(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする劇症肝炎疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は劇症肝炎疾患治療剤に関する。より詳細には、肝実質細胞増殖因子(Hepatocyte Growth Factor、以下、ＨＧＦという)を有効成分として含有し、劇症肝炎の治療及び予防に有用な劇症肝炎疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓は糖新生、アミノ酸代謝、脂質代謝、さらには血漿蛋白の合成、分泌、胆汁の生成分泌、解毒、エネルギー源としての糖の貯蔵、ビタミン類の貯蔵など多くの生理機能を有する生体にとって必須の臓器である。この臓器はウイルス感染や長期にわたるアルコール摂取などが原因で肝炎を発症する。
劇症肝炎は、肝炎ウイルスや薬物が原因となって、肝細胞の広帆な壊死と脱落をきたす重篤な肝障害で致命率が高い。第１２回犬山シンポジウム（１９８１年８月）の診断基準では、激症肝炎とは、肝炎のうち症状発現後約８週間以内に高度の肝機能障害に基づいて肝性昏睡をきたし、プロトロンビン時間４０％以下を示すものとされ、そのうちには発現後１０日以内に脳症が発現する急性型と１１日以後に発現する亜急性型がある。臨床像では肝炎症状発現後、数日以内に黄疸が高度となり、急速に意識障害を伴ってくる。早期から出血傾向を伴い、肝濁音界の縮小もみられる。血清総ビリルビン値は１０mg/dl以上の場合が多く、血清トランスアミナーゼ値は初期には著しい高値を示すが、数日中に著しく下降する。プロトロンビン値は４０％以下と著名な低下を示す。脳浮腫、消化管出血、腎不全、血管内凝固症候群、全身感染症を伴いやすく、これらの合併症が死因となることが多い。予後は極めて不良で、我が国での生存率は２０−３０％である。治療としては、確立された治療法はなく、全身的な管理が必要とされているのが現状である。
【０００３】
血漿交換、交換輸血、人工肝補助装置、およびグルカゴン・インスリン療法などが行われている。このように、この劇症肝炎を治療する治療剤がないのが現状と言っても過言ではない。血漿交換については国内において約８０％で施行されているが、施行群と非施行群の間にほとんど生存率の差は認められていない。また、グルカゴン・インスリン療法も９０例で施行されているが、施行群と非施行群間にあまり生存率の差はない。特殊組成アミノ酸投与もほとんどの例で施行されているが、ほとんど両群間に生存率の差はない。つまり、この間８割の症例が我が国において代表的な治療法である血漿交換、グルカゴン・インスリン療法、特殊組成アミノ酸療法が施行されていながら、そのような治療が行われる前に比べてほとんど生存率が上がっていないということになり、その効果について非常に懐疑的にならざるを得ない現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
劇症肝炎は、１９８１年の犬山シンポジウムの診断基準によれば、肝炎のうち症状発現８週以内に高度の肝機能障害に基づいて、II度以上の昏睡とプロトロンビン時間(PT)が４０％に低下する症例と定義されている。
肝臓は予備能の大きい臓器であるので、３割ぐらい残っていれば普通は十分代償されている。しかし、それ以下になると肝不全といって肝臓の機能の不全の状態が起こってくる。
具体的には肝臓の機能は物質を合成する機能と、物質を代謝する機能の二大機能に大別できる。その機能の不全状態が起こるために合成能低下の表現としてPTが低下する。PTは凝固因子のうちのI, II, V, VII及び Xの５つの凝固因子総体の機能を測る検査だが、その全てがともに肝臓でつくられている。その内、特に第VII因子は半減期が短く、大体数時間で半減する。すなわち合成能が低下すると第VII因子が初期から低下し、それを含むPT時間が低下する。もう一つは、解毒代謝機能の低下のため昏睡が発現する。II度以上とした理由はI度の場合には主治医の主観が判定に入るので、II度以上を有意とされた。
【０００５】
その原因疾患は日本では肝炎が大半である。肝炎はウイルス性も薬剤性肝炎も含まれる。また、外国では劇症肝炎は急性肝炎の範疇の疾患と考えているが、日本の場合ＨＢＶキャリアが多数存在し、キャリアの劇症化もまれに見られる。キャリアの場合肝炎の発症時期が不明であり、ウイルスを持っている限り慢性肝炎があり得るし、それが劇症化することもある。
一方、外国、例えばイギリスではウイルスが半分弱で半分強は薬剤性である。特にイギリスではウイルスがパラセタモール、つまりアセトアミノフェトンという鎮痛解熱剤を自殺目的で服用することによる劇症肝炎が多い。通常、臨床的に経験される薬剤性肝障害はむしろアレルギー性の肝炎が多く、この際は投与量も少なくて肝障害がおこり、原因となる薬剤を除去しても既に炎症維持機転が作動しており、直ちに肝障害が終息するわけにはいかない。
【０００６】
肝炎が劇症化する機序については２つの条件があると言われている。１つは多くの肝細胞に感染が生じていること。他のもう１つは非常に強い細胞障害性Ｔリンパ球の免疫応答があって旺盛に肝細胞が破壊される点である。つまり、多くの肝細胞が感染を受けているということと、免疫応答が激しくて肝細胞破壊がひどい、という２つ要因がないと劇症肝炎は起こらないとされている。この理論を基礎に考えると、Ａ型肝炎ウイルスは排除が速いので感染があるところまで拡大するうちに排除反応が起こってきて排除されてしまい、劇症化しないで急性肝炎として治ってしまう。Ｃ型肝炎ウイルスの場合は、多くの肝細胞まで感染が進行する、宿主の免疫応答をあまり強く惹起しないウイルスなので劇症化しにくい。Ｂ型肝炎は中間的でウイルスの感染が広がるし、免疫応答もかなり強いので、もっとも劇症化しやすいと、理解されている。
【０００７】
１９７２年病理学者のKerrらが、「核の凝集や断片化」を特徴とする細胞死の形態を記載し、アポトーシス(apoptosis)と呼称した。これ以降細胞死は、ネクロシス（necrosis, 壊死）とアポトーシス（apoptosis, 自死）の２つに分けられることになった。ネクロシスはウイルス、虚血、毒物といった病理的、非生理的な要因でおこり、形態的には細胞質・核・ミトコンドリアの膨張の後、細胞膜が破綻する像を示す。これに対し、アポトーシスは生理的な死であり、細胞が情報を自ら総合的に判断して、細胞に内蔵されている自死装置の発動により起こると考えられる。そして核の濃縮と断片化という形態的特徴と、DNAの断片化という生化学的な特徴を示す。また別な言い方をすれば、遺伝子に支配された死がアポトーシスであり、遺伝子の支配を受けない死がネクロシスである。
近年、分子生物学の進歩によりアポトーシスの遺伝子レベルでの解析が進み、アポトーシスの疾患との関係も注目されている。肝臓では、ウイルス肝炎などでよく見られる好酸性ボディ(acidophilic body)が実は肝細胞のアポトーシスであること、ウイルス肝炎の代表的な細胞死の断片的ネクロシス(piecemeal necrosis)の主体が実はネクロシスではなくアポトーシスであることなどが示され、また多くの肝疾患にアポトーシスが関与していることが示唆されている。特にアポトーシスを引き起こす系として、Fas/Fasリガンドの系は最も研究が進んでおり、1993年に長田らが、抗Fas抗体のマウスの腹腔内投与により広範な肝細胞死を引き起こすことを報告し、Fasシステムが劇症肝炎の原因となりえるのではないかという可能性を示した（Nature, 364, 806, 1993）。
いずれにしても劇症肝炎は、我が国では９０％以上がウイルス性であり急性型で致死率が５０％以上、亜急性型だと致死率は９０％以上を越える。しかも、予後不良の疾患であり、その成因の解明、そして有効な治療法の開発が切に望まれている。
【０００８】
本発明者等は、かかる観点から、アポトーシスによる肝障害、すなわちFas誘起アポトーシス及びそれに伴う肝障害に対してＨＧＦが抑制、改善あるいは予防の作用を有することを見出し、ＨＧＦが劇症肝炎疾患の予防・治療に有用であることが判明した。
上記のＨＧＦは肝実質細胞をin vitroで増殖させる因子として見出されたタンパク質である（Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1986, FEBS Letter, 22, 311, 1987, Nature, 342, 440, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990）。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見されたＨＧＦは、本発明者らをはじめとする多くの研究者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治癒などの種々の活性を示していることが明らかとなり、研究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まっている。
【０００９】
ＨＧＦは主に間葉系の細胞により産生されていることが解明されており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給される、所謂パラクリン機構が成立していることが明らかにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにおいてもＨＧＦの産生が高まることから、所謂エンドクリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えられる。
このようなＨＧＦの受容体に関して、最近の研究から、c-Met原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが確定的になった（Bottaro et al., Science 251, 802-804, 1991; Naldini et al., Oncogene 6, 501-504, 1991）。
上述のようにＨＧＦに関して多くの知見が得られているが、ＨＧＦがアポトーシスによる肝障害に対して、抑制、改善あるいは予防が可能であることは従来知られていない新知見である。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は新規な劇症肝炎疾患治療剤を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする劇症肝炎疾患治療剤；
▲２▼劇症肝炎疾患が、アポトーシスによる肝障害を主体とする劇症肝炎疾患である上記▲１▼記載の劇症肝炎疾患治療剤に関する。
【００１１】
本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる（FEBS Letters, 224, 312, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照）。
【００１２】
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる（例えば、Nature, 342, 440, 1989, 特開平5-111383号公報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
【００１３】
より具体的にはＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えばラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を抽出して摘出して粉砕し、S-セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、遺伝子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸をコードする遺伝子を、ウシパピローマウイルスDNAなどのベクターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウスC127細胞、サルCOS細胞などを形質転換し、その培養上清より得ることができる。
【００１４】
かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されたり、N末端及び/又はC末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
【００１５】
本発明の治療剤は上記のＨＧＦを有効成分とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるように、肝実質細胞を増殖させることにより、アポトーシスによる肝障害に対してＨＧＦの抑制、改善あるいは予防の効果を有する。更に、ＨＧＦは障害を受けていない組織には作用を示さず、障害を受けている組織にのみ作用するので、副作用を惹起するおそれが少ないという特長を有する。従って、本発明の治療剤は、劇症肝炎疾患、特に肝実質細胞の増殖を主体とする病変の治療・予防に有効である。
本発明の治療剤は、ヒトの他、各種の哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）における肝障害に起因する種々の疾患の治療・予防に適用される。
【００１６】
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002-0.2(w/v%)程度、好ましくは0.001-0.1(w/v%)程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
【００１７】
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製剤とした場合には凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
本発明の治療剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常、ＨＧＦとして0.05mg-500mg、好ましくは1mg-100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００１８】
【発明の効果】
本発明において、有効成分であるＨＧＦは、劇症肝炎の原因とされているアポトーシスによる肝障害、すなわちFas誘起アポトーシス及びそれに伴う肝障害に対してＨＧＦが抑制、改善あるいは予防の作用を有する。従って、本発明の治療剤は、前述した劇症肝炎疾患の治療・予防に有効である。更に、ＨＧＦは、障害を受けている組織のみに作用するので、副作用の少ない薬剤を得ることができるという効果を奏する。
【００１９】
【実施例】
以下、実験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
試験例１
アポトーシス肝障害の基礎条件設定
長田らによって検討されたアポトーシスによる肝細胞死の試験では、3-5週令のBALB/Cマウスを使用して、Jo-2抗体（Fas抗体）100μg及び10μgを腹腔内投与している（Nature, 364, 806, 1993）。本試験においては、ＨＧＦ投与によるアポトーシス肝障害の抑制効果を判定するための至適の抗体投与量設定し、またアポトーシス肝障害の個体間のばらつきを最小にするために基礎条件を設定した。
材料としてJo-2抗体（Fas抗体）、BALB/Cマウス雄（８週令）を使用した。方法は以下のとおりである。
【００２０】
Jo-2抗体投与量として、マウス当たりJo-2抗体5μgを腹腔内（i.p.）投与（マウス２匹）、またJo-2抗体5μg（マウス２匹）、 2μg（マウス３匹）、 1μg（マウス３匹）を尾静脈（i.v.）投与、さらにコントロールとして食塩水をi.v.投与（マウス１匹）した。Jo-2抗体あるいは食塩水を投与し、６時間後に尾静脈より採血し、２４時間後に剖検、組織を採取した。検討項目としては、肝機能マーカーとして、GPT, TP, ALB, GOTを測定し、肝臓の一部を１０％ホルマリン固定して、顕微鏡下Ｈ＆Ｅ染色による肝障害の判定、さらにアポトーシスの評価を行った。また、肝臓の一部は凍結して、DNA抽出し、電気泳動法によりDNAの断片化解析を行った。DNA抽出とDNA断片化の解析は以下のとおりである。
【００２１】
１）凍結肝臓20-30mgを2mlのcell lysis buffer(320mM Saccharose, 5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 7.5)でホモジナイズした。
２）20mg/ml Proteaseを100μl加え、50℃で2時間インキュベートした。
３）RNase Aを200μg/mlになるように加え、さらに50℃で１時間インキュベートした。
４）500μlをとりイソプロパノール沈殿させ、エタノール洗浄し、20μl ＴＥ緩衝液に溶解した。
５）エチジウムブロマイド含2%アガロースで全量(20μl)を電気泳動し、DNA断片化をみた。
【００２２】
結果を表１及び図１（病理組織標本の顕微鏡写真）に示す。
表１に示されたように基礎条件の設定の結果としては、5μg i.v.又はi.p.投与が最適であった。
図１に肝の病理組織標本の顕微鏡写真の一例を示す。図において、Ａ及びＢは倍率１００倍、Ｃは倍率２００倍の顕微鏡写真である。図に示されるように、肝の病理組織では、Jo-2抗体投与で誘起されるアポトーシスは、Ｚone 1(門脈域周囲の肝細胞)から起こり、Jo-2抗体量の増加によりZone 1からZone 2, Zone 3(中心静脈周囲の肝細胞)までアポトーシスが延び、壊死の程度が進み、広範囲、びまん性にほぼ全ての肝細胞がアポトーシスによる壊死に陥ることが判明した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
試験例２
ＨＧＦ投与によるアポトーシス肝障害の抑制効果
ＨＧＦがFas誘起アポトーシスによる肝障害を抑制できるかどうか、in vivoで検討した。
材料としてJo-2抗体（Fas抗体）、BALB/Cマウス雄（８週令）及び組換えヒトＨＧＦ(human recombinant ＨＧＦ)を使用した。方法は以下のとおりである。
Jo-2抗体投与量として、マウス当たり5μgを腹腔内（i.p.）投与（マウス９匹）した。Jo-2抗体投与６時間前に、ＨＧＦ（マウス４匹）あるいはコントロールとして食塩水（マウス５匹）をi.p.投与した。さらに、抗体投与時、抗体投与６時間後、１２時間後に連続してＨＧＦあるいは食塩水のi.p.投与を行った。Jo-2抗体投与１２時間後に尾静脈より採血し、２４時間後に剖検、組織を採取した。検討項目としては、肝機能マーカーとして、GPTを測定し、肝臓の一部を１０％ホルマリン固定して、顕微鏡下Ｈ＆Ｅ染色による肝障害の判定、さらにアポトーシスの評価を行った。
【００２５】
結果を表２並びに図２及び３（病理組織標本の顕微鏡写真）に示す。なお、図２はＨＧＦ投与群のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真であり、Ａは試験Ｎｏ．１６のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真（倍率２００倍）、Ｂは試験Ｎｏ．１９のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真（倍率１００倍）である。また、図３は食塩水投与群（コントロース）のマウス（試験Ｎｏ．１４のマウス）の肝の病理組織標本の顕微鏡写真であり、Ａは倍率１００倍、Ｂは倍率２００倍である。
表２に示されたように、ＨＧＦ投与マウスは４例とも肝機能GPTが低値を示した。また、図２に示されるように、アポトーシスによる肝障害は明らかに抑制された。一方、ＨＧＦの代わりに食塩水を投与したマウスは１例がJo-2抗体投与後８時間に死亡したが、その肝組織は広範性びまん性にほとんどの肝細胞がアポトーシスによる壊死の状態を呈しており、肝不全による死亡であった。また、残りの４例でも肝機能GPTが高値を示した。更に、図３に示されるように、門脈域周囲(Zone 1)から中間帯(Zone 2)にかけて、著明な肝細胞のアポトーシスとそれによる細胞死という肝病理組織像を呈する重度の肝障害を伴っていた。
以上の結果から、ＨＧＦはFas抗体によって誘起されるアポトーシス肝障害を抑制することが認められた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
実施例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【００２８】
実施例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真の一例を示すものである（生物の形態）。図において、Ａ及びＢは倍率１００倍、Ｃは倍率２００倍の顕微鏡写真である。
【図２】試験例２におけるＨＧＦ投与群のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真である（生物の形態）。図において、Ａは試験Ｎｏ．１６のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真（倍率２００倍）、Ｂは試験Ｎｏ．１９のマウスの肝の病理組織標本の顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
【図３】試験例２における食塩水投与群（コントロール）のマウス（試験Ｎｏ．１４のマウス）の肝の病理組織標本の顕微鏡写真である（生物の形態）。図において、Ａは倍率１００倍、Ｂは倍率２００倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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