(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｖ）および（ｊ）に記載のポリヌクレオチドからなる群より選ばれる、いずれか１つのポリヌクレオチドからなる喘息の遺伝的素因マーカー：
（ａ）配列番号１または配列番号２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−７番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７または配列番号８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の３５１９番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９または配列番号１０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の４７９２番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１７または配列番号１８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の６４４４番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１９または配列番号２０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−８９２１番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；および
（ｊ）上記いずれかのポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
喘息の遺伝的素因を検査する方法であって、ヒトトル様レセプター３遺伝子における遺伝子多型を検出することを特徴とし、前記遺伝子多型が以下の（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｓ）および（ｔ）に記載の一塩基多型部位からなる群より選ばれる、少なくとも一箇所の一塩基多型であることを特徴とする方法：
（ｋ）配列番号１または配列番号２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−７番目に存在する一塩基多型部位；
（ｎ）配列番号７または配列番号８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の３５１９番目に存在する一塩基多型部位；
（ｏ）配列番号９または配列番号１０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の４７９２番目に存在する一塩基多型部位；
（ｓ）配列番号１７または配列番号１８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の６４４４番目に存在する一塩基多型部位；および
（ｔ）配列番号１９または配列番号２０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−８９２１番目に存在する一塩基多型部位。
【請求項３】
喘息が小児喘息であることを特徴とする請求項２に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトアレルギー疾患に関連する遺伝子の変異を伴う多型、特にアレルギー疾患の遺伝的素因マーカーとしてのヒトトル様レセプター３（以下、ヒトＴＬＲ３または単にＴＬＲ３という）の遺伝子多型およびその使用に関する。より詳しくは、ＴＬＲ３遺伝子多型、およびその検出用プライマー若しくはプローブ、それらを用いるアレルギー疾患の遺伝的素因の検査方法、ウイルス疾患の罹患性の判定方法、およびアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法、並びにアレルギー疾患の治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー疾患には遺伝的素因が強く関与していることが、双生児や家系を対象にした研究で示されてきた。遺伝子領域の塩基配列の変化が直接疾患を引き起こす原因となる遺伝性疾患とは異なり、アレルギー疾患を含む糖尿病や高血圧などは「ありふれた疾患（ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）」と呼ばれている。ありふれた疾患は、遺伝的素因と環境要因との相互作用により疾患が発現すると考えられ、遺伝的素因として多数の遺伝子が疾患に関与しており、その疾患関連遺伝子の多型に起因した量的および質的（機能的）相違が疾患の多様性に影響していると言われている。
【０００３】
ヒトゲノム中の塩基配列において、各個体間で多くの部位において配列の相違があることが明らかになっており、この相違が遺伝子多型である。この配列の相違は、個体毎の表現型や疾患への罹患しやすさ（罹患性）等の多様性を生じる一因と考えられている。一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍともいう）は、個体間のＤＮＡ塩基配列上の１塩基の違いが生じている部位において、人口中１％以上の頻度で存在するものと定義される遺伝子多型であり、ヒトゲノム中に３００〜１０００万カ所あると言われる。ＳＮＰは遺伝子発現の質的・量的変化をもたらす原因となりうるとともに、ゲノム中に高頻度存在することから遺伝子解析におけるマーカーとして重要であり、遺伝子機能との関連検討や疾患関連遺伝子の探索において利用が図られている。
【０００４】
一塩基多型を含む遺伝子多型を利用したゲノム解析により、疾患と強く連関した一塩基多型、疾患に対する罹患性の差異の原因となる遺伝子多型などを明らかにする研究が行われている。疾患の原因となる一塩基多型部位や遺伝子同定による原因物質の明確化により、遺伝子多型の塩基配列の差異を判定して、疾患への罹患リスクの判定、疾患発症の機構解明、疾患に対する予防指針の提示、疾患の発症機構や標的明確化による創薬開発など多くの展開の可能性があることから、遺伝子多型による疾患関連遺伝子探索・同定の研究が注目を集めている。
【０００５】
アレルギー疾患の代表でもある喘息は、様々な刺激に対する気管支系の過剰な反応性亢進によって引き起こされる発作性、可逆性の気管支閉塞を特徴とする疾患であり、気道炎症、上皮損傷、気道平滑筋肥厚、および気道過敏症などの症状をもたらす。喘息における遺伝的素因の存在は、分子生物学的手法の確立以前から双生児や家系の研究等により研究が重ねられており、一卵性双生児の方が二卵性双生児よりも形質の一致率が高いことなど多くの報告において遺伝的素因の関与が示されてきた。喘息患者は世界的に増加傾向にあり、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）によると、世界全体の喘息患者数は１億５０００万人以上である。日本における喘息患者は３００万人以上であり、罹患率は３０年前の２倍以上と顕著な増加を示しており、発作による呼吸困難などで１年間におよそ６０００人が亡くなっている。
【０００６】
ヒトＴＬＲは、自然免疫における病原体認識分子であり、認識するリガンドにより現在１０種類が確認され、ＴＬＲファミリーを形成している（特許文献１および特許文献２）。ＴＬＲは、レセプター型のＩ型膜タンパク質であり、細胞外部分としてタンパク質間の結合に関わるロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）と呼ばれるモチーフを含む部分があり、細胞内部分としてＩＬ−１レセプターに類似したシグナル伝達ドメインを含む部分がある。ＴＬＲは２重鎖ＲＮＡ、リポ多糖、ペプチドグリカン、フラジェリン、細菌由来ＤＮＡなど病原体の成分である異物分子を認識し、自然免疫による病原体排除機構（マクロファージや好中球、或いは樹状細胞）の活性化に関与することが分かっており、獲得免疫の発動にも関与していると考えられている。
【０００７】
ＴＬＲ３は、ＴＬＲファミリーの中で２重鎖ＲＮＡをリガンドとして認識する分子であることから、ウイルス感染の防御に関与していると考えられている。これは、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら（非特許文献１）によっても、報告されている。
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５１４０８３（Ｐ２００２−５１４０８３Ａ）号公報
【特許文献２】特開２０００−１２８９００（Ｐ２０００−１２８９００Ａ）号公報
【非特許文献１】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ，４１３巻，７３２−７３８頁，２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、近年、アレルギー疾患の罹患者が急増しており、その予防や発症機序の解明が望まれている。特に喘息は、アレルギー疾患としては重篤な症状を呈し、その予防、発症機序・原因の解明が強く望まれている。アレルギー疾患には遺伝的素因が関与するが、患者の発症リスクや重症度の予測が可能になれば、個々の体質を考慮した効果的な生活指導や予防対策を行うことが可能となる。また、アレルギー疾患関連遺伝子の特定は、より有効な治療方法や治療薬開発の重要な指針となる。
【００１０】
したがって、本発明は、アレルギー疾患の素因遺伝子同定とその遺伝子領域に存在する、疾患に関連した遺伝子多型を明らかにし、この遺伝子多型を利用したアレルギー疾患の遺伝的素因の検査方法を提供することを主な目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は前記遺伝子多型を構成する一塩基多型の検出用プライマー若しくは検出用プローブを提供し、アレルギー疾患の診断へそれらを使用することを目的とする。
【００１２】
くわえて、本発明は、前記遺伝子多型を利用して、ウイルス疾患の罹患性の判定方法、およびアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法、並びにアレルギー疾患の治療剤などを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、連鎖解析等によりアレルギー疾患との関連を示す染色体領域を絞り込む連鎖不平衡マッピングと、既知の情報から喘息やアトピーなどのアレルギー疾患の病態に関連すると予測される候補遺伝子を選択して罹患性（疾患感受性）に直接影響を及ぼしていると考えられるＳＮＰの頻度をアレルギー疾患群と対照群とで比較する候補遺伝子アプローチによる関連解析との双方でアレルギー疾患に関連する遺伝子を探索した。さらに、候補遺伝子領域の多型解析、患者−対照研究による相関解析等による検討を重ねた結果、ＴＬＲ３遺伝子領域内にアレルギー疾患群と対照群間で有意にアレル頻度の異なる（すなわち、罹患性と相関のある）新規遺伝子多型を同定することに成功した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
したがって、上記の課題は以下に述べる本発明によって達成される。すなわち、本発明は、アレルギー疾患の遺伝的素因マーカー（発症危険因子）としてのＴＬＲ３遺伝子多型およびアレルギー疾患の診断および治療におけるその使用を提供するものであるが、特定的には下記の（１）〜（３）である。
（１）  以下の（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｖ）および（ｊ）に記載のポリヌクレオチドからなる群より選ばれる、いずれか１つのポリヌクレオチドからなる喘息の遺伝的素因マーカー：
（ａ）配列番号１または配列番号２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−７番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７または配列番号８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の３５１９番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９または配列番号１０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の４７９２番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１７または配列番号１８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の６４４４番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１９または配列番号２０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−８９２１番目に存在する一塩基多型部位を含むポリヌクレオチド；および
（ｊ）上記いずれかのポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド。
（２）  喘息の遺伝的素因を検査する方法であって、ヒトトル様レセプター３遺伝子における遺伝子多型を検出することを特徴とし、前記遺伝子多型が以下の（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｓ）および（ｔ）に記載の一塩基多型部位からなる群より選ばれる、少なくとも一箇所の一塩基多型であることを特徴とする方法：
（ｋ）配列番号１または配列番号２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−７番目に存在する一塩基多型部位；
（ｎ）配列番号７または配列番号８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の３５１９番目に存在する一塩基多型部位；
（ｏ）配列番号９または配列番号１０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の４７９２番目に存在する一塩基多型部位；
（ｓ）配列番号１７または配列番号１８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の６４４４番目に存在する一塩基多型部位；および
（ｔ）配列番号１９または配列番号２０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の−８９２１番目に存在する一塩基多型部位。
（３）  喘息が小児喘息であることを特徴とする上記（２）に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に従えば、アレルギー疾患の遺伝的素因を検査することが可能になり、これは本発明のポリヌクレオチドを使用して、被験者（個体）のゲノムＤＮＡ等の試料から、本発明の遺伝的素因マーカーを検出することによって達成される。本発明の検査方法を利用すると、被験者のアレルギー疾患に対する罹患性（易罹患性）を予測できるので、アレルギー疾患の予防のための生活指導が可能となる。さらに、アレルギー疾患発症の遅延、早期発見をも可能とする。また、本発明で得られた知見は、アレルギー疾患の発症機序の解明および治療薬の開発にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、異なる遺伝子型からの検体のＣＤ１４＋細胞をｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激したときに発現されるＴＬＲ３の発現量を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）濃度に対してプロットした図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本明細書において使用する、「ポリヌクレオチド」とは、２個以上のヌクレオチドがホスホジエステル結合で結合されてなる物質を意味する。「ポリヌクレオチド」には、「リボヌクレオチド（ＲＮＡ）」と、「デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）」がある。ここでＤＮＡはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。また、「ポリヌクレオチド」は、これらに限定されず、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸などの人工合成核酸をも包含する。本明細書で使用する「核酸」という用語は、前記「ポリヌクレオチド」と、同義的若しくは、交換的に使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。さらに、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸およびポリヌクレオチドを指し、これは組換えＤＮＡ技術などにより調製された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリヌクレオチドを指す。
【００１９】
本明細書において使用する、「遺伝子多型」とは、ヒトゲノム上の塩基配列が各個体間において異なる部分を意味するものである。「一塩基多型（ＳＮＰ）」とは、このような遺伝子多型の中で、一塩基の核酸の変異として現れるものを指す。さらに、「核酸断片」とは、核酸の部分配列および／または全長配列を有するものを指す。「遺伝子領域」とは、タンパク質をコードする翻訳領域および／またはタンパク質コード領域以外のプロモーター、イントロン領域、該遺伝子近傍の機能未同定領域などの非翻訳領域を指す。
【００２０】
本明細書において使用する、「特異的にハイブリダイズする」とは、当業者に認識されている、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語と同義であり、２つの核酸（または断片）が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ），米国，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９年，ｐｐ．９．４７−９．６２，ｐｐ．１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００２１】
より具体的には、前記「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃において６．６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで高くすることができる。
【００２２】
本発明において使用する核酸被検試料（検体ともいう）の起源は、個体の体細胞であればその部位は限定されない。例えば、試料の採取しやすさ、含有量および抽出用試薬の種類などから、血液、皮膚、組織、口腔粘膜細胞などが好適に用いられる。また、試料は抽出したゲノムＤＮＡのほかにも、ゲノムＤＮＡの一部塩基配列を含むものでもよい。すなわち、一塩基多型部位の分析前に、試料核酸中の目的に合致する全部または一部塩基配列（ＤＮＡ断片）を任意の好適な方法、例えばＰＣＲなどで増幅した試料を核酸被検試料として使用してもよい。なお、ＤＮＡの抽出は、公知の方法、例えば、「ＱＩＡａｍｐ  ｍｏｎｏ  ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ社製）などの市販の抽出キットを用いて行うことができる。
【００２３】
本発明において使用するプライマーは、化学合成法など任意の好適な作成方法で調製できる。プライマーには、ＴＬＲ３遺伝子領域上の遺伝子多型部位を含むプライマー、および一塩基多型部位を含まないがＰＣＲなどにより一塩基多型部位を含む核酸断片を得るためのプライマー、のいずれもが含まれる。後者のプライマーとしては、例えば検出する目的ＳＮＰの直前の塩基または数塩基前の塩基配列に対応するように設計したプローブ、すなわちその３’末端または５’末端がＳＮＰの１塩基の上下流または近傍にあるように設計したプライマーが好ましい。プライマーは、使用する検出方法等に合致した任意の好適な長さでよいが、連続する１０ヌクレオチド以上、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。具体的には、このようなプライマーは、一塩基多型部位および／またはその近傍の塩基配列情報に基づいてフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーとして、例えば自動合成装置を用いて合成できる。プライマーは、必要ならば１個以上の標識を保有してもよい。好ましい標識としては、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などが挙げられる。プライマーは、鋳型となる核酸と相補的な配列を有することが望ましいが、必要ならばそのプライマー内に、望ましくない影響が生じない限り１箇所以上の相補的でない塩基対（ミスマッチ）を導入してもよい。
【００２４】
本発明において使用するポリヌクレオチドプローブは、任意の好適な合成方法で調製できる。ポリヌクレオチドプローブは、検出方法等に合致した任意の好適な長さでよいが、連続する１０ヌクレオチド以上、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。プローブは、ＴＬＲ３遺伝子領域中の対応する一塩基多型部位のいずれか一方のアレルに相補的な塩基配列を含む。ただし、必要ならば、そのポリヌクレオチドプローブに望ましくない影響が生じない限り、１箇所以上の相補的でない塩基対を導入してもよい。また、プローブは、プライマーと同様に、１個以上の標識を保有してもよい。
【００２５】
本発明には、一塩基多型部位１箇所以上を含む核酸断片も包含される。例えば、一塩基多型部位を含まないその近傍の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲなどにより、該一塩基多型部位を含むように増幅した核酸などである。１箇所以上の一塩基多型部位を含む核酸は、マルチプライマーＰＣＲ増幅産物のように各遺伝子多型が別個の核酸断片上にあっても、または連続した核酸断片上に複数の遺伝子多型が存在してもよい。ＰＣＲにおける試料の増幅可能な長さの限界、伸長反応での塩基の相補性の正確さ、解析の容易さなどの条件から、核酸断片の長さは１５ｂ〜１ｋｂが望ましい。このような核酸断片は、例えば塩基配列解析（シークエンス）やＳＳＣＰなどの試料として一塩基多型部位の判定のための試料、チップ・マイクロアレイ用のプローブ等に使用できる。核酸断片は、必要ならば１個以上の標識を保有してもよい。
【００２６】
一塩基多型の検出方法としては数多くの方法が知られている。例えば、塩基配列解析（シークエンス）、インベーダーアッセイ（Ｃｌｅａｖａｓｅ、アレル特異的プローブおよびＦＲＥＴプローブによる検出反応を用い、アレル特異的プローブが多型部位に相補的で３重鎖が形成されれば、Ｃｌｅａｖａｓｅによる反応が進行して蛍光が発生する）、ＴａｑｍａｎＰＣＲ（遺伝子多型部分の各アレルに相補的な配列をプローブ内に有するＴａｑｍａｎプローブとＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲであり、Ｔａｑｍａｎプローブ中の一塩基多型部位の塩基配列が相補的な場合に蛍光が発生する）、ＭＳによる塩基判定（遺伝子多型部分直前までのプライマーを用いて一塩基伸長反応を行い、伸長した塩基をＭＳで質量分析する）、パイロシークエンシング（塩基伸長反応で発生するピロリン酸をＡＴＰに転換し生物発光で測定し、発光により相補鎖合成の有無を判定する）、ＳｎａＰｓｈｏｔ（一塩基多型部位直前までのプライマーを用いて標識ｄｄＮＴＰ（４種類の塩基毎に異なる標識）による一塩基伸長反応を行い、伸長した塩基を標識の種類で判別する）、アレル特異的プライマー法（一塩基多型部位の配列が相補的な場合はＰＣＲで伸長するが、ミスマッチの場合には伸長しない配列のプライマーを設計し、ＰＣＲにおけるプライマーと増幅産物の有無を対照して遺伝子多型を判定する）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）、ＤＮＡマイクロアレイ等ハイブリダイゼーションによる遺伝子多型検出、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）、ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ヘテロ２本鎖分析、ＷＡＶＥシステム（クロマトグラフィーによる塩基の相違検出）、分子ビーコン（Ｓｎｉｐｅｒ法など）などが挙げられる。このような公知であるいずれかの検出方法において、本発明のプローブ、および／またはプライマー、および／またはポリヌクレオチドなどを用いて、本発明の検査方法に従い所望の一塩基多型部位を検出することができる。
【００２７】
本発明の１つの実施の形態において、アレルギー疾患の発症と関連する遺伝子多型は、例えば以下のようにして検出できる。
【００２８】
アレルギー疾患患者（例えば、喘息患者）群からの検体を用いて、ＳＮＰを決定し、その中から、１次候補ＳＮＰを選抜する（１次スクリーニング）。さらに、検体数を増やして候補ＳＮＰを絞り込む（２次スクリーニング）。一方、健常者の対照群からの検体を用いて、ＳＮＰを決定し、その中から、１次候補ＳＮＰを選抜する。これらＳＮＰと前記２次スクリーニングから得られたＳＮＰとから、高密度ＳＮＰマップの作成、対象関連解析を行って、遺伝子多型を同定し、さらにＳＮＰ間で連鎖不均衡が成立するか否かを検証して、互いに連鎖不均衡であることが確認されたものをアレルギー疾患と関連するＳＮＰと特定する。すなわち、これらの多型ごとにアレルギー疾患患者群と対照群の間に、アレル出現頻度に有意差がある。
【００２９】
このようにして、本発明において、以下の（ｋ）〜（ｔ）に示すＴＬＲ３遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域にある１０個のＳＮＰが特定された。
（ｋ）配列番号１または配列番号２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の−７番目に存在する一塩基多型部位；
（ｌ）配列番号３または配列番号４で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の１６３８番目に存在する一塩基多型部位；
（ｍ）配列番号５または配列番号６で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の１６５６番目に存在する一塩基多型部位；
（ｎ）配列番号７または配列番号８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の３５１９番目に存在する一塩基多型部位；
（ｏ）配列番号９または配列番号１０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の４７９２番目に存在する一塩基多型部位；
（ｐ）配列番号１１または配列番号１２で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の４９６０番目に存在する一塩基多型部位；
（ｑ）配列番号１３または配列番号１４で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の５２５２番目に存在する一塩基多型部位；
（ｒ）配列番号１５または配列番号１６で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の翻訳領域の６３０１番目に存在する一塩基多型部位；
（ｓ）配列番号１７または配列番号１８で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の翻訳領域の６４４４番目に存在する一塩基多型部位；および
（ｔ）配列番号１９または配列番号２０で特定され、ヒトトル様レセプター３遺伝子の非翻訳領域の−８９２１番目に存在する一塩基多型部位。
【００３０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９は、それぞれ上記（ｋ）〜（ｔ）に示す一方の対立遺伝子型で、一塩基多型部位から５’側および３’側に各１０塩基ずつの連続する塩基配列である。
【００３１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０は、それぞれ上記（ｋ）〜（ｔ）に示す上記と異なるもう一方の対立遺伝子型で、一塩基多型部位から５’側および３’側に各１０塩基ずつの連続する塩基配列である。
【００３２】
上記に列挙した配列からなる、或いはそれを含むポリヌクレオチドは、アレルギー疾患の遺伝的素因マーカーであり、各マーカーを本発明の検査方法において、検出することによりアレルギー疾患の遺伝的素因を検査することが可能となる。
【００３３】
本発明の別の実施の形態に従えば、前記検査は以下のように行うことができる。
【００３４】
被験者から核酸試料（例えば、組織、細胞、血液など）を採取し、常法に従いＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを抽出する。得られたＤＮＡサンプルをＰＣＲ法により増幅し（遺伝的素因マーカーを含む領域）、各種の一塩基多型の検出方法を用いて、ＴＬＲ３遺伝子領域の各多型部位（−７番目、１６３８番目、１６５６番目、３５１９番目、４７９２番目、４９６０番目、５２５２番目、６３０１番目、６４４４番目、−８９２１番目）のうち、１箇所以上における遺伝子多型の塩基の種類を決定する。上記のようにして、関連解析から得られたＳＮＰとアレルギー疾患の病態（重症度を含む）との相関関係から、決定したＴＬＲ３遺伝子多型を参照してその個体の状態を判定する。
【００３５】
ＴＬＲ３遺伝子の６４４４番目のＳＮＰと喘息患者との間に強い相関関係があることを、下記実施例において確かめている。したがって、ＴＬＲ３遺伝子の６４４４番目のＳＮＰを検出することによって、アレルギー疾患の遺伝的素因を検査することが可能である。また、ＴＬＲ３遺伝子の６４４４番目のＳＮＰを検出する代わりに、ＴＬＲ３遺伝子の６４４４番目に存在するＳＮＰ部位と連鎖不平衡にあるＴＬＲ３遺伝子におけるＳＮＰ部位を検出しても、アレルギー疾患の遺伝的素因を検査することが可能である。ＴＬＲ３遺伝子の６４４４番目に存在するＳＮＰ部位と連鎖不平衡にあるＴＬＲ３遺伝子のＳＮＰ部位としては、３５１９番目及び４７９２番目のＳＮＰなどがあるが、これらに限定されない。当業者であれば、公知の方法に基づいて、連鎖不平衡にあるＳＮＰ部位を見つけることが可能である。
【００３６】
より具体的には、前記ＤＮＡサンプルの遺伝的素因マーカーを含む領域で、ＰＣＲを行い、１）ＳＳＣＰ法で塩基の種類を決定する、または２）該ＰＣＲ増幅産物を直接シークエンス（Ｓａｎｇｅｒ法やＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法）する。或いは、遺伝的素因マーカーを含む領域に特異的にハイブリダイズするプローブを使用して、前記ＤＮＡサンプルまたはそのＰＣＲ増幅産物から多型部位を直接検出する（インベーダーアッセイなど）。さらに、遺伝的素因マーカー近傍（直前）までの配列を有するプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行い、伸長した塩基をＭＳ（質量分析器）で解析する。
【００３７】
前記の多型部位の検出、解析には、本発明のポリヌクレオチドが好ましく使用されるが、プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に記載の塩基配列のいずれか１つの塩基配列を含むことがさらに好ましい。
【００３８】
また、前記検出に、本発明のポリヌクレオチドがプライマーとして使用される場合は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に記載の塩基配列のいずれか１つの塩基配列を含むことが好ましい。
【００３９】
本発明において、本発明のプローブおよびプライマーは、それらの各々を有効成分とする検査用キットとして好ましくは提供される。特に、プライマーを含んでなる本発明の検査用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびサイズマーカー等を含んでよい。さらに、適当な緩衝剤、洗浄剤、反応停止液などが含まれてもよい。
【００４０】
くわえて、ＴＬＲ３遺伝子の遺伝子多型に特異的な抗体を検出に使用することもできる。
【００４１】
本発明の検査用キットは、アレルギー疾患の遺伝的素因マーカーの検出を企図するものであるが、必要ならば他の疾患関連因子（マーカー）の検査用キットと組み合わせて、その検査結果から被験者の複合的な状態を判定することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１）
関連性研究
【００４４】
（１）被験者
十分なインフォームドコンセントの上で、アレルギー疾患（小児喘息および成人喘息）患者および対照者（健常者）の検体を、臨床情報と共に収集した。なお、被験者は、全て日本人であった。
【００４５】
（２）ＳＮＰ
上述のようにＴＬＲ３遺伝子におけるアレル頻度を算出した。それぞれの多型について、小児喘息患者群と対照群との間の有意差を検定したところ、特に６４４４番目の塩基置換が小児喘息患者に多く存在することが分かった。すなわち、健常者におけるＴのホモ接合体の場合が、Ｃのホモ接合体およびＣＴのヘテロ接合体の場合にくらべて有意に高かった（ｐ＝０．００００２０）。結果を表１に示す。したがって、ＴＬＲ３遺伝子領域の６４４４番目の遺伝子多型がＴのホモ接合体である場合、小児喘息疾患群に比べて健常者である確率が有意に高く、この特定の遺伝子多型が疾患の表現型との強い関連を有するという結果を得た。また、それぞれの多型について、成人喘息患者群と対照群との間の有意差を検定したところ、この場合も、特に６４４４番目の塩基置換が成人喘息患者に多く存在することが分かった。すなわち、健常者におけるＴのホモ接合体の場合が、Ｃのホモ接合体およびＣＴのヘテロ接合体の場合にくらべて有意に高かった（ｐ＝０．００９７）。結果を表２に示す。したがって、ＴＬＲ３遺伝子領域の６４４４番目の遺伝子多型がＴのホモ接合体である場合、成人喘息疾患群に比べて健常者である確率が有意に高く、この遺伝子多型が疾患の表現型との強い関連を有するという結果を得た。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
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【００４８】
また、６４４４番目以外のＳＮＰについて調べたところ、−７番目のＳＮＰではホモ接合体ＣＣの場合に、３５１９番目のＳＮＰではホモ接合体ＣＣまたはヘテロ接合体ＣＡの場合に、４７９２番目のＳＮＰではホモ接合体ＧＧまたはヘテロ接合体ＧＣの場合に、６３０１番目のＳＮＰではホモ接合体ＣＣまたはヘテロ接合体ＣＴの場合に、−８９２１番目のＳＮＰではホモ接合体ＴＴの場合に、それぞれ、健常者に比べて喘息患者の割合が高かった。
【００４９】
（実施例２）
遺伝子多型と表現型の関連
【００５０】
（１）実験方法
ＴＬＲ３遺伝子領域の６４４４番目における遺伝子多型のアレル型とＴＬＲ３遺伝子の発現についての相関を調べた。ＴＬＲ３遺伝子領域の６４４４番目の遺伝子多型ＴまたはＣアレル検体の末梢血から「リンフォプレップ」（Ａｘｉｓ  ｓｈｉｅｌｄ社製）を用いて、ヒト末梢血単球画分を得た。単離した末梢血単球画分は、磁気分離法（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）に供し、分化抗原ＣＤ１４を持つ単球画分を得た。この画分をＴＬＲ３リガンド（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、アマシャムファルマシア社製）１０μｇ／ｍＬ濃度で添加したＲＰＭＩ１６４０培養液において培養した。培養後の細胞からＲＮＡ抽出液（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、総ＲＮＡを抽出した。抽出した総ＲＮＡからｃＤＮＡ合成試薬（Ｔｈｉｒｍｏｓｃｒｉｐｔ、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、総ＲＮＡ中のｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成した。ＴＬＲ３のｃＤＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により定量してＴＬＲ３の発現量を調べた。
【００５１】
（２）実験結果
６４４４番目の塩基の一塩基多型Ｔアレルのホモ接合体４名、Ｃアレルのホモ接合体４名を検体として、ＴＬＲ３発現量を比較した。各アレル４検体分の発現量比の平均値を図１に示す。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１０μｇ／ｍＬで添加し、培養した場合、Ｔアレル試料におけるＴＬＲ３発現量は、Ｃアレル試料よりも約８倍多かった。試験した各アレル４検体ともに同様の傾向であり、Ｃ６４４４Ｔの多型によりＴＬＲ３発現量に大きな差がみられることがわかった。すなわち、小児喘息に罹りやすい遺伝子型の検体では、ＴＬＲ３の発現量が少なかった。
【００５２】
以上、実施例１〜２の結果から、ＴＬＲ３遺伝子の遺伝子多型はアレルギー患者と健常者との間で有意な頻度差があることを見いだした。また、そのアレル型とＴＬＲ３発現量との間に有意な差異を見いだし、アレル型と機能の間に関連があることを明らかにした。したがって、前記遺伝子多型はアレルギー疾患との関連が明らかになった多型であり、アレルギー疾患発症の機能および遺伝的素因の検査指標（マーカーを含む）として有用であることがわかった。
【００５３】
また、実施例２に示した結果から、ＴＬＲ３発現量がアレルギー疾患の表現型と関連があることが明らかになったが、この発現量の調節がアレルギー疾患の治療に繋がる可能性がある。したがって、ＴＬＲ３の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする薬剤は、アレルギー疾患の治療剤となりうる。本発明には、このような機能を有するアレルギー疾患の治療剤も包含される。
【００５４】
前記候補薬剤がＴＬＲ３遺伝子発現を調節するかどうかは、ＴＬＲ３遺伝子の発現量を実施例２で行ったように、直接決定してもよい。また、別法としてＴＬＲ３遺伝子のＯＲＦと公知のレポーター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子）との遺伝子融合物を作成し、それを含む細胞系を候補薬剤に曝し、対照との間のレポーター遺伝子の示差的発現をモニターしてもよい。本発明には、このようにして実施されるアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法も包含される。
【００５５】
さらに、実施例２に示した結果から、Ｔアレル試料がＣアレル試料と比較して、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激により、ＴＬＲ３を多量に発現することが分かった（前述）。ＴＬＲ３は、ウイルスの二重鎖ＲＮＡを認識して（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、前掲）、抗ウイルス蛋白を合成することが知られている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７，２５１，２００２）。したがって、この結果は、Ｔアレル接合体を有する個体が、Ｃアレル接合体を有する個体と比較して、ウイルス感染に対する抵抗力が高いことを示唆している。すなわち、被験者ＴＬＲ３遺伝子の遺伝子多型がウイルス疾患の罹患性と相関関係にあり、その指標となりうることである。そのような指標を用いて、分析すると、特定の被験者のウイルス疾患に対する罹患性を判定できることになる。さらに、その被験者のアレルギー疾患に対する罹患性とウイルス疾患に対する罹患性との相関関係を解析することもできる。本発明は、ＴＬＲ３遺伝子の遺伝子多型を利用する、ウイルス疾患に対する罹患性の判定方法（発症前診断）をも包含する。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上説明したとおり、ＴＬＲ３遺伝子領域における遺伝子多型は、アレルギー疾患（特に小児喘息）と有意に関連する遺伝子多型であり、個体におけるアレルギー疾患発症の遺伝的素因を検査するマーカーとして用いることができる。したがって、該マーカーを検出する、本発明の検出用キットは、アレルギー疾患の検査に有用である。
【図１】
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【配列表】
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