(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びｏ−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液。
【請求項２】
発色酵素基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）である請求項１記載の微生物判定用比色液。
【請求項３】
波長６１０ｎｍにおける吸光値が、０．０７〜０．１２である請求項１又は２記載の微生物判定用比色液。
【請求項４】
インディゴカルミンを０．０１〜１ｍｇ／１００ｍｌ、ｏ−ニトロフェノールを０．１〜１０ｍｇ／１００ｍｌ含有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物判定用比色液。
【請求項５】
判定微生物が、大腸菌及び／又は大腸菌群である請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物判定用比色液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インディゴ系物質により呈色した培地色を判定するために用いられる微生物判定用比色液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品や飲料水中の大腸菌及び大腸菌群の有無の判定は、食品や水の糞便性汚染の有無を確認するための日常検査として重要である。特に、飲料水中の大腸菌群の検出には、簡便且つ迅速に判定できる方法が望まれ、上水試験法においても、従来から用いられていた乳糖ブイヨン−ブリリアントグリーン乳糖胆汁ブイヨン培地法（ＬＢ−ＢＧＬＢ法）に加え、１９９３年には、迅速法として特定酵素基質培地法が追加された。
【０００３】
斯かる特定酵素基質培地法は、微生物、例えば大腸菌や大腸菌群に特異的に存在するβ−グルタロニダーゼ又はガラクトシダーゼを利用するものであって、培地に添加されたｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｇａｌ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）等の発色酵素基質や４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）等の蛍光酵素基質から当該酵素によって分解されて生じた発色物質や蛍光物質の色や蛍光により微生物を検出するものである。中でも発色酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を用いた場合、生じる青色反応産物（ブロモクロロインディゴ）は、肉眼的に明瞭であることから、Ｘ−Ｇａｌを添加した培地は、大腸菌群を迅速且つ特異的に検出するための好適な培地とされている。
【０００４】
しかし、菌の濃度が低い場合は、肉眼では判定が難しく分光光度計を用いて吸光値を測定する必要があり、簡易性・迅速性の点で問題があった。
一方、培地中には、栄養成分等の複数の有機・無機物質が含有され、培地自体が着色されていることから、培地中でのインディゴ青色の色調は変化し、肉眼で陽性を判断する場合には対照色を示す必要があるが、発色酵素基質から生じるインジゴ系色素は水溶性が低く、水溶性の色素溶液として用いることはできなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定酵素基質培地法において、微生物の存在によりインディゴ青色を発色した培地色を、肉眼で確実に判定するために用いられる比色液を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、培地中でインディゴ青色が発色し呈色した培地色の陽性対照となり得る水溶性色素について種々検討した結果、インディゴカルミンとｏ−ニトロフェノールを配合した溶液が、インディゴ青色が発色した培地色に極めて近くしかも安定であり、微生物判定の陽性限界を示す比色液となり得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びｏ−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物判定用比色液は、特定酵素基質培地法において、微生物の存在により発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するために用いられるものである。
【０００９】
ここで、特定酵素基質培地法とは、培地に添加された発色酵素基質や蛍光酵素基質が、微生物、例えば大腸菌や大腸菌群に特異的に存在する酵素（β−グルタロニダーゼ又はガラクトシダーゼ等）により分解され、生じた発色物質や蛍光物質の色や蛍光により微生物を検出する方法をいい、上水試験法にも採用されているものであるが、本発明においては、このうち特に、インディゴ系の発色物質を生成する発色酵素基質を用いたものをいう。
【００１０】
斯かる発色酵素基質としては、例えば５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｇａｌ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニックアシド・サイクロヘキシルアンモニウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニックアシド・ナトリウム塩等が挙げられ、特に大腸菌群の検出に用いられるＸ−Ｇａｌが好ましい。
【００１１】
本発明の比色液は、特定酵素基質培地法を用いて微生物の存在を判定する際に用いられるものであるが、ここでいう微生物とは、特定酵素基質培地法が適用できる細菌類であれば特に制限されるものではなく、例えば大腸菌（E.coli）や大腸菌群が挙げられる。
【００１２】
尚、大腸菌群とは、ラクトース分解酵素を産生する能力を有する一群の微生物で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属等に属するものをいう。
【００１３】
本発明の微生物判定用比色液は、インディゴカルミン及びｏ−ニトロフェノールを含有するものであるが、青色成分であるインディゴカルミンと共に黄色成分としてのｏ−ニトロフェノールを配合することにより、インディゴ青色が発色した培地色に極めて近い色調とすることができる。
【００１４】
また、培地中の細菌数によってその呈色の色調も変化し、比色液としては、陽性限界を示す色と同一のものである必要がある。斯かる観点から、本発明の比色液は、波長６１０ｎｍにおける吸光値が０．０７〜０．１２であることが好ましく、更に波長４２０ｎｍにおける吸光値が０．１〜０．３であることが好ましい（参考例１参照）。
【００１５】
そして、このような吸光値とするためには、例えばインディゴカルミンの濃度が０．２〜０．８ｍｇ／１００ｍｌ、ｏ−ニトロフェノールの濃度が０．４〜２ｍｇ／１００ｍｌであり、その混合比率は１：９〜４：６とすることが好ましい。発色酵素基質としてＸ−Ｇａｌを用いた培地に対しては、インディゴカルミンの濃度を０．２ｍｇ／１００ｍｌ、ｏ−ニトロフェノールの濃度を０．４８ｍｇ／１００ｍｌとした比色液とすることが最も好ましい。
【００１６】
本発明の比色液は、特定量のインディゴカルミン及びｏ−ニトロフェノールを水、エタノール、メタノール等の透明の溶媒に溶解して調製すればよいが、着色安定性に影響を与えない範囲で、適宜他の成分、例えば使用される培地に含有される成分、緩衝剤、保存剤、防腐剤等を添加することができる。
【００１７】
例えば、大腸菌を検出する目的で、培地中に蛍光酵素基質である４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）が添加されている場合には、本発明の比色液に４−メチル−ウンベリフェロンを添加することにより、同時に大腸菌検出のための陽性対照液としても使用できる。尚、この場合は、波長３６６ｎｍの紫外線照射による蛍光の有無で確認でき、また、比色液に添加される４−メチル−ウンベリフェロンの濃度は、０．１〜１ｍｇ／１００ｍｌとするのが好ましい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００１９】
参考例１  陽性反応の限界色の検討
E.coli ATCC l1775、K.ascorbata ATCC 33433、A.hydrophilia JCM 3976、C.freundii ATCC 8090、C.diversus ATCC 25407、S.marcescens ATCC 8100、E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 23355、E.intermedium ATCC 33421、E.cloaceae ATCC 13047、K.oxytoca ATCC 13182、K.pneumoniae ATCC 13883、K.ozaenae ATCC 11296及びH.alvei ATCC 13337の細菌（大腸菌、大腸菌群）計１４株を、トリプトソーヤブイヨンで３５℃、２４時間培養した菌液を供試して、E.coli を除く菌種は１０-9まで滅菌生理食塩水で希釈し、E.coliは１０-10まで希釈し、各々の希釈液１０ｍlをＸ−Ｇａｌ含有培地（「ＥＣブルー１０」日水製薬（株）製）に接種し、３５℃、２４時間培養後、各菌種における陽性反応を肉眼判定及び６１０ｎｍ（光電光度計（ＡＮＡ−７Ｓ）、丸型試料セル使用）における測定を行った。表１に示すように、波長６１０ｎｍにおける吸光値が０．０７以上の場合に肉眼判定において陽性と判定できた。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
参考例２  インデイゴカルミン溶液とｏ−ニトロフェノール溶液の配合検討
精製水１０００ｍｌ当たりリン酸二水素カリウム１ｇとリン酸水素ニカリウム４ｇを溶かしたリン酸緩衝液を調製した。インディゴカルミン溶液は１００ｍｌのリン酸緩衝液にインディゴカルミンを０．２ｍｇ又は０．５ｍｇを溶かして調製し、ｏ−ニトロフェノール溶液は同様に１００ｍｌのリン酸緩衝液にｏ−ニトロフェノールを０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ又は１ｍｇを溶かして調製した。各濃度の２種類の溶液を混ぜ合わせ、波長６１０ｎｍ（光電光度計（ＡＮＡ−７Ｓ）、丸型試料セル）で吸光値を測定した。また、Ｘ−Ｇａｌ含有培地（「ＥＣブルー１０」日水製薬（株）製）に各濃度のインディゴカルミン溶液を加えて、陽性色の指標とした。
【００２２】
表２に示すように、ＥＣブルー１０にインディゴカルミン溶液（０．２ｍｇ／１００ｍｌ）を１０ｍｌ加えることにより陽性限界色に近い色になった。これを指標として、インディゴカルミン溶液とｏ−ニトロフェノール溶液を組合せて最も近い色を呈したのは、インディゴカルミン溶液（０．５ｍｇ／１００ｍｌ）４ｍｌとｏ−ニトロフェノール溶液（０．８ｍｇ／１００ｍｌ）６ｍｌの組合せであった。この時の溶液の波長６１０ｎｍの吸光値は０．０７、波長４２０ｎｍの吸光値は０．１１であった。これに対し、ＥＣブルー１０にインディゴカルミン溶液（０．２ｍｇ／１００ｍｌ）を１０ｍｌ加えた溶液の波長６１０ｎｍの吸光値は０．１０、波長４２０ｎｍの吸光値は０．１５であることから、ほぼ同等の比色液が調製できた。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
参考例３  蛍光確認液の検討
４−メチルウンベリフェロン（７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン）  ナトリウム塩（ＳＩＧＭ）１０ｍｇを１００ｍｌの精製水に溶解し、精製水で１０倍段階希釈した溶液を波長３６６ｎｍ（ＭＯＤＥＬ  ＵＶＢＬ−２５，ＵＶＰ，ＩＮＣ）の紫外線の照射による肉眼判定とＭＴＰ−３２蛍光リーダー（３６５ｎｍ）による測定を行った。
【００２５】
表３に示すように、４−メチルウンベリフェロンナトリウム溶液の濃度が０．１ｍｇ／１００ｍｌの時、蛍光として確認できる限界であることを認めた。よって、精製水１０００ｍｌ当たり１ｍｇ  ４−メチルウンベリフェロンナトリウムを加えて蛍光確認溶液とすることにした。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
実施例１  比色液の調製
インディゴカルミン  ２ｍｇ、ｏ−ニトロフェノール  ４．８ｍｇ、４−メチルウンベリフェロンナトリウム  １ｍｇ、リン酸二水素カリウム  １ｇ、リン酸水素二カリウム  ４ｇを精製水で溶かして全量を１Ｌとした。尚、容器は使用する培地と同様のものを使用した。
【００２８】
実施例２  比色液の性能
E.coli ATCC l1775（2.1×109/ml）、C.diversus ATCC 25407（4.0×108/ml）、C.freundii ATCC 8090（2.0×107/ml）、E.aerogences ATCC 13048（9.0×108/ml）、E.cloacae ATCC 23355（8.0×108/ml）、K.oxytoca ATCC 13182（1.5×109/ml）、K.ozaenae ATCC 11296（2.7×108/ml）、K.pneumoniae ATCC 13883（9.0×108/ml）及びK.ascorbata ATCC 33433（6.3×108/ml）の供試菌株（括弧内は３５℃、２４時間培養後のトリフトソイブロス中の菌数を示す）を１ｍｌ当たり数個になるように希釈し（１０-7〜１０-10）、それを９ｍｌの精製水を分注してあるＸ−Ｇａｌ含有培地（「ＥＣブルー１０」日水製薬（株）製）に接種し、３５℃で培養し、１８時間〜４８時間まで陽性反応を観察した。
この時、実施例１で調製した比色液を対照として置き、陽性限界を見極め、その後、それが実際に陽性になるか否かを確認したところ、全ての菌株について、本発明の比色液と同等の発色を示した陽性限界の培地では、培養を続けるとすべて陽性になり、比色液の性能は十分であることが確認できた。
E.coli ATCC l1775の場合及びC.diversus ATCC 25407の場合の結果を例として表４及び表５に示す。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
【表５】
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【００３１】
【発明の効果】
本発明の比色液を用いることにより、特定酵素基質培地法における微生物判定の陽性限界を肉眼で明確に判断することができる。また、該比色液は室温に保管しても色調の変化がなく、保存安定性がよいことから、微生物判定用キットとして培地と共に提供することが可能である。