたＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験される哺乳動物内（例えば、非経口で、皮下または腹腔内）に導入される。被験体のサイズおよび使用される画像処理システムが、診断的画像処理の作製を必要とする画像処理部分の量を決定することは、当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体のために、注入される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキューリーの99mＴｃの範囲である。次いで、標識化抗体または抗体フラグメントは、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリペプチドを含む細胞の位置で優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像処理は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび共同研究者（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））により記載される。
【０２３３】
上記に記載のように、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβポリヌクレオチドならびにポリペプチドは、異常に高いかまたは低いＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβ活性に関与する状態の診断のために有用である。ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβが発現される細胞および組織、ならびにＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβにより調節される活性が与えられると、標準または「正常」レベルと比較された個体におけるＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβの発現の実質的に改変されたレベル（増加されたかまたは減少された）が、ＶＥＧＩαおよび／またはＶＥＧＩβが発現され、そして／または活性である身体系に関連した病理学的状態を生じることが容易に明白である。
【０２３４】
本発明はまた、動物において、好ましくはヒトにおいて、種々の免疫系および循環器系関連障害の診断または処置のために有用である。このような障害は、細菌、ウイルス、および他の寄生生物による感染症、免疫不全、炎症性疾患、リンパ節腫脹、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、ならびに自己免疫、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免疫、液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制などを含むがこれらに限定されない免疫系および循環器系細胞機能の任意の調節不全を含む。
【０２３５】
ＶＥＧＩポリペプチドが、細胞性ＮＦ−κＢおよびｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を誘導し得るので、これはまた、細菌、ウイルス、および他の寄生生物による感染、免疫不全、炎症性疾患、リンパ節腫脹、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、自己免疫、免疫抑制、炎症性腸疾患、骨髄抑制、および関連する後遺症のような細胞性および免疫系障害を、治療学的に調節することにおいて有用である。
【０２３６】
ＶＥＧＩ−αおよびＶＥＧＩ−βはＴＮＦスーパーファミリーに属するので、それらはまた血管新生を調節し得る。さらに、ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドは免疫細胞の機能を阻害するので、それらは広範な抗炎症活性を有する。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドは、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の浸潤および活性化を刺激するための抗血管新生剤として使用され得る。当業者は、血管増殖が所望されない多くの非ガン性指標を認識する。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよびＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、抵抗性の慢性感染および急性感染（例えば、殺菌性白血球の誘引および活性化を介するミコバクテリア（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）感染）に対する宿主防御を増強するために使用され得る。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患の処置のためのＩＬ−２生合成阻害によって、Ｔ細胞増殖を阻害するために使用され得る。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、細片のクリアランスおよび結合組織の増加性の両方の炎症細胞の補充を介して、創傷治癒を刺激するために使用され得る。これと同じ様式で、ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、肝硬変、変形性関節症、および肺線維症を含む、他の線維症障害を処置するために使用され得る。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、住血吸虫症、旋毛虫症、および回虫症におけるような、組織に侵入する寄生虫の幼虫を殺傷する固有の機能を有する、好酸球の存在を増加させる。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、種々の造血前駆細胞の活性化および分化を調節し、例えば化学療法後、すなわち幹細胞動員において、骨髄から成熟白血球を遊離させることによって、造血を調節するために使用され得る。ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはまた、敗血症を処置するために使用され得る。
【０２３７】
本発明のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドはＴＮＦファミリーのメンバーであるので、このタンパク質の成熟分泌形態は、タンパク質分解切断によってＶＥＧＩを発現する細胞から可溶性形態で放出され得ることもまた、当業者に理解される。従って、ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドの成熟形態または可溶性細胞外ドメインが、外因性供給源から、個体の細胞、組織、または身体に添加される場合、このポリペプチドは、その個体の標的細胞に対して生理学的活性を働かせる。また、この２型膜貫通ポリペプチドを発現する細胞は、個体の細胞、組織、または身体に添加され得、そしてこれらの添加された細胞は、ＶＥＧＩ−αおよび／またはＶＥＧＩ−βについてのレセプターを発現する細胞に結合し、それによってＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドを発現する細胞は、レセプター保有標的細胞に対して作用（例えば、内皮細胞の増殖および調節の調節）を生じ得る。
【０２３８】
従って、個体中のＶＥＧＩ−α活性および／またはＶＥＧＩ−β活性の標準レベルまたは正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系および循環系の障害）は、ＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチド（成熟または細胞外ドメインポリペプチドの形態）の投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＶＥＧＩ−α活性および／またはＶＥＧＩ−β活性のレベルを増加させる必要性のある個体の処置方法を提供し、この方法は、そのような個体中のＶＥＧＩ−α活性レベルおよび／またはＶＥＧＩ−β活性レベルを増大させるのに有効な量の、本発明の単離されたＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチド、特に本発明の成熟形態のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドを含む薬学的組成物を、そのような個体に投与することを含む。
【０２３９】
ＶＥＧＩの細胞接着活性は、創傷治癒のために使用され得る。ＶＥＧＩは、ＶＥＧＩが創傷治癒において役割を果たすという指標である、強い内皮細胞増殖効果を有する。ＶＥＧＩの細胞接着効果はまた、創傷治癒において役割を果たし得る。
【０２４０】
ＶＥＧＩポリペプチドはまた、増殖促進活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）を処置するために使用され得る。上述のように、ＶＥＧＩは、内皮細胞増殖に対して強い増殖効果を有することが示される。従って、ＶＥＧＩはまた、造血および内皮細胞発達を調節するために使用され得る。
【０２４１】
ＶＥＧＩポリペプチドは、Ｔ細胞の活性化を刺激するその能力を介して、免疫応答の重要なメディエーターである。従って、このポリペプチドは、種々の寄生虫性疾患、細菌性疾患、およびウイルス性疾患に対する免疫応答を刺激するために使用され得る。ＶＥＧＩポリペプチドは、ウイルスに感染した細胞を溶解し得、従ってＨＩＶに感染した細胞を制止するために使用され得る。
【０２４２】
ＶＥＧＩポリペプチドはまた、Ｔ細胞増殖性応答を増強させることによって、Ｉ型糖尿病のような自己免疫疾患を処置するために使用され得る。
【０２４３】
【表２】
0004441112.tif 000016
説明：*は、高用量でのみ。「＋」の数は、活性の相対的レベルを示す。「−」は、試験された濃度範囲で、活性が検出されなかったことを示す。
【０２４４】
ＶＥＧＩは、内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞）の増殖を阻害するために使用され得る。１０μｇ／ｍｌまでの濃度にて、ＶＥＧＩは、内皮細胞の増殖をほぼ完全に阻害し得るが、ヒト乳ガン細胞の増殖に対して明らかな効果を有さない。結果として、ＶＥＧＩは、内皮細胞増殖の阻害が有利である疾患および障害を処置するために使用され得る。
【０２４５】
本発明のＶＥＧＩポリペプチドは、インビトロにて内皮細胞によって形成される毛細管様管状構造体の形成を低減するために使用されている。本発明のＶＥＧＩポリペプチドは、ＦＧＦ−２のような血管形成因子に応答して、毛細管様管状構造体へと組織化された内皮細胞の形成を阻害するために使用され得る。さらに、本発明の単離されたＶＥＧＩはまた、改変されたニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）中の毛細血管への内皮細胞の増殖および組織化を阻害するために使用され得る。結果として、本発明のＶＥＧＩは、インビトロでの内皮細胞からの毛細管または毛細管様構造体の形成を阻害するために使用され得る。
【０２４６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。
【０２４７】
本発明は、ＶＥＧＩについてのレセプターの同定のための方法を提供する。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．１（２）、第５章（１９９１））によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここでポリアデニル化ＲＮＡを、ＶＥＧＩ応答性細胞から調製し、そしてこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをプールに分け、そしてＣＯＳ細胞またはＶＥＧＩに対して応答性ではない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。スライドガラス上で増殖させた、トランスフェクトした細胞を、標識したＶＥＧＩに曝露する。ＶＥＧＩは、組織特異的プロテインキナーゼについての認識部位のヨウ素化または包含を含む種々の手段によって標識され得る。固定およびインキュベーションの後に、このスライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性プールを同定し、そしてサブプールを調製し、反復サブプールおよび再スクリーニングプロセスを使用して再トランスフェクトし、推定レセプターをコードする単一クローンを最終的に生じる。
【０２４８】
レセプター同定のための別のアプローチとして、標識したＶＥＧＩを、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合させ得る。架橋した物質を、ＰＡＧＥで分離し、そしてＸ線フィルムに曝露する。ＶＥＧＩレセプターを含む標識された複合体を、切り出し、ペプチドフラグメントに分離し、そしてタンパク質微量配列決定に供し得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するために使用し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０２４９】
ＶＥＧＩポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床的状態（特に、ＶＥＧＩポリペプチド単独での処置の副作用）、ＶＥＧＩポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および専門医に公知の他の因子を考慮して、優良医薬品製造基準と一致する様式で処方および投与する。従って、本明細書中の目的のためのＶＥＧＩポリペプチドの「有効量」は、そのような考慮によって決定される。
【０２５０】
アンタゴニストは、例えば本明細書中以後に記載されるような薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物中で使用され得る。
【０２５１】
本発明のＶＥＧＩポリペプチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療的に有効な量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。この処方物は、投与様式に適合すべきである。
【０２５２】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって定められた形態での注意書（この注意書は、ヒト投与についての製造、使用、または販売の機関による認可を反映している）が、そのような容器に付随し得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、他の治療用組成物と組み合わせて使用され得る。
【０２５３】
この薬学的組成物は、例えば、局部経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻腔内経路、または皮内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症の処置および／または予防のために有効である量で投与される。一般には、それらは、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合において、それらは、１日あたり約８ｍｇ／Ｋｇ体重を越えない量で投与される。ほとんどの場合において、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２５４】
種々の送達系が公知であり、そして本発明のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドを投与するために使用され得る（例えば、リポソーム、微粒子、微小カプセル中へのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと））。導入の方法は、局所経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、眼経路、および経口経路を含むがこれらに限定されない。この化合物は、任意の簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮内層または皮膚粘膜内層（例えば、口内粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を介する吸収によって投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。
【０２５５】
特定の実施態様において、本発明の薬学的組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましくあり得る。このことは、例えば手術中の局所的注入によって、局部適用（例えば、創傷包帯と組み合わせて）によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または移植片によって達成され得るが、これらに限定されない。ここで上記移植片は、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維のような膜を含む、多孔性物質、非多孔性物質、またはゼラチン性物質である。
【０２５６】
本明細書中で議論される眼の障害のうちの少なくともいくつかの処置のための、本発明のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドの局所適用は、以下のような眼科学的に受容可能な賦形剤中の有効量の本発明のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドからなる：緩衝化生理食塩水、鉱油、植物油（例えば、コーン油または落花生油など）、ワセリンゼリー、Ｍｉｇｌｙｏｌ  １８２、アルコール溶液、またはリポソームもしくはリポソーム（ｉｐｏｓｏｍｅ）様製品。任意のこれらの組成物はまた、本発明のＶＥＧＩ−αポリペプチドおよび／またはＶＥＧＩ−βポリペプチドに対して有害な効果を発揮しない保存剤、抗酸化薬、抗生物質、免疫抑制剤、および他の生物学的または薬学的に有効な薬剤を含み得る。
【０２５７】
ＶＥＧＩポリペプチド、ならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現（これは、頻繁に「遺伝子治療」と呼ばれる）によって、本発明に従って使用され得る。
【０２５８】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供され得る。そのような方法は、当該分野において周知であり、そして本明細書中の教示から明らかである。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用によって操作され得る。
【０２５９】
同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボでポリペプチドを発現するために、インビボにおいて操作され得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作すること、およびインビボでポリペプチドを発現することのために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から、当業者に明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えば適切な送達ビヒクルとの組み合わせ後にインビボで細胞を操作するために使用され得るアデノウイルスであり得る。
【０２６０】
本明細書中上述のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーヴェイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺ガンウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来である。
【０２６１】
このベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；ならびにＭｉｌｌｅｒおよび共同研究者によって記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０〜９９０（１９８９））、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびｂ−アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない、真核生物細胞プロモーターのような細胞性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルス性プロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９プロウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
【０２６２】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター）、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルス性チミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中上記の改変されたレトロウイルスＬＴＲを含む）；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御するネイティブのプロモーターであり得る。
【０２６３】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞株の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４（１９９０）、これは、その全体が本明細書中において参考として援用される）に記載されるような、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｂ−２、ｂ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＣＲＥ、β−ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段を介して、パッケージ細胞に形質導入され得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替法として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中に封入され得るか、または脂質と結合され、次に宿主に投与され得る。
【０２６４】
プロデューサー細胞株は、感染性レトロウイルスベクター粒子を生成し、これは、所望のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。このようなレトロウイルスベクター粒子は，次にインビトロまたはインビボのいずれかにおいて、真核生物細胞を形質導入するために、使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６５】
本発明はまた、化合物をスクリーニングしてＶＥＧＩを模倣する化合物（アゴニスト）、またはＶＥＧＩの効果を妨げる化合物（アンタゴニスト）を同定する方法に関連する。そのような方法の例は、コマイトジェンＣｏｎＡの存在下でヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激するＶＥＧＩポリペプチドの能力を利用する。内皮細胞を得て、そして２ｇ／ｍｌのＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下で、１０％熱非働化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１％  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１％ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＲＰＭ１  １６４０中で、９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、およびスクリーニングされるべき化合物を、０．２ｍｌの最終容量まで添加する。３７℃にて６０時間後、培養物を、１Ｃｉの［3Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＢＧｑ；ＮＥＮ）で１２〜１８時間パルスし、そしてガラスファイバーフィルター（ＰｈＤ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）に収集する。三連培養物の平均［3Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて決定する。有意な［3Ｈ］チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
【０２６６】
あるいは、ＶＥＧＩポリペプチドとレセプターとの相互作用の後の、公知のセカンドメッセンジャー系の応答を、化合物の存在または非存在下で測定および比較する。そのようなセカンドメッセンジャー系は、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解を含むが、これらに限定されない。
【０２６７】
アンタゴニストをアッセイするために、上記のアッセイを行うが、このアッセイにおいて、ＶＥＧＩはスクリーニングされるべき化合物とともに添加され、そしてＶＥＧＩポリペプチドの存在下で［3Ｈ］チミジン取り込みを阻害するその化合物の能力は、その化合物がＶＥＧＩに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＶＥＧＩアンタゴニストは、ＶＥＧＩおよび潜在的なアンタゴニストを、競合阻害アッセイに適切な条件下で膜結合ＶＥＧＩレセプターまたは組換えレセプターと組み合わせることによって検出され得る。ＶＥＧＩは、レセプターに結合したＶＥＧＩ分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を決定し得るように、例えば放射能によって標識され得る。
【０２６８】
あるいは、ＶＥＧＩレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、その化合物の存在下で、標識されたＶＥＧＩとともにインキュベートされる。次いで、この相互作用を増強またはブロックするその化合物の能力が測定され得る。
【０２６９】
本実施態様の別の局面において、本発明は、ＶＥＧＩポリペプチドに特異的に結合するレセプタータンパク質（例えば、ＤＲ３）または他のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、膜またはその調製物のような細胞区画は、ＶＥＧＩポリペプチドに結合する分子を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、標識されたＶＥＧＩポリペプチドとともにインキュベートされ、そしてレセプターまたは他の結合タンパク質に結合したＶＥＧＩポリペプチドの複合体は、当該分野において公知の慣用的方法によって単離および特徴付けされる。あるいは、ＶＥＧＩポリペプチドは、細胞から可溶化された結合分子がカラムに結合し、次いで溶出され、慣用的方法によって特徴づけされ得るように、固体支持体に結合され得る。
【０２７０】
アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、膜またはその調製物のような細胞区画は、ＶＥＧＩを結合する分子（例えば、ＶＥＧＩによって調整されるシグナル伝達または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、ＶＥＧＩアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で、標識されたＶＥＧＩポリペプチドとともにインキュベートされる。この結合分子に結合するこの候補化合物の能力は、標識されたリガンドの減少した結合に反映される。無償に（すなわち、ＶＥＧＩ結合分子を結合することに対してＶＥＧＩの効果を誘導することなしに）結合する分子は、良好なアンタゴニストである可能性が最も高い。十分に結合し、そしてＶＥＧＩと同じまたはＶＥＧＩに非常に関連する効果を誘発する分子が、アゴニストである。
【０２７１】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのＶＥＧＩ様効果は、例えば、候補化合物と細胞または適切な細胞調製物との相互作用後のセカンドメッセンジャー系の活性を決定すること、およびその効果と、ＶＥＧＩまたはＶＥＧＩと同じ効果を誘発する分子の効果とを比較することによって測定され得る。このことについて有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセンジャー系を含むがこれらに限定されない。
【０２７２】
ＶＥＧＩアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、ＶＥＧＩポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストを、膜結合ＶＥＧＩレセプター分子または組換えＶＥＧＩレセプター分子と、競合阻害アッセイに適切な条件下で組み合わせる競合アッセイである。ＶＥＧＩポリペプチドは、レセプター分子に結合したＶＥＧＩ分子の数を正確に決定し、潜在的アンタゴニストの有効性を評価し得るように、例えば放射能によって標識され得る。
【０２７３】
潜在的なアンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害するか、または消す有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体が挙げられる。潜在的なアンタゴニストはまた、ＶＥＧＩ誘導活性を誘導することなく結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位を結合し、それによってＶＥＧＩが結合するのを排除することによってＶＥＧＩの作用を妨害する密接に関連したタンパク質または抗体のような、有機低分子、ペプチド、ポリペプチドであり得る。
【０２７４】
他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して、または三重らせん形成を介して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、多くの研究において議論されている（例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９８））。三重らせん形成も同様に、多くの研究において議論されている（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１））。これらの方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり、それによってＶＥＧＩの転写および産生を妨害するように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＩポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現され、ＶＥＧＩポリペプチドの産生を阻害し得るように、細胞に送達され得る。
【０２７５】
ＶＥＧＩポリペプチドに特異的な抗体は、ＶＥＧＩに結合し、そしてＶＥＧＩがＶＥＧＩレセプターに結合するのを妨げることによって、アンタゴニストとして使用され得る。このことについて、モノクローナル抗体は特に有効である。しかし、ＶＥＧＩレセプターに特異的な抗体は、ＶＥＧＩレセプターとの相互作用の際にＶＥＧＩの効果をアゴナイズする傾向のある、異なる細胞応答を媒介し得る。
【０２７６】
潜在的なＶＥＧＩアンタゴニストはまた、ＶＥＧＩレセプターに結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発せず、レセプターをその天然のリガンドから有効にブロックするＶＥＧＩ変異体を含む。特別に設計されたオリゴヌクレオチドおよび低分子もまた、ＶＥＧＩレセプター（例えば、ＤＲ３）に結合し、そしてＶＥＧＩレセプターをＶＥＧＩからブロックし得る。低分子の例は、低分子ペプチドまたはペプチド様分子を含むがこれらに限定されない。
【０２７７】
別の潜在的なＶＥＧＩアンタゴニストは、ＶＥＧＩに結合し、そしてＶＥＧＩが膜結合ＶＥＧＩレセプターと相互作用するのを妨げるＶＥＧＩレセプターの可溶性形態である。この方法において、このレセプターは、ＶＥＧＩによって刺激されない。
【０２７８】
別の潜在的なＶＥＧＩアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御し得る。この方法の両方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であり（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによってＶＥＧＩの転写および産生を妨害するように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＩポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現され、ＶＥＧＩの産生を阻害し得るように、細胞に送達され得る。
【０２７９】
ＶＥＧＩアンタゴニストはまた、ＶＥＧＩによって抑制されるリポタンパク質リパーゼの全身性欠損から生じる脂質クリアランス欠損である悪液質を処置するために使用され得る。ＶＥＧＩアンタゴニストはまた、ＶＥＧＩが病原性の役割を果たすようである大脳マラリアを処置するために使用される。
【０２８０】
ＶＥＧＩアンタゴニストはまた、ＶＥＧＩによって移植片の存在下での免疫系の刺激を予防することによって、移植片拒絶を予防するために使用され得る。
【０２８１】
ＶＥＧＩアンタゴニストはまた、骨粗しょう症を処置するために使用され得る。なぜなら、ＶＥＧＩは骨吸収を誘導し得るからである。
【０２８２】
ＶＥＧＩに対するアンタゴニストはまた、抗炎症剤として使用され得る。なぜなら、ＶＥＧＩは、炎症性応答の増強を媒介するからである。
【０２８３】
このアンタゴニストはまた、敗血症性ショックとも呼ばれる内毒素性ショックを処置するために使用され得る。この臨床的状態は、細菌または他の型の感染に対する応答のし過ぎから生じる。この応答は、ショックおよび組織傷害を引き起こす、ＶＥＧＩのレベルの上昇を導く。
【０２８４】
本発明はまた、種々の組織中のＶＥＧＩポリペプチドのレベルの変化を検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常なコントロール組織サンプルと比較して過剰なこのタンパク質の発現は、疾患の存在または疾患（例えば、大脳マラリア）に対する感受性を検出し得るからである。宿主由来のサンプル中のＶＥＧＩポリペプチドのレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドウィッチ」アッセイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１（２）、第６章（１９９１））は、最初に、ＶＥＧＩ抗原に対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター抗体に、放射能、蛍光、または本実施例において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬が結合される。サンプルは、宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質に結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ＢＳＡのような非特異的タンパク質とともにインキュベートすることによって、このディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位が覆われる。次に、モノクローナル抗体がこのディッシュ上でインキュベートされ、この間にこのモノクローナル抗体はこのポリスチレンディッシュに付着した任意のＶＥＧＩポリペプチドに結合する。すべての結合していないモノクローナル抗体は、緩衝液で洗浄されて除かれる。ここで、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体がこのディッシュ上に置かれ、ＶＥＧＩに結合した任意のモノクローナル抗体へのこのレポーター抗体の結合が生じる。次いで、結合していないレポーター抗体が、洗浄されて除かれる。次いで、ペルオキシダーゼ基質がこのディッシュに添加される。所定の時間内に発色した色の量は、標準曲線と比較される場合、所定の容量の患者サンプル中に存在するＶＥＧＩポリペプチドの量の尺度である。
【０２８５】
競合アッセイが使用され得、ここでＶＥＧＩポリペプチドに特異的な抗体は固体支持体に結合され、そして標識されたＶＥＧＩおよび宿主由来のサンプルがその固体支持体に通され、そして例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出された標識の量が、このサンプル中のＶＥＧＩの量と相関付けされ得る。
【０２８６】
「サンドウィッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンドウィッチ」アッセイにおいて、ＶＥＧＩは固体支持体に通され、そして固体支持体に結合した抗体に結合する。次いで、第２の抗体がＶＥＧＩに結合する。次いで、標識され、そしてこの第２の抗体に特異的である第３の抗体がこの固体支持体に通され、そして第２の抗体に結合し、次いで量が定量され得る。
【０２８７】
本発明の配列はまた、染色体同定のために価値がある。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定するための必要性が存在する。現在のところ、染色体位置をマーキングするのに利用可能な実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬はほとんどない。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を疾患と関連する遺伝子と相関付けする際に重要な第１の工程である。
【０２８８】
手短には、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、配列が染色体にマッピングされ得る。配列の３’非翻訳領域のコンピューター分析が使用されて、ゲノムＤＮＡ中の１つより多いエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って増幅プロセスを複雑にする。次いで、これらのプライマーが、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含む体細胞ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを生じる。
【０２８９】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを指定するための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーと本発明を使用して、特定の染色体のフラグメントまたは大きなゲノムクローンのプール由来のパネルを類似の様式で用いて、準位置付けが達成され得る。染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピング方策は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフローソート染色体での予備スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。
【０２９０】
中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、一工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０塩基程度の短いｃＤＮＡとともに用いられ得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０２９１】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ．  ＭｃＫｕｓｉｃｋ，  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）によって同定される。
【０２９２】
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原因因子である可能性が高い。
【０２９３】
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度で、疾患と関連する染色体領域に正確に位置付けされたｃＤＮＡは、５０〜５００の間の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度、および２０ｋｂあたり１遺伝子を想定する）。
【０２９４】
上記の技術を利用して、ＶＥＧＩの染色体位置は９ｑ３２であると、非常に高い確実性をもって決定された。これまでの染色体マッピング研究は、第９染色体のこの領域中の遺伝子座にしていくつかの発生欠損を連鎖付けた。
【０２９５】
（実施例）
本発明の実施例を以下に記載するが、この実施例は、例示の目的のためのみで提供され、そして本発明の範囲を限定する意図はない。この開示を考慮して、本請求の範囲内の多くの実施態様が当業者に明らかである。
【０２９６】
本発明はさらに、以下の実施例に関して記載されるが；本発明がそのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。他に特定しない限り、すべての部または量は、重量による。
【０２９７】
以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に使用される方法および／または用語を記載する。
【０２９８】
「プラスミド」は、小文字の場合のｐの前および／または後の大文字および／または数によって命名される。本明細書中の出発プラスミドは、他に述べられない限り、市販されているか、制限されないベースに基づいて公に利用可能であるか、または公開された手順に従って利用可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野において公知であり、そして当業者に明らかである。
【０２９９】
ＤＮＡの「消化」とは、そのＤＮＡ中の特定の配列にのみ作用する制限酵素でのそのＤＮＡの触媒性切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の要件は、当業者に公知である通りに使用された。分析の目的のために、代表的には、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｌの緩衝溶液中、約２単位の酵素とともに使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡを、より大きな容量中の２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のために適切な緩衝液および基質の量は、製造業者によって特定される。通常、３７℃にて約１時間のインキュベーション時間を使用するが、供給業者の指示書に従って変化させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。
【０３００】
切断されたフラグメントのサイズ分離を、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）によって記載される８パーセントのポリアクリルアミドゲルを使用して行う。
【０３０１】
「オリゴヌクレオチド」とは、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、そのためキナーゼの存在下でＡＴＰを有するリン酸を添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０３０２】
「連結」とは、２つの二本鎖核酸フラグメント間でホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、同書、第１４６頁）。他に提供しない限り、連結は、０．５μｇのほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメントあたり１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を使用して達成され得る。
【０３０３】
他に述べない限り、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６〜４５７（１９７３）の方法において記載されるように、形質転換を行った。
【０３０４】
（実施例１：ＶＥＧＩポリペプチドの細菌発現および精製）
推定全長ＶＥＧＩ−αポリペプチドのＮ末端配列から３８アミノ酸欠失をコードするポリヌクレオチド挿入物を含む発現ベクターを構築した。Ｎ末端を欠失するＶＥＧＩ−αポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を、ＶＥＧＩ−αコード配列のコード配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を生成するさらなるヌクレオチドを、それぞれ３’配列および５’配列に付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮｃｏＩ制限部位、続いて１８ヌクレオチドのコード配列を含有する、５’−ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴ−３’（配列番号３）を有した。３’プライマーは、ＨｎｄＩＩＩ制限部位、続いて、コード配列の最後の１５ヌクレオチドおよび終止コドンに相補的な１８ヌクレオチドを含有する、配列５’−ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＴＣＣ−３’（配列番号４）を有する。増幅したＶＥＧＩ−α  ＤＮＡ構築物を、適切な制限酵素での消化および続く連結後にベクターｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングした。この連結混合物で、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５／ｒｅｐ４株）を形質転換した。所望の構築物を含むクローンを、０．４〜０．６の６００ｎｍでの光学密度にまで増殖した。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、最終濃度１ｍＭで添加して、タンパク質の発現を誘導した。３時間後、細胞を採取し、封入体を破壊した細胞から精製し、そしてタンパク質を封入体から８Ｍ尿素で可溶化した。可溶化したタンパク質を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でＰＤ−１０カラムを通過させ、それにより尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再折り畳みさせた。このタンパク質を、さらなるクロマトグラフィー工程により精製して、エンドトキシンを除去した。得られるＶＥＧＩ−αポリペプチド調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で９０％を超えて純粋であることが見い出され、そして＜１０ＥＵエンドトキシン／ｍｇを含んだ。
【０３０５】
さらに、全長ＶＥＧＩ−α  ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列であるＡＴＣＣ受託番号７５９２７を、最初に、ＶＥＧＩ−αタンパク質の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。ＶＥＧＩ−αに対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’配列に付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは配列番号１３として示され、そして配列５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  Ｃ−３’を有し、これは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いてＶＥＧＩ−αコード配列の開始メチオニンコドンから始まる最初の２４ヌクレオチドを含む。３’配列５’−ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ−３’（配列番号１４）は、ＸｂａＩ部位およびＶＥＧＩ−αの２２ヌクレオチドに相補的な配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）における制限酵素部位に対応する。次いで、ｐＱＥ−９を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。増幅した配列を、ｐＱＥ−９に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列にインフレームに挿入した。次いで、連結混合物を用いて、Ｑｉａｇｅｎから商標Ｍ１５／ｒｅｐ４として入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される手順によって形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまた、カナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。形質転換体を、それらが、ＬＢプレート上で増殖する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認した。所望の構築物を含むクローンを、一晩（Ｏ／Ｎ）、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養において増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種した。この細胞を、０．４〜０．６の間の光学密度６００（「Ｏ．Ｄ．600」）にまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を１ｍＭの最終濃度で添加した。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活化し、Ｐ／Ｏを解除することによって誘発し、遺伝子発現の増加をもたらす。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離によって採取した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６ＭグアニジンＨＣｌ（２．５Ｍ以上のグアニジンＨＣｌ濃度は、より高いレベルの純度の組換えタンパク質の回収をもたらすことが経験的に見い出されている）中で可溶化した。明澄化後、可溶化したＶＥＧＩ−αポリペプチドを、この溶液からニッケルキレートカラム上で、６−Ｈｉｓタグを含むタンパク質によって強固な結合が可能となる条件下でクロマトグラフィーによって精製した（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７−１８��（１９８４））。ＶＥＧＩ−αポリペプチドをさらに、ニッケルキレートカラム上の２回目の実行により精製した。ＶＥＧＩ−αポリペプチド（９０％純粋）を、６Ｍ  グアニジンＨＣｌ  ｐＨ５．０中でそのカラムから溶出し、そして再生の目的のために、ＰＢＳ緩衝液中で透析した。この発現産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動した。
【０３０６】
当業者は、ｐＱＥ−９以外の細菌発現ベクターもまた、ＶＥＧＩポリペプチドの発現に使用され得ることを認識する。１つのそのような好ましい細菌発現ベクターは、ｐＨＥ４−５である。ｐＨＥ４−５は、ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３プラスミドＤＮＡ（この構築物は、無関係のＯＲＦをコードする無関係の挿入物を含む）として得られ得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３プラスミドを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Ｐａｒｋ  Ｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に１９９７年９月３０日に寄託した（受託番号２０９３１１）。無関係ＭＰＩＦ  ＯＲＦ挿入物に隣接するＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８制限部位を用いて、当業者は、現在の分子生物学的技術を容易に用いて、ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３プラスミドにおける無関係ＯＲＦを、本発明のＶＥＧＩ  ＯＲＦまたはその改変体と置換し得る。
【０３０７】
（実施例２：バキュロウイルス発現系を使用するＶＥＧＩポリペプチドのクローニングおよび発現）
全長ＶＥＧＩ−αポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号７５９２７）を、その遺伝子の５’および３’の配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した：５’プライマーは、以下の配列
【０３０８】
【化１４】
0004441112.tif 000017
（配列番号１５）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、続いて２４ヌクレオチドのＶＥＧＩ−αコード配列（「ＡＴＧ」翻訳開始コドンに下線を付す）を含む。３’プライマーは、配列５’−ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ−３’（配列番号１６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩについての切断部位およびＶＥＧＩ−αコード配列の３’非翻訳配列に相補的な２２ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、１％アガロースゲルから、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を用いて単離した。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と命名した。
【０３０９】
ベクターｐＡ２（ｐＶＬ９４１ベクターの改変体、以下に議論する）を、バキュロウイルス発現系（概説については、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、１９８７、Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＮＯ．１５５５を参照のこと）を使用してＶＥＧＩ-αポリペプチドの発現のために使用した。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面体病ウイルスの強力なポリヘドリンプロモーター（ＡｃＭＮＰＶ）に続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩについての認識部位を含む。シミアンウイルスＳＶ４０のポリアデニル化部位は、効率よいポリアデニル化のために使用される。簡単な組換えウイルスの選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向に、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入した。このポリヘドリン配列を、同時トランスフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列の両側に隣接させた。多くの他のバキュロウイルスベクターがｐＡ２の代わりに用いられている可能性がある（例えば、ｐＲＧ１、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１）（Ｌｕｃｋｏｗ、Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１−３９）。
【０３１０】
このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ２」と称する。
【０３１１】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を、連結混合物で形質転換した。このクローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０３１２】
５μｇのプラスミドｐＢａｃ  ＶＥＧＩ−αを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７  （１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ」，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトした。
【０３１３】
１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａ  ＶＥＧＩ−αを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下した。このプレートを前後に揺らして新たに添加した溶液を混合した。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後に、このトランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。このプレートをインキュベータに戻して、培養を、２７℃で４日間継続した。
【０３１４】
４日後、その上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって本質的に記載されるようにプラークアッセイを行った。改変法として「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いた。これは、青色染色されたプラークの簡単な単離を可能にする。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、によって配布されるＴｈｅ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｏｌｏｇｙ（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０３１５】
連続希釈の４日後、そのウイルスをその細胞に添加し、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。この寒天を、短い遠心分離によって除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞に感染させた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で保存した。
【０３１６】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させた。細胞に、２の感染多重度（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−ＶＥＧＩ−αを感染させた。６時間後にその培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００  ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間後に、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集した。標識したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０３１７】
（実施例３：哺乳動物細胞における組換えＶＥＧＩ−αの発現）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性（ＤＨＦＲ−）細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。ＶＥＧＩ−α  ｃＤＮＡのｐＣＩチャイニーズハムスター卵巣細胞発現ベクターへのクローニングは、本質的に以下のとおりに行った。全長ＶＥＧＩ−αポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡ配列を、ＶＥＧＩ−αコード配列の５’末端および３’末端に特異的なプライマーを用いて増幅した（５’プライマー：ＧＣＧ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  Ｃ（配列番号５）、これは、ＢａｍＨＩ制限部位、続いて「Ｋｏｚａｋ」配列（上記の小文字）、およびＩＬ６コード配列の最初の８４塩基およびＶＥＧＩ−αコード配列の１３塩基を含む；３’プライマーは：ＣＧＣ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡ（配列番号６）、これは、ＢａｎＨＩ制限部位、続いて非翻訳領域の１７ヌクレオチドおよび終止コドンを含む。増幅したフラグメントを、ゲル精製し、そしてＢａｎＨＩで消化した。ＣＨＯ細胞発現ベクター（ｐＣＩ）をＢａｍＨＩで消化し、続いてアガロースゲル精製した。増幅したＶＥＧＩ−αコード配列を、精製したｐＣＩベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。続いて、ＨＢ１０１細胞を形質転換した。陽性クローン（ｐＣＩ  ＶＥＧＩ）をＰＣＲスクリーニング／酵素消化によって同定し、そして挿入物のＤＮＡ配列を自動化ＤＮＡ配列決定を用いて確認した。安定なＣＨＯ細胞クローンの選択および増幅を、Ｒ．Ｇｅｎｔｚら、Ｅｕｒ．ＬＴ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１０．５４５（１９９２）に以前に記載されるように実施した。ＣＨＯ安定トランスフェクタントＣＨＯ−ＶＥＧＩ−αおよびＣＨＯ−ベクターを、１０％ＦＣＳ（透析した）を含むＭＥＭ−ａ培地中で維持した。
【０３１８】
プラスミドＶＥＧＩ−α−ＨＡの発現は、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導される。このベクターは以下を含む：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ＣＭＶプロモーターに続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位。ＶＥＧＩ−α前駆体全体およびその３’末端にインフレームに融合した血液凝集素（ＨＡ）タグをコードするＤＮＡフラグメントをそのベクターのポリリンカー領域にクローニングした。従って、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの指揮下にある。ＨＡタグは、以前に記載されるようなインフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、ＭＣｏｎｎｏｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）。ＨＡタグの本発明者らの標的タンパク質への融合によって、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いて組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。
【０３１９】
このプラスミド構築戦略は以下に記載されるとおりである：ＶＥＧＩ−αをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ番号７５９２７を、元のＥＳＴクローンに対して２つの以下のプライマーを用いてＰＣＲにより構築した：５’プライマー（配列番号１５）は、ＢａｍＨＩ部位、続いて開始コドンから始まるＶＥＧＩ−αコード配列の２４ヌクレオチドを含み；３’配列５’−ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧ−３’（配列番号１７）は、ＸｂａＩ部位、翻訳終止コドン、ＨＡタグおよびＶＥＧＩ−αコード配列の最後の１８ヌクレオチド（終止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。従って、このＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ部位、ＶＥＧＩ−αコード配列、続いてインフレーム融合されたＨＡタグ、ＨＡタグの隣の翻訳終結終止コドン、およびＸｂａＩ部位を含んだ。ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、そしてともに連結した。連結混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０９９  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７）を形質転換した。この形質転換した培養物をアンピシリン培地プレートにプレートし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの存在について制限分析によって試験した。組換えＶＥＧＩ−αポリペプチドの発現について、ＣＯＳ細胞に、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法によって発現ベクターをトランスフェクトした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。ＶＥＧＩ−α−ＨＡタンパク質の発現を、放射標識方法および免疫沈降方法によって検出した（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、［35Ｓ］−Ｓ−システインを用いて８時間標識した。次いで、培養培地を収集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５；Ｗｉｌｓｏｎ、Ｉ．ら、前出３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体とともに沈降させた。次いで、沈降したタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０３２０】
（実施例４：種々の細胞および細胞型におけるＶＥＧＩの発現パターン）
ＲＮＡブロット分析を実施して、ヒト組織におけるＶＥＧＩ発現レベルを検査した。総細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌTMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．  ６０２３  Ｓｏｕｔｈ  Ｌｏｏｐ  Ｅａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ  ７７０３３）で単離した。特定された各ヒト組織から単離した約２μｇの総ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒド上で分離し、そしてナイロンフィルター上へブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。標識反応を、５０ｎｇの  ＶＥＧＩ−α  ｃＤＮＡを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行って、［32Ｐ］標識ＶＥＧＩ−α  ｃＤＮＡを生成した。標識したＤＮＡを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラム（５  Ｐｒｉｍｅ  −３  Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．，５６０３  Ａｒａｐａｈｏｅ  Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ  ＣＯ  ８０３０３）で精製した。次いで、このフィルターを放射性標識全長ＶＥＧＩ−αプローブと、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌで、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．４および７％  ＳＤＳ中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。次いで、０．５％×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて室温で２回洗浄し、そして６０℃で２回洗浄した後、Ｘ線フィルムを、そのブロットに増感スクリーンを用いて−７０℃で一晩曝露させた。ＶＥＧＩ−αのメッセンジャーＲＮＡは、腎臓において豊富である。
【０３２１】
ＶＥＧＩは、種々の系統の培養細胞の２２の異なる型からの総ＲＮＡ調製物のノーザンブロット分析によって確認されるように、内皮細胞において特異的に発現される（図１Ａ）。ＶＥＧＩのメッセンジャーは、２つの型の内皮細胞の初代培養においてのみ検出された：早期の継代のＨＵＶＥ細胞およびヒト静脈細胞。このｍＲＮＡは、後期の継代のヒト静脈内皮細胞においては検出されず、ヒト動脈細胞においても検出されなかった。顕著に対照的に、ＴＮＦファミリーメンバーは、免疫細胞において最も発現される（Ｂ．Ｂ．ＡｇｇａｒｗａｌおよびＫ．Ｎａｔａｒａｊａｎ、前出）。例えば、ＴＮＦ−αは、マクロファージ、単球、好中球およびＴ細胞によって産生されるが、ＴＮＦ−βは、マイトジェン刺激Ｔリンパ球および白血球によって優勢に発現される。同様に、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０および４−１ＢＢに対するリガンドはすべて、免疫系における細胞型において発現される。
【０３２２】
多重組織ノーザンブロットを用いると、ＶＥＧＩ転写物は、胎盤、肺、腎臓、骨格筋、膵臓、脾臓、前立腺、小腸および結腸において発現された。最小限量のＶＥＧＩシグナルは、心臓、脳、肝臓、胸腺、精巣、卵巣および末梢血リンパ球（図１Ｂ）において検出された。ほとんどの主要な器官におけるＶＥＧＩの発現によって、この遺伝子産物が、正常血管系の機能において役割を果たし得ることが示唆された。
【０３２３】
ノーザンブロット分析もまた行って、ＨＵＶＥＣ細胞培養物の増殖状態に関して、ＶＥＧＩ  ＲＮＡの相対発現レベルを決定した。これらの実験において、ＨＵＶＥＣ細胞から単離した当量の総ＲＮＡ（１５μｇ）を、上記に記載のように電気泳動的に分離し、そしてブロットした。ＲＮＡを、播種後１日後、２日後、３日後、４日後、６日後、および７日後の培養物から単離した。ＶＥＧＩ  ＲＮＡは、新たに播種した培養物において低レベルで見られたのみであった（１日目、２日目および３日目）。しかし、ＶＥＧＩ  ＲＮＡの発現は、培養物中のＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達し始める（４日目、６日目、および７日目）と明白になった。これらの実験によって、ＶＥＧＩ発現は、培養物または組織中の細胞が増殖しないかまたは増殖が減少した静止状態に達し始めると増加することを示唆する。
【０３２４】
（実施例５：ＡＢＡＥ細胞増殖のＶＥＧＩ媒介性阻害）
細胞を、適切な密度（ＡＢＡＥ細胞、８，０００細胞／ウェル：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、２０００細胞／ウェル；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、２，０００細胞／ウェルを、３連で２４ウェルプレート中）で播種した。この培養培地は、ＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＦＣＳを含んだ。ＦＧＦ−２（１ｎｇ／ｍｌ）は、ＡＢＡＥ細胞のための培養培地に存在した。この培養物を３７℃、５％ＣＯ2で６日間維持した。この細胞をトリプシン処理し、そして細胞数をＣｏｕｌｔｅｒ計数機を用いて決定した。回収したＡＢＡＥ細胞の総数の５分の１を使用して、ガン細胞との比較を正規化した。
【０３２５】
残基３８−１７４からなる推定細胞外ドメインに対応する短縮型のＶＥＧＩ−αを、上記に記載のようにＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、精製し、そして種々の細胞アッセイにおいて試験した。短縮型ポリペプチドは、内皮細胞の増殖を特異的に阻害することが見い出された（図２）。生体ウシ動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の殆ど完全な増殖阻害が１０ｍｇ／ｍｌで達成された。ここで、半数最大阻害濃度値（ＩＣ  ５０）は約１ｍｇ／ｍｌ（約７０ｎＭ）であった。組換えポリペプチドの活性は、アンギオスタチン、エンドスタチンおよび血小板因子４のものに匹敵する。対照的に、このポリペプチドは、類似の実験条件下ではヒト乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５）の増殖を阻害しなかった。ＶＥＧＩ−α欠失変異体もまた、ヒトＴ細胞白血病細胞（ｊｕｒｋａｔ）、ヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）、ヒト単球白血病細胞（ＴＨＰ−１）、またはヒト前骨髄細胞白血病細胞（ＨＬ６０）の増殖に対しては殆ど効果がないことが見い出された。この変異体は、異なるレセプターに結合するようである。なぜなら、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ３、およびＤＲ４を含む、試験したＴＮＦレセプタースーパーファミリーのいかなるメンバーとも相互作用が認められなかったからである（Ｇ．Ｊ．Ｍａｚｚｅｉら、（１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７２０５）。いくつかのＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドを含む）が、膜結合型前駆体から金属プロテアーゼによって活性化されることが示されている（Ｍ．Ｔａｎａｋａら（１９９６）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：３１７；Ｒ．Ａ．Ｂｌａｃｋら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：７２９）。
【０３２６】
（実施例６：毛細管様管形成のＶＥＧＩ媒介性阻害）
このアッセイを使用して、短縮型ＶＥＧＩ−αポリペプチドが、生体ウシ動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の培養物においてＦＧＦ−２誘導性の毛管様管構造の形成を阻害する相対能力を決定した。三次元コラーゲンゲルプレート（２４ウェル）を、ラット尾Ｉ型コラーゲン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）の０．７ｍｇ／ｍｌの冷却溶液を０．５ｍｌ、１×ＤＭＥＭを含む各ウェルに添加し、そしてＮａＨＣＯ3で中性ｐＨに調整することによって調製した。コラーゲンゲルの形成（約１〜２ｍｍの厚さ）後、ＡＢＡＥ細胞を、５×１０4細胞／ウェルで播種した。この培養物を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充した１０％仔ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含むＤＭＥＭ中で、その培養物がコンフルエンスに達するまで維持した。次いで、その培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を含む新鮮な培地に置換した。ＡＢＡＥ培養物におけるＦＧＦ−２誘導性の毛管様管構造の形成のインヒビターとしてのＶＥＧＩ−α12-147の効果を、０．１、０．３、１、３、または１０μｇ／ｍｌのＶＥＧＩ−α12-147を培養培地に補充することによって分析した。次いで、すべての培養物を、３７℃でさらに４８時間維持し、次いで、冷メタノール（−２０℃）で固定することによって中断した。
【０３２７】
ＡＢＡＥ細胞によって形成された毛管様構造の量を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ２４００ビデオカメラおよびＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｈｏｐ顕微鏡を備えたＫｏｔｒｏｎ  ＩＢＡＳ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。毛管様構造の量を、測定した総面積に対する白色の面積の割合として測定した。コントロールとして、新脈管形成因子ＦＧＦ−２がインビトロで新脈管形成を刺激する能力についてのＥＣ50値は約５ｎｇ／ｍｌであった。さらなるコントロールとして、最大の刺激効果は、１０ｎｇ／ｍｇのＦＧＦ−２で観察された。
【０３２８】
（実施例７：腫瘍増殖のＶＥＧＩ媒介阻害）
ＶＥＧＩポリペプチドの新脈管形成に対する潜在的効果のインビボ分析を、異種移植片腫瘍モデルを用いて実施した。この実験アプローチにおいて、１００万のヒト乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を、雌性ヌードマウスの乳腺脂肪パッドに、単独、またはＶＥＧＩ−α発現哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくはＣＨＯベクターのみでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（５×１０6細胞／マウス）と混合して、注射した。これらの実験において発現されたＶＥＧＩポリペプチドは、Ｎ末端の２２アミノ酸を除いた配列番号２に示されるポリペプチドからなる。このＶＥＧＩムテインのＮ末端の２２アミノ酸を、ヒトインターロイキン−６の分泌シグナルペプチドで置換した（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：７３−７６（１９８６））。
【０３２９】
この実施例において観察されるＶＥＧＩポリペプチドの抗新脈管形成活性は、ＶＥＧＩポリペプチドが腫瘍増殖の阻害を示し得ることを示唆する。ＶＥＧＩの潜在的な抗ガン活性を、上記に記載した異種移植片腫瘍モデルを用いて、雌性無胸腺ヌードマウスの乳腺脂肪パッドへ移植した場合、高度に腫瘍原性である、乳ガン細胞をもちいて試験した。トランスフェクタントにおけるその構築物の転写を、ノーザンブロット分析によって確認した。ＶＥＧＩ−αの分泌形態を過剰発現するＣＨＯ細胞の馴化培地を濃縮し、そして部分精製し、そしてＡＢＡＥ細胞増殖を阻害し得ることが見い出されたが、ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のものでも、全長ＶＥＧＩをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のものでも全く効果は有しなかった（データは示さず）。ＶＥＧＩ−αの潜在的な抗ガン活性を、ヒト乳ガン異種移植片モデルにおいて試験した。可溶性ＶＥＧＩ−αトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびヒト乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を、乳腺脂肪パッドへ同時注射し、そして異種移植片腫瘍の増殖を注射後にモニターした。
【０３３０】
可溶性ＶＥＧＩ−αムテインを過剰発現するＣＨＯ細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図４Ａ）によって形成されたヒト乳ガン異種移植片腫瘍の増殖に対する顕著な阻害効果を発揮したが、ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は腫瘍増殖に対して効果を示さなかった。同様に、ヌードマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍増殖の有意な抑制が観察された（図４Ｂ）。いずれの場合においても、全長ＶＥＧＩ−αを過剰発現するＣＨＯ細胞は、類似の実験的条件下で異種移植片腫瘍の増殖に対して効果を有さなかった。異種移植片モデルにおいて観察された可溶性ＶＥＧＩの抗腫瘍効果は、腫瘍血管系の内皮細胞に対する抗新脈管形成効果に帰し得る。
【０３３１】
次いで、ヒト乳ガン細胞およびＶＥＧＩ−α発現ＣＨＯ細胞もしくはベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のいずれかの同時注入をしたマウスをランダム化し、そして腫瘍を１週間に２回測定した。腫瘍の大きさを、ノギスで垂直直径を測定することによって評価し、そして２次元における直径の測定値を乗ずることによって計算した。腫瘍を、０日目において開始し、そしてほぼ５日の間隔で、ほぼ２８日目まで測定した。各々の場合、ＶＥＧＩ−α発現ＣＨＯ細胞と同時注入した乳ガンから得た腫瘍細胞は、ベクターのみのＣＨＯ細胞を同時注入した乳ガン細胞から得たものよりは大きさが有意に小さいままであった。
【０３３２】
これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＶＥＧＩが内皮細胞特異的な、新脈管形成の負の調節因子であって、これは、成熟脈管系の維持または新脈管形成のプロセスの終結において機能し得ることを示唆する。生理的条件下の内皮は、静止組織であって、約１％の内皮細胞が、増殖を経験する（Ｊ．Ｄｅｎｅｋａｍｐ［１９９０］Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓ．Ｒｅｖ．９：２６７）。内皮の静止の維持を支える機構はまだ明らかではない。自己制限機構が存在し、ここで、内皮細胞がオートクリン経路を通して内皮細胞自体に作用する増殖インヒビターを産生することが認められている。ＶＥＧＩは、この重要な機構において役割を果たし得る。
【０３３３】
（実施例８：組換えＶＥＧＩ−αがＷＥＨＩ  １６４、ＡＢＡＥおよびＬ９２９細胞増殖を阻害する能力、およびＨＬ−６０細胞において細胞接着を誘導する能力）
接着性標的細胞を、ＰＢＳ中でトリプシン処理したコンフルエント培養物から調製し、そして非接着性標的細胞を、安定期の培養物から採取し、そして培地で１回洗浄した。標的細胞を、３×１０5細胞／ｍｌで、１０％ＦＣＳを含有する培地中で懸濁した。０．１ｍｌのアリコートを、０．１ｍｌの連続希釈試験細胞サンプル（ＷＥＨＩ  １６４およびＬ９２９）を含む９６ウェル平底マイクロタイタープレートに分与した。インキュベーションを、７０時間継続した。ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよび細菌で産生させたＶＥＧＩ−αを、０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。細胞傷害性および増殖活性を、２０μｌのＭＴＳおよびフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液の各ウェルへの添加によって実施されるＭＴＳアッセイを用いて定量した。３時間のインキュベーション後、４９２ｎｍでのＯＤをＥＬＩＳＡプレートリーダーにより測定した。ＯＤ492は、そのウェル中の生存細胞数に比例する。細胞傷害性の％を、以下のように計算した：％細胞傷害性＝（１００−ＯＤ実験／ＯＤコントロール）×１００。ＶＥＧＩ−αは、暗色の丸い細胞（死んだ細胞を示す）として現れる形態学的変化を誘発した。
【０３３４】
配列番号２に示される完全ＶＥＧＩ−αアミノ酸配列のアミノ酸１２−１４７からなるＶＥＧＩ−αポリペプチドの短縮形態（ＶＥＧＩ−α12-147と称する）もまた使用して、内皮細胞増殖に対するＶＥＧＩ−αの効果を試験した。成体ウシ動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞をＶＥＧＩ−α12-147で処置すると、ＡＢＡＥ培養物の細胞増殖において殆ど完全な阻害が生じたが、乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては細胞の増殖阻害は生じなかった。内皮細胞の増殖の殆ど完全な阻害は、１０μｇ／ｍｌのＶＥＧＩ−α12-147で達成された。そして、半数最大阻害濃度値（ＩＣ50）は約１μｇ／ｍｌ（約７０ｎＭ）であった。
【０３３５】
ＶＥＧＩ−αの接着能力を試験するために、ＨＬ−６０細胞を使用し、そして細胞接着および細胞間接触を顕微鏡での観察によって測定し、そして２人の独立した研究者が主観的にスコア付けした。これらの実験において、ＶＥＧＩ−αは、細胞接着を誘発するようであった。ＶＥＧＩ−αで処置しなかった培養物は、培養ディッシュ中に広がった細胞を含んだ。しかし、ＶＥＧＩ−αで処置した培養物は、明らかに互いに凝集した細胞を含んだ。
【０３３６】
（実施例９：遺伝子治療を介した発現）
線維芽細胞を被験体から皮膚生検により得る。得られる組織を組織培養培地に配置し、そして小片に分離する。組織の小さな塊を組織培養フラスコの湿潤面に配置し、およそ１０片を各フラスコに配置する。フラスコを上下反転させ、きつく閉め、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織の塊をフラスコの底部に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地）を添加する。次いで、この培養物を３７℃でおよそ一週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を加え、続いて２〜３日毎に交換する。培養のさらに２週間後、単層の線維芽細胞が出現する。単層を、トリプシン処理して、そしてより大きなフラスコへと規模拡大する。
【０３３７】
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８））を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。直線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
【０３３８】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のＭｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で合わせる。得られた混合物を２つのフラグメントの連結に適切な条件で維持する。連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、これを、ベクターが目的の遺伝子を適切に挿入したことを確認する目的のためにカナマイシンを含む寒天上にプレートする。
【０３３９】
両指向性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での組織培養でコンフルエント密度にまで増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。パッケージング細胞は、ここで遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージング細胞をここでプロデューサー細胞と称する）。
【０３４０】
新鮮な培地を形質導入されたプロデューサー細胞に添加し、続いて培地を１０ｃｍプレートのコンフルエントプロデューサー細胞から採集する。感染性ウイルス粒子を含む使用した培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して剥離したプロデューサー細胞を除去した。次いで、この培地を線維芽細胞を感染させるために使用する。培地を、コンフルエント未満の線維芽細胞のプレートから除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地と素早く置換する。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置換する。ウイルス力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染されており、そして選択は必要とされない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要であり得る。
【０３４１】
次いで、操作された線維芽細胞を、単独でまたはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエンスに増殖させた後のいずれかで宿主に注入する。線維芽細胞は、ここでタンパク質産物を産生する。
【０３４２】
（実施例１０：ニワトリ胚性漿尿膜（ＣＡＭ）新脈管形成アッセイ）
ＣＡＭアッセイを、本質的に、Ｎｇｕｙｅｎら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４７：３１−４０（１９９４））ならびにＩｒｕｅｌａ−ＡｒｉｓｐｅおよびＤｖｏｒａｋ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：６７２−６７７（１９９７））によって記載されるように実施した。この方法は、漿尿膜（ＣＡＭ）に直接配置されたコラーゲンゲルペレットへの新たな毛細管の成長に基づく。新脈管形成因子ＦＧＦ−２（１００ｎｇ）またはＶＥＧＦ（２５０ｎｇ）を、コラーゲンゲルペレットに包埋し、そしてＣＡＭと接触させた。このゲルにおける新脈管形成の定量を、ゲルペレットの配置後２４時間で、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いることによって実施した。画像を、ＣＣＤ  Ｓｏｎｙのカメラを用いてＰｏｗｅｒＰＣ１００ＡＶに移した。蛍光強度を、ＮＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１ソフトウェアを用いて評価した。陽性コントロールについての蛍光強度（これは、新脈管形成因子単独を含む）を、最大の新脈管形成応答とみなし、そして任意に１００に設定した。このアッセイの偏差に起因して、２０％を超える阻害を有意とみなした。
【０３４３】
ＦＧＦ−２誘発またはＶＥＧＦ誘発の新脈管形成に対するＶＥＧＩ−αの効果の実験的決定として、細菌で生成したＶＥＧＩ−α（２５０ｎｇ）を、ＦＧＦ−２（１００ｎｇ）またはＶＥＧＦ（２５０ｎｇ）のいずれかを混合し、そしてコラーゲンゲルペレット中に包埋した。次いで、このペレットを上記のようにＣＡＭと接触させた。ＶＥＧＩ−αは、コラーゲンゲルへの新たな毛細管の成長を顕著に阻害した。
【０３４４】
本発明の多数の改変および変更は、上記の教示に照らせば可能であり、それゆえ、請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載したもの以外の方法で実施され得る。
【０３４５】
【表３】
0004441112.tif 000018
【０３４６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＶＥＧＩの転写のノザンブロット分析を示す。パネルＡ、以下のヒト細胞におけるＶＥＧＩの発現：Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞白血病細胞；Ｌ９２３、ヒト胚腎臓細胞；ＨＬ６０、ヒト前骨髄球白血病；Ｖ．Ｅ、ヒト静脈内皮細胞（第１０継代）；Ａ４３１、ヒト類表皮ガン；Ｖ．Ｅ．−２、ヒト静脈内皮細胞（第２０継代）；Ｒａｊｉ、ヒトバーキットリンパ腫；Ａ．Ｅ、ヒト動脈内皮細胞；ＴＨＰ−１、ヒト単球白血病；ＣＣＤ−２９Ｌｕ、ヒト肺気腫；ＣＡＭＡ１、乳ガン；ＡＮ３ＣＡ、子宮ガン；ＳＫ．ＵＴ．１、子宮ガン；ＭＧ６３、骨芽細胞腫；ＨＯＳ、骨芽細胞腫；ＭＣＦ７、乳ガン；ＯＶＣＡＲ−３、卵巣ガン；ＣＡＯＶ−３、卵巣ガン；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍静脈内皮細胞；ＡＯＳＭＩＣ、平滑筋。見積もられたメッセージサイズは、６．５ｋｂである。パネルＢ、種々の型のヒト組織におけるＶＥＧＩの発現：３つの別々のブロットを行なった。３つの実験のいずれかからのポジティブな結果を示す。
【図２】  図２は、内皮細胞および乳ガン細胞の増殖に対するＶＥＧＩの効果を示す。細胞数を、示したようなＶＥＧＩ濃度に対してプロットする。ＡＢＡＥ細胞（白丸）の増殖の阻害は示されるが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（四角）細胞の増殖の阻害は示されない。
【図３】  図３は、コラーゲンゲル上でのＡＢＡＥ細胞による毛細血管様管の形成を阻害するＶＥＧＩの能力を示す。示すような種々のＶＥＧＩの濃度の存在下におけるＡＢＡＥ細胞による毛細血管様管形成の程度をＶＥＧＩが培養培地に存在しない場合の毛細血管様管形成の程度と比較することにより、カラムの上に示したｐ値（ｔ検定）を得る。毛細血管様構造体の量を、測定された全面積に対する白い面積の百分率として測定する。
【図４Ａ】  図４は、ＶＥＧＩによる無胸腺症ヌードマウスにおけるヒト乳ガン異種移植片腫瘍の増殖の阻害を示す。パネルＡ：接種後の時間（日）の関数として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ2）のプロット。パネルＢ：接種後の時間（日）の関数として、ｉｍ−ＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ2）のプロット。白丸、ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と同時接種した。黒丸、分泌されたＶＥＧＩをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と同時接種した。
【図４Ｂ】  図４は、ＶＥＧＩによる無胸腺症ヌードマウスにおけるヒト乳ガン異種移植片腫瘍の増殖の阻害を示す。パネルＡ：接種後の時間（日）の関数として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ2）のプロット。パネルＢ：接種後の時間（日）の関数として、ｉｍ−ＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ2）のプロット。白丸、ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と同時接種した。黒丸、分泌されたＶＥＧＩをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と同時接種した。
【図５Ａ】  図５Ａは、本発明のＶＥＧＩαのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号８）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。最初の２７アミノ酸（下線を付す）は、推定のリーダー配列である。アミノ酸の標準の１文字の省略形を使用する。潜在的なアスパラギン結合グリコシル化部位を、図５Ａで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のアスパラギン記号（Ｎ（太字））でマークし、そしてＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてそのアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に太字のポンド記号（＃（太字））でマークする。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−２９からＮ−３２（Ｎ−２９、Ｙ−３０、Ｔ−３１、Ｎ−３２）およびＮ−１２５からＤ−１２８（Ｎ−１２５、Ｖ−１２６、Ｓ−１２７、Ｄ−１２８）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位もまた、図５Ａで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列においてその太字のトレオニン記号（Ｔ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｔ−３２からＫ−３４（Ｔ−３２、Ｎ−３３、Ｋ−３４）およびＴ−５０からＲ−５２（Ｔ−５０、Ｆ−５１、Ｒ−５２）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位もまた、図５Ａで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列において適切なセリンまたはトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｓ−８３からＥ−８６（Ｓ−８３、Ｙ−８４、Ｐ−８５、Ｅ−８６）；Ｓ−９６からＥ−９９（Ｓ−９６、Ｖ−９７、Ｃ−９８、Ｅ−９９）；Ｓ−１１５からＥ−１１８（Ｓ−１１５、Ｌ−１１６、Ｑ−１１７、Ｅ−１１８）；Ｓ−１３０からＤ−１３３（Ｓ−１３０、Ｌ−１３１、Ｖ−１３２、Ｄ−１３３）；およびＴ−１３５からＤ−１３８（Ｔ−１３５、Ｋ−１３６、Ｅ−１３７、Ｄ−１３８）。潜在的なミリスチル化部位もまた、図５Ａで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において二重下線でマークする。潜在的なミリスチル化部位は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｇ−２０からＫ−２５（Ｇ−２０、Ｌ−２１、Ａ−２２、Ｆ−２３、Ｔ−２４、Ｋ−２５）およびＧ−１１１からＬ−１１６（Ｇ−１１１、Ａ−１１２、Ｍ−１１３、Ｆ−１１４、Ｓ−１１５、Ｌ−１１６）。
【図５Ｂ】  図５Ｂは、本発明のＶＥＧＩαのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号８）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。最初の２７アミノ酸（下線を付す）は、推定のリーダー配列である。アミノ酸の標準の１文字の省略形を使用する。潜在的なアスパラギン結合グリコシル化部位を、図５Ｂで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のアスパラギン記号（Ｎ（太字））でマークし、そしてＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてそのアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に太字のポンド記号（＃（太字））でマークする。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−２９からＮ−３２（Ｎ−２９、Ｙ−３０、Ｔ−３１、Ｎ−３２）およびＮ−１２５からＤ−１２８（Ｎ−１２５、Ｖ−１２６、Ｓ−１２７、Ｄ−１２８）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位もまた、図５Ｂで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列においてその太字のトレオニン記号（Ｔ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｔ−３２からＫ−３４（Ｔ−３２、Ｎ−３３、Ｋ−３４）およびＴ−５０からＲ−５２（Ｔ−５０、Ｆ−５１、Ｒ−５２）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位もまた、図５Ｂで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列において適切なセリンまたはトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｓ−８３からＥ−８６（Ｓ−８３、Ｙ−８４、Ｐ−８５、Ｅ−８６）；Ｓ−９６からＥ−９９（Ｓ−９６、Ｖ−９７、Ｃ−９８、Ｅ−９９）；Ｓ−１１５からＥ−１１８（Ｓ−１１５、Ｌ−１１６、Ｑ−１１７、Ｅ−１１８）；Ｓ−１３０からＤ−１３３（Ｓ−１３０、Ｌ−１３１、Ｖ−１３２、Ｄ−１３３）；およびＴ−１３５からＤ−１３８（Ｔ−１３５、Ｋ−１３６、Ｅ−１３７、Ｄ−１３８）。潜在的なミリスチル化部位もまた、図５Ｂで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において二重下線でマークする。潜在的なミリスチル化部位は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｇ−２０からＫ−２５（Ｇ−２０、Ｌ−２１、Ａ−２２、Ｆ−２３、Ｔ−２４、Ｋ−２５）およびＧ−１１１からＬ−１１６（Ｇ−１１１、Ａ−１１２、Ｍ−１１３、Ｆ−１１４、Ｓ−１１５、Ｌ−１１６）。
【図５Ｃ】  図５Ｃは、本発明のＶＥＧＩαのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号８）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。最初の２７アミノ酸（下線を付す）は、推定のリーダー配列である。アミノ酸の標準の１文字の省略形を使用する。潜在的なアスパラギン結合グリコシル化部位を、図５Ｃで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のアスパラギン記号（Ｎ（太字））でマークし、そしてＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてそのアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に太字のポンド記号（＃（太字））でマークする。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−２９からＮ−３２（Ｎ−２９、Ｙ−３０、Ｔ−３１、Ｎ−３２）およびＮ−１２５からＤ−１２８（Ｎ−１２５、Ｖ−１２６、Ｓ−１２７、Ｄ−１２８）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位もまた、図５Ｃで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列においてその太字のトレオニン記号（Ｔ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列においてトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｔ−３２からＫ−３４（Ｔ−３２、Ｎ−３３、Ｋ−３４）およびＴ−５０からＲ−５２（Ｔ−５０、Ｆ−５１、Ｒ−５２）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位もまた、図５Ｃで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩαヌクレオチド配列において適切なセリンまたはトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｓ−８３からＥ−８６（Ｓ−８３、Ｙ−８４、Ｐ−８５、Ｅ−８６）；Ｓ−９６からＥ−９９（Ｓ−９６、Ｖ−９７、Ｃ−９８、Ｅ−９９）；Ｓ−１１５からＥ−１１８（Ｓ−１１５、Ｌ−１１６、Ｑ−１１７、Ｅ−１１８）；Ｓ−１３０からＤ−１３３（Ｓ−１３０、Ｌ−１３１、Ｖ−１３２、Ｄ−１３３）；およびＴ−１３５からＤ−１３８（Ｔ−１３５、Ｋ−１３６、Ｅ−１３７、Ｄ−１３８）。潜在的なミリスチル化部位もまた、図５Ｃで、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において二重下線でマークする。潜在的なミリスチル化部位は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｇ−２０からＫ−２５（Ｇ−２０、Ｌ−２１、Ａ−２２、Ｆ−２３、Ｔ−２４、Ｋ−２５）およびＧ−１１１からＬ−１１６（Ｇ−１１１、Ａ−１１２、Ｍ−１１３、Ｆ−１１４、Ｓ−１１５、Ｌ−１１６）。
【図６Ａ】  図６Ａは、本発明のＶＥＧＩβのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号２６）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。アミノ酸の標準の１文字の省略形を使用する。アミノ酸メチオニン−１からトリプトファン−３５は、推定の細胞内ドメインである。アミノ酸残基アラニン−３６からアラニン−６１（下線を付す）は、推定の膜貫通配列である。アミノ酸残基グルタミン−６２からロイシン−２５１（下線を付す）は、推定の膜貫通配列である。潜在的なアスパラギン結合グリコシル化部位を、図６Ａで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のアスパラギン記号（Ｎ（太字））で、およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列においてそのアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に太字のポンド記号（＃（太字））でマークする。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−１３３からＮ−１３６（Ｎ−１３３、Ｙ−１３４、Ｔ−１３５、Ｎ−１３６）およびＮ−２９９からＤ−２３２（Ｎ−２９９、Ｖ−２３０、Ｓ−２３１、Ｄ−２３２）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位もまた、図６Ａで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列においてそのトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｓ−２３からＲ−２５（Ｓ−２３、Ｃ−２４、Ｒ−２５）；Ｓ−３２からＲ−３４（Ｓ−３２、Ａ−３３、Ｒ−３４）；Ｔ−１３５からＫ−１３７（Ｔ−１３５、Ｎ−１３６、Ｋ−１３７）；およびＴ−１５４からＲ−１５６（Ｔ−１５４、Ｆ−１５５、Ｒ−１５６）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位もまた、図６Ａで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列において適切なセリンまたはトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｓ−８からＥ−１１（Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｓ−１８７からＥ−１９０（Ｓ−１８７、Ｙ−１８８、Ｐ−１８９、Ｅ−１９０）；Ｓ−２００からＥ−２０３（Ｓ−２００、Ｖ−２０１、Ｃ−２０２、Ｅ−２０３）；Ｓ−２１９からＥ−２２２（Ｓ−２１９、Ｌ−２２０、Ｑ−２２１、Ｅ−２２２）；Ｓ−２３４からＤ−２３７（Ｓ−２３４、Ｌ−２３５、Ｖ−２３６、Ｄ−２３７）；およびＴ−２３９からＤ−２４２（Ｔ−２３９、Ｋ−２４０、Ｅ−２４１、Ｄ−２４２）。潜在的なミリスチル化部位もまた、図６Ａで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において二重下線でマークする。潜在的なミリスチル化部位は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｇ−６からＥ−１１（Ｇ−６、Ｌ−７、Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｇ−１２４からＧ−１２９（Ｇ−１２４、Ｌ−１２５、Ａ−１２６、Ｆ−１２７、Ｔ−１２８、Ｋ−１２９）；およびＧ−２１５からＬ−２２０（Ｇ−２１��、Ａ−２１６、Ｍ−２１７、Ｆ−２１８、Ｓ−２１９、Ｌ−２２０）。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、本発明のＶＥＧＩβのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号２６）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。アミノ酸の標準の１文字の省略形を使用する。アミノ酸メチオニン−１からトリプトファン−３５は、推定の細胞内ドメインである。アミノ酸残基アラニン−３６からアラニン−６１（下線を付す）は、推定の膜貫通配列である。アミノ酸残基グルタミン−６２からロイシン−２５１（下線を付す）は、推定の膜貫通配列である。潜在的なアスパラギン結合グリコシル化部位を、図６Ｂで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のアスパラギン記号（Ｎ（太字））で、およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列においてそのアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に太字のポンド記号（＃（太字））でマークする。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−１３３からＮ−１３６（Ｎ−１３３、Ｙ−１３４、Ｔ−１３５、Ｎ−１３６）およびＮ−２９９からＤ−２３２（Ｎ−２９９、Ｖ−２３０、Ｓ−２３１、Ｄ−２３２）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位もまた、図６Ｂで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列においてそのトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｓ−２３からＲ−２５（Ｓ−２３、Ｃ−２４、Ｒ−２５）；Ｓ−３２からＲ−３４（Ｓ−３２、Ａ−３３、Ｒ−３４）；Ｔ−１３５からＫ−１３７（Ｔ−１３５、Ｎ−１３６、Ｋ−１３７）；およびＴ−１５４からＲ−１５６（Ｔ−１５４、Ｆ−１５５、Ｒ−１５６）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位もまた、図６Ｂで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において太字のセリンまたはトレオニン記号（ＳまたはＴ（太字））およびＶＥＧＩβヌクレオチド配列において適切なセリンまたはトレオニン残基をコードする最初のヌクレオチドの上に星印（*）でマークする。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｓ−８からＥ−１１（Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｓ−１８７からＥ−１９０（Ｓ−１８７、Ｙ−１８８、Ｐ−１８９、Ｅ−１９０）；Ｓ−２００からＥ−２０３（Ｓ−２００、Ｖ−２０１、Ｃ−２０２、Ｅ−２０３）；Ｓ−２１９からＥ−２２２（Ｓ−２１９、Ｌ−２２０、Ｑ−２２１、Ｅ−２２２）；Ｓ−２３４からＤ−２３７（Ｓ−２３４、Ｌ−２３５、Ｖ−２３６、Ｄ−２３７）；およびＴ−２３９からＤ−２４２（Ｔ−２３９、Ｋ−２４０、Ｅ−２４１、Ｄ−２４２）。潜在的なミリスチル化部位もまた、図６Ｂで、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において二重下線でマークする。潜在的なミリスチル化部位は、ＶＥＧＩβアミノ酸配列において以下の位置で見出される：Ｇ−６からＥ−１１（Ｇ−６、Ｌ−７、Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｇ−１２４からＧ−１２９（Ｇ−１２４、Ｌ−１２５、Ａ−１２６、Ｆ−１２７、Ｔ−１２８、Ｋ−１２９）；およびＧ−２１５からＬ−２２０（Ｇ−２１��、Ａ−２１６、Ｍ−２１７、Ｆ−２１８、Ｓ−２１９、Ｌ−２２０）。
【図７】  図７は、ＶＥＧＩαアミノ酸配列（配列番号９）の分析を示す。記載したコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて予測された、α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性の領域；可撓性の領域；抗原性の指数および表面の確率を示す。「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｒ  Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、ポジティブなピークは、ＶＥＧＩポリペプチドの高度に抗原性の領域（例えば、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域）の位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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