(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビンの精製および晶出の方法であって、激しく混合しながら５〜２５℃の温度において水性鉱酸溶液中に、安定な変態Ａの針状リボフラビンを溶解し、得られた溶液に活性炭を添加し、その活性炭上への溶液中からの溶解した不純物の吸着後、活性炭を含有する媒体を、２０〜２００ｎｍの細孔径を有するセラミック膜を通過する向流ろ過に付し、得られたろ過液を４〜１０℃の温度において５〜１０倍量（容量／容量）の水で処理し、得られたリボフラビンの沈殿球状結晶を、次いで遠心分離またはろ過により分離することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医薬品用および食品用のためのリボフラビンの精製および晶出についての新規な方法に関する。
【０００２】
現在、商業的に入手できるリボフラビンは、一部分は合成的に生産され、一部分はバイオテクノロジー的に生産され、バイオテクノロジー的生産方法が近年優勢となっている。特に発酵による生産方法においては、医薬品用および食品用のため必要とされるような、できる限り完全な程度までのリボフラビンの精製および濃縮は、極めて困難である。このような適用例のためのリボフラビンは、酸性またはアルカリの媒体に通常溶解されている。リボフラビンそのものを溶解した後、基質に依存して溶解または不溶の形態で存在することができる細胞残査、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸は、いくつか種々の特異的操作の組み合わせによる、比較的大きな労力でのみ、しばしば分離することができる。溶解したリボフラビンは、安定変態Ａ（たとえば米国特許２，３２４，８００、２，７９７，２１５および４，６８７，８４７を参照）に標準的に相当する針状結晶として、主に３０℃より高い温度において種々の方法によって通常晶出させる。更に、リボフラビンは、従来、もっぱら安定な結晶の変態Ａとして生産および流通してきた。この形状のリボフラビンは、非常に制限された量しか水に溶解しないので、医薬品用および食品用のために必要な溶解性は、比較的乏しい。したがって、長い間、リボフラビンの溶解性および同時に生物学的利用能も改良する必要性があった。
【０００３】
文献での多くの報告は、アルカリ溶液からの沈殿によって形成されるリボフラビンの種々の安定な結晶の変態に関するが、そのような報告からは、実際の操作方法は、いままで開発されておらず、これは多分アルカリ媒体中のリボフラビンの化学的分解（たとえば米国特許２，６０３，６３３を参照）による。
【０００４】
今日、上市されているリボフラビンは、一部分は精製微粉末の形状であり一部分は黄色長針の形状である。微粉末は、かなりの粉塵、極めて低いかさ密度および乏しい流動性を有し、たやすく帯電する、そのため、たとえば錠剤への圧縮は妨げられ、添加物がその流動性および圧縮性の改善のため必要とされる。同様に、針状物も操作時に粉塵を発生し、たとえば小麦粉へのビタミン添加のようなさらなる操作中での問題となる。晶出中に実施される多様な凝集工程も、リボフラビンの大規模生産（たとえば、カナダ特許６３３，８５２および欧州特許３０７，７６７を参照）のために従来使用されていない。更なる凝集工程が、変態Ａの針状結晶を用いる乾燥中に実施される（ドイツ特許４，０１４，２６２）。したがって、よりよい流動性および溶解性、耐摩耗性および９８％を越える純度（リボフラビン含量）を有するような、実質的によりよい物理的特性を有するリボフラビンの形態を生産する必要性は継続する。
【０００５】
本発明の目的は、針状リボフラビンから出発し、より純粋なリボフラビンを製造することであり、後者のリボフラビンは変態Ａに相当し、９８％を超えるリボフラビン含量で合成的にまたはバイオテクノロジー的に生産され、現在入手し得る材料より優れた流動性および溶解性を明らかに有する。一般的に、この新しいリボフラビンは、たとえば錠剤化において、改良された生物学的利用能および改良された物理特性を有するべきである。
【０００６】
上記リボフラビン生産を可能にする比較的簡単な方法が今見出された。本方法は、いわゆる予備精製および晶出を基本的に含み、晶出は乾燥の結果として生じる。
【０００７】
本発明に記載の方法は、リボフラビンの精製および晶出のための方法でありこの方法は、約３０℃を越えない温度において水性鉱酸溶液中で安定な変態Ａの針状リボフラビンを激しい混合を用いて溶解し、得られた溶液に活性炭を添加し、活性炭上への溶液からの溶解した不純物の吸着後、活性炭を含有する媒体を約２０〜約２００nmの細孔径を有するセラミック膜を通過する向流ろ過に付し、得られたろ過液を約３０℃を越えない温度において５〜１０倍量（容量／容量）の水で処理し、得られた沈殿したリボフラビンの球状結晶を遠心分離またはろ過によって分離する方法を含む。
【０００８】
リボフラビン結晶をこの手法によって得た後、所望により結晶を水で洗浄することができ、続いてそれ自体既知の方法に従い乾燥する。この拡張した方法は、上記の本発明に記載の方法の更なる一面を意味する。
【０００９】
本発明の方法のために使用される出発物質は、たとえば食品のための生産で得られるような変態Ａの針状のリボフラビンである。本リボフラビンは、通常約８５〜約９８％までの含量を有し、およびその製造方法に依存して化学的副産物および／または発酵残査並びに水の総量は、したがって約２重量％を越える。
【００１０】
本方法の最初の工程として、乾燥またはフィルター湿潤形状での出発物質が、水性鉱酸溶液中で溶解される。その結果、溶解は、プロトン付加反応により生じる。溶解工程においては、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸および／または化学的副産物のような発酵残査が遊離した状態となり、次いで一部分は溶解した状態および一部分は固体の状態で存在する。鉱酸としては、特に適切には塩酸または硝酸、好ましくは前者であり、その濃度は通常約１０％〜約６５％（重量パーセント）である。
【００１１】
好ましい水性塩酸溶液の場合、その濃度は、好都合には約１８〜約２４％の範囲内にある。約１９％まで、乾燥リボフラビンはその水性塩酸溶液中に溶解する。その溶液は、それゆえほぼ飽和している。一般的に、鉱酸の量に対するリボフラビンの量は、鉱酸の特性、溶液の濃度および溶解温度によって左右される。
【００１２】
更に、水性鉱酸溶液中の針状のリボフラビンの溶解は、最高３０℃までの温度において、通常は約５℃〜約２５℃の温度において、好ましくは約１０〜約２０℃の温度において適切な激しい混合、たとえば激しい攪拌によって実施する。
【００１３】
溶解時間は、温度の上昇および／または混合を強化することによって短縮することができる。全溶解工程は、約３０分までの時間を通常要し、温度および混合の程度に依存する。
【００１４】
本方法の次の工程として、活性炭が水性鉱酸溶液中のリボフラビンの溶液に添〕加される。結果として、溶解した形状で存在する不純物が活性炭上に吸着される。これは粉末化または粒状化することができる。都合の良いことに、リボフラビン含量に基づいて約０．５〜約９％までの（重量パーセント）、好ましくは約３％の活性炭を、溶解した不純物の吸着的除去のために添加する。不純物により、活性炭を約１２時間まで、好ましくは約０．５〜約３時間溶液中に放置する。約２５０〜約４００kg/m3、好ましくは約３００kg/m3のかさ密度、約１２００〜１６００m2/g、好ましくは約１４００m2/gの比表面積および約２０〜約７０μmの平均細孔径を有する、酸で洗浄された活性炭が活性炭として適切である。活性炭の例として、溶解した生物的不純物の吸着に特に適切であるNorit（登録商標）CA1およびBentonorit（登録商標）CA1のみならず化学的不純物の分離のため特に適しているNorit（登録商標）SX2もある。
【００１５】
所望ならば、活性炭に加えて、水性鉱酸溶液にろ過助剤を加えることができ、それはリボフラビン量に基づいて、好都合には約２〜約９重量パーセントの量を使用する。適切なろ過助剤は、たとえばRettenmeier & SoehneGmbH＋Co製のArbocel（登録商標）BWW40およびB800である。
【００１６】
活性炭、存在することがあるろ過助剤および存在する溶解しなかった発酵残査の分離を、続く向流ろ過によって実施する。驚くべきことに、活性炭が、吸着に加え、膜上に形成する被覆層への研磨作用をも示すことが見出されている。この作用により、活性炭が無いときに比べてほぼ２倍の処理量でもって、より長い時間にわたり安定して膜を操作することが今や可能である。活性炭は研磨のみならず吸着特性も有する。向流ろ過を、約２０〜約２００nm、好ましくは約５０nmの細孔径を有するセラミック膜で実施する。ポンプで回路中を循環させた活性炭は、摩耗により、膜上に形成された炭素と発酵残査の被覆層の浄化を引き起こす。一般に、膜を通過する向流速度は、比較的速い；約５〜約６m/sの範囲内に都合よくある。被覆層を過度に圧縮しないため、経膜圧力は、適切には１〜２bar（０．１〜０．２MPa）である。
【００１７】
向流ろ過後、すべての不純物がほとんどなく、活性炭に加えろ過助剤が存在してもよいリボフラビン溶液は、５〜１０倍量の水の添加によってもたらされる晶出を生じる。結果として生じる水溶液中にあるリボフラビンの脱プロトン化が、その沈殿に導く。
【００１８】
晶出を生じる媒体の温度は、その生産方法およびリボフラビンの不純物の程度に依存して０〜３０℃の範囲にわたることができる。特に合成的に生産された物質の場合は、温度を３０℃まで上げることができ；発酵的または比較的純粋な物質の場合は１０℃以下の温度が通常十分である。しかしながら、好ましくは、４℃と１０℃との間が選択される。晶出は、回分または連続的に、好ましくは連続的に実施することができる。段状または独立した容器を晶出装置として使用できる。特に、独立容器の場合は、リボフラビン溶液を容器内の異なる位置に導入することが望ましい。その晶出装置内で良好な肉眼で見える混合は、すべての場合に始めるべきである。これは、たとえば２段式攪拌装置により、供給溶液を１８０度転置させることにより最上層または最下層の攪拌面に供給することで実現することができる。好都合には、これを達成するために、水を最上層に供給して、またリボフラビンの鉱酸溶液を最下層に供給する。攪拌は、結晶を損傷させないために十分注意して実施すべきである。滞留時間は、適切には約５〜約２０分の間、好ましくは約１０〜１３分である。続いてろ過をフィルターまたは遠心機を用いて実施する；好ましくはバンドフィルターを用いる、そのとき実施することがある洗浄もまた非常に有効である。乾燥は、それ自体知られた方法で実施する。
【００１９】
晶出装置中の初期の相対的過飽和状態（水を添加する前に）は、流水での洗浄から晶出装置内への母液を再循環することによって制御できる。母液：水の比率は、好都合には約１：１〜約１：８である。相対的過飽和状態は、晶出装置中に存在する伝導率によって評価でき、約１７０〜約２２２mS/cmの範囲を理想的には厳守する。伝導率に依存して、母液の再循環は、省くことができる。再循環の場合は、晶出装置中での伝導率により好ましくは制御する。
【００２０】
混合率、温度、混合および滞留時間の適切な選択によって、棘状表面を有する球状のリボフラビンのより不安定な変態を晶出させることが、本発明に記載の方法の晶出工程において可能であり、このように変態Ａの既知の針状結晶より相当に広い表面積を有することが、驚くべきことに今や発見された。驚くべきことに、球状結晶は、球状結晶に関する文献中に一般的に記載されてきた凝集方法によっては得られない〔たとえば、欧州特許３０７，７６７およびCan. J. Chem. Eng. 47, 166-170 (1969)を参照〕；これに反して、新方法の場合の針状結晶の成長は、晶出の初期、小さな、多分非晶質の種晶から始まる。より溶解性の高い変態ＢまたはＣに相当するこのように得られた樹枝状結晶は、十分な保存安定性を有し、更により不安定な変態およびより大きい表面積によって、優れた溶解特性を有し、それらの球状結晶のおかげで優れた流動特性を有する。そのうえ本発明に記載の本方法は、凝集の場合に比べて強い耐摩耗性を有するリボフラビン結晶を与える。
【００２１】
上記のように、晶出物をろ過または遠心分離によって分離する。それからケークは、好ましくは水で洗浄し、その後湿潤ケークは乾燥することができる。
【００２２】
【実施例】
本発明に記載の本方法を、以下の実施例によって説明する。
【００２３】
実施例１
以下に記載する方法のために使用する出発物質は、９７．０２％（ＨＰＬＣによる）のリボフラビン含量、０．８０％の残存水分含量（Ｈ2Ｏ）および１．１１％のアミノ酸含量を有し、かつ安定な変態Ａの針状結晶として存在する発酵的に産生したリボフラビンである。
【００２４】
この出発物質３５０．０ｇを攪拌しながら２２℃において２４％塩酸１７０８．６ｇ中で溶解した。約１５〜２０分の溶解期間の後、約１７％のリボフラビンを含有する黒褐色溶液を得た。
【００２５】
活性炭（Norit（登録商標）CA1）１６ｇ（リボフラビン量の約３％）を溶液に添加して、混合物を更に４時間攪拌した。混合物を実験用膜装置の二重被覆原料タンク内に充填した。タンクを最大３５℃の温度を維持するために冷却した。遠心ポンプを用いて、溶液を０．００５５m2の有効表面積を有するセラミック膜上に置いた。経膜圧力は１．５bar（０．１５MPa）に調節し、膜を通過する向流速度を６m/sに調節した。これは、ろ過のほぼ終了まで維持することができる約１００リットル／（m2・h）の浸透処理量を得た。
【００２６】
塩酸中のリボフラビンの溶液を次に連続的に動作する沈殿晶出装置中で晶出させた。
【００２７】
３リットルの沈殿晶出装置を最初約２リットルの水で充たし、液体を２段式傾斜平板ブレード攪拌棒攪拌装置を用いて１００rpmの速度で攪拌した後、１０℃まで冷却した。その後、約１０℃で塩酸中のリボフラビン溶液について約１５９０g/hの速度を上段の攪拌器内で連続的に達成し、同時かつ連続的に水について約９０００g/hの速度を下段の攪拌器内で達成した。開始から約２〜４分後、リボフラビンが橙黄色結晶として晶出し始めた。最初に分離した結晶は綿状で現れたが、２０〜３０分後それらは顆粒状の粒子に変化した。結晶懸濁液は、晶出装置内の３リットルマーク（２重被覆側）に達する（すなわち約７分後）まで連続的に排液した。バルブを、液量を３リットルマークあたりに保つために調整した。流出した懸濁液を直接Ｐ３吸引フィルターに加え、そこで固体を溶液から分離した。
【００２８】
懸濁液約２５００mlを１５分ごとに集め、そして厚さ約１cmのケークを得た。
次いで、これを水１３００mlを用いてpHが約５になるまで洗浄した。
【００２９】
次いで、湿潤黄色晶出物（残存水分６５〜７５％）を乾燥した。
【００３０】
実施例２
リボフラビン溶液を生産し、実施例１に記載したように活性炭で処理した。実施例１とは対照的に、溶液を約５０nmの細孔径を有する膜を通過させて精製した。経膜圧力は、１．５〜１．７bar（０．１５〜０．１７MPa）であり、向流速度は、５〜６m/sであった。これによって約７０ リットル／（m2・h）の浸透処理量を得た。晶出、ろ過および洗浄は、実施例１と同様に実施した。晶出温度は９〜１０℃の間にあり、乾燥は１００℃において実験用乾燥器内で実施した。
【００３１】
実施例３
使用した出発物質は、化学的に生産した９８％の含量を有するリボフラビンであった。出発物質を実施例１に記載したように溶解した。向流ろ過を実施例２に記載したように実施した。晶出は、塩酸中のリボフラビン溶液について１５０６０g/hで、水について１０３０g/hで２０℃において実施した。ろ過および洗浄は実施例１と同様に実施した。乾燥は実施例２と同様に実施した。
【００３２】
上記３実施例の結果を以下の表に編集した。
【００３３】
【表１】
0004560155.tif 000002