(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミンの一段階の競合的インヒビターであることを特徴とするプラスミンインヒビターの調製物であって、アミノ酸配列ＥＣＥＳＴＣＡＡを含み、一般式：ＫＤＺＰＺＹ”ＣＺＬＢＢＺＢＧＸＣＺＸＸＸＢＸＦＡ”ＹＸＢＺＺＺＺＣＢＺＦＢＹＧＧＣＸＢＮＡＮＮＦＸＴＸＥＥＣＥＳＴＣＡＡを有し、
ただし、Ｘはいずれかのアミノ酸であり；
Ｙ”は疎水性アミノ酸であり；
Ａ”は芳香族アミノ酸又はヒスチジンであり；
ＺはＫ，Ｒ，Ｈ，Ｄ，Ｅ，ＱまたはＮであり；及び
Ｂは中性アミノ酸、もしくはＰ，Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，ＶまたはＬであり、１９番目のＸはＲであり；並びに、医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤を含み、調製物中の総物質の少なくとも６０％がプラスミンインヒビターである、前記調製物。
【請求項２】
３番目のＺがＨまたはＲである請求項１の調製物。
【請求項３】
５番目のＺがＫ，Ｎ，ＥまたはＤである請求項１の調製物。
【請求項４】
６番目のＹ”がＦまたはＬである請求項１の調製物。
【請求項５】
８番目のＺがＥまたはＫである請求項１の調製物。
【請求項６】
10番目のＢがＰまたはＬである請求項１の調製物。
【請求項７】
11番目のＢがＰまたはＡである請求項１の調製物。
【請求項８】
12番目のＺがＥまたはＤである請求項１の調製物。
【請求項９】
13番目のＢがＴまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項１０】
15番目のＸがＰ，ＳまたはＲである請求項１の調製物。
【請求項１１】
17番目のＺがＫ，Ｎ，Ｅ，ＤまたはＲである請求項１の調製物。
【請求項１２】
18番目のＸがＤ，Ｇ，ＡまたはＶである請求項１の調製物。
【請求項１３】
20番目のＸがＴ，Ｐ，ＦまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項１４】
21番目のＢがＧ，ＶまたはＰである請求項１の調製物。
【請求項１５】
22番目のＸがＡ，ＳまたはＲである請求項１の調製物。
【請求項１６】
24番目のＡ”がＹまたはＨである請求項１の調製物。
【請求項１７】
26番目のＸがＳまたはＮである請求項１の調製物。
【請求項１８】
27番目のＢがＰ，ＡまたはＴである請求項１の調製物。
【請求項１９】
28番目のＺがＤまたはＲである請求項１の調製物。
【請求項２０】
29番目のＺがＥ，Ｄ，ＨまたはＱである請求項１の調製物。
【請求項２１】
30番目のＺがＨ，Ｋ，ＲまたはＱである請求項１の調製物。
【請求項２２】
31番目のＺがＫ，ＱまたはＥである請求項１の調製物。
【請求項２３】
33番目のＢがＬまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項２４】
34番目のＺがＥまたはＫである請求項１の調製物。
【請求項２５】
36番目のＢがＬまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項２６】
41番目のＸがＥ，ＧまたはＫである請求項１の調製物。
【請求項２７】
42番目のＢがＣまたはＧである請求項１の調製物。
【請求項２８】
48番目のＸがＫ，ＮまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項２９】
50番目のＸがＫ，ＱまたはＩである請求項１の調製物。
【請求項３０】
プラスミンインヒビターが更にアミノ酸配列ＮＡＮＮＦを含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項３１】
プラスミンインヒビターが更にアミノ酸配列ＹＧＧＣを含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項３２】
プラスミンインヒビターが、
（ａ）配列番号２
（ｂ）配列番号４
（ｃ）少なくとも１５の連続した配列番号２又は４のアミノ酸配列を含み、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持している配列番号２又は４いずれか１つの生物学的活性断片
（ｄ）プラスミンの一段階の競合的阻害を保持している配列番号２又は４の配列に少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含むプラスミンインヒビターである、請求項１、請求項３０又は３１に記載の調製物。
【請求項３３】
ポリペプチドが、一段階の競合的阻害を保持する、少なくとも１５の連続したアミノ酸配列及び配列番号１４の配列を含むリーダーペプチド又は生物学的活性を有するそのフラグメントを含むポリペプチドである、請求項３２に記載の調製物。
【請求項３４】
ポリペプチドが、配列番号１６及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項３３に記載の調製物。
【請求項３５】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して１×10-8Ｍ-1から１×10-10Ｍ-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３４のいずれかの調製物。
【請求項３６】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して５×10-8Ｍ-1から８×10-9Ｍ-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３４のいずれかの調製物。
【請求項３７】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して１×10-9Ｍ-1から５×10-9Ｍ-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３４のいずれかの調製物。
【請求項３８】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して４×10-5秒-1Ｍ-1から５×10-7秒-1Ｍ-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３７のいずれかの調製物。
【請求項３９】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して１×10-6秒-1Ｍ-1から１×10-7秒-1Ｍ-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３７のいずれかの調製物。
【請求項４０】
プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して２×10-6秒-1Ｍ-1から９×10-6秒-1Ｍ-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項１〜３７のいずれかの調製物。
【請求項４１】
調製物中の全物質の少なくとも７５％がプラスミンインヒビターである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項４２】
調製物中の全物質の少なくとも９０％がプラスミンインヒビターである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項４３】
調製物中の全物質の少なくとも９５％がプラスミンインヒビターである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項４４】
調製物中の全物質の少なくとも９９％がプラスミンインヒビターである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項４５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載されたプラスミンインヒビターのアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項４５に記載の単離されたポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号３；及び
（ｃ）前記ポリヌクレオチド配列のいずれかの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、前記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４７】
リーダーポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号１３、又は前記配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列である、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号１５、配列番号１７、及び配列番号４３からなる群から選択される、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
患者における血液損失を軽減するための医薬組成物であって、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の調製物及び医薬的に許容される担体を含む上記組成物。
【請求項５１】
抗フィブリン抗体にコンジュゲート（conjugate）された請求項１〜３４のいずれか一項に記載の調製物を含む抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗線維素溶解剤、特に、反跳性血栓形成を引き起こす傾向が低い、新規プラスミンインヒビターに関する。本発明は、新規プラスミンインヒビターをコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびにこれらのインヒビターおよびそれを含有する薬学的組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
大手術関連の失血は、以前は、新鮮な凍結血漿、新鮮な全血および血小板濃縮物を含んでもよい、代償療法で補われてきた。近年、様々な血液伝播性ウイルス感染（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ）が認識され、手術中の失血を減少させる必要性が重要な優先事項となっている。さらに、現在では、信頼できる分析法がない、狂牛病（ＢＳＥ）およびクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）関連作用物による感染性に関する不安が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ内で発生している。
【０００３】
プラスミノーゲン−プラスミン経路経由の非束縛線維素溶解活性は、出血の一助となり、アプロチニン等のプラスミンインヒビターは失血の軽減に役立つことが証明されている（Ｒｏｙｓｔｏｎ，  １９９０，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．  Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．  １：５３−６９；  Ｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔ．  ８５：５９６−５９９）。このことから、線維素血餅および凝固系成分のプラスミン媒介性消化は、この出血状態に貢献するものとして一番重要であろうことが示唆される（Ｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３、前掲）。
【０００４】
現在、心肺バイパス（ＣＰＢ）術中のアプロチニン使用は普通である（Ｒｏｙｓｔｏｎ，  １９９０、前掲；Ｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３、前掲）。特に、Ｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３、前掲）は、ウシ由来のインヒビター・アプロチニン（医薬Ｔｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）中の有効物質として）が、プラスミン活性を中和することによりＣＰＢ患者における失血を減少させ、血小板活性に影響を及ぼさないことを証明した。この後者の発見は、他の研究者によって確認された（Ｒａｙ  ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，  １９９７，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７８：  １０２１−１０２６）。
【０００５】
アプロチニンは、十分に研究されたセリンプロテアーゼインヒビター、すなわち「セルピン」である。アプロチニンは、アミノ酸５８個を含み、トリプシン、α−キモトリプシン、プラスミンならびに組織カリクレインおよび血漿カリクレインを阻害するように作用する（Ｆｒｉｔｚ  ａｎｄ  Ｗｕｎｄｅｒｅｒ，  １９８３，  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  ３３：４７９−４９４；  Ｇｅｂｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６  Ｉｎ   “Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”，  Ｂａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  （ｅｄｓ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＢＶ  ｐｐ  ３７４−３８７）。アプロチニンは、トロンビンおよびプラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡおよびｕＰＡ）とも反応することが確認されている（Ｗｉｌｌｍｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ９：１−８）。
【０００６】
アミノ酸配列の１５位にリシンの代わりに他のアミノ酸を含む半合成的に生成されたアプロチニンの同族化合物は、アプロチニンのものとは独特の差がある作用プロフィールおよび作用特異性を有することが、最近の研究で証明された（米国特許第４，５９５，６７４号；Ｗｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５，  Ｉｎ  “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｖｏｌ．３）。これらの半合成的アプロチニン同族化合物の幾つかは、たとえば、膵臓および白血球由来のエラスターゼに対する強い阻害作用を有する。１５位にアルギニン、１７位にアラニン、４２位にセリンを含む他のアプロチニン同族化合物は、血漿カリクレインに対して、アプロチニンより明らかに大きい阻害作用を示すという特徴がある（ＷＯ  ８９／１０３７４号参照）。
【０００７】
アプロチニンと同じタイプのヒトプロテアーゼインヒビターが開示されている米国特許第５，５７６，２９４号（Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ）を参照することも可能である。特に、好中球エラスターゼ、カテプシンＧおよび／またはプロテイナーゼ３を優先的に阻害するヒトクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテアーゼインヒビターの変異型が開示されている。アプロチニンと比較して、これらの変異型は本質的に負の電荷を有し、患者に大量投与されたとき、腎障害のリスクが少ないと考えられる。対照的に、アプロチニンは、比較的高用量で投与されたとき、腎毒作用を有する（Ｂａｙｅｒ，  Ｔｒａｓｙｌｏｌ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；  Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎ  “Ｖｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ  ｄｅｒ  Ｄｅｕｔｃｈｅｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｆｕｅｒ  Ｉｎｎｅｒｅ  Ｍｅｄｉｚｉｎ，  ７８．  Ｋｏｎｇｒｅｓｓ”，  Ｂｅｒｇｍａｎｎ，  Ｍｕｅｎｃｈｅｎ，  １９７２，  ｐｐ  １６１２−１６１４）。この腎毒性は、アプロチニンが本質的に正に強く帯電している（そのため、負に帯電した腎細管の表面に結合する）結果であると考えられる。
【０００８】
アプロチニンを抗線維素溶解的に臨床使用すると血管手術中の失血が減少することは確かであるが、移植片閉塞および周手術心筋梗塞に現れる「反跳性血栓形成」の発生率が上昇するという証拠がある（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ，  ７５：１−３；  Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ａｎｎａｌｓ  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ５４：  １０３１-１０３８；  Ｓａｍａｍａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７１：６６３-６６９）。これらの知見と一致して、アプロチニンが、幾らか広い特異性およびプラスミンに対する緩徐な強束縛動的作用を有することが証明されている（Ｗｉｌｌｍｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５、前掲）。したがって、反跳性血栓形成の高い発生率は、アプロチニンのプラスミンへの束縛結合および同時に生じる線維素溶解系の不可逆的中和の結果であろう。
【０００９】
従来技術で説明した、アプロチニンと比較して反跳性血栓形成を引き起こす傾向が低い有効な抗線維素融解剤は最近までなかった。しかし、最近の研究で、Ｗｉｌｌｍｏｔｔら（１９９５、前掲）は、オーストラリアのコブラモドキＰｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓの毒液から、反跳性血栓形成に関して有望な動的プロフィールを備えたプラスミンインヒビターを単離して特性決定した。この単離されたプラスミンインヒビター調製物（Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ（Ｔｘｌｎ）と呼ばれる）は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびクマシーブルー染色で評価したとき、単一の約７ｋＤａのタンパク質からなることが判った。アプロチニンにより阻害される多くのセリンプロテアーゼ酵素と対照的に、Ｔｘｌｎは、プラスミンおよびトリプシンを阻害するにすぎなかった。一段階競合的可逆的機構に従うことも明らかにされている。対照的に、アプロチニンは、二段階可逆的機構に従う。酵素とバージンインヒビターが反応して最初に遊離した非共有結合型錯体を生成し、続いて、酵素およびインヒビターがほとんど未変化のままである、しっかり結合した安定な錯体を生成する（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｋａｔｏ，  １９８０，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９：５９３−６２６；  Ｔｒａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ，  １９８３，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５２；  ６５５−７０９；  Ｌｏｎｇｓｔａｆｆ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｎｅｙ，  １９９１，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：  ９７９−９８６）。さらに、Ｔｘｌｎは、アプロチニン（解離速度定数、Ｋ2＝１．６４×１０-5／秒／Ｍ、解離定数、Ｋi＝５．３×１０-11Ｍ、この後者の値は、先に報告された値Ｋi＝２×１０-10Ｍ（Ｌｏｎｇｓｔａｆｆ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｎｅｙ，  １９９２，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ３：  ８９−８７））より速くプラスミンを結合し（解離速度定数、Ｋ1＝３．８５×１０-5秒-1Ｍ-1）、親和性が低いＫi（解離定数、Ｋi＝１．４×１０-8Ｍ）を有する。したがって、周手術出血および術後出血を管理する際に、Ｔｘｌｎ動的プロフィールは、アプロチニンよりも、反跳性血栓形成に関して臨床的に魅力的であることが示唆される。
【００１０】
（発明の要約）
本願発明は、最初は本質的に同質であると考えられていたウィルモット（Willmott）ら（1995，上記）のプラスミンインヒビター調製物中の２つの異なったプラスミンインヒビターの予期せぬ発見から生じたものである。驚くべきことに、テキスティリニン１（Textilinin 1，Txln 1）及びテキスティリニン２（Textilinin 2，Txln 2）と称するこれらのプラスミンインヒビターは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価によって約７ｋＤａの分子量で共に移動し、ウィルモットらに用いられた、親となるプラスミンインヒビター調製物において（重量で）総タンパク質の約50％だけしか構成していない。これは、Txln 1及びTxln 2が各々、親となる調製物と比べて異なった速度論的プロファイルを有するという事実と合せて、親となる調製物がプラスミン阻害を妨げる可能性がある他の化合物を含有していることを示唆する。特に、Txln 1及びTxln 2が別個のアミノ酸配列、多少類似する速度論的プロファイル（Txln 1，ｋ1＝3.09×10-6秒-1Ｍ-1；Ｋi＝3.5×10-9Ｍ及びTxln 2，ｋ1＝8.20×10-6秒-1Ｍ-1；Ｋi＝2.0×10-9Ｍ）を有する一方、両方ともネズミモデルでの血液損失を阻害する。親となる対応物と同様に、Txln 1及びTxln 2はプラスミン及びトリプシンとのみ反応し、そのため、アプロチニンと比べて高い酵素特異性を有するものである。さらに、Txln 1，Txln 2及びアプロチニンのプラスミンに対する個々の速度論的プロファイルの比較によって、Txln 1及びTxln 2が、プラスミンを阻害することにおいてアプロチニンより10倍から100倍効果が小さいことが明らかである。これはまた、Txln 1及びTxln 2がアプロチニンより10倍から100倍速くプラスミンから解離することを見出すものである。それらのプラスミンに対する高い特異性、及び、低い阻害効果によって、アプロチニンに比べて、血液の流動性を制御する線維素分解系の酵素とインヒビターの微妙なバランスに一時的に影響を与えるという治療的な利点を有する可能性をもつ。
【００１１】
本願発明者はまた、驚くべきことに、オーストラリア・ブラウン・スネーク（Australian brown snake）がTxln 1及びTxln 2をコードする転写物を発現するばかりでなく、テキスティリニン（Textilinin）３，４，５及び６（即ち、Txln 3，Txln 4，Txln 5及びTxln 6）と称する、さらに４つのプラスミンインヒビターをコードする転写物も発現することを見出した。これら後者の転写物は、Txln 1及びTxln 2をコードするものに比べて著しく低いレベルで発現されているようであるが、ヌクレオチドレベル及び推定されたアミノ酸レベルの両方において、Txln 1及びTxln 2に高い相同性を示す。
【００１２】
即ち、本願発明の１つの面は、プラスミンの一段階の競合的インヒビターであることを特徴とするプラスミンインヒビターの本質的に純粋な調製物を提供することにある。
【００１３】
好ましくは、当該一段階の競合的インヒビターが、プラスミンに対して１×10-8Ｍ-1から１×10-10Ｍ-1の範囲、より好ましくは５×10-8Ｍ-1から８×10-9Ｍ-1の範囲、最も好ましくは１×10-9Ｍ-1から５×10-9Ｍ-1の範囲の解離定数を有する。
【００１４】
当該一段階の競合的インヒビターが、プラスミンに対して４×10-5秒-1Ｍ-1から５×10-7秒-1Ｍ-1の範囲、より好ましくは１×10-6秒-1Ｍ-1から１×10-7秒-1Ｍ-1の範囲、最も好ましくは２×10-6秒-1Ｍ-1から９×10-6秒-1Ｍ-1の範囲の解離速度定数を有していてもよい。
【００１５】
適したものとしては、当該一段階の競合的インヒビターはポリペプチドからなる。好ましくは、ポリペプチドは以下のものからなる群から選ばれる。
0004542705.tif 000002
(g)配列番号２，４，６，８，10及び12のいずれか１つの生物学的に活性なフラグメント；並びに
(h)いずれかの前記ポリペプチドの変異体または誘導体、もしくはそのフラグメント。
【００１６】
好ましくは、当該変異体が一般式：ＫＤＺＰＺＹ”ＣＺＬＢＢＺＢＧＸＣＺＸＸＸＢＸＦＡ”ＹＸＢＺＺＺＺＣＢＺＦＢＹＧＧＣＸＢＮＡＮＮＦＸＴＸＥＥＣＥＳＴＣＡＡ（Ｉ）を有するものであって、
Ｘはいずれかのアミノ酸であり；
Ｙ”は疎水性アミノ酸であり；
Ａ”は芳香族アミノ酸またはヒスチジンであり；
ＺはＫ，Ｒ，Ｈ，Ｄ，Ｅ，ＱまたはＮであり；及び
Ｂは中性アミノ酸、もしくはＰ，Ａ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，ＶまたはＬである。
好ましくは、３番目のＺがＨまたはＲである。
適したものとしては、５番目のＺがＫ，Ｎ，ＥまたはＤである。
好ましくは、６番目のＹ”がＦまたはＬである。
８番目のＺはＥまたはＫでもよい。
適したものとしては、10番目のＢがＰまたはＬである。
好ましくは、11番目のＢがＰまたはＡである。
12番目のＺはＥまたはＤが好ましい。
適したものとしては、13番目のＢがＴまたはＩである。
15番目のＸはＰ，ＳまたはＲでもよい。
17番目のＺはＫ，Ｎ，Ｅ，ＤまたはＲが適している。
好ましくは、18番目のＸがＤ，Ｇ，ＡまたはＶである。
適したものとして、19番目のＸがＦ，Ｎ，ＫまたはＲである。
20番目のＸはＴ，Ｐ，ＦまたはＩが好ましい。
21番目のＢはＧ，ＶまたはＰでもよい。
適したものとしては、22番目のＸがＡ，ＳまたはＲである。
好ましくは、24番目のＡ”がＹまたはＨである。
26番目のＸはＳまたはＮが適している。
27番目のＢはＰ，ＡまたはＴが好ましい。
28番目のＺはＤまたはＲでもよい。
適したものとしては、29番目のＺがＥ，Ｄ，ＨまたはＱである。
好ましくは、30番目のＺがＨ，Ｋ，ＲまたはＱである。
31番目のＺはＫ，ＱまたはＥでもよい。
33番目のＢはＬまたはＩが好ましい。
34番目のＺはＥまたはＫが適している。
適したものとして、36番目のＢがＬまたはＩである。
好ましくは、41番目のＸがＥ，ＧまたはＫである。
42番目のＢはＣでもよいが、Ｇが好ましい。
適したものとしては、48番目のＸがＫ，ＮまたはＩである。
好ましくは、50番目のＸがＫ，ＱまたはＩである。
【００１７】
ポリペプチドはリーダーペプチドを含んでいてもよい。適したものとしては、リーダーペプチドがアミノ酸配列：Met-Ser-Ser-Gly-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Thr-Leu-Trp-Glu-Val-Leu-Thr-Pro-Val-Ser-Ser［配列番号14］、またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはこれらの変異体または誘導体を含む。
【００１８】
リーダーペプチドを含む例示的なポリペプチドは以下のものからなる群から選択されてもよい。
0004542705.tif 000003
【００１９】
0004542705.tif 000004
【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
0004542705.tif 000008
【００２４】
他の面として、本願発明は、第１に述べた面による、ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、もしくは当該フラグメントまたはポリペプチドの変異体または誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。適したものとしては、当該ポリヌクレオチドが以下のものからなる。
【００２５】
0004542705.tif 000009
【００２６】
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【００２７】
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【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
0004542705.tif 000014
【００３１】
(7)ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号２，４，６，８，10及び12のいずれか１つの生物学的に活性なフラグメントをコードする、配列番号１，３，５，７，９及び11のいずれか１つのポリヌクレオチドフラグメント；並びに
【００３２】
(8)前記配列のいずれかのポリヌクレオチド相同体。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、好ましくはリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。適したものとしては、ヌクレオチド配列：
0004542705.tif 000015
またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはこれらのヌクレオチド相同体を含む。
【００３４】
当該ヌクレオチド配列からなる例示的なポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択されてもよい。
【００３５】
0004542705.tif 000016
【００３６】
0004542705.tif 000017
【００３７】
0004542705.tif 000018
【００３８】
0004542705.tif 000019
【００３９】
0004542705.tif 000020
【００４０】
0004542705.tif 000021
【００４１】
0004542705.tif 000022
【００４２】
もう１つの面として、本願発明は患者における血液損失を軽減するための医薬的組成物を提供し、当該組成物はポリペプチドまたはその生物学的フラグメント、またはこれらの変異体または誘導体（「治療剤」）及び医薬的に許容できる担体を含む。
【００４３】
本願発明のもう一つの面によって、治療に有効な量の本願発明の治療剤を、医薬的に許容される担体と組合せて、治療が必要な患者に投与する段階からなる、血液損失を軽減する方法が提供される。
【００４４】
さらにまた別の面において、本願発明は抗フィブリン抗体にコンジュゲートされた本願発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体または誘導体からなる抗腫瘍剤を併せ持つものである。
【００４５】
（詳細な説明）
１．定義
特に記載がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において普通に熟練した人により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似したもしくは等価の方法および物質を本発明の実行または試験に使用してもよいが、好ましい方法および材料をについて説明する。本発明の場合、下記の用語を以下の通りに定義する。
【００４６】
「生物学的に活性なフラグメント」は、フラグメントが親ポリペプチド活性を保持する実質的に全長の親ポリペプチドのフラグメントを意味する。たとえば、配列識別番号２、４、６、８、１０および１２によるポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントの場合、このポリペプチドフラグメントは、プラスミンに関して、親ポリペプチドの一段階競合阻害特性を保持しなければならない。
【００４７】
本明細書で使用する用語「生物学的試料」は、未処理であってもよく、処理済みであってもよく、希釈もしくは濃縮されていてもよい、患者からの試料を指す。胎児細胞、および脳の尾状核および／または被殻領域由来の組織等を含む組織試料から生物学的試料を選択することが適当である。
【００４８】
「対応する」は、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と実質的に同じであるか相補的であるヌクレオチドを有するか、またはペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド、あるいは（ｂ）参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドを意味する。
【００４９】
「誘導体」は、たとえば、他の化学部分との共役または錯形成によって、あるいは当技術分野で理解されるであろう翻訳後修飾技術による修飾によって、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。用語「誘導体」は、機能的等価分子を提供する付加、または欠失を含む、親配列に対して行われた変更も、その範囲内に含む。
【００５０】
「相同性」は、同じであるか、下表１に示す保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。ＧＡＰ等の配列比較プログラムを使用して、相同性を決定することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ３８７−３９５）（参照により本明細書に援用する）。この方式で、アラインメントに空隙を挿入することにより（このような空隙は、たとえば、ＧＡＰに使用されている比較アルゴリズムによって決定される）、本明細書に列挙したものと類似した配列または実質的に異なる長さの配列を比較することが可能である。
【００５１】
本明細書では、「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生成するための、相補的ヌクレオチド配列の対合を示すために使用される。相補的塩基配列は、塩基対合規則と関連のある配列である。ＤＮＡでは、ＡはＴと対合し、ＣはＧと対合する。ＲＮＡでは、ＵはＡと対合し、ＣはＧと対合する。この点に関して、本明細書で使用する用語「適合する」および「適合しない」は、相補的核酸鎖における対合ヌクレオチドのハイブリダイゼーション潜在能力を指す。適合したヌクレオチドは、上述の古典的Ａ−Ｔ塩基対およびＧ−Ｃ塩基対のように、効率よくハイブリダイズする。適合しない組み合わせは、効率よくハイブリダイズしない、ヌクレオチドの他の組み合わせである。
【００５２】
「単離物」は、その天然の状態で、通常は随伴する成分を実質的にもしくは本質的に含まない物質を意味する。たとえば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、天然の状態でそれを挟む配列から除かれているポリヌクレオチド、たとえば、通常はフラグメントに隣接している配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指す。
【００５３】
「から得られる」は、たとえば、核酸抽出物等の試料が、宿主の特定のソースから単離される、または誘導されることを意味する。たとえば、宿主から直接単離された組織から核酸抽出物を得ることが可能である。
【００５４】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により連結された様々なヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはその関連した構造的変異型または合成類縁体）を含むポリマー（あるいはその関連した構造的変異型または合成類縁体）を指す。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」は、一般に、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が天然であるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート類、ホスホロチオアート類、メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボ核酸等々を含むがその限りではない様々な類縁体を、その範囲内に含むことが理解されるであろう。分子の正確なサイズは、個々のアプリケーションによって様々であってもよい。オリゴヌクレオチドは、一般に、かなり短く、一般に、約１０〜３０ヌクレオチドであるものの、この用語は、任意の長さの分子を指すことができるが、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一般に、高分子オリゴヌクレオチドに使用される。
【００５５】
「操作可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の転写が開始でき且つ終結できる方式で、転写および翻訳の調節核酸が、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドに関連して配置されることを意味する。
【００５６】
用語「患者」は、ヒトまたは他の動物起源の患者を指し、本発明の方法を使用して検査もしくは治療することが望ましい個体を含む。しかし、「患者」は、症状が存在することを含意しないことが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを示す。この用語は、一般に、３０ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドを指す。
【００５８】
「薬学的に許容される担体」は、全身投与において安全に使用することが可能な、固体または液体の充填剤、希釈剤または封入材料を意味する。
【００５９】
用語「ポリヌクレオチド相同体」は、一般に、実質的にストリンジェントな条件下で、参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異型および合成類縁体を指すために、本明細書では互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、たとえば、対応する天然のアミノ酸の化学的類縁体、ならびに天然のアミノ酸ポリマー等に使用される。
【００６１】
「プライマー」は、ＤＮＡ鎖と対合するとき、適当な重合剤の存在下で、プライマー伸長生成物の合成を開始することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅効率を最高にするために、１本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。プライマーは、重合剤の存在下で、伸長生成物の合成をプライムできるほど十分に長くなければならない。プライマーの長さは、用途、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、およびプライマーのソースを含む、多くの因子によって異なる。たとえば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に１５〜３５またはそれより多いヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーは、たとえば約２００ヌクレオチドから数千塩基対以上までの、高分子ポリヌクレオチドであってもよい。ハイブリダイズして合成開始部位の役割を果たすように設計されている鋳型で、配列に「実質的に相補的」であるようにプライマーを選択することができる。「実質的に相補的な」は、プライマーが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできるほど、十分に相補的であることを意味する。プライマーは、ハイブリダイズするように設計された対象である鋳型と不適合な組み合せを含まないことが好ましいが、このことは必要不可欠ではない。たとえば、非相補的ヌクレオチドを、プライマーの５’末端につけることが可能であり、プライマー配列の残りは鋳型に相補的である。あるいは、プライマー配列が、ハイブリダイズできるほど鋳型の配列と十分な相補性を有し、その結果、プライマーの伸長生成物を合成するための鋳型を形成する限り、非相補的ヌクレオチドまたは非相補的ヌクレオチドの伸長部をプライマー内に散在させることができる。
【００６２】
「プローブ」は、別の分子の特定の配列もしくは亜配列または他の部分に結合する分子を指す。特に記載がない限り、用語「プローブ」は、一般に、相補的塩基対合により別の核酸（しばしば「標的核酸」と呼ばれる）に結合するオリゴヌクレオチドプローブを指す。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブは、プローブとの完全な配列相補性を欠く標的細胞を結合することが可能である。プローブを、直接もしくは間接に標識することができる。
【００６３】
本明細書で使用される用語「組換えポリヌクレオチド」は、核酸を、通常は自然界にない形に操作することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるポリヌクレオチドを指す。たとえば、組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターの形であってもよい。一般に、このような発現ベクターは、ヌクレオチド配列に操作可能に連結された転写および翻訳の調節核酸を含む。
【００６４】
「組換えポリペプチド」は、組換え技術を使用して（すなわち、組換えポリヌクレオチドの発現により）、製作されるポリペプチドを意味する。
【００６５】
２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」などが挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２モノマー単位の長さであるが、多くの場合、１５〜１８モノマー単位、しばしば少なくとも２５モノマー単位の長さである。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間、で異なる配列を含んでもよいため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、一般に、局所領域配列類似性を同定し、比較するための、「比較ウインドウ」に関して、２つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施される。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される、一般に、１２連続した残基の概念上のセグメントを指す。２つの配列の最適アラインメントでは、比較ウィンドウは、参照配列（付加もしくは欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加もしくは欠失（すなわち、空隙）を含んでもよい。比較ウインドウを整列化するための最適アラインメントは、コンピュータ化されたアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）の実行、または精査および選択された様々な方法のいずれかによって作成された最もすぐれたアラインメント（すなわち、結果として、比較ウィンドウに関して、最高のパーセンテージ相同性が得られる）によって実行される。
【００６６】
「配列同一性」は、比較ウィンドウに関して、同じ（すなわち、個々のヌクレオチドベースもしくは個々のアミノ酸ベースで）配列を指す。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列した配列を比較し、適合した位置の数を出すために、同じ核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両配列に現れる位置の数を決定し、適合した位置の数を比較ウインドウにおける位置総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、配列類似性のパーセンテージを出すために、その結果に１００を掛けることにより算出される。
【００６７】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、ならびにある特定の有機溶媒の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、固定化ヌクレオチド配列と標識ポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度が高くなる。
【００６８】
「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイズする温度およびイオン条件を指す。必要なストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存的であり、ハイブリダイゼーション中に存在する様々な成分にも左右される。一般に、明示されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列について、熱的融解温度（Ｔm）より約１０〜２０℃低くなるような、ストリンジェントな条件が選択される。Ｔmは、（明示されたイオン強度およびｐＨで）標的配列の５０％が相補的プローブにハイブリダイズする温度である。
【００６９】
本明細書で使用される用語「実質的に純粋」は、生来随伴する成分から分離された化合物、たとえば、ペプチドを表す。試料中の全物質の少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％（容量基準、重量もしくは乾燥重量基準、またはモルパーセントもしくはモル分率で）が、関心のある化合物であるとき、一般に、化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適当な方法、たとえば、ペプチドの場合、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動法またはＨＰＬＣ分析によっ測定することができる。生来関連した成分を本質的に含まないとき、その天然の状態で随伴する固有の汚染物質から分離されているとき、化合物、たとえばペプチドは、実質的に純粋である。
【００７０】
用語「変異型」は、１つまたは複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置き換えられているポリペプチドを指す。ポリペプチドの活性の性質を変えずに、幾つかのアミノ酸を、概ね類似した特性を有する他のアミノ酸に変更できること（保存的置換）は、当技術分野で周知である。
【００７１】
「ベクター」は、合成核酸配列を挿入またはクローニングすることが可能な核酸分子、好ましくは、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスから誘導されるＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、１つまたは複数の制限部位を含み、標的細胞、標的組織、前駆細胞またはその組織を含む明示された宿主細胞で自律複製できる可能性があるか、クローニングされた配列が複製できるように、明示された宿主のゲノムと結合する可能性があることが好ましい。したがって、「発現ベクター」は、タンパク質の合成を指示することができる自律エレメントを意味する。このような発現ベクターは、当業者に周知である。このベクターは、適当な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子等の、選択マーカーも含んでもよい。このような耐性遺伝子の例は、当業者に周知である。
【００７２】
本明細書で使用される、下線またはイタリック体を使用しない遺伝子の名称で示されるタンパク質生成物と違って、下線またはイタリック体を使用した遺伝子の名称は、遺伝子を示す。たとえば、「Ｔｘｌｎ  １」は、Ｔｘｌｎ遺伝子を意味し、「Ｔｘｌｎ  １」は、「Ｔｘｌｎ  １」遺伝子のタンパク質生成物を示す。
【００７３】
本明細書を通して、「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”，“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”，“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”」は、明示した整数または整数群を包含するが、他の整数または整数群を排除しないとを意味すると理解される。
【００７４】
２．本発明のプラスミンインヒビター
本発明は、プラスミンの一段階競合インヒビターであることを特徴とする、プラスミンインヒビターの実質的に純粋な調製物を提供する。好ましい実施形態において、この一段階競合インヒビターは、プラスミンに関する解離定数を有する。１×１０-8Ｍ-1〜１×１０-10Ｍ-1の範囲内、さらに好ましくは５×１０-8Ｍ-1〜８×１０-9Ｍ-1、最も好ましくは１×１０-8Ｍ-1〜５×１０-8Ｍ-1の範囲内の、プラスミンに関する解離定数を有する。一段階競合インヒビターは、好ましくは、４×１０-5秒-1Ｍ-1〜５×１０-7秒-1Ｍ-1、さらに好ましくは１×１０-6秒-1Ｍ-1〜１×１０-7秒-1Ｍ-1、最も好ましくは２×１０-6秒-1Ｍ-1〜９×１０-6秒-1Ｍ-1の範囲内の、プラスミンに関する解離速度定数を有する。
【００７５】
２．１  テキスティリニン（Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ）ポリペプチド
プラスミンインヒビターは、テキスティリニンポリペプチドであることが好ましい。したがって、本発明は、配列識別番号２、４、６、８、１０および１２による単離されたポリペプチド、あるいは、それぞれ、その生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を提供する。配列識別番号２および配列識別番号４は、さらに十分に後述する通り、それぞれ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓから得られる、新規な約７ｋＤａのテキスティリニン１（Ｔｘｌｎ  １）およびテキスティリニン２（Ｔｘｌｎ  ２）ポリペプチドに相当する。配列識別番号６、８、１０および１２は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓから推定される相同のポリペプチドに相当する。
【００７６】
１つの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列識別番号１４による、リーダーペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体をを含んでもよい。これに関して、本発明は、配列識別番号１６、１８、２０、２２、２４および２６による、単離されたポリペプチドも提供する。
【００７７】
２．２  テキスティリニンポリペプチドフラグメント
本発明では、本発明によるテキスティリニンポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを考える。この種の代表的なフラグメントとしては、配列識別番号２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４および２６によるポリペプチドの、欠失突然変異体ならびに、たとえば、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０連続したアミノ酸の低分子ポリペプチドが挙げられる。
【００７８】
２．３  テキスティリニンポリペプチド変異体
本発明の変異型ポリペプチドに関して、このような変異型は、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの、プラスミンの一段階競合阻害を保持すべきであることが理解されるであろう。表１に従って、親ポリペプチドにおける代表的な保存的置換を行うことが可能である。
【００７９】
【表１】
0004542705.tif 000023
【００８０】
表１に示したものより保存性が低い置換を選択することにより、機能の実質的な変化がもたらされる。他の置き換えは、非保存的置換となり、これらの比較的小数が許容される。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化をもたらす可能性がある置換は、次のものである：（ａ）親水性残基（たとえば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を疎水性残基（たとえば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）と取り換える、（ｂ）システインまたはプロリンを任意の他の残基と取り換える、（ｃ）陽電性側鎖を有する残基（たとえば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を陰電性残基（たとえば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）と取り換える、あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（たとえば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を小さい側鎖を有する残基（たとえば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）または側鎖を持たない残基（たとえば、Ｇｌｙ）と取り換える。
【００８１】
一般に、変異型は、たとえば、配列識別番号２、４、６、８、１０および１２に表示されている基本的配列と少なくとも７５％相同な、さらにふさわしくは、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％相同な領域を含む。代替実施態様では、変異型は、同じサイズの親アミノ酸配列（「比較ウインドウ」）に関して、あるいは、当技術分野で周知のコンピューター相同性プログラムによってアラインメントが実施される整列配列と比較するとき、少なくとも７０％、さらにふさわしくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する領域を含む。何が適当な変異型を構成するかは、従来技術によって決定することが可能である。たとえば、トランスポゾン突然変異誘発を使用したランダム突然変異誘発、または位置指定突然変異誘発のいずれかを使用して、たとえば、配列識別番号２、４、６、８、１０および１２によるポリヌクレオチドをコードする核酸に突然変異させることができる。次いで、従来技術を使用して、結果として得られたＤＮＡフラグメントを、Ｅ．  ｃｏｌｉ等の適当な発現宿主にクローニングし、所望の活性を保持するクローンを検出する。上述の通り、所望の活性は、親ポリペプチドもしくは参照ポリペプチドの、プラスミンの一段階競合阻害を含む。ランダム突然変異技術を使用してクローンが誘導された場合、突然変異を検出するために、陽性クローンを配列決定しなければならないであろう。用語「変異型」は、天然の対立遺伝子の変異型も含む。
【００８２】
好ましい実施形態では、変異型は、一般式：
ＫＤＺＰＺＹ”ＣＺＬＢＢＺＢＧＸＣＺＸＸＸＢＸＦＡ”ＹＸＢＺＺＺＺＣＢＺＦＢＹＧＧＣＸＢＮＡＮＮＦＸＴＸＥＥＣＥＳＴＣＡＡ（Ｉ）
を有し、ここで、
Ｘは、任意のアミノ酸であり
Ｙ”は、疎水性アミノ酸であり、
Ａ”は、芳香族アミノ酸またはヒスチジンであり、
Ｚは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、ＱまたはＮであり、
Ｂは、中性アミノ酸、またはＰ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＬである。
【００８３】
２．４  テキスティリニンポリペプチド誘導体
本発明の適当な誘導体を参照すると、このような誘導体は、たとえば、配列識別番号２、４、６、８、１０および１２、またはその変異型等の、本発明によるテキスティリニンポリペプチドに対するアミノ酸欠失および／または付加を含み、前述の誘導体は、プラスミンの一段階競合阻害を保持する。「アミノ酸」の付加は、ポリペプチド、そのフラグメントまたはこれらの変異型と、他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を含んでもよい。これに関して、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたは変異型を高分子ポリペプチドに組み込むことができ、このような高分子ポリペプチドが、上述のプラスミンの一段階競合阻害を保持することも予期される。
【００８４】
本発明のテキスティリニンポリペプチド、そのフラグメントまたはこれらの変異型を、たとえば、もとの宿主から誘導されないさらなるタンパク質と融合させることが可能である。他方のタンパク質は、一例として、タンパク質の精製に役立つ。以下に詳述する通り、この点に関して、たとえば、ポリヒスチジンタグ、またはマルトース結合性タンパク質を使用することが可能である。あるいは、他方のタンパク質は、ポリペプチドもしくはそのフラグメントに対して有効な、抗原性応答もしくは免疫原性応答をもたらす可能性がある。他の可能な融合タンパク質は、免疫調節応答をもたらすものである。このようなタンパク質の個々の例としては、プロテインＡまたはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などが挙げられる。
【００８５】
本発明で考えられる他の誘導体としては、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成中の、側鎖への修飾、非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに架橋剤および本発明のポリペプチド、フラグメントおよび変異型に立体配置的制約を加える他の方法の使用が挙げられるが、その限りではない。
【００８６】
本発明で考えられる側鎖修飾の例としては、無水酢酸を用いたアシル化等によるアミノ基の修飾、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートを用いたアミド化、シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−ホスフェートを用いたリシンのピリドキシル化に続くＮａＢＨ4を用いた還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続くＮａＢＨ4を用いた還元、および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化が挙げられる。
【００８７】
Ｏ−アクリルイソウレア生成によるカルボジイミド活性化に続いて、例として、対応するアミドに誘導することにより、カルボキシル基を修飾することができる。
【００８８】
２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサール等の試薬と複素環縮合生成物を生成することにより、アルギニン残基のグアニジン基を修飾することができる。
【００８９】
システイン酸への過ギ酸酸化、４−塩化水銀フェニルスルホン酸、４−塩化安息香酸水銀、２-塩化水銀−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀剤を使用した水銀誘導体の生成、および他のチオール化合物との混合ジスルフィドの生成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化、およびアリカリ性ｐＨにてシアナートを用いたカルバモイル化等の方法によって、スルフヒドリル基を修飾することができる。
【００９０】
たとえば、２−ヒドロキシ−５−ニトロ臭化ベンジルもしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化またはＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって、トリプトファン残基を修飾することができる。
【００９１】
テトラニトロメタンでニトロ化することによりチロシン残基を修飾し、３−ニトロチロシン誘導体を生成することができる。
【００９２】
ピロ炭酸ジエチルを用いたＮ−カルボエトキシル化またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化により、ヒスチジン残基のイミダゾール環を修飾することができる。
【００９３】
ペプチド合成中に非天然のアミノ酸および誘導体を組み込む例としては、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルペンタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用などが挙げられるが、その限りではない。本発明で考えられる非天然アミノ酸のリストを表２に示す。
【００９４】
【表２】
0004542705.tif 000024
0004542705.tif 000025
0004542705.tif 000026
【００９５】
本発明は、たとえば、本発明のペプチドもしくはペプチド相同体の３Ｄ立体配置を安定化するために、（ＣＨ2）nスペーサー基（ｎ＝１〜６）を有するニ官能価イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類等のホモニ官能価架橋剤、および通常はＮ−ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応部分およびマレイミド等の別の基特異的反応部分またはジチオ部分またはカルボジイミドを含むヘテロニ官能価試薬を使用した、架橋剤の使用も考える。さらに、たとえば、アミノ酸のＣα原子とＣβ原子との間に二重結合を導入することによって、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の組み込みによって、また共有結合を導入することにより環状ペプチドまたは類縁体を生成することによって、たとえば、ペプチドまたは類縁体の、２つの側鎖間のＮ末端とＣ末端との間、または側鎖とＮ末端またはＣ末端との間にアミドを生成することによって、ペプチドを立体配置的に束縛することができる。たとえば、以下のものを参照することができる：直交保護基としてトリメチルシリル（ＴＭＳＥ）エステルを使用した、ＴＦＡ樹脂上でのペプチド環状化について説明しているＭａｒｌｏｗｅ（１９９３，  Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３：４３７-４４、参照により本明細書に援用する）、オキシム生成による水溶液中での非保護ペプチドの環状化について説明しているＰａｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔａｍ（１９９５，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｏｍｍ．  ２０２１−２０２２、参照により本明細書に援用する）、リシン側鎖固定による頭尾環状ペプチドの固相合成について開示しているＡｌｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：  ９６３３−９６３６、参照により本明細書に援用する）、三次元固相法による頭尾環状ペプチドの生成について説明しているＫａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９３，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４；  １５４９−１５５２、参照により本明細書に援用する）、Ｎ−保護基を損なわずに固定化ペプチドの活性化が実行され、その後の除去が環状化につながる、固定化されて活性化された中間体からの環状ペプチドの合成について説明しているＴｕｍｅｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９４，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．  １０６７−１０６８、参照により本明細書に援用する）、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖を用いた、不溶性支持体に付着したペプチドの頭尾環状化について説明しているＭｃＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９４，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：  １９５−２０６、参照により本明細書に援用する）、固体支持体によりペプチドを環状化する代替法について教示しているＨｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９４，  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：２３１−２４１、参照により本明細書に援用する）、およびシクロテトラペプチドおよびシクロペンタペプチドを合成する方法を開示しているＳｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ（１９９７，  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．  ４９：６７−７３ 、参照により本明細書に援用する）。前述の方法を使用して、プラスミンに関して一段階競合阻害反応速度論に従う立体配置的に束縛されたペプチドを生成することができる。
【００９６】
本発明は、テキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントのタンパク質分解的分解に対する抵抗性を改良したり、溶解特性を最適化したり、あるいはそれらを治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたテキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントも考える。
【００９７】
本発明は、さらに、テキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントの化学的類縁体を含み、その類縁体は、前述のポリペプチドまたはフラグメントの機能的類縁体として機能する。これに関して、化学的類縁体は必ずしも前述のポリペプチドまたはフラグメントから誘導されるとは限らないが、ある一定の立体配置的類似性を共有することが可能である。あるいは、化学的類縁体は、前述のポリペプチドまたはフラグメントの、ある一定の物理的特性によく似るように特別に設計することが可能である。化学的類縁体は、化学的に合成することも可能であり、たとえば、自然産物スクリーニングにより検出されることもある。
【００９８】
当業者に周知の適当な手順でテキスティリニンポリペプチドを調製することが可能である。たとえば、このようなポリペプチドは、
（ａ）テキスティリニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、たとえば、配列識別番号２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４または２６、またはそれぞれその生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を含み、そのヌクレオチド配列が転写および翻訳の調節核酸に操作可能に連結されている、組換えポリヌクレオチドを調製するステップと、
（ｂ）組換えポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入するステップと、
（ｃ）前述の組換えポリヌクレオチドから組換えポリペプチドを発現させるために宿主細胞を培養するステップと、
（ｄ）組換えポリペプチドを単離するステプと
を含む手順によって調製することが可能である。
【００９９】
前述の組換えポリヌクレオチドは、単離された天然のテキスティリニン配列を含むことが適当である。たとえば、このようなポリヌクレオチドは、配列識別番号１、３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２３、２５および４３のいずれか１つから選択することが可能である。
【０１００】
組換えポリヌクレオチドは、プラスミド等の自己再生型染色体外ベクターか、宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい発現ベクターを含むことが好ましい。
【０１０１】
転写および翻訳の調節核酸は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適する。多数のタイプの適切なな発現ベクターおよび適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関する技術分野で知られている。
【０１０２】
一般に、転写および翻訳の調節核酸としては、プロモーター配列、リーダーもしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列、転写終止配列、翻訳開始配列、転写終止配列、エンハンサー配列または活性化因子配列んどが挙げられるがその限りではない。
【０１０３】
本発明では、当技術分野で周知の構成プロモーターまたは誘導プロモーターを考える。プロモーターは、天然プロモーターか、複数のプロモーターのエレメントを結合するハイブリッドプロモーターの、いずれであってもよい。
【０１０４】
好ましい実施形態では、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、発現ベクターは、選択可能なマカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
【０１０５】
発現ベクターは、本発明の組換えポリペプチドが、前述の融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現されるように、融合パートナー（一般に発現ベクターにより適用される）を含んでもよい。融合パートナーの主な利点は、上述の融合ポリペプチドの同定および／または精製を助けることである。
【０１０６】
前述の融合ポリペプチドを発現させるためには、融合パートナーの翻訳リーディングフレームと本発明のヌクレオチド配列が一致するように、本発明によるヌクレオチド配列を発現ベクターに連結させる必要がある。
【０１０７】
融合パートナーの周知の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｅ部分、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ6）が挙げられるが、その限りではなく、これらは、アフィニティクロマトグラフィによる融合ポリペプチドの単離に特に有用である。アフィニティクロマトグラフィによる融合ポリペプチドの精製のために、適当なアフィニティクロマトグラフィ用マトリックスは、それぞれ、グルタチオン共役樹脂、アミロース共役樹脂、およびニッケル共役樹脂またはコバルト共役樹脂である。多くのこのようなマトリックスは、（ＨＩＳ6）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システム等の「キット」の形で入手できる。
【０１０８】
当技術分野で周知の別の融合パートナーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、顕微鏡またはフローサイトメトリーによる本発明の融合ポリペプチドの同定を可能にする蛍光「タグ」の役割をする。このＧＦＰタグは、本発明の融合ポリペプチドの亜細胞局在性を評価するとき、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞の単離に有用である。この後者の用途には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等のフローサイトメトリー法が特に有用である。
【０１０９】
融合パートナーは、Ｘａまたはトロンビン等（適切なプロテアーゼに本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化させ、その結果、本発明の組換えポリペプチドをそれから放出させる）に対するプロテアーゼ切断部位も有することが好ましい。次いで、放出されたポリペプチドを、次のクロマトグラフィー分離によって、融合パートナーから単離することができる。
【０１１０】
本発明による融合パートナーは、通常、特定の抗体を利用できる短いペプチド配列である、「エピトープタグ」もその範囲内に含む。特定のモノクロナル抗体を容易に利用できるエピトープの周知の例としては、ｃ−Ｍｙｃタグ、インフルエンザウイルスタグ、赤血球凝集素タグおよびＦＬＡＧタグが挙げられる。
【０１１１】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するステップは、トランスフェクション、形質転換を含む適当な方法で行うことが可能であり、その選択は、使用される宿主細胞によって異なる。このような方法は、当業者に周知である。
【０１１２】
本発明の組換えポリペプチドは、本発明によるテキスティリニンポリペプチド、フラグメント、変異型または誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することによって生成することができる。タンパク質発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なる。これは、当業者により通常の実験で容易に確認されるであろう。
【０１１３】
発現に適した宿主細胞は、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。本発明によるポリペプチドの発現に好ましい１つの宿主細胞は細菌である。使用される細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであってもよい。あるいは、宿主細胞は、たとえば、バキュロウイルス発現システムと共に使用することが可能なＳＦ９細胞等の、昆虫細胞であってもよい。
【０１１４】
当業者は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）（参照により本明細書に援用する）、特にセクション１６および１７、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  １９９４−１９９８）（参照により本明細書に援用する）、特に１０章および１６章、ならびにＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５−１９９７）（参照により本明細書に援用する）、特に１章、５章および６章に記載の標準的なプロトコールを使用して、組換えタンパク質を便利に調製することができる。
【０１１５】
組換えポリペプチドはリフォールディングを必要とする場合もある。ポリペプチドをリフォールディングする代表的な方法としては、たとえば、Ｂｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４：１３０５９−１３０６５）およびＮｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋに付与された米国特許第５，３７３，０９０号）（参照により本明細書に援用する）に記載のものが挙げられる。
【０１１６】
あるいは、たとえば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｓ出版の、「合成ワクチン」と題する出版物に掲載されている、「ペプチド合成」と題する９章に、Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈａｒｄにより記載されている溶液合成または固相合成を使用して、テキスティリニンポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を合成することが可能である。
【０１１７】
３．本発明のポリヌクレオチド
３．１  テキスティリニンポリペプチド
本発明は、上述のテキスティリニンポリペプチド、フラグメント、変異型または誘導体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。上述のポリヌクレオチドは、配列識別番号１、３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２３、２５および４３、配列識別番号１、３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２３、２５または４３のいずれか１つのポリヌクレオチドフラグメント、および前述の配列のポリヌクレオチド相同体からなる群から選択されることが適当である。これらの配列は、上述の通り、プラスミンの一段階競合阻害を示す生成物をコードすることが好ましい。
【０１１８】
さらに十分に後述する通り、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓから、プラスミンの一段階競合阻害をコードするテキスティリニン（Ｔｘｌｎ）遺伝子のファミリーが得られている。配列識別番号１は、配列識別番号２に明示された約７ｋＤａの成熟Ｔｘｌｎ  １ポリペプチドをコードするＴｘｌｎ  １遺伝子の一部に対応し、配列識別番号３は、配列識別番号４に明示された約７ｋＤａの成熟Ｔｘｌｎ  ２ポリペプチドをコードするＴｘｌｎ  ２遺伝子の一部に対応する。配列識別番号５、７、９および１１は、それぞれ、Ｔｘｌｎ  ３、Ｔｘｌｎ  ４、Ｔｘｌｎ  ５、およびＴｘｌｎ  ６遺伝子の一部に対応する。これらの部分は、それぞれ、成熟Ｔｘｌｎ  ３ポリペプチド、成熟Ｔｘｌｎ  ４ポリペプチド、成熟Ｔｘｌｎ  ５ポリペプチド、成熟Ｔｘｌｎ  ６ポリペプチドをコードする。
【０１１９】
本発明は、Ｔｘｌｎ  １、Ｔｘｌｎ  ２、Ｔｘｌｎ  ３、Ｔｘｌｎ  ４、Ｔｘｌｎ  ５およびＴｘｌｎ  ６に関連した全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ポリヌクレオチドも提供する。前述の各全長ポリヌクレオチドは、２４残基のリーダーペプチドをコードする第１の配列、および成熟Ｔｘｌｎポリペプチドをコードする第２の配列を含む。第１の配列は、配列識別番号１５を含むことが好ましい。配列識別番号１７、１９、２１、２３および２５は、それぞれ、Ｔｘｌｎ  １、Ｔｘｌｎ  ２、Ｔｘｌｎ  ３、Ｔｘｌｎ  ４、Ｔｘｌｎ  ５およびＴｘｌｎ  ６に関する全長ＯＲＦポリヌクレオチドに対応する。配列識別番号４３は、Ｔｘｌｎ  １に関して得られた最大のｃＤＮＡ配列に対応し、ＯＲＦ配列に加えて、５’ＵＴＲ配列および３’ＵＴＲ配列を含む。
【０１２０】
あるいは、遺伝子コードを利用し、たとえば、オリゴヌクレオチドシーケンサーを使用して、宿主細胞が翻訳したときに、配列識別番号２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４または２６によるポリペプチド、そのポリペプチドフラグメントを結果として生成するヌクレオチドの配列を合成することにより、本発明のテキスティリニンポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を便利に調製することが可能である。
【０１２１】
３．２  ポリヌクレオチド相同体
下記の手順：
（ｉ）適当な宿主から核酸抽出物を得ることと、
（ii）それぞれが参照ポリヌクレオチドの一部を含む、任意に変性するプライマーを製作することと、
（iii）上述のプライマーを使用して、核酸増幅技術により、上述の核酸抽出物から少なくとも１つの増幅生成物を増幅すること（前述の増幅生成物はポリヌクレオチド相同対に対応する）と
に従って、本発明の適当なポリヌクレオチド相同対調製することができる。
【０１２２】
核酸抽出物が得られる宿主は、ヘビである。適当なヘビは、Ｅｌａｐｉｄａｅ科、およびＶｉｐｅｒａｅ科からなる群から選択される。
【０１２３】
プライマーは、
（Ａ）ＡＴＧＡＡＲＧＡＹＡＧＲＣＣＨＧＡＲＹＴＮＧＡＲ［配列番号２７］
（Ｂ）ＧＴＲＣＴＹＴＣＲＴＧＹＴＣＹＴＣＹ［配列番号２８］
（Ｃ）ＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣ［配列番号２９］
（Ｄ）ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ［配列番号３０］
（Ｅ）ＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＣ［配列番号３１］
（Ｆ）ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号３２］
（Ｇ）ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ［配列番号３３］
（Ｈ）ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号３４］
（Ｉ）ＡＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴ［配列番号３５］
（Ｊ）ＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＴ［配列番号３６］
（Ｋ）ＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＧＧＡＴ［配列番号３７］
（Ｌ）ＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧ［配列番号３８］
（Ｍ）ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＡＴ［配列番号３９］
（Ｎ）ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡ［配列番号４０］
（Ｏ）ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡ［配列番号４１］
（Ｐ）ＡＴＴＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＡＧ［配列番号４２］
からなる群から選択されることが適当である。
【０１２４】
あるいは、ヘビの組織から誘導されるポリヌクレオチドライブラリーから、本発明のポリヌクレオチド相同体を得ることができる。このようなライブラリーは、ヘビｃＤＮＡライブラリーであってもよく、ヘビゲノムＤＮＡライブラリーであってもよい。
【０１２５】
適当な核酸増幅技術は熟練者に周知であり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４−１９９８、前掲、１５章）（参照により本明細書に援用する）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、たとえば、米国特許第５，４２２，２５２号に記載の鎖置換増幅（ＳＤＡ）、たとえば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：１５８７−１５９４および国際出願ＷＯ９２／０１８３）およびＬｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （国際出願ＷＯ９７／１９１９３）（参照により本明細書に援用する）に記載のローリングサークル複製、たとえば、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：１０７７−１０８０）（参照により本明細書に援用する）に記載の核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、および、たとえば、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：  ５３９５−５４００）（参照により本明細書に援用する）に記載のＱ−Ｂレプリカーゼ増幅などが挙げられる。
【０１２６】
一般に、参照ポリヌクレオチドに実質的に相補的なポリヌクレオチド相同体は、核酸がマトリックス（ニトロセルロース等の合成膜が好ましい）上に固定されるステップ、その後のハイブリダイゼーションステップ、および検出ステップを含むブロッティング技術により同定される。相補的ＤＮＡ配列の同定にはサザンブロッティンッグが使用され、相補的ＲＮＡ配列の同定にはノーザンブロッティングが使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングを使用して、相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド配列を同定することができる。このような技術は、当業者に周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４−１９９８、前掲）の２．９．１〜２．９．２０ページに記載されている。
【０１２７】
このような方法によれば、サザンブロッティングは、ゲル電気泳動でサイズによりＤＮＡ分子を分離すること、サイズ分離したＤＮＡを合成膜に移動させること、および膜結合したＤＮＡを、放射的、酵素的もしくは蛍光色素的に標識した相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングでは、上述の通り、ハイブリダイゼーションの前に、ＤＮＡ試料を合成膜に直接適用する。
【０１２８】
プラークハイブリダイゼーション法またはコロニーハイブリダイゼーション法等により、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内の相補的ポリヌクレオチドを同定するとき、代替ブロッティングステップが使用される。この方法の代表例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９、前掲）８〜１２章に記載されている。
【０１２９】
一般に、下記の一般手順を使用して、ハイブリダイゼーション条件を決定することができる。上述の通り、ポリヌクレオチドを、合成膜にブロットする／移動させる。上述の通りに、本発明のヌクレオチド等の参照ポリヌクレオチドを標識し、この標識ポリヌクレオチドが固定化ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる能力を分析する。
【０１３０】
熟練者は、多数の因子がハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことを認識するであろう。検出可能なシグナルを提供するために、放射標識したポリヌクレオチド配列の比活性は、約１０8ｄｐｍ／ｍｇ以上であるべきである。比活性１０8〜１０9ｄｐｍ／ｍｇの放射標識ヌクレオチド配列は、約０．５ｐｇのＤＮＡを検出することができる。検出できるためには、十分なＤＮＡを膜上に固定しなければならないことは、当技術分野で周知である。過剰な固定化ＤＮＡ、通常は１０μｇを有することが望ましい。ハイブリダイゼーション中に、１０％（ｗ/ｖ）硫酸デキストラン（分子量５００，０００）またはポリエチレングリコール６０００等の不活性なポリマーを加えると、ハイブリダイゼーションの感度を高めることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ、前掲、２．１０．１０参照）。
【０１３１】
膜上に固定されたポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションから意味深い結果を得るためには、洗浄後、固定化ポリヌクレオチドに十分な量の標識ポリヌクレオチドをハイブリダイズしなければならない。洗浄することにより、標識ポリヌクレオチドと所望の程度の相補性を有する固定化ポリヌクレオチドのみに、標識ポリヌクレオチドがハイブリダイズされることが保証される。
【０１３２】
本発明によるポリヌクレオチド相同体は、ストリンジェントな条件で、参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが理解されるであろう。代表的なストリンジェントな条件としては、たとえば、（１）０．７５Ｍ  リン酸水素ナトリウム／０．５Ｍ  リン酸ナトリウム／１ｍＭ  ＥＤＴＡニナトリウム／１％ｓａｒｋｏｓｙｌ、約４２℃にて少なくとも３０分間、または（２）６．０Ｍ  尿素／０．４％ラウリル硫酸ナトリウム／０．１×ＳＳＣ、約４２℃にて少なくとも３０分間、または（３）０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約６８℃にて少なくとも２０分間、または（４）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約５５℃にて約６０分間、または（５）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約６２℃にて約６０分間、または（６）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約６８℃にて約６０分間、または（７）０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約５５℃にて約６０分間、または（８）０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約６２℃にて約１時間、または（９）０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、約６８℃にて約６０分間などが挙げられる。詳細な例については、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、前掲、２．１０．１〜２．１０．１６ページおよびＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）のセクション１．１０１〜１．１０４におけるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（参照により本明細書に援用する）を参照されたい。
【０１３３】
ストリンジェントな洗浄は、一般に、約４２℃〜６８℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度もストリンジェントな条件に適する可能性があることを理解するであろう。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成の場合、最高のハイブリダイゼーションは、一般に、Ｔｍより約２０℃〜２５℃低い温度で起こる。Ｔmが、融解温度、すなわち、２つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当技術分野で周知である。Ｔmを推定する方法は、当技術分野で周知である（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  前掲、２．１０．８ページ参照）。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの場合、最高のハイブリダイゼーションは、一般に、Ｔｍより約１０℃〜１５℃低い温度で起こる。
【０１３４】
その他のストリンジェントな条件は、当技術分野で周知である。熟練者は、様々な因子を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化できることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確保するのに役立つことができる。
【０１３５】
固定化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドを検出する方法は、当業者に周知である。このような方法としては、オートラジオグラフィー検出法、ケミルミネッセンス検出法、蛍光検出法および比色検出法などが挙げられる。
【０１３６】
４．ベクター
ポリヌクレオチドを１つまたは複数の調節核酸と操作可能に連結することにより、本発明によるポリヌクレオチドは、宿主において、都合よく発現可能になる。このようにして製作された合成構築物すなわちベクターを、生物またはその一部に先ず導入してから、特定の細胞型または組織型で、その構築物を発現させることが可能である。単細胞生物ならびに多細胞生物を含んでもよい適当な生物が、本発明で考えられる。適当な単細胞生物としては細菌が挙げられる。代表的な多細胞生物としては、酵母、哺乳類および植物が挙げられる。
【０１３７】
ベクターの構築は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）の関連したセクションに記載されている適当な技術によって行うことが可能である。しかし、本発明は、ベクターを構築するための、いずれか１つの特定の技術に依存もしくは関連するものではないことに留意されたい。
【０１３８】
ポリヌクレオチドの発現の調節に使用することが可能な調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなどが挙げられるが、その限りではない。このような調節配列は当業者に周知である。本発明のポリヌクレオチドの発現の誘導に使用することが可能な適当なプロモーターとしては、構成プロモーターおよび誘導プロモーターが挙げられる。
【０１３９】
５．治療薬
本発明のさらなる特徴は、血液消失に対して患者を軽減する薬学的組成物の有効成分としての本発明のペプチド、フラグメント、改変体または誘導体（治療薬）である。適切には、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１４０】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、全身投与に安全に使用され得る固体もしくは液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当該分野において周知の様々な薬学的に受容可能なキャリアが使用され得る。これらのキャリアは、糖、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝化溶液、乳化剤、等張生理食塩水、ならびに発熱物資を含まない水を含む群から選択され得る。
【０１４１】
任意の適切な投与経路は、患者に本発明の組成物を提供するために使用され得る。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを用い得る。好ましくは、静脈内経路が用いられる。
【０１４２】
剤形としては、錠剤、散布剤、懸濁剤、注射剤、懸濁液、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアゾル、経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形はまた、特にこの目的のために設計される注入用もしくはインプラント用制御放出デバイスまたはこの様式で付加的に作用するために改良されたインプラントの形態を含む。治療薬の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪酸アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸を含む疎水性ポリマーならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体で該治療薬を被覆することによって生じ得る。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いることによって生じ得る。
【０１４３】
経口または皮経口投与に適切な本発明の薬学的組成物は、それぞれ予め定められた量の１以上の本発明の治療薬を含有するカプセル、小袋または錠剤などの個別単位、粉末または顆粒あるいは水性液体、非水性液体、水中油滴乳濁液もしくは油中水滴乳濁液中の溶液もしくは懸濁液として含有する。そのような組成物は、薬学的方法のいずれかによって調製され得るが、すべての方法は、上記の１種以上の免疫原因子と１種以上の必要な成分を構成するキャリアとを関連させる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原因子と液体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアもしくは両方とを均一あるいは完全に混合し、次いで必要であれば生成物を所望の体裁に形成することによって調製される。
【０１４４】
投与処方物に適合する方法、および血液消失から患者を軽減するのに治療上有効である量で、上記の組成物を投与し得る。患者に投与される用量は、本明細書に関し、期間中に患者において血液消失の低減または停止などの有益な応答を生じるのに十分であるべきである。投与すべき治療薬の量は、年齢、性、重量およびその一般的健康状態を含む治療すべき被験体に依存する。これに関し、投与のための治療薬の正確な量は、実施者の判断に依存する。血液消失の治療において投与すべき治療薬の有効量を決定する場合、医師は、期間中の血液消失の進行を評価し得る。いずれにしても、当業者であれば、本発明の治療薬の適切な用量を容易に決定することができるであろう。そのような用量は、治療薬のナノグラムからミリグラムのオーダーである。
【０１４５】
６．抗腫瘍剤
本発明はまた、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、抗フィブリン抗体にコンジュゲートした誘導体の改変体を含む抗腫瘍剤にまで及ぶ。従って、そのようなコンジュゲートは、そのような腫瘍の進行および浸潤を阻害すべきであり得る。この点については、参考文献としてＲａｕｔおよびＧａｆｆｎｅｙ（１９９６，Ｆｉｖｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １０（補遺４）：１−２６、要約Ｎｏ３９）（参考として本明細書に援用されている）による要約があり得る。
【０１４６】
抗フィブリン抗体は、フィブリン、好ましくはヒトフィブリンに結合またはコンジュゲートする任意の適切な抗体を含み得る。例えば、抗フィブリン抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、例えば、ポリクローナル抗体血清を得るためのマウスまたはウサギを含み得る産生種にフィブリンを注入することによって調製してもよい。
【０１４７】
産生種において得られる抗フィブリンポリクローナル抗血清の代わりに、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）による記事に記載の標準的な方法を用いて、
【０１４８】
またはフィブリンを接種された産生種由来の脾臓もしくは他の抗体産生細胞を不死化することによって、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（１９９４，Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｉｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎ  Ｉｎｃ．
【０１４９】
（参考として本明細書に援用される））より最近のその改良法によって、モノクローナル抗体を産生してもよい。
【０１５０】
本発明の抗腫瘍剤を産生するために使用され得る好ましいモノクローナル抗体としては、Ｔｙｍｋｅｗｙｃｚら（１９９３，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．４：２１１−２２１）（参考として本明細書に援用される）により記載の抗フィブリンモノクローナル抗体またはＲａｕｔおよびＧａｆｆｎｅｙ（１９９６、前掲）により記載のモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
上記のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃもしくはＦａｂフラグメントを含む抗フィブリン抗体も考慮される。あるいは、抗フィブリン抗体は、フィブリンに対する単一鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖｓ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖｓは、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号においてそれぞれ記載の方法またはＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３）（参考として本明細書に援用される）に従い調製され得る。
【０１５２】
任意の適切な手順を使用して、抗フィブリン抗体と本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、改変体または誘導体とをコンジュゲートし得る。参考文献として、例えば、ＧｒａｂａｒｅｋおよびＧｅｒｇｅｌｙ（１９９０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５）（参考として本明細書に援用される）があり得る。
【０１５３】
本発明を容易に理解し実用効果を得るために、以下の非制限的実施例により特に好適な実施態様について説明する。
【０１５４】
（実施例）
実施例１
動物モデルにおいて出血を阻害するＰｓｅｕｄｏｎｎｊａ  Ｔｅｘｔｉｌｉｓ  Ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来の２つのプラスミンインヒビターの特徴付け
材料および方法
材料
回収および凍結乾燥されたＰ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ毒を、Ｍｒ  Ｐｅｔｅｒ  Ｍｉｒｔｓｃｈｉｎ，Ｖｅｎｏｍ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｔａｎｕｎｄａ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａより得た。毒を０．０５Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍｇ／ｍｌにて再構成し、クロマトグラフィーまたは分析前に遠心分離（２，０００ｇ、３０分間）した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００、ｃｏｎ  Ａ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎより入手し、合成発色物質Ｓ−２２５１はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎより入手した。いくつかの動力学的実験のために、Ｓａｎｏｆｉ／Ｃｈｏａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ）由来の高度に精製されたプラスミンを使用した。他の全ての緩衝液および試薬は分析用であった。
【０１５５】
プラスミノーゲンおよびプラスミンの調製
他に記載のアフィニティークロマトグラフィー手順（ＤｅｕｔｓｃｈおよびＭｅｒｔｚ．１９７０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７０：１０９５）を用いて、過去に回収され、クエン酸処理された血漿より、ヒトプラスミノーゲンを精製した。ウロキナーゼ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂで活性化することによって、プラスミノーゲンよりヒトプラスミンを調製し（Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＫＣ．，１９７８「プラスミン」：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｋｗａｒｄｔ  Ｆ編、Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ４６：３１７）、プラスミンの内部標準（７７／５５８）に対して較正した。
【０１５６】
プラスミン阻害アッセイ
本質的に他に記載（Ｆｒｉｂｅｒｇｅｒら、１９７８，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７：１３８）の通り、プラスミン阻害アッセイを行った。９００μＬの０．１５Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５μＬ（０．１ＩＵ）のプラスミン、２５μＬのインヒビターを５０μＬの基質Ｓ−２２５１（３．０ｍＭ）に添加し、Ｈｉｔａｃｈｉ５５７記録分光光度計において４０５ｎｍの吸収を連続測定することによって、残存プラスミンを決定した。内部標準（７７／５５８）を使用して、プラスミン活性の標準曲線を調製した。
【０１５７】
Ｔｘｌｎ１および２の精製
ここで、本発明者らは、２つの異なる形態のＴｘｌｎインヒビターの単離を可能にする精製手順についてはじめて記載する。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（５．０×９５ｃｍ）を、４℃にて０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）で、１分間あたり１ｍＬの流速で平衡化した。５００ｍｇの凍結乾燥Ｐ．ｔｅｘｉｌｉｓ毒を２５ｍＬのカラム緩衝液において再構成し、続いて１０，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行った。ＬＫＢフラクションコレクターを使用して１２ｍＬ画分を回収し、ラインＵＶ検出器のＡｌｔｅｘ二波長を用いて、溶出物を２８０ｎｍで監視した。ＹＭ３メンブランを有するＡｍｉｃｏｎ攪拌型セル濃縮機Ｍｏｄｅｌ４０２を使用して、回収したプラスミンインヒビーター画分を濃縮し、この濃縮物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×１２ｃｍ）を、４℃にて０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、１分間あたり１．０ｍＬの流速で平衡化した。濃縮されたプラスミンインヒビターを適用後、カラムを緩衝液で洗浄し、プラスミンインヒビター活性を有さない非結合タンパク質のピークを得た。２つの形態のＴｘｌｎを分離するために、ＮａＣｌ（０−０．５Ｍ、５００ｍＬ）の直線勾配を１分間あたり１．０ｍＬの流速で適用した。回収したプラスミンインヒビター１および２（Ａｍｉｃｏｎセルにおいて濃縮された）を、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−１００上で個々にさらに精製した。最大のプラスミン阻害活性を有する画分を回収し、濃縮し、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中約１ｍｇ／ｍＬ（１４３μＭ）の濃度で保存した。最後に、０．１５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で緩衝化されたＣｏｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（１×１０ｃｍ）のカラムに適用することにより、微小の混入物をＴｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２サンプルから除去した。回収および濃縮したプラスミンインヒビターを、１分間あたり１．０ｍＬの流速でこのカラムに適用し、洗浄ピークにおいて阻害活性を見出した。
【０１５８】
水中０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で緩衝化し、０．０５％ＴＦＡ中０〜７０％アセトニトリル勾配を用いて展開するＷａｔｅｒｓ  Ｃ18μ結合充填カラム（０．６×３０ｃｍ）上の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって、Ｔｘｌｎ調製物の精製を確認した。クロマトグラフィーを２１４ｎｍを監視し、６０分間で勾配を展開した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）（ＷｅｂｅｒおよびＯｓｂｏｒｎ，１９６９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４０６）を用いて精製を確認する一方、サンプル溶液中４Ｍ尿素を組み入れる方法（ＧａｆｆｎｅｙおよびＤｏｂｏｓ．１９７１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１５：１３）によってサンプルを調製した。
【０１５９】
アミノ酸配列決定
アルゴン下、３７℃で１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を有する６Ｍ塩酸グアニジン、０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、（ｐＨ９．５）において、Ｔｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２の還元およびカルボキシメチル化を行った。１５ｍＭヨード酢酸、３０分間でカルボキシメチル化（ＣＭ）工程を行った。（１：１００）の酵素対基質比を使用し、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０中、それぞれエンドプロテイナーゼＬｙｓＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐＮで３７℃にて１８時間処理することにより、ＣＭ  Ｔｘｌｎ１および２を消化した。ＴＦＡによる酸化で反応を停止し、ダイオードアレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ１０９０液体クロマトグラフを使用するＶｙｄａｃ  Ｃ８カラム（２．１×１５０ｃｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、消化物を分画した。０．２ｍｌ／分の流速で、水中０．１％ＴＦＡ〜７０％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡの直線勾配を形成した。全てのクロマトグラフィーは、室温で行った。Ｔｘｌｎ１および２の長Ｎ末端配列決定を最初に行うことによって、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇ１０００５Ａシークエンサー上で、アミノ酸配列決定を行った。エンドＬｙｓＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐＮ消化から得られるＣ末端フラグメントから、Ｔｘｌｎ１および２のＣ末端配列を誘導した。配列の証拠は、全分子の長Ｎ末端配列長、逆相クロマトグラフィーによって単離されるペプチドの１つのさらなるクロマトグラフィーによって得られるエンドＬｙｓ  Ｃペプチドの伸長配列およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ  Ｎペプチドの配列から誘導される。Ｃ末端の２つのアミノ酸を、クローニングおよびＥ．ｃｏｌｉにおけるテキシチリニンの発現中に得られる全長ｃＤＮＡ配列から同定した（以下の実施例２に記載する）。
【０１６０】
質量分析
マトリックス援用レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｆｒａｎｚｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｋ  ＧＭＢＨ，Ｂｒｅｍａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、リフレクトロン（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）様式で排他的に作動した。サンプルを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する３０％アセトニトリル水溶液およびステンレススチール標的上に０．５〜１ｍＬを沈積する前に、クエン酸水素二アンモニウムを含有する２，６−ジヒドロアセトフェノンから成る２ｍＬのマトリックスに希釈した。
【０１６１】
マウス尾出血モデル
ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＲｏｍｐｕｎ（ジラジン、４０ｍｇ／ｍＬ）の等量混合物の１０倍希釈の０．４ｍＬの腹腔内注射による麻酔導入後、雌雄の成熟異系交配Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（平均２０グラム）を用いて、出血モデルを確立した。麻酔を確立し、２分後にそれぞれのマウスにつき尾摘出を行った後、アプロチニン、２種のｔｘｌｎ（それぞれの物質について１００μｇ／１００μＬの生理食塩水）の尾静脈の静脈内送達を行った。これらの実験で使用されたプラスミンインヒビターの用量は、２０グラムのマウスの重量に対して調節されたヒトＣＰＢ手術中での用量に類似した。予め秤量したエッペンドルフチューブに回収することによって、血液消失を測定した。正確性のため、血液消失は容量よりむしろ重量によって測定した。頚部脱臼により全てのマウスを安楽死させた。全てのマウス実験は、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会より承認された。該委員会は、用量応答研究を促進しなかったため、本発明者らは、ヒト手術において用いられる調整された用量は、これらの初期研究ついて現実的なレベルであった。Ｔｘｌｎのそのような用量は、２日間観察した場合、マウスに対して任意の有害作用を誘導しないことが認められた。
【０１６２】
プラスミン阻害の動力学
２種の精製されたテキシチリニン（Ｔｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２）によるプラスミン阻害動力学の研究手順は、他に記載されている通り（Ｓｔｏｎｅら、１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３：１７５）であり、不純なＴｘｌｎ調製物を研究するために使用される方法（Ｗｉｌｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）とは、４倍および３６倍高い酵素濃度を使用した点で異なった。この後者のアプローチは、１時間から１０分未満への時間尺度の短縮を可能にした。２５℃にて０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４において酵素インヒビターアッセイを行った。７５μＭ発色物質（Ｓ−２２５１）および１６〜４１０ｎＭ  Ｔｘｌｎを使用するこれらの実験では、２ｎＭまたは１８ｎＭプラスミンのいずれかの濃度を使用した。プラスミン阻害のパターンは、遅いタイトバインディング阻害に関連する形態のパターンであったため、進行曲線を以下の関係について分析した。
［Ｐ］＝ｖsｔ＋（ｖs−ｖ0）{１−ｅｘｐ（−ｋｔ）}／ｋ  （式１）
該式は、初期値（ｖ0）および最終的に達成された（ｖs）速度ならびに初期および最終（定常）状態の間の転移についての見かけの速度定数（ｋ）の関数として発色生成物［Ｐ］の濃度の時間依存性を表す。本発明のシステムでは、発色物質の濃度［Ｓ］を固定して実施した実験の初期速度は、インヒビター濃度［Ｉ］に依存しなかった（ｖ0がプラスミンインヒビターの非存在下で初期速度として同定され得る簡素化環境（式２を参照のこと））。これらの条件下で、速度定数（ｋ）は、競合的インヒビター定数（ＫI）および発色物質のミカエリス定数（Ｋm）について以下の式として表現され得る。
ｋ＝ｋd［１＋（Ｉ）／{ＫI（１＋［Ｓ］／Ｋm）}］  （式２）
式中、ｋdはプラスミン−インヒビター複合体の解離に対する速度定数である（Ｓｔｏｎｅら、１９８４、前掲）。定常状態の速度、ｖsは、最大速度Ｖおよび古典的競合阻害について表現され得る。即ち、
ｖs＝Ｖ［Ｓ］／{［Ｓ］＋Ｋm（１＋（Ｉ）／ＫI）}  （式３）
インヒビター定数ＫIおよび解離速度定数ｋdは、進行曲線の包括的分析から生じる２つの曲線固定パラメータであった。
【０１６３】
結果
精製データ
図１は、３つの大きなピークおよび２つの小さなピークを示す粗毒からのタンパク質（１〜５と標記される）のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００クロマトグラフィー分離を示す。プラスミン阻害活性は、溶出画分を監視するためのプラスミン中和アッセイを使用して、右肩上がりのピーク４（斜線を施した領域を参照のこと）で示される。さらに、回収したインヒビターの分画（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ３濃縮）を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム上で行った。図３は、プラスミン阻害活性の２つの異なるピークを示す得られた分離を示し、中実の水平棒で表し、１および２と標記される。それぞれのピークを個別に回収し、濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラムに適用して微量の不純物を除去した。図２は、Ｔｘｌｎ１の溶出プロフィールを示し、これは、Ｔｘｌｎ１の溶出プロフィールに同一である。但し、図２の挿入は、このカラムとは異なる溶出容積を有するそれぞれを示すそれぞれのＴｘｌｎの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００溶出物質の純度をさらに実証した（データ示さず）。最終的に濃縮されたプラスミンインヒビターを、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝化生理食塩水中、約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、−２０℃で保存した。
【０１６４】
これらの調製物は、動力学的および物理的特徴付けに適切である一方、Ｔｘｌｎ１および２は、血液消失を評価するために使用されたマウスモデルにおいて困難を生じたことが認められた。そのような実験では、他に記載（Ｍａｓｃｉ  ＰＰ．１９８６．凝固および線溶に対するオーストラリアヘビ毒の影響  Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｔｈｅｓｉｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）のＣｏｎ  Ａ−Ｓｅｐａｈｒｏｓｅカラムを使用して、微量の強力なプロトロンビンアクチベーター複合体を除去する必要があった。
【０１６５】
一次配列
図５は、Ｔｘｌｎ１および２のアミノ酸配列ならびに、比較のために、アプロチニンおよびＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｔａｉｐａｎ、Ｏｘｙｕｔａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓの毒から単離されたＴａｉｃｏｔｏｘｉｎ関連プラスミンインヒビター（Ｔｘｌｎ１および２に最も近い相同性を有する）のアミノ酸配列を示す。４つの全てのプラスミンインヒビターは、このグループのプラスミンインヒビターに典型的であり、該インヒビターに安定性を付与するシステイン配位を有することが認められ得る。Ｔｘｌｎ１および２は、８０℃で２時間加熱した場合でも阻害活性を失わないことが見出された（データ公開せず）。Ｔｘｌｎ１とＴｘｌｎ２との間には６つのアミノ酸の配列の差異が認められたが、それぞれ、アプロチニンに４５および４３％の相同性を示した。Ｔｘｌｎ１および２間では、それぞれ５８％および５５％の相同性が認められ、Ｔａｉｃｏｔｏｘｉｎは、プラスミンインヒビターに関連した。両Ｔｘｌｎは、正味の負電荷が−４（Ｔｘｌｎ１）および−６（Ｔｘｌｎ２）であるかなりの酸性タンパク質であるが、アプロチニンはかなりの塩基性であり、正味の電荷が＋６である。Ｔｘｌｎ１および２に関する質量分析のデータは、６６８２．４および６６８９．３の分子量を示し（データ示さず）、アミノ酸組成由来の分子量と十分に一致した。
【０１６６】
動力学的データ
図４は、０〜４１０ｎＭ  Ｔｘｌｎ１の存在下で２ｎＭプラスミンによる発色物質の加水分解に対する進行曲線を示す。これらのデータは、アプロチニンについて報告されたデータ（Ｗｉｌｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）により緊密に類似し、本発明者らの不純Ｔｘｌｎに関する過去のデータは簡単な競合的阻害を示唆したが、精製されたＴｘｌｎ１および２に関するこれらの後のデータは、アプロチニンの２段階メカニズムの方に類似する。式１〜３に関する包括的分析によるデータから推定されるインヒビター定数（ＫI）を、Ｔｘｌｎ２およびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーの前に共クロマトグラフィーを行ったテキシチリニンの混合物の対応する値と共に表３に示す。
【０１６７】
【表３】
0004542705.tif 000027
【０１６８】
高プラスミン濃度（１８ｎＭ）による実験についての進行曲線から得られる対応する結果も表３にまとめる。単離されたＴｘｌｎ１および２に関するインヒビター定数（相互に区別され得る）と部分精製された調製物の定数との比較は、イオン交換および排除（ｅｘｔｒａ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００クロマトグラフィー工程によって３〜５倍のタンパク質の純化が達成されたことを示唆する。表３に示されるインヒビター定数は、不純Ｔｘｌｎについて先に報告された１５０μＭの値（Ｗｉｌｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）よりもはるかに小さい。本発明の研究において観察されたＴｘｌｎ−プラスミン結合の強度の増加は、おそらく、本発明のより広範な精製手順の後者の工程の間に、Ｔｘｌｎから同定されていない化合物が除去されたことを反映していると思われる。このことにも係わらず、プラスミンに関する純粋ＴｘｌｎのＫi値は、アプロチニンについて観察される値（Ｗｉｌｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）よりも約１００倍少ない。
【０１６９】
動物出血モデルにおけるＴｘｌｎの挙動
プラスミン活性のＴｘｌｎ阻害は、アプロチニンについて観察される値よりもかなり弱い（１００倍、表３を参照のこと）ため、血液消失を阻止するＴｘｌｎについて、アプロチニンと同じ用量で使用する場合の有効性を確立するために動物モデルが使用されている。
【０１７０】
摘出されたマウス尾静脈からの血液消失に対する（尾静脈）Ｔｘｌｎ１および２の静脈内送達の効果を表４に示し、比較のため、アプロチニンの結果も示す。
【０１７１】
【表４】
0004542705.tif 000028
0004542705.tif 000029
【０１７２】
使用された量は、重量レベルでヒトにおいて臨床的に使用されるアプロチニンの量に等価であり、これは、平均２０グラムのマウスあたりで研究されたそれぞれの物質の１００μｇであった。アプロチニンは血液消失を６０％抑制したが、両Ｔｘｌｎは、生理食塩水を注射された対照と比較して、同様の程度で血液消失を抑制した。動物モデルで使用されたＴｘｌｎおよびアプロチニンの量はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプラスミンの中和に基づいており、何らかの誤差を生じ得る、これらの比較の確認はさらに調査を必要とし得る。将来実験に使用すべきこれらのインヒビターの量は、モルで比較するのがより適切であろう。
【０１７３】
考察
血液供与の状態が悪化しているため、主な手術または以後の外傷での血流の抑制が現在の関心事である。血液へのウイルス混入の発生率が上昇していることは、社会医学上の問題となってきており、緩和されていないようである。ＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスの血液への混入に関する不安がある一方、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）およびクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）に関連するプリオンによって交差混入の可能性が依然としてあり、主に全血輸血中に生じ得る。
【０１７４】
ウシ肺から誘導されるアプロチニンは、人工心肺などの手術手順中の血流を阻止するために使用される（Ｒｏｙｓｔｏｎ  Ｄ．１９９０．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．１：５３；Ｒｏｙｓｔｏｎ  Ｄ．１９９２．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｖａｓｃ．Ａｎｅｓｈ．６：７６）。実際に、ＣＰＢは、アプロチニンが使用される主な手術環境であるが、この薬物を使用して、神経手術（ＧｕｒｄｅｔｔｉおよびＳｐａｌｌｏｎｅ．１９８１．Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５：２３９）、整形外科（Ｋｅｒｔｅｒｌら、１９８２．Ｍｅｄｉｓｉｎｉｓｈｅ  Ｗｅｌｔ３３：４８０）、肝（Ｎｅｕｈａｕｓら、１９８９  Ｌａｎｃｅｔ  １１：９２４）および泌尿器科（ＫｏｓｔｅｒｓおよびＷａｎｄ、１９７３．Ｕｒｏｌｏｇｅ  １２：２９５）手術中の血液消失が抑制されている。血栓症（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら、１９９６．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７５：１；Ｃｏｓｇｒｏｖｅら、１９９２．Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５４：１０３１；Ｓａｍａｍａら、１９９４  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７１：６６３）および心臓手術中の致死性アナフィラキシー（Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈら、１９９５．Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．８０：８３０）の若干の報告があるにも係わらず、このような広範な使用が認められる。アプロチニンの正確な作用機序については不明であるが、プラスミン阻害が血液消失抑制能の中心であることが現在受け入れられている（Ｒｏｙｓｔｏｎ  Ｄ．１９９０、前掲；Ｏｒｃｈａｒｄら、１９９３．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：５９６）。しかし、アプロチニンは、凝固カスケードおよび血小板機能に対して他の効果を有する（Ｗｅｓｔａｂｙ，Ｓ．１９９３．Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５５：１０３３）。血小板付着の主な原因であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターは、バイパス回路表面との接触により影響を受けないが、プラスミンは血小板を分解し、血小板が止血栓を形成する能力を抑制することができる（Ｗｅｎｇｅｒら、１９８９．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．９７：２３５）。プラスミン阻害はまた、止血栓の安定性を増強するこの後者の血小板メカニズムに影響を与え得る。ここで、アプロチニンがタンパク質Ｃを阻害し、次いで、トロンビン産生の減少および線溶の増強が生じる（Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ，Ｅｄｇｅｌｌ  ＴＡ．線溶と止血のバランス「新旧の概念の調和」、Ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｏｎｏｌｙｓｉｓ．Ｔａｋａｄａ  Ａ，Ｃｏｌｌｅｎ  Ｄ，Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ  １２７，１９９７）ことが見出されていることを示すのは価値がある。
【０１７５】
これらの後者の両効果は、血液消失を抑制するアプロチニンの有効性を減少し得る。アプロチニンに特異性がなければその作用機序に混乱が生じるが、プラスミンの阻害はその有効性に重要であるようである。アプロチニン処置患者においてフィブリンフラグメントＤ二量体の形成が抑制されることは、プラスミン阻害がその機序に重要であることの証拠であるが、フィブリン形成の阻害およびそれによるプラスミノーゲンのプラスミンへのフィブリン介在性活性化もＤ二量体レベルの減少についての説明を提供し得る。
【０１７６】
プラスミン阻害に基づく他の代替的止血を提供するために、数年もの間ヘビ毒が研究されている。ヘビ毒に見出されるプラスミン／トリプシンインヒビターに関する最初の報告は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９７２．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７：２０７）によるものであったが、他のクサリヘビおよびコブラ科毒におけるプラスミンインヒビターのさらなる報告もある（Ｓｈａｆｑｕｔら、１９９０．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４（２）：３３７；Ｓｈａｊｑｕｔら、１９９０．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７：６；Ｙａｍａｋａｗａら、１９８７．Ｂｉｏｃｈｔｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９２５：１２４；Ｒｉｔｏｎｊａら、１９８３．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：４２７；Ｓｔｒｙｄｏｍら、１９７９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４９１：３６１）。オーストラリアクサリヘビ毒のスクリーニングでは、２種のヘビ属が強力なプラスミンインヒビターを有することが明らかにされた（Ｍａｓｃｉ  ＰＰ．Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｔｈｅｓｉｅ  １９８６、前掲）。これらは、ＰｓｅｕｄｏｎａｊａおよびＯｘｙｕｒａｎｕｓ属である。Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ属では、全ての種由来の毒がプラスミンのインヒビターを有することが明らかにされた。このインヒビターは部分精製され、ｔｅｘｔｉｌｉｓ亜種から動力学的に特徴付けされており、その後テキシチリニン（Ｔｘｌｎ）と命名されている。さらなる精製（図１および３）により、このインヒビターには２つの形態、Ｔｘｌｎ１および２が存在することが明らかにされている。Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ属では、ただ１つの種の毒がプラスミン・トリプシンインヒビターを含有することが明らかにされており、これは配列が決定され、多量体複合体で会合することが明らかにされている。この複合体は、α神経毒を含有するカルシウムチャンネル、ホスホリパーゼおよびタイコトキシンと呼ばれるトリプシンインヒビターであることが実証された。図５は、このトリプシンインヒビター（ＴＡＣ）がそれぞれＴｘｌｎ１および２に５８％および５５％の相同性を有し、これは、天然に存在する既知のプラスミンインヒビターであるテキシチリニンに最も近い相同性であることを示す。Ｔｘｌｎ１および２とアプロチニンとの間では、それぞれ４５％および４３％の相同性しかない。Ｔｘｌｎ１および２間では６つのアミノ酸の差異があり、両者とも正味の負の電荷（それぞれ−４および−６）含有する酸性であり、塩基性分子（＋６）であるアプロチニンとは異なる。
【０１７７】
部分精製されたＰ．ｔｅｘｉｌｉｓ由来のプラスミンインヒビター調製物の動力学を研究する一方、このインヒビターは、迅速かつアプロチニン（ＦｒｉｔｚおよびＷａｎｄｅｒｅｒ．１９８３．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４：４７９）より特異的にプラスミンに結合することが観察されている（Ｗｉｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）。結果はまた、テキシチリニンが、アプロチニンよりも強固にはプラスミンに結合しないことを示した。アプロチニンの特異性は、広範にｔＰＡ、ウロキナーゼおよびカリクレイン、ならびにならびにプラスミンおよびトリプシン中和する（ＦｒｉｔｚおよびＷａｎｄｅｒｅｒ．１９８３、前掲）ことに基づいており、ヘビ毒プラスミンインヒビター、Ｔｘｌｎの研究により、可逆的であると思われる迅速な一段階反応でより特異的にプラスミンおよびトリプシンに結合することが明らかにされている（Ｗｉｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）。アプロチニンは、静脈移植片閉塞および血栓症の発症率の増加に関連することが報告されている（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら、１９９６、前掲；Ｃｏｓｇｒｏｖｅら、１９９２、前掲；Ｓａｍａｍａら、１９９４、前掲）ため、Ｔｘｌｎなどの強固ではない結合インヒビターが、臨床的により効果的であり得ることが概略された。この元の所見により、本発明者らは毒よりＴｘｌｎのさらなる精製を進め、次いで、それぞれのヘビ毒が２つの形態のＴｘｌｎを含有することを見出した。このことは他の研究者の研究にも反映しており（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９７４．Ｔｏｘｉｃｏｎ．１２：１９３）、該他の研究者もＲｕｓｓｅｌｌのクサリヘビ毒プラスミンインヒビターの２つの改変体について報告した。両Ｔｘｌｎは、アプロチニンほど強固にプラスミンに結合しないが、先に報告されている部分精製された物質で示されている結合（Ｗｉｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）よりは強い。
【０１７８】
Ｔｘｌｎ１および２は、アプロチニンと同等に効率的にマウス尾静脈出血モデルの血液消失を抑制する（表４）。このモデルでの血液消失の抑制が、示唆されているように（Ｒｏｙｓｔｏｎ  Ｄ，１９９２、前掲）、止血栓形成部位でのプラスミン中和に関連する場合、それらが好適に同等であることは驚くべきことではない。アプロチニンとは対照的にＴｘｌｎがカリクレインを中和できない（本発明者らのデータ公開せず）ことは、臨床的重要性を有し得る。もちろん、これは、創傷治癒部位でのプラスミンの産生に対するカリクレイン−第ＸＩＩ因子経路の寄与に依存する（Ｋｌｕｆｔら、１９８７．Ｓｅｔｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１３：５０）。実際、アプロチニンのカリクレイン阻害効果は、この薬物のプロトロンビン効果または前出血（ｐｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ）効果のいずれかに対する寄与因子であり得る。一般的見解では、カリクレイン−第ＸＩＩ因子を介する外因性凝固経路は、凝固、続いてＣＰＢ機械への血液の通過を阻害する傾向がある（Ｗｅｓｔａｂｙ  Ｓ，１９９３、前掲）。
【０１７９】
このヘビの噛み傷に伴うヒト凝固の不均衡においてＴｘｌｎ分子が果たす役割については不明である。何故なら、毒液の注入は線溶活性の劇的な増加を伴い、噛まれた個体で血管内凝固が広がることに関連するからである（Ｍａｓｃｉら、１９９０．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：８５９；Ｔｉｂｂａｌｌｓら、１９９２．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｊｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  ２０：２８）。おそらく、この線溶活性は、プロトロンビン介在性フィブリン複合体によって刺激される（ＧａｆｆｎｅｙおよびＥｄｇｅｌ、１９９７、前掲）。線溶のその後の阻害が微小血管のこのフィブリン介在性閉塞に寄与し得ることは妥当である。
【０１８０】
現在、Ｔｘｌｎの動力学的プロフィールおよび狭い特異性は、血液消失を抑制するアプロチニンの臨床的有益性があることを強く示唆する。マウス出血モデルのデータは、血液消失を比較的抑制することを示すことは疑いもないが、Ｔｘｌｎがアプロチニンよりも有害な副作用が少ないことを示唆する生理学的データはない。しかし、Ｔｘｌｎで処置した全てのマウスは、副作用を示さなかった。この証拠が得られていないにも係わらず、アプロチニンの反復的治療的使用が禁忌であるという事実（Ｗｕｔｈｒｉｃｈら、１９９２  Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：１７３）により、これらの新規の出血インヒビターのクローニングおよび発現が十分に正当化される。
【０１８１】
実施例２
テキスティリニンｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
材料および方法
材料
処置され得ない臨床状態を有する破壊すべきと思われる爬虫類より一般のＢｒｏｗｎ  Ｓｎａｋｅ毒腺を入手した。致死量のペントバルビトン（６０ｍｇ／Ｋｇ）で動物を安楽死させた後、直ちに、滅菌状態下で毒腺を外科的に取り出した。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ＨｅｒｉｔａｇｅおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ動物倫理委員会は、これらの爬虫類の殺傷を承認した。２つの摘出された毒腺（約１００ｍｇの湿組織）を、液体窒素中で直ちに凍結し、総ＲＮＡ抽出までに−７０℃で保存した。
【０１８２】
変性プライマー
Ｍａｓｃｉ−３  （センス）  ＡＴＧＡＡＲＧＡＹＡＧＲＣＣＨＧＡＲＹＩＮＧＡＲ  ［配列番号２７］；
Ｍａｓｃｉ−５  （アンチセンス）  ＧＴＲＣＴＹＴＣＲＴＧＹＴＣＹＴＣＹ  ［配列番号２８］；
【０１８３】
総ＲＮＡの単離
Ｄｙｎａｌ  Ｂｅａｄ総ＲＮＡ抽出キットを使用して、総ＲＮＡを単離した。凍結毒腺（２）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブ中の１．０ｍＬの溶解緩衝液（キットに供給されている）中に置き、ＲＮＡａｓｅを含まない滅菌Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）プローブを用いて直ちに均質化した。均質化は、氷上にて４×１０秒間隔で行った。均質物を０．５ｍＬアリコートに分割し、等容積のフェノール−クロロホルム（１：１）抽出を行った。ＲＮＡおよびＤＮＡを含有する水層（上部）を分離し、等容積のイソプロパノールで１晩沈殿させた。１３，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃での遠心分離後、７０％エタノール洗浄を行った。沈殿したＲＮＡを、ＤＥＰＣ処置した水中で再構成し、以下の式を用い、２６０ｎｍの吸収を測定することによって、希釈アリコートに対して核酸含有量を決定した。
総ＲＮＡ（ｍｇ）＝Ａ２６０×［０．０４ｍｇ／（１Ａ２６０×１ｍＬ）］×希釈倍数×容積（ｍＬ）
【０１８４】
その後、取扱説明書の通りに、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、総ＲＮＡの調製を行った。簡単に説明すると、１００ｍｇの組織を（小さなホモゲナイジングアタッチメントを有するＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモゲナイザーを使用して）１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬中で均質化した。
【０１８５】
サンプルを変性ホルムアルデヒドアガロース／ＥｔＢｒゲル上で電気泳動することによって、ＲＮＡ分析を行った。哺乳動物の総ＲＮＡは、４．５および１９ｋｂで典型的な２つの明るいバンドを示した。これらのバンドは、２８Ｓおよび１８ＳリボゾームＲＮＡに相当する。これらのバンドの強度の比は、約２：１であった。
【０１８６】
ｍＲＮＡの単離
供給者の推薦通りに、Ｄｙｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓを使用して、メッセンジャーＲＮＡを単離した。磁気ビーズからｍＲＮＡを溶出後、１μｇを逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し、残りを１０分の１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２／２容積の無水エタノール中で沈殿させ、−７０℃で保存した。
【０１８７】
ＲＴ−ＰＣＲ
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲＴキットＭＭＬＶ逆転写酵素および単離された総ＲＮＡならびにテンプレートとしてｍＲＮＡを４２℃で１．５時間使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたｃＤＮＡを、第２鎖の合成に使用した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレートして第１鎖ｃＤＮＡを使用して、第２鎖の合成を行った。
【０１８８】
反応は、１４℃で３時間行った。第２合成反応の最終容積は１００μＬであった。フェノール−クロロホルム抽出を行い、水層（上部、二本鎖ｃＤＮＡを含有する）をきれいなＥｐｐｅｎｄｏｒｆに移し、エタノールで１晩ｃＤＮＡを沈殿させた。１３，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃での遠心分離後、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、１０μＬの滅菌水中で再構成して、Ｔｘｌｎ１および２に対する変性プライマーを用いるＰＣＲ増幅Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡにおいて使用するまで−２０℃で凍結保存した。
【０１８９】
Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅
Ｔｘｌｎ１のアミノ酸配列より、センスおよびアンチセンス変性オリゴヌクレオチドプライマーＭａｓｃｉ−３／Ｍａｓｃｉ−５を設計した。Ｂｒｏｗｎ  Ｓｎａｋｅの肝組織よりゲノムＤＮＡを単離し、変性プライマーを使用するＰＣＲにおいてプライマーとして使用し、Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡの任意のイントロンの存在を決定した。
【０１９０】
９４℃／１分；４６℃、１分間；７２℃、１分間、３５サイクルから成る増幅パラメータを使用して、予想５９アミノ酸をコードするポリヌクレオチドに対応する１７７塩基対のＰＣＲ産物を得た。同様に、ゲノムＤＮＡを使用して、１７７塩基対産物を得た。１７７塩基対ＰＣＲ産物を、それぞれｐ−ＧＥＭ  ５ｚｆおよびｐＧＥＸ−２Ｔに連結した。得られた組換えプラスミドを、自動化ヌクレオチド配列分析のためのテンプレートとして使用した。Ｔｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２に関する成熟ポリペプチドをコードするそれぞれのヌクレオチド配列を図６および７に示す。
【０１９１】
ｐＧＥM−２Ｔベクターの調製
ｐＧＥM−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、約５ｐｍｏｌ）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。消化産物をＴＡＥアガロースゲル電気泳動で分画し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して線状化されたベクターを精製し、続いてエタノール沈殿した。
【０１９２】
連結
ｐＧＥM−２ＴまたはｐＧＥＸベクター（０．０３ｐｍｏｌ）、および１．５ｐｍｏｌの１７７塩基対ＰＣＲ産物を、総容積３０μＬ中２単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを含有する献血混合物に添加した。連結は、１４℃で１晩インキュベーションしながら行った。
【０１９３】
形質転換
３分の１の連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを宿主としてエレクトロポレーションを行った（標準条件）。０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬを含有する指示標準ＬＢプレート上で、それぞれの構築物について、合計で１０未満のコロニーを選択した。特異的に設計されたプライマーにより６個のｃＤＮＡ異性体を同定した。それらの配列を示す。
【０１９４】
線状化された分子のそれぞれの末端を超えて伸張している３’末端チミジンを有する線状化ｐＧＥＸ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号Ａ３６００、部品番号Ａ３６０Ａ、ロット番号９６８１４）を用いて、クローニングを行った。精製されたＴｘｌｎ  ＰＣＲ産物（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  Ｔａｑポリメラーゼ酵素システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、これらの末端に連結した。次いで、Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αにエレクトロポレートし、従来の青／白選択基準を使用して、適切な形質転換体を選択した。Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物（１７７塩基対または全長）を含有する少なくとも１０個の陽性コロニーを同定した。染料ターミネーターマトリックスを使用して、Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡ挿入物の配列決定を行い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ３７７シークエンサーを用いる配列決定に供した。
【０１９５】
発現
良好なコンセンサス配列を有する少なくとも１０個のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび発現を誘導するための０．１Ｍ  ＩＰＴＧの存在下で２ＹＴ培地中にて培養した。Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ（１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７；６８０）に従う１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、融合タンパク質の直接検出を行った。
【０１９６】
アフィニティークロマトグラフィーグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号１７−０７５６−０１）を使用して、Ｔｘｌｎ−ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ＢゲルをＰＢＳで４回洗浄し、Ｔｘｌｎ−ＧＳＴ融合タンパク質とのインキュベート前に全てのトロンビンインヒビターを除去することを確実にした。トロンビン（５Ｕ／ｍｇの融合タンパク質）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベートすることによって、Ｔｘｌｎ−ＧＳＴ融合タンパク質結合グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂから組換えＴｘｌｎを切断した。１ｍｌ培養物由来のＴｘｌｎ−ＧＳＴ融合タンパク質を含有する１ｍＬの充填ゲルついて、５０単位のトロンビンを添加し、室温で２１時間インキュベートした。２、７および２１時間に上清サンプルを取り出し、組換えＴｘｌｎについてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。
【０１９７】
組換えＴｘｌｎの再生
組換えＴｘｌｎの再生効率を最大にするために、Ｂｉｅｒｉら（１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１３０５９−１３０６５）（参考として本明細書に援用される）、およびＮｏｒｒｉｓら、（１９９４．アプロチニンアナログおよびその産生プロセス、米国特許第５，３７３，０９０号、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）（参考として本明細書に援用される）による例に記載のように、手順の組み合わせについて検討した。
【０１９８】
簡単に説明すると、２Ｍ塩酸グアニジンを添加した２０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８．３中の組換えＴｘｌｎを４５ｍＭ  ＤＴＴで１５分間５０℃で還元した。次いで、還元および再生されたＴｘｌｎを、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ８．３に添加することによって迅速に１００倍希釈し（最終塩濃度は０．０５Ｍ未満）、１８時間放置した。天然Ｔｘｌｎに関する記載のように、希釈されたＴｘｌｎ溶液をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（１．０×１０ｃｍ）イオン交換カラムに適用することによって、活性型組換えＴｘｌｎ（１〜１０ｍｇ）の濃縮および精製得を行った。Ｓ−２２５１（３．０ｍＭ）発色アッセイを用いて、プラスミン（０．１Ｕ）を阻害することによって、活性型組換えＴｘｌｎをアッセイした。マウス尾静脈出血モデルにおいて、組換えＴｘｌｎの臨床効果について検討した。
【０１９９】
結果
変性プライマー（Ｍａｓｃｉ−３／Ｍａｓｃｉ−５）を使用して得られたテキシチリニンのｃＤＮＡ配列
プライマー（Ｍａｓｃｉ−３／Ｍａｓｃｉ−５）は、アミノ酸の重複性に基づき、そしてＴｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２配列（以下に記載）のＮ末端およびＣ末端の特異的領域を選択することによって、設計された。それらを用いて、Ｂｒｗｏｎヘビ毒腺から単離された総ＲＮＡから産生されたｃＤＮＡを増幅した。平滑末端クローニングを用いて、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−５ｚｆ（＋）にクローニングした。Ｍａｓｃｉ−３／Ｍａｓｃｉ−５をプライマー、およびｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ手順により調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用することによって、ＰＣＲスクリーニングにより挿入物を含有する陽性クローン（白）をさらにサブ染色した。ＡＢＩ染料−ターミネーターキットを使用するＤＮＡ配列分析により、Ｔｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２に対する２つの個別の配列（図６および７）を得た。少なくとも１０個の個別のクローンを用いて、これらの配列を得た。
【０２００】
Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を決定するための遺伝子特異的プライマーの設計
２つのヌクレオチドの変更を伴うプライマーの新しい組（Ｆ１およびＲ１；Ｔｘｌｎ２Ｒ１）を設計し、Ｇ−Ｃ含有量を増加し、それによってＤＮＡに対するプライマーのアラインメントを増大した。２つの変更は、コドン６でＴＴＴをＴＴＣ（Ｆへのコードは維持する）に変更し、コドン５でＧＡＴをＧＡＣ（同じく、同一アミノ酸、Ｄを維持する）に変更する。以下の配列を有する新しい前方プライマー、Ｆ１を設計した。
Ｆ１：Ｔｘｌｎ１遺伝子特異的前方プライマー
ＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣ  ［配列番号２９］
ＢａｍＨＩ
【０２０１】
後方プライマーの場合、Ｒ１コドンＡＧＴ（アミノ酸５９をコードする）をＴＣＡに変更して、アミノ酸、セリン（Ｓ）を保存し、さらにＲ１プライマーのＧＣ含有量を増加した。コドンＧＧ（Ｎ）（アミノ酸５８をコードする）をＣに変更し、プライマーのＤＮＡに対する結合を最適にした。対応するＴｘｌｎ２に特異的な後方プライマー、Ｒ２も用いた。プライマーの配列を以下に列挙する。
Ｒ１：Ｔｘｌｎ１遺伝子特異的後方プライマー
ＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ  ［配列番号３０］
ＥｃｏＲＩ    終止
Ｒ２：Ｔｘｌｎ２遺伝子特異的後方プライマー
ＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＣ  ［配列番号３１］
ＥｃｏＲＩ    終止
（Ｔｘｌｎ２遺伝子特異的後方プライマーは陽性ＰＣＲ産物を生じるが、使用しなかった。）
【０２０２】
アガロースゲル電気泳動によって増幅産物を分離し、ＱＩＡｑｕｉｏｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、１７７ｂｐ増幅物を精製した。１〜２μｇ精製Ｔｘｌｎ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−２Ｔベクターに連結し、染料ターミネーターキット（Ｐｅｒｋｅｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎノート、１９９５年８月）を使用して、配列決定を行った。Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列により、本発明者らは、遺伝子の５’および３’配列を決定するためのＴｘｌｎ１遺伝子特異的プライマーの第２の組を設計することが可能になった（３’および５’ＲＡＣＥ方法）。それらのプライマー配列を以下に示し、最初の組と区別するために、遺伝子特異的プライマー（ＴＸ１ＦＮおよびＴＸ１ＲＮ）と呼ぶ。
５’および３’−ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）
【０２０３】
５’−および３’−ＲＡＣＥ反応について、ｃＤＮＡの新調製物を調製した。ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥキットは、２つの個別のｃＤＮＡ集団：５’−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡおよび３’−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡの合成のためのプロトコルを含む。修飾ロック−ドッキングオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳＭＡＲＴ（登録商標）ＩＩオリゴを使用して、５’−ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡを合成した。修飾されたオリゴ（ｄＴ）プライマーを５’−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ合成プライマー（５’−ＣＤ）と呼び、これは３’末端に２つの変性オリゴ位置を有する。これらのヌクレオチドは、ポリＡ＋テイルの開始位置にプライマーを置き、従来のオリゴ（ｄＴ）プライミングに固有の３’異種性を消失する（Ｂｏｒｓｅｎら、１９９４、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：１４４−１４８）。
【０２０４】
従来の逆転写手順を用い、しかし特殊なオリゴ（ｄＴ）プライマーを伴って、３’ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡを合成した。３’−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ合成（３’−ＣＤ）は、５’−ＣＤ同様にロック−ドッキングヌクレオチド位を含み、５’末端同様にＳＭＡＲＴ（登録商標）配列の一部も有する。両５’および３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ（登録商標）ｃＤＮＡ集団にＳＭＡＲＴ（登録商標）配列を取り込むことによって、異なるＴｘｌｎ遺伝子特異的プライマーと組み合わせてＳＭＡＲＴ（登録商標）配列を認識するユニバーサルプライマー混合物（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ）（ＵＰＭ）を用い、両ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応をプライムすることができる。ＲＡＣＥのために使用されるプライマーの組は以下の通りである。
ユニバーサルプライマー混合物：
長ユニバーサルプライマー（０．２μＭ）
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ  ［配列番号３２］
短ユニバーサルプライマー（１μＭ）
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ  ［配列番号３３］
ネステッドユニバーサルプライマー（ＮＵＰ；１０μＭ）
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ  ［配列番号３４］
【０２０５】
図８は、Ｔｘｌｎ遺伝子特異的プライマーによって得られたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の移動パターンを示す。ＰＣＲ産物（両５’−および３’−ＲＡＣＥ）を電気泳動し、切り出し、そしてＱＬＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲル精製した。
【０２０６】
Ｔｘｌｎ１の前形態をコードする領域のクローニング
５’および３’ＲＡＣＥ配列より、ＴＸ１ＦＮ中にＢａｍＨＩ制限部位（最初の１２ヌクレオチド）およびＴＸ１ＲＮ中にＥｃｏＲＩ部位（１２ヌクレオチド）を含有するＴｘｌｎ遺伝子特異的前方（ＴＸ１ＦＮ）および後方（ＴＸ１ＲＮ）プライマーを設計した。これらのプライマーの配列を以下に列挙する。
ＴＸ１ＦＮ
ＡＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴ  ［配列番号３５］
ＴＸ１ＲＮ
ＴＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＴ  ［配列番号３６］ｃＤＮＡをプライマーとしておよびＡｄｖａｎｔａｇｅ２（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼを用い、以下の条件：９２℃／１分；５０℃／１分；７２℃／１分、３０サイクルを使用して、ＰＣＲを行った。これらのプライマーは、Ｔｘｌｎ１前形態（８３アミノ酸）をコードする配列に対応する産物を増幅した。
【０２０７】
Ｔｘｌｎ１前形態のクローニング
ゲルから３つの全てのＰＣＲ産物を精製し、挿入物に隣接するｐＧＥＭ特異的プライマーを使用して、ＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−２Ｔにクローニングした。３’および５’ＲＡＣＥ産物を配列決定することによって、図９に概略されたヌクレオチドおよび推定アミノ酸［それぞれ、配列番号４３および４４］を誘導した。これにより、フレーム内のＡＡＧ（Ｋ）の上流外７２ヌクレオチドの同定が可能となった。このことは、存在していたＴｘｌｎ１の全形態の存在を示唆する。外２４種アミノ酸は、コード５９アミノ酸の直ぐ上流に存在する。５’ＵＴＲの１１ヌクレオチドも、３’ＵＴＲの１４３ヌクレオチドと共に同定された。さらに、３’ＲＡＣＥ配列決定より、終止コドンの直ぐ上流の２つのアミノ酸は、アラニン、グリシンではなく、それほど正確な配列決定ではない本来の配列から誘導されるセリン（ｓｅｔｉｎｅ）であることが示された。しかし、Ｔｘｌｎ１およびＴｘｌｎ２に対するさらなる配列を、複数のクローンを配列決定することによって得た。広範な配列決定後、６つの個別なＴｘｌｎ遺伝子があることが明らかである。
【０２０８】
Ｔｘｌｎ１のコード領域のクローニング
同様に、Ｔｘｌｎ遺伝子特異的プライマーを設計して、活性型ペプチド（５９種アミノ酸）をコードするＰＣＲ産物を得た。さらに、この場合、ＢａｍＨＩ部位を前方プライマー（ＴＸ１ＴＦ）に取り込ませた。後方プライマーはＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙユニバーサルプライマー（長ＳＭＡＲＴ（登録商標））であった。
【０２０９】
Ｔｘｌｎ活性型ペプチド配列プライマー：
ＴＸ１ＴＦ（前方）
ＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＧＧＡＴ  ［配列番号３７］；
ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ長ユニバーサルプライマー
ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ  ［配列番号３２］
【０２１０】
さらなるＴｘｌｎ遺伝子のクローニング
長ユニバーサルプライマー（ＬＵＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙキット）と組み合わせて、上記のＰＣＲ条件を用いて、Ｔｘｌｎ２〜６（以下）のための前方プライマーも設計した。これらのプライマーの配列を以下に示す。
Ｔｘｌｎ２の前方プライマー（ＴＸ２Ｔ）
ＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧ  ［配列番号３８］Ｔｘｌｎ３の前方プライマー（ＴＸ３Ｔ）
ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＡＴ  ［配列番号３０］Ｔｘｌｎ４の前方プライマー（ＴＸ４Ｔ）
ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡ  ［配列番号４０］Ｔｘｌｎ５の前方プライマー（ＴＸ５Ｔ）
ＡＡＣＧＴＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＡＡＡ  ［配列番号４１］；および
Ｔｘｌｎ６の前方プライマー（ＴＸ６Ｔ）
ＡＴＴＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＡＧ  ［配列番号４２］
【０２１１】
全ての場合において、前方プライマーはクローニングを容易にするために挿入されたＢａｍＨＩ部位を有した。下線を付した配列は、コード配列の開始トリプレットを示す。
【０２１２】
上記のプライマーを用いて得られる増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分画し、適切なサイズでＤＮＡを精製し、ｐＧＥＭ−２Ｔベクターにクローニングした。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ染料ターミネーターマトリックスおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｍ（登録商標）モデル３７７シークエンサーを用いて、組換えプラスミドの配列決定を行った。この手順によって得られるＴｘｌｎ−６のヌクレオチド配列を、対応する推定アミノ酸配列と共に図１０に示す。図１１を見れば明らかなように、Ｔｘｌｎアミノ酸配列は高度に相同であり、この点ではコンセンサス配列が提供されている。
【０２１３】
Ｔｘｌｎ  ｃＤＮＡゲル精製されたＰＣＲ産物のｐＧＥＭ−２Ｔ発現ベクターへの再クローニング
ｐＧＥＭ−２Ｔ構築物を用いて、組換えＴｘｌｎ（両５９アミノ酸ペプチドおよび２４アミノ酸ペプチドを含有する８３アミノ酸分子）を発現させた。組換え発色物質Ｓ−２２５１および酵素プラスミンを用いて、Ｔｘｌｎ活性をアッセイした（Ｆｒｉｂｅｒｇｅｒら、１９７８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴｘｌｎに対する多価抗体を用いるウエスタンブロッティングにより、組換えＴｘｌｎを同定した（図１２）。
【０２１４】
実施例３
フィブリン特異的モノクローナル抗体−テキシチリニン１コンジュゲートの産生  ＧｒａｂａｒｅｋおよびＧｅｒｇｅｌｙ（１９９０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５）に従う２工程ゼロ長架橋手順によって、フィブリン特異的モノクローナル抗体、ＭＡｂ  １２Ｂ３．Ｂ１０（ＩｇＧ２Ａ／κ）（Ｔｙｍｋｅｗｙｃｚら、１９９３、前掲）を、化学的にプラスミンインヒビターＴｘｌｎにコンジュゲートする。簡単に説明すると、Ｔｘｌｎ１を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）の存在下で水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）と共にインキュベートすると、ＧｌｕまたはＡｓｐのカルボキシル基がスクシンイミジルエステルに変換する。ゲル濾過によって過剰のＥＤＣを除去した後、ＭＡｂ  １２Ｂ３．Ｂ１０を活性化されたＴｘｌｎ１に添加する。架橋は、求核置換の２時間のインキュベーションによってＩｇＧのリジン−アミノ基をスクシンイミジル部分にすることによって生じる。次いで、ＲａｕｔおよびＧａｆｆｎｅｙ（１９９６，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １０（補遺４）：１−２６、要約番号３９）Ｓｅｐａｈｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０カラム上でサイズ排除ＨＰＬＣを介して、ＩｇＧ−Ｔｘｌｎ１コンジュゲートを、遊離のＴｘｌｎ１から精製する。次いで、精製された構築物を、発色物質Ｓ−２２５１を用い、プラスミン阻害活性についてＥＬＩＳＡによって試験する。
【０２１５】
本明細書全体を通して、任意の１つの実施態様または特徴の特定の収集に対し、本発明を制限することなく、本発明の好適な実施態様を説明することを目的としてきた。当業者であれば、本発明の開示内容に照らし合わせて、本発明の範囲から逸脱することなく、具体化された特定の実施態様において様々な改変および変更を行うことができることを理解するであろう。そのような全ての改変および変更は、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２１６】
表の説明
表１．保存的アミノ酸および置換
表２．改変されたペプチドの作製のための非保存的アミノ酸
表３．阻害定数の概要。Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒ分析プログラムを用いて測定されたＴｘｌｎ  Ｓ−１００回収物のＫiは、プラスミン濃度０．５ｎＭを用い、０．１５μＭ（ｎ＝６）であった。*先の研究（Ｗｉｌｌｍｏｔｔら、１９９５、前掲）から得られたデータを示す。ここで、プラスミンの濃度を用いて、アプロチニンが０．５ｎＭであった場合のＫiを決定する。
表４．マウス尾出血モデル−出血消失の決定。アプロチニンおよび２つの形態のＴｘｌｎ（１および２）で処置したマウスの血液消失を生理食塩水群と比較して示す。血液消失の減少％も示す。
【図面の簡単な説明】
本願発明を速やかに理解して実行に移せるようにするために、好ましい態様を、添付の図面を参照して実施例の形式で以下に記載する。
【図１】  オーストラリア・ブラウン・スネークからの毒のセファクリル（登録商標）Ｓ-300溶出プロファイルを示す。５つのタンパク質のピーク（１-５）が得られて、プラスミン阻害活性（即ち、Txln）は、カラムに添加された総タンパク質量の約２％からなるショルダーのピーク４において得られた。
【図２】  DEAE-セファロース（登録商標）CL-6Bクロマトグラフィーから得られた２つのプールされ濃縮されたフラクションの１つのセファクリル（登録商標）Ｓ-100溶出プロファイルを示す。示されたプロファイルは、Txln 1のものであるが、Txln 2のプロファイルも同一である。一方、挿入図は、逆相Ｃ18ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いたTxln 1、Txln 2各々に対する２つの異なった溶出プロファイルを示す。
【図３】  図１におけるセファクリル（登録商標）Ｓ-300クロマトグラフィー由来の濃縮されたプラスミン阻害活性のDEAE-セファロース（登録商標）CL-6Bカラムの溶出プロファイルを表す。太線はプラスミン阻害活性の２つの分離したピークを示す（１及び２の記号）。
【図４】  プラスミン（２ｎＭ）のTxln 1（０-410ｎＭ）阻害のシグマプロット（Sigmaplot）を用いたリアルタイムカーブフィット分析を図示する。同様な阻害曲線がTxln 2で得られた（データは示さない）。
【図５】  Txln 1及びTxln 2のアミノ酸配列を、タイコトキシン（Taicotoxin）関連プラスミンインヒビター（TAC）及びアプロチニン（APRO）と同様に示す。配列は６つのシステインの位置によってアラインメントされた。
【図６】  Txln 1の部分的ｃＤＮＡ配列をリストする。この部分的配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に１文字表記で示される。文字「Ｎ」は不特定のヌクレオチドを表す。
【図７】  Txln 2の部分的ｃＤＮＡ配列をリストする。この部分的配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に１文字表記で示される。文字「Ｎ」は不特定のヌクレオチドを表す。
【図８】  ２％アガロースゲル上での電気泳動の移動パターンをTxln遺伝子特異的プライマーで得られたＰＣＲ産物のEtBrによる染色で示す。レーン１，対照（テンプレート、プライマーなし）；レーン２，５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物；レーン３，３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物；レーンＭ，サイズマーカー。
【図９】  ５’及び３’ＲＡＣＥ産物のヌクレオチド配列分析由来のTxln 1 ｃＤＮＡ配列をリストする。
【図１０】  Txln 1-6の個々のプロフォーム（proform）に関連するヌクレオチド及び推定上のアミノ酸配列を示す。
【図１１】  ＧＣＧウィスコンシン・スーツ（Wisconsin Suite）のPILEUPプログラムを用いたテキスティリニン・ポリペプチド配列の配列比較を示す。
【図１２】  pGEM-2T-Txln 1組換えクローンを停留する多くのコロニーから発現されたテキスティリニン-ＧＳＴ融合タンパク質の還元条件下での15％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに関する。コロニーは配列特異的プライマーを用いてＰＣＲスクリーニングによって選択された。数字はクローンの指示番号を表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
0004542705.tif 000049
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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0004542705.tif 000058
0004542705.tif 000059
【図１１】
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【図１２】
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