(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体環境中における少なくとも２化学種間の相互作用の速度論的性質を決定するための方法であって、
前記化学種の少なくとも一方を含んだ液体がフローとして測定システムを通過させられて、前記測定システム内で相互作用が生じ、該方法は、以下のステップ：
前記液体フローに前記化学種の少なくとも一方の濃度勾配を与えるステップと、
前記化学種の少なくとも一方を含んだ前記液体フローをセンサデバイスに通過させるステップと、
前記の少なくとも２化学種間の相互作用の結果を前記センサデバイスによって検出するステップと、
を包含し、該方法は、
前記濃度勾配を含む液体フローは、該フローが前記センサを通過させられる前に、少なくとも一回、追加の液体と交差させられて、濃度勾配を形成する前記化学種の濃度の異なる分離された少なくとも２液体セグメントが作製されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
相互作用に関する親和性および／またはアッセイ条件がさらに決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アッセイ条件がさらに決定され、前記化学種の一方はアッセイ関数と結びついた薬剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ関数と結びついた前記薬剤は再生剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アッセイ関数と結びついた前記薬剤は相互作用効率に影響を及ぼす薬剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
液体フローは一回より多く交差させられて、分離された液体セグメントが作製される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分離された前記セグメントの少なくとも１セグメントは前記センサを通過しないように廃棄される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
相互作用は前記化学種とフローセル内の表面に固定化された標的との間に生ずる、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
追加の液体はバッファおよび溶剤からなる群より選択される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
液体フローは複数回にわたって交差させられる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
流れバッファによる望ましくない分散がセンサデバイス内で生じることを防止するために、空気と試料との連続したセグメントがセンサデバイスにインジェクションされる、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加の液体は、前記溶液がセンサデバイスを通過している間も、低下された流量でシステムを通過することができる、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
異なった化学種を含んだ異なった２種の溶液の混合によって二重勾配がつくり出され、これによって、一方の化学種には正（漸増）勾配が形成され、他方の化学種には負（漸減）勾配が形成される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
溶液の各々のセグメントの長さは８〜２０秒である、請求項２乃至請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
各々のセグメントは１〜４０μｌの体積を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
フローセルを通過する液体の流量は５０〜２００μｌ／分である、請求項１乃至請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体フローの１または複数のアリコートは該フローが前記追加の液体によって交差させられる前に廃棄される、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記セグメントの大半は前記化学種に関して異なった濃度を有すると考えられる、請求項１０乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
相互作用は溶液中の化学種と前記測定システム内の表面に固定化された化学種との間で生ずる、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
固定された化学種は抗体であり、溶液中の化学種は前記抗体に対する抗原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固定化された化学種は抗原であり、溶液中の化学種は前記抗原に対する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
相互作用は溶液中の２化学種の間で生じる、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
一方の化学種は酵素であり、他方の化学種は前記酵素に対する基質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の試料および／またはその他の液体が所定の順序で交互に前記測定システムを通過させられる、請求項１乃至請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
第一の液体はセンサデバイス上の標的に結合する化合物を含有し、第二の液体は再生液であり、第三の液体はバッファを含み、検出された相互作用の結果は前記センサデバイスの適切な再生レベルを決定するために使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
液体環境中における少なくとも２化学種の相互作用の速度論的性質を決定するための装置であって、前記化学種の少なくとも一方を含んだ液体がフローとして測定システムを通過させられて、前記測定システム内で相互作用が生じ、該装置は：
前記化学種の少なくとも一方の第一の化学種の濃度勾配または、相互作用または被相互作用成分に影響を及ぼす他の少なくとも１化学種の濃度勾配をつくり出すための手段と、
前記フローをセンサデバイスに通過させるための手段と、
前記センサデバイスによって前記の少なくとも２化学種間の相互作用の結果を検出するための手段と、
を備え、該装置は、
前記濃度勾配を含む液体フローを、該フローが前記センサを通過させられる前に、少なくとも一回、追加の液体と交差させ、前記化学種の濃度の異なる分離された少なくとも２液体セグメントを作製する手段を特徴とする、装置。
【請求項２７】
請求項１乃至請求項２５のいずれか１項に記載のステップを実施するためのソフトウェアコード手段を備える、請求項２６に記載の装置と組み合わされた処理手段の内部記憶装置へ直接にロードし得るコンピュータプログラム製品。
【請求項２８】
請求項２６に記載の装置と組み合わされた処理手段が請求項１乃至請求項２５のいずれか１項に記載のステップの実施を制御し得るようにするための読取り可能プログラムを備える、コンピュータ使用可能な媒体上に記憶されたコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、多成分系におけるさまざまな相互作用に関する特性たとえば速度論的性質または親和性を決定することが所望される場合の分析方法に関する。特に本発明は、液体環境中の化学種間たとえば化合物と標的間の相互作用を分析するための方法に関する。本発明はまた、化学種間たとえば化合物と標的間の部位特異結合の分析にも関する。より詳細には本発明は、当該の化合物を含んだ試料のパルス勾配を供することにより速度論的性質または親和性を決定するための方法と装置とに関するものであり、この場合、標的分子はそれが相互作用し得る化合物の勾配に曝露され、この相互作用の結果が検出される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
新薬の候補の研究（スクリーニング）において、弱い結合を示し、急速な事象に達して、小さな時定数を示す物質に遭遇する場合がしばしばある。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は基質と標的との間の親和性の研究にとって強力な技法であるが、一般に緩慢な事象向けに設計されている。ＳＰＲの原理を使用した計測器（たとえば、本発明の出願人、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎによって供給される計測器）は、表面での質量濃度の変化から生ずる、センサチップに隣接した媒質の屈折率の変化を計測する。
【０００３】
従来の（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手のシステムを使用した）ＳＰＲアッセイにおいて、１試料インジェクションは選択された化合物の１濃度に相当しており、該インジェクションは試料液の単一のセグメントまたは“プラグ”を有する。速度論的ならびに親和性決定のほとんどのケースにおいて、相互作用速度または強度（つまり、会合速度定数、解離速度定数および解離定数）に関する信頼し得る結果を得るには、異なった濃度の若干数のインジェクションで十分である。ただし、低い親和性または早い反応速度を示す分子を研究する場合には、多数のこの種の測定を実施することが必要である。これは比較的時間のかかる処理であり、しかもかなりの試料ロスを伴う。使用可能なインジェクション法のうち最も高い精度を示すインジェクションによれば、いずれのインジェクションも、バッファによる分散を防止するために、所望のインジェクション量に加えて４０μｌの試料が必要である。
【０００４】
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．１７，ｐｐ４２１２−４２２０に掲載された、Ｓｈａｎ−Ｒｅｔｚｌａｆ  ｅｔ  ａｌ．による“Ａｎａｌｙｔｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：Ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ”を表題とする論文において、ＳＰＲを使用して反応速度と平衡結合親和性を決定する方法が開示されている。
【０００５】
これは、連続フロー条件下で、センサ表面を通過する被検化合物の濃度は時間と共に直線的に増加するという、勾配を利用した一段法である。固定化されたレセプタに検体が結合する速度は、検体濃度が増加する際の表面プラズモン共鳴最小時の変化を監視することによって測定される。反応速度は改良バージョンの２コンパートメントモデルへのデータのフィッティングによって決定される。
【０００６】
改善されているとはいえ、これはなお比較的急速な速度論的挙動を示す系に関する測定を実施する能力に欠け、かつまた、全滴定に比較的多量の試料が要される点でも問題がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
従来の技法の短所は、本発明により、請求項１に記載した、液体環境中における少なくとも２化学種間の相互作用  ―  たとえば親和性および／または速度論的性質および／またはアッセイ条件  ―  の特性決定のための方法によって克服される。
【０００８】
これにより、上記化学種の少なくとも一方の第一の化学種の濃度勾配がつくり出され、該勾配がセンサデバイスを通過させられる。上記の少なくとも２化学種間の相互作用の結果は上記センサデバイスによって検出される。液体フローが該センサデバイスを通過する前に、該液体フローは少なくとも一回、さらなる液体と交差させられ、こうして、分離された少なくとも２液体セグメントが作製される。
【０００９】
こうして、測定に必要とされる試料量が著しく減少させられると共に測定の完遂に必要とされる時間も著しく減少させられる。
【００１０】
本発明の１実施形態において、１研究対象化合物と１標的が使用される。これは個々の化合物／物質の研究に最も繁用される方法であろう。
【００１１】
別の実施形態において、２またはそれ以上の化合物  ―  この場合、一方の化合物は既知の結合特性を有すると共に試料勾配を形成し、他方の化合物（単数または複数）の特性は未知である  ―  を含んだ試料液が使用される。この実施形態は、未知の特性を有する化合物（単数または複数）の結合の強さに関する情報を評価し、該化合物が標的分子上の同一部位に結合するか否かを決定するために使用される。
【００１２】
さらに別の実施形態において、当該の化合物は基質と反応する酵素である。
【００１３】
またさらに別の実施形態において、たとえばセンサ表面の再生（つまり、標的からの化合物の除去）のための最適条件（濃度またはｐＨ）を見出すことにより、アッセイ条件を改善するために、勾配を使用することができる。
【００１４】
本発明のさらに別の面において、請求項２６に記載した、少なくとも１標的と相互作用する溶液中の少なくとも１化合物の相互作用  ―  たとえば親和性および／または速度論的性質および／またはアッセイ条件  ―  の特性決定のための装置が提供される。
【００１５】
この装置は、該装置内部に設けられているかまたは該装置と連結されている処理手段の内部記憶装置に直接にロードし得る、本発明による方法のステップを実施するためのソフトウェアコード手段を備えるコンピュータプログラム製品の形のソフトウェアの制御下で適切に稼働される。
【００１６】
このソフトウェアは、上記装置の処理手段が本発明による方法のステップの実施を制御し得るようにするための読み取り可能プログラムを備える、コンピュータ使用可能な媒体上に記憶されたコンピュータプログラム製品の形であってもよい。
【００１７】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的にとって、以下の用語及び表現は以下に記載する意味を有すると解されることとする。
【００１９】
本出願の目的にとって、“化学種”とは任意の実体たとえば、分子、化合物、物質、抗体、抗原、細胞、細胞フラグメントまたは、液体環境中で供され得るその他の任意の成分である。検出可能であるために、それは好ましくは他の化学種となんらかの種類の相互作用を行うことができ、その相互作用の結果がなんらかの手段で検出可能であるのがよい。ただし、言うまでもなく一定の場合にあっては、検体は当該の他の化学種と相互作用せず、したがって明確な相互作用の結果を測定することはできないが、この結果の欠如が検出可能であればよく、それゆえ、この種の非相互作用性化学種も化学種の定義の中に含まれる。
【００２０】
“インジェクション”とは分析器のフローセルなどへの液体量の少なくとも一部の送達である。
【００２１】
“パルス”とはインジェクションの一部、つまりインジェクション量の液体のセグメントである。
【００２２】
“パルスシリーズ”とは少なくとも２パルスのことである。
【００２３】
本発明による方法は、標識たとえば放射性標識、発色団、蛍光団、散乱光マーカ、電気化学活性マーカ、磁気活性マーカ、熱活性マーカ、化学発光成分または遷移金属に依拠する検出システムを含めた多様な検出システムならびにいわゆる無標識検出システムと共に使用することができる。
【００２４】
多くの適用にとって検出は、ソリッドステートの物理化学的変換器と直接に組合わされているかまたは変換器と結ばれた移動キャリアビーズ／粒子を備えた分子認識用要素（  たとえば固定化抗体の層またはパターン）を使用したデバイスとして広く定義される化学センサまたはバイオセンサを用いて至便に実施される。この種のセンサは一般に無標識技法、たとえば固定化層の質量、屈折率または厚さの変化の検出を基礎としている一方で、ある種の標識化に依拠したセンサも存在する。代表的なセンサ検出技法は質量検出法たとえば圧電、光学、熱光学および表面弾性波（ＳＡＷ）デバイス法、および電気化学法たとえば電位差、電導度、電流およびキャパシタンス／インピーダンス測定法であるが、これらに限定されるものではない。光学的検出法に関して言えば、代表的な方法は質量表面濃度を検出する方法たとえば内部反射法および外部反射法の双方を含む反射光学法、角度、波長、偏光または位相分解を検出する方法たとえばエリプソメトリおよびエバネッセント波分光分析法（ＥＷＳ）であり、これら両者は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光分析法、ブルースター角屈折率測定法、臨界角屈折率測定法、減衰全反射法（ＦＴＲ）、エバネッセント波エリプソメトリ、散乱内部全反射法（ＳＴＩＲ）、光導波路センサ、エバネッセント波をベースとした画像化たとえば臨界角分解画像化、ブルースター角分解画像化、ＳＰＲ角分解画像化などを含んでいてよい。さらに、たとえば表面強化ラマン分光（ＳＥＲＳ）、表面強化共鳴ラマン分光（ＳＥＲＲＳ）、エバネッセント波蛍光（ＴＩＲＦ）およびりん光をベースとした測光画像化／顕微法ならびに導波路干渉計、導波路漏洩モード分光分析、反射干渉分光分析（ＲＩｆＳ）、透過インターフェロメトリ、ホログラフィ分光分析、および原子間力顕微鏡法（ＡＦＲ）にも触れておくこととする。
【００２５】
本発明を主としてＳＰＲを使用した実施例によって説明するが、これは本発明の範囲を制限するものと解されてはならない。
【００２６】
最初にＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムで使用されるＳＰＲ技法を簡単に説明する。
【００２７】
ＳＰＲでは、表面の質量濃度の変化から生ずる、センサチップに隣接した媒質の屈折率の変化が測定される。信号は応答単位ＲＵ  ―１，０００ＲＵはほぼ１ｎｇ／ｍｍ２の表面濃度に相当する  ―  で測定されて、センサグラムに時間の関数としてグラフ表示される。本出願の目的のための用語使用において、表面に結合された分子は標的と称され、他方、分析さるべき化合物は溶液中の分子である。該化合物を含んだ溶液は表面全体つまり一般にカルボキシメチルデキストラン基質でコートされたセンサチップにインジェクションされ、連続フローによって輸送される。このプロセスは２台の自動化されたポンプシステム  ―  そのうち１台は一定のバッファフローを維持し、他方はインジェクションを制御する  ―  によって推進される。
【００２８】
標的は固定化と称されるプロセスでセンサチップ基質と共有結合される。最も一般的に使用されている固定化技法は、反応性エステルがカルボキシメチル基の修飾によって表面基質に導入されるアミン結合である。これらのエステルは次いで自発的に標的上のアミンおよびその他の求核基と反応して共有結合を形成する。アミン結合以外にも、標的を基質に結合するその他の方法がある。たとえば、いわゆる“リガンド・チオール結合”法は反応性ジスルフィド基をセンサチップ基質のカルボキシル基に導入し、これが標的の固有のチオール基と交換される。
【００２９】
共有結合は、再生と称される、標的と化合物との間の結合を破壊する条件に耐えることができる。したがって、同一の表面は数回使用することが可能である。
【００３０】
インジェクションの間、化合物分子は連続的に表面に輸送され、標的分子と結合することが可能とされる。インジェクションが停止すると、バッファフローが解離した化合物を洗い流す。結合相は以下によって表される（１：１結合の場合）。
ｄＲ／ｄｔ＝ｋａＣ（Ｒｍａｘ−Ｒ）−ｋｄＲ    （１）
平衡時に、応答は
Ｒｅｑ＝ｋａＣＲｍａｘ／（ｋａＣ＋ｋｄ）    （２）
として得られ、解離の間は
ｄＲ／ｄｔ＝−ｋｄＲ０    （３）
として得られる。式中、Ｒは任意の時間ｔにおける応答を表し、Ｒｅｑは平衡時の応答を表し、Ｒ０はインジェクション終了時の応答を表し、Ｒｍａｘは表面の最大結合能力をＲＵで表している。Ｃは当該の化合物のモル濃度である。
【００３１】
図１は、１試料溶液（勾配を示す）と１バッファとを配置した構成の実施形態による、本発明によるパルスインジェクションの原理を使用する方法を実施するためのシステムを概略的に示したものである。これは、本発明の目的のため、特性決定さるべき液体が流れる、配管、ポンプ、バルブおよびセンサを備える測定システムを備える。少なくとも１化合物がフローとして測定システムを通過させられ、この測定システム内部で相互作用が生ずる。バルブ、ポンプおよび、上記化合物のうち少なくとも第一の１化合物の濃度勾配を生み出すための制御装置を備えた手段が設けられている。少なくとも上記の第一の化合物と他の化学種との間の相互作用の結果を検出することのできるセンサデバイスがフローセルとして適切に設けられている。ポンプおよび／またはバルブは、上記のフローを上記のセンサデバイスを通過させるとともに、液体フローをそれが上記のセンサを通過させられる前に少なくとも１回さらに別の液体と交差させるために使用され、こうして、制御装置の制御下で、当該の化合物を含んだ液体の、分離された少なくとも２セグメントが作製される。
【００３２】
こうして、装置は該装置と組み合わされた処理手段の内部記憶装置へ直接にロードし得るコンピュータプログラム製品の形のソフトウェアの制御下で稼働される。該プログラムは本発明による方法の一連のステップを実施するためのソフトウェアコード手段を備える。
【００３３】
該ソフトウェアはまた、装置内の処理手段が本発明による方法の一連のステップの実施を制御し得るようにするための読み取り可能プログラムを備える、コンピュータ使用可能な媒体上に記憶されたコンピュータプログラム製品の形であってもよい。
【００３４】
本発明によるパルスインジェクション法は主たる２特徴を有している。第一に、各々のインジェクションは、試料とバッファフローの交番によってつくり出されたいくつかの、適切には４または５〜４０パルスまで、好ましくは１５〜３０、より好ましくはほぼ２０パルスの短い一連の試料パルスを有し、各々のパルスは１〜４０μｌ、好ましくは１０〜４０μｌ、より好ましくは１５〜２５μｌ、適切には約２０μｌの体積を有している。パルスつまり各々の溶液セグメントの長さは８〜２０、好ましくは約１０〜１５、適切には１２秒であってよく、フローセルを貫流する試料液の流量は５０〜２００、好ましくは８０〜１２０、適切には１００μｌ／分であってよい。
【００３５】
対照的に、従来の技術による方法は１パルス（１インジェクション当たり；  インジェクション全体が１パルスである）を備える。第二に、パルスインジェクションと組み合わされた濃度勾配が供され、これらは、まとまって、各々のパルスが基本的に１濃度を形成している単一のインジェクションによるいくつかの濃度レベルから情報を生成する。該勾配はバッファと試料が以下に述べるように試料吸引中に管路内で混合され得る場合に生ずる。また、１インジェクションの間にいくつかのパルスを廃棄することができ、これにより、廃棄されたセグメントはセンサを通過しないとの点に注意すべきであろう。別法として、分離されたセグメントを生み出すためにバッファインジェクションの交番を実施する前にも液体のいくつかのアリコートを廃棄することが可能である。
【００３６】
本発明を実施するシステムの概略と流路を示す図１を参照して、本発明による方法の基本的原理を説明する。
【００３７】
図１から看取されるように、それぞれ試料とバッファを含んだ２つの容器（たとえば試験管）が設けられている。また、試験管に向かって下方に延びる垂直線で示した、試験管から液体を吸引するための手段も設けられている。この手段は適切には針であってよく、かつ同一の針が双方の液体に使用されることから、試料管中の針は破線で示されている。この針は、したがって、液体の吸引のため双方の管の間を物理的に順次移動させられることになろう。液体吸引手段を考案するその他の可能性も存在することは言うまでもなく、本図は例示的なものにすぎない。
【００３８】
システムバッファ供給も行なわれる。当初にシステム全体はバッファで満たされる。つまり、すべての配管はこのバッファを収容している。配管のそれぞれの区間（それぞれ試料とシステムバッファ）は組み合わされて統合型液体カートリッジ（ＩＦＣ）、つまり、１または複数のフローセルへの制御式の液体送達を可能とするデバイスを形成している。各々のフローセルは、１または複数の適切な標的が固定されるセンサ表面を有している。ＩＦＣには、それぞれの液体のフローを制御するための一連のバルブも設けられている。別法として、さまざまなラインのフローを精密ポンプで制御することも可能であり、これにより、その時々の流量を単調に制御して、ゼロから所要の最大流量までに及ぶ所望の流量を供することが可能であり、あるいはこれらを組合わせることもできる。
【００３９】
手順の第一のステップは、少量のバッファを針の内部に吸引することである。つまり、針をバッファ管に沈め、適量を針の内部に吸引することである。ただし、吸引によって針にバッファを満たすことは必ずしも必要ではない。それに代えて、システム全体をバッファで満たすことにより、他端から、つまりシステムバッファ供給からのバッファで針を満たすことが可能である。次いで、針は試料管に向かって移動させられ、約５００μｌの適量の試料が吸引される。ただし、実際の量は適用ケースと試料の種類に応じて異なっていてよく、広い範囲内たとえば１μｌから４ｍｌまでの範囲内で変動してよい。  
【００４０】
試料の吸引は分散による試料とバッファの混合を結果し、これによって、配管内に勾配がつくり出される。この場合、勾配はフローセルを通って流れる（針から見て）漸減勾配となろう。もしも増加勾配が所要の試料である場合には、試料吸引の後にバッファを吸引し、すでに針内に存在する液体から当該試料を保護するために最初に気泡を、第二に試料を、第三にバッファセグメントを吸引することにより、非分散試料の後端が作り出されるように保証しなければならないであろう。吸引の順序は常に、すでにＩＦＣ内に存在する液体から勾配を保護するために、１または数個の気泡の吸引で終了する。
【００４１】
第一のステップに先立って、空気と試料の連続したセグメントを作り出し、それらをＩＦＣにインジェクションするために、空気と試料の交番吸引を数回実施するのが好ましい。このようにして試料はＩＦＣ内の流れバッファとの望ましくない分散から保護されることとなり、吸引された試料溶液の前端は公称（最大）濃度を示すであろう。
【００４２】
勾配が確立されると、それは針を経てＩＦＣにインジェクションされ、試料ラインとバッファラインのバルブｖ２とｖ３がプログラムされた順序に従って開閉されて、フローセルに供給される試料パルス（配管の長手方向に勾配を示す）とバッファパルスの交番を可能とし、こうして、試料液フローは少なくとも１回、好ましくは複数回にわたって、この場合システムバッファによって代表されるさらなる液体によって交差させられる。この交差によって、分離された少なくとも２液体セグメントが作り出されることになろう。ただし、システムバッファ以外のその他の液体、たとえば純溶媒、当該の他の化学種を含んだ溶液等も可能であることは言うまでもない。
【００４３】
こうして、漸減試料勾配フローの前端は第一の濃度を表すであろう。最も多くの場合に、前端の濃度は公称濃度に非常に近く、既知の濃度を表していると解することができる。ただし、試料フローの大部分は勾配を示し、したがって、つくり出される上記セグメントの大部分は上記の化合物に関して異なった勾配を有するであろう。
【００４４】
所定量の試料勾配フローがフローセルに流入した後、バルブｖ２は閉じられ、バルブｖ３が開放され、これによって、バッファが試料フローの後にラインにインジェクションされる。固定化された標的を有するセンサ表面の試料通過中に、試料は標的と結合するであろう。試料量は好ましくは平衡の確立を可能とするのに十分な量とされるのがよいであろう。ただし、平衡の達成は必ずしも必要ではない。一例として、図２は非平衡状態を示しているが、平衡レベルはグラフから計算することが可能である。必要とされる時間枠は、試料特異結合および輸送特性、流量、温度、フローセル寸法等に依存している。
【００４５】
試料が十分長時間にわたってインジェクションされたとき、バッファはバルブｖ３を開放しかつバルブｖ２を閉鎖することによってインジェクションされる。バッファが表面を通過している間に、試料は解離するであろう。このプロセスは吸引された試料がインジェクションされてしまうまで反復される。
【００４６】
勾配をフローセルに完全にインジェクションする必要はない。バッファインジェクション（ｖ３開、ｖ２閉）の間に、バルブ１を開放し、小さなセグメントの勾配を廃棄することができる。これは生み出されたパルスの数を減少させ、フルインジェクションに必要とされる時間を減少させるであろう。
【００４７】
図３は前述した手順から結果したセンサグラムの代表例である。
【００４８】
バルブなしのシステムが使用される好ましい１実施形態において、結合相の間つまり試料がセンサセルを通過させられる間、バッファフローは非常に低い値、正規フローの５％未満、たとえば約１％に設定される。これは絶対に必要というわけではないが、試料溶液がバッファラインに漏洩することを防止する。次いで、ある一定の、所定量の試料が特定の速度でＩＦＣにインジェクションされる。次いで、バッファ流量が正規量にリセットされる。バッファがセルを貫流している間、センサ表面の標的に結合した試料化合物は適切な期間内に解離させられる。
【００４９】
本発明の１実施形態において、試料勾配は“二重勾配”であってよい。これは異なった２試料溶液の吸引によって行われ、その際、両者は試料とバッファの場合と同様に分散によって管路内で混合されると、一方の試料化合物の増加勾配と他方の試料化合物の漸減勾配とをつくり出す。この種の勾配は、２試料が標的上の同一の結合部位をめぐって競合するかあるいは両者は標的上の異なった結合部位に結合するかどうかを決定するのに有用である。こうした情報は、異なった治療分野における薬物間の望ましくない相互作用の可能性を指示し得ることから、創薬プロセスにおいて高度に有用である。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、研究さるべき反応系は酵素−基質相互作用であってよい。この場合、酵素溶液がバッファに置き換えられ、当該酵素の適切な基質の勾配は、前述した方式と同様な方法で適切なバッファと基質溶液との吸引によって供される。
【００５１】
図１０に関連して言えば、既知の濃度の試料セグメントを吸引し、それを、連結部ｃ１と管路区間ｍ１とを使用して、ＩＦＣ内でバッファで稀釈することによって、勾配を生み出す別法が可能である。これにより、バッファと試料とはフローセルに接触する前に均質な混合物を形成することができる。パルスは、前述したようにして、つまりポンプまたはバルブｖ２とｖ３の交番によって発生させられよう。連結部ｃ１は単純なＴ連結であってよく、こうして、勾配中の試料濃度は［流量（バッファ）］と［流量（試料）］との比が時間とともに変化するようにして制御される。もう一つの方法は連結部ｃ１として二方弁を使用することであろう。試料の濃度は、ｍ１に向かう口をバッファと試料との間で切り換えて、二方弁の開放時間をバッファと試料に関して異ならせることによって制御されるであろう。管路セグメントｍ１において、試料とバッファの飛び飛びにつながったセグメントは分散によって均質な混合物を形成するであろう。この方法により、最初の若干のパルスのみが既知の化合物濃度を有する分散濃度勾配とは異なって、常に既知の試料濃度を有した勾配を生み出すことが可能である。
【００５２】
本発明による方法は、実用上の限界が実際の数の可能性を制限するとしても、一般的な意味で、つまり任意の数の試料フローに適用することが可能である。複数の異なった試料または試薬液を通すことが所望される場合には、相応した数の管路を設けることができよう。この場合、複数の試料および／またはその他の液体は所定の順序に従って測定システムを交互に通過させられる。ただし、１勾配内にいくつかの成分を有することも可能であり、その場合には単独の管路しか要しないであろう。これは物理的な構成がより複雑になり得ることを意味するが、この種のシステムを考案することもなお本発明のコンセプトに含まれている。
【００５３】
以下、本発明を制限するものと解されてはならない一連の実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００５４】
化合物−標的のいくつかの候補モデル系が適切な特性たとえば急速な結合および解離ならびに十分な応答レベル（２０ＲＵ以上）の有無につき試験された。
【００５５】
比較的緩慢な反応速度を示す系に由来する結合曲線が類似していると思われる事態の理解を得るために、ミオグロビン−抗ミオグロビンにつきパルスインジェクション法による試験が実施された。
【００５６】
リゾチームとラクダ由来のモノクローナル抗リゾチーム抗体との間の相互作用が相互作用速度定数を決定するためのテンプレートとして使用された。
【００５７】
その急速な反応速度により、マルトース−抗マルトース系が、平衡応答レベルが親和性（ＫＤ）を評価するために使用される定常状態研究のために、使用された。
【００５８】
競合阻止がパルスインジェクション法を使用して、ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ、およびいくつかの既知の結合剤（薬物）につき調査された。
【００５９】
使用されたすべてのモデル系につき、１：１結合が仮定された。
【００６０】
（材料および方法）
（計装およびソフトウェア）
一貫して使用されたセンサチップはＣＭ−５表面（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であった。すべての相互作用研究はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて実施された。データはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００制御ソフトウェアによりセンサグラムとして提示され、ＢＩＡ評価ソフトウェア、バージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｍａｔｌａｂバージョン５．３（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）およびＥｘｃｅｌ９７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用して評価された。
【００６１】
（試薬）
別段の記載がないかぎり、ＢＩＡ認証ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，０．１５ＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＥＤＴＡ，０．００５％のＴｗｅｅｎ２０；Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が流れバッファとして使用された。
【００６２】
モノクローナル抗ミオグロビン抗体とヒツジ・ミオグロビンはＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢから入手された。
【００６３】
ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：ｓ  ＳＧＳ、つまり、リゾチームに向けられるラクダ由来の重鎖三重変異体一ドメイン抗体はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手された。鶏卵白リゾチームも同所から入手された。
【００６４】
モノクローナル抗マルトース抗体、モノクローナル抗ＡＦＰ抗体（クローン１１８Ｂ）およびマルトースはＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢから入手された。
【００６５】
ＨＳＡ（基本的に脂肪酸／グロブリン・フリーである、Ａ３７８２）ならびにワルファリン、ジギトキシンおよびフェニルブタゾンはＳｉｇｍａから入手された。
【００６６】
（実施例１）
（緩慢な速度論的相互作用）
モノクローナル抗ミオグロビン抗体が、２０℃にて標準アミン結合方式により、ほぼ２０７０および９３０  ＲＵ（それぞれ図１のフローセル２および４）のレベルに固定化された。ＥＤＣ−ＮＨＳによる７分間の賦活に続いて、抗ミオグロビン（１０μｇ／１０ｍＭの酢酸ナトリウム１ｍｌ当たり，ｐＨ５．０）が５分間にわたって表面にインジェクションされた。次いで、反応しなかったエステルは１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５、の７分間のインジェクションによって脱活された。チャンネル１と３は参照セルとして使用され、上記のようにして賦活／脱活された。流量は５μｌ／分であった。
【００６７】
ミオグロビン２０μｇ／ｍｌ（流れバッファ中の初期濃度１１０ｎＭ）が、パルスインジェクション法を使用して、同時に２０、２５および３０℃にてすべてのフローセルにインジェクションされた。体積誤差を補正するため、フローセル１と３のシグナルがフローセル２と４のシグナルから差し引かれた。各々のインジェクションの後に、再生液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ３，１ｍＭのＮａＣｌ，１０％エタノール）の３０秒の２パルスが続いた。インジェクション手順は以下の通りであった。
【００６８】
１．  空気と試料との若干数の交番セグメントが吸引されて、ＩＦＣにインジェクションされる。このようにして試料はＩＦＣ内における流れバッファとの望ましくない分散から保護されるであろう。
【００６９】
２．  針はある一定の量のバッファで満たされる。次いで試料が吸引されるが、これは分散により試料とバッファとの急速な混合を結果するであろう。吸引とインジェクションとの間の時間に応じ、その寄与はわずかであるとはいえ、拡散もまたおそらくある程度まで試料濃度に影響を及ぼすと考えられる。
【００７０】
３．  試料フローとバッファフローとのバルブは試料パルスとバッファパルスとの交番を可能とするために開放される。図１は流路を概略的に示している。結合相（この場合には１２秒）の間、バッファフローは１μｌ／分に設定され、ある一定量の試料（この場合には２０μｌ）が定められた速度、この場合には１００μｌ／分でＩＦＣ（ｄｉｓｐ）にインジェクションされる。次いで流量は１００μｌ／分にリセットされ、結合した化合物は１２秒間にわたって解離可能とされる。このプロセスは吸引された試料全体がインジェクションされるまで繰り返される。
【００７１】
参照フローセルのシグナルは抗ミオグロビン・セルの応答曲線から差し引かれた。
【００７２】
異なった３温度にて抗ミオグロビン表面で実施されたミオグロビンのパルスインジェクションの結合曲線（図２）はコンピュータシミュレーションによって得られた曲線によく一致していた。
【００７３】
（実施例２）
（相互作用速度定数の評価）
リゾチームに結合するラクダ抗体の三重変異体（ＳＧＳ）の速度論が本発明によるパルスインジェクション法を用いて研究された。すべての実験は３０℃にて実施された。１９０ＲＵ（チップ１）と２８０ＲＵ（チップ２）のリゾチームが実施例１に述べたアミン結合方式を使用して固定化された。２分間におよぶ賦活の直後に、リゾチーム（８μｇ／１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４  １ｍｌ当たり，ｐＨ７．０）が３分間（チップ１）と４分３０秒間（チップ２）にわたってインジェクションされた。１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．０（流量５μｌ／分）が、固定化中、流れバッファとして使用された。ＳＧＳは異なった初期濃度（０．５，１．０および２．０μＭ，ＨＢＳ−ＥＰ）でインジェクションされた。結果は図３に示されている。
【００７４】
試料溶液の体積誤差は参照フローセル・シグナルを差し引いて補正された。個々のパルスは、ＭＡＴＬＡＢを使用して、分離・整列され、その結果、各々のパルスには１結合曲線が対応していた。これらの曲線はＢＩＡ評価ソフトウェアで重ね合わされた。いずれのフィットにも１５パルスが使用された。最初の２パルスは初期濃度であると仮定された。ｋａ，ｋｄおよびＲｍａｘの大域出発値が、その濃度が既知であるために、第二のパルスにフィットされた（第一のパルスはその不規則な形状のために除去された）。これらの値は、次いで、すべてのパルスの濃度を局所的にフィットさせるために使用された。新しい濃度情報を使用して、ｋａ，ｋｄおよびＲｍａｘの評価が改善された。このプロセスはすべてのパラメータが集束するまで反復された。各々のパルスインジェクションは別々に評価された。濃度のフィッティングから一部線形の濃度勾配が生じた。パルスインジェクション法で得られた速度論データは、表１（ＳＧＳ）に、平均値および標準偏差と共に示されている。
【００７５】
【表１】
0004495151.tif 000002
（実施例３）
（親和性の評価）
ほぼ１５０００ＲＵの抗マルトース抗体が４フローセルの１つに固定化された。おおよそ同量のもう一つの抗体、抗ＡＦＰが、高い固定化レベルに起因する参照減算誤差を最小化するために、参照フローセルに固定化された。これらの２タンパク質は以下のように“アミン結合”を使用して固定化された：  ＨＢＳ−ＥＰが、定流量５μｌ／分の流れバッファとして使用された。ＥＤＣで１２分間にわたって賦活した後、標的（抗マルトースまたは抗ＡＦＰ，５０μｇ／１０ｍＭの酢酸ナトリウム１ｍｌ当たり、ｐＨ５．０）が７分間にわたってインジェクションされ、続いて１２分間の脱活が行われた。表面への固定化とすべての測定は２５℃にて実施された。
【００７６】
異なった初期濃度（０．０５および０．１ｍＭ）の試料が表面にインジェクションされた。各々のパルスの結合相と解離相は１２秒であった。これは、平衡レベルに達して、複合体が完全に解離し得るのに十分であった。各々の実験は空のラン、つまり流れバッファのみのパルスの連続、で開始された。最初のパルスＣ１の濃度はバイアル中の濃度に等しいと仮定された。マルトースの屈折率は比較的高く、続くパルスＣｉの濃度は以下のようにして、参照フローセルの応答から評価することができよう：  
Ｃｉ＝Ｒｅｑ（ｉ）／Ｒｅｑ（１）・Ｃ１    （４）
センサグラムからのデータは、ラクダ抗体パルスの場合と同様にして、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）結果ファイルから抽出された。応答レベルは平衡時における１０データポイントの平均を取ることによって得られた。評価はＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて実施された。親和定数ＫＡは線形フィットされたＲｅｑ／Ｃ  対  Ｒｅｑ−プロット（スキャッチャードプロット解析に類似）で負の傾きとして得られた。ＫＤは１／ＫＡとして得られた。Ｒｍａｘはｘ軸との交点から見出された。コンスタントな多濃度パルスシリーズは非線形フィットされたＲｅｑ  対  Ｃ−プロットで評価され、その際、ＫＡ，ＫＤおよびＲｍａｘは直接にソフトウェアから得られた。
【００７７】
パルスインジェクションで得られた結果を従来の方法で得られた結果と比較するため、０から１５００μＭまでに及ぶ範囲の濃度の１２マルトースインジェクションが実施された。インジェクション時間は１５秒であった。データはＢＩＡ評価ソフトウェアを使用してＲｅｑ  対  Ｃ−プロットから評価された。
【００７８】
本発明によるパルスインジェクション法で得られたデータから計算された親和性は９０×１０−４Ｍの平均ＫＤを結果した。従来の親和性アッセイからは８５×１０−４ＭのＫＤが結果した。
【００７９】
（実施例４）
（ＨＳＡに結合する薬物の部位アベイラビリティ）
ＨＳＡ（１５μｇ／酢酸ナトリウム１ｍｌ当たり、ｐＨ５．２）が、標準アミン結合方式（Ｆｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３：１９８６−２０００）を使用して、ほぼ１２２００ＲＵのレベルに固定化された。隣接するフローセルは賦活および脱活され、参照セルとして使用された。新たに固定化された表面は５０ｍＭのＮａＯＨの連続した３〜３０秒インジェクションでコンディショニングされた。表面への固定化とすべての測定は２５℃で実施された。
【００８０】
１００％のＤＭＳＯに溶解した化合物の原液、１００ｍＭ（フェニルブタゾン、ジギトキシン）と１０ｍＭ（ワルファリン）が６７ｍＭの等張リン酸緩衝液（１リットルに対し、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ９．６ｇ，ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ，ＮａＣｌ  ４．１ｇ，ｐＨ７．０）でＤＭＳＯ濃度５％に稀釈された。試料は、次いで、流れバッファ（６７ｍＭの等張リン酸緩衝液、５％ＤＭＳＯ，ｐＨ７．４）で化合物濃度５０μＭに稀釈された。
【００８１】
等量の異なった２試料が封止されたバイアルから、分離用の気泡なしで吸引され、管路内で分散によって混合された。２試料の管路内での推定濃度分布は図４に示されている。試料はそれぞれ１２秒の結合相と解離相を使用してインジェクションされた。試料の組合わせは表２に示されている。いずれの薬物も流れバッファと一度組み合わされて流された。各々のランの前後にＤＭＳＯ補正（Ｆｒｏｓｔｅｌｌ−Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）が実施されて、参照セルとＨＳＡフローセルとの間のＤＭＳＯ体積差が補償された。
【００８２】
試料−バッファ・ランからの平衡データが収集され、応答レベルが積算された。この和が、同じ化合物が混合物としてインジェクションされた時に得られた応答と比較された。
【００８３】
【表２】
0004495151.tif 000003
２試料勾配アッセイによる平衡応答レベルは図５と６に示されている。図７は、個々の試料からの積算応答（Ｘ＋Ｙ）と、混合物としてインジェクションされた試料の応答（ＸＹ）との間の比較を示したものである。ジギトキシン（Ｄ）とワルファリン（Ｗ）は非競合結合剤である。したがって、個々の試料の積算応答と混合試料の応答は同じはずであろう（図６）。他方、フェニルブタゾンとワルファリンの場合には、これらが同じ部位をめぐって競合することから、個々の試料の積算応答は混合物としてインジェクションされた試料からの応答よりも高いであろう（図５）。
【００８４】
（実施例５）
（最適再生条件の決定）
ＳＰＲ分析においてしばしば遭遇する問題は最適再生条件の決定である。再生が弱すぎれば、センサチップは十分な程度まで回復せず、再生が強すぎれば、センサチップは破壊されるであろう。したがって、信頼性の高い速やかな手順で再生を最適化し得ることが望ましい。これは本発明によるパルスインジェクション法で行うことができる。
【００８５】
図８は、インジェクションが異なった３種の液体の交番パルスを含む場合向けの構成を示している。
【００８６】
こうして、異なった３種の液体ライン、つまり、システムバッファ（ＨＢＳバッファ）用の第一のラインと、抗体（抗ビオチン抗体（（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ  Ｕ．Ｋ．））用の第二のラインと、再生液（５０ｍＭのＮａＯＨまたは１０ｍＭのグリシンｐＨ３．０（（いずれもＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ））用の第三のラインとを備えたシステムが設けられる。センサチップはＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）である。
【００８７】
インジェクション順序は以下の通りであった：  バッファ−抗体−バッファ−再生（勾配）−バッファ−抗体−バッファ−再生（勾配）−バッファ等々。２つの実験が実施されたが、それらの結果は図９に示されている：  第一の実験は水とＮａＯＨの勾配で実施され（破線）、第二の実験は水とグリシンの勾配（実線）で実施された。
【００８８】
ＮａＯＨ  ―  第一の（最大稀釈された）再生パルス  ―  については、再生効果は見られない。第二のパルスは有意な再生をもたらし、３およびそれ以上のパルスは完全な再生をもたらす。グリシンについては、いかなる稀釈でも再生は見られない。
【００８９】
（実施例６）
（酵素と基質の相互作用）
図１に示したものと類似のシステム構成が採用されるが、試料ラインは酵素ＭＡＰＫ２の勾配を供するために使用され、バッファは酵素基質としてのミエリン塩基性タンパク質を含んだ溶液に代えられる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）センサまたは分光光度計が、酵素作用の生成物（リン酸化ミエリン塩基性タンパク質）の検出またはミエリン塩基性タンパク質濃度の減少の検出に使用される。
【００９０】
二重勾配は、針を適切な稀釈溶液たとえば基質を含んだバッファで満たし、次いで酵素溶液を吸引することによって達成される。この場合、分散は先述したのと同様にして勾配をつくり出すであろう。
【００９１】
図１の場合に論じたのと同様なパルス順序が使用される。
【００９２】
本出願において、新しいインジェクション法が開示された。これは、親和性、速度論および部位特異性の研究に使用することが可能である。
【００９３】
上述した一連の実施例は本発明の機能を裏付けている。
【００９４】
試料の分散によるパルスインジェクション法で生み出されたマルトース−抗マルトース相互作用のＫＤ値の平均は従来の方法で評価された平均ＫＤ値に非常に類似している。
【００９５】
従来の方法ならびに本発明による方法はいずれも、ｋｄにつき、同等な、比較的低い標準偏差を結果する。いずれの方法についても、平均ｋａならびにｋｄは同じ範囲内にある。
【００９６】
パルスインジェクション法の主たる利点の一つは試料消費量が低いことである。従来の速度論的解析にはいくつかの試料吸引が必要とされ、それらのそれぞれに追加量の溶液が使用されるが、パルスインジェクション法によれば多数の結合曲線を得るのに単一の吸引で十分である。さらに、パルスアッセイは従来のアッセイに比較して非常にわずかな時間しか要しない。従来の方法（たとえば、１２の濃度を含む、実施例３の従来のマルトースアッセイ）の一時間半以上に比較して、２０パルスからなる１サイクルの持続時間は約２０分である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は本発明による方法を実施するためのシステムを概略的に示す図である。
【図２】図２は本発明によるパルスインジェクションの非平衡状態を示すグラフである。
【図３】図３は本発明による方法の１実施形態によって得られた、時間の関数としての表面近傍質量濃度を表す代表的なセンサグラムである。
【図４】図４は二重勾配を示す図である。
【図５】図５はフェニルブタゾンとワルファリンとの個々の試料の応答と両者の混合試料の応答を示す図である。
【図６】図６はジギトキシンとワルファリンとの個々の試料の応答と両者の混合試料の応答を示す図である。
【図７】図７は加算された応答の総計とジギトキシンとワルファリンとの混合物の応答を示す図である。
【図８】図８はインジェクションが３種の異なった液体の交番パルスを含む場合のシステム構成を示す図である。
【図９】図９は３パルスインジェクションが使用される場合の応答曲線を示す図である。
【図１０】図１０は勾配をつくり出す別法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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