(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレアノール酸を有効成分とするチロシナーゼ産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ産生抑制剤に関する。また、このチロシナーゼ産生抑制剤を皮膚外用剤中に配合することで、日焼け後の色素沈着・しみ・そばかす・肝班等の予防及び改善等を可能ならしめるものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のしみやそばかす等の色素沈着は、紫外線やその他の刺激により引き起こされるメラニンの過剰な産生の亢進の結果とされており、美容上大きな問題となる。メラニンは、メラノサイト内において、必須アミノ酸であるチロシンがチロシナーゼにより酵素的に酸化された後、数段階の反応を経て形成されると考えられている。従って、反応の第１段階であるチロシナーゼをコントロールすることが、メラニンの産生を抑制し、皮膚のしみやそばかす等の発生を抑制する上で重要である。チロシナーゼの活性を阻害する物質として、アルブチン、コウジ酸、カゼイン加水分解物等が知られており、美白剤の有効成分として広く使用されている。
【０００３】
近年の研究では、従来にない新しい美白メカニズムを有する美白剤として、メラノサイト内のチロシナーゼ酵素を制御することができる有効成分が報告されている。例えば、チロシナーゼの分解を促進する成分としてリノール酸が、チロシナーゼの成熟を抑制する成分としてジフェニル誘導体（５，５'−Ｄｉｐｒｏｐｙｌ−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２，２'−ｄｉｏｌ、一般名：マグノリグナン）が挙げられる。チロシナーゼ産生抑制剤については、酢酸類、乳酸類およびピルビン酸類やＨｉｂｉｓｃｕｃ  ｓｙｒｉａｃｕｓ  Ｌ．抽出物などにその効果が認められるという報告があるが、これらの成分以外についてはほとんど報告されていない。（非特許文献１〜２、特許文献１〜２）
【０００４】
一方、ウルサン系トリテルペノイドの一種であるウルソール酸、その塩類、その類縁体およびその誘導体は、チロシナーゼ活性阻害に基づく皮膚の黒化防止剤として利用されているだけでなく、テストステロン−５α−レダクダーゼの活性を阻害することに基づく養毛剤として、さらに、シワ改善剤として、また、シワ・肌荒れ・シミと深い関係がある皮膚の光老化を防止する成分として利用されてきた。（特許文献３〜６）しかしながら、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体が、チロシナーゼ活性阻害以外の新規作用機序、をもつこと、すなわちチロシナーゼ産生抑制をもつことは知られていない。
【特許文献１】特開平０１−３０５０２５号公報
【特許文献２】特開２００３−１７１３００号公報
【特許文献３】特開昭５８−５７３０７号公報
【特許文献４】特開昭６２−９３２１５号公報
【特許文献５】特開平０９−１４３０５０号公報
【特許文献６】特開平１１−０１２１２２号公報
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７９，１５４２７−３３（２００４）
【非特許文献２】Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１６，４９４−５００（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、チロシナーゼ産生抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体について鋭意研究した結果、極めて少量でもチロシナーゼ活性阻害以外の作用機序であるチロシナーゼ産生抑制作用をもつこと、また、その作用が極めて優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００７】
ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体を用いたチロシナーゼ産生に対する作用評価試験、マウスメラノーマを用いたメラニン産生抑制試験を実施したところ、いずれもその効果が顕著であった。これらの成分を配合することで、日焼け後の色素沈着・しみ・そばかす・肝班等の予防及び改善等、肌に対して優れた美白効果を発揮する皮膚外用剤を可能ならしめるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いるウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体は、バラ科植物であるリンゴやサクランボの果実や葉のロウ状皮膜物質や、シソ科植物であるローズマリーやシソなどに広く分布していることが知られており、これらの植物から溶剤を用いて抽出することで、容易にウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体や、それらの混合物を得ることができる。従って、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体、それ自体を利用することはもちろん、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体を含む植物分画物を利用することもできる。また、ウルソール酸は、例えば、和光純薬社から、試薬として入手することができる。
【０００９】
ウルソール酸の塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが挙げられ、ウルソール酸の類縁体としては、オレアノール酸、ベツリン酸などが挙げられるが、いずれもこれらに限定するものではない。また、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体のアシル誘導体、エステル誘導体などの誘導体などが含まれることについても限定するものではない。
【００１０】
ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体をチロシナーゼ産生抑制剤として皮膚外用剤中に配合する場合の配合量は、用途、剤型、配合目的等によって異なり、特に限定されるものではないが、一般的には、皮膚外用剤中０．０００１〜５．０質量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜２．０質量％である。
【００１１】
また、その場合、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体とともに、既存の美白薬剤であるＬ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸グルコシド、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、コウジ酸、システイン、アルブチン、グルタチオン、リノール酸、リノール酸レチノール、トラネキサム酸およびトラネキサム酸誘導体等を併用することができる。
【００１２】
本発明のチロシナーゼ産生抑制剤は、ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体を必須成分とするものであるが、本発明のチロシナーゼ産生抑制剤を皮膚外用剤に使用する場合、例えば、その皮膚外用剤には、油脂類、エステル類、炭化水素類、ロウ類、シリコーン系の油相成分、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、水溶性高分子類、香料、水、各種溶媒等と併用することができ、さらに、老化防止剤、保湿剤、育毛剤、発毛剤、経皮吸収促進剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、抗炎症剤、その他生理活性成分、防腐防カビ剤等を配合することができる。
【００１３】
本発明のチロシナーゼ産生抑制剤は、医薬品組成物、化粧料等皮膚外用剤に好適に応用することができる。
【００１４】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
１．チロシナーゼ産生への作用評価試験
１−１．方法
ヒト正常メラノサイトを９６穴プレートに播種し、２４時間後各試料を含むＭｅｄｉｕｍ２５４（クラボウ）に交換しさらに４８時間継続培養した。ＰＢＳ（−）で洗浄し試料除去後、０．５％  Ｔｒｉｏｔｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．８）にて細胞破砕しこれをチロシナーゼ粗酵素液とした。細胞破砕液にＬ−ドーパを添加し、３７℃で２時間反応させた後Ａｂｓ．４０５ｎｍを測定し、市販のメラニン（シグマ社製）で作成した検量線より合成されたメラニン量を算出した。また同時に細胞破砕液のタンパク質量を測定し、単位タンパク質あたりのメラニン産生量として表したチロシナーゼ比活性を指標とした。
１−２．試料
ウルソール酸
１−３．結果
６．２５μＭ以上のウルソール酸処理により、細胞内チロシナーゼ活性の有意な減少が認められた（表１）。以上より、ウルソール酸にはチロシナーゼ産生抑制作用がある。
【００１６】
【表１】
0004528745.tif 000002
【００１７】
２．メラニン産生抑制試験
２−１．方法
Ｂ１６マウスメラノーマＦ０株（Ｂ１６Ｆ０）に５％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法ＭＥＭ（ＤＭＥＭ／５）を６穴プレートに播種した。培養２４時間後に所定の濃度の試料を含有したＤＭＥＭ／５と交換した。このとき目視判定で細胞ペレットの色調をスコア化（５段階スコア：１白−５黒）した。
次にメラニン生成量をアルカリ可溶化法にて測定した。細胞ペレットを５％トリクロロ酢酸、エタノール／ジエチルエーテル溶液、ジエチルエーテルで洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して加熱溶解（１００℃、５分）した。マイクロプレートリーダーを用いて４３０ｎｍの吸光度を測定した。メラニン量は、合成メラニン（シグマ社製）を標準品として作成した検量線から算出した。同時にタンパク量を定量した。全細胞のタンパク量でメラニン量を除することによって単位タンパク量あたりのメラニン量を算出した。それぞれのメラニン産生量はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を用いて有意差検定を行ない、コントロールとの差を評価した。
２−２．試料
ウルソール酸
２−３．結果
ウルソール酸処理により、細胞色調の白色化およびメラニン産生量の減少が認められた（表２、３）。従って、ウルソール酸にはメラニン産生抑制作用がある。
【００１８】
【表２】
0004528745.tif 000003
【００１９】
【表３】
0004528745.tif 000004
【００２０】
以下に、本発明に係る化合物を配合した皮膚外用剤の応用例を挙げる。配合量は質量％を表す。応用例１〜１１で得られた応用品はいずれも、紫外線照射による色素沈着の改善効果を評価した試験系において美白効果が認められた。
【００２１】
（応用例１）
0004528745.tif 000005
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製法の常法に従い調製した。
【００２２】
（応用例２）
美容液
（処方）                                  質量％
ウルソール酸                            ０．１
スクワラン                              １．０
べヘニルアルコール                      ４．０
ワセリン                                ３．０
流動パラフィン                        １５．０
モノラウリン酸デカグリセリル            １．０
モノステアリン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン
３．０
キサンタンガム                          ０．１
１，３−ブチレングリコール            １０．０
防腐剤                                  適量
香料                                    適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製法の常法に従い調製した。
【００２３】
（応用例３）
化粧水
（処方）                                  質量％
ウルソール酸ナトリウム                  １．０
スクワラン                              ０．２
モノラウリン酸デカグリセリル            ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．２
１，３−ブチレングリコール              ３．０
エチルアルコール                      １０．０
防腐剤                                  適量
香料                                    適量
精製水                                  残部
（調製方法）
全ての成分を５０℃で均一になるまで混合し、調製した。
【００２４】
（応用例４）
クリーム２（エモリエントタイプ）
（処方）                                  質量％
ウルソール酸                            １．０
スクワラン                            １０．０
ミリスチン酸イソセチル                  ６．０
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル      ３．０
マカデミアナッツ油                      １．０
ジメチルポリシロキサン（６ｃｓ）        ０．２
セタノール                              ５．０
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル            １．０
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビット
０．５
モノステアリン酸グリセリル              １．０
水素添加大豆レシチン                    ０．２
１，３−ブチレングリコール              ５．０
キサンタンガム                          ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．０１
クエン酸                                ０．１
クエン酸ナトリウム                      ０．４
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００２５】
（応用例５）
美容オイル
（処方）                                  重量％
オレアノール酸                          ０．５
ミリスチン酸イソセチル                １０．０
ホホバ油                                ５．０
天然ビタミンＥ                          ０．１
スクワラン                              残部
（調製方法）
全ての成分を５０℃で均一になるまで混合し、調製した。
【００２６】
（応用例６）
スキンローション
（処方）                                  質量％
トリ（カプリル酸・カプリン酸）グリセリル
０．１
ＰＯＰ（４）ＰＯＥ（２０）セチルエーテル
０．６
プロピレングリコール                  １０．０
ウルソール酸及びその類縁体を含むシソエキス
２．０
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００２７】
（応用例７）
乳液
（処方）                                  質量％
ｄ−δ−トコフェロール                  ０．１
スクワラン                              ５．０
２−エチルヘキサン酸セチル              ５．０
ジメチルポリシロキサン（１００ｃｓ）    ０．５
パルミチン酸セチル                      ０．５
ベヘニルアルコール                      １．５
ステアリン酸                            ０．５
親油型モノステアリン酸グリセリル
１．０
モノステアリン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン
１．０
テトラオレイン酸ＰＯＥ（４０）ソルビタン
１．５
プロピレングリコール                    ７．０
ウルソール酸及びその類縁体を含むシソエキス
２．０
ウルソール酸及びその類縁体を含むリンゴエキス
２．０
キサンタンガム                          ０．１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
水中油型乳化組成物の製造方法の常法に従い調製した。
【００２８】
（応用例８）
クリーム３（油中水型エモリエントタイプ）
（処方）                                  質量％
ウルソール酸                            １．０
オレアノール酸                          １．０
ジメチコンコポリオール                  ０．５
デカメチルシクロペンタシロキサン        ５．０
トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル
１５．０
ミツロウ                                ２．０
ペンタヒドロキシ酸デカグリセリル        ２．０
イソステアリン酸                        １．０
グリセリン                              ４．５
ヒアルロン酸ナトリウム                  ０．０１
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
油中水型乳化組成物の乳化法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００２９】
（応用例９）
サンスクリーンクリーム
（処方）                                  質量％
ウルソール酸                            ０．１
流動パラフィン                          ７．０
デカメチルシクロペンタシロキサン        ３．０
セチルアルコール                        ４．０
縮合リシノール酸ヘキサグリセリル        ０．５
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル            １．０
パラメトキシ桂皮酸オクチル              ７．０
酸化チタン                              ３．０
セチル硫酸ナトリウム                    １．０
ステアロイルメチルタウリンナトリウム    ０．３
１，３−ブチレングリコール              ５．０
キサンタンガム                          ０．３
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調製方法）
粉体相を油相中に添加した後、油中水型乳化組成物の乳化法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００３０】
（応用例１０）
外用剤（軟膏製剤）
ウルソール酸                            ０．５
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル            ２．０
モノステアリン酸グリセリル            １０．０
流動パラフィン                        １０．０
白色ワセリン                            ５．０
セタノール                              ６．０
プロピレングリコール                  １０．０
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調整方法）
軟膏組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【００３１】
（応用例１１）
外用剤（乳剤）
オレアノール酸                          ０．２
白色ワセリン                          ４１．０
マイクロクリスタリンワックス            ３．０
ラノリン                              １０．０
モノオレイン酸ソルビタン                ４．７５
モノオレイン酸ＰＯＥ（２０）ソルビタン  ０．２５
防腐剤                                  適量
精製水                                  残部
（調整方法）
乳剤組成物の製造方法の常法に従い、乳化組成物を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
ウルソール酸、その塩類、もしくはその類縁体が極めて優れたチロシナーゼ産生抑制剤として利用でき、さらには、このチロシナーゼ産生抑制剤を応用して、美白効果に優れた皮膚外用剤を提供ならしめるものである。