(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、
a)配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b)配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
c)配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、および
d)配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、からなる群から選択され、
前記核酸分子は、下記の生物学的活性：即ち、核受容体との相互作用、ＵＣＰ−２の発現、アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現、脂肪細胞中での熱産生、脂肪細胞の分化、および脂肪細胞のインスリン感受性のうち１種もしくはそれ以上を調節する能力を持つポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号７または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子であって、
前記核酸分子は、下記の生物学的活性：即ち、核受容体との相互作用、ＵＣＰ−２の発現、アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現、脂肪細胞中での熱産生、脂肪細胞の分化、および脂肪細胞のインスリン感受性のうち１種もしくはそれ以上を調節する能力を持つポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、
a)配列番号６、配列番号９または配列番号１１のヌクレオチド配列に、全長にわたり少なくとも８０％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
b)配列番号８のヌクレオチド配列に、全長にわたり少なくとも約９５％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
c)配列番号１０のアミノ酸配列に、全長にわたり少なくとも約８５％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、および、
d)配列番号７のアミノ酸配列に、全長にわたり少なくとも約９５％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、からなる群から選択され、
前記核酸分子は、下記の生物学的活性：即ち、核受容体との相互作用、ＵＣＰ−２の発現、アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現、脂肪細胞中での熱産生、脂肪細胞の分化、および脂肪細胞のインスリン感受性のうち１種もしくはそれ以上を調節する能力を持つポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、下記のドメインもしくはモチーフのうちの1つもしくはそれ以上を含む、請求項１、２または３に記載の単離された核酸分子：
a)ｃＡＭＰリン酸化部位；
b)チロシンリン酸化部位；
c)ＬＸＸＬＬモチーフ。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の核酸分子、および非相同のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１、２、３または４のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
発現ベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を適切な培養培地中で培養し、それによってポリペプチドを作製することを含む、ポリペプチドの作製方法。
【請求項１０】
単離されたポリペプチドであって、
ａ）配列番号６、配列番号９、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、全長にわたり少なくとも８０％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド、
ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、全長にわたり少なくとも９５％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列に、全長にわたり少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列に、全長にわたり少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択され、前記ポリペプチドは、下記の生物学的活性：即ち、核受容体との相互作用、ＵＣＰ-２の発現、アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現、脂肪細胞中での熱産生、脂肪細胞の分化、および脂肪細胞のインスリン感受性のうち１種もしくはそれ以上を調節する能力を維持する、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが下記のドメインもしくはモチーフのうちの1つもしくはそれ以上を含む、請求項１０に記載の単離されたポリペプチド：
a)ｃＡＭＰリン酸化部位；
b)チロシンリン酸化部位；
c)ＬＸＸＬＬモチーフ。
【請求項１２】
配列番号７または配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
非相同なアミノ酸配列をさらに含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１５】
サンプル中の、請求項１０に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、前記方法は、
a)前記サンプルを、前記ポリペプチドに選択的に結合する化合物に接触させること、および
b)前記化合物が前記サンプル中の前記ポリペプチドに結合するかどうかを検出し、それによって、サンプル中の請求項１０に記載のポリペプチドの存在を検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドと結合する前記化合物が抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドと選択的に結合する化合物と、使用説明書とを含むキット。
【請求項１８】
サンプル中の、請求項１、２、３、または４のいずれか1項に記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、前記方法は、
a)前記サンプルを、前記核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーに接触させること、および
b)前記核酸プローブまたはプライマーが前記サンプル中の核酸分子に結合するかどうかを決定し、それによって前記サンプル中の請求項１、２、３または４のいずれか1項に記載の核酸配列の存在を検出することを含む方法。
【請求項１９】
前記サンプルはｍＲＮＡ分子を含み、前記サンプルを核酸プローブに接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の核酸分子と、使用説明書とを含むキット。
【請求項２１】
請求項１０に記載のポリペプチドと結合する化合物のin vitro同定方法であって、前記方法は、
a)前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞を、試験化合物に接触させること、および
b)前記ポリペプチドが前記試験化合物と結合するかどうかを検出すること
を含む方法。
【請求項２２】
前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合は、下記の群から選択される方法によって検出される、請求項２１に記載の方法：
a)試験化合物／ポリペプチド結合を直接検出することによる結合の検出、
b)競合結合アッセイを用いた結合の検出、および
c)ＰＧＣ-１ｂ活性のアッセイを用いた結合の検出。
【請求項２３】
ＰＧＣ-１ｂ活性は、
a)核酸受容体との相互作用、
b)ＵＣＰ-２の発現の調節、
c)アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現の調節、
d)脂肪細胞中での熱産生の調節、
e)脂肪細胞の分化の調節、および
f)脂肪細胞のインスリン感受性の調節、
から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載のポリペプチドの活性を調節するin vitro方法であって、前記方法は、ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞と、前記ポリペプチドと十分な濃度で結合する化合物とを接触させることによって、前記ポリペプチドの活性を調節することを含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞は、筋芽細胞、分化した筋芽細胞、筋肉細胞、前脂肪細胞、および脂肪細胞からなる群から選択される、請求項２１、２２、または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するinvitro方法であって、
a)請求項１０に記載のポリペプチドを試験化合物に接触させること、および
b)前記試験化合物のポリペプチドの前記活性に及ぼす影響を決定し、それによってポリペプチドの活性を調節する化合物を同定することを含む方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドの活性は、
a)核酸受容体との相互作用、
b)ＵＣＰ-２の発現の調節、
c)アシルＣｏ-Ａオキシダーゼの発現の調節、
d)脂肪細胞中での熱産生の調節、
e)脂肪細胞の分化の調節、および
f)脂肪細胞のインスリン感受性の調節、
から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００１年７月５日に出願された米国仮特許出願第60/303,468号の優先権を主張し、この出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。
【０００２】
政府助成研究
本明細書中に記載の研究は、国立保健研究所（National Institute of Health）からの助成ＤＫ５４４７７を受けて行われた。したがって、米国政府は、本発明に特定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
心臓および骨格筋は、それらのエネルギーの要求を支えるために、主に脂肪酸の酸化に依拠している。脂肪酸は、非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）として、または、複合体を形成してリポ蛋白質となったトリアシルグリセロールとして、組織間を輸送される。ＮＥＦＡの細胞の取り込みは、広範なクラスの輸送体（例えば、ＦＡＢＰｍ、ＦＡＴ／ＣＤ３６およびＦＡＴＰ）に関与する蛋白促進メカニズムによって促進されるのに対して、リポ蛋白質が媒介する脂肪酸の取り込みは、まずリポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）の活動を介してのエステル結合の加水分解が必要であると考えられる。アシルＣｏＡシンセターゼによってサイトゾル中において活性化された後、脂肪アシルＣｏＡはβ酸化経路に入る。短鎖および中鎖脂肪酸の酸化の部位はミトコンドリアであるが、長鎖脂肪酸（Ｃ２２およびそれ以上）は、パルミトイルＣｏＡが形成されるまではペルオキシソーム中でまず酸化されて、さらにミトコンドリアで酸化される。この短鎖化活性に加えて、ペルオキシソームβ酸化もまた、ジカルボン酸やプロスタグランジン類等の種々の脂肪酸類似体の代謝に関与する。
【０００４】
複数の動物モデルによって、異なる組織中における脂肪酸の酸化の重要性が強調されている。例えば、ペルオキシソームのアシルＣｏＡオキシダーゼの欠乏しているマウスは、血中に非常に長い脂肪酸（ＶＬＣＦＡ)を蓄積し、重篤な脂肪肝炎（脂肪肝に関連した肝臓の炎症）をきたし、最終的には肝臓腫瘍を発症させる(Fan, C. Y.ら、(1998)J. BioL Chem. 273 (25): 15639-45)。脂肪肝の表現型はまた、転写因子ＰＰＡＲαを欠いたマウスの空腹時に反応して観察され、栄養的攻撃に反応して肝臓内の脂肪酸酸化酵素を誘導する上で重要な役割を果たす(Hashimoto、T.ら(2000)、J. Biol. Chem. 275 (37): 28918-28)。
【０００５】
逆に、制御されない脂肪酸の酸化は有害となる可能性もある。骨格筋および心臓にＬＰＬを過剰発現する遺伝子導入マウスでは、筋肉における遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の取り込みが上昇し、血漿トリグリセリド濃度が低下するが、広範囲にわたるミトコンドリアおよびペルオキシソームの増殖が起こり、重篤な筋障害をきたし、早期に死ぬ(Levak-Frank、S.ら(1995)、J. Clin. Invest. 96 (2): 976-86)。
【０００６】
循環系から脂肪を除去する上で、骨格筋は量的に最も重要な組織であるにもかかわらず、この組織において脂肪酸の代謝を制御する因子についてはあまり知られていない。抗しがたい証拠が、肝臓での脂肪酸の酸化の制御におけるＰＰＡＲαの役割を裏付けている一方で、最近のデータは、筋肉におけるペルオキシソームのβ酸化に関与する遺伝子の構成的な発現にはＰＰＡＲαが必要でないことを示している（Djouadi、F.ら(1998)、J. Clin. Invest. 102 (6):1083-91; Aoyama、T.ら(1998)、J; Biols Chem. 273 (10):5678-84; Watanabe、K.ら(2000)、J. Biol. Chem. 275 (29): 22293-9）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的に、熱産生的コアクチベータＰＧＣ-１の新規なイソフォームの発見に基づく。本明細書中でＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃと称される、これらイソフォームは、ＰＧＣ-１のアミノ末端領域に対応する２つの短い蛋白質をコードするが、カルボキシ末端ＲＮＡ処理ドメインの全体性を欠いている。
【０００８】
１つの態様において、本発明は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されるヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む単離された核酸分子であることを特徴とする。別の態様において、本発明は、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子であることを特徴とする。
【０００９】
他の諸態様において、本発明は、本明細書に記載の単離された核酸分子に対して相補的である、アンチセンスである、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズされていることを特徴とする。
【００１０】
ある関連する局面において、本発明は、本明細書に記載の単離された核酸分子を含むベクターを提供する（例えば、ＰＧＣ-１をコードする核酸分子）。そのようなベクターは、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を任意に含むことができる。そのようなベクターを含む宿主細胞（例えば、ＰＧＣ-１核酸分子およびポリペプチドを作製するのに好適なベクターを含む宿主細胞）もまた本発明の特徴である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、単離されたＰＧＣ-１ポリペプチドおよび／またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは抗原的フラグメントを特徴とする。例示の実施形態は、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。
【００１２】
ＰＧＣ-１ポリペプチドおよび／またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは抗原的フラグメントは、例えば、ＰＧＣ-１に関連する障害の治療および／または診断に適用可能なアッセイにおける試薬または標的として有用である。１つの態様において、ＰＧＣ-１ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＰＧＣ-１活性を有する。別の態様において、ＰＧＣ-１ポリペプチドまたはそのフラグメントは、少なくとも１つもしくはそれ以上の、下記ドメインもしくはモチーフ、即ち、チロシンリン酸化モチーフ、ｃＡＭＰリン酸化モチーフ、ＬＸＸＬＬモチーフおよび／またはペルオキシソーム局在性シグナルを有し、かつ任意にＰＧＣ-１活性を有する。関連する局面において、本発明は、抗体（例えば、本明細書に記載のポリペプチドのいずれか１つと特異的に結合する抗体）ならびに本明細書に記載のポリペプチドの全てもしくは１つのフラグメントを含む融合ポリペプチドを特徴とする。
【００１３】
本発明はさらに、ＰＧＣ-１ポリペプチドおよび／またはＰＧＣ-１核酸分子を検出する方法を特徴とする。そのような方法は、例えば、本明細書に記載のプローブ、プライマー、または抗体を含むことを特徴とする。また、ＰＧＣ-１ポリペプチドおよび／またはＰＧＣ-１核酸分子の検出用キットもまた本発明の特徴である。関連する局面において、本発明は、本明細書に記載のＰＧＣ-１ポリペプチドまたはＰＧＣ-１核酸分子に結合、および／または、該ＰＧＣ-１ポリペプチドまたはＰＧＣ-１核酸分子の活性を調節する化合物を同定するための方法を特徴とする。ＰＧＣ-１の活性を調節する方法もまた本発明の特徴である。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および請求の範囲によって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、少なくとも部分的に、熱産生的コアクチベータＰＧＣ-１の新規なイソフォームの発見に基づく。本明細書中でＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃと称される、これらイソフォームは、ＰＧＣ-１のアミノ末端領域に対応する２つの短い蛋白質をコードするが、カルボキシ末端ＲＮＡ処理ドメインの全体性を欠いている。
【００１６】
ＰＧＣ-１については、これまでに記載がある(Puigserver, P.ら(1998)、Cell、92 (6): 829-39; 米国特許第6,166,192号;ＰＣＴ国際公開WO 98/54220号; これらすべての内容を本明細書に引用によって援用する)。ＰＧＣ-１の新規なイソフォームの現時点の発見に基づいて、これまで「ＰＧＣ-１」と呼ばれてきた分子を本明細書では、「ＰＧＣ-１ａ」と称する。本明細書で用いられる「ＰＧＣ-１」という語は、ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂ、およびＰＧＣ-１ｃを含む。ＰＧＣ-１ｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１および図２にそれぞれ示す。ＰＧＣ-１ｃのクレオチドおよびアミノ酸の配列を図３および図４にそれぞれ示す。図５および図７は、ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃの間の構造的関係を示す。 
【００１７】
ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃは、核酸配列の５'末端におけるＰＧＣ-１ａと同一であるが、各イソフォームの５'末端の５'非翻訳領域（ＵＴＲ）においてわずかな相違がある（図６参照）。したがって、３つ全てのイソフォームに共通の領域（本明細書において、「共通領域」と称する；配列番号４に示される）は、ＰＧＣ-１ａ(配列番号１）のヌクレオチド４１〜９６４、ＰＧＣ-１ｂ(配列番号６）のヌクレオチド３９〜９６２、およびＰＧＣ-１ｃ(配列番号１２）のヌクレオチド１６〜９３９に対応する。ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド配列はそれぞれ共通領域の３’末端に位置する特有の領域を含有する。３つ全てのイソフォームに共通のアミノ酸配列（配列番号５に示される）は、ＰＧＣ-１ａ(配列番号２）、ＰＧＣ-１ｂ(配列番号７）およびＰＧＣ-１ｃ(配列番号１３）の残基１〜２９１に対応し、各ポリペプチドの特有の領域はアミノ酸残基２９２から始まる。
【００１８】
ＰＧＣ-１ｂの特有の領域は、配列番号６(配列番号９として記載)のヌクレオチド９６３〜１８９３に対応する。配列番号６のヌクレオチド９０〜１０４９に対応するＰＧＣ-１ｂのコーディング領域全体は、配列番号８として記載され、３２０のアミノ酸残基（配列番号７として記載）のポリペプチドをコードする。配列番号６のヌクレオチド９６３〜１０４９に対応するＰＧＣ-１ｂの特有のコーディング領域は、配列番号１１として記載され、２９のアミノ酸残基（配列番号１０として記載）の特有のＣ末端をコードする。
【００１９】
ＰＧＣ-１ｃの特有の領域は、配列番号１２(配列番号１５として記載)のヌクレオチド９４０〜１７４４に対応する。配列番号１２のヌクレオチド６７〜９６６に対応するＰＧＣ-１ｃのコーディング領域全体は、配列番号１４として記載され、３００のアミノ酸残基（配列番号１３として記載）のポリペプチドをコードする。配列番号１２のヌクレオチド９４０〜９６６に対応するＰＧＣ-１ｃの特有のコーディング領域は、配列番号１７として記載され、９のアミノ酸残基（配列番号１６として記載）に特有のＣ末端をコードする。ＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド９４０〜１６４８(配列番号１２)は、実際にはＰＧＣ-１ｂのヌクレオチド配列（配列番号６のヌクレオチド１０９２〜１８５９）に存在するが、そこでは翻訳されない。
【００２０】
ＰＧＣ-１ａの発現とは異なり、Ｃ２Ｃ１２の筋管でのＰＧＣ-１ｂイソフォームの発現は、ミトコンドリアの機能に直接的にも影響を及ぼさないし、または、ＰＧＣ-１ａの介入を経た影響も及ぼさないことが今回の発見によって示された。しかしながら、ＰＧＣ-１ｂは、脂肪酸の取り込みおよび利用を調節するいくつかの遺伝子の発現を誘導する。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＧＣ-１ｂにより活性化された遺伝子は、筋肉基質を用いたグルコースから脂肪酸へ移行する為の既知の条件である、絶食下での骨格筋において誘導される遺伝子と類似する。驚くべきことに、これらの遺伝子のいくつかは、ＰＧＣ-１ａおよびＰＧＣ-１ｂの両方に誘導されたが、一方、リポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）およびアシルＣｏ-Ａオキシダーゼ（ＡＯＸ）は、ＰＧＣ-１ｂのみによって誘導された。
【００２１】
転写活性化コアクチベータＰＧＣ-１ａは、細胞代謝の重要な局面を制御する際に大きな役割を果たす。筋肉細胞において発現したとき、ＰＧＣ-１ａは、ミトコンドリア生合成を刺激し、同時にＵＣＰ-２、非結合の蛋白質ファミリーに属するミトコンドリア膜蛋白質を活性化させる（Wu, Z.ら(1999)、Cell 98(1): 115-24）。筋肉細胞中でのミトコンドリア能力を刺激することに加えて、ＰＧＣ-１ａは、同時にＧｌｕｔ４の発現を刺激する。その結果、グルコースの取り込みを増加させることになる（Michael、L. F.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (7): 3820-5)。さらに、ＰＧＣ-１ａはまた、ミトコンドリアβ酸化経路の２つの制御因子であるＭＣＡＤおよびＭ-ＣＰＴ-１の心筋細胞での発現を刺激することも示された(Lehman, J.J. ら(2000)、J Clin. Invest. 106 (7): 847-56)。
【００２２】
新規なイソフォームＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃは、脂肪酸代謝を含む細胞代謝の新規な標的を提供する。双方のイソフォームとも核から除外されるが、ＰＧＣ-１ｂは、そのカルボキシ末端ペルオキシソーム局在性シグナルゆえにペルオキシソームに対する標的とされる。ＰＧＣ-１ａとは対照的に、ＰＧＣ-１ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞でのミトコンドリア生合成および機能を刺激する。
【００２３】
筋肉における脂肪酸の酸化率は、全身の代謝に影響を及ぼす重要な因子である。この変数を変えることによって、肥満、糖尿病、心疾患のような病理症状に深い影響を及ぼしうる。この率は、甲状腺ホルモン、成長ホルモンを含むいくつかのホルモン、より最近では、アジプシン、脂肪組織によって分泌される蛋白質によって直接刺激されることがわかってきた（Fruebis、J.ら(2001)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA98 (4): 2005-2010）。これらのホルモン性の手がかり（hormonal cues）に加えて、脂肪酸の酸化率はまた、代謝中間物マロニル-ＣｏＡによって制御されることもわかっている（Abu-Elheiga、L.ら(2001)、Science 291 (5513): 2613-6）。（酵素アシル-ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の破壊によって）筋肉中に少量のマロニル-ＣｏＡしか産生しないように操作されたマウスは、体脂肪蓄積がより低くなり、骨格筋における脂肪酸を期待通り酸化する能力が上昇したが、食欲過剰であること、筋肉中に非結合の蛋白質ＵＣＰ３を過剰発現するマウスと酷似している表現型であることがわかった（Clapham, J. C. ら(2000)、Nature 406 (6794): 4158）。ＰＧＣ-１ｂは、その活性がＡＣＣの効果に反対し、それによってミトコンドリアのβ酸化経路を通る脂肪酸の流動を促進する酵素であるマロニルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＤ）を活性化する。
【００２４】
ＬＰＬを過剰発現させることによって骨格筋での脂肪酸の取り込みを増加させることが、マウスでの肥満症に有効な効果を及ぼす一方で、脂肪酸の酸化の平行な上昇を達成できない場合、筋肉の生理機能にとって有害であることが証明されている。ＰＧＣ-１ｂは、脂肪酸の取り込み及び利用のプログラム全体を刺激すると思われるため、この分子は、抗肥満薬の開発の標的を代表するものであるかもしれない。
【００２５】
本発明の蛋白質および核酸分子について言及する際の「ファミリー」という語は、共通の構造ドメインもしくはモチーフを有し、かつ本明細書で定義されている十分なアミノ酸もしくはヌクレオチド配列の相同性を有する、２種もしくはそれ以上の蛋白質または核酸分子を意味することを意図している。このようなファミリーメンバーは、天然もしくは非天然に存在するもの、また、同一かもしくは異なるかのいずれかの種のものであることができる。例えば、あるファミリーは、ヒト起源の第一の蛋白質、ならびにヒト起源の他の別個の蛋白質を含有することができ、あるいは、非ヒト起源、例えば、ラットまたはマウス蛋白質の相同物を含有することができる。あるファミリーのメンバーは、共通の機能的特徴を有することもできる。
【００２６】
例えば、本発明のＰＧＣ-１蛋白質を含むＰＧＣ-１蛋白質のファミリーは、いくつかのドメインおよび／またはモチーフを含む。これらのドメイン／モチーフは、推定上のチロシンリン酸化部位(配列番号７のアミノ酸残基２０４〜２１２および配列番号１３のアミノ酸残基２０４〜２１２)、推定上のｃＡＭＰリン酸化部位(配列番号７のアミノ酸残基２３８〜２４１および配列番号１３のアミノ酸残基２３８〜２４１)、核受容体との相互作用を媒介するＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号７のアミノ酸残基１４２〜１４６および配列番号１３のアミノ酸残基１４２〜１４６）、およびペルオキシソーム局在性シグナル（配列番号７のアミノ酸残基３１８〜３２０）を含む。本明細書で用いられるように、チロシンリン酸化部位は、チロシン蛋白質キナーゼによってリン酸化され得る少なくとも１つのチロシン残基を含むアミノ酸配列である。典型的に、チロシンリン酸化部位は、リン酸化されたチロシンのＮ末端側の約７つのリジンまたはアルギニンの残基によって特徴付けられる。酸性残基（アスパラギンもしくはグルタミン）も、チロシンのＮ末端側の３もしくは４の残基にしばしば見出される（Patschinsky、T.ら(1982)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 79:973-977); Hunter、T.(1982)、J BioL Chem. 257:4843-4848; Cooper、J. A.ら(1984)、J Biol. Chem. 259:7835-7841）。本明細書で用いられているところのｃＡＭＰリン酸化部位は、ｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼによってリン酸化され得るセリンまたはトレオニン残基を含むアミノ酸配列である。典型的に、ｃＡＭＰリン酸化部位は、セリンまたはトレオニンのＮ末端側の少なくとも２つの連続する塩基残基によって特徴付けられる（Fremisco、J. R.ら(1980)、J. Biol. Chem.255: 4240-4245; Glass、D. B.とSmith、S. B.(1983)、J. Biol. Chem. 258:14797-14803; Glass、D. B.ら（1986)、J. Biol. Chem. 261: 2987-2993）。本明細書で用いられているところのＬＸＸＬＬモチーフは、Ｘはあらゆるアミノ酸であり得、核受容体とコアクチベータとの間の相互作用を媒介するモチーフである（Heeryら (1997)、Nature 397:733-736；Torchiaら(1997)、Nature 387: 677-684）。本明細書で用いられているところのペルオキシソーム局在性シグナルは、蛋白質中に存在するとき、前記蛋白質のペルオキシソームへの局在化を導くのに十分な蛋白質モチーフである。
【００２７】
本発明の単離された蛋白質、好ましくはＰＧＣ-１蛋白質は、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列をもち、または、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に十分に相同なヌクレオチド配列によってコードされている。本明細書で用いられているところの「十分に相同な」という語は、第1および第2のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフおよび／または共通の機能的活性を持つように、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と同一もしくは同等（例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを十分もしくは最低数含有する第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を言う。例えば、ドメインのアミノ酸配列の全体に対して少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%、もしくはそれ以上の相同性または同一性をもつ共通の構造ドメインを共有し、かつ、少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインもしくはモチーフ含有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を本明細書においては、十分に相同であると定義する。さらに、少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．２５%、９９．５%、９９．７５%、もしくはそれ以上の相同性または同一性を共有し、かつ共通の活性を共有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、本明細書においては十分に相同であると定義する。
【００２８】
好ましい態様において、ＰＧＣ-１蛋白質は、チロシンリン酸化モチーフ、ｃＡＭＰリン酸化モチーフ、ＬＸＸＬＬモチーフ、および／またはペルオキシソーム局在性シグナルのうち少なくとも１つまたはそれ以上のドメインもしくはモチーフを含み、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列、またはプラスミド中のＤＮＡ挿入物によってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも約６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%、もしくはそれ以上相同する、もしくは同一のアミノ酸配列を有している。さらに別の態様において、ＰＧＣ-１蛋白質は、チロシンリン酸化モチーフ、ｃＡＭＰリン酸化モチーフ、ＬＸＸＬＬモチーフ、および／またはペルオキシソーム局在性シグナルのうち少なくとも1つもしくはそれ以上のドメインもしくはモチーフを含み、かつ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列にハイブリダイズされている。別の好ましい態様において、ＰＧＣ-１蛋白質は、チロシンリン酸化モチーフ、ｃＡＭＰリン酸化モチーフ、ＬＸＸＬＬモチーフ、および／またはペルオキシソーム局在性シグナルのうち、少なくとも1つもしくはそれ以上のドメインもしくはモチーフを含み、かつ、ＰＧＣ-１活性を有する。
【００２９】
本明細書において互換可能に用いられているところの「ＰＧＣ-１活性」、「ＰＧＣ-１の生物学的活性」または「ＰＧＣ-１の機能的活性」は、細胞内または膜上で発現させたとき、標準的な方法にしたがってインビボまたはインビトロで決定される、ＰＧＣ-１蛋白質、ポリペプチドまたは核酸分子によって影響を受けたり、媒介されたりする活性を含む。１つの態様において、ＰＧＣ-１活性は、ＰＧＣ-１標的分子との相互作用のような直接的活性である。別の態様において、ＰＧＣ-１活性は、例えば、ＰＧＣ-１分子とＰＧＣ-１標的分子または結合パートナーとの相互作用によって媒介される、直接的でない活性である。本明細書で用いられているところの「標的分子」または「結合パートナー」は、ＰＧＣ-１蛋白質が自然に結合または相互作用し、その結果、標的分子または結合パートナーの機能が調節される分子である。ある事例的態様において、ＰＧＣ-１標的分子または結合パートナーは、ペルオキシソーム蛋白質である。
【００３０】
ある好ましい態様において、ＰＧＣ-１活性は少なくとも下記(i)〜(vii)の活性のうちの1つである。(i)ＰＧＣ-１標的分子との相互作用；(ii)細胞内シグナリングの調節；(iii)細胞代謝の調節；(iv)ペルオキシソームへの局在化；(v)脂肪酸の取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現の調節(例えば、ＬＰＬ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＶＬＡＣＳ、ＡＯＸ、ＭＣＡＤおよび／またはＭＣＤ)；(vi) 脂肪酸の取り込みおよび／または酸化の調節；(vii)エネルギーホメオスタシシスの調節；および／または、(viii)脂肪のホメオスタシスの調節。
【００３１】
単離されたヒトＰＧＣ-１ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびＰＧＣ-１ｂのｃＤＮＡによってコードされた予測されるアミノ酸配列をそれぞれ図１および２ならびに配列番号６および７にそれぞれ示す。
【００３２】
約１８９３ヌクレオチド長のヒトＰＧＣ-１ｂ遺伝子は、約３２０アミノ酸残基長にあたる約３５．２ｋＤの分子量を有する蛋白質をコードする。
【００３３】
単離されたヒトＰＧＣ-１ｃのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびＰＧＣ-１のｃＤＮＡによってコードされた予測されるアミノ酸配列をそれぞれ図３および４、ならびに配列番号１２および１３にそれぞれ示す。
【００３４】
約１７４４ヌクレオチド長のヒトＰＧＣ-１ｃ遺伝子は、約３００アミノ酸残基長にあたる約３３ｋＤの分子量を有する蛋白質をコードする。
【００３５】
本発明の種々の局面をさらに詳細に下記のサブセクションにおいて説明する。
【００３６】
Ｉ．単離された分子
本発明の1つの局面は、ＰＧＣ-１蛋白質またはその生物学的に活性のある部分をコードする単離された核酸分子、ならびにＰＧＣ-１コード核酸分子(たとえば、ＰＧＣ-１ ｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメントおよびＰＧＣ-１核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントに関する。本明細書で使用されるところの「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似物を使用して生成されるＤＮＡもしくはＲＮＡの類似物を包含することを意図している。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００３７】
「単離された核酸分子」という語は、該核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離されたものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然に関連する染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸は、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該核酸に天然に隣接する配列（すなわち、該核酸の５’および３’末端に配置される配列）を含まない。例えば、種々の態様において、単離されたＰＧＣ-１核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で該核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有する可能性がある。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により製造される場合に他の細胞性物質もしくは培地を、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものとすることができる。
【００３８】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、プラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列またはその一部を、標準的な分子生物学的方法および本明細書に提供された配列情報を用いて単離することができる。配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、プラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の全てまたは一部を用いて、ハイブリダイゼーションプローブとして、ＰＧＣ-１核酸分子を標準的なハイブリダイゼーション法およびクローニング技術を用いて単離することができる（例えば、Sambrook、J.ら、Molecular
Cloning : A Laboratory Manual. 第２版、Cold Spring Harbor
Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989)。
【００３９】
さらに、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の全てまたは一部を包含する核酸分子を、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７の配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって単離することができる。
【００４０】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。そのように増幅された核酸を適切なベクターにクローンニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。さらに、ＰＧＣ-１のヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術により（例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して）調製することができる。
【００４１】
１つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列を含む。このｃＤＮＡは、ヒトＰＧＣ-１ｂ蛋白質(例えば、「コーディング領域」、９０〜１０４９のヌクレオチドから)、ならびに配列番号６の５’末端非翻訳配列（ヌクレオチド１〜８９）および３’末端非翻訳配列（ヌクレオチド１０５０〜１８９３）を含むことができる。あるいは、核酸分子は、配列番号６(例えば、配列番号８に対応するヌクレオチド９０〜１０４９)のコーディング領域のみを含むことができる。したがって、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号８および配列番号６のヌクレオチド１〜８９を含む。さらに別の態様において、単離された核酸分子は、配列番号８および配列番号６のヌクレオチド１０５０〜１８９３を含む。さらに別の態様において、単離された核酸分子は、配列番号６または配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなる。別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号８および停止コドン(例えば、配列番号６のヌクレオチド１０５０〜１０５２)を含む。
【００４２】
別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号９に対応する、ヒトＰＧＣ-１ｂ遺伝子の「特有の領域」(例えば、ヌクレオチド９６３〜１０４９の「特有のコーディング領域」、ならびに配列番号６の３’末端非翻訳配列（ヌクレオチド１０５０〜１８９３）)を含む。あるいは、核酸分子は、配列番号６の特有のコーディング領域(例えば、配列番号１１に対応するヌクレオチド９６３〜１０４９)のみを含むことができる。別の態様において、核酸分子は、配列番号９または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列からなる。別のいくつかの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１１および停止コドン(例えば、配列番号６のヌクレオチド１０５０〜１０５２)を含む。別のいくつかの態様おいて、発明の単離された核酸分子は、配列番号６のヌクレオチド１〜３８またはヌクレオチド１〜８９を含む。さらに別のいくつかの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６のヌクレオチド１０５０〜１８９３、ヌクレオチド９６３〜１０９１、ヌクレオチド１０９２〜１８５９、またはヌクレオチド１８６０〜１８９３を含む。
【００４３】
別の態様において、ｃＤＮＡは、ヒトＰＧＣ-１ｃ蛋白質をコードする配列(例えば、「コーディング領域」、６７〜９６６のヌクレオチド)、ならびに配列番号１２の５’末端非翻訳配列（ヌクレオチド１〜６６）および３’末端非翻訳配列（ヌクレオチド９６７〜１７４４）を含むことができる。あるいは、核酸分子は、配列番号１２のコーディング領域のみ（例えば、配列番号１４に対応する、ヌクレオチド６７〜９６６）を含むことができる。したがって、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１４および配列番号１２のヌクレオチド１〜６６を含む。さらに別の態様において、単離された核酸分子は、配列番号１４および配列番号１２のヌクレオチド９６７〜１７４４を含む。さらに別の態様において、核酸分子は、配列番号１２または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列からなる。別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１４と停止コドン(例えば、配列番号１２のヌクレオチド９６７〜９６９)を含む。
【００４４】
別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１５に対応する、ヒトＰＧＣ-１ｃ遺伝子の「特有の領域」(例えば、ヌクレオチド９４０〜９６６の「特有のコーディング領域」、ならびに配列番号１２の３’末端非翻訳配列（ヌクレオチド９６７〜１７４４）を含む。あるいは、核酸分子は、配列番号１２の特有のコーディング領域(例えば、配列番号１７に対応するヌクレオチド９４０〜９６６)のみを含むことができる。別の態様において、核酸分子は、配列番号１５または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなる。別のいくつかの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１２のヌクレオチド１〜１５またはヌクレオチド１〜６６を含む。さらに別のいくつかの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１２のヌクレオチド９４０〜１０６８、ヌクレオチド９６７〜１７４４、ヌクレオチド９６７〜１０６８、またはヌクレオチド１０６９〜１７４４を含む。
【００４５】
さらに別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されたヌクレオチド配列に対する相補配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の一部である核酸分子を含む。配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されたヌクレオチド配列に対する相補配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されたヌクレオチド配列に対する相補配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に対して、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されたヌクレオチド配列に対する相補配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列をハイブリダイズし、安定な二重構造を形成するほどに、十分相補的である配列である。
【００４６】
さらに別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されたヌクレオチド配列(例えば、ヌクレオチド配列の全長)、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列(例えば、ヌクレオチド配列の全長)、またはこれらのヌクレオチド配列の相補配列の一部に、少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%、９９．５%、９９．７５%もしくはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。１つの態様において、本発明の核酸配列は、少なくとも（あるいはそれ以上）長さが２５、２６、２７、２８、３０、３０、３６、３８、４０、５０、５９、６１、８７、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７０４、７５０、８００、８４３、８５０、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、９００、９０４、９０５、９０６、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９２４、９２５、９２６、９２７、９３２、９３３、９３４、９３９、９４０、９４１、９４７、９４８、９４９、９５０、１０００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０もしくはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列および、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、または、プラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列にハイブリダイズされている。別の態様において、本発明の核酸分子は、少なくとも３０ヌクレオチド、例えば、配列番号６のヌクレオチド配列の核酸分子の３０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含み、かつ、配列番号６の少なくとも９６４のヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては、本発明の核酸分子は、少なくとも３０ヌクレオチド、例えば、配列番号１２のヌクレオチド配列の核酸分子の３０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含み、かつ、配列番号１２の少なくとも９４２のヌクレオチドを含む。
【００４７】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７の核酸配列、または、プラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の一部のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用することができるフラグメント、またはＰＧＣ-１蛋白質、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な一部分をコードするフラグメントを含むことができる。ＰＧＣ-１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のＰＧＣ-１ファミリーのメンバー、ならびに他の種からのＰＧＣ-１相同物の同定および／またはクローニングでの使用のために設計されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。該プローブ／プライマー（例えば、オリゴヌクレオチド）は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。該オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列のセンス配列、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列のアンチセンス配列、または、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の天然の対立変異体または突然変異体の、最低約１２もしくは１５、好ましくは約２０もしくは２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５もしくは７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の一領域を典型的に含む。
【００４８】
典型的なプローブまたはプライマーは、少なくとも１２または１５、２０または２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５ヌクレオチド長以上(もしくは同程度)であり、および／または本明細書に記載の単離された核酸分子の連続するヌクレオチドを含む。本明細書に記載の単離された核酸分子の隣接もしくは連続するヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーも、プローブまたはプライマー配列内の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基の違いを別にすれば、本発明の範囲に含まれる。ＰＧＣ-１ヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写またはそれをコードする遺伝子配列または相同な蛋白質を検出する（例えば、特異的に検出する）ために用いることができる。好ましい態様において、該プローブは、それに付着された標識基をさらに含む。その標識基としては、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子をあげることができる。別の態様において、１組のプライマー、例えば、ＰＧＣ-１配列の選択された領域、例えば、本明細書に記載のドメイン、領域、部位、または他の配列を増幅するために用いられるＰＣＲでの使用に適したプライマーが設けられる。プライマーは少なくとも、５、１０または５０塩基対の長さおよび、１００未満または２００未満の塩基対の長さとすべきである。プライマーは、本明細書に記載の配列または天然の変異体と比較したとき、同一の塩基対または、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基程度の違いであるべきである。そのようなプローブは、被験者からの細胞サンプル中のＰＧＣ-１コード核酸の濃度を測定する、例えば、ＰＧＣ-１ ｍＲＮＡ濃度を検出する、またはゲノムＰＧＣ-１遺伝子が突然変異したか欠失したかを決定することによって、ＰＧＣ-１蛋白質を誤発現させる細胞または組織を同定するための診断テスト用キットの一部として使用することができる。
【００４９】
「ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＰＧＣ-１生物学的活性（本明細書にはＰＧＣ-１蛋白質の生物学的活性が記載されている）を有し、ＰＧＣ-１蛋白質(例えば、インビトロでの組換え発現によって)を発現し、ＰＧＣ-１蛋白質のコードされた部分の活性を評価するポリペプチドをコードする、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の一部を単離することによって調製することができる。１つの例示的態様において、核酸分子は、少なくとも２５、２６、２７、２８、３０、３０、３６、３８、４０、５０、５９、６１、８７、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７０４、７５０、８００、８４３、８５０、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、９００、９０４、９０５、９０６、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９２４、９２５、９２６、９２７、９３２、９３３、９３４、９３９、９４０、９４１、９４７、９４８、９４９、９５０、１０００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０もしくはそれ以上のヌクレオチド長であり、（本明細書に記載の）ＰＧＣ-１活性を有する蛋白質をコードする。
【００５０】
別の態様において、核酸分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、少なくとも１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜２８もしくはそれ以上の連続する配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基を含むフラグメントをコードする。別の態様において、核酸分子は、配列番号７または１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、少なくとも９、１０、１５、２０、２５、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、３００もしくはそれ以上の連続する配列番号７または１３のアミノ酸残基を含むフラグメントをコードする。さらに別の態様において、核酸分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、少なくとも９、１０、１５、２０、２５、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９２、２９３、２９４、２９５、３００もしくはそれ以上の連続する配列番号７のアミノ酸残基を含み、配列番号７の少なくとも残基２９２を含むフラグメントをコードする。さらに別の態様において、核酸分子は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、少なくとも９、１０、１５、２０、２５、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９２、２９３、２９４、２９５もしくはそれ以上の連続する配列番号１３のアミノ酸残基を含み、配列番号１３の少なくとも残基２９３を含むフラグメントをコードする。
【００５１】
本発明は、遺伝コードの縮重により、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されるヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列とは異なり、したがって配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されるヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列によりコードされるものと同一のＰＧＣ-１蛋白質をコードする核酸分子をさらに包含する。別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも１、しかし５、１０、２０、５０または１００以下のアミノ酸残基だけが異なるアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する。さらに別の態様において、核酸分子は、ヒトＰＧＣ-１のアミノ酸配列をコードする。この比較のために配列が必要であれば、最大の相同性を持つように配列すべきである。
【００５２】
核酸変異体は、対立変異体（同じ座位）、相同(異なる座位)および相同分子種（異なる微生物）のような天然に発生するものであってもよいし、または非天然のものでもよい。日天然の変異体は、ポリヌクレオチド、細胞もしくは微生物に適用することができるものを含む、変異原性技術によって作製することができる。該変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、反転および挿入を含有することができる。変異は、コーディング領域および非コーディング領域のいずれか、または両方に発生し得る。変異は、保存的および非保存的なアミノ酸置換（コードされた生成物中において比較）を生成することができる。
【００５３】
対立遺伝子変異体は、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質のアミノ酸配列に変化を導く個体群(例えば、ヒト個体群)中のＤＮＡ配列遺伝子多型から得られる。ＰＧＣ-１遺伝子中のそのようなゲノム遺伝子多型は、天然の対立遺伝子によって個体群中の個体に存在し得る。本明細書で用いられているところの、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という語は、ＰＧＣ-１蛋白質、好ましくは哺乳動物のＰＧＣ-１蛋白質をコードする１個の読取り枠を含む核酸分子を指し、さらに、非コーディング制御配列およびイントロンを含むことができる。
【００５４】
したがって、１つの態様において、本発明は、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする単離された核酸分子を特徴とする。ここでは例えば該核酸分子はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７を含む核酸分子の相補配列にハイブリダイズする。
【００５５】
ＰＧＣ-１、例えば、ヒトＰＧＣ-１の対立遺伝子変異体は、機能的および非機能的ＰＧＣ-１蛋白質の両方を含む。機能的対立遺伝子変異体は、例えば脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節することができる能力を維持するＰＧＣ-１蛋白質の天然に発生するアミノ酸配列の変異体である。機能的対立遺伝子変異体は、典型的に配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列の１もしくはそれ以上のアミノ酸の保存的置換のみ、または蛋白質の重要でない領域中の重要でない残基の、置換、欠失もしくは挿入を含有するものである。
【００５６】
機能的でない対立遺伝子変異体は、例えば、脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節することができる能力を持たないＰＧＣ-１蛋白質、例えば、ヒトＰＧＣ-１の天然に存在するアミノ酸配列の変異体である。機能的でない対立遺伝子変異体は、典型的に配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列の保存的でない置換、欠失、もしくは挿入、もしくは中途切断、または、重要な残基もしくは蛋白質の重要な領域における置換、挿入、もしくは欠失を典型的に含有するであろう。
【００５７】
本発明は、さらに、非ヒトの相同分子種(例えば、ヒトＰＧＣ-１蛋白質の非ヒト相同分子種)を提供する。ヒトＰＧＣ-１蛋白質の相同分子種は、非ヒト生物から単離され、ヒトＰＧＣ-１と同じ脂肪酸取り込みおよび／または酸化調節機能を持つ蛋白質である。ヒトＰＧＣ-１蛋白質の相同分子種は、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列に略相同するアミノ酸配列を含むことが容易に同定される。
【００５８】
さらに、他のＰＧＣ-１ファミリーメンバーをコードし、したがって、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列のＰＧＣ-１配列とは異なるヌクレオチド配列を持つ核酸分子が本発明の範囲に含まれることが意図される。例えば、ヒトＰＧＣ-１のヌクレオチド配列に基づいて、別のＰＧＣ-１のｃＤＮＡを同定することができる。さらに、異なる種のＰＧＣ-１蛋白質をコードし、したがって、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のＰＧＣ-１配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を持つ核酸分子が本発明の範囲に含まれることが意図される。例えば、マウスもしくはサルＰＧＣ-１のｃＤＮＡがヒトＰＧＣ-１のヌクレオチド配列に基づいて同定される。
【００５９】
天然の対立遺伝子変異体および本発明のＰＧＣ-１のｃＤＮＡの相同体に対応する核酸分子を、本明細書に開示されているｃＤＮＡ、またはそれらの一部をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術におけるハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書に開示されているＰＧＣ-１核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。天然に存在する対立遺伝子変異体に対応し、本発明のＰＧＣ-１のｃＤＮＡに相同な核酸分子をさらに、ＰＧＣ-１遺伝子と同じ染色体もしくは座位にマッピングすることによってさらに単離することができる。
【００６０】
当該技術分野において公知の方法（例えば、本発明の単離された核酸分子に、例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすること）によって、相同分子種、相同体および対立遺伝子変異体を同定することができる。１つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。別の態様において、核酸は、少なくとも、２５、２６、２７、２８、３０、３０、３６、３８、４０、５０、５９、６１、８７、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７０４、７５０、８００、８４３、８５０、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、９００、９０４、９０５、９０６、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９２４、９２５、９２６、９２７、９３２、９３３、９３４、９３９、９４０、９４１、９４７、９４８、９４９、９５０、１０００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０もしくはそれ以上のヌクレオチド長である。
【００６１】
本明細書で用いられている、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という語は、ハイブリダイゼーションおよび、互いに有意に同一もしくは相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされている状態での洗浄の条件を表すことが意図されている。好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％もしくは９０％互いに同一である配列が、互いにハイブリダイズされるような条件であることが好ましい。そのようなストリンジェントな条件は、当該技術分野の当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編）John Wiley & Sons、Inc.(1995)、第2、4、6節に記述がある。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、第7、9および11章に記載されている。ストリンジェントな条件の好ましい、限定的でない例は、約６５〜７０℃での４×または６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中での約４２〜５０℃でのハイブリダイゼーション）およびそれに続く約６５〜７０℃での１×ＳＳＣでの１回以上の洗浄である。ストリンジェントな条件のさらに好ましい、限定的でない例は、６×のＳＳＣ中で４５℃でのハイブリダイゼーションおよびそれに続く約６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、限定的でない例は、１×ＳＳＣでの約６５〜７０℃でのハイブリダイゼーション（または、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中での約４２〜５０℃でのハイブリダイゼーション）およびそれに続く約６５〜７０℃での０．３×ＳＳＣでの１回以上の洗浄である。減少したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、限定的でない例は、４×もしくは６×ＳＳＣでの、約５０〜６０℃でのハイブリダイゼーション（または、予備的に６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中での約４０〜４５℃でのハイブリダイゼーション）およびそれに続く約５０〜６０℃での２×ＳＳＣでの１回以上の洗浄である。上記値の中間値の範囲、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃も本発明に包含されることが意図される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄用緩衝剤として、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム）をＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に置換することができる。洗浄は、ハイブリダイゼーション終了後、それぞれ１５分間行う。ハイブリッドがの長さが５０塩基対未満であることが予期されるハイブリダイゼーション温度は、該ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５〜１０℃低くすべきである。ここで、Ｔｍは下記の式で決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）で決定される。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（log１０[Ｎａ＋]＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）で決定される。式中、Ｎはハイブリッド���の塩基数を表し、[Ｎａ＋]は、ハイブリダイゼーション緩衝剤中のナトリウムイオンの濃度を表す（１×ＳＳＣの[Ｎａ＋]は０．１６５Ｍ）。核酸分子の、膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）への非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるために、追加的試薬を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝剤に添加してもよい。限定されないが、ブロッキング剤(例えば、ＢＳＡまたはサケもしくはニシンの精子担体ＤＮＡ)、界面活性剤(例えば、ＳＤＳ)，キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰ等の試薬を用いてもよいことを当業者は認識するであろう。ナイロン膜を用いるときの、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加的な好適な非限定的な例として、０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中での約６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳ中での約６５℃での１回以上の洗浄がある(例えば、ChurchおよびGilbert (1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991〜1995（または、予備的に０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）。
【００６２】
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列にハイブリダイズした本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する(例えば、天然の蛋白質をコードする)ヌクレオチド配列を持つＲＮＡまたはＤＮＡ分子である。
【００６３】
個体群中に存在するかもしれないＰＧＣ-１配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、突然変化によって、ＰＧＣ-１蛋白質の機能に変化をもたらすことなく、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に変化がもたらされ、それによって、コードされたＰＧＣ-１蛋白質のアミノ酸配列に変化がもたらされ得ることをさらに予期するであろう。例えば、「非必須の（non-essential）」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列において行うことができる。「非必須の」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変えることなく、ＰＧＣ-１の配列(例えば、配列番号７、１０、１３または１６の配列)の野生型配列から変化させることができる残基である。一方、「必須の」アミノ酸残基は、生物学的活性にとって必要である。例えば、本発明のＰＧＣ-１蛋白質中に保存されるアミノ酸残基、例えば、ペルオキシソーム局在性シグナルに存在するものは、特に改変に適さないと予測される。さらに、本発明のＰＧＣ-１蛋白質と他のＰＧＣ-１のメンバーの間に保存される追加的アミノ酸残基は、改変に適する。
【００６４】
したがって、本発明の別の局面は、活性にとって必須でないアミノ酸残基中に改変を含むＰＧＣ-１蛋白質をコードする核酸分子に関する。そのようなＰＧＣ-１蛋白質は、配列番号７、１０、１３または１６のアミノ酸配列において相違があるが、生物学的活性は保たれている。１つの態様において、単離された核酸分子は、ある蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、該蛋白質は、配列番号７、１０、１３または１６のアミノ酸配列、例えば、配列番号７、１０、１３または１６のアミノ酸配列の全長に少なくとも、約６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%もしくはそれ以上相同するアミノ酸配列を含む。
【００６５】
配列番号７、１０、１３または１６の蛋白質に相同するＰＧＣ-１蛋白質をコードする核酸分子は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に、１もしくはそれ以上の分子の置換、追加または毛質を導入し、それによって１もしくはそれ以上のアミノ酸の置換、追加または欠失を、コードされた蛋白質に導入することによって作成することができる。配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性の突然変異誘発のような標準的技術により、突然変異を導入することができる。好ましくは、１個もしくはそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基で保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、該アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖をもつアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電しない極性の側鎖をもつアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖をもつアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝状側鎖をもつアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖をもつアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。従って、ＰＧＣ-１中の予測される非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で好ましく置き換えられる。あるいは、別の態様においては、飽和突然変異誘発によるような突然変異をＰＧＣ-１コーディング配列の全部もしくは一部に沿って無作為に導入することができ、そして、結果として生じる突然変異体を、本明細書で記述されるＰＧＣ-１活性についてスクリーニングして、ＰＧＣ-１活性を保持する突然変異体を同定することができる。配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の突然変異誘発の後に、コードされた蛋白質を組換え的に発現させることができ、そして例えば本明細書に記述されるアッセイを使用して該蛋白質の活性を測定することができる。
【００６６】
１つの好ましい態様において、突然変異ＰＧＣ-１蛋白質は、（i）ＰＧＣ-１標的分子と相互作用する；（ii）細胞内シグナリングを調節する；（iii）細胞代謝を調節する；(iv)ペルオキシソームに局在化する；(v)脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節する（例えば、ＬＰＬ、ＦＡＴ/ＣＤ３６、ＶＬＡＣＳ、ＡＯＸ、ＭＣＡＤおよび／またはＭＣＤ);(vi)脂肪酸取り込みおよび／または酸化を調節する；(vii)エネルギーのホメオスタシスを調節する；および／または(viii)脂肪のホメオスタシスを調節する能力を調べるためにアッセイを行うことができる。
【００６７】
上記ＰＧＣ-１蛋白質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の局面は、それらに対しアンチセンスである単離された核酸 分子に関する。例示的実施例において、本発明はＰＧＣ-１核酸分子に対してアンチセンスである(例えば、ＰＧＣ-１核酸分子のコーディング鎖にアンチセンスである)単離された核酸分子を提供する。「アンチセンス」核酸 は、蛋白質をコードする「センス」核酸 に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、もしくはｍＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、ＰＧＣ-１のコーディング鎖全体またはその一部分のみに相補的であることができる。一態様において、アンチセンス核酸分子は、ＰＧＣ-１をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域配列」にアンチセンスである。「コーディング領域配列」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を言う（例えば、配列番号８に対応するヒトＰＧＣ-１ｂのコーディング領域配列、または配列番号１４に対応するヒトＰＧＣ-１ｃのコーディング領域配列）。別の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＰＧＣ-１をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および／または３’配列を言う（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも称される）。
【００６８】
本明細書に開示されるＰＧＣ-１をコードするコーディング鎖の配列（例えば、配列番号８または１４）が与えられれば、ワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であることができるが、より好ましくは、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡの一部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ヌクレオチドもしくはそれ以上であることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸 （例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、該分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された多様に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生じさせるのに使用することができる修飾ヌクレオチドの例は、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２，２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ−マンノシルケオシン、５’-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-（３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６-ジアミノプリンを包含する。あるいは、核酸がアンチセンスの向きでサブクローニングされている発現ベクターを使用してアンチセンス核酸を生物学的に調製することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる。以下のサブセクションにさらに記述する）。
【００６９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、被験者に投与されるか、またはインサイチュで生成され、それによって、ＰＧＣ-１蛋白質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合し、それによって転写および／または翻訳を阻害することによって蛋白質の発現を阻害する。該ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によることができるか、もしくは、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝中の特異的相互作用によることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組織部位での直接注入を包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞に標的を定めるよう改変することができ、そしてその後に全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、例えば、細胞表面の受容体もしくは抗原に結合するペプチドもしくは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面上で発現される受容体もしくは抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するような、アンチセンス分子を修飾することができる。該アンチセンス核酸分子は、本明細書に記述されるベクターを使用して細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、該アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【００７０】
なお別の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子である。Α-アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットに反して鎖が相互に対し平行に走っている(Gaultierら(1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641）。該アンチセンス核酸分子は、２’-ｏ-メチルリボヌクレオチド(Inoueら(1987)、Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148)もしくはキメラのＲＮＡ−ＤＮＡ類似物(Inoueら(1987)、FEBS Lett. 215: 327-330)もまた含む可能性がある。
【００７１】
さらに別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム(HaseloffとGerlach(1988)、Nature 334: 585-591に記載される)を使用して、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断してそれによりＰＧＣ-１のｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＰＧＣ-１をコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるＰＧＣ-１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のヌクレオチド配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、TetrahynaenaのＬ-１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここで、活性部位のヌクレオチド配列は、ＰＧＣ-１をコードするｍＲＮＡ中の切断されるべきヌクレオチド配列に相補的である。例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照されたい。あるいは、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡを使用してＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば、Bartel, D. とSzostak, J. W. (1993) Science
261: 1411-1418を参照されたい。
【００７２】
あるいは、ＰＧＣ-１遺伝子発現は、標的細胞中でのＰＧＣ-１遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成するように、ＰＧＣ-１の調節領域（例えば、ＰＧＣ-１のプロモーターおよび／またはエンハンサー；例えば、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、または配列番号１２のヌクレオチド１〜６６）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることにより阻害することができる。別の態様において、ＰＧＣ-１ｂまたはＰＧＣ-１ｃに特有の配列（例えば、配列番号９または配列番号１５）を標的とすることもできる。一般に、Helene, C.(1991) Anticancer DrugDes. 6 (6): 569-84; Helene, C.ら(1992)、Ann. N.Y Acad Sci. 660: 27-36; およびMaher, L. J. (1992) Bioessays 14 (12): 807-15を参照されたい。
【００７３】
さらに別の態様において、本発明のＰＧＣ-１核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸塩骨格(backbone)において、例えば、安定性、ハイブリダイゼーション、または分子の溶解性を改良するために改変することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸塩骨格を改変してペプチド核酸にすることができる(Hyrup, B.およびNielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23)。本明細書で用いられる「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という語は、核酸体、例えば、オキシリボースリン酸塩骨格が擬ペプチドで置き換えられ、４つの核酸塩基のみが残されたＤＮＡ擬似体を言う。天然のＰＮＡの骨格は、低いイオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションが可能であることがわかっている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、HyrupとNielsen(1996)、前掲、およびPerry-O'Keefe ら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。.
【００７４】
ＰＧＣ-１核酸分子のＰＮＡは、治療および診断の用途に使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写の誘発または翻訳の抑止または複製の阻止によって、遺伝子発現の配列特異的調節アンチセンスまたは抗原作用物質として使用することができる。ＰＧＣ-１核酸分子のＰＮＡは、遺伝子（例えば、ＰＮＡ誘導性ＰＣＲ固定（PNA directed PCR clamping）による）中の単一塩基対突然変異の分析に使用することもできる。他の酵素と組み合わせて用いられるとき、「人工制限酵素」として使用することができる(例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ(HyrupとNielsen、(1996)、前掲))；またはＤＮＡ配列またはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして(HyrupとNielsen (1996)、前掲；Perry-O'Keefeら、(1996)、前掲)使用することができる。
【００７５】
別の態様において、ＰＧＣ-１核酸分子のＰＮＡは、脂肪親和性の強いまたは他のヘルパー基をＰＮＡに付着することによって、ＰＮＡ-ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該技術で既知の他の薬物輸送技術を用いることによって(例えば、それらの安定性または細胞取り込みを高めるために)修飾することができる。例えば、ＰＧＣ-１核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成して、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特徴を組み合わせることができる。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を持つ一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、RNase HおよびＤＮＡポリメラーゼ)が、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いて結合することができる（HyrupとNielsen(1996)、前掲）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、HyrupとNielsen(1996)、前掲、およびFinn, P. J.ら(1996)、Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63に記載のように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイト結合化学を用いた固体支持体上で合成し、ヌクレオシド類似体(例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジン-ホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端の間に用いることができる（Mag、M.ら(1989)、Nucleic Acids Res. 17: 5973-88）。次に、ＰＮＡモノマーを段階的に結合し、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを用いてキメラ分子を作製する（Finn, P. J.ら(1996)、前掲）。あるいはまた、キメラ分子は、５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子を合成することもできる(Peterser, K. H.ら、(1975) Bioorganic Med. Chen 2. Lett. 5: 1119-11124)。
【００７６】
別の諸態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）、または細胞膜を横切っての輸送(例えば、Letsingerら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitreら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652;ＰＣＴ国際公開第WO 88/09810号を参照されたい)、もしくは血液脳関門の輸送を促進させる物質のような付属基（appended group）を含んでもよい(例えば、ＰＣＴ国際公開第WO89/10134号を参照されたい)。さらにオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断部位で修飾することができる(例えば、Krolら、(1988)、Biotechniques 6: 958-976を参照されたい)、または介在物質(例えば、Zon (1988)、Pharm. Res. 5: 539-549を参照されたい)。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子に（例えば、ペプチドハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、もしくはハイブリダイゼーション誘発性切断剤）に接合してもよい。
【００７７】
II.単離されたＰＧＣ-１蛋白質および抗ＰＧＣ-１抗体
本発明の１つの局面は、単離されたまたは組換えＰＧＣ-１蛋白質およびポリペプチド、および生物学的に活性のあるそれらの部分、ならびに抗ＰＧＣ-１抗体に対する免疫源として用いるのに好適なポリペプチドフラグメントに関する。１つの態様において、未変性のＰＧＣ-１蛋白質は細胞または組織源から、適切な精製スキームによって単離することができる。さらに別の局面において、ＰＧＣ-１蛋白質は、組換えＤＮＡ技術によって作製される。ＰＧＣ-１蛋白質またはポリペプチドは、組換え発現に換えて、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【００７８】
「単離された」または「精製された」蛋白質もしくはその生物学的に活性の部分は、ＰＧＣ-１蛋白質が由来する細胞または組織源からの細胞的物質またはその他の含有蛋白質を実質的に含まない。または、化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という語は、蛋白質が、単離されるまたは組換え的に作製される細胞の細胞的成分から分離される、ＰＧＣ-１蛋白質の調製物を含む。１つの態様において、「細胞性物質を実質的に含まない」という語は、（乾燥重量で）約３０％未満の非ＰＧＣ-１蛋白質（本明細書で「混入蛋白質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非ＰＧＣ-１蛋白質、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＰＧＣ-１蛋白質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＰＧＣ-１蛋白質を有するＰＧＣ-１蛋白質の調製物を包む。ＰＧＣ-１蛋白質もしくはその生物学的に活性な部分を組換え的に作製する場合は、培地を実質的に含まない、すなわち、培地が蛋白質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満に相当することが好ましい。
【００７９】
「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」という語は、化学的前駆物質または蛋白質の合成に関与する他の化学物質から該蛋白質が分離されている該蛋白質の調製物を含む。１つの態様において、「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」という語は、（乾燥重量で）約３０％未満の化学的前駆物質または非ＰＧＣ-１化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆物質または非ＰＧＣ-１化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆物質または非ＰＧＣ-１化学物質、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆物質または非ＰＧＣ-１化学物質を有するＰＧＣ-１蛋白質の調製物を包む。
【００８０】
本明細書に用いられているところの、ＰＧＣ-１蛋白質の「生物学的に活性な部分」という語は、ＰＧＣ-１分子と非ＰＧＣ-１分子との間の相互作用に関与し、または脂肪酸の取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節することができるＰＧＣ-１蛋白質のフラグメントを含む。ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な部分は、ＰＧＣ-１アミノ酸配列、例えば、配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列に十分に相同、もしくはそれに由来し、ＰＧＣ-１蛋白質の少なくとも１つの活性を示すペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＰＧＣ-１蛋白質の活性の少なくとも１つ、例えば、脂肪酸の取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現の調節を有するドメインもしくはモチーフを含む。ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な部分は、長さが例えば、９、１０、２５、２８、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、３００もしくはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであることができる。ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な部分は、ＰＧＣ-１媒介性の活性、例えば、脂肪酸の取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節する物質を開発するための標的として用いることができる。
【００８１】
１つの態様において、ＰＧＣ-１蛋白質の生物学的に活性な部分は、チロシンリン酸化モチーフ、１つのｃＡＭＰリン酸化モチーフ、１つのＬＸＸＬＬモチーフ、および／またはペルオキシソーム局在性シグナルの少なくとも１つを含む。さらに、該蛋白質のその他の領域が削除された他の生物学的に活性の部分は、組換え技術によって調製することができ、未変性ＰＧＣ-１蛋白質の１以上の機能的活性を持つかどうかを評価されることができる。
【００８２】
本発明の別の局面は、例えば、免疫源として使用するための配列番号７、１０、１３、または１６のアミノ酸配列をもつ蛋白質のフラグメントを特徴とする。１つの態様において、フラグメントは、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸(例えば、隣接もしくは連続するアミノ酸)を含む。別の態様において、フラグメントは、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列の、少なくとも８、９、１０、１５、２０、２５、２８、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、３００もしくはそれ以上のアミノ酸 (例えば、隣接もしくは連続するアミノ酸)を含む。
【００８３】
別の態様において、フラグメントは、配列番号７の少なくとも８、９、１０、１５、２０、２５、２８、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、３００もしくはそれ以上の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号７の少なくとも残基２９２を含む。さらに別の態様において、フラグメントは、配列番号１３の少なくとも８、９、１０、１５、２０、２５、２８、２９、３０、３１、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、２９１、２９２、２９３、２９４、もしくは２９５それ以上の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号１３の少なくとも残基２９３を含む。
【００８４】
好ましい態様において、ＰＧＣ-１蛋白質は、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列を持つ。別の諸態様において、上記サブセクションＩで詳細に述べたように、ＰＧＣ-１蛋白質は、配列番号７、１０、１３、または１６の配列と略一致し、配列番号７、１０、１３、または１６の配列の機能的活性を維持し、かつ天然の対立変異体もしくは変異原性によるアミノ酸配列とは異なる。別の態様では、ＰＧＣ-１蛋白質は、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列に少なくとも約６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%、もしくはそれ以上一致するアミノ酸配列を含む蛋白質である。
【００８５】
別の態様において、本発明は、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７に示されるヌクレオチド配列に約６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８５%、９０%、９1%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９.２５%、９９．５%、９９．７５%、もしくはそれ以上一致するヌクレオチド配列またはその相補配列からなる核酸分子によってコードされたＰＧＣ-１蛋白質を特徴とする。本発明はさらに、配列番号６，８，９，１１，１２，１４，１５、または１７のヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む核酸分子の相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされている核酸分子によってコードされたＰＧＣ-１蛋白質をさらに特徴とする。
【００８６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性（percent identity）を決定するために、最適な比較目的のための配列を行う（例えば、最適な配列のために、第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の１つもしくは両方にギャップを導入し、および比較目的のために非相同な配列を無視することができる）。好ましい態様において、比較のために配列された参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０%、８０%、または９０％である（例えば、３２０個のアミノ酸残基を持つ配列番号７のＰＧＣ-１ｂアミノ酸配列に対して第２の配列を並べるとき、少なくとも９６、好ましくは少なくとも１２８、より好ましくは１６０、さらに好ましくは少なくとも１９２およびさらにより好ましくは２２４、２５６または２８８のアミノ酸残基を並べ；例えば、３００個のアミノ酸残基を持つ配列番号１３のＰＧＣ-１ｃアミノ酸配列に対して第２の配列を並べるとき、少なくとも９０、好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは１５０、さらに好ましくは少なくとも１８０およびさらにより好ましくは２１０、２４０または２７０のアミノ酸残基を並べる）。次に、アミノ酸残基または対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置は、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドに占められており、分子はその位置において同一である（本明細書においては、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同じ意味で用いられる）。２つの配列の間のパーセント同一性は、２つの配列を最適に並べるのに必要なギャップ、それぞれのギャップの長さを考慮した、該配列に共有される同一箇所の数の関数である。
【００８７】
２つの配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい態様において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Needlemanおよび Wunsch（J MoL Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを用いて決定される。それは、GCG ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Groupよりオンラインにて入手可能)のGAPプログラムに、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ギャップ量：１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さ量（length weight）：１、２、３、４、５または６を用いて導入されている。さらに別の好ましい態様において、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、GCG ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Groupよりオンラインにて入手可能)のGAPプログラムを用いて、NWSgapdna CMPマトリックス、ギャップ量：４０、５０、６０、７０または８０、および長さ量：１、２、３、４、５または６を用いて決定される。GAPプログラムとの結合に用いるパラメータの好ましい、非制限的な例は、ギャップペナルティー１２、ギャップ拡張ペナルティー４およびフレームシフトギャップペナルティ５のBlosum 62スコアリングマトリックスがあげられる。
【００８８】
別の態様において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、MeyersおよびMiller（Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて決定される。それは、PAM120量（PAM120 weight）の重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて、ALIGNプログラム（version 2.0 または version 2.0U)に導入されている。
【００８９】
本発明の核酸および蛋白質配列はさらに、例えば、他のファミリーメンバーもしくは関連する配列を同定するために、公開されているデータベースに対してサーチを行うための「クエリー配列」として用いることができる。そのようなサーチは、NBLASTおよびXBLAST プログラム（version 2.0）（Altschulら (1990) J.Mol. Biol. 215: 403-10）を用いて行うことができる。本発明のＰＧＣ-１核酸分子に相同するヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチドサーチは、NBLAST プログラム（スコア＝100、ワード長＝12）を用いて行うことができる。本発明のＰＧＣ-１蛋白質分子に相同するアミノ酸配列を得るために、BLAST蛋白質サーチは、XBLASTプログラム（スコア＝50、ワード長＝3）を用いて行うことができる。比較の目的で、ギャップのある並び方を得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids、Res. 25 (17): 3389-3402に記載のように用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる際、それぞれのプログラムのデフォルトプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを参照されたい。
【００９０】
本発明は、ＰＧＣ-１のキメラもしくは融合蛋白質もまた提供する。本明細書で使用されるところのＰＧＣ-１の「キメラ蛋白質」もしくは「融合蛋白質」は、非ＰＧＣ-１ポリペプチドに作用可能に連結されるＰＧＣ-１ポリペプチドを含んで成る。「ＰＧＣ-１ポリペプチド」は、ＰＧＣ-１（例えば、ＰＧＣ-１またはＰＧＣ-１）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、一方「非ＰＧＣ-１ポリペプチド」は、ＰＧＣ-１蛋白質に実質的に相同でない蛋白質（例えばＰＧＣ-１蛋白質と異なり、かつ同一もしくは異なる生物体由来である蛋白質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ＰＧＣ-１融合蛋白質内で、ＰＧＣ-１ポリペプチドは、ＰＧＣ-１蛋白質の全部もしくは一部に対応することができる。好ましい態様において、ＰＧＣ-１融合蛋白質は、ＰＧＣ-１蛋白質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の態様において、ＰＧＣ-１融合蛋白質は、ＰＧＣ-１蛋白質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。ＰＧＣ-１融合蛋白質内で「作用可能に連結される」という用語は、ＰＧＣ-１ポリペプチドおよび非ＰＧＣ-１ポリペプチドが相互に同じ読み枠で融合されることを示すことを意図している。非ＰＧＣ-１ポリペプチドは、ＰＧＣ-１ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合することができる。
【００９１】
例えば、一態様において、融合蛋白質は、ＰＧＣ-１配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＰＧＣ-１融合蛋白質である。このような融合蛋白質は、組換えＰＧＣ-１の精製を助長することができる。別の態様において、融合蛋白質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有するＰＧＣ-１蛋白質である。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）におけるＰＧＣ-１の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用により増大させることができる。別の態様において、融合蛋白質は、ＰＧＣ-１配列が緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）に融合し、ＰＧＣ-１融合蛋白質を生きた細胞内で見えるようにしたＧＦＰ-ＰＧＣ-１融合蛋白質である。
【００９２】
本発明のＰＧＣ-１融合蛋白質は、薬学的組成物に組み込み、被験者にインビボで投与することができる。ＰＧＣ-１融合蛋白質は、ＰＧＣ-１標的分子の生物学的利用能に影響を及ぼすために用いられる。ＰＧＣ-１融合蛋白質は、例えば、(i)ＰＧＣ１蛋白質をコードする遺伝子の異常型修飾もしくは突然変異、(ii)ＰＧＣ-１遺伝子の誤調節、および（iii)ＰＧＣ-１蛋白質の異常型翻訳修飾、によって起こる障害の処置において治療的に有用であることができる。
【００９３】
さらに、本発明のＰＧＣ-１融合蛋白質は、被験者において抗ＰＧＣ-１抗体を作製するための免疫源として用いることができ、それによってＰＧＣ‐１標的分子を精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＰＧＣ-１基質の輸送もしくはＰＧＣ-１とＰＧＣ-１標的分子との相互作用を阻害もしくは向上させる分子を同定する。
【００９４】
好ましくは、本発明のＰＧＣ-１キメラ蛋白質もしくは融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製される。例えば、従来の技術に従い、例えば、平滑端もしくはスタガー（stagger）端の末端をライゲーションに使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切であれば付着端の埋込(filling-in)、所望されない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的ライゲーションにより、多様なポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを同じ読み枠で一緒に連結する。別の態様においては、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２個の連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができ、続いて、アニーリングおよび再増幅を行ってキメラ遺伝子配列を生じさせることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照されたい）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチドもしくはＧＦＰポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが商品として入手可能である。融合部分がＰＧＣ-１蛋白質に同じ読み枠で連結されているように、発現ベクター中にＰＧＣ-１をコードする核酸をクローニングすることができる。
【００９５】
本発明は、ＰＧＣ-１アゴニスト（類似物）またはＰＧＣ-１アンタゴニストのいずれかとして機能するＰＧＣ-１蛋白質の変異体にもまた関する。このＰＧＣ-１蛋白質の変異体は、変異原性、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質の分離した点突然変異または切断によって生成することができる。ＰＧＣ-１蛋白質のアゴニストは、天然に存在する形態のＰＧＣ-１蛋白質の生物学的活性と実質的に同じ、またはサブセットであることができる。ＰＧＣ-１蛋白質のアンタゴニストは、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質のＰＧＣ-１によって媒介される活性を競合的に調節することによって、天然に存在する形態のＰＧＣ-１蛋白質の１以上の活性を阻害することができる。従って、機能の制限された変異体での処理により特定の生物学的効果を導き出すことができる。一つの態様において、天然に存在する形態の蛋白質の生物学的活性の１つのサブセットを有する変異体での被験者の治療は、天然に存在する形態のＰＧＣ-１蛋白質での治療と比較して被験者における副作用が少ない。
【００９６】
１つの態様において、ＰＧＣ-１アゴニスト（類似物）またはＰＧＣ-１アンタゴニストのいずれかとして機能するＰＧＣ-１蛋白質の変異体は、ＰＧＣ-１蛋白質の突然変異体（例えば、短縮突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーをＰＧＣ-１蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることにより同定することができる。一つの態様において、ＰＧＣ-１変異体の多様なライブラリーが核酸レベルの組み合わせ変異原性により生成され、かつ、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより、潜在的ＰＧＣ-１配列の縮重セット（degenerate set）が個別のポリペプチドとして、あるいはその中にＰＧＣ-１配列セットを含有する（例えば、ファージディスプレイのための）一セットのより大きな融合蛋白質として発現可能であるように、ＰＧＣ-１変異体の多様なライブラリーを生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的なＰＧＣ-１変異体のライブラリーを作製するために使用することができる多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施することができ、そして、該合成遺伝子をその後適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットの使用は、所望のセットの潜在的ＰＧＣ-１配列をコードする配列の全部の一混合物での供給を可能とする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えば、Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39 : 3;Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakuraら (1984) Science 198: 1056; Ike ら(1983) Nucleic Acids Res. 11: 477)。
【００９７】
加えて、ＰＧＣ-１蛋白質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、ＰＧＣ-１蛋白質の変異体のスクリーニングおよびその後の選択のためのＰＧＣ-１フラグメントの多彩な集団を生じさせることができる。一つの態様において、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが分子あたり約１回のみ発生する条件下でＰＧＣ-１コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて異なるニックを入れられた産物からのセンス／アンチセンス対を包含する可能性のある二本鎖ＤＮＡを形成させること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントのライブラリーを発現ベクターに連結することにより生成させることができる。この方法により、多様な大きさのＰＧＣ-１蛋白質のＮ末端、Ｃ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを生じさせることができる。
【００９８】
点突然変異または切断により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、また、選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。このような技術は、ＰＧＣ-１蛋白質の組み合わせの変異原性により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループット分析に適する、最も広く用いられている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターライブラリーを用いて適切な細胞を形質転換すること、および、所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件下で組換え遺伝子を発現させることを含む。スクリーニングアッセイと組み合わせて、ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術、Recursive ensemble mutagenesis(REM)を使用して、ＰＧＣ-１変異体を同定することができる(ArkinとYouvan(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delagraveら (1993) Protein Eng 6 (3): 327-331)。
【００９９】
１つの態様において、細胞ベースアッセイを活用して、多様なＰＧＣ-１ライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーは、通常ＰＧＣ-１に特定のＰＧＣ-１依存的に反応する細胞株にトランスフェクトされる。次に、トランスフェクトされた細胞をＰＧＣ-１に接触させ、例えば、脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を測定することによって、その突然変異体の発現がＰＧＣ-１によるシグナリングに及ぼす効果を検出することができる。次に、プラスミドＤＮＡを細胞から回収し、ＰＧＣ-１突然変異体によるシグナリングの阻害または増強の評価を行い、個別のクローンをさらに特徴付ける。
【０１００】
単離されたＰＧＣ-１蛋白質またはその一部分もしくはフラグメントを、ＰＧＣ-１を結合する抗体を作製するための免疫原として、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて使用することができる。全長ＰＧＣ-１蛋白質を用いることができる。あるいは、本発明は、免疫原として使用するためのＰＧＣ-１の抗原ペプチドフラグメントを提供する。ＰＧＣ-１の抗原ペプチドは、配列番号７、１０、１３、または１６に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、また、ペプチドに対する抗体がＰＧＣ-１との特異的な免疫複合体を形成するようにＰＧＣ-１のエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。別の好ましい態様において、抗原ペプチドは、ＰＧＣ-１ｂまたはＰＧＣ-１ｃに特有のアミノ酸配列、例えば、配列番号１０または１６に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含むペプチドである。
【０１０１】
抗原ペプチドに包含されるエピトープは、蛋白質の表面に位置するＰＧＣ-１の領域、例えば、親水性領域ならびに高い抗原性をもつ領域であることが好ましい。
【０１０２】
ＰＧＣ-１免疫原は、典型的に、好適な被験者（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）に対して免疫原を免疫することによって抗体を調製するために用いられる。適切な免疫原調製物には、例えば、ＰＧＣ-１組換え蛋白質またはＰＧＣ-１化学合成ポリペプチドが含まれる。該調製物は、さらにフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫促進剤をさらに含むことができる。免疫原性のＰＧＣ-１調製物での好適な被験者の免疫感作はポリクローナル抗ＰＧＣ-１抗体応答を誘導する。
【０１０３】
したがって、本発明の別の局面は、ＰＧＣ-１抗体に関する。本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわちＰＧＣ-１のような抗原を特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分の例はF (ab) およびF (ab') 2フラグメントを含み、これらは抗体をペプシンのような酵素で処理することにより生成させることができる。本発明は、ＰＧＣ-１に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」もしくは「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＰＧＣ-１の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位を１種のみ有する抗体分子の集団を指す。従って、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定のＰＧＣ-１蛋白質に対する単一の結合親和性を典型的に示す。
【０１０４】
ポリクローナル抗ＰＧＣ-１抗体は、ＰＧＣ-１免疫原を用いて好適な被験者を免疫することにより上述のように調製することができる。免疫された被験者での抗ＰＧＣ-１抗体力価は、固定化されたＰＧＣ-１を使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるもののような標準的技術により経時的にモニターすることができる。望ましい場合は、ＰＧＣ-１を標的とする抗体分子を哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、そしてＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製することができる。免疫感作後の適切な時間、例えば、抗ＰＧＣ-１抗体力価が最高である場合に、抗体産生細胞を被験者から得ることができ、そして、KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256: 495-497に元となる手法が記述されたハイブリドーマ技術（Brown ら(1981) J : Immunol. 127: 539-46; Brown ら(1980) J.Biol. Chem. 255:4980-83 ; Yeh ら (1976) Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 76:2927-31 ; およびYehら (1982) Int. J Cancer 29: 269-75もまた参照されたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、(1983) Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Coleら(1985)、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、pp. 77-96）もしくはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を製造するのに使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は公知である（全般として、Kenneth、R. H. in Monoclonal Antibodies : A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp.、New York、New York(1980) ; Lemer, E. A.(1981) Yale J. Biol. Med. 54: 387-402; Gefter, M. L.ら(1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36を参照されたい）。簡潔には、上述されたようなＰＧＣ-１免疫原で免疫された哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に不死細胞株（典型的には骨髄腫）を融合し、そして生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングしてＰＧＣ-１を結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１０５】
抗ＰＧＣ-１モノクローナル抗体を生じさせる目的で、リンパ球および不死化細胞株を融合するために使用される多くの公知のプロトコルのいずれかを適用することができる（例えば、Galfre, G. ら(1977) Nature 266: 55052; Gefterら (1997) 前掲；Lerner (1981)前掲； Kenneth (1980)前掲を参照されたい）。さらに、当業者は、また有用であるとみられるこうした方法の多くの変形物が存在することを認識するであろう。典型的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一の哺乳動物種由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞株と融合することにより作製することができる。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のいずれか、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、もしくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統を標準的技術に従って融合パートナーとして使用することができる。これらの骨髄腫系統は、ＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合する。その後、融合されない骨髄腫細胞および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を使用して融合から生じるハイブリドーマ細胞を選択する（融合されない脾細胞は、それらが形質転換されていないため、数日後に死ぬ）。例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＰＧＣ-１を結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を検出する。
【０１０６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をＰＧＣ-１でスクリーニングして、それによりＰＧＣ-１と結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより、モノクローナル抗ＰＧＣ-１抗体を同定かつ単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生じさせかつスクリーニングするためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01；およびStratagene Surf APTM Phage Display Kit、カタログ番号240612）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングでの使用にとりわけ敏感に反応する方法および試薬の例は、例えば、Ladnerら 米国特許第5,223, 409号；Kangら、ＰＣＴ国際公開第WO 92/18619号；Dowerら、ＰＣＴ国際公開第WO91/17271号；Winterら、ＰＣＴ国際公開第WO 92/20791号；Marklandら、ＰＣＴ国際公開第WO 92/20791号；Breitlingら、ＰＣＴ国際公開第WO 93/01288号；McCaffertyら、ＰＣＴ国際公開第WO 92/01047号；Garrardら、ＰＣＴ国際公開第WO 92 / 09690号；Ladnerら、ＰＣＴ国際公開第WO 90/02809号：Fuchs、(1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372 ；Hayら、(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huseら、(1989) Science 246:1275-1281；Griffiths ら、(1993) EMBO A 12 : 725-734；Hawkinsら (1992) J : Mol.Biol. 226: 889-896；Clackson ら (1991) Nature 352:624-628；Gramら(1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 3576-3580；Garrardら、(1991) Biotechnology(NI) 9: 1373-1377；Hoogenboom ら、(1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137；Barbasら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 : 7978-7982；およびMcCaffertyら(1990) Nature 348: 552-554に見出すことができる。
【０１０７】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができるヒトおよび非ヒト双方の部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗ＰＧＣ-１抗体は、本発明の範囲内にある。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、Robinson ら、国際特許出願第 ＰＣＴ/ＵＳ86/02269；Akira ら、欧州特許出願第184,187号；Taniguchi, M.、欧州特許出願第171,496号；Morrisonら、欧州特許出願第173,494号；Neubergerら、ＰＣＴ国際公開第WO86/01533号；Cabilly ら、米国特許第4,816,567号； Cabillyら、欧州特許出願第125,023号； Betterら(1988) Science 240: 1041-1043；Liuら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liuら (1987) J Immunol. 139: 3521-3526；Sunら(1987) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218；Nishimura ら(1987) Cancer Res. 47: 999-1005；Wood ら(1985) Nature 314 : 446-449；および Shaw ら(1988) J Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559)；Morrison、S. L. (1985) Science 229: 1202-1207；Oiら (1986) Biotechniques 4: 214；Winter、米国特許第5,225, 539号；Jones ら(1986) Nature 321: 552-525；Verhoeyen ら (1988) Science 239 : 1534;およびBeidlerら (1988) R Immunol. 141: 4053-4060に記述される方法を使用して作製することができる。
【０１０８】
アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりＰＧＣ-１を単離するために、抗ＰＧＣ-１抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用することができる。抗ＰＧＣ-１抗体は、細胞からの天然のＰＧＣ-１、および宿主細胞において発現された、組換え的に作製されたＰＧＣ-１の精製を容易化することができる。さらに、抗ＰＧＣ-１抗体は、ＰＧＣ-１蛋白質の十分さおよび発現のパターンを評価するために（例えば、細胞ライセートもしくは細胞上清中の）ＰＧＣ-１蛋白質を検出するのに使用することができる。抗ＰＧＣ-１抗体は、例えば、所与の治療計画の効力を決定するためなどの臨床検査処置の一部として組織中の蛋白質濃度をモニターするために診断的に使用することができる。検出可能な物質に抗体を結合する（すなわち物理的に連結する）ことにより検出を容易に行うことができる。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を包含する。好適な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；好適な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；好適な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例は、ルミノールを包含し；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして好適な放射活性物質の例は125Ｉ、131Ｉ、35Ｓもしくは3Ｈを包含する。
【０１０９】
III．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は、ベクター、例えば、ＰＧＣ-１核酸分子を含有する発現ベクター、または、ＰＧＣ-１蛋白質（もしくはその一部分）をコードする核酸分子を含有するベクターに関する。本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ある型のベクターは「プラスミド」であり、これは、それに付加的なＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ここでは付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律増殖が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結される遺伝子の発現を指図することが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を互換的に使用することができる。なぜならプラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるからである。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製不能レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのその他の形態のベクターを包含することを意図している。
【０１１０】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞での該核酸の発現に適する形態で含んでおり、これは、該組換え発現ベクターが、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１個もしくはそれ以上の、発現されるべき核酸配列に作用可能に連結されている、制御配列を包含することを意味する。組換え発現ベクター内での「作用可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系で、もしくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）該ヌクレオチド配列の発現を可能とするように制御配列（１個もしくは複数）に連結されることを意味することを意図している。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル酸化シグナル）を包含することを意図している。そのような制御配列は、例えば、Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185: 3-7に記述がある。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば、組織特異的制御配列）を包含する。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望される蛋白質の発現のレベルなどのような要因に依存する可能性があることが、当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入されることができ、それにより本明細書に記述されるような核酸によりコードされる融合蛋白質もしくはペプチドを包含する蛋白質もしくはペプチド（例えば、ＰＧＣ-１蛋白質、突然変異体の形態のＰＧＣ-１、融合蛋白質など）を産生することができる。
【０１１１】
したがって、典型的な実施形態は、組換え発現ベクターを含有する本発明の宿主細胞（例えば、非ヒト哺乳動物のような哺乳動物宿主細胞）を好適な培地中で培養し、それによって蛋白質を産生させることによって、蛋白質、好ましくはＰＧＣ-１蛋白質を作製する方法を提供する。
【０１１２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞中でのＰＧＣ-１蛋白質の発現のために設計することができる。例えば、ＰＧＣ-１蛋白質は、大腸菌（E. coli）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Goeddel (1990)前掲書でさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写かつ翻訳することができる。
【０１１３】
原核生物での蛋白質の発現は、融合蛋白質もしくは非融合蛋白質のいずれかの発現を指図する構成プロモーターもしくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（E.coli）で最もしばしば実施される。融合ベクターは、その中でコードされる蛋白質に、通常は組換え蛋白質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に、１）組換え蛋白質の発現を増大させること；２）組換え蛋白質の可溶性を増大させること；および、３）親和性精製のリガンドとして作用することにより組換え蛋白質の精製において補助すること、の３つの目的を担う。しばしば、融合発現ベクターでは、蛋白質分解性の切断部位が融合部分と組換え蛋白質との接合部で導入されて、融合蛋白質の精製後の融合部分からの組換え蛋白質の分離を可能にする。このような酵素およびそれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換え蛋白質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質もしくはプロテインＡをそれぞれ融合する、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. およびJohnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）を包含する。
【０１１４】
精製された融合蛋白質は、ＰＧＣ-１活性アッセイ(例えば、以下において詳細に示す、直接的アッセイもしくは比較アッセイ)において、または、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質に特異的な抗体を作製するために用いることができる。好ましい態様において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現されたＰＧＣ-１融合蛋白質を用いて骨髄細胞を感染させることができる。そしてそれを続いて照射を受けたレシピエントに移植する。その後、十分な時間（例えば、６週間）経過後、この被験レシピエントの病状を試験する。
【０１１５】
好適な誘導可能な非融合大腸菌（E.coli）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ (Amann ら (1988) Gene 69: 301-315)およびｐＥＴ１ ｌｄ(Studierら (1990) Methods Enzymol. 185: 60-89)を包含する。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ｔｒｐ−ｌａｃ融合ハイブリッドプロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現されるウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）により媒介されるＴ７ ｇｎ１０-ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスのポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１遺伝子をもつ定住プロファージからの宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１１６】
大腸菌（E.coli）での組換え蛋白質の発現を最大にするための１つの方法は、該組換え蛋白質を蛋白質分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌中で該蛋白質を発現することである(Gottesman、S. (1990) Methods Enzymol. 185: 119-128)。別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（E.coli）中で優先的に利用されるものとなるように発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである（Wadaら (1992)、Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118）。本発明の核酸配列のそのような変化は、標準的ＤＮＡ合成技術により実施することができる。
【０１１７】
別の態様において、ＰＧＣ-１発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母S. cerevisiaeでの発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃｌ(Baldariら(1987) EMBOJ. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan およびHerskowitz (1982) Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultzら(1987) Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corp.、San Diego、CA）、およびｐｉｃＺ（Invitrogen Corp.、San Diego、CA）を包含する。
【０１１８】
あるいは、ＰＧＣ-１蛋白質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現することができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中での蛋白質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Smithら(1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165）およびｐＶＬ系列（LucklowおよびSummers (1989) Virology 170: 31-39）を包含する。
【０１１９】
なお別の態様において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Seed, B. (1987) Nature 329: 840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら(1987) EMBOR 6: 187-195）を包含する。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能がしばしばウイルスの制御要素により提供される。例えば、普遍的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞双方のための他の好適な発現系については、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989の第１６および１７章を参照されたい。
【０１２０】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に該核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節要素が該核酸を発現するのに使用される）。組織特異的制御要素は、当該技術分野で既知である。限定されるわけではないが、好適な組織特異的プロモーターの例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkert ら(1987) Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的プロモーター（CalameとEaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275）、とりわけＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto とBaltimore (1989) EMBO J 8 : 729-733）、および免疫グロブリンのプロモーター（Banerjiら (1983) Cell 33: 729-740; QueenとBaltimore (1983) Cell 33 : 741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneとRuddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlund ら (1985) Science 230:912-916）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願第264,166号）を包含する。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselとGruss (1990) Science 249: 374-379）およびα-フェトプロテインプロモーター（Campes とTilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546）もまた包含される。
【０１２１】
本発明はさらに、アンチセンスの向きで発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んで成る組換え発現ベクターを提供する。すなわち、該ＤＮＡ分子が、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に作用可能に連結される。多様な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に作用可能に連結された制御配列、例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを選ぶことができるか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的な発現を指図する制御配列を選ぶことができる。該アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒性ウイルスの形態であることができ、そこではアンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下に産生され、その活性は該ベクターが導入される細胞型により決定される可能性がある。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Weintraub, H.ら、「遺伝子分析のための分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ」（"Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis"）、Reviews-Trends in Genetics, Vol.1 (1) 1986を参照されたい。
【０１２２】
本発明の別の局面は本発明のＰＧＣ-１核酸分子が導入されている宿主細胞に関し、ＰＧＣ-１核酸分子は例えば、ベクター内のＰＧＣ-１核酸分子(例えば、組換え発現ベクター)または宿主細胞ゲノムの特異的部位に相同的に組換え配列を含有するＰＧＣ-１核酸分子である。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語を本明細書で互換的に使用する。こうした用語は特定の被験者細胞のみならずしかしこうした細胞の子孫もしくは潜在的な子孫を指すことが理解される。突然変異もしくは環境の影響のいずれかによりある種の改変が次の世代で起こるかも知れないため、こうした子孫は実際のところ親細胞に同一でないかも知れないが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。
【０１２３】
宿主細胞は、いずれかの原核生物細胞もしくは真核生物細胞であることができる。例えば、ＰＧＣ-１蛋白質は、大腸菌（E.coli）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、もしくはＣ２Ｃ１２のような）哺乳動物細胞中で発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、当該技術分野の当業者に既知である。
【０１２４】
ベクターＤＮＡは、慣習的な形質転換もしくはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞もしくは真核生物細胞中に導入することができる。本明細書で使用されるところの「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを包含する、宿主細胞中に外来核酸 （例えば、ＤＮＡ）を導入するための、技術分野で認識されている技術を指すことを意図している。宿主細胞の好適な形質転換もしくはトランスフェクション方法は、Sambrookら (Molecular Cloning :A Laboratory Manual. 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、NY、1989）および他の実験室手順書に見出すことができる。
【０１２５】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小部分のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込むことができることが既知である。これらの組込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を与えるものを包含する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＰＧＣ-１をコードするものと同一のベクター上で宿主細胞中に導入することができるか、もしくは別個のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を薬物選択により同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存することができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【０１２６】
培養物中の原核生物もしくは真核生物の宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用して、ＰＧＣ-１蛋白質を産生（すなわち発現）させることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用するＰＧＣ-１蛋白質の製造方法を提供する。１つの態様において、該方法は、ＰＧＣ-１が産生されるまで発明の宿主細胞（ＰＧＣ-１をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を好適な培地中で培養することを含む。別の態様において、該方法は、培地もしくは宿主細胞からＰＧＣ-１を単離することをさらに含む。
【０１２７】
本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用することもできる。例えば、一つの態様において、本発明の宿主細胞は、ＰＧＣ-１コーディング配列が導入されている受精卵もしくは胚幹細胞である。その後、こうした宿主細胞を使用して、外在性のＰＧＣ-１配列がそれらのゲノム中に導入されている非ヒトのトランスジェニック動物、もしくは内在性のＰＧＣ-１配列が変えられている相同的組換え動物を作製することができる。こうした動物は、ＰＧＣ-１の機能および／もしくは活性を研究するため、ならびにＰＧＣ-１の活性のモジュレーターを同定および／もしくは評価するために有用である。本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞の１個もしくはそれ以上がトランスジーンを包含する非ヒトの動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットもしくはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒトの霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などを包含する。トランスジーンは、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれそして成熟動物のゲノム中に留まりそれにより該トランスジェニック動物の１種もしくはそれ以上の細胞型もしくは組織中でのコードされる遺伝子産物の発現を指図する、外在性ＤＮＡである。本明細書で使用されるところの「相同的組換え動物」は、内在性遺伝子と動物のある細胞（例えば、動物の発生前の該動物の胚細胞）に導入された外在性ＤＮＡ分子との間の相同的組換えにより内在性のＰＧＣ-１遺伝子が変えられている非ヒトの動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０１２８】
本発明のトランスジェニック動物は、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により受精卵の雄性前核中にＰＧＣ-１をコードする核酸を導入すること、および該受精卵を偽妊娠の雌性里親動物(pseudopregnant
female foster animal)中で発生させることにより作製することができる。配列番号６、８、１２、または１４のＰＧＣ-１のｃＤＮＡ配列をトランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ラットもしくはマウスＰＧＣ-１遺伝子のような、ヒトＰＧＣ-１遺伝子の非ヒト相同物をトランスジーンとして使用することができる。あるいは、別のＰＧＣ-１ファミリーメンバーのようなＰＧＣ-１遺伝子相同物を、配列番号６、８、９、１１、１２、１４、１５、または１７のＰＧＣ-１のｃＤＮＡ配列、またはプラスミドのＤＮＡ挿入物(上記Iにさらに記載)のＰＧＣ-１のｃＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに基づいて、単離し、トランスジーンとして使用することができる。ＰＧＣ-１蛋白質の発現を特定の細胞に向けるために、組織特異的な制御配列（１種もしくは複数）をＰＧＣ-１トランスジーンに作用可能に連結することができる。胚の操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の発生方法は、当該技術分野で慣習的になっており、そして、例えば、双方ともLederらによる米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、Wagnerらによる米国特許第4,873, 191号、ならびにHogan,B.）、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)に記述されている。他のトランスジェニック動物の産生に類似の方法が使用される。トランスジェニックの初代動物は、そのゲノム中のＰＧＣ-１トランスジーンの存在、および／または該動物の組織もしくは細胞中でのＰＧＣ-１のｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。次に、トランスジェニック初代動物を使用して、トランスジーンをもつ付加的な動物を繁殖させることができる。さらに、ＰＧＣ-１蛋白質をコードするトランスジーンをもつトランスジェニック動物は、他のトランスジーンをもつ他のトランスジェニック動物にさらに繁殖させることができる。
【０１２９】
相同的組換え動物を作製するために、欠失、付加もしくは置換を導入することによってＰＧＣ-１遺伝子を変える（例えば、機能的に破壊させる）ＰＧＣ−１遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。ＰＧＣ-１遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号６、８、１２、または１４のＰＧＣ-１のｃＤＮＡ）であることができるが、より好ましくは、ヒトＰＧＣ-１遺伝子（例えば、配列番号６、８、１２、または１４のヌクレオチド配列を用いた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって単離されたｃＤＮＡ）の非ヒト相同物である。例えば、マウスＰＧＣ-１遺伝子を使用して、相同的な組換え核酸分子、例えば、マウスゲノムの内在性ＰＧＣ-１遺伝子を変えるのに好適なベクターを構築することができる。好ましい一態様において、相同的な組換え核酸分子は、相同的組換えに際して内在性のＰＧＣ-１遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的蛋白質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称される）ようにベクターを設計する。あるいは、相同的組換えに際して内在性のＰＧＣ-１遺伝子が突然変異されるかもしくは別の方法で変えられるがしかしなお機能的蛋白質をコードする（例えば、上流の調節領域を変えてそれにより内在性のＰＧＣ-１蛋白質の発現を変えることができる）ように相同的な組換え核酸分子を設計することができる。該相同的組換え核酸分子において、ＰＧＣ-１遺伝子の変えられた部分は、該相同的組換え核酸分子により運ばれる外在性のＰＧＣ-１遺伝子と細胞、例えば、胚幹細胞中の内在性のＰＧＣ-１遺伝子との間に相同的組換えを起こさせるようにＰＧＣ-１遺伝子の付加的核酸によりその５’および３’端で隣接される。付加的な隣接するＰＧＣ-１核酸は、内在性の遺伝子との相同的組換えを成功させるのに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接するＤＮＡ（５’および３’端の双方で）が相同的組換え核酸分子中に包含される（例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas、K. R. およびCapecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503を参照されたい）。該相同的組換え核酸分子を胚幹細胞株中に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入し、そして、導入されたＰＧＣ-１遺伝子が内在性のＰＧＣ-１遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えば、Li、E.ら(1992) Cell 69 : 915を参照されたい）。その後、選択された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞中に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, Robertson, E. J. (編) (IRL、Oxford、1987) pp. 113-152を参照されたい）。キメラ胚をその後、好適な偽妊娠の雌性里親動物中に移植することが可能であり、そして胚を出産予定日まで維持し出産させることができる。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、該動物の全部の細胞がトランスジーンの生殖系列の伝播により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Bradley,A.（1991）Current Opin. Biotechfzol. 2: 823-829、ならびに、Le MouellecらによるＰＣＴ国際公開第WO 90/11354号；Smithiesらによる第WO 91/01140号；Zijlstraらによる第WO 92/0968号；およびBernsらによる第WO 93/04169号にさらに記述されている。
【０１３０】
別の態様においては、トランスジーンの制御された発現が可能な選択された系を含有する非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。このような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵素系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵素系の記述については、例えば、Laksoら(1992) PNAS 89:6232-6236を参照されたい。組換え酵素系の別の例は、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰ組換え酵素系である（O’Gormanら(1991)Science 251:1351-1355）。トランスジーンの発現を制御するのにｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵素系を使用する場合は、Ｃｒｅ組換え酵素および選択された蛋白質の双方をコードするトランスジーンを含有する動物が必要とされる。そのような動物は、例えば、選択された蛋白質をコードするトランスジーンを含有する一方および組換え酵素をコードするトランスジーンを含有する他方の２種のトランスジェニック動物を交尾させることによる「二重」トランスジェニック動物の構築により提供することができる。
【０１３１】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローニングは、Wilmut,I.ら(1997)Nature 385:810-813、ならびにＰＣＴ国際公開第WO 97/07688号および第WO 97/07669号に記述される方法に従って作製することもできる。簡潔に述べれば、トランスジェニック動物からの１個の細胞（例えば、１個の体細胞）を単離し、そして成長周期を出てかつＧ0期に進入するよう誘導することができる。次に、静止状態の細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止状態の細胞が単離される同一の種の動物からの除核卵母細胞に融合することができる。その後、それが桑実胚もしくは胚盤胞に発生するような再構築された卵母細胞を培養し、そしてその後偽妊娠の雌性里親動物に移す。本雌性里親動物から生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンとなることができる。
【０１３２】
ＩＶ．薬学的組成物
本発明のＰＧＣ-１核酸分子、ＰＧＣ-１蛋白質、そのフラグメント、抗ＰＧＣ-１抗体、およびＰＧＣ-１モジュレーター（本明細書中では「有効成分」とも称される）は、投与に好適な薬学的組成物中に組込むことができる。このような組成物は典型的に、核酸分子、蛋白質、または抗体、および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用されるところの「薬学的に許容できる担体」という語は、薬学的投与と適合するいずれかのおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことを意図している。薬学的有効成分のための、このような媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体もしくは作用物質が該有効化合物と不適合性である場合に限りそれを除き、本発明の組成物中でこうした媒体を使用することができる。補足の有効成分もまた該組成物中に組込むことができる。
【０１３３】
本発明の薬学的組成物はその意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例は、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与を包含する。非経口、皮内もしくは皮下適用に使用される溶液もしくは懸濁剤は、以下の成分、すなわち注射用水、生理的食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムもしくはブドウ糖のような張性の調節のための作用物質を包含することができる。塩酸もしくは水酸化ナトリウムのような酸もしくは塩基でｐＨを調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作成された複数用量のバイアル中に封入することができる。
【０１３４】
注入可能な使用に適する薬学的組成物は、滅菌の水性溶液（水溶性の場合）もしくは分散剤、および滅菌の注入可能な溶液もしくは分散剤の即座の調製のための滅菌粉末を包含する。静脈内投与のための好適な担体は、生理的食塩水、静菌水、Cremophor EL(登録商標) (BASF, Parsippany、NJ)もしくはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。すべてにおいて、組成物は滅菌でなくてはならず、そして容易に注射可能な程度に流動性を持つべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、また、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましいであろう。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物中に包含することにより達成することができる。
【０１３５】
滅菌の注入可能な溶液は、必要に応じて、上に挙げられた成分の１種またはその組み合わせを含む適切な溶媒中に、必要量の有効成分（例えば、ＰＧＣ-１蛋白質のフラグメントまたは抗ＰＧＣ-１抗体）を組み込み、次いで濾過滅菌を行うことにより、調製することができる。一般に、分散剤は、基本的分散媒および上に挙げられたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌賦形剤中に有効成分を組み込むことにより製造する。滅菌の注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合の好ましい調製方法は、それらは、その既に滅菌濾過された溶液から、いずれかの付加的な所望の成分を含む有効成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１３６】
経口組成物は、一般に不活性の希釈剤または可食担体を包含する。それらはゼラチンカプセル中に封入することができるか、または錠剤に圧縮することができる。経口の治療的投与の目的のために、有効成分を賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、含嗽剤としての使用のため液体担体を使用して調製することもでき、ここでは、液体担体中の有効成分は経口投与され、口内でグチュグチュ(swish)して吐き出すか、もしくは飲み込む。薬学的に適合する結合剤、および／または補助物質を組成物の一部として包含することができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、すなわち、微晶質セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）もしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローツ（Sterotes）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑走剤(glidant)；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ調味料のような矯味矯臭剤、または類似の性質の化合物のいずれかを含有することができる。
【０１３７】
吸入による投与のためには、化合物は、好適な噴射剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアゾルスプレーの形態で送達する。
【０１３８】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与のためには、製剤において浸透させるべき障壁に適切な浸透剤を使用する。こうした浸透剤は当該技術分野で公知であり、そして、経粘膜投与用には、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与のためには、有効成分を、当該技術分野で公知のような軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲルもしくはクリームにて処方する。
【０１３９】
化合物は、直腸送達のために、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）、または保持浣腸の形態で調製することもできる。
【０１４０】
一つの態様において、有効化合物は、埋込物および微小カプセル化送達系を包含する放出制御製剤のような、身体からの急速な排泄に対して化合物を保護する担体を含んで調製する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生物分解性の生物適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の製造方法は、当該技術分野の当業者に明白であろう。これらの素材はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から購入することもできる。薬学的に許容できる担体として、リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを含む）もまた使用することができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記述されるような、当業者に既知の方法に従って製造することができる。
【０１４１】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、経口もしくは非経口の組成物を投薬単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用されるところの投薬単位形態は、治療されるべき被験者のための単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された、所定量の有効成分を含有する。本発明の投薬単位形態の仕様は、有効化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこうした有効成分の調合の技術に固有の限界による要件があり、かつそれらに直接依存する。
【０１４２】
このような化合物の毒性および治療的効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（個体群の５０％における治療的有効用量）を決定するための細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療的効果との間の用量比率は、治療的インデックスであり、LD50/ED50で表すことができる。大きな治療的インデックスを示す化合物が好ましい。毒性効果を示す化合物を用いることもできるが、感染細胞に対する潜在的損傷を最小限にし、副作用を少なくするために、そのような化合物を罹患組織の部位を標的とする送達系の設計には注意が必要である。
【０１４３】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトでの使用用量の範囲を処方する際に使用することができる。そのような化合物の用量は、毒性が少ししかないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、適用される用量形態および使用される投与経路に依存した範囲内で変えることができる。本発明の方法において使用することができるあらゆる化合物について、治療的に有効な用量は、まず最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて公式化され、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状を阻害する最大半減を達成する試験化合物の濃度）を決定してもよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することもできる。
【０１４４】
本明細書に定義されているように、治療的に有効な量の蛋白質またポリペプチド(すなわち、有効用量)は、体重１kgあたり約0.001〜30 mg、好ましくは体重１kgあたり約0.01〜25 mg、より好ましくは体重１kgあたり約0.1〜20 mg、およびさらにより好ましくは体重１ｋｇあたり約1〜10 mg、約2〜9 mg、約3〜8 mg、約4〜7 mg、もしくは約5〜6 mgである。特定の要因が被験者を有効に治療するために必要とされる用量に影響を及ぼしうることを当業者は予期するであろう。それらの要因は、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、被験者の一般的な健康状態および／または年齢、ならびにその他の疾患の存在を包含する。さらに、治療的に有効な用量の蛋白質、ポリペプチド、または抗体を用いた被験者の治療は、単回治療とすることもできるし、または好ましくは連続的な治療とすることができる。
【０１４５】
好ましい例では、抗体、蛋白質、またはポリペプチドを体重１ｋｇあたり約0.1〜20 mgの範囲で用いて、1週間に一度、1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは3〜7週間、そしてさらに好ましくは4、5、もしくは6週間、被験者に対して治療を行う。治療に使用される抗体、蛋白質、またはポリペプチドの有効な用量は、特定の治療コースの間に増減してもよいことを当業者は予期するであろう。用量の変更は、本明細書に記載の診断的アッセイから明らかになるであろう。
【０１４６】
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を含む。薬剤は、例えば、小さな分子であることができる。例えば、そのような小さな分子は、限定されないが、ペプチド、ペプチド類似物、アミノ酸、アミノ酸類似物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似物、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、分子量約10,000 g/mol未満の有機化合物もしくは無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、分子量約5,000 g/mol未満の有機化合物もしくは無機化合物、分子量約1,000 g/mol未満の有機化合物もしくは無機化合物、分子量約500 g/mol未満の有機化合物もしくは無機化合物、および塩、エステルならびにその他の薬学的に許容できる形態のそのような化合物を含む。小分子物質の適切な用量は、通常の技量を有する医師、獣医師または研究者の知識の範囲のいくつかの要因に依存することが理解される。小分子の用量は、例えば、治療される被験者もしくはサンプルの個性（identity）、大きさおよび条件にしたがって、さらに適用可能であれば、該組成物が投与される経路、そして医師がその小分子が本発明の核酸もしくはポリペプチドに対して及ぼし得ることを望む効果に基づいて変更することができる。
【０１４７】
用量の例は、小分子の量が被験者もしくはサンプルの重さ１ｋｇあたりミリグラムもしくはマイクログラム量である場合を含む（例えば、約1マイクログラム/kg〜約500ミリグラム/kg、約100マイクログラム/kg〜約5ミリグラム/kg、もしくは約1マイクログラム/kg〜約50マイクログラム/kg）。さらに、小分子の適切な用量は、該小分子の、調節されるべき発現もしくは活性に関する力価に依存することが理解される。そのような適切な用量は、本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。本発明のポリペプチドもしくは核酸の発現もしくは活性を調節するために、これらの小分子の1つもしくはそれ以上を動物（例えば、ヒト）に適用するとき、医師、獣医師または研究者は、例えば、最初は比較的低用量、続いて適切な反応が得られるまで用量を増加させていくであろう。さらに、いくつかの特別な動物被験者の特異的な用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食生活、投与時間、投与経路、排泄率、あらゆる薬剤の組み合わせ、および調節されるべき発現もしくは活性の度合いといった種々の要因に依存することが理解されるであろう。
【０１４８】
本発明の特定の実施形態において、ＰＧＣ-１活性のモジュレーターが、他の物質（例えば、小分子）と組み合わせて、または別の相補的な治療方針と組み合わせて投与される。例えば、１つの態様において、ＰＧＣ-１活性のモジュレーターは、ＰＧＣ-１に関連する障害を治療するために使用される。したがって、ＰＧＣ-１活性の調節は、例えば、その障害を治療するために用いられる他の薬剤と組み合わせて用いることができる。
【０１４９】
さらに、抗体（もしくはそのフラグメント）を、細胞毒のような治療的部分、治療的物質、または放射線金属イオンと接合してもよい。細胞毒または細胞毒性物質は、細胞に有害なあらゆる物質を包含する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシン、D,1−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似物もしくは相同体があげられる。治療薬には、限定されないが、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５-フルオロウラシルダカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、およびシス‐ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビジン(以前はダウノマイシン)、およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、プレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（anthramycin）（AMC）)、及び有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が含まれる。
【０１５０】
本発明の接合体は、所与の生物学的反応を変更するために用いることができ、薬物部分は、古典的化学治療薬に限定されて構築することはない。例えば、その薬物部分は、所望の生物学的活性を持つ蛋白質でもポリペプチドでもよい。そのような蛋白質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、α‐インターフェロン、β‐インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーターのような蛋白質；または、例えば、リンホカイン 、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)、または他の成長因子のような生物学的反応性変更因子を包含する。
【０１５１】
そのような治療的部分を抗体に接合する技術は公知である。例えば、Arnonらのモノクローナル抗体と癌治療：「癌治療における薬物を免疫標的化するためのモノクローナル抗体」（"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）、Reisfeldら(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985) ; Hellstromらの放出制御薬剤送達：「薬物輸送のための抗体」（"Antibodies For Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery)(第２刷)、Robinsonら (編)、pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe 、モノクローナル抗体'８４：「癌治療における細胞毒性作用物質の抗体担体:再考」（"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies'84 : Biological And Clinical Applications）、Pinchera ら(編)、pp. 475-506 (1985);癌検出と治療のためのモノクローナル抗体「癌治療における放射標識を用いた治療の分析、結果および将来の展望」（"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy "in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy）、Baldwin ら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985); およびThorpeら「抗体−毒素接合体の調製および細胞毒性」（"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"）Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982)。あるいは、抗体は、米国特許第4,676, 980号（Segal）に記載のように、第2の抗体に接合され、抗体へテロ接合体を形成することができる。
【０１５２】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（米国特許第5,328,470号を参照されたい）、または走触性注射によって（例えば、Chenら(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照されたい)、被験者に送達される。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、遺伝子治療ベクターを許容可能な希釈剤中に含むことができる、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無処置で作製する場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を作製するための１つまたはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０１５３】
薬学的組成物は、容器、パックまたはディスペンサー中に、投与のための指示書とともに含まれ得る。
【０１５４】
Ｖ．本発明の使用および方法
本明細書に記載の核酸分子、蛋白質、蛋白質相同体、蛋白質フラグメント、抗体、ペプチド、ペプチド類似物、および小分子は、以下の方法、すなわち、ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）予測的医療(例えば、診断アッセイ、予防アッセイモニタリング臨床試験、および薬理遺伝学)；およびｃ）治療の方法(例えば、治療的および予防的)のうちの１種もしくはそれ以上において使用することができる。本明細書で記載されているように、本発明のＰＧＣ-１蛋白質は、以下の活性、すなわち、(i)ＰＧＣ-１標的分子との相互作用；(ii)細胞内シグナリングの調節；(iii)細胞代謝の調節；(iv)ペルオキシソームへの局在化；(v)脂肪酸の取り込みおよび／もしくは酸化に関与する遺伝子の発現の調節(例えば、LPL、FAT/CD36、VLACS、AOX、MCAD、および／もしくはMCD)；(vi)脂肪酸の取り込みおよび／もしくは酸化の調節;(vii)エネルギーホメオスタシスの調節；ならびに／または、(viii)脂質ホメオスタシスの調節のうちの１つもしくはそれ以上を有する。
【０１５５】
本発明の単離された核酸は、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質（例えば、遺伝子治療における適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）発現させるため、ＰＧＣ-１ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的サンプルにおいて)またはＰＧＣ-１遺伝子中の遺伝子改変を検出するため、ならびにＰＧＣ-１活性を調節するために用いることができる。以下により詳細に記載する。ＰＧＣ-１蛋白質は、不十分もしくは過度のＰＧＣ-１標的分子の輸送もしくはＰＧＣ-１インヒビターを特徴とする障害、例えば、ＰＧＣ-１関連障害の治療に使用することができる。
【０１５６】
本明細書で用いられているところの、「ＰＧＣ-１関連障害」は、ＰＧＣ-１活性の誤制御（例えば、下方制御もしくは上方制御）により引き起こされるか、または特徴付けられる障害、疾患もしくは状態を含む。ＰＧＣ-１関連障害は、脂肪酸取り込みおよび／または酸化の誤制御（例えば、下方制御もしくは上方制御）に関連付けられる障害、疾患もしくは状態を含み、例えば、トリグリセリド貯蔵性の疾患（triglyceride storage disease）、脂肪性肝炎、肝腫瘍、脂肪肝、肝臓病、筋障害、高脂血症、低脂血症、異脂肪血症、高コレステロール血症、低コレステロール血症、高血圧、卒中、高トリグリセリド血症、低トリグリセリド血症、低リポ蛋白質血症、ニーマン・ピック病、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、冠動脈疾患、肥満、過体重、節食障害、悪疫質、糖尿病、インスリン耐性（insulin resistance）、高血圧、卒中、膵炎、拡散性特発性骨格骨過形成(ＤＩＳＨ)、アテローム産生リポ蛋白質表現型（atherogenic lipoprotein phenotype）（ＡＬＰ）、てんかん、多嚢胞性卵巣症候群、ならびに上記のものに対して2次的に起こるあらゆる障害、疾患、もしくは状態が含まれる。
【０１５７】
ＰＧＣ-１が関与もしくは関連する障害はまた、ＰＧＣ-１蛋白質が発現される組織(例えば、心臓もしくは筋肉)を罹患させる障害を含む。
【０１５８】
加えて、ＰＧＣ-１蛋白質を使用して、天然に存在するＰＧＣ-１標的分子をスクリーニングし、ＰＧＣ-１活性を調節する薬物もしくは化合物をスクリーニングし、ならびにＰＧＣ-１蛋白質の不十分もしくは過度の産生、もしくはＰＧＣ-１野生型蛋白質(例えば、ＰＧＣ-１関連障害)に比較して低下された、異常な、もしくは望ましくない活性を有するＰＧＣ-１蛋白質の形態の産生を特徴とする障害を治療することができる。
【０１５９】
さらに、本発明の抗ＰＧＣ-１抗体を使用して、ＰＧＣ-１蛋白質を検出かつ単離し、そしてＰＧＣ-１蛋白質活性を調節することができる。
【０１６０】
Ａ. スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、すなわち、ＰＧＣ-１蛋白質に結合し、例えば、ＰＧＣ-１発現もしくはＰＧＣ-１活性に対する刺激性もしくは阻害性効果をもち、またはＰＧＣ-１標的分子に対する刺激性もしくは阻害性効果をもつ、候補化合物もしくは試験化合物もしくは作用物質(例えば、ペプチド、ペプチド類似物、小分子またはその他の薬物)を同定するための方法（「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。
【０１６１】
1つの態様において、本発明は、ＰＧＣ-１蛋白質もしくはポリペプチドもしくはその生物学的に活性のある部分の標的分子である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の態様において、本発明は、ＰＧＣ-１蛋白質もしくはポリペプチドもしくはその生物学的に活性のある部分に結合する、またはそれを調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー法；空間的に処理可能な平行固層ライブラリー法もしくは溶液相ライブラリー法；逆重畳積分が必要な合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法の多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、一方、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 45）。
【０１６２】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、従来技術、例えば、DeWittら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6909 ; Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermannら (1994) J. Med.Chem. 37:2678 ; Choら(1993) Science 261: 1303; Carrellら (1994) Angew. Chem.liit. Ed. Engl. 33: 2059; Carellら (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; およびGallopら (1994) J. Med. Chena. 37 :1233に見出すことができる。
【０１６３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上（Lam (1991) Nature 354 : 82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-556）、バクテリア（Ladner、米国特許第5,223,409号)、胞子（Ladner米国特許第'409号）、プラスミド（Cullら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869）またはファージ上（ScottとSmith (1990) Science 249:386-390）；（Devlin (1990) Science 249: 404406）； （Cwirlaら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6378-6382）； （Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310）；（Ladner前掲）に存在することができる。.
【０１６４】
１つの態様において、アッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を試験化合物に接触させ、試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質を調節する能力を測定する細胞ベースのアッセイである。試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質を調節する能力の測定は、脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現（例えば、LPL、FAT/CD36、VLACS、AOX、MCAD、および／またはMCD）を、ＰＧＣ-１を発現する細胞中でモニターすることによって達成することができる。例えば、細胞は、哺乳動物起源、例えば、1次筋細胞（primary muscle cell）またはＣ２Ｃ１２筋芽細胞もしくは筋管、または心筋細胞のような心臓細胞とすることができる。
【０１６５】
標的分子に結合するＰＧＣ-１を調節する、またはＰＧＣ-１に結合する、試験化合物の能力も測定することができる。試験化合物の標的分子に結合するＰＧＣ-１蛋白質を調節する能力は、ＰＧＣ-１標的分子のＰＧＣ-１への結合が複合体中の標識されたＰＧＣ-１標的分子を検出することによって測定することができるように、例えば、ＰＧＣ-１標的分子を放射性同位元素もしくは酵素標識と結合させることによって達成することができる。あるいは、ＰＧＣ-１を放射性同位元素もしくは酵素標識と結合して、試験化合物が複合体中のＰＧＣ‐１標的分子に結合するＰＧＣ-１を調節する能力をモニターすることもできる。試験化合物がＰＧＣ-１蛋白質と結合する能力の測定は、例えば、複合体中の標識されたＰＧＣ-１化合物を検出することによって該化合物のＰＧＣ-１への結合を測定することができるように、該化合物に放射性同位元素もしくは酵素標識を結合させて、行うことができる。例えば、化合物（例えば、ＰＧＣ-１標的分子）は、125I、35S、14C、または3Hのいずれかによって、直接的もしくは間接的に標識することができ、該放射性同位元素は、放射線発光（radioemission）を直接的に計数することによって、またはシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはルシフェラーゼおよび他の適切な基質を生成物に変換する測定法によって検出された酵素標識によって、酵素的に標識することもできる。
【０１６６】
化合物(例えば、ＰＧＣ-１標的分子)が、反応体を標識することなくＰＧＣ-１と相互作用する能力を決定することもまた本発明の範囲である。化合物もしくはＰＧＣ-１のいずれかを標識することなく、化合物とＰＧＣ-１との相互作用を検出するためにマイクロフィジオメーター（microphysiometer）を使用することができる（McConnell, H. M.ら(1992) Science 257:1906-1912）。本明細書で使用されている「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサ（Cytosensor））は、細胞が光処理可能電位測定センサ（light-addressable potentiometric sensor (LAPS)）を用いて環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化の速度の変化は、化合物とＰＧＣ-１の間の相互作用の指標として用いることができる。
【０１６７】
別の態様において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、それは、ＰＧＣ-１標的分子を発現させる細胞(例えば、ＰＧＣ-１ポリペプチドまたは非ＰＧＣ-１カリウムチャンネルサブユニット)を試験化合物に接触させること、および試験化合物がＰＧＣ-１標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するまたは阻害する）能力を測定することを含む。試験化合物のＰＧＣ-１標的分子の活性を調節する能力の測定は、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質がＰＧＣ-１標的分子と結合する、もしくは相互作用する能力を測定することによって、またはＰＧＣ‐１蛋白質が脂肪酸の取り込みおよび／または酸化に関与する遺伝子の発現を調節(例えば、ＬＰＬ、ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＶＬＡＣＳ、ＡＯＸ、ＭＣＡＤ，および／またはＭＣＤ)する能力を測定することによって達成することができる。
【０１６８】
ＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるそれらのフラグメントがＰＧＣ-１標的分子と結合する、もしくは相互作用する能力の決定は、直接的な結合を行うための上記方法のうちの1つを用いて達成することができる。好ましい態様において、ＰＧＣ-１蛋白質がＰＧＣ-１蛋白質をＰＧＣ-１標的分子と結合する、もしくは相互作用する能力の決定は、標的分子の活性を決定することによって達成することができる。例えば、標的分子の活性は、細胞の反応の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的分子の触媒的／酵素的活性を検出すること、レポーター遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作用可能に連結した標的反応性調節エレメントを含む)の誘導を検出すること、または、標的調節細胞反応（すなわち、脂肪酸取り込みおよび／または酸化）を検出することによって決定することができる。
【０１６９】
さらに別の態様において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ここではＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその一部を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物がＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその一部と結合する能力が決定される。本発明の使用されるＰＧＣ-１蛋白質の好ましい生物学的に活性のある部分は、非ＰＧＣ-１分子(例えば、高い表面確率スコア（surface probability score）をもつフラグメント)との相互作用に関係するフラグメントを含む。さらに好ましいＰＧＣ-１蛋白質は、ＰＧＣ-１ｂもしくはＰＧＣ-１ｃ、例えば、配列番号１０もしくは配列番号１６、またはそのフラグメントに特有のアミノ酸配列を含む。試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質への結合は、上記のようにして直接的もしくは間接的に決定することができる。好ましい態様において、アッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその一部を、ＰＧＣ-１に結合してアッセイ混合物を形成する公知の化合物と接触させること、該アッセイ混合物と試験化合物を接触させること、および試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質と相互作用する能力を決定することを含み、試験化合物がＰＧＣ-１蛋白質と相互作用する能力の決定は、試験化合物が、公知の化合物と比較して、優先的にＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその部分と結合する能力を決定することを含む。
【０１７０】
別の態様において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ここではＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその一部を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物がＰＧＣ-１標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するまたは阻害する）能力が決定される。試験化合物がＰＧＣ-１蛋白質の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＰＧＣ-１蛋白質がＰＧＣ-１標的分子と、上述した直接的な結合を決定する方法の1つを用いて決定することによって達成される。ＰＧＣ-１蛋白質のＰＧＣ-１標的分子とする能力の決定は、リアルタイムのBiomolecular Interaction Analysis (BIA)のような技術を用いて行うことができる（Sjolander, S.とUrbaniczky, C. (1991) Anal.Chem. 63: 2338-2345 および Szaboら(1995) Curr. Opin. Nfruct. Biol. 5: 699-705）。本明細書で用いられているところによると、「ＢＩＡ」は、生物特異的相互作用を、反応体(例えば、BIAcore)を用いずに、リアルタイムで研究するための技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生物学的分子間のリアルタイムの反応の指標として使用することができる。
【０１７１】
別の態様において、試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質を調節する活性の決定は、ＰＧＣ-１蛋白質がＰＧＣ-１標的分子の下流のエフェクターの活性をさらに調節する能力を決定することによって達成できる。例えば、適切な標的上のエフェクター分子の活性が決定され、または、エフェクターの適切な標的への結合が上記のように決定される。
【０１７２】
さらに別の態様において、無細胞アッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質または生物学的に活性のあるその一部を、ＰＧＣ-１蛋白質に結合してアッセイ混合物を形成する公知の化合物と接触させること、該アッセイ混合物と試験化合物を接触させること、および試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質と相互作用する能力を決定することを含み、試験化合物がＰＧＣ-１蛋白質と相互作用する能力の決定は、ＰＧＣ-１蛋白質がＰＧＣ-１標的分子と優先的に結合する能力、またはその活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１７３】
上記本発明のアッセイ方法の一以上の態様において、ＰＧＣ-１またはその標的分子のいずれかを固定化し、蛋白質の１つもしくは双方について複合体の形状から複合体でない形状への分離を促進すること、ならびにアッセイの自動化をはかることが望ましい。試験化合物のＰＧＣ-１蛋白質への結合、または候補化合物の存在下または非存在下でのＰＧＣ-１蛋白質と標的分子との相互作用は反応物質を含有するのに好適なあらゆる容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管があげられる。1つの態様において、融合蛋白質を提供することができる。それは、該蛋白質の１つもしくは双方がマトリックスと結合することができるようにするドメインを追加したものである。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ／ＰＧＣ-１融合蛋白質もしくはグルタチオンＳトランスフェラーゼ／標的融合蛋白質が、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical、 St. Louis、MO）、もしくはグルタチオン誘導体化されたマイクロタイタープレート上に吸着され得る。次にそれを試験化合物もしくは吸着されていない標的蛋白質もしくはＰＧＣ-１蛋白質のいずれかと組み合わせ、その混合物を、複合体形成を誘導し得る条件下（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件）でインキュベートする。インキュベーション後、該ビーズもしくはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、結合していない成分を除去し、ビーズの場合、マトリックスを固定化し、複合体を上記の方法で直接的もしくは間接的に決定する。あるいは、該複合体をマトリックスから解離し、ＰＧＣ-１の結合レベルもしくは活性を標準的な技術を用いて決定することができる。
【０１７４】
蛋白質をマトリックス上に固定化するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、ＰＧＣ-１蛋白質もしくはＰＧＣ-１標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化されたＰＧＣ-１分子または標的分子は、当該技術分野で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、そしてストレプトアビジン被覆された９６穴プレート（Pierce Chemicals）のウェルに固定化することができる。あるいは、ＰＧＣ-１蛋白質または標的分子と反応性をもつが、その標的分子へのＰＧＣ-１蛋白質の結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そして未結合の標的またはＰＧＣ-１蛋白質を抗体複合によりウェル中で捕捉することができる。このような複合体の検出方法は、ＧＳＴ固定化された複合体について上述したものに加え、ＰＧＣ-１蛋白質または標的分子と反応性がある抗体を用いた、複合体の免疫検出法、ならびにＰＧＣ-１蛋白質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依拠する酵素結合アッセイを包含する。
【０１７５】
別の態様において、ＰＧＣ-１発現のモジュレーターをある方法において同定する。そこでは、細胞を候補化合物に接触させ、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の細胞中での発現を決定する。候補化合物の存在下でのＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現のレベルを、候補化合物の非存在下でのＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現のレベルと比較する。次に、その比較に基づいて候補化合物をＰＧＣ-１発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現が、候補化合物の非存在下でよりも候補化合物の非存在下での方が大きい（統計学的に有意に大きい）場合、その候補化合物は、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現の促進剤として同定される。または、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現が、候補化合物の非存在下でよりも候補化合物の非存在下での方が少ない（統計学的に有意に少ない）場合、その候補化合物は、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現の阻害剤として同定される。細胞中でのＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質の発現は、本明細書に記載のＰＧＣ-１のｍＲＮＡもしくは蛋白質を検出する方法によって決定することができる。
【０１７６】
本発明の別の局面において、ＰＧＣ-１蛋白質は、ＰＧＣ-１（「ＰＧＣ-１結合蛋白質」もしくは「ＰＧＣ-１‐ｂｐ」）と結合し、またはそれと相互作用し、かつＰＧＣ-１の活性に関与する他の蛋白質を同定するための、2-ハイブリッドアッセイまたは3-ハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第5,283,317号； Zervos ら(1993) Cell 72: 223-232；Maduraら(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054；Bartelら(1993) Biotechniques 14: 920-924；Iwabuchiら(1993)Oncogene 8: 1693-1696；およびBrentによるＰＣＴ国際公開第WO 94/10300号)において「ベイト蛋白質」として使用することができる。このようなＰＧＣ-１結合蛋白質はまた、例えば、ＰＧＣ-１媒介性信号伝達経路の下流の要素としてＰＧＣ-１蛋白質によるシグナルの伝播に関与する可能性もある。あるいは、そのようなＰＧＣ-１結合蛋白質は、ＰＧＣ-１インヒビターであってもよい。
【０１７７】
２ハイブリッド系は、大部分の転写因子のモジュラーの性質に基づき、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインより成る。簡潔には、該アッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物では、ＰＧＣ-１蛋白質をコードする遺伝子を既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他方の構築物では、同定されない蛋白質（「プレイ」もしくは「サンプル」）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリーからのあるＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「ベイト」および「プレイ」蛋白質がインビボで相互作用して、ＰＧＣ-１依存性の複合体を形成することが可能である場合、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが近接するようになる。このように近接することによって転写因子に応答性の転写制御部位に作用可能に連結されるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、そして、機能的転写因子を含有する細胞のコロニーが単離され、ＰＧＣ-１と相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用することができる。
【０１７８】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の２またはそれ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、調節物質は、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイによって同定することができ、また、該物質がＰＧＣ-１蛋白質の活性を調節する能力をインビボ、例えば、脂肪酸代謝に関する動物モデルのような動物において確認することができる。そのような動物モデルは当該技術分野において公知であり、それは、脂肪酸取り込みおよび／または酸化に関与する種々の遺伝子が欠損しているマウス、例えば、ペルオキシソームAcyl-CoAオキシダーゼ（Fan, C. Y. ら(1998) J. Biol. Chem. 273 (25): 15639-45）もしくは転写因子ＰＰＡＲａの欠損しているマウス、または骨格筋および心臓においてリポ蛋白質リパーゼを過剰発現させるマウスを包含する。
【０１７９】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規な物質に関する。したがって、本明細書において同定される物質の、適切な動物モデルにおける更なる使用も本発明の範囲に含まれる。例えば、本明細書に記載のように同定された作用物質(例えば、ＰＧＣ-１調節物質、アンチセンスＰＧＣ-１核酸分子、ＰＧＣ-１特異性抗体、またはＰＧＣ-１結合パートナー)を動物モデルにおいて使用し、そのような物質を用いて行った治療の効果、毒性もしくは副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載のように同定された物質を動物モデルにおいて使用し、そのような物質の代謝を決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の治療のためのスクリーニングアッセイによって同定される新規な物質の使用に関する。
【０１８０】
Ｂ．検出アッセイ
本明細書において同定されたｃＤＮＡ配列の部分もしくはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）を、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用することができる。例えば、これらの配列は、(i)染色体上のそれらのそれぞれの遺伝子をマッピングし、遺伝病に関連する遺伝子領域の位置を突き止め；(ii)微小の生物学的サンプルから個体を同定し（組織タイピング）；そして、(iii)生物学的サンプルの法医学的同定を助けるために使用することができる。これらの適用については、以下のサブセクションにおいて説明する。
【０１８１】
１．染色体マッピング
遺伝子の配列（もしくはその配列の一部）を単離した後、この配列を染色体上における遺伝子の位置をマッピングするために使用することができる。このプロセスを染色体マッピングと称する。したがって、本明細書に記載のＰＧＣ-１ヌクレオチド配列の部分もしくはフラグメントを染色体上のＰＧＣ-１遺伝子の位置をマッピングするために用いることができる。ＰＧＣ-１ヌクレオチド配列の染色体上へのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関させる際の重要な第１のステップである。
【０１８２】
簡潔に言えば、ＰＧＣ-１遺伝子は、ＰＣＲプライマー（好ましくは、15〜25ヌクレオチド長）をＰＧＣ-１ヌクレオチド配列から調製することによってマッピングすることができる。ＰＧＣ-１配列のコンピュータ分析を使用して、遺伝子ＤＮＡ中の1以上のエキソンにまたがって増幅プロセスを複雑にすることのないプライマーを予測することができる。次にこれらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用することができる。ＰＧＣ-１配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを産出する。
【０１８３】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物(例えば、ヒト細胞およびマウス細胞)からの体細胞を融合させることによって調製される。ヒト細胞およびマウス細胞が成長し、分割すると、徐々にランダムな順序でヒト染色体を失われるが、マウス染色体は維持される。特別の酵素がないためマウス細胞は成長できないがヒト細胞は成長することができる媒体を使用することによって、必要な酵素をコードする遺伝子を含有する１つのヒト染色体が維持されるであろう。種々の媒体を用いることにより、ハイブリッド細胞株のパネルを確立することができる。パネルの各細胞株は、単一のヒト染色体もしくは少数のヒト染色体、およびフルセットのマウス染色体を含有しており、個別の遺伝子を特異的なヒト染色体に容易にマッピングすることができる（D'Eustachio P. ら (1983) Science 220: 919-924）。ヒト染色体のみを含有する体細胞ハイブリッドも、転位置と欠失を持つヒト染色体を用いることによって作成することができる。
【０１８４】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り付けるための迅速な処理である。１日に３つもしくはそれ以上の配列を、単一の熱サイクラー（thermal cycler）を用いて割り付けることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにＰＧＣ-１ヌクレオチド配列を用いることによって、特定の染色体からのフラグメントのパネルを用いたサブ局在化（sublocalization）が達成される。ＰＧＣ-１配列をその染色体にマッピングする他のマッピング方法には、インサイチュハイブリダイゼーション（Fan, Y. ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6223-27に記載）、標識されたフロー選別された染色体のプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによる事前選択が含まれる。
【０１８５】
ＤＮＡ配列のメタフェーズ染色体スプレッド（metaphase chromosomal spread）への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、正確な染色体の位置を1ステップで提供することができる。メタフェーズにおいて、紡錘体を分裂させるコルセミドのような化学物質によって、その分割が遮断される細胞を用いて染色体スプレッドを形成することができる。染色体はトリプシンを用いて簡単に処理することができ、次にギムザ染色することができる。各染色体に明暗のバンドのパターンが現れ、その結果、染色体を個別に同定することができる。できるだけ短い500塩基もしくは600塩基のＤＮＡを用いたＦＩＳＨを行うことができる。しかしながら、1000塩基より大きなクローンは、染色体の特有の位置に単一の検出のために十分な信号強度で結合する可能性がある。合理的な時間において良好な結果を得るために十分なのは、好ましくは、1000塩基、より好ましくは2000塩基である。この技術を検討するために、Vermaら、Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques （Pergamon Press、New York 1988）を参照されたい。
【０１８６】
単一の染色体もしくは染色体上の単一の部位をマークするために染色体マッピングのための試薬を個別に使用することができる。または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体をマークするために使用することができる。遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬は、実際にはマッピングプロセスにとって重要である。コーディング配列は、遺伝子ファミリー内に保存される可能性がより高い。したがって、染色体マッピング中のクロスハイブリダイゼーションの確率が高くなる。
【０１８７】
配列が染色体の正確な位置に一旦マッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置は遺伝子マップデータと相関させることができる（そのようなデータは、例えば、McKusick、V.、Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能）に見出される）。次に同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）から同定することができる。これについては、例えば、Egeland, J.ら(1987) Nature 325: 783-787に記載がある。
【０１８８】
さらに、ＰＧＣ-１遺伝子に関連する疾患に罹患した個体と罹患していない個体との間のＤＮＡ配列の相違を決定することができる。罹患している個体の一部もしくはすべてにおいて突然変異が観察され、罹患していない個体において観察されなければ、そのときは突然変異が特定の疾患の原因物質である可能性がある。罹患した個体と罹患していない個体との間の比較は一般に、まず、染色体スプレッドの中に見ることが可能であり、かつＤＮＡ配列に基づいてＰＣＲを用いて検出することが可能な染色体中での欠失や転位置のような構造的変化を探すことに関する。究極的には、いくつかの個体からの遺伝子の完全な配列を行うことができ、突然変異の存在を確認し、多型と突然変異とを識別することが可能である。
【０１８９】
２．組織タイピング
本発明のＰＧＣ-１配列を用いて微小生物学的サンプルから個体を同定することができる。例えば、米国軍隊は、職員を同定するために制限断片長多型(RFLP)の使用を検討している。この技術において、個体のゲノムＤＮＡを１もしくはそれ以上の酵素によって消化し、サザンブロッティングでプローブし、同定するための特有のバンドを産出する。この方法によれば、現在の「認識票（"DogTags"）」の制限、すなわち、紛失したり、切り替えられたり、または盗まれたりする可能性があり、積極的な本人同定が困難であるいったことが問題にならない。本発明の配列は、ＲＦＬＰの追加的ＤＮＡマーカーとして有用である(米国特許第5,272,057号に記載されている)。
【０１９０】
さらに、本発明の配列は、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替的な技術を提供するのに用いることができる。したがって、本明細書に記載のＰＧＣ-１ヌクレオチド配列は、該配列の5'末端および 3'末端からの、２つのＰＣＲプライマーを調製するために用いることができる。次にこれらのプライマーは、個体のＤＮＡを増幅し、続いて、その配列決定をするために用いることができる。
【０１９１】
このようにして得られた、個体からのＤＮＡ配列のパネルは、特有の個体の同定を提供することができる。対立遺伝子の相違によって、各個体はＤＮＡ配列の特有のセットを有しているからである。本発明の配列は、そのような個体からおよび組織からの同定配列を得るために用いることができる。本発明のＰＧＣ-１ヌクレオチド配列は、特有にヒトゲノムの部分を表している。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコーディング領域ではある程度生じ、非コーディング領域ではより高い程度で生じる。ヒト個体間における対立遺伝子の変異は、500塩基に約1回生じると推定される。本明細書に記載の配列のそれぞれは、ある程度、個体からのＤＮＡ同定の目的で比較するための標準として使用することができる。より多数の多型遺伝子が非コーディング領域において生じるので、個体を区別するために必要な配列はより少数すくない。配列番号６、９、１２または１５の非コーディング配列は、抗体の確定同定に対して、それぞれが非コードの増幅された100塩基の配列を産出するおそらく10〜1000のプライマーのパネルを提供する。予測されたコーディング配列、例えば、配列番号８，１１，１４または１７の配列が用いられるとき、より個体の確定同定のためのよりプライマーのより適切な数は、500〜2000であろう。
【０１９２】
ＰＧＣ-１ヌクレオチド配列からの試薬のパネルを用いて、特有の個体のための同定データベースを生成するとき、同じ試薬を後に用いて、個体からの組織を同定することができる。特有の同定データベースを用いて、生存しているもしくは死んでいる、個体の確定同定を非常に小さな組織サンプルから作製することができる。
【０１９３】
３．部分的ＰＧＣ-１配列の法医学的生物学における使用
ＤＮＡベースの同定技術は、法医学的生物学にも用いることができる。法医学的生物学は、犯罪の現場において見つけられた生物学的証拠の遺伝子型解析を、例えば、ある犯罪の犯罪者を確定的に同定するための手段として採用する科学分野である。そのような同定を行うために、ＰＣＲ技術を用いて、例えば、毛髪もしくは皮膚、または、血液、唾液もしくは精液などの体液といった組織のような非常に小さな生物学的サンプルのＤＮＡ配列を増幅することができる。次に、増幅された配列を標準と比較することによって、その生物学的サンプルの起源を同定することができる。
【０１９４】
本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特異的な座位を標的とした、ポリヌクレオチド試薬、例えば、ＰＣＲプライマーを提供することができる。それは、例えば、別の「同定マーカー」(すなわち、特定の個体に特有の別のＤＮＡ配列)を提供することによって、ＤＮＡベースの法医学的同定の信頼性を高めることができる。上記のように、制限酵素生成フラグメントによって形成されたパターンにとって代わる正確な代替物として、実際の塩基配列情報を同定に用いることができる。配列番号１の非コーディング領域を標的とした配列は、多数の遺伝子多型がこの非コーディング領域に生じており、この技術を用いた個体の識別をより容易にするので、特にこの使用に適切である。ポリヌクレオチド試薬の例には、例えば、長さが２０塩基、好ましくは３０塩基の、ＰＧＣ-１ヌクレオチド配列またはその部分、例えば、配列番号１の非コーディング領域に由来するフラグメントが含まれる。
【０１９５】
本明細書に記載のＰＧＣ-１ヌクレオチド配列はさらに、ポリヌクレオチド試薬、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術において、特異的な組織、例えば、ＰＧＣ-１を発現する組織（例えば、心臓もしくは筋肉）を同定するために使用することが可能な、標識されたもしくは標識可能なプローブを提供するために用いることができる。これは、法医学的病理学者が未知の起源の組織を処理する場合に、非常に有用であることができる。そのようなＰＧＣ-１プローブのパネルを用いて、種および／または臓器型別に組織を同定することができる。
【０１９６】
同様に、これらの試薬、例えば、ＰＧＣ-１プライマーもしくはプローブを用いて、混入物（すなわち、培養中の異なるタイプの混合物の存在）に関して組織培養物をスクリーニングすることができる。
【０１９７】
Ｃ．予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、およびモニタリング臨床試験が、予後(予測)目的で用いられ、それによって個体に対して予防的に治療することができる予測医学にもまた関する。したがって、本発明の1局面は、ＰＧＣ-１蛋白質および／または核酸の発現、ならびにＰＧＣ−１の活性を決定するための診断アッセイに関する。それは、生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、もしくは組織)と関連づけて、個体が疾患または障害(例えば、ＰＧＣ-１関連障害)に罹患しているかどうか、または異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する障害を発症させる危険があるかどうかを決定するものである。本発明はまた、個体が、ＰＧＣ-１蛋白質、核酸発現、もしくは活性に関連する障害を発症させる危険にあるかどうかを決定するための予後的（もしくは予測的）アッセイを提供する。例えば、ＰＧＣ-１遺伝子中の突然変異を、生物学的サンプルにおいてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質、核酸発現、もしくは活性によって特徴付けられる障害が起こる前に、予後もしくは予防目的で使用して個体に対して予防的に治療を行うことができる。
【０１９８】
本発明の別の局面は、臨床試験において、作用物質(例えば、薬物、化合物)がＰＧＣ-１の発現または活性に及ぼす影響をモニタリングすることに関する。
【０１９９】
これらおよび他の物質を下記のセクションにおいてさらに詳細に述べる。
【０２００】
１．診断アッセイ
生物学的サンプル中のＰＧＣ-１蛋白質、ポリペプチド、または核酸の存在もしくは非存在を検出する例示の方法は、試験化合物から生物学的サンプルを取得すること、ＰＧＣ−１蛋白質または核酸が生物学的サンプルにおいて検出されるように、生物学的サンプルをＰＧＣ-１蛋白質、ポリペプチド、もしくはＰＧＣ−１蛋白質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、遺伝子ＤＮＡ)を検出することが可能な化合物もしくは作用物質に接触させることに関与する。別の局面において、本発明は、生物学的サンプルをＰＧＣ-１活性の指標を検出することが可能な作用物質と接触させることによって、生物学的サンプル中にＰＧＣ-１活性の存在を検出する方法を提供する。ＰＧＣ-１のｍＲＮＡを検出するのに好ましい物質は、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能な標識された核酸プローブ、もしくはゲノムＤＮＡである。核酸プローブは、例えば、配列番号6、８、９、１１、１２、１４、１５または１７の完全長のＰＧＣ-１核酸、またはプラスミドへのＤＮＡ挿入物、またはその一部、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドであり、かつストリンジェントな条件下でＰＧＣ-１のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド等であることができる。本発明の診断アッセイに用いられる好適な他のプローブを本明細書において記載する。
【０２０１】
ＰＧＣ-１蛋白質を検出するのに好ましい物質は、ＰＧＣ-１蛋白質に結合することが可能な抗体、好ましくは、検出可能な標識をもつ抗体である。抗体は、ポリクローナル、もしくはより好ましくはモノクローナルであることができる。インッタクトの抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）2）を使用することができる。プローブもしくは抗体に関しての「標識された」という用語は、プローブもしくは抗体に検出可能な物質を結合（すなわち、物理的に連結）することによる、プローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例は、蛍光で標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光で標識されたストレプトアビジンでそれを検出することができるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は、被験者から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに被験者内に存在する組織、細胞および液体を包含することを意図している。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボで生物学的サンプル中のＰＧＣ-１のｍＲＮＡ、蛋白質もしくはゲノムＤＮＡを検出するのに使用することができる。例えば、ＰＧＣ-１のｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。ＰＧＣ-１蛋白質の検出のためのインビトロ技術は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を包含する。ＰＧＣ‐１ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、ＰＧＣ‐１ゲノムＤＮＡを検出するためのインビボ技術は、被験者に標識された抗-ＰＧＣ-１抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、標準的画像形成技術により被験者中におけるその存在および位置を検出することが可能な放射活性マーカーで標識することができる。
【０２０２】
本発明はまた、遺伝子改変の有無を同定するための診断アッセイであって、(i)ＰＧＣ-１蛋白質をコードする遺伝子の異常な修飾もしくは突然変異；(ii)ＰＧＣ-１蛋白質をコードする遺伝子の異常な発現；(iii)遺伝子の誤制御；および(iii)ＰＧＣ-１蛋白質の異常な翻訳後修飾；のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、遺伝子の野生型がＰＧＣ-１活性を持つ蛋白質をコードする、診断アッセイを提供する。本明細書で用いられているところの「誤発現または異常な発現」という語は、ＲＮＡもしくは蛋白質レベルにおける、非野生型パターンの遺伝子発現を指す。それは、限定されないが、非野生型レベルの発現（例えば、過剰発現もしくは過少発現）；遺伝子が発現される時間もしくは段階の点において野生型とは異なる発現のパターン(例えば、所定の発展期間もしくは段階において(野生型と比較して)発現が上昇もしくは減少)；所定の細胞タイプもしくは組織タイプにおいて（野生型と比較して）減少した発現という点において、野生型とは異なる発現のパターン；スプライシングの大きさ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または発現されたポリペプチドの生物学的活性という点において、野生型とは異なる発現のパターン；環境的刺激もしくは細胞外刺激の遺伝子発現に対する効果の点において野生型とは異なる発現のパターン（例えば、刺激の強さの増減の存在下で (野生型と比較して)増加または減少した発現のパターン）を包含する。
【０２０３】
1つの態様において、生物学的サンプルは、試験被験者からの蛋白質分子を含有する。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験者からのｍＲＮＡもしくは試験被験者からの遺伝子ＤＮＡ分子を含有することができる。好ましい生物学的サンプルは、常法により、被験者から単離された血清サンプルである。
【０２０４】
別の態様において、方法はさらに、対照生物学的サンプルを対照被験者から取得し、ＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくは核酸の存在が生物学的サンプルにおいて検出されるように、対照サンプルをＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡを検出することが可能な化合物に接触させること、および対照サンプルにおけるＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡと、試験化合物中のＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくは遺伝子ＤＮＡの存在とを比較することを含む。
【０２０５】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＰＧＣ-１の存在を検出するためのキットも包含する。例えば、該キットは、生物学的サンプル中のＰＧＣ-１蛋白質もしくはｍＲＮＡを検出することが可能な標識された化合物もしくは作用物質；サンプル中のＰＧＣ-１量を測定するための手段；およびサンプル中のＰＧＣ-１量を標準と比較するための手段を含むことができる。該化合物もしくは作用物質は、好適な容器内に包装することができる。該キットはさらに、ＰＧＣ-１蛋白質もしくは核酸を検出するためのキットを使用するための説明書をさらに含むことができる。
【０２０６】
２．予後アッセイ
本明細書に記載の診断方法は、異常な、もしくは望ましくないＰＧＣ-１発現または活性に関連する疾病もしくは障害（例えば、ＰＧＣ-１関連疾患）を有する、または該疾患を発症させる危険がある被験者を同定するために使用することができる。本明細書において使用されているところの「異常な」という語は、野生型ＰＧＣ-１発現もしくは活性に由来するＰＧＣ-１発現もしくは活性を含む。異常な発現もしくは活性は、発現もしくは活性の増加もしくは減少、ならびに野生型の発症パターンもしくは発現の細胞下のパターンに従わない発現もしくは活性を含む。例えば、異常なＰＧＣ-１発現または活性は、ＰＧＣ-１遺伝子の突然変異がＰＧＣ-１遺伝子を過小発現もしくは過剰発現させる場合、およびそのような突然変異が非機能的ＰＧＣ-１蛋白質もしくは野生型的に機能しない蛋白質、例えば、ＰＧＣ-１標的分子と相互作用しない蛋白質もしくは非ＰＧＣ-１標的分子と相互作用しない蛋白質になる状況を含むことを意図している。本明細書において用いられているところの、「望ましくない」という語は、調節されない脂肪酸取り込みおよび／または酸化のような生物学的反応に関与する望ましくない状況を含む。例えば、望ましくないという語は、被験者において望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性を含む。
【０２０７】
本明細書に記載のアッセイ、例えば、先に述べた診断アッセイまたは下記のアッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質活性もしくは核酸発現における誤制御に関与する障害を有する、またはそれを発症させる危険がある被験者を同定するために使用することができる。あるいは、予後アッセイは、ＰＧＣ-１蛋白質活性もしくは核酸発現における誤制御に関与する障害を有する、またはそれを発症させる危険がある被験者を同定するために使用することができる。したがって、本発明は、試験サンプルを被験者から得て、ＰＧＣ-１蛋白質または核酸（例えば、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を検出する、異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現または活性に関連する疾患もしくは障害を同定する方法であって、ＰＧＣ−蛋白質または核酸の存在が、異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現または活性に関連する疾患もしくは障害をもつ、もしくはそれを発症させる危険のある被験者の診断となる方法を提供する。本明細書に用いられる「試験サンプル」は、関連する被験者から得られた生物学的サンプルを言う。例えば、試験化合物は、生物学的液体(例えば、血清)、細胞サンプルもしくは組織であることができる。
【０２０８】
さらに、本明細書に記載の予後アッセイは、異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害を治療するために、被験者が作用物質(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似物、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子もしくは他の薬物候補物質)を投与され得るかどうかを決定するために用いることができる。例えば、そのような方法は、薬物もしくは毒素感受性障害もしくは細胞増殖および／または分化障害のための作用物質を用いて被験者が効果的に治療され得るかどうかを決定するために使用することができる。したがって、本発明は、試験化合物を得て、ＰＧＣ-１蛋白質もしくは核酸の発現もしくは活性を検出する方法であって、被験者が異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する障害のための作用物質を用いて効果的に治療され得るかどうかを決定するための方法（例えば、ＰＧＣ-１蛋白質または核酸の発現もしくは活性が、異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する障害を治療するための作用物質を投与されることができる被験者のための診断）を提供する。
【０２０９】
本発明の方法は、ＰＧＣ-１遺伝子中の遺伝子改変を検出するために使用することができ、それによって改変された遺伝子を持つ被験者がＰＧＣ-１蛋白質活性または核酸発現の誤制御を特徴とする障害、例えばＰＧＣ-１関連障害に罹る危険があるかどうかを決定するために使用することもできる。好ましい態様において、この方法は、被験者からの細胞のサンプル中において、ＰＧＣ-１蛋白質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも１つの変更を特徴とする遺伝子改変の有無を検出することを含む。例えば、そのような遺伝子改変は、下記のうちの少なくとも1つの存在をスクリーニングすることによって検出することができる。すなわち、１）1以上のヌクレオチドのＰＧＣ-１遺伝子からの欠失；２）1以上のヌクレオチドのＰＧＣ-１遺伝子への付加；３）ＰＧＣ-１遺伝子の1以上のヌクレオチドの置換；４）ＰＧＣ-１遺伝子の染色体再配列；５）ＰＧＣ-１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの転写レベルの変更；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなＰＧＣ-１遺伝子の異常な修飾；７）メッセンジャーＲＮＡのＰＧＣ-１遺伝子の転写の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＰＧＣ-１蛋白質の非野生型レベル；９）ＰＧＣ-１遺伝子の対立遺伝子の損失；および１０）ＰＧＣ-１蛋白質のミスマッチな翻訳後修飾のうちの少なくとも１つの存在を確認することによってそのような遺伝子改変を検出することがきる。本明細書に記載されているように、ＰＧＣ-１遺伝子の変更を検出するために用いられる当該技術分野に公知のアッセイは多く存在する。好ましい生物学的サンプルは、常法で被験者から単離された組織もしくは血清サンプルである。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、改変の検出は、アンカーＰＣＲ法もしくはＲＡＣＥ ＰＣＲ法のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683, 202号を参照されたい）、あるいは、ライゲーション連鎖反応法（ＬＣＲ）（例えば、Landegranら(1988) Science 241: 1077-1080; およびNakazawa ら(1994) Proc. Natl.Scad. Sci. USA 91: 360-364を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの使用に関与する。後者は、ＰＧＣ-１遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用である（Abravayaら(1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682)。この方法は、核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、または両方)を単離した、被験者から細胞のサンプルを採取すること、該核酸サンプルを、ＰＧＣ-１遺伝子（存在すれば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で、特異的にＰＧＣ-１遺伝子とハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させること、および増幅産物の有無もしくは増幅産物の大きさを検出すること、および対照サンプルとその長さを比較することを含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の突然変異を検出するために用いられる技術のいずれかと組み合わせた予備的増幅工程として使用することが好ましい。
【０２１１】
別の増幅方法は、自己持続性配列反復（Guatelli, J. C.ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878）、転写増幅系（Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86: 11731177）、または他の核酸増幅方法のいずれかを含み、続いて、当該技術分野の当業者に公知の技術を用いて、増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。
【０２１２】
別の態様において、サンプル細胞からのＰＧＣ-１遺伝子における突然変異は、制限酵素の切断パターンの変更によって同定することができる。例えば、、サンプルＤＮＡおよび対照ＤＮＡを単離し、増幅し(任意)、１つもしくはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、フラグメント長をゲル電気泳動で決定し、比較する。サンプルＤＮＡと対照ＤＮＡの間のフラグメント長の相違は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示すものである。さらにリボザイムに特異的な配列は、リボザイム切断部位の発生もしくは損失による特異的な突然変異の存在をスコアするために使用することができる。
【０２１３】
別の諸態様において、ＰＧＣ-１の遺伝子突然変異は、サンプル核酸と対照核酸(例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ)を、数百もしくは数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度配列にハイブリダイズすることによって同定することができる（Cronin, M. T.ら (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal, M. J. ら(1996) Nat. Med. 2:753-759）。例えば、ＰＧＣ-１の遺伝子突然変異は、Croninら(1996)前掲書に記載の光生成（light-generated）ＤＮＡプローブを含有する、２次元アレイで同定することができる。簡潔に述べれば、プローブの第1のハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよび対照において、長く伸びたＤＮＡをスキャンし、系列的に重なったプローブの配列を線形化することによって、配列間の塩基の違いを同定することができる。この工程は点突然変異を同定することが可能である。この工程の後に第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。それは、検出された全ての変異体もしくは突然変異に対して相補的なより小さな、特別なプローブアッセイを用いることによって特異的変異の特徴づけを行うことができる。各突然変異配列は、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は変異遺伝子に相補的である、パラレルプローブセットによって構成されている。
【０２１４】
別の態様において、公知の技術における種々の配列決定反応のいずれかを用いて直接的にＰＧＣ-１遺伝子の配列決定を行い、およびサンプルＰＧＣ-１の配列と対応する野生型（対照）配列とを比較することによって突然変異を検出することができる。配列決定反応の例としては、MaxamとGilbert（（1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560）またはSanger（（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463））によって開発された技術に基づいたものがある。診断アッセイを行う際、質量分析法（例えば、ＰＣＴ国際公開第WO 94/ 16101号；Cohenら(1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162 ; およびGriffinら (1993) Appl. Biochem.Biotechnol. 38: 147-159）による配列決定を含む種々の自動配列決定技術のいずれかを用いることができると考えることもできる（Naeve,C. W. (1995) Biotechniques 19:448）。
【０２１５】
ＰＧＣ-１遺伝子における突然変異を検出するための他の方法には、切断物質からの保護を用いて、ＲＮＡ/ＲＮＡもしくはＲＮＡ/ＤＮＡヘテロ二本鎖中のミスマッチな塩基を検出する方法が含まれる（Myersら (1985) Science 230: 1242））。一般的に、「ミスマッチな切断」にかかる従来技術は、野生型ＰＧＣ-１配列を含有する（標識された）ＲＮＡもしくはＤＮＡをハイブリダイズすることによって作製されたヘテロ二本鎖に、組織サンプルから得た、潜在的に変異のあるＲＮＡもしくはＤＮＡを付与することによって開始する。二本鎖は、対照鎖とサンプル鎖の間のミスマッチな塩基対によって存在することになる二本鎖の一本鎖領域を切断する物質を用いて、処理される。例えば、ＲＮＡ/ＤＮＡ二本鎖は、Ｓ１ヌクレアーゼによって処理されたRNaseとＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッドを用いてミスマッチな領域を酵素的に消化するように、処理される。別の諸態様において、ＤＮＡ/ＤＮＡ二本鎖もしくはＲＮＡ/ＤＮＡ二本鎖は、ミスマッチな領域を消化するために、ヒドロキシルアミンもしくは四酸化オスミウムを用いて、およびピペリジンを用いて処理することができる。ミスマッチな領域の消化の後、得られた物質を、ポリアクリルアミドゲルを変性して突然変異部位を決定する際に、大きさによって分離する（例えば、Cottonら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleebaら(1992) Methods Enqymol. 217: 286-295参照）。好ましい態様において、対照ＤＮＡもしくはＲＮＡは、検出のために標識される。
【０２１６】
さらに別の態様において、ミスマッチな切断反応は、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチな塩基対を認識する１つもしくはそれ以上の蛋白質(いわゆる、「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を、細胞のサンプルから得たＰＧＣ-１のｃＤＮＡにおける点突然変異を検出・マッピングするための定義されたシステム系に用いる。例えば、E.ColiのmutY酵素は、Ｇ/ＡミスマッチにおいてＡを切断し、HeLa細胞切断ＴのチミジンＤＮＡグルコシラーゼは、Ｇ/TミスマッチにおいてＴを切断する（Hsuら(1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662）。例示の実施形態によれば、ＰＧＣ-１配列に基づくプローブ、例えば、野生型ＰＧＣ-１配列は、ｃＤＮＡまたは他の試験細胞からのＤＮＡ産物にハイブリダイズする。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理し、あれば、切断産物を電気泳動プロトコルから検出することができる。例えば、米国特許第.5,459,039号を参照されたい。
【０２１７】
別の諸態様において、ＰＧＣ-１遺伝子の突然変異を同定するために電気泳動の移動度における変化を用いる。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を、突然変異核酸と野生型核酸との間の電気泳動の移動度の相違を検出するために用いることができる（Oritaら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766; また、Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79）。サンプルの一本鎖ＤＮＡフラグメントおよび対照ＰＧＣ-１核酸は、変性し、再び未変性の状態にすることができる。一本鎖核酸の２次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られた変更は単一の塩基変化の検出さえできる。ＤＮＡフラグメントを標識することもできるし、または標識されたプローブを用いて検出することもできる。（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを用いることによってアッセイの感受性を高めることもできる。そこでは、２次構造が配列中の変化に対してより高い感受性を示す。好ましい態様において、該方法は、電気泳動の移動度における変化に基づいてヘテロ二本鎖分析を用いて、二重螺旋のヘテロ二本鎖分子を分離する（Keenら (1991) Trends Genet. 7: 5）。
【０２１８】
別の態様において、変性勾配ゲル電気泳動を用いて変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体もしくは野性型のフラグメントの動きをアッセイする（ＤＧＧＥ）（Myersら(1985) Nature 313: 495）。分析方法としてＤＧＧＥを用いる場合、ＤＮＡは、例えば、約４０ｂｐの高融点ＧＣに富んだＤＮＡをＰＣＲによってＧＣクランプを追加することによって完全には変性しないことを確実にするために修飾される。さらに別の態様において、変性勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照ＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における相違を同定する（RosenbaumとReissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753）。
【０２１９】
点突然変異を検出するための他の技術の例は、限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長を包含する。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを調製することができる。そこでは、公知の突然変異を中心に配置し、次に完全な一致が見つかった場合のみ、ハイブリダイゼーションが可能な条件で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（Saikiら (1986) Nature 324: 163); Saikiら (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230）。オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に付着され、標識された標的ＤＮＡにハイブリダイズされたとき、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅標的ＤＮＡもしくはいくつかの異なる突然変異にハイブリダイズする。
【０２２０】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明に組み合わせて用いることもできる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に関連突然変異を持つ（その結果、増幅が特異なハイブリダイゼーションに依存する）（Gibbsら (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448）、またはミスマッチがポリメラーゼの伸長を阻害もしくは減少させる適切な条件のもとで、1つのプライマーの3'末端に突然変異をもつ（Prossner (1993) Tibtech 11:238）。さらに、新たな制限部位を突然変異領域に導入し、切断に基づく検出を行うことが望ましい（Gaspariniら (1992) Mol. Cell Probes 6: 1）。特定の実施形態において、増幅用Taq リガーゼを用いて増幅を行うこともできることが予期される（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 189）。そのような場合、5'配列の3'末端に完全な一致が存在し、それによって増幅の有無を探すことによって公知の突然変異を特異的な部位において検出することが可能となる場合のみライゲーションが生じる。
【０２２１】
本明細書に記載の方法は、例えば、プレパッケージされた、本明細書に記載の少なくとも1つのプローブ核酸もしくは抗体試薬を含む診断キットを用いて行うこともできる。それは、例えば、ＰＧＣ-１遺伝子に関与する疾患もしくは疾病の徴候または家族歴を示す患者を診断するための臨床セットにおいて都合よく用いることができる。
【０２２２】
さらに、ＰＧＣ-１が発現される、あらゆる細胞のタイプまたは組織（例えば、心臓または筋肉）を、本明細書に記載の診断アッセイにおいて使用することもできる。
【０２２３】
３．臨床試験中の効果のモニタリング
作用物質(例えば薬剤)の、ＰＧＣ-１蛋白質の発現もしくは活性（例えば、ＰＧＣ-１活性の調節、脂肪酸取り込みおよび／もしくは酸化遺伝子の発現、ならびに／または脂肪酸取り込みおよび／または酸化メカニズム）に及ぼす影響のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験においても適用することができる。例えば、ＰＧＣ-１遺伝子発現、蛋白質レベルを増加させる、またはＰＧＣ-１活性を上方制御するための、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定された作用物質の効果を、ＰＧＣ-１遺伝子発現、蛋白質レベルが減少し、ＰＧＣ−１活性が下方制御された被験者の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、ＰＧＣ-１遺伝子発現、蛋白質質レベルを減少させる、またはＰＧＣ-１活性を下方制御するための、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定された作用物質の効果を、ＰＧＣ-１遺伝子発現、蛋白質レベルが増加し、ＰＧＣ−１活性が上方制御された被験者の臨床試験においてモニターすることができる。そのような臨床試験においては、ＰＧＣ-１遺伝子の発現もしくは活性、および好ましくは、例えば、ＰＧＣ-１関連性疾患に関係する他の遺伝子を「読出し」、または特定の細胞の表現型のマーカーとして使用することができる。
【０２２４】
例えば、限定されないが、作用物質(例えば、化合物、薬物、または小分子)を用いた処理によって、細胞内で調節され、ＰＧＣ-１活性(本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される)を調節する、ＰＧＣ-１を含む遺伝子を同定することができる。したがって、ＰＧＣ-１遺伝子に関連する疾患(例えば、ＰＧＣ-１活性、脂肪酸取り込みおよび／または酸化遺伝子の発現、および／または脂肪酸取り込みおよび／または酸化メカニズムの下方制御によって特徴づけられる疾患)に対する作用物質の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞を単離することができ、ＲＮＡを調製し、ＰＧＣ-１に関連する疾患に関係するＰＧＣ-１および他の遺伝子の発現のレベルに関する分析を行うことができる。遺伝子発現のレベル(例えば、遺伝子発現パターン)は、本明細書に記載のように、ノーザンブロット分析またはＲＴ-ＰＣＲによって、あるいは、本明細書に記載の方法の1つによって作製された蛋白質の量を測定することによって、または、ＰＧＣ-１またはその他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量化することができる。このように、遺伝子発現パターンは、細胞の作用物質に対する生理学的反応を示すマーカーとして機能することができる。したがって、この反応状態は、作用物質を用いて個体に対する治療を行う前、および治療中の種々の時点で決定することができる。
【０２２５】
好ましい態様において、本発明は、作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似物、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子もしくは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補物質) を用いた個体の治療の効果をモニターする方法を提供する。この方法は、作用物質を用いた個体の治療の効果を、治療の前、および治療中の種々の時点において測定することができる。この方法は、(i)作用物質の投与前に被験者から前投与サンプルを得ること；(ii)投与前サンプル中に、ＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出すること；(iii)該被験者から１もしくはそれ以上の投与後サンプルを得ること；(iv)投与後サンプルにおけるＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出すること;(v)投与前サンプルにおけるＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと投与後サンプルにおけるＰＧＣ-１蛋白質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルの比較をすること；そして(vi)作用物質の被験者に対する投与を変えることを含む。例えば、検出されたものより高いレベルに、ＰＧＣ-１の発現または活性を増加させるため、すなわち、作用物質の効果を高めるためには、作用物質の投与を増加させることが望ましいかもしれない。あるいは、例えば、検出されたものより低いレベルに、ＰＧＣ-１の発現または活性を減少させるため、すなわち、作用物質の効果を低くするためには、作用物質の投与を減少させることが望ましいかもしれない。そのような態様によれば、ＰＧＣ-１発現もしくは活性は、観察可能な表現型の反応がない場合でさえも、作用物質の効果の指標として用いることができる。
【０２２６】
Ｄ．治療方法
本発明は、障害もしくはＰＧＣ-１関連障害、例えば、異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する障害を発症させる危険がある（もしくは罹りやすい）被験者を治療するための予防的方法および治療的方法の双方を提供する。本明細書において用いられているところの、被験者の「治療」という語は、治療薬を被験者に提供もしくは投与すること、または治療薬を、疾患または障害をもち、疾患または障害の徴候を示し、疾患または障害の危険がある（もしくは罹りやすい）被験者の細胞もしくは組織へ、疾患または障害、疾患または障害の徴候、もしくは疾患または障害の危険（もしくは罹りやすさ）を回復、治癒、緩和、軽減、変更、療養、寛解、改善させるもしくは影響を及ぼす目的で、適用または投与することを含む。本明細書で使用されているところの、「治療薬」という語は、限定されないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【０２２７】
予防的方法および治療的方法の双方に関して、そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて、特異的に目的合わせたり、または変更したりすることができる。本明細書で使用される「薬理ゲノミクス」という語は、遺伝子の配列決定、統計的遺伝学、および臨床開発中もしくは市販されている薬剤に対する遺伝子発現分析のようなゲノミクスの技術の適用を言う。より具体的には、この語は、どのようにして患者の遺伝子が、その患者の薬物に対する反応（例えば、患者の「薬物反応表現型」もしくは「薬物反応遺伝子型」）を決定するかという研究に関する。したがって、本発明の別の局面は、個体の薬物反応遺伝子型に従った、本発明のＰＧＣ-１分子もしくはＰＧＣ-１モジュレーターのいずれかを用いた、個体の予防的または治療的処置のための方法を提供する。薬理ゲノミクスによって、臨床医または内科医は、患者に対して、その患者がその治療から最大の恩恵を受けるように、予防的または治療的処置を標的化し、かつ、患者が毒性的な薬物関連の副作用を受けるような治療を避けることが可能となるだろう。
【０２２８】
１．予防的方法
1つの局面において、本発明は、ＰＧＣ-１またはＰＧＣ-１発現もしくは少なくとも１つのＰＧＣ-１活性を調節する作用物質を被験者に投与することによって、被験者において異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性に関連する障害を予防する方法を提供する。異常なもしくは望ましくないＰＧＣ-１発現もしくは活性によって引き起こされる、または寄与する疾患の危険にある被験者の同定は、例えば、本明細書に記載の診断アッセイもしくは予後アッセイのすべてもしくは組み合わせを用いて行うことができる。ＰＧＣ-１異常を特徴とする徴候が現れる前に予防薬の投与を行うことができる。それによって疾患または障害を予防したり、あるいは、その進行を遅らせたりすることができる。ＰＧＣ-１異常の型にしたがって、例えば、ＰＧＣ-１、ＰＧＣ-１アゴニスト、またはＰＧＣ-１アンタゴニスト作用物質を被験者の治療に用いることができる。適切な作用物質を本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０２２９】
２．治療方法
本発明の別の局面は、治療の目的でＰＧＣ-１発現または活性を調節する方法に関する。したがって、例示した態様において、本発明の調節方法は、ＰＧＣ-１を発現することが可能な細胞を、該細胞中のＰＧＣ-１活性を調節するように、ＰＧＣ-１蛋白質の1もしくはそれ以上の活性を調節する作用物質に接触させることを含む。ＰＧＣ-１蛋白質活性を調節する作用物質は、核酸もしくは蛋白質、ＰＧＣ-１蛋白質の天然に存在する標的分子（例えば、ＰＧＣ-１標的分子）、ＰＧＣ-１抗体、ＰＧＣ-１アゴニストもしくはアンタゴニスト、ＰＧＣ-１アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド類似物、または他の小分子、等の本明細書に記載の作用物質とすることができる。1つの態様において、該作用物質は、１もしくはそれ以上のＰＧＣ-１活性を刺激する。そのような刺激性の作用物質の例としては、細胞に導入された、活性のあるＰＧＣ-１蛋白質およびＰＧＣ-１をコードする核酸分子を包含する。別の態様において、該作用物質は、１つもしくはそれ以上のＰＧＣ-１活性を阻害する。そのような刺激性の作用物質の例は、アンチセンスＰＧＣ-１核酸分子、抗ＰＧＣ-１抗体およびＰＧＣ-１インヒビターを包含する。これらの修飾的な方法は、インビトロで(例えば、細胞を該作用物質を用いて培養することによって)、あるいは、インビボで（例えば、該作用物質を被験者に投与することによって）行うことができる。そうであるので、本発明は、ＰＧＣ-１蛋白質または核酸分子の異常なもしくは望ましくない発現もしくは活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患している個体を治療する方法を提供する。1つの態様において、該方法は、ＰＧＣ-１発現もしくは活性を調節する(例えば、上方制御もしくは下方制御する)、または作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される作用物質）を投与すること、または作用物質の組み合わせを投与することを含む。別の局面において、該方法は、ＰＧＣ-１蛋白質または核酸分子を、減少した、異常な、もしくは望ましくないＰＧＣ-１発現または活性を補う治療薬として投与することを含む。
【０２３０】
ＰＧＣ-１活性の刺激は、ＰＧＣ-１が異常に下方制御された状況および／または増加したＰＧＣ-１が効率的な効果を持つような状況において望ましい。例えば、ＰＧＣ-１活性の刺激は、ＰＧＣ-１活性が下方制御された状況および／または増加したＰＧＣ-１が効率的な効果を持つような状況において望ましい。同様に、ＰＧＣ-１活性の阻害は、ＰＧＣ-１が異常に上方制御された状況および／または減少したＰＧＣ-１活性が効率的な効果を持つ可能性のある状況において望ましい。
【０２３１】
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限するとして解釈されるべきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許出願、特許および公開特許出願の内容は、本明細書中に引用によって援用する。
実施例
【０２３２】
材料と方法
ライブラリースクリーニングおよびｃＤＮＡクローニング
ＨＩＢ-1Ｂ ポリＡ+ｍＲＮＡから調製されたオリゴ-ｄＴプライムｃＤＮＡ ＳＺＡＰライブラリーをスクリーニングすることによって、ＰＧＣ‐１ｂおよびＰＧＣ‐１ｃのｃＤＮＡを単離した。このライブラリーをＰＧＣ‐１ａのｃＤＮＡに由来する２９７bpのＮｈｅＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントを用いてスクリーニングした。低ストリンジェントな条件(２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４２℃)下でスクリーニングを３回行った後、３１の陽性クローンをpBluescript中に切り取り、標準的な方法によって配列決定を行った。陽性クローン中の７つがＰＧＣ-１の２つの新規なイソフォーム（本明細書においてＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃと称する）のうちの1つであることがわかった。
【０２３３】
ｐＥＧＦＰ-ＰＧＣ-１ａの１８６６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ＰＧＣ-１ｂのｃＤＮＡ（配列番号６）のヌクレオチド６４３〜１１００またはＰＧＣ-１cのｃＤＮＡ（配列番号12）のヌクレオチド６２０〜９７３に対応するＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ ＰＣＲフラグメントでそれぞれ置き換えることによって、ｐＥＧＦＰ-ＰＧＣ-１ｂおよびｐＥＧＦＰ-ＰＧＣ-１ｃを構築した。ベクターには、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech）を使用した。
【０２３４】
アデノウイルスベクターを構築するために、ＰＣＲを使用して、ＰＧＣ-１ａおよびＰＧＣ-１ｂのｃＤＮＡの第１のＡＴＧコドンの上流にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を導入した。次にそれぞれの全長ｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてｐＥＧＥＰベクターから切り出し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで切断したpShuttle-CMVにクローニングした。pShuttle-ＣＭＶ-ＰＧＣ-１ａ構築物もしくはpShuttleＣＭＶ-ＰＧＣ-１ｂ構築物とアデノウイルスバックボーンとの間のとインビボ組換えによって最終的なアデノウイルスベクターを得た（He, T. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514参照）。２９３細胞中でアデノウイルスを作製し、He, T.ら(1998)前掲に記載のように、２倍の塩化セシウム勾配によって精製した。
【０２３５】
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ（CellGro））を追加したＤＭＥＭ中サブ融合(subconfluent)培養中に維持した。細胞がコンフルエントに達したとき培養を分化培地（２％の加熱不活化ウマ血清を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies））に切り換えることによって、筋管中に分化が引き起こされた。完全な分化が観察されるまで(典型的には４日目まで)、毎日細胞に対して分化培地を添加した。次にこれらの細胞を、感染効率（ＭＯＩ）５００で、精製アデノウイルスに一晩感染させた。このＭＯＩは、ＧＦＰ発現アデノウイルスを用いた測定によれば、分化された筋管の約９０％を感染させるのに十分であった。
【０２３６】
免疫蛍光法
１×１０６個のＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、６ウェルプレートのカバーガラス上に播き、指示されたＧＦＰ融合蛋白質をコードする１μｇの発現ベクターを用いて、トランスフェクション試薬としてFugene 6(Roche Molecular Biochemicals)を用いて１８時間後トランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、そのカバーガラスをスライドガラス上に載せ、落射蛍光（epifluorescence）によって試験した。カタラーゼ染色するために、細胞を0.1% Triton-X100含有ＰＢＳ中に固定し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で３０分ブロックし、続いて、ヒトカタラーゼに対するヒツジポリクローナル抗体（The Binding Site、Binningham、U. K. )を用いて３７℃で１時間、またTexas-Red 結合２次抗体を用いてインキュベートした後、細胞を透過処理した。
【０２３７】
未処理細胞での呼吸測定
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を１００ｍｍのシャーレに播き、４日間筋管に分化させ、等ＭＯＩで異なるアデノウイルスによって感染させた。感染４８時間後、下記のようにして酸素消費を測定した。すなわち、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞リフターを用いてプレートから機械的に取り外し、５００Ｘｇで２分間遠心分離し、０．７５ｍｌの分化培地中に再懸濁させた。
【０２３８】
０．５ｍｌの細胞懸濁液を、３７℃に維持した１ｍｌのClark型酸素電極チャンバ（Rank Bros.、Bottisham、Cambridge、U. K.）に移し、空気飽和分化培地を用いて検量した。移した直後、約１０分間基礎呼吸を測定した。３２０ng/mlのオリゴマイシン（ミトコンドリアATPaseおよびホスホリル基転移のインヒビター）を添加することによって、状態４の（非リン酸化）呼吸を誘導し、定常状態の酸素消費に達した後、その速度を測定した。さらに１０分後、８μＭ ＦＣＣＰ（シアン化カルボニルトリフルオロメトキシフェニルメトラゾン、酸化的リン酸化の脱共役剤）を添加して、細胞中の脱共役呼吸を測定した。全呼吸速度を、各実験の最初に測定された基礎呼吸に対して相対的に表した。
【０２３９】
ノーザンブロット法
６０ｍｍシャーレ中で成長させた感染Ｃ２Ｃ１２筋管を１．５ｍｌのTrizol試薬（Life Technologies）中に溶解し、すべてのＲＮＡを製造元の指示にしたがって精製した。ＲＮＡを、ナイロン膜（ＩＣＮ）に移す前に１．２％アガロース/ホルムアルデヒドゲル上に溶解させた。製造元の指示にしたがってUltraHyb溶液（Ambion）中でハイブリダイゼーションを行った。いくつかのｃＤＮＡプローブについては、Wu, Z.ら (1999) Cell 98 (1) : 115-24に記載がある。下記のマウスｃＤＮＡフラグメントを用いたノーザンブロット分析のプローブとして、リポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ；GenBankアクセッションナンバー J03302）：４００ヌクレオチドフラグメント（コーディング領域の３’末端の４００ヌクレオチド）；FAT/CD36（GenBankアクセッションナンバー L23108）: ９６２ヌクレオチドフラグメント（ヌクレオチド６８６〜１６４７）；ＭＣＤ（GenBankアクセッションナンバー BC004764）：６９６ヌクレオチドフラグメント（ヌクレオチド８６０〜１５５５）；VLACS (GenBankアクセッションナンバー AJ223958)：９３４ヌクレオチドフラグメント（ヌクレオチド８６４〜１７９７））。ＡＯＸは、ラットｃＤＮＡ由来の1.4ｋｂフラグメント（GenBankアクセッションナンバー J02752）を用いて検出した。ＭＣＡＤ（GenBankアクセッションナンバー NM＿007382）は、全長ｃＤＮＡフラグメントを用いて検出した。
【実施例１】
【０２４０】
ＰＧＣ-１の２つの新規なイソフォームの同定
褐色脂肪特異的ＰＰＡＲγ転写促進型コアクチベータ(Puigserver, P.ら (1998) Cell 92 (6): 829-39; 米国特許第6,166,192号；PCT国際公開第WO 98/54220号)を同定する目的で、ＰＧＣ-１ａを酵母２-ハイブリッドスクリーニングにおいて、あらかじめ同定しておいた。ＰＧＣ-１ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号１および２にそれぞれ示す。ＰＧＣ-１ａのコーディング領域を配列番号３に示す。
【０２４１】
２つの短いＰＧＣ-１を現時点で同定した。本明細書においてＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃと称する、これらのクローンは、１８９３ヌクレオチドおよび１７４４ヌクレオチドをそれぞれ挿入していた（それぞれ配列番号６および配列番号１２）。ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂ、およびＰＧＣ-１ｃはそれらの5'領域全体において同じであった（各イソフォームの３’末端ＵＴＲの短い領域のヌクレオチドを除く；図６参照）が、ＰＧＣ-１ｂのヌクレオチド９６２(配列番号６)およびＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド９３９(配列番号１２)に対応するＰＧＣ-１ａのヌクレオチド９６４（配列番号１）の後が異なっていた。図５および７を参照されたい。これは、ヒトＰＧＣ-１ａゲノム配列のエキソン７および８の間の連結部に対応しており、このことは、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃが代替的なスプライシングから生じ得ることを示唆するものである。ＰＧＣ−１ｂおよびＰＧＣ-１ｃは、９６０ヌクレオチドおよび９００ヌクレオチドの予期された読み取り枠をそれぞれ含有し、したがって、ＰＧＣ-１ａにおいて同定されたＣ末端ＳＲおよびＲＲＭ ＲＮＡ処理モチーフが欠けている（Monsalve, M.ら (2000) Mol. Cell 6 (2): 307-16）。ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃによってコードされる蛋白質は、ＰＧＣ-１ａ蛋白質（配列番号２）と同一である。配列番号７（ＰＧＣ-１ｂ）および配列番号１３（ＰＧＣ-１ｃ）のアミノ酸残基１〜２９１にわたって同一であるが、それぞれ特有のＣ末端領域を含有する（図５および７参照）。
【実施例２】
【０２４２】
ＰＧＣ-１ｂの発現パターン
ＰＧＣ-１ｂの発現パターンを決定するために、３’末端のＰＧＣ-１ｂに特異的な領域の２つのオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＧＣ-１ｂの発現レベルを、定量的ｒｔ−ＰＣＲによって決定した。ｒｔ−ＰＣＲ分析の結果から、ＰＧＣ-１ｂは、心臓および視床下部において高度に発現され、一方、腎臓、骨格筋および褐色脂肪においては、中間程度の発現であった。白色脂肪または脾臓においては、シグナルは検出されなかった。発現パターンは、ＰＧＣ-１ａに記載のものと緊密に重なっている（Puigserver, P.ら (1998) Cell 92 (6): 829-39）。
【実施例３】
【０２４３】
ＰＧＣ-１ｂはミトコンドリア生合成または機能を促進しない
ＰＧＣ-１ａは、ミトコンドリア生合成およびＣ２Ｃ１２細胞中での呼吸を促進する（Wu, Z.ら (1999) Cell 98 (1) : 115-24）。ＰＧＣ-１ｂも同様であるかどうかを確認するために、ＧＦＰ（対照）、ＰＧＣ-１ａまたはＰＧＣ−１ｂのいずれかを発現させるアデノウイルスにＣ２Ｃ１２筋芽細胞（分化の５日目）感染させた。感染４８時間後に酸素消費を測定した。ＰＧＣ-１ａは、総合的な呼吸およびオリゴヌクレオチド依存性の呼吸、ならびに全体的なミトコンドリア容量（脱共役剤ＦＣＣＰの存在下における酸素消費によって評価される）を刺激したが、一方、ＰＧＣ-１ｂ発現は、これらの変数のいずれにも有意な影響を及ぼさなかった。
【０２４４】
ＰＧＣ-１ａのミトコンドリア呼吸への影響はそれが呼吸鎖の成分（Ｂ ＡＴＰシンセターゼ、ＣｙｔＣ、ＣｏｘＩＩおよびＣｏｘＩＶ）を誘導する能力に関連付けられた。ミトコンドリア呼吸に対する影響がないことから、ＰＧＣ-１ｂは、呼吸鎖遺伝子のいずれの発現も刺激しなかったし、ミトコンドリア生合成に関与する２つの重要な要因であるｍＴＦＡまたはＮＲＦ-１を形成するｍＲＮＡを誘導しなかった。
【０２４５】
ＰＧＣ-１ａはミトコンドリア生合成および、共活性化ＮＲＦ−１による複数の呼吸器遺伝子の誘導を組織化する(Wu, Z. ら(1999) Cell 98 (1) :115-24)ので、ＰＧＣ-１ｂが過渡的なトランスフェクションにおいて、この転写因子を共活性化する能力を調べた。しかしながら、ＰＧＣ-１ｂがＮ末端転写活性化ドメインを含有し、転写因子相互作用モチーフの大半がＰＧＣ-１ａに存在するという事実にもかかわらず(Puigserver, P. ら. (1999) Science 286 (5443): 1368-71)、それはＮＲＦ−１レポーター遺伝子を活性化することができなかった。
【０２４６】
上記データに基づけば、ＰＧＣ-１ｂが全長ＰＧＣ-１ａの不活性変異体であると思われるという事実から、それがＰＧＣ-１ａのドミナントネガティブレギュレータとして作用し得るか否かの評価の必要性が生じた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、一定ＭＯＩのＰＧＣ-１ａアデノウイルスで、およびＭＯＩを増量させながら、ＧＦＰ(対照として)またはＰＧＣ-１ｂウイルスで感染させた。ＰＧＣ-１ｂの発現を増加させることによって、チロクロムＣ、ＮＲＦ−１/ＰＧＣ-１ａ複合体の直接的な標的の誘導を阻害することはなかった、
【０２４７】
これらの結果を総合すれば、ＰＧＣ-１ｂは、直接的にも、ＰＧＣ-１ａとの相互干渉を介しても、ミトコンドリア生合成または機能に影響を及ぼさず、ＰＧＣ-１ｂは、ＰＧＣ−１ａの役割とは異なる特異的な機能を持つことを示唆するものである。
【実施例４】
【０２４８】
ＰＧＣ-１ｂはペルオキシソームに局在化される
Ｎ末端活性化ドメインおよび転写活性ファクター相互作用モチーフの大半の存在にもかかわらず、ＰＧＣ-１ｂが公知のＰＧＣ-１ａ標的遺伝子を活性化することができないことによって、その細胞下局在の試験が促進された。ＧＦＰ-ＰＧＣ-１ｂ融合蛋白質を細胞質に局在化したところ、ＧＦＰ-ＰＧＣ-１ａおよびＧＦＰ-ＰＧＣ‐１ｃとで観察される核および細胞質局在化とは対照的に、顕著な点状パターンを示した。なぜなら、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃは、これらの特有のＣ末端のみが異なるため、ＰＧＣ-１ｂの特有のＣ末端は、その点状の局在を細胞質内に示すものと仮定される。この仮定を直接的に調べるために、ＰＧＣ-１ｂのＣ末端の２９個のアミノ酸（配列番号７、配列番号１０に示されている、アミノ酸残基２９２〜３２０）をＧＦＰに融合した。その得られた融合蛋白質は、細胞質に点として局在化され、このことは、これらの２９個のアミノ酸は、ＰＧＣ-１ｂの点状の局在化を導くのに十分であることを示すものである。
【０２４９】
Ｃ末端ドメインに独特のＰＧＣ-１ｂの分析によって、酵素ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ中に認められるペルオキシソーム局在化シグナルに類似するカルボキシ末端トリペプチド（配列番号７の残基３１８〜３２０、および配列番号１０の残基２７〜２９）の存在が明らかになった（Ser-Asn-Leu-COOH; Amery, L.ら(1998) Biochem. J. 336 (Pt. 2): 367-71）。
【０２５０】
点状局在がペルオキシソームに対応するかどうかを確認するために、ＧＦＰ−ＰＧＣ‐１ｂによってトランスフェクトされた細胞をペルオキシソームのマーカーカタラーゼに特異的な抗体で染色した。この分析結果によれば、ＧＦＰ−ＰＧＣ‐１ｂおよびカタラーゼシグナルが着色され、それによってＰＧＣ-１ｂが実際にペルオキシソームに標的化されることが実証された。最終的にＰＧＣ-１のアミノ末端領域に特異的な抗体を用いることで、ペルオキシソーム局在化がＰＧＣ-１ｂの非標識形態によって確認された。この分析はさらに、ＰＧＣ-１ｂが完全に分化されたＣ２Ｃ１２筋管におけるペルオキシソームに局在化されたままであることを示していた。
【実施例５】
【０２５１】
ＰＧＣ-１ｂが脂肪酸取り込みおよび酸化に関与する遺伝子を誘導する
ＰＧＣ-１ｂのペルオキシソーム局在は、脂肪酸酸化遺伝子のレギュレータとしての潜在的関与の試験を促進した。完全に分化したＣ２Ｃ１２筋管におけるＰＧＣ-１ｂの発現は、重要な調節遺伝子のパネルを脂肪酸代謝経路に沿って誘導した。すなわち、循環するカイロミクロンの核となるトリグリセリドを加水分解するリポ蛋白質リパーゼ（ＬＰＬ）；長鎖脂肪酸の特別な蛋白質の促進膜輸送系の一部である、脂肪酸転移酵素（ＦＡＴ／ＣＤ３６）；ペルオキシソームの非常に長い鎖の脂肪酸の輸送に関与するペルオキシソーム膜蛋白質である、非常に長い鎖のアシルＣｏＡシンセターゼ（ＶＬＡＣＳ）；ペルオキシソーム脂肪酸酸化の速度制限酵素であるアシルＣｏ−Ａオキシダーゼ（ＡＯＸ）；ミトコンドリア脂肪酸の酸化における中枢のステップを触媒する、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）；およびその作用がマロニル‐ＣｏＡ、脂肪酸酸化を促進する酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ−１）のアロステリックなインヒビターの定常レベルを低下させる、マロニル‐ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＤ）を誘導した。これらの遺伝子のいくつかは、ＰＧＣ-１ｂ（ＬＰＬおよびＡＯＸ）によって特異的に誘導され、一方の他の遺伝子はＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ａ（ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＶＬＡＣＳ、ＭＣＤおよびＭＣＡＤ）によって活性化された。
【０２５２】
肝臓でのこれらの遺伝子の大半の誘導におけるＰＰＡＲαの役割、およびＰＧＣ-１ａがＰＰＡＲαを共活性化するという事実（Vega, R. B.ら (2000) Mol. Cell. Biol. 20 (5): 1868-76）にもかかわらず、ＰＰＡＲαリガンドＷＹによる治療は、飽和用量においてさえ、それらの発現のさらなる刺激を何ももたらさなかった。これらの結果は、ＰＰＡＲαを過剰発現させるＣ２Ｃ１２筋芽細胞において確認された。ＷＹリガンドによる治療は、ＰＰＡＲα標的のいくつか(例えば、ＵＣＰ３)を誘導しうるにもかかわらず、ＰＧＣ-１ｂが媒介する遺伝子活性とＰＰＡＲαの間には何の協同性も観察されなかった。Ｃ２Ｃ１２細胞で、ＰＧＣ-１ｂがＡＯＸおよびＬＰＬをＰＰＡＲａ依存的に活性化することを示唆するものである。
【０２５３】
等価物：  当業者であれば、ルーチンの実験法を用いるのみで、本明細書に記載された特定の態様および方法の数多くの等価物を認識し、または確かめることができるであろう。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】図１は、ＰＧＣ-１ｂのヌクレオチド配列(配列番号６)を示す。特有の領域に下線を施した。
【図２】図２は、ＰＧＣ-１ｂのアミノ酸配列(配列番号７)を示す。特有の領域に下線を施した。
【図３】図３は、ＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド配列(配列番号１２)を示す。特有の領域に下線を施した。
【図４】図４は、ＰＧＣ-１ｃのアミノ酸配列(配列番号１３)を示す。特有の領域に下線を施した。
【図５】図５は、ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の間の構造的関係を示す。共通のヌクレオチド領域（その大半は図の上部に示されている）は、配列番号１のヌクレオチド６２〜９６４（ＰＧＣ-１ａ）、配列番号６のヌクレオチド６０〜９６２（ＰＧＣ-１ｂ）および配列番号１２のヌクレオチド３７〜９３９（ＰＧＣ-１ｃ）に対応する。5'非翻訳領域（開始コドンの直前）の最後の３０ヌクレオチドのみが示されている。共通のアミノ酸配列(配列番号５)は、配列番号２（ＰＧＣ-１ａ）、配列番号７（ＰＧＣ-１ｂ）および配列番号１３（ＰＧＣ-１ｃ）のアミノ酸残基１〜２９１に対応する。ＰＧＣ-１ａの特異的配列は、配列番号１のヌクレオチド９６５〜３０６６および配列番号２のアミノ酸残基２９２〜７９７に対応する（しかしながら、ＰＧＣ-１ａの特異的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図示していない）。ＰＧＣ-１ｂの特異的配列は、配列番号６のヌクレオチド９６３〜１８９３（配列番号９として記載）および配列番号７のアミノ酸残基２９２〜３２０（配列番号１０として記載）に対応する。ＰＧＣ-１ｃの特異的配列は、配列番号１２のヌクレオチド９４０〜１７４４（配列番号１５として記載）および配列番号１３のアミノ酸残基２９２〜３００（配列番号１６として記載）に対応する。
【図６】図６は、ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃの5'ＵＴＲの配列を示す。これは、配列番号１のヌクレオチド１〜９１（ＰＧＣ-１ａ）、配列番号６のヌクレオチド１〜８９（ＰＧＣ-１ｂ）および配列番号１２のヌクレオチド１〜６６（ＰＧＣ-１ｃ）に対応する。
【図７】図７は、ＰＧＣ-１ａ、ＰＧＣ-１ｂおよびＰＧＣ-１ｃのヌクレオチド配列間の構造的関係を示す模式図である。コーディング領域をボックスで示している。オープンボックスは、すべてのイソフォームに共通のコーディング領域であり、ハッチングを施したボックスは各イソフォームに特有のコーディング領域を示す。破線は、各イソフォームの間の分岐点を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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