(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される化合物またはその互変異性体を有する硫黄転移試薬：
0004393594.tif 000013
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7であり；
Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基またはフェニル基であり；
Ｒ2は独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基、フェニル基または−ＳＯ2−フェニル基であり；そして、
Ｒ6およびＲ7は各々独立してＣ1-4アルキル基またはフェニル基であり；
ただし、ＸがＮＲ2Ｒ3であるとき、Ｒ2およびＲ3は両方ともＨであることはなく、またはＲ2およびＲ3は両方ともＣＨ3であることはない。
【請求項２】
式Ｉで表される化合物が３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンまたは３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項１に記載の硫黄転移試薬。
【請求項３】
少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、式Ｉで表される化合物またはその互変異性体を含有する硫黄転移試薬
0004393594.tif 000014
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7であり；
Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基またはフェニル基であり；
Ｒ2は独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基、フェニル基または−ＳＯ2−フェニル基であり；そして、
Ｒ6およびＲ7は各々独立してＣ1-4アルキル基またはフェニル基である；
と接触させることを含む、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する方法。
【請求項４】
式Ｉで表される化合物が、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、水素化キサンタン、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンまたは３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
各硫化し得るヌクレオチド間結合が燐（ＩＩＩ）原子を含有する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
該硫化し得るヌクレオシド間結合が、ホスファイト、チオホスファイト、Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネートまたはアルキルホスファイトヌクレオシド間結合である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
硫化反応を約１分〜約５分行なう、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを硫黄転移試薬と接触させることを含む、オリゴヌクレオチドの合成方法であって、ここにおいて硫黄転移試薬は式Ｉ
0004393594.tif 000015
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7であり；
Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基またはフェニル基であり；
Ｒ2は独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基、フェニル基または−ＳＯ2−フェニル基であり；そして、
Ｒ6およびＲ7は各々独立してＣ1-4アルキル基またはフェニル基である；
で表される化合物またはその互変異性体を含む、前記方法。
【請求項９】
式Ｉで表される化合物が３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉで表される化合物が水素化キサンタンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
式Ｉで表される化合物が３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
式Ｉで表される化合物が３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
式Ｉで表される化合物が３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
式Ｉで表される化合物が３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
請求項３〜７のいずれか１項に記載されたヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する方法を含む、オリゴヌクレオチドの合成方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドの合成のための、式Ｉ
0004393594.tif 000016
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7であり；
Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基またはフェニル基であり；
Ｒ2は独立してＨ、Ｃ1-4アルキル基、フェニル基または−ＳＯ2−フェニル基であり；そして、
Ｒ6およびＲ7は各々独立してＣ1-4アルキル基またはフェニル基である；
で表される化合物またはその互変異性体の使用。
【請求項１７】
式Ｉで表される化合物が、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、水素化キサンタン、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンおよび３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンよりなる群から選択される、請求項１６に記載の化合物またはその互変異性体の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はオリゴヌクレオチド類の化学合成および該合成に有用な化学物質に関する。さらに詳しくは、本発明はオリゴヌクレオチド類のヌクレオシド間結合の硫化に関する。
背景技術
オリゴヌクレオチド類は、近代的分子生物学における不可欠の道具となっており診断方法から遺伝子発現のアンチセンス抑制のＰＣＲに渡る広範な技術に用いられている。
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類は核酸研究に重要な関係を有し、オリゴヌクレオチド治療にて試験される類似物の中にある。オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類はヌクレオシド間結合に含まれ、そこではホスフェート基の非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置換されている。オリゴヌクレオチド類のこれら広範な使用により、オリゴヌクレオチド類の迅速で低廉でかつ効率的な合成法に対する要求が増大している。
アンチセンスおよび診断用のオリゴヌクレオチド類の合成は今やルーチンにて完成している（Methods in Molecular Biology,Vol 20:Protocols for Oligonucleotides and Analogs,pp.165-189（S.Agrawal,ed,Humana Press,1993）;Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp.87-108（F.Eckstein.,ed.,1991）;およびUhlmann and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584（1990）;Agawal and Iyer,Curr.Op.in Biotech.6:12（1995）;およびAntisense Research and Applications（Crooke and Lebleu,eds,CRC Press,Boca Raton,1993）を参照）。初期合成手法にはホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学が含まれる。コラナ等（Khorana et al,J.Molec.Biol,72 209（1972））には、オリゴヌクレオチド合成のホスホジエステル化学が開示されている。
リーズ（Reese,Tetrahedron Lett.34:3143-3179（1978））にはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成のホスホトリエステル化学が開示されている。これら初期合成手法は、より効果的なホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート手法から自動合成へと大きく道を開いた。ビューケイジら（Beaucage and Carruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862（1981））はポリヌクレオチド合成にデオキシヌクレオチドホスホルアミダイトの使用を開示している。アグラウォールら（Agrawal and Zamecnik,U.S.Patent No.5,149,798（1992））にはＨ−ホスホネート手法によるオリゴヌクレオチドの最適合成を開示している。
これら後者の手法は各種の改変またヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチド類の合成に用いられている。アグラウォールら（Agrawal and Goodchild,Tetrahedron Lett.28:3539-3542（1987））はホスホルアミダイト化学を利用したオリゴヌクレオチドメチルホスホネート類の合成について教示している。コノリーら（Connolly et al.,Biochemistry 23:3443（1984））は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の合成を開示している。ジェイガーら（Jager et al.,Biochemistry 27:7237（1988））はホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミデート類の合成を開示している。アグラウオールら（Agrawal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7079-7083（1988））は、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミデート類およびホスホロチオエート類の合成を開示している。
上記方法によるオリゴヌクレオチド類の固相合成法は同じ一般的プロトコールを含んでいる。簡単に示せば、この手法は、３’−モストヌクレオシド（３’−most nucleoside）をアミノおよび／またはヒドロキシ基で官能性を付与した固体担体に固定させ、ついで追加のヌクレオシドを段階的に追加することからなる。ヌクレオシド間結合は、付加されるヌクレオシドの３’−官能基と初期の担体に固定されたオリゴヌクレオシドの５’−モストヌクレオシドとの間で形成される。ホスホルアミダイド手法では、ヌクレオシド間結合はホスファイド結合であり、一方、Ｈ−ホスホネート手法では、Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間結合である。硫黄含有ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を作るためには、ホスファイト結合またはＨ−ホスホネート結合は適当な硫黄転移試薬で酸化しなければならない。Ｈ−ホスホネート手法では、この硫化はすべてのＨ−ホスホネート結合において単一工程で行なわれ、ついでオリゴヌクレオチド鎖組立が完成する。
それは、典型的にはＣＳ2／ピリジン等の混合溶媒中で硫黄元素を用いて行なわれる。反対に、ホスホルアミダイド手法では、各カップリング後に段階的に硫化が行なわれ、それにより、部位特異的に各結合の状態がコントロールできる。部位特異的に各結合状態をコントロールできると共に、優れたカップリング効果のために、ホスホルアミダイト手法が有利である。
しかし、洗練された手法開発が依然要求されており、とくに、大規模合成（１０μｍｏｌ〜１ｍｍｏｌまたはそれ以上）に移行するときには余計に必要である（パドマプリヤら（Padmapriya et.al.,Antisense Res.Dev.4:185（1994）を参照）。標準的ホスホルアミダイト法のいくつかの改良法が合成法に関して報告されている（パドマプリヤら（Padmapriya et.al.,supra;Ravikumar et.a1.,Tetrahedron 50:9255（1994）、テイセンら（Theisen et al.,Nucleosides & Nucleotides 12:43（1994））およびアイヤーら（Iyer et.al.,Nucleosides & Nucleotides 14:1349（1995））。またオリゴヌクレオチドの単離に関して〔キュイジュパースら（Kuijipers et.al.,Nucl.Acids.Res.18:5197（1990））およびレディら（Reddy et.al.,Tetrahedron Lett.35:4311（1994））〕報告されている。
ホスホロアミダイト手法を介してオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類を合成するためには効果的な硫黄転移試薬を使用することが肝要である。
硫黄元素は低溶解性および遅い硫化反応のために効果的でない。近年、多くのより効果的な硫化試薬が報告されている。これらには、フェニルアセチルジスルフィド（カメルら（Kamer et.al.Tetrahedron Lett.30:6757-6760（1989））、Ｈ−１，２−ベンゾジオチール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビューケイジ試薬（Beaucage reagent）（アイヤーら（Iyer et.al.,J.Org.Chem.55:4693-4699（1990））、テトラエチルチューラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）（ヴーら（Vu et al.,Tetrahedron Lett.32:3005-3008（1991））、ジベンゾイルテトラスルフィド（ラオら（Rao et.al.,Tetrahedron Lett.33:4839-4842（1992））、ビス（Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド（Ｓ−Tetra）（ステックら（Stec et al.,Tetrahedron Lett.33:5317-5320（1993））、ベンジルトリエチルアンモニウムテトラチオモリベート（ＢＴＴＭ）（ラオら（Rao et.al.,Tetrahedron Lett.35:6741-6744（1994））、ビス（ｐ−トルエンスルホニル）ジスルフィド（エフィルノフら（Effirnov et.al.,Nucl.Acids Res.23:4029-4033（1995））、３−エトキシ−１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＥＤＩＴＨ）（シューら（Xu et.al.,Nucleic Acid Res.24:1602-1607（1996））、および１，２，４−ジチアゾリジン−３，５−ジオン（ＤｔｓＮＨ）（シューら（Xu et.al.,Nucleic Acid Res.24:1602-1607（1996））がある。
ビューケイジ試薬およびＴＥＴＤの両者は共に市場で入手可能である。ビューケイジ試薬は広く用いられるが、その合成および安定性に難点がある。さらに、硫化中にビューケイジ試薬で形成される副生成物、３Ｈ−２，１−ベンゾキサンチオラン−３−オン−１−オキシドは潜在的な酸化剤となってある条件下では好ましくないホスホジエステル結合をもたらす。したがって、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の大規模合成にそれを適用するのはとくに好ましくない。我々は２つの商業的に利用し得る化合物１および２および新規なその類似体を強力な硫化試薬として報告する。
したがって、新たな硫黄転移試薬およびオリゴヌクレオチドの硫化方法の開発に対する要求がなお引続き存在する。実際に、そのような硫黄転移試薬は、低廉に作られ、貯蔵安定性がよく、かつ高効率のものであるべきである。
発明の要旨
本発明は、硫黄転移試薬を用いたオリゴヌクレオチド類の新規な硫化方法を提供するものである。本発明の方法によれば、硫化が安価に貯蔵安定性良く、かつ高効率で行なわれる。
第1の態様では、本発明は式Ｉの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000002
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨまたはアルキルまたは芳香族有機基、Ｒ6およびＲ7は各々独立してアルキルまたは芳香族有機基である。
第2の態様は、本発明は式ＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000003
式中、Ｒ8はＨまたは有機基、Ｒ9は有機基である。
本発明の他の態様は、式ＩＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000004
式中、Ｒ10およびＲ11は各々独立してＨまたは有機基である。
第4の態様では、本発明は、本発明の新規硫黄転移試薬を用いてオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する新規な方法を提供するものである。
好ましい態様では、本発明の新規な方法は、少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを、本発明の新規な硫黄転移試薬とヌクレオシド間結合を硫化するに充分な時間接触させることからなる。
【図面の簡単な説明】
図１は標準のＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。図1Ａは、標準Ｐ＝ＳダイマーのＨＰＬＣを示す。図１ＢはＰ＝ＳおよびＰ＝Ｏダイマーの共注入を示す。
図２は、硫黄転移試薬として化合物１を用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。図２Ａは、４等量１分間の条件で硫化した場合を示す。図２Ｂは、４等量５分間の条件で硫化した場合を示す。図２Ｃは、１２等量１分間の条件で硫化した場合を示す。図２Ｄは、１２等量５分間の条件で硫化した場合を示す。
図３は、硫黄転移試薬として化合物２を用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。
図４は、硫黄転移試薬として化合物３用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。
図５は、硫黄転移試薬として化合物４用いて合成したＤＭＴ保護Ｔ−ＴホスホチオエートダイマーのＨＰＬＣを示す。
図６は、硫黄転移試薬として化合物１を用いて合成したＳＥＱＩＤＮｏ：１のＨＰＬＣを示す。図６Ａは、各合成サイクルにおいて１分間の硫化の場合を示す。
図６Ｂは、各合成サイクルにおいて２分間の硫化の場合を示す。
図７は、硫黄転移試薬として化合物１を用い、硫化を１分間行なって合成したＳＥＱＩＤＮｏ．１のＣＥを示す。
図８は、硫黄転移試薬として化合物２を用い、硫化を２分間行なって合成したＳＥＱＩＤＮｏ．１のＣＥを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明はオリゴヌクレオチド類の化学合成および該合成に有用な化学物質に関する。さらに詳しくは、本発明はオリゴヌクレオチド類のヌクレオシド間結合の硫化に関する。
本明細書に示している特許および刊行物は当該技術分野の習熟者に知られているものであって、それら全体を本明細書において引用する。
本発明は、新規な硫黄転移試薬およびそれらのオリゴヌクレオチド硫化への使用法を提供する。本発明の硫黄転移試薬は、安価に製造でき、貯蔵安定性で、硫化に高い効率を有する。
第1の態様では、本発明は式Ｉの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000005
式中、ＸはＲ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ4ＣＯＲ5、ＳＲ6またはＯＲ7を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は各々独立してＨまたはアルキルまたは芳香族有機基、Ｒ6およびＲ7は各々独立してアルキルまたは芳香族有機基である。
好ましい具体例は、式Ｉの硫黄転移試薬が３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）または３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（６）である。
第2の態様は、本発明は式ＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000006
式中、Ｒ8はＨまたは有機基、Ｒ9は有機基である。
本発明の他の態様は、式ＩＩＩの構造を有する新規な硫黄転移試薬を提供する。
0004393594.tif 000007
式中、Ｒ10およびＲ11は各々独立してＨまたは有機基である。
好ましい具体例は、式ＩＩＩの硫黄転移試薬が３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）、３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）または３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（６）である。
化合物１および２の３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンおよび水素化キサンタンは、ランカスター、クレセントケミカルス、メイグリッジおよびＴＣＩアメリカを含む種々の化学会社から市販されている。得られる化合物１および２の純度は９８％以上で、両化合物共に、さらに精製することなくオリゴヌクレオチド合成に直接使用し得る。これらの化合物はゴム工業において加硫化剤として用いられている。しかし、これらの化合物は、我々の知る限りでは、オリゴヌクレオチド合成に適用されたことはない。
化合物１の誘導体は容易に合成される。反応式１に示すように、化合物１を出発物質として、固相ホスホルアミダイト法により、７０％以上の収率にて３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）、３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）、３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）および３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（６）を容易に得ることができる。
0004393594.tif 000008
より詳細に説明すると、反応条件としては、化合物３では酢酸無水物／ピリジン中で（収率９６％）、化合物４ではトリメチル酢酸無水物／Ｅｔ3Ｎ中で（収率７０％）、化合物５ではベンゾイルクロリド／Ｅｔ3Ｎ中で（収率７０％）および化合物６ではベンゼンスルホニルクロリド／Ｅｔ3Ｎ中で（収率７６％）行なう。最終生成物を簡単な沈殿法で精製しうる。
これらの硫黄転移試薬の安定性および溶解性を調べた。化合物１〜６はＣＨ3ＣＮ、ピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：９）およびピリジン中で１週間以上安定である。テスト期間中沈殿は生じなかった。すべての試薬は自動ＤＮＡシンセサイザーの操作中安定であり、合成中に凝結その他の問題は生じなかった。
親化合物１および２はＣＨ3ＣＮに溶解し、０．０１Ｍ溶液が得られる。それらの安定性はピリジン添加〔ピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：９）中０．０２Ｍ、純ピリジン中０．５Ｍ〕により改良される。
したがって、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート類は、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）、水素化キサンタン（２）およびそれらの対応誘導体を用いて固相ホスホルアミダイト手法により効率よく製造されることがわかる。化合物１および２は市販されており、ビューケイジ試薬やＥＤＩＴＨなどの一般に使われている硫化試薬と比較して安価である。
その高効率と低価格により、化合物１および２ならびにそれらの改変類似体はビューケイジ試薬の代替として有利であり、特にオリゴヌクレオチドホスホロチオエート類の大規模製造において有利である。
他の態様では、本発明は、本発明の新規硫黄転移試薬を用いてオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合に硫黄基を付加する新規な方法を提供するものである。好ましい態様では、本発明の新規な方法は、少なくとも１つの硫化し得るヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを本発明の新規な硫黄転移試薬とヌクレオシド間結合を硫化するに充分な時間接触させることからなる。
各硫化し得るヌクレオシド間結合は好ましくは燐（ＩＩＩ）原子を含有する。とくに好ましい態様では、硫化し得るヌクレオシド間結合は、ホスファイト、チオホスファイト、Ｈ−ホスホネート、チオ−Ｈ−ホスホネート、またはアルキルホスファイト（特にメチルホスファイト）ヌクレオシド間結合である。
好ましくは、硫化反応は、31Ｐ−ＮＭＲで測定して、先行技術における化合物に期待されるよりも高い効率にて硫黄転移が行なわれる。そのような効率をもたらす典型的な合成条件は、新規な転移試薬を用いて約１〜約５分間反応させることにより達成される。典型的には反応をピリジン、ＴＨＦまたはそれらの混液中で行なう。本発明においては、オリゴヌクレオチドなる語は、２またはそれ以上の天然デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドモノマー類またはそれらの組合せの線状ポリマーを含む。該オリゴヌクレオチドなる語はまた化学的に修飾した塩基または糖および／またはホスホジエステル結合またはその類似体が数モノマー単位（例えば２〜３）から数百モノマー単位のサイズで結合した非ヌクレオシド類似結合および／またはさらに置換基を有するポリマー類も含み、それらは何らの制限のない親油性基、内位添加剤、ジアミン類およびアダマンタンを含んでいる。特に、オリゴヌクレオチド類は、燐含有ヌクレオシド間結合を有する非天然オリゴマー類も含み、その燐（ＩＩＩ）プリカーサーは硫化に適合している（タケシタら（Takeshita et.al.,J.Biol.Chem.282:10171−10179（1987）を参照）。
本発明において「２’−Ｏ−置換」なる語はペントース基の２’位に１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する−Ｏ−低級アルキル基、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基で置換されたものを意味し、そのアルキル、アリール、アリル基は非置換でも、またハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、またはアミノ基であるいはヒドロキシ、アミノまたはハロゲンで置換していてもよい。ただし、２’−Ｈ基ではない。
それらのオリゴヌクレオチド類は、公知のヌクレオシド間結合を有していてもよく、何らの制限なく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート（特にメチルホスホネート）、ホスホルアミド、アミド（ＰＮＡ）、カルバメートおよびアルキルホスホノチオエート結合を含む。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは固体担体に結合しているが、これらのオリゴヌクレオチド類は溶液相で硫化してもよい。
これらの新規な硫黄転移試薬の効率は、ジヌクレオチドホスホロチオエート、Ｓ’−ＤＭＴ−ＴＴ−ＯＨ−３’（図１）の固相によりまず評価された。合成は、標準ホスホロチオエートプロトコールを１．０μｍｌの規模（ＴＨＩＯ  １μｍｏｌ）で用いて行なわれた。ジヌクレオチドホスホロチオエートは逆相ＨＰＬＣにより分析した。その結果、化合物１および２を用いて硫黄転移効率は９９％以上であった（図２および図３）。化合物３〜４も効率的な硫黄転移試薬であることがわかった（図４〜５）。
化合物１および２の硫化試薬としての効果についてさらに評価するために、０．０２ＭＣＨ3ＣＮ／ピリジン（９：１）中溶液を用い１．０μｍｏｌの規模にて、各合成サイクルで１〜２分間の硫化を行なってオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、５’−ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤＮｏ．１）を合成した。ＣＰＧからアンモノリシスにて解離させ、脱保護したのち、粗製のオリゴヌクレオチドホスホロチオエートをイオン交換ＨＰＬＣおよびＣＥにて分析した（図６〜８）。その結果、各ステップで９９％以上の硫黄転移効率が達成され、８０％以上の収率で合成できた（図３）。
実施例
本発明の好ましい態様について下記実施例で具体的に示すが、本発明はこれらに限定されない。
一般に、無水ピリジンおよびＣＨ2Ｃｌ2はアルドリッチ（Milwarkee,WT）より購入した。無水ＣＨ3ＣＮはＪ．Ｔ．ベイカー社（Phillipsburg,NJ）から購入した。ｄＴ−ＣＰＧ、５’−ＤＭＴ−チミジンシアノエチルホスホルアミダイト、ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、活性化剤、酸化および脱ブロック溶液はパーセプティブバイオシステムズ（PerSeptive Biosystems）（Framingham,MA）より購入した。ビューケイジ試薬（3Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）は」Ｒ．Ｉ．ケミカル（Orange,CA）より購入した。他のすべての化学物質はアルドリッチから購入した。31Ｐ−ＮＭＲスペクトル（１２１．６５ＭＨｚ）および1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）はヴァリアンＵＮＩＴＹ３００（化学シフトをそれぞれ８５％Ｈ3ＰＯ4およびテトラメチルシランにて補正した）上に記録した。ジヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成を自動核酸シンセサイザー（８９０９  ExpediteTM、Millipore,Bedford,MA）にて行なった。
逆相ＨＰＬＣはウォーターズ６００Ｅポンプ上で、ウォーターズ４４０吸光度検出器、ウォーターズ７４６インテグレイター、およびノバーパックＣ１８（３．９×１５０ｍｍ）カラムにて、ＣＨ3ＣＮ−水性ＮＨ4ＯＡｃ（０．１Ｍ）（４：１）および０．１Ｍ水性ＮＨ4ＯＡｃの１：９〜３：２の直線勾配を用い、流速２ｍＬ／分、２６０ｎｍ検出で行なった。イオン交換ＨＰＬＣ分析は、ベックマン１６６吸光度検出器を用いるベックマンSystems Gold １２６上でバッファＡ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ＣＨ3ＣＮ、ｐＨ８）およびバッファＢ（２ＭＮａＣｌおよびバッファＡ）を１００％Ａから１００％Ｂの直線勾配で用い、３分間、流速２ｍＬ／分、２５４ｍｍで検出の条件でＮＵＣＥＯＰＡＣＰＡ−１００カラム（４×５０ｍｍ）にて行なった。毛細管電気泳動はベックマンＰ／ＡＣＥシステム５０１０上で行なった。試料は５秒で注入し、４０分間分析した。
化合物３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１）は、ランカスター、クレセントケミカルズ、およびメイブリッジを含む種々の化学会社から市販されている９８％純度のものを、さらに精製することなくそのまま用いた。
化合物水素化キサンタン（２）はＴＣＩアメリカより市販されている純度９８％のものを、さらに精製することなくそのまま用いた。
実施例１
３−Ｎ−アセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３）の合成
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純粋の酢酸無水物（１．４９ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（化合物１、２．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）のピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：５、５０ｍＬ）懸濁液中に３０分をかけて滴下した。得られる澄明な黄色溶液を２５℃で１時間攪拌し、減圧濃縮した。得られた黄色固体をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、１０％クエン酸水溶液（５００ｍＬ）、水（２×５００ｍＬ）、ついで食塩水（５００ｍＬ）にて洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。有機溶媒を蒸発させて、標記化合物の黄色固体を得た。収量２．５０ｇ（９６％）、融点２２９．６−２３０．１℃
実施例２
３−Ｎ−トリメチルアセチル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（４）の合成
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純粋のトリメチル酢酸無水物（３．２０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（化合物１、２．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）のＥｔ3Ｎ−ＣＨ2ＣＨ2（１：５、３０ｍＬ）懸濁液中に１度に加えた。澄明な黄色溶液が１０分で得られ、それを２５℃で２時間攪拌し、減圧濃縮した。得られた黄色固体をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶かし、１０％クエン酸水溶液（２×１００ｍＬ）、水（２×１００ｍＬ）、ついで食塩水（１００ｍＬ）にて洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。有機溶媒を減圧留去させ、得られた黄色固体をヘキサン（１００ｍＬ）で処理し、４℃で２時間保持した。その黄色沈殿物を濾取し、ヘキサン（３×５ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥した。収量２．１７（７０％）、融点１７９．６−１７９．６℃
実施例３
３−Ｎ−ベンゾイル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（５）の合成
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３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（化合物１、１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）をＥｔ3Ｎ−ＣＨ2Ｃｌ2（１：５、２０ｍＬ）中に懸濁させ、これに安息香酸クロリド（０．９２ｍＬ、１．２等量）を加えた。澄明な黄色溶液を５分で得た。その反応溶液を２５℃で２時間攪拌し、減圧濃縮して有機溶媒を除去した。得られた黄色固体をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）にて処理し、不溶物を濾過して除き、そのＥｔＯＡｃ層を１０％クエン酸水溶液（２×２００ｍＬ）、水（２×２００ｍＬ）、ついで食塩水（２００ｍＬ）にて洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。ＥｔＯＡｃを蒸発させて黄色固体を得、それをＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）で処理し、ついでヘキサン（１００ｍＬ）を加えた。得られた固体を濾去し、濾液を減圧蒸留して黄色固体を得た。収量１．１７ｇ（７０％）
実施例４
３−Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（６）の合成
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安息香酸クロリドの代わりにベンゼンスルホニルクロリドを用いた以外は化合物５の製造の場合と同様に処理した。収量：１．４６ｇ（７６％）
実施例５
水素化キサンタン、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンおよびそれらの誘導体のＣＨ3ＣＮ中の安定性および溶解性の検討
溶解性および安定性の検討を、すべての場合について、ＣＨ3ＣＮ、ピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：９）およびピリジン中で２５℃で行なった。飽和溶液を乾燥し、その溶解性を試験溶液の実際量中の試験化合物の重量で決定した。安定性はＴＬＣまたはＨＰＬＣ分析のいずれかにより決定した。
実施例６
ジヌクレオチドホスホロチオエートの合成
出発物質としてＤＭＩ−Ｔ−Ｓｕ−ＣＰＧ（５００Å、充填６０μｍｏｌ／ｇ）を用い、合成プロトコール”ＴＨＩＯｌμｍｏ１”（Expedite software verrion１．０１）にて０．１μｍｏｌのスケールにてPerSeptiveＤＮＡ／ＲＮＡ（Millipore ８９０９ Expedite、Millipore,Bedford,MA）上でダイマーを組み立てた。硫化試薬は、ＣＨ3ＣＮまたはピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：９）のいずれかで、特に断らない限り０．０２Ｍの濃度にて調製した。硫化は、４等量または１２等量の硫化試薬を用い、各々１または５分間行なった。濃水酸化アンモニウム（１μｍｏｌ／１ｍＬ）を用い２５℃で１時間処理して最終の開裂を行なった。ＣＰＧおよび他の不溶残留物を濾去し、水酸化アンモニウム溶液を凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、０．１Ｍ水性ＮＨ4ＯＡｃおよびＣＨ3ＣＮ−水性ＮＨ4ＯＡｃ（０．１Ｍ）（４：１）の１：９〜３：２の直線勾配にて、４０分間、流速１．０ｍＬ／分、２６０ｍｍ検出により行なった。５’−ＯＭＴ−Ｔ（Ｐ＝Ｓ）−Ｔ−ＯＨ−３’ジアステレオマーがｔR＝３１．６分およびｔR＝３１．７分で溶出された。対応するＰ＝ＯダイマーはｔR＝２８．４分で溶出された（図１）。
実施例７
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（５’−ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ．１））の合成
ジヌクレオチドホスホロチオエート合成で記載したと同じプロトコールにしたがって、鎖組み立てを行なった。硫化試薬（化合物１）は０．０２Ｍピリジン−ＣＨ3ＣＮ（１：９）溶液で用い、硫化は１２等量で１または２分間行なった。イオン交換ＨＰＬＣおよびＣＥ分析をこのオリゴマー合成の評価のために行なった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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