(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶII因子を生産する方法であって、
ａ）（ｉ）ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ又はその誘導体であって、Ｃ末端に加えられたアミノ酸ＫＤＥＬの形態のＥＲ保持シグナルを含む誘導体をコードするＤＮＡ配列、及び
（ｉｉ）第ＶＩＩ因子をコードするＤＮＡ配列
を含む哺乳類細胞系統を、当該ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ又はＫＥＸ２エンドプロテアーゼ誘導体、及び第ＶＩＩ因子が発現する条件下において、適切な培地で培養し、
ｂ）培地から第ＶII因子を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
前記培地が無血清培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類細胞系統がＣＨＯ、ＢＨＫ、及びＨＥＫ２９３細胞株からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ誘導体が、ＫＥＸ２1-613及びＫＥＸ２1-674からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
本発明は真核細胞における組換えタンパク質の高能率放出方法またはより詳細には、哺乳類起原の培養細胞においてＫｅｘ２エンドプロテアーゼとの共発現によりＶII因子の分泌を促進する方法に関する。
【０００２】
［従来の技術］
細胞培養及び組換えＤＮＡ技術における進歩は、遺伝子工学による細胞を用いる、治療用のまたは他の経済的価値の種々のタンパク質の発現を容易にした。高級真核源に由来する多くの生物学的活性治療用タンパク質の発現はしばしば特異的な翻訳後修飾を必要とし、それは低級真核細胞または原核細胞では自然には起こらない。したがって高級真核源に由来する細胞を用いることが必要となる。たとえば、哺乳類細胞における糖タンパク質の発現は自然のグリコシル化を含むタンパク質を提供するという利点をもつ。哺乳類の生産した糖タンパク質は、外鎖炭水化物部分を含有し、それは、低級真核生物から生産された糖タンパク質に存在する外鎖炭水化物部分とは著しく異なる。分泌哺乳類タンパク質の生産のための宿主として哺乳類細胞を用いることは、哺乳類細胞が、容易に認識し、かつ適切に分泌指向タンパク質をプロセシングする分泌系を有する（これは低級真核生物については必ずしも真実ではない）点で、低級真核生物からの分泌よりも顕著な利点を有する。
【０００３】
真核宿主におけるコード配列の有効な発現は、生物学的活性を達成するためにタンパク質のプロセシング、安定化及び修飾のために必要である会合タンパク質の発現も必要とし得る。生物学的に活性な組換えタンパク質の最適発現は特異的翻訳因子及び／または転写因子の存在にも依存し得る。これらのタンパク質は宿主細胞において、組換えタンパク質の有効な発現が限定されるような低レベルで存在し得る。特異的翻訳後修飾を必要とするタンパク質の例は特定の凝固因子を含み、これらは、生物学的活性のために特異的グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化を必要とし、生物学的活性のために特異的アスパラギン酸残基のベータ−ヒドロキシアスパラギン酸への変換も必要とし得る。
【０００４】
血液凝固は、種々の血液成分または因子の複雑な相互作用の過程であり、結局フィブリン血餅を引き起こす。一般に、いわゆる凝固カスケードに関係する血液成分は、プロ酵素またはチモーゲン、すなわち、それ自体が活性化血餅化因子である活性剤の作用により、タンパク質分解活性酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。上記の変換をし、そして一般的に活性因子と呼ぶ、凝固因子は、下つきの活字ケース「ａ」サフィックスを加えることにより示す（たとえば、ＶIIａ因子）。
【０００５】
ＶII因子は、一本鎖チモーゲンとして血液中を循環する微量血漿糖タンパク質である。チモーゲンは触媒的に不活性である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６４，１９８９、Ｐ．７５３６−７５４３；Ｒａｏ他「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８５、１９８８、Ｐ．６６８７６６９１）。一本鎖ＶII因子は、Ｘａ因子、ＸIIａ因子、ＩＸａ因子またはトロンビンにより、インビトロで、二本鎖ＶIIａ因子に変換される。Ｘａ因子はＶII因子の主要生理学的活性化因子であると信じられる。止血に伴なわれるいくつかの他の血漿タンパク質のように、ＶII因子は活性形における発現についてはビタミンＫに依存し、ビタミンＫは、タンパク質のＮ−末端に密集する多数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされる。γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）−含有ドメインには表皮増殖因子（ＥＧＦ）と相同である２つのドメインが隨伴し、一方、セリンプロテアーゼ部分は分子のＣ末端半分を占める。
【０００６】
凝固カスケードに関係するタンパク質もしばしば二塩基性アミノ酸残基での開裂により成熟タンパク質にプロセスされる。したがって、ＶII因子はＮ−末端３８アミノ酸プロペプチドを用いて合成され、該プロペプチドは、Ｃ−末端で２つのアルギニン（Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）対に切断される。このインビボのプロセシングに関係するかもしれないいくつかの候補酵素があり、これらのいくつかは小胞体（ＥＲ）において、いくつかはゴルジ装置において膜結合形で優先的に働く。
【０００７】
ＶII因子の他の重要な翻訳後修飾はプロペプチドの開裂点の近くに位置する１０グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化である。でき事の配列はプロペプチド及びその正しい配列の存在がガンマ−カルボキシル化のプロセスに重要であるようであるという事実により示され（Ｂｕｓｂｙ他「Ｃｕｒｒ．Ａｄｖ．ｉｎ  Ｖｉｔ．Ｋ．Ｒｅｓ．」１７３−１８１（１９８７）及びＵｌｒｉｃｈ他「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６３（２０）、９６９７−９７０２（１９８８））、ガンマ−カルボキシル化は膜結合カルボキシラーゼにより触媒されるＥＲにおいて起こる。
【０００８】
サッカロミセス酵母のＫｅｘ２エンドプロテアーゼは、接合型α−因子の前駆体及びキラー因子を特異的にプロセスするプロテアーゼである。Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼの性質は次のようであると報告される。（１）Ｋｅｘ２は、その前駆体から接合型α−因子の除去のためにＬｙｓ−Ａｒｇ配列のＣ末端で、そしてＬｙｏ−Ａｒｇ配列及びＰｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端で開裂して成熟キラー因子を放出する、（２）その精製が試みられ、その酵素は膜分画に存在し、その活性化のためにカルシウムイオンが必要であることが分かった、（３）Ｋｅｘ２は１００〜１２０Ｋダルトンの分子量を有する糖タンパク質である、（４）Ｋｅｘ２はＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ及びＰｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ−末端で特異的に開裂する（ＢＢＲＣ，１４４，８０７−８１４，１９８７）。
【０００９】
ＷＯ９０／０１５５０号においては、プラスミドはインターシストロンリーダーを含むポリシストロン発現ユニットを担持することを開示する。米国特許第５４６０９５０号においては、宿主細胞は、前駆体ポリペプチドを開裂できる、ヒトエンドプロテアーゼであるＰＡＣＥを発現し、そこで、ＰＡＣＥコード配列と前駆体ポリペプチドコード配列は、２つの配列の共発現を可能とする発現調節配列に操作可能に結合していることを開示する。
【００１０】
本発明の概要
本発明はＶII因子を生産する方法であって、
ａ）酵母エンドプロテアーゼまたはその誘導体をコードするＤＮＡ配列及びＶII因子をコードする配列を含む哺乳類細胞系統を適切な培地において培養し、そして、
ｂ）培地からＶII因子を単離することを含む方法に関する。
【００１１】
本発明の一態様によると、酵母エンドプロテアーゼは好ましくはサッカロミセス株に由来し、好ましくはＫｅｘ２様エンドプロテアーゼである。酵母エンドプロテアーゼはそのＣ末端で切断されて、それによりそのトランスメンブラン領域を失ってもよい。さらにＥＲ保持シグナルを切断されたエンドプロテアーゼのＣ−末端に付加してもよい。酵母エンドプロテアーゼは好ましくはサッカロミセス・セレビシエからのＫｅｘ２エンドプロテアーゼである。
培地は好ましくは血清不含培地であり、哺乳類細胞系統は好ましくはＣＨＯ細胞系統またはＢＨＫ細胞系統である。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
定義：
本明細書では用語「ＫＥＸ２」はサッカロミセス・セレビシエからの酵母エンドプロテアーゼ遺伝子を意味する。
本明細書では用語「Ｋｅｘ２」はサッカロミセス・セレビシエからの酵母エンドプロテアーゼ遺伝子産物を意味する。
本明細書では用語「完全長Ｋｅｘ２」はアミノ酸１〜８１４からのＫｅｘ２の完全な配列を意味する。
【００１３】
本明細書では用語「切断されたＫｅｘ２」は、Ｃ−末端が特に、それぞれアミノ酸８１４からアミノ酸６１４または６７５まで除去されているＫｅｘ２酵素を意味する。
本明細書では、用語「ＥＲ」は、小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｌｕｍ）を意味する。
本明細書では、「ＥＲ保持シグナル」はＣ−末端でのＫＤＥＬを意味する。
【００１４】
本明細書では「Ｋｅｘ２様エンドプロテアーゼ」は、完全長Ｋｅｘ２のアミノ酸配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、よりさらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性の程度を有するアミノ酸配列を有する酵母エンドプロテアーゼを意味する。
Ｋｅｘ２様酵母エンドプロテアーゼのアミノ酸配列は、完全長Ｋｅｘ２のアミノ酸から１以上のアミノ酸残基の挿入または欠失により及び／または天然の配列における１以上のアミノ酸残基の異なったアミノ酸残基による置換により異なっていてもよい。好ましくはアミノ酸の変更は重要でない性質のものであり、エンドプロテアーゼの折りたたみ及び／または活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である。
【００１５】
保存的置換の例は塩基性アミノ酸（たとえば、アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（たとえば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（たとえば、ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小アミノ酸（たとえば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。特異的活性を一般に変更しないアミノ酸置換は当業界で既知であり、たとえば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ及びＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌによる「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）に記載されている。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ並びにこれらの逆である。
【００１６】
用語「酵母エンドプロテアーゼの誘導体」は、Ｃ−末端に付着したＥＲ保持シグナルを含有してもよいＣ−末端で切断された配列を意味する。
【００１７】
本発明の方法は一般に、
（ａ）哺乳類細胞系統にエンドプロテアーゼをコードするＤＮＡ及びＶII因子をコードするＤＮＡを含むベクター系を導入すること、
ｂ）トランスフェクトされた哺乳類細胞を適当な培地で増殖すること、及び
ｃ）ＶII因子の単離を含む。
【００１８】
ベクター系は、好ましくは、それぞれ、ＶII因子及びエンドプロテアーゼを発現できる、２つの別個のベクターを含む。本発明のこの態様において、哺乳類細胞を前記２つのベクターで共トランスフェクトし、次いで、適切な培地において培養する。あるいは、既に確立されたＶII因子発現クローンを該エンドプロテアーゼを発現できるベクターでトランスフェクトし得る。ベクター系はＶII因子発現カセット及びエンドプロテアーゼ発現カセットを含む１個の単一ベクターも含み得る。
【００１９】
本発明の方法において宿主細胞として用いられる哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、赤ちゃんハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞または、たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる多くの不死化細胞系統を包含する。
【００２０】
適切な哺乳類細胞系統の例はＣＯＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６３２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、ＣＨＬ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３９）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）系統である。哺乳類細胞をトランスフェクトし、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現する方法は、たとえば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈｏｒｐ「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」１５９（１９８２）、６０１−６２１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ「Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．」１（１９８２）、３２７−３４１、Ｌｏｙｔｅｒ他「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」７９（１９８２）、４２２−４２６、Ｗｉｇｌｅｒ他「Ｃｅｌｌ」１４（１９７８）、７２５、Ｃｏｒｓａｒｏ及びＰｅａｒｓｏｎ「Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｅｓ」７（１９８１）、６０３、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」５２（１９７３）、４５６及びＮｅｕｍａｎｎ他「ＥＭＢＯ  Ｊ．」１（１９８２）、８４１−８４５に記載されている。
【００２１】
ベクターは、組換えＤＮＡ手順を都合よく受けることができる任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞に依存するだろう。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実在物として存在するベクターでよく、その複製は染色体複製、たとえば、プラスミドに無関係である。あるいは、ベクターは、好ましくは、宿主細胞に導入される時、宿主ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものでよい。ベクターは好ましくは、コードＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な追加のセグメントに操作可能に結合している、発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスのＤＮＡに由来するか、両方の要素を含有し得る。用語「操作可能に結合した」は、セグメントはそれらが意図された目的に一致して機能するように、たとえば、転写はプロモーター中で開始し、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して進行するように配置される。
【００２２】
プロモーターは、宿主細胞の中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。哺乳類細胞においてコードＤＮＡの転写を指示するために適切なプロモーターの例はＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ他「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」１（１９８１），８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２２２（１９８３），８０９−８１４）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。
【００２３】
コードＤＮＡ配列は、適切なターミネーター、たとえば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、前掲書中に）またはＡＤＨ３（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ他、前掲書中に）ターミネーターに操作可能に結合していてもよい。
さらに、ベクターは、要素、たとえば、ポリアデニル化シグナル（たとえば、ＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅｌｂ領域からの）転写エンハンサー配列（たとえば、ＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（たとえば、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）を含み得る。
【００２４】
ベクターは好ましくはシグナルペプチドコード領域も含有するだろう。それは、発現したＶII因子ポリペプチドを宿主細胞の細胞の分泌経路に導くことができる、ＶII因子ポリペプチドのアミノ酸末端に結合するアミノ酸配列をコードする。シグナルは宿主哺乳類細胞系統に同種であるか、異種であってよく、天然のシグナルペプチドであってもよい。
【００２５】
最後に、ベクターは、その当該宿主細胞における複製を可能にする、ＤＮＡ配列を含むことができる。哺乳類細胞におけるそのような配列の例はＳＶ４０複製開始点である。
【００２６】
トランスフェクトされた哺乳類細胞は、適切な栄養培地において、ＶII因子とエンドプロテアーゼの共発現を可能とする条件下で培養され、ＶII因子は培地から回収される。哺乳類細胞を培養するのに用いられる培地は、哺乳類細胞を増殖させるのに適切な任意の慣用の培地、たとえば、適当な補足を含有する最少または複合培地でよい。適切な培地は、商業的供給者から入手できるか、あるいは出版されたレシピ（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）に従って製造し得る。細胞により生産されたＶII因子は、次いで、当該ポリペプチドの型に依存して、遠心またはろ過による培地からの宿主細胞の分離、塩、たとえば、硫酸アンモニウムによる上清またはろ液のタンパク質成分の沈殿、種々のクロマトグラフィー手順、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等による精製を包含する慣用の手順により培地から回収し得る。
【００２７】
次の例は説明のためのものであって、限定のためのものではない。
例１
ＫＥＸ２発現プラスミドの構築
図１は、発現カセットとして、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐｃＤＮＡ３を用いるＫｅｘ２発現プラスミドの構築を概説する。
プラスミドｐＭＥ５６８中のＫＥＸ２のゲノムクローンから、プライマー
0004463988.tif 000002
を用いて、Ｎ−末端の３７５塩基対のＰＣＲにより、最初のＡＴＧの１５塩基対上流のＡｃｃ６５１部位の組み込み後、コード領域のＮ−末端８００塩基対をｐＵＣ１９Ａｃｃ６５１−Ｘｂａｌにサブクローン化した。
【００２８】
この３７５塩基対のＡｃｃ６５１−Ｈｉｎｄ３フラグメントを隣接する４２０塩基対に結合し、ｐＵＣ１９にクローン化した。得られたプラスミドであるｐＨＷ１２５２から、８００塩基対のＡｃｃ６５１−Ｘｂａｌフラグメントを切除し、ｐＭＥ５６８からのＣ−末端１７５０塩基対Ｘｂａｌ−ＳｎａＢ１フラグメントと共にｐｃＤＮＡ３  Ａｃｃ６５１−ＥｃｏＲＶ  ５．４kbに挿入し、発現プラスミドｐＨＷ１２５３を生成させた。ｐＨＷ１２５３中のＫＥＸ２の配列は本質的にＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｐ他、「Ｎａｔｕｒｅ」３８７（補足）、９３−９８（１９９７）の酵母ゲノム名録に記載されている。
【００２９】
例２
Ｋｅｘ２とＶII因子の共発現
ＶII因子を発現している赤ちゃんハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｂｅｒｋｎｅｒ他「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｕｔ．Ｂｉｏｌ．」５１、５３１−５４１（１９８６））に、供給者（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｒｏｓｋｃｌｄｅ、デンマーク）により記載されたリポフェクトアミン（ＬｉｐｏＦｅｃｔ  Ａｍｉｎｅ）法を用いて、例１に記載されているように、２μｇのプラスミドｐＨＷ１２５３をトランスフェクトした。１mg／ｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｃｔｉｃｉｎ）Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有する培地（ダルベッコの修飾イーグル培地、１０％のウシ胎児血清、１００IUのペニシリン、１００IUのストレプトマイシン、１ミリモル／ｌのＮａ−ピロベート及び５mg／ｌのビタミンＫ１）中で安定なクローンを選択した。選択後、安定なクローンをクローン化シリンダーを用いて選び取り、５％のＣＯ2 を含有する雰囲気中に３７℃で維持した。
【００３０】
安定なクローンをＶII因子生産のためにＦＶII−ＥＬＩＳＡ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）中でふるい分けした。上記クローンの１００万個の細胞から、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ」３６（７）、１９１２−１９１７（１９９７）（Ｎ．Ｃ．Ｒｏｃｋｗｅｌｌ，Ｇ．Ｔ．Ｗａｎｇ．Ｇ．Ａ．Ｋｒａｆｔ及びＲ．Ｓ．Ｆｕｌｌｅｒ）により本質的記載されたように、Ｋｅｘ２酵素活性を測定した。
我々は、ＢＨＫ細胞系統におけるＫｅｘ２発現とＶII因子の分泌の間に、Ｋｅｘ２を共発現するクローン中に２〜３倍以上のＶII因子が生産されるという、明確な相関性を見ている。
【００３１】
例３
ＶII因子発現プラスミドの構築
非翻訳領域を除去したＶII因子ｃＤＮＡを次のプライマー、
AAC GGA TCC ACC ATG GTC TCC CAG GCC CTC AGG（配列番号３)
ACG GAA TTC ACT AGT CTA GGG AAA TGG GGC TCG CAG GA（配列番号４）
及び鋳型としてのヒトＶII因子ｃＤＮＡを用いて、Ｔａｑポリメラーゼを用いるＰＣＲにより製造した（Ｈａｇｅｎ他「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８３、１９８６、ｐ．２４１２−２４１６）。ＰＣＲフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ１１  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクター中にクローン化し、配列を確かめた。ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ−Ｓｐｅｌフラグメントとして哺乳類細胞発現ベクターＺｅｍ２１９ｂに転移させた（Ｂｕｓｂｙ他「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６６、１９９１、ｐ．１５２８６−１５２９２）。該ベクターはプロモーター中に挿入されたｃＤＮＡを駆動するためのマウスメタロチオニン及び選択マーカーとして用いるためのＳＶ４０プロモーターにより駆動されるデヒドロフォレートレダクターゼｃＤＮＡを担持する。得られたプラスミドはｐＬＮ１７４と呼ばれた。
【００３２】
例４
ＫＥＸ２ｃＤＮＡを含みまたは含まないＣＨＯ細胞のＶII因子−トランスフェクト及びトランスフェクトされた細胞からのＶII因子生産の測定
懸濁液中の増殖に適応させたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）にキアフェクト（Ｑｉａｆｅｃｔ）トランスフェクト試薬を用いて、
ａ．ＶII因子発現プラスミドｐＬＮ１７４（例ａ）及び挿入ｃＤＮＡのない発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
ｂ．ＶII因子発現プラスミドｐＬＮ１７４（例ａ）及びｐｃＤＮＡ３／ＫＥＸ２発現ベクター
をトランスフェクトした。二重トランスフェクト物を１μＭのメトトレキセート及び７００μｇ／mlのジェネティシン（ＧＩＢＣＯ）を用いて選択した。クローンが裸眼で見えた時、培養物をさらなる培養のために、Ｔ−フラスコに移した。
【００３３】
トランスフェクト物（上記ａ及びｂ）のプールをＶII因子生産物の測定のためにＴ２５フラスコ（０．２５×１０-6細胞／フラスコ）に接種した。細胞を基質に付着させた時、５μｇ／mlのビタミンＫ１を含有する新鮮な培地を加えた。培地をさらなる２日後に収集し、ＥＬＩＳＡキット（ＤＡＫＯ）でＶII因子活性についてアッセイした。下表から分かるように、ｐｃＤＮＡ３／ＫＥＸ２及びＶII因子の共トランスフェクションは、ＶII因子をｐｃＤＮＡ３ベクターのみと共トランスフェクトする時と比較して５倍増加した発現レベルのＶII因子免疫反応性を示した。
【表１】
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【配列表】
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【図１】
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