(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性を有する、下記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
（ａ）  配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは１０個以下のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）  配列番号：３または５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質の基質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質の被検試料に対するプロテアーゼ活性を検出する工程、および
（ｃ）該プロテアーゼ活性により分解または切断を受ける化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体と、請求項１または２に記載のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触させ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体の生成を検出又は測定することを含んでなる、該タンパク質を検出又は測定する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ、その遺伝子、並びにそれらの製造及び用途に関する。
背景技術
雄性配偶子である精子は、雄の生殖器官である精巣において、主に（１）生殖幹細胞である精原細胞の自己増殖と精子への分化の開始、（２）精母細胞の減数分裂と遺伝子の組み換え、（３）半数体精子細胞の精子への形態形成、の３段階の過程を経て生産される。こうして形成された精子は交尾により雌体に排出され、卵管を通過し、雌性配偶子である卵子と結合し受精に至る（Ｋ．ＹｏｍｏｇｉｄａおよびＹ．Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ（１９９８）蛋白質核酸酵素，５１１−５２１）。
受精において、精子は卵管を通り卵子表面の透明帯と結合し、その透明帯を通過し、さらに卵子と融合する必要がある。これら受精の過程にはさまざまなプロテアーゼが関与している。例えば精子型アンジオテンシン変換酵素（ｔｅｓｔｉｓ  ＡＣＥ）は、そのノックアウトマウスの解析（Ｊ．Ｈ．Ｋｒｅｇｅら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７５，１４６−１４８；Ｃ．Ｒ．Ｅｓｔｈｅｒ  Ｊｒら（１９９６）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４，９５３−９６５）から、精子が卵管を通る際に重要な役割を果たしていることが示されており（Ｊ．Ｒ．Ｈａｇａｍａｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２５５２−２５５７）、また、前駆体タンパク質変換酵素４（ＰＣ４）も、雄のノックアウトマウスでは受精が著しく低下する（Ｍ．Ｍｂｉｋａｙら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，６８４２−６８４６）。
セリンプロテアーゼに関しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの受精が各種のトリプシンインヒビターにより阻害されることから、精子が透明帯を通過する際、精子（特に先端）に含まれるトリプシン様セリンプロテアーゼが透明帯を消化することが示唆されている（Ｐ．Ｍ．Ｓａｌｉｎｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８，６２３１−６２３５；Ｄ．Ａ．ＢｅｎａｕおよびＢ．Ｔ．Ｓｔｏｒｅｙ（１９８７）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３６，２８２−２９２；Ｄ．Ｙ．ＬｉｕおよびＨ．Ｗ．Ｂａｋｅｒ（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４８，３４０−３４８）。従来は精子先端に存在するトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであるアクロシン（ａｃｒｏｓｉｎ）がこの働きを担っていると考えられていた（Ｃ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ（１９８３）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．６９，２８９−２９５；Ｈ．Ｋｒｅｍｌｉｎｇら（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１，８２８−８３４；Ｕ．Ｋｌｅｍｍら（１９９０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ４２，１６０−１６６）。しかしそのノックアウトマウスがほぼ正常な受精をすることが判明し、アクロシン以外の精子に存在するセリンプロテアーゼが透明帯の消化を行っていることが示唆されている（Ｔ．Ｂａｂａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１８４５−３１８４９；Ｉ．Ｍ．Ａｄｈａｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ，Ｄｅｖ．４６，３７０−３７６）。ホヤではスペルモシン（ｓｐｅｒｍｏｓｉｎ）というトリプシンファミリーセリンプロテアーゼが精子で発現しており（Ｈ．Ｓａｗａｄａら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，２９００−２９０４）、この特異抗体がホヤの受精を濃度依存的に阻害することが判明している（Ｈ．Ｓａｗａｄａら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２，４９９−５０４）。また、最近マウスの精子先端に特異的に発現しているトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであるＴＥＳＰ１、ＴＥＳＰ２のｃＤＮＡがクローニングされた（Ｎ．Ｋｏｈｎｏら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４５，６５８−６６５）。しかし、この遺伝子が有する受精の際の役割はいまだ判明していない。これまでに透明帯を消化する働きを持つ、精子に存在するセリンプロテアーゼは報告されていない。
発明の開示
本発明は、精子の形成や機能に関連する新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼおよびそれらをコードする遺伝子、並びにそれらの製造方法および用途を提供することを課題とする。
本発明者らは、７６Ａ５ｓｃ２と命名された遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応による増幅の結果、７６Ａ５ｓｃ２遺伝子とは異なる配列を有する遺伝子断片を見出した。本発明者らは、この遺伝子断片を基に、成体マウス精巣に特異的に発現する２つの新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ（「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」）の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡをクローニングし、さらにこれら遺伝子の組織における発現について解析した。
単離された「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」（Ｔｅｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）は３２１アミノ酸をコードすると予想され、その予想アミノ酸配列はトリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフである「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ」および「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」活性部位を有し、また他のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであるアクロシンやプロスタシン、トリプシンなどと、この２つのモチーフおよびその近傍において非常に高い相同性を示した。しかし、それ以外の領域においては核酸およびアミノ酸レベルで高い相同性を示す既知遺伝子は存在せず、新規なトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであることが判明した。
一方、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は３１９アミノ酸をコードすると予想され、「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ」活性部位を保持していた。［Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」活性部位については１２アミノ酸よりなるモチーフ中、２アミノ酸がモチーフとは異なるが、他の既知トリプシンファミリーセリンプロテアーゼにおいてもこのような例は存在するため、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」はプロテアーゼとして機能すると考えられる。「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」もまた、核酸およびアミノ酸レベルで高い相同性を示す既知遺伝子は存在せず、新規なトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであることが判明した。
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」には、興味深いことに「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の前半領域と「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」の後半領域がつながったスプライシングアイソフォームが存在した。このため、これら２つのプロテアーゼは染色体上で非常に近い位置に存在することが示唆された。「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」には種々のスプライシングアイソフォームが存在するが、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」以外のアイソフォームは長いＯＲＦが開かず、プロテアーゼをコードしていなかった。「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」および「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は核酸レベル、アミノ酸レベルでそれぞれ５２．２％、３３．１％の相同性を有していた。
本発明者らは、また、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の核酸配列を基に、ＲＴ−ＰＣＲ及びＲＡＣＥを用いて、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｃＤＮＡのクローニングを行った。これにより取得されたヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」とマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２］は核酸レベル、アミノ酸レベルでそれぞれ７４．２％、６９．８％の相同性を有することが判明した。また、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は第８染色体にコードされていることが判明した。
本発明者らはさらに、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」の核酸配列を基に、ＲＴ−ＰＣＲ及びＲＡＣＥを用いて、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡのクローニングに成功した。また、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のカウンターパートであるマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡのクローニングにも成功した。
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」をコードする領域をプローブとしたマウスノーザンブロットの解析より、この遺伝子は成体マウス精巣でのみ発現が見られ、他の組織や胎児期ではその発現は確認されなかった。同様にＲＴ−ＰＣＲによる解析からも、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」の発現は成体精巣で非常に高いことが判明した。また、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」は生後１８日目以降の精巣で発現の上昇が確認できたが、生後１２日目以前の精巣や精子形成不全の変異体マウス精巣ではその発現が全く見られなかった。同様な解析を「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」でも行ったところ、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」と同様の発現パターンであることが判明した。これら事実は「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１］及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」が、精子の分化・熟成または精子の機能（受精）に関与していることを示唆する。一方、トリプシンファミリーセリンプロデアーゼに関しては、受精の際に重要な役割を担っていることが示唆されている。
従って、本発明者らは、見出した遺伝子によりコードされるタンパク質が、受精の鍵となるセリンプロテアーゼである可能性があり、新しい不妊症の治療薬や不妊症診断薬の開発、あるいは新しい避妊薬の開発に有用であると考えた。
本発明は、精子の形成や機能に関連すると考えられる新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ、それらをコードする遺伝子、並びにそれらの製造方法および用途に関し、より具体的には、
１．  配列番号：２、４、６、８、１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
２．  配列番号：２、４、６、８、１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な、下記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質、
（ａ）  配列番号：２、４、６、８、１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号：１、３、５、７、９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
３．  （１）または（２）に記載のタンパク質の部分ペプチド、
４．  （１）または（２）に記載のタンパク質と他のペプチドとからなる融合タンパク質、
５．  （１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
６．  （５）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
７．  （５）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換体、
８．  （７）に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質の製造方法、
９．  （１）または（２）に記載のタンパク質の基質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該タンパク質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質の被検試料に対するプロテアーゼ活性を検出する工程、および
（ｃ）該プロテアーゼ活性により分解または切断を受ける化合物を選択する工程、を含む方法、
１０．  （９）に記載の方法により単離されうる、（１）または（２）に記載のタンパク質の基質、
１１．  （１）または（２）に記載のタンパク質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で該タンパク質に（１０）に記載の基質を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質による該基質に対するプロテアーゼ活性を検出する工程、および
（ｃ）被検試料非存在下において検出した場合と比較して、該プロテアーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
１２．  （１１）に記載の方法により単離されうる、（１）または（２）に記載のタンパク質の活性を阻害する化合物、
１３．  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、
１４．  （１３）に記載の抗体と、（１）または（２）に記載のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触させ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体の生成を検出又は測定することを含んでなる、該タンパク質を検出又は測定する方法、
１５．  配列番号：１、３、５、７または９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するヌクレオチド、を提供するものである。
本発明は、新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼを提供する。本発明のタンパク質に含まれる「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」と命名されたマウスタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」と命名されたマウスおよびヒトタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４および６に、また「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」と命名されたマウスおよびヒトタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：８および１０に示し、それらのタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３、５、７および９に示す。
本発明のタンパク質に含まれる［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は、マウス精巣において高い発現が観察された（実施例５および６）。これらのタンパク質は精子、特にその先端領域に存在するならば、精子が透明帯を消化し受精を成立させる際の鍵となるプロテアーゼである可能性がある。従って、本発明のタンパク質は、不妊症治療薬や不妊症診断薬あるいは避妊薬の開発に有用であると考えられる。
また、本発明のタンパク質にはマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」タンパク質、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」タンパク質、またはヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。ここで「機能的に同等」とは、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」タンパク質、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」タンパク質、またはヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」タンパク質と同等の生物学的特性を有していることを意味する。生物学的特性としては、例えば、▲１▼活性の特性として、トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性を有すること、▲２▼配列の構造的特性として、トリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフ（「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ００１３４）」、「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ００１３５）」）および／またはそれと類似した配列を有することや、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」タンパク質、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」タンパク質、マウス［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３］タンパク質、もしくはヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性が見られること（後述）、▲３▼発現特性として、精巣に発現すること、などが挙げられる。
このようなタンパク質を得るための方法としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列に変異を導入する方法が用いられている。アミノ酸配列に変異が導入されたタンパク質を得るためには、例えば、合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用した部位特異的変異誘発法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５４，３５０−３６７）やＰＣＲによる部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））を使用することができる。これらの方法により、配列番号：２、４、６、８または１０に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質において、その生物学的特性に影響を与えないよう、１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたタンパク質を得ることができる。
変異するアミノ酸の個数は、配列番号：２、４、６、８または１０に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質の生物学的特性を保持しつる限り特に制限はない。配列番号：２、４、６、８または１０のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、配列番号：２、４、６、８または１０のいずれかに示されるアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、配列番号：２、４、６、８または１０のいずれかに示されるアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものが挙げられる。また、アミノ酸の変異部位も、配列番号：２、４、６、８または１０に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質の生物学的特性を保持しうる限り特に制限はない。
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
例えば、本発明のタンパク質に１または複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質として、融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、本発明のタンパク質と他のペプチドとが融合したものである。融合タンパク質は人為的に作製することもできる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、すでに公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、特に限定されない。例えば、ペプチドとしては、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、ＰｒｏｔｅｉｎＣの断片等、すでに公知であるペプチドが使用される。またタンパク質としては、例えばＧＳＴ（グルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらをコードするＤＮＡを融合させたものを用いることができる。
また、当業者にとっては、周知技術であるハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を用いて、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、５、７または９に記載のＤＮＡ）またはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることも当業者が通常行い得ることである。本発明のタンパク質には、ストリンジェントな条件下で上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部とハイブリダイズするＤＮＡがコードし、上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。ハイブリダイズするＤＮＡを他の生物から単離する場合、生物種に制限はないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタなどを挙げることができる。「ストリンジェントな条件」とは、通常、「４２℃、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ」程度であり、好ましくは「５０℃、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ」程度であり、さらに好ましくは「６５℃、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ」程度である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。
ハイブリダイズ技術により得られたＤＮＡがコードするタンパク質は、通常、配列番号：２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。「高い相同性」とは、少なくとも６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を指す。タンパク質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、該タンパク質を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態が異なっていてもよい。得られたタンパク質が配列番号：２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の生物学的特性を保持している限り、本発明のタンパク質に含まれる。
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質として、また遺伝子組換技術を利用して組み換えタンパク質として製造することが可能である。天然のタンパク質は、本発明のタンパク質が存在すると考えられる組織若しくは細胞（例えば精巣）からタンパク質を抽出し、後述する本発明の抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより調製することができる。
また、組み換えタンパク質を製造するには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを発現制御領域、例えばエンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現可能なように発現ベクターに組み込み、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現させることができる。
具体的には、例えば、哺乳類細胞を使用する場合、常用される有用なプロモーター／エンハンサー、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターを構築することができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他にタンパク質発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）の哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を用いることができる。
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
複製開始点としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
大腸菌を使用する場合、常用される有用なプロモーター、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列、発現させる遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。
本発明のタンパク質を製造するための発現ベクターは、本発明に好適に使用される発現ベクターであればいかなる発現ベクターであってよい。本発明の発現ベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター「ｐＡｄｅｘＬｃｗ」やレトロウイルスベクター「ｐＺＩＰｎｅｏ」などが挙げられる。また哺乳動物由来の発現ベクター、例えばｐＥＦ、ｐＣＤＭ８、昆虫細胞由来の発現ベクター、例えばｐＢａｃＰＡＫ８、植物由来の発現ベクター、例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２、動物ウイルス由来の発現ベクター、例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ、レトロウイルス由来の発現ベクター。例えばｐＺＩｐｎｅｏ、酵母由来の発現ベクター、例えばｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１、枯草菌由来の発現ベクター、例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０、大腸菌由来の発現ベクター、例えばｐＱＥ、ｐＧＥＡＰＰ、ｐＧＥＭＥＡＰＰ、ｐＭＡＬｐ２、ｐＲＥＰ４が挙げられる。
本発明において、タンパク質の製造のために、任意の産生系を使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えばｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特にＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。
植物細胞としては、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。真核細胞であれば例えば、培養液としてＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（ＶｉｃｋｉＧｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。例えば、目的とするＤＮＡをヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。このＤＮＡが挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁からタンパク質を得る。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的とするＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望のタンパク質を得る（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上記で得られた本発明のタンパク質は、細胞内外、宿主から単離し実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼが用いられる。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドも含む。このようなペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に結合する抗体を得るための免疫原として利用しうる。この場合、ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸以上の鎖長を有し、好ましくは、２０アミノ酸以上の鎖長を有する。本発明のタンパク質の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
遺伝子工学的手法を利用して宿主内で発現させた本発明のタンパク質若しくはその部分ペプチドは、細胞内外から単離し実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼが用いられる。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のタンパク質を製造するのみならず、例えば、哺乳動物、例えばヒトの遺伝子治療に用いることもできる。特に、本発明の遺伝子は、不妊症の遺伝子治療への応用が期待される。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを生体内の標的部位へ投与する。投与方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。なお、本発明のベクターには、このように遺伝子治療に用いられるベクターも含まれる。
本発明のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、当業者に周知のハイフリダイゼーション技術を用いて、それぞれゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー等をスクリーニングして得ることができる。
得られたＤＮＡ又はＤＮＡ断片をプローブとして、さらにゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる細胞、組織、臓器又は種から遺伝子を得ることができる。ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。
具体的には、例えば次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器からｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプローブを用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認すればよい。
また、本発明のＤＮＡは、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−ｒ７４）。また、本発明のＤＮＡを市販のキットや公知の方法によって改変することができる。例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終始コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ  又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には例えば配列番号：１の塩基配列において４８位の塩基Ａから１０１０位の塩基ＣからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において６９位の塩基Ａから１０２５位の塩基ＣからなるＤＮＡ、配列番号：５の塩基配列において７３位の塩基Ａから８６７位の塩基ＡからなるＤＮＡ、配列番号：７の塩基配列において３８位の塩基Ａから１０００位の塩基ＡからなるＤＮＡ、配列番号：９の塩基配列において４１位の塩基Ａから１０９６位の塩基ＣからなるＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、５、７または９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
「ストリンジェントな条件」とは、通常、「４２℃、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ」程度であり、好ましくは「５０℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度であり、さらに好ましくは「６５℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。
上記のハイブリダイズするＤＮＡは、例えば天然由来のＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）であってよい。天然由来のＤＮＡの場合、機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するための生物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタなどが挙げられる。例えばこれらの生物において、実施例において本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡが検出される組織（例えば精巣）由来のｃＤＮＡを用いて本発明のＤＮＡを単離することができる。また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡはｃＤＮＡやゲノムＤＮＡの他、合成ＤＮＡであってもよい。
また、本発明は、本発明のタンパク質の基質のスクリーニング方法を提供する。本発明のタンパク質の「基質」とは、本発明のタンパク質が結合することにより特定の部位で分解または切断を受ける化合物を指す。
基質となる化合物としては、タンパク質に制限されない。例えば、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）やキモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）は、タンパク質のみならず、ペプチド化合物の誘導体のアミド結合やエステル結合も切断することが知られている（Ｆａｒｍｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９７５）２５０，７３６６−７３７１；ｄｅｌ  Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（１９７１）２３５，３５８−６９）。従って、本発明において、基質としては本発明のタンパク質が結合することにより特定の部位で分解または切断を受ける限り限定されず、ペプチドやその類縁体、誘導体（ペプチド性化合物）、または非ペプチド性化合物などでもよい。
本発明の基質のスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパク質に被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質の被検試料に対するプロテアーゼ活性を検出する工程、および（ｃ）本発明のタンパク質のプロテアーゼ活性により分解若しくは切断を受ける化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに使用される被検試料としては、本発明のタンパク質の基質を含むことが期待される試料であれば特に制限はなく、例えば、細胞抽出液、動物組織抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、ペプチドの類縁体若しくは誘導体、非ペプチド性化合物、合成化合物、天然化合物などが挙げられる。
本発明のタンパク質に結合する基質のスクリーニングにおいては、例えば、本発明のタンパク質と被検試料とを混合し、インキュベートした後、被検試料の変化（切断、分解）を測定する。例えば、タンパク質を被検試料とする場合、被検試料を直接、またはアジド化したり、蛍光物質と結合させ、反応前後の試料の変化をＵＶスペクトル（Ｒ．Ｊ．Ｂｅｙｎｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｄ，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８９）ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ  ２５−５５）や、ＨＰＬＣ（Ｍａｉｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３２，３９５−３９８，Ｇａｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９８３）１５６，４８３−４９４）で検出し、プロテアーゼ活性を測定することができる。
また、ペプチド（及び類縁体、誘導体）を被検試料とする場合、数アミノ酸（１〜５アミノ酸の場合が多いが、特に制限はない）からなるペプチド（及び類縁体、誘導体）を本発明のタンパク質と混合し、インキュベート後被検試料の変化を測定する。例えば、被検試料のカルボキシル末端に蛍光性化合物（ＭＥＣ；Ｋａｗａｂａｔａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，１７−２５，ＡＭＣ；  Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．８２，１４９５−１４９８，ＡＦＣ；Ｇａｒｒｅｔｔ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７，８０５−８１７，など）を導入しておき、被検試料が切断を受けた際に生じる蛍光性化合物のスペクトル変化を指標にプロテアーゼ活性を測定すればよい。また、その他の蛍光標識ペプチド基質を用いたスクリーニング方法を用いることもできる（Ｒ．Ｊ．Ｂｅｙｎｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｄ，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８９）ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ２５−５５，Ｇｏｓｓｒａｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１６７，１９１−２０７，Ｙｕ  ＪＸ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９，１８８４３−１８８４８）。
また、上記方法の原理を利用して、被検化合物として合成化合物、または天然物バンク、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー、もしくはピンペプチド合成物等を用いてスクリーニングすることや、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットスクリーニングも可能である（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；  Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）。
上記スクリーニング方法を利用して、本発明のタンパク質の基質が単離されれば、本発明のタンパク質の該基質に対するプロテアーゼ活性を阻害する活性を指標に、本発明のタンパク質の阻害剤をスクリーニングすることができる。従って、本発明は、また、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
この方法は、（ａ）被検試料の存在下で本発明のタンパク質にその基質を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質の該基質に対するプロテアーゼ活性を検出する工程、および（ｃ）被検試料が非存在下において検出した場合と比較して、該プロテアーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに使用される本発明のタンパク質としては、天然のタンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの部分ペプチドであってもよい。また、スクリーニングに使用される被検試料としては、特に制限はなく、例えば、細胞培養上清、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチド、ペプチドの類縁体若しくは誘導体、精製若しくは粗精製タンパク質（抗体を含む）、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液、が挙げられる。
本発明のタンパク質の阻害剤のスクリーニングは、例えば、上記文献「Ｒ．Ｊ．Ｂｅｙｎｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｄ，Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８９）ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ２５−５５；Ｍａｉｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３２，３９５−３９８；Ｇａｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９８３）１５６，４８３−４９４）；Ｋａｗａｂａｔａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，１７−２５，；ＭｏｒｉｔａＴ，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．８２，１４９５−１４９８；Ｇａｒｒｅｔｔ  ＪＲ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７，８０５−８１７；Ｇｏｓｓｒａｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１６７，１９１−２０７，Ｙｕ  ＪＸ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９，１８８４３−１８８４８」に記載の系を利用して行なうことができる。また、ペプチド性基質をリード化合物とし、その構造の一部を修飾したり置換した化合物を、本発明のタンパク質の阻害剤スクリーニングにおける被検化合物として用いることも可能である（Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２２，３２８−３４０）。
上述したように、本発明のタンパク質は、その発現特性等から、精子の分化・熟成または精子の機能（受精）に関与していることが示唆される。本発明のスクリーニング方法により単離される上記阻害剤は、本発明のタンパク質の受精への関与を解析するために利用しうる。例えば、本発明のタンパク質の阻害剤を用いて、インビトロ受精解析（Ｙ．Ｔｏｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１６：１４７−１５１；Ｙ．Ｋｕｒｉｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６６：１０１２−１０１７）を行い、該阻害剤が受精を阻害するか否かを検討することにより、本発明のタンパク質の受精への関与を判定することができる。受精を阻害しうる本発明のタンパク質の阻害剤には、例えば、新たな避妊薬としての利用が考えられる。
本発明のスクリーニング方法を利用して得られる化合物をヒトや他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合、常用される手段に従って実施することができる。
例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば本発明のタンパク質と結合活性を有する化合物を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤とともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油のような天然産出植物油を溶解又は懸濁させるための通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば塩化ペンザルコニウム、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、本発明は、本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。このような抗体は、本発明のタンパク質の検出や精製などに利用しうる。また、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精解析において利用しうる。抗体は、公知の手段を用いてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体として得ることができる。
本発明のタンパク質に対して特異的に結合する抗体は、タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、本発明のタンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
例えば、抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを用いることができる。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えばタンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本発明における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に結合する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入して本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞内外又は、宿主から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得、このタンパク質を感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、一般的にはげっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。モノクローナル抗体を作成する場合は、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えばサルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与し、以降フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としてポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開９２−０３９１８号、国際公開９３−２２２７号、国際公開９４−０２６０２号、国際公開９４−２５５８５号、国際公開９６−３３７３５号および国際公開９６−３４０９６号参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコートするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合するかぎり、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を同相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えばアルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識するに次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片あるいはＮ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触させ、前記抗体とタンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
また、本発明は、配列番号：１、３、５、７または９に示される塩基配列からなるＤＮＡ（その相補鎖を含む）と特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するヌクレオチドを提供する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは上記したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを指す。このようなヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。特異的なハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシーは、ハイブリダイズ反応の温度、反応時間、プローブ又はプライマー濃度、プローブ又はプライマーの長さ、塩強度などを考慮することにより、当業者であれば適宜選択することができる。
本発明のマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」および「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」遺伝子は精巣に特異的に発現し、またマウスにおいて生後１８日以降、生殖細胞に特異的に発現していると考えられる。このため、これらのＤＮＡは生殖細胞のマーカー（検査薬）としても利用することが可能である。また、本発明の遺伝子は、精子の分化・成熟、および／または受精の成立を含む精子の機能に関与している可能性が考えられるため、これらＤＮＡは、不妊症の検査に利用することも考えられる。
また、「配列番号：１、３、５、７または９に示される塩基配列からなるＤＮＡ（その相補鎖を含む）と特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するヌクレオチド」には、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムも含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ  又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１、３、５、７または９に示される塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、５、７または９に示される塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、５、７または９に示される塩基配列に選択的に安定にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。このようなオリゴヌクレオチドとしては、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。なお、相同性を決定するためのアルゴリズムは、上記した文献に記載のアルゴリズムを使用すればよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体はｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも適用できる。また、患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用してもよい。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」遺伝子断片の単離
Ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｃＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＧＩＢＣＯ社，５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）から、５×１０４クローンからなるプラスミドを単離、精製し、これを鋳型として、本発明者らが「７６Ａ５ｓｃ２」と命名した遺伝子に由来する遺伝子特異的プライマー「７６Ａ５ｓｃ２−Ｂ」とベクタープライマー「ＳＰＯＲＴ  ＲＶ」を用いて以下の様にＰＣＲをおこなった。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＧＩＢＣＯ社，５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を１００倍に希釈したものを、１６本の３ｍｌ  ＬＢ−Ａｍｐ培地に１μｌずつ加え、３０℃で培養したのちＱＩＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）でプラスミドを得た（このプラスミドにはそれぞれ５×１０４の独立なクローンが存在する）。マウス心臓由来のプラスミドを鋳型とし、７６Ａ５ｓｃ２−Ｂ（配列番号：１１／５’ＧＡＴ  ＣＭＡ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  Ａ  ３’）とＳＰＯＲＴ  ＳＰ６（配列番号：１２／５’ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＡＡ３’）のプライマーで、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）をポリメラーゼとして用い、９５℃１２分の後、「９６℃，２０秒、５５℃，２０秒、７２℃，２分」×４０サイクル、続いて７２℃３分の条件でＰＣＲをおこなった。
ＰＣＲ反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い約０．７ＫｂのＰＣＲ生成物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）でＰＣＲ生成物を回収した。このＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）にＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を用いてＴＡクローニングした。
出現したコロニーから８つを選択し、コロニーＰＣＲにより挿入断片を以下のようにして増幅した。
ＳＰＯＲＴ  ＦＷ（配列番号：１３／５’ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ３’）、ＳＰＯＲＴ  ＲＶ（配列番号：１４／５’ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ３’）及びＫＯＤ  ｄａｓｈポリメラーゼを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液に組み替え体を持つコロニーを直接懸濁し、９４℃１分の後、「９６℃  １５秒、５５℃  ５秒、７２℃  ２５秒」を３２サイクルの条件でＰＣＲをおこなった。
増幅されたＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で確認し、必要に応じてＰＣＲ生成物をＭｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓ−３００あるいはＳ−４００ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で精製した。
シークエンス反応のテンプレートとして、上記のコロニーＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲ産物を用いてシークエンスを行った。ＰＣＲ反応後アガロースゲル電気泳動で生成物を確認し、夾雑物が混入している場合はアガロースゲルより目的ＰＣＲ産物を切り出し、そうでない場合は上記のゲルろ過で精製した。シークエンス反応はＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、またはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いたサイクルシークエンシングを行った。プライマーには、ＳＰＯＲＴ  ＦＷおよびＳＰＯＲＴ  ＲＶを用いた。未反応のプライマー、ヌクレオチド等を９６  ｗｅｌｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ＨＬ  ｋｉｔ（ＡＧＴＣ社）で除去し、ＡＢＩ  ３７７あるいはＡＢＩ  ３７７ＸＬ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）で塩基配列を決定した。
その結果、７つは７６Ａ５ｓｃ２由来の塩基配列であったが、１つは（インサートサイズ約０．５Ｋｂ）異なる塩基配列を持っていた。そこでこの塩基配列をＧＣＧのデータベースサーチで解析した。また、この塩基配列はＯＲＦが開いていたのでアミノ酸に翻訳し、アミノ酸配列もＧＣＧのデータベースで解析した。その結果、この遺伝子断片は核酸及びアミノ酸レベルで多数の既知トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ（ｔｒｙｐｓｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）と一部の領域で相同性を持っていることが判明した。しかしこの遺伝子断片の全領域において高い相同性を示す既知遺伝子はなく、新規な遺伝子であることが判明した。また、このアミノ酸配列はトリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフである「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ００１３４）」モチーフを有することが判明し、新規なプロテアーゼの断片であることが示唆された。
［実施例２］［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニング
実施例１においてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙより得たプラスミドをテンプレートとし、実施例１で単離された遺伝子断片より新たにデザインしたＮｏ９−Ｃ（配列番号：１５／５’ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  Ｇ３’）とベクタープライマーＳＰＯＲＴ  ＦＷあるいはＳＰＯＲＴＴ７（配列番号：１６／５’ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ３’）のプライマーセット、及び該遺伝子断片より新たにデザインしたＮｏ９−Ｂ（配列番号：１７／５’ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  Ｇ３’）とベクタープライマーＳＰＯＲＴ  ＲＶのプライマーセットでＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄをポリメラーゼとして用いてｐｌａｓｍｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＢＡＣＥをおこなった。ＰＣＲ反応は９５℃１２分の後、「９６℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃５分」×４２サイクル、次いで７２℃３分の条件でおこなった。
ＰＣＲ反応液をアガロースゲルで電気泳動し、ＰＣＲ産物の確認を行った。さらにこれらＰＣＲ産物について、直接またはｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングしたのち塩基配列を決定した。
３’ＲＡＣＥをおこなったところ、２つのＰＣＲバンドが得られたのでその塩基配列を決定した。一方のバンドの塩基配列は他方のバンドの塩基配列の途中にｐｏｌｙ  Ａが付加したものであった。
一方、５’ＲＡＣＥの結果も同様に、ＰＣＲ産物は長短２つのバンドを与えたので、それぞれのバンドをサブクローニングした後、塩基配列を決定した。その結果、この両者の３’側の塩基配列は同一であり、スプライシングアイソフォーム（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍ）であることが判明した。
５’ＲＡＣＥで出現した短い方のバンドと、３’ＲＡＣＥの長い方のバンドの塩基配列をつなぎあわせることによりプロテアーゼをコードする塩基配列が得られたので、これを「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」（Ｔｅｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）と名付けた。
得られた「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」ｃＤＮＡは１０３３塩基で、３２１アミノ酸をコードしていると予想される（図１）。その塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。アミノ酸配列にはＮ末端にシグナルペプチドと思われる疎水性アミノ酸領域が存在し、またＣ末端にも疎水性アミノ酸に富む領域が存在していた。このアミノ酸配列はＧＣＧでの解析結果からトリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフである「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ００１３４）」および「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ００１３５）」を持つことが判明した。ＰＲＯＳＩＴＥによれば、「あるタンパク質がセリンおよびヒスチジン活性化部位の両方を有している場合は、そのタンパク質がトリプシンファミリーセリンプロテアーゼである確率は１００％である（”ｉｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ，ｔｈｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｔ  ｂｅｉｎｇ  ａ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｆａｍｉｙ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｓ  １００％”）」とされている（Ｓ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５２８−５３０；Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１９−６１）ため、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」はトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであると考えられる。この遺伝子について塩基配列及びアミノ酸配列についてＧＣＧのデータベースサーチをおこなった。その結果上述の２つのモチーフとその近傍ではアクロシンやプロスタシン、トリプシンなど既知のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼと高い相同性を示し、またプロテアーゼ活性に必要なアスパラギン酸残基や、プロテアーゼ活性に必要と思われる分子内ジスルフィド結合に必要なシステインの位置も他のプロテアーゼと比較してよく保存されていた（図３）。しかしそれ以外の領域においては、核酸およびアミノ酸レベルで高い相同性を示す既知の遺伝子、タンパク質は存在せず、新規なトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであることが判明した。
［実施例３］「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニング
実施例２において「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のクローニングの際の５’ＲＡＣＥで取得できた分子量の大きいバンド（５’側で「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」ではない塩基配列を持つ）について、その塩基配列より新たに合成したプライマー（Ｎｏ９−ＧあるいはＮｏ９−Ｊ）を用いて、実施例１に示したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙから得たプラスミドをテンプレートとし、更に３’及び５’ＲＡＣＥをおこなった。
具体的には、Ｎｏ９−Ｇ（配列番号：１８／５’ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  Ｔ３’）とＳＰＯＲＴ  ＦＷ、及びＮｏ９−Ｊ（配列番号：１９／５’ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  Ｃ３’）とＳＰＯＲＴ  ＲＶのプライマーセットでＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄをポリメラーゼとして用い、９５℃１２分の後、「９６℃  ２０秒、５５℃  ２０秒、７２℃  ５分」×４２サイクル、次いで７２℃３分の条件でＰＣＲをおこなった。
ＰＣＲ産物について、直接またはｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングしたのち塩基配列を決定した。
３’ＲＡＣＥをおこない、２つの３’ＲＡＣＥ産物を得た。両者の塩基配列を決定したところ、両者とも５’側の塩基配列は同一であるが、３’側の塩基配列が異なっていた。一方は上述した「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」の塩基配列の途中にｐｏｌｙ  Ａが付加したものと同一であった。他方の３’側の塩基配列は「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のものとは異なる配列を持っていた。
５’ＲＡＣＥをおこなうと、マルチバンドを与えたのでサブクローニングをした後、それらの塩基配列を決定した。その結果これらはすべて３’側の配列が共通であり、スプライシングアイソフォームであることが判明した。その内の１つは長いＯＲＦが開いており、この５’ＲＡＣＥ産物と、先に述べた３’側の塩基配列が「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のものとは異なる３’ＲＡＣＥ産物をつなぎあわせることにより、プロテアーゼをコードすると思われる塩基配列が得られたので、これを「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」と名付けた。その塩基配列を配列番号：３に、アミノ酸配列を配列番号：４に示す。
得られた「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」ｃＤＮＡは１０３４塩基で（図２）、５’非コード領域は６８塩基であるのに対し３’非コード領域が９塩基と非常に短かく、またｐｏｌｙ  ＡシグナルもＧＡＴＡＡＡと一般のｍＲＮＡ（ＡＡＵＡＡＡ）よりも弱いと思われる。このｃＤＮＡより「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は３１９アミノ酸をコードすると予想され、そのアミノ酸配列はＮ末端にシグナルペプチドと思われる領域が存在するが、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」とは異なりＣ末端には疎水性アミノ酸に富む領域は存在しない。またこのアミノ酸配列はトリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフである「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ」を持つが、「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」については１２アミノ酸よりなるモチーフ（［ＤＮＳＴＡＧＣ］−［ＧＳＴＡＰＩＭＶＱＨ］−Ｘ−Ｘ−Ｇ−［ＤＥ］−Ｓ−Ｇ−［ＧＳ］−［ＳＡＰＨＶ］−［ＬＩＶＭＦＹＷＨ］−［ＬＩＶＭＦＹＳＴＡＮＱＨ］）中、２アミノ酸がこのコンセンサスから外れている（ＧＫＣＱＧＤＳＧＡＰＭＶ）。しかし既知のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼにおいても、コンセンサス配列から数アミノ酸異なった配列を持つものも存在するため、取得した「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」も、プロテアーゼとして機能するものと思われる。
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」についても塩基配列及びアミノ酸配列について、ＧＣＧのデータベースサーチをおこなった。その結果、「ＴｅｓｐｅｃＰＲＯ−１」同様上述の２つのモチーフとその近傍では、既知のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼと高い相同性を示し、またプロテアーゼ活性に必要なアスパラギン酸残基や、プロテアーゼ活性に必要と思われる分子内ジスルフィド結合に必要なシステインの位置も他のプロテアーゼと比較してよく保存されていたが（図３）、それ以外の領域においては、核酸およびアミノ酸レベルで高い相同性を示す既知の遺伝子、タンパク質は存在せず、新規なトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであることが判明した。
［実施例４］「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」および「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のスプライシングアイソフォーム
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」と「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の核酸及びアミノ酸レベルでの相同性はそれぞれ５２．２％、３３．１％であった。これらの値は他の既知トリプシンファミリーセリンプロテアーゼに対する相同性と同程度である。
実施例３の５’ＲＡＣＥで取得できた「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のスプライシングアイソフォームは、スプライシングジャンクション部分や「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」では使用されない領域の塩基配列に終止コドンが現れ、長いＯＲＦを見出すことはできずプロテアーゼをコードしていないと考えられた。スプライシングアイソフォームを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて以下の様により詳しく解析した。
ｃＤＮＡクローニングによって得られた塩基配列を基に、Ｎｏ９−Ｐ（配列番号：２０／５’ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣ３’）、Ｎｏ９−Ｑ（配列番号：２１／５’ＡＴＴ  ＧＧＣＧＴＧ  ＧＣＡ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  Ａ３’）、Ｎｏ９−Ｎ（配列番号：２２／５’ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＧＣＡＣＡＧ  Ａ  ３’）、Ｎｏ９−Ｍ’（配列番号：２３／５’ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  Ｇ  ３’）、Ｎｏ９−Ｋ（配列番号：２４／５’ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＡＧ  ３’）、Ｎｏ９−Ｇ、Ｎｏ９−Ｊ、Ｎｏ９−０（配列番号：２５／５’ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  Ａ  ３’）の各プライマーを合成した。これらを用い、マウスの組織より調製したｃＤＮＡをテンプレートとして、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄをポリメラーゼとして、９５℃１２分の後、「９６℃  ２０秒、６０℃  ２０秒、７２℃  １分」を４０サイクル、次いで７２℃３分の条件でＲＴ−ＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ反応液は１．５％Ｓｅａｋｅｍ  ＧＴＧアガロース（ＴａＫａＲａ社）で電気泳動を行った。
ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果（図４および５）、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のスプライシングアイソフォームのうち、５’側がＢｏｘ２−Ｉ〜２−ＩＩＩ〜２−ＶＩというアイソフォームが主要であると思われ、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」よりその存在は多いと思われる。また、Ｂｏｘ２−Ｉを使用したアイソフォームとしては、Ｂｏｘ２−ＶＩを経てＢｏｘ２−ＶＩＩあるいはＢｏｘ１−ＩＩへとつながっていくｃＤＮＡ（後者は「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」とのキメラｃＤＮＡと思われる）がＲＴ−ＰＣＲで確認できたが、Ｂｏｘ２−ＩＩＨｂを使用したアイソフォームとしては、Ｂｏｘ２−ＶＩを経てＢｏｘ  １−ＩＩへとつながっていく「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」とのキメラ型のｃＤＮＡのみが確認できた（図４および５）。このことは、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」と「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」が染色体上で非常に接近しており、また「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｐｏｌｙＡシグナルが弱いために起きているものと思われる。また、このような一見無意味と思われるような（短いタンパク質しかコードできない）スプライシングアイソフォームが存在する意義は不明であるが、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の発現が転写時のみならずスプライシングによっても制御されている可能性も考えられる。
［実施例５］「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「ＴｅｓｐｅｃＰＲＯ−２」遺伝子発現の組織分布
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」と［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の発現がどの組織で見られるかをＲＴ−ＰＣＲで確認した。成体マウスの１０種の組織（肝臓、脳、胸腺、心臓、肺、脾臓、精巣、子宮、腎臓、１０〜１１日目胎児）より単離した全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）を逆転写酵素として用い、（ｄＴ）３０ＶＮプライマーでｃＤＮＡ合成をしＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとした。また、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ  ｍｏｕｓｅ  ７ｄａｙ  ｅｍｂｒｙｏ，１７ｄａｙ  ｅｍｂｒｙｏ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）もＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして用いた。
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」特異的プライマーとしてＮｏ９−Ａ（配列番号：２６／５’ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ３’）とＮｏ９−Ｂを、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」特異的プライマーとして２９（−）（配列番号：２７／５’ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  Ｇ３’）と１７（＋）９５（＋）（配列番号：２８／５’ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  Ｃ  ３’）を用いた。Ｇ３ＰＤＨのコントロールプライマーとしてＧ３ＰＤＨ５’（配列番号：２９／５’ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  Ｃ３’）とＧ３ＰＤＨ３’（配列番号：３０／５’ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  Ｃ３’）を用いた。Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄをポリメラーゼとして、９５℃  １２分の後、「９６℃  ２０秒、６０℃  ２０秒、７２℃  ３０秒」×４２サイクル（Ｇ３ＰＤＨの場合は２８サイクル）、次いで７２℃  ３分の条件でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ反応液は１．５％Ｓｅａｋｅｍ  ＧＴＧアガロース（ＴａＫａＲａ社）で電気泳動を行った。
その結果、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の両者とも精巣で高い発現が確認された（図６）。興味深いことに、この遺伝子はマウス心臓ｃＤＮＡプラスミドライブラリーよりクローニングしたにもかかわらず、心臓での発現はほとんどないことが判明した。また、精巣以外の組織においても、目的とする大きさのバンドが非常に弱いながらも観察された。
さらに、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のコーディング領域の一部（Ｂｏｘ  １−ＩＩを完全に含む領域、１１０〜４０１核酸残基）、及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｅｘｏｎ２−ＶＩ付近（３４０〜７２３核酸残基）（「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」には多くのスプライシングアイソフォームが存在し、このプローブはそれらの共通領域であるので「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」特異的なプローブではなく、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」及びそのスプライシングアイソフォームを認識するものである）をプローブとしてｍｏｕｓｅ  ＭＴＮ  ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）による組織分布を解析した。
成体マウス精巣のｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｎｏ９−ＡとＮｏ９−Ｂのプライマーで増幅したＲＴ−ＰＣＲ生成物をＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈｅｒｍ社）を使用し［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベリングし、未反応の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを除去したものを「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」プローブとした。同様にＮｏ９−ＧとＮｏ９−Ｊのプライマーで増幅した後、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベリングしたものを［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」プローブとした。Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｂｌｏｔおよびＭｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）中で、添付マニュアルの方法に従い、６８℃でハイブリダイゼーションを行った。
「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のプローブを用いたところ、精巣にのみ約１．２Ｋｂのバンドが観察できた（図７）。また、精巣以外の組織や胎児期にはこのバンドは観察できなかった。「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のプローブを用いたところ、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」と同様に精巣にのみ約１．２Ｋｂのバンドが観察でき（図７）、精巣以外の組織や胎児期ではバンドは観察できなかった。
以上の結果より「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の両者は精巣特異的な発現をしていることが判明した。
［実施例６］「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」遺伝子の精巣での発現時期
マウスにおいて原始生殖細胞は受精後７日目の胎児において出現し、生殖巣への移動（受精後１１日目）後、前精原細胞へと分化をする（受精後１３日目）。この前精原細胞はそれ以降停止期に入るが、出生後生殖幹細胞である精原細胞として自己増殖と精子への分化を開始する。精原細胞から精母細胞、精子細胞を経て熟成した精子へと分化するのに約３４日かかる（実際には精原細胞にも分化段階があるためそれを含めると約４２日である）。そのため出生後のマウスの精巣を経日的に採取し、そこでの「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」遺伝子の発現を確認することで、これらの遺伝子がどの分化段階の精子で発現しているか、あるいは精巣内の支持細胞（セルトリ細胞やラディッヒ細胞）で発現しているかが判明する。
一方、突然変異体のマウスとして第５染色体異常に起因するＷ（Ｗｉｔｅｓｐｏｔｔｉｎｇ）がある（Ｐ．Ｂｅｓｍｅｒら（１９９３）Ｄｅｖ．Ｓｕｐｐｌ．，１２５−１３７）。これは精原細胞及び精母細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼであるｃ−ｋｉ先に異常のある変異体で、これにより精巣内のセルトリ細胞やラディヒ細胞などの支持細胞は正常であるにもかかわらず、生殖細胞が欠損したり（完全変異型）、精原細胞以降の分化が不全となったり（不完全変異型）する。そこでこの変異体マウスＷ／Ｗｖの精巣での「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の発現も確認した。
出生後４日、８日、１２日、１８日、４２日のマウス精巣より単離した全ＲＮＡ、及び生後５６日目の異なる３匹のＷ／Ｗｖマウス精巣より単離した全ＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこなった。このとき同時に成体マウスの精巣、肝臓由来のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲも実施した。プライマーは上記実施例５の「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」特異的プライマー、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」特異的プライマーを使用し、４０サイクル（Ｇ３ＰＤＨは２９サイクル）のＰＣＲを実施例５と同様に行った。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は生後１８日目以降の精巣で発現の上昇が見られたが、両遺伝子とも生後１２日目以前及びＷ／Ｗｖ変異体マウスの精巣では発現が全く認められなかった（図８）。またネガティブコントロールとしておこなった肝臓においても、発現は確認できなかった。以上の結果は、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」及び「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の両者の発現が、セルトリ細胞やラディッヒ細胞のような支持細胞ではなく、生殖細胞が分化した精母細胞あるいは減数分裂後の精子細胞あたりから上昇していることを示唆する。
［実施例７］ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」全長ｃＤＮＡのクローニング
マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の塩基配列を基にしてヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のクローニングをおこなった。ヒト精巣ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）を逆転写酵素として用い、（ｄＴ）３０ＶＮプライマーでｃＤＮＡ合成をしＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとし、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」由来のＮｏ９−ＧとＮｏ９−ＱをプライマーとしてＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄをポリメラーゼとして、９５℃１２分の後、「９６℃  ２０秒、５５℃  ２０秒、７２℃  ３０秒」×４２サイクル、次いで７２℃３分の低ストリンジェンシーの条件でＰＣＲをおこなった。
その結果得られたＲＴ−ＰＣＲ産物について、直接塩基配列を決定した。その結果、このＰＣＲ産物はマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の塩基配列と約８０％の相同性を持つ、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の遺伝子断片であることが判明した。この塩基配列を基に５’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｈ−Ｂ（配列番号：３１／５’ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ３’）、ｈ−Ｄ（配列番号：３２／５’ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  Ｃ３’）を、３’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｈ−Ａ（配列番号：３３／５’ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  Ａ  ３’）、ｈ−Ｃ（配列番号：３４／５’ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  Ａ  ３’）を作成し、ｈｕｍａｎｔｅｓｉｔｉｓ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）をテンプレートとして、添付マニュアルの方法に従いネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）３’及び５’ＲＡＣＥを実施した。その結果、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の全長ｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。その塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に示す。
ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｃＤＮＡは１０３５塩基で、２６５アミノ酸をコードしていると予想される（図９）。ヒト及びマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」では、核酸及びアミノ酸レベルで互いにそれぞれ７４．２％、６９．８％の相同性を持つが、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」に比較してアミノ酸配列のＣ末端が５４残基短く、それに伴い核酸配列の３’非コード領域が長くなっている（図１０，１１）。また、Ｎ末端にはシグナルペプチドと思われる領域が存在し、Ｃ末端領域も疎水性アミノ酸に富んでいる。ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の予想されるアミノ酸配列には、トリプシンファミリーセリンプロテアーゼモチーフである「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ」を持つ。更に「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」については１２アミノ酸よりなるモチーフ（［ＤＮＳＴＡＧＣ］−［ＧＳＴＡＰＩＭＶＱＨ］−Ｘ−Ｘ−Ｇ−［ＤＥ］−Ｓ−Ｇ−［ＧＳ］−［ＳＡＰＨＶ］−［ＬＩＶＭＦＹＷＨ］−［ＬＩＶＭＦＹＳＴＡＮＱＨ］）中、１アミノ酸（ＧＩＦＫＧＤＳＧＡＰＬＶ）がこのコンセンサスから外れている（マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」では１２アミノ酸モチーフ中２アミノ酸がコンセンサスから外れている）。
データベースサーチの結果、取得したヒト［Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は、核酸およびアミノ酸レベルで高い相同性を示す既知の遺伝子、タンパク質は存在せず、新規なトリプシンファミリーセリンプロテアーゼであることが判明した。
［実施例８］ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の染色体マッピング
ヒト染色体パネル（ＣＯＲＲＩＥＬＬ  ＣＥＬＬ  ＲＥＰＯＳＩＴＯＲＩＥＳ社製）をテンプレートとし、ｈ−Ａとｈ−Ｆ（配列番号：３５／５’ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  Ｃ  ３’）のプライマーで、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）をポリメラーゼとして、９５℃  １分の後、「９６℃  １５秒、６０℃  １５秒、６８℃  ３０秒」×３７サイクル、次いで６８℃  ３分の条件でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ反応液は１．５％Ｓｅａｋｅｍ  ＧＴＧアガロース（ＴａＫａＲａ）で電気泳動を行った。
電気泳動の結果を基に染色体マッピングを行った結果、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」は第８染色体上に存在することが判明した（図１２）。
［実施例９］ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」遺伝子の全長ｃＤＮＡクローニング
ヒト精巣ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）を逆転写酵素として用い、（ｄＴ）３０ＶＮプライマーでｃＤＮＡ合成をしＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとし、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」由来の塩基配列より合成したＰＲＯ１−Ｅ（配列番号：３６／５’ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＴ  ３’）とＰＲＯ１−Ｄ（配列番号：３７／５’ＣＣＡ  ＧＣＡＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  Ｇ  ３’）をプライマーとして用い、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄをポリメラーゼとして、９５℃  １２分の後、「９６℃  ２０秒、５０℃  ２０秒、７２℃  ４５秒」×５サイクル、次いで「９６℃  ２０秒、６０℃  ２０秒、７２℃  ４５秒」×３５サイクル、次いで７２℃  ３分の低ストリンジェンシーの条件でＰＣＲをおこなった。
その結果得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をゲルろ過後、塩基配列を決定したところ、トリプシンファミリーセリンプロテアーゼをコードする遺伝子断片であることが判明した。この遺伝子断片をアミノ酸に翻訳するとそのアミノ酸配列には「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｈｉｓ」のモチーフが含まれていた。この遺伝子断片の塩基配列のデータベースサーチをおこなったところ、ヒト  ＥＳＴ（ＡＡ７８１３５６、ａｊ２５ｃ０４．ｓ１  Ｓｏａｒｅｓ−ｔｅｓｔｉｓ−ＮＨＴ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  １３９１３３４  ３’，ｍＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）と一部重なり合うことが判明した。このＥＳＴをアミノ酸に翻訳すると「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」モチーフが存在した。そこで得られた遺伝子断片の塩基配列を基に、５’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｈＰＲＯ３−Ｂ（配列番号：３８／５’ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  Ｃ  ３’）およびｈＰＲＯ３−Ｄ（配列番号：３９／５’ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  Ｔ  ３’）を、３’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｈＰＲＯ３−Ａ（配列番号：４０／５’ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＣ  ３’）およびｈＰＲＯ３−Ｃ（配列番号：４１／５’ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  Ｇ  ３’）を作製し、ｈｕｍａｎ  ｔｅｓｔｉｓ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）をテンプレートとして、添付のマニュアルの方法に従いｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥを実施し、全長ｃＤＮＡのクローニングをおこなった。ＲＡＣＥ産物を直接またはｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングしてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列番号：９に、アミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
この新規ヒト遺伝子は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」の塩基配列より合成したプライマーを用いて得られたにもかかわらず、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」よりもデータベース中のマウス精巣（ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ）ＥＳＴ（ＡＡ４９７９６５、ＡＡ４９７９３４、ＡＡ４９７９１９等）に、より相同性が高かった（図１４）。そこで、この遺伝子をヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」と名付けた。
ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡは１１２３塩基で、３５２アミノ酸をコードしていると予想される（図１３）。Ｎ末端にはシグナルペプチドと思われる配列が存在し、「Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｈｉｓ」及び「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」モチーフを有していた。また分子内ジスルフィド結合をしていると思われるＣｙｓ残基も他のセリンプロテアーゼと比較してよく保存されていた。
［実施例１０］マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」遺伝子の全長ｃＤＮＡクローニング
上述したヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のマウスカウンターパートであるマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」は、上述の数個のマウス精巣ＥＳＴの塩基配列を含む遺伝子であると思われる。この遺伝子のマウスＥＳＴは合計８つデータベースに登録されており、４つは精巣由来、１つは腎臓由来、残りの３つは組織不明のｃＤＮＡ由来であった。そこでこれらのＥＳＴからプライマーを作成し、ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡをテンプレートとしたＲＡＣＥをおこない、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」の全長ｃＤＮＡ配列のクローニングをおこなった。
マウスＥＳＴ（ＡＡ４９７９６５，ＡＡ４９７９３４，ＡＡ４９７９１９，ＡＡ４９７９４９，ＡＡ２７１４０４，ＡＡ２３８１８３，ＡＡ２４０３７５，ＡＡ１０５２２９）の塩基配列を基に、５’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｍＰＲＯ３−Ｂ（配列番号：４２／５’ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  Ｇ  ３’）及びｍＰＲＯ３−Ｄ（配列番号：４３／５’ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  Ａ  ３’）を、３’ＲＡＣＥ用プライマーとしてｍＰＲＯ３−Ａ（配列番号：４４／５’ＡＴＡ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  Ａ  ３’）及びｍＰＲＯ３−Ｃ（配列番号：４５／５’ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ３’）を作成し、ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をテンプレートとして、添付マニュアルの方法に従いｎｅｓｔｅｄ  ＲＡＣＥを実施した。ＲＡＣＥ産物を直接またはｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングしてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列番号：７に、アミノ酸配列を配列番号：８に示す。
得られたマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡは１０２８塩基で、３２１アミノ酸をコードしていると思われる（図１５）。予想されるアミノ酸配列は、「Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｓｅｒ」モチーフは持つが「Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｈｉｓ」モチーフは６アミノ酸のコンセンサス［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−Ａ−［ＳＴＡＧ］−Ｈ−Ｃから１アミノ酸異なる（ＬＴＶＡＨＣ）。しかしマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」同様、既知のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼにおいても、コンセンサス配列から数アミノ酸異なった配列を持つものも存在するため、得られたマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」もプロテアーゼとして機能するものと考えられる。また、Ｎ末端にはシグナルペプチドと思われる疎水性領域が存在し、また分子内ジスルフィド結合をしていると思われるＣｙｓ残基も他のセリンプロテアーゼと比較してよく保存されていた。
ヒト及びマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」は、核酸及びアミノ酸レベルでそれぞれ７０．２％、および５９．６％の相同性を持つ（図１６、１７）。ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」に比べてマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」は、核酸レベルにおいて５’側が約１００塩基短く、またアミノ酸レベルにおいてもＮ末端側が約３０アミノ酸短いことが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規トリプシンファミリーセリンプロテアーゼおよびその遺伝子が提供された。本発明のタンパク質は、精子の分化・熟成または精子の機能（受精）に関与していることを示唆される。したがって、本発明のプロテアーゼやその遺伝子は、新しい不妊症の治療薬や不妊症診断薬の開発、あるいは新しい避妊薬の開発への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を下線で示した。また、ポリＡシグナルを波線で示した。
図２は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を下線で示した。また、ポリＡシグナルを波線で示した。
図３は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」および既知のプロテアーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。全てで一致するアミノ酸は「＊」で、類似するアミノ酸は「・」で表した。またトリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を枠で囲んで示した。
図４は、マウス精巣のＲＴ−ＰＣＲによる「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」ｃＤＮＡの増幅結果を表す図である。上段に使用したプライマーの位置を、下段にＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の図を示す。
図５は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」およびそれらのスプライシングアイソフォームの構造を表す模式図である。長方形の下の数字は塩基数を示す。
図６は、ＲＴ−ＰＣＲによるマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の組織での発現を表す図である。上段に使用したプライマーの位置を、下段にＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の図を示す。１；肝臓、２；脳、３；胸腺、４；心臓、５；肺、６；脾臓、７；精巣、８；卵巣、９；腎臓、１０；１０〜１１日目胎児、１１；蒸留水（対照）。
図７は、ノーザンブロットによるマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の組織での発現を表す図である。上段に使用したプローブの位置を、下段にノーザンブロットの結果を示す。１；７日胚、２；１１日胚、３；１５日胚、４；１７日胚、５；心臓、６；脳、７；脾臓、８；肺、９；肝臓、１０；骨格筋、１１；腎臓、１２；精巣。
図８は、ＲＴ−ＰＣＲ解析によるマウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の精巣での発現時期を示す図である。１；Ｗ／Ｗｖ  Ｎｏ．１精巣、２；Ｗ／Ｗｖ  Ｎｏ．２精巣、３；Ｗ／Ｗｖ  Ｎｏ．３精巣、４；生後４日精巣、５；生後８日精巣、６；生後１２日精巣、７；生後１８日精巣、８；生後４２日精巣、９；成体精巣、１０；成体肝臓、１１；蒸留水（対照）。
図９は、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を下線で示した。また、ポリＡシグナルを波線で示した。
図１０は、マウスおよびヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の塩基配列の比較を示す図である。２つで一致する塩基は枠で囲んだ。
図１１は、マウスおよびヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」のアミノ酸配列の比較を示す図である。２つで一致するアミノ酸は「＊」で、類似するアミノ酸は「・」で示した。また、トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を枠で囲んだ。
図１２は、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−２」の染色体マッピングのためのＰＣＲの結果を示す図である。
図１３は、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を下線で示した。また、ポリＡシグナルを波線で示した。
図１４は、「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」および「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」の塩基配列の相同性の比較を表す図である。なお、塩基配列の相同性は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−１」においては全長塩基配列、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」においては約４００ｂＰのＥＳＴ領域、ヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」においては実施例９に記載の低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲで取得した約２００ｂｐの領域を比較した。
図１５は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。トリプシンファミリーセリンプロテアーゼ活性部位を下線で示した。また、ポリＡシグナルを波線で示した。
図１６は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」（ｍ．Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３）およびヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」（ｈ．Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３）の塩基配列の比較を示す図である。２つで一致する塩基は枠で囲んだ。
図１７は、マウス「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」（ｍ．Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３）およびヒト「Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３」（ｈ．Ｔｅｓｐｅｃ  ＰＲＯ−３）のアミノ酸配列の比較を示す図である。２つで一致するアミノ酸残基は枠で囲んだ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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