(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主から分離されて培養液中で増殖又は分化された軟骨細胞成分と、培養液に含有される
２〜１０ＩＵ／ｍＬのトロンビン及び２０〜２００ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、０．０
１〜２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含むフィブリノゲンマトリックスとの混合物からなる
骨欠損部位注入用軟骨治療剤組成物。
【請求項２】
宿主から分離されて培養液中で増殖又は分化された軟骨細胞成分と、培養液に含有される
２〜１０ＩＵ／ｍＬのトロンビン及び２０〜２００ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、０．１
〜２０ｍｇ／ｍＬのＧＡＧを含むフィブリノゲンマトリックスとの混合物からなる骨欠損
部位注入用軟骨治療剤組成物。
【請求項３】
宿主から分離されて培養液中で増殖又は分化された軟骨細胞成分と、培養液に含有される
２〜１０ＩＵ／ｍＬのトロンビン及び２０〜２００ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、０．１
〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を含むフィブリノゲンマトリックスとの混合物からなる
骨欠損部位注入用軟骨治療剤組成物。
【請求項４】
前記細胞成分が、宿主から分離された正常軟骨組織を、酵素を用いて細胞に分離した後、
培養液を添加し、１００万個／ｍＬ以上の軟骨細胞を該培養液に含有するものからなる請
求項１ないし３のいずれかに記載の軟骨治療剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトや動物の宿主において、膝関節や足関節、特に、臨床症状のある大腿骨関節軟骨（外側、内側、滑車面）欠損部位及び距骨の骨軟骨欠損部位に、臨床的に移植可能にする軟骨治療剤組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、脊椎動物の関節をなす軟骨組織は、一度損傷すると、正常に生体内で再生されることはない。
【０００３】
このような関節の軟骨組織が損傷すると、酷い痛みと共に日常生活に制限を受け、さらに、慢性化すると、致命的な退行性関節炎を引き起こしたり、正常な生活や職業的な活動を阻害されたりするようになる。
【０００４】
このような関節軟骨損傷を治療するためには、損傷した関節面を磨いて柔らかくする治療法、或いは、関節面に微細骨折を引き起こし、又は小孔を開ける治療法が用いられている実状である。
【０００５】
しかしながら、この治療法では、わずか数週間後に症状が再発してしまい、正常生活への復帰を不可能にし、このような治療のために作られた組織は、繊維性組織であり、正常な軟骨組織とは質的に全く異なる組織である。
【０００６】
しかも、関節の軟骨組織損傷が酷い場合は、軟骨組織の再生が不可能となり、酷い損傷によって軟骨組織が再生不能状態に陥った場合は、不可避的に関節軟骨を完全に除去し、金属やプラスチックを用いた人工関節に置き換える方法が用いられた。
【０００７】
また、現在までは、このような人工関節置換術が再生不能の軟骨損傷に対する唯一の治療法として知られている。
【０００８】
上記した人工関節置換術は、米国で膝関節にのみ毎年３０万例以上が用いられていることが実状である。
【０００９】
しかしながら、人工関節軟骨は、器具であり、そのものの寿命が約１０年であって永久使用することができず、費用面では、器具そのものの価格のみでも、１件当たり約５００万ウォンして経済的負担が大きい。
【００１０】
さらに、このような人工関節軟骨は、活動量の多い若者に用いるのには合併症の発生頻度があまりにも高いと報告されており、有用な治療法として認識されていない。
【００１１】
最近、損傷した関節軟骨の治療のために、組織工学に基づいた新たな治療法として、自己由来軟骨細胞移植術が脚光を浴びている。
【００１２】
この技術は、ニューヨーク所在のＨｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｊｏｉｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅにおいて初めて研究され、スウェーデン所在のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇとＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて発展された。
【００１３】
上記した自己由来軟骨細胞移植術は、膝関節軟骨が損傷した患者の軟骨部位のうち、使用の少ない軟骨を採取した後、軟骨細胞を分離し、前記軟骨細胞を培養して、軟骨欠損部位を治療するだけの軟骨細胞数を獲得し、培養された軟骨細胞を患者の軟骨欠損部位に移植して、患者の関節軟骨を復元させる方法である。
【００１４】
このような自己由来軟骨細胞移植術は、根本的な関節治療術として、その性能が様々な臨床結果によって立証されているが、軟骨細胞治療剤移植の際に骨膜を採取しなければならず、患部に移植した後、軟骨細胞治療剤を注入する過程が随伴しなければならない。
【００１５】
また、骨膜採取の際に膝の多くの切開と、手術部位と骨膜の不完全な密封による軟骨細胞治療剤の消失、骨膜の関節欠損部位への縫合時間が多くかかるという短所があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上述の問題点を考慮してなされたもので、その目的は、軟骨治療剤移植の際に、骨膜の採取、縫合、骨膜と移植部位の不完全な密封、多くの部位の切開による移植術の困難と、手術所要時間を短縮させることができる軟骨治療剤を提供することにある。
【００１７】
また、軟骨細胞成分と、トロンビンとフィブリノゲンマトリックス成分を混合使用して固形化することにより、治療剤の損失を最小化し、フィブリノゲンマトリックスと細胞の相互作用により、さらに完全な軟骨再生の効果と、さらには、手術時間の短縮と、関節鏡により使用が可能になる軟骨治療剤組成物及びその使用方法を提供することにある。
【００１８】
上記目的を達成すべく、本発明に係る軟骨治療剤組成物によれば、宿主から分離されて増殖又は分化された軟骨の細胞成分と、トロンビンとフィブリノゲンマトリックスとの混合物とからなることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る軟骨治療剤組成物の使用方法によれば、宿主から分離されて増殖又は分化された軟骨細胞成分を準備するステップと、トロンビンを準備するステップと、フィブリノゲンマトリックスを準備するステップと、軟骨の欠損部位を処理するステップと、欠損部位に、軟骨細胞成分と、トロンビンとフィブリノゲンマトリックスを混合した後、注入するステップとを含むことを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好ましい実施の形態を、添付図面に基づき詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、組織と臓器を代替するのに寄与する組織工学によるものであり、組織の機能を向上、維持及び回復させることができる。
【００２２】
このような組織工学を用いる本発明は、ヒトや動物の宿主から分離されて増殖又は分化された軟骨の細胞成分に、トロンビンとフィブリノゲンマトリックスを混合して形成される。
【００２３】
また、本発明では、組織代替剤として、特定の細胞と成長因子等が含まれてもよい基質を必要とし、基質としては、細胞外基質（ＥＣＭ）の構成成分のような生体内成分、基質代替物である天然高分子等が用いられる。
【００２４】
さらに、前記細胞とマトリックスの相互作用は、直接的に細胞の粘着、移動、増殖、分化、アポトーシスを引き起こす。
【００２５】
また、サイトカインと成長因子の活性を調節して、細胞内信号伝達を活性化させ、組織の早い生成、早い回復の結果をもたらす。
【００２６】
一方、本発明に係る軟骨治療剤組成物の使用方法は、先ず、ヒトや動物から分離された後、増殖又は分化される軟骨細胞成分を準備し、凝固因子として用いられるトロンビンを準備する。
【００２７】
また、上記した軟骨細胞成分及びトロンビンと混合するフィブリノゲンマトリックス、すなわち、フィブリノゲン、コラーゲン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」という）、アプロチニン等の成分を準備する。
【００２８】
この際、フィブリノゲンが必ず含まれるフィブリノゲンマトリックスは、フィブリノゲンに他のマトリックス成分であるコラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧ、アプロチニン等を適量混合して、フィブリノゲンマトリックスを形成する。
【００２９】
さらに、前記アプロチニンの役割は、トロンビンによるフィブリノゲンの分解を抑制して、一定の形状に軟骨治療剤（トロンビン、軟骨細胞成分、フィブリノゲンの混合物）を混合するとき、固形化する軟骨治療剤の形態が長期間維持されるようにする。
【００３０】
この際、前記軟骨治療剤を移植する軟骨欠損部位は、先ず、きれいにした後、移植のために、移植部位の内部に直径２〜３ｍｍ、深さ３〜５ｍｍの孔を開けて、トロンビンを噴射する。
【００３１】
また、トロンビンが噴射された軟骨欠損部位に、軟骨細胞成分と、トロンビン及びフィブリノゲンマトリックスが混合された軟骨治療剤を欠損部位に注入する。
【００３２】
続けて、前記軟骨治療剤が注入された欠損部位の上に、軟骨細胞治療剤の生着と形態維持のために、高濃度のトロンビンを振り撒く。
【００３３】
本発明における前記軟骨細胞成分としては、正常軟骨組織を適当な酵素を用いて細胞に分離した後、培養液を加えて培養し、最終的に１００万個／ｍＬ以上の軟骨細胞を該培養液に含有するものを使用する。単位のｍＬは培養液１ｍＬを意味する（以下同じ）。
【００３４】
また、前記フィブリノゲンは、凍結乾燥状態のフィブリノゲンを、ＤＭＥＭ培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を始めとして、Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、α−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ'ｓ Ｌ−１５ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍのように、一般に使用される細胞培養液で復元させる。
【００３５】
そして、前記トロンビンもまた、凍結乾燥状態のトロンビンを、ＤＭＥＭ培養液を始めとして、前記培養液で復元させる。
【００３６】
また、前記フィブリノゲンには、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧから選ばれる一つ以上が、所定の濃度に混合されて、フィブリノゲンマトリックスを形成する。
【００３７】
この際、前記フィブリノゲンは、血液中に存在する物質であり、出血が生じたとき、トロンビンと反応して、フィブリンの形態に変形し、前記トロンビンに加えられるＣａＣｌ2とｆａｃｔｏｒ XIIIにより凝固され、止血作用するものである。
【００３８】
また、前記凍結乾燥状態のフィブリノゲンを溶解する場溶液には、１０Vol.％以下のウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ＦＣＳ）、ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、ウマ血清、ヒト血清を加えてもよく、さらに、微生物の感染を防ぐために、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン等の抗生剤、及びカナマイシン、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ゲンタマイシン等の抗真菌剤を適量加えてもよい。
【００３９】
さらに、前記フィブリノゲンを溶解する培養液は、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ、イーグル基礎培地、グラスゴーの最小必須培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２培地、ｌｓｃｏｖｅ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ培地、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ'Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等、一般に用いられる細胞培養用培地はいずれも使用可能である。
【００４０】
本発明によるフィブリノゲンマトリックスの具体的な実施例については、前記フィブリノゲンは、移植部位と患者の状態を考慮して、２０〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲において単独で用いられる。
【００４１】
前記フィブリノゲンは、高濃度であるときに比較的硬くて稠密なマトリックスを形成するものの、分解時間が増加し、使用後に異物感等が感じられることに対して、低濃度であるときには、組織での分解は迅速に行われるものの、粗いマトリックスを形成するようになり、軟骨に代替し難いという短所がある。
【００４２】
しかも、前記フィブリノゲンマトリックスは、２０〜２００ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンに、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、０．１〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、又は０．１〜２０ｍｇ／ｍＬのＧＡＧを単独又は複合的に混合して使用する。さらに、１〜３０００ＫＩＵ／ｍＬのアプロチニンを混合してもよい。
【００４３】
前記コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧ、アプロチニンは、宿主内に存在する物質であり、限定された濃度以上に含まれても、細胞に及ぼす影響において大差はないが、硬化時間が増加して手術時間が遅延する結果をもたらすようになる。
【００４４】
また、前記アプロチニンは、生体内においてフィブリンの分解を抑制して止血作用を助ける物質であり、多く添加するほど、フィブリンの分解速度が遅くなるので、濃度を調節すると、マトリックスの分解速度を調節することができる。
【００４５】
一般に、脊椎動物の軟骨は、軟骨細胞と基質からなり、基質の多くは、コラーゲンとヒアルロン酸を含むＧＡＧからなり、血管が存在せず、滑液から栄養分を供給される。
【００４６】
また、滑液の主成分は、ヒアルロン酸であり、このような成分を混合使用したとき、優れた軟骨再生能力を示すものである。
【００４７】
また、本発明に係る軟骨治療剤には、準備された０．０１〜５０ＩＵ／ｍＬ、好ましくは２〜１０ＩＵ／ｍＬのトロンビンが混合され、軟骨細胞成分とフィブリノゲンマトリックスを混合するとき、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリンに変化させる。
【００４８】
この際、前記軟骨治療剤の混合物に投入されるトロンビンの濃度に応じて、軟骨治療剤の硬化速度を調節することができ、フィブリンマトリックスの物性も調節が可能である。
【００４９】
しかも、前記トロンビンが低濃度であるときは、マトリックスが太い繊維質からなり、細孔のサイズが大きくなって、細胞と生理活性物質を含んで有利であるが、硬化時間が遅延して、所期の目的を達成し難くなる。
【００５０】
また、前記トロンビンが高濃度であるときは、マトリックスが薄い繊維質からなり、細孔のサイズが小さくなって、細胞の浸透を遮断するとともに、内部成長を容易にするが、硬化時間が早くなり、組成物を混合するうちに硬化することがあり、作業性が極めて低下する。
【００５１】
このため、前記トロンビンの濃度は、２〜１０ＩＵ／ｍＬが好ましく、このように投入されるトロンビンは、１〜１０分間で硬化し、本発明のマトリックスに混合するときは、低濃度のトロンビンを、組成物の投入前後には、高濃度のトロンビンを用いることが好ましい。
【００５２】
これにより、軟骨組織の再生に適合した程度の機械的強度及び柔軟性を有するようになる。
【００５３】
また、軟骨損傷部位に現れ得る様々な立体構造に合わせて、その形態を容易に変形させることができるので、手術の便宜を図るとともに、移植後も、一定の形態を維持しながら損傷部位に持続的に位置して、一緒に移植された軟骨細胞の体内増殖及び分化を促進することができる。
【００５４】
また、本発明において、軟骨細胞移植用組成物が移植される欠損部位は、先ず、軟骨治療剤を移植すべき軟骨欠損部位をきれいにし、患部の大きさに応じて、移植部位の内部に、直径２〜３ｍｍ、深さが約３〜５ｍｍの孔を０〜５個開けて止血した後、患部の表面に１００〜１０００ＩＵ／ｍＬの高濃度のトロンビンを振り撒き、軟骨治療剤の接着力を高くする。
【００５５】
この際、前記トロンビンは、軟骨治療剤を、移植すべき軟骨欠損部位と軟骨治療剤が密接に結合して、軟骨再生の密度を高くするとともに、外部からの衝撃にも耐えるようにする役割をする。
【００５６】
また、軟骨治療剤組成物を動物やヒトの軟骨欠損部位に注入する。
【００５７】
この際、前記軟骨治療剤組成物の注入は、軟骨欠損部位の穿孔部位からゆっくり注入し、残りの欠損部位を全て充填する順による。
【００５８】
また、フィブリノゲンがトロンビンと結合してフィブリンとなる時間は、濃度によって異なるので、適正時間である約１〜１０分内に欠損部位に軟骨治療剤を注入するようにする。
【００５９】
また、前記欠損部位の軟骨治療剤組成物の移植時は、１００〜１０００ＩＵ／ｍＬの高濃度のトロンビンを、移植された軟骨細胞成分−トロンビン−フィブリノゲンからなる軟骨治療剤組成物上に振り撒き、生着と形態維持を助け、これにより、保護膜が形成され、軟骨が再生される間、軟骨治療剤を保護する。
【００６０】
また、前記トロンビンの働きにより、フィブリノゲンがフィブリンに転換しながら、完全に固まるように、約５分間施術部位を放置する。
［実験例１］
【００６１】
軟骨治療剤の移植に用いられる各種のマトリックスの適切な物理的・化学的特性を測定するために、先ず、市販されている凍結乾燥状態のトロンビンを、２〜１０ＩＵ／ｍＬの濃度となるように溶解させる。
【００６２】
この際、２〜１０ＩＵ／ｍＬ濃度のトロンビンは、主に用いられるマトリックスであるフィブリノゲンをフィブリンに変形させるために加えるものである。
【００６３】
その他に加えられる、コラーゲンは０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸は０．１〜２０ｍｇ／ｍＬ、ＧＡＧは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、それぞれのマトリックスを準備する。
【００６４】
このように準備されたそれぞれのマトリックスを混合して形成される組成物の硬度、強度、及び曲げ強さを測定した。
【００６５】
先ず、２０〜２００ｍｇ／ｍＬ濃度のフィブリノゲン１ｍＬと、２〜１０ＩＵ／ｍＬ濃度のトロンビン１ｍＬとを混合し、それぞれの組成物の硬度、圧縮強度をレオメータで測定した。
【００６６】
また、実際の軟骨治療剤と上記した濃度のマトリックスとを混合して形成される組成物の強度を測定した。
【００６７】
その結果、図１に示すように、様々な臨床実験を通じて、軟骨細胞成分−トロンビン−フィブリノゲン混合物からなる軟骨治療剤組成物を移植するとき、適切な強度は、約１６０〜１７０ｇ／ｃｍ2であって、前記測定結果によって、トロンビン２ＩＵ／ｍＬであり、フィブリノゲン２０ｍｇ／ｍＬであるとき、組成物の強度は１６６ｇ／ｃｍ2であり、トロンビン４ＩＵ／ｍＬであり、フィブリノゲンがそれぞれ１６０、２００ｍｇ／ｍＬであるとき、組成物の強度はそれぞれ１７０、１６５ｇ／ｃｍ2であり、トロンビン８ＩＵ／ｍＬであり、フィブリノゲンがそれぞれ１６０、２００ｍｇ／ｍＬであるとき、組成物の強度はそれぞれ１７０、１６６ｇ／ｃｍ2であり、トロンビン１０ＩＵ／ｍＬであり、フィブリノゲンがそれぞれ１６０、２００ｍｇ／ｍＬであるとき、組成物の強度はそれぞれ１７１、１６９ｇ／ｃｍ2であるという測定値を得た。その結果として、図２に示すように、移植のためのフィブリノゲンとトロンビンの好適な濃度が得られた。
【００６８】
組成物のフィブリノゲン濃度に関しての物性の差は、図２の写真に示されるような性状を示した（左から右へＡ：２００ｍｇ／ｍＬ、Ｂ：１６０ｍｇ／ｍＬ、Ｃ：２０ｍｇ／ｍＬ）。
【００６９】
また、ヒアルロン酸、コラーゲン、ＧＡＧを加えた軟骨細胞成分−トロンビン−フィブリノゲンからなる軟骨治療剤組成物の強度測定結果は、前記適切なフィブリノゲンとトロンビンの濃度に各マトリックス、すなわち、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧを混合し、それぞれ硬さを測定したとき、前記測定結果よりも約１〜６ｇ／ｃｍ2の強度が減少し、約１５４〜１５９ｇ／ｃｍ2の強度測定値が得られた。
【００７０】
このような強度の減少は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧのマトリックス成分量を調節し、又は混合して用いることにより調節可能である。
【００７１】
また、患者の特性によりマトリックスの構成が異なるので、上述したフィブリノゲンとトロンビンの濃度に、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧのマトリックス成分を混合使用する。
【００７２】
さらには、年取った患者の場合は、コラーゲンやヒアルロン酸を加えるのに対して、酷い外傷や交通事故による若い患者の場合は、ＧＡＧやヒアルロン酸を混合使用する組成物を用いれば、軟骨生成に効果が得られた。
［実験例２］
【００７３】
上記したように投入されたフィブリノゲンとトロンビンが軟骨治療剤として用いるのに適合した強度である１６０〜１７０ｇ／ｃｍ2程度の強度を示すのに所要される重合時間（秒）は、表１のとおりである。
【００７４】
【表１】
0004542106.tif 000002
【００７５】
すなわち、低濃度のトロンビンでは、遅い重合時間が観察され、約５μｍ以上の細孔サイズを有する薄い繊維質構造を形成し、高濃度のトロンビンでは、早い重合時間が観察され、１μｍ以下の小さい細孔サイズの構造を形成するようになる。
【００７６】
また、前記トロンビンとフィブリノゲンからなる組成物は、軟骨治療剤として使用可能な強度である１５０〜１８０ｇ／ｃｍ2程度の強度を維持する時間が２〜７分程度であることが分かる。
［参考例１］
【００７７】
＜関節鏡により軟骨治療剤組成物を注入した場合＞
先ず、宿主である動物やヒトから軟骨組織を採取し、組織から細胞を分離した後、培養して０．３〜０．５ｍＬのＤＭＥＭ培養液に９００万〜１５００万個以上の軟骨細胞からなる軟骨治療剤を調製した。
【００７８】
また、医薬品として市販されるフィブリンシーラントを準備した後、凍結乾燥状態のフィブリノゲンの濃度が１００〜２００ｍｇ／ｍＬとなるように、バイアルにＤＭＥＭ培養液を入れて溶解させた。
【００７９】
また、凍結乾燥状態のトロンビンは、５００ＩＵ／ｍＬの濃度に溶解させた後、トロンビン溶液を軟骨治療剤に１〜１０ＩＵ／ｍＬの濃度になるように入れた。
【００８０】
以上の過程を終えた後、患者の膝を関節鏡を用いて軟骨欠損部位をきれいにして、移植する準備をした。
【００８１】
また、軟骨損傷部位を手術道具を用いてきれいにした後、損傷部位内に手術用ドリルを用いて、直径３ｍｍ、深さ５ｍｍの孔を、欠損部位の大きさに応じて３〜５個を開けた。
【００８２】
その後、軟骨と骨の小塊を除去してから止血をし、移植準備を終えた。
【００８３】
移植準備を終えた後、軟骨細胞成分と、トロンビン、フィブリノゲンが少なくとも含まれるフィブリノゲンマトリックスとを混合して軟骨治療剤を準備した。
【００８４】
この際、フィブリノゲンは、トロンビンと反応してフィブリンとなった後、凝固するので、５分以内に移植部位に移植しなければならない。
【００８５】
続けて、患者の軟骨治療剤組成物の移植部位に予め準備した５００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液をスプレーチップを用いて振り撒いた後、ガーゼで拭い取った。
【００８６】
次いで、軟骨細胞成分と、トロンビン、フィブリノゲンの混合物からなる軟骨治療剤組成物を、注射器を用いて、予め患部に開けた孔からゆっくり注入した後、全体を注入した。
【００８７】
また、前記組成物を注入するときは迅速でなければならず、泡が立たないようにし、注入が終わった途端に５００ＩＵ／ｍＬの高濃度のトロンビン溶液をスプレーチップで均一に振り撒く。
【実施例１】
【００８８】
＜関節鏡下で軟骨細胞成分、トロンビン、フィブリノゲンの混合物からなる組成物にコラーゲンを加えた軟骨治療剤を移植する場合＞
上述したように、軟骨細胞成分と、トロンビン、フィブリノゲンとを準備した。
【００８９】
また、関節の弾力が不足した患者の場合、弾力性を補強し、軟骨再生に効果を挙げるために、コラーゲンを混合したフィブリノゲンマトリックスを用いて移植することができる。
【００９０】
前記フィブリノゲンマトリックスは、フィブリノゲンとこれに加えられるコラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＡＧからなり、フィブリノゲンとコラーゲンを複合使用するとき、患者によって異なるが、５０歳前後の男性の場合、フィブリノゲンマトリックス濃度の１／１０〜１／５程度を単独又は混合して用いた。
【００９１】
例えば、５２歳の男性患者に移植すべきマトリックスの構成は、８０〜１６０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、１０〜２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの濃度を製造し、フィブリノゲン０．３ｍＬとコラーゲン０．１ｍＬを混合して、移植すべきフィブリノゲンマトリックスを準備した。
【００９２】
また、参考例１と同様に、患部に関節鏡を投入するための孔を開けて関節鏡を入れ、移植部位をきれいにし、患部に直径３ｍｍ、深さ５ｍｍの孔を約４個（患者の病変の大きさは約４ｃｍ2）開けて移植する準備をした。
【００９３】
続けて、軟骨細胞成分に１〜１０ＩＵ／ｍＬ濃度のトロンビンを入れた後、軟骨細胞成分とコラーゲンが混合されたフィブリノゲンマトリックスを混合した軟骨治療剤組成物を欠損部位に充填した。
【００９４】
以降の過程は、参考例１と同様である。
【００９５】
この際、前記フィブリノゲンに他の混合物を加えて形成されるフィブリノゲンマトリックスを移植する場合は、患者の状態と年齢により、フィブリノゲンに加えられる混合物が異なり、患者が年を取れば取るほど、コラーゲンとヒアルロン酸のようなマトリックス成分を軟骨治療剤と混合して用いることができる。
【００９６】
このようにフィブリノゲンマトリックスから軟骨細胞が分化したパターンが図７に示さ
れており、１０Vol.％のコラーゲンと１０Vol.％のヒアルロン酸が含まれたフィブリノゲンマトリックスでの軟骨細胞の分化パターンが図８に示されている。
［参考例２］
【００９７】
＜骨膜を用いて軟骨治療剤組成物を注入した場合＞
先ず、患者から軟骨細胞を採取して組織から細胞を分離した後、培養して約１２００万個以上の軟骨細胞と、０．４ｍＬのＤＭＥＭ培養液からなる軟骨治療剤を調製した。
【００９８】
次に、医薬品として市販されているフィブリンシーラントを準備した後、凍結乾燥状態のフィブリノゲンバイアルに、ＤＭＥＭ培養液を入れて、フィブリノゲンの濃度を５０〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解させた。
【００９９】
また、凍結乾燥状態のトロンビンバイアルに、ＤＭＥＭ培養液を加えて５００ＩＵ／ｍＬの濃度に溶解させた。
【０１００】
また、軟骨治療剤組成物を移植すべき部位を手術道具を用いて、滑らかにした。
【０１０１】
以上の過程を終えた後、患者の膝から骨膜を採取した後、移植部位に注意して縫合した。
【０１０２】
縫合後、縫合した骨膜の消失があるかを、シーラントを塗って確認した。
【０１０３】
次いで、予め製造した軟骨細胞成分に溶解されたトロンビン溶液を１〜１０ＩＵ／ｍＬ程度の濃度となるように加えた後、よく混ぜた。
【０１０４】
また、トロンビンが混合された０．４ｍＬの軟骨細胞成分と０．４ｍＬのフィブリノゲン溶液をよく混合して、移植用組成物を形成し、前記組成物を、注射器を用いて図５のように患部の骨膜内に注入した。
【０１０５】
この際、前記フィブリノゲンは、トロンビンと反応してフィブリンとなった後、凝固が起こるので、迅速に進行しなければならない。
【実施例２】
【０１０６】
＜フィブリノゲンに、ヒアルロン酸及びＧＡＧを加えたフィブリノゲンマトリックスとトロンビンを加えた細胞成分の混合物からなる組成物を注入した場合＞
交通事故に逢って軟骨に損傷を受けた２７歳男性の軟骨組織の一部を採取して培養し、約３×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬの軟骨細胞を準備した。
【０１０７】
フィブリノゲンマトリックスの構成としては、フィブリノゲン５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度、１０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、５〜１０ｍｇ／ｍＬのＧＡＧを準備する。
【０１０８】
交通事故による軟骨損傷により、患者の病変の大きさが４〜８ｃｍ2であるので、５０〜１００ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン０．５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸０．２ｍＬ、５〜１０ｍｇ／ｍＬのＧＡＧ０．２ｍＬを混合した。
【０１０９】
軟骨治療剤を移植すべき部位をきれいにし、損傷部位の大きさにより、直径３ｍｍ、深さ５ｍｍの孔を２〜５個程度開けた。
【０１１０】
また、５ＩＵ／ｍＬのトロンビンが混合された軟骨細胞成分と、三つの成分が混合されたフィブリノゲンマトリックスを準備した。
【０１１１】
続けて、５００ＩＵ／ｍＬの高濃度トロンビンを、スプレーチップを用いて移植すべき部位に均一に噴射させた後、軟骨細胞成分０．９ｍＬと、三つの成分が混合されたフィブリノゲンマトリックスとを混合した。
【０１１２】
混合された軟骨細胞成分−フィブリノゲンマトリックス（ヒアルロン酸＋ＧＡＧ）からなる組成物を移植部位の孔からゆっくり充填した。
【０１１３】
移植した部位に５００ＩＵ／ｍＬの高濃度トロンビンをさらに振り撒いた後、約５分間放置し、硬化が完了すると、移植を終えた。
【０１１４】
この際、患者が若い場合、軟骨組織の弾力性はよいが、外傷による軟骨部位の滑らかさが不足するので、このような点を補完するために、ヒアルロン酸やＧＡＧを用いて、不足した面は補完し、軟骨再生が容易に行われるようにすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
このような本発明によると、軟骨治療剤の漏れを防止し、形態を維持するので、手術過程が簡便であり、生体内基質成分と一緒に移植することにより、より優れた軟骨生成能を維持することができるという効果がある。
【０１１６】
また、骨膜の縫合をしない場合、手術時間を短縮することができ、関節鏡を用いて手術することができるので、手術過程が簡便であり、生体内基質成分と一緒に移植することにより、より優れた軟骨生成能を維持し、膝切開が不要になるという効果がある。
【０１１７】
以上、特定の実施例について図示して説明したが、以下の特許請求の範囲により提供される本発明の精神や分野を逸脱しない限り、本発明が様々に改良及び変化され得ることは、当業界において通常の知識を有する者であれば、容易に理解されることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、本発明に係る軟骨細胞移植用マトリックスにおいて、実験例１のフィブリノゲンとトロンビンの投入濃度による圧縮強度をレオメータにより測定したグラフである。
【図２】図２は、図１により、マトリックスにおいて、フィブリノゲンを、Ａ：２００ｍｇ／ｍＬ、Ｂ：１６０ｍｇ／ｍＬ、Ｃ：２０ｍｇ／ｍＬで投入したときのマトリックス写真（図面代用）である。
【図３】図３は、本発明によるマトリックスが移植される軟骨欠損部位をきれいにした様子を示す写真（図面代用）である。
【図４】図４は、本発明によるマトリックスを移植部位に移植した様子を示す写真（図面代用）である。
【図５】図５は、本発明の他の実施例による骨膜縫合後、軟骨治療剤組成物の注入状態を示す写真（図面代用）である。
【図６】図６は、本発明の他の実施例により、欠損部位に接合孔を予め形成した後、軟骨治療剤組成物を注入した様子を示す写真（図面代用）である。
【図７】図７は、本発明によるフィブリンマトリックスにおける軟骨細胞分化パターンを示す写真（図面代用）である。
【図８】図８は、本発明の他の実施例により、１０Vol.％のコラーゲンと１０Vol.％のヒアルロン酸が含まれたフィブリノゲンマトリックスにおいて、軟骨細胞の分化パターンを示す写真（図面代用）である。
【図１】
0004542106.tif 000003
【図２】
0004542106.tif 000004
【図３】
0004542106.tif 000005
【図４】
0004542106.tif 000006
【図５】
0004542106.tif 000007
【図６】
0004542106.tif 000008
【図７】
0004542106.tif 000009
【図８】
0004542106.tif 000010