(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性のPLGA共重合体と、トリプトレリン酢酸塩であって、2m2/gより大きい比表面積の水溶性活性物質とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物であって、前記のマイクロカプセル又は移植錠が前記の活性物質を３ヶ月又はそれ以上の長期間にわたって放出させることができる生成物において、
−  前記の生成物がマイクロカプセルの形態である場合には、PLGA共重合体の固有粘度がCHCl3中で0.9dl/g〜1.6dl/gであり且つ前記マイクロカプセルの製造方法が該マイクロカプセルの溶融工程を伴なわないものであるか、又は
−  前記の生成物が移植錠の形態である場合には、前記PLGA共重合体の固有粘度がCHCl3中で0.5dl/g〜1.6dl/gであること
を特徴とするマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項２】
生分解性の共重合体がCHCl3中で少なくとも0.9dl/gの固有粘度をもつものである請求項１記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項３】
前記のラクチドとグリコリドとの共重合体（PLGA）の酸価が共重合体１g当たりKOH１ミリ当量よりも大きいものであることを特徴とする請求項２記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項４】
PLGAがラクチド70〜80％とグリコリド20〜30％とから製造されるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項５】
生分解性の重合体がL-ラクチドとグリコリドとの共重合体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項６】
活性物質の比表面積が５m2/gよりも大きいものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項７】
活性物質の比表面積が20m2/gよりも大きいものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【請求項８】
前記共重合体が親水性を示すものであり、その酸価が共重合体１g当たりKOH１ミリ当量よりも大きいものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロカプセル又は移植錠の形態の生成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、先ず第一に、CHCl3中で0.5dｌ/g〜1.6dｌ/gの固有粘度
0004557312.tif 000002
すなわち対数粘度数をもつ生分解性の重合体又は共重合体賦形剤又はかかる賦形剤の混合物と、少なくとも１種の活性物質とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠（implant）の形態の組成物に関する。本発明はまた、高分子量をもつ生分解性の重合体又は共重合体の少なくとも１種と、大きい比表面積をもつ水溶性の活性物質の少なくとも１種とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物に関する。かかる組成物は３ヶ月以上の長期間にわたって活性物質を均一に放出させるのに使用される。
これらの組成物、特にマイクロカプセルは、主として薬学において使用されるが、他の分野、特に農芸化学すなわち植物の病害予防の分野において使用することもできる。
有効成分が典型的な医薬化合物、例えば、ステロイド、ペプチド又はタンパク質（例えば、Boswellの米国特許第3,773,919号明細書参照）であろうと又は植物の病害予防に使用される化合物であろうと、有効成分を徐放性組成物の形態で投与することが重要であることは、久しい以前から知られている。採用される製剤は、ポリラクチド／コグリコリド（polylactide-co-glycolide）共重合体（PLGAと略記する）のような生分解性の重合体又は共重合体に有効成分が組み込まれているマイクロカプセルの形を取ることができる。
特に、比較的一定で、いずれにしろ、中断されない放出方法、例えば欧州特許第58481号明細書において“単相（monophasique）”と呼ばれる方法が求められる場合には、比較的小さい分子量をもつ、すなわち低粘度をもつPLGA型の重合体が必要であることが明らかにされている。これに関連して、欧州特許第21 234号明細書（0.5dｌ/gの固有粘度をもつ共重合体を記載している実施例8.B.2参照）、ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIPと略記する）中で0.38dｌ/gの粘度をもつ共重合体を生体内で試験している欧州特許第52 510号明細書、及び具体例として0.12〜0.20dｌ/gの粘度をもつ重合体を記載し且つ0.08〜0.30dｌ/gの粘度をもつ重合体を特許請求している欧州特許第26 599号明細書を挙げ得る。これらの特許明細書に記載されている重合体は、一定した徐放性をもつ組成物を与えるものとして提示されている。欧州特許第26 599号明細書に記載の組成物は例えば肥沃調節剤
0004557312.tif 000003
を含有することができる。
また、この点に関しては、本出願の出願日の時点でまだ進行中である欧州特許第58 481号明細書に関する異議手続において、出願人がメインクレームを低粘度（0.3又は0.5dｌ/gよりも低い粘度）をもつ重合体に限定したことを認めることが重要である。前記欧州特許の出願人によれば、単相型の放出を可能にすることができる唯一の粘度であるとのことである。
さらにまた、さらに長い期間、例えば１ヶ月よりも長い期間が求められる場合には、さらに複雑な問題が生じ、例えば欧州特許第0 302 582号明細書によって提案された解決策は異なる粘度をもつ複数の重合体からなる数種のマイクロカプセルを混合することからなる。
今般、本出願人は、大きい粘度をもつある種の重合体が長期徐放性の組成物の調製に適することを知見した。また、ある種の重合体を使用すると、極めて長い持続時間をもち且つ放出を行わない初期期間〔“不感期間（dead period）”〕が存在しない単相放出（relargage monophasique）のプロフィールをもつ組成物を生成することも知見された。これはまた特に、好ましくはCHCl3中で少なくとも0.5dｌ/g、さらに好ましくは少なくとも0.6又は0.7dｌ/gの固有粘度をもつ重合体である。しかしながら、原則として、これらの重合体の固有粘度は、CHCl3中で1.6dｌ/gを超えないものであり、1.4又は1.2dｌ/gよりも小さいものであり得る。前記の重合体はラクチド／グリコリドの比が40／60〜90／10、好ましくは約75／25であるPLGAであることが好ましい。
本発明の重合体は、常法によって製造することができ、特にラクチド環又はグリコリド環の開環によって製造することができる。かかる方法は、例えば米国特許第3,773,919号明細書に記載されている。
本発明においては、異なる大きい粘度をもつ複数の重合体の混合物を使用することもできるが、１種類の重合体又は共重合体のみを含有する組成物が好ましい。
従って、本発明は先ず第一に、CHCl3中で0.5dｌ/g〜1.6dｌ/gの固有粘度をもつ生分解性の重合体又は共重合体賦形剤又はかかる賦形剤同士の混合物と、活性物質又は活性物質混合物とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物に関するものである。これらのマイクロカプセル又は移植錠は、前記の活性物質又は活性物質混合物を少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、さらに好ましくは少なくとも３ヶ月の長期間にわたって放出することができる。
マイクロカプセルとは、微小球、微粒子、ナノカプセル、ナノ微小球又はナノ微粒子を包含するものであると解釈される。重合体とは、重合体、共重合体又はこれらの混合物を意味すると解釈される。最後に、活性物質とは、活性物質、その塩又は前駆体、あるいはこれらの化合物の混合物を意味すると解釈される。
本発明の組成物に使用できる活性物質の塩としては、特に有機酸、例えば酢酸、リンゴ酸、酒石酸、蓚酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、パモイック酸（acid pamoique）、メタンスルホン酸又はp-トルエンスルホン酸から得られる塩類、あるいは無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸又は臭化水素酸から得られる塩類が挙げられる。活性物質の塩としては、活性物質を例えば酢酸を用いて陽イオンの形で塩形成させることによって得られる水溶性生成物を使用することが好ましい。しかしながら、不溶性塩、例えばパモエートすなわちパモイック酸塩（pamoate）を使用することができる。
特に、本発明は生分解性の重合体又は共重合体賦形剤又はかかる賦形剤同士の混合物と、活性物質又は活性物質混合物とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物であって、前記のマイクロカプセル又は移植錠が前記の活性物質又は活性物質混合物を本質的に単相放出プロフィールに従って３ヶ月又はそれ以上の長期間にわたって放出させることができる組成物において、
−  前記の組成物がマイクロカプセルの形態である場合には、
前記の重合体又は共重合体の粘度がCHCl3中で0.7dｌ/g〜1.6dｌ/gであり且つ前記マイクロカプセルの製造方法がマイクロカプセルの溶融工程を伴なわないものであるか、又は
前記の重合体又は共重合体の粘度がCHCl3中で0.5dｌ/g〜1.6dｌ/gであり且つ前記重合体又は共重合体が親水性をもつものであること；あるいは
−  前記の組成物が移植錠の形態である場合には、前記の重合体又は共重合体の粘度がCHCl3中で0.5dｌ/g〜1.6dｌ/gであること
を特徴とするマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物に関する。
本発明の組成物用の重合体又は共重合体の粘度は少なくとも0.9dｌ/gの固有粘度をもつものであることが好ましい。
本発明に使用できる重合体又は共重合体は、特に乳酸、グリコール酸、クエン酸又はリンゴ酸の重合体のような重合体であるか、あるいは別の生分解性の重合体、例えばポリ-β-ヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリオルトカルボン酸エステル、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリアルキレンオキサレート例えばポリトリメチレン又はポリテトラメチレンオキサレート、ポリアミノ酸などであり得る。これらはまた、PLGAのような共重合体、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、メタクリル酸／アクリル酸共重合体、ポリアミノ酸、無水マレイン酸重合体、エチルセルロース、ニトロセルロース、アセチルセルロースなどであってもよい。これらの重合体又は共重合体は全て、単独で使用してもよいし又は混合して使用してもよい。一般に、PLGAはラクチド40〜90％とグリコリド10〜60％とからなるものである。D,L-PLGA、好ましくはDL-ラクチド70〜80％とグリコリド20〜30％とから製造されたD,L-PLGAを使用することが好ましい。
DL-ラクチド75％とグリコリド25％とから合成されたPLGAが本発明に特に適している。
本発明に特に好ましい別の重合体は、L-ラクチドとグリコリドとから得られるL-PLGAである。同じ粘度をもつD,L-PLGAと比較して、L-PLGAはより遅い放出を確実にし、しかもより大きい粘度をもつD,L-PLGAの代替品となる。
一般的に、親水性をもつ重合体又は共重合体が好ましい。従って、一般に疎水性開始剤、例えばラウリルアルコール型の疎水性開始剤を用いて開環することによって得られるPLGA、親水性開始剤、例えば乳酸又はグリコール酸型の親水性開始剤を用いて開環することによって得られるPLGAが好ましい。
親水性をもつ重合体又は共重合体とは、その末端鎖が極性である（例えば、この末端鎖はその末端に酸官能基を有する）重合体又は共重合体を意味し、反対に疎水性をもつ重合体又は共重合体とはその末端鎖が非極性である（例えば、この末端鎖は脂肪族鎖である）重合体又は共重合体を意味する。
酸価（これは遊離の酸を中和するのに必要な重合体１g当たりのKOHのミリ当量数に相当する）は、重合体又は共重合体の親水性又は疎水性に最も関連するパラメーターであると思われる。単量体の性質に基づいて重合体又は共重合体の末端鎖が遊離の酸官能基を含有し得る場合には、酸価を測定し得る。
一般に、本出願人は親水性の重合体がより優れた放出プロフィールを示すことを知見した。従って、本発明に使用する重合体の酸価は、少なくとも１、好ましくは1.2、さらに好ましくは少なくとも1.5又は２である。
本発明のマイクロカプセルの活性物質の装填量〔“芯装填量（core loading）”〕、すなわちマイクロカプセルの全重量に対するカプセル化される純ペプチドの重量の比は、一般的に０〜20％、好ましくは２〜15％である。トリプトレリン
0004557312.tif 000004
の酢酸塩については、その装填量は、約３ヶ月の期間にわたる放出を可能にする形態については10％以下であるのが好ましく、４〜８％であるのがさらに好ましい。ランレオチド
0004557312.tif 000005
の酢酸塩については、その装填量は10〜20％であるのが好ましい。
移植錠の場合には、活性物質の装填量は一般的に０〜30重量％であり、好ましくは15〜25％である。
カプセル化工程は、例えば米国特許第3,773,919号明細書又は欧州特許第52510号明細書に記載にされているようなコアセルベーションと呼ばれる工程であり得る。
また、欧州特許第58 481号明細書又は米国特許第5,225,205号明細書に記載されているような溶融押出と呼ばれる方法を使用することもできる。次いで、得られた生成物は、場合によっては慣用の方法で粉砕することにより微粒子が得られる。
さらにまた、ペプチドの水溶性塩、例えば酢酸塩のような水溶性の有効成分を使用することができる。ペプチドの脂肪酸塩のような可溶性分子の不溶性塩、例えば英国特許第2,209,937号明細書に記載されているようなペプチドのパモイック酸塩を使用することもできる。
また、本発明の重合体を使用して溶融押出によって得られる組成物は移植錠の形態であってもよく、しかもそのままで使用できる。
これらの移植錠は、１mm程度の直径、例えば0.8〜1.2mmの直径をもつ小さい移植錠（ミニ移植錠又はミクロ移植錠）であるのが好ましい。これらの移植錠の長さは、例えば10〜35mm、例えば25mm程度であり得る。これらの移植錠は、有効成分を低薬量で用いて、例えば移植錠当たりトリプトレリン酢酸塩３mg程度を用いて極めて都合の良い結果をもたらす。かかる移植錠は３ヶ月以上の期間にわたって有効成分を放出することができる。
さらにまた、有効成分の形状がこの製品の拡散に影響を及ぼし得ることが認められた。特に、有効成分が結晶形又は無定形で得られる場合には、前記２つの形態のいずれかを選択するかは重要である。
欧州特許出願第709 085号明細書には、重合体と無定形の水溶性活性物質とを含有するマイクロカプセルが記載されている。該明細書は、活性物質の小さい粒子、特に10μｍ未満の大きさの粒子を得ることが重要であることが議論の的になっている。しかしながら、この特許出願明細書には、前記の粒子の製造方法については何ら記載されておらず、しかも有効成分の粒子を含有する組成物の放出プロフィールに及ぼす該有効成分粒子の比表面積の影響についても何ら記載されていない。さて、本出願人は無定形の活性物質、すなわち粒子の大きさが約８μｍであるDecapeptyl 3.75mgという名称で販売されているトリプトレリン酢酸塩を含有するマイクロカプセルを既に1986年以来使用している。しかしながら、粒子の大きさが、３カ月以上の長期間にわたる放出を助長するために決定される唯一の因子ではないことを知見した。
無定形性についての問題は、原則として、製造方法特に凍結乾燥により多くの場合に無定形品がもたらされるペプチド又はタンパク質のような化合物については生じておらず、Decapeptyl 3.75mgに関する限りは生じていない。
文献にはこの現象が多数例証されており、特に次の文献：Hsu,C.C.らの論文、Pharmaceutical Research,12（1）,69-71（1975）又はTowns,J.K.の論文、Journal of Chromatography,A,705（1）,115-127（1995）が挙げられる。
従って、本発明はまた、生分解性の重合体又は共重合体であって好ましくは高分子量をもつ重合体又は共重合体の少なくとも１種と、大きい比表面積をもつ水溶性の活性物質の少なくとも１種とを含有してなるマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物に関する。特に、前記の比表面積は２m2/gよりも大きいものであり、好ましくは３m2/gよりも大きいものである。さらに好ましくは、前記の比表面積は５m2/g又は10m2/gよりも大きいものである。またさらに好ましくは、前記の比表面積は20m2/gよりも大きいものであり、好ましくは30m2/gよりも大きいものである。
好ましくは、本発明は水溶性の活性物質がタンパク質又はペプチドである前記組成物に関する。
さらにまた、本発明は、前記の重合体又は共重合体の粘度がCHCl3中で0.5〜1.6dｌ/g、好ましくは0.9〜1.6dｌ/gである前記組成物に関する。特に、CHCl3中で0.7〜1.3dｌ/gの粘度をもつ重合体又は共重合体を選択し得、さらに好ましくは0.9〜1.3dｌ/gの粘度をもつ重合体又は共重合体を選択し得る。使用する重合体は特にPLGAである。前記のPLGAはラクチド40〜90％とグリコリド10〜60％とから製造されるものが好ましく、ラクチド70〜80％とグリコリド20〜30％とから製造されるものがさらに好ましい。前記のマイクロカプセル又は移植錠に組み込まれる水溶性の活性物質はタンパク質又はペプチドであることが好ましい。
前記の大きい比表面積をもつ活性物質を含有する組成物は、前記重合体又は共重合体の粘度がCHCl3中で0.5〜1.6dｌ/gであり且つ前記重合体又は共重合体が親水性を示すものであり、その酸価が重合体又は共重合体１g当たりKOH１ミリ当量よりも大きい、好ましくは重合体又は共重合体１g当たりKOH1.2ミリ当量、好ましくは1.5ミリ当量又は２ミリ当量よりも大きいものであるのが好ましい。
本発明はまた、マイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物であって、重合体又は共重合体がPLGA、好ましくはラクチド70〜80％とグリコリド20〜30％とから製造されるPLGAであり、該PLGAの粘度がCHCl3中で0.5〜1.6dｌ/gであり且つマイクロカプセル又は移植錠に組み込まれる活性物質がタンパク質又はペプチドであることを特徴とする大きい比表面積をもつ活性物質を含有するマイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物に関する。
これらのマイクロカプセル又は移植錠は、より小さい分子量をもつ重合体を使用する別のある種の調剤と比較して、初期ピーク〔すなわち英語ではバースト（burst）〕が減り、従って３ヶ月以上の長期間にわたる活性物質の放出を可能にする単相放出プロフィールを可能にする。
換言すれば、本出願人は、下記の特徴：すなわち
a）前記の重合体又は共重合体がクロロホルム中で0.5dｌ/gよりも大きい粘度、好ましくは0.9dｌ/gよりも大きく且つ原則として1.6dｌ/gよりも小さい粘度を示すPLGAであること；
b）前記の重合体又は共重合体がラクチド70〜80％とグリコリド20〜30％とから製造されるPLGAであること；
c）前記の重合体又は共重合体が親水性を示し且つ好ましくは前記重合体又は共重合体１g当たりKOH１ミリ当量よりも大きい酸価、さらに好ましくはKOH1.2ミリ当量又は1.5ミリ当量よりも大きい酸価をもつこと；
d）有効成分、好ましくはペプチド又はタンパク質が大きい比表面積をもち、２m2/gよりも大きい比表面積、好ましくは10m2/gよりも大きい比表面積、さらに好ましくは20m2/gよりも大きい比表面積又は30m2/gよりも大きい場合もある比表面積をもつこと;
の少なくとも一つを示す場合には、マイクロカプセル又は移植錠の形態の組成物、特にPLGAを基剤とし且つ有効成分としてペプチド又はタンパク質を含有する組成物の放出性能、特に単相型の放出性能が著しく向上し、これらの特徴は場合によってはD,L-PLGAの代わりにL-PLGAの使用と組み合わせてもよいことを知見した。
前記の知見において、本出願人は、前記の特徴d）を単独で採用することが極めて重要であり、他の特徴a）、b）又はc）と組み合わせても都合がよいと考える。特に、前記の特徴d）は次の特徴：すなわちa）単独、b）単独、c）単独、a）及びb）、a）及びc）、b）及びc）、又はa）、b）及びc）と一緒に組み合わせてもよい。前記の特徴d）は少なくとも特徴c）と組み合わせることがさらに好ましい。
本発明の種々の態様に使用できる活性物質の中から、特にタンパク質とペプチドを挙げ得る。前記の活性物質は、例えば下記の物質：トリプトレリン又はその塩、特にトリプトレリン酢酸塩、ランレオチド又はその塩、特にランレオチド酢酸塩、オクトレオチド
0004557312.tif 000006
又はその塩（例えば欧州特許第29,579号明細書に記載のもの）、特にオクトレオチドの酢酸塩又はパモイック酸塩；LH-RH活性をもつ化合物例えばトリプトレリン、ゴセレリン
0004557312.tif 000007
ロイプロレリン
0004557312.tif 000008
ブセリン又はこれらの塩；LH-RH拮抗物質、GP IIb/IIIa拮抗物質；GP IIb/IIIa拮抗物質に類似の活性をもつ化合物、エリスロポエチン（EPO）又はその類縁体、種々のインターフェロンα、インターフェロンβ又はγ、ソマトスタチン、欧州特許第215,171号明細書に記載されているようなソマトスタチン誘導体、米国特許第5,552,520号明細書（この特許明細書それ自体がソマトスタチン類縁体を記載している他の特許明細書の一覧を含んでおり、これらは本願明細書において参考文献として参照される）に記載されているようなソマトスタチン類縁体、インスリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子（GRF）、成長ホルモン放出ペプチド（GHRP）、上皮成長因子（EGF）、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）又はその塩もしくは誘導体、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、副甲状腺ホルモン（PTH）又はその誘導体、塩酸リゾチーム、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（PTHrp）、ヒトPTHホルモンのN-末端ペプチド断片（位置１→34）、バソプレシン又はその誘導体、オキシトシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、グルカゴン、グルカゴンに類似のペプチド（GLP）、ガストリン、ガストリン放出ペプチド（GRP）、セクレチン、パンクレオザイミン、コレストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤性ラクトゲン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）、エンケファリン、エンケファリン誘導体、コロニー刺激因子（CSF）、エンドルフィン、キオトルフィン（kyotorphin）、インターロイキン類例えばインターロイキン２、タフトシン、サイモポエチン、サイモスティムリン、胸腺液性因子（THF）、胸腺血清因子（TSF）、胸腺血清因子（TSF）の誘導体、サイモシン、胸腺因子Ｘ、腫瘍壊死因子（TNF）、モチリン、ボンベシン又は米国特許第5,552,520号明細書に記載のボンベシン誘導体（この特許明細書それ自体はボンベシン誘導体を記載している他の特許明細書の明細を含んでおり、前記の他の特許明細書は本願明細書に参考文献として参照される）、プロラクチン、ニューロテンシン、ダイノルフィン、セルレイン、サブスタンスＰ、ウロキナーゼ、アスパラギナーゼ、ブラジキニン、カリクレイン、神経成長因子、血液凝固因子、ポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン、タンパク質合成刺激ペプチド、エンドセリン拮抗物質又はその塩もしくは誘導体、血管作用腸内ポリペプチド（VIP）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）又はその断片、血小板由来成長因子（PDGF）、骨形態形成タンパク質（BMP）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（PACAP）、神経ペプチドＹ（NPY）、ペプチドYY（PYY）、胃機能抑制ポリペプチド（GIP）及びポリヌクレオチド類、特に二重鎖RNA類（ds-RNA）、例えば欧州特許出願第0 300 680号明細書又は仏国特許第2 622 586号明細書に記載されている二重鎖RNAからなる群の中から選択することができる。
ds-RNAは、好ましくはポリウリジル酸と複合したポリアデニル酸〔これはポリ（A）−ポリ（U）又はPoly-adenur▲Ｒ▼とも呼ばれる〕を意味するものと解釈される。その他のds-RNA、特にポリイノシン酸とポリシチジル酸との複合体〔これはポリ（I）−ポリ（C）という名称でも知られている〕及びウリジル酸をポリシチジル酸鎖中に導入することによって変成されたこれらの同じ複合体、例えばHEMISPHERx社のAmpligen▲Ｒ▼という製品が本発明に使用できる（これらの製品の記載については、特に欧州特許出願第0,300,680号明細書が参照される）。使用するds-RNAは例えば前記のds-RNA同士の混合物であってもよい。ds-RNAは仏国特許第2,622,586号明細書に記載の方法により調製されることが好ましい。
大きい比表面積は、前記の活性物質について該物質が水溶性である場合又は該物質を例えば塩を形成させるか又はその構造に水溶性鎖をグラフトすることによって水溶性にする場合に得られる。これは特に前記のペプチド又はタンパク質には有効である。他の水溶性の活性物質又はその塩もしくは前駆体、特に酢酸を用いて塩を形成させることによって得られる塩は、有効であると考えられる場合には、当業者によって本発明のこの態様に使用され得る。
本発明の好ましい態様の一つによれば、大きい比表面積をもつペプチド又はタンパク質はトリプトレリン酢酸塩、ランレオチド酢酸塩及びオクトレオチド酢酸塩からなる群の中から選択される。
ペプチド及び／又はタンパク質は、本明細書においてはペプチド及び／又はタンパク質それ自体並びにこれらのペプチド又はタンパク質の薬理学的断片、塩もしくは誘導体を意味すると解釈される。
本発明のマイクロカプセル又は移植錠の製造に使用される水溶性の活性物質、特にトリプトレリン酢酸塩、ランレオチド酢酸塩、オクトレオチド酢酸塩、ゴセレリン、ロイプロレリン、ブセレリン又はこれらの塩は、主として下記の２工程：すなわち
−  前記の水溶性の活性物質の希釈溶液を−50℃よりも低い温度、好ましくは−70℃よりも低い温度の媒体に急速に浸漬することからなる凍結乾燥工程と；
−  場合によっては、好ましくは超音波で超微粉砕（micronization）することからなる粉砕工程と
からなる方法によって得られるものであるのが好ましい。
前記の活性物質の希釈溶液とは、活性物質の濃度が飽和濃度の２分の１よりも低い濃度の溶液、好ましくは飽和濃度が少なくとも200g/ｌに相当する場合には前記飽和濃度の４分の１よりも低い濃度の溶液を意味すると解釈される。この方法により大きい比表面積をもつ活性物質が得られる。
前記の急速浸漬とは、前記の水溶性活性物質の溶液の凍結を直ちに生ずる低温の媒体と接触させることを意味すると解釈される。
凍結乾燥については、前記溶液を、例えば液体窒素のタンクに浸したトレー（plateau）中で凍結し、その後に実際の凍結乾燥を行ってもよい。
最大の比表面積を得るためには、前記溶液の急速浸漬は活性物質の溶液の超微粉砕の後に行うのが好ましい。活性物質の溶液を予め超微粉砕する場合には、前記の低温媒体の温度は−50℃よりも低いものであり得る。
例えば、極めて大きい比表面積を得るためには、前記の活性物質の溶液を噴霧器で極めて低い温度の金属板上に噴霧することにより該溶液を噴霧することを選択してもよい。金属板の温度は、好ましくは−50℃よりも低い温度、さらに好ましくは−70℃よりも低く、あるいは−80℃又は−120℃よりも低い場合もある。この温度は、例えば金属板を極めて低い温度の媒体、例えば液体窒素中に浸漬することによって達成し得る。本発明の一つの好ましい変法によれば、金属板は中空であり、前記溶液を噴霧器で該金属板の中に噴霧する。
その他の凍結方法は、例えば活性物質の溶液を、該活性物質の非溶剤の予め冷却した浴中に噴霧する方法であると考え得る。上記の非溶剤は例えば液体窒素のような液化ガスであるのが好ましい。
別の態様は、冷却された板上で活性物質の溶液を凍結させる方法（“ドラム凍結”法）である。前記のように、この凍結法は活性物質の溶液の超微粉砕に先立って行ってもよい。
前記のトレー中での凍結方法を活性物質に適用して本発明の徐放性マイクロカプセル又は移植錠を調製する場合には、活性物質の比表面積は凍結乾燥後であってしかも粉砕前には２m2/gよりも大きいのが好ましい。活性物質の比表面積は３m2/gよりも大きいのがさらに好ましく又は５m2/gよりも大きい場合もある。
10m2/gよりも大きい比表面積を必要とする場合には、噴霧工程を伴なう方法を採用するのが好ましい。凍結乾燥後の活性物質について得られた比表面積は５m2/gよりも大きいのが好ましい。この比表面積は20m2/gよりも大きいのがさらに好ましく、30m2/gよりも大きい場合もある。
得られる比表面積は、例えば凍結速度又は溶液の濃度のような種々のパラメーターに基づいて活性物質の溶液の凍結条件を変化させることによって変化させ得る。
活性物質の比表面積は、特にマイクロカプセルの場合には長期間にわたる放出を得るのに好ましい因子である。事実、前述のように、同じ重合体賦形剤を用いても、同じ大きさをもつが異なる比表面積をもつ活性物質の粒子は全く異なる結果を与える。
従って、本発明はまた生物学的に活性な水溶性物質に適用される前記の方法に関する。さらにまた本発明はこれらの方法によって得られる生物学的に活性な水溶性物質であって、大きい比表面積をもつ水溶性物質に関する。
特に、本発明は前記の方法によって得られたトリプトレリン酢酸塩、ランレオチド酢酸塩又はオクトレオチド酢酸塩、あるいはこれらの方法によって得られた二重鎖RNA、好ましくはポリアデニル酸とポリウリジル酸との複合体に関する。
前記のように、本発明の組成物は医薬分野で使用するのが好ましい。前記の医薬組成物は種々の経路で患者に投与できるが、好ましい経路は皮下又は筋肉内注射である。本発明のマイクロカプセルは先ず注射用に適したビヒクル、例えば塩化ナトリウムの水溶液又はマンニトールの水溶液に懸濁される。
特に定義しない限りは、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は本発明が属する分野において通常の専門家によって通常的に理解されている意味と同じ意味を有する。同様に、本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願明細書、特許明細書及びその他の文献は参考文献として参照される。
以下の実施例は前記の方法を例証することを目的に示すものであり、しかもいかなる場合でも本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
実施例：
実施例の全てについて、固有粘度（IV）は、例えば
0004557312.tif 000009
に記載の慣用の流出時間測定方法（毛細管法）によって測定した。特に明記しない限りは、粘度はクロロホルム中で0.1％の濃度で25℃で測定するか又はヘキサフルオロイソプロパノール中で0.5％濃度で30℃で測定した。測定する場合、活性物質の比表面積は当業者に周知の方法、BET法（活性物質上への窒素単層の吸収）と呼ばれる方法により測定した。
下記の実施例については、本発明の凍結乾燥法を適用したペプチドを“変性（modified）”ペプチドと呼び、これに対して慣用の方法（低温での急速浸漬を行わない方法）で凍結乾燥したペプチドを“未変性”ペプチドと呼ぶ。
実施例１：
“未変性”トリプトレリン酢酸塩16.620gを水554mlに溶解した。得られた溶液を液体窒素のタンクに浸したトレー（plateau）中で凍結させ、次いで凍結乾燥した。
このようにして“変性”トリプトレリン酢酸塩15.18gが収率91.34％で得られた。この化合物は、凍結乾燥前には0.8m2/gの比表面積を有していたのに対し、4.7m2/gの比表面積を有していた。
次いで、得られたトリプトレリン酢酸塩を超音波により粉砕した：前記“変性”ペプチドについては10μmよりも小さい粒子を得るのに15分で十分であった（これに対して、前記の“未変性”ペプチドについてはこれと同じ粒度を得るためには30分を要した）。
次いで、この粉砕した変性トリプトレリン酢酸塩3.378gと、ジクロロメタンに溶解したD,L-PLGA（DL-ラクチド75％とグリコリド25％とからなるD,L-PLGA、クロロホルム中の固有粘度＝0.70dｌ/g、酸価＝1.61ミリ当量KOH／g）の7.30％溶液とから、欧州特許第52,510号明細書及び米国特許第3,773,919号明細書に記載されているようなコアセルベーション法によりマイクロカプセル化を行った。シリコーンオイル390mlを加えてコアセルベーション法によりマイクロカプセルを形成させた。これらのマイクロカプセルをヘプタン（22ｌ）浴に浸漬し、10μmの膜でろ過した後に回収した。
実施例２：
30分間超音波粉砕した後に８μｍの粒子サイズをもつ未変性トリプトレリン酢酸塩0.338gを、ジクロロメタンに溶解したD,L-PLGA（実施例１に記載のPLGAに相当するPLGA）の7.30％溶液に、攪拌しながら加えた。シリコーンオイル40mlを加えてマイクロカプセルを形成させ、次いでこれをヘプタン（２ｌ）浴に沈殿させ、次いで10μmの膜でろ過した。
実施例３〜６：
下記の表１に記載した条件下で変性させたトリプトレリン酢酸塩0.338gを、超音波粉砕した後に、３種類のD,L-PLGA（下記の表２に記載した特性をもつ）の33.3％／33.3％／33.3％混合物をジクロロメタンに溶解した7.30％溶液に、攪拌しながら加えた。シリコーンオイル40mlを加えてマイクロカプセルを生成させ、次いでこれをヘプタン（２ｌ）の浴に沈殿させ、次いで10μmの膜でろ過した。
0004557312.tif 000010
前記の（未変性）出発物質トリプトレリン酢酸塩の比表面積は0.8m2/gである。
混合した前記の３種類の重合体の物理化学的特性を下記の表２に記載する。
0004557312.tif 000011
実施例７：
未変性トリプトレリン酢酸塩22.560gを水752mlに溶解した。得られた溶液を液体窒素浴に浸したトレー中で凍結させ、次いで凍結乾燥した。4.4m2/gの比表面積をもつ変性トリプトレリン酢酸塩21.75gが収率96.41％で得られた。
次いで、この粉砕した変性トリプトレリン酢酸塩7.5gと、ジクロロメタンに溶解したD,L-PLGA（DL-ラクチド50％とグリコリド50％とからなるD,L-PLGA、HFIP中の固有粘度＝0.55dｌ/g）の3.7％溶液とから、欧州特許第52 510号明細書及び米国特許第3,773,919号明細書に記載されているようなコアセルベーション法によりマイクロカプセル化を行った。シリコーンオイル650mlを加えてコアセルベーション法によりマイクロカプセルを形成した。これらのマイクロカプセルをヘプタン（30ｌ）浴に浸漬し、10μmの膜でろ過した後に回収した。
実施例８及び９：
種々の重量平均分子量（Ｍw）をもつD,L-PLGA（DL-ラクチド75％とグリコリド25％とからなるD,L-PLGA）を用いてトリプトレリン酢酸塩のマイクロカプセルを製造した。これらの製造は、マイクロカプセルは4.7m2/gの比表面積をもつトリプトレリン酢酸塩を使用して実施例１に記載の方法に従って行った。
実施例８及び９の物理化学的パラメーターを下記の表に示す：
0004557312.tif 000012
実施例10：
疎水性をもつD,L-PLGA（DL-ラクチド75％とグリコリド25％とからなるD,L-PLGA;THF中で測定した分子量:80,100;クロロホルム中の粘度:0.75dl/g;酸価＝0.40ミリ当量KOH/g）を用いて実施例１に記載の方法に従ってマイクロカプセルを製造した。
実施例11：
結晶性をもつL-PLGA（L-ラクチド75％とグリコリド25％とからなるL-PLGA;THF中で測定した分子量：99,260;クロロホルム中の粘度:0.78dｌ/g;酸価＝1.80ミリ当量KOH/g）から実施例１に記載の方法に従ってマイクロカプセルを製造した。
実施例12：
D,L-PLGA（ラクチド75％とグリコリド25％とからなるD,L-PLGA；THF中で測定した分子量：103,810；クロロホルム中の固有粘度：0.82dｌ/g）４重量部にトリプトレリン酢酸塩１重量部を加えた。
得られた塊状物を400μmメッシュの篩を用いて篩分けすることにより破砕し、得られた生成物を42rpmで20分間混合し、得られた混合物をスクリュー押出機を用いて直径１mmのダイスを通して120℃で押出した。次いで、得られた押出し物を空気中で冷却し、延伸することにより（延伸機）最終的に直径0.85mmの大きさにした。
得られた混合物の単位長さ（mm）当たりの濃度を測定し、マイクロ移植錠がトリプトレリンを３mgの薬量で含有するように、押出し物のロッドを算出した長さ（この場合は24mm）に切断した。最後に各マイクロ移植錠の重量を検査した。
実施例13及び14：
この２つの実施例には前記と同じ方法を用いた。
ランレオチド酢酸塩５gを水に溶解して選択した濃度の溶液を得た（例えば、30g/ｌを得るためには滅菌水167mlを加えた）。この溶液を、できる限り微細な液滴を得るように噴射流を調整した500ml噴霧器で噴霧した。得られた小さい液滴を、低部を液体窒素に浸したトレー中に噴霧した。２本の温度探針を前記のトレーに予め導入し、製品の温度変化を監視した。
製品が凍結したら直ちに、トレーを冷却板が約−54℃である凍結乾燥機に導入した。
製品の温度及び冷却板の温度を１時間平衡にさせた。これにより昇華状態がもたらされる（冷却板の温度を20℃に設定し、タンクの圧力を100μバールに設定した）。この状態を約30時間保持した。製品の平均（mean）最終温度は13℃であった。その後に二次乾燥を（50μバールのタンク内圧力で）約24時間続けた。製品の平均最終温度は20℃であった
用いた反応剤及び得られた生成物の特性を下記の表に要約する。
0004557312.tif 000013
前記で得られた比表面積43m2/gのランレオチド酢酸塩（実施例14）を、下記の方法に従ってマイクロカプセルに組み込んだ。
ランレオチド酢酸塩0.782gをガラス管に秤量した。このペプチド塩にジクロロメタン15mlを加えた。このペプチドの粉砕を、増幅器を備え且つ浸漬端部又はプレートに探針を備えた超音波発信機（周波数＝50Hz、出力＝250Ｗ；粉砕時間約15分）による超音波で行った。
次いで、得られた粉砕ランレオチド酢酸塩0.782gと、50：50 D,L-PLGA（IV＝CHCl3中で0.48dｌ/g）４gをジクロロメタン35mlに溶解した溶液とを用いて、欧州特許第52,510号明細書及び米国特許第3,773,919号明細書に記載されているようなコアセルベーション法に従ってマイクロカプセル化工程を行った。シリコーンオイル34.2mlを加えてコアセルベーション法によりマイクロカプセルを形成した。これらのマイクロカプセルをヘプタン（2.5ｌ）浴に浸漬し、10μmの膜で濾過した後に回収した。
次いで、得られたマイクロカプセルを真空乾燥し、瓶中で粉砕し、次いで良好な条件下で貯蔵を可能にし且つマイクロカプセルの懸濁を促進させるために賦形剤（例えば、バラスト又は界面活性剤）と共に凍結乾燥した。
実施例15及び16：
これらの２つの実施例には実施例１記載の方法と同様の方法を使用した。用いたペプチドは実施例１のペプチドと同じペプチドである。使用したPLGAの特性、使用したペプチドの量（これらの実施例には変性トリプトレリン酢酸塩を使用した）及びマイクロカプセルの調製パラメーターを下記の表に示す。
0004557312.tif 000014
本発明のマイクロカプセルの放出プロフィールの研究：
本発明のマイクロカプセルの有用性を例証することを目的として、その放出プロフィールを生体外（in vitro）で調べた。
実施例１〜11及び15〜16のマイクロカプセルそれぞれについて、0.9％塩化ナトリウム水溶液４ml中に入れた約25mgのマイクロカプセル（実施例７については約20mg）の試料３個からの放出を測定した。37℃に保持した前記の塩化ナトリウム水溶液中の放出物を１時間後、１日後及び４日後に抽出した。
トリプトレリンの量を、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によりトリフルオロ酢酸（TFA）系において濃度勾配法で検量線と対比して測定した。トリプトレリンの標準検量線を得るために、溶液T1を下記のようにして調製した：すなわち、対照のトリプトレリン酢酸塩約7.5mgの試験試料を50mlフラスコに入れ;これを0.1％酢酸溶液で50mlに調製した。得られた溶液T1から溶液T2及びT3を下記のようにして調製した：すなわち溶液T2については、溶液T1を10ml採取し、これを0.1％酢酸溶液で20mlに調製した。溶液T3については、溶液T1を１ml採取し、これを0.1％酢酸溶液で50mlに調製した。
ランレオチドを同様にしてHPLCにより測定した。ランレオチドの標準検量線を得るために、溶液T′1を下記のようにして調製した：すなわち、対照のトリプトレリン酢酸塩約16.5mgの試験試料を50mlフラスコにいれ；これを0.1％酢酸溶液で50mlに調製した。得られた溶液T′1から溶液T′2、T′3、T′4及びT′5を柿のようにして調製した：すなわち、溶液T′2については、溶液T′1を10ml採取し、これを0.1％酢酸溶液で25mlに調製した。溶液T′3については、溶液T′1を５ml採取し、これを0.1％酢酸溶液で25mlに調製した。溶液T′4は、溶液T′1２mlを0.1％酢酸溶液に希釈して全容量を25mlにすることにより得、溶液T′5は溶液T′1１mlを0.1％酢酸溶液に希釈して全容量を25mlにすることにより得た。
放出されたトリプトレリン酢酸塩又はランレオチド酢酸塩の量は、対照として働く最初に存在するトリプトレリン酢酸塩又はランレオチド酢酸塩の量（100％）と対比して百分率（％）として測定した。
試験管内（in vitro）試験の結果を下記の表に要約する。
0004557312.tif 000015
生体内試験の結果は、上記の生体外試験の結果と完全に相関性があった。具体例として、実施例１のマイクロカプセルを1.2mg/kgの薬量でラットに筋肉内注射した。血漿を分析することにより、トリプトレリンの量が90日を越える期間にわたって0.1ng/mlよりも多い量で一定に放出されることが明らかになった。実施例２のマイクロカプセルについて行った調査により、テストステロンの量が90日を越える期間にわたって１ng/mlよりも少ない量で一定に放出されることが明らかになった。さらにまた、実施例９のマイクロカプセルを1.2mg/kgの薬量でラットに筋肉内注射し、その血漿を分析することによりトリプトレリンの量が90日を越える期間にわたって0.1ng/mlよりも多い量で放出されることが明らかにされた。
実施例12のマイクロカプセルを下記のようにして生体内で試験した：すなわち、全体でトリプトレリン３mgの薬量をビーグル犬６匹（体重約12kg）にそれぞれの後足の筋肉に筋肉内注射した。血漿を分析することにより、トリプトレリンの量が90日を越える期間にわたって0.1ng/mlよりも多い量で一定に放出されることが明らにされた。