(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に表示された異なる標識の配置を含むサンプルであって、各異なる標識は、微粒子支持体を含み、該支持体に、少なくとも２つのシグナル生成発蛍光団が結合し、該発蛍光団の各々が、他によって生成されるシグナルとは異なる検出可能なシグナルを生成し、そしてここで、該生成されるシグナルの各々の大きさが、該異なる標識の間で変化し、
これによって、各異なる標識が、異なる色によって特徴づけられ、該色は、検出され、そして多数の標識における他の色から区別可能であり、これによって、各異なる標識が、インサイチュで同定可能であり、そして
該表面上の微粒子標識の配置が、蛍光顕微鏡による、該サンプル中のあらゆる特異的標識の空間的位置の決定を可能にし；そして
各異なる標識が、異なる試薬と会合している、
サンプル。
【請求項２】
各前記微粒子支持体が、少なくとも３つの前記シグナル生成部分に結合される、請求項１に記載のサンプル。
【請求項３】
前記微粒子支持体が、ラテックスビーズである、請求項１または２に記載のサンプル。
【請求項４】
前記試薬が、抗体；ｃＤＮＡライブラリーから生成されたペプチド；コンビナトリアル化学ライブラリー中の物質；またはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサンプル。
【請求項５】
各前記試薬が前記標識に共有結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサンプル。
【請求項６】
前記共有結合が、ジスルフィド結合またはカルボキシアミド結合である、請求項５に記載のサンプル。
【請求項７】
各前記試薬が前記標識に非共有結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサンプル。
【請求項８】
前記非共有結合が、エピトープ／抗体結合またはヒスチジン／Ｎｉキレート剤結合であるか、または前記試薬が捕捉される寒天層を含む、請求項７に記載のサンプル。
【請求項９】
サンプル内の任意の特異的標識の空間的位置を決定する方法であって、該方法は、請求項１に記載のサンプルにおける異なる標識の配置を、蛍光顕微鏡によって観察する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
蛍光顕微鏡によってサンプル中のあらゆる特異的標識の空間的位置の決定を可能にするために、表面上に表示された異なる標識の配置を含むサンプルであって、
各異なる標識は、微粒子支持体を含み、該支持体に、少なくとも２つのシグナル生成発蛍光団が結合し、該発蛍光団の各々が、他によって生成されるシグナルとは異なる検出可能なシグナルを生成し、そしてここで、該生成されるシグナルの各々の大きさが、該異なる標識の間で変化し、
これによって、各異なる標識が、異なる色によって特徴づけられ、該色は、検出され、そして多数の標識における他の色から区別可能であり、これによって、各異なる標識が、インサイチュで同定可能であり、そして
各異なる標識が、異なる試薬と会合している、
サンプル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、シグナル生成部分（その比が調節され得る）を含む独特の標識粒子を利用するアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、その標識の色が漸増的に調節され得る粒子標識に関する。
【０００２】
（背景技術）
種々の試薬に対する反応性についてサンプルを試験することは、しばしば所望される。例えば、組織分類において、特定の組織において、細胞がマーカー抗原に関して惹起された一団の抗体と免疫反応する能力が、必要とされる。遺伝子試験は、しばしば、特定の遺伝子の多型性形態を、多くの対立遺伝子の可能性のうちのたった１つに対するそのハイブリダイゼーションを評価することによって検出することを包含する。簡単な配列のＤＮＡの固定された参照スポットを、配列決定されるべきフラグメントでプローブすることによって行われるＤＮＡハイブリダイゼーションによって配列決定するための技術もまた存在する。この技術において、配列決定されるべきフラグメントの結合の、簡単な配列の各々に対する比は、標的フラグメント中の各々の可能な配列について独特である。特定の細胞の特徴的な発現産物を表すｃＤＮＡライブラリーから生成されたタンパク質は、種々の標的との反応性についてスクリーニングされ得る。その標的は、例えば、抗体、または低分子薬物候補を含み得る。
【０００３】
これらの例の全てにおいて、種々の試薬との反復的多試験が必要とされるか、またはその試薬は、整列したアレイ（例えば、マイクロタイタープレートまたは「チップ」上のアレイ）に表示されるかのいずれかで、サンプルの反応性が評価される。これらの手順の全てにおいて、特定の標識と、サンプルの成分に結合することによる複合体の形成との関連は、時間（連続的な試験について）または空間（パネルに対する試験について）的なその位置による標識の同定、または標識に対するさらなる測定による標識の同定を必要とし、これは、例えば、質量分析による、その標識の固体粒子からの放出を必要とする。例えば、米国特許第５，７２１，０９９号は、コンビナトリアルライブラリーの多段階合成において使用される固体支持体を記載する。固体支持体に結合した標識は、付着したそのライブラリーのメンバーの構造を同定する。各粒子の反応の履歴は、標識を放出し、そしてタグの性質および量を決定するために分析することによって決定され得る。
【０００４】
サンプルが、多重の試薬との反応性について、物理的または時間的な分離を要せずに、簡単に評価され得るならば、有利である。本発明は、標識を利用することによってその結果を達成し、その標識は、それらの同一性が、それらの「グレー」の程度（すなわち、両極端の間の広範な範囲にわたって（例えば、「白」から「黒」）小さな段階によって変化し得る特性）によってインサイチュで評価され得る。ここでの単純性についての説明のための例示および手段として可視光が使用されるのに対し、本発明は、その他の光学的特性（例えば、磁場に応答する高周波関連振動緩和時間）を含む「色」の実施態様を含む。上記のような、広範にわたって変化し得る任意の特性が利用され得る。従って、サンプルの成分に結合される標識の性質は、直接観察によって決定され、多重並行アッセイを可能にする。
【０００５】
単一サンプルにおける多重色標識の試みは、異なる色の標識で染色体を「ペイント」するにおいて最も顕著であった（これは、各染色体についての異なる色標識を使用する蛍光インサンチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）として公知の技術である）。この技術はまた、異なる発蛍光団を有する結合リガンドを使用することによって、異なる表面レセプターで細胞をペイントするために使用されている。このようなアプローチの要約は、Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９６）２７：４９４−５０２に示される。ヒトの眼が異なる色成分の混合物によって色を識別する能力は（成分の同じ混合物の種々の比によってではないが）、Ｓｐｅｅｌ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ（１９９７）４５：１４３９−１４４６によって実証された。染色体をペイントする目的のために多数の異なる色を生成するために色素が種々の比で適用されたオリゴヌクレオチド標識に対するこのアプローチの適合は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９７）２７：３１４−３２６に記載された。標識は微粒子ではないので、従って、均一なビーズの最大シグナル強度または異なる形状シグナルを許容しないが、この研究は、微視的技術が、種々の比の発蛍光団が単一の標識に適用された場合、生成された色を効果的に検出し得、そして選別し得ることを実証する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ）からのカタログに記載されるように、１００ｎｍ直径のミクロスフェアには、フルオレセインが充填され、７４００の遊離のフルオレセイン分子に等価な強度を生じ得、その充填は、プラスまたはマイナス５パーセントよりも良好な精度まで制御可能である。
【０００６】
本発明は、多重色ビーズにより利用可能な試薬の多能性およびシグナルの強度を提供し、ここで、シグナル生成部分を保有する微粒子支持体は、これらの種々の比により特定の区別し得るシグナルを提供する。さらに、標識は、溶液中または懸濁液中において評価され得るのみならず、それらの位置までが、サンプルを評価するにおける微視的技術の使用により確立され得る。
【０００７】
（本発明の開示）
その色の直接的な観察によって同定され得る標識は、多重反応性が観察されなければならないアッセイにおいて多大な都合良さを与える。本発明の標識は、少なくとも２つの異なるシグナル生成部分（例えば、各々は、反射または蛍光のいずれかによって、特定の波長範囲の光を提供する）を含有する微粒子性材料である。従って、１つの実施態様において、個々の粒子は、異なる色の光を放射または反射する部分を含有する。その粒子に結合した異なる部分の相対量を調整することによって、その標識の認知された「色」は、異なり、そして異なる比率でこれらの部分を含有するその他の標識から区別され得る。これらの標識の有効な使用は、その粒子に結合した部分の各々についての検出のための別々の手段を必要とする。好ましくは、その粒子は、対応する数の検出手段で異なる波長を生成する少なくとも３つの部分を含有する。
【０００８】
従って、１つの局面において、本発明は、その部分が、異なる波長の光のような、インサイチュで識別し得るシグナルを生成する少なくとも２つのシグナル生成部分に結合した微粒子支持体を含む標識に関する。これらの標識は、生成されるインサイチュシグナルの各々について検出されるための、別々の手段を含む任意の装置によって区別される。一般に、別々の検出器が利用され得る。しかし、単一の検出器が、適切なフィルターまたはその他の手段（例えば、プリズムまたは格子）を使用して単一の検出器が別々に複数のシグナル（例えば、異なる波長範囲）を認識するように利用され得る。
【０００９】
特に、インサイチュシグナルは、サンプル中の標識の全体的なパターンを得るために局在化され得る。共焦点光学および広視野顕微鏡は、微視的スケールでの構造を区別し、そして本発明の標識の地形的区別の観察を可能にし得る。
【００１０】
顕微鏡レベルで個々の分析物の位置を確立することに加えて、本発明の多重色標識は、生理学的現象をマッピングするために巨視的に使用され得る。その標識は、複雑な系において内因性経路を追跡するための「トレーサー」として使用され得る。従って、別の局面において、本発明は、本発明の多重標識の分布を、そのままか、または観察されるべき経路についての親和性を示すさらなる部分とともに提供されてのいずれかによって、観察することによって生理学的経路を追跡するための方法に関する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、色、または本発明の多重ビーズ上のシグナル生成部分の比を、広いバンドパスフィルターによってシグナルを観察し、そしてそのオーバーラップを補正することによって、分析するための改善された方法に関する。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、微粒子支持体の公知の形状に従う観察されたシグナルを規定することによって、微粒子支持体に関連する色の定義を改善する方法に関する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、異なる溶解パラメータを有するリンカーを介して支持体に対して使用されるべきシグナル生成部分の実質的に全てを結合させることによって、微粒子支持体上のシグナル生成部分の所望の比を提供するための方法に関する。このようなリンカーの１つの実施態様は、各々異なるシグナル生成部分についての異なる制限酵素の切断部位を有する二本鎖ＤＮＡの短いストレッチを含む。各シグナル生成部分について、１つより多い制限部位が存在する。あるいは、単一のシグナル生成部分が、多重のリンカーを介して結合され得、その各々は、異なる制限パラメータを有する。従って、二本鎖ＤＮＡの多重度は、異なる制限酵素部位を有する。これらの条件下で、シグナル生成部分の最終的な比は、標識した粒子を作製することにおいて使用されるリンカーの比を変化させること、そしてその微粒子を処理するために使用した切断パラメータの性質によって制御され得る。
【００１４】
別の局面において、本発明は、形状の制御された変化が、その粒子上の標識の組成を調節するのに補助するために使用され得るように、開放形状への相転移を行うポリマーを利用する微粒子支持体の改善された組成物に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、上記のタイプの標識の集団に関し、ここでその部分の比は、その集団の中の標識ごとに異なる。代表的には、標識のこの集団は、少なくとも２０、好ましくは、１００、より好ましくは、５００、そしてなおより好ましくは、少なくとも１０００を数える同定可能なメンバーを提供する。従って、各色のその検出の信頼度が、プラスまたはマイナス１０パーセントである場合、１０のグレー標識が各シグナルについて存在し、それゆえ２つのシグナル生成部分が各標識に含まれる場合、１００の色が区別され得る。サンプルの分析に使用するために、各標識は、さらに異なる試薬に結合される。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、標識に結合した多重の試薬とのサンプルの反応性を評価するためのシステムに関し、このシステムは、別々の検出器とともに上記の試薬に結合した標識の集団、または標識の集団における微粒子上に存在する各々の異なる部分によって生成されたシグナルについてのそれらの等価物を含む。
【００１７】
本発明のなお別の局面は、ライブラリー対ライブラリースクリーニング中の標識の集団の使用に関する。従って、例えば、異なるサイズの粒子は、抗体の集団が抗原のライブラリーに比較して異なるサイズの微粒子支持体に結合している抗体／抗原のような特定の結合対の潜在的に反対のメンバーである試薬に結合し得る。首尾良い結合は、適切に誘導体化したより大きな粒子のまわりのより小さい粒子の凝集によって検出し得る。
【００１８】
なお別の局面において、異なるサイズの粒子は、競合結合フォーマットにおける分析物濃度についての均質なアッセイのための、または標識されたより小さなビーズに結合した分析物アナログからの競合による、より大きな微粒子からの標識されていない分析物の置換によるアフィニティー滴定のための、基礎として使用され得る。
【００１９】
なお別の局面において、本発明は、上記のアッセイシステムを使用するにおけるサンプル中の成分の反応性を評価する方法に関する。
【００２０】
（発明を実施する形態）
好ましい実施態様において、本発明の標識は、特定の波長または波長範囲の光の強度を検知し得る検出器の利用可能性を利用する。このタイプの代表的なデバイスは、ホームビデオのためのカムコーダーにおいて使用される標準的な色フィルターを装備した電荷結合素子（ＣＣＤ）として現在市販されている。より高感度かつ高信頼度の科学的グレードのＣＣＤデバイスおよびフィルターもまた利用可能である。従って、単一ＣＣＤが、狭い波長バンドの光のみを検出するために設計され得、その結果、例えば、検出器が、赤、緑、または青の光のみについて得られ得る。ＣＣＤ検出器は、広視野蛍光顕微鏡（これは、３次元における高解像度、ならびに高い時間分解能を提供する技術である）において現在利用される。このタイプの高精度装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から市販されており、そしてＪｏｈｎ  Ｗ．Ｓｅｄａｔによって導かれるグループによって書かれた一連の論文に記載されている。これらの刊行物には、Ｕｒａｔａ，Ｙら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｏｌ（１９９５）１３１：２７９−２９５；Ｐａｄｄｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ（１９９６）１０９：５９１−６０７；Ｃｈｅｎ，Ｈ．ら、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ（１９９６）１１６：５６−６０；Ｋａｍ，Ｚ．ら、ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ（１９９７）５：４０−４９が含まれる。これらの技術の要約は、「Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍａｇｅｓ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ」、第二版（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ中のＳｗｅｄｌｏｗ，Ｊ．Ｒ．らによる章（２８６−３０７頁）に提供される。
【００２１】
この装置は、３つの別々の光の波長の検出のための蛍光励起および能力を提供する。本願において、これらの装置は、サンプル中の成分の反応を、ＣＣＤ検出器の１つに対応する色を有するラテックスビーズに各々結合した３つの異なる反応物で、検出するために使用され得、そして使用される。このようなビーズは、サイズおよび発蛍光団ドーピングレベルにおいて高い均一性を有するいくつかの異なる発蛍光団の色で、とりわけＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）；Ｐｏｌｙ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）；およびＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＬＳ−５Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｇｒｏｕｐから市販されている。
【００２２】
単一ＣＣＤ検出器およびフィルターホイールを有する代表的な広視野蛍光顕微鏡の模式図を、図１に示す。本発明の多重色標識は、このシステムにおいて都合良く読まれる。図３に図示される固定したフィルタおよび別々のＣＣＤ検出器は、画像の登録およびデータ収集のスピードを単純化する。
【００２３】
本発明において利用される検出器の１つの利点は、サンプル内の任意の特定の微粒子または微粒子のグループの位置を決めることが可能であるということであることは明らかである。従って、細胞内に特定の色を含有する微粒子で標識されたタンパク質の位置は、サンプル内の各規定された容量について別々の読み出しを生成する微視的技術の能力を使用して確認され得る。このような整列は、サンプルの区画内（例えば、特定の細胞内、または任意の他の規定されたサンプル容量内）の関連する分析物についての分布のパターンを観察者が得ることを可能にする。
【００２４】
さらに、上記の高グレードの狭い波長バンドＣＣＤおよびフィルタを、粒子の集団における色を区別することに利用することは有利であり、本発明のさらなる局面は、これを不要とする。
【００２５】
広い波長バンドパスフィルタによって引き起こされるひずみに対処する方法は、米国特許第５，８３４，２０４号に記載されている。’２０３特許に示されるように、アルゴリズムは、各色の光に関連する真のシグナルを、異なる色の色素に起因する公知のオーバーラップを考慮に入れて計算するために適用される。従って、種々の検出器に光を供給する３つの色素、赤、緑、および青が存在する場合、例えば、赤チャネル中のその検出器のシグナルは、各々の色素濃度×そのオーバーラップの和である。（この目的のために、赤自体への応答が、オーバーラップと指定される）。従って、赤チャネルＳRにおけるシグナルは、各ＯR、（色素ｄについての赤チャネル中のオーバーラップ）、ｄi×［ｄi］に等しく、あるいは、異なる用語では：
ＳR＝ＯR、R×［Ｒ］＋ＯR,G×［Ｇ］＋ＯR,B×［Ｂ］
ＳG＝ＯG,R×［Ｒ］＋ＯG,G×［Ｇ］＋ＯG,B×［Ｂ］；および
ＳB＝ＯB,R×［Ｒ］＋ＯB,G×［Ｇ］＋ＯB,B×［Ｂ］。
【００２６】
理解されるように、これは、ｎ個の未知数にｎ個の等式を提供する。
【００２７】
従って、’２０３特許は、公知のオーバーラップ（Ｏ）における検出されたシグナル（Ｓ）逆転制動（ｐｌｕｇｇｉｎｇ）に対してアルゴリズムを提供し、従って、種々の色素の濃度を計算し、これは次いでカテゴリーを規定する。
【００２８】
しかし、本発明の改善された方法に従って、分類の比が、出力シグナルから直接得られ得るように、検出されたシグナルの生成におけるオーバーラップが考慮される。図４は、いくらかのオーバーラップを含むより広いバンドパス検出器を使用して、図２に例示される簡単な読み出しを得るために本発明によって使用される方法の模式図を示す。図４Ａに示されるように、カテゴリーは、１、２、または３ユニットの赤または緑の色素の存在に基づいて規定され得る。指定された波長の光のみを忠実に記録する検出器（すなわち、狭いバンドパス検出器）を使用して得られる読み出しは、図４Ｂに反映されて示される。これらのデバイスからの強度出力は、関連する観察された支持体からの濃度に比例する実際の強度を忠実に記録する。しかし、図４Ｃに示されるように、出力は、広いバンドパスフィルタが使用される場合、オーバーラップによってゆがめられる（すなわち、ここでは、緑の色素により赤のチャネルにオーバーラップが存在する場合（またはその逆の場合）、各々が他方の主要な検出器チャネル中に３３％オーバーラップすると仮定して、示す）。例えば、２：２（赤：緑色素）として規定される分類は、２．６の赤チャネルにおいて観察される出力を与える。’２０３特許におけるアルゴリズムは、観察された強度を、分類の基礎を形成する色素濃度へと変換するために意図される。あるいは、そしてより単純には、本発明の方法に従って、その出力が、オーバーラップを考慮にいれるために調節される。従って、図４Ｄに示される簡単なパターンを観察することによって規定される分類は、図４Ｅに示されるように入力を調節することによって作製される。３：３（赤：緑）を観察することによる分類は、例えば、赤および緑の色素の各々の２．２５ユニットをその粒子に添加することによって作製される。従って、観察されたシグナルに関しての逆算は、もはや必要ではない。
【００２９】
（多重色標識）
本発明は、これらの条件下で、シグナル生成部分（代表的には、利用されるＣＣＤ検出器に対応する異なる色の発蛍光団）を特定の比で有する微粒子支持体の系統的かつ正確なドーピングによって別々に検出され得る試薬の数を乗算する。発蛍光団の異なる比を有する粒子が、このシステムにおいて異なる検出シグナルを生成する。発蛍光団の比が、色素を強制的に近くに配置することにより消光を導く点にまで恣意的に変更され得るので、多くの異なる「色」が、各粒子型が色生成部分の独特の比および／または量を有して、標識された粒子の集団において生成され得る。各異なる標識が、異なる試薬に結合される場合、その集団は、各粒子がそれが生成する光の色によって同定され得るとすぐに、多重アッセイを行うために使用され得る。
【００３０】
本明細書において使用される用語「標識」とは、一般的に、シグナル生成部分の適切なアレイに結合した微粒子の支持体を記載するために使用される。このシグナル生成部分は、シグナルが微粒子の支持体の上にインサイチュ（その場）で検出されるようなものでなければならない。従って、それらの比率を確認するために、その支持体からそのシグナル生成部分が脱離することは不要である。この比率は、その標識の「色」の手段によって直接読まれる。呈色が好ましいシグナルである。本発明の標識は、少なくとも２つ、および好ましくは少なくとも３つの識別可能なシグナル生成部分を含む。シグナル生成部分の比率および量は、特定の「色」（すなわち、少なくとも２つのおよび好ましくは少なくとも３つのシグナル生成部分の特定の組合せ（比率および絶対強度））を有する各標識を提供する。使用される場合、その標識は、「試薬」（すなわち、相補的な分析物を検出するための標識と会合する物質）と連結される。本発明の簡便なアッセイにおける使用のために、標識される試薬のコレクション（すなわち、「複数色アレイ」）（これは、各試薬に対応する色が充分に定義された、標識試薬のセットである）が必要とされる。
【００３１】
可視光が特定の「色」を生成するための特に簡便な方法であることから、本発明のこの実施態様は、本明細書に例示される。しかし、他のシグナル生成部分が使用され得るか、または可視光を生成するための間接的な方法も使用され得る。例えば、粒子には、不溶性のシンチレーション物質とともに、異なるエネルギーを有する放射性同位体が提供され得る。不溶性のシンチレーション物質を有する単一の粒子に含まれる3Ｈおよび35Ｓは、識別可能な光子バーストを与え、同様に、標準的なシンチレーションカウンターにおいて用いられるパルス高分析機についての基礎である。適切な基質とともに特定の比率で含まれるアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼは、異なるシグナル（発色団またはより直接には、異なる電気化学的還元力によって生成されるものが含まれる）を提供する。さらに、異なる材料の重原子クラスター（例えば、コロイド金ドット対鉄さび）は、電子顕微鏡光線に関しての異なる散乱特徴を提供する。Ｋｉｒｋ  Ｇ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（１９９６）１８３：１８１−１８６。好ましい「色素生成」部分は、代表的に、発蛍光団であるが、それらはまた、反射（単純色素）または発光（発蛍光団またはデノボ光生成化合物（例えば、ルシフェラーゼもしくは他の化学発光系））のいずれかによって、特徴的な波長を生成し得る。多数の化学発光系が当該分野で公知である（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼベースの化学発光産物の生成）。適切な吸呈色素としては、アリザリン赤、チアゾール黄、ナフチル緑Ｙ、インドフェノール青、およびリンドウ紫が挙げられる。適切な発蛍光団としては、ダンシル、グリーン蛍光タンパク質、フルオレセイン、ヘキスト、テキサスレッド、メロシアニンなどが挙げられる。広汎な波長の発光を網羅する多数の色素が、Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９６）２７：４９４−５０２（本明細書において参考として援用される）に記載されるように開発されている。蛍光色素に加えて、燐光物質（例えば、ランタニド金属キレート）もまた使用される。これは、時間により分離された蛍光が、より長い検出期間にわたって、平均化された等価なシグナルを識別するという利点を追加する。外的な照射による励起を必要としない光発光系としては、上記の放射性同位体およびシンチレーション物質の実施態様ならびに識別可能な発色団を生成するかまたは自然に化学発光基質に作用する酵素系が挙げられる。
【００３２】
概念的には、発蛍光団の比率を単純に変動させることが色を変える最も直接的な方法である。しかし、より洗練されたアプローチとしては、それらが所定の方法（例えば、最初の色素についての励起最大での励起が第二の色素への非放射的な転移を生じこれが次いで発光するエネルギ−転移）によって相互作用するような色素を選択することが挙げられる。２つの色素の励起ピークに関する異なる入力比率は、適切な条件下で異なる出力を生じる。さらに、ある色素がその粒子の内部に配置され、そして他方が外部に配置される場合、その２つの色素がその粒子中に均一に混合した場合またはその色素の位置が反転している場合に得られるものとは異なる色が形成される。
【００３３】
支持粒子は、代表的には、直径が０．１〜１μｍであり、そして好ましくはラテックスである。しかし、より小さな粒子もまた使用され得る。一般的に、５０ｎｍ（０．０５μｍ）が、適切な最小限であるとみなされる。いくつかの状況において、５μｍほどの大きさの粒子を使用することが可能となってきた。しかし、これは好ましくはない。より大きな粒子の使用は、より少ない拡散速度を生じ、従って、有効な、あまり効率的ではなく、かつあまり生き生きとしない標識が生じる。好ましい範囲は、１００〜５００ｎｍであり、好ましくは１００〜３００ｎｍであり、そしてより好ましくは１００〜２００ｎｍ直径の粒子である。この微粒子の支持体は、一般に、球面であり、そして使用した顕微鏡技術は、他の一般的な概略から、球面構造を識別し得る。しかし、他の粒子もまた使用され得る（例えば、ポリビニル、ポリサッカリド（例えば、デキストランおよびセファロース）、ポリマー（例えば、架橋ポリアクリルアミドおよびポリエチレングリコールなど））。シリカゲル粒子もまた使用され得る。適切な物理的特性（自然に凝集、接着または他の方法で、独立の粒子として挙動しない）を有し、そして発色部分を用いておよび試験試薬を用いて適切に誘導体化され得る任意の粒子が使用され得る。
【００３４】
この粒子の構造自体が、検出される色に影響を与える。その粒子の大きさに寄与する差違に加えて、上記のように、その形状がそのシグナルの性質を決定する。形状は、例えば、球状から楕円状へ棒状へストリング状への連続に従って変動し得る。星形状または他の任意の形状の粒子が、Ｘ線リソグラフィーによって作製され得、その結果、異なる点に広がる機能を有する。従って、異なるシグネチャを提供する標識された粒子の任意の局面が使用され得る。例として、屈折指数は、その粒子自身の密度および組成によって影響を受ける。手短には、同じ比率および絶対的な強度の発蛍光団を有するが、識別可能な形状を有する２つの粒子は、本明細書において異なる色を有すると定義される。
【００３５】
その粒子の形状によって寄与される情報成分に加えて、その粒子の形状の知識を使用して、シグナル対ノイズの比率を増強し得る。その検出器は、空間にわたってその粒子を調査することから、その比率は、その微粒子の支持体の公知の形状および大きさによって規定される空間の容量にわたってのみ、観察された出力チャネル強度を試験することによって改善される。規定された形状の外側にあるピクセルは、ノイズとして拒絶され、従って、その粒子のイメージは鋭くなる。
【００３６】
そのようなデータをフィルタリングする好ましい方法は、三次元アレイを収集し、そしてフーリエ変換技術を適用してその直接観察された形式におけるいずれの歪みにもかかわらず、その基礎をなす形状を認識させることである。すなわち、観察されたイメージは、実際のシグナルの畳込みおよびそのレンズの点展開関数である。フーリエ表現の脱畳込みは、有利である。なぜなら、それは、困難な計算をより単純な算術へと置換するからである。さらに、有効倍率が異なる波長について若干異なることから、ＳＩＭＰＬＥＸアルゴリズムは、そのサンプルの空間的次元を横切って拡散する標識を用いたいくつかのチャネルの各々において観察されるイメージを整列するのに有用である。公知の大きさの微粒子の支持体は、特に簡便な標識である。
【００３７】
使用される光の波長よりも数倍大きな粒子について、出力における歪みは、その対象の大きさの数％のみにあたるが、より小さな粒子について、その歪みはより実質的である。
【００３８】
最後に、本発明において有用な粒子が凝集しないという上記の所望の特徴にかかわらず、制御された凝集を適切な例で用いて、構成粒子の比率に基づいた大きさの分散を入手し得る。例えば、その粒子が二官能性または一官能性の架橋リンカーを用いて誘導される場合、粒子の混合物中での異なる比率の二リンカーおよび一リンカーによって、異なる大きさの凝集体が生じる。このアプローチは、インビボ適用において特に有用である。インビボ適用では、小粒子（個々の色素分子でさえ）は細胞中により容易に輸送される。次いで、これらは、酵素活性または光分解によって微粒子へと自己アセンブリするよう設計され得る。
【００３９】
発色部分および試薬の両方についての結合技術の性質は、支持体粒子の性質、発色部分の性質およびその試薬の性質に依存する。適切な連結技術は当該分野で周知である。例示の目的のみで、その試薬がタンパク質である場合、それらは、ヘキサヒスチジン配列またはエピトープ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ（次いで、これは、ニッケルキレート剤またはそのエピトープに対する抗体を組み込むように製造された粒子に結合され得る）とともに組換え生成され得る。複数の物質および微粒子支持体上で利用可能な官能基に適用可能な標準的な連結技術としては、各成分におけるスルフヒドリル部分から生成されるジスルフィド結合ならびにカルボキシ官能基およびアミノ官能基から生成したアミド結合が挙げられる。他の例としては、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬについてのカタログにおいて示されるようなホモ二官能性およびヘテロ二官能性のリンカーが挙げられる。
【００４０】
さらに、Ｓｈｒｅｉｂｅｒ（Ｂｏｒｓｃｈａｒｄｔ、Ａ．ら、Ｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌ（１９９７）４：９６１−９６８；Ｙｏｕ、Ａ．Ｊ．ら、同上、９６９−９７５）（これらは両者とも本明細書において参考として援用される）によって記載される技術に基づく減算方法を使用する技術が実施可能である。Ｓｈｒｅｉｂｅｒは、特別な量のリガンドが不安定な結合の光分解によってビーズから放出され得ることを示した。ここで、シグナル生成部分の混合物が最初に使用され得、そしてそれらの特定部分が、選択的に減ぜられ得る。Ｓｈｒｅｉｂｅｒによって記載されるように、最初の結合は、光に不安定な結合を通じでである；光曝露によって、光分解が生じ、そしてシグナル生成部分の一部分が放出される。
【００４１】
本発明に適用されるように、シグナル生成部分は、切断のための異なる要求性を有するリンカーを通じて微粒子支持体へと結合され得、その結果、例えば、赤色色素に付着するリンカーが、緑色色素に対してその微粒子を結合するものとは反対に選択的に切断され得る。そのような示差的な選択に対する１つの例示的なアプローチは、１つ以上の制限部位を含む二重鎖ＤＮＡの使用を含む。微粒子支持体を異なる制限酵素で処理することによって、特定のシグナル生成部分が選択的に除去され得る。さらに、単一のシグナル生成部分を、所定のセットのリンカーによってビーズに結合し得、各々を異なる様式で切断し、その結果、微粒子支持体の製造において使用されるリンカーの比率もまた、色を決定する因子である。
【００４２】
例えば、赤色色素を、ＥｃｏＲＩに対する制限部位を含むＤＮＡを通じて微粒子へと結合し得、緑色色素を、ＢａｍＨＩに対する制限酵素を有するＤＮＡを通じて結合し得、そして青色色素をＸｂａＩに対する制限部位を有するＤＮＡと結合させ得る。所定量の緑色色素を、ＢａｍＨＩを用いて微粒子支持体を処理することによって除去し得、赤色および青色の結合した色素をインタクトなまま残す。あるいは、緑色色素を混合物として付着し得、緑色色素のいくつかを、ＢａｍＨＩ部位を含むＤＮＡを通じて結合し得、そして別の部分を、ＳｍａＩ部位を含むＤＮＡに付着させ得る。次いで、ＳｍａＩでの処理によって、その緑色色素の一部のみが除去される。色素およびポリマー支持体の両方への二重鎖ＤＮＡの結合のための技術は、周知である。
【００４３】
この方法は、すべてが、異なるビーズに示差的に結合した複数のシグナル生成部分を含むビーズのコレクションを、プレートして出すこと、および異なる位置においてそのコレクションに、異なる放出試薬を含むグリッドを重層すること、それゆえ、各位置が異なる比率の各シグナル生成部分を除去することを確実にすることによって精緻させ得る。あるいは、色素およびそのＤＮＡリンカーは、異なる量の各色素が使用される放出酵素のパターンに依存して放出され得るリザーバとして固定され得る。そのリザーバから放出された得られた色素は、ビーズに受動的に取り込まれ得、ポリマーの成長によってその位置で成長する。ＤＮＡ切断がそのビーズまたはそのリザーバ上で生じるか否かに拘らず、その結果は同一である。ビーズの空間的パターンは、色パターンに対応する。従って、その空間パターンは、例えば抗体の空間パターンに適合され得る。
【００４４】
標識に対する試薬の共有結合ではなく、その試薬は、単に、例えば、微粒子の標識を寒天コーティングする薄層において捕捉されることによってその標識と物理的に会合され得る。その試薬は、その寒天を融解することによって分析されるサンプルが標識のコレクションと接触される場合に放出される。米国特許第５，７８３，３０２号に記載されるポリマーは、ビーズをコーティングすることについて寒天よりも有利である。これらのポリマーは、０℃と１００℃との間の範囲の殆どにわたって調整可能な鋭い遷移温度を有することから、それらは、化合物を浸漬させるように一過的に融解され得、これは次いで、別の緩和な温度パルスによって放出されるまで固定される。このようにして、任意の化合物ライブラリーが、コンビナトリアル化学ライブラリーが現在処理している方法と同様に処理され得る。次いで、この標識の物理的な近接度は、そのサンプルの成分と首尾よく反応する試薬を同定するために役立てられる。物理的近接度を使用するそのようなアプローチは、Ｂｏｒｓｃｈａｒｄｔ、Ａ．ら、Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．（１９９７）４：９６１−９６８；Ｙｏｕ、Ａ．Ｊ．ら、同上、９６９−９７５によって記載された。これらの文書はまた、光不安定性リンカーおよびコーティングされたビーズを含む小滴を作製するエアロゾル生成器の使用を記載する。
【００４５】
上記のように、標識の構築の様式は、シグナル生成部分の性質および固体支持体の化学的組成に依存する。１つの例示的な手順は、Ｖｏｇｔ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：２９４−３０２に示されている。これは、ラテックスビーズに付加されたＦＩＴＣのモルと、細胞ソーターにおいて観察された取り込まれた蛍光強度との間の線形関係を記載する。そこに記載されたこの技術を用いて、広汎な種々の色が、各シグナル生成部分の量を変動させることによって入手され得る。
【００４６】
本発明とは対照的に、各々が単一の無機蛍光体を有するコロイド粒子を調製することの説明は、Ｂｅｖｅｒｌｏｏ，Ｈ．Ｂ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９２）１３：５６１−５７０に示されるように、個々の試薬で標識された粒子が混合物ではなく、サンプルに連続的に供給されるべきであることを強調する。連続的な供給は、明白な像を提供するために必要である。なぜなら、抗原の比率は、捕捉された抗体の比率を決定するからである。他方、本発明の標識された試薬は、混合物として、サンプルに容易に供給され得る。なぜなら、それらは、個々に試験されたそれらの標識の異なる色によって容易に識別されるからである。
【００４７】
次いで、各標識は、少なくとも２つの異なるシグナル生成部分（代表的には発蛍光団）を含み、そしてアッセイにおける使用のために、関連試薬に結合される。各異なる試薬は、異なる標識に結合される。複数の異なる標識を生成するための本発明の方法が、２つの発蛍光団のみを有するビーズについて図２に例示されている。この例示において、赤色光生成部分の青色光生成部分に対する比率は、各色について１０のレベルのシリーズにわたって変動する。これは、１００個の異なる「色」（すなわち、比率および強度）を生じる。図２に示されるように、異なるシグナルは、赤色生成部分および青色生成部分の比率および／または量に依存して入手される。赤色検出器および青色検出器における応答の比率および強度は、測定される標識の指標である。この検出器が強度および色自体を測定し得ることから、１０赤対２青の比率を含む標識は、５赤対１青を含む標識から識別され得る。さらなる複数の数の異なる可能な標識を、上記の顕微鏡系において独立して測定され得る微粒子支持体の大きさを変動させることによって付加し得る。
【００４８】
類似の拡張は、複数次元における発蛍光団のさらなる呈色を用いて行われ得る。利用可能な複数の色は、光生成および検出に関して適切な識別能力の利用可能性によってのみ制限される。従って、３つの発色部分が含有される場合、それら各々は、高信頼度で、１０個のグレイシェードへと分類し得、１０００個の異なる色を有する標識が生成され得る。各発色部分が高信頼度で１００のレベルのグレイへと分類され得る場合、１００万個の異なる色がこれらの標識のコレクションについて可能である。
【００４９】
（複数色標識の使用）
本発明の複数色標識の適用のほとんどは、結合対のメンバーについて特異的な試薬に対してその標識を結合することを包含する。しかし、その複数色標識は、そのような試薬の使用を必要としない適用を有する。一般に、その標識を使用して、特に、複雑なアレイの経路がオーバーラップしている場合において生理学的経路を解明し得る。
【００５０】
一般原則は、そのような経路が存在する場合に、それらの経路は、その標識がそれらの行程を移動することを可能にすることによって追跡され得ることである。例えば、脊髄において、神経末端の脳内における起源への接続は、オルガネラを、軸索を上下するように移動する微小管の「レール」を追跡する。本発明の粒子は、好ましくは、直径が２００ｎｍ未満であり、より好ましくは、直径が５０ｎｍ未満であり、神経末端へと貫通することが生じ得、これは、いわば、軸索の起源へ「レールを乗せる」。微粒子支持体が神経末端によって取り込まれる機構は、完全には理解されていない；レセプター媒介性のエンドサイトーシスが、誤ってその微粒子を単純に包み込むと考えられている。逆行性移動のこの減少は、神経解剖学において広汎に使用されている。次いで、微粒子支持体の逆行性移動は直接観察され得る。逆に、神経細胞体からの軸索および樹状細胞への順行性移動もまた、本発明の微粒子標識の使用によって観察可能であるが、細胞に微粒子標識を進入させることは、一般にあまり容易ではない。複数の色を用いることによって、複数のそのような経路が観察され得る。さらに、発生胚における特定の型の細胞の移動もまた追跡され得る。
【００５１】
続いての生理学的経路における観察を整理するために、しばしば、細胞または樹状細胞の視野に亙って系統的に複数色の標識を適用することが有用である。これを図５に示す。これは、所定の複数色ビーズのマトリクスを如何に使用してオーバーラップする経路を選別するかを示す。複数のビーズが各経路の末端によって吸着されることから、類似の結果が、マトリクスに単色ビーズの種々の組合せを含む位置を提供することによって達成され得る（すなわち、色における相違は、個々のビーズにおいてその混合物を変動させるのではなく、ビーズミックスを変動させることによって達成される）。しかし、単一の微粒子支持体上で比率を変動させることにおいて、主要な色を混合することによって入手可能な種々の色を利用することがより簡便である。
【００５２】
使用のために、一般に、この標識は、試薬に付着され、その結果、各々の個々の色の標識が異なる公知の試薬へと結合される。次いで、この試薬の性質は、それが付着する標識の色から確認され得る。この試薬は、潜在的な標的もしくは分析物と反応性である任意の物質または化合物である。次いで、適切な試薬としては、タンパク質、炭水化物、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）などが挙げられ、これは、実行されるべきアッセイの性質に依存する。
【００５３】
１つの特に有用なセットの試薬としては、代表的に「抗体」として公知のタンパク質のクラスが挙げられる。このクラスは、種々の特異性の多種類の結合領域の生成を提供する。特定の抗原について特異的な古典的な「抗体」は、適切な脊椎動物の免疫および血漿もしくは血清からのポリクローナル抗体の回収またはハイブリドーマ技術を通じたモノクローナル抗体の回収を通じて得られる。この方法で得られた抗体は、結合特異性のためにその全体が必要であることはない。可変領域のみが存在することが必要である。従って、本明細書において使用される用語「抗体」の中には、抗体のフラグメント、例えば、Ｆab、Ｆａｂ’、およびＦ(ab')2フラグメントが含まれる。さらに、組換え技術の利用可能性は、潜在的に変更され、そして種に適合された形態の、特異的に結合する領域（例えば、単鎖Ｆv「抗体」）を作製する。より一般的には、「抗体」は、可変結合領域を含み得る、任意のグループのタンパク質性化合物をいうために本明細書において使用される。従って、多くのタンパク質において存在する溶媒に曝露されたループは、変異誘発技術を用いて構造において変更されて、広汎な種々の結合特異性を得ることができる。Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｅ．Ｗ．ら、Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ（１９９６）３：３５９−３６７．さらに、広汎な種々の特遺跡を有するペプチドおよび他のオリゴマーがコンビナトリアル技術を用いて構築されて、広汎に異なる結合特異性を有するパラログのパネルを得ることができる。Ｋａｕｖａｒ、Ｌ．Ｍ．米国特許第５，３４０，４７４（１９９４）。本明細書において使用される「抗体」には、そのような変動して結合するタンパク質すべてが含まれる。
【００５４】
タンパク質に加えて、核酸、特にオリゴマーは結合特異性が広範に変動し得る。多くの技法が、異なる結合特異性のオリゴマーを生成するために利用可能である；例えば、Ｓｅｌｅｘ技法（米国特許第５，５６７，５８８号）。
【００５５】
勿論、試薬の性質は、適用の性質に依存する。抗体は、組織型決定および他の診断アッセイに有用であり、ｃＤＮＡライブラリーから生成されたペプチドは、例えば、レセプター結合を評価することで有用である。例えば、オリゴヌクレオチドである試薬は、相補鎖ハイブリダイゼーションに基づくアッセイで有用である。コンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーである試薬は、医薬のスクリーニングにおいて有用である。アッセイの目的および型に依存する試薬の選択は、当業者に周知である。
【００５６】
従って、本発明の複数色標識は、種々のアッセイ、特に、複数の反応性が評価されなければならないアッセイで有用である。上記のように、１つの例は、標準的な血清学が、主要な型および亜型（サブタイプ）を規定する組織型決定である。例えば、診断抗体に結合した標識が設計され得、その結果、各々が３つの発蛍光団を異なる比率で有する大きなビーズが、主要クラスを表す異なる抗体に結合し、１０００までの主要クラスの同定を可能にする。同様に、各々が３つの発蛍光団を有する小ビーズが、１０００の亜型の間を識別し得る。従って、理論的に、単一の組織標本が、百万の血清に関して分類され得る。しかし、実際的な事項として、約１０００の別の抗体のみが、適切な分類を行うことを必要とされるに過ぎない。
【００５７】
本適用およびその他の適用においても、試験されるべき組織を固定することが必要である。例えば、グルタルアルデヒドを含む、標準的な固定状態は、あまり好まれない。なぜなら、本発明の標識には、透過性の表面を提供することが望ましいからである。固定条件の変化は、異なる型の標識間をさらに識別し得、これは、識別性の別の次元を付加する。これらの状況下で組織試料を固定化するために特に有用なポリマーは、Ｌａｎｄｅｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造されるポリマーに代表され、これは、所定の温度範囲で、ゲル状態とゾル状態との間の鋭い遷移を示す。これらポリマー間の遷移温度における差異は、ヒドロキシル化のような誘導体化を変動させることにより達成される。試料を固定することは、組織を、その遷移温度を越える温度、すなわちゾル状態のポリマーで浸潤することにより達成され得、次いで、冷却による切片形成のために固定される。異なる遷移温度を持つポリマーの比率を変えることにより、透過性の程度は、一般に、切片化後に再加温することにより、得られる試料中で調節され得る。さらなる温度操作は、所望のように透過性を変え得る。
【００５８】
別の適用では、ｃＤＮＡライブラリーを、各々が異なる「色」、すなわち、呈色生成成分の比率および／または異なる強度の呈色生成を持ち、そして各々がライブラリーからの異なるタンパク質を持つ、複数のビースを生成することにより、標的と相互作用するタンパク質について試験される。次いで、複数色のビーズのこのセットは、特定の標的への結合について一度にすべて試験され得、そしてそれが付着されるビーズの生成シグナルにより成功した相互作用が同定される。この標的は、固定化天然産物またはレセプターであり得；あるいは、このシステムは、酵母ツーハイブリッドアッセイにほぼ類似して、タンパク質の２つのライブラリー間、または基質の２つのコレクション間の相互作用を指向するように適合され得る。
【００５９】
本発明の標識により特徴付けられたアッセイシステムはまた、米国特許第５，２０２，２３１号および第５，５２５，４６４号に記載のように、ＤＮＡハイブリダイゼーションによるヌクレオチド配列決定での使用に適合され得る。この適合では、各参照単純ＤＮＡ配列が、異なる標識に結合される。次いで、標識配列のコレクションが、配列決定されるフラグメントの複数コピーに適用される。代表的には、このフラグメントは固定化され、そして標識のコレクションでプローブされる。
【００６０】
標識のコレクション（各々は異なるヌクレオチド配列に結合される）はまた、遺伝的試験に用いられ得る。１つの設計では、大きな粒子は、例えば、遺伝子の保存された領域に相補的な長ヌクレオチド配列を含み、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で全体遺伝子を規定するために用いられる。その一方、より短いヌクレオチド配列を含むより小さい粒子を基礎にした標識の別のセットを用いて、ハイブリダイゼーション条件下で多形性の領域中の変異を検出し得、ここで、単一のミスマッチでさえ、シグナルの減少に至る。この標識は、ＣＣＤ検出器を備えた高精度広視野顕微鏡中で読み取られ得る。これは、洗浄工程の必要性なしにこの標識を含む呈色生成成分に適切である。なぜなら、このような装置の鋭い焦点平面は、表面固定化された標的にハイブリダイズされる標識された配列と、そうでない配列との間の区別を可能にするからである。従って、一連の時点からの試料が、例えば、多くの遺伝子の発現について同時にアッセイされ得る。同様に、規定された時点において停止された胚発達における遺伝子発現の調査が可能であり、発現の空間的および時間的パターンが簡単に測定されることを可能にする。図３はこのアプローチを概略的に示す。黒三角および黒四角は、焦点平面（例えば組織切片）中に固定化された２つの分析物を示す。組織切片中の各分析物の存在は、これらの分析物の各々について標識保持試薬により検出される。
【００６１】
複数試薬に関する分析が所望されるなお別の例は、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにある。コンビナトリアルライブラリーの各メンバーは、標識と、異なる比率および／または呈色生成成分の量で結合する。従って，このライブラリー中の標的に結合し得る化合物の同一性は、その標識により生成される強度および呈色により確認され得る。微粒子標識への呈色生成成分の付加は、ライブラリーメンバーの合成と組み合わせて実施し得、その結果、提色生成成分の量または比率は、このライブラリーメンバーの構造的特徴と協調される。あるいは、呈色生成成分は、易動性リンカーにより結合され得、そして光分解または化学的切断の制御された程度によって、異なる量の標識が除去され得る。
【００６２】
コンビナトリアルライブラリーの１つの適用は、ランダム化された結合部位を有する組換え抗体のライブラリーである。このライブラリーは、呈色生成成分および／または光強度の異なる比率の標識に結合もしたメンバーとともに、例えば、ニトロセルロースにトランスファーしたｃＤＮＡの発現による得られたような、タンパク質ライブラリーをプローブするために用いられ得る。
【００６３】
標識された抗体のこのようなライブラリーを調製するために、簡便なアプローチは以下のようである：
微粒子支持体を、最初に、特定波長の活性化により溶解される連結を通じてこれら粒子に結合する呈色生成成分で均一に標識される微粒子支持体が、表面上に拡散される。次いで、フィルターが、この表面上に、特定のパターンで、呈色生成成分の比率およびその総数の多重度を生成するように採用される。この結果は、標識が系統的な様式で変化する二次元表面である。次いで、この表面は、各々が異なる組換え抗体を産生する個々のコロニーで重層される。好ましくは、この抗体は、ヘキサヒスチジンまたはＦＬＡＧエピトープにより改変され、対応する標識へのそれらの結合をより容易にする。次いで、複数色のアレイで標識された抗体のコレクションをプールし得、そしてこれらの抗体との反応性を有する抗原について試料をスクリーニングするために用いられる。成功した抗体を産生する細胞の回収は、標識の色を読み取ること、および各々を、その色が作成され、そしてその上にクローンが配置された二次元表面パターンに参照することにより達成される。このように、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で発現される抗原と特異的に反応する抗体が、次の診断使用のために同定され得る。
【００６４】
同様のプロトコールを用いて、酵母ツーハイブリッドアッセイに類似の様式で、ヌクレオチド配列を含む２つの異なるライブラリーのタンパク質またはペプチドメンバーの特異的相互作用を測定し得る。この２つのタンパク質の相互作用は、中間リンカーにより改変され得、その結果、１つのライブラリー中のタンパク質の、例えば、別にある小分子との相互作用もまた評価され得る。ヌクレオチド配列とタンパク質、例えばエンハンサーと転写因子との間の相互作用もまた、この方法で解明され得る。
【００６５】
コンビナトリアルライブラリーのタンパク質メンバーは、勿論、抗体である必要はないが、それに代わって、ｃＤＮＡライブラリーの産物であり得る。従って、本発明の標識および方法は、例えばヒトゲノムプロジェクトにより同定されるほぼすべての遺伝子に相互作用する特異的抗体を同定するために、ｃＤＮＡ×ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを可能にする。ＤＮＡプロモーター配列の転写因子との一致が同様に上記のように可能である。
【００６６】
より一般的に、本発明の方法を用いて、分泌タンパク質を一般に評価し得る。これらのタンパク質を分泌する細胞を、二次元でプレートし、そして、例えば、共に大部分のタンパク質を結合するＤＥＡＥアガロースとＣＭアガロースの組み合わせを含む捕獲層でカバーする。あるいは、この捕獲層は、抗体またはこの分泌タンパク質に相補的な他の特異的結合対メンバーを含み得る。この分泌され、かつ捕獲されたタンパク質を、曝されたままにある捕獲されたタンパク質上のエピトープに対する標識抗体のアレイに対して試験し得る。
【００６７】
別の適用は、１つのライブラリーの他に対するスクリーニングに関する。上記のように、抗体のライブラリーは、抗原のライブラリーに対してスクリーニングされ得る。抗体または抗原またはその両方は、それら自身が提供されるか、または発現ｃＤＮＡライブラリーもしくはコンビナトリアル核酸ライブラリーから生成され得る。このようなライブラリー×ライブラリースクリーニングを容易にするため、ライブラリーの１つのメンバーを、一致されるべき特異的結合対の反対のメンバーを含むと推定されるライブラリーのメンバーを結合するために用いれる支持体より相対的に大きい微粒子支持体に結合させることが有用である。粒子の２つのセットの相互作用は、成功した対合の「ロゼット」の形成を生じ、ここでより大きな粒子に結合した対のメンバーは、この結合対の反対のメンバーを含むより小さな粒子の数の蓄積を獲得する。ロゼットの存在は、パターンフィルターで簡便に検出され得て、その結果、これは、均一アッセイとして実施される。第１のライブラリーのメンバーおよび第２のライブラリーのメンバーの相互作用の測定の結果は、コンピューター読み出し可能な形態で記録され得る。
【００６８】
終点としてのロゼットパターンの使用はまた、競合アッセイを用いる分析物濃度のアッセイで用いられ得、ここでは、試料中の分析物は、図６に示されるように、大きな微粒子支持体に結合した特異的結合対の反対のメンバーについて、小粒子状支持体に結合した対応する分子と競合する。より高い濃度の分析物は、より効果的な競合を生じ、それ故、得られるロゼットの濃度を消滅させる。さらに、ロゼット形成に至る相互作用の親和性は、本明細書に参考として援用される米国特許第５，３５６，７８４号および同第５，６２０，９０１号に呈示されるように変化され得る。この競合アッセイは、均一フォーマットで実施し得、それ故それらを細胞内濃度測定に適切にする。従って、レセプター活性化によるホスホチロシンの産生は、このモチーフに対する抗体を用いて生細胞内で検出され得る。
【００６９】
本発明の方法および物質の別の特定の適用は、分析物溶液の連続分析のために設計され得るバイオセンサーの使用に関する。この分析物溶液は、標識された試薬のコレクションを含むメッシュを通過し、ここで、メッシュ穴のサイズは、標識された試薬が通過することを可能にするには小さ過ぎ；それ故、標識された試薬は、センサー内に捕獲される。このメッシュにより規定される区画は、標識が検出され得る位置、すなわち、例えば、顕微鏡の焦点平面にこの溶液中に含まれる分析物の競合するアナログをさらに含む。従って、この標識は、それが適切な位置で分析物の競合アナログにより捕獲される場合に認知されるのみである。分析されるべき試料がメッシュにより規定される区画を通過するとき、試料中の任意の分析物は、標識について、焦点平面に束縛されたアナログと競合し、それ故、それが検出され得る位置から標識を遊離する。従って、検出可能な標識の減少は、溶液中の分析物の存在および量を示す。複数色の標識のコレクションが用いられ得るので、複数の分析物が同時に評価され得る。これは、図７に模式的に示される。このようなシステムは、例えば、血液および尿中の薬物およびその代謝物のレベルを連続的にモニターするために有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、サンプルと標識との反応性を検出するためのシステムの模式図である。
【図２】  図２は、種々の色の標識の代表的なサンプルの組成を図示する。
【図３】  図３は、その対応する標識を有する各試薬が、独立して画像化される多重の分析物について溶液を分析するためのアッセイシステムを図示する。
【図４】  図４は、広いバンドパスフィルタまたは検出器を使用して、種々の色素が測定される場合の、色の強度の補正を示す。
【図５】  図５は、標識の規定されたマトリックスを使用する複雑な経路の観察を示す。
【図６】  図６は、競合アッセイを使用する終点としてのロゼットパターンの使用を示す。
【図７】  図７は、連続的な操作バイオセンサを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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