(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）、（２）、（３）のいずれかで表される、アミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリン。
【化１】
0004497592.tif 000010
【化２】
0004497592.tif 000011
【化３】
0004497592.tif 000012
（式中、Ｒはグルコサミニル基、ガラクトサミニル基またはマンノサミニル基である。）
【請求項２】
縮合剤の存在下、グルクロニルグルコシルシクロデキストリンとグルコサミン、ガラクトサミンおよびマンノサミンの中から選ばれた１種のアミノ糖を溶液中で反応させることを特徴とする請求項１記載のアミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリンの製造法。
【請求項３】
縮合剤が、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドである請求項２記載の製造法。
【請求項４】
一般式（４）で表されるグルコサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン。
【化４】
0004497592.tif 000013
【請求項５】
一般式（５）で表されるガラクトサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン。
【化５】
0004497592.tif 000014
【請求項６】
一般式（６）で表されるマンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン。
【化６】
0004497592.tif 000015
【請求項７】
請求項１記載のアミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリンからなる標的指向性薬物キャリヤー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリン、その製造法およびその利用に関する。詳しくは、カルボン酸結合型シクロデキストリンとアミノ糖を酸アミド結合させたアミノ糖を分岐側鎖に持つシクロデキストリン誘導体とその製造方法並びにこのシクロデキストリン誘導体を用いた標的指向性薬物キャリヤー等としての利用である。
本発明により得られるシクロデキストリン誘導体は医薬品工業、化学工業の分野で広く利用される。
【０００２】
【従来の技術】
シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記することがある。）は、澱粉類に微生物酵素を作用させて得られる環状オリゴ糖で、グルコース分子がα−１，４結合で連なっており、グルコースが６，７，８個からなるα−，β−，γ−ＣＤが良く知られている。
ＣＤは、環の外部は親水性を示し、内部は疎水性を示す、きわめて特異な物質である。ＣＤは、この空洞内に酸やアミンのような有極性イオン物質から無極性の脂肪族あるいは芳香族の炭化水素や希ガスまで、様々な物質を取り込んで包接複合体を形成することができる。
この包接機能を利用して、ＣＤは環内に包接された物質の安定性の向上、物性の改変、異臭・異味除去、さらには難溶性物質の可溶化などを目的に食品、化粧品、医薬品、繊維、建材などの幅広い分野で使用されている。
【０００３】
さらに、ＣＤの有用性が認識されるに従って、ＣＤの溶解度の向上、あるいは人や動物に対する安全性を高めることを目的として、酵素反応によりＣＤに糖の側鎖を結合させた分岐ＣＤや、ＣＤ環を構成するグルコースの水酸基を有機合成により、メチル化、エチル化、ヒドロキシプロピル化などを行った置換ＣＤなどのＣＤ誘導体が開発されている。
【０００４】
なかでも、糖質酸化菌を用いて合成するカルボン酸結合型シクロデキストリン、例えばグルクロニルグルコシル−β−ＣＤ（以下、ＧＵＧ−β−ＣＤと略記することがある。) は、イオン交換樹脂を用いた精製法により、容易に高純度の製品を得ることができるとともに、安全性に優れており、医薬品向けのＣＤとして最適である（特開平07-076594 号、同10-070993 号、同10-210996 号）。
【０００５】
一方、自然界に存在する糖質で、細胞表層の糖鎖は、細胞や組織認識に深く関わっている。Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと略記することがある。）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、ＧａｌＮＡｃと略記することがある。）、Ｎ−アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃと略記することがある。）がそのような糖鎖の構成成分である。
【０００６】
しかしながら、従来の合成されたＣＤやマルトシルＣＤ、ＧＵＧ−β−ＣＤにはＧｌｃＮＡｃなどのアミノ糖を結合したものはなく、組織親和性の面から標的指向性薬物キャリヤーとしては不完全であった。
【０００７】
本発明者らは先にタチナタマメなどを由来とするＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ、または卵白リゾチームの酵素の縮合反応、または糖転移反応を利用して、β−ＣＤおよびマルトシル−β−ＣＤをはじめとした各種ＣＤ類にＧｌｃＮＡｃやＧａｌＮＡｃを結合させることに成功している（特開平08-325304 号、同10-25305号）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの方法は、使用する酵素が入手が困難なもので、高価であるため、コスト高になるほか、これらの合成方法は加水分解酵素の逆反応や転移反応を利用するため、その収率は一般的に低かった。
これらの課題を解決するため、本発明者らはカルボン酸結合型シクロデキストリンとアミノ糖を酸アミド結合することを特徴とするアミノ糖を分岐側鎖にもつ新規分岐シクロデキストリンを合成し、これらの分岐シクロデキストリン誘導体を用いた標的指向性薬物キャリヤーとしての利用方法を開発した。
【０００９】
本発明の目的は、カルボン酸結合型シクロデキストリンとアミノ糖を酸アミド結合させた新規分岐シクロデキストリンとその製造法並びにこれら化合物の標的指向性薬物キャリヤーとしての利用を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
このような事情に鑑み、本発明者らはＧＵＧ−β−ＣＤをはじめとしてカルボン酸結合型シクロデキストリンとグルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）などのをアミノ糖をＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ法による縮合反応によって、アミノ糖を分岐側鎖にもつ新規分岐シクロデキストリン誘導体の合成に成功した。さらに、光学バイオセンサーを利用して、この化合物の標的指向性薬物キャリヤーとしての有用性を検討し、本発明を完成させた。
【００１１】
請求項１に記載の本発明は、一般式（１）、（２）、（３）のいずれかで表される、アミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリンである。
【００１２】
【化７】
0004497592.tif 000002
【００１３】
【化８】
0004497592.tif 000003
【００１４】
【化９】
0004497592.tif 000004
（式中、Ｒはグルコサミニル基、ガラクトサミニル基またはマンノサミニル基である。）
【００１５】
請求項２に記載の本発明は、縮合剤の存在下、グルクロニルグルコシルシクロデキストリンとグルコサミン、ガラクトサミンおよびマンノサミンの中から選ばれた１種のアミノ糖を溶液中で反応させることを特徴とする請求項１記載のアミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリンの製造法である。
【００１７】
請求項３に記載の本発明は、縮合剤が、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドである請求項２記載の製造法である。
【００１８】
請求項４に記載の本発明は、一般式（４）で表されるグルコサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンである。
【００１９】
【化１０】
0004497592.tif 000005
【００２０】
請求項５に記載の本発明は、一般式（５）で表されるガラクトサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンである。
【００２１】
【化１１】
0004497592.tif 000006
【００２２】
請求項６に記載の本発明は、一般式（６）で表されるマンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンである。
【００２３】
【化１２】
0004497592.tif 000007
【００２４】
請求項７に記載の本発明は、請求項１記載のアミノ糖を分岐側鎖に有する分岐シクロデキストリンからなる標的指向性薬物キャリヤーである。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明に関わる新規シクロデキストリン誘導体の合成材料としては、ＧＵＧ−β−ＣＤをはじめとしたカルボン酸結合型シクロデキストリンおよびＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮなどのアミノ糖である。
【００２６】
本発明に関わる新規シクロデキストリン誘導体は、一般式（１）〜（３）の構造式で表され、アミノ糖がカルボン酸とアミド結合した構造を有するシクロデキストリン類である。
当該シクロデキストリン誘導体のうち、代表的な化合物は前記一般式（４）〜（６）の構造式で表される。
【００２７】
上記の一般式から明らかなように、本発明に関わるシクロデキストリン誘導体としては、シクロデキストリン誘導体に少なくともＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮが結合した分岐側鎖を当該シクロデキストリン誘導体当たり１分子含んでいればよく、ＣＤとしては、いわゆる複分岐ＣＤも使用でき、また分岐側鎖の鎖長についても制限はない。
【００２８】
次に、本発明に関わるシクロデキストリン誘導体の製造法について説明する。
このシクロデキストリン誘導体は、カルボン酸結合型シクロデキストリンとアミノ糖を縮合反応させることによって得られる。
このときに用いる縮合剤としては、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）が挙げられ、ＥＤＣが特に好ましい。
この反応を行うにあたり、コハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）を反応液に加えてもよい。加える場合は、ＥＤＣ：ＨＯＮＳｕ＝１０：１〜１：１が好ましいが、これに限定されない。ＤＤＣの場合も同様である。
【００２９】
本発明の方法では、基本的にＧＵＧ−β−ＣＤをはじめとしたカルボン酸結合型シクロデキストリンとアミノ糖がある程度溶解する溶液中で実施すればよく、通常は水溶液として反応を行うが、水以外の有機溶媒、例えばＤＭＦなどの有機溶媒や水と該有機溶媒との混合液を使用することができる。
【００３０】
次に、上記方法で生成したシクロデキストリン誘導体は、必要に応じて反応液をイオン交換樹脂、溶媒沈殿法、高速液体クロマトグラフィーなどで分画、分取して精製することが可能である。
本発明において、反応液から未反応のアミノ糖を除去するためのイオン交換樹脂としては、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘなどのカチオン交換樹脂が用いられ、カルボン酸結合型シクロデキストリンを除去するためのイオン交換樹脂としては、ダイヤイオンＰＡ−４０６、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘなどのアニオン交換樹脂が用いられる。しかし、これら未反応の原料を除く方法は、イオン交換樹脂を用いる方法に限るものではなく、電気透析などを用いても良い。
【００３１】
ここで、シクロデキストリン誘導体の具体的な取得方法について述べると、上記の方法により得られた反応液から、未反応の原料をイオン交換樹脂を用いて除去したのち、アセトン再沈、高速液体クロマトグラフィーを用いて目的とするシクロデキストリン誘導体を分画することができる。
生成物が、目的とするシクロデキストリン誘導体であることは、ＦＡＢ−ＭＳにて分子量を測定し、 1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲにより構造解析を行って確認することができる。
その結果、実施例で得られた化合物は、一般式（４）〜（６）の構造式で表されるものであることを確認した。
【００３２】
シクロデキストリンは、難溶性薬物を包接、可溶化、安定化することができるので、薬物単独で投与する場合に比べて、バイオアベイラビリティーが改善されることが報告されている。本発明に関わるシクロデキストリン誘導体は、包接能に加えてアミノ糖を分岐側鎖に持つことから、その組織親和性は標的指向性を有する。
【００３３】
本発明のシクロデキストリン誘導体のリガンドおよびゲスト物質との相互作用の解析は、ＦＡＳＴ社製の光学バイオセンサーｌＡｓｙｓを用いて測定することができる。すなわち、光学バイオセンサーのキュベット表面に固定化したリガンド（レクチン、薬剤）を調製し、これに当該シクロデキストリン誘導体を加え、分子間相互作用によって変動する相互差用量（レスポンス）を観察するものである。
【００３４】
当該シクロデキストリン誘導体の標的指向性と、包接能を利用して標的指向性薬物キャリヤーとして使用することができる。薬物などの化合物を、このシクロデキストリン誘導体と包接させる方法としては、水溶液中で当該シクロデキストリン誘導体（ホスト) と薬物（ゲスト) を包接させ、凍結乾燥、噴霧乾燥などで乾燥物を得るような通常の包接物の調製方法を適用することができる。
【００３５】
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
実施例１
ＧＵＧ−β−ＣＤ（ナトリウム塩) は特開平07-76594号の実施例４に記載の方法従って合成した。
次に、ＧＵＧ−β−ＣＤを蒸留水に溶解し、ＥＤＣとＨＯＮＳｕを加え、０℃で１時間攪拌した後、マンノサミンを加え、０℃で２時間攪拌した。次いで、室温下にて２４時間攪拌し、反応させた。
反応終了後、イオン交換樹脂アンバーライトＭＢ３を用いてバッチ法にて、未反応物および塩を除去し、濃縮後、アセトンを加えて再沈させることによって、マンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤ（ＭａｎＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤ）を収率８４％で得た。
【００３６】
さらに、分取用高速液体クロマトグラフィーにて精製し、当該シクロデキストリン誘導体を得た。ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示した。なお、ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
溶媒：５％アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
【００３７】
単離した当該シクロデキストリン誘導体はＦＡＢ−ＭＳ（ＪＥＯＬ−ＬＡ５００）にて分子量を測定したところ、分子量１６３４であることがわかった。ＦＡＢ−ＭＳスペクトラムを図２に示した。
さらに、 1Ｈ−ＮＭＲ（ＪＥＯＬ  ＳＸ−１０２Ａ）分析を行った。当該シクロデキストリ誘導体の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを図３に示した。図から明らかなように、５．０〜５．１ｐｐｍのアノメリックＣ１プロトンと糖鎖、シクロデキストリンを含めたＣ１プロトン以外のノンアノメリックプロトンの３．２〜４．０ｐｐｍの積分値の比は１：６となっており、これは計算値の“６”とよく一致した。また、これ以外のピーク面積は相対的に少ないことから、当該シクロデキストリン誘導体、つまり一般式（６）で示されるＭａｎＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤであることを確認できた。
【００３８】
実施例２
ＧＵＧ−β−ＣＤ、ＥＤＣおよびＨＯＮＳｕを蒸留水に溶解し、０℃で１時間攪拌した後、グルコサミンを加え、０℃で２時間攪拌した。次いで、室温下にて２４時間反応させた。
反応終了後、イオン交換樹脂アンバーライトＭＢ３を用いてバッチ法にて、未反応物および塩を除去し、濃縮後、アセトンを加えて再沈させることによって、グルコサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤ（ＧｌｃＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤ）を収率９４％で得た。
さらに、分取用高速液体クロマトグラフィーにて精製し、当該シクロデキストリン誘導体を得た。
【００３９】
単離した当該シクロデキストリン誘導体は、ＦＡＢ−ＭＳ（前出）にて分子量を測定したところ、分子量１６３４であることがわかった。さらに、 1Ｈ−ＮＭＲ（前出）と13Ｃ−ＮＭＲの結果より、当該シクロデキストリン誘導体は、一般式（４）で表されるＧｌｃＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤであることを確認した。
【００４０】
実施例３
ＧＵＧ−β−ＣＤ、ＥＤＣおよびＨＯＮＳｕをを蒸留水に溶解し、０℃で１時間攪拌した後、ガラクトサミンを加え、０℃で２時間攪拌した。その後、室温下にて２４時間反応させた。
反応終了後、イオン交換樹脂アンバーライトＭＢ３を用いてバッチ法にて、未反応物および塩を除去し、濃縮後、アセトンを加えて再沈させることによって、ガラクトサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤ（ＧａｌＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤ）を収率８９％で得た。
さらに、分取用高速液体クロマトグラフィーにて精製し、当該シクロデキストリン誘導体を得た。
【００４１】
単離した当該シクロデキストリン誘導体は、ＦＡＢ−ＭＳ（前出）にて分子量を測定したところ、分子量１６３４であることがわかった。さらに、 1Ｈ−ＮＭＲ（前出）と13Ｃ−ＮＭＲの結果より、当該シクロデキストリン誘導体は、一般式（５）で示されるＧａｌＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤであることを確認した。
【００４２】
実施例４
実施例１、2 、3 で得られた当該シクロデキストリン誘導体の標的指向性薬物キャリヤーの可能性を検討するために、各々当該シクロデキストリン誘導体の末端糖残基に特異的認識を持つコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびＳｏｙｂｅａｎ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＢＡ）をキュベット表面上に固定化した光学バイオセンサーにより、各々解析した。会合定数を表１に示した。
【００４３】
【表１】
第１表
0004497592.tif 000008
【００４４】
ＭａｎＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤおよびＧｌｃＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤはＣｏｎＡと会合挙動を示し、ＧａｌＮ−ＧＵＧ−β−ＣＤはＳＢＡと会合挙動を示した。それぞれ末端糖鎖を認識するレクチンとの間に当該シクロデキストリン誘導体の認識性が確認された。
【００４５】
実施例５
実施例４と同様に、医薬モデル物質としてコール酸および制癌剤ドキソルビシンをキュベット表面上に固定化した光学バイオセンサーを用いて、これら薬剤と当該シクロデキストリン誘導体の包接会合相互作用を各々解析した。
その結果、当該シクロデキストリン誘導体は、いずれもコール酸およびドキソルビシンとの間で包接会合挙動を示した。会合定数を表２に示した。
【００４６】
【表２】
第２表
0004497592.tif 000009
【００４７】
以上のことから、当該シクロデキストリン誘導体は、特定のレクチンタンパク質と会合相互作用を示し、医薬モデル物質や制癌剤との間で包接会合作用することが確認でき、二重認識を行う化合物であることを示せたことから、標的指向性薬物キャリヤーの用途が期待できる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、アミノ糖を分岐側鎖に有するシクロデキストリン誘導体とその製造法が提供される。当該シクロデキストリン誘導体を用いて抗がん剤、抗炎症剤などの医薬品化合物を包接させることによって、医薬品化合物の生体内動態、生体内安定性および生体刺激性を改善し、作用時間を遅延し、さらにはバイオアベイラビリティーを改善することが期待できる。特に、当該シクロデキストリン誘導体を、組織親和性を高めた標的指向性薬物キャリヤーとして利用することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１のマンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤのＯＤＳカラムの高速液体クロマトグラムを示す。
【図２】  実施例１のマンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤのＦＡＢ−ＭＳスペクトラムを示す。
【図３】  実施例１のマンノサミニドグルクロニルグルコシル−β−ＣＤの 1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図１】
0004497592.tif 000016
【図２】
0004497592.tif 000017
【図３】
0004497592.tif 000018