(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
最大で100個の固有のアミノ酸連鎖からなることを特徴とする細胞内に浸透する能力を有するポリペプチドであって、
(i)配列ＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧから成るＣＤＲ２領域及び
配列ＱＫＹＮＫＲＡＭＤＹから成るＣＤＲ３領域；
(ii)配列ＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧから成るＣＤＲ２領域及び
配列ＥＫＹＧＫＲＧＭＤＹから成るＣＤＲ３領域；又は
(iii)配列ＡＩＳＲＧＧＧＹＳＹＹＬＤＳＶＫＧから成るＣＤＲ２領域及び
配列ＴＡＲＡＴＷＤＷＦＡＹから成るＣＤＲ３領域；
を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項２】
最大で60個の固有のアミノ酸連鎖からなることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＣＤＲ２とＣＤＲ３との融合からなることを特徴とする、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドと、そのＮ末端側の３０個未満のリジン残基を有するポリリジンからなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項５】
末端にシステイン残基をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項６】
化学的に結合したビオチニル基をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項７】
細胞及び／又はウイルス由来の少なくとも１つのタンパク質抗原を認識する能力をもつことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項８】
陰イオン巨大分子又は陽イオン巨大分子と生体外で反応できる能力を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項９】
陰イオン巨大分子が二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡであり、陽イオン巨大分子がヒストンである、請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ヘパリンまたは硫酸ヘパリンと生体外で反応できる能力を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
物質を細胞に移送することを目的とする組成物を調製するための請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１２】
物質を細胞に移送するために当該物質に結合された請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記結合が共有結合である、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記結合が共有マレイミド、スクシニミド、ペプチド、ジスルフィド、アミン、酸、ビオチン−ストレプトアビジン又はｐ−ベンゾキオノン型結合による、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記物質が核酸である、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記物質がタンパク質である、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記物質が薬物である、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記物質が抗原である、請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１０及び請求項１２〜１８のいずれか１項記載のポリペプチドを含む真核細胞。
【請求項２０】
物質を細胞に生体外で移送するための方法であって、
前記物質に請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドをカップリングさせ、そして
細胞を当該カップリングの生成物とインキュベーションする、
ことを含んでなる方法。
【請求項２１】
前記細胞を前記カップリング生成物と、グリセロールの存在下でインキュベーションする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
生理学的に受容可能なビヒクルと、前記物質が薬物の活性成分である請求項１２記載のポリペプチド、とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２３】
生理学的に受容可能なビヒクルと、前記物質が抗原である請求項１２記載のポリペプチド、とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
抗ウイルス剤として使用するための請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項２５】
抗ウイルス組成物の調製のための請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項２６】
抗ウイルス剤との組み合わせにおける、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
前記ウイルスがヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルスであることを特徴とする、請求項２５又は２６記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜１０及び請求項１２〜１８のいずれか１項記載のポリペプチド１又は複数の存在下で生体外でインキュベーションされた細胞を含む組成物。
【請求項２９】
細胞がヒト末梢血液単核細胞である、請求項２８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内でのヘプタン、タンパク質、ペプチド、核酸及びその他の分子の活発な移送に関する。本発明はさらに、細胞特に真核細胞内に効果的に浸透しそこで有利な物質のビヒクルとして作用する能力をもちかつ新しい抗ウイルス組成物を構成する可能性のある新しいポリペプチドに関する。本発明は、さまざまな分野、特に遺伝子療法及びワクチンの分野に応用可能であることから、きわめて大きな重要性を帯びたものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法はなおも多数パラメータにより条件づけされるものであり、これらのパラメータの中には、その利用に付随する遺伝的変性無くかつ移入された有効成分の生物学的活性の劣化無く、考慮対象の宿主の生体の細胞の細胞質内で予め規定された特異的物性を備えた有効成分を移送する能力をもつベクターの開発が含まれる。今日、ウイルス由来又は非ウイルス由来のベクターの開発のために払われてきた努力にもかかわらず、これらの条件の全てが満足のいく形で満たされてはいない。
【０００３】
又、バイオテクノロジーのあらゆる利用分野にとって、細胞内部で物質を効果的に運ぶことができるということも又同様に重要である。かくして in vitro 又は ex vitro での細胞内の物質移送は、タンパク質又はペプチドの産生のため、又は遺伝子の発現の調節のためさらには又前記細胞上での与えられた物質の物性の分析のために利用することができる。In vivo では、１つの細胞内での物質の移送は、さらに、動物における病理学研究のため又は同様に生体に対して与えられた化合物の効果を研究するためのモデルの作製に役立つことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、有効であると同様に、現在その利用が考慮されているウイルスベクタよりも高い安全性をもつ新しいタイプのベクターを利用可能にすることを目的としている。
【０００５】
特許出願第Ｗ０９７/ ０２８４０号においては、出願人は、生物学的に活性な物質の細胞質内かつ核内における移送のための免疫ベクターとしての、生きた細胞の内部に浸透できる抗体又はそのフラグメントＦ（ab')２及びＦab' の利用について記述した。これらのベクターは、高い効果を示すものの、その利用は或る種の利用分野において複雑さを呈する可能性がある。かくして、抗体又は抗体フラグメントＦ（ab')２の利用には、高い力価でしかも治療的利用と相容れる品質をもつこれらの分子の産生が関与してくる。さらに、抗体の複雑さ及びサイズをもつ分子の利用は、特に実施面でのその他の欠点ともなりうる。特許ＵＳ５, ６３５, ３８３号は、細胞内での核酸移送のための、ポリリシンベースのもう１つのタイプの複雑なベクターを例示している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細胞内での物質移送用としてと同時に抗ウイルス剤としても有利な物性を呈する新しいポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、特に抗体よりもはるかに単純な一次構造及び縮小されたサイズを有する。その上、それらの調製は容易であり、その潜在的利用分野はきわめて多様である。
【０００７】
より特定的に言うと、本発明は、完全抗体から細胞浸透活性をもつ制限された領域を識別することが可能であるということを発明人が発見した結果もたらされたものである。本発明はさらに、完全抗体、特にこれらの抗体の一本鎖から、細胞浸透活性を備えたペプチド又はポリペプチドを分離することが可能であるという発見からも導かれている。本発明は、抗体の一本鎖のフラグメントが細胞内に有効に浸透できるということを初めて実証したものである。本発明は同様に、かかるフラグメントが有利な形で、注目の物質を前記細胞内に移送する能力をさらに有し、好ましい形で抗ウイルス活性を呈することができるということを初めて実証するものでもある。
【０００８】
従って、本発明は、真核細胞、特に哺乳動物の細胞内での生物学的に活性な物質の移送に特に適した新しい分子を提供する。
【０００９】
従って本発明の第１の目的は、より特定的に言うと、固有又は反復ペプチドモチーフで構成されていること、及び細胞内への浸透、そして必要であれば注目の物質の細胞内に至る輸送を司るアミノ酸配列を含むこと、を特徴とするポリペプチドにある。
【００１０】
本発明は、この点において、固有又は反復ペプチドモチーフで構成されていること、１又は数種の異なる抗体フラグメントで構成されたアミノ酸配列を含んで成ること、及び細胞内に浸透する能力をもつこと、を特徴とするポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗体の構造の表示である。
【図２】浸透性モノクローナル抗体の重鎖の可変領域のペプチド配列である。ＣＤＲ領域が表わされている。”＿”は同一のアミノ酸を表わす。
【図３】細胞内の浸透性抗ＤＮＡ抗体のＶＨドメインのＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の配列。
【図４】本発明のポリペプチドの in vivoでのアジュバント効果をＥＬＩＳＡにより明らかにしている。
【図５】ＣＣＬ３９細胞内でのペプチドＣＤＲ２−３−Ｐ２１９のＤＮＡトランスフェクション活性。
【図６】異なるペプチド/ プラスミド比でのペプチドＫ１９−ｐ３による３Ｔ３細胞のポリフェクション。
【図７】複合体を用いた細胞のインキュベーション時間に応じてのペプチドＫ１９−Ｐ３による細胞３Ｔ３のポリフェクション。
【図８】グリセロールという促進剤の不在下（図８ａ）又は存在下（図８ｂ）での細胞３Ｔ３のポリフェクション。
【図９】グリセロールという促進剤の不在下（図９ａ）又は存在下（図９ｂ）での細胞ＣＣＬ３９のポリフェクション。
【図１０】異なる抗体調製物により処置されＨＩＶ１Ｌaiの感染を受けたヒト循環単核細胞（ＰＢＭＣ）培地内で産生されたＨＩＶ１の抗原ｐ２４の用量及び感染力価。独立した３回の実験の平均値。
【図１１Ａ】異なるポリペプチド又は抗体調製物により処置され、ＨＩＶ１，ＢＸ０８菌株の感染を受けたヒトＰＢＭＣの培地中で産生されたＨＩＶ１の抗原ｐ２４の用量及び感染力価。  １１Ａ及び１１Ｂ：独立した２セットの実験における１３日目の感染力価の測定（実験 III及びＶ）。
【図１１Ｂ】図１１Ａの説明のとおりである。
【図１１Ｃ】９日目に１０−２希釈物の接種を受けた培地の上清中の抗原ｐ２４の数量化（実験Ｖ）。
【図１２】５日目のウイルス力価の減少係数の測定による、ポリペプチドによるポリオウイルスの複製の阻害。  白抜き棒線：野生ポリオウイルス菌株  線影入り棒線：弱毒化ポリオウイルス菌株
【図１３】ポリペプチド  Ｋ１９−ｐＦ４．１（ＰＬ），ペプチドＰ３で処置した後又はいかなるペプチド（ＮＴ）でも処置していない（ＮＴ），ウイルス感染前（１３ａ，１３ｂ），ウイルス感染中（１３ｃ）又はウイルス感染後（１３ｄ）のＣＭＶのタンパク質合成の阻害を明らかにしている。顕示は、抗−ｐｐ１５０（後発性タンパク質について）、抗−ｐｐ６５（早発性タンパク質について）及び抗−ＩＥ（非常に早発性のタンパク質について）抗体を用いて実施される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
従って本発明の１つの態様に従うと、ポリペプチドは１つの抗体の異なる又は同じ単数又は複数のフラグメントを含んで成る。免疫グロブリンスーパーファミリーの分子である抗体は、その最も単純な形で、互いに会合された４つの鎖（例えばＩｇＧ），すなわち「ヘビー」又は「Ｈ」と呼ばれる２つの重鎖、及び「ライト」又は「Ｌ」と呼ばれる２つの軽鎖で構成されている（図１）。従ってこれら４つの鎖は、合成後に一緒に会合させられて、約１５０，０００Kd  の分子量の分子を形成する。抗体の抗原特異性は、重鎖の複数の領域及び軽鎖の複数の領域が関与する可変領域によって確保される（図１）。
【００１３】
ポリペプチドは同様に、ＩｇＭといったその他の代表的免疫グロブリンに由来する配列で構成され得る。
【００１４】
抗体の各重鎖は、約４５０のアミノ酸で構成され、定常ドメイン（Ｃ），可変ドメイン（Ｖ）及び接合ドメイン（Ｄ及びＪ）と呼称される異なるドメインを含む。可変ドメインの内部には、配列のアラインメントによって容易に位置を特定できるＣＤＲ（「相補的決定領域」）と呼ばれる特殊なモチーフが存在する（C. Janeway及び P.Travers １９９６，Immunobiology, Academic Press,「標準的抗体分子の構造」）。同様に、可変領域の配列の分析については、T.T. Wu 及び E.Kabat（J.Exp. Med.,１９７０，第１３２巻，ｐ２１１−２５０）を参照することができる。ＣＤＲモチーフはそれ自体、超可変領域を有している。
【００１５】
本出願は、抗体構造から、非常に有利な物性を有する単純な構造をもちサイズが制限された領域を得ることが可能であることを明らかにした結果もたらされたものである。かくして複雑（会合された４つの鎖）で大きいサイズ（１５０, ０００Kd）の分子から出発して、出願人は、細胞内に浸透しそこで注目の物質のビヒクルとして作用する能力をもつ、一本鎖のポリペプチドを構築することに成功した。本発明のポリペプチドの物性は、その配列が抗体の鎖のうち一つ鎖のみの１又は複数のフラグメントの配列に対応し、従って活性となるために重鎖及び軽鎖に由来する定常領域を必要としないことからなおさら注目すべきである。化学的合成によって得られる本発明に従ったポリペプチドは、同じ物性を有する。
【００１６】
ポリペプチドという語は、本発明の意味合いでは、例えばアミノ酸６０個未満といったように、アミノ酸３〜１００個の間のサイズを有するアミノ酸連鎖を含む分子のことを指す。さらに好ましくは、これは、３〜６０個、有利には３〜３０個のアミノ酸連鎖を含む分子である。特に好ましいポリペプチドは有利には、約１０個以上のアミノ酸を有する。本発明に従ったポリペプチドはさらに、例えば化学的又は酵素的ないくつかの構造的修飾を含むこともできる。かくして本発明に従ったポリペプチドは、化学又は酵素反応によりもう１つの物質とのカップリングを実現できるいくつかの官能基を有することができる。さらに本発明のポリペプチドは、それらをプロテアーゼに対しより耐性あるものにするか又は免疫系に対する可視性のさらに低いものにするべく、化学的に修飾することが可能である。本発明に従ったポリペプチドは、当業者にとって既知のあらゆる方法、特に化学的合成方法、例えばペプチドシンセサイザーを用いて、又はより大きなサイズの天然又は非天然のポリペプチドからの断片化又は欠失により、得ることができる。さらにこれらは、対応する核酸を真核又は原核細胞宿主の中で発現させることで、組換え型ＤＮＡの技術によって調製することができる。当然のことながら、これらは、これらの異なる方法の組合せの結果として得ることもできる。
【００１７】
この点で、本発明のポリペプチドは、合成コンビナトリアルライブラリーといったような核酸又はペプチドのライブラリーから産生することができる。
【００１８】
「固有ペプチドモチーフ」という語は、例えば抗体又はＦab又はＦ（ab')2タイプの抗体フラグメントとは異なり、本発明のポリペプチドが一本のアミノ酸鎖しか有していないことを意味する。「反復ペプチドモチーフ」という語は、本発明のポリペプチドが一本鎖を形成するように、場合によっては化学的方法により互いに組立てられている異なるペプチドブロックを含みうることを意味する。
【００１９】
「浸透する」又は「浸透性」という語は、本発明の意味合いでは、外部環境から細胞内環境内、特に細胞の細胞質内に移行する能力をもつポリペプチドを指す。この能力は、さまざまな形で決定されうるが、特に、培養中の細胞の存在下における研究対象のポリペプチドの最初のインキュベーション段階と、それに続くこれらの細胞の固定及び透過性付与の後の前記細胞の内部での前記ポリペプチドの存在の顕示を含む細胞浸透試験に従って決定され得る。この顕示は、前記ポリペプチドに対し導かれた標識付けされた抗体を用いたもう１回のインキュベーション及び、細胞質内又は核のすぐ近くさらには核内でのポリペプチドと標識付けされた抗体の間での抗原−抗体タイプの免疫反応の検出によって行なうことができる。この顕示は同様に、予め標識付けされた本発明のポリペプチド及び、これらの細胞区画内での前記標識付けの存在の検出を利用することによっても実施されうる。このような細胞浸透試験については例えば、出願Ｗ０９７/ ０２８４０号の中で記述されている。
【００２０】
前述の通り、本発明は、細胞浸透特性を備え有利な物質のためのビヒクルの役目をも果たし得る抗体の縮小された領域の存在が明らかにされた結果としてもたらされたものである。より特定的に言うと、発明人は、出願Ｗ０９７/ ０２８４０内で記述されたもののようないわゆる浸透性のあるいくつかの抗体の構造の中に、細胞浸透物性を備え全抗体の代わりにベクターとして利用され得る領域の存在を探究した。そのため、発明人はまず最初に、Ｊ２０．８，Ｆ４．１及びＦ１４．６と呼ばれる特殊な３つのモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の完全な配列を決定した。これらの抗体は、Ｉ−１６０５，Ｉ−１６０６及びＩ−１６０７という番号でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生される多反応性の抗ＤＮＡ抗体である（前述の特許出願を参照のこと）。これらの配列のアラインメント及びその比較的分析は、以下のような注目に値するデータを明らかにした：
−  これらの３つの抗体の領域ＣＤＲ２内のきわめて高い相同性（６５〜７０％）をもつ領域の存在、及び
−  これら３つの抗体内の、リシン及びアルギニン（塩基性アミノ酸）が豊富な領域ＣＤＲ３の存在。
【００２１】
これらの結果を見ると、輸送能力及び核の場所特定能力をもつペプチドの大部分がリシン及びアルギニンを豊富に含むことから、次に、出願人は、これらの抗体のさまざまな領域特に領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に対応するポリペプチド系列ならびに、これらの領域のうちのいくつかが互いに融合されているハイブリッド構成体（特に領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を連続的に支持する  ポリペプチド  ＣＤＲ２−３）を合成した。なおこれらのポリペプチドのＮ末端側には、ビオチン残基が導入され、こうしてそれらの検出が容易になっている。
【００２２】
これらのポリペプチドは次に、細胞内に浸透するその能力についてテストされた。得られた結果は、全く注目すべきことに、これらのポリペプチドのいくつかが細胞内に有効に浸透する能力を有するということを示している。特に、得られた結果は、領域ＣＤＲ３の全部又は一部を含むポリペプチド全体が、細胞内に浸透する能力を有することを示している。
【００２３】
従って、より好ましくは、本発明のポリペプチドは、抗体の重鎖の少なくとも１つのフラグメントを含む固有鎖で構成されている。さらに一層好ましくは、これらのポリペプチドは、抗体の重鎖の可変領域の少なくとも１つのフラグメントを含む。
【００２４】
より特定的な１実施形態に従うと、本発明は、抗体の領域ＣＤＲ３の全部又は一部分を含む上述のようなポリペプチドに関する。
【００２５】
なお、得られた結果は同様に、領部ＣＤＲ２の全部又は一部をさらに有するポリペプチドが同様に、細胞内に浸透する能力を有していたことをも示した。この点で、領域ＣＤＲ３の全部又は一部及び領域ＣＤＲ２の全部又は一部が中で組合わされているポリペプチドは、全く注目に値すべき細胞浸透能力を有する。
【００２６】
かくして、もう１つの特別な実施形態に従うと、本発明のポリペプチドは、抗体の領域ＣＤＲ２の全部又は一部を含む。
【００２７】
特に有利な１実施形態に従うと、本発明のポリペプチドはより好ましくは、領域ＣＤＲ３の全部又は一部及び領域ＣＤＲ２の全部又は一部を含んで成る。このタイプのポリペプチドは、生きた細胞の内部に大量に浸透する能力をもつことから、特に有利である。
【００２８】
本出願の中で利用している「全部又は一部」という表現は、より特定的には、本発明のポリペプチドが、当然細胞内に浸透する能力を有するものとして（機能的相同体）、１つの抗体の関係するＣＤＲ領域の全体か又はその一部分のみを有し得ることを意味する。ＣＤＲ領域の一部というのは、特に単数又は複数の末端アミノ酸特に１つ、２つ又は３つの末端アミノ酸を備えていないＣＤＲ領域で構成されていてよい。これは同様に、単数又は複数の内部残基がその他のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸（例えば塩基性アミノ酸）により置換されたか又は欠失させられた１つのＣＤＲ領域であってもよい。有利には、ＣＤＲ領域の内部残基の３０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１５％未満が修飾される。
【００２９】
従って、本発明の意味合いでの好ましいポリペプチドは、抗体のＣＤＲ３領域の全部又は一部を有するポリペプチドである。一例を挙げると、例えば、配列番号１，２，３，８の配列のＣＤＲ３領域又は図２及び図３上に表わされた配列、又は全ての機能的相同体を挙げることができる。
【００３０】
抗体フラグメントは、それだけで本発明のポリペプチドを構成することができる。これは、同様に、特にその単数又は複数の末端に対して残基を添加することによっても修飾されうる。特に、場合によっては、フラグメント特にＣＤＲ領域に対してより優れた空間配置を付与することになるアミノ酸を添加することが有利である可能性もある。さらに、ポリペプチドを安定化させ細胞膜とのその相互作用を増大させるべく、リシン及び/ 又はアルギニンタイプの基本的に塩基性の単数又は複数のアミノ酸を添加することが有利であり得る。その上、上述の通り、本発明のポリペプチドは、例えばＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域といったような抗体鎖の複数の領域を有することができる。これらの領域は特に互いに融合されていてもよいし、又は上述のようなアミノ酸で間隔どりされていてもよい。
【００３１】
本発明の意味合いでの特別なポリペプチドは、特に、複数の抗体の１つのＣＤＲ３領域を含むポリペプチド又は基本的に１つの抗体のＣＤＲ３領域と１つの抗体のＣＤＲ２領域の間の融合を含むポリペプチドである。このようなポリペプチドの例としては、特にポリペプチド  ＣＤＲ３及びポリペプチド  ＣＤＲ２−３があり、これらの配列は例中に示されている。
【００３２】
これらのポリペプチド，特にＣＤＲ３領域を含むポリペプチド，特にＣＤＲ領域及びＣＤＲ２領域を含むポリペプチドを用いて実施された実験は、明確に次のことを示している：
【００３３】
1)  ポリペプチドを含む完全培地（ウシ胎児血清１０％）を用いた細胞ＰｔＫ２，ＨｅＬａ又は３Ｔ３の一時間のインキュベーションは、全ての細胞の細胞質内及び関係する系統に応じて可変的な大部分の割合のこれらの細胞の核内に大量のポリペプチドが輸送されるのに充分なものである。
【００３４】
2)  ペルオキシダーゼにカップリングされたペプチド−ストレプトアビジン（ＰＭ≧１００, ０００）又はアルカリホスファターゼにカップリングされたペプチド−ストレプトアビジン（ＰＭ≧１８０, ０００）の予備成形された複合体を含む完全培地内で細胞を２時間インキュベートしたとき、培養の全ての細胞の細胞質のレベルにおいて、又これらの細胞の核の大部分の中でわずかに乃至は強く、対応する酵素が検出される。細胞がペルオキシダーゼにカップリングされたストレプトアビジンの存在下で、アルカリホスファターゼにカップリングされたストレプトアビジンの存在下で、又はその未変性形態のストレプトアビジン又は酵素を用いてインキュベートされた場合には、いかなる細胞内染色も観察されない。
【００３５】
特にＣＤＲ３及びＣＤＲ２−３タイプの本発明のポリペプチド，ならびにそのペプチド−ストレプトアビジン−酵素複合体は、大きな割合のヒト末梢細胞特に活性化Ｔリンパ球内で大量に輸送される。
【００３６】
一般に、本発明に従ったポリペプチドは、与えられた全ての抗体、特に与えられた全てのモノクローナル抗体から出発して、当業者にとって既知の異なる技術に従って構築され得る。
【００３７】
好ましくは、本発明のポリペプチドは化学的合成により得られるか又は単数又は複数の浸透性抗体、好ましくは浸透性モノクローナル抗体から構築される。細胞特にヒトリンパ球を播種性紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）患者に由来する血清を含む培地内で in vitro でインキュベートした時点でこれらの細胞及びヒトリンパ球の核の内部に浸透する能力を有する抗体の存在は、１９７８年 Alarcon Segovia et al. により最初に報告された (Nature, ２７１）。最近になって、このタイプの抗体は、狼瘡にかかったＭＲＬ Ipr/Ipr  マウスのみならず自己免疫性溶血症候群を呈するＮＺＢマウス、さらには正常なＢＡＬＢ/ Ｃマウスにおいても検出された。これらのマウスの脾臓から調製されたいくつかのモノクローナル抗体は、培養状態に維持された細胞の核内でin vitroで浸透する能力をもつことが判明した（Viahakos et al., J.Am. Soc. Nephrol,２（１９９２）１３４５；Eyal Raz et al., Eur. J. Immunol, ２３（１９９３）３８３）。その上、これらの抗体は、同様に、マウス体内に注入された時点で、複数のタイプの細胞内に浸透し、その核内に再び戻ることができるということが立証された（Okudaira et al., Arthritis and Rheumatism,( 関節炎とリウマチ），３０（１９８７）６６９）。
【００３８】
一般に、その浸透性を見極める目的で、あらゆる抗体を選定することが可能である。特に、この選定は、例えば、細胞特に、有利な物質を内部で運ぶことが考慮されている細胞の存在下で研究対象の抗体を最初にインキュベートする段階及びそれに続いてこれらの細胞の固定及び透過性付与の後、原形質膜内、細胞質内又は核のすぐ近くさらにはこの核の内部にこの抗体が存在するか否かを顕示する段階を含む細胞浸透試験によって実現可能である。この顕示は、テスト対象の抗体に対して向けられた標識付けされた第２の抗体を用いたインキュベーション、及びそれに続く、これら２つの抗体の間の抗原抗体タイプの免疫学的反応の検出によって実現できる。このような試験については、特許出願ＦＲ９５０８３１６号の中で詳細に記述されている。
【００３９】
さらに一層好ましくは、本発明のポリペプチドの構築のために利用される抗体フラグメントは、多反応性、特に浸透性でかつ多反応性の抗体のフラグメントである。多反応性抗体というのは、異なる複数の抗原を認識する能力をもつ抗体である。一般的には、かかる抗体は、１つのタイプの特定の抗原について特に高い親和性をもち、より低い親和力で単数又は複数のその他の抗原を認識することができる。抗体の多反応性は、例えば Sibille et al. (Eur. J.Immunol.１９９７．２７：１２２１−１２２８）によって記述された方法論といった従来のあらゆる免疫学的方法によって明らかにすることができる。
【００４０】
有利には、本発明のポリペプチドの構築において利用される多反応性抗体は、遊離した又はタンパク質と複合体形成された状態で核酸と反応することができる（抗ＤＮＡ抗体）。この物性はＥＬＩＳＡ技術又は、カラム又はＤＮＡが予め上に固定化された他の全ての支持体上に抗体を通過させることによって明らかにすることができる。かくして抗ＤＮＡ抗体は、支持体上に保持され、従来の技術に従って溶出及び分離され得る。一般に、本発明の枠内で利用される抗ＤＮＡ抗体は、約１×１０6 Ｍ〜２×１０7 ＭのＤＮＡに対する結合力を呈する。好ましくは、これらの抗体は、ゲノミックＤＮＡ，特にゲノミックＤＮＡを認識する。特定の一形態においては、利用される抗体は、ヒト造血細胞のゲノミックＤＮＡを認識する多反応性抗体である。より一層好ましくは、核酸と反応できしかもなかんづくＨＩＶレトロウイルスの Tatといったタンパク質、細胞表面の構成成分及び/ 又は細胞の細胞骨格の構成成分を認識する抗体である。
【００４１】
本発明のポリペプチドの構築のためには、このように保持された抗体はその後、以下のように利用される：
ａ）この抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域の配列がアクセス不可能である場合、これがまず最初に決定される。そのためには、例の中で示されているように、従来の配列決定技術を使用することができる。
ｂ）ＣＤＲ領域の位置を、その他の抗体鎖配列との核配列のアラインメント又はその他のあらゆる技術により特定する。
ｃ）この配列のフラグメントを調製するか又は、この配列に対応するポリペプチドを合成するか場合によっては組立てる。そのためには、当業者にとって既知のあらゆる従来の技術を利用することができる（ペプチド  シークエンサ、制限酵素、リガーゼの利用など）。
ｄ）かくして得られたフラグメントを、場合によってアミノ酸の添加、欠失又は置換により修飾させる。
ｅ）その後、かくして得られたポリペプチドの細胞内浸透能力をフルオロセイン又はベルオキシダーゼといった物質のビヒクルとして作用する能力と共に、上述の条件下でテストする。
【００４２】
場合によっては、本発明のポリペプチドの生成効率又は一般的物性を改善するような形で、段階ｃ），ｄ）及びｅ）又はｄ）及びｅ）を反復する。
【００４３】
その後の補足的段階ｆ）では、細胞内に浸透する能力をもつかくして得られたポリペプチドを次に、以下に規定するようなベクターを生成する目的で、与えられた１つの物質とのカップリング反応において利用する。
【００４４】
この方法に対する１つの代替案は、出発材料としての１又は複数の核酸又はペプチドのライブラリーの利用にある。かくして、１つの抗体の配列から出発するのではなくむしろ、例えばコンビナトリアル化学により、抗体のＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域の機能的相同体を提示するペプチドをコードするペプチド又は核酸ライブラリーを構築することが可能である。
【００４５】
その後、これらのライブラリーのペプチド或いは、ペプチドの組合せ又は核酸の組合せを上述の方法のｃ）〜ｅ）の段階に従って調製し、場合によって修飾しそれらの活性についてテストする。
【００４６】
好ましくは、以上に記述した段階ｃ）において、調製されたフラグメントは、１つの抗体のＣＤＲ３領域の全部又は一部を含んでいる。
【００４７】
段階ｄ）において、修飾は、例えば、単に技術上の理由（合成、異なる領域間のカップリングの容易さなど）又は構造的又は物理化学的な理由から、いくつかの補足的アミノ酸を導入することから成るものであってよい。「充てん」用アミノ酸である場合、有利には、構造面及び物理化学面で比較的中性のアミノ酸が利用される。上述のような構造上の理由の場合、残基の添加がポリペプチドの立体配座を改善し、かくしてその活性の効果を高めることができる。例えば、位置特定因子（ＦＬＮ）の配列を導入することにより、その核内移送の潜在能力を増大させることができる。なお、ポリペプチドの塩基性を増大させることが望ましい可能性もある。
【００４８】
この点で、特に核酸に対する本発明のポリペプチドの緊密化物性を改善させるため、リシン残基をＮ末端側に支持するポリペプチドが構築された。有利には、リシン残基の数は３０未満、より好ましくは１０〜２０個の間にある。
【００４９】
例中に紹介されている結果は、これらのポリペプチドの浸透特性及び有利な物質特に核酸を有効に運ぶそれらの能力を確認するものである。
【００５０】
行なわれる添加の如何に関わらず、例えば上述の手法に従って調製されたような本発明に従ったポリペプチドは、好ましくは、多くとも１００個のアミノ酸を有している。さらに一層好ましくは、このポリペプチドは３〜６０個、好ましくは３〜４０個のアミノ酸を含んでいる。
【００５１】
本発明のもう１つの目的は、in vitro, ex vivo 又は in vivo  での細胞内の物質の移送のための上述のようなポリペプチドの利用に関する。
【００５２】
本発明のもう１つの目的は、前記物質がカップリングされる上述のようなポリペプチドを含むことを特徴とする細胞内の物質の移送のためのベクターに関する。
【００５３】
本発明の１つの実施形態によると、ポリペプチドは、細胞内に浸透する能力をポリペプチドに付与しポリペプチドがそれに会合された生物学的に有利な物質例えば薬物、タンパク質又は核酸といったような数百〜数千ＫＤを有する巨大分子又はヘプタンのビビクルとして細胞内で作用することを可能にするようなアミノ酸配列を含んで成る。
【００５４】
アミノ酸配列及び会合した治療用として有利な物質は、例えば共有結合又は非共有結合を介してカップリンク又は結合され得る。
【００５５】
本発明に従ったポリペプチドは、有利には、生きた細胞の内部に浸透する能力をもつ巨大分子又はペプチドで構成され、より特定的には、特許出願Ｗ０９７/ ０２８４０内で記述されているような抗体のペプチド誘導体又は抗体フラグメントから、又は抗体の単数又は複数の超可変部分を含むその他のペプチド、或いは又例えば細胞内浸透基準に基づくペプチドライブラリーのスクリーニングによって得ることができる、抗体タイプの構造に直接関係していない合成分子から構成される。
【００５６】
従って、本発明に従った特定のポリペプチドは、固有又は反復ペプチドモチーフで構成され、細胞内に浸透し、そこに注目の物質を移送するのを司るアミノ酸配列を含んで成り、このアミノ酸配列は、細胞内浸透についてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。かかるライブラリーのスクリーニング条件については、以上で記述した。
【００５７】
本発明に従ったもう１つの特定のポリペプチドは、固有又は反復ペプチドモチーフで構成され、細胞内に浸透し、そこに注目の物質を移送するのを司るアミノ酸配列を含んで成り、この配列は、単数又は複数の抗体超可変部分を含むペプチドで構成されている。
【００５８】
カップリンクされる物質は、特に生物学的、薬学的又は農産物加工上有利なあらゆる製剤であり得る。これは、特に例えばリボ核酸又はデオキシリボ核酸といった核酸であってよい。この核酸はさらに、多様な由来のものであってよく、特に、ヒト、ウイルス、動物、真核又は原核生物、植物、合成のものであり得る。なおこの核酸は、単純なオリゴヌクレオチドからゲノム又はゲノムフラグメントに至る可変的サイズを有することができる。特にこれは、ウイルスゲノム又はプラスミドでありうる。物質は同様に、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパク、成長因子などといったようなタンパク質であってもよい。抗原により１つの特定のタイプの物質が表わされる。以下で記すように、本発明のポリペプチドは、実際、有利な形で、アジュバンドの役目を果たし、１つの抗原に対して向けられた免疫応答を刺激することを可能にする。
より一般的には、物質は、それが化学的、生化学的又は合成のいずれの製剤であろうと、薬剤のあらゆる有効成分であってよい。
【００５９】
従って、細胞内でのその移送を可能にするため、前記物質は、本発明のポリペプチドにカップリングされる。
【００６０】
「カップリングされる」という語は、本発明の意味合いでは、物質とポリペプチドの間の物理的会合を可能にするあらゆるタイプの相互作用を意味する。しかしながら、この相互作用は、ベクターが細胞浸透の前に解離しないように充分安定していることが好ましい。このような理由で、本発明の意味合いで好ましいカップリングは、共有結合である。
【００６１】
共有結合は、当業者にとって既知の異なる技術により実現されうる。特にこれは、マレイミド、スクシニミド、ペプチド、ジスルフィド及びチオエーテルタイプの結合により行なうことができる。Greg. T. HERMANSONの「Bioconjugate Techniques 」(Academic Press,１９９６）という著書を参照することができる。
【００６２】
特定の１方法は、例えば本発明のポリペプチドの１末端に、二硫化物、チオエーテル、アミン又は酸結合のために容易に利用できるシステイン残基を添加することから成る。もう１つのアプローチは、その後ストレプトアビジンに結合された全ての物質をカップリングすることを可能にするビオチニル基を化学的にカップリングすることから成る。カップリングはさらにｐ−ベンゾキノンを介して行なうこともできる。（例えばＦＲ第７５３７３９２号、及び米国特許第４９２５９２１号）
【００６３】
一般に、文献中で知られている化学的、生化学的、酵素的又は遺伝的な全てのカップリング方法を利用することができる。
【００６４】
なお、本発明に従ったベクターは、同一又は異なる複数の物質がカップリングされている上述のとおりのポリペプチドを有することができる。
【００６５】
以下に提示されている例は、本発明のポリペプチドが細胞内に浸透する能力のみならずそこで有利な物質のビヒクルとして作用する能力も有していることを明確な形で立証している。これらの例は特に、酵素タイプのタンパク質の輸送を示す。当然のことながら、酵素は、同じ条件下で酸、核、ペプチド、薬物といったようなその他全ての有利な分子によって置換され得る。
【００６６】
この点に関して、これらの例は同様に、細胞内で核酸を移送する本発明のペプチドの能力をも示している。この特定の利用分野については、ペプチドと核酸の間のカップリングは一般に、イオン相互作用、静電相互作用又はファン・デル・ワールス相互作用に基づく非共有結合である。より特定的には、細胞内の核酸移送のための利用については、本発明のペプチドは有利にも、負に荷電された核酸と１つの複合体（ポリプレックス）を形成することを可能にする例えばリシンタイプの塩基性アミノ酸で構成された１つの領域を含む。かくして、本発明の特定の１実施形態は、細胞内での核酸（すなわちプラスミド、コスミド、線状フラグメント，遺伝子、抗原、アンチセンス、オリゴヌクレオチドなど）の移送を目的とする、ポリリシン領域を支持する上述のとおりのペプチドの利用にある。従って、本発明の特定の目的には、細胞内で浸透する能力をもち、ポリリシン領域及び浸透性の多反応性抗体から誘導された領域を含むペプチドが含まれている。より特定的に言うと、ポリリシン領域は、有利にもその他の残基によって中断されていない５〜３０個好ましくは５〜２０個のリシン残基を含んで成る。浸透性抗体から誘導された領域に関して言うと、これは、上述のように定義づけすることができる。かかるポリペプチドは有利には、以上で説明したように、１００個未満の残基を含んで成る。
【００６７】
一方で、本発明に従ったポリペプチドは細胞内部でタンパク質を大量に移送することを可能にすることから、出願人は、抗原にアジュバンド効果を付与しこれらの抗原に対する免疫応答を増大させる抗原の細胞内輸送用作用物質として、これらを利用する可能性について検討するに至った。かくして、マウスに対し、単独又は本発明のポリペプチドと複合体作成されたストレプトアビジン−べルオキシダーゼ接合体が数回注射された。得られた結果は、本発明のポリペプチドの利用により、抗ストレプトアビジン及び抗ペルオキシダーゼ抗体の力価を平均して４〜８倍増大させることができるということを示している。
【００６８】
本発明は同様に、in vitro, ex vivo 又は in vivoで細胞内に物質を移送するための方法において、
−  前述の通りのポリペプチド及び前記物質の間のカップリング、及び
−  前記カップリングの産物と細胞の接触、
を含む方法にも関する。
【００６９】
In vitro又は ex vivoでの利用については、該接触段階は、カップリング産物（ベクター）を用いた細胞の単なるインキュベーションによって実施することができる。In vivo での利用については、接触は一般に、考慮対象の生体内でのカップリング産物（ベクター）の投与によって実施される。前述のとおり、カップリングが共有結合である場合、ベクターは、単数又は複数の有利な分子を有することができる。なお、非共有結合タイプのカップリング、例えば核酸については、ベクターは一般に、それらの複合体形成を可能にする培地内でのペプチドと核酸のインキュベーションにより形成される。パートナのそれぞれの量は、ペプチドの性質（長さ及び電荷）、核酸及び細胞タイプに応じて、当業者によって容易に適合可能である。一例を挙げると、カップリングは、核酸１μｇにつき０. ０１〜１００n moles 好ましくは０. ０１〜１０n moles/μg まで変動するペプチド濃度で実施可能である。なお、本発明の方法においては、グリセロールといった安定剤又は促進剤をさらに利用することも有利でありうる。かくして、例中で提示されている結果は、グリセロールの存在下で、核酸のトランスフェクションの効果が４０倍近く改善されうる、ということを示している。かくして、本発明の方法の１つの特定の実施形態には、特にグリセロールといった安定剤の存在下でのカップリング産物と細胞の接触段階が含まれる。有利には、トラスンフェクションは、例えば０. １〜２Ｍまで変動する濃度でグリセロールの存在下で in vitro 又は ex vivoで実施される。当然のことながら、これらの濃度は、当業者によって適合化されうる。
【００７０】
なお本発明のもう１つの目的は、以上で定義づけしたようなポリペプチド又はベクターを含有する、特に真核細胞といった細胞にある。この細胞は有利には、哺乳動物の細胞、特に動物又はヒトの細胞である。特に、始原細胞又は株細胞又はリンパ球（Ｔ，Ｂ）といった造血系統の細胞でもありうる。同様にこれは、例えばマクロファージ又は樹状細胞といった抗原提示細胞であってもよい。
【００７１】
一方、発明人は同様に、本発明のポリペプチド及び多反応性抗原が固有の生物学的特性を備えていることも示した。本発明は特に、これらのポリペプチド（ペプチド誘導体）又は抗体が、その活性物質のベクター化能力とは全く異なる生物学的効果を誘発する能力をもつことを示している。予期せぬことに、本発明は特に、これらの抗体及びペプチド誘導体がそれ自体、異なる細胞個体群及び異なるタイプのウイルスに対し抗ウイルス活性を及ぼす能力をもつことを示している。
【００７２】
従って、本発明は同様に、細胞内でのウイルスの感染及び/ 又はその複製を阻害するための新しいアプローチにも関する。本発明は、特に細胞内のウイルス感染及び/ 又は複製の阻害のための、抗ウイルス剤としての特定の抗体又は抗体フラグメントの利用にも特に関するものである。本発明は同様に、細胞をウイルス感染及び/ 又はその複製に対し、より耐性あるものにするための新しい細胞処置方法についても記述している。本発明は同様に、ウイルス感染及び/ 又はその複製に対する感受性がより低い抗体又はポリペプチドにより処置された細胞個体群にも関する。この特性は、ウイルスの感染及び発達、特にヒト後天性免疫不全症ウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルスなどの感染及び/ 又は複製を減少させるため、場合によって他の作用物質と組合わせた形で、in vitro，ex vivo 又は in vivoで使用可能である。
【００７３】
従って、本発明のもう１つの目的は、前述のような単数又は複数のポリペプチドの、抗ウイルス組成物調製のための利用に関する。本発明は、より特定的には、抗ウイルス組成物調製を目的とする、単数又は複数の抗体又は抗体フラグメントの利用において、前記抗体又は抗体フラグメントが多反応性であり、核酸そして好ましくはＤＮＡに結合される可能性があることを特徴とする利用に関する。
【００７４】
より特定的には、本発明の意味合いでの抗ウイルス組成物は、ウイルスによる標的細胞の感染及び/ 又は標的細胞内でのウイルスの複製を阻害する能力をもつ組成物から成る。
【００７５】
上述の通り、本発明のこの態様は、上述したポリペプチドそしてより一般的には多反応性をもつすなわち複数の抗原を認識できる、ＤＮＡ結合能力をより特定的に示すいくつかの抗体の予想外の生物学的特性が明らかにされたことに由来するものである。
【００７６】
従って、本発明のより特定的な目的は、多反応性の抗体又は抗体フラグメント或いは抗ＤＮＡで浸透性の誘導ポリペプチドの、抗ウイルス剤としての利用に関する。
【００７７】
上述のように、利用される多反応性の抗体又は抗体フラグメントは好ましくは、細胞及び/ 又はウイルス由来の少なくとも１つのタンパク質抗原を認識する能力をもつ。より特定的に言うと、これらの抗体又は抗体フラグメントは、ＤＮＡに加えて、ウイルス外被タンパク質抗原といったような少なくとも１つのウイルス抗原を認識する。本発明の特定の一実施形態は、ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のタンパク質又はペプチドを結合させる能力をもつ多反応性抗体又は抗体フラグメントの利用を含んで成る。この特性は、従来のあらゆる免疫学技法によりテストすることができる。かくして、適切なあらゆる支持体（プレート、カラム、球など）の上に、ＨＩＶのタンパク質又はペプチドを固定化しこの支持体を抗体と共にインキュベートすることが可能である。その後抗原−抗体複合体の形成を、従来のあらゆる技術（免疫螢光、酵素反応など）により検出することができる。一般に、本発明の枠内で利用される抗ＤＮＡ抗体は、約１０6 〜１０7 ＭのＨＩＶのタンパク質又はペプチドに対する結合力を示す。
【００７８】
好ましくは、利用される抗体は、ＨＩＶのタンパク質Ｔat及び/ 又は rev, さらに一層好ましくはタンパク質Ｔat又はこのタンパク質のペプチドを結合させる能力を示す。特定のペプチドとしては、ＨＩＶのタンパク質Ｔatの残基２２−３７及び４６−６０を含むペプチドを挙げることができる。
【００７９】
この抗ウイルスの利用分野においては、利用される抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。ポリクローナル抗体は、採血及び（例えばセファロースタイプの支持体上にカップリングされたタンパク質Ａといった）免疫吸着剤の存在下での抗体の分離によって、対象者（免疫化された又はされていない、健康な又は病的状態である者）の血清から直接分離できる。本発明において利用可能なポリクローナル抗体は、特に、げっ歯類特にマウスといった健康な又は病的状態にある動物の血清から得ることができる。これは、より特定的には、さまざまな抗体を認識する高い比率の天然抗体を提示する、自己免疫性狼瘡マウスであってよい。ポリクローナル抗体は同様に、ヒト血清から、すなわち例えば、同じく高い天然多反応性抗体比率を提示するものとして知られている播種性紅斑性狼瘡を患う患者から得ることもできる。モノクローナル抗体の場合、これらは、免疫化された又はされていない健康な又は病的状態にある動物の脾細胞の採取、骨髄腫細胞との融合、その後のクローン希釈及び抗体産生ハイブリドーマの選択により、従来の免疫学的技術に従って調製することができる。これらの技術については、特に、S.L. Morriso  及び V.T. Oi, 免疫学における進歩（１９８９）４４：６５−９２；J. G. R. Hurrell, モノクローナルハイブリドーマ抗生物質：その技術と応用、CRC Press １９８２内といったように、文献中で充分に考証されている。これらの技術は同様に、例中でも説明されている。モノクローナル多反応性抗体は同様に人工的に合成するか又は動物のモノクローナルからヒト化することもできる。
【００８０】
利用される抗体は、異なるタイプの免疫グロブリン、特にＩｇＧ又はＩｇＭであってよい。ただし、必要な特性を提示するかぎりにおいて、その他のタイプの抗体も同様に使用可能である（ＩｇＥ，ＩｇＡ etc.)。
【００８１】
一方、上述の通り、無傷の抗体ではなく、本発明に従ったあらゆるポリペプチドならびに必要な特性を保つこれらの抗体のあらゆるフラグメントを利用することも同様に可能である。これらのフラグメントは例えばフラグメント（Ｆab')２，（Ｆab')又はＳｃＦｖでありうる。これらのフラグメントは、抗体の酵素消化の結果として得ることもできるし、組換え又は合成により得ることもできる。かかるフラグメントの調製（例えば酵素処理による）については、文献中で充分に考証されており、従って当業者であれば抗体調製物から単純な定型作業により実現できる。
【００８２】
上述のように、本発明のこの態様は、部分的には、かかるポリペプチド，抗体及びフラグメントの抗ウイルス特性、特に標的細胞内でのウイルスの複製又はウイルスによる標的細胞の感染を阻害するその能力が明らかにされたことの結果としてもたらされるものである。「感染」という語は、標的細胞内へのウイルス又はウイルスゲノムの進入を意味し、「複製」という語は、基本的に前記標的細胞中のウイルスゲノムの複製を意味する。
【００８３】
本発明は、異なるウイルス、より特定的にはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）又はＤＮＡウイルスのサイクルを阻害するために使用することができる。さらに、これは、ヒト又は異なる動物、特に哺乳動物（イヌ、ネコ、ウサギ、ウシなど）に対する向性を有するウイルスであってもよい。より好ましくは、本発明は、ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ），ポリオウイルス、ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）といったウイルスの阻害を可能にする。
【００８４】
本発明の特定の一実施形態には、（ＨＩＶ）による標的細胞の感染及び/ 又は標的細胞内のＨＩＶの複製を阻害することを目的とする組成物の調製のための、単数又は複数の多反応性抗体又はこのような抗体のフラグメントの利用において、前記抗体又は抗体フラグメントがＤＮＡを結合させる能力を呈することを特徴とする利用が含まれる。本発明はより特定的には、ＨＩＶの異なる菌株、特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の感染及び/ 又は複製を阻害するために利用することができる。
【００８５】
本発明は、より特定的には、ウイルス感染及び/ 又はその複製を阻害することを目的とする組成物の調製のための、前述のような単数又は複数のポリペプチドの利用に関する。
【００８６】
本発明の意味合いでは、標的細胞というのは、好ましくはウイルスの複製を可能にすることのできる、ウイルスによる感染を受ける可能性を天然に有するあらゆる細胞のことである。かくして、ＨＩＶについては、それは、より特定的には免疫系の細胞、特にリンパ細胞である。ＨＩＶにより特異的な標的細胞としては、Ｔリンパ球、特に補助的Ｔリンパ球（ＣＤ４＋）を挙げることができる。本発明の意味合いでのＨＩＶのその他の標的細胞は、より一般的には、例えば、特にヒトの末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）により構成されている。ポリオウイルスに関しては、標的細胞の例として、上皮細胞を挙げることができる。一般には、本発明は、利用される抗体のあらゆるタイプの標的細胞内のウイルスの発達と干渉するように使用することができる。
【００８７】
有利には、本発明に従ったポリペプチドは、ＤＮＡと又はその他の陰イオン又は陽イオン巨大分子特にヘパリン及び硫酸ヘパリンと反応する能力をもちしかも正常な又は異なる疾患特に播種性紅斑性狼瘡を患う患者に由来するリンパ球から得られた組換え型フラグメント sc Ｆv から誘導される。
【００８８】
本発明に従った化合物の単数又は複数の作用メカニズムは、なおも今後明確にされなくてはならない。この点で、特にヘルペスウイルス、特に例えばヒトヘルペスウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）についての最近得られた一連の結果は、本発明のペプチドが、宿主細胞内へのその浸透のためウイルス自体が利用する細胞レセプタの上に固定されるということを示していると思われる。これらのレセプタ上へのペプチドの固定の後には、ペプチド−レセプタ複合体の内在化が続き、これはウイルスの固定のために利用可能な残りの細胞レセプタの数の減少という形で現われることになる。この減少は、時としてＣＭＶの場合のようにきわめて大規模なものであると思われる。しかしながら、特に核レベルではその他のメカニズムもこれらの抗体及び誘導体の予想外の特性に関与している可能性がある。
【００８９】
有利には、ポリペプチドの抗ウイルス活性は、本発明の意味合いにおいて、複製又は感染の著しい減少として理解される。有利には、本発明のポリペプチド又は抗体により生成される阻害は、処理がない場合の同じ細胞又は細胞個体群における感染及び/ 又は複製レベルとの関係において、少なくとも３分の２の減少に対応する。より好ましくは、阻害は、少なくとも4 分の１の減少に対応する。この阻害は、例えば、ウイルス溶菌斑、細胞中に存在するウイルス抗原レベル、細胞生存度の測定などによって数量化されうる。特定の一実施形態においては、阻害の効果は、例えば、ＨＩＶについての抗原ｐ２４及び/ ｇｐ１２０といったウイルス抗原のレベルを測定することによって評価される。
【００９０】
特定の１実施形態に従うと、本発明は、標的細胞内でのウイルスの複製の２倍以上の阻害を誘発するための抗体又はポリペプチドの利用に関する。
【００９１】
第１の実施形態においては、本発明には、上述のような唯一のタイプのポリペプチド又は抗体又は抗体フラグメントの利用が含まれる。例中に示されているように、実際には、唯一の化合物を利用することにより、標的細胞中のＨＩＶ−１の複製を１０倍以上特に１００倍のの阻害を行うことが可能である。唯一の化合物の利用は、同様に、標的細胞内でのＩ型ポリオウイルスの複製の２倍以上の阻害をも可能にする。
【００９２】
一方、本発明に従ったいくつかの抗体及びペプチドの顕著な抗ヘルペス作用が観察された。Acyclovir が効果をもたないＨＳＶ−１チミジン−キナーゼ”（ＴＫ”）に対しても、この作用が及ぼされるという点も指摘しておくと有利である。
【００９３】
なお、特にポリペプチドＫ１９−ｐＦ４. １では、強い抗ＣＭＶ作用も同様に観察された。一連の実験においては、かくしてＫ１９−ｐＦ４. １がＣＭＶによる細胞の感染をほぼ１００％阻害することが示された。早発性抗原の合成でさえ完全に阻害されるということも指摘しておきたい（免疫螢光法及び放射線標識付けとそれに続く免疫沈降法の両方による検出）。
もう１つの実施形態においては、本発明は、上述のような複数のポリペプチド，抗体及び/ 又は抗体フラグメントの利用を含む。例中で示されるように、これらの化合物のいくつかを組合わせることにより、標的細胞におけるウイルス複製の相乗的阻害効果を及ぼすことが可能となる。かくして、予期せぬことに、いくつかの抗体は単独では中庸な阻害活性をもつものの、組合せた形では、標的細胞内でのＨＩＶ−１の複製の１０倍以上、特に１００倍の阻害を誘発する。
【００９４】
もう１つの実施形態においては、本発明は同様に、単数又は複数の抗ウイルス剤との組合せでの上述のような単数又は複数のポリペプチド、抗体及び/ 又は抗体フラグメントの利用をも含んでいる。かかる抗ウイルス剤は例えば、ＡＺＴ，ＤＤＩ，抗タンパク分解酵素である。この点において、本出願は同様に、同時に又は分割して、或いは時間的に間隔を置いて利用することを目的とする、
−  上述のような単数又は複数のポリペプチド，抗体及び/ 又は抗体フラグメント及び
−  抗ウイルス剤
を含む製剤にも関する。
【００９５】
本発明は、in vitro, ex vivo 又は in vivoでのウイルスの感染及び/ 又は複製を阻害するためにも利用することができる。
【００９６】
In vitro又は ex vivoでの利用のためには、標的細胞又は標的細胞を含む細胞組成物は一般に、上述のような化合物の存在下でインキュベートされる。利用されるポリペプチド，抗体又は抗体フラグメントの用量は一般に、約１０6 個の細胞について１〜５００μｇの間、好ましくは約１０6 個の細胞について１〜１００μｇである。これらの用量は当然のことながら、当業者が問題無く適合できるものである。インキュベーションは、細胞の培養に適したあらゆる培地内で、通常の温度条件（例えば大気温と約３７℃の間）で行なわれる。利用される培地は、例えばＲＰＭＩ，ＤＭＥＭ，ＭＥＭ培地などといった当業者にとって既知の全ての哺乳動物細胞培地である。インキュベーションは、好ましくは滅菌状態の皿、フラスコ、アンプル、袋、小びん、注射器などといった適切なあらゆる装置において実施され得る。有利には、インキュベーションは一定期間中、追求される用途及び目的に応じて、約１時間〜約５日の期間中実施される。例えば、約１時間〜１２時間の間に含まれる期間中細胞をインキュベートすることも考慮可能である。その後、このようにインキュベートされた細胞を被験体（自己由来）に投与することができ、この被験体は同様に、抗体又は抗体フラグメントの単数回又は複数回の投与を受けることもできる。
【００９７】
In vivo での利用のためには、化合物を、全身、筋肉又は皮下などといったような異なる経路で投与することができる。好ましい経路は、全身経路（特に静脈内）及び皮下経路である。利用される用量は同様に、被験体の段階、追求する目的及び投与の回数及び/ 又は頻度に応じて、当業者により適合されうる。
【００９８】
好ましくは、本発明は、ex vivo での標的細胞内のウイルスの複製又は感染を阻害するために利用される。このため、標的細胞を被験体（例えばＰＢＭＣ）の体内で採取し、上述のような化合物を用いてこれを ex vivoでインキュベートさせ（例えば、無菌包の中で３７℃で１〜６時間），その後被験者に再度投与する。被験者は同様に、場合によっては単数又は複数のその他の抗ウイルス剤と組合わせた形で、化合物の単数回又は複数回の投与を受けることもできる。以上で記述したような化合物又は組成物は、予防的利用、つまり健康であるか又はＨＩＶ感染しているものの発症していない被験体におけるウイルスの感染又は複製を阻害するために、特に適合されたものである。本発明は同様に、前述したように、単独又はその他の抗ウイルス剤と組合せた状態で維持用処置としても利用可能である。
【００９９】
この点において、本発明は同様に、前述のようなポリペプチド，抗体又は抗体フラグメントの組合せ利用を含む抗ウイルス剤の効果を改善することを可能にする方法にも関する。
【０１００】
本発明は同様に、前述のような単数又は複数のポリペプチド，抗体又は抗体フラグメントと細胞の接触段階を含んで成る、ウイルスによる細胞の感染及び/ 又はウイルス内のウイルスの複製を減少させる目的をもつ（すなわち、この細胞のウイルス耐性を改善させるための）細胞の修飾方法にも関する。本発明は、同様に、上述のようなポリペプチド，抗体又は抗体フラグメントの存在下でインキュベートされたあらゆる細胞個体群にも関する。かかる個体群は、より特定的には、場合によって無菌装置内で条件づけされたＰＢＭＣ細胞、又は免疫系のその他の細胞であってよい。好ましくは、かかる細胞組成物は一般に１０5 〜１０8 個の細胞を含む。これらの細胞組成物は、ウイルスサイクルの研究、阻害物質化合物又は阻害物質化合物の会合の研究のため、或いは場合によって、投与後の in vivoのウイルス感染の危険性及び効果を減少させるために利用することができる。
【０１０１】
本発明は、同様に、生理学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、物質が薬剤の有効成分である上述のようなベクターを含む薬学的組成物にも関する。
【０１０２】
本発明はさらに、生理学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、物質が抗原である上述のようなベクタを含んで成るワクチンにも関する。
【０１０３】
本発明について、制限的な意味の無い一例としてみなすべき、以下の例を用いて、さらに詳細に記述する。
【０１０４】
材料と方法
マウス及び細胞系統：
ＢＡＬＢ/ Ｃマウス（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１は、パスツール研究所の実験動物飼育場において維持された。異なる品種及び異なる組織の以下の細胞が利用される：ＰｔＫ２細胞（腎臓線維芽細胞）、ＧＭＡ−３２細胞（ハムスタの肺）、３Ｔ３細胞（マウス胎芽の線維芽細胞）、ＣＣＬ３９細胞（ハムスタ線維芽細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト頸ガン）、ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓）、ＨＥｐ−２細胞（ヒト喉頭ガン）、ＪＵＲＫＡＴ細胞及びＣＥＭ細胞（ヒトＴリンパ芽球）。なおこれらは全て、ＡＴＣＣコレクソンから入手可能である。これら異なるタイプの細胞を、不活性化させＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び可欠アミノ酸ならびに抗生物質（完全培地）を補足したウシ胎児血清１０％を含むＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ培地内、３７℃で、ＣＯ２  ５％に加湿された雰囲気内で培養した。
【０１０５】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体Ｊ２０. ８，Ｆ４. １  及び  Ｆ１４. ６の調製及び分離については、特許出願ＦＲ９５０８３１６号の中で記述されている。これらの抗体は、抗ＤＮＡ多反応性でかつ特にタンパク質Ｔat  のペプチド２２−３７及び４６−６０といった異なる抗原をも認識する抗体である。これらの抗体は、マウスＩｇＧ２ａである。利用される抗ＴＡＴ抗体は、ＨＩＶ−１のタンパク質ＴＡＴを認識する単反応性のマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ１である。
【０１０６】
これらの抗体は、セファロースプロテインＡカラム上で精製された（Ey et al., Immunochemistry１５（１９７８）４２９）。これらの精製された抗体の、一方では２本鎖ＤＮＡ，他方ではその他の抗原に対する多反応性は、文献中に記述された方法論（Guilbert et al., J. Immunol,１２８（１９８２）２７７９）を利用して、ＥＬＩＳＡによりテストされた。
【０１０７】
ペプチド合成
ペプチド合成は、当業者にとって既知の技術に従って実施された。かくして、ペプチドは、Fmoc樹脂上で固相合成により産生される。分割は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により実施され、ペプチドは、ＨＰＬＣ−ＲＰＣ５半調製カラム（Eurosil Bioselect ５μ，３００Ａ（１. ６×２５cm））上で精製され、ＴＦＡ０. １％溶液及びアセトニトリル勾配（１０−７０％）で１. １ｍｌ/ 分で溶離された。凍結乾燥されたペプチドは、Ｎａｃｌ  ０. １５ｍＭ中に溶解させられ、０. ２２μｍのフィルタ上で殺菌された。ペプチド濃度を決定するため、フェノール２％−６Ｎ  ＨＣｌの存在下で１１０℃でアリコートが加水分解され、その後、アミノ酸分析装置 Beckman６３００上で分析された。
【０１０８】
ウイルス菌株
以下に記述されている実験は、次のウイルス菌株を利用して実施された：ＨＩＶ−１，ＢＸ０８菌株（亜型Ｂの一次隔離集団）；ＨＩＶ−１ Lai菌株：１型ポリオウイルス（野生菌株ＰＶ１ Mahoney  及び弱毒化菌株ＰＶ１ Sabin）：サイトメガロウイルス，Ａｄ１６９菌株及び１型単純ヘルペスウイルス。
【０１０９】
例
１．モノクローナル抗体の配列決定
モノクローナル抗体  Ｊ２０. ８，Ｆ４. １及びＦ１４. ６の領域ＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列を決定した。このためには、チオシアン酸グアニジン技術を利用することによってハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し（Schwartz et al., Biol. Cell.７３（１９９１）７），次にホルムアルデヒド/ アガロースゲル上での電気泳動により分離させた。かくして得られた伝令ＲＮＡを次に、逆転写酵素キット（Life Technologies, E ragny, France) を利用して相補的ＤＮＡへと形質転換し、メーカーの推奨事項に従って、ＤＮＡポリメラーゼ Taq(Boehringer, Mannheim,  フラグメント）を利用して増幅反応（ＰＣＲ）におけるプライマとしてこれを利用した。相補的ＤＮＡを生成するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマは、以下の通りである：
−  一方では、免疫グロブリンＩｇＧ２ａの保存された配列に対応するプライマ：
５' −ＧＴＴＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＴ( 配列番号１１) 
−  他方では、ＶＨ領域のための４つのプライマ：
５' −ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ( 配列番号１２) 
５' −ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧＧ( 配列番号１３) 
５' −ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧ( 配列番号１４) 
５' −ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣ( 配列番号１５) 
【０１１０】
その後、ＰＣＲによる増幅産物を、Geneclean キット（Bio １０１，Vista, CA)を利用して精製した。Genome express (Grenoble, FRANCE) により化学的配列決定を実施した。ヌクレオチド配列は、配列分析ソフトウェア（ＧＣＧ（Devereux J.,  ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ，１９８９）を利用してパスツール研究所（科学情報処理単位）に保存されたデータバンクＧＥＮＢＡＮＫ及びＥＭＢＬを利用して分析し、対応するアミノ酸配列を演繹した。
【０１１１】
これらの抗体のＶＨ領域の配列は、図２に表わされている。これらの配列のアラインメントにより、これらの配列中に存在するＣＤＲ領域（ＣＤＲ１，ＤＣＲ２及びＣＤＲ３）の位置を特定することができる。このアラインメントはさらに、領域ＣＤＲ２間の重大な構造的相同性及び領域ＣＤＲ３間の共通の構造的特徴、特に塩基性残基の存在（アルギニン及びリシン）を明らかにすることができる。その他の抗体のＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の配列は、図３に示されている。
【０１１２】
２．浸透性ポリペプチドの構築
図１に示されている配列から、抗体のＣＤＲ３領域及び/ 又はＣＤＲ２領域の全部又は一部を有する異なるポリペプチドを調製した。合成はペプチドシンセサイザにより実施した（材料及び方法を参照）。以下のポリペプチドを合成したが、ここでｍの値は１又は０である：
【０１１３】
ＣＤＲ３：
配列番号１
（Ｔｈｒ）ｍ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｇｌｎ）ｍ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（Ｍ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ）ｍ
この配列の１変形形態は、例えば配列ＴＲＱＫＹＮＫＲＡ（ＭＤＹＷＧＱＧＴ）ｍである。もう１つの変形形態（機能的相同体）は例えば配列  Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）である。
【０１１４】
配列番号２：
（Ｔｈｒ）ｍ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｇｌｎ）ｍ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−（Ｍ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ）ｍ
この配列の一変形形態は例えば、配列ＴＲＱＫＹＮＫＫＲＧ（ＭＤＹＷＧＱＧＴ）ｍである。
【０１１５】
配列番号３：
（Ｔｈｒ）ｍ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｇｌｎ）ｍ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−（Ｆ−Ａ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ）ｍ
【０１１６】
この配列の一変形形態は例えば、配列ＴＲＧＡＲＡＴＷＤＷ（ＦＡＹＷＧＱＧＴ）ｍである。
以上の配列１〜３においては、ＭＤＹＷＧＱＧＴ＝Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＴｈｒそしてＦＡＹＷＧＱＧＴ＝Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒである。
さらに、式（ａ−ｂ−ｃ）ｍは、カッコ内に言及されている単数、複数又は全ての残基が存在するか否かを意味している。
【０１１７】
ＣＤＲ２：
配列番号４：
（Ｖａｌ）ｍ−（Ａｌａ）ｍ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｐｈｅ）ｍ−（Ｔｈｒ）ｍ（ＣＤＲ２（１））。この配列の１変形形態は、例えば、ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦ又はＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴである。
【０１１８】
配列番号５： （Ｖａｌ）ｍ−（Ａｌａ）ｍ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｌｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ｌｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｐｈｅ）ｍ−（ＣＤＲ２（２））。この配列の変形形態は、例えば、ＶＡＹＩＳＲＧＧＩＦＹＹＱＤＳＩＫＧＲＦである。
【０１１９】
配列番号６：
（Ｖａｌ）ｍ−（Ａｌａ）ｍ−Ａｌａ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−（Ａｒｇ）ｍ−（Ｐｈｅ）ｍ−（Ｔｈｒ）ｍ−（ｌｌｅ）ｍ（ＣＤＲ２（３））。この配列の変形形態は、例えば配列、ＶＡＡＩＳＲＧＧＧＹＳＹＹＬＤＳＶＫＧＲＦＴＩである。
【０１２０】
ＣＤＲ２−３：
配列番号７（ペプチドＰ３又はｐＦ４. １）：
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  −Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ．この配列の変形形態は、例えば配列、ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＲＱＫＹＮＫＲＡＶＡＹである。
【０１２１】
機能化されたＣＤＲ２−３：
ビオチニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（配列番号７の配列に対応する）
Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（配列番号９）。
【０１２２】
配列番号９の配列の中に、もう１つの配列に対するカップリングを行なうため、システインを介して活性基（ＳＨ）を導入する。
【０１２３】
機能化されたＣＤＲ２：
配列番号４の配列に対応する、ビオチニル−ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴ（ビオチニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ）。
【０１２４】
機能化されたＣＤＲ３：
（配列番号８の配列に対応する）ビオチニル−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ。
【０１２５】
３．細胞内のポリペプチドの浸透の研究
ウェルあたり５×１０4 個の細胞の割合でカバーグラス上に前夜播種した培養中の線維芽細胞ＰｔＫ２を、ビオチニル化した本発明のポリペプチド（５〜２０μｇ/ ｍｌ）を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０（又はＤＭＥＭ）培地（１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム）中で１〜１８時間３７℃でインキュベートする。その後、細胞を洗浄し、１０分間４℃で２％のｐ−ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄する。
【０１２６】
その後、３０分間ＰＢＳ中の５μｇ/ ｍｌのペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジン溶液を用いて細胞をインキュベートし、次にＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼの細胞化学基質（ジアミノベンチジン＋Ｈ2 Ｏ2 ）内でインキュベートする。洗浄の後、細胞を顕微鏡で検査する。
【０１２７】
得られた結果は、１時間の培養の後、ＣＤＲ３の全部又は一部を有するポリペプチドが、全ての細胞の細胞質内及び多数の細胞の核内のペルオキシダーゼの染色により可視状態となるということを示している。結果はさらに、ポリペプチドＣＤＲ２−３（特に配列番号７の配列のポリペプチド  ｐＦ４.1  ）が大量かつ急速に細胞内に侵入し大部分が前記細胞の核に達するということも示している。従って、これらの結果は、ＣＤＲ３タイプのフラグメントから、高い細胞浸透能力をもつポリペプチドを生成することが可能であるということを示している。
【０１２８】
４．細胞内への酵素にカップリングされたポリペプチド−ストレプトアビジンの浸透
この例は、本発明のポリペプチドをいかにして活性物質にカップリングさせ、細胞内へと前記物質を運ぶために利用できるかを示している。
【０１２９】
ベクターは、実験室温度で１５分間１０μｌの体積中でアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼに接合された１０μｇのストレプトアビジンと共にビオチニル化されたポリペプチド  ＣＤＲ２−３（ｐＦ４. １）１. ４μｇをインキュベートすることによって調製する。その後、混合物を０. ５ｍｌの完全培地中で希釈してから、培養中の細胞上に被着させる。２時間の培養の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｐ−パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、次にペルオキシダーゼ（ジアミノベンチジン＋Ｈ2 Ｏ2 ）又はアルカリホスファターゼ（ナフトールＡｓＭｘ＋テトラゾリウム塩Ｆast Red ）の細胞化学基質中でインキュベートする。
【０１３０】
得られた結果は、培養の細胞全ての細胞質レベルにおいて、又これらの細胞の大部分の核内ではわずかに乃至は強く、対応する酵素が検出されることを示している。これに対して、ペルオキシダーゼにカップリングされたストレプトアビジン、アルカリホスフォターゼに結合されたストレプトアビジンの存在下で、又はその未変性形態のストレプトアビジン又は酵素と共に細胞がインキュベートされた場合には、いかなる細胞内染色も観察されない。
【０１３１】
５．補足的リシン残基を含むポリペプチドの構築及びその活性
ポリペプチドＣＤＲ−２−３−ＰＬ１９（ポリリシン）（Ｋ１９−Ｐ３又はＫ１９−ｐＦ４. １とも呼ばれる）を合成し精製した（ＡＬＴＥＲＧＥＮ）。このポリペプチドの配列は以下の通りである：
（ＮＨ２（Ｋ１９）−ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＲＱＫＹＮＫＲＡ−ＣＯＯＨ）配列番号１０．
【０１３２】
細胞ＣＣＬ３９（ハムスタの線維芽細胞）（５×１０4 個）を、ＭＥＭ＋１０％のＳＶＦ（ウシ胎児血清）培地の中でのトランスフェクションの１８時間前に、２４ウェルの培養平板内に入れる。
その他の補助剤（クロロキン）が全く無い状態でＭＥＭ＋１０％ＳＶＦの中でトランスフェクションを実施する。ペプチド−ＰＬ及び遊離ポリリシンＰＬ（１９リシンに対応する）を３０分間プラスミドＰＣＭＶＬＵＣと複合体形成させる（それぞれプラスミド６μｇに対して２４μｇ及び７０μｇ）。その後、複合体をＣＣＬ３９上に滴下にて添加する。５時間のインキュベーションの後、培地を、新鮮な培地と交換する。２４時間後に、ルシフェラーゼの発現を決定する。ＰＢＳで細胞を２回洗浄する。洗浄の後、細胞を、１０〜１５分間、細胞溶解緩衝液１００μｌ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて溶解させる。その後、細胞を７分間４℃で遠心分離して細胞デブリを除去する。この溶解産物２０μｌを１００μｌのルシフェラーゼ緩衝液（ＰＲＯＭＥＧＡ）と混合する。ルシフェラーゼの相対単位（ＲＬＵ）をＬＵＭＡＴ  ＬＢ９５０１（ＢＥＲＴＨＯＬＤ）上に記録する。タンパク質濃度を Biorad Protein Assay-１キットによって決定し、各標本中のルシフェラーゼの率をタンパク質１ｍｇあたりで正規化する。なおここで各トランスフェクションは３回実施される。
【０１３３】
得られた結果は、図５に示されている。これらの結果は、ペプチド−ＰＬが完全培地内でいかなる補助剤もなく、タンパク質１ｍｇあたり２×１０6 ＲＬＵの効率つまりポリリシン単独の場合よりも約１０００倍高く、最近記述された（Wadhwa et al., Bioconjugate Chem. １９９７，８；８１−８８）ただしその活性がクロロキン１００μＭの存在によって左右されるペプチドと同程度の効率でトランスフェクションするということを示している。
【０１３４】
従って、ポリペプチド  ＣＤＲＫ１９−Ｐ３による細胞のトランスフェクションは、補助剤の不在下で完全培地内で実施されうることから、特に有利である。現在、ポリリシンを利用するトランスフェクション系は全て、補助剤、最も頻繁には、細胞にとって有毒であるクロロキンの添加を必要とする。このクロロキンは、従来のエンドサイト−シスにより内在化された接合体とポリリシンの複合体のリソソーム内での分解を回避できるようにする。
本発明は、反対に、かかる補助剤の利用を必要としない。
【０１３５】
６．ペプチドＫ１９−Ｐ３での３Ｔ３細胞のポリフェクション
この例は、細胞３Ｔ３内の本発明のペプチドの核酸移送特性を例示している。
３Ｔ３細胞（８×１０4 個）を、トランスフェクションの前日に２４ウェルの平板内で展延させた。０. １５ＭのＮａＣｌ５０μｌ中のプラスミド３μｇと可変量のペプチドの２０℃２０分間のインキュベーションにより、プラスミドｐＣＭＶ  ＬＵＣとペプチドＫ１９−Ｐ３又は対照ペプチドＣＷ−Ｋ１９及びＫ１９の間のポリプレックスを調製した。より特定的には、ポリプレックスを、ＤＮＡ１μｇあたりペプチド０. ０５〜１. ４ｎmoles という化学量論で実現した。
【０１３６】
トランスフェクションの直前に、細胞を洗浄し、次に可変的期間中、０. ５ｍｌの完全培地でインキュベートした。加湿した雰囲気（空気９２％，ＣＯ２  ８％）の中で３７℃で１時間１５分、２時間３０分、５時間３０分及び２４時間、ポリプレックスを添加した。培地を除去し、新鮮培地１ｍｌ中で３７℃で２４時間新たに細胞をインキュベ−ションした。各実験を同一条件で少なくとも３回実施した。ルシフェラーゼ活性を例５にあるように決定した。
得られた結果は、図６及び７に示されている。
【０１３７】
図６は、ペプチド濃度の増大とルシフェラーゼ発現の増大の相関関係を示しており、ここで、最大活性は、ＤＮＡ１μｇにつきペプチド０. ６ｎmole  という濃度で観察されている。この濃度は、Ｒ＝４. ４という負荷比に対応する。さらに高い濃度では、発現は一定にとどまっている。
【０１３８】
なお、図７は、Ｒ＝４. ４という負荷比で、ポリプレックスに対する２４時間の細胞露呈がいかなる毒性も誘発しないことを示している。５時間３０分のインキュベ−ションの後、測定されたルシフェラーゼ活性は、ペプチドＫ１９−Ｐ３についてタンパク質１ｍｇあたり２〜３×１０7 ＲＬＵである。２４時間のインキュベ−ションの後のトランスフェクションは、５時間３０分のインキュベ−ションに比べ約１. ３倍増大する。
【０１３９】
７．グリセロールの存在下でのポリフェクション
この例は、グリセロールといった安定剤と本発明のペプチドを含む組成物を利用することによってトランスフェクションの効果が改善されうるということを示している。
【０１４０】
この例では、トランスフェクションは、２. ２というペプチド/ ＤＮＡ負荷比でグリセロールを含むか又は含まない（０. ２３Ｍ）完全培地の中で、例６で記述されているとおりに、３Ｔ３及びＣＣＬ３９細胞について実施された（インキュベ−ション  ３７℃で５時間３０分）。
【０１４１】
なお、比較を目的として、グリセロール存在下では２. ２，グリセロール不在下では５という負荷比で、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ｋＤａ（Aldrich, St. Louis, MO) の存在下でトランスフェクションを行なった。
得られた結果は、図８及び９に示されている。
【０１４２】
これらの結果は、グリセロール（０. ２３Ｍ）が、５倍以上そして４０倍に達するまでポリフェクションの増大（ルシェラーゼ活性の測定により決定されるもの）を誘発することを示している。かくして、細胞ＣＣＬ３９（図９）においては、３８倍の増大が明らかにされ、このことは、特にトランスフェクションが困難な細胞のトランスフェクションのための、グリセロールを含む本発明の組成物の有利性を例証している。なお、培地のグリセロール濃度を１. １５Ｍのレベルまで変動させても、類似の結果が得られた。
【０１４３】
図８及び９に示された結果は、同様に、非毒性で単純かつ規定の構造をもつ本発明のペプチドが、３Ｔ３細胞と同時にＣＣＬ３９細胞でも、グリセロールの存在下でＰＥＩ２５ｋＤａ以上のトランスフェクション効果を呈することを示している。
【０１４４】
８．免疫アジュバントとしてのポリペプチドの利用
ペルオキシダーゼ（Sigma)に接合された１４μｇのストレプトアビジンと１４μｇのビオチニル化ＣＤＲ２−３ポリペプチドを１５分間インキュベ−ション状態に放置することでベクターを形成し、各マウスへの注射に先立ち０. １ｍｌのＰＢＳ中でこれを希釈する。注射は、掌球に行なわれる。対照マウスは、ＰＢＳ０. １ｍｌ中のペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジン４０μｇを受ける。
【０１４５】
毎週マウスを潟血させる。最初の注射から１カ月後に、同じ条件下で追加注射を行なう。ＥＬＩＳＡ試験により、ペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンとＣＤＲ２−３の複合体を受けたマウスが、抗−ストレプトアビジン及び抗−ペルオキシダーゼ  ＩｇＧ抗体で応答するものの、ＩｇＭではほとんど応答せず、値は、１４日目以降、ペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンを単独で受けたものよりもはるかに高いものであることが観察できる（図４）。追加注射は、２つのグループにおいて抗体力価の増加をひき起こすが、値はつねに、複合体を受けたグループにおいて上回っている。従って、これらの結果に基づくと、テストされた条件下で、本発明のポリペプチドは、与えられた抗原に対し向けられた抗体の力価を４〜８倍以上増大させる能力をもつと思われる。
【０１４６】
同じ実験を、抗原として今度はタンパク質ではなくこの抗原についてコードする核酸を利用して再現することができる。なおこれらの実験は、同様に、特にポリリシンといった補足的塩基性残基を有するポリペプチドで、同一条件下で反復することもできる。
【０１４７】
９．ＨＩＶの阻害
この例は、ＨＩＶ−１  Lai 菌株上での本発明に従った多反応性抗体の抗ウイルス特性を例示している。
【０１４８】
細胞
利用されたＨＩＶの標的細胞は、ヒト末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）である。これらの細胞は、当業者にとって既知のあらゆる技術によって健康な被験者から得られる（フィコール勾配、白血球搬出など）。ＰＢＭＣを、約３日間フィトヘムアグルチニンで活性化し、インタロイキン２の存在下でＣＯ２雰囲気にて３７℃で培養状態に維持する。
【０１４９】
抗原Ｐ２４の秤量
市販のキット（Diagnostic Pasteur) を利用してＥＬＩＳＡ試験により細胞培養上清中でタンパク質ｐ２４を秤量した。
【０１５０】
ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィトヘムアグルチニンによる活性化の後、３７℃で４時間３つの抗体Ｊ２０−８，Ｆ１４−６  及び  Ｆ４−１を用い異なる濃度でインキュベートした。抗体の除去後、細胞を、ＨＩＶ１ Lai  の連続希釈液で感染させ（３７℃で１時間）、洗浄し、抗体の存在下又は不在下で新鮮な培地を用いてインキュベ−ションし、３〜４回毎に上清をＨＩＶの抗体Ｐ２４の存在について検査し、処理済み又は未処理細胞内のウイルス複製レベルを評価した。抗体で処理した又は未処理のＰＢＭＣ上でのＨＩＶ１ Lai  のこれらの滴定の結果は、図１０に示されている。これらの結果は、抗体Ｆ４−１が、未処理又は抗ＴＡＴ単反応抗体で処理した細胞と比較してウイルス力価を約ログ２だけ低減させる能力をもつことを示している。その上、これらの結果は同様に、単独にテストされたときＨＩＶ１を阻害しない抗体Ｆ１４−６が、単独で阻害活性をもたない抗体Ｊ２０−８と相乗作用して感染力価の減少を誘発することを実証している。
【０１５１】
抗体を用いた細胞の予備インキュベ−ションがＨＩＶ１の感染力の強い阻害を誘発することを可能にするという事実によって例示されるように、抗体がひとたび細胞内部に浸透した時点で、本発明に従った抗体の作用が及ぼされるという確率はきわめて高い、その上、予備実験は、抗体による処理がＣＤ４分子を介してのウイルス−細胞認識を修飾しないことを示しており、このことは、本発明の抗体がＨＩＶの感染力及び複製に対して特異的な細胞内効果を有することを示唆している。
【０１５２】
10．ＨＩＶの阻害
この例は、本発明に従った組成物特にポリペプチドがＨＩＶのもう１つの隔離集団に対してもつ特性を改めて例示している。
【０１５３】
ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、３日間フィトヘムアグルチニンの存在下で活性化させ、次にインタロイキン−２の存在下で培地内に再懸濁させる。その後、以下のポリペプチド又は抗体を細胞２・１０6 個あたり２５μｇ又は５０μｇ用いて、３７℃で４時間、細胞を予備インキュベ−ションする：
−  ペプチドＰ３：このペプチドは、配列番号７の配列のペプチドｐＦ４. １に対応する。
−  ペプチドＰ３ＰＬ：このペプチドは、配列番号１０の配列のペプチドＫ１９−ｐＦ４. １に対応する。
−  抗体Ｆ４. １。
【０１５４】
比較を目的として、ＡＺＴの存在下でも細胞をインキュベ−ションした。
【０１５５】
インキュベ−ションの後、細胞を新鮮な培地中で洗浄し、その後、１時間３７℃で２・１０6 個の細胞の沈渣上にＨＩＶ−１，ＢＸ０８菌株のウイルス希釈物０. ５ｍｌ（実験に応じて１０-3〜１０-5又は１０-1〜１０-4）を用いて感染させる。その後、細胞を新鮮な培地内で３回洗浄し、上述のペプチド又は抗体（１２. ５μｇ又は２５μｇ）を含む培地中に再懸濁させ、ウイルス及びペプチド/ 抗体１用量につき４ウェルの割合で４８ウェルの平板の中に分布させる。ペプチド/ 抗体を含む培地は、３〜４日毎に変換する。その後、材料及び方法の中で記述した条件下で、培養上清中の抗原ｐ２４の秤量により、ウイルス産生（感染及び複製の結果）を推定する。
【０１５６】
複数回の実験の結果は、表１１Ａ，１１Ｂ及び１１Ｃに示されている。
【０１５７】
例９にあるように、これらの結果は、異なる用量で標的細胞内のＨＩＶの複製を低減させる抗ＤＮＡ多反応性抗体又はポリペプチドの能力を例示している。
【０１５８】
11．ポリオウイルスの阻害
この例は、ポリオウイルスについての本発明の製剤の抗ウイルス特性を例示している。
【０１５９】
ポリオウイルスの複製についてのペプチドＫ１９ｐＦ４. １，Ｋ１９ｐＪ２０. ８，Ｋ１９ｐＦ１４. ６の阻害能をテストするため、１型ポリオウイルス（ＰＶ１）の２つの菌株すなわち野生菌株ＰＶＡ/Mahoney及び弱毒化菌株ＰＶ１/Sabin  を利用した。ペプチドの存在下でのポリオウイルスのウイルス懸濁液の力価の減少係数を測定することにより、ペプチドの阻害能を評価した。ウイルス懸濁液の力価を、限界希釈マイクロ技法によりヒト上皮細胞Ｈｅｐ−２ｃについて１ｍｌあたりの細胞変性用量５０（ＤＣＰ５０）の形で決定する（Meinick et al., １９７９，Melnick, J.L., Wenner, H.A. 及び Philips, C. A. （１９７９），エンテロウイルス、「Diagnostic procedure for viral, rickettsial and chlamydial infections 」中（E.H. Lennette 及び N.J. Schmidt. Eds.), ｐ４７１〜５３４。米国公衆衛生協会、ワシントンD.C.）。従って力価の減少係数は、ペプチド不在下のウイルス懸濁液の力価及びテスト対象ペプチドの存在下での力価の間の比に対応する。
【０１６０】
材料
ペプチド
抗ＤＮＡモノクローナル抗体：Ｋ１９  ｐＦ４. １（配列番号１０）から誘導されたペプチド：Ｋ１９ｐＦＪ２０. ８
（Ｋ）19- Ｖ- Ａ- Ｙ- Ｉ- Ｓ- Ｒ- Ｇ- Ｇ- Ｇ- Ｉ- Ｆ- Ｙ- Ｙ- Ｑ- Ｄ- Ｓ- Ｉ- Ｋ- Ｇ- Ｒ- Ｆ- Ｔ- Ｒ- Ｅ- Ｋ- Ｙ- Ｇ- Ｋ- Ｒ- Ｇ- Ｍ- Ｄ- Ｙ．
Ｋ１９ｐＦ１４. ６
（Ｋ）19- Ａ- Ｉ- Ｓ- Ｒ- Ｇ- Ｇ- Ｇ- Ｙ- Ｓ- Ｙ- Ｙ- Ｌ- Ｄ- Ｔ- Ｖ- Ｋ- Ｒ- Ｔ- Ａ- Ｒ- Ａ- Ｔ- Ｗ- Ｄ- Ｗ- Ｆ- Ａ- Ｙ．
【０１６１】
負の対照として利用されるペプチド：Ｎ末端側に１９のリシンを有する２０個のアミノ酸の卵白アルブミンのペプチドに対応するＫ１９ＰＴ。
【０１６２】
ウイルス
１型ポリオウイルスの野生型菌株：ＰＶ１/Mahoney
１型ポリオウイルスの弱毒化菌株：ＰＶ１/Sabin
【０１６３】
細胞
喉頭類表皮ガン由来のヒト上皮細胞 Hep-2c 
【０１６４】
プロトコル
１日目に細胞を培養に付した。このため、ＭＥＭ培地、１０％のウシ胎児血清（ＳＶＦ），０. ５％のゲンタマイシン中ｍｌあたり２. ５・１０5 個の細胞の懸濁液を調製し、クプラ１杯あたり２００μｌ（つまり１クプラあたり５・１０4 個の細胞）の割合で９６クプラの平板５枚に播種を行なった。５％のＣＯ２の存在下で３７℃で細胞をインキュベ−ションする。
【０１６５】
０日目に、細胞を２時間ペプチドと共に予備インキュベ−ションする。そのためには、上述のペプチドを、ＭＥＭ培地、１０％ＳＶＦ，０. ５％ゲンタマイシン中で５０μｇ/ ｍｌまで希釈した。吸引によりクプラを空にし、１クプラあたり１００μｌの培地＋ペプチド（ペプチド毎に平板１枚）を添加する。対照として、ペプチド不在下でのウイルス懸濁液の滴定のためペプチド無しの培地１００μｌ/ クプラを伴う平板を調製する。混合物を、５％のＣＯ２の存在下で３７℃で２時間インキュベ−ションする。
並行して、ウイルス懸濁液の希釈物を１０個毎に１０-4に至るまで、そしてその後４個毎に１０-8.6に至るまで、ＭＥＭ培地、ＳＶＦ無し、０. ５％ゲンタマイシン（５０μｌ/ クプラで４クプル/ 希釈物）中で調製する。
【０１６６】
感染時の利用のためには、（テストのために５０μｌのウイルス希釈物上にペプチドを含む培地１５０μｌを添加することがわかっているため）、最終的に２５μｇ/ ｍｌのペプチド濃度を得るような形で、ＭＥＭ培地、３％ＳＶＦ，０. ５％ゲンタマイシンの中にペプチドを希釈させる。
【０１６７】
クプラを（吸引によって）空にしその後次の要素を添加することによって、感染段階を実施した：
−  １５０μｌ/ クプラの希釈ペプチド又は未処理平板のための培地、
−  ４クプラ/ 希釈物の割合での、５０μｌ/ クプラのウイルス希釈物１０-5.8〜１０-8.8。
５％のＣＯ２の存在下で５日間３７℃でインキュベ−ションする。
【０１６８】
感染から５日後に、上述のとおりにＤＣＰ５０/ ｍｌでの力価を決定する。
得られた結果は、下表及び図１２上に示されている。これらの結果は、本発明のポリペプチドが単独で異なる菌株のポリオウイルスの複製を阻害する能力を示している。
【０１６９】
【表１】
0004482054.tif 000002
【０１７０】
特に、これらの結果は、ペプチドＫ１９−ｐＦ４. １が、３０倍以上のきわめて顕著なＩ型ポリオウイルス複製阻害効果を有することを示している。この実験は、異なるタイプのウイルスの阻害に対する本発明の多数の利用分野を例示している。
【０１７１】
１２．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の複製の阻害
この例は、サイトメガロウイルスについての本発明に従った化合物の抗ウイルス特性を例示している。
【０１７２】
材料：
細胞：
ヒト２倍体線維芽細胞及びヒト原発性星状細胞腫（Ｕ３７３ＭＧ）を利用した。２ｍＭのグルタミン及びウシ胎児血清１０％を添加したダルベッコ培地内でこれらを培養する。
【０１７３】
ペプチド：
利用された化合物は、ペプチド誘導体Ｋ１９−ｐＦ４−１である。
【０１７４】
ウイルス：
ＣＭＶの菌株Ａｄ１６９（ＡＴＣＣ  ＶＲ５３８）を利用した。ＣＭＶの滴定は、カルボキシメチル−セルロース（０. ６％）下で形成された溶菌斑を計数することによって行なわれる。
【０１７５】
方法：
細胞をトリプシンで処理し、洗浄し、ウェルあたり１０5 個の割合で培養平板のウェルの中に分配させ、６〜２４時間培養した。無菌溶液状態のポリペプチドを２５〜５０μｇ/ ｍｌの最終濃度まで培養に添加した。１ｐｆｕ/ 細胞の多数の感染で、細胞感染を行なう。
【０１７６】
次の３つの作業様式に従った：
ａ）ウイルス感染の４時間前にポリペプチドを添加する。
ｂ）ウイルスと同時にポリペプチドを添加する。
ｃ）細胞上のウイルスの吸収（３７℃で２時間）の後、ポリペプチドを添加する。
【０１７７】
抗ウイルス効果は以下の要領で評価される：
１）光学顕微鏡で細胞の形態学的様相を観察することによって目視による、
２）感染から５日後に形成された溶菌斑を計数してウイルス増殖を滴定することによる及び、
３）ウイルス感染の超早発性、早発性及び後発性タンパク質の出現をウエスタンブロット法で分析することによる。
【０１７８】
結果
得られた結果は、次のことを示している：
１）ウイルス感染の前又は同時にＫ１９−ｐＦ４−１で処理された細胞は、形態学的修飾（細胞変性効果：ＥＣＰ）を示さない。反対に、ウイルス吸着の終りでＫ１９−ｐＦ４. １で処理された細胞は、感染から２４時間及び４８時間後に重大なＥＣＰを示す。Ｋ１９−ｐＦ４. １又は１９残基の遊離ポリリシン（Ｋ１９）でウイルス感染後に処理された又は未処理の細胞は、重大なＥＣＰを示す。
２）ウイルスの複製は、ウイルス感染の前ならびにそれと同時に、Ｋ１９−ｐＦ４. １で処理された細胞中で９９. ５％まで阻害される（下表参照）。
３）ウイルス感染前にＫ１９−Ｆ４. １で処理された細胞においては、ＣＭＶの早発性タンパク質及び後発性タンパク質のいずれの出現もみられない（図１３ａ及び１３ｂ）。ウイルス感染と同時にＫ１９−ｐＦ４. １で処理された細胞においては、後発性タンパク質の出現は見られないが、量的に減少しているものの超早発性タンパク質の出現が指摘される（図１３ｃ）。Ｋ１９−ｐＦ４. １は、ウイルス吸着の後に細胞に添加された場合、作用を示さない（図１３ｄ）。
【０１７９】
結論としては、提示された結果は、細胞がウイルス感染の前にその処理を受けている場合、ポリペプチドＫ１９−ｐＦ４. １はＣＭＶの複製を著しく阻害するということを示している。ペプチドは、ＣＭＶと同時に細胞に添加された場合、同様に有効であるが、ただしその程度は低い可能性がある（早発性抗原の出現）。
【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
２５μｇ/ ｍｌでＫ１９−ｐＦ４. １で前処理された細胞又は処理無しの細胞（ＲＸ無し）の感染５日後のＣＭＶの滴定
【０１８２】
１３．ヘルペスウイルスの阻害
この例は、単純ヘルペスウイルスについての本発明の化合物の抗ウイルス特性を例示している。
【０１８３】
抗ウイルス活性は、ＨＳＶ−１  ＴＫ+ ウイルス（すなわちチミジンキナーゼを発現する）及びＨＳＶ−１  ＴＫ- ウイルス（すなわちチミジンキナーゼを発現しない、従ってＡＺＴに対する感受性が無い）により誘発された細胞変性効果（ＥＣＰ）の測定により、決定された。
【０１８４】
利用されたペプチド及び抗体は以下のとおりである：Ｋ１９，Ｋ１９−ｐＦ４. １，Ｋ１９−ｐＪ２０. ８，Ｋ１９−ｐＦ１４. ６及びＦ１４. ６。
【０１８５】
基準抗ＨＳＶ−１ＴＫ＋化合物としては、Acy-clovirＲを利用した（２ｍｇ，ＭＷ２２５，Wellcome) 。Acyclovir を抗生物質を追加したＤＭＥＭ１×培地２ｍｌの中で溶解させ、次に、１ＮのＮａＯＨを５０μｌを添加した。体積を、ＤＭＥＭ  １×培地ＡＢで４. ４４ｍｌになるまで調整し、１ＮのＨＣｌを用いてＰＨを７〜７. ４に調整した。中和した溶液を０. ４５μｍのフィルタ上で滅菌し、次にアリコートの形で−２０℃に保存した。利用の直前に溶液（１０−２Ｍ）を  １/ １０〜１/ １０4 希釈し（１０-3Ｍから）、感染から１時間後に５０μｌの割合でこれを添加した。
【０１８６】
ウイルス株（ＨＳＶ−１，ＴＫ+ ，ベロ細胞上の第７継代及びＨＳＶ−１ＴＫ- ，第４継代）を平板内への分配（５０μｌ/ ウェル）の前に培地内で１/ １０００に希釈した。
【０１８７】
ＥＣＰ阻害試験は、細胞の生存率を測定する半定量試験である。以下のプロトコルが利用された：すなわち、ベロ細胞をトリプシン化し（トリプシン−Versene, Euro bio), ９６の平底ウェルの平板（Falcon）の中でウェルあたり２×１０4 個の細胞の割合で、抗生物質、Ｌ−グルタミン及び５％ＳＶＦ（Eurobio)が追加されたＤＭＥＭ培地（Bioproducts)５０μｌ中に分布させ、その後２４時間インキュベートした。フィルタ０. ２２μＭ上で滅菌されたペプチド/ 抗体を、５０〜４００μｇ/ ｍｌの割合で以下のスキーマに従った添加した：
−  Ｈ−２４：細胞の培養開始
−  Ｈ０：感染
−  Ｈ−２，Ｈ−１，Ｈ０，Ｈ＋１：ペプチド添加、
−  Ｈ＋４８：ＥＣＰ試験。
【０１８８】
感染から４８時間後に、培地を除去し、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含む無菌ＰＢＳ緩衝液２００μｌを用いてウェルを３回洗浄し死枯した細胞を除去する。ニュートラルレッド（ＲＡＬ，０. ３％）を添加し（１００μｌ/ ウェル）、さらに２時間細胞をインキュベ−ションした。その後、細胞に取込まれていない染料を除去するため前述のとおり細胞を３回洗浄した。このとき細胞を、１％のＳＤＳ精製水溶液１００μｌを添加することによって破裂させた。ニュートラルレッドの完全な塩析を可能にするため４℃で１時間置いた後、結晶をピペットで溶解させた。高温空気流（ヘヤドライヤ）により気泡を破壊し、６３０ｎｍの基準フィルタを利用して５７０ｎｍでマイクロプレート読取り装置を用いて平板を読取った。光学密度のブランクが空気上に実現された。
【０１８９】
以下の対照が作製された：
−  対照細胞：ニュートラルレッドと共にインキュベ−ションされた未感染未処理のもの：
−  対照ウイルス：ＥＣＰ効果１００％（希釈１/ １）からＥＣＰ１２. ５％（希釈１/ ８）に至る、係数２の異なるウイルス希釈物で感染を受けた細胞；
−  抗ウイルス対照： acyclovirで処理され感染を受けた細胞；及び
−  毒性対照：未感染で、異なるペプチド/ 抗体での処理を受けた細胞。
抗ウイルス活性は、以下のように決定される：
【数１】
0004482054.tif 000004
【０１９０】
得られた結果は、以下の各表に示されている。これらの結果は、ウイルスＨＳＶ−１ＴＫ+ 及びＴＫ- によって誘発されたＥＣＰ効果の阻害を明確に示している。観察された効果は、ウイルス感染に先立って又はそれと同時にインキュベ−ションされた場合に特に２つのウイルス菌株に対し非常に高い活性をもつペプチドＫ１９−ｐＪ２０. ８について特に強いものである。
【０１９１】
従って前述の結果は全体として、ＨＩＶ，ポリオウイルス，ＣＭＶ及びＨＳＶ−１といった異なるタイプのウイルスについて、単独で又は組合わせた形での本発明の抗体/ ペプチドの重要な抗ウイルス特性を実証している。これらの結果は、ウイルス感染効果を in vitro, ex vivo又は in vivoで最小限におさえるための本発明の製剤の利用分野を例示している。
【０１９２】
【表３】
0004482054.tif 000005
【０１９３】
【表４】
0004482054.tif 000006
【０１９４】
【表５】
0004482054.tif 000007
【０１９５】
【表６】
0004482054.tif 000008
【０１９６】
【表７】
0004482054.tif 000009
【０１９７】
【表８】
0004482054.tif 000010
【０１９８】
【表９】
0004482054.tif 000011
【０１９９】
【表１０】
0004482054.tif 000012
【０２００】
【表１１】
0004482054.tif 000013
【０２０１】
これらの結果全体は、好ましくはＣＤＲ３の全部又は一部分を含む抗体の一領域を含む本発明のポリペプチドが、（ｉ）細胞内に効率良く浸透し（ii) そこで物質特にサイズの大きな物質のビヒクルとして作用し、（iii)  与えられた抗原に対する免疫応答を刺激することにより、in vivo でアジュバントの役割を果たし、かつ (iv) 抗体ウイルス活性を及ぼす能力をもつということを実証している。その上、本発明のポリペプチドは、細胞の核に至るまで物質を輸送することさえできると思われ、このことは、物質が核酸又は核酸に作用する分子である場合に１つの明らかな利点を表わすものである。なお、本発明のポリペプチドは、これまで利用されてきたベクターの大部分とは異なる細胞浸透メカニズムを利用すると思われる。特に、本発明のポリペプチドは、リソソームを免れていると思われ、これは、重要な分解現象が一般にこれらの細胞区画内で発生するかぎりにおいて、補足的な１つの利点を構成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004482054.tif 000023
【図１１Ａ】
0004482054.tif 000024
【図１１Ｂ】
0004482054.tif 000025
【図１１Ｃ】
0004482054.tif 000026
【図１２】
0004482054.tif 000027
【図１３】
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【配列表】
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