(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のターゲット核酸配列に特有の検出アッセイに使用されるオリゴヌクレオチドの組み合わせであって：
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第一のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第一の増幅プライマーとして機能する第一のオリゴヌクレオチドと；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン３に含まれる第二のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第二の増幅プライマーとして機能する第二オリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列であるＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＴＧ若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物を含む第二のオリゴヌクレオチドと；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第三のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする検出プローブとして機能する第三のオリゴヌクレオチドであって、ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物を含む第三のオリゴヌクレオチドと；
を含んでなり、第一のオリゴヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ＧＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物を含む、オリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項２】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のターゲット核酸配列に特有の検出アッセイに使用されるオリゴヌクレオチドの組み合わせであって：
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第一のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第一の増幅プライマーとして機能する第一のオリゴヌクレオチドと；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン３に含まれる第二のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第二の増幅プライマーとして機能する第二オリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列であるＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＴＧ若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなる配列を含む第二のオリゴヌクレオチドと；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第三のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする検出プローブとして機能する第三のオリゴヌクレオチドであって、ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなる第三のオリゴヌクレオチドと；
を含んでなり、第一のオリゴヌクレオチドが、ＧＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなる、オリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項３】
核酸を含有する生物学的サンプルにおいて前立腺関連ターゲット核酸を検出する方法であって：
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする発現遺伝子配列の少なくとも一部分を含むターゲット核酸を含有する核酸サンプルを提供する工程；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第一のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第一の増幅プライマーとして機能する第一のオリゴヌクレオチドを、前記ターゲット核酸またはターゲット核酸の相補鎖にハイブリダイズさせる工程；
第二の増幅プライマーとして機能する第二オリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列であるＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＴＧ若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物と、該ターゲット結合配列に隣接した追加のプロモーター配列とを含む第二のオリゴヌクレオチドを、前記ターゲット核酸にハイブリダイズさせる工程；
前記第一の増幅プライマー及び第二の増幅プライマー、並びに少なくとも１つのポリメラーゼ活性を用いることによって、前記ターゲット核酸の複数の増幅産物を提供する工程；
前記ターゲット核酸の少なくとも１つの増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドであって、ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物を含むプローブオリゴヌクレオチドを提供する工程；並びに
前記増幅産物とハイブリダイズしたプローブから生じるシグナルを検出する工程
を含んでなり、第一のオリゴヌクレオチドが、ＧＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物を含む、方法。
【請求項４】
核酸を含有する生物学的サンプルにおいて前立腺関連ターゲット核酸を検出する方法であって：
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする発現遺伝子配列の少なくとも一部分を含むターゲット核酸を含有する核酸サンプルを提供する工程；
ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソン２に含まれる第一のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする第一の増幅プライマーとして機能する第一のオリゴヌクレオチドを、前記ターゲット核酸またはターゲット核酸の相補鎖にハイブリダイズさせる工程；
第二の増幅プライマーとして機能する第二オリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列であるＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＴＧ若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のターゲット結合配列と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなる配列と、前記ターゲット結合配列に隣接した追加のプロモーター配列とを含む第二のオリゴヌクレオチドを、前記ターゲット核酸にハイブリダイズさせる工程；
前記第一の増幅プライマー及び第二の増幅プライマー、並びに少なくとも１つのポリメラーゼ活性を用いることによって、前記ターゲット核酸の複数の増幅産物を提供する工程；
前記ターゲット核酸の少なくとも１つの増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドであって、ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなるプローブオリゴヌクレオチドを提供する工程；並びに
前記増幅産物とハイブリダイズしたプローブから生じるシグナルを検出する工程
を含んでなり、第一のオリゴヌクレオチドが、ＧＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）若しくはそのＲＮＡ均等物、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と相補的な塩基配列若しくはそのＲＮＡ均等物からなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌マーカーとして役立つ核酸の、生物学的サンプルにおける検出に関し、特に、生物学的サンプルにおいて個別又は一緒に存在するときに生物体の癌、特に前立腺癌及び乳癌の存在を指示する、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、及び／又はヒト腺カリクレイン（ｈＫ２）をコードする核酸を特異的に検出する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
前立腺癌は、男性、特に６０歳以上の男性の主要な死因である。この癌の生物学的攻撃性は個体間で大きく異なり、臨床上の重大性に進展しない潜在腫瘍としてとどまる癌もあれば、２〜３年以内に致命的な疾患へ急速に進行して転移する癌もある。前立腺腫瘍の臨床診断及び段階付けは、指直腸診（ＤＲＥ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン及び／又は直腸内磁気共鳴画像（ＭＲＩ）に基づいている。さらに、前立腺組織に特異的であるか又は高度に発現されている分子マーカーを有する細胞の検出が診断に使用されてきた。
【０００３】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺の上皮細胞において高濃度で産生されて前立腺の管へ分泌されるプロテアーゼである。ＰＳＡは前立腺癌（前立腺の腺癌）を検出するための分子マーカーである。前立腺の酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、前立腺転移を検出するための血清マーカーとして使用されているもう１つの分泌酵素である。前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）は、骨及びリンパ節の転移を含む前立腺癌組織においてやはり高度に発現されていて、特徴づけられ、単離され、そしてそれをコードする遺伝子がクローン化されている（Israeli et al., への米国特許第５，５３８，８６６号；O'Keefe D. S. et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta 1443 (1-2): 113-127）。ヒト腺カリクレイン−２（ｈＫ２）は、前立腺癌に結びつけられているもう１つの前立腺関連タンパク質である（Partin A. W. et al., 1999, Urology 54 (5): 839-845; Darson M. F. et al., 1999, Urology 53 (5): 939-944）。
【０００４】
研究者たちはまた前立腺特異マーカーの存在を乳房組織及び／又は乳房分泌物と関連づけてきた（Yu H. & Berkel H., 1999, J. La. State Med. Soc. 151 (4): 209-213）。例えば、良性又は悪性の乳房腫瘍と乳房の嚢胞液におけるＰＳＡの検出が明示されている（Diamandis, E. P. et al., 1994, Breast Cancer Res. Treat. 32: 291-300; Yu, H. et al., 1994, Clin. Biochem. 27: 75-79; Monne, M. et al., 1994, Cancer Res. 54: 6344-6347; Malatesta M. et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 57(2): 157-163; Romppanen J. et al., 1999, Br. J. Cancer 79 (9-10): 1583-1587）。ヒトカリクレイン−２も乳房腫瘍と正常な乳房分泌物に発現されている（Black M. H. et al., 2000, Br. J. Cancer 82 (2): 361-367）。乳癌には米国女性人口の約１０％が罹患し、したがって、この疾患に関連した癌マーカーの検出には臨床上の有用性がある。
【０００５】
前立腺癌又は乳癌のような癌が臓器内にとどまり、局部侵襲性である（つまり、前立腺癌では、被膜又は精嚢に浸透している）か、又は離れた部位へ転移しているかを決定することは、癌の予後判定と適切な治療法の決定の両方に重大な影響を及ぼす。従って、癌の転移を検出する有効な方法は医学的に重要である。例えば、前立腺癌の骨組織又は骨盤リンパ節への転移を検出することがこの疾患の進行を段階づけるのに使用されてきた。これらの部位にある転移性の前立腺癌細胞は、組織学的検査、ＰＳＡ特有の免疫細胞学、又はＰＳＡ・ｍＲＮＡを検出する逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Deguchi, T. et al., 1993, Cancer Res. 53: 5350-5354）により検出され得る。前立腺癌細胞はまた、血流に入ることで遠い部位へ広がり、そこでこの細胞は転移が成立し得ると推定されている。検出可能な前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び／又はＰＳＡ合成細胞が循環血に存在していることは、潜在的な前立腺癌の転移（「血行性微小転移」と言われる場合もある）を示唆する異常な状況である。ただし、循環する固形癌細胞のなかで最終的に転移性の沈着物になるのはその約０．０１％にすぎない（Moreno, J. G. et al., 1992, Cancer Res. 52: 6110-6112）。同様に、女性において異常量のＰＳＡを検出することは乳癌の存在を示す可能性がある（Yu H. & Berkel H., 1999, J. La. State Med. Soc. 151 (4): 209-213）。
【０００６】
様々な前立腺組織抗原と反応するモノクローナル抗体が開示されている（Bazinet et al. による米国特許第４，９７０，２９９号、Freeman et al.による第４，９０２，６１５号、Chu et al.による第４，４４６，１２２号及び再発行Ｒｅ ３３，４０５号、McEwan et al.による第４，８６３，８５１号、Ueda et al.による第５，０５５，４０４号、Horoszewiczによる第５，７６３，２０２号、及び Banderによる第５，７７３，２９２号）。体液中の全ＰＳＡ、フリーＰＳＡ（α−１−アンチキモトリプシン又は「ＡＣＴ」に結合していない）及びＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を測定するためのモノクローナル抗体をベースとした免疫アッセイが、良性前立腺肥大症（ＢＨＰ）の患者と前立腺癌の患者とを区別するための診断法として開示されている（Lilja et al.による米国特許第５，６１４，３７２号、Luderer et al.による米国特許第５，６９８，４０２号及び第５，７１０，００７号）。他の既知の免疫アッセイは血清の全ＰＳＡを測定し、血清中のフリーＰＳＡとＰＳＡ−タンパク質複合体を区別するが、前立腺癌患者の血清では後者がより高い濃度になる傾向がある（Dowell et al.による米国特許第５，６７２，４８０号）。羊水のＰＳＡ濃度も、抗体をベースとするアッセイにより判定されるように、胎児の異常を示唆するものとして妊娠期間に関連づけられている（Diamandisによる米国特許第５，５７９，５３４号）。
【０００７】
末梢血におけるＰＳＡ−合成細胞のＲＴ−ＰＣＲ検出も、Ｄ１〜Ｄ３段階の病態、及び前立腺腫瘍細胞による被膜浸透と関連づけられている（Moreno, J. G. et al., 1992, Cancer Res. 52: 6110-6112; Katz, A. E. et al., 1994, Urology 43: 765-775; Croce et al.による米国特許第５，５０６，１０６号、５，６８８，６４９号及び５，６７４，６８２号；Vessella, R. L. et al., 1992, Proc. Am. Soc. Cancer Res. 33: Abstract No. 2367; Diamandis, E. P. & Yu, H., 1995, Clin. Chem. 41: 177-179）。一般に、ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、血液サンプルからＲＮＡを得ること、このＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写すること、ＰＳＡ遺伝子の様々な個別領域に相補的なプライマー対を使用してこのｃＤＮＡを増幅させること、及び特定サイズのＤＮＡをゲル上で観察することによってこの増幅されたＤＮＡの存在を証明することに基づく。ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、繰り返される連続の熱変性、プライマーアニーリング及び合成の諸工程を必要とする（Mullis et al.による米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，８００，１５９号）。増幅されたＤＮＡはまた、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＳＡ特異オリゴヌクレオチドを用いたプロービング（例、サザンブロッティング）、及び／又はＤＮＡ配列決定によりさらに特徴づけられる場合がある。他のタイプの固形腫瘍（メラノーマ、神経芽細胞腫、乳癌、頚部癌）の微小転移も他の細胞マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して検出されている（Wu, A. et al., 1990, US & Can. Acad. Pathol. Ann. Mtg., Abstract No. 641.; Smith B. et al., 1991, Lancet 338: 1227-1229; Naito, H. et al., 1991, Eur. J. Cancer 27: 762-765; Mattano, Jr., L. A. et al., 1992, Cancer Res. 52: 4701-4705; Sobel et al.による米国特許第５，５４３，２９６号及び５，７６６，８８８号）。
【０００８】
ＰＳＡは腺カリクレインとして知られるセリンプロテアーゼ群のメンバーである。ヒトカリクレインには、膵臓／腎臓カリクレイン（ｈＫ１）、前立腺特異腺カリクレイン（ｈＫ２又はＨＰＳＫ）及びＰＳＡ（ｈＫ２としても知られている）が含まれ、関連する遺伝子（それぞれｈＫＬＫ１、ｈＫＬＫ２及びｈＫＬＫ３又はＰＳＡ）によりコードされる。上記タンパク質及び遺伝子の化学的及び構造上の類似性のために、免疫アッセイにおいて個々のタンパク質を、核酸検出法において個々の遺伝子又はその対応するｍＲＮＡを区別し得ることが重要である。ｈＫ２の発現は前立腺癌及び乳癌と関連づけられてきた（Black M. H. et al., 2000, Br. J. Cancer 82 (2): 361-367; Partin A. W. et al., 1999, Urology 54 (5): 839-845; Darson M. F. et al., 1999, Urology 53 (5): 939-944）。ヒト前立腺特異腺カリクレインと特異的に反応してＰＳＡとは反応しない抗体（抗ｈＫ２）が記載されている（Tindall et al.による米国特許第５，５１６，６３９号； Bandman et al.による米国特許第５，７８６，１４８号）。ヒトカリクレインの遺伝子配列が知られている（Bandman et al.による米国特許第５，７８６，１４８号；ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＮＭ００５５５１、Ｍ２１８９５、Ｍ２７２７４、Ｍ２４５４３、Ｍ２１８９７、Ｍ２６６６３、Ｍ２１８９６、Ｓ７５７５５、Ｕ１７０４０、Ｓ３９３２９及びＭ１８１５７）。
【０００９】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＰＳＡ・ｍＲＮＡの増幅とＤＮＡ産物の検出に有用な核酸配列がいくつか記載されている（例えば、Deguchi, T. et al., 1993, Cancer Res. 53: 5350-5354; Katz, A. E. et al., 1994, Urology 43: 765-775; Moreno, J. G. et al., 1992, Cancer Res. 52: 6110-6112; Croce et al.による米国特許第５，５０６，１０６号、５，６８８，６４９号及び５，６７４，６８２号）。前立腺組織外の部位にある前立腺関連遺伝マーカー（例、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ及び／又はｈＫ２）の検出は、特に男性の前立腺癌と男性及び女性の乳癌の癌転移を検出し、それにより適切な治療法を示すことに有用である。このように、前立腺関連遺伝マーカー、即ち、診断情報を提供する特定ｍＲＮＡの配列の遺伝的な発現の存在を特異的に検出するのに使用される核酸配列及び方法についての臨床上のニーズが存在する。微小転移において出現するような、このｍＲＮＡを含有する比較的少数の細胞を生物学的サンプルにおいて検出するのに有用なレベルで上記の前立腺関連マーカーｍＲＮＡを検出することについて、特にニーズが存在する。
【００１０】
発明の概要
本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする核酸、特にｍＲＮＡを非前立腺の生物学的サンプルにおいて検出及び／又は定量するためのアッセイ法に向けられている。特に、本発明には、ＰＳＡ特異核酸を増幅して、増幅されたそれにハイブリダイズするのに有用な好ましい核酸配列が含まれる。
【００１１】
本発明の１つの側面によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のもう１つの側面は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のいずれか１つの配列からなるターゲット結合配列、並びに所望により増幅反応に必要とされる隣接配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである。好ましい態様では、増幅反応に必要とされる隣接配列はポリメラーゼ結合配列であり、より好ましくは、このポリメラーゼ結合配列はＴ７・ＲＮＡポリメラーゼに結合する。好ましい態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいずれか１つである配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
本発明のもう１つの側面は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のターゲット核酸配列に特有の検出アッセイに使用されるオリゴヌクレオチドの組み合わせである。この組み合わせは、ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソンに含まれる第一のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズするか、又はＰＳＡ発現遺伝子配列の２つのエクソンを連結する結合点に及ぶ、第一の増幅プライマ―として役立つ第一のオリゴヌクレオチド；ＰＳＡ発現遺伝子配列のエクソンに含まれる、別の、重複しない第二のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズするか、又はＰＳＡ発現遺伝子配列の２つのエクソンを連結する結合点に及ぶ、第二の増幅プライマ―として役立つ第二のオリゴヌクレオチド；及びＰＳＡ発現遺伝子配列の１つまたはそれ以上のエクソンに含まれる第三のＰＳＡ特異配列と特異的にハイブリダイズする、検出プローブとして役立つ第三のオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、第一のＰＳＡ特異配列は、ＰＳＡのエクソン２、エクソン３若しくはエクソン４に含まれるか、又はエクソン２及び３、又はエクソン３及び４を連結する結合点に及ぶ配列である。好ましくは、第二のＰＳＡ特異配列は、ＰＳＡのエクソン３、エクソン４若しくはエクソン５に含まれるか、又はエクソン３及び４若しくはエクソン４及び５を連結する結合点に及ぶ配列である。好ましくは、第三のＰＳＡ特異配列は、ＰＳＡのエクソン２、エクソン３、エクソン４若しくはエクソン５の内部に含まれるか、又はＰＳＡのエクソン２及び３、エクソン３及び４、若しくはエクソン４及び５を連結する結合点に及ぶ。特に好ましいオリゴヌクレオチドの組み合わせは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６からなる群から選択される配列を含んでなる第一のオリゴヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１からなる群から選択される配列を含んでなる第二のオリゴヌクレオチド；及び、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる群から選択される配列を含んでなる第三のオリゴヌクレオチドである。追加の好ましい第一、第二、及び第三のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、その順で、以下の配列を有する：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８。
【００１３】
第一、第二及び第三のオリゴヌクレオチドの特に好ましい組み合わせは、その順で、以下の配列を有する：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８。
【００１４】
他の態様では、第一、第二及び第三のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、少なくとも１つのヘルパープローブオリゴヌクレオチドをさらに包含する。ある組み合わせに包含される好ましいヘルパープローブオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の配列を有するオリゴヌクレオチド、又はこれらの配列を有するオリゴヌクレオチドの組合せからなる。第一、第二、及び第三のオリゴヌクレオチド、及びヘルパープローブオリゴヌクレオチドの特に好ましい組み合わせは、その順で、以下の配列を有する：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８。
【００１５】
より好ましくは、第一、第二、及び第三のオリゴヌクレオチド、及びヘルパープローブオリゴヌクレオチドの特に好ましい組み合わせは、その順で、以下の配列を有する：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８；又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８。
【００１６】
本発明の１つの側面は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）又はヒトカリクレイン２（ｈＫ２）をコードする少なくとも１つの発現遺伝子配列の少なくとも一部が含まれるターゲット核酸を含有する核酸サンプルを提供すること；次いで、ターゲット核酸又はその相補体と特異的にハイブリダイズする配列を含有する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドを前記ターゲット核酸とハイブリダイズさせること；少なくとも１つのポリメラーゼ活性を使用することによってターゲット核酸の複数の増幅産物を産生させること；ターゲット核酸の少なくとも１つの増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを提供すること；及び増幅産物とハイブリダイズしたプローブから生じるシグナルを検出することの工程を含んでなる、核酸を含有する生物学的サンプルにおいて前立腺関連のターゲット核酸を検出する方法である。好ましい態様では、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のいずれか１つの配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のいずれか１つのターゲット結合配列を含む。１つの態様では、ターゲット核酸がＰＳＡ・ｍＲＮＡであり；少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが、ＰＳＡ・ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とプロモーター配列である配列とからなるプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチド、及び、ＰＳＡ・ｍＲＮＡに相補的な核酸鎖と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドを含み；及び、プローブオリゴヌクレオチドがＰＳＡ・ｍＲＮＡの増幅産物と同じであるセンスのそれと特異的にハイブリダイズする。好ましくは、プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のいずれか１つの配列を含み、及び、ＰＳＡ・ｍＲＮＡに相補的な核酸鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のいずれか１つの配列を含む。もう１つの態様では、ターゲット核酸がＰＳＭＡ・ｍＲＮＡであり；少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが、ＰＳＭＡ・ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とプロモーター配列である配列とからなるプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチド、及び、ＰＳＭＡ・ｍＲＮＡに相補的な核酸鎖と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドを含み；及び、プローブオリゴヌクレオチドがＰＳＭＡ・ｍＲＮＡの増幅産物と同じであるセンスのそれと特異的にハイブリダイズする。好ましくは、プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９の配列を含み、及び、ＰＳＭＡ・ｍＲＮＡの増幅産物と同じであるセンスのそれと特異的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を含む。もう１つの態様では、ターゲット核酸がｈＫ２・ｍＲＮＡであり；少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが、ｈＫ２・ｍＲＮＡの���なくとも一部に相補的な配列とプロモーター配列である配列とからなるプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチド、及び、ｈＫ２・ｍＲＮＡに相補的な核酸鎖と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドを含み；及び、プローブオリゴヌクレオチドがｈＫ２・ｍＲＮＡの増幅産物と同じであるセンスのそれと特異的にハイブリダイズする。好ましくは、プロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７の配列を含み、及び、ｈＫ２・ｍＲＮＡの増幅産物と同じであるセンスのそれと特異的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６の配列を含む、請求項１４に記載の方法である。好ましくは、検出工程が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のいずれか１つの配列からなる少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを使用する。この方法の１つの態様は、ＰＳＡをコードする発現遺伝子配列とＰＳＭＡ又はｈＫ２をコードする少なくとも１つの発現遺伝子配列についてアッセイすることを含む。好ましい態様では、核酸サンプルは、ヒト前立腺組織、末梢血、乳房組織、腎臓組織、小腸、肺組織、肝臓組織又はリンパ節から単離したＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡである。好ましい態様では、検出工程は均質な検出アッセイにおけるシグナルを検出する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明には、ヒトＰＳＡ遺伝子のセグメントに特有の核酸配列が含まれ、これは前立腺組織からは採取されない生物学的サンプルから調製された核酸においてＰＳＡ特異配列を検出する方法に使用される。さらに本発明には他の前立腺関連遺伝マーカーであるヒトＰＳＭＡ遺伝子及びｈＫ２遺伝子のセグメントに特有の核酸配列が含まれ、これらは、乳房組織を含む非前立腺組織の生物学的サンプルから調製された核酸において、有用な癌検出マーカーである前立腺関連配列を検出する方法に使用される。この非前立腺組織には、例えば、血液、リンパ節、乳房又は乳房の嚢胞、腎臓、肝臓、肺、筋肉、胃又は小腸の組織が含まれる。本発明には、非前立腺組織内のＰＳＡ特異配列、ＰＳＭＡ及び／又はｈＫ２配列を個別にか又は一緒に増幅して検出するための核酸配列群を組み合わせる好ましい方法も含まれる。この好ましい方法では、加熱サイクリングを必要とせずにＰＳＡ、ＰＳＭＡ及び／又はｈＫ２のｍＲＮＡ配列が増幅され、この増幅された配列が均質アッセイ系において検出される。この方法には、末梢血、リンパ節又は骨髄のような非前立腺組織サンプルに由来するＲＮＡサンプルを調製するための単純化された方法が場合により含まれるが、他の非前立腺組織も使用され得る。好ましいＲＮＡ調製法は比較的単純であり、生物学的サンプルにおいて比較的少ない量で出現するｍＲＮＡ種の分析及び検出に適したＲＮＡを提供する。
【００１８】
ヒトＰＳＡ遺伝子の配列は知られていて、数多くのデータベースで利用可能である（ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータベース、受入れ番号：ＡＦ００７５４４、Ｘ０５３３２、Ｍ２６６６３、Ｘ０７７３０、Ｍ２１８９５、Ｍ２１８９６、Ｍ２１８９７、Ｓ７５７５５、Ｕ１７０４０、Ｘ１３９４２、Ｘ１４８１０、Ｍ２４５４３、Ｍ２７２７４；「Ｘ」ではじまる受入れ番号はＥＭＢＬデータベースの配列を示す）。ヒト腺カリクレイン−１に関連する遺伝子の配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｓ３９３２９）も、ヒト前立腺特異膜抗原配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ９９４８７）と同じように知られている。図１に示すように、ＰＳＡ及びカリクレイン−１の遺伝子は類似の構造特性を共有し、４個の内部イントロン（Ｉ１〜Ｉ４と表示）により分離された５個のエクソン（Ｅ１〜Ｅ５と表示）が含まれる。非翻訳５’及び３’領域を含むＰＳＡ遺伝子の完全な配列は約６．８ｋｂに及ぶ。ＰＳＡ遺伝子と他のカリクレイン遺伝子ファミリーメンバーとの構造及び配列上の類似性のために、ＰＳＡ特異プライマー及びプローブとして役立つ好適なＰＳＡ配列部分は、非前立腺組織サンプルにあるＰＳＡ特異核酸を増幅して検出する方法にきわめて重要である（即ち、カリクレイン核酸の増幅及び／又は検出から生じる偽陽性を回避するために）。ＰＳＡ特異配列を検出するのに使用される本発明の好ましいプローブ、プライマー及びプロモーター−プライマーを（そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：とともに）表１に示す。
【００１９】
【表１】
0004495349.tif 000002
【００２０】
【表２】
0004495349.tif 000003
【００２１】
図２〜４は、発現されるヒトＰＳＡ遺伝子配列（ＨＳＰＳＡＲ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０５３３２の１，４６６ｂｐ）に比較した上記配列の相対位置を示し、エクソンとイントロンスプライス部位の相対位置を図の下に示す。図２を参照すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列を有するプローブの相対位置が示される。上記の好ましいプローブは、エクソン２、３及び４においてＰＳＡ配列に特異的である。ＰＳＡのイントロン３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）に特有のプローブは図２に示されていない。図３を参照すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の配列を有するプライマーの相対位置が示される。これらの好ましいプライマーは、エクソン２、３、４において、及びスプライス連結部（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含んで広がるエクソン２及び３において、ＰＳＡ配列に特異的である。図４を参照すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の配列を有するプロモーター−プライマーのターゲット結合配列の相対位置が示される。これらの好ましいターゲット結合配列はエクソン３、４、５においてＰＳＡ配列に特異的である。
【００２２】
ｈＫ２配列を増幅して検出するのに好ましいプライマーは、ＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）の配列を有し、好ましいプロモーター−プライマーは、ＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）の配列を有する。増幅されたｈＫ２配列を検出するのに適した標識プローブは、表１に示したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を使用する。
【００２３】
ＰＳＭＡ配列を増幅して検出するのに好ましいプライマーは、ＣＡＧＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の配列を有し、好ましいプロモーター−プライマーは、ＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）の配列と、配列ＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）が含まれる標識プローブを有する。
【００２４】
本発明には、ＰＳＡ特異ＲＮＡ種を検出して定量する方法も含まれるが、これが特に重要であるのは，これらのｍＲＮＡ種が非前立腺組織から調製されるＲＮＡサンプルでは比較的少ない量しか出現しないからである。本発明の他の態様には、前立腺に関連したＰＳＭＡ及びｈＫ２のＲＮＡ種を検出する方法が含まれるが、これらが個別にか又はそれぞれ互いにか又はＰＳＡ配列とともに検出されるときに重要になるのは、これらも非前立腺組織において見出されるときに前立腺癌及び乳癌の癌マーカーとなるからである。さらに、上記前立腺関連マーカー（ＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２）を個別にか又は組み合わせて検出することが臨床的に重要であるのは、それぞれの患者に由来する癌が１種又はそれ以上のマーカーを発現する場合があるので、この諸マーカーの１つ又はそれ以上を検出することで、たった１つのマーカーの存在だけを試験した場合に得られるかもしれない偽陰性の可能性が減らせるからである。上記の方法は、前立腺の生検を必要としない医学的診断と前立腺癌の治療に対する患者の応答を臨床的にモニターするのに有用である。この方法は、ＰＳＡ特異ｍＲＮＡのような前立腺関連ＲＮＡの比較的低いレベルの存在を検出するのに十分な感度があるので、それらは前立腺癌及び／又は乳癌の再発又は転移を検出するのに有用である。本方法のもう１つの利点は、ターゲット配列の様々なエクソンに特異的な増幅プライマーが、スプライスされて近傍にあるエクソンが連結したｍＲＮＡだけを増幅するので、それにより、生物学的サンプル中に混在しているゲノムＤＮＡから生じる可能性のある偽陽性の増幅及び検出をなくせることである。本発明のそのような態様では、ゲノム配列のエクソンがイントロン配列により分かれているために、２つのプライマー結合部位間の全領域が効率よく増幅されないので、ゲノムＤＮＡの検出が除外され、従って検出されない。
【００２５】
本発明には、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２核酸配列に特異的なマーカーを含む、ヒト前立腺関連遺伝マーカーを増幅して検出するための核酸配列の好ましい組み合わせも含まれる。
【００２６】
本明細書の随所で提供される定義に加え、いくつかの用語を以下のように定義した。他に示すか又は定義することがなければ、本明細書に使用されるあらゆる科学及び技術の用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に使用される多くの用語の一般的な定義については、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY) 及び Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27th ed. (W. A. Dorland, 1988, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA) に提供される。
【００２７】
「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、相補的な塩基配列を有するもう１つのＤＮＡ又はＲＮＡの核酸鎖と水素結合し得る直線状の情報含有分子に沿った窒素性塩基の配列を意味する。この用語は、そのような情報含有分子をヌクレオチドのポリマーそのものに限定することを意味せず、ポリマー内に１つ又はそれ以上のヌクレオチド類似体又は非塩基性ユニットを含有する分子構造も包含する。ポリマーは、糖部分又はリボース又はデオキシリボースの置換物（例えば、２’−ハロゲン化物か、メトキシ置換されたペントース糖）を含有する塩基サブユニットを含み、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、及びペプチド連結のような、ホスホジエステル結合以外の連結により連結される場合がある。
【００２８】
「オリゴヌクレオチド」は、２種又はそれ以上の化学サブユニットのポリマー鎖を意味し、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、サブユニットを線状の空間配置においてつなぐ連結部分を含んでなる。オリゴヌクレオチドはそのようなサブユニットを１０００個まで含有し得るが、一般には、約５〜約１０個のサブユニットの下限と約２０〜約１０００個のサブユニットの上限範囲にあるサブユニットを含有する。最も一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）であるが、水素結合し得る他の稀であるか又は修飾されたヌクレオチド塩基（例、イノシン又はＩ）も当業者によく知られている。最も一般的な糖部分はリボース及びデオキシリボースであるが、２’−Ｏ−メチルリボース、ハロゲン化された糖、及び他の修飾された異なる糖もよく知られている。連結基は通常リン含有部分であり、普通はホスホジエステル連結であるが、他の既知のリン酸含有連結（例、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）と当技術分野で知られているリンを含有しない連結（例えば、「ペプチド核酸」又はＰＮＡに見出されるペプチド様の連結）も含まれる。このように、ＰＮＡはこのオリゴヌクレオチドの定義に該当すると考えられる。同様に、オリゴヌクレオチドには、少なくとも１つの塩基部分が、例えばプロピン基の付加により修飾されたものが含まれるが、但し、（１）修飾された塩基部分がＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＵと非共有結合を形成する能力を保持すること、及び（２）少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド塩基部分を含んでなるオリゴヌクレオチドが相補的な単鎖核酸とハイブリダイズすることが立体的に妨害されないことの限りにおいてである。特定の条件（例えば、温度、塩濃度）の下で相補的な核酸鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力は、当業者によく知られるように、塩基部分の配列によって支配される（Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 特に、pp. 7.37-7.35 及び 11.47-11.57）。
【００２９】
「増幅」は、意図された特定のターゲット核酸配列（ＰＳＡ、ＰＳＭＡ又はｈＫ２）の少なくとも一部分を含有するターゲット核酸の多重コピーを産生することを意味する。この多重コピーはアンプリコン又は増幅産物と言われる場合がある。好ましくは、増幅されるターゲットは、完全なターゲット遺伝子（イントロン及びエクソン）より少ない配列か、又は発現されるターゲット遺伝子配列（エクソン及び隣接非翻訳配列のスプライスされた転写物）を含有する。例えば、ＰＳＡ特異アンプリコンは、ＰＳＡターゲットポリヌクレオチドの内部位置にハイブリダイズし、そこからポリマー化を開始する増幅プライマーを使用することにより、ＰＳＡターゲットポリヌクレオチドの一部を増幅することによって産生し得る。好ましくは、この増幅される部分は、様々な既知の方法のいずれかを使用して検出され得る、検出可能なターゲット配列を含有する。
【００３０】
「核酸増幅条件」は環境条件を意味し、それには、塩濃度、温度、温度サイクリングの有無、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び、核酸増幅法を使用してターゲット核酸又はその相補鎖の多重コピーの産生を可能にする補助因子の存在が含まれる。核酸増幅に関する多くの既知の方法では、二本鎖の核酸を選択的に変性してプライマーをハイブリダイズするために熱サイクリングが必要とされる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；４，８００，１５９号；４，９６５，１８８号）では、変性、プライマー対の反対鎖へのアニーリング、ターゲット配列のコピーを指数関数的に増加させるプライマー伸長のサイクルが何度も使用される。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変法では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をつくり、次いでこのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して多数のＤＮＡコピーを産生する。リガーゼ連鎖反応又はＬＣＲ（Weiss, R. 1991, Science 254: 1292）は、ターゲット核酸の隣接領域にハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合される相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの２セットを使用し、熱変性、ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを繰り返して、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を産生する。もう１つの方法は、鎖置換増幅又はＳＤＡ（Walker, G. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396; 米国特許第５，２７０，１８４号及び５，４５５，１６６号）であり、ここでは、ターゲット配列の反対の鎖へプライマー配列の対をアニールさせること、ｄＮＴＰ［α］Ｓの存在下でプライマーを伸長させ、二重鎖の半ホスホロチオエート化されたプライマー伸長産物を産生すること、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位をエンドヌクレアーゼ介在ニッキングすること、及び、ニックの３’末端からポリメラーゼ介在性のプライマー伸長を実施して、既存の鎖を置換し、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキング及び鎖置換のために鎖を産生することのサイクルを使用して、幾何学的な増幅産物を生じさせる。好熱性ＳＤＡ又はｔＳＤＡは、本質的に同じ方法においてより高い温度で好熱性のエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを使用する（欧州特許出願０６８４，３１５号）。他の増幅法には、核酸ベースの配列増幅又はＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号）、ＲＮＡレプリカ−ゼ（Ｑβレプリカ−ゼ）を使用してプローブ分子そのものを増幅する方法（Lizardi, P. et al., 1988, BioTechnol. 6: 1197-1202）、転写ベースの増幅法（Kwoh, D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177）、自己持続性の配列複製（Guatelli, J. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878）、及び、ターゲット配列の多重ＲＮＡ転写物を産生する転写介在増幅（Kacian & Fultzによる米国特許第５，４８０，７８４号及び５，３９９，４９１号）が含まれる。既知の増幅法に関するさらなる論考については、Persing, David H., 1993, "In Vitro Nucleic Acid Amplication Techniques" in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.,), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC) を参照のこと。
【００３１】
本発明の好ましい転写ベースの増幅系はＲＮＡポリメラーゼを利用して、ターゲット領域のＲＮＡ転写物を多数合成する（Kacian & Fultzによる米国特許第５，４８０，７８４号及び５，３９９，４９１号）。転写介在増幅（ＴＭＡ）は、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの存在下でターゲット核酸とハイブリダイズするプロモーター−プライマーを使用し、二本鎖プロモーターを形成させる。次いで、ＲＮＡポリメラーゼの活性により、ＲＮＡ転写物とハイブリダイズし得る第二のプライマーの存在下でＴＭＡのさらなるラウンドの鋳型になり得るＲＮＡ転写物が産生される。熱変性を必要とするＰＣＲ、ＬＣＲ又は他の方法と異なり、ＴＭＡは等温法であり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化するＲＮアーゼＨの活性を使用することによって、ＤＮＡ鎖をプライマー又はプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能なようにする。一般に、このＲＮアーゼＨ活性は、増幅のために供されるレトロウイルスの逆転写酵素とともに使用される。
【００３２】
「プライマー」又は「増幅プライマー」は、ターゲット核酸又はその相補体の領域に結合し、このターゲット核酸の核酸増幅を促進し得るオリゴヌクレオチドを意味する。ほとんどの場合、プライマーは、核酸ポリメラーゼにより伸長され得るフリーの３’末端を有する。すべての増幅プライマーには、ターゲット核酸の少なくとも１つの鎖と直接か又はターゲット配列に相補的である鎖のいずれか一方と、相補的な塩基相互作用を介してハイブリダイズし得る塩基配列が含まれる。増幅プライマーは、より長い核酸産物を産生する酵素活性の基質として役立つ。
【００３３】
例えば、ＰＣＲでは、増幅プライマーは、変性した二本鎖ターゲットＤＮＡの反対鎖にアニールし、このプライマーは熱安定なＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて二本鎖ＤＮＡ産物を産生し、これが熱で変性され、冷却され、増幅プライマーにアニールされ、そしてこのプライマーは多数サイクル（例えば、約２０〜約５０回の熱サイクル）の間にポリメラーゼ活性により伸長される。
【００３４】
もう１つの例であるＴＭＡでは、１つの増幅プライマーは、ターゲットＲＮＡとハイブリダイズする「プロモーター−プライマー」であり、逆転写酵素（ＲＴ）がターゲットＲＮＡのｃＤＮＡコピーを産生する一方、ＲＮアーゼＨの活性がターゲットＲＮＡを分解する。このプロモーター−プライマーは、ターゲット配列にハイブリダイズし得るターゲット結合配列の５’に位置するプロモーター配列（二本鎖になったときに機能性になる）を含むオリゴヌクレオチドである。このターゲット結合配列はこの配列の３’位でターゲットＲＮＡの結合部位とハイブリダイズして増幅され得る。二本鎖になると、プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモータープライマーがハイブリダイズしているターゲット配列の転写を開始させる。プロモーター−プライマーは、Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼ認識に特定した場合、「Ｔ７−プライマー」と言われる場合がある。ある状況では、プロモーター−プライマー、又はそのようなプロモーター−プライマーの亜集団の３’末端がプライマー伸長を妨害又は抑制するように修飾される場合がある。次いで、第二の増幅プライマーがｃＤＮＡに結合し、ＲＴが別のＤＮＡ鎖を産生し、機能性のＲＮＡプロモーターを一端に含有する二本鎖ＤＮＡを生じる。第二の増幅プライマーは、ターゲットＲＮＡの相補体（即ち、ｃＤＮＡ鎖）にハイブリダイズし得るターゲット結合配列を含む。これは、「Ｔ７プライマー」と区別するために「非Ｔ７プライマー」と言われる場合がある。ＲＮＡポリメラーゼはこのプロモーター配列を使用して、多数のＲＮＡ転写物（すなわち、アンプリコン）を、概して約１００〜１，０００コピー産生する。新たに合成された各アンプリコンが第二の増幅プライマーとアニールし得て、これがＲＴにより伸長されてＤＮＡコピーを産生するのに対し、ＲＮアーゼＨ活性はこのＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを分解する。次いで、プロモーター−プライマーは新たに合成されたＤＮＡに結合し、ＲＴにより二本鎖のＤＮＡが創出され、それからＲＮＡポリメラーゼが多数のアンプリコンを産生する。このようにして、２種の増幅プライマーを使用して、１０億倍の等温増幅が達成され得る。
【００３５】
増幅プライマーの「ターゲット結合配列」とは、ターゲット特異性を決定する部分である。なぜなら、この部分がターゲットの核酸鎖又はその相補鎖にアニールし得るからである。ターゲット結合配列がハイブリダイズする相補的なターゲット配列はプライマー結合配列と言われる。プライマーに追加の機能配列を必要としないプライマー又は増幅方法（例えば、ＰＣＲ増幅）では、プライマー配列は本質的にターゲット結合配列からなる。一方、他の方法（例えば、ＴＭＡ又はＳＤＡ）では、ターゲット結合配列に隣接した追加の特殊な配列が含まれる（例えば、プロモーター−プライマーのターゲット結合配列に隣接したＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、又はＳＤＡプライマーの制限エンドヌクレアーゼ認識配列）。例えば、表１に示した好ましいＰＳＡ特異ターゲット結合配列では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９が追加の機能配列を含まない増幅プライマーであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３はターゲット結合配列（下線なし）以外の追加の機能配列（下線部分）を含むＴ７プロモーター−プライマーであり、下線を施した配列は好ましいＴ７ポリメラーゼプロモーター配列である。本発明のすべてのプライマー及びプローブ配列は標準的な in vitro 合成法を使用して合成し得ることが当業者には理解されよう。また、多種多様な増幅法での使用に適したプライマーをつくるために、追加の特殊な配列（例えば、プロモーター又は制限エンドヌクレアーゼ認識配列）を付加するための定法を使用して本明細書に開示されるプライマー配列を修飾し得ることも理解されるだろう。同様に、本明細書に記載されるプロモーター−プライマー配列は、プロモーター配列を除去することによって、追加の機能配列を使用しないＰＣＲのような増幅法に適した、本質的にはターゲット結合配列である増幅プライマーを産生するように修飾し得る。
【００３６】
例えば、国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine）から入手可能なＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのようなアルゴリズムのデフォルト変数を用いる並置アルゴリズムを使用するか、又は以前に詳しく記載された（Shuler et al., 1991, Proteins 9 (3): 180-190）ような多重並置構築・分析作業用（「ＭＡＣＡＷ」；Multiple Alignment Construction and Analysis Workbench）アルゴリズムを使用して、既知のＨＳＰＳＡＲ配列を有するＰＳＡエクソンの既知配列とヒトカリクレインのエクソン配列（ＨＵＭＫＡＬ２、ＨＵＭＫＡＬ２ａ、ＨＵＭＫＡＬ２ｂ、ＨＵＭＫＡＬ２ｃ、ＨＵＭＫＡＬ２ｄ、ＨＳＫＡＬＬＩ及びＨＵＭＰＳＡＡ）と並置することによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のプライマー及びプローブのＰＳＡ特異配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６及び４７のｈＫ２特異プライマー配列を選択した。上記の配列群を並置した後で、他の配列との最少量の同一性を含有する、プライマー又はプローブが所望されるＰＳＡエクソンの領域又はｈＫ２領域を同定した。それらの配列から、プライマー又はプローブにとって好適な長さ及びＧＣ含量を有するオリゴヌクレオチド配列を選択し、試験のために合成した。ある場合では、以前に詳しく記載された（Matzura and Wennborg, Complete Applications in the Biosciences, 1996, Vol. 12, No. 3, pp 247-9）ようなＲＮＡの二次構造を計算するアルゴリズムを使用することによって、選択されたプライマー又はプローブの予測二次構造を決定した。ヒトＰＳＭＡについてのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のプローブも同様に設計して選択した。配列の並置と二次構造の予測にアルゴリズムを援用したが、当業者ならば上記の工程をマニュアルで容易に実施し得る。
【００３７】
「ターゲット配列」は、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、少なくともその一部が検出され得る核酸鎖のヌクレオチド塩基配列を意味する。プライマーはターゲット配列の一部に結合するが、ターゲット配列が二本鎖の核酸である場合は、両方の相補鎖が含まれる。
【００３８】
「均等なＲＮＡ」は、Ｔの代わりにＵが適切に置換されている、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と同じヌクレオチド塩基配列を有するリボ核酸を意味する。同様に「均等なＤＮＡ」は、ＵがＴに適切に置換されている以外はＲＮＡと同じヌクレオチド塩基配列を有するＤＮＡのことである。当業者には、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語がＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列か、ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基配列の合成的な組み合わせのいずれかを有する分子構造を意味し、「非塩基（ａｂａｓｉｃ）」残基が含まれる、その類似体も含むことを理解されよう。
【００３９】
「固形支持体」は、オリゴヌクレオチド又は核酸との結合に利用し得るフリーの化学基を含んでなる、アッセイ法の溶媒及び温度条件下ではほとんど溶けない素材を意味する。好ましくは、固形支持体は、ターゲット核酸と直接的又は間接的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドと共有的にカップルする。ターゲット核酸がｍＲＮＡである場合、固形支持体に付着したオリゴヌクレオチドは、好ましくはポリＴ配列である。好ましい固形支持体はミクロン又はサブミクロンサイズのビーズ又は球体のような粒子である。例えば、シリカ、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、金属、ポリスチレン、ラテックス、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ナイロン又はそれらの組み合わせのような多種多様な固形支持体の素材が考慮される。より好ましくは、固形支持体は、磁気コアを有する固形支持体のように、磁場によってある場所に付着され得る。特に好ましい支持体は、単分散磁気球体（即ち、均質サイズ±約５％）である。
【００４０】
増幅産物を「検出すること」とは、例えば、標識プローブを増幅産物の一部へハイブリダイズさせることのような、増幅された核酸の存在を判定する様々な方法のいずれかを意味する。標識プローブとは、別の配列と特異的に結合し、例えば、蛍光部分、化学発光部分、放射性同位体、ビオチン、アビジン、酵素、酵素基質又は他の反応基であり得る検出可能な基を含有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、標識プローブには、（米国特許第５，２８３，１７４号に記載されるような）好適な条件下で化学発光的に検出され得るアクリジニウムエステル（ＡＥ）部分が含まれる。他のよく知られた検出技術には、例えば、ゲル濾過、ゲル電気泳動及びアンプリコンの視覚化、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。検出工程は定性的か定量的かのいずれかであり得るが、非前立腺サンプルにおける前立腺関連遺伝子の発現（例えば、ＰＳＡ特異ｍＲＮＡ）のレベル（これは前立腺癌及び／又は乳癌の転移又は再発の程度を示す）を決定するには、ＰＳＡ特異的又は他の前立腺関連遺伝子のアンプリコンの定量的な検出が好ましい。
【００４１】
ターゲットポリヌクレオチドを精製して検出するアッセイは、しばしば、ターゲットポリヌクレオチドを固形支持体上に捕捉することを含む。固形支持体は、ターゲットポリヌクレオチド精製法の１回又はそれ以上の洗浄工程の間、ターゲットポリヌクレオチドを保持する。ターゲットポリヌクレオチドを捕捉してその存在を検出するためのハイブリダイゼーションサンドイッチ技術は、固形支持体に結合したプローブによりターゲットポリヌクレオチドを捕捉すること、及び捕捉されたターゲットポリヌクレオチドへ検出プローブをハイブリダイズさせることを含む（Ranki et al.による米国特許第４，４８６，５３９号）。ターゲットポリヌクレオチドへハイブリダイズしない検出プローブは固形支持体から速やかに洗浄除去される。こうすれば、残っているラベルは、初めにサンプルに存在したターゲットポリヌクレオチドと結びついている。もう１つの方法は、ターゲットポリヌクレオチドと固形支持体上に固定されたポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズするメディエーターポリヌクレオチドを使用するが、メディエーターポリヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドを固形支持体へつなげて結合ターゲットを産生させる（Stabinskyによる米国特許第４，７５１，１７７号）。標識プローブはこの結合ターゲットとハイブリダイズし得るが、結合しなかった標識プローブは固形支持体から洗浄除去され得る。
【００４２】
ｍＲＮＡを検出するための多くの方法、特に増幅を包含するものは、増幅及び検出に先立ってＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡを十分精製することを必要とし、しばしばグアニジウムチオシアネートのような劇物を含む（Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), pp. 7.37-7.57; Lin, L. et al., 1993, "Simple and Rapid Sample Preparation Methods for Whole Blood and Blood Plasma" in Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications (Persing, D. H. et al., Eds., American Society for Microbiology, Washington, DC), pp. 605-616)。本発明の１つの態様は、非前立腺の生物学的サンプルを調製しＲＮＡを得るための簡便かつ迅速な方法を使用するが、前立腺癌及び／又は乳癌の細胞を非前立腺組織において検出するために、このＲＮＡから前立腺関連ｍＲＮＡ（例えば、ＰＳＡ特異ｍＲＮＡ）を増幅して検出し得る。非前立腺の生物学的サンプルは、末梢血又は骨髄のような造血系の組織、血漿、リンパ節を含む非前立腺の生検組織、呼吸器系組織又は滲出液、胃腸組織、尿、糞、精液又は他の体液ないし物質であり得る。好ましいサンプル調製法は最少限の専門技術を必要とし、標準的な実験機器と比較的廉価な試薬を使用して、増幅に適したターゲットｍＲＮＡを産生する一方、染色体ＤＮＡに見出される潜在的に交叉反応する配列から生じ得る偽陽性を回避するものである。この好ましい簡便なサンプル調製法は、染色体ＤＮＡを十分抽出して（粘度を低下させるために）剪断することをなくし、潜在的に有害な試薬（例えば、グアニジウム化合物、フェノール又はクロロホルム）の使用を回避し、工程数を最少化し、それによりサンプルの損失を最少化して、少量のｍＲＮＡ種の検出を増加させる。
【００４３】
本発明の方法には、ＰＳＡ特異核酸、特にｍＲＮＡのような前立腺関連遺伝マーカーを検出するか又は定量する方法が含まれる。この方法には、前立腺関連遺伝マーカーのターゲット配列を潜在的に含有する非前立腺の生物学的サンプルを、ターゲット遺伝子配列（ＰＳＡ、ＰＳＭＡ及び／又はｈＫ２）と特異的にハイブリダイズし得る第一のプライマー又はプロモーター−プライマーと接触させること、及び、ターゲット特有の増幅産物（「アンプリコン」）を産生する核酸増幅条件の下で、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ活性を提供することが含まれる。好ましくは、このターゲット特有の増幅産物は、この特有のターゲット配列に相補的な領域と、増幅されたターゲット配列に特有の標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることによりプローブ：ターゲットのハイブリッドを形成し得る少なくとも１つのプローブ結合部位とを含んでなる、複数の核酸鎖である。この方法にはまた、非前立腺の生物学的サンプルにおける前立腺関連遺伝マーカー核酸の存在を示すものとして、標識プローブ：ターゲットのハイブリッドを検出することが含まれる。好ましい態様には、比較的簡略なサンプル調製法を使用して、生物学的サンプルからターゲット核酸の基質を調製することがさらに含まれる。さらに、この検出工程には、アッセイにおいてターゲットの検出を高める、増幅されたターゲット核酸の一部に特有の１種又はそれ以上のヘルパープローブが含まれる場合がある。ヘルパープローブが検出を高める機序に束縛されることを望まないが、一般に、ヘルパープローブは増幅されたターゲット配列にハイブリダイズして二次構造を除去するか、又は他のやり方で、検出される配列に他のプローブが結合する能力を高めると考えられる。好ましくは、前立腺関連遺伝マーカーのターゲット配列がＲＮＡである場合、標識オリゴヌクレオチドプローブは同じセンスのものである。
【００４４】
本発明の１つの態様では、増幅工程にはプロモーター−プライマーだけが使用され、プローブはアンプリコンの一部をターゲットにする。単一のプロモーター−プライマーが反対センスのプライマーがないままに利用される場合、ターゲットＲＮＡは、ターゲットＲＮＡと同じセンスのプローブを使用して検出され、（Kacian et al.による米国特許第５，５５４，５１６号にかつて詳しく説明されたように）増幅された相補核酸の内部に位置する塩基配列領域とハイブリダイズし得る。
【００４５】
本発明の好ましい態様では、ヒトＰＳＡ、ＰＳＭＡ及び／又はｈＫ２遺伝子配列に特有の選択プライマーが、プロモーター−プライマーとプロモーター配列のない増幅プライマーの両方を使用する転写介在増幅において使用され、増幅産物は、均質アッセイにおいて検出され得るプローブとともに検出される（Kacian & Fultzによる米国特許第５，４８０，７８４号及び５，３９９，４９１号；Kacian et al.による米国特許第５，５５４，５１６号；Arnold et al. への米国特許第５，２８３，１７４号；欧州特許出願ＥＰ０７０９４６６号を参照のこと）。上記の一般的な増幅及び検出の方法は当技術分野で周知である。好ましい増幅法は、ＲＮＡである増幅された核酸又はアンプリコンを産生し、さらにより好ましくは、ターゲット配列に相補的である（即ち、ターゲットと反対のセンス）増幅ＲＮＡを主に産生する。従って、ターゲットがｍＲＮＡであり、仮に（＋）センス鎖と指定すれば、アンプリコンは、好ましくは（−）センス鎖である。そのようなアンプリコンを検出するプローブは、増幅された配列と特異的にハイブリダイズし得る（即ち、アンプリコンの一部に相補的である）任意の配列である。かつて記載された（米国特許第５，４８０，７８４号及び５，３９９，４９１号）ような転写介在増幅（「ＴＭＡ」）法を使用すれば、プロモーター−プライマーは（−）センスであり、鋳型のターゲット核酸は（＋）センスであり、産生されるアンプリコンは（−）センスである。
【００４６】
本発明の方法は実質的に等温であり、核酸増幅の温度サイクリングやＰＳＡ特異的な連続増幅用のネスティドプライマーを必要としないので、ＰＳＡ特異配列を検出する先行法より好ましい。本発明の特に好ましい態様では、増幅工程において使用される２種のプライマーの１つは、前立腺関連遺伝マーカーのｍＲＮＡに結合するＴ７（−センス）プロモーター−プライマーであり、２種のプライマーのもう１つは、このｍＲＮＡを鋳型として使用してＴ７プロモーター−プライマーを伸長させる逆転写酵素の活性から産生されたｃＤＮＡ産物に結合する非Ｔ７（＋センス）プライマーである。このＴ７プロモーター−プライマーは、ターゲット結合配列の５’末端にＴ７・ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、非Ｔ７プライマーはＴ７・ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有せず、本質的にターゲット結合配列からなる。好ましいプロモーター−プライマーは約３５〜４５ｎｔの間の下限と約４５〜１００ｎｔの間の上限がある長さの範囲を有する。好ましくは、プロモーター−プライマーは約４０〜７０ｎｔの長さであり、より好ましくは、約４５〜５５ｎｔの長さである。好ましくは、プロモーター−プライマーのＴ７プロモーター配列は約２５〜３０ｎｔの長さであり；特に好ましいＴ７プロモーター配列には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５が含まれる。ＰＳＡ特異プロモーター−プライマーの好ましいターゲット結合領域は、ヒトＰＳＡ遺伝子のエクソン配列と、好ましくはエクソン３、４又は５のいずれか１つの内部で、特異的にハイブリダイズする。転写介在増幅においてプロモータープライマーとともに使用されるプライマーは、本質的に、ヒトＰＳＡ、ＰＳＭＡ又はｈＫ２遺伝子の配列に特有のターゲット結合配列からなる。好ましいＰＳＡ特異配列は、エクソン内部か、又は２つのエクソンのスプライス連結部に及ぶＰＳＡ配列に結合し、より好ましくは、ヒトＰＳＡ遺伝子のエクソン２、３又は４のいずれかに特有なターゲット結合配列を有する、又はエクソン２及び３のスプライス連結部に及ぶ。プライマーは、好ましくは、約１５〜２０ｎｔの下限と約２５〜１００ｎｔの範囲内に上限を有する範囲内の長さを有し、より好ましくは、約１５〜３０ｎｔの範囲であり、最も好ましくは、約２０〜２５ｎｔの範囲の長さである。表１に示すように、好ましいＰＳＡ特異プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の配列を有し、好ましいＰＳＡ特異プロモーター−プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の配列を有するる（ここではプロモーター配列に下線をし、ターゲット結合配列には下線がない）。
【００４７】
本発明の１つの側面は、非前立腺組織から採取したサンプルに存在するｍＲＮＡ中のＰＳＡ特異ターゲット配列を増幅すること、及び、増幅された生成物を非前立腺組織内に存在する前立腺癌又は乳癌の細胞の程度として検出し、それにより乳癌の存在や前立腺癌の転移を示す方法である。核酸プローブを検出するための均質な化学発光検出アッセイは好ましい態様であるが、当業者ならば、ハイブリダイズしたプローブを検出するには、酵素、酵素基質、蛍光、発光、化学発光及び電気化学発光の分子、放射核種及び蛍光原子に基づいたラベルのような、当技術分野でよく知られている他のラベル及び検出法を容易に使用し得るし、ゲル電気泳動又は濾過、増加吸光、濃色シフト、又はＨＰＬＣといった標準法を使用して増幅産物を検出し得るだろう。好ましい均質アッセイは非均質アッセイ（つまり、ハイブリダイズしたプローブのシグナルをハイブリダイズしていないプローブによるシグナルから差別化するために物理的な分離を必要とするアッセイ）に対する利点を有するが、均質検出という側面は本発明にとって決定的ではない。好ましくは、蛍光又は化学発光のラベルがこのプローブに取込まれ、より好ましくは、ラベルは化学発光性のアクリジニウムエステル（ＡＥ）である。
【００４８】
本発明の方法に使用されるプローブは検出されるアンプリコンの任意の領域へターゲットされ得て、好ましくは、プローブはターゲット核酸と同じセンスである。例えば、ＰＳＡ特異プローブは、イントロン又はエクソン配列のいずれかにハイブリダイズし得るが、好ましくは、ＰＳＡ遺伝子のエクソン（例えば、エクソン２、３又は４）内にあるか、又はエクソンのスプライス部位に及ぶ（例えば、エクソン３の３’末端とエクソン４の５’末端に及ぶ）か、又はＰＳＡ遺伝子イントロンの内部（例えば、イントロン３の内部）にある配列とハイブリダイズする。プローブ配列は、約５〜１００ｎｔの長さの範囲内にあり得るが、好ましくは約１０〜５０ｎｔの長さであり、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの長さである。好ましいプローブ配列には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を（表１に示すヒトＰＳＡ遺伝子内のその全般的な位置で）有するものが含まれる。好ましくは、このプローブはＡＥで標識され、ＴＭＡ反応の増幅ＲＮＡ産物とハイブリダイズする。
【００４９】
本発明のプライマー及びプローブは、多種多様な周知の方法のいずれかにより単離される核酸基質を使用する増幅及び検出の方法において使用し得る。ターゲットｍＲＮＡは、ＴＭＡにおける使用に適したｍＲＮＡを産生する以下の比較的簡単な方法により製造され得る。この方法では、少なくとも約１５０ｍＭの可溶な塩、好ましくはハロゲン化リチウム塩、キレート剤及び非イオン性界面活性剤を、核のＤＮＡ又はＲＮＡの実質的な放出を起さずに細胞の細胞膜を溶かすのに有効な量だけ含有する溶解液に細胞懸濁液を接触させることによって、生物学的サンプル（例えば、末梢血又は骨髄細胞）中の細胞を溶かした。細胞懸濁液と溶解液を約１：１〜１：３の比率で混合し、溶解液の界面活性剤濃度を約０．５％〜１．５％（ｖ／ｖ）の間とした。多種多様な既知の非イオン性界面活性剤のいずれもが溶解液において有効である（例えば、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）タイプ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）タイプ及びＮＰタイプ）が、典型的には、溶解液はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールの界面活性剤、好ましくは１％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２を含んでいた。この方法は主に細胞懸濁液を含有する生物学的サンプル（例えば、血液及び骨髄）について使用されてきたが、それは、細胞を個別にか又は小さな塊へ分離するための標準的な刻み、篩い、及び／又はタンパク分解法を使用して細胞が分離されれば、他の組織についても同じように有効である。細胞の溶解後、放出された全ＲＮＡは安定であったが、追加のＲＮアーゼ阻害剤がなくても、少なくとも２時間は室温で、有意なＲＮＡ分解を起こすことなく保存し得る。全ＲＮＡはさらに精製せずに増幅に使用し得るし、又は、ｍＲＮＡのポリＡ部分へのアフィニティー結合に概して依存した標準法を使用してｍＲＮＡを単離し得る。
【００５０】
好ましくは、ｍＲＮＡの単離には上記の溶解混合物へ加えた不溶性の粒子に付いたポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドから本質的になる捕捉粒子を使用し、ポリ−ｄＴ部分をポリ−Ａ・ｍＲＮＡへアニールし、この粒子をこの混合物から物理的に分離した。一般に、超常磁性の粒子を使用し、容器の外側へ磁場をかけることによって分離した。好ましくは、約１ｍｌの溶解混合液へ、約１〜１００ピコモル／ｍｇ（好ましくは１０〜１００ピコモル／ｍｇ、より好ましくは１０〜５０ピコモル／ｍｇ）の密度で連結したｄＴ14又はｄＴ30を有する約３００μｇの粒子の懸濁液（標準的なリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えた。任意の超常磁性粒子を使用し得るが、典型的には、粒子はラテックス又はシリカでコートされた磁気コア（Ｓｅｒｏｄｙｎ又はＤｙｎａｌから市販されている）であり、標準法（Lund et al., Nuc. Acid Res., 1988, 16: 10861-10880）を使用して、これにポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドを付けた。この粒子を含有する溶解混合液を穏やかに混合し、約２２℃〜４２℃で約３０分インキュベートした後、試験管の外側に磁場をかけて、ｍＲＮＡの付いた粒子をこの混合液から分離し、上澄液を除去した。上記のような標準の再懸濁法と磁気分離を使用して、粒子を１回又は数回、一般的には３回洗浄した。次いで、粒子を緩衝液に懸濁し、すぐに増幅に使用するか又は冷凍保存した。
【００５１】
サンプル調製に実質的に影響を及ぼすことがなければ、多くの変数を変化させてよい。例えば、粒子洗浄工程の回数は変えてよいし、粒子は他の手段（例えば、濾過、沈澱、遠心分離）により上澄液から分離し得る。固形支持体は、特定のターゲット配列に相補的である、それに結合した核酸捕捉プローブを有する場合があり、このターゲット核酸と非特異的に結合する任意の粒子又は固形支持体（例えば、Arnold et al.による米国特許第５，５９９，６６７号に記載のようなポリカチオン性の支持体）を使用し得る。増幅のためには、標準の低塩溶出法を使用して捕捉粒子から単離ＲＮＡを放出させるか、又はポリ−ｄＴとの塩基対合にも固相マトリックスとの他の相互作用にも関わらないＲＮＡの領域に結合するプライマーを使用して、粒子上に保持させながら増幅した。上記の具体的な容量や比率は決定的ではなく、核内物質の有意な放出が起こらない限りは、変えてもよい。小規模の調製には振盪混合が好ましいが、他の混合法に換えてもよい。しかし、重要なのは、生物学的組織由来のサンプルを凝集させないように処理すべきことであり、溶解液のイオン強度は少なくとも約１５０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭ〜１Ｍとする。より低いイオン強度では核内物質（例えば、ＤＮＡ）の混入につながり、これが粘度を高め、増幅及び／又は検出の工程に干渉し、偽陽性を産生させる可能性があるからだ。ＲＮＡの分解を防ぐには溶解液にリチウム塩が好ましいが、他の可溶塩（例えば、ＮａＣｌ）を１種又はそれ以上の既知ＲＮアーゼ阻害剤と組み合わせるのも同等に有効だろう。
【００５２】
表２は、米国特許第５，３９９，４９１号、５，４８０，７８４号及び５，５５４，５１６号の先行記載とほとんど同じようにＴＭＡを使用し、米国特許第５，２８３，１７４号の先行記載とほとんど同じ均質保護アッセイで検出するときの、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２遺伝マーカーの増幅及び検出に使用されるプライマー及びプローブの（ヘルパープローブを含むか又は含まない）好ましい組み合わせを列挙する。各行は好ましい組み合わせを表す。この中で、ＰＳＡ・ｍＲＮＡを増幅して検出するのに特に好ましい組み合わせを、表２の行の各欄に星印（★）で示す。表２の最後の２つのエントリーは、ｈＫ２ターゲット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、４７及び１）とＰＳＭＡターゲット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、４９及び５０）を特に増幅して検出するためのプライマー及びプローブである。
【００５３】
多種多様な生物学的サンプルからの核酸が、本明細書に記載のプライマー及びプローブを用いた前立腺関連マーカーｍＲＮＡの増幅及び検出の方法を試験するのに使用されてきたが、それには、ＰＳＡ・ｃＤＮＡの in vitro 転写物、ＰＳＡ・ｃＤＮＡの in vitro 転写物でスパイクした全血、前立腺癌細胞系（ＬＮＣａＰ細胞、Horoszewicz J. S. et al., 1983, Cancer Res. 43: 1809-1818; ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１０９９５）、ＬＮＣａＰ細胞でスパイクした全血、末梢血、乳房組織細胞、肺細胞から単離した全ＲＮＡ、及び、前立腺癌細胞、リンパ節、乳房組織細胞、腎臓細胞、小腸組織細胞及び白血球のゲノムＤＮＡから単離し、それぞれ試験したポリ−Ａ・ＲＮＡが含まれる。全ＲＮＡ（肺、乳腺及び前立腺由来）とポリ−Ａ・ＲＮＡ（腎臓、肝臓、リンパ節、乳腺、小腸及び前立腺由来）を標準法（Chirgwin et al., 1979, Biochem. 18: 5294 の方法、クローンテク・ラボラトリーズ社、パロアルト、ＣＡから市販のオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いて選択されるポリ−Ａ・ＲＮＡを用いる）を用いて調製した。実質的に同じ方法を使用して、正常ヒトドナーの末梢血から全ＲＮＡ及びポリ−Ａ・ＲＮＡを調製した。
【００５４】
ＰＳＡ・ｃＤＮＡの in vitro 転写物はベクター（ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−；Adams et al., 1985, Nature 377 (3): 174）に存在するＰＳＡ・ｃＤＮＡクローン（ＡＴＣＣ，受入れ番号１０６５２７より入手）を用いて調製するか、又は約１．２ｋｂのＰＳＡ・ｃＤＮＡフラグメントを in vitro 転写物の調製に使用する別のベクター（ｐＳＰ６４  ポリ（Ａ）ベクター）へサブクローン化した。標準法を使用してプラスミドＤＮＡを調製及び精製し、ｃＤＮＡ挿入物の３’位での酵素消化により線状にし、ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写した。標準的な方法及び試薬（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．，マジソン、ＷＩのＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ翻訳キットで供給される）を使用して転写物を製造した。
【００５５】
【表３】
0004495349.tif 000004
【００５６】
他に断らなければ、本明細書において利用されるか又は考慮される技術は当業者に周知の標準法である。以下の態様の実施例は、説明だけのために提供される。
【００５７】
【実施例】
実施例１：生物学的サンプルの溶解とｍＲＮＡの単離
約２５０μｌの非凝固性末梢血又は骨髄を約７５０μｌの溶解液へ加えた。上記２つの成分の各比率は決定的ではなく、ほぼ１：１の比から１：３の成分比でサンプルを溶解することが可能である。最も一般的に使用される溶解液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１Ｍ  ＬｉＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２から構成された。「非凝固」とは、血液又は骨髄を回収と同時に約２ｍＭ〜約２０ｍＭのＥＤＴＡ、又は有効量のヘパリン又は当技術分野で既知の類似した抗凝固剤で処理したことを意味する。この混合液へ、約１０〜５０ピコモルのポリｄＴ／粒子１ｍｇの密度で連結したｄＴ14又はｄＴ30を有する約３００μｇの超常磁性粒子の懸濁液（ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）を加えた。ポリｄＴ粒子を含有する溶解混合液を振盪により穏やかに混合し、約２２℃〜４２℃で約３０分インキュベートした。試験管の外側に磁場をかけることによって、ｍＲＮＡの付いた粒子をこの混合液から分離し、上澄液を除去した。約１ｍｌの洗浄溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））にそれを再懸濁し、約３〜５秒間振盪により混合してビーズを懸濁させることによって粒子を１〜３回洗浄し、上記のようにビーズを上澄液から分離し、この上澄洗液を捨てた。洗浄後、粒子を緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２５０μｌに懸濁し、後の使用のために−３０℃で保存するか、又はすぐに使用した。増幅法における使用では、ＲＮＡの付いた粒子は直接使用するか、ときには標準溶出法（例えば、加熱）を使用して、この付いたＲＮＡを捕捉粒子から遊離させた。固形粒子の存在は増幅を妨害しなかったので、ＲＮＡの付いた粒子を使用する簡便性が追加のＲＮＡ単離工程より好まれた。
【００５８】
実施例２：ＰＳＡ特異ｍＲＮＡの増幅及び検出
既知ＰＳＡ配列の転写介在増幅におけるプライマー及びプロモーター−プライマーの様々な組み合わせの相対効率を初めに試験するために、非Ｔ７（＋）プライマーとＴ７（−）プロモーター−プライマーの各組み合わせを使用して、ＰＳＡ遺伝子配列の（上記のような）in vitro 転写物を増幅した。増幅後、アクリジニウムエステルで標識した単一プローブを使用して、相対光単位（「ＲＬＵ」）として化学発光シグナルを検出する、Arnold et al.による米国特許第５，２８３，１７４号に記載の通りの均質保護アッセイにおいて、この増幅産物を検出した。すべての実験サンプルは同一３検体で試験し、３回の試験の平均ＲＬＵを算出した。上記の実験ではプロモーター−プライマーとプローブはすべての反応で同じであったが、非Ｔ７プライマーは変化させた。Ｔ７プロモーター−プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）はＰＳＡのエクソン４に特有であり、プライマーはＰＳＡのエクソン３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）に特有であり、プローブはＰＳＡのエクソン３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に特有である。
【００５９】
簡略に言うと、様々な数（１０3、１０4若しくは１０5個の分子、又は転写物を含まない陰性対照）の in vitro 転写物を含有する溶液５０μｌを、１６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７０ｍＭ  ＫＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、４種のリボヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）各１６ｍＭ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）各４ｍＭ、４００ｎＭ（１５ピコモル）を含有する増幅試薬２５μｌの入った試験管へ加えた。この実施例で試験した３種の組み合わせでは、反応あたり１５ピコモル（約４００ｎＭに相当する）のＴ７プロモーター−プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の配列を有し、そして４００ｎＭ（１５ピコモル）の非Ｔ７プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の配列を有した。各反応液は６０℃で１０分インキュベートしたが、ターゲット核酸における分子内塩基対合を溶かし得る任意の温度が適している（例えば、約６０℃〜７０℃の間、より好ましくは約６５℃〜約６７℃の間）。次いで、各反応液を約４２℃で５分インキュベートした後、酵素試薬（組換えＭＭＬＶ逆転写酵素２０００ユニット、組換えＴ７・ＲＮＡポリメラーゼ２０００ユニット、８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０４ｍＭ  酢酸亜鉛、８０ｍＭ  トレハロース、１４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）フェノールレッド、１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２及び２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する２５μｌ）を加え、この反応液を穏やかに混合し、４２℃で約１時間インキュベートした。この増幅法により、ターゲットＲＮＡに反対のセンスの増幅ＲＮＡが産生された。
【００６０】
１００ｍＭ  コハク酸リチウム（ｐＨ４．７）、１．２Ｍ  ＬｉＣｌ、１５ｍＭ  アルドリチオール−２、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、３％  エタノール及び、Arnold et al., への米国特許第５，５８５，４８１号に記載の通りの方法を使用して非ヌクレオチドリンカーを介して連結された化学発光性のアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するハイブリダイゼーションプローブ７．５ｎＭを含有するプローブ試薬１００μｌを使用して、増幅されたＲＮＡを検出した。この検出溶液を反応液へ加え、６０℃で３０分間インキュベートして、プローブの増幅ターゲットへのハイブリダイゼーションを可能にした。
【００６１】
プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を、以下の工程を含む均質保護アッセイ（ＨＰＡ）において検出した。非結合プローブ上のＡＥラベルを加水分解するために、上記の混合液へアルカリ溶液（６００ｍＭ  ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５及び１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）３００μｌを加えた。ハイブリダイズしたプローブ上のＡＥラベルが二重らせんと結合していることにより加水分解から保護されているのに対し、ハイブリダイズしていないプローブ上のＡＥラベルは加水分解から保護されていないので、ハイブリダイズしないプローブは検出されない。この溶液を６０℃で１０分インキュベートし、５分間室温で冷やし、３０ｍＭ  過酸化水素と１ｍＭ  硝酸を含有する溶液２００μｌと混合し、直後に１Ｍ  ＮａＯＨ及び２％（ｗ／ｖ）ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４を含有する溶液２００μｌを加えた。ルミノメーター（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）５０）を使用して化学発光を検出し、相対光単位（「ＲＬＵ」）で測定して出力した。
【００６２】
上記の試験の結果を表３に示す。ここでは、プライマー及びプロモーター−プライマーの各組み合わせについての３回の試験それぞれについて検出されたＲＬＵの平均数が表示されている。ＰＳＡ転写物なし（陰性対照）と１０3、１０4又は１０5個の転写物それぞれを使用して、プライマー及びプロモーター−プライマーの各組み合わせを試験した。
【００６３】
【表４】
0004495349.tif 000005
【００６４】
表３に示す結果は、この実施例で試験したプライマー及びプロモーター−プライマーの３種の組み合わせが様々なレベルの増幅をもたらすこと、同一のプローブですべて検出され、１０3個のコピーのターゲットＲＮＡがアッセイに含まれるときはすべてバックグラウンド以上のシグナルをもたらすことを示した。この３種の組み合わせのなかで最良の結果を与えたのはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の組み合わせであり、この系では、１０4個のターゲットＲＮＡのコピーがアッセイに含まれるとき、検出が飽和した。
【００６５】
実施例３：前立腺組織由来の全ＲＮＡ及びポリ−Ａ・ＲＮＡにおけるＰＳＡ・ｍＲＮＡの増幅及び検出
この実施例では、プライマー、プロモーター−プライマー及びプローブの多数の組み合わせを使用して、上記のように前立腺から調製した全ＲＮＡサンプルのなかに含まれるＰＳＡ特異ｍＲＮＡを増幅して検出した。
【００６６】
転写介在増幅及び化学発光検出の工程は、実質的に実施例２の記載通りに実施した。初め、このアッセイの感度を決定するために、様々な数の前立腺細胞のＲＮＡ含量を表す、１ｐｇ〜１０ｎｇの範囲にわたり、全ＲＮＡを使用した。つまり、試験サンプル中の全ＲＮＡは、以下のように、算出される細胞数と同等であった：１ｐｇは１個より少ない細胞（約０．１個の細胞）と同等であり、１０ｐｇは約１個の細胞と同等であり、１００ｐｇは約１０個の細胞に同等であり、１，０００ｐｇ（１ｎｇ）は約１００個の細胞に同等であり、１０，０００ｐｇ（１０ｎｇ）は約１００個の細胞に同等である。ある実験では、全範囲のＲＮＡ濃度を試験しなかった。ＲＮＡを加えない陰性対照（バックグラウンド）をすべての試験に含め、すべての試験は同一３検体で実施し、平均ＲＬＵで表４に報告した。表４は、増幅に使用し、多くのＡＥ標識プローブで検出した、非Ｔ７（＋）プライマー及びＴ７（−）プロモーター−プライマーの数多くの組み合わせについての結果を示す。
【００６７】
【表５】
0004495349.tif 000006
【００６８】
表４に示された結果からわかるように、プライマー、プロモーター−プライマー及びプローブの組み合わせはすべて、ＲＮＡを加えなかった各組み合わせのバックグラウンドシグナルに比較して、反応液へ加えた全ＲＮＡサンプルのなかにＰＳＡ・ｍＲＮＡを検出した。さらに、１ｐｇ程度のＲＮＡを加える（０．１個の細胞に存在していると算出される量にほぼ同等である）と、バックグラウンドより有意に高いシグナルが概ね検出された。
【００６９】
上記の結果は、前立腺組織から単離したポリ−Ａ・ＲＮＡを使用する別の実験において確かめられた。ポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドが約ｄＴ14〜ｄＴ30の長さで、磁気粒子に共有的に連結しているポリ−ｄＴハイブリダイゼーションを使用して、前立腺のポリ−Ａ・ＲＮＡを単離した；使用した精製工程（磁気分離と洗浄）は実施例１の記載と実質的に同じであった。前立腺の全ＲＮＡが約５％のＰＳＡ特異ｍＲＮＡを含むと予測されたので、増幅及び検出のサンプルへ加えるポリ−Ａ・ＲＮＡ（即ち、精製したｍＲＮＡ）の量をそれに応じて減少させた。１つの試験セットでは、前立腺組織由来のポリ−Ａ・ＲＮＡを反応あたり５ｐｇ又は０．５ｐｇで同一３検体の試験管へ加え、表４に示した結果の記載と実質的に同じようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（プライマー）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（プローブ）の組み合わせを使用して、これを増幅して検出した。５ｐｇの前立腺ｍＲＮＡでは、検出された平均ＲＬＵは１，４０４，２８６であり、０．５ｐｇでは、検出された平均ＲＬＵは３９２，５５８であった。上記の結果は、ＰＳＡ特異ターゲットをさらに精製することが、必ずしも増幅及び検出に必要ではないものの、０．５ｐｇ程度のｍＲＮＡについて検出し得るシグナルを産生することを示している。
【００７０】
増幅反応へ加えられるヘルパープライマーが検出シグナルを高めるかどうかを判定するために、以下の実施例に記載のように、一連の増幅及び検出実験を実施した。
【００７１】
実施例４：ヘルパープローブを用いたＰＳＡ特異ターゲットの増幅及び検出
本実施例は、１種又はそれ以上のヘルパープローブを加えることで検出されるシグナルが増加し、前立腺組織から単離した０．１ｐｇ未満の全ＲＮＡ中に存在するＰＳＡ特異配列の検出が好ましい増幅及び検出系を使用して可能になることを示す。以下の試験では、実質的に実施例２及び３の記載通りに増幅を実施したが、但し、検出工程で使用するＡＥ標識プローブとともに約１００ピコモルのヘルパープローブオリゴヌクレオチドを増幅反応液へ加えた。次いで、上記のように増幅を進行させた後、上記のように化学発光を検出した。ＰＳＡ特異ターゲットは、実施例３の記載のように、前立腺組織から単離した全ＲＮＡにおいて提供し、０．０１６ｐｇ〜１０ｐｇの範囲の濃度で試験した。上記実験でのヘルパープローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（ＰＳＡのエクソン２）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８（ＰＳＡのエクソン２及び３の連結点に及ぶ）であった。上記試験の結果を表５に示すが、シグナルは試験した各ＲＮＡ濃度の同一３検体サンプルの平均を表す。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
この増幅及び検出系がＰＳＡ・ｍＲＮＡの検出に特異的であることを示すために、前立腺組織から単離した全ＲＮＡ（クローンテク、パロアルト、ＣＡより入手）について増幅及び検出反応を実施し、正常ドナーの末梢血から得た白血球（「ＷＢＣ」）から単離した全ＲＮＡで実施したものと比較した。ヘルパープローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を、約１００ピコモルの濃度で、上記増幅反応液のすべてに含ませ、非Ｔ７プライマー、Ｔ７プロモーター−プライマー及びプローブの４種の異なる組み合わせを含めた。上記の試験では、前立腺の全ＲＮＡを各反応につき１０ｐｇ又は１ｐｇで使用し、これに対し、比較のために、少なくとも１０，０００倍以上のＷＢＣ全ＲＮＡ（各反応につき１μｇ又は１００ｎｇ）を使用した。各反応のセットにつきＲＮＡを加えない陰性対照を含め、すべての反応を同一３検体で試験し、３回の試験の平均値（平均ＲＬＵ）として結果を表示した。この結果を表６に示す。
【００７４】
【表７】
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【００７５】
表６に示した結果からわかるように、試験したプライマー及びプローブの４種の各組み合わせは、前立腺の全ＲＮＡ中のＰＳＡ特異ターゲットＲＮＡを増幅して検出した。対照的に、ＰＳＡ特異ターゲットｍＲＮＡを含有するとは考えられない正常ドナー由来のＷＢＣ全ＲＮＡを含む、同一条件下のサンプルについては、結果はほとんど陰性であった。即ち、前立腺の全ＲＮＡに比較して、１０，０００倍〜１，０００，０００倍以上のＷＢＣ全ＲＮＡを反応に使用しても、偽陽性は観察されなかった（つまり、１ｐｇの前立腺ＲＮＡで観察されるものと同等の結果は得られなかった）。表６では、１００ｎｇのＷＢＣ全ＲＮＡとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の組み合わせを使用した試験で比較的高い平均ＲＬＵ（平均ＲＬＵ：１６，１３６）が得られたが、これは１つの試験管で４３，４８５ＲＬＵが検出されたためであり、このセットの残り２つの試験管がほとんど陰性対照と同じであった（２，４５８及び２，４６４ＲＬＵ）ことから、この１回の高い結果は異物混入か作業者の過失によるものであろう。
【００７６】
別の試験で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の非Ｔ７（＋）プライマー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のＴ７プロモーター−プライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のプローブの組み合わせを、各反応につき１０ｐｇ〜０．００１ｐｇの範囲の前立腺全ＲＮＡとともに使用する（即ち、各反応につき１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１又は０．００５ｐｇを使用する）増幅及び検出アッセイにおいて、ＰＳＡ特異ターゲット配列の検出の直線性を測定した。試験アリコートは、１０ｐｇのアリコートを１：２及び１：１０に希釈して５ｐｇ及び１ｐｇのアリコートを得て、次いで５ｐｇのアリコートを１：１０に連続希釈して０．５、０．０５及び０．００５ｐｇのアリコートを得て、１ｐｇのアリコートを同様に希釈して０．１及び０．０１ｐｇのアリコートを得た。すべてのアッセイを同一３検体で実施し、陰性対照は反応液に前立腺全ＲＮＡを含まなかった。上記アッセイの結果を図５に図示して示すが、ここでＸ軸とＹ軸はいずれも対数スケールであり、「正味平均ＲＬＵ」は、実験サンプルの平均ＲＬＵから陰性対照結果の平均値を差引いた値を意味する。図５を参照すると、実験結果を点の記号及び点線で示し、上記の結果から計算された回帰直線を実線で示す（Ｒ2の適合値は０．９７７６に等しい）。全ＲＮＡの１０倍連続希釈系列内の結果を同じように図示し、１０、１、０．１及び０．０１ｐｇの群の中でＲ2を算出するとＲ2値は０．９９９７であり、そして５、０．５、０．０５及び０．００５ｐｇの群では、Ｒ2値は０．９８７９であった。上記の結果は、本明細書に記載の増幅及び検出系がＰＳＡ特異ターゲット核酸の検出について定量的であることを示す。
【００７７】
実施例５：変性ゲノムＤＮＡにおけるＰＳＡターゲット配列の増幅及び検出
末梢ＷＢＣから単離したＲＮＡを用いた実施例４で得られたネガティブな結果がＷＢＣにおけるＰＳＡ遺伝子発現の不足によるものであることを示すために、末梢ＷＢＣから得られる変性及び非変性ゲノムＤＮＡを使用して、増幅及び化学発光検出アッセイを実施した。ゲノムＤＮＡは正常なＰＳＡ遺伝子を含有すると考えられるが、その非変性状態では、増幅用プライマーや検出用プローブはそれに接近できないだろう。この実験では、非Ｔ７（＋）プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で、Ｔ７プロモーター−プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０で、ＡＥ標識プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０であった。陽性対照は、実質的に実施例２のように調製したＰＳＡ遺伝子の in vitro 転写物であり、各反応につき１００コピー、各反応につき１０コピー、及び各反応につき１コピーとして使用した。陰性対照は、核酸ターゲット（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を加えずに実施した反応物であった。ＷＢＣのゲノムＤＮＡを標準的なＤＮＡ単離法を使用して単離し、剪断して溶液内の粘度を低下させ（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）、変性させるか又はさせないで、各反応につき約５μｇ、０．５μｇ及び０．０５μｇで使用した。ＤＮＡは約１０分間で９５℃へ加熱して変性させ、次いですぐに冷やした。増幅及び検出のアッセイは実質的に実施例２及び３の記載通りに実施し、各サンプルにつき同一３検体の試験の結果を平均ＲＬＵとして表７に示す。
【００７８】
【表８】
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【００７９】
表７に示す結果は、ＷＢＣのゲノムＤＮＡがＰＳＡ遺伝子配列を含有し、ＤＮＡが変性したときは、反応液へ加えられるターゲットの量の減少に一致してシグナルが減少して、増幅されて検出されたことを示す。対照的に、ＷＢＣの非変性ＤＮＡは比較的高いバックグラウンドを示したものの、試験した２つの濃度でほとんど同じで、同一条件の下で０．５μｇのＷＢＣ変性ＤＮＡについて検出されたシグナルの１／１０未満であった。
【００８０】
実施例６：前立腺のポリ−Ａ・ＲＮＡとＰＳＡ・in vitro 転写物の増幅
この実施例では、プライマー及びプローブの好ましい組み合わせを使用して増幅及び検出の結果を比較する。ターゲット核酸は前立腺組織から単離したポリ−Ａ・ＲＮＡか又はＰＳＡ・ｃＤＮＡ配列の in vitro 転写物のいずれかであった。前立腺のポリ−Ａ・ＲＮＡは、実質的に実施例１及び３の記載通りに、固形支持体に固定化したポリ−ｄＴオリゴマーへのハイブリダイゼーションを使用して単離し、in vitro 転写物は、実質的に実施例２の記載通りに調製した。増幅及び検出法は、非Ｔ７（＋）プライマーとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を有するオリゴヌクレオチドを、Ｔ７（−）プロモーター−プライマーとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２を有するオリゴヌクレオチドを、プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を有し、ＡＥで標識したオリゴヌクレオチドを使用して、実施例２〜４の記載通りに実質的に実施した。ターゲット配列を、試験管あたり１０，０００コピーの in vitro 転写物か又は試験管あたり０．８７５ｎｇのポリ−Ａ含有前立腺ＲＮＡの算出濃度で増幅反応液へ加えるか、又は陰性対照の試験管にはＲＮＡを加えずに、各組み合わせにつき同一３検体で増幅反応を実施した。平均の結果は、陰性対照では４，０２２ＲＬＵ、in vitro 転写物のサンプルでは８，８５８ＲＬＵ、及びポリ−Ａ・ＲＮＡサンプルでは１，７９１，１９７であった。つまり、上記試験において検出された化学発光は他の実施例に比較して相対的に低かったが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の組み合わせは、陰性対照に比較して、２種の陽性サンプル（ＰＳＡ・in vitro 転写物と前立腺ｍＲＮＡ）においてＰＳＡ特異ターゲット核酸を増幅して検出することができた。
【００８１】
実施例７：臨床の末梢血サンプルにおけるＰＳＡ特異ターゲットの増幅及び検出
本実施例では、良性前立腺肥大か前立腺癌のいずれかを有すると疑われる人々に由来する末梢血の臨床サンプルを試験した。末梢血のサンプルは前立腺の手術直前（術前）と前立腺の外科的除去の直後（術後）で採取した。比較のために、前立腺癌細胞系（ＬＮＣａＰ細胞；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬＩ−１０９９５）の既知数の細胞、又はＰＳＡ特異 in vitro 転写物（実施例２に記載）を正常人から採取した末梢血と混合した。臨床又は対照の血液サンプルを溶解し、実質的に実施例１の記載通りに、磁気粒子に付いたポリ−ｄＴオリゴマーの系を使用してｍＲＮＡを単離した。各アッセイにつき、臨床サンプルの溶解液を約１．２ｍｌ使用し、比較のためにＬＮＣａＰ細胞の溶解液を約１．０ｍｌ使用した。増幅及び検出法は、非Ｔ７（＋）プライマーとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオリゴヌクレオチドを、Ｔ７（−）プロモーター−プライマーとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有するオリゴヌクレオチドを、プローブとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有し、ＡＥで標識したオリゴヌクレオチドを使用して、実質的に実施例２〜４の記載通りに実施した。ターゲット配列を（１）約５０〜１００ｎｇの全ＲＮＡ（各臨床サンプルの各反応につき約２．５〜５ｎｇのｍＲＮＡに相当する）、（２）各反応につき算定濃度２，０００又は２００又は２０コピーの in vitro 転写物、及び（３）各反応につき約１０個の細胞、１個の細胞、０．１個の細胞に等しいと算定されるＬＮＣａＰ細胞において、増幅反応液へ加え、各サンプルにつき同一３検体で反応を実施した。陰性対照にはＲＮＡを加えなかった。各反応セットの同一３検体についての平均ＲＬＵ結果、又は陰性対照に関する９回の反応の平均ＲＬＵを表８に示す。
【００８２】
【表９】
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【００８３】
上記の結果に基づけば、このプライマー及びプローブが、１個のＬＮＣａＰ細胞の当量を含有するサンプルにおいて検出されるように、約１．０ｍｌ容量の末梢血にある１つの癌細胞の当量より少ない量のＰＳＡ特異ターゲットＲＮＡを検出し得ることが明らかである。in vitro・ＰＳＡ遺伝子転写物を含有する血液サンプルに基づけば、このアッセイが血液サンプル中にある２０コピーほどの転写物を検出し得ることが明らかである。これら陽性対照とターゲットＲＮＡを加えない陰性対照において得られた結果の比較により、臨床サンプルＮｏ．１において検出されたＲＬＵは、末梢血におけるＰＳＡ特異ターゲットの存在を示し、この患者の前立腺癌が血液へ発散する細胞になっていて、転移した可能性があることを示唆する。対照的に、臨床サンプルＮｏ．２〜４は、このアッセイにおいて検出されるＰＳＡ特異核酸を含有せず、これらの患者では前立腺癌ではなく、良性前立腺肥大（「ＢＰＨ」）があることを示唆した。試験したすべての臨床サンプルで、個々の患者から得た術前及び術後のサンプルに検出されたＲＬＵのレベルは、有意には異なっていなかった。ＢＰＨを示唆するＲＬＵレベルを有する患者では、これは予想されたことである。臨床サンプルＮｏ．１を提供した患者で、手術直後の末梢血において検出し得るＰＳＡ特異ターゲットＲＮＡが存在していたのは、ＰＳＡ・ｍＲＮＡを発現する細胞、おそらくは前立腺癌細胞が依然として末梢血に存在し、癌細胞の発散又は転移を示唆することを示している。
【００８４】
臨床サンプルのさらなる試験では、末梢血においてＰＳＡ特異ターゲットＲＮＡを検出する同一のアッセイ系を使用して、全部で３０個のサンプルを試験した：そのうち５個は正常対照から、１５個は臨床的に前立腺癌を有すると診断された患者から、１０個は臨床的にＢＰＨと診断された患者からのものである。各反応物は約５００ｎｇの全ＲＮＡを含み、各サンプルは同一３検体でアッセイした。５，０００より大きい平均ＲＬＵが検出されたサンプルを前立腺癌について陽性（＋）として記録し、残りは前立腺癌について陰性（−）として記録した。正常対照サンプルのすべてとＢＰＨ患者由来の１０サンプルのうち９個は陰性であった。ＰＳＡ特異ターゲットＲＮＡが陽性であったサンプルには、臨床的に前立腺癌を有すると診断された患者からの１５サンプルのうち１１個とＢＰＨと診断された患者の１サンプルが含まれた。上記の結果は、末梢血におけるＰＳＡ特異ターゲットのアッセイが大部分の症例で臨床症状と一致することを示す。前立腺と診断され、ＰＳＡ特異ターゲットが血液中に検出されなかった患者では、癌が転移してないか、又は血液中に発散していない可能性がある。
【００８５】
実施例８：様々な生物学的サンプルにおけるＰＳＡ特異ターゲットの増幅及び検出
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺組織の癌に関連づけられてきたが、増幅及び検出のアッセイを他のヒト組織から単離したＲＮＡに対して実施し、それら組織において検出されるＰＳＡ特異ターゲットの相対レベルを測定した。特に断らなければ、すべての組織は正常ドナー（つまり、非癌性組織）から入手した。アッセイは、ヒト組織サンプルから単離した全ＲＮＡか又はポリ−Ａ・ＲＮＡのいずれかを使用して、実質的にこれまでの実施例の記載通りに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオリゴヌクレオチドを非Ｔ７（＋）プライマーとして、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有するオリゴヌクレオチドをＴ７（−）プロモーター−プライマーとして、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を有するオリゴヌクレオチドをＡＥ標識化プローブとして使用して、各サンプルにつき同一３検体で実施した。これらのアッセイの結果を表９に示すが、陰性対照の結果はターゲットＲＮＡを加えないで実施した１２回の反応の平均である。
【００８６】
【表１０】
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【００８７】
別の実験で、ヒト前立腺組織、末梢血、乳房組織、腎臓組織、肝臓組織、小腸及びリンパ節から単離したポリ−Ａ・ＲＮＡを、上記と同じプライマー及びプローブの組み合わせを使用して、同様の増幅及び検出アッセイにおいて比較した。前立腺組織のｍＲＮＡは各反応につき５ｆｇ又は０．５ｆｇでアッセイし、他の生物学的起源由来のｍＲＮＡは各反応につき５ｎｇ及び０．５ｎｇでアッセイした。上記の条件下で、ＰＳＡ特異ターゲットの配列は前立腺組織、乳房組織、腎臓組織、小腸及びリンパ節において検出されたが、肝臓組織や血液には陰性対照（つまり、ＲＮＡを加えない反応）以上のシグナルが検出されなかった。検出された相対シグナル（同一２検体アッセイの平均ＲＬＵ）は、乳房組織、腎臓組織、小腸及びリンパ節に存在するＰＳＡターゲット核酸が前立腺組織に存在するものの１／１０5〜１／１０6未満であることを示した。
【００８８】
上記の結果は、このＰＳＡターゲット検出系が前立腺組織以外の組織にある比較的少ない量のターゲットさえ検出し得ることを示している。このアッセイで試験した組織のいくつか（肝臓と末梢血）がＰＳＡ特異ターゲットについて陰性であったので、ＰＳＡ遺伝子が必ずしも前立腺以外のすべてのヒト組織でより低レベルで発現されているわけではないことを示す。従って、ＰＳＡターゲットは、選択される他のヒト組織の癌性又は前癌性状態についての一般的なマーカーになり得る。検出されるＰＳＡ特異ターゲットの（例えば、末梢血における）増加は、転移した前立腺癌又は他のタイプの癌についての指標になり得る。
【００８９】
実施例９：様々な生物学的サンプルにおけるＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２ターゲットの増幅及び検出
ＰＳＡだけでなく、他の前立腺関連癌マーカーターゲットであるＰＳＭＡ及びｈＫ２も非前立腺組織におけるこれらのターゲットｍＲＮＡの存在を検出するのに有用である。この実施例では、ヒト組織から単離した全ＲＮＡ及びポリ（Ａ）ＲＮＡについて増幅及び検出アッセイを実施し、上記組織内のＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２特異ターゲットの相対レベルを測定した。組織はすべて正常ドナー（即ち、非癌性組織）から入手し、実質的に実施例８の記載通りに、各サンプルにつき同一３検体で実施した。各試験サンプルで、ＲＮＡ又はポリ（Ａ）ＲＮＡの既知量は表１０に示す通りであり、ここでは５ｎｇのポリ（Ａ）ＲＮＡが約１００ｎｇの全ＲＮＡに相当する。ＰＳＡの検出には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有する非Ｔ７（＋）プライマー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を有するＴ７（−）プロモーター−プライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するＡＥ標識プローブを使用して、転写介在増幅を実施した。ＰＳＭＡの検出には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を有する非Ｔ７（＋）プライマー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９を有するＴ７（−）プロモーター−プライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０を有するＡＥ標識プローブを使用して、転写介在増幅を実施した。ｈＫ２の検出には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６を有する非Ｔ７（＋）プライマー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７を有するＴ７（−）プロモーター−プライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するＡＥ標識プローブを使用して、転写介在増幅を実施した。ＲＬＵの検出は実質的に上記の通りであった。同一３検体のサンプルについて実施したアッセイの平均ＲＬＵ結果を各結果について表１０に示す（ＮＤは「実施せず」を意味する）。
【００９０】
【表１１】
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【００９１】
表１０に示した結果は、この実施例で使用した増幅及び検出法が、少なくとも１０ｆｇの全ＲＮＡを含有する前立腺サンプル、少なくとも１ｎｇの全ＲＮＡを含有する乳房サンプル、少なくとも１００ｎｇの全ＲＮＡを含有する肺サンプル、及び、リンパ節、腎臓及び小腸から単離した少なくとも５０ｐｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを含有するサンプルにおいて、ＰＳＡ特異ＲＮＡを検出したことを示す。ｈＫ２については、このアッセイは、前立腺の全ＲＮＡ（少なくとも１０ｐｇ／サンプル）、乳房の全ＲＮＡ（少なくとも１００ｎｇ／サンプル）、及びリンパ節のポリ（Ａ）ＲＮＡ（少なくとも５００ｐｇ／サンプル）において、この遺伝マーカーＲＮＡを検出した。ＰＳＭＡについては、このアッセイは、前立腺の全ＲＮＡ（少なくとも１０ｐｇ／サンプル）、乳房の全ＲＮＡ（少なくとも１ｎｇ／サンプル）、肺の全ＲＮＡ（少なくとも１ｎｇ／サンプル）、及びリンパ節（少なくとも５０ｐｇ／サンプル）、腎臓（少なくとも５０ｐｇ／サンプル）及び小腸（少なくとも５ｐｇ／サンプル）から単離したポリ（Ａ）ＲＮＡにおいて、この遺伝マーカーＲＮＡを検出した。正常血液から単離したＲＮＡでは、プライマー及びプローブのいかなる組み合わせも遺伝マーカー（ＰＳＡ、ｈＫ２、ＰＳＭＡ）を検出せず、ｈＫ２は、他の組織では、ＰＳＡ又はＰＳＭＡに比較して概して低い量で検出された。表１０はまた、このアッセイが定量的であり、検出の飽和点（上記の実験では約２．５ｘ１０6ＲＬＵ）まではサンプル中のターゲット特異ＲＮＡの量に比較的比例しているＲＬＵを検出することを示している。このように、標準滴定実験を使用すれば、サンプル中のターゲットＲＮＡの相対量を定量的に決定し得る。
【００９２】
実施例１０：臨床サンプルにおけるＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びｈＫ２ターゲットの増幅及び検出
この実施例では、臨床サンプル（良性前立腺肥大（ＢＰＨ）又は前立腺癌（ＣａＰ）を有する患者から採取した末梢血、又は正常対照から採取した血液）を、アッセイ実施者が試験サンプルの起源を知らない盲検法で試験した。標準的なグアニジウムイソチオシアネート抽出法（Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), pp. 7.37-7.57）を使用して、臨床サンプルから全ＲＮＡを単離した。ＴＭＡを使用する増幅と実質的に本明細書ですでに記載した検出については、ＰＳＡ・ＲＮＡの検出については５００ｎｇ、ｈＫ２・ＲＮＡの検出については５００ｎｇ、及びＰＳＭＡの検出については１００ｎｇを使用して、各サンプルを同一２検体でアッセイした。ＰＳＡ検出では５，０００ＲＬＵより高く、ｈＫ２検出では１０，０００ＲＬＵより高く、ＰＳＭＡ検出では１，５００ＲＬＵより高いカットオフ点を上回る検出シグナルを産生したものを陽性サンプルとし、各ターゲットについてのカットオフ点を下回るシグナルを産生したものを陰性サンプルとした。プライマー及びプローブは実施例９に記載のアッセイで使用したものと同じであった（ＰＳＡでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、３０及び１；ＰＳＭＡでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、４９及び５０；ｈＫ２では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、４７及び１）。上記アッセイの結果を表１１に示す。サンプルを採取したヒトの病態に応じてサンプルを群分けした。
【００９３】
【表１２】
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【００９４】
表１１の結果は、サンプルドナーの臨床状態とＰＳＡの検出との間に概して正の相関性があることを示す。このアッセイでは、１４名の前立腺癌患者のうち１１名が陽性で、１０名のＢＰＨ患者のうち１名だけが陽性で、正常対照は誰も陽性ではなかった。ｈＫ２の検出も前立腺癌の状態と正の相関を示した（１４名のうち７名が陽性だった）が、正常対照の１名が陽性で、１０名のＢＰＨ患者のうち３名が陽性だった。ＰＳＭＡの検出はドナーの臨床状態と強い相関を示さなかったが、ＰＳＭＡ陽性と判定された３名の前立腺癌患者のうち２名については、ＰＳＡについても陽性だった。１名の前立腺癌患者（標本１０）はＰＳＭＡだけが陽性で、２名の前立腺癌患者はｈＫ２だけが陽性だった。上記の結果は、このアッセイが臨床サンプルから単離したＲＮＡにおいて個別の癌遺伝マーカーを特異的に検出すること、及び各マーカーが、単独でも他の１〜２種の前立腺関連癌遺伝マーカーと組み合わせても、前立腺癌と相関する分子マーカーを検出するのに有用であることを示している。前立腺癌の症状を示すが１つの遺伝マーカー（例えば、ＰＳＡ）で陰性と判定された患者に対しては、別のマーカー（例えば、ｈＫ２）が陽性シグナルを生じる可能性があり、それにより、１つだけのマーカーの結果に依拠することから生じ得る偽陰性診断の可能性を減らすことになる。１つの前立腺関連遺伝マーカー（例えば、ＰＳＡ）について陽性と判定された前立腺患者では、別の遺伝マーカー（例えば、ＰＳＭＡ又はｈＫ２）で得られる陽性の結果は、この陽性診断の裏付けをさらに加えるか、又は腫瘍増殖の程度を示すものを提供することに使用し得る。いずれの症例でも、非前立腺のサンプルで陽性の結果が得られたので、この結果は転移が起きているという診断を裏付ける可能性がある。
【００９５】
本明細書に示した実施例は、先述の特許請求の範囲により規定される本発明の好ましい態様をより詳しく説明するためのものである。本発明の法的同等物である態様はすべて本発明の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＰＳＡ遺伝子の構造と、以下に示す受け入れ番号（Ａｃｃ．Ｎｏ．）を使用する、ＧｅｎＢａｎｋ及び／又はＥＭＢＬから入手可能な様々なＰＳＡ及びカリクレイン−１の配列の並置を示す概略図であり、ここで閉じた四角（黒四角）はエクソン１〜５（「Ｅ１」、「Ｅ２」、「Ｅ３」、「Ｅ４」及び「Ｅ５」）を示し、開いた四角（白四角）はイントロン（「Ｉ１」、「Ｉ２」、「Ｉ３」及び「Ｉ４」を特に表示し、第一のエクソンに先行するか又は最後のエクソンに続くイントロンは表示しない）を示すが、０〜６，８００の塩基番号を表すスケールにわたってイントロン及びエクソンの相対位置が示される。図で示した既知のＰＳＡ遺伝子配列を以下のように表示する：「ＨＳＰＳＡＲ」（１，４６６ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０５３３２）、「ＨＵＭＡＰＳ」（１，４４６ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２６６６３）、「ＨＳＰＳＡ」（１，７２９ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０７７３０）、「ＨＵＭＰＡＡ」（１，４１５ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２１８９５）、「ＨＵＭＰＡＢ」（１，６５４ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２１８９６）、「ＨＵＭＰＡＣ」（６５８ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２１８９７）、「Ｓ７５７５５」（５６９ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｓ７５７５５）、「ＨＳＵ１７０４０」（９９０ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ１７０４０）、「ＨＳＰＳＡ１」（３８９ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１３９４０）、「ＨＳＰＳＡ２」（２８７ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１３９４１）、「ＨＳＰＳＡ３」（３７２ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１３９４２）、「ＨＳＰＳＡ４」（２８１ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１３９４３）、「ＨＳＰＳＡ５」（９００ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１３９４４）、「ＨＳＰＳＡＧ」（５，８７３ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１４８１０）、「ＨＵＭＰＳＡＮＴＩＧ」（６，１５３ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２４５４３）及び「ＨＵＭＰＳＡＡ」（７，１３０ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２７２７４）、及びヒト腺カリクレイン−１の配列「Ｓ３９３２９」（１，５４１ｂｐ；Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｓ３９３２９）。
【図２】  図２は、発現されるＰＳＡ遺伝子（ＨＳＰＳＡＲ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０５３３２の１，４６６ｂｐ配列に基づく）の大部分を表す実線にわたり本発明の様々なプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．を使用して左側に列挙される）の相対位置を示す概略図であり、エクソン１〜５（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びＥ５と表示される）の位置を実線の上に示し、欠失されるイントロン１〜４（Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３及びＩ４と表示される）のスプライス連結部位を実線の下に示す。
【図３】  図３は、発現されるＰＳＡ遺伝子（ＨＳＰＳＡＲ、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０５３３２の１，４６６ｂｐ配列に基づく）の大部分を表す実線にわたり本発明の様々なプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．を使用して左側に列挙される）の相対位置を示す概略図であり、エクソン１〜５（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びＥ５と表示される）の位置を実線の上に示し、欠失されるイントロン１〜４（Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３及びＩ４と表示される）のスプライス連結部位を実線の下に示す。
【図４】  図４は、発現されるＰＳＡ遺伝子（ＨＳＰＳＡＲ、Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０５３３２の１，４６６ｂｐ配列に基づく）の大部分を表す「ＨＳＰＳＡＲ」と表示された実線にわたり本発明の様々なプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．を使用して左側に列挙される）の相対位置を示す概略図であり、エクソン１〜５（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４及びＥ５と表示される）の位置を実線の上に示し、欠失されるイントロン１〜４（Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３及びＩ４と表示される）のスプライス連結部位を実線の下に示す。
【図５】  図５は、各反応あたり前立腺の全ＲＮＡを１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１又は０．００５ｐｇ含有するアッセイにおける、ＰＳＡ特異ターゲットの増幅及び化学発光（正味平均ＲＬＵ）の検出との直線性を示す図であり、実験結果を点線及び点の記号として示し、計算された回帰直線を実線で示す。
【配列表】
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0004495349.tif 000026
0004495349.tif 000027
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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