(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のいずれかである、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤：
（ａ）配列番号７で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するペプチド、
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において１のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つインフルエンザウイルス・ヘマグルチニンに結合性を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の（ａ）または（ｂ）のいずれかのペプチドをアルキル化又は脂質化してなる、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤。
【請求項３】
請求項２に記載のアルキル化又は脂質化してなるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを含有するリポソームを、有効成分として含有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤。
【請求項４】
請求項１に記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを有効成分として、薬学的に許容される担体とともに含有するインフルエンザウイルスの感染予防薬。
【請求項５】
請求項２に記載のアルキル化又は脂質化してなるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを有効成分として、薬学的に許容される担体とともに含有するインフルエンザウイルスの感染予防薬。
【請求項６】
請求項３に記載のリポソームを有効成分として、薬学的に許容される担体とともに含有するインフルエンザウイルスの感染予防薬。
【請求項７】
対象とするインフルエンザウイルスがＡ型ウイルスである請求項４〜６のいずれかに記載のインフルエンザウイルスの感染予防薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、インフルエンザウイルスに特異的結合性を有するペプチドに関する。より詳細には、本発明はインフルエンザウイルス膜に存在するヘマグルチニンに特異的に結合するペプチドに関する。
インフルエンザウイルスの宿主への感染は、ウイルスがその表面膜に埋め込まれたヘマグルチニンを介して宿主受容体に結合することによって成立する。本発明のペプチドは、ヘマグルチニンと結合することにより、インフルエンザウイルスの宿主受容体への結合を妨げることによって、インフルエンザウイルス感染の防止に有意に寄与するものである。
ゆえに、本発明は、上記ペプチドについて、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを介した宿主受容体への結合の阻害剤としての用途、並びに抗インフルエンザ剤としての用途に関するものでもある。
背景技術
インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそれに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽または遊離する際に、自らのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。
インフルエンザウイルスは、ウイルス核蛋白質やウイルス膜の内側に存在するマトリックス蛋白質などの抗原性により、Ａ型、Ｂ型及びＣ型に分類される。特にＡ型インフルエンザウイルスは、遺伝子交雑や点変異等による抗原性の変化に伴う亜型間の変化により、世界的規模での流行を繰り返している。
前述するようにインフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、極めて変異しやすい抗原決定領域（Ａ〜Ｅ）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。ヘマグルチニンの亜型間のアミノ酸配列の相違は２５〜７５％にわたるが、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異がなく、その三次元構造はよく保存されている（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．，３３，４２９（１９９４））
従来から、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与するヘマグルチニンに特異的に結合することによってその働きを阻害する作用を有するワクチンの開発が検討されている。
その一例として、ヘマグルチニンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合することに基づいて、種々の糖アナログを用いてヘマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖をスクリーニングするという手法により、現在までに種々のヘマグルチニン結合性糖アナログが取得されている（Ｒ．Ｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６９（１９９３）；Ｍ．Ｍａｍｍｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４１７９（１９９５）；Ｔ．Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１４５（１９９９）；Ｍ．ｌｔｚｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６３，４１８（１９９３））。
そのほか、ヘマグルチニンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合部位のもつ抗原性（イディオタイプ）に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を作成する手法もある。すなわち、これはヘマグルチニンの受容体となるシアル酸およびシアロ糖鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディオタイプ抗体の超可変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のヘマグルチニン受容体に模擬させるというものである（鈴木康夫「ウイルス感染と糖鎖」、別冊日経サイエンス「糖鎖と細胞］，８９−１０１頁，１９９４年１０月）。
しかし、これらのいずれもヘマグルチニンの種々の亜型に特異的であり、また結合定数も高くない。
このため、亜型の別に関わらずインフルエンザウイルス全般に働く広域ワクチンの開発が待たれているのが現状である。
インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に認識し結合する物質、すなわち宿主細胞の受容体に代えてヘマグルチニンの受容体となり得る物質が提供できれば、インフルエンザがヘマグルチニンを介して宿主受容体に結合することを競合的に抑制ないし阻害することができ、インフルエンザウイルスの感染を予防することが可能になるものと期待される。また上記物質が、インフルエンザウイルスの亜型間でよく保存されたヘマグルチニンの「受容体結合ポケット」を特異的に認識してそれと結合するものであれば、亜型の別なくインフルエンザウイルス全般にわたってその感染を予防できるものと期待される
本発明は、かかる効果を奏し得る、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドを提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、ファージディスプレイ法を用いることにより、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に認識して結合するペプチドが選択的に取得できることを確認した。
本発明は、かかる知見に基づいて開発されたものである。
すなわち、本発明は下記１〜６に掲げるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドである：
１．下記（ａ）または（ｂ）のいずれかである、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド：
（ａ）配列番号１〜６、８〜１１で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するペプチド、
（ｂ）配列番号１〜１１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つインフルエンザウイルス・ヘマグルチニンに結合性を有するペプチド。
２．配列番号１または６で示されるアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド。
３．配列番号８〜１１で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド。
４．インフルエンザウイルスがＡ型ウイルスである、１乃至３のいずれかに記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド。
５．インフルエンザウイルスがＨ１亜型である、１乃至３のいずれかに記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド。
６．インフルエンザウイルスがＨ３亜型である、１又は３に記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド。
これらのペプチドはアルキル化又は脂質（リン脂質）化することによってリポペプチドとして調製することもできる。従って本発明のペプチドにはリポペプチドが包含される。
また本発明は、当該リポペプチドを含有するリポソームである。
さらに本発明は、上に記載されるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドの少なくとも１種を有効成分として含有するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤である。尚、当該ペプチドはリポソームの形態であることもできる。
また本発明は下記に掲げる、抗インフルエンザ剤、具体的にはインフルエンザ予防若しくは治療剤として有用な薬学的組成物である。
（Ａ）有効成分として上記のいずれかに記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドの少なくとも１種、及び薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物。
（Ｂ）有効成分であるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドをリポペプチドの形態で含有する上記薬学的組成物。
（Ｃ）有効成分であるインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチドをリポソーム修飾体の形態で含有する上記薬学的組成物。
（Ｄ）対象とするインフルエンザウイルスがＡ型ウイルスである上記薬学的組成物。
（Ｅ）対象とするインフルエンザウイルスがＡ型ウイルスのＨ１亜型である上記薬学的組成物。
（Ｆ）対象とするインフルエンザウイルスがＡ型ウイルスのＨ３亜型である上記薬学的組成物。
（Ｇ）インフルエンザの予防又は治療剤として用いられる上記薬学的組成物。
また本発明は、上記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかに記載の薬学的組成物を被験者に投与することからなるインフルエンザの感染予防方法若しくはインフルエンザの治療方法である。なお、ここで被験者としては、インフルエンザウイルスの感染を受ける可能性のある者（ヒト若しくはその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等を含む）並びにインフルエンザウイルスに感染した者を挙げることができる。好ましくは感染に係るインフルエンザウイルスがＡ型に属するものであり、より好ましくはＡ型Ｈ１亜型又はＨ３亜型に属するものである。
さらに本発明は前記に記載するインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド並びに該ペプチド修飾リポソームの、上記抗インフルエンザ剤（インフルエンザ予防若しくは治療剤）としての使用に関し、さらには前記記載のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド並びに該ペプチド修飾リポソームの、抗インフルエンザ剤（インフルエンザ予防若しくは治療剤）として用いられる薬学的組成物の製造のための使用に関する。
なお、以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
本発明のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン結合性ペプチドの具体例としては、後述する実施例に示される方法により得られる配列番号１から１１に示されるアミノ酸配列を有するものを例示することができる。
以下、本発明のヘマグルチニン結合性ペプチド（以下、ＨＡ結合性ペプチドともいう）の選別方法及びこれにより得られたペプチドの同定、並びに該ペプチドのヘマグルチニンへの結合性について説明する。
本発明のＨＡ結合性ペプチドの選別及び同定には、分子ライブラリーのスクリーニング手法を採用することができ、上記ライブラリーとしては、例えばファージディスプレイライブラリーを好ましく用いることができる。
かかるライブラリーとしては、市販のものを用いることができる。該ライブラリー中のランダムペプチドディスプレイファージによれば、特定の標的分子又は目的の細胞に結合するペプチドを、該分子又は細胞を用いてインビトロでスクリーニングでき、しかも該スクリーニングにより選別されたペプチドが発現できるので、標的とする分子又は細胞と特異的に結合するペプチドの選別及び同定に有用である。該ファージディスプレイライブラリーを用いるスクリーニングは、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗体の選別及び同定に使用されている。なお、これらファージディスプレイライブラリーの作成方法及びインビトロスクリーニング法については、スコット及びスミスらの方法が参照される（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２２８−２５７（１９９３））。なお、これらの文献は、本発明の一部としてここに引用される。
本発明のＨＡ結合性ペプチドは、上記ファージディスプレイ法を用いてヘマグルチニンに結合するペプチドをインビトロでスクリーニングすることによって取得することができる。具体的には以下の方法によって行うことができる。
すなわち、まず、公知のファージライブラリーにランダムなＤＮＡ配列を挿入して、ファージの外殻表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るように構築したランダムペプチドディスプレイファージを用いて、これを予めマイクロプレート等の固相表面上に固定化したインフルエンザウイルスのヘマグルチニンと反応させて、該ヘマグルチニンと特異的に結合するファージを回収する（バイオパニング）。
なお、マイクロプレートに固定化させるインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとしては、少なくとも宿主細胞の受容体と結合する「受容体結合ポケット」を保存的に有するものであれば特に制限されず、例えばヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスそのものであってもよいし、またインフルエンザウイルスをエーテル等の各種有機溶媒で抽出処理したインフルエンザウイルス抽出物等であってもよい。また、インフルエンザウイルスの種類も特に制限されず、目的に応じてＡ型、Ｂ型またはＣ型、乃至はヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型または鳥類分離型等のいずれであることができる。好ましくはＡ型ウイルス、またはヒト分離型のウイルスである。
前述するようにヘマグルチニンの「受容体結合ポケット」の三次構造はインフルエンザウイルスの亜型にかかわらずよく保存されているので、上記マイクロプレートに固定化させるインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとしては、亜型の別を何ら問うものではないが、好適には最近約１０年の間ヒトから分離されているＡ型の亜型であるＨ１亜型やＨ３亜型を例示することができる。
ヘマグルチニンと特異的に結合するファージの回収は、宿主細胞の受容体と競合してヘマグルチニンと結合する能力を有するＨＡ受容体物質、またはヘマグルチニンの宿主細胞の受容体への結合を阻害する能力を有するＨＡ阻害剤を、固定化したヘマグルチニンに対して作用させることによって行うことができる。すなわち、マイクロプレート上に固定化されたヘマグルチニンに特異的に結合しているファージは、上記ＨＡ受容体物質またはＨＡ阻害剤を競合反応させることにより脱離溶出し、それにより回収することができる。
ここで、ＨＡ受容体物質としては、ヘマグルチニンに特異的に結合する能力を有するものであれば特に制限されない。ヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合しているファージを回収するには、ＨＡ受容体物質としてヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合する能力を有するものを用いることが好ましい。かかるＨＡ受容体物質としては、制限はないが、ガングリオシドＧＭ３、α（２→６）ＧＭ３、シアリルＬｅｗｉｓＸ等を例示することができる。
また、ＨＡ阻害剤としては、ヘマグルチニンの宿主細胞受容体への結合を阻害する能力を有するものであれば特に制限されず、例えばシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ、２，７−Ｄｉｄｅｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ、シアル酸デンドリマー、シアル酸含有ポリマー等を挙げることができる。
かくして得られるファージを大腸菌に感染させて大量培養し、分離、精製して、ヘマグルチニンと特異的に結合するペプチド発現ファージ、好ましくはヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合するペプチド発現ファージを得る。かくして得られるファージは、再び上記と同様に、固定化ヘマグルチニンと反応させてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンと特異的に結合するファージをスクリーニングするパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）操作に供される。
かかるパニング操作を数回、好ましくは４〜６回程度繰り返すことによりヘマグルチニンと特異的に結合するペプチド、好ましくはヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合するペプチドを発現し得るファージが選別できる。
次いで、選択されたファージからＤＮＡを抽出しその配列を決定することにより、ファージが発現するペプチド、すなわちインフルエンザのヘマグルチニンと特異的に結合するペプチド（ＨＡ結合性ペプチド）、好ましくはヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合するペプチドを同定することができる。
上記ＤＮＡの配列決定は、当業界で公知の方法により容易に行うことができ、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０）〕等を挙げることができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行うことができる。
上記ファージディスプレイ法においてファージライブラリーとしては、通常この方法で用いられる公知のファージライブラリーがいずれも使用できる。特に制限されないが、具体的にはファージのコートタンパク質ｐＩＩＩ遺伝子にランダムなＤＮＡが挿入されて、ファージ外殻表面にランダムな１５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドを発現し得るように構築されたランダムペプチドディスプレイファージ（繊維状ファージ）を好適に例示することができる（演題：２Ｃ１０３「ファージディスプレイ法による糖脂質に結合するペプチドのセレクション」、第３回  日本化学会バイオテクノロジー部会シンポジウム（１９９８）；日本国特願平１１−０００７６９号；）。
このようにして同定されたＨＡ結合性ペプチドのヘマグルチニンに対する親和性（結合性）は、前述するＨＡ結合性ペプチドを発現し得るファージの選別方法（パニング）において、ランダムペプチドディスプレイファージに代えて、測定対象ペプチドである同定されたＨＡ結合性ペプチドを用いて同様に行うことによって確認、評価することができる。
本発明の一例として、固定化インフルエンザウイルス（ヘマグルチニン）として、Ａ型（Ｈ１亜型）のインフルエンザウイルスであるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のエーテル抽出物を、また溶出用物質としてＨＡ受容体物質またはＨＡ阻害剤のいずれかを用いて、ＨＡ結合性ペプチドを発現するファージを選択し、その発現ペプチドを同定する方法を後記実施例１に記載する。
かかる本発明の一態様によって同定されたペプチドは、配列番号１から６に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものであり、これらはいずれもインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、特にヘマグルチニンの受容体結合ポケットに対して結合性を有することにより特徴づけられる。またこれらのペプチドは、インフルエンザウイルスの中でもＡ型ウイルスまたはヒト型ウイルスのヘマグルチニンに対して結合性を有するものとして特徴づけることができる。なお、これらのペプチドは、ヘマグルチニンＨ１亜型をターゲットとして選択されたものであり、この亜型に特異的結合性を有するものとして特徴づけられる。中でも配列番号１及び配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが、Ｈ１亜型に特異的に結合するペプチドとして好適に例示される。
また本発明の一例として、固定化インフルエンザウイルス（ヘマグルチニン）として、Ａ型のＨ１亜型であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）及びＨ３亜型であるＡ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）のエーテル抽出物を、また溶出用物質として各種のＨＡ受容体物質（シアリルＬｅｗｉｓＸ、α（２→６）ＧＭ３）を用いて、これらのヘマグルチニンの両方を認識し結合するペプチドを発現するファージを選択し、該発現ペプチドを同定する方法を後記実施例３に記載する。
かかる本発明の態様によって同定されたペプチドは、配列番号７から１１に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するものである。これらのＨＡ結合性ペプチドは、ヘマグルチニンの亜型であるＨ１及びＨ３の両方に対して結合性を有することにより特徴づけられる。ヘマグルチニンのＨ１亜型及びＨ３亜型は、互いにアミノ酸配列が７５％相違することが知られていることから、上記ＨＡ結合性ペプチドはヘマグルチニンのＨ１亜型とＨ３亜型の相同性の高い部位を認識して、該部分に結合するものと考えられる。
また上記ＨＡ結合性ペプチドのうち、特に配列番号７で示されるペプチドは、異なる２つの溶出用物質（シアリルＬｅｗｉｓＸ、α（２→６）ＧＭ３）で共に溶出され取得されることから、そのヘマグルチニンへの結合部位はシアリルＬｅｗｉｓＸやα（２→６）ＧＭ３のヘマグルチニンへの結合部位と同一であって、また同じ結合様式を有するものと考えられる。
本発明のペプチドには、上記配列番号１から６に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、並びに配列番号７から１１に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの他に、これらのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、特にＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合性を有するペプチド並びに蛋白質が包含される。  ここで配列番号１から６に示されるペプチドに関して、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくは蛋白質が、配列番号１から６で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチドと同様にインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、特にヘマグルチニンの受容体結合ポケットに対して結合性を有するといった上記特徴を備えた同効物であれば特に制限されない。好ましい特徴としては、ヘマグルチニンのＨ１亜型に特異的に結合性を有することを挙げることができる。
また、ここで配列番号７から１１に示されるペプチドに関して、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくは蛋白質が、配列番号７から１１で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチドと同様にインフルエンザウイルスのヘマグルチニン、特にヘマグルチニンの受容体結合ポケットに対して結合性を有するといった特徴を備えた同効物であれば特に制限されないが、好ましくはヘマグルチニンのＨ１亜型及びＨ３亜型の双方に対して結合性を有するといった特徴を備えた同効物を挙げることができる。
このようなアミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に行うこともできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含するものである。
本発明のＨＡ結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、本発明で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種のペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
かくして得られる本発明のＨＡ結合性ポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
また、上記本発明のＨＡ結合性ペプチドは、適宜に化学修飾することができ、例えばアルキル化や脂質化（リン脂質化）等による化学修飾により、ＨＡ結合性ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させ、或いは血中半減期の延長等による薬理効果の増強を意図することができる。
ＨＡ結合性ペプチドのアルキル化は常法に従って実施することができる。例えば、脂肪酸とＨＡ結合性ペプチドのＮ末端アミノ基とのアミド結合形成反応（前記のペプチド合成と同様にして実施）により容易に実施される。
脂肪酸としては、直鎖や分枝鎖の別及び飽和や不飽和の別に特に制限されることなく、任意の脂肪酸を広く例示できる。一般的には、生体内に存在する脂肪酸が好適に採用でき、具体的にはラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸；オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸が例示される。
またアルキル化は、アルキルアミンとＨＡ結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応（前記ペプチド合成と同様にして実施）によっても収得できる。アルキルとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンが例示でき、一般的には生体内に存在する脂肪鎖（炭素数が１２〜２０程度）を好適に採用することができる。
ＨＡ結合性ペプチドの脂質化も常法に従って実施できる（Ｎｅｗ  Ｃｕｒｒｅｎｔ，１１（３），１５−２０（２０００）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．，１１２８，４４−４９（１９９２）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１３，１７７−１８０（１９９７）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，２８６−２８８（１９８２）等）。例えば、各種リン脂質の２位水酸基或いは３位のリン酸基を利用して、任意のスペーサーを介してＨＡ結合性ペプチドの脂質修飾体を調製することができる。反応には各種の縮合法が採用でき、必要によりＨＡ結合性ペプチドのＮ端或いはＣ端に任意の長さ（通常数個）のシステインを含むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性ＳＨ基を導入することもできる。
ここでリン脂質としても、特に制限はなく、上記した各種の脂肪酸からなる、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が良好に使用できる。
なお、これらのアルキル化や脂質化された本発明のＨＡ結合性ペプチド（リポペプチド）は、リポソーム調製の際の脂質成分としても作用し、また当該ペプチドがリポソーム上に提示されることにより、後述するリポソーム製剤に極めて好適に用いられる。
本発明のＨＡ結合性ペプチドは、インフルエンザ感染の第１ステップに関与するインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを特異的に認識してそれに結合するアミノ酸配列を有するものであり、それ自身、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスと宿主細胞受容体との結合を競合的に妨げることのできるものとして、すなわちヘマグルチニン結合阻害剤として用いることができる。当該ヘマグルチニン結合阻害剤は、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、並びにそれに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するのためのツールとして用いることができ、また宿主細胞受容体へのヘマグルチニンの結合を介して生じるインフルエンザウイルスの感染を予防したり、インフルエンザを治療するのに用いられる抗インフルエンザ剤、具体的にはインフルエンザの感染予防薬又は治療薬の有効成分として有用であると期待される。
なお、本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、前述するようにその型や由来を特に制限するものでなく、Ａ型、Ｂ型またはＣ型乃至はヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型または鳥類分離型等のいずれであることができる。好ましくはＡ型インフルエンザウイルスである。また好適にはヒト分離型若しくはヒト感染型のウイルスである。
インフルエンザウイルス感染の予防又は治療薬の有効成分として用いられる場合、本発明のＨＡ結合性ペプチド（ＨＡ結合性を有するその改変若しくは修飾ペプチドを包含する。以下同じ。）は、そのままか、若しくは薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物として調製され、被験者に投与される。
ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される薬学的組成物の形態に応じて、当該分野において慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。
例えば、薬学的組成物が水溶液形態として調製される場合、上記の担体としては、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液を利用することができる。また、該組成物が適当な溶液形態に調製される場合、上記担体としては例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、これらの組成物には、当該分野、特にペプチド製剤ないしは蛋白製剤の分野で慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含むことができる。
また本発明のＨＡ結合性ペプチドはリポソーム製剤として調製することができる。
リポソーム製剤は、酸性リン脂質を膜構成成分とするか或いは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明のＨＡ結合性ペプチドを保持させることによって調製できる。
ここで、膜構成成分としての酸性リン脂質としては、通常の酸性リン脂質より狭義に定義され、より具体的にはジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然または合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）およびジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然または合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）を示す。これらは一種単独でまたは二種以上混合して使用できる。
また、中性リン脂質としては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアリイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然または合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然または合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等を例示できる。これらは一種単独でまたは二種以上混合して使用することができる。
上記リポソーム膜は、上記酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるかまたは上記中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して常法に従い形成される。ここで酸性リン脂質の併用割合は、リポソーム膜構成成分中に約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とするのがよい。
上記リポソームの調製に当たっては、更に例えばコレステロールなどを添加することができる。このコレステロールの添加によればリン脂質の流動性を調整して、リポソームの調製をより簡便なものとすることができる。該コレステロールは通常リン脂質に対して等量まで、好ましくは０．５〜１倍等量の量で添加配合されるのが好ましい。
リポソーム分散液中の有効成分と酸性リン脂質との配合割合は、有効成分に対して酸性リン脂質が約０．５〜１００当量程度、好ましくは約１〜６０当量程度、より好ましくは約１．５〜２０当量程度とされるのがよい。
また、リポソームに含まれる本発明ＨＡ結合性ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度、好ましくは５〜１０モル％程度であることができるが、通常は５モル％程度でもあってもよい。
本発明のＨＡ結合性ペプチドを薬物とするリポソームの製造には種々の公知の方法を用いることができ、また、リポペプチドである本発明ペプチドは、当該方法における脂質成分として利用することによっても所望のリポソームとすることができる。
例えば多重層リポソーム（ＭＬＶ）は次のようにして調製される。まず、脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、薬物溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色のリポソーム懸濁液が得られる。
また大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ２＋を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ２＋を除去する方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９４，４８３−４９１，１９７５）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３，６２９−６３４，１９７６）により作ることができる。
また、Ｓｚｏｋａらの考案した逆相法によるリポソームの調製法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，４１９４−４１９８，１９７８）を用いることもできる。この方法によると、リン脂質のエーテル溶液に薬物溶液を加え、超音波処理するとＷ／Ｏ型エマルションが作成される。このＷ／Ｏ型エマルションを減圧下、エバポレーターによりエーテルを除去し、次いで緩衝液を加えボルテックスミキサーで撹拌すると、Ｗ／Ｏ型エマルションからＯ／Ｗ型エマルションに転相し、更に残留する有機溶媒を除くことによってリポソームが作成できる。
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．９９，２１０−２１４，１９７９）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２，２４４２−２４４５，１９８４）と凍結融解法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３，２９１６−２９２３，１９８５）を使用することもできる。
このように調製されたリポソームは、透析法（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７１，８０６−８１２，１９８２）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７，９−２３，１９７９；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６０１，５５９−５７１，１９８０）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、リポソーム内に保持されなかった薬物を除くためには、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用することができる（リポソーム．”脂質の化学”［日本生化学会編、生化学実験講座３］、東京化学同人、１９７４）。更にまた透析膜を用いてリポソームを濃縮することも可能である。
このようにして調製されるリポソーム分散液には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液または水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ例示できる。
また、本発明のＨＡ結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、例えば抗ウイルス剤等の他の薬剤を更に封入させることができ、同様にリポソーム製剤とすることができる。
リポソーム製剤の製造は、具体的には例えばウッドレら（Ｌｏｎｇ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｏｌｄ  ｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．，Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ，Ｇ．Ｓｔｏｒｍ，Ｅｄｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８））またはナンバら（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｙ．Ｎａｍｂａ，Ｎ．Ｏｋｕ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｔ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，８，１５８−１７７（１９９３））の文献に記載される方法に従って調製することができる。また本発明に関するリポソーム製剤の具体例は、例えば後記実施例９に示されている。
上記リポソーム製剤を含む本発明の薬学的組成物中のＨＡ結合性ペプチドの量としては、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常組成物中０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）程度とするのがよい。
本発明のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤並びに薬学的組成物は、有効成分としてのＨＡ結合性ペプチドと薬学的に許容される担体を含有する製剤組成物として、インフルエンザウイルスに感染若しくは感染前の被験者に投与される。
上記阻害剤並びに薬学的組成物の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定される。製剤形態としては注射剤、点滴剤、点鼻剤及び吸入剤等の非経口投与形態を好適に挙げることができ、特に注射剤や点滴剤として調製される場合は、必要に応じてブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与されるか、また筋肉内投与、皮肉投与、皮下投与もしくは腹腔内投与される。
本発明のインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合阻害剤乃至は薬学的組成物の１日当りの投与量は、被験者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、ＨＡ結合性ペプチドの量に換算して通常成人１日当り約０．００１〜１００ｍｇ程度の範囲から選ぶことができる。当該製剤は１日１回投与に限らず、数回に分けて投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の説明のために実施例を記載するが、当該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
参考例１  ファージディスプレイライブラリーの調製
西、佐谷らの報告（Ｎｉｓｈｉ  Ｔ．，Ｓａｙａ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，３９９，２３７−２４０（１９９６））に従ってファージディスプレイライブラリーを作成した（２．５×１０８クローン）。該ファージディスプレイライブラリーは、具体的にはＮＮＫ（Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）のいずれかの核酸塩基を示し、Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）を示す。）が１５回繰り返された配列を含むＤＮＡが遺伝子工学的に挿入された繊維状ファージｆｄであって、更に外殻タンパク質ｐＩＩＩ遺伝子のＮ末端部分に１５残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡが挿入されてファージ外殻表面にランダムな１５残基のアミノ酸配列を有するペプチドが発現できるように構築されている。
上記のファージディスプレイライブラリーは、スコットら（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０））により報告されている特徴を有している。
参考例２  インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンの固定化
インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンをバイオパニングのターゲットとして用いるために、次のようにして固定化した。
なお、固定化するヘマグルチニン（ＨＡ）として、Ａ型のＨ１亜型であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（以下、単にＨ１若しくはＨ１Ｎ１とも称する。）のエーテル抽出物、及びＡ型のＨ３亜型であるＡ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）（以下、単にＨ３若しくはＨ３Ｎ２とも称する。）のエーテル抽出物を用いた。
まず、９６穴カルボプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）の各ウエルに、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）およびＮ−ヒドロキシスクシイミドの等量混合液６０μｌを添加して、プレートに結合したカルボキシル基を活性化させた。１０分後に該プレートのウエルを５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄し、Ｈ１Ｎ１の溶液（７０μｌ／ｍｌ）またはＨ３Ｎ２溶液（７０μｌ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。２時間放置した後、５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄し、１ｍＭエタノールアミン水溶液を１００μｌ添加した。１０分放置した後、再度５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）で６回洗浄し、プレートにインフルエンザＨＡを固定化した（図１参照）。
実施例１  インフルエンザＨＡ（Ｈ１）結合性ペプチドの選別及びその同定
（１）ＨＡ結合性ペプチドディスプレイファージの選別
（ｉ）バイオパニング−第１回目−
ＨＡ固定化プレートとして参考例２で調製したＨＡ（Ｈ１Ｎ１）固定化プレートを使用し、該プレートに参考例１で調製したファージディスプレイライブラリー溶液（６．２×１０１０ＴＵ、ＴＢＳ緩衝液中）を１００μｌインジェクトし、室温で４時間放置した。その後、２００μｌの溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、よくピペッティングしながら５回洗浄し、結合していない非特異ファージを除去した。次いで、各ウエルに１０ｍＭのシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ溶液または１０ｍＭのガングリオシドＧＭ３溶液を１００μｌ添加し、室温で１時間放置した。
なお、シアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎは、ヘマグルチニン、特にＨ１Ｎ１へのシアル酸含有糖鎖の結合を阻害する能力を有するＨＡ阻害剤であり、またガングリオシドＧＭ３は、ヘマグルチニンの受容体結合ポケットに対して特異的結合性を有する特異的なＨＡ受容体物質であることが、本発明者らによって確認されている（Ｔ．Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１４５（１９９９））。このため、ファージを結合させたプレートのウエルに、上記のようにＨＡ阻害剤またはＨＡ受容体物質を添加することにより、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン受容体結合ポケットに特異的に結合しているファージを溶出することができる。
かくして、ＨＡ結合性ファージを溶出し、該ファージを含む溶液を回収した。
得られたファージ溶液に調製済み大腸菌Ｋ９１−Ｋａｎ溶液１００μｌを加え、１５分間室温で感染させた。１５分後、あらかじめ３７℃で保温しておいた、０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ社製）（以下、ＴＣという）を含むＮＺＹ培地２０ｍｌにこの感染溶液を加えて、３７℃で４０分間振盪培養した。  ４０分後、ＴＣのストック溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加え（終濃度２０μｇ／ｍｌ）、３７℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心して大腸菌を除去した。上清を再度１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心して更に大腸菌を除去した。上清にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液３ｍｌ（０．１５ｖ／ｖ）を加え、１００回穏やかに攪拌した後、４℃で４時間以上静置した。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去し、沈殿したファージペレットに１ｍｌ  ＴＢＳを加えて完全に溶解した。得られたファージ溶液を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ（Ｅｐチューブ）に移し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して不溶物を除去した。この中に再びＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を１５０μｌ加え、数回穏やかに攪拌した後、４℃で１時間以上静置した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心してペレットを回収し、０．０２％  ＮａＮ３／ＴＢＳ（２００μｌ）に溶解した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して、不溶物を除去し、上清のファージ溶液（２００μｌ）を０．６ｍｌ容Ｅｐチューブに移した。こうして得られたファージ溶液の半分を２回以降のパニングに、また２μｌをｔｉｔｅｒｉｎｇに使用し、残りを保存した。
（ｉｉ）バイオパニング−第２回目−
参考例２で作成したＨＡ（Ｈ１Ｎ１）固定化プレートに、増幅したファージディスプレイライブラリー溶液を１００μｌ  インジェクトし、室温で４時間放置した。その後２００μｌの溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、よくピペッティングしながら１０回洗浄し、結合していない非特異ファージを除去した。次いで、各ウエルに１０ｍＭシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ溶液または１０ｍＭ  ＧＭ３溶液を１００μｌ添加し、室温で１時間放置し、インフルエンザＨＡの結合ポケットに特異的に結合しているファージを溶出し、その溶液を回収した。
（ｉｉｉ）バイオパニング−第３回目−
ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）固定化プレートに、増幅したファージディスプレイライブラリー溶液を１００μｌインジェクトし、室温で１時間放置した。その後２００μｌの溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、よくピペッティングしながら１０回洗浄し、結合していない非特異ファージを除去した。次いで、各ウエルに１０ｍＭシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ溶液または１０ｍＭ  ＧＭ３溶液を１００μｌ添加し、室温で１時間放置し、インフルエンザＨＡの結合ポケットに特異的に結合しているファージを溶出し、その溶液を回収した。
（ｉｖ）バイオパニング−第４回目−
ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）固定化プレートに、増幅したファージディスプレイライブラリー溶液を１００μｌインジェクトし、室温で１時間放置した。その後２００μｌの溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて、よくピペッティングしながら１０回洗浄し、結合していない非特異ファージを除去した。次いで、各ウエルに１０μＭシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ溶液または１０μＭ  ＧＭ３溶液を１００μｌ添加し、室温で３０分間放置し、インフルエンザＨＡの結合ポケットに弱く結合しているファージを溶出した。次いで、各ウエルに１０ｍＭシアル酸誘導体７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ溶液または１０ｍＭ  ＧＭ３溶液を１００μｌ添加し、室温で１時間放置し、ＨＡの結合ポケットに特異的に結合しているファージを溶出し、その溶液を回収した。
（ｖ）バイオパニング−第５〜７回目−
（ｉｖ）に記載の操作を繰り返して、第５回目、第６回目及び第７回目のバイオパニングを行った。
上記パニング操作（第１〜７回目）によって得られた結果（ファージの回収率）を、溶出用物質（７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎ、ＧＭ３）の種類別に表１及び２に示す。
【表１】
0004528989.tif 000002
【表２】
0004528989.tif 000003
いずれの場合も、１回目から４回目にかけてのパニングは、サイクル毎にパニングの条件を厳しくしているため高い回収率の増加は認められなかったが、同一条件でパニングを繰り返した４回目から６回目にかけて、ファージの増加がみられた。これにより、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン（Ｈ１Ｎ１）に特異的に結合するペプチドを発現しているファージが回収されていることが確認された。
（２）ＨＡ結合性ペプチドのアミノ酸配列の決定
上記各パニングにおいて第６回目のパニング操作で得られたファージを用いて、発現しているペプチドのアミノ酸配列を決定した。具体的には、固定化ヘマグルチニンＨ１Ｎ１に結合し７−Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎで溶出されたファージ（以下、Ｈ１／７ファージという：１９クローン）、及び固定化ヘマグルチニンＨ１Ｎ１に結合しガングリオシドＧＭ３で溶出されたファージ（以下、Ｈ１／３ファージという：２０クローン）の２種類のファージについて、発現ペプチドのアミノ酸配列をシークエンスによって決定した。
まず、６回目のパニングの後のタイター測定で得られたプレート上のコロニーをそれぞれ５０コロニーずつ、無作為に拾い上げ、新しいＮＺＹプレートに、植菌し直し、一晩３７℃にて培養し、これをマスタープレートとして４℃で保存した。マスタープレートのコロニーを各々２０ｍｌのＮＺＹ培地（２０μｇ／ｍｌ  ＴＣ含有）の入った５０ｍｌ遠心チューブに懸濁し、３７℃で一晩２００ｒｐｍで振盪培養した。ついで３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行った後、上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、大腸菌を除菌した。更に上清をオーク・リッジ遠心チューブに移し、３ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００：ナカライテスク社製）／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃に４時間静置した。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ファージを沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを１ｍｌのＴＢＳ（トリス緩衝塩溶液）に懸濁させた。１．５ｍｌのＥｑチューブに移し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶性物質を除去後、上清を別のＥｑチューブに移し、１５０μｌのポリエチレングリコール／ＮａＣｌを加え、よく撹拌した後、４℃で１時間静置した。次いで１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ファージを再沈殿させた。ついで上清を除去し、沈殿したファージを２００μｌのＴＢＳで再度懸濁した。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈殿させた後、該沈澱物を０．５ｍｌのＥｑチューブに移し、ファージクローンを４℃で保存した。
上記で得られたファージクローンからのＤＮＡの抽出は、１．５ｍｌのＥｑチューブにファージクローン１００μｌに対してＴＢＳ  １００μｌ及びＴＥ飽和フェノール（ニッポジーン社製）２００μｌを加えて、１０分間激しく撹拌後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上清（水相）２００μｌに対してＴＥ飽和フェノール２００μｌ及びクロロホルム２００μｌを加えて、前記と同様１０分間激しく撹拌後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。更に、上清（水相）１５０μｌに対してＴＥ２５０μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム４０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（ベーリンガー・マインハイム社製）１μｌ及びエタノール１ｍｌを加えて、１．５ｍｌのＥｑチューブにて−２０℃で、一時間放置した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を取り除き、１ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）を緩やかに加えて、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し残存する塩を除いた。上清を除去後、チューブ内の水分を蒸発させ、沈殿しているＤＮＡを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、４℃にて保存した。かくして得られた個々のファージＤＮＡをペプチドの配列決定のために使用した。
ファージＤＮＡによりコードされるペプチドの配列決定は、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７））により、アマシャム社のＴＨＥＲＭＯ配列キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｅ，Ｃｏｄｅ；ＵＳ７９７６５，Ｌｏｔ番号；２０１５０３）を用いて機器の使用説明書に従い実施した。ＤＮＡの伸長反応は、９６℃、３０秒、４５℃、１５秒、６０℃、４分を１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、ＤＮＡの配列決定は、ＡＢＩ社製のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ３７７）を用いて行った。
このようにして２種類のファージ（Ｈ１／７ファージ、及びＨ１／３ファージ）の各クローンから決定された、ヘマグルチニンの受容体結合ポケットに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を１文字表記として表３に示す。なお、下記表記載の各アミノ酸配列を後記配列表に、配列番号１（Ｎｏ．１及び５）、２（Ｎｏ．２）、３（Ｎｏ．３）、４（Ｎｏ．４）、５（Ｎｏ．６）及び６（Ｎｏ．７）としてそれぞれ記載する。
【表３】
0004528989.tif 000004
なお、各ファージにおいて表に記載しなかった残りのクローンは、いずれもランダムに配列が欠損しているか、もしくは配列解読が不能なものであった。
表からわかるように、ファージＨ１／７並びにファージＨ１／３はいずれも、複数のクローン間で共通のアミノ酸配列が見られた。さらに、各ファージ間で比べると、ファージＨ１／７とファージＨ１／３間で共通の配列（Ｎｏ．１とＮｏ．５）が見られた。
なお、ＨＡ受容体物質であるガングリオシドＧＭ３はヘマグルチニンＨ１に対して高い親和性を有し、またＨＡ阻害剤である７Ｆ−Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎはヘマグルチニンＨ１に対して高い阻害能を有することが知られている。
実施例２  ＨＡ結合性ペプチドのインフルエンザ・ヘマグルチニンへの結合性
実施例１で得られたファージをクローニングし、得られた発現ペプチドについて、ヘマグルチニンに対する結合性ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
具体的には、まずヘマグルチニン（Ｈ１Ｎ１）を９６穴カルボプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に、参考例２に記載する方法に従って固定化した。固定化後、プレートの各ウエルに１％ＢＳＡ（Ａｌｕｂｕｍｉｎｅ  Ｂｏｖｉｎｅ，Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｆｒｅｅ：Ｓｉｇｍａ製）を含有するＴＢＳを１００μｌ添加し、室温で１時間放置した。ここに増幅させたファージの溶液（Ｈ１／７ファージ：クローンＮｏ．１〜４、Ｈ１／３ファージ：クローンＮｏ．５〜７）を５０μｌ添加し、室温で１時間放置した。各ウエルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、ＴＢＳ／５％ＢＳＡを１５０μｌ添加し、室温で１晩放置した。
次いで、各ウエルに抗−ｆｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ抗体／ＴＢＳ溶液（１／１０００希釈）を１５０μｌ添加し、室温で１晩放置した後、ＴＢＳＴで５回洗浄した。次いで、各ウエルに、抗−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体／ＴＢＳ溶液（１／１０００希釈）を１００μｌ添加し、室温で１晩放置した後、ＴＢＳＴで５回洗浄した。
各ウエルに、基質溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０））を１００μｌ添加し、１０分間反応させた後、３ＮＨ２ＳＯ４を１００μｌずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレート・リーダーで４９２ｎｍの吸収を測定した。
ヘマグルチニン（Ｈ１Ｎ１）をターゲットとしてパニングされたＨ１ファージ（Ｈ１／７ファージ及びＨ１／３ファージ）について、ヘマグルチニンＨ１に対する結合性を調べた結果を図２に示す。
図２からわかるように、Ｈ１／７ファージのクローンＮｏ．１（図２において○で表示、以下「Ｈ１−１」と称する。）及びＨ１／３ファージのクローンＮｏ．６（図２において△で表示、以下「Ｈ１−２」と称する。）が、ヘマグルチニンＨ１に対して高い結合性を示した。
これは、本発明においてヘマグルチニンの認識部位（受容体結合ポケット）に対して特異的に結合するペプチドを発現するファージが選択されたことを示す。
実施例３  ２種の亜型を認識するＨＡ結合性ペプチドの選択
実施例１に従って、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンＨ１（Ｈ１Ｎ１、Ａ／ＰＲ／８／３４）及びＨ３（Ｈ３Ｎ２、Ａ／武漢／３５９／９５）の２種類をターゲットとして、バイオパニングを行った。具体的には、ＨＡ固定化プレートとして参考例２に従って調製したＨ１固定化プレート及びＨ３固定化プレートを用いて、また溶出用物質としてＨＡ受容体物質であるシアリルＬｅｗｉｓＸ及びα（２→６）ＧＭ３を用いて、実施例１と同様にしてバイオパニングを行い、ＨＡ結合性ペプチドを発現するファージを選択した。かかるバイオパニング選択によって得られた代表的なファージのクローンについて、その発現ペプチドのアミノ酸配列をシークエンスした結果を表４に示す。
【表４】
0004528989.tif 000005
クローン「Ａ−１」は、下記の表５に示す全てのパニング系で選択されたファージクローンに認められた。
【表５】
0004528989.tif 000006
クローン「Ｂ−１」は、パニング系「Ｈ１／ＧＭ」で選択された９クローンのうち２クローンに認められた。
クローン「Ｂ−２」は、パニング系「Ｈ３／Ｘ」で選択された１０クローンのうち１クローンに認められた。
クローン「Ｃ−１」は、パニング系「Ｈ１／ＧＭ」で選択された９クローンのうち１クローン、及びパニング系「Ｈ３／ＧＭ」で選択された１０クローンのうち１クローンに認められた。
クローン「Ｃ−２」は、パニング系「Ｈ１／ＧＭ」で選択された９クローンのうち１クローン、及びパニング系「Ｈ３／Ｘ」で選択された１０クローンのうち４クローンに認められた。
上記で示すように、クローン「Ａ−１」は、ターゲット及び溶出用物質を種々異にした全てのパニング系から選択された。溶出用物質を異にしたパニングでこのように同一の配列を有するペプチドを発現するクローンが得られたことから、当該クローン「Ａ−１」の発現ペプチドは、ＨＡ受容体物質であるシアリルＬｅｗｉｓＸ及びα（２→６）ＧＭ３が有するヘマグルチニンに対する結合サイト（ＮｅｕＡｃが関与しているサイト）と同一の結合サイトを有し、これらの受容体物質と同じ結合様式をもったペプチドであると考えられる。
また、クローン「Ｂ−１」及び「Ｂ−２」の発現ペプチドは共通のモチーフとしてＧＲｘＰ（ｘは、Ｖ又はＰを意味する）を有しており、またクローン「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」の発現ペプチドは共通のモチーフとしてＩＡＦＳｘｙＡ（ｘはＳ又はＲを、またｙはＬ又はＡをそれぞれ意味する）を有していた。
実施例４  ＨＡ結合性ペプチドのインフルエンザ・ヘマグルチニンへの結合性
実施例１及び実施例３で得られたファージクローン「Ｈ１−１」、「Ｈ１−２」、「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」について、ヘマグルチニン（Ｈ１、Ｈ３）に対する結合性を、実施例２に準じてＥＬＩＳＡを用いて評価した。
具体的には、ヘマグルチニンＨ１（Ｈ１Ｎ１）及びＨ３（Ｈ３Ｎ２）、並びにレクチンの１種である小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ：Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）をそれぞれ９６穴カルボプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に固定し、これらに各ファージクローン溶液５×１０１０ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍｌを添加することによって、ＥＬＩＳＡを行った。
結果を図３に示す。図３からわかるように、実施例１で得られたクローン「Ｈ１−１」及び「Ｈ１−２」はヘマグルチニンＨ３に殆ど結合せず、ヘマグルチニンＨ１に対して特異的な結合性を示すのに対して、実施例３で得られたクローン「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」はいずれもヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方に共通して結合するという結果が得られた。
ヘマグルチニンＨ１とＨ３はアミノ酸配列において７５％相違することが知られている。このことから、クローン「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」の各発現ペプチドは、ヘマグルチニンＨ１とＨ３の両者間で相同性の高い部位を認識して、そこに特異的に結合するものと考えられる。
実施例５  ＨＡ結合性ペプチドの抗ＧＭ３抗体への結合性
実施例１及び実施例３で得られたファージクローン「Ｈ１−１」、「Ｈ１−２」、「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」について、抗ＧＭ３抗体に対する結合性を実施例４に準じてＥＬＩＳＡを用いて評価した。具体的には、ＥＬＩＳＡは、抗ＧＭ３抗体（Ｍ２５９０、日本バイオテスト研究所）を９６穴カルボプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に固定し、これらに各ファージクローン溶液５×１０１０ｖｉｒｉｏｎｓ／ｍｌを添加することによって行った。
結果を図４に示す。図４（ａ）及び（ｂ）からわかるように、実施例１で得られたクローン「Ｈ１−１」及び「Ｈ１−２」は抗ＧＭ３抗体に殆ど結合しないのに対して、実施例３で得られたクローン「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」はいずれも抗ＧＭ３抗体に対して特異的に結合することが認められた。
このことから、クローン「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」の各発現ペプチドは、ＧＭ３のシアル酸を含む構造を模倣する配列を有することが示唆された。
実施例６  ファージクローンによる、ガングリオシドＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合阻害
実施例１及び実施例３で得られたファージクローン（「Ｈ１−１」、「Ｈ１−２」、「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」、「Ｃ−２」）によって、ガングリオシドＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合が阻害されるかどうかを常法に従って実験することによって調べた（「ガングリオシド研究法Ｉ」鈴木康夫・安藤進、編著、学会出版センター、１９９５年）。なお、ヘマグルチニンとしてＨ１（Ｈ１Ｎ１）及びＨ３（Ｈ３Ｎ２）を用いた。
具体的には、９６穴マイクロタイタープレート上に１０μ１のＧＭ３溶液（８．５μｇ／ｍｌメタノール溶液）を加えた後、５０μｌの０．０８％ポリイソブチルメタクリレート溶液を加えた。溶媒をドライヤーで蒸散させ、５０μｌの１％ＢＳＡ／ＴＢＳを添加して４℃で一晩放置した。ＴＢＳでプレートを３回洗浄した後、所定濃度のファージクローン（表６参照）とヘマグルチニン（系内のヘマグルチニン濃度が３０ｎＭとなる濃度）溶液５０μｌを添加して、２０℃で２時間放置した。ＴＢＳでプレートを５回洗浄した後、プレートに結合しているヘマグルチニン量を抗体で検出してその減少量より阻害活性を求めた。結果（ＩＣ５０値）を表６に示す。なお、表中の“ｎｄ”は“ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ”を意味する。
【表６】
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表６からわかるように、ファージクローン「Ａ−１」、「Ｃ−１」及び「Ｂ−２」について、その発現ペプチドがヘマグルチニンＨ１及びＨ３の両方の結合を阻害することを示す結果が得られた。この結果はこれらファージクローンが有するヘマグルチニンに対する結合特異性と相関していた。
実施例７  脂質によるファージのヘマグルチニンに対する結合阻害
実施例３で得られたファージクローン（「Ａ−１」、「Ｂ−１」、「Ｂ−２」、「Ｃ−１」、「Ｃ−２」）について、該ファージクローンがヘマグルチニン（ＨＡ）の宿主受容体認識部位を実際に認識していることを確認するために、実施例６に準じてＥＬＩＳＡを用いて、ＨＡ受容体物質であるＧＭ３によって固定化ＨＡに対する上記ファージクローンの結合が阻害されるかどうかを調べた。なお、ヘマグルチニンとしてＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２をそれぞれ用いた。また比較実験としてＧＭ３に代えてＧＭ１及びＧｌｃＣｅｒを用いて同様に実験を行った。
ＧＭ３による阻害実験の結果を図５に、ＧＭ１による阻害実験の結果を図６に示す。なお、各図とも、ａ）はヘマグルチニンとしてＨ１Ｎ１を、ｂ）はＨ３Ｎ２を用いた結果を示す。
図５からわかるように、試験したいずれのファージクローンも、ヘマグルチニンに対する特異的なリガンド（ＨＡ受容体物質）であるＧＭ３を添加した時にその結合が阻害されるという挙動が観察された。これに対して、ヘマグルチニンに特異結合性をもたないＧＭ１（図６）及びＧｌｃＣｅｒ（結果省略）を添加しても、ファージクローンのヘマグルチニンへの結合は阻害されなかった。
これらのことから、上記ファージクローンの発現ペプチドは、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンの受容体認識部位に対して特異的に相互作用することによって、インフルエンザウイルスの宿主受容体への結合（感染）を特異的に阻害するように働くことが示唆された。
実施例８  ファージ上に発現しているペプチドの合成
実施例１及び３でそれぞれ得られたファージクローン上に発現しているペプチドを下記のようにして合成した。
なお、ペプチドの合成は、全自動ペプチド合成機（ＡＣＴ３５７、アドバンストケムテック社製）を使用し、同社のプログラムに従い、Ｆｍｏｃ／ＮＭＰ，ＨＯＢｔ法〔Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン、ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシペンゾトリアゾール〕による固相合成により実施した。
具体的には、合成を所望するペプチドのアミノ酸配列に従って、Ｃ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸−Ａｌｋｏ樹脂０．２５ｍｍｏｌに、Ｃ末端より２番目以降の各アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸を順次、合成プログラムに従い伸長反応させた。尚、Ｃ末端アミドのペプチドは、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＦＡＬ樹脂０．２５ｍｍｏｌにＣ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸を合成プログラムに従い縮合反応させ、その後、Ｃ末端より２番目以降の各アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸を順次縮合反応させて鎖伸長を行つた。
各反応終了後、プログラムに従って、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護反応を行った。かくして得られた各ペプチド樹脂をポリプロピレン製のミニカラム（アシスト社製）に回収し、メタノール洗浄後、真空で乾燥し、以下の操作に付してペプチドを樹脂から切り出し、側鎖の脱保護反応を行った。即ち、各樹脂にリージェントＫ（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋ，８２．５％  ＴＦＡ，５％フェノール，５％  Ｈ２Ｏ，５％チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ），２．５％エタンジチオール）２ｍｌを加え、ミニカラム中で６０分間反応させた。次いで、反応液を冷ジエチルエーテル８ｍｌ中に滴下して反応を停止させ、同時にペプチドを沈殿させた。更に、ミニカラムをＴＦＡ２ｍｌにて洗浄し、冷ジエチルエーテル５ｍｌを追加し、遠心し、沈殿をジエチルエーテル１０ｍｌで４回洗浄後、約５ｍｌの５０％アセトニトリルでペプチドを可溶化し、凍結乾燥した。更に可溶化と凍結乾燥操作を２回繰り返して、所望の粗凍結乾燥品を得た。
これをオクタデシルカラム（直径２０×２５０ｍｍ，ＷＣ社製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画し、所望のペプチドを単離した。尚、上記において用いた樹脂およびアミノ酸誘導体は、いずれも渡辺化学工業社製のものである。
かくして単離された各ペプチドの同定を、アミノ酸配列分析およびマススペクトロメトリーによる分子量測定により行った。
尚、システイン残基を有する合成ペプチドは所望により環化することができる。具体的には、クローン「Ｈ１−１」の発現ペプチドを例示すると、当該ペプチドは次のようにして環化された。
まず、ペプチド５．０ｍｇ（３．２μｌ）を２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）／ＴＦＥ（４／１）５ｍｌに溶解した（０．６４ｍＭ）。反応系を水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．５に調整した後、酸素雰囲気下、室温で激しく撹拌し、ＳＨ基を酸化して分子内ジスルフィド結合を形成させた。反応はＨＰＬＣにより追跡し、約３０時間後、１０％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを７以上として反応を停止させた。生成物はシングルピークとして検出される。反応溶液を電気透析装置（マイクロアシライザーＧ１，旭化成工業（株）製）を用いて脱塩処理を行った後、凍結乾燥し、環状ペプチドの白色粉末を得た（収量：４０１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、収率：８２％）。
実施例９  リポペプチド及びこれを用いたペプチド修飾リポソーム
ペプチドのＮ末端にステアリン酸を結合することによって、本発明のＨＡ結合性ペプチドをリポソーム上に導入することができる。一例として、実施例３で得られたクローン「Ａ−１」の発現ペプチドについて説明する。
まず、上記実施例８に従って、クローン「Ａ−１」の発現ペプチド配列（配列番号７）を順次伸長反応させた。次いでこのペプチドのＮ末端に、同合成プログラムに従って、ステアリン酸を伸長させた後、樹脂から切り出し、脱保護反応を行った。以下、実施例８に従って所望のステアリン酸化ペプチド（「Ｃ１８Ａ−１リポペプチド」）を得た。
このリポペプチド（Ｍｗ：１８４０．７３）、卵黄レシチン（Ｍｗ：７７３、日本油脂ＮＣ−１０Ｓ）及びコレステロール（Ｍｗ：３８６．６６、Ｎａｋａｒａｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｌｏｔ  Ｍ８Ａ９９２６）を、０．７５：２：１（２０％リポペプチド）、０．３：２：１（１０％リポペプチド）又は０．１６：２：１（５％リポペプチド）のモル比にて、３０ｍｌナス型フラスコ中に、クロロホルム／メタノール（３／１）溶液２ｍｌに溶解した。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧条件下に除去して一晩真空乾燥した。これにダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝塩溶液（Ｃａ，Ｍｇ不含）（ｐＨ７．４）を５ｍｌ加え、バス型ソニケーターで３０分処理してリポソーム（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を得た。ベシクルを形成していない脂質は、遠心型限外濾過（１，５００×ｇ、１５分：分画分子量３０，０００、Ａｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０）にて除去した。
かくして得られたリポソームについて、内部に存在するペプチド含量を市販キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）により測定し、上記で調製したりポペプチドがリポソームに組み込まれていることを確認した。
実施例１０  ペプチド修飾リポソーム
ＤＤＰＥ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌ  ａｍｉｎｅ：シグマ社）６．７ｍｇ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−Ｍａｌ（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−α−Ｎ−β−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ：日油リポソーム社）４５ｍｇ、トリエチルアミン９８０μｌをクロロホルム１０ｍｌに溶解し、室温で撹拌した、反応をＴＬＣで追跡し、ニンヒドリン反応が陰性であることを確認した後、溶媒を留去した。得られた白色粘稠体に蒸留水２ｍｌを加え、バス型超音波で処理し、ミセルを形成した。この溶液を２倍体積のセロファンチューブ（分画分子量１２，０００、サイズ：２０／３０、三光純薬製）に入れ、透析膜の外の蒸留水１Ｌを適宜交換して、３日間透析を行い、ミセルを形成していない副反応物を除去した。さらにゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０  Ｆｉｎｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）により、ボイド近傍のフラクションを回収し、凍結乾燥して、ＴＬＣ上で単一バンドを示す白色粉末として目的のＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌを得た。
実施例９と同様にして調製したリポソーム（卵黄レシチン／コレステロール＝２／１）とこのＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌを混合し、５，１０，２０及び１００％ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ含有リポソームを調製した。このリポソーム溶液に１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを約８とし、「Ａ−１」ペプチドのＣ端にＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨを付加してなる本発明のペプチドを所定濃度となるように混合して、室温で６時間穏やかに撹拌し、実施例９と同様に遠心型限外濾過してリポソーム溶液とした。得られたリポソーム上に導入されたペプチド含量は実施例９と同様にして測定した。
以上のようにして、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌのマレイミドを介してＨＡ結合性ペプチドがシステインのＳＨ基で結合してなるペプチド修飾体をリポソーム上に導入し、ペプチド修飾リポソームとした。
実施例１１  ヘマグルチニンのＧＭ３キャスト膜への結合の阻害評価
実施例８に記載する方法によって、クローン「Ａ−１」の発現ペプチドを合成し、該合成ペプチドについて、その、ガングリオシドＧＭ３に対するヘマグルチニンの結合の阻害活性を調べた。具体的には、固定化ＨＡ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）に対するガングリオシドＧＭ３の結合を、上記合成ペプチドが阻害するかどうかをＥＬＩＳＡを用いて実験した。なお、比較対照実験として、上記合成ペプチドに代えて、ファージのコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ端１５残基ペプチド、及びシアリルラクトースを用いて同様に実験を行った。
結果を図７に示す。
この結果から、Ａ−１ペプチドはヘマグルチニンとＧＭ３との結合を用量依存的に阻害することが明らかとなった。これに対してｐＩＩＩ蛋白由来のペプチドは阻害を示さなかった。このことから、Ａ−１ペプチドが配列特異的にヘマグルチニンと結合することにより、ＧＭ３との結合を阻害することが示された。なお、シアリルラクトースはＧＭ３のシアル酸部分と競合することにより、ヘマグルチニンとＧＭ３との結合を阻害することが示唆された。
実施例１２  インフルエンザウイルス感染阻害活性の評価
本発明のＨＡ結合性ペプチドについて、インフルエンザウイルス感染阻害活性を評価した。
インフルエンザウイルス感染細胞として、ＭＤＣＫ細胞（Ｍａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）を用いた。当該細胞へのインフルエンザウイルス感染の評価は、市販キット（ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ，Ｗａｋｏ）を用いてＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性を検出することにより行った（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５１，１８５−１９２（１９９５））。またインフルエンザウイルスとして、Ａ型のＨ１（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））及びＨ３（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３９５（Ｈ３Ｎ２））を用いた。
具体的には、インフルエンザウイルスの感染力価は次のようにして測定した。
即ち、ＭＥＭ／１０％ＦＢＳの培地で培養した３×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌのＭＤＣＫ細胞を９６穴マイクロタイタープレートに１００ｍｌずつ蒔き、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。全てのウエルの細胞が単層飽和になっていることを確認した後、血清を含まないＭＥＭ（ＭＥＭ（−））で２回洗浄し、これに系列希釈したウイルス溶液（ＭＥＭ（−））を１００μｌずつインジェクトした。これを５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で２時間インキュベートした後、ウイルス溶液を除き、培地で２回洗浄後、同培地で２０時間インキュベートした。ウエル内の上清１５μｌをとり、これをＰＢＳで４倍希釈して５０μｌとし、これを新しいプレートに移し、各ウエルに発色液（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａ  ｚｏｌｉｕｍ，ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ  ａｎｄ  ＮＤＡ＋  ｉｎ  ｌｉｔｉｕｍｌａｃｔａｔｅ  ＰＢＳ）を５０ｍｌ添加した。室温で２０分放置した後、反応停止液（０．５Ｍ  ＨＣｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を１００ｍｌ添加し、発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果からＩＤ５０値を求めた。
ＨＡ結合性ペプチドによるインフルエンザウイルス感染阻害実験は、上記で得られたＩＤ５０値の５０倍濃度（５０  ＬＤＨ  ＩＤ５０）のウイルス量を用いて試験した。ＨＡ結合性ペプチドとして実施例９で得られた「Ｃ１８Ａ−１リポペプチド」及びこれを１０％含むリポソームを用いて行ったインフルエンザウイルスの感染阻害試験の結果を図８及び図９に示す。図８は「Ｃ１８Ａ−１リポペプチド」を用いた結果を、また図９は「Ｃ１８Ａ−１リポペプチド」により修飾されたリポソーム（１０％ペプチド）を用いた結果を示す。尚、いずれの図も、ａ）はＡ型インフルエンザウイルスＨ１（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））に対する感染阻害を、ｂ）はＨ３（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３５９（Ｈ３Ｎ２））に対する感染阻害をみた結果である。
図８及び図９からわかるように、「Ｃ１８Ａ−１リポペプチド」は、効果的にインフルエンザウイルスの細胞への感染を阻害し、この効果は該ペプチドをペプチド修飾リポソームにすることにより増強された。これらのことから本発明のＨＡ結合性ペプチドがインフルエンザ感染の予防若しくは治療剤として有用であることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに特異的結合性を有するペプチドが提供される。
本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンに特異的に結合することにより、宿主受容体へのウイルスの結合を妨げることができ、これによりインフルエンザウイルス感染予防剤として、またインフルエンザ治療剤としての応用が可能である。特に、本発明の好適なペプチドは、亜型間で三次構造がよく保存されているヘマグルチニンの受容体結合ポケットに特異的に結合する性質を有している。また比較的短いペプチドゆえに安定であり、その側鎖の多様性から、ヘマグルチニンの結合部位と相互作用する。このことから、本発明のペプチドは亜型の種類に関わらず、多種の亜型間にまたがってインフルエンザウイルス全般、特にＡ型全般に有効な広域感染予防剤及び治療剤としての応用が期待される。
さらに従来抗インフルエンザ剤として開発検討されている糖鎖アナログに比べ、本発明はペプチドであるがゆえに、大量合成並びに修飾が容易であり、薬剤の生産ならびにさらなる薬剤の開発という面においても有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マイクロプレートへのインフルエンザウイルス・ヘマグルチニンの固定化工程を示す概略図である。
図２は、ヘマグルチニンＨ１をターゲットとしてパニングされたＨ１ファージ（Ｈ１／７ファージ及びＨ１／３ファージ）について、ヘマグルチニンＨ１に対する結合性を調べた結果を示す図である。
図３は、実施例４において、実施例１及び実施例３で得られたファージクローン（「Ａ−１」，「Ｂ−１」，「Ｂ−２」，「Ｃ−１」，「Ｃ−２」，「Ｈ１−１」及び「Ｈ１−２」）の、インフルエンザ・ヘマグルチニンＨ１及びＨ３、並びに小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ）に対する結合性を調べた結果を示す図である。
図４は、実施例５において、実施例１及び実施例３で得られたファージクローン（「Ａ−１」，「Ｂ−１」，「Ｂ−２」，「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」（以上、図４（ａ）に示す）、「Ｈ１−１」及び「Ｈ１−２」（以上、図４（ｂ）に示す））の、抗ＧＭ３抗体に対する結合性を調べた結果を示す図である。尚、図中、ｒａｎｄｏｍ  ｌｉｂｒａｒｙ（図中−△−で示す）とは、パニング前のランダムなペプチドを発現しているファージの集合を意味する。
図５は、実施例７において、ヘマグルチニンへのファージクローン（「Ａ−１」，「Ｂ−１」，「Ｂ−２」，「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」）の結合に対するガングリオシドＧＭ３の阻害作用を調べた結果を示す図である。図５のａ）はヘマグルチニンとしてＨ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用した場合の結果を、ｂ）はヘマグルチニンとしてＨ３亜型（Ａ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））を使用した場合の結果を示す。
図６は、実施例７において、ヘマグルチニンへのファージクローン（「Ａ−１」，「Ｂ−１」，「Ｂ−２」，「Ｃ−１」及び「Ｃ−２」）の結合に対するガングリオシドＧＭ１の阻害作用を調べた結果を示す図である。図６のａ）はヘマグルチニンとしてＨ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用した場合の結果を、ｂ）はヘマグルチニンとしてＨ３亜型（Ａ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））を使用した場合の結果を示す。
図７は、実施例１１において、ガングリオシドＧＭ３（ＧＭ３キャスト膜）へのヘマグルチニンの結合に対する、ファージクローン（「Ａ−１」）発現ペプチド（合成ペプチド）の阻害作用を調べた結果を示す図である（図中、−○−で示す。）。図７のａ）はヘマグルチニンとしてＨ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用した場合の結果を、ｂ）はヘマグルチニンとしてＨ３亜型（Ａ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））を使用した場合の結果を示す。尚、図中、−□−はペプチドを挿入しているｐＩＩＩ蛋白のＮ端１５残基ペプチド（コントロール）、−◇−はシアリルラクトース（スタンダード）による結果を示す。
図８は、実施例１２において、実施例９で調製したリポペプチド（Ｃ１８Ａ−１リポペプチド）を用いて、細胞に対するインフルエンザウイルス感染阻害活性を調べた結果を示す図である。ａ）はインフルエンザウイルスとしてＨ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用したときの結果を、ｂ）はＨ３亜型（Ａ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））を使用したとき結果である。尚、図中、−○−はＣ１８Ａ−１リポペプチドの結果、−□−はｐＩＩＩ蛋白Ｎ端１５残基ペプチドのステアリン酸誘導体の結果を示す。
図９は、実施例１２において、実施例９で調製したリポペプチド（Ｃ１８Ａ−１リポペプチド）修飾リポソームを用いて、細胞に対するインフルエンザウイルス感染阻害活性を調べた結果を示す図である。ａ）はインフルエンザウイルスとしてＨ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））を使用したときの結果を、ｂ）はＨ３亜型（Ａ／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））を使用したときの結果である。尚、図中、−〇−はＣ１８Ａ−１  リポペプチドの結果、−□−はｐＩＩＩ蛋白Ｎ端１５残基ペプチドのステアリン酸誘導体の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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