(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式：
A-R-NH-Y-CH2-O-CO-Q
（式中、ＡはカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは無置換p-フェニレン基を示し；Ｑは医薬化合物の残基を示す）
で表される薬物複合体。
【請求項２】
Ｒがペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーである請求項１に記載の薬物複合体。
【請求項３】
カルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールがカルボキシメチルデキストランポリアルコールである請求項１又は２に記載の薬物複合体。
【請求項４】
医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の薬物複合体。
【請求項５】
アミノ基を有する医薬化合物が該アミノ基を介してA-R-NH-Y-CH2-O-CO-と結合した請求項１ないし４のいずれか１項に記載の薬物複合体。
【請求項６】
医薬化合物が(1S,9S)-1-アミノ-9- エチル-5- フルオロ-2,3- ジヒドロ-9- ハイドロキシ-4- メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7] インドリジノ[1,2-b] キノリン-10,13(9H,15H)- ジオンである請求項５に記載の薬物複合体。
【請求項７】
Ｒが-Gly-Gly-Phe-Gly- である請求項６に記載の薬物複合体。
【請求項８】
Ｒが-Gly-Gly-Gly-Phe- である請求項６に記載の薬物複合体。
【請求項９】
下記の式：
A-R-NH-Y-CH2-O-CO-Q
（式中、ＡはカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは無置換p-フェニレン基を示し；Ｑは医薬化合物の残基を示す）
で表されるＤＤＳ化合物。
【請求項１０】
医薬化合物が (1S,9S)-1-アミノ-9- エチル-5- フルオロ-2,3-ジヒドロ-9-ハイドロキシ-4- メチル-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-10,13(9H,15H)-ジオンである請求項９に記載のＤＤＳ化合物。
【請求項１１】
Ｒが-Gly-Gly-Phe-Gly- である請求項１０に記載のＤＤＳ化合物。
【請求項１２】
Ｒが-Gly-Gly-Gly-Phe- である請求項１０に記載のＤＤＳ化合物。
【請求項１３】
下記の式：
A-R-NH-Y-CH2-O-CO-X
〔式中、ＡはカルボキシC1-4アルキルデキストランポリアルコールを示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは無置換p-フェニレン基を示し；Ｘは水酸基、-O-M（Ｍはカルボキシル基の保護基を示す）、又は脱離基を示す〕で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、多糖誘導体などの薬物担体と抗腫瘍剤などの医薬化合物とをスペーサーを介して結合させた薬物複合体に関するものである。
背景技術
肺癌や消化器癌などの固形癌や白血病などの血液癌の治療に際して用いられる抗腫瘍剤は、静脈内投与や経口投与などの投与経路により全身的に投与された後、特定の腫瘍部位に移行して癌細胞の増殖を阻害ないし抑制することにより治療効果を発揮する。しかしながら、全身投与された抗腫瘍剤は、血中から肝臓・網内系臓器に速やかに取り込まれたり、あるいは速やかに尿中排泄されるために、血中濃度が低下して腫瘍部位への移行が制限される場合がある。また、通常の抗腫瘍剤自体では腫瘍部位への移行選択性（腫瘍選択性）が低いために、抗腫瘍剤が全身の様々な細胞や組織に満遍なく分布してしまい、正常な細胞や組織に対しても細胞毒として作用するので、嘔吐、発熱、あるいは脱毛などの副作用を極めて高率に発生させるという問題がある。従って、抗腫瘍剤を効率的かつ選択的に腫瘍部位に移行させる手段の開発が求められている。
このような手段の一つとして、カルボキシル基を有する多糖誘導体を薬物担体として用い、該多糖誘導体に対して抗腫瘍剤を結合させて抗腫瘍剤の血中における消失を遅延させるとともに、癌組織への指向性を高める方法が提案されている。例えば、国際公開ＷＯ９４／１９３７６号には、カルボキシル基を有する多糖のカルボキシル基にペプチド鎖（アミノ酸数１〜８）が結合されており、さらにこのペプチド鎖を介してドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、又はブレオマイシンなどを結合した薬物複合体が開示されている。また、特公平７−８４４８１号公報には、カルボキシメチル化されたマンノグルカン誘導体にシッフ塩基や酸アミド結合を介して上記の抗腫瘍剤を導入した薬物複合体が開示されている。これらの薬物複合体は、薬物担体に結合された抗腫瘍剤自体に比べてより優れた抗腫瘍効果を有するとともに、毒性・副作用が軽減されていることを特徴としている。
その他、ポリアルコール化多糖誘導体を薬物担体として用いた薬物複合体に関する技術については、「多糖−ペプチド−ドキソルビシン複合体に関する研究・多糖誘導体の血中安定性と抗腫瘍効果の関係」（第１０回日本ＤＤＳ学会講演要旨集，２７９，１９９４）；「多糖−ペプチド−ドキソルビシン複合体に関する研究・体内動態と抗腫瘍効果」（第９回日本薬物動態学会年会講演要旨集，２９２，１９９４）；第１９回研究開発動向セミナー（医薬品機構主催）要旨集，Ｄ−９，１９９５；及び「多糖キャリアーによる腫瘍への薬物送達に関する研究」（第１２回コロイド・界面技術シンポジウム，日本化学会，講演要旨集，５１，１９９５）などの報告がある。一方、抗腫瘍剤を抗体などに結合させるための技術として、パラアミノベンジルオキシカルボニル基とペプチド基とを組み合わせた試薬が開発されているが（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３８，５２５７，５２６１，１９９７）、上記のような薬物担体を備えた薬物複合体への応用は知られていない。
発明の開示
本発明者らは、多糖誘導体などの薬物担体と抗腫瘍剤などの医薬化合物とを１から８個のアミノ酸を含むスペーサーを介して結合させた薬物複合体について鋭意研究を進め、抗腫瘍剤などの医薬化合物を目的組織に対して部位選択的に移行させることができる薬物複合体を提供することに成功した（ＷＯ９７／４６２６０）。しかしながら、１から８個のアミノ酸を含むスペーサーを含む薬物複合体では、医薬化合物の遊離速度が必ずしもスペーサー部分の酵素的分解（ペプチダーゼによる加水分解）速度に依存せず、遊離速度が医薬化合物の立体構造に影響される場合があることが判明した。特に、医薬化合物の反応性官能基（例えばアミノ基）とスペーサーとの結合部分に立体障害がある場合には、この傾向が特に顕著であることが見出された。また、このような薬物複合体では、スペーサーの酵素的分解により遊離された医薬化合物にスペーサー由来のアミノ酸が１個ないし数個残存する場合があり、その結果、医薬化合物の放出にばらつきが生じることがあった。
従って、本発明の課題は、抗腫瘍剤や抗炎症剤などの医薬化合物と薬物担体とを１から８個のアミノ酸を含むスペーサーを介して結合させた薬物複合体であって、有効成分を腫瘍部位などに対して部位選択的に移行させることができ、かつ医薬化合物の遊離速度が実質的にスペーサー部分の酵素的な分解速度に依存する薬物複合体を提供することにある。また、本発明の別の課題は、医薬化合物の遊離速度が医薬化合物の立体構造によって実質的に影響を受けず、スペーサー部分の酵素的な分解速度から期待される医薬化合物の遊離速度を達成できる薬物複合体を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、抗腫瘍剤や抗炎症剤などの医薬化合物と薬物担体とを１から８個のアミノ酸を含むスペーサーを介して結合させた薬物複合体において、該スペーサーと医薬化合物との間にさらにアミノベンジルオキシカルボニル基などを挿入すると、スペーサー部分の酵素的分解が生じると直ちにアミノベンジルオキシカルボニル基が非酵素的に加水分解されて医薬化合物が遊離されること、並びにこの薬物複合体では医薬化合物の遊離速度が医薬化合物の立体構造には影響されず、実質的にスペーサー部分の酵素的な分解速度に依存していることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。本発明の薬物複合体では、医薬化合物の立体構造を考慮することなく、スペーサー部分の酵素的分解速度を基にして医薬化合物の遊離速度を制御することができるという特徴がある。
すなわち、本発明によれば、下記の式（Ｉ）：
Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑ
（式中、Ａは薬物担体である高分子を示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは置換基を有していてもよいフェニレン基を示し；Ｑは医薬化合物の残基を示す）で表される薬物複合体が提供される。この薬物複合体は、例えば、ＤＤＳ（ドラッグ・デリバリ・システム）機能を備えたＤＤＳ化合物として有用である。
別の観点からは、Ｒ’−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑ（式中、Ｒ’−は１個のアミノ酸又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含み、Ｎ末端が保護されている又は保護されていない基を示し；Ｙは置換基を有していてもよいフェニレン基を示し；Ｑは医薬化合物の残基を示す）で表される化合物；及び、下記の式：Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｘ（式中、Ａは薬物担体である高分子を示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは置換基を有していてもよいフェニレン基を示し；Ｘは水酸基、−Ｏ−Ｍ（Ｍはカルボキシル基の保護基を示す）、又は脱離基を示す）で表される化合物が提供される。これらの化合物は、上記の薬物複合体の製造用中間体として有用である。
本発明の好ましい態様によれば、薬物担体がカルボキシル基を有する多糖誘導体である上記薬物複合体；Ｒがペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーである上記薬物複合体；Ｙが置換基を有していてもよいｐ−フェニレン基である上記薬物複合体；Ｙが無置換ｐ−フェニレン基である上記薬物複合体；カルボキシル基を有する多糖誘導体がカルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールである上記薬物複合体；カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストランを処理して得られたデキストランポリアルコールである上記薬物複合体；カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールがカルボキシメチルデキストランポリアルコールである上記薬物複合体；医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である上記薬物複合体；Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−と医薬化合物のアミノ基とが結合した上記薬物複合体；並びに、医薬化合物が（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ハイドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオンである上記薬物複合体が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明により提供される薬物複合体は、式（Ｉ）：Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＧＯ−Ｑで表される。式中、Ｑは医薬化合物の残基を示すが、本発明の薬物複合体に含まれる医薬化合物の残基は、例えば、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤などの医薬としてヒトを含む哺乳類の病気の治療及び／又は予防に用いられる医薬化合物の主要な部分構造であり、少なくともその医薬作用の発現に不可欠な部分を含むものを意味している。もっとも、該医薬化合物の用途は上記のものに限定されることはなく、医薬化合物としては、Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−で表される基のカルボニル基との結合に関与できる１又は２以上の反応性官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、エステル基など）を有するものであればいかなるものを用いてもよい。本明細書において医薬化合物という場合には、それ自体が医薬作用を有する化合物の主要構造をその部分構造として含み生体内で該化合物を再生することができるプロドラッグ化合物も含まれる。
本明細書において医薬化合物の残基とは、Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−で表される基のカルボニル基と医薬化合物残基との結合が、医薬化合物中の反応性官能基とＡ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯＯＨで表されるカルボキシル基との反応（例えば脱水縮合など）により形成されたと仮定した場合において、結合後の薬物複合体中に存在する医薬化合物に由来する部分構造のことである。例えば、医薬化合物がＤ−ＮＨ２，Ｄ−ＮＨ−Ｄ’，Ｄ−ＯＨ，及びＤ−ＳＨで表される場合、医薬化合物の残基はそれぞれＤ−ＮＨ−，Ｄ−Ｎ（Ｄ’）−，Ｄ−Ｏ−，及びＤ−Ｓ−で表すことができ、これらの医薬化合物を用いた薬物複合体は、それぞれＡ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｄ，Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｎ（Ｄ’）−Ｄ，Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−Ｄ及びＡ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｓ−Ｄで表すことができる。もっとも、Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−で表される基と医薬化合物残基との結合の種類は上記のものに限定されることはない。
医薬化合物としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金系抗腫瘍剤（シスプラチン若しくはその誘導体）、タキソール若しくはその誘導体、カンプトテシン若しくはその誘導体（特開平６−８７７４６号公報に記載された抗腫瘍剤、好ましくは請求項２に記載された（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ハイドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン等）などの抗腫瘍剤を好適に用いることができる。また、例えば、コハク酸ヒドロコルチゾン、コハク酸プレドニゾロンなどのステロイド系抗炎症剤、又はメフェナム酸、フルフェナム酸、ジクロフェナク、イブプロフェン、チノリジンなどの非ステロイド系抗炎症薬の残基も好適である。
Ｙで表されるフェニレン基としては、ｏ−フェニレン基又はｐ−フェニレン基のいずれを用いてもよい。フェニレン基が置換基を有する場合、置換基の種類、並びに置換基の個数及び置換位置は特に限定されない。フェニレン基の環上に存在可能な置換基の例としては、例えば、低級アルキル基（直鎖若しくは分枝鎖のＣ１−６アルキル基、又は環状のＣ３−６アルキル基など。以下、低級アルキル部分を含む置換基についても同様である）、ハロ低級アルキル基（クロロメチル基、トリフルオロメチル基など）、ヒドロキシ低級アルキル基（ヒドロキシメチル基など）、低級アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基など）、低級アルケニル基（ビニル基、アリル基など）、低級アルキニル基（プロパルギル基など）、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（メトキシカルボニル基など）、アルカノイル基（アセチル基など）、ハロアルカノイル基（トリフルオロアセチル基など）、アリール基（フェニル基、ナフチル基など）、アラルキル基（ベンジル基など）、アリールオキシ基（フェノキシ基など）、アラルキルオキシ基（ベンジルオキシ基など）、アロイル基（ベンゾイル基など）、ヘテロアリール基（ピリジル基、キノリル基など）、アミノ基、モノ若しくはジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、チオール基、又は低級アルキルチオ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
フェニレン基の環上に２以上の置換基が存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。また、これらの置換基がさらに別の１又は２以上の官能基を有していてもよい。このような置換基の例として、具体的には、クロロフェニル基、メチルカルバモイル基、クロロベンジル基、アルコキシベンジル基などを挙げることができる。Ｙが示すフェニレン基としては、置換又は無置換のｐ−フェニレン基が好ましく、無置換のｐ−フェニレン基が特に好ましい。
Ｒはスペーサーを示す。本明細書において用いられるスペーサーという用語は、本発明の薬物複合体の部分構造であって、薬物担体である高分子と医薬化合物残基との間に存在し、１個のアミノ酸又は２ないし８個のアミノ酸からなる部分を意味しており、医薬化合物を遊離すべきではない組織や血中などにおいては医薬化合物残基を薬物担体に保持し、医薬化合物を遊離すべき組織（例えば腫瘍組織など）においては酵素的に分解されて医薬化合物を遊離する役割を有する。スペーサーとしては、１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを用いることができる。該スペーサーは、１個のアミノ酸の残基（アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）、又はペプチド結合した２ないし８個のアミノ酸を含むオリゴペプチドの残基（Ｎ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）の形態を有しており、Ｃ末端（１個のアミノ酸を含むスペーサーの場合にはカルボキシル基）でＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑにペプチド結合するように配置される。
一般的には、Ａで表される薬物担体とスペーサーとの結合は、薬物担体のカルボキシル基とオリゴペプチドスペーサーのＮ末端（１個のアミノ酸を含むスペーサーの場合にはアミノ基）とのペプチド結合により形成される。もっとも、スペーサーと薬物担体との結合は上記のペプチド結合に限定されることはなく、他の化学結合や１又は２以上のスペーサーを利用した結合であってもよい。例えば、スペーサー中に１個又は２個以上のジカルボン酸化合物の残基（例えばコハク酸などのジカルボン酸の残基など）を構成単位として含めて両末端がカルボキシル基となるようなスペーサーとした場合には、薬物担体中の反応性アミノ基などを結合に利用できる。
好ましいスペーサーは２から６個のアミノ酸を含むオリゴペプチドの残基である。スペーサーを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、例えば、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸を用いることができ、α−アミノ酸のほか、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸、γ−アミノ酪酸などを用いてもよい。このようなα−アミノ酸以外のアミノ酸は、スペーサー中で薬物担体に近接した位置に配置されることが好ましい。
オリゴペプチドを含むスペーサーを用いる場合のアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、スペーサーが−Ｘ−Ｚ−で表されるジペプチドの残基（Ｘは疎水性アミノ酸の残基を示し、Ｚは親水性アミノ酸の残基を示し、−Ｘ−Ｚ−は疎水性アミノ酸（Ｘ）と親水性アミノ酸（Ｚ）とがそれぞれＮ末端側及びＣ末端側となってペプチド結合したジペプチドのＮ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基からそれぞれ１個の水素原子及び１個の水酸基を除いた残基を意味する）であるか、又は該ジペプチドの残基を部分ペプチド配列として含むスペーサーを好適に用いることができる。疎水性アミノ酸としては、例えば、フェニルアラニン、チロシン、ロイシンなどを用いることができ、親水性アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニンなどを用いることができる。スペーサーがこのようなジペプチド残基の繰り返し配列（例えば−Ｘ−Ｚ−Ｘ−Ｚ−，−Ｘ−Ｚ−Ｘ−Ｚ−Ｘ−Ｚ−など）を有していてもよい。
このようなジペプチド構造を含むスペーサーを用いると、スペーサーがペプチダーゼが豊富であると考えられる腫瘍部位や炎症部位で加水分解され、当該部位において短時間に高濃度の医薬化合物が遊離するので、上記ジペプチドを含むスペーサーと医薬化合物とが結合して形成される部分構造は、本発明の薬物複合体の好ましい部分構造である。医薬化合物の残基として、濃度に依存した抗腫瘍作用を発現する抗腫瘍剤（より高い濃度でより強い抗腫瘍作用を発現する抗腫瘍剤：濃度依存型の抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビシンなど）の残基を用いる場合には、−Ｘ−Ｚ−で示される上記のジペプチド残基からなるスペーサー又は該ジペプチド残基を部分ペプチド配列として含むスペーサーを用いることが好ましい。
一方、医薬化合物の残基として、一定の濃度以上で作用時間の持続を必要とする抗腫瘍剤（例えば、メトトレキセートなど）を用いる場合にも、上記のスペーサーを用いることによって高い抗腫瘍効果を達成できる場合があるが、一般的には、上記のスペーサーに限定されることなく、抗腫瘍剤の体内動態の特徴や毒性などの観点から好ましいスペーサーを選択する必要がある。なお、一般的に、増殖の速い癌種に対しては、短時間に高濃度の医薬化合物を遊離することができる上記のスペーサーを選択することが好ましい。特に、本発明の薬物複合体における医薬化合物の遊離速度は、スペーサー部分の酵素的分解が実質的な律速段階になっているので、適宜のスペーサーを酵素的分解速度の見地から選択することによって医薬化合物の所望の遊離速度を容易に達成できる。
スペーサーとして利用可能なオリゴペプチドの具体例は特開平１１−９２４０５号公報の表１に記載されており、これらのオリゴペプチドは本発明のスペーサーとして好適に使用できる。
Ａで表される薬物担体としては、多糖誘導体のほか、合成高分子などを用いることができる。多糖誘導体及び合成高分子としては、生体に対して実質的に毒性を示さず、薬物担体として作用できるものであればいかなるものを用いてもよい。例えば、薬物複合体の製造に従来より用いられている多糖誘導体及び合成高分子は本発明の薬物複合体にいずれも利用可能である。例えば、カルボキシル基を有する多糖誘導体は本発明の薬物複合体に好適に使用でき、ポリアルコール化多糖誘導体は特に好適である。また、合成高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、若しくはポリリジンなどのポリアミノ酸類；又はＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド誘導体などのポリビニル化合物の誘導体を挙げることができる。
より具体的には、カルボキシル基を有する多糖誘導体としては、例えば、多糖類又はそれらを化学的若しくは生物学的に修飾した誘導体であって分子中にカルボキシル基を有するものであればいかなるものを用いてもよい。例えば、ヒアルロン酸、ペクチン酸、アルギン酸、コンドロイチン、ヘパリンなどの多糖類のほか、プルラン、デキストラン、マンナン、キチン、イヌリン、レバン、キシラン、アラバン、マンノグルカン、キトサン、プルランなどの多糖の一部又は全部の水酸基に対してカルボキシル基を有する官能基を導入したものなどを用いることができる。
例えば、水酸基をカルボキシＣ１−４アルキル化したものや、水酸基に多塩基酸の一のカルボキシル基をエステル結合させたものなどを好適に用いることができる。また、上記の多糖類をポリアルコール化した後に、カルボキシル基を有する官能基を導入したものを用いてもよい。本明細書において用いられる多糖誘導体という用語は、糖を構成要素として含む多糖化合物のほか、多糖化合物の環状糖部分を部分的又は完全に開環して得られる化合物（例えばポリアルコール化合物など）を含めて、最も広義に解釈する必要がある。これらの多糖誘導体のうち、カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールやカルボキシＣ１−４アルキルプルランポリアルコールなどを用いることが好ましい。以下、本発明の薬物複合体の製造にカルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールを利用する場合についてより具体的に説明するが、本発明の薬物複合体における薬物担体はカルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールに限定されることはない。
本発明の薬物担体の製造に用いるカルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールのポリアルコール化度は特に限定されないが、カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下においてデキストランを処理して得られたデキストランポリアルコールであって、ＤＤＳ化合物としての使用に耐える程度のポリアルコール化がされていることが好ましい。
カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールを製造するために用いるデキストランの種類は特に限定されず、α−Ｄ−１，６−結合を任意の割合で含んでいてもよい。例えば、α−Ｄ−１，６−結合の割合が８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のデキストランなどを用いることができる。デキストランの分子量は特に限定されないが、例えば１０，０００程度から２，０００，０００程度のもの、好ましくは５０，０００程度から８００，０００程度のものを用いることができる。カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシＣ１−４アルキル基を構成するＣ１−４アルキルとしては、直鎖又は分枝鎖のＣ１−４アルキル、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基などを用いることができるが、好ましくはメチル基を用いることができる。
出発原料としてデキストランを用いる場合には、デキストランに大過剰の過ヨウ素酸ナトリウムと水素化ホウ素ナトリウムとを順次作用させてデキストランを実質的に完全にポリアルコール化したデキストランポリアルコールを製造することができる。もっとも、デキストランのポリアルコール化の方法は上記のものに限定されることはなく、当業者に利用可能なものであればいかなる方法を採用してもよい。カルボキシＣ１−４アルキル化は、例えば、デキストランポリアルコールの水酸基に対してクロル酢酸、ブロム酢酸、α−クロルプロピオン酸、α−メチル−α−クロルプロピオン酸、β−クロルプロピオン酸、α−メチル−β−クロルプロピオン酸、α−クロル酪酸、β−クロル酪酸、γ−クロル酪酸などのハロゲン化Ｃ１−４アルキルカルボン酸、好ましくはクロル酢酸を反応させて水酸基を部分的又は完全にカルボキシＣ１−４アルキル化することにより行うことができる。
例えば、デキストランポリアルコールを反応に関与しない不活性溶媒（例えば、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に溶解し、塩基（例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等）の存在下にハロゲン化Ｃ１−４アルキルカルボン酸又はその塩を添加し、氷冷下ないし１００℃程度の温度範囲で数分ないし数日間反応させればよい。カルボキシＣ１−４アルキル基の導入の程度は、例えば、カルボキシＣ１−４アルキル化の反応温度や試薬として用いるハロゲン化Ｃ１−４アルキルカルボン酸及び塩基の量を適宜選択することにより容易に調節可能であり、そのような手段は当業者に周知である。デキストランポリアルコールの水酸基に対するカルボキシＣ１−４アルキル化の程度は特に限定されないが、例えば、構成糖残基あたり０．０１〜２．０の範囲、好ましくは０．１〜１．０の範囲である。このようにして、カルボキシＣ１−４アルキルデキストランポリアルコールのナトリウム塩又はカリウム塩などのアルカリ金属塩の形態の水溶液を調製することができる。
上記のようにして調製されるアルカリ金属塩の形態の多糖誘導体のほか、有機アミンの塩の形態の多糖誘導体を薬物担体の原料として用いてもよい。有機アミンの塩の形態の多糖誘導体は、実質的に水を含まない有機溶媒中に高濃度に溶解できるので、この塩を用いると反応を非水系で行うことができ、反応効率を顕著に高めることができる場合がある。有機アミンの塩としては、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリエタノールアミンなどの脂肪族アミン類の塩のほか、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジメチルアミノピリジンなどの脂環式又は芳香族アミン類の塩、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウムなどの四級アンモニウム塩、などを用いることができる。
多糖誘導体のナトリウム塩から有機アミンの塩への変換は、イオン交換樹脂などを用いて行うことができる。例えば、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を水に溶解し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ２（２００−４００メッシュ、Ｈ＋型）樹脂を充填したカラムに付して水で溶出した後、トリエチルアミンなどの有機アミンを添加して凍結乾燥することができる。また、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を水に溶解し、トリエチルアンモニウム型の樹脂を通過させることによって一工程で変換を行うことも可能である。
本発明の薬物複合体は、例えば、Ｒ’−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑ（式中の定義は上記と同義である）で表される化合物を適宜の方法により製造し、必要に応じて保護基を除去した後、スペーサーのＮ末端アミノ基とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とを酸アミド結合により結合させることにより製造することができる。例えば、Ｎ−末端を保護したペプチド化合物を酸アミド結合によりＮＨ２−Ｙ−ＣＨ２−ＯＨのアミノ基に結合させ、必要に応じてペプチド鎖を延長した後、水酸基にＣＯ−Ｘ部分又はＣＯ−Ｑ部分を導入することができる。ＣＯ−Ｘ部分を導入した場合には、さらにＸをＱに変換すればよい。ＣＯ−Ｘ部分の導入に用いる反応剤としては、ｐ−ニトロフェニルジカルボネート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（Ｘがｐ−ニトロフェノキシ基に相当する）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（Ｘがイミダゾイル基に相当する）などを用いることができる。ＣＯ−Ｑ部分を導入する方法としては、Ｑにホスゲンを作用して得られるＣｌ−ＣＯ−Ｑ、Ｑにｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを作用させて得られるＸ−ＣＯ−Ｑ（Ｘがｐ−ニトロフェノキシ基に相当する）などを用いることができる。また、Ｒ’−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＸをＲ’−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑに変換するときには、医薬化合物又は保護された医薬化合物を反応させるが、必要により、ＸとＱの種類に応じてトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基や、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性化剤を反応系に添加してもよい。その後、保護基の種類に応じて適宜の方法で保護基を除去することにより目的物を得ることができる。保護基の種類と除去の方法は、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９１）などに記載されている。例えば、ｔ−ブチルカルボニル基の場合には、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸などの酸類、好ましくはギ酸などの比較的弱い酸を用いることができ、トリチル基の場合には、酢酸などの酸類を用いることができる。９−フルオレニルメチルカルボキシ基の場合には、ピペラジンなどの塩基類を用いることができる。
酸アミド結合の形成には、ペプチド鎖の合成に用いる通常の脱水縮合剤、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなＮ，Ｎ’−ジシクロアルキルカルボジイミド類、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＰＣ）等のカルボジイミド誘導体、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）のようなベンゾトリアゾール誘導体のほか、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＥＥＤＱ）などを用いることができる。また、活性エステル法や酸ハライド法などにより反応を行ってもよい。
多糖誘導体を用いた反応を非水系で行う場合には、実質的に水を含まない有機溶媒であって、反応種（多糖誘導体の有機アミンの塩及び遊離又は塩の形態のＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑ：Ｈ−ＲはＮ末端が保護されていないことを示す）を溶解することができるものならばいかなるものを用いてもよい。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、スルホランなどを用いることが好適である。薬物担体に導入される医薬化合物残基の量は特に限定されないが、医薬化合物残基の種類、並びに薬物複合体の体内動態、薬効、及び毒性などの観点から適宜選択すべきである。一般的には、０．１〜３０重量％、好ましくは２〜１５重量％程度の範囲を選択することができる。薬物担体に導入された医薬化合物残基の割合は、例えば、吸光度分析などにより容易に決定することが可能である。
なお、本発明の薬物複合体の製造方法のさらに具体的な例を実施例に示した。当業者は、上記の一般的な説明及び実施例の具体的説明を基にして、出発原料や反応試薬を適宜選択することにより、また必要に応じて反応条件や工程に適宜の修飾ないし改変を加えることにより、上記一般式（Ｉ）に包含される本発明の薬物複合体を製造することができる。
本発明の薬物複合体は、医薬化合物の残基の種類（例えば、抗腫瘍剤又は抗炎症剤などの医薬化合物の残基）に応じて、所望の医薬活性を腫瘍部位や炎症部位などの局所において特異的に発現させることができ、かつ、医薬化合物自体の有する毒性を低減できるという特徴を有する。例えば、多糖誘導体部分としてカルボキシメチルデキストランポリアルコールを有する薬物複合体は極めて優れた血管透過性を有しており、腫瘍選択性及び炎症部位選択性を有している。
また、本発明の薬物複合体では、腫瘍部位や炎症部位においてプロテアーゼ（ペプチダーゼ）によりスペーサー部分が酵素的に加水分解されると、直ちにアミノベンジルオキシカルボニルアミドのウレタン結合が加水分解されるという特徴を有している。従って、本発明の薬物複合体では、遊離後の医薬化合物にスペーサー由来のアミノ酸が全く残存せず、医薬化合物自体の薬効が損なわれることがない。さらに、本発明の薬物複合体では、スペーサーの種類を選ぶことによって医薬化合物の適切な遊離速度を達成できるという特徴がある。
本発明の薬物複合体を含む医薬は、通常、凍結乾燥品などの形態でバイアル等に充填することができ、用時溶解型の注射用又は点滴用製剤等の非経口投与用製剤として臨床に提供されるが、このような医薬の製剤形態は上記態様に限定されることはない。上記製剤の製造には、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、安定化剤など当業界で利用可能な製剤用添加物を用いることができる。上記医薬の投与量は特に限定されないが、通常は、医薬化合物残基を構成する医薬化合物の投与量、薬物複合体中に導入された医薬化合物の残基の量、患者の状態や疾患の種類などを勘案して決定すべきである。例えば、特開平６−８７７４６号公報の請求項２に記載された抗腫瘍剤の残基が約６重量％程度の割合で導入された薬物複合体を投与する場合には、非経口投与の場合には、一般に一日あたり体表面積１ｍ２につき約０．１〜１００ｍｇ程度、好ましくは約１〜３０ｍｇの範囲で一回投与し、３〜４週毎に繰り返すことが好ましい。
別の観点から提供される本発明の化合物は、下記一般式（ＩＩ）：Ｒ’−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｑ（式中、Ｒ’は１個のアミノ酸又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含み、Ｎ末端が保護されているか又は保護されていない基を示し；Ｙは置換基を有していてもよいフェニレン基を示し；Ｑは医薬化合物の残基を示す）で表される。この化合物において、Ｙが無置換ｐ−フェニレン基であり、Ｒ’がＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−又はＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−で表される基であり、医薬化合物が（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ハイドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオンである化合物が好ましい。
また、下記の一般式（ＩＩＩ）：Ａ−Ｒ−ＮＨ−Ｙ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｘ〔式中、Ａは薬物担体である高分子を示し；Ｒは１個のアミノ酸を含むスペーサー又はペプチド結合した２から８個のアミノ酸を含むスペーサーを示し；Ｙは置換基を有していてもよいフェニレン基を示し；Ｘは水酸基、−Ｏ−Ｍ（Ｍはカルボキシル基の保護基を示す）、又は脱離基を示す〕で表される化合物も本発明により提供される。カルボキシル基の保護基の種類は特に限定されず、当業者に利用可能なものであればいかなるものを用いてもよい。また、脱離基はカルボニル炭素上での置換反応において脱離基として作用するものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、塩素原子、臭素原子などのハロゲン原子、エトキシ基などのアルコキシル基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基などのアリールスルホニルオキシ基などを挙げることができる。なお、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）におけるＹ、Ｑ、又はＲなどの記号は式（Ｉ）についてすでに説明したものと同義である。式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表されるこれらの化合物は、本発明の薬物複合体の製造用中間体として有用である。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例中、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシメチル化度（構成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度）は、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩を遊離酸型に変換した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解して０．１Ｎ塩酸で滴定することにより求めた。カルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩の水溶液をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−ｘ２（Ｈ＋）型カラムに付して通過液を凍結乾燥して試料として用いた。この試料を所定過剰量の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、フェノールフタレンを指示薬として０．１Ｎ塩酸で滴定した。試料の採取量をｓ（ｍｇ）、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液の所定過剰量をａ（ｍｌ）、０．１Ｎ塩酸の滴定量をｂ（ｍｌ）とし、カルボキシメチル化度を１３．４（ａ−ｂ）／［ｓ−５．８（ａ−ｂ）］の式により求めた。また、薬物の導入量（重量％）は、薬物の特性吸収を利用した吸光度分析（３６２ｎｍ付近）から求めた。さらに、ゲル濾過法は次の条件に従って行った（カラム：ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ４０００ＰＷＸＬ、溶離液：０．１Ｍ  ＮａＣｌ、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃）。
また  ＤＸ−８９５１は特開平６−８７７４６号公報の請求項２に記載された医薬化合物〔（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ハイドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオン〕であり、−ＣＯ−ＤＸ−８９５１は該医薬化合物の１−位アミノ基が−ＣＯ−で表されるカルボニル基とペプチド結合を形成していることを示す。ＤＸ−８９５１はラクトン環が閉環型若しくは開環型のいずれか又はそれらの混合形態として存在していることを理解すべきである。また、下記スキームに示された糖鎖の構成単位には１個又は２個のカルボキシメチル基が導入されているが、これは糖鎖の構成単位の一例を示したものであり、本発明の薬物複合体の薬物担体部分が上記構成単位の繰り返しによって構成されるものではないことを理解すべきである。なお、実施例中の化合物番号は以下のスキーム中の化合物番号に対応させてある。例えば、実施例５中の化合物２ａはスキーム中の化合物２ａに対応し、このスキーム中の構造式のペプチド部分がＧＧＦＧの化合物を表している（スキーム中、Ｐｅｐｔｉｄｅ＝ＧＧＦＧと記載されている）。
0004560210.tif 000002
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例１：カルボキシメチルデキストランポリアルコール−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＤＸ８９５１の合成
デキストランＴ５００（２０ｇ，ファルマシア社製，分子量５００Ｋ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５，２０００ｍｌ）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（６６．０ｇ）の水溶液（２０００ｍｌ）を加えた。遮光しながら４℃で１０日間撹拌した後、エチレングリコール（１４．０ｍｌ）を加え、一晩撹拌した。反応液を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（２８ｇ）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でｐＨ５．５に調整して４℃で１時間撹拌した後、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５に調整した。得られた水溶液をバイオマックス−５０膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（１０．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は１５９Ｋであった。
このデキストランポリアルコール（７．５ｇ）を、水酸化ナトリウム（３１．５ｇ）を水（２２５ｍｌ）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（４５ｇ）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。この反応液を酢酸でｐＨを８に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（８．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は２７４Ｋであり、カルボキシメチル化度は０．４であった。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ（８７５ｍｇ）、４−アミノベンジルアルコール（４９２ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）の混合物に、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（９８９ｍｇ）を加えた。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製して化合物（２）を８００ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．７３（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．９１−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ），４．５０−４．５４（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），３．６６−３．９４（ｍ，３Ｈ），３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１６．７Ｈｚ），３．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，１３．５Ｈｚ），１．３８（ｓ，９Ｈ）．
化合物（２）（４６５ｍｇ）、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（５２２ｍｇ）、ジイソプロピルエリルアミン（０．２２４ｍｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１０．５ｍｇ）及びテトラヒドロフラン（３ｍｌ）の混合物を室温で４日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９９：１溶液）で精製して化合物（３）を２０５ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８８（ｓ，１Ｈ），８．４０−８．４２（ｍ，１Ｈ），８．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．２７−８．２８（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９４（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９３−６．９５（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ），４．５０−４．５３（ｍ，１Ｈ），３．７７−３．９５（ｍ，３Ｈ），３．６１−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５，１３．５Ｈｚ），１．３８（ｓ，９Ｈ）．
化合物（３）（１８５ｍｇ）、ＤＸ−８９５１のメタンスルホン酸塩（１５２ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５４ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０９３ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物を室温で２日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製し、得られた黄色固体を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：０．５％酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝９７：３溶液）で精製して化合物（４）を１３０ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８４（ｓ，１Ｈ），８．４０−８．４１（ｍ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９２−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９４−６．９５（ｍ，１Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），５．２４−５．３４（ｍ，３Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．４９−４．５２（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１６．７Ｈｚ），３．５４−３．５６（ｍ，１Ｈ），３．３１−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３，１３．５Ｈｚ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．８６−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）；ｍ／ｅ  ７９７（Ｍ＋１）
化合物（４）（９８ｍｇ）をトリフルオロ酢酸（１．５ｍｌ）に溶かし、１．５時間放置した。反応液をエーテル（３０ｍｌ）に滴下し、沈殿を濾取した。エーテルで洗浄して化合物（５）を１００ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８６（ｓ，１Ｈ），８．４８−８．６１（ｍ，２Ｈ），８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．００−８．２０（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），７．６６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．１９（ｍ，１Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），５．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．０Ｈｚ），５．３３−５．４８（ｍ，３Ｈ），５．２３−５．３０（ｍ，１Ｈ），５．０８−５．１１（ｍ，２Ｈ），４．５８−４．６１（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．９９（ｍ，３Ｈ），３．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９，１６．６Ｈｚ），３．５６−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．２２−３．３０（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．１８（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．１１（ｍ，１Ｈ），２．７８−２．８３（ｍ，１Ｈ），２．４６−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．１８−２．２３（ｍ，１Ｈ），１．８２−１．９３（ｍ，２Ｈ），０．９０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
化合物（５）（９５ｍｇ）を水（５ｍｌ）とメタノール（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液を、上で得られたカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（６００ｍｇ）を水（１０ｍｌ）とメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液に加えた。水溶性カルボジイミド（２６ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５ｍｇ）を加えた後、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。室温で２時間撹拌した後、水溶性カルボジイミド（１３ｍｇ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に水（５００ｍｌ）を加えた後、限外濾過膜１０Ｋ（フィルトロン社製）を用いて限外濾過した。膜を通過しない残留溶液を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９とし、濾過膜（０．１６μｍ、フィルトロン社製）を通過させた。通過した溶液をバイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥して化合物（６）を４９０ｍｇ得た。本化合物を０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解後、ＧＰＣ（カラム：東ソ−ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ−４０００ＸＬ、溶媒：０．１Ｍ  ＮａＣｌ、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（０．１Ｍトリス緩衝液，ｐＨ１０．０，０．２０ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ図１及び図２に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）：アセトニトリル＝７：３中での３６６ｎｍにおける吸光度に基づいて定量したところ２．３％（Ｗ／Ｗ）であった。
例２：薬物複合体からの医薬化合物の遊離
３７℃のＭｅｔｈ  Ａ（ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  Ｍｅｔｈ  Ａ）ホモジネート中又は緩衝液中に例１で得た薬物複合体を溶解し（３７８μｇ／ｍｌ）、２０時間後に遊離されたＤＸ−８９５１を定量した。スペーサーとＤＸ−８９５１とをｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基を介さずに結合した化合物を製造して比較化合物として用いた。結果を表１に示す。薬物遊離量は用いた薬物複合体中の薬物量に対する遊離した薬物量（％）で示した。本発明の薬物複合体は、弱酸性のホモジネート中で速やかに遊離されたが、緩衝液中ではほとんど遊離されなかった。一方、比較化合物は弱酸性のホモジネート中でごく少量遊離されたが、緩衝液中では全く遊離されなかった。
0004560210.tif 000004
例３：Ｍｅｔｈ  Ａ担癌マウスに対する例１の薬物複合体の最大耐量（ＭＴＤ、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  Ｄｏｓｅ）
Ｍｅｔｈ  Ａ細胞をＢＡＬＢ／ｃ系マウスに移植してＭｅｔｈ  Ａ担癌マウスを作成し、２０日目に例１の薬物複合体を単回投与した。投与後、経時的に体重測定、毒性死の有無の観察を実施し、最大体重減少率、死亡率を表２にまとめた。投与量はＤＸ−８９５１の無水遊離塩基の重量に換算したものを示す。２．５ｍｇ／ｋｇ投与時においてわずかな体重減少、１０ｍｇ／ｋｇ投与時において全例の毒性死が観察されたことから、例１のＭＴＤを５〜７．５ｍｇ／ｋｇと判断した。
0004560210.tif 000005
例４：例１の薬物複合体の抗腫瘍活性
Ｍｅｔｈ  Ａ細胞（ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  Ｍｅｔｈ  Ａ）をＢＡＬＢ／ｃ系マウスに移植してＭｅｔｈ  Ａ担癌マウスを作成し、移植後７日目に例１の薬物複合体を単回投与した。腫瘍の重量を２１日目に測定して、腫瘍に対する抑制効果と毒性を評価した。結果を表３に示す。表中、＊はダネット検定で有意差ありを示し（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１）、投与量はＤＸ−８９５１の無水遊離塩基の重量に換算したものを示し、ＩＲは腫瘍の縮小率を示す。例１の薬物複合体が用量依存的に腫瘍の縮小効果を発揮することが明らかである。
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例５：脱保護剤としてギ酸を用いた、カルボキシメチルデキストランポリアルコール−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＤＸ８９５１の合成
デキストランＴ５００（２０ｇ，ファルマシア社製，分子量５００Ｋ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５，２０００ｍｌ）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（６６．０ｇ）の水溶液（２０００ｍｌ）を加えた。遮光しながら４℃で１０日間撹拌した後、エチレングリコール（１４．０ｍｌ）を加え、一晩撹拌した。反応液を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（２８ｇ）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でｐＨ５．５に調整して４℃で１時間撹拌した後、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５に調整した。得られた水溶液をバイオマックス−５０膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（１０．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は１５９Ｋであった。
このデキストランポリアルコール（７．５ｇ）を、水酸化ナトリウム（３１．５ｇ）を水（２２５ｍｌ）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（４５ｇ）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。この反応液を酢酸でｐＨを８に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（８．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は２７４Ｋであり、カルボキシメチル化度は０．４であった。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ（８７５ｍｇ）、４−アミノベンジルアルコール（４９２ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）の混合物に、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（９８９ｍｇ）を加えた。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製して化合物２ａ（８００ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．７３（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．９１−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ），４．５０−４．５４（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），３．６６−３．９４（ｍ，３Ｈ），３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１６．７Ｈｚ），３．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，１３．５Ｈｚ），１．３８（ｓ，９Ｈ）．
化合物２ａ（４６５ｍｇ）、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（５２２ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．２２４ｍｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１０．５ｍｇ）及びテトラヒドロフラン（３ｍｌ）の混合物を室温で４日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９９：１溶液）で精製して化合物３ａ（２０５ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８８（ｓ，１Ｈ），８．４０−８．４２（ｍ，１Ｈ），８．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．２７−８．２８（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９４（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９３−６．９５（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ），４．５０−４．５３（ｍ，１Ｈ），３．７７−３．９５（ｍ，３Ｈ），３．６１−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５，１３．５Ｈｚ），１．３８（ｓ，９Ｈ）．
化合物３ａ（１８５ｍｇ）、ＤＸ−８９５１のメタンスルホン酸塩（１５２ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５４ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０９３ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物を室温で２日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製した。得られた黄色固体をもう一度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：０．５％酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝９７：３溶液）で精製してして化合物４ａ（１３０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８４（ｓ，１Ｈ），８．４０−８．４１（ｍ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．９２−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９４−６．９５（ｍ，１Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），５．２４−５．３４（ｍ，３Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．４９−４．５２（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，１６．７Ｈｚ），３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１６．７Ｈｚ），３．５４−３．５６（ｍ，１Ｈ），３．３１−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１３．５Ｈｚ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３，１３．５Ｈｚ），２．３８（ｓ，３Ｈ），１．８６−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）．
化合物４ａ（２００ｍｇ）をギ酸（４ｍｌ）に溶かし、２時間放置した。反応液をエーテル（４０ｍｌ）に滴下した。沈澱をエーテルで洗浄して化合物５ａ（１９８ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．９０（ｓ，１Ｈ），８．４８−８．５０（ｍ，１Ｈ），８．３３−８．３６（ｍ，１Ｈ），８．２７−８．３０（ｍ，２Ｈ），８．００−８．０８（ｍ，１Ｈ），７．７４−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３１−７．３９（ｍ，３Ｈ），７．２１−７．２５（ｍ，５Ｈ），７．１５−７．２０（ｍ，１Ｈ），５．４３−５．４８（ｍ，２Ｈ），５．２２−５．３３（ｍ，３Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１６．５Ｈｚ），３．８０−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．６４−３．７２（ｍ，３Ｈ），３．２０−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．１３（ｍ，１Ｈ），３．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，１３．８Ｈｚ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１，１３．８Ｈｚ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１５−２．２２（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．８８（ｍ，２Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
化合物５ａ（１９０ｍｇ）を水（５ｍｌ）とメタノール（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液を、例１で得たカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（１．０ｇ）を水（１０ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）に溶かした溶液に加えた。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４４ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（３９ｍｇ）を加えた後、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。室温で３時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（２２ｍｇ）を加えた。室温で１．７５時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（１１ｍｇ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液を０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．９に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥した。得られたアモルファスを、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウオーターズ社製）及びＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ＋ｆｏｒｍ）カラムで精製した後、再度バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥して化合物６ａ（７００ｍｇ）を得た。本化合物を０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解後、ＧＰＣ（カラム：東ソーＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ−４０００ＸＬ、溶媒：２０％アセトニトリル含有０．１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（０．１Ｍトリス緩衝液，ｐＨ９．０，０．１０ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ図３及び図４に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）：アセトニトリル＝７：３中での３６６ｎｍにおける吸光度に基づいて定量したところ３．３％（Ｗ／Ｗ）であった。
例６：脱保護剤としてギ酸を用いた、カルボキシメチルデキストランポリアルコール−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＮＨ−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＤＸ８９５１の合成
デキストランＴ５００（２０ｇ，ファルマシア社製，分子量５００Ｋ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５，２０００ｍｌ）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（６６．０ｇ）の水溶液（２０００ｍｌ）を加えた。遮光しながら４℃で１０日間撹拌した後、エチレングリコール（１４．０ｍｌ）を加え、一晩撹拌した。反応液を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（２８ｇ）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でｐＨ５．５に調整して４℃で１時間撹拌した後、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５に調整した。得られた水溶液をバイオマックス−５０膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（１０．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は１５９Ｋであった。
このデキストランポリアルコール（７．５ｇ）を、水酸化ナトリウム（３１．５ｇ）を水（２２５ｍｌ）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（４５ｇ）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。この反応液を酢酸でｐＨを８に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（８．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は２７４Ｋであり、カルボキシメチル化度は０．４であった。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１０００ｍｇ）、４−アミノベンジルアルコール（３２４ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４６４ｍｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）の混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（５７１ｍｇ）を加えた。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９２：８溶液）で精製して化合物２ｂ（１２２０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．９１（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），８．０８−８．２０（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２５−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．１６−７．２１（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），４．６２−４．６７（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９，５．４Ｈｚ），３．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１６．６Ｈｚ），３．５９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４，１３．７Ｈｚ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，１３．７Ｈｚ），１．３７（ｓ，９Ｈ）．
化合物２ｂ（１１６０ｍｇ）、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（１３０３ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５５５ｍｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２６ｍｇ）及びテトラヒドロフラン（０ｍｌ）の混合物を室温で４日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製して化合物３ｂ（６５０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．０７（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．２４−８．２５（ｍ，１Ｈ），８．０９−８．１２（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２７−７．２８（ｍ，５Ｈ），７．１８−７．１９（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），５．６８−５．７３（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），４．６４−４．６９（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．７９（ｍ，６Ｈ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９，１３．７Ｈｚ），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，１３．７Ｈｚ），１．３７（ｓ，９Ｈ）．
化合物３ｂ（５７６ｍｇ）、ＤＸ−８９５１のメタンスルホン酸塩（４９７ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１１３ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．３０３ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）の混合物を室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：０．５％酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝９２：８溶液）で精製してして化合物４ｂ（２９０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），８．０９−８．１３（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），７．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．１９（ｍ，１Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），５．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），５．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），５．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ），５．２７−５．２９（ｍ，１Ｈ），５．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．６２−４．６７（ｍ，１），３．７３−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５３−３．５９（ｍ，２Ｈ），３．２３−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９，１３．７Ｈｚ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，１３．７Ｈｚ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１７−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），０．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
化合物４ｂ（２００ｍｇ）をギ酸（４ｍｌ）に溶かし、２時間放置した。反応液をエーテル（４０ｍｌ）に滴下した。沈澱をエーテルで洗浄して化合物５ｂ（１９８ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．０６（ｓ，１Ｈ），８．２０−８．４１（ｍ，３Ｈ），８．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２１−７．３０（ｍ，５Ｈ），７．１８−７．２０（ｍ，１Ｈ），５．４１−５．４８（ｍ，２Ｈ），５．２３−５．３３（ｍ，３Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．６２−４．６５（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，２Ｈ），３．７２−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１６．５Ｈｚ），３．５８−３．６０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１３．７Ｈｚ），３．２０−３．２３（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．１３（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１３．７Ｈｚ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，１３．７Ｈｚ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１５−２．２２（ｍ，２Ｈ），１．８４−１．９０（ｍ，２Ｈ），０．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）．
化合物５ｂ（１００ｍｇ）を水（５ｍｌ）とメタノール（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液を、例１で得られたカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（１１００ｍｇ）を水（１０ｍｌ）とメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液に加えた。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（２６ｍｇ）を加えた後、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。室温で２時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（２５ｍｇ）を加えた。室温で１．５時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（１３ｍｇ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液を０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．５に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥した。得られたアモルファスを、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウオーターズ社製）及びＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ＋ｆｏｒｍ）カラムで精製した後、再度バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥して化合物６ｂ（４０５ｍｇ）を得た。本化合物の医薬化合物残基の含量を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）：アセトニトリル＝７：３中での３６６ｎｍにおける吸光度に基づいて定量したところ１．７％（Ｗ／Ｗ）であった。
例７：脱保護剤としてギ酸を用いた、カルボキシメチルデキストランポリアルコール−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ｐ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＤＸ８９５１の合成
デキストランＴ５００（２０ｇ，ファルマシア社製，分子量５００Ｋ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５，２０００ｍｌ）に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム（６６．０ｇ）の水溶液（２０００ｍｌ）を加えた。遮光しながら４℃で１０日間撹拌した後、エチレングリコール（１４．０ｍｌ）を加え、一晩撹拌した。反応液を８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（２８ｇ）を加えて溶解した後、一晩撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸でｐＨ５．５に調整して４℃で１時間撹拌した後、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５に調整した。得られた水溶液をバイオマックス−５０膜を用いて限外濾過法による脱塩を行なった。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥して、デキストランポリアルコール（１０．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は１５９Ｋであった。
このデキストランポリアルコール（７．５ｇ）を、水酸化ナトリウム（３１．５ｇ）を水（２２５ｍｌ）に溶かして得られる水溶液に加え、室温で溶解させた。この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（４５ｇ）を加えて溶解させた後、室温で一晩反応させた。この反応液を酢酸でｐＨを８に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液を凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（８．５ｇ）を得た。この物質の分子量（ゲル濾過、プルラン標準）は２７４Ｋであり、カルボキシメチル化度は０．４であった。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２．３ｇ）、４−アミノベンジルアルコール（２．０ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．２９ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（４．０５ｇ）を加えた。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９４：６溶液）で精製して化合物２ｃ（２．９ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．７５（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．０７（ｓ，１Ｈ），５．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．６０（ｓ，１Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）．
化合物２ｃ（１．０ｇ）、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（２．７２ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．１７ｍｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（５５ｍｇ）及びテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）の混合物を室温で３日間撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン：メタノール＝９６：４溶液）で精製して化合物３ｃ（３７６ｍｌｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．９２（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１４−８．２５（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．２５（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．
化合物３ｃ（３３８ｍｇ）、ＤＸ−８９５１のメタンスルホン酸塩（４００ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０９ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．２４３ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物を室温で一晩撹拌しながら反応させた後、反応液を減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：０．５％酢酸を含むジクロロメタン：メタノール＝９４：６溶液）で精製してして化合物４ｃ（４６０ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．８４（ｓ，１Ｈ），８．１３−８．１５（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），７．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．４８（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），５．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．０Ｈｚ），５．２６−５．２９（ｍ，１Ｈ），５．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．０Ｈｚ），５．０８（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．０７−３．１２（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．１５−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．８３−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），０．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．  化合物４ｃ（１００ｍｇ）をギ酸（４ｍｌ）に溶かし、２時間放置した。反応液をエーテル（４０ｍｌ）に滴下した。沈澱をエーテルで洗浄して化合物５ｃ（９８ｍｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．２４−８．３０（ｍ，３Ｈ），８．０５−８．０９（ｍ，１Ｈ），７．７３−７．７６（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．３４−７．３８（ｍ，３Ｈ），６．５１（ｓ，１Ｈ），５．４１−５．４９（ｍ，２Ｈ），５．２４−５．３１（ｍ，３Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），３．２８（ｓ，２Ｈ），３．０７−３．１４（ｍ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１４−２．２８（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．９０（ｍ，２Ｈ），０．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）．
化合物５ｃ（９５ｍｇ）を水（１５ｍｌ）とメタノール（１５ｍｌ）に溶解した。この溶液を、例１で得られたカルボキシメチルデキストランポリアルコールのナトリウム塩（１０００ｍｇ）を水（１５ｍｌ）とメタノール（１５ｍｌ）に溶かした溶液に加えた。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２８ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（５３ｍｇ）を加えた後、０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整した。室温で３時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（２６ｍｇ）を加えた。室温で１．５時間撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（１２ｍｇ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液を０．１規定水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．５に調整した後、バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥した。得られたアモルファスを、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウオーターズ社製）及びＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ＋ｆｏｒｍ）カラムで精製した後、再度バイオマックス−５０膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター（０．２２μｍ）で濾過した後、凍結乾燥して化合物６ｃ（５８８ｍｇ）を得た。本化合物を０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解後、ＧＰＣ（カラム：東ソーＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ−４０００ＸＬ、溶媒：２０％アセトニトリル含有０．１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ）で分析した結果、及び本化合物の紫外線吸収スペクトル（０．１Ｍトリス緩衝液，ｐＨ９．０，０．１２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ図５及び図６に示す。本化合物の医薬化合物残基の含量を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）：アセトニトリル＝７：３中での３６６ｎｍにおける吸光度に基づいて定量したところ３．３％（Ｗ／Ｗ）であった。
例８：薬物複合体からの医薬化合物の遊離
３７℃のＭｅｔｈ  Ａ（ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  Ｍｅｔｈ  Ａ）ホモジネート中又は緩衝液中に例５、６、及び７で得た薬物複合体を溶解し（５０μｇ／ｍｌ）、２０時間後に遊離されたＤＸ−８９５１を定量した。スペーサーとＤＸ−８９５１とをｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基を介さずに結合した化合物を製造して比較化合物として用いた。結果を表４に示す。薬物遊離量は用いた薬物複合体中の薬物量に対する遊離した薬物量（％）で示した。例５、６、及び７の薬物複合体は、弱酸性のホモジネート中で速やかに遊離されたが、緩衝液中ではほとんど遊離されなかった。一方、比較化合物は弱酸性のホモジネート中でごく少量遊離されたが、緩衝液中では全く遊離されなかった。
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例９：Ｍｅｔｈ  Ａ担癌マウスに対する例５、例６、及び例７の薬物複合体の最大耐量（ＭＴＤ、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  Ｄｏｓｅ）
Ｍｅｔｈ  Ａ細胞をＢＡＬＢ／ｃ系マウスに移植してＭｅｔｈ  Ａ担癌マウスを作成し、１３日目に例５、例６及び例７で得た薬物複合体を単回投与した。投与後、経時的に体重測定、毒性死の有無の観察を実施し、最大体重減少率、死亡率を表５にまとめた。投与量はＤＸ−８９５１の無水遊離塩基の重量に換算したものを示す。
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体重減少及び死亡例が観察された投与量から、各複合体のＭＴＤを以下のように判断した。
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例５で得た薬物複合体のＭＴＤは例１で得た薬物複合体のＭＴＤ（例３参照）の約１／３であり、例１で得た薬物複合体を用いた場合のＤＸ−８９５１の遊離率（例２の表参照）が、例５で得た薬物複合体を用いた場合のＤＸ−８９５１の遊離率の約１／３（例８の表参照）であることと、相関していた。
例１０：例５及び例６に示した複合体の抗腫瘍活性
Ｍｅｔｈ  Ａ細胞をＢＡＬＢ／ｃ系マウスに移植してＭｅｔｈ  Ａ担癌マウスを作成し、移植後７日目に例１，例５及び例６で示した薬物複合体を単回投与した。腫瘍の重量を２１日目に測定して、腫瘍に対する抑制効果と毒性を評価した。結果を表に示す。表中、＊はダネット検定で有意差有りを示し（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）、投与量はＤＸ−８９５１の無水遊離塩基の重量に換算したものを示し、ＩＲは腫瘍の縮小率を示す。例５及び例６で示した薬物複合体が用量依存的に腫瘍の縮小効果を発揮することが明らかである。
また、例５で示した薬物複合体の最小有効用量は、例１で示した薬物複合体の最小有効用量の約１／３であり、腫瘍ホモジネート中でのＤＸ−８９５１の遊離率（例２の表及び例８の表参照）及びＭｅｔｈ  Ａ担癌マウスでのＭＴＤ（例３の表及び例９参照）において、同様な乖離が観察されたことと相関していた。
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産業上の利用可能性
本発明の薬物複合体は、抗腫瘍剤や抗炎症剤などの医薬化合物を腫瘍部位などに対して部位選択的に移行し、その部位において医薬化合物を速やかに遊離することができる。また、遊離後の医薬化合物にはスペーサー部分に由来するアミノ酸が残存しないので、期待される医薬化合物の薬効を確実に発揮できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の薬物複合体（例１）のＧＰＣ（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）チャートを示す。
図２は、本発明の薬物複合体（例１）の紫外線吸収スペクトルを示す。
図３は、本発明の薬物複合体（例５）のＧＰＣチャートを示す。
図４は、本発明の薬物複合体（例５）の紫外線吸収スペクトルを示す。
図５は、本発明の薬物複合体（例７）のＧＰＣチャートを示す。
図６は、本発明の薬物複合体（例７）の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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