(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物であって、５’から３’方向で、作動可能に連結した、以下：
（１）プロモーター；
（２）スプライスドナー部位；
（３）レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌコード配列；
（４）レンチウイルスＲｅｖ応答性エレメント；
（５）スプライスアクセプター部位；
（６）選択可能なマーカーコード配列；および
（７）ポリアデニル化部位
からなる、核酸構築物。
【請求項２】
前記レンチウイルスがＨＩＶである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記スプライスアクセプター部位が最適なコンセンサススプライスアクセプター配列と一致しない、請求項１または２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記スプライスアクセプター部位がＨＩＶ−１  ｔａｔ遺伝子およびＨＩＶ−１  ｒｅｖ遺伝子の３番目のエキソンのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記スプライスドナー部位がＨＩＶの主要５’スプライスドナー部位である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
組成物であって、以下：
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む第一の発現カセット；ならびに
（ｂ）第二発現カセットであって、５’から３’方向で作動可能な結合において、以下：
（１）プロモーター；および
（２）該第一発現カセットのエレメント（４）に結合する因子をコードする核酸であって、該因子はこのように結合しているとき、ｍＲＮＡが該第一発現カセットから転写される場合に、該第一発現カセットの該部位（２）および該部位（５）でのスプライシングを抑制する、核酸、
を含む、第二発現カセット、
を含む、組成物。
【請求項７】
組成物であって、以下：
（ａ）第一発現カセットであって、５’から３’方向で、作動可能に連結した、以下：
（１）プロモーター；
（２）スプライスドナー部位；
（３）レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌコード配列；
（４）ＨＩＶ−１  ｔａｔ遺伝子およびＨＩＶ−１  ｒｅｖ遺伝子の３番目のエキソンに由来するスプライスアクセプター部位と連続した、レンチウイルスＲｅｖ応答性エレメント；および
（５）選択可能なマーカーコード配列、
を含む、第一発現カセット；ならびに
（ｂ）第二発現カセットであって、５’から３’方向で作動可能な結合において、以下：
（１）プロモーター；および
（２）該第一発現カセットのエレメント（４）に結合する因子をコードする核酸であって、該因子はこのように結合しているとき、ｍＲＮＡが該第一発現カセットから転写される場合に、該第一発現カセットの該部位（２）および該部位（４）でのスプライシングを抑制する、核酸、
を含む、第二発現カセット、
を含む、組成物。
【請求項８】
前記レンチウイルスがＨＩＶである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記スプライスドナー部位がＨＩＶの主要５’スプライスドナー部位である、請求項７または８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
レンチウイルスベクターに対する効率的なパッケージング細胞株の産生は、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子のいくつかの産物の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によって妨害される。従って、ｇａｇおよびｐｏｌの誘導性発現を有し、その結果、必要な場合に、高レベルでｇａｇおよびｐｏｌを発現する最適クローンが、ｇａｇ／ｐｏｌ発現の非存在下で選択され得ることが望ましい。
【０００２】
（発明の要旨）
ｇａｇおよびｐｏｌを発現し、そして従って、パッケージング細胞として有用な細胞を選択する方法は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現は抑制されるが、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を制御する同じプロモーターによってマーカーが発現されるような方法において、選択可能なマーカーを、パッケージングベクターのｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットに連結することによって得られる。マーカーの効率的な発現は、誘導におけるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の効率的な発現を予測する。
【０００３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、シス作用性ＲＮＡエレメントであるＲＲＥ、およびトランス作用性調節タンパク質であるＲｅｖによって、後期ウイルス遺伝子であるｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖの発現を調節する、ＨＩＶおよび他のレンチウイルスのスプライシング制御メカニズムを利用する。スプライス制御エレメントの戦略的配置によって、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物におけるスイッチが、基底状態における下流の選択マーカー遺伝子の発現、および誘導したときのみの上流のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を可能にする。両方の遺伝子が、同じ構成的なプロモーターによって駆動されるため、スイッチの作動が、選択マーカーの発現レベルに関連する発現レベルまでのｇａｇ／ｐｏｌの誘導を可能にする。
【０００４】
３つの特徴が、スイッチを作動させる：１）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が、スプライスドナー部位および１つ以上のスプライスアクセプター部位内で含まれ、ここでこのアクセプター部位の配列は、マーカー遺伝子の上流の、最適なコンセンサススプライスアクセプター配列と一致しないこと（Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；２）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が、ｇａｇ／ｐｏｌの発現を拮抗する配列を含むこと（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３、１９９７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：７１７６−７１８２、１９９２）；および３）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が、シスにおいてＲＲＥエレメントに連結され、ならびにＲｅｖコード配列から隔てられていること。
【０００５】
ｇａｇ／ｐｏｌおよびマーカー遺伝子の両方の発現を制御するプロモーターが、作動可能にそれらの遺伝子に（一般的にｇａｇ／ｐｏｌ配列から上流に）配置される。
【０００６】
ＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムは、レンチウイルスにおいて見出され、そして従って、ＨＩＶ−１のＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムまたは任意の他のレンチウイルスのＲＲＥ／Ｒｅｖ調節システムが、用いられ得る。また、本明細書中で記載される通り、ｇａｇ／ｐｏｌの発現を制御する選択的スプライシングをもたらす、任意の他のトランス補完制御システムが、本発明の実施において用いられ得る。
【０００７】
最初の２つの特徴は組合わさって、基底状態におけるｇａｇ／ｐｏｌ発現を抑制する。３番目の特徴は、スプライシングされていないＲＮＡの輸送のＲｅｖ依存性刺激（すなわち、誘導）、およびその後のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を可能にする。
【０００８】
スプライス部位に関しては、効率的なスプライスドナー部位（例えば、ＨＩＶの５’主要スプライスドナーのスプライスドナー部位）と１つ以上のスプライスアクセプター部位との組み合わせが用いられ、ここで、このスプライスアクセプター部位は、最適なコンセンサスに正確には一致しない。従って、目的のスプライスアクセプターは、当業者が、効率的でも、強力でも良好でもないと認識するものである。それにもかかわらず、最適未満の速度の効率ではあるが、スプライスアクセプター部位は作動可能である。最適未満のスプライス部位が、Ｒｅｖ−ＲＲＥシステムによる、スプライシングされていない転写物からの、より効率的な発現を可能にするようである。このような最適未満のスプライスアクセプター部位の一例は、ＨＩＶ−１  ｔａｔ遺伝子およびＨＩＶ−１  ｒｅｖ遺伝子の３番目のエキソンのスプライスアクセプター部位である。
【０００９】
非レンチウイルススプライスドナー部位および非レンチウイルススプライスアクセプター部位もまた、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子のスプライシング、従って発現が、トランス作用性因子（例えば、Ｒｅｖ）の存在によって制御される限りは、本発明の実施において用いられ得る。
【００１０】
レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌコード配列（特にイントロンに含まれる配列）の内因性の不安定性が、スプライス部位の最適未満の性質に起因して、蓄積し得るスプライシングされていない転写物からの、基底状態における発現を相殺する。転写物の不安定性に関連することが公知である任意の配列が、本発明の実施において用いられ得る。しかし、不安定性配列（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、およびＳｃｈｗａｒｔｚら、前出、において記載され、同定される、ｇａｇ／ｐｏｌ配列における、不安定性配列）は、スイッチの作動を厳密には必要としないかもしれない。
【００１１】
多くの可能性のある選択マーカーのいずれもが、用いられ得る。容易に検出可能なマーカーが、望ましい。例えば、マーカーは、抗原性である細胞表面分子（例えば、ＣＤ分子またはリンパ球抗原）、あるいは発光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）であり得る。当業者は、当該分野において公知のものから、目的の選択マーカーを自由に選択できる。
【００１２】
本発明の種々のエレメントを目的のベクターにクローニングするための方法は、当該分野において公知である。
【００１３】
さらに別のレベルの調節を導入する手段として、トランス作用性スプライス調節エレメント（ＨＩＶ−１の場合はＲｅｖ）の発現は、同様に誘導性であり得る。別の誘導性のＲｅｖ発現構築物の存在下においては、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現が誘導性になる。例えば、Ｒｅｖの発現は、Ｏｒｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１４００−１１４０６、１９９６）の、テトラサイクリン依存性調節システムを用いて誘導性であり得、ここでＲｅｖが、ｔｅｔオペレーターに隣接してサブクローン化される。ｔｅｔの存在下において、Ｒｅｖは発現されない。しかし、ｔｅｔが培地で使用中止とされる場合に、Ｒｅｖの発現が生じる。
【００１４】
他の公知の調節エレメントが、当該分野において公知であるように用いられ得る。従って、適切かつ公知のプロモーターが、構築物において作動可能に配置され得、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびマーカー遺伝子の発現を調節する。他の調節エレメント（例えば、ポリアデニル化部位）が、所望の通りに用いられ得る。
【００１５】
さらに、種々の改変が、目的のベクターに含まれる任意の１つのエレメントに対してなされ得、所望でない活性を取り除くか、または所望の活性を増強する。当業者は、意図されたエレメントの公知の活性に依存し得、そして公知の技術を実施して、所望の変化（例えば、選択的サブクローニングによる配列欠失、部位特異的変異誘発による遺伝子の不活化など）をもたらし得る。
【００１６】
本発明の利点は、ベクター（例えば、レンチウイルス由来ベクター、特に、ＨＩＶ由来ベクター）に対して最適なパッケージングクローンの選択である。連鎖選択（ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）についての表面マーカーを用いて、安定な、高レベルの発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）の集団が、構築物のトランスフェクトによって選別され得、その後性能を維持することが必要とされる毎に選別され得る。以前に記載された連鎖選択システムにおいて、マーカー遺伝子の発現が、所望の遺伝子の発現と対になっており、そして逆方向においては作動され得ない。
【００１７】
本方法はまた、相同調節エレメントが、目的のコード配列に対してトランスに位置するインデューサー分子の存在下において機能的に同等に作動して、ｇａｇ／ｐｏｌ配列の選択可能なスプライシングが得られる限りは、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ−ＲＲＥシステム、または他のレンチウイルスの相同エレメントのいずれかを用いて、ＨＩＶ−１以外のレンチウイルスベクターのためのパッケージングクローンを選択するために用いられ得る。
【００１８】
さて本発明は、以下の非制限的な実施例において例示される。
【００１９】
（実施例）
パッケージングベクターであるｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４（図１）を、以下を含むように構築した：ヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前／初期  エンハンサー／プロモーター；ＨＩＶ主要５’スプライスドナー；Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に一致する最適化された翻訳開始配列を有する、ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌコード領域（Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、１９９８）；ＨＩＶ  ＲＲＥエレメント；ｔａｔおよびｒｅｖの３番目のエキソン由来のＨＩＶスプライスアクセプター部位；ヒトＣＤ４コード領域；ならびにラットインスリンポリアデニル化配列。
【００２０】
レンチウイルスパッケージングベクターであるｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４が、ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の非常に低い発現を伴った、表面マーカーＣＤ４の高レベルの発現の選択を可能にする。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子へのＣＤ４マーカーの結合に起因して、ＣＤ４の高発現は、ｇａｇ／ｐｏｌの高い誘導性発現に相関する。ＨＩＶ  Ｒｅｖの非存在下において、ＨＩＶスプライスドナーとＨＩＶスプライスアクセプターとの間のｇａｇ／ｐｏｌ配列のスプライシングが、ｇａｇおよびｐｏｌの検出可能な発現を伴わずに、ＣＤ４の効率的な発現をもたらす（図２Ａ）。Ｒｅｖの存在下において、スプライシングされていないｇａｇ／ｐｏｌメッセージのＲＲＥ媒介性輸送が、ｇａｇ  ｐｏｌタンパク質の発現を可能にする（図２Ｂ）。
【００２１】
ｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４プラスミドを、Ｒｅｖ発現プラスミド（Ｄｕｌｌら、前出）を用いて、または用いずに、および選択マーカーである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレンチウイルスベクター送達を引き起こすために必要とされる他のプラスミドの組み合わせを用いて、２９３Ｔ（Ｄｕｌｌら、前出）にトランスフェクトした。
【００２２】
１０センチ皿あたり約４×１０6個の２９３Ｔ細胞を、トランスフェクトの前の夜に、プレーティングした。以下のプラスミドのＣａＰＯ4同時トランスフェクションを行った：ｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４、７μｇ（ＨＩＶ由来ｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド）；ｐＲＳＶ  Ｒｅｖ、２．５μｇ；ｐＣＭＶ  ｔａｔ、１μｇ；ｐＭＤ  ＶＳＶＧ  ｅｎｖ、３．５μｇ；およびｐＲＲＬｈＰＧＫＧＦＰＳＩＮ−１８、１０μｇ（ＰＧＫプロモーターに連結された緑色蛍光タンパク質コード配列を保有する自己不活化ＨＩＶ由来移入ベクター）。同一のトランスフェクションをまた、ｐＲＳＶ  Ｒｅｖプラスミドを用いずに、およびｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４の代わりに親のパッケージングベクターｐＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥを用いて行った。トランスフェクションから２０時間後、新鮮な培地を添加し、そして２４時間後、馴化培地を、免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）（Ｄｕｐｏｎｔ）によってＨＩＶ  ｇａｇ産物であるｐ２４の含有量を測定するため、および形質導入をアッセイするために、収集した。トランスフェクトされた細胞を収集し、フィコエリトリンで標識された抗ＣＤ４抗体とともにインキュベートし、そしてフィコエリトリンおよびＧＦＰ蛍光について、ＦＡＣＳによって分析した。
【００２３】
トランスフェクト体を、ＨＩＶ  Ｒｅｖを伴うおよび伴わない、ＣＤ４およびＧＦＰの両方の発現について分析した。両方の場合において、細胞の大部分が、ＣＤ４およびＧＦＰに対して二重にポジティブであった。期待されるように、ＣＤ４の平均発現レベルが、Ｒｅｖを発現しない細胞において、より高かった。Ｒｅｖの存在下における、基底レベルのＣＤ４の発現は、Ｒｅｖは、ＲＲＥ含有転写物のスプライシングを完全には妨げない、という事実に起因する。
【００２４】
同様のトランスフェクションをまた、ｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４の代わりに親のパッケージングベクターｐＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥを用いて行った。ベクターｐＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥは、βグロビン遺伝子由来の構成的にスプライシングされたイントロンの下流で、Ｒｅｖ依存性様式で、ＨＩＶのｇａｇ／ｐｏｌを発現する。ｐＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥパッケージングベクターおよびＲｅｖを用いて同時トランスフェクトされた細胞は、ｇａｇ／ｐｏｌを発現したが、一方、Ｒｅｖの非存在下において、ｇａｇ／ｐｏｌは、検出されなかった。
【００２５】
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の発現を、免疫捕獲（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）（ＤｕＰｏｎｔ）によって、馴化培地における、ｇａｇ遺伝子産物であるｐ２４の含有量を測定することによって分析した。図３は、ＨＩＶ  Ｒｅｖの存在下およびＨＩＶ  Ｒｅｖの非存在下において、両方のパッケージングベクターを用いてトランスフェクトされた細胞の馴化培地における、ｐ２４濃度を示す。両方のプラスミドに対するｇａｇ／ｐｏｌ発現のＲｅｖ依存性が、明らかである。ＣＤ４コード配列を含むプラスミドは、Ｒｅｖの存在下において、非常に高レベルのｐ２４タンパク質を発現し、これは、コントロールプラスミドを用いて得られたものと類似する。
【００２６】
機能的ベクターの産生を、２９３Ｔ馴化培地を用いてＨｅＬａ細胞へＧＦＰ遺伝子を形質導入することにより分析した。ＨｅＬａ細胞を、ｐＭＤＨ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ  Ｓｐｌ  ＣＤ４パッケージングベクターを用いてトランスフェクトされた細胞、またはＨＩＶ  Ｒｅｖの存在下（ａ）および非存在下（ｂ）において、ｐＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥパッケージングベクターを用いてトランスフェクトされた細胞によって馴化された、１０μｌの培地に曝露した。形質導入実験を、感染の前の夜に、６ウェルプレート中に、１ウェルあたり５×１０4個の細胞をプレーティングすることによって行った。翌日、凍結２９３Ｔ馴化培地を解凍し、そして１：１０、１：１００、１：１０００に希釈し、そして各々の希釈物の１ｍｌを用いて、細胞を感染させた。感染から２０時間後、新鮮な培地を添加し、そして２４時間後、細胞を、ＧＦＰ発現について、ＦＡＣＳによって分析した。
【００２７】
形質導入のＲｅｖ依存性は、両方のプラスミドについて明らかであった。Ｒｅｖが、ベクタープロデューサー細胞において発現される場合においてのみ、標的ＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰを発現する。さらに、いずれかのプラスミドによって産生されたベクターの感染性（１ｎｇのｐ２４あたりの形質導入単位）は類似しており、このことは、ＣＤ４連結プラスミドが、コントロールプラスミドと同じくらい効率的に作動することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明を例示する組換えベクターを示す。ｇａｇ／ｐｏｌ配列が、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位に隣接する。ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答性エレメント）もまた、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位内に含まれる。
【図２】  図２は、図１の例示的な組換えベクターの場合において、ＲＲＥを含むベクターが、マーカー遺伝子のみの誘導可能な発現を提供するメカニズムを示し、このマーカーはＣＤ４である。Ｒｅｖの非存在下において、スプライシングは、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間で生じ、それによって、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を排除する。ＣＤ４のみが発現される。Ｒｅｖが存在する場合、スプライシングは生じず、そしてｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子が発現される。
【図３】  図３は、本発明のベクターを含む細胞が、Ｒｅｖの存在下または非存在下において増殖する場合の、培養培地におけるｐ２４（ｇａｇ遺伝子の産物）の量を示すグラフである。２つの異なるベクター（ＭＤＨ  ｓｐｌ  ＣＤ４およびＭＤ  Ｌ  ｇ／ｐ  ＲＲＥ）が用いられた。両方のベクターにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位によって囲まれ、従って、Ｒｅｖが培養物中に存在する場合に、ｐ２４が発現される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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