(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉組織の再生のための医薬組成物の調製のための同種異系間葉幹細胞の使用法であって、前記同種異系間葉幹細胞が、受容者哺乳類に対する前記医薬組成物の投与の前に供与者哺乳類と前記受容者哺乳類とのＭＨＣマッチング段階なしで前記供与者哺乳類から獲得されることを特徴とする同種異系間葉幹細胞の使用法。
【請求項２】
受容者哺乳類がヒト被験者であり、同種異系間葉幹細胞が同種異系ヒト間葉幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の使用法。
【請求項３】
同種異系ヒト間葉幹細胞が、ヒト骨髄から回収されることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項４】
組成物が、事実上無血球であることを特徴とする請求項３記載の使用法。
【請求項５】
組成物が、受容者哺乳類における結合組織増殖を促進するのに使用されることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項６】
組成物が、受容者哺乳類における骨形成を生成するためのものであることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項７】
組成物が、受容者ヒト被験者における結合組織欠損を処置あるいは修復するためのものであることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項８】
欠損が、骨欠損であることを特徴とする請求項７記載の使用法。
【請求項９】
欠損が、軟骨欠損であることを特徴とする請求項７記載の使用法。
【請求項１０】
欠損が、骨格組織欠損であることを特徴とする請求項７記載の使用法。
【請求項１１】
組成物が、支質の増殖を促進するためのものであることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項１２】
組成物が、全身投与のためのものであることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項１３】
組成物が、静脈内投与のためのものであることを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項１４】
組成物を調製するために使用される同種異系ヒト間葉幹細胞が、対象となる組み込み遺伝物質を発現することを特徴とする請求項２記載の使用法であって、ここで前記組み込み遺伝物質が副甲状腺ホルモン、インスリン、因子VIII、因子IX、ジストロフィン、アルファ１抗トリプシン、エリスロポイエチン、フェニルアラニンヒドロシキラーゼ、シスタチオニンβシンターゼ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、組織プラスミノゲン活性化剤、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、およびアデノシンデアミナーゼから成る群より選ばれる、使用法。
【請求項１５】
組成物が、受容者哺乳類における筋組織増殖を促進することを特徴とする請求項２記載の使用法。
【請求項１６】
組成物が、受容者哺乳類への直接注射のためのものであることを特徴とする請求項１５記載の使用法。
【請求項１７】
直接注射が、筋組織への直接注射であることを特徴とする請求項１６記載の使用法。
【請求項１８】
受容者哺乳類に移植するための人工装具装置調製のための同種異系間葉幹細胞の使用法であって、ここで前記同種異系間葉幹細胞が、その増殖が促進される結合組織の型に幹細胞を分化させるのに適した条件下で、受容者哺乳類に移植される前記人工装具装置の結合組織表面に付着され、ここで前記同種異系間葉幹細胞が、前記組成物の投与の前に供与者哺乳類と前記受容者哺乳類とのＭＨＣマッチング段階なしで前記供与者哺乳類から獲得されることを特徴とする使用法。
【請求項１９】
受容者哺乳類が、ヒト被験者であり、また同種異系間葉幹細胞が、同種異系ヒト間葉幹細胞であることを特徴とする請求項１８記載の使用法。
【請求項２０】
同種異系間葉幹細胞が、ヒト骨髄から回収されることを特徴とする請求項１９記載の使用法。
【請求項２１】
同種異系間葉幹細胞が、事実上無血球であることを特徴とする請求項２０記載の使用法。
【請求項２２】
人工装具装置が、受容者哺乳類における結合組織増殖のためのものであることを特徴とする請求項１９記載の使用法。
【請求項２３】
人工装具装置が、受容者哺乳類における骨形成を生成するためのものであることを特徴とする請求項１９記載の使用法。
【請求項２４】
人工装具装置が、受容者ヒト被験者における結合組織欠損を処置又は修復するためのものであることを特徴とする請求項１９記載の使用法。
【請求項２５】
欠損が、骨欠損であることを特徴とする請求項２４記載の使用法。
【請求項２６】
欠損が、軟骨欠損であることを特徴とする請求項２４記載の使用法。
【請求項２７】
欠損が、骨格組織欠損であることを特徴とする請求項２４記載の使用法。
【請求項２８】
人工装具装置が、支質の増殖を促進するためのものであることを特徴とする請求項１９記載の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
この発明は１９９８年３月１３日受理された合衆国特許出願番号０９／０３９．１２７号を部分継承しその優先権を請求する。
【０００２】
この発明は間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）を使用する各種の方法と産物に向けられる。
【０００３】
【背景技術】
この発明の一つの見地に従って、ある動物は間葉幹細胞で処置され、ここで前記間葉幹細胞は処置される前記動物以外のある動物から獲得される。すなわち、前記間葉幹細胞は自己のものではない。
【０００４】
より詳細には、この発明の一つの見地に従って、ある患者は同種異系ヒト間葉幹細胞で処置される。この用語はここで使用されるように、同種異系ヒト間葉幹細胞は間葉幹細胞の意図された受容者以外のヒトから獲得される。
【０００５】
間葉幹細胞は表面ＭＨＣ分子を発現するけれども、出願人は間葉幹細胞が免疫学上中性であり、従ってここで記載の通り細胞の受容者に有害な免疫応答を誘導することなく使用できることを発見した。
【０００６】
加えて出願人は、間葉幹細胞の提供者が受容者に「適合」する必要がないことを発見した。
【０００７】
この発明に従って、間葉幹細胞は免疫系に「不可視」であることが発見された。通常、異なった個体（同種異系細胞）からの共存培養細胞は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で明らかにされるようにＴ細胞増殖に帰着する。しかしヒト間葉幹細胞を試験管内で同種異系Ｔリンパ球と接触させると、それはＴ細胞による免疫応答を生成せず、つまりＴ細胞は増殖せず、Ｔ細胞が不適合の間葉幹細胞に応答しないことを示している。この発見は予期されなかったが、その理由は、ヒト間葉幹細胞がそれに免疫性を付与する表面分子のすべてを発現し、つまりそれは同種異系クラスＩおよびII  ＭＨＣ分子を発現するからである。
【０００８】
間葉幹細胞が用量依存様式で混合リンパ液での同種異系Ｔ細胞応答を有効に減少させることも発見された。また更に異なった提供者からの間葉幹細胞がＭＨＣ型に関して減少応答の特異性を明示しないことも発見された。かくして間葉幹細胞は、間葉幹細胞に対する同種異系反応Ｔ細胞の増殖応答を減少するために、混合リンパ球反応で標的細胞集団に適合するＭＨＣである必要はない。
【０００９】
【発明の開示】
同種異系間葉幹細胞を含むこの発明に基づく組成物は結合組織欠損の修復、再構築およびもしくは再生を促進するのに特に有用である。この発明の一つの見地に従って、同種異系間葉幹細胞は骨その他結合組織を処置する各種の方法と産物に利用することができる。
【００１０】
も一つの見地において、この発明は造血細胞産生を高めるために同種異系間葉前駆細胞あるいは幹細胞を利用するための各種の方法と装置に関する。
【００１１】
更にここに記載され発明の一つの見地において、同種異系間葉幹細胞は遺伝子操作（形質導入あるいは形質移入）される。形質導入細胞はそれを必要とする患者に、例えば遺伝子疾患あるいは疾病を処置するために投与することができる。
【００１２】
この発明の方法および産物はそれが意図される受容者に対し同種異系である分離培養拡張間葉幹細胞を利用する。発明はそれにより限定されるものではないが、間葉幹細胞はここに記載された方法を利用する目的で十分な数の細胞を得るために、培養つまり試験管内で分離され、精製され、また拡張することができる。キャプランおよびヘインズワース、合衆国特許番号第５，４８６，３５９号、合衆国特許番号第５，１９７，９８５号、合衆国特許番号第５，２２６，９１４号、ＷＯ９２／２２５８４号を参照されたい。
【００１３】
【発明を実施するための最良の手段】
かくして、望ましい実施例において、ヒト間葉幹細胞は受容者に対して同種異系の個体から採取された骨髄から得られる。望ましい実施例において、間葉幹細胞調製は実質的に純粋であり、つまり間葉幹細胞以外の同種異系細胞を少なくとも９５％欠いている。
【００１４】
対象となるヒト間葉幹細胞は骨髄もしくは他の間葉幹細胞源から得られる。骨髄細胞は腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊髄、あるいは他の骨髄腔から得られる。ヒト間葉幹細胞の他の源は胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および青年の皮膚、ならびに血液を含む。
【００１５】
分離精製同種異系ヒト間葉幹細胞は特殊な培地で有糸分裂拡張を通じて未分化状態で成長できる。これらの細胞は機械的刺激、細胞的刺激および生化学的刺激を含む数多くの因子により骨、軟骨およびその他各種の結合組織に分化するために収穫され活性化することができる。ヒト間葉幹細胞は広範な間葉幹組織細胞並びに腱、靭帯、真皮を産生する骨芽細胞および軟骨細胞などの細胞に分化する潜在能力を持ち、この潜在能力は分離後もまた培養でのいくつかの集団拡張のために保持される。このように間葉幹細胞を分離し、精製し、大幅に増幅し活性化できることで、それらを骨、軟骨、腱、靭帯、筋、脂肪、骨髄支質などの骨格および結合組織のような望ましい特殊な型の間葉細胞に分化させることができるために、骨格とその他結合組織疾患を処置する高度に有効な方法が存在する。合衆国特許番号第５，１９７，９８５号を参照されたい。
【００１６】
望ましい実施例では間葉幹細胞は使用の前に培養拡張されるが、このような間葉幹細胞を培養拡張なしで使用することも可能である。例えば、間葉幹細胞は骨髄から誘導され、そこで血球から分離後に使用することもある。かくして例えば、同種異系骨髄は血球を除去して同種異系ヒト間葉幹細胞で濃縮され、それを必要とする患者に例えば骨格修復のために導入される。
【００１７】
かくしてこの発明の一つの実施例は同種異系間葉幹細胞の移植と分化を高めるための各種の方法と装置を提供する。従って、間葉幹細胞は、例えば結合組織の成長を促進するために、結合組織疾患の処置に使用することができる。結合組織という用語は特殊化された要素を支持する身体の組織を含むものとしてここで使用され、骨、軟骨、靭帯、腱、支質、筋、および脂肪組織を含む。
【００１８】
この実施例の望ましい見地に従って、同種異系間葉幹細胞は骨格その他結合組織の疾患を処置する各種の方法と産物に使用することができる。この発明の方法と装置は分離された同種異系間葉前駆細胞を利用し、それはある種の条件の下で骨あるいは軟骨に入り細胞形成するように、分化して各種の型の望ましい結合組織を産生するよう誘導することができる。
【００１９】
追加の見地において、この発明は処置およびもしくは診断目的のためにヒト同種異系間葉幹細胞あるいは前駆細胞を利用する各種の方法に向けられる。例えば同種異系ヒト間葉幹細胞あるいは前駆細胞は、（１）急性損傷、異常遺伝子発現または後天性疾病を通じて損傷を受けた間葉組織の再生、（２）同種異系間葉幹細胞を、間葉幹細胞を損傷組織部位に送達するのに適した生体適合性担体と組み合わせて処置することにより宿主の損傷間葉組織を処置し、（３）各種の間葉組織を産生し、（４）間葉幹細胞自己再生および委託間葉系列への分化と関連する成長因子を検知し評価し、（５）特異的間葉系列への間葉幹細胞委託と分化を調節する阻害因子を検知し評価し、また（６）間葉細胞系列を発展させ間葉組織発展と関連する因子を検定することに利用される。
【００２０】
同種異系間葉幹細胞の用量は広い範囲内で変化し、各特定の事例で勿論個体の要求に適合するであろう。使用される細胞数は受容者の重量と疾患および従来の技術に習熟した人に既知の他の変数に依存するであろう。細胞は治療される特定の組織あるいは器官に適したルートにより投与することができる。細胞は例えば非経口、静脈内注射により全身に投与できる。大抵の場合、同種異系間葉幹細胞は望ましい処置の部位に送達され、また骨髄などの特定の組織あるいは器官を目標とすることができる。
【００２１】
細胞は約０．５〜５×１０6細胞／ｍｌの濃度で適切な希釈剤に懸濁できる。このような溶液の適当な賦形剤は緩衝生理食塩水などのような受容者と生物学的にも生理的にも適合するものである。他の賦形剤は水、等張共通食塩水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油を含む。投与のための組成物は適当な無菌性と安定性を満たす標準方法に従って処方され、産生され貯蔵されねばならない。
【００２２】
ヒト間葉幹細胞は細胞の皮下移植を経由して、あるいは幹細胞の注射により、例えば筋細胞に投与できる。
【００２３】
も一つの見地はおいて、この発明は結合組織損傷を修復する方法に関する。この方法は同種異系間葉幹細胞あるいは前駆細胞含有抽出物を修復に必要な結合組織の型に細胞を分化するのに適した条件の下で結合組織損傷区域に適用する段階よりなる。
【００２４】
この見地の更なる実施例において、この方法は人工装具装置の骨格組織への移植を高める方法に向けられる。この方法は同種異系間葉細胞あるいは前駆細胞人工装具装置の結合表面に付着し、細胞を分化するのに適した条件の下でこれらの間葉細胞を含む人工装具装置を移植を必要とする骨格あるいは結合組織の型に移植する段階よりなる。
【００２５】
この発明はそれを必要とする個体に骨形成を増強する方法を提供する。かくしてこの発明のこの見地の方法はトラウマ（外傷）、疾病年齢、出生時欠損、手術介入などに起因して生じる正常な結合組織と比較される何らかの損傷あるいは異常を含む「結合組織欠損」に適用できる。より詳細には、この発明は分節性骨欠損、偽関節、変形治癒あるいは遅滞癒合の修復を行う方法を提供する。ここで使用されるように、「結合組織欠損」は更に骨形成が例えば美容整形にのみ望まれる損傷のない領域にも関連する。ここで開示される方法と材料は従って整形外科、歯科、口腔、顎顔面、歯根膜その他外科手順での使用に適している。
【００２６】
この発明はまた結合組織疾患を補正しあるいは修飾するために同種異系間葉前駆細胞あるいは幹細胞を利用する方法に指向される。かくしても一つの見地において、この発明は同種異系間葉幹細胞あるいは前駆細胞を骨あるいは軟骨形成細胞などの望ましい表現型の特殊な型に分化するよう誘導するために開発された各種の装置および因子に指向される。例えば発明者は各種の多孔トリカルシウムあるいはヒドロキシアパタイトセラミック装置が、同種異系間葉幹細胞あるいは前駆細胞を骨格欠損に移植し、それにより細胞の骨格組織への細胞の分化を可能にしおよびもしくは促進する時に同種異系間葉幹細胞あるいは前駆細胞の担体あるいはキャリアとして利用することができる。
【００２７】
かくしてこの発明の一つの実施例は、リン酸トリカルシウムあるいはヒドロキシアパタイトもしくはこの２種の組合せよりなる多孔セラミック組成物を間葉幹細胞あるいは前駆細胞の担体あるいはキャリアとして使用し、これら細胞が骨格欠損に移植された時に細胞の骨格組織への分化を促進する方法に指向される。
【００２８】
も一つの実施例において、この発明は、同種異系間葉幹細胞と併用して吸収可能ゼラチン、セルロース、およびもしくはコラーゲンベース基質を使用する方法に指向される。この組成物はスポンジ、帯条、パウダ、ゲル、ウエブ、あるいは他の物理的形状の形態で使用できる。
【００２９】
各種の代替的担体が結合組織の修復のためにヒト間葉幹細胞の送達に使用される。この組成物は新しい骨あるいは軟骨形成にかさと足場を提供するために損傷組織用のパッチとして設計される。ここに記載される各種の組成物、方法および材料は、この発明に従って、新しい骨折、偽関節骨折の修復を刺激し、脊椎固定を促進するために使用できる。合衆国特許第５，１９７，９８５号を参照されたい。同様に軟骨および他の筋骨格組織の修復も実行できる。脊椎固定の場合には、このような組成物、方法と材料は板と横突起に沿って量癒合を促進するため器具ありもしくはなしで後で使用でき、更に先には椎体間癒合を促進するため癒合ケージを充たすために使用することができる。同種異系間葉幹細胞を使用するこの発明の方法は、全関節置換および骨粗鬆症を処置するために使用することができる。
【００３０】
この発明のも一つの見地に従って、間葉幹細胞は骨髄支質を産生するために使用することができる。骨髄支質は血球合成、すなわち造血に向け支持する足場ならびに可溶因子を提供する。従って発明のこの見地は、例えば、骨髄が強烈な照射および化学療法の間に骨髄が激減しあるいは破壊される場合に、例えば骨髄あるいは末梢血から誘導された造血前駆細胞を使用することによって患者の血球および骨髄組織再生を改良するための方法に向けられる。
【００３１】
従って一つの実施例において、この発明は同種異系間葉幹細胞を造血幹細胞あるいは前駆細胞の移植を高めるために間葉幹細胞を使用する方法と産物を提供する。
【００３２】
かくしてこの発明の一つの実施例は同種異系間葉幹細胞を用いることにより骨髄組織の再生を高めるための方法を提供する。造血幹細胞移植あるいは前駆細胞移植値を高める方法は、（ｉ）同種異系間葉幹細胞、および（ｉｉ）造血幹細胞あるいは前駆細胞をこれを必要とする個体に投与することによりなり、ここで、前記間葉幹細胞は個体にあるそのような造血幹細胞あるいは前駆細胞の移植を促進するために有効な量で投与される。より詳細には、この発明の一つの実施例は、間葉幹細胞が全身に投与された場合に、それが骨髄腔に移動しあるいは進み、骨髄支質を再生する方法に指向する。同種異系間葉幹細胞は全身に、例えば静脈内に、各種の送達部位にもしくは直接骨の中に投与できる。
【００３３】
この見地で更に考慮されるのは、造血幹細胞あるいは前駆細胞と関連して同種異系間葉幹細胞を患者に注射するタイミングに指向される。一つの実施例において、間葉幹細胞は造血幹細胞あるいは前駆細胞と同時に注射される。も一つの実施例では、間葉幹細胞は造血幹細胞あるいは前駆細胞の投与の前あるいは後に投与される。造血幹細胞は自己由来のものであり、あるいは同種異系細胞に適合するものである。
【００３４】
この発明は癌の処置に骨髄移植の効果を高めるのに有用である。Ｘ線照射あるいはアルキル化治療法は骨髄微環境ならびに造血幹細胞を破壊する。現在の治療はこれまで収穫され冷凍保存された骨髄を用いて骨髄切除後に患者に移植するものである。しかし骨髄微環境が破壊されるために、骨髄生体移植は支質環境が回復するまで遅延する。この結果、この発明の限界的見地は骨髄組織の支質再構築と再生の過程を促進する分離精製培養拡張同種異系間葉幹細胞を移植するという利点に指向する。
【００３５】
間葉幹細胞薬剤の投与モードは必ずしもそれに限定されないが、全身静脈内注射および意図された活性部位への直接の注射を含む。薬剤は注入あるいはボーラス注射などいずれかのルートで投与することができ、また他の生物活性剤と共に投与できる。投与は全身であることが望ましい。
【００３６】
発明のこの見地において、間葉幹細胞は単独で投与できるが、望ましい実施例では間葉幹細胞は薬理組成物の形態で利用される。このような組成物は同種異系間葉幹細胞の治療有効量と、薬理許容担体あるいは賦形剤よりなる。このような担体は必ずしもそれに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、およびこれらの組合せを含む。その構成は投与のモードに適するものでなければならない。
【００３７】
望ましい実施例において、間葉幹細胞薬剤あるいは組成物は、人間への静脈内投与に適した薬理組成物として日常的手順に基づいて構成される。典型的には、静脈内注射に適した組成物は無菌等張水緩衝液の溶液である。必要とあれば、この組成物は更に注射の部位で何らかの疼痛を改善する局所麻酔薬を含む。一般に成分は別個にあるいは単位用量形態に混合されたもののいずれかで、例えば活性剤の量を示すアンプルのような密封容器での冷凍保存濃縮物として供給される。組成物が注入で注入投与される場合は、それは無菌薬剤グレードの水あるいは食塩水を含む輸液ボトルで調合される。組成物が注射で投与される場合には、注射用無菌水のアンプルあるいは食塩水が準備され成分は投与の前に混合される。
【００３８】
この発明の方法は特に（１）間葉幹細胞の注射と組織の移植の間の時間間隔を増減し、（２）注射される間葉幹細胞の量を増減し、（３）間葉幹細胞注射の数を変化させ、あるいは（４）間葉幹細胞の送達方法を変化させることにより変更することができる。
【００３９】
間葉幹細胞薬剤は受容者の造血細胞あるいは前駆細胞の移植を促進するのに有効な量で使用される。一般にこのような量は体重キログラム当り少なくとも１×１０4間葉幹細胞であり、大抵の場合は３×１０6／ｋｇを必要としない。望ましくは、それは移植導入に先立ち少なくとも約１×１０6間葉幹細胞／ｋｇであり、通常２×１０6間葉幹細胞／ｋｇ以上を必要としない。同種異系間葉幹細胞薬剤は移植導入の少なくとも約７日前、しかし一般的には３０日前以内に造血幹細胞あるいは前駆細胞と同時に投与される。間葉幹細胞調剤は望ましくは１日１乃至３回静脈内で投与され、最適効率と薬理用量に適合するよう調節される。
【００４０】
この発明は更にこの発明の薬理調剤の１個もしくはそれ以上の成分を充填した１個もしくはそれ以上の容器よりなる薬剤パックあるいはキットを提供する。このような容器と関連して、薬剤産物あるいは生物学産物の製造、使用、販売を規制する政府機関の指示した形の通達があり、この通達はヒトへの投与のための製造、使用、販売についての政府機関の承認を反映するものとなる。
【００４１】
この発明は、間葉幹細胞の源が受容者のみのものであり、その源が受容者に適合するかどうかを必要としない各種の処置に間葉幹細胞が使用されるということでとりわけ有利である。更にこのような間葉幹細胞は免疫抑制薬の長期投与を必要とせずに使用される。
【００４２】
また、更なる見地において、この発明はまた、生理的或いは薬理的活性タンパク質を発現するためもしくは遺伝子処置での使用のために特に対象となる遺伝子をその内で運ぶ遺伝子操作細胞としての同種異系ヒト間葉幹細胞の適用に向けられる。
【００４３】
この発明のこの見地に従って、同種異系ヒト間葉幹細胞あるいは前駆細胞は外因性遺伝子産物の発現のための宿主細胞として使用することができる。これらの培養拡張細胞は骨髄を目標として向かい骨髄移植環境で造血回復力を高める。更にこれらの細胞は細胞処置のために操作され、例えば拡張され、精製され、選択され臨床用途で保持され、一方その前駆体表現型を維持することができる。この操作の部分はこのような細胞よび将来の使用のための冷凍保存を特徴付けるものである。
【００４４】
形質転換同種異系幹細胞と組み込み遺伝子材料の発現産物が単独であるいは他の細胞およびもしくは組成物と併用して使用できることも考慮される。
【００４５】
外部遺伝子をこれら前駆細胞培養に導入するために使用された技術は、例えば合衆国特許番号５，５９１，６２５号に記載されており、すべての細胞の子孫が新しい遺伝物質を運ぶ形質導入間葉幹細胞を提供する。形質転換細胞の細胞送達は骨膜、骨髄、筋および皮下部位への注入および直接注射を含む各種のモードを通じて実行される。
【００４６】
この発明のこの見地のおかげで遺伝子は同種異系間葉幹細胞に導入され、後者は次いで遺伝子発現がその処置利益を達成する患者に投与される。このような適用の例は、間葉幹細胞の保持、組織の成長、外部遺伝子産物の再モデル化、修復および生体内産生で中心的役割を持つ遺伝子を含む。
【００４７】
遺伝子疾患の補正に加えて、この発明のこの見地はある遺伝子産物の発現の増強を可能とするために必須遺伝子の追加コピーを標的方式で導入することができる。これらの遺伝子は例えば、ホルモン、基礎タンパク質、細胞膜タンパク質サイトカイン、細胞培養分子、解毒酵素、組織修復に重要な「再構築」タンパク質などであることができる。正常間葉幹細胞は異常間葉幹細胞を治療するために提供できる。
【００４８】
追加の適用は同種異系間葉幹細胞の表現型とその分化された子孫を特異的治療用途に変更する導入遺伝子の使用である。これは細胞内遺伝子産物、シグナル形質導入分子、細胞表面タンパク質、細胞外遺伝子発現産物およびホルモンレセプターを含む。このような処置が用途を持つ疾病状態および手順は、筋骨格系の遺伝子疾患、骨や軟骨の疾病、骨髄、炎症状態、筋変形症、悪性疾患、自己由来もしくは同種異系骨あるいは骨髄移植を含む。
【００４９】
一つの実施例で、分離ヒト間葉幹細胞は望ましくは遺伝子治療産生細胞になるようにウイルス配列をパッケージできる翻訳産物を発現できる少なくとも１個のＤＮＡ配列で形質転換された間葉幹細胞である。この見地の望ましい実施例において、分離ヒト間葉幹細胞はレトロウイルス５′ＬＴＲ、およびその転写調節の下で少なくとも１個のレトロウイルスｇａｇ，ｐｏｌあるいはｅｎｖ遺伝子よりなるＤＮＡ配列で形質転換される。も一つの見地において、分離ヒト間葉幹細胞は、レトロウイルスパッケージングシグナルと配列、およびインコンピテントレトロウイルスになるようにそのプロモーターの制御の下で発現される組み込み遺伝物質よりなるＤＮＡ配列で形質転換されている。更に考慮されるべきは造血を開始し、調節しあるいは増強する委託ストローマ芽細胞の形質移入である。
【００５０】
事実間葉幹細胞あるいは組織のすべての遺伝子損傷は、この技術で治療あるいは「修正」され得る。主要な成分は、幹細胞が組織空間を拡張し再び住みつくという条件下で適切な組織に遺伝子運搬幹細胞を送達する能力である。同種異系間葉幹細胞へのための患者の準備は、必ずしもされに限定されないが、（ａ）骨髄移植と併用する化学療法およびもしくは照射による骨髄切除、と（ｂ）とりわけ形質導入細胞生存の利益、分化の間の利益あるいは機能における利益（筋ジストロフィーなどの筋疾患をジストロフィンもしくは類似の遺伝子で修正する事例のような場合）を持つ場合に薬剤なしで「形質導入」細胞の直接組織浸潤を含む。追加の用途は生体内にのみ準備され、あるいは留置装置、例えば骨格整形装置などに使用される間葉幹細胞の放射性同位元素による識別にあり、ここで間葉幹細胞を「標識」し、その生存、維持、分化ならびに時間をかけての装置との関連を観察することは興味深いものである。
【００５１】
発現されるタンパク質をコード化する外因性遺伝物質で形質移入された同種異系ヒト間葉幹細胞により提供される利点は、（ａ）投与される個体以外の各種の源から得られたヒト間葉幹細胞を個体に利用する能力、（ｂ）これらの遺伝子運搬間葉幹細胞を逆免疫応答を誘導することなく患者の適切な組織に運び、かくして細胞の投与の前に免疫抑制療法の必要を最小にする能力、（ｃ）間葉幹細胞が間葉組織空間に局在化する場所で注入のためのヒト間葉幹細胞を培養拡張する能力、（ｄ）安定した相続遺伝子移転に宿主として使用されるヒト間葉幹細胞を培養拡張し冷凍保存する能力、（ｅ）生体内での取付けの後で、遺伝子変更細胞を回収する能力、（ｆ）標的組織に対して遺伝子変更を正確にピンポイントし遺伝子療法を広範な疾患に適合させる能力、および（ｇ）発現されるヒト間葉幹細胞とその子孫内で新しく誘導された遺伝子を他の細胞よりもより制限された様式で留め、これにより医学的疾病を処置するのに潜在的用途を拡張する能力を含む。
【００５２】
レトロウイルスの構造とライフサイクル（生活環）は遺伝子導入ベクターに理想的に適したものにする。一般にレトロウイルス媒介遺伝子導入についてマクローリン、他、核酸研究の進歩と分子生物学、３８巻，９１−１３５ページ、（１９９０年）を参照されたい。レトロウイルスを用いる幹細胞の形質転換については合衆国特許番号５，５９１，６２５号に記載されている。
【００５３】
同種異系幹細胞を遺伝子操作あるいは修飾するためにレトロウイルス以外のベクターを利用することも可能である。新しい遺伝物質を例えばＳＶ４０、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびヒトパピローマウイルスなどの細胞に新しい遺伝物質を発現できるいずれかのウイルスによる対象となる遺伝情報を導入することができる。クローン真核ＤＮＡを培養哺乳類細胞に導入するのに多くの方法を使用することができ、それはリン酸カルシウムあるいはＤＥＡＥデキストラン、原形質融合および、電気窄孔法を含む。幹細胞に導入される遺伝物質はウイルス核酸、細菌性プラスミドあるいはエピソームの形態にある。
【００５４】
この発明は同種異系間葉幹細胞が生物学的に著しい量あるいは少量で通常のヒト間葉幹細胞で産出されるのではなく、過剰産生が処置利益に導くような状況でそれを遺伝子操作することを可能にする。これらの産物は次いで血流あるいは身体の他の領域、例えば中枢神経系に分泌される。このようにして形成されたヒト幹細胞は必要とされる物質の（経口摂取、注射、デポット注入などにより）周期的投与を必要とする現在の処方に代わる薬剤送達システムとして役立つ。この発明はこのような物質を必要とするヒトにホルモン、酵素および薬剤を提供する応用性を有する。延長された時間期間で徐放用量を必要とするホルモン（例えば小皮小体（副甲状腺）ホルモン、インスリンなど）のようなホルモンなどの物質を提供するのに非常に価値あるものである。
【００５５】
例えばこれはインスリンの連続送達に使用することができ、またその結果毎日のインスリン注射は必要となくなる。遺伝子操作ヒト間葉幹細胞は更に因子VIIIなどの凝固因子の産生に使用することができ、あるいは筋ジストロフィーのためにジストロフィンの筋細胞への連続送達のために使用できる。
【００５６】
対象となる遺伝物質の同種異系ヒト間葉幹細胞への取り込みは先天性および後天性疾病の処置に特に価値がある。先天性疾病の場合には、このアプローチは遺伝子修飾ヒト間葉幹細胞および代謝吸い込みに使用できる他の細胞を提供するために使用される。つまりこのようなヒト間葉幹細胞は潜在的に毒性物質を分解するのに役立つであろう。例えばこれは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠損による高フェニルアラニン血症を含むアミノ酸異化作用、シスタチオニンβシンターゼの欠損によるホモシスチン血症などの疾患を処置するのに利用できた。この方法で処置できる他の疾患は、シスチン症などのアミノ酸代謝の疾患、ヒスチジン尿症あるいは家族性低コレステロール血症などの膜輸送の疾患、遺伝性オロチン酸尿症などの核酸代謝の疾患などを含む。
【００５７】
この発明の同種異系ヒト間葉幹細胞はまた、身体で通常産生される産物（例えば酵素あるいはホルモンなど）が産生されずあるいは十分な量でしか作られない遺伝疾病の処置に使用できる。ここで失われたか不適切に産出された物質をコード化する遺伝子で形質導入されたヒト間葉幹細胞はその物質を十分な量で産生するのに使用できる。これはアルファ１抗トリプシンを産生するのに利用できる。これはまた因子VIIIと因子IXの産生に使用でき、血友病の処置に有用になるであろう。
【００５８】
処置が遺伝子操作同種異系間葉幹細胞（すなわち対象となる遺伝物質で形質導入されたヒト間葉幹細胞）の使用を通じて提供できる多くの後天性疾病がある。例えば、このような細胞は慢性疾患に普通に存在し（例えば血液透析患者における）慢性腎不全としばしば関連づけられる貧血を処置するのに利用できる。この場合エリスロポイエチンをコード化する遺伝子をそれ自身に取り込んだヒト間葉幹細胞はエリスロポイエチン（すなわち赤血球の産生）を増加するよう骨髄を刺激することにより貧血を補正するであろう。他のコード化サイトカインは例えばＧ−ＣＳＦあるいはＧＭ−ＣＳＦである。
【００５９】
この発明の同種異系ヒト間葉幹細胞はまた血栓形成を予防する活性化剤として低容量の組織プラスミノゲン活性化剤を投与するために使用できる。この場合ＴＰＡをコード化するとり込み遺伝子物質を持つヒト間葉幹細胞は血栓予防を望む個体に配置されるであろう。これは例えば、冠状動脈症、脳血管障害、末梢血管閉塞症、例えば塞栓あるいは深静脈血栓症でみられる静脈（例．表面）血栓症などのような一般の疾患に対する予防薬として有用である。カルシトニンをコード化するＤＮＡを含むヒト間葉幹細胞はカルシトニン皮下で現在投与されているバジェット病、つまり進行性骨代謝慢性疾患の処置に使用できる。
【００６０】
も一つの適用は、同種異系ヒト間葉幹細胞のみ、あるいは間葉幹細胞をその中に留め生体内で分化に向かわせる多孔セラミックキューブ装置に付着させた同種異系ヒト間葉幹細胞の皮下移植である。も一つの例はそれが筋細胞に分化する筋への同種異系間葉幹細胞の注射である。も一つの例はポリペプチドホルモンを連続して分泌し、例えば産児制限に使用される黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を分泌する遺伝子操作ヒト間葉幹細胞を持つ移植片である。
【００６１】
インターロイキン（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３、あるいはＩＬ−４乃至ＩＬ−１１）を産出し分泌するように産生されたヒト間葉幹細胞はいくつかの体系で使用できる。例えばＩＬ―３をコード化する遺伝子物質を含むヒト間葉幹細胞を通じるＩＬ−３の投与は好中球減少症を治療するために好中球数を増加するのに使用できる。同種異系間葉幹細胞はまたトロンボポエチンの遺伝子で形質導入でき、低血小板数で特徴づけられる病気を持つ個体に投与された時にはコード化産物の産生と分泌が血小板産出を刺激するものとなる。
【００６２】
この発明のも一つの用途は酵素欠損症の処置である。この場合ヒト間葉幹細胞に導入された遺伝子でコード化される産物（ポリペプチド）は（ホルモンのように）分泌されない。むしろそれは細胞内に留まる酵素である。個体が特殊な酵素を欠き各種のアミノ酸あるいは他の代謝中間体を代謝できない遺伝病の例が数多くある。これらの酵素に対する正しい遺伝子は同種異系間葉幹細胞に導入され個体に移植することができる。移植片は次いでその代謝機能を実行するであろう。例えば、酵素アデノシンデアミナーゼを欠くことで影響される遺伝病がある。この酵素はプリンの尿酸への分解に係る。この発明を利用して、移植片が適用される域を血液が流れるにつれて血液を解毒し失われた酵素を十分に高い水準にまで産生できる前記の皮下移植片を産生することが可能であると考えられる。
【００６３】
追加の用途は必ずしもそれに限定されないが、骨髄の先天性疾患による骨髄欠損に対する骨髄移植に続き造血再形成を高めるサイトカイン遺伝子、損傷した骨の修復と治癒を改善する骨サイトカイン損傷あるいは変性骨の修復と治癒を改善する骨基質問題、骨形成不全症および筋ジストロフィーなどの間葉遺伝疾患の補正、多くの異なった化合物で細胞療法を提供するタンパク質ホルモン等の局所産生細胞をガンシクロビルに敏感にするチミジンキナーゼなどの細胞毒遺伝子を含む。腫瘍細胞に対するギャップジャンクション癒着は間葉幹細胞が癌療法に役立つことを可能にする。
【００６４】
しかしこの発明の範囲は前記の特異的実施例に限定されないことを理解すべきである。この発明は特に記載されたもの以外にも実施されかつ前記の請求の範囲内にある。
【００６５】
ここに記載された方法は数多くの修飾および変形で従来周知の数多くの方法で実施されることは理解されねばならない。細胞の型の間での行為の態様あるいは相互作用として設定された理論はこの発明を何らかの様式で限定するものと解釈されてはならないし、そのような発明の方法がより完全に理解できるように提示されねばならない。
【００６６】
下記の実施例は更にこの発明の見地を説明する。しかしそれはこの発明の教示あるいは開示を決して限定するものではない。
【００６７】
実施例１
間葉幹細胞に対する同種異系反応性の欠除
移植片拒絶を引き出す原因となる細胞表面抗原はクラスＩおよびクラスII ＭＨＣ抗原である。Ｔ細胞は外部ＭＨＣ抗原に対し同種異系反応性である。クラスＩおよびクラスII ＭＨＣ分子は混合リンパ球反応を刺激する。
【００６８】
個体Ａ（ＴA）からの１×１０5細胞が個体Ｂ（ｍＰＢＭＣB）からの（Ｔ細胞に対するＰＢＭＣSの増殖を予防する）ミトシンＣ処置同種異系ＰＢＭＣSと共に平底マイクロタイタウエルで７日培養された。ｍＰＢＭＣBSは２０Ｋと１００Ｋで播種された。培養物はＴ細胞増殖を測定するため培養期間の最後の１８時間3Ｈチミジンでパルス標識された。図１で示された結果はＴA細胞がＰＢＭＣBを外部のものであると認識したことを示している。（「ＴA＋ｍＰＢＭＣB」の棒グラフを参照されたい）。ＰＢＭＣBSがより多く存在すればＴ細胞はより増殖する。
【００６９】
ＰＢＭＣSと同じ供与者からの２×１０4ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）が個体Ａ（ＴA）からの１×１０5Ｔ細胞と同時保温された。細胞は平底マイクロタイタウエルで全部で７日培養された。培養物はＴ細胞増殖を測定するために培養期間の最後の１８時間3Ｈチミジンでパルス標識された。Ｔ細胞での同時培養の２日前に、ヒト間葉幹細胞は上に与えられた数（密集）でマイクロタイタウエルに播種され、間葉幹細胞に対する表面ＭＨＣ発現を刺激するためにＩＦＮ−γ（５０ユニット／ｍｌ）で処置された。ヒトＢ７−１あるいはヒトＢ７−２副刺激分子で形質導入されたヒト間葉幹細胞あるいはヒト間葉幹細胞［原文通り］（ラファーティ，Ｋ．Ｊ．，プラウズ，Ｓ．Ｊ．，およびＣ．Ｊ．シメオノビッチ，免疫学アニュアルレビュー，１巻：１４３−１７３（１９８３年））がＴ細胞で保温された。
【００７０】
図１で示された結果（図１「ＴA＋形質導入ｈＭＳＣｓ」を参照）はＴリンパ球が形質導入あるいは非形質導入ヒト間葉幹細胞に非応答性であった（増殖しなかった）、すなわちそれらは外部のものであると認識されなかったとことを示している。かくして混合リンパ球反応は存在しなかった。
【００７１】
この結果はまた、間葉幹細胞に対する応答の欠除が個体間の遺伝物適合性に起因するものでなく、何故ならＴ細胞が間葉幹細胞供与者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣB）を外部のものと認識しなかったことを示している。
【００７２】
実施例２
混合リンパ球反応の抑制
間葉幹細胞が同種異系応答を活発に抑制したかどうか決定するために、２個の異なる供与者から得られた癒着性間葉幹細胞ありもしくはなしの条件で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が組織培養平板にセットされた。１個の供与者はＭＬＲ内で標的あるいは刺激細胞に適合し、も１個の供与者は無関係であった。
【００７３】
個体Ａ（ＰＢＭＣA）からの１０5ＰＢＭＣが１０5標的個体（ＰＢＭＣB）と混合された。ＰＢＭＣASの活性化による増殖を予防するために、ＰＢＭＣBSは３０００ラドＸ線で（刺激細胞）照射された。かくしてＰＢＭＣASのみ（応答細胞）が増殖した。ＰＢＭＣASとＰＢＭＣBSが混合された時、ＰＢＭＣA細胞がＰＢＭＣBSの表面抗原により活性化され混合リンパ球反応が起こった。培養物は７日の間隔で保温され最後の１８時間 3Ｈチミジンでパルス標識された。ＰＢＭＣBSの存在下で、ＰＢＭＣASは４０，０００の数まで増殖した。図２，１番目の棒グラフ参照（「無し」は間葉幹細胞が存在しないことを引用する）。
【００７４】
しかしＰＢＭＣASとＰＢＭＣBSが間葉幹細胞の存在下で混合されると、混合リンパ球反応は抑制された。１０5ＰＢＭＣASがヒト間葉幹細胞の単層で被覆されたマイクロタイタ平板ウエルで１０5ＰＢＭＣBS と混合された。間葉幹細胞はウエル当り７，５００乃至２２，５００間葉幹細胞の範囲の量でウエルで平板培養された。２個の間葉幹細胞集団がテストされた。ヒト間葉幹細胞は個体ＢのＭＨＣ型に適合した個体から得られた。またヒト間葉幹細胞は個体ＡあるいはＢのＭＨＣ型のいずれにも適合しない個体から得られた。培養物は７日の間隔にわたり保温され、最後に１８時間3Ｈチミジンでパルス標識された。ヒト間葉幹細胞の存在下で、ＭＬＲは抑制された（図２参照）。かくして間葉幹細胞のＭＨＣ起原のものであるにも拘らず、間葉幹細胞は混合リンパ球反応を抑制した。
【００７５】
図２で示される結果も、ヒト間葉幹細胞が用量依存様式で混合リンパ球反応を減少させたことを示している。いずれの供与者からの間葉幹細胞も同じように増殖を抑制し、これはＭＨＣ型に関連する抑制の特異性は存在しないことを示していた。これらの結果は間葉幹細胞が一緒に培養された時に活発に混合リンパ球反応を抑制することを示している。
【００７６】
実施例３
同種異系イヌ皮下研究
この研究目的は同種異系ＭＳＣ負荷ＨＡ／ＴＣＰ標本が皮下でイヌに免疫応答を起こすかどうかおよびこの応答がＭＳＣ媒介骨形成に影響を与えたかどうかを決定することであった。
【００７７】
２匹のイヌがこの同種異系皮下移植に使用された。それぞれのイヌは６個の自己由来ＭＳＣ移植片を１個の大腿に、また２個の同種異系供与者それぞれから３個の同種異系ＭＳＣ移植片を対側性大腿に受けた。３個の自己由来移植片とすべての同種異系標本は無血清無フェノールＤＭＥＭ低グルコースに負荷された。他の３個の自己由来標本は無血清ＤＭＥＭ高グルコースに負荷された。冷凍保存ＭＳＣｓのみがこの研究に使用され、標本は移植２４時間前に負荷された。
【００７８】
それぞれのタイプの２個の標本は組織処理と一つはＲＮＡ抽出を割当てられた。加えて限定された量の血液とリンパ節が免疫応答の決定のために採取された。終点は２週と６週であった。２週のイヌは双方の腱手術を受け、一方６週のイヌは自己由来皮下移植片を受けた肢の片方だけの腱手術を受けた。イヌは一腹子ではなかった。
【００７９】
結果
犠牲にされた移植床の概略的な観察結果およびまた一般的な健康状態の観察結果は２週および６週終点の何れにおいても同種異系移植片に対するなんらの大きな免疫反応を示さなかった。膝窩リンパ節は両方の時間点で両肢で拡大された。鼠蹊リンパ節は同定できなかった。供与者−宿主対の一つの組合せからのＰＢＭＣSを用いる予備ＭＬＲデータは増殖検定で１５Ｋの数で正の反応を示し、この対が不適合であることを示した。
【００８０】
自己由来および同種異系標本からの２週組織切片はお互いに区別ができなかった。すべての標本に存在する目の粗い縦連合がありいずれの標本でも（２週で予期されたように）骨形成は見られなかった。６週時間点で各グループの２個からの１個の標本から組織データが得られた。ＤＭＥＭ−ＬＧで処理された６週自己由来標本は標本内にかなりの骨の量を有していた（図３）。２個の同種異系供与者のそれぞれからの同種異系標本もまた骨に対して正であり（図４と５）、組織形成のパターンは自己由来標本のものと類似していた。同種異系標本での骨形成量は自己由来標本のものよりも低かった。しかしこの検定に関連する骨形成量に変異性が与えられて限定された標本の大きさに基づいて結論を引き出すことはできなかった。Ｈ＆Ｅ染色の下では同種異系標本のいずれかにも免疫応答は観察できなかった。
【００８１】
これら予備研究での骨形成データは明らかにイヌＭＳＣｓが同種異系セッティングの下でその骨形成潜在能を保持し主な免疫応答を引き出さないことを示している。
【００８２】
実施例４
この研究の目的は、適度に高用量の供与体イヌ白血球抗原（ＤＬＡ）同一一腹子イヌ間葉幹細胞（ｃＭＳＣ）を１０×１０6細胞／ｋｇで同種異系骨髄移植セッティングで注入することのイヌでの実現可能性と安全性を示すためのものである。二次目標は供与者ｎｅｏ−とＧＦＰ標識ｃＭＳＣの分布と機能を移植後５０日と１００日で試験することであった。
【００８３】
材料と方法
実験動物
ビーグル犬がこの研究に使用された。２匹の雄と２匹の雌ＤＬＡ同一一腹子が研究に使用され０日の時に７歳と９歳であった。使用された類別方法は、主な組織適合性複合体のイヌ等価物であるイヌ白血球抗原（ＤＬＡ）でのクラスII ＤＲＢ区域の遺伝体質を追う高度に多形性のマイクロサテライトマーカーの使用を含む。マイクロサテライトは小さなジ−，トリ−あるいはテトラヌクレオチド反復であり、これはそれから多世代交雑を通じて染色体部分の遺伝体質を追うように使用される対立遺伝子で十分な長さの変化を示している。対立遺伝子の分離は各反復を囲むＤＮＡのユニーク配列から誘導されるプライマーで単一段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いて典型的にモニターされる。加えて混合白血球反応はＰＣＲマイクロサテライトマーカー検定結果を確認するための研究用に選択されたＤＬＡ同一一腹子対で実行される。
【００８４】
研究設計
同じＤＬＡ同一一腹子供与者からｃＭＳＣｓと骨髄を使用して移植を受けた。骨髄移植片は全身照射（ＴＢＩ）に先立ち０日に２個のＤＬＡ同一一腹子のそれぞれから収穫され、交換された。骨髄切除は０日に単一ＴＢＩ用量９２０センチグレイ（ｃＧｙ）に露出されることで誘導された（７ｃＧｙ（９．３Ｒ）／分の速度で送られた２個の対向する60Ｃｏ源からの正中線空気露出）。移植に先立つ４週あるいはそれ以上の週に供与者骨髄吸引液から分離された培養拡張ｃＭＳＣはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）の遺伝子を含むＰａｐｐ＠ＯＴ−２４で形質導入された。ｃＭＳＣは継代１（Ｐ１）あるいは継代２（Ｐ２）の後冷凍保存された。ＴＢＩに続きｃＭＳＣは解凍されたポータブル注入ポンプで１５分以上にわたり静脈内に送達された。ｃＭＳＣ注入１乃至２時間後に骨髄移植片が１×１０8全有核細胞（ＴＮＣ）／ｋｇと同じかそれ以上の用量で静脈内注入された。
【００８５】
シクロスポリンが４匹すべてのイヌに対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）予防のために０日乃至５日に１０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）の用量で静脈内に投与された。（サンディミューン注射液，ノバルティス・ファーマシュ−ティカルス・コーポレイション）。グループＩ．１．ａには６乃至５０日（研究終了日）、グループＩ．１．ｂには６日乃至１００日に、シクロスポリンが１０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ  ＰＯ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）で投与された（ネオラール・ソフトゼラチンカプセル，ノバルティス・ファーマシューティカルス・コーポレイション）。受容者への経口抗生物質での通常の支持ケアは５日までに開始し、全身への抗生物質は０日に始まり移植が完了するまで続けられた。体液支持は必要な場合に与えられた。回復の過程で４匹のイヌはいずれも血小板移入を必要としなかった。もし血小板数が１０，０００／ｍｍ3以下にたえず低下するなら、あるいはもし処置スタッフが出血の微候を観察する場合には、全血移入は任意の供与者からの全照射（２０００ｃＧｙ）血液５０ｍｌで投与されるべきであった。移植は連続３回の最初の日、５００以上の絶対好中球細胞ｍｍ3，１０００／ｍｍ3以上［原文通り］、および血小板１０，０００／ｍｍ3以上、５０，０００／ｍｍ3以上、および１００，０００／ｍｍ3以上で確定される。
【００８６】
造血回復を調べるために完全血球算定（ＣＢＣS）が０日乃至５０日で得られ、その後２週毎に１００日の研究グループで得られた。血清化学分析は０日、２日、その後は毎週行われた。末梢血標本は０日ＭＳＣ注入前、５分および１５分、１時間および２時間、または１，２，３，４日の時点でＤＮＡ分離のために採取された。ＤＮＡは抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザにより産物にとり込まれたジゴキシゲニンで、また第２段階抗ジゴキシゲニン比色分析でＧＦＰ標識細胞の存在を評価された。骨髄吸引液は血小板数がたえず５０，０００／ｍｍ3に達し、同じＰＣＲを用いてＧＦＰ標識細胞の存在を試験した時に得られた。ｃＭＳＣ培養物はコロニー形成単位（ＣＦＵ）を試験し、更なる抗ＥＧＦＰ  ＰＣＲ分析のためにｃＭＳＣを拡張することが確定された。剖検に際し、末梢血、骨髄吸引液および骨髄生検が抗ＥＧＦＰ  ＰＣＲ分析のために得られた。ＣＦＵ検定は骨髄吸引液で実行され、抗ＥＧＦＰ  ＰＣＲ分析が培養拡張ｃＭＳＣで行われた。組織分析は各種の組織でＧＦＰの存在のために行われた。
【００８７】
ｃＭＳＣ分離、培養拡張、形質導入と冷凍保存
両側骨髄吸引液がイヌＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２では４週までの週、およびイヌＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４では９週までの週にｃＭＳＣ分離と培養確定のために得られた。骨髄の１５ｍｌ（各上腕骨から７ｍｌ）が各イヌから得られた。イヌはブトルファノールの注射で、次いでジアゼパムと塩酸ケタミンの混合物の注射で麻酔された（アベコ・カンパニー，インコーポレイテッド，フォートダッジ，アイオワ）。針挿入部位はポビドンヨードでガス浄化され次いでアルコールで洗浄された。吸引液は１６ゲージ、２インチ骨髄針を用いて各イヌの各上腕骨顆から得れた。注射器は針に付着され、吸引が各上腕骨から８ｍｌの骨髄を除くために適用された。骨髄吸引液は無菌技術を使用して１５ｍｌポリプロピレン円錐チューブに移された。この処理に続きイヌは次いで回復のために暖かいパッドに置かれた。
【００８８】
骨髄の５乃至１０ｍｌアリコートがダルベッコ食塩加リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）でポリプロピレン培養チューブで５０ｍｌに希釈された。細胞懸濁液は２２００ＲＰＭで１０分室温（ＲＴ）で遠心分離を受けた。全有核細胞数は４％酢酸で計数された。細胞は次いでＤＰＢＳで最終濃度２０×１０6細胞／ｍｌに希釈された。１０ｍｌすなわち２００×１０6細胞が５０ｍｌ円錐チューブで２０ｍｌのパーコル（比重１．０７３ｇｍ／ｍｌ）に負荷され、１３００ＲＰＭで２０分遠心分離を受けた。単核細胞を含む細胞界面はＤＰＢＳで洗浄され、完全培地に再懸濁され、回収割合を得るために計数された。細胞は次いで完全培地で希釈され、培養物は下記の通りに確定され、３７℃恒温器に５％炭酸ガスに置かれた。
【００８９】
二重シストロンＭｕＬＶレトロウイルスベタクーの構築
グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レトロウイルスが刺胞動物Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ（クロテック，カリフォルニア）からＥＧＦＰ−１遺伝子を分離することで構築された。ＥＧＦＰ遺伝子はレトロウイルスベクターｐＪＭ５７３−ｎｅｏにクローンされた（生成プラスミドはｐＯＴ−２４と名付けられた）。プラスミドｐＪＭ５７３−ｎｅｏは下記の修飾でｐＮ２から誘導された（ケラー他、１９８５年，ネイチャー３１８：１４９）。マウスレトロウイルスｇａｇ開始部位はインフレーム終止コドンで置換された。５′ＬＴＲと３′ＬＴＲは同一カセットに構築された。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）と内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）はｐＮ２に挿入された。ＥＧＦＰ  ｐＯＴ−２４プラスミドの図解地図は図６で示される。
【００９０】
組換えレトロウイルスの調製
ｐＯＴ−２４は製造業者が示唆するようにＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム）を用いてＧＰ＆Ｅ８６エコトロピック生産者細胞に形質移入された。形質移入細胞は１０％熱不活性化ＦＢＳ，ペニシリン・ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ）および選択マーカーとしての硫酸プロタミン０．５ｍｇ／ｍｌで補充されたＤＭＥＭ高グルコース（ＨＧ）培地で成長した。培養物は７０％密集まで維持され、この点で培地は新鮮レトロウイルス培地（Ｇ４１８無し）で置換され、細胞は３２℃で２日維持された。レトロウイルスを含む培養接地が集められ、０．４５μフィルターで濾過され、−７０℃で貯蔵された。両種性ウイルスが遠心分離形質導入手順、続いてＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）の選択を用いてエコトロピックウイルスで２度ＰＡ３１７細胞を形質導入することで調製された。レトロウイルス上澄みが集められた。３Ｔ３細胞にプールされたＥＧＦＰレトロウイルスの力価は１．２×１０6ＣＦＵ／ｍｌであった。ＧＦＰ−レトロウイルス上澄みは−７０℃で冷凍保存された。
【００９１】
ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２
パーコル界面で得られた洗浄単核細胞は、３０ｍｌの完全培地と１０×１０6細胞／フラスコを含む１０個のＴ−１８５フラスコに固定された。
【００９２】
培養の２日、６日、９日に、フラスコの培地は新鮮完全培地で置換された。一次培養の１２日に、写真が撮られ、細胞は継代０（Ｐ０）から継代１（Ｐ１）に移った。培地は吸引されフラスコは２回８ｍｌＤＰＢＳで洗浄された。８ｍｌのトリプシンが加えられ、フラスコは３７℃恒温器に３分置かれた。細胞が持ち上がると、反応は完全培地８ｍｌの追加で停止された。細胞は５０ｍｌ円錐チューブに移されプールされた。フラスコはＤＰＢＳで洗浄されプールされた細胞はＲＴ（室温）で２０００ＲＰＭ、５分遠心分離された。上澄みは除かれ細胞ペレットは完全培地に再懸濁された。細胞はプールされ、計数され生存能力を試験された。細胞は１８ｍｌの完全培地と０．４×１０6細胞／フラスコを含む１５個のフラスコに平板培養された。
【００９３】
培養１５日に、１８個のフラスコの内１５個で最初の形質導入が行われた。培地は除去された。レトロウイルス上澄みのアリコートが解凍され、形質導入カクテル（反応混合液）を作るために８μｇ／ｍｌの最終濃度にポリブレンが加えられた。細胞培地は１０ｍｌの形質導入カクテルで置換され、フラスコは３０００ＲＰＭで１時間３２℃で遠心分離された。遠心分離の後、熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を用いて調製された１０ｍｌの完全培地が（形質導入カクテルと共に）各フラスコに加えられ、フラスコは恒温器に戻された。３個のフラスコは形質導入されず、完全培地は置換された。培養の１６日に、培地は新鮮完全培地で置換された。培養の１７日に形質導入は反復された。
【００９４】
培養の１８日に、細胞は前記の通り収穫されＰ１からＰ２に移った。３×１０6細胞が１００ｍｌの完全培地に加えられた三つ組みフラスコ（５００ｃｍ2）に注がれた。１５個の三つ組みフラスコが形質導入細胞で準備され、３個は未形質導入細胞で準備された。残存細胞はいずれも冷凍保存された。凍結液は１０％ＤＭＳＯと９０％ＦＢＳを含んで準備された。１０×１０6細胞が１ｍｌの凍結液に再懸濁された。小びんは標識されナルジェンクリオコンテナーで最低４時間−７０℃で冷凍保存され−７０℃で貯蔵された。
【００９５】
Ｐ２培養の２２日細胞分布と形態を記録するために写真が撮られ、Ｐ２細胞は収穫され下記の通り冷凍保存された。
【００９６】
ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４
パーコル界面で得られた洗浄単核細胞が２０ｍｌ完全培地と１２×１０6細胞／フラスコを含む１５個のＴ−７５フラスコに固定された。
【００９７】
培養の２日に、フラスコ内および皿の培地は新鮮完全培地で置換された。ｃＭＳＣの一次培養の６日に、第１形質導入が前記の通り実施された。３個のフラスコは形質導入されず、新鮮培地は６日に置換された。培養の７日に、培地は新鮮培地で置換された。
【００９８】
培養の８日に形質導入手順が反復された。培養９日に、写真が撮られ、細胞は前記の通りＰ０からＰ１に継代した。３×１０6細胞が１００ｍｌの完全培地に加えられ、三つ組みフラスコに注がれた。１５個の三つ組みフラスコが形質導入細胞と共に準備され、３個は未形質導入細胞で準備された。
【００９９】
１５ｍｌ骨髄吸引液は供与者ＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４それぞれに対し９１０×１０6，１２１２×１０6，８５６×１０6および１９４８×１０6有核細胞を産出した。パーコル界面から得られた単核細胞数は６１２×１０6，６６６×１０6，５８８×１０6および４６２×１０6となり６７．２％，５５％，６８．７％および２３．７％の回収を示した。Ｐ１に際して、細胞生存能力は９７．１％（９３．３乃至１００％の範囲）の平均値であった。供与者ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２のＰ２、および供与者ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４に対するＰ１細胞に際して、形質導入の細胞生存能力は９６．７％（９６．３％乃至９７．９％の範囲）の平均値であった。未形質導入細胞は９５．４％（９３．３％乃至９６．９％の範囲）で生存可能であった。未形質導入細胞は９５．４％（９６．３％乃至９６．９％の範囲）で生存可能であった。未形質導入細胞は９５．４％（９３．３乃至９６．９の範囲）で生存か可能であった。ｃＭＳＣの冷凍保存の収穫に際し、形質形質導入細胞の生存能力は９９．４％（９７．４％乃至１００％の範囲）の平均値であり、未形質導入細胞は９９．４％（９７．６％乃至１００％の範囲）で生存可能であった（表４）［原文通り］。
【０１００】
継代２の４日後に収穫されフラスコ当り３×１０6に平板培養された供与者ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２のフラスコ当り形質導入ｃＭＳＣ産出量は５．９×１０6と６．７×１０6であり、またフラスコ当り未形質導入ｃＭＳＣ産出量は８．４×１０6と７．５×１０6であった。継代１（異なった形質導入と継代設計）の４日後に収穫されたフラスコ当り３×１０6で平板培養された供与者ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４のフラスコ当り形質導入ｃＭＳＣ産出量は２０×１０6と１４．０×１０6であり、またフラスコ当り未形質導入ｃＭＳＣ産出は２５．３×１０6と１８．０×１０6であった。
【０１０１】
Ｐ０培養からのｃＭＳＣに関するＣＦＵ検定
１０ｍｌ完全培地を含む１００ｍｌ皿三つ組みに０．５×１０６細胞を平板培養してＣＦＵコロニー検定が次培養固定の時点で準備された。皿は３７℃で５％炭酸ガスで保温された。培地は２日乃至４日毎に置換された。培養の１０日に、ＣＦＵ検定皿はＨＢＳＳで２度洗浄され、１％グルタルアルデヒドデ１５分固定され、ＨＢＳＳで更に２度洗浄され、空気乾燥された。皿のｃＭＳＣは次いで０．１％クリスタルバイオレットで染色され、脱イオン水で３回洗浄され、空気乾燥された。
【０１０２】
単核細胞分離と培養確定の日に平板培養され１０日に収穫されたＣＦＵ検定は、ＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４それぞれに対し５６，４６．７，１１４、および７２の各コロニーを産出した。
【０１０３】
Ｐ１培養の１３日に、写真が細胞分布と形態を記録するために撮られ、Ｐ１細胞はトリプシン消化により収穫され、下記の通り冷凍保存された。
【０１０４】
三つ組みフラスコの培地は傾瀉され、フラスコは５０ｍｌＤＰＢＳで洗浄された。ＤＰＢＳの傾瀉の後、０．２５％トリプシン２３ｍｌが各三つ組みフラスコに加えられた。フラスコは３７℃恒温器に３分置かれた。細胞剥離後、２３ｍｌの完全培地が各フラスコに加えられた。細胞懸濁液は５０ｍｌ円錐チューブに移され、フラスコは３０ｍｌＨＢＳＳで洗浄された。チューブは２２００ＲＰＭで５分室温で遠心分離された。形質導入あるいは未形質導入細胞それぞれを含むペレットはプールされ計数された。１×１０7細胞の１個のアリコートが抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲ検定により形質導入パーセンテージを決定するためにとっておかれた。
【０１０５】
収穫の後、回収Ｐ１あるいはＰ２形質導入培養拡張ｃＭＳＣｓは１３００ＲＰＭで５分遠心分離され、８５％プラズマライトＡ（バクスターIVセラピー）、１０％ＤＭＳＯ、および５％自己由来イヌ血清を含む冷却冷凍保護液での１×１０7ｃＭＳＣ／ｍｌで１ｍｌアリコートに再懸濁された。細胞アリコートはそれぞれ１ｍｌを含む別の冷凍小びんに分配された。チューブはイヌ供与者番号と全生存可能細胞数で標識された。ｃＭＳＣｓは細胞小びんをナルジーン凍結コンテナーに配置し、−７０℃フリーザーで４時間置き、−７０℃で貯蔵するため移動された。
【０１０６】
産物の冷凍保存のための細胞収穫に際して、１×１０7細胞アリコートが形質導入効率を測定するために得られた。形質導入効率は産物へのジオキシゲニンとり込みで抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザにより分析され、第２段階では抗ジオキシゲニン比色分析で分析された。
【０１０７】
ｃＭＳＣ注入産物
注入の１〜２時間前に、ｃＭＳＣの小びんは３７℃ウォーターバスの回転運動で解凍され、７０％エタノールでスプレーされ、バイオセーフティキャビネットで開かれた。ｃＭＳＣ産物はＤＭＥＭ−ＬＧプラス細胞供与者自己由来３０％血清を含む５０ｍｌ注入培地に懸濁された。ｃＭＳＣ産物の生存能力は実際の生存可能用量を決定するためにトリパンブルー排除で測定された。各ｃＭＳＣ産物のアリコートは酵母分離、好気性成長および非好気性成長に付託された。ｃＭＳＣは組織培養プラスチックに付着し、Ｐ２（ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２に対してはＰ３）で増殖する能力を評価された。１×１０6と０．１６×１０6ｃＭＳＣのアリコートがＴ−２５プラスチック培養フラスコで三つ組みの完全イヌ培養培地に平板培養された。２４時間後、フラスコは１×１０6ｃＭＳＣで平板培養され、３日には０．１６×１０6ｃＭＳＣで平板培養されたフラスコはトリプシン消化で収穫され計数された。
【０１０８】
ＴＢＩの後、ｃＭＳＣ懸濁液は５０ｍｌを１５−２０分にわたり送達するために手操作（ハンドヘルド）ハーバード・バード・ミニ・インヒューザーを用いて橈側皮静脈に挿入されたカテーテルを経由して注入された。
【０１０９】
適度に高用量の７．４９×１０6，７．３５×１０6，１０．０×１０6，１０．０×１０6（平均値８．７×１０6）の生存可能ｃＭＳＣ／ｋｇがイヌＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３，ＣＡＮ−０７−０４それぞれに０日に注入された。これらの用量は患者が受けるであろう典型的な用量の４乃至１０倍の量を表わす。注入された全生存可能ｃＭＳＣは６７．７×１０6乃至１２９×１０6（平均値９３．９×１０6）のｃＭＳＣにわたった。細胞の生存可能性はトリパンブルー排除で測定されたように９２．１乃至９７．６（平均値９４．９）にわたった。ｃＭＳＣ注入はＴＢＩ後７１から１４６（平均値１１０）で与えられた。
【０１１０】
注入後血液標本
血液標本（２ｍｌ）がｃＭＳＣ注入前（ｐｒｅ）および注入開始５分と１５分、１時間と２時間後のｃＭＳＣ注入期間、更に１日、２日、３日、４日の時点で得られた。細胞溶菌液（ライゼート）は産物にとり込まれたジゴキシゲニンでの抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザでの、また血流内のＧＦＰ標識ｃＭＳＣの水準を検知する第２段階抗ジゴギシゲニン比色分析での使用のためにピュアジーン（ジェントラ・システムズ，インコーポレイテッド）ＤＮＡ分離キットを用いて準備された。
【０１１１】
骨髄収穫と移植片注入
移植用移植片に使用される骨髄はＴＢＩに先立ちＤＬＡ同一一腹子から収穫された。吸引駅は１００ｍｌ組織培養培地１９９と４ｍｌ（４０００単位）ヘパリンを含む真空フラスコから出たポリビニルチュービングに付着された１１ゲージ、４−６インチ、ボールトップステンレススチール骨髄採取針を用いて各上腕骨から得られた。骨髄は３００および２００μｍ孔サイズを通過され、トランスファーパックコンテナーで４℃で貯蔵され、その日の日後での注入まで供与者と受容者の標識をされた。骨髄の全骨髄有核細胞（ＢＭ−ＴＮＣ）は骨髄採取の間に得られた末梢血量に存在するいずれの有核細胞数も排除するように補正される。
【０１１２】
骨髄の全有核細胞数（ＴＮＣ）は骨髄採取の間に得られた末梢血量に存在するいずれの有核細胞も排除するように修正された。骨髄の修正された用量はイヌＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４それぞれに対して４．３×１０8，３．５×１０8，３．１×１０8，２．０×１０8（平均値３．２×１０8）ＴＮＣ／ｋｇであった。
【０１１３】
注入の２０分前に骨髄は室温に置かれた。ｃＭＳＣ注入の１時間後、骨髄は１乃至２分バッグに圧を加え撓側皮静脈に挿入されたバタフライ針を通じて静脈内に注入された。
【０１１４】
支持ケア
５日に、経口抗生物質（硫酸ネオマイシンと硫酸ポリミキシン）が１日３回与えられた。これらの経口抗生物質は絶対好中球数が５００／ｍｍ3に達するまで投与された。０日に、全身抗生物質ベイトリルが１日２回静脈内で投与され、絶対好中球数が安定して１，０００／ｍｍ3に達するまで続けられた。一過性照射毒性の結果として失われた体液と電解質とはリンゲル液５００ｍｌの皮下投与により置換され、食料と水とが受け入れられるまで１日２回続けられた。
【０１１５】
示差血球数
血球標本（２ｍｌ）が、０日乃至５０日、および研究の終了までその後２週毎にｃＭＳＣの分離のために骨髄吸引の朝毎に頸静脈あるいは橈側皮静脈のいずれかから採取された。血液はＥＤＴＡを含む真空コンテナーに移された。ｍｍ3当り全白血球数（ＷＢＣ）および血小板数がシスメックスＥ２５００を用いて側テされ、示差血球数はライト染料での固定と染色後、手動で決定された。
【０１１６】
剖検
血液標本はＣＢＣ，ケミストリー２３分析、およびＰＣＲ評価で得られた。イヌはブルトルファノールで次いでジアゼパムと塩酸ケタミンの混合物で鎮静状態の後、生検と両側性骨髄吸引液が上腕骨、大腿骨および腸骨稜から得られた。次いで安楽死が鎮静薬ペントバルビタールナトリウムの過剰用量で行われた。５０日グループのイヌ（ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２）は研究の４３日に安楽死された。１００日グループのイヌ（ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４）は研究の１００日に安楽死された。完全なセットの組織が動物の剖検で採取された。
【０１１７】
組織試験のための組織の採取が直ちに行われた。組織のサブセットが抗ＥＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザ分析に使用された。骨髄吸引液と生検は、抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲより分析に、更なるＰＣＲ分析に、またＣＦ４の検定に使用された。
【０１１８】
組織は約１インチ平方部分に切り取られ、１０％中性緩衝ホルマリン液（Ｐｈ６．８−７．２）で満たされた別標識５０ｍｌ円錐チューブに置かれた。組織はパラフィンに包埋され、切断され、ヘマトキシリンとエオシンで染色された。骨髄標本は過ヨウ素酸シッフ染色で染色された。
【０１１９】
剖検に先立って得られた骨髄吸引液は各イヌの左側および右側の上腕骨、大腿骨および腸骨稜から１５ｍｌ標本チューブに採取された。組織標本のサブセットは剖検の間に得られ、約１／４インチ平方片に切断され、ＰＢＳ浸漬ガーゼに包まれ、標識されたジップロックバック内に個別に置かれた。骨髄吸引液は氷上に保持された。
【０１２０】
ＣＦＵ検定のための骨髄吸引液の調製
ＰＣＲ分析に得られた各イヌからの左側と右側上腕骨、大腿骨および腸骨稜からの骨髄吸引液のアリコートが個別の１５ｍｌ標識チューブにアリコートされた。骨髄標本は氷上で保持された。
【０１２１】
剖検で得られた骨髄からのｃＭＳＣについてのＣＦＵ検定
剖検で得られた骨髄からのｃＭＳＣについて行われたＣＦＵコロニー検定は１０ｍｌ完全培地を含む１００ｍｍ皿三つ組みに０．５×１０6細胞を平板培養して調製された。皿は３７℃で５％炭酸ガスで保温された。培地は新鮮完全培地で２−４日毎に置換された。培養の１０日に、ＣＦＵ検定皿はＨＢＳＳで２回洗浄され、１％グルタルアルデヒドで１５分固定され、ＨＢＳＳで２回洗浄され、そして空気乾燥された。皿のｃＭＳＣは次いで０．１％クリスタルバイオレットで染色され、脱イオン水で３回洗浄され、そして空気乾燥された。コロニーは平板培養１０6細胞当りのコロニー数を計算するため計数された。
【０１２２】
ＤＮＡの分離と精製
ＤＮＡは各組織の部分から分離された。標本の残りの部分は冷凍保存され−７０℃フリーザーで貯蔵された。ＤＮＡは標本を食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置き、プロティナーゼＫ溶液を加え、５５℃で３時間あるいは組織が溶解するまで保温することで分離された。標本は次いでＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）で３７℃、６０分処理された。標本は室温で冷却されタンパク質は沈殿した。標本は遠心分離され水相はゆっくりと１００％イソプロパノールで採取された。標本は混合され遠心分離され、ペレットは７０％エタノールで洗浄された。チューブは遠心分離され、上澄みは汲み出されペレットは約１乃至６時間乾燥された。ＤＮＡは一晩室温で水和され次いで４℃で貯蔵された。
【０１２３】
末梢血と骨髄の標本はまずＲＢＣ溶解液（塩化アンモニウム緩衝液）で溶解された。ＤＮＡは次いで前記の通りライゼートから分離された。ＤＮＡは９９８μｌの脱イオン水と標本からの２μｌＤＮＡをキュベットに追加して分離され回転運動された。分光測光器が不透明度（ＯＤ）を決定するために使用された。ＯＤは２６０と２８０で読み取られＤＮＡ濃度はμｇ／ｍｌで計算された。ＤＮＡ濃度は脱イオン水を使って１μｇ／ｍｌまで調節された。
【０１２４】
抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザ
これらの研究で用いられた抗ＥＧＦＰ  ＤＮＡ  ＰＣＲエリザ検定は、ＧＦＰに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用する注入ｃＭＳＣｓを検出する。遺伝子発現の分析に対し、我々はＰＣＲ−エリザ（ＤＩＧ標識／検出）キット（ベーリンガー・マンハイム）を利用した。要約すると、ＰＣＲはジゴキシゲニン標識ヌクレオチドの存在下で増幅産物を標識するために行われた。次いで２５μｌのＰＣＲ産物が変性され、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタ平板で溶液で５′ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブに３７℃で雑種形成することを可能にした。結合プローブＰＣＲ産物は抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲートで、また比色基質２，２′アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の使用により検出された。滴定標準曲線は検定で使用されたＤＮＡの量当りＤＮＡ濃度を概算するために形質移入対照ｃＭＳＣを用いて創り出された。ＤＬＡクラスIIゲノムＤＮＡのＰＣＲの内部標準で最初の相関を行い、次いでＤＮＡ濃度を細胞等価物と相関させ、また形質導入細胞当りの１個のレトロウイルス組み込み事象を想定することにより、細胞数の推定値を得ることができる。
【０１２５】
ＧＦＰのためのＤＮＡの量測定はすべての骨髄へら／生検で認められた。
【０１２６】
移植後の血球回復
１０，０００／ｍｍ3までの血小板の閾値（３連続値まで）の平均日は１２．８（１１−１７の範囲）、５０，０００／ｍｍ3までは１９．８（１６−２５の範囲）、１００，０００／ｍｍ3までは２３．０（２０−２７の範囲）であった。絶対好中球細胞の５００／ｍｍ3までの閾値（３連続日）までの平均日は９．３（８−１１の範囲）、１，０００／ｍｍ3までは１０．５（９−１３の範囲）であった。
【０１２７】
暫定骨髄吸引液
血小板が５０，０００／ｍｍ3以上の値に安定して回復した時、暫定骨髄吸引液が腸骨稜から採取された。この手順はＣＡＮ０７−０１とＣＡＮ０７−０２の研究では２７日に、またＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４には２９日に行われた。
【０１２８】
結果
４３日に安楽死されたＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２からのすべての組織の組織病理学評価に際して、転位結合組織と亜急性ＧＶＨＤに関する発見は負であった。
【０１２９】
検出可能ＤＮＡシグナルは注入１時間以内に、また２日に再び発見できた。１個の標本はＧＦＰ  ＤＮＡに関し注入３日後に量的に測定できた。これはシグナルが２日と３日で発見された自己由来イヌ移植研究での過去の観察と一致する。
【０１３０】
ＧＦＰ＋細胞に対するＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４での１００日の剖検データは、ＣＡＮ−０７−０３の大腿骨と上腕骨に、またＣＡＮ−０７−０４の上腕骨にＧＦＰシグナル（１０マイクログラムＰＣＲインプットＤＮＡ当り１ＧＦＰ＋細胞等価物）を示した。
【０１３１】
これらの結果は同種異系ＭＳＣｓが骨髄造血細胞の急速移植を支持できることを示している。輸血支援は必要ではなかった。ＧｖＨＤの臨床的徴候もなかった。血小板回復は組織対照よりも速かった。同種異系移植後に支質細胞にキメラ現象の徴候が存在した。同種異系ＭＳＣｓを使用することによる同種異系組織を移植する選択肢は臨床移植シナリオに使用できる移植物質の範囲を拡大する。
【０１３２】
かくして、ヒト非自己間葉幹細胞はヒト骨髄から回収され、結合組織の骨欠損を処置するために、また造血幹細胞あるいは前駆細胞の移植を高めるために細胞薬剤として単独であるいは担体と併用して使用することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  間葉幹細胞に対する同種異系反応の欠如。ＡからのＴ細胞はＢからのＰＢＭＣｓと異なった量で混合された時には用量依存様式で増殖した。ＡからのＴ細胞は間葉幹細胞が全Ｔ細胞活性化を提供するために操作された時でさえＢからの間葉幹細胞に応答して増殖しなかった（間葉幹細胞は同時刺激分子Ｂ７−１あるいはＢ７−２で形質導入された）。
【図２】  間葉幹細胞は異なった２個の個体からのリンパ球間の混合リンパ球反応を活発に抑制した。ｈＭＳＣ−１は混合リンパ球反応の刺激細胞と応答細胞の両者に対し第三者であった。ｈＭＳＣ−２は混合リンパ球反応では刺激細胞に対して自己由来のものであった。かくして間葉幹細胞はＭＨＣ型としての特異性無しで混合リンパ球反応を抑制した。間葉幹細胞は用量依存様式で混合リンパ球反応を抑制した。
【図３】  同種異系イヌの研究。ＤＭＥＭ−ＬＧで処理された６週自己由来標本の組織分析はかなりの量の骨を示した。
【図４】  同種異系イヌの研究。６週同種異系標本の組織分析は骨形成を示した。
【図５】  同種異系イヌの研究。図４で示されたもの以外の異なった供与者からの６週同種異系標本の組織分析は同じように骨形成を示した。
【図６】  実施例４で使用されたＥＧＦＰ  ｐＯＴ２４プラスミドの概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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