(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法であって、
前記微生物は、ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで該ラクトアルデヒドレダクターゼの活性が付与又は強化されており、且つ、該微生物が本来有しているグリコール酸オキシダーゼ活性が不活化或いは低減されている、且つ／またはピルベートホルメートリアーゼ活性が不活化または低減されており、
前記脂肪族多価アルコール類が、エチレングリコール、グリセロール及びジエチレングリコールのいずれかであることを特徴とするヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
【請求項２】
前記微生物は、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能するプロモーターと機能的に連結することで該ラクトアルデヒドレダクターゼを発現することを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記微生物は、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼ及びラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで該ラクトアルデヒドレダクターゼ及び該ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの両活性がそれぞれ付与又は強化されており、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子及び前記ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能するプロモーターと機能的に連結することで該ラクトアルデヒドレダクターゼ及び該ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをそれぞれ発現することを特徴とする請求項２に記載のヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
【請求項４】
解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能する前記プロモーターが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターであることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の生産方法。
【請求項５】
ヒドロキシカルボン酸が光学活性を有するヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の生産方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の生産方法に利用される微生物。
【請求項７】
請求項１〜４に記載の生産方法を利用することにより、エチレングリコールを基質として収率９５％以上、生産速度２ｇ／L／時間以上でグリコール酸水溶液を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸を生産する微生物と、それを用いたグリコール酸を始めとするヒドロキシカルボン酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシカルボン酸類の中にはポリマー原料や医薬中間体として有用で、その効率的な生産方法が求められているものがある。
【０００３】
その一例としてグリコール酸（α―ヒドロキシ酢酸）が挙げられる。グリコール酸は、洗浄剤や化粧品原料として利用されてきたが、近年、ガスバリア性ポリマーや医療用ポリマーとして有用なポリグリコール酸の原料として注目されている。ガスバリア性材料として注目されている理由はポリグリコール酸層は、高い酸素ガスバリア性を有しており、酸素の存在下で変質しやすい食品や炭酸飲料を包装するための材料としての性能を備えているからである。
【０００４】
将来的にポリグリコール酸が工業的規模で実生産されるためには、その原料であるグリコール酸が高純度かつ安価に供給されねばならない。しかしながら現行市販されている化学合成品のグリコール酸は少なからず夾雑物を含んでおり、ポリマー原料としては純度的に問題がある。なぜならこれらの夾雑物はグリコール酸の脱水縮合反応を阻害するのみならず、夾雑物の一つであるメトキシ酢酸が発癌性の疑いのある化合物であり、食品や飲料の包材中に含まれることが望ましくないからである。無論、精製によって夾雑物を除くことは技術的には可能であるが、実際にそのような精製品は価格が高くなり、安価な包材原料としては現実的でない。
【０００５】
化学合成品のグリコール酸に見られる上記の問題点を回避するため、エチレングリコール（以下、ＥＧと呼ぶことがある）を原料としたバイオ法によるグリコール酸製造の試みが行われている。特開平１０−１７４５９３号公報及び特開平１０−１７４５９４号公報において、エチレングリコール含有培地に、ピシア（Pichia）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、トルロプシス（Torulopsis）属に属する酵母、ノカルディア（Nocardia）属に属する菌株、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する菌株、またはエシェリヒア・コリＢ（Escherichia
coli B）株を培養し、培養液中からグリコール酸を分離・採取することを特徴とする微生物によるグリコール酸の生産方法が開示されている。なおエシェリヒア・コリＫ１２（Escherichia
coli K12）株についてはグリコール酸の収率が低いことが開示されている。特開平１０−１７４５９３号公報及び特開平１０−１７４５９４号公報の実施例に記載されているグリコール酸生産方法の中でグリコール酸蓄積濃度が最も高いものは、ピシア・ナガニシイ（Pichia
naganishii）を用いた方法であり、３０時間の反応で３５．３ｇ／Ｌのグリコール酸が得られている。ピシア・ナガニシイを用いたグリコール酸生産については更に、反応条件の改善がなされ、１２０時間の反応で１０５ｇ／Ｌのグリコール酸が得られることが文献（Kataoka,M.,et.al.,Biosci.Biotechnol.
Biochem.,Vol.65(10),pp.2265-2270(2001)）で報告されている。要するにピシア・ナガニシイを用いた生産方法では、エチレングリコールからグリコール酸への反応時間が１２０時間と長く、このことはグリコール酸の製造コストの上昇を招来するため工業規模的実生産を想定した場合には更なる反応時間の短縮が必要であった。そしてさらにこの生産方法においては使用する微生物が生産する副生有機酸が混入し、その後の精製工程や脱水縮合反応に支障をきたすという問題点も存在した。
【０００６】
微生物によるエチレングリコールからグリコール酸に至る代謝反応については、ボロナットらがエシェリヒア・コリを用いた研究結果を開示している（Boronat,A.,et.al.,
J. Bacteriol., Vol. 153 (1), pp.134-139, (1983)）。すなわちエチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応と、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応の二段階の代謝経路である。ボロナットらは、１，２−プロパンジオール（以下ＰＤＯと呼ぶことがある）からラクトアルデヒドへの反応触媒酵素プロパンジオールオキシドレダクターゼ（以下、ＰＤＯ酸化還元酵素と呼ぶことがある）が、エチレングリコールをも基質とすることに着目した（Boronat,A.,et.
al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 672, pp.98-107, (1981)）。ＰＤＯ酸化還元酵素活性が突然変異により向上した菌株の中から、グリコールアルデヒドからグリコール酸への反応触媒酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＬ脱水素酵素と呼ぶことがある）活性が向上した菌株を単離したのである。なお以下の表（表１）は、ボロナットらの論文から引用したものである。
【０００７】
【表１】
0004523939.tif 000002
【０００８】
対象株エシェリヒア・コリＧ１株は１，２−プロパンジオールとエチレングリコールのどちらも資化できない。それに対してＰＤＯ酸化還元酵素活性が顕著に向上した突然変異株であるＧ３株はＰＤＯ資化能を獲得したが、依然ＥＧを資化できなかった。この結果に基づいてボロナットらは、Ｇ３株がＥＧを資化できない理由は、ＧＡＬ脱水素酵素活性が不十分なためにグリコールアルデヒドからグリコール酸の反応が進まないためではないかと推論した。そしてＧＡＬ脱水素酵素活性が顕著に向上した突然変異株ＥＧ３株を単離し、この株がＥＧを資化することから、彼等の推論が正しいと結論した。換言すれば、ボロナットらはＥＧからグリコール酸を生成するためには、ＧＡＬ脱水素酵素活性が十分に存在していなくてはならないと主張しているのである。
【０００９】
それに対して本明細書で開示している新たな知見は、ＥＧからグリコール酸を生成するためには、ＧＡＬ脱水素酵素の活性向上は必ずしも必要ではなく、ＰＤＯ酸化還元酵素の活性向上のみで良いというものである。このような差異が生じた原因としては、ボロナットらがＥＧ３株においてＧＡＬ脱水素酵素活性の向上のみに着目し、ＰＤＯ酸化還元酵素活性も同時に向上していることに注意を払わなかったことが挙げられる。我々の知見に基づいてボロナットらの実験結果を考察し直せば、ＥＧ３株がＥＧ資化能を獲得できたのは、ＧＡＬ脱水素酵素の活性が向上したからではなく、ＰＤＯ酸化還元酵素の活性が向上したからであるということになる。
【００１０】
さらにボロナットらの報告の中では、ＥＧ３株においては基質であるＥＧと共にグリコール酸が存在する条件下では中間体であるグリコールアルデヒドが蓄積することが示されている。このことはつまりエシェリヒア・コリを用いたバイオ法によってＥＧを原料としてグリコール酸を製造した際には、中間体のグリコールアルデヒドが夾雑物として蓄積するという不具合が生じることを示している。
【００１１】
以上のことから過去の知見においては、エシェリヒア・コリを用いてＥＧからグリコール酸を製造する際には、ＧＡＬ脱水素酵素の活性向上が必要不可欠であること、および製造したグリコール酸には中間体のグリコールアルデヒドが蓄積することが示されている。そのような理由から、ＧＡＬ脱水素酵素活性の向上なしに、グリコール酸を選択的に製造可能であること、さらには中間体グリコールアルデヒドを含まない効率のよいグリコール酸製造が可能であるということは当業者といえども容易には推測できないことであった。
【００１２】
グリコール酸以外のヒドロキシカルボン酸の例として、グリセリン酸についても種々製法検討がなされてきた。なかでも、安価なグリセロールを原料としてグリセリン酸を製造する方法については、特開平５―３３１１００号公報においてPt触媒を用いた化学合成法、特開平１―１６８２９２号公報においてグルコノバクター（Gluconobacter）属微生物によるバイオ法が開示されている。前者のPt触媒を用いる方法では反応の選択率が８０％程度と決して十分ではなく、相当量の副生物が生じること、さらに反応温度を厳密に制御する必要性が示されている。後者のバイオ法においてはグリセリンを原料としたD−グリセリン酸の製法が記載されていが、この製法では菌体の調製ならびに反応に４日間という長時間を要することが問題点として挙げられ、また製造したグリセリン酸中には使用した微生物由来の副生有機酸が相当量混入することが容易に想像できる。ちなみにL−グリセリン酸の製造方法に関しては知られていない。
【００１３】
さらにヒドロキシカルボン酸の一例としてヒドロキシエトキシ酢酸のバイオ法による製造については特開昭５９−８５２９６号公報においてジエチレングリコール含有培地に、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する酵母を培養し、培養液中からヒドロキシエトキシ酢酸を分離・採取する方法が開示されている。この生産方法においては培養に長時間を要することと、さらには相当量のジグリコール酸が副生することが示されており、ヒドロキシエトキシ酢酸の分離・精製に多大な労力を要することが容易に想像される。
【００１４】
【特許文献１】
特開平１０−１７４５９３号公報
【特許文献２】
特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献３】
特開平５−３３１１００号公報
【特許文献４】
特開平１−１６８２９２号公報
【特許文献５】
特開昭５９−８５２９６号公報
【非特許文献１】
Kataoka, M., et. al., Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 65(10),pp.2265-2270, (2001)
【非特許文献２】
Boronat, A., et.al., J. Bacteriol., Vol. 153 (1), pp.134-139, (1983)
【非特許文献３】
Boronat, A., et.al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 672,pp.98-107,(1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
以上のとおり、従来のグリコール酸をはじめとする各種ヒドロキシカルボン酸の生産法の欠点は、総じて化学合成法では得られるヒドロキシカルボン酸が多くの夾雑物を含み純度が低いことであり、バイオ法では反応時間が長く生産設備の単位時間当たりの生産性が低くなり生産コストが高くなり、また副生有機酸が混入することである。
以上の点に鑑み、本発明の解決するべき課題は、グリコール酸をはじめとするヒドロキシカルボン酸類を短時間で安価に且つ大量に供給し、かつ副生物を低減させ純度を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するための改善策として、従来のバイオ法でのグリコール酸の生産に使用されていた自然界から選別された微生物の代替として、エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入する手法などにより改変された、該酵素の活性のみを十分に強化した微生物を利用して、エチレングリコールからグリコール酸を生産する方法が本発明の目的に適うことを見出した。そして更にエチレングリコールからグリコールアルデヒドの反応を触媒する酵素と、グリコールアルデヒドからグリコール酸の反応を触媒する酵素の両活性を、２種の該酵素をコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで強化した微生物を利用することで、エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素のみを強化した微生物に比べ菌体の培養に要するグルコース量を削減することができるという予想し得なかった好ましい効果を見出した。さらに、上記の微生物に関してグリコール酸からグリオキシル酸の反応を触媒する酵素、かつ／またはピルビン酸からギ酸の反応を触媒する酵素の活性を低減させることで、シュウ酸や酢酸といった副生有機酸の低減が可能となり、より純度の高い（副生有機酸の少ない）グリコール酸を生産可能であること、さらに詳細は不明であるがこれら２種の酵素活性低減により、細胞内の状況がよりグリコール酸生産に好適となりグリコール酸生産性が有意に向上することを見出した。またこれらの微生物はグリコール酸以外のヒドロキシカルボン酸を生産する方法へも利用可能であることを見出した。
【００１７】
即ち、本発明は以下の〔１〕から〔７〕に記載のとおりである。
〔１〕  微生物を利用することを特徴とする、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類を基質としたヒドロキシカルボン酸類の生産方法であって、
前記微生物は、ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで該ラクトアルデヒドレダクターゼの活性が付与又は強化されており、且つ、該微生物が本来有しているグリコール酸オキシダーゼ活性が不活化或いは低減されている、且つ／またはピルベートホルメートリアーゼ活性が不活化または低減されており、
前記脂肪族多価アルコール類が、エチレングリコール、グリセロール及びジエチレングリコールのいずれかであることを特徴とするヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
〔２〕  前記微生物は、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能するプロモーターと機能的に連結することで該ラクトアルデヒドレダクターゼを発現することを特徴とする〔１〕に記載の生産方法。
〔３〕  前記微生物は、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼ及びラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をプラスミドの形態で導入することで該ラクトアルデヒドレダクターゼ及び該ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼの両活性がそれぞれ付与又は強化されており、
前記ラクトアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子及び前記ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能するプロモーターと機能的に連結することで該ラクトアルデヒドレダクターゼ及び該ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼをそれぞれ発現することを特徴とする〔２〕に記載のヒドロキシカルボン酸類の生産方法。
〔４〕  解糖系、核酸生合成系、又はアミノ酸生合成系に関わるタンパク質の発現を司る遺伝子のプロモーターのうち恒常的に前記微生物内で機能する前記プロモーターが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターであることを特徴とする〔２〕又は〔３〕に記載の生産方法。
〔５〕  ヒドロキシカルボン酸が光学活性を有するヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕の何れか一項に記載の生産方法。
〔６〕  〔１〕〜〔５〕の何れか一項に記載の生産方法に利用される微生物。
〔７〕  〔１〕〜〔４〕に記載の生産方法を利用することにより、エチレングリコールを基質として収率９５％以上、生産速度２ｇ／L／時間以上でグリコール酸水溶液を得る方法。
【００１８】
本発明により夾雑物の少ないグリコール酸をこれまでに知られているよりもはるかに短時間で高生産する微生物が創出され、ポリマー原料用途として使用可能な高純度なグリコール酸を安価に工業生産することが可能となる。また上記生産方法を応用することでグリコール酸以外のヒドロキシカルボン酸の生産も可能である。
【００１９】
またグリコール酸生産に関しては、公知情報と相反して活性を強化するべき標的酵素が１種類のみでグリコール酸の高生産が可能となることから、酵素活性の強化に必要となる労力を低減させるとともに、人為的な複数種の酵素活性の強化のために生じるストレスによる導入遺伝子の脱落をはじめとする宿主微生物への好まざる悪影響を回避することが可能となる。
【００２０】
またヒドロキシカルボン酸類の生産に供する微生物の培養に必要なグルコースを低減させることでより製造コストの低減させる手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例３における反応液中のグリコール酸蓄積量の経時変化を示したグラフである。図中、三角はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株の結果を示し、丸はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株の結果を示す。
【図２】実施例４における反応液中のグリコール酸蓄積量の経時変化を示したグラフである。図中、四角はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株の結果を示し、丸はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株株の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明を詳しく説明する。
【００２３】
本発明においてエチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素とは、エチレングリコールを反応基質としてグリコールアルデヒドを生成し得る酵素であれば特に制限はなく、そのような酵素全てを指す。そのようなものとして、ラクトアルデヒドレダクターゼが例示される。
【００２４】
本発明においてある標的酵素の活性を付与した微生物とは、該酵素活性を全く有していない該微生物に何らかの方法によって該酵素活性が与えられた微生物を指し、本発明においてある標的酵素の活性を強化した微生物とは、野生型の該微生物と比較して有意に該酵素の活性が向上している微生物を指す。これらの微生物は、例えば該酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に導入する等の方法を用いて作出することができる。野生型の微生物（又は組換え前の微生物）に該遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子をプラスミドの形態で微生物に導入することが例示できる。微生物への遺伝子の導入に用いられるゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ(Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook,J.,et.al.,"Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Second Edition",ColdSpring Harbor Laboratory
Press, (1989)等に記載されている。
【００２５】
本発明において微生物とは、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を本来有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールからヒドロキシカルボン酸を生産する能力を有し得る微生物の総称を意味する。このようなものとしてエシェリヒア・コリが例示される。
【００２６】
本発明において、末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコール類とは、炭素鎖の末端に水酸基を有し、かつ分子内に２つ以上の水酸基を有する脂肪族化合物であればその構造に特に制限はないが、そのような化合物としてエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、グリセロール、１,３−プロパンジオール、１,２−ブタンジオール、１,３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、１,２,４−ブタントリオールなどが例示できる。
【００２７】
本発明においてある標的酵素をコードする遺伝子を微生物に導入するにあたっての「プラスミドの形態で」とは該遺伝子をベクターに連結し組換えプラスミドを作成し、これを形質転換等の方法で該微生物に導入する事を意味する。また本発明の実施例記載のように恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターと目的遺伝子を機能的に連結した際には、プラスミドが有するレプリコンの性質により微生物細胞当たりのコピー数が一般的に少ないといわれるプラスミドを利用することでも本発明の目的を達し得る。そのようなレプリコンを有するプラスミドとしてｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０３）などが例示できる。
【００２８】
本発明においてグリコールアルデヒドからグリコール酸への反応を触媒する酵素とは、グリコールアルデヒドを反応基質としてグリコール酸を生成し得る酵素であれば特に制限はなく、そのような酵素全てを指す。そのようなものとして、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが例示される。
【００２９】
本発明における解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
【００３０】
本発明におけるプロモーターとはσ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されている。
【００３１】
本発明において、遺伝子が機能的にプロモーターと連結しているとは、当該遺伝子がプロモーターの制御下にあり、遺伝子の発現がプロモーターの制御によりなされるように該遺伝子とプロモーターが結合していることを意味する。
【００３２】
本発明におけるラクトアルデヒドレダクターゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．７７に分類され、１．２−プロパンジオールから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でラクトアルデヒドを生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
【００３３】
本発明におけるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２２に分類され、ラクトアルデヒドから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で乳酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指し、且つ国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．２．１．２１に分類され、グリコールアルデヒドから、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でグリコール酸を生成する反応を触媒する酵素グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼの総称も併せて指すものである。なぜならば大腸菌を用いた先行文献で、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼとグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは同一の酵素であることが報告されているからである（Caballero,E.,et.al.,J.Biol.Chem.,258(12),7788-7792(1983)）。
【００３４】
本発明におけるグリコール酸オキシダーゼ（以下ｇｌｃＤＥＦと呼ぶことがある）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．３．１５に分類され、グリコール酸からグリオキシル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
【００３５】
本発明におけるピルベートホルメートリアーゼ（以下ｐｆｌＢと呼ぶことがある）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．５４に分類され、ピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
【００３６】
本発明におけるｇｌｃＤＥＦやｐｆｌBの酵素機能の不活化とは、その酵素活性が完全に消失することを意味する。本発明におけるｇｌｃＤＥＦやｐｆｌＢの酵素機能の低減とは、その酵素活性の一部が消失することを意味する。酵素機能を不活化、或いは低減するには、そのタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入するか、欠失させる、あるいはそのタンパク質を特異的に不活化する薬剤を添加する、紫外線を照射する、などの方法がある。具体的にはエシェリヒア・コリＭＴ−１１０２３株がｇｌｃＤＥＦ遺伝子とｐｆｌＢ遺伝子の破壊によりこれらの酵素機能が不活化した微生物として例示できる。
【００３７】
エシェリヒア・コリＭＴ−１１０２３株は遺伝子破壊によりｇｌｃＤＥＦ、ｐｆｌＢが不活化しているため、これを用いて容易に本発明を実施することが可能である。本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ―１０２９３の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、特許手続き上の微生物の寄託等の国際承認に関するブタペスト条約に基づいて、平成１７年３月１０日より寄託されている。
【００３８】
本発明の生産方法を実施するに際しては、通常エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの反応を触媒する酵素の活性を付与又は強化した微生物を培地を用いて培養して増殖させて必要量の微生物菌体を得る。
【００３９】
本発明に係る培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する培地であれば特に制限は無い。炭素源としては、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
なお、本発明に係る培養に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
【００４０】
本発明に係る微生物の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば、好気条件下でｐＨ６〜８、温度２５℃〜４０℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は５０時間以内である。
【００４１】
本発明に係るヒドロキシカルボン酸生産反応に使用される反応液は基質となる末端に水酸基を有する脂肪族多価アルコールを添加し得る（或いは含有する）液体であれば特に制限はなく、リン酸カリウム緩衝液などの緩衝液や、前述の微生物の培養に用いた培地、及び純水を例示することができる。本発明においてはこのような液体に先に培養により得られた微生物菌体を接触させて反応を行う。微生物菌体は、培養が終わった培養液そのものを使用する外、培養液から菌体のみを回収して使用する方法が例示できる。
【００４２】
本発明のヒドロキシカルボン酸類の生産方法における反応に際して、反応条件は特別の制限はないが、例えば、ｐＨ６〜９、温度２０℃〜４０℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら反応することが好ましい。
【００４３】
以上のようにして得られた反応液液中に蓄積したヒドロキシカルボン酸を回収する方法としては、特に制限はないが、例えば反応液から菌体を遠心分離などで除去した後、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法でヒドロキシカルボン酸を分離する方法が採用できる。
【実施例１】
【００４４】
エシェリヒア・コリ由来ラクトアルデヒドレダクターゼ発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。ｆｕｃＯを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号１）、及びＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。さらに、グリセルアルデヒド  ３−リン酸脱水素酵素(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号３）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯを回収した。このプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することによりＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を得た。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、エシェリヒア・コリＤＨ５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【実施例２】
【００４５】
ラクトアルデヒドレダクターゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ同時発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築
エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドレダクターゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ｆｕｃＯと略することがある）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。またエシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６４５４１）。ｆｕｃＯを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号５）、及びＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。さらに、ａｌｄＡを取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣ（配列番号６）、及びＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧ（配列番号７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化することで約１．５ｋｂｐのａｌｄＡフラグメントを得た。さらに実施例１と同様にしてグリセルアルデヒド  ３−リン酸脱水素酵素(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)（ＧＡＰＤＨ）プロモーターをコードするフラグメントを得た。上記の３つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡを回収した。このプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することによりＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株を得た。
【実施例３】
【００４６】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株によるグリコール酸生産
前培養として三角フラスコに入れたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬに実施例１において得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株を植菌し、一晩、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。各々の前培養液全量を、表２（表２）に示す組成の培地４７５ｇの入った１L容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量１ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２で洗浄後、同緩衝液で懸濁し最終液量を５００ｍｌとした。懸濁液をＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に移し、エチレングリコールを５ｇ／時間の速度で添加し、２２時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量１ｖｖｍ、撹拌速度８００ｒｐｍ、反応温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。得られた反応液中のグリコール酸蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を図１（図１）に示す。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株において２２時間で１０６ｇ／Lのグリコール酸の蓄積が確認され、エチレングリコールからグリコール酸に至るまでの中間体であるグリコールアルデヒドは検出されなかった。一方野生株では反応２２時間後においてもグリコール酸は検出されなかった。
【００４７】
【表２】
0004523939.tif 000003
【実施例４】
【００４８】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株によるグリコール酸生産
実施例２で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株を実施例３と同様に培養した。培養開始後２４時間以降、培養中の培養槽に直接エチレングリコールを５ｇ／時間の速度で２２時間添加することで反応を行った。得られた培養液中のグリコール酸蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を図２（図２）に示す。
【００４９】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株において、エチレングリコール添加開始後２２時間で１１０ｇ／Lのグリコール酸の蓄積が確認され、エチレングリコールからグリコール酸に至るまでの中間体であるグリコールアルデヒドは検出されなかった。一方野生株ではエチレングリコール添加開始後２２時間においてもグリコール酸は検出されなかった。
【実施例５】
【００５０】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ａｌｄＡ欠失株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子（以下、ａｌｄＡと略することがある）の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６４５４１）。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡのａｌｄＡ近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣ（配列番号８）とＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＧＡＡＴＣＧ（配列番号９）、ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧ（配列番号１０）とＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧ（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化することにより、それぞれ約８００ｂｐ、７００ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩ、ＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
【００５１】
このプラスミドをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【００５２】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、薬剤を含まないＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりａｌｄＡを含む約３．２ｋｂ断片を増幅させ、ａｌｄＡが欠失している株を選抜し、得られた株をＭＧ１６５５ａｌｄＡ欠失株（以下△ａｌｄＡと略することがある）と命名した。
【実施例６】
【００５３】
△ａｌｄＡ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株の構築
実施例１において得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯを実施例５において得られた△ａｌｄＡ株、に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することで△ａｌｄＡ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を得た。
【００５４】
△ａｌｄＡ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株によるグリコール酸生産
実施例３と同様に△ａｌｄＡ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株をそれぞれ培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例３と同様にエチレングリコールを添加し、１０時間反応を行った。反応により△ａｌｄＡ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株において６４.８ｇ、ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株において６４．２ｇのグリコール酸蓄積が確認された。グリコール酸の生産にラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼが必ずしも必要ないことが示された。
【実施例８】
【００５５】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株の菌体増殖比較
実施例２で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株、実施例１で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を実施例３と同様に培養した。ただし表１（表１）に示す培地組成のうちグルコース量を７０ｇ／Ｌとして実施した。２４時間培養した後、全培養液を遠心分離することで集菌し得られた湿菌体重量を測定した。また、培地中の残存グルコース量を定法に従って測定し、菌体の増殖に要したグルコース量を算出した。結果を表３（表３）に示す。
【００５６】
２種類の菌株間で得られた菌体重量はほぼ同様であるにもかかわらず、その際に必要とするグルコース量がＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ−ａｌｄＡ株において二割以上少なくてすむことが示された。実施例７においてグリコール酸生産においてラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼは必ずしも必要無い事を示したが、該酵素活性の強化によってグリコール酸生産において必要となるグルコース量の低減に効果があることが確認された。
【００５７】
【表３】
0004523939.tif 000004
【実施例９】
【００５８】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム上ｆｕｃＯプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｆｕｃＯの塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３１０５９）。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｆｕｃＯの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＡＣＧ（配列番号１２）とＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＡＴＧＧＡＡＣＧ（配列番号１３）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約６５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００５９】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号１４）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｆｕｃＯの配列情報に基づいて作製されたＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣ（配列番号１５）を用いて、実施例１で作製した発現ベクターｐＧＡＰｆｕｃＯを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｆｕｃＯの開始コドン近傍領域からなる約７３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
【００６０】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【００６１】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｆｕｃＯ部分配列を含む約７３０ｂｐ断片を増幅させ、ｆｕｃＯプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ｆｕｃＯ欠失ＧＡＰｐｆｕｃＯゲノム挿入株と命名した。
【実施例１０】
【００６２】
ＭＧ１６５５ｆｕｃＯ欠失ＧＡＰｐｆｕｃＯゲノム挿入株によるグリコール酸生産
実施例３と同様にエシェリヒア・ＭＧ１６５５ｆｕｃＯ欠失ＧＡＰｐｆｕｃＯゲノム挿入株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例３と同様にエチレングリコールを添加し、２４時間反応を行った。グリコール酸の蓄積は確認されなかった。
【実施例１１】
【００６３】
低コピーベクターを用いたｆｕｃＯ発現ベクターの構築
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号３）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｆｕｃＯの配列情報に基づいて作製されたＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号２）を用いて、実施例１で作製した発現ベクターｐＧＡＰｆｕｃＯを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｆｕｃＯからなる約１３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
【００６４】
このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０３）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５株に形質転換し、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＡＣＹＣｆｕｃＯを回収した。このプラスミドｐＡＣＹＣｆｕｃＯをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することによりＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣｆｕｃＯ株を得た。
【実施例１２】
【００６５】
ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣｆｕｃＯ株によるグリコール酸生産
実施例３と同様にエシェリヒア・ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣｆｕｃＯ株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例３と同様にエチレングリコールを添加し、９時間反応を行った。反応により２８ｇのグリコール酸が蓄積した。
【実施例１３】
【００６６】
ＭＧ１６５５野生株、ＭＧ１６５５ｆｕｃＯ欠失ＧＡＰｐｆｕｃＯゲノム挿入株、ＭＧ１６５５／ｐＡＣＹＣｆｕｃＯ株、ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株のラクトアルデヒドレダクターゼ活性測定
それぞれの菌株を実施例３と同様に培養した。培養後の菌体を集菌、洗浄の後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４に懸濁し、超音波破砕した。破砕後の菌体抽出液を遠心分離し、その上清をラクトアルデヒドレダクターゼ活性測定に用いた。活性測定は基質にエチレングリコールを用い、反応により生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの増加を分光光度計で測定することで実施した。反応に用いた可溶性タンパク質重量当たりの1分間の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの生成量を算出し、ＭＧ１６５５野生株の値を１とした際の結果を表４（表４）に示す。
【００６７】
ＭＧ１６５５ｆｕｃＯ欠失ＧＡＰｐｆｕｃＯゲノム挿入株においてもラクトアルデヒドレダクターゼ活性がＭＧ１６５５野生株の１８倍と有意に上昇しているものの、グリコール酸生産にはその活性上昇は十分ではなく、少なくとも低コピーベクターの導入により活性を強化した場合の１７００倍程度の活性上昇が、ラクトアルデヒドレダクターゼ単独強化によるグリコール酸生産に必要であることが示された。
【００６８】
【表４】
0004523939.tif 000005
【実施例１４】
【００６９】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株によるＬ−グリセリン酸生産
実施例３と同様にエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、およびエシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株を培養し、集菌、洗浄の後、得られた菌体に対し、実施例３においてエチレングリコールを添加する替わりにグリセロールを１５０ｇ／Ｌの濃度となるよう一括添加し、最終液量を５００ｍｌとして２４時間反応を行った。得られた培養液中のＬ−グリセリン酸蓄積量を光学異性体分割用カラムを用いＨＰＬＣで定法にしたがって測定した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株において２４時間で６７ｇ／ＬのＬ−グリセリン酸の蓄積が確認された。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株においてはＬ−グリセリン酸の蓄積は確認されなかった。
【実施例１５】
【００７０】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株によるヒドロキシエトキシ酢酸生産
実施例３と同様にエシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株を培養した。培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２で洗浄した。洗浄後の菌体約３００ｍｇを同緩衝液で懸濁し終濃度１００ｍＭのジエチレングリコール存在下、最終液量４ｍｌで１８時間反応を行った。反応は大気圧下、反応温度３７℃でマグネティックスターラーにより攪拌しつつ行った。得られた反応液中のヒドロキシエトキシ酢酸をＨＰＬＣで定法に従って測定した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株において１ｇ／Ｌのヒドロキシエトキシ酢酸の蓄積が確認された。ジグリコール酸をはじめとするジエチレングリコール由来の副生物は検出されなかった。またエシェリヒア・コリＭＧ１６５５野生株においてはヒドロキシエトキシ酢酸の蓄積は確認されなかった。
【実施例１６】
【００７１】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ遺伝子欠失株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎａｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｇｌｃＤＥＦ遺伝子の塩基配列もすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ４３４９０）。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡのｇｌｃＤＥＦ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧ（配列番号１６）とＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号１７）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号１８）とＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣ（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化することにより、それぞれ約６７０ｂｐ、７９０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をＫｐｎＩ、ＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをｐＴＨ△ｇｌｃＤＥＦと命名した。
【００７２】
プラスミドｐＴＨ△ｇｌｃＤＥＦをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【００７３】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、薬剤を含まないＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｇｌｃＤＥＦ遺伝子を含む約３．８ｋｂ断片を増幅させ、ｇｌｃＤＥＦ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、得られた株をＭＧ１６５５ｇｌｃＤＥＦ遺伝子欠失株（以下△ｇｌｃＤＥＦ株と略することがある）と命名した。
【実施例１７】
【００７４】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｐｆｌＢ遺伝子欠失株の作製
エシェリヒア・コリのｐｆｌＢ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０８０３５）。ＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡのｐｆｌＢ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧ（配列番号２０）とＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＣＧ（配列番号２１）、ＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＧ（配列番号２２）とＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩ、ＳｐｈＩとＰｓｔＩで消化することにより、それぞれ約１７７０ｂｐ、約１３４０ｂｐのフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,
241, 185-191 (2000)〕をＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
【００７５】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、薬剤を含まないＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｐｆｌＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂ断片を増幅させ、ｐｆｌＢ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、得られた株をＭＧ１６５５ｐｆｌＢ遺伝子欠失株（以下△ｐｆｌB株と略することがある）と命名した。
【実施例１８】
【００７６】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｐｆｌＢ＆ｇｌｃＤＥＦ遺伝子欠失株の作製
実施例１6において得られたプラスミドｐＴＨ△ｇｌｃＤＥＦを△ｐｆｌＢ株に形質転換し、最終的にＭＧ１６５５ｐｆｌＢ＆ｇｌｃＤＥＦ遺伝子欠失株（以下△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ株と略することがある）を得た。詳細な方法は実施例１6に記載された方法に準じた。
【実施例１９】
【００７７】
△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株の構築
実施例１において得られたプラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯを実施例１６において得られた△ｇｌｃＤＥＦ株、実施例１７で得られた△ｐｆｌＢ株、および実施例１８で得られた△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ株にそれぞれ形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することで△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を得た。
【実施例２０】
【００７８】
△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株によるグリコール酸生産
実施例３で得られたＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、実施例１９において得られた△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株、△ｐｆｌＢ△ｇｌｃＤＥＦ／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株について実施例３と同様に培養を行った。培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌し、蒸留水で洗浄した。洗浄後の集菌体を７５ｇ秤量し、エチレングリコール１５０ｇと共に蒸留水に懸濁し最終液量を１５００ｍｌとした。懸濁液をＡＢＬＥ社製培養装置ＤＰＣ−２の培養槽に移し、２２時間反応を行った。反応は大気圧下、通気量０．７ｖｖｍ、攪拌速度８００ｒｐｍ、反応温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。得られた反応液中のグリコール酸およびシュウ酸、酢酸の蓄積量、さらにエチレングリコールの残存量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表５（表５）に示す。ｇｌｃＤＥＦ遺伝子、且つ／またはｐｆｌＢ遺伝子の欠失によりシュウ酸、酢酸といった副生有機酸の低減が可能となり、さらにエチレングリコールの転化率が向上し、グリコール酸の生産性が飛躍的に向上した。
【００７９】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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