(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカロイドの総含有率が０．２％以下であり、かつ、フラボン、イソフラボン、カルコンおよびプテロカルパンを含有する、ソホラフラヴェスセンス、ソホラサブプロストラータ、ソホラアロペクロイド、ソホラジャポニカ、ソホラトンキネシス、ソホラトメントーサ、ソホラモオルクロフティアナおよびソホラリーチアーナからなる群から選択されるソホラ種からの抽出物であって、前記フラボンが、８−プレニルナリンゲニン、クシェノールＸ、８−プレニルケンペロール、レアキアノンＧおよびクシェノールＥを包含し、前記イソフラボンが、ダイゼインおよびゲニスタインを包含し、前記カルコンが、２，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−３’−ラヴァンジュリル−２’−メトキシカルコンを包含し、前記プテロカルパンが、マアッキアインおよびマアッキアイングルコシドを包含する、ことを特徴とするソホラ種からの前記抽出物。
【請求項２】
アルカロイドの総含有率が０．１％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
アルカロイドを含有しないことを特徴とする、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
前記ソホラ種が、ソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１記載のソホラ種から抽出物を得るための方法であって、
ａ）ｉ）水性アルコール類および水性ケトン類、および
ｉｉ）水性エステルまたは水飽和エステルなどのエステル類
からなる群から選択される溶媒を用いて、ソホラ種から１回以上抽出を行う工程と、
ｂ）工程ａ）ｉ）で得られたアルコール抽出溶液またはケトン抽出溶液から前記溶媒を取り除く工程と、
ｃ）ｉ）工程ｂ）で得られた残留物を、エチルアセテート、ｔ−ブチルメチルエーテル、ｎ−ブタノールおよびブタノンからなる群から選択される有機溶媒と、水との間に１回以上分散させ、得られた溶媒相を混ぜ合わせる工程、または
ｃ）ｉｉ）工程ａ）ｉｉ）で得られた抽出物を水に１回以上直接分散させる工程と、
ｄ）ｃ）で１つにまとめられた有機溶媒相を乾燥するまで濃縮する工程と、
によって特徴付けられる前記方法。
【請求項６】
工程ａ）における抽出は２回行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）ｉ）において用いられる溶媒は水性エタノールである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）ｉ）において用いられる溶媒は水性アセトンである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）ｉ）において用いられる前記アルコールは、１０〜９６％［Ｖ／Ｖ］または「Ｗ／Ｗ」水性混合物として存在するか、工程ａ）ｉ）において用いられる前記ケトンは、１０〜９９％［Ｖ／Ｖ］または「Ｗ／Ｗ」水性混合物として存在する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）ｉ）において用いられる前記アルコールまたはケトンは、５０〜９２％［Ｖ／Ｖ］または「Ｗ／Ｗ」水性混合物として存在する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）ｉ）において用いられる前記溶媒は、７０％［Ｖ／Ｖ］または６０％「Ｗ／Ｗ」水性エタノールである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）ｉｉ）において用いられる前記溶媒は、エチルアセテート、水性エチルアセテートまたは水飽和エチルアセテートである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）ｉ）において用いられる前記溶媒はエチルアセテートである、請求項５〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ソホラ種が、ソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータから選択される、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抽出物と、慣用の薬学的に許容できる添加剤とを含んでなる薬剤。
【請求項１６】
エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンの代謝の異常によって引き起こされる病状であって、更年期愁訴、性ホルモン依存性癌、良性前立腺肥大、骨粗鬆症、アルツハイマー病および心臓血管性疾患からなる群から選択される病状を予防および治療するための薬物を調合するための、請求項１〜４のいずれかに記載の抽出物または請求項１５に記載の薬剤の使用。
【請求項１７】
前記性ホルモン依存性癌が、乳癌、前立腺癌および子宮癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
性ホルモンの代謝がエストロゲンの代謝である請求項１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、ソホラ種の抽出物、それらの製法、およびエストロゲンの欠乏または性ホルモンの代謝、特にエストロゲンの代謝の異常によって引き起こされる病状を予防および治療するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
月経不順は４０歳前後以降の女性に現れ、閉経の始まりを示す。更年期として知られる内分泌系におけるこの相変化は、１０年以上続くことがある。これは、発育卵胞の枯渇および性腺刺激ホルモンに対する反応の低下に因るものである。この卵胞の枯渇により、エストロゲンの生成が低下し、最終的には全く生成されなくなってしまう。これに関連して、顔面潮紅、鬱、不安、精神錯乱、不眠などの様々な症状が現れることがある。これらに加えて、エストロゲンの生成の低下に因り、骨粗鬆症、心不全、脳梗塞（脳卒中）および癌の如き深刻な健康上の問題が生じることがある。
【０００３】
更年期に関する病訴を軽減するためのエストロゲンを用いたホルモン置換療法は非常に効果的であるが、これは乳癌、子宮癌、心臓血管性疾患、肝臓代謝変化の起こる危険性が増大することに結びつく可能性があることを、多くの研究が示している。癌の発症する可能性は、プロゲスチンを投与することによって下げることができる。しかしながら、プロゲスチンの防護作用は長期の使用において次第に弱まってゆくように思われる。ホルモン置換療法（ＨＲＴ）は、乳癌の発症する可能性を３５〜４０％増大させると考えられている。副作用があるだけでなく、この種の治療法の信頼性も明らかに疑わしいため、４０歳を過ぎた閉経後の女性に対するＨＲＴ薬物の使用は拒まれる傾向がある。閉経後のアメリカ人の女性のわずか２０％程度がＨＲＴを受けており、そのうちの４０％が１年を過ぎてもその治療法を受け続けていると推定される。
【０００４】
人間または動物に対してエストロゲン作動作用のある物質、すなわちエストロゲンと相互作用する物質は、各種植物に含まれていることが分かっている。１６科を上回る植物のうちの３００種類を上回る植物から採取される少なくとも２０種類の、エストロゲン性／抗エストロゲン性を有する物質がこれまでに発見されている。公知の植物エストロゲンの大部分は、イソフラボン、リグナンまたはクメスタン類に属する。最近になって初めて、さらに効力の強い植物エストロゲン、すなわち８−プレニルナリンゲニンが確認された（Ｓ．Ｒ．Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８４，  ２２４９−２２５２［１９９９］）。試験管内における８−プレニルナリンゲニンのエストロゲン効力をＩｓｈｉｋａｗａ−Ｖａｒ−Ｉ細胞内のアルカリ性ホスファターゼを刺激することによって検査した。これにより、８−プレニルナリンゲニンが、クメストロール、ゲニスタインまたはダイゼインの如き従来公知の植物エストロゲンよりも著しく活発であり、１７βエストラジオールよりもわずかに弱い効果を発揮することが分かった。
【０００５】
アメリカ合衆国、欧州、中国および日本の住民に対して行われた制御された疫学的調査によって、植物エストロゲンの食物による摂取と、各種腫瘍、特に乳癌および前立腺癌の発症との間には、密接な負の相関関係が存在することが示された。乳癌細胞および前立腺癌細胞の増殖に対する植物エストロゲンの抑制効果も動物実験において確認されている。植物エストロゲンの予防性は、これらの合成エストロゲンと天然エストロゲンとの組み合わせを区別する数多くの異なる生物学的特徴に基づくことは明らかである。投与量および内因性ホルモンの状態によって、植物エストロゲンは、エストロゲン作用、あるいは抗エストロゲン作用さえも有する。他の生物学的作用の例としては、チロシンキナーゼ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、リボソームＳ６キナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アロマターゼまたは５αレダクターゼの抑制が挙げられる。さらに、植物エストロゲンは抗酸化性を有することが多く、これらの様々な活性のすべてが組み合わさることによって腫瘍の発生および成長を抑制する役割が果たされることは明らかである（Ｔｈａｍ ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  ８３，２２２３−２２３５［１９９８］）。
【０００６】
本発明の目的は、エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンの代謝、特にエストロゲンの代謝における異常によって引き起こされる病状を予防および治療するのに好適な植物抽出物を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、前記抽出物の製法を提供することである。
【０００８】
これらの目的は、請求項１〜５に記載のソホラ種からの抽出物と、請求項６〜１６に記載の前記抽出物の製法と、請求項１７に記載の薬剤と、請求項１８〜２０に記載の前記抽出物の使用とによって、本発明に従って解決される。
【０００９】
いくつかのソホラ種（ファバカエア）は、根を薬用に用いることができる伝統的な漢方薬により知られている。これらは、ソホラフラヴェスセンス、ソホラサブプロストラータ、ソホラアロペクロイド、ソホラジャポニカ、ソホラトンキネシス、ソホラトメントーサ、ソホラモオルクロフティアナおよびソホラリーチアーナである。中でも、ソホラフラヴェスセンスが特に重要であることが分かっている。そのため、それは中国薬局方（ソホラフラヴェスセンティスラディックス、「クシェン」、漢方薬局方、９／１９９７）に掲載されており、従来から下痢、胃腸内出血および湿疹の治療に用いられている（Ｗ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｄｒｕｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｏｒｉｇｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  １９９２）。
【００１０】
ソホラフラヴェスセンスの根、並びに他のソホラ種の根は、それらの主成分の１つとして一連のキノリジジンアルカロイドを含有している。前記漢方薬局方には、アルカロイドの総滴定含有率は２％を割ってはならないと規定されている。主なアルカロイドは、マトリンおよびオキシマトリンである。
【００１１】
アルカロイドに加えて、各種フラボンおよび関連する化合物並びにトリテルペンサポニンが、ソホラフラヴェスセンスの根、並びにごくわずかの他のソホラ種の根に含まれていることが発見された。
【００１２】
ソホラフラヴェスセンス、その各成分または各成分群の様々な薬理学的特徴についてこれまで述べられている。特にアルカロイドには、抗不整脈作用、抗喘息作用および鎮咳効果、さらに抗潰瘍作用があると考えられている（Ｔａｎｇ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄ，上記参照）。抗腫瘍作用および免疫抑制性も確認されている。
【００１３】
Ｍ．Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  １９９９，  ６２（１２）  １５９５〜１５９９には、ソホラフラヴェスセンスからの抗菌性および抗アンドロゲン性フラボノイドについて記述されている。ソホラフラヴェスセンスから単離された実質的にすべてのプレニルフラボン誘導体が抗アンドロゲン作用を示すことが分かった。
【００１４】
Ｗ．Ｍ．Ｍａｚｕｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，９，１９３−２００には、特にソホラジャポニカの種子を調査した場合の、イソフラボンホルモノネチン、バイオチャニンＡ、ダイゼイン、ゲニスタイン、クメストロール、およびマメ科種子に含まれるリグナンセコイソラリシレシノールおよびマタイレシノールの定量法について記述されている。
【００１５】
毒物学では、ソホラフラヴェスセンスおよびソホラジャポニカは毒物に分類されている。特に、マトリン種のアルカロイドは有毒であると考えられている（Ｔ．Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅ  Ｚｅｉｔｕｎｇ  ２００１，  １４１［１４］，  １６８７−１６９６）。臨床症例においては、ソホラアルカロイドの場合に、重度の動悸、呼吸困難および痙攣の如き中毒作用が見られた。動物試験では、オキシマトリンの場合に中毒作用が見られた（Ｋ．−Ｃ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈｅｒｂｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３）。
【００１６】
ＥＰ  ０  ９９８  ９２４  Ａ１には、トポイソメラーゼＩＩ抑制活性を有する植物から得られる化合物を含有する抗腫瘍治療薬が記載されている。従って、実施例８では、ソホラからレアキアノールＡを得ることについて触れている。この実施例では、ソホラの乾燥粉末を、還流下において、アセトンおよびメタノールで連続して抽出した。アセトン抽出物を減圧下において濃縮し、水と混ぜ合わせた。得られた混合物を、ベンゼン、エチルアセテートおよびｎ−ブタノールを用いる増分分散抽出に附した。エチルアセテート抽出物を減圧下において濃縮することによって残留物を得た。このようにして得られた残留物を、ベンゼン−アセトン溶媒混合物を用いるシリガゲルクロマトグラフィーで精製して、レアキアノールＡを得た。実施例８で説明されているエチルアセテート抽出物は、本発明に従って得られた抽出物がマアッキアインを含有し、マアッキアイングルコシドが非常に豊富（約５倍）であるという点で、本発明の抽出物とは異なる。これらの両方の化合物については、本発明者らが実施例５のエストロゲンレセプター−結合アッセイを利用して初めて示すことができた、本発明の抽出物の効力に関連する成分が取り扱われている。ＥＰ  ０  ９９８  ９２４  Ａ１には、エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンの代謝、特にエストロゲンの代謝における異常によって引き起こされる病状を予防および治療するためのソホラ種の抽出物の使用について何も提案されていない。
【００１７】
本発明にとって特に好ましいソホラ種とは、ソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータである。その理由は、それらの水性アルコールによる根抽出物が本発明の意味合いにおいて驚くほど強力なエストロゲン作用を有していることが分かったからである。これらの水性アルコール抽出物は、さらに分離および精製することによって濃縮することが可能であった。確認された薬理作用は、抽出物中に存在するゲニスタインおよびダイゼインの如きイソフラボン、８−プレニルナリンゲニン、クシェノールＸ、８−プレニルケンペロール、レアキアノンＧおよびクシェノールＥの如きフラボン、マアッキアインおよびマアッキアイングルコシドの如きカルコンおよびプテロカルパン、並びに他の未確認のフラボニド様化合物の相互作用によって生じることが分かった。これに関連して、本発明者らによって新たに発見されたカルコン、すなわち下記式の２，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−３’−ラヴァンジュリル−２’−メトキシカルコンも挙げておくべきである。
【００１８】
【化１】
0004393062.tif 000002
【００１９】
一般に、同様の抽出物は、水性アルコール、水性ケトン、および水性または水飽和エステルの如きエステルからなる群から選択される中位の極性の溶媒で抽出し、前記溶媒を取り除き、そして得られた残留物を有機溶媒と水との間に液液分散させることによって得ることができる。
【００２０】
本発明によれば、
ａ）ｉ）水性アルコール類および水性ケトン類、および
ｉｉ）水性エステルまたは水飽和エステルなどのエステル類
からなる群から選択される溶媒を用いて、ソホラ種から１回以上抽出を行い、
ｂ）工程ａ）ｉ）で得られたアルコール溶液またはケトン溶液から前記溶媒を取り除き、
ｃ）ｉ）工程ｂ）で得られた残留物を、エチルアセテート、ｔ−ブチルメチルエーテル、ｎ−ブタノールおよびブタノンからなる群から選択される有機溶媒と、水との間に１回以上分散させ、得られた溶媒相を混ぜ合わせ、または
ｃ）ｉｉ）工程ａ）ｉｉ）で得られたエチルアセテート抽出物を水に１回以上直接分散させ、そして
ｄ）ｃ）で１つにまとめられた有機溶媒相を乾燥するまで濃縮する、
ことによって得られるソホラ種の抽出物が提供される。
【００２１】
各抽出毎の薬物の溶媒に対する比は、約１：７〜１：１０である。
【００２２】
好ましい実施態様では、工程ａ）の抽出は２回行われる。
【００２３】
工程ａ）で使用される溶媒は、水性エタノール、水性アセトン、水性エチルアセテートおよび水飽和エチルアセテートからなる群から選択されることが好ましい。特に、工程ａ）で使用される溶媒は、７０％［Ｖ／Ｖ］（６２％［Ｗ／Ｗ］）エタノール、６０％「Ｗ／Ｗ」エタノールまたは水飽和エチルアセテートである。
【００２４】
工程ａ）ｉ）で使用されるアルコールまたはケトンは、好ましくは１０〜９６％［Ｖ／Ｖ］もしくは［Ｗ／Ｗ］または１０〜９９％［Ｖ／Ｖ］もしくは［Ｗ／Ｗ］水性混合物、特に好ましくは５０〜９２％［Ｖ／Ｖ］もしくは［Ｗ／Ｗ］水性混合物として用いられる。
【００２５】
工程ｃ）ｉ）では、エチルアセテートが好ましい溶媒である。
【００２６】
前記方法の工程ｃ）で行われることとは、主に、アルカロイドの総含有量を少なくすることである。本発明により得られる抽出物は、総アルカロイド含有率が０．２％未満、好ましくは０．１％未満であるという点で特徴付けられる。特に、本発明により得られる抽出物は、アルカロイドを全く含有しない。この文脈において、「アルカロイドを含有しない」という句は、ＨＰＬＣの如き標準的な分析方法もってしてもアルカロイドを検出できないことを意味している。さらに、本発明の抽出物は、フラボン、イソフラボン、カルコンおよびプテロカルパンを含有するという点で特徴付けられる。ナリンゲニンのプレニル誘導体の如き、フラボン化合物をイソプレニル化することができる。イソフラボン化合物は、必要に応じて、モノ−、ジ−またはトリヒドロキシ置換またはｏ−メチル化することができる。さらに、前記抽出物は、グリコシド化フラボン化合物およびグリコシド化イソフラボン化合物を含有していてもよい。特に、本発明による抽出物は、マアッキアイン、マアッキアイングルコシド、８−プレニルナリンゲニン、クシェノールＸ、８−プレニルケンペロール、レアキアノンＧ、クシェノールＥ、および２，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−３’−ラヴァンジュリル−２’−メトキシカルコンを含有する。
【００２７】
前記抽出物をソホラフラヴェスセンス、ソホラサブプロストラータ、ソホラアロペクロイド、ソホラジャポニカ、ソホラトンキネシス、ソホラトメントーサ、ソホラモオルクロフティアナおよびソホラリーチアーナを含んでなるソホラ種のうちの１種から生成することができる。前記抽出物をソホラフラヴェスセンスまたはソホラサブプロストラータから生成することが好ましい。
【００２８】
本発明により得られる抽出物は、慣用の薬学的に許容できる添加剤と共に、カプセル、フィルム錠剤またはコーティング錠剤の如き薬剤へと加工することができる。前記慣用の薬学的に許容できる添加剤としては、フィルムおよびコーティング錠剤用の充填剤、結合剤、展張剤、潤滑剤および被覆剤、並びにカプセル用賦形剤としての油または脂肪を用いることができる。
【００２９】
本発明により得られる抽出物は、エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲンの代謝の異常によって引き起こされる病状を予防および治療するために用いることができる。
【００３０】
前記病状は、更年期愁訴、性ホルモン依存性癌、良性前立腺肥大、骨粗鬆症、アルツハイマー病および心臓血管性疾患からなる群に属するものから選択することができる。ここで言う癌とは、乳癌、前立腺癌および子宮癌のことである。
【００３１】
本発明による抽出物は、一日当たり１〜１，０００ｍｇ、好ましくは一日当たり１００〜１，０００ｍｇの投与量で投与される。
【００３２】
フラボン、イソフラボン、カルコン、プテロカルパンおよび他の同様の化合物からなる本発明による組み合わせを用いることによって、エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲンの代謝の異常によって引き起こされる病状を抑制するのに特に好適な治療薬が得られる。
【００３３】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものととらえるべきではない。特に断りがない限り、すべての％表記は重量を意味する。
【００３４】
【実施例】
実施例１：  ソホラフラヴェスセンスからの抽出物の生成
ａ）  抽出
２ｋｇのソホラフラヴェスセンスの根の粉末を１４ｋｇの７０％［Ｖ／Ｖ］（６２％［Ｗ／Ｗ］）エタノールと混ぜ合わせ、スピニング（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）で５分間抽出した後、５０℃で１時間激しく攪拌した。その後、Ｓｕｐｒａ  Ｓｅｉｔｚ  １５００フィルターを用いて吸引濾過し、得られた薬物残留物に対して１回目と同じようにして２回目の抽出を行った。両方の抽出溶液を混ぜ合わせ、乾燥後の抽出物の含有量をアリコートを用いて求めた。その結果、乾燥残留物は４７５．６ｇであり、これは２３．８％の収率に相当することが分かった。
【００３５】
ｂ）  分散
５０℃の回転式蒸発器で前記抽出溶液から前記エタノールを取り除いた。水性残留物（５Ｌ）を２Ｌのエチルアセテートと共に攪拌することを３回繰り返し、得られたエチルアセテート相を混ぜ合わせ、乾燥するまで前記回転式蒸発器で濃縮した。
【００３６】
エチルアセテート抽出物  ＝  ６７．８４ｇ（薬物を基準として３．４％、全抽出物を基準として１４．３％）
【００３７】
ＨＰＬＣ分析によれば、得られたエチルアセテート抽出物は、フラボン、イソフラボン、カルコン、プテロカルパン（例えば、８−プレニルナリンゲニン、ダイゼイン、クシェノールＸ、ノルクラリノン、マアッキアイン、ゲニスタイン、８−プレニルケンペロール）を含有していた。アルカロイドの形跡はなかった。
【００３８】
これらの物質の組み合わせは、（実施例５と比較して）エストロゲンの欠乏、または、性ホルモンに関連する代謝、特にエストロゲンの代謝の異常によって引き起こされる病状の予防および治療に好適である。
【００３９】
実施例２：  ソホラサブプロストラータからの抽出物の生成
ａ）  抽出
１ｋｇのソホラサブプロストラータの根の粉末を７ｋｇの７０％［Ｖ／Ｖ］（６２％［Ｗ／Ｗ］）エタノールと混ぜ合わせ、スピニング（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）で５分間抽出した後、５０℃で１時間激しく攪拌した。その後、Ｓｕｐｒａ  Ｓｅｉｔｚ  １５００フィルターを用いて吸引濾過し、得られた薬物残留物に対して１回目と同じようにして２回目の抽出を行った。両方の抽出溶液を混ぜ合わせ、乾燥後の抽出物の含有量をアリコートを用いて求めた。その結果、乾燥残留物は１１１．８ｇであり、これは１１．２％の収率に相当することが分かった。
【００４０】
ｂ）  分散
５０℃の回転式蒸発器で前記抽出溶液から前記エタノールを取り除いた。水性残留物（２．５Ｌ）を１Ｌのエチルアセテートと共に攪拌することを３回繰り返し、得られたエチルアセテート相を混ぜ合わせ、乾燥するまで前記回転式蒸発器で濃縮した。
【００４１】
エチルアセテート抽出物  ＝  １０．４ｇ（薬物を基準として１．０％、全抽出物を基準として９．３％）
【００４２】
実施例３：
３６ｋｇの粉末ソホラフラヴェスセンス薬を、その重量の７．７倍の６０％（Ｗ／Ｗ）エタノールと混ぜ合わせた。流通しているＤｉｓｐａｘ（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）で激しく攪拌した後、５０℃で１時間抽出溶液を抽出した。得られた抽出溶液を濾過して透明にし、得られた薬物残留物を、同じ条件下において、その重量の７倍の６０％（Ｗ／Ｗ）エタノールで再度抽出し、最後に濾過した。
【００４３】
そして、得られた抽出溶液を、エタノールの含有率が３．５％、乾燥抽出物の含有率が１０．５２％になるまで遠心蒸発器で濃縮した。次に、この濃縮した溶液を、水飽和エチルアセテートに対して、１：０．４の体積比で分散させた。得られたエチルアセテート相を回転式蒸発器で濃縮し、６０℃の乾燥カップボード内で乾かした。
【００４４】
これにより、粉末状態で１．１８８ｋｇ（薬物を基準として３．３％）のエチルアセテート抽出物が得られた。
【００４５】
薬理的に関連のある物質のＨＰＬＣ含有率
マアッキアイングルコシド                    ２．８％
８−プレニルナリンゲニン                    ０．４％
マアッキアイン                              ０．６％
クシェノールＸ                              １．３％
８−プレニルケンペロール                    ０．７％
レアキアノンＧ                              ６．６％
クシェノールＥ                              ０．３％
２，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−        ０．７％
３’−ラヴァンジュリル−２’−メトキ
シカルコン
【００４６】
ダイゼインおよびゲニスタインも確認された。アルカロイドは全く確認されなかった。
【００４７】
実施例５によるイーストアッセイにおいて挙げられた各物質についてエストロゲン活性が見られた。前記抽出物のエストロゲン活性は、実施例５によるイースト細胞を用いたレポーターゲン（Ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎ）アッセイによってもたらされた。図３を参照されたい。
【００４８】
【表１】
0004393062.tif 000003
【００４９】
実施例４
１５０ｇの粉末ソホラフラヴェスセンス薬を水飽和エチルアセテートで１：７（ｍ／ｍ）の比で２回抽出した。そのため、前記薬物を前もってＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘで５分間粉砕しておいた（動的抽出）。次に、前記薬物を６０℃で１時間還流下において抽出した。得られた抽出溶液を混ぜ合わせたものを濾過し、得られたエチルアセテート抽出溶液を、エチルアセテート飽和水で、１：１［Ｖ／Ｖ］の比で２回振とうした。得られたエチルアセテート相を混ぜ合わせ、乾燥するまで濃縮した。
収率は、前記薬物を基準にして３．９９％であった。
【００５０】
実施例５：  ヒトαエストロゲンレセプターを発現する形質移入されたイースト細胞を用いた、生成されたエチルアセテート抽出物のエストロゲン活性の検査
抽出物のエストロゲン特性の検査は、イースト細胞（サッカロミセス属）を用いたレポーターゲンアッセイで行った。これらの細胞は、ヒトαエストロゲンレセプターおよび、エストロゲン反応成分と酵素βガラクトシダーゼの遺伝子とを含有する発現プラスミドに対しては安定である。すべてのサンプルを濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶かした後、希釈せずに、または１／１０もしくは１／１００の比または１μｌ対１００μｌの体積比でＤＭＳＯで希釈した後に、９６ウェル平底マイクロタイターディッシュ内の培地に移した。次に、１００μｌのイースト懸濁液と、色原体基質クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドとを添加した。各ディッシュに、前記培地のみ、前記溶媒のみまたは標準的な濃度の１７βエストラジオールの入ったコントロールウェルを設置した。イースト細胞を３２℃で７２時間培養した後、培地の吸収をマイクロタイターディッシュ光度計において５４０ｎｍで測定した。一部のサンプルは２回検査した。
【００５１】
【表２】
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【表３】
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【００５２】
前記アッセイの結果が図１、２および３に示されている。これにより、前記抽出物のエストロゲン活性を１７βエストラジオールの活性と比較した。この目的においては、「活性である」と呼べる抽出物は、１７βエストラジオールと比較した場合に、１７βエストラジオールの活性の曲線の明確に上昇している範囲（すなわち１７βエストラジオール濃度約０．１〜０．２ｎＭに対応する範囲）内で確立される１７βエストラジオールの活性に、その活性が一致する抽出物である。
【００５３】
特に、図１は、１７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータからの（実施例１ａ）および２ａ）による）７０％［Ｖ／Ｖ］（６２％［Ｗ／Ｗ］）エタノール抽出物のエストロゲン活性を示している。
【００５４】
図２は、１７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータから得られた本発明の抽出物（実施例１ｂ）および２ｂ）による、エチルアセテートで分散させた後の７０％［Ｖ／Ｖ］すなわち６２％［Ｗ／Ｗ］エタノール抽出物）のエストロゲン活性を示している。
【００５５】
図３は、１７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスから得られた本発明の抽出物（実施例３による、エチルアセテートで分散させた後の６０％［Ｗ／Ｗ］エタノール抽出物）のエストロゲン活性を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  １７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータからの（実施例１ａ）および２ａ）による）７０％［Ｖ／Ｖ］（６２％［Ｗ／Ｗ］）エタノール抽出物のエストロゲン活性を示す。
【図２】  １７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスおよびソホラサブプロストラータから得られた本発明の抽出物（実施例１ｂ）および２ｂ）による、エチルアセテートで分散させた後の７０％［Ｖ／Ｖ］すなわち６２％［Ｗ／Ｗ］エタノール抽出物）のエストロゲン活性を示す。
【図３】  １７βエストラジオールと比較した、イーストアッセイ中のソホラフラヴェスセンスから得られた本発明の抽出物（実施例３による、エチルアセテートで分散させた後の６０％［Ｗ／Ｗ］エタノール抽出物）のエストロゲン活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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